(57)【要約】  シノビオリンの機能を阻害することにより、p53癌抑制タンパク質が活性化されることを見出した。シノビオリンの機能を阻害する物質は癌治療剤として有用である。また、シノビオリンの機能を阻害することにより、p53のユビキチン化が阻害されること、p53リン酸化タンパク質の活性が上昇すること等を見出した。当該知見に基づいて、効率的に癌治療剤をスクリーニング可能な方法が提供された。さらにシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御することにより、リウマチ滑膜細胞の増殖が抑制されることを見出した。シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質は、抗リウマチ剤として有用である。また効率的に抗リウマチ剤をスクリーニングする方法が提供された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シノビオリンタンパク質の発現および／または機能阻害物質を有効成分として含有する、p53タンパク質活性化剤。
【請求項２】
前記発現および／または機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、請求項１に記載のp53タンパク質活性化剤。
【請求項３】
前記発現および／または機能阻害物質がp53タンパク質のユビキチン化を阻害する機能を有する低分子化合物である、請求項１に記載のp53タンパク質活性化剤。
【請求項４】
前記発現および／または機能阻害物質が、p53リン酸化タンパク質を活性化する機能を有する低分子化合物である、請求項１に記載のp53タンパク質活性化剤。
【請求項５】
前記p53リン酸化タンパク質が、ＡＴＭまたはＡＴＲである、請求項４に記載のp53タンパク質活性化剤。
【請求項６】
前記発現および／または機能阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載のp53タンパク質活性化剤。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）シノビオリン遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【請求項７】
前記発現および／または機能阻害物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、請求項１に記載のp53タンパク質活性化剤。
（ａ）シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質と結合する抗体
（ｂ）シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のp53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤。
【請求項９】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１０】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質のユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記ユビキチン化を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１３】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、p53リン酸化タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質を基質とするp53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項１４】
p53リン酸化タンパク質がＡＴＭまたはＡＴＲである、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）および（ｂ）を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット。
（ａ）シノビオリンタンパク質
（ｂ）p53タンパク質
【請求項１６】
シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤。
【請求項１７】
前記シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質が低分子化合物である、請求項１６に記載の抗リウマチ剤。
【請求項１８】
前記低分子化合物が、以下の一般式（I)または(II)に記載の化合物である、請求項１７に記載の抗リウマチ剤。
2006137514.tif 000009
2006137514.tif 000010
【請求項１９】
リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、請求項１８に記載の抗リウマチ剤。
【請求項２０】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項２１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項２２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
（ａ）シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ユビキチン化を制御する化合物を選択する工程
【請求項２３】
シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シノビオリンタンパク質の発現または機能阻害物質を有効成分とするp53タンパク質活性化剤、およびp53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
また本発明は、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見された新規タンパク質である（特許文献１参照）。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。【０００３】
タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンはRING fingerモチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすE3ユビキチンライゲースという酵素に多く見出されているが、実際、シノビオリンがE3ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（特許文献１参照）。【０００４】
ところで、p53遺伝子は、第17染色体p13に位置しており、癌細胞の発生および増殖においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。p53タンパク質は、DNA上の特異的塩基配列[5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、p21、GADD45、BAX等の特定の遺伝子の転写活性化を促す。また、(i)その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、(ii)SV40ラージT抗原、アデノウイルスEIBタンパク質、パピローマウイルスE6などのウィルス性癌遺伝子産物、あるいはmdm2等の細胞性癌遺伝子産物と結合すること、(iii)ミスマッチを含むDNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。
【特許文献１】WO02/052007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌を抑制する薬剤の提供を目的とする。より具体的には、p53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。また、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こしている細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与しているp53タンパク質が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビオリンの機能を阻害することにより、p53癌抑制遺伝子またはp53癌抑制タンパク質が活性化されて癌細胞の増殖が阻止されることを見出した。
また本発明者らは、シノビオリンの機能阻害によるp53タンパク質の活性化のメカニズムを解明すべく、さらに詳細な研究を行った。【０００７】
そして本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによって、リン酸化酵素によりp53がリン酸化されてp53が活性化されることを見出した。
また、シノビオリンの発現もしくは機能を阻害することにより、p53タンパク質のユビキチン化が阻害され、その結果、p53タンパク質が活性化されることが見出された。【０００８】
さらに本発明者らによって、シノビオリンの発現もしくは機能を阻害することにより、シノビオリンとp53タンパク質との結合が阻害され、その結果、p53が活性化されることが示された。また、シノビオリンにおけるp53タンパク質との結合部位を決定することに成功した。【０００９】
本発明者らによって見出された上述の知見から、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害する物質は、p53タンパク質の活性化剤として有用であり、また、該活性化剤は癌治療剤となり得ることが示された。【００１０】
さらに本発明者らは、本願によって見出された種々の知見を基に、新規癌治療薬の開発を目指し、p53タンパク質のシノビオリンによるユビキチン化を阻害する物質の取得を試みた。その結果、p53タンパク質のユビキチン化を阻害する物質として、低分子化合物Compound X、Yを実際に取得することに成功した。【００１１】
次に、Compound X、Yの培養癌細胞に対する細胞増殖への影響を調べたところ細胞増殖が抑制され、また、Compound Yでは、細胞内のp53のタンパク発現量の増加がみられた。Compound X、Yが培養癌細胞においてシノビオリンによるp53のユビキチン化反応阻害によりp53のタンパク発現量を増加させることが示唆された。【００１２】
即ち、Compound X、Yがシノビオリンによるp53のユビキチン化を阻害することによりp53タンパク発現量を増加させ、抗癌作用を発揮すると考えられる。p53の安定化、核内への集中的な局在を引き起こすことにより、放射線への感受性を高め治療効率を上げる、集学的治療の一環としての臨床応用も期待される。【００１３】
上述の知見は、該低分子化合物が癌治療剤として有用であることを示すとともに、本発明者らによって見出された知見に基づいて、癌治療剤を効率的にスクリーニングすることが可能であることを示すものである。【００１４】
上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害する物質を含有するp53タンパク質活性化剤、および該活性化剤を含む癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。【００１５】
即ち本発明は、p53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、
〔１〕  シノビオリンタンパク質の発現および／または機能阻害物質を有効成分として含有する、p53タンパク質活性化剤、
〔２〕  前記発現および／または機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、〔１〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
〔３〕  前記発現および／または機能阻害物質がp53タンパク質のユビキチン化を阻害する機能を有する低分子化合物である、〔１〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
〔４〕  前記発現および／または機能阻害物質が、p53リン酸化タンパク質を活性化する機能を有する低分子化合物である、〔１〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
〔５〕  前記p53リン酸化タンパク質が、ＡＴＭまたはＡＴＲである、〔４〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
〔６〕  前記発現および／または機能阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔１〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）シノビオリン遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
〔７〕  前記発現および／または機能阻害物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、〔１〕に記載のp53タンパク質活性化剤、
（ａ）シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質と結合する抗体
（ｂ）シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体
〔８〕  〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のp53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤、
〔９〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１０〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質のユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記ユビキチン化を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、p53リン酸化タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質を基質とするp53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔１４〕  p53リン酸化タンパク質がＡＴＭまたはＡＴＲである、〔１３〕に記載のスクリーニング方法、
〔１５〕  以下の（ａ）および（ｂ）を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット、
（ａ）シノビオリンタンパク質
（ｂ）p53タンパク質
を、提供するものである。【００１６】
さらに本発明は、本発明に記載のp53タンパク質活性化剤あるいはp53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤を投与する工程を含む癌を予防もしくは治療する方法、および本発明に記載のp53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における使用を提供するものである。【００１７】
また本発明者らは、ELISAによるシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化反応を評価する系を構築し、それによって得られた２種の低分子化合物であるNo.32（Compound X）およびNo.38（Compound Y）が低濃度でリウマチ滑膜細胞（RASC）の増殖を抑制することを見出した。【００１８】
上述の知見は、該低分子化合物が抗リウマチ剤として有用であることを示すとともに、本発明者らによって見出された知見に基いて、抗リウマチ剤を効率的にスクリーニングすることが可能であることを示すものである。【００１９】
上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法を開発することに成功した。【００２０】
即ち本発明は、さらに
〔１６〕  シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤、
〔１７〕  前記シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質が低分子化合物である、〔１６〕に記載の抗リウマチ剤、
〔１８〕  前記低分子化合物が、以下の一般式（I)または(II)に記載の化合物である、〔１７〕に記載の抗リウマチ剤、
2006137514.tif 000002
2006137514.tif 000003
〔１９〕  リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、〔１８〕に記載の抗リウマチ剤、
〔２０〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
〔２１〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔２２〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
（ａ）シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ユビキチン化を制御する化合物を選択する工程
〔２３〕  シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング用キット、
を提供する。
さらに本発明は、本発明に記載のシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を投与する工程を含むリウマチ性疾患を予防もしくは治療する方法、および本発明に記載のの自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔線維芽細胞(MEF)における蛍光免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図２】図２は、syno-/-のembryoにおける抗p53抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図３】図３は、p53に関するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図４】図４は、syno-/-のMEF培養細胞におけるp53のリン酸化部位を同定した結果を示す写真である。
【図５】図５は、シノビオリンに対するsiRNA処理によって亢進したSer15のリン酸化がカフェイン添加によりどのように影響するかを調べたウェスタンブロッティングの写真である。
【図６】図６は、シノビオリン に対するsiRNA処理による、p53およびp21の発現が高まることを示すウェスタンブロッティングの写真である。
【図７】図７は、フローサイトメーターによる細胞周期の観察結果を示す図である。
【図８】図８は、Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体(10Da)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。
【図９】図９は、Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体(10Da)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、GFP野生型p53を導入した細胞におけるp53の局在を観察した写真である。
【図１１】図１１は、GFP野生型p53およびFLAG野生型シノビオリンをSaos-2細胞に共発現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。
【図１２】図１２は、GFP野生型p53およびFLAGシノビオリンC307SをSaos-2細胞に共発現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。
【図１３】図１３は、MBP-Synoviolin ΔTM-HisによるGST-p53のin vitroユビキチン化反応を示す写真である。
【図１４】図１４は、シノビオリンRNAiによるRA滑膜細胞でのp53 mRNA量を示すグラフである。
【図１５】図１５は、作製したp53結合ドメイン欠失体の概略図、および結合アッセイを行った結果を示す図である。
【図１６】図１６は、p53結合ドメイン欠失体と35S-p53についてGSTプルダウンアッセイを行った結果を示す図である。
【図１７】図１７は、Ａ：Compound X、Yの構造式を示す図である。Ｂ：Compound X、Yのp53タンパク質ユビキチン化反応阻害活性を示す写真である。
【図１８】図１８は、Compound X、Yの細胞毒性への影響を示す図である。
【図１９】図１９は、培養細胞におけるp53タンパク発現量に対するCompound Yの作用を示す写真である。
【図２０】図２０は、ELISAを用いたin vitro 自己ユビキチン化反応検出時における抗体濃度の影響を示す図である。
【図２１】図２１は、ELISAを用いたin vitro 自己ユビキチン化反応系におけるシノビオリン濃度の影響を示す図である。
【図２２】図２２は、ELISA を用いたin vitro 自己ユビキチン化反応におけるユビキチン化反応時間の影響を示す図である。
【図２３】図２３は、低分子化合物No.32の細胞増殖抑制効果を示す図である。
【図２４】図２４は、低分子化合物No.38の細胞増殖抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内のp53が活性化して、その結果細胞増殖が阻止されることから、p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。つまり、p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行することになる。事実、p53変異は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこのp53の欠損又は点変異が起こっている。また、このような変異が起こっていない場合でも、p53の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。従って、癌の進行を抑えるにはp53を有効に機能させることが必要である。【００２３】
本発明者らは、p53タンパク質の活性化を癌治療の有効な方法の一つとするため、シノビオリン(synoviolin)の機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が多数観察された。即ち、シノビオリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与しているp53タンパク質の活性化が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につながることを見出した。【００２４】
本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現および／または機能（活性）を阻害（抑制）することによって、p53タンパク質が活性化することを見出した。即ち本発明は、シノビオリンタンパク質の発現および／または機能阻害物質を有効成分として含有する、p53タンパク質活性化剤を提供する。【００２５】
本発明のシノビオリンタンパク質は、ヒトのシノビオリンタンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるシノビオリンと同等なタンパク質（シノビオリンのホモログ・オルソログ等）も本発明における「シノビオリンタンパク質」に含まれる。例えば、ヒトp53に相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのシノビオリンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。【００２６】
シノビオリン、およびp53のヒト並びにその他の生物における「相当するタンパク質」の名称、mRNA、アミノ酸配列のアクセッション番号を、表１に示す。【００２７】
【表１】
2006137514.tif 000004
【００２８】
ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号は、AB024690（配列番号：１）である。【００２９】
ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、シノビオリンタンパク質が有する機能（例えばp53タンパク質と結合する機能、p53リン酸化タンパク質の活性を阻害する機能、p53のユビキチン化を促進する機能等）を持つタンパク質は、本発明のシノビオリンに含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。【００３０】
本発明における「シノビオリン遺伝子」には、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトのシノビオリン遺伝子のホモログ等）が含まれる。【００３１】
また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、配列番号：１に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、配列番号：１に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるシノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、シノビオリン遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物におけるシノビオリンタンパク質（遺伝子）に相当するタンパク質（遺伝子）、あるいは、上述のシノビオリンと機能的に同等なタンパク質（遺伝子）を、単に「シノビオリンタンパク質（遺伝子）」と記載する場合がある。【００３２】
本発明の「シノビオリンタンパク質」は、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばシノビオリンタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、シノビオリンタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。【００３３】
本発明において「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」とは、シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。また、「シノビオリンタンパク質の機能」とは、例えば、シノビオリンがp53と結合する機能、p53リン酸化タンパク質の活性を抑制する機能、p53のユビキチン化を促進する機能、またはp53の活性化を抑制する機能等を挙げることができる。【００３４】
上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。【００３５】
従って、「シノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する」とは、野生型シノビオリン遺伝子またはタンパク質の量、機能または活性と比較して、その量、機能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には、機能と発現の両者を阻害すること、およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。【００３６】
シノビオリンはp53のユビキチン化を促進するため、シノビオリンとp53との結合を阻害することにより、p53のユビキチン化を阻害することができる。また、p53のユビキチン化を阻害することにより、p53が活性化され癌が抑制される。【００３７】
本発明において「p53タンパク質活性化剤」とは、より具体的にはp53タンパク質の発現および／または機能を亢進（上昇）させるような機能を有する薬剤ということができる。【００３８】
本発明の上記阻害物質としては、好ましくは、低分子化合物を挙げることができる。従って、本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する低分子化合物を有効成分として含有する、p53タンパク質活性化剤を提供する。【００３９】
本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することにより、p53タンパク質のユビキチン化が阻害され、その結果、p53タンパク質が活性化されることが見出された。
シノビオリンは、p53のユビキチン化を促進するものと考えられる。ユビキチン化とは、タンパク質の分解マーカー分子であるユビキチンによるタンパク質の翻訳後の修飾反応をいう。このユビキチン化の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究により、現時点でのユビキチン化の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられている。【００４０】
ユビキチン化は、具体的には、ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）およびユビキチンリガーゼ（E3）などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返すことにより、基質となるタンパク質にユビキチン分子を枝状に結合させてポリユビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリユビキチン鎖は、ユビキチン分子内の４８番目のリシン残基のε‐アミノ基を介して形成され、26Sプロテアソームへの分解シグナルとなり、標的タンパク質を分解に導く。【００４１】
本発明は、シノビオリンの発現および／または機能を阻害することによりp53を活性化させることを特徴とし、このようなp53の活性化は、上記p53のリン酸化機構とは別に、p53のユビキチン化が阻害されるという機構に着目したものである。
本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、p53タンパク質のユビキチン化を阻害する機能を有する化合物である。【００４２】
本発明者らは、後述の実施例に示すように、シノビオリンによるp53のユビキチン化の促進活性を阻害する低分子化合物(Compound X, Y)を同定することに成功した。
本発明における低分子化合物として、例えば、本発明者らによって同定された以下の一般式(I)(Compound X)または一般式(II)(Compound Y)で表される化合物を具体的に示すことができる。【００４３】
2006137514.tif 000005
【００４４】
2006137514.tif 000006
【００４５】
上記一般式(I)および(II)で表される化合物は、ナミキ商事（AMBINTER)より取得可能である。（カタログNo.はそれぞれ、 A0420/0019436、A1328/0060050である。）
また、本発明において有効成分となる一般式（I）または（II）の化合物は、該化合物において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに、該化合物の塩に加えて、例えば、該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。これらの化合物も同様にp53活性化作用もしくは癌抑制作用を有することが期待される。【００４６】
本発明において「塩」とは、本発明の化合物（一般式（I）または（II）の化合物）と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。通常、本発明において「塩」とは、通常、薬学的に許容される塩を言う。【００４７】
無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。【００４８】
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。【００４９】
酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
本発明に係る化合物の単離・精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィーなどの通常の化学操作を適用して行うことができる。【００５０】
本発明においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずるすべての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従って、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。【００５１】
また、本発明に係る化合物について得られる種々の異性体（例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等）は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、等）を用いることにより精製し、単離することができる。【００５２】
また本発明者らによって、シノビオリンがp53と結合し、p53の機能を阻害する機能を有することが分かった。つまり、シノビオリンの発現および／または機能を阻害することにより、シノビオリンとp53との結合が阻害され、p53の機能が活性化される。
従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合（相互作用）を阻害する機能を有する化合物である。【００５３】
シノビオリンタンパク質のp53結合ドメインは、例えば、シノビオリンのアミノ酸配列のうち、特定の領域を欠失させた、p53結合ドメイン欠失体を数種類作製して、35S-p53についてGSTプルダウンアッセイを行うことにより決定することができる。具体的には、上記のシノビオリンのp53結合ドメイン欠失体をGST-融合タンパク質として大腸菌等で発現させて、35S-p53タンパク質とのタンパク質-タンパク質間結合をGSTプルダウンアッセイ法により確認する。【００５４】
上記方法により、シノビオリンにおけるp53結合ドメインは、シノビオリンタンパク質に含まれるアミノ酸配列（配列番号：２）の第236から270番目までの35アミノ酸残基であることが判明した。
従って、上記の化合物として、例えば、シノビオリンタンパク質の236位から270位の35アミノ酸領域をターゲットとして、p53との結合を阻害する化合物が挙げられる。【００５５】
また本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによって、p53タンパク質のアミノ酸残基の一部がリン酸化酵素によりリン酸化され、活性化することが見出された。
従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、p53リン酸化タンパク質を活性化する機能を有する化合物である。【００５６】
p53タンパク質の活性化につながるリン酸化の対象となるアミノ酸残基は、p53のアミノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましく、第15番目のセリン残基(Ser15)がさらに好ましい。
従って、上記の化合物として、例えば、p53の15位のセリン残基を基質とするリン酸化タンパク質の活性を上昇させる機能を有する化合物を挙げることができる。【００５７】
p53のSer15がリン酸化されると、p53の発現が高まり、転写活性が亢進し、その結果転写産物が増加する。このp53のSer15のリン酸化には、ATM(ataxia-telangiectasia mutated)、ATR(ataxia-telangiectasia related)、等のリン酸化酵素が深く関与している。ATMは、ヒトの常染色体性劣性遺伝疾患である毛細血管拡張性運動失調症の原因タンパク質であり、DNAの損傷を感知して癌抑制遺伝子p53をリン酸化することで細胞の増殖をコントロールする機能を有する。ATRは、ATMのファミリーの一つであるが、広範囲にわたる化学療法薬、紫外線の照射、あるいはタンパクリン酸化酵素の抑制により誘導され、かつ、ATMが関与しないp53の活性化に関与するリン酸化酵素である。【００５８】
ATMおよびATRは、カフェインによりその機能が阻害されることが知られているが、本発明においては、シノビオリンの発現および/または機能の阻害実験にカフェインを用いることにより、シノビオリンがATMおよびATR活性化を調節していることが判明した。【００５９】
即ち、カフェイン非存在下において、シノビオリンの発現および/または機能を阻害するとp53が活性化される。一方、カフェイン存在下でシノビオリンの発現および/または機能を阻害すると、p53の活性化は抑制される。また、カフェインによりATMおよびATRの活性（p53のリン酸化）が阻害されることは知られている。【００６０】
カフェインによりATMおよびATRの活性を阻害することにより、シノビオリンの発現および/または機能を阻害してもp53は活性化されないことから、シノビオリンの発現および/または機能を阻害すると、ATMおよびATRによるp53の活性化を誘導するというメカニズムが考えられる。そうすると、シノビオリンの発現および/または機能を阻害することによりこれらのリン酸化酵素活性が高められるといえる。従って、本発明は、シノビオリンの発現および/または機能を阻害することにより、リン酸化酵素の活性化を促進することを特徴とする。ATMおよびATRと同様の活性を有する酵素等（p53をリン酸化する酵素等）は、DNA-PKまたはGSK3β等でも良い。
従って、本発明において「p53リン酸化タンパク質」とは、p53を基質としてリン酸化し得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、ATM、ATR、DNA-PKまたはGSK3β等を指し、より好ましくは、ATMもしくはATRである。【００６１】
p53のSer15がリン酸化されることにより発現が誘導される物質としては、p21というタンパク質が知られている。p21は、サイクリン依存性リン酸化酵素（CDK）活性の阻害剤として機能し、CDK活性を阻害することにより、細胞周期の調節を担うタンパク質である。CDKは、細胞周期の抑制の要となり、そのパートナーであるサイクリンタンパク質と共に機能し、例えば、細胞の休止状態であるG1期からDNAの複製期であるS期へのスムーズな移行を司る。癌細胞において、p53が活性化されると、CDK阻害剤であるp21の発現が高まるため、癌細胞のG1期からS期への移行が妨げられることにより癌が抑制される。従って、本発明は、上記のように、シノビオリンの発現および/または機能を阻害させることにより、p53の活性化を高めてp21の発現を誘導させ、CDKの阻害を起こすことにより癌を抑制することを特徴とする。【００６２】
なお本発明における、上記低分子化合物は、天然由来の化合物または人工的に合成された化合物のいずれであってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。【００６３】
さらに本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および／または機能阻害物質として、例えば以下の（ａ）または（ｂ）の化合物を挙げることができる。
（ａ）シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質と結合する抗体
（ｂ）シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体【００６４】
シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。【００６５】
ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のシノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。【００６６】
また、モノクローナル抗体であれば、例えばシノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００６７】
本発明の抗体は、本発明のシノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。上記抗体は、p53との結合に関与するシノビオリンタンパク質の第236から270番目のアミノ酸領域を認識する抗体であることが好ましい。該抗体は、効果的にシノビオリンとp53との結合を阻害することが期待される。【００６８】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のシノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。【００６９】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。【００７０】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【００７１】
本発明のシノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質に対する抗体は、シノビオリンタンパク質および／またはp53タンパク質と結合することにより、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害し、例えばp53タンパク質の活性化する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。【００７２】
さらに本発明のシノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体（シノビオリンドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなシノビオリンドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、p53との結合を野生型シノビオリンと競合阻害するようなシノビオリンタンパク質変異体を挙げることができる。より具体的には、p53との結合ドメインを含むシノビオリンタンパク質の部分断片ペプチドを挙げることができる。シノビオリンタンパク質のアミノ酸配列において236位〜270位のアミノ酸領域を含む断片ペプチドは、上記ドミナントネガティブタンパク質の好ましい一例である。【００７３】
本発明においてシノビオリンタンパク質の発現および／または機能阻害物質には、例えばシノビオリン遺伝子の転写もしくは該転写産物からの翻訳を阻害する物質が含まれる。本発明の上記物質の好ましい態様として、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）シノビオリン遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸【００７４】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。また所謂LNA(Locked Nucleic Acid)も本発明の核酸に含まれる。【００７５】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【００７６】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりシノビオリン遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、シノビオリン遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、シノビオリン遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子（シノビオリン）の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。【００７７】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばGenBankのアクセッション番号AB024690で取得されるシノビオリン遺伝子の塩基配列（配列番号：１）等をもとに作成することができる。【００７８】
また、シノビオリン遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【００７９】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。【００８０】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。【００８１】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。【００８２】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【００８３】
siRNAの設計は、以下の通り行うことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、GenBank アクセッション番号 AB024690（配列番号：１）の任意の領域を候補にすることができる。
(b) 選択した領域から、AAで始まる配列を選択し、その配列の長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。その配列のGC含量は、例えば40〜60%となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号：１に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列を含むDNAをsiRNAの標的配列として使用することができる。特に、(i) （配列番号：３）、(ii) （配列番号：４）、(vi) （配列番号：８）、(vii) （配列番号：９）、(viii) （配列番号：10）を標的とすることが好ましい。【００８４】
(i) AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA（配列番号：３）
(ii) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG（配列番号：４）
(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT（配列番号：５）
(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT（配列番号：６）
(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT（配列番号：７）
(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA（配列番号：８）
(vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA（配列番号：９）
(viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG（配列番号：１０）
(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC（配列番号：１１）
(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC（配列番号：１２）
(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT（配列番号：１３）
(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG（配列番号：１４）
(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT（配列番号：１５）
(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA（配列番号：１６）【００８５】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。【００８６】
また本発明の好ましいsiRNAの一例として、配列番号：１８に記載されたセンス鎖と、配列番号：１９に記載されたアンチセンス鎖とをアニールさせた２本鎖RNAを示すことができる。該RNAは、より具体的には、以下のような構造のRNA分子である。
2006137514.tif 000007
（上記「I」は水素結合を表す。）【００８７】
なお、上記RNA分子は、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。【００８８】
また、本発明の好ましい態様としては、シノビオリン遺伝子の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：３〜１６）を標的とするsiRNA、または配列番号：１８および１９によって形成されるsiRNAの塩基配列において、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
RNAi(siRNA)のために使用されるRNAは、シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。【００８９】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは特に制限されない。【００９０】
例えば、本発明のシノビオリン遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明のシノビオリン遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【００９１】
本発明の上記「RNAi効果を有する二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明のシノビオリン遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。【００９２】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。【００９３】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００９４】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００９５】
また、本発明の発現阻害物質には、例えば、シノビオリンの発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、シノビオリンの発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えばシノビオリンのプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビオリンの発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【００９６】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、シノビオリンの発現を阻害するsiRNAを発現するベクターを挙げることができる。【００９７】
また本発明の発現阻害物質には、例えばシノビオリンの発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、シノビオリンの発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は例えばシノビオリンのプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビオリンの発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【００９８】
本発明のp53タンパク質活性化剤は、癌抑制タンパク質であるp53を活性化することにより癌細胞の増殖を阻止する作用を有する。従って、本発明は、本発明のp53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤を提供する。【００９９】
シノビオリンの発現もしくは機能を阻害すると、リン酸化酵素によりp53がリン酸化されてp53が活性化し、サイクリン依存性リン酸化酵素阻害タンパク質であるp21タンパク質の発現を高め、その結果、癌細胞のG1期からS期への移行を妨げることにより、癌の発生または増殖を抑制するものと考えられる。
従って、本発明のp53タンパク質活性化剤を含有する薬剤は、p21タンパク質活性化剤、あるいは、細胞周期（特にG1期からS期への移行）阻害剤となり得る。【０１００】
なおp53が関与する疾患については、上述の癌の他にも、例えば神経変性疾患が知られている（実験医学、増刊号、2001、p53研究の新たな挑戦、p.122-127）。そのため本発明のp53タンパク質活性化剤は、神経変性疾患に対する治療剤ともなり得ると考えられる。【０１０１】
また、本発明の「癌治療剤」は、「癌細胞増殖抑制剤」、「癌細胞発生抑制剤」、「腫瘍増殖抑制剤」、「抗癌剤」、あるいは「制癌剤」と表現することも可能である。また、本発明において「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。【０１０２】
なお、本発明における「治療」には、癌の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、癌細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。【０１０３】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。【０１０４】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。【０１０５】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。【０１０６】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。【０１０７】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。【０１０８】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。【０１０９】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。癌組織等に局所的に投与することもできる。【０１１０】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。【０１１１】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。【０１１２】
本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくは癌種は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型T細胞白血病、悪性リンパ腫）、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。【０１１３】
また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。
シノビオリン遺伝子の発現量を低下（抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤となることが期待される。本発明のスクリーニング方法によって、癌治療剤もしくは癌治療剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。【０１１４】
本発明の方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を選択する工程【０１１５】
上記方法においてはまず、シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、シノビオリンを発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノビオリン遺伝子を発現する細胞」としては、内在性のシノビオリン遺伝子を発現している細胞、または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は、通常シノビオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。【０１１６】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。【０１１７】
シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常シノビオリン遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことができる。【０１１８】
本方法においては次いで、該シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。【０１１９】
例えば、シノビオリン遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、シノビオリン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、シノビオリンタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。【０１２０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は癌治療のための薬剤となる。【０１２１】
また本発明のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタンパク質の活性を指標とする方法である。上記方法は、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリンタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程【０１２２】
本方法においてはまず、シノビオリンタンパク質または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる。【０１２３】
次いで、シノビオリンタンパク質の活性を測定する。シノビオリンタンパク質の活性としては、例えばp53タンパク質との結合活性（相互作用活性）、p53タンパク質のユビキチン化を促進させる活性、p53リン酸化タンパク質の活性化を阻害する活性等が挙げられる。該活性の測定は当業者においては公知の手法、例えば、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、酵母ツーハイブリッド法等によって適宜実施することができる。【０１２４】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該タンパク質の活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。【０１２５】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のシノビオリン遺伝子の発現レベルを低下させる化合物をレポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。【０１２６】
本発明の上記方法の好ましい態様は以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【０１２７】
本方法においてはまず、シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、シノビオリン遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、シノビオリン遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。シノビオリン遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するシノビオリン遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。【０１２８】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。【０１２９】
「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。【０１３０】
本方法における「接触」は、「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。【０１３１】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。【０１３２】
本方法においては、次いで測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤もしくは癌治療のための候補化合物となる。【０１３３】
また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合活性を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリンタンパク質はp53タンパク質に対して結合（相互作用）活性を有するタンパク質である。従って、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質の結合活性を指標として、該結合活性を低下（抑制）させる物質を選択することにより、癌治療のための薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。【０１３４】
本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程【０１３５】
本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次いでシノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合活性を測定する。【０１３６】
通常シノビオリンタンパク質とp53タンパク質との結合（相互作用）活性を測定することは当業者においては簡便に行い得ることであり、上記工程（ｂ）の結合活性の測定は、一般的な方法、例えば免疫沈降法およびプルダウンアッセイ等を利用して、適宜実施することが可能である。【０１３７】
また上記方法に使用するシノビオリンタンパク質およびp53タンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、結合（相互作用）活性を有するものであれば、これらタンパク質の一部のアミノ酸が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。【０１３８】
上記方法において用いられるシノビオリンタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質（全長タンパク質）であることが好ましいが、p53タンパク質との結合活性を保持している限り、その部分断片ペプチドであってもよく、また、タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。【０１３９】
p53タンパク質との結合に関与するシノビオリンタンパク質における領域は、シノビオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）における236〜270位の領域である。従って、本スクリーニング方法において、236〜270位のアミノ酸領域を含むシノビオリンタンパク質の断片ポリペプチドを好適に使用することができる。【０１４０】
上記方法は次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該結合活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。【０１４１】
また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、p53タンパク質のユビキチン化を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリンタンパク質は、p53タンパク質のユビキチン化を促進させる機能を有するタンパク質である。従ってp53タンパク質のユビキチン化を指標として、該ユビキチン化を低下（抑制）させる物質を選択することにより、癌治療のための薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。【０１４２】
本発明の上記方法は、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質のユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記ユビキチン化を低下させる化合物を選択する工程【０１４３】
本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次いでp53タンパク質のユビキチン化の程度を測定する。
当業者においては、一般的な手法によって、p53タンパク質のユビキチン化の程度を測定することが可能である。【０１４４】
一例を示せば、GST-p53およびMBP-Synoviolin ΔTM-Hisを用いてin vitro ユビキチン化反応の測定を行う。まずpGEX/p53を保持した大腸菌(BL21) 抽出液よりGST-p53をGSH-セファロース樹脂を用いて精製し、透析後の試料を用いて、MBP-Synoviolin ΔTM-Hisおよび他のin vitro ユビキチン化反応に用いる組成物（ATP、PK-His-HA-Ub、yeast E1、His-UbcH5c）を組み合わせて反応を行う。反応後、タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜上に転写して抗p53抗体(FL393あるいはDO-1)により膜上のp53タンパク質を検出することによって、in vitroユビキチン化の測定を行うことができる。【０１４５】
上記方法は次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、ユビキチン化の程度を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤もしくは癌治療のための候補化合物となる。【０１４６】
また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、p53タンパク質を基質とするp53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を指標とする方法を挙げることができる。シノビオリンタンパク質は、p53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を阻害することにより、p53の活性を阻害する。従って、p53リン酸化タンパク質の活性を上昇させる物質は、p53を活性化させる機能を有することが期待される。【０１４７】
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、p53リン酸化タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）p53タンパク質を基質とするp53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を上昇させる化合物を選択する工程【０１４８】
本方法においてはまず、シノビオリンタンパク質、p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次いでp53タンパク質を基質としたp53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を測定する。【０１４９】
本発明において「p53リン酸化タンパク質」とは、上述のように、p53を基質としてリン酸化し得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、ATM、ATR、DNA-PKまたはGSK3β等を指し、より好ましくは、ATMもしくはATRである。【０１５０】
上記方法において使用するp53リン酸化タンパク質は変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、p53タンパク質をリン酸化する活性を有するものであれば、p53リン酸化タンパク質の一部のアミノ酸が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。【０１５１】
また基質となるp53タンパク質も、変異を含まない野生型タンパク質（全長タンパク質）であることが好ましいが、p53リン酸化タンパク質によってリン酸化を受ける限り、その部分断片ペプチド（ペプチド断片）であってもよく、また、タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。さらに好ましくは、リン酸化を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。【０１５２】
上記方法においてp53リン酸化タンパク質によってリン酸化を受けるp53タンパク質上の部位は特に制限されるものではないが、好ましくはp53タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号：１７に記載のアミノ酸配列）における15位のセリン残基である。従って、本方法においては、15位のセリン残基を含むp53の断片ポリペプチドを好適に使用することができる。
p53リン酸化タンパク質のリン酸化酵素活性は、上述にように例えばリン酸化特異的抗体を用いたウエスタンブロット法等により測定することができる。【０１５３】
上記方法においてはさらに、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記p53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を上昇させる化合物を選択する。通常、使用するp53もしくはp53の断片ペプチドにおけるリン酸化の状態を指標として、適宜選択することができる。このようにして選択された化合物は、p53リン酸化タンパク質のp53タンパク質を基質とするリン酸化活性を促進させ、その結果、癌細胞の増殖を阻害し、癌治療効果を有することが期待される。【０１５４】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。【０１５５】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、少なくとも本発明の（ａ）シノビオリンタンパク質、（ｂ）p53タンパク質を構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗シノビオリン抗体、抗リン酸化Ser抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。【０１５６】
本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の発現および／または機能が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、シノビオリンタンパク質の検出の際に利用可能な、シノビオリン遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、シノビオリンタンパク質を認識する抗体（抗シノビオリンタンパク質抗体）も、本発明の癌治療剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。【０１５７】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のシノビオリン遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、シノビオリン遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。【０１５８】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。【０１５９】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のシノビオリン遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。【０１６０】
本発明において、胎児胚におけるp53の免疫染色を行ったところ、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚では全身においてp53が強く発現することが分かった。また、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚から単離した胎仔線維芽細胞（MEF）も、野生型から単離したものに比して強く発現しており、しかもp53は核内に強く局在した。この核局在は野生型ではまったく観察されなかった。また、シノビオリンとp53を強発現させると、p53は細胞質内にシノビオリンと共局在した。このことは、シノビオリンの発現および/または機能を阻害することにより、p53を核内へ移行させることができることを意味する。【０１６１】
さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔MEFでは、高い放射線感受性または紫外線感受性を示した。従って、本発明において、癌細胞中のシノビオリンの発現および/または機能を阻害してp53を癌細胞の核に移行させた後に、癌細胞に対して放射線照射または紫外線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。放射線照射手段は、特に限定されるものではないが、例えばγ線を1〜10Gy照射することができる。また、紫外線照射は、紫外線（波長100〜400 nm、好ましくは290〜400 nm）を、適当な紫外線照射装置（フナコシ社、デルマレイ社、キーエンス社製等）を用いて照射することができる。【０１６２】
さらに、核に局在化したp53を含む細胞（特に癌細胞）に、さらに抗癌剤を接触させることにより、効率良く癌を抑制することが可能である。あるいは、上記核に局在化したp53を含む癌細胞の周囲の脈管（例えば血管またはリンパ管）に塞栓を施すことで、癌を抑制することもできる。【０１６３】
「抗癌剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、白金錯化合物、分子標的治療薬などが含まれる。これらの抗癌剤の具体例として以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
<アルキル化剤>
マスタード系：シクロホスファミド（エンドキサン）、メルファラン等
アジリジン系：チオテパ等
アルキルスルホン系：ブスルファン等
ニトロソ尿素系：ニムスチン、ロムスチン等
<代謝拮抗薬>
葉酸誘導体：メトトレキセート等
プリン誘導体：メルカプトプリン、アザチオプリン等
ピリミジン誘導体：５−フルオロウラシル、テガフール、カルモフール等
<微小管阻害薬>
ビンカアルカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン等
タキサン：パクリタキセル、ドセタキセル等
<ホルモン類似薬>
タモキシフェン、エストロゲン等
<白金錯化合物>
シスプラチン、カルボプラチン等
<分子標的治療薬>
イマニチブ、リツキシマブ、ゲフィニチブ等【０１６４】
抗癌剤を癌細胞に接触させるための方法は、p53が核に局在化した細胞が含まれる細胞または組織（癌細胞または癌組織）に、抗癌剤を添加する方法、あるいは担癌患者または担癌動物に抗癌剤を投与する方法などが採用される。この場合の抗癌剤の処理量は、特に限定されるものではないが、添加する場合には100 pM 〜100μM、好ましくは1 nM〜10μMである。動物体内に投与するときは、例えば抗癌剤としてエンドキサンを使用するときは、0.1〜100 mg/kg/day、好ましくは2〜25 mg/kg/dayである。エンドキサン以外の抗癌剤についても、当業者は投与量または添加量を適宜設定することができる。【０１６５】
核に局在化したp53を含む癌細胞の周囲の脈管に塞栓を施すには、p53が核に局在化した癌細胞が含まれる細胞集団または組織の周囲の血管に血栓を形成させてもよく、血管またはリンパ管については脂肪による塞栓、空気やガスによる塞栓を形成させてもよい。【０１６６】
また本発明は、本発明のp53タンパク質活性化剤あるいはp53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤を個体（例えば、患者等）へ投与することを特徴とする、癌を予防もしくは治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず非ヒト動物であってもよい。【０１６７】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【０１６８】
さらに本発明は、本発明のp53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における使用に関する。【０１６９】
また本発明は、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。本発明の上記物質としては、好ましくは低分子化合物を挙げることができる。即ち本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する低分子化合物を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。【０１７０】
具体的には本発明者らは、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化反応を評価するアッセイ系を構築することに成功し、そのアッセイ系からシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する上記一般式（I)（Compound X）または一般式(II)（Compound Y）で表される２種の低分子化合物を取得することに成功した。【０１７１】
従って本発明の好ましい態様においては、上記一般式（I)または(II)に記載の化合物を有効成分として含有する抗リウマチ剤を提供する。【０１７２】
上記一般式（I)または(II)で表される化合物については、それぞれ上述した通りである。【０１７３】
また本発明において抗リウマチ剤における有効成分となる一般式（I)または(II)に記載の化合物は、該化合物において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに該化合物の塩に加えて、例えば該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。これらの化合物も同様に抗リウマチ作用を有することが期待される。【０１７４】
本発明において「塩」とは、本発明の化合物（一般式（I)または(II)に記載の化合物）と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸などが挙げられる。通常本発明において「塩」とは薬学的に許容される塩をいう。また上記塩の好ましい態様については上述した通りである。【０１７５】
また本発明者らは、上述の一般式（I)または(II)に記載の化合物がそれぞれリウマチ滑膜細胞（RASC）の増殖抑制効果を有することを見出した。即ち本発明の好ましい態様においては、上記一般式（I)または(II)に記載の化合物がリウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、抗リウマチ剤を提供する。【０１７６】
本発明の抗リウマチ剤は、上述のようにリウマチ滑膜細胞の増殖を抑制する効果を有する。例えばリウマチ性疾患の一つである慢性関節リウマチ（RA）では、リウマチ滑膜細胞の過増殖や活性化が主な病変として知られている。そのため、リウマチ滑膜細胞の増殖を抑制することができれば、慢性関節リウマチを含むリウマチ性疾患の治療に有用であると考えられる。【０１７７】
本発明における「リウマチ」には、いわゆるリウマチ性疾患が含まれ、具体的には、リウマチ：関節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リウマチなどを例示することができる。また上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したものであってよい。【０１７８】
本発明の「抗リウマチ剤」は、「リウマチ滑膜細胞増殖抑制剤」、「リウマチ滑膜細胞発生抑制剤」、「リウマチ治療剤」、「リウマチ性疾患治療剤」、「抗リウマチ薬」、あるいは「抗リウマチ性疾患薬」と表現することもできる。【０１７９】
なお本発明における「治療」には、リウマチ性疾患の発症を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。またリウマチ滑膜細胞が増殖している組織に対して、必ずしも完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。【０１８０】
本発明の薬剤については上述した通りである。また本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくはリウマチ性疾患の種類は特に限定されず、例えばリウマチ：関節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リウマチなどが対象として適用される。上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したものであってよい。【０１８１】
また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、抗リウマチ剤のスクリーニング方法を提供する。シノビオリン遺伝子の発現量を低下（抑制）させる化合物は、リウマチ性疾患の治療のための薬剤となることが期待される。本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法によって、抗リウマチ剤または抗リウマチ剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。【０１８２】
本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法である。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程【０１８３】
上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニング方法によって選択された化合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補化合物となる。【０１８４】
また本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、レポーター遺伝子の発現を指標として、シノビオリン遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法である。【０１８５】
本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【０１８６】
上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニング方法によって選択された化合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補化合物となる。【０１８７】
また本発明者らは、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を評価するアッセイ系を構築することに成功した。詳しくは以下の実施例に示すように、ELISAによる簡便なアッセイ系を構築し、ATP存在下の場合に、抗HA抗体濃度および二次抗体濃度、GST-Syno ΔTM濃度および反応時間に依存して、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を示すシグナルが増強することを見出した。そして、当該アッセイ系によってスクリーニングされた上記一般式（I)または(II)に記載の低分子化合物がリウマチ滑膜細胞の増殖抑制効果を示し、抗リウマチ効果を有することを初めて見出した。【０１８８】
すなわち本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を指標とする方法である。本発明のシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質を選択することにより、抗リウマチ剤のスクリーニングを行うことが可能である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。
（ａ）シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ユビキチン化を制御する化合物を選択する工程【０１８９】
本方法においてはまず、シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる。次いで、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化の程度を測定する。当業者においては例えば以下の実施例に記載される手法によって、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化の程度を測定することが可能である。【０１９０】
上記方法は次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、自己ユビキチン化の程度を制御する化合物を選択する。制御する化合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補化合物となる。【０１９１】
なお本発明において「制御する」とは、上方制御（例えば促進）あるいは下方制御（例えば抑制）が含まれる。【０１９２】
また本発明は、本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法を実施するために用いられる各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。【０１９３】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング用キットは、少なくとも本発明のシノビオリンタンパク質を構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗シノビオリン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法等を記載した指示書等を含めることができる。【０１９４】
また本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を個体（例えば患者等）へ投与することを特徴とする、リウマチ性疾患を予防または治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず非ヒト動物であってもよい。個体への投与については、上述した通りである。【０１９５】
さらに本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用に関する。【０１９６】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１９７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１９８】
〔実施例１〕  MEF培養細胞におけるp53の活性化の検討
シノビオリンホモノックアウトマウス（syno-/-）胎児線維芽細胞(MEF)におけるp53を免疫蛍光染色により確認した。
すなわち、免疫染色法は、MEFを常法に従いスライドガラス上に固定し、抗p53抗体（マウスモノクローナル抗体BD：Becton, Dickinson社）を用いて免疫染色を行った。3% 牛血清アルブミン（BSA）で30分ブロッキングを行った標本に、0.3% BSAで希釈した抗p53抗体（BD：10μg/mL）を室温で60分免疫反応させた。反応後の標本をPBSで洗浄後、TRITC標識抗マウスIgG抗体（Dako社）を２次抗体として免疫反応させた。抗p53抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。
その結果、野生型に比し、syno-/-のMEF培養細胞ではp53の発現上昇、及び核内移行を起こしている細胞が多数確認された（図１、「MEF-/-」のパネル）。【０１９９】
〔実施例２〕  syno-/-マウスにおけるp53活性化の検討
syno-/-マウスにおけるp53活性化の検討を、embryoを用い免疫染色により行った。
すなわち、syno-/-の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス上に固定し、ベクタステインABCキット(VECTOR社)を用いて行った。ブロッキング試薬で30分ブロッキングした標本に対して、5μg/mLに希釈した抗p53抗体FL393を室温で60分間免疫反応させた。反応後の標本をPBSで洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を２次抗体として免疫反応させた。抗p53抗体に免疫反応する抗原は、HRP活性に基づく3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメチルグリーン染色を行った。
この結果、syno-/-のembryoにおけるp53が安定化及び発現上昇していることが確認された（図２）。【０２００】
〔実施例３〕  p53に対するシノビオリンの効果
syno-/-のMEF培養細胞におけるp53をウェスタンブロッティングにより検出した。
すなわち、各種細胞を細胞破砕液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1% NP40、1 mM PMSF、0.1% sodium dodecyl sulfate（SDS）、2μg/mL Leupeptin、2μg/mL Aprotinin、2μg/mL Pepstatin）を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、SDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により細胞破砕画分を分離した。SDS-PAGE後、細胞由来タンパク質は、エレクトロブロッティング法によりニトロセルロース（NC）膜に転写した。このNC膜に対し、5%スキムミルクを加えたTris buffered saline（TBS）で室温、1時間ブロッキングした後、抗p53抗体c-terminal aa;195-393またはFL393を5%スキムミルクを加えたTBSで希釈して室温、1時間免疫反応させた。反応後のNC膜を0.1% Tween20/TBSで洗浄し、horse radish peroxidase（HRP）標識抗ウサギIgG抗体を2次抗体として室温、1時間免疫反応させ、0.1% Tween20/TBSで洗浄し、HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。HRP活性の検出にはECLキット（Amersham社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, p1531, 1979）。
その結果、ウェスタンブロッティングによりsyno-/-のMEF培養細胞におけるp53発現量が増加していることが確認された（図３）。【０２０１】
〔実施例４〕  syno-/-のMEF培養細胞におけるp53のリン酸化部位の同定
本実施例においては、抗p53抗体を用いたウェスタンブロッティングによりp53のリン酸化部位の同定を行った。
すなわち、p53（配列番号：１７）の異なるセリン残基のリン酸化を認識する4種の抗リン酸化p53モノクローナル抗体（Phospho-p53(ser15)、Phospho-p53(ser20)、Phospho-p53(ser37)およびPhospho-p53(ser46)；Cell Signaling社）を用いて、MEF細胞のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化p53モノクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウスIgGヒツジ-HRPを用いる他は実施例3に記載のとおりである。
その結果、syno-/-のMEF培養細胞において、p53のアミノ酸配列（配列番号：１７）中、第15番目のセリン残基のリン酸化が顕著であった（図４）。図４において、左上のパネルが、第15番目のセリン残基がリン酸化されたものである。53kDa付近のバンドが顕著に濃く表れている。【０２０２】
〔実施例５〕  Ser15のリン酸化亢進のメカニズムの解明
細胞株として野生型のp53を発現していることが確認されているRKO(ヒト大腸がん由来細胞株)を60 mmプレートに1.0x105細胞/プレート/2 mLで細胞を播種し、Oligofectamineを用いてGFPおよびシノビオリンに対するsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後、72時間後にSer15のリン酸化に重要なATM(ataxia-telangiectasia mutated)およびATR(ATM and Rad3 related)の阻害剤であるカフェイン(10 mM)を添加し、リン酸化Ser15-p53に対する抗体Phospho-p53(ser15)を用いてウェスタンブロッティングを行った。
その結果、シノビオリンに対するsiRNAによって亢進したSer15のリン酸化はカフェイン添加（添加後12時間、24時間）により、完全に阻害された（図５）。シノビオリンの発現を阻害すると、ATMおよびATRによるp53の活性化を誘導することが示唆された。【０２０３】
〔実施例６〕  p53により誘導されるp21の発現にシノビオリンが及ぼす影響
RKO細胞をシノビオリンに対するsiRNA処理し、p53の転写産物であるp21の発現の変化をウェスタンブロッティングで検討した。
すなわち、細胞株として野生型のp53を発現していることが確認されているRKO(ヒト大腸がん由来細胞株)を60 mmプレートに1.0x105細胞/プレート/2 mLで細胞を播種し、Oligofectamineを用いてGFPおよびシノビオリンに対するsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。72時間後に細胞を回収し調製した。調製したタンパク質をSDS-PAGEで分離し、抗p21ポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗p21ポリクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウスIgGヒツジ-HRPを用いる他は実施例3に記載のとおりである。
その結果、シノビオリンに対するsiRNA処理によって、p53の発現が高まると同時に、p21の発現も増加した。この効果は72時間で明確に示された（図６）。【０２０４】
〔実施例７〕  シノビオリン発現阻害による、細胞周期への影響等の検討
本実施例においては、リウマチ患者由来滑膜細胞におけるシノビオリンを、RNAi効果により阻害した際の細胞周期への影響の検討を行った。
RA滑膜細胞を10 cmディッシュに9.0x104細胞で播種し、シノビオリンsiRNA（最終濃度25 nM）をトランスフェクトした後、フローサイトメーターにより細胞周期を観察した。その結果、siRNA 25 nM(h589)では、G0/G1期における細胞周期の遅延が見られた（図７）。【０２０５】
siRNAとしてはh589を用いた。
なお、h589とは、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖をアニールさせた２本鎖RNAを意味する。
センス鎖 h589：GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT（配列番号：１８）
アンチセンス鎖 h589：CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT（配列番号：１９）【０２０６】
〔実施例８〕  癌組織におけるシノビオリンの発現の検討
Tissue array (CHEMICON 社: 10 common human cancer tissue with normal human tissue)を、抗シノビオリン抗体(10Da)を用いて免疫染色した。
免疫染色に使用した抗体濃度は8μg/mLであり、使用したキットはシンプルステインMAX (M)である。
その結果、正常組織でのシノビオリンの発現は、大腸、腎、肺、卵巣、精巣、皮膚および乳腺で認められたのに対し、神経およびリンパ節では認められなかった。また、各腫瘍組織においてシノビオリンの発現が確認され、特に、発現が明らかに亢進していると判断された組織は、神経・リンパ節であった（図８および図９）。【０２０７】
〔実施例９〕  培養細胞中でシノビオリンおよびp53を共発現させた場合の各々の局在への影響
３種類のプラスミド、GFP-p53、FLAG-synoviolin、およびFLAG-synoviolin C307S(ユビキチン（Ub）化活性なし)をSaos-2細胞に導入した。【０２０８】
各プラスミドは、以下の通りである。
GFP-p53：Green fluorescence protein と野生型p53のフュージョン蛋白発現
FLAG-synoviolin：FLAGタグつき野生型シノビオリン発現
FLAG-synoviolin C307S(ユビキチン（Ub）化活性なし)：FLAGタグつき失活型シノビオリン発現【０２０９】
FuGene6 (Roche)によるトランスフェクション処理して24時間後に10%ホルマリンで固定し、400倍希釈一次抗体α-FLAG抗体、200倍希釈二次抗体α-mouse IgG-TRITC、1μM DAPIで核を染色して、その局在を観察した。【０２１０】
その結果、野生型p53は強発現させると核に局在することが観察された（図１０）。野生型シノビオリンは強発現すると細胞質（特に核周辺）に局在した。また、野生型p53と野生型シノビオリンを強発現させると、本来核に局在するp53が核周辺に細かいドット状に分布し、シノビオリンと共局在していることが観察された（図１１）。野生型p53とシノビオリンC307S mutantを強発現させると、p53が細胞質内に大きなドットを形成し、シノビオリンと共局在していることが観察された（図１２）。
以上のことから、シノビオリンとp53は一定条件下で共局在することが示された。ユビキチン化活性の有無でその局在の形態が変化することが考えられる。【０２１１】
〔実施例１０〕  MBP-Synoviolin ΔTM-HisによるGST-p53のin vitroユビキチン化の検討
シノビオリンの細胞内における増減によりp53の細胞内タンパク質量の変動が観察されており、シノビオリンによるp53の制御が示唆されている。そこで、シノビオリンが直接p53をユビキチン化（Ub）するか否かを調べるために、GST-p53およびMBP-Synoviolin ΔTM-Hisを用いてin vitro ユビキチン化反応の検討を行った。【０２１２】
GST-p53：N末端側にGSTを融合させたp53を大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。
MBP-Synoviolin ΔTM-His：N末端側にMBP, C末端側にHisタグを融合させたシノビオリンを大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。【０２１３】
pGEX/p53を保持した大腸菌(BL21)を500 mLのLB培地で培養し、IPTGによる誘導後(1 mM、30℃、6 h)、培養液より0.5% NP-40を含む緩衝液を用いて大腸菌抽出液を調製した。
大腸菌抽出液よりGST-p53をGSH-セファロース樹脂を用いて0.1% NP-40存在下で精製した。その透析後の試料を用いて、MBP-Synoviolin ΔTM-Hisおよび他のin vitro ユビキチン化反応に用いる組成物（ATP、PK-His-HA-Ub、yeast E1、His-UbcH5c）を組み合わせて反応を行った（図１３）。反応後、タンパク質を7.5% SDS-PAGEにより分離し、PVDF膜上に転写して抗p53抗体(FL393あるいはDO-1)により膜上のp53タンパク質を検出した。また、GST-p53の添加量を変化させて同様の反応および検出を行った。【０２１４】
その結果、GST-p53精製画分およびMBP-Synoviolin ΔTM-Hisを含む全ての組成物を添加した場合に、約90kDaの位置を中心としてp53由来のラダー状のシグナルが観察された（図１３）。これらの結果から、シノビオリンが直接p53のユビキチン化に関与していると言える。従って、シノビオリンの発現および/または機能を阻害することにより、p53のユビキチン化を抑制できることが示された。【０２１５】
〔実施例１１〕  RNAi下におけるシノビオリン、p53 mRNA量の検討
本実施例では、シノビオリンRNAi条件下において、シノビオリンおよび関連遺伝子について、経時的にmRNA量の変化を検討することでシノビオリンが細胞周期、アポトーシスなどへ及ぼす影響を検討した。
RA滑膜細胞を30000 cells/10 cmディッシュで播種し、定法に従い25 nM siRNA（No. 589）をトランスフェクションし、細胞培養4日間の間、経時的に細胞を回収し、mRNAを得た。1μgのmRNAをテンプレートとし、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNAについて、ABI TaqMan Gene expression assay (GEX)を用いて、定量を行った。対照遺伝子を18S rRNAとしてmRNA量を算出した。
GEX試薬ターゲットアッセイNo.（アッセイID）は、シノビオリンがHs00381211_m1、p53がHs00153340_m1である。
その結果、シノビオリンsiRNA存在下では、シノビオリンmRNA量が減少するが、p53のmRNA量は変化していないことが確認された（図１４）。【０２１６】
〔実施例１２〕  シノビオリンのp53結合ドメインの決定
GST-Synoviolinとp53がin vitroプルダウンアッセイで結合し、それにはシノビオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）の第236から270番目までの35アミノ酸残基が必要十分である。
そこで、本実施例では、さらに、シノビオリンがp53に結合するために必要なドメインを同定するために、図１５に示すように、シノビオリンのp53結合ドメイン欠失体を作製して、35S-p53について以下の通りGSTプルダウンアッセイを行った（図１６）。【０２１７】
100μLのCompetent cell（BL-21株）を1μLの各GSTタンパク質をコードしたプラスミドで形質転換した。各GSTタンパク質とプラスミドの名前は以下のとおりであった。
GSTタンパク質 : プラスミド
GST : pGEX-6P-1 (Pharmacia Biotech)
GST-SynoΔTM 236-617 : pGEX-5-1 / SΔTM
GST-SynoΔTM 236-270 : p6-3
GST-SynoΔTM 271-617 : pST490【０２１８】
4 mLのLB-Amp+に接種し、37℃で一晩培養した。翌日Pre-cultureのOD600を測定し、15 mLのLB-Amp+にOD600=3.0相当を接種した（終濃度≒0.2）。25℃恒温槽で約2hr培養し、OD600=0.6〜0.8になったことを確認した後、恒温槽に氷を加えて20℃に冷却し、培養容器を10分つけて20℃まで冷却した。0.1 M IPTGを15μL（終濃度＝0.1 mM、通常の1/1000）、1 mM ZnCl2を150μL（終濃度=10μM）加えて、20℃で4hr震盪培養しGSTタンパク質の発現を誘導した。誘導後、遠心して細胞を回収した（5000 rpm、5min、4℃）。1 mL PBS(-)に細胞を再懸濁し、エッペンドルフチューブに移し、細胞を回収した（14000 rpm、1min、4℃）。上清を全て吸い取った後、500μLのPBS(-) / Z （PBS(-) / 10μM ZnCl2）に再懸濁し、液体窒素で凍結、−20℃で保存した。翌日−20℃のサンプルを37℃の恒温槽に10minつけて融かし、次に氷水中につけて0℃まで冷却した。以下のプロテアーゼ阻害剤を混合し、1サンプルあたり6.5μL加えた。【０２１９】
100 mM PMSF (Final 1 mM)                               20μL
Aprotinin (Final 0.1%)                                  2μL
0.5 mg/mL PepstatinA (Final 0.5μg/mL)                  2μL
1 mg/mL Leupeptin (Final 1μg/mL)                       2μL【０２２０】
各サンプルを超音波破砕した（Power Level 7、15秒、3回）。一回ごとに氷水中に３０秒つけて冷却した。次に500μLの2 x GST Buffer / Z （2% TritonX-100、720 mM NaCl、1 x PBS(-)、10μM ZnCl2、10 mM β-Mercaptoethaol、2 mM PMSF、0.1% aprotinin）を加え混合後、さらに超音波破砕した（Power Level 7、15秒、1回）。破砕した液を14000rpm 30min 4℃で遠心した。この間に1mLの1 x PBS(-)で200μLの80%-slurry Glutathione Sepharoseビーズを3回洗い、160μLの1 x PBS(-)を加え、50%-slurryに調整した。遠心後の上清1mLに80μLの50%-slurry Glutathione Sepharoseビーズを加え、4℃で2hr RotationしてGSTタンパク質をビーズに結合させた。1 mLの1 x GST-Buffer / Z （1% TritonX-100、360 mM NaCl、0.5 x PBS(-)、5μM ZnCl2、5 mM β-mercaptoethanol、1 mM PMSF、0.05% aprotinin）で4回ビーズを洗った。遠心は2000 rpm、1min、4℃で行った。残った上清を全てきれいに吸いとった後、60μLの1 x GST-Buffeｒ / Zを加え、合計100μLにした。このうち10μLを等量の2 x SDS Sample Bufferと混ぜ、100℃、5min、ヒートブロックで熱し、10μLずつ10%ゲルにApplyした。同時に0.25〜4μgのBSAもApplyした。泳動（150 V 50min）、CBB染色（未使用のもので30min）、脱色（1hrを2回）、グリセロール水（30〜60min）、（ゲル乾（80℃、1hr）して、GSTタンパク質の発現、回収効率をチェックした。翌日、35S-p53のIn vitro Translationを行った。まず、以下の試薬を混合した。【０２２１】
TNT Reticulocyte Lysate                  25μL
TNT Reticulocyte Buffer                   2μL
Amino Acids Mixture (-Met)                1μL
DEPC-treated Water                       15μL
RNase Inhibitor                           1μL
TNT polymerase                            1μL
35S-Met                                   4μL
Plasmid (p53・HA)                         1μL
Total    50μL【０２２２】
30℃恒温槽で1.5〜2.5hr保温し、In vitro Translationした。この間にG-25カラムのふたを緩めて軽く遠心（2500 rpm、1min、4℃）し、100μLのPull-down Buffer V（20 mM HEPES pH 7.9、150 mM NaCl、0.2% Triton X-100）を乗せてさらに遠心し、カラムを洗った。このカラムにIn vitro Translation溶液を50μL全量乗せて遠心した（2500 rpm、1min、4℃）。さらに200μLのPull-down Buffer Vを乗せて、再度遠心した（2500rpm、1min、4℃）。これをIn vitro Translation Product（IvTL）として用いた。そのうち4μLを、16μLのMilli-Q、20μLの2 x SDS Bufferと混ぜ、On put 10%とした。30μgのGSTタンパクが結合したビーズを含んだ1 mLのPull-down Buffer Vに120μLのIvTLを加え、4℃で１hr Rotationした。遠心（10000rpm、1min、4℃）した後、上清を370μLずつGST、各GST-Synoviolinビーズを含んだ1 mLのPull-down Buffer Vに加え、4℃で1hr Rotationした。このビーズを1 mLのPull-down Buffer Vで4回洗った。この時上清は必ず100μLぐらい残し、ビーズを吸い取らないようにした。遠心は2500 rpm、1min、4℃で行った。上清を吸いとった後、40μLの1 x SDS Sample Bufferを加えて、Pull-downサンプルとした。On put 10%とPull-downサンプルを100℃で5min、熱し、-20℃で保存した。翌日サンプルを37℃の恒温槽で10min温め、10μLずつ10%ゲルにApplyした。泳動（150 V 50min）、CBB染色（30min）、脱色（1hr x 2）、グリセロール水（30〜60min）、ゲル乾（80℃、1hr）した後、IP Plateに露光させた。14時間後、露光したIP PlateをBASで読み取り、ImageGaugeで定量した。またC.B.B.染色したゲルはフィルムスキャナーで読み取った。【０２２３】
その結果、p53結合ドメイン欠失体は結合活性をほぼ完全に失っていた。また、図１５から、p53結合ドメインは236から270アミノ酸の35アミノ酸の一ヶ所のみであると考えられる。【０２２４】
〔実施例１３〕  シノビオリンによるp53ユビキチン化活性に対するCompound X, Yの影響
シノビオリンによるGST-p53のin vitroユビキチン化反応を解析することを目的として、同反応におけるCompound X、Yの影響を調べた。Compound X、Yの化学構造式を図１７Ａに示す。
GST-p53存在下で、MBP-SynoΔTM-Hisを用いたin vitroユビキチン化反応系に、Compound X、 Yの濃度を変化させて（75,150,300,600μM）添加した。反応後、タンパク質を7.5% SDS-PAGEにより分離し、PVDF膜上に転写して抗p53抗体、FL393（Santa Cruz Biotechnology,Inc.）により検出した。
その結果、Compound X、YはGST-p53のユビキチン化反応に対して、濃度依存的に阻害効果を示した（図１７Ｂ）。【０２２５】
〔実施例１４〕  Compound X、Yの細胞毒性への検討
RKO細胞（ヒト大腸癌由来細胞株、ATCC:CRL-2577）を96穴マイクロタイタープレート(FALCON,non coated)に1000 cells/100μL/wellで10% 牛胎児血清含Eagle's Minimum Essential Medium 播種し24時間培養した。
Compound X、Yを10% 牛胎児血清含Eagle's Minimum Essential Mediumに溶解し、各well 10μLずつ添加し、24〜72時間培養を行った。
培養後、各wellにつき、WST-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)- 5-(2,4-disulfophenyl)-2H- tetrazolium, monosodium salt）を添加し、2〜4時間後の450 nmにおける吸光度を測定し（参照波長  750 nm）細胞生存率を算出した（図１８）。
算出方法は以下の計算式による。【０２２６】
2006137514.tif 000008
【０２２７】
その結果、Compound X、Yにより、細胞増殖が抑制された（図１８）。【０２２８】
〔実施例１５〕  培養細胞におけるp53タンパク発現量に対するCompound X, Yの影響
RKO細胞をCompound Yで処理し、p53の蛋白質発現量の変化をウェスタンブロッティングで検討した。すなわち、RKO細胞を10 cmプレートに5.0×105細胞/プレートで細胞を播種し、24時間培養後、Compound Yを終濃度5、10、20μMで添加した。24時間後に細胞を回収し、細胞溶解液を調製した。タンパク質をSDS-PAGEで分離し、抗p53抗体（FL393, Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗p53抗体を、そして標識抗体として抗ヒトIgGウサギ-HRPを用いる他は実施例３に記載のとおりである。その結果、Compound Yによりp53のタンパク質発現量が上昇した（図１９）。【０２２９】
〔実施例１６〕  ELISAによるシノビオリンの自己ユビキチン（auto-Ub）化反応評価系の構築
ELISAによる簡便な自己ユビキチン化反応のアッセイ系を構築し、自己ユビキチン化反応を阻害する化合物を評価する事を目的とした。
まず、ELISA法を用いたシノビオリン自己ユビキチン化反応検出系における抗体濃度の検討を行った。
即ち、ATP(10 mM)存在下あるいは非存在下で、His-E1(human, 125 ng), His-PK-HA-Ub(1.6μg), His-UBE2G2(0.8μg), GST-Syno ΔTM(0.4μg)と混合し、in vitroユビキチン化反応(30μl)を37℃で1時間行った。反応液に70μl の0.5 M EDTAを添加して反応停止後、予めPBST/10% Skim milkで2時間ブロッキングしたglutathione coated ELISA用プレート(Reacti-Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗HA抗体（1/2000, 1/4000, 1/8000）を100μlずつ分注し、室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗ウサギIgG抗体（1/1000, 1/2000, 1/4000）を100μlずつ分注し、室温で30分間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのOPD発色液を添加し、室温で15分間振盪後、50μlの2 N硫酸を50μl添加して反応停止後、プレートリーダーにより492 nmにおける吸光度を測定した（図２０）。【０２３０】
次に、ELISA法を用いたシノビオリン自己ユビキチン化反応検出系におけるGST-Syno ΔTM濃度の検討を行った。
即ち、ATP(10 mM), His-E1(human, 125 ng), His-PK-HA-Ub(1.6μg), His-UBE2G2(0.8μg), GST-Syno ΔTM(0.83、1.7、3.3、6.7、13.3 ng/μl)を混合しin vitroユビキチン化反応(30μl)を37℃で1時間行った。反応液に70μl の0.5 M EDTAを添加して反応停止後、予めPBST/10% Skim milkで2時間ブロッキングしたglutathione coated ELISA用プレート(Reacti-Bind,PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗HA抗体（1/2000）を100μlずつ分注し、室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗ウサギIgG抗体（1/2000）を100μlずつ分注し、室温で30分間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのOPD発色液を添加し、室温で15分間振盪後、50μlの2 N硫酸を50μl添加して反応停止後、プレートリーダーにより492 nmにおける吸光度を測定した（図２１）。【０２３１】
最後に、ELISA法を用いたシノビオリン自己ユビキチン化反応検出系における反応時間の検討を行った。
即ち、ATP(10 mM), His-E1(human, 125 ng), His-PK-HA-Ub(1.6μg), His-UBE2G2(0.8μg), GST-Syno ΔTM(200 ng)を混合しin vitroユビキチン化反応(30μl)を37℃で15, 30, 60, 120分間行った。反応液に70μl の0.5 M EDTAを添加して反応停止後、予めPBST/10% Skim milkで2時間ブロッキングしたglutathione coated ELISA用プレート(Reacti-Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗HA抗体（1/1000）を100μlずつ分注し、室温で1時間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。PBSTで希釈した抗ウサギIgG抗体（1/2000）を100μlずつ分注し、室温で30分間振盪した。廃液後、200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのOPD発色液を添加し、室温で15分間振盪後、50μlの2 N硫酸を50μl添加して反応停止後、プレートリーダーにより492 nmにおける吸光度を測定した（図２２）。
その結果、今回構築したELISA系では、ATP存在下の場合に、抗HA抗体濃度および二次抗体濃度（図２０）、GST-Syno ΔTM濃度（図２１）および反応時間（図２２）に依存してシグナルの増強が認められた。【０２３２】
〔実施例１７〕  低分子化合物のリウマチ滑膜細胞（RASC）に対する効果
シノビオリン自己ユビキチン化を指標としたスクリーニングによりデザインされた2種の低分子化合物(No.32（Compound X）、38（Compound Y）)のリウマチ滑膜細胞(RASC)に対する効果を評価する為、まず、RASCに対する増殖抑制効果を検討した。
検体はNo. 32（Compound X）、38（Compound Y）と命名した低分子化合物を使用した。RASCにはHFLS-RA(Cell applications inc.,Code CA40405)を用いた。RASCを96 well microtiter plateに1000 cells / wellで播種し、10% ウシ胎児血清含DMEM（KOHJIN BIO）により24時間培養を行った。その後、検体を細胞に、終濃度50μMから1/2ずつ段階希釈して添加し、1、24、48時間後に3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)を終濃度0.5 mg/mLとなるように添加し、2時間後に培地を吸引し、残ったフォルマザンをdimethyl sulfoxide 50μLで溶解し、540 nmにおける吸光度を測定した。細胞および検体を添加していない群を0%、検体を添加していない群を100%としたときの、検体を添加した群の吸光度を細胞生存率として算出した。
その結果、各化合物において、72時間培養後のIC50値はNo.32で20μM、No.38で約6μMであった（図２３、２４）。これらの低分子化合物は低濃度でRASC細胞増殖抑制効果を示し、抗リウマチ効果を有すると考えられた。
【配列表フリーテキスト】
【０２３３】
配列番号：１８：合成オリゴヌクレオチド（DNA/RNA混合物）
配列番号：１９：合成オリゴヌクレオチド（DNA/RNA混合物）
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
本発明により、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能の阻害物質を有効成分として含有する、p53タンパク質活性化剤が提供される。この薬剤は癌治療剤として有用である。
また本発明者らによって見出された知見に基づいて開発されたスクリーニング方法を利用することにより、癌治療剤の候補化合物を効率的に取得することが可能である。
さらに、本発明者らによって見出された種々の知見は、p53の癌抑制作用のメカニズムを解明するための学術的研究に対しても大いに貢献するものと期待される。
また、本発明のp53タンパク質活性化剤は、p53に関連する癌抑制作用の解明のための研究用試薬としても有用である。【０２３５】
また本発明により、シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤が提供される。本発明者らによって見出された知見に基いて開発されたスクリーニング方法を利用することにより、抗リウマチ剤の候補化合物を効率的に取得することが可能である。
【図１４】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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