(57)【要約】  メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドとメチル化シトシンを含まないオリゴデオキシリボヌクレオチドを動物に投与する工程を含むことを特徴とする抗メチル化DNA抗体の作製方法を提供する。この方法によって作製された抗体は、メチル化シトシンを含むDNAを生体成分に近い状態で検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化シトシンを含む二本鎖DNAと結合する抗体。
【請求項２】
メチル化シトシンを含まないDNAとは結合しない請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、ポリクローナル抗体である請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項５】
メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドとメチル化シトシンを含まないオリゴデオキシリボヌクレオチドを動物に投与する工程を含むことを特徴とする抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【請求項６】
メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドが、タンパク質と結合していることを特徴とする請求項５に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【請求項７】
動物が、哺乳動物であることを特徴とする請求項５又は６に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【請求項８】
オリゴデオキシリボヌクレオチドを投与した動物から血清を採取する工程、採取した血清から抗メチル化DNA抗体以外の抗体を除去する工程を含むことを特徴とする請求項５乃至７のいずれか一項に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【請求項９】
オリゴデオキシリボヌクレオチドを投与した動物から脾細胞を採取する工程、採取した脾細胞とミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマを作製する工程を含むことを特徴とする請求項５乃至７のいずれか一項に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗メチル化DNA抗体及びその作製方法に関する。本発明の抗体を用いることにより、DNAのメチル化状態を正確に調べることができるようになる。【０００２】
DNAのメチル化は、正常な細胞の発生・維持、ひいては異常な細胞が生じ、その形質を維持する結果として生じる癌などの疾病の発症と維持まで深く関わっており、DNAのメチル化状態を調べることは、生命現象を理解する上で重要な情報を提供する。またDNAのメチル化状態を調べることにより、細胞が正常か異常かを診断することが出来る。さらにDNAのメチル化を制御することにより、異常な細胞を正常に戻す、つまり治療を行うことが出来る。すなわちDNAのメチル化状態を調べることは、産業上大きな利用価値がある。
【背景技術】
【０００３】
エピジェネティクスとは「塩基配列の変化（変異）を伴わず細胞世代を超えて継承される遺伝子機能の変化、またはこの現象を研究する学問領域」であり、同一の遺伝情報（ゲノム）を持ちながら個々の細胞が異なる形質を維持するシステムを解明する研究を含む。エピジェネティクス研究は、ヒトやマウスの全ゲノム塩基配列が決定され、ポストゲノム時代に突入した生命科学研究の重要領域の一つである。エピジェネティクな遺伝子調節の主な分子機構は、DNAメチル化とヒストンの修飾である。【０００４】
哺乳類を含む脊椎動物において、CpGジヌクレオチドのシトシン（Ｃ）の第5位に起こるメチル化は、ゲノムDNAに観察される唯一の修飾であり、遺伝子の活性調節に強く関わっている。すなわち遺伝子の発現が強く抑制されているレトロトランスポゾンなどのリピート配列、セントロメアなどではDNAは強くメチル化されており、染色体は、クロマチンが凝集したヘテロクロマチンを形成している。ヒトやマウス等の哺乳類では、ゲノムCpGのほぼ70-80％がメチル化されている一方で、CpGアイランドと呼ばれる、CpGの出現頻度が高い領域が、恒常的に発現する遺伝子領域のプロモータや第一エクソン周辺に見いだされ、遺伝子発現の標識として機能すると考えられてきた。【０００５】
しかし、CpGアイランドに焦点を当て、各組織、発生段階の異なる組織、細胞のDNAのメチル化状態をゲノムワイドに解析することにより、組織・細胞特異的に発現する遺伝子領域には、組織・細胞特異的に異なるメチル化状態を現す領域（T-DMR）が存在し、T-DMRのメチル化の状態が組織・細胞特異的遺伝子の発現調節に深く関わっていることが分かってきた。またゲノム全域にあるT-DMRのメチル化状態のパターンからなる、細胞・組織特異的なDNAメチル化プロフィールの維持、形成が正常な発生・細胞分化に重要であることが示されて来ている。【０００６】
異常なメチル化が重要な発癌機構の一つであることは、癌細胞・患者検体を用いたp16やp53などの癌抑制遺伝子のメチル化状態を解析することにより示されている。メチル化の異常は特定の遺伝子座のみに観察されるのではなく、癌細胞、発癌の前段階の細胞群ではDNAのメチル化状態はゲノム全体的に低メチル化状態にある。すなわちDNAのメチル化は発癌、発癌後の癌細胞の増殖に深く関わっていると考えられる。【０００７】
近年、成体の核を卵に人工的に導入する核移植によって成体まで個体発生させることが可能となった。この核移植によって生まれたクローン動物では、短命、肥満、腎異常等の異常が高頻度に発生する。クローン動物のゲノムDNAのメチル化状態をゲノムワイドに調べると、複数の箇所でDNAのメチル化状態に異常が認められた。これらの結果はいずれも、DNAのメチル化プロフィールの形成と維持が細胞、生体を正常な状態を保つのに重要であり、DNAメチル化プロフィールの異常と疾患の関係を強く示唆している。【０００８】
DNAのメチル化状態を調べる方法としては、メチル化されているか否かで切断効率が変化する制限酵素を用い、切断部位にタグ（または標識）を導入し、切断した断片を適当な方法で分画した後にタグ（標識）を検出する方法、タグは導入しないが、断片に対するプローブを用い、切断断片の分画パターンを比較する方法、タグを起点にPCR等で増幅し、増幅した断片を解析する方法、メチル化されたシトシンとされていないシトシンの薬剤に対する感受性、すなわちメチル化シトシンはバイサルファイト反応に対して抵抗性を示すことを利用し、バイサルファイト反応後の断片を増幅後、解析する方法がある。【０００９】
いずれの方法も、ゲノムワイドに解析するという視点にたったとき、解析可能な領域が限られてくることが問題である。例えば制限酵素を利用するRLGS法では、解析可能な遺伝子領域は約2000ヶ所であり、遺伝子の数が約20,000〜40,000とすると、たとえ均等に解析されているとしても5%〜10%の領域しか解析できないことになる。一方PCRを組み合わせる場合は、特定の遺伝子領域に注目する場合には有効であるが、複数の箇所を解析する方法にするためには、諸課題がある。網羅的な解析には、さらに異なる方法を組み合わせることが必要である。【００１０】
メチル化シトシンを直接検出する、もしくはメチル化シトシンを目印にDNA断片を分けることにより、DNAのメチル化の状態を調べる方法が考えられる。例えばメチル化シトシンの有無によりDNAを分別し、分別した断片を解析する方法である。この方法であれば、制限酵素を用いる場合に比べて配列の偏りが少ないことが期待され、より網羅的な解析が可能となる。この方法を用いる場合の最大の課題はメチル化シトシンをいかに効率良く目印として利用し検出するかにある。【００１１】
抗原抗体反応は、特異的な分子認識機構として広く用いられている。メチル化シトシンに対する抗体も報告されている。すなわちメチルシチジンのリボースを開環し、キャリアである蛋白質に共有結合させる(Erlanger and Beiser 1964)ことによりメチル化シトシンをハプテン化し、それを抗原として用いることによって抗体を誘導した(Vilpo, Rasi et al. 1984; Reynaud, Bruno et al. 1992; Itoh, Aida et al. 1995)。しかしこの抗体には分子認識という大きな問題がある。キャリアと結合させるためにリボースを開環しているため、抗体はメチル化シトシンを認識する抗体であっても、メチル化シトシンを含むDNAに対する抗体ではない。そのため、検出にはDNAを熱、酸、アルカリ処理等の物理化学的な手法で変性させ、メチル化シトシンを露出させる必要がある。この抗体の大きな問題は、生体内の二本鎖DNAにあるメチル化シトシンを、その本来の状態、すなわち二本鎖のままで検出しがたいことである（非特許文献１、非特許文献２）。【００１２】
【非特許文献１】Vilpo, J. A., S. Rasi, et al. (1984). "Radioimmunoassay of 5-methyl-2'-deoxycytidine. A method for the quantitation of DNA methylation." J Immunol Methods 75(2): 241-6.
【非特許文献２】Hernandez-Blazquez, F. J., M. Habib, et al. (2000). "Evaluation of global DNA hypomethylation in human colon cancer tissues by immunohistochemistry and image analysis." Gut 47(5): 689-93.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願発明の課題は、メチル化されているCpG（メチル化シトシン・グアニン・ジヌクレオチド）を含み、生体成分に近い状態のDNAに対する抗体を作製することである。
しかし、この課題を達成するにあたり大きな問題がある。すなわち哺乳類のゲノムDNAにあるCpGのほとんどがメチル化されている。もともとDNAは自己成分であり、またメチル化されているDNAも自己成分である。哺乳類の免疫系は自己成分に対しては免疫寛容であり、抗体の産生が起こらない。すなわちメチル化CpGを含むDNAに対する抗体は、脊椎動物を宿主に免疫する限り産生させることは困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、免疫抗原、免疫方法、スクリーニング抗原を改良することにより、健常な哺乳類の個体を宿主に、メチル化CpGを含むDNAに対する抗体を産生することに成功した。産生された抗体は、従来から知られているメチル化シトシンに対する抗体とは異なり、メチルシチジンを含む変性していないDNA断片に対し、変性した断片に対するのと同等に強く反応することを確認した。【００１５】
本発明の課題を解決する方法について説明を加える。メチル化していないCpGを含む一本鎖DNA断片は強い免疫賦活化活性を示す(Krieg, Yi et al. 1995)。これはメチル化していないCpGを含む一本鎖DNAを特異的に認識する、主にpDC細胞に発現しているTLR9を介した反応である(Hemmi, Takeuchi et al. 2000)。pDC細胞とは抗原提示を主な役割とする細胞であり、TLR9により自然免疫反応が誘導され、各種サイトカインが誘導される(Akira and Hemmi 2003)。【００１６】
メチル化していないCpGを含むDNA断片の免疫賦活化活性は、配列に依存してTh1サイトカイン、Th2サイトカインを誘導することが示されている。そのためTh1/Th2バランスの異常によって起こると考えられているアレルギー、自己免疫疾患などの免疫疾患の治療法への応用が多く検討されている。【００１７】
一方メチル化していないCpGを含む一本鎖DNAの投与によりTh1/Th2バランスを変動できることに着目し、免疫疾患の病態を誘導する試みがなされている。それ自体強い抗原性を持つHEL（卵白リゾチーム）の遺伝子を組み込んだTgマウスを用い、HEL抗原に対し自己寛容にした後に、メチル化していないCpGを含むDNA断片とともに抗原を免疫し、抗体が誘導できることが報告されている。このように組換え生物であるトランスジェニックマウスを用いた非常に特殊な例ではあるが、自己成分に対する抗体が誘導可能であることが示されている(Wang and Krieg 2004)。【００１８】
同様にウシ胸腺DNAを免疫原として、メチル化していないCpGを含むDNA断片とともにマウスを免疫し、抗DNA抗体が誘導できたことが報告されている(Pisetsky, Wenk et al. 2001; Tran, Reich et al. 2003)。誘導された抗体はメチル化されていない大腸菌DNA、ほとんどのCpGがメチル化されていると考えられるウシ胸腺DNAに対し、同様の強さで共に強く反応していた。この結果は、このような免疫方法で自己成分であるDNAを免疫原として用いる場合に、誘導された抗体は種特異性のない抗DNA抗体が誘導できることを示している。その一方、大腸菌DNA、ウシ胸腺DNAに対し、全く同等の反応を示したことは、メチル化しているCpGに対する抗体がほとんど誘導出来ていないことを示している(Tran, Reich et al. 2003)。【００１９】
本発明では、課題とするメチル化シトシンを含むDNAに対する抗体を得るために、本来自己成分であるものを、非自己として認識させるために、アジュバントとしてメチル化していないシトシン・グアニン・ジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いる。この際上記のように哺乳類のDNAをそのまま用いたのでは、目的の抗体が得られないことは既に明白である。これを解決するために、メチル化シトシンを含むオリゴヌクレオチドを免疫原と用いた。これにより、課題の抗体を得ることに成功し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。【００２０】
（１）メチル化シトシンを含む二本鎖DNAと結合する抗体。
（２）メチル化シトシンを含まないDNAとは結合しない（１）に記載の抗体。
（３）抗体が、ポリクローナル抗体である（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体が、モノクローナル抗体である（１）又は（２）に記載の抗体。
（５）メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドとメチル化シトシンを含まないオリゴデオキシリボヌクレオチドを動物に投与する工程を含むことを特徴とする抗メチル化DNA抗体の作製方法。
（６）メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドが、タンパク質と結合していることを特徴とする（５）に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
（７）動物が、哺乳動物であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
（８）オリゴデオキシリボヌクレオチドを投与した動物から血清を採取する工程、採取した血清から抗メチル化DNA抗体以外の抗体を除去する工程を含むことを特徴とする（５）乃至（７）のいずれかに記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
（９）オリゴデオキシリボヌクレオチドを投与した動物から脾細胞を採取する工程、採取した脾細胞とミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマを作製する工程を含むことを特徴とする（５）乃至（７）のいずれかに記載の抗メチル化DNA抗体の作製方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗体により、メチル化シトシンを含むDNAを、生体成分に近い状態で検出することが可能になる。これにより、DNAのメチル化状態を従来以上に正確かつ詳細に調べることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】メチル化ODNとキャリアタンパク質との化学結合を模式的に表した図。R1がキャリアタンパク質を表わす。
【図２】家兎免疫血清のメチル化ODNに対する反応性を示した図。
【図３】家兎4血清のSssIメチラーゼ処理された大腸菌DNAに対する反応性を示した図。
【図４】家兎４の免疫血清及び従来の抗メチル化シトシン抗体の熱処理DNA（一本鎖DNA）及び非熱処理DNA（二本鎖DNA）に対する反応性を示した図。黒色のバーは家兎４の免疫血清の反応性を示し、白色のバーは従来の抗メチル化シトシン抗体の反応性を示す。
【図５】マウス血清（希釈倍率1000倍）の熱変性処理を施していないDNAに対する反応性を示した図。黒色のバーはマウス肝臓DNAに対する反応性を示し、白色のバーは大腸菌（JM110）DNAに対する反応性を示す。
【図６】マウスモノクローナル抗体のマウスDNAおよび大腸菌DNAに対する反応性を示した図。黒色のバーはマウスDNAに対する反応性を示し、白色のバーは大腸菌DNAに対する反応性を示す。
【図７】マウスゲノムDNAの熱変性処理がマウスモノクローナル抗体との反応性に与える影響を示した図。黒色のバーは熱変性処理DNAに対する反応性を示し、白色のバーは熱変性未処理DNAに対する反応性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体は、メチル化シトシンを含む二本鎖DNAと結合する抗体である。
前述したようにメチル化シトシンに対する抗体は以前から知られていたが（例えば、前述した非特許文献１及び非特許文献２）、これはDNAを変性させ、メチル化シトシンを露出させて初めて結合できるものであった。メチル化シトシンを含むDNAを変性させず、二本鎖の状態のままで実用的なレベルで結合可能な抗体は、本発明者によって初めて作り出されたものである。【００２４】
本発明の抗体は、メチル化シトシンを含むDNAと結合するものであればどのようなものでもよいが、メチル化シトシンを含まないDNAとは結合しない抗体が好ましく、また、メチル化シトシンを含む二本鎖DNAに対して、メチル化シトシンを含む一本鎖DNAと同様の強さで結合する抗体が好ましい。ここで、「メチル化シトシンを含む一本鎖DNAと同様の強さで結合する」とは、例えば、一本鎖DNAに対する結合性の５０％以上の結合性を示すことをいう。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも含み、また、ヒト化抗体も含む。【００２５】
本発明の抗メチル化DNA抗体の作製方法は、メチル化シトシンを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、「メチル化ODN」という）とメチル化シトシンを含まないオリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、「アジュバントODN」という）を動物に投与する工程を含むことを特徴とするものである。なお、上述した本発明の抗体は、ここでいう「抗メチル化DNA抗体」に含まれる。
メチル化ODNはそのまま投与してもよいが、免疫原性を高めるため、メチル化したオリゴヌクレオチドの構造を変化させないようにタンパク質と結合した状態で投与することが好ましい。タンパク質としては、免疫原性を持つものであればよく、ウシ血清アルブミン、KLH（スカシガイ・ヘモシアニン）、卵白アルブミン等を用いることができる。【００２６】
メチル化ODNの長さは特に限定されないが、10〜50塩基の範囲内であることが好ましく、20〜30塩基の範囲内であることが更に好ましい。
メチル化ODNの塩基配列もメチル化シトシン・グアニン・ジヌクレオチドを含み、メチル化されていないシトシン・グアニン・ジヌクレオチドを含まない限り特に限定されない。メチル化ODN中に含まれるメチル化シトシンの個数は特に限定されないが、複数箇所存在することが好ましい。【００２７】
アジュバントODNは、天然型のオリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよいが、ホスホロチオエート化したオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。
アジュバントODNの長さは免疫賦活化活性を持つ範囲内であれば特に限定されないが、10〜50塩基の範囲内であることが好ましく、20〜30塩基の範囲内であることが更に好ましい。
メチル化ODNと共に、アジュバントODNとは別のアジュバント等を投与してもよい。このようなアジュバント等としては、Toll様受容体-9(TLR-9)を介して作用しないものが好ましく、例えば、不完全フロイントアジュバント、アラム、Oil等が好ましい。【００２８】
メチル化ODN等を投与する動物の種類は特に限定されない。実施例では、家兎、マウスを用いて抗体を得ているが、CpGを含むオリゴヌクレオチドのアジュバント活性は、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラットなどの動物でも確認されていることから(Kandimalla, Bhagat et al. 2003; Nichani, Kaushik et al. 2004)、少なくとも、これらの動物は投与対象とすることができる。また、これらの動物に限らず、哺乳動物一般を投与対象とすることもできる。
メチル化ODN等の投与量は、投与対象とする動物の種類に応じて決めればよく、その量は特に限定されない。家兎に投与する場合であれば、一回当りのメチル化ODNの投与量は1μg〜1mg、アジュバントODNの投与量は10μl〜1ml程度とすることができる。【００２９】
メチル化ODN等の投与は、1〜8週間程度の間隔を空け、2〜10回程度投与すればよい。
本発明の抗メチル化DNA抗体の作製方法は、メチル化ODNとアジュバントODNを動物に投与する工程を含んでいれば、その他の工程はどのようなものであってもよい。【００３０】
例えば、メチル化ODN等を投与した動物から血清を採取し、その血清からに抗メチル化DNA抗体以外の抗体を除去し、メチル化DNAに対するポリクローナル抗体を作製してもよい。ここで、除去の対象となる抗体としては、メチル化していないDNAに対する抗体、免疫する際に含まれる夾雑物、例えば、メチル化ODNと結合しているタンパク質（キャリヤタンパク質）に対する抗体などが挙げられる。これら抗体を除去する方法としては、例えば、メチル化していないDNAを結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、非結合分画を回収することにより、メチル化していないDNAに対する抗体を除くことが可能であり、同様にキャリアに用いたタンパク質を結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、非結合分画を回収することにより、キャリアに対する抗体を除くことが可能である。【００３１】
また、メチル化ODN等を投与した動物から脾細胞を採取し、その脾細胞とミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマを作製し、メチル化DNAに対するモノクローナル抗体を作製してもよい。メチル化シトシンを含むDNAに対する抗体を産生する細胞株は、メチル化シトシンを含まないDNAには反応せず、メチル化シトシンを含むDNAに反応することを指標に容易に選択することが出来る。【００３２】
更に、メチル化ODN等を投与した動物の脾細胞のmRNAを回収し、それを材料に遺伝子組換え法を利用し、さらにメチル化シトシンを含まないDNAには反応せず、メチル化シトシンを含むDNAに反応することを指標として、選択を行うことにより、抗メチル化DNA抗体のcDNAを単離することができ、それをもとにした組換え抗体を作製することが出来る(Holliger and Hudson 2005; Hoogenboom 2005)。さらに常法に従えば、ヒト型のメチル化シトシンを含むDNAに反応するモノクローナル抗体を樹立することも出来る(Lonberg 2005)。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００３４】
〔実施例１〕  オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成とDNAの調製
アジュバントODNは以下の配列を持ち、ホスホロチオエート化（S化）したものを用いた。合成はホスホアミダイト法により行い、HPLCカラムを用いて精製した。なお合成はシグマジェノシス社に依頼した。
メチル化ODNは、以下の配列を持ち、ホスホアミダイト法により合成し、HPLCカラムにより精製した。なお合成はシグマジェノシス社に依頼した。
【表１】
2007119518.tif 000002
大腸菌、マウス肝臓からのDNAの調整は、Wizard SV Genome DNA kit（Promega）を用い、メーカーの推奨する方法に従い調製した。DNAをHeaIIIにて切断したものを抗体価測定に使用した。DNAの濃度は260nmにおける吸光度を基に算出した。【００３５】
〔実施例２〕  免疫原［メチル化ODN-BSAコンジュゲート］の作製
メチル化ODN-BSAコンジュゲートの合成反応の概略を図１に示す。10 mg/ ml [リン酸バッファー (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3, pH 7.5)] ウシ血清アルブミン(BSA)溶液1mlに、25 μlの20 mM SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate; Pierce)を加えて室温で2時間インキュベートした。NAP-10 Column (Amersham Bioscience)で未反応のSPDPを除き1.5 mlのリン酸バッファーで溶出した後、24 mg/ml [酢酸ナトリウムバッファー [100 mM sodium acetate, 100 mM 100 mM NaCl, (pH 4.5)、1mM DTT] に調製した標識BSAを750 μl 加えて室温で1時間インキュベートした。NAP-25 Column（アマシャムバイオサイエンス）を用いて3.5 mlのリン酸バッファーに交換し、その一部を後述するメチル化ODNとのコンジュゲートに使用した（BSA-SPDP）。
5 mg/ ml [リン酸バッファー (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0)]となるように希釈したメチル化ODN 180 μlに、10 mM EMCS (N-[ε-maleimidocaproyloxy]succinimide ester；同仁化学)を20 μl加え、室温で2時間インキュベートした。NAP-10 Column（アマシャムバイオサイエンス）で未反応のEMCSを除き1.5 mlのリン酸バッファー (pH 7.0)で溶出した後、231 μlのBSA-SPDPを加えて室温で1時間インキュベートした。最後にCentricut20 (コスモバイオ)を用いて濃縮した後NAP-10 Columnで1.5 mlのリン酸バッファー (pH7.0)に交換し、メチル化ODN-BSAコンジュゲート （以下「BSAmODN」という）を得た。濃度はBCA Protein Assay Reagent (Pierce)を用いて測定した。【００３６】
〔実施例３〕  家兎の免疫
20μgのBSAmODN、20μgのアジュバントODN（ODN2007）をフロイントの不完全アジュバントとともにエマルジョン化させ、家兎（白色日本種）に皮内免疫した。2週間ごと5回免疫した後に全血採取し常法に従い血清を分離した。【００３７】
〔実施例４〕  抗体価測定抗原［メチル化ODN-OVAコンジュゲート］の作製
10 mg/ ml [リン酸バッファー (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3, pH 7.5)] 卵白アルブミン(OVA) 1mlに、25 μlの20 mM SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate; Pierce)を加えて室温で2時間インキュベートした。NAP-10 Column (Amersham Bioscience)で未反応のSPDPを除き1.5 mlのリン酸バッファーで溶出した後、24 mg/ ml [酢酸ナトリウムバッファー [100 mM sodium acetate, 100 mM 100 mM NaCl, (pH 4.5)、1mM DTT］ に調製した標識OVA 溶液750 μl を加えて室温で1時間インキュベートした。NAP-25 Columnを用いて3.5 mlのリン酸バッファーに交換し、その一部を後述するメチル化ODNとのコンジュゲートに使用した（OVA-SPDP）。
5 mg/ ml [リン酸バッファー (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0)]となるように希釈した メチル化ODN 180 μlに、10 mM EMCS (N-[ε-maleimidocaproyloxy]succinimide ester)を20 μl加え、室温で2時間インキュベートした。NAP-10 Columnで未反応のEMCSを除き1.5 mlのリン酸バッファー (pH 7.0)で溶出した後、231 μlのOVA-SPDPを加えて室温で1時間インキュベートした。最後にCentricut20 (コスモバイオ)を用いて濃縮した後NAP-10 Columnで1.5 mlのリン酸バッファー (pH7.0)に交換し、メチル化ODN-OVAコンジュゲート（以下、「OVAmODN」という）を得た。濃度はBCA Protein Assay Reagent (Pierce)を用いて測定した。【００３８】
〔実施例５〕  ELISAによる抗体価の測定
メチル化ODNとOVA、BSAのコンジュゲート、メチル化ODNの結合していない各蛋白質は、PBSにより2.5μg/mlとなるように希釈した。希釈した抗原をヌンク社のMaxisorbマルチモジュールプレートにウェルあたり100μｌのせ、室温に2時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり100μｌのブロッキング液［0.5％カゼイン、TBS］を加え室温に4時間静置し抗原をプレートに固定した。
DNAを固相化する場合は、DNAを3μg/mlとなるように滅菌水に希釈したものをヌンク社のCova-linkマルチモジュールプレートにウェルあたり50μｌ分注した。そこに100 mMの1-methyl-imidazole (pH7.0)を37.5μｌ、10 mMの1-methyl-imidazole (pH7.0)溶液に10  mMとなるように希釈したEDC（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）を12.5μｌ加え、50℃にて4時間〜一夜保温しDNAを共有結合させた。Wellを0.1% Tween20を含むTBS（T-TBS） にて洗浄した後ウェルあたり100μｌのブロッキング液［0.5％カゼイン、T-TBS］を加え4℃に一夜静置した。
各ウェルに検体希釈液［0.1％カゼイン、TBS］によって希釈したウサギ血清100μｌを加え1時間静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むTBSで洗浄した後、100μｌのホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識された抗ウサギIgG抗体を加え、1時間静置した。ウェルを0.1% Tween20を含むTBSで洗浄した後、OPD発色液（シグマ）を100μｌ加え30分インキュベートした後、2N硫酸液を加えた後、490nmにおける吸光度を計測した。【００３９】
〔実施例６〕  抗メチル化シトシンDNA抗体の確認
BSAmODNを実施例に従い免疫した家兎5匹から回収した血清中の抗体の反応性をELISAにて確認した。免疫原であるBSAmODN、及びBSAには、免疫前の血清は反応を示さず、免役後5週（結果は示していない）、8週のいずれの血清も強い反応を示した（図２）。しかし、その反応性には差があり、BSAmODNにより強い反応を示した。同様に、OVAmODNに対しても、反応の強弱に個体差はあるものの、免疫前の血清は反応を示さず、免役後5週（結果は示していない）、8週のいずれの血清も強い反応を示した（図２）。一方メチル化したODNを結合していないOVAには反応しない。これらの結果は免疫により、メチル化ODNに対する抗体が産生されされていることを示している。
以下の検討は、上記の検討で抗体価の高かった家兎４の血清を用いて行った。CpGのCのみがメチル化しているDNAに対する抗体は以下の検討により確認した。SssI DNA methylaseはCpGのCのみ特異的にメチル化する酵素である。CpGが全てメチル化されていない2本鎖DNAとして大腸菌JM110から調製したDNA断片を用いた。このDNAを基質にSssIメチラーゼ処理を施し、処理断片とSssIメチラーゼ未処理の断片に対する反応をELISAにより比較した（図３）。SssIメチラーゼ処理断片に対する反応の著しい反応の上昇が確認された。この結果からCpGのCがメチル化しているDNA断片に対する抗体が産生されていることを確認した。【００４０】
〔実施例７〕  従来の抗メチル化シトシン抗体との反応性の違い
哺乳類のゲノムDNA中のCpGにあるCのほとんどはメチル化されている。一方大腸菌ゲノムDNAのシトシンはメチル化されていない。マウスの肝臓から精製したDNAと大腸菌JM110株から精製したDNAに対する反応性をELISAにて確認した（図４）。家兎４から得られた免疫血清は、大腸菌JM110株に対するよりもマウス肝臓DNAにより強い反応を示しており、この結果はメチル化されているDNAに対する抗体が産生されていることを強く支持するものである。一方、従来の抗メチル化シトシン抗体は熱処理をしていない断片にはほとんど反応しない。
次にDNAの熱変性による反応性の違いの有無により検討した。従来の抗メチル化シトシン抗体は、熱変性したマウス肝臓DNA（一本鎖）に強い反応を示し、熱変性した大腸菌DNA（一本鎖）に対しては反応を示さないことから、熱変性したメチル化DNA（一本鎖）を認識していることが確認された（図４）。しかし熱変性していないマウス肝臓DNA（二本鎖）に対しては著しく反応性が低下した（図４）。その一方家兎４から得られた免疫血清は、熱変性の有無に関わらず強い反応性を示した（図４）。この結果は家兎４から得られた免疫血清が、従来の抗メチル化シトシンに対する抗体と全く異なる抗体を含むことを示している。【００４１】
〔実施例８〕  抗メチルDNA抗体の分画
実施例２に示す免疫法によって得た抗血清は大腸菌DNA、及びmODNを結合していないBSAいずれにも反応することから、抗DNA抗体、抗BSA抗体が含まれていることは明らかである。これら抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより除いた。
BSAの結合しているカラムはHi-trap NHS activated columnに、メーカーの推奨する方法に従いBSAを共有結合させることにより得た。大腸菌DNAが結合しているカラムは、CNBr activated sepharoseにメーカーの推奨する方法に従いDNAを共有結合させることによって得た。抗BSA抗体、抗DNA抗体の除去は、BSA、および大腸菌DNAに対する反応性をELISAにて調べることにより確認した。アフィニティークロマトグラフィーの非結合分画を集めることにより、抗BSA抗体価が91分の１まで低下しており、抗DNA抗体価は確認できないレベルまで低下していることを確認した。これらの工程により、抗メチル化DNAに対する抗体を精製することが出来た。
【表２】
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【００４２】
〔実施例９〕  マウスを用いた抗メチルDNA抗体の産生
実施例２に示す方法に従いマウスを免疫し、得られた抗血清の反応性を実施例６に示す方法により確認した。なおアジュバントODNとしてODN1826を用いた。免疫マウスから回収した抗血清は、大腸菌DNAにも反応するものの、マウス肝臓DNAにより強く反応しており、家兎同様に抗メチルDNA抗体が産生されていることが確認された（図５）。【００４３】
〔実施例１０〕抗メチル化オリゴヌクレオチド・マウスモノクローナル抗体産生株の樹立
融合３日前にBSAmODNを投与したマウスから脾細胞を摘出し、PBSにて遠心（1,200rpm  5min 室温）することにより洗浄した。脾細胞を含むペレットをRPMI1640培地（血清無し10ｍｌ）を加え懸濁した。細胞融合に備えて培養していたミエローマ細胞（ＳＰ２株）を回収し、RPMI1640培地を加え懸濁した。上記脾細胞とミエローマ細胞を５：１の比率で混合し、1,200rpm、 5min遠心し沈渣細胞を得た。（脾細胞：ミエローマ細胞） ＝ （５：１）＝（6.25×107cell ： 1.25×107cell）。50％PEGを加え、細胞融合を行わせた。1,200rpm において5min 遠心し、上清を廃棄した。10％FBS RPMI1640培地（10％BM-condimed H1・HAT入り）を50ｍｌ添加して懸濁し、マウス１匹あたり96well培養プレート５枚に、各wellに100μｌなるように播いた。  5日後に10％FBS-RPMI1640培地（10％BM-condimed H1・HAT無し）を各wellに100μｌずつ添加した。96well培養プレート（細胞入り）からオクタピペットを使用し、抗原（BSAmODN）を固相化した96well ELISAプレートに培養上清を分注した（1wellあたり100μｌ分注）。ELISA法にて陽性反応を呈した培養上清を生じさせる株をスクリーニングした。陽性反応を呈した培養上清は、さらにマウスDNAを固相化したプレート、および大腸菌DNAを固相化したプレートを用いたELISAに供し、マウスDNAに強く反応し、大腸菌DNAに強く反応しない株を選択した。陽性細胞は、限界希釈法により、96well培養プレートに1wellあたり4個になるように播いた。５日後に、10％FBS RPMI1640培地（BM-condimed H1・HAT無し）を各プレート1wellあたり100μｌ分注した。数日間培養し、コロニーが肉眼で確認でき、培地の色が薄い黄色になってきた時点でスクリーニングを実施した。上記と同様の方法で陽性細胞を含むwellを選択し、さらに第二次クローニングを限界希釈法（wellあたり1細胞）にて行い、再度培養上清中の抗メチル化ODNモノクローナル抗体を含む培養上清をスクリーニングした。再度数日間培養し、ある程度細胞が増えたら第二次クローニングを実施した。
第二次クローニング後のスクリーニングで得られた陽性wellの細胞を5種類選び、それらを、10％FBS-RPMI1640培地（2.5％BM-condimed H1・HAT 入り）を分注した24well培養プレートに播いた（1wellあたり培地1ｍｌ添加）。数日間培養し、ある程度細胞が増えたら各細胞を25ｃｍ培養フラスコに移した。10％FBS RPMI1640培地（2.5％BM-condimed H1・HAT 入り）各5ｍｌにて細胞を増殖させた。10％FBS RPMI1640培地で培養可能になり、コンフルエントに近づいた時点で、各細胞をクライオチューブ（セルバンカーを使用）2本に凍結ストックした。上記の方法により2C5(F1)、4E8(F8)、6H11(F3)Ｇ4、6H11(F3)Ｆ5、8A6(G7)の5株のモノクローナル抗体産生株を樹立した。【００４４】
〔実施例１１〕  モノクローナル抗体の反応性の確認
樹立した細胞株から得たモノクローナル抗体の熱変性していないマウスDNA、大腸菌DNAとの反応性を、各モノクローナル抗体産生株の培養上清を用い、ELISAにより調べた。図6に示すようにいずれのモノクローナル抗体も熱変性していないマウスDNAに対し強い反応性を呈するのに対し、大腸菌DNAにはほとんど反応していないことを確認した。
6H11(F3)G4モノクローナル抗体を用い、熱変性の有無による反応性の違いについて検討を加えた。  図7に示すごとく、熱変性を施さないマウスゲノムDNAに対し、熱変性処理を施したものと同等の反応を示した。【００４５】
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本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2006-086948号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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