(57)【要約】光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の発光現象をイメージングするための新規な装置及び方法が提供される。本発明の方法及び装置に於いては、被験試料を照明することにより取得された照明画像と、被験試料を照明せずに被験試料内の細胞の発光現象により放出される光により取得された発光画像とを重ね合わせて重ね合わせ画像が生成される。重ね合わせ画像に於いて解析領域が指定される。これにより、発光観察で検出される光が微弱であっても、被験試料に於いて、発光している細胞や細胞内の発光部位を特定することができる。
2007074929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する装置であって、前記被験試料を照明する照明部と、前記被験試料の照明画像を取得する照明画像取得部と、前記被験試料内の細胞の発光画像を取得する発光画像取得部と、前記照明画像と前記発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成し、前記重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する画像処理部とを有することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、前記照明画像が前記照明部の照明光を用いて前記光学顕微鏡に於いて透過光観察することにより得られる透過光顕微鏡像であり、前記発光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記細胞内の発光現象により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像であり、前記照明画像取得部と前記発光画像取得部とが共通の顕微鏡像撮影装置を含み、前記透過光顕微鏡像と前記発光顕微鏡像とが前記共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項２の装置であって、前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、前記光学顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前記対物レンズとレンズ組立体を含み、前記受光面に於ける前記被験試料の像の投影倍率に対する前記対物レンズの開口数の比の２乗の値が０．０１以上であることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１の装置において、前記細胞の蛍光画像を取得するための蛍光画像取得部を有することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項４の装置であって、前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、前記蛍光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料の蛍光観察をすることにより得られる蛍光顕微鏡像であり、前記発光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記細胞内の発光現象を観察して得られる発光顕微鏡像であり、前記蛍光画像取得部と前記発光画像取得部とが共通の顕微鏡像撮影装置を含み、前記蛍光顕微鏡像と前記発光顕微鏡像とが前記共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１の装置であって、前記重ね合わせ画像を表示する表示部を有することを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１の装置であって、前記重ね合わせ画像を記録する記録部を有することを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１の装置において、細胞を刺激する細胞刺激供給部を有していることを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項４の装置において、前記細胞刺激供給部が、前記細胞へ試薬を供給する試薬供給部と、前記被験試料の温度を調整する温度調整部と、前記細胞へガスを供給するガス供給部とからなる群から選択される少なくとも一つであることを特徴とする装置。
【請求項１０】
光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する方法であって、
前記被験試料を照明し照明画像を取得する過程と、
前記被験試料を照明せずに前記被験試料内の細胞の発光現象により放出される光による発光画像を取得する過程と、
前記照明画像と前記発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成する過程と、
前記重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する過程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、前記重ね合わせ画像を表示する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０の方法であって、前記重ね合わせ画像を記録する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０の方法であって、前記被験試料を照明し前記照明画像を取得する過程を複数回実行することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０の方法であって、前記照明画像及び前記発光画像を取得する過程に先立って前記細胞に刺激を与える過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、前記細胞に刺激を与える過程に先立って前記照明画像及び前記発光画像を取得する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４の方法であって、前記細胞に刺激を与える過程に於いて該細胞に与えられる刺激が、薬剤刺激と、電気刺激と、ガスによる刺激と、熱による刺激とからなる群から選択される少なくとも一つの刺激であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０の方法であって、更に、前記解析領域に対応する前記発光画像の領域の光強度を測定する過程と、該光強度の変化を表示する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０の方法であって、前記被験試料内の細胞の蛍光画像を取得する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、前記解析領域に対応する前記照明画像の領域と、前記解析領域に対応する前記発光画像の領域と、前記解析領域に対応する前記蛍光画像のうち少なくとも２つを表示する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１０の方法であって、前記光学的結像装置が光学顕微鏡であり、前記照明画像が前記光学顕微鏡に於いて透過光観察することにより得られる透過光顕微鏡像であり、前記発光画像が前記光学顕微鏡に於いて前記細胞内の発光現象により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像であり、前記透過光顕微鏡像と前記発光顕微鏡像とが共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、前記光学顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前記対物レンズとレンズ組立体を含み、前記受光面に於ける前記被験試料の像の投影倍率に対する前記対物レンズの開口数の比の２乗の値が０．０１以上であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
光学顕微鏡と、前記光学顕微鏡により観察される被験試料の顕微鏡像を撮影する顕微鏡像撮影装置と、前記顕微鏡像を画像データとして取込んで画像処理を行う画像処理装置とを含む生物由来の被験試料の画像を取得する装置であって、
前記画像処理装置が、前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料を透過光観察する際の前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる透過光画像と、前記光学顕微鏡に於いて前記被験試料中の細胞内の発光現象に発せられる光を前記顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる発光画像とを重ね合わせて重ね合わせ画像を生成する画像重合部と、前記重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する画像領域指定部とを含むことを特徴とする装置。
【請求項２３】
請求項２２の装置であって、前記顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、前記光学顕微鏡が前記被験試料の像を前記顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる前記対物レンズとレンズ組立体を含み、前記受光面に於ける前記被験試料の像の投影倍率に対する前記対物レンズの開口数の比の２乗の値が０．０１以上であることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来の被験試料、例えば、細胞、バクテリア又はその他の生物試料から発せられる微弱光をイメージングする方法及び装置に係り、より詳細には、生物発光現象による微弱光をイメージングして被験試料の観察又は種々の測定をするための方法及び装置に係る。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命科学分野の研究に於いて、任意の細胞内に遺伝子を導入して発現されるＧＦＰなどの蛍光タンパク質やルシフェラーゼやエクオリンなどの発光タンパク質を利用して細胞などの生物由来の試料をイメージングする技術が利用されるようになってきている。蛍光又は発光タンパク質は、細胞内にて別の任意の特定のタンパク質と融合した状態で発現させたり（タンパク質のマーキング）、蛍光又は発光タンパク質をコードした遺伝子を或る特定の遺伝子の調節領域の下流に挿入又は置換し、その特定の遺伝子調節領域が活性化されたときにのみ発現できるようにすることができる。そこで、細胞内外で起こっている種々の生命現象に於いて注目するタンパク質の発現又は注目する遺伝子領域の活性化に伴って蛍光又は発光タンパク質を発現させ、光学顕微鏡によるイメージングに於いて、その注目されるタンパク質又は遺伝子領域が何時或いはどのように発現するか、或いは、細胞内外で発現されたタンパク質がどのように振舞うかなどを観察又は検出するためのレポーター分子又はプローブ分子として利用する試みが為されている。
ＧＦＰ等の蛍光タンパク質は、細胞内で比較的安定で、そのタンパク質から発せられる蛍光が明るいので、既に、細胞内の構造物を安定的に且容易にイメージングするために、広範囲に利用されつつある（例えば、メイソン著、「生物活性のための蛍光・発光プローブ」（Ｍａｓｏｎ（１９９９），Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．）参照）。他方、ルシフェラーゼなどの化学発光又は生物発光現象により発光する発光タンパク質は、光学顕微鏡による観察の際に、蛍光色素を励起するための（しばしば細胞又はその他の生物試料にダメージを与え得る）励起光を必要としないので、生物試料を、それにダメージを与えることなく、イメージングするためのプローブの一つとして期待されている。そのような発光タンパク質を利用したイメージングの例はいくつか報告されている。例えば、ルッター等（Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗｈｉｔｅ，Ｔａｖａｒｅ（１９９５）”Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎ‐ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．５：８９０‐８９９．）は、フォトンカウンティングカメラを使用して単一の生細胞中のルシフェラーゼの遺伝子発現のイメージングによりインシュリン信号伝達にＭＡＰキナーゼが関与していることを観察した。また、スターンベルグ等（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｅｂｅｒｌ，Ｋｏｎｇｓｂａｋ，Ｍｏｌｉｎ（１９９７），”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｏｗ‐ｌｉｇｈｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．１２：７‐１３．）は、フォトンカウンティングカメラと冷却ＣＣＤカメラを用い生物発光の検出について報告した。更に、タカスカ等（Ｔａｋａｓｕｋａ，Ｗｈｉｔｅ，Ｗｏｏｄ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄａｖｉｓ（１９９８），“Ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｌｉｖｉｎｇ  ｌａｃｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１３９：１３６１‐１３６８．）は、フォトンカウンティングカメラを使用して単一の生細胞中のルシフェラーゼの遺伝子発現のイメージングによりプロラクチンプロモーターの活性化に於ける動的変化が観察されたことを報告した。
上記の如き細胞内にて遺伝子発現させられた蛍光又は発光タンパク質のイメージングに於いて、蛍光タンパク質の蛍光は、既に述べた如く、比較的明るいので、その蛍光の顕微鏡像は、既存の光学顕微鏡及び撮影システムを用いて比較的鮮明な画像として取得することが可能である。しかしながら、細胞又はその他の生物試料（以下、「細胞等」とする。）からの発光タンパク質の発光強度は、一般に極めて微弱であり、通常の顕微鏡像を撮影するためのカメラ又は撮影装置では顕微鏡像を撮影することが相当に困難である（実際、発光タンパク質の発光は、光学顕微鏡下に於いて、接眼レンズから肉眼で目視することは通常できない）。そこで、従来の技術に於ける発光タンパク質のイメージングでは、光学顕微鏡に超高感度カメラやフォトンカウンティングカメラ等の微弱光を検出するために特化したカメラ又は撮影装置を取り付けたシステムが用いられる（しかしながら、そのような超高感度カメラ等を用いても一つの画像を生成するまでには、少なくとも数分から数十分間、カメラの受光面に於いて試料からの光を積算することが必要となっている。）。
ところで、光学顕微鏡下で蛍光観察又は発光観察する場合、顕微鏡像に現れる光は、原理的にタンパク質から発せられる光だけであるので、被験試料中のタンパク質が存在していない領域の様子又は形態は観察することができない。蛍光タンパク質を観察する場合には、蛍光タンパク質の蛍光が比較的明るいことと、励起光を当てることにより細胞等の内部の蛍光タンパク質以外の物質からの自家蛍光が発せられることとにより、細胞等の形態又は状態が観察可能な場合がある。しかしながら、発光タンパク質の発光観察の場合、発光タンパク質からの発光のように試料からの光は、数分から数十分間積算しないと画像が生成できないほど、極めて微弱であり、発光タンパク質以外の物質から光が全く発せられない状況に於いては、被験試料中の細胞等の位置、形態又はその変化は、殆ど把握することができない（光が来ないところに細胞があるのかないのかも分からない。）。また、観察期間中に（特に、生きた細胞等の試料を長期間観察する際）、発光強度が変化したり、細胞が移動又は変形する場合があり、どの細胞が発光しているのか、又は、細胞のどの部位が発光しているのかの特定は極めて困難である。例えば、或る神経細胞に於いて、細胞質と神経突起の発光現象の変化を解析するといったことは非常に困難であった。
従来の技術の幾つかに於いては、発光タンパク質の発光観察の際に細胞等の位置、形態を観察するために透過光観察が併用されているが、その場合、カメラの受光面に於ける受光量が透過光観察の場合と発光観察の場合とで著しく異なるので、透過光観察のために、発光観察のためのカメラとは別のカメラが使用され（対物レンズも異なる場合がある。）、発光画像（発光タンパク質の光による画像）と照明画像（透過光による画像）がそれぞれ別々のカメラで生成される。即ち、細胞等の形態を表す顕微鏡像と、発光タンパク質の分布を表す顕微鏡像が別々の画像上に存在することとなるので、被験試料内に於ける発光タンパク質の実際の分布又は位置を正確に決定することは困難となる（しばしば、透過光観察のためのカメラと発光観察のためのカメラと視野の大きさや位置がずれることもあり、そうなると、被験試料内に於ける発光タンパク質の実際の分布又は位置の特定はより困難となる。）。また、一度に観察する細胞数が多い場合には、発光画像中の光っている細胞を照明画像中の細胞に対応させることも容易ではない。
上記の如き発光タンパク質を用いた「発光イメージング」に於いて、もし被験試料内の細胞等の形態又は状態を把握しつつ、被験試料内の発光タンパク質の分布を検出又は特定することができれば、「発光イメージング」の利用範囲が広がり、種々の生命現象に関わる反応の解析等に応用できるはずである。しかしながら、既に述べた如く、従来の技術に於いては、発光タンパク質が極めて微弱であり、また、試料中の発光タンパク質の存在しないところから全く光が来ないということに起因にして、画像に於いて発光タンパク質の発現の有無は検出できるが、或る細胞中のどこで又は被験試料中のどの細胞で発光タンパク質が発現したかといった情報を取得することが非常に困難となっている。実際、超高感度の検出素子を用いれば、微弱な発光を検出することが可能であるが、モザイク画像しか得ることができず、発光量を測定する領域を指定して詳細な解析を行うことは困難であった。
【発明の開示】
【０００３】
かくして、本発明の一つの目的は、上記の生物発光現象により生ずる微弱光による細胞又はその他の生物試料のイメージングに於いて、発光している細胞や細胞内の発光部位を特定することのできる態様にて細胞等の発光画像を取得する装置又は方法を提供することである。
また、本発明のもう一つの目的は、上記の如き装置又は方法に於いて特定した領域からデータを取得して、種々の細胞内の現象の解析に用いることを可能にする装置又はその方法を提供することである。
本発明の一つの態様によれば、光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する装置は、被験試料を照明する照明部と、被験試料の照明画像を取得する照明画像取得部と、被験試料内の細胞の発光画像を取得する発光画像取得部と、照明画像と発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成し、重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する画像処理部とを有することを特徴とする。かかる構成に於いて、典型的には、光学的結像装置は、光学顕微鏡であってよい。その場合、照明画像は、照明部の照明光を用いて光学顕微鏡に於いて透過光観察することにより得られる透過光顕微鏡像であり、発光画像は、光学顕微鏡に於いて細胞内の発光現象により発せられる光を観察して得られる発光顕微鏡像である。そして、好ましくは、照明画像取得部と発光画像取得部とは、共通の顕微鏡像撮影装置を含み、透過光顕微鏡像と発光顕微鏡像とは、共通の顕微鏡像撮影装置により撮影される。
上記の構成によれば、被験試料内の細胞の発光現象を観察して得られる発光画像が、被験試料を照明部により照明して得られ被験試料内の細胞等の形態又は状態が観察できる照明画像と重ね合わされることにより、発光画像上の細胞の発光部位の、被験試料内又は細胞内の位置が、従前に比して、より正確に特定できることとなる。特に、照明画像（透過光顕微鏡像）と発光画像（発光顕微鏡像）とが共通の顕微鏡像撮影装置により撮影される場合には、画像の重ね合わせは、極めて簡単となり、有利である。似たような形態の細胞が観察領域内に多数存在していても、どの細胞が発光しているかは、発光画像が被験試料内の細胞の形態を表す照明画像と重ね合わされた画像を見れば、直ちに特定することが可能であり、従って、画像に於いて着目すべき領域、即ち、発光現象等の解析を行う際に注目すべき領域（解析領域）の指定も容易にできることとなる。また、被験試料の状態が照明画像に於いて把握されるので、細胞が移動又は変形しても、どの細胞が何処に如何に移動又は変形したかが容易に判定でき、これに対応して発光強度がどのように変化したかも容易に把握できることとなる。更に、被験試料中の細胞の密度により複数の細胞が重なっている場合、発光画像のみでは、そのような細胞等の重なりは、判別が困難であるが、上記の本発明の構成によれば、照明画像により予め適宜の細胞密度の領域を指定でき、細胞の重なりの有無を判別できるので、発光量を、より正確に解析できることとなる。
上記の本発明の装置に於いては、既に述べた如く、重ね合わされる透過光顕微鏡像と発光顕微鏡像とは、好ましくは、共通の顕微鏡像撮影装置により撮影される。この点に関し、本願出願人の研究によれば、光学顕微鏡の、被験試料の像を顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる対物レンズとレンズ組立体に於いて、受光面に於ける被験試料の像の投影倍率（β）に対する対物レンズの開口数（ＮＡ）の比（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上とすると、単一の細胞から発生する発光だけでＣＣＤカメラ等の撮影装置に於いて画像を生成できることが証明された（特願２００５−２６７５３１号参照）。そして、驚くべきことに、この撮像条件は、従来、画像化が困難であったあらゆる生物由来の試料にも適用できる可能性が有り、生物発光のような光学顕微鏡下で肉眼では直接観察出来ないような微弱な発光成分による場合でも、細胞等の画像を短い時間（例えば２０分以内）で撮像できることが見出された。又、さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮影装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内という短時間で画像化でき、画像解析も可能な細胞等の画像が取得できることを突き止めた。従って、本発明の装置の実施の形態に於いては、（ＮＡ÷β）の２乗の値が、好ましくは、０．０１以上、より好ましくは、０．０７１以上となるよう、顕微鏡像撮影装置の受光面と対物レンズとレンズ組立体とを構成することにより、より良好な透過光顕微鏡像と発光顕微鏡像との重ね合わせ画像を生成できることとなる。
また、上記の本発明の装置に於いては、更に、細胞の蛍光画像を取得するための蛍光画像取得部が設けられていてもよい。光学的結像装置が光学顕微鏡である場合には、蛍光画像は、光学顕微鏡に於いて被験試料の蛍光観察をすることにより得られる蛍光顕微鏡像となる。この場合も、蛍光顕微鏡像と発光顕微鏡像とは共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されてよい。当業者にとってよく知られているように、蛍光観察に於いては、種々の環境条件に感受性のある蛍光色素、例えば、ｐＨ感受性、Ｃａ濃度感受性、膜電位感受性の色素など、を用いることにより、細胞内の種々の反応を検出できるので、そのような蛍光観察による蛍光画像と発光画像とを組み合わせることにより、細胞内の発光部位と種々の細胞内の現象とを関連付けられることは理解されるべきである。重要なことは、照明画像と発光画像とを重ね合わせることにより、被験試料内の細胞等の形態と発光部位との位置関係が容易に把握できるという特徴によって、蛍光画像と発光画像とを組み合わせることの有用性が更に増大するということである。
実施の形態に於いて、本発明の装置では、重ね合わせ画像を表示する表示部が設けられ、表示部上で使用者が被験試料内又は細胞内に於いて発光部位を容易に目視できるようになっていてよい。また、画像の解析や表示の目的で、本発明の装置に於いては、重ね合わせ画像を記録する記録部が設けられていてよい。
ところで、細胞の発光を観察する場合、特に、その発光が遺伝子導入により発現されるルシフェラーゼ、エクオリンなどの発光タンパク質の発光をイメージングする場合、既に述べた如く、発光タンパク質の遺伝子が、発光タンパク質が任意の（測定対象となる）タンパク質と融合した状態で発現するように、又は、遺伝子の調節領域の下流に置換若しくは挿入されるように、細胞内に導入され、かくして発現される発光タンパク質が、測定対象の任意のタンパク質が何時何処で発現するかを探索するためのレポーター分子として利用される。この点に関し、発光タンパク質によりレポートされるタンパク質は、しばしば、細胞が種々の刺激を受けたときに発現される。そこで、本発明の装置の実施の形態に於いては、細胞へ任意の刺激を与える細胞刺激供給部が設けられていてよい。細胞刺激供給部は、例えば、細胞へ試薬を供給する試薬供給部と、被験試料の温度を調整する温度調整部と、細胞へガスを供給するガス供給部とからなる群から選択される少なくとも一つであってよい。
また、実施の形態として、上記の本発明による装置は、光学顕微鏡と、その光学顕微鏡により観察される顕微鏡像を撮影する顕微鏡像撮影装置と、該顕微鏡像を画像データとして取込んで画像処理を行う画像処理装置とを含む生物由来の被験試料の画像を取得する装置であって、画像処理装置が、光学顕微鏡に於いて被験試料を透過光観察する際の被験試料の像を顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる透過光画像と、光学顕微鏡に於いて被験試料中の細胞内の発光現象に発せられる光を顕微鏡像撮影装置により撮影して得られる発光画像とを重ね合わせて重ね合わせ画像を生成する画像重合部と、その重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する画像領域指定部とを含むことを特徴とする装置であってよい。かかる装置に於いて、好適には、顕微鏡像撮影装置が受光面を有し、光学顕微鏡が被験試料の像を顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる対物レンズとレンズ組立体を含み、光学顕微鏡の光学系は、受光面に於ける被験試料の像の投影倍率に対する対物レンズの開口数の比の２乗の値が０．０１以上となるよう構成される。
本発明のもう一つの態様によれば、光学的結像装置を用いて生物由来の被験試料の画像を取得する方法であって、被験試料を照明し照明画像を取得する過程と、被験試料を照明せずに被験試料内の細胞の発光現象により放出される光による発光画像を取得する過程と、照明画像と発光画像を重ね合わせて重ね合わせ画像を生成する過程と、重ね合わせ画像に於いて解析領域を指定する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。かかる本発明の方法によれば、上記の本発明による装置の場合と同様に、照明画像と発光画像とを重ね合わせた画像を生成し、これにより、照明画像に現れる細胞内又は被験試料内に於いて発光の観られる領域を把握しながら、発光現象の解析を実行することが可能となる。なお、本発明の方法は、上記本発明の装置を用いて実行可能であるが、その他の任意の装置を用いて実行されてもよい。また、上記の本発明の方法に於いても、発光画像と照明画像に加えて、被験試料内の細胞の蛍光画像を取得する過程が実行されてよい。これにより、細胞内又は被験試料内で発光現象が起きている部位を把握しつつ、発光現象と蛍光により得られる情報とを関連付けることが可能となる。
上記の本発明の方法に於いては、本発明の装置の場合と同様に、光学的結像装置が光学顕微鏡であってよく、その場合、照明画像は光学顕微鏡に於いて透過光観察することにより得られる透過光顕微鏡像であり、発光画像が光学顕微鏡に於いて被験試料の細胞内の発光現象を観察して得られる発光顕微鏡像であり、透過光顕微鏡像と発光顕微鏡像とが共通の顕微鏡像撮影装置により撮影されることが好ましい。また、光学顕微鏡に於いて、好適には、被験試料の像を顕微鏡像撮影装置の受光面に結像させる対物レンズとレンズ組立体は、受光面に於ける被験試料の像の投影倍率に対する対物レンズの開口数の比の２乗の値が０．０１以上となるよう構成されてよい。
実施の態様に於いて、例えば、発光現象を長時間に亙って撮影する場合など、被験試料を照明し照明画像を取得する過程を複数回実行し、これにより、被験試料内の細胞等の形態の変化、位置の移動が任意に確認されてよい。また、細胞に或る特定の刺激、例えば、薬剤刺激と、電気刺激と、ガスによる刺激と、熱による刺激が与えられることにより、細胞内の遺伝子に組み込まれた発光タンパク質の遺伝子が発現する場合には、照明画像及び発光画像（又は追加的に、蛍光画像）を取得する過程に先立って細胞に前記に列記されている如き刺激のうちの少なくとも一つの刺激を選択的に与える過程が実行されてよい。その場合、好適には、刺激前の状態を確認する目的で、細胞に刺激を与える過程に先立って照明画像及び発光画像を取得する過程が実行されてよい。
また、上記の一連の種々の画像の取得後、照明画像と発光画像を重ね合わせる処理過程の後、使用者が画像を確認し又は後に実行される任意の処理の目的で、照明画像と発光画像との重ね合わせ画像を表示し又は記録する過程が実行されてよい。また、任意に、解析領域の指定後に、より詳細に解析領域の状態を確認し又は観察するために、解析領域に対応する照明画像の領域と、解析領域に対応する発光画像の領域と、（蛍光画像も在るときには）解析領域に対応する蛍光画像のうち少なくとも２つを表示する過程が実行されてよい。発光現象の解析に於いては、解析領域に対応する発光画像の領域の光強度を測定する過程と、該光強度の変化を表示する過程が実行されてよい。
上記の説明から理解される如く、総じて、発光イメージングに於いては、本来、被験試料中の発光タンパク質が存在していない領域の状態を観察することができない上に、画像を撮影する装置又はカメラに於いて観測される光が極めて微弱であることにより、発光タンパク質による発光現象が検出できても、被験試料中のどこで発光現象が発生しているかを正確に把握することが困難であったところ、本発明の装置及び方法によれば、照明画像と発光画像とを重ね合わせた画像を生成し、これにより、被験試料に於いてどこで発光が起きているかを把握した態様にて発光現象の解析を実行することが可能となる。かかる本発明の特徴によれば、照明画像と発光画像との重ね合わせ画像から直ちに発光している細胞と発光していない細胞とをそれぞれ特定できるので、発光が見られた細胞数と発光が見られなかった細胞数についての任意の統計的な解析を実行することも可能となる。また、発光している細胞についてのみ注目した発光強度の経時的な観測も従前に比して非常に容易になる。例えば、測定中に、被験試料に於いて細胞が移動しても照明画像と発光画像との重ね合わせ画像に於いて発光している細胞を追跡するといったことが可能である。顕微鏡の対物レンズの倍率を増大する場合、従前では、対物レンズの倍率を上げることにより、相対的に発光部位からの信号が低減し、これにより、発光部位を見失うことがあったが、本発明によれば、照明画像と発光画像との重ね合わせ画像に於いて発光する被験試料中の部位が特定されるので、発光部位を見失うといった不具合も低減される。
本発明は、細胞又はその他の生物試料のイメージングに於ける発光タンパク質の有用性を増大するものであるということができる。本発明によれば、従前では、専ら分光計測により実行されていた発光タンパク質をレポーター分子として用いる細胞内の種々のタンパク質の発現に関する種々の実験又は測定・解析が、イメージングにより個々の細胞を特定しつつ実行できるようになると期待される。
本発明のその他の目的及び利点は、以下に於いて、部分的に明らかになり、指摘される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、倒立型光学顕微鏡を含む本発明の微弱光測定装置の第一の実施形態の構成の概略を示す模式図であり、図１Ｂは、被験試料中の細胞に刺激を与える装置を含む図１Ａの試料容器周辺をより詳細に示す模式図である。
図２Ａは、微弱光測定装置のコンピューター８０（画像処理装置）の構成を機能ブロック図で表した図であり、図２Ｂは、コンピューター８０へ接続される操作パネルの模式図である。
図３は、本発明の微弱光測定装置を用いて実行可能な本発明の生物由来の被験試料の画像を取得する方法の処理過程をフローチャートの形式で表したものである。
図４は、時計遺伝子を導入した発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドを発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞に於いて観察される発光強度の周期的変動を模式的に示す図である。２４時間周期で発光が極めて微弱となる時間（ａ）に於いては、発光画像が得られない状態となる。
図５は、蛍光と生物発光の同時測定を行なう本発明の微弱光測定装置の第二の実施形態の構成（光学系）の模式図である。
図６は、蛍光と生物発光についての測定およびデジタルズームと光学ズームによる画像拡大をそれぞれ同時に行なう本発明の微弱光測定装置の第三の実施形態の構成（光学系）の模式図である。
図７は、例１の被験試料として用いられるＨｅｌａ細胞に導入されるテトラサイクリン・オペレータ（ＴｅｔＯ２）をもつ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドに於いて想定される分子の状態を説明する図である。図７Ａに示されている如く、ＴｅｔＲホモダイマーがＴｅｔＯ２領域に結合すると、ＴｅｔＯ２領域に接続されたルシフェラーゼ遺伝子が発現しないが、細胞にテトラサイクリンを与えると、図７Ｂに示されている如く、ＴｅｔＲホモダイマーが構造変化し、ＴｅｔＯ２領域から外れ、ルシフェラーゼが発現する。
図８は、例１におけるテトラサイクリンの添加と照明画像・発光画像の露光タイミングを示す図である。
図９Ａは、例１において取得された照明画像であり、図９Ｂは、例１において取得された発光画像であり、図９Ｃは、図９Ａの照明画像と図９Ｂの発光画像を重ね合わせた画像（図９Ａの枠内の拡大像）を示す。図９Ｃに於いて、ＲＯＩ−１、ＲＯＩ−２と示した四角枠は、解析領域として指定された領域である。
図１０は、図９Ｃに於いて指定された解析領域の（ＨｅＬａ細胞の）発光強度の経時的変動を表すグラフである。
図１１Ａは、例２において取得された照明画像であり、図１１Ｂは、例２において取得された発光画像であり、図１１Ｃは、図１１Ａの照明画像と図１１Ｂの発光画像を重ね合わせた画像を示す。図１１Ｃに於いて、発光部位は、実際の装置に於いては、擬似カラーで表示されるが、図に於いては、白色にて示されている。
図１２は、図１１に於ける領域ＰＰ−１の発光バクテリアの発光強度の経時的変動を示すグラフである。
図１３Ａは、例３において取得された照明画像であり、図１３Ｂは、例３において取得された発光画像であり、図１３Ｃは、図１３Ａの照明画像と図１３Ｂの発光画像を重ね合わせた画像を示す。
図１４は、例３において時間変化に伴う発光バクテリアの移動している様子を示す重ね合わせ画像（左）と照明画像（右）である。
図１５は、例３における発光バクテリア（Ｖ．ｔ．）の発光強度の経時的変動のグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。図中、同一の符号は、同一の部位を示す。
本発明の装置の第一の実施形態
装置の構成
図１Ａは、本発明による、生物発光現象によって生ずる微弱光を測定して細胞又はその他の生物試料のイメージングを行うための生物由来の被験試料の画像を取得する装置（以下、「微弱光測定装置」と称する。）の好ましい第一の実施形を模式的に表した図である。
同図を参照して、本発明の微弱光測定装置は、光源２と、光源２から発せられた光を平行光とし、被験試料４へ導くための照明光学系１と、被験試料４の像を生成するための観察光学系５と、被験試料４の像を拡大して目視観察するための接眼レンズ６とを含む倒立型顕微鏡と、被験試料４の顕微鏡像を撮像するための撮像素子７を有するＣＣＤカメラ８（画像取得部又は顕微鏡像撮影装置）と、ＣＣＤカメラ８が信号ケーブル８１により接続されＴＶモニタ３７を含むコンピューター８０（画像処理部又は画像処理装置）とを含んでいる。
光学顕微鏡の構成
上記の光学顕微鏡の構成は、通常の倒立型の顕微鏡であってよく、照明光学系１は、光源２側から順に、コレクターレンズ１０、照明光の光軸１１を偏向させるための偏向ミラー１２及びコンデンサーレンズ１４により構成される。光源２はハロゲンランプ、ＬＥＤ光源、タングステンランプ、水銀ランプなどの可視域の波長のインコヒーレント光源であってよい。なお、レーザーのようなコヒーレント光源の光を拡散板などによりインコヒーレントな光に変えて、光源として用いても良い。光源の波長は通常、可視光を用いるが、赤外光を用いても良い。
観察光学系５は、被験試料４側から順に、被験試料４の像を形成するための対物レンズ１５、第１のリレーレンズ１６、対物レンズ１５からの光を偏向するための偏向ミラー１７、第１のリレーレンズ１６と共に対物レンズ１５の像（被験試料４の像）を結像面に結像させるための第２のリレーレンズ１８により構成される。また、第２のリレーレンズ１８と結像面１９との間には、被験試料４の像を接眼レンズ６による目視観察とＣＣＤカメラ８による観察が任意に切り替えることができるように、切替ミラー２０が配置されていてよい。なお、切替ミラー２０は機械的な切り替えタイプ以外に、ハーフミラーを用いて２つの光路を分離するようにしても良い。
上記の構成に於いて、透過光による被験試料の観察の際、通常の光学顕微鏡による透過光観察の場合と同様に、被験試料４は、ケーラー照明により照明される。即ち、光源２からの光は、コレクターレンズ１０により平行光とされ、コンデンサーレンズ１４の瞳位置にて光源２の像が結像された後、被験試料４を照明する。そして、被験試料４を照明した光は、被験試料４を透過して対物レンズ１５に入射し、第１のリレーレンズ１６及び第２のリレーレンズ１８により結像面１９にて被験試料４の像を形成し、かかる結像面１９に形成された被験試料４の像は、接眼レンズ６を介して観察者により観察される。また。ＣＣＤカメラ８にて被験試料４の像を撮影するときには、第２のリレーレンズ１８を透過してきた光は、切替ミラー２０により、反射され、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７上で被験試料４の像が形成される。なお、対物レンズの倍率は、例えば、２０倍であってよい。
被験試料４は、図示されている如く、試料ステージ３に載置される。試料ステージ３上に於いて、好適には、図１Ｂにより詳細に示されている如く、被験試料４は、フタ２６付きのシャーレなどの試料容器２１に培養液と共に入れられてよい。試料容器２１の底面は、光学的に透明な顕微鏡用カバーガラスと同じ材質で、その厚さが０．１７ｍｍであり、通常の対物レンズにより試料容器２１の底面上の試料が観察できるようになっている（なお、試料容器２１はシャーレに限ることなく、スライドガラス、マイクロプレートなどを用いても良い。）。また、試容器２１内の湿度を保つために、試料容器２１は、ノズル２３を通して純水が供給される水槽２２内に配置され、更に、水槽２２とともにフタ付き密閉容器３０内に収容される。そして、図１Ｂにより詳細に示されている如く、水槽２２の上面には、測定装置本体の外部に置かれたガスボンベ２５からガス供給チューブ２４とＣＯ２ノズル８４を通してＣＯ２ガスが供給される。ガスボンベ２５内のガスは、例えば、ＣＯ２５％、Ｏ２９５％の混合ガスである。フタ付き密閉容器３０内へ供給されるＣＯ２ガスの流速は、５０ｍＬ／ｍｉｎ程度であってよい。更に、好適には、試料容器２１の下には、ヒートプレート２７が配置されてよい。ヒートプレート２７は、典型的には、温度コントローラー（図示せず）により０．５℃ステップ間隔で試料容器内の温度を調節する。
更に、後で説明されるように、細胞に刺激を与えることにより、発光現象を発生させる（発光タンパク質を発現させる）実験を行うために、細胞に刺激を与える装置として自動分注装置１００が備えられてよい。自動分注装置１００に於いては、ポンプ１０２により試薬容器１０１から試薬溶液を吸引し、試料容器２１に所定量の試薬溶液をノズル１０３により吐出する。図示の如く、試料容器２１がフタ付き密閉容器３０内に収容されている場合には、好適には、密閉容器３０のフタ３１と試料容器フタ２６が自動分注装置１００の作動と協調してノズル１０３からの試薬溶液の吐出前にモーター（図示せず）により開き、溶液の吐出が終了すると、フタ３１と試料容器フタ２６がモーターにより閉じるようになっていてよい。なお、自動分注装置１００は、後に説明するコンピューターの制御により、顕微鏡像の取得の前後又はその途中の任意の時点に作動できるようになっていてよい。
更にまた、好適には、試料ステージ３には、試料ステージ３を水平方向（Ｘ方向、Ｙ方向）に自在に移動させる２個のステッピング・モーター（図示せず）がそれぞれ９０°方向に別々に取り付けられ、コンピューター８０の指令に基づき試料ステージコントローラー（図示せず）により２個のステッピング・モーターを駆動し、自動的に試料ステージ３の位置を移動制御できるようになっていてよい。
また更に、好適には、試料ステージ３の下方に配置された対物レンズ１５には、対物レンズヒーター２８が接触して周囲に取り付けられ、対物レンズ１５の温度が、温度調整装置（図示せず）の制御下、対物レンズヒーター２８によって０．５℃ステップ間隔で制御され、対物レンズ１５を外側から任意の温度に保持できるようになっていてよい。更に、対物レンズヒーター２８の周囲には対物レンズＺ軸駆動機構９が備えられ、対物レンズ１５をＺ軸（光軸方向）に沿って自動的に駆動できるようになっていてよい。対物レンズＺ軸駆動機構９は、ラックピニオン機構（図示せず）で対物レンズ１５を上下に移動させる。ラックピニオン機構のノブの回転動作はコンピューター制御されたステッピング・モーター（図示せず）により行なわれる。なお、対物レンズＺ軸駆動機構９は、フリクションローラー機構であってもよい。
顕微鏡像撮影装置の構成
被験試料４の像を受光するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラ８の受光面にある撮像素子７の画素数は、例えば、１，３６０×１，０２４であってよい。本発明の装置に於いては、後に説明される如く、ＣＣＤカメラ８により、被験試料４の透過光観察により得られる透過光顕微鏡像と、被験試料４の発光観察、即ち、被験試料４中の細胞内の発光現象により発せられる微弱光を観察することにより得られる発光顕微鏡像との双方を撮影する。従って、発光観察時の微弱光を撮影するために受光器としてのＣＣＤカメラ８は、できる限り高感度のものであることが好ましい。好適には、ＣＣＤカメラ８は、ＣＣＤカメラ８から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラ８の底部にペルチエ素子から成る冷却装置２９が備え付けられ、ＣＣＤカメラ８の温度が＋５℃〜−７０℃程度の温度範囲にて冷却することのできる冷却ＣＣＤである。また更に、ＣＣＤカメラ８の受光面の上方には、赤外線カットフィルター１３が配置され、背景光となる赤外線を遮断するようになっていることが好ましい。ＣＣＤカメラ８で撮影された像は、信号ケーブル８１を通してコンピューター８０へ送信され、コンピューター８０に接続されたＴＶモニタ３７上に映し出される。なお、ＣＣＤカメラ８は、３板式カラーカメラとして、カラーの照明画像が得られるようになっていてもよい。また、顕微鏡像の撮影装置として、例えば、ＣＭＯＳイメージセンサーやＳＩＴカメラなどが採用されてもよい。
画像処理装置の構成
コンピューター８０は、ＣＰＵを含み、当業者にとって公知の任意の形式の各種の画像処理が可能なコンピューターにより構成されてよい。コンピューター８０は、本発明の微弱光測定装置に於ける各部の作動を制御して顕微鏡像を画像データとして取得するとともに、後に説明される如く透過光観察により取得された照明画像と発光観察により取得された発光画像の重ね合わせ画像の生成、重ね合わせ画像を用いた解析領域の指定等の画像データを用いた種々の処理を実行する。
図２Ａは、コンピューター８０を機能のブロック図の形式にて表したものである。同図を参照して、コンピューター８０は、ＣＰＵ３５と、ＣＰＵ３５の動作を制御するための制御プログラムが記憶されているメモリ４１と、ＣＣＤカメラ８の撮影像を画像データとして変換するための信号処理回路３３及びディジタルズーム回路３４と、ＣＣＤカメラ８の撮影像を表示するための表示制御回路３６及びＴＶモニタ３７と、ＣＣＤカメラ８の撮影像又はそれを画像処理により得られた画像を記録し或いはＴＶモニタ３７に表示するための記録再生制御回路３８及び記録媒体３９のためのドライブと、使用者の指示を入力するための操作パネル４０を含んでいる。操作パネル４０に於いては、図２Ｂに例示されている如く、再生ボタン４３、録画ボタン４７、シャッタボタン４４、ズーム拡大ボタン４２、ズーム縮小ボタン１４３、十字カーソルボタン４５、モードスイッチ４８等の種々のボタンが設けられ、使用者の指示がＣＰＵ３５に接続された操作パネル４０を介して入力されるよう構成される。
上記の構成に於いて、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７に結像された被験試料４の顕微鏡像は、撮像素子７にてアナログの電気信号、即ち、画像信号に変換され、画像信号は、ＣＰＵ３５の制御下、信号処理回路３３へ送信され、増幅処理やフィルタリング処理、輪郭強調などの画像処理が施された後、ディジタルズーム回路３４（ディジタル信号処理部）に送られる。デジタルズーム回路３４は、信号処理回路３３からのアナログの画像信号をＡ／Ｄ変換してディジタル画像信号に変換し、必要に応じてガンマ補正などのディジタル処理を施した後、ＴＶモニタ３７に画像を表示するための表示制御回路３６と、画像データをメモリスロット（図示せず）に収容されている着脱可能な記録媒体３９（例えば、メモリカード、ハードディスク、磁気ディスク、光磁気ディスクなど）に記録するための記録再生制御回路３８とにディジタル画像信号を送信する。この点に関し、本発明の装置に於けるデジタルズーム回路３４は、ＣＰＵ３５からの制御信号に基づいてＣＣＤカメラ８によって取り込まれる全画素領域のうちの任意の一部の領域のみを切り出して、その切り出された画像領域を任意の倍率にて拡大して表示制御回路３６又は記録再生制御回路３８へ送信できるよう構成されている。従って、ＣＣＤカメラ８によって撮影された顕微鏡像のうちの一部のみを、ＴＶモニタ３７上に拡大して表示することができ、或いは、記録媒体に記録することが可能である。
また、上記の構成に於いて、記録再生制御回路３８は、ＣＰＵ３５から与えられる再生制御信号に応答して、記録媒体３９に記録されているディジタル画像信号を読み出し、読み出されたディジタル画像信号は、表示制御回路３６を介してＴＶモニタ３７に入力され、これによって、ＴＶモニタ３７の画面上に記録された被験試料４の画像が表示されるようになっていてよい。
上記の画像処理装置の操作に於いて、使用者が操作パネルの録画ボタン４７をＯＮにすると、本発明の装置は、録画モードに入り、ＣＰＵ３５は、記録制御信号を記録再生制御回路３８に供給する。記録再生制御回路３８は、記録制御信号に応答して、ディジタルズーム回路３４から供給される画像信号を記録媒体に記録する。また、再生ボタン４３をＯＮすると、本発明の装置は、再生モードに入り、ＣＰＵ３５は、再生制御信号を記録再生制御回路３８に供給し、記録再生制御回路３８は、上記の如く記録された画像データをＴＶモニタ３７に表示する。更に、モードスイッチ４８が撮像モードとなっているとき、シャッタボタン４４を押すと、ＣＰＵ３５からデジタルズーム回路３４に制御信号が出力され、そのときのＣＣＤカメラ８から１コマ分の画像が、デジタルズーム回路３４にてディジタル信号処理を施された後、メモリ４１に書き込まれる。メモリ４１に書き込まれた画像データは、任意の圧縮回路によって圧縮処理されて、カードリーダ／ライタ装置によってメモリカードに記録される。
デジタルズーム回路３４に於けるＣＣＤカメラ８によって取り込まれる全画素領域のうちの任意の一部の領域のみの切り出しは、ズーム拡大ボタン４２、ズーム縮小ボタン１４３と十字カーソルボタン４５とにより設定される。画像の切り出し領域の設定の際、ＴＶモニタ３７上には、デジタルズーム回路３４によって切り出される画像領域の中心を表す「ズーム中心位置」が表示され、また、切り出される画像領域の枠が表示される。使用者は、ＴＶモニタ３７を観ながら、十字カーソルボタン４５を操作して、任意の位置にズーム中心位置を設定するとともに、ズーム拡大ボタン４２、ズーム縮小ボタン１４３を操作して、切り出される画像領域の大きさを設定することができる。切り出した後の画像の拡大倍率は、Ｍ＝１．００（ＣＣＤカメラで取り込む全領域）〜４．００（ＣＣＤカメラで取り込む全領域の１／４）の範囲内にて自由に設定可能であってよい。
なお、上記の如き、画像の拡大は、デジタルズーム回路３４に於いて行うのではなく、顕微鏡内の光学系を調節すること（光学的ズーム）により行なってもよい。光学ズームは、例えば、ＣＣＤカメラ８と第２のリレーレンズ１８の間の焦点距離をステッピング・モーターによるモーター駆動で、光軸上で移動させることにより実行される。また、光学ズームを行うためのレンズ（ズームレンズ）の構成として、３変倍レンズ群、収差補正などを行なう補正レンズ群及びフォーカス調整を行なうフォーカスレンズ（図示せず）を用いて、レンズの焦点距離を１０段階で手動又は自動で可変できるようになっていてよい。ズームレンズの駆動は、ＣＰＵ３５から発せられる制御信号に基づいて、ズームレンズの周囲に取り付けられたズームモーター（超音波モーターなど）の作動により、ズームレンズを光軸に沿って移動させることにより為されてよい。
更に、コンピューター８０は、自動分注装置１００、照明装置８２（光源２を含む）の作動を制御するべく、これらの装置と接続され、自動分注装置１００による分注動作の実行と同期して、ＣＣＤカメラ８による撮像された画像信号を取得できるようになっていてよい。
第一の実施形態の装置による被験試料の観察及び測定
既に述べた如く、発光タンパク質による発光現象を測定する場合、発光強度が極めて微弱で、ほとんど光信号として、ＣＣＤカメラで検出することができず、細胞の内部構造は、通常、観察できない。即ち、通常の顕微鏡観察のように、試料内の観察対象である細胞を確認しながら対物レンズのフォーカスを合わせることができない。そこで発光観察に於ける対物レンズのフォーカス位置は、透過光観察により、ハロゲンランプなどの光源からの光を照明光学系を通して、被験試料に照明し、被験試料による顕微鏡の照明画像を得て、これに基づいて決定される。例えば、透過光観察において、高いコントラスト像が得られる、対物レンズの光軸上の２箇所の略中心位置を対物レンズの焦点位置とすることにより、生物発光タンパク質による発光強度が大きくなってきたときに、ＣＣＤカメラに合焦された鮮明な発光像が得られる。以下、上記の本発明の装置を用いて、本発明の発光タンパク質による発光によるイメージングの方法について述べる。
図３は、本発明の発光イメージングの方法に於ける処理過程をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、まず、被験試料４（細胞等）と培養液をシャーレ（試料容器２１）に入れ、試料容器２１を装置にセットし（ステップ１）、照明光が点灯される。（ステップ２）。そして、対物レンズ１５をして、被験試料４の顕微鏡像をＣＣＤカメラ８の撮影素子７の受光面上に結像させ撮像素子７からの信号から、被験試料の照明画像を取得する（ステップ３）。次いで、得られた照明画像のうち、所望の領域を指定し、適切な細胞密度の領域を指定する（ステップ４）。しかる後に、ステージを移動し、指定した適切な細胞密度の領域を視野の中心に移動する（ステップ５）。そして、照明画像のデータを記憶装置に記憶し（ステップ６）、照明を消灯し（ステップ７）、最初の照明画像の取得が完了する。
次に、被験試料中の細胞内で発光タンパク質を発現させるために、細胞の刺激手段を用いて細胞を刺激する。細胞を刺激する薬剤は、自動分注装置で投与されてよい（ステップ８）。なお、ここで、ステップ８の直後に照明を行い、照明画像のデータを記憶装置に保存してもよい（ステップ９）。そして、照明を行わず、発光信号を取得し、（ステップ１０）、発光信号を記憶装置に保存して（ステップ１１）、これにより、最初の発光画像の取得が完了する。次いで、所定時間、または、所定の発光強度、または、所定回数に達するまで、ステップ１０、ステップ１１を繰り返し、発光画像を取得する。このときに、照明画像の取得と発光画像の取得は一対で行うことも可能であり、または、所定回数ごとに照明画像を取得するようにしてよい。このパターンは、細胞の動きやすさ、測定期間等により適したパターンで実行されてよい。
かくして、照明画像と発光画像の取込が完了すると、画像処理装置（コンピューター８０）に於いて、照明画像と発光画像の重ね合わせ画像を作製し、表示する（ステップ１２）。かくして、表示された照明画像と発光画像の重ね合わせ画像を参照することにより、発光している細胞を特定することができる。したがって、測定中に細胞が移動しても容易に細胞を特定することができる。
次に、重ね合わせた画像に於いて細胞の発光部位を判別できるかどうかの判断を行い、判別できる場合（ステップ１３：Ｙｅｓ）は、測定領域を指定する（ステップ１５）。測定領域の指定は、モニタ上でマウスやカーソル、或いは、ポインタなどの手動による画面領域の指定が可能な任意の手段を用いたり、画像処理を行って、閾値を変更することによりすることにより為されてよい。例えば、細胞１つを測定領域とすることも可能であり、細胞のある一部を測定領域として指定することもできる。
一方、細胞の発光部位を判別しにくい場合（ステップ１３：Ｎｏ）は、ＣＣＤカメラからの出力を擬似カラーで表示し（ステップ１４）、見やすくしてから、測定領域を指定する（ステップ１５）。ここでも、例えば、細胞１つを測定領域とすることも可能であり、細胞のある一部を測定領域として指定することもできる。なお、領域指定は、細胞などの解析対象への刺激前だけでなく、刺激後にもようにしてもよく、刺激後に得た照明画像または発光画像に基づいて、解析対象が適切な測定を行なえる領域に、測定領域を移動してもよい。刺激時点では発光がない、極めて弱い、または、少ない場合に、適正な発光を検出できる領域に測定領域を変更してもよい。または、刺激時点では発光が極めて弱いか非発光の解析対象細胞のうち、刺激により発光量が増加した解析対象を特定し、その後も検出した解析対象を選択的に追跡してデータを取得し、解析してもよい。
更に、発光強度の経時変化をアニメーション表示したり、数値化してグラフにして表示してもよい（ステップ１６）。そして、最後に、解析を行う（ステップ１７）。具体的には、得られたデータを用いて、個々の細胞の発光強度の比較、同一細胞の部位別の発光強度の比較、細胞の発光パターンの同定や発光パターンの経時変化の比較などを行う。この結果から、薬剤、電気、ガス、熱刺激に対する細胞の応答の状態を解析することが可能である。なお、刺激が行われない場合の細胞活動に関しても解析することが可能である。
本発明を用いれば、例えば、図４に示されている如く、周期的に発光強度が増減する試料を観察する場合に於いて、発光が消失しても、取得した照明画像と発光画像を重ね合わせることにより、発光消失の前後において当該細胞を見失うことなく、所望の細胞の発光強度の変化を観測することが出来るので、特定の細胞を特定し、発光強度を継続して追跡することが可能である。
本発明の装置の第二の実施形態
図５は、図１に例示の本発明の第一の実施形態の微弱光測定装置に於いて、更に蛍光観察を実行するための構成が追加された本発明の第二の実施形態を模式的に表したものである。
同図を参照して、第一の実施形態と同様にデジタルズーム又は光学ズームを同時に行なうことができる本発明の第二の実施形態の装置は、励起光用の光学系４９が追加され、また、被験試料４から発せられた蛍光をＣＣＤカメラに導くよう観察光学系５が修正されている。
励起用光学系４９は、励起光源５０、コリメートレンズ５１、偏向ミラー５２、切替式ダイクロイックミラー５３より構成される。励起光源５０は、典型的には、波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷのアルゴンレーザーである。なお、励起光源５０は、ヘリウムネオン・レーザーなどの可視域のガスレーザーであってもよい。レーザー光は、コリメートレンズ５１によりビーム幅を有する円形の平行光束に変換されて偏向ミラー５２で反射され、観察光学系５に設置された切替式ダイクロイックミラー５８に入射する。
切替式ダイクロイックミラー５８は、励起光源５０の発振波長の光を反射し、被験試料４からの蛍光および発光信号のスペクトルを透過させるスペクトル特性を有する。観察光学系５に入射したレーザー光は、切替式ダイクロイックミラー５３により反射されて対物レンズ１５に下から入射し、試料容器２１内の被験試料４に集光され、被験試料４内の蛍光分子を励起する。なお、切替式ダイクロイックミラー５８は、ホルダー（図示せず）に収められており、励起レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に設置されてよい。また、励起光源５０の波長を変更する必要がなければ、切替式ダイクロイックミラー５８を用いず、通常のダイクロイックミラーが固定されていてもよい。
対物レンズ１５は、ＮＡ（開口数）０．９程度のもの、又は、１．０以上の高ＮＡの液浸式の対物レンズが用いられてよい。被験試料４から発せられた蛍光信号、発光信号は、対物レンズ１５を通って、装置本体の観察光学系５を通過する際に、切替式ダイクロイックミラー５８を透過し、第１のリレーレンズ１６、第２のリレーレンズ１８を通って、切替ミラー２０で反射され、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７の受光面にて結像される。そして、第一の実施形態の装置と同様に、ＣＣＤカメラ８からの光信号は、コンピューター８０に送られ、コンピューター８０により、発光画像の描出、解析、また発光強度の時間測定、信号解析などが行なわれ、解析結果はコンピューター８０のＴＶモニタ３７の画面上に表示される。
蛍光観察は、当業者にとって公知の態様にて行われてよい。蛍光観察に於いて用いられる蛍光色素は、例えば、ローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＲｈＧ）ＴＭＲ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、５−Ｔａｍｒａ（５−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であってよい。ＴＭＲを励起する場合には、波長５１４．５ｎｍのアルゴンレーザー、５−Ｔａｍｒａを励起する場合には、波長５４３．５ｎｍのＨｅ・Ｎｅレーザーなどを励起レーザー光源として用いられてよい。また、蛍光色素として、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＴＯＴＯ  １、Ａｃｒｉｄｉｎｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄなどが用いられてもよい。
本発明の装置の第三の実施形態
図６は、図５の装置と同様に、デジタルズーム又は光学ズームを行なうことができ、蛍光と生物発光の同時測定を実施可能なもう一つの本発明の微弱光測定装置の実施形態の模式図を表している。
同図を参照して、本実施形態に於いては、測定装置本体、即ち、光学顕微鏡は、遮光ボックス５４内に収容され、遮光ボックス５４の底部は、底板５５の上に止め具５６で固定され、外部の光が観察光学系５に侵入しないよう構成されている。遮光ボックス５４の上面には、遮光フタ５７が分離して取り付けられており、遮光フタ５７の一端は、遮光ボックス５４本体と蝶番５８で連結され、遮光フタ５７は扇状に開閉できるようになっている。
照明画像を取得するために、例えば、ハロゲンランプ又はメタルハライドランプなどの照明用の光源２の光が、照明用光ファイバー６０を通して試料ステージ３上の試料容器２１上面へ導入され、被験試料４全体を照明する。また、蛍光画像を取得するために、本体外部に於いて、レーザー（励起）光源５０が光源ボックス６２内に固定され、レーザー光源５０を出射したレーザー光は、外枠に取り付けられたレーザー入射口６４を通して、装置本体に入射する。レーザーは、例えば、波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷのアルゴンレーザーであってよい。レーザー入射口６４を通して装置本体に入射したレーザー光は、観察光学系に入り、切替式ダイクロイックミラー５３により反射されて対物レンズ１５に下部から入射し、被験試料４に集光して照射される。切替式ダイクロイックミラー５３はホルダーに収められ、励起レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に設置される。
試料容器２１はＸＹ試料ステージ３の上に止めピンで固定される。ＸＹ試料ステージ３はＸＹ平面に沿って、ラックピニオン機構により自在にＸＹ平面上の位置を移動できるよう構成される。試料容器２１の下方に設置される対物レンズ１５は対物レンズＺ軸駆動機構９に取り付けられており、光軸（Ｚ軸）に沿って移動可能となっている。対物レンズＺ軸駆動機構９は、導線によって、微弱光測定装置外部に設置された焦点検出部７７と通信し制御される。
観察光学系５に於いて、対物レンズ１５により集光した信号光は、切替式ダイクロイックミラー５３を透過し、前記の第一及び第二の実施形態とは異なり、屈曲せずに鏡筒下部６６に取り付けられたレンズ６７を通過して、ＣＣＤカメラ８の受光面に集光される。レンズ６７は、ベース架台７５の上に止め具により固定されている鏡筒下部６６に配置され、ＣＣＤカメラ８は、レンズ６７のＺ軸上のフォーカス位置に受光面のほぼ中心が合うように、底板５５の上に固定されたベース架台７５上に置かれる。試料ステージ３、対物レンズ１５を担持する本体架台７６は、底板５５の上に固定された支柱７３に取り付けられており、本体架台７６は、鏡筒上部７２及び鏡筒下部６６に対して上下移動できるようになっている。なお、任意に、対物レンズの焦点検出部７０が設けられ、位置検出部７１に繋がれ、位置検出部７１の出力信号がＴＶモニタ３７に出力されるようになっていてよい。
試料から発せられる光が微弱であるので、第一及び第二の実施形態と同様に、好適には、ＣＣＤカメラ８はできる限り高感度のものが用いられる。ＣＣＤカメラ８の画素数は、例えば、１，３６０×１，０２４となっていてよい。ＣＣＤカメラ８から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラ８の底部にはペルチエ素子から成る冷却装置２９が装着され、ＣＣＤカメラ８の温度を０℃程度で冷却保温するようになっていてよい。ＣＣＤカメラ８の受光面の上方には、赤外線カットフィルター１３が設置され、背景光となる赤外光を遮断する。ただし、赤外光を信号光として取り出す場合は、この赤外線カットフィルター１３を測定の前に鏡筒下部６６から取り外される。ＣＣＤカメラ８の出力部には信号ケーブル６９が接続され、ＣＣＤカメラからの試料の画像は、信号処理部７４を介して、コンピューター８０へ送信され、ＴＶモニタ３７上に表示される。ＣＣＤカメラ８は３板式カラーカメラとして、カラーの照明画像が得られるようにしても良い。
作動に於いて、まず、照明用の光源２による被験試料４の照明画像により、対物レンズの焦点が試料に合わされる。そのために、対物レンズＺ軸駆動機構９により対物レンズ１５を光軸に沿って適当量移動し、その移動ステップ毎にＣＣＤカメラ８からの光出力信号を信号処理部７４で信号解析し、高コントラスト画像が得られる対物レンズ１５の光軸上の位置を検出する。そして、上下２箇所の高コントラスト画像が得られる対物レンズ１５の光軸上の位置を見つけ出し、信号処理部７４で計算を行なって、上下２箇所の略中央位置を発光観察時の焦点位置とする。そして、対物レンズＺ軸駆動機構９を動作させて、その焦点位置に対物レンズ１５を移動し固定し、その後、被験試料４から発せられる蛍光信号並びに発光信号をＣＣＤカメラ８で受光する。
対物レンズＺ軸駆動機構９には、複数の対物レンズ１５が交換可能に取り付けられるようになっていてよい。被験試料４中の細胞等が培養液中で移動する場合、高倍率の対物レンズ１５でこれを観察すると、視野が狭いので、場合によっては被験試料４の細胞等が移動して視野からいなくなってしまうことがある。そこで、好適には、×１０、×２０といった低倍率の対物レンズ１５で被験試料４を観察し、被験試料４の所望の位置を確認してマウスやキーボードを用いて指定し、本発明の装置によるズームアップ機能により画像を拡大することが望ましいであろう。なお、信号処理部７４として、コンピューターを用いても良い。
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
例１
例１では、図１の測定装置に自動分注装置１００を付加した微弱光測定装置を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した複数のＨｅＬａ細胞に於いて、薬剤刺激によって引き起こされる発光を画像中の特定の細胞について経時的に観察した。
被験試料としては、ＨｅＬａ細胞に、テトラサイクリン・リプレッサー（ＴｅｔＲ）を恒常的に発現させるベクター「ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（インビトロジェン社製）」と、テトラサイクリン・オペレータ（ＴｅｔＯ２）をもつ発現ベクター「ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（インビトロジェン社製）」にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとを導入したものを用いた。これら二つの遺伝子を導入された細胞内に於いては、図７Ａに模式的に示されているように、まず、ＴｅｔＲのベクター（ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ）によりＴｅｔＲが発現し、ＴｅｔＲがホモダイマーとなって、ＴｅｔＯ２遺伝子領域に結合し、これにより、ＴｅｔＯ２領域に接続されているルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。ここで、図７Ｂに模式的にされているように、細胞にテトラサイクリンを与えると（薬物刺激）、テトラサイクリンがＴｅｔＲホモダイマーの立体構造変化を引き起こし、ＴｅｔＲホモダイマーがＴｅｔＯ２領域から脱離し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写、ルシフェラーゼの発現が誘導される。本実験例では、上記の遺伝子が導入された細胞に於いて、テトラサイクリンによる刺激によって、細胞内にてルシフェラーゼが発現し発光現象が起きることを観察した。
図１の装置に於いて、対物レンズ１５は、オリンパス製ＵＡｐｏ／３４０（２０倍、Ｎ．Ａ．０．７５）、及び、市販の顕微鏡用対物レンズ「Ｏｉｌ、２０倍、ＮＡ０．８」又は「５倍、ＮＡ０．１３」のものを用いた。ＣＣＤカメラ８は、５℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ３０ＢＷ（オリンパス社製）」を用いた。同ＣＣＤカメラに於いて、ＣＣＤ素子（撮像素子７に対応）は、２／３インチ型、画素数１３６０×１０２４、画素サイズ６μｍ角である。対物レンズから結像レンズ（リレーレンズ）を通してＣＣＤ素子上に結像する被験試料の像の総合倍率は、４倍とした。ＨｅＬａ細胞の観察及び撮像中は、装置全体を暗箱で覆った状態で行った。
実験操作は、以下の手順で行った。
（１）ＴｅｔＲを恒常的に発現させるベクターとＴｅｔＯ２をもつ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとをＨｅＬａ細胞に共発現させた試料を調製した。培養液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に、１ｍＭのルシフェリンを加えたものを用いた。
（２）次いで、（１）の試料を被験試料とし照明画像と発光画像を撮像した。照明画像と発光画像は常に一対で撮像した。撮像時の露出時間（ＣＣＤカメラに於ける信号の積算時間）は、照明画像については、１０ｍｓｅｃ、発光画像については、５ｍｉｎとした。
（３）次いで、被験試料テトラサイクリンを添加し、被験試料におけるルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導し、テトラサイクリンの添加直後に、（２）と同様に照明画像と発光画像を一対として撮像した。
（４）その後、図８に示されている如く、１０ｍｉｎの間隔で、１０時間後まで上記（２）の撮像を繰り返した。撮像はコンピューター処理によって自動的に行い、ＣＣＤカメラで得られた光信号は、本発明の装置に於いて、自動的にデジタルデータに変換した。
（５）撮像の完了後、取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、ルシフェラーゼが発現しているＨｅＬａ細胞を特定し、ルシフェラーゼが発現しているＨｅＬａ細胞の発光強度の経時的変動を数値化し、解析した。重ね合わせ画像において、ＨｅＬａ細胞の発光部位の判別が困難なときは、ＣＣＤカメラ８からの出力値を疑似カラー表示にして、より視認しやすくした。
図９Ａ、図９Ｂ及び図９Ｃは、それぞれ、照明画像、発光画像及び重ね合わせ画像を示している。図１０は、上記の手順にて得られた画像に於いて、特に、図９Ｃの重ね合わせ画像に於いて四角枠にて囲まれた領域ＲＯＩ−１とＲＯＩ−２の二つの細胞に於ける発光強度の経時的変動を示す。かくして、本発明によれば、どの細胞が発光しているかを特定して、発光の経時変化を測定することが可能となることが証明された。
例２
例２では、例１と同様の装置を用い、発光バクテリア（Ｐ．ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）の発光観察を行い、細胞に於ける薬物刺激による発光強度の経時的変動を追跡した。発光バクテリアは、（ｉ）海水中に独立生活、（ｉｉ）魚類、頭足類の発光器内での共生、（ｉｉｉ）死魚、獣肉上での繁殖、（ｉｖ）海水魚の消化管中やイカの表皮への常習的寄生などの形で自然界に広く存在する運動性を有する発光生物であり、好気的条件にて連続的に肉眼で観察できるほど強い発光を示す。
観察に於いては、対物レンズ１５は、オリンパス製ＵＡｐｏ／３４０（４０倍Ｎ．Ａ．１．３５）又はＯｉｌ  Ｉｒｉｓ「Ｏｉｌ、４０倍、ＮＡ  １．３５」を用いた。その他の撮像条件は例１と同じ条件で撮像を行った。
実験操作は、以下の手順により行った。
（１）ホタルイカの発光器に共生する発光バクテリアを分離して、ＮａＣｌ濃度３％のＬＢ培地中で培養した。この培養液にグリセロールを加え、終濃度２５％グリセロール溶液（ｖ／ｖ）とした。
（２）（１）の試料を被験試料とし、照明画像（観察画像）と発光画像を撮像した。照明画像と発光画像は常に一対で撮像した。撮像時の露出時間（ＣＣＤカメラに於ける信号の積算時間）は、照明画像については、１０ｍｓｅｃ、発光画像については、１ｍｉｎとした。
（３）次いで、自動分注装置１００を用いて、被験試料にアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を添加し、発光バクテリアの細胞壁合成を阻害した。これにより、発光バクテリアは増殖を抑制され、死滅へ向かう。アンピシリンの添加は、自動分注装置１００の動作と撮像とを同期させて実行し、アンピシリンの添加直後に照明画像と発光画像を一対として撮像した。
（４）その後、５ｍｉｎの間隔で、アンピシリンの添加から１時間後まで、上記（２）の撮像を繰り返した。撮像はコンピューター処理によって自動的に行い、ＣＣＤカメラで得られた光信号は、本発明の装置に於いて、自動的にデジタルデータに変換した。
（５）撮像の完了後、取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、強く発光している発光バクテリアを特定し、重ね合わせ画像を時間順に並べてアニメーション化し、発光バクテリアの移動に伴う発光位置の変化を追跡し、発光バクテリアの発光の経時的変動を数値化し、解析した。なお、発光バクテリアの追跡はコンピューター処理によって自動的に行っても良い。
図１１Ａ、図１１Ｂ及び図１１Ｃは、それぞれ、照明画像、発光画像及び重ね合わせ画像（疑似カラーによる着色）を示している。図１２は、発光バクテリアの発光強度の図１１Ｃ中の領域ＰＰ−１の経時的変動を示す。例２によれば、測定中にバクテリア等の微生物が移動しても、どの微生物が発光しているかを特定して、発光の経時変化を測定することが可能となることが証明された。
例３
例３では、発光バクテリア（Ｖ．ｔｉｓｃｈｅｒｉ）の発光観察を行い、発光バクテリアの位置および発光強度の経時的変動を追跡した。撮像条件は、例２と同じとした。
実験操作は、以下の手順により行った。
（１）発光バクテリアをＮａＣｌ濃度３％の寒天ＬＢ培地プレートで培養し、培養プレートから発光強度の高いコロニーを選別し、そのコロニーをＮａＣｌ濃度３％の液体ＬＢ培地中に懸濁した。
（２）（１）の試料を被験試料とし、照明画像（観察画像）と発光画像を撮像した。照明画像と発光画像は常に一対で撮像した。撮像時の露出時間（ＣＣＤカメラに於ける信号の積算時間）は、照明画像については、５ｍｓｅｃ、発光画像については、３ｍｉｎとした。
（３）その後、上記（２）の撮像を繰り返した。撮像はコンピューター処理によって自動的に行い、ＣＣＤカメラで得られた光信号は、本発明の装置に於いて、自動的にデジタルデータに変換した。
（４）撮像の完了後、取得した照明画像と発光画像を重ね合わせ、発光バクテリアは時間変化と共に移動するため、重ね合わせ画像を時間順に並べてアニメーション化し、発光バクテリア（Ｖ．ｔ．）の移動に伴う発光位置の変化を追跡し、発光バクテリアの発光の経時的変動を数値化し、解析した。なお、発光バクテリアの追跡はコンピューター処理によって自動的に行っても良い。
図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃは、それぞれ、照明画像、発光画像及び重ね合わせ画像であり、図１４は、時間変化に伴う発光バクテリアの移動している様子を示している。図１５は、発光バクテリア（Ｖ．ｔ．）の発光強度の経時的変動を示す。例３に示されている如く、本発明によれば、測定中にバクテリア等の微生物が移動しても、発光部位を特定して、発光の経時変化を測定することが可能となった。このように、刺激有無に関わらず動態追跡するだけでも、例えば行動学的ないし細胞学的解析（増殖活性等）を行なうことができる。また、バクテリアの動態追跡が可能であることから、刺激有無に関わらず、被検試料の発光領域の移動を測定することが可能である。
以上に於いては本発明を特定の実施形態について詳細に説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内にて他の種々の実施例が可能であることは当業者にとって明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１５】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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