(57)【要約】タンパク質の分析に従来より用いられているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利用して、被検試料中のリン酸化ペプチド（タンパク質）を容易に検出するための方法、並びに当該方法に用いられる電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、その製造方法、およびその合成中間体を提供する。本発明方法で用いられる電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に下記式（Ｉ）で表される構造を有する。2007015312.tif 000027［式中、Ｍ２＋は遷移金属イオンを示し、Ｘはリンカー基を示す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
その構造中の少なくとも一部に下記式（Ｉ）で表される構造を有することを特徴とする電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
2007015312.tif 000024
［式中、Ｍ２＋は遷移金属イオンを示し、Ｘはリンカー基を示す。］
【請求項２】
Ｍ２＋が第４周期に属する遷移金属の２価陽イオンである請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
【請求項３】
Ｍ２＋がＭｎ２＋またはＺｎ２＋である請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを分離ゲルとして用いることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動方法。
【請求項５】
下記式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド化合物および／またはその遷移金属錯体をモノマーとして含むアクリルアミド混合溶液を重合させることを特徴とする電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法。
2007015312.tif 000025
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【請求項６】
下記式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド化合物。
2007015312.tif 000026
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法およびアクリルアミド化合物に関するものである。
【背景技術】  ある種の生体内酵素は、活性中心やアロステリック部位を代表とする特定部位にセリンやトレオニン、チロシン残基を有し、これらの水酸基が、キナーゼと呼ばれる酵素によりリン酸化されたり或いは脱リン酸化されることによって、酵素活性が調節されている。また、リシン、アルギニン、ヒスチジンのアミノ基或いはイミノ基や、アスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル基がリン酸化（または脱リン酸化）されることによって、活性が調節されている酵素もある。
この様なリン酸化−脱リン酸化により調節されている代謝系としては、グリコーゲンの合成とその分解系がよく知られている。この代謝系は、主としてリン酸化−脱リン酸化によりカスケード制御され、調節されている。
そして近年、このリン酸化−脱リン酸化が、疾病に関係する代謝系において重要な役割を有していることが明らかとなってきている。例えば細胞のガン化は、リン酸化−脱リン酸化の異常が一因であるといわれている。つまり、細胞周期の進行や停止は様々な酵素（タンパク質）のリン酸化（または脱リン酸化）により制御されており、このリン酸化（または脱リン酸化）にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）が関与しているが、斯かるメカニズムが損傷するとリン酸化（または脱リン酸化）に乱れが生じ、その結果、細胞の異常増殖が引発されることになる。
その他にも、プロテインキナーゼＣが、アトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の原因となる肥満細胞の脱顆粒に関与することや、アルツハイマー病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、リン酸化されたタウタンパク質によることが明らかにされている。
従って、タンパク質のリン酸化−脱リン酸化状況を把握することは、生体組織細胞の遺伝子発現の探索や酵素活性評価のみならず、疾病の診断や治療にも役立つ可能性がある。
ところが、従来より用いられてきたリン酸化タンパク質（または脱リン酸化タンパク質）の特定方法には様々な欠点がある。例えば酵素免疫法は、対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能という利点があるが、必要な抗体を充分量得ることが困難であり、また、対象タンパク質が数ｋＤａ以下である場合には、タンパク質中のリン酸化部位に結合する抗体を調製することができない。
また、放射性同位元素３２Ｐで標識されたリン酸を使用することによって、タンパク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、放射性同位元素の取扱いには当然に注意が必要であり、廃液の管理や処理まで要求される。
更に、リン酸化タンパク質と脱リン酸化タンパク質とでは電荷が異なることから、二次元電気泳動法の応用も考えられる。しかし、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうちアスパラギン酸やリシンなど側鎖に電荷を有するものは５種もあるため、タンパク質自体の電荷に対し、リン酸化或いは脱リン酸化されることによる電荷の変化が小さいことが考えられる。この様な場合、電荷に依存する電気泳動法では、リン酸化または脱リン酸化を検出することが困難になる。特に生体試料を分析する場合には、試料に多種類のタンパク質が含まれていることから、わずかなバンド位置変化のみでは検出できない。それに加え、スポット特定のために放射性同位元素を用いるとすれば、前述した問題が生じてくる。
ところで、国際公開第０３／０５３９３２号公報には、リン酸基に特異的で且つ高い配位能を有する化合物と、それを試料に添加してリン酸化ペプチドの電荷を変化させた上で電気泳動を行なうことによって、リン酸化ペプチドを特定する方法が開示されている。しかし、アクリルアミド構造が含まれる側鎖を有する化合物は記載されておらず、また、より鋭敏なリン酸化ペプチドの検出方法が求められている。
【発明の開示】
上述した状況の下、本発明が解決すべき課題は、タンパク質の分析に従来より用いられているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利用して、被検試料中のリン酸化ペプチド（タンパク質）を容易に検出するための方法、並びに当該方法に用いられる電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、その製造方法、およびその合成中間体を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、リン酸化ペプチドを他のペプチドから分離同定できる方法について鋭意研究を進めた。その結果、リン酸イオン或いはリン酸モノエステル中の２つの水酸基に対する配位結合能が極めて高い構造を有する本発明化合物を用いれば、多数のペプチドを含む被検試料の中からでもリン酸化ペプチドを特異的に検出できることを見出して、本発明を完成した。
即ち、本発明に係る電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に下記式（Ｉ）で表される構造を有することを特徴とする。
2007015312.tif 000002
［式中、Ｍ２＋は遷移金属イオンを示し、Ｘはリンカー基を示す。］
本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動方法は、上記電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを分離ゲルとして用いることを特徴とする。
また、本発明に係る電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法は、下記式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド化合物および／またはその遷移金属錯体をモノマーとして含むアクリルアミド混合溶液を重合させることを特徴とし、このアクリルアミド化合物（ＩＩ）は、当該製造方法で用いる合成中間体化合物として重要である。
2007015312.tif 000003
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【図面の簡単な説明】
【図１】分離ゲルとして、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（図１（１）、分離ゲルＡ）と従来のゲル（（図１（２）、分離ゲルＢ）を用い、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果である。当該ポリアクリルアミドゲルは、遷移金属イオンとしてＺｎ２＋を有する。
【図２】分離ゲルとして、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果である。（１）はα−カゼイン、（２）はβ−カゼイン、（３）は卵白アルブミンの結果であり、それぞれ０〜１５０の数字は本発明化合物の濃度（μＭ）を示し、各カラムにおいて左側はリン酸化型タンパク質の結果であり右側は脱リン酸化型の結果である。当該ポリアクリルアミドゲルは、遷移金属イオンとしてＭｎ２＋を有する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、先ず、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造する方法について説明する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で用いられる分離ゲルは、通常、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなるアクリルアミド混合物の水溶液と、ＳＤＳおよび過硫酸アンモニウムの水溶液、およびＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液を混合した後、更にＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）の水溶液を加え、気泡が入らないよう静かに混ぜたものをガラスプレート間に流し込み、静置して重合させることにより製造される。そして、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に下記式（Ｉ）で表される構造を有する点に要旨を有する。
2007015312.tif 000004
［式中、Ｍ２＋は遷移金属イオンを示し、Ｘはリンカー基を示す。］
上記式（Ｉ）において、Ｍ２＋の遷移金属イオンとしては、第４周期に属する遷移金属の２価陽イオンが好適である。例えば、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＺｎ２＋から適宜選択して用いることができる。より具体的には、Ｍｎ２＋またはＺｎ２＋が好ましい。アクリルアミド構造（Ｉ）中、これら遷移金属イオンが配位した錯体部分は、リン酸化タンパク質のリン酸基（リン酸モノエステル基）への配位能が極めて高いことによる。
「リンカー基」は、リン酸化ペプチドと相互作用する主要部分（以下、「フォスタグ」ということがある）とアクリルアミド部分とを結合する基であり、ポリアクリルアミド化合物の前駆体（モノマー）の製造を容易にしたり、また、フォスタグ部分の自由度を増すことによって、リン酸化ペプチドとの配位を容易にする作用を有する。
「リンカー基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えばＣ１−Ｃ６アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオニル基（−Ｃ（＝Ｓ）−）、エステル基、アミド基、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）、チオウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−）；および、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ１−Ｃ６アルキレン基を挙げることができる。
ここで「Ｃ１−Ｃ６アルキレン基」とは、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の２価脂肪族炭化水素基をいい、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、メチルエチレン、メチルプロピレン、ジメチルプロピレン等を挙げることができ、Ｃ１−Ｃ４アルキレン基が好ましく、Ｃ１−Ｃ２アルキレン基がより好ましい。
なお、アクリルアミド構造（Ｉ）では、本発明と同一の作用効果を享有するものとしてピリジン環にメチル基等の一般的な置換基を導入することも可能であるが、この様な均等物も本発明の範囲内に含まれるものとする。
また、本発明に係るアクリルアミド構造（Ｉ）におけるリンカー基の置換位置も特に限定されず、下記構造（Ｉ’）に示す位置に存在する場合もある。
2007015312.tif 000005
この構造（Ｉ’）と構造（Ｉ）は全く等価であり、いかなる位置に側鎖が存在するかは必ずしも明らかではないが、実際には両者の混合物であると考えられ、勿論、構造（Ｉ’）も本発明の範囲内に含まれる。
本発明では、ポリアクリルアミドゲルの少なくとも一部に構造（Ｉ）を存在せしめる必要があることから、分離ゲルを製造するに当たって、下記式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド化合物および／またはその遷移金属錯体を、モノマーとしてアクリルアミド混合溶液に添加する。
2007015312.tif 000006
［式中、Ｘは前述したリンカー基を示す。］
このアクリルアミド混合溶液に含まれるアクリルアミド化合物は、全てアクリルアミド化合物（ＩＩ）であってもよいが、好適には、従来より用いられているアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの混合物に、化合物（ＩＩ）および／またはその遷移金属錯体を添加することが好ましい。Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドには架橋作用があるからであり、また、化合物（ＩＩ）のみでは、嵩高いフォスタグ部分が重合を阻害することによりゲルが形成され難くなる場合があるからである。その一方で、ゲル中における構造（Ｉ）の割合が高いほどリン酸化ペプチドの移動距離は短くなり、その分離同定は容易になる。化合物（ＩＩ）の添加量は、用いる被験試料等に応じて、予備実験により最適なものを採用すればよく特に制限されないが、一般的には、アクリルアミドに対するモル比で１×１０−７〜１×１０−３程度（より好適には、１×１０−６〜１×１０−４程度）とすることが好ましい。
また、１個のフォスタグ部分には２個の遷移金属または遷移金属イオンが配位するため、遷移金属塩等の遷移金属化合物は、化合物（ＩＩ）に対して２倍モル当量以上添加する。遷移金属化合物の添加は、少なくともモノマーが重合してゲルが形成される前に行なう。重合した後では、遷移金属または遷移金属イオンが配位し難いからである。なお、遷移金属または遷移金属イオンが化合物（ＩＩ）に配位してから重合が起こるのか、重合した後に配位するかは明らかでないが、おそらく両方が同時に起こっていると考えられる。
遷移金属または遷移金属イオンを配位させるための遷移金属化合物としては、硝酸塩や酢酸塩などの遷移金属塩を好適に用いることができる。例えばＺｎ２＋を配位させる場合には硝酸亜鉛や酢酸亜鉛を使用すればよいが、酢酸亜鉛を添加する場合には、一旦、フォスタグ部分に酢酸が以下の様に配位した化合物が得られと考えられる。
2007015312.tif 000007
この構造は、構造（Ｉ）よりも安定であるが、構造（Ｉ）と等価なものであり、構造（Ｉ）と同様に用いることができる。即ち、電気泳動時には、リン酸モノエステル基が酢酸と交換的に配位して相互作用するため、リン酸化ペプチドを検出することができる。
本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に構造（Ｉ）を有し、複数の構造（Ｉ）が隣接することも考えられるが、アクリルアミド或いはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと隣り合って重合している可能性が高い。いかなる構造をとるかはアクリルアミド化合物（ＩＩ）の添加量などに依存するが、本発明では、その構造中の少なくとも一部に構造（Ｉ）を有すれば、その厳密な構造は特に問わないものとする。
本発明のアクリルアミド化合物（ＩＩ）は、スキーム１を含むことを特徴とする方法によって容易に製造することができるが、製造方法は、以下に示すものに制限されない。
［スキーム１］
2007015312.tif 000008
［式中、Ｘは前述したリンカー基を示す。］
上記スキーム１においては、カルボン酸とアミンとの一般的なアミド化反応を採用することができる。例えば、化合物（ＩＩＩ）とアクリル酸とをカルボジイミド化合物等の縮合剤の存在下で反応させるなど、公知方法を採用することができる。
スキーム１の反応で用いられる溶媒は、化合物（ＩＩＩ）等を適度に溶解できるものであれば特に制限されないが、例えば、塩化メチレンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素を使用できる。また、縮合剤も特に制限されないが、水溶性のカルボジイミドが後処理も容易であり便利である。
反応は、好ましくは室温で３０分から６時間程度行なえばよい。反応終了後は、例えば水と水に不溶性の有機溶媒との間で分配し、有機層を乾燥濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなど公知方法により精製すればよい。
上記スキーム１において、化合物（ＩＩＩ）は、以下のスキーム２により製造することができる。
［スキーム２］
2007015312.tif 000009
［式中、Ｒは−Ｘ−ＮＨ２基またはＸ−ＮＨ２基へ容易に変換可能な置換基を示す。また、“Ｈａｌ”はハロゲン原子を示し、好適には臭素原子を示す。］
原料化合物である化合物（ＩＶ）（１，３−ジアミノ−２−プロパノール）は、市販のものを使用することができる。また、化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩＩ）は比較的簡単な構造を有しているので、市販のものを用いるか、或いは当業者公知の方法により合成することができる。
スキーム２では、先ず、触媒の存在下に化合物（ＩＶ）と（Ｖ）を縮合反応させて化合物（ＶＩ）を得る。本反応は一段階ずつ化合物（Ｖ）を導入していってもよいが、３当量以上の化合物（Ｖ）を使用することによって一段階反応で化合物（ＶＩ）を得ることもできる。
スキーム２では、縮合反応として還元的アミノ化反応を行なっている。その場合に使用される溶媒は、化合物（ＩＶ）と（Ｖ）とを実質的に溶解でき、反応を阻害しないものであれば特に制限なく使用することができるが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；水；又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
還元的アミノ化反応では、先ず化合物（ＩＶ）と（Ｖ）を触媒としての濃塩酸存在下に縮合した後、一般的な還元試薬により還元することができる。
反応温度と反応時間は、原料化合物の種類等によって好適な条件を採用すればよいが、例えば２０〜８０℃で１２〜１００時間反応させる。反応終了後は、溶媒等を減圧留去した後に水を加え、非水溶性溶媒で抽出し、油相を無水硫酸マグネシウム等で乾燥した後に溶媒を減圧留去する。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知方法により精製して、化合物（ＩＶ）を得ることができる。
なお、化合物（ＶＩ）を得る方法はスキーム２で示した方法に限られず、例えば化合物（ＩＶ）とハロゲン化合物から合成してもよい。
次に、化合物（ＶＩＩ）を反応させることにより、化合物（ＩＩＩ’）を得ることができる。この反応は、一般的な三級アミンの合成反応を採用することができる。例えば、溶媒中塩基の存在下で縮合させる。また、当該ステップにおいては、Ｒの種類に応じて、適宜保護基の導入と脱保護を行なってもよい。或いは、化合物（ＶＩＩ）中Ｒの代わりに不活性置換基を有する化合物を用いて当該ステップを行なった後、官能基変換により当該不活性置換基をＲ２へ変換することにより化合物（ＩＩＩ’）を合成してもよい。例えば、不活性置換基としてニトロ基を有する化合物を使用し、当該ステップ後にニトロ基を反応性基であるアミノ基に変換してもよい。更に、例えばＸ基のフォスタグ側末端がアミド基やエステル基である場合には、Ｒ基としてメチルエステル基を有する化合物（ＶＩＩ）を用いて反応を行なった後、エステル交換反応を行なうことによりアクリルアミド化合物（ＩＩ）としてもよい。
本発明に係る方法に使用できるフォスタグ部分としては、下の構造を用いることもできる。
2007015312.tif 000010
［式中、Ｍ２＋とＸは前述したものと同義を示す。また、Ｒ１〜Ｒ３は、ピリジン環上の４または６位における電子供与性置換基を示す。］
上記フォスタグ部分においては、適切な置換位置に導入された電子供与性置換基によってピリジン窒素が電子リッチとなっているため、Ｍ２＋に対する配位性に優れており、結果的に製造が容易であり、また、安定性を有すると考えられる。
本発明の電気泳動方法の他のステップ等は、従来のものをそのまま利用できる。例えば、濃縮ゲルや電流のかけ方等は、一般的な方法を用いればよい。
従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、試料中のペプチドの電荷はＳＤＳにより打ち消されるため、各ペプチドの移動距離は分子量にのみ依存する。そして、ペプチド（タンパク質）の分子量は一般的な化合物に比してはるかに大きいことから、リン酸化されたのみでは電気泳動で検出できるほどに分子量の差は生じない。一方、本発明の電気泳動方法においては、試料中のリン酸化ペプチドは分離ゲル中のフォスタグ部分と相互作用しながら移動するため、その移動距離は明らかに小さくなる。従って、本発明の電気泳動方法による結果と従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果を比較すれば、リン酸化されているペプチドを容易に特定することが可能になる。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】  製造例１−１  ６−ブロモメチルニコチン酸メチル
2007015312.tif 000011
６−メチルニコチン酸メチル（５０ｇ、３３１ミリモル）の四塩化炭素（６２５ｍＬ）溶液にＮ−ブロモコハク酸イミド（５９ｇ、３３１ミリモル）を加えた。更に過酸化ベンゾイル（１．０ｇ）を添加後、投光器で光を照射しながら４０〜５０℃で２４時間反応させた。反応液を冷却後、析出した結晶を濾別し、濾液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、３７ｇの目的物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ３．９６（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），４．５８（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２Ｂｒ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ），８．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），９．１７（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ）
製造例１−２  Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−１，３−ジアミノプロパン−２−オール
2007015312.tif 000012
１，３−ジアミノプロパン−２−オール（３２．６ｇ、３６２ミリモル）のメタノール（２４００ｍＬ）溶液に濃塩酸（６０ｍＬ）を加え、更に２−ピリジンアルデヒド（１１６．３ｇ、１．０９ミリモル）を滴下した後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（５０．１６ｇ、７９８ミリモル）を添加した。添加終了後、室温で３日間反応させた。反応液に濃塩酸を加えてｐＨ６に調整した後、ある程度濃縮し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７に調整し、クロロホルムで抽出した。当該クロロホルム層を集め、乾燥した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、３４ｇの目的物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ２．５９−２．８３（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．８６−４．０１（７Ｈ，ｍ，ＮＣＨ２Ｐｙ，ＣＨ），７．１５（３Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），７．２３−７．３２（３Ｈ，ｍ，Ｐｙ），７．５６−７．６５（３Ｈ，ｍ，Ｐｙ），８．５３（３Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ）
製造例１−３  Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−Ｎ’−（５−メトキシカルボニル−２−ピリジルメチル）−１，３−ジアミノプロパン−２−オール
2007015312.tif 000013
製造例１−２で得たＮ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−１，３−ジアミノプロパン−２−オール（１８．２ｇ、５０ミリモル）の乾燥ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１３．８ｇ、１００ミリモル）を加え、製造例１−１で得た６−ブロモメチルニコチン酸メチル（１１．５ｇ、５０ミリモル）の乾燥ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）溶液を滴下し、滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、溶液を冷却した後、７５０ｍＬの水に投入して１Ｎ塩酸でｐＨ８に調整した。酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層を集め、水，飽和食塩水で洗浄した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、２１．５ｇの目的物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ２．５８−２．７３（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．８３−３．９５（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ３，ＮＣＨ２Ｐｙ，ＣＨ），７．１０−７．１４（３Ｈ，ｍ，Ｐｙ），７．３４（３Ｈ，ｄ，Ｐｙ），７．５０−４．６０（４Ｈ，ｍ，Ｐｙ），８．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），８．５０（３Ｈ，ｄ，Ｐｙ），９．０９（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ）
製造例１−４  Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−Ｎ’−［５−Ｎ’’−（２−アミノエチル）カルバモイル−２−ピリジルメチル］−１，３−ジアミノプロパン−２−オール
2007015312.tif 000014
製造例１−３で得たＮ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−Ｎ’−（５−メトキシカルボニル−２−ピリジルメチル）−１，３−ジアミノプロパン−２−オール（９．７ｇ、１８．９ミリモル）のメタノール（１００ｍＬ）溶液にエチレンジアミン（２２．７ｇ、３７８ミリモル）を滴下し、滴下後、室温で３日間反応させた。反応後、溶液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して９．７２ｇの目的物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ２．５４−２．７１（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），２．９４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２Ｎ），３．４９（２Ｈ，ｄｔ，ＣＨ２Ｎ），３．８０−３．９９（９Ｈ，ｍ，ＮＣＨ２Ｐｙ，ＣＨ），７．１２（３Ｈ，ｄｄｄ，Ｐｙ），７．３５（３Ｈ，ｄ，Ｐｙ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ），７．５８（３Ｈ，ｄｄｄ，Ｐｙ），８．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），８．４９（３Ｈ，ｄｄｄ，Ｐｙ），８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ）
製造例１−５  アクリルアミド化合物
2007015312.tif 000015
製造例１−４で得たＮ，Ｎ，Ｎ’−トリ（２−ピリジルメチル）−Ｎ’−［５−Ｎ’’−（２−アミノエチル）カルバモイル−２−ピリジルメチル］−１，３−ジアミノプロパン−２−オール（２２０ｍｇ、０．３７ミリモル）とヒドロキノンモノメチルエーテル（０．３５ｍｇ）との塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液に、アクリル酸（３５．３ｍｇ、４９ミリモル）を添加し、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（９３．５ｍｇ、４９ミリモル）を添加し、室温で７５分間反応させた。反応終了後、反応液に水を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を合わせて濃縮して得られた粗製品をカラムクロマトグラフィーで精製し、２３７ｍｇの目的物を得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ２．６０−２．６６（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．６２（４Ｈ，ｂｓ，ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ），３．７８−３．９１（９Ｈ，ｍ，ＮＣＨ２Ｐｙ，ＣＨ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ＝ＣＨ２），６．１１（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ＝ＣＨ２），６．３０（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ＝ＣＨ２），６．７２（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨＣＯ），７．１２（３Ｈ，ｄｄｄ，Ｐｙ），７．３５（３Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ），７．５８（３Ｈ，ｄｄｄ，Ｐｙ），７．８２（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨＣＯ），８．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），８．４９（３Ｈ，ｄｄ，Ｐｙ），８．９０（１Ｈ，ｄ，Ｐｙ）
製造例１−６  電気泳動用ゲルの作成
上記製造例１−５で得たアクリルアミド化合物を用い、表１の組成に従って、分離ゲルを作成した。また、表１の組成で濃縮ゲルを作成した。なお、各溶液の溶媒は、蒸留水または再蒸留水である。
【表１】
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表１の分離ゲル組成のうちＴＥＭＥＤ以外の試薬を５０ｍＬのプラスチック遠心チューブに入れ、溶液が均一になるまで室温で穏やかに混ぜた。この際、気泡ができないよう十分に注意を払った。次に、マイクロピペッターのチップの先端を分離ゲル溶液に浸ける様にしながらＴＥＭＥＤを加え、すぐに室温で混合した。この際にも気泡ができないよう十分に注意を払った。
別途、アトー社製のゲル作製キット（ＡＥ−６４０１型ミニスラブゲル作製キット）を用いて、ミニスラブゲルプレート（内部厚さ：１ｍｍ，内部幅：９０ｍｍ）を組み立てた。このゲルプレートへ、上記分離ゲルを、気泡が入らないように高さ７０ｍｍまで注ぎ入れた。この際、実験台にゲルプレートを立てて、分離ゲル上面が水平になっていることを確認した。
次に、マイクロピペッターを用いて、蒸留水を分離ゲル上面に静かに重層した。重層する蒸留水の量は、分離ゲル上面から約１ｃｍの高さを目安にした。そのまま室温で１時間静置して、分離ゲルを硬化させた。以下、この分離ゲルを「分離ゲルＡ」という。分離ゲルの硬化を確認し、重層した蒸留水を除去した後、濃縮ゲルの準備をした。
表１の組成に従って、分離ゲル溶液の調製と同様の方法により濃縮ゲル溶液を調製し、上記分離ゲルの上に注ぎ入れた。次いで、サンプル充填用のウェルを形成するためのミニコウムを差込み、そのまま室温で１時間静置することによって、濃縮ゲルを硬化させた。
濃縮ゲルの硬化を確認した後、ミニコウムをゆっくり抜き取った。その結果できたサンプル充填用のウェルに、表２の組成を有する泳動用バッファーを、マイクロピペッターで満たした。この泳動用バッファーを除去し、再度同様の処理を行なってウェルを洗浄した。ウェル洗浄後、ミニスラブゲルプレートからシールガスケットを取り外して、ゲルプレートを完成させた。
【表２】
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また、比較対照のために、表１のうち製造例１−５のアクリルアミド化合物と酢酸亜鉛を添加しない以外は同様の組成で分離ゲルを作製した。以下、このフォスタグを含まない分離ゲルを「分離ゲルＢ」という。
試験例１
表３の組成で、サンプル調製用バッファーを調製した。
【表３】
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別途、リン酸化型タンパク質であるαＳ１−カゼイン（Ｍ．Ｗ．２４，０００）とβ−カゼイン（Ｍ．Ｗ．２５，０００）と卵白アルブミン（Ｍ．Ｗ．４５，０００）（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、３．３ユニットのアルカリフォスファターゼを用いて、３７℃で１２時間処理することにより脱リン酸化した。表４に示す各タンパク質のうち、サンプルＮｏ．１、３、５は１μＬのサンプル調製用バッファーに、サンプルＮｏ．２、４、６、７は３μＬのバッファーに溶解し、サンプルとした。なお、牛血清アルブミンは宝酒造製で分子量は６６，０００、分子量マーカーはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＰｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓである。
【表４】
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上記製造例１−５で作製したゲルプレートを、アトー社製のＡＥ−６５００型ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置にセットし、各タンパク質サンプルをウェルにチャージした。但し、分子量マーカーは、サンプル調製用バッファーを加えずそのままチャージした。Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ製のｉＭｙＲｕｎ型パワーサプライを用いて、フォスタグを含む分離ゲルＡでは２０ｍＡで９０分間、従来の分離ゲルＢでは４０ｍＡで４５分間電気泳動を行なった。
電気泳動後、ゲルを外し、染色液（３．０ｍＭクマジーブリリアントブルーＲ−２５０＋４５％（ｖ／ｖ）メタノール＋１．２％（ｖ／ｖ）酢酸）に室温で一晩浸漬して染色した。次いで、脱色液（２５％（ｖ／ｖ）メタノール＋１０％（ｖ／ｖ）酢酸）に室温で５時間浸漬し、脱色した。得られたゲルの写真を、図１として示す。
当該結果によれば、従来ゲル（分離ゲルＢ）を用いた場合には、同一のタンパク質においてはリン酸化型のものと脱リン酸化型のもののバンドは、同じ位置にある。一方、本発明のゲル（分離ゲルＡ）を用いて電気泳動を行なった場合には、リン酸化されたタンパク質（サンプルＮｏ．１、３、５）は、脱リン酸化された同一のタンパク質（サンプルＮｏ．２、４、６）に対して、明らかにバンド移動距離が小さくなっている。従って、本発明に係る電気泳動用ゲルを用いれば、リン酸化或いは脱リン酸化されたタンパク質を容易に特定できることが実証された。
製造例２  電気泳動用ゲルの作成
上記製造例１−５で得たアクリルアミド化合物を用い、表５の組成とする以外は上記製造例１−６と同様にして分離ゲルを作成した。なお、ＭｎＣｌ２の添加量はアクリルアミド化合物に対して２当量である。
【表５】
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また、表６の組成を有する泳動用バッファーを別途調製し、当該泳動用バッファーを用いて上記製造例１−６と同様にしてゲルプレートを作成した。
【表６】
2007015312.tif 000021
試験例２
表７の組成で、サンプル調製用バッファーを調製した。
【表７】
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当該サンプル調製用バッファー３．０μＬへ、表８のタンパク質の０．３μｇ／Ｌ水溶液１．０μＬと蒸留水６．０μＬを混合してサンプルとした。なお、分子量マーカーはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＰｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓである。
【表８】
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製造例２で作製したゲルプレートを使用して上記試験例１と同様の条件で上記サンプルＮｏ．９〜１４につき電気泳動を行ない、その後染色した。得られたゲルの写真を、図２として示す。図２中、（１）はα−カゼイン、（２）はβ−カゼイン、（３）は卵白アルブミンの結果であり、それぞれ０〜１５０の数字は本発明化合物の濃度（μＭ）を示し、各カラムにおいて左側はリン酸化型タンパク質の結果であり右側は脱リン酸化型の結果である。
当該結果の通り、脱リン酸化型タンパク質を電気泳動した場合であっても、ゲルにおける本発明のアクリルアミド化合物濃度が高くなるにつれＲｆ値は小さくなる。しかし、リン酸化型タンパク質のＲｆ値は脱リン酸化型タンパク質のＲｆ値よりも明らかに小さくなっている。従って、本発明に係る電気泳動用ゲルを用いれば、遷移金属イオンとしてＺｎ２＋を用いる場合のみならずＭｎ２＋を用いても、リン酸化或いは脱リン酸化されたタンパク質を容易に特定できることが実証された。
【産業上の利用可能性】  本発明に係る電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なえば、通常のゲルを使用した場合に比べ、リン酸化ペプチド（タンパク質）のバンドの移動距離は明らかに短くなる。従って、生体試料など多種多様な化合物が含まれている被検試料であっても、リン酸化ペプチド（タンパク質）の有無を容易に判断することができることから、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルと電気泳動方法は、病気の診断等に応用でき得る点で非常に有用である。
また、本発明の製造方法とその合成中間体であるアクリルアミド化合物は、この様な電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造に用いることができるものとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月3日(2007.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その構造中の少なくとも一部に下記式（Ｉ）で表される構造を有することを特徴とする電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
【化１】
2007015312.tif 000030
［式中、Ｍ2+は遷移金属イオン（ただし、Ｚｎ2+を除く）を示し、Ｘはリンカー基を示す。］
【請求項２】
Ｍ2+が第４周期に属する遷移金属の２価陽イオン（ただし、Ｚｎ2+を除く）である請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
【請求項３】
Ｍ2+がＭｎ2+である請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを分離ゲルとして用いることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動方法。
【請求項５】
下記式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド化合物の遷移金属錯体（ただし、亜鉛錯体を除く）をモノマーとして含むアクリルアミド混合溶液を重合させることを特徴とする電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法。
【化２】
2007015312.tif 000031
［式中、Ｘはリンカー基を示す。］
【国際調査報告】
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2007015312.tif 000033
2007015312.tif 000034
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