(57)【要約】  シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）の培養菌体よりビタミンＤ３の水酸化酵素を精製し、そのアミノ酸配列情報からプライマーを設計した後、シュードノカルディア・オートトロフィカのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行ってビタミンＤ３の水酸化酵素遺伝子をクローニングする。この遺伝子を適当な発現系のもとで発現させた微生物を用いて変換反応を行うことで、ヒドロキシビタミンＤ３などビタミンＤ等の水酸化体を効率よく製造できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、及び７−デヒドロコレステロールのうち少なくとも一つを水酸化する酵素をコードする放線菌由来の水酸化酵素遺伝子。
【請求項２】
シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）由来の請求項１記載の水酸化酵素遺伝子。
【請求項３】
シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）ＮＢＲＣ１２７４３株に由来する請求項２記載の水酸化酵素遺伝子。
【請求項４】
配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる請求項３記載の水酸化酵素遺伝子。
【請求項５】
下記の（１）または（２）で示される請求項４記載の水酸化酵素遺伝子の改変体または相同遺伝子：
（１）請求項４記載の水酸化酵素遺伝子の改変体であって請求項４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その改変体にコードされる水酸化酵素のビタミンＤ類に対する水酸化活性及び基質スペクトルが請求項４記載の水酸化酵素遺伝子にコードされる水酸化酵素と同等と認められるもの、
（２）シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株以外の微生物に由来し、かつビタミンＤ類に対する水酸化活性を有するポリペプチドをコードする、請求項４記載の水酸化酵素遺伝子に相同な遺伝子であって、請求項４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その相同遺伝子にコードされる水酸化酵素のビタミンＤ類に対する水酸化活性及び基質スペクトルが請求項４記載の水酸化酵素遺伝子にコードされる水酸化酵素と同等と認められるもの。
【請求項６】
配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列のうち連続する少なくとも２０塩基またはその逆相補鎖をプローブとして放線菌から取得される請求項５記載の水酸化酵素遺伝子の改変体または相同遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載された遺伝子によってコードされる水酸化酵素。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む水酸化酵素。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載された遺伝子を宿主生物に導入して得られる形質転換体。
【請求項１０】
宿主生物が大腸菌または放線菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の形質転換体を培養して得られる培養液またはその加工物にビタミンＤ類または７−デヒドロコレステロールを反応基質として添加して変換反応を行わせることを特徴とするビタミンＤ類もしくはその前駆体、代謝物、誘導体またはステロイド類もしくはその修飾化合物の水酸化体の製造方法。
【請求項１２】
請求項９または１０記載の形質転換体において水酸化酵素遺伝子とレドックスパートナー遺伝子を共発現させる請求項１１記載の水酸化体の製造方法。
【請求項１３】
レドックスパートナー遺伝子が下記の（１）〜（３）のいずれかで示される請求項１２記載の水酸化体の製造方法：
（１）ｔｈｃＣＤ遺伝子、
（２）（１）のｔｈｃＣＤ遺伝子の改変体であって、該ｔｈｃＣＤ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその改変体にコードされるレドックスパートナーが、配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる水酸化酵素に電子を伝達する能力を有するもの、
（３）ロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１株以外の微生物に由来する、ｔｈｃＣＤ遺伝子に相同な遺伝子であって、かつ（１）のｔｈｃＣＤ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその相同遺伝子にコードされるレドックスパートナーが配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる水酸化酵素に電子を伝達する能力を有するもの。
【請求項１４】
ビタミンＤ類の水酸化体が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である請求項１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
【請求項１５】
ビタミンＤ類の水酸化体が２５−ヒドロキシビタミンＤ３である請求項１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
【請求項１６】
ビタミンＤ類の水酸化体が２５−ヒドロキシビタミンＤ２である請求項１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
【請求項１７】
配列番号１の塩基配列のうち連続する少なくとも２０塩基またはその逆相補鎖をプローブとして微生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから水酸化酵素遺伝子を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ等の水酸化酵素、これをコードする遺伝子、その単離方法、その遺伝子を導入した形質転換生物、及びその生物を用いた２５−ヒドロキシビタミンＤ３や１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などを含む水酸化ビタミンＤ等の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、主に高等生物において必須な脂溶性ビタミン群でコレステロールから生合成される。その生理作用はカルシウムの吸収促進や代謝促進、細胞分化誘導、免疫調節作用など多岐に及び、生体において重要な役割を果たしている。【０００３】
ヒトにおけるビタミンＤの生合成の主要な経路は、まずコレステロールから７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）が合成された後、皮膚において紫外線と熱反応からビタミンＤ３がつくられる。ビタミンＤ３は肝臓のミトコンドリアに局在するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ２７Ａ１）によって２５位の水酸化を受けて２５−ヒドロキシビタミンＤ３となる。その後、腎臓の近位尿細管において別のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ２７Ｂ１）によって、さらに１α位の水酸化を受けて１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（活性化型ビタミンＤ３）がつくられる。この物質が細胞内の受容体（レセプター）に結合することで、生理作用発現に関わる核内の特定の遺伝子の発現調節を行うことが分かっている。【０００４】
従って、肝臓または腎臓が機能不全に陥ると、正常なビタミンＤ代謝が阻害されることがある。そのような患者では血中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３や１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が極度に低下することがあり、治療のためには２５−ヒドロキシビタミンＤ３や１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を投与して補う必要がある。【０００５】
一方、先天的に、ビタミンＤ３の水酸化に関与するシトクロムＰ４５０の遺伝子に変異があることに起因する水酸化機能不全から、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が不足して起こるくる病が知られている。のみならず、後天的なくる病や骨粗鬆症を含めて、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が不足することで起こる疾患の治療薬として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び同様な生理作用をもつ類縁化合物の有する重要性は非常に高い。【０００６】
さらに、ビタミンＤ類はその多様な生理活性から、様々な誘導体が薬物の候補として研究され、抗腫瘍薬、乾癬治療薬、免疫賦活薬などの開発にも期待がもたれている。このような観点から、ビタミンＤ類誘導体化の一修飾法としての水酸化は重要である。この場合、水酸化位置の重要性は１α位及び２５位のみに限定されず、他の位置の水酸化に高い必要性が生じることもある。以上のような製薬的または創薬的需要から、ビタミンＤ類の水酸化体の製造法を改良して、より効率的で、より安価にビタミンＤ水酸化体を製造して供給することが医薬産業上強く望まれてきた。【０００７】
ビタミンＤ類の中で特に生理活性が強く、価値のある１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３について言及すると、その製造手法としては、有機合成法、ヒトのシトクロムＰ４５０を利用する方法、微生物の水酸化酵素を利用する方法等が挙げられるが、このうち、有機合成法ではコレステロールから１７工程を経て合成する製法が知られている。また、ヒトのシトクロムＰ４５０を利用する方法では、関与する遺伝子、発現する技術、シトクロムＰ４５０酵素の性質に関する生物学的・生化学的知見の蓄積がある（T. Sakakiらの総説，Frontiers in Bioscience, 10, 119-134, 2005；非特許文献１）。しかし、これら二つのいずれの方法も高い製造コストや低い生産性の問題から、実用化には極めて不向きである。【０００８】
一方、微生物の水酸化酵素を利用する方法は比較的有望な製造法である。
例えば、大正製薬（株）の佐々木らは微生物探索研究において、ビタミンＤ３を水酸化して１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を生産する放線菌シュードノカルディア・オートトロフィカを分離した（J. Sasaki et. al, Applied Microbiology and Biotechnology, 38, 152-157, 1992；非特許文献２）。その後のメルシャン（株）におけるこの菌株の育種改良、及び製造プロセス開発の結果、微生物変換法による１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の製造法が確立し（K. Takeda et. al, J. Ferment. Bioeng., 78, 380-382, 1994；非特許文献３）、実用化に至った。【０００９】
三菱化学（株）の特許公開公報（特開２００３−３２５１７５号公報；特許文献１）においてはバチルス・メガテリウムにより、ビタミンＤ３の２５位を水酸化することで２５−ヒドロキシビタミンＤ３を製造する方法が開示されているが、この方法による２５−ヒドロキシビタミンＤ３の培養液中の蓄積量は少なく、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の生産についての記載はない。【００１０】
微生物由来のビタミンＤ３水酸化遺伝子に関する知見では、１９９４年に、シュードノカルディア・オートトロフィカ由来のヒドロキシビタミンＤ３２５位水酸化酵素遺伝子の報告（H. Kawauchi et. al, Biochimica et Biophysica Acta, 179-183, 1994；非特許文献４）がなされているが、本発明の遺伝子とは塩基配列及びそれにコードされる酵素の性状から考えて明らかに異なるものである。また、Ｓａｗａｄａらは２００４年に、放線菌ストレプトミセス・グリセオラス  ＡＴＣＣ  １１７９６由来のシトクロムＰ４５０遺伝子がコードするＰ４５０ＳＵ−１（ＣＹＰ１０５Ａ１）が、ビタミンＤ３から２５−ヒドロキシビタミンＤ３ならびにヒドロキシビタミンＤ３から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への弱い水酸化活性を有することを報告している（N. Sawada et. al, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 156-164, 2004；非特許文献５）。【００１１】
このように、これまで微生物を利用した、ビタミンＤ３水酸化変換については様々な知見が示されてきたが、シュードノカルディア・オートトロフィカ菌株を変換菌に用いたビタミンＤ３から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を製造する方法だけが産業的に実用化されている（特開平２−４６９号公報（US4892821）；特許文献２及び特開平２−２３１０８９号公報；特許文献３）。しかしこの製造方法においても、より効率的な製造プロセスの改良を志向して、解決すべき課題がある。【００１２】
【非特許文献１】Ｔ．  Ｓａｋａｋｉらの総説，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１０，１１９−１３４，２００５
【非特許文献２】Ｊ．Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ．ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３８，１５２−１５７，１９９２
【非特許文献３】Ｋ．Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７８，３８０−３８２，１９９４
【非特許文献４】Ｈ．Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７９−１８３，１９９４
【非特許文献５】Ｎ．Ｓａｗａｄａ  ｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３２０，１５６−１６４，２００４
【特許文献１】特開２００３−３２５１７５号公報
【特許文献２】特開平２−４６９号公報
【特許文献３】特開平２−２３１０８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述のビタミンＤ３から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を製造する方法とは、シュードノカルディア属放線菌を発酵槽において培養した後、ビタミンＤ３を反応基質として培養液に添加し、菌体のもつ水酸化酵素の作用で反応を進行させて、その結果蓄積する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を培養液から回収・精製して行うものである。【００１４】
この製造法においては、変換微生物として生育時間の長い放線菌を用いるため、製造期間が長期になり、さらに、変換菌がもつビタミンＤ３変換作用の中には目的の水酸化のみならず、望ましくない副反応が存在する。その反応には、例えば、２６位の水酸化や、２４位の水酸化などが挙げられる。また、基質のビタミンＤ３や目的生成物の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に対する分解活性も存在する。【００１５】
特に、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の分解は、目的産物の蓄積量に直接的に関わる極めて重要な問題である。これに加えて、副産物の存在も、変換反応後の培養液からの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の回収・精製工程を多くし、結果的に生産物収量を低下させる。このような経緯から、現製造法においては、いかにして前述のような副反応や分解活性を抑制して、なおかつ目的産物の蓄積量を増やすことは、より効率のよい製造法を実現するための大きな課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、製造法の改良のために鋭意研究を重ねた結果、まず、高いビタミンＤ３の水酸化能力を有するシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株から１α及び２５位を水酸化する酵素をコードする遺伝子をクローニングした。次いで、この遺伝子を副反応及び分解活性のない、もしくは極めて少ない宿主であるロドコッカス・エリスロポリスや大腸菌に組み換えて発現させて本発明を完成させた。【００１７】
本発明により、これまで変換菌シュードノカルディア・オートトロフィカの細胞全体の複雑な生理・代謝機構を、製造に都合よく制御しようとしてきた制限的な範囲の試みからの脱却ができた。すなわち、１α位及び２５位を水酸化する酵素をコードする遺伝子を単離したことで、遺伝子工学技術を用いて、製造に最適な宿主での該水酸化酵素の大量発現が可能となり、これまでの技術的課題を解決できる。加えて、変換菌の育種に利用できる技術の中には高度な遺伝子発現系の構築や遺伝子の改変による酵素機能の向上が含まれるが、これらの技術も本発明の遺伝子を扱うことではじめて可能になるものである。該水酸化酵素は、これまで報告されたビタミンＤ等の水酸化酵素の中では、新規で極めて産業利用に適した性状を有している。従って本発明により、産業上極めて有用で、かつ効率のよいビタミンＤ等の水酸化体の製造方法が提供される。【００１８】
すなわち、本発明は、以下のビタミンＤ等の水酸化酵素、これをコードする遺伝子、その単離方法、その遺伝子を導入した形質転換生物、及びその生物を用いた２５−ヒドロキシビタミンＤ３や１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などを含む水酸化ビタミンＤ等の製造方法に関する。
１．ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、及び７−デヒドロコレステロールのうち少なくとも一つを水酸化する酵素をコードする放線菌由来の水酸化酵素遺伝子。
２．シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）由来の前記１記載の水酸化酵素遺伝子。
３．シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）ＮＢＲＣ１２７４３株に由来する前記２記載の水酸化酵素遺伝子。
４．配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる前記３記載の水酸化酵素遺伝子。
５．下記の（１）または（２）で示される前記４記載の水酸化酵素遺伝子の改変体または相同遺伝子：
（１）前記４記載の水酸化酵素遺伝子の改変体であって前記４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その改変体にコードされる水酸化酵素のビタミンＤ類に対する水酸化活性及び基質スペクトルが前記４記載の水酸化酵素遺伝子にコードされる水酸化酵素と同等と認められるもの、
（２）シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株以外の微生物に由来し、かつビタミンＤ類に対する水酸化活性を有するポリペプチドをコードする、前記４記載の水酸化酵素遺伝子に相同な遺伝子であって、前記４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その相同遺伝子にコードされる水酸化酵素のビタミンＤ類に対する水酸化活性及び基質スペクトルが前記４記載の水酸化酵素遺伝子にコードされる水酸化酵素と同等と認められるもの。
６．配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列のうち連続する少なくとも２０塩基またはその逆相補鎖をプローブとして放線菌から取得される前記５記載の水酸化酵素遺伝子の改変体または相同遺伝子。
７．前記１〜６のいずれかに記載された遺伝子によってコードされる水酸化酵素。
８．配列番号２のアミノ酸配列を含む水酸化酵素。
９．前記１〜６のいずれかに記載された遺伝子を宿主生物に導入して得られる形質転換体。
１０．宿主生物が大腸菌または放線菌である前記９記載の形質転換体。
１１．前記９または１０記載の形質転換体を培養して得られる培養液またはその加工物にビタミンＤ類または７−デヒドロコレステロールを反応基質として添加して変換反応を行わせることを特徴とするビタミンＤ類もしくはその前駆体、代謝物、誘導体またはステロイド類もしくはその修飾化合物の水酸化体の製造方法。
１２．前記９または１０記載の形質転換体において水酸化酵素遺伝子とレドックスパートナー遺伝子を共発現させる前記１１記載の水酸化体の製造方法。
１３．レドックスパートナー遺伝子が下記の（１）〜（３）のいずれかで示される前記１２記載の水酸化体の製造方法：
（１）ｔｈｃＣＤ遺伝子、
（２）（１）のｔｈｃＣＤ遺伝子の改変体であって、該ｔｈｃＣＤ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその改変体にコードされるレドックスパートナーが、配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる水酸化酵素に電子を伝達する能力を有するもの、
（３）ロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１株以外の微生物に由来する、ｔｈｃＣＤ遺伝子に相同な遺伝子であって、かつ（１）のｔｈｃＣＤ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその相同遺伝子にコードされるレドックスパートナーが配列番号１の３２０番目〜１５３１番目の塩基配列によってコードされる水酸化酵素に電子を伝達する能力を有するもの。
１４．ビタミンＤ類の水酸化体が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である前記１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
１５．ビタミンＤ類の水酸化体が２５−ヒドロキシビタミンＤ３である前記１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
１６．ビタミンＤ類の水酸化体が２５−ヒドロキシビタミンＤ２である前記１１〜１３のいずれかに記載の水酸化体の製造方法。
１７．配列番号１の塩基配列のうち連続する少なくとも２０塩基またはその逆相補鎖をプローブとして微生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから水酸化酵素遺伝子を取得する方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書においては、本発明に含まれるビタミンＤ等の水酸化酵素遺伝子は、単にシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）ＮＢＲＣ１２７４３株から由来した配列番号１記載のＤＮＡ配列にコードされる遺伝子のみを指すほか、その遺伝子の改変体や相同体も含めて指すこともある（以下これらを「ｖｄｈ遺伝子」と略称することがある。）。ｖｄｈ遺伝子はビタミンＤ等を水酸化する能力を有するシュードノカルディア属放線菌またはその他近縁の微生物の培養菌体から、ビタミンＤ等を水酸化する酵素（以下これを「ＶＤＨ」と略称することがある。）を精製し、その酵素のＮ末端アミノ酸及び内部アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴＤＮＡプライマーによってＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）を行ってクローニングすることができる。【００２０】
本明細書にて使用される「ビタミンＤ等」とは、本発明に含まれるＶＤＨによって基質として認識され、１α位、２５位、その他の炭素に一酸素原子添加を行うことが可能なものを意味し、例えば、以下の物質を包含する。
（１）ビタミンＤ３、ビタミンＤ２などのビタミンＤ類
（２）ビタミンＤ類の前駆体、代謝物、その他の誘導体（この中には７−デヒドロコレステロール、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ３などが含まれる。）
（３）ステロイド類またはその修飾化合物【００２１】
本発明のｖｄｈ遺伝子を取得するための菌株は、ビタミンＤ等を水酸化する能力を有する微生物であれば、種及び株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい例としてはシュードノカルディア属に属する放線菌であり、さらに好適な例としては、すでに開示された菌株（特開平２−４６９号公報及び特開平２−２３１０８９号公報参照）の他、ＰＣＲ法によって、ｖｄｈ遺伝子の存在を確認できた下記表１記載の菌株を挙げることができる。ｖｄｈ遺伝子を有する菌株は本リストに記載された菌株に限定されない。本リストにおいて「Pseudonocardia」を「P.」と略す。
【表１】
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【００２２】
これらの菌株は、通常Ｌ液体培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）などの微生物一般の培養に適した培地を用いて３０℃、３日間程度で培養が可能で、ＤＮＡや酵素を精製するための菌体を調製できる。【００２３】
本明細書に記載された本発明を実施するのに必要な方法、例えばＤＮＡの抽出、遺伝子のクローニング及び発現、ＰＣＲ、インバースＰＣＲによる全長遺伝子の取得など遺伝子工学的手法を含む微生物の実験操作は、モレキュラ・クローニング第２版に記載された方法に従って行うことができる。また、特に放線菌に関する同様な操作は、Ｋｉｅｓｅｒらの実験書（Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000）に記載された方法に従って行うことができる。【００２４】
前述のＳａｗａｄａらの論文（N. Sawada et. al, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 156-164, 2004）から、ストレプトミセス属放線菌に存在するビタミンＤ類の水酸化に関与する活性本体は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである可能性が高いことが示された。ＶＤＨもその性状及び公知の関連情報からシトクロムＰ４５０であると考えられた。微生物菌体からシトクロムＰ４５０酵素を精製するための一般的な方法は、例えば、Ｐ４５０ＳＵ−１に関する文献（N. Sawada et. al, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 156-164, 2004）に記載された方法またはその変法で行うことができる。すなわち、調製された菌体を適当な緩衝液に懸濁させ、フレンチプレス処理または超音波破砕処理などを行うことで、無細胞抽出液をつくる。次に、この抽出液に対して２−３段階のカラムクロマトグラフィー精製を行うことで、ほとんど単一の酵素タンパクを得ることができる。この時使用できるカラムはイオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。【００２５】
次に、この酵素タンパク質をコードする遺伝子を取得するには、以下の一般的な手順で達成できる。すなわち、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけて、観察されるタンパク質のバンドを切り出し、ＰＶＤＦ（poly vinylidene difluoride）膜に転写させる。これをアミノ酸シークエンサーの試料として、エドマン法により目的とする酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定することができる。また、タンパク質のプロテアーゼ消化後に生成するポリペプチドを試料に用いて同様に処理することで、目的とする酵素の内部アミノ酸配列を決定することができる。【００２６】
Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列に基づいて合成したプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的の遺伝子断片を得ることができる。プライマーの設定領域から判断して、この遺伝子断片は、Ｎ末端から遺伝子内部の一部アミノ酸配列までのポリペプチドをコードするＤＮＡであるので、遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を取る必要がある。このためには、まずインバースＰＣＲを行って遺伝子全体を含む配列情報を獲得し、次いで、再編集された配列の任意の両末端またはコード領域を増幅するためのＰＣＲを行って最終的に目的の断片を得ることができる。これら一連の操作において得られるＰＣＲ増幅ＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサーにより決定できる。【００２７】
後の実施例６においても細説するように、このようにして獲得されるｖｄｈ遺伝子は配列番号１に記載された塩基配列で表すことができ、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるＶＤＨをコードしている。ＶＤＨのアミノ酸配列には酸素結合部位とヘム結合部位が存在し、実施例４で決定したＶＤＨの内部アミノ酸配列も存在しており、精製したＶＤＨ酵素をコードする遺伝子であることを裏付けている。ＶＤＨアミノ酸配列の相同性検索調査の結果、ＶＤＨはストレプトマイセス・コリナス（Streptomyces collinus DSM 2012）由来のシトクロムＰ４５０ＲｕｂＵと相同性が５０％あり、ＣＹＰ１０７ファミリーに属するシトクロムＰ４５０であることが推定された。【００２８】
本発明のｖｄｈ遺伝子の取得については、当業者らが一般に試みる手法では容易に解決できないいくつかの問題点が明らかになった。
その一つは、最も試みられる遺伝子のクローニング手法としてのショットガンクローニング法が有効でなかった点である。すなわち、放線菌ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）で確立している宿主ベクター系を利用して構築したシュードノカルディア・オートトロフィカのランダムなＤＮＡ断片を組み換えたストレプトミセス・リビダンスの個々のクローンから、ビタミンＤ３の水酸化活性を指標にしてスクリーニングしたが、多数のクローンを試験したにもかかわらず水酸化活性を有するクローンは取得することができなかった。【００２９】
後にＶＤＨの活性化に必須の電子伝達コファクタータンパクに厳格な特異性があることが分かった。事実、ホウレンソウ由来のフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素と精製ＶＤＨを含む再構成系では反応が進行するのに対し、多くの放線菌Ｐ４５０に電子伝達が可能とされるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のプチダレドキシンとプチダレドキシン還元酵素との再構成系では電子伝達が成立せず反応が進行しなかった。
なお、本明細書において、ＶＤＨの活性化に必須の電子伝達コファクタータンパクを「レドックスパートナー」ということがある。【００３０】
そこで、もう一つのアプローチであるＶＤＨを精製して、そのアミノ酸配列情報からｖｄｈ遺伝子を取得する方法を試みた。この時、菌体当たりのＶＤＨの発現量が非常に少なく精製に困難を極めたが、コレステロールの添加で、ＶＤＨの良好な発現誘導が起こることを見出し、精製に適した菌体の調製に成功した。【００３１】
ところが意外にも、この菌体を破砕して調製した無細胞抽出液には活性が検出できず、検討の結果、通常のシトクロムＰ４５０酵素の反応条件とは大きく異なる高い塩濃度に設定することで活性が回復し、問題の解決に至った。このようにｖｄｈ遺伝子のクローニングに至るまでには技術的に数々の困難な問題が発生したが、発明者らの鋭意検討の結果、すべて問題の解決を実現し本発明を完結させた。【００３２】
当業者ならば、発明者らが実施した方法を再現することで、本発明に含まれるｖｄｈ遺伝子を取得できる他、配列番号１に記載したｖｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列をプローブに用いて、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子をクローニングする一般的な遺伝子工学的手法で、ｖｄｈ遺伝子を取得することができる。【００３３】
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子」とは、例えば、遺伝子の配列情報の一部をもつＲＮＡまたはＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄した後においてもハイブリダイジング・シグナルを呈するＤＮＡとして定義することができる。【００３４】
とりわけ、取得しようとする、ｖｄｈ遺伝子の相同遺伝子が非常に相同性の高いものである時、例えば、配列番号１に記載のｖｄｈ遺伝子の塩基配列と比較して９０％以上の相同性が認められる場合は、配列番号１に記載したｖｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列をプローブとして用いて取得することもできる。新たなｖｄｈ遺伝子の取得は、前記配列を用いて既存のデータベースから所定の相同性を有する配列を検索して得てもよいし、これを基に合成したプライマーを用いてＰＣＲを行って取得することもできる。このようなプローブは、好ましくは、配列番号１に記載したｖｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列のうち少なくとも連続する２０塩基またはその逆相補鎖である。
なお、このようにして得られる相同性の高い相同遺伝子を「相同体」ということがある。【００３５】
ｖｄｈ遺伝子の組換えや発現などの一連の遺伝子工学的操作を実施する過程において、異宿主でのｖｄｈ遺伝子中のコドンを変更したり、制限酵素認識部位を付加または削除したり、あるいはＶＤＨに特定のポリペプチドを融合させたりする目的で、該遺伝子の機能・効果を損なわない範囲で、構成塩基配列の削除、変換、付加、挿入等のＤＮＡの改変を行うことがある。このようにして構築されたＤＮＡを「ＤＮＡの改変体」と定義する。本明細書において、「ＤＮＡの改変体」とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あるいはその誘導体を意味し、しばしばコードされたアミノ酸配列の置換をともなうことがあるが、もとのものと実質的に同じ効果を発現するＤＮＡを意味する。【００３６】
取得したｖｄｈ遺伝子は適当なベクターに組み込んだ後、宿主に導入することで、本発明のｖｄｈ遺伝子の形質転換生物を作製することができる。宿主としては、ｖｄｈ遺伝子を安定に保持し、発現できる宿主であればどのような生物でもよい。植物細胞などに導入することで活性化型ビタミンＤ３を含む遺伝子組換え作物を得ることもできる。しかし、好ましくは分解や副反応がなく、安価な培養手段で早く生育、かつ製造現場において扱いやすい微生物宿主が好ましい。【００３７】
使用できる宿主の具体的な例として、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌の他、放線菌（この中には例えば、ストレプトミセス（Streptomyces）属細菌、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属細菌、ノカルディア（Nocardia）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ミコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌等が含まれる。）などが挙げられる。【００３８】
ベクターは選択された宿主において、自律複製するプラスミドまたはゲノムにインテグレートされるインテグレーションベクターのいずれであってもよいが導入された細胞内において安定に保持され、担持されたｖｄｈ遺伝子が発現可能な状態にあるものが望ましい。この時ｖｄｈ遺伝子を効果的に発現させるためには宿主内において機能する適当なプロモーターを利用すればよい。プロモーターはその発現特性において構成型及び誘導型に分けられるが、構築した形質転換生物を用いる製造において最も望ましい効果を発揮できるものを選択するのがよい。使用できるプロモーターの具体的な例として、細菌のプロモーターでは、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｅｒｍプロモーター、ｔｉｐプロモーター、ｎｉｔプロモーターなどが、酵母のプロモーターでは、ＡＤＨプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ＰＫＧプロモーター、ＧＡＰプロモーターなどが、動物のプロモーターではＳＶ４０の初期プロモーターなどが、植物のプロモーターではカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどが挙げられる。【００３９】
ベクターはそれを導入する宿主に適合したもの使用することが必要であるが、具体的な例を挙げると、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−２、ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ）、ｐＴｒｃＨｉｓ（Invitrogen）、ｐＥＴ１１ａ（Stratagene）などを、その他のグラム陰性細菌では、ｐＢＢＲ１２２（Mobiotech）、ｐＢＨＲ１（Mobiotech）などを、バチルス属細菌ではｐＨＷ１５２０（Mobiotech）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）などを、放線菌では、ｐＳＨ１９（Herai et. al, Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 14031-14035, 2004）、ｐＩＪ７０２（John Innes Centre）、ｐＩＪ９４３（John Innes Centre）、ｐＩＪ８６００（John Innes Centre）、ｐＩＪ６０２（John Innes Centre）１、ｐＴｉｐ−ｖｅｃｔｏｒｓ（Nakashima et. al, Appl. Environ. Microbiol., 70, 5557-5568, 2004）、ｐＴＹＭ１９（Onaka et. al, J. Antibiot., 56, 950-956, 2003）などを、真菌では、ｐＡＯ８１５（Invitrogen）、ｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ），ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）、ｐＡＵＲ３１６（タカラバイオ）などが使用できる。【００４０】
前述のような宿主ベクターによりｖｄｈ遺伝子を発現させ、水酸化活性を現出させるには、ＶＤＨへ効率よく電子伝達が可能なレドックスパートナータンパク質（より具体的には、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素)をコードする遺伝子を共に発現させることが好ましい。その理由として宿主によっては内在性のレドックスパートナータンパク質がＶＤＨへ電子伝達できず、水酸化活性を発現できないことが懸念されるためである。【００４１】
ｖｄｈ遺伝子と共発現させるために適したレドックスパートナータンパク質の遺伝子として、例えば、アシネトバクタ一・スピーシズ  ＯＣ４(Acinetobacter sp. OC4)、ロドコッカス・エリスロポリス由来のものの他にもホウレンソウ由来のものを挙げることができるが、好ましい例としては、ロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１株（NCAIM (P)B.001020；National Collection of Agriculture and Industrial Microorganisms （NCAIM,Budapest, Hungary））由来のレドックスパートナーである、ｔｈｃＣＤ遺伝子（Nagy et al., J. Bacteriol. vol. 177, 676-687 (1995)）またはその相同体を挙げることができる。【００４２】
ｔｈｃＣＤ遺伝子は、フェレドキシン（ＴｈｃＣ）をコードする遺伝子ｔｈｃＣと、フェレドキシン還元酵素（ＴｈｃＤ）をコードする遺伝子ｔｈｃＤとを意味し、それらの相同体は、上記文献に記載の遺伝子情報を基に適当に設計したプライマを用い、ロドコッカスに属する菌株のＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法によって容易に取得することができる。このようなレドックスパートナータンパク質の遺伝子を共発現させる発現系を利用することで、宿主内在のレドックスパートナーの適合性に制限されずに様々な宿主においてＶＤＨの強化された活性の発現が実現できる。【００４３】
形質転換生物の培養は通常、その形質転換生物の栄養培地となり得、さらに反応基質の変換に悪影響を及ぼさない培地で行う。このような培地は、適当な炭素源、窒素源、無機塩及び天然有機栄養物等により成り立っている。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、有機酸類等を単独に用いるかもしくは併用でき、その使用濃度は特に限定されず、おおよそ１〜１０％が適当である。窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物を一種または二種以上使用することができる。無機塩としては、燐酸一カリウム、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することができる。さらに、使用菌の生育促進効果を持つ有機栄養源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などが用いられ、さらにビタミン類、核酸類を少量培地に含有せしめることもできる。【００４４】
本発明の製造方法では、例えば、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）を宿主とした形質転換生物を使用する場合、前述のような生育に適した培地にて、その増殖に適する温度、例えば１０〜３５℃で培養した後に得られた培養液またはその加工物に反応基質であるビタミンＤ等を通常の濃度範囲０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で接触させ、変換反応を行わせることで、本発明の、ビタミンＤ等の水酸化体の製造法を提供できる。培養液の「加工物」とは培養液に様々な処理を施して酵素反応を効率よく行わせるための形態であって、菌体懸濁液、固定化菌体、粗精製ＶＤＨ、精製ＶＤＨ、固定化ＶＤＨ、修飾されたＶＤＨなどを含む。【００４５】
前述のようにしてｖｄｈ遺伝子を導入して得られる形質転換生物は、すでに述べたように従来よりも効率よくビタミンＤ等の水酸化体を蓄積するための能力を有している。
例えば、本発明のロドコッカス・エリスロポリスにｖｄｈ遺伝子を導入して得られた形質転換生物はｖｄｈ遺伝子の由来株であるシュードノカルディア・オートトロフィカに比べ多量のＶＤＨを発現し、生育速度も速い性質を持っていた。また、ビタミンＤ３の水酸化変換速度も向上していた。【００４６】
さらに、本発明のＶＤＨの酵素化学的データ、すなわちビタミンＤ３や２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対するＫｍ値及びＶｍａｘ値を調べることで、類似の反応を触媒する従来の水酸化酵素と比較することができる。後述の実施例１１において記述した方法にて決定したＶＤＨのビタミンＤ３と２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対するＫｍ値はそれぞれ９．１μＭと３．７μＭであり、Ｖｍａｘは２４３．９ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ  ｏｆ  ＶＤＨと５８８．２ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ  ｏｆ  ＶＤＨだった。細菌由来でビタミンＤ３と２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対して水酸化活性を持つと報告されているＰ４５０ＳＵ−１（Sawada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 320, 156-164, 2004）との活性の比較を表２に示した。
【表２】
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【００４７】
Ｖｍａｘに関して、ＶＤＨのビタミンＤ３と２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対する活性はそれぞれＰ４５０ＳＵ−１と比較して約１５倍と約１６３倍高いことが示された。また、ビタミンＤ３の２５位水酸化活性が知られているヒトＣＹＰ２７Ａ１とＶＤＨは同等の２５位水酸化活性のＶｍａｘを示した（Sawada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 320, 156-164, 2004）。さらに、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の１α位水酸化活性が知られているマウスＣＹＰ２７Ｂ１（Uchida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 323, 505-511, 2004）の約５分の１の１α位水酸化活性のＶｍａｘを示した。従ってＶＤＨは一つの酵素で高いビタミンＤ３の２５位水酸化活性と２５−ヒドロキシビタミンＤ３の１α水酸化活性の両方を有することが示された。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に何ら制限されるものではない。【００４９】
実施例１：シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）ＮＢＲＣ１２７４３株の無細胞抽出液の調製
ビタミンＤ３（以下、ＶＤ３という）水酸化体の発酵生産に使われているシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株をＬ液体培地（１．０％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム）に接種し、３日間３０℃で培養した後、終濃度５ｍｇ／ｍｌになるようにコレステロールを添加して、さらに６時間３０℃で培養した。得られた培養液を遠心機（Beckman AVANTI J-E）で６０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を集めた。培養液３Ｌから得られた菌体を１５０ｍｌのBuffer Ａ（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、１０％ グリセロール、２ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁した。その細胞懸濁液をマルチビーズショッカー細胞破砕機（安井器械社）により０．１ｍｍガラスビーズを用いて４℃で細胞破砕した。破砕条件は１分間、２５００ｒｐｍで振とうした後、１分間停止するという処理を１０サイクル行った。遠心により得られた１１０ｍｌの無細胞抽出液を１ＬのBuffer Ｂ（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、２０％ グリセロール）で２回透析を行った。析出した沈殿を３０００ｒｐｍ、１５分遠心して除き、上清を無細胞抽出液とした。【００５０】
実施例２：無細胞抽出液によるＶＤ３水酸化反応系の再構成
シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株の無細胞抽出液からDEAE Sephacelカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社）とApatite Macro-Prep Ceramicカラム（カラムボリューム：５ｍｌ；BIO-RAD社）で部分精製したＶＤＨに、１６０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３２μｇ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン（Sigma社）、０．１Ｕ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン還元酵素（Sigma社）、３Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ、２ｍＭ ＮＡＤＨ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、６０ｍＭ グルコース、１０μＭ ＶＤ３になるように加えてBuffer Ｂ中で３０℃、１６時間反応を行った。ＨＰＬＣ解析により、基質であるＶＤ３から生産された２５−ＯＨ  ＶＤ３、１α，２５−（ＯＨ）２  ＶＤ３のエリア値を求め、基質由来の全てのピークのエリア値（ＶＤ３、２５−ＯＨ  ＶＤ３、１α，２５−（ＯＨ）２  ＶＤ３）に対する水酸化体（２５−ＯＨ  ＶＤ３、１α，２５−（ＯＨ）２  ＶＤ３）のエリア値の比率を求めて変換率とした。【００５１】
実施例３：ＶＤＨの精製
透析したシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株の無細胞抽出液をBuffer Ｂにより平衡化したDEAE Sephacelカラム（カラムボリューム：２０ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテック社）に供した。吸着したタンパクは２００ｍｌのBuffer Ｂを用いて０ｍＭから８００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線グラジエントにより溶出した。得られたフラクションのＶＤＨ活性測定を行い、活性を保持するフラクションを集めた。ＶＤＨはDEAE Sephacelカラムクロマトグラフィーにおいて約４００ｍＭ 酢酸ナトリウムにより溶出された。集めたフラクション（５５ｍｌ）を７５０ｍｌのBuffer Ｃ（７．５ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０、２０％ グリセロール）で２回透析した。透析の際、析出した沈殿を遠心により除き、上清を、Buffer Ｃで平衡化したCM Sepharose（カラムボリューム：１０ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテック社）に供した。カラム吸着しなかったサンプルから再度析出した沈殿を遠心して除いたのち、この上清がＶＤＨ活性を示すことを確認した。この活性を保持するサンプル（４７ｍｌ）を１ＬのBuffer Ｄ（２ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、２０％ グリセロール）で２回透析した。透析したサンプルを、Buffer Ｄで平衡化したApatite Macro-Prep Ceramicカラム（カラムボリューム：５ｍｌ、BIO-RAD社）に供した。この時の素通り画分（７５ｍｌ）を、Buffer Ｂで平衡化したQ Sepharoseカラム（カラムボリューム：７ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテック社）に供した。吸着したタンパクは１００ｍｌのBuffer Ｂを用いて０ｍＭから８００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線グラジエントにより溶出した。得られたフラクションのＶＤＨ活性測定を行い、活性を保持するフラクションを集めた。ＶＤＨはQ Sepharoseカラムクロマトグラフィーにおいて約５５０ｍＭ 酢酸ナトリウムにより溶出された。集めた活性フラクション（２２．５ｍｌ）をAmicon Ultra 30000 MWCO（ミリポア社）を用いて限外ろ過により２ｍｌまで濃縮した。得られたサンプルをSephacryl S-100カラム（カラムボリューム：１２０ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテック社）に供し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行った。カラムクロマトグラフィーはＡＫＴＡシステム（アマシャムファルマシアバイオテック社）により行った。溶出されたフラクションのＶＤＨ活性測定を行い、活性を保持するフラクションを集めた。得られたサンプル（１．７ｍｌ）をＭｏｎｏ−Ｑカラム（カラムボリューム：１ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）に供した。カラムクロマトグラフィーはＡＫＴＡシステムを用い、吸着したタンパクは２０ｍｌのBuffer Ｂを用いて０ｍＭから８００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線グラジエントにより溶出した（図３）。得られたフラクションのＶＤＨ活性測定を行った。ＶＤＨはMono-Qカラムクロマトグラフィーにおいて５５０ｍＭ酢酸ナトリウムにより溶出された。各フラクションをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）によりタンパク質の溶出パターンを解析し、その溶出パターンとＶＤＨ活性と比較して、活性と相関のあるタンパク質バンドをＶＤＨとして同定した（図３）。Mono-Qカラムクロマトグラフィーで２つのＶＤＨ活性とヘム吸収を持つ��ークが観察され、そのどちらのフラクションにも約４５ｋＤａのＶＤＨと考えられるピークが存在した。【００５２】
実施例４：ＶＤＨのＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列決定
ＶＤＨタンパク質を含むサンプルの一つ（フラクション５１）１８０μｌに対して６０μｌの滅菌水と１２００μｌのアセトンを加え、−２０℃で１６時間冷却させてサンプル中のタンパク質を沈殿させた。１３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル緩衝液（６２．５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、１０％ グリセロール、２％ ドデシル硫酸ナトリウム、０．００１％ ブロモフェノールブルー）を２０μｌ加えてタンパク質を溶解させた。、このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動後のゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ（poly vinylidene difluoride）膜（Immobilon-P：ミリポア社）にセミドライブロッター（TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELL；BIO-RAD社）により移した。タンパク質を吸着させたＰＶＤＦ膜を染色液（０．１％ クマシーブリリアントブルーＲ−２５０、１０％ 酢酸、４０％ メタノール）で２分間染色し、脱色液（１０％ 酢酸、３０％ メタノール）でタンパク質バンドが確認できるまで脱色した。このＰＶＤＦ膜を風乾し、ＶＤＨのバンドを切り取り、エドマン法によるＮ末端アミノ酸配列解析を高感度アミノ酸シークエンサーProcise 491 cLC（Applied Biosystems社)により行った。得られたアミノ酸配列を以下に１文字表記で示した。
（Ｎ末端）−ＡＬＧＴＥＱＨＤＬＦＳＧＦＦＷＱＮＰＱＰＰＹＡＡ−（Ｃ末端）：配列番号３【００５３】
さらにＶＤＨの内部アミノ酸配列を決定する為に、アセトンにより濃縮したＶＤＨサンプル（フラクション４６）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、脱色液（２５％メタノール、８％酢酸）でタンパク質バンドが見えるまで脱色した。ＶＤＨのバンドをカッターで切り取り、リジルエンドペプチダーゼによりゲル内消化を行い、常法に従いＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）に供し、得られたペプチドを高感度アミノ酸シークエンサーProcise 494 cLC（Applied Biosystems社）により解析した。４種のペプチドが得られたが、そのうち１サンプルを解析し、以下に解析で得られた配列をアミノ酸１文字表記で示した。
（Ｎ末端）−ＬＨＧＹＬＳＤＬＬＥＲＫ−（Ｃ末端）：配列番号４【００５４】
実施例５：シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株とロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１（Rhodococcus erythropolis NI86/21）株染色体ＤＮＡの調製
Ｌ液体培地にシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株を接種し、３０℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めたその菌体からIsoplant DNA isolation kit（ニッポン・ジーン社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。同様にしてロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１株の染色体ＤＮＡを調製した。【００５５】
実施例６：ＶＤＨ遺伝子のクローニング
インバースＰＣＲ反応によりＶＤＨ遺伝子を増幅する為に、実施例４で得られたＮ末端アミノ酸配列より以下のようなミックス・プライマーを設計し作製した。
ＶＤＨ−Ｉ−１Ｆ：配列番号５
ＶＤＨ−Ｉ−１Ｒ：配列番号６
コドンのゆらぎを考慮して反応性を高めるために、以下に示した等量混合塩基を使用した。
Ｎ：Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ，Ｓ：Ｇ＋Ｃ，Ｙ：Ｃ＋Ｔ【００５６】
次に、この２種のプライマー（ＶＤＨ−Ｉ−１Ｆ及びＶＤＨ−Ｉ−１Ｒ）を用いてインバースＰＣＲ反応を行う為の鋳型の調製を行った。実施例５で調製したシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株のゲノムＤＮＡを４μｇ使用し、反応液量５０μｌ中で、制限酵素Ａａｔ II（New England Biolads社）で３７℃、２時間消化した。消化後のサンプルをQIAquick PCR purification kit（QIAGEN社）で精製し、２００μｌの溶出用緩衝液により溶出した（４μｇ  ｏｆ  ＤＮＡ／２００μｌ）。そのうち５０μｌをＬｉｎｅａｒ  ＤＮＡ鋳型として保存し、残りの１５０μｌをＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（New England Biolads社）と付属の緩衝液を加えて、１６℃、１６時間自己環状化を行った。そのサンプルをQIAquick PCR purification kitにより精製し、１００μｌの１０ｍＭ Tris ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により溶出した。自己環状化を行ったものをＣｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ鋳型とした。次いでＶＤＨ−Ｉ−１Ｆ及びＶＤＨ−Ｉ−１Ｒを用いて調製したＬｉｎｅａｒ  ＤＮＡ鋳型とＣｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ鋳型を鋳型としてインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼ（TOYOBO社）を用い、ＰＣＲ増幅装置（Applied Biosystems社、GeneAmp PCR System 2700）で変性を９４℃、１分間、アニーリングを６０℃、３０秒間、伸長を７２℃、３分間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ鋳型特異的に約１．２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａという）が増幅された。この反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した後、ＤＮＡ断片−Ａをアガロースゲルから切り出して、QIAquick Gel extraction kit（QIAGEN社）によって回収精製した。こうして精製されたＤＮＡ断片−Ａの塩基配列を解析する為にT4 polynucleotide kinase（New England Biolads社）によりＤＮＡ断片−Ａをリン酸化した。前もってＥｃｏＲＶで消化し、Calf intestine alkalinephosphatase（New England Biolads社）により脱リン酸化したpBluescript II SK(+)（TOYOBO社）にDNA Ligation kit ver 2.1（宝酒造社）を用いてリン酸化したＤＮＡ断片−Ａを連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside；４０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-thiogalactopyranoside；１００μＭ）を含むＬ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天）上で、ＤＮＡ断片−Ａを組み込んだプラスミドで形質転換された大腸菌株を選択した。この大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地で培養し、得られた菌体からQIAprep Spin Miniprep kit（QIAGEN社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行った。得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片−Ａの塩基配列１２０１ｂｐをＤＮＡシークエンサーABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて決定した。さらにＶＤＨ遺伝子の全長配列を取得する為に、ＤＮＡ断片−Ａ中のＶＤＨコード領域の配列をもとにして、新たにインバースＰＣＲ反応に用いる以下のようなプライマーを設計した。
ＶＤＨ−Ｉ−２Ｆ：配列番号７
ＶＤＨ−Ｉ−２Ｒ：配列番号８【００５７】
インバースＰＣＲ反応は、シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株のゲノムＤＮＡをＡａｔ IIの代わりにＢａｍ ＨＩで消化すること以外は前述と同様な方法で行い、その結果、約１．４ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｂという）がＣｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ鋳型特異的に増幅した。ＤＮＡ断片−Ａの場合と同様な操作を行い、ＤＮＡ断片−Ｂの配列決定を行った。塩基配列解析の結果、１４５１ｂｐの塩基配列が明らかとなった。ＤＮＡ断片−ＢはＤＮＡ断片−Ａとオーバーラップしており（図４）、ＤＮＡ断片−ＡとＤＮＡ断片−Ｂをつなぎ合わせることによって、ＶＤＨ遺伝子の全長を決定した。【００５８】
実施例７：ＶＤＨ発現ベクターｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢの構築
ｖｄｈ遺伝子を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社）を宿主として、シュードモナス・プチダ由来のｃａｍＡＢ（フェレドキシン還元酵素遺伝子及びフェレドキシン遺伝子）と共発現させるベクターを構築する為に、ＶＤＨ遺伝子を以下に示したプライマーを用いて増幅した。
ＶＤＨ−１Ｆ：配列番号９
ＶＤＨ−１Ｒ：配列番号１０【００５９】
この２種のプライマー（ＶＤＨ−１Ｆ及びＶＤＨ−１Ｒ）とＢｇｌ IIで消化したシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（TOYOBO社）を用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを６３℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｃという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｎｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＮｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉにより消化されたＤＮＡ断片−Ｃを精製した。Ｎｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉ部位を利用してシュードモナス・プチダ由来のフェレドキシン還元酵素とフェレドキシンと共発現させるベクターｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢ（Arisawa et al., 国際公開公報第２００３／０８７３８１号パンフレット）のＮｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉ部位にＤＮＡ断片−Ｃを連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（STRATAGENE社）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天培地（１．０％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム、１．５％ 寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からQIAprep Spin Miniprep kitを用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行いｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢを得た。得られたプラスミドのＤＮＡ配列を解析し、ＶＤＨ遺伝子に変異がなく、かつ同遺伝子が目的部位に挿入されていることを確認した。このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換してＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢ株を得た。【００６０】
実施例８：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢ株によるＶＤ３変換試験
実施例７で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢ株のコロニーを１０ｍｌのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地に接種し、３７℃、１６時間培養した。得られた培養液のうち５ｍｌを５００ｍｌのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＭＣＧ液体培地（０．５４％ リン酸水素二ナトリウム、０．３％ リン酸二水素カリウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、１％ カザミノ酸、０．４％ グルコース、０．０２％ 塩化マグネシウム、０．００１５％ 塩化カルシウム、１００μＭ 硫酸鉄）に接種し、３７℃で２．５時間振とう培養した。培養液に１５ｍｌ エタノールと５０ｍｌの５０％ グリセロールを添加した後、２２℃で２０分間培養し、ＩＰＴＧ（終濃度：１００μＭ）と５−アミノレブリン酸（終濃度：８０μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、２２℃で２０時間培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体は２５ｍｌのBuffer Ａに懸濁し、培養液に対して２０倍濃縮した細胞懸濁液を得た。【００６１】
ＶＤＨの発現を確認する為に、還元一酸化炭素結合差スペクトル解析（Omura et al., J. Biol. Chem., 239, 2370-2378, 1964）を行った。まず、上記の方法で得た細胞懸濁液をマルチビーズショッカー細胞破砕機（安井器械社）により０．１ｍｍガラスビーズを用いて４℃で細胞破砕した。破砕条件は３０秒間、２５００ｒｐｍで振とうした後、３０秒間停止するという処理を３サイクル行った。細胞破砕液を１２０００ｒｐｍ、１０分遠心し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液をキャップ付き試験管２本に７００μｌずつ分け、一方の無細胞抽出液に一酸化炭素を通した。次に、両方の無細胞抽出液にハイドロサルファイトナトリウムを少量添加した。一酸化炭素を通していない方のサンプルの４００ｎｍから５００ｎｍの吸収スペクトルをベースラインとして、スペクトルフォトメーター（HITACHI社、U-3210 SpectrophotoMeter）で一酸化炭素を通したサンプルの４００から５００ｎｍの吸収をスキャンした。その結果、シトクロムＰ４５０に特徴的な４５０ｎｍのピークを観察し、その吸収から培養液当たりに換算して１１３ｎＭのＶＤＨが発現していたことを示した。【００６２】
上記の方法で調製した細胞懸濁液を用いて、ＶＤ３の変換試験を行った。変換反応は２００μｌの２０倍濃縮細胞懸濁液に７７５μｌのBuffer Ｂ、５．２μｌの１００ｍＭ ＶＤ３、２０μｌの１０％ ＲＭＣＤ（Randomly substituted Methyl-β-cyclodextrin；塩水港精糖社）を添加し、３０℃で１６時間反応させた。ＶＤ３変換反応に用いたＲＭＣＤはＨＶＤ生産の際に使用される添加剤である。反応後、１．５ｍｌと０．７５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出を行い、酢酸エチル相を集めてエバポレーターにより乾固した。その残渣に１５０μｌのメタノールを加えてＨＰＬＣ分析によりＶＤ３の水酸化体の検出を行った。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＹＭＣ社Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（Ｉ．Ｄ．４．６×７５ｍｍ）
移動相：（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル
（Ａ）と（Ｂ）のグラジエントで、タイムプログラムは以下のように行った。
【表３】
2007138894.tif 000004
流速：１．０ｍｌ／分
波長：２７５ｎｍ
カラム温度：４０℃【００６３】
ＨＰＬＣ解析の結果、ＶＤ３の水酸化体は観察されなかった。ＶＤＨと共発現させたＣａｍＡ（フェレドキシン還元酵素）とＣａｍＢ（フェレドキシン）からのＶＤＨに対する電子伝達が起こっていない可能性が考えられたので、形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢ株の無細胞抽出液を調製し、ＶＤ３変換試験を行った。上記の方法で形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｃａｍＡＢ株の無細胞抽出液を調製し、それをＶＤＨ酵素液として１６０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３２μｇ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン還元酵素、３Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ（TOYOBO社）、２ｍＭ ＮＡＤＨ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、６０ｍＭ グルコース、１０μＭ ＶＤ３を加えてBuffer Ｂ中で変換反応を行った。変換反応は３０℃で１６時間行った。反応後、１．５ｍｌと０．７５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出を行い、酢酸エチル相を集めてエバポレーターにより乾固した。その残渣に１５０μｌのメタノールを加えてＨＰＬＣ分析によりＶＤ３の水酸化体の検出を行った。ＨＰＬＣ解析の結果、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（以下、ＨＶＤという）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、ＤＨＶＤという）、１α，１７，２５−トリヒドロキシビタミンＤ３（以下、ＴＨＶＤという）が検出された。この結果より、シュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株より精製し、クローニングしたＶＤＨはＶＤ３からＨＶＤ、ＤＨＶＤ、ＴＨＶＤへ変換する酵素であることが明らかとなった。【００６４】
実施例９：ヒスチジンタグ融合ＶＤＨ（以下、ＶＤＨ−Ｈｉｓという）発現ベクターｐＥＴ２９−ＶＤＨの構築
ＶＤＨの基質特異性解析や反応速度論的解析を行う為に、ＶＤＨをヒスチジンタグ融合タンパクとして発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにより精製した。まずは発現ベクターを構築した。ＶＤＨ遺伝子を増幅する為に、以下に示したプライマーを構築した。
ＶＤＨ−１Ｆ：配列番号９
ＶＤＨ−２Ｒ：配列番号１１【００６５】
次に、この２種のプライマー（ＶＤＨ−１Ｆ及びＶＤＨ−２Ｒ）を用いて、予めＢｇｌ IIで消化したシュードノカルディア・オートトロフィカ  ＮＢＲＣ１２７４３株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はＰｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを６３℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｄという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｎｄｅ ＩとＸｈｏＩにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＮｄｅ ＩとＸｈｏＩにより消化されたＤＮＡ断片−Ｄを精製した。次に、予めＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉにより消化して精製したｐＥＴ２９ｂ（Novagen社）にDNA Ligation kit ver. 2.1を用いてＤＮＡ断片−Ｄを連結し、大腸菌を形質転換した。その後、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からQIAprep Spin Miniprep kitを用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行いｐＥＴ２９−ＶＤＨを得た。得られたプラスミドのＤＮＡ配列を解析し、ＶＤＨ遺伝子に変異がなく、かつ同遺伝子が目的部位に挿入されていることを確認した。このプラスミドで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２９−ＶＤＨ株を得た。【００６６】
実施例１０：ＶＤＨ−Ｈｉｓの精製
実施例９で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２９−ＶＤＨ株のコロニーを１０ｍｌのカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地に接種し、３７℃、１６時間培養した。得られた培養液のうち５ｍｌを５００ｍｌのカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＭＣＧ液体培地に接種し、３７℃で２．５時間振とう培養した。培養液に１５ｍｌエタノールと５０ｍｌの５０％グリセロールを添加した後、２２℃で２０分間培養し、ＩＰＴＧ（終濃度：１００μＭ）と５−アミノレブリン酸（終濃度：８０μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、２２℃で２０時間培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体は２５ｍｌのBuffer Ａに懸濁し、形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２９−ＶＤＨの細胞懸濁液（培養液に対して２０倍濃縮）を得た。
ヒスチジンタグを融合させてもＶＤＨが機能的に発現しているか確かめる為に、還元一酸化炭素結合差スペクトル解析を行った。その結果、明瞭な４５０ｎｍのピークが確認され、その吸収から１６３ｎＭ（培養液当たり）のＶＤＨ−Ｈｉｓが機能的に発現していることが示された。【００６７】
ＶＤＨ−Ｈｉｓを精製する為に、２２ｍｌの形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２９−ＶＤＨの細胞懸濁液（培養液に対して２０倍濃縮）をマルチビーズショッカー細胞破砕機（安井器械社）により０．１ｍｍガラスビーズを用いて４℃で細胞破砕した。破砕条件は３０秒間、２５００ｒｐｍで振とうした後、３０秒間停止するという処理を３サイクル行った。細胞破砕液を３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を酵素液として、１６０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３２μｇ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン還元酵素、３Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ、２ｍＭ ＮＡＤＨ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、６０ｍＭ グルコース、１０μＭ ＶＤ３を加えてBuffer Ｂ中で変換反応を行った。上述の方法で抽出及びＨＰＬＣ解析を行った結果、ＨＶＤ、ＤＨＶＤ、ＴＨＶＤの生成が観察された（図６Ａ）。【００６８】
この形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２９−ＶＤＨの無細胞抽出液（１６ｍｌ）を５００ｍｌのBuffer Ｂで２回透析した。遠心により透析の際に析出した沈殿を除き、その上清をBuffer Ｂで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（カラムボリューム：２ｍｌ；QIAGEN社）に供した。吸着したタンパクは１００ｍｌのBuffer Ｂを用いて０ｍＭから３００ｍＭのイミダゾールの直線グラジエントにより溶出した。ＶＤＨ−Ｈｉｓは約４５ｍＭイミダゾールで溶出された。ＶＤＨ−Ｈｉｓのフラクションを集め（１９ｍｌ）、イミダゾールを除く為に５００ｍｌのBuffer Ｂで３回透析した。精製されたＶＤＨ−Ｈｉｓ溶液は還元一酸化炭素結合差スペクトルにより酵素の濃度が２５９０ｎＭであることが示された。ＶＤＨ−Ｈｉｓ精製酵素を用いてＶＤ３変換試験を３０℃、３時間行った結果、ＨＶＤ、ＤＨＶＤ、ＴＨＶＤの生成が観察された（図６Ｂ）。本精製酵素液は使用するまで−２０℃で保存した。【００６９】
実施例１１：ＶＤＨの反応速度論的解析
実施例１０で調製したＶＤＨ−Ｈｉｓ精製酵素を用いて、ＶＤ３に対する２５位水酸化活性とＨＶＤに対する１α位水酸化活性の酵素反応速度論的解析を行った。反応液は１ｍｌ Buffer Ｂ中で２５９ｐｍｏｌ／ｍｌ ＶＤＨ−Ｈｉｓ、９６μｇ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン還元酵素、３２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ、６０ｍＭ グルコース、基質、２ｍＭ ＮＡＤＨと２ｍＭ ＮＡＤＰＨとなるように調製した。基質濃度は０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、１００μＭとし、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの添加により反応を開始した。反応は１８０ｒｐｍ、３０℃で１０分行った。１．５ｍｌ酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、１．５ｍｌ酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、１００μｌメタノールで残渣を溶解した。実施例８に示した条件と同様にしてＨＰＬＣ解析を行い、生成物の定量するために水酸化体の検量線を作成した。調製したサンプルのＨＰＬＣ解析を行い、検量線を用いて反応により生成したＨＶＤとＤＨＶＤを定量した。ＶＤ３を基質として２５位の水酸化活性を測定した際に、ＨＶＤの生成とともにＤＨＶＤの生成も確認された。２５位の水酸化活性は単位時間（１分間）に得られたＨＶＤとＤＨＶＤ量の和として計算した。得られた結果をもとに、基質をＶＤ３とＨＶＤとした場合の基質濃度と活性（ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ ｏｆ ＶＤＨ：１ｍｏｌのＶＤＨが１分間に触媒するｍｍｏｌ基質量）の関係図を作成した（図７）。さらに、Lineweaver-Burkプロット（逆数プロット）図を作成して、ＶＤＨのＶＤ３とＨＶＤに対するＫｍ値とＶｍａｘ値を求めた（図８）。ＶＤＨのＶＤ３とＨＶＤに対するＫｍ値は９．１μＭと３．７μＭであり、Ｖｍａｘは２４３．９ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ ｏｆ ＶＤＨと５８８．２ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ ｏｆ ＶＤＨだった。【００７０】
実施例１２：ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）におけるＶＤＨ発現プラスミドｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨの構築
ｐＴｉｐＱＴ２（Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 5557-5568, 2004）のＮｄｅ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉサイトに、実施例７で調製したＮｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉで消化されたＶＤＨ遺伝子断片（ＤＮＡ断片−Ｃ）をDNA Ligation Kit ver 2.1を用いて連結し、約９．４ｋｂｐのプラスミドｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨを構築した（図９）。【００７１】
実施例１３：ロドコッカス・エリスロポリスにおけるｖｄｈ遺伝子とｔｈｃＣＤ遺伝子の共発現プラスミドｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの構築
ロドコッカス・エリスロポリス  ＮＩ８６／２１株由来のフェレドキシン（ＴｈｃＣ）とフェレドキシン還元酵素（ＴｈｃＤ）（Nagy et al., J. Bacteriol. 676-687, 1995）をコードする遺伝子（ｔｈｃＣＤ）をクローニングするために以下のプライマー（ＴｈｃＣＤ−１ＦとＴｈｃＣＤ−１Ｒ）を設計した。
ＴｈｃＣＤ−１Ｆ：配列番号１２
ＴｈｃＣＤ−１Ｒ：配列番号１３【００７２】
次に、この２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ−１ＦとＴｈｃＣＤ−１Ｒ）と実施例５で調製されたロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＮＩ８６／２１のゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５５℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｅという）が増幅された。QIAquick PCR purification kit精製し、Ｈｉｎｄ IIIとＢａｍＨ Ｉにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＨｉｎｄ IIIとＢａｍＨ Ｉにより消化されたＤＮＡ断片−Ｅを精製し、Ｈｉｎｄ IIIとＢａｍＨ Ｉにより消化したｐＵＣ１８（TOYOBO社）にDNA Ligation Kit ver 2.1を用いて連結し、プラスミドｐＵＣ１８−ｔｈｃＣＤを得た。【００７３】
ＴｈｃＣＤをコードする遺伝子中に存在するＮｄｅ Ｉサイトを除去する為に以下に示した２種のプライマーを設計し、インバースＰＣＲを行った。
ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−１Ｆ：配列番号１４
ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−１Ｒ：配列番号１５
上述の２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−１ＦとＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−１Ｒ）を用いてｐＵＣ１８−ｔｈｃＣＤを鋳型としてインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応はＰｆｕ  ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９４℃、１分間、アニーリングを５０℃、１分間、伸長を７２℃、７分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約４．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｆという）が増幅された。インバースＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ｆを含む反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。この４．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片−Ｆをアガロースゲルから切り出して、QIAquick Gel extraction kit（QIAGEN社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−ＦをT4 polynucleotide kinaseによりリン酸化し、DNA Ligation Kit ver 2.1を用いて自己環状化を行いｐＵＣ１８−ｔｈｃＣＤ−１を得た。ＤＮＡシークエンス解析によりｔｈｃＣＤ遺伝子中のＮｄｅ Ｉサイト（ＣＡＴＡＴＧ）が非認識部位（ＣＡＣＡＴＧ）に置換されていることを確認した。【００７４】
ｐＵＣ１８−ｔｈｃＣＤ−１からｔｈｃＣＤ遺伝子をクローニングする為に以下のプライマーを構築した。
ＴｈｃＣＤ−２Ｆ：配列番号１６
ＴｈｃＣＤ−１Ｒ：配列番号１３
次に、この２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ−２ＦとＴｈｃＣＤ−１Ｒ）とｐＵＣ１８−ｔｈｃＣＤ−１を鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５５℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｇという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｎｄｅ ＩとＢａｍＨ Ｉにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＮｄｅ ＩとＢａｍＨ Ｉにより消化されたＤＮＡ断片−Ｇを精製し、Ｎｄｅ ＩとＢａｍＨ Ｉにより消化したｐＮｉｔＲＣ２（Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 5557-5568, 2004）にDNA Ligation Kit ver 2.1を用いて連結し、プラスミドｐＮｉｔＲＣ−ｔｈｃＣＤを得た。【００７５】
ｔｈｃＣＤ遺伝子の５’側上流に存在するｐＮｉｔＲＣ２由来のリボソーム結合部位配列とｔｈｃＣＤ遺伝子配列をクローニングする為に以下のプライマーを構築した。
ＴｈｃＣＤ−３Ｆ：配列番号１７
ＴｈｃＣＤ−２Ｒ：配列番号１８
次に、この２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ−３ＦとＴｈｃＣＤ−２Ｒ）とｐＮｉｔＲＣ−ｔｈｃＣＤを鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５５℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｈという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｘｂａ ＩとＥｃｏＲ Ｉにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＸｂａＩとＥｃｏＲＩにより消化されたＤＮＡ断片−Ｈを精製し、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩにより消化したｐＵＣ１８にDNA Ligation Kit ver 2.1により連結し、プラスミドｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤを得た。【００７６】
ｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤにおいてリボソーム結合部位とｔｈｃＣＤ遺伝子の間に存在するＮｄｅ  Ｉサイトを除去する為に以下に示した２種のプライマーを設計し、インバースＰＣＲを行った。
ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−２Ｆ：配列番号１９
ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−２Ｒ：配列番号２０
上述の２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−２Ｆ  とＴｈｃＣＤ  ＩＰＣＲ−２Ｒ）を用いてｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤを鋳型としてインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応はＰｆｕ  ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９４℃、１分間、アニーリングを５０℃、１分間、伸長を７２℃、７分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約４．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｉという）が増幅された。インバースＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ｉを含む反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。この４．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片−Ｉをアガロースゲルから切り出して、QIAquick Gel extraction kitによって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−ＩをT4 polynucleotide kinaseによりリン酸化し、DNA Ligation Kit ver 2.1を用いて自己環状化を行いｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤ−１を得た。ＤＮＡシークエンス解析によりリボソーム結合部位とｔｈｃＣＤ遺伝子の間に存在するＮｄｅ Ｉサイト（ＣＡＴＡＴＧ）が非認識部位（ＣＡＣＡＴＧ）に置換されていることを確認した。【００７７】
ｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤ−１からリボソーム結合部位を含むＴｈｃＣＤをコードする遺伝子をクローニングする為に以下のプライマーを構築した。
ＴｈｃＣＤ−４Ｆ：配列番号２１
ＴｈｃＣＤ−３Ｒ：配列番号２２
次に、この２種のプライマー（ＴｈｃＣＤ−４ＦとＴｈｃＣＤ−３Ｒ）とｐＵＣ１８−ＲＢＳ−ｔｈｃＣＤ−１を鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５５℃、３０秒間、伸長を７２℃、２分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｊという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｓｐｅ ＩとＢｇｌ IIにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＳｐｅ ＩとＢｇｌ IIにより消化されたＤＮＡ断片−Ｊを精製した。【００７８】
Ｎｄｅ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｂｇｌ II部位の順でクローニング部位を持つチオストレプトン誘導型プラスミドを構築する目的で以下に示すリンカーを設計した。
Ｌｉｎｋｅｒ  ＮＳＢＳ−１：配列番号２３
Ｌｉｎｋｅｒ  ＮＳＢＳ−２：配列番号２４
終濃度がそれぞれ５ｐｍｏｌ／μｌになるようにＬｉｎｋｅｒ  ＮＳＢＳ−１ＦとＬｉｎｋｅｒ  ＮＳＢＳ−１Ｒを混合し、９８℃で加熱した後、３０分間かけて３０℃まで冷却した。このリンカーをＮｄｅ ＩとＳａｌ Ｉで消化したｐＴｉｐＱＴ２（Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 5557-5568, 2004）とDNA Ligation Kit ver 2.1を用いて連結し、ｐＴｉｐＱＴ−ＮＳＢＳを得た。
上記のＳｐｅ ＩとＢｇｌ ＩＩにより消化されたＤＮＡ断片−ＪをＳｐｅ ＩとＢｇｌ ＩＩで消化したｐＴｉｐＱＴ−ＮＳＢＳとDNA Ligation Kit ver 2.1により連結し、ｐＴｉｐＱＴ−ＮＳ−ｔｈｃＣＤを得た。
ｐＴｉｐＱＴ−ＮＳ−ｔｈｃＣＤのＮｄｅ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉサイトに、実施例７で調製したＮｄｅ ＩとＳｐｅ Ｉで消化されたＶＤＨ遺伝子断片（ＤＮＡ断片−Ｃ）をDNA Ligation Kit ver 2.1を用いて連結し、約１０．９ｋｂｐのプラスミドｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤを構築した（図９）。【００７９】
実施例１４：ｐＴｉｐＱＴ２、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤによるロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３２０１株の形質転換
ロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３２０１株をＬ液体培地１００ｍｌにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養した。培養液を３０分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収した。これに１００ｍｌの氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収した。これに１００ｍｌの氷冷１０％グリセロール溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収した。この氷冷１０％グリセロール溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を５ｍｌの氷冷１０％グリセロール溶液に懸濁した。４００μｌずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。−８０℃から菌体を取り出し、氷上にて融解し、プラスミドｐＴｉｐＱＴ２、またはｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ、またはｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤを３μｌ（それぞれ約３００ｎｇ）加えた。この菌体とＤＮＡの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad社：０．２ｃｍギャップキュベット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて、電場強度１２．５ｋＶ／ｃｍで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス２５μＦ、外部抵抗４００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍｌのＬ液体培地に混合し、３０℃にて２時間培養した後集菌し、２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン入りＬ寒天培地（寒天濃度１．５％）に塗布し、３０℃にて３日間培養し、それぞれのプラスミドの形質転換体を得た。【００８０】
実施例１５：ロドコッカス・エリスロポリス形質転換体によるＶＤ３変換試験
実施例１４にて作製したロドコッカス・エリスロポリス  ＪＣＭ  ３２０１株の形質転換体を８μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２０ｍｌのＬ液体培地で３０℃にて培養し、６００ｎｍの波長で測定したオプティカルデンシティー（ＯＤ  ６００）が０．８になった時点で、終濃度１μｇ／ｍｌになるようにチオストレプトン（溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え、ＶＤＨ、ＴｈｃＣ、ＴｈｃＤを誘導させた。２４時間後培養液を遠心して集菌した。４ｍｌのBuffer Ａを加えよく撹拌し、細胞懸濁液を得た（培養液に対して５倍濃縮）。調製した形質転換体の細胞懸濁液を用いて、ＶＤ３変換試験を行った。変換反応は２００μｌの形質転換体の細胞懸濁液に７６７μｌのBuffer Ｂ、１３μｌの１００ｍＭ ＶＤ３、２０μｌの１０％ ＲＭＣＤ（Randomly substituted Methyl-β-cyclodextrin）を添加し、３０℃で１８時間反応させた。ＶＤ３変換反応に用いたＲＭＣＤはＨＶＤ生産の際に使用される添加剤である。反応後、１．５ｍｌと０．７５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出を行い、酢酸エチル相を集めてエバポレーターにより乾固した。その残渣に１５０μｌのメタノールを加えてＨＰＬＣ分析によりＶＤ３の水酸化体の検出を行った（図１０）。変換の結果、ＶＤＨ発現株ではＨＶＤの生産が確認され、その濃度を定量した。形質転換体の細胞懸濁液より無細胞抽出液を調製し、還元一酸化炭素結合差スペクトル解析によりＶＤＨの発現量を定量するとｐＴｉｐＱＴ２、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤにより形質転換された株の培養液あたりのＶＤＨ発現量はそれぞれ０、１７４７、１２５６ｎＭであった。ＶＤＨ発現量で水酸化体の生成活性を補正すると、発現したＶＤＨあたりの比活性はｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨとｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤで形質転換された株でそれぞれ２０．２と１１９．２ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｏｌ ｏｆ ＶＤＨであった。この結果より、比活性がＶＤＨとＴｈｃＣＤの共発現によりＶＤＨを単独で発現したときの約６倍上昇することが示された（表４）。
【表４】
2007138894.tif 000005
【００８１】
実施例１６：大腸菌におけるＶＤＨとＴｈｃＣＤの共発現プラスミドｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの構築
ｖｄｈ遺伝子とｔｈｃＣＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する為に以下のプライマーを構築した。
ＶＤＨ−１Ｆ：配列番号９
ＴｈｃＣＤ−３Ｒ：配列番号２２
次に、この２種のプライマー（ＶＤＨ−１ＦとＴｈｃＣＤ−３Ｒ）と実施例１５で作製したｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤを鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５５℃、３０秒間、伸長を７２℃、３分間行う３段階の反応を２５回繰り返した。その結果、約３．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｋという）が増幅された。QIAquick PCR purification kitで精製し、Ｎｄｅ ＩとＢｇｌ IIにより消化した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけて分画し、約３．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。QIAquick Gel extraction kitによりＮｄｅ ＩとＢｇｌ IIにより消化されたＤＮＡ断片−Ｋを精製し、Ｎｄｅ ＩとＢｇｌ IIにより消化したｐＥＴ２９ｂにDNA Ligation Kit ver 2.1により連結し、プラスミドｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤを得た。このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／を形質転換して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤ株を得た。【００８２】
実施例１７：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤ株によるＶＤ３変換試験
実施例１６で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤ株のコロニーを２ｍｌのカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地に接種し、３７℃、１６時間培養した。得られた培養液のうち２５０μｌを２５ｍｌのカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬ液体培地に接種し、３７℃で２．５時間振とう培養した。培養液に７５０μｌエタノールと２．５ｍｌの５０％グリセロールを添加した後、２２℃で２０分間培養し、ＩＰＴＧ（終濃度：１００μＭ）と５−アミノレブリン酸（終濃度：８０μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、２２℃で２０時間培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体は５ｍｌのBuffer Ａに懸濁し、形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの細胞懸濁液（培養液に対して５倍濃縮）を得た。【００８３】
ＶＤＨの発現を確認する為に、還元一酸化炭素結合差スペクトル解析（Omura et al., J. Biol. Chem., 239, 2370-2378, 1964）を行った。まず、上記の方法で得た形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの細胞懸濁液をマルチビーズショッカー細胞破砕機（安井器械社）により０．１ｍｍガラスビーズを用いて４℃で細胞破砕した。破砕条件は３０秒間、２５００ｒｐｍで振とうした後、３０秒間停止するという処理を３サイクル行った。細胞破砕液を１２０００ｒｐｍ、１０分遠心し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液をキャップ付き試験管２本に７００μｌずつ分け、一方の無細胞抽出液に一酸化炭素を通した。次に両方の無細胞抽出液にハイドロサルファイトナトリウムを少量添加した。一酸化炭素を通していない方のサンプルの４００ｎｍから５００ｎｍの吸収スペクトルをベースラインとして、スペクトルフォトメーター（HITACHI社、U-3210 SpectrophotoMeter）で一酸化炭素を通したサンプルの４００から５００ｎｍの吸収をスキャンした。解析の結果、シトクロムＰ４５０に特徴的な４５０ｎｍのピークを観察し、その吸収から２５８ｎＭ（培養液当たり）のＶＤＨが発現していたことを示した。【００８４】
上記の方法で調製した形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの細胞懸濁液を用いて、ＶＤ３の変換試験を行った。変換反応は２００μｌの形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの細胞懸濁液（培養液に対して５倍濃縮）に７６７μｌのBuffer Ｂ、１３μｌの２０ｍＭ ＶＤ３、２０μｌの１０％ ＲＭＣＤ（Randomly substituted Methyl-β-cyclodextrin）を添加し、３０℃で１９時間反応させた。コントロールとして宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤと同じ条件で培養した細胞を用いた。ＶＤ３変換反応に用いたＲＭＣＤはＨＶＤ生産の際に使用される添加剤である。反応後、１．５ｍｌと０．７５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出を行い、酢酸エチル相を集めてエバポレーターにより乾固した。その残渣に１５０μｌのメタノールを加えてＨＰＬＣ分析（実施例８と同様）によりＶＤ３の水酸化体の検出を行った。
ＨＰＬＣ解析の結果、ＨＶＤの生成が観察された（図１１）。この結果より、ｖｄｈ遺伝子とｔｈｃＣＤ遺伝子を共発現させることにより、大腸菌を宿主としてＶＤ３の水酸化が可能であることが示された。【００８５】
実施例１８：ＶＤＨによるビタミンＤ２（ＶＤ２）及び７−デヒドロコレステロール（7-dehydrocholesterol）の水酸化試験
実施例１０で調製したＶＤＨ−Ｈｉｓ精製酵素を用いて、ＶＤ２及び7-dehydrocholesterolの変換を行った。反応液は１ｍｌ Buffer Ｂ中で２５９ｐｍｏｌ／ｍｌ ＶＤＨ−Ｈｉｓ、３２μｇ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌ ホウレンソウ由来フェレドキシン還元酵素、２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、３Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ、６０ｍＭ グルコース、２０μＭ基質（ＶＤ２、２５−ＯＨ  ＶＤ２、7-dehydrocholesterol）、２ｍＭ  ＮＡＤＨと２ｍＭ ＮＡＤＰＨとなるように調製した。7-dehydrocholesterolの変換溶液にのみ０．００４％ＲＭＣＤを添加した。反応はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの添加により開始し、１８０ｒｐｍ、３０℃でＶＤ２変換は６０分、7-dehydrocholesterol変換は９０分行った。１．５ｍｌ酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、０．７５ｍｌ酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、１００μｌメタノールで残渣を溶解した。ＨＰＬＣ分析によりＶＤ２及び7-dehydrocholesterolの水酸化体の検出を行った。【００８６】
ＨＰＬＣ条件（ＶＤ２）
カラム：ＹＭＣ社Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（Ｉ．Ｄ．４．６×７５ｍｍ）
移動相：（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル
（Ａ）と（Ｂ）のグラジエントで、タイムプログラムは以下のように行った。
【表５】
2007138894.tif 000006
流速：１．０ｍｌ／分
波長：２６５ｎｍ
カラム温度：４０℃
ＨＰＬＣ条件（7-dehydrocholesterol）
カラム：ＹＭＣ社Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（Ｉ．Ｄ．４．６×７５ｍｍ）
移動相：（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル
（Ａ）と（Ｂ）のグラジエントで、タイムプログラムは以下のように行った。
【表６】
2007138894.tif 000007
流速：１．０ｍｌ／分
波長：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃【００８７】
ＨＰＬＣ解析の結果より、ＶＤ２を基質としてＶＤＨによる変換を行うと２５−ＯＨ  ＶＤ２が生成することが示された。そして２５−ＯＨ  ＶＤ２を基質としてＶＤＨによる変換を行うと、２５，２８−（ＯＨ）２  ＶＤ２と２５，２６−（ＯＨ）２  ＶＤ２が生成することが示された（図１２）。また、ＶＤＨによる７−dehydrocholesterolの変換において２５−ＯＨ−７−dehydrochoelsterolが生成することが示された（図１３）。これらの結果から、ＶＤＨは様々なステロイド骨格を持つ化合物の水酸化体生産に利用できることが示された。【００８８】
実施例１９：ｖｄｈ遺伝子の相同遺伝子の取得
ｖｄｈ遺伝子またはその相同遺伝子断片を増幅する為に以下のプライマーを構築した。
ＶＤＨ−１０１Ｆ：配列番号２５
ＶＤＨ−１０６Ｒ：配列番号２６
次に、この２種のプライマーと実施例５に記載された方法と同様な方法で、シュードノカルディア属放線菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応はＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅装置により変性を９５℃５分間行った後、９８℃、３０秒間、５２℃、３０秒間、７２℃、２分間で行う３段階の反応を３０回繰り返した。この増幅反応後、反応液４μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動した。その結果、試験したすべての菌株で約１．２ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片が増幅された。試験した菌株は以下リストに記載した３８株である。本リストにおいて「Pseudonocardia」を「P.」と略す。
【表７】
2007138894.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）ＮＢＲＣ１２７４３株によるビタミンＤ３水酸化反応の概略を表わす説明図。
【図２】ビタミンＤ水酸化酵素（ＶＤＨ）活性に対する酢酸ナトリウム濃度の影響を示すグラフ。
【図３】Mono-Qカラムクロマトグラフィーの溶出パターンをフラクション番号に対する吸光度変化として示すグラフ。
【図４】SDS-PAGEによる精製ＶＤＨの解析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図５】ＶＤＨをコードする遺伝子のクローニングを示す模式図。
【図６】ＶＤＨ−Ｈｉｓ発現株の無細胞抽出液（図６Ａ）及び精製ＶＤＨ−Ｈｉｓ（図６Ｂ）によるビタミンＤ３変換試験のＨＰＬＣ解析結果を示すチャート。
【図７】基質濃度とＶＤＨ活性の関係を示すグラフ。
【図８】ビタミンＤ３２５位水酸化活性と２５−ＯＨビタミンＤ３１α位水酸化活性のLineweaver-Burkプロット（逆数プロット）を示すグラフ。
【図９】ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）を宿主としたＶＤＨ発現用プラスミドｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ及びｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤの構築を表す模式図。
【図１０】ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）を宿主とした組み換えＶＤＨ（ｐＴｉｐＱＴ２（図１０ａ）、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ（図１０ｂ）、ｐＴｉｐＱＴ−ＶＤＨ−ｔｈｃＣＤ（図１０ｃ））によるビタミンＤ３変換試験のＨＰＬＣ解析結果を示すチャート。
【図１１】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（図１１ａ）及びｐＶＤＨ−ｔｈｃＣＤ（図１１ｂ）株によるビタミンＤ３変換試験のＨＰＬＣ解析結果を示すチャート。
【図１２】ＶＤＨによるビタミンＤ２及び２５−ＯＨビタミンＤ２変換試験のＨＰＬＣ解析結果を示すチャート（ａは対照試験のチャート）。
【図１３】ＶＤＨによる７−デヒドロコレステロール（7-dehydrocholesterol）変換試験のＨＰＬＣ解析結果を示すチャート（ａは対照試験のチャート）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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