(57)【要約】  本発明の目的は、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率的に評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することにある。  即ち、本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び（ｂ）関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、を含む方法、並びに該方法を利用したスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
（ｂ）関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
サイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ４及びＣＤＫ６の少なくともいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関節組織の破壊が軟骨組織の破壊である請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞におけるＭＭＰ−３の遺伝子発現である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞の増殖である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
（ｂ）滑膜線維芽細胞におけるＭＭＰ−３の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、及び
（ｃ）滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
関節組織の破壊が硬骨組織の破壊である請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞から破骨細胞への分化である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞の増殖である請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
（ｂ）破骨前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、及び
（ｃ）破骨前駆細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
（ｂ）破骨前駆細胞の増殖及び破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）請求項１から１４のいずれかに記載の方法により、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択する工程、を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、その原因は未だ明らかではないが、遺伝因子や、感染、その他の環境因子などが契機となって、関節の組織に炎症が起こり、関節が腫れて痛む疾患である。その症状が進行すると、罹患関節の軟骨や硬骨は破壊され、手足の関節の変形や機能障害を引き起こす。この関節リウマチに罹患した関節の滑膜組織では、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞が浸潤し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）やインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６などの様々な炎症性サイトカインが大量に産生されて、炎症が起こる。そして、これらの炎症性サイトカインにより、更に、関節の滑膜組織を形成する滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）が活性化され、過度の増殖が引き起こされる。この異常増殖した滑膜線維芽細胞により、パンヌスと呼ばれる肉芽腫性滑膜組織が形成され、罹患関節の軟骨や硬骨の破壊が導かれる。また、この異常増殖した滑膜線維芽細胞により、ＭＭＰ−３などの多くの関節破壊関連因子が産生され、また、破骨細胞が活性化されて、骨基質の吸収が促進される。これらの様々な事象により、罹患関節の軟骨及び硬骨の破壊がもたらされる。【０００３】
従来より、関節リウマチ治療薬としては、例えば、メトトレキサート、ブシラミン、金製剤や、インフリキシマブ、エタネルセプト等のサイトカイン阻害薬などが知られている。これらの治療薬は、関節リウマチの治療において有効に使用されてきている。【０００４】
しかしながら、これらの従来の治療薬は、そのほとんどが関節リウマチにおける炎症症状の改善を対象としたものであり、効果が充分得られないことも多く、対象とした炎症因子の抑制が他の炎症因子の活性化を促すことにより治療効果が不完全となったり、治療効果が長続きしないなどという欠点も有しており、全ての患者において十分な、関節リウマチの根治的な治療薬であるとは言い難いものであった。【０００５】
そこで、近年、滑膜線維芽細胞の増殖を抑制することによって、関節リウマチにおける軟骨や硬骨の破壊を治療又は予防する試みがなされている。例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）の一種であるｐ１６ＩＮＫ４ａ又はｐ２１Ｃｉｐ１を滑膜組織に強制発現させ、ＣＤＫ４のリン酸化活性を阻害したところ、滑膜線維芽細胞の増殖が抑制され、これが関節リウマチ動物モデルの治療に有効であったことが報告されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
ところが、この報告後、サイクリン依存性キナーゼインヒビターがサイクリン依存性キナーゼ抑制を介さずに炎症性サイトカインなどを抑制することが報告された（非特許文献４）。
このため、抗関節リウマチ活性において、実際は、サイクリン依存性キナーゼの抑制が有効であるのか、それともサイクリン依存性キナーゼインヒビターによる直接の炎症抑制作用が有効であるのかが、依然として不明であった。【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら；Ｎａｔ  Ｍｅｄ.１９９９；５：７６０−７６７
【非特許文献２】Ｎａｓｕ；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.２０００；１６５：７２４６−７２５２
【非特許文献３】Ｎｏｎｏｍｕｒａ；Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.２００１；１３：７２３−７３１
【非特許文献４】Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１（９）：４９１３−４９１９
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、従来の関節リウマチ治療における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率的に評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、関節リウマチにおける関節破壊に着目し、鋭意検討を重ねた結果、以下のような知見を得た。即ち、抗関節リウマチ活性において、サイクリン依存性キナーゼインヒビターによる直接の炎症抑制作用のみならず、サイクリン依存性キナーゼの抑制が有効であるという知見である。この知見により、関節リウマチにおける関節破壊を誘導する様々な生命現象が、サイクリン依存性キナーゼの働きによって直接的に制御されていることが明らかとなり、サイクリン依存性キナーゼの働きを抑制し、かつ、関節破壊を誘導する生命現象を抑制することのできる物質を探索することによって、関節リウマチの優れた治療薬又は予防薬となり得る物質をより効率的にスクリーニングすることが可能となった。
【０００９】
更に、関節破壊を誘導する様々な生命現象は、必ずしも同一の経路によらず、それぞれが互いに異なる経路を介してサイクリン依存性キナーゼによる制御を受けており、このような制御経路の異なりを利用して、関節破壊を誘導する様々な生命現象のうち、所望の生命現象を所望の度合いで抑制することのできる物質を探索することによって、関節リウマチに対して所望の治療又は予防効果を有する物質をより効率的にスクリーニングし得るという知見である。
例えば、関節破壊を誘導する様々な生命現象の一例として、滑膜線維芽細胞の増殖やＭＭＰ−３の遺伝子発現などが挙げられるが、これらのうち、ＭＭＰ−３の遺伝子発現は抑制するが滑膜線維芽細胞の増殖は抑制しないような物質を選択すれば、関節破壊に対して治療又は予防効果を有する一方で、正常な細胞増殖まで停止させてしまうなどの副作用の危険性の少ない、安全性の高い物質を選択することが可能となる。
一方、ＭＭＰ−３の遺伝子発現及び滑膜線維芽細胞の増殖の双方を抑制するような物質を選択すれば、滑膜線維芽細胞の異常増殖が原因となる関節破壊に対して、より強い治療又は予防効果が期待できる物質を選択することが可能となる。
【００１０】
本発明者らは、被験物質が有する、サイクリン依存性キナーゼの働きに対する抑制作用と、関節破壊を誘導する様々な生命現象に対する抑制作用のバランスとを様々に検討することによって、所望の治療又は予防効果を有する、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングできる可能性を見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
（ｂ）関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞  サイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ４及びＣＤＫ６の少なくともいずれかである＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  関節組織の破壊が軟骨組織の破壊である＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である＜３＞に記載の方法である。
＜５＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞におけるＭＭＰ−３の遺伝子発現である＜３＞に記載の方法である。
＜６＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞の増殖である＜３＞に記載の方法である。
＜７＞  被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
（ｂ）滑膜線維芽細胞におけるＭＭＰ−３の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、及び
（ｃ）滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
＜８＞  関節組織の破壊が硬骨組織の破壊である＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である＜８＞に記載の方法である。
＜１０＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現である＜８＞に記載の方法である。
＜１１＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞から破骨細胞への分化である＜８＞に記載の方法である。
＜１２＞  関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞の増殖である＜８＞に記載の方法である。
＜１３＞  被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
（ｂ）破骨前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、及び
（ｃ）破骨前駆細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
＜１４＞  被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
（ｂ）破骨前駆細胞の増殖及び破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
＜１５＞  抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の方法により、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択する工程、を含むことを特徴とする方法である。
【００１２】
本発明によれば、前記従来の関節リウマチ治療における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率的に評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐ１６ＩＮＫ４ａのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐ１６ＩＮＫ４ａのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｐ１６ＩＮＫ４ａのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質発現に対する抑制作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ又はｐ２１Ｃｉｐ１のＭＩＰ−３及びＩＬ−６タンパク質発現に対する抑制作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＣＤＫ４Ｉ、又は活性型Ｒｂの、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＣＤＫ４Ｉ、又は活性型Ｒｂの、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ又はｐ２１Ｃｉｐ１の、ＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ又はｐ２１Ｃｉｐ１の、ＪＮＫに対する結合を、免疫沈降及びウエスタンブロットにより調べた結果を示すブロット像である。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質発現に対する抑制作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＤＫ４ＩのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＤＫ４ＩのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＣＤＫ４ＩのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質発現に対する抑制作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、活性型ＲｂのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、活性型ＲｂのＲＳＦ細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、活性型ＲｂのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質発現に対する抑制作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＤＫ４Ｉの、骨髄細胞から破骨細胞への分化に対する抑制作用を、組織学的に観察した結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＤＫ４Ｉの、骨髄細胞から破骨細胞への分化に対する抑制作用を、細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＣＤＫ４Ｉの、骨髄細胞から破骨細胞への分化における細胞増殖に対する抑制作用を、細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＤＫ４Ｉの、ＲＡＷ２６４．７細胞から破骨細胞への分化に対する抑制作用を、組織学的に観察した結果を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＤＫ４Ｉの、ＲＡＷ２６４．７細胞から破骨細胞への分化に対する抑制作用を、細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＤＫ４ＩのＮＦＡＴｃ１ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＣＤＫ４ＩのＴＲＡＰｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＣＤＫ４ＩのＯＳＣＡＲｍＲＮＡ発現に対する抑制作用を、ＰＣＲにより調べた結果を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４を共導入した場合の、ＲＳＦ細胞増殖に対する作用を、３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４を共導入した場合の、ＲＳＦ細胞増殖に対する作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４を共導入した場合の、ＭＭＰ−３タンパク質発現に対する作用を、ＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＣＤＫを介した関節破壊に関連する生命現象の多様な制御経路の一部を表す経路図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（評価方法）
本発明の、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法は、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
（ｂ）関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。【００１５】
＜被験物質＞
前記被験物質としては、抗関節リウマチ活性の評価対象となり得る物質であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどが挙げられる。前記低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどは、天然物から抽出及び精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液などであっても、前記被験物質として使用することができる。本発明では、これらの中でも、前記被験物質を、関節リウマチの治療薬又は予防薬として適用することを考慮した場合、前記被験物質は低分子化合物であることが好ましい。前記被験物質としては、新規な物質に限らず、公知の物質やその改良物であってもよい。例えば、新規な抗関節リウマチ治療薬や予防薬の開発のため、既存の治療薬又は予防薬やその誘導体につき、本発明の方法により、抗関節リウマチ活性を評価することができる。また、既知のサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）や、それらを改良したものなどを使用することもできる。ここで、前記ＣＤＫＩとは、サイクリン依存性キナーゼのキナーゼ活性を阻害する細胞内タンパク質群であり、例えば、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６を特異的に阻害することが知られている、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、ｐ１９ＩＮＫ４ｄ等のＩＮＫ４ファミリー・タンパク質、全てのＣＤＫを阻害することが知られている、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５７Ｋｉｐ２等のＣｉｐ／Ｋｉｐファミリー・タンパク質などが挙げられる（例えば、Ｓｈｅｒｒｒａら；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９９；１３：１５０１−１５１２参照）。【００１６】
＜（ａ）工程＞
前記（ａ）工程では、サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する。【００１７】
前記サイクリン依存性キナーゼ（以下、ＣＤＫと称することがある）としては、関節リウマチにおける関節組織の破壊を誘導する生命現象に関与し得るものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＣＤＫ４（配列番号：１〜配列番号：４参照、以下同様；なお、配列番号：１中、「ｎ」はａ、ｔ、ｇ、及びｃのいずれかを表す）、ＣＤＫ６（配列番号：５〜配列番号：８参照、以下同様）などが好ましい。【００１８】
前記ＣＤＫに対する被験物質の結合能力の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、直接的に前記ＣＤＫと被験物質との結合の有無を調べることができる方法として、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いた方法；ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：水晶振動子)を用いた方法；アフィニティークロマトグラフィーを用いた方法；電気化学測定を用いた方法；ＥＬＩＳＡ法；質量分析法；などが挙げられる。【００１９】
前記Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ社）とは、物質間の相互作用を、結合特異性、相互作用の速度、アフィニティーなどの観点から解析できるシステムであり、例えば、センサー表面にＣＤＫを固定化して該システムを使用することにより、被験物質とＣＤＫとの結合の有無を判断することができる。【００２０】
前記ＱＣＭとは、水晶振動子の電極表面に物質が付着すると、その質量に応じて共振周波数が変動する（下がる）性質を利用した、極めて微量な質量変化を計測することの可能な質量センサーであり、例えば、ＣＤＫを電極上に固定化して該センサーを使用することにより、被験物質のＣＤＫに対する結合量の重さを、リアルタイムに検出することができ、被験物質とＣＤＫとの結合の有無を判断することができる。【００２１】
前記アフィニティークロマトグラフィーは、分子等の分離に使用されるクロマトグラフィー法の応用であり、例えば、クロマトグラフィーのカラムに詰める担体表面にＣＤＫを固定化し、そこに被験物質を流すことにより、被験物質のＣＤＫに対する結合性の差を利用して、ＣＤＫに結合する被験物質を分離することができる。これにより、被験物質とＣＤＫとの結合の有無を判断することができる。【００２２】
前記電気化学測定は、リガンドを電極上に固定化して、物質の結合を別に加えた酸化還元種の電機化学応答によって検出する方法であり、例えば、ＣＤＫを電極上に固定化して、被験物質と、酸化還元種を加えることにより使用する。被験物質がＣＤＫと結合する場合は、それらの結合物が電極表面を覆うため、酸化還元種が電極に物理的に近づくことができず、電気化学応答が下がることから、被験物質とＣＤＫとの結合の有無を判断することができる。【００２３】
また、前記サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力は、前記したようなサイクリン依存性キナーゼと被験物質との結合の有無を直接的に調べる方法のみに制限されず、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化作用に対する被験物質の抑制作用を調べる方法によって、間接的に検出することもできる。
サイクリン依存性キナーゼは、細胞周期の進行にあたり、サイクリンと複合体を形成することによって活性化し、網膜芽細胞腫遺伝子産物（Ｒｂ；配列番号：９〜配列番号：１２参照、以下同様）や他の関連するタンパク質をリン酸化する。Ｒｂのリン酸化により、Ｅ２Ｆ転写因子の転写活性を阻害しているＲｂの機能は不活化されて、細胞周期が進行することが知られている。
したがって、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化作用に対する被験物質の抑制作用は、サイクリン依存性キナーゼの基質であるＲｂや、そのミミックなどのリン酸化状態を調べることにより検出することができる。【００２４】
ＣＤＫの基質であるＲｂやそのミミックなどのリン酸化状態を調べる方法としては、例えば、被験物物質の存在下で、ＲＰＰＴＬＳＰＩＰＨＩＰＲ（配列番号：５１）などの合成ペプチドと、組換え技術を用いて作成したＣＤＫ４やＣＤＫ６タンパクとを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ、５０μｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、及び、１μＣｉ（３７ｋＢｑ）γ−３３Ｐ  ＡＴＰとともに反応させること、などが挙げられる。被験物質の非存在下と比較して、被験物質の存在下では、前記合成ペプチドのリン酸化が抑制されるという結果が得られた場合、被験物質はＣＤＫの基質のリン酸化に対して抑制能力を有していると判断することができ、即ち、被験物質がＣＤＫに対して結合能力を有すると判定することができる。【００２５】
前記（ａ）工程においては、前記ＣＤＫに対する被験物質の結合能力を検出する方法のうち、１種のみを行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。なお、２種以上の方法を行う場合、必ずしも選択した全ての方法において被験物質がＣＤＫに対する結合能力を示す結果となる必要はなく、選択した中で、少なくとも１種の方法において被験物質がＣＤＫに対する結合能力を有するという結果であれば、前記被験物質はＣＤＫに対する結合能力を有すると判定することができる。【００２６】
＜（ｂ）工程＞
前記（ｂ）工程では、関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する。【００２７】
−関節組織の破壊を誘導する生命現象−
前記関節組織の破壊を誘導する生命現象としては、関節組織の破壊に関連して生体内で起こり得る現象であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば以下に示すような、軟骨組織及び硬骨組織の少なくともいずれかの破壊に関連する任意の現象が挙げられる。
なお、前記関節組織の破壊を誘導する生命現象を、便宜的に軟骨組織及び硬骨組織の場合に分け、以下、順に説明をするが、生体内において互いの生命現象は複雑に関連し合っており、関節組織の破壊は、軟骨組織及び硬骨組織を含む、全体として進行する。したがって、前記（ｂ）工程においては、後述する軟骨組織及び硬骨組織の少なくともいずれかの破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出することによって、全体としての関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出することができる。【００２８】
――軟骨組織の破壊を誘導する生命現象――
関節リウマチにおける軟骨組織の破壊は、例えば、以下のようにして引き起こされることが知られている。関節リウマチが進行した関節の滑膜組織では、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞が浸潤し、様々な炎症性サイトカインを産生する。これらの炎症性サイトカインにより、滑膜組織を形成する滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）は活性化され、過剰に増殖する。この異常増殖した滑膜線維芽細胞が、パンヌスと呼ばれる増殖性肉芽腫性滑膜組織を形成することにより、罹患関節の軟骨の破壊が引き起こされる。また、この異常増殖した滑膜線維芽細胞は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３（配列番号：１７〜配列番号：２０参照、以下同様）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１（配列番号：１３〜配列番号：１６参照、以下同様）などの関節破壊関連因子を産生する。これらの関節破壊関連因子の働きによっても、罹患関節の軟骨組織の破壊は促進される。【００２９】
マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３とは、プロテオグリカン、ゲラチン、フィブロネクチン、及びコラーゲンを分解する組織分解プロテイナーゼである。ＭＭＰ−３は、他のＭＭＰを活性化する機能も有しており、関節リウマチに罹患した関節での組織分解酵素カスケードにおける主要プロテイナーゼとして知られている（例えば、Ｏｋａｄａ；Ｉｎ  Ｒｕｄｄｙら；Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．６ｔｈ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ；２００１．５５−７２、Ｔｏｌｂｏｏｍら；Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ、２００２；６１：９７５−９８０、及び、Ｎａｇａｓｅ；Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９７；３７８：１５１−１６０参照）。更に、ＭＭＰ−３は関節リウマチ動物モデルにおいてもその発現が必須である（例えば、ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、１９９９；４２：２０７４−２０８４参照）。ＭＭＰ−３により活性化されたプロテイナーゼを抑制するＭＭＰインヒビターは、他の関節リウマチモデルの関節破壊を予防することが報告されている（例えば、Ｈａｍａｄａら；Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０００；１３１：１５１３−１５２０、Ｉｓｈｉｋａｗａら；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００５；５０８：２３９−２４７．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊａｎ  ２０１２、及び、Ｌｅｗｉｓら；Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９７；１２１：５４０−５４６参照）。
また、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１は、リウマチ性滑膜組織のリンパ球やマクロファージの遊走や活性化を起こすことが知られている（例えば、Ｋｏｃｈら；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９２；９０：７７２−７７９参照）。ＭＣＰ−１アンタゴニストの投与は、関節リウマチ動物モデルの治療に有効であったことが報告されている（例えば、Ｇｏｎｇら；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９９７；１８６：１３１−１３７参照）。
即ち、これらＭＭＰ−３、ＭＣＰ−１などの関節破壊関連因子は、関節リウマチにおいて重要な役割を果たす。【００３０】
したがって、前記軟骨組織の破壊を誘導する生命現象としては、特に制限はなく、例えば、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞の組織浸潤、炎症性サイトカインの産生、滑膜線維芽細胞の増殖、パンヌスの形成、ＭＭＰ−３、ＭＣＰ−１等の関節破壊関連因子の遺伝子発現、などが挙げられる。【００３１】
―――関節破壊関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出方法―――
ＭＭＰ−３やＭＣＰ−１などの関節破壊関連因子の遺伝子発現に対する、被験物質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種ＰＣＲ法（半定量的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法等を用いて、被験物質の存在下で培養した滑膜線維芽細胞における、関節破壊関連因子の遺伝子発現量を検出する方法、などが挙げられる。
なお、遺伝子発現とは、ｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現の少なくともいずれかを指すものとする。例えば、前記した方法の中では、各種ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法により、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現量を検出することができ、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法により、タンパク質レベルでの遺伝子発現量を検出することができる。【００３２】
なお、前記検出を「被験物質の存在下」で行うには、前記検出時に、被験物質が標的（ここでは、滑膜線維芽細胞）に作用し得る状態にあれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、滑膜線維芽細胞の培養液中に被験物質を添加することにより、被験物質を滑膜線維芽細胞に作用させることができる。また、被験物質遺伝子をアデノウイルスに組み込み、該アデノウイルスを滑膜線維芽細胞に感染させることによって、被験物質を滑膜線維芽細胞に導入することもできる。
また、前記検出における被験物質の使用量としては、特に制限はなく、被験物質の種類、検出方法の種類、被験物質の最終的な使用目的などを考慮して、適宜選択することができる。
本明細書中において、「被験物質の存在下」という場合は上記と同義である。【００３３】
前記したような、ＭＭＰ−３やＭＣＰ−１などの関節破壊関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出を行った場合、具体的には、被験物質の存在下での関節破壊関連因子の遺伝子発現量が、被験物質の非存在下での関節破壊関連因子の遺伝子発現量に対して低ければ、被験物質が、選択された関節破壊関連因子の遺伝子発現に対して抑制作用を有すると判定することができる。【００３４】
―――滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法―――
前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法としても、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質の存在下で培養した滑膜線維芽細胞について、Ｇ０／Ｇ１期からＳ期への細胞周期の進行度合いを、３Ｈ−チミジン取り込み量の測定、フローサイトメトリー等によって調べる方法などが挙げられる。
前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を、前記３Ｈ−チミジン取り込み量の測定により調べた場合、具体的には、被験物質の存在下での３Ｈ−チミジン取り込み量が、被験物質での非存在下での３Ｈ−チミジン取り込み量に対して低ければ、被験物質が、滑膜線維芽細胞の増殖に対して抑制作用を有していると判定することができる。
また、前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出を、前記フローサイトメトリーにより行った場合、具体的には、被験物質の存在下での、全細胞中におけるＳ期以降（Ｇ２期、Ｍ期を含む）の細胞の割合が、被験物質の非存在下での同割合に対して低ければ、被験物質が、滑膜線維芽細胞の増殖に対して抑制作用を有していると判定することができる。【００３５】
―――軟骨組織における有用な検出態様―――
軟骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合、前記した方法の中でも、関節破壊関連因子の遺伝子発現（ｍＲＮＡ発現及び／又はタンパク質発現）を調べることが好ましく、中でも、以下の点から、ＭＭＰ−３の遺伝子発現を調べることがより好ましい。【００３６】
本発明者らは、関節リウマチにおける関節破壊を誘導する様々な生命現象がサイクリン依存性キナーゼの働きによって直接的に制御されていることを見出し、更に、これらの様々な生命現象が、様々な経路を介して制御されている可能性を見出した。中でも、本発明者らは、後述の実施例においても示される通り、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現と、滑膜線維芽細胞の増殖とは、それぞれ異なる経路を介して、ＣＤＫによる制御をうけている可能性を見出した。
ＣＤＫは、サイクリンと複合体を形成して、網膜芽細胞腫遺伝子産物（Ｒｂ）をリン酸化する働きを有する。Ｒｂがリン酸化され、不活性化されると、細胞周期の進行に働くＥ２Ｆ転写因子の抑制は解除され、細胞周期が進行する。すなわち、Ｒｂが活性化すれば、細胞周期の進行は抑制される。
本発明者らの実験において、このＲｂの活性型である非リン酸化Ｒｂを滑膜線維芽細胞において過剰発現させたところ、細胞周期の進行は抑制され、かつ、ＭＭＰ−３のタンパク質発現量は低下したが、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現量は変化しない、という結果が得られた。
一方、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）を滑膜線維芽細胞に導入し、ＣＤＫの働きを阻害させたところ、ＭＭＰ−３のタンパク質発現量が低下した点においてはＲｂの過剰発現の場合と同様であったが、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現量も低下するという点において、Ｒｂの過剰発現の場合とは異なる結果が得られた。
これらの結果から、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現は、従来知られているＣＤＫの基質であるＲｂを介した経路以外の経路により、ＣＤＫによる発現制御を受けていることが見出された。この経路はＲｂを介さないため、Ｒｂの不活性化が重要な役割を果たす細胞周期の進行を抑制することなしに、ＭＭＰ−３の発現量のみを低下させることができると考えられる。
このように、本発明の評価方法における工程（ｂ）の「関節組織の破壊を誘導する様々な生命現象」は、上記ＭＭＰ−３の発現と滑膜線維芽細胞の増殖の例から明らかなように、それぞれ独立性を有しうるものである。したがって、本発明の評価方法における工程（ｂ）においては、技術の本質に反しない限り、関節組織の破壊を誘導する様々な生命現象のうち、複数を組み合わせて検出してもよい。【００３７】
例えば、ＭＭＰ−３の発現と滑膜線維芽細胞の増殖の双方を検出した場合において、被験物質が、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現に対しては抑制作用を有し、滑膜線維芽細胞増殖に対しては抑制作用を有しないという結果が得られた場合、このような被験物質は、細胞増殖を抑制することなしに、関節の破壊を抑制する効果が期待できる。このため、正常な細胞増殖まで抑制してしまうなどといった副作用の危険性の少ない、安全性の高い、関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質として評価することができる。このような候補物質は、例えば、副作用を引き起こすリスクの高い関節リウマチ患者の治療に対して、有用であることが期待される。
一方、被験物質が、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現に対しても、滑膜線維芽細胞増殖に対しても抑制作用を有する場合、このような被験物質は、滑膜線維芽細胞の過剰増殖が引き起こす関節破壊に対しても、強い効果を有する、関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質であるとして、評価することができる。【００３８】
このようなことから、軟骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合において、ＭＭＰ−３の遺伝子発現を調べることは有意である。中でも、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現を調べることは有用であり、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現と併せ、滑膜線維芽細胞増殖の抑制の有無を調べることもまた、有意である。【００３９】
また、ＭＭＰ−３に限らず、他の組織分解プロテイナーゼも、ＭＭＰ−３と同様な経路（Ｒｂ非依存的経路）を介して制御されている可能性が高い。一方、後述する実施例にも示されるように、ＭＣＰ−１はＲｂを介した経路（Ｒｂ依存的経路）により制御されていることが示されており、このようなことからも、関節破壊を誘導する様々な生命現象は、それぞれが互いに多様な経路によりＣＤＫによる制御を受けていることがわかる。【００４０】
――硬骨組織の破壊を誘導する生命現象――
関節リウマチにおける硬骨組織の破壊は、例えば、前記した軟骨組織の破壊と同様なメカニズムを経て、引き起こされ得る。即ち、関節リウマチが進行した関節の滑膜組織においては、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞が浸潤し、様々な炎症性サイトカインを産生する。これらの炎症性サイトカインにより、滑膜組織を形成する滑膜線維芽細胞は活性化され、過剰に増殖する。この異常増殖した滑膜線維芽細胞が、パンヌスと呼ばれる増殖性肉芽腫性滑膜組織を形成することによって、前記軟骨と同様に、罹患関節の硬骨も破壊される。また、これらの異常増殖した滑膜線維芽細胞が産生する破骨細胞分化誘導因子（ＲＡＮＫＬ）の作用により、骨髄細胞などの破骨前駆細胞は、過度に破骨細胞へと分化誘導される。この破骨細胞の活性化により、硬骨組織の破壊は促進される。この破骨前駆細胞から破骨細胞への分化には、活性化Ｔ細胞核内因子ｃ１（ＮＦＡＴｃ１：ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃ１）（配列番号：２１〜配列番号：３４参照、以下同様）がマスター分子として機能していることが知られている。また、破骨細胞に特異的な因子として、例えば、破骨細胞関連受容体（ＯＳＣＡＲ：ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（配列番号：３９〜配列番号：５０参照、以下同様）、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ：ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（配列番号：３５〜配列番号：３８参照、以下同様）などが知られている。【００４１】
したがって、前記硬骨組織の破壊を誘導する生命現象としては、特に制限されるものではないが、例えば、前記軟骨組織の場合と同様の生命現象の他、骨髄細胞などの破骨前駆細胞の増殖、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化、ＮＦＡＴｃ１、ＯＳＣＡＲ、ＴＲＡＰ等の破骨細胞関連因子の遺伝子発現、などが挙げられる。
なお、破骨前駆細胞とは、破骨細胞へと分化し得る可能性のある細胞全てを指すものとし、骨髄細胞も含まれるものとする。【００４２】
―――破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出方法―――
前記したＮＦＡＴｃ１、ＯＳＣＡＲ、ＴＲＡＰ等の破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種ＰＣＲ法（半定量的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法等を用いて、被験物質の存在下で培養された破骨前駆細胞又は破骨細胞における各因子の遺伝子発現量を検出する方法、などが挙げられる。
前記破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出を、遺伝子発現量の検出により行った場合、具体的には、被験物質の存在下での破骨細胞関連因子の遺伝子発現量が、被験物質の非存在下での破骨細胞関連因子の遺伝子発現量に対して低いとき、被験物質が、選択された破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対して、抑制作用を有すると判定することができる。【００４３】
―――骨髄細胞（破骨前駆細胞）の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法―――
前記骨髄細胞（破骨前駆細胞）の増殖に対する、被験物質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＷＳＴ−８を利用した、セルカウンティングキット−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８；同仁化学）等を用いて、被験物質の存在下で培養された骨髄細胞の細胞数を測定する方法などが挙げられる。
前記骨髄細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を、骨髄細胞の細胞数を測定する方法により検定する場合、具体的には、被験物質の存在下での骨髄細胞数が、被験物質の非存在下での骨髄細胞数に対して少ないとき、被験物質が骨髄細胞の増殖に対して抑制作用を有していると判定することができる。【００４４】
―――破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用の検出方法―――
前記破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対する、被験物質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質の存在下で骨髄細胞を培養し、更に破骨細胞分化誘導因子の添加により破骨細胞への分化を誘導した後、ＴＲＡＰ染色キット（セルガレージ）等を用いて、破骨細胞に分化された細胞数を測定する方法、などが挙げられる。
前記破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用を、破骨細胞に分化された細胞数を測定することにより検定する場合、具体的には、被験物質の存在下での破骨細胞数が、被験物質の非存在下での破骨細胞数に対して少ないとき、被験物質が、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対して抑制作用を有していると判定することができる。【００４５】
―――硬骨組織における有用な検出態様―――
硬骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合、前記した方法の中でも、検出が容易である点で、破骨細胞関連因子の遺伝子発現（ｍＲＮＡ発現及び／又はタンパク質発現）を調べることが好ましく、中でも、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化のマスター分子であるＮＦＡＴｃ１因子の遺伝子発現を調べることが、より好ましい。【００４６】
本発明者らは、硬骨組織に関しても、前記軟骨組織の場合と同様に、様々な生命現象が、それぞれ異なる経路を介して、ＣＤＫによる制御を受けている可能性を見出した。中でも、本発明者らは、後述する実施例にも示されるとおり、骨髄細胞（破骨前駆細胞）の増殖と、ＮＦＡＴｃ１などの破骨細胞関連因子の遺伝子発現とが、互いに異なる経路により制御されている可能性を見出した。【００４７】
例えば、ある被験物質が、破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対しては抑制作用を有し、骨髄細胞（破骨前駆細胞）増殖に対しては抑制作用を有しない場合、このような被験物質は、細胞増殖を抑制することなしに関節破壊を抑制する効果が期待できることから、正常な細胞増殖まで阻害してしまうなどといった副作用の危険性の少ない、安全性の高い、関節リウマチの治療薬又は予防薬の候補物質として評価することができる。このような候補物質は、例えば、副作用を引き起こすリスクの高い関節リウマチ患者の治療に対して、有用であることが期待される。
一方、被験物質が、破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対しても、骨髄細胞（破骨前駆細胞）増殖に対しても抑制作用を有する場合、このような被験物質は、細胞の過剰増殖により引き起こされる関節破壊に対しても、強い効果を有する、関節リウマチの治療薬又は予防薬の候補物質であると評価することができる。
したがって、硬骨の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合、破骨細胞関連因子の遺伝子発現を調べることは有意であり、破骨細胞関連因子の遺伝子発現と併せ、破骨前駆細胞増殖の抑制作用の有無を調べることもまた、有意である。中でも、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化のマスター分子であるＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現を調べることが好ましく、ＮＦＡＴｃ１の遺伝子発現と併せ、破骨前駆細胞増殖の抑制作用の有無を検出することもまた、好ましい。【００４８】
また、破骨細胞関連因子の遺伝子発現と、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化とは、互いに密接に関連した事象である。したがって、硬骨の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を調べることもまた、有用であり、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の分化と併せ、破骨細胞前駆細胞増殖の抑制作用の有無を調べることもまた、有意である。【００４９】
前記したような例に限らず、関節破壊を誘導する様々な生命現象は、それぞれが多様な経路を介して、サイクリン依存性キナーゼによる制御をうけている可能性が高く、このような制御経路の違いを利用することにより、被験物質の抗関節リウマチ活性を、様々な視点から評価することが可能となる。即ち、例えば、関節リウマチの治療にあたり、個々の患者の症状に応じた、より適切な治療薬又は予防薬を選択することなども可能となると考えられる。【００５０】
前記（ｂ）工程においては、前記したような関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用の検出方法のうち、１種のみを行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。２種以上の検出方法を行う場合、必ずしも選択した全ての検出方法において、被験物質が抑制作用を有する結果となる必要性はなく、選択した検出方法の中で、少なくとも１種の検出方法に対して被験物質が抑制作用を有する結果となれば、被験物質は関節組織の破壊を誘導する生命現象に対して抑制作用を有すると判定することができる。検出方法及び結果の組み合わせを適宜選択することにより、被験物質の抗関節リウマチ活性を、様々な視点から評価することが可能となる。【００５１】
＜評価＞
以上のように、被験物質が、前記（ａ）工程においてサイクリン依存性キナーゼに対する結合能力を有すると判定され、かつ、前記（ｂ）工程において関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する抑制作用を有すると判定された場合に、前記被験物質は、抗関節リウマチ活性を有すると評価される。
なお、前記（ａ）工程及び前記（ｂ）工程は、いずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。【００５２】
（スクリーニング方法）
本発明の抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法は、
（Ａ）前記評価方法を実施する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択する工程、を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。【００５３】
前記（Ａ）工程は、前記評価方法を実施する工程であり、前記（ａ）及び（ｂ）工程と同様に実施することができる。
前記（Ｂ）工程は、前記（Ａ）工程により、抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択する工程である。ここで選択された被験物質は、抗関節リウマチ活性を有する物質であり、関節リウマチに対する治療薬又は予防薬の候補物質（以下、候補物質と称する場合がある）であるということができる。前記候補物質は、関節リウマチ、特に、関節リウマチにおける関節破壊に対して、治療又は予防効果が期待できる。【００５４】
（確認方法）
前記スクリーニング方法により選択された、抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質（候補物質）が、実際に関節リウマチの治療又は予防に有効であるかどうかは、例えば、関節リウマチモデル動物への、候補物質の投与実験などにより確認することができる。
前記関節リウマチモデル動物としては、例えば、コラーゲン誘導性関節炎マウス（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）、コラーゲン誘導性関節炎ラット（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）、アジュバント関節炎ラットなどが使用できる。前記アジュバント関節炎ラットは、例えば、８週齢程度のＬｅｗｉｓラットに、１ｍｇのＭ.ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ死菌（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を１００μＬのミネラルオイルに懸濁して、尾根部皮内に免疫することにより得ることができる。【００５５】
候補物質が投与された前記関節リウマチモデル動物の、関節リウマチの症状の緩和度合いを観察することによって、前記スクリーニング方法により選択された関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質の効果を確認することができる。【００５６】
なお、前記スクリーニング方法により選択された関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質の適用対象となり得る動物としては、関節リウマチに罹患する可能性のある動物であれば特に制限はなく、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウスなどが挙げられる。【００５７】
（効果）
前記評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチの治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。
より具体的には、前記評価方法又はスクリーニング方法によれば、所望の効果のバランスを有する、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。例えば、関節における細胞の異常増殖の抑制と、関節の破壊に関連する因子（前記した関節破壊関連因子、破骨細胞関連因子などを含む）の産生抑制という２種類の効果が、所望のバランスで奏される、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を選択することが可能となる。即ち、例えば、正常な細胞の増殖は阻害することなく、関節の破壊に関連する因子の産生のみを抑制することのできる、副作用の危険性の少ない物質を選択することも可能となり、一方で、細胞の異常増殖と関節の破壊に関連する因子の産生とを共に抑制することのできる、強い効果の期待できる物質を選択することも可能となる。【００５８】
したがって、前記評価方法又はスクリーニング方法は、関節リウマチの治療又は予防に関する様々な場面において有用であり、例えば、以下（１）〜（４）のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）新たに開発された関節リウマチの治療薬又は予防薬の、抗関節リウマチ活性を効率的に評価することができる。
（２）公知のＣＤＫ阻害剤、他疾患対象の薬剤などの中から、関節リウマチの治療薬又は予防薬として使用可能な物質を、効率的に選択することができる。
（３）既存の関節リウマチの治療薬又は予防薬の中から、例えば、患者の症状に応じて所望の効果を有する治療薬又は予防薬を、適切に選択することができる。
（４）既存の関節リウマチの治療薬又は予防薬に改良を加え、より副作用の少ない治療薬又は予防薬など、所望の効果に優れた治療薬又は予防薬を効率的に得ることができる。【００５９】
関節リウマチの根治には、関節リウマチの進行により引き起こされる、関節破壊と炎症という２つの側面を、それぞれ効率的に抑制することが有効であると考えられる。前記評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を得ることができることから、既存の炎症療法などと併用することによって、関節リウマチの根治的な治療方法の開発が期待できる。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００６１】
（実施例１〜５：軟骨における評価）
被験物質として、ｐ１６ＩＮＫ４ａ（実施例１）、ｐ２１Ｃｉｐ１（実施例２）、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ（実施例３）、ＣＤＫ４Ｉ（実施例４）、活性型Ｒｂ（実施例５）を選択し、各々の抗関節リウマチ活性を、軟骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する抑制作用の観点から、以下のようにして評価した。
ここで、実施例４として選択したＣＤＫ４Ｉとは、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を特異的に阻害するＣＤＫ４／６インヒビターである合成化合物、２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−１］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン（２−ｂｒｏｍｏ−１２，１３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５Ｈ−ｉｎｄｏｌｏ［２，３−１］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４−ｃ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ−５，７（６Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）である。
なお、実施例１〜３で選択したｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ１８ＩＮＫ４ｃは、それぞれサイクリン依存性キナーゼのキナーゼ活性を阻害する細胞内タンパク質群であるサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）の一種である。ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びｐ１８ＩＮＫ４ｃは、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を特異的に阻害することが知られており、ｐ２１Ｃｉｐ１は全てのＣＤＫを阻害することが知られている。
また、実施例５で選択したＲｂ（網膜芽細胞腫遺伝子産物）は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の主な基質として知られており、Ｒｂがリン酸化されて不活性化されることにより、細胞周期の進行に働くＥ２Ｆ転写因子の抑制が解除され、細胞周期が進行することが知られている。即ち、実施例５において使用する活性型Ｒｂは、細胞周期の進行の抑制に寄与する。【００６２】
＜細胞増殖の評価＞
各被験物質の細胞増殖に対する抑制作用は、以下のようにして評価した。
−滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）培養−
滑膜組織を、抗リウマチ薬への反応が悪く、東京医科歯科大学病院、東京都立墨東病院、国立療養所下志津病院で、関節置換術及び／又は滑膜切除術を受けたリウマチ患者から採取した。滑膜組織を採取した全患者が、関節リウマチ（ＲＡ）分類についての、米国リウマチ学会、関節リウマチ診断基準（Ａｒｎｅｔｔら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９８８；３１：３１５−３２４参照）を満たしていた。滑膜組織を採取した患者らは、本実施例１〜５における全処置に合意しており、また、本実施例１〜５における全処置は、東京医科歯科大学及び理化学研究所の倫理委員会により承認されている。得られたヒト絨毛性、鬱血性滑膜組織検体から、滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）を分離し、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら；Ｎａｔ  Ｍｅｄ.１９９９；５：７６０−７６７に記載の方法で培養した。これらを早期継代（３〜９継代）で使用した。【００６３】
−被験物質導入アデノウイルスの感染−
ｐ１６ＩＮＫ４ａ（実施例１）、ｐ２１Ｃｉｐ１（実施例２）、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ（実施例３）、及び活性型Ｒｂ（実施例５）の各被験物質は、アデノウイルスを利用してＲＳＦに導入した。
以下の、各被験物質遺伝子を含む組み換え型アデノウイルスを、購入又は調製した；ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子を含むアデノウイルス（ＡｘＣＡｐ１６）（Ｔｅｒａｄａら；Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９７；８：５１−６０参照）、ヒトｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＲＧＤ−ｐ１８）（Ｂｌａｉｓら；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８；２４７：１４６−１５３、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ及びＫａｙ；Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；１０：２０１３−２０１７、並びに、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ及びＫａｙ；Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９８；９：２５７７−２５８３参照）、ヒトｐ２１Ｃｉｐ１遺伝子を含むアデノウイルス（ＡｘＣＡｐ２１）（Ｔｅｒａｄａら；Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９７；８：５１−６０参照）、非リン酸化型で、構成的活性型をコードするヒトＲｂ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−Ｒｂ）（Ｃｈａｎｇら；Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２６７：５１８−５２２、及び、Ｔｅｒａｏら；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９８；２８：６０５−６１２参照）。
また、βガラクトシダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＬａｃＺ）を準備した（Ｃｈａｎｇら；Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２６７：５１８−５２２、及び、Ｔｅｒａｏら；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９８；２８：６０５−６１２参照）。
また、挿入遺伝子を持たないコントロール・アデノウイルスＡｘ１ｗ１（独立行政法人  理化学研究所  筑波研究所  バイオリソースセンター、日本、つくば市）及びコントロールＡｄ５−ＲＧＤ（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：７３０−７３５参照）を準備した。【００６４】
準備したアデノウイルスのうち一種を、１００％の感染効率を保証する最低限の多重感染率（ＭＯＩ）（通常、５０〜２００ＭＯＩ）で、得られた滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）に感染させた。
アデノウイルス感染から３日後、導入遺伝子の発現レベルが最高に達した時点で、ＲＳＦの増殖を検証、又は、ＲＳＦをサイトカイン刺激した。サイトカイン刺激は、５ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ロッキーヒル）、及び２５μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を用いて行い、１２時間にわたり、炎症メディエーター（関節破壊関連因子）の産生を刺激した。なお、予備実験は、ＲＳＦ刺激時の各サイトカインの最適濃度が、５ｎｇ／ｍＬであることを示していた。【００６５】
−ＣＤＫ４Ｉの添加−
ＣＤＫ４Ｉ（実施例４）は、培養液中に添加することにより、ＲＳＦに作用させた。
ＣＤＫ４Ｉ（２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−１］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン）（２−ｂｒｏｍｏ−１２，１３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５Ｈ−ｉｎｄｏｌｏ［２，３−１］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４−ｃ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ−５，７（６Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）（Ｍｅｒｃｋ社、ニュージャージー州ホワイトハウス・ステーション）（Ｚｈｕら；Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００３；４６：２０２７−２０３０参照）はＤＭＳＯに溶解させ、ＲＳＦ培養液に添加した。培養液中のＤＭＳＯの最終濃度は０．５％（ｖ／ｖ）とした。ＣＤＫ４Ｉを添加した状態で、ＲＳＦを６時間、前培養した。次に、細胞及び培養上清を回収するまでの３６時間、又はＲＮＡを抽出するまでの１２時間、前記アデノウイルス感染の場合と同様に、ＲＳＦをサイトカイン刺激した。【００６６】
−３Ｈ−チミジン取り込み−
ＲＳＦ細胞増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みにより評価した。アデノウイルス感染から３日後、アデノウイルス感染ＲＳＦを８，０００細胞／ウェルでマイクロタイター・ウェルに播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、及びインドメタシン添加ＤＭＥＭ培地で、３６時間培養した。最後２４時間の培養で、３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー州）を存在させ、取り込まれた放射活性をカウントした。相対的生細胞数は、セルカウンティングキット−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８；同仁化学）により測定した。【００６７】
−フロー・サイトメトリー−
アデノウイルス感染から３日後、ＲＳＦを回収し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、ＲＳＦを０．１５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ含有ＰＢＳで、１０分間固定した。固定後、ＲＳＦを、５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）、及び５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡとともにインキュベートした。データを、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて集計した。【００６８】
＜遺伝子発現の評価＞
各被験物質の遺伝子発現に対する抑制作用は、以下のようにして評価した。
−ノーザンブロット解析及びリアルタイムＰＣＲ−
ノーザンブロット解析及びリアルタイムＰＣＲでは、全ＲＮＡを単離するために、ＲＮｅａｓｙ  キット（ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ：Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州ヴァレンシア）を使用した。Ｉ型インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）及びマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３ｍＲＮＡ検出のためのノーザンブロット解析を、Ｎｏｎｏｍｕｒａら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９に記載の方法で実施した。リアルタイムＰＣＲでは、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、ｉＱ  サイバーグリーンスーパーミックス（ｉＱ  ＳＹＢＥＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、及び、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡ特異的プライマー・セット（Ｅｌｓｈａｗら；Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４；１４２：１３１８−１３２４参照）又は単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１ｍＲＮＡ特異的プライマー・セット（Ｐｉｅｒｅｒら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７２：１２５６−１２６５参照）を用いて実施した。ヒト・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを、サイクル閾値法での標準化のために用いた（Ｚｈｏｎｇ及びＳｉｍｏｎｓ；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９；２５９：５２３−５２６参照）。【００６９】
−酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）−
ＥＬＩＳＡでは、アデノウイルス感染ＲＳＦを６０時間培養し、１．０×１０５細胞／ｍＬで、マイクロウェルに播種した。播種から１２時間後、培養上清を、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、インドメタシンと、１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地と交換した。２４時間の培養後、培養上清を回収した。ＭＣＰ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、カリフォルニア州カマリロ）、ＩＬ−６（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−３α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州マッキンレー）、ＭＭＰ−３（富士化学、日本、富山）に対する各ＥＬＩＳＡキットを使用し、培養上清中の各タンパク質濃度を定量した。【００７０】
＜その他の評価＞
−免疫沈降及びウェスタン・ブロット解析−
免疫沈降では、アデノウイルス感染から３日後に、ＲＳＦ細胞の全溶解物を調製した（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら；Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９；５：７６０−７６７、及び、Ｎｏｎｏｍｕｒａ；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９参照）。ＪＮＫ  １−３を、マウス抗ＪＮＫモノクローナル抗体（Ａｂ）（ｓｃ−７３４５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、免疫沈降させた（Ｐａｔｅｌら；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９８；１１１：２２４７−２２５５参照）。ウサギ抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ、マウス抗ヒトｐ１８ＩＮＫ４ｃ、及びｐ２１Ｃｉｐ１ポリクローナル抗体（各ｓｃ−４６８、ｓｃ−９９６５、ｓｃ−３８７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カリフォルニア州サンタクルーズ）を、ウェスタン・ブロット解析での一次抗体として使用した。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＮＡ−９３４；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）又は抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（６１７５−０５；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃ社、アラバマ州バーミングハム）を、二次抗体として使用した。結合抗体を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で可視化させた。【００７１】
−マルチウェル比色転写因子アッセイ−
ＲＳＦにおける転写因子及びＪＮＫ活性を測定するために、核抽出キット（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｋｉｔ；Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して核抽出物を調製した。ＡＰ−１及びＮＦ−кＢ転写因子のＤＮＡ結合活性を定量するために、ＡＰ−１／ｃ−Ｊｕｎ、ＮＦ−кＢ／ｐ５０、及びｐ６５  転写因子アッセイキット（Ｔｒａｎｓ ＡＭ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔｓ）（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社）を使用した。【００７２】
＜統計解析＞
前記３Ｈ−チミジン取り込み、リアルタイムＰＣＲにおける強度比、及びＲＳＦ上清におけるタンパク質濃度は、スタットビュー（ＳｔａｔＶｉｅｗ）−５．０Ｊソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．社、ノースカロライナ州カリー）を使用し、対応のあるスチューデントｔ−検定により比較した。【００７３】
＜評価結果：実施例１（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）及び実施例２（ｐ２１Ｃｉｐ１）＞
−細胞増殖の評価結果−
関節リウマチを患う患者の関節由来ＲＳＦを、前記の方法によりインビトロで培養した。特異抗体を用いたウェスタン・ブロット解析では、内在性ｐ１６ＩＮＫ４ａが、いずれの培養ＲＳＦ試料においても発現していないことを示していた（データは図示せず）。ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子が導入されたＡｘＣＡｐ１６アデノウイルス、又は、導入遺伝子を有さないコントロールＡｘ１ｗ１アデノウイルスを、培養ＲＳＦ試料に感染させた。導入遺伝子の発現レベルが最高の場合に、３Ｈ−標識チミジン取り込み及びフローサイトメトリーにより、細胞増殖及び細胞周期進行を検証した。ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦによる３Ｈ−標識チミジン取り込みは、コントロール・ウイルス感染ＲＳＦによる取り込みと比較して、大幅に抑制された。これは、細胞周期のＧ０／Ｇ１期率の上昇を伴った（図１Ａ及び図１Ｂ）。【００７４】
以下に、図１Ａ及び図１Ｂを具体的に説明する。図１Ａ及び図１Ｂは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子導入が、ＲＳＦの増殖を阻害し、Ｇ０／Ｇ１期における細胞周期停止を誘導したことを示す図である。
図１Ａは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、黒いカラム）を有するアデノウイルス、又は、コントロールアデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦを、前記のようにして、インターロイキン（ＩＬ）−１β及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αで刺激した結果を示す。ＲＳＦによる３Ｈ−チミジン取り込みを、アデノウイルス感染から３日後にカウントした。カラムとバーは、５個のウェルでの平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ｐ１６ＩＮＫ４ａによる３Ｈ−チミジン取り込みの平均低下率は８３％であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。
図１Ｂは、フロー・サイトメトリー解析の結果を示す。コントロール細胞（コントロール）と比較し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）では、細胞周期Ｇ０／Ｇ１期停止の増加を示した。３検体中１検体での代表結果を示している。【００７５】
−遺伝子発現（タンパク質発現／ｍＲＮＡ発現）の評価結果−
ｐ１６ＩＮＫ４ａが発現している又は発現していないＲＳＦをサイトカイン刺激し、ＭＭＰ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３α及びＩＬ−６のタンパク質発現を、特異的ＥＬＩＳＡにより検証した。なお、ＭＭＰ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３α及びＩＬ−６は、ｐ２１Ｃｉｐ１の遺伝子導入によりダウンレギュレートされることが知られている、炎症メディエーター（関節破壊関連因子）の一員である（Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９参照）。培養上清中のＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１産生は、いずれもｐ１６ＩＮＫ４ａの発現により抑制されたが、ＩＬ−６及びＭＩＰ−３α産生は、影響を受けなかった（図１Ｃ及び図１Ｄ参照）。なお、これらの炎症メディエーター（関節破壊関連因子）の産生は、アデノウイルス感染のみでは促進されなかった（データは図示せず）。【００７６】
以下に、図１Ｃ及び図１Ｄを具体的に説明する。図１Ｃ及び図１Ｄは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子導入は、ＲＳＦによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１のタンパク質産生を抑制したが、ＩＬ−６及びマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−３αの産生は抑制しなかったことを示す図である。ｐ１６ＩＮＫ４ａアデノウイルス（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、黒いカラム）又はコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦを２４時間、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの併用で刺激した。培養上清中のＭＭＰ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３α、及びＩＬ−６タンパク質発現を、ＥＬＩＳＡで測定した。刺激されたＲＳＦでの、これらの分子の産生を、コントロール・ウイルスを感染させたコントロールＲＳＦのものと比較して示している。過去の一連の実験（Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９参照）において、ｐ２１Ｃｉｐ１アデノウイルス（ｐ２１Ｃｉｐ１、灰色のカラム）を用いて研究されたＭＩＰ−３α及びＩＬ−６での増殖に対するｐ２１Ｃｉｐ１の作用を、同形式で示した。カラムとバーはそれぞれ、３検体での平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ｐ１６ＩＮＫ４ａによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１産生の平均低下率は、それぞれ７８％、９１％であった（＊Ｐ＜０．０５）。ｐ２１Ｃｉｐ１によるＭＩＰ−３α及びＩＬ−６産生の平均低下率は、それぞれ６９％、６７％であった。ｐ２１Ｃｉｐ１とは異なり、ＲＳＦでのＭＩＰ−３α及びＩＬ−６の産生は、ｐ１６ＩＮＫ４ａにより影響を受けなかった。【００７７】
また、前記タンパク質発現を測定した場合と同様に、アデノウイルス感染後サイトカイン刺激したＲＳＦにおいて、ＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現レベルを検証した。ノーザンブロット解析では、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦにおいてＭＭＰ−３ｍＲＮＡレベルの低下を示したが、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡレベルに有意な変化は観察されなかった（データは図示せず）。この結果をリアルタイムＰＣＲ解析により確認したところ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦではＭＭＰ−３ｍＲＮＡの有意な低下を示したが、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡは小幅な低下しか示さなかったことが確認された（図１Ｅ及び図１Ｆ）。したがって、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡレベルの変化では、タンパク質の減少を説明できなかった。
これらの結果から、ＭＭＰ−３産生は、ＣＤＫの働きにより、ｍＲＮＡレベルで調節されるが、ＭＣＰ−１産出はｍＲＮＡレベルで調節されないことが示された。【００７８】
以下、図１Ｅ及び図１Ｆを具体的に説明する。図１Ｅ及び図１Ｆは、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡレベルは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＣＤＫ４Ｉ（後述、実施例４）によりダウンレギュレートされたが、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡレベルはダウンレギュレートされず、また、両方とも活性型Ｒｂ（後述、実施例５）により影響を受けなかったことを示す図である。ＲＳＦをｐ１６ＩＮＫ４ａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、黒いカラム）、Ｒｂ（Ｒｂ、黒いカラム）、又はコントロール（コントロール、白いカラム）アデノウイルスに感染させた。また、濃度１μＭのＣＤＫ４Ｉ（ＣＤＫ４Ｉ、黒いカラム）又はＤＭＳＯ培地コントロール（ＤＭＳＯ、白いカラム）で、ＲＳＦを処理した。これらのＲＳＦを、前記のようにして、ＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激した。ＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１のｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲで定量した。これらのｍＲＮＡ発現量を、ＧＡＰＤＨと比較して示している。カラムとバーはそれぞれ、平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。２検体中１検体の代表結果を示した。【００７９】
また、ｐ２１Ｃｉｐ１による炎症メディエーター（関節破壊関連因子）の分泌抑制は、少なくとも部分的にはＩＬ−１Ｒ１発現のダウンレギュレーションに起因するはずである（Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；  １７１：  ４９１３−４９１９参照）。しかし、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦにおいて、ＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現は、コントロール・アデノウイルスを感染させたものと比較して低下していなかった（図１Ｇ）。【００８０】
以下、図１Ｇを具体的に説明する。図１Ｇは、ｐ２１Ｃｉｐ１はＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートするが、ｐ１６ＩＮＫ４ａはＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートしないことを示す図である。コントロール・ウイルス感染ＲＳＦ（コントロール、白いカラム）及びｐ１６ＩＮＫ４ａアデノウイルス感染ＲＳＦ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、黒いカラム）のＲＮＡについて、Ｉ型インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット解析により検証した。ＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現に対するｐ２１Ｃｉｐ１アデノウイルス（ｐ２１Ｃｉｐ１、灰色のカラム）の作用も、同様に図示した。カラムとバーはそれぞれ、３検体の平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ｐ２１Ｃｉｐ１によるＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現の平均低下率は７１％であった（＊Ｐ＜０．０５）。ｐ２１Ｃｉｐ１とは異なり、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、ＩＬ−１Ｒ１ｍＲＮＡ発現に影響を与えなかった。【００８１】
また、本発明者らや他のグループにより、ｐ２１Ｃｉｐ１はＪＮＫと結合してＪＮＫ酵素活性を低下させることが示されている（Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９、Ｓｈｉｍら；Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８１：８０４−８０６、及び、Ｐｅｒｌｍａｎら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０：８３８−８４５参照）。本発明者らは、更に、ｐ２１Ｃｉｐ１発現ＲＳＦにおいて、ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性の低下を示しており、ＡＰ−１はＪＮＫ経路の下流に存在することを示している（Ｎｏｎｏｍｕｒａら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９１３−４９１９参照）。このことから、ＪＮＫの免疫沈降により、ｐ１６ＩＮＫ４ａとＪＮＫとの結合活性を検証した。また、ｐ２１Ｃｉｐ１とＪＮＫとの結合活性を確認した。
ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子を含むＡｘＣＡｐ１６アデノウイルス感染ＲＳＦ細胞又はヒトｐ２１Ｃｉｐ１遺伝子を含むＡｘＣＡｐ２１アデノウイルス感染ＲＳＦ細胞の溶解物を、抗１６Ｉｎｋ４ａ又は抗ｐ２１Ｃｉｐ１抗体を用いて免疫沈降させた。続く免疫ブロッティングでは、ｐ１６ＩＮＫ４ａではなく、ｐ２１Ｃｉｐ１がＪＮＫと結合することが明らかになった（図１Ｈ）。ｐ２１Ｃｉｐ１とは異なり、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、３０分間にわたりサイトカイン刺激されたＲＳＦにおいて、ＡＰ−１およびＮＦ−кＢのＤＮＡ結合活性を阻害しなかった（データは図示せず）。これらのデータは、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、炎症メディエーターの産生を阻害するために、ＪＮＫ経路抑制またはＩＬ−１Ｒ１発現抑制に依存しないことを示している。【００８２】
以下、図１Ｈを具体的に説明する。図１Ｈは、ｐ２１Ｃｉｐ１はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）と共に免疫沈降されたが、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びｐ１８ＩＮＫ４ｃ（後述、実施例３）タンパク質は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）と共に免疫沈降されなかったことを示す図である。ｐ１６ＩＮＫ４ａ又はｐ１８ＩＮＫ４ｃ発現ＲＳＦ細胞の全抽出物を抗ＪＮＫ抗体（Ａｂ）（α−ＪＮＫ）又はコントロールＩｇＧ（ＩｇＧ）と免疫沈降させ、各ＣＤＫＩ特異的抗体（抗−ｐ１６ＩＮＫ４ａ（α−ｐ１６）、抗−ｐ１８ＩＮＫ４ｃＡｂ（α−ｐ１８）、抗−ｐ２１Ｃｉｐ１抗体（α−ｐ２１））を用いて、ウェスタン・ブロットにより解析した。別々の２検体の、ウエスタンブロットの代表結果を示している。【００８３】
＜評価結果：実施例３（ｐ１８ＩＮＫ４ｃ）＞
ｐ１８ＩＮＫ４ｃは、前記実施例１及び２と同様にしてＪＮＫとの結合を解析したところ、ｐ１６ＩＮＫ４ａと同様に、ＪＮＫとは結合しなかった（図１Ｈ）。
また、ヒトｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子を含むＡｄ−ＲＧＤ−ｐ１８アデノウイルス、及びコントロール・アデノウイルスを感染させた培養ＲＳＦを用いて、実施例１及び２と同様に、細胞増殖の評価及び遺伝子発現の評価を行った。ＲＳＦがｐ１８ＩＮＫ４ｃを発現した場合、コントロールと比較して、３Ｈ−標識チミジンの取り込みが減少した（図２Ａ）。また、フロー・サイトメトリー解析によって、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ発現ＲＳＦにおいて、細胞周期進行がＧ０／Ｇ１期で阻害されることが明らかになった（図２Ｂ）。培養上清を用いたＥＬＩＳＡでは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子導入が、ＲＳＦによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質産生をダウンレギュレートさせることを示した（図２Ｃ）。これらの３Ｈ−標識チミジン取り込み、フローサイトメトリー解析、及びＥＬＩＳＡにおけるｐ１８ＩＮＫ４ｃの結果は、ｐ１６ＩＮＫ４ａと類似しており、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びｐ１８ＩＮＫ４ｃが同様の作用を有することが示唆された。【００８４】
以下に、図２Ａ〜Ｃを具体的に説明する。
図２Ａ及びＢは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子導入はＲＳＦの増殖を抑制し、Ｇ０／Ｇ１期における細胞周期停止をもたらしたことを示す図である。図２Ａに、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子を有するアデノウイルス（ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、黒いカラム）又はコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦを、ＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激して、３Ｈ−チミジン取り込みを評価した結果を示した。３検体中１検体の代表結果を示した。カラムとバーはそれぞれ、５個のウェルの平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ｐ１８ＩＮＫ４ｃによる３Ｈ−チミジン取り込みの平均低下率は４３％であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。図２Ｂに、細胞周期のフロー・サイトメトリー解析による、ｐ１８ＩＮＫ４ｃによるＧ０／Ｇ１期細胞の増加を示した。３検体の代表結果を示した。
図２Ｃは、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子導入は、ＲＳＦによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質産生を抑制したことを示す図である。ｐ１８ＩＮＫ４ｃアデノウイルス（ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、黒いカラム）及びコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦを、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの併用で刺激した。培養上清中のＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡで測定した。カラムとバーはそれぞれ、３検体の平均値と標準偏差（ＳＤ）を現している。ｐ１８ＮＫ４ｃによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１産生の平均低下率は、それぞれ４８％、７１％であった。差は統計的に有意であった（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）。【００８５】
＜評価結果：実施例４（ＣＤＫ４Ｉ）＞
被験物質として、ＣＤＫ４／６キナーゼを特異的に阻害する合成化合物であるＣＤＫ４Ｉ（２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−１］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン）（２−ｂｒｏｍｏ−１２，１３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５Ｈ−ｉｎｄｏｌｏ［２，３−１］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４−ｃ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ−５，７（６Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）を使用した。実施例１と同様に、ＣＤＫ４ＩのＲＳＦにおける影響を検証した。この化合物は、サイトカイン刺激されたＲＳＦによる３Ｈ−チミジン取り込みを用量依存的に阻害した。検証された最高濃度でさえ、細胞の生存に影響を及ぼすことなく、細胞周期進行におけるＧ０／Ｇ１期の割合を増加させた（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＣＤＫ４Ｉで処理されたＲＳＦは、コントロールであるＤＭＳＯ処理されたＲＳＦよりも、ＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１のタンパク質産生量が有意に減少した（図３Ｃ）。
また、実施例１と同様にして、ＣＤＫ４ＩのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を検証したところ、ｐ１６ＩＮＫ４ａと同様に、ＣＤＫ４ＩはＲＳＦにおけるＭＭＰ−３ｍＲＮＡを低下させたが、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡは低下させなかった（図１Ｅ及び図１Ｆ）。【００８６】
以下に、図３Ａ〜Ｃを具体的に説明する。
図３Ａ及び図３Ｂは、ＣＤＫ４Ｉは、Ｇ０／Ｇ１期における細胞周期停止を誘導することにより、ＲＳＦの増殖を阻害することを示す図である。ＲＳＦを、阻害濃度のＣＤＫ４／６特異的インヒビターＣＤＫ４Ｉで１２時間処理し、次いでＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激した。図３Ａには、処理済みＲＳＦによる３Ｈ標識−チミジン取り込みを、未処理ＲＳＦと比較して示した。図３Ｂには、フロー・サイトメトリー解析において、培地コントロール（ＤＭＳＯ）と比較し、濃度１μＭのＣＤＫ４Ｉで処理した細胞（ＣＤＫ４Ｉ）での、Ｇ０／Ｇ１期の増加を示した。２つの独立した実験の代表を示した。
図３Ｃは、ＣＤＫ４Ｉは、ＲＳＦによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質産生を抑制したことを示す図である。１μＭのＣＤＫ４Ｉ（ＣＤＫ４Ｉ、黒いカラム）又はコントロールである０．５％ＤＭＳＯ培地（コントロール、白いカラム）で処理したＲＳＦを、ＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激した。培養上清のＭＭＰ−３又はＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡで測定した。カラムとバーはそれぞれ、５検体の平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ＣＤＫ４ＩによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１産生の平均低下率は、それぞれ５７％と６４％であった（＊Ｐ＜０．０５）。【００８７】
＜評価結果：実施例５（活性型Ｒｂ）＞
活性型、つまり非リン酸化型Ｒｂ導入は、リウマチ様炎症に関与する組織分解酵素の１種であるＭＭＰ−１の産生を転写後レベルで抑制することが報告されている（Ｂｒａｄｌｅｙら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００４；  ５０：  ７８−８７参照）。被験物質として、リン酸化部位に置換変異を有する変異Ｒｂ遺伝子を利用した。この遺伝子をアデノウイルス導入することで、活性な非リン酸化型Ｒｂを増加させ、これによってＲｂのＣＤＫ依存性リン酸化の抑制を模倣させた（Ｃｈａｎｇら；Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２６７：５１８−５２２参照）。実施例１と同様に、活性型Ｒｂの、ＲＳＦにおける影響を検証した。活性型ＲｂのＲＳＦが活性型Ｒｂを過剰発現した場合、コントロールＲＳＦと比較し、３Ｈ−チミジン取り込みが減少した（図４Ａ）。細胞周期のフロー・サイトメトリー解析は、活性型Ｒｂが細胞周期をＧ０／Ｇ１期に停止させることを示した（図４Ｂ）。
細胞上清でのＥＬＩＳＡ解析は、活性型Ｒｂを発現するＲＳＦにおけるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１双方のタンパク質産生低下を示した（図４Ｃ）。リアルタイムＰＣＲ解析は、コントロールＲＳＦと比較し、活性型Ｒｂ過剰発現ＲＳＦにおいてＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１ｍＲＮＡが維持されることを明らかにした（図１Ｅ及び図１Ｆ）。これらのことから、ＭＭＰ−３の転写制御は、Ｒｂ非依存的であることが示された。【００８８】
以下に、図４Ａ〜Ｃを具体的に説明する。
図４Ａ及び図４Ｂは、構成的活性型Ｒｂの遺伝子導入は、ＲＳＦの増殖を抑制したことを示す図である。非リン酸化型Ｒｂをコードするアデノウイルス（Ｒｂ、黒いカラム）又はコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦをＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激し、３Ｈ−チミジン取り込みを評価した。図４Ａは３Ｈ−チミジン取り込みの評価結果である。２検体中１検体の代表結果を示している。カラムとバーは５個のウェルの平均値とＳＤを表している。図４Ｂには、フロー・サイトメトリー解析における、構成的活性型Ｒｂ発現ＲＳＦにおける細胞周期Ｇ０／Ｇ１期の増加を示した。独立した２検体の代表を示した。
図４Ｃは、構成的活性型Ｒｂは、ＲＳＦによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質産生を抑制したことを示す図である。構成的活性型Ｒｂアデノウイルス（Ｒｂ、黒いカラム）又はコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させたＲＳＦを、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの併用で、２４時間刺激した。培養上清中のＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１を、ＥＬＩＳＡで測定した。刺激されたＲＳＦによるこれらの分子の産生を、コントロール・アデノウイルスを感染させたコントロールＲＳＦと比較して示した。カラムとバーはそれぞれ、３検体の平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。ＲｂによるＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１産生の平均低下率は、それぞれ４８％、３６％であった（＊Ｐ＜０．０５）。【００８９】
以上、実施例１〜５により、被験物質として選択したｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、ＣＤＫ４Ｉ、活性型Ｒｂは、それぞれが抗関節リウマチ活性を有すると評価することができた。また、被験物質の種類により各項目の評価結果が異なることから、各被験物質は、多様な経路で関節破壊関連因子と関係しており、それぞれが独自の、関節リウマチに対する抑制効果を有している可能性が示された。【００９０】
（実施例６：硬骨における評価）
被験物質として、ＣＤＫ４Ｉ（ＣＤＫ４インヒビター；Ｍｅｒｃｋ社製）を選択し、硬骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する抑制作用の観点から、ＣＤＫ４Ｉの抗関節リウマチ活性を以下のようにして評価した。【００９１】
＜破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化の評価＞
ＤＢＡ／１Ｊマウス（オリエンタル酵母工業（株）製）の大腿骨より採取した骨髄細胞（ＢＭ）を、２．５×１０４細胞／ウェル（４８ウェルプレート）でまき、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２０ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を含んだα−ＭＥＭ培地（α−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２日間培養した。２日後、付着した細胞を骨髄／マクロファージ系統細胞（ＢＭＭ：ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）とした。ＢＭＭを、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  破骨細胞分化誘導因子（ＲＡＮＫＬ：ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ；ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含んだα−ＭＥＭ培地で培養し、破骨細胞（ＯＣ：Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）に分化させた。ＯＣ分化に及ぼすＣＤＫ４Ｉの作用を検討するため、ＣＤＫ４Ｉ（ＣＤＫ４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を、ＲＡＮＫＬ添加と同時に、図５Ｂに示す各濃度で細胞に加えた。３日後、ＴＲＡＰ染色キット（セルガレージ）で細胞を染色し、ＴＲＡＰ陽性多核（核が３つ以上認められる）細胞（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣ：ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ（＞３  ｎｕｃｌｅｉ）ｃｅｌｌｓ）をカウントした。
また、ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣより入手）（１×１０３細胞／ウェル；９６ウェルプレート）は、前記ＢＭと同様に、ＣＤＫ４Ｉ（１μＭ）存在、又は非存在下で、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、５日後、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣをカウントした。【００９２】
＜細胞増殖の評価＞
ＣＤＫ４Ｉによる細胞増殖への作用を検討するため、前記と同様に骨髄細胞（ＢＭ）を１．２５×１０４細胞（９６ウェルプレート）まき、Ｍ−ＣＳＦ存在下で２日間培養した後、Ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ、及び、ＣＤＫ４Ｉ（１μＭ）の存在又は非存在下で、３日間培養した。細胞増殖は、セルカウンティングキット−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８；同仁化学）で評価した。【００９３】
＜遺伝子発現の評価＞
−定量的ＰＣＲ−
ＢＭＭにＲＡＮＫＬを加えて、３日後の細胞からＲＮｅａｓｙ  ミニキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社）にて全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、オムニスクリプトＲＴキット（Ｏｍｉｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社）にてｃＤＮＡに合成した。サイバーグリーン（Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ）を用いた定量的ＰＣＲ法で、活性化Ｔ細胞核内因子ｃ１（ＮＦＡＴｃ１：ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃ１）、破骨細胞会合受容体（ＯＳＣＡＲ：ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ：ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の各遺伝子発現を、内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用い、リアルタイムＰＣＲ装置ＡＢＩ７９００（アプライドバイオシステム社製）にて解析した。ＢＭの発現を１として、各遺伝子発現を評価した。【００９４】
＜評価結果＞
Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬ存在下で、ＢＭＭからＯＣに分化誘導されるときの、ＣＤＫ４Ｉの作用を解析した。ＣＤＫ４Ｉはコントロール（ＤＭＳＯ）と比べて、著しくＯＣ分化を抑制した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
細胞増殖に影響を与えないＣＤＫ４Ｉ（１μＭ）の濃度においても、（図６）、破骨細胞の分化抑制が認められることから（図５Ｂ）、ＣＤＫ４Ｉは細胞増殖抑制に依存せずに、破骨細胞分化を抑制することが考えられた。
また、ＲＡＷ２６４．７でも破骨細胞分化の抑制が認められたことから（図７Ａ及び図７Ｂ）、ＣＤＫ４ＩはＭ−ＣＳＦの作用には影響を与えず、ＲＡＮＫＬによる作用を阻害することで、ＯＣ分化を抑制していることが示唆された。
ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の分化に必須な遺伝子であるＮＦＡＴｃ１の発現を誘導することが知られている。ＮＦＡＴｃ１のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ法で検討したところ、ＣＤＫ４ＩはＮＦＡＴｃ１の発現を著明に抑制した（図８Ａ）。更に、ＮＦＡＴｃ１によって発現誘導されるＯＳＣＡＲやＴＲＡＰのｍＲＮＡ発現も顕著に抑制された（図８Ｂ及び図８Ｃ）。このことから、ＣＤＫ４ＩはＮＦＡＴｃ１の発現を阻害することで、ＯＣの分化を抑制していることが示唆された。【００９５】
以上、実施例６により、被験物質として選択したＣＤＫ４Ｉは、抗関節リウマチ活性を有すると評価することができた。【００９６】
（参考例：ＣＤＫ４及びサイクリンＤ１の共導入）
なお、参考例として、ＲＳＦへの、ＣＤＫ４及びサイクリンＤ１の共導入の影響を調べた。
核局在化シグナルを有するヒト・サイクリンＤ１を導入したアデノウイルス（Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ）、及びヒトＣＤＫ４遺伝子を導入したアデノウイルス（Ａｄ−ＣＤＫ４）を準備した（Ｔａｍａｍｏｒｉ−Ａｄａｃｈｉら；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２；２９６：２７４−２８０、及び、Ｔａｍａｍｏｒｉ−Ａｄａｃｈら；Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９２：ｅ１２−１９参照）。実施例１と同様にして、ＲＳＦにおけるＣＤＫ４及びサイクリンＤ１の共導入の影響を検証した。結果を以下に示す。【００９７】
正常細胞でのＣＤＫ４／６活性はサイクリンＤ量によって制御されるが、サイクリンＤ遺伝子導入のみではＲＳＦの細胞周期進行を加速させなかった（データは図示せず）。核内ＣＤＫ４と結合するサイクリンＤの機能を促進させるために、サイクリンＤ１導入遺伝子の産物に核局在化シグナルをコードするミニ遺伝子を付加することで核内へ移動させた（Ｔａｍａｍｏｒｉ−Ａｄａｃｈｉら；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２；２９６：２７４−２８０参照）。アデノウイルスにより、ＲＳＦにサイクリンＤ１−ＮＬＳ遺伝子コンストラクトとＣＤＫ４遺伝子を共導入することで、Ｒｂがリン酸化された、つまり、Ｒｂが不活化された（Ｔａｍａｍｏｒｉ−Ａｄａｃｈｉら；Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９２：ｅ１２−１９）。これは、培養ＲＳＦでの３Ｈ−チミジン取り込みをアップレギュレートさせ、Ｇ０／Ｇ１期の細胞を減少させた（図９Ａ及び図９Ｂ）。
また、サイクリンＤ１とＣＤＫ４とを共導入することで、ＣＤＫ４／６キナーゼ活性を上昇させた場合の、ＲＳＦでの炎症メディエーターの産生（間接破壊関連因子）に対する影響を調べた。調製されたアデノウイルスの力価には限度があるため、培養上清についてはＭＭＰ−３のＥＬＩＳＡのみ行った。サイクリンＤ１−ＮＬＳとＣＤＫ４を過剰発現するＲＳＦを刺激した場合、コントロール・ウイルス感染ＲＳＦを刺激した場合よりも多量のＭＭＰ−３を産生した（図９Ｃ）。したがって、ＭＭＰ−３発現レベルはＣＤＫ４活性と直接相関していた。ＣＤＫ４活性の上昇は、細胞増殖及びＲＳＦでのＭＭＰ−３発現をアップレギュレートさせることが示された。【００９８】
以下に、図９Ａ〜Ｃを具体的に説明する。
図９Ａ及び図９Ｂは、サイクリンＤ１−ＮＬＳ及びＣＤＫ４の同時遺伝子導入はＲＳＦの増殖を高めたことを示す図である。ＮＬＳを有するサイクリンＤ１及びＣＤＫ４をコードするアデノウイルス（Ｄ１＋ＣＤＫ４、黒いカラム）、又はコントロール・アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を、ＲＳＦに感染させた。感染から６０時間後、ＲＳＦによる３Ｈ−チミジン取り込みをカウントした。３Ｈ−チミジン取り込みの結果を、図９Ａに示している。カラムとバーはそれぞれ、平均値と標準偏差（ＳＤ）を表している。平均増加率は２４０％であった。差は統計的に有意であった（＊Ｐ＜０．０１）。また、細胞周期のフロー・サイトメトリー解析の結果を、図９Ｂに示している。コントロールであるアデノウイルス感染ＲＳＦ（コントロール）と比較し、サイクリンＤ１−ＮＬＳ及びＣＤＫ４の遺伝子を導入したＲＳＦ（Ｄ１＋ＣＤＫ４）においては、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の減少が示された。独立した２検体の代表を示した。
図９Ｃは、サイクリンＤ１−ＮＬＳ及びＣＤＫ４の遺伝子導入が、ＲＳＦによるＭＭＰ−３タンパク質産生をアップレギュレートさせたことを示す図である。ＮＬＳを有するサイクリンＤ１及びＣＤＫ４（Ｄ１＋ＣＤＫ４、黒いカラム）発現ＲＳＦと、コントロールＲＳＦ（コントロール、白いカラム）との培養上清におけるＭＭＰ−３を、ＥＬＩＳＡにより測定した。カラムとバーはそれぞれ、コントロールＲＳＦと比較した、３検体の平均値と標準偏差（ＳＤ）を示している。平均増加率は４９０％であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。【００９９】
なお、図１０には、本実施例１〜５及び参考例で関節リウマチ性の滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）について示された、ＣＤＫを介した関節破壊に関連する生命現象の多様な調節を、経路図として表した。
ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、又は小分子ＣＤＫ４インヒビター（ＣＤＫ４Ｉ）によるサイクリンＤ−ＣＤＫ４／６阻害は、ＲＳＦでのＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質産生を抑制した。また、このＣＤＫ４／６阻害はＭＭＰ−３ｍＲＮＡを抑制したが、ＭＣＰ−１ｍＲＮＡは抑制しなかった。活性型Ｒｂは、転写後調節によりＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１タンパク質発現を低下させた。ｐ２１Ｃｉｐ１はＣＤＫ−Ｒｂ経路以外で抗炎症作用を発揮できることが報告されており、本実施例においても同様に確認された。サイクリン依存性キナーゼ４／６は、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）依存的及び非依存的経路により、種々の関節炎メディエーター（関節破壊関連因子）の発現を直接的に制御することが示唆された。【０１００】
また、本実施例における結果から、以下のようなことが実証又は推測される。
本実施例において、ＣＤＫ４／６キナーゼ活性がＲｂ非依存的にＭＭＰ−３産生を制御することが明らかにされた。この制御はｍＲＮＡレベルである。ＣＤＫ４／６の基質であるＲｂは、ＭＭＰ−３と同様に、ＭＣＰ−１の発現を転写後レベルで調節可能であるが、ＣＤＫ４／６活性はこれよりも上流で作用している（図１０）。現在、知られている唯一のＣＤＫ４／６の基質はＲｂであり、これは細胞周期進行のためのＥ２Ｆ転写因子の機能的可用性を調節する。本実施例の結果は、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡの産生を調節する、Ｒｂ以外の、ＣＤＫ４／６への結合分子の存在を予測している。また、ＭＭＰ−３ｍＲＮＡ以外の組織分解酵素のｍＲＮＡ発現も、同様に調節されている可能性が高い。
Ｂｒａｄｌｅｙらは、Ｒｂのリン酸化状態とＭＭＰ−１及びＩＬ−６産生との相関関係を報告した（Ｂｒａｄｌｅｙら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、２００４；５０：７８−８７参照）。彼らは、非リン酸化Ｒｂによる転写後レベルでのＭＭＰ−１発現抑制を示し、この抑制がｐ３８キナーゼ阻害を介することを示唆した。本発明者らは、同様の調節がＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１の翻訳において作用することを見出した。しかし、本発明において明らかにされたＲｂ非依存的制御は、ＭＭＰ−３産生調節の中心にあると考えられる。これは、Ｒｂ依存性制御よりも上流にある。また、ＣＤＫ阻害分子が、活性型Ｒｂと同程度の効率でＭＭＰ−３産生を抑制することも指摘されている。
本発明者らは、ｐ２１Ｃｉｐ１がＣＤＫ非依存的に炎症メディエーターを調節可能であることを報告した。本実施例において、本発明者らは、ＣＤＫとその基質であるＲｂは個別にそれらを調節可能であることを示している。したがって、細胞周期タンパク質は、多様な経路において炎症分子の発現と密接に関連している。恐らく、未知なる進化上の選択が、細胞周期調節因子による炎症の安全制御をもたらしたのであろう。【０１０１】
また、ＣＤＫ４／６の阻害によりダウンレギュレートされる炎症メディエーター（関節破壊関連因子）は、リウマチ様炎症において重要な役割を果たす。それにもかかわらず、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、ＭＭＰ−３及びＭＣＰ−１の産生を完全には消失させなかった。ＩＬ−１β及びＴＮＦαで刺激されたｐ１６ＩＮＫ４ａ発現ＲＳＦは、未刺激のＲＳＦよりも多量の炎症メディエーターを産生する。ＣＤＫ４／６阻害による抗炎症作用は、ＣＤＫＩ遺伝子治療におけるＣＤＫＩの増殖抑制作用を助ける可能性があると、本発明者らは推測している。
ヒーラ細胞において、ｐ１６ＩＮＫ４ａはＮＦ−кＢと相互作用し、その転写を阻害する（Ｗｏｌｆｆ及びＮａｕｍａｎｎ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９９；１８：２６６３−２６６６参照）。本発明者らの予備試験では、ＲＳＦのｐ１６ＩＮＫ４ａが、ＣＤＫ４／６非依存的に他のサイトカイン発現を調節可能であることを示唆している。しかし、ＲＳＦでのｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現が、ＡＰ−１及びＮＦ−кＢのＤＮＡ結合活性を抑制しないことを本発明者らは見出した（データは図示せず）。Ｅｔｓファミリー転写因子であるＥｔｓ−１、Ｅｔｓ−２は、ＭＭＰ−３発現をアップレギュレートさせるため、それらの抑制がＭＭＰ−３発現のダウンレギュレーションの主な原因となる可能性がある（Ｗａｓｙｌｙｋら；ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９１；１０：１１２７−１１３４、及び、Ｗｈｉｔｅら；Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ、１９９７；３６：３２１−３３５参照）。
ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ、及びｐ２１Ｃｉｐ１遺伝子導入が、ＣＤＫ４／６活性の阻害によりＲＳＦでの炎症メディエーターやプロテアーゼの産生を抑制可能であることを本発明者らは示した。小分子ＣＤＫＩ化合物（ＣＤＫ４Ｉ）も、これらの分子の発現をダウンレギュレートさせた。臨床応用のためには、遺伝子導入よりも、小分子ＣＤＫインヒビターによるサイクリン−ＣＤＫキナーゼ活性調節の方がより実現可能であると考えられる。多くの小分子ＣＤＫインヒビターが既に開発されており、抗腫瘍薬として治験が実施されている（Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００３；２２：６６０９−６６２０参照）。それらは関節リウマチ治療に有用であろう。炎症分子の阻害はＲｂ非依存的であるため、異なるインヒビターが、増殖抑制及び抗炎症作用の異なるバランスを有する可能性がある。したがって、小分子ＣＤＫインヒビターを用いて実際にリウマチ患者を治療する場合、２つの共同作用を最適化する必要があるだろう。その最適化においても、本発明の評価方法及びスクリーニング方法は、非常に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する物質を効率的に選択することができることから、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質の探索に非常に有用である。
前記評価方法又はスクリーニング方法は、例えば、以下（１）〜（４）のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）新たに開発された関節リウマチ候補薬の、抗関節リウマチ活性を効率的に評価することができる。
（２）公知のＣＤＫ阻害剤、他疾患対象の薬剤などの中から、関節リウマチ治療薬又は予防薬として使用可能な物質を、効率的に選択することができる。
（３）既存の関節リウマチ治療薬又は予防薬の中から、例えば、患者の症状に応じて所望の効果を有する治療薬又は予防薬を適切に選択することができる。
（４）既存の関節リウマチ治療薬又は予防薬に改良を加え、より副作用の少ない治療薬又は予防薬など、所望の効果に優れた治療薬又は予防薬を効率的に得ることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007097109.tif 000032
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