(57)【要約】アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなる生体適合性ブロック共重合体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなることを特徴とする、生体適合性ブロック共重合体。
【請求項２】
下記式（１）
Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ（Ｒ３）］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｑ−Ｏ−［−ＣＨ（Ｒ４）ＣＨ２Ｏ−］ｒ−Ｒ５  ・・・（１）
（式中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり；Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり；Ｒ３は水素原子、アルキル基または置換されたアルキル基であり；Ｒ４は水素原子またはメチル基であり；Ｒ５は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基、Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ（Ｒ３）］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｑ−で表わされる基であり；ｎは１〜２０の整数であり；ｋは１〜６の整数であり；ｍは１〜２０の整数であり；ｐは１〜２０の整数であり；ｑは０〜２０の整数でありそしてｒは２〜８７０の整数である）で表わされる請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項３】
アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンおよびそれらの側鎖における誘導体よりなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸である請求項１または２に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項４】
ヒドロキシカルボン酸が、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つのヒドロキシカルボン酸である請求項１〜３のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項５】
親水性セグメントのポリアルキレンオキシドがポリエチレンオキシドである請求項１〜４のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項６】
親水性セグメントのポリアルキレンオキシドの数平均分子量が１０，０００以下である請求項１〜５のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項７】
親水性セグメントのポリアルキレンオキシドがポリ（エチレンオキシド／プロピレンオキシド）ブロック共重合体である請求項１〜６のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項８】
疎水性セグメントが、デプシペプチドである請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項９】
式（１）のＲ５のリガンド残基を生じるリガンドが、レクチン、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、接着因子、トランスフェリンまたは葉酸である請求項２に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体の疎水性セグメントが内核を形成しそして親水性セグメントが外殻を形成してなるミセル。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなりそして内核が疎水性セグメントと薬物からなり外殻が親水性セグメントからなるミセル。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる微粒子（ミセルを除く）。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる複合体（ミセルを除く）。
【請求項１４】
平均粒子径が５ｎｍ〜３００ｎｍである請求項１０または１１に記載のミセル。
【請求項１５】
薬物が、抗炎症薬、解熱薬、鎮痛薬、抗関節炎薬もしくは抗リウマチ薬、抗痛風薬、強心薬、抗狭心症薬、ベータ遮断薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、利尿薬、抗高血圧薬、末梢循環障害改善薬、抗血栓薬、抗高脂血症薬、抗血小板薬、昇圧薬、脳循環代謝改善薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬、気管支拡張薬、抗喘息薬、鎮咳薬、去痰薬、抗潰瘍薬、止瀉薬、制吐薬、抗糖尿病薬、催眠薬・鎮静薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬、自律神経系作用薬、抗生物質、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウィルス薬、駆虫薬、ホルモン薬、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬、ビタミン薬、止血薬、酵素薬、ワクチン、麻酔薬、診断薬、造影薬または検査薬である請求項１１〜１４のいずれかに記載のミセル、微粒子または複合体。
【請求項１６】
薬物が疎水性薬物である請求項１１〜１４のいずれかに記載のミセル、微粒子または複合体。
【請求項１７】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のミセル、微粒子または複合体を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
投与形態が、注射剤、経口剤、吸入剤，経皮剤または経粘膜剤の形態にある請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法。
【請求項２０】
アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントおよびポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体、薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミセル、微粒子または複合体の製造法。
【請求項２１】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物と組み合わせて生体に適用するための使用。
【請求項２２】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物とのミセル、微粒子または複合体を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体、この生体適合性ブロック共重合体と薬物からなるミセル、微粒子または複合体ならびにそれらの用途、これらを含む医薬組成物およびその製造法に関する。このミセル、微粒子または複合体は、薬物の可溶化、分散化、安定化、徐放化、病巣部位への送達などを可能とする。
【背景技術】
【０００２】
薬物は生体内の薬物作用部位へ到達することによりその効果を発揮するものである。薬物がその作用部位に到達できない原因は種々ある。例えば、薬物が、（１）体液に溶けにくいこと、（２）酵素、ｐＨ、その他の生理的条件下で不安定であること、（３）内皮、粘膜などの膜性バリアーを通過できないこと、（４）望ましくない免疫反応を引き起こすこと、（５）血中から速やかに消失し排泄されること、（６）標的部位へのターゲティング能力が欠如していることなどが挙げられる。
これらの原因が引き起こす結果として、例えば、（１）注射液の調製が困難、（２）タンパク性医薬の経口投与が困難、（３）癌組織や脳、神経組織への薬物送達が不十分、（４）親水性薬物の粘膜吸収が不十分、（５）疎水性薬物の生体利用率が不十分、（６）サイトカインなどの早すぎる血中消失、（７）標的部位への移行性の欠如などが問題点として挙げられる。
これらの問題点を解決するためのアプローチは多数提案されている。例えば、（１）親水性高分子化合物とタンパク性薬物との結合体の形成、（２）能動輸送物質と薬物との結合体の形成、（３）リポソームへの親水性薬物の封入、（４）ナノまたはマイクロメーターサイズの生分解性重合体微粒子への薬物の封入、（５）両親媒性の高分子物質と薬物による高分子ミセル形成などが挙げられる。しかし、薬物送達に関わる全ての問題に対する普遍的解決策はいまだ見出されていない。
生分解性重合体として、主鎖がアミド結合で連結したポリアミノ酸が挙げられる。しかしながら、アミド結合は分子間あるいは分子内で強固に水素結合して安定な高次構造を形成するため、ポリアミドを生分解によって分解するためには、この強固な水素結合で支持された高次構造を切断する必要があり、不安定構造を有するラセミ体や、イオン化する極性側鎖を有する特殊なポリアミノ酸を除き、完全には生分解されないことが明らかにされている（Ｍ．Ａｓａｎｏ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｉ．Ｋａｅｔｓｕ，Ｋ．Ｎａｋａｉ，Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｈ．Ｙｕａｓａ，Ｋ．Ｓｈｉｄａ，Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．Ｏｙａ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９８３）８４：１７６１参照）。
生分解が可能な薬物送達用の高分子として、水酸基とカルボキシル基を分子内に有するヒドロキシカルボン酸がエステル縮合したポリオキシ酸が挙げられる。ポリオキシ酸においては、エステル結合が水素原子を有しないことから、エステル結合において水素結合が生じることがなく、ポリアミノ酸より容易に生分解されることが明らかにされている。更に、ヒドロキシカルボン酸と水から無触媒でヒドロキシカルボン酸を重合する方法が開発され、触媒の残渣の混入がないオリゴマーを重縮合したポリマーは、薬物送達システムに使用した場合、金属触媒を使用して生成したものと比較して異物反応を誘発するおそれがなく、また、分子間相互作用が弱いため成型も容易に行なえることから、薬物送達システムの好ましい材料とされている。ポリオキシ酸は低分子量の試料ほど生分解速度が速く、特に、低分子量ポリ−ＤＬ−乳酸が好ましい薬物送達システムとして採用されている（Ｍ．Ａｓａｎｏ，Ｈ．Ｆｕｋｕｚａｋｉ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｋｕｍａｋｕｒａ，Ｔ．Ｍａｓｈｉｍｏ，Ｈ．Ｙｕａｓａ，Ｋ．Ｉｍａｉ，Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌａｓｅ，（１９８９）９：１１１、Ｍ．Ａｓａｎｏ，Ｈ．Ｆｕｋｕｚａｋｉ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｋｕｍａｋｕｒａ，Ｔ．Ｍａｓｈｉｍｏ，Ｈ．Ｙｕａｓａ，Ｋ．Ｉｍａｉ，Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，（１９８９）１０：５６９および真下透、湯浅久子、今井強一、山中英寿、浅野雅春、吉田勝、熊倉稔著「北関東医学４１」１９９１年ｐ．３１１参照）。
一方、高分子ミセルは、基本的に、親水性セグメントを外殻とし、疎水性セグメントを内核として形成されるナノ粒子であり、薬物の可溶化、安定化、持続放出、送達用担体として多数報告されている。例えば、ポリアルキレンオキシド等の親水性セグメントおよびポリアルキルアスパルテート等の疎水性セグメントからなるブロック共重合体の薬物担持用担体（特開平０６−１０７５６５号公報、特開平０６−２０６８３０号公報、特開平０６−２０６８３２号公報、特開平１１−１００３３１号公報、特開２００１−２２６２９４号公報、特開２００３−３４２１６７号公報、特開２００４−０１０４７９号公報、特開２００４−３５２９７２号公報、特開２００５−０２９４８０号公報、特表２００５−５０１８３１号公報および国際公開第０３／０００７７１号パンフレット参照）、親水性ポリアミノ酸等の親水性セグメントおよびポリラクチド等の疎水性セグメントからなるブロック共重合体の微粒子（特開平１１−２６９０９７号公報参照）、ポリエチレングリコール等の親水性セグメントおよびポリアミンやポリカルボン酸等の荷電性セグメントを含むブロック共重合体（特開平０８−１８８５４１号公報、特開２００１−１４６５５６号公報、特開２００５−００８６１４号公報および特表２００１−５２５３５７号公報参照）、水難溶性薬物を含有する高分子ミセルの調製方法（特開平１１−３３５２６７号公報、特開２００３−０１２５０５号公報、特開２００３−０２６５６６号公報、特開２００３−０２６８１２号公報、特開２００３−３４２１６８号公報、特表２００３−５３２６８８号公報および国際公開第０２／０２６２４１号パンフレット参照）が報告されている。
しかし、上記のいずれの文献にもアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生分解性プラスチックスとして、光学活性３−置換−２，５−モルホリンジオンと環状ラクトンを重合せしめたデプシペプチド共重合体や、ポリデプシペプチドから製造される生物吸収外科用装置等（特開平７−１８８４１１号公報参照）や、特定のポリアミドユニット、特定のポリエステルユニットおよび特定のポリラクトンユニットとを有する生分解性ポリラクトンエステルアミド（特開平１１−３５６７９号公報参照）が報告されている。また、特定のデプシペプチドと、ポリ乳酸とからなる重合体が、良好な生分解性を有し、強度を保持したまま、柔軟性を向上させること（特開２００１−３１７６２号公報参照）が可能であることや、ラクチドと水酸基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選択される少なくとも１種の反応性置換基を有するε−カプロラクトンとを開環重合して得られる生分解性共重合体が、成形性が良好で各種の利用形態に応じた機能性を有すること（特開２００２−２３４９３４号公報参照）等が知られている。また、本発明者の一人がデプシペプチドの合成法並びに合成物を開示している（特開２００４−２６９４６２号公報参照）。
しかし、上記特開平７−１８８４１１号公報、特開平１１−３５６７９号公報、特開２００１−３１７６２号公報、特開２００２−２３４９３４号公報、特開２００４−２６９４６２号公報のいずれの文献にも、同様に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなるブロックとポリアルキレングリコールからなるブロックとからなる生分解性プラスチックスとして、三元ブロック共重合体が報告されている（国際公開第２００５／００３２１４号パンフレット参照）。
しかし、この国際公開第２００５／００３２１４号パンフレットにも、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、薬物がその作用部位に到達できない上記６つの原因を除去することを可能とする、薬物に親和性を有する生体適合性ブロック共重合体を提供することにある。
本発明の他の目的は、生体内で切断され易いエステル結合と切断され難いアミド結合とを有し、抗原性を示さず、そしてアミノ酸とヒドロキシカルボン酸の種類と数と配列を制御することにより薬物との親和性を制御することのできる、生体適合性ブロック共重合体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、上記生体適合性ブロック共重合体と薬物からなりそして薬物の可溶化、分散化、安定化、徐放化ならびに生体内の必要な部位に薬物を送達することを可能とする、ミセル、微粒子または複合体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、上記ミセル、微粒子および複合体の有利な製造法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなることを特徴とする生体適合性ブロック共重合体によって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、本発明の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなるミセルによって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、本発明の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる微粒子または複合体（ミセルを除く）によって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第４に、本発明のミセル、微粒子または複合体を含有する医薬組成物によって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第５に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメント、ポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法によって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、最後に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントおよびポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体、薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミセル、微粒子または複合体の製造法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明の生体適合性ブロック共重合体は、疎水性セグメントと親水性セグメントを有する。本明細書において「生体適合性」とは、生体内に投与後、生体組織に適合して生体への障害などを示さない性質をいい、例えば、生体内で分解代謝されまたは分解されなくても、最終的には体外に排泄される性質をいう。本明細書において「生体内分解性」とは、生体内に投与後、生体組織において分解代謝され生体への障害などを示さない性質をいい、例えば、生体内で分解代謝され、最終的には体外に排泄される性質をいう。本明細書において「疎水性セグメント」とは、水に難溶または不溶である生体内分解性ポリマーまたはその誘導体であって、本ブロック共重合体を形成するもう一方の成分である親水性セグメントよりも疎水性である高分子重合体をいう。本明細書において「親水性セグメント」とは、水に可溶であるか、あるいは水に難溶であっても本ブロック共重合体の疎水性セグメントに対して親水的である高分子重合体またはその誘導体をいう。本明細書において「ミセル」とは、組成が異なる内核部分と外殻部分を有する粒子をいう。本明細書において「微粒子」とは、平均粒子径が３００マイクロメートル以下であって、明確な内核および外殻部分を有さず、本ブロック共重合体中に薬物がほぼ均一に分散してなる粒子を言う。本明細書において「複合体」とは、明確な内核および外殻部分を有さず、薬物分子または薬物結晶と本ブロック共重合体の相互作用により形成された複合体を言う。本明細書において「リガンド」とは、一般に特定の標的分子と特異的に結合し、結合複合体を形成することができる全ての分子を指し、標的に向かうリーディング部分である。
本発明の生体適合性ブロック共重合体は、疎水性セグメントとしてのアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生体内分解性ブロックと、親水性セグメントとしてのポリアルキレンオキシドからなる生体適合性ブロックからなる。具体的には、例えば生体内分解性の疎水性セグメントの末端に親水性セグメントを共有結合してなるブロック共重合体である。これらのセグメントは直接または連結基を有するスペーサーを介して結合していても良い。このようなブロック共重合体としては、例えば、下記式（１）
Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ（Ｒ３）］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｑ−Ｏ−［−ＣＨ（Ｒ４）ＣＨ２Ｏ−］ｒ−Ｒ５      ・・・（１）
（式中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基又はアミノ基の保護基であり；Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり；Ｒ３は水素原子、アルキル基または置換されたアルキル基であり；Ｒ４は水素原子またはメチル基であり；Ｒ５は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基、またはＲ１−〔［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ（Ｒ３）］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｑ−  で表される基であり；ｎは１〜２０の整数であり；ｋは１〜６の整数であり；ｍは１〜２０の整数であり；ｐは１〜２０の整数であり；ｑは０〜２０の整数であり；ｒは２〜８７０の整数である）で表される生体適合性ブロック共重合体が挙げられる。
疎水性セグメント
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、上記式（１）中に示されるように、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる化合物である。用いられるアミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はない。天然のＬ−α−アミノ酸だけでなく、ＤＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、合成アミノ酸およびこれらアミノ酸の側鎖における誘導体も使用することができる。アミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、ノルバリン、ノルロイシン、α−ｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、アスパラギン、グルタミンおよびβ−シクロヘキシルアラニンなどが挙げられる。これらのうち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが好ましく用いられる。さらに、これらのうちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが特に好ましく用いられる。用いられるヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、α−ヒドロキシカルボン酸だけでなく、その他のヒドロキシカルボン酸を用いることもできる。具体例としては、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸などが挙げられる。これらのうち、グリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
デプシペプチド
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、α−アミノ酸およびα−ヒドロキシカルボン酸からなるデプシペプチド化合物であってもよい。用いられるα−アミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、天然のＬ−α−アミノ酸だけでなく、ＤＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、合成α−アミノ酸を使用することができる。α−アミノ酸の具体例としては、上記したアミノ酸のうちのα−アミノ酸およびその側鎖における誘導体が挙げられる。用いられるα−ヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、上記したヒドロキシカルボン酸のうちのα−ヒドロキシカルボン酸であるグリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
デプシペプチドの加水分解性および抗原性回避の可能性
デプシペプチドはその分子内にアミド結合とエステル結合を有し、そのアミド結合部分は水素原子を有するので分子間水素結合を形成して強固な分子間結合を形成するが、エステル結合部分は水素原子を有さないので分子間水素結合を形成しえず比較的加水分解されやすい。したがってアミド結合連鎖の中にエステル結合があるデプシペプチドは生体内で分解されやすく、その分解速度をアミノ酸の種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数およびその配列順序により制御することが可能である。またポリアミノ酸はしばしばその抗原性が問題となるが、アミノ酸数が約５以下のペプチドにおいてはほとんど抗原性を示さないとされている。デプシペプチドにおいては抗原性を示さないように分子設計することが可能である。ポリデプシペプチドはそれを構成するアミノ酸の種類とシーケンスの長さ、及びヒドロキシカルボン酸の種類によって全く異なる物理化学的特性を示す。アミノ酸が３個連結しヒドロキシカルボン酸が１個存在するテトラデプシペプチドシーケンスは、アミノ酸２個とヒドロキシカルボン酸１個のトリデプシペプチドシーケンスとは全く異なる溶媒への溶解性、二次構造の安定性、ミセル形成能などを示す。更に、アミノ酸の種類、ヒドロキシカルボン酸の種類を変化させれば様々な特性を有するポリデプシペプチドを合成することができる。
とりわけ、アミノ酸の配列を３〜５個とし次いでこれにヒドロキシカルボン酸を１〜３個結合させたポリデプシペプチドが好ましい。
アミノ酸の数、ヒドロキシカルボン酸の数およびデプシの繰り返し数
式（１）で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントのポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数ｎは１〜２０の整数であり、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜６の整数である。疎水性セグメントの親水性セグメント結合側のポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数ｑは０〜２０の整数であり、好ましくは０〜１０の整数、より好ましくは０〜６の整数である。疎水性セグメントのポリヒドロキシカルボン酸を構成するオキシ酸の数ｍは１〜２０の整数であり、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数である。アミノ酸ヒドロキシカルボン酸結合体の繰り返し数ｐは１〜２０の整数であり、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数である。ヒドロキシカルボン酸のメチレン基および置換メチレン基の数ｋは１〜６の整数である。
なお、ｎ、ｐまたはｑが２〜２０の整数の場合の複数のＲ２は同一でも異なっていてもよく、ｍまたはｐが２〜２０の整数の場合の複数のＲ３は同一でも異なっていてもよく、さらにｒが２以上の場合の複数のＲ４も同一でも異なっていてもよい。
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３
式（１）で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントの末端Ｒ１は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基である。アミノ基の保護基としては、例えばｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ−）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ−）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ−）などが挙げられる。生体適合性である限り特に限定されないが、とりわけ、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ−）が好ましく用いられる。
Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖または誘導体化された側鎖（以下、誘導基と称する）を表し、アミノ酸単位ごとに、それぞれ独立に、天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基の一つを示す。誘導基を有するアミノ酸誘導体としては、例えばグルタミン酸５−誘導体、アスパラギン酸４−誘導体、リジンε−誘導体などが挙げられる。グルタミン酸５−誘導体、アスパラギン酸４−誘導体としては側鎖の末端カルボキシル基が保護基で保護された誘導体、メチルエステル、エチルエステルなどのアルキルエステル体、薬物の水酸基とのエステル体、薬物のアミノ基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体が挙げられる。また、リジン誘導体としては、例えばリジンの側鎖の末端アミノ基が保護基で保護された誘導体、薬物のカルボキシル基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体などが挙げられる。薬物との誘導体の他に、グルタミン酸５−エチルエステル単位、アスパラギン酸４−エチルエステル単位、末端アミノ基がベンジルオキシカルボニル基で保護されたリジン単位が好ましく用いられる。
Ｒ３はヒドロキシカルボン酸の側鎖を表し、ヒドロキシカルボン酸ごとに、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基または置換されたアルキル基を示す。また、Ｒ１およびＲ３のアルキル基および置換アルキル基としては炭素数１〜３のアルキル基またはそれが置換基で置換されたものが好ましい。かかるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、を挙げることができる。また、置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基を挙げることができる。
親水性セグメントおよびＲ４
本発明に用いられるブロック共重合体の親水性セグメントは、ポリアルキレンオキシドからなり、より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、ポリプロピレングリコールを挙げることができる。より好ましくはポリエチレングリコールである。式（１）において、アルキレンオキシドの繰り返し数ｒは２〜８７０であり、好ましくは３〜５７０であり、より好ましくは３〜２５０である。Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
Ｒ５
上記式（１）におけるＲ５は、水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基または式  Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ（Ｒ３）］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯ−］ｑ−  で表される基である（ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎ、ｋ、ｍ、ｐおよびｑの定義は上記と同じである）を表す。
リガンドとしては、例えばレクチン、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメントなど）、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク質（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４，ＣＤ７１など）、核酸、抗原、ホルモン、接着因子（例えば、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、ＲＧＤ、ＮＧＲなど）、トランスフェリン、葉酸、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦなど）および所望の標的細胞と特異的に結合するものなどを挙げることができる。
本発明のブロック共重合体は、例えば、以下のようにして製造することができる。
（ｉ）親水性セグメントであるポリアルキレンオキシドの両末端ヒドロキシル基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを、ジメチルアミノピリジンを触媒として反応させることにより、両末端に保護されたアミノ基を有するアミノ酸がエステル結合したポリアルキレンオキシドが得られる。この両末端にあるアミノ酸残基のアミノ保護基をジオキサン中塩酸で処理して除去する。この処理で、保護基が除去され両末端がジアミノアシル化されたポリアルキレンオキシドまたは両末端の内の一方のアミノ酸が脱離し、一つのヒドロキシル基が再生したモノアミノアシル化ポリアルキレンオキシドが得られる。
末端アミノ酸のアミノ基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させて、保護ジペプチド結合ポリアルキレンオキシドを得る。保護基をはずして生じたアミノ基に，末端アミノ基が保護され他末端がヒドロキシカルボン酸からなるオリゴデプシペプチドＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させる。このアミノ基保護オリゴデプシペプチドエステルの反応を繰り返すと，任意のアミノ酸，ヒドロキシカルボン酸配列をもつポリデプシペプチド疎水性セグメントとポリアルキレンオキシド親水性セグメントからなるブロック共重合体が得られる。
（ｉｉ）ヒドロキシカルボン酸にハロゲンおよびハロゲン化チオニルを作用させてヒドロキシカルボン酸のハロゲン化物を得、これにアミノ酸またはポリアミノ酸をアルカリの存在下で反応させてデプシペプチドを得る。なお、アミノ酸がアミノ基とカルボキシル基の２つの官能基以外に、他の官能基を有する場合は、ポリデプシペプチドの製造中、他の官能基を保護基と結合させておくことが好ましい。次に、このアミノ酸誘導体を、アルカリの存在下、加熱することにより閉環させて、環状デプシペプチドを得ることができる。次いで、オクチル酸第一錫のような触媒の存在下、環状デプシペプチドとポリアルキレンオキシド、モノ置換ポリアルキレンオキシド、あるいは一方のヒドロキシル基が保護されたポリアルキレンオキシドとを反応させることにより、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有するブロック共重合体を得ることができる。
また、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントは本発明者の一人が出願した特開２００４−２６９４６２号公報に記載された方法によって合成することができる。すなわち、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基と、無保護のカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸のヒドロキシル基とを、アミノピリジン化合物を触媒として反応させ、ジデプシペプチドを合成する。得られたジデプシペプチドのカルボキシル基をイミド誘導体とし、かつ、ジデプシペプチドの保護されたアミノ基の脱保護を行い、これらにより得られたジデプシペプチドの脱保護されたアミノ基と、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基とを反応させることにより、オリゴデプシペプチドが合成される。
ポリアルキレンオキシドに保護アミノ酸あるいは保護オリゴデプシペプチドを結合させる反応はこれらを溶解する適当な溶媒例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル中で行うことができる。反応後は生成物をジクロロメタンあるいはクロロホルムに溶解し、次いでこれを炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸水溶液などで洗浄することにより副生成物を除去し、溶媒を留去した後、エーテルを加えて純粋な生成物を沈殿、単離する。必要であれば、本ブロック共重合体のテトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチルなどの溶液にエーテルを加えて再沈殿させ、精製する。この再沈殿法による精製は、ポリデプシペプチドを疎水性セグメントとする本ブロック共重合体に対して有効な方法である。ポリペプチド−ポリアルキレンオキシドポリマーではポリペプチドのアミド結合に基づく水素結合が分子内、分子間および分子−溶媒間で強く形成され、再沈殿に適した溶媒−非溶媒の組み合わせを見いだすことが困難である。
ミセルおよび微粒子
本発明のブロック共重合体は、薬物とのミセル形成、薬物を含有する微粒子、薬物との複合体を製するだけでなく、リポソームなどの小胞体を製することにも使用することができる。また、目的に応じ、当該ミセル、微粒子または複合体をリポソームに含有せしめることもできる。
本発明のブロック共重合体は薬物と一緒に用いることができる。該薬物としては天然物、合成物、半合成物、発酵産物、生体由来物質、遺伝子工学の産物のいずれの生理活性化合物でも用いられる。また、合成生理活性化合物、ペプチド、タンパク質、ホルモン、ビタミン、酵素、補酵素、脂肪酸、脂質、遺伝子、これらの誘導体などのいずれでも用いられる。
薬物は、溶解性については、水不溶性、水難溶性、脂溶性、水溶性のいずれであってもよい。このような薬物としては、例えば、抗炎症薬（例えば、メフェナム酸、ブフェキサマク、フェルビナクなどの非ステロイド系薬物、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベクロメタゾンなどのステロイド系薬物など）、解熱薬（例えば、アセトアミノフェン、アルクロフェナク、ブフェキサマクなど）、鎮痛薬（例えば、アミノピリン、アセタミノフェン、モルヒネ、ブプレノルフィンなど）、抗関節炎薬／・抗リウマチ薬（例えば、オーラノフィン、アザチオプリン、メトトレキサートなど）、抗痛風薬（例えば、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾンなど）、強心薬（例えば、オキシフェドリン、テオブロミンなど）、抗狭心症薬（例えば、アルプレノロール、ジルチアゼム、イソソルビドジニトレート、ニフェジピンなど）、ベータ遮断薬（例えば、塩酸プロプラノロール、アテノロール、カルベジロールなど）、カルシウム拮抗薬（例えば、ニフェジピン、ニカルジピン、ジルチアゼムなど）、抗不整脈薬（例えば、キニジン、ベラパミル、チモロールなど）、利尿薬（例えば、フロセミド、アルブチンなど）、抗高血圧薬（例えば、チモロール、カプトプリル、ニカルジピン、プラゾシンなど）、末梢循環障害改善薬（例えば、プロスタグランジン類など）、抗血栓薬（例えば、アルガトロバン、オザグレル、チクロピジンなど）、抗高脂血症薬（例えば、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、プロビコールなど）、抗血小板薬（例えば、プロスタサイクリンなど）、昇圧薬（例えば、ドパミン、ノルエピネフリンなど）、脳循環代謝改善薬（例えば、塩酸チアプリド、スルピリソなど）、抗腫瘍薬（例えば、ドキソルビシン、アクチノマイシン、メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェンなど）、免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、タクロリムス、シクロフォスファミドなど）、抗アレルギー薬（例えば、アゼラスチン、クロモリン、ペンチゲチドなど）、抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、クレマスチン、ジフェンヒドラミンなど）、気管支拡張薬（例えば、アルブテロール、イソプロテレノール、臭化イプラトロピウムなど）、抗喘息薬（例えば、ツロブテロール、クレンブテロールなど）、鎮咳薬（例えば、リン酸コデイン、デキストロメトルファンなど）、去痰薬（例えば、アンブロキソール、カルボシステインなど）、抗潰瘍薬（例えば、セトラキサート、ラニチジン、シメチジンなど）、止瀉薬（例えば、アセチルタンニン酸、ジフェノキシンなど）、制吐薬（例えば、ジフェニドール、スコポラミンなど）、抗糖尿病薬（例えば、ビグアニド系物質、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミドなど）、催眠薬・鎮静薬（例えば、ニトラゼパム、フルラゼパム、アモバルビタールなど）、抗不安薬（例えば、ジアゼパム、オキサゾラムなど）、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール、ベルフェナジン、クロルプロマジンなど）、抗うつ薬（例えば、ジメタザン、イミプラミン、スルピリドなど）、抗眩暈薬（例えば、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェニドール、メシル酸ベタヒスチンなど）、抗てんかん薬（例えば、カルバマゼピン、フェノバルビタール、５−ヒドロキシトリプトファンなど）、筋弛緩薬（例えば、塩化ツボクラリン、バクロフェン、メトカルバモールなど）、抗パーキンソン病薬（例えば、アマンタジン、カルビドパなど）、自律神経系作用薬（例えば、ベタネコール、ネオスチグミンなど）、抗生物質（例えば、アミノグリコシド系物質、セファロスポリン系物質、マクロライド系物質など）、抗菌薬（例えば、キノロン系物質、スルフォナミド系物質、スルホン系物質など）、抗真菌薬（例えば、アリルアミン系物質、エコナゾールなどのイミダゾール系物質、フルコナゾールなどのトリアゾール系物質など）、抗ウィルス薬（例えば、アシクロビル、シタラビン、アマンタジンなど）、駆虫薬（例えば、アミノピリン、ニクロサミド、キナクリンなど）、ホルモン薬（例えば、ソマトスタチン、ゴナドトロピン、ＬＨＲＨなど）、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬（例えば、ビタミンＤ、カルシトニン、ビスフォスフォネートなど）、ビタミン薬（例えば、トコフェロール、ビタミンＢ１２など）、止血薬（例えば、トラネキサム酸など）、酵素薬（例えば、プロナーゼ、リゾチーム、セラペプターゼなど）、ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、コレラワクチンなど）、麻酔薬、診断薬、造影薬、検査薬などが用いられる。
また、薬物は親水性、疎水性のいずれであってもよい。本発明のブロック共重合体はミセルを形成することができる。ミセルは、疎水性セグメントがミセル内核に、親水性セグメントがミセル外殻に存在する場合や、逆にブロック共重合体の親水性セグメントがミセル内核に、疎水性セグメントがミセル外殻に存在する場合があり、さらにビヒクル内で両セグメントがランダムに存在して、ドメイン構造を持たない場合がある。ミセル内核が疎水性セグメントからなる場合は疎水的な薬物を選択し、ミセル内核が親水性セグメントからなる場合は親水的な薬物を選択することが好ましく、微粒子内でランダムに各セグメントが存在する場合には親水性あるいは疎水性のどちらの物性の薬物も選択することができる。
疎水性薬物としては、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、インドメサシン、ナプロキセンなど）、ステロイド性抗炎症薬（例えば、デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、酢酸パラメタゾン、酢酸ハロプレゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、ブチル酢酸プレドニゾロン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾンなど）、抗腫瘍薬（例えば、パクリタキセル、カンプトテシン、エポトシド、ビンブラスチン、フルオロウラシル、メトトレキサート、テガフール、テガフール・ウラシル、マイトマイシンＣ、シスプラチン、カルボコン、ダカルバジン、メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、塩酸ドキソルビシン、クエン酸タモキシフェンなど）、解熱鎮痛薬（例えば、イブプロフェン、ブプレノルフィンなど）、抗喘息薬（例えば、アゼラスチン、ケトチフェン、プロピオン酸フルチカゾンなど）、抗うつ薬（例えば、オキシペルチン、ネフォパムなど）、抗痛風薬（例えば、アロプリノール、コルヒチン、スルフィンピラゾン、プロベネシドなど）、中枢神経系薬（例えば、アニラセタムなど）、抗高血圧薬（例えば、カプトプリル、エナラプリル、塩酸マニジピンなど）、抗血小板薬（例えば、プロスタグランジン類など）、抗高脂血症薬（例えば、クロフィブラート、ガンマーオリザノールなど）、気管支拡張薬（例えば、テオフィリン、塩酸メトキシフェナミン、塩酸ツロブテロールなど）、抗アレルギー薬（例えば、エメダスチン、トラニラスト、テルフェナジンなど）、抗尿失禁薬（例えばカプロン酸ゲストノロンなど）、抗ウィルス薬（例えば、アシクロビル、リバビリンなど）、蛍光色素（例えば、ピレン系蛍光色素、ローダミン系蛍光色素など）などが用いられる。
親水性薬物としては、例えば、水溶性ポリペプチドなどが用いられる。このような水溶性ポリペプチドとしては、例えば、サイトカイン、造血因子、各種増殖因子、酵素などが挙げられる。なかでも、サイトカインが好ましく、例えば、リンホカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）など）、モノカイン（インターロイキン−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）が挙げられる。
その他、薬物としては、黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、インスリンおよび誘導体または類縁体、ソマトスタチンおよび誘導体または類縁体、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、プロラクチン、エリスロポイエチン、副腎皮質ホルモンおよび誘導体または類縁体、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシンおよび誘導体、オキシトシン、カルシトニンおよび誘導体または類縁体、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エンケファリンおよび誘導体または類縁体、エンドルフィン、キョウトルフィン、タフトシン、サイモポイエチン、サイモシン、サイモチムリン、胸腺液性因子、血中胸腺因子およびその誘導体、コロニー誘導因子（例えば、ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦなど）、モチリン、デイノルフィン、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、心房性ナトリウム排泄増加因子、神経成長因子、細胞増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦなど）、神経栄養因子（例えば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦなど）、エンドセリン拮抗作用を有するペプチド類およびその類縁体などが挙げられる。
本発明で用いられる薬物は、それ自身であることはもちろんのこと、薬理学的に許容される形態にあってもよい。このような塩としては、該薬物がアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸など）や有機酸（例えば、炭酸、重炭酸、コハク酸、酢酸、プロピオン酸、フマール酸、トリフルオロ酢酸など）などとの塩が挙げられる。該薬物がカルボキシル基等の酸性基を有する場合、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属あるいはカルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属など）や有機塩基（例えば、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類など）などとの塩が挙げられる。また、薬物は金属錯体化合物例えば、銅錯体、亜鉛錯体を形成していてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有ミセルを調製するには、例えば、薄膜水中攪拌法、溶液水中希釈法、透析法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
（１）薄膜水中攪拌法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、容器に入れ、溶媒を除去して薄膜を形成させる。これに水を加え、攪拌しミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体と薬物を溶解できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒であっても該ブロック共重合体が析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。水相には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど）、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、水中攪拌時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで残存溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
（２）溶液水中希釈法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去して高分子ミセルを調製する。ここで用いる溶媒としては、水に混和できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。溶媒は単独であるいは２種以上組み合わせて使用することができる。なかでもテトラヒドロフランとアセトンと水の組み合わせが好ましく用いられる。該ブロック共重合体にとっての良溶媒とはポリマーの組成により当然変化するものであるため、使用するポリマーに応じて溶媒の選択を行うのが好ましい。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、溶液水中希釈時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで溶媒を除去することや通気法によって溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
（３）透析法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、透析チューブに入れ水中で透析し、溶媒を除去してミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体を溶解でき、水に混和できるものであれば特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリルなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、２種以上組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒も該ブロック共重合体および薬物を析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。ブロック共重合体と溶媒の比率は特に限定されるものではない。また、透析膜としては、用いるブロック共重合体の分子量により適切な分子量分画サイズを選択すればよく、セルロース膜などを用いることが多いが、これに限定されるものではない。また、透析溶液には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど）、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。透析時間は、通常１回約５分〜約２４時間であるが、外水相の液交換操作を１回以上繰り返すことでミセルを調製する。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。これによって調製できたミセルは透析膜中で透明からやや白濁した状態で得ることができる。
本発明において、疎水性／親水性セグメントを有するブロック共重合体が形成しうるミセルの形態は、調製方法により変えることが可能である。ブロック共重合体を有機溶媒に溶解または分散後、多量の水溶液中でミセルを調製した場合は、Ｏ／Ｗ型となり疎水性セグメントを内核にしてそして親水性セグメントを外殻に配した形態となる。また、逆にブロック共重合体を水溶液中で溶解または分散した後、多量の有機溶媒内でミセルを調製した場合、Ｗ／Ｏ型となり親水性セグメントを内核にして疎水性セグメントを外殻に配した形態となる。通常は、例えば、疎水性セグメントを内核として親水性セグメントを外殻とするコア／シェル型ミセルである。その場合ブロック共重合体の疎水性セグメントが集合して高密度に凝集してコアを形成し、親水性セグメントは粒子表面から外に向いて延びていると推察される。また、親水性セグメントの末端を保護または修飾した場合には、親水性セグメントの部分的凝集の存在も考えられる。これらの調製方法も目的に応じて変えることができる。例えば、薬物を封入する場合、その薬物の水あるいは有機溶媒への溶解度や安定性などの物性によって決められる。
上記方法によって得られる薬物含有ミセルまたはその集合体の平均粒子径は、水中で分散した状態で、例えば１ｎｍ〜１，０００ｎｍであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍであり、特に好ましくは５ｎｍ〜３００ｎｍである。これら粒子径の決定要因は、ブロック共重合体の組成とその調製方法にある。また、粒子径は使用目的に応じて変えられるため、これらの粒子径に限定されない。粒子径は公知の方法で測定することができるが、例えば、光散乱測定法や顕微鏡観察などが用いられる。
上記いずれの調製方法においても薬物含有ミセル形成後に水に分散した状態で凍結乾燥または真空乾燥を行い、乾燥粉末として保存できる。乾燥操作中の凝集抑制を目的として添加剤を添加することもできる。添加剤としては、例えば、マンニトール、ラクトース、ブドウ糖、トレハロース、デンプン類、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩、水溶性多糖、ポリエチレングリコール、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが用いられる。添加剤の添加量は、ミセルを再分散した時に凝集抑制が達成される範囲であれば、特に制限されない。
親水性セグメントにリガンドを結合させた本発明のブロック共重合体は、生体内でのターゲティング能を有する。本発明に基づく高分子ミセルは比較的穏やかな条件で調製することができるためリガンドの活性維持、不安定性な薬物の封入に適している。また疎水性セグメントと親水性セグメントの分子量を適切に変えることにより粒子径の調整が可能となるので、粒子径を調製して薬物を封入した製剤では血中滞留性を調節することも可能である。また、本発明のブロック共重合体は、上記性能からも理解されるように、疎水性化合物の水への可溶化にも利用できる。
高分子ミセルは、通常疎水性セグメントを核とする製剤であるため、封入する薬物は疎水性であるのが好ましいが、水溶性であっても疎水性部分を持つ化合物にあってはその疎水性部分で本ブロック共重合体とミセルを形成することも可能である。また、特定臓器（例えば、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脳など）または疾患部位・臓器（例えば、癌、炎症部位など）に指向することにより、薬効を増強できるものや、血中滞留性を延長することで薬効を増強できるものが好ましい。
本発明のブロック共重合体は疎水性セグメントからなるミセルの内核部分に安定にこれらの薬物を封入することができる。本発明の薬物の封入方法は、ポリマー溶解液中に添加し、薬物と疎水性セグメントとを核にし、親水性セグメントを表面に配した高分子ミセルの調製を可能にする。この際、薬物を効率良くトラップするために、適切な溶媒を添加することができる。例えば、クロロホルムやジクロロメタンなどの溶媒を添加してブロック共重合体中の疎水的環境を安定にし、薬物を封入する方法が考えられる。また、ブロック共重合体を用いて予め高分子ミセルを調製しておき、後に溶媒に溶解した薬物を高分子ミセル溶液に添加して薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させる方法もある。この場合溶液のｐＨや塩濃度などを適切に変えることにより浸透効率を上げることも可能である。また、ブロック共重合体を用いて予め高分子ミセルを調製しておき、薬物を高分子ミセル溶液に添加して混練することにより薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させる方法もある。封入する疎水性薬物としては、前記と同様のものが挙げられる。上記高分子ミセルとは逆に、親水性セグメントをコアに、疎水性セグメントをシェルにした高分子ミセルも好ましく、これは親水性薬物を高分子ミセルのコア内に封入し、徐放性や薬物安定性を示すものである。親水性薬物としては、前記と同様のものが用いられる。この高分子ミセルも後述の投与形態によって投与することができる。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有微粒子を調製するには、例えば、水中乾燥法、超音波処理法、凍結乾燥法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
（１）水中乾燥法
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去または拡散せしめて微粒子を調製する。ここで用いる溶媒としては、該ブロック重合体と薬物を溶解するものである限り特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。これらを単独であるいは２種以上溶媒と組み合わせて使用することができる。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。有機溶媒に対しては水の量は任意に選択できる。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、水中乾燥時に外的剪断力を付与することや通気により溶媒を除去することや減圧条件下でエバポレーターなどで溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機やホモジナイザーなどが挙げられる。
（２）超音波処理法
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を適切な溶媒で溶解して多量の水中に分散させる。装置の形状、処理量によって一概に決定できないが、例えば、１Ｗ〜約２００Ｗ、好ましくは１Ｗ〜約１０Ｗの範囲で１秒〜約２４時間、より好ましくは１分〜約５時間超音波照射を行う。調製温度は約０℃〜約８０℃の範囲で行われるが、好ましくは約５℃〜５０℃である。上記の水中乾燥法と組み合わせて行われることが多い。
本発明の微粒子におけるブロック共重合体の含有割合は、微粒子全体に対して、通常１０〜１００重量％、好ましくは３０〜１００重量％である。本発明の微粒子に薬物が含まれる場合、本発明の微粒子における薬物の含有割合は、治療上の必要量により定まるものであり、特に限定されない。本発明の微粒子は、例えば、分散剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０などの界面活性剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類；硫酸プロタミン；ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、油脂類（例えば、ゴマ油、コーン油など）、リン脂質（例えば、レシチンなど）、賦形剤（例えば、乳糖、コーンスターチ、マンニトール、セルロースなど）、結合剤（例えば、ショ糖、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリンなど）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）などと混合されていてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物複合体粒子を調製するには、例えば、水中混練法などが用いられる。該ブロック共重合体の水溶液に薬物を添加して混練することにより薬物複合体を製することができる。混練を効率よく行うことにより、ナノオーダーの薬物結晶と本ブロック共重合体との複合体を形成せしめることができ、薬物の懸濁状態が安定に保たれる。
本発明の薬物を含有したミセル、微粒子または複合体は、種々の医薬品添加物を加え種々の剤形に製剤化し、注射剤または埋め込み剤（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、間接腔内投与、組織内投与など）、経粘膜剤（例えば、経口腔粘膜剤、経鼻剤、坐剤、膣剤、経肺剤など）、経皮剤（例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤など）、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤など）などとして投与することができる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を注射剤または埋め込み剤とするには、これらを界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖、プロリンなど）、緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムなど）と共に水性液剤、水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤とすることができる。水性液剤、水性懸濁剤は凍結乾燥により凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を無菌製剤にするには、無菌濾過、無菌充填工程を経る方法、ガンマ線滅菌する方法、防腐剤を添加する方法、全製造工程を無菌化する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子は、哺乳動物に対して安全な医薬として用いることができる。本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子の投与量は、主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって種々異なるが、薬物の有効量であればよい。投与回数は１日１〜数回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、または数か月に１回など主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
以上のとおり、本発明のブロック共重合体は、疎水性化合物とミセル、微粒子、複合体を形成することができる。ミセル化により、疎水性化合物を可溶化でき、静脈投与可能となる。リガンドにより疾患部位への集積も可能である。更に本ブロック共重合体は生体適合性であり、かつ徐放性により薬効持続性も期待できる。ミセル化により経口吸収性の向上も期待できる。また、微粒子は皮下注射剤として長期にわたる薬物放出が期待でき、複合体は難吸収性薬物のナノ粒子化を可能とし経口吸収性の向上も期待できる。また、本発明のブロック共重合体は、その構成アミノ酸の種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数、配列順序の規定あるいは修飾基を変えることにより、選択性などさまざまな特性を付与することができる。
【実施例】
【０００５】
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
アミノアシルポリエチレングリコールの合成
平均分子量４，０００のポリエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ）２００ｇ（０．０５モル）を４００ｍＬのアセトニトリルに溶かした。この溶液にｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＮＳｕ）５５ｇ（０．１５モル）と４−ジメチルアミノピリジン２．６５ｇ（０．０１５モル）を加えて２日間室温で撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去後、残査を６００ｍＬのジクロロメタンに溶かし、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトリトリルに溶かし、４５０ｎｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶させた。このもののＮＭＲスペクトルはＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの両末端にＢｏｃ−Ｐｈｅがエステル結合により結合したＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｂｏｃであることを示した。収量２１５ｇ（９４％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｂｏｃ  ９０ｇ（０．０２モル）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。７７．８ｇ（９３％）。
参考例２
アミノアシルポリエチレングリコールへのｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシンの導入
上記ポリエチレングリコール−Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）１．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕ）４．９２ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし，エーテルを加えて再結晶させた。４１ｇ（９４％）。
参考例３
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）の合成
Ｌ−乳酸  ４５ｇ（０．５モル）を５００ｍＬのＴＨＦに溶かし，ピリジン４０．５ｍＬ（０．５モル）を加えた。室温で撹拌しながらＢｏｃ−Ｌ−アラニン−ＯＮＳｕ  １４３ｇ（０．５モル）を加え、更に４−ジメチルアミノピリジン６．１ｇ（０．０５モル）を加えた。室温で１．５日撹拌し、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル５００ｍＬに溶かし、クエン酸飽和水溶液、水で洗った。溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液で３回抽出し、得られた抽出液を合わせてクエン酸で酸性にした。酸性水溶液を３００ｍＬ酢酸エチルで３回抽出した。合わせた抽出液を水洗し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られたオイルにヘキサンを加えると結晶化した。酢酸エチルから再結晶し，純粋なＢｏｃ−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸（Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨ）を得た。９１ｇ（７％）。このジデプシペプチドをジオキサン中の４Ｍ塩酸で処理し、Ｂｏｃ保護基を除去した。得られたジデプシペプチド塩酸塩を４００ｍＬのＴＨＦに溶かし、撹拌しながら２８ｍＬのピリジンを加えた。この溶液にＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕ  １２１ｇ（０．３７モル）を加え，撹拌しながらＮＭＭ  ３８．５ｍＬ（０．３５モル）を加えた。室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を５００ｍＬの酢酸エチルに溶かした。この溶液を上記のように処理してＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨを１１５ｇ（８８％）得た。このトリデプシペプチドのＢｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕと反応させてＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨを１２７ｇ（８５％）得た。このＢｏｃ−テトラデプシペプチドを４００ｍＬのＴＨＦに溶かし、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）３４．５ｇ（０．３モル）を加えた。溶液を−１０℃に冷却し、５５．４ｇ（０．２７モル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて，−１０℃で３時間、室温で一夜撹拌した。溶液を５００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、生じたジシクロヘキシル尿素の結晶を濾去し、濾液を減圧濃縮した。残渣にヘキサンを加えて結晶化させた。酢酸エチルから再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを１３８ｇ（９０％）得た。
［実施例１］
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４０ｇ（９．２ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）８．１ｇ（１３．９ミリモル）を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４１．８ｇ（９６％）を得た。
［実施例２］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。
［実施例３］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例２のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１３．１（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（４２Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（４８Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ１４Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１１Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
［実施例４］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例３のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９５％の收率で得られた。
［実施例５］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例４のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９５％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１３．７（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（６６Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（７２Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（２２Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１７Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
［実施例６］
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量６００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃが９６％の収率で得られた。
［実施例７］
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ１５４０−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量１，５４０のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ１５４０−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃが９５％の収率で得られた。
［実施例８］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６０００−ＯＨの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量６，０００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６０００−ＯＨが９５％の収率で得られた。
［実施例９］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ２００００−ＯＨの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量２０，０００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ２００００−ＯＨが９７％の収率で得られた。
［実施例１０］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３の製造
平均分子量４，０００のモノメトキシポリエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３）２００ｇ（０．０５モル）を４００ｍＬのアセトニトリルに溶かし、この溶液にｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＮＳｕ）５５ｇ（０．１５モル）と４−ジメチルアミノピリジン２．６５ｇ（０．０１５モル）を加えて２日間室温で反応させた。反応後、溶媒を減圧留去し、残査を６００ｍＬのジクロロメタンに溶かし、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトニトリルに溶かし、４５０ｎｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶した。このもののＮＭＲスペクトルはＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３の末端にＢｏｃ−Ｐｈｅがエステル結合により結合したＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３であることを示した。収量２００ｇ（９４％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３９０ｇ（０．０２モル）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３であることを示した。収量７７．８ｇ（９３％）。以下、参照例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３を得た。
［実施例１１］
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
参考例１で合成したポリエチレングリコール  Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、ＮＭＭ  １．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ）４．３ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られたＢｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量３９ｇ（９０％）。Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４３．２ｇ（１０ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グリコール酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−ＯＮＳｕ）８．５５ｇ（１５ミリモル）を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４２．１ｇ（９０％）を得た。
［実施例１２］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１１のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが８９％の收率で得られた。
［実施例１３］
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１２のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９０％の收率で得られた。
［実施例１４］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１３のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。
［実施例１５］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１４のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９１％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１１．２（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（６０Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．１〜１．７ｐｐｍ（６６Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（２４Ｈ）アミノ酸、乳酸およびグリコール酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１７Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
［実施例１６］
Ｂｏｃ−｛Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ｝４−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
ＨＣｌ・Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４３ｇ（１０ミリモル）をＴＨＦに溶かし、ＮＭＭ  １．１ｍＬ及びＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ  ８．６ｇ（１５ミリモル）を加えて、一夜室温で撹拌した。常法通り処理してＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  を４１．７ｇ（８９％）得た。このＢｏｃ−テトラデプシペプチド活性エステルの反応を更に３回繰り返してデプシペプチド鎖長を延長して、最終的にＢｏｃ−｛Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ｝４−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  を得た。
［実施例１７］
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
ポリエチレングリコール  Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、Ｎ−メチルモルホリン１．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシＬ−フェニルアラニル−Ｌ−乳酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）１０．４ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量４５．４ｇ（９６％）。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４７．３ｇ（１０ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １．１５ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ  １０．４ｇを加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４２．１ｇ（９０％）を得た。このＤＰ−ＰＥＧを４Ｍ−ＨＣｌ／ジオキサンで処理してＢｏｃ基を除去し、得られた塩酸塩にＢｐｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを常法通り反応させてＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−  Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ３８．７ｇ（９５％）を得た。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１２．２（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（１２Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（２４Ｈ）Ｌａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（１１Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（３０Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（８Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
［実施例１８］
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ３００ｍｇとパルミチン酸デキサメタゾン（ＤＭＰ）１５ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、２０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液から５０℃で溶媒を減圧留去した。得られたフィルム状残渣に水１００ｍＬを加えて、フラスコを手で振って、残渣を水に溶解させた。ＤＭＰは水に不溶であるが、フィルム状残渣は完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。これにより、本ブロック共重合体は難溶性疎水性化合物を可溶化することができることが示された。
［実施例１９］
ミセルの製造とミセルの粒径
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２００ｍｇとＤＭＰ  ６０ｍｇをアセトニトリルに溶かし、常法通り処理し、生理的食塩水１００ｍｌを加えた。溶液はわずかに白濁したので、メンブランフィルターでろ過した。フィルター上には不溶分１４ｍｇが残った。従って、生理的食塩水溶液１００ｍＬ中に４６ｍｇのＤＭＰを含むミセルを調製することができた。このミセルの直径は１０２．５ｎｍであった。
［実施例２０］
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ３００ｍｇとアシクロビル（ＡＶ）１０．５ｍｇをアセトニトリルに溶かした。溶液を５０℃で減圧濃縮し、残渣に水３ｍＬを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
［実施例２１］
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ３００ｍｇとアシクロビル１０．５ｍｇをアセトニトリルに溶かした。溶液を５０℃で減圧濃縮し、残渣に水３ｍＬを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
［実施例２２］
ミセル形成の証拠
実施例１８と同様と同様の重量、操作でＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからなるミセルを調製し、これを凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ２Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をＤ２Ｏに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたＮＭＲスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びＤＭＰは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解するとミセルが破壊され、試料中のＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰは分子状でＤＭＳＯ溶液となり、ＮＭＲでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからなるミセルが形成されているといえる。
［実施例２３］
凍結乾燥によるミセルの凝集、破壊のないことの証明
Ｂｏｃ（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｌａｃ）３（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｈｅａ）２−Ａｒａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ５００ｍｇとＤＭＰ  １００ｍｇをアセトニトリルに溶解し、減圧で溶媒を留去した。残査に水５０ｍＬを加えてよく振った。一夜放置後、生じた不溶物を４５０ｎｍのメンブランフィルターで濾過した。不溶物の重量は２４ｍｇであった。ろ液を２分割し、一方には２５０ｍｇ（サンプル１）、及び他方には１２５ｍｇ（サンプル２）のＰＥＧ４０００を加えて凍結乾燥した。収量はそれぞれ４７７ｍｇと４１３ｍｇであった。サンプル１を２６．６ｍｇ取り、生理的食塩水１ｍＬを加えて手で軽く振ったところ１５秒で透明な均一溶液となった。一方、サンプル２を２０．０ｍｇ取り、同様な処理をしたところ、軽く振った後、４５秒後には均一溶液になった。いずれも、凍結乾燥品は生理的食塩水に極めてすばやく溶解し、透明な均一溶液を与えた。粒径はそれぞれ１０５．５ｎｍ、１０１．６ｎｍであった。
［実施例２４］
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  １００ｍｇとＤＭＰ  ５ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に１４％、４８時間後に３３％が放出された。
［実施例２５］
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  １００ｍｇとＤＭＰ  ５ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に２％、４８時間後に４％が放出された。
［実施例２６］
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  １００ｍｇとＤＭＰ  １０ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に２４％が放出された。
［実施例２７］
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  １００ｍｇとデキサメタゾン  ５ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。１０時間後に５７％が放出され、その後の１０時間では３％の放出しかなかった。これらのことから、薬物と本発明のブロック共重合体との親和性は、薬物ごとに大きな差異があり、薬物の化学的特性に適合するようにミセル中の疎水性セグメントのポリマー構造を薬物毎に構築することにより、ミセルの形成を制御できることが分かった。また、ミセル内に内封された薬物の放出性は薬物、本発明のブロック共重合体の構造と内封させる薬物量によりその放出性を制御できることが分かった。
［実施例２８］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄとの縮合物の合成
葉酸  ４．４ｇ（０．０１モル）を１００ｍＬの酢酸に溶かし、０℃で塩化チオニル  １．２ｇ（０．０１モル）を滴下し、得られた溶液をＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ（０．００５モル）とピリジン４ｍＬを含むＴＨＦ溶液３００ｍＬに滴下し、室温で３時間反応させた。得られた溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルに溶かして、水、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮しエーテルを加えて生成物を沈殿させた。ＴＨＦから再沈殿させて精製されたＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄとの縮合物を得た。
［実施例２９］
微粒子の製造
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃ  ２００ｍｇとパルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇをアセトニトリル−ＴＨＦ（１：１）２ｍＬに溶かし、スターラーで高速撹拌下、水を徐々に加えて１００ｍＬにした。その後、３０分間撹拌した。溶液は白濁し、薬物を含有する微粒子が調製された。
［実施例３０］
複合体の製造
パルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇを乳鉢に取り、これに、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  １００ｍｇを１５ｍＬの水に溶かし超音波処理した水溶液１ｍＬを加えて、乳棒で１分間混練した結果、パルミチン酸デキサメタゾン結晶は極微小の結晶状態で均一に分散し、この懸濁液は室温で十分に安定であった。一方、パルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇをメノウの乳鉢に取り、これに水１ｍＬを加えて、メノウの乳棒で混練した場合には、パルミチン酸デキサメタゾンが水に全く親和性がなく、大きな塊のままで分散しなかった。このことから本発明ブロック共重合体は微小薬物結晶と安定な複合体を形成することが分かった。
［実施例３１］
薬理効果の持続性
実施例１８と同様にして得たＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパルミチン酸デキサメタゾンからなるミセルを含有する注射液（生理食塩水）を調製し、デキサメタゾンとして０．５ｍｇ／ｋｇの投与量になる様に雄性ＳＤラット（５週令、ｎ＝３〜５）に静注した。薬剤投与７日後、ラットの右足に３％カラギーナン溶液０．１ｍｌを皮下注し、浮腫による足体積増加を４時間後に測定した。比較として、上記したミセルに代えて、パルミチン酸デキサメタゾンのリピッドマイクロスフェア注射液（リメタゾン（登録商標）、三菱ウェルファーマ（株）製）、リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液（デカドロン（登録商標）、万有製薬（株）製）、薬物不含有の生理食塩水を同量投与し、同様のタイムスケジュールで足体積を測定した。薬物不含有の生理食塩水では足体積が１９．９±７．７％増加し、リメタゾンでは１５．４±３．５％の増加をみた。しかし、上記のミセルは１．４６±１．４６％の増加しかなく、生理食塩水及びリメタゾンに対し、有意（Ｐ＜０．０１）な抗炎症効果が認められた。リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液（デカドロン（登録商標）、万有製薬（株）製）を用いた実験においては、生理食塩水と比較し２４時間後が最も強く抗炎症作用があり足体積増加は顕著に抑制されたが、３日目以降その効果は消失していた。このことより、本発明のミセルの薬理効果の持続性が明らかとなった。
［実施例３２］
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ６ｍｇとプロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）０．１２ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、３０ｍＬのアセトニトリル−ＴＨＦ−エタノール（５：５：１）に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られたフィルムに蒸留水３０ｍＬを加えて、フィルムを水に溶解させた。フィルムは完全に水に溶けた。次いでＵＶスペクトルを測定した。３日後でも１９５ｎｍに吸収極大をもつＵＶスペクトルは変化しなかった。またこの水溶液に３ｍｇのＰＥＧ４０００を加え、凍結乾燥した。凍結乾燥物を室温に２４日保存した後でもＵＶスペクトルは変化しなかった。
［実施例３３］
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ５０ｍｇとプロスタサイクリンであるベラプロストナトリウム５．０ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、３０ｍＬのアセトニトリル−ＴＨＦ−エタノール（５：５：１）に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られた固形物にｐＨ４．５の酢酸緩衝液（０．１Ｍ）を１ｍＬ加え、超音波をかけ固形物を溶解させた。ベラプロストナトリウム単独では、このｐＨでは沈殿が生じるが、固形物はこのｐＨで完全に緩衝液に溶け、ミセルに取り込まれたことが示唆された。
［実施例３４］
ミセルの製造
パクリタキセル２．２ｍｇとＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ５５ｍｇを１０ｍＬのアセトニトリルに溶かし、溶媒を減圧留去した。
ガラス壁に残った透明なフィルムを水３０ｍＬに４０℃で溶解した。パクリタキセルは水に不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に２５ｍｇのＰＥＧ４０００を加えて、凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ２Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をＤ２Ｏに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたＮＭＲスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びパクリタキセルは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解するとミセルが破壊され、試料中のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルは分子状でＤＭＳＯ溶液となり、ＮＭＲでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
［実施例３５］
ミセルの製造
メトトレキサート２０ｍｇとＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２００ｍｇを３０ｍＬのＴＨＦ−メタノール（１：１）に溶かし、溶媒を減圧留去した。残った透明なフィルムに水５０ｍＬを加えて溶解した。メトトレキサートは水にほとんど不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に１００ｍｇのＰＥＧ４０００を加えて、凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ２Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとメトトレキサートからのプロトンピークが全て観測された。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとメトトレキサートからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
［実施例３６］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−  Ｄ−アラニンＮ−ヒドロキシコハク酸エステルＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ  ４．３ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン  ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量２０ｇ（収率９２％）次いで、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｄ−Ａｌａ−Ｂｏｃ  ２０ｇ（４．６ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。１７．６ｇ（９３％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
［実施例３７］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシハク酸エステルＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＳｕ  ７．２ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン  ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量２１ｇ（収率８９％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｂｏｃ  １８．９ｇ（４ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。収量１６．５ｇ（収率９６％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
［実施例３８］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−エチル−Ｌ−アスパラギン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステルＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−ＯＮＳｕ  ５．４ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン  ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量１９ｇ（収率８５％）。次いで、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｂｏｃ  １８ｇ（４．０１ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。収量１５．１ｇ（収率９０％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
［実施例３９］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットにおける静脈内単回投与毒性試験
動物種としては、Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット、１０週齢、体重３３８−４９０ｇを用いた。被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量２０ｍｇ／ｋｇ）、対照としてＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水で溶解し、超音波処理を行った後、０．２２μｍのメンブラン・フィルターを通して濾過滅菌を行った。また生理食塩水も同様に０．２２μｍのメンブラン・フィルターを通し濾過滅菌を行った。１群５匹のモルモットに、生理食塩水、ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  、及びＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを１ｍｌ／ｋｇで１分間かけて前肢の静脈内に単回投与し、２４時間観察を行った。その後１ヶ月間、週１回体重を測定するとともに一般状態も観察した。その結果、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ及びＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの投与群において、死亡例は見られなかった。一般状態についても特に異常は見られなかった。また体重についても、特記すべき変化はみられなかった。以上のことから、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットにおける静脈内単回投与による毒性はみとめられなかった。
［実施例４０］
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー（ＡＳＡ）反応試験
動物種として、Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット、７週齢、体重３８０−５１０ｇを用いた。動物感作において、被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陽性対照として卵白アルブミン（投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整し等量のＦＣＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、もしくはＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を加え、ｗ／ｏエマルジョンを作製した。初回にＦＣＡエマルジョンを、第２・３週目にＦＩＡエマルジョンを投与量２．５ｍｌ／ｋｇとして背部皮下及びｆｏｏｔ  ｐａｄに投与し感作した。惹起反応としては、被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量４．０ｍｇ／ｋｇ）、陽性対照として卵白アルブミン（０．４ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整した。第５週目に投与量１．０ｍｌ／ｋｇとして、前肢もしくは後肢の静脈に誘発投与し、４時間観察を行った。その後１ヶ月間、週１回体重を測定するとともに一般状態も観察した。動物数はＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ群：４匹、卵白アルブミン群：３匹、生理食塩水群：３匹とした。その結果、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨはアナフィラキシー反応を示さなかった。その後の一般状態及び体重についても特に異常は見られなかった。陽性対照となる卵白アルブミン投与群においては、誘発投与直後にすべての個体にアナフィラキシー症状が観察された。以上のことから、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー（ＡＳＡ）反応試験は陰性であり、抗原性がないことがわかった
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月15日(2008.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有し、疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなりそして下記式（１）で表されることを特徴とする、生体適合性ブロック共重合体。
Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−Ｏ−［−ＣＨ(Ｒ４)ＣＨ２Ｏ−］ｒ−Ｒ５   ・・・（１）
（式中、Ｒ１は水素原子, アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり； Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり； Ｒ３は水素原子またはＣ1〜Ｃ３のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基であり； Ｒ４は水素原子であり； Ｒ５は水素原子, Ｃ1〜Ｃ3のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはＲ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−で表わされる基であり；ｎは１〜１０の整数であり；ｋは１〜６の整数であり；ｍは１〜５の整数であり；ｐは１〜２０の整数であり；ｑは０〜６の整数でありそしてｒは３〜５７０の整数である）。
【請求項２】
アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンおよびそれらの側鎖における誘導体よりなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸である請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項３】
ヒドロキシカルボン酸が、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つのヒドロキシカルボン酸である請求項１〜２のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項４】
親水性セグメントのポリエチレンオキシドの数平均分子量が１０，０００以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項５】
疎水性セグメントが、デプシペプチドである請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項６】
式(１)のＲ５のリガンド残基を生じるリガンドが、レクチン、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、接着因子、トランスフェリンまたは葉酸である請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体の疎水性セグメントが内核を形成しそして親水性セグメントが外殻を形成してなるミセル。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなりそして内核が疎水性セグメントと薬物からなり外殻が親水性セグメントからなるミセル。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる微粒子(ミセルを除く)。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる複合体(ミセルを除く)。
【請求項１１】
平均粒子径が５ｎｍ〜３００ｎｍである請求項７または８に記載のミセル。
【請求項１２】
薬物が、抗炎症薬、解熱薬、鎮痛薬、抗関節炎薬もしくは抗リウマチ薬、抗痛風薬、強心薬、抗狭心症薬、ベータ遮断薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、利尿薬、抗高血圧薬、末梢循環障害改善薬、抗血栓薬、抗高脂血症薬、抗血小板薬、昇圧薬、脳循環代謝改善薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬、気管支拡張薬、抗喘息薬、鎮咳薬、去痰薬、抗潰瘍薬、止瀉薬、制吐薬、抗糖尿病薬、催眠薬・鎮静薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬、自律神経系作用薬、抗生物質、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウィルス薬、駆虫薬、ホルモン薬、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬、ビタミン薬、止血薬、酵素薬、ワクチン、麻酔薬、診断薬、造影薬または検査薬である請求項８〜１１のいずれか１項に記載のミセル、微粒子または複合体。
【請求項１３】
薬物が疎水性薬物である請求項８〜１１のいずれか１項に記載のミセル、微粒子または複合体。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載のミセル、微粒子または複合体を含有する医薬組成物。
【請求項１５】
投与形態が、注射剤、経口剤、吸入剤，経皮剤または経粘膜剤の形態にある請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法。
【請求項１７】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体、薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミセル、微粒子または複合体の製造法。
【請求項１８】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物と組み合わせて生体に適用するための使用。
【請求項１９】
請求項１に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物とのミセル、微粒子または複合体を製造するための使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体、この生体適合性ブロック共重合体と薬物からなるミセル、微粒子または複合体ならびにそれらの用途、これらを含む医薬組成物およびその製造法に関する。このミセル、微粒子または複合体は、薬物の可溶化、分散化、安定化、徐放化、病巣部位への送達などを可能とする。
【背景技術】
【０００２】
薬物は生体内の薬物作用部位へ到達することによりその効果を発揮するものである。薬物がその作用部位に到達できない原因は種々ある。例えば、薬物が、（１）体液に溶けにくいこと、(２)酵素、ｐＨ、その他の生理的条件下で不安定であること、(３)内皮、粘膜などの膜性バリアーを通過できないこと、(４)望ましくない免疫反応を引き起こすこと、(５)血中から速やかに消失し排泄されること、(６)標的部位へのターゲティング能力が欠如していることなどが挙げられる。
これらの原因が引き起こす結果として、例えば、（１）注射液の調製が困難、(２)タンパク性医薬の経口投与が困難、(３)癌組織や脳、神経組織への薬物送達が不十分、(４)親水性薬物の粘膜吸収が不十分、(５)疎水性薬物の生体利用率が不十分、(６)サイトカインなどの早すぎる血中消失、(７)標的部位への移行性の欠如などが問題点として挙げられる。
これらの問題点を解決するためのアプローチは多数提案されている。例えば、（１）親水性高分子化合物とタンパク性薬物との結合体の形成、(２)能動輸送物質と薬物との結合体の形成、(３)リポソームヘの親水性薬物の封入、(４)ナノまたはマイクロメーターサイズの生分解性重合体微粒子への薬物の封入、(５)両親媒性の高分子物質と薬物による高分子ミセル形成などが挙げられる。しかし、薬物送達に関わる全ての問題に対する普遍的解決策はいまだ見出されていない。
生分解性重合体として、主鎖がアミド結合で連結したポリアミノ酸が挙げられる。しかしながら、アミド結合は分子間あるいは分子内で強固に水素結合して安定な高次構造を形成するため、ポリアミドを生分解によって分解するためには、この強固な水素結合で支持された高次構造を切断する必要があり、不安定構造を有するラセミ体や、イオン化する極性側鎖を有する特殊なポリアミノ酸を除き、完全には生分解されないことが明らかにされている（非特許文献１参照）。
生分解が可能な薬物送達用の高分子として、水酸基とカルボキシル基を分子内に有するヒドロキシカルボン酸がエステル縮合したポリオキシ酸が挙げられる。ポリオキシ酸においては、エステル結合が水素原子を有しないことから、エステル結合において水素結合が生じることがなく、ポリアミノ酸より容易に生分解されることが明らかにされている。更に、ヒドロキシカルボン酸と水から無触媒でヒドロキシカルボン酸を重合する方法が開発され、触媒の残渣の混入がないオリゴマーを重縮合したポリマーは、薬物送達システムに使用した場合、金属触媒を使用して生成したものと比較して異物反応を誘発するおそれがなく、また、分子間相互作用が弱いため成型も容易に行なえることから、薬物送達システムの好ましい材料とされている。ポリオキシ酸は低分子量の試料ほど生分解速度が速く、特に、低分子量ポリ−ＤＬ−乳酸が好ましい薬物送達システムとして採用されている（非特許文献２〜４参照）。
【０００３】
一方、高分子ミセルは、基本的に、親水性セグメントを外殻とし、疎水性セグメントを内核として形成されるナノ粒子であり、薬物の可溶化、安定化、持続放出、送達用担体として多数報告されている。例えば、ポリアルキレンオキシド等の親水性セグメントおよびポリアルキルアスパルテート等の疎水性セグメントからなるブロック共重合体の薬物担持用担体（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０および特許文献１１参照）、親水性ポリアミノ酸等の親水性セグメントおよびポリラクチド等の疎水性セグメントからなるブロック共重合体の微粒子（特許文献１２参照）、ポリエチレングリコール等の親水性セグメントおよびポリアミンやポリカルボン酸等の荷電性セグメントを含むブロック共重合体（特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６参照）、水難溶性薬物を含有する高分子ミセルの調製方法（特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２および特許文献２３参照）が報告されている。
しかし、上記のいずれの文献にもアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生分解性プラスチックスとして、光学活性３−置換−２，５−モルホリンジオンと環状ラクトンを重合せしめたデプシペプチド共重合体や、ポリデプシペプチドから製造される生物吸収外科用装置等（特許文献２４参照）や、特定のポリアミドユニット、特定のポリエステルユニットおよび特定のポリラクトンユニットとを有する生分解性ポリラクトンエステルアミド（特許文献２５参照）が報告されている。また、特定のデプシペプチドと、ポリ乳酸とからなる重合体が、良好な生分解性を有し、強度を保持したまま、柔軟性を向上させること（特許文献２６参照）が可能であることや、ラクチドと水酸基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選択される少なくとも１種の反応性置換基を有するε−カプロラクトンとを開環重合して得られる生分解性共重合体が、成形性が良好で各種の利用形態に応じた機能性を有すること（特許文献２７参照）等が知られている。また、本発明者の一人がデプシペプチドの合成法並びに合成物を開示している（特許文献２８参照）。
しかし、上記特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８のいずれの文献にも、同様に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなるブロックとポリアルキレングリコールからなるブロックとからなる生分解性プラスチックスとして、三元ブロック共重合体が報告されている（特許文献２９参照）。
しかし、この特許文献２９にも、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
【特許文献１】特開平０６−１０７５６５号公報
【特許文献２】特開平０６−２０６８３０号公報
【特許文献３】特開平０６−２０６８３２号公報
【特許文献４】特開平１１−１００３３１号公報
【特許文献５】特開２００１−２２６２９４号公報
【特許文献６】特開２００３−３４２１６７号公報
【特許文献７】特開２００４−０１０４７９号公報
【特許文献８】特開２００４−３５２９７２号公報
【特許文献９】特開２００５−０２９４８０号公報
【特許文献１０】特表２００５−５０１８３１号公報
【特許文献１１】国際公開第０３／０００７７１号パンフレット
【特許文献１２】特開平１１−２６９０９７号公報
【特許文献１３】特開平０８−１８８５４１号公報
【特許文献１４】特開２００１−１４６５５６号公報
【特許文献１５】特開２００５−００８６１４号公報
【特許文献１６】特表２００１−５２５３５７号公報
【特許文献１７】特開平１１−３３５２６７号公報
【特許文献１８】特開２００３−０１２５０５号公報
【特許文献１９】特開２００３−０２６５６６号公報
【特許文献２０】特開２００３−０２６８１２号公報
【特許文献２１】特開２００３−３４２１６８号公報
【特許文献２２】特表２００３−５３２６８８号公報
【特許文献２３】国際公開第０２／０２６２４１号パンフレット
【特許文献２４】特開平７−１８８４１１号公報
【特許文献２５】特開平１１−３５６７９号公報
【特許文献２６】特開２００１−３１７６２号公報
【特許文献２７】特開２００２−２３４９３４号公報
【特許文献２８】特開２００４−２６９４６２号公報
【特許文献２９】国際公開第２００５／００３２１４号パンフレット参照
【非特許文献１】M. Asano,  M. Yoshida, I. Kaetsu, K.Nakai, H. Yamanaka, H. Yuasa, K. Shida, K. Suzuki, M. Oya, Makromol. Chem., (1983) 84:1761
【非特許文献２】M. Asano, H. Fukuzaki, M. Yoshida, M. Kumakura, T. Mashimo, H. Yuasa, K. Imai, H. Yamanaka, K. Suzuki,  J.Controlled Release, (1989) 9: 111
【非特許文献３】M. Asano, H. Fukuzaki, M. Yoshida, M. Kumakura, T. Mashimo, H. Yuasa, K. Imai, H. Yamanaka, Biomaterials, (1989) 10: 569
【非特許文献４】真下透、湯浅久子、今井強一、山中英寿、浅野雅春、吉田勝、熊倉稔著「北関東医学４１」１９９１年ｐ．３１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、薬物がその作用部位に到達できない上記６つの原因を除去することを可能とする、薬物に親和性を有する生体適合性ブロック共重合体を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、生体内で切断され易いエステル結合と切断され難いアミド結合とを有し、抗原性を示さず、そしてアミノ酸とヒドロキシカルボン酸の種類と数と配列を制御することにより薬物との親和性を制御することのできる、生体適合性ブロック共重合体を提供することにある。
【０００６】
本発明のさらに他の目的は、上記生体適合性ブロック共重合体と薬物からなりそして薬物の可溶化、分散化、安定化、徐放化ならびに生体内の必要な部位に薬物を送達することを可能とする、ミセル、微粒子または複合体を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、上記ミセル、微粒子および複合体の有利な製造法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなりそして下記式（１）で表されることを特徴とする生体適合性ブロック共重合体によって達成される。
Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−Ｏ−［−ＣＨ(Ｒ４)ＣＨ２Ｏ−］ｒ−Ｒ５   ・・・（１）
（式中、Ｒ１は水素原子, アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり； Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり； Ｒ３は水素原子またはＣ1〜Ｃ３のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基であり； Ｒ４は水素原子であり； Ｒ５は水素原子, Ｃ1〜Ｃ3のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはＲ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−で表わされる基であり；ｎは１〜１０の整数であり；ｋは１〜６の整数であり；ｍは１〜５の整数であり；ｐは１〜２０の整数であり；ｑは０〜６の整数でありそしてｒは３〜５７０の整数である）。
【００１０】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、本発明の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなるミセルによって達成される。
【００１１】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、本発明の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる微粒子または複合体(ミセルを除く)によって達成される。
【００１２】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第４に、本発明のミセル、微粒子または複合体を含有する医薬組成物によって達成される。
【００１３】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第５に、本発明の上記生体適合性ブロック共重合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法によって達成される。
【００１４】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、最後に、本発明の上記生体適合性ブロック共重合体、薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミセル、微粒子または複合体の製造法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の生体適合性ブロック共重合体は、疎水性セグメントと親水性セグメントを有する。本明細書において「生体適合性」とは、生体内に投与後、生体組織に適合して生体への障害などを示さない性質をいい、例えば、生体内で分解代謝されまたは分解されなくても、最終的には体外に排泄される性質をいう。本明細書において「生体内分解性」とは、生体内に投与後、生体組織において分解代謝され生体への障害などを示さない性質をいい、例えば、生体内で分解代謝され、最終的には体外に排泄される性質をいう。本明細書において「疎水性セグメント」とは、水に難溶または不溶である生体内分解性ポリマーまたはその誘導体であって、本ブロック共重合体を形成するもう一方の成分である親水性セグメントよりも疎水性である高分子重合体をいう。本明細書において「親水性セグメント」とは、水に可溶であるか、あるいは水に難溶であっても本ブロック共重合体の疎水性セグメントに対して親水的である高分子重合体またはその誘導体をいう。本明細書において「ミセル」とは、組成が異なる内核部分と外殻部分を有する粒子をいう。本明細書において「微粒子」とは、平均粒子径が３００マイクロメートル以下であって、明確な内核および外殻部分を有さず、本ブロック共重合体中に薬物がほぼ均一に分散してなる粒子を言う。本明細書において「複合体」とは、明確な内核および外殻部分を有さず、薬物分子または薬物結晶と本ブロック共重合体の相互作用により形成された複合体を言う。本明細書において「リガンド」とは、一般に特定の標的分子と特異的に結合し、結合複合体を形成することができる全ての分子を指し、標的に向かうリーディング部分である。
本発明の生体適合性ブロック共重合体は、疎水性セグメントとしてのアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生体内分解性ブロックと、親水性セグメントとしてのポリエチレンオキシドからなる生体適合性ブロックからなる。具体的には、例えば生体内分解性の疎水性セグメントの末端に親水性セグメントを共有結合してなるブロック共重合体である。これらのセグメントは直接または連結基を有するスぺーサーを介して結合していても良い。このようなブロック共重合体は、下記式（１）
Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−Ｏ−［−ＣＨ(Ｒ４)ＣＨ２Ｏ−］ｒ−Ｒ５              ・・・（１）
（式中、Ｒ１は水素原子, アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり； Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり； Ｒ３は水素原子またはＣ1〜Ｃ３のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基であり； Ｒ４は水素原子であり； Ｒ５は水素原子, Ｃ1〜Ｃ3のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはＲ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−で表わされる基であり；ｎは１〜１０の整数であり；ｋは１〜６の整数であり；ｍは１〜５の整数であり；ｐは１〜２０の整数であり；ｑは０〜６の整数でありそしてｒは３〜５７０の整数である）で表される。
【００１６】
疎水性セグメント
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、上記式（１）中に示されるように、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる化合物である。用いられるアミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はない。天然のＬ−α−アミノ酸だけでなく、ＤＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、合成アミノ酸およびこれらアミノ酸の側鎖における誘導体も使用することができる。アミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、ノルバリン、ノルロイシン、α−ｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、アスパラギン、グルタミンおよびβ−シクロヘキシルアラニンなどが挙げられる。これらのうち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが好ましく用いられる。さらに、これらのうちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが特に好ましく用いられる。用いられるヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、α−ヒドロキシカルボン酸だけでなく、その他のヒドロキシカルボン酸を用いることもできる。具体例としては、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸などが挙げられる。これらのうち、グリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
【００１７】
デプシペプチド
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、α−アミノ酸およびα−ヒドロキシカルボン酸からなるデプシペプチド化合物であってもよい。用いられるα−アミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、天然のＬ−α−アミノ酸だけでなく、ＤＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、合成α−アミノ酸を使用することができる。α−アミノ酸の具体例としては、上記したアミノ酸のうちのα−アミノ酸およびその側鎖における誘導体が挙げられる。用いられるα−ヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、上記したヒドロキシカルボン酸のうちのα−ヒドロキシカルボン酸であるグリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
【００１８】
デプシペプチドの加水分解性および抗原性回避の可能性
デプシペプチドはその分子内にアミド結合とエステル結合を有し、そのアミド結合部分は水素原子を有するので分子間水素結合を形成して強固な分子間結合を形成するが、エステル結合部分は水素原子を有さないので分子間水素結合を形成しえず比較的加水分解されやすい。したがってアミド結合連鎖の中にエステル結合があるデプシペプチドは生体内で分解されやすく、その分解速度をアミノ酸の種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数およびその配列順序により制御することが可能である。またポリアミノ酸はしばしばその抗原性が問題となるが、アミノ酸数が約５以下のペプチドにおいてはほとんど抗原性を示さないとされている。デプシペプチドにおいては抗原性を示さないように分子設計することが可能である。ポリデプシペプチドはそれを構成するアミノ酸の種類とシーケンスの長さ、及びヒドロキシカルボン酸の種類によって全く異なる物理化学的特性を示す。アミノ酸が３個連結しヒドロキシカルボン酸が１個存在するテトラデプシペプチドシーケンスは、アミノ酸２個とヒドロキシカルボン酸１個のトリデプシペプチドシーケンスとは全く異なる溶媒への溶解性、二次構造の安定性、ミセル形成能などを示す。更に、アミノ酸の種類、ヒドロキシカルボン酸の種類を変化させれば様々な特性を有するポリデプシペプチドを合成することができる。
とりわけ、アミノ酸の配列を３〜５個とし次いでこれにヒドロキシカルボン酸を１〜３個結合させたポリデプシペプチドが好ましい。
【００１９】
アミノ酸の数、ヒドロキシカルボン酸の数およびデプシの繰り返し数
式（１）で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントのポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは１〜６の整数である。疎水性セグメントの親水性セグメント結合側のポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数ｑは０〜６の整数である。疎水性セグメントのポリヒドロキシカルボン酸を構成するオキシ酸の数ｍは１〜５の整数である。アミノ酸ヒドロキシカルボン酸結合体の繰り返し数ｐは１〜２０の整数であり、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数である。ヒドロキシカルボン酸のメチレン基および置換メチレン基の数ｋは１〜６の整数である。
なお、ｎ、ｐまたはｑが２〜２０の整数の場合の複数のＲ２は同一でも異なっていてもよく、ｍまたはｐが２〜２０の整数の場合の複数のＲ３は同一でも異なっていてもよく、さらにｒが２以上の場合の複数のＲ４も同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３
式（１）で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントの末端Ｒ１は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基である。アミノ基の保護基としては、例えばｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ−）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ−）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ−）などが挙げられる。生体適合性である限り特に限定されないが、とりわけ、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ−）が好ましく用いられる。
Ｒ２は天然アミノ酸の側鎖または誘導体化された側鎖（以下、誘導基と称する）を表し、アミノ酸単位ごとに、それぞれ独立に、天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基の一つを示す。誘導基を有するアミノ酸誘導体としては、例えばグルタミン酸５−誘導体、アスパラギン酸４−誘導体、リジンε−誘導体などが挙げられる。グルタミン酸５−誘導体、アスパラギン酸４−誘導体としては側鎖の末端カルボキシル基が保護基で保護された誘導体、メチルエステル、エチルエステルなどのアルキルエステル体、薬物の水酸基とのエステル体、薬物のアミノ基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体が挙げられる。また、リジン誘導体としては、例えばリジンの側鎖の末端アミノ基が保護基で保護された誘導体、薬物のカルボキシル基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体などが挙げられる。薬物との誘導体の他に、グルタミン酸５−エチルエステル単位、アスパラギン酸４−エチルエステル単位、末端アミノ基がベンジルオキシカルボニル基で保護されたリジン単位が好ましく用いられる。
Ｒ３はヒドロキシカルボン酸の側鎖を表し、ヒドロキシカルボン酸ごとに、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１〜３のアルキル基またはそれが置換基で置換されたものである。かかるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、を挙げることができる。また、置換基は、メチル基、エチル基もしくはプロピル基である。
【００２１】
親水性セグメントおよびＲ４
本発明に用いられるブロック共重合体の親水性セグメントは、ポリエチレンオキシドからなり、より具体的には、ポリエチレングリコールである。式（１）において、エチレンオキシドの繰り返し数ｒは３〜５７０であり、好ましくは３〜２５０である。Ｒ４は水素原子である。
【００２２】
Ｒ５
上記式(１)におけるＲ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、またはそれがメチル基、エチル基もしくはプロピル基で置換基で置換されたもの、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基または式  Ｒ１−〔［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｎ−｛−Ｏ［ＣＨ(Ｒ３)］ｋＣＯ−｝ｍ−〕ｐ−［−ＮＨＣＨ(Ｒ２)ＣＯ−］ｑ−  で表される基である（ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎ、ｋ、ｍ、ｐおよびｑの定義は上記と同じである）を表す。
リガンドとしては、例えばレクチン、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメントなど）、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク質（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４，ＣＤ７１など）、核酸、抗原、ホルモン、接着因子（例えば、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、 ＰＥＣＡＭ−１、ＲＧＤ、ＮＧＲ など）、トランスフェリン、葉酸、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦなど）および所望の標的細胞と特異的に結合するものなどを挙げることができる。
本発明のブロック共重合体は、例えば、以下のようにして製造することができる。
（ｉ）親水性セグメントであるポリエチレンオキシドの両末端ヒドロキシル基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを、ジメチルアミノピリジンを触媒として反応させることにより、両末端に保護されたアミノ基を有するアミノ酸がエステル結合したポリエチレンオキシドが得られる。この両末端にあるアミノ酸残基のアミノ保護基をジオキサン中塩酸で処理して除去する。この処理で、保護基が除去され両末端がジアミノアシル化されたポリエチレンオキシドまたは両末端の内の一方のアミノ酸が脱離し、一つのヒドロキシル基が再生したモノアミノアシル化ポリエチレンオキシドが得られる。
末端アミノ酸のアミノ基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させて、保護ジペプチド結合ポリエチレンオキシドを得る。保護基をはずして生じたアミノ基に，末端アミノ基が保護され他末端がヒドロキシカルボン酸からなるオリゴデプシペプチドＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させる。このアミノ基保護オリゴデプシペプチドエステルの反応を繰り返すと，任意のアミノ酸，ヒドロキシカルボン酸配列をもつポリデプシペプチド疎水性セグメントとポリエチレンオキシド親水性セグメントからなるブロック共重合体が得られる。
（ｉｉ）ヒドロキシカルボン酸にハロゲンおよびハロゲン化チオニルを作用させてヒドロキシカルボン酸のハロゲン化物を得、これにアミノ酸またはポリアミノ酸をアルカリの存在下で反応させてデプシペプチドを得る。なお、アミノ酸がアミノ基とカルボキシル基の２つの官能基以外に、他の官能基を有する場合は、ポリデプシペプチドの製造中、他の官能基を保護基と結合させておくことが好ましい。次に、このアミノ酸誘導体を、アルカリの存在下、加熱することにより閉環させて、環状デプシペプチドを得ることができる。次いで、オクチル酸第一錫のような触媒の存在下、環状デプシペプチドとポリエチレンオキシド、モノ置換ポリエチレンオキシド、あるいは一方のヒドロキシル基が保護されたポリエチレンオキシドとを反応させることにより、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有するブロック共重合体を得ることができる。
また、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントは本発明者の一人が出願した特開２００４−２６９４６２号公報に記載された方法によって合成することができる。すなわち、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基と、無保護のカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸のヒドロキシル基とを、アミノピリジン化合物を触媒として反応させ、ジデプシペプチドを合成する。得られたジデプシペプチドのカルボキシル基をイミド誘導体とし、かつ、ジデプシペプチドの保護されたアミノ基の脱保護を行い、これらにより得られたジデプシペプチドの脱保護されたアミノ基と、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基とを反応させることにより、オリゴデプシペプチドが合成される。
ポリエチレンオキシドに保護アミノ酸あるいは保護オリゴデプシペプチドを結合させる反応はこれらを溶解する適当な溶媒例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル中で行うことができる。反応後は生成物をジクロロメタンあるいはクロロホルムに溶解し、次いでこれを炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸水溶液などで洗浄することにより副生成物を除去し、溶媒を留去した後、エーテルを加えて純粋な生成物を沈殿、単離する。必要であれば、本ブロック共重合体のテトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチルなどの溶液にエーテルを加えて再沈殿させ、精製する。この再沈殿法による精製は、ポリデプシペプチドを疎水性セグメントとする本ブロック共重合体に対して有効な方法である。ポリペプチド−ポリエチレンオキシドポリマーではポリペプチドのアミド結合に基づく水素結合が分子内、分子間および分子−溶媒間で強く形成され、再沈殿に適した溶媒−非溶媒の組み合わせを見いだすことが困難である。
【００２３】
ミセルおよび微粒子
本発明のブロック共重合体は、薬物とのミセル形成、薬物を含有する微粒子、薬物との複合体を製するだけでなく、リポソームなどの小胞体を製することにも使用することができる。また、目的に応じ、当該ミセル、微粒子または複合体をリポソームに含有せしめることもできる。
本発明のブロック共重合体は薬物と一緒に用いることができる。該薬物としては天然物、合成物、半合成物、発酵産物、生体由来物質、遺伝子工学の産物のいずれの生理活性化合物でも用いられる。また、合成生理活性化合物、ペプチド、タンパク質、ホルモン、ビタミン、酵素、補酵素、脂肪酸、脂質、遺伝子、これらの誘導体などのいずれでも用いられる。
薬物は、溶解性については、水不溶性、水難溶性、脂溶性、水溶性のいずれであってもよい。このような薬物としては、例えば、抗炎症薬（例えば、メフェナム酸、ブフェキサマク、フェルビナクなどの非ステロイド系薬物、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベクロメタゾンなどのステロイド系薬物など）、解熱薬（例えば、アセトアミノフェン、アルクロフェナク、ブフェキサマクなど）、鎮痛薬（例えば、アミノピリン、アセタミノフェン、モルヒネ、ブプレノルフィンなど）、抗関節炎薬／・抗リウマチ薬（例えば、オーラノフィン、アザチオプリン、メトトレキサートなど）、抗痛風薬（例えば、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾンなど）、強心薬（例えば、オキシフェドリン、テオブロミンなど）、抗狭心症薬（例えば、アルプレノロール、ジルチアゼム、イソソルビドジニトレート、ニフェジピンなど）、ベータ遮断薬（例えば、塩酸プロプラノロール、アテノロール、カルベジロールなど）、カルシウム拮抗薬（例えば、ニフェジピン、ニカルジピン、ジルチアゼムなど）、抗不整脈薬（例えば、キニジン、ベラパミル、チモロールなど）、利尿薬（例えば、フロセミド、アルブチンなど）、抗高血圧薬（例えば、チモロール、カプトプリル、ニカルジピン、プラゾシンなど）、末梢循環障害改善薬（例えば、プロスタグランジン類など）、抗血栓薬（例えば、アルガトロバン、オザグレル、チクロピジンなど）、抗高脂血症薬（例えば、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、プロビコールなど）、抗血小板薬（例えば、プロスタサイクリンなど）、昇圧薬（例えば、ドパミン、ノルエピネフリンなど）、脳循環代謝改善薬（例えば、塩酸チアプリド、スルピリソなど）、抗腫瘍薬（例えば、ドキソルビシン、アクチノマイシン、メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェンなど）、免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、タクロリムス、シクロフォスファミドなど）、抗アレルギー薬（例えば、アゼラスチン、クロモリン、ペンチゲチドなど）、抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、クレマスチン、ジフェンヒドラミンなど）、気管支拡張薬（例えば、アルブテロール、イソプロテレノール、臭化イプラトロピウムなど）、抗喘息薬（例えば、ツロブテロール、クレンブテロールなど）、鎮咳薬（例えば、リン酸コデイン、デキストロメトルファンなど）、去痰薬（例えば、アンブロキソール、カルボシステインなど）、抗潰瘍薬（例えば、セトラキサート、ラニチジン、シメチジンなど）、止瀉薬（例えば、アセチルタンニン酸、ジフェノキシンなど）、制吐薬（例えば、ジフェニドール、スコポラミンなど）、抗糖尿病薬（例えば、ビグアニド系物質、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミドなど）、催眠薬・鎮静薬（例えば、ニトラゼパム、フルラゼパム、アモバルビタールなど）、抗不安薬（例えば、ジアゼパム、オキサゾラムなど）、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール、ベルフェナジン、クロルプロマジンなど）、抗うつ薬（例えば、ジメタザン、イミプラミン、スルピリドなど）、抗眩暈薬（例えば、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェニドール、メシル酸ベタヒスチンなど）、抗てんかん薬（例えば、カルバマゼピン、フェノバルビタール、５−ヒドロキシトリプトファンなど）、筋弛緩薬（例えば、塩化ツボクラリン、バクロフェン、メトカルバモールなど）、抗パーキンソン病薬（例えば、アマンタジン、カルビドパなど）、自律神経系作用薬（例えば、ベタネコール、ネオスチグミンなど）、抗生物質（例えば、アミノグリコシド系物質、セファロスポリン系物質、マクロライド系物質など）、抗菌薬（例えば、キノロン系物質、スルフォナミド系物質、スルホン系物質など）、抗真菌薬（例えば、アリルアミン系物質、エコナゾールなどのイミダゾール系物質、フルコナゾールなどのトリアゾール系物質など）、抗ウィルス薬（例えば、アシクロビル、シタラビン、アマンタジンなど）、駆虫薬（例えば、アミノピリン、ニクロサミド、キナクリンなど）、ホルモン薬（例えば、ソマトスタチン、ゴナドトロピン、ＬＨＲＨなど）、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬（例えば、ビタミンＤ、カルシトニン、ビスフォスフォネートなど）、ビタミン薬（例えば、トコフェロール、ビタミンＢ１２など）、止血薬（例えば、トラネキサム酸など）、酵素薬（例えば、プロナーゼ、リゾチーム、セラペプターゼなど）、ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、コレラワクチンなど）、麻酔薬、診断薬、造影薬、検査薬などが用いられる。
【００２４】
また、薬物は親水性、疎水性のいずれであってもよい。本発明のブロック共重合体はミセルを形成することができる。ミセルは、疎水性セグメントがミセル内核に、親水性セグメントがミセル外殻に存在する場合や、逆にブロック共重合体の親水性セグメントがミセル内核に、疎水性セグメントがミセル外殻に存在する場合があり、さらにビヒクル内で両セグメントがランダムに存在して、ドメイン構造を持たない場合がある。ミセル内核が疎水性セグメントからなる場合は疎水的な薬物を選択し、ミセル内核が親水性セグメントからなる場合は親水的な薬物を選択することが好ましく、微粒子内でランダムに各セグメントが存在する場合には親水性あるいは疎水性のどちらの物性の薬物も選択することができる。
疎水性薬物としては、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、インドメサシン、ナプロキセンなど）、ステロイド性抗炎症薬（例えば、デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、酢酸パラメタゾン、酢酸ハロプレゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、ブチル酢酸プレドニゾロン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾンなど）、抗腫瘍薬（例えば、パクリタキセル、カンプトテシン、エポトシド、ビンブラスチン、フルオロウラシル、メトトレキサート、テガフール、テガフール・ウラシル、マイトマイシンＣ、シスプラチン、カルボコン、ダカルバジン、メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、塩酸ドキソルビシン、クエン酸タモキシフェンなど）、解熱鎮痛薬（例えば、イブプロフェン、ブプレノルフィンなど）、抗喘息薬（例えば、アゼラスチン、ケトチフェン、プロピオン酸フルチカゾンなど）、抗うつ薬（例えば、オキシペルチン、ネフォパムなど）、抗痛風薬（例えば、アロプリノール、コルヒチン、スルフィンピラゾン、プロベネシドなど）、中枢神経系薬（例えば、アニラセタムなど）、抗高血圧薬（例えば、カプトプリル、エナラプリル、塩酸マニジピンなど）、抗血小板薬（例えば、プロスタグランジン類など）、抗高脂血症薬（例えば、クロフィブラート、ガンマーオリザノールなど）、気管支拡張薬（例えば、テオフィリン、塩酸メトキシフェナミン、塩酸ツロブテロールなど）、抗アレルギー薬（例えば、エメダスチン、トラニラスト、テルフェナジンなど）、抗尿失禁薬（例えばカプロン酸ゲストノロンなど）、抗ウィルス薬(例えば、アシクロビル、リバビリンなど)、蛍光色素（例えば、ピレン系蛍光色素、ローダミン系蛍光色素など）などが用いられる。
【００２５】
親水性薬物としては、例えば、水溶性ポリペプチドなどが用いられる。このような水溶性ポリペプチドとしては、例えば、サイトカイン、造血因子、各種増殖因子、酵素などが挙げられる。なかでも、サイトカインが好ましく、例えば、リンホカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）など）、モノカイン（インターロイキン−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）が挙げられる。
その他、薬物としては、黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、インスリンおよび誘導体または類縁体、ソマトスタチンおよび誘導体または類縁体、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、プロラクチン、エリスロポイエチン、副腎皮質ホルモンおよび誘導体または類縁体、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシンおよび誘導体、オキシトシン、カルシトニンおよび誘導体または類縁体、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エンケファリンおよび誘導体または類縁体、エンドルフィン、キョウトルフィン、タフトシン、サイモポイエチン、サイモシン、サイモチムリン、胸腺液性因子、血中胸腺因子およびその誘導体、コロニー誘導因子(例えば、ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦなど)、モチリン、デイノルフィン、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、心房性ナトリウム排泄増加因子、神経成長因子、細胞増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦなど）、神経栄養因子（例えば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦなど）、エンドセリン拮抗作用を有するペプチド類およびその類縁体などが挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられる薬物は、それ自身であることはもちろんのこと、薬理学的に許容される形態にあってもよい。このような塩としては、該薬物がアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸など）や有機酸（例えば、炭酸、重炭酸、コハク酸、酢酸、プロピオン酸、フマール酸、トリフルオロ酢酸など）などとの塩が挙げられる。該薬物がカルボキシル基等の酸性基を有する場合、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属あるいはカルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属など）や有機塩基（例えば、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類など）などとの塩が挙げられる。また、薬物は金属錯体化合物例えば、銅錯体、亜鉛錯体を形成していてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有ミセルを調製するには、例えば、薄膜水中攪拌法、溶液水中希釈法、透析法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
【００２７】
（１）薄膜水中攪拌法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、容器に入れ、溶媒を除去して薄膜を形成させる。これに水を加え、攪拌しミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体と薬物を溶解できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒であっても該ブロック共重合体が析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。水相には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど）、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、水中攪拌時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで残存溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
【００２８】
（２）溶液水中希釈法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去して高分子ミセルを調製する。ここで用いる溶媒としては、水に混和できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。溶媒は単独であるいは２種以上組み合わせて使用することができる。なかでもテトラヒドロフランとアセトンと水の組み合わせが好ましく用いられる。該ブロック共重合体にとっての良溶媒とはポリマーの組成により当然変化するものであるため、使用するポリマーに応じて溶媒の選択を行うのが好ましい。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、溶液水中希釈時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで溶媒を除去することや通気法によって溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
【００２９】
（３）透析法
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、透析チューブに入れ水中で透析し、溶媒を除去してミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体を溶解でき、水に混和できるものであれば特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリルなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、２種以上組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒も該ブロック共重合体および薬物を析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。ブロック共重合体と溶媒の比率は特に限定されるものではない。また、透析膜としては、用いるブロック共重合体の分子量により適切な分子量分画サイズを選択すればよく、セルロース膜などを用いることが多いが、これに限定されるものではない。また、透析溶液には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど）、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。透析時間は、通常１回約５分〜約２４時間であるが、外水相の液交換操作を１回以上繰り返すことでミセルを調製する。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。これによって調製できたミセルは透析膜中で透明からやや白濁した状態で得ることができる。
本発明において、疎水性／親水性セグメントを有するブロック共重合体が形成しうるミセルの形態は、調製方法により変えることが可能である。ブロック共重合体を有機溶媒に溶解または分散後、多量の水溶液中でミセルを調製した場合は、Ｏ／Ｗ型となり疎水性セグメントを内核にしてそして親水性セグメントを外殻に配した形態となる。また、逆にブロック共重合体を水溶液中で溶解または分散した後、多量の有機溶媒内でミセルを調製した場合、Ｗ／Ｏ型となり親水性セグメントを内核にして疎水性セグメントを外殻に配した形態となる。通常は、例えば、疎水性セグメントを内核として親水性セグメントを外殻とするコア／シェル型ミセルである。その場合ブロック共重合体の疎水性セグメントが集合して高密度に凝集してコアを形成し、親水性セグメントは粒子表面から外に向いて延びていると推察される。また、親水性セグメントの末端を保護または修飾した場合には、親水性セグメントの部分的凝集の存在も考えられる。これらの調製方法も目的に応じて変えることができる。例えば、薬物を封入する場合、その薬物の水あるいは有機溶媒への溶解度や安定性などの物性によって決められる。
【００３０】
上記方法によって得られる薬物含有ミセルまたはその集合体の平均粒子径は、水中で分散した状態で、例えば１ｎｍ〜１，０００ｎｍであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍであり、特に好ましくは５ｎｍ〜３００ｎｍである。これら粒子径の決定要因は、ブロック共重合体の組成とその調製方法にある。また、粒子径は使用目的に応じて変えられるため、これらの粒子径に限定されない。粒子径は公知の方法で測定することができるが、例えば、光散乱測定法や顕微鏡観察などが用いられる。
上記いずれの調製方法においても薬物含有ミセル形成後に水に分散した状態で凍結乾燥または真空乾燥を行い、乾燥粉末として保存できる。乾燥操作中の凝集抑制を目的として添加剤を添加することもできる。添加剤としては、例えば、マンニトール、ラクトース、ブドウ糖、トレハロース、デンプン類、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩、水溶性多糖、ポリエチレングリコール、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが用いられる。添加剤の添加量は、ミセルを再分散した時に凝集抑制が達成される範囲であれば、特に制限されない。
親水性セグメントにリガンドを結合させた本発明のブロック共重合体は、生体内でのターゲティング能を有する。本発明に基づく高分子ミセルは比較的穏やかな条件で調製することができるためリガンドの活性維持、不安定性な薬物の封入に適している。また疎水性セグメントと親水性セグメントの分子量を適切に変えることにより粒子径の調整が可能となるので、粒子径を調製して薬物を封入した製剤では血中滞留性を調節することも可能である。また、本発明のブロック共重合体は、上記性能からも理解されるように、疎水性化合物の水への可溶化にも利用できる。
高分子ミセルは、通常疎水性セグメントを核とする製剤であるため、封入する薬物は疎水性であるのが好ましいが、水溶性であっても疎水性部分を持つ化合物にあってはその疎水性部分で本ブロック共重合体とミセルを形成することも可能である。また、特定臓器（例えば、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脳など）または疾患部位・臓器（例えば、癌、炎症部位など）に指向することにより、薬効を増強できるものや、血中滞留性を延長することで薬効を増強できるものが好ましい。
【００３１】
本発明のブロック共重合体は疎水性セグメントからなるミセルの内核部分に安定にこれらの薬物を封入することができる。本発明の薬物の封入方法は、ポリマー溶解液中に添加し、薬物と疎水性セグメントとを核にし、親水性セグメントを表面に配した高分子ミセルの調製を可能にする。この際、薬物を効率良くトラップするために、適切な溶媒を添加することができる。例えば、クロロホルムやジクロロメタンなどの溶媒を添加してブロック共重合体中の疎水的環境を安定にし、薬物を封入する方法が考えられる。また、ブロック共重合体を用いて予め高分子ミセルを調製しておき、後に溶媒に溶解した薬物を高分子ミセル溶液に添加して薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させる方法もある。この場合溶液のｐＨや塩濃度などを適切に変えることにより浸透効率を上げることも可能である。また、ブロック共重合体を用いて予め高分子ミセルを調製しておき、薬物を高分子ミセル溶液に添加して混練することにより薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させる方法もある。封入する疎水性薬物としては、前記と同様のものが挙げられる。上記高分子ミセルとは逆に、親水性セグメントをコアに、疎水性セグメントをシェルにした高分子ミセルも好ましく、これは親水性薬物を高分子ミセルのコア内に封入し、徐放性や薬物安定性を示すものである。親水性薬物としては、前記と同様のものが用いられる。この高分子ミセルも後述の投与形態によって投与することができる。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有微粒子を調製するには、例えば、水中乾燥法、超音波処理法、凍結乾燥法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
【００３２】
（１）水中乾燥法
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去または拡散せしめて微粒子を調製する。ここで用いる溶媒としては、該ブロック重合体と薬物を溶解するものである限り特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。これらを単独であるいは２種以上溶媒と組み合わせて使用することができる。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。有機溶媒に対しては水の量は任意に選択できる。調製温度は約０℃〜約８０℃が好ましく、さらに好ましくは約５℃〜約５０℃である。さらに、水中乾燥時に外的剪断力を付与することや通気により溶媒を除去することや減圧条件下でエバポレーターなどで溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機やホモジナイザーなどが挙げられる。
【００３３】
（２）超音波処理法
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも１種類と薬物を適切な溶媒で溶解して多量の水中に分散させる。装置の形状、処理量によって一概に決定できないが、例えば、１Ｗ〜約２００Ｗ、好ましくは１Ｗ〜約１０Ｗの範囲で１秒〜約２４時間、より好ましくは１分〜約５時間超音波照射を行う。調製温度は約０℃〜約８０℃の範囲で行われるが、好ましくは約５℃〜５０℃である。上記の水中乾燥法と組み合わせて行われることが多い。
本発明の微粒子におけるブロック共重合体の含有割合は、微粒子全体に対して、通常１０〜１００重量％、好ましくは３０〜１００重量％である。本発明の微粒子に薬物が含まれる場合、本発明の微粒子における薬物の含有割合は、治療上の必要量により定まるものであり、特に限定されない。本発明の微粒子は、例えば、分散剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０などの界面活性剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類；硫酸プロタミン；ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、油脂類（例えば、ゴマ油、コーン油など）、リン脂質（例えば、レシチンなど）、賦形剤（例えば、乳糖、コーンスターチ、マンニトール、セルロースなど）、結合剤（例えば、ショ糖、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリンなど）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）などと混合されていてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物複合体粒子を調製するには、例えば、水中混練法などが用いられる。該ブロック共重合体の水溶液に薬物を添加して混練することにより薬物複合体を製することができる。混練を効率よく行うことにより、ナノオーダーの薬物結晶と本ブロック共重合体との複合体を形成せしめることができ、薬物の懸濁状態が安定に保たれる。
【００３４】
本発明の薬物を含有したミセル、微粒子または複合体は、種々の医薬品添加物を加え種々の剤形に製剤化し、注射剤または埋め込み剤（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、間接腔内投与、組織内投与など）、経粘膜剤（例えば、経口腔粘膜剤、経鼻剤、坐剤、膣剤、経肺剤など）、経皮剤（例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤など）、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤など）などとして投与することができる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を注射剤または埋め込み剤とするには、これらを界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖、プロリンなど）、緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムなど）と共に水性液剤、水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤とすることができる。水性液剤、水性懸濁剤は凍結乾燥により凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を無菌製剤にするには、無菌濾過、無菌充填工程を経る方法、ガンマ線滅菌する方法、防腐剤を添加する方法、全製造工程を無菌化する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子は、哺乳動物に対して安全な医薬として用いることができる。本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子の投与量は、主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって種々異なるが、薬物の有効量であればよい。投与回数は１日１〜数回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、または数か月に１回など主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
【００３５】
以上のとおり、本発明のブロック共重合体は、疎水性化合物とミセル、微粒子、複合体を形成することができる。ミセル化により、疎水性化合物を可溶化でき、静脈投与可能となる。リガンドにより疾患部位への集積も可能である。更に本ブロック共重合体は生体適合性であり、かつ徐放性により薬効持続性も期待できる。ミセル化により経口吸収性の向上も期待できる。また、微粒子は皮下注射剤として長期にわたる薬物放出が期待でき、複合体は難吸収性薬物のナノ粒子化を可能とし経口吸収性の向上も期待できる。また、本発明のブロック共重合体は、その構成アミノ酸の種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数、配列順序の規定あるいは修飾基を変えることにより、選択性などさまざまな特性を付与することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３７】
参考例１
アミノアシルポリエチレングリコールの合成
平均分子量４，０００のポリエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ）２００ｇ（０．０５モル）を４００ｍＬのアセトニトリルに溶かした。この溶液にｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＮＳｕ）５５ｇ（０．１５モル）と４−ジメチルアミノピリジン２．６５ｇ（０．０１５モル）を加えて２日間室温で撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去後、残査を６００ｍＬのジクロロメタンに溶かし、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトリトリルに溶かし、４５０ｎｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶させた。このもののＮＭＲスペクトルはＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの両末端にＢｏｃ−Ｐｈｅがエステル結合により結合したＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｂｏｃであることを示した。収量２１５ｇ（９４％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｂｏｃ ９０ｇ（０．０２モル）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。７７．８ｇ（９３％）。
【００３８】
参考例２
アミノアシルポリエチレングリコールへのｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシンの導入
上記ポリエチレングリコール−Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）  １：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）１．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕ）４．９２ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし，エーテルを加えて再結晶させた。４１ｇ（９４％）。
【００３９】
参考例３
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）の合成
Ｌ−乳酸  ４５ｇ（０．５モル）を５００ｍＬのＴＨＦに溶かし，ピリジン４０．５ｍＬ（０．５モル）を加えた。室温で撹拌しながらＢｏｃ−Ｌ−アラニン−ＯＮＳｕ  １４３ｇ（０．５モル）を加え、更に４−ジメチルアミノピリジン６．１ｇ（０．０５モル）を加えた。室温で１．５日撹拌し、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル５００ｍＬに溶かし、クエン酸飽和水溶液、水で洗った。溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液で３回抽出し、得られた抽出液を合わせてクエン酸で酸性にした。酸性水溶液を３００ｍＬ酢酸エチルで３回抽出した。合わせた抽出液を水洗し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られたオイルにヘキサンを加えると結晶化した。酢酸エチルから再結晶し，純粋なＢｏｃ−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸（Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨ）を得た。９１ｇ（７％）。このジデプシペプチドをジオキサン中の４Ｍ塩酸で処理し、Ｂｏｃ保護基を除去した。得られたジデプシペプチド塩酸塩を４００ｍＬのＴＨＦに溶かし、撹拌しながら２８ｍＬのピリジンを加えた。この溶液に Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕ  １２１ｇ（０．３７モル）を加え，撹拌しながらＮＭＭ  ３８．５ｍＬ（０．３５モル）を加えた。室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を５００ｍＬの酢酸エチルに溶かした。この溶液を上記のように処理してＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨを１１５ｇ（８８％）得た。このトリデプシペプチドのＢｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＳｕと反応させてＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＨを１２７ｇ（８５％）得た。このＢｏｃ−テトラデプシペプチドを４００ｍＬのＴＨＦに溶かし、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）３４．５ｇ（０．３モル）を加えた。溶液を−１０℃に冷却し、５５．４ｇ（０．２７モル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて，−１０℃で３時間、室温で一夜撹拌した。溶液を５００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、生じたジシクロヘキシル尿素の結晶を濾去し、濾液を減圧濃縮した。残渣にヘキサンを加えて結晶化させた。酢酸エチルから再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを１３８ｇ（９０％）得た。
【００４０】
実施例１
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４０ｇ（９．２ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−乳酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）８．１ｇ（１３．９ミリモル）を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４１．８ｇ（９６％）を得た。
【００４１】
実施例２
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。
【００４２】
実施例３
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例２のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１３．１（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（４２Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（４８Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ１４Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１１Ｈ）  アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
【００４３】
実施例４
Ｂｏｃ−(Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ)４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例３のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９５％の收率で得られた。
【００４４】
実施例５
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例４のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）４−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに実施例１と同様な操作および条件でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９５％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１３．７（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（６６Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（７２Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（２２Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１７Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
【００４５】
実施例６
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃの製造
参考例１の平均分子量４,０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量６００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃが９６％の収率で得られた。
【００４６】
実施例７
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ１５４０−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量１，５４０のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ１５４０−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃが９５％の収率で得られた。
【００４７】
実施例８
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６０００−ＯＨの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量６，０００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−(Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ)５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６０００−ＯＨが９５％の収率で得られた。
【００４８】
実施例９
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ２００００−ＯＨの製造
参考例１の平均分子量４，０００のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量２０，０００のポリエチレングリコールを用い、以下参考例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ２００００−ＯＨが９７%の収率で得られた。
【００４９】
実施例１０
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３の製造
平均分子量４，０００のモノメトキシポリエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３） ２００ｇ（０．０５モル）を４００ｍＬのアセトニトリルに溶かし、この溶液にｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＮＳｕ）５５ｇ（０．１５モル）と４−ジメチルアミノピリジン２．６５ｇ（０．０１５モル）を加えて２日間室温で反応させた。反応後、溶媒を減圧留去し、残査を６００ｍＬのジクロロメタンに溶かし、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトニトリルに溶かし、４５０ｎｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶した。このもののＮＭＲスペクトルはＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３の末端にＢｏｃ−Ｐｈｅがエステル結合により結合したＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３であることを示した。収量２００ｇ（９４％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３９０ｇ（０．０２モル）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３であることを示した。収量７７．８ｇ（９３％）。以下、参照例２、実施例１〜５と同様に処理して、Ｂｏｃ−(Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ)５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＣＨ３を得た。
【００５０】
実施例１１
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
参考例１で合成したポリエチレングリコール  Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、ＮＭＭ  １．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ）４．３ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られたＢｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量３９ｇ（９０％）。Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４３．２ｇ（１０ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グリコール酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−ＯＮＳｕ）８．５５ｇ（１５ミリモル）を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４２．１ｇ（９０％）を得た。
【００５１】
実施例１２
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１１のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが８９％の收率で得られた。
【００５２】
実施例１３  
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ)２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１２のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９０％の收率で得られた。
【００５３】
実施例１４
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１３のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９２％の收率で得られた。
【００５４】
実施例１５
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
実施例１４のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）２−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのＢｏｃ保護基を４Ｍ−塩酸／ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを反応させると、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨが９１％の收率で得られた。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１１．２（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（６０Ｈ）Ｌｅｕの二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．１〜１．７ｐｐｍ（６６Ｈ）ＡｌａおよびＬａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（２４Ｈ）アミノ酸、乳酸およびグリコール酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（５Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（１７Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
【００５５】
実施例１６
Ｂｏｃ−｛Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ｝４−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
ＨＣｌ・Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４３ｇ（１０ミリモル）をＴＨＦに溶かし、ＮＭＭ  １．１ｍＬ及びＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ ８．６ｇ（１５ミリモル）を加えて、一夜室温で撹拌した。常法通り処理してＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  を４１．７ｇ（８９％）得た。このＢｏｃ−テトラデプシペプチド活性エステルの反応を更に３回繰り返してデプシペプチド鎖長を延長して、最終的にＢｏｃ−｛Ｇｌｕ（ＯＥｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌａｃ｝４−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  を得た。
【００５６】
実施例１７
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの製造
ポリエチレングリコール  Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩  ３８．９ｇ（０．０１モル）をアセトニトリル（ＡＣＮ）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１：１混合溶媒３００ｍＬに溶かし、Ｎ−メチルモルホリン１．１５ｍＬ（０．０１０５モル）を加え、これにｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシＬ−フェニルアラニル−Ｌ−乳酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ）１０．４ｇ（０．０１５モル）を加えて室温で１夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨをＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量４５．４ｇ（９６％）。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４７.３ｇ（１０ミリモル）を４Ｍ塩酸／ジオキサンで処理してＢｏｃ保護基を除去した。得られた塩酸塩をＡＣＮ−ＴＨＦ（１：１）に溶かし、ＮＭＭ  １．１５ｍＬを加えた。これにＮ−保護テトラデプシペプチド活性エステル、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕ １０．４ｇを加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をＴＨＦ−エーテルで再結晶し、純粋なＢｏｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２− Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ４２．１ｇ（９０％）を得た。このＤＰ−ＰＥＧを４Ｍ−ＨＣｌ／ジオキサンで処理してＢｏｃ基を除去し、得られた塩酸塩にＢｐｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−ＯＮＳｕを常法通り反応させてＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−  Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ３８．７ｇ（９５％）を得た。このものの比旋光度は［α］Ｄ２５＝−１２．２（ｃ＝１．０，ＣＨ３ＣＮ）であり、ＮＭＲスペクトル〔０．８４ｐｐｍ（１２Ｈ）Ｌｅｕ の二つのＣＨ３に基づく多重ピーク；１．２〜１．７ｐｐｍ（２４Ｈ）Ｌａｃのβ−ＣＨ３，ＬｅｕのβＣＨ２，γＣＨ，Ｂｏｃの三つのＣＨ３に基づく多重ピーク；３．５ｐｐｍ（３６０Ｈ）ＰＥＧのＣＨ２に基づくシングルピーク；４．２〜４．９ｐｐｍ（１１Ｈ）アミノ酸および乳酸のα−ＣＨに基づく多重ピーク；７．２ｐｐｍ（３０Ｈ）Ｐｈｅの芳香環水素に基づく多重ピーク；７．６〜８．５ｐｐｍ（８Ｈ）アミド結合のＮＨに基づく多重ピーク〕はこのものがＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。
【００５７】
実施例１８
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ ３００ｍｇとパルミチン酸デキサメタゾン（ＤＭＰ） １５ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、２０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液から５０℃で溶媒を減圧留去した。得られたフィルム状残渣に水１００ｍＬを加えて、フラスコを手で振って、残渣を水に溶解させた。ＤＭＰは水に不溶であるが、フィルム状残渣は完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。これにより、本ブロック共重合体は難溶性疎水性化合物を可溶化することができることが示された。
【００５８】
実施例１９  
ミセルの製造とミセルの粒径
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ ２００ｍｇとＤＭＰ ６０ｍｇをアセトニトリルに溶かし、常法通り処理し、生理的食塩水１００ｍｌを加えた。溶液はわずかに白濁したので、メンブランフィルターでろ過した。フィルター上には不溶分１４ｍｇが残った。従って、生理的食塩水溶液１００ｍＬ中に４６ｍｇのＤＭＰを含むミセルを調製することができた。このミセルの直径は１０２．５ｎｍであった。
【００５９】
実施例２０
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ ３００ｍｇとアシクロビル（ＡＶ） １０．５ｍｇをアセトニトリルに溶かした。溶液を５０℃で減圧濃縮し、残渣に水３ｍＬを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
【００６０】
実施例２１
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ  ３００ｍｇとアシクロビル１０．５ｍｇをアセトニトリルに溶かした。溶液を５０℃で減圧濃縮し、残渣に水３ｍＬを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
【００６１】
実施例２２
ミセル形成の証拠
実施例１８と同様と同様の重量、操作でＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからなるミセルを調製し、これを凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ２Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をＤ２Ｏに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたＮＭＲスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びＤＭＰは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をＤＭＳＯ−ｄ6に溶解するとミセルが破壊され、試料中のＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰは分子状でＤＭＳＯ溶液となり、ＮＭＲでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ）２−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとＤＭＰからなるミセルが形成されているといえる。
【００６２】
実施例２３
凍結乾燥によるミセルの凝集、破壊のないことの証明
Ｂｏｃ（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｌａｃ）３（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｈｅａ）２−Ａｒａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ ５００ｍｇとＤＭＰ １００ｍｇをアセトニトリルに溶解し、減圧で溶媒を留去した。残査に水５０ｍＬを加えてよく振った。一夜放置後、生じた不溶物を４５０ｎｍのメンブランフィルターで濾過した。不溶物の重量は２４ｍｇであった。ろ液を２分割し、一方には２５０ｍｇ（サンプル１）、及び他方には１２５ｍｇ（サンプル２）のＰＥＧ４０００を加えて凍結乾燥した。収量はそれぞれ４７７ｍｇと４１３ｍｇであった。サンプル１を２６．６ｍｇ取り、生理的食塩水１ｍＬを加えて手で軽く振ったところ１５秒で透明な均一溶液となった。一方、サンプル２を２０．０ｍｇ取り、同様な処理をしたところ、軽く振った後、４５秒後には均一溶液になった。いずれも、凍結乾燥品は生理的食塩水に極めてすばやく溶解し、透明な均一溶液を与えた。粒径はそれぞれ１０５．５ｎｍ、 １０１．６ｎｍであった。
【００６３】
実施例２４
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）３−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｅａ）２−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＰＥＧ４０００−ＯＨ １００ ｍｇとＤＭＰ ５ ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に１４％、４８時間後に３３％が放出された。
【００６４】
実施例２５
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ １００ ｍｇとＤＭＰ ５ ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に２％、４８時間後に４％が放出された。
【００６５】
実施例２６
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ １００ｍｇとＤＭＰ １０ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。２４時間後に２４％が放出された。
【００６６】
実施例２７
ミセル内封薬物の放出性
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ １００ ｍｇとデキサメタゾン ５ｍｇからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約１４，０００、孔径約５ｎｍの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたＤＭＰを紫外分光光度計により測定した。１０時間後に５７％が放出され、その後の１０時間では３％の放出しかなかった。これらのことから、薬物と本発明のブロック共重合体との親和性は、薬物ごとに大きな差異があり、薬物の化学的特性に適合するようにミセル中の疎水性セグメントのポリマー構造を薬物毎に構築することにより、ミセルの形成を制御できることが分かった。また、ミセル内に内封された薬物の放出性は薬物、本発明のブロック共重合体の構造と内封させる薬物量によりその放出性を制御できることが分かった。
【００６７】
実施例２８
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄとの縮合物の合成
葉酸  ４．４ｇ（０．０１モル）を１００ｍＬの酢酸に溶かし、０℃で塩化チオニル  １．２ｇ（０．０１モル）を滴下し、得られた溶液をＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ（０．００５モル）とピリジン４ｍＬを含むＴＨＦ溶液３００ｍＬに滴下し、室温で３時間反応させた。得られた溶液を減圧濃縮し、 酢酸エチルに溶かして、水、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮しエーテルを加えて生成物を沈殿させた。ＴＨＦから再沈殿させて精製されたＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄとの縮合物を得た。
【００６８】
実施例２９
微粒子の製造
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ６００−Ｏ−Ｐｈｅ−Ｌａｃ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌａｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃ  ２００ｍｇとパルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇをアセトニトリル−ＴＨＦ（１：１）２ｍＬに溶かし、スターラーで高速撹拌下、水を徐々に加えて１００ｍＬにした。その後、３０分間撹拌した。溶液は白濁し、薬物を含有する微粒子が調製された。
【００６９】
実施例３０
複合体の製造
パルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇを乳鉢に取り、これに、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ １００ｍｇを１５ｍＬの水に溶かし超音波処理した水溶液１ｍＬを加えて、乳棒で１分間混練した結果、パルミチン酸デキサメタゾン結晶は極微小の結晶状態で均一に分散し、この懸濁液は室温で十分に安定であった。一方、パルミチン酸デキサメタゾン１０ｍｇをメノウの乳鉢に取り、これに水１ｍＬを加えて、メノウの乳棒で混練した場合には、パルミチン酸デキサメタゾンが水に全く親和性がなく、大きな塊のままで分散しなかった。このことから本発明ブロック共重合体は微小薬物結晶と安定な複合体を形成することが分かった。
【００７０】
実施例３１
薬理効果の持続性
実施例１８と同様にして得たＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパルミチン酸デキサメタゾンからなるミセルを含有する注射液（生理食塩水）を調製し、デキサメタゾンとして０．５ｍｇ／ｋｇの投与量になる様に雄性ＳＤラット（５週令、ｎ＝３〜５）に静注した。薬剤投与７日後、ラットの右足に３％カラギーナン溶液０．１ｍｌを皮下注し、浮腫による足体積増加を４時間後に測定した。比較として、上記したミセルに代えて、パルミチン酸デキサメタゾンのリピッドマイクロスフェア注射液（リメタゾン（登録商標）、三菱ウェルファーマ（株）製）、リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液（デカドロン（登録商標）、万有製薬（株）製）、薬物不含有の生理食塩水を同量投与し、同様のタイムスケジュールで足体積を測定した。薬物不含有の生理食塩水では足体積が１９．９±７．７％増加し、リメタゾンでは１５．４±３．５％の増加をみた。しかし、上記のミセルは１．４６±１．４６％の増加しかなく、生理食塩水及びリメタゾンに対し、有意（Ｐ＜０．０１）な抗炎症効果が認められた。リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液（デカドロン（登録商標）、万有製薬（株）製）を用いた実験においては、生理食塩水と比較し２４時間後が最も強く抗炎症作用があり足体積増加は顕著に抑制されたが、３日目以降その効果は消失していた。このことより、本発明のミセルの薬理効果の持続性が明らかとなった。
【００７１】
実施例３２
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ ６ｍｇとプロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）０．１２ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、３０ｍＬのアセトニトリル−ＴＨＦ−エタノール（５：５：１）に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られたフィルムに蒸留水３０ｍＬを加えて、フィルムを水に溶解させた。フィルムは完全に水に溶けた。次いでＵＶスペクトルを測定した。３日後でも１９５ｎｍに吸収極大をもつＵＶスペクトルは変化しなかった。またこの水溶液に３ｍｇのＰＥＧ４０００を加え、凍結乾燥した。凍結乾燥物を室温に２４日保存した後でもＵＶスペクトルは変化しなかった。
【００７２】
実施例３３
ミセルの製造
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ ５０ｍｇとプロスタサイクリンであるベラプロストナトリウム５．０ｍｇを１００ｍＬナス形フラスコに取り、３０ｍＬのアセトニトリル−ＴＨＦ−エタノール（５：５：１）に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られた固形物にｐＨ４．５の酢酸緩衝液（０．１Ｍ）を１ｍＬ加え、超音波をかけ固形物を溶解させた。ベラプロストナトリウム単独では、このｐＨでは沈殿が生じるが、固形物はこのｐＨで完全に緩衝液に溶け、ミセルに取り込まれたことが示唆された。
【００７３】
実施例３４
ミセルの製造
パクリタキセル２．２ｍｇとＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ５５ｍｇを１０ｍＬのアセトニトリルに溶かし、溶媒を減圧留去した。  
ガラス壁に残った透明なフィルムを水３０ｍＬに４０℃で溶解した。パクリタキセルは水に不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に２５ｍｇのＰＥＧ４０００を加えて、凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ2Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をＤ２Ｏに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたＮＭＲスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びパクリタキセルは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解するとミセルが破壊され、試料中のＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルは分子状でＤＭＳＯ溶液となり、ＮＭＲでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとパクリタキセルからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
【００７４】
実施例３５
ミセルの製造
メトトレキサート２０ｍｇとＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２００ｍｇを３０ｍＬのＴＨＦ−メタノール（１：１）に溶かし、溶媒を減圧留去した。残った透明なフィルムに水５０ｍＬを加えて溶解した。メトトレキサートは水にほとんど不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に１００ｍｇのＰＥＧ４０００を加えて、凍結乾燥した。５００ＭｈｚプロトンＮＭＲにより、凍結乾燥試料をＤ2Ｏ及びジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。Ｄ２Ｏ溶媒中で測定したスペクトルは３．８ｐｐｍにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと５．０ｐｐｍに系中に存在する水からのプロトンピークの２種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のＤＭＳＯ−ｄ６中でのスペクトルにはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとメトトレキサートからのプロトンピークが全て観測された。従って、このＮＭＲスペクトルはＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨとメトトレキサートからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
【００７５】
実施例３６
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｄ−アラニンＮ−ヒドロキシコハク酸エステルＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＮＳｕ  ４．３ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン   ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量２０ｇ（収率９２％）次いで、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｄ−Ａｌａ−Ｂｏｃ  ２０ｇ（４．６ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。１７．６ｇ（９３％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
【００７６】
実施例３７
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−ベンジルオキシカルボニル?−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシハク酸エステルＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＳｕ  ７．２ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン  ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量２１ｇ（収率８９％）。次いで、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｂｏｃ  １８．９ｇ（４ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨであることを示した。収量１６．５ｇ（収率９６％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
【００７７】
実施例３８
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨの合成
ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  ２０ｇ（５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、ｔ−ブトキシカルボニル−エチル−Ｌ−アスパラギン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステルＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−ＯＮＳｕ  ５．４ｇ（１５ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン  ０．１９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン４００ｍＬに溶かし、この溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温ＴＨＦに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量１９ｇ（収率８５％）。次いで、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−Ｏ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｂｏｃ  １８ｇ（４．０１ｍｍｏｌ）をジオキサン中の４Ｍ−ＨＣｌで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。ＮＭＲスペクトルはこの結晶がＨＣｌ・Ｈ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨであることを示した。収量１５．１ｇ（収率９０％）。以下、参考例２、実施例１〜４と同様に処理して、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを合成した。
【００７８】
実施例３９
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットにおける静脈内単回投与毒性試験
動物種としては、Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット、１０週齢、体重３３８−４９０ｇを用いた。被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量２０ｍｇ／ｋｇ）、対照としてＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水で溶解し、超音波処理を行った後、０．２２μｍのメンブラン・フィルターを通して濾過滅菌を行った。また生理食塩水も同様に０．２２μｍのメンブラン・フィルターを通し濾過滅菌を行った。１群５匹のモルモットに、生理食塩水、ＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  、及びＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨを１ｍｌ／ｋｇで１分間かけて前肢の静脈内に単回投与し、２４時間観察を行った。その後１ヶ月間、週１回体重を測定するとともに一般状態も観察した。その結果、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ及びＨＯ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  の投与群において、死亡例は見られなかった。一般状態についても特に異常は見られなかった。また体重についても、特記すべき変化はみられなかった。以上のことから、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットにおける静脈内単回投与による毒性はみとめられなかった。
【００７９】
実施例４０
Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー（ＡＳＡ）反応試験
動物種として、Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット、７週齢、体重３８０−５１０ｇを用いた。動物感作において、被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陽性対照として卵白アルブミン（投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整し等量のＦＣＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、もしくはＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を加え、ｗ／ｏエマルジョンを作製した。初回にＦＣＡエマルジョンを、第２・３週目にＦＩＡエマルジョンを投与量２．５ｍｌ／ｋｇとして背部皮下及びｆｏｏｔ  ｐａｄに投与し感作した。惹起反応としては、被検物質としてＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ  （投与量４．０ｍｇ／ｋｇ）、陽性対照として卵白アルブミン（０．４ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整した。第５週目に投与量１．０ｍｌ／ｋｇとして、前肢もしくは後肢の静脈に誘発投与し、４時間観察を行った。その後１ヶ月間、週１回体重を測定するとともに一般状態も観察した。動物数はＢｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨ群：４匹、卵白アルブミン群：３匹、生理食塩水群：３匹とした。その結果、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨはアナフィラキシー反応を示さなかった。その後の一般状態及び体重についても特に異常は見られなかった。陽性対照となる卵白アルブミン投与群においては、誘発投与直後にすべての個体にアナフィラキシー症状が観察された。以上のことから、Ｂｏｃ−（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｃ）５−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＰＥＧ４０００−ＯＨのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー（ＡＳＡ）反応試験は陰性であり、抗原性がないことがわかった。
【国際調査報告】
2007043486.tif 000002
2007043486.tif 000003
2007043486.tif 000004
2007043486.tif 000005