(57)【要約】  本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染を診断する方法、HCV感染の予防剤および予防方法、HCV感染症の治療方法、ならびに候補抗HCV薬をスクリーニングする方法を提供する。本発明のHCV診断方法は、白血球に存在するHCV蛋白を検出することを特徴とする。HCV感染予防剤はHCV蛋白に対する抗体を有効成分とすることを特徴とする。HCV感染症の治療方法は、HCV感染症患者に対して白血球除去または低減療法を行うことを特徴とするものである。さらに候補抗HCV薬のスクリーニング方法は、被験物質の中から、単核球に対するHCV感染阻止能力またはHVC感染単核球に対するHCV抗原量低減能力を有する物質を選択することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球を対象として、当該白血球に存在するC型肝炎ウイルス蛋白を検出する工程を有する、C型肝炎ウイルス感染の診断方法。
【請求項２】
白血球が単核球である、請求項１記載の診断方法。
【請求項３】
C型肝炎ウイルス蛋白の検出を、C型肝炎ウイルスのコア蛋白またはNS4蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて行う、請求項１記載の診断方法。
【請求項４】
C型肝炎ウイルス蛋白に対する抗体を有効成分とする、C型肝炎ウイルス感染予防剤。
【請求項５】
抗体が、C型肝炎ウイルスのコア蛋白またはNS4蛋白に特異的に反応する抗体である請求項４記載の予防剤。
【請求項６】
抗体が、C型肝炎ウイルス蛋白に対するモノクローナル抗体である請求項４記載の予防剤。
【請求項７】
白血球へのC型肝炎ウイルス感染を阻止するための製剤である請求項４記載の予防剤。
【請求項８】
上記白血球が単核球である請求項７記載の予防剤。
【請求項９】
被験者にC型肝炎ウイルス蛋白に対する抗体を有効量投与することからなる、C型肝炎ウイルス感染の予防方法。
【請求項１０】
C型肝炎ウイルス蛋白に対する抗体の、C型肝炎ウイルス感染予防剤の調製のための使用。
【請求項１１】
C型肝炎ウイルス感染症患者の血液からC型肝炎ウイルスに感染した白血球を除去または低減する工程を有する、C型肝炎ウイルス感染症の治療または改善方法。
【請求項１２】
下記（１）〜（３）の工程を有する、請求項１１記載のC型肝炎ウイルス感染症の治療または改善方法：
（１）C型肝炎ウイルス感染症患者の体内から血液を取り出す工程、
（２）取り出した血液からC型肝炎ウイルスに感染した白血球を除去する工程、および
（３）工程（２）により白血球が除去または低減した血液を、上記C型肝炎ウイルス感染症患者の体内に戻す工程。
【請求項１３】
下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有する候補抗C型肝炎ウイルス薬のスクリーニング方法：
（Ａ）被験物質の存在下で、C型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルスに感染していない単核球とを接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた単核球のC型肝炎ウイルス蛋白の量（HCV蛋白量）を測定する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で測定したHCV蛋白量と、被験物質非存在下でC型肝炎ウイルスと接触させた対照の単核球中のHCV蛋白の量（対照HCV蛋白量）を比較する工程、および
（Ｄ）工程（Ｂ）で得られたHCV蛋白量が対照HCV蛋白量より低い場合に、当該被験物質を候補抗C型肝炎ウイルス薬として選択する工程。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する候補抗C型肝炎ウイルス薬のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質をC型肝炎ウイルスに感染した単核球と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた単核球のC型肝炎ウイルス蛋白の量（HCV蛋白量）を測定する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で測定したHCV蛋白量が、被験物質と接触させる前の単核球のHCV蛋白量、または被験物質を接触させない対照のC型肝炎ウイルス感染単核球中のHCV蛋白の量よりも低下している場合に、当該被験物質を候補抗C型肝炎ウイルス薬として選択する工程。
【請求項１５】
単核球中のC型肝炎ウイルス蛋白の量を、当該C型肝炎ウイルス蛋白に対する抗体を用いた免疫測定法で測定する請求項１３または１４に記載するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルス（hepatitis C virus、以下「HCV」と略す）感染を診断する方法に関する。また本発明は、HCV感染の予防剤、HCV感染症の治療方法、および候補抗HCV薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎は、輸血に起因する肝炎の90-95％を占めており、治療法も未だ確立するに至っていないために、その診断法、予防用ワクチンおよび治療薬等の早期開発が強く要望されている疾患の一つである。【０００３】
これまで知られているC型肝炎の診断は、主としてGOT、GPT、LDH等を初めとする血液検査によっているが、その精度や感度は十分なものではなく、この診断自体、C型肝炎の早期発見を行い得るものではない。【０００４】
また、感染患者体内のHCV（ウイルス蛋白、ウイルスRNA等のウイルスマーカー）の有無を検査する方法として、抗HCV抗体を用いた免疫学的方法やHCV RNAを測定する方法も知られているが、これらも尚その精度は充分に満足できるものではない。特に、従来のRNAハイブリダイゼーションによる組織内HCV RNAの検出法や免疫組織学的方法では、HCV抗原の検出の感度、特異性に問題があり、利用できる分野は極めて限られていた。【０００５】
これらの従来技術には、(1)ウイルスRNAを利用してHCVを検出する方法に関する報告(非特許文献1−8参照)、(2) HCV蛋白に対する抗体を利用して、肝細胞に陽性の所見を認めた報告(非特許文献9-14参照)、(3) HCV蛋白に対する抗体を利用して、肝細胞以外の心筋細胞、腎臓の上皮細胞、尿細管、膵臓の腺細胞等に、陽性所見を認めた報告(非特許文献15参照)、及び(4)末梢血や骨髄、リンパ節のリンパ球、単球及びマクロファージにHCV蛋白が検出されたとの報告(非特許文献16及び17参照)が含まれる。【０００６】
しかしながら、生体におけるHCV感染が、白血球、特に単核球にHCVが入ることによって生じること、当該白血球へのHCV感染を阻止することによって生体におけるHCV感染を予防できること、ならびにHCV感染した白血球を除去することによってHCV感染症が治療改善できることについては知られていない。【０００７】
尚、HCV蛋白及びHCV遺伝子の部分塩基配列は知られており（特許文献1及び非特許文献18及び19参照）、HCV蛋白に対する抗体も既に知られている。当該公知の抗HCV抗体としては、例えばHCVのコア蛋白に対するCoreA-2抗体（非特許文献20参照）、およびHCVのNS4a蛋白に対するNS4a抗体(非特許文献21参照)等を挙げることができる。
【特許文献１】欧州特許出願公開第318216号明細書
【非特許文献１】Nishiguchi, S., et al., Hepatogastroenterology, 50; 1301-1304, 2003
【非特許文献２】Azzari, C., et al., Blood, 96; 2045-2048, 2000
【非特許文献３】Crovatto, M., et al., Haematologica, 85; 356-361, 2000
【非特許文献４】Criber, B., et al., Arch. Virol., 144; 355-364, 1999
【非特許文献５】Martin, J., et al., J. Med. Virol., 54; 265-270, 1998
【非特許文献６】Moonka, D. K., et al., J. Viral. Hepat., 5; 27-33, 1998
【非特許文献７】Navas, S., et al., J. Virol., 1640-1646, 1998
【非特許文献８】Zehender, G., et al., J. Infect. Dis., 176; 1209-1214, 1997
【非特許文献９】Nepomnyaschhikh, G. I., et al., Bull. Exp. Biol. Med., 134: 307-311, 2002
【非特許文献１０】Nayak, N. C., et al., Acta Histochem., 101: 409-419, 1999
【非特許文献１１】Chamlian, A., et al., Cell Mol. Biol., 42; 557-166, 1996
【非特許文献１２】Zhao, X., et al., Chin. Med. J., 109; 486-488, 1996
【非特許文献１３】Blight, K., et al., Am. J. Pathol., 143; 1568-1573, 1993
【非特許文献１４】Hiramatsu, N., et al., Hepatology, 16; 306-311, 1992
【非特許文献１５】Yan, et al., World J. Gastroenterol., 6; 805-811, 2000
【非特許文献１６】Sansonno, D., et al., Clin. Exp. Immunol., 103; 414-421, 1996
【非特許文献１７】Sanonno, D., Blood, 88; 4638-4645, 1996
【非特許文献１８】岡本ら、The Japan Journal of Experimental Medicine, Vol. 60, pages 167-177 (1990)
【非特許文献１９】加藤ら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Vol. 87, pages 9524-9528 (1990)
【非特許文献２０】Takahashi, K., et al., J. Gen. Virol., 73: 667-672, 1992
【非特許文献２１】Hijikata, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90; 10773-10777, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はHCV感染の診断方法を提供することを目的とする。また本発明は、HCV感染の予防剤および予防方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、HCV感染症の治療または改善方法、ならびにHCV感染の予防または治療に有効な抗HCV薬の候補物質（候補抗HCV薬）をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めていたところ、HCV感染症患者の白血球、特に単核球内にはHCV蛋白が局在しており、その局在がHCV感染をよく反映していることを見出した（実施例１および２）。そこでさらに研究を重ねたところ、生体におけるHCV感染が白血球、特に単核球にHCVが感染することによって成立することを見出した（実施例３）。これは、裏を返せば、白血球へのHCV感染を阻止することにより生体へのHCV感染が防御（予防）できることを意味する。そこで、本発明者は、従来公知の抗HCV薬であるインターフェロンの抗HCV作用について検討したところ、インターフェロンに白血球へのHCV感染阻止作用（実施例５（２））および白血球中のHCV抗原量を低減させる作用（実施例４）があることを確認し、上記考えが正しいことを確認した。また、これらの知見は、HCVによって感染した白血球を生体から除去することにより、HCV感染症を治療または改善できることを示すものである。【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明には、下記に掲げる態様が含まれる。【００１１】
（Ｉ）C型肝炎ウイルス感染の診断方法
(I-1) 白血球を対象として、当該白血球に存在するC型肝炎ウイルス蛋白（HCV蛋白）を検出する工程を有する、C型肝炎ウイルス（HCV）感染の診断方法。
(I-2) 白血球が単核球である、(I-1)記載の診断方法。
(I-3) HCV蛋白の検出を当該蛋白に対する抗体を用いて行う、(I-1)または(I-2)記載の診断方法。
(I-4) HCV蛋白の検出をHCVのコア蛋白またはNS4蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて行う、(I-1)または(I-2)記載の診断方法。【００１２】
（II）C型肝炎ウイルス感染の予防剤および予防方法
(II-1) HCV蛋白に対する抗体を有効成分とする、HCV感染予防剤。
(II-2) 抗体が、HCVのコア蛋白またはNS4蛋白に特異的に反応する抗体である(II-1)に記載の予防剤。
(II-3) 抗体が、HCV蛋白に対するモノクローナル抗体である(II-1)または(II-2)に記載の予防剤。
(II-4) 白血球へのHCV感染を阻止するための製剤である(II-1)乃至(II-3)のいずれかに記載の予防剤。
(II-5) 上記白血球が単核球である、(II-4)記載の予防剤。
(II-6) 被験者にHCV蛋白に対する抗体を有効量投与することからなる、HCV感染の予防方法。
(II-7) 抗体が、HCVのコア蛋白またはNS4蛋白に特異的に反応する抗体である(II-6)に記載の予防方法。
(II-8) 抗体が、HCV蛋白に対するモノクローナル抗体である(II-6)または(II-7)に記載の予防方法。
(II-9) HCV蛋白に対する抗体の、HCV感染予防剤の調製のための使用。【００１３】
（III）C型肝炎ウイルス感染症の治療方法
(III-1) HCV感染者の血液の中からHCVに感染した白血球を除去または低減する工程を有する、HCV感染症の治療または改善方法。
(III-2) 下記（１）〜（３）の工程を有する、(III-1)記載の治療または改善方法：
（１）HCV感染症患者の体内から血液を取り出す工程、
（２）取り出した血液から、HCVに感染した白血球を除去する工程、および
（３）工程（２）により白血球が除去または低減した血液を、上記HCV感染症患者の体内に戻す工程。
(III-3) 白血球が単核球である、(III-1)または(III-2)記載の治療または改善方法。【００１４】
（IV）候補抗C型肝炎ウイルス薬のスクリーニング方法
(IV-1) 下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有する候補抗HCV薬のスクリーニング方法：
（Ａ）被験物質の存在下で、HCVとHCV感染していない単核球とを接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた単核球のHCV蛋白量を測定する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で測定したHCV蛋白量と、被験物質非存在下でHCVと接触させた対照単核球中のHCV蛋白の量（対照HCV蛋白量）を比較する工程、および
（Ｄ）工程（Ｂ）で得られたHCV蛋白量が対照HCV蛋白量より低い場合に、当該被験物質を候補抗HCV薬として選択する工程。【００１５】
(IV-2)  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する候補抗C型肝炎ウイルス薬のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質を、HCVに感染した単核球を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた単核球のHCV蛋白の量（HCV蛋白量）を測定する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で測定したHCV蛋白量が、被験物質を接触させる前の単核球中のHCV蛋白の量、または被験物質を接触させない対照のC型肝炎ウイルス感染単核球中のHCV蛋白の量よりも低い場合に、当該被験物質を候補抗HCV薬として選択する工程。【００１６】
(IV-3) 単核球中のHCV蛋白の量を、当該HCV蛋白に対する抗体を用いた免疫測定法で測定する(IV-1)または(IV-2)に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、HCV感染の診断方法を提供することができる。本発明の診断方法は、白血球中に存在するHCV蛋白を測定する直接的な方法であるため、抗体産生を待つ必要がなく、体内の抗HCV抗体を指標とする従来のHCV感染診断法に比べて早期にHCV感染の有無を判定することができる。また本発明の診断方法は、上記のように白血球中に存在するHCV蛋白を測定する方法であるため、治癒後も体内に残存する可能性のある抗HCV抗体を指標とする従来のHCV感染診断法に比べて、信頼性の高い診断方法である。本発明の診断によれば、HCV感染の診断のみならず、HCV感染者の薬物治療等の治療効果や予後の経過を観察することも可能である。【００１８】
また本発明によれば、HCV感染に対して有効な予防剤および予防方法を提供することができる。本発明の予防剤および予防方法は、生体のHCV感染の発端となる白血球、特に単核球へのHCV感染を、抗HCV抗体を用いて阻止することによって行うことができる。【００１９】
さらに本発明によれば、HCV感染症の治療および改善方法を提供することができる。当該方法は、HCV感染症の発端をなすHCV感染白血球を除去することにより生体におけるHCV感染を治療または改善する方法であるため、HCV感染症の根治療法として有用である。【００２０】
さらにまた本発明によれば、HCV感染予防薬またはHCV感染症治療薬となりえる候補抗HCV薬をスクリーニングする方法を提供する。本発明によれば、生体のHCV感染の発端となる白血球、特に単核球へのHCV感染を阻止する作用を有する新規HCV感染予防薬、または単核球中のHCV抗原量を低減する作用を有する新規HCV感染症治療薬を取得することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
(Ｉ) HCV感染の診断方法
本発明のHCV感染の診断方法は、被験者の白血球を対象として、当該白血球内に存在するHCV蛋白を検出することを特徴とする。【００２２】
HCVは、全長約9.5kbの１本鎖（＋）RNAゲノムをもつウイルスで、ゲノム構造は5’-非翻訳領域、翻訳領域および3’-非翻訳領域の３つの領域からなる。ここで翻訳領域は、コア蛋白とエンベロープ蛋白（E1,E2/NS1）からなる構造蛋白領域と、NS2、NS3、NS4およびNS5からなる非構造蛋白領域の、合計約3000のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードする領域である。【００２３】
本発明において検出対象とする「HCV蛋白」は、上記HCVの蛋白質を意味するが、HCVの全長蛋白に限られず、その部分蛋白も含まれる。当該部分蛋白としては、例えば、コア蛋白やエンベロープ蛋白（E1,E2/NS1）などの構造蛋白、またはNS2、NS3、NS4およびNS5などの非構造蛋白を挙げることができる。好ましくはコア蛋白および非構造蛋白であり、より好ましくはコア蛋白およびNS4蛋白である。【００２４】
白血球は、一般に顆粒球、単核球およびリンパ球に分類することができる。本発明の方法において測定の対象とする白血球は、好ましくは単核球である。よって、以下、本明細書で単に「白血球」という場合であっても、その意味には好適な態様として「単核球」が含まれる。【００２５】
測定対象とする白血球は、各組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、脳、肺、膵臓、子宮、卵巣および膀胱等の臓器、骨髄、血管、リンパ節、神経、骨格筋、口腔を含む全身の粘膜、消化管、眼球、内耳、関節、皮膚等の組織）に存在するものでもよいが、採取の簡便性から、血液、特に末梢血中の白血球であることが好ましい。【００２６】
白血球内、特に単核球内に存在するHCV蛋白の検出は、通常、HCV蛋白、好ましくはヒトHCV蛋白に対する抗体との抗原-抗体反応を用いた免疫測定方法に従って行うことができる。当該HCV蛋白に対する抗体（以下、単に「抗HCV抗体」ともいう）は、HCV蛋白を免疫抗原として得られ、HCV蛋白に特異反応性を有するモノクローナル抗体より適宜選択することができる。【００２７】
ここで免疫抗原として利用されるHCV蛋白には、ヒト由来の天然HCV蛋白（全長蛋白）の他、遺伝子工学的手法により得られる組換え型HCV蛋白（全長蛋白）、およびこれらの部分構造を有する部分蛋白が含まれる。当該部分蛋白としては、前述するように、例えば、コア蛋白やエンベロープ蛋白（E1,E2/NS1）などの構造蛋白、またはNS2、NS3、NS4およびNS5などの非構造蛋白を挙げることができる。好ましくはコア蛋白または非構造蛋白であり、より好ましくはコア蛋白またはNS4蛋白である。【００２８】
モノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、免疫抗原（ヒトHCV蛋白）で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハイブリドーマ）を作成し、所望の抗体産生クローンを選択し、当該クローンを培養することによって製造することができる〔例えばHanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 15, 105 (1975) : Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 10, 201 (1976) : Koscielak, J., Eur. J. Biochem., 37, 214 (1978)等参照〕。ヒトHCV蛋白に対する所望のモノクローナル抗体の採取には、ハイブリドーマを常法に従って培養してその培養上清として得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採用される。上記培養上清及び腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができ、また常法に従って精製して精製抗HCV抗体として利用することができる。【００２９】
本発明の診断方法で用いられる好ましいモノクローナル抗体としては、具体的には、HCVコア蛋白に対するモノクローナル抗体（Takahashi, K., et al., J. Gen. Virol., 73: 667-672, 1992）、HCV NS4蛋白に対するモノクローナル抗体（Hijikata, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90; 10773-10777, 1993）であり、これらはいずれも商業的に入手することができる（例えば、Biogenesis  Ltd., Poole，UK）。【００３０】
白血球、好ましくは単核球を対象とした免疫測定法は、具体的には下記のように実施することができる。【００３１】
被験試料として血液を使用する場合は、例えば、実施例２に記載するように、比重遠心法を用いて血液から単核球を分離し、分離した単核球をスライドガラスなどに塗布固定して、これを検体としてスライドガラス上で、抗HCV抗体を用いて抗原抗体反応する。【００３２】
また、被験試料として各種組織（例えば肝臓、心臓、腎臓、脾臓、脳、肺、膵臓、子宮、卵巣、膀胱等の臓器、骨髄、血管、リンパ節、末梢血、神経、骨格筋、口腔を含む全身の粘膜、消化管、眼球、内耳、関節、皮膚等の組織）を使用する場合は、これらの組織内の白血球（単核球）を対象として、抗HCV抗体を用いて抗原抗体反応を行うことができる。具体的には、実施例１に記載するように、各臓器のホルマリン固定標本または細胞を検体として、抗HCV抗体を用いて抗原抗体反応を行い、当該組織内の白血球を染色して、当該白血球内に存在するHCV蛋白を免疫組織学的に特異的に検出する。なお、この場合、各臓器の固定標本は、通常、キシレンにより脱パラフィン後、アルコールで脱水し、過酸化水素により内因パーオキシダーゼを不活性化した後に使用される。【００３３】
免疫測定法は、競合法、サンドイッチ法等によるRIA法、ELISA法、凝集法等に従って実施することができる。好ましくはサンドイッチ法によるELISA法である。また、間接法、直接法、または高感度法（例えばビオチン−ストレプトアビジン反応を利用したLSAB法）の別を問わない。これらの各方法の操作や手順等は常法に従うことができる。【００３４】
上記の場合、免疫測定法は、具体的には、白血球（単核球）を塗布固定したスライドガラスまたは各臓器の固定標本または細胞に、一次抗体として抗HCV抗体（好ましくはHCVコア蛋白またはNS4蛋白に対するマウスモノクローナル抗体）を加えて反応させ（抗原抗体反応）、次いで標識した二次抗体と反応させて、さらにこれを、二次抗体の標識剤と反応して発色する発色基質と反応させることにより実施することができる。この場合、白血球（単核球）中のHCV蛋白の存在は、白血球（単核球）が特異的に染色されることにより検出することができる。【００３５】
標識二次抗体としては、公知のものでよく、通常、酵素標識した抗イムノグロブリン抗体が使用される。当該二次抗体は、通常、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ等の動物に免疫して得られる抗イムノグロブリン抗体が使用されるが、一次抗体（抗HCV抗体）を作成した動物とは異なる動物を用いて免疫して得られた抗体であることが望ましい。二次抗体の標識に使用する酵素としては、制限されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)などのペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ(alkaline phosphatase)、βガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、酸性ホスファターゼなどを挙げることができる。好ましくはペルオキシダーゼである。【００３６】
発色基質は、二次抗体の標識に使用する酵素と反応して発色するものであれば特に制限されず、適宜選択して使用することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合は、制限されないが、o-フェニレンジアミン（OPD）やDAB（diaminobenzidine）を例示することができる。発色反応の停止も常法に従って行うことができ、例えば反応液に1〜4Nの硫酸等の適当な酵素活性阻害剤を添加する方法を挙げることができる。【００３７】
免疫測定の際の免疫反応条件は、特に制限はなく、通常のこの種の測定法と同様のものとすることができる。例えば、上記測定系に利用される溶媒としては、反応に悪影響を与えない通常の各種のものがいずれも利用でき、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水含有リン酸緩衝液（PBS）、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液等のpHが約5.0〜9.0程度の緩衝液を挙げることができる。【００３８】
なお、本発明のHCV感染の診断方法は、抗HCV抗体を用いた3ステップサンドイッチ法を用いて行うこともできる。この方法は、例えば代表的には以下の如くして実施される。即ち、96ウェルプレート等の適当な担体に固相化させた白血球に対する抗体を第1抗体として用い、これと被験者の血液とを、室温にて一夜静置反応させ〔第1ステップ〕、次いで、第2抗体としての抗HCV抗体（HCVモノクローナル抗体）を上記プレートに加え、室温で2時間程度反応させることにより、当該第2抗体と第1ステップでの反応物（抗-白血球抗体と白血球との複合体）とを反応させ〔第2ステップ〕、更に酵素標識抗家兎IgG抗体等の標識抗体の一定量を、上記第2ステップでの反応物（抗HCV抗体と白血球との反応複合体）と室温にて2時間程度反応させ〔第3ステップ〕、次いで上記第3ステップで得られた反応複合体と標識抗体との結合体から非結合標識抗体を分離除去した後、発色溶液を加えて発色反応させ、2N硫酸にて発色反応を停止させ、得られる発色反応液の吸光度を測定することにより実施される。かくしてHCVに感染した白血球を検出、定量することができる。【００３９】
本発明の方法によれば、被験者の白血球中のHCV蛋白の存在、すなわち白血球へのHCV感染の有無を検出することにより、生体のHCV感染の有無を診断することができる。すなわち、被験者の白血球、特に単核球内にHCV蛋白が検出される場合、当該被験者はHCV感染に罹患していると診断することができる。本発明の診断方法は、体内の抗HCV抗体を指標とする従来のHCV感染診断法に比べて、直接的な方法であるため、抗体産生を待たずして早期に感染の有無を判定することができる。また、本発明の方法によれば、HCV感染の診断のみならず、HCV感染者の薬物治療等の治療効果や予後の経過を観察することも可能である。前述するように、本発明の診断方法は、白血球中に存在するHCV蛋白を測定する直接的な方法であるため、治癒後も体内に残存する可能性のある抗HCV抗体を指標とする従来のHCV感染診断法に比べて、信頼性の高い診断方法である。【００４０】
(II)  HCV感染予防剤
実施例３に示すように、HCV感染症患者の血清をHCVに感染していない健常者の白血球（単核球）に接触させると当該白血球にHCVが感染するが、この系にHCV蛋白に対する抗体（抗HCV抗体）を存在させておくと、上記白血球へのHCV感染を阻止することができる。また、実施例５（２）に示すように、公知の抗HCV薬であるインターフェロン-α（IFN-α）にも同様に、かかる白血球へのHCV感染阻止作用が認められた。さらに、実施例４に示すように、HCVに感染した白血球（単核球）を公知の抗HCV薬であるインターフェロン-α（IFN-α）とともに培養すると当該白血球中のHCV抗原量が低下する。【００４１】
これらのことから、生体のHCV感染には、白血球、特に単核球へのHCV感染が関与または発端となっており、当該白血球へのHCV感染を阻止することにより、生体のHCV感染を防御（予防）できると考えられる。すなわち、白血球に対するHCV感染を阻止する作用を有する物質、例えば抗HCV抗体など、HCV感染予防剤の有効成分として有用である。【００４２】
従って、本発明は、抗HCV抗体を有効成分とするHCV感染予防剤を提供する。【００４３】
抗HCV抗体には、上記（Ｉ）で説明するように、ヒトHCVの全長蛋白に対する抗体、およびその部分蛋白に対する抗体が含まれる。当該部分蛋白に対する抗体としては、例えば、コア蛋白やエンベロープ蛋白（E1,E2/NS1）などの構造蛋白に対する抗体、またはNS2、NS3、NS4およびNS5などの非構造蛋白に対する抗体を挙げることができる。好ましくはコア蛋白に対する抗体または非構造蛋白に対する抗体であり、より好ましくはコア蛋白に対する抗体またはNS4蛋白に対する抗体である。【００４４】
HCV蛋白に対する特異性から抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、さらにヒトに適用するという点から、ヒトに対する抗原性の低いヒト型抗体、ヒト化抗体（CDR移植抗体）またはキメラ抗体であることが好ましい。なお、これらの抗体の製造方法は公知であり、本発明の抗体も常法に従って調製することができる（例えば、Eda et al., J Virol 80:5552-5562, 2006など）。【００４５】
本発明のHCV感染予防剤は、かかる抗HCV抗体を有効成分として含有することを必須とするものであり、この限りにおいて、他成分配合の有無は特に制限されない。例えば、本発明のHCV感染予防剤は、有効量の抗HCV抗体に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を含有するものであってもよい。【００４６】
ここで抗HCV抗体の有効量としては、白血球へのHCV感染を阻止することのできる量であればよく、特に制限されない。通常、HCV蛋白１μgに対して有効な抗HCV抗体の最小量としては１ｎｇを挙げることができる。HCV感染予防剤に配合される抗HCV抗体の量は、これを基準として適宜選択することができる。例えば被験者（成人）に対する１投与あたりの抗HCV抗体の量が０.１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１〜１００ｍｇとなるような割合で、抗HCV抗体を含むことが好ましい。【００４７】
上記HCV感染予防剤に配合できる薬学的に許容される担体としては、後述する各種の投与形態に応じて、当業界で通常使用されるものを広く挙げることができる。例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤等を挙げることができる。また、本発明のHCV感染予防剤には、必要に応じて安定剤、殺菌剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味料等を含有させることもできる。【００４８】
本発明のHCV感染予防剤は、経口的または非経口的に投与することができ、かかる投与経路に応じた製剤形態（例えば、粉末、顆粒、錠剤、ピル剤、カプセル剤、シロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、点滴剤、坐剤など）に調製することができる。【００４９】
なお、ここで非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法などを含むものである。注射用調剤、例えば無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物は、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤を用いて当該分野で知られた方法で調製することができる。その無菌注射用調剤は、また、例えば水溶液などの製剤上許容される非経口投与可能な希釈剤あるいは溶剤中の無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用することのできるベヒクルあるいは溶剤として許されるものとしては、水、リンゲル液、等張食塩液などが挙げられる。さらに、通常溶剤または懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油または脂肪酸を用いることができる。かかる不揮発性油および脂肪酸には、天然、合成あるいは半合成の脂肪油または脂肪酸、並びに天然、合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類が含まれる。【００５０】
直腸投与用の坐剤は、その薬物と適当な低刺激性の補形剤、例えばココアバターやポリエチレングリコール類といった常温では固体であるが腸管の温度では液体で、直腸内で融解し、薬物を放出するものなどと混合して製造できる。【００５１】
経口投与用の固形投与剤型としては、上記した粉末（散剤）、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤などが挙げられる。そのような剤型において、活性成分である抗HCV抗体は、少なくとも一つの添加物、例えばショ糖、乳糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、寒天、アルギネート類、キチン類、キトサン類、ペクチン類、トラガントガム類、アラビアゴム類、ゼラチン類、コラーゲン類、カゼイン、アルブミン、合成または半合成のポリマー類またはグリセリド類と混合することができる。そのような剤型物は、通常の剤型のようにさらに別の添加物を含んでもよい。別の添加物としては、例えば不活性希釈剤、マグネシウムステアレートなどの滑沢剤、パラベン類、ソルビン酸などの保存剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合化剤、増粘剤、緩衝化剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パフューム剤などが挙げられる。錠剤およびピル剤は、さらにエンテリックコーティングすることもできる。【００５２】
経口投与用の液剤としては、医薬として許容されるシロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤などが挙げられる。これらは、当該分野で普通用いられる不活性希釈剤、例えば水を含んでいてもよい。【００５３】
本発明のHCV感染予防剤の投与量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、被験者のその時に治療を行っている病状の程度などに応じて、適宜設定することができる。【００５４】
前述するように、通常、HCV蛋白１μgに対して有効な抗HCV抗体の最小量として１ｎｇを挙げることができる。従って、本発明のHCV感染予防剤の１回の投与量は、これを基準として適宜選択することができる。例えば被験者（成人）に対して１投与あたり、抗HCV抗体の量が０.１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１〜１００ｍｇとなるような割合で、HCV感染予防剤を投与することができる。【００５５】
また本発明は、HCV感染を予防する方法を提供する。当該方法は、白血球へのHCV感染を阻止する作用を有する物質を被験者に投与することからなる。当該HCV感染阻止物質としては、前述する抗HCV抗体を好適に挙げることができる。すなわち、本発明のHCV感染予防方法は、被験者に抗HCV抗体、特に前述する本発明のHCV感染予防剤を投与することによって実施することができる。投与量については前述の通りである。【００５６】
（III）C型肝炎ウイルス感染症の治療または改善方法
また本発明は、C型肝炎ウイルス感染症の治療または改善方法を提供する。【００５７】
本発明が対象とするC型肝炎ウイルス感染症（HCV感染症）には、C型肝炎などの肝臓疾患に限られず、C型肝炎ウイルス感染が発端となって発症する疾患が広く含まれる。具体的には、本発明が対象とするHCV感染症には、例えば、C型肝炎ウイルスによって生じる肝炎（C型肝炎）、肝硬変、肝癌、心筋炎、心筋症、心不全、腎炎、腎不全、膀胱炎、筋炎、膵炎、シェーグレン症候群、リンパ腫、晩発性皮膚ポルフィリン症、扁平苔鮮、関節炎、糖尿病、動脈硬化、血管炎、脳神経疾患も含まれる。【００５８】
本発明のHCV感染症の治療または改善方法は、基本的には、C型肝炎ウイルス感染者の血液の中からC型肝炎ウイルスに感染した白血球を除去または低減することによって行うことができる（白血球除去療法または白血球低減療法）。【００５９】
白血球除去療法（LCAP療法）は、従来より潰瘍性大腸炎や関節リウマチに対する治療法として用いられている血液浄化方法であり、本発明のC型肝炎ウイルス感染症の治療または改善方法にも同様に用いることができる。当該療法は、基本的には、下記の工程（１）〜（３）を有する；
（１）C型肝炎ウイルス感染症患者の体内から血液を取り出す工程、
（２）取り出した血液から白血球を除去する工程、および
（３）（２）の工程で浄化された血液を、上記C型肝炎ウイルス感染症患者の体内に戻す工程。【００６０】
当該療法は、具体的には、C型肝炎ウイルス感染症患者の、一方の肘または大腿などの静脈から血液を体外に取り出して、白血球除去具または比重の違いを利用して目的の白血球を除去し、次いで浄化された血液を反対側の静脈に戻すことによって行われる。【００６１】
ここで白血球除去具としては、制限されないが、例えば、白血球吸着能を有するビーズを充填したカラムや、白血球吸着能を有する繊維やフィルターを充填した器具（セルソーバ）を挙げることができる。白血球吸着能を有するビーズとしては、白血球のうち顆粒球と単核球を吸着する能力に優れた酢酸セルロース製のビーズ（G-1ビーズ、日本抗体研究所、日本）を例示することができる。また白血球吸着能を有する繊維やフィルターとしては、白血球が3μm以下の極細繊維にひっつく性質を有することから、かかる極細繊維からなるものであれば特に制限されないが、具体的にはポリエステル製等の極細繊維またはかかる繊維からなるフィルター〔例えば、セパセルRZ：旭メディカル社製（日本）、ピュアセルRC RC400H：ポール社製（アメリカ）、イムガードIII-RC：テルモ社製（日本）など〕を例示することができる。【００６２】
また白血球除去具を使用する以外に、血液成分の比重の違いを利用して遠心分離などを用いて白血球（単核球）を分離し、除去する方法も使用することができる。【００６３】
さらに白血球数を低減する療法（白血球低減療法）として、白血球を減らす公知の薬剤、例えば抗がん剤、抗腫瘍薬、または白血病治療薬を投与する方法を用いることもできる。当該投薬による白血球低減療法は、上記白血球除去療法と組み合わせて行うこともできる。【００６４】
なお、骨髄における白血球産生細胞がHCVに感染している場合は、白血球除去療法後も、再びHCVに感染した白血球が産生されて血液中にでてくる可能性がある。従ってこの場合は、白血球除去療法後、インターフェロン投与などの抗ウイルス療法を行うことが好ましい。【００６５】
（IV）候補抗HCV薬のスクリーニング方法
(IV-1)  候補HCV感染予防薬のスクリーニング方法
前述するように、実施例３および実施例５（２）の結果から、生体のHCV感染には、白血球、特に単核球へのHCVの感染が関与しており、当該白血球に対するHCV感染を阻止することにより、生体のHCV感染を防御（予防）することができる。すなわち、白血球に対するHCV感染を阻止する作用を有する物質は、抗HCV薬、特にHCV感染予防薬として有用である。【００６６】
このことから、白血球に対するHCV感染阻止作用を指標とすることにより、HCV感染防御作用を有する抗HCV薬、すなわちHCV感染予防薬をスクリーニングすることができる。【００６７】
当該スクリーニングは、下記（A）〜（D）の工程を通じて行うことができる：
（A）被験物質の存在下で、C型肝炎ウイルスとHCVに感染していない単核球とを接触させる工程、
（B）工程（A）で得られた単核球のC型肝炎ウイルス蛋白の量（HCV蛋白量）を測定する工程、
（C）工程（B）で測定したHCV蛋白量と、被験物質非存在下でC型肝炎ウイルスと接触させた対照の単核球中のHCV蛋白の量（対照HCV蛋白量）を比較する工程、および
（D）工程（B）で得られたHCV蛋白量が対照HCV蛋白量より低い場合に、当該被験物質を候補抗C型肝炎ウイルス薬として選択する工程。【００６８】
ここで使用される被験物質は、核酸（ポリヌクレオチドを含む）、ペプチド（ポリペプチドを含む）、有機化合物、無機化合物などのいずれでもよい。スクリーニングは、かかる被験物質または当該被験物質を含む試料（被験試料）の存在下で、C型肝炎ウイルスとHCVに感染していない単核球とを接触させることにより行うことができる。かかる被験試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、植物や動物等の天然物の抽出物等が含まれる。【００６９】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、ヒトに感染するヒト型HCVであることが好ましい。単核球と接触させるHCVは、白血球を混入しないものである限りにおいて精製物である必要はなく、HCVに感染した患者の血清など、HCVを含むものであればよい。当該HCVとの接触に使用する単核球は、HCVに感染していないものであり、HCVに感染していない健常者に由来する単核球または培養単核球（例えば、実施例５で使用するU937細胞株など）を使用することができる。【００７０】
工程（A）においてHCVと単核球を接触させる条件は、HCVと単核球が死なない条件であればよいが、通常、体内環境に準じる条件を挙げることができる。制限はされないが、例えば、後述する実施例で使用する10％胎児牛血清を含むRPMI培地での37℃、5%炭酸ガス存在による条件を、好適に用いることができる
工程（B）において単核球中のHCV蛋白量の測定は、HCV蛋白に対する抗体を用いた免疫測定法に従って行うことができる。その詳細は（Ｉ）で説明した通りであり、好ましくはサンドイッチ法によるELISA法を用いることができる。【００７１】
工程（D）で選択された被験物質は、HCVを単核球に接触させた状況下で当該単核球へのHCV感染を阻止する能力を有する物質であると、判断することができる。【００７２】
前述するように、生体におけるHCV感染は白血球、特に単核球にHCVが感染することによって成立する。従って、上記単核球へのHCV感染阻止能力を有する物質によれば生体へのHCV感染を防御（予防）することができる。従って、上記本発明のスクリーニング方法で選択された被験物質は、抗HCV薬、特にHCV感染予防薬となりえるものである。【００７３】
(IV-2)  候補HCV治療薬のスクリーニング方法
また実施例４において、HCV治療薬として公知のIFN-αに、白血球、特に単核球中のHCV抗原量を低減させる作用があることを示した。このことは、白血球、特に単核球中のHCV抗原量を低減させる作用がある物質は、抗HCV薬、特にHCV治療薬として有用であることを示すものである。【００７４】
このことから、HCVに感染した白血球、特に単核球中のHCV抗原量（HCV蛋白量）の低減を指標とすることにより、HCV感染治療作用を有する抗HCV薬、すなわちHCV治療薬をスクリーニングすることができる。【００７５】
当該スクリーニングは、下記（a）〜（c）の工程を有する：
（ａ）被験物質をC型肝炎ウイルスに感染した単核球と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた単核球のC型肝炎ウイルス蛋白（HCV蛋白）の量を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で測定したHCV蛋白量が、被験物質と接触させる前の単核球のHCV蛋白量より低下している場合、または被験物質を接触させない対照のC型肝炎ウイルス感染単核球中のHCV蛋白の量よりも低い場合に、当該被験物質を候補抗C型肝炎ウイルス薬として選択する工程。【００７６】
被験物質としては、(IV-1）に記載のものを同様に挙げることができる。被験物質と接触させる単核球は精製物である必要はなく、HCVに感染した患者から採取した血液そのものであってもよい。【００７７】
工程（a）においてHCVと単核球を接触させる条件は、(IV-1）の方法と同様、単核球が死なない条件であればよいが、通常、体内環境に準じる条件を挙げることができる。制限はされないが、例えば、後述する実施例で使用する10％胎児牛血清を含むRPMI培地での37℃、5%炭酸ガス存在による条件を、好適に用いることができる。【００７８】
工程（b）において単核球中のHCV蛋白量の測定は、(IV-1）の方法と同様、HCV蛋白に対する抗体を用いた免疫測定法に従って行うことができる。その詳細は（Ｉ）で説明した通りであり、好ましくはサンドイッチ法によるELISA法を用いることができる。【００７９】
工程（c）で選択された被験物質は、HCVに感染した白血球（単核球）中のHCV抗原量を低減させる能力を有する物質であると、判断することができる。前述するように、単核球中のHCV抗原量を低減させる作用がある物質は、HCV治療薬として有用であることから、上記スクリーニング方法によって選択された被験物質は、抗HCV薬、特にHCV治療薬になりえるものである。【００８０】
上記(IV-1)および(IV-2)の方法より、選択された候補抗HCV薬は、さらなる薬効試験、安全性試験、ならびにHCVに感染した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、HCV感染症の予防または治療剤としてより実用的な抗HCV薬を取得することができる。【００８１】
このようにして選択された候補抗HCV薬は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）、または遺伝子学的操作によって工業的に製造することができ、HCV感染症の予防または治療に有効な抗HCV薬として用いることができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を更に詳述するために実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００８３】
実施例1    白血球におけるHCV抗原の検出
（１）HCV感染症患者から入手した肝臓、心臓、腎臓、大動脈、リンパ節及び骨髄組織の各ホルマリン固定標本（一片5μmの切片）を、キシレンを用いて脱パラフィン処理した後、アルコールで脱水し、次いで過酸化水素で処理して内因性のベルオキシダーゼを不活性化した。なお、ここでHCV感染患者としては、血中の抗HCV抗体が陽性である患者を対象とした。【００８４】
得られた各臓器標本を検体として、これらに、一次抗体として、HCVのコア領域の蛋白に対するマウスモノクローナル抗体（特殊免疫研究所製、CoreA-2抗体、Takahashi, K., et al., J. Gen. Virol., 73: 667-672, 1992、以下「コア抗体」という）、またはHCVの非構造領域NS4蛋白に対するマウスモノクローナル抗体（阪大微生物学研究会観音寺研究所研究部から入手、NS4a抗体、Hijikata, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 90, 10773-10777, (1993)、以下「NS4抗体」という）を、それぞれ0.2mL (20μg/mL)の割合で加えて、4℃で一夜インキュベートした。次いで、マウスIgG用ベクタスタインABCキット（バーリンゲーム、CA, USA.）を利用して、該キットの仕様書に従って、免疫染色を行い、DAB (diaminobenzidine)発色させた。【００８５】
得られた結果を図１〜７に示す。図１はNS4抗体と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像、図２はNS4抗体と反応させた心臓組織の顕微鏡画像、図３はコア抗体と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像、図４はコア抗体と反応させた心臓組織の顕微鏡画像、図５はコア抗体と反応させた腎臓組織の顕微鏡画像、及び図６はコア抗体と反応させた大動脈組織の顕微鏡画像、図７はコア抗体と反応させたリンパ節組織の顕微鏡画像、及び図８はコア抗体と反応させた骨髄組織の顕微鏡画像である。【００８６】
各図に示すように、HCV感染症患者の肝臓（図１及び３）、心臓（図２及び４）、腎臓（図５）、大動脈（図６）、リンパ節組織（図７）及び骨髄組織（図８）のいずれの組織でも白血球が染色されていることが確認された。このことから、HCV感染患者の白血球内に、HCV抗原が局在していることが明らかとなった。【００８７】
（２）さらに、これらの免疫反応の特異性を検討するため、（１）と同様にHCV感染患者の肝臓組織標本を用いて下記の実験を行った。【００８８】
まず、（１）と同様にペルオキシダーゼ不活性化処理した肝臓組織標本に、一次抗体としてコア抗体20μg/mLと共に、その免疫源として使用されたコア抗原(HCVのコア蛋白)10μg/mLを混和し、室温で2時間反応させた。次いで、マウスIgG用ベクタスタインABCキット（バーリンゲーム、CA, USA.）を利用して、仕様書に従って免疫染色（DAB発色）を行った。また対照試験として、上記試験において、コア抗原(HCVのコア蛋白)を添加しないで、コア抗体20μg/mLと反応させたHCV感染患者の肝臓組織標本を、上記と同様にして免疫染色した。【００８９】
結果を図９及び図１０に示す。図９はコア抗原を加えないでコア抗体と反応させた対照の肝臓組織の顕微鏡画像であり（対照試験）、図１０はコア抗原と予め反応させたコア抗体を反応させた場合の肝臓組織の顕微鏡画像である。【００９０】
対照試験では白血球の染色が確認され（図９）、肝臓組織の白血球内にHCVのコア抗原が局在することが確認された。一方、図１０では図９で認められた陽性像が消失していた。その理由として、一緒に混合したコア抗体とコア抗原とが抗原抗体反応により複合物を生成し、肝臓組織の白血球内に存在するHCVのコア抗原と反応しなかったためと考えられる。このことは、コア抗体が、白血球内に存在するHCVのコア抗原と特異的に反応することを示している。【００９１】
また、心臓、腎臓、大動脈、リンパ節及び骨髄組織の標本を用いて、上記肝臓組織と同様の試験を行ったところ、これらの組織標本においても、同様にコア抗体の反応の特異性が証明された。【００９２】
実施例２  末梢血単核球内HCV抗原の検出
（１）HCV 感染症患者及びHCV非感染の健常者よりそれぞれ末梢血を採取し、フィコールパック液（アマシャム社、U.S.A.）を用いた比重遠心法により、該血液から白血球のうち単核球を分離した。これをスライドガラス上に塗布し、乾燥後、エタノールで固定した。この単核球を検体として、実施例1と同様にして免疫染色を行った。具体的には、HCV 感染症患者及びHCV非感染者の単核球に、コア抗体またはNS4抗体をそれぞれ0.2mL（20μg/mL）加えて、4℃で一夜インキュベートし、次いでマウスIgG用ベクタスタインABCキットを用いて免疫染色してDAB発色させた。【００９３】
結果を図１１〜１４に示す。図１１および１２は、HCV 感染者の単核球とNS4抗体との反応結果およびHCV 非感染者の単核球とNS4抗体との反応結果をそれぞれ示す顕微鏡画像である。また、図１３および１４は、HCV 感染者の単核球とコア抗体との反応結果およびHCV 非感染者の単核球とコア抗体との反応結果をそれぞれ示す顕微鏡画像である。図１１及び１３に示すように、HCV 感染者の単核球はNCV抗体であるNS4抗体およびコア抗体のいずれとも反応し、免疫染色像が観察された。これに対して、HCV非感染者の単核球については、図１２及び１４に示すように、そのような染色像は認められなかった。【００９４】
（２）次いで、HCV非感染者の単核球（1×10６個/mL）に、HCV 感染者から採取した血清（HCV定量値：225KIU/mL）を添加し、胎児牛血清(BSA)10％を含むRPMI1640培地にて96時間培養した。培養後、得られた培養物を、実施例1と同様にしてNS4抗体と反応させて免疫染色した。具体的には、培養物にNS4抗体を0.2mL（20μg/mL）加えて、4℃で一夜インキュベートし、次いでマウスIgG用ベクタスタインABCキットを用いて免疫染色してDAB発色させた。なお、対照試験として、上記HCV 感染者の血清（HCV定量値：225KIU/mL）に代えて、HCV非感染者の血清を用いて同様にして、HCV非感染者の単核球（1×10６個/mL）を培養した後、NS4抗体と反応させて免疫染色した。【００９５】
図１５にHCV感染者の血清と反応させた単核球の顕微鏡画像を、また図１６にHCV非感染者の血清と反応させた単核球の顕微鏡画像を示す。図からわかるように、HCV非感染者の単核球にHCV非感染者の血清を添加しても、免疫染色像は観察されなかったが（図１６）、HCV非感染者の単核球にHCV 感染者由来の血清を加えると、HCV 感染者と同様に（図１１及び１３参照）、単核球に免疫染色像が出現した（図１５）。【００９６】
上記（１）および（２）の結果から、HCVは白血球の単核球に感染することがわかった。このことから、単核球をターゲットとし、当該単核球におけるHCV抗原の有無を検出することによって、HCV感染症が診断できることがわかる。【００９７】
実施例３  HCV感染症の予防及び治療
HCV 感染症患者の血清(HCV定量値：225KIU/mL)をリン酸緩衝液にて100倍希釈したもの10μLに、(1)コア抗体(実施例1に記載のもの)10μg/mL、(2)NS4抗体(実施例1に記載のもの)60μg/mL、及び(3)対照としてマウスIgG(Dako社製)10μg/mLを、それぞれ10μL添加混合し、4℃で一夜インキュベートした。【００９８】
一方、HCV非感染者から末梢単核球を分離し、10％胎児牛血清を含むRPMI培地を用いて1×106個／mLに調整し、得られた懸濁液を24穴プレートの各穴に500μLずつ注入した。【００９９】
当該プレートの各穴に、前記HCV感染者血清（希釈物）10μL と(1)〜(3) 各10μLとの混合物20μLを加えて、5％炭酸ガス環境下で37℃、4日間培養を行った。その後、それぞれの培養単核球を採取し、各単核球について、実施例1と同様にしてコア抗体を用いて免疫染色を行った。【０１００】
得られた結果を、図１７〜１９に示す。図１７は、HCV感染者血清と(1)コア抗体の混合物と反応させたHCV非感染者の単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像；図１８は、HCV感染者血清と(2)NS4抗体の混合物と反応させたHCV非感染者の単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像；図１９は、HCV感染者血清と(3)マウスIgGの混合物と反応させたHCV非感染者の単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像である。【０１０１】
図1７〜１８からわかるように、HCV 感染者血清に(1)コア抗体または(2)NS4抗体を混合した場合は、HCV感染者血清に(3)マウスIgGを混合した場合に比べて（図１９）、HCV非感染者の単核球の染色濃度の明らかな低下が認められた。これは、HCV感染者血清と混合することによって生じる単核球のHCV感染（単核球へのHCV抗原の導入）が、HCV抗体であるコア抗体およびNS4抗体の存在によって抑制されていること、すなわちHCV抗体（コア抗体またはNS4抗体）によって、HCV感染が防御（予防）できることを意味する。【０１０２】
実施例４  HCV感染末梢単核球を用いた抗ウイルス薬の評価
実施例３と同様にHCV感染症患者から末梢単核球を分離し、これにHCV治療薬として知られているヒトインターフェロンα（ヒトIFN-α）１×10５μg/mL (PeproTech EC社, London, UK.) を加えて５日間培養した。また比較実験としてヒトIFN-αを加えないで、HCV感染者の末梢単核球を同様にして５日間培養した。次いで、これらの各培養単核球を採取して、実施例１と同様にして一次抗体としてコア抗体を用いて免疫染色を行った。【０１０３】
ヒトIFN-αを加えないで培養した単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を図２０に、またヒトIFN-αを加えて培養した単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を図２１に示す。図２０および２１の結果から、HCV感染者の単核球にINF-αを加えると、INF-αを加えない場合に比して単核球の免疫染色濃度が著しく低下することが認められた。すなわち、INF-αの作用によって単核球内のHCV抗原量が減少することが認められた。このことから、単核球内のHCV抗原量を減少させる作用を有する物質は、INF-αと同様に、HCV治療薬となり得ることを示唆するものである。【０１０４】
実施例５  培養細胞株を用いた抗ウイルス薬の評価系
（１）培養単球細胞株を用いたHCV感染系の確立
前単球系細胞株であるU937細胞株(ATCC CRL-1593.2：American Type Culture Collection, Manassas, VA, VSA)を、10%胎児牛血清を含むRPMI培地を用いて1×10６個/mLに調整し、24穴プレートを用いて培養した。これに、HCV感染症患者の血清(HCV定量値：225KIU/mL)またはHCV非感染者の血清を加え、5％炭酸ガス環境下、37℃で２〜７日間培養を行った。次いで、各培養U937細胞株を採取して、実施例１と同様にしてコア抗体を用いて免疫染色を行った。【０１０５】
HCV感染症患者の血清を加えて培養したU937細胞株の免疫染色の結果を図２２に、HCV非感染者の血清を加えて培養したU937細胞株の免疫染色の結果を図２３に示す。これらの図からわかるように、HCV感染者血清を混合したU937細胞株は免疫染色陽性像がみられたが(図２２)、HCV非感染者の血清を混合したU937細胞株は陽性像は認められなかった(図２３)。【０１０６】
このことから、生体から採取した末梢単核球と同様に、培養単球細胞株を用いても、HCV感染系が確立できることが確認できた。【０１０７】
（２）培養単球細胞株を用いた抗ウイルス薬の評価
（１）と同様に、10%胎児牛血清を含むRPMI培地を用いて培養した前単球系細胞株（U937細胞株）に、HCV感染症患者の血清(HCV定量値：225KIU/mL)を加え、さらにこれに抗HCV薬として知られているヒトINF-α（1×10５μg/mL）を加えて、5％炭酸ガス環境下、37℃で２〜７日間培養を行った。比較実験として、ヒトINF-αを加えない系についても同様に、5％炭酸ガス環境下、37℃で２〜７日間培養を行った。次いで、各培養U937細胞株を採取して、実施例１と同様にしてコア抗体を用いて免疫染色を行った。【０１０８】
INF-αを加えないで培養したU937細胞株の免疫染色の結果を図２４に、INF-αを加えて培養したU937細胞株の免疫染色の結果を図２５に示す。【０１０９】
図２４および２５の結果からわかるように、HCV感染させた培養単球細胞株にINF-αを加えると、INF-αを加えない場合に比して、培養単球細胞株の免疫染色濃度が著しく低下することが認められた。すなわち、INF-αの作用によって培養単球細胞株内のHCV抗原量が減少することが認められた。これは、培養単球細胞株を用いて、当該単核球内のHCV抗原量を減少させる作用を有する物質を探索することにより、HCV治療薬となる物質（候補抗HCV薬）が選別できることを示している。【０１１０】
実施例６    ビーズによる白血球吸着によるHCVの除去
あらかじめ無菌的に乾燥させた2ｇ のG-1 ビーズ（日本抗体研究所、高崎市、日本）を5ml のシリンジに充填し、これにヘパリンを含有するHCV感染症患者の血液1.0ml を加え、これをインキュベーター（37℃）内に設置したローターRT-5（タイテック）にセットし、１時間反応（1分間に1回転）させた。【０１１１】
反応終了後、シリンジ内の血液をシリンジ内筒で押し出し、G-1ビーズ処理前と処理後の白血球数を計測して、G-1ビーズに吸着した白血球数を求めた。さらに、G-1ビーズ処理前と処理後の血液中のHCV核酸量およびHCVコア蛋白量を測定した。なお、HCV核酸量は、リアルタイムPCR法（ロシュデイアグノステイックス）により、HCVコア蛋白量はオルソHCV抗原IRMAテストにより測定した。【０１１２】
次いで、白血球を吸着したG-1ビーズを24穴培養プレートに入れ、これに1mlの10％FCS-RPMI液（Gibco社, Grand Island NY, USA）を加え、37℃、 5％ CO2インキュベーターで72時間培養した。培養後、上清を回収しHCVコア蛋白の量を測定した。【０１１３】
この結果、下記の結果が得られた。【０１１４】
１．G-1ビーズ処理前の血液中の白血球数は平均3,780個/ μl (n=2) 、およびG-1ビーズ処理後の血液中の白血球数は平均2,070個/μlであり（55％）、G-1ビーズに45％の白血球が吸着された。【０１１５】
２．G-1ビーズ処理前の血液中のHCV 核酸量は1680±870 KIU/ml (n=5, 平均±標準誤差)であったが、G1ビーズ処理後は1150±610 KIU/ml であり、処理前の68％に減少した。【０１１６】
３．G-1ビーズ処理前の血液中のHCVコア蛋白量は平均6890±3530 fmol/L (n=5) であったが、G-1ビーズ処理後は平均307±178 fmol/Lであり、処理前の4.5％にまで減少した。【０１１７】
４．白血球を吸着したG-1ビーズを72時間培養した結果、培養上清中には、平均17fmol/L (n=2) の HCVコア蛋白（HCVコア抗原）が検出された。【０１１８】
以上のことからG-1ビーズ処理により、HCVに感染した白血球を除去できることがわかった。また、G-1ビーズに吸着した白血球からHCVが検出されたことから、白血球を標的としたHCV治療が有効であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実施例1(1)に記載の試験で得られた、HCVのNS4蛋白に対するモノクローナル抗体（NS4抗体）と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像を示す(200倍)。
【図２】実施例1(1)で得られた、NS4抗体と反応させた心臓組織の顕微鏡画像を示す(200倍）。
【図３】実施例1(1)で得られた、HCVのコア蛋白に対するモノクローナル抗体（コア抗体）と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図４】実施例1(1)で得られた、コア抗体と反応させた心臓組織の顕微鏡画像を示す(600倍）。
【図５】実施例1(1)で得られた、コア抗体と反応させた腎臓組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図６】実施例1(1)で得られた、コア抗体と反応させた大動脈組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図７】実施例1(1)で得られた、コア抗体と反応させたリンパ節組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図８】実施例1(1)で得られた、コア抗体と反応させた骨髄組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図９】実施例1(2)で得られた、コア蛋白非存在下でコア抗体と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１０】実施例1(2)で得られた、コア蛋白存在下でコア抗体と反応させた肝臓組織の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１１】実施例２(1)で得られた、HCV感染症患者単核球のNS4抗体との反応を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１２】実施例２(1)で得られた、HCV非感染健常者単核球のNS4抗体との反応を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１３】実施例２(1)で得られた、HCV感染症患者単核球のコア抗体との反応を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１４】実施例２(1)で得られたHCV非感染健常者単核球のコア抗体との反応を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１５】実施例２(2)で得られた、HCV 感染症患者血清と反応させたHCV非感染健常者単核球の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１６】実施例２(2)で得られた、HCV非感染健常者血清と反応させたHCV非感染健常者単核球の顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１７】実施例３で得られた、コア抗体存在下でHCV 感染症患者の血清と反応させたHCV非感染健常者単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１８】実施例３で得られた、Ns4抗体存在下でHCV 感染症患者の血清と反応させたHCV非感染健常者単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図１９】実施例３で得られた、マウスIgG存在下でHCV 感染症患者の血清と反応させたHCV非感染健常者単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２０】実施例４で得られた、インターフェロン-α（IFN-α）非存在下で培養したHCV感染症患者単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２１】実施例４で得られた、IFN-α存在下で培養したHCV感染症患者単核球の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２２】実施例５(1)で得られた、HCV感染症患者血清とともに培養した培養単球細胞（U937細胞株）の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２３】実施例５(1)で得られた、HCV非感染健常者血清とともに培養した培養単球細胞（U937細胞株）の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２４】実施例５(2)で得られた、HCV感染症患者血清と反応させた培養単球細胞（U937細胞株）の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す(600倍)。
【図２５】実施例５(2)で得られた、IFN-aの存在下でHCV感染症患者血清と反応させた培養単球細胞（U937細胞株）の免疫染色結果を示す顕微鏡画像を示す (600倍)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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