(57)【要約】  ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型（ＵＣＨ−Ｌ１）を介した神経分化誘導剤のスクリーニング方法を提供すること。  ＵＣＨ−Ｌ１活性測定系を用いて、該酵素の活性を阻害する物質を選択することを特徴とする神経分化誘導剤のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系を用いて、該酵素の活性を阻害する物質を選択することを特徴とする神経分化誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
試験薬物をユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系に供し、該試験薬物がユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性を阻害する場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系が、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型とユビキチンを反応させることにより、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出することにより実施される、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出し、該試験薬物の存在により該ユビキチンのＣ末端側分解産物の生成が抑制された場合には、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型により生じるユビキチンの分解反応を５０％阻害する試験薬物濃度を算出し、該試験薬物濃度が５０μＭ以下である場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型により生じるユビキチンの分解反応を５０％阻害する試験薬物濃度を算出し、該試験薬物濃度が０．００１μＭ以上である場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
神経分化誘導剤が脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害の予防及び／または治療剤である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経分化誘導剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型（ＵＣＨ−Ｌ１）は脱ユビキチン化酵素の一員であり、脳内で最も豊富な蛋白質の一つである。他のＵＣＨ系酵素は全身的に発現するのに対してＵＣＨ−Ｌ１は成人において神経や精巣・卵巣に特異的に発現する（非特許文献１）。ＵＣＨ−Ｌ１はＰＧＰ９．５としても知られており、細胞解剖学や神経病理学の研究における神経マーカとしても用いられている（非特許文献２、同３）。最近の研究によれば、ＵＣＨ−Ｌ１は神経変性への関与が指摘されている。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１のＩ９３Ｍ変異体（Ｎ末９３番目のＩｌｅがＭｅｔに置換したもの）、Ｓ１８Ｙ多形体（Ｎ末１８番目のＳｅｒがＴｙｒに置換したもの）がパーキンソン病患者で見出されている（非特許文献４、同５）。ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子に変異が生じた自然発症型変異マウスである軸索変性マウス（ｇａｄマウス）では後退性の神経変性が観察される（非特許文献６）。またＵＣＨ−Ｌ１はユビキチンに対して親和性を有し、インビボにおいて神経内での安定化に寄与することが知られている（非特許文献７）。【０００３】
しかしながらＵＣＨ−Ｌ１は生体内で幅広い機能を有すると考えられているものの、その機能解明はまだ充分ではなく、ＵＣＨ−Ｌ１を介した医薬品の研究開発もほとんど行われていないのが実情である。【０００４】
一方、神経分化誘導剤は、損傷を受けた神経の修復、新生、再生を行う働きを有することから、神経が損傷を受けるような疾患、例えば、脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性末梢神経障害等の予防及び／または治療に有用である。神経分化誘導剤を評価するための指標として例えば、神経突起伸展（neurite outgrowth）が用いられる。最近になって、プロテアソーム阻害剤（ＴＭＣ−９５Ａやlactacystin）がＰＣ１２突起伸展作用を有すること（非特許文献８、同９）、プロテアソーム阻害剤（ＭＬＮ５１９）が脳梗塞として開発中であることが報告された（非特許文献１０）。よって神経突起伸展を指標とすれば新たな脳梗塞治療剤を探索することが可能と期待される。ただし、プロテアソーム阻害剤はＵＣＨ−Ｌ１阻害と全く関係がない。
【非特許文献１】Science, (1989), vol.246, p670-673
【非特許文献２】Acta. Neuropathol. (Berl), (1994), vol.87, p269-276
【非特許文献３】J. Pathol., (1995), vol.176, p207-216
【非特許文献４】Nature, (1998), vol.395, p451-452
【非特許文献５】J. Neurol. Sci., (2001), vol.189, p113-117
【非特許文献６】Nat. Genet., (1999), vol.23, p47-51
【非特許文献７】Hum. Mol. Genet., (2003), vol.12, p1945-1958
【非特許文献８】Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (2004), vol.14, p663-665
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., (1994), vol.91, no.8, p3358-3362
【非特許文献１０】Stroke, (2004), vol.35, no.5, p1186-1191
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＵＣＨ−Ｌ１を介した神経分化誘導剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の事情を考慮に入れて研究を行い、神経分化誘導剤のスクリーニング方法として、ＵＣＨ−Ｌ１活性測定系を用いて該酵素を阻害する物質を選択する手法が有効であることを見出して、本発明を完成した。【０００７】
本発明は、
１）ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系を用いて、該酵素の活性を阻害する物質を選択することを特徴とする神経分化誘導剤のスクリーニング方法。
２）試験薬物をユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系に供し、該試験薬物がユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性を阻害する場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、１）のスクリーニング方法。
３）ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型の活性測定系が、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型とユビキチンを反応させることにより、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出することにより実施される、１）または２）のスクリーニング方法。
４）試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出し、該試験薬物の存在により該ユビキチンのＣ末端側分解産物の生成が抑制された場合には、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、１）のスクリーニング方法。
５）試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型により生じるユビキチンの分解反応を５０％阻害する試験薬物濃度を算出し、該試験薬物濃度が５０μＭ以下である場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、１）のスクリーニング方法。
６）試験薬物、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型及びユビキチンを反応させ、ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型により生じるユビキチンの分解反応を５０％阻害する試験薬物濃度を算出し、該試験薬物濃度が０．００１μＭ以上である場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する、１）のスクリーニング方法。
７）神経分化誘導剤が脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害の予防及び／または治療剤である１）のスクリーニング方法、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＵＣＨ−Ｌ１を介した新たな作用機作に基づく新規な医薬品（神経分化誘導剤）を医療の場に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本図はUCH-L1阻害剤（化合物３）を用いた場合のPC12突起伸展の様子を顕微鏡画像にて示したものである。左の図は薬物未添加、中央の図はUCH-L1阻害剤添加、右の図はUCH-L3阻害剤添加、の各場合である。薬物添加濃度は40μmol/Lである。
【図２】本図はPC12突起伸展を画像解析した結果を数値化したグラフである。縦軸は490nmの吸光度（OD490nm）を、横軸は左から、Lactacystin（添加濃度は2、5、10μmol/L。以下同様）、UCH-L1阻害剤（化合物３；10、20、40μmol/L）、UCH-L3阻害剤（化合物４；10、20、40μmol/L）、NGF（0、10、50ng/mL）を各々示す。各棒グラフは平均値±SD（例数は４）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１１】
本発明のスクリーニング方法はＵＣＨ−Ｌ１の活性測定法を含むことを特徴とする。すなわち、試験薬物をＵＣＨ−Ｌ１活性測定系に供し、該試験薬物がＵＣＨ−Ｌ１活性を阻害する場合、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択するものである。【００１２】
本発明のＵＣＨ−Ｌ１活性測定系としては、具体的にはＵＣＨ−Ｌ１とユビキチン（ＵＢ）を反応させることにより、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出することにより実施することができる。生成した分解産物を検出するための手段として、蛍光基質を用いる方法などが例示される。具体的にはユビキチン−７−アミノ−４−メチルクマリン（ＵＢ−ＡＭＣ）蛍光基質などを用いる。【００１３】
本測定系で用いるＵＣＨ−Ｌ１は公知の蛋白質であり、その由来には特に限定されるものではない。好ましくはヒト由来のものである。ＵＣＨ−Ｌ１は遺伝子組換え等により調製することができる。また市販品を使用することもできる。なお、本発明においてはＵＣＨ−Ｌ１変異体など、ＵＣＨ−Ｌ１と実質的に同様の機能を有するものも使用することができる。【００１４】
ユビキチンも公知の蛋白質であり、その由来には特に限定されるものではない。好ましくはヒト由来のものである。ＵＢ−ＡＭＣは市販品を使用することができる。【００１５】
反応条件としては、ＵＣＨ−Ｌ１濃度は０．０１〜１００ｎＭ、好ましくは０．１〜１０ｎＭ程度、ＵＢ濃度は１〜５０００ｎＭ、好ましくは１０〜１０００ｎＭ程度、試験薬物濃度は０．００１〜１０００μＭ、好ましくは０．００１〜１００μＭ程度が例示される。他の反応条件としては、ｐＨ６〜９程度、温度１０〜３０℃程度、反応時間１０秒〜１時間程度が例示される。【００１６】
本発明においては、試験薬物を上記のＵＣＨ−Ｌ１活性測定系に供し、生成したユビキチンのＣ末端側分解産物を検出し、該試験薬物の存在により該ユビキチンのＣ末端側分解産物の生成が抑制された場合には、該試験薬物を神経分化誘導剤として選択する。ここで、本発明における神経分化誘導剤を選択する基準としては、試験薬物濃度０．００１〜１００μＭにおいて１０％以上、好ましくは３０％のＵＣＨ−Ｌ１阻害率を有すること、もしくはＩＣ５０値（５０％阻害率を示す濃度）が５０μＭ以下および／または０．００１μＭ以上であることが挙げられる。【００１７】
本発明の試験薬物としては新規の化合物だけでなく、ＵＣＨ−Ｌ１阻害剤として公知の化合物を用いることができる。そのような化合物としては、下記の構造式（１）〜（３）で表される化合物などが例示される。【００１８】
【化１】
2006132189.tif 000002
【００１９】
これらの化合物は例えば、Chemistry and Biology (2003), vol.10, p837-846に開示された方法により調製することができる。【００２０】
本発明においてスクリーニングされた神経分化誘導剤は、脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害に対する予防及び／または治療剤として有用である。
【実施例】
【００２１】
本発明をより詳細に説明するために以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【００２２】
なお、本発明においては以下の材料を使用した。
humanUCH-L1酵素及びUB-AMC基質（ともにBoston Biochem社）
UCH-L1阻害剤［化合物１〜３、下記の構造式（１）〜（３）に相当；前述のChemistry and Biology (2003)等を参考に合成］
UCH-L3阻害剤 ［化合物４、下記の構造式（４）に相当；メイブリッジ社］
プロテアソーム阻害剤（Lactacystin；SIGMA社）
神経成長因子［NGF(2.5S) ; Invitrogen社］
monoclonal anti-neuronal tubulinβIII (TuJ1；COVANCE社)
HRP標識抗マウスIgG抗体（DAKO社）
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト）【００２３】
【化２】
2006132189.tif 000003
【００２４】
【化３】
2006132189.tif 000004
【００２５】
実施例１
(1)UCH-L1酵素活性測定系 
humanUCH-L1酵素及びUB-AMC基質は、UCH反応バッファー [50mmol/L Tris-HCl (pH7.6)、0.5mmol/L EDTA、5mmol/L DTT及び0.5mg/mL Ovalbumin ] に希釈した。各阻害剤は化合物粉末を100％DMSOに溶解した。96wellプレートに、各阻害剤0-50μmol/L及び300pmol/LのUCH-L1酵素液を添加し、plate shakerで45-60秒間shakeし、室温で30分間反応させた。続いて各wellに100nmol/LのUB-AMC基質を50μL添加し、plate shakerで30秒間shake後、Polar STAR（BMG Lab Technologies社）を用いてEx.355nm、Em.460nmにおける蛍光強度を測定した。【００２６】
さらに、UCH-L1酵素の添加により生じるUB-AMC基質の分解反応を50%阻害する薬物濃度をIC50値（単位はμmol/L）として算出した。UCH-L1阻害剤のUCH-L1阻害活性（IC50）は約20μmol/Lであった。なおUCH-L3阻害剤は40μmol/LでもUCH-L1阻害活性を示さなかった。【００２７】
(2)PC12分化測定系
ラット副腎褐色細胞種由来PC12細胞 (ATCC社)は、37℃5％CO2下で10％Fetal Bovine Serum（GibcoBRL）及び5％Horse Serum（GibcoBRL）を含むF12KKaleid 培地（GibcoBRL）で維持した。各化合物のPC12細胞分化測定には、コラーゲンコートTypeIマイクロプレート96well（IWAKI）にPC12細胞を5000個/well藩種し、37℃5％CO2下で一晩培養した。各阻害剤もしくはNGFを含むアッセイ培地 [終濃度で5％Fetal Bovine Serum （GibcoBRL）、2.5％Horse Serum (GibcoBRL)、1/100量N2サプリメント（GibcoBRL）及び0.1％DMSO] をプレートに添加し、37℃5％CO2下で72時間培養した。化合物は終濃度が10-40μmol/Lに、NGFは終濃度が0-100ng/mLになるように添加した。培養72時間後に10％中性緩衝ホルマリン液で細胞を固定した。固定後、0.1％TritonX-100 (w/v, PBS(-)に溶解) を用いて室温で15分間洗浄後、ブロッキング液 [90％ PBS(-)、5％Goat Normal Serum(Cedarlane社)] を用いて室温で2時間静置した。次にTUJ1抗体（COVANCE社；ブロッキング液で1000倍希釈）を用いて室温で1時間反応させた。0.1％Tween-20を含むPBSで3回洗浄後、HRP標識抗マウスIgG抗体（DAKO社；ブロッキング液で2000倍希釈）を添加し、室温で1時間抗体を反応させた。反応後、0.1％Tween-20を含むPBSで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ用発色液を添加し、室温で10〜30分間反応させた。停止液で反応を停止後、マイクロプレートリーダーを用いて490nmの吸光度を測定した。【００２８】
UCH-L1阻害剤（化合物３）ではPC12突起伸展が観察された。よって当該試験薬物は神経分化誘導に有用なことが判明した。一方、UCH-L3阻害剤（化合物４）ではPC12突起伸展は観察されなかった（図１、同２）。【００２９】
実施例２
別のUCH-L1阻害剤（化合物１、同２）を用いて実施例１に準じて実験を行った。いずれの薬物とも化合物３と同程度のUCH-L1阻害活性を有しており、かつ同様にPC12突起伸展が観察された。【００３０】
上記実施例の結果より、ＵＣＨ−Ｌ１活性測定系を用いて、ＵＣＨ−Ｌ１阻害活性を有する物質を選択することにより、神経分化誘導剤のスクリーニングが可能であることがわかる。【００３１】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2005年6月10日出願の日本特許出願（特願2005−170413）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、ＵＣＨ−Ｌ１を介した新たな作用機作に基づく新規な医薬品（神経分化誘導剤）を医療の場に供給することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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