(57)【要約】  本発明は、抗酸化力に優れ安全で汎用性が高い酸化防止法を提供することを目的とする。本発明は、フェノール性化合物を揮発可能な状態で対象物質と共存させることを含む酸化防止方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール性化合物を揮発可能な状態で対象物質と共存させることを含む酸化防止方法。
【請求項２】
フェノール性化合物が、以下の式I：
【化１】
2007110924.tif 000007
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表される化合物である、請求項１記載の酸化防止方法。
【請求項３】
対象物質が油性成分または油性成分を含む物質である、請求項１または２記載の酸化防止方法。
【請求項４】
フェノール性化合物が、グアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、イソオイゲノールおよび２，４，６−トリメチルフェノールからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の酸化防止方法。
【請求項５】
以下の式I：
【化２】
2007110924.tif 000008
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表されるフェノール性化合物を含む、酸化防止剤。
【請求項６】
油性成分または油性成分を含む物質の酸化を防止するための請求項５記載の酸化防止剤。
【請求項７】
グアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、イソオイゲノールおよび２，４，６−トリメチルフェノールからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項５または６記載の酸化防止剤。
【請求項８】
フェノール性化合物が揮発可能な状態にある、請求項５〜７のいずれか１項記載の酸化防止剤。
【請求項９】
被検物質の揮発状態での抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、
ｂ）該溶液および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法
【請求項１０】
被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）リノール酸とβ−カロテンとを添加した油性成分の吸光度を測定する工程、
ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、油性成分の吸光度を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法。
【請求項１１】
被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、
ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定したマロンジアルデヒド量とｃの工程で測定したマロンジアルデヒド量の差を算出する工程、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノール性化合物を揮発させて用いる酸化防止方法、フェノール性化合物を含む酸化防止剤、および被検物質の揮発状態での抗酸化能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂および油脂食品を長期保存すると、空気中の酸素によって酸化され、色調や風味が損なわれる。不飽和脂肪酸を多く含む植物油や魚油はとくに酸化されやすい。油脂の酸化で過酸化脂質が生じ、その過剰摂取は毒性が懸念されている。したがって、食品、特に油脂を含む食品の酸化防止法が重要となる。【０００３】
食品の酸化防止法として、現在、酸化防止剤が多用されている。酸化防止剤としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、トコフェロール（ビタミンＥ）およびフラボノイド等の天然酸化防止剤、ならびにブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の合成酸化防止剤が知られている。しかし、アスコルビン酸は水溶性化合物であり、油脂食品には使用しにくい。トコフェロールは抗酸化力がさほど高くなく、他の酸化防止剤と併用する必要がある。フラボノイドは着色性があり、使用量が限られる。ＢＨＡやＢＨＴなどの合成酸化防止剤は、安全性の問題から食品や医薬品への使用が制限されている。こうした背景から、従来の酸化防止剤に代わる、優れた酸化防止剤の開発が望まれていた。【０００４】
なお、空気中に抗酸化作用のある１，８−シネオールを揮発させて浮遊させ、ヒトの体内に取り込ませるという方法が報告されている（Y. Saito et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 781-786 (2004)、特開2005-110760）。しかし、揮発させた１，８−シネオールの生体に対する抗酸化能は十分なものとはいえない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、抗酸化力に優れ安全で汎用性が高い酸化防止法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、フェノール性化合物を揮発可能な状態で用いることにより優れた抗酸化効果が発揮されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）フェノール性化合物を揮発可能な状態で対象物質と共存させることを含む酸化防止方法。
【０００９】
（２）フェノール性化合物が、以下の式I：
【化１】
2007110924.tif 000002
【００１０】
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表される化合物である、（１）記載の酸化防止方法。
【００１１】
（３）対象物質が油性成分または油性成分を含む物質である、（１）または（２）記載の酸化防止方法。
【００１２】
（４）フェノール性化合物が、グアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、イソオイゲノールおよび２，４，６−トリメチルフェノールからなる群から選択される少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれかに記載の酸化防止方法。
【００１３】
（５）以下の式I：
【化２】
2007110924.tif 000003
【００１４】
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表されるフェノール性化合物を含む、酸化防止剤。
【００１５】
（６）油性成分または油性成分を含む物質の酸化を防止するための（５）記載の酸化防止剤。
【００１６】
（７）グアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、イソオイゲノールおよび２，４，６−トリメチルフェノールからなる群から選択される少なくとも１種を含む、（５）または（６）記載の酸化防止剤。
【００１７】
（８）フェノール性化合物が揮発可能な状態にある、（５）〜（７）のいずれかに記載の酸化防止剤。
【００１８】
（９）被検物質の揮発状態での抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、
ｂ）該溶液および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法
（１０）被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）リノール酸とβ−カロテンとを添加した油性成分の吸光度を測定する工程、
ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、油性成分の吸光度を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法。
【００１９】
（１１）被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、
ａ）油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、
ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、
ｃ）一定時間経過後、油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、および
ｄ）ａの工程で測定したマロンジアルデヒド量とｃの工程で測定したマロンジアルデヒド量の差を算出する工程、
を含む前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の評価方法の一実施形態を示す。
【図２】図２は、各種物質を添加した場合の１５０分後のβ−カロテンの退色量を示す。
【図３】図３は、各種物質を添加した場合の５日後のβ−カロテンの退色量を示す。
【図４】図４は、各種物質を添加した場合の５日後のマロンジアルデヒドの変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２２】
一実施形態において本発明は、フェノール性化合物を揮発可能な状態で対象物質と共存させることを含む酸化防止方法に関する。【００２３】
本明細書においてフェノール性化合物は、ベンゼン環に１〜３個の水酸基が直接結合した骨格構造を含み、該ベンゼン環がさらなる置換基を有する化合物をさす。本発明においてフェノール性化合物にはフェノール自体は含まれない。ここで置換基としては、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジＣ１−６アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、メルカプト、Ｃ１−６アルキルチオなどが挙げられ、好ましくは、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシである。置換基は、好ましくは１〜３個である。【００２４】
本明細書においてハロゲンは、好ましくはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択される。【００２５】
本明細書において、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシといった記載は、単独でまたは他の基の一部として、指定数の数の炭素原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシをそれぞれ指し、直鎖状でも分岐状でもよい。【００２６】
本発明のフェノール性化合物は、好ましくはベンゼン環に直接結合した水酸基を１つ有し、その場合、該水酸基に対して少なくともオルト位にＣ１−６アルコキシまたはＣ１−６アルキルを有する。【００２７】
本発明においてはフェノール性化合物として、室温、すなわち約２５℃で揮発性を有する化合物を用いる。【００２８】
フェノール性化合物として、好ましくは式Ｉ：
【化３】
2007110924.tif 000004
【００２９】
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表される化合物が挙げられる。【００３０】
本発明において、式Ｉの化合物を含むフェノール性化合物には、上記化合物の幾何異性体、回転異性体および光学異性体等の立体異性体、ならびに塩および溶媒和物も包含される。塩としては、特に限定されないが、例えば、トリメチルアンモニウム塩などのアンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウムの塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムの塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。【００３１】
Ｒ１〜Ｒ５における置換基としては、例えば、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジＣ１−６アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、メルカプト、Ｃ１−６アルキルチオなどが挙げられる。Ｒ１およびＲ２において、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルおよびＣ１−６アルコキシは、最大３個の置換基を有する。【００３２】
Ｒ１は、好ましくはＣ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ、さらに好ましくはＣ１−３アルキルまたはＣ１−３アルコキシ、特にメトキシまたはメチルである。【００３３】
Ｒ２は、好ましくは水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルまたはＣ２−６アルキニルである。【００３４】
Ｒ３〜Ｒ５は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンまたはＣ１−６アルキルである。【００３５】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである場合、好ましくは、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＣ１−６アルキルであり、Ｒ４およびＲ５は水素原子である。【００３６】
Ｒ１がＣ１−６アルコキシである場合、好ましくは、Ｒ２はＣ２−６アルケニルであり、Ｒ３〜Ｒ５はすべて水素原子である。【００３７】
本発明におけるフェノール性化合物の具体例としては、４−アリル−２，６−ジメトキシフェノール、４−アリルフェノール、カルバクロール、カテコール、クレオゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ジヒドロオイゲノール、２，６−ジメトキシフェノール、２，３―ジメチルフェノール、２，６−ジメチルフェノール、３，５−ジメチルフェノール、ｐ−エトキシフェノール、４−エチルグアヤコール、２−エチルフェノール、３−エチルフェノール、４−エチルフェノール、２−エチルチオフェノール、オイゲノール、グアヤコール、ビニルグアヤコール、ヘキセナールジヘキシルアセタール、４−ヒドロキシベンゾイックアシド、４−ヒドロキシベンジルエチルエーテル、イソオイゲノール、２−イソプロピルフェノール、４−イソプロピルフェノール、３−メトキシ−５−メチルフェノール、３−メトキシフェノール、４−メトキシフェノール、４−メチル−２，６−ジメトキシフェノール、３，４−メチレンジオキシフェノール、５−メチルグアヤコール、４−（メチルチオ）フェノール、ｐ−プロピルフェノール、プロトカテキュイックアシド、レゾルシノール、サリシリックアシド、シリンジックアシド、チモール、チオグアヤコール、バニリンプロピレングリコールアセタール、バニトロープ、ビニルグアヤコール、ｐ−ビニルフェノール、２，４−キシレノール、２，５−キシレノール、３，４−キシレノール、２，３，６−トリメチルフェノール、ｏ―プロピルフェノール、３−ｔｅｒｔ―ブチルフェノールなどが挙げられ、グアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、イソオイゲノールおよび２，３，６−トリメチルフェノールが好ましい。これらの構造を以下に示す。
【化４】
2007110924.tif 000005
【００３８】
フェノール性化合物は、単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。【００３９】
本発明は、上記のようなフェノール性化合物を揮発可能な状態で、対象物質と共存させることを特徴とする。【００４０】
フェノール性化合物は、合成のものでもよく、または植物等から抽出した天然のものでもよい。例えば、グアヤコールはササなどから抽出することができ、オイゲノールはクローブ、ケイヒ、ニクズク、ピメントなどから抽出することができ、イソオイゲノールはニクズクなどから抽出することができる。さらに、食品や天然物の加工条件で生成するフェノール性化合物でもよく、例えばコーヒーの焙煎時に生ずるビニルグアヤコールが挙げられる。これらのフェノール性化合物は、抗酸化能に優れ、安全で汎用性が高いという利点を有する。【００４１】
揮発可能な状態で対象物質と共存させるとは、フェノール性化合物が揮発した状態で対象物質と共存するようにすること、または保存等の過程において少なくとも一定期間にわたってフェノール性化合物が揮発した状態で対象物質と共存するようにすることをいう。フェノール性化合物を揮発した状態で対象物質と共存させることにより、揮発して気体となったフェノール性化合物が対象物質と接触し、酸化防止効果が発揮される。換言すれば、フェノール性化合物を揮発させて対象物質と接触させること、または気体の状態のフェノール性化合物を対象物質と接触させることを含む。【００４２】
フェノール性化合物が揮発可能であり、揮発したフェノール性化合物と対象物質とが接触しうる状態である限り、対象物質とフェノール性化合物とは別個に存在させてもよいし、フェノール性化合物を対象物質に混合してもよい。【００４３】
ある程度閉じた空間内、好ましくは密封された空間内において、対象物質とフェノール性化合物とを共存させることにより、空間内における揮発したフェノール性化合物の濃度が増し、揮発したフェノール性化合物を効率的に対象物質と接触させることができる。【００４４】
例えば、好適な容器内において、対象物質とフェノール性化合物とを共存させる。容器は、密封容器であることが好ましいが、完全な密封容器でなくてもよい。あるいは、対象物質とフェノール性化合物とを、同じ部屋、例えば同じ保存室内、陳列棚内、ケース内等で共存させてもよい。【００４５】
現在多用されている酸化防止剤は対象物質に添加して使用するため、対象物への溶解性を考慮する必要がある。また、酸化防止剤の種類や添加量により酸味や苦味の付与および着色のおそれがある。よって、揮発可能な状態でフェノール性化合物を対象物と共存させる本発明の方法は、添加が必要な従来の酸化防止剤より簡便な酸化防止法となりえる。【００４６】
例えば、フェノール性化合物が、２５℃の条件で、対象物質１ｇあたり、通常２０〜８０μｍｏｌ、好ましくは４０〜６０μｍｏｌのフェノール性化合物を存在させる。また、室内の揮発性有機物（ＶＯＣ）濃度に関して、４００μｇ／ｍ３以下に抑えるべきとの暫定指針値が厚生労働省から示されているため、揮発物中フェノール性化合物を含めた有機物濃度は４００μｇ／ｍ３程度を上限とすることが望ましい。【００４７】
本発明における酸化防止の対象物質としては、特に制限されないが、例えば、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品および飼料等が挙げられる。本発明は、油性成分または油性成分を含む物質の酸化防止に特に好適に用いられる。【００４８】
油性成分としては、特に制限されず、合成のものでも天然のものでもよく、例えば、炭化水素類、エステル類、動植物性油脂類、ワックス類、ハゼ脂、高級脂肪酸類、高級アルコール類、シリコーン系物質、ステロール類、樹脂類等、これらを酵素的処理（加水分解、エステル交換等）や化学的処理（エステル交換、水素添加等）したもの等が該当する。具体的には、大豆油、なたね油、コーン油、ごま油、綿実油、サフラワー油、ひまわり油、落花生油、米胚芽油、小麦胚芽油、玄米胚芽油、ハトムギ油、マカダミアンナッツ油、ガーリックオイル、ツバキ油、パーム油、オリーブ油、ホホバ油、マカデミアンナッツ油、アボガド油、ヒマシ油、アマニ油、シソ油、ユーカリ油、月見草油、タートル油、ミンク油、豚脂、牛脂、馬油、蛇油、魚油、卵油、卵黄油、流動パラフィン、イソパラフィン、ワセリン、スクワラン、スクワレン、テレピン油、ミリスチン酸イソプロピルエステル、ミリスチン酸イソパルミチルエステル、ミリスチン酸２−オクチルドデシルエステル、２−エチルヘキサン酸セチルエステル、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリルエステル、トリ−カプリル酸グリセリルエステル、カプリル酸及びカプリン酸の混合脂肪酸のトリグリセリド、ジ−２−エチルヘキサン酸ネオペンチルグリコールエステル、リンゴ酸ジイソステアリルエステル、イソノナン酸イソノニルエステル（３，５，５−トリメチルヘキシル−３’，５’，５’−トリメチルヘキサノエート）、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリルエステル、エメリー社製イソステアリン酸及び／又は高級脂肪酸とジペンタエリスリトールとのモノエステルないしヘキサエステル、パラメトキシケイ皮酸及び２−エチルヘキサン酸のグリセリンエステル、パラメトキシケイ皮酸イソオクチルエステル等が挙げられる。【００４９】
また、大豆硬化油、なたね硬化油、パーム硬化油、魚硬化油、トリステアリン酸グリセリルエステル、ロジン、コレステロール、フィトステロール（カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール等）、オレンジラフィー油、ラノリン、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、エメリー社製イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、１０−ヒドロキシステアリン酸、ベヘン酸、エルシン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ラノリンアルコール、パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、ミツロウ、ワセリン、ハードファット、カルナウバワックス、キャンデリラワックス、ライスワックス、米ぬかワックス、木ろうセラック、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、動植物由来の精油成分等も対象とすることができる。【００５０】
油性成分を含む物質としては、油性成分を含む飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品および飼料等が挙げられる。例えば、ラーメン、タンメン、うどん、そば、マカロニ、スパゲティ、フライ麺、ノンフライ麺等の麺類；粉末及び液状スープ；ヨーグルト、調製乳、育児粉乳、アイスクリーム、ヨーグルト、クリーム、ホイップクリーム等の乳製品；せんべい、スナック、ビスケット、ウエハース、チョコレート、飴、キャラメル、ガム、キャンディー、グミ等の菓子類；ちくわ、かまぼこ、魚肉ソーセージ、魚肉ハム等の水産加工品；冷凍天ぷら、冷凍唐揚げ、冷凍フライ、冷凍餃子、冷凍シュウマイ等の冷凍食品；みそ、ハンバーグ、ハム、ソーセージ、餃子、シュウマイ、パン、食用油、バター、マーガリン、ショートニング、チーズ、マヨネーズ、ドレッシング、飲料、健康食品、治療食等のその他の食品；口紅、化粧用クリーム、乳液、シャンプー、リンス、パック剤、パップ剤等の化粧品；栄養ドリンク剤、粉末薬、錠剤薬、軟膏、ビタミン薬等の医薬品及び医薬部外品；肥料及び潤滑油等の工業製品；ならびにペットフード等の飼料などが挙げられる。【００５１】
本発明はまた、式I：
【化５】
2007110924.tif 000006
【００５２】
[式中、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルキニルまたは置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシであり、
Ｒ３〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子または置換基である]
で表されるフェノール性化合物を含む、酸化防止剤に関する。【００５３】
式Ｉの化合物および好ましい化合物については、酸化防止方法について記載したのと同様である。本発明の酸化防止剤は、式Iの化合物として一種を含むものでもよく、複数種を含むものでもよい。本発明の酸化防止剤は、好ましくは油性成分の酸化を防止するためのものである。油性成分についてもすでに記載したとおりである。【００５４】
本発明の酸化防止剤においては、フェノール性化合物が揮発可能な状態とされている。換言すれば、揮発して気体となったフェノール性化合物が対象物質と接触し、酸化防止効果を発揮できる状態にある。【００５５】
本発明はまた、被検物質の揮発状態での抗酸化能を評価する方法に関する。【００５６】
一実施形態において本発明は、被検物質の揮発状態での抗酸化能を評価する方法であって、ａ）リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、ｂ）該溶液および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、ｃ）一定時間経過後、リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液の吸光度を測定する工程、およびｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法に関する。【００５７】
上記実施形態は、時間経過と共に酸化したリノール酸とβ-カロテンが反応し、β-カロテンが退色することを利用するものである。被検物質が揮発した状態で抗酸化能を示す場合には、揮発した被検物質がβ-カロテン溶液と反応しβ-カロテンの退色が抑制される。このβ-カロテンの変化を吸光度（４９０ｎｍにおける吸光度）から判断することにより、被検物質の抗酸化能を評価することができる。【００５８】
リノール酸とβ−カロテンとを含む溶液には、さらに界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ４０を使用できる。溶媒としては、水やエタノールを使用でき、所望により緩衝液を加えてもよい。溶液中におけるリノール酸の濃度は、通常１００〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２００〜４００μｇ／ｍＬであり、β−カロテンの濃度は、通常５〜５０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜４０μｇ／ｍＬである。また、溶液のｐＨは、通常ｐＨ５〜８とする。溶液と被検物質を密封容器中に配置する時間は、適宜選択されるが、通常０．５〜３時間、好ましくは１〜２．５時間であり、温度は通常１０〜３０℃である。【００５９】
ｂ）の工程においては、例えば９６穴プレートなどを用いて、溶液および被検物質を別の穴に導入し、これを密封容器に配置すればよい。別々に配置するとは、溶液と被検物質とが混合または接触しないように配置することをさす。【００６０】
一実施形態において本発明は、被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、ａ）リノール酸とβ−カロテンとを添加した油性成分の吸光度を測定する工程、ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、ｃ）一定時間経過後、油性成分の吸光度を測定する工程、およびｄ）ａの工程で測定した吸光度とｃの工程で測定した吸光度の差を算出する工程、
を含む前記方法に関する。【００６１】
上記実施形態もまた、時間経過と共に酸化したリノール酸とβ-カロテンが反応し、β-カロテンが退色することを利用するものであり、リノール酸とβ−カロテンを添加した油性成分を用いる点が異なる。油性成分としては、特に制限されないが、試験する温度、通常室温において液体であるものが好ましく、上記の油性成分などから適宜選択すればよい。例えば、コーン油、大豆油、なたね油、ごま油、綿実油、サフラワー油、ひまわり油、落花生油、米胚芽油、小麦胚芽油、玄米胚芽油、ハトムギ油、マカダミアンナッツ油、ガーリックオイル、ツバキ油、パーム油、オリーブ油などの植物性油を使用できる。【００６２】
上記実施形態において、油性成分中におけるリノール酸の濃度は、通常０．１〜６ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍＬであり、β−カロテンの濃度は、通常１〜６０μｇ／ｍＬ、好ましくは３〜５０μｇ／ｍＬである。【００６３】
一実施形態において本発明は、被検物質の揮発状態での油性成分に対する抗酸化能を評価する方法であって、ａ）油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、ｂ）該油性成分および被検物質を密封容器中に別々に配置する工程、ｃ）一定時間経過後、油性成分におけるマロンジアルデヒド量を測定する工程、およびｄ）ａの工程で測定したマロンジアルデヒド量とｃの工程で測定したマロンジアルデヒド量の差を算出する工程、
を含む前記方法に関する。【００６４】
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、脂質過酸化物の二次生成物であり、酸性条件化チオバルビツール酸と反応して赤色色素を形成する。生じた赤色色素の吸収波長５９５ｎｍを測定することにより、脂質過酸化を測定することができる(Ohkawa H et al., Anal.Biochem., 95,351-358 (1979)、Kikukawa K et al., Anal. Biochem.,202 :249-255 (1992))。【００６５】
油性成分を用いる上記２つの実施形態において、油性成分と被検物質を密封容器中に配置する時間は、適宜選択されるが、通常４〜１０日間、好ましくは５〜７日間であり、温度は通常５０〜６０℃である。油性成分を用いる評価方法は、被検物質の油性成分に対する抗酸化能をより正確に評価できる点で有利である。【００６６】
リノール酸とβ−カロテンを添加した油性成分においてβ−カロテンの退色を吸光度の差で測定することにより抗酸化能を評価する実施形態において、同時にマロンジアルデヒド量の変化を測定してもよい。【００６７】
β−カロテンの退色を吸光度の差で測定することにより抗酸化能を評価する場合、５００μｍｏｌの被検物質の存在下、室温（２５℃）で１５０分経過後、吸光度の差が０．８以下、好ましくは０．７以下であれば、当該被検物質は、揮発状態で抗酸化能を有すると判定することができる。あるいは、５００μｍｏｌの被検物質の存在下、５０℃で５日間経過後、吸光度の差が１．５以下、好ましくは１．２以下であれば、当該被検物質は、揮発状態で抗酸化能を有すると判定することができる。【００６８】
マロンジアルデヒド量を測定することにより抗酸化能を評価する場合、５００μｍｏｌの被検物質の存在下、５０℃で５日間経過後、マロンジアルデヒド量のコントロールに対する比が油性成分１ｇあたり０．８以下、好ましくは０．６以下であれば、当該被検物質は、揮発状態で抗酸化能を有すると判定することができる。【００６９】
本発明の抗酸化能の評価方法において、被検物質としては、特に制限されず、液体でも固体でもよい。例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が用いられ、これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。【００７１】
実施例１
装置および試薬
９６穴プレートはＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥＳ ９６Ｆを使用した。密封容器としてスギヤマゲン株式会社製のアネロパックジャー（内寸１９．５ｃｍ×１９．７ｃｍ×１．８ｃｍ）を使用した。マイクロプレートリーダーは日本バイオ・ラッド社製（Ｍｏｄｅｌ５５０）を使用した。試薬はすべて和光純薬から購入した。【００７２】
試料溶液の調製
クロロホルムを使用し、β−カロテンは１ｍｇ／ｍＬ、リノール酸は０．１ｇ／ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ４０は０．２ｇ／ｍＬの濃度に調製した。水を使用し、リン酸二水素ナトリウムは２４ｇ／ｍＬ（０．２Ｍ）、リン酸水素二ナトリウムは２８ｇ／ｍＬ（０．２Ｍ）の濃度に調製した。リン酸水素二ナトリウム水溶液に、リン酸二水素ナトリウム水溶液（０．２Ｍ）を加えｐＨを６．８にし、０．２Ｍリン酸緩衝液とした。【００７３】
β-カロテン溶液（２２５μＬ）、リノール酸溶液（５０μＬ）、Ｔｗｅｅｎ４０（１５０μＬ）を５０ｍＬの三角フラスコにとり、窒素ガスでクロロホルムを完全に除去した。その後に、蒸留水（１５ｍＬ）を加え溶解した。これに、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を１．３５ｍＬ添加して、リノール酸・β−カロテン溶液を調製した。【００７４】
リノール酸・β−カロテン溶液を９６穴プレートの中心部に２００μLずつ加えた。フェノール性化合物（ビニルグアヤコール、イソオイゲノール、オイゲノール、グアヤコール、２，３，６−トリメチルフェノール）およびその他の被検物質（各５００μｍｏｌ）は、９６穴プレートの四隅に添加した（図１）。【００７５】
その後直ちに、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定した。Ａ０測定後、９６穴プレートを密封容器（アネロパックジャー）内におき、密封した（図１）。ｔ分後４９０ｎｍにおける吸光度の低下量、すなわちΔＡｔ＝Ａ０−Ａｔを算出した。コントロールにはフェノール性化合物も被検物質も用いず同様の操作を行った。【００７６】
図２に、ビニルグアヤコール（ＰＶＧ）またはトコフェロール（α−Ｔｏｃ）を添加した場合の、０、３０、６０、９０、１２０、１５０分後のβ−カロテンの退色（吸光度の低下＝ΔＡｔ）を示した。ΔＡｔが少ないほど、抗酸化力が強いといえる。【００７７】
本発明のフェノール性化合物が、揮発状態で優れた抗酸化力を有することが示された。【００７８】
実施例２
装置および試薬
９６穴プレートはＴＰＰ社製 ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＴＥＳＴ ＰＬＡＴＥＳ ９６Ｆを使用した。密封容器としてスギヤマゲン株式会社製のアネロパックジャー（内寸１９．５ｃｍ×１９．７ｃｍ×１．８ｃｍ）を使用した。マイクロプレートリーダーは日本バイオ・ラッド社製（Ｍｏｄｅｌ５５０）を使用した。試薬は和光純薬から購入した。【００７９】
試料溶液の調製
クロロホルムを使用し、β−カロテンは１ｍｇ／ｍＬ、リノール酸は０．１ｇ／ｍＬの濃度に調製した。【００８０】
β-カロテン溶液（２４０μＬ）、リノール酸溶液（４８０μＬ）、を蓋付試験管にとり、窒素ガスでクロロホルムを完全に除去した。その後に、トコフェロール除去コーン油（６ｍＬ）加え攪拌し、リノール酸・β−カロテン溶液を調製した。【００８１】
リノール酸・β−カロテン溶液を９６穴プレートの中心部に１００μLずつ加えた。フェノール性化合物（ビニルグアヤコール、イソオイゲノール、オイゲノール、グアヤコール）は、９６穴プレートの四隅に添加した（図１）。【００８２】
その後直ちに、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定した。Ａ０測定後、９６穴プレートを密封容器（アネロパックジャー）内におき、密封した（図１）。【００８３】
ｔ日後４９０ｎｍにおける吸光度の低下量、すなわちΔＡｔ＝Ａ０−Ａｔを算出した。コントロールにはフェノール性化合物も被検物質も用いず同様の操作を行った。ΔＡｔが少ないほど、抗酸化力が強いといえる。【００８４】
５日後のリノール酸・β−カロテン溶液のマロンジアルデヒド量を測定した。酢酸緩衝液は２０ｍＬの酢酸を水に溶かして１００ｍＬとし、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ３．５に調製した。０．８％ＴＢＡ溶液は加温後、超音波をかけて完全に試薬を溶解させた。【００８５】
スクリューキャップ付の試験管にリノール酸・β−カロテン溶液０．２ｇ、８．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液０．２ｍＬ、酢酸緩衝液１．５ｍＬ、０．８％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）酢酸溶液０．０５ｍＬ、０．８％ＴＢＡ溶液１．５ｍＬ、水１ｍＬを加えてよく混和した。密栓して５℃で６０分放置した後、１００℃のブロックヒーター中で６０分間加熱した。冷却した後、水１．０ｍＬとブタノール/ピリジン（１５／１）を５ｍＬ加えてよく混和して、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られて上清について５３２ｎｍの吸光度を測定した。分子吸光係数（ε＝１５６０００）を用いてマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に換算し、コントロールで除して比較した。別に、油を加えないものについて同様の操作を行って試料ブランクとした。【００８６】
図３に、各物質を添加した場合の５日後の吸光度の低下量、すなわちβ−カロテンの退色量を示す。フェノール性化合物であるビニルグアヤコール、イソオイゲノール、オイゲノール、グアヤコールを密閉容器中で揮発させた場合、これらは強い抗酸化能を示した。比較として用いたその他の物質には作用が認められず、この酸化防止効果はフェノール性化合物に特有のものであることがわかった。【００８７】
図４に、各物質を添加した場合の５日後のマロンジアルデヒドのコントロールに対する比を示す。フェノール性化合物であるビニルグアヤコール、イソオイゲノール、オイゲノール、グアヤコールを密閉容器中で揮発させた場合、これらは強い抗酸化能を示した。比較として用いたその他の物質には作用が認められず、この酸化防止効果はフェノール性化合物に特有のものであることがわかった。【００８８】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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