(57)【要約】【課題】  ｐＩＩＩの内部で融合できるファージディスプレイのベクターを得る。また、該ベクターを用いたファージディスプレイ方法を提供する。【解決手段】  配列番号１で表されるＭ１３ファージｐＩＩＩ蛋白質の１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間に、アミノ酸を挿入した変異ｐＩＩＩ蛋白質を用いることを特徴とする、ファージディスプレイ方法を用いる。本発明のファージディスプレイ方法は、ランダムペプチドの効率的な産生のみならず、ペプチドの立体構造における新しいソースを提供することができる。
2007114139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される繊維状ファージのｐＩＩＩ蛋白質の１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間に、アミノ酸残基を挿入した変異体ｐＩＩＩ蛋白質。
【請求項２】
挿入されるアミノ酸残基が１〜５０個である、請求項１に記載の変異体ｐＩＩＩ蛋白質。
【請求項３】
挿入されるアミノ酸残基が４〜３０個である、請求項１に記載の変異体ｐＩＩＩ蛋白質。
【請求項４】
配列番号３４、３５、３６、３７または３８で表されるポリペプチド。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
【請求項５】
配列番号２、３、４または５で表される、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の変異体ｐＩＩＩ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
ベクターが、繊維状ファージである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が、大腸菌である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号３４、３５、３６、３７または３８で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリ。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
【請求項１３】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む繊維状ファージ。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の変異体ｐＩＩＩ蛋白質を提示する、繊維状ファージ。
【請求項１５】
請求項４または５に記載のポリペプチドを提示する、繊維状ファージ。
【請求項１６】
繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の繊維状ファージ。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の、２種以上の変異体ｐＩＩＩ蛋白質を提示する、繊維状ファージライブラリ。
【請求項１８】
配列番号３４、３５、３６、３７または３８で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリ。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
【請求項１９】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の繊維状ファージを用いることを特徴とする、ファージディスプレイ方法。
【請求項２０】
繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、請求項１９に記載のファージディスプレイ方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の繊維状ファージライブラリを用いることを特徴とする、ファージディスプレイ方法。
【請求項２２】
繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、請求項２１に記載のファージディスプレイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のファージベクターおよびそれを用いたファージディスプレイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ蛋白質のＮ末端にペプチドを融合すると、ペプチドはＭ１３ファージ粒子上に提示される。これは、いわゆるファージディスプレイ技術として知られている。融合するペプチドをランダムペプチドにすると、ペプチドライブラリが作製でき、リガンドのスクリーニングソースを提供している（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−９０．）。【０００３】
ファージディスプレイ技術は、理論的には膨大な数の小ペプチドを提供することができ、これによって得られるペプチドライブラリは、ペプチドの一次構造で多様性を発生させている。Ｍ１３ファージディスプレイにおいて多くの技術開発が行われており、種々のペプチド提示用のベクターが開発されてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．＆Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．（１９９７）．  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９７，３９１−４１０．）。【０００４】
Ｍ１３ファージを用いたファージディスプレイ技術において、ｐＩＩＩとペプチドとの融合は、成熟ｐＩＩＩあるいは欠損ｐＩＩＩのＮ末端あるいはそのすぐ近傍に限局されている。ｐＩＩＩとペプチドとの融合蛋白質は分泌過程においてペプチドの影響を受けるため、あらゆるペプチドをファージ上に提示することは不可能と考えられており、ペプチドの多様性における生物学的なバイアスを発生させている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．＆Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．（１９９８）．  Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４４，３１３−２９．）。【０００５】
このため、ランダム融合ペプチドをペリプラズマに分泌させるには、Ｎ末端あるいはＮ末端近傍のランダムペプチドのアミノ酸配列に由来する、分泌上の制限を強いられることがある（Ｌｉ，Ｐ．，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｈ．（１９８８）．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５，７６８５−９．およびＰｅｔｅｒｓ，Ｅ．Ａ．，Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｓ．＆Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９９４）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐＩＩＩ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｆｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｌＡ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６，４２９６−３０５．）。【０００６】
このバイアスは、ランダムペプチドの挿入部位がＮ末端から遠くになればなるほど少なくなる（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｒ．Ｇ．＆Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ｒ．（１９８９）．  Ｉｌｌｉｃｉｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｌｕｓ  ａ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，２００７４−８１．）。それ故、ｐＩＩＩとペプチドとを融合するとき、融合蛋白質の分泌に関する限り、成熟ｐＩＩＩのＮ末端融合より内部でペプチドを融合することが、融合蛋白質の分泌上の優位性を与えると考えられる。このように、生物学的な制約を減少することは、ファージディスプレイ技術ではペプチドの多様性において重要な役割を演じることになる。【０００７】
ペプチドは、蛋白質に結合できるリガンドとして生物界に広く存在しており、医薬品や試薬などに応用されている。ペプチドがリガンドとして機能するためには、ペプチドの一次構造のみならず立体構造の形成が必要である。ペプチドにおいて、一次構造はアミノ酸配列を意味し、立体構造は分子中の含有アミノ酸の分子内相互作用によりペプチド鎖が折りたたみ構造を形成した、分子全体の幾何学的構造を意味している。ペプチドを融合蛋白質にした場合、ペプチドの立体構造はペプチドの１次構造のみならず、融合蛋白質全体の立体構造に大きく依存する。その依存は、融合蛋白質においてペプチドが融合する部位で決定される。【０００８】
抗体の多様性が、このことの適切な例となる。抗体において抗原に結合する部位は、ＣＤＲ（相補性決定領域）とよばれるペプチドである。そのペプチドはＦａｂ蛋白質の内部に存在しており、ペプチドの１次構造のみならず、Ｆａｂ蛋白質スキャフォード（ｓｃａｆｆｏｌｄ）によってペプチドの立体構造が形成されている。それ故、抗体は、ＣＤＲのペプチドの立体構造と１次構造の多様性により、あらゆる標的タンパク質に結合する能力を発生させている。融合蛋白質でも、Ｎ末端やＣ末端で融合したペプチドの立体構造では、融合蛋白質全体の立体構造から受けるペプチドの立体構造への影響は比較的に少ない。このように融合蛋白質の内部にあるペプチドの立体構造は、融合蛋白質全体の立体構造に大きく影響される。言い換えれば、融合蛋白質の内部にあるペプチドの立体構造は、融合蛋白質から大きな立体的な制限を受けることになる。その制限が、ペプチドに特有の立体構造を創出する起源となっている。【０００９】
一方、ジスルフィド結合は特定部位のシステイン間で形成され、ペプチドを環状化してペプチドの立体構造を形成している。特定部位でのジスルフィド結合の形成は、ジスルフィド結合間のペプチドの立体構造に大きな影響を与える。【００１０】
このようにペプチドの立体構造は、主としてペプチドの１次構造、融合蛋白質全体からの立体的要請、さらにジスルフィド結合の３つの要因で決定されている。【００１１】
Ｍ１３ファージでランダムペプチドを作製する場合、ペプチドの１次構造およびジスルフィド結合の形成は、インサート（挿入するペプチド）で決まり、融合蛋白質からの立体的要請は、Ｍ１３ファージベクターで決定される。現在開発されているＭ１３ファージベクターはすべて、Ｎ末端あるいはＣ末端の融合を行うものであり、融合蛋白質からの立体的要請はほとんどない。このことは、現在開発されているＭ１３ファージディスプレイでのペプチドの立体構造は、ペプチドの１次構造に大きく依存している。Ｍ１３ファージディスプレイにおいて、融合蛋白質全体からの立体的要請のあるＭ１３ファージベクターの開発、言い換えればｐＩＩＩの内部でペプチドを融合できるＭ１３ファージベクターの開発は、ランダムペプチドライブラリにおいてペプチドの新規な立体構造を創出することになる。【００１２】
ファージディスプレイ技術でのランダムペプチドの提示方法は、大別すると２種類存在している。一つは、ｐＩＩＩのＮ末端に環状化したランダムペプチドを融合する方法であり、ほとんどすべてのランダムペプチドライブラリの作製に用いられている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．＆Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．（１９９７）．  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９７，３９１−４１０．）。もう一つの方法は、ｐＩＩＩのＮ末端に特定の蛋白質を融合して、その蛋白質の一部分の構造をランダムペプチドに置換する方法である。その例としては、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの蛋白質スキャフォードを利用して行われるものがある（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．＆Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９５）．  Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５０，４６０−７０．）。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ融合法では、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのターン構造部分をランダムペプチドに置換する方法がとられている。このように、ｐＩＩＩ内部でペプチドを融合できるファージベクターは現在報告されていない。【００１３】
ｐＩＩＩは、繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）のｇｅｎｅ−３−ｐｒｏｔｅｉｎ（ｇ３ｐ）であり、ファージの感染に係わる蛋白質である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．，Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．＆Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９８１）．Ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｆｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １３５，１６７−７２．）。ｐＩＩＩはファージ当たり５分子存在し、４０６アミノ酸から成り、Ｎ１、Ｎ２、Ｃドメインの結晶構造が明らかにされている（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｆ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆Ｗｌｏｄａｗｅｒ，Ａ．（１９９９）．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇ３ｐ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＴｏｌＡ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７，７１１−２２．、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｌ．（１９９９）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｇ３ｐ  ｆｒｏｍ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｆｄ  ａｔ  １．９  Ａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｌａｂｉｌｉｔｙ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８８，６４９−５７．およびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｆ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆Ｗｌｏｄａｗｅｒ，Ａ．（１９９８）．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｇ３ｐ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５，１４０−７．）。Ｎ１、Ｎ２ドメインは、ファージの感染において各々大腸菌細胞膜の貫通と、大腸菌への吸着の作用があり（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．，Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．＆Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９８１）．Ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｆｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １３５，１６７−７２．およびＳｔｅｎｇｅｌｅ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｓ，Ｐ．，Ｇａｒｃｅｓ，Ｘ．，  Ｇｉｒａｙ，Ｊ．＆  Ｒａｓｃｈｅｄ，Ｉ．（１９９０）．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｆｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１２，１４３−９．）、Ｃドメインは、ファージのｇ６ｐ分子との相互作用によるファージ粒子形成に関わっている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．，Ｐｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｎ．＆Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９８１）．Ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｆｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １３５，１６７−７２．、Ｋｒｅｍｓｅｒ，Ａ．＆Ｒａｓｃｈ��ｄ，Ｉ．（１９９４）．Ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｆｄ：  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏａｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １３９５４−８．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｆ．  Ｋ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｓ．  Ｍ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．  （１９８１）．  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａ  ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩＩ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０８，３３８−５０．）。このようにｐＩＩＩは、ファージの感染という本質的な機能を果たすため、この機能を保持させながら変異体を作製することは非常に難易度が高いと考えられる。特に、Ｎ１ドメインに存在するＣ７−Ｃ３６のジスルフィド結合の解離によってファージの感染能力がなくなっており、言い換えればＮ１ドメインの立体構造の変化が、ファージ感染能力の消失を導いている（Ｋａｔｈｅｒ，Ｉ．，Ｂｉｐｐｅｓ，Ｃ．Ａ．＆Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｆ．Ｘ．（２００５）．Ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｅ−３−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｆｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５４，６６６−７８．）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ファージディスプレイにおいて新規のランダムペプチドライブラリを作成するため、ｐＩＩＩの内部でランダムペプチドを融合できるファージディスプレイのベクターを得ることにある。また、本発明の課題は、該ベクターを用いたファージディスプレイ方法、および該ファージディスプレイ方法によりペプチドライブラリを得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ｐＩＩＩ蛋白質のＮ−末端ドメインの内部でペプチドの挿入を許容できる繊維状ファージベクターを開発し、ペプチドの新規ディスプレイを創出した。ｐＩＩＩのＮ−末端ドメインの内部でペプチドを挿入できる部位を、Ｍ１３ＫＯ７ファージの１本鎖ＤＮＡを用いた挿入突然変異誘発（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｏｓｉｓ）で検索した。そのうち１つの部位、成熟ｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間でペプチドを挿入した変異ファージを得ることができた。変異ファージは、その挿入部位で３０アミノ酸残基までのペプチドを挿入することができ、ファージの感染および増殖機能を損なわなかった。【００１６】
そして、変異ファージにソマトスタチン−１４の合成ＤＮＡを挿入して、ソマトスタチン−１４のファージ上の提示を検討した。ファージ上でのソマトスタチン−１４の提示は、抗ソマトスタチン抗体を用いるＥＬＩＳＡで同定された。また、ｐＩＩＩとソマトスタチン−１４の融合蛋白質は、抗ソマトスタチン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより同定された。【００１７】
さらに、ファージ上に提示したソマトスタチン−１４をペプチドスキャフォードにして、ランダムペプチドライブラリを作製した。ソマトスタチン−１４の活性中心であるＦＷＫＴ残基をランダムテトラペプチドに置き換えて、ファージディスプレイライブラリを構築した。さらに一般式Ｃ（Ｘ）ｎＣで表現されるランダムペプチドを導入することができ、後述するＭ１３ｙｔ４２ベクターは、ペプチドサイズで３０アミノ酸残基まで、多様なジスルフィド構造を有するペプチドライブラリを作成することができた。【００１８】
また、得られたペプチドライブラリについて、アミノ酸配列の多様性を検討するため、適当に選択した１７１クローンにおけるランダム配列中のアミノ酸残基の出現頻度を解析した。その結果、ランダム配列をコードするコドンから予測されるアミノ酸出現頻度と、クローンからの実測したランダム配列中のアミノ酸出現頻度に高い正の相関が認められた。このことは、Ｍ１３ｙｔ４２ベクターを用いたライブラリの作製では生物学的なバイアスを受けにくく、ランダムペプチドの発現において大きな利点を有することを示している。いままでのＮ末端融合型のファージライブラリでは、ジスルフィドによる環状のランダム配列中ではプロリン残基の出現頻度が高いことが特徴であったが、本ライブラリでのアミノ酸出現頻度において唯一グリシン残基の出現が多いことが特徴である。このようにＭ１３ｙｔ４２ベクターは、ｐＩＩＩのＮ−末端ドメインの内部でペプチドをディスプレイすることができるので、ペプチドの発現上の利点があるとともに、いままでのＮ末端融合型のＭ１３ライブラリとは異なるグリシンに富む、立体的にある程度拘束されたランダムペプチド配列を提示することができる。【００１９】
即ち、本発明は、配列番号１で表される繊維状ファージのｐＩＩＩ蛋白質の１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間に、アミノ酸残基を挿入した変異体ｐＩＩＩ蛋白質である。
また、本発明は、挿入されるアミノ酸残基が１〜５０個である、上記の変異体ｐＩＩＩ蛋白質である。
また、本発明は、挿入されるアミノ酸残基が４〜３０個である、上記の変異体ｐＩＩＩ蛋白質である。
また、本発明は、配列番号３４で表されるポリペプチドである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３５で表されるポリペプチドである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３６で表されるポリペプチドである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３７で表されるポリペプチドである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３８で表されるポリペプチドである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、Ｘが、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を示す、上記のポリペプチドである。
また、本発明は、配列番号２で表される、ポリペプチドである。
また、本発明は、配列番号３で表される、ポリペプチドである。
また、本発明は、配列番号４で表される、ポリペプチドである。
また、本発明は、配列番号５で表される、ポリペプチドである。
また、本発明は、上記の変異体ｐＩＩＩ蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。
また、本発明は、請求項４〜１３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
また、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターである。
また、本発明は、ベクターが、繊維状ファージである上記のベクターである。
また、本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞である。
また、本発明は、宿主細胞が、大腸菌である上記の宿主細胞である。
また、本発明は、配列番号３４で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３５で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３６で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３７で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３８で表される、２種以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、Ｘが、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を示す、上記のポリペプチドライブラリである。
また、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む繊維状ファージである。
また、本発明は、上記の変異体ｐＩＩＩ蛋白質を提示する、繊維状ファージである。
また、本発明は、上記のポリペプチドを提示する、繊維状ファージである。
また、本発明は、繊維状ファージが、ｆｌファージ、ｆｄファージ、およびＭ１３ファージからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、上記の繊維状ファージである。
また、本発明は、繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、上記の繊維状ファージである。
また、本発明は、上記の、２種以上の変異体ｐＩＩＩ蛋白質を提示する、繊維状ファージライブラリである。
また、本発明は、配列番号３４で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３５で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３６で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３７で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、配列番号３８で表される、２種以上のポリペプチドを提示する、繊維状ファージライブラリである。（配列表中、Ｘは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を示す。）
また、本発明は、Ｘが、それぞれ独立に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を示す、上記の繊維状ファージライブラリである。
また、本発明は、上記の繊維状ファージを用いることを特徴とする、ファージディスプレイ方法である。
また、本発明は、繊維状ファージが、ｆｌファージ、ｆｄファージ、およびＭ１３ファージからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、上記のファージディスプレイ方法である。
また、本発明は、繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、上記のファージディスプレイ方法である。
また、本発明は、上記の繊維状ファージライブラリを用いることを特徴とする、ファージディスプレイ方法である。
また、本発明は、繊維状ファージが、ｆｌファージ、ｆｄファージ、およびＭ１３ファージからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、上記のファージディスプレイ方法である。
また、本発明は、繊維状ファージがＭ１３ファージであることを特徴とする、上記のファージディスプレイ方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のファージディスプレイ方法は、ランダムペプチドの効率的な産生のみならず、ペプチドの立体構造における新しいソースを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、Ｍ１３ｙｔ６ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。二重下線部分は、オリゴヌクレオチド番号＃１８６を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入突然変異により挿入されたアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｍ１３ｙｔ４２ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。二重下線部分は、オリゴヌクレオチド番号＃２５０とオリゴヌクレオチド番号＃２５１をアニールした合成ＤＮＡを、Ｍ１３ｙｔ６ファージのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素サイトにクリーニングして得た変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、Ｍ１３ｙｔ２７ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。二重下線部分は、オリゴヌクレオチド番号＃１５５とオリゴヌクレオチド番号＃１５６をアニールした合成ＤＮＡを、Ｍ１３ｙｔ６ファージのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素サイトにクリーニングして得た変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。四角で囲んだ部分は、ソマトスタチン−１４のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、Ｍ１３ｍｋ７ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。二重下線部分は、オリゴヌクレオチド番号＃２４６とオリゴヌクレオチド番号＃２４７の２本のオリゴヌクレチドをアニーリングした後、ＤＮＡポリメラーゼｋｌｎｏｗフラグメントで２本鎖ＤＮＡに変換したＤＮＡをＭ１３ｙｔ６ファージのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素サイトにクリーニングして得た変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を示す。四角で囲んだ部分は、ソマトスタチン−１４のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、変異ファージのファージ形成能を示す。
【図７】図７は、融合ｐＩＩＩたんぱく質のウエスタンブロッティングによるソマトスタチン−１４の同定を示す。
【図８】図８は、ソマトスタチン−１４をクローニングしたファージ粒子におけるＥＬＩＳＡによるソマトスタチン−１４の同定を示す。
【図９】図９は、ギャップドＤＮＡ（Ｇａｐｐｅｄ  ＤＮＡ）オリゴヌクレオチド番号＃２５５−オリゴヌクレオチド番号＃２５６−オリゴヌクレオチド番号＃２５７の構造を示す。
【図１０−１】図１０−１は、ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリのｐＩＩＩ融合蛋白質とＤＮＡの構造を示す。下線は、挿入したペプチドを示す。
【図１０−２】図１０−２は、ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリのｐＩＩＩ融合蛋白質とＤＮＡの構造を示す。下線は、挿入したペプチドを示す。
【図１１】図１１は、Ｐｈ．Ｄ．７ライブラリにおいて報告されたアミノ酸頻度に対してプロットした、ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリにおけるアミノ酸頻度を示す。
【図１２】図１２は、コドンから予測されるアミノ酸出現頻度と実測したアミノ酸出現頻度の比較を示す。
【図１３】図１３は、各種ランダムペプチドライブラリにおけるランダム配列部分のアミノ酸残基数の頻度（％）と、挿入したオリゴヌクレチドを含むコドンから予測されるアミノ酸残基数の理論値から求めた頻度の相関を示す。
【図１４】図１４は、合成オリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１５】図１５は、マウス抗Ｍ１３ｍｐ１８抗血清の結合曲線（抗体価測定）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に用いる繊維状ファージは、ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅと呼ばれるものであり、ｆｌファージ、ｆｄファージ、およびＭ１３ファージ等を用いることができる。中でも、Ｍ１３ファージが好ましく用いられる。【００２３】
以下、本発明をＭ１３ファージを具体例として説明するが、本発明はＭ１３ファージに限られず、いずれの繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を用いてもよい。【００２４】
（１）ｐＩＩＩ内部でペプチドを融合できる部位の探索とクローニングベクターの作製
本発明者は、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩの内部でペプチドを挿入できる部位を探索した。挿入部位については、Ｍ１３ＫＯ７ファージのｓｓＤＮＡをテンプレートにして種々のオリゴヌクレチドを用いて遺伝子−３（ｇｅｎｅ−３）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで挿入突然変異誘発を行った。オリゴヌクレチドは、各挿入部位でＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒの４アミノ酸残基、ＤＮＡではＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素部位を導入できるように設計した。その結果、図１４に示すオリゴヌクレオチド番号＃１８６のオリゴヌクレチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異から、１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間に４アミノ酸残基が挿入されたＭ１３ｙｔ６ファージが得られた。Ｍ１３ｙｔ６ファージのクローニングの利便性を高めるため、ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素部位にオリゴヌクレオチド番号＃２５０とオリゴヌクレオチド番号＃２５１の２本のオリゴヌクレチドをアニーリングしたＤＮＡをクローニングして、Ｍ１３ｙｔ４２ファージを作製した。図１から図３に各々Ｍ１３ファージ、Ｍ１３ｙｔ６ファージ、Ｍ１３ｙｔ４２ファージのｐＩＩＩ蛋白質のアミノ酸配列を示す（配列番号１〜３）。【００２５】
Ｍ１３ｙｔ６ファージのＲＦ  ＤＮＡのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素部位に、オリゴヌクレオチド番号＃１５５とオリゴヌクレオチド番号＃１５６の２本のオリゴヌクレチドをアニーリングしたＤＮＡをクローニングして、Ｍ１３ｙｔ２７ファージを作製した。Ｍ１３ｙｔ２７ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を、図４に示す（配列番号４）。【００２６】
また、オリゴヌクレオチド番号＃２４６とオリゴヌクレオチド番号＃２４７の２本のオリゴヌクレチドをアニーリングした後、ＤＮＡポリメラーゼｋｌｎｏｗフラグメントで２本鎖ＤＮＡに変換したＤＮＡを、Ｍ１３ｙｔ６ファージのＲＦ  ＤＮＡのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限酵素部位にクローニングして、Ｍ１３ｍｋ７ファージを作製した。Ｍ１３ｍｋ７ファージの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列を、図５に示す（配列番号５）。【００２７】
Ｍ１３ｙｔ２７ファージあるいはＭ１３ｍｋ７ファージの変異ｐＩＩＩは、天然のｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間に各々２１アミノ酸残基あるいは２４アミノ酸残基が挿入されており、両者はソマトスタチン−１４のアミノ酸配列を有している。このように、Ｍ１３ｙｔ６あるいはＭ１３ｙｔ４２は、ｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間にアミノ酸残基を挿入できるＭ１３ファージベクターとして機能できることが判明した。【００２８】
Ｍ１３ｙｔ６あるいはＭ１３ｙｔ４２のファージベクターを用いたクローニングは、ｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間にアミノ酸残基を挿入することになる。ｐＩＩＩ蛋白質は、大腸菌への感染およびｇ６ｐのファージ蛋白質との相互作用によるファージ粒子形成に機能しており、クローニングによりｐＩＩＩのＮ１ドメインは二分割される。この挿入部位は、Ｎ１ドメインのＣ７−Ｃ３６のジスルフィド結合内に存在しているが、Ｃ７−Ｃ３６のジスルフィド結合は、Ｎ１ドメインの立体構造の形成に必須の機能を有しており、このジスルフィド結合を解離するとファージ粒子は産生しなくなることが報告されている（非特許文献１５）。【００２９】
そこで、ｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間へのアミノ酸残基の挿入により、Ｎ１ドメインの機能への影響を検討した。Ｍ１３ｙｔ２７ファージおよびＭ１３ｍｋ７ファージを用いて、各々の変異ｐＩＩＩのファージ産生能を測定した。Ｍ１３ｙｔ２７ファージ、Ｍ１３ｍｋ７ファージおよびコントロールとしてＭ１３ＫＯ７ファージについて各々５００ｐｆｕを大腸菌ＪＭ１０９に感染して、培養６時間におけるファージ産生量を測定した。その結果を図６に示す。ｐＩＩＩ変異体から成るＭ１３ｙｔ２７およびＭ１３ｍｋ７ファージは、ファージ感染後６時間におけるファージ産生量ではコントロールのＭ１３ＫＯ７ファージに比べて少ないものの、ファージ産生能は十分認められた。このことはファージ感染においてＭ１３ｙｔ２７ファージおよびＭ１３ｍｋ７ファージの変異ｐＩＩＩは感染機能を保持していることを示している。【００３０】
（２）ソマトスタチン−１４のファージディスプレイ
Ｍ１３ｙｔ２７ファージは、ソマトスタチン−１４をコードするＤＮＡがｇｅｎｅ−３に融合している。Ｍ１３ｙｔ２７ファージがｐＩＩＩ上にソマトスタチン−１４のペプチド配列を有していることを、抗ソマトスタチン抗体を用いるウエスタンブロッティングで検証した。Ｍ１３ｙｔ２７ファージの全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ソマトスタチン抗体を用いるウエスタンブロッティングした結果を、図７に示す。Ｍ１３ｙｔ２７ファージでは約５２ｋＤａのバンドが抗ソマトスタチン抗体で染色された。この分子サイズはｐＩＩＩ蛋白質の分子サイズと一致している（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｅ．＆Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．（１９７７）．Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｆｄ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６，２６８６−９４）。この結果、ファージ上のｐＩＩＩは、ソマトスタチン−１４の融合蛋白質として存在していることを示している。【００３１】
Ｍ１３ｙｔ２７ファージ粒子上のソマトスタチン−１４の提示が、パニングなどのスクリーニングで機能するかを検討するため、Ｍ１３ｙｔ２７ファージについて、抗ソマトスタチン抗体を用いるＥＬＩＳＡを行った。その結果を図８に示す。１ｘ１０８ファージ／ウェルまでのタイトレーションでは、Ｍ１３ｙｔ２７ファージとＭ１３ＫＯ７ファージで有意な差は認められないが、１ｘ１０９ファージ／ウェル、１ｘ１０１０ファージ／ウェルにおいて、Ｍ１３ｙｔ２７ファージがＭ１３ＫＯ７に比べて抗ソマトスタチン抗体に有意な結合が認められた。このことは、Ｍ１３ｙｔ２７ファージ上にソマトスタチン−１４が提示され、ソマトスタチン−１４のペプチド配列が抗ソマトスタチン抗体と反応することを示している。【００３２】
（３）ペプチドライブラリの作製と評価
ペプチドライブラリは、ｐＩＩＩの１１番目のプロリンと１２番目のヒスチジンの間にランダム配列を有するペプチドを挿入することにより作製した。まずはじめに、ソマトスタチン−１４のペプチドスキャフォードを用いて、ランダムテトラペプチドを作製した。ソマトスタチン−１４は、ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣのアミノ酸配列と分子内のジスルフィドを形成し、成長ホルモン、グルカゴン、インスリン、ガストリンなどのホルモンの分泌を制御するペプチドホルモンである。そのループ構造の中心にあるＦＷＫＴの４アミノ酸残基を、ランダムアミノ酸配列に置換した。Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターのＢｓｔＸＩ制限酵素部位にランダム配列を有するＤＮＡを、クローニングした。ランダム配列を有する挿入ＤＮＡは、オリゴヌクレオチド番号＃２５５、オリゴヌクレオチド番号＃２５６、オリゴヌクレオチド番号＃２５７の３本のオリゴヌクレチドをアニールして図９に示すようなギャップドＤＮＡ（Ｇａｐｐｅｄ  ＤＮＡ）を用いた。図１０−１および１０−２に、クローニングによって得られたｐＩＩＩとランダムペプチドの融合蛋白質のＮ１ドメインのアミノ酸配列と、ＤＮＡ配列を示す。このクローニングにより、１．０ｘ１０６ｐｆｕの独立したクローンが得られた。ランダムペプチドの理論的なペプチド種は、２０４、すなわち１．６ｘ１０５種類であり、実験的に得られたライブラリサイズの１．０ｘ１０６種類のクローン数は、ランダムペプチドの理論値を網羅することができている。【００３３】
ランダムペプチドライブラリの評価は、ランダムペプチドの数が膨大なため全クローンの解析はできないが、一部のクローンのアミノ酸配列の統計に基づいてライブラリを評価する方法が報告されている（Ｒｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｏａｒｅｓ，Ａ．Ｓ．＆Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（２００２）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｍ１３  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２２，１０３９−５２）。この方法に基づいて、ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリの性状を把握した。１．０ｘ１０６種類のクローンから適当に選択した１２４クローンより、ランダム配列部分のアミノ酸配列を対応するＤＮＡ部分の塩基配列より決定した。ランダムアミノ酸配列の各ポジションおよび全ポシションにおけるアミノ酸の出現頻度を、集計した。その結果を表１に示す。ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣのライブラリの特徴として、４つのランダム配列におけるグリシン残基の出現頻度は１５．７％で最も高く、プロリン残基は３．９％であった。これに対して、ｐＩＩＩのＮ末端で融合した環状のランダムヘプタペプチドライブラリである既存のＰｈ．Ｄ．７ライブラリにおいて、７つのランダム配列中でプロリン残基が１３．３％で最も多く、グリシン残基は３．９％であった（上掲、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２２，１０３９−５２）。これらのライブラリ間のランダム配列中のアミノ酸出現頻度を、図１１に示す。この結果は、機能的多様性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、上掲、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２２，１０３９−５２）においてＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣのライブラリはグリシン−リッチ型ライブラリであり、既存のｐＩＩＩのＮ末端融合のライブラリがプロリン−リッチ型であることに比べて大きな相違が見られた。【００３４】
【表１】
2007114139.tif 000003
【００３５】
一方、クローニングにおけるオリゴヌクレチドのコドンから予測されるランダム配列におけるアミノ酸出現頻度は、技術的多様性（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）として定義され、クローニング後の生物学的なバイアスがなければ、コドンからのアミノ酸出現頻度は実測頻度に類似してくるはずである。コドン予測は６１コドンシステム（６１  ｃｏｄｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）より、頻度情報を百分率（％）で求めた。図１２にＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリにおけるアミノ酸出現頻度を、コドン予測と実測の頻度を比較した。その結果、理論値と実測値の相関係数はｒ＝０．８６１であり、両者間に正の相関関係が認められた。また、グリシンを除く２０アミノ酸残基での相関係数は  ｒ＝０．９０８であり、高い正の相関が認められた。この結果は、Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターを用いたランダムオリゴマーのクローニングでは、ファージ形成においてｐＩＩＩのトランスロケーション、分泌などの過程での生物学的なバイアスが少ないことを意味している。【００３６】
挿入できるペプチドサイズあるいはペプチドのデザインの多様性において、Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターの許容性を検討するため、いくつかのライブラリを構築した。ライブラリの作製はすべて、Ｍ１３ｙｔ４２ベクターのＢｓｔＸＩサイトにランダム配列を含む二本鎖ＤＮＡをクローニングして行った。挿入する二本鎖ＤＮＡは、ランダムオリゴヌクレチドをテンプレートにして２本のプライマーでＰＣＲを行い、生成する２本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断して作製した。各ライブラリ作製において使用したオリゴヌクレチドの組合せは次の通りである。ＸＣＸ１０Ｃライブラリはオリゴヌクレオチド番号＃３０８、オリゴヌクレオチド番号＃２９８、オリゴヌクレオチド番号＃３１０を、Ｘ４ＣＸ６Ｃライブラリではオリゴヌクレオチド番号＃３１１とオリゴヌクレオチド番号＃２９８とオリゴヌクレオチド番号＃３１０を、ＸＣＸ４ＣＸ４ライブラリではオリゴヌクレオチド番号＃３１２とオリゴヌクレオチド番号＃３０９とオリゴヌクレオチド番号＃２９９を、Ｘ４ＣＸ４ＣＸ４ライブラリではオリゴヌクレオチド番号＃２９７とオリゴヌクレオチド番号＃２９８とオリゴヌクレオチド番号＃２９９を使用した。ＸＣＸ１０Ｃライブラリの作製では、全長９０塩基対のＤＮＡ断片、３０アミノ酸残基のペプチドを挿入することができた。これらのライブラリの変異ｐＩＩＩのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を、配列番号８〜１５に示す。この結果、Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターは、ペプチドとｐＩＩＩ融合蛋白質によるランダムペプチドライブラリを作製するために十分な長さのペプチド、および多様な環状サイズのジスルフィド環状ペプチドを挿入することができることが判明した。【００３７】
４種類のライブラリについて適当に選択した５７クローンからのランダム配列部分のアミノ酸配列を、対応するＤＮＡ部分の塩基配列より決定した。ランダムアミノ酸配列の全ポシションにおけるアミノ酸の出現頻度を集計した結果を、表２に示す。これらのライブラリでのランダム配列部分のアミノ酸出現頻度と、クローニングしたＤＮＡより予測されるアミノ酸出現頻度の理論値を比較した。その結果を、図１３に示す。これらのライブラリにおいても、ＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣライブラリと同様にグリシンの出現頻度は多く、グリシン−リッチライブラリの性状を示した。アミノ酸出現頻度の実測値と理論値の相関係数はｒ＝０．８９１であり、両者間に高い正の相関が存在していた。このようにＭ１３ｙｔ４２ファージベクターを用いたランダムペプチドライブラリでは、クローニングするＤＮＡに対応したアミノ酸の出現頻度を示した。このことからＭ１３ｙｔ４２ファージベクターを用いたランダムオリゴマーのクローニングは、ファージ形成におけてｐＩＩＩのトランスロケーション、分泌などの過程での生物学的なバイアスが少ないことを意味している。【００３８】
【表２】
2007114139.tif 000004
【実施例１】
【００３９】
＜本明細書におけるＤＮＡ実験操作の方法＞
本明細書において特記しない限り、次のプロトコールに従って行った。Ｍ１３ファージの培養、Ｍ１３ファージの調製、大腸菌およびＭ１３ファージからＤＮＡの抽出、ＤＮＡとオリゴヌクレチドを用いた酵素反応、大腸菌の形質転換は用いる材料のメーカーのプロコールに沿って行い、メーカープロトコールがない場合は「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ」の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」にしたがって行った。【００４０】
ＤＮＡ塩基配列の決定は、ＡＬＦ  ＤＮＡシークエンサー（アマシャムバイオサイエンス社）あるいはＯｐｅｎ  Ｇｅｎｅ  ＤＮＡシークエンサーを用い、専用のキット試薬で行った。【００４１】
オリゴヌクレチドは、（株）グライナージャパンあるいはジーンネット（株）に依託合成した。各オリゴヌクレチドの塩基配列は、図１４に示す。なお＃は、オリゴヌクレオチド番号を示す。
【実施例２】
【００４２】
＜繊維状ファージでランダムペプチドを発現するベクター、Ｍ１３ｙｔ６の構築＞
Ｍ１３ＫＯ７の１本鎖ＤＮＡ（以下、ｓｓＤＮＡと略す）と図１４に示すオリゴヌクレチド番号＃１８６とＭｕｔａｎｔ  Ｋキット（Ｔａｋａｒａ  ６０６０、タカラバイオ株）を用いて、キットのプロトコールに従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異を行った。形質転換して得られた単一のプラークより、ファージ液、ＲＦ  ＤＮＡ，ｓｓＤＮＡを調製した。ＲＦ  ＤＮＡは、ＫｐｎＩあるいはＥｃｏＲＶの制限酵素切断で、各々８．７Ｋｂ、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩあるいはＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩの２ヶ所での制限酵素切断により、各々５．７Ｋｂおよび３．０ＫｂのＤＮＡ断片を同定した。更に、ｓｓＤＮＡで変異部位のＤＮＡ塩基配列を決定し、Ｍ１３ｙｔ６ファージを同定した。
【実施例３】
【００４３】
＜Ｍ１３ｙｔ６ベクターの制限酵素ＥｃｏＲＶとＫｐｎＩの２重切断ＤＮＡ断片の調製＞
Ｍ１３ｙｔ６ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ株）で切断したのち、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ株）切断し、８．７ＫｂのＥｏｃＲＶ−ＫｐｎＩの２重切断ＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離後、アガロースゲルよりＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ濃度は、コントロールＤＮＡ（λＨｉｎｄＩＩＩマーカー：ＴＯＹＯＢＯ）との０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドによる発色を比較して決定した。
【実施例４】
【００４４】
＜Ｍ１３ｙｔ２７（ソマトスタチン−１４ペプチドをディスプレイできるファージ）の作製＞
ソマトスタチン−１４ペプチドをコードするＤＮＡは、合成オリゴヌクレチドから作製した。具体的には、図１４に示すオリゴヌクレオチド番号＃１５５とオリゴヌクレオチド番号＃１５６の２本のオリゴヌクレチドを、各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。反応液を当量混合し、６５℃で３０分間加熱後、室温まで放冷し、ソマトスタチン−１４  ＤＮＡ溶液とした。８．７ＫｂのＭ１３ｙｔ６のＥｏｃＲＶ−ＫｐｎＩの２重切断ＤＮＡ断片（実施例３参照）と、ソマトスタチン−１４  ＤＮＡをリガーゼ反応に付した。リガーゼ反応液で大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。生じた単一プラークをスクリーニングし、Ｍ１３ｙｔ６のＥｃｏＲＶとＫｐｎＩ制限酵素部位間にソマトスタチン−１４  ＤＮＡが挿入しているプラークを選択した。その選択はプラークより調製したＲＦ  ＤＮＡの制限酵素ＢａｍＨＩ切断により、約８．８ＫｂのＤＮＡ断片を確認し、Ｍ１３ｙｔ２７と命名した。Ｍ１３ｙｔ２７ファージのｓｓＤＮＡを用いてＤＮＡ塩基配列を決定し、Ｍ１３ｙｔ２７ファージを同定した。
【実施例５】
【００４５】
＜Ｍ１３ｙｔ２７ファージのウエスタンブロッティングによるソマトスタチン−１４ペプチドのディスプレイ＞
Ｍ１３ｙｔ２７およびＭ１３ＫＯ７（ネガティブコントロール）の精製したファージの各々１０９ｐｆｕを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。分離したタンパク質を、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。１０％スキムミルクのＰＢＳ溶液で３７℃、３０分間の条件でフィルターをブロッキングした。フィルターを１次抗体として、４００倍希釈したウサギ抗ソマトスタチン−１４抗血清（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号ＣＡ−０８−３２５）で反応させた。洗浄後、２次抗体として、３０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号３８５９ＳＡ）で反応させた。洗浄後、ＨＲＰ発色キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させた。Ｍ１３ｙｔ２７ファージ由来のタンパク質には、５２ｋＤａの鮮明なバンドが現れた。一方、ネガティブコントロールのＭ１３ＫＯ７ファージ由来のタンパク質では、発色するバンドは全く認められなかった。
【実施例６】
【００４６】
＜マウス抗Ｍ１３ファージ抗血清の作製＞
常法に従ってＭ１３ｍｐ１８ファージ調整後、ファージ溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ファルマシア）のゲルろ過に付し、１０１４ｐｆｕ／ｍｌファージのＰＢＳ溶液を調製した。２００μｌのファージ液に、２００μｌのフロイントの完全アジュバント（フナコシ）を混和してＢａｌｂ／ｃ雌６週令のマウス（日本チャールズリバー）の腹腔に投与し、一回目の感作を行った。２週間隔で合計３回の感作を行った後、３０μｌのファージ液を静注投与してブーストした。ブースト後３日目に全採血を行い、遠心分離してその上清を抗血清とした。【００４７】
抗血清の性状は、ＥＬＩＳＡで検査した。１０１４ｐｆｕ／ｍｌファージのＰＢＳ溶液１００μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）に入れ、３７℃、１時間放置した。溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、１０％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液を１５０μｌ添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液で１０２から１０６倍希釈したマウス血清溶液を１００μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、３０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１７０−６５１６）の１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液を添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄し、更にＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＡＢＳＴ発色キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でキットのプロトコールに従って染色し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１５に示す。この抗血清は、コントロール血清に比べて１０５倍希釈以下の倍率で、Ｍ１３ｍｐ１８ファージに特異的な結合能をＥＬＩＳＡで示した。
【実施例７】
【００４８】
＜Ｍ１３ｙｔ２７ファージのＥＬＩＳＡによるソマトスタチン−１４ペプチドのディスプレイ＞
ウサギ抗ソマトスタチン−１４抗血清（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１００μｇを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ＝９．６、から成るコーティングバファー１ｍｌに溶解し、その溶液１００μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）に入れ、４℃で１２時間放置した。溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、１０％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を１５０μｌ添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、Ｍ１３ｙｔ２７あるいはＭ１３ＫＯ７（ネガティブコントロール）の精製したファージ溶液を、各々１０７ｐｆｕ／ウェルから１０１０ｐｆｕ／ウェル添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、１次抗体として４００倍希釈したマウス抗Ｍ１３ファージ抗血清（実施例６参照）の１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液を添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄後、２次抗体として３０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１７０−６５１６）の１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液を添加し、３７℃で１時間放置した。溶液を除去し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄し、更にＰＢＳ溶液で２回洗浄後ＡＢＳＴ発色キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でキットのプロトコールに従って染色し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図８に示す。Ｍ１３ｙｔ２７ファージは、ファージｐｆｕの容量依存的にウサギ抗ソマトスタチン−１４抗血清への結合量が増加した。
【実施例８】
【００４９】
＜Ｍ１３ｙｔ６ベクターにＢｓｔＸＩのクローニング部位を挿入したファージベクター、Ｍ１３ｙｔ４２の作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃２５０とオリゴヌクレオチド番号＃２５１の２本のオリゴヌクレチドを、各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。反応液を当量混合し、６５℃で３０分間加熱後、室温まで放冷し、挿入ＤＮＡ断片とした。８．７ＫｂのＭ１３ｙｔ６のＥｏｃＲＶ−ＫｐｎＩの２重切断ＤＮＡ断片（実施例３参照）と挿入ＤＮＡ断片をリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌にしてトップアガーでプラークを生成させた。単一プラークを培養し、ファージを調整し、ファージ粒子よりＲＦ  ＤＮＡを回収した。ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩおよびＸｂａＩで切断して、８．７ＫｂのＤＮＡ断片を示すクローンを選択した。そのクローンよりｓｓＤＮＡを調製し、ｓｓＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を決定し、Ｍ１３ｙｔ４２を同定した。
【実施例９】
【００５０】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣの作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃２５５とオリゴヌクレオチド番号＃２５６とオリゴヌクレオチド番号＃２５７の３本のオリゴヌクレチドを、各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。反応液を当量混合し、６５℃で１５分間加熱後、３７℃室温で１５分間、４℃で１０分間処理し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いる電気泳動で分離後、ゲルより８．７ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、ベクターＤＮＡとした。８．７ＫｂのＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片をリガーゼ反応に付し、その反応液で大腸菌ＭＣ１０６１をエレクロトポレーション法で形質転換し，大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。プレートよりファージ液を回収し、ファージライブラリＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣとした。
【実施例１０】
【００５１】
＜大腸菌のエレクロトポレーションによる形質転換＞
大腸菌の単一コロニーを、４ｍｌのＳＯＢ培地で３７℃にて終夜培養した。４００ｍｌのＳＯＢ培地に４ｍｌの終夜培養液を加え、３７℃で３時間培養し、菌体溶液のＯＤ６２０＝０．５１に達したところで培養液を４℃に冷却した。菌体を４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を４００ｍｌの滅菌水で懸濁後、４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を２００ｍｌの滅菌水で懸濁後、４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を１００ｍｌの滅菌水で懸濁後、４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を４０ｍｌの１０％グリセロール溶液で懸濁後、４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を１４ｍｌの１０％グリセロール溶液で懸濁後、４５００ｒｐｍで１５分間、４℃で集め、上清を除いた。菌体を４ｍｌの１０％グリセロール溶液で懸濁後、２００μｌずつ分注し、ドライアイスで凍結させ、コンピーテントセルとし、−８０℃で保存した。【００５２】
２００μｌのコンピーテントセルを４℃に解凍し、０．２ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ）に移した。コンピーテントセルにリガーゼ反応液を１μｌを混和し、遺伝子導入装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）で２．５ｋＶ，４００Ω，２５μＦのパルスをかけた。プラーク作製時は形質転換溶液の培地で希釈し、その希釈液０．１ｍｌに対して指示菌を０．２ｍｌ、Ｈトップアガーを０．５ｍｌ添加して、Ｈアガープレートにまき、３７℃、終夜培養した。一方、コロニー形成では、形質転換溶液に１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間培養した。その適量をＬＢアガープレートにまき、３７℃で終夜培養した。
【実施例１１】
【００５３】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣの作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃２５５とオリゴヌクレオチド番号＃２５６とオリゴヌクレオチド番号＃２５７の３本のオリゴヌクレチドを、各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。反応液を当量混合し、６５℃で１５分間加熱後、３７℃室温で１５分間、４℃で１０分間処理し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いる電気泳動で分離後、ゲルより８．７ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、ベクターＤＮＡとした。Ｍ１３ｙｔ４２のＢｓｔＸＩの切断ＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片を１：４のモル比でリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９をＣａ法で形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。形質転換１回当たりのタイターは、１４８，２００であった。形質転換を繰り返し、ファージライブラリＣＫＮＦＸ４ＦＴＳＣを作製した。
【実施例１２】
【００５４】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＸ４ＣＸ４ＣＸ４の作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃２９７とオリゴヌクレオチド番号＃２９８とオリゴヌクレオチド番号＃２９９の３本のオリゴヌクレチドを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７５℃で１分間を１サイクルとし、２５サイクル行い、最後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ反応液を、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断した。反応液を４％から２０％のポリアクリルアミドゲル（第一化学、プレキャストゲル）で分離後、６５ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、８．７ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルを用いる電気泳動で分離後、ゲルより回収し、ベクターＤＮＡとした。Ｍ１３ｙｔ４２のＢｓｔＸＩの切断ＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片を１：４のモル比でリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９をＣａ法で形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。プレートよりファージ液を回収し、ファージライブラリＸ４ＣＸ４ＣＸ４とした。
【実施例１３】
【００５５】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＸＣＸ１０Ｃの作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃３０８とオリゴヌクレオチド番号＃２９８とオリゴヌクレオチド番号＃３１０の３本のオリゴヌクレチドを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７５℃で１分間を１サイクルとし、２５サイクル行い、最後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ反応液を、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断した。反応液を４％から２０％のポリアクリルアミドゲル（第一化学、プレキャストゲル）で分離後、６５ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、８．７ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルの電気泳動で分離後、ゲルより回収し、ベクターＤＮＡとした。Ｍ１３ｙｔ４２のＢｓｔＸＩの切断ＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片を１：４のモル比でリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９をＣａ法で形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。プレートよりファージ液を回収し、ファージライブラリＸＣＸ１０Ｃとした。
【実施例１４】
【００５６】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＸ４ＣＸ６Ｃの作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃３１１とオリゴヌクレオチド番号＃２９８とオリゴヌクレオチド番号＃３１０の３本のオリゴヌクレチドを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７５℃で１分間を１サイクルとし、２５サイクル行い、最後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ反応液を、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断した。反応液を４％から２０％のポリアクリルアミドゲル（第一化学、プレキャストゲル）で分離後、６５ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、８．７ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルの電気泳動で分離後、ゲルより回収し、ベクターＤＮＡとした。Ｍ１３ＫＯ７ｙｔ４２のＢｓｔＸＩの切断ＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片を１：４のモル比でリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９をＣａ法で形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。プレートよりファージ液を回収し、ファージライブラリＸ４ＣＸ６Ｃとした。
【実施例１５】
【００５７】
＜Ｍ１３ｙｔ４２ファージベクターにランダムペプチドをコードするＤＮＡを挿入したファージライブラリＸＣＸ４ＣＸ４の作製＞
オリゴヌクレオチド番号＃３１２とオリゴヌクレオチド番号＃３０９とオリゴヌクレオチド番号＃２９９の３本のオリゴヌクレチドを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７５℃で１分間を１サイクルとし、２５サイクル行い、最後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ反応液を制限酵素ＢｓｔＸＩで切断した。反応液を４％から２０％のポリアクリルアミドゲル（第一化学、プレキャストゲル）で分離後、８７ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、挿入ＤＮＡ断片とした。Ｍ１３ｙｔ４２  ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、８．７ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルの電気泳動で分離後、ゲルより回収し、ベクターＤＮＡとした。Ｍ１３ｙｔ４２のＢｓｔＸＩの切断ＤＮＡ断片と挿入ＤＮＡ断片を１：４のモル比でリガーゼ反応を行い、その反応液で大腸菌ＪＭ１０９をＣａ法で形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９を指示菌としてプラークを作製した。プレートよりファージ液を回収し、ファージライブラリＸＣＸ４ＣＸ４とした。
【実施例１６】
【００５８】
＜ファージライブラリの同定＞
形質転換後の単一プラークより、ＲＦ  ＤＮＡおよびｓｓＤＮＡを抽出した。ＲＦ  ＤＮＡおよびその制限酵素切断したＤＮＡは、０．８％アガロース電気泳動によりＤＮＡサイズを同定した。ｓｓＤＮＡはＤＮＡ塩基配列を決定し、所望のＤＮＡ配列を有することを同定した。ファージライブラリは混合したクローンとして、保存したファージ液を増幅してＲＦ  ＤＮＡおよびその制限酵素切断したＤＮＡについて、０．８％アガロース電気泳動によりＤＮＡサイズを同定した。
【図１】
2007114139.tif 000005
【図２】
2007114139.tif 000006
【図３】
2007114139.tif 000007
【図４】
2007114139.tif 000008
【図５】
2007114139.tif 000009
【図６】
2007114139.tif 000010
【図７】
2007114139.tif 000011
【図８】
2007114139.tif 000012
【図９】
2007114139.tif 000013
【図１０−１】
2007114139.tif 000014
【図１０−２】
2007114139.tif 000015
【図１１】
2007114139.tif 000016
【図１２】
2007114139.tif 000017
【図１３】
2007114139.tif 000018
【図１４】
2007114139.tif 000019
【図１５】
2007114139.tif 000020
【配列表】
2007114139000001.app
【国際調査報告】
2007114139.tif 000021
2007114139.tif 000022
2007114139.tif 000023
2007114139.tif 000024