(57)【要約】自己免疫疾患のマーカーとなる新規な自己抗体を見出し、自己免疫疾患を診断するための有効な手段を提供すること。  イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）タンパク質及び／又はその断片を含むことを特徴とする自己抗体検出用試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）タンパク質及び／又はその断片を含むことを特徴とする自己抗体検出用試薬。
【請求項２】
ＩＰ３Ｒがマウス又はヒト由来のＩＰ３Ｒである、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
ＩＰ３Ｒが、タイプ１  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ１）、タイプ２  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ２）、及びタイプ３  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ３）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１又は２記載の試薬。
【請求項４】
ＩＰ３Ｒタンパク質の断片が、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４番のアミノ酸、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜６０４番のアミノ酸、又はＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７番のアミノ酸若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１番のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
ＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片が固相に固定されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
ＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片が標識されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
サンプル中の抗イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）抗体を検出することを特徴とする自己抗体の検出方法。
【請求項８】
サンプルとＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片とを接触させ、該ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片との反応を測定することにより該サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の自己抗体検出用試薬を含むことを特徴とする自己免疫疾患診断キット。
【請求項１０】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、分類不能結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、橋本病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びベーチェット病からなる群より選択される、請求項９記載の診断キット。
【請求項１１】
自己抗体検出用試薬が、全長ＩＰ３Ｒ１、全長ＩＰ３Ｒ２及び全長ＩＰ３Ｒ３、並びにＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４番のアミノ酸、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜６０４番のアミノ酸、及びＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７番のアミノ酸若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１番のアミノ酸を含む断片からなる群より選択される少なくとも１つのＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含む、請求項９又は１０記載の診断キット。
【請求項１２】
抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体、抗ＳＳ−Ｂ／Ｌａ抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗Ｓｍ抗体、抗Ｓｃｌ７０抗体、抗Ｋｉ抗体、抗Ｋｕ抗体、抗ｒＲＮＰ抗体、抗Ｗａ抗体、抗ｐ９５ｃ／ｐ９７／ＶＣＰ抗体、抗セントロメア抗体、抗核抗体、及びリウマトイド因子からなる群より選択される少なくとも１つの自己抗体の検出用試薬をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体の検出用試薬及び自己抗体の検出方法に関する。また本発明は、自己免疫疾患の診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患とは、免疫系が内因性抗原に対する抗体を産生することで自己の正常な細胞及び組織に対する過剰な免疫反応が起こることによって発症する疾患の総称であり、代表的な疾患として、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、分類不能結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、橋本病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）などが含まれる。このような自己免疫疾患の診断には、自己の細胞又は組織を抗原として反応する抗体（自己抗体）の検出が行われている。そのような自己抗体としては、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、抗ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、抗セントロメア抗体などが知られている。例えば最近、本発明者の研究グループは、多様な細胞活性を有する最も豊富なＡＡＡ（ＡＴＰａｓｅ関連）であるｐ９７／ＶＣＰを見出し（非特許文献１１）、これが原発性胆汁性肝硬変患者からの自己免疫血清と反応することを確認した。
シェーグレン症候群（ＳｊＳ）は外分泌障害の１つであり、主に中年女性において発症し、男性と女性の比率は１：９である。その病因は依然として不明であるが、遺伝的要因、免疫学的要因、環境的要因、及びホルモン（例えばエストロゲンレベルの低下）などの要因が関係していると考えられる（非特許文献１）。シェーグレン症候群は日本に約３０万人、米国に約４００万人の患者がいると推定されている。
シェーグレン症候群（ＳｊＳ）の患者は、臨床学的に、ドライアイ（ｄｒｙ  ｅｙｅ）、ドライマウス（ｄｒｙ  ｍｏｕｓｅ）、Ｔ細胞及びＢ細胞が浸潤する種々の器官における他の全身症状を示す。さらに、これらは１次性シェーグレン症候群（乾燥のみ）と２次性シェーグレン症候群（他の結合組織疾患と合併）に分類される。シェーグレン症候群患者の７０％が血清学的にＳＳ−Ａ／Ｒｏに対する抗体を有し、１次性シェーグレン症候群（Ｐ−ＳｊＳ）患者の２０〜３０％がＳＳ−Ｂ／Ｌａに対する抗体を有する（非特許文献２）。ＳＳ−Ａ／Ｒｏに対する自己抗体は、小さな一本鎖ＲＮＡ（いわゆるＹ１〜Ｙ５  ＲＮＡ）及び１以上のタンパク質から構成されるリボ核タンパク質複合体を認識する。最近、自己抗原の１つが５２ｋＤａのＥ３ユビキチニンリガーゼであると報告されている（非特許文献３）。ＳＳ−Ｂ抗原は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結因子であると考えられている。さらに、Ｋｉに対する抗体は、最近プロテアソーム（ＰＡ  ２８γ）と同定されたが、シェーグレン症候群患者の１０％未満において認められている（非特許文献４）。さらに、α−Ｆｏｄｒｉｎに対する抗体がシェーグレン症候群の数名の患者に存在することが報告されている（非特許文献５）。さらに、シェーグレン症候群で見出されている他の細胞質抗体として、ゴルジ複合体（非特許文献６）、初期エンドソーム抗原１（非特許文献７）、リボソームＰ、ミトコンドリア及びｐ９７／ＶＣＰ（非特許文献８）に対する抗体が挙げられる。
一方、小胞体内で四量体Ｃａ２＋チャネルを形成することが知られるイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）は、生体細胞におけるカルシウム濃度の調節に寄与する重要な分子の１つである。この受容体は、Ｃａ２＋シグナル伝達を介して神経伝達に関与し、生体における形態学的及び生理学的プロセスに関連する他の多くの機能を有する。哺乳動物においては、３つの異なる遺伝子に由来する３種のＩＰ３Ｒが同定されている。タイプ１  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ１）は、主に脳組織において発現され、運動系及び学習系の調節に重要な役割を果たしている（特許文献１）。またこれは平滑筋及び内皮細胞においても発現される。他の２タイプ、すなわちタイプ２及び３  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ２及びＩＰ３Ｒ３）は、種々の組織及び細胞系において発現される（非特許文献１０）。また最近、ＩＰ３Ｐ２及びＩＰ３Ｒ３ノックアウトマウスは細胞内で小胞体からのＣａ２＋放出の欠損を示し、それゆえ唾液及び膵液の分泌が誘導されないことが示されている（特許文献２及び非特許文献９）。
【特許文献１】特開平８−２４５６９８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０６２１３４号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｏｘ  ＲＩ．Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｌａｎｃｅｔ  第３６６巻第３２１−３３１頁，２００５年
【非特許文献２】Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．第１０巻第３８７−３９４頁，１９８３年
【非特許文献３】Ｗａｄａ  Ｋ，ａｎｄ  Ｋａｍｉｔａｎｉ  Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ  第３３９巻第４１５−４２１頁，２００６年
【非特許文献４】Ｔａｎａｈａｓｈｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  第２（３）巻第１９５−２１１頁，１９９７年
【非特許文献５】Ｈａｎｅｊｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７６巻第６０４−６０７頁，１９９７年
【非特許文献６】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  第４０巻第１６９３−１７０２頁，１９９７年
【非特許文献７】Ｓｅｌａｃｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  第１０９巻第１５４−１６４頁，２００３年
【非特許文献８】Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  第１３６巻第５６８−５７３頁，２００４年
【非特許文献９】Ｆｕｔａｔｓｕｇｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３０９巻第２２３２−２２３４頁，２００５年
【非特許文献１０】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  第３４２巻第３２−８頁，１９８９年
【非特許文献１１】Ｏｇｕｒａ  Ｔ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＡＪ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  第６巻第５７５−５９７頁，２００１年
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、自己免疫疾患のマーカーとなる新規な自己抗体を見出し、自己免疫疾患を診断するための有効な手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、シェーグレン症候群を含む自己免疫疾患患者の血清中に、イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）に対する自己抗体が高頻度で存在することを見出した。また、異なる自己免疫疾患に由来する血清は、ＩＰ３Ｒの異なるタイプ又はドメインを認識する可能性があるという知見を得た。以上の知見により、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の（１）〜（３）に関する。
（１）イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）タンパク質及び／又はその断片を含むことを特徴とする自己抗体検出用試薬。
上記自己抗体検出用試薬において、ＩＰ３Ｒは、例えばマウス又はヒト由来のＩＰ３Ｒである。またＩＰ３Ｒは、タイプ１  ＩＰ３Ｒ、タイプ２  ＩＰ３Ｒ、及びタイプ３  ＩＰ３Ｒからなる群より選択される少なくとも１つである。また、ＩＰ３Ｒタンパク質の断片としては、例えば限定されるものではないが、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４番のアミノ酸、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜６０４番のアミノ酸、又はＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７番のアミノ酸若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１番のアミノ酸を含む断片が挙げられる。
上記自己抗体検出用試薬において、ＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片は固相に固定されていてもよく、また標識されていてもよい。
（２）サンプル中の抗イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）抗体を検出することを特徴とする自己抗体の検出方法。
上記方法は、例えば、サンプルとＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片とを接触させ、該ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片との反応を測定することにより該サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出することを含む。
（３）上記（１）の自己抗体検出用試薬を含むことを特徴とする自己免疫疾患診断キット。
上記診断キットの診断対象となる自己免疫疾患は、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、分類不能結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、橋本病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びベーチェット病からなる群より選択される。
また、上記診断キットにおける自己抗体検出用試薬は、全長ＩＰ３Ｒ１、全長ＩＰ３Ｒ２、全長ＩＰ３Ｒ３、及びこれらの一部断片からなる群より選択される少なくとも１つのＩＰ３Ｒ全長タンパク質及び／又はその断片を含む。より好ましくは、全長ＩＰ３Ｒ１、全長ＩＰ３Ｒ２、及び全長ＩＰ３Ｒ３、並びにＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４番のアミノ酸、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜６０４番のアミノ酸、及びＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７番のアミノ酸若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１番のアミノ酸を含む断片からなる群より選択される少なくとも１つのＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含む。
また上記診断キットは、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体、抗ＳＳ−Ｂ／Ｌａ抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗Ｓｍ抗体、抗Ｓｃｌ７０抗体、抗Ｋｉ抗体、抗Ｋｕ抗体、抗ｒＲＮＰ抗体、抗Ｗａ抗体、抗ｐ９５ｃ／ｐ９７／ＶＣＰ抗体、抗セントロメア抗体、抗核抗体、及びリウマトイド因子からなる群より選択される少なくとも１つの自己抗体の検出用試薬をさらに含んでもよい。
本発明は、人体から取得したサンプル中の抗イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）抗体を検出する工程を含む、自己免疫疾患の発症可能性及び／又は発症の有無を評価する方法に関する。より具体的には、上記サンプルとしては例えば血清を用い、被験者の血清中に抗ＩＰ３Ｒ抗体が検出された場合には、何れかの自己免疫疾患に将来的に罹病する可能性がある、あるいは既に罹病している虞があると評価する方法に関する。すなわち、抗ＩＰ３Ｒ抗体を自己免疫疾患の一指標として利用する方法に関する。
なお、いうまでもないが、被験者が自己免疫疾患に罹病しているか否かの最終的な診断は、既に確立されたあるいは将来的に確立される診断手法に従い、医師により行われる。本発明はその前診断として有用な方法である。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−１７９４０３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＩＰ３Ｒの５つのドメインの構造モデルを示す。
図２は、種々の自己免疫疾患患者、正常健常被験者由来の血清、及び対照として抗ＩＰ３Ｒ抗体を用いたマウスＩＰ３Ｒの３つのタイプのイムノブロット分析を示す。
図３は、ＲＡ及びＳＬＥ患者由来血清を用いたイムノブロット分析の代表的な写真を示す。
図４は、ＳｊＳ患者由来血清を用いたイムノブロット分析の代表的な写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）は、Ｃａ２＋シグナル伝達を介して神経伝達に関与し、生体における形態学的及び生理学的プロセスに関連する他の多くの機能を有することが知られているが、今回、種々の自己免疫疾患患者においてイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）に対する抗体の存在が認められた。従って、本発明は、被験者におけるイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）に対する自己抗体の存在を検出することによって、自己免疫疾患を診断するための手段及び方法を提供する。
本発明においては、自己抗体の存在を検出するため及び／又は自己免疫疾患を診断するために、自己抗体の存在を検出することができる手段、具体的には抗原抗体反応に基づいて自己抗体を検出することができる手段、すなわちＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片、を使用する。
ＩＰ３Ｒは、ヒト、マウス、ラット、ヒトデ、線虫、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル及びロブスターなどにおいて単離されており、また哺乳動物のＩＰ３Ｒでは少なくとも３つのサブタイプが存在することが知られている。しかしながら、ＩＰ３Ｒのタイプ間でのアミノ酸配列の相同性は高く、また動物種差による違いもあまりないことが知られている（例えば、Ｍａｒａｎｔｏ  ＡＲ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２２−１２３０，１９９４；Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１１９６７−１１９７５，２００４；Ｙａｍａｄａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０２：７８１−７９０，１９９４）。従って、本発明においては、任意の動物種由来の任意のタイプのＩＰ３Ｒタンパク質及びその断片を使用することができると考えられる。例えば、ヒトとマウスのＩＰ３Ｒタンパク質は９５〜９８％の相同性があり、実際、後述する実施例においては、マウスＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を使用してヒト被験者由来の血清との反応を検出することができた。
代表的なＩＰ３Ｒの配列情報は公的なデータベースより取得することができる。例えばマウス由来のタイプ１イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ１）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示される塩基配列によりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５３７３；Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：３２−３８，１９８９等）。また、マウス由来のタイプ２  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ２）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号３に示される塩基配列によりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８２２８８；Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１０３０５−１０３１７，２００５）。マウス由来のタイプ３  ＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ３）は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号５に示される塩基配列によりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８２２８９；Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１０３０５−１０３１７，２００５）。また、ヒト由来のＩＰ３Ｒ１はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２６０７０、Ｌ３８０１９及びＵ２３８５０に、ヒトＩＰ３Ｒ２はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２６３５０に、ヒトＩＰ３Ｒ３はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２６３５１及びＵ０１０６２に登録されており、また特開平８−２４５６９８号公報、特開平８−１３４０９７号公報、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０２：７８１−７９０，１９９４；Ｈａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８３３−２８４０，１９９５；Ｎｕｃｉｆｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２９１−２９６，１９９５；Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔ．Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ２：９−２２，１９９４；及びＭａｒａｎｔｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２２２−１２３０，１９９４にそのアミノ酸配列及び塩基配列情報が記載されている。ラット由来のＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２及びＩＰ３Ｒ３は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０５５１０、Ｘ６１６７７及びＬ０６０９６に登録されている（Ｍｉｇｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２６７９−１２６８５，１９９０；Ｓｕｄｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．１０：３１９９−３２０６，１９９１；Ｂｌｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１３５６−１１３６３，１９９３）。アフリカツメガエルＩＰ３Ｒ１はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１４４００に登録されており（Ｋｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：５５５−５７０，１９９３）、ヒトデＩＰ３ＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７１３７２に登録されており（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７６３−２７７２，２００２）、ショウジョウバエＩＰ３ＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ９０４０３に登録されており（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６６１３−１６６１９，１９９２）、ロブスターＩＰ３ＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッション���号ＡＦ０５５０７９に登録されており（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２０４５０−２０４５７，２０００）、線虫ＩＰ３ＲはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４３１７９−８２に登録されている（Ｂａｙｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：４６７−４７６，１９９９）。
本発明において、ＩＰ３Ｒタンパク質は、抗ＩＰ３Ｒ抗体との反応性を有する限り、天然ＩＰ３Ｒタンパク質のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。例えば、配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列の１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列に１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列の１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明において用いることができる。特に、配列番号２、４若しくは６に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が保存的置換されていることが好ましい。「保存的置換」とは、当技術分野で公知であり、あるアミノ酸が、そのアミノ酸と類似の性質を示すアミノ酸と置換されることをいう。例えば、中性（極性）アミノ酸（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ）、中性（非極性、すなわち疎水性）アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）、酸性（極性）アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（極性）アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）が、同じ性質を有するアミノ酸と置換される。
また例えば、天然のＩＰ３Ｒタンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列相同性又は同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドもまた本発明において用いることができる。なお、アミノ酸配列の相同性又は同一性は、当技術分野で公知の方法により容易に求めることができる。
ＩＰ３Ｒタンパク質の断片は、抗ＩＰ３Ｒ抗体との反応性を有する限り、任意の長さの任意の部分の断片とすることができる。抗体に対する反応性（抗原性）を保持するアミノ酸の長さは、当技術分野において約５〜６アミノ酸であることが知られている。従って、ＩＰ３Ｒタンパク質の断片は、少なくとも５アミノ酸又は６アミノ酸を含むポリペプチドとすることができる。またＩＰ３Ｒは、図１に示すような５つの機能ドメイン、すなわちＮ末端カップリングドメイン、ＩＰ３結合コアドメイン（コア）、中央カップリング・調節ドメイン、膜貫通ドメイン、及びゲートキーパードメインから構成されている（Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３  ２７８：１６５５１−１６５６０）。ＩＰ３Ｒの各ドメインの位置及び境界は当業者であれば文献などを参照して容易に理解することができる。ＩＰ３Ｒタンパク質の断片は、例えばこれらのドメインのいずれかを含む又はそれからなるポリペプチド断片とすることができる。好ましくは、ＩＰ３結合コアドメイン（コア）、Ｎ末端カップリングドメインとＩＰ３結合コアドメインからなるＩＰ３結合ドメイン（Ｔ６０４）、及びＮ末端カップリングドメインとＩＰ３結合コアドメインと中央カップリング・調節ドメインからなるＮ末端細胞質領域（ＥＬ）を含むポリペプチド断片を用いる（図１）。なお、これに限定されるものではないが、コア（ＩＰ３結合コアドメイン）はマウスＩＰ３Ｒ１及びＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４アミノ酸残基に位置し、Ｔ６０４（ＩＰ３結合ドメイン）は、マウスＩＰ３Ｒ１及びＩＰ３Ｒ２の１〜６０４アミノ酸残基に位置し、ＥＬ（Ｎ末端細胞質領域）は、マウスＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７アミノ酸残基又はＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１アミノ酸残基に位置する。これらの断片の例についての詳細は、例えばＵｃｈｉｄａら（前掲）、特開２００５−３０４３６０号公報、特開２０００−１３５０９５号公報、及び特開２００５−５８１１６号公報などを参照されたい。
ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片は、天然に単離してもよいし、あるいはその配列情報に基づいて化学合成により又は組換え手法を用いて生成することも可能である。
ＩＰ３Ｒタンパク質を天然に単離する場合には、公知の単離・精製方法を用いることができる。例えば、ＩＰ３Ｒタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィにより簡便に精製することができる（特開平６−１３５９９７号公報）。
また、遺伝子組換え手法を用いる場合には、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片をコードする核酸は、生体組織又は培養細胞などより抽出したＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、ＩＰ３Ｒ遺伝子の配列に基づいて設計したプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、又はＩＰ３Ｒ遺伝子の配列に基づいて設計したプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングにより得ることができる。あるいは、生体組織又は培養細胞などより抽出したＤＮＡを鋳型として、ＩＰ３Ｒ遺伝子の配列に基づいて設計したプライマーを用いたプライマーを用いて核酸増幅反応（例えばＰＣＲなど）を行うことにより、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片をコードする核酸を得ることができる。また、変異を有するＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片をコードする核酸の調製方法は、当技術分野で公知である。
本発明において、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を組換え発現させるための発現ベクターは、上記核酸を適当なベクターに連結することにより得ることができる。また、上記核酸又は発現ベクターを、目的のタンパク質が発現し得るように宿主細胞中に導入することにより、形質転換体を作製することができる。
ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスに基づくベクター、人工染色体などの公知のベクターであれば任意のものを用いることができる。プラスミドＤＮＡとしては、細菌由来のプラスミド（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系等）、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＦａｓｔＢａｃ１等）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することができる。
ベクターに核酸を挿入するには、例えば、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。ベクターが宿主細胞において自立複製されるか、又はベクター上の核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主細胞においてＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片が発現されるようにベクターを構築する必要がある。そこで、ベクターには、プロモーター、核酸のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、相同配列などを連結することが好ましい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片の精製を容易にするため、シグナル配列、Ｈｉｓタグなどを付加してもよい。これらの各種配列とベクターとを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、上記各種配列とベクターとをアニーリングさせた後に連結させ、発現ベクターを作製する。
形質転換に使用する宿主としては、導入される核酸を発現し、タンパク質を産生できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌ＢＬ２１系等）、酵母（サッカロミセス・セレビシエ等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等）などが挙げられる。
細菌又は酵母への核酸又は発現ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、動物細胞、昆虫細胞への核酸又は発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片は、それをコードする核酸が導入された前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞又は細胞破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
細菌又は酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約２０〜４０℃で約１〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。動物細胞又は昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、約３７℃で約１〜７日間行う。培養中は必要に応じてストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片が細胞内又は菌体に生産される場合には、細胞又は菌体を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片が細胞外又は菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞又は菌体を除去する。
化学合成又は組換え手法により生成されたＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離精製することができる。
目的のＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片が得られたか否かは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等により確認することができる。
また、ＩＰ３Ｒタンパク質の断片を化学合成する場合には、公知のペプチド合成手法に従って、例えば市販のペプチド合成機や市販のペプチド合成用キットを用いて合成することができる。ペプチドの合成手法は、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６などの文献に記載されている。
あるいは、ＩＰ３Ｒタンパク質の断片は、上述のように単離した又は組換え手法により作製したＩＰ３Ｒタンパク質を化学的に又は酵素的に切断することによって得ることもできる。
得られたＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片が自己抗体と反応するか否かは、該タンパク質又はその断片を、自己免疫疾患患者から得られた血清と又は公知の抗ＩＰ３Ｒ抗体と反応させることにより確認することができる。
上述のＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を用いて、サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出することが可能である。この検出は、抗原−抗体反応を測定する方法、すなわち免疫学的測定方法であれば、任意の方法に基づいて実施することができる。例えば、抗ＩＰ３Ｒ抗体の検出は、イムノアッセイ（酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法及びイムノブロット法等）、オクタロニー法（免疫二重拡散法）並びに免疫組織化学染色法及び免疫電顕法などを利用して実施することができる。  対象となるサンプルは、自己抗体の存在を検出しようとするサンプルであれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血清又は血漿を含む血液サンプル、唾液、髄液、関節液又は尿を含む体液サンプル、細胞又は組織を含む固形サンプルなどを用いることができる。特に、自己抗体の存在を検出しようとする被験者に由来する血液サンプルが好ましい。
免疫学的測定方法においては、サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体をＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片と結合させて、その結合を検出することによって、抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出する。本発明において「検出」とは、抗ＩＰ３Ｒ抗体の存在の有無を検出することだけではなく、抗ＩＰ３Ｒ抗体を定量的に検出することも含む。
抗ＩＰ３Ｒ抗体についてのイムノアッセイは、典型的には、試験対象のサンプルをＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片と接触させ、当技術分野で公知の手法を用いて抗ＩＰ３Ｒ抗体と結合したＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を検出することを含む。「接触」は、サンプル中に存在する抗ＩＰ３Ｒ抗体とＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片とが結合できるように近接することができる状態にすることを意味し、例えば、液状サンプルとＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を含有する溶液とを混合すること、液状サンプルにＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を添加すること、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を含むゲルプレートの穴又はウエルなどに液状サンプルを添加すること、固形サンプルに対してＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を含有する溶液を塗布することなどの操作が含まれる。
イムノアッセイは、液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。検出の容易性の点で、固相系を利用することが好ましい。またイムノアッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法などであってもよい。
アッセイの操作法は、公知の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１″ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ″Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）により行うことができる。例えば、イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）を利用することができる。あるいは、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片と抗体との複合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法、免疫拡散法等）によって分離し、標識のシグナルを検出するようにしてもよい。
イムノアッセイの一例として、例えば固相系を利用する場合、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を固相支持体又は担体（樹脂、膜、フィルム、ビーズ、ゲルなど）に固定してもよいし、あるいはサンプルを固定してもよい。例えば、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を固相支持体に固定し、支持体を適当なバッファーで洗浄した後、サンプルを用いて処理する。次に固相支持体にバッファーを用いた２回目の洗浄を行って、未結合のサンプルを除去する。そして固体支持体上の結合した抗体の量を、慣用的な手段により検出することによって、サンプル中の自己抗体とＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片との結合を検出することができる。
固相支持体又は担体としては、合成有機高分子化合物（ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン等）、多糖類（デキストラン誘導体、セルロース、アガロースゲル等）、無機高分子化合物（ガラス、シリカ、シリコン等）が挙げられる。また担体の形状は、平板状、粒子状、管状、繊維状、膜状、微粒子状などの任意の形状であってよい。ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を担体に結合するには、物理的吸着、イオン結合、共有結合などを利用してもよいし、あるいは他の基（リンカー）を介して結合してもよい。
抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用するイムノアッセイの種類及び形式、使用する標識の種類及び標識の対象などに応じて、各アッセイについての有効かつ最適な測定方法を決定することができる。
本発明の一実施形態においては、サンプル中に存在する自己抗体とＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片との反応を容易に検出するために、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン−アビジン複合体等を用いることにより間接的に検出する。本発明で使用可能な標識の例とその検出方法について以下に記載する。
酵素イムノアッセイの場合には、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素との結合は、グルタルアルデヒド、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。
蛍光イムノアッセイの場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等を用いることができる。これらの蛍光標識は、慣用の手法により結合させることができる。
放射性イムノアッセイの場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５及びヨウ素１３１等を用いることができる。放射性標識は、クロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法により結合させることができる。
例えば、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を上記のように標識で直接標識する場合には、サンプルを標識したＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片と接触させて、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片−自己抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片を分離して、結合した標識ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片の量又は未結合の標識ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片の量よりサンプル中の自己抗体量を測定することができる。
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片とサンプルとを反応させ（１次反応）、得られた複合体にさらに標識二次抗体を反応させる（２次反応）。１次反応と２次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。１次反応及び２次反応により、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片−自己抗体−標識二次抗体の複合体、あるいは自己抗体−ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片−標識二次抗体の複合体が形成される。そして未結合の標識二次抗体を分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中の自己抗体量を測定することができる。
ビオチン−アビジン複合体系を利用する場合には、ビオチン化したＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片とサンプルとを反応させるか、あるいはＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片とサンプルとを反応させた後にビオチン化二次抗体を反応させ、それにより得られた複合体に標識を付加したアビジンを反応させる。アビジンは、ビオチンと特異的に結合することができるため、アビジンに付加した標識のシグナルを検出することによって、自己抗体とＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片との結合を測定することができる。アビジンに付加する標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）が好ましい。
標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合した自己抗体量に換算してもよいし、あるいはサンプルの希釈系列を利用して自己抗体の存在度を希釈率から評価してもよい。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等を、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。
本発明の好ましい実施形態においては、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片の少なくとも１種、好ましくはＩＰ３Ｒタンパク質のタイプ１、タイプ２及びタイプ３、並びにＩＰ３Ｒタンパク質の断片（例えばコア、Ｔ６０４及びＥＬ）からなる群より選択される複数種を、固相（例えば膜、チップ、プレートなど）に結合させ、ブロッキング処理を行う。この固相に対して、被験者由来の血液サンプルをアプライする。好ましくは血液サンプルの希釈系列を調製し、それぞれを固相にアプライする。洗浄して未反応サンプルを除去した後、標識した二次抗体（例えば抗ヒトＩｇＧ抗体など）をアプライする。未反応二次抗体を洗浄除去した後、固相上の標識に基づいて、サンプル中の自己抗体を検出する。
上述の通り、本発明の自己抗体検出用試薬を用いることによって、サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体の検出を容易かつ簡便に行うことができる。
また本発明の自己抗体検出用試薬は、自己免疫疾患の診断キットにおいて用いることができる。診断対象となる自己免疫疾患は、抗ＩＰ３Ｒ抗体を自己抗体として発現する自己免疫疾患であれば特に限定されるものではなく、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、分類不能結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、橋本病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病などが挙げられる。
本発明の診断キットは、上記の自己抗体検出用試薬、すなわちＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含む。診断キットは、１つのタイプのＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含んでもよいし、あるいは複数のタイプのＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含んでもよい。好ましくは、全長ＩＰ３Ｒ１、全長ＩＰ３Ｒ２及び全長ＩＰ３Ｒ３、並びにＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の２２４〜６０４番のアミノ酸、ＩＰ３Ｒ１若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜６０４番のアミノ酸、及びＩＰ３Ｒ１の１〜２２１７番のアミノ酸若しくはＩＰ３Ｒ２の１〜２１７１番のアミノ酸を含む断片からなる群より選択される少なくとも１つのＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片を含み、特に好ましくは上記の全長ＩＰ３Ｒタンパク質及びその断片を全て含む。
診断キットに含まれる自己抗体検出用試薬は、上述のように固相に固定されていてもよい。例えば、ＩＰ３Ｒタンパク質又はその断片のいずれか１つが固相に固定されていてもよいし、複数種のＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片が同じ固相又は異なる固相に固定されていてもよい。また、自己抗体検出用試薬は、上述のように標識されていてもよい。
また、本発明の診断キットは、免疫学的測定方法を実施するために有用なさらなる成分を含有してもよい。そのような成分としては、抗原抗体反応を検出するための、例えば免疫沈降法、イムノアッセイ法（ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等）、イムノブロッティング法などの方法の実施に必要な成分が挙げられる。例えば、バッファー、サンプル処理用試薬、標識、二次抗体、陽性対照、陰性対照などである。
診断キットの形態は、特に限定されるものではないが、自己抗体検出用試薬含有溶液を含む容器、自己抗体検出用試薬が固定された固相（膜、チップ、プレートなど）、凍結乾燥した自己抗体検出用試薬を含む容器などの形態をとることができる。
上記診断キットは、自己免疫疾患への罹患を検査しようとする被験体又は自己免疫疾患患者から採取したサンプル中に含まれる抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出することによって、該被験体の自己免疫疾患の罹患の有無、疾患の状態及び進行、並びに疾患の罹患リスクを迅速かつ簡便に判定することができる。このような免疫学的測定方法を利用した疾患の診断キットは周知であり、当業者であれば、公知の免疫学的測定方法において本発明の診断キットを用いることができる。
また本発明の診断キットは、自己抗体の検出及び／又は自己免疫疾患の診断に用いられている他の成分を含んでもよい。そのような成分としては、例えば、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体、抗ＳＳ−Ｂ／Ｌａ抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗Ｓｍ抗体、抗Ｓｃｌ７０抗体、抗Ｋｉ抗体、抗Ｋｕ抗体、抗ｒＲＮＰ抗体、抗Ｗａ抗体、抗ｐ９５ｃ／ｐ９７／ＶＣＰ抗体、抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、リウマトイド因子（ＲＦ）などの自己抗体を検出するための試薬が挙げられる。このような試薬は市販品、例えば株式会社医学生物学研究所（ＭＢＬ）製のものを用いてもよいし、あるいは文献に記載の試薬を用いてもよい。
診断キットにおいて、上記の自己抗体の検出及び／又は自己免疫疾患の診断のための他の成分は、固相に固定されていてもよい。その場合、他の成分は別個に固定されていてもよいし、あるいは本発明の自己抗体検出用試薬（ＩＰ３Ｒタンパク質及び／又はその断片）と一緒に固相に固定されていてもよい。例えば、全ての成分が同一固相上に固定され、１回の反応操作によってサンプル中の種々の自己抗体の存在を検出できることが好ましい。
サンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体の存在、又はサンプル中の抗ＩＰ３Ｒ抗体及び他の自己抗体の存在を検出することによって、自己免疫疾患を簡便かつ高精度に診断することが可能となる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
〔実施例１〕
本実施例においては、種々の自己免疫疾患患者における抗ＩＰ３Ｒ抗体の存在を調べた。
患者は、７４名のシェーグレン症候群患者（３５名の１次性（Ｐ−ＳｊＳ）、３９名の２次性シェーグレン症候群（Ｓ−ＳｊＳ）患者）、１４４名の関節リウマチ（ＲＡ）患者、９６名の他の結合組織疾患患者（ＣＴＰ）、及び３３名の正常な健常被験者（ＮＨＳ）を含む。シェーグレン症候群（ＳｊＳ）の診断は、ＳｊＳについての欧州又は国際基準のいずれかで行った（Ｖｉｔａｌｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５３：６３７−６４７，１９９４；Ｖｉｔａｌｉ  Ｃ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２：９４−９５，２００３；ａｕｔｈｏｒ’ｓ  ｒｅｐｌｙ  ９５）。以下の４つの項目のうち２つを満たす場合には、ＳｊＳの診断を行った：（１）組織病理学的試験が、各唇小管又は涙小管の周囲に浸潤した５０個を超えるリンパ球を示す。（２）口内試験が、唾液腺撮影法（Ｒｕｂｉｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔ  ＪＦ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ  １９５７；７７：５７５−５９８）によりステージ１以上である、又は唾液シンチグラフィにより唾液の分泌量低下（Ｇｕｍ試験により１０分当たり１０ｍｌ未満、又はＳａｘｏｎ試験により２分当たり２ｇ未満）及び分泌障害を示す。（３）眼の試験が、シルマー試験により５分当たり５ｍｍ湿潤を示す、及びローズベンガル試験においてｖａｎ  Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄスコア３以上を示す。（４）血清学的試験が、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体又は抗ＳＳ−Ｂ／Ｌａ抗体の存在を示す（Ｆｕｊｉｂａｙａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｗｅｌｆａｒｅ．１３５−１３８，１９９９）。
ＲＡ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）の診断は標準的な基準に従って行った。全ての患者と医師からこの試験について書面で同意を得た。
抗ＩＰ３Ｒ抗体を検出するため、以下のようにイムノブロッティングを実施した。Ｉｗａｉら（Ｉｗａｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５，１８：２８０：１０３０５−１７）に記載のようにマウスＩＰ３Ｒを過剰発現するＳｆ９細胞からミクロソーム画分を調製した。具体的には、Ｓｆ９細胞にマウスＩＰ３Ｒタンパク質のいずれか１タイプをコードするｃＤＮＡを含有する組換えバキュロウイルスを感染させ、Ｓｆ９細胞において各々のタイプのＩＰ３Ｒを発現させた。各タイプのＩＰ３Ｒタンパク質を５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。膜をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中３％スキムミルクでブロッキングした後、血清と共にインキュベートした。血清（１：３００）とのインキュベーションは、４℃で一晩実施した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、膜を抗ヒトＩｇＧ（ｈ＆ｌ）抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＢＥＴＨＹＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ；１：２０００）と共に室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてブロットを発色させた。シグナル強度は、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて計算した。この値は、少なくとも３回の測定値の平均とした。これらのシグナル強度は半定量的であり、いずれかのタイプのＩＰ３Ｒタンパク質に対するシグナル強度が８０（ＮＨＳの平均値の２倍以上）を超える血清を便宜的に陽性とした。なお、実施例において、２群間の数値はχ二乗検定を用いて比較し、ｐ値＜０．０５の場合に有意とみなした。
その結果を以下の表１に示す。抗ＩＰ３Ｒ抗体は、Ｐ−ＳｊＳ患者３５名のうち２２名（６２．９％）において、Ｓ−ＳｊＳ患者３９名のうち１２名（３０．８％）において認められた。これらのＳｊＳ患者で観察された頻度は、正常な健常被験者において認められた９．１％よりも有意に高かった。また、抗ＩＰ３Ｒ抗体は、ＲＡにおいて５３．３％（６６名／１２４名）、他のＣＴＤにおいて４８．２％（２６名／５４名）及び他の自己免疫疾患において３９．２％（９名／２３名）に存在した。
【表１】
2008001944.tif 000002
2008001944.tif 000003
図２は、代表的なＰ−ＳｊＳ患者、Ｓ−ＳｊＳ患者、ＲＡ患者及びＳＬＥ患者の血清、正常な健常被験者（ＮＨＳ）の血清、並びにウサギ由来の抗ＩＰ３Ｒ抗体（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４  ２７９，１１９６７−７５）と組換えタンパク質ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、及びＩＰ３Ｒ３との反応性についてイムノブロットにより得られた種々のパターン（１セット）を表す。図２中、写真の上に示す数（１〜３）はＩＰ３Ｒの各タイプを表し、ＩＰ３Ｒ１の位置は矢じりで示し、ＩＰ３Ｒ２及びＩＰ３Ｒ３の位置は星印で示す。また、写真の下に示す数は被験者の血清番号を表す。
Ｐ−ＳｊＳ患者由来の３つの血清（Ｎｏ．１７３、２１８及び２２８）は、タイプ１においてタイプ２又は３よりも濃いバンドを生じた。Ｓ−ＳｊＳ患者由来の３つの血清（Ｎｏ．５０、２２３及び２２７）は、タイプ３においてタイプ１又は２よりも濃いバンドを生じた。ＲＡ患者由来の４つの血清（Ｎｏ．２６、１４１、１５５及び２７８）は、タイプ２においてタイプ１又は３よりも濃いバンドを生じた。ＮＨＳ由来の４つの血清は、有意なバンドを示さず、ウサギ由来の陽性対照血清はＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２及びＩＰ３Ｒ３に対して特異的に反応した。また興味深いことに、ＩＰ３Ｒ２ドミナントに対する自己抗体は、乾燥症状のないＲＡ患者１２４名のうち１９名（１５．４％）において認められた。
従って、自己免疫疾患患者血清中の抗ＩＰ３Ｒ抗体は、その疾患の種類によって異なるエピトープを認識することが示唆される。
〔実施例２〕
本実施例においては、種々の自己免疫疾患患者における抗ＩＰ３Ｒ抗体の存在と公知の他の自己抗体の存在を調べた。
具体的には、実施例１における自己免疫疾患患者における自己抗体（ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ抗体、Ｕ１ＲＮＰ抗体、Ｓｍ抗体、Ｓｃｌ７０抗体、Ｋｉ抗体、Ｋｕ抗体、ｒＲＮＰ抗体、Ｗａ抗体、及びｐ９５ｃ／ｐ９７／ＶＣＰ抗体を含む）の存在を、二重免疫拡散法によりスクリーニングした（Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｈａｎｋｉｎｓ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ９５−ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１３６：５６８−５７３）。なお、正確な頻度を決定するために、３９名のＳ−ＳｊＳ患者をＣＴＤに再度分類した。それにより、ＲＡ、ＳＬＥ、ＳＳｃ及びＭＣＴＤの数はそれぞれ１４４名、３４名、２６名及び６名となった。
さらに、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、Ｕ１ＲＮＰ、Ｓｍ及びＳｃｌ７０（トポイソメラーゼ１）に対する抗体を市販のキットを用いてＥＬＩＳＡで確認した。抗Ｋｉ、抗Ｋｕ（Ｍｉｍｏｒｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｈ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：１７７７−８１）、抗ｒＲＮＰ、抗Ｗａ（Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９９１；１８：３７３−３７８）、抗ＷＳ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９６；４４：８７７−８８２）及び抗ｐ９７／ＶＣＰ（Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１３６：５６８−７３）の確認については免疫沈降法を用いて確認した。抗セントロメア抗体は、公知のＲＩＡ又はＥＬＩＳＡを用いて確認した（柏崎他、臨床免疫２１（ｓｕｐｐｌ．１４）春期特別増刊号：５７１−５７８，１９８９）。
その結果を表２に示す。Ｐ−ＳｊＳ及びＳ−ＳｊＳにおいて観察された抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体の頻度は、それぞれ３５名のうち２２名（６２．９％）、３９名のうち２３名（５９％）であった。抗セントロメア抗体は、Ｐ−ＳｊＳ患者３５名のうち３名（８．６％）、Ｓ−ＳｊＳ患者３９名のうち４名（１０．３％）、ＳＳｃ患者２６名のうち１０名（３８．５％）で観察された。抗Ｋｉ抗体は、Ｐ−ＳｊＳ患者３５名のうち１名（２．９％）、Ｓ−ＳｊＳ患者３９名のうち４名（１０．３％）、ＳＬＥ患者３４名のうち８名（２３．６％）で観察された。
【表２】
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また、シェーグレン症候群患者において、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体陰性を示すが、抗ＩＰ３Ｒ抗体に対して陽性である患者を調べた。その結果を表３に示す。抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体は、１次性シェーグレン症候群（Ｐ−ＳｊＳ）患者３５名のうちの２２名（６２．９％）、及び２次性シェーグレン症候群（Ｓ−ＳｉＳ）患者３９名のうちの２３名（５９．０％）において認められた。抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体を有しない患者２９名のうち、抗ＩＰ３Ｒ抗体は、Ｐ−ＳｊＳ患者１３名のうちの７名に、Ｓ−ＳｊＳ患者１６名のうちの５名に認められた。従って、抗ＩＰ３Ｒ抗体は、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体陰性を示すシェーグレン症候群患者２９名のうち１２名（４１．４％）で陽性であった（表３）。
【表３】
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従って、抗ＩＰ３Ｒ抗体の検出は、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ陰性シェーグレン症候群の診断に有用であり、抗ＩＰ３Ｒ抗体の検出と抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体又は他の自己抗体の検出とを組み合わせることによって種々の自己免疫疾患を高精度に診断することが可能になると考えられる。
〔実施例３〕
本実施例においては、自己免疫疾患患者由来の血清がＩＰ３Ｒのどの領域を認識するかを検討した。
まず、抗原としてマウスＩＰ３ＲのＩＰ３結合コアドメイン（コア）、ＩＰ３結合ドメイン（Ｔ６０４）、及びＮ末端細胞質領域（ＥＬ）の組換えタンパク質を調製した。具体的には、マウスＩＰ３ＲのＩＰ３結合コアドメイン（コア；配列番号２又は４における２２４〜６０４番のアミノ酸）及びＩＰ３結合ドメイン（Ｔ６０４；配列番号２又は４における１〜６０４番のアミノ酸）を大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において発現させ、ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（Ｉｗａｉ  Ｍ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。マウスＩＰ３Ｒ１のＮ末端細胞質領域（配列番号２における１〜２２１７のアミノ酸；ＥＬｍ１）をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５バキュロウイルス導入ベクターに挿入した。マウスＩＰ３Ｒ２のＮ末端領域（配列番号４における１〜２１７１のアミノ酸；ＥＬｍ２）をコードするｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス導入ベクターに挿入した。ＥＬｍ１を含有する組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製した。ＥＬｍ２を含有する組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製した。組換えウイルスをＳｆ９細胞において増幅させ、発現に使用した。Ｓｆ９細胞を培養し、Ａｎｄｏら（Ａｎｄｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２００３  ２７８：１０６０２−１２）に記載のようにトランスフェクトした。組換えタンパク質を含有する可溶性画分はＡｎｄｏら（前掲）のように調製した。タンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、実施例１と同様にイムノブロッティングを実施した。
その結果を図３及び４に示す。図３及び４は、患者由来血清を用いたイムノブロット分析の代表的な写真を示す。図３及び４中、ＥＬ、Ｔ６０４及びコアのバンドの位置は矢印で示しており、他の位置に存在するバンドは全て非特異的バンドである。イムノブロット写真の下に血清番号を示す。
図３は、ＩＰ３Ｒ２に対して強い強度を示した１０の血清を示している。これらの血清には、ＲＡ患者９名、ＳＬＥ患者１名からの血清が含まれた。Ｎｏ．２８１の血清以外は全てＥＬ（アミノ酸１〜２１７１残基）を含有するレーンにおいて強力なバンドを生じた。対照的に、コア及びＴ６０４を含有するレーンにおいては有意なバンドは検出されなかった（図３）。
また図４は、ＩＰ３Ｒ１に対して強い強度を示した１０の血清を示している。これらの血清には、Ｐ−ＳｊＳ患者４名及びＳ−ＳｊＳ患者６名からの血清が含まれた。大部分の血清は弱いながらもＥＬ、Ｔ６０４及びコアの全てに反応し、これらの共通のエピトープはコアタンパク質内に存在すると考えられた（図４）。
以上から、自己免疫疾患の種類によって、産生される自己抗体がＩＰ３Ｒタンパク質の異なるタイプ及び／又は異なるエピトープを認識することが示唆された。また、本実施例においては、３つのドメインについて比較的広範囲の領域を抗原として用いたが、抗体により認識されるエピトープは５〜６アミノ酸程度であることから、さらに狭い範囲の領域を抗原として用いることによって、特定のエピトープ領域と自己免疫疾患の種類との関係について詳細に解析できる可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、自己抗体検出用試薬が提供される。かかる試薬は、サンプル中の抗イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター（ＩＰ３Ｒ）抗体を簡便に検出することができ、サンプル中の自己抗体の検出に有効である。またかかる試薬を含むキットは、サンプル中の自己抗体を検出することによって自己免疫疾患を診断することができ、自己免疫疾患の早期診断・モニターに有効である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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