(57)【要約】本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する線維芽細胞賦活剤、ブドウ樹液を使用する線維芽細胞賦活方法、およびブドウ樹液を線維芽細胞賦活剤として使用する方法に関する。さらに、本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤、ブドウ樹液を使用するコラーゲン合成促進方法、およびブドウ樹液をコラーゲン合成促進剤として使用する方法に関する。さらに、本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する皮膚老化防止剤、ブドウ樹液を使用する皮膚老化防止方法およびブドウ樹液を皮膚老化防止剤として使用する方法に関する。本発明は、安全性が高く且つ有効な老化防止手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ樹液を有効成分として含有する線維芽細胞賦活剤。
【請求項２】
プロリンをさらに含有する請求項１に記載の線維芽細胞賦活剤。
【請求項３】
ブドウ樹液を使用する線維芽細胞賦活方法。
【請求項４】
プロリンを併用する請求項３に記載の線維芽細胞賦活方法。
【請求項５】
ブドウ樹液を線維芽細胞賦活剤として使用する方法。
【請求項６】
線維芽細胞賦活剤がプロリンをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ブドウ樹液を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤。
【請求項８】
プロリンをさらに含有する請求項７に記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項９】
ブドウ樹液を使用するコラーゲン合成促進方法。
【請求項１０】
プロリンを併用する請求項９に記載のコラーゲン合成促進方法。
【請求項１１】
ブドウ樹液をコラーゲン合成促進剤として使用する方法。
【請求項１２】
コラーゲン合成促進剤がプロリンをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ブドウ樹液を有効成分として含有する皮膚老化防止剤。
【請求項１４】
プロリンをさらに含有する請求項１３に記載の皮膚老化防止剤。
【請求項１５】
ブドウ樹液を使用する皮膚老化防止方法。
【請求項１６】
プロリンを併用する請求項１５に記載の皮膚老化防止方法。
【請求項１７】
ブドウ樹液を皮膚老化防止剤として使用する方法。
【請求項１８】
皮膚老化防止剤がプロリンをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンの分解、合成に関与する線維芽細胞を賦活化する線維芽細胞賦活剤および線維芽細胞賦活方法、コラーゲン合成促進剤およびコラーゲン合成促進方法、および線維芽細胞の賦活化およびコラーゲン合成促進により皮膚の老化を防止し得る皮膚老化防止剤および皮膚老化防止方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に皮膚老化とは、加齢に伴う生理的老化と紫外線による光老化とが互いに影響しあって生じる生理現象である。皮膚では２０〜３０代以降年齢とともに、真皮層にあり肌弾力の元となるコラーゲンなどのタンパク質が減少する。また、コラーゲンを作り出す線維芽細胞自体の力も衰える。光老化は、皮膚に紫外線を浴びるとコラーゲンを分解する酵素が分泌され、これによりコラーゲンが壊されて真皮の弾力が失われる現象である。このようなコラーゲン量の低下や線維芽細胞の機能低下は、シワやタルミなどの老化現象を生む大きな要因となっている。【０００３】
そこで従来、老化対策としてコラーゲン分解酵素(コラゲナーゼ)の活性を抑制する抗老化成分を用いることが提案されている。例えば、コラゲナーゼ阻害剤として、ある種のキノコの抽出エキス（特開平9-40552号公報）、ヨモギ属植物の抽出エキス（特開平10-194982号公報）、ブドウ種子やリンゴ種子、ユキノシタ科植物全草の抽出エキス（特開平11-71294号公報）、タイム属植物の抽出エキス（特開平11-79970号公報）、ユーカリノキ、サルビア、ドクダミ、ボタン、シャクヤク等の抽出エキス（特開平11-147833号公報）、オトギリソウ、セイヨウオトギリソウの抽出物（特開平11-315008号公報）、ヒメオオギズイセン球根の抽出物（特開2000-191512号公報）、アセンヤク、柿、ワレモコウ、ペパーミント等の抽出物（特開2000-159631号公報）を用いることが提案されている。
しかし、コラーゲン分解酵素(コラゲナーゼ)の活性を抑制するだけでは、紫外線によるコラーゲン分解(光老化)を予防するだけで、既に紫外線や加齢により進行した肌の老化を効果的に改善することはできない。【０００４】
より有効的にコラーゲンの合成自体を促進する抗老化成分としては、レチノール酸(レチノイン酸、ビタミンＡ誘導体)が良く知られている（Methods in Enzymology,1990,vol.190,p352-360）。
しかし、レチノール酸は刺激性が強く、日本では医師の使用に限定されている。そのため、有効性が高くかつ安全な老化防止剤の開発が切望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
かかる状況下、本発明は、安全性が高く且つ有効な老化防止手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ブドウの樹液が線維芽細胞賦活作用および線維芽細胞のコラーゲン合成を促進する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する線維芽細胞賦活剤、ブドウ樹液を使用する線維芽細胞賦活方法、およびブドウ樹液を線維芽細胞賦活剤として使用する方法に関する。【０００８】
さらに、本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤、ブドウ樹液を使用するコラーゲン合成促進方法、およびブドウ樹液をコラーゲン合成促進剤として使用する方法に関する。【０００９】
さらに、本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する皮膚老化防止剤、ブドウ樹液を使用する皮膚老化防止方法およびブドウ樹液を皮膚老化防止剤として使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、コラーゲンの合成を促進し、皮膚の老化を効果的に防止することができる。さらに、本発明において、ブドウ樹液にプロリンを併用すると、ブドウ樹液の効果をさらに強化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。【００１２】
本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する線維芽細胞賦活剤に関し、本発明の線維芽細胞賦活剤は、ブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。【００１３】
本発明は、ブドウ樹液を使用する線維芽細胞賦活方法に関し、本発明の線維芽細胞賦活方法は、ブドウ樹液に加えてプロリンを併用することもできる。【００１４】
本発明は、ブドウ樹液を線維芽細胞賦活剤として使用する方法に関し、本発明の使用方法では、線維芽細胞賦活剤はブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。【００１５】
コラーゲンは、皮膚、血管、腱、歯などほとんどの細胞に存在する繊維状のタンパク質であり、人体を構成する全タンパク質の約３０％を占める。人体は、６０兆個以上の細胞から構成されているが、細胞や細胞が構成している臓器は、細胞外マトリックスにより正しく形作られている。コラーゲンはこの細胞外マトリックスを構成するタンパク質であり、細胞の足場となりその増殖や機能の維持に役立ち、軟骨や骨では基質タンパク質の構成成分として重要な役割を果たしている。【００１６】
線維芽細胞は、コラーゲンを産生する主な細胞の１つであり、線維芽細胞から分泌されたコラーゲンが、細胞の間を埋めて細胞間マトリックスが形成される。本発明者らの検討の結果、ブドウ樹液が、この線維芽細胞自身を賦活させる作用（線維芽細胞賦活作用）を有することが新たに見出された。【００１７】
ブドウ樹液にプロリンを併用することで、ブドウ樹液が有する線維芽細胞賦活効果をさらに増強することができる。プロリンはL-プロリンであることが好ましい。【００１８】
本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤に関し、本発明のコラーゲン合成促進剤は、ブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。本発明は、ブドウ樹液を使用するコラーゲン合成促進方法に関し、本発明のコラーゲン合成促進方法は、ブドウ樹液に加えてプロリンを併用することもできる。本発明は、ブドウ樹液をコラーゲン合成促進剤として使用する方法に関し、本発明の使用方法では、コラーゲン合成促進剤はブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。【００１９】
前述のように、ブドウ樹液は、線維芽細胞賦活作用を有する。さらに、本発明者らの検討の結果、ブドウ樹液が、線維芽細胞のコラーゲン合成を促進する作用を有することも新たに見出された。本発明のコラーゲン合成促進剤は、このように、線維芽細胞自体に働きかけ、細胞自身を賦活させる作用および線維芽細胞のコラーゲン合成を促進する作用を有するブドウ樹液を有効成分として含むことにより、コラーゲンの合成を効果的に促進することができる。【００２０】
ブドウ樹液にプロリンを併用することで、ブドウ樹液が有するコラーゲン合成促進効果をさらに増強することができる。プロリンはL-プロリンであることが好ましい。【００２１】
本発明は、ブドウ樹液を有効成分として含有する皮膚老化防止剤に関し、本発明の皮膚老化防止剤は、ブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。本発明は、ブドウ樹液を使用する皮膚老化防止方法に関し、本発明の皮膚老化防止方法は、ブドウ樹液に加えてプロリンを併用することもできる。本発明は、ブドウ樹液を皮膚老化防止剤として使用する方法に関し、本発明の使用方法では、皮膚老化防止剤はブドウ樹液に加えてプロリンを含有することもできる。【００２２】
コラーゲンの性質や状態の変化、線維芽細胞の作用は、はりの低下やしわといった、皮膚の老化に深くかかわっている。これは、水分を除いた皮膚の約８０％が、コラーゲンから成り立っていることに起因する。皮膚は、表面から順に、表皮、真皮、皮下組織の３つの層に分けられる。コラーゲンは、その中の真皮に存在し、その大部分を占め、織物のような構造と性質を有する。皮膚には、外界から様々な力が加わるため、強さと柔軟さが要求されるが、これらの性質を支える主な働きをしているのがコラーゲンである。コラーゲンは、線維芽細胞により、その分解や合成が制御され、かつ線維芽細胞の力で常に引っ張られた状態に保たれている。本発明の皮膚老化防止剤は、ブドウ樹液を有効成分として含み、そのコラーゲン合成促進作用や線維芽細胞賦活作用により、はりの低下やしわといった、皮膚の老化を効果的に防止することができる。【００２３】
ブドウ樹液にプロリンを併用することで、ブドウ樹液が有する皮膚の老化効果をさらに増強することができる。プロリンはL-プロリンであることが好ましい。【００２４】
ブドウ樹液は、ブドウ(Vitis科)の木の生体内を流れる植物導管水である。本発明において用いられるブドウ樹液は、ブドウに属する植物の樹液であれば特にその種属は限定されないが、ブドウ、ヤマブドウ等の樹液を利用できる。例えば、ブドウとしては、巨峰、甲州、甲斐路、マスカット・ベリーＡ、デラウェア、キャンベル・アーリー、ピオーネ、ネオ・マスカット、ナイアガラ、コンコード、スチューベン、カベルネ・ソーヴィニヨン、ピノ・ノワール、メルロー、セミヨン、リースリング、シャルドネ等の品種を挙げることができる。また、栽培されている地域、栽培方法等も限定されないが、中でも、春先の発芽期前に、剪定されたブドウの枝より溢出する樹液であることが好ましい。【００２５】
ブドウ樹液は、ブドウの茎を切って流出する樹液を採取して得ることができる。樹液の採取方法は、特に限定されず、例えば、小さな容器等を樹液が流れるよう剪定された箇所に取り付けて流れ出てくる樹液を採取し、これを防腐剤等が投入された大きめの保存容器に集めることによって行うことができる。一度に種々の位置から樹液を採取できる装置、例えば、特開平10-295207号公報記載の採取装置、特開2005-118035公報に記載の受液器を用いて採取することが、作業効率が高く、また、品質劣化を防ぐことができ好ましい。【００２６】
採取したブドウ樹液は、必要に応じて防腐剤等と混合して液状物質として用いることができ、または、凍結乾燥品として用いることができる。また、採取したブドウ樹液には、必要に応じて加熱処理、清澄処理を施してもよい。これにより、樹液の白濁や褐変を防止することができる。加熱処理は、ブドウ樹液を、例えば６０〜１００℃、好ましくは８０〜９０℃で、例えば１０分以上加熱することによって行うことができる。なお、加熱処理は、採取後のブドウ樹液に対して行ってもよく、または製品とした後に行ってもよい。また、清澄処理は、公知の清澄剤、例えば、活性炭、ベントナイト、シリカゲル、シリカゾル、PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)等を用いて行うことができる。【００２７】
本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤および皮膚老化防止剤は、いずれも、ブドウ樹液を液体のまま含むことができ、または、凍結乾燥物として含むこともできる。剤型は特に限定されず、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、粉末剤、顆粒剤等の種々の剤型で提供することができる。本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤および皮膚老化防止剤は、ブドウ樹液のみ、若しくはブドウ樹液とプロリンとからなることもでき、または、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料等に配合される油性成分、界面活性剤、保湿剤、顔料、紫外線吸収剤、酸化防止剤、香料、色素、抗菌剤、防黴剤、アルコール、水等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の細胞賦活剤 、コラーゲン合成促進剤、老化防止剤と併用することもできる。【００２８】
本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤は、いずれも、ブドウ樹液を、未調整樹液換算で１質量％以上、より好ましくは３質量％〜１００質量％、さらに好ましくは１０質量％〜８０質量％含むことができる。本発明では、ブドウ樹液そのものを、線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤として用いることもできる。【００２９】
本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤にブドウ樹液に加えてプロリンを配合する場合、配合量は、０．１〜３質量％、好ましくは０．１〜１．５質量％の範囲とすることが適当である。プロリン配合量は、ブドウ樹液との合計を１００質量％としたときの割合である。【００３０】
本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤の皮膚外用剤としての適用方法は、外用剤の種類に応じて適宜選択することができる。一般に、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤として調製された外用剤として適用する場合には、顔等の皮膚に対し、１日１〜２回程度塗布することが好ましい。本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤は、化粧品としても利用でき、ローション、乳液、美容液、クリーム、リキッドファンデーション、パウダーファンデーション、口紅などに応用できる。【００３１】
本発明の線維芽細胞賦活剤、コラーゲン合成促進剤、および皮膚老化防止剤を粉末剤、顆粒剤等の経口投与薬として用いる場合の投与量は、被投与者の年齢、肌状態等の条件に応じて適宜選択することができる。投与量は、例えば、成人１人当たり１００〜１０００ｍｇ（有効成分量として）の範囲である。ただし、上記の投与量は、上記の条件に応じて適宜増減することができる。
【実施例】
【００３２】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例で使用したブドウ樹液は、２００５年４月上旬、山梨県東山梨群勝沼町のブドウ畑において、剪定中のブドウ（品種：甲州）の枝より流出している樹液を、特開平10-295207号公報記載の装置を用いて採取したものであり、ブドウ樹液の凍結乾燥品１ｇは、未調整樹液２８０ｇに相当する。【００３３】
実施例１
（線維芽細胞賦活作用試験）
臭化3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム (MTT)は、ミトコンドリアにおいて細胞内のエネルギー代謝過程で生じるNADPHあるいはNADHにより開裂し、ホルマザンを生成する。このためホルマザン生成量を、細胞賦活作用の指標とした。【００３４】
正常ヒト線維芽細胞を3.0×104cells/wellの細胞密度で96 穴マイクロプレートに播種した。24 時間1 %ウシ胎児血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）にて培養後、ブドウ樹液の凍結乾燥品を表１に示す濃度を含有した1 %FBS含有DMEMに交換した。陽性コントロール (PC)として5 % FBS含有DMEMを用いた。さらに48 時間培養後、0.4 mg/mL MTT (ナカライ)を含有する1 %FBS含有DMEMに交換し2時間培養した。【００３５】
細胞を洗浄後、2-プロパノールにて細胞内に生成したホルマザンを溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて550 nmおよび650 nmの吸光度を測定し、両者の差をもって細胞内に生成したホルマザン量として評価した。細胞賦活作用は、試料無添加培養細胞 (コントロール)の吸光度 (ABS.)を100とした活性指標(Activation Index) (%)で表した。結果を表１に示す。すべての結果は、平均値±標準偏差で表した。有意差検定にはStudent-t検定を用いた。p値がp<0.05の時有意であると判定した。表１に示すように、ブドウ樹液を添加した培地において培養することにより、線維芽細胞を賦活できることが確認された。【００３６】
【表１】
2007046353.tif 000002
【００３７】
実施例２
（線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用試験）
線維芽細胞のコラーゲン合成は、培養上清中に分泌されたＩ型コラーゲンをELISAにて定量することにより評価した。【００３８】
正常ヒト線維芽細胞を3.0×104cells/wellの細胞密度で96 穴マイクロプレートに播種した。24 時間0.5 %FBS含有DMEMにて培養後、表２に示す濃度のブドウ樹液の凍結乾燥品を含有した0.5 %FBS含有DMEMに交換した。PCとして、アスコルビン酸リン酸マグネシウムエステル (VCPMg)を用いた。さらに48 時間後、培養上清を回収してＩ型コラーゲンのELISAに供した。【００３９】
培養上清および検量線用Ｉ型コラーゲンを96 ウェルプレートに入れ、4 ℃にて一晩コーティングした。1 %牛血清アルブミン (BSA)溶液を用いて37 ℃にて1時間ブロッキングしたのち、一次抗体 (抗ヒトＩ型コラーゲン (ウサギ))を37 ℃にて1.5時間反応させた。さらに二次抗体 (ヒストファインPO(ウサギ))を37 ℃にて1.5 時間反応後、0.3 mg/mLの 2,2'-アジノビス (3-エイチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸) 二アンモニウム (ABTS)含有リン酸-クエン酸緩衝液 (0.1 M, pH 4.0)を加えた。20 分後、マイクロプレートリーダーを用いて405 nmの吸光度を測定した。培養上清中のコラーゲン量は、同じプレートで測定した検量線から算出した。【００４０】
同時に細胞のタンパク量をBCA Protein Assay Reagent (PIERCE)を用いて定量した。培養上清中のコラーゲン量をタンパク量で除することにより、単位タンパク量あたりのコラーゲン量を算出し、細胞のコラーゲン合成量とした。結果を表２に示す。すべての結果は、平均値±標準偏差で表した。有意差検定にはStudent-t検定を用いた。p値がp<0.05の時有意であると判定した。表２に示すように、ブドウ樹液を含む培地において培養することにより、無添加時(Control)の約１．２倍〜３．６倍も線維芽細胞のコラーゲン合成が促進されることがわかる。特に、その作用は、５００μｇ／ｍｌ以上のブドウ樹液凍結乾燥品を含む培地を用いた場合、顕著であった。また、２５０μｇ／ｍｌ以上のブドウ樹液凍結乾燥品を含む培地を用いた場合には、タンパク量の有意な増加が認められた。なお、タンパク質の増加は、線維芽細胞が賦活され増殖していることを示す。表２に示すコラーゲン量は、タンパク量で割った値であり、さらに個々の細胞のコラーゲン合成量も有意に増加していることがわかる。【００４１】
【表２】
2007046353.tif 000003
【００４２】
実施例３
（プロリン併用試験）
試験サンプルの調製
ぶどう樹液に対するプロリン併用の効果を確認するため、下記官能評価試験及びしわ評価試験に供するクリームを表３のように処方した。表３に示す組成物の配合量は全て質量％で示す。【００４３】
【表３】
2007046353.tif 000004
【００４４】
官能評価試験  
肌の乾燥や柔軟性、はりのなさを訴える30代から50代の６０人の女性を被験者として、年齢が偏らないように１５名ずつ４群に分け、表３で示した比較例１及び例１〜３の４種類の処方例のクリームをそれぞれの群の被験者に、朝夜1日2回、連続30日間使用してもらい、使用感：しっとり感（湿潤性）、はり感（弾力性）、やわらか感（柔軟性）についての官能評価試験を行った。評価基準は表４に示したとおりであり、官能評価試験結果を表５に示す。【００４５】
【表４】
2007046353.tif 000005
【００４６】
【表５】
2007046353.tif 000006
【００４７】
しわ評価試験
肌のしわ（特に目じりの小じわ）が気になる４０代から６０代の４０人の女性を被験者として、年齢が偏らないように１０名ずつ４群に分け、表３で示した比較例１及び例１〜３の４種類の処方例のクリームをそれぞれの群の被験者に、朝夜1日2回、しわができやすい目の周りを中心に連続30日間使用してもらい、塗布前後の目じりのしわ本数を紫外線写真を用いた視観判定法にて比較した。その結果を表６に示す【００４８】
【表６】
2007046353.tif 000007
【００４９】
試験結果
官能評価試験結果を示す表５においても、しわ評価試験結果を示す表６においても、例１のブドウ樹液を含むクリームは、比較例１のプロリンを含むクリームに比べて、乾燥、はり、しわ等に対する改善効果は高かった。さらに、例２および３のブドウ樹液とプロリンを組合わせたクリームは、ブドウ樹液とプロリンを単独で用いる場合より、乾燥、はり、しわ等に対する改善効果はさらに高かった。即ち、ブドウ樹液の乾燥、はり、しわ等に対する改善効果は優れており、さらに、
ブドウ樹液に、コラーゲンを構成するアミノ酸、特にプロリンを組み合わせて使用することで、肌の保湿効果を高め、しわを目立ちにくくする効果がさらに高まることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、ブドウ樹液の線維芽細胞賦活作用および線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用を通して、皮膚の老化を効果的に防止することができる。【００５１】
本発明のコラーゲン合成促進剤および線維芽細胞賦活剤は、老化防止に加え、ニキビ痕、妊娠線の治癒、火傷などの創傷治療、人工皮膚の培養促進などへの応用が期待される。
【国際調査報告】
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