(57)【要約】  試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを、より簡便な操作で、且つ感度良く測定する方法及び測定試薬の提供。  リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を用いることを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を用いることを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
更に、正常なリポ蛋白に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体を用いるものである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
界面活性剤又は界面活性剤と正常なリポ蛋白に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体を被検試料に作用させた後に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させるものである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
界面活性剤として、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸若しくはそれらの塩類又はポリアクリル酸塩を用いるものである請求項１〜３のいずれか１記載の測定方法。
【請求項５】
リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００のコレステロールエステラーゼを少なくとも１種使用するものである請求項１〜４のいずれか１記載の測定方法。
【請求項６】
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を含有するレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬。
【請求項７】
更に、正常なリポ蛋白に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体を含有するものである請求項６記載の測定試薬。
【請求項８】
界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸若しくはそれらの塩類又はポリアクリル酸塩である請求項６又は７記載の測定試薬。
【請求項９】
リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００のコレステロールエステラーゼを少なくとも１種使用するものである請求項６〜８のいずれか１記載の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法及び測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査において、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。【０００３】
近年、レムナント様リポ蛋白質の如く、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが、動脈硬化症の危険因子として、ＬＤＬ中のコレステロールより密接な指標となることが示されており、生体試料中のリポタンパク質の中からレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを効率よく測定することが課題となっている。【０００４】
レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの酵素測定法に関しては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼに、リン脂質を分解するための酵素を添加することにより、また場合によっては、更に界面活性剤を添加する測定方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、斯かる方法においても、酵素反応の選択性や簡便性の点で、必ずしも充分であるとは云えない。
【特許文献１】特開平２００１−２３１５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを、より簡便な操作で、且つ感度良く測定する方法及び測定試薬を提供することにある。【０００６】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを使用してリポ蛋白質中のコレステロールを測定する際の条件を種々検討したところ、特定の界面活性剤を用いることにより、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試料の中からレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを選択的に高感度で測定できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を用いることを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法に係るものである。【０００８】
また本発明は、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を含有するレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬に係るものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の測定方法及び測定試薬を用いることにより、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを極めて簡便な方法にて感度良く測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明品１を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図２】本発明品２を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図３】本発明品３を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図４】本発明品４を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図５】本発明品５を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図６】本発明品６を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図７】比較品１を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図８】比較品２を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図９】比較品３を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１０】比較品４を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１１】比較品５を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１２】比較品６を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１３】比較品７を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１４】比較品８を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１５】本発明測定方法により求めた吸光度値（縦軸）と、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キットを用いて得られる値（横軸）との相関を示した図である。
【図１６】本発明測定方法により求めた吸光度値（縦軸）と、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キットを用いて得られる値（横軸）との相関を示した図である。
【図１７】本発明測定方法により求めた吸光度値（縦軸）と、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キットを用いて得られる値（横軸）との相関を示した図である（（Ａ）：抗アポＢ−１００抗体未添加、（Ｂ）：抗アポＢ−１００抗体添加）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の測定方法は、試薬として、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤を用い、これをリポタンパク質を含有する被検試料に作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定するものである。【００１２】
本発明の酵素反応は、水性媒体中で行われるが、特に緩衝液中で行うのが好ましい。
緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤及びグッドの緩衝剤等が挙げられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等が挙げられる。【００１３】
緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００ｍＭが特に好ましい。【００１４】
コレステロールエステラーゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず、微生物又は動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ等が挙げられる。この酵素の多くは少なからず該エステラーゼ活性の他にリポタンパク質リパーゼ活性を併せ持つことが知られており、本発明においては、コレステロールエステラーゼ活性に比しリポタンパク質リパーゼ活性の強いコレステロールエステラーゼを少なくとも１種使用するのが好ましい。【００１５】
具体的にはリポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率（リポタンパク質リパーゼ活性／コレステロールエステラーゼ活性）が１２〜７０００、好ましくは２０〜１０００、より好ましくは２８〜８００であるコレステロールエステラーゼを少なくとも１種以上使用するのが好ましく、これを用いることによりレムナント様リポタンパク質に対する当該酵素の選択性を上げることができる。尚、リポタンパク質リパーゼ活性とは、オリーブ油エマルジョンを用いたリポタンパク質リパーゼ活性分析法により算出した時の活性単位を示し（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７６；８０：３６７−３７０）、コレステロールエステラーゼ活性とは、仔牛血清を用いたＣＥＮ活性分析法により算出した活性単位を示す（Ｋａｍｅｎｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊａｐ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ  １９７６；２４：６５０）。【００１６】
斯かる活性比率を有するコレステロールエステラーゼとしては、例えばＬＰ（旭化成ファーマ社製、活性比率４６０〜８００）、ＬＰＢＰ（旭化成ファーマ社製、活性比率５６００〜６９００）、ＣＥＮ（旭化成ファーマ社製、活性比率１３．０〜１６．０）、ＣＥ（天野エンザイム社製、活性比率１３．０〜１６．０）、ＣＯＥ３１１（東洋紡社製、活性比率２８．０〜３５．０）又はこれらと同等の活性比率を有する酵素が挙げられ、これらを組み合わせて用いるのがより好ましい。具体的には、ＣＥＮとＬＰ、ＣＯＥ３１１とＬＰ等の組み合わせが挙げられる。【００１７】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールオキシダーゼが挙げられる。【００１８】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼが挙げられる。【００１９】
尚、これらの酵素は、当該酵素の特異性、安定性をさらに向上させるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該酵素を化学的に修飾したものでもよく、また、遺伝子操作により得られる同等の活性を有する改良酵素でもよい。【００２０】
上記コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬがより好ましい。【００２１】
分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はポリアクリル酸系高分子界面活性剤としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様リポ蛋白質に対する選択性を高めることができるもの、すなわち当該酵素のレムナント様リポタンパク質に対する作用を高めるか、或いは当該酵素群のレムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させることによって、レムナント様リポ蛋白質に対する酵素反応を相対的に増強せしめるものであればよい。分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤としては、例えばラウリルベンゼンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸、又はこれらの塩類等が好適に挙げられ、塩類としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。具体的には、例えばニューレックスＲ（アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム；日本油脂）、ネオペレックスＮｏ．６、ネオペレックスＮｏ．２５（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；花王）、ペレックスＳＳ−Ｌ（アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム；花王）、ポリスチレンスルホン酸カルシウム（三和ケミカル）等が好適に挙げられ、中でもニューレックスＲ、ペレックスＳＳ−Ｌを用いるのが、酵素反応の選択性を高める点で特に好ましい。【００２２】
ポリアクリル酸系高分子界面活性剤としては、ポリアクリル酸塩、架橋型ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸塩共重合体等が挙げられ、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが特にナトリウム塩が好ましい。具体的には、例えばジュリマーＡＣ−１０３（ポリアクリル酸ナトリウム；日本純薬）、ジュリマーＡＣ−２０Ｎ（ポリアクリル酸ナトリウム共重合体；日本純薬）、レオジック２５２Ｌ、レオジック３０６Ｌ（架橋型ポリアクリル酸ナトリウム；日本純薬）等が挙げられ、このうちジュリマーＡＣ−１０３が好ましい。【００２３】
斯かる界面活性剤の使用濃度は、特に限定されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。【００２４】
また、本発明の測定方法においては、更に正常なリポ蛋白に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体を併せて用いるのが好ましい。これによりレムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質への酵素反応を抑えることができ、レムナント様リポ蛋白質に対する酵素反応を相対的に増強することができる。斯かる抗アポＢ−１００抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れでもよいが、例えば抗ヒトアポＢ−１００マウスモノクローナル抗体（ＪＩ−Ｈ、ＪＩＭＲＯ社製）が好適である。【００２５】
斯かる抗体の使用濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく０．１〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
尚、抗アポＢ−１００ポリクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、免疫原として使用する正常人血清ＬＤＬは、常法により精製したものを使用することができるが、例えば超遠心法（続生化学実験講座３「膜脂質と血漿リポタンパク質」５９７−６１２ｐ）にて好適に調製することができる。次いで、該精製ＬＤＬをヒト以外の動物に対して単回乃至複数回免疫し、血清中の抗体力価が上昇した時点で採血し、抗血清の形で得ることができる。また、該抗血清中にレムナント様リポ蛋白質に反応する抗体が存在する場合は、必要に応じてレムナント様リポ蛋白質を添加し、該リポ蛋白質を吸収することにより、該抗血清を測定に使用することができる。【００２６】
また、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体の作製手順としては、まず上述正常人血清由来精製ＬＤＬを抗原として、フロインドアジュバンド等に混濁させ、マウスに数回免疫し、免疫終了後摘出した脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、ＮＳ−１細胞など）と融合させハイブリドーマを作製しクローンを得る（特公平４−５３５１６号公報）。目的の抗体を産生するクローンの検索は、上述正常人精製ＬＤＬ及び高脂血症患者由来精製ＬＤＬに対する結合性を比較し、正常人精製ＬＤＬにより強く結合するハイブリドーマを選択することにより目的のクローンを得ることができる。本実施例にて使用されたモノクローナル抗体ＪＩ−Ｈも、該手順に従って作製された。【００２７】
また、免疫動物は、必要に応じてマウス以外の動物、例えばラットなどを用いることもできる。この場合、ミエローマ細胞としては、Ｙ３、Ａｇ１２３細胞などを好適に用いることができる。【００２８】
本発明の測定方法において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬又は高感度の色素源を用いて定量することができる。【００２９】
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。【００３０】
トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版総合カタログ、２００２年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−ｍ−３−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＰＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−３−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−３−スルフプロキシル−３−メトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。【００３１】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９号公報で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６号公報で示される化合物等が挙げられる。【００３２】
これら色素源の濃度としては、０．０１〜１０ｍＭが好ましい。
また、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマザン色素を比色して行うこともできる。
反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。【００３３】
本発明の測定方法は、上記の試薬を被検試料に作用させるものであるが、被検試料が上記界面活性剤、又は界面活性剤と正常なリポ蛋白質に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体と反応し、次いでコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼが反応するという作用順序が維持されていれば、各試料の添加方法や添加順序等は特に制限されるものではない。尚、反応は水性媒体中で行なわれるため、被検試料を緩衝液などから構成される水性媒体に添加し２５℃〜４０℃で攪拌調製した後、本発明の試薬を添加し１〜１０分間反応させて、測定することが好ましい。【００３４】
従って、本発明試薬の構成は、界面活性剤を含有する試薬、界面活性剤と正常なリポ蛋白質に含まれるアポリポ蛋白Ｂ−１００に対して反応し、変性したアポリポ蛋白Ｂ−１００には反応しない抗アポＢ−１００抗体を含有する試薬、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有する試薬をそれぞれ個別に用意すること、或いはこれらを一体として構成することのいずれでもよい。そして、個別に構成した場合には、それらを順次添加して用いること或いは一度に添加して用いることができる。
尚、上記各試薬は、液状でもよく、錠剤、粉末等の固形状でもよい。【００３５】
また、当該測定試薬には、必要により生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類、リポ蛋白質凝集剤、他の酵素等を含有させることができる。
斯かる塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが挙げられ、０〜１００ｍＭの範囲で使用される。【００３６】
リポ蛋白質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩があげられる。他の酵素としてはアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。
尚、本発明を適用する被検試料は、特に限定されるものではなく、具体的には生体試料においては血液自体又は血漿、血清等の血液画分を使用することができる。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
（１）試料の調製
血清成分をレムナント様リポタンパク質画分、ＬＤＬ画分及びＨＤＬ画分に分画し、各リポタンパク質の測定を行った。該タンパク質の分画方法を下記に示す。
抗アポＢ−１００抗体結合アフィニテイカラム、抗アポＡ−１抗体結合アフィニテイカラムをそれぞれ作製し、血清を添加して結合画分を回収し、それぞれＬＤＬ，ＨＤＬとした。また、前述両カラムに血清を添加し素通り画分を回収しレムナント様リポタンパク質画分（ＲＬＰ）とした。それぞれのリポタンパク質はＨＰＬＣによる分析で確認を行った。また、各リポタンパク質中のコレステロールの濃度を総コレステロール測定用試薬キットを用いて５ｍｇ／ｄｌに調製した。【００３８】
（２）測定試薬の調製
下記に示されるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。【００３９】
【表１】
2007083523.tif 000002
【００４０】
（３）測定方法・結果
試薬１を２１０μＬ分光光度計のセルに入れ、試料２０μＬを添加して攪拌し、３７℃で加温した。ついで３４４秒後に試薬２を７０μＬ添加して攪拌し、主波長５７２ｎｍ及び副波長７４８ｎｍにて６６７秒後まで測定した。【００４１】
試薬２添加時、即ち３４４秒後（測光ポイント２０）から６６７秒後（測光ポイント３８）までの吸光度変化量を求め、ＲＬＰ、ＨＤＬ及びＬＤＬにおいて、ＲＬＰの吸光度変化量を１００とした場合の相対比率を算出した。結果を表２及び図１〜１４に示す。【００４２】
【表２】
2007083523.tif 000003
【００４３】
表２及び図１〜１４より、本発明品１〜６は、比較品１〜８と比較して、ＬＤＬ及びＨＤＬに対する酵素反応が共に抑制され、ＲＬＰに対する酵素作用の選択性が顕著に上昇していた。【００４４】
実施例２
次に、自動分析装置ＴＢＡ−２０Ｒ（東芝）を使用して本発明測定方法により、ヒト血清中のＲＬＰ−コレステロール量を測定した。なお、界面活性剤には、ニューレックスＲ（本発明品）を用いた。
試料：ヒト血清  １０６検体【００４５】
【表３】
2007083523.tif 000004
【００４６】
測定方法は、試薬１を２１０μＬ分光光度計のセルに入れ、血清５μＬを添加して攪拌し、３７℃で加温した。ついで３４４秒後に３７℃に予備加温された試薬２を７０μＬ添加して攪拌し、主波長５７２ｎｍおよび副波長７４８ｎｍにて６６７秒後まで測定した。【００４７】
測光ポイント３４〜３８（５９５〜６６７秒）の吸光度値（ブランク：測光ポイント１５〜１９（２５１〜３２８秒））を求め、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キット（ＪＩＭＲＯ社製）との相関をとった（図１５）。その結果、図１５より、本発明測定方法により求めた値と、市販キットとの間には、高い相関が認められた。【００４８】
実施例３
自動分析装置７０８０（日立）を使用して本発明測定方法により、ヒト血清中のＲＬＰ−コレステロール量を測定した。なお、界面活性剤には、ペレックスＳＳ−Ｌ（本発明品４）を用い、コレステロールエステラーゼとして、ＣＯＥ３１１（活性３１．８）及びＬＰ（活性比率５１２）を用いた。
試料：ヒト血清  ３０検体【００４９】
【表４】
2007083523.tif 000005
【００５０】
測定方法は、血清５μＬを分光光度計のセルに入れ、試薬１を２１０μＬ添加して撹拌し、３７℃で加温した。ついで３２０秒後に試薬２を７０μＬ添加して撹拌し、主波長５７０ｎｍおよび副波長７５０ｎｍにて９８０秒後まで測定した。
測光ポイント３３（６６０秒）と測光ポイント１７（３４０秒）の吸光度差を求め、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キット（ＪＩＭＲＯ社製）との相関をとった（図１６）。その結果、図１６より、本発明法により求めた値と、市販キットとの間には、高い相関（Ｒ＝０．９２９４）が認められた。【００５１】
実施例４
自動分析装置７０８０（日立）を使用して本発明の測定法により、血清中のＲＬＰ−コレステロール量を測定した。
試料  ヒト血清２７検体【００５２】
【表５】
2007083523.tif 000006
【００５３】
測定条件・方法
測定パラメーターを以下のように設定して測定を行った。
測定方法：レート法ｔｅｓｔ  ｒｅａｄ  ｔｉｍｉｎｇ〔２２〕−〔２５〕
試料量：５μＬ
Ｒ１量：２１０μＬ
Ｒ２量：７０μＬ
測定波長：主波長５７０ｎｍ
副波長：７５０ｎｍ
測定温度：３７℃【００５４】
検体５μＬに試薬１を２１０μＬ添加して撹拌し、３７℃で加温した。ついで５分後に試薬２を７０μＬ添加して撹拌し、主波長５７０ｎｍおよび副波長７５０ｎｍにて測定を行った。試薬２添加後の１分間当たりの吸光度変化量を求め、市販のＲＬＰ−コレステロール測定キット（ＪＩＭＲＯ社製）との相関をとった（図１７）。その結果、図１７より抗アポＢ−１００抗体を添加した場合は、未添加に比べ市販キットとの間により高い相関が認められた。
【図１】
2007083523.tif 000007
【図２】
2007083523.tif 000008
【図３】
2007083523.tif 000009
【図４】
2007083523.tif 000010
【図５】
2007083523.tif 000011
【図６】
2007083523.tif 000012
【図７】
2007083523.tif 000013
【図８】
2007083523.tif 000014
【図９】
2007083523.tif 000015
【図１０】
2007083523.tif 000016
【図１１】
2007083523.tif 000017
【図１２】
2007083523.tif 000018
【図１３】
2007083523.tif 000019
【図１４】
2007083523.tif 000020
【図１５】
2007083523.tif 000021
【図１６】
2007083523.tif 000022
【図１７】
2007083523.tif 000023
【国際調査報告】
2007083523.tif 000024
2007083523.tif 000025
2007083523.tif 000026
2007083523.tif 000027
2007083523.tif 000028
2007083523.tif 000029