(57)【要約】ヒトグリオーマ等の腫瘍細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマ等の治療に有用でかつ安全であり、臨床応用が容易なリコンビナントＨＳＶを提供するものである。Musashi１プロモーターで発現するγ３４．５遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した新たな組換えＨＳＶであるＫｅＭ３４５を構築し、純化獲得する。ＫｅＭ３４５は、組換えウイルスそのものであるため、培養細胞に感染させるだけでウイルスの増殖を行うことができるばかりでなく、悪性グリオーマに対して選択的に優れた殺細胞効果（細胞溶解力）を示し、野生型ＨＳＶに匹敵するウイルス複製を誘導できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Musashi１プロモーターと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi１プロモーターによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスＤＮＡとを備えたことを特徴とするリコンビナントＨＳＶ。
【請求項２】
Musashi１プロモーターの下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のリコンビナントＨＳＶ。
【請求項３】
ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物が、ＨＳＶのγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼであることを特徴とする請求項１又は２記載のリコンビナントＨＳＶ。
【請求項４】
Musashi１プロモーターで発現するγ３４．５遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した組換えＨＳＶであるＫｅＭ３４５であることを特徴とする請求項１〜３記載のリコンビナントＨＳＶ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載のリコンビナントＨＳＶを有効成分とすることを特徴とする、Musashi１が発現している腫瘍に対する治療薬。
【請求項６】
Musashi１が発現している腫瘍が、ヒトグリオーマである請求項５記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Musashi１プロモーターを利用したヒトグリオーマ等の治療に有用なリコンビナントＨＳＶ、より詳しくはニューロビルレンスファクターと呼ばれるγ３４．５などのヒトグリオーマ等の腫瘍細胞内でＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスＤＮＡとを備えたリコンビナントウイルス等に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性グリオーマ、特に、多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人の主要な脳腫瘍の最も一般的で絶望的な形態である（例えば、非特許文献１参照。）。ＧＢＭは、周囲の正常な脳組織を広範囲に浸潤する傾向があるため、最近の神経画像処理技術や外科的技術の改善による助けを用いても、それを完全に除去することは実質的に不可能であり、その他の治療の形態を必要とした。しかしながら、診断上の手順、放射線治療、化学療法及び支持療法の大きな進展にも関わらず、これらの新生物（neoplasm）は、従来の治療に対して強い耐性を示す（例えば、非特許文献２，３，４，５参照。）。患者の予後は、過去２０年間において低いままであり、患者のほとんどが診断から１年以内に病気に屈する（例えば、非特許文献６，７参照。）。したがって、有効な治療がなく、この病気の予後が著しく低いことから、遺伝子治療等の新たな治療の選択肢が必要となる。【０００３】
現在まで、非複製ベクター（replication-defective vector）による腫瘍への遺伝子導入（tumor transduction）の高効率性が達成していないため、複製型ウイルスベクター（replication-competent virus vector）は癌治療剤として期待されている（例えば、非特許文献８，９，１０参照。）。癌の遺伝子治療における近年の発達は、細胞毒性遺伝子を腫瘍細胞に送達（deliver）するばかりでなく融解性感染を介してそれらを直接破壊する、遺伝子改変して分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用を中心に展開し（例えば、非特許文献１１，１２参照。）、少なくとも１０種のウイルス種について臨床試験が始まっている（非特許文献１３参照。）。分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用は、新生物内複製（intraneoplastic replication）が、接種した腫瘍塊に抗癌効果の解剖学的広がりの増大や、抗癌遺伝子の送達（delivery）による腫瘍性効果の増強を可能にすることから（例えば、非特許文献１４，１５参照。）、殺腫瘍活性と安全性の両面で有望視されている。【０００４】
ＨＳＶは２本鎖ＤＮＡウイルスで、核内で増殖するＤＮＡウイルスの中で最大長のゲノム（１５３ｋｂ）を有し、８４種のオープンリーディングフレームをコードする。ゲノムはＬ（long）領域とＳ（short）領域から構成され、各ユニーク配列をその両側に倒置反復配列が挟む形で存在する。ウイルスゲノムの全塩基配列が決定され、ほとんどのウイルス遺伝子の機能は解明されている。そして、このＨＳＶの、分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性変異体として、２つのタイプの単一遺伝子が変異したＨＳＶ変異体が研究されてきた。１つは、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＲＲ）、ウラシルＮ−グリコシレート（uracyl N-glycosylate）等の核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子の機能に欠陥を持つウイルス変異体であり、もう１つは、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強することによりビルレンスファクターとして機能するγ３４．５遺伝子（ＩＣＰ３４．５）の機能に欠陥を持つウイルス変異体である（例えば、非特許文献１６，１７参照。）。【０００５】
単一遺伝子が変異したＨＳＶ変異体は、相同組み換え等のバックミューテーションによる野生型への復帰変異の危険の他、例えば、チミジンキナーゼの機能欠損変異体におけるガンシクロビルに対する抵抗力の増強、γ３４．５の機能欠損変異体における殺腫瘍活性の減少等の問題を有する。そこで、野生型への復帰変異の危険性を減少させるため、多重変異が導入されたＨＳＶが開発された。これらには、γ３４．５の欠失変異及びリボヌクレオチドリダクターゼの挿入変異（insertional mutation）の両方の機能が欠損した変異体であるＧ２０７及びＭＧＨ１を挙げることができる。これら二重変異体は、頭蓋内に直接注入することによりニューロビルレンスの著しい減少を示し、ガンシクロビルに対し感受性を維持し、正常な組織と比較して腫瘍細胞において相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異ＨＳＶ系統は、欠陥γ３４．５遺伝子を維持し、それによって正常な組織に対して弱いビルレンスを示す。しかしながら、それらは腫瘍細胞に対して明らかな殺腫瘍効果を示すが、かかる効果は正常なγ３４．５遺伝子を有する変異体において観察されるものより少ない。【０００６】
上記Ｇ２０７は、Martuzaらにより、γ３４．５遺伝子における欠失及びリボヌクレオチドリダクターゼ（ＩＣＰ６）遺伝子へのｌａｃＺ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の二重変異体として開発された（例えば、非特許文献１８，特許文献１参照。）。Ｇ２０７は他のウイルスベクター類よりも治療上の観点において優れている。Ｇ２０７は分裂細胞において複製され、その結果感染細胞は融解して死に至るが、非分裂細胞ではその増殖は顕著に弱まっている。無胸腺症マウスに樹立された腫瘍内にＧ２０７を接種すると腫瘍選択的複製によって腫瘍増殖が抑制され、マウスが延命された（例えば、非特許文献１９参照。）。また、免疫応答性マウスにおいてはＧ２０７を腫瘍内接種することにより腫瘍特異的免疫応答が誘導され、Ｇ２０７を接種しなかった腫瘍の増殖をも抑制する（例えば、非特許文献２０参照。）。この場合、Ｇ２０７がインサイチュー癌ワクチンとして機能している。現在まで、脳腫瘍を中心に変異ヘルペスウイルスＧ２０７を用いた遺伝子治療が行われ、米国で臨床応用も開始された（例えば、非特許文献９参照。）。この臨床応用において、Ｇ２０７の安全性は証明されているが、これまでに報告された臨床結果は、あまり効果的でないことが報告されている（例えば、非特許文献９，１０参照。）。【０００７】
臨床的に関連するウイルスベクターを構築する際は、安全性及び殺腫瘍の有効性（oncolytic efficacy）の両方が必須である（例えば、非特許文献２１，２２参照。）。安全性は、変異ウイルスの複製の選択性に直接依存する。有効性は、ウイルスの効率的に腫瘍細胞を感染させ、感染した新生物塊の中で増殖する能力に依存する。Ｇ２０７等の多重変異ＨＳＶベクターは、安全性を高め、野生型復帰変異のリスクを減らそうと努力して構築されたが、それらの殺腫瘍の有効性は同時に減少したようである。Ｇ２０７における欠失遺伝子のひとつであるγ３４．５遺伝子は、ニューロビルレンスファクター（neurovirulence factor）とも呼ばれており、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強する機能を有する（例えば、非特許文献１６，２３参照。）。γ３４．５遺伝子を欠失させることにより、Ｇ２０７は非常に安全性が高くなったが、その治療効果は少々低下したと考えられる。【０００８】
腫瘍細胞に選択的なＨＳＶ複製を与えるいくつかの戦略が知られている。例えば、分裂終了細胞における複製に必要とされるウイルス遺伝子の欠失又は変異（例えば、非特許文献１２，１４，２４参照。）、ウイルスの子孫産生調節の責任を有するウイルス遺伝子の欠失（例えば、非特許文献２５，２６，２７参照。）、必須のウイルス遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターの使用（例えば、非特許文献２８参照。）、正常な組織よりむしろ腫瘍に対するＨＳＶ糖タンパク質の受容体特異性の変化（例えば、非特許文献２９参照。）等が知られている。【０００９】
Musashi１は、本発明者らにより見い出された神経のＲＮＡ結合タンパク質であり、神経幹細胞／前駆細胞の進化的によく保存されたマーカーである（例えば、非特許文献３０，３１，３２，３３参照。）。それは、固有の（proper）神経細胞及び膠細胞の発達に必須である転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たす可能性が高い（例えば、非特許文献３０，３１，３２，３３，３４参照。）。近年、Musashi１は、複数の腫瘍、特に中枢神経系では悪性グリオーマに発現し（例えば、非特許文献３５，３６，３７参照。）、悪性グリオーマのマーカーとして使用できることが解明された（例えば、非特許文献３６，３７参照。）。さらに、マウスのMusashi１プロモーター（Ｐ／Musashi１）がヒト胎児脳においても機能することや、Ｐ／Musashi１の作動によるＧＦＰ発現に基づいて、蛍光標識細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて神経幹細胞の選別ができることが報告されている（例えば、非特許文献３８参照。）。【００１０】
前述したように、すでにＨＳＶ−Ｇ２０７によりグリオーマに対する腫瘍溶解性ウイルス療法の臨床試験が米国で実施中であるが、安全性の立証は出来たが治療効果が証明されていない。これはＧ２０７が弱毒化したために複製減弱型となってしまったためと考えられる。そこで本発明者らは、グリオーマ選択的に作用するMusashi１プロモーターで、Ｇ２０７で不活化されたγ３４．５をグリオーマでのみ復元させれば、より強い治療効果を示すことができると考え、Musashi１プロモーターでγ３４．５を発現するアンプリコンベクターを開発した（特許文献２）。しかしながら、上記アンプリコンベクターは生産過程が煩雑で安定したベクターを得るのが難しいため臨床応用が容易ではなかった。【００１１】
【特許文献１】米国特許第５５８５０９６号明細書
【特許文献２】特開２００５−７３６５３号公報
【非特許文献１】Benign Cerebral Gliomas, Vol. 1. pp. 181-189, 1995
【非特許文献２】Hum. Gene Ther. 8, 965-977, 1997
【非特許文献３】Pathol. Res. Pract. 194, 149-155, 1998
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14453-14458, 1998
【非特許文献５】J. Neurooncol. 42, 95-102, 1999
【非特許文献６】J. Neurosurg. 88, 1-10, 1998
【非特許文献７】Cancer Res. 62, 756-763, 2002
【非特許文献８】Nat. Med. 6, 879-885, 2000
【非特許文献９】Gene Ther. 7, 867-874, 2000
【非特許文献１０】Gene Ther. 7, 859-866, 2000
【非特許文献１１】Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7, 589-602, 1998
【非特許文献１２】Science 252, 854-856, 1991
【非特許文献１３】Nat. Med. 7, 781-787, 2001
【非特許文献１４】Hum. Gene. Ther. 5, 183-191, 1994
【非特許文献１５】Cancer Res. 58, 5731-5737, 1998
【非特許文献１６】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3266-3270, 1992
【非特許文献１７】Nat Cell Biol 3, 745-750, 2001
【非特許文献１８】Nat. Med. 1, 938-943, 1995
【非特許文献１９】Cancer. Res. 55, 4752, 1995
【非特許文献２０】Hum. Gene Ther. 9, 2177-2185, 1998
【非特許文献２１】J. Virol. 73, 3843-3853, 1999
【非特許文献２２】J. Virol. 74, 4765-4775, 2000
【非特許文献２３】Science 250, 1262-1266, 1990
【非特許文献２４】Hum. Gene Ther. 8, 533-544, 1997
【非特許文献２５】Neurosurgery 32, 597-603, 1993
【非特許文献２６】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1411-1415, 1995
【非特許文献２７】Lab. Investig. 73, 636-648, 1995
【非特許文献２８】J. Virol. 73, 7556-7564, 1999
【非特許文献２９】J. Virol. 72, 9683-9697, 1998
【非特許文献３０】Neuron 13, 67-81, 1994
【非特許文献３１】Dev. Biol. 176, 230-242, 1996
【非特許文献３２】Genomics 52, 382-384, 1998
【非特許文献３３】Dev. Neurosci. 22, 139-153, 2000
【非特許文献３４】J. Neurosci. 17, 8300-8312, 1997
【非特許文献３５】Differentiation. 68, 141-152, 2001
【非特許文献３６】BBRC 293, 150-154, 2002
【非特許文献３７】GLIA 34, 1-7, 2001
【非特許文献３８】Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
悪性脳腫瘍、特に神経膠芽腫は従来手術摘出・放射線照射・抗癌剤投与が標準治療として行われているが、予後が著しく悪く、新規治療法の開発が急務である。手術では全摘出が極めて困難であり、放射線照射では反応率が低く、化学療法では薬剤耐性機構が機能するため効果が低いという問題点があった。本発明の課題は、ヒトグリオーマ等の腫瘍細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマ等の治療に有用でかつ安全であり、臨床応用が容易なリコンビナントＨＳＶや、前記リコンビナントＨＳＶを有効成分とするヒトグリオーマ等の治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、臨床的に適用可能なＨＳＶベクターを構築することを考慮して、安全性を可能な限り低下させずに、従来の変異体の殺腫瘍の有効性を増強することが必要であると考えた。そこで、腫瘍細胞に選択的なＨＳＶ複製を与えるためのいくつかの戦略のうち、必須のウイルス遺伝子の発現を調節するために腫瘍特異的プロモーターを使用することが有望であると考えた。【００１４】
他方、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の変異体Ｇ２０７は、前記のように、γ３４．５遺伝子の一部欠失及びリボヌクレオチドリダクターゼ（ＵL３９）遺伝子へのｌａｃＺ挿入により、これら遺伝子が不活性化されてγ３４．５やリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能が欠失するように設計されている。Ｇ２０７は、インビトロ及びインビボでの研究で効率的な殺腫瘍活性（oncolytic activity）を示すが、正常な組織においては最小の毒性を示し、現在、悪性グリオーマの臨床試験が行なわれている。しかしながら、フェイズＩ試験の結果によると、Ｇ２０７の安全性については証明されているが、その殺腫瘍活性については有効であるとの結果が得られなかった。ニューロビルレンスファクターをコードするγ３４．５遺伝子を欠失させることにより、Ｇ２０７の安全性は非常に高くなったが、ＨＳＶ１による殺腫瘍活性は著しく減少した。かかるＧ２０７の殺腫瘍活性の低下を考慮すると、γ３４．５遺伝子が腫瘍細胞にのみ特異的に発現した場合、γ３４．５が発現しない場合と比較して、治療効果はより強く増強すると考えた。【００１５】
本発明者らは、Ｇ２０７の安全性を低下させることなくその治療効果を増強するため、本発明者らにより見い出された神経のＲＮＡ結合タンパク質であり、最近ヒト悪性グリオーマに発現し、それらのマーカーとして使用されることが明らかになったMusashi１のプロモーター（Ｐ／Musashi１）が神経前駆細胞以外の悪性グリオーマにおいても機能し、特に悪性グリオーマにおけるＨＳＶの複製増殖能に関与するＨＳＶ１遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターとして使用できるのではないかと考えた。そこで、まず最初に、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ）及びその他のいくつかの癌細胞株（肺癌細胞株Ａ５４９、胃癌細胞株ＴＭＫ−１、大腸癌細胞株ＨＴ２９、膀胱癌細胞株ＫＵ１９−９及びＴ２４、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５）におけるMusashi１のｍＲＮＡ発現についてＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。その結果、腫瘍細胞株の中では、Musashi１のｍＲＮＡがグリオーマ細胞株及びニューロブラスト細胞株に特異的に発現することを確認した。この結果は、これまでに報告された事例と完全に一致した（Differentiation 68, 141-152, 2001、GLIA 34, 1-7, 2001）。次に、ヒト胎児脳の神経幹細胞において機能することが知られているＰ／Musashi１の転写活性について調べた（Nat. Biotechnol.19, 843-850, 2001）。ＧＦＰレポーターアッセイにより、ヒトグリオーマ細胞株及びその他のいくつかの腫瘍細胞株におけるＰ／Musashi１の転写活性について調べた結果、ヒトグリオーマ細胞株の方がその他の癌細胞株と比較して、Ｐ／Musashi１の転写活性が著しく高いデータが得られた。この結果から、本発明者らは、Ｐ／Musashi１がヒトグリオーマ細胞株で選択的に機能することを確認した。【００１６】
次に、本発明者らは、ＨＳＶの複製増殖能に関与するＨＳＶ１遺伝子であるγ３４．５遺伝子をＰ／Musashi１で転写する再ターゲティングが、正常な組織においては減衰したビルレンスを維持しながら、グリオーマにおいては選択的ビルレンスを達成する手段を提供する可能性があると考えた。そこで、γ３４．５遺伝子をＰ／Musashi１で転写制御した複製欠損ウイルスを作製し、この複製欠損ウイルスとヘルパーウイルスとしてのＧ２０７とをグリオーマ細胞にコ・トランスフェクションすることによりｄｖＭ３４５をウイルスストックとして得た。そして、このｄｖＭ３４５（ウイルスストック）が、培養において、Ｇ２０７単独の場合と比較して、ヒトグリオーマ細胞株においてより高い細胞変性の有効性を顕著に示すことがわかった。これに対して、その他の癌細胞株においては、ｄｖＭ３４５とＧ２０７単独との場合の差異は明白ではなかった。また、一段階ウイルス成長解析の結果によると、Ｐ／Musashi１が効率的に働くヒトグリオーマ細胞株におけるＵ８７ＭＧにおいては、ｄｖＭ３４５のより高い子孫ウイルス（Ｇ２０７）産生能力から、ｄｖＭ３４５のより高い殺腫瘍活性が得られるが、Ｐ／Musashi１が効率的に作動しない肺癌細胞株Ａ５４９においては、かかる効果は観察されず、ｄｖＭ３４５の高い殺腫瘍活性は腫瘍タイプ特異的であることを確認した。しかし、Ｐ／Musashi1が効果的に機能する肺癌細胞株Ｌｕ−９９及びＰＣ−１３においてはＫｅＭ３４５の子孫ウイルス産生は増加した。【００１７】
次いで、ヌードマウスにおける皮下Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデル及び脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルの両モデルを用いて、ｄｖＭ３４５のインビボでの治療効果について調べた。皮下腫瘍モデルにおいては、ｄｖＭ３４５はＧ２０７単独の場合と比較して、Ｕ８７ＭＧ腫瘍の成長をより劇的に阻害した。脳内Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルにおいては、５．０×１０５ＰＦＵのウイルスの低投与量で、Ｇ２０７で処理したグループと比較して、ｄｖＭ３４５で処理した動物では統計的に有意な生存の増加を確認した。両モデルにおいて、ｄｖＭ３４５（ウイルスストック）の腫瘍内直接投与での治療効果が増大することがわかった。また、本発明者らは、３匹のマウスを使用して、ｄｖＭ３４５の安全性について調べたところ、投与量５．０×１０6ＰＦＵでは副作用を観察することができなかった。【００１８】
さらに、変異ウイルスの安全性について考慮すると、前記のように、ウイルスの複製の選択性に直接依存する。このように、腫瘍特異的プロモーターＰ／Musashi１を使用した場合、主要な問題はプロモーターの特異性に直接依存する。原始的な未分化ＣＮＳ細胞において優先的に発現する神経のＲＮＡ結合タンパク質であるMusashi１の性質（Dev. Biol. 176, 230-242, 1996、J. Neurosci. 17, 8300-8312, 1997、Genomics 52, 382-384,1998、Dev. Neurosci. 22, 139-153, 2000）を考慮すると、そのプロモーターは末端の分化した正常な組織においては機能しないと考えられたが、Ｐ／Musashi１は、本発明者らによる文献（Nat.Biotechnol.19,843-850, 2001）に最初にその活性を報告した神経前駆細胞以外に、グリオーマ特異的プロモーターと呼ぶことができる。このように、Ｐ／Musashi１をｄｖＭ３４５作製に利用し、グリオーマ特異的にγ３４．５を発現させた結果、Ｇ２０７の治療効果を、その安全性に障害を与えることなく増強しうることを既に見い出している（特許文献２参照）。【００１９】
しかしながら、ｄｖＭ３４５（ウイルスストック）を用いる場合、Ｇ２０７単独の場合と比較して、インビトロ及びインビボでのより高い殺腫瘍活性を示しながら、安全性上好ましい毒性プロファイルを維持しうるという優れた効果を奏するものの、増産時にその都度アンプリコンプラスミドとヘルパーウイルスを用いてベクターの作製を行わなければならず、臨床応用が容易とはいえなかった。そこで、本発明者らは、遺伝子組換え技術を用いて、Musashi１プロモーターで発現するγ３４．５遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)Ｇ２０７のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した新たな組換えＨＳＶであるＫｅＭ３４５を構築し、純化獲得したところ、組換えウイルス（ＩＣＰ６のみのdeletion mutantと同等に戻る）そのものであるため、培養細胞に感染させるだけでウイルスの増殖を行うことができるばかりでなく、ｄｖＭ３４５（ウイルスストック）に比べても、悪性グリオーマに対して選択的に、かつ予想を超えた極めて優れた殺細胞効果（細胞溶解力）を示し、野生型ＨＳＶに匹敵するウイルス複製を誘導できることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００２０】
すなわち本発明は、（１）Musashi１プロモーターと、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi１プロモーターによる前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、前記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスＤＮＡとを備えたことを特徴とするリコンビナントＨＳＶや、（２）Musashi１プロモーターの下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子であることを特徴とする上記（１）記載のリコンビナントＨＳＶや、（３）ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物が、ＨＳＶのγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のリコンビナントＨＳＶや、（４）Musashi１プロモーターで発現するγ３４．５遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、例えば、γ３４．５遺伝子における欠失及びリボヌクレオチドリダクターゼ（ＩＣＰ６）遺伝子へのｌａｃＺ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の二重変異体ウイルスのゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した組換えＨＳＶであるＫｅＭ３４５であることを特徴とする上記（１）〜（３）記載のリコンビナントＨＳＶに関する。【００２１】
また本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載のリコンビナントＨＳＶを有効成分とすることを特徴とする、Musashi１が発現している腫瘍に対する治療薬や、（６）Musashi１が発現している腫瘍が、ヒトグリオーマである上記（５）記載の治療薬に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５のサザンブロットの結果を示す図である。
【図２】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５のヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６）に対する殺腫瘍細胞効果の結果を示す図である。
【図３】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５のヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ２５１，Ｔ９８Ｇ）に対する殺腫瘍細胞効果の結果を示す図である。
【図４】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＳＨに対する殺腫瘍細胞効果の結果を示す図である。
【図５】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の肺癌細胞株Ａ５４９及び大腸癌細胞株ＨＴ２９に対する殺腫瘍細胞効果の結果を示す図である。
【図６】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５のヒトグリオーマ由来細胞株等における一段階ウイルス成長の結果を示す図である。
【図７】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５におけるＰ/Musashi１が効率よく機能し、γ３４．５を発現していることを示す図である。
【図８】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の皮下腫瘍に対する腫瘍の成長抑制効果を示す図である。
【図９】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の脳内腫瘍モデルに対する生存延長効果を示す図である。
【図１０】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の脳内腫瘍モデルに対する生存延長効果が、ｄｖＭ３４５よりも優れていることを示す図である。
【図１１】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５で処理したマウス腫瘍内にＨＳＶの高い分布が確認されたことを示す図である。
【図１２】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の安全性評価の結果を示す図である。
【図１３】本発明の、各種ヒト由来腫瘍細胞株におけるMusashi1ｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図１４】本発明の、Musashi1ｍＲＮＡの発現が陽性あるいは陰性であった各種ヒト由来腫瘍細胞株におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１５】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の、ヒト由来非小細胞性肺癌細胞株（Ｌｕ−９９）における殺腫瘍細胞効果を示す図である。
【図１６】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の、ヒト由来非小細胞性肺癌細胞株（ＰＣ−１３）における殺腫瘍細胞効果を示す図である。
【図１７】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の、ヒト由来非小細胞性肺癌細胞株（Ａ５４９）における殺腫瘍細胞効果を示す図である。
【図１８】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の、ヒト由来非小細胞性肺癌細胞株（ＰＣ−１４）における殺腫瘍細胞効果を示す図である。
【図１９】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の非小細胞性肺癌細胞株（Ｌｕ−９９）における一段階ウイルス成長の結果を示す図である。
【図２０】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の非小細胞性肺癌細胞株（ＰＣ−１３）における一段階ウイルス成長の結果を示す図である。
【図２１】本発明のリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の非小細胞性肺癌細胞株から誘導された皮下腫瘍に対する腫瘍の成長抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のリコンビナントＨＳＶとしては、Musashi１プロモーター（Ｐ／Musashi１）と、その下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と、Ｐ／Musashi１による前記遺伝子の転写を終結させるポリＡ配列と、上記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスＤＮＡとを備えたものであればどのようなものでもよく、上記ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子としては、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＩＣＰ６）遺伝子、ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子等を挙げることができるが、殺腫瘍活性と安全性の両立の点で、ＨＳＶのγ３４．５遺伝子が好ましく、より好適には、Musashi１プロモーターの下流に連結されたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子としてはＨＳＶのγ３４．５遺伝子を、ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物としてはＨＳＶのγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼを例示することができ、具体的にはリコンビナントウイルスＫｅＭ３４５を挙げることができる。リコンビナントウイルスＫｅＭ３４５は、Musashi１プロモーターで発現するγ３４．５遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)Ｇ２０７のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した新規組換えＨＳＶである。また、ＨＳＶのタイプとしては、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２を挙げることができる。【００２４】
本発明のリコンビナントＨＳＶ作製に用いられるＰ／Musashi１は、文献（Nat. Biotechnol.19,843-850,2001）記載の方法により調製することができる。また、転写を終結させるポリＡ配列としては、哺乳動物に由来するポリＡ配列であれば特に制限されるものではなく、例えばラビットβ−グロビン、ＳＶ４０、ＢＧＨ等のポリＡ配列を例示することができる。これらはMusashi１プロモーターで発現するＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子転写ユニットは常法により調製することができる。また、ＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスＤＮＡとしては、前記遺伝子転写ユニット作製に用いられたＨＳＶの複製増殖能に関与する遺伝子と同じ遺伝子が不活性化されているＨＳＶの変異ゲノムＤＮＡであれば特に制限されず、γ３４．５遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与するγ３４．５を発現する機能を失ったＲ３６１６や１７１６や、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＩＣＰ６）遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能に関与するリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったｈｒＲ３や、これらγ３４．５及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったＧ２０７や、ＩＣＰ４遺伝子が不活性化されてＨＳＶの複製増殖能を失ったｄ１２０等を具体的に例示することができる。これらＨＳＶの変異ゲノムＤＮＡは、Ｒ３６１６については文献（Science,250,1262-1266,1990）、１７１６については文献（Gene Ther,7,859-866,2000）、ｈｒＲ３については文献（J Virol,62,196-205,1988）、Ｇ２０７については文献（Nat.Med.1,938-943,1995、米国特許第５５８５０９６号明細書）にそれぞれ記載の方法で調製することができる。【００２５】
本発明のリコンビナントＨＳＶは、線状化した前記遺伝子転写ユニットと上記ＨＳＶの変異ゲノムＤＮＡとともに宿主細胞に共感染させ、前記遺伝子転写ユニットをＨＳＶの変異ゲノムＤＮＡにホモロガスリコンビネーションの手法により挿入することにより、構築することができる。また、本発明のリコンビナントＨＳＶの形態としては、液状、その凍結物、その凍結乾燥による粉体、プロファージ状態の宿主細胞の凍結物等を挙げることができる。【００２６】
本発明のリコンビナントＨＳＶの作製に用いられる上記宿主細胞としては、線状化した前記遺伝子転写ユニットと上記ＨＳＶの変異ゲノムＤＮＡとをともに感染させた場合、ホモロガスリコンビネーションが生起し、リコンビナントＨＳＶを得ることができる細胞であれば制限されず、ＨＳＶの宿主となりうる哺乳動物細胞を挙げることができる。また、本発明のリコンビナントＨＳＶが感染しうる細胞としては、Ｐ／Musashi１が特異的に作動する腫瘍細胞を好適に例示することができ、具体的には、ヒトグリオーマ細胞や、ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞を挙げることができ、ヒトグリオーマ細胞としては、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ等のヒトグリオーマ細胞株やヒトグリオーマ組織から単離された腫瘍細胞を例示することができる。【００２７】
本発明のMusashi１が発現している腫瘍に対する治療薬としては、上記本発明のリコンビナントＨＳＶを有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、Musashi１が発現している腫瘍としては、ヒトグリオーマの他、便宜上ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍や、一部の非小細胞性肺癌を例示することが出来る。従って、本発明の代表的な治療薬としては、ヒトグリオーマ治療薬を挙げることができる。また、例えば、ヒトグリオーマ治療薬を用いた治療方法としては、上記ヒトグリオーマ治療薬をヒトグリオーマに直接投与する方法を挙げることができる。例えば、ヒトグリオーマ治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これら治療薬は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、ヒトグリオーマ等の腫瘍組織に直接接種することが、即答的な腫瘍融解を誘導しうる点で好ましい。【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１及びＴ９８Ｇ）、ヒト神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ヒト由来肺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト由来大腸癌細胞株（ＨＴ２９）、及びアフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ細胞）を、American Type Culture Collectionより入手した。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ａ５４９及びＶｅｒｏ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＩＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨＴ２９を、１０％のＩＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。全ての細胞株は、抗生物質（Sigma社製）を添加した培地で、加湿下５％のＣＯ２、３７℃で維持した。０．２５％のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液（Sigma社製）を用いて、通常は２週間に１度の継代を行なった。
【実施例１】
【００２９】
［リコンビナントウイルスＫｅＭ３４５の作製］
（ホモロガスリコンビネーション）
アンプリコンプラスミドpSRaP/Musashi１:γ３４．５（Kanai R et al. Gene Ther; advance online publication, September 15, 2005; doi:10.1038/sj.gt.3302636 ／特開２００５−７３６５３号公報）を制限酵素ＸｂａIで処理し、断端を平滑末端とした約５Ｋｂの断片を回収し、これを挿入断片(インサート)とした。この挿入断片にはＰ/Musashi１の下流にγ３４．５の全長、ＢＧＨｐｏｌｙＡ配列が連結されている。次にｐＫＸ２βＧ３(Mineta et al. Nat Med,1995;1:938-943)をＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶで処理し、断端を平滑末端とした。これに上記挿入断片を挿入し（ligation）、プラスミドpKX−Ｐ/Musashi１:γ３４．５を得た。プラスミドpKX−Ｐ/Musashi１:γ３４．５を制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理し、線状化したものを、Ｇ２０７のウイルスＤＮＡとともにリポフェクション法(Lipofectamine 2000,Invitrogen社製)でＶｅｒｏ細胞に共感染 (co-transfection)した。ウイルスＤＮＡの調製はMinetaら(Mineta et al. Nat Med,1995;1:938-943)と同様に行った。約４日後、生じたウイルスを一旦回収してヒト神経芽細胞腫株であるＳＫ−Ｎ−ＳＨに感染させ、更に１日後、細胞毒性効果があらわれたところで回収した。これを１０ｃｍ皿にコンフルエントに育った単層のＶｅｒｏ細胞に感染させ、感染後およそ１８時間でＸ−ｇａｌ入りのアガロースを重層し、さらに１日間生育させた。育ったプラークを光学顕微鏡上で青白セレクションし、白いプラークのみをいくつか回収した後、２４ウエル皿に育ったＶｅｒｏ細胞に感染させた。生じたウイルスを再度１０ｃｍ皿にコンフルエントに育った単層のＶｅｒｏ細胞に感染させ、これを更に青白セレクションし、白いプラークのみを選別した。同様の作業を繰り返し、計３回行った。なお、青白セレクションでは、Ｇ２０７はＬａｃＺが挿入されているため、Ｘ−ｇａｌ染色すると青いプラークを生じるが、想定するリコンビナントウイルスではＬａｃＺ遺伝子の部分にインサートが挿入されているため、白いプラークを生じる。【００３０】
（サザンブロット）
リコンビナントウイルスにインサートが適切に挿入されているか否か、サザンブロットで確認した。用いたプローブは３種あり、ｐＫＸ２βＧ３を制限酵素ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶで処理し得られる約１．９Ｋｂの断片をＬａｃＺプローブ、残りの部分をセルフライゲーションさせ、出来たプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIII、ＸｂａIで処理し得られる断片をＩＣＰ６プローブ、Ｐ/Musashi１を制限酵素ＸｈｏIで処理し得られる２．２Ｋｂ断片をＰ/Musashi１プローブとした。StrainＦ,ｈｒＲ３,Ｇ２０７,ＫｅＭ３４５のウイルスＤＮＡを制限酵素（ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ）で処理した後、１％アガロースゲル電気泳動しナイロンメンブレイン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，Amersham社製)にトランスファーし、上記のプローブでサザンブロットをおこなった。プローブのラベリング、シグナルの検出にはECL Random Prime Labelling and Detection Systems, VersionII(Amersham社製）を用いた。その結果、各リコンビナントウイルスにインサートがきちんと挿入されていることが確認できた。（図１）
【実施例２】
【００３１】
［殺腫瘍細胞効果］
ウイルス感染の２４時間前に、ヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ｕ２５１，Ｔ９８Ｇ）、ヒト神経芽細胞種株（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、ヒト非小細胞性肺癌細胞株（ Ａ５４９）及びヒト結腸癌細胞株（ＨＴ２９細胞 ）の各２．０×１０5個を１２ウエル皿に蒔いた。ウイルス感染は、０．０１プラーク形成単位(ＰＦＵ)/細胞のＭＯＩでＧ２０７あるいはＫｅＭ３４５を、１％ＩＦＢＳを補填したＰＢＳ（０．３ｍｌ）中で３０分間行った。また、ウイルス接種に用いたときと同じ手順によりモック感染細胞(mock-infected cells)から調整した抽出物を用いて、コントロールをモック感染させた。生存細胞数は、感染後１２時間毎に行ったトリパンブルー排除法により決定した。アッセイは、全て３回ずつ行った。ＫｅＭ３４５の細胞毒性の特徴を調べるため、Ｐ/Musashi１が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ｕ２５１，Ｔ９８Ｇ）、神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及び、Ｐ/Musashi１が効率的に働かないその他の細胞株（Ａ５４９及びＨＴ２９）について検査を行った。ウイルス（Ｇ２０７或いはＫｅＭ３４５）感染はＭＯＩ＝０．０１で行った。結果を図２〜５に示す。In vitroでの殺細胞効果はＰ/Musashi１が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株（Ｕ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ｕ２５１，Ｔ９８Ｇ）、神経芽細胞種株ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいてＧ２０７よりも有意に強いことが確認された(ｔ検定、ｐ＜０．０１)。また、グリオーマ細胞株では、感染から２４時間後には ＫｅＭ３４５の細胞変性効果とＧ２０７の細胞変性効果との間に統計学的な有意差が認められた（ｐ＜０．０５、不対ｔ検定）。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ においても感染後６０時間以降では有意差が認められた。一方、その他の腫瘍細胞株（Ａ５４９及びＨＴ２９）においては、本研究で使用したウイルスの間で細胞変性効果の差異は認められなかった。
【実施例３】
【００３２】
［一段階ウイルス成長］
６ウエル皿にＵ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ｕ２５１,Ｔ９８Ｇ，ＳＫ−Ｎ−ＳＨ，Ａ５４９，およびＨＴ２９の各細胞種（５．０×１０5 ）を蒔き、２４時間後にウイルス（Ｒ３６１６，Ｇ２０７，ＫｅＭ３４５，StrainＦ）を感染させた。ウイルス感染は０．０１ＭＯＩにて行い、１％のＩＦＢＳを補填した０．５ｍｌのＰＢＳ中で３０分間行った。感染後２４時間でウイルスをウエルから収集し、滴定を行った。プラーク数をカウントし、プラーク形成単位毎ウエル(plaque-forming units per well：ＰＦＵ/well)を算出し、対数表示(Log ＰＦＵ/well)した（図６）。実験は全て３回ずつ行った。その結果、ヒトグリオーマ由来細胞株（Ｕ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ｕ２５１，Ｔ９８Ｇ）では、ＫｅＭ３４５はＧ２０７に比較し多くの子孫ウイルスを産出し（ｐ＜０．０５、不対ｔ検定）およそ１００倍の子孫ウイルスを産出していた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨでも同様であった。これに対して、その他の細胞株(Ａ５４９及びＨＴ２９）では産出ウイルス量にＧ２０７との間で差はなかった（不対ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
【実施例４】
【００３３】
［ＫｅＭ３４５におけるＰ/Musashi１の高効率機能発現］
ＨＳＶ感染細胞は、ウイルス由来の２重鎖ＲＮＡへの反応を発端に真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）をリン酸化し蛋白合成を停止する方向、ひいてはウイルスの増殖を妨げる方向へ働くが、γ３４．５はｅＩＦ−２αを脱リン酸化することで蛋白合成を停止させないため、ウイルスの複製を促進するとされる（Chou J, Roizman B. Proc Natl Acad Sci USA,1992; 89:3266-3270.）。そこで我々は、ＫｅＭ３４５がＰ/Musashi１が効率よく機能する細胞種においてのみにγ３４．５を発現していることを生化学的に裏付けるため、１０ｃｍ皿にサブコンフルエントに育ったＵ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６，Ａ５４９にウイルス（Strain Ｆ,Ｒ３６１６，Ｇ２０７，ＫｅＭ３４５）をＭＯＩ＝０．５で感染させ、感染１５時間後に回収したんぱく質を抽出し、ウエスタンブロットをおこなった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１ウエルあたり５０μｇの蛋白量で行い、抗体は抗ｅＩＦ２-α抗体（Biosource社製）、リン酸特異的な抗リン酸化ｅＩＦ２-α抗体（Biosource社製）、コントロールに抗アクチン抗体を用いた。適宜２次抗体を反応させ、ECL detection Kitを用い検出した。その結果、Ｐ/Musashi１が効率よく機能するＵ８７ＭＧ，Ｕ８７Ｅ６においては、ＫｅＭ３４５の感染によりγ３４．５が発現し、ｅＩＦ−２αが脱リン酸化されていることが示唆された（図７）。
【実施例５】
【００３４】
［リコンビナントウイルスＫｅＭ３４５のインビボでの抗腫瘍効果］
（動物実験）
Japan SLC社より購入した、生後６週間の胸腺欠損のＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、５匹又は５匹以下のグループにして無菌ケージで飼育し、オートクレーブした食物及び水を自由に利用できるようにした。全ての動物手順はLaboratory Animal Center（慶応義塾大学医学部）により承認された手順に従った。外科的手順に関しては、８４％の静菌性生理食塩水 (bacteriostatic saline)、１０％ペントバルビタールナトリウム (５０ｍｇ／ｍｌ;Abbott Laboratories社製）及び６％エチルアルコールからなる溶液を、各マウスの腹腔内に０．２５ｍｌ投与して麻酔をかけた。マウスの生存状態を確認するために毎日巡回した。【００３５】
（モデル１：皮下腫瘍モデル及び皮下腫瘍への新生物内接種）
５０μl中の５．０×１０６個のＵ８７Ｅ６細胞をＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスの右脇腹皮下に注入し、皮下腫瘍を誘発した。移植から約1２日後、皮下腫瘍の直径が６ｍｍに到達した頃、マウスをランダムに３つのグループに分けた（各グループにおいて、ｎ＝６）。マウスは、２０μｌのウイルス緩衝液に懸濁した、１．０×１０６ＰＦＵのＧ２０７（グループII）又は ＫｅＭ３４５（グループIII）を用いて、新生物内で処理した。また、コントロールとしてグループIのマウスを、２０μｌのモック感染抽出物で処理した。腫瘍は、０．１ｍｍ以内の外側ノギス測定で測定した。二次元直径測定 (bidemensional diameter measurements)により段階的な腫瘍量を得た。腫瘍の平均成長速度は、ａが長軸、ｂが短軸である、０．５(ａ×ｂ２)日ｎ／０．５(ａ×ｂ２)日により決定した。腫瘍の直径が２４ｍｍを超えた場合には、その動物を屠殺した。成長速度の統計学的差異については、不対ｔ検定を用いることにより評価した(ｐ＜０．０１)。その結果、ｍｏｃｋ及びＧ２０７を投与したグループと比較し、ＫｅＭ３４５を投与した群では有意に腫瘍の成長速度が抑制されていることが明らかになった（図８）。【００３６】
（モデル２：脳内腫瘍モデル及びウイルスの接種）
ＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスに麻酔をかけて定位的装置(D. Kopf Instruments 社製)で不動化した後、ブレグマ上に直線的な皮膚切開を行い、頭蓋骨（ブレグマの前方１．０ｍｍ,外側２．０ｍｍの部位）に１ｍｍの穴を開けた。２μｌ中の２．０×１０5個のＵ８７Ｅ６細胞を、５μｌのハミルトンシリンジ(Hamilton Company社製)を用いて、ヌードマウスの右前頭葉に定位的に注入した。1２日後、マウスをランダムに３つのグループ（ｎ＝１０）に分けた。５．０×１０5ＰＦＵのＧ２０７（グループII）、１．０×１０6ＰＦＵのＧ２０７（グループIII）、５．０×１０5ＰＦＵのＫｅＭ３４５（グループIＶ）、１．０×１０6ＰＦＵのＫｅＭ３４５（グループＶ）又は、２μｌのモック感染抽出物（グループＩ）を同じ配位で定位的に接種し、生存を継続した。生存率の統計学的差異については、Wilcoxon signed-ranks testをもちいることにより評価した（ｐ＜０．０１）。その結果、グループＩ〜IIIと比較し、グループIV、Ｖは有意にその生存延長効果が見られた。また、Ｋｅｍ３４５を投与したグループIVとＶを比較した場合、用量依存的な効果が確認された（図９）。【００３７】
（モデル３：ｄｖＭ３４５とＫｅＭ３４５による生存延長効果の比較）
ｄｖＭ３４５とＫｅＭ３４５との効果を比較検討するため、Ｇ２０７での効果がより弱いＵ８７ＭＧ細胞（２．５×１０5個）をＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスの右前頭葉に移植し、１０日経過時点でウイルスを腫瘍内に投与した。ウイルスはＫｅＭ３４５、ｄｖＭ３４５、Ｇ２０７及びモック感染抽出物（各群ｎ＝６）を用い、投与量は、Ｇ２０７ではほとんど効果の出ない５．０×１０5ＰＦＵとした。その結果、ＫｅＭ３４５投与群は、ｄｖＭ３４５投与群と比較して有意に高い生存延長効果を示した (図１０：Wilcoxson test,ｐ＜０．０１)。
【実施例６】
【００３８】
［病理学的検討］
ＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスにＵ８７Ｅ６細胞を移植後１７日経過時点でマウスを１．０×１０6ＰＦＵのＧ２０７又はＫｅＭ３４５で処理し、かかる処理の５日後に屠殺した。１％ＰＦＡを含むＰＢＳ中で灌流し固定を行った後、脳を取り除いた。試料をＰＢＳ中の４％ＰＦＡで、４℃で２４時間以上固定した。エタノール、キシレンで処理後パラフィン包埋し、針路の周辺脳のスライド切片(４μｍ厚)を作成した。脱パラフィン処理後に抗ＨＳＶ抗体（ラビット抗ＨＳＶ抗体、１：２００の希釈にて使用、BETHYL Laboratories社製）、２次抗体（ビオチン化抗ラビットＩｇＧ）にて免疫染色した。その後、ヘマトキシリン溶液で対比染色し、自動化顕微鏡（Nikon社製 エクリプスE1000）による観察を行った。その結果、Ｇ２０７を感染させた細胞と比較し、ＫｅＭ３４５を処理した群において、ＨＳＶの高い分布が確認された（図１１）。
【実施例７】
【００３９】
［ＫｅＭ３４５の安全性評価］
ＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスにＵ８７Ｅ６細胞を移植後、ＫｅＭ３４５（５．０×１０6ＰＦＵ）をマウスの右大脳半球に注入して２８日後に屠殺（２匹）し、脳、脊髄、肺、肝臓、脾臓、腎臓を取り除いた後、ＤＮＡｚｏｌ(Invitrogen社製)を用いてＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを鋳型にして、Sundaresan Pらの方法（J virol 2000; 74: 3832-3841）と同様にＨＳＶのＤＮＡが検出できるか否か検討した。ＨＳＶのＤＮＡ検出にはチミジンキナーゼ（ＴＫ）のプライマーペアを、内部コントロールにはマウスβアクチンのプライマーペア（Morita A et al. Hepatol Res,2003;27:143-150）を用いた。その結果、コントロールであるβアクチンは全ての臓器で発現が確認されたことに対し、チミジンキナーゼは脳特異的な発現が観察された（図１２）。
【実施例８】
【００４０】
［各種ヒト由来腫瘍細胞株におけるMusashi1ｍＲＮＡの発現］
５つの非小細胞性肺癌細胞株（Ｌｕ−９９、Ａ５４９、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ５９６）、２つの胃癌細胞株（ＴＭＫ１、ＭＫＮ７４）、２つの結腸癌細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＴ１５／Ｗ）、１つの膀胱癌細胞株（ＫＵ１９−１９）、１つの腎細胞癌細胞株（Ａ４９８）の、計１１のヒト由来の癌細胞株におけるMusashi1ｍＲＮＡの発現についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。内在性のコントロールとして、βアクチンを用いた（５５１ｂｐ）。その結果、Musashi1遺伝子の発現は、５つの肺癌細胞のうちの２つ（Ｌｕ−９９、ＰＣ−１３）、２つの胃癌細胞株のうちの１つ（ＭＫＮ７４）、２つの結腸癌細胞株うち１つ（ＨＣＴ１５／Ｗ）に観察された。対照的に、それ以外の細胞株においては、Musashi1ｍＲＮＡは検出されなかった（図１３）。
【実施例９】
【００４１】
［ヒト由来腫瘍細胞株におけるMusashi1タンパクの発現］
Musashi1ｍＲＮＡの発現が陽性であった肺癌細胞株Ｌｕ−９９、及び結腸癌細胞株ＨＣＴ１５／Ｗ、他方Musashi1ｍＲＮＡの発現が陰性であった２つの肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５９６、及び結腸癌細胞株ＨＴ２９について、ウエスタンブロットによる解析を行った。内在性のコントロールとしてはアクチンを用いた。Ｌｕ−９９とＨＣＴ１５／Ｗにおいて、Musashi1タンパク質は分子量約４０ｋＤあたりに検出されたが、その他の細胞株では検出されなかった（図１４）。
【実施例１０】
【００４２】
［ヒト由来非小細胞性肺癌細胞株における殺腫瘍細胞効果］
実施例２に記載の方法に準じて、本発明のＨＳＶのヒト由来非小細胞性肺癌細胞株における殺腫瘍細胞効果を検討した。実施例８においてMusashi1ｍＲＮＡが検出された細胞株Ｌｕ−９９、ＰＣ−１３、及び検出されなかったＡ５４９、ＰＣ−１４の４種類のヒト由来非小細胞性肺癌細胞株を対象とした。ウイルス感染は、ＫｅＭ３４５、及び、対照としてｄｖＨｍｓｉ１：ＧＦＰ（ｄｖＭ３４５のγ３４．５をＧＦＰに置換した非複製型ウイルス）及びＧ２０７を、ヘルペスウイルス（Ｇ２０７）の力価に基づき０．１ＭＯＩでそれぞれ感染させた。P/Musashi1が効果的に機能する細胞株においては、ＫｅＭ３４５ウイルス感染後１６時間で、コントロールウイルスと比較して統計学的に有意な細胞変異効果を認めた（Ｐ＜０．０５、不対ｔ−検定）（図１５、１６）。一方、その他の細胞株では、ウイルス間における細胞変異効果の差異は認められなかった（図１７、１８）。
【実施例１１】
【００４３】
［非小細胞性肺癌細胞株における一段階ウイルス成長］
６ウエル皿にMusashi1陽性非小細胞性肺癌細胞株（Ｌｕ−９９、ＰＣ−１３、Ａ５４９、ＰＣ−１４）を５．０×１０5を蒔き、２４時間後にウイルス（Ｇ２０７，ｄｖＨｍｓｉ１：ＧＦＰ，ＫｅＭ３４５）を感染させた。ウイルス感染は０．０１ＭＯＩにて行い、１％のＩＦＢＳを補填した０．５ｍｌのＰＢＳ中で３０分間行った。感染後４時間毎に滴定を行い、プラーク数をカウントした。プラーク形成単位毎ウエル(plaque-forming units per well：ＰＦＵ/well)を算出し、対数表示(Log ＰＦＵ/well)した。Ｐ／Musashi1が効果的に機能するＬｕ−９９及びＰＣ−１３においてはＫｅＭ３４５の子孫ウイルス産生は増加した（図１９、２０）が、P/Musashi1が効果的に機能しないＡ５４９及びＰＣ−１４においては、同様の効果は見られなかった（データは示さず）。
【実施例１２】
【００４４】
［肺癌細胞から誘導された皮下腫瘍へのウイルス接種］
実施例５に記載の方法と同様に、５．０×１０６個のＬｕ−９９細胞をＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスの右脇腹皮下に注入し、皮下腫瘍を誘発後、マウスをランダムに３つのグループに分けた（各グループにおいて、ｎ＝６）。マウスは、１．０×１０７ＰＦＵのＧ２０７（グループII）又は ＫｅＭ３４５（グループIII）を用いて、新生物内で処理した。また、コントロールとしてグループIのマウスを、モック感染抽出物で処理した。腫瘍の直径が２４ｍｍを超えた場合には、その動物を屠殺した。【００４５】
コントロール動物（グループＩ）において腫瘍が大きくなり（＞直径２４ｍｍ）３０日目に実験が終了したとき、グループＩとグループIIの間の差異は統計学的に有意でなかったが（Ｐ＜０．００６５、不対ｔ−検定）、グループＩの平均成長速度はグループIIよりも大きい値であった。また、重要なことは、グループIIとグループIIIの差異は統計学的に有意であったことである（Ｐ＜０．０１）（図２１）。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によると、ヒトグリオーマ等の腫瘍細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全なリコンビナントＨＳＶや、前記リコンビナントＨＳＶを有効成分とするヒトグリオーマ等の腫瘍治療薬を提供することができる。本発明のリコンビナントＨＳＶがヒトグリオーマ等の腫瘍組織に直接投与された場合、Musashi１プロモーターがヒトグリオーマ細胞等の腫瘍内でのみ特異的に作動することから、選択的にヒトグリオーマ等の腫瘍細胞内でリコンビナントＨＳＶが増殖し、グリオーマ等の腫瘍細胞が融解して、腫瘍組織の増殖抑制や消滅を図ることができる。例えば、本発明のリコンビナントＨＳＶであるＫｅＭ３４５は、Ｇ２０７で不活化されていたリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子及びγ３４．５遺伝子はそのままであるため、正常細胞に対する安全性はＧ２０７と同様であるが、ひとたびMusashi１が発現している悪性グリオーマ細胞に感染すれば、Musashi１プロモーターによってγ３４．５が発現するため、野生型ＨＳＶに匹敵するウイルス複製を誘導でき、腫瘍細胞に対する高い殺細胞効果（細胞溶解力）を示す。また、構築したリコンビナントＨＳＶＫｅＭ３４５は、ウイルスそのものであるので、培養細胞に感染させることにより、安定した状態で容易に純化・増産が可能である。つまり、ＧＭＰレベルのウイルスを生産すれば、臨床応用が容易で早期に臨床試験が開始でき、ウイルスの治療効果も非常に期待でき、前記本発明者らによるｄｖＭ３４５（ウイルスストック）に比べても、悪性グリオーマに対して選択的に予想を超えた極めて優れた細胞溶解力を有する治療薬となる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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