(57)【要約】本発明は、新規作用機序を有する、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防または治療剤を提供する。より詳細には、本発明は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、あるいはセリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防または治療剤；被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質、あるいは骨・関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法；骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらすセリン合成酵素遺伝子の変異の同定方法；骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤；骨芽細胞または軟骨細胞分化効率の診断剤；セリン合成酵素の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000017
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤。
【請求項２】
Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤。
【請求項３】
Ｌ−セリンまたはその塩を含む骨または軟骨の形成剤である、請求項２記載の剤。
【請求項４】
医薬である、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
食品である、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000018
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物、あるいはＬ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を、食品材料に添加して、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品を得ることを含む、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品の製造方法。
【請求項７】
Ｌ−セリンまたはその塩が食品材料に添加される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
食品材料が、骨・軟骨の形成作用を有する食品材料である、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000019
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
【請求項１０】
Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
【請求項１１】
骨・関節疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎および変形性関節症からなる群より選ばれる疾患である、請求項９または１０記載の剤。
【請求項１２】
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤。
【請求項１３】
セリン合成酵素がセリンラセマーゼまたは３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が、セリン合成酵素タンパク質またはセリン合成酵素発現ベクターである、請求項１２記載の剤。
【請求項１５】
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸、ターゲティングベクター、抗体、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターからなる群より選ばれる、請求項１２記載の剤。
【請求項１６】
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
【請求項１７】
被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
セリン合成酵素がセリンラセマーゼまたは３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
被験物質およびセリン合成酵素の発現を測定可能な細胞を用いて、被験物質が該細胞におけるセリン合成酵素の発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
被験物質およびセリン合成酵素の機能を測定可能な再構成系を用いて、被験物質が該再構成系におけるセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
被験物質およびセリン合成酵素発現細胞を用いて、被験物質が該細胞においてセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
被験物質および非ヒト動物を用いて、被験物質が該動物においてセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
発現または機能の調節が発現または機能の促進である、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
発現または機能の調節が発現または機能の抑制である、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨・関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
骨・関節疾患が、骨または軟骨の癌、骨または軟骨の形成異常、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、変形性関節症および骨大理石病からなる群より選ばれる疾患である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
セリン合成酵素の特定の変異が骨芽細胞または軟骨細胞分化に及ぼす影響を解析することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらすセリン合成酵素変異の同定方法。
【請求項２８】
変異が多型である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
セリン合成酵素の発現量の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
【請求項３０】
Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
【請求項３１】
セリン合成酵素の多型の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
【請求項３２】
以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの構成成分を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化効率の診断剤：
（ｉ）下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000020
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩；
（ｉｉ）Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩；
（ｉｉｉ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質。
【請求項３３】
以下（ａ）および（ｂ）を含む、キット：
（ａ）下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの構成成分：
（ｉ）下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000021
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩；
（ｉｉ）Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩；
（ｉｉｉ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質；
（ｉｖ）セリン合成酵素の発現量または多型の測定用試薬；
（ｖ）Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬；
（ｂ）骨芽細胞または軟骨細胞の同定用試薬、ならびに／あるいは骨芽細胞または軟骨細胞の分化調節用試薬（但し、（ａ）の物質を含む試薬を除く）。
【請求項３４】
セリン合成酵素の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞。
【請求項３５】
骨芽細胞または軟骨細胞が、セリン合成酵素安定発現骨芽細胞株または軟骨細胞株である、請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
骨芽細胞または軟骨細胞特異的なセリン合成酵素発現ベクター。
【請求項３７】
下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000022
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
【請求項３８】
Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
【請求項３９】
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
【請求項４０】
骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000023
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩の使用。
【請求項４１】
骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩の使用。
【請求項４２】
骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分化調節剤、骨・関節疾患の予防・治療剤、細胞分化を調節し得る物質または骨・関節疾患を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法、細胞分化に変化をもたらす多型等の変異の同定方法、細胞分化に対する動物の生体状態または細胞分化効率の判定方法、遺伝子発現が調節された骨・軟骨形成能を有する細胞などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
セリン（２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸）は、生体においてタンパク質を構成する主要なアミノ酸の一つである。Ｌ−セリンは、解糖系中間体３−ホスホグリセレート（３ＰＧ）から３反応を経て合成される。先ず、一連のＬ−セリン合成反応における律速酵素である３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）により３ＰＧから３−ホスホヒドロキシピルビン酸が生成される。次いで、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ）により３−ホスホヒドロキシピルビン酸からＯ−ホスホセリンが生成し、最後にホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）によりＬ−セリンが合成される。
近年、哺乳動物の脳にＤ−セリンが存在し、神経伝達を担うグルタメート／Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）レセプターを活性化することが見出された。従って、Ｄ−セリンは、脳において重要な役割を果たしていると考えられている。哺乳動物におけるＤ−セリンの起源は不明であったが、Ｌ−セリンをＤ−セリンに変換する触媒活性を有する酵素として、セリンラセマーゼ（ＳＲ）が報告された（Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ（１９９９）ｖｏｌ．９６，ｎｏ．２３  ｐｐ．１３４０９−１３４１４）。ＳＲは、ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）依存性の酵素であり、脳、肝臓等の組織での発現が確認されている。従って、ＳＲは、脳内Ｄ−セリンの生成を担うと考えられ、神経伝達においてその重要性が認識されている。
しかしながら、３ＰＧＤＨ、ＳＲを始めとするセリン合成酵素およびＬ−セリンが骨芽細胞、軟骨細胞の分化を調節し得ることについては何ら報告がない。
【発明の開示】
【０００３】
遺伝子の機能解析は、種々の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬、または試薬の開発などにつながる。本発明は、一連のセリン合成酵素の機能解析により得られた知見に基づき、種々の疾患に対し新たな作用機序を有する医薬、または試薬を提供すること、ならびに医薬または試薬の開発などに有用な手段を提供することなどを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＳＲが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を負に調節し得ることを見出した。一方、本発明者らはまた、予想外なことに、３ＰＧＤＨがＳＲとは異なり骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を正に調節し得ることを見出した。本発明者らはさらに、３ＰＧＤＨのこの作用が、それにより合成されるＬ−セリンによりもたらされ得ることなどを見出した。従って、セリン合成酵素の発現または機能の調節により、あるいはＬ−セリンもしくはその天然前駆体を用いることにより、骨芽細胞、軟骨細胞を始めとする骨・軟骨形成能を有する細胞の分化、あるいは骨・軟骨形成を調節することが可能になると考えられる。また、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質のスクリーニングは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節能を有する、ならびに／あるいは骨・軟骨形成の異常に起因する疾患に対する医薬および研究用試薬の開発などに有用であると考えられる。
以上に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は下記の通りである：
［１］下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000002
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物またはその塩を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤。
［２］Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤。
［３］Ｌ−セリンまたはその塩を含む骨または軟骨の形成剤である、上記［２］の剤。
［４］医薬である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［５］食品である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［６］上記式（Ｉ）で表される化合物、あるいはＬ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を、食品材料に添加して、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品を得ることを含む、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品の製造方法。
［７］Ｌ−セリンまたはその塩が食品材料に添加される、上記［６］の方法。
［８］食品材料が、骨・軟骨の形成作用を有する食品材料である、上記［６］または［７］の方法。
［９］上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
［１０］Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
［１１］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎および変形性関節症からなる群より選ばれる疾患である、上記［９］または［１０］の剤。
［１２］セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤。
［１３］セリン合成酵素がセリンラセマーゼまたは３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、上記［１２］の剤。
［１４］セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が、セリン合成酵素タンパク質またはセリン合成酵素発現ベクターである、上記［１２］の剤。
［１５］セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸、ターゲティングベクター、抗体、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターからなる群より選ばれる、上記［１２］の剤。
［１６］セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む、骨・関節疾患の予防または治療剤。
［１７］被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１８］セリン合成酵素がセリンラセマーゼまたは３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、上記［１７］の方法。
［１９］被験物質およびセリン合成酵素の発現を測定可能な細胞を用いて、被験物質が該細胞におけるセリン合成酵素の発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、上記［１７］の方法。
［２０］被験物質およびセリン合成酵素の機能を測定可能な再構成系を用いて、被験物質が該再構成系におけるセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、上記［１７］の方法。
［２１］被験物質およびセリン合成酵素発現細胞を用いて、被験物質が該細胞においてセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、上記［１７］の方法。
［２２］被験物質および非ヒト動物を用いて、被験物質が該動物においてセリン合成酵素の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、上記［１７］の方法。
［２３］発現または機能の調節が発現または機能の促進である、上記［１７］の方法。
［２４］発現または機能の調節が発現または機能の抑制である、上記［１７］の方法。
［２５］被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨・関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法。
［２６］骨・関節疾患が、骨または軟骨の癌、骨または軟骨の形成異常、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、変形性関節症および骨大理石病からなる群より選ばれる疾患である、上記［２５］の方法。
［２７］セリン合成酵素の特定の変異が骨芽細胞または軟骨細胞分化に及ぼす影響を解析することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらすセリン合成酵素変異の同定方法。
［２８］変異が多型である、上記［２６］の方法。
［２９］セリン合成酵素の発現量の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
［３０］Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
［３１］セリン合成酵素の多型の測定用試薬を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤。
［３２］以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの構成成分を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化効率の診断剤：
（ｉ）上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩；
（ｉｉ）Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩；
（ｉｉｉ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質。
［３３］以下（ａ）および（ｂ）を含む、キット：
（ａ）下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの構成成分：
（ｉ）上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩；
（ｉｉ）Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩；
（ｉｉｉ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質；
（ｉｖ）セリン合成酵素の発現量または多型の測定用試薬；
（ｖ）Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬；
（ｂ）骨芽細胞または軟骨細胞の同定用試薬、ならびに／あるいは骨芽細胞または軟骨細胞の分化調節用試薬（但し、（ａ）の物質を含む試薬を除く）。
［３４］セリン合成酵素の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞。
［３５］骨芽細胞または軟骨細胞が、セリン合成酵素安定発現骨芽細胞株または軟骨細胞株である、上記［３４］の細胞。
［３６］骨芽細胞または軟骨細胞特異的なセリン合成酵素発現ベクター。
［３７］上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
［３８］Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
［３９］セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与することを含む、骨・関節疾患の予防または治療方法。
［４０］骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の使用。
［４１］骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグ、あるいはそれらの塩の使用。
［４２］骨・関節疾患の予防または治療剤の作製における、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の使用。
本発明の調節剤は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節、ならびに骨・関節疾患の予防・治療などに有用であり得る。本発明のスクリーニング方法は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節剤、ならびに骨・関節疾患に対する予防・治療剤の開発などに有用である。本発明の診断剤は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動物の生体状態の評価を可能とするため、あるいは骨・関節疾患の患者の治療に際して、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の当該患者における治療効果の予測を可能とするため有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、生後１日齢のＷｉｓｔａｒ系ラットの脛骨におけるセリンラセマーゼ（ＳＲ）の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションにより確認した結果を示す。
図２は、生後１日齢のＷｉｓｔａｒ系ラットの脛骨に見出される骨芽細胞おけるセリンラセマーゼ（ＳＲ）の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションにより確認した結果を示す。矢印は骨芽細胞を示す。
図３は、樹立したＳＲ安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＳＲの発現を、ノザンブロッティングにより確認した結果を示す。
図４は、樹立したＳＲ安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるアルシアンブルー染色（ｎ＝４）の結果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１
図５は、樹立したＳＲ安定発現ＡＴＤＣ５細胞株の細胞増殖性を、ＭＴＴアッセイ（ｎ＝４）、ＢｒｄＵの取り込み能（ｎ＝４）により解析した結果を示す。
図６は、ＳＲがＳＯＸ９の転写活性能に与える影響を、レポーターアッセイ（ｎ＝４）により解析した結果を示す。
図７は、作製した３ＰＧＤＨ安定発現ＭＣ３Ｔ３細胞株における３ＰＧＤＨの発現をノザンブロッティングにより確認した結果を示す。
図８は、ＭＣ３Ｔ３−３ＰＧＤＨ細胞におけるノジュール（ｎｏｄｕｌｅ）形成を、位相差顕微鏡により観察した結果示す。矢印はノジュールを示す。
図９は、Ｌ−Ｓｅｒを作用させた初代培養軟骨細胞におけるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性、Ｃａ２＋蓄積の変化（いずれもｎ＝６）を示す。ＡＬＰ活性は培養後１４日目に、Ｃａ２＋蓄積は培養後２８日目に測定した。＊＊Ｐ＜０．０１
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（１．分化調節剤、予防・治療剤）
（１．１．セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む調節剤）
本発明は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を含む、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節剤、ＳＯＸ９発現の調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防・治療剤を提供する。また、必要に応じて、本発明は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質自体も提供する。
セリン合成酵素とは、本明細書中で使用される場合、セリン（Ｌ−セリンまたはＤ−セリン）の生合成に関与しているタンパク質をいう。セリン合成酵素としては、３−ホスホグリセレート（３ＰＧ）から３−ホスホヒドロキシピルビン酸を生成する触媒活性を有する３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）、３−ホスホヒドロキシピルビン酸からＯ−ホスホセリンを生成する触媒活性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ）、Ｏ−ホスホセリンからＬ−セリンを生成する触媒活性を有するホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）、ならびにＬ−セリンをＤ−セリンに変換する触媒活性を有するセリンラセマーゼ（ＳＲ）が挙げられる。
Ｌ−セリン合成酵素とは、本明細書中で使用される場合、上述したセリン合成酵素のうち、Ｌ−セリンの生合成に関与している３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ）、ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）を包括的に意味するが、セリンラセマーゼ（ＳＲ）は除かれるものとする。
３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）は、ヒト３ＰＧＤＨ（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６６２３参照）またはそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）であり得る。３ＰＧＤＨのオルソログは特に限定されず、例えば哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来するものであり得る。３ＰＧＤＨは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節（例、促進）し得る限り、または骨・関節疾患の予防・治療に十分な程度にその機能（例、ノジュール形成能）を保持し得る限り、あるいは３−ホスホグリセレート（３ＰＧ）から３−ホスホヒドロキシピルビン酸を生成する触媒活性を有し得る限り、そのコードするアミノ酸配列（例、配列番号１で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列）において１以上（例、１〜１０）のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。
ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ）は、ヒトＰＳＡＴ（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０５８１７９参照）またはそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）であり得る。ＰＳＡＴのオルソログは特に限定されず、例えば哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来するものであり得る。ＰＳＡＴは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る限り、または骨・関節疾患の予防・治療に十分な程度にその機能（例、ノジュール形成能）を保持し得る限り、あるいは３−ホスホヒドロキシピルビン酸からＯ−ホスホセリンを生成する触媒活性を有し得る限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上（例、１〜１０）のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。
ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）は、ヒトＰＳＰＨ（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４５７７参照）またはそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）であり得る。ＰＳＰＨのオルソログは特に限定されず、例えば哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来するものであり得る。ＰＳＰＨは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る限り、または骨・関節疾患の予防・治療に十分な程度にその機能（例、ノジュール形成能）を保持し得る限り、あるいはＯ−ホスホセリンからＬ−セリンを生成する触媒活性を有し得る限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上（例、１〜１０）のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。
セリンラセマーゼ（ＳＲ）は、ヒトＳＲ（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１９４７参照）またはそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）であり得る。ＳＲのオルソログは特に限定されず、例えば哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来するものであり得る。ＳＲは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節（例、抑制）し得る限り、または骨・関節疾患の予防・治療に十分な程度にその機能を保持し得る限り、あるいは間葉系幹細胞から骨・軟骨形成能を有する細胞の前駆細胞への分化に重要な役割を果たし得る因子（例、ＳＯＸ９）の発現の調節（例、抑制）能を有し得る限り、またはＬ−セリンからＤ−セリンを変換する触媒活性を有する限り、そのコードするアミノ酸配列（例、配列番号３で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列）において１以上（例、１〜１０）のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。
一実施形態では、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質は、セリン合成酵素の発現を促進する物質であり得る。
セリン合成酵素の発現とは、セリン合成酵素遺伝子からの翻訳産物（即ち、蛋白質）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、セリン合成酵素の発現を促進する物質は、セリン合成酵素の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化および蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、セリン合成酵素の発現の促進としては、セリン合成酵素（蛋白質）自体の補充をも含むものとする。
セリン合成酵素の発現を促進する物質の例は、セリン合成酵素（蛋白質）、セリン合成酵素をコードする核酸を含む発現ベクター（セリン合成酵素発現ベクター）、リポポリサッカライド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０３５：１３３−４６（２００４））、またはアミロイドβペプチド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．１（１）：２（２００４））であり得る。
セリン合成酵素は、天然蛋白質または組換え蛋白質であり得る。セリン合成酵素は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）セリン合成酵素を含む生体試料（例、骨、軟骨、肝臓、脳）からセリン合成酵素を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にセリン合成酵素発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるセリン合成酵素を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりセリン合成酵素を合成してもよい。セリン合成酵素は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、セリン合成酵素抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
別の実施形態では、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質は、セリン合成酵素の発現を抑制する物質であり得る。セリン合成酵素の発現を抑制する物質は、セリン合成酵素の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化および蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
セリン合成酵素の発現を抑制する物質の例は、セリン合成酵素の転写産物、詳細にはｍＲＮＡもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、セリン合成酵素の転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、セリン合成酵素の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
セリン合成酵素の発現を抑制する物質の別の例は、セリン合成酵素の転写産物、詳細にはｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムである。リボザイムとは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。また、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
セリン合成酵素の発現を抑制する物質の別の例は、ＲＮＡｉ誘導性核酸である。ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡｉ効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
セリン合成酵素の発現を抑制する物質の別の例は、デコイ核酸である。デコイ核酸とは、転写調節因子が結合する領域を模倣するポリヌクレオチドをいい、セリン合成酵素の発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、セリン合成酵素に対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子を含むものであり得る。デコイ核酸は、セリン合成酵素に対する転写活性化因子が結合する領域を含むものである限り限定されないが、例えば、３ＰＧＤＨに対する転写活性化因子Ｓｐ１が結合するＳｐ１結合部位、ＳＲに対する転写活性化因子ＡＰ１が結合するＡＰ１結合部位を含むもの、あるいはこれらの遺伝子上流約２ｋｂｐを含むものであり得る。デコイ核酸としては、例えば、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、またはリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、セリン合成酵素に対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。
セリン合成酵素の発現を抑制する物質の別の例は、ターゲティングベクターである。本発明で用いられるターゲティングベクターは、セリン合成酵素遺伝子の相同組換えを誘導し得るセリン合成酵素遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、ならびに必要に応じて選択マーカーを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、セリン合成酵素を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドは、セリン合成酵素遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおいて、第一および第二のポリヌクレオチドに対して相同な２つの領域の間に存在するゲノムＤＮＡ部分領域が欠失すると、セリン合成酵素遺伝子の機能的欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。
別の実施形態では、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質は、セリン合成酵素の機能を抑制する物質であり得る。セリン合成酵素の機能を抑制する物質としては、セリン合成酵素の作用を妨げ得る物質である限り特に限定されないが、セリン合成酵素阻害タンパク質（例、セリン合成酵素ドミナントネガティブ変異体、セリン合成酵素抗体）、これらをコードする核酸を含む発現ベクターが例示される。
セリン合成酵素に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、単鎖抗体）であってもよい。
例えば、ポリクローナル抗体は、セリン合成酵素あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化またはヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
セリン合成酵素のドミナントネガティブ変異体とは、セリン合成酵素に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、天然のセリン合成酵素と競合することで間接的にその活性を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、セリン合成酵素をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製できる。例えば、ＳＲの機能性部位としては、ピリドキサール−５’−ホスフェート結合領域（例、Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２３）：１３４０９−１３４１４（１９９９）参照）が挙げられる。
セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が、核酸分子または蛋白質分子である場合、本発明の剤は、核酸分子または蛋白質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、骨・軟骨形成能を有する細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞）に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、骨・軟骨形成能を有する細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得るが、例えば、骨芽細胞特異的プロモーターとしては、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン遺伝子由来プロモーターを、軟骨細胞特異的プロモーターとしては、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン遺伝子由来プロモーターを使用できる。本発明はまた、このようなプロモーターを有する発現ベクターを提供する。
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
本発明の剤は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。
本発明の剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。本発明の剤が医薬または研究用試薬として使用される場合、骨・関節疾患の予防・治療、あるいは骨・関節疾患モデルの誘発のために使用することができる。骨・関節疾患としては、例えば、骨または軟骨の癌、骨または軟骨の形成異常、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、変形性関節症、骨大理石病が挙げられる。
詳細には、本発明の剤は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質として、例えばＬ−セリン合成酵素（即ち、３ＰＧＤＨ、ＰＳＡＴ、ＰＳＰＨ）の発現または機能を抑制する物質、あるいはＳＲの発現または機能を促進する物質を含む場合、骨・軟骨形成能を有する細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞）の分化を抑制し得る。本発明者らは、３ＰＧＤＨおよびそれにより生成されるＬ−セリンが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し得る因子であることを見出した。従って、３ＰＧＤＨ、ならびにＬ−セリン合成に関与するＰＳＡＴおよびＰＳＰＨのいずれかの発現または機能を抑制する物質は、Ｌ−セリンによる骨・軟骨形成能を有する細胞の分化促進を解除し（即ち、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し）、以ってその分化細胞数の減少、あるいは骨・軟骨形成の抑制を引き起こし得ると考えられる。本発明者らはまた、ＳＲが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し得る因子であることを見出した。従って、ＳＲの発現または機能を促進する物質は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し、以ってその分化細胞数の減少、あるいは骨・軟骨形成の抑制を引き起こし得ると考えられる。この場合、本発明の剤は、骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防・治療、あるいは骨・軟骨形成が抑制された疾患モデル（例、細胞、動物）の作製（本明細書中以下、必要に応じて「骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防・治療など」と省略する。）のために使用され得る。骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患としては、例えば、骨または軟骨の癌、骨または軟骨の形成異常、骨大理石病が挙げられる。骨・軟骨形成が抑制された疾患モデルにおける骨・軟骨形成が抑制された疾患は、骨・軟骨形成の促進が所望される後述の疾患と同様であり得る。
一方、本発明の剤は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質として、例えばＬ−セリン合成酵素の発現または機能を促進する物質、あるいはＳＲの発現または機能を抑制する物質を含む場合、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し得る。本発明者らは、３ＰＧＤＨおよびそれにより生成されるＬ−セリンが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し得る因子であることを見出した。従って、３ＰＧＤＨ、ならびにＬ−セリン合成に関与するＰＳＡＴおよびＰＳＰＨのいずれかの発現または機能を促進する物質は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し、以ってその分化細胞数の増加、あるいは骨・軟骨形成の促進を引き起こし得ると考えられる。本発明者らはまた、ＳＲが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し得る因子であることを見出した。従って、ＳＲの発現または機能を抑制する物質は、ＳＲによる骨・軟骨形成能を有する細胞の分化抑制を解除し（即ち、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し）、以ってその分化細胞数の増加、あるいは骨・軟骨形成の促進を引き起こし得ると考えられる。この場合、本発明の剤は、骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療、あるいは骨・軟骨形成が促進された疾患モデル（例、細胞、動物）の作製（本明細書中以下、必要に応じて「骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療など」と省略する。）に使用され得る。骨・軟骨形成の促進が所望される疾患としては、例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、変形性関節症が挙げられる。骨・軟骨形成が促進された疾患モデルにおける骨・軟骨形成が促進された疾患は、骨・軟骨形成の抑制が所望される上述の疾患と同様であり得る。
本発明の剤はまた、有効成分としてセリン合成酵素の発現または機能を調節する上述の物質を含む場合、該物質が２種以上、あるいは該物質および他の有効成分が配合された併用剤であり得る。本発明の剤が併用剤である場合の他の有効成分としては、例えば、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質、骨・関節疾患の予防・治療薬が挙げられる。
本発明の併用剤が含み得る、他の有効成分としての、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質としては、例えば、骨芽細胞分化を促進し得る物質（例、ＢＭＰ２）、骨芽細胞分化を抑制し得る物質（例、ｎｏｇｇｉｎ）等の骨芽細胞分化を調節し得る物質、ならびに軟骨細胞分化を促進し得る物質（例、ＴＧＦ−β）、軟骨細胞分化を抑制し得る物質（例、ＰＴＨ）等の軟骨細胞分化を調節し得る物質が挙げられる。
本発明の併用剤が含み得る、他の有効成分としての、骨・関節疾患の予防・治療薬としては、例えば、抗癌剤等の骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患に対する予防・治療薬、ならびに骨粗鬆症の予防・治療薬（例、エストロゲン製剤、ビスホスフォネート製剤、ビタミンＤ製剤、ビタミンＫ（例、Ｋ２）製剤）、抗リウマチ薬（例、ＤＭＡＲＤ（Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉ−Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｒｕｇ）、金化合物）、ステロイド系抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬（例、ＣＯＸ２選択的阻害剤）等の骨・軟骨形成の促進が所望される疾患に対する予防・治療薬が挙げられる。
（１．２．Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグあるいはそれらの塩を含む調節剤）
本発明は、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を含む、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防・治療剤を提供する。
一実施形態では、Ｌ−セリンもしくはそのアナログは、下記式（Ｉ）：
2007000884.tif 000003
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、各々独立して、水素原子、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい４〜７員の複素環基であるか、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜７員の複素環基を形成し、
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基、置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、置換されていてもよい４〜７員の複素環基、またはハロゲン原子であり、
Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいリン酸基、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいチオール基である〕で表される化合物であり得る。
「置換されていてもよいＣ１−８アルキル基」の「Ｃ１−８アルキル基」は、直鎖または分岐鎖であり、好ましくは炭素数１〜６、より好ましくは炭素数１〜４である。Ｃ１−８アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ２−８アルケニル基」の「Ｃ２−８アルケニル基」は、直鎖または分岐鎖であり、好ましくは炭素数２〜６、より好ましくは炭素数２〜４である。Ｃ２−８アルケニル基としては、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、オクテニルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ２−８アルキニル基」の「Ｃ２−８アルキニル基」は、直鎖または分岐鎖であり、好ましくは炭素数２〜６、より好ましくは炭素数２〜４である。Ｃ２−８アルキニル基としては、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基」の「Ｃ３−８シクロアルキル基」は、好ましくは炭素数３〜６、より好ましくは炭素数３〜４である。Ｃ３−８シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ３−８シクロアルケニル基」の「Ｃ３−８シクロアルケニル基」は、好ましくは炭素数３〜６、より好ましくは炭素数３〜４である。Ｃ３−８シクロアルケニル基としては、例えば、２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル、３−シクロヘキセン−１−イル、３−シクロヘプテン−１−イル、４−シクロオクテン−１−イルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ１−８アシル基」の「Ｃ１−８アシル基」は、直鎖または分岐鎖であり、好ましくは炭素数２〜６、より好ましくは炭素数２〜４である。Ｃ１−８アシル基としては、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ６−１０アリール基」の「Ｃ６−１０アリール基」としては、例えば、フェニル、ナフチル（例、１−ナフチル、２−ナフチル）が挙げられる。
「置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基」の「Ｃ７−１０アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチルが挙げられる。
上述したＣ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ１−８アシル基、Ｃ６−１０アリール基、およびＣ７−１０アラルキル基は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アミジノ基、チオール基、スルホ基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ニトロソ基、オキソ基、リン酸基（以上、置換基Ａ）、ならびにそれぞれ置換可能な位置に１〜３個の置換基Ａを有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ３−６シクロアルケニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ７−１０アラルキル基、５〜６員の単環式芳香族および非芳香族複素環基（後述と同様）、Ｃ１−６アルコキシ基（例、Ｃ１−６アルキルオキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ１−６アルキニルオキシ基）が挙げられる。
「置換されていてもよい４〜７員の複素環基」の「４〜７員の複素環基」としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）含有する４〜７員（好ましくは５または６員）の単環式芳香族および非芳香族複素環基が挙げられる。このような単環式芳香族複素環基としては、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリルが挙げられる。このような単環式非芳香族複素環基としては、例えば、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ヘキサメチレンイミニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリジニル、ジオキソリル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニルが挙げられる。
上述の「４〜７員の複素環基」は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、上述したＣ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ１−８アシル基、Ｃ６−１０アリール基、およびＣ７−１０アラルキル基が有していてもよい置換基と同様のものが挙げられる。また、４〜７員の複素環基の２個以上の置換基が一緒になって形成される、置換されていてもよい４〜１３員の縮合芳香族または非芳香族複素環を表してもよい。このような縮合芳香族複素環基としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、キノキサリル、フタラジニル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリル、インダゾリルが挙げられる。このような縮合非芳香族複素環基としては、例えば、ジヒドロキノリニル、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾジオキシニル、テトラヒドロベンゾフラニル、ジヒドロインドリルが挙げられる。このような４〜１３員の縮合複素環が有していてもよい置換基としては、例えば、上述したＣ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ１−８アシル基、Ｃ６−１０アリール基、およびＣ７−１０アラルキル基が有していてもよい置換基と同様のものが挙げられる。
「置換されていてもよいヒドロキシル基」および「置換されていてもよいチオール基」としては、例えば、それぞれ置換されていてもよい、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ７−１０アラルキル基、４〜７員の複素環基から選ばれる置換基で置換されていてもよいヒドロキシル基およびチオール基がそれぞれ挙げられる。
「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、それぞれ置換されていてもよい、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ７−１０アラルキル基、４〜７員の複素環基から選ばれる置換基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基が挙げられる。
「置換されていてもよいリン酸基」としては、例えば、それぞれ置換されていてもよい、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ７−１０アラルキル基、４〜７員の複素環基から選ばれる置換基で置換されていてもよいモノホスフェート基、ジホスフェート基およびトリホスフェート基がそれぞれ挙げられる。
「置換されていてもよいヒドロキシル基」、「置換されていてもよいチオール基」、「置換されていてもよいアミノ基」および「置換されていてもよいリン酸基」における、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基およびＣ７−１０アラルキル基としては、それぞれ上述したものが挙げられる。「置換されていてもよいヒドロキシル基」、「置換されていてもよいチオール基」および「置換されていてもよいアミノ基」における４〜７員の複素環基としては、上述の「置換されていてもよい４〜７員の複素環基」の「４〜７員の複素環基」として例示したものが挙げられる。
「置換されていてもよいヒドロキシル基」、「置換されていてもよいチオール基」、「置換されていてもよいアミノ基」および「置換されていてもよいリン酸基」における、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ７−１０アラルキル基および４〜７員の複素環基は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、上述したＣ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ３−８シクロアルケニル基、Ｃ６−１０アリール基、およびＣ７−１０アラルキル基が有していてもよい置換基と同様のものが挙げられる。
以下、式（Ｉ）で表される化合物の好ましい実施形態を説明する。
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は、上述した通りであるが、なかでも、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ１−６アシル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基または置換されていてもよい５〜６員の複素環基（例、置換されていてもよい５〜６員の単環式非芳香族または芳香族複素環基、あるいは置換されていてもよい５〜１１員の縮合非芳香族または芳香族複素環基）、あるいはＲ１、Ｒ２は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい５〜６員の複素環基（例、置換されていてもよい５〜６員の単環式非芳香族または芳香族複素環基、あるいは置換されていてもよい５〜１１員の縮合非芳香族または芳香族複素環基）を形成するのが好ましく、水素原子がより好ましい。
式（Ｉ）中、Ｒ３は、上述した通りであるが、なかでも、水素原子、置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基が好ましく、置換されていてもよいヒドロキシル基がより好ましい。置換されていてもよいヒドロキシル基は上述した通りであるが、なかでも、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基から選ばれる置換基で置換されたヒドロキシル基、あるいは非置換ヒドロキシル基が好ましい。
式（Ｉ）中、Ｒ４は、上述した通りであるが、なかでも、置換されていてもよいヒドロキシル基、または置換されていてもよいリン酸基が好ましい。置換されていてもよいヒドロキシル基は上述した通りであるが、なかでも、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基から選ばれる置換基で置換されたヒドロキシル基、あるいは非置換ヒドロキシル基が好ましい。置換されていてもよいリン酸基は上述した通りであるが、なかでも、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキル基、置換されていてもよいＣ３−６シクロアルケニル基、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基から選ばれる置換基で置換されたリン酸基、あるいは非置換リン酸基が好ましく、非置換リン酸基（例、モノホスフェート基、ジホスフェート基およびトリホスフェート基）が好ましい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４における「置換されていてもよいＸ基」における「Ｘ基」は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、上述したものが挙げられるが、好ましくは、置換基Ａ、ならびにそれぞれ置換可能な位置に１または２個の置換基Ａを有していてもよい、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ２−４アルケニル基、Ｃ２−４アルキニル基、Ｃ２−４アルコキシ基（例、Ｃ２−４アルキルオキシ基）であり得る。
式（Ｉ）で表される化合物は、最も好ましくは、Ｌ−セリンまたはＯ−ホスホセリンであり得る。
別の実施形態では、Ｌ−セリンもしくはそのアナログは、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体またはそれらのプロドラッグであり得る。
Ｌ−セリンの天然前駆体は、Ｌ−セリン生合成経路におけるＬ−セリン前駆体であり得、例えば、３−ホスホグリセレート、３−ホスホヒドロキシピルビン酸、Ｏ−ホスホセリンが挙げられるが、３−ホスホヒドロキシピルビン酸、Ｏ−ホスホセリンが好ましい。
Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のプロドラッグは、生体内における生理条件下の反応（例、酵素による酸化、還元または加水分解反応、あるいは胃酸による加水分解反応）によりＬ−セリンもしくはその天然前駆体に変換され得る化合物をいう。Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のプロドラッグとしては、例えば、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のアミノ基がアシル化またはアルキル化された化合物（例、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のアミノ基が、上述した置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基で置換された化合物）、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のカルボキシル基がエステル化またはアミド化された化合物（例、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のカルボキシル基が、上述した置換されていてもよいヒドロキシル基、置換されていてもよいアミノ基で置換された化合物）、あるいはＬ−セリンもしくはその天然前駆体のヒドロキシル基がアシル化またはアルキル化された化合物（例、Ｌ−セリンもしくはその天然前駆体のヒドロキシル基が、上述した置換されていてもよいＣ１−８アシル基、置換されていてもよいＣ１−８アルキル基で置換された化合物）が挙げられる。
Ｌ−セリンもしくはそのアナログの塩としては、特に限定されないが、医薬上または食品上許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）または酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩は、自体公知の有機化学的方法または生化学的方法（例、酵素反応）により製造できる。
本発明の剤は、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩に加え、任意の担体、例えば医薬上または食品上許容され得る担体を含むことができる。医薬上または食品上許容され得る担体は、上述した医薬上許容され得る担体と同様であり得る。本発明の剤はまた、上述した経口投与または非経口投与に好適な製剤であり得る。
本発明の剤の投与または摂取量は、用いる様式（例、医薬、飲料水等の食品）、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５ｇである。
本発明の剤は、例えば、医薬、食品または研究用試薬として有用である。本発明の剤が医薬または研究用試薬として使用される場合、例えば、上述した骨・関節疾患の予防・治療剤、または該疾患モデルの誘発剤として使用することができる。
本発明の剤が食品として使用される場合、食品としては、例えば、一般食品（例、パン、乳製品（牛乳、ヨーグルト）、菓子、キャンデー、飴、チョコレート、ケーキ、プリン、ゼリー、清涼飲料水、麺類）、健康食品、ダイエタリーサプリメント、ならびに厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品および栄養機能食品が挙げられる。
詳細には、本発明の剤は、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を含む場合、骨・軟骨形成能を有する細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞）の分化を促進し得る。本発明者らは、Ｌ−セリンが骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し得る因子であることを見出した。従って、Ｌ−セリンもしくはそのアナログは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を促進し、以ってその分化細胞数の増加、あるいは骨・軟骨形成の促進を引き起こし得ると考えられる。この場合、本発明の剤は、上述した骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。
本発明の剤はまた、有効成分として、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を含む場合、これらの化合物などが２種以上、あるいはこれらの化合物および他の有効成分が配合された併用剤であり得る。本発明の剤が併用剤である場合の他の有効成分としては、例えば、上述した他の有効成分、ならびにアミノ酸またはペプチド、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖）、脂質（例、不飽和脂肪酸）、ビタミン、無機塩またはイオン（例、Ｃａ塩、Ｃａ２＋）、ならびに微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分が挙げられる。
本発明の剤が、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩に加え、有効成分として他の物質（例、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節能を有する物質、骨・関節疾患の予防・治療作用を有する物質）を含む場合、それらは一緒になった形態（例、同一容器中に混合物として格納）、あるいは互いに隔離された形態（例、異なる容器に格納）で提供され得る。
本発明の剤は、液状（水溶性、不溶性）、固形、粉末、顆粒等の任意の形態であり得る。本発明の剤が固形、粉末、顆粒等の形態である場合、水又は水溶液に溶解して用いることができる。このような場合、本発明の剤は溶解補助物を含んでいてもよい。
本発明の剤、例えば食品は、アミノ酸組成の観点から特徴付けることもできる。ここで、アミノ酸とは、天然蛋白質を構成する天然のＬ−アミノ酸を意味する。例えば、本発明の剤（食品）は、アミノ酸としてＬ−セリン（もしくはそのアナログまたはそれらの塩）のみを含むか、あるいはアミノ酸としてＬ−セリンの量が最も高いものであり得る。アミノ酸としてＬ−セリンの量が最も高い場合、Ｌ−セリンの量は、他の特定のアミノ酸の量に対して、重量において、例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらにより好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上又は２０倍以上であり得るか、あるいはアミノ酸の総量に占めるＬ−セリンの量が、重量において、例えば約３０％以上、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約６０％以上、最も好ましくは約９０％以上又は約９５％以上であり得る。
本発明はまた、本発明の剤、例えば食品の製造方法を提供する。例えば、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を食品材料に添加して、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品を得ることを含む、骨・軟骨形成作用が付加又は増強された食品の製造方法が提供される。本明細書中で使用される場合、食品材料とは、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩の添加前の任意の食用可能なものをいう。食品材料は、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩をもともと含んでいるものであっても、含んでいないものであってもよい。食品材料はまた、骨・軟骨の形成作用を有する食品材料であり得、例えば、骨・軟骨の形成に好ましい成分（例、上述したビタミンＤ、ビタミンＫ、Ｃａ）を含むもの、並びに／あるいは骨・軟骨の形成に好ましい一般食品（例、牛乳、ヨーグルト等の乳製品、及び上記成分を含む清涼飲料水等）又はその材料が挙げられる。本発明者らの研究成果によれば、このような食品材料とＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩とを組み合わせる動機付けが生まれるが、本発明者らの研究成果なしには、これらを組み合わせる動機付けはない。本発明の食品はまた、このように製造された、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩が添加又は増量された食品であり得る。
（１．３．分化調節方法）
本発明はまた、本発明の剤のインビトロ使用の一形態であり得る、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節方法を提供する。本方法は、例えば、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、ならびに／あるいはセリンもしくはそのアナログあるいはそれらの塩を用いて、骨・軟骨形成能を有する細胞におけるセリン合成酵素の発現または機能を調節するように培養することを含む。
骨・軟骨形成能を有する細胞は、任意の動物、例えば鳥類、哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ヒト、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）に由来する細胞であり得る。該細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞等の幹細胞から分化誘導される細胞であり得る。また、本発明の方法により得られる細胞の移植を意図する場合、移植が意図される動物と同種動物由来の細胞を用いることで、同種移植に好適な細胞が得られ、移植が意図される個体由来の細胞を用いることで、同種同系移植に好適な細胞が得られる。該細胞は、マーカー分子（後述）を利用する自体公知の方法（例、ＦＡＣＳ）により入手できる。
細胞培養に用いられる培地は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に適切である限り特に限定されず適宜選択されるが、例えば、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地またはＲＰＭＩ１６４０培地、あるいはそれらの混合培地を基本培地として含むものなどである。培地への添加剤としては、例えば、各種アミノ酸、各種無機塩、各種ビタミン、各種抗生物質、緩衝剤などが挙げられる。培養条件もまた適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃である。培地は、血清を含んでも含まなくともよいが、細胞移植を意図する場合、未同定成分の混入の防止、感染リスクの軽減などの観点から、無血清培地が好ましい。なお、本発明の方法により得られた細胞は、細胞治療（移植）に用いることができるが、この場合、培養で使用する物質、材料は、同種移植という観点から、細胞治療を受ける被験体と同種動物由来の物質、材料で統一するのが好ましい。
本発明の調節方法は、骨・軟骨形成能を有する細胞から分化調節された細胞（例、分化が促進または抑制された細胞）を単離することをさらに含むことができる。細胞の単離は、細胞マーカーを利用する自体公知の方法等により行うことができる。
本発明の調節方法はまた、骨・軟骨形成能を有する細胞から分化誘導された細胞をさらに分化調節することを含むこともできる。骨・軟骨形成能を有する細胞から分化誘導された細胞をさらに分化させる方法は特に限定されるものではないが、例えば、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、ならびに／あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩と他の分化調節物質（例、上述した骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質）との共存下で細胞を培養する方法、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、ならびに／あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩の存在下での骨・軟骨形成能を有する細胞の培養後に他の分化調節物質を使用する方法が挙げられる。
本発明の調節方法は、例えば、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節することができるため、あるいは骨・軟骨形成能を有する細胞以外の細胞を幹細胞からより特異的に分化させる際に、骨・軟骨形成能を有する細胞への分化を抑制することによりその分化効率を高めることができるため有用である。
（２．スクリーニング方法）
本発明は、被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質、ＳＯＸ９発現を調節し得る物質、あるいは骨・関節疾患を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含む分化調節剤あるいは予防・治療剤を提供する。
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法は、被験物質がセリン合成酵素の発現または機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法は、１）セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞を用いたセリン合成酵素の発現の測定、２）セリン合成酵素の機能を測定可能な再構成系（非培養細胞系）を用いたセリン合成酵素の機能の測定、３）セリン合成酵素発現細胞を用いたセリン合成酵素の機能の測定、４）非ヒト動物を用いたセリン合成酵素の発現または機能の測定などに基づき行われ得る。
上記１）において、セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質とセリン合成酵素の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるセリン合成酵素の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セリン合成酵素の発現量を調節する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がセリン合成酵素の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。
セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞とは、セリン合成酵素の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的または間接的に評価可能な細胞をいう。セリン合成酵素の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、セリン合成酵素発現細胞であり得、一方、セリン合成酵素の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物細胞であり得る。
セリン合成酵素発現細胞は、セリン合成酵素を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。また、セリン合成酵素発現細胞としては、骨・軟骨形成能を有する細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞）を使用することもまた好ましい。また、骨・関節疾患モデル動物（後述）由来の細胞を用いてもよい。
セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域は、セリン合成酵素の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、各セリン合成酵素遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは３ＰＧＤＨのシス作用性エレメント（例、Ｓｐ１結合部位）またはＳＲのシス作用性エレメント（例、ＡＰ１結合部位）、あるいは該領域の塩基配列において１以上（例、１〜１０）の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つこれらのセリン合成酵素の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質または検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
セリン合成酵素遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、セリン合成酵素遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、セリン合成酵素に対する生理的な転写調節因子を発現し、セリン合成酵素の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、セリン合成酵素発現細胞が好ましい。
被験物質とセリン合成酵素の発現を測定可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞として、セリン合成酵素発現細胞を用いた場合、発現量は、セリン合成酵素の産物、例えば、転写産物または翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法などが使用できる。一方、セリン合成酵素の発現を測定可能な細胞として、セリン合成酵素転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるセリン合成酵素の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるセリン合成酵素の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
上記方法の工程（ｃ）では、セリン合成酵素の発現量を調節する被験物質が選択される。例えば、Ｌ−セリン合成酵素（即ち、３ＰＧＤＨ、ＰＳＡＴ、ＰＳＰＨ）の発現量を減少させる（発現を抑制する）、またはＳＲの発現量を増加させる（発現を促進する）被験物質は、骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。一方、Ｌ−セリン合成酵素の発現量を増加させる、またはＳＲの発現量を減少させる被験物質は、骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。
上記２）において、セリン合成酵素の機能を測定可能な再構成系とは、セリン合成酵素（タンパク質）およびその他の因子を含む、被験物質によるセリン合成酵素の機能調節能を評価可能な非培養細胞系をいう。再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質、ならびにセリン合成酵素（タンパク質）およびその基質を接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた場合におけるセリン合成酵素による基質からの生成物量を測定し、該量を被験物質を接触させない場合の該生成物量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セリン合成酵素の機能を調節する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ）では、セリン合成酵素による基質から生成物への変換が可能であるアッセイ系において、被験物質、セリン合成酵素およびその基質が接触される。基質としては、セリン合成酵素の種類に応じて、３−ホスホグリセレート（３ＰＧＤＨ）、３−ホスホヒドロキシピルビン酸（ＰＳＡＴ）、Ｏ−ホスホセリン（ＰＳＰＨ）、Ｌ−セリン（ＳＲ）またはそれらと等価な物質（例、放射性同位体等により標識された物質）が適宜使用される。本アッセイ系はまた、セリン合成酵素の触媒活性に必要な補因子（必要に応じて放射性同位体等により標識されていてもよい）を含んで構成される。例えば、このような補因子としては、ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＳＲ）が挙げられる。また、本アッセイ系では、セリン合成酵素（および補因子）等を含む細胞ホモジネート（例、セリン合成酵素発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた場合における生成物量が測定される。生成物量の測定は、自体公知の方法、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳにより、または抗生成物抗体を用いる免疫学的手法により、あるいは液体シンチレーションカウンター等による放射活性の検出に基づき行われ得る。また、基質の減少量または補因子の消費量を測定することにより、生成物量を間接的に評価することもできる。このような方法論もまた本工程（ｂ）に含まれる。
次いで、被験物質を接触させた場合の生成物量が、被験物質を接触させない場合の生成物量と比較される。生成物量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない場合の生成物量は、被験物質を接触させた場合の生成物量の測定に対し、事前に測定した生成物量であっても、同時に測定した生成物量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した生成物量であることが好ましい。なお、セリン合成酵素としてＳＲの機能を測定可能な再構成系については、例えば、Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１３４０９−１３４１４（１９９９）、Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７２１−７２５（１９９９）を参照のこと。
上記方法の工程（ｃ）では、生成物量を調節する被験物質が選択される。例えば、３ＰＧＤＨによる３−ホスホグリセレートからの３−ホスホヒドロキシピルビン酸の生成、ＰＳＡＴによる３−ホスホヒドロキシピルビン酸からのＯ−ホスホセリンの生成、またはＯ−ホスホセリンからのＬ−セリンの生成（本明細書中以下、必要に応じて、「Ｌ−セリン合成酵素による生成」と省略する。）を抑制する、またはＳＲによるＬ−セリンからのＤ−セリンの生成を促進する被験物質は、骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。一方、Ｌ−セリン合成酵素による生成を促進する、またはＳＲによるＤ−セリンの生成を抑制する被験物質は、骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。
上記３）において、セリン合成酵素発現細胞を用いるセリン合成酵素の機能レベルを測定するスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質とセリン合成酵素発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の機能レベルを測定し、該機能レベルを被験物質を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セリン合成酵素の機能レベルを調節する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がセリン合成酵素発現細胞と接触条件下におかれる。セリン合成酵素発現細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。ここで用いられるセリン合成酵素発現細胞は、タンパク質レベルでのセリン合成酵素のアッセイが可能な程度にセリン合成酵素を発現し得る細胞であり得る。このようなセリン合成酵素発現細胞の好ましい例としては、セリン合成酵素発現ベクターがトランスフェクトされた細胞が挙げられる。セリン合成酵素発現細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。基質、補因子は、上記２）の方法と同様のものを使用できる。
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるセリン合成酵素の機能レベルが測定される。セリン合成酵素の機能レベルは、例えば、セリン合成酵素による基質からの生成物量、ＳＯＸ９発現量またはそのプロモーター活性を指標にして測定、評価できる。これらの測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、セリン合成酵素による生成物量は上記方法２）の工程ｂ）と同様の方法により、または培養上清における生成物量の測定により測定できる。例えば、抗Ｄ−セリン抗体（Ｓｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３９４８−３９５２（１９９５））が知られているので、測定に際してはこのような抗体を用いた免疫学的手法が利用され得る。また、ＳＯＸ９発現量は免疫学的手法、ＰＣＲ法、ノザンブロッティングにより、プロモーター活性はレポーターアッセイにより測定できる。なお、本工程（ｂ）における機能レベルの比較は、上述した比較と同様に行われ得る。なお、セリン合成酵素発現細胞としてＳＲ発現細胞を用いたＳＲの機能レベルの測定の詳細については、例えば、Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１３４０９−１３４１４（１９９９）、Ｗｏｌｏｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７２１−７２５（１９９９）を参照のこと。
上記方法の工程（ｃ）では、機能レベルを調節する被験物質が選択される。例えば、Ｌ−セリン合成酵素による生成を抑制する、またはＳＲによるＬ−セリンからのＤ−セリンの生成を促進する、あるいはＳＯＸ９の発現量またはそのプロモーター活性を減少させる被験物質は、骨・軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。一方、これらの反対の作用を有する被験物質は、骨・軟骨形成の促進が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。
上記４）において、非ヒト動物を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物質を投与した動物におけるセリン合成酵素の発現量または機能レベルを測定し、該発現量を被験物質を投与しない対照動物におけるセリン合成酵素の発現量または機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セリン合成酵素の発現量または機能レベルを調節する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ）では、動物として、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の非ヒト哺乳動物、およびニワトリ等の鳥類などの動物が使用される。動物としてはまた、骨・関節疾患モデル動物（例、卵巣摘出マウス（閉経後骨粗鬆症モデルマウス）、ＳＡＭＰ６（老年性骨粗鬆症モデルマウス）、コラーゲン誘発性関節炎モデルラット）が使用され得る。被験物質の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。
上記方法の工程（ｂ）では、セリン合成酵素の発現量または機能レベルの測定は自体公知の方法により測定され得る。例えば、動物から単離または採取された骨芽細胞または軟骨細胞あるいは骨または軟骨組織におけるセリン合成酵素の発現量または機能レベルが、上記１）〜３）の方法の工程（ｂ）と同様の方法論により測定され得る。本工程（ｂ）における発現量の比較および上記方法の工程（ｃ）もまた、上記１）〜３）の方法論と同様に行われ得る。
本発明のスクリーニング方法は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質、骨・関節疾患を予防・治療し得る物質、あるいはＳＯＸ９発現を調節し得る物質などのスクリーニングを可能とする。従って、本発明のスクリーニング方法は、医薬または研究用試薬の開発などに有用である。
（３．セリン合成酵素遺伝子の変異の同定方法）
本発明は、セリン合成酵素の特定の変異が骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に及ぼす影響、あるいは骨・関節疾患の発症リスクに及ぼす影響を解析することを含む、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に変化をもたらす、あるいは骨・関節疾患の発症リスクに変化をもたらすセリン合成酵素遺伝子の変異の同定方法、当該方法により同定されるセリン合成酵素遺伝子の変異を含むタンパク質・核酸分子を提供する。
セリン合成酵素遺伝子の変異は、セリン合成酵素における任意の変異であり、セリン合成酵素の多型、セリン合成酵素の人工変異を含む。セリン合成酵素の多型とは、ある母集団において、セリン合成酵素遺伝子を含むゲノムＤＮＡに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、セリン合成酵素遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおける１以上のＤＮＡの置換、欠失、付加、挿入（例、ＳＮＰ、ハプロタイプ）、ならびに該ゲノムＤＮＡ中の部分領域の反復、逆位、転座などであり得る。本発明の方法により同定されるセリン合成酵素の多型のタイプは、セリン合成酵素における全てのタイプの多型のうち、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化効率に変化をもたらし得るヌクレオチド配列の変異、あるいは所定の疾患（例、骨・関節疾患）に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異であり得る。なお、セリン合成酵素多型の解析対象となる動物は上述の通り特に限定されないが、ヒトが好ましい。
解析は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、連鎖解析等の解析方法の結果、疾患（例、骨・関節疾患）の発症頻度、重症度に応じて特定の多型の保有頻度に有意差が認められたとき、そのタイプの多型は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化、あるいは骨・関節疾患の発症リスクに変化をもたらす多型であると判定され得る。また、解析はインビトロで行うことも可能である。例えば、特定の変異（例、多型）を含むセリン合成酵素発現ベクターを導入した骨・軟骨形成能を有する細胞を培養し、その分化効率を、対照セリン合成酵素発現ベクターを導入した対照細胞での効率と比較することで、変異が解析され得る。
本発明の同定方法は、哺乳動物由来の生体試料から調製されたＤＮＡサンプルをシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に供し、セリン合成酵素多型の新たなタイプを決定する工程、あるいはヌクレオチド変異の導入によりセリン合成酵素遺伝子の変異体を人工的に作製する工程をさらに含むこともできる。生体試料は、セリン合成酵素の発現組織または細胞あるいはその他の試料（例、血液）のみならず、毛髪、爪、皮膚、粘膜等のゲノムＤＮＡを含む任意の組織も使用できる。入手の容易性、人体への負担等を考慮すれば、生体試料は、毛髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましい。多型の決定は、由来が異なる生体試料に含まれるゲノムまたは転写産物のヌクレオチド配列を多数解析し、決定されたヌクレオチド配列中に一定頻度で見出される変異を同定することで行われ得る。
本発明の同定方法は、例えば、所定の疾患の発症リスクに影響を及ぼし得る多型の同定、あるいはセリン合成酵素遺伝子の変異体（例、分化調節能または特定の活性が増強または抑制された変異体）の作製などに有用である。
（４．判定方法および診断剤）
（４．１．セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定に基づく判定方法および診断剤）
本発明は、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定に基づく、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化（例、骨・関節疾患）に対する動物の生体状態の判定方法を提供する。
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物から採取された生体試料においてセリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量を測定する工程；
（ｂ）セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量に基づき、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化（例、骨・関節疾患）に対する動物の生体状態を評価する工程。
上記方法の工程（ａ）では、動物から採取した生体試料においてセリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量が測定される。動物は上述の通り特に限定されないが、ヒトが好ましい。生体試料は、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量を測定可能な試料である限り特に限定されず、例えば骨、軟骨（または骨芽細胞、軟骨細胞）が挙げられる。セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定は、本発明のスクリーニング方法における測定と同様に行われ得る。
上記方法の工程（ｂ）では、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量に基づき、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動物の生体状態が評価され得る。詳細には、先ず、測定されたセリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量が、該分化の異常を伴わない動物または正常動物におけるセリン合成酵素の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。該分化の異常を伴わない動物または正常動物におけるセリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量は、自体公知の方法により決定できる。
次いで、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の比較結果より、動物が骨・軟骨形成能を有する細胞の分化の異常を有している可能性があるか否か、あるいは所定の疾患に罹患している可能性があるか否か、または将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断され得る。例えば、Ｌ−セリン合成酵素の発現量が低い、および／またはＳＲの発現量が高い場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより抑制され、一方、Ｌ−セリン合成酵素の発現量が高い、および／またはＳＲの発現量が低い場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより促進され得ると考えられる。また、Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量が低い場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより抑制され、一方、Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量が高い場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより促進され得ると考えられる。さらに、特定の疾患の発症前後に、当該疾患に関連する特定の遺伝子の発現量の変化または生体内物質の量の変化がしばしば観察されることが知られている。従って、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の解析より、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化の異常、ならびに／あるいは所定の疾患の発症または発症リスクを判定することが可能であると考えられる。
本発明はまた、セリン合成酵素の発現量あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬を含む、上記判定を可能とする診断剤を提供する。
セリン合成酵素の発現量の測定用試薬は、セリン合成酵素の発現を定量可能である限り特に限定されないが、例えば、上述したセリン合成酵素に対する抗体、セリン合成酵素転写産物に対する核酸プローブ、またはセリン合成酵素転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
セリン合成酵素転写産物に対する核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。また、該プローブは、１本鎖または２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、セリン合成酵素の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、例えば約１５〜１０００ｂｐ、好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
セリン合成酵素を増幅可能な複数のプライマー（例、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は特に限定されないが、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、セリン合成酵素を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。セリン合成酵素の発現量の測定用試薬がプライマーを含むものである場合、本発明の診断剤は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
Ｌ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬は、Ｌ−セリンまたはその天然前駆体を定量可能である限り特に限定されないが、例えば、Ｌ−セリンに対する抗体（例、コスモバイオより入手可能）またはＬ−セリンの天然前駆体に対する抗体を含むものであり得る。また、本試薬は、セリン抗体（Ｌ体、Ｄ体を同様に認識する抗体）および／またはＤ−セリン抗体（Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３９４８−３９５２）を含むものであってもよい。これらの抗体は、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、上述したものなどが挙げられる。
本発明の上記判定方法および診断剤は、例えば、所定の被験体における骨・軟骨形成能を有する細胞の分化異常、骨・関節疾患の発症または発症リスクなどを判定し得るため、あるいは所定の被験体における該異常または疾患がセリン合成酵素の発現の抑制または促進に起因するものであると、ならびに／あるいはＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の減少または増加に起因するものであると判定し得るため、該被験体における所定の疾患に対する治療指針の決定、あるいは所定の疾患等の予防を目的とする生活習慣改善などに有用である。
（４．２．多型の測定に基づく判定方法および診断剤）
本発明は、セリン合成酵素の多型の測定に基づく、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化（例、骨・関節疾患）に対する動物の生体状態の判定方法を提供する。
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物から採取された生体試料においてセリン合成酵素の多型を測定する工程；
（ｂ）セリン合成酵素の多型に基づき、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動物の生体状態を評価する工程。
上記方法の工程（ａ）では、動物から採取された生体試料においてセリン合成酵素の多型が測定される。動物は上述の通り特に限定されないが、ヒトが好ましい。生体試料は、本発明の同定方法で上述したものと同様であり得る。
多型のタイプの測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法などが使用できる。
上記方法の工程（ｂ）では、セリン合成酵素の多型に基づき、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動物の生体状態が評価され得る。詳細には、動物が細胞分化異常（例、過剰な促進または抑制）を有している可能性があるか否か、あるいは所定の疾患に将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断され得る。例えば、Ｌ−セリン合成酵素がその機能を低下させるような多型を含む、および／またはＳＲがその機能を増強させるような多型を含む場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより抑制され、一方、Ｌ−セリン合成酵素がその機能を増強させるような多型を含む、および／またはＳＲがその機能を低下させるような多型を含む場合には骨・軟骨形成能を有する細胞の分化がより促進され得ると考えられる。また、特定の疾患を発症しやすい動物では、当該疾患に関連する遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られている。従って、セリン合成酵素の機能を増強または低下させるような多型を含む動物は、骨・関節疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。従って、多型の解析より、所定の疾患の発症可能性を判断することが可能であると考えられる。なお、例えば、３ＰＧＤＨの機能を低下させ得る多型として配列番号１で表される塩基配列において１４６８番目のＧがＡに変異し、アミノ酸変異（Ｖａｌ→Ｍｅｔ）を生じるもの（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（９）：７１３６−４３（２００２））が報告されているので、測定対象となり得る多型はこのような多型であり得る。また、測定対象となり得る多型は、例えば、本発明の同定方法により得られたものであり得る。
本発明はまた、セリン合成酵素の多型の測定用試薬を含む、上記判定を可能とする診断剤を提供する。
セリン合成酵素の多型の測定用試薬は、多型のタイプを決定可能である限り特に限定されず、多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体、特定のタイプの多型を有するセリン合成酵素を特異的に測定可能である核酸プローブ、あるいは特定のタイプの多型を有するセリン合成酵素を特異的に増幅可能である複数のプライマーを含むものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、セリン合成酵素を含むゲノムＤＮＡまたはセリン合成酵素転写産物に対するものであり得る。該試薬は、標識用物質で標識されていてもよい。また、該試薬が標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。本発明の診断剤はまた、核酸プローブ、プライマーは、転写産物またはゲノムＤＮＡの抽出用試薬を含んでいてもよい。
多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体は、該多型を含まないセリン合成酵素よりも、該多型を含むセリン合成酵素をより選択的に認識するものである限り特に限定されない。多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体の作製は、抗原として使用する部分ペプチドを適切に選択することにより行われ得る。例えば、特定の多型に対する認識性を高めるため、多型部位を含むサイズがより短い部分ペプチドが好ましく使用される。部分ペプチドのサイズは、免疫原性を有する限り特に限定されず、例えば８、１０または１２以上の連続するアミノ酸からなるペプチドであり得る。また、多型部位を含むサイズがより短い部分ペプチドについてハプテン化し、免疫原性を持たせることも可能であるため、部分ペプチドのサイズは、必ずしも上記サイズに限定されるものではない。
特定のタイプの多型を有するセリン合成酵素を特異的に測定可能である核酸プローブは、特定のタイプの多型を有するセリン合成酵素を選別可能である限り特に限定されない。該プローブはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。また、該プローブは、１本鎖または２本鎖のいずれであってもよい。例えば、多型がＳＮＰである場合、該プローブのサイズは、所定のＳＮＰを有するセリン合成酵素を選別可能とするため短ければ短いほどよく、例えば、約１５〜３０ｂｐのサイズであり得る。該プローブにより、例えばＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法が可能となる。
特定のタイプの多型を有するセリン合成酵素を特異的に増幅可能である複数のプライマー（例、プライマー対）は、測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。このような複数のプライマーは、例えば、いずれか一方のプライマーの３’末端に多型部位を含むように設計される。測定可能なサイズのヌクレオチド断片、プライマーのサイズは、上述と同様であり得る。セリン合成酵素の多型を測定し得る手段がセリン合成酵素転写産物に対する複数のプライマーである場合、本発明の診断剤は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
また、セリン合成酵素の多型の測定用試薬として、特定の多型部位を認識する制限酵素を含むものを挙げることもできる。このような試薬によれば、ＲＦＬＰによる多型解析が可能となる。
本発明の上記判定方法および診断剤は、例えば、所定の被験体における骨・軟骨形成能を有する細胞の分化異常、骨・関節疾患の発症リスクなどを判定し得るため、あるいは所定の被験体における該異常または疾患がセリン合成酵素の発現の抑制または促進に起因するものであると判定し得るため、該被験体における所定の疾患に対する治療指針の決定、あるいは所定の疾患等の予防を目的とする生活習慣改善などに有用である。
（４．３．セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を用いる判定方法および診断剤）
本発明は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を用いる、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化効率の判定方法を提供する。
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩を用いて、動物から採取された骨・軟骨形成能を有する細胞を培養する工程；
（ｂ）培養された該細胞の形質に基づき、該細胞の分化効率を評価する工程。
上記方法の工程（ａ）では、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、あるいはＬ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩（本明細書中以下、必要に応じて「セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質など」と省略する。）の存在下において、動物から採取された骨・軟骨形成能を有する細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞等の骨または軟骨由来細胞）が、培地中で培養され得る。セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質などは、上述の通りであり得るが、Ｌ−セリンまたはその天然前駆体、セリン合成酵素発現ベクターが好ましい。動物もまた上述の通りであり得るが、好ましくは、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化効率の判定が所望される被験体（例、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質などによる治療が検討されている被験体）から採取された細胞が使用され得る。
上記方法の工程（ｂ）では、上述の通り培養された細胞の形質の解析結果に基づき、分化効率が評価され得る。細胞の形質の解析は、骨・軟骨形成能を有する細胞を特徴付けることができるものである限り特に限定されず、例えば、酸性ムコ多糖量、沈着Ｃａ２＋量、アルカリフォスファターゼ活性、骨芽細胞特異的なマーカー分子（例、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン）、軟骨細胞特異的なマーカー分子（例、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン）等の骨・軟骨形成能を有する細胞に特異的なマーカー分子の発現量の測定によりなされ得る。また、分化効率の評価は、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を用いる所定の疾患の予防・治療の有用性を肯定する程度に十分なものであるか否かの観点から行われてもよい。さらに、必要に応じて、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質を用いて培養された細胞の分化効率は、該物質を用いて培養された対照細胞（例、正常細胞）の分化効率と比較されてもよい。分化効率の比較は、例えば、形質についてのパラメータの有意差の有無に基づいて行なわれる。対照細胞の分化効率は、動物から採取され、且つ該物質を用いて培養された細胞の分化効率の測定に対し、事前に測定した効率であっても、同時に測定した効率であってもよい。
本発明はまた、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質などを含む、上記判定を可能とする診断剤を提供する。
本発明の上記判定方法および診断剤は、例えば、所定の被験体における骨・軟骨形成能を有する細胞の分化異常を判定し得るため、あるいは所定の被験体にセリン合成酵素の発現または機能を調節する物質などを用いる予防・治療の効果を予測し得るため、該被験体における所定の疾患に対する治療指針の決定などに有用である。
（５．キット）
本発明は、本明細書中で言及した任意の物質、試薬等の構成要素を含むキット（構成要素のセットまたは組合せ）を提供する。
一実施形態では、本発明のキットは、以下（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩、セリン合成酵素の発現量または多型の測定用試薬、ならびにＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬からなる群より選ばれる少なくとも１つ；
（ｂ）骨・軟骨形成能を有する細胞の形質解析用試薬、ならびに／あるいは骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節用試薬。
上記キットの構成要素（ａ）において、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質、Ｌ−セリンもしくはそのアナログまたはそれらの塩、セリン合成酵素の発現量または多型の測定用試薬、ならびにＬ−セリンまたはその天然前駆体の量の測定用試薬は、上述の通りである。
上記キットの構成要素（ｂ）において、骨・軟骨形成能を有する細胞の形質解析用試薬は、該細胞特異的な形質の解析を可能とする成分を含むものである限り特に限定されず、例えば、骨・軟骨形成能を有する細胞の染色用試薬（例、アリザリンレッド染色、アルシアンブルー染色、沈着Ｃａ２＋量の定量を可能とする成分を含む試薬）、あるいは骨・軟骨形成能を有する細胞に特異的な活性（例、アルカリフォスファターゼ活性）の測定用試薬、骨・軟骨形成能を有する細胞の同定用試薬（例、上述した骨芽細胞または軟骨細胞特異的なマーカー分子に対する抗体、あるいは該マーカー分子を検出または定量可能な核酸プローブまたは複数のプライマーを含む試薬）が挙げられる。
骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節用試薬は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質（例、上述した骨芽細胞または軟骨細胞の分化を調節し得る物質）を含むものであり得る。
本発明のキットは、本発明の剤の作製、ならびに本発明の判定方法などを簡便に行い得るため有用である。
（６．細胞）
本発明は、セリン合成酵素（例、ＳＲ、３ＰＧＤＨ）の発現が調節された、骨・軟骨形成能を有する細胞を提供する。
本発明の細胞は、骨・軟骨形成能を有する任意の細胞であり得、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞が挙げられる。本発明の細胞はまた、例えば、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質が導入された、セリン合成酵素の発現が調節（例えば、促進または抑制）された細胞であり得るが、好ましくは、セリン合成酵素発現ベクターが導入されたセリン合成酵素発現細胞であり得る。本発明の細胞はさらに、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、サル、ヒト等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類などの動物に由来する細胞であり得るが、なかでも哺乳動物由来の細胞が好ましい。本発明の細胞はまた、例えば初代培養細胞または細胞株（例、初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株）であり得るが、好ましくは細胞株である。
本発明では、骨・軟骨形成能を有する細胞として、骨芽細胞株、軟骨細胞株が好ましい。骨芽細胞株としては、例えばＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＳＶ−ＨＦＯ細胞、ＴＥ−８５細胞、Ｕ２ＯＳ細胞が挙げられるが、なかでもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞が好ましい。遺伝子が導入される軟骨細胞株としては、例えばＡＴＤＣ５細胞、ＨＣＳ−２／８細胞、Ｃ２０／Ａ４細胞が挙げられるが、なかでもＡＴＤＣ５細胞が好ましい。
本発明の細胞は、例えば、上述の遺伝子を一過的または安定発現し得る細胞であるが、好ましくは安定発現し得る細胞であり得る。なお、「安定発現」とは、目的遺伝子の発現が一過性ではないことをいい、詳細には、細胞の培養（例えば継代）後、および／または細胞の凍結保存後でも、目的遺伝子の活性レベルが保持されることを意味する。
本発明の細胞は、その分化が抑制または促進されたものであり得、特異的な種々の形質を示す。例えば、本発明の細胞は、骨芽細胞への分化が抑制または促進され得、酸性ムコ多糖量、沈着Ｃａ２＋量、アルカリフォスファターゼ活性、上述のマーカー分子の発現量が減少または増加し得る。また、本発明の細胞は、軟骨細胞への分化が抑制または促進され得、酸性ムコ多糖量、アルカリフォスファターゼ活性、上述のマーカー分子の発現量が減少または増加し得る。
本発明の細胞は、自体公知の方法、例えば上述の培養方法により作製できる。
本発明の細胞は、例えば、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質、あるいは骨・関節疾患を予防・治療し得る物質のスクリーニング（上述）に有用である。本発明の細胞はまた、骨・関節疾患の病態マーカー遺伝子のスクリーニング、骨および／または軟骨細胞マーカー遺伝子のスクリーニング、骨・関節疾患の病態メカニズムの解析、骨および／または軟骨細胞の分化メカニズムの解析などに有用である。これらは、例えば、マイクロアレイ、プロテインチップ（例、抗体チップ、またはサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ）等を用いた発現プロファイル解析により行われ得る。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］軟骨組織におけるセリンラセマーゼ（ＳＲ）ｍＲＮＡの発現
生後１日令のＷｉｓｔａｒ系ラットから脛骨を摘出し、インサイチュハリブリダイゼーション法によりＳＲ  ｍＲＮＡ発現の局在を調べた。その結果軟骨組織全体にＳＲ  ｍＲＮＡ発現が認められ、特に肥大（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ）層に強い発現が認められた（図１）。同様に、骨芽細胞でもＳＲ  ｍＲＮＡ発現が認められた（図２）。
［実施例２］セリンラセマーゼ（ＳＲ）の安定発現株の作製
前軟骨細胞であるＡＴＤＣ５細胞において、Ｄ−Ｓｅｒ合成酵素であるセリンラセマーゼ（ｗｔＳＲ）の安定発現株を作製した。方法としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてｐｃＤＮＡ−ｗｔＳＲ（ｗｔＳＲの過剰発現用ベクター）をＡＴＤＣ５細胞に導入し、その後Ｇ４１８を用いて、Ｇ４１８耐性の細胞（ＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃２，３，５，６，７，１０，１１，１３，１４，１５，１７，１９，２０，２１，２３，２８の計１６種類）を採取した。また、これらの実験コントロールの細胞として、ｐｃＤＮＡ−ｗｔＳＲの代わりにｐｃＤＮＡをＡＴＤＣ５細胞に導入し、同様にＧ４１８耐性の細胞（ＡＴＤＣ５−ｐｃＤＮＡ＃３，４の計２種類）を採取した。その後、これらの細胞からトータルＲＮＡを採取し、ＳＲを特異的に認識するＤＩＧラベルされたＲＮＡプローブを用いて、ノザンブロッティングを行い、ＳＲ発現を確認した。その結果、ｗｔＳＲ（＃１１，２８）において、ＳＲの発現が高い事実が明らかとなった（図３）。
［実施例３］ＳＲの軟骨細胞分化過程に対する影響の解析
ＳＲの軟骨細胞分化過程に対する影響を解析するために、ＳＲ安定発現株であるＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１およびＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃２８を用いてアルシアンブルー染色を行った。アルシアンブルーは、軟骨組織の細胞外基質である酸性多糖類と反応して青色を呈する物質であり、アルシアンブルーの染色性は、軟骨細胞の分化段階が進むにつれて増加することが知られている。
ＡＴＤＣ５−ｐｃＤＮＡ＃４、ＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１およびＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃２８を２Ｘ１０４（細胞／ｃｍ２）の密度で培養用プレートに播き、５％ＦＢＳおよびホルモンミックス（１０μｇ／ｍＬインスリン、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中にて培養を行い、培養７日目および１４日目にアルシアンブルー染色を行った。また、アルシアンブルー染色の染色性を、画像解析ソフトを用いて定量化した。結果を図４に示す。
ＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１においては、培養７日目および１４日目におけるアルシアンブルーの染色性は、ＡＴＤＣ５−ｐＣＤＮＡ＃４と比べて有意に低下した。また、ＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃２８においては、培養７日目におけるアルシアンブルーの染色性は、ＡＴＤＣ５−ｐＣＤＮＡ＃４と比べて著明な変化は認められなかったが、培養１４日目においては、有意に低下した。
［実施例４］ＳＲの細胞増殖性に対する影響の解析
ＳＲの細胞増殖性に対する影響を解析するために、ＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１を用いてＭＴＴアッセイおよびＢｒｄＵの取り込み能を解析した。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴが細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であることを利用した、生細胞数を定量する解析法である。また、ＢｒｄＵは、チミジンのアナログであり、細胞周期のＳ期特異的に取り込まれるため、ＢｒｄＵの取り込み能は、細胞の増殖率の指標となる。
（１）ＭＴＴアッセイ
ＡＴＤＣ５−ｐｃＤＮＡ＃４およびＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１を２Ｘ１０４（細胞／ｃｍ２）の密度で培養用プレートに播き、翌日５％ＦＢＳおよびホルモンミックス（１０μｇ／ｍＬインスリン、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中にて培養を開始し、培養２４時間後にＭＴＴアッセイを行った。その結果、ＡＴＤＣ５−ｐｃＤＮＡ＃４とＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１におけるＭＴＴ還元率には、著明な変化は認められなかった（図５）。
（２）ＢｒｄＵの取り込み能
ＡＴＤＣ５−ｐｃＤＮＡ＃４およびＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１を０．２５Ｘ１０４（細胞／ｃｍ２）の密度で培養用プレートに播種し、翌日５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中にて細胞をＢｒｄＵにて２時間標識し、ＥＬＩＳＡにてそれらの細胞のＢｒｄＵ取り込み能を測定した。その結果、ＡＴＤＣ５−ｐＣＤＮＡ＃４とＡＴＤＣ５−ｗｔＳＲ＃１１におけるＢｒｄＵ取り込み能には、著明な変化は認められなかった（図５）。
［実施例５］ＳＲの細胞増殖性に対する影響の解析
実施例３の結果より、ＳＲは、軟骨細胞の分化過程に対して抑制的に作用する可能性が考えられたため、次に、ＳＲがＳＯＸ９の転写活性能に与える影響を解析した。ＳＯＸ９は、間葉系幹細胞からの軟骨前駆細胞の分化、およびその後の軟骨細胞への分化に重要な役割を果たすことが知られている転写因子である。ＣＯＳ７細胞を３．８Ｘ１０４（細胞／ｃｍ２）の密度で培養用プレートに播種し、翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、４Ｘ４８−ｐ８９−Ｌｕｃベクター（コラーゲンＩＩ遺伝子のエンハンサー領域を４つ含むルシフェラーゼアッセイ用ベクター）とともに、それぞれの発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＳＯＸ９：ＳＯＸ９を過剰発現させるベクター、ＰＲＫ−ｗｔＳＲ：野生型ＳＲを過剰発現させるベクター、ＰＲＫ−ＳＲ（Ｋ５６Ｇ）：Ｄ−Ｓｅｒ合成能を欠失させたＳＲを過剰発現させるベクター）を導入し、その４８時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図６に示す。
その結果、ＳＯＸ９によってルシフェラーゼ活性の有意な上昇が認められたが、この上昇効果は、野生型ＳＲを過剰発現させることにより有意に抑制された。これに対して、Ｄ−Ｓｅｒ合成能を欠失させたＳＲ（ドミナントネガティブ変異体）の場合では、抑制効果はほとんど認められなかった。
［実施例６］３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の安定発現株の作製
骨芽細胞株であるＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−Ｓｅｒ合成酵素である３ＰＧＤＨの安定発現株を作製した。方法としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてｐｃＤＮＡ−ｗｔＳＲ（ｗｔＳＲの過剰発現用ベクター）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に導入し、その後Ｇ４１８を用いて、Ｇ４１８耐性の細胞を採取した（ＭＣ３Ｔ３−３ＰＧＤＨ）。また、これらの実験コントロールの細胞として、ｐｃＤＮＡ−３ＰＧＤＨの代わりにｐＣＤＮＡをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に導入し、同様にＧ４１８耐性の細胞（ＭＣ３Ｔ３−ｐｃＤＮＡ）を採取した。その後、これらの細胞からトータルＲＮＡを採取し、３ＰＧＤＨを特異的に認識するＤＩＧラベルされたＲＮＡプローブを用いて、ノザンブロッティングを行い、３ＰＧＤＨ発現を確認した。その結果、ＭＣ３Ｔ３−３ＰＧＤＨにおいて、３ＰＧＤＨの発現が高い事実が明らかとなった（図７）。
［実施例７］３ＰＧＤＨの骨芽細胞分化過程に対する影響の解析
３ＰＧＤＨの骨芽細胞分化過程に対する影響を解析するために、３ＰＧＤＨ安定発現株であるＭＣ３Ｔ３−３ＰＧＤＨ細胞の培養後、位相差顕微鏡で観察した。培養は、細胞を１×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレートに播種し、翌日メディウムを５０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸および５ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェートを含む１０％ＦＢＳ−αＭＥＭに交換し、この時点を培養０日目として２８日間行った。
その結果、ＭＣ３Ｔ３−ｐｃＤＮＡ細胞と比べて、ＭＣ３Ｔ３−３ＰＧＤＨ細胞では、ノジュール（ｎｏｄｕｌｅ）形成の亢進が認められた（図８）。以上より、３ＰＧＤＨは骨形成を促進し得ることが示唆された。
［実施例８］Ｌ−Ｓｅｒの軟骨細胞分化過程に対する影響の解析
実施例６の結果、および３ＰＧＤＨはＬ−Ｓｅｒ合成の律速酵素であることが知られていることから、３ＰＧＤＨにより合成されるＬ−Ｓｅｒが骨・軟骨形成を促進し得る可能性が示唆された。そこで、Ｌ−Ｓｅｒの培養軟骨細胞の分化能に与える影響を解析する目的で、初代培養軟骨細胞に対して、Ｌ−Ｓｅｒを０．６（ｍＭ）の濃度で培養０日目から１４日目および２８日目まで持続的に暴露し、培養１４日目にアルカリフォスファターゼ活性の測定および培養２８日目にＣａ２＋蓄積の測定を行った。
なお、初代培養軟骨細胞の調製、培養は以下の通り行った。Ｗｉｓｔａｒ系雌性ラットより肋軟骨を摘出し、ＧＰＢＳ中に浸した。クリーンベンチ内で肋骨組織を１本づつ取り出し、付着した肉片を殺ぎ落とし、光にかざすとやや透明に見える軟骨−骨移行部位に近い部分である成長軟骨組織部位を切り出し、ＧＰＢＳ中に回収した。解剖用鋏で組織を細切したのち、０．１％ＥＤＴＡ溶液１０ｍＬ中で３７℃、１０分間攪拌して脱灰処理後、上清を吸引除去した。ついで軟骨組織を酵素溶液（０．３％コラゲナーゼを含むＤＭＥＭ）１０ｍＬ中で３７℃、３時間攪拌後、細胞浮遊画分を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中へ回収した。回収した画分を細胞ろ過用フィルターでろ過し、ろ液を２５０ｇ、５分間遠心後、沈渣を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで懸濁し、１×１０４細胞／ｃｍ２の密度で各プレートに播種した。翌日、培地を交換し、この時点を培養０日目とした。以後２日おきに培地を交換し、６日間培養したのち、５０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸および５ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェートを含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで２８日間培養した。
その結果、Ｌ−Ｓｅｒは、培養１４日目のアルカリフォスファターゼ活性を有意に上昇させ、また培養２８日目のＣａ２＋を有意に促進した（図９）。以上より、Ｌ−Ｓｅｒが骨・軟骨形成を促進する可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の調節剤は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節、ならびに骨・関節疾患の予防・治療などを可能とする。本発明のスクリーニング方法は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化調節剤、ならびに骨・関節疾患に対する予防・治療剤の開発などを可能とする。本発明の診断剤は、骨・軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動物の生体状態の評価を可能とし、また、骨・関節疾患の患者の治療に際して、セリン合成酵素の発現または機能を調節する物質の当該患者における治療効果の予測を可能とする。
本出願は、２００５年６月２９日に日本で出願された特願２００５−１９０７４３を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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