(57)【要約】本発明は、Ｒｂパスウェイ上に存在する分子であって、抗癌剤の創薬標的又は腫瘍マーカーとして使用しうる分子及び当該分子を使用した化合物（抗癌剤候補化合物）の評価を可能とする方法を提供することを目的とする。ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２又はＫＩＦ１８Ａ遺伝子又はタンパク質と被検化合物の相互作用を検出する化合物の評価方法により上記目的の達成が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＫＩＦ１１、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該タンパク質に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項２】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の細胞内情報伝達物質の活性とを比較し、被検化合物の接触によって生じる細胞内情報伝達物質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項３】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該タンパク質を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
該発現レベルと被検化合物を接触させない場合の細胞内情報伝達物質の発現レベルとを比較し、被検化合物の接触によって生じる細胞内情報伝達物質の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項５】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
被検化合物を、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＫＮＴＣ２、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に同等なタンパク質に接触させる工程と、
接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項６】
前記タンパク質がＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２である、請求項５に記載の化合物の評価方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とする化合物。
【請求項８】
被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現量を測定する工程と、
該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、
比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む癌の分子診断方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２である、請求項８に記載の癌の分子診断方法。
【請求項１０】
被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に同等なタンパク質の発現量を測定する工程と、
該タンパク質の発現量と正常組織又は正常細胞における対応タンパク質の発現量とを比較する工程と、
比較した結果、被検組織又は被検細胞におけるタンパク質の発現量が正常組織又は正常細胞におけるタンパク質の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む癌の分子診断方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２タンパク質である、請求項１０に記載の癌の分子診断方法。
【請求項１２】
前記癌がＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の異常に起因する癌である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の癌の分子診断方法。
【請求項１３】
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に同等なタンパク質である、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカー。
【請求項１４】
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカー。
【請求項１５】
Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、
該細胞において所望の遺伝子の発現量を測定する工程と、
該発現量とＲｂ発現細胞における該遺伝子の発現量を比較する工程と、を含む抗癌剤の標的遺伝子の検出方法。
【請求項１６】
前記Ｒｂ発現細胞が、Ｕ−２  ＯＳ、ＨＣＴ１１６又はＨｅｐＧ２である、請求項１５に記載の標的遺伝子の検出方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡｓが配列番号２７に記載の配列である、請求項１５又は１６に記載の標的遺伝子の検出方法。
【請求項１８】
Ｒｂ発現細胞を用いてＲｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、
Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、
接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該活性を比較する工程と、を含む、化合物の評価方法。
【請求項１９】
Ｒｂ発現細胞を用いてＲｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、
Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、
接触により生じた細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該発現レベルを比較する工程と、を含む、化合物の評価方法。
【請求項２０】
Ｒｂ発現抑制細胞においてＲｂの発現を抑制する手段がＲＮＡ干渉によるものである、請求項１８又は１９に記載の化合物の評価方法。
【請求項２１】
前記Ｒｂ発現細胞が、Ｕ−２  ＯＳ、ＨＣＴ１１６又はＨｅｐＧ２である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の標的遺伝子の検出方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡｓが配列番号２７に記載の配列である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の標的遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌抑制遺伝子Ｒｂが転写調節する遺伝子群に属する遺伝子の新規用途に関する。より具体的には、当該遺伝子群に属する遺伝子を標的とする化合物の評価方法及び当該遺伝子の腫瘍マーカーとしての使用に関する。
【背景技術】  癌抑制遺伝子として知られるＲｂは、非常に重要な細胞周期の調節因子として機能している。すなわち、Ｒｂは、Ｅ２Ｆをはじめとするいくつかの転写制御因子を介して細胞周期のＧ１期からＳ期への移行を調節する。哺乳動物の細胞は、通常、Ｇ０期にて静止しており、増殖刺激に伴ってＧ１期に入り、順に、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期と細胞周期が進行する。Ｒｂは、細胞周期の進行に異常を来たした場合に、細胞周期をＧ１期で停止させ、Ｓ期のＤＮＡ合成を停止させる機能を有すると考えられている。
具体的には、Ｒｂタンパク質は、Ｓ期の開始に必要なＥ２Ｆと結合してその働きを阻止することにより細胞周期をＧ１期に止める。Ｒｂは、静止状態ではリン酸化されていないが、Ｇ１期中期にＣＤＫキナーゼによりリン酸化を受けると活性を失い、Ｅ２Ｆへの結合ができなくなる。その結果、Ｅ２Ｆが機能し、細胞周期がＳ期へと進行する。Ｒｂは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の作用を受けて活性調節がなされるが、Ｒｂを中心としたこれら一連の細胞周期の調節パスウェイをＲｂパスウェイという。このパスウェイに異常が生じると細胞周期にも異常が生じ、細胞の異常増殖を通じて組織の癌化を来たす。例えば、Ｒｂ−Ｅ２Ｆパスウェイが正常に機能しなくなるとＳ期への進行が生じるとの報告がある（非特許文献１）。
このように、細胞周期と癌化との関連は非常に強く、Ｒｂパスウェイ上の分子をはじめとする多くの細胞周期関連の分子を抗癌剤の標的分子とした創薬が盛んに進められている。
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１１巻、１４７９頁（１９９７年）
【発明の開示】
しかしながら、より有効な抗癌剤や癌診断マーカーを得るため、新たな作用機作の抗癌剤や未知の癌診断マーカーが望まれているのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、Ｒｂパスウェイ上に存在する分子であって、抗癌剤の創薬標的又は腫瘍マーカーとして使用しうる分子及び当該分子を使用した化合物（抗癌剤候補化合物）の評価を可能とする方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＩＬ−８、ＥＣＴ２をはじめ種々の分子が、Ｒｂの活性に応じてその発現を増減させることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＫＩＦ１１、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該タンパク質に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の細胞内情報伝達物質の活性とを比較し、被検化合物の接触によって生じる細胞内情報伝達物質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子を導入し、該遺伝子の転写産物であるタンパク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該タンパク質を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、当該発現レベルと被検化合物を接触させない場合の細胞内情報伝達物質の発現レベルとを比較し、被検化合物の接触によって生じる細胞内情報伝達物質の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記３つの態様の化合物の評価方法においては、前記遺伝子として、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２が好適に用いられる。
また、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＫＮＴＣ２、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質に接触させる工程と、接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記の化合物の評価方法においては、前記タンパク質として、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２が好適に用いられる。
さらに、本発明には、上記いずれかの化合物の評価方法によって単離された化合物も含まれる。
また、本発明の癌の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む癌の分子診断方法。
ここで、前記分子診断方法においては、前記遺伝子として、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２が好適に用いられる。
さらに、本発明の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に同等なタンパク質の発現量を測定する工程と、当該タンパク質の発現量と正常組織又は正常細胞における対応タンパク質の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞におけるタンパク質の発現量が正常組織又は正常細胞におけるタンパク質の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記分子診断方法においては、前記タンパク質として、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体又はＥＣＴ２タンパク質が好適に用いられる。
また、前記の２つの態様の分子診断方法においては、前記癌がＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の異常に起因する癌であることが好ましい。各分子診断方法において測定の対象となる遺伝子群に属する遺伝子は、いずれもＲｂパスウェイ上に存在する遺伝子であり、このような癌を対象とした正確な診断が可能となる。
また、本発明のＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカーは、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に同等なタンパク質であることを特徴とする。
さらに、本発明のＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカーは、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に同等な遺伝子であることを特徴とする。
また、本発明の抗癌剤の標的遺伝子の検出方法は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、当該細胞において所望の遺伝子の発現量を測定する工程と、当該発現量とＲｂ発現細胞における該遺伝子の発現量を比較する工程と、を含むことを特徴とする。ここで、前記Ｒｂ発現細胞が、Ｕ−２  ＯＳ、ＨＣＴ１１６又はＨｅｐＧ２であることが好ましい。また、Ｒｂ発現抑制細胞においてＲｂの発現を抑制する手段がＲＮＡ干渉によるものであることが好ましく、さらにＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡｓが配列番号２７に記載の配列であることが好ましい。かかる配列を用いることにより、より確実にＲｂ発現抑制細胞を調製することができる。
また、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該活性を比較する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、接触により生じた細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該発現レベルを比較する工程と、を含むことを特徴とする。ここで、前記２つの態様のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法において、前記Ｒｂ発現細胞が、Ｕ−２  ＯＳ、ＨＣＴ１１６又はＨｅｐＧ２であることが好ましい。また、Ｒｂ発現抑制細胞においてＲｂの発現を抑制する手段がＲＮＡ干渉によるものであることが好ましく、さらに前記ＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡｓが配列番号２７に記載の配列であることが好ましい。かかる配列を用いることにより、より確実にＲｂ発現抑制細胞を調製することができる。
本発明によれば、Ｒｂパスウェイ上に存在する分子であって、抗癌剤の創薬標的又は腫瘍マーカーとして使用しうる分子及び当該分子を使用した化合物（抗癌剤候補化合物）の評価を可能とする方法を提供することが可能となる。従って、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上に存在する分子の異常によって生じる腫瘍や癌の治療剤や診断薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｒｂ  ｓｈＲＮＡを導入した細胞におけるＲｂの発現抑制を確認した結果を示す図である。
図２は、Ｒｂ  ｓｈＲＮＡを導入した細胞におけるＲｂの発現抑制をＥ２Ｆの阻害活性を指標にレポーターアッセイにより確認した結果を示す図である。
図３は、Ｒｂノックダウン細胞（ベクターのみを導入しＤＭＳＯ処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図４は、Ｒｂノックダウン細胞（ベクターのみを導入し１０ｎＭドキソルビシンで２４時間処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図５は、Ｒｂノックダウン細胞（ベクターのみを導入し１０ｎＭドキソルビシンで４８時間処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図６は、Ｒｂノックダウン細胞（Ｒｂ  ｓｈＲＮＡを導入しＤＭＳＯで処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図７は、Ｒｂノックダウン細胞（Ｒｂ  ｓｈＲＮＡを導入し１０ｎＭドキソルビシンで２４時間処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図８は、Ｒｂノックダウン細胞（Ｒｂ  ｓｈＲＮＡを導入し１０ｎＭドキソルビシンで４８時間処理した細胞）をドキソルビシンで処理した際の細胞周期に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
図９は、Ｒｂノックダウン細胞におけるＩＬ−８の発現をｍＲＮＡレベルで確認した結果を示す図である。
図１０は、Ｒｂノックダウン細胞におけるＩＬ−８の発現をタンパク質レベルで確認した結果を示す図である。
図１１は、Ｒｂノックダウン細胞において発現量が変動する種々の遺伝子を、マイクロアレイを用いて確認した結果を示す図である。
図１２は、Ｒｂノックダウン細胞において発現量が変動し、細胞周期の進行を制御する遺伝子群を示す図である。上欄は細胞周期のＧ１／Ｓの進行を制御する遺伝子群を、下欄はＧ２／Ｍの進行を制御する遺伝子群を示す。
図１３は、ＥＣＴ２プロモーターとＥ２Ｆとの相互作用について検討した結果を示す図である。
図１４は、ＥＣＴ２プロモーターとＥ２Ｆとの相互作用について検討した結果を示す図である。
図１５は、ＲｂがＥＣＴ２を介してＧ２／Ｍ期の進行を阻害していることを確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明にかかる用語について説明する。
本発明にかかる遺伝子は、ＩＬ−８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００５８４：配列番号１）、ＩＬ−８受容体（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００６３４（ＩＬ−８ＲＡ）：配列番号２及びＮＭ＿００１５５７（ＩＬ−８ＲＢ）：配列番号３）、ＥＣＴ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１８０９８：配列番号４）、ＭＣＭ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４５２６：配列番号５）、ＭＣＭ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２３８８：配列番号６）、ＭＣＭ４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１８２７４６：配列番号７）、ＭＣＭ５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６７３９：配列番号８）、ＭＣＭ６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５９１５：配列番号９）、ＭＣＭ７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５９１６：配列番号１０）、ＣＣＮＥ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４７０２：配列番号１１）、ＦＥＮ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４１１１：配列番号１２）、ＨＭＧＢ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２１２９：配列番号１３）、ＣＥＮＰＥ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１８１３：配列番号１４）、ＫＩＦ２０Ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５７３３：配列番号１５）、ＣＤＣ２５Ｃ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１７９０：配列番号１６）、ＣＤＣＡ８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１８１０１：配列番号１７）、ＫＩＦ１１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４５２３：配列番号１８）、ＨＣＡＰ−Ｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６４４４：配列番号１９）、ＨＣＡＰ−Ｇ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２２３４６：配列番号２０）、ＫＮＴＣ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６１０１：配列番号２１）、ＨＣＡＰ−Ｃ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５４９６：配列番号２２）、ＢＵＢ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４３３６：配列番号２３）、ＮＥＫ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２４９７：配列番号２４）、ＣＣＮＡ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３７：配列番号２５）及びＫＩＦ１８Ａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３１２１７：配列番号２６）からなる群より選択される。これらの遺伝子の由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、評価される化合物の投与対象がヒトであることからヒト遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係る前記の遺伝子には、当該遺伝子と同等の生理機能を有するものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係る前記の遺伝子には、当該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明に係る前記の遺伝子の転写産物であるタンパク質には、当該タンパク質と同等の生理機能を有するものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入があるものも含まれる。ここで、当該タンパク質の配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
本発明者らは、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａ（以下、場合により、単に「遺伝子群」又は「タンパク質群」という。）の遺伝子の発現量がＲｂの発現量と相関関係を有することを見出した。すなわち、Ｒｂは、転写因子であるＥ２Ｆ等を介して下流の遺伝子の発現制御を司るが、上に列挙した遺伝子群はその制御を受けＲｂに転写調節されると考えられる。前述の遺伝子群は、いずれも血管新生関連遺伝子、ｍａｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ、ｓｐｉｎｄｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ、ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ、細胞周期関連遺伝子のいずれかに分類され、Ｒｂの発現調節、発現誘導されることによりその機能を発揮する。Ｒｂは癌抑制遺伝子として知られるが、前記の遺伝子群の発現調節を介して癌の抑制能、すなわち、正常な細胞増殖を司っていると考えられる。従って、この遺伝子群は、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の異常に起因する癌を検出する腫瘍マーカーとして利用可能であり、また、抗癌剤の創薬標的分子として利用可能である。ここで、本発明に係る「Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の異常」とは、Ｒｂ遺伝子又はＲｂパスウェイ上の遺伝子（例えば、Ｅ２Ｆ、ＣＤＫファミリー等）における塩基の欠失（例えばナンセンス変異）、置換（例えば、ミスセンス変異、ポイントミューテーション）、挿入、フレームシフト等を原因とするものが考えられるが、本発明の対象としては、機能異常の原因は特に限定されず、これらのいずれが原因となっていてもよい。
また、Ｒｂタンパク質又はＲｂパスウェイ上のタンパク質の機能異常の具体例としては、これらのタンパク質の転写活性が低下又は活性化する場合や、転写が全く起こらない場合が挙げられるが、活性には異常を認めないがコードされる遺伝子には変異を生じている場合も含まれる。具体的には、例えば、Ｒｂとの関与が知られている網膜芽細胞腫（Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｏｒｉｇ．Ａｒｔ．Ｓｅｒ．、第１８巻、６８９頁、１９８２年：Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３２１巻、１６８９頁、１９８９年）、ピネローマ（Ｐｉｎｅａｌｏｍａ）（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌ．、第１０２巻、２５７頁、１９８４年）、骨原性肉腫（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ、第１７５巻、１８５頁、１９７７年）が挙げられる。
本発明における「被検組織」とは、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織あり、Ｒｂの関与を検討する必要のある癌組織や、癌診断の必要があると認められる組織であればその種類は特に限定されない。かかる組織の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。
また、本発明における「被検細胞」も同様に、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、Ｒｂの関与を検討する必要のある癌組織由来の細胞や、癌診断の必要があると認められる組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。かかる細胞の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。
（１）化合物の評価
ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２又はＫＩＦ１８Ａ遺伝子又はタンパク質を用いて、これら遺伝子群又はタンパク質群に属する遺伝子又はタンパク質に作用する化合物の評価をすることができる。これら遺伝子群又はタンパク質群に属する遺伝子又はタンパク質に対する作用を検出する方法として、被検化合物のタンパク質群に属するタンパク質に対する特異的結合（例えば、酵素活性の阻害を生じる結合）を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じた細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物のタンパク質群に属するタンパク質に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、遺伝子群に属するいずれか一つの遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該遺伝子に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の化合物の評価方法は、遺伝子群に属するいずれか一つの遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被検試料に加えて、これらの被検試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、前記遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、前記遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製した前記遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、タンパク質群に属するいずれか一つのタンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被検試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液又は当該細胞抽出液に被検試料を添加することにより行うことができる。被検試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、前記タンパク質が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターを当該タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
前記タンパク質と被検化合物との結合は、ＩＬ−８受容体のような受容体タンパク質であれば、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）による方法が挙げられる。また、タンパク質群に属するいずれか一つのタンパク質が細胞内シグナル伝達に関与する分子である場合、シグナル伝達によって生じたシグナル伝達パスウェイ上の分子（当該タンパク質も含む）の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、前記タンパク質を介した情報伝達パスウェイ上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、前記タンパク質を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたタンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をタンパク質に接触させ、次に、接触によって生じた当該タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたタンパク質の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により所望の方法を選択すればよく、例えばＩＬ−８の場合、ＩＬ−８受容体に対する結合活性を検出する方法や、好中球遊走アッセイ（サイトカイン実験法、８７−９３頁、１９９７年、羊土社）により検出することができる。また、ＥＣＴ２の場合、ＥＣＴ２がＧＴＰ結合型のＲｈｏＡやＣＤＣ４２を増加させることから、被検化合物がＥＣＴ２に結合してその結合活性を阻害することをＲｈｏＡの活性を測定することにより評価することができる。また、ＥＣＴ２の活性を阻害すると細胞周期がＭｉｔｏｓｉｓに止まることを利用し、ＥＣＴ２の阻害をＭｉｔｏｓｉｓ  ａｒｒｅｓｔ  ａｓｓａｙにより評価することができる。
本発明にかかる遺伝子群に属する遺伝子が、それぞれ本発明の化合物の評価方法のいずれに適用可能であるかを表１に示す。表１において、「種類」は遺伝子の生体内での機能を示し、「結合」は本発明の化合物の評価方法のうち、分子と被検化合物の結合により化合物を評価する方法を示し、「シグナル」は本発明の化合物の評価方法のうち、被検化合物の接触によって生じた細胞内情報伝達を指標に化合物の評価をする方法を示し、「活性」はタンパク質分子と被検化合物との接触によって生じた活性を指標に化合物を評価する方法を示す。
【表１】
2007018309.tif 000002
2007018309.tif 000003
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物の評価を行った結果、被検化合物の存在下におけるタンパク質の活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るタンパク質とリガンドとの結合を阻害する活性を有するアンタゴニストと判定される。アンタゴニストは、タンパク質に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このようなアンタゴニストは、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の機能異常による細胞の異常増殖を抑える可能性があり、Ｒｂを介したシグナル伝達系の異常に起因する癌の治療等のための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、Ｒｂパスウェイのシグナル伝達、転写調節を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の下流へのシグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、タンパク質群に属するいずれか一つのタンパク質の下流へのシグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、当該タンパク質への被検化合物結合後のシグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の機能異常に起因する癌の治療及び診断に有効である。
また、上述した本発明の化合物の評価方法により、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いるリガンドの評価を行うことができる。ＰＥＴは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。ＰＥＴの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてＰＥＴリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。
（２）化合物の評価方法によって得られた化合物
また、本発明の化合物の評価方法によって得られた化合物も本発明に含まれる。このような化合物としては、その性状は特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、抗体、アンチセンス、ＲＮＡｉ又はリボザイムが挙げられる。
本発明の化合物の評価方法で得られた化合物をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
（３）癌の分子診断方法
本発明の癌の分子診断方法の第１の態様は、被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の癌の分子診断方法の第２の態様は、被検組織又は被検細胞における、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質の発現量を測定する工程と、当該タンパク質の発現量と正常組織又は正常細胞における対応タンパク質の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞におけるタンパク質の発現量が正常組織又は正常細胞におけるタンパク質の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
本発明において、先ず、被検組織又は被検細胞における、遺伝子群に属するいずれか一つの遺伝子又はその転写産物であるタンパク質の発現量を測定する。遺伝子又はタンパク質の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、遺伝子の場合であれば、被検組織又は被検細胞から抽出したｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。また、タンパク質の場合であれば、例えば、被検体より採取した血液中に含まれる当該タンパク質の濃度を測定する方法が挙げられる。本発明に係る遺伝子・タンパク質群には分泌タンパク質であるＩＬ−８、細胞膜上の受容体タンパク質であるＩＬ−８、細胞内シグナル伝達分子であるＥＣＴ２等が含まれているので、その分子種に応じて適宜好適な方法を選択すればよい。
ここで、遺伝子又はタンパク質の「発現量」とは、遺伝子転写産物又はタンパク質の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は、後述する正常組織における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。
次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する。
ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されず、健常人由来であっても癌患者由来であってもよい。また、癌組織の近辺に存在する正常組織又は正常細胞であってもよい。
本工程においては、被検組織又は細胞に発現する対象遺伝子と正常組織又は細胞に発現する遺伝子（対応遺伝子）の発現量を比較するが、発現量の絶対量を比較してもよく、また、比較による相対値を算出してもよい。
次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。前記の有意差の判断手法としては特に制限はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればよい。
被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞において発現が高い又は低いと認められた場合には当該被検組織又は被検細胞におけるＲｂの発現に異常が生じており、癌化している可能性があると判断できる。従って、Ｒｂとの関連が知られている癌の診断が可能となる。
（４）腫瘍マーカー
本発明のＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカーの第１の態様は、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質を含むことを特徴とする。
また、本発明のＲｂ又はＲｂパスウェイ上の分子に異常を有する癌を検出する腫瘍マーカーの第２の態様は、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＥＣＴ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＣＮＥ２、ＦＥＮ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＥ、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣＡ８、ＫＩＦ１１、ＨＣＡＰ−Ｅ、ＨＣＡＰ−Ｇ、ＫＮＴＣ２、ＨＣＡＰ−Ｃ、ＢＵＢ１、ＮＥＫ２、ＣＣＮＡ２及びＫＩＦ１８Ａからなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子を含むことを特徴とする。
腫瘍マーカーは腫瘍細胞が多量に産生する物質であり、通常では検出されない物質で腫瘍関連抗原とも呼ばれる。さらに、当該抗原に対する自己抗体も、同様に抗原が産生されてはじめて、生成するので腫瘍マーカーとなり得る。その他、腫瘍化した細胞が多量のホルモン、酵素、特定の低分子化合物等を産生することもあり、これらは、いずれも癌・腫瘍の存在を検出するのに有用である。本発明にかかる遺伝子群に属する遺伝子は、Ｒｂ遺伝子の発現が抑制された場合に発現が増加する遺伝子であり、腫瘍マーカーとして利用可能である。
腫瘍マーカーとしての利用の態様は、先ず、被検組織又は被検細胞における、遺伝子群に属するいずれか一つの遺伝子又はその転写産物であるタンパク質の発現量を測定する。遺伝子又はタンパク質の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、遺伝子の場合であれば、被検組織又は被検細胞から抽出したｃ  ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。また、タンパク質の場合であれば、例えば、被検体より採取した血液中に含まれる当該タンパク質の濃度を測定する方法が挙げられる。本発明に係る遺伝子・タンパク質群には分泌タンパク質であるＩＬ−８、細胞膜上の受容体タンパク質であるＩＬ−８、細胞内シグナル伝達分子であるＥＣＴ２等が含まれているので、その分子種に応じて適宜好適な方法を選択すればよい。ここで、当該遺伝子群に属する遺伝子・タンパク質のいずれか１種を検出の対象としても良いが、２種以上を検出対象としてもよい。２種以上の分子を検出対象とすることにより、より正確な診断が可能となる。
次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する。ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されない。
また、被検組織又は細胞に発現する対象遺伝子と正常組織又は細胞に発現する遺伝子（対応遺伝子）の発現量を比較する際、発現量の絶対量を比較してもよく、また、比較による相対値を算出してもよい。
次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。前記の有意差の判断手法としては特に制限はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればよい。
被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞において発現が高い又は低いと認められた場合には当該被検組織又は被検細胞におけるＲｂの発現に異常が生じており、癌化している可能性があると判断できる。従って、Ｒｂとの関連が知られている癌の診断が可能となる。
なお、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が顕著に多い場合や、正常組織における当該遺伝子の発現量が既知である場合には、腫瘍マーカーとしての使用の度に正常組織又は正常細胞での発現量との比較を行う必要はなく、被検組織又は被検細胞における発現量のみを測定して腫瘍の判定を行うこともできる。
本発明の腫瘍マーカーの検出対象となる腫瘍としては、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子が原因となって生じる腫瘍であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、網膜芽細胞腫、ピネローマ又は骨原性肉腫が挙げられる。
（５）抗癌剤の標的遺伝子の検出方法
本発明の検出方法は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、当該細胞において所望の遺伝子の発現量を測定する工程と、当該発現量とＲｂ発現細胞における該遺伝子の発現量を比較する工程と、を含むことを特徴とする。
「ＲＮＡ干渉」とは、細胞に導入された二本鎖ＲＮＡが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制し、当該遺伝子にコードされているタンパク質の合成を抑制する現象をいう。本発明の検出方法においては、先ず、Ｒｂを標的とするｓｉＲＮＡｓを用いてＲＮＡ干渉を生じさせ、Ｒｂの発現を抑制した細胞を調製する。調製の方法としては特に制限はなく、当業者に公知の方法によって実施すればよい。ここで、使用するｓｉＲＮＡｓとしては、Ｒｂの発現を抑制可能な配列であればその配列は特に限定されないが、Ｒｂ特異的な配列であることが好ましい。また、塩基長が２１〜２７塩基であることが好ましく、２１〜２３塩基であることがより好ましい。
また、ｓｉＲＮＡｓの導入の効果は数日〜１週間程度であることが知られているが、本発明者らは特定の発現ベクターを使用してｓｉＲＮＡｓを細胞内へ導入することにより恒常的にＲｂの発現を抑制することに成功している。本発明の検出方法においては、ＲＮＡ干渉によりＲｂの発現が抑制されていればｓｉＲＮＡｓの導入方法は特に限定されないが、恒常的にＲｂの発現が抑制されるベクターを用いた遺伝子導入によることが好ましい。ここで、用いるベクターとしては、例えば、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ｐｕｒｏ、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯが挙げられる。
こうして調製されたＲｂ発現抑制細胞は、癌抑制遺伝子であるＲｂの発現及び機能が抑制されている。
次に、Ｒｂ発現抑制細胞とＲｂ発現細胞とにおける所望の遺伝子の発現量を測定する。「所望の遺伝子」とは、抗癌剤の標的とする候補遺伝子をいうが、本工程においては、特定の候補遺伝子を逐次選択してもよく、また、候補遺伝子をプロットしたＤＮＡチップを用いて網羅的に検討してもよい。
また、発現量の測定の方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＤＮＡチップ、ノーザンブロッティング又はＰＣＲが挙げられる。
次に、前工程で測定したＲｂ発現抑制細胞とＲｂ発現細胞における遺伝子の発現量を比較する。比較した結果、両細胞間で発現量が相違している遺伝子は生体内でＲｂの発現量又は活性に影響を受けている分子、すなわち、Ｒｂを介した情報伝達経路上の分子である。かかる分子（遺伝子、タンパク質）は細胞の癌化、すなわち細胞増殖や細胞周期に密接に関与する分子であり、当該分子の機能を抑制又は増強することにより、癌化を抑制することが可能となる可能性がある。すなわち、このような分子を抗癌剤の標的とすることにより、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上の分子の異常によって生じた癌・腫瘍を抑える治療剤を開発することが可能となる。
（６）Ｒｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法
本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法の第１の態様は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該活性を比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法の第２の態様は、Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる工程と、接触により生じた細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における該発現レベルを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法においては、先ず、Ｒｂ発現細胞を用いてＲＮＡ干渉により該Ｒｂの発現が抑制されたＲｂ発現抑制細胞を調製する。調製の方法としては特に制限はなく、当業者に公知の方法によって実施すればよい。ここで、使用するｓｉＲＮＡｓとしては、Ｒｂの発現を抑制可能な配列であればその配列は特に限定されないが、Ｒｂ特異的な配列であることが好ましい。また、塩基長が２１〜２７塩基であることが好ましく、２１〜２３塩基であることがより好ましい。
また、ｓｉＲＮＡｓの導入の効果は数日〜１週間程度であることが知られているが、本発明者らは特定の発現ベクターを使用してｓｉＲＮＡｓを細胞内へ導入することにより恒常的にＲｂの発現を抑制することに成功している。本発明の検出方法においては、ＲＮＡ干渉によりＲｂの発現が抑制されていればｓｉＲＮＡｓの導入方法は特に限定されないが、恒常的にＲｂの発現が抑制されるベクターを用いた遺伝子導入によることが好ましい。ここで、用いるベクターとしては、例えば、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ｐｕｒｏ、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６、ｐＥＮＴＲ／Ｈ１／ＴＯが挙げられる。
こうして調製されたＲｂ発現抑制細胞は、癌抑制遺伝子であるＲｂの発現及び機能が抑制されている。
次に、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞に被検化合物を接触させる。かかる接触の方法としては特に制限はなく、例えば、細胞の培養液又は細胞抽出液に被検試料を添加し、混合することにより実施できる。
次に、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法の第１の態様においては、接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する。細胞に被検化合物を接触させることにより細胞内にシグナルが入る。本工程においては、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞それぞれについて、細胞内情報伝達物質の活性を測定し、Ｒｂの発現の有無又は強弱によって活性に相違があるかどうかを検討する。活性測定の方法は、測定の対象となる物質に応じて適宜好適な方法を選択すればよいが、例えば、測定の対象がリン酸化酵素であれば、キナーゼアッセイを行うことにより活性を測定することができる。
また、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法の第２の態様においては、接触により生じた細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する。すなわち、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞それぞれについて、細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する。発現レベルの測定の方法としても特に制限はないが、例えば、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ又はＤＮＡチップにより測定することができる。
次に、本発明のＲｂ発現抑制細胞を用いた化合物の評価方法の第１の態様においては、Ｒｂ発現抑制細胞及びＲｂ発現細胞における細胞内情報伝達物質の活性を比較する。活性を比較した結果、Ｒｂ発現抑制細胞における活性とＲｂ発現細胞における活性が近似する場合には、当該被検化合物は細胞の癌化を抑制し、正常なＲｂを介した情報伝達に寄与する化合物であると判断できる。
【実施例】  以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
（Ｒｂノックダウン細胞の樹立と細胞の評価）
Ｒｂがｒｅｇｕｌａｔｅする新たなパスウェイを明らかにするために、同一のｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを持ちながらＲｂ遺伝子のｓｔａｔｕｓのみが異なる細胞のペアを樹立することを試みた。具体的には、下記のとおり、野生型Ｒｂを持つＵ−２  ＯＳ細胞にｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ｐｕｒｏ．ｓｈＲｂベクターを導入することで、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞を樹立した。
（Ｒｂノックダウン用ｓｈＲＮＡベクターの構築）
Ｒｂノックダウン用ｓｈＲＮＡベクターは下記オリゴＤＮＡ、
2007018309.tif 000004
をｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ｐｕｒｏ．（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）に挿入することにより調製した。
（Ｒｂノックダウン細胞の作成）
野生型Ｒｂを持つＵ−２  ＯＳ細胞にｐＳｕｐｅｒｉｏｒ−ｐｕｒｏ．ｓｈＲｂベクターをＦｕｎｅｇｅ  ６を用いて導入した。導入した細胞を２４時間培養後、細胞数が約５０分の１になるように培養し、１．０μｇ／ｍｌピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）存在下で約２週間培養した。コロニーを形成した細胞を、シリンダークローニング法により単離した。樹立したＲｂノックダウン細胞を以下Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂと記す。
（ｍＲＮＡの発現レベルでのＲｂノックダウンの確認）
Ｕ−２  ＯＳ細胞及びＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞からＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いてＴａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＴａｑ−ｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを行うことで、それぞれの細胞中のＲｂ  ｍＲＮＡ量を定量した。
図１に示すとおり、ベクターのみを導入したコントロールと比較して、樹立した細胞におけるＲｂの発現は９０％以上抑制されていることが確認できた。
（Ｅ２Ｆレポーターアッセイを利用したＲｂノックダウンの確認）
Ｕ−２  ＯＳ細胞とＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞に、Ｒｂ／Ｅ２Ｆ経路により転写制御を受けるレポータープラスミドとｐ１６発現プラスミドをＦｕｎｅｇｅ  ６を用いて導入し、４８時間後にレポーター遺伝子であるＳＥＡＰの活性をＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ−（東洋紡社）を用いて測定した。すなわち、Ｒｂ＋の細胞ではレポーターの活性が抑制されるが、Ｒｂ−の細胞ではレポーターの活性が抑制されないことを利用してＲｂのノックダウンを確認した。レポーター活性はＬｕｃｉｆｅｒａｓｅにより補正した。
図２に示すとおり、Ｒｂ＋であるコントロール細胞ではレポーター活性が抑制されたが、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂではレポーター活性が抑制されなかった。この結果は、Ｒｂ−のコントロールとして使用した、Ｓａｏｓ−２細胞と同程度であった。
（Ｒｂノックダウン細胞に対するＤＮＡ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の効果）
Ｒｂの機能としては細胞周期の進行を正しく制御していることが知られている。そこで、Ｒｂノックダウンによる細胞周期への影響を調べた。
先ず、Ｕ−２  ＯＳ細胞及びＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞を１０ｎＭドキソルビシンで処理した。２４時間及び４８時間後に細胞を回収し、細胞のＤＮＡをＣｙｃｌｅ  ＴＥＳＴＴＭ  ＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。
図３〜図８に示すとおり、処理後２４時間では両細胞共にＧ２／Ｍ期にａｒｒｅｓｔされた。しかし、処理後４８時間ではＵ−２  ＯＳはＧ２／Ｍ期にａｒｒｅｓｔされているのに対して、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂはＧ２／Ｍ  ａｒｒｅｓｔが維持されていなかった。このことから、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞はＲｂの機能の不活化により、Ｇ２／Ｍ期進行の制御機能が異常になっていると考えられた。
なお、図３はベクターのみを導入しＤＭＳＯ処理した細胞、図４はベクターのみを導入し１０ｎＭドキソルビシンで２４時間処理した細胞、図５はベクターのみを導入し１０ｎＭドキソルビシンで４８時間処理した細胞、図６はＲｂ  ｓｈＲＮＡを導入しＤＭＳＯで処理した細胞、図７はＲｂ  ｓｈＲＮＡを導入し１０ｎＭドキソルビシンで２４時間処理した細胞、図８はＲｂ  ｓｈＲＮＡを導入し１０ｎＭドキソルビシンで４８時間処理した細胞を用いた実験結果を示す。また、各条件下において、各細胞がどの細胞周期に維持されているかを表２に示す。
【表２】
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（Ｒｂ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ細胞の発現プロファイルの解析）
Ｒｂ異常による癌化のメカニズムを解析するため、マイクロアレイによりＵ−２  ＯＳ細胞及びＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞の発現プロファイルを比較した。
具体的には、対数増殖期のＵ−２  ＯＳ細胞とＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞からＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。また、両細胞を１０ｎＭドキソルビシンにより２４時間処理した後のＲＮＡも同様に抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写した後、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて解析した。
その結果、血管新生関連遺伝子である（インターロイキン８：ＩＬ８）の発現がＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞において７倍以上上昇していた。
また、樹立した細胞の解析から、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞はＧ２／Ｍ期進行の制御機能が異常になっていた。そこで、ＲｂによるＧ２／Ｍ期の進行のメカニズムを明らかにすることを試みた。すなわち、１０ｎＭのドキソルビシンで２４時間処理したときの両細胞の発現プロファイルをマイクロアレイにより比較した。
その結果、図１１に示すように、Ｕ−２ＯＳ細胞では発現が減少するが、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂでは発現が減少しない遺伝子群が見つかった。図１２に示すように、これらの遺伝子はＧ１／Ｓの進行を制御する遺伝子群とＧ２／Ｍの進行を制御する遺伝子群より構成されていた。この中にはＲｂによる制御が報告されていない、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔに関連するＫＩＦ１１、ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎに関連するＨＣＡＰ−Ｇ、ｓｐｉｎｄｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔに関連するＣＤＣＡ８、ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓｉに関連するＥＣＴ２、ＫＩＦ２０Ａが含まれていた。このことから、Ｒｂはこれらの分子の発現を調節することで、Ｍ期の進行を制御していることが明らかとなった。また、ＥＣＴ２は癌遺伝子であることも知られているため、Ｒｂ異常による癌化の新たなメカニズムが明らかとなった。
（発現変化の見られた遺伝子（ＩＬ８）の解析）
１．ｍＲＮＡレベルでのＩＬ８の定量
Ｕ−２  ＯＳ細胞とＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞からＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いてＴａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＴａｑ−ｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを行うことで、それぞれの細胞中のＩＬ８  ｍＲＮＡ量を定量した。
２．タンパク質レベルでのＩＬ８の定量
Ｕ−２  ＯＳ細胞とＵ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞を同じ細胞数、播種した。播種後７２時間後に培養上清を回収し、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔｋｉｎｅ社）によりそれぞれの細胞中のＩＬ８タンパク量を測定した。
図９にＴａｑ−ｍａｎ  ＰＣＲによって得られた結果を、図１０にＥＬＩＳＡによって得られた結果を示す。また、コントロールとして、ＩＬ８の発現が高いことが知られているＤＵ−１４５とＩＬ８の発現が低いことが知られているＬｎＣａｐを使用した。
その結果、ＩＬ８の発現は生理的に高いレベルにまで上昇していた。従来、Ｒｂの機能は細胞内での増殖制御であると考えられていた。今回の結果から、Ｒｂは血管新生関連遺伝子の発現を介して細胞外環境に対して影響を与え、腫瘍の形成を促進していることが分かった。
（発現変化の見られた遺伝子（ＥＣＴ２）の解析）
本解析で示された遺伝子がＲｂ／Ｅ２ＦによりｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされているかをＥＣＴ２に注目して検証した。
１．ＥＣＴ２プロモーターを挿入したレポータープラスミドの構築
Ｕ−２  ＯＳ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＥＣＴ２遺伝子の転写開始点から１０００ｂｐｓをＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをｐＧＬ３ベクターに挿入することで、ＥＣＴ２プロモーターを挿入したレポータープラスミドを構築した。以下、構築したプラスミドをｐＧＬ３  ＥＣＴ２と記す。
２．ＥＣＴ２プロモーターのＲｂ／Ｅ２Ｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎの証明
Ｕ−２  ＯＳ細胞にｐＧＬ３  ＥＣＴ２とＥ２Ｆ１発現プラスミドをＦｕｎｅｇｅ  ６を用いて導入した。２４時間後にレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。レポーター活性はＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅにより補正した。
３．ＥＣＴ２プロモーター領域へのＥ２Ｆ結合の証明
Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈＩＰ）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて行った。Ｕ−２  ＯＳ細胞をホルムアルデヒドで処理することにより、転写因子とプロモーターの結合をクロスリンクした。その後、細胞を溶解し、クロスリンクされたクロマチンを超音波処理により約５００ｂｐのＤＮＡサイズに裁断した。このようにして調製した可溶性クロマチンを、Ｅ２Ｆ１及びＥ２Ｆ４抗体で免疫沈降した。免疫沈降したクロマチン分画中に、ＥＣＴ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒが存在しているかをＰＣＲ法にて定量した。ＰＣＲには下記のプライマーを使用した。
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図１３に、ＥＣＴ２プロモーターのレポーターアッセイの結果を示す。ポジティブコントロールとして使用したＲｂ／Ｅ２Ｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎが知られているＣＤＣ６プロモーターと同様に、ＥＣＴ２プロモーターはＥ２Ｆ１によって転写活性が亢進した。この結果が直接的なものであることを示すため、ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙによりＥＣＴ２プロモーターとＥ２Ｆとの結合を調べた。図１４に示すとおり、Ｅ２ＦとクロスリンクしたプロモーターにはＥＣＴ２のプロモーターが含まれていることが確認できた。
（ＥＣＴ２の細胞周期の進行に与える効果）
以上の結果より、ＲｂはＥＣＴ２等のＧ２／Ｍ期関連遺伝子の発現を抑制することで、Ｇ２／Ｍ期の進行を阻害していると考えられた。これを証明するために、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞をドキソルビシン処理すると同時に、ｓｉＲＮＡによりＥＣＴ２を阻害し、細胞周期をＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙで調べた。具体的には、Ｕ−２  ＯＳ  ｓｈＲｂ細胞にＥＣＴ２に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。その２４時間後に１０ｎＭドキソルビシンを添加し、添加後２４時間及び４８時間の細胞を回収した。細胞のＤＮＡをＣｙｃｌｅ  ＴＥＳＴＴＭ  ＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｃａｔ＃；３４０２４２）により染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。
図１５に示すとおり、コントロールであるＬｕｃ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では２４時間と比べて４８時間においてＧ２／Ｍ期が減少するのに対して、ＥＣＴ２阻害下では４８時間でもＧ２／Ｍ期の減少がなくＧ２／Ｍ期の進行が阻害されていることが分かった。
【産業上の利用可能性】  以上説明したように、本発明の化合物の評価方法等によれば、Ｒｂパスウェイ上に存在する分子であって、抗癌剤の創薬標的又は腫瘍マーカーとして使用しうる分子及び当該分子を使用した化合物（抗癌剤候補化合物）の評価を可能とする方法を提供することが可能となり、Ｒｂ又はＲｂパスウェイ上に存在する分子の異常によって生じる腫瘍や癌の治療剤や診断薬を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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