(57)【要約】要約  プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉特異的プロモーターを用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に渡って維持することができる、新規なプロモーターが開示されている。該プロモーターは、筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターを連結した混成プロモーター、又は筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターの一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたSV40プロモーター由来プロモーターとが連結されて成る混成プロモーターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモーターよりも高い転写活性を発揮する。
2007061053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターとが連結した混成プロモーター、又は筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターの一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたSV40プロモーター由来プロモーターとが連結されて成る混成プロモーターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモーターよりも高いプロモーター活性を発揮する混成プロモーター。
【請求項２】
前記筋肉指向性プロモーターが、筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター又はその一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じた筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター由来プロモーターであって、前記SV40プロモーター又はSV40プロモーター由来プロモーターと連結された混成プロモーターの筋肉細胞内におけるプロモーター活性が、筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター単独のプロモーター活性よりも高いプロモーターである請求項１記載の混成プロモーター。
【請求項３】
前記筋肉クレアチニンキナーゼ由来プロモーターが、エンハンサー領域又はシスエレメント領域を有し、該エンハンサー領域又はシスエレメント領域は、筋肉クレアチニンキナーゼプロモーターのエンハンサー領域又はシスエレメント領域と同一か又は９０％以上の同一性を有する請求項２記載の混成プロモーター。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の混成プロモーターを含むベクター。
【請求項５】
遺伝子導入用ベクターである請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の混成プロモーターと、該混成プロモーターの下流に位置し、該混成プロモーターによりその発現が制御される、所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子とを含むベクター。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、動物の体内で生産すべきポリペプチドである、遺伝子治療用のベクターである請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項６記載のベクターを動物に導入し、所望のポリペプチドを動物体内で生産させることを含む、該ポリペプチドの体内生産方法。
【請求項９】
請求項７記載のベクターを動物に導入し、所望のポリペプチドを動物体内で生産させることを含む遺伝子治療方法。
【請求項１０】
請求項６記載のベクターの、ポリペプチドの体内生産用薬剤の製造のための使用。
【請求項１１】
請求項７記載のベクターの、遺伝子治療用薬剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを含む動物体内で所望の遺伝子を発現させる遺伝子治療に適した混成プロモーター及びそれを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋はアプローチがし易く、導入遺伝子産物を容易に発現するので、実験的遺伝子治療の魅力的な対象臓器となっている (非特許文献１)。筋肉を指向した遺伝子導入は、レポーター遺伝子発現の発現が可能であることを示したWolffらによる実験(非特許文献２)から、凝固因子(非特許文献３)、エリスロポイエチン(非特許文献４、非特許文献５)、ジストロフィン(非特許文献６)、ホルモン(非特許文献７)、及びリソソーム蓄積症の原因となる酵素群(非特許文献８)のような種々の治療的タンパク質の生産に至るまで、急速に発展してきた。これらの実験結果は先天性疾患の治療に新たな光明を投じた。しかしながら、長期間持続的する導入遺伝子の発現が達成されていないために該疾患の治療に応用する試みは難航しており、該疾患の大部分において欠損タンパク質を生涯にわたって補充する必要が生じている。【０００３】
サイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター／エンハンサー(以後CMVプロモーターと呼ぶ) (非特許文献９)又はそれより派生した合成プロモーターであるCAGプロモーター(非特許文献１０)は、筋肉を対象とした遺伝子治療のためのもっとも強力なプロモーターとして広く用いられている。CMVプロモーターは生体内で導入遺伝子を強く発現させることができるが、多くの動物実験において遺伝子導入後数週間のうちに導入遺伝子産物の活性はほとんど認められなくなってしまう。多くの例で、CMVプロモーターからの発現は遺伝子導入後２ないし４日でピークに達し、４週間以内にバックグラウンドレベルにまで低下した(非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３)。このような導入遺伝子の発現減弱では、ベクターDNAと宿主の免疫応答の相互作用に起因する非特許文献１４、非特許文献１５; 非特許文献１６)、免疫系による遺伝子導入細胞の排除が重要な役割を果たしている(非特許文献１７、非特許文献１８)とされる。従って、長期的な導入遺伝子発現を成功させる鍵は、導入遺伝子産物に対する免疫応答の誘導をいかに回避するかにかかっている。筋肉特異的プロモーターは抗原提示細胞(APC)中でほとんど活性を持たないが、組織非特異的な発現特性をもつCMVプロモーターはAPC中で活性を示すので(非特許文献１９)、筋肉特異的プロモーターの使用は(非特許文献２０、非特許文献２１)先述の導入遺伝子発現細胞に対する免疫応答を回避するための有効な手段である。しかしながら、この方法の最大の欠点は、組織非特異的なCMVプロモーターと比較して、筋肉特異的プロモーターは導入遺伝子の発現レベルが低い点である。【０００４】
【非特許文献１】Lu, Q.L., Bou-Gharios, G. and Partridge, T.A.: Non-viral gene delivery in skeletal muscle: a protein factory. Gene Ther. 10 (2003) 131-42.
【非特許文献２】Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. and Felgner, P.L.: Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247 (1990) 1465-8.
【非特許文献３】Chuah, M.K., Collen, D. and VandenDriessche, T.: Gene therapy for hemophilia. J. Gene Med. 3 (2001) 3-20.
【非特許文献４】Kreiss, P., Bettan, M., Crouzet, J. and Scherman, D.: Erythropoietin secretion and physiological effect in mouse after intramuscular plasmid DNA electrotransfer. J. Gene Med. 1 (1999) 245-50.
【非特許文献５】Bohl, D., Bosch, A., Cardona, A., Salvetti, A. and Heard, J.M.: Improvement of erythropoiesis in beta-thalassemic mice by continuous erythropoietin delivery from muscle. Blood 95 (2000) 2793-8.
【非特許文献６】Chamberlain, J.S.: Gene therapy of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 11 (2002) 2355-62.
【非特許文献７】MacColl, G.S., Goldspink, G. and Bouloux, P.M.: Using skeletal muscle as an artificial endocrine tissue. J. Endocrinol. 162 (1999) 1-9.
【非特許文献８】Cheng, S.H. and Smith, A.E.: Gene therapy progress and prospects: gene therapy of lysosomal storage disorders. Gene Ther. 10 (2003) 1275-81.
【非特許文献９】Boshart, M., Weber, F., Jahn, G., Dorsch-Hasler, K., Fleckenstein, B. and Schaffner, W.: A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (1985) 521-30.
【非特許文献１０】Miyazaki, J., Takaki, S., Araki, K., Tashiro, F., Tominaga, A., Takatsu, K. and Yamamura, K.: Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5. Gene 79 (1989) 269-77.
【非特許文献１１】Bettan, M., Emmanuel, F., Darteil, R., Caillaud, J.M., Soubrier, F., Delaere, P., Branelec, D., Mahfoudi, A., Duverger, N. and Scherman, D.: High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer into skeletal muscle. Mol. Ther. 2 (2000) 204-10.
【非特許文献１２】Payette, P.J., Weeratna, R.D., McCluskie, M.J. and Davis, H.L.: Immune-mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occurs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395-400.
【非特許文献１３】Gronevik, E., von Steyern, F.V., Kalhovde, J.M., Tjelle, T.E. and Mathiesen, I.: Gene expression and immune response kinetics using electroporation-mediated DNA delivery to muscle. J. Gene Med. 7 (2005) 218-27.
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【非特許文献１５】Chen, Z.Y., He, C.Y., Meuse, L. and Kay, M.A.: Silencing of episomal transgene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo. Gene Ther. 11 (2004) 856-64.
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【非特許文献１７】Payette, P.J., Weeratna, R.D., McCluskie, M.J. and Davis, H.L.: Immune-mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occurs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395-400.
【非特許文献１８】Ghazizadeh, S., Kalish, R.S. and Taichman, L.B.: Immune-mediated loss of transgene expression in skin: implications for cutaneous gene therapy.[see comment]. Mol. Ther. 7 (2003) 296-303.
【非特許文献１９】Weeratna, R.D., Wu, T., Efler, S.M., Zhang, L. and Davis, H.L.: Designing gene therapy vectors: avoiding immune responses by using tissue-specific promoters. Gene Ther. 8 (2001) 1872-8.
【非特許文献２０】Dunant, P., Larochelle, N., Thirion, C., Stucka, R., Ursu, D., Petrof, B.J., Wolf, E. and Lochmuller, H.: Expression of dystrophin driven by the 1.35-kb MCK promoter ameliorates muscular dystrophy in fast, but not in slow muscles of transgenic mdx mice. Mol. Ther. 8 (2003) 80-9.
【非特許文献２１】Yoshimura, M., Sakamoto, M., Ikemoto, M., Mochizuki, Y., Yuasa, K., Miyagoe-Suzuki, Y. and Takeda, S.: AAV vector-mediated microdystrophin expression in a relatively small percentage of mdx myofibers improved the mdx phenotype. Mol.Ther. 10 (2004) 821-8.
【非特許文献２２】Ross, T.M., Xu, Y., Bright, R.A. and Robinson, H.L.: C3d enhancement of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus challenge. Nat. Immunol. 1 (2000) 127-31.
【非特許文献２３】Donoviel, D.B., Shield, M.A., Buskin, J.N., Haugen, H.S., Clegg, C.H. and Hauschka, S.D.: Analysis of muscle creatine kinase gene regulatory elements in skeletal and cardiac muscles of transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 16 (1996) 1649-58.
【非特許文献２４】Wang, M., Orsini, C., Casanova, D., Millan, J.L., Mahfoudi, A. and Thuillier, V.: MUSEAP, a novel reporter gene for the study of long-term gene expression in immunocompetent mice. Gene 279 (2001) 99-108.
【非特許文献２５】Trask, R. V., J. C. Koster, M. E. Ritchie, and J. J. Billadello. 1992. The human M creatine kinase gene enhancer contains multiple functional interacting domains. Nucleic Acids Research 20:2313-20.
【非特許文献２６】Trask, R. V., A. W. Strauss, and J. J. Billadello. 1988. Developmental regulation and tissue-specific expression of the human muscle creatine kinase gene. Journal of Biological Chemistry 263:17142-9
【非特許文献２７】Li, Z. L., and D. Paulin. 1991. High level desmin expression depends on a muscle-specific enhancer. Journal of Biological Chemistry 266:6562-70
【非特許文献２８】Gao, J., Z. Li, and D. Paulin. 1998. A novel site, Mt, in the human desmin enhancer is necessary for maximal expression in skeletal muscle. Journal of Biological Chemistry 273:6402-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉特異的プロモーターを用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に渡って維持することができる、新規なプロモーターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、筋肉指向性プロモーターである筋クレアチニンキナーゼプロモーターに、SV40(simian virus 40)プロモーターを連結することにより、プロモーターの筋肉細胞内でのプロモーター活性が、該筋肉指向性プロモーターよりも高く、一方、抗原提示細胞内でのプロモーター活性が、組織非特異的なプロモーターよりも低く、それによって、該プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉指向性プロモーターを用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に渡って維持することができることを実験的に確認し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターを連結した混成プロモーター、又は筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターの一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたSV40プロモーター由来プロモーターとが連結されて成る混成プロモーターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモーターよりも高い転写活性を発揮する混成プロモーターを提供する。また、本発明は、上記本発明の混成プロモーターを含むベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の混成プロモーターと、該混成プロモーターの下流に位置し、該混成プロモーターによりその発現が制御される、所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子とを含むベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のベクターを動物に導入し、所望のポリペプチドを動物体内で生産させることを含む、該ポリペプチドの体内生産方法又は遺伝子治療方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明のベクターの、ポリペプチドの体内生産用薬剤又は遺伝子治療用薬剤の製造のための使用を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場合に、細胞非特異的プロモーター又は筋肉指向性プロモーターを用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に渡って維持することができるプロモーターが初めて提供された。本発明の混成プロモーターを、遺伝子導入用ベクターのプロモーターとして用い、筋肉細胞を標的として遺伝子導入を行なうと、筋肉細胞内での導入遺伝子の発現量が、筋肉指向性プロモーターを単独で用いた場合よりも高くなる。一方、抗原提示細胞内での導入遺伝子の発現量が、細胞非特異的プロモーターを単独で用いた場合よりも低くなる。その結果、遺伝子導入後、長期間経過後も、動物体内での導入遺伝子産物の活性を、筋肉指向性プロモーターや細胞非特異的プロモーターを用いた場合よりも高く維持することができる。従って、本発明の混成プロモーターは、外来遺伝子を動物体内に導入して発現させる遺伝子治療に大いに貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施例で性状解析した各種プロモーターの構造の模式図を示す。
【図２】CMVプロモーターとSV40プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルを示す図である。
【図３】CMV、 MCK、およびMCK/SV40混成プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルの測定結果を示す図である。
【図４】エレクトロポレーション法により筋肉内にSEAP発現プラスミドを遺伝子導入されたマウスの血中SEAP活性の経時変化を示す図である。
【図５】種々のプロモーターを用いた場合の血中SEAP活性の経時変化を示す図である。
【図６】CAG、CMV、 MCK/SV40の三種のプロモーターの転写制御下にβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドをマウスにエレクトロポレーション法により筋肉内に投与した後の血清中抗lacZ IgG力価の測定結果を示す図である。
【図７】マウス SEAPをマウスの筋肉または肝臓内に遺伝子導入した場合の血漿中のSEAP活性の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記の通り、本発明のプロモーターは、筋肉指向性プロモーターに、SV40プロモーターを連結して混成プロモーターとしたものである。筋肉指向性プロモーターに連結するものはSV40プロモーターであることが重要であり、下記実施例において具体的に示されるように、筋肉指向性プロモーターに、細胞非特異的プロモーターであるサイトメガロウイルス（以下、「CMV」と略すことがある）プロモーターや、CAGプロモーターの構成要素であるβ−アクチンプロモーターを連結した場合には本発明の効果は得られない。【００１１】
SV40プロモーター自体は周知であり、SV40プロモーターを含む発現ベクターが市販されているので、市販のベクターから制限酵素で切り出して用いることができる。SV40プロモーターの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、プロモーターの塩基配列の一部を変更した改変プロモーターも種々知られており、SV40プロモーターの改変プロモーターも知られている。本発明においても、天然のSV40プロモーター（配列番号１）の一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたプロモーター（本発明において、「SV40プロモーター由来プロモーター」と呼ぶ）であって、任意の筋肉指向性プロモーターと連結して混成プロモーターとした場合に、筋肉細胞内において、筋肉クレアチニンキナーゼプロモーターよりも高いプロモーター活性を発揮するものも本発明において用いることができる。このようなSV40プロモーター由来プロモーターは、配列番号１に示すSV40プロモーターの塩基配列と好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。ここで、塩基配列の相同性は、両者の塩基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両塩基配列を整列させ、不一致の塩基数を、全塩基数（両者の配列で全塩基数が異なる場合には短い方の配列の全塩基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。なお、SV40プロモーター由来プロモーターの長さが配列番号１に示すSV40プロモーターの長さよりも短い場合には、その長さは、配列番号１に示すSV40プロモーターの長さの９０％以上であることが好ましく、さらに好ましくは９５％以上である。また、配列番号１の塩基配列に対する置換、欠失及び／又は挿入の塩基数が１個ないし数個のものが好ましい。【００１２】
本発明の混成プロモーターに含まれる筋肉指向性プロモーターは、筋肉細胞内では転写活性を発揮するが、抗原提示細胞内では転写活性を実質的に発揮しないプロモーターであり、天然のプロモーターでも天然のプロモーターを改造したプロモーターであってもよい。「実質的に発揮しない」は、全く発揮しないか又は発揮するとしても本発明の効果を害さない程度に弱く（好ましくはバックグランドの３倍以下）程度にしか発揮しないプロモーターを意味する。筋肉指向性プロモーターとしては、筋肉クレアチニンキナーゼ（以下、「MCK」と呼ぶことがある）プロモーター、デスミンプロモーター(非特許文献２７及び２８、GenBank Accession No. M63391）等を例示することができ、これらのうち、MCKプロモーターが好ましい。MCKプロモーター自体は公知である。なお、本発明において、「MCKプロモーター」という語は、エンハンサー領域まで含む意味で用いている。下記実施例で用いた、マウスMCKプロモーターの塩基配列を配列番号２に示す。また、ヒトMCKプロモーターの塩基配列を配列番号４に示す（非特許文献２５、非特許文献２６、GenBank Accession No. M21487 J04435)。なお、配列番号２中、第１番目の塩基〜第２０８番目の塩基（以下、例えば第１番目の塩基を「1nt」のように表示することがある）の領域がエンハンサー領域であり、995nt〜1023ntの領域がE-box領域である。また、配列番号４中、1689nt〜1986ntの領域がエンハンサー領域を含むシスエレメント領域(cis element)であり、この中の1736nt〜1789ntの領域がMyoD領域である。【００１３】
筋肉指向性プロモーターは、上記した天然の筋肉指向性プロモーターを好ましく用いることができるが、SV40プロモーター又は上記SV40プロモーター由来プロモーターと連結した混成プロモーターが、筋肉細胞内において天然の筋肉指向性プロモーター単独よりも高いプロモーター活性を発揮するものとなる場合には、その一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたプロモーターを用いることができる。すなわち、MCKプロモーターの場合、配列番号２や配列番号４に示す天然のMCKプロモーターを好ましく用いることができるが、SV40プロモーター又はSV40プロモーター由来プロモーターと連結した混成プロモーターが、筋肉細胞内において天然のMCKプロモーター単独よりも高いプロモーター活性を発揮するものとなる場合には、その一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたプロモーター（本発明において、「筋肉クレアチニンキナーゼ(MCK)プロモーター由来プロモーター」と呼ぶことがある）を用いることができる。この場合、上記したエンハンサー領域又はヒトの場合にはエンハンサー領域を含むシスエレメント領域は、筋肉指向性発現のために重要である。従って、エンハンサー領域又はヒトの場合にはシスエレメント領域は、天然のMCKプロモーターのエンハンサー領域又はシスエレメント領域と同一か又は９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。また、エンハンサー領域又はシスエレメント領域は、天然型の塩基配列に対する置換、欠失及び／又は挿入の塩基数が１個ないし数個のものが好ましい。なお、ヒトのMCKプロモーターの場合には、上記したシスエレメント領域のみあればプロモーター活性を発揮することが知られているので（非特許文献２５）、シスエレメント領域を含んでいれば本発明において筋肉指向性プロモーターとして用いることが可能である。また、シスエレメント領域の中でも特に上記したMyoD領域が重要であり、この領域は、天然のMyoD領域と同一か又は９５％以上の相同性を有することが好ましい。さらに、マウスの場合、エンハンサー領域に加え、近位E-box領域も有することが好ましく、近位E-box領域も天然のMCKプロモーターの近位E-box領域と同一か又は９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。また、近位E-box領域は、天然型の塩基配列に対する置換、欠失及び／又は挿入の塩基数が１個ないし数個のものが好ましい。上記したいずれの領域の場合も、天然物よりも長さが短い場合には、その長さは天然物の９０％以上が好ましく、さらには９５％以上が好ましい。【００１４】
なお、エンハンサー領域又はヒトMCKの場合にはシスエレメント領域以外の領域はそれほど重要ではなく、下記実施例では、配列番号２に示すマウスMCKプロモーターの766nt以降の494塩基を欠失させたもの及び1144nt以降の116塩基を欠失させたものを用いているが、いずれの場合も本発明の効果が得られている。従って、マウスMCKプロモーターの場合、プロモーター領域のうち、少なくとも5'側の60%の領域があれば、本発明の効果を得ることができる。また、5'側の60%の領域の天然プロモーターとの相同性は９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が好ましく、天然物よりも長さが短い場合には、その長さは天然物の９０％以上が好ましく、さらには９５％以上が好ましい。また、上記の通り、ヒトのMCKプロモーターの場合には、上記したシスエレメント領域のみあればプロモーター活性を発揮することが知られているので（非特許文献２５）、シスエレメント領域又は該領域と９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有し、筋肉細胞内においてプロモーター活性を発揮する領域を含んでいれば、その両端の領域は必ずしも必要ではなく、また、本発明の効果を阻害しない任意の領域とすることもできる。【００１５】
筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターとは、直接連結してもよいし、スペーサーを介して連結してもよい。後者の場合、スペーサーのサイズは特に限定されないが、通常、100塩基以下、好ましくは50塩基以下である。下記実施例では、SV40プロモーターを切り出した市販のベクターのマルチクローニング部位に由来する15塩基の領域を介して両プロモーターが連結されている。【００１６】
プロモーターの筋肉細胞内でのプロモーター活性は、下記実施例に具体的に記載するように、プロモーターの下流にルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼ等の遺伝子のようなレポーター遺伝子を連結したベクターを作製し、これを筋芽細胞に導入して前記レポーター遺伝子の発現量を測定することにより測定することができる。なお、筋芽細胞は筋肉細胞の前駆細胞であり、筋芽細胞内での活性を測定することにより筋肉細胞内での活性を評価することができる。本発明の混成プロモーターの筋肉細胞（筋芽細胞）内でのプロモーター活性は、筋肉指向性プロモーター単独をプロモーターとして用いた場合よりも高く、好ましくは３倍以上のプロモーター活性（すなわちレポーター遺伝子の発現量が３倍以上）を有する。好ましい混成プロモーターでは、筋肉細胞（筋芽細胞）内でのプロモーター活性は、天然の筋肉指向性プロモーター単独をプロモーターとして用いた場合の３〜５倍程度である。【００１７】
プロモーターの抗原提示細胞中での活性は、下記実施例に具体的に記載するように、プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子を連結したベクターを作製し、これを代表的な抗原提示細胞であるマクロファージに導入して前記レポーター遺伝子の発現量を測定することにより測定することができる。本発明の混成プロモーターのマクロファージ内でのプロモーター活性は、CMVプロモーターをプロモーターとして用いた場合よりも低く、好ましくは1/10以下のプロモーター活性を有する。好ましい混成プロモーターでは、マクロファージ内でのプロモーター活性は、CMVプロモーターをプロモーターとして用いた場合の1/10〜1/15程度である。【００１８】
本発明は、さらに、上記本発明の混成プロモーターを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、プロモーターが上記混成プロモーターであることを除き、常用されている遺伝子導入用ベクターと同様な構成を有していてよく、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよい。混成プロモーターの下流には、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子が挿入される。本発明は、このような、混成プロモーターと、該混成プロモーターの下流に位置し、該混成プロモーターによりその発現が制御される、所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子とを含むベクターをも提供する。所望のタンパク質は、動物の体内で生産すべきタンパク質であり、遺伝子治療を目的とする場合には例えば、第VIII因子、第IX因子、von Willebrand因子などの血液凝固に関わる因子やエリスロポイエチンのような造血因子、あるいは成長ホルモン、ジストロフィン、先天的酵素欠損症において欠損している種々の酵素などが挙げられる。これらのタンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターは、遺伝子治療用として用いることができる。【００１９】
これらの遺伝子治療用ベクターを投与する場合、筋肉内投与が好ましい。使用するベクターはプラスミドベクターであるか、アデノウィルスなどに由来するウィルスベクターであるかを問わない。投与は、ベクターを生理食塩水等の媒体に溶解又は懸濁させた溶液又は懸濁液を筋肉内注射することにより行なうことができる。この場合の投与量は、投与の目的やベクターの性質等により適宜設定されるが、成人に投与する場合、プラスミドでは通常、１〜１０ミリグラム程度である。【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
１．材料及び方法
(1)  プラスミドの構築及び調製
一連の構築物に対する出発プラスミドは、CMVプロモーター＋イントロンA、ウシ成長ホルモンターミネーター、Kanr、及びpUCバックボーンから成るpGA(非特許文献２２)である。なお、pGAベクターは、広く用いられている周知のベクターであり、エモリー大学ワクチンセンターなどより入手可能である。図１は本実施例で性状解析したプロモーターの模式図を示す。マウスMCKプロモーター(ヌクレオチド1256から+7; GeneBank Accession No. AF188002)は、RAW264.7細胞のゲノムDNAからプライマーペア5'-gac tag tcc act acg ggt cta ggc tgc cc-3'及び5'-ccc aag ctt ggg ggc agc ccc tgt gcc cct ggg-3'を用いてＰＣＲ増幅した。pGA中のCMVプロモーター＋イントロンAはSpeI及びHindIIIで消化することにより切り出し、SpeI-HindIII MCKプロモーター単位複製配列で置き換えた。同様に、pCAGGSベクターから切り出されたSpeI-EcoRI CAGプロモーター断片(非特許文献１０)をCMVプロモーター＋イントロンAと置き換え、pGA-CAGベクターを得た。一連のハイブリッドプロモーターを創出するため、エンハンサー領域を含むMCKプロモーター(非特許文献２３)及び他のプロモーターを共にライゲーションした。SV40プロモーターは、SmaI及びHindIII、又はNheI及びHindIIIを用いてpGL3-controlベクター(商品名、Promega, Madison, ウィスコンシン州)から切り出した。pGA-MCKは、SmaI及びHindIII、又はNheI及びHindIIIで消化し、次いでそれぞれSmaI-HindIII又はNheI-HindIII SV40プロモーター断片と共にライゲーションした。該ライゲーション産物はMCKエンハンサー及びSV40プロモーターを含む本発明の混成プロモーターを含んでおり、それぞれpGA-MCK/SV40 (L) 及びpGA-MCK/SV40 (S)と命名した（これらのプロモーター部はそれぞれ、「MCK/SV40 (L)」 及び「pGA-MCK/SV40 (S)」と呼ぶ）。pGA-CAG中のCMVエンハンサーはSpeI及びNcoIを用いて除去し、末端を平滑化し、次いでエンハンサー領域を有する末端平滑化したSpeI-SmaI MCK断片で置き換えることにより、MCKエンハンサー及びニワトリβ−アクチンプロモーターから成るハイブリッドプロモーターを含むプラスミドpGA-MCK/β−アクチンを得た。同様に、pGAベクター中のCMVエンハンサーをMCKエンハンサーと置き換えることにより、MCKエンハンサー及びCMVプロモーターから成るハイブリッドプロモーターを含むpGA-MCK/CMVを作製した。レポーター遺伝子として、pGL3-Control (Promega)由来のホタルルシフェラーゼ(luc)、pSEAP2-Basic (BD-Clontech, Palo Alto, カリフォルニア州)由来のヒト分泌性アルカリフォスファターゼ(SEAP)、非特許文献２４に記載の通りクローニングされたマウスSEAP、又はマウスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（pSV-b-galactosidase control vector由来）を、適切な制限部位を用いて、構築したベクター中に挿入した（pGAベクターのマルチクローニング部位に挿入）。全てのプラスミドは、形質転換した大腸菌DH-5αをLB培地中で増殖させることにより生産し、次いでQiagenエンドトキシンフリーDNA精製カラム (Qiagen, Hilden, 独国)で精製した。【００２２】
作製した上記混成プロモーターMCK/SV40 (L)の塩基配列を配列番号３に示す。配列番号３中、1nt〜6ntは制限酵素部位、7nt〜1149ntがMCKプロモーターの部分領域、1150nt〜1164ntがpGL3-control（商品名）ベクターのマルチクローニング部位の部分領域、1165nt〜1367ntがSV40プロモーターである。また、配列番号３の771nt〜776ntがNheI部位であり、MCK/SV40 (S)では、配列番号３の774ntから1149ntが欠失している（さらに、1150nt〜1164ntのpGL3-control（商品名）ベクターのマルチクローニング部位の部分領域も、切断した制限酵素が異なるため、一部異なる）。【００２３】
(2)  トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
マウス筋芽細胞C2C12（文献又は入手先：American type culture collection, Manassas, VA 20108, USA:ATCC No.CRL-1772）及びマウスマクロファージRAW264.7細胞（文献又は入手先：ATCC No. TIB-71）は、10% FCSを添加したDMEM高グルコース中で３７℃にて培養した。それらを９６ウェル組織培養プレート中に植え、５０〜７０％のコンフルーエンシーに達するまで増殖させた。次いで、FuGene 6トランスフェクション試薬(Roche, Mannheim, 独国)を用いて、種々のプロモーターの制御下でlucを発現するレポータープラスミドで細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションはFuGene 6のマニュアルに記載の方法に従って行なった。トランスフェクションから２日後、製造者の指示書に従いDual-Gloルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて、マイクロプレートルミノメータ(Veritas, Turner Biosystems, Sunnyvale, カリフォルニア州)で蛍光シグナルを測定した。第二のレポーターベクターとして、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するphRL-TK (Promega)を用いて、ホタルレポーター活性を標準化した。【００２４】
(3)  動物の取り扱いならびに血漿SEAP活性の測定
日本SLC株式会社(静岡、日本国)より雌のBALB/cマウスを購入し、横浜市立大学医学研究院の動物施設内で飼育した。DNA注入、エレクトロポレーション、及び眼窩静脈叢からの採血は全て、ケタミン及びキシラジンの４：１混合物の皮下注射による麻酔下で行なった。動物実験は、研究機関の動物管理使用委員会による承認の下で行なわれた。エレクトロポレーションでは、大腿四頭筋を露出させ、３０ゲージの針を２〜３ｍｍの深さまで刺し込み、生理食塩水に溶解した100μgのプラスミドを注入した後、筋束を円形白金電極(直径：１０ｍｍ、間隔：約５ｍｍ、CUY650-10, Nepa Gene, 千葉県)で挟んだ。矩形波エレクトロポレーター(square wave electroporator) CUY21EDIT (Nepa Gene)により、３０Ｖにて電気パルスを６回印加した。パルス幅は50ms、パルス間隔は１００ｍｓとし、３回のパルス刺激の後に極性を反転させた。その後外科クリップで切開部を閉鎖した。眼窩静脈叢からの採血により定期的に血液サンプルを得て、アッセイまで−２０℃にて保存した。血漿SEAP活性は、製造者の指示書に従い、マイクロプレート蛍光リーダーを用いてSEAPレポーター遺伝子化学発光アッセイキット (Roche)を使用して測定した。【００２５】
(4)  統計
統計学的解析は、StatView J-4.02ソフトウェア(Abacus Concepts, Berkeley, カリフォルニア州)を用いた対応のあるt検定(paired t-test)により行い、p < 0.05を有意と定義した。【００２６】
２．  結果
(1)   CMVプロモーター及びSV40プロモーター各種培養細胞中のプロモーター活性
図２に、CMVプロモーターとSV40プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルを示す。Jurkat（リンパ球）、K562（白血病細胞）、HeLa（子宮ガン細胞）の３種で比較した。いずれの細胞でもSV40プロモーターによる遺伝子発現はCMVプロモーターより極端に低かった。【００２７】
(2)  マクロファージ及び筋芽細胞内での各種プロモーターの活性
図３に、CMV、 MCK、およびMCK/SV40混成プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルの測定結果を示す。RAW（マクロファージ）とC2C12（筋芽細胞）で比較した。MCK/SV40プロモーターによる遺伝子発現はCMVプロモーターと MCKプロモーターの中間くらいであった。なお、図３中「luc w/oプロモーター」は、プロモーターなしでルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞のルシフェラーゼ活性であり、プロモーター活性が０の場合のバックグランドである。【００２８】
(3)  トランスフェクション後の導入遺伝子産物の血中レベル
エレクトロポレーション法により筋肉内にSEAP発現プラスミドを遺伝子導入されたマウスの血中SEAP活性の経時変化を図４に示す。本発明の混成プロモーターであるMCK/SV40(L)プロモーターによる遺伝子発現は長期間持続した。【００２９】
同様に、種々のプロモーターを用いた場合の血中SEAP活性の経時変化を図５に示す。全プロモーターの中で本発明の混成プロモーターであるMCK/SV40(L)プロモーターが最も高いパフォーマンスを示した。【００３０】
(4)  導入遺伝子産物に対する血中抗体の測定
CAG、CMV、 MCK/SV40の三種のプロモーターの転写制御下にβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドをマウスにエレクトロポレーション法により筋肉内に投与した後の血清中抗lacZ IgG力価の測定結果を図６に示す。投与は０と４週目に行い、抗体価の測定は２と６週目に行った。CAG、CMVプロモーターでは抗体の誘導が明らかであるが、MCK/SV40(L)プロモーターでは抗体はほとんど検出されなかった。【００３１】
(5)  筋肉内又は肝臓内に遺伝子導入した場合の導入遺伝子の発現量の比較
マウス SEAPをマウスの筋肉または肝臓内に遺伝子導入した場合の血漿中のSEAP活性の経時変化を図７に示す。マウス SEAPはマウスにとって同種タンパクのため免疫原性がないので、プロモーターの活性に発現レベルが比例している。MCK/SV40(L)プロモーターでは肝臓では非常に弱い発現しか得られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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