(57)【要約】本発明の目的は、様々な基質に対して、温和な条件下でアミド化合物またはエステル化合物を加水分解する方法を提供することである。様々な土壌分離菌や保存菌株を対象としたスクリーニングを行った結果、アシルアミダーゼ活性をもつ微生物を取得した。また、その微生物から、該活性を有する酵素の単離精製に成功した。さらに、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換えの手法で取得し、その塩基配列を明らかにした。さらに、該遺伝子を用いて当該酵素を産生する形質転換体を育種することで、より高活性な該形質転換体を作製した。その高活性な形質転換体を用いて、温和な条件下でアミド加水分解反応またはエステル加水分解反応を行う方法を確立した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質を有するアシルアミダーゼ：
（１）分子量：ゲルろ過分析で約９０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析で約４０，０００；
（２）基質特異性：ホルムアニリド、アセトアニリド、酢酸フェニルのそれぞれに実質的に作用し、かつ、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンのそれぞれに実質的に作用しない；
（３）作用至適ｐＨ：６〜９；
（４）作用至適温度：２５〜４５℃；
（５）熱安定性：１０〜４０℃；
（６）阻害剤：ＨｇＣｌ２、ＡｇＮＯ３で活性が完全に阻害される。
【請求項２】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から得られた酵素である、請求項１記載のアシルアミダーゼ。
【請求項３】
バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得られた酵素である請求項１記載のアシルアミダーゼ。
【請求項４】
バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）から得られた酵素である、請求項１記載のアシルアミダーゼ。
【請求項５】
下記のいずれかのポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の理化学的性質を示すアシルアミダーゼ活性を有する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
少なくともホルムアニリドに作用するアシルアミダーゼ活性を有する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡ：
（Ａ）配列番号２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルアミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１記載の理化学的性質を示すアシルアミダーゼをコードする請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
少なくともホルムアニリドに作用するアシルアミダーゼ活性を有するアシルアミダーゼをコードする請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１４】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、請求項１３または１４に記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、得られた培養液から、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアシルアミダーゼあるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを取得することを特徴とする、アシルアミダーゼあるいはポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
アミド化合物あるいはエステル化合物に請求項１〜４のいずれか１項に記載のアシルアミダーゼあるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、請求項１３又は１４に記載の形質転換体の培養物を作用させ、前記アミド化合物あるいはエステル化合物を加水分解させることを特徴とするカルボン酸、アルコール、あるいは、アミンの製造方法。
【請求項１７】
ラセミ体のアミド化合物あるいはエステル化合物に請求項１〜４のいずれか１項に記載のアシルアミダーゼあるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、請求項１３又は１４に記載の形質転換体の培養物を作用させ、前記ラセミ体の一方の立体のみを選択的に加水分解させることを特徴とする光学活性体の製造方法。
【請求項１８】
一般式（１）：
【化１】
2007097429.tif 000008
（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立して０〜７の整数を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、シアノ基、メチル基またはカルボキシル基を示し、これらの基は置換されていてもよい。Ｒ３は水素原子、炭素数１〜６の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基を示す。Ｘは窒素原子あるいは酸素原子を示す。）で表されるエステル化合物あるいはアミド化合物に請求項１〜４のいずれか１項に記載のアシルアミダーゼあるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、請求項１３又は１４に記載の形質転換体の培養物を作用させることによる、一般式（２）：
【化２】
2007097429.tif 000009
（式中、Ｘ、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２は前記式（１）と同じ）で表される光学活性アルコールあるいは光学活性アミンの製造方法。
【請求項１９】
一般式（１）で表される化合物において、ｍ＝０〜３かつＲ１が置換されていてもよいメチル基、ｎ＝０〜４かつＲ２がメチル基あるいは炭素数６〜１２のアリール基であり、Ｒ３が水素原子又は炭素数１〜３の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基である請求項１８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アシルアミダーゼ、そのアシルアミダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを利用したアシルアミダーゼの製造方法、および、アシルアミダーゼを用いた光学活性化合物の製造方法に関する。アシルアミダーゼは、温和な条件下でアミド結合またはエステル結合を加水分解できる産業上有用な酵素である。
【背景技術】
【０００２】
アミド結合を化学的に加水分解するには強酸性や強塩基性など激しい条件下での反応が必要であるが、アミダーゼに代表されるアミド加水分解酵素を用いることで、温和な条件下でのアミド結合の加水分解反応が可能である。また、アミダーゼはエナンチオ選択的な反応が可能であり、光学活性な化合物を生成できることも知られている（特許文献１）。
しかし、酵素反応は一般に基質特異性が厳密であり、目的の反応に適用できない場合が多い。これまでに知られている広い基質特異性をもつアミダーゼとしては、ノカルディア・グロベルーラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）由来のもの（特許文献２、非特許文献１）、アースロバクター・アウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来のもの（非特許文献２）などが挙げられる。前者はアセトアニリド類、ベンズアミド等のアミド類、酢酸フェニル等のエステル類など広範な化合物に作用する。後者は広範なＮ−アセチルアリールアルキルアミンに作用するが、アセチル基以外のアシル基には作用しない。このようにさまざまな基質特異性をもつアミド加水分解酵素が見出されている。
【特許文献１】特開昭６１−８８８９４号公報
【特許文献２】特開平３−２７７２８１号公報
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９，１７−２４（１９９１）
【非特許文献２】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４７，６５０−６５７（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、新規のアシルアミダーゼを取得することである。また、この新規なアシルアミダーゼをコードするＤＮＡを単離し、それを利用して、様々な基質に対して、温和な条件下でのアミド加水分解反応またはエステル加水分解反応の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、様々な土壌分離菌や保存菌株を対象としたスクリーニングを行った結果、アシルアミダーゼ活性をもつ微生物を取得した。また、その微生物から、該活性を有する酵素の単離精製に成功した。
さらに、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換えの手法で取得し、その塩基配列を明らかにした。さらに、該遺伝子を用いて当該酵素を産生する形質転換体を育種することで、より高活性な該形質転換体を作製した。その高活性な形質転換体を用いて、温和な条件下でアミド加水分解反応またはエステル加水分解反応を行う方法を確立した。
本発明は、以下の複数の特徴を有する。【０００５】
本発明の一つの特徴は、下記（１）から（６）の理化学的性質を有するアシルアミダーゼである：
（１）分子量：ゲルろ過分析で約９０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析で約４０，０００；
（２）基質特異性：ホルムアニリド、アセトアニリド、酢酸フェニルのそれぞれに実質的に作用し、かつ、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンのそれぞれに実質的に作用しない；
（３）作用至適ｐＨ：６〜９；
（４）作用至適温度：２５〜４５℃；
（５）熱安定性：１０〜４０℃；
（６）阻害剤：ＨｇＣｌ２、ＡｇＮＯ３で活性が完全に阻害される。
本発明の別の特徴は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドである。
本発明の別の特徴は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および、このベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明の別の特徴は、一般式（１）：【０００６】
【化１】
2007097429.tif 000002
【０００７】
（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立して０〜７の整数を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、シアノ基、メチル基またはカルボキシル基を示し、これらの基は置換されていてもよい。Ｒ３は水素原子、炭素数１〜６の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基を示す。Ｘは窒素原子あるいは酸素原子を示す。）で表されるエステル化合物あるいはアミド化合物に前記アシルアミダーゼ、ポリペプチドあるいは該酵素の生産能を持つ微生物の培養物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：【０００８】
【化２】
2007097429.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｘ、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２は前記式（１）と同じ）で表される光学活性アルコールあるいは光学活性アミンの製造方法である。
本発明のその他の特徴及びその効果は、以下の実施形態の記載によって明らかにされる。【００１０】
以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明する。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等の成書に記載されている方法により行うことができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。また、本明細書の記述に用いられる酵素活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌの生成物であるアミン、アルコールあるいはアンモニアを生成する酵素量と定義した。【００１１】
１．アシルアミダーゼ
本発明の実施形態の酵素は下記（１）から（６）の理化学的性質を有するアシルアミダーゼである：
（１）分子量：ゲルろ過分析で約９０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析で約４０，０００；
（２）基質特異性：ホルムアニリド、アセトアニリド、酢酸フェニルのそれぞれに実質的に作用し、かつ、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンのそれぞれに実質的に作用しない；
（３）作用至適ｐＨ：６〜９；
（４）作用至適温度：２５〜４５℃；
（５）熱安定性：１０〜４０℃；
（６）阻害剤：ＨｇＣｌ２、ＡｇＮＯ３で活性が完全に阻害される。
（分子量）
酵素の分子量は、例えば、ＴＳＫ  ＧＥＬ−Ｇ−３０００（０．７５×６０ｃｍ、東ソー株式会社製）を用いたゲルろ過分析により行い、標準蛋白質に対する相対溶出時間から決定しうる。溶離液としては、０．２０Ｍ  ＫＣｌを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いる。また、サブユニットの分子量は、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白質に対する相対移動度から決定しうる。【００１２】
（基質特異性）
上記酵素の各基質に対するアミダーゼ活性は、例えば、後述の実施例３に記載の方法で測定することができる。即ち、精製酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させる。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、生成したアミン、アルコールあるいはアンモニアを定量する。
［基質溶液組成］
基質：１〜１００ｍＭ、
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：５０ｍＭ【００１３】
本明細書における「アシルアミダーゼ」とは、Ｐ−ＣＯ−ＮＨ−Ｑで表される化合物（Ｐは任意の置換基、Ｑは水素原子以外の任意の置換基を示す）に実質的に作用し、Ｐ−ＣＯＯＨとＱ−ＮＨ２に加水分解する活性を有すればいかなるものでも意味する。例えば、ＩＵＢＭＢの分類によれば、アリルアシルアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１３）、ペニシリンアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）、アリルアルキルアシルアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．７６）、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェネチルアミンヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．８５）、ホルムアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．９）、ペプチドデホルミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．２７）、Ｎ−サブスティテューティッドホルムアミドデホルミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．９１）などが挙げられる。
しかし、ＩＵＢＭＢの分類ではアシルアミダーゼの分類が不明確な場合があることが知られている（酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８２年、ｐ．５８５）。したがって、本発明の酵素を他の酵素と区別するために、特定の基質に対する反応性の違いから特徴づけを行った。【００１４】
すなわち、本発明のアシルアミダーゼは、ホルムアニリド、アセトアニリド、酢酸フェニルのそれぞれに実質的に作用し、かつ、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンのそれぞれに実質的に作用しないアシルアミダーゼである。
ここで、上記の「実質的に作用しない」とは、後述の実施例３の方法でアミダーゼ活性を測定した場合において、各基質を用いたときの精製酵素の比活性が０．０２Ｕ／ｍｇ以下であることを意味する。本発明のアシルアミダーゼとしては、上記比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ以下のものが好ましく、０．０００２Ｕ／ｍｇ以下のものが更に好ましい。
また、「実質的に作用する」とは、上記の方法でアミダーゼ活性を測定した場合において、各基質を用いたときの精製酵素の比活性が０．２Ｕ／ｍｇ以上であることを意味する。本発明のアシルアミダーゼとしては、上記比活性が２．０Ｕ／ｍｇ以上のものが好ましい。【００１５】
（作用至適ｐＨ）
酵素反応の至適ｐＨは、例えば、アセトアニリドを基質とした活性を、ｐＨ４．０〜１１．０の範囲で測定したとき、その最大の活性を１００％として、おおよそ８０％以上の相対活性を示す範囲とする。ただし、上記測定方法において、測定を行うｐＨに応じて基質溶液における緩衝液は下記のものを用いる。
ｐＨ４．０〜６．０  ：０．１Ｍクエン酸緩衝液
ｐＨ６．０〜８．０  ：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．５〜９．０  ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ９．０〜１１．０：０．１Ｍグリシンナトリウム緩衝液【００１６】
（作用至適温度）
酵素反応の至適温度は、例えば、アセトアニリドを基質とした活性を、反応温度１０〜８０℃の範囲で測定し、３０℃での活性を１００％として、おおよそ８０％以上の相対活性を示す範囲とする。【００１７】
（熱安定性）
酵素の熱安定性は、例えば、精製酵素を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に添加し、これを１０〜８０℃において３０分間処理した後、上記アミダーゼ活性を測定することで決定しうる。【００１８】
（阻害剤）
阻害剤（例えばＨｇＣｌ２、またはＡｇＮＯ３が含まれる）の添加効果は、例えば以下のように決定しうる。即ち、精製酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させる。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、生成したアニリンを定量する。ここで、「アミダーゼ活性を完全に阻害する」とは、阻害剤を添加して以下の測定を行ったときに、阻害剤を添加しない場合に比べて、その活性が、１／１００以下であることをいう。本発明のアシルアミダーゼとしては、上記活性が１／１０００以下であることが好ましく、さらに好ましくは１／１００００以下である。【００１９】
［基質溶液組成］
アセトアニリド                      ５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）      １００ｍＭ
阻害剤                              １ｍＭ
計０．９ｍＬ【００２０】
（アセトアニリドに対するＫｍ）
酵素の、アセトアニリドに対するＫｍは、例えば以下のように決定しうる。即ち、精製酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させる。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアニリンを定量し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ＰｌｏｔｓによりＫｍを求める。
［基質溶液組成］
アセトアニリド          ０．１〜２．５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）      １００ｍＭ
計０．９ｍＬ
本発明のアシルアミダーゼは、ラセミ体のアミド化合物あるいはエステル化合物を立体選択的に加水分解させることができる。【００２１】
２．酵素の取得およびアミノ酸配列
本発明の酵素は、上記性質を示す酵素であれば、いかなる酵素であっても含まれるが、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物から取得できる。本発明の酵素の起源となる微生物としては、好ましくは当業者が公的保存機関（例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ））より容易に入手可能なバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）が挙げられ、さらに好ましくは、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１が挙げられる。この、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１は、平成１９年１月２２日付けで、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている（原寄託日：平成１８年１月２６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。上記バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌学的性質は当業者に周知である。上記バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１の菌学的性質は、所定のアシルアミダーゼ活性を有するほか、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌学的性質と同様である。【００２２】
（培地成分）
本発明の酵素を生産する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。【００２３】
（酵素精製）
本発明の酵素を生産する微生物からの該酵素の精製は、当業者に周知の蛋白質精製法により行い得る。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、アシルアミダーゼを単離できる。【００２４】
（アミノ酸配列）
精製したアシルアミダーゼは、後述する方法でそれをコードするＤＮＡ配列を明らかにでき、そのＤＮＡ配列からアシルアミダーゼのアミノ酸配列を決定できる。このようにして得られるアシルアミダーゼとしては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。しかし、本発明の酵素はこれに限定されず、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも、それがアシルアミダーゼ活性（好ましくは立体選択的なアシルアミダーゼ活性）を有する限り、本発明に包含される。
本発明のアシルアミダーゼ及びポリペプチドは、天然のものであってもよいし、人工的に改変されたものであってもよい。【００２５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を利用して、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等の実験書に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
アミノ酸を置換、挿入、欠失または付加する場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、同様の機能を有する、由来の異なる複数の酵素について、例えば、ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス社製）のマルチプルアライメント機能を利用して、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を示す。
配列番号１における高度保存領域としては、例えば、１１１〜１１５番目、１３８〜１４９番目、１６３〜１６７番目のアミノ酸配列等が挙げられる。【００２６】
置換、挿入、欠失または付加されるアミノ酸の数（上記「数個のアミノ酸」）としては、１０以下が好ましく、５以下がより好ましく、３以下が更に好ましい。改変されたアミノ酸配列は、１種類のタイプ（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換後のアミノ酸はもとのアミノ酸の同族アミノ酸であるのが好ましい。
本明細書においては、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ【００２７】
本発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドも、本発明のポリペプチドである。
本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。
このように、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、配列番号１に記載のポリペプチドへのランダムな変異導入や活性に不要な配列を除去することで得ることができる。
本発明のポリペプチドは、上述の（１）〜（６）の理化学的性質を示すアシルアミダーゼ活性を有するか、又は、少なくともホルムアニリドに作用するアシルアミダーゼ活性を有することが好ましい。【００２８】
３．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上述の新規アシルアミダーゼ、及び、ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。精製された上記ポリペプチドが取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該ポリペプチドの起源となる微生物より上記ＤＮＡを取得することができる。【００２９】
以下に、本発明のＤＮＡを取得する方法として、上記バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１を用いた例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、該微生物の無細胞抽出液より精製した上記ポリペプチド（酵素）を、適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりアミノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。
次に、通常のＤＮＡ単離法、例えばＭｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４３２１−４３２５，１９８０）により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ＡＢＩ３７３Ａ型ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行われ得る。該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、サザンハイブリダイゼーション法によりその全体の配列を決定することができる。【００３０】
このようにして得られるＤＮＡとしては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。しかし、本発明のＤＮＡはこれに限定されず、上述した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはすべて本発明に包含される。例えば、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは本発明に包含される。
ここで、「配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。
本発明のＤＮＡは、天然のものであってもよいし、人工的に改変されたものであってもよい。【００３１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件である。好ましくは、上記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄を行う条件であり、より好ましくは上記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄する条件であり、更に好ましくは上記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄する条件である。
本発明のＤＮＡは、上述の（１）〜（６）の理化学的性質を示すアシルアミダーゼをコードするか、又は、少なくともホルムアニリドに作用するアシルアミダーゼ活性を有するアシルアミダーゼをコードすることが好ましい。【００３２】
４．ベクター
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。【００３３】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等）等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含むベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡社製）、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、国際公開第９４／０３６１３号パンフレットに記載の方法によって当業者が作成可能なｐＵＣＮＴ等に本発明のＤＮＡを発現可能な状態で連結し、好適に用いることができる。【００３４】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００３５】
５．宿主
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは公知の方法により宿主細胞に導入し得る。宿主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウム法により、当該ベクターを導入することができる。【００３６】
６．アシルアミダーゼあるいはポリペプチドの製造方法
本発明は、また、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、上述の形質転換体を栄養培地中で培養し、得られた培養液から、上述のアシルアミダーゼあるいはポリペプチドを取得することにより、アシルアミダーゼあるいはポリペプチドを製造する方法に関する。
すなわち、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１、又は本発明の形質転換体を培養することにより、アシルアミダーゼを効率良く製造することができる。バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１、及び、本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１、及び、本発明の形質転換体の培養液中に蓄積したアシルアミダーゼは、当該培養液のままアシルアミダーゼ含有物として使用することも可能であるが、通常公知の蛋白質精製手法を用いて、精製もしくは部分精製した後に使用することもできる。【００３７】
７．アミド化合物あるいはエステル化合物の加水分解
アミド化合物あるいはエステル化合物に、上述の新規アシルアミダーゼあるいはポリペプチド、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、上述の形質転換体の培養物を作用させ、前記アミド化合物あるいはエステル化合物を加水分解させることにより、カルボン酸、アルコール、あるいは、アミンを製造することができる。本発明のアシルアミダーゼまたは当該酵素の生産能を持つ微生物は、光学活性化合物の製造に好適である。【００３８】
８．光学活性化合物の製造方法
次に、本発明のアシルアミダーゼまたは当該酵素の生産能を持つ微生物を用いて光学活性化合物を製造する方法について説明する。
本発明の光学活性体の製造方法は、ラセミ体のアミド化合物あるいはエステル化合物に上述のアシルアミダーゼあるいはポリペプチド、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、または、上述の形質転換体の培養物を作用させ、前記ラセミ体の一方の立体のみを選択的に加水分解させることを特徴とする。
本発明のアミダーゼの生産能を持つ微生物としては、例えば、前記バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）、及び、上述のＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体が挙げられる。
本製造方法によれば、一般式（１）：【００３９】
【化３】
2007097429.tif 000004
【００４０】
で表されるエステル化合物あるいはアミド化合物に前記酵素あるいは該酵素の生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（２）：【００４１】
【化４】
2007097429.tif 000005
【００４２】
で表される光学活性アルコールあるいは光学活性アミンを製造することができる。
前記式（１）および（２）において、ｍおよびｎはそれぞれ独立して０〜７の整数を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、シアノ基、メチル基またはカルボキシル基を示し、これらの基は置換されていてもよい。Ｒ３は水素原子、炭素数１〜６の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基を示す。Ｘは窒素原子あるいは酸素原子を示す。【００４３】
炭素数６〜１４のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。炭素数４〜１４のヘテロアリール基としては、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基等が挙げられる。炭素数６〜１４のアリールオキシ基としては、フェノキシ基、ナフトキシ基等が挙げられる。炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基としては、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。炭素数３〜５の分岐アルキル基としてはイソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。炭素数２〜５のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基等が挙げられる。炭素数２〜５のアルキニル基としては、アセチレン基等が挙げられる。炭素数５〜７のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。なお、アルコキシカルボニル基の炭素数はカルボニル炭素を含めた数である。
これらの基は更に置換されていてもよく、その置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基やメチレンジオキシ等の炭素数１〜４のアルコキシ基等が挙げられる。【００４４】
前記式（１）で表される化合物の中では、ｍ＝０〜３かつＲ１が置換されていてもよいメチル基、ｎ＝０〜４かつＲ２がメチル基あるいは炭素数６〜１２のアリール基であり、Ｒ３が水素原子又は炭素数１〜３の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基であることが好ましい。具体的には、Ｎ−（１−フェニルエチル）アセトアミド、１−フェニルエチルアセテート等が挙げられる。
前記式（１）で表される化合物が、ｍ＝０〜３かつＲ１が置換されていてもよいメチル基、ｎ＝０〜４かつＲ２がメチル基あるいは炭素数６〜１２のアリール基であり、Ｒ３が炭素数１〜３の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基である場合、生成するアミンあるいはアルコールが３７％ｅ．ｅ．、５１％ｅ．ｅ．、さらには９９％ｅ．ｅ．以上の高い光学純度で得ることができる。
本発明の製造方法においては、前記アミドあるいはエステル化合物に、前記本発明の酵素または当該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させる。ここで、「培養物」とは、菌体を含む培養液、培養菌体、又はその処理物を意味する。ここで「その処理物」とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、又はそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらにこれら酵素及び培養物は、公知の手段により固定化酵素あるいは固定化菌体の形態として用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。【００４５】
（基質濃度）
反応に用いる基質の濃度としては、アミドあるいはエステル化合物が、反応液組成中、０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。【００４６】
（反応ｐＨ）
本発明の酵素を作用させる際のｐＨは、酵素の作用至適ｐＨの観点から、下限は、好ましくはｐＨ５．０以上であり、より好ましくはｐＨ６．０以上であり、上限は、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下である。【００４７】
（反応温度）
本発明の酵素を作用させる際の温度は、酵素の作用至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２０℃以上であり、より好ましくは２５℃以上であり、好ましくは４５℃以下であり、より好ましくは４０℃以下である。【００４８】
（溶媒）
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒；ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
上記反応は、１相系で行ってもよいし、必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて、水相と有機溶媒相との２相系で反応を行うこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。【００４９】
（反応時間）
反応は、通常、ラセミ体のエステルあるいはアミド化合物の半量程度が加水分解されるまでの反応をおこなう。通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。なお、求められる生成物の光学純度や収率に応じて、反応の初期の段階で反応を中断したり、あるいは過剰に反応させてもよい。【００５０】
（抽出精製）
上記の反応により、一般式（２）で表される光学活性化合物と未反応の対掌体の基質が生成する。生成した光学活性化合物、および未反応の対掌体の基質は反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
例えば、生成物が光学活性アミンである場合、ｐＨを酸性に調節後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の対掌体の基質を選択的に抽出することができる。その後、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒をもちいて生成した光学活性アミノ化合物抽出することができる。
上記の反応における未反応の対掌体の基質は、光学活性を維持したままエステルあるいはアミド部分を通常の方法で加水分解することができ、必要に応じて、上記反応で得られた光学活性体とは逆の立体のアルコールあるいはアミンを導くことができる。
また、上記の反応によって得られた光学活性アルコールあるいはアミンは、光学活性を維持したままエステル化あるいはアミド化することができる。このようにして得られた基質で実施形態の酵素反応を複数回繰り返すことにより、必要に応じて、より光学純度の高い目的化合物を得ることも可能である。
【発明の効果】
【００５１】
本発明により、新規のアシルアミダーゼ、この新規なアシルアミダーゼをコードするＤＮＡ、または、それらのいずれかを利用して、様々な基質に対して、温和な条件下でアミド化合物あるいはエステル化合物を加水分解する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）  アシルアミダーゼＨＢＳの精製
バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）を５Ｌの培地（組成：ポリペプトン  １０ｇ／Ｌ、Ｍｅａｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ３ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．２））にて、２８℃で２４時間培養した。ついで、遠心分離により培養液から菌体を集め、生理食塩水で十分に洗浄したのち、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕により破砕した。次に、該破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調整した。
得られた無細胞抽出液に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、ついで生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させて、ついで遠心分離により生じた沈殿を回収した。【００５３】
この沈殿を１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解させ、さらに同緩衝液に対して透析をおこなった。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（ｓｉｚｅ：３０ｘ２１５ｍｍ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムおよび、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により活性画分を溶出させた。【００５４】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度２０％となるように硫酸アンモニウムを溶解し、２０％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（ｓｉｚｅ：２０×６５ｍｍ）に供し、活性画分を吸着させた。１０％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、ついで５％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄したのち、１ｍＭ  ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で活性画分を溶出させた。【００５５】
溶出させた活性画分を集めて、１ｍＭ  ＤＴＴを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析をおこなった。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（ｓｉｚｅ：２０ｘ１５ｍｍ）に供し、活性画分を吸着させた。１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄したのち、１ｍＭ  ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で活性画分を溶出させた。【００５６】
溶出させた活性画分を集めて、２０％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で十分に希釈した。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー株式会社製）カラム（ｓｉｚｅ：２０ｘ２０ｍｍ）に供し、活性画分を吸着させた。１５％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、ついで１０％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄したのち、５％硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で活性画分を溶出させた。【００５７】
溶出させた活性画分を集めて、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素をＨＢＳと称する。
なお、アシルアミダーゼの活性は以下のように測定した。即ち、酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させた。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアニリン濃度を定量した。得られたアシルアミダーゼの活性は、精製酵素１ｍｇあたり２．７Ｕであった。【００５８】
［基質溶液組成］
アセトアニリド                     ５．０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）        １００ｍＭ
計０．９ｍＬ【００５９】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム   ：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＡＲ  ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ（和光純薬工業株式会社製）
移動相  ：１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）：メタノール＝４：１
流速     ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６５ｎｍ【００６０】
（実施例２）  精製酵素の理化学的性質１
実施例１で得たＨＢＳ精製酵素について、その理化学的性質について調べた。
（１）作用
ＨＢＳ精製酵素のアシルアミダーゼ活性は、実施例１と同様に測定した。【００６１】
（２）分子量
精製酵素をＴＳＫ  ＧＥＬ−Ｇ−３０００（０．７５ｘ６０ｃｍ、東ソー株式会社製）を用いたゲルろ過分析により行ったところ、分子量は約９０，０００であった。また、サブユニットの分子量を１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、分子量は約４０，０００であった。【００６２】
（３）至適ｐＨ
ｐＨ４．０〜１１．０の範囲で、上記と同様にしてアセトアニリドを基質とした活性を、測定し、ＨＢＳの至適ｐＨを調べた。その結果、至適ｐＨは６〜９であった。ただし、上記測定方法において、測定を行うｐＨに応じて基質溶液における緩衝液は下記のものを用いた。
ｐＨ４．０〜６．０  ：０．１Ｍクエン酸緩衝液
ｐＨ６．０〜８．０  ：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．５〜９．０  ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ９．０〜１１．０：０．１Ｍグリシンナトリウム緩衝液【００６３】
（４）至適温度
上記と同様にしてアセトアニリドを基質とした活性を、反応温度１０〜８０℃の範囲で測定した。その結果、至適温度は２５〜４５℃であった。【００６４】
（５）熱安定性
精製酵素を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に添加し、これを１０〜８０℃において３０分間処理した後、上記アミダーゼ活性を測定した。その結果、処理前と比べて、１０℃〜４０℃処理では９０％以上の活性が残存していた。【００６５】
（６）阻害剤
精製酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させた。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアニリンを定量した。その結果、ＨｇＣｌ２またはＡｇＮＯ３のいずれを添加した場合であっても、反応が進行しなかった。
［基質溶液組成］
アセトアニリド                      ５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）      １００ｍＭ
阻害剤                              １ｍＭ
計０．９ｍＬ【００６６】
（実施例３）精製酵素の理化学的性質２（基質特異性）
精製酵素液０．１ｍＬを、下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させた。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液中に生成したアルコール、アミン、あるいはアンモニアを表１および表２に示す条件で分析した。
ただし、ｐ−ニトロフェニルアセテート、ｐ−ニトロフェニルプロピオネート、ｐ−ニトロフェニルブチレートを基質としたときは、反応液をＮａＨＣＯ３で塩基性にしたのち、４００ｎｍでの吸光度で、生成したｐ−ニトロフェノールを測定した。
また、アセトアミド、ｎ−ブチルアミド、ベンズアミドを基質とした反応は、生成したアンモニアをＣｏｎｗａｙの拡散分析法を用いて測定した。すなわち、Ｃｏｎｗａｙの拡散ユニットの外室に反応液上清０．２ｍＬと炭酸カリウム飽和溶液２．０ｍＬをそれぞれ加えた。また、内室に０．０１Ｎ硫酸１．５ｍＬを加えた後、蓋をし、外室の２液を接触させて３時間放置した。その後、内室の反応液０．５ｍＬを採取した。
採取した内液０．５ｍＬに０．５ｍＬの３３０ｍＭナトリウムフェノキシドと０．５ｍＬの０．０１％（ｗ／ｖ）のニトロプルシドナトリウム、０．５ｍＬの０．８４％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム水溶液を加えた後、１００℃で５分加熱した。その後蒸留水を３ｍＬ加え、その反応液の吸光度（Ａ６４０）を標準サンプルの吸光度と比較し、活性値を求めた。【００６７】
基質特異性の測定に用いる酵素量は、使用する基質によって異なり、その量を表１の酵素使用量の欄に記載した。この酵素使用量の単位（ｍＵ）はアセトアニリドを基質として用いた場合の酵素活性で示した。相対活性は単位酵素量あたりの各基質に対する活性をアセトアニリドに対する活性を１００としたときの相対値で示した。
その結果を表１に示した。この酵素は、アセトアニリド、ホルムアニリド、酢酸フェニルに高い活性を示した。また、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンには作用しなかった。【００６８】
したがって、本実施例のアシルアミダーゼは、ホルムアニリド、アセトアニリド、酢酸フェニルのそれぞれに実質的に作用し、かつ、ベンズアミド、ｎ−ブチルアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンのそれぞれに実質的に作用しないという、従来のアシルアミダーゼの基質特異性とは異なる、ユニークかつ有用な基質特異性を有することが明らかとなった。【００６９】
［基質溶液組成］
基質                              １〜１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）              ５０ｍＭ【００７０】
【表１】
2007097429.tif 000006
【００７１】
【表２】
2007097429.tif 000007
【００７２】
（実施例４）精製酵素の理化学的性質３（立体選択性）
実施例３で得られた反応液のうち、１−フェニルエチルアセテートとＮ−（１−フェニルエチル）アセトアミドについて下記の測定条件で生成物の光学純度を測定した。その結果、１−フェニルエタノールはＲ体で３７％ｅ．ｅ．、１−フェネチルアミンはＲ体で５１％ｅ．ｅ．であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件（１−フェニルエタノール）］
カラム   ：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ  ４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ
（ダイセル化学工業社製）
移動相  ：ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ＝９：１
流速      ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２５４ｎｍ【００７３】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件（１−フェネチルアミン）］
カラム    ：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＣＲ（＋）  ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ
（ダイセル化学工業社製）
移動相   ：ＨＣｌＯ４（ｐＨ１．５）
流速      ：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２１０ｎｍ【００７４】
（実施例５）  精製酵素の理化学的性質４（アセトアニリドに対するＫｍ）
実施例１で得たＨＢＳ精製酵素について、アセトアニリドに対するＫｍを調べた。精製酵素液０．１ｍＬを下記組成を有する基質溶液０．９ｍＬに添加し、３０℃で反応させた。３０分後、メタノールを１ｍＬ添加して反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアニリンを定量し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ＰｌｏｔｓによりＫｍを求めところ、０．２１ｍＭであった。高速液体クロマトグラフィーは、実施例１と同じ条件で行った。
［基質溶液組成］
アセトアニリド          ０．１〜２．５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）      １００ｍＭ
計０．９ｍＬ【００７５】
（実施例６）  ＨＢＳ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ＨＢＳのＮ末端アミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により決定した。また、実施例１で得られた精製ＨＢＳをリシルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列と同様の方法で決定した。このアミノ酸配列から予想される塩基配列を考慮し、ＨＢＳ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（配列番号３）、および、プライマー２（配列番号４）を合成した。
（ＰＣＲによるＨＢＳ遺伝子の増幅）
バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ−Ｍ０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６５）の培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４３２１，１９８０）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型に、上記で合成したプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、ＨＢＳ遺伝子の一部と考えられる約１３４ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を決定した。【００７６】
（サザンハイブリダイゼーション）
上記染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＤＮＡ断片を調整した。決定したＤＮＡ配列をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片をゲルから抽出した。抽出したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに挿入し、ミニライブラリーを作成後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）を形質転換した。形質転換された大腸菌ライブラリーの中から、コロニーハイブリダイゼーション法により、プローブとハイブリダイズするポジディブクローンを選択し、インサートのＤＮＡ配列をＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて決定した。その結果、１０５０ｂｐのＯＲＦ（配列番号２）が明らかとなった。【００７７】
（ＯＲＦのデータベース解析）
得られたＯＲＦのＤＮＡ配列についてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行ったところ、相同性の高い上位３つの遺伝子とその相同性は以下のとおりであった。
Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２）：６４％
Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＤＫ  １７）：６３％
Ｄｅａｃｅｔｙｌｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ｃ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）：３４％【００７８】
（実施例７）  ＨＢＳ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例６で得られたＯＲＦの情報をもとに、ＯＲＦの５’末端に制限酵素ＮｄｅＩのサイトを付加させるように設計したプライマー３（配列番号５）、および、ＯＲＦの３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩのサイトを付加させるように設計したプライマー４（配列番号６）を合成した。このプライマーを用いて、ポジティブクローンから得られたプラスミドを鋳型にしてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、組換えベクターｐＥＴ２１ＨＢＳを得た。【００７９】
（実施例８）  ＨＢＳ遺伝子を含む組換え大腸菌の作製とＨＢＳの発現
実施例７で得た組換えベクターｐＥＴ２１ＨＢＳを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を取扱説明書にしたがって形質転換し、組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２１ＨＢＳ）を得た。得られた組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２１ＨＢＳ）をＬＢ培地に植菌し、３７℃で４−６時間培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように無菌的に添加し、さらに２０℃で２０時間培養した。得られた培養液を集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液について実施例３と同様にアセトアニリドを基質としてアミダーゼ活性を測定したところ、培養液１ｍＬあたり０．７３Ｕの該活性が見られた。
【配列表】
2007097429000001.app
【国際調査報告】
2007097429.tif 000010
2007097429.tif 000011
2007097429.tif 000012
2007097429.tif 000013