(57)【要約】  本発明は、感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生する方法であって、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCVの5’非翻訳領域および構造タンパク質および任意に非構造タンパク質をコードするDNA配列とHCV JFH1株由来の非構造タンパク質および3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNA断片を含む発現ベクターを、HCVの増殖を許容する細胞に導入する工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のi)またはii)の発現ベクターを、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2およびそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される細胞に導入する工程を含む、感染性C型肝炎ウイルス（HCV）粒子を産生する方法：
i) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、NS2タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター、または
ii) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。
【請求項２】
前記HCV株が遺伝子型1または遺伝子型2のHCV株である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子型1のHCV株がH77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株よりなる群から選択されるものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子型2のHCV株がJ6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株よりなる群から選択されるものである請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性ヒトＣ型肝炎ウイルス粒子の高産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣ型肝炎ウイルス（HCV）は持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす一本鎖のRNAウイルスである。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がHCV持続感染である。実際、持続感染者の50％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約20％の患者が10年〜20年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。【０００３】
このように重大な疾患の治療方法を開発するための研究を妨げている主な原因は、HCV増殖に効率的な細胞培養系がないこと、HCV感染に適切な小動物モデルがないこと、低いレベルのウイルス複製、およびウイルスゲノムの遺伝的な不均一性による。【０００４】
従って、細胞培養系でのHCVゲノムの複製系の開発は、ウイルスの複製、ウイルスと細胞の相互作用を理解し、HCVによって引き起こされる疾患の治療薬の評価系を提供することになると期待されている。【０００５】
最近になって、HCV由来の自律複製能を有するRNAとして、HCVサブゲノムRNAレプリコンが作製されたことにより（特許文献1、特許文献２および非特許文献１〜３）、培養細胞を用いてHCVの複製機構を解析することが可能となった。これらのHCVサブゲノムRNAレプリコンは、HCVゲノムRNAの5'非翻訳領域中のHCV IRESの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子およびその下流に連結したEMCV-IRESによって置換したものである。このRNAレプリコンを、ヒト肝癌細胞Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Huh7細胞内でRNAレプリコンが自律複製することが証明された。しかし、この実験系は、HCVウイルスの増殖複製過程における、ウイルスRNA複製のみ評価可能な実験系であり、ウイルス粒子を産生しないので、HCV粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価することはできない。【０００６】
この課題に対して、培養細胞系でウイルス粒子を産生する方法が報告されている。RNAレプリコンを使用せず、HCV全ゲノムRNAのcDNAを利用した系である。【０００７】
Limらは、テトラサイクリン応答プロモーターの下流に遺伝子型1bのHCV-S1株のゲノムRNAのcDNAを連結した発現ベクターをHuh7細胞に導入して得た細胞株を、テトラサイクリンで処理し、HCV粒子の産生を試みた。彼らは、その培養上清には1〜6 x 105コピー/mlのHCV粒子の存在を確認したが、そのHCV粒子の感染性は低いと記載している（非特許文献４）。【０００８】
しかし、HCV cDNAをCMVなどのRNAポリメラーゼII型のプロモーター制御下で発現させると、転写されたRNAの5’末端にはCAP構造が、3’末端にはポリA鎖が付加されるため、リボソームにてタンパク質合成の鋳型として利用されてしまい、転写された RNAの複製が起こらないという問題もある。【０００９】
この問題を解決するために、Hellerらは、HCV ゲノムの5’末端と3’末端にリボザイム配列を連結し、細胞内でRNAポリメラーゼIIで転写された後、リボザイムで切断させることにより、キャップとポリAが付加していないHCV RNAを細胞内で合成できるようなコンストラクトを作製した（非特許文献５）。なお、リボザイムで5’末端にキャップを付加させない方法はヘアピン型RNAを細胞内で合成する方法に利用されている（非特許文献６）。実際、２つのリボザイムで挟まれたHCVコンストラクトをもつ発現ベクターをHuh7で発現させることにより、1 x 107コピー/mlのHCV粒子が産生されることが示されている。ただし、この粒子に感染性があるかについては検討されていない。【００１０】
さらに最近、HCV全ゲノムRNAから細胞培養系で感染能を有するHCV粒子を生産できることが示された（特許文献３、非特許文献７、非特許文献８）。この系でのHCV粒子の産生量は約1 x 107コピー/mlである。また、HCVの遺伝子型1bのcon1株の非構造タンパク質領域を遺伝子型2aのウイルス株の遺伝子に置き換えたキメラウイルスRNAについて、細胞培養系で感染能を有するHCV粒子を生産できることが示された（非特許文献９）。この系でのHCV粒子産生量の具体的数値については開示されていない。【００１１】
以上の結果から、HCV粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価する実験系の作製が可能となった。【００１２】
しかし、Limらの系では生産性が低く、Hellerらの系では感染性が不明であり、HCV全ゲノムRNAを用いた系では、RNAの複製時に変異が起こる可能性が考えられる。HCVゲノムに変異が起こると、複製が起こらなくなる場合があることが知られている。実際HCV非構造タンパク質であるNS5Bタンパク質中のGDDアミノ酸配列がGNDに変異すると複製が起こらないことが示されている。一方、HCV粒子の産生量については、両者とも約1 x 107コピー/mlであり、さらに産生量をあげることが期待される。【００１３】
HCVウイルス粒子の産生量を上げる方法として、レプリコン生産量の高い細胞の作製が検討された。HCVウイルスの複製にはヒト肝臓由来のHuh7細胞が使用されているが、この株から派生する細胞がいくつかクローン化された。その中でHuh7.5と名付けられた細胞は親株の約３倍のHCV RNA レプリコンを複製することが示された（非特許文献１０）。【００１４】
以上の状況にあって、HCV全ゲノムRNAのcDNAを用いて感染性HCV粒子の高産生系を開発することが重要であることが想起される。【００１５】
RNAウイルスのゲノムRNAに対応するcDNAを用いてウイルス粒子を産生させる系としては、インフルエンザウイルス（マイナス鎖のRNAウイルス）の動物細胞系での生産に用いられているRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとを用いた系（非特許文献１１）も知られている。しかしながらこのようなRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターを用いたインフルエンザウイルス粒子の産生系は、従来のインフルエンザウイルス粒子産生系よりも産生量において優れているとはいえない。また、非特許文献１１にはプラス鎖のRNAウイルスであるHCVの産生系については記載も示唆もない。
【特許文献１】特開2001-17187号公報
【特許文献２】WO2004/104198A1
【特許文献３】WO05080575A1
【非特許文献１】Blight et al., Science, 290(2000)  p1972-74
【非特許文献２】Friebe et al., J. Virol., 75(2001) p12047-57
【非特許文献３】Kato, T. et al., Gastroenterology , 125(2003) p1808-17
【非特許文献４】Lim SP. et al., Virology, 303(2002)p79-p99.
【非特許文献５】Heller, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) p2579-83
【非特許文献６】Shinagawa, T. & Ishii, S.,Genes Dev., 17(2003) p1340-45
【非特許文献７】Wakita et al. Nature Med. 11 (2005) p791-96
【非特許文献８】Lindenbach BD. et al., Science. 309 (2005) p623-26
【非特許文献９】Pietschmann T. et al., 11th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, (2004)
【非特許文献１０】Blight, KJ. et al., J. Virol., 76 (2002) p13001-14
【非特許文献１１】Neumann, G. et al., Virology, 202 (1994) p477-479
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、組換えDNAから感染性Ｃ型肝炎ウイルス粒子を培養細胞系で高生産するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、HCVゲノムcDNAから複製能のあるHCVゲノムRNAを細胞内で合成する方法を構築するために、遺伝子型の異なるHCVゲノム、これを発現させるためのプロモーター/ターミネーターを検討しHCVゲノムRNAが複製される新規な組合せを見出した。ついで、該HCVゲノムRNAを合成する細胞を培養し、これまで報告されているよりも感染性HCV粒子が高産生されていることを確認し、本発明を完成させるに至った。【００１８】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）に関する。【００１９】
（ａ）  感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生する方法であって、リボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するプロモーターの下流にJFH1株由来のHCVゲノムcDNAを含みさらにその下流にリボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するターミネーターを含むDNAを含む発現ベクターを、HCVの増殖を許容する細胞に導入する工程を含む、感染性HCV粒子を産生する方法、
（ｂ）  HCVの増殖を許容する細胞が、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2およびそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される（ａ）の感染性HCV粒子を産生する方法、
（ｃ）  感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生するためのベクターであって、リボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するプロモーターの下流にJFH1株由来のHCVゲノムcDNAを含みさらにその下流にリボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。【００２０】
さらに本発明は、感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生する方法であって、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCVの5’非翻訳領域および構造タンパク質および任意に非構造タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来の非構造タンパク質および3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクターを、HCVの増殖を許容する細胞に導入する工程を含む方法にも関する。【００２１】
より具体的には、本発明は、以下の（１）〜（４）の方法に関する。【００２２】
（１）  以下のi)またはii)の発現ベクターを、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2およびそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される細胞に導入する工程を含む、感染性C型肝炎ウイルス（HCV）粒子を産生する方法：
i) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、NS2タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター、または
ii) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。【００２３】
（２）  前記HCV株が遺伝子型1または遺伝子型2のHCV株である、上記（１）の方法。【００２４】
（３）  遺伝子型1のHCV株がH77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株よりなる群から選択されるものである上記（２）の方法。【００２５】
（４）  遺伝子型2のHCV株がJ6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株よりなる群から選択されるものである上記（２）の方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、組換えDNAから感染性Ｃ型肝炎ウイルス粒子を培養細胞系で生産するための方法において、従来の方法に対して、感染性を有するHCV粒子を約60倍の高密度で高産生できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１ＡはRNAポリメラーゼI プロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターの構築図を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはpHH H77c、pHH JFH1，pHH JFH1/GNDのマップを示す。
【図１Ｃ】図１ＣはpHH H77c(C-p7)/JFH1、pHH J6(C-p7)/JFH1、pHH J1(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-NS2)/JFH1のマップを示す。
【図２】図２はRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系のHCV発現ベクターを導入した細胞において、HCV RNAが転写されていることを確認した実験結果を示す写真である。レーン１，３はpHH JFH1をそれぞれHuh7およびHepG2に導入したとき、レーン２，４はpHH JFH1/GNDをそれぞれHuh7およびHepG2に導入したときの結果である。
【図３】図３はポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系の発現ベクターで転写されたHCV RNAの5’末端の配列を示している。PHH JFH1およびpHH JFH1/GNDを導入した細胞で転写されるHCV RNAの5’末端はJFH1ゲノムRNAの配列と同一であった。
【図４】図４はRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系のHCV発現ベクターを導入した細胞において、HCVタンパク質が翻訳されているかについて確認した実験結果を示す写真である。pHH JFH1を導入した細胞では、コアタンパク質およびNS5Aタンパク質が翻訳されていることが示されている。pHH H77cおよびpHH JFH1/GNDを導入した細胞ではHCVタンパク質は翻訳されていない。
【図５】図５はpHH JFH1およびpHH JFH1/GNDをGFP発現ベクターと共に、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2および293T細胞に導入後、それらの細胞でのHCVタンパク質の発現とベクターの導入効率をGFPの発現によって示す写真である。pHH JFH1は293T以外の細胞でコアタンパク質を発現した。一方pHH JFH1/GNDはいずれの細胞でもコアタンパク質を発現しなかった。
【図６】図６ＡはpHH JFH1を導入したHepG2細胞中のコアタンパク質を示す写真である。図６Ｂは、pHH JFH1を導入したHepG2細胞培養液をショ糖密度遠心にて分画した試料のコアタンパク質量を示す。pHH JFH1培養上清（▲）のコアタンパク質の比重が1.15g/mlの分画に見出されコアタンパク質がウイルス粒子として分泌されることが示されている。一方コア、E１、E2、p7を発現させた細胞の培養上清（X）はブロードとなる。
【図７】図７はpHH JFH1を導入したHepG2細胞培養液をNP40処理した場合、非処理と比較して、コアタンパク質のピークが変動することを示す。NP40非処理（◆）と比較して、NP40で処理すると（■）コアタンパク質のピークは、比重1.20g/mlへシフトした。比重の軽い表面膜がNP40によりウイルス粒子から剥離したことを示している。
【図８】図８は限外濾過膜で濃縮したpHH JFH1を導入したHepG2細胞培養液（A）またはHuh7細胞培養液（B）をHuh7.5.1に接種し、４日後に抗NS5A抗体で染色した結果を示す写真である。抗NS5A抗体陽性細胞（感染細胞）が検出されることを示す。
【図９】図９はpHH JFH1にSV40プロモーター制御下でZeocin耐性遺伝子を発現するカセットが挿入されたベクターのマップを示す。
【図１０Ａ】図１０は挿入断片J6(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１０Ａはその最も5'末端側の配列を示す。
【図１０Ｂ】図１０は挿入断片J6(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１０Ｂは図１０Ａの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１０Ｃ】図１０は挿入断片J6(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１０Ｃは図１０Ｂの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１０Ｄ】図１０は挿入断片J6(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１０Ｄは図１０Ｃの配列の3'側に続く、最も3'末端側の配列を示す。
【図１１Ａ】図１１は挿入断片H77c(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１１Ａはその最も5'末端側の配列を示す。
【図１１Ｂ】図１１は挿入断片H77c(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１１Ｂは図１１Ａの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１１Ｃ】図１１は挿入断片H77c(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１１Ｃは図１１Ｂの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１１Ｄ】図１１は挿入断片H77c(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１１Ｄは図１１Ｃの配列の3'側に続く、最も3'末端側の配列を示す。
【図１２Ａ】図１２は挿入断片J1(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１２Ａはその最も5'末端側の配列を示す。
【図１２Ｂ】図１２は挿入断片J1(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１２Ｂは図１２Ａの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１２Ｃ】図１２は挿入断片J1(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１２Ｃは図１２Ｂの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１２Ｄ】図１２は挿入断片J1(C-p7)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１２Ｄは図１２Ｃの配列の3'側に続く、最も3'末端側の配列を示す。
【図１３Ａ】図１３は挿入断片J1(C-NS2)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１３Ａはその最も5'末端側の配列を示す。
【図１３Ｂ】図１３は挿入断片J1(C-NS2)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１３Ｂは図１３Ａの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３は挿入断片J1(C-NS2)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１３Ｃは図１３Ｂの配列の3'側に続く配列を示す。
【図１３Ｄ】図１３は挿入断片J1(C-NS2)JFH1のDNA配列を示す図であり、図１３Ｄは図１３Ｃの配列の3'側に続く、最も3'末端側の配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
１．RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターの構築
RNAを転写するRNAポリメラーゼには3種類知られている。RNAポリメラーゼIはリボソームRNA遺伝子からrRNAを、RNAポリメラーゼIIはタンパク質をコードする遺伝子からmRNAを、RNAポリメラーゼIIIはtRNA遺伝子からtRNAを転写する。【００２９】
RNAポリメラーゼIおよびIIIによって転写されるゲノムRNAはそれぞれのターミネーターを持ち、そのターミネーター配列によって転写が終結する。一方RNAポリメラーゼIIによる転写ではターミネーター配列は必要とされない。その転写終結の様式は明らかではないが、mRNAの３’末端の形成に重要なのは転写終結そのものではなく、一次転写産物の切断反応によるものと考えられている。【００３０】
RNAポリメラーゼIおよびIIIプロモーターの下流に連結された遺伝子の転写産物には、RNAポリメラーゼIIプロモーターの下流にある遺伝子の転写産物とは異なり、その5’および3’末端にそれぞれ、キャップ、ポリAが付加されない。天然のHCVゲノムRNAは5’および3’末端には、キャップおよびポリAが付加されていない。このことから、HCVゲノムDNAを、RNAポリメラーゼIまたはIIIプロモーターにて発現させることにより、HCVウイルスゲノムRNAと同じRNAを転写することができると期待できる。【００３１】
利用できるプロモーターは転写されるRNAの5’および3’末端にそれぞれ、キャップ、ポリAが付加されないものであれば良いが、好ましくはRNAポリメラーゼIプロモーターが良く、さらに好ましくはrRNA遺伝子由来のプロモーターがよい。また、プロモーターの由来は、動物由来のものであればよいが、好ましくはマウス、ヒト由来のものがよい。特に好ましいRNAポリメラーゼIプロモーターは、ヒトリボソームRNA（rRNA）遺伝子のプロモーターである。【００３２】
さらに、ターミネーターの配列もRNAポリメラーゼIターミネーターが良く、好ましくはrRNA遺伝子由来のターミネーターがよい。また、ターミネーターの由来は、動物由来のものであればよいが、好ましくはマウス、ヒト由来のものがよい。特に好ましいRNAポリメラーゼIターミネーターは、マウスリボソームRNA（rRNA）遺伝子のターミネーターである。【００３３】
RNAポリメラーゼI プロモーター/ターミネーター系はインフルエンザウイルス粒子の再構成に使用されている（Neumann, G. et al., Virology, 202(1994) p477-479、Neumann, G. & Kawaoka, Y., Virology  287 (2001) p.243-250、特表2003-520573）。本発明の方法には、RNAポリメラーゼI プロモーター/ターミネーター系ベクターであるpHH21（Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345-9350）を使用できる。pHH21は、プロモーターとしてヒトRNAポリメラーゼIプロモーターを含み、ターミネーターとしてマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含む発現ベクターである。【００３４】
HCVゲノムcDNAの5’端および3’端に、PCRを用いて制限酵素BsmBI認識配列をそれぞれ付加した後、BsmBIで消化し、pHH21のBsmBI部位にHCVゲノムを挿入すると、プロモーター／ターミネーターとHCVゲノムcDNAの間に余分な塩基配列を含むことなくそれらを連結できる。【００３５】
また、上記プロモーター、HCVゲノムcDNAおよびターミネーターを適切に連結させることにより、本発明の方法に用いる発現ベクターを新たに構築することができる。【００３６】
HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、HCVは遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型3a、遺伝子型3bの６タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) p1321-1324、およびChoo, Q.L et al., Science, 244 (1989) p359-362, Okamoto, H et al., J. Gen. Virol., 73(1992) p673-679、Mori, S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334-342）。【００３７】
本発明では、HCV株として、具体的には、遺伝子型1（遺伝子型1aおよび1bが含まれる）のH77c（H77株のコンセンサス配列：GenBankアクセッション番号AF011751）、1株（GenBankアクセッション番号M62321）、H株（GenBankアクセッション番号M67463）、HC-J1株（GenBankアクセッション番号D10749）、J1株（GenBankアクセッション番号D89815）、con1株（GenBankアクセッション番号AJ238799）、TH株（Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., (1994) 269, p.14205-14210）、、J株（GenBankアクセッション番号D90208）、JT株（GenBankアクセッション番号D01171）、BK株（GenBank アクセッション番号M58335）などが、遺伝子型2（遺伝子型2aおよび2bが含まれる）のJ6CF株（GenBankアクセッション番号AF177036）、JFH1株（GenBankアクセッション番号AB047639、JFH-1株と称することもある）、JCH1株（GenBankアクセッション番号AB047640）、HC-J8株（GenBank アクセッション番号D01221）などを用いることができる。また、その他の株についても既にGenBankアクセッション番号のリストが報告されており（Tokita, T. et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, p.1847-1857、Cristina J. & Colina R. Virolgy Journal, (2006) 3, p.1-8）、入手可能である。【００３８】
RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系ベクターに挿入するHCVゲノムRNA由来のcDNAは上記遺伝型のどのタイプでも利用でき、さらにはそれらのキメラからなるものも利用できる。好ましくは、Huh7等のHCV許容性の細胞に導入した場合にHCVゲノムRNAの自律複製が起こる遺伝子型由来のものであり（Wakita, T., et al. Nat. Med., 11, (2005) p791-796、Lindenbach BD., et al., Science, 309(2005) p623-626）、さらに好ましくは遺伝子型2aのJFH1株（特開2002-171978号公報）のゲノムRNAに対応するゲノムcDNA配列（GenBankアクセッション番号AB047639、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) p1808-1817；配列番号27）が挙げられる。【００３９】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTRとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTRとも表記する）からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。【００４０】
このようなHCVの構造タンパク質（Core、E1、E2およびp7）と非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質および非構造タンパク質（すなわち、HCVのウイルスタンパク質）のうち、Coreはコアタンパク質であり、E1およびE2はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。【００４１】
本発明のHCV粒子を産生する方法に用いる発現ベクターは、RNAポリメラーゼIが認識するプロモーター（RNAポリメラーゼIプロモーター）の下流にHCVゲノムcDNAの5'非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2、NS3、NS4（NS4AおよびNS4Bを含む）、NS5A、およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域がこの順で並んだ配列からなるDNAを有し、さらにその下流にRNAポリメラーゼIが認識するターミネーター（RNAポリメラーゼIターミネーター）を含んでいればよい。これらの配列は一続きのポリプロテインとして翻訳された後に、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成されHCV粒子が産生される。【００４２】
本発明のHCV粒子を産生する方法では、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、任意のHCV株由来のHCVゲノムRNAから合成したcDNAを連結し、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを連結したDNA断片を含む発現ベクターを用いる。RNAポリメラーゼIプロモーターの下流およびRNAポリメラーゼIターミネーターの上流に連結するそのようなHCV cDNAは、1種のHCV株（好ましくはJFH1株）由来のゲノムRNAに対応するゲノムcDNAであってもよいし、2種以上のHCV株（好ましくは、少なくともその1種がJFH1株である）由来のゲノムRNAから合成したcDNAから誘導されるキメラ核酸であってもよい。RNAポリメラーゼIプロモーターとRNAポリメラーゼIターミネーターの間に連結されるそのようなHCV cDNAは、HCVの5’非翻訳領域、構造タンパク質（Core、E1、E2およびp7）、非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B）および3’非翻訳領域をコードするDNA配列をこの順番に1つずつ含むHCV全ゲノム様cDNA配列であることが好ましい。【００４３】
特に、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株（好ましくは、遺伝子型1または2のHCV株）由来の5’非翻訳領域および構造タンパク質をそれぞれコードするDNA配列、さらに必要に応じてHCV株由来の非構造タンパク質をコードするDNA配列、続いてHCV JFH1株由来の非構造タンパク質および3’非翻訳領域をそれぞれコードするDNA配列をこの順番で含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNA断片を含むキメラHCV発現ベクターは、感染性HCV産生能が高いため、非常に好ましい。【００４４】
本発明に係るより好ましい発現ベクターは、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に任意のHCV株由来のHCVゲノムcDNA（すなわち、HCVゲノムRNA全長をコードするDNA）の5'非翻訳領域コード配列、Coreタンパク質コード配列、E1、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列と、JFH1株由来のHCVゲノムcDNAのNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質コード配列ならびに3’非翻訳領域コード配列とからなるHCVゲノムcDNA配列を含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含有するものである。また他の好ましい発現ベクターは、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に任意のHCV株由来のHCVゲノムcDNAの5'非翻訳領域、Coreタンパク質コード配列、E1、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列と、JFH1株由来のHCVゲノムcDNAのNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質コード配列ならびに3’非翻訳領域コード配列とからなるHCVゲノムcDNA配列を含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含有するものである。【００４５】
上記発現ベクターにおいて、任意のHCV株としては、好ましくは遺伝子型1または2のHCV株である。また上記発現ベクターにおける5’非翻訳領域コード配列は、JFH1株由来の配列または遺伝子型1及び遺伝子型2のHCV株から選ばれる２種以上のHCV株由来のキメラ配列である事が好ましく、キメラ配列である場合、JFH1株由来の配列が含まれることがさらに好ましい。遺伝子型1のHCV株としては、例えばH77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株などを用いることができる。遺伝子型2のHCV株としては、例えばJ6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株などを用いることもできる。より好ましいHCV株として、JFH1株、J6CF株、J1株、H77c株が挙げられる。【００４６】
一例として、JFH1株由来の全長ゲノムcDNAにおいて、本発明の発現ベクターに組み込まれうる5’非翻訳領域からNS2タンパク質までをコードする領域は、配列番号27（GenBankアクセッション番号AB047639のDNA配列）で示される塩基配列において塩基番号1〜3430であり、またNS3タンパク質から3’非翻訳領域までをコードする領域は塩基番号3431〜9678である。同様に、JFH1株由来の全長ゲノムcDNAにおいて、5’非翻訳領域からp7タンパク質までをコードする領域は、配列番号27で示される塩基配列において塩基番号1〜2779であり、またNS2タンパク質から3’非翻訳領域までをコードする領域は塩基番号2780〜9678である。他のHCV株由来のゲノムcDNA上の各領域の位置についても、このJFH1株のゲノムcDNA配列を基準として定めることができる。【００４７】
本発明に係る特に好適な発現ベクターの例は、後述の実施例に示すDNA断片J6(C-p7)JFH1（配列番号２９）、H77c(C-p7)JFH1（配列番号３０）、J1(C-p7)JFH1（配列番号３１）、J1(C-NS2)JFH1（配列番号３２）のいずれかを含有する発現ベクターである。これらのDNA断片は、ベクター中の発現プロモーターの制御下に挿入されることが好ましい。【００４８】
HCVの非構造タンパク質NS5B中のGDDアミノ酸配列がGNDに変異すると自律複製が起こらないことが示されている（Kato, T. et al., Gastroenterology, 125(2003) p1808-1817）ので、実験のコントロールとして、NS5Bタンパク質のアミノ酸配列がGNDに変異したものを使用することができる。【００４９】
２．細胞内でのHCV RNAの合成確認
上記のようにして作製される本発明の発現ベクターを細胞内に導入してHCV RNAを転写することができる。細胞へのDNAの導入はエレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシュウム法など一般的な方法を用いて行うことができる。【００５０】
発現ベクターDNAから転写されるHCV RNAの解析は、通常の分子生物学的方法（Molecular Cloning 3rd Edition Sambrook & Russell Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）で解析することができる。具体的には、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法、RT-PCR法およびRACE法などを用いて、転写されたRNAの量または配列を解析することができる。RNAの定量を行う場合はノーザンブロット法やRT-PCR法が、RNAの配列を解析する場合はRACE法が用いられる。【００５１】
細胞内で転写されたHCV RNAの5’末端の配列を解析する場合、特定の配列の合成RNAリンカーをHCV RNAにRNAリガーゼを用いて連結し、これを鋳型として、HCV RNAに相補的な合成DNAプライマーを用いて逆転写酵素にてcDNAを合成する。次にリンカー内の配列と先に用いたプライマーより5’側のプライマーにてPCRを行いHCV RNAに相補的な断片を増幅し、プラスミドベクターにクローン化後、塩基配列を決定することで、細胞内で転写されたHCV RNAの配列を解析することができる。最初のPCRでDNA断片が増幅されなかった場合はnested-PCR法で行えば解析を行うことが可能となる。【００５２】
３．細胞内でのHCVタンパク質の発現確認
HCVが感染し、HCVゲノムRNAが複製されている細胞では、上記のHCVタンパク質が発現されている。従って、HCVゲノムRNA複製細胞から抽出したタンパク質中からHCVタンパク質が検出されれば、その細胞は、HCVゲノムRNAを複製しているものと判断することができる。HCVタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に従って行うことができ、例えば、導入されたHCVゲノムRNAから発現されるべきHCVタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。より具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗HCVタンパク質抗体（例えば、抗NS3特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗HCVタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。【００５３】
HCVタンパク質を発現させるための宿主細胞は、継代培養可能な細胞であれば特に限定されないが、真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。また、細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、Huh7細胞（ATCC CCL-185）、HepG2細胞（ATCC HB 8065）、IMY-N9細胞（Date, T. et al., J. Biol. Chem., (2004) 279, p.22371-22376）、HeLa細胞（ECACC 93021013）、RCYM1RC細胞（Murakami, K., et al., Virology, 351, 381-392, 2006）、5-15RC細胞（Pietschmann T., et al., J Virol. (2001) 75, p.1252-1264）、およびそれらの細胞から派生した株化細胞等がより好ましい。特に好ましい細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した株化細胞が挙げられる。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。Huh7細胞から派生した細胞株として、Huh7.5細胞（Blight, KJ. Et al., J. Virol., (2002) 76, p.13001-13014）およびHuh7.5.1細胞（Zhong, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, (2005) 102, p.9294-9299）が挙げられる。前者は、Huh7細胞にレプリコンを遺伝子導入した後に樹立されたレプリコン複製細胞をインターフェロン処理でレプリコンを排除することによりHCV複製能が高くなった細胞であり、後者は、Huh7.5細胞で作製したレプリコン複製細胞からインターフェロンγ処理でレプリコンを排除したレプリコン複製効率の良い細胞である。【００５４】
４．HCV粒子の産生確認
本発明の発現ベクターをHCV許容性細胞（HCVの増殖を許容する細胞）に導入し、その細胞を培養することにより、本発明の発現ベクターから転写されたHCVゲノムRNAを有するC型肝炎ウイルス（HCV）粒子を産生することができる。HCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した株化細胞などを好適に用いることができる。このようにして産生されたC型肝炎ウイルス（HCV）粒子は、他の細胞への感染性を保持している。本発明は、このような感染性C型肝炎ウイルス粒子の産生方法に関する。【００５５】
細胞のウイルス粒子産生能は、公知の任意のウイルス検出法を用いて確認することができる。例えば、ウイルス粒子を産生していると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度、HCVコアタンパク質濃度、およびHCVゲノムRNAの量を測定した結果、HCVコアタンパク質とHCVゲノムRNAのピークが一致し、しかもそのピークが検出される画分の密度が、培養上清を0.25％ NP40（ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether]）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い場合には、該細胞はウイルス粒子産生能を有すると判定することができる。また、フリーのHCV粒子の比重は1.14〜1.16g/mlと報告されている（Kaito, M. et al., J. Gen. Virol. 75 (1994) p1755-1760）のでこの値と比較することもできる。【００５６】
培養液中に放出されたHCVウイルス粒子は、例えば、Coreタンパク質、E1タンパク質、又はE2タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT-PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。【００５７】
５．本発明のHCV粒子の他の細胞への感染
本発明の方法で産生されるHCVウイルス粒子は、細胞（好ましくはHCV許容性（感受性）細胞）への感染能を有する。本発明は、RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養液）中のウイルス粒子を他の細胞（好ましくはHCV感受性細胞）に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、HCV許容性細胞とは、HCVゲノムRNAの複製能および/またはHCVに感染する能力を有する細胞である。HCV許容性細胞は、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものではない。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。特に好ましいHCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した（作製された）株化細胞が挙げられる。Huh7細胞から派生した細胞で好ましい細胞として、Huh7.5細胞およびHuh7.5.1細胞が挙げられる。【００５８】
本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞において産生されたHCV粒子を細胞（例えば、HCV許容性細胞）に感染させると、その感染細胞中ではHCVゲノムRNAが複製され、さらにウイルス粒子が形成される。【００５９】
本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞において産生されたHCVウイルス粒子は、チンパンジーなどのHCVウイルスに感染しうる動物に感染して、HCV由来の肝炎を引き起こすことができる。【００６０】
本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞において産生されたHCV粒子が感染性を有しているか否かは、本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞を培養して得られた上清をHCV許容性細胞（たとえばHuh7）に処理して、たとえば48時間後に細胞抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、コアタンパク質を検出することで判断できる。【００６１】
６．感染性HCV 粒子産生細胞株の取得
本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターが安定的に導入された細胞は、感染性HCV粒子を持続的に生産することができる。本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを安定的に発現する細胞株を得るためには、本ベクター内に薬剤抵抗性遺伝子を組み込んで置くことが望ましい。薬剤抵抗性遺伝子として、G418抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、Zeocin抵抗性遺伝子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤抵抗性を指標として選別されたクローンのHCV粒子産生能は、それらのクローンの培養上清中のCoreタンパク質量やクローンで複製されるHCV RNA量をノーザンブロットや定量的RT-PCRにて検出することで推定できる。【００６２】
本明細書は本願の優先権主張の基礎とする日本国特許出願2005-287646号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。【００６３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願の全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。【００６５】
[実施例１]
RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターの構築
HCVゲノムRNAのcDNAとして、遺伝子型2aのJFH1株由来ゲノムRNAのcDNA（GenBankアクセッション番号AB047639、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125(2003) p1808-1817）、JFH1株のNS5B中のGDDアミノ酸配列がGNDとなるようにDNA配列を変換したJFH1株由来ゲノムRNAのcDNA（Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p.791-796）、J6CF株由来ゲノムRNAのcDNA（GenBankアクセッション番号AF177036、Yanagi, M. et al. Virology, 262 (1999) p.250-263）、遺伝子型1aのH77c株由来のゲノムRNAのcDNA（GenBankアクセッション番号AF011751、Yanagi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997) p.8738-8743）、および遺伝子型1bのJ1株由来のゲノムRNAのcDNA（GenBankアクセッション番号D89815、Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621-627）を使用した。【００６６】
上記のHCVゲノムcDNA（JFH1、JFH1/GNDおよびH77c）の5’端および3’端に、PCRを用いて制限酵素BsmBI認識配列をそれぞれ付加した。BsmBIの切断部位がその酵素の認識部位から離れている性質を利用し、ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターの配列を有するpHH21ベクター（Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345-9350）のBsmBI部位に、HCVゲノムをプロモーター／ターミネーターとHCVゲノムの間に余分な塩基配列を含むことなく、挿入させた（図１Ａ）。また、それぞれのクローンのマップは図１Ｂに示した。得られたHCVゲノムcDNAを含むベクターをそれぞれpHH JFH1、pHH JFH1/GNDおよび、pHH H77cと呼ぶ。【００６７】
さらに、J6CFとJFH1、H77cとJFH1、J1とJFH1のゲノムcDNAにそれぞれ由来するキメラHCV発現ベクターの作製は以下に示す方法で行った。【００６８】
pHH J6(C-p7)/JFH1の作製
JFH1株由来ゲノムRNA全領域に対応するcDNAをpUC19プラスミド中にクローニングすることにより構築されたプラスミドDNAであるpJFH1（Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p791-796、国際公開WO2004/104198）をAgeIで消化後、さらにBclIで部分消化し、AgeI部位から最初のBclI部位までの断片（2672 bp）が除去されたプラスミドDNA断片を精製した。一方、J6CF株由来ゲノムcDNAをAgeIとBclIで部分消化して得られる2672 bpの断片を上記の断片に連結し、pUC J6/JFH1を得た。【００６９】
次にpHH JFH1をNocIで消化して得られる約4.3kbの断片と、pUC J6/JFH1をNocIで消化して得られる約8.2kbの断片をリガーゼにより連結して、発現ベクターpHH J6(C-p7)/JFH1を得た。このpHH J6(C-p7)/JFH1の挿入断片（J6(C-p7)JFH1；配列番号２９、図１０Ａ〜Ｄ）は、JFH1株およびJ6CF株由来のキメラからなる5'非翻訳領域と、J6CF株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、およびp7タンパク質をそれぞれコードするDNA配列と、JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質および3’非翻訳領域をそれぞれコードするDNA配列とを含む。【００７０】
pHH H77c(C-p7)/JFH1の作製
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 5-JFH-S （配列番号10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT）および5-JFH-A（配列番号11：TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.1とした。次に、JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-JFH-S（配列番号12：GGCATACGCATATGACGCACCTGTGCACGG）および3-JFH-A（配列番号13：GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.2とした。さらに、上記H77cゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 5-H77-S（配列番号14：ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC）および5-H77-A（配列番号15：GAAGCCGCACGTAAGGGTATCGATG:）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.3とした。次に、H77cゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-H77-S（配列番号16：CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT）および3-H77-A（配列番号17：GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を１μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.4とした。【００７１】
次に、それぞれのPCR産物を精製し、50μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.1とPCR産物no.3のDNAを100倍希釈して各1μlを混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、プライマー5-JFH-S（配列番号10）および5-H77-A（配列番号15）を添加して、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR5HJと名付けた。さらに、PCR産物no.2とPCR産物no.4を100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、プライマー3-H77-S（配列番号16）および3-JFH-A（配列番号13）を添加し、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR3HJと名付けた。【００７２】
次いで、pCR5HJを制限酵素AgeIおよびKpnIで、H77cゲノムcDNAを制限酵素KpnIおよびAscIで、pCR3HJを制限酵素AscIおよびNotIで消化し、各HCVcDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら３つのDNA断片を、pHH JFH1をAgeIおよびNotIで消化して得られたベクターに連結した。このベクターをpHH H77c(C-p7)/JFHと名付けた。この発現ベクターpHH H77c(C-p7)/JFHの挿入断片（H77c(C-p7)JFH；配列番号３０、図１１Ａ〜Ｄ）は、JFH1株およびH77c株由来のキメラからなる5'非翻訳領域、H77c株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、およびp7タンパク質をそれぞれコードするDNA配列と、JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質および3’非翻訳領域をそれぞれコードするDNA配列とを含む。【００７３】
pHH J1(C-p7)/JFH1の作製
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-JFH-S（配列番号10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT）および5-JFH-A2（配列番号18：TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.5とした。【００７４】
次に、JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー3-JFH-S2（配列番号19：AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG）および3-JFH-A（配列番号13：GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC）をそれぞれ１μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.6とした。【００７５】
遺伝子型1bのJ1株由来のゲノムRNAに対応するcDNA（GenBankアクセッション番号D89815、Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621-627）を鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-J1-S（配列番号20：ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC）および5-J1-A（配列番号21：AAGCGGGATGTACCCCATGAG）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.7とした。【００７６】
次に、上記のJ1株由来ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー3-J1-S（配列番号22：CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT）および3-J1-A（配列番号23：GTGCGTCATAGGCGTAAGCTCGTGGTGGTA）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.8とした。【００７７】
それぞれのPCR産物を精製し、50μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.5とPCR産物no.7のDNAを100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、プライマー5-JFH-S（配列番号10）および5-J1-A（配列番号21）を添加し、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR5JJと名付けた。【００７８】
さらに、PCR産物no.6とPCR産物no.8のDNAを100倍希釈して各1μlを混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、プライマー3-J1-S（配列番号22）および3-JFH-A（配列番号13）を添加し、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR3JJと名付けた。【００７９】
pCR5JJを制限酵素AgeIおよびClaIで、J1ゲノムcDNAを制限酵素ClaIおよびAvrIIで、pCR3JJを制限酵素AvrIIおよびKpnIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら３つのDNA断片をpHH JFH1をAgeIおよびKpnIで消化して得られたベクターに連結した。このベクターをpHH J1(C-p7)/JFHと名付けた。この発現ベクターpHH J1(C-p7)/JFHの挿入断片（J1(C-p7)JFH；配列番号３１、図１２Ａ〜Ｄ）は、JFH1株およびJ1株由来のキメラからなる5'非翻訳領域、J1株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、およびp7タンパク質をそれぞれコードするDNA配列と、JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質および3’非翻訳領域をそれぞれコードするDNA配列とを含む。【００８０】
pHH J1(C-NS2)/JFH1の作製
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-JFH-S（配列番号10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT）および5-JFH-A2（配列番号18：TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.9とした。【００８１】
次に、JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-JFH-NS3-S（配列番号24：GCGACTCCTTGCTCCCATCACTGCTTATGC）および3-JFH-NS3-A（配列番号25：TGGGAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT）をそれぞれ１μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.10とした。【００８２】
遺伝子型1bのJ1株由来のゲノムRNAのcDNA（GenBankアクセッション番号D89815、Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621-627）を鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-J1-S（配列番号20：ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC）および5-J1-A（配列番号21：AAGCGGGATGTACCCCATGAG）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を１μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.11とした。【００８３】
次に、J1株由来のゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-J1-S（配列番号22：CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT）および3-J1-NS3-A（配列番号26：CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.12とした。【００８４】
それぞれのPCR産物を精製し、50μlのH2Oに溶かした。PCR産物no.9とPCR産物no.11のDNAを100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、5-JFH-S（配列番号10）および5-J1-A（配列番号21）をプライマーとして添加し、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR5JJと名付けた。【００８５】
さらに、PCR産物no.10とPCR産物no.12のDNAを100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でPCRを5サイクル行った。その後、3-J1-S（配列番号22）および3-JFH-NS3-A（配列番号25）をプライマーとして添加し、さらにPCRを25サイクル行い、それにより増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。pCRIIにキメラDNA断片をクローン化したこのプラスミドをpCR3JJNS3と名付けた。【００８６】
pCR5JJを制限酵素AgeIおよびClaIで、J1ゲノムcDNAを制限酵素ClaIおよびAvrIIで、pCR3JJNS3を制限酵素AvrIIおよびBspDIで消化し、各HCV cDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら３つのDNA断片をpHH JFH1をAgeIおよびBspDIで消化して得られたベクターに連結した。このベクターをpHH J1(C-NS2)/JFHと名付けた。この発現ベクターpHH J1(C-NS2)/JFHの挿入断片（J1(C-NS2)JFH；配列番号３２、図１３Ａ〜Ｄ）は、JFH1株およびJ1株由来のキメラからなる5'非翻訳領域、J1株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、およびNS2タンパク質をそれぞれコードするDNA配列と、JFH1株由来のNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質および3’非翻訳領域をそれぞれコードするDNA配列とを含む。【００８７】
それぞれの発現ベクタークローンのマップを図１Ｃに示した。【００８８】
[実施例２]
細胞内でのHCV RNAの合成確認
実施例１で作製したpHH JFH1およびpHH JFH1/GNDをHuh7およびHepG2細胞にFugene 6（ロシュ社）を用いて、添付マニュアルに従って導入した。24時間後に各細胞からRNAをIsogen(日本ジーン社)にて、添付マニュアルに従って調製した。【００８９】
これらのRNAを鋳型として、以下の通り、RACE法にてpHH JFH1およびpHH JFH1/GNDからHCV RNAが合成されたかについて確認した。【００９０】
2μgの上記の通り調製したRNAと、2.5μMのRNAリンカー（配列番号１:GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA）をT4 RNAリガーゼ（Takara社）により、添付緩衝液を用いて連結した。次に、RNAリンカーが連結されたRNAを鋳型として、HCV RNAに相補的なプライマー（配列番号２:gtaccccatgaggtcggcaaag）を用いて、逆転写酵素SuperScript III（インビトロジェン社）にて添付マニュアルに従ってcDNAを合成した。【００９１】
次いで、合成された上記cDNAを鋳型とし、5’末端のRNAリンカーに対するセンスプライマー（配列番号３:GCTGATGGCGATGAATGAACACTG）と3’末端側のアンチセンスプライマー（配列番号４:gaccgctccgaagttttccttg）の２種類のプライマーを用いて、PCRによりDNAを増幅した。さらに、増幅されたDNAを鋳型として、増幅されたDNAの内側の配列からなる5’末端側のプライマー（配列番号５:GAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG）および3’末端側のプライマー（配列番号６:cgccctatcaggcagtaccacaag）のプライマーセットを用いて、第２のPCRを行った。なお、このPCRは市販のキット：Ex Taq（Takara）を使用して、96℃で５分間加熱処理後、96℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間の反応のサイクルを35回繰り返し、その後４℃で保存することにより行った。次いで、上記２回目のPCR産物が得られたかを確認するため、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動にて確認した。その結果（図２）、Huh7細胞およびHepG2細胞の何れでも、pHH JFH1とpHH JFH1/GNDからHCV RNAの転写が起こっていることが確認できた。さらに、２回目のPCR産物をpGEM-T Easy（Promega社）ベクターにクローン化した。得られたプラスミドDNAにクローン化されたDNAの塩基配列を、DNAシークエンサー（ABI PRISM 377）を用いて決定した。その結果、pHH JFH1およびpHH JFH1/GNDから転写されたHCV RNAの5’末端の配列は、HCVゲノムの5’末端と同一であることが明らかとなった。図３に、pHH JFH1から転写されたHCV RNAの5’末端とリンカーの配列を示した。【００９２】
[実施例３]
細胞内でのHCV タンパク質の発現確認
pHH JFH1、pHH H77cおよびpHH JFH1/GNDを導入された細胞で、転写に引き続き、HCVタンパク質の翻訳が起こっているかについて確認した。【００９３】
pHH JFH1、pHH H77cおよびpHH JFH1/GNDをHuh7細胞にFugene 6（ロシュ社）を用いて、添付マニュアルに従って導入した。培養４日後、常法により、細胞抽出液を調製した。次いで、これらの抽出液中のタンパク質をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により解析した。解析にあたって、Core遺伝子を含む発現プラスミドDNAをHuh7細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照とした。さらに、トランスフェクションしていないHuh7細胞から得られた細胞抽出液を陰性対照とした。それぞれの細胞クローンから抽出した試料をSDS-PAGEを行った後、PVDF膜（Immobilon- P, Millipore社製）にブロッティングし、抗Core特異的抗体（ウサギポリクローナル抗体）および抗NS5A抗体としてマウスモノクローナル（Austral社）とこれらの抗体を認識するHRP標識２次抗体を用いて、ECL(アマシャムファルマシア社)にて細胞内で翻訳されたCoreタンパク質およびNS5Aタンパク質を検出した。【００９４】
その結果、図４に示すように、pHH JFH1を導入した細胞では、CoreおよびNS5Aタンパク質の発現が確認された。しかし、pHH H77cおよびpHH JFH1/GNDを導入した細胞では、これらのタンパク質の発現は検出できなかった。この結果は、pHH JFH1が導入された細胞では、pHH JFH1からRNAが転写された後、このRNAが細胞内で複製された後、タンパク質の翻訳が起こり、タンパク質の検出可能なレベルに達するのに対し、pHH JFH1/GNDを導入された細胞では、pHH JFH1/GNDからRNAが転写された後、このRNAはNS5Bに変異があるため、細胞内で複製されず、タンパク質が検出できるレベルに達しないことを示していると考えられた。一方、HCVゲノムRNAは培養細胞で自律複製するにも係わらず（Yi,M. & Lemon ST., J. Virol., 78 (2004) p7904-7915）、pHH H77cにおいてHCVタンパク質の発現が検出できなかった原因は不明である。【００９５】
次に、どのような細胞株で、HCVタンパク質が発現するかについて検討した。pHH JFH1およびpHH JFH1/GNDをGFP発現ベクター（pGreenLantern：Life Technologies Inc.）と共に、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2および293T細胞にFugen 6（ロシュ社）を用いて添付マニュアルに従って導入した。導入４日後、蛍光顕微鏡にて、GFPの発現を観察し、各ベクターが導入されていることを確認後、各細胞から細胞抽出液を調製した。次いで、これらの抽出液中のCoreタンパク質をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により解析した。Coreタンパク質の検出は、抗Core特異的ウサギポリクロ抗体とこの抗体を認識するHRP標識２次抗体を用いて、ECL(アマシャムファルマシア社)にて行った。その結果、図５に示す様に、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2細胞でCoreタンパク質を検出することができた。【００９６】
[実施例４]
HCV 粒子の産生
次に、pHH JFH1導入細胞からHCV粒子が産生されるかどうかを確認するため、培養上清中のCoreタンパク質の解析を行った。pHH JFH1および対照として、Core、E1、E2およびp7を発現するベクターpCAG327JFH1をHepG2細胞にFugene 6を用いて導入して２日後に培養上清を除き、新鮮な培地を加えさらに２日間培養した。次いで、細胞と培養液を回収し、細胞からタンパク質を抽出し、実施例３に示す方法で、細胞中のコアタンパク質の発現を解析した。その結果、コアタンパク質が発現していることを確認した（図６Ａ）。培養液中のHCV粒子の存在を確認するため、培養液をショ糖密度勾配により分画した。10〜60%（重量/重量）の密度勾配ショ糖溶液（50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解）に、さらにサンプルの培養上清を0.2ml重層した。これをベックマンローターS W41Eで35,000RPM、４℃、16時間遠心し、遠心終了後遠心チューブの底から0.5mlずつ分画回収した。各分画の密度、HCV Core蛋白濃度を定量した。HCV Coreタンパク質の測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p.1802-1808）。【００９７】
図６Ｂに示すように、1.15〜1.18mg/mlのフラクションでCoreタンパク質のピークが見られた。それに対し、Core、E1、E2およびp7を発現する細胞では、Coreタンパク質のピークは観察されなかった。【００９８】
1.15〜1.18mg/mlのフラクションに存在するCoreタンパク質とHCV RNAがHCV粒子構造を形成しているとすれば、界面活性剤NP40での処理に感受性のはずである。そこで次に、pHH JFH1をHepG2に導入して、２日から４日間の培養液を0.2%のNP40で20分間処理した後にショ糖密度勾配により分画した。図７に示すように、NP40処理を行うことで、Coreタンパク質のピークは、1.20 mg/mlのフラクションに認められた。すなわち、脂質を含み比重の軽い表面膜がNP40によりウイルス粒子から剥離して、ウイルス様構造を保持していない核酸とCoreタンパク質のみのCore粒子となり、比重が重くなったものと考えられた。【００９９】
以上の結果から、pHH JFH1をHepG2細胞へ導入することによりHCVゲノムcDNAからウイルスRNAが転写された後、ウイルスタンパク質の合成とウイルスRNAの複製が起こり、ウイルス粒子が形成され、培養液中に分泌されたことが確認された。【０１００】
[実施例５]
HCV粒子の感染性確認
実施例４で得られたHCV粒子が感染性を有しているかについて検討した。pHH JFH1をHuh7細胞およびHepG2細胞にFugene 6を用いて導入し、３日から５日間培養した培養上清を限外濾過膜（cut off 1×105 Da）を用いて30倍に濃縮した。次に、濃縮したHCV粒子を含む培養液100μlでHuh7.5.1細胞を15mmカバースリップ上で培養して、４日後に細胞を抗NS5A抗体で蛍光染色した。抗NS5A抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図８に示すように、一部の感染細胞が確認された。これらの結果から、pHH JFH1をHuh7またはHepG2細胞へ導入することにより、培養液中に分泌されたHCV粒子は、感染する能力を有することが確認された。【０１０１】
[実施例６]
感染性HCV粒子産生細胞株の取得
上記実施例で示されたシステムを利用して、感染性HCV粒子を持続的に生産する細胞株の樹立を試みた。【０１０２】
pHH JFH1をNhe Iにて消化し、その部位にpSV40/Zeo2（Invitrogen社）をNhe IとXba Iで消化して取り出したSV40プロモーターの下流にZeocin抵抗性遺伝子が連結され、さらにその下流にSV40ポリA付加シグナルが連結された発現ユニット（SV40プロモーター／Zeo/polyA）を組み込んだベクターを作製した。そのベクターをpHH/ZeoJFH1と名付けた（図９）。【０１０３】
pHH/ZeoJFH1をHepG2細胞にFugene 6にて導入した。Zeocin含有培地にて培養した。その後、週に２回培養液を交換しながらZeocin含有培地にて培養を継続した。上記の培養21日後の培養ディッシュから生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、100個の細胞クローンを取得した。それらのクローンの培養上清中のCoreタンパク質量は、オーソHCV抗原IRMAテストを用いて行い（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p.1802-1808）、Coreタンパク質の発現量の多いクローンHepG2/No59細胞を選出した。【０１０４】
２×106個のHepG2/No59細胞を10cmのディッシュを用いて、８mlの培地にて培養した。48時間後、培養上清を回収した。【０１０５】
培養上清中のCoreタンパク質を測定した結果、HepG2/No59細胞は1,400fmol/LのCoreタンパク質を産生していることが確認された。【０１０６】
また、培養上清中から調製したRNAから、HCVゲノムRNA量の測定を行った。HCV RNAの定量的RT-PCRによる検出は、Takeuchiらの方法（Takeuchi T. et al., Gastroenterology, 116 (1999) p.636-642）に従いHCV RNAの5'非翻訳領域のRNAを検出することにより行った。具体的には、細胞から抽出したRNAに含まれるHCV RNAを、以下の合成プライマーとEZ rTth RNA PCR kit（Applied Biosystems）を用いてPCR増幅し、ABI Prism 7700 sequence detector system（Applied Biosystems）により検出した。【０１０７】
R6-130-S17：5’- CGGGAGAGCCATAGTGG -3’（配列番号７）
R6-290-R19：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’（配列番号８）
TaqMan Probe, R6-148-S21FT：5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’（配列番号９）
その結果、HepG2/No59細胞培養上清中のHCV RNAは6.1×108コピー/mlであることが分かった。この産生量はこれまでに報告された量より約60倍高い。【０１０８】
さらに、HepG2/No59細胞培養上清を限外濾過膜（cut off 1×105 Da）を用いて30倍に濃縮し、濃縮したHCV粒子を含む培養液100μlでHuh7.5.1細胞を15mmカバースリップ上で培養して、４日後に細胞を抗NS5A抗体で免疫染色した。その結果、抗NS5A抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を検出することができた。以上から、HepG2/No59細胞培養液中に分泌されたHCV粒子は感染する能力を有することが確認された。【０１０９】
[実施例７]
キメラHCV発現ベクターによるHCV粒子の作製
実施例１で作製されたキメラHCV発現ベクターpHH H77c(C-p7)/JFH1、pHH J6(C-p7)/JFH1、pHH J1(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-NS2)/JFH1を、Huh7細胞から派生した株化細胞であるHuh7.5.1細胞（Zhong, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 102, 9294-9299, (2005)）にFugene 6(ロシュ社)を用いて、添付マニュアルに従って導入した。導入３日後にそれらの培養上清を回収し、培養上清中に含まれるCoreタンパク質の量を測定した。Coreタンパク質量の測定にはオーソHCV抗原IRMAテストを用いた（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p.1802-1808）。陰性コントロールとしてベクターを導入していない細胞の培養上清、陽性コントロールとして、pHH JFH1を導入した細胞の培養上清を用いた。それら実験結果の一例を表１に示す。各キメラHCV発現ベクターを導入された細胞上清にCoreタンパク質が確認できたことから、ウイルス粒子が産生されたと判断された。また、pHH J6(C-p7)/JFH1は、pHH JFH1より10倍以上高いHCV産生能を有することも判明した。
【表１】
2007037428.tif 000002
【０１１０】
[実施例８]
pHH J6(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-p7)/JFH1を実施例７に示した方法でHuh7.5.1細胞に導入し、導入後３日後の培養上清を限外濾過膜（cut off 1×105 Da）を用いて濃縮した。濃縮したHCV粒子を含む培養上清100μlを加えてHuh7.5.1細胞を15mmカバースリップ上で培養して、４日後に細胞を抗NS5A抗体で免疫染色した。その結果、pHH J6(C-p7)/JFH1を導入した細胞から得られた培養上清で処理した細胞では、抗NS5A抗体で強く染色される細胞が見られた。一方、pHH J1(C-p7)/JFH1を導入した細胞から得られた培養上清で処理した細胞では、pHH J6(C-p7)/JFH1と比較すると抗NS5A抗体で染色される強度は弱いが、コントロールの細胞と比較して明らかに染色されていた。以上から、pHH J6(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-p7)/JFH1が導入された細胞では感染性HCVが産生されたことが判明した。【０１１１】
また、pHH J1(C-p7)/JFH1に実施例６に示した方法で、Zeocin抵抗性遺伝子発現ユニットを挿入したpHH/Zeo J1(C-p7)/JFH1を作製した。次に、pHH/Zeo J1(C-p7)/JFH1をHuh7.5.1に導入し、Zeocin含有培地にて増殖する、ウイルス粒子を安定的に発現可能な細胞を得た。この細胞の培養上清8mlを限外濾過膜（cut off 1×105 Da）を用いて濃縮した。この濃縮した培養上清中のHCV Coreタンパク質量は2365 fmol/Lであった。この濃縮培養上清100μlを用いてHuh7.5.1を感染させ、４日後に細胞を抗NS5A抗体で免疫染色した。その結果、pHH/Zeo J1(C-p7)/JFH1を導入された安定的発現性細胞から得られた培養上清で処理した細胞では、抗NS5A抗体で強く染色される細胞が見られた。このことから、本細胞から感染性HCVが産生されたことが判明した。【０１１２】
上記のようなキメラHCV発現ベクターが、それを感染させた細胞内で感染性HCVを産生できることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１の配列は合成RNAを示す。【０１１４】
配列番号２〜配列番号９の配列は合成DNAを示す。【０１１５】
配列番号１０〜２６の配列はプライマーを示す。【０１１６】
配列番号２９〜３２の配列はキメラDNAを示す。【０１１７】
配列番号３３〜４５の配列は合成DNAを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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