(57)【要約】  ルシフェラーゼ基質となり活性酸素測定用試薬として有用な下記の一般式(I)：2007111345.tif 000013［式中、R1及びR2は水素原子、C1-6アルキル基、又は下記の式（A）：2007111345.tif 000014〔式中、X1は−N(R3)(R4)（式中、R3及びR4は水素原子、C1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、C1-6アルコキシ基、スルファニル基又はアルキルスルファニル基で表される基を示し；X2はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示し；Yは-O-又は-S-を示し；ｎは1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式（A）で表される基を示す］で表される化合物又はその塩、及び該化合物を含む活性酸素測定用試薬。
2007111345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
2007111345.tif 000010
［式中、R1及びR2はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は下記の式(A)：
【化２】
2007111345.tif 000011
〔式中、X1は−N(R3)(R4)（式中、R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、C1-6アルコキシ基、スルファニル基又はアルキルスルファニル基で表される基を示し；X2はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示し；Yは-O-又は-S-を示し；ｎは1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式（A）で表される基を示す］で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
R1及びR2がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は式(A)〔式中、X1が−N(R3)(R4)（式中、R3及びR4がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、又はC1-6アルコキシ基を示し、X2がベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示し、Yが-O-を示し、ｎが1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式（A）で表される基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
R1が水素原子であり、R2が式(A)〔式中、X1は−NH2を示し、X2は水素原子を示し、Yは-O-を示し、ｎは2を示す〕である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質。
【請求項５】
下記の一般式(II)：
【化３】
2007111345.tif 000012
〔式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-又は-S-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）で表される基を示すが、R11及びR12の少なくとも一つは−(CH2)m−Z−Hで表される基を示す〕で表される化合物又はその塩。
【請求項６】
R11及びR12がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）で表される基を示すが、R11及びR12の少なくとも一つは−(CH2)m−Z−Hで表される基である請求項５に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
R11が水素原子であり、R12が−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）である請求項５又は６に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
R11が水素原子であり、R12が−(CH2)2−OHである請求項５ないし７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
請求項５ないし８のいずれか１項に記載の化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質。
【請求項１０】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬。
【請求項１１】
活性酸素の測定方法であって、下記の工程：
(A)請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び
(B)上記工程(A)で生成した請求項５に記載の一般式(II)で表される化合物又はその塩をルシファラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する工程
を含む方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の活性酸素測定用試薬とルシフェラーゼとを要素として含む活性酸素測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素測定用試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光法は、励起光を必要としないためバックグランドノイズがほぼゼロであり高感度な測定が可能である。また、励起光を必要としないことから簡単な構造の装置で測定をすることができる。これらの特長により、生物発光法は、ブロッティングにおける目的物質の検出やレポーター酵素など様々なアッセイ系に汎用されている。さらに、最近では、光透過性の悪い生物試料の深部のイメージングも可能であることから、イン・ビボのイメージング系への応用も検討されるようになってきた。【０００３】
このようにイン・ビボのイメージングにおいて生物発光法は有効であると考えられているが、従来の生物発光法における発光波長はルシフェリンが有する570 nmに限られているため、イン・ビボのイメージングに用いるには波長が短いという問題がある。このため、発光波長をより組織透過性に優れた長波長側にシフトさせる研究が行われているが、これらの研究は、いずれの場合も酵素であるルシフェラーゼの特性を改変することにより行われており、基質であるルシフェリンについてアプローチした報告はほとんどない。【０００４】
本発明者らは、アミノルシフェリンのアミノ基にアルキル基を導入した化合物が、ルシフェリンと同様の高い発光性を有し、かつ発光波長がルシフェリンに比べて大幅に長波長側にシフトし610 nm以上の発光波長を有すること、及びアミノルシフェリンのアミノ基にアミノフェネチル基を導入した化合物がルシフェラーゼの基質としての性質を失わず、基質となって反応した際にも無発光性であること、及び該化合物のアミノ基をアシル化した化合物ではルシフェラーゼの基質としての性質が保持されるとともに、ルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出し、これを原理として生物発光特性のon/off制御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質が提供可能なことを報告している（第18回バイオメディカル分析科学シンポジウム講演要旨集, pp.101-102, 2005）。【０００５】
また、生物発光法はその感度に注目が集中していたが、標的分子の存在下のみで発光が生じるような生物発光特性のon/off制御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質の研究も報告されている（例えば特開2000-270894号公報、J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 25, pp.23-30, 1987など）。これらはルシフェリンのメチルエーテル型やアミノルシフェリンのアミド型がルシフェラーゼの基質とならず発光しないことを利用し、ルシフェリンやアミノルシフェリンに糖やペプチドを結合させて、それらと特異的に反応する酵素の活性を測定するという原理に基づくものである。しかし、この原理では適用可能なプローブの標的は非常に限られてしまうという問題がある。このため、機能性イン・ビボ発光イメージングを可能にする汎用性の高い生物発光プローブの開発が望まれていた。【０００６】
一方、活性酸素は生体において様々な重要な役割を演じていることが報告されている。例えば、一酸化窒素は情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系などにおいて血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮していることが知られており、スーパーオキサイドアニオンや過酸化水素は免疫系などにおいて重要な生理作用を発揮していることが明らかにされている。ヒドロキシラジカルは血管障害や虚血後の脳障害、あるいは紫外線によるDNA修飾に関わる知見が多数報告され、病因・病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。【０００７】
また、一酸化窒素とスーパーオキサイドアニオンが反応することにより生成するパーオキシナイトライト(ONOO-)は芳香環のニトロ化が可能であるなど高い酸化能を有し、またチロシンのニトロ化を効率よく行うなど、特徴的な反応性を有する。最近の報告によれば、チロシンがニトロ化されることにより、チロシンのリン酸化が阻害され、MAPK、PI3K/Aktカスケードなどの情報伝達に重要な影響を及ぼすことが指摘されている。さらに、近年、次亜塩素酸イオンの生体内での作用が注目されている。好中球による殺菌作用は主に次亜塩素酸イオンによると考えられており、アズール顆粒中のミエロペルオキシダーゼにより、過酸化水素と塩化物イオンから次亜塩素酸イオンが生成することがイン・ビトロで示され（Klebanoff, S. J. et al., The Neutrophils: Function and Clinical Disorders, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, Netherlands, 1978）、また、次亜塩素酸イオンは血小板活性化因子に誘導される微小循環障害の血管内皮表面の損傷において重要な役割を果たすとの報告がある（Suematsu, M., et al., J. Biochem., 106, pp.355-360, 1989）。【０００８】
このように活性酸素は炎症、老化、動脈硬化等の各種疾患や情報伝達に関与していることから、種々の活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっており、生体内の活性酸素種を測定するため、いくつかの蛍光プローブが提案されている。例えば、国際公開WO 01/64664の活性酸素蛍光プローブ（J. Biol. Chem., 278, pp.3170-3175, 2003）、国際公開WO99/51586、及び国際公開WO02/18362に記載の一重項酸素蛍光プローブ、特開平10-226688、及び国際公開WO 2004/76466に記載の一酸化窒素蛍光プローブ、H2DCFDA（2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキュラー・プローブス社、カタログ番号D-399）などが知られている。また、ウミホタルルシフェリン誘導体MCLAを用いて化学発光法によってスーパーオキサイドアニオンを測定する方法（Clinica Chimica Acta, 179, pp.177-182, 1989）、及び一重項酸素を測定する方法（J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69-72, 1991）も提案されている。しかし、ルシフェリン誘導体を活性酸素に対する生物発光プローブとして使用した活性酸素を測定する方法についてはほとんど知られていなかった。
【特許文献１】特開2000-270894号公報
【特許文献２】国際公開WO01/64664
【特許文献３】国際公開WO99/51586
【特許文献４】国際公開WO02/18362
【特許文献５】特開平10-226688号公報
【特許文献６】国際公開WO2004/76466
【非特許文献１】J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 25, pp.23-30, 1987
【非特許文献２】Clinica Chimica Acta, 179, pp.177-182, 1989
【非特許文献３】J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69-72, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヒドロキシラジカル、次亜塩素酸イオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）/過酸化水素系などの高い酸化活性を有する活性酸素種を選択的に可視化可能な試薬を提供することにある。特に、従来法では不可能であった酸化ストレスの動物個体イメージングに適応可能な活性酸素測定用試薬を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アミノルシフェリンのアミノ基にアルキル基を導入した化合物が、ルシフェリンと同様の高い発光性を有し、かつ発光波長がルシフェリンに比べて大幅に長波長側にシフトし610 nm以上の発光波長を有すること、及びアミノルシフェリンのアミノ基にアミノフェネチル基を導入した化合物がルシフェラーゼの基質としての性質を失わず、基質となって反応した際にも無発光性であること、及び該化合物のアミノ基をアシル化した化合物ではルシフェラーゼの基質としての性質が保持されるとともに、ルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出し、これを原理として生物発光特性のon/off制御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質が提供可能なことを見出した（特願2005-286948号明細書）。【００１１】
本発明者らは上記の知見を基にさらに検討を行った結果、特願2005-286948号明細書に記載された一般式に包含される化合物のうち、アミノルシフェリンのアミノ基にアミノフェニルオキシアルキル基を導入した化合物が、活性酸素との反応前はルシフェラーゼの基質としての性質を有しており、該化合物が基質となって反応した際には無発光性であること、ヒドロキシラジカルやパーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及びHRP/過酸化水素系などの酸化力の強い活性酸素種と反応して該アミノフェニルオキシアルキル基において脱アリール化反応が起こること、並びに該脱アリール化反応生成物がルシフェラーゼの基質としての性質を保持しており、かつルシフェラーゼとの反応により強く発光することを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。【００１２】
すなわち、本発明により、下記の一般式（I）：
【化１】
2007111345.tif 000003
［式中、R1及びR2はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は下記の式（A）：
【化２】
2007111345.tif 000004
〔式中、X1は−N(R3)(R4)（式中、R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、スルファニル基又は置換基を有していてもよいC1-6アルキルスルファニル基で表される基を示し；X2はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示し；Yは-O-又は-S-を示し；ｎは1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式（A）で表される基を示す］で表される化合物又はその塩が提供される。【００１３】
上記の発明の好ましい態様によれば、一般式(I)において、R1及びR2がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は式（A）〔式中、X1が−N(R3)(R4)（式中、R3及びR4がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、又は置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基を示し、X2がベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示し、Yが-O-を示し、ｎが1〜6の整数を示す〕で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式（A）で表される基を示す化合物又はその塩が提供される。この発明の最も好ましい態様によれば、R1が水素原子であり、R2が式（A）〔式中、X1は−NH2を示し、X2は水素原子を示し、Yは-O-を示し、ｎは2を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。【００１４】
別の観点からは、下記の一般式（II）：
【化３】
2007111345.tif 000005
〔式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-又は-S-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）で表される基を示すが、R11及びR12の少なくとも一つは−(CH2)m−Z−Hで表される基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。【００１５】
上記の発明の好ましい態様として、一般式(II)において、R11及びR12がそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）で表される基を示すが、R11及びR12の少なくとも一つは−(CH2)m−Z−Hで表される基を示す化合物又はその塩が提供される。この発明の好ましい態様によれば、R11が水素原子であり、R12が−(CH2)m−Z−H（式中、Zは-O-を示し；ｍは1〜6の整数を示す）で表される化合物又はその塩が提供される。この発明の最も好ましい態様によれば、R11が水素原子であり、R12が−(CH2)2−OHで表される化合物又はその塩が提供される。【００１６】
別の観点からは、上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬が本発明により提供される。さらに、本発明により、活性酸素の測定方法であって、下記の工程：(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した脱アリール化合物（上記一般式(II)で表される化合物）又はその塩をルシファラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する工程を含む方法が提供される。さらに、上記の活性酸素測定用試薬とルシフェラーゼとを要素として含む活性酸素測定用キットが本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により提供される上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を有しているものの、基質となって反応しても無発光性であるが、一方、ヒドロキシラジカルやパーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオンなどの極めて酸化力の強い活性酸素種と接触して脱アリール化を起こして上記一般式(II)で表される化合物又はその塩を生じる。該上記一般式(II)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を保持しつつ、かつ基質となって反応すると発光性の化合物を生じることから、ヒドロキシラジカルやパーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及びHRP/過酸化水素系などの極めて酸化力の強い活性酸素種と一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドアニオン、及び一重項酸素などの活性酸素種を区別して測定する活性酸素測定試薬として極めて有用である。さらに、本発明により提供される上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、イン・ビボでの活性酸素のイメージングや酵素免疫測定法などのイン・ビトロアッセイの測定系として好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物８と種々の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。
【図２】化合物８と各濃度の次亜塩素酸イオンを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光強度を次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットした結果である。
【図３】化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。
【図４】化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光強度を過酸化水素の濃度に対してプロットした結果である。
【図５】化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させた時の発光強度をHRPの濃度に対してプロットした結果である。
【図６】化合物１３をルシフェラーゼと反応させた時の発光スペクトルを測定した結果である。
【図７】化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を過酸化水素の濃度に対してプロットした結果である。
【図８】化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をHRPの濃度に対してプロットした結果である。
【図９】化合物８と次亜塩素酸イオンを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度を次亜塩素酸イオンの濃度に対してプロットした結果である。
【図１０】化合物８とパーオキシナイトライトを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をパーオキシナイトライトの濃度に対してプロットした結果である。
【図１１】化合物８とヒドロキシルラジカルを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をヒドロキシルラジカルの濃度に対してプロットした結果である。
【図１２】HRPとALPの同時検出系において、化合物８とHRP/過酸化水素系の活性酸素種を反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をHRPの濃度に対してプロットした結果である。
【図１３】HRPとALPの同時検出系において、LuphosとALPを反応させ、その生成物をルシフェラーゼと反応させたときの発光強度を発光測定装置を用いて測定し、その積算発光強度をALPの濃度に対してプロットした結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルキルカルボニル基など）のアルキル部分は、直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなる飽和炭化水素基を意味している。より具体的には、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基などを挙げることができる。【００２０】
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と言う場合には、置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、アルキル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。また、本明細書においてアリール基という場合には、単環性又は多環性のアリール基のいずれであってもよいが、好ましくはフェニル基を用いることができる。アリール環についても同様であり、好ましくはベンゼン環を用いることができる。【００２１】
上記一般式(I)において、R1及びR2は水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は式(A)で表される基を示すが、R1及びR2の少なくとも一つは式(A)で表される基を示す。R1及びR2の一方が式（A）で表される基を示し、他方が水素原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基であることが好ましく、R1及びR2のいずれか一方が式(A)で表される基であり、他方が水素原子であることが特に好ましい。【００２２】
R1及びR2が示す置換基を有していてもよいC1-6アルキル基としては、置換基を有していてもよい直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなる飽和炭化水素基の何れでもよいが、C1-6アルキル基が直鎖C1-6アルキルであることが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。R1及びR2が示すC1-6アルキル基が置換基を有する場合、該置換基は特に限定されず、上記一般式(I)で表される本発明の化合物の活性酸素測定用試薬としての機能を損なわないものであればいかなるものであってもよい。【００２３】
一般式(I)中のR1及びR2に置換する式(A)で表される基において、X1は−N(R3)(R4) （式中、R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、スルファニル基又は置換基を有していてもよいC1-6アルキルスルファニル基で表される基を示すが、X1が−N(R3)(R4) で表される基である場合には、R3及びR4が共に水素原子であることが好ましい。X1が置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基である場合にはメトキシ基が好ましく、置換基を有していてもよいC1-6アルキルスルファニル基である場合には、メチルスルファニル基であることが好ましい。X1は−(CH2)n−Y−が置換する位置に対してパラ位に結合することが好ましい。X2はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし3個の一価の置換基を示すが、2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。X2が示す置換基の置換位置は特に限定されず、ベンゼン環上の置換可能な任意の位置に置換することができる。Yは−O−、又は−S−を示すが、−O−であることが好ましい。ｎは1〜6の整数を示すが、ｎが1〜3であることが好ましく、特にｎが2であることが好ましい。【００２４】
一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質となりうる構造を有しており、かつルシフェラーゼの基質として反応した際に電子密度の高い（HOMOエネルギーの高い）ベンゼン環部位から発光部位であるアミノルシフェリン部位への電子供与が起こり、その結果、発光を生じない性質を有している。【００２５】
上記一般式(II)において、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、又は−(CH2)m−Z−Hで表される基を示すが、R11及びR12の少なくとも一つは−(CH2)m−Z−Hで表される基を示す。R11及びR12の一方が−(CH2)m−Z−Hで表される基を示し、他方が水素原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基であることが好ましく、R11及びR12のいずれか一方が−(CH2)m−Z−Hで表される基であり、他方が水素原子であることが特に好ましい。R11及びR12が示す置換基を有していてもよいC1-6アルキル基は、一般式（I）が示すR1及びR2が示す置換基を有していてもよいC1-6アルキル基と同様である。Zは−O−、又は−S−を示すが、−O−であることが好ましい。ｍは1〜6の整数を示すが、ｍが1〜3であることが好ましく、特にｍが2であることが好ましい。【００２６】
一般式(II)で表される本発明の化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質となりうる構造を有し、かつルシフェラーゼの基質として反応した際に発光する性質を有している。
本明細書において「発光性」とはルシフェラーゼとの反応により発光を生じる性質を意味している。一方、本明細書において、本発明の化合物が「無発光性」であるとは、ルシフェラーゼの基質となって化学修飾を受けるものの、酵素反応の生成物が実質的に発光しないことを意味している。【００２７】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。【００２８】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。【００２９】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式(I)及び一般式(II)で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。【００３０】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素の測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した一般式(II)で表される化合物又はその塩をルシフェラーゼと反応させて生じる生物発光を測定する方法を含んでいる。【００３１】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光は、アデノシン三リン酸（ATP）及びマグネシウムイオンの存在下、基質のD-ルシフェリンがルシフェラーゼによって発光体であるオキシルシフェリンに酸化される反応によっておこる。従来は発光が速やかに減衰してしまうためにオートインジェクターを備えたルミノメーターを必要としていたが、現在ではコエンザイムA（CoA）を添加した改良法（Promega Protocols and Application Guide, 2nd edition）により、より強くかつ安定した発光が得られるようになり、特別な装置は不要となっている。
【化４】
2007111345.tif 000006
【００３２】
また、近年、CCDカメラや画像解析技術の進歩により、従来は捕捉が難しかった体内（イン・ビボ）の微量ルシフェラーゼ発光を捉えることが可能となっている。ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光イメージング技法は、蛍光プローブを用いたイメージングと比較して励起光照射の必要がないため、(1)バックグラウンドノイズがほとんど無く、高S/Nイメージングが可能であること、及び(2)光透過性の悪い深部のイメージングも可能であることなどの特徴を有する。【００３３】
本発明の一般式(I)で表される化合物を含む活性酸素測定用試薬は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞（癌細胞や細菌など）に接触させ、あるいはトランスジェニックマウス、又は病態モデル動物などに腹腔内投与することにより、細胞又は生物個体内での酸化ストレスをリアルタイムに測定することが可能であり、疾患病態の原因究明、治療薬の開発などに好適に利用できる。また、本発明の活性酸素測定用試薬は、バックグラウンドノイズがほとんど無く、高感度にHRP/過酸化水素系の反応を測定することが可能なことから、酵素免疫測定法などのイン・ビトロアッセイ系の測定系としても有用である。【００３４】
本発明の一般式（I）で表される化合物が活性酸素種およびルシフェラーゼの両方と反応して得られる化合物の発光は長波は615nm付近にあるので、活性酸素以外の測定対象物及びルシフェラーゼの両方と反応して得られる化合物の発光ピーク波長が本発明の発光ピークと異なる化合物を組み合わせて用いることにより、活性酸素種とそれ以外の測定対象物を同時に測定することが可能である。【００３５】
例えば、アルカリホスファターゼ（ALP）及びルシフェラーゼの両方と特的に反応してALP活性を測定することができるLuphos（Toya, Y. et. al., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 65, pp.2604-2610, 1992）と本発明の化合物を組み合わせれば、資料中のALP活性と活性酸素種を同時に測定できる。【００３６】
本発明の化合物又はその塩を活性酸素測定用試薬として用いる場合、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１： 化合物８の合成
化合物８の合成スキームを以下に示した。
【化５】
2007111345.tif 000007
【００３８】
(A)化合物２の合成
4-ニトロフェノールナトリウム塩（化合物１）（1.1 g, 7.0 mmol)を15 mLのジメチルホルムアミドに溶解し、２−クロロエタノール（0.6 mL, 8.9 mmol)を加え130 ℃で加熱還流して一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1)で原料の消失を確認した後、反応溶液を留去し、残渣を酢酸エチルで抽出して飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 1 − 2 / 1)にて精製し、化合物２（固体）を得た（850 mg, 66%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.96 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 4.00-4.07 (m, 2H), 4.19 (t, 2H, J = 4.5 Hz), 6.99 (td, 2H, J = 2.8, 10.1 Hz), 8.22 (td, 2H, J = 2.8, 10.1 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 61.0, 69.9, 114.5, 125.9, 141.6, 163.7.
MS (EI+) 183, M+【００３９】
(B)化合物３の合成
化合物２（850 mg, 4.6 mmol)を20 mLのメタノールに溶解し、30 mgの10% パラジウムカーボンを加え水素置換して室温にて一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1)で原料の消失を確認した後、反応溶液をろ過してろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1) にて精製し、化合物３（固体）を得た (590 mg, 84%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.05 (br, 1H), 3.45 (br, 2H), 3.88-3.92 (m, 2H), 3.99-4.04 (m, 2H), 6.65 (td, 2H, J = 2.7, 8.9 Hz), 6.77 (td, 2H, J = 2.7, 8.9 Hz).
13C-NMR (75 MHz, acetone-d6) δ 61.4, 70.9, 116.2, 116.4, 142.6, 151.9.
MS (EI+) 153, M+【００４０】
(C)化合物４の合成
化合物３（1.8 g, 12 mmol)を10 mLのピリジンに溶解し、ベンジルオキシカルボニルクロライド（2.2 mL, 15 mmol)を氷浴上で加えて、そのまま一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1)で反応の進行を確認した後、反応溶液を留去し、残渣を酢酸エチルで抽出して飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 2 − 2 / 1)にて精製して、化合物４（白色固体）を得た(2.3 g, 68 %)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.98 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 3.91-3.99 (m, 2H), 4.03-4.09 (m, 2H), 5.19 (s, 2H), 6.53 (br, 1H), 6.87 (td, 2H, J = 2.4, 9.2 Hz), 7.26-7.43 (m, 7H).
13C-NMR (75 MHz, acetone-d6) δ 61.4, 66.7, 70.8, 115.5, 120.8, 128.8, 128.9, 129.2, 133.2, 138.0, 154.5, 155.8.
HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 310.1055, Found, 310.1057.【００４１】
(D)化合物５の合成
ジメチルスルホキシド（2.8 mL, 39 mmol)を−78 ℃で2 mol/L二塩化オキサリル（ジクロロメタン溶液)20 mLに加えた。5分撹拌した後、化合物４（1.1 g, 3.8 mmol)と2 mLのジメチルスルホキシドのジクロロメタン溶液を−78 ℃で滴下し30分撹拌した。その後、10 mLのトリメチルアミンを加えた。室温に戻した後、反応溶液に水を加えて有機溶媒層を分離し1 mol/L塩酸、0.5w/w%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 3 − 1 / 1)にて精製して、化合物５（白色固体）を得た（700 mg, 64 %)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.55 (d, 2H, J = 1.0 Hz), 5.19 (s, 2H), 6.61 (br, 1H), 6.85 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.28-7.44 (m, 7H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 66.9, 73.0, 115.0, 120.6, 128.2, 128.3, 128.5, 132.0, 136.0, 153.6, 153.8, 199.2.
HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 308.0899, Found, 308.0938.【００４２】
(E)化合物６の合成
化合物５（140 mg, 0.5 mmol) を20 mLのテトラヒドロフランに溶解し、180 mmol/L硫酸2.8 mL（0.5 mmol)を加え室温で数分撹拌した。２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾール（93 mg, 0.5 mmol)と水素化ホウ素ナトリウム（23 mg, 0.6 mmol)を30 mLのテトラヒドロフランに溶かしこれを加え、室温で撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1）で反応の進行を確認し反応溶液に精製水を加えた後、飽和食塩水を加えてテトラヒドロフラン層と分離した。水層を酢酸エチルで抽出しテトラヒドロフラン層と合わせ、この有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 3 − 1 / 1）で精製した後、セミ分取HPLC（溶出液A = 水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、溶出液B = 80%アセトニトリル / 20%水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、A / B = 50 / 50 − 0 / 100（10分)）で精製し、化合物６（黄色固体）を得た（130 mg, 58 %)。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 3.49 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 4.07 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 5.05 (s, 2H), 6.79 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 6.97 (dd, 1H, J = 2.3, 9.1 Hz), 7.07 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.17-7.33 (m, 7H), 7.75 (d, 1H, J = 9.1 Hz).
13C-NMR (75 MHz, acetone-d6) δ 43.6, 66.8, 67.4, 100.6, 114.8, 115.7, 118.2, 120.7, 126.0, 128.8, 128.9, 129.3, 129.7, 133.6, 138.0, 139.8, 145.2, 150.9, 154.5, 155.5.
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 445.1334, Found, 445.1355.【００４３】
(F)化合物８の合成
化合物６を5 mLのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸を20 mL加えて60 ℃で加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1）で原料の消失を確認した後、トルエンと共沸して溶媒を除去した。残渣を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 2 − 1 / 1 − 2 / 1）で精製し、化合物７を得た。次に、D−システイン塩酸塩・一水和物（150 mg, 0.85 mmol)をアルゴンで脱気した精製水に溶解し、0.5 mol/L炭酸カリウム溶液でpHを8としたD−システイン溶液を調製した。化合物７（84 mg, 0.27 mmol)をアルゴンで脱気したエタノール20 mL、アセトン2 mLに溶解し、D−システイン溶液を加えた。アルゴン置換し、遮光して室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、残った水層を分取HPLC（溶出液A = 水 /  0.1 %トリフルオロ酢酸、溶出液B = 80 %アセトニトリル / 20%水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、A / B = 80 / 20 − 20 / 80（20分)）で精製し、化合物８を得た（18 mg, 16%, 2段階)。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 3.62 (t, 2H, J = 5.3 Hz), 3.65-3.77 (m, 2H), 4.23 (t, 2H, J = 5.3 Hz), 5.35 (t, 1H, J = 9.1 Hz), 6.96 (dd, 1H, J = 2.3, 9.0 Hz), 7.09 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.29 (td, 2H, J = 2.2, 9.0 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 9.0 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 35.8, 40.4, 43.9, 68.2, 79.3, 101.7, 117.0, 124.6, 125.2, 125.5, 140.1, 146.4, 150.2, 155.7, 160.6, 167.7, 173.5.
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 415.0899, Found, 415.0933.【００４４】
例２：化合物13の合成
【化６】
2007111345.tif 000008
【００４５】
(A)化合物９の合成
エチレングリコール（1 mL, 18 mmol）と ベンジルブロミド（2.1 mL, 18 mmol）を2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液10 mLとテトラヒドロフラン5 mLに溶解し、80 ℃で加熱還流した。薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1)で反応の進行を確認した後、反応溶液を酢酸エチルで振り取り、水層を4 mol/L塩酸にて酸性にした。水層を酢酸エチルで振り取り、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 4 − 1 / 2 − 1 / 1)にて精製し、化合物９（液体）を得た (970 mg, 36 %)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.00 (br, 1H), 3.58-3.63 (m, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 4.5 Hz), 4.57 (s, 2H), 7.28-7.38 (m, 5H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 60.9, 71.0, 72.6, 127.1, 127.3, 127.8, 137.6.
MS (EI+) 152, M+【００４６】
(B)化合物１０の合成
ジメチルスルホキシド（2.7 mL, 38 mmol）を−78 ℃で2 mol/L二塩化オキサリル（ジクロロメタン溶液） 20 mLに加えた。5分撹拌した後、化合物９（1.1 g, 3.8 mmol）と1 mLのジメチルスルホキシドのジクロロメタン溶液を−78 ℃で滴下し30分撹拌した。その後、10 mLのトリメチルアミンを加えた。室温に戻した後反応溶液に水を加えて、有機溶媒層を分離し1 mol/L塩酸、0.5w/w%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 4 − 1 / 2） にて精製して、化合物１０（液体）を得た (300 mg, 53 %)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.11 (d, 2H, J = 0.8 Hz), 4.64 (s, 2H), 7.28-7.39 (m, 5H), 9.73 (t, 1H, J = 0.8 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 73.1, 74.9, 127.6, 127.7, 128.2, 136.6, 199.9.
MS (EI+) 150, M+【００４７】
(C)化合物１１の合成
化合物１０（120 mg, 0.8 mmol）を30 mLのテトラヒドロフランに溶解し、180 mmol/L 硫酸3.3 mL（0.6 mmol）を加え室温で数分撹拌した。２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾール（110 mg, 0.6 mmol） と水素化ホウ素ナトリウム（23 mg, 0.6 mmol）を30 mLの テトラヒドロフランに溶かしこれを加え、室温で撹拌した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1）で反応が進んでいることを確認し反応溶液に精製水を加えた後、飽和食塩水を加えテトラヒドロフラン層と分離した。水層を酢酸エチルで抽出し テトラヒドロフラン層と合わせ、この有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 / 4 − 1 / 2）で精製し、化合物１１（黄色固体）を得た (70 mg, 38 %)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.36-3.44 (m, 2H), 3.75 (t, 2H, J = 5.1 Hz), 4.57-4.63 (m, 3H), 6.89 (dd, 1H, J = 2.4, 9.0 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.28-7.39 (m, 5H), 7.92 (d, 1H, J = 9.0 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3 ) δ 43.3, 67.9, 73.2, 100.0, 113.8, 117.1, 125.3, 127.7, 127.9, 128.4, 129.6, 137.6, 138.6, 144.7, 148.9.
HRMS (ESI-) Calcd for [M-H]-, 308.0858, Found, 308.0816.【００４８】
(D)化合物１２の合成
化合物１１（30 mg, 0.1 mL）を2 mLのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸を15 mL加え、60 ℃で一晩加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 2 / 1）で原料の消失を確認した後、トルエンと共沸して溶媒を除去した。残渣を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル / n−ヘキサン = 1 /3 − 1 /1 − 3 / 1）で精製した後、分取HPLC (溶出液A = 水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、 溶出液B = 80%アセトニトリル / 20%水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、 A / B = 80 / 20 − 20 / 80 (20分))で精製し、化合物１２（黄色固体）を得た (9 mg, 41 %)。
1H-NMR (300 MHz, CD3CN) δ 3.25 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.69 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 7.01 (dd, 1H, J = 2.3, 9.1 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 9.1 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CD3CN) δ 46.5, 60.7, 100.6, 115.0, 118.1, 125.9, 130.0, 139.9, 145.1, 150.9.
HRMS (ESI-) Calcd for [M-H]-, 218.0388, Found, 218.0429.【００４９】
(E)化合物１３の合成
D−システイン塩酸塩・一水和物（18 mg, 0.1 mmol）をアルゴンで脱気した精製水に溶かし、0.5 mol/L炭酸カリウム水溶液でpHを8としたD−システイン溶液を調製した。化合物１２（9 mg, 40 μmol）をアルゴンで脱気したメタノール10 mLに溶解し、D−システイン溶液を加えた。アルゴン置換し、遮光して室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、残った水層を酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗い減圧濃縮した。残渣を分取 HPLC (溶出液A = 水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、 溶出液B = 80%アセトニトリル / 20%水 / 0.1%トリフルオロ酢酸、A / B = 80 / 20 − 20 / 80 (20 分) )で精製し、化合物１３を得た(13 mg, 99 %)。
1H-NMR (300 MHz, CD3CN) δ 3.26 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.64-3.74 (m, 4H), 5.34 (t, 1H, J = 9.3 Hz), 6.94 (dd, 1H, J = 2.3, 9.0 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 9.0 Hz).
13C-NMR (75 MHz, CD3CN) δ 35.4, 47.1, 60.5, 78.7, 102.8, 117.0, 125.5, 139.5, 146.6, 148.7, 155.7, 166.7, 171.5.
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 324.0477, Found, 324.0450.【００５０】
例３：化合物８と種々の活性酸素種との反応
pH 7.7、0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液にて化合物８の溶液（最終濃度12 μmol/L、共溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を調製して試験に使用した。調製した溶液を以下の条件：
(a)パーオキシナイトライトを終濃度6μmol/Lとなるよう添加し、25℃にて1分間撹拌
(b)過酸化水素を終濃度1 mmol/Lとなるよう添加し、25℃にて1分間撹拌
(c)二酸化カリウムを終濃度1 mmol/Lとなるよう添加し、25℃にて5分間撹拌
(d)過酸化水素及び過塩素酸鉄(II)をそれぞれ終濃度１mmol/L、360 μmol/Lとなるよう添加し、25℃にて1分間撹拌
(e)次亜塩素酸ナトリウムを終濃度6μmol/Lとなるよう添加し、25℃にて1分間撹拌
(f)NOC-13（一酸化窒素放出剤：同仁化学研究所製）を終濃度1 mmol/Lとなるよう添加し、25℃にて15分間撹拌
で処理した。【００５１】
次いで、それぞれ反応液に硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加え、最後に最終濃度40 μg / mLのホタルルシフェラーゼを加え発光スペクトルを測定することで、(a)パーオキシナイトライト、(b)過酸化水素、(c)一重項酸素、(d)ヒドロキシルラジカル、(e)次亜塩素酸イオン、(f)一酸化窒素との反応性を比較した。測定の装置はF-4500（日立）を用いた。結果を図１に示す。化合物８はパーオキシナイトライト、ヒドロキシルラジカル及び次亜塩素酸イオンと反応して強く発光したが、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素とはほとんど反応せず発光スペクトルに変化が観察されなかった。従って、化合物８はパーオキシナイトライト、ヒドロキシルラジカル及び次亜塩素酸イオンなどの酸化力の強い活性酸素種のみを特異的に認識する生物発光プローブであることが確認された。【００５２】
例４：化合物８と次亜塩素酸イオンとの反応における次亜塩素酸イオン濃度依存性
pH 7.7、0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液に化合物８（最終濃度12 μmol/L、補助溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解した後、次亜塩素酸ナトリウムを最終濃度1.87 μmol/L、3.74 μmol/L、6.2 μmol/L、9.34 μmol/L、12.4 μmol/Lとなるようにそれぞれ添加し、25 ℃にて１分間撹拌した。次に硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加え、615 nmにおける発光の測定を開始した。30秒後に最終濃度20 μg / mLとなるように ホタルルシフェラーゼを加え、その時の初期発光強度を次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットした。測定の装置は F-4500 （日立）を用いた。
結果を図２に示す。次亜塩素酸ナトリウム濃度依存的に発光強度が増加しており、化合物８を用いて定量的に次亜塩素酸イオン濃度が測定可能なことが示された。【００５３】
例５： HRP / 過酸化水素系での化合物８の発光
(A)発光スペクトルの測定
pH 7.7、0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液に化合物８（最終濃度12 μmol/L、共溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解し、HRPを最終濃度0.2 μmol/Lとなるように加えた後で、過酸化水素を3 μmol/Lとなるように加え室温にてピペッティングした。次に硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加え、最後に最終濃度40 μg / mL ホタルルシフェラーゼを加え測定した。さらに、pH 7.7、0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液に化合物８（最終濃度12 μmol/L、共溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解した溶液に、前記と同量のHRPのみを添加したサンプル、過酸化水素のみを添加したサンプル、および双方ともに添加していないサンプルを調整し、硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加えた後、これらにそれぞれ最終濃度40 μg / mL ホタルルシフェラーゼを加え測定した。測定の装置は F-4500 （日立）を用いた。
結果を図３に示す。化合物８は、HRPと過酸化水素が共に存在するときのみ、大きな発光スペクトル変化を示した。これによりHRP/ 過酸化水素系の高い酸化活性を有する活性酸素種についても測定が可能なことが示された。【００５４】
(B)発光強度の過酸化水素に対する濃度依存性
pH 7.7、0.1 mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液に化合物８（最終濃度12 μmol/L、共溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解し、HRPを最終濃度0.2 μmol/Lとなるように加えた後で、過酸化水素を最終濃度0.12 μmol/L、0.36 μmol/L、0.6 μmol/L、1.2 μmol/L、1.8 μmol/L、2.4 μmol/L、3.6 μmol/Lとなるようにそれぞれ添加して、室温にてピペッティングした。次に硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加え、615 nmにおける発光の測定を開始した。30秒後に最終濃度20 μg / mL ホタルルシフェラーゼを加え、その時の初期発光強度を過酸化水素の濃度に対してプロットした。測定の装置は F-4500 （日立）を用いた。
結果を図４に示す。過酸化水素濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物８とルシフェラーゼ反応を組み合わせることにより過酸化水素濃度を定量的に測定できることが示された。【００５５】
(C)発光強度のHRPに対する濃度依存性
pH 7.7、0.1 mol/L  リン酸ナトリウム緩衝液に化合物８（最終濃度12 μmol/L、共溶媒として0.2%ジメチルホルムアミド含有）を溶解し、HRPを最終濃度0.05 nmol/L、0.1 nmol/L、0.3 nmol/L、0.5 nmol/L、0.75 nmol/L（100 unit / mg）となるように加えた後で、過酸化水素を最終濃度1 mmol/Lとなるようにそれぞれ添加して、室温にて10分間撹拌した。次に硫酸マグネシウム、ATPをそれぞれ最終濃度5 mmol/L、2.6 mmol/Lとなるように加え、615 nmにおける発光の測定を開始した。30秒後に最終濃度20 μg / mL ホタルルシフェラーゼを加え、その時の初期発光強度をHRPの濃度に対してプロットした。測定は2回行ない、その平均値をグラフに示した。測定の装置は F-4500 （日立）を用いた。
結果を図５に示す。HRP濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物８とルシフェラーゼ反応を組み合わせることによりHRP濃度を定量的に測定できることが示された。【００５６】
例６：化合物１３の発光スペクトル
発光の測定は pH 7.7、30 mmol/L N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）緩衝液に5 mmol/L 硫酸マグネシウム、 2.6 mmol/L ATP、 3.5 mmol/Lジチオスレイトール（DTT）、 1.5 mmol/L CoA、40 μg / ml ホタルルシフェラーゼ となるようにそれぞれ試薬を溶解させておいて、最後に最終濃度が 12 μmol/L （共溶媒として0.2%ジメチルスルホキシド含有）になるように化合物１３を加えた。測定の装置は F-4500 （日立）を用いた。
結果を図６に示す。化合物１３は化合物８と活性酸素との反応生成物である。この化合物１３がルシフェラーゼの基質となって反応し、発光することが確認された。【００５７】
例７  HRP／過酸化水素系での化合物８の発光
例５では発光を蛍光測定装置F-4500（日立）を用いて検出したが、発光測定装置Perkin-Elmer Envision 2103 Multilabel readerを用いて再度、HRP／過酸化水素系での化合物８の発光測定を実施した。
(A)発光強度の過酸化水素に対する濃度依存性
キュベット中に0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7）を用意し12 μmol/Lの化合物８（最終濃度）を加え、そこに過酸化水素（最終濃度0 μmol/L、0.011 μmol/L、0.043 μmol/L、0.065 μmol/L、0.11 μmol/L、0.22 μmol/L、0.43 μmol/L、0.65 μmol/L、1.1 μmol/L、2.2 μmol/L、4.3 μmol/L、6.5 μmol/L、過酸化水素溶液の濃度は ε240 = 43.6 M-1・cm-1 を用いて算出した）、HRP（最終濃度86 nU/mL）を添加し化合物８と10分反応させた。その後、プレートの各ウェルに0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、5 mmol/L 硫酸マグネシウムおよび300 ng/mL ホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ウェルに対し先のキュベット中から最終濃度1.8 μmol/L（反応開始時の化合物８の濃度として） となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後5秒後に2.6 mmol/L ATP（最終濃度）を添加し、添加後の5秒間の発光量を積算し、過酸化水素の濃度に対してプロットした。HRP との反応は37 °Cで行い、発光の測定は室温にて行った。結果を図７に示す。発光測定装置を用いた場合にも過酸化水素濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物８とルシフェラーゼを組み合わせることにより過酸化水素濃度を定量的に測定できることが示された。【００５８】
(B) 発光強度のHRPに対する濃度依存性
キュベット中に0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7）を用意し12 μmol/Lの化合物８（最終濃度）を加え、そこに過酸化水素（最終濃度100 μmol/L）、HRP（最終濃度0 nU/mL、0.086 nU/mL、0.13 nU/mL、0.22 nU/mL、0.43 nU/mL、0.86 nU/mL、1.3 nU/mL、2.2 nU/mL、HRP の濃度は ε403 = 102000 M-1・cm-1 を用いて算出した。）を添加し化合物８と10分反応させた。その後、プレートの各ウェルに0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、5 mmol/L 硫酸マグネシウムおよび300 ng/mL ホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ウェルに対し先のキュベット中から最終濃度1.8 μmol/L （反応開始時の化合物８の濃度として） となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後5秒後に2.6 mmol/L ATP（最終濃度）を添加し、添加後の５秒間の発光量を積算し、HRP の濃度に対してプロットした。HRP との反応は37 °Cで行い、発光の測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite（IWAKI）を用いて Perkin-Elmer Envision 2103 Multilabel reader で行った。結果を図８に示す。発光測定装置を用いた場合にもHRP濃度依存的に発光強度が増加していることから、化合物８とルシフェラーゼを組み合わせることによりHRP濃度を定量的に測定できることが示された。【００５９】
例８  化合物８の発光強度の各種活性酸素種に対する濃度依存性
キュベット中に0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7）を用意し12 μmol/L の化合物８（最終濃度）を加えた。ここに、次亜塩素酸イオンとの反応性を観察する場合は、最終濃度が0 μmol/L、0.19 μmol/L、0.37 μmol/L、0.62 μmol/L、1.9 μmol/L、3.7 μmol/L、6.2 μmol/L、9.4 μmol/L、12.4 μmol/L になるように次亜塩素酸ナトリウムを添加し、パーオキシナイトライトとの反応性を観察する場合は、最終濃度が0 μmol/L、0.24 μmol/L、0.40 μmol/L、0.60 μmol/L、1.2 μmol/L、2.4 μmol/L、4.0 μmol/L、6.0 μmol/Lになるように 硝酸ナトリウム溶液を添加し、ヒドロキシルラジカルとの反応性を観察する場合は、最終濃度1 mmol/Lの過酸化水素に対して過塩素酸鉄を最終濃度0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、12 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、120 μmol/L、160 μmol/Lになるように添加した。化合物８と各種活性酸素種を反応させた後、プレートに0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、5 mmol/L 硫酸マグネシウムおよび300 ng/mL ホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ウェルに対し先のキュベット中から最終濃度 1.8 μmol/L（反応開始時の化合物８の濃度として） となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後5秒後に2.6 mmol/L ATP（最終濃度）を添加し、添加後の5秒間の発光量を積算し、各活性酸素種の濃度に対してプロットした。測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite（IWAKI）を用いて Perkin-Elmer Envision 2103 Multilabel reader で行った。結果を図９、図１０、図１１に示す。いずれの活性酸素種についても化合物８を用いて定量的に検出できることが確認された。【００６０】
例９  HRPとALPの同時検出
化合物８と自製したアルカリフォスファターゼ（ALP）検出発光プローブLuphos（Toya, Y. et. al., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 65, pp.2604-2610, 1992）とを用いて、HRPとALPの同時活性検出を行った。
キュベット中に30 mmol/L HEPES 緩衝液（pH 7.7）を用意し化合物８とLuphosをそれぞれ12 μmol/L （最終濃度）加え、そこにHRP と ALP を、HRP濃度が0 nU/mLのときALP濃度0 μU/mL、HRP濃度が0.13 nU/mLのときALP濃度2.2 μU/mL、HRP濃度が0.22 nU/mLのときALP濃度5.4 μU/mL、HRP濃度が0.43 nU/mLのときALP濃度11 μU/mL、HRP濃度が0.86 nU/mLのときALP濃度22 μU/mL、HRP濃度が1.3 nU/mLのときALP濃度54 μU/mL、HRP濃度が2.2 nU/mLのときALP濃度110 μU/mL（いずれも最終濃度）になるように添加し10分反応させた。過酸化水素濃度は、100 μmol/L（最終濃度）である。その後、プレートの各ウェルに0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7.7、5 mmol/L 硫酸マグネシウムおよび300 ng/mL ホタルルシフェラーゼ含有、いずれも濃度は最終濃度）を分注し、該ウェルに対し先のキュベット中から最終濃度1.8 μmol/L（反応開始時の化合物８及びLuphosの濃度として） となるように反応液を加え測定を開始した。測定開始後5秒後に2.6 mmol/L ATP（最終濃度）を添加した。添加後の10秒間の発光量を測定した。HRP とALP の反応は37 °Cで行い、発光の測定は室温にて行った。測定はプレートとして Microlite（IWAKI）を用いて Perkin-Elmer Envision 2103 Multilabel reader で行った。フィルターとして615 nm/8.5 nm と545 nm/7 nm（Perkin-Elmer）を使用し、解析においては以下の行列式を用いた。
【数１】
2007111345.tif 000009
F615、F545 はそれぞれのフィルターを用いたときの実測値、κ615X、κ615Y、κ545X、κ545Y はそれぞれのフィルターを用いた時のホタルルシフェリンとヒドロキシエチルアミノルシフェリンの発光の透過度で κ545X = 0.062、κ615X = 0.028、κ545Y = 0.0041、κ615Y = 0.072を用いた。X(Luphos) はLuphosを用いた時の10秒間の積算発光強度、Y(化合物８) は化合物８を用いた時の10秒間の積算発光強度である。この式を解いて得られた発光量をそれぞれHRP、ALP の濃度に対してプロットした結果を図１２、図１３に示す。HRPとALPの同時検出系においても、化合物８を用いてHRPを、Luphosを用いてALPをそれぞれ定量的に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を有しているものの、基質となって反応しても無発光性であるが、一方、ヒドロキシラジカルやパーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオンなどの極めて酸化力の強い活性酸素種と接触して脱アリール化を起こして上記一般式(II)で表される化合物又はその塩を生じる。該上記一般式(II)で表される化合物又はその塩は、ルシフェラーゼの基質としての性質を保持しつつ、かつ基質となって反応すると発光性の化合物を生じることから、ヒドロキシラジカルやパーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及びHRP/過酸化水素系などの極めて酸化力の強い活性酸素種と一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドアニオン、及び一重項酸素などの活性酸素種を区別して測定する活性酸素測定試薬として極めて有用である。
【図１】
2007111345.tif 000015
【図２】
2007111345.tif 000016
【図３】
2007111345.tif 000017
【図４】
2007111345.tif 000018
【図５】
2007111345.tif 000019
【図６】
2007111345.tif 000020
【図７】
2007111345.tif 000021
【図８】
2007111345.tif 000022
【図９】
2007111345.tif 000023
【図１０】
2007111345.tif 000024
【図１１】
2007111345.tif 000025
【図１２】
2007111345.tif 000026
【図１３】
2007111345.tif 000027
【国際調査報告】
2007111345.tif 000028
2007111345.tif 000029
2007111345.tif 000030
2007111345.tif 000031