(57)【要約】  本被検体評価装置は、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、被検体を配置するための担体と、蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、担体を挟んで、光照射装置と蛍光検出装置とが互いに反対側にあり、光照射装置から照射された光を蛍光検出装置のある側に透過させることができ、透過光が蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、透過光により被検体から蛍光を発光させることができるようになっている。本装置を使用すれば、蛍光観察によりタンパク質等の被検体を評価する場合に、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できるようになる。
2007135741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備えた、被検体評価装置において、
当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にあり、
当該光照射装置から照射された光を当該蛍光検出装置のある側に透過させることができ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させることができるようになっている
被検体評価装置。
【請求項２】
前記担体に前記被検体が付着することができる、請求項１に記載の被検体評価装置。
【請求項３】
前記担体が表面に金からなる層を有する、付記１または２に記載の被検体評価装置。
【請求項４】
前記被検体が蛍光標識部を備え、
外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るようになっている、
請求項１〜３のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項５】
前記外部からの作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響からなる群から選ばれた少なくとも一つである、請求項４に記載の被検体評価装置。
【請求項６】
前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影響が実現される、請求項５に記載の被検体評価装置。
【請求項７】
前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項８】
前記評価対象がタンパク質である、請求項７に記載の被検体評価装置。
【請求項９】
前記光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能である、請求項１〜８のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項１０】
前記光照射装置からの照射がエバネッセント光が発生しない条件で行われ得る、請求項１〜９のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項１１】
被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にある被検体評価装置を用い、
当該光照射装置から照射された光を、当該蛍光検出装置のある側に透過させ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させる
ことを含む被検体評価方法。
【請求項１２】
前記担体に前記被検体が付着させる、請求項１１に記載の被検体評価方法。
【請求項１３】
前記担体が表面に金からなる層を有する、請求項１１または１２に記載の被検体評価方法。
【請求項１４】
前記被検体が蛍光標識部を備え、
外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るようになっている、
請求項１１〜１３のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項１５】
前記外部からの作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響からなる群から選ばれた少なくとも一つである、請求項１４に記載の被検体評価方法。
【請求項１６】
前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影響が実現される、請求項１５に記載の被検体評価方法。
【請求項１７】
前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものを含む、請求項１１〜１６のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項１８】
前記評価対象がタンパク質である、請求項１７に記載の被検体評価方法。
【請求項１９】
前記光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整することを含む、請求項１１〜１８のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項２０】
前記光照射装置からの照射がエバネッセント光が発生しない条件で行われる、請求項１１〜１９のいずれかに記載の被検体評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察によりタンパク質等の被検体を評価する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム解析研究の急速な進展によって得られる塩基配列、遺伝子発現情報、およびたんぱく質などに関するゲノム情報を利用して、効率的に医薬品の開発を行う、いわゆるゲノム創薬が進められている。ゲノム創薬ではゲノム情報をもとに、病気に関係する遺伝子を探し出し、その解析から発病のメカニズムを解明すると共に、治療に最も有効なたんぱく質等の標的分子を決定する。そのうえで、この標的分子に対して薬効のある医薬品候補化合物の設計、合成等を行う。このようなプロセスにおいて、タンパク質等の標的分子を容易に検出可能な装置の重要性が高まっている。【０００３】
タンパク質を簡便に測定できる技術は、プロテオーム解析技術として発展途上にある。現在確立されている方法として、二次元電気泳動と質量分析機の組み合わせで測定が行われているが、これには比較的大がかりな装置が必要になる。従って、臨床の現場、たとえば病院の検査室やベッドサイドで患者の症状を把握するためにはあらたな技術の開発が必要とされている。【０００４】
一方、より簡単にタンパク質を解析できる技術としては、ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（μ−ＴＡＳ）やＬａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれるものが知られている。これは、数センチメートル角のガラスやシリコンの基板にマイクロメートルサイズの溝（マイクロチャネル）を加工して微細な装置となし、その中で化学分析や反応を行うものである。液体や気体のサンプルを微細な流路（数百μｍ〜数μｍ幅、数百μｍ〜数μｍ深）の中に流すため、試料・廃棄物量の低減、高速処理等の利点をもたらし、更に化学プラントさえも小型化できる可能性があり、この技術のバイオ分野への応用が期待されている。なお、μ−ＴＡＳは、「集積化化学分析システム」、「マイクロ化学・生化学分析システム」等と訳され、センサ、分析装置等を小型化した化学分析システムであり、分析化学実験室で使用される機器の機能をチップ上に集約させたものである。【０００５】
中でも、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイ）に代表されるバイオチップの技術は、遺伝子解析に有効な手段として注目されている。バイオチップとは、ガラス、シリコン、プラスチック等からなる基板の表面上に、ＤＮＡ、タンパク質等の生体高分子からなる多数の異なった被検体を高密度に整列化してスポットしたもので、臨床診断や薬品治療等の分野で、核酸やタンパク質の試験を簡素化できるのが特徴である（たとえば特許文献１、非特許文献１参照）。【０００６】
このような研究、開発においては、何らかの手段によりタンパク質に蛍光色素等の蛍光標識部を導入し、光の照射によりこの蛍光標識部から蛍光を発光させる被検体評価技術が多用されている。このような目的のためには、エバネッセント光の反射率角度分布を測定することで、タンパク質−タンパク質の相互作用を解析する装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社のＢｉａｃｏｒｅ  ３０００等）が市販されており、プロテオーム解析に貢献している。また、細胞表面に導入された蛍光色素を観測することで、物質代謝の様子と薬品が各器官へ到達する様子等を観測するエバネッセント顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社のＢＸ２ＷＩ−ＴＩＲＦＭ等）が市販されている。【０００７】
これらの装置は、発生させたエバネッセント光で蛍光色素を励起し、その蛍光を検出するために、全反射照明光学系を採用していることに特徴がある。すなわち、タンパク質または細胞等の試料は、透明基板または金属薄膜電極の表側表面に固定され、裏面から全反射条件を満たすように励起光が入射される。【０００８】
このような光学配置では、励起光学系を基板裏側に、蛍光観察光学系を基板表側に配置することが可能となり、基板表側の作業空間を大きく取ることができる。
【特許文献１】特開２００１−２３５４６８号公報（段落番号０００２〜０００９）
【特許文献２】特開２００５−２８３５６０号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】「ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｔｙ）」，１９９７年，第１１９巻，ｐ．８９１６−８９２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来のエバネッセント光を用いた測定装置には、以下の問題があった。【００１０】
その一つは、透明基板や金属薄膜電極の表面に発生させたエバネッセント光の強度は、表面から離れるに従って指数関数的に減衰し、１波長の長さ（約数百ｎｍ）程度に離れると、極めて弱い強度になる。このため、細胞表面に導入された蛍光色素しか励起することができず、細胞内部（基板表面から数百μｍ）に導入された蛍光色素を励起し、物質代謝の様子や薬品が各器官へ浸透される様子等を観測することはできないという問題である。【００１１】
他の一つは、基板を金属薄膜電極として使用し、この電極に電位を印加した場合に、表面に発生させたエバネッセント光の強度がその電極に印加する電位によって変動するという欠点である。このため、ヌクレオチドプローブ法を用いたタンパク質検出センサへの適用は不可能であった。【００１２】
ヌクレオチドプローブ法とは、例えば特許文献２に示されるように、金電極に帯電性ポリマーを介して結合させた付着した抗体等の被検体が電位の印加により電極に引きつけられ、印加を停止すると電極から離れる性質（あるいはその逆の性質）を利用した技術である。この技術によれば、帯電性ポリマーに蛍光標識部を持たせた場合には、電位のオンオフにより、蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得、蛍光標識部を励起できる光が存在する場合には、たとえば、電位がオフのときには、蛍光標識部が蛍光を発光し、電位がオンのときには、蛍光標識部が消光（クエンチング）するので、電位のオンオフの周期を低い方から高い方に掃引させると、もはや蛍光の発光と消光とを繰り返さなくなる条件（カットオフ条件）を見出すことができる。このカットオフ条件は、被検体の分子量等の大きさに依存して特有な値を示す。たとえば、抗体のみであれば、カットオフ条件が２ｋＨｚであったものが、タンパク質が結合した抗体では５００Ｈｚになる。そこで、帯電性ポリマーに結合させた抗体等に特異的にタンパク質等を結合させ、カットオフ条件の変化を利用して、タンパク質等がこの抗体等に結合したことを見出すことにより、この抗体等に特異的に結合するタンパク質の存在を見出したり、蛍光の強さから結合したタンパク質の量を評価したりすることが可能となる。しかしながら、エバネッセント光を利用すると、その強度がその電極に印加する電位によって変動するため、上記評価が不可能となるのである。【００１３】
これらの問題を解決する手段としては、透明基板や金属薄膜電極の表側から励起光を入射し、同じ表側に蛍光観察光学系を組み込む光学系が知られているが、励起光学系と蛍光観察光学系とが、共に表側の空間を占有することになり、作業空間を大きく取ることができなくなる。具体的には励起光学系の照射用ファイバースコープおよびその付属部品、蛍光観察光学系の対物レンズ、ファイバースコープおよびその付属部品、ヌクレオチドプローブ法に用いる参照電極、印加電極、対向電極およびその付属部品、被検体を取り扱う微細流路およびその付属部品（ポート、チューブ等）を同一空間に配する必要が出てくる。このため、たとえば、ヌクレオチドプローブ法と微細流とを組み合わせることができず、高感度、かつ、再現性の高いタンパク質検出センサを製作できなくなる問題があった。【００１４】
本発明はこれらの問題を解決し、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価が可能で、担体に電位を印加した場合にもその影響がなく、かつ、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できる被検体評価技術を提供することを目的としている。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備えた、被検体評価装置において、
当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にあり、
当該光照射装置から照射された光を当該蛍光検出装置のある側に透過させることができ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させることができるようになっている
被検体評価装置が提供される。【００１６】
本発明の他の一態様によれば、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にある被検体評価装置を用い、
当該光照射装置から照射された光を、当該蛍光検出装置のある側に透過させ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させる
ことを含む被検体評価方法が提供される。【００１７】
これらの態様により、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価が可能で、担体に電位を印加した場合にもその影響がなく、かつ、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できる被検体評価技術を提供することができる。【００１８】
いずれの態様においても、前記担体に前記被検体が付着することができること（または付着すること）、前記担体が表面に金からなる層を有すること、前記被検体が蛍光標識部を備え、外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るようになっていること、前記外部からの作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響からなる群から選ばれた少なくとも一つであること、前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影響が実現されること、前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものを含むこと、前記評価対象がタンパク質であること、前記光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、前記蛍光検出装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であること（または調整されること）、および、前記光照射装置からの照射がエバネッセント光が発生しない条件で行われ得ること（または行われること）、が好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価が可能で、担体に電位を印加した場合にもその影響がなく、かつ、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できる被検体評価技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る被検体評価装置の模式的側面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。【００２２】
本発明に係る被検体評価装置は、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、被検体を配置するための担体と、蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、光照射装置から照射された光が担体を透過して、蛍光観察光学系側である蛍光検出装置のある側に至るようになっている。【００２３】
光照射装置と蛍光検出装置とは、担体を挟んで、互いに反対側にある。担体の下側に光照射装置があり、上側に蛍光検出装置がある場合が好ましいが、光照射装置と蛍光検出装置とが担体を挟んで互いに反対側にあれば、その他のどのような配置でもよい。【００２４】
なお、本発明において、「評価」とは被検体の有無、被検体の種類、被検体の量、被検体の存在場所、電磁的影響、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対する被検体の挙動等を定性的または定量的に把握することを意味する。【００２５】
従来の被検体評価装置に使用する担体は光を透過させることができず、その構造も複雑であることから光を透過できるようにすることができるとは思いもよらず、したがって、透過光を励起光として使用すると言う考え方は、これまで知られていなかった。【００２６】
しかしながら、発想を転換して、もし透過光を励起光として使用できれば、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保でき、様々な利益を得ることができるという観点から検討した結果、たとえ複雑な構造の担体でも、膜厚を薄くすれば、担体としての機能を維持しつつ、十分な光を透過させ得ることが見出された。このようになっていれば、その際、この透過光が、蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしておきさえすれば、この透過光が被検体を励起して蛍光を発光させたときに、この透過光に邪魔されることなく蛍光を検出することが可能となる。なお、このとき、光照射装置からの照射がエバネッセント光を発生させる場合もあり得る。そのような場合でも被検体の評価に差し支えない限り問題はないが、上記のヌクレオチドプローブ法を採用する場合等では、エバネッセント光を発生させない条件を選択できることが好ましい。【００２７】
上記のようにすれば、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保することが可能となる。作業スペースが大きく取れることで、たとえば、ヌクレオチドプローブ法と微細流路を組み合わせることが可能となる、具体的には、微細流路を採用できることにより、タンパク質の検出に要する時間を従来の約１／１００に短くできた。また、ヌクレオチドプローブ法で、金電極に固定化する過程から、タンパク質検出の過程までを、微細流路中で連続的に行えるようになる。タンパク質検出の再現性が向上し、かつ、必要な試薬量が従来の約１／１０になることが見出された。【００２８】
しかも、透過した励起光は、その後基板からの距離に依存して減衰することがなく、基板表面からの距離によらず一定であるため、被検体が担体から遠い距離にあっても蛍光を発光させることが可能となる。たとえば、細胞内部に導入された蛍光色素を励起し、物質代謝の様子と薬品が各器官へ浸透される様子等を観測することが可能となる。したがって、狙った器官に運搬されるように設計した薬が、実際に運搬されるかどうか検証できるようになり、薬品開発のコストが大幅に減少することが期待される。【００２９】
また、エバネッセント光の場合には、基板を金属薄膜電極として使用し、この電極に電位を印加した場合、印加電位によって、エバネッセント光強度が変動するという欠点があるが、本発明ではこの問題も解消する。具体的効果としては、このことと作業スペースが大きく取れることとで、アレイ型に配置した電極に固定されたヌクレオチドプローブのスイッチングを、マルチチャンネル検出器（たとえば、ＣＣＤ）で観測することが可能となり、これにより、１０〜１００種類のタンパク質の同時検出が可能となった。【００３０】
更に、エバネッセント光強度は、媒質の屈折率が変化すると変動する欠点があり、たとえば粘性の高い溶媒中のタンパク質−タンパク質相互作用解析は困難であったが、透過励起光の強度は屈折率変化の影響を受けないため、このような検討も可能となる。【００３１】
蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにするには、担体面に対する透過光の入射角度と、光照射装置と蛍光検出装置との相対的位置を適宜選択する。「蛍光検出部を直接照射しない」とは、光照射装置から照射された光が他の物体で反射され、間接光として蛍光検出部を照射することはあり得ることを意味する。この間接光も少ない方がよいことは言うまでもない。一般的には、蛍光検出部を照射する透過光の量が少なければ少ないほど、要求される被検体評価におけるバックグラウンドノイズを低く抑えられる。【００３２】
光照射装置から照射された光が担体を透過して蛍光検出装置のある側に至ることができるためには、担体が光照射装置から照射された光を透過することが必要であるが、光照射装置から照射された光が担体を透過して蛍光検出装置のある側に至るときに通過すべき物体、たとえば、担体を収納する容器があればその容器も光照射装置から照射された光を透過することが必要であることは言うまでもない。【００３３】
光照射装置から照射された光に対する蛍光検出装置のある側の透過光の割合である透過率については特に制限はないが、実用上は少なくとも２０％であることが好ましい。２０〜３０％の間であれば十分である。励起光としては、通常５００μＷ／３ｍｍ２のエネルギー密度があれば十分である。このことは、透過率が２０〜３０％の場合、光照射装置からの照射光のエネルギーとしては、１．７〜２．５ｍＷ／ｍｍ２でよいことを意味する。この程度のエネルギーであれば、ポータブル型の固体レーザーが使用できるので便利である。【００３４】
本発明における担体に用いる材料としては、被検体を配置することができ、所望の被検体の評価に使用できるものであればどのようなものでもよく、任意のものから選択することができる。例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属等を使用できる。タンパク質等を付着させる目的からは、公知の金属（金、プラチナ、チタン等）やセラミックス（サファイア等）を含むものを利用することが好ましい。この中でも、金が特に好ましい。生体高分子を被検体として使用する場合に、担体への付着が容易に行えるからである。【００３５】
その場合、担体として使用する材料の膜厚に留意する必要がある。たとえば、サファイア板の上に金の膜を設けて担体とする場合、金はサファイアとの接着性に欠けるため、まずサファイア板の上にチタンの層を密着層として設け、その上に、担体作製中の加熱によりチタン層が金の層まで移動するのを防止するためのプラチナからなるバリア層を設け、その上に金の層を設ける等の対策が必要となるので、これら材料全ての膜厚を適切に決めることが重要となる。たとえば、サファイア板の膜厚が３５０μｍ、チタンの膜厚が５ｎｍ、プラチナの膜厚が５〜１０ｎｍ、金の膜厚が２０〜２５ｎｍといった構成であれば上記透過率を２０〜３０％とすることが可能である。【００３６】
この担体は、形状も、容器、板等任意に選択できる。被検体が液状で与えられる場合には、担体そのものが容器であっても、容器の一部であっても、容器の中に入れられたものであってもよい。層状の場合は、単層でも複数の層からなっていてもよい。【００３７】
担体は、被検体が付着することができると、流路を通して被検体を含む液体を担体上に通して、被検体を担体に付着させ、評価することが可能となるため、好ましい場合が多い。【００３８】
この場合の、「付着」は、物理的、化学的、生物的付着等どのような付着でもよい。共有結合、配位結合のような化学的結合の他、生物学的結合、静電気的結合、物理吸着、化学吸着等、本発明の趣旨に反しない限りどのような付着を利用することもできる。【００３９】
この目的のためには、担体の表面に被検体と結合し得る構造部分（被検体結合部）を設けることも有用である。たとえば金の上にチオール基等のヌクレオチド類と結合し得る基を被検体結合部として設けることもできる。また、後述する外部からの作用として電磁的影響を利用する場合、担体の全部または一部を電極として使用するのが合理的である。導電性の物質そのものを担体とする場合やガラス、セラミックス、プラスチック、金属等の表面に導電性の物質の層を設けることが考えられる。このような導電性の物質としては、単金属、合金、それらの積層体等どのようなものでもよい。金に代表される貴金属は化学的に安定であり、好ましく使用できる。【００４０】
本発明における被検体を励起して蛍光を発光させる励起光を照射するための光照射装置や蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置としては公知のどのようなものを採用してもよいが、微小な領域に適用することになるので、１本または２本以上の光ファイバーを使用することが有利である場合が多い。光ファイバーの内径（直径）としては１μｍ〜１０ｍｍ程度のものを使用することができる。励起光として使用する光源にも制限はないが、一般的には可視光が好適である。【００４１】
上記光照射装置、蛍光検出装置、担体等の機能については、光照射装置の、光照射角度、光照射強度および光照射面積、蛍光検出装置の蛍光検出角度および蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、ならびに、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であることが好ましい。これらの因子が調整可能であれば、被検体評価における検出感度を上げたり、被検体の挙動の差から、被検体の種類や、その量を推定したりすることが可能になる場合がある。また、蛍光観察下に各種の実験を行うことが容易になる。【００４２】
本発明における被検体は評価の目的に応じて適宜選択すればよい。被検体そのものが蛍光を発してもよいが、蛍光標識部を持った物質であってもよい。具体例としては、たんぱく質に含まれる色素であるヘム、アミノ酸であるトリプトファンやチロシンや、蛍光標識部を備えた、薬品、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つを挙げることができる。また、これらのものを含むものでもよい。例えば、細胞中の蛍光標識された薬品の場合のように、他の物体の一部である場合には、その薬品を被検体と考えればよいが、場合によってはその物体を被検体と考えてもよい。【００４３】
ここで、本発明において「ヌクレオチド体」とは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドよりなる群のいずれか一つまたはその混合物を意味する。このような物質は、マイナスに帯電していることが多い。１本鎖あるいは２本鎖を用いることができる。ハイブリダイゼーションすることにより被検体と特異的に結合することもできる。なお、蛋白質、ＤＮＡ、ヌクレオチド体が混在していてもよい。また、生体高分子には、生体に由来するものの他、生体に由来するものを加工したもの、合成された分子も含まれる。【００４４】
ここで、上記「産物」とは、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られるものであり、本発明の趣旨に合致する限り、抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ’）2フラグメントや抗体のＦａｂ’フラグメントに由来する断片、さらにはその誘導体等どのようなものを含めることもできる。【００４５】
抗体としては、たとえば、モノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧ抗体を使用することができる。また、ＩｇＧ抗体に由来する断片として、たとえばＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ’）2フラグメントを使用することもできる。更に、そのようなＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ’）2フラグメントに由来する断片などを使用することもできる。蛋白質に対して親和性を有する有機化合物として使用可能な例を挙げると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）等の酵素基質アナログや酵素活性阻害剤、神経伝達阻害剤（アンタゴニスト）などがある。蛋白質に対して親和性を有する生体高分子の例としては、蛋白質の基質または触媒となる蛋白質、分子複合体を構成する要素蛋白質同士等を挙げることができる。【００４６】
上記抗体薬品としては、「アクテムラ(R)（一般名：トシリズ マブ）（中外製薬株式会社）」を例示することができる。上記の中では、実用上タンパク質を被検体とするものが重要であり、好ましい。【００４７】
上記蛍光標識部としては、公知のものを利用できる。本発明で蛍光標識部として好適に使用できるものの例を挙げると、インドカルボシアニン３（商標Ｃｙ３）などである。被検体に蛍光標識部を備えさせる方法は、公知の任意の方法から選択することができる。例えば、化学反応によって導入する方法や、１本鎖ヌクレオチドから２本鎖ヌクレオチドを形成させる反応を利用することができる。後者の例としては、蛍光標識部を３’末端または５’末端に導入したオリゴヌクレオチド鎖を例示できる。【００４８】
本発明に係る被検体評価装置は、被検体の有無、被検体の種類、被検体の量、被検体の存在場所、電磁的影響、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対する被検体の挙動等を定性的または定量的に把握する目的で利用することができる。【００４９】
例えば、細胞中に取り込まれた被検体の有無、種類、量、存在場所の情報を得ることができる。【００５０】
また、被検体が蛍光標識部を備え、外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るようになっていれば、担体との間の距離が小さい場合には消光作用により蛍光の発光が抑えられ、担体との間の距離が大きい場合には蛍光を発光させるようにできるため、蛍光の発光と消光の挙動から、被検体の有無や種類等に関する情報を得ることができる。【００５１】
さらには、電磁的影響を与えた場合における蛍光発光および消光の挙動から被検体の挙動を把握することができる。たとえば、電磁的影響は、担体として電極を使用し、対向電極を設け、これらの電極間に電位差を与えることにより実現することができる。担体と対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることにより電磁的影響を実現することができる。【００５２】
このような各種の電位差を採用することにより、被検体の伸縮、担体からの脱離、拡散等の状況を種々の条件で評価することができる。また、比較的簡単に担体から脱離するものと脱離しにくいものとを分離して評価することもできる。【００５３】
同様に、化学的影響、生物学的影響等の様々な影響に対する被検体の挙動も把握し得る。化学的影響や生物学的影響としては、生じている共有結合、配位結合等の結合を切断することや、イオン的、疎水性または極性的相互作用を阻害しまたは付与すること等どのようなものでもよい。【００５４】
本発明に係る被検体評価方法を、図１の被検体評価装置の模式図を使用して、例示的に説明すれば次のようになる。図１は、本発明に係る被検体評価装置の模式的側面図である。図１において、被検体評価装置１は、被検体から蛍光を発光させるための光照射装置２と、蛍光検出装置３とが、被検体を配置するための担体４を挟んで、互いに反対側にある。被検体評価装置１は、入り口５１、流路５２および出口５３を持つ微細流路５の中に設けられ、その上に（図示されていない）被検体が付着する。担体４は電極になっており、Ａｇ／ＡｇＣｌ／３Ｍ  ＫＣｌ参照電極１００と担体４の間に所望の電位差（電圧計１０１で測定）が生じるように電位差発生装置６を制御する。【００５５】
このような構成を用いて、光照射装置２から照射された光８を、蛍光検出装置３のある側に透過させ、透過光９が蛍光検出装置３の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、透過光９により被検体から蛍光１０を発光させるようにする。このとき、上記したような本発明に係る被検体評価装置についての好ましい態様を本方法に適用することができる。【００５６】
このようにして、本発明方法を利用すれば、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保することができる。また、このため、被検体評価を迅速に行え、蛍光観察下における各種の実験や作業が可能になる。更には、従来のエバネッセント光を利用する技術では不可能であった、担体表面から遠く離れた場所における被検体の評価も可能になる。また、担体に電位を印加した場合にもその影響がなく、エバネッセント光を利用する技術の場合のような屈折率変化の影響も防止できる。
【実施例】
【００５７】
次に本発明の実施例および比較例を詳述する。【００５８】
［実施例１］
図１の構造の微細流路の担体表面に金を用い、その上に被検体結合部としてチオール基を設けた。この微細流路に、一方の末端に蛍光標識部を持ち、もう一方の末端にチオール基を持つヌクレオチドを含む水溶液を流し、ヌクレオチドを金担体の表面に付着させた。【００５９】
この状態で、Ag/AgCl/3M KClの参照電極に対し±２００ｍｖの電位差を金担体に印加し、図１の被検体評価装置を用いて観察したところ、低周波数では、蛍光の発光と消光の繰り返しが観察されたが、１０ｋＨｚ以上の周波数では消光のみとなった。【００６０】
［実施例２］
実施例１と同様の光学系を用いてガラス板の上にマウスの皮膚由来の線維芽細胞（3T3細胞）を細胞固定液でガラス基板に固定化し、乾燥しないようにパラフィルムで覆い、細胞の高さ方向をスキャンして観察した観察したところ、微細管の細胞内分布が観察できた。【００６１】
［比較例１］
実施例２と同様の観察を実施例１と同様の微細流路を使用して行おうとしたが、蛍光観察光学系側に十分な作業空間を確保できず、不可能であった。【００６２】
［比較例２］
ガラス板の上にマウスの皮膚由来の線維芽細胞（3T3細胞）を細胞固定液でガラス基板に固定化し、乾燥しないようにパラフィルムで覆い、エバネッセント光を利用したエバネッセント顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社のＢＸ２ＷＩ−ＴＩＲＦＭ）を使用して観察したところ、ガラス基板板近傍の微細管は観察できたが、細胞の高さ方向をスキャンすることによる細胞内分布観察はできなかった。
【図１】
2007135741.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月22日(2008.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備えた、被検体評価装置において、
当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にあり、
当該光照射装置から照射された光を当該蛍光検出装置のある側に透過させることができ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させることができるようになっている
被検体評価装置。
【請求項２】
前記担体に前記被検体が付着することができる、請求項１に記載の被検体評価装置。
【請求項３】
前記担体が表面に金からなる層を有する、請求項１または２に記載の被検体評価装置。
【請求項４】
前記被検体が蛍光標識部を備え、
外部からの作用により、当該蛍光標識部と前記担体との間の距離が変化し得るようになっている、
請求項１〜３のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項５】
前記外部からの作用が、電磁的影響、化学的影響および生物学的影響からなる群から選ばれた少なくとも一つである、請求項４に記載の被検体評価装置。
【請求項６】
前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的影響が実現される、請求項５に記載の被検体評価装置。
【請求項７】
前記被検体が、蛍光標識部を有する、薬品、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体をタンパク質分解酵素で限定分解して得られる産物、タンパク質に対して親和性を有する有機化合物、タンパク質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の被検体評価装置。
【請求項８】
前記評価対象がタンパク質である、請求項７に記載の被検体評価装置。
【請求項９】
被検体から蛍光を発光させるための光照射装置と、当該被検体を配置するための担体と、当該蛍光を受光するための蛍光検出装置とを備え、当該担体を挟んで、当該光照射装置と当該蛍光検出装置とが互いに反対側にある被検体評価装置を用い、
当該光照射装置から照射された光を、当該蛍光検出装置のある側に透過させ、
当該透過光が当該蛍光検出装置の蛍光検出部を直接照射しないようにしつつ、当該透過光により当該被検体から蛍光を発光させる
ことを含む被検体評価方法。
【請求項１０】
前記担体が表面に金からなる層を有する、請求項９に記載の被検体評価方法。
【国際調査報告】
2007135741.tif 000004
2007135741.tif 000005
2007135741.tif 000006
2007135741.tif 000007