(57)【要約】  本発明は、新規な角結膜疾患治療用組成物を提供する。  本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とする角結膜疾患の予防又は治療剤に関するものであり、より詳細には、本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とする、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患の予防剤又は治療剤、特に角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患の予防剤又は治療剤に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰを有効成分とする角結膜疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
角結膜疾患が、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍である請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
セレノプロテインＰを有効成分とする、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍の予防又は治療剤。
【請求項４】
点眼剤又は眼軟膏である請求項１〜３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
セレノプロテインＰ及び眼科用製剤に許容される眼科用担体を含有してなる眼科用組成物。
【請求項６】
角結膜疾患の予防又は治療剤を製造するためのセレノプロテインＰの使用。
【請求項７】
角結膜疾患が、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍である請求項６に記載の予防又は治療剤の製造のための使用。
【請求項８】
角結膜疾患を患っている患者又はそのおそれのある患者に、有効量のセレノプロテインＰを投与することからなる角結膜疾患を予防・治療する方法。
【請求項９】
角結膜疾患が、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とする角結膜疾患の予防又は治療剤に関するものであり、特に、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の予防剤又は治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
角膜は厚さがおよそ１ｍｍの透明で血管のない薄い組織であるが、上皮層、ボーマン膜、実質層、デスメ膜、及び内皮細胞層から成る非常に規則正しく微細な構造を有している。この角膜は眼球の最前面に位置し、外界からの光を網膜にある光受容体に導くための透過性と屈折力を有する高度に分化した組織であり、視覚にとって極めて重要であるとともに外界と直接接していることから、化学的な侵襲や微生物等の生物学的な侵襲等に対するバリアーとしても機能している。角膜の上皮層の上には、涙液層があり、眼を常に濡れた状態に保ち、眼瞼と結膜との癒着を防ぐと共に、角膜や結膜の生理的状態を維持させている。角膜上皮細胞は、基底部は円柱状であるが、表面にゆくにしたがって扁平になり、基底部で分裂した上皮細胞は次第に上部に移動し、最後は脱落して、涙液により運び去られる。角膜内皮細胞は細胞分裂をしないので、脱落しても再生されることはない。ドライアイ、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎等の種々の角膜疾患によって引き起こされる角結膜障害が、何らかの理由で修復が遅延したり、あるいは修復が行われずに遷延化すると角膜上皮のみならず、実質や内皮の構造や機能までも害され、視覚やバリアー機能に重大な影響を与える。反復性角膜びらん、遷延性角膜上皮欠損等の角結膜上皮疾患等はそのような疾患である。角結膜上皮障害の修復過程は角結膜上皮の細胞の移動による上皮欠損部の被覆と、それに続く細胞の分裂、分化によって正常な角結膜が再構築されていくものであり、角結膜上皮の修復に関わる因子も報告されつつある（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
また、例えば、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、マイボーム腺機能不全、ＶＤＴ（Visual Display Terminal）症候群等の一連の疾患に伴うドライアイや眼手術（白内障手術、角膜移植、屈折矯正手術）後のドライアイ、乾性角結膜炎、また、薬剤性角膜上皮障害、眼神経麻痺性角膜炎、糖尿病角膜症、アレルギー性結膜炎等でみられる、角膜上皮に生じる微細な点状の多発性上皮欠損である点状表層角膜症（ＳＰＫ）等の角膜障害も、視覚やバリアー機能に重大な影響を与える（例えば、非特許文献２参照）。さらに近年では、コンタクトレンズ装用者等にも点状表層角膜症（ＳＰＫ）等の角膜上皮障害が起こることが問題となっている（例えば、非特許文献３参照）。【０００４】
角膜上皮創傷の治療剤としてはフィブロネクチン、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ヒアルロン酸等の成分がある。しかしながら、フィブロネクチンは患者自身の血漿から特殊な精製キットを用いて精製しなければならない血液製剤であり、手間がかかる上、患者の負担も大きいことから、臨床上十分には用いられていない。またＥＧＦは角膜上皮細胞の分裂増殖作用を有するが、炎症を伴う場合や糖尿病性角膜症では、血管新生が発生する副作用が問題となり臨床上ほとんど用いられてはいない。
ヒアルロン酸はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸を構成糖とする分子量数百万のグルコサミノグリカンで、保水効果を持つことからドライアイ患者に用いられている。ヒアルロン酸は角膜上皮細胞の接着、移動にも働くものの、上皮細胞の増殖効果は弱い。また、高濃度では粘度が高くなってしまう問題もある。【０００５】
一方、セレノプロテインＰは１９７７年にグルタチオンペロオキシダーゼ（gultathione  peroxidase）とは異なるセレン含有タンパク質として確認され、１９８２年にセレンがセレノシステイン(selenocystein)の形態で取り込まれていることが明らかにされた。さらに、１９９１年にラットセレノプロテインＰのｃＤＮＡのクローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該タンパク質は最大１０個のセレノシステインを含む可能性が示された（例えば、非特許文献４参照）。セレノプロテインＰの活性としては、脳を含めた各組織へ微量必須元素のセレンを運搬、供給するセレン・トランスポーターの役割をしていると考えられる（例えば、非特許文献５参照）。また、グルタチオン等のチオール存在下に過酸化脂質を還元、除去するグルタチオンペルオキシダーゼ活性（例えば、非特許文献６参照）やperoxynitrite消去活性（例えば、非特許文献７参照）が報告されている。さらには、近年、セレノプロテインＰやその断片が細胞死抑制活性（例えば、特許文献１参照）や神経細胞の初代培養での生存促進因子としての作用（例えば、非特許文献８参照）、シナプス形成促進作用に基づく神経伝達機能異常疾患改善作用（例えば、特許文献２参照）、インターロイキン６産生抑制効果に代表される炎症疾患改善作用（例えば、特許文献３参照）、運動失調改善効果に基づく神経変性疾患改善作用（例えば、特許文献４参照）等の作用を有していることも見出されている。
しかしながら、上記のいずれの文献にも、セレノプロテインＰを上述のような角結膜疾患に適用することは全く記載されておらず、また、示唆もされていない。さらに、本発明で述べるようなセレノプロテインＰの眼部疾患に関わるような作用を類推することは難しく、実際に、そのような作用を見出した報告もない。【０００６】
【非特許文献１】Suzuki K et al．Progress in Retinal and Eye Research.，22，113-133 (2003)
【非特許文献２】大橋裕一  「2.点状表層角膜症」眞鍋禮三、木下茂、大橋裕一監修「角膜クリニック第二版」p36-43（2003）医学書院
【非特許文献３】濱野  光  日本コンタクトレンズ学会誌  37，1-6  (1995)
【非特許文献４】Hill K.E. and Burk R.F.，Biomed. Environ. Sci.，10，p.198-208 (1997)
【非特許文献５】Richardson  D.R.  Biochem.J. 386，e5-e7 (2005)
【非特許文献６】Saito Y  et al. J. Biol. Chem. 274, 2866-2871 (1999)
【非特許文献７】Arteel G.E. et al. J. Biol. Chem. 379，1201-1205 (1998)
【非特許文献８】Yan J and Barrentt J.N. J. Neurosci.，18，8682- 8691 (1998)
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／３１１３１号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−１８２６１６
【特許文献３】特開２００４−１８２６８３
【特許文献４】国際公開ＷＯ０２／９２１２１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来の角結膜疾患治療組成物には未だ満足できるものは知られておらず、更に優れた組成物が望まれていた。また、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、角膜潰瘍などの眼科障害の予防や治療剤においても、更に優れた組成物が望まれていた。
本発明は、新規な角結膜疾患治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまで角結膜疾患への治療効果が検討されていなかった生体由来成分についてスクリーニングを行った結果、ヒト血液中に存在するセレノプロテインＰに角結膜障害に対する優れた治癒効果を見出し、本発明に至った。【０００９】
すなわち、本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とする角結膜疾患の予防又は治療剤を提供するものである。より詳細には、本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とする、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患の予防又は治療剤、好ましくは角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患の予防又は治療剤を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、セレノプロテインＰを有効成分とするドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍の予防又は治療剤、好ましくは角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍の予防又は治療剤を提供するものである。【００１１】
さらに、本発明は、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患を予防又は治療する点眼剤又は眼軟膏、好ましくは角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患を予防又は治療する点眼剤又は眼軟膏を提供するものである。本発明は、セレノプロテインＰ又はその断片、及び眼科用製剤に許容される眼科用担体を含有してなるドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患を予防又は治療するための眼科用組成物に関する。
また、本発明は、角結膜疾患の予防又は治療剤の有効成分としてのセレノプロテインＰ又はその断片の使用に関する。さらに本発明は、セレノプロテインＰ又はその断片の角結膜疾患の予防又は治療剤の製造のための使用に関する。
また、本発明は、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患、好ましくは角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等を患っている患者又はこれらの疾患を患うおそれのある患者に、有効量のセレノプロテインＰ又はその断片を投与することからなるドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患を予防又は治療する点眼剤又は眼軟膏、好ましくは角結膜上皮障害を伴う、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等を予防・治療する方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、角結膜疾患、例えば、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患、特に角結膜上皮障害を伴うこれらの疾患の優れた予防又は治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に用いるセレノプロテインＰは、天然物でも組換え蛋白（例えば、特開２００４−３３７０９０号参照）でもよく、ヒトセレノプロテインＰが好ましい。天然のヒトセレノプロテインＰは、後記する実施例のごとくヒト血漿から精製することができる。また、本発明のセレノプロテインＰは全長のものでも、その部分配列からなる断片（例えば、国際特許公開第００／３１１３１号パンフレット参照）であってもよい。【００１４】
本発明に用いるセレノプロテインＰは、後記する実施例に示すように、ラット角膜上皮障害モデルに対して優れた治療効果が認められる。従って、これらを含有する医薬は、角膜や結膜における炎症や欠損に伴う疾患、例えば、角結膜疾患、より具体的には、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の予防又は治療剤、特に角結膜上皮障害を伴うこれらの疾患の予防又は治療剤として有用である。
本明細書における「角結膜」とは、角膜及び／又は結膜の意味であり、「角結膜疾患」とは角膜及び／又は結膜における疾患である。本発明におけるドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の疾患は、一般的には角結膜疾患に包含される疾患であるが、必ずしも角結膜疾患に起因するものである必要はない。したがって、本発明におけるドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等は、角結膜疾患によらないものをも包含するものである。
また、本発明における「眼科用製剤に許容される眼科用担体」とは、点眼剤や眼軟膏などの眼科用製剤を製造するために許容されている製剤用の担体である。眼科用製剤の担体は、目という特殊な器官に適用される製剤のための担体であり、通常の医薬組成物において使用される錠剤などの経口投与用製剤、貼付剤などの経皮投与用製剤、又は注射剤などの血管や筋肉などへの投与用製剤のための担体と区別することもできることから、本発明の眼科用組成物は、通常のセレノプロテインＰを含有してなる医薬組成物とは区別されうるものである。【００１５】
本発明の予防又は治療剤は、有効成分としてセレノプロテインＰ又はその断片及び製薬上許容される担体を含有する医薬組成物であり、セレノプロテインＰ又はその断片以外の有効成分を含有していてもよい。
本発明の予防又は治療剤は、眼科用製剤として公知の各種の剤型に製剤化したものを使用することができる。製剤は、眼科用製剤、特に点眼用として用いるのが好ましく、斯かる点眼剤は、水性点眼剤、非水性点眼剤、懸濁性点眼剤、乳濁性点眼剤、眼軟膏等のいずれでもよい。このような製剤は、投与形態に適した組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等を配合し、当業者に公知の製剤方法により製造できる。【００１６】
等張化剤としては、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜５重量％が好ましい。【００１７】
キレート剤としては、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜０．２重量％が好ましい。【００１８】
安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜１重量％が好ましい。【００１９】
ｐＨ調節剤としては、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウムなどのアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウムなどのアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜２０重量％が好ましい。【００２０】
防腐剤としては、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜０．２重量％が好ましい。【００２１】
抗酸化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜０．４重量％が好ましい。【００２２】
溶解補助剤としては、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜３重量％が好ましい。【００２３】
粘稠化剤としては、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられ、その配合量は、組成物全量に対して０〜７０重量％が望ましい。【００２４】
点眼剤を調製する場合、例えば、所望な上記成分を滅菌精製水、生理食塩水等の水性溶剤、又は綿実油、大豆油、ゴマ油、落花生油等の植物油等の非水性溶剤に溶解又は懸濁させ、所定の浸透圧に調整し、濾過滅菌等の滅菌処理を施すことにより行うことができる。尚、眼軟膏剤を調製する場合は、前記各種の成分の他に、軟膏基剤を含むことができる。前記軟膏基剤としては、特に限定されないが、ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレン等の油性基剤；油相と水相とを界面活性剤等により乳化させた乳剤性基剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール等からなる水溶性基剤等が好ましく挙げられる。【００２５】
本発明の角結膜疾患の予防又は治療剤を投与する場合、その用量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して、セレノプロテインＰとして１日０．２５〜３０００μｇ、好ましくは２．５〜３００μｇを１回、又は、数回に分けて投与すればよく、液体点眼剤の場合は、１回に１〜数滴点眼すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、動物の両眼を使って本発明のセレノプロテインＰによる角膜上皮の障害の防止を試験した結果を示すものである。図１の（ａ）はコントロール群、（ｂ）はセレノプロテインＰ５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）投与群、（ｃ）はセレノプロテインＰ５０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）投与群、（ｄ）は正常群におけるそれぞれの結果を示す。図中、縦軸は蛍光スコア値を示し、左側のカラムがコントロールの左眼の結果を示し、右側のカラムが薬剤投与（図１の（ｂ）及び（ｃ））の右眼の結果を示す。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
セレノプロテインＰの調製
血漿からのセレノプロテインＰの精製は、既報(Ｓａｉｔｏ Ｙ.ｅｔ ａｌ.，Ｊ.  Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.，ｖｏｌ.２７４，ｐ.２８６６−２８７１，(１９９９))に準じて以下のように行った。
ヒト新鮮凍結血漿２リットルを温浴槽内で完全に融解し、低温室に置いた。これにＰＥＧ４０００の１００ｇを少量ずつ添加しながら撹拌し、全量添加後さらに１時間撹拌を続けた。これを１０,０００ｇにて２０分間遠心した。上清を回収し、ＡＰ２５(ミリポア)にてろ過した。ヘパリンセファローズ(アマシャムファルマシアバイオテク)１００ｍＬを充填したカラムを、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液(２０ｍＭリン酸(ｐＨ７.４)、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、０.２ｍＭ  ＥＤＴＡ)で平衡化し、これに得られたろ液を全量アプライした。２０倍量の平衡化バッファーで洗浄した後、塩濃度を０.１５Ｍから０.６Ｍまでの濃度勾配を作製することによって、吸着タンパク質をグラジエント溶出した。溶出画分は５ｍＬずつ分取し、各フラクションに含まれるセレノプロテインＰの量をＥＬＩＳＡで確認し、セレノプロテインＰを含むフラクションをプールした。精製工程中におけるセレノプロテインＰ断片化を避けるため、ＤＦＰ（diisopropyl fluorophosphate）を終濃度５ｍＭとなるよう添加した。
次に、この画分を２０ｍＭトリス緩衝液(２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８))で６倍に希釈した。この段階で総量が０.７５〜１Ｌとなった。これを、同じ２０ｍＭトリス緩衝液で平衡化した４０ｍＬのＱセファローズ(アマシャムファルマシアバイオテク)カラムにアプライした。２５０〜３００ｍＬの平衡化バッファーで洗浄し、塩濃度０.２５Ｍまでのグラジエントで溶出した。グラジエントには２５０ｍＬの緩衝液を用いた。得られたフラクションをＥＬＩＳＡで定量し、セレノプロテインＰを含むフラクションをプールした。また、このプール画分にも、ＤＦＰを終濃度５ｍＭとなるよう添加した。
引き続き、得られたプール画分に、終濃度２ｍＭとなるようイミダゾールを添加し、４ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル(キアゲン)カラムにアプライした。このカラムは、あらかじめ２０ｍＭトリス緩衝液(２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８)、２ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ)で平衡化した。アプライ終了後、洗浄バッファー(２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８)、２０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ)３０ｍＬで洗浄し、溶出バッファー(２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８)、１５０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ)で溶出した。溶出画分は１ｍＬずつ分取し、２８０ｎｍの吸光度で、吸収の観察されたピークをプールした。この画分を、２.５ｍＬまでＳｐｅｅｄＶａｃ(ＳＡＲＶＡＮＴ)を用いて遠心濃縮した。この濃縮画分にも、ＤＦＰを終濃度５ｍＭとなるよう添加した。最後に、濃縮したセレノプロテインＰ画分は、リン酸緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラム(アマシャムファルマシアバイオテク)にアプライし、脱塩、バッファー置換した。こうして得られたセレノプロテインＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量約６７,０００の移動度を示し、そのほとんどが全長型のセレノプロテインＰと考えられた。
【実施例２】
【００２９】
角結膜上皮障害の治癒効力試験
藤原らの方法（Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 96-100, 2001）を参考に、以下に示す方法でドライアイによる角結膜上皮障害モデルを作製し、セレノプロテインＰの角結膜上皮障害に対する治癒効果を評価した。この実験は、各個体の両眼を用いて、片眼をコントロールとし、他方の眼に薬液を投与することにより、同一個体での比較ができるようにした。
（実験方法）
雄性ＳＤラット（７週齢）にペントバルビタールを腹腔内に投与（３５ｍｇ／ｋｇ）して、全身麻酔後、両側の眼窩外涙腺を摘出しドライアイモデルを作製した。【００３０】
涙腺摘出翌日より、いずれの群にも左眼にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）を、右眼にはＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、セレノプロテインＰ５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）、又はセレノプロテインＰ５０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）を、それぞれ１回５μＬで１日６回、３週間連日点眼した。また、正常群として、涙腺摘出を施さない動物を用意し、同一の条件にて両眼に共にＰＢＳを点眼した（Ｎｏｒｍａｌ群）。なお、動物は各群とも６〜７匹使用した。
３週間の点眼終了後、角膜上皮の障害部を蛍光色素フルオレセインにて染色した。
角膜上皮の障害の程度は、角膜全体を上中下及び左中右の合わせて９つの部分に分割して、各部分ごとに下記の基準で障害をスコア化し、その合計値を求めた。その後、各群において、左眼の合計スコア値と右眼の合計スコア値との比較をステューデントのｔ検定にて行った。なお、公平な評価を行うため、点眼開始から角膜上皮障害のスコア化まで、各群に投与した薬液の内容にブラインドをかけ、スコア化後に照合した。【００３１】
（角膜上皮のフルオレセイン染色スコア判断基準）
０：染色されない（点状蛍光なし）
１：わずかに点状蛍光がみられる
２：比較的多く点状蛍光がみられる
３：密に点状蛍光がみられる【００３２】
（結果）
結果を図１に示す。図１は、それぞれ、（ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ群（以下Ｃ群）、（ｂ）はセレノプロテインＰ５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）投与群（以下Ｓ５群）、（ｃ）はセレノプロテインＰ５０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）投与群（以下Ｓ５０群）、（ｄ）はＮｏｒｍａｌ群（以下Ｎ群）である。図中、縦軸は蛍光スコア値を示し、左側のカラムが左眼、即ちコントロールのＰＢＳ点眼側を、右側のカラムが右眼、即ちＰＢＳ（（ａ）及び（ｄ））、又はセレノプロテインＰ（図中、ＳｅＰと表記）の５又は５０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ溶液）（それぞれ（ｂ）、（ｃ））を点眼した側を示す。また、各蛍光スコア値は、平均値±標準偏差で示してある。
（ａ）〜（ｃ）の左側カラムにおいて、蛍光スコアの平均値は７．３〜８．３を示しており、涙腺摘出後、３週間のＰＢＳ点眼により、角膜上皮の障害が進行していることが明らかとなった。なお、涙腺摘出を施さない（ｄ）のＮ群において、３週間のＰＢＳ点眼により、蛍光スコアの平均値は１．５（左眼）、及び２．０（右眼）となった。
一方、（ａ）〜（ｃ）の右側カラムに見られるように、蛍光スコアの平均値は、まず（ａ）のＣ群では６．８を示し、左眼のスコアと比較して殆ど変化が無かった。これに対し、（ｂ）のＳ５群では蛍光スコアの平均値は４．０、（ｃ）のＳ５０群では同じく２．４となり、左眼と比較して有意に（図１（ｂ）ではＰ＜０．０１で有意差が有り、図１（ｃ）ではＰ＜０．００１で有意差が有った。）、且つ用量依存的に、角膜上皮障害の進行を抑制することが判明した。特に（ｃ）のＳ５０群においては、（ｄ）のＮ群の数値に近いところまで、蛍光スコアの平均値が下がっていることが判る。
上記の薬理試験の結果から明らかなように、セレノプロテインＰ点眼群では、フルオレセイン染色によって確認される角膜上皮の障害の悪化が用量依存的に抑制され、角膜上皮障害の進行を抑制した。従って、セレノプロテインＰは、ドライアイ、乾性角結膜炎、点状表層角膜症、角膜びらん、又は角膜潰瘍等の角結膜疾患の予防又は治療剤、特に角結膜上皮障害を伴うこれらの疾患の予防又は治療剤として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、角結膜疾患に対する新規な予防・治療用の眼科製剤としての医薬組成物を提供するものであり、産業上有用なものである。
【図１】
2006137426.tif 000002
【国際調査報告】
2006137426.tif 000003
2006137426.tif 000004
2006137426.tif 000005
2006137426.tif 000006
2006137426.tif 000007