(57)【要約】肺癌の初期において、癌細胞の存在証拠を血液中から検出でき、しかも、癌か否かの癌診断をした場合、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断してしまったり、また、肺癌患者でないにもかかわらず、陽性と判断する場合を著しく低減した、癌診断方法及びそのような癌診断方法を用いた肺癌診断方法を提供する。ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、前記ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、第一の癌診断方法と第二の癌診断方法の双方の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、
前記ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、
前記第一の癌診断方法の結果が、陽性と判定され、且つ、前記第二の癌診断方法の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断する、癌診断方法。
【請求項２】
前記ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットが、上流側プライマーが、ＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧであり、下流側プライマーが、ＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴである、請求の範囲第１項記載の癌診断方法。
【請求項３】
前記ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットが、上流側プライマーが、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡであり、下流側プライマーが、ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡである、請求の範囲第１項又は請求の範囲第２項記載の癌診断方法。
【請求項４】
前記体液が、血液である、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の癌診断方法。
【請求項５】
請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の癌診断方法を用いた、肺癌診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌診断方法及び肺癌診断方法に関し、特に、早期に肺癌か否かの診断ができ、また、抗癌剤が患者に有効か否かの判断をできる、高感受性且つ特異性のある癌診断方法及びそのような癌診断方法を用いた肺癌診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、過去２０年間において、生存率において少しの変化があったものの、依然として、悪性腫瘍関連死の主要な原因となっている。
そして、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ））は、現在、総肺癌患者の３／４を占めており、多くの患者が、新規な治療方法や外科的腫瘍学の進歩にもかかわらず、進行性かつ転移性の病気によって死に続けている。
また、メスなどを用いない、診断ツールとして、腫瘍マーカーがある。
この腫瘍マーカーは、一般に、癌の診断や、治療指標として用いられている。
腫瘍マーカーとしては、小細胞癌の診断には、例えば、ＮＳＥ（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ、以下、単に「ＮＳＥ」という。）やｐｒｏＧＲＰ（Ｐｒｏ−ｇａｓｔｏｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、以下、単に、「ｐｒｏＧＲＰ」という。）が有効なマーカーとされている。
非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、以下、単に、「ＮＳＣＬＣ」という。）や、癌胎児性抗原（ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、以下、単に、「ＣＥＡ」という。）や、扁平上皮癌（ＳＣＣ（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、以下、単に、「ＳＣＣ」という。）や、サイトケラチン２１−１フラグメント（シフラ２１−１）（ＣＹＦＲＡ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １９  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、以下、単に、「ＣＹＦＲＡ」という。）や、シアリルＬｅＸ−抗原（ＳＬＸ（ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｓｉａｌｙｌ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）、以下、単に、「ＳＬＸ」という。）や、ＣＡ１９−９（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９、以下、単に、「ＣＡ１９−９」という。）は、一般に、診断に用いられており、少なくとも、ＣＥＡ、ＳＣＣ及びＣＹＦＲＡの群から選択される１つのマーカーが、陽性の場合、７０％の患者が、非小細胞癌（ＮＳＣＬＥ）の患者である、とされている。
また、組織学的カテゴリーに基づけば、ＣＥＡとＣＹＦＲＡとの双方が陽性の割合は、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の患者において高く、ＣＹＦＲＡとＳＣＣとの双方が陽性の割合は、扁平上皮癌ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の患者において高い、とされている。
また、Ｘ線診断（Ｘ−ｒａｙ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ）や、従来の腫瘍マーカーを用いた診断や、気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｌａｖａｇｅ（ＢＬ）のような標準的な手法は、肺癌の発見に重要であるが、これらの手法は、臨床の初期段階における肺癌の発見には十分では無い、という問題がある。
また、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、以下、単に、「ＥＧＦＲ」という。）のチロシンキナーゼ活性（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、腫瘍細胞の増殖や、細胞生存や、血管形成や、滲出や、転移に関与し、また、合成アニリノキナゾリン（ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｉｌｉｎｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ）、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（商品名：「イレッサ」（登録商標）、販売会社：アスロラゼネカ株式会社）のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用をうける作用点でもある。
ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（商品名：「イレッサ」（登録商標）、販売会社：アスロラゼネカ株式会社）のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用は、患者によっては、極めて有効な薬剤であるが、他方、副作用の問題がある。
ＥＧＦＲは、ＮＳＣＬＣの組織標本の８０％に発現するが、その発現は、小細胞癌（Ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＳＣＬＣ）の進行性タイプ（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｙｐｅ）に観察される。この意味において、ＥＧＦＲは、優れた肺癌の生体用マーカー（ｂｉｏｍａｋｅｒ）であり、そして、ＥＦＦＲターゲット療法（ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）に腫瘍反応（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）する分子決定因子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔａｅｒｍｉｎａｎｔｓ）である。
ＲＧＦＲＴが、腫瘍マーカーのように利用できれば、医師が、患者に対し、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を処方するか否かの判断するのが容易となり、また、患者に対し、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を処方後においても、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）が腫瘍に有効であるか否かの追跡調査が容易に行える。
また、本発明者等は、患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、癌診断方法を既に提案している。
しかしながら、この癌診断方法だけを用いて、例えば、肺癌か否かの癌診断をした場合、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断したり、また、肺癌患者でないにもかかわらず、陽性と判断したりする場合が全く無い、とは言い切れない、という問題がある。
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＲＴ，Ｈｉｌｌ−Ｈａｒｍｏｎ  ＭＢ，Ｍｕｒｒａｙ  Ｔ，Ｔｈｕｎ  Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ＣＡ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２００５；５１：１５−３６．
【非特許文献２】Ｇｉａｃｃｏｎｅ  Ｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００２；２１：６９７０−８１．
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＢＥ，Ｇｒａｙｓｏｎ  Ｊ，Ｍａｋｕｃｈ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｎ−ｙｅａｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９０；８：３９６−４０１．
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｎａ  Ｒ，Ｆｉｌｅｌｌａ  Ｘ，Ａｕｇｅ  ＪＭ．ＰｒｏＧＲＰ：ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４；３７：５０５−１１．
【非特許文献５】Ｓｕｇｉｏ  Ｋ，Ｓｕｇａｙａ  Ｍ，Ｈａｎａｇｉｒｉ  Ｔ，Ｙａｓｕｍｏｔｏ  Ｋ．Ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．ＪＵＯＥＨ  ２００４；１：４７３−９．
【非特許文献６】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ｍ，Ｖｅｌｃｏｖｓｋｙ  ＨＧ，Ｍｏｒｒ  Ｈ，Ｋａｔｚ  Ｎ．Ｐｒｏ−ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰｒｏＧＲＰ），ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ），ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ），ａｎｄ  ｃｙｔｏ  ｋｅｒａｔｉｎ  １９−ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；２３：８８５−９３．
【非特許文献７】Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉ  Ｐ，Ｔａｓｓｏｎｅ  Ｐ，Ｂｌｏｔｔａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００５；６：２８９−３００．
【非特許文献８】Ｌｙｎｃｈ  ＴＪ，Ｂｅｌｌ  ＤＷ，Ｓｏｄｅｌｌａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５０：２１２９−３９．
【非特許文献９】Ｇａｍｏｕ  Ｓ，Ｈｕｎｔｓ  Ｊ，Ｈａｒｉｇａｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８７；４７：２６６８−７３．
【非特許文献１０】Ｐａｅｚ  ＪＧ，Ｊａｎｎｅ  ＰＡ，Ｌｅｅ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．ＥＧＦＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０４：１４９７−５００．
【特許文献１１】ＷＯ２００５０４９８６４号
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、上記した問題や医師等の要望を解決するためになされたものであって、癌、より具体的に説明すると、肺癌の初期において、癌細胞の存在証拠を血液中から検出でき、しかも、癌か否かの癌診断をした場合、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断したり、また、肺癌患者でないにもかかわらず、陽性と判断したりする場合を著しく低減した、癌診断方法及びそのような癌診断方法を用いた肺癌診断方法を提供することを目的としている。
請求項１に記載の癌診断方法は、ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、前記ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、第一の癌診断方法の結果が、陽性と判定され、且つ、第二の癌診断方法の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断する。
請求項２に記載の癌診断方法は、請求項１に記載の癌診断方法で用いる、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットの、上流側プライマーが、ＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧであり、下流側プライマーが、ＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴである。
請求項３に記載の癌診断方法は、請求項１又は請求項２に記載の癌診断方法で用いる、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットの、上流側プライマーが、上流側プライマーが、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡであり、下流側プライマーが、ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡである。
請求項４に記載の癌診断方法は、請求項１〜３のいずれかに記載の癌診断方法で用いる、体液が、血液またはリンパ液である。
請求項５に記載の肺癌診断方法は、請求項１〜４のいずれかに記載の癌診断方法を用いた。
［発明の効果］
本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、体液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からＥＧＦＲを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるようになった。
また、本発明に係る癌診断方法では、第一の癌診断方法と第二の癌診断方法の両方が、陽性と判断された場合を、癌と判断するようにしているので、癌でない者を誤って癌と誤って判断したり、癌であるにもかかわらず癌では無いと誤って判断することがない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
第１図は、本発明に係る癌診断方法と、その対象とを概略的に説明する説明図である。
第２図は、本発明に係る癌診断方法で使用するプライマーセットを説明する図である。
第３図は、全長塩基配列を示す図である。
第４図は、ＥＧＦＲの全長塩基配列を示す図である。
第５図は、ＥＧＦＲの全長塩基配列を示す図である。
第６図は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの各々の組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、図６（ａ）は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、また、図６（ｂ）は、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの組織と血清との間の相関関係を表すグラフである。
第７図は、腫瘍マーカーの臨床因子に関する多変量解析結果を示す図である。
第８図は、ロックカーブ解析（ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ）の結果を示すグラフである。
第９図は、各種の腫瘍マーカーの肺癌に対する感受性と特異性とを説明する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明に係る癌診断方法の一例を更に詳しく説明する。
１．患者と標本の収集
図１は、本発明に係る癌診断方法と、その対象とを概略的に説明する説明図である。
図１に示す試験を行うために、２００３年７月〜２００４年１２月の期間、国立米子病院に許可された、８９人の肺癌患者を登録した。
患者の平均年齢は６３歳（２２歳〜９０歳）であった。
これらの患者について、血清試験、胸部Ｘ線、（ヘリカル）コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、胸部又は脳の磁気共鳴映像法、細胞学的試験、経気管支、経皮、又は胸腔鏡下肺生体組織検査の後に外科的切除標本の病理的評価を診断した。
臨床病理学的所見［性別、年齢、診断、腫瘍の大きさ、腫瘍の数、ＣＥＡ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ（Ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）及びＳＬＸといった腫瘍マーカー検査、肝炎ウイルスの有無（ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、喫煙暦（ｓｍｏｋｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐａｃｋ−Ｙｅａｒ  ｉｎｄｅｘ）、転移や再発の有無（ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）及び臨床病期（ＩＡ〜ＩＶ）（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ（ＩＡ〜ＩＶ））］を評価した。
また、対照群（比較例）として、１２人の女性を含む２７人の健常人（２２歳〜７８歳：平均年齢５３歳）を用いた。
更に、同じ患者に関して、外科的処置の前と後（手術後３週間後）の血清中の興味のある遺伝子を調べるため、また、腫瘍マーカーとしての能力を決定するため、我々は、肺癌患者のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴと略）ｍＲＮＡと、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｍＲＮＡとの発現を計量的に分析した。
この試験を行うに際し、患者からインフォームドコンセントを得て、且つ、研究プロトコール（計画案）は、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理的ガイドラインに従ったものとした。
且つ、鳥取大学の倫理委員会（ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の承認を得た（承認番号第１３８、Ｎｏ．１３８−１，２００１年（ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏ．１３８，Ｎｏ．１３８−１，２００１））。
本発明に係る癌診断方法では、まず、被験者（患者）の血液を採取した。
次に、血液中からＲＮＡを含む試料を得た。
より具体的に説明すると、患者から採取した体液（この例では、血液）（約１〜２ｍｌ）について、１０℃で１０分間、３段階（８００ｘｇ、１０００ｘｇ、１５００ｘｇ）の遠心分離操作を行うことにより、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の存在を無視できる量になるまで減少させた血清（上澄み）（ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ）を得た。
この血清（上澄み）（ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ）中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡが、肺の悪性腫瘍（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）に起源を発しそこから放出されたものであるかを調べるため、２３名の肺癌患者の外科的切除肺組織と漿液（ｓｅｒａ）とを採取した。
２．ＲＮＡの抽出とＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．
次に、ＲＮＡを、従来公知の方法で、血清（上澄み）（ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ）から、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ；ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を用いて抽出した。
血清（上澄み）（ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ）２００μｌ中から抽出したＲＮＡをヌクレアーゼフリーの水（Ｈ２Ｏ）に溶解した。
次に、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ社製）の中に、１μｌのＲＮＡ抽出物と２μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とを使用して、行った。
ＲＮＡは、同じ容量の血清を使用しＨＣＣ組織を用いて抽出し、その後、２０倍の濃度になるまで乾燥させた。
ＨＣＣ組織からのＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用し、この試薬の製造販売会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の使用説明書に従って行った。
この実験に使用したプライマー及び標的塩基配列を、図２に示す。
即ち、ＥＧＦＲを検出するためのプライマーセットとして、上流側プライマー（ＥＧＦＲ−Ｆ）を、ＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧとし、下流側プライマー（ＥＧＦＲ−Ｒ）を、ＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴとした。
尚、上流側プライマーは、標的塩基配列の順方向（５’→３’）に設定し、下流側プライマーは、標的塩基配列の上流側プライマーの順方向に相当する鎖に対し、相補的配列で且つ逆方向に設定したものである。
図３〜図５に、ＥＧＦＲの全長塩基配列を示す。
この増幅ターゲットは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ加リン酸サイト（ａ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＥＧＦＲ）であり、また、このプライマーは、その塩基配列中に変異を含んでいないものとした。
また、比較のため、ｈＴＥＲＴを検出するプライマーセットとして、上流側プライマー（ｈＴＥＲＴ−Ｆ）を、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとし、下流側プライマー（ｈＴＥＲＴ−Ｒ）を、ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡとした。
また、２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎでは、上流側プライマー（２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ−Ｆ）を、ＴＧＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡとし、下流側プライマー（２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ−Ｒ）を、ＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＴＴＧとした。
リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件は、最初の逆転写反応を、５０℃で３０分間行い、その後、反応活性化段階として、９５℃に、１２分間保ち、その後、ＰＣＲ反応を５０サイクル（９５℃（０秒）、５５℃（１０秒）次いで７２℃（１５秒）行い、そして、４０℃で２０秒間、熱変性した。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の射程範囲は、この分析では、約５コピーであり、そして、我々は、患者と比較例からの血清試料中、誤って陰性とする可能性を排除することができた。
このＰＣＲは、ｈＴＥＲＴに対し、１３１ｂｐの産出物を、ＥＧＦＲに対し、１１４ｂｐの産出物を、また、β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ  ＲＮＡに対し、８８ｂｐの産出物を、各々、産生した。
このＲＴ−ＰＣＲ分析は、２回、繰り返し、この定量化については、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を用いることで、繰り返し再現性があることを確かめた。
３．免疫組織学的検討（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
切除組織をパラフィン中に包埋する（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）ための処理をした。免疫組織研究のため、血清中に腫瘍マーカーの強い蛋白質発現を有する、患者を３人ずつ（全員で１２名の患者）選び出し、ｈＴＥＲＴ，ＥＧＦＲ，ＳＣＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）及びＣＹＦＲＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）の各々を識別する抗体を用いて、肺癌横断研究を行った。
免疫組織研究において、４％パラホルムアルデヒド中に固定した肝臓組織（ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ）をパラフィンに包埋（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）した。免疫組織分析のため、次に示す抗体を連続したセクション（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）に培養した；肺の切除標本のａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ５−ｍｉｃｒｏｎ−ｔｈｉｃｋ  ｓｅｃｔｉｏｎｓが、一連のキシレン浴脱パラフィン化（ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｘｙｌｅｎｅ  ｂａｔｈｓ）され、また、これらの試料は、等級に分けられたアルコール（ｇｒａｄｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）中で再水和化（ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ）された。
染色された全てのセクション（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、電子レンジを用い、６００Ｗで、１５分間、１０ｍｍｏｌ／ｌｉｔｔｅｒのクエン酸ナトリウム緩衝液中で加熱処理された。
ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  リン酸〔塩〕）緩衝生理的食塩水の略）中で洗浄後、これらの切断面は、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって染色された。
エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ、抗原決定基）エキスポージャー（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を高める（ｅｎｈａｎｃｅ）するために、スライドを、９８℃で、１０−ｍｍｏｌ／ｌｉｔｔｅｒのクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）用い、ｐＨ６で、９０分間、前処理した。
セクション（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、その際に、非特異性の結合を減じるために２．５％の遮断血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ）中で培養された。これに引き続き、試料を、３７℃で、プライマリーモノクロールマウスｈＴＥＲＴ（Ｈ−２３１）ｓｃ−７２１２抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｈＴＥＲＴ（Ｈ−２３１）ｓｃ−７２１２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ（１００５）、ｓｃ−０３抗体（ｓｃ−０３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して、９０分間、パラフィンセクションの上で、１：５０の希釈で、培養した。これらのセクシション（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、企業（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）の推奨に従って、標準アビジン−ビオチン免疫化学（ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で処理された。
最後に、色素原として、ジアミノベンゼンを用い、そして、核対比染色として、ヘマトキシリンを用いた。陰性対象として、一時抗体を省略して染色処理を行った。結果をパーセンテージで表した。
核小体（ｎｕｃｌｅｏｌａｒ）ｈＴＥＲＴは、テロメア機能と関係している。核小体染色された細胞だけが分子計算器（ｎｕｍｅｒａｔｏｒ）に含められた。免疫反応性は、蛍光色素接合２次抗体を用いて視覚化した。
ｈＴＥＲＴ染色は、陰性（＜５０％  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｌｅｖｅｌ）と陽性（＞５０％  ｏｆ  ｔｈｅｍ）とに分類した。
４．統計解析
ＳＰＳＳ  ＩＩ（ＳＰＳＳ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ及びその他のマーカーに影響する重要な臨床病理学的知見を行った。
各々の臨床因子（パラメーター）における層別分類は、論理学的回帰分析モデルを使用して、多変量解析法によって評価した。
各々の腫瘍マーカーについて、多変量解析法によって、肺疾患の間に見られる重要な相違を調べた。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ，ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ，従来の腫瘍マーカー及び臨床的因子（パラメーター）間の相関を調べるために、ピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）を計算した。
この結果、０．０５以下の確立で、統計上の差異があることが、判った。
診断試験（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ）の正確さを査定（ａｓｓｅｓｓ）するため、ＳＰＳＳ  ＩＩ（ＳＰＳＳ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＣＥＡ，ＳＣＣ，ＣＹＦＲＡ，ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ及びｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの各々に関する、マッチ試験（ｔｈｅ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ（肺癌患者と肺癌ではない患者間（ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ））を、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）カーブ（ｃｕｒｖｅ）分析（ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
この評価分析は、コピー数（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）とＲＮＡコントロール（ＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）（ｒ２＞０．９９）を用いたＰＣＲサイクル（ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅｓ）との間に強い直線関係があることを示していた。肺組織と血清との間のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとの相関関係は、２点  試験法（Ｐａｉｒｅｄ  ｔｔｅｓｔ）及びスペアマン試験（Ｓｐｅａｒｍａｎ‘ｓ  ｔｅｓｔ）の両方を使用して解析した。
各々の定量分析において、コピー数とＲＮＡコントロール（ＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）を用いたＰＣＲサイクル（ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅｓ）との間には、強い直線関係が示された（ｒ２＞０．９９）。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現は、疾病の進行に伴って、徐々に、増加作用を示し、また、その定量値は、健常人に比べ、肺癌において、有意に高くなっていた（Ｐ＜０．０１）。
また、ピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎｓ’ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）によれば、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡレベルは、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡレベル（ｌｅｖｅｌ）、肺疾患、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＣＣ、及び、腫瘍数と有意差を持って関係がないことが判った（各々、Ｐ＝０．０１５、Ｐ＝０．０１７、Ｐ＜０．００１及びＰ＝０．０４２）。
また、ピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）によれば、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡは、（癌に）占拠された肺葉ｉ（ｏｃｃｕｐｉｅｄ  ｌｏｂｕｌａｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の数，転移、再発及び臨床病期と有意差を持って相関関係があった（各々、Ｐ＝０．０３３、Ｐ＝０．０４３、Ｐ＝０．００２及びＰ＜０．００１）。
スペアマン試験（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ  ｔｅｓｔ）は、肺癌組織におけるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡと、血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとが強い関係があることを示していた（各々、Ｐ＝０．０２１及びＰ＝０．００２）。
図６は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの各々の組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、図６（ａ）は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの組織と血清との間の相関関孫を表すグラフであり、また、図６（ｂ）は、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの組織と血清との間の相関関係を表すグラフである。
この組織と血清との間の相関は、血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとが肺癌組織から由来していることを示している。
多変量解析によって、臨床病理学的知見として、血清中のｈＴＥＲＴおよびＥＧＦＲの発現には強い関係があることが判った（図７を参照）。
喫煙、腫瘍の大きさ、腫瘍数、転移や再発の有無は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現と強い関係があることが判った（各々、Ｐ＝０．０２９、ｐ＝０．００２．Ｐ＝０．００３、Ｐ＝０．００４及びＰ＝０．０１３）。
腫瘍数、腫瘍の大きさ、再発及び臨床ステージは、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現と強い関係があることが判った（各々、Ｐ＝０．０４７、Ｐ＝０．０４３、Ｐ＝０．０３７及びＰ＝０．０３２）。
肺癌において、全ての腫瘍マーカーは、病因との関係を示さない。従来の腫瘍マーカーはどうかといえば、ＣＥＡレベルは、喫煙や肺癌に占拠された肺葉の数と強い関係が有り（各々、Ｐ＝０．０３１）、ＳＣＣレベルは、腫瘍数、腫瘍の大きさ及び転移と強い関係が有り（各々、Ｐ＝０．０１６、Ｐ＝０．０１５及びＰ＝０．０４４）、また、ＣＹＦＲＡレベルは、腫瘍数、腫瘍の大きさ、転移及び再発と強い関係がある（各々、Ｐ＝０．０１７、Ｐ＝０．０１９、Ｐ＝０．０４５及びＰ＝０．０１１）（図７を参照）。
図８は、ロックカーブ解析（ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ）の結果を示すグラフである。
図８から、肺癌に対するｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの感受性／特異性は、各々、７１．８％／７２．５％及び６０．８％／６２．５％，であることが判った（図９を参照）。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現のオプティマルカットオフ値（Ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔ−ｏｆｆｖａｌｕｅｓ）は、統計学的に、各々、１０３．７６ｃｏｐｉｅｓ／０．２ｍｌ、１０１．２１  ｃｏｐｉｅｓ／０．２ｍｌであるとして計算された。
また、癌形成時の陽性予見値（ＰＰＶ）／陰性予見値（ＮＰＶ）は、各々、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡにおいて、０．７７５／０．６６７であり、また、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡにおいて、０．６６７／０．４０７であった。
ＣＹＦＲＡ、ＳＣＣ及びＣＥＡの癌形成時の陽性予見値（ＰＰＶ）／陰性予見値（ＮＰＶ）は、各々、０．６５０／０．５００、０．２０７／０．８７５、及び、０．６５０／０．３９１であった。
癌形成時の陽性予見値（ＰＰＶ）／陰性予見値（ＮＰＶ）についての感受性／特異性の比較によって、多くの患者の定量化を用いた正確なカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）の設定（ｓｅｔ−ｕｐ）により、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの統計的な評価を更に改善できた。
次に、外科的処置の前と後（術後３週間）のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの定量値について説明する。
切除前と外科的処置後３週間後との比較によれば、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの術後の定量値は、術前の定量値に比べ低くなっていた。
免疫組織学的試験において、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ、ＳＣＣ及びＣＹＦＲＡの高い発現は、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ蛋白質の高い発現を示しており、結果として、血清中における測定値は、組織中における測定値と完全に互換できるものであった。
また、血清中と腫瘍組織との間にあるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとの相関は、血清中において見出されたｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ腫瘍細胞由来であることを強く示していた。
また、ＲＮＡは、採血後２４時間以内においては安定である。
ここで、ｈＴＥＲＴ発現は、健常人の血清中において非常に、微弱である。
また、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現の感受性／特異性が、他の従来の腫瘍マーカーよりも優れている。
一方、ＥＧＦＲは、細胞増殖、アポトーシス、血管新生、細胞死や、転移のような、発癌過程に関係する。
即ち、ＥＧＦＲ発現と増殖潜在能力とは、非小細胞癌患者には、独立の予後因子（パラメータ）である。
ＥＧＦＲは、グリア芽細胞腫（３３％）、結腸直腸癌（７０％）、頚部新生物（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ），頭部と頚部ＳＣＣ（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ＳＣＣ）（４１％）、メラノーマに発現する。
ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ｐｒｏＧＲＰ、ＴＰＡおよびＳＬＸは、腺腫、うろこ細胞癌腫、小細胞肺癌、その他の病理的な種類を含む肺癌に、広く使われている信頼できるマーカーである。
しかしながら、この試験により、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡは、ロックカーブ解析（ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（感受性／特異性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ／ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））、ＰＰＶ／ＮＰＶ及び計算したカットオフ値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔ）に基づけば、総合的に他のものより優れている、ということが判った（図８及び図９を参照）。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、癌細胞の発達においての、癌細胞それ自体の発現と、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡに関連することが提案されているので、肺癌患者のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現は、特に、ＴＰＡ，ＳＣＣ、腫瘍の数、活動的な肝臓の炎症の発現（各々、Ｐ＝０．０１７、Ｐ＜０．００１、Ｐ＝０．０４２及びｐ＝０．０１５）と関係が有り、そして、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現は、ピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎｓ’  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）を用いれば、転移、再発の発現や、有意差のある、医学的な段階相関性がある（各々、Ｐ＝０．０４３、Ｐ＝０．００２及びＰ＜０．００１）。
さらに、多変量解析によれば、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、特に、腫瘍の大きさ、喫煙、転移の存在、再発の存在と、腫瘍の数に（各々、Ｐ＝０．００２、Ｐ＝０．０２９、Ｐ＝０．００４、Ｐ＝０．０１３及びＰ＝０．００３）、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ、多かれ少なかれ、腫瘍の大きさ、再発、臨床ステージ、腫瘍の数と、関係がある（各々、Ｐ＝０．０４３、Ｐ＝０．０３７、Ｐ＝０．０３２及びＰ＝０．０４７）。
喫煙は、持続する炎症を引き起こす急激な細胞周期による発癌の危険性を増すことが示され、ＣＥＡは、喫煙（Ｐ＝０．０３１）と相関関係があり、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、ＣＥＡよりは、喫煙とより強い相関関係がある。
血清中と、腫瘍組織との間のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとの相関関係は、血清中で検出されるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡが特に腫瘍細胞に由来することを示している（図６を参照。）。
一方、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡは、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡほど分散しない（各々、Ｐ＝０．００２及びＰ＝０．０２１）。
これは、比較試料が十分でなく、且つ、炎症レベルがこのものの発現には介在しない、という理由で、血清中のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現、即ち、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡのｏｎ／ｏｆｆが明らかである肺癌組織にだけ検出できるからである。
ＥＧＦＲ陰性患者（１９／８９患者；陽性割合は、７８．７％）中に、我々は、共通する因子（パラメータ）を見出ことは出来なかった。１７名（１７／１９）の患者に、いかなる発現も見ることが出来ず、
そして、一般に、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡが不存在か存在するのかを区別するのは難しいと言われているように、２名の患者のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡは、ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｖａｌｕｅ以下で発現した。
しかしながら、本発明に係る癌診断方法は、血清中に何らかの処理をする前にこの発現を検出することによって、このことを可能とし、この点に光を当てるものである。
これと同時に、ＥＧＦＲ発現をターゲットする抗癌剤が有効か有効でないかについての適用と見積もりの双方に決断することができる。
また、この試験により、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現が高い肺癌組織において、１１．５％（３／２６患者）が、血清中において、カットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ）以下の低い発現を示していることを認識した。
また、今回の試験では、８９人の肺癌患者のうち１５人の患者は、陰性であった。血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの計算された、陽性のものは、８１．３％であり、間違って陰性としているものをカバーするための他の生体マーカーが必要である。
また、肺癌を持った患者の中で他のマーカーと比較して、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、より高い感度および特異性を示した。
ｈＴＥＲＴとＥＧＦＲは肺癌に対し必ずしも特異的ではないが、そのようなバイオマーカーの臨床への適用は、臨床相におけるより簡単な診断および評価に役立つ。
また、肺癌の診断に、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡとの２つのバイオマーカーを適応させた場合には、その検知割合は、８７．８％（７８／８９患者）（Ｐ＜０．０００１）になる、ことが判った。
また、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、感度と特異性の両方を改善するだけでなく、腫物サイズや腫瘍の数と密接な相関性があることが、判った。
生物学の特性として、肺癌は、処置後、繰り返し、再発するので、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの血清の測定は、１ポイント分析（ｏｎｅ−ｐｏｉｎｔ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）と同様、詳細に、再発や治療効果を把握することを可能にするものである。
また、外科的処置前と外科的処理後３週間後を比較すると、外科手術後において、両方のバイオマーカーの定量値は、手術前の両方のバイオマーカーの定量値に比べ低くなっており、このことは、両方のバイオマーカー正確な腫瘍マーカーでありえることを示唆していた。
今回の研究結果、次のことが明らかになった。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＲ  ｍＲＮＡは、肺癌を患者に対し、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡと比較して、より高い感受性と特異性を示した。
血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの定量化することは、肺癌診断によって重要な意味合いを持つ。
即ち、本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、体液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からＥＧＦＲを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるようになった。
また、本発明に係る癌診断方法を用いれば、医師が、患者に対し、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）のようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用剤を処方するか否かの判断するのが容易となり、また、患者に対し、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）のようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用剤を処方後においても、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）のようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用剤が腫瘍に有効であるか否かの追跡調査が容易に行える。
更に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法では、ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、前記ある患者の体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、第一の癌診断方法と第二の癌診断方法の双方の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断するようにしているので、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断してしまったり、また、肺癌患者でないにもかかわらず、陽性と判断する場合を著しく低減する。
尚、本明細書の、発明を実施するための最良の形態では、本発明に係る癌診断方法として、血液中からＲＮＡを抽出した例を示したが、本発明に係る癌診断方法では、血液からＲＮＡを抽出する場合に限られず、血液以外の体液からＲＮＡを抽出するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になり、また、患者に処方する前に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法を行えば、その結果に基づいて、抗癌剤が有効か否かの判断や、患者に抗癌剤を処方後に、その患者を治療する際に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法を行うことで、その患者に処方されている抗癌剤が有効か否かを判断できるので、癌治療の効果を高めることが可能になるので、産業上の利用可能性が高い。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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