(57)【要約】【課題】ジアシル体のリン脂質の中でホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対して加水分解活性の低い新規なホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）を提供する。また、本酵素の基質特異性を利用してリン脂質混合物からＰＩ、グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）を効率的に製造する方法を提供する。【解決手段】ホスファチジルコリン（レシチン）等のＰＩ以外のリン脂質に良く作用し、ＰＩに対して低いＰＬＢ活性を有する酵素を含有するリン脂質加工剤の提供。【選択図】選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ属由来のホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素を含有するリン脂質加工剤。
【請求項２】
リン脂質混合物中ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素を含有するリン脂質加工剤。
【請求項３】
ホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素が、さらにリパーゼ活性を有するものである、請求項１又は２に記載のリン脂質加工剤。
【請求項４】
ＰＬＢ活性を有する酵素が下記の物理化学的性質を有する請求項１〜３のいずれかに記載のリン脂質加工剤。
１）作用：リン脂質を２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）至適ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
【請求項５】
キャンディダ・シリンドラッセの培養液から得られる酵素を含有することを特徴とするリン脂質加工剤。
【請求項６】
下記工程により得られるリン脂質加工剤。
１）キャンディダ・シリンドラッセを培養する工程
２）キャンディダ・シリンドラッセの培養液を濃縮する工程
３）有機溶媒により酵素を沈殿させる工程
４）３）の工程により得られる粗酵素液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程
５）４）の工程で得られる酵素をイオン交換クロマトグラフィーで分離精製する工程
【請求項７】
配列表配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素、配列表配列番号１のアミノ酸配列との相同性が７５％以上でありＰＬＢ活性を有する酵素、あるいは配列表配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりＰＬＢ活性を有する酵素のいずれか一つ以上の酵素を含有するリン脂質加工剤。
【請求項８】
配列表配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素、配列表配列番号２のアミノ酸配列との相同性が７５％以上でありＰＬＢ活性を有する酵素、あるいは配列表配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりＰＬＢ活性を有する酵素のいずれか一つ以上の酵素を含有するリン脂質加工剤。 
【請求項９】
リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするホスファチジルイノシトール及びグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
【請求項１０】
リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするホスファチジルイノシトールの製造方法。
【請求項１１】
下記の１）〜３）の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法。
１）リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させる工程
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを抽出する工程
３）水溶性又は水混和性アルキルカルボニルアルキル溶媒処理により、ホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程
【請求項１２】
リン脂質混合物が大豆由来である請求項９〜１１のいずれかに記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造方法によって得られる、全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトール。
【請求項１４】
リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
【請求項１５】
下記の１）〜３）の工程を含むグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
１）リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させる工程
２）有機溶媒を含有する溶媒で脂質成分を抽出除去し、水層にグリセリルホスフォリルコリンを回収する工程
３）活性炭に１）の工程で作用させたリン脂質加工剤を吸着させて除去する工程
【請求項１６】
リン脂質混合物が大豆由来である請求項９、１４又は１５に記載のグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の製造方法によって得られる、純度が５５重量％以上であるグリセリルホスフォリルコリン。
【請求項１８】
高純度なグリセロホスフォイノシトールを製造するための、請求項１３に記載のホスファチジルイノシトールの使用。
【請求項１９】
高純度なコリンリン脂質を製造するための、請求項１７に記載のグリセリルホスフォリルコリンの使用。
【請求項２０】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
【請求項２１】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の製造法により製造されたグリセリルホスフォリルコリンを含有する食品、医薬品又は化粧料。
【請求項２２】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素を作用させて得られるリゾホスファチジルイノシトール。
【請求項２３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素を作用させるリゾホスファチジルイノシトールの製造方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の製造方法によって製造されたリゾホスファチジルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
【請求項２５】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスファチジルイノシトールによく作用するホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素を作用させて得られるグリセリルホスフォリルイノシトール。
【請求項２６】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスファチジルイノシトールによく作用するホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素を作用させるグリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の製造方法によって製造されたグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
【請求項２８】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトール、請求項１４〜１６のいずれかに記載の製造法により製造されたグリセリルホスフォリルコリン、請求項２３に記載の製造方法によって製造されたリゾホスファチジルイノシトール、及び請求項２６に記載の製造方法によって製造されたグリセリルホスフォリルイノシトールからなる群から選択される２種以上を含有する食品、医薬品又は化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有し、リン脂質に対して基質特異性を有する新規なリン脂質加工剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスフォリパーゼはリン脂質を加水分解する酵素の総称であり、リン脂質（グリセロールリン脂質）は、グリセロールのα位及びβ位のヒドロキシル基に脂肪酸がエステル結合しており、他方のα位のヒドロキシル基にリン酸基を介してコリン、エタノールアミン、イノシトール等が結合している化合物である。
グリセロールリン脂質中のグリセロール基のα位の脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素をホスフォリパーゼＡ１ と称し、グリセロール基のβ位の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素をホスフォリパーゼＡ２ と称し、また、ホスフォリパーゼＡ１活性及びホスフォリパーゼＡ２ 活性を併有する酵素をホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称する。
また、リン脂質中のα位又はβ位の脂肪酸アシル基の内一方のみが除去されたリン脂質をリゾリン脂質と称し、リゾリン脂質に作用して残っている脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素も、分解生成物が前記ＰＬＢの場合と同じであるため、ＰＬＢに含められる。
他方、リン脂質のグリセロール基とリン酸基との間のエステル結合を加水分解する酵素をホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）と称し、リン酸基とコリンやエタノールアミン等との間の結合を加水分解する酵素をホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤ）と称する。
上記のようにＰＬＢはリゾホスフォリパーゼ活性も併せ持っており、動植物やペニシリウム属の糸状菌、大腸菌、又は酵母などにその存在が知られているが、リゾレシチンに対する活性は強い一方でジアシル体であるリン脂質に対する作用は極めて弱く、通常のリン脂質を効率よく加水分解する点においては実用的でなかった。また、これら公知のＰＬＢはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジルイノシトール等のリン脂質に幅広く作用することが報告されているのみである（非特許文献１、２）。
ホスファチジルイノシトールは、大豆レシチンに含まれ、細胞の情報伝達と深く関与していることが数多く報告されてきた。近年、ホスファチジルイノシトールの摂取が血中のトリアシルグリセロール（ＴＧ）濃度を減少させ、ＨＤＬ−Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）濃度を上昇させることが報告され（非特許文献３）、その代謝誘導体であるリゾホスファチジルイノシトールおよびグリセリルホスフォリルイノシトールと共にその生理作用が注目されている。
また、リゾホスファチジルイノシトールは抗カビ作用を持つことも報告されている（特許文献１）。
リン脂質にＰＬＣあるいはＰＬＤを作用させてホスファチジルイノシトールを酵素特異的に得ようとする試みはなされているが、得られるホスファチジルイノシトールの純度は低く、より選択的なホスファチジルイノシトール製造法が望まれる（特許文献２）。PLCをホスファチジルイノシトール以外のリン脂質に作用させたとき、加水分解率３０％程度で反応が止まってしまうことは非特許文献２にも記載されている。    
【特許文献１】特開平６−２５６３６６号公報
【特許文献２】特開昭６２−４８３９０号公報
【非特許文献１】Biochimica Biophysica Acta (1974) 369, 245-253
【非特許文献２】Biochimica Biophysica Acta (1975) 403, 412-424
【非特許文献３】Biochem. J (2004) 382, 441-449
【非特許文献４】Jim W. Burgessら、Journal of Lipid Research (46) 350-355
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、高いＰＬＢ活性を有し、リン脂質に対して基質特異性を有する新規なリン脂質加工剤、及び高純度のホスファチジルイノシトール並びにグリセリルホスフォリルコリンを効率良く製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、驚くべき事にキャンディダ属由来の酵素がジアシル体のリン脂質に対して高いＰＬＢ活性を持つことを見出すとともに、意外にも該酵素がリン脂質混合物である大豆リン脂質においてホスファチジルイノシトール以外のリン脂質を選択的に加水分解するというリン脂質に対する特異性を有しており、この特異性を利用して高純度のホスファチジルイノシトール及びグリセリルホスフォリルコリンを効率良く製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。キャンディダ属由来の酵素はリパーゼとして食品工業、医薬品原料製造用に汎用されているが、該酵素は中性脂質に作用するいわゆるリパーゼ活性を有することが報告されているのみであり、ＰＬＢ活性を持つことは全く報告されていない。
すなわち、本発明は以下のものに関する。
＜１＞  キャンディダ属由来のホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素を含有するリン脂質加工剤。
＜２＞  リン脂質混合物中ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素を含有するリン脂質加工剤。
＜３＞  ホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素が、さらにリパーゼ活性を有するものである、上記＜１＞又は＜２＞に記載のリン脂質加工剤。
＜４＞  ＰＬＢ活性を有する酵素が下記の物理化学的性質を有する上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のリン脂質加工剤。
１）作用：リン脂質を２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）至適ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
＜５＞  キャンディダ・シリンドラッセの培養液から得られる酵素を含有することを特徴とするリン脂質加工剤。
＜６＞  下記工程により得られるリン脂質加工剤。
１）キャンディダ・シリンドラッセを培養する工程
２）キャンディダ・シリンドラッセの培養液を濃縮する工程
３）有機溶媒により酵素を沈殿させる工程
４）３）の工程により得られる粗酵素液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程
５）４）の工程で得られる酵素をイオン交換クロマトグラフィーで分離精製する工程
＜７＞  配列表配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素、配列表配列番号１のアミノ酸配列との相同性が７５％以上でありＰＬＢ活性を有する酵素、あるいは配列表配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりＰＬＢ活性を有する酵素のいずれか一つ以上の酵素を含有するリン脂質加工剤。
＜８＞  配列表配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素、配列表配列番号２のアミノ酸配列との相同性が７５％以上でありＰＬＢ活性を有する酵素、あるいは配列表配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりＰＬＢ活性を有する酵素のいずれか一つ以上の酵素を含有するリン脂質加工剤。
＜９＞  リン脂質混合物に上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするホスファチジルイノシトール及びグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
＜１０＞  リン脂質混合物に上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするホスファチジルイノシトールの製造方法。
＜１１＞  下記の１）〜３）の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法。
１）リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させる工程
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを抽出する工程
３）水溶性又は水混和性アルキルカルボニルアルキル溶媒処理により、ホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程
＜１２＞  リン脂質混合物が大豆由来である上記＜９＞〜＜１１＞のいずれかに記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
＜１３＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造方法によって得られる、全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトール。
＜１４＞  リン脂質混合物に上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させることを特徴とするグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
＜１５＞  下記の１）〜３）の工程を含むグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
１）リン脂質混合物に請求項１〜８のいずれかに記載のリン脂質加工剤を作用させる工程
２）有機溶媒を含有する溶媒で脂質成分を抽出除去し、水層にグリセリルホスフォリルコリンを回収する工程
３）活性炭に１）の工程で作用させたリン脂質加工剤を吸着させて除去する工程
＜１６＞  リン脂質混合物が大豆由来である上記＜９＞、＜１４＞又は＜１５＞に記載のグリセリルホスフォリルコリンの製造方法。
＜１７＞  上記＜１４＞〜＜１６＞のいずれかに記載の製造方法によって得られる、純度が５５重量％以上であるグリセリルホスフォリルコリン。
＜１８＞  高純度なグリセロホスフォイノシトールを製造するための、上記＜１３＞に記載のホスファチジルイノシトールの使用。
＜１９＞  高純度なコリンリン脂質を製造するための、上記＜１７＞に記載のグリセリルホスフォリルコリンの使用。
＜２０＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
＜２１＞  上記＜１４＞〜＜１６＞のいずれかに記載の製造法により製造されたグリセリルホスフォリルコリンを含有する食品、医薬品又は化粧料。
＜２２＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素を作用させて得られるリゾホスファチジルイノシトール。
＜２３＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素を作用させるリゾホスファチジルイノシトールの製造方法。
＜２４＞  上記＜２３＞に記載の製造方法によって製造されたリゾホスファチジルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
＜２５＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスファチジルイノシトールによく作用するホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素を作用させて得られるグリセリルホスフォリルイノシトール。
＜２６＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造法により製造されたホスファチジルイノシトールにホスファチジルイノシトールによく作用するホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素を作用させるグリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法。
＜２７＞  上記＜２６＞に記載の製造方法によって製造されたグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する食品、医薬品又は化粧料。
(２８＞  上記＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載の製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトール、上記＜１４＞〜＜１６＞のいずれかに記載の製造法により製造されたグリセリルホスフォリルコリン、上記＜２３＞に記載の製造方法によって製造されたリゾホスファチジルイノシトール、及び上記＜２６＞に記載の製造方法によって製造されたグリセリルホスフォリルイノシトールからなる群から選択される２種以上を含有する食品、医薬品又は化粧料。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のリン脂質加工剤を用いることにより、機能性リン脂質又は機能性リン脂質原料として有用な高純度のホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、グリセリルホスフォリルコリン、及びグリセリルホスフォリルイノシトール等を効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
１．リン脂質加工剤としてのホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）
本明細書において、ＰＬＢとはリン脂質のα位及びβ位の脂肪酸エステルを加水分解、脂肪酸エステル合成、又は脂肪酸エステル交換を行う酵素を意味する。また、リゾリン脂質に作用し、残っている脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素も本発明のＰＬＢに含まれる。また、リン脂質加工とはリン脂質の加水分解、脂肪酸エステル合成、又は脂肪酸エステル交換等の反応を意味し、好ましくは加水分解又は脂肪酸エステル合成を意味し、より好ましくは加水分解を意味する。また、脂肪酸エステル合成を意味するより好ましい別の態様もある。なお、本発明の加工剤には、ＰＬＢ単独からなる場合の他、酵素の安定化剤として例えば糖類、またｐＨ緩衝液などを添加したものも含まれる。また、リン脂質加工剤は、乾燥粉末や液体などの通常の酵素と同じように提供される。
本発明により、リン脂質混合物中のホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないことを特徴とする、ＰＬＢ活性を有するリン脂質加工剤が提供される。
「ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しない」とは、本発明のリン脂質加工剤において、基質であるリン脂質混合物中に含まれるホスファチジルイノシトールのホスファチジルコリンに対する活性比（相対活性）が、上限として１０％以下であることを意味し好ましくは７％以下であることを意味し、さらに好ましくは５％以下であることを意味し、特に好ましくは３％以下であることを意味し、最も好ましくは１％以下であることを意味し、下限として０．０１％以上であることを意味し、より好ましくは０．１％以上を意味する。さらにホスファチジルイノシトールとホスファチジルコリン以外のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジン酸（ＰＡ）等の、ホスファチジルコリンに対する活性比（相対活性）が、下限として１５％以上であることを意味し、好ましくは２０％以上であることを意味し、さらに好ましくは２５％以上であることを意味し、特に好ましくは３０％以上であることを意味し、最も好ましくは４０％以上であることを意味し、上限として２００％以下であることを意味し、好ましくは１５０％以下であることを意味し、さらに好ましくは１００％以下であることを意味する。【０００７】
また、本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは以下の諸性質を有することが好ましい。
１）作用：レシチン等のリン脂質から２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用とトリグリセリドに作用し３モル比の遊離脂肪酸と等モルのグリセリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点電気泳動法による等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）最適反応ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）熱安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下【０００８】
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは、上記の特性を有する限り特にその起源（由来）は限定されない。由来が天然物である場合、好ましくは微生物由来であり、より好ましくはキャンディダ属由来であり、さらに好ましくはキャンディダ・シリンドラッセ由来である。また、本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは上記のような天然物由来の酵素に基づいて遺伝的に改変された酵素であってもよく、遺伝子組換え技術によって生産されたＰＬＢも本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢに含まれ、上記の特性を有していることが好ましい。【０００９】
また、配列表配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有する酵素それ自体、あるいは配列表配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との相同性が７５％以上であるアミノ酸配列を有し、ＰＬＢ活性を有する酵素も本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢに含まれ、該ＰＬＢ活性を有していれば特に限定されないが、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく９５％以上であることが特に好ましく、９８％以上であることが最も好ましい。また、該リン脂質加工剤はホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないことが好ましい。「ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しない」とは前記と同義である。【００１０】
本発明における「相同性」とはアミノ酸配列、ＤＮＡレベルにおける相同性を意味し、これは既知の方法、例えばコンピュータを用いた配列比較で決定することができる。解析ソフトとしてはGENETEX WIN 5.2（ソフトウエア株式会社製）を使用した。相同性決定に用いられるコンピュータープログラムには、GAP（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12 (12):387 (1984)）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴパッケージ（NCBI，又はAltschul,S.F.ら、J.Mol.Biol., 215:403-410(1990)）、又はスミス−ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズムが例示されるが、これらに限定されない。【００１１】
さらに、配列表配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＬＢ活性を有する機能的に等価のまま改変された酵素も本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢに含まれ、該ＰＬＢ活性を有していれば特に限定されないが、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、下限としては１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、上限としては２５個以下であることが好ましく、２０個以下であることがより好ましく、１５個以下であることがさらに好ましく、１０個以下であることが特に好ましく、５個以下であることが最も好ましい。また、該リン脂質加工剤はホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないことが好ましい。「ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しない」とは前記と同義である。【００１２】
キャンディダ・シリンドラッセ由来のリパーゼのアミノ酸配列は５種類について公知である。いずれの天然のリパーゼも本発明のリン脂質加工剤として使用できるが、一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の酵素であってもＰＬＢ活性があれば以下に記載する用途に使用することができる。
また、本発明におけるリン脂質加工剤はリパーゼ活性をさらに有していることが好ましい。トリグリセリドに作用し、３モル比の遊離脂肪酸と等モルのグリセリンとに加水分解することができ、リン脂質とトリグリセリドとの混合物に適用すれば、トリグリセリドとリン脂質を同時に加水分解することができる。【００１３】
２．ＰＬＢの製造法
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは、市販のキャンディダ属由来の酵素製品としても簡単に入手でき利用することができるが、キャンディダ属の微生物を培養しその培養物から酵素を製造することもできる。キャンディダ属の微生物の好ましい例としてはキャンディダ・シリンドラッセ株が挙げられるが、これに限定されることはない。使用するＰＬＢ生産菌株は紫外線や化学的変異剤で処理した変異株でもいい。更に後述するＰＬＢ遺伝子を高発現可能な形で宿主に組み込んだ遺伝子組換え体を使用してもよい。
微生物の培養のための培地成分及び培養条件は、菌株がＰＬＢを生産するようなものであれば特に限定されない。酵素の生産に適した培養条件は、一般的には、栄養豊富な培地中で、好気的条件下、中程度の培養温度である。このような条件で菌株を培養すると菌体の良好な生育および酵素の産生がみられる。具体的には培地に用いる炭素源としては、例えばグルコース、蔗糖、フルクトース、ラクトース、マルトース、コーンスターチ、又はジャガイモ澱粉が挙げられ、窒素源としては、例えばフスマ、ペプトン、酵母エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、カゼイン、綿実粉、脱脂綿実粉、ゼラチン、グルタミン酸等の各種アミノ酸類、硫安、又は尿素等が挙げられる。これら炭素源及び窒素源を適宜組み合わせて使用することができるが、大豆粉及びグルコースの組み合わせ、又は脱脂大豆粉及びグルコースの組み合わせが好ましい例として挙げられる。上記の炭素源及び窒素源の他に培地に使用するものとして、食塩、燐酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化カルシウム等の無機塩類が例示されるが、食塩、燐酸塩、又はマグネシウム塩を使用することが好ましい。炭素源、窒素源、及び無機塩類を含有した無菌培地にキャンディダ属の酵母を植菌し、好気的条件下で培養を行う。培養温度は２２〜３３℃の範囲で使用できるが、好ましくは２６〜３０℃、特に好ましくは２７〜２８℃である。培養時間は通気、攪拌、又は培養温度によって異なるが３０〜６０時間である。培養上清のＰＬＢ活性をモニタリングし定常に達した時期を見計らって培養を終了させればよい。【００１４】
本発明において用いる微生物は、上記のような培養条件下で培養液中に本発明のリン脂質加工剤としての酵素、すなわちＰＬＢを分泌生産する。本酵素を製造するための材料としての培養液上清は、菌体と分離することによって得ることができる。遠心分離や濾過操作により得られた培養液上清に含有されるＰＬＢは、硫酸アンモニウムによる塩析沈殿、アセトンやエタノール等の有機溶媒による沈殿によって精製できるが、中でもアセトン沈殿による精製が好ましい。これらの沈殿操作に先立ち限外濾過による酵素の濃縮を行ってもよい。更に必要に応じてイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等公知の手法で必要な程度にまで精製及び／又は濃縮することによって精製酵素を得ることができる。本発明で用いるリン脂質加工剤に含まれる酵素の精製の度合いは、高ければそれだけ効率よくリン脂質を分解することができるが、目的に応じて粗酵素の段階でも用いることができ、イオン交換クロマトグラフィーによって分画される酵素画分ＡとＢの混合物であっても用いることができる。【００１５】
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢが、機能的に等価のまま改変された酵素である場合については、当業者であれば配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする配列表配列番号３の遺伝子の塩基配列の情報を基にして該酵素を取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、公知の方法（例えば、Sambrook, j.ら；「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能である。【００１６】
例えば、配列表配列番号３の遺伝子配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物由来の試料とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法又はハイブリダーゼーション法を実施することにより目的の遺伝子を取得し、続いて遺伝子を改変するために通常用いられる方法、例えば部位特異的突然変異誘発法（Mark, D. F. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984）により遺伝子を改変し、その改変された遺伝子を適当な発現系、例えばサッカロマイセスやピシアを宿主として用いて発現させることにより改変された酵素を取得することができる。該改変された酵素がＰＬＢ活性を有するか否かは実施例２に示す方法で確認することができる。また該改変酵素を含有するリン脂質加工剤は、リン脂質混合物中において、ホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないことが好ましい。さらにはリパーゼ活性を持つことが好ましい。【００１７】
３．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及び／又はグリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）の製造方法
本発明により、高純度のＰＩ及びＧＰＣを同時に、かつ効率的に製造する方法が提供される。また、高純度のＰＩ又はＧＰＣを別個独立に、効率的に製造する方法も提供される。本発明のリン脂質加工剤は、リン脂質混合物においてＰＩ以外のリン脂質を選択的に加水分解する、というリン脂質に対する特異性を有しており、高純度のＰＩを選択的に製造することができる。また、ＰＣを主成分として含有する大豆リン脂質を、本発明のリン脂質加工剤を用いて分解することによりＰＩを製造することができると同時に、ＧＰＣを高純度で製造することができる。高純度のＰＩ及びＧＰＣを取得することは機能性リン脂質又は機能性リン脂質原料として非常に有用である。
なお、リン脂質にＰＬＣを作用させることによってもＰＩを得ることはできるが（前記の特許文献２参照）、ＧＰＣは生成されない。本発明により反応生成物として生じるＧＰＣは、認知症予防等が期待される素材であり、ＰＬＢを作用させる本発明はこの点においても有利である。【００１８】
以下にそれぞれの製造方法を具体的に説明する。
イ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の製造法
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは天然型リン脂質加工の用途に極めて有用であり、本発明により、高純度のＰＩを効率的に製造する方法が提供される。リン脂質は細胞膜の構成成分であり重要な生理機能を担っている。特にＰＩは細胞膜中の細胞内外のシグナル伝達に深く関っている。医薬・食品用途でのリン脂質の給源は主に大豆、鶏卵卵黄、魚卵等である。これらのリン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等複数の分子種の混合物として得られる。これらのリン脂質混合物からＰＩを分離するには有機溶媒分画、シリカゲル、アルミナ等の担体でのクロマトによる分離などが汎用される。比較的含量の多いＰＣやＰＥはこれらの方法でも効率良く取得できるが含量の少ないＰＩなどのリン脂質成分を取得するには極めて効率が悪い。またクロロホルムのようなハロゲン系の有機溶媒を大量に使用する必要があり製品の用途が限定される。ＰＣ、ＰＥ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＩ等を含有するリン脂質からＰＩを効率よく製造するためにはＰＩ以外のＰＣ、ＰＥ、ＰＡ、ＰＳ等のリン脂質を選択的に加水分解しＰＩを残存させればよい。【００１９】
本発明のリン脂質加工剤をリン脂質混合物に作用させることにより、リン脂質混合物のうちＰＩのみを選択的に残存させ、効率良くＰＩを取得することができる。リン脂質混合物は予めホモゲナイザー等を使用して水に分散させてもいいし強制的な攪拌によって均一な水溶液を調製できる。リン脂質濃度は水に分散したリン脂質混合物にＰＬＢが作用しうる濃度であれば良いが、１〜２０％の範囲、好ましくは５〜１０％、特に好ましくは６〜８％である。反応のｐＨはＰＬＢがリン脂質混合物に作用しうるｐＨであれば良いが、ｐＨ３〜１０、ＰＬＢの活性が最大になるｐＨ５．５〜６．５付近に調整することが好ましい。特に好ましくはｐＨ６付近である。【００２０】
反応のｐＨを一定に保つために緩衝液を使用することが好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液であればその種類は特に限定されないが、食品用途の観点からは酢酸緩衝液の使用が特に好ましい。また、反応中にＮａＯＨ溶液を適宜添加して反応液のｐＨを好ましい範囲にコントロールすることもできる。
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢの使用濃度は、リン脂質１ｋｇあたり１０００〜１００００００００単位の範囲で使用することができるが２０００〜５００００００位の範囲が好ましい。
使用するＰＬＢの形態は水溶液の形で添加してもよく、セライト又はイオン交換樹脂等の不溶性担体に固定化された形態でもよい。
酵素反応の温度はＰＬＢが失活しない範囲で使用することができるが、上限としては６０℃以下であることが好ましく、４５℃以下であることがより好ましく、また下限としては１０℃以上であることが好ましく、３０℃以上であることがより好ましい。
反応時間は上記の酵素反応条件によって異なり、通常１〜１５０時間であるが、基質の残存量を定性的に把握して反応を止めればよい。
反応終了後、熱処理、ｐＨ処理などによりＰＬＢを失活させても何ら問題は無い。
加水分解反応の状態を確認するにはシリカゲル薄層クロマト（ＴＬＣ）法が最も簡便である。ＴＬＣを用い、ヨウ素発色して基質の残存量を定性的に確認する場合、ＰＩ以外のリン脂質を示すスポットがＴＬＣ上でほぼ確認できなくなった時点で反応を止めるのが好ましい。
反応後の生成物中には遊離の脂肪酸、グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）、グリセリルホスフォリルエタノールアミン（ＧＰＥ）、グリセロリン酸（ＧＰ）と反応せずに残ったＰＩが混合して存在している。該混合物からＰＩを回収するにはクロロホルム、エタノール、メタノール、又はヘキサン等の有機溶媒を使用することができるが、食品用途の観点からはエタノール又はヘキサン、あるいはこれらの混合溶媒の使用が特に好ましい。また、抽出工程での液液分離をよくする目的で抽出前に反応のｐＨを変化させることもできる。
遊離脂肪酸とＰＩは有機溶媒に可溶でありＧＰＣ、ＧＰＥなどはヘキサン等の有機溶媒に不溶であり水に可溶性である。有機溶媒層に回収されたＰＩと遊離脂肪酸は減圧濃縮等の操作により溶媒を留去する。ＰＩは水溶性又は水混和性アルキルカルボニル溶剤に不溶性であり、遊離脂肪酸はこれらの溶剤に可溶性であるので、ＰＩは沈殿物として回収することができる。水溶性又は水混和性アルキルカルボニル溶剤としては、アセトン又はメチルエチルケトン等が例示されるが、アセトンが好ましい例として挙げられる。ＰＩの回収は遠心分離法でも濾過法の固液分離操作いずれの方法をとってもよい。【００２１】
リン脂質混合物は特に限定されない。鶏卵卵黄由来のリン脂質、イクラ等の魚卵由来リン脂質、又は大豆由来のリン脂質等を使用することができるが、原料リン脂質の安定供給の面で鶏卵卵黄由来のリン脂質又は大豆由来のリン脂質が好ましく、大豆由来のリン脂質が特に好ましい。本発明のリン脂質加工剤はＰＬＢ活性の他に強いリパーゼ活性を有することが好ましいが、リパーゼ活性を有することは大豆リン脂質からＰＩやグロセリルホスフォリルコリンを製造する上では全く問題はない。大豆リン脂質はトリグリセリドとの混合物でも供給されており、該混合物を原料とした場合に、トリグリセリドとリン脂質を同時に加水分解することができる点で、リパーゼとＰＬＢ活性を併せ持つことは有意である。なお、ＰＬＢ活性は高いが、リパーゼ活性が低い、あるいは有さない場合には、別途リパーゼを添加することでトリグリセリドとリン脂質を同時に分解することができる。【００２２】
本発明の上記方法により、高純度のＰＩが提供される。ＰＩの純度は高純度であれば特に限定されないが、全リン脂質中のＰＩの純度が、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましい。  高純度のＰＩは機能性リン脂質として有用である。ＰＩは分子中に水酸基を豊富に含むイノシトールを有するため、ＰＣ又はＰＥ等の他のリン脂質と比較して水への分散又は溶解が良好であったり、他の脂質成分の溶解性等が極端に異なりリン脂質としての応用範囲が広げられるという利点が考えられる。【００２３】
ロ）グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）の製造
本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢは天然型リン脂質加工の用途に極めて有用であり、本発明により、高純度のＧＰＣを効率的に製造する方法が提供される。
リン脂質混合物に本発明のリン脂質加工剤を作用させる方法は、上記ＰＩの製造方法における方法と同様である。反応の時間は、通常５〜２０時間の範囲で行えばいいが、使用する酵素濃度にもよるため反応物中のＧＰＣ濃度が最大になった時に反応を止めればよい。
リン脂質混合物に本発明のリン脂質加工剤を作用させることにより得られたＰＬＢの反応液に、クロロホルム、エタノール、メタノール、又はヘキサン等上記と同様の有機溶媒を添加し、遊離脂肪酸を含む脂質成分を抽出除去して残った水層には、ＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰ、又は遊離の酵素が含有される。これらＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰを含む水溶液を直接減圧濃縮しシロップ状の溶液を得ることができるが、濃縮に先立ち、該ＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰを含む水溶液を活性炭処理することは、着色成分や本発明のリン脂質加工剤を除去することができる点で好ましい。更に高純度のＧＰＣを得るには陽イオン交換樹脂等を使用してもよい。【００２４】
本発明のＧＰＣの製造方法において用いるリン脂質混合物は、ＰＣ含量が多いものであれば特に限定されない。鶏卵卵黄由来のリン脂質、イクラ等の魚卵由来リン脂質、大豆由来のリン脂質等を使用することができるが原料リン脂質の安定供給の面で鶏卵卵黄由来のリン脂質や大豆由来のリン脂質が好ましく、特に大豆由来のリン脂質が特に好ましい。本発明の上記方法により、高純度のＧＰＣが提供される。ＧＰＣの純度は高純度であれば特に限定されないが、下限としては４５重量％以上であることが好ましく、５０重量％以上であることがより好ましい。【００２５】
４．リゾホスファチジルイノシトールの製造法  
次にリゾホスファチジルイノシトールの製造方法について説明する。
本発明の、高純度のリゾホスファチジルイノシトールの製造方法は、次の工程からなる。
工程１）高純度のＰＩをホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素によって加水分解反応する工程、
工程２）遊離の脂肪酸が溶解し、且つ、リゾホスファチジルイノシトールが溶解しない溶媒の１種又は２種以上の混合溶媒で遊離の脂肪酸を洗浄除去し、反応生成物である遊離の脂肪酸とリゾホスファチジルイノシトールを分離しリゾホスファチジルイノシトールを回収する工程。
以下に詳細に説明する。【００２６】
本発明のリゾホスファチジルイノシトール製造に用いるホスフォリパーゼＡ１又はホスフォリパーゼＡ２活性を有する酵素としては、ＰＩに作用してリゾホスファチジルイノシトールに変換する酵素であれば何ら限定されるものではなく、例えば豚膵臓由来の酵素剤パンクレアチンに含まれるホスフォリパーゼＡ２（ノボザイム社製のレシターゼ又はジェネンコア協和社製のリポモッド６９９L）、ストレプトマイセス・ビオラセオルバー由来のホスフォリパーゼＡ２（ジェネンコア協和社製のリゾマックスＰＦ）、アスペルギルス・オリゼ由来のホスフォリパーゼＡ１（三共ライフテック社製のホスフォリパーゼＡ１）などが挙げられ、豚膵臓由来の酵素剤パンクレアチンに含まれるホスフォリパーゼＡ２（ノボザイム社製のレシターゼ）又はアスペルギルス・オリゼ由来のホスフォリパーゼＡ１（三共ライフテック社製のホスフォリパーゼＡ１）が好ましい例として挙げられる。【００２７】
本発明のリゾホスファチジルイノシトール製造における酵素反応は、酵素と基質を水性媒体中または湿潤状態で接触させればよい。反応のｐＨは酵素反応が行われる範囲であれば何ら限定されることはないが、例えばｐＨ６．５〜９．０が好ましい範囲として例示できる。
反応温度は酵素反応が行われる範囲であれば何ら限定されることはないが、例えば１０〜７０℃が好適な範囲として挙げられ、３０〜６０℃がさらに好適な範囲として挙げられる。
反応は、ＰＩの減少やリゾホスファチジルイノシトールの増加など、反応を追跡するのに好ましい化合物を、例えば高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー等の分析を用いて反応を追跡して所望の状態となった時点で停止すればよい。所望の状態としては、例えば、反応が終了した状態、定常状態、或いは十分量のリゾホスファチジルイノシトールが生成した状態等が挙げられるが、工業生産上の様々な観点から決定すればよい。
反応時間を例示すれば、例えば１時間から１０日間が挙げられる。
反応に使用する酵素量は反応が十分に進行する量であればよいが、工業生産上の観点からは必要量以上に用いることは利点がない。一例として１０００Ｕ／ｇの酵素を用いる場合、基質に対して０．０５〜５０重量％が好適な例として挙げられる。また、酵素の安定化剤としてカルシウムイオン（塩化カルシウム）などを添加しても良い。また、酵素反応が終了した後、通常の手段で酵素を失活させても良い。
失活手段としては加熱処理（５０〜９０℃で１０分間〜２時間）、ｐＨ（ｐＨ１〜４またはｐＨ８〜１２で１０分間〜２時間）処理などが挙げられる。更に、反応終了後、又は酵素を失活させた後、生成した遊離脂肪酸を、アセトンなどの脂肪酸が溶解し、且つ、リゾホスファチジルイノシト
ールが溶解しない溶媒で洗浄することにより除去してもよい。【００２８】
５．グリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法  
次にグリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法について述べる。
本発明の、高純度のグリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法は、次の工程からなる。
工程１）高純度のＰＩを、ホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素によって加水分解反応する工程、
工程２）反応生成物である遊離の脂肪酸とグリセリルホスフォリルイノシトールを分離しグリセリルホスフォリルイノシトールを回収する工程。
以下に詳細に説明する。【００２９】
本発明のグリセリルホスフォリルイノシトール製造に用いるホスフォリパーゼＢ活性を有する酵素としては、ＰＩによく作用してグリセリルホスフォリルイノシトールに変換する酵素であれば何ら限定されるものではなく、例えばペニシリウム属や酵母由来の酵素などが挙げられる。
本発明における酵素反応は、酵素と基質を水性媒体中または湿潤状態で接触させればよい。反応のｐＨは酵素反応が行われる範囲であれば何ら限定されることはないが、例えばｐＨ３．５〜８．０が好ましい範囲として例示できる。ペニシリウム・ノタツム由来ホスフォリパーゼＢを酵素として使用する場合にはｐＨ４．０〜５．０付近が特に好ましい。
反応温度は酵素反応が行われる範囲であれば何ら限定されることはないが、例えば１０〜７０℃が好適な範囲として挙げられ、３０〜６０℃がさらに好適な範囲として挙げられる。
反応は、ＰＩの減少やグリセリルホスフォリルイノシトールの増加など、反応を追跡するのに好ましい化合物を、例えば高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー等の分析を用いて反応を追跡して所望の状態となった時点で停止すればよい。所望の状態としては、例えば、反応が終了した状態、定常状態、或いは十分量のグリセリルホスフォリルイノシトールが生成した状態等が挙げられるが、工業生産上の様々な観点から決定すればよい。反応時間を例示すれば、例えば１時間から１０日間が挙げられる。
反応に使用する酵素量は反応が十分に進行する量であればよいが、工業生産上の観点からは必要量以上に用いることは利点がない。一例として３８００Ｕ／ｇの酵素を用いる場合、基質に対して０．０５〜５重量％が好適な例として挙げられる。また、酵素の安定化剤としてカルシウムイオン（塩化カルシウムなど）を添加しても良い。また、酵素反応が終了した後、通常の手段で酵素を失活させても良い。失活手段としては加熱処理（５０〜９０℃で１０分間〜２時間）、ｐＨ（ｐＨ１〜４またはｐＨ８〜１２で１０分間〜２時間）処理などが挙げられる。
更に、反応終了後、又は酵素を失活させた後、生成した遊離脂肪酸を、へキサンなどの溶媒で抽出除去し水層を減圧濃縮した後高濃度のグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する水溶液で保存してもいいし、凍結乾燥粉末にして保存してもいい。水層を直接イオン交換樹脂などにグリセリルホスフォリルイノシトールを吸着させ洗浄後高濃度の塩あるいはｐＨ変動させることにより更に精製を行ってもいい。更に必要に応じて着色成分を活性炭に吸着させ脱色操作を行ってもいい。【００３０】
６．高純度ＰＩ及び高純度ＧＰＣの使用
本発明のＰＩの製造方法により得られるＰＩは、ＰＩを良好に加水分解するペニシリウム・ノタツムやジクティオスレリウム・ディスコイデウム由来のＰＬＢを用いて加水分解を行い、高純度のグリセリルホスフォリルイノシトールを製造する際の原料として使用することができる。また、本発明のＧＰＣの製造方法によって得られるＧＰＣは、これと遊離脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとの化学的または酵素的なエステル合成により任意の脂肪酸を含有する高純度のコリンリン脂質、すなわち機能性リン脂質を製造する際の原料として使用することができる。【００３１】
７．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトール含有する食品、医薬又は化粧品
ＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトールの食品及び医薬中の含有量は、何ら限定されるものではないが、1日のＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトールの摂取量が１〜１００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５０００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。
本発明のＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する食品としては、これらを含有するものであれば何ら限定されるものでは無く、例えばこれらを含有するサプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、ケチャップ、ソース、流動食、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、パン類、麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等）、スープ類（味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等）、ふりかけ等が挙げられる。【００３２】
本発明に用いられるＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン、酸化チタニウム等）、食物繊維、各種糖類（セルロース、デキストリン、キチン等）、各種多価不飽和脂肪酸（アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸等）、各種共役脂肪酸類（共役リノール酸、共役リノレン酸、共役アラキドン酸、共役ＤＨＡ、共役ＥＰＡ、共役ＤＰＡ等）、各種リン脂質（レシチン、ＰＡ、ＰＳ、ＰＥ、ホスファチジルグリセロール、ＰＣ、ホスファチジルＤＨＡ等）、各種糖脂質類（セレブロシド等）、各種カロチノイド類（β-カロチン、リコピン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、各種フラボノイド類（ケルセチン、ルテオリン、イソフラボン等）、各種アミノ酸類（グリシン、セリン、アラニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、システイン等）、その他の各種栄養素（酸化型コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、カルニチン、セサミン、α−リポ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、クルクミン、γ−オリザノール、グルタチオン、γ−アミノ酪酸、シネフリン、ピロロキノリンキノン、カテキン、カプサイシン等）、各種分散剤、各種乳化剤等の安定化剤、各種甘味料（ソルビトール、ショ糖等）、各種呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、蜂蜜、蜜ロウ、プロポリス、アガリクス、高麗人参、バイオペリン等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモンミール、ラベンダーなどのハーブ類を配合してもよい。また、テアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。    【００３３】
本発明のＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトールを含有する医薬としては、これらを含有するものであれば何ら限定されない。該医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、ＰＩは水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いてもよい。更に、ＰＩの吸収性を高めるために、賦型剤（アラビアガム、デキストリン、カゼイン等）の存在化又は非存在化、平均粒子系を１ミクロン程度まで微粉砕して用いることも可能である。【００３４】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、マルトース、レシチン、アラビアガム、デキストリン、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。【００３５】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ポーラス投与のいずれであってもよい。
本発明の、ＰＩ、ＧＰＣ、リゾホスファチジルイノシトール、又はグリセリルホスフォリルイノシトール含有化粧料としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、ハップ剤、入浴剤などが挙げられ、香料等を混合してもよい。
次に、実施例によって本発明を説明するが本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］ＰＬＢの製造方法
３０リットル容積のジャーファメンターに３％脱脂綿実粉、０．３％食塩、０．２％リン酸２カリウム、０．２％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、消泡剤０．３％から成る滅菌した培地２０リットルに、同一培地で前培養（２８℃、４日間）したキャンディダ・シリンドラッセＡＴＣＣ１４８３０株の培養液１００ｍｌを無菌的に植菌した。１分間２０リットルの無菌空気を通気し１分間３００回転で攪拌しながら２８℃で培養を行った。５０時間後のＰＬＢは最大の活性（０．２Ｕ／ｍｌ）が確認された。
得られた培養液を５０００回転、１０分間遠心分離を行い、１６リットルの上清を得た。この上清を限外濾過法により濃縮を行った。得られた濃縮液３リットルに９リットルの冷アセトンを添加し生じた沈殿物について、５０００回転、１０分間遠心分離を行って沈殿物を回収し、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと略す）（ｐＨ７．５）２リットルに溶解した。不溶物を遠心分離により除去し、予めカラムに充填したオクチルセファロース（ベッド容積；３００ｍｌ）に通しＰＬＢを吸着させた。次いで、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。カラムに吸着されたＰＬＢは２％アデカトールＳＯ１２０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出された（疎水クロマトによる精製）。次いで、溶出液（1リットル）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（ベッド容積；２００ｍｌ）に通してＰＬＢを吸着させ、前記の緩衝液でカラムを洗浄後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて酵素を溶出した。塩化ナトリウムが約０．１Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ａ、塩化ナトリウムが約０．２５Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ｂを得た（イオン交換クロマトによる分離精製）。
酵素画分Ａ及び酵素画分ＢのＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサーにより特定したところ、酵素画分Ａのアミノ酸配列は配列番号１に示す配列であることが、また、酵素画分Ｂのアミノ酸配列は配列番号２に示す配列であることがわかった。さらに、GENETEX WIN 5.2（ソフトウエア株式会社製）による相同性解析により、酵素画分Ｂの酵素画分Ａに対する相同性を解析したところ、８８．５％であることがわかった。【００３７】
［実施例２］ＰＬＢ活性の測定法
ＰＬＢの酵素活性は、ホスファチジルコリンから生成されるＧＰＣを酵素法により測定することによって確認できる。すなわち、１Ｍ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＭＥＳ−ＮａＯＨと略す）（ｐＨ６）０．０５ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ卵黄ホスファチジルコリン０．０５ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．２％ＴＯＤＢ０．０５ｍｌ、０．２％４−アミノアンチピリン０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．１ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．１ｍｌ、６Ｕ／ｍｌＧＰＣホスフォジエステラーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０５ｍｌからなる反応液０．５ｍｌを３７℃で２〜３分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し同一緩衝液で希釈したＰＬＢ溶液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加して反応を始め、正確に１０分後に０．５％ＳＤＳ１ｍｌを加えて反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、１分間に１マイクロモルのＧＰＣを遊離する活性を１単位とした。【００３８】
［実施例３］リパーゼ活性の測定法
リパーゼ活性測定は、ジグリセリドを基質にして生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグルセリンに変換後、酵素法により測定した。すなわち１Ｍ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ１，２ジグリセリド０．０５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化マグネシウム０．０２５ｍｌ、０．０５ＭＡＴＰ０．０５ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．０５ｍｌ、５Ｕ／ｍｌグリセロキナーゼ０．０５ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０２５ｍｌ、０．３％ＴＯＯＳ０．０２５ｍｌ、０．３％４−アミノアンチピリン０．０２５ｍｌから成る反応液０．５ｍｌに０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した酵素液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加し反応を３７℃で１０分間行った後０．５％ＳＤＳで反応を止め５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なおリパーゼ活性１単位は１分間に１マイクロモルのグリセリンを遊離する活性とした。【００３９】
［実施例４］ＰＬＢ画分Ａのゲル濾過クロマトによる精製
実施例１で得たＰＬＢ活性酵素画分Ａを遠心型の限外濾過装置にかけ濃縮を行った。濃縮した液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したゲル濾過クロマト（スーパーデックス７５）にかけ1分間あたり０．５ｍｌの流速で分離を行い活性画分を得た。
各分画において、実施例２及び３の方法によりＰＬＢ活性及びリパーゼ活性をそれぞれ求め、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。各分画におけるＰＬＢ活性、リパーゼ活性、及び蛋白濃度の結果を図１に示した。
その結果、２８０ｎｍで測定した蛋白濃度とリパーゼ活性及びＰＬＢ活性が一致した溶出パターンが得られ、リパーゼ活性とＰＬＢ活性を有する蛋白は同一酵素蛋白であることがわかった。【００４０】
［実施例５］ＰＬＢの諸性質
５−１（反応の至適ｐＨ）
実施例２に示した反応液組成のうち、緩衝液として酢酸緩衝液（以下、Ａｃｅｔａｔｅと略す）、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨと略す）、又はＭＥＳ−ＮａＯＨを用いて各ｐＨにおける酵素画分Ａの酵素活性を測定し、ＭＥＳ−ＮａＯＨｐＨ６．０を使用したときの活性に対する各緩衝液での相対活性を求めた。その結果を図２に示した。
図２に示したように、ＭＥＳ−ＮａＯＨについてはｐＨ６付近で最大の酵素活性を示し、またＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ及びＡｃｅｔａｔｅについてもｐＨ６付近で最大の酵素活性を示すことが予想された。【００４１】
５−２（ｐＨ安定性）
Ａｃｅｔａｔｅ、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨと略す）の１０ｍＭの各種緩衝液に、５Ｕ／ｍｌになるように酵素画分Ａを溶解して３７℃に９０分間静置した後、実施例２の方法に基づきＰＬＢ活性を測定し、Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ５における活性に対する各種ｐＨでの相対残存活性を求めた。その結果を図３に示した。
図３に示したように、ｐＨ５からｐＨ８の広い範囲で安定であることがわかった。【００４２】
５−３（熱安定性）
５Ｕ／ｍｌになるように１０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）に酵素画分Ａを溶解し、実施例２の方法により０〜７０℃の温度範囲で１０分間加温した後ＰＬＢ活性を測定した。その結果を図４に示した。冷蔵保存した酵素画分ＡのＰＬＢ活性を１００％とした時の相対残存活性は、５５℃までの処理で９０％以上であり、熱に対して安定な酵素であることがわかった。【００４３】
５−４（基質特異性）
実施例２に記載のＰＬＢ活性測定法により、実施例１のイオン交換クロマトで得られた２種類のリン脂質加工剤としてのＰＬＢ（酵素画分Ａ及び酵素画分Ｂ）の、ＰＣ対する各種リン脂質についての活性を測定した。すなわち実施例２に示した反応組成のレシチンの代わりにＰＥ、ＰＩ、ＰＡを使用して活性測定を行いＰＣに対する相対活性を求めた。その結果を表１に示した。その結果、酵素画分Ａ及び酵素画分ＢともにＰＣに対するＰＩの相対活性は他のリン脂質に比べて低く、本発明のリン脂質加工剤は、リン脂質の中でもＰＩに対する活性が小さいという基質特異性があることがわかった。表１の結果より、いずれの画分もＰＬＢ活性を有することからリン脂質加工剤としては両画分の混合物を用いることもできることがわかる。【００４４】
【表１】
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【００４５】
５−５（分子量）
実施例１に記載した方法によって得られた精製酵素画分ＡはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で単一のバンドが得られた。分子量既知の蛋白をマーカーにして得られた分子量は５３キロダルトンであった。【００４６】
５−６（等電点）
実施例１に記載した方法によって得られた精製酵素画分Ａについて、キャリアアンフォライトを用いたｐＨ勾配を作製して行う等電点電気泳動法により酵素画分Ａについての等電点を測定し、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。酵素画分Ａの等電点及び酵素濃度との関係を図５に示した。その結果、２８０ｎｍの吸光度で測定した蛋白が示すｐＨとリパーゼ活性及びＰＬＢ活性は完全に一致し、そのｐＨ値（等電点）は４．２１であった。図５からわかるようにＰＬＢ、リパーゼと蛋白は全く同じピークを示したことからＰＬＢとリパーゼは同じ酵素蛋白であることが明らかとなった。【００４７】
［実施例６］ＰＩの定量法
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）０．１ｍｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤ  ０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム０．０５ｍｌ、２％トリトンＸ１００  ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ  ＰＩ特異的ホスフォリパーゼＣ  ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌイノシトールデヒドロゲナーゼ０．０５ｍｌ、５％ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、精製水０．１５ｍｌから構成される発色液０．５ｍｌに、ＰＩを含有する被検体（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を２％トリトンＸ１００に溶解してできたＰＩ溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応を行い０．５％ＳＤＳ０．５ｍｌで反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度のイノシトール水溶液をキャリブレーターに用いてＰＩ量を定量した。【００４８】
［実施例７］ＧＰＣの定量法
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．１ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．２％ＴＯＤＢ０．０５ｍｌ、０．２％４−アミノアンチピリン０．０５ｍｌ、６Ｕ／ｍｌグリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０５ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ０．０５ｍｌ、精製水０．１５ｍｌから構成される反応液０．５ｍｌにＧＰＣを含有する試料２５μｌ（０．３〜０．９ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１０分間反応後０．５％ＳＤＳ０．５ｍｌを加え５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度のコリン水溶液をキャリブレーターに用いてＧＰＣを定量した。【００４９】
［実施例８］ＰＩの製造方法
４０グラムの大豆由来リン脂質を４００ｍｌの１０ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．８）に攪拌し懸濁させた後１４００単位の本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢ（実施例１で得た酵素画分Ａ）を添加して４５℃で反応を開始した。２０時間後に反応を止めエタノール２００ｍｌ、ヘキサン４００ｍｌを加え１時間攪拌した。ヘキサン層と水層とを遠心分離により分離して有機溶媒層を回収した。回収した有機溶媒を減圧下で濃縮を行った後、濃縮物にアセトン１５０ｍｌを加え生じた沈殿物を集め乾燥させ８．２グラムのＰＩを高濃度に含有する粉末を得た。得られたリン脂質の純度を基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、1996年）により測定した結果、全リン脂質中８６．８モル％であった。【００５０】
［実施例９］ＧＰＣの製造方法
実施例８に記載した方法においてＰＬＢ反応物から有機溶媒抽出を行い得られた水層にはＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰが含まれる。水層３８０ｍｌを活性炭を充填したカラム（ベッド容積；５０ｍｌ）に通し無色の通過液を得た。これを減圧下で濃縮を行い４０ｍｌのＧＰＣ溶液を得た。実施例２に示したＧＰＣの定量法によりＧＰＣの純度は５５重量％であった。【００５１】
［実施例１０］リゾホスファチジルイノシトールの製造方法
実施例８により得られたＰＩ１０ｇに２０ｍｌの水を加えよく撹拌した後、三共ライフテック社製ホスフォリパーゼＡ１（１１，９００Ｕ／ｇ）１００ｍｇを加え５０℃で撹拌させながら酵素反応を行わせた。反応開始から２４時間後、反応液を８０℃で３０分間処理することにより、反応を終了させた。反応液を乾燥後、１００ｍｌのアセトンを加え、よく撹拌させた後、ろ過して固形物を得た。この固形物を乾燥させ、６ｇのリゾホスファチジルイノシトールを得た。ＴＬＣ分析にて未反応のＰＩ及び反応副生成物の遊離脂肪酸は除去されていることが確認された。
ＴＬＣ担体；Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０、層厚２ｍｍ（メルク社製）、展開液；クロロホルム：メタノール：水＝６５：３５：４、発色方法；ヨード発色、Ｒｆ値；リゾホスファチジルイノシトール（０．１２）、ＰＩ（０．２８）、遊離脂肪酸（０．８１））。【００５２】
［実施例１１］ペニシリウム・ノタツムからホスフォリパーゼＢを製造する方法
公知方法に準じて以下のようにペニシリウム・ノタツムからホスフォリパーゼＢを製造した。５００ｍｌ容三角フラスコで前培養したペニシリウム・ノタツム（ＩＦＯ−４６４０）１００ｍｌをオートクレーブにより殺菌した培地（コーンスティプリカー３．５％、５．５％ラクト-ス、０．７％リン酸Ｉカリウム、０．３％硫酸マグネシウム、０．５％炭酸カルシウム、０．２５％で大豆油、ｐＨ５．４）２０リットルに移植し２６℃で４日間好気的条件で培養を行った。培養終了後、濾過を行い菌体を得た。この菌体に１０リットルの精製水を加えホモゲナイザーで１０分間処理し酵素を可溶化した後、濾過を行い８リットルの粗製の酵素液を得た。この濾液を２Ｋｇのパルミトイル化したセルロース繊維を充填したカラムに通して酵素を吸着させ精製水でカラムを洗浄後、０．５％アデカトールＳＯ１２０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で酵素を溶出させた。この溶出液（１０リットル）をＱ−セファロースイオン交換カラムにかけ酵素を吸着させた。カラムを０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗浄した後０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で酵素を溶出した。２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析脱塩後凍結乾燥して酵素粉末を得た（３８００Ｕ／ｇ）。【００５３】
［実施例１２］グリセリルホスフォリルイノシトールの製造方法
実施例８により得られたＰＩ１０ｇに１００ｍｌの２ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．０）を加えよく撹拌した後、実施例１１に記載したペニシリウム・ノタツムから得たホスフォリパーゼＢ２００ｍｇを加え４０℃で撹拌させながら酵素反応を行わせた。反応開始から２４時間後、反応液を８０℃で３０分間処理することにより、反応を終了させた。反応液に５０ｍｌのへキサンを添加攪拌を行った後、静置しへキサン層を除去し水層を回収した。この水槽を予め活性炭を充填したカラムに通して通過した液を回収後、凍結乾燥し８ｇのグリセリルホスフォリルイノシトールを得た。【００５４】
［食品製造例１］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有マーガリン
実施例８で得たＰＩを、マーガリンの５重量％になるように植物油に添加した後、乳化剤などとともに均一になるよう攪拌し、通常の方法によりマーガリンを作製した。【００５５】
［食品製造例２］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有パン
実施例８で得たＰＩの１ｇ、砂糖１５ｇ、食塩２ｇ、脂肪粉乳５ｇを湯７０ｇに溶かし、鶏卵２個を添加してよく混ぜた。これを小麦粉１３０ｇとドライイースト２ｇを混合した混合物に加え、手でこねた後、バター約３０ｇを加えて更にこね、３０個のロールパン生地を作った。ついで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で１５分間焼き、ロールパンを得た。【００５６】
［食品製造例３］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有うどん
小麦粉４００ｇに対して、水２００ｇに実施例８で得たＰＩを２ｇ、食塩２０ｇを添加して、よくこねて寝かした。この後、生地を延伸し、幅約６ｍｍで切断してうどんを製造した。【００５７】
[食品製造例４]ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有飲料
実施例８で得たＰＩ３０ｇを５倍量のオリーブオイルに懸濁して５０℃に加温し、油相を得た。グリセリン９０ｇに乳化剤としてグリセロール脂肪酸エステル１０ｇを添加し、７０℃に加温して溶解させた。この溶液に先の油相を撹拌しながら徐々に添加した。混合液を、乳化機を用いて高圧乳化処理して乳化組成物を得た。この乳化組成物２０ｇに水１８０ｍｌを添加、撹拌してＰＩ含有飲料を得た。【００５８】
［製剤例１］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有錠剤
実施例８で得たＰＩ                                １２０ｇ
結晶セルロース                                    ３３０ｇ
カルメロース−カルシウム                            １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                        １０ｇ
精製水                                            ６０ｍｌ
上記組成物を通常の方法にて配合、乾燥した後、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、１錠あたりＰＩを２０ｍｇ含有する１００ｍｇの錠剤を得た。【００５９】
［製剤例２］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有ソフトカプセル
実施例８で得たＰＩを、５倍量のオリーブオイルに懸濁し、均質になる様に十分に混合した後、カプセル充填機にてカプセル充填し、内容物約３００ｍｇのカプセルを得た。【００６０】
［化粧品製造例］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有クリーム剤（化粧品）
実施例８で得たＰＩを、白色ワセリンに１０重量％になるように添加し、芳香剤などとともに、均一になるように攪拌し、通常の方法によりクリーム剤を作製した。【００６１】
［食品製造例５］リゾホスファチジルイノシトール含有マーガリン
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトールを、マーガリンの５重量％になるように植物油に添加した後、乳化剤などとともに均一になるよう攪拌し、通常の方法によりマーガリンを作製した。【００６２】
［食品製造例６］リゾホスファチジルイノシトール含有パン
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトールの１ｇ、砂糖１５ｇ、食塩２ｇ、脂肪粉乳５ｇを湯７０ｇに溶かし、鶏卵２個を添加してよく混ぜた。これを小麦粉１３０ｇとドライイースト２ｇを混合した混合物に加え、手でこねた後、バター約３０ｇを加えて更にこね、３０個のロールパン生地を作った。ついで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で１５分間焼き、ロールパンを得た。【００６３】
［食品製造例７］リゾホスファチジルイノシトール含有うどん
小麦粉４００ｇに対して、水２００ｇに実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトールを２ｇ、食塩２０ｇを添加して、よくこねて寝かした。この後、生地を延伸し、幅約６ｍｍで切断してうどんを製造した。【００６４】
[食品製造例８]リゾホスファチジルイノシトール含有飲料
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトール３０ｇを５倍量のオリーブオイルに懸濁して５０℃に加温し、油相を得た。グリセリン９０ｇに乳化剤としてグリセロール脂肪酸エステル１０ｇを添加し、７０℃に加温して溶解させた。この溶液に先の油相を撹拌しながら徐々に添加した。混合液を、乳化機を用いて高圧乳化処理して乳化組成物を得た。この乳化組成物２０ｇに水１８０ｍｌを添加、撹拌してリゾホスファチジルイノシトール含有飲料を得た。【００６５】
［製剤例３］リゾホスファチジルイノシトール含有錠剤
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトール    １２０ｇ
結晶セルロース                                    ３３０ｇ
カルメロース−カルシウム                            １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                        １０ｇ
精製水                                            ６０ｍｌ
上記組成物を通常の方法にて配合、乾燥した後、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、１錠あたりリゾホスファチジルイノシトールを２０ｍｇ含有する１００ｍｇの錠剤を得た。【００６６】
［製剤例４］リゾホスファチジルイノシトール含有ソフトカプセル
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトールを、５倍量のオリーブオイルに懸濁し、均質になる様に十分に混合した後、カプセル充填機にてカプセル充填し、内容物約３００ｍｇのカプセルを得た。【００６７】
［化粧品製造例］リゾホスファチジルイノシトール含有クリーム剤（化粧品）
実施例１０で得たリゾホスファチジルイノシトールを、白色ワセリンに１０重量％になるように添加し、芳香剤などとともに、均一になるように攪拌し、通常の方法によりクリーム剤を作製した。【００６８】
［食品製造例９］グリセリルホスフォリルイノシトール含有マーガリン
実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトールを、マーガリンの５重量％になるように植物油に添加した後、乳化剤などとともに均一になるよう攪拌し、通常の方法によりマーガリンを作製した。【００６９】
［食品製造例１０］グリセリルホスフォリルイノシトール含有パン
実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトールの１ｇ、砂糖１５ｇ、食塩２ｇ、脂肪粉乳５ｇを湯７０ｇに溶かし、鶏卵２個を添加してよく混ぜた。これを小麦粉１３０ｇとドライイースト２ｇを混合した混合物に加え、手でこねた後、バター約３０ｇを加えて更にこね、３０個のロールパン生地を作った。ついで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で１５分間焼き、ロールパンを得た。【００７０】
［食品製造例１１］グリセリルホスフォリルイノシトール含有うどん
小麦粉４００ｇに対して、水２００ｇに実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトールを２ｇ、食塩２０ｇを添加して、よくこねて寝かした。この後、生地を延伸し、幅約６ｍｍで切断してうどんを製造した。【００７１】
[食品製造例１２]グリセリルホスフォリルイノシトール含有飲料  実施１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトール３０ｇを５倍量のオリーブオイルに懸濁して５０℃に加温し、油相を得た。グリセリン９０ｇに乳化剤としてグリセロール脂肪酸エステル１０ｇを添加し、７０℃に加温して溶解させた。この溶液に先の油相を撹拌しながら徐々に添加した。混合液を、乳化機を用いて高圧乳化処理して乳化組成物を得た。この乳化組成物２０ｇに水１８０ｍｌを添加、撹拌してグリセリルホスフォリルイノシトール含有飲料を得た。【００７２】
［製剤例５］グリセリルホスフォリルイノシトール含有錠剤
実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトール        １２０ｇ
結晶セルロース                                            ３３０ｇ
カルメロース−カルシウム                                    １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                                １０ｇ
精製水                                                    ６０ｍｌ
上記組成物を通常の方法にて配合、乾燥した後、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、１錠あたりグリセリルホスフォリルイノシトールを２０ｍｇ含有する１００ｍｇの錠剤を得た。【００７３】
［製剤例６］グリセリルホスフォリルイノシトール含有ソフトカプセル
実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトールを、５倍量のオリーブオイルに懸濁し、均質になる様に十分に混合した後、カプセル充填機にてカプセル充填し、内容物約３００ｍｇのカプセルを得た。【００７４】
［化粧品製造例］グリセリルホスフォリルイノシトール含有クリーム剤（化粧品）
実施例１２で得たグリセリルホスフォリルイノシトールを、白色ワセリンに１０重量％になるように添加し、芳香剤などとともに、均一になるように攪拌し、通常の方法によりクリーム剤を作製した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のリン脂質加工剤は大豆由来リン脂質を原料とする機能性リン脂質製造用として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例４に基づく本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢのゲル濾過クロマトによるクロマトパターンを示す。
【図２】実施例５に基づく本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢの最適ｐＨを示す。
【図３】実施例５に基づく本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢのｐＨ安定性の結果を示す。
【図４】実施例５に基づく本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢの熱安定性の結果を示す。
【図５】実施例５に基づく本発明のリン脂質加工剤としてのＰＬＢの等電点電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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