(57)【要約】本発明は、（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成することを含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法、および前記スクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置などを提供する。本発明によれば、時間、コスト、手間などが削減されたタンパク質のスクリーニング方法およびスクリーニング装置を提供することができる。
2007046520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；
（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成することを含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；
を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２】
工程（ｃ）において選択されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のタンパク質を同定する工程：をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の同定が、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡから逆転写により調製されたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行われる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
さらに、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡに対応するＤＮＡを逆転写により合成し、該ＤＮＡに変異を導入することによって変異ＤＮＡを得、該変異ＤＮＡを用いて改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、該改変された配列を有するｍＲＮＡを工程（ａ）に供する工程：
を含む、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記固定化ピューロマイシン・リンカーが、リンカーに設けられた固相結合部位と、固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記固相結合部位がビオチンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記固相結合部位認識部位がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記固相がビーズである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記磁性ビーズが、ポリマービーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズおよびセファロースビーズから選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記標的物質が固相に固定化されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記標的物質が固定化されている固相が、磁性ビーズである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を作製するための、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカー。
【請求項１５】
前記固相が、ビーズ、基板、容器およびメンブレンから選択される、請求項１４記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
【請求項１６】
前記固相が、ビーズである、請求項１５記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
【請求項１７】
前記ビーズが、磁性ビーズである、請求項１６記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
【請求項１８】
リンカーに設けられた固相結合部位と、固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されている請求項１４〜１７のいずれかに記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
【請求項１９】
ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結する工程を含む、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体の製造方法。
【請求項２０】
ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；および、該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成する工程を含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体
の製造方法。
【請求項２１】
（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；
（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成した後、逆転写反応に供することを含む、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；
を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
標的物質あるいは標的分子結合磁性体と、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置であって、標的物質、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質磁性連結体、試薬及びバッファーを投入するための投入口と、使用後の試薬、バッファー及び反応副生成物を排出するための排出口と、磁力によってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質磁性連結体、標的分子結合磁性体を回収する手段とを設けた反応器を備えることを特徴とするタンパク質のスクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法、このスクリーニング方法に用いる固定化ピューロマイシン・リンカーなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近のゲノム科学の領域においては、遺伝子配列を明らかにするという「構造解析」から遺伝子の発現産物による「機能解析」へと研究テーマがシフトしている。遺伝子の機能を具現するのは、基本的に、タンパク質などの発現産物だからである。ゆえに、遺伝子の機能解析にはタンパク質の解析が必須となる。タンパク質の機能解析は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通して行われている。
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２（１９９１））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１３１５−１３１７（１９８５））、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法（Ｒｅｖｚｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３，１７２（１９８６））、ＤＮａｓｅＩフットプリント法（Ｃａｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，５，３１５７（１９７８））、メチル化緩衝法等が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）；Ｔａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０８，３０９（２００１）等参照）を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている（国際公開第０１／０１６６００号パンフレット参照）。
ｍＲＮＡとピューロマイシンとがリンカーを介して連結されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＶ）法はタンパク質の進化工学における有力な手法として注目されている。
しかしながら、ＩＶＶ法で用いられるｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体の調製には、ＲＮＡ精製カラムなどによる精製、エタノール沈殿などによる濃縮などの操作が必要であり、操作が煩雑である、回収率が低いなどの問題があり自動化を含むハイスループット化が困難であった。また、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をＲＮＡ精製カラムを用いて精製する場合、未反応のｍＲＮＡによる精製効率の低下を防止するために過剰量のリンカーを用いる必要があることから、高価なリンカーが無駄になるという問題もあった。
【発明の開示】
【０００３】
このような状況下、煩雑な操作を必要とせず、かつ高価なリンカーなどを無駄にすることのない、時間、コスト、手間などが削減されたタンパク質のスクリーニング方法の開発が望まれていた。また、自動化に適したタンパク質のスクリーニング方法の開発が望まれていた。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、タンパク質のスクリーニングにおいて、ピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物が固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーを用いることにより、時間、コスト、手間などが削減できることを見出し、本発明を完成したものである。すなわち、本発明は、以下に示すようなタンパク質のスクリーニング方法、固定化ピューロマイシン・リンカー、それを用いる固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体の製造方法、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体の製造方法などを提供する。
（１）（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；
（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成することを含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；
を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
（２）工程（ｃ）において選択されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のタンパク質を同定する工程：
をさらに含む、上記（１）記載の方法。
（３）前記タンパク質の同定が、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡから逆転写により調製されたＤＮＡ塩基配列を解析することによって行われる、上記（２）記載の方法。
（４）さらに、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡに対応するＤＮＡを逆転写により合成し、該ＤＮＡに変異を導入することによって変異ＤＮＡを得、該変異ＤＮＡを用いて改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、該改変された配列を有するｍＲＮＡを工程（ａ）に供する工程：
を含む、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、上記（４）記載の方法。
（６）前記固定化ピューロマイシン・リンカーが、リンカーに設けられた固相結合部位と、固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されている、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記固相結合部位がビオチンである、上記（６）記載の方法。
（８）前記固相結合部位認識部位がアビジンまたはストレプトアビジンである、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）前記固相がビーズである、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記ビーズが磁性ビーズである、上記（９）記載の方法。
（１１）前記磁性ビーズが、ポリマービーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズおよびセファロースビーズから選択される、上記（１０）記載の方法。
（１２）前記標的物質が固相に固定化されている、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記標的物質が固定化されている固相が、磁性ビーズである、上記（１２）記載の方法。
（１４）ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を作製するための、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカー。
（１５）前記固相が、ビーズ、基板、容器およびメンブレンから選択される、上記（１４）記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
（１６）前記固相が、ビーズである、上記（１５）記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
（１７）前記ビーズが、磁性ビーズである、上記（１６）記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
（１８）リンカーに設けられた固相結合部位と、固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されている上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の固定化ピューロマイシン・リンカー。
（１９）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結する工程を含む、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体の製造方法。
（２０）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；および、該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成する工程を含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体の製造方法。
（２１）（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；
（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成した後、逆転写反応に供することを含む、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；
を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
（２２）標的物質あるいは標的分子結合磁性体と、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置であって、標的物質、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質磁性連結体、標的分子結合磁性体、試薬及びバッファーを投入するための投入口と、使用後の試薬、バッファー及び反応副生成物を排出するための排出口と、磁力によってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質磁性連結体、及び、標的分子結合磁性体を回収する手段とを設けた反応器を備えることを特徴とするタンパク質のスクリーニング装置。
本発明のタンパク質のスクリーニング方法などは、例えば、次のような効果を有する。
（１）本発明においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン・リンカーとの結合効率が極めて改善されている。このため、高価なピューロマイシン・リンカーを無駄にしない。
（２）カラム精製（例えば、ＲＮＡカラム精製など）などの煩雑で回収率の低い精製操作を必要としない。
（３）エタノール沈殿などの濃縮操作を必要としない。
したがって、本発明のスクリーニング方法などによれば、時間、コスト、手間などを削減することができる。さらに、固定化ピューロマイシン・リンカー、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体などを高収率で得ることができる。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、固相としてビーズを用いることにより、タンパク質のスクリーニングを自動化することが容易になる。また、タンパク質のスクリーニングのハイスループット化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の一実施態様に係るタンパク質のスクリーニング方法の概要を示す図である。
図２は、本発明の自動化に適した実施態様に係る、本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーを用いてタンパク質を合成する方法の概要を示す図である。
図３は、本発明の自動化に適した実施態様に係る、タンパク質を選択および同定する方法の概要を示す図である。
図４は、実施例１において固定化されなかったリンカーを調べるための電気泳動の結果を示す図である。
図５は、実施例１および溶液中でのタンパク質合成で得られたＤＮＡ−タンパク質連結体（ＩＶＤＶビリオン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
１．タンパク質のスクリーニング方法
本発明は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法に関する。
（ａ）ｍＲＮＡと、ピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物が固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；
（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成することを含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程。
さらに、好ましい態様としては、工程（ｃ）に続いて、さらに下記工程（ｄ）を含む、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得するスクリーニング方法にも関する。
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡから逆転写により調製されたＤＮＡに変異を導入することによって得られた変異ＤＮＡを用いて改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供する工程。
以下、各工程の詳細について説明する。
（１）工程（ａ）：固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体の調製
工程（ａ）では、ｍＲＮＡと、固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する。
ここで、固定化ピューロマイシン・リンカーにおいては、ピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物（単に「ピューロマイシン」と称することもある）はリンカーと結合されている。このピューロマイシンとリンカーとの結合体を「ピューロマイシン・リンカー」と称する。さらに、ピューロマイシン・リンカーは、固相に結合されている。
（ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物）
ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、固相に固定化された固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、ｍＲＮＡにリンカーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓビリオンが生成することが知られている（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）参照）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、その３′末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似している、下記式（Ｉ）：
2007046520.tif 000003
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その３′末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３′−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。また、３′−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３′−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などであり、下記にその化学構造式を示す。
2007046520.tif 000004
2007046520.tif 000005
（リンカー）
次に、本発明で用いられるリンカーとは、本発明で用いられるｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製する際に、ｍＲＮＡとピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーを意味する。リンカーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのＡサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために用いられる。したがって、リンカーとしては、そのような性質を有する限り特に限定されない。例えば、リンカーとしては、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法で使用しうるリンカーであればいずれのリンカーも使用できるが、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好ましい。具体的には、ここで用いられるスペーサーとして、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ含む）、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用いられる。上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。
本発明のリンカーは、好ましくは、１本鎖ＤＮＡ及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を主骨格として含むものであり、上記リンカーの機能を果たす限り、１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡの部分以外に、それ以外の骨格部分を有することもできる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、ＤＮＡやＲＮＡとは異なり、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているＤＮＡ類似構造の化合物である。１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡ以外の部分としては、例えば、ＲＮＡ鎖、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを選択することができる。これらの直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。なお、本明細書で、「１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡを主骨格として含む」とは、例えば、リンカーの骨格全長に対して、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上が１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡで構成されていることをいう。なお、ＤＮＡとＰＮＡの両者を主骨格中に含む場合は、その比率は特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ：ＰＮＡ＝１：９〜９：１の範囲が例示される。
本発明のリンカーは、種々の反応工程での反応性、得られるｍＲＮＡ−タンパク質複合体（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓビリオン（ｖｉｒｉｏｎ））の精製効率などを考慮して、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは１５〜３０ｍｅｒの長さを有する。なお、本発明のリンカーは、公知の化学合成の手法を用いて作成することができる。
本発明のリンカーには、好ましくは、ピューロマイシン・リンカーを固相に結合するための固相結合部位を設ける。
また、本発明のリンカーには、必要に応じて、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−（タンパク質）連結体を固相から取り外すために、前記固相結合部位を挟む位置に一対の切断部位を設ける。このような切断部位は、特にこれに限定されないが、例えば、酵素切断部位である。本発明の好ましい態様においては、前記切断部位は酵素切断部位であり、例えば、リボＧ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）である。固相に結合されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−（タンパク質）連結体を固相から取り外す際は、上記切断部位を切断する酵素等で切断する。ここで用いられる酵素としては、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、膵臓ＲＮａｓｅ、Ｓ１ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンヌクレアーゼなどを用いることができる。本発明では、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉ及び膵臓ＲＮａｓｅが好ましく、特にＲＮａｓｅＴ１が好ましい。また、酵素切断部位は、使用する酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
なお、本発明のリンカーは、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、リンカー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
本発明のピューロマイシン・リンカーには、ｍＲＮＡを連結する部位としてＤＮＡ配列を設けても良く、ＤＮＡ配列を設けるのが好ましい。ピューロマイシン・リンカーにＤＮＡ配列を設けた場合には、例えば、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡ配列と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。
さらに、本発明のピューロマイシン・リンカーには、逆転写用プライマーを設けてもよく、逆転写用プライマーを設けるのが好ましい。ピューロマイシン・リンカーに逆転写用プライマーを設けた場合には、その逆転写用プライマーを利用して、（固定化）ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を逆転写反応に供することにより、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡを生成させ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製することができる。
（固定化ピューロマイシン・リンカー）
本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーにおいては、ピューロマイシン・リンカーが固相に固定化されている。本発明のピューロマイシン・リンカーは、上述のピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物と上述のリンカーとを公知の科学的手法によって連結することにより製造することができる。さらに、本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーは、前述のピューロマイシン・リンカーを固相に固定化することにより製造することができる。
本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーが固定化される固相は特に限定されず、その使用目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、ポリマービーズ（例えば、スチレンビーズ）、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性ビーズなどのビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。磁性ビーズなどのビーズとしては、ポリマービーズ（例えば、スチレンビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズなど）、ガラスビーズ、シリカビーズなどが挙げられる。
本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーを固相に固定化する手段は、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体の調製など、その後の工程の障害とならないように固定すればよく、特に限定されない。好ましくは、リンカーに設けられた固相結合部位と、固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合される。
本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーが固定される固相結合部位は、本発明のピューロマイシン・リンカーを固相に結合しうるものであればよく、特に限定されない。固相結合部位としては、例えば、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）を用いることができる。この場合には、固相結合部位認識部位としては、その分子と結合する特定のポリペプチドが用いられる。固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、ビオチン／アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質、マルトース／マルトース結合タンパク質、グアニンヌクレオチド／Ｇタンパク質、ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン／ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質、抗原分子（エピトープ）／抗体、カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、ＡＴＰ／ＡＴＰ結合タンパク質、あるいはエストラジオール／エストラジオール受容体タンパク質などの、各種リガンド／その受容体タンパク質などが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、ビオチン／アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース／マルトース結合タンパク質、ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン／ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、抗原分子（エピトープ）／抗体などが好ましく、特にビオチン／ストレプトアビジンの組合せが最も好ましい。
上記の固相結合部位は、例えば、ピューロマイシン・リンカーを固相に結合しうる化合物または結合基を、公知の化学的方法によって、リンカー中の塩基に結合させることによって設けることができる。より具体的には、ピューロマイシン・リンカーを固相に結合しうる化合物または結合基としては、ビオチンなどが挙げられる。リンカー中の塩基としては、（デオキシチミン（ｄＴ））、アミノ基によって修飾された塩基（例えば、アミノ修飾デオキシチミン（例、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６−ｄＴ：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製）、カルボキシ基によって修飾された塩基（例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄＴ））、チオール基によって就職された塩基（たとえば、チオール修飾デオキシチミン（４−Ｔｈｉｏ−ｄＴ））等が挙げられる。固相結合部位としては、リンカー中のデオキシチミン（ｄＴ）に結合したビオチンが好ましい。固相結合部位としてビオチンを用いた場合には、固相結合部位認識部位としてアビジンまたはストレプトアビジンを有する固相を用いることにより、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの親和性を利用して、ピューロマイシン・リンカーを固相に固定化することができる。なお、上記固相結合部位としてカルボキシル基またはアミノ基を用いる場合には、エステル結合またはアミド結合によってピューロマイシン・リンカーを固相に固定化することができる。
上記の固相結合部位認識部位として用いられるポリペプチドの固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位に用いられる特定のポリペプチドに特異的に結合する分子と固相結合部位認識部位に用いられる前記分子と結合する特定のポリペプチドとを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビース、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
（固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体の調製）
上記工程（ａ）では、ｍＲＮＡと、上記固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する。
本発明で用いられるｍＲＮＡは、配列未知のもの、配列既知のものの両者を含む。すなわち、本発明のｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を用いて配列既知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、配列既知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いる。逆に、本発明のｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析する場合は、配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いることができる。ここで用いられる、ｍＲＮＡは、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、各種抗体又はその断片をコードするｍＲＮＡ、各種酵素をコードするｍＲＮＡ、各種遺伝子ライブラリー中のＤＮＡから転写される配列未知のｍＲＮＡ、有機合成によってランダムに合成された配列を有するＤＮＡから転写されたランダムな配列を有するｍＲＮＡなどから選択される。
ｍＲＮＡと固定化ピューロマイシン・リンカーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをリンカーとして用いる場合、またはリンカーにＤＮＡ配列を設けた場合には、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡ配列と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。
また、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を作成するに際しては、リンカーの一部をｍＲＮＡを調製する際にｍＲＮＡの３’末端側に形成しておき、これにピューロマイシン・リンカーの残部を結合することによってｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を作製することもできる。この場合は、ｍＲＮＡの３’末端側に形成したリンカーの一部中に切断部位を設けることもできる。
（２）工程（ｂ）：ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体の調製
工程（ｂ）では、上記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質の合成を行い、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体（単に、「ｍＲＮＡ−タンパク質連結体」と称することもある）を調製する。なお、ｍＲＮＡ−タンパク質連結体のことを、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＶ）ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）」と称することもある。
ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ  Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ  Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  Ｕ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７  ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、前記ピューロマイシン・リンカーの固相結合部位を挟む位置に切断可能部位が設けられている。そこで、タンパク質を合成した後、好ましくは固相上でタンパク質を確実にフォールディングさせた後に、その切断可能部位を切断することにより、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製することができる。このようにして得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体は、種々の解析実験やスクリーニングに用いることができる。
必要に応じて、タンパク質を合成した後、前記ピューロマイシン・リンカーの切断可能部位を切断する前または切断した後に、逆転写反応に供することにより、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡを生成させ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体（単に、「ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体」と称することもある）を調製しても良い。ピューロマイシン・リンカーの切断可能部位を切断する前に逆転写反応に供するのが、バッファー交換、洗浄などの操作を行うのが容易である点で好ましい。なお、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを、まとめて「ｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体」または「ｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−タ
ンパク質連結体」と称することもある。
このようにして調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体は、工程（ｃ）において標的物質と接触させた場合に、ｍＲＮＡと該標的物質とが非特異的に結合することを抑制することができるので、標的物質とタンパク質との相互作用を測定する際のバックグラウンドを低減させることができる点で好ましい。また、ｍＲＮＡが分解されにくいという点でも好ましい。
さらに、このようにして生成されたＤＮＡは、以下に説明する工程（ｃ）においてタンパク質を同定するために用いることができる。また、以下に説明する工程（ｄ）において、変異ＤＮＡを生成させるために用いることもできる。
また、必要に応じて、得られたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡを、ＲＮａｓｅＨなどの酵素によって分解し、ＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体（単に、「ＤＮＡ−タンパク質連結体」と称することもある）を調製してもよい。なお、これらのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体またはＤＮＡ−タンパク質連結体のことを、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＤＶ）ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）」と称することもある。
（３）工程（ｃ）：ｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体の選択
工程（ｃ）では、標的物質と、上記ｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する。
標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体の選択は、標的物質とタンパク質との相互作用を測定することによって行うことができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
標的物質とタンパク質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行うことができる。そのような測定手法としては、例えば、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））、エバネッセント場分子イメージング法Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））、蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、及び蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））等が挙げられる。
また、標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体の選択は、単純に両分子が結合するか否かを判定することによって行うことができ、両分子の特異的親和性を利用した方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）によってそのような結合実験を行うことができる。具体的には、セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上（例えばビーズ、フィルター、メンブレン等の担体）に標的物質を常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料を通して溶出させることにより、該試料中に含まれる、標的物質に結合するｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を分離することができる。またこのような操作を行なうことによって、標的物質に結合しなかったｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を本スクリーニングプロセスから排除することができ、必要なｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のみを選別することができる。
あるいは、両分子の特異的親和性を利用した方法としてアフィニティービーズ法によって結合実験を行うことができる（文献，Ｏｇａｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；７４：４７０２−４７０８）。具体的にはストレプトアビジンを表面に結合させた磁性ビーズまたは標的分子をアミノ基などを介して表面に固定した磁性ビーズを用いる。ビオチン化した標的分子に結合するｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体はストレプトアビジンビーズと接触させた後、磁石でストレプトアビジン磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。また、標的分子を表面に固定した磁性体ビーズ（「標的分子結合磁性体」ビーズ）とｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させた後に磁石で磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。他にも、ビーズが磁性体でなく、アガローズビーズ、等の場合は、磁石の代わりに遠心機を用いてビーズのみ沈殿させて回収することで分離することが可能である。
ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
本発明の方法においては、必要に応じて、さらに、工程（ｃ）において選択された標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体中の、タンパク質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているＤＮＡ、すなわち、逆転写により得られる本発明のｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体のｍＲＮＡに対応するＤＮＡ、の塩基配列を解析することによって行うこともできる。この逆転写は、前述の工程（ｂ）におけるタンパク質合成後に行えばよい。例えば、前記ピューロマイシン・リンカーの切断部位を切断する前に行ってもよいし、切断部位の切断後、工程（ｃ）に供する前に行ってもよい。さらに、工程（ｃ）において標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択した後に行っても良い。
（４）工程（ｄ）：標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質の調製
本発明においては、好ましくは、工程（ｃ）に続いて、さらに、（ｄ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン−タンパク質連結体のｍＲＮＡに対応するＤＮＡを逆転写により合成し、得られたＤＮＡに変異を導入することによって変異ＤＮＡを調製し、得られた変異ＤＮＡを用いて改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、この改変された配列を有するｍＲＮＡを工程（ａ）に供し、次いで上述のように工程（ｂ）及び（ｃ）の処理を行うことによって、標的物質との相互作用力を強化したタンパク質を取得することができる。ここで、前記逆転写は、前述のように、工程（ｂ）におけるタンパク質合成後に行えばよく、それを行う時期は特に限定されない。また、前記ＤＮＡへの変異の導入は、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法（Ｇｒａｍ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２，８９，３５７６−８０．）、ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９４，３７０，３８９−３９１）等の公知の方法によって行うことができる。本発明においては、ＤＮＡにランダムに低確率で変異を導入することができる、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法が好ましい。なお、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＴ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈは商標）として市販されている。このような方法を利用すると、上記工程（ａ）〜（ｃ）において、ある標的物質に対して少しでも相互作用するタンパク質を取得できた場合に、そのタンパク質のアミノ酸配列をランダムに改変して、より相互作用力の強いタンパク質を取得することができる。したがって、上記工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力をより強化したタンパク質を取得することができる。
また、このような工程を複数回（例えば、２〜１０回、好ましくは４〜８回）繰り返すことによって、ある特定の標的物質と相互作用するタンパク質が複数取得できた場合は、それら複数タンパク質のアミノ酸配列のコンセンサス配列情報等に基づいて新たなアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、これを前記工程（ａ）に供することによって、さらに高い相互作用力を有するタンパク質を取得することが可能となる。
このようにして得られたタンパク質は、公知の有機合成手法に基づいて有機合成することができる（泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）等参照）。
なお、このようなスクリーニング方法によって得られるタンパク質は、標的物質の生理的機能を調整する、生理活性物質として、種々の医薬用途に用いることができる。
次に、本発明のタンパク質のスクリーニング方法の好ましい実施態様について、図１に基づいて説明する。図１は、本発明のタンパク質のスクリーニング方法について説明するための、本発明の一実施態様の概要を示す図である。図１（１）に示されたピューロマイシン・リンカー１においては、ピューロマイシン２がリンカー３と結合されている。リンカー３には、固相結合部位３ａ、切断部位３ｂ、蛍光標識３ｃが設けられている。ピューロマイシン・リンカー１と、ストレプトアビジンビーズ４とを結合することによって、本発明の固定化ピューロマイシン・リンカー５を調製する（図１（２））。
次に、図１（３）および（４）に示すように、ｍＲＮＡ６と、固定化ピューロマイシンリンカー５とを連結することによって、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体７を調製する。
得られた固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体７と翻訳系とを接触させることによってタンパク質８を合成し、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体９を調製する（図１（５））。合成されたタンパク質８は、ピューロマイシン２に結合する。次いで、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体９を逆転写反応に供することによって、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ１０を合成し、固定化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体１１を調製する（図１（６））。
さらに、切断部位３ａでリンカーを切断することによって、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体１２を調製する（図１（７））。このようにして得られるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体１２を種々のスクリーニング系に供することによって、標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択することができる。
２．自動化に適したタンパク質のスクリーニング方法
次に、図２および図３に基づいて、自動化に適したタンパク質のスクリーニング方法について具体的に説明する。
本発明のタンパク質のスクリーニング方法を用いたスクリーニング自動化装置は、試薬、バッファー、洗浄液などを投入するための投入口と、それらを排出するための排出口と、磁力による保持手段とを設けた反応器（進化リアクター）を備える。ここで、投入口と排出口とを別々に設ける必要はなく、投入と排出とを行うための投入・排出口を設けてもよい。また、ｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体などを合成するための合成反応器と、標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ（／ｃＤＮＡ）−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体などを選択するためのスクリーニング反応器とを別々に設けてもよいし、合成とスクリーニングとを行うための合成・スクリーニング反応器を設けてもよい。
図２（１）中、Ｐはピューロマイシン、ＳｔＡＶはストレプトアビジン磁性ビーズであり、ピューロマイシン・リンカーは、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって磁性ビーズに固定化されている（本発明の固定化ピューロマイシン・リンカー）。
まず、この固定化ピューロマイシン・リンカーと連結するｍＲＮＡを含むｍＲＮＡライブラリを加えて固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する（図２（２））。次いで、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどのＲＮＡリガーゼを用いてピューロマイシン・リンカーの末端とｍＲＮＡの末端をライゲーションしてもよい。その後、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカーが固定化されている磁性ビーズを磁石で吸着しながら、未反応のｍＲＮＡやＲＮＡリガーゼを含む反応液を排出し、バッファー交換する（図２（３））。
次に、得られた固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を無細胞翻訳系などの翻訳系に接触させることによって、そのｍＲＮＡに対応するタンパク質を合成する（図２（４））。このタンパク質は、図に示されるようにピューロマイシンＰに結合する。
その後、得られた固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体が固定化されている磁性ビーズを磁石で吸着しながら、翻訳系を排出し、洗浄する（図２（５））。次いで、逆転写反応に供することによって、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡを生成させてもよい（図２（６））。逆転写反応に供した場合には、得られた固定化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体が固定化されている磁性ビーズを磁石で吸着しながら、逆転写酵素とバッファーを排出し、洗浄する（図２（７））。ここで、必要に応じて、ＲＮａｓｅＨなどの酵素によってｍＲＮＡを分解してもよい。
さらに、ＲＮａｓｅ  Ｔ１などの酵素によって、切断部位でリンカーを切断することによってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体またはＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を磁性ビーズから分離することができ（図２（８））、これを溶出することによって、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体またはＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体（ＩＶＤＶビリオン）を得ることができる。
次に、標的物質と、得られたＩＶＤＶビリオンとを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むＩＶＤＶビリオンを選択する。
まず、ＩＶＤＶビリオンを、標的分子を固定した磁性ビーズと接触させ、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むＩＶＤＶビリオンを磁性ビーズに結合させる（図３（１０））。標的分子との結合が所望の強度以上であるＩＶＤＶビリオンを選択するために、洗浄用バッファーで洗浄し、所望の結合強度未満のＩＶＤＶビリオンを除去する。洗浄用バッファーを交換する場合には、標的分子を固定した磁性ビーズを磁石によって吸着しながら行うことができる。また、洗浄用バッファー中の磁性ビーズを磁石を用いて移動させることにより、洗浄効率を向上させることができる。所望の結合強度のＩＶＤＶビリオンの選択は、洗浄用バッファーの組成（例えば、塩濃度など）を適宜設定することにより行うことができる。
次いで、標的分子を固定した磁性ビーズを磁石によって吸着しながら、高塩濃度溶液などの溶出液によってＩＶＤＶビリオンを溶出することによって、標的物質と相互作用するタンパク質を含むＩＶＤＶビリオンを得ることができる（図３（１２））。溶出液の組成を段階的に（ステップワイズ）、あるいは連続的に（グラジエント）変化させることによって、標的物質との相互作用力に応じてＩＶＤＶビリオンを分離することもできる。
このようにして得られたＩＶＤＶビリオンをＰＣＲに供し（図３（１３））、そのＤＮＡ配列を決定（図３（１４））することにより、該ＩＶＤＶビリオン中のタンパク質を同定することができる。
このようにして、本発明によれば、ｍＲＮＡライブラリを本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーを含む反応系に加えることによって、標的分子と相互作用する（親和性の高い）タンパク質を選択し、そのアミノ酸配列を決定するスクリーニング自動化装置を提供することが可能となる。
【実施例】
【０００６】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ用リンカーＳｈｏｒｔ−Ｂｉｏｔｉｎ−ピューロマイシンＬｉｎｋｅｒ（ＳＢＰリンカー）の合成
まず、以下の特殊ＤＮＡ合成をＢＥＸ社に合成依託した。
（Ａ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５′−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３′］
ここで、（Ｓ）は５′−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ、（Ｓｐａｃｅｒ１８）は商品名「Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８」で化学名は（１８−０−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する。
2007046520.tif 000006
以上すべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製。
（Ｂ）Ｈｙｂｒｉ［配列番号１：５′−ＣＣ（ｒＧ）Ｃ（Ｔ−Ｂ）Ｃ（ｒＧ）ＣＣＣ  ＣＧＣＣＧ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧ（Ｔ）ＣＣ  Ｔ−３′］
ここで、（ｒＧ）はリボＧ、（Ｔ）はＡｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、（Ｔ−Ｂ）はＢｉｏｔｉｎ−ｄＴですべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製。
本発明のリンカーは（Ａ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓと（Ｂ）Ｈｙｂｒｉを以下の方法に従って架橋し精製したもので、これを「ＳＢＰリンカー」と名づける。以下に合成法を示す。
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ  １０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を１μｌ加え（ｆｉｎａｌ  １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰを除いた。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌのＨｙｂｒｉ  ２０μｌ、１００ｍＭ  架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅｅｓｔｅｒ）、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＨｙｂｒｉを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ  ＣＳＯＭＯＳＩＬ  ３７９１８−３１  １０ｘ２５０ｍｍ  Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％  ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下
で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
２．ＳＢＰリンカーのストレプトアビジン・ビーズ（ＳｔＡＶビーズ）への固定化
実験にあたっては以下に示すようにまず固定化する分子を完全にＳｔＡＶビーズに結合させるために必要な最適な量を検討した。
（１）ＳｔＡＶビーズを洗浄後、０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ＤＥＰＣ処理水で最終濃度２．５μｇ／μｌ（約、１５０，０００ビーズ／μｌ）に希釈した。
（２）１ｐｍｏｌのＳＢＰリンカーは１．２５μｇから２０μｇの範囲でＳｔＡＶビーズに結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で、２５℃、１５分間、攪拌しながら固定した。
（３）反応後、固定化されなかったリンカーを調べるため上清を回収し電気泳動（１２％ＰＡＧＥ）で解析した。結果は図４に示すとおり、リンカー１ｐｍｏｌに対しダイナビーズＭ−２７０を１０μｇ以上必要なことがわかった。
以上のことより固相上でのＩＶＶ形成には、１０ｐｍｏｌのリンカーに対し１０μｌ（１００μｇ）のＭ−２７０ビーズを用いて固定化し、０．０１％  ＲＮａｓｅフリーＢＳＡバッファー（０．０１％  ＢＳＡ，ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ａｍｂｉｏｎ））で２回洗った。
３．固定化リンカーへのｍＲＮＡの固相連結反応
滅菌したＲＮａｓｅフリーエッペンドルフチューブに１０ｐｍｏｌのＰｏｕドメインのｍＲＮＡと２．で作製したリンカー固定化ビーズを以下に示す組成の順番に加え、最終体積を２０μｌになるように氷上でゆっくり混合した。
２（ｌ  １０×Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；
１００ｍＭ  ＤＴＴ；１０ｍＭ  ＡＴＰ）→１．２（ｌ  ０．１％  ＢＳＡ→ｍＲＮＡ→固定化ｌｉｎｋｅｒ−ＤＮＡビーズ
次に、ヒートブロックにこのエッペンドルフチューブを置き、８０℃で２分間インキュベートした後、室温に放置し１５分間ハイブリダイゼーションする。さらに１（ｌのＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／（ｌ），１．５（ｌのＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（４０Ｕ／（ｌ），１（ｌのＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ／（ｌ）を加えた後、ライゲーション反応のためにローターにチューブをセットし１時間２５℃で反応させた。ライゲーション反応後、１分間マグネットスタンドにチューブを静置し上精を取り除き、０．０１％ＲＮａｓｅフリーＢＳＡバッファーで２回ビーズを洗う。
固相上翻訳用ｍＲＮＡとしてこの洗浄したビーズを以後用いた。
４．固相Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＶ）合成
ウサギ網状赤血球の無細胞翻訳系（Ａｍｂｉｏｎ社）の試薬はすべて氷上において以下の順番で５０μｌスケールで調整した。
（１）（「−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」１．２５（ｌ＋「−ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」１．２５（ｌ＋「１Ｍ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ」２．５（ｌ＋「ＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」２（ｌ）を注意深く混ぜ合わせた後、３４（ｌのＲｅｔｉｃ  ｌｙｓａｔｅを泡立てないように丁寧にピペットを用いて混合した。
（２）調整した（１）の混合液をｍＲＮＡ固定化ビーズの入ったチューブに加え、泡立てないように再び注意深く攪拌した。
（３）氷上からチューブをインキュベーターに移して３０分、３０秒反応させた。
（４）１Ｍ  ＭｇＣｌ２  ６（ｌと３Ｍ  ＫＣｌ  １４（ｌをさらに加えて３７°Ｃで９０ｍｉｎインキュベートした。
５．逆転写
氷上で以下の組成をピペットによって丁寧に混合した。
（１）５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭ  ＫＣｌ：１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）４（ｌ＋０．１Ｍ  ＤＴＴ  １（ｌ＋ＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １（ｌ＋ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５１ｍＭ  ｅ
ａｃｈ）３（ｌ＋ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／（ｌ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１（ｌ
（２）（１）を４．で反応させたビーズの入ったチューブに加え、ピペットでビーズを懸濁させた。
（３）５０℃のヒートブロックにチューブを移した後、３０分間ほどローターを用いてゆっくり攪拌しながらインキュベーターの中で反応させた。
（４）ビーズをマグネットスタンドで集め、注意深く上清を取り除き次の反応に用いた。
６．ＤＮＡ化したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓ；ＩＶＤＶ）ビリオンのビーズからの解離とｍＲＮＡの除去
スクリーニングをする際には５．の過程のままではビーズに同定されたままであるので、これをビーズから解離する必要がある。このためにＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いて以下のように行った。
（１）５．のビーズが入ったチューブにＲＮａｓｅ  Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ社）１００Ｕと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５を２μｌ加え２０μｌになるように水を加え、１５分間、３７℃でローターを用いてインキュベートした。
（２）マグネットスタンドを用いてビーズを分離し、ビーズを攪拌しないように注意深く上清を取り除いた。
この上清の中にＩＶＤＶビリオンが存在するため通常これを用いてスクリーニングするが、今回はＩＶＤＶの合成効率を知るために以下のＲＮａｓｅＨ処理をした。これはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質の形であると分子量が大きいため電気泳動によって容易に確認できないからである。
（３）（２）の上清に、Ｔｔｈ  ＲＮａｓｅ−Ｈ（東洋紡）１０Ｕ加え、２０分間、４０℃反応させた。
８Ｍ−ｕｒｅａ  ６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＤＮＡ−タンパク質連結体（ＩＶＤＶビリオン）を解析した（図５）。
図５の「固相」は、本発明の実施例１により作成したＤＮＡ−タンパク質連結体（ＩＶＤＶビリオン）を解析した結果であり、「液相」は、ｍＲＮＡ／ＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を無細胞翻訳系に加え、溶液中で（通常通りに）タンパク質合成を行い、その後ＲＮａｓｅＨ処理によりｍＲＮＡを除去して作成したＤＮＡ−タンパク質連結体（ＩＶＤＶビリオン）を解析した結果である。ＩＶＤＶ−ビリオンは、ＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を表し、ＩＶＤＶ−ゲノムは、タンパク質が結合していないＤＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を表す。図３に示されるように、本発明の方法（固相合成）によるＤＮＡ−タンパク質連結体（ＩＶＤＶビリオン）の合成効率は、液相合成の場合に比べて５倍以上であった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のタンパク質のスクリーニング方法は、高価なリンカーを無駄にすることがなく、かつ、煩雑で回収率の低い精製操作および濃縮操作を必要としないので、時間、コスト手間などが低減されたタンパク質のスクリーニング方法として有用である。
さらに、本発明のタンパク質のスクリーニング方法は自動化に適しているので、ハイスループットなスクリーニング自動化装置に利用することができる。
また、本発明の固定化ピューロマイシン・リンカーは、前述のタンパク質のスクリーニング方法、スクリーニング自動化装置などに利用することができる。
［配列表］
2007046520.tif 000007
【図１】
2007046520.tif 000008
【図２】
2007046520.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2007046520.tif 000012
【国際調査報告】
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