(57)【要約】  試料中のリガンドを低濃度域から高濃度域まで高感度かつ広範囲に測定できると同時に、良好な測定再現性能を有する凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬の提供を課題とする。  リガンドを担持した不溶性担体粒子と遊離状の特異的レセプターに加え、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なる特異的レセプターを担持させた不溶性担体粒子を用いる凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二箇所以上のレセプター結合部位を有する測定対象リガンドを含む試料と、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）  予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
（Ｂ）  前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
（Ｃ）  前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
とを混合し、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定法。
【請求項２】
不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項１に記載の凝集阻害測定法。
【請求項３】
レセプターが抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定する請求項１又は２に記載の凝集阻害測定法。
【請求項４】
遊離状レセプター及び不溶性担体粒子に担持されたレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
【請求項５】
測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
【請求項６】
レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の１／２〜１／１０である請求項１〜５のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
【請求項７】
下記（Ａ）〜（Ｃ）を含み、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定用試薬。
（Ａ）  予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
（Ｂ）  前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
（Ｃ）  前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
【請求項８】
不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求項７に記載の凝集阻害測定用試薬。
【請求項９】
レセプターが、抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定するための請求項７又は８に記載の凝集阻害測定用試薬。
【請求項１０】
遊離状レセプター及びリガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である請求項７〜９のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
【請求項１１】
レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の１／２〜１／１０である請求項７〜１０のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
【請求項１２】
測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である請求項７〜１１のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象となるリガンドを、（担体）粒子の凝集阻止反応を利用して測定する方法及びそれに用いる試薬に関する。特に、予めリガンドを担持した不溶性担体粒子、リガンド特異的な遊離状のレセプター、及びリガンド特異的なレセプターを担持した不溶性担体粒子による凝集の形成が、サンプル中のリガンドによって阻害される凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
不溶性担体粒子を利用して粒子の凝集又は凝集阻害を生起させ、リガンドを定性、定量する測定法は、簡易かつ高感度であることから、抗原抗体間の免疫反応や相補性塩基鎖間の結合反応などのリガンド−レセプター反応原理を利用した各種測定試薬が開発されている。
凝集法は、レセプターを感作した担体粒子が測定対象リガンドを介した架橋反応で凝集する度合いを測定する方法であり、微量物質の高感度測定の必要性を背景として、多くの測定項目について実用化されている。
一方、凝集阻害法は、予めリガンド又はリガンド様物質を感作した担体粒子とレセプターによる凝集が測定対象であるリガンドによって阻止される割合を測定する方法であり、凝集法では特殊なリガンドを除き２種類以上の特異的レセプターが必須であるのに対して、凝集阻害法は１種類の特異的レセプターがあれば測定系を構築できることが大きな特徴である。
さらに、免疫反応に関していえば、凝集阻害法には地帯現象（抗原過剰による見かけ上の反応低下現象）が起こらないという利点があるものの、現在までの適用は、ハプテンのような低分子リガンドすなわち２種類以上のレセプターが利用できないリガンドを測定対象としているケースがほとんどである。【０００３】
凝集阻害法の適用が限定されている理由として、凝集法と比較して測定濃度範囲の調整が難しいという点が挙げられる。凝集法においては、リガンド量に比例して凝集が進行するため、例えばラテックス免疫凝集法に関する特許文献１に示されるように、高濃度域の感度上昇を増強するだけで容易に測定範囲を拡大できる。
一方、リガンド量に比例して凝集阻止反応が進行する凝集阻害法の測定範囲に関しては、リガンド高濃度域の測定上限値は、基本的には初期凝集（リガンド量ゼロ時の凝集）の大きさに依存し、リガンド低濃度域の測定下限値は、凝集阻止反応の感受性に依存するため、二つの要因を複合的に考慮する必要がある。【０００４】
凝集阻害法の初期凝集を増強する方法として、例えば、特許文献２に記載の方法では、ハプテンの測定において非特異的な凝集促進物質を利用する方法が提示されている。本方法により高濃度域までリガンドの測定が可能となり測定上限値を拡張できるものの、リガンドとレセプター間の特異反応に関係のない凝集増強であるため凝集阻止反応に対する感受性が低下し、結果として低濃度域の検出能は著しく悪化する。【０００５】
また、特許文献３には単一のモノクローナル抗体感作担体と抗原感作担体を利用する凝集阻害法が示されている。本方法ではリガンドとレセプターをそれぞれ担持した担体粒子を利用して、光学的に感度の変化量を増強することで、凝集阻止反応に対する感受性を損なわずに低濃度域の検出能を向上している。しかしながら、該方法は抗原と抗体間の反応自体が増強されるわけではないため、測定範囲を拡張するような効果は認められない。同じく特許文献４に提案される抗原感作ラテックス、抗体及び抗体に特異的なレセプターを利用する凝集阻害法は、抗原と抗体、抗体とレセプターの特異反応のみで凝集を増強しているため、従来法と比較すると測定範囲の拡張が達成される。しかしながら実施例でレセプターとして示されているプロテインＡは抗体（ＩｇＧ）全般に反応性を有するため、ＩｇＧを含有する血清や血漿といった試料の測定には不向きであり、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体に関しても、一般的に利用される素材ではないため入手が困難なケースも考えられる。また測定原理自体が抗原-抗体、抗体-レセプターという二相性の反応を介しているため、測定機器、方法によっては性能が不良となる可能性も考えられる。 【０００６】
上記に示したように、初期凝集は強く、同時に凝集阻止反応への感受性も高いという相反する特性を兼ね備えた凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬は未だ確立されておらず、これまでの測定法では通常のリガンド、例えば２箇所以上のレセプター結合部位を有するようなリガンドを高感度かつ広範囲に再現性良く測定することは困難な状況にあった。
【特許文献１】特開２００４−１９１３３２号公報
【特許文献２】特公平０５−０００６６５号公報
【特許文献３】特開昭５９−１７３７６０号公報
【特許文献４】特開２００１−３３７０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決するためのものであって、試料中のリガンドを低濃度域から高濃度域まで高感度かつ広範囲に測定できると同時に、良好な測定再現性能を有する凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、凝集阻害測定法について鋭意検討を行ったところ、リガンドを担持した不溶性担体粒子と遊離状の特異的レセプターに加え、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なる特異的レセプターを担持させた不溶性担体粒子を用いることで、凝集阻止反応への感受性を保持したまま初期凝集を増強でき、リガンド低濃度域から高濃度域まで予想外に高感度かつ広範囲に測定でき、良好な測定再現性能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）二箇所以上のレセプター結合部位を有する測定対象リガンドを含む試料と、下記（Ａ）〜（Ｃ）、
（Ａ）予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
（Ｂ）前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
（Ｃ）前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
とを混合し、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定法。
（２）不溶性担体粒子がラテックス粒子である上記（１）に記載の凝集阻害測定法。
（３）レセプターが抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定する上記（１）又は（２）に記載の凝集阻害測定法。
（４）遊離状レセプター及び不溶性担体粒子に担持されたレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
（５）測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
（６）レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の１／２〜１／１０である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
（７）下記（Ａ）〜（Ｃ）を含み、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定用試薬。
（Ａ）予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
（Ｂ）前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
（Ｃ）前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
（８）不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である上記（７）に記載の凝集阻害測定用試薬。
（９）レセプターが、抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定するための上記（７）又は（８）に記載の凝集阻害測定用試薬。
（１０）遊離状レセプター及びリガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である上記（７）〜（９）のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
（１１）レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の１／２〜１／１０である上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
（１２）測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬は、測定対象リガンドを低濃度域から高濃度域まで高感度かつ広範囲に測定できると同時に、良好な測定再現性能を有する。特に、免疫反応を利用する場合、地帯現象を発生しないという特徴から異常高値を呈する可能性のあるリガンド測定時には粒子凝集法よりも測定の信頼性が高い。また、本発明のレセプターにモノクローナル抗体を利用した場合には、リガンドが全長でなくてもエピトープが残存していれば凝集阻止反応が起こるため、断片化したリガンドも全長のリガンドと同様に測定できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（測定対象試料）
本発明の測定対象となるリガンドを含む試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等が挙げられる。【００１１】
（リガンド）
本発明の測定対象となるリガンドとしては、二箇所以上のレセプター結合部位を有する物質であれば、いずれも対象とすることができる。具体的には、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ＦＤＰ、Ｄ−ダイマー、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヘモグロビンＡ１Ｃ、アルブミン、ペプシノーゲンＩ（ＰＧＩ）、ペプシノーゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシン等のタンパク質、その他、ペプチド、糖類、核酸、脂質、高分子薬剤などが挙げられる。理論的には二箇所以上のレセプター結合部位を有するリガンド(リガンドが抗原であれば二箇所以上のエピトープ（抗原決定基）を有するリガンド、例えば二種類以上のモノクローナル抗体を利用したサンドイッチ測定で検出可能なリガンド)は全て測定対象物質として適用可能である。
リガンド様物質とは、レセプターとの関係において前記リガンドと同等、同質の反応性（リガンドが抗原であれば抗原性）を有するものをいう。例えば、リガンド（抗原など）を分解して得られる断片、遺伝子操作で得られた組み替えリガンド、リガンド構造が類似した物質（リガンド類縁物質）等があげられる。【００１２】
（レセプター）
本発明で用いるレセプターとしては、測定対象であるリガンドに特異的に結合する物質を用いる。一般的にはウサギ、ヒツジ、ヤギ等に、測定対象のリガンドを免疫して得られる抗リガンドポリクローナル抗体や抗リガンドモノクローナル抗体を用いることができる。その中でも特異性の点からはモノクローナル抗体の使用が特に望ましい。用いる抗体は、常法に従い調製した抗体のフラグメントであってもよい。その他、リガンドの種類によってはレクチン、核酸塩基等も抗体と併用してあるいは単独でレセプターとして用いることができる。【００１３】
本発明で用いるレセプターの種類は、２種類以上であれば特に制限はなく、遊離状レセプターと担体に固定化されるレセプターとは異なるものを用いることを要する。すなわち、遊離状レセプターと担体固定化レセプターとは、リガンド上の結合部位が異なるレセプターであることを要する。すなわち、各レセプターがリガンドとの結合を相互に干渉しないような関係にあるレセプターであればよい。また、遊離状レセプター及び担体固定化レセプターはともにモノクローナル抗体であることが望ましい。本発明では、遊離状レセプターと固定化担体レセプターの両者を組み合わせて用いることにより、初期凝集を促進し、かつ、高濃度域での感度変化をも増大させることができ、測定可能な範囲を拡張することができる。レセプターの種類や含量、存在様式（遊離状態あるいは担体担持状態）はリガンドのレセプター結合部位の数や分析に必要な粒子の凝集度合い、目的とする測定範囲などを考慮して適宜選択することができる。
レセプターとしてモノクローナル抗体を用いる場合、それらの選定は、例えば次のような手順で行われる。
まず、測定対象リガンドを免疫源として調製したモノクローナル抗体とリガンドとの反応性をウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法等で確認し、反応性が強い抗体を２種類以上選択する。さらに、選択されたこれらの抗体を組み合わせたときの反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で確認する。このとき、反応性が強ければそれだけ、感度が高く測定範囲を拡張できる可能性が高いため、モノクローナル抗体の組み合わせは、測定対象、要求性能に応じて適宜選択することが望ましい。このようにして得られたモノクローナル抗体の組み合わせを、一方を担体に固定化させた状態で、もう一方を担体に固定化しない遊離の状態で、実際の測定系に供し、初期凝集、測定感度、測定範囲、リガンドと類似した構造を有する測定対象外の物質との交差反応性等を考慮していずれの組み合わせが適当か最終的な判断を行う。【００１４】
（担体粒子）
本発明で使用するリガンドあるいはレセプターを担持させる不溶性担体粒子は、特に限定されないが平均粒子径５０〜１０００ｎｍのラテックスが好ましい。ラテックスの材質としては、リガンドあるいはレセプターの担持に適したものなら良く、一般的に用いられるポリスチレンを主成分とするラテックスの他に、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマーなどが挙げられる。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することもできる。担体粒子に前記リガンド又はリガンド様物質及びレセプターを担持する方法としては、一般的に使用されている物理吸着法のほか化学結合法も採用できる。【００１５】
また、本発明で用いるリガンド及びレセプターをそれぞれ担持する担体粒子は、その材質が同一でも異なっていてもよい。また、それぞれの担体粒子の粒子径は分析方法や目的に適した粒子径を選択することができるが、本発明の効果を充分発揮するには、レセプターを担持する担体粒子の平均粒子径は、リガンドを担持する担体粒子の平均粒子径の１／２から１／１０であることが好ましい。【００１６】
（緩衝液）
本発明における凝集反応は、緩衝液中で行われ、その緩衝液は、凝集反応が最適に行われる種類、濃度、ｐＨが選択され、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を用いる事ができる。その緩衝液の緩衝剤の濃度は、５ｍＭ〜５００ｍＭ程度で用いられ、ｐＨは中性域から塩基性域で用いられることが多く、通常７．０〜９．５の範囲で用いられる。【００１７】
（凝集シグナルの測定方法）
凝集シグナルの測定は、通常凝集阻止反応測定に用いられる方法であればいずれでもよく、吸光度比による評価、粒子数測定、粒子サイズ測定（凝集すればサイズは大きくなる）、散乱光測定や吸収スペクトルの測定（凝集すれば増大もしくはシフトする）など当業者が用いうる手段があげられる。さらに、光学的な検出を可能な範囲で電気化学的な検出によって置き換えることも可能である。【００１８】
凝集シグナルの測定は、前記の如く種々の方法があるが、ラテックス粒子と汎用の生化学分析装置を用いる方法が便利である。例えば、測定対象であるリガンドを含む試料に、遊離状のレセプターと別種のレセプターを担持したラテックス、リガンドを担持したラテックス等の不溶性担体粒子を含む試薬を加え、一定温度で一定時間加温し、この間の吸光度を測定し、吸光度の変化量を検出し、予め濃度の判っている標準液を試料とした場合の検量線から被検試料中のリガンドの濃度を算出することができる。ラテックス凝集阻害法では、通常５００〜９００ｎｍの波長の吸光度が用いられ、反応時の吸光度の変化量を定量に用いるのが一般的である。本発明を利用した測定範囲は、測定対象とするリガンドの種類、レセプターのアビディティー、各レセプターの量比などを考慮して適宜所望の測定範囲に設定できる。例えば、測定対象が尿中アルブミンの場合、臨床検査での使用を考慮すると１μｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬの範囲が好適であり、後述する実施例のように、本発明により正確に測定することができる。【００１９】
本発明の凝集阻害測定用試薬は、（Ａ）予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子、（Ｂ）前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター、（Ｃ）前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子を含み、（Ｂ）、（Ｃ）を含む第一試薬と（Ａ）を含む第二試薬とに分けることが望ましい。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
凝集阻害測定法による微量アルブミンの測定
（１）レセプター（抗アルブミンモノクローナル抗体）の調製
精製ヒトアルブミン（シグマ社製）１００μｇを１回の免疫に使用した。初回免疫は、アルブミンとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン２００μＬを用い、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射して行った。追加免疫は、フロインドの不完全アジュバンドを使用して前記と同様に調製したエマルジョン２００μＬを用い、２週間の間隔で３回、腹腔注射を繰り返した。【００２１】
マウス眼底静脈より採血した血液中の抗体価を、精製ヒトアルブミンを固相化したＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に供した（なお抗体価の確認方法は後述する培養上清中の抗アルブミン抗体の存在確認方法と同様である）。４回目の免疫から２週間後に、アルブミン１００μｇを生理食塩液２００μＬに溶解したものをマウス腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出した。該摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐした後、１５００ｒｐｍで遠心分離して脾細胞を回収した。これを牛胎児血清フリーのＲＰＭＩ１６４０培地で３回以上遠心・沈殿による洗浄後、沈殿部に対して１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加えて懸濁し、脾細胞懸濁液とした。脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−ＡＧ１４を細胞数で６対１の割合で混合した後、５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合させた。１５００ｒｐｍの遠心分離で沈殿部を集め、ＧＫＮ液（グルコース２ｇ、塩化カリウム０．４ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４１ｇ及びリン酸二水素ナトリウム二水和物０．７８ｇを精製水に溶かして１リットルとしたもの）に懸濁・遠心分離により洗浄後、沈殿部を回収した。該沈殿部を１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬに懸濁したものを１ウェルあたり１００μＬ分注し、同じウエルに、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を２．５×１０６個／ｍＬ含むＨＡＴ培地を１ウェルあたり２００μＬ分注した。９６穴マイクロプレート３枚に分注し、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で培養した。【００２２】
培養上清中の抗アルブミン抗体の存在は、精製ヒトアルブミンを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した。培養１０日後に全てのウェルで融合細胞の増殖を確認した。抗アルブミン抗体の存在確認方法の詳細は以下である。
先ず、１０μｇ／ｍＬのアルブミン及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳと略す）１００μＬを９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で１晩放置した。次にこれを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ３００μＬで３回洗浄した後、培養を行った３枚の９６穴マイクロプレート各ウェルの培養上清を５０μＬ／ウェル加え室温で１時間放置した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（第一化学薬品社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置した。これを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗アルブミン抗体の存在する（即ち、抗アルブミン抗体産生融合細胞の存在する）ウエル（陽性ウエル）として選択した。【００２３】
単クローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウェルあたり１０６個ずつ分注した９６穴マイクロプレートに、陽性ウェル中の融合細胞を１０個／ｍＬとなるように希釈したものを０．１ｍＬずつ分注した。培地は、初回はＨＴ培地を、２回目以降は１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。前記した、精製ヒトアルブミンを固相化したＥＬＩＳＡ法による陽性ウェルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して３０種の抗アルブミンモノクローナル抗体産生細胞を得た。各細胞の約１０５個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析し得られた３０種の精製抗体のうち、サンドイッチ法で最も高感度が得られる２種類の抗体の組み合わせ（抗体１−８と抗体３−８）を選択した。【００２４】
（２）アルブミン測定用ラテックス試薬の調製
選択した２種類の抗アルブミンモノクローナル抗体のうち、抗体３−８を２．８ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍＬに、平均粒子径５０ｎｍの４％ラテックス（積水化学工業社製）懸濁液３ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに０．４％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）６ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。遠心分離後、沈殿を５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７.０）で、波長６００ｎｍにおける吸光度が４０ｍＯＤとなるように再懸濁し、抗アルブミン抗体３−８感作ラテックスを調製した。遊離状態の抗体１−８と抗体３−８感作ラテックスを混合し第一試薬を調製した。【００２５】
次に、ヒト血清アルブミン０.５ｍｇ/ｍＬを含む１０ｍＭ ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）３ｍＬを用い、平均粒径３００ｎｍの０.５％ラテックス（積水化学工業社製）懸濁液３ｍＬを加え、４℃にて１時間撹拌した。遠心分離後、上清を除去し、沈殿を５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７.０）で、波長６００ｎｍにおける吸光度が２.１５ＯＤとなるように再懸濁し、アルブミン感作ラテックス溶液として第二試薬を調製した。【００２６】
（３）アルブミンの測定
汎用型の日立７１７０型自動分析装置を用いて各濃度のアルブミン試料を測定し、測定感度を確認した。具体的には、第一試薬１００μＬに各濃度のアルブミンを含有する試料液３μＬをそれぞれ加えて撹拌後、３７℃で５分間加温し、さらに第二試薬１００μＬを添加して３７℃、５分間の主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。まず、アルブミン濃度０μｇ／ｍＬの際の初期凝集を表1に示した。さらに５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００、８００μｇ／ｍＬのアルブミンを含有する各試料測定時の初期凝集からの吸光度変化量を測定し、アルブミン濃度対―（マイナス）吸光度（以下同様）の反応曲線として図１に実線で示した。この反応曲線の形状に基づき０、５、２５、１００、４００、８００μｇ／ｍＬの６ポイントから検量線を作成し、各濃度のアルブミン試料の吸光度変化量をアルブミン濃度に換算した測定値を表２に示した。【００２７】
（４）比較例  
比較例として実施例と最終の抗体濃度が同一となるように下記（Ａ）〜（Ｅ）の５種類の第一試薬を調製した。
（Ａ）遊離状態の抗体１−８を単独で含有する第一試薬
（Ｂ）抗体１−８感作ラテックスを単独で含有する第一試薬
（Ｃ）遊離状態の抗体１−８と抗体１−８感作ラテックスの両方を含有する第一試薬
（Ｄ）遊離状態の抗体１−８と遊離状態の抗体３−８の両方を含有する第一試薬
（Ｅ）抗体１−８感作ラテックスと抗体３−８感作ラテックスの両方を含有する第一試薬
上記（Ａ）〜（Ｅ）の各第一試薬と、（２）で調製した第二試薬を組み合わせ、（３）の方法に従って測定を行った。実施例と同様に初期凝集の結果を表１に、アルブミン濃度対―吸光度の反応曲線を図1に、各比較例の反応曲線の形状に基づき０〜８００μｇ／ｍＬの範囲から選択した至適な濃度ポイントから検量線を作成し、各濃度のアルブミン試料の吸光度変化量をアルブミン濃度に換算した測定値を表２に示した。【００２８】
（５）結果
表１に示したように、実施例の初期凝集（吸光度）に対して、比較例Ａ、Ｂ、Ｃは約半分、比較例Ｄは２／３程度の初期凝集しか得られておらず、凝集阻害法における基本的な測定性能が劣っていることが容易に推察された。一方、比較例Ｅでは実施例よりも大きい初期凝集が得られた。【００２９】
【表１】
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【００３０】
図1のアルブミン濃度対−（マイナス）吸光度の反応曲線より、実施例（−●−）では凝集阻止反応の感受性が高く、アルブミン低濃度域（５−５０μｇ/ｍＬ）で大きな感度（−吸光度）変化を示すと同時にアルブミン高濃度域（１００−８００μｇ／ｍＬ）でも明瞭な感度変化を示すことから、低濃度域から高濃度域まで広範囲に精度良くアルブミンを測定できることが確認された。一方、比較例Ａ（−□−）、同Ｃ（−△−）ではアルブミン低濃度域でほとんど感度変化が認められないため、低濃度域を正確に測定することができない。また、比較例Ｄ（−×−）はアルブミン濃度対―吸光度の反応曲線の形状が実施例と近似しているものの、初期凝集や感度変化自体が実施例に対して小さく、測定精度に課題がある。比較例Ｂ（−○−）、同Ｅ（−一−）ではアルブミン低濃度域で大きな感度変化を示すが、高濃度域では感度変化がないため、低濃度域から高濃度域までを広範囲に測定することができない。【００３１】
表２に示したように、実施例では低濃度から高濃度までほぼ理論値どおりの測定値が得られた。比較例Ａ、Ｃではアルブミン０μｇ／ｍＬを含む低濃度域を正確に測定することができなかった。また、比較例Ｂ、Ｅでは高濃度域を正確に測定することができなかった。比較例Ｄではいずれの濃度でも理論値との乖離が大きく、測定値全般の正確性に問題が認められた。【００３２】
【表２】
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【００３３】
上記実施例及び比較例について、同条件で同時再現性試験を行った（ｎ＝５）。結果を表３に示す。
表３に示したように、実施例では低濃度から高濃度まで再現性良く、変動係数６％以下の値が得られ、測定平均値もアルブミン濃度レベルと同等の測定値が得られた。比較例Ａ、Ｃ、Ｄでは再現性が悪く、特に低濃度の変動係数が２０％を上回る場合があった。比較例Ｂ、Ｅでは、再現性良く測定できているものの、高濃度域における測定平均値はアルブミン濃度レベルと乖離しており、正確性が低かった。【００３４】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によれば、測定対象リガンドを低濃度域から高濃度域まで高感度かつ広範囲に測定できると同時に、良好な測定再現性能を有する凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬を提供することができる。特に、免疫反応を利用する場合、地帯現象を発生しないという特徴から測定値の信頼性が高く、また、異常高値を呈する可能性のあるリガンドを測定する場合には粒子凝集法よりも正確な測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、実施例及び比較例におけるアルブミン濃度対―吸光度の反応曲線を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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