(57)【要約】  本発明は、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質、特にCRM197を有効成分とする癌治療薬であって、癌が膀胱癌、大腸癌、あるいは、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質を有効成分とする癌治療薬であって、前記有効成分がジフテリア毒素の変異体であってHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないポリペプチドであり、癌が大腸癌、膀胱癌および腹膜播種転移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬。
【請求項２】
膀胱癌治療薬である、請求項1に記載の癌治療薬。
【請求項３】
大腸癌治療薬である、請求項1に記載の癌治療薬。
【請求項４】
腹膜播種性転移癌の治療薬である、請求項１に記載の癌治療薬。
【請求項５】
腹膜播種性転移癌が、胃癌または膵癌から転移した腹膜播種転移癌である請求項４に記載の癌治療薬。
【請求項６】
有効成分がCRM197である、請求項１に記載の癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱癌、大腸癌、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌に対する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリア毒素或いはCRM197などの変異体は、分泌型及び非分泌型(膜結合型)HB-EGFのEGF様ドメインと結合し、HB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性を有する。この結合に関与するのはジフテリア毒素のレセプター結合ドメインである。【０００３】
CRM197の抗癌作用については、種々の研究がなされている。例えば、特許文献1には、CRM197が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌などに有効であることが記載され、非特許文献1には、CRM197を転移を有する癌患者に投与し、乳癌及びニューロブラストーマには有効例(complete response)があったが、非小細胞肺癌(NSCLC)、大腸癌、膀胱癌などでは癌が進行したことが開示されている。【０００４】
胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌は有効な抗癌剤がなく、予後も悪いことが知られている。これらの癌に対するジフテリア毒素或いはCRM197などの変異体の作用は知られていなかった。
【特許文献１】特開2004-155776
【非特許文献１】S. Buzzi, et al. Cancer Immunol. Immunother. (2004) 53: 1041-1048
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、膀胱癌、大腸癌、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌に有効な抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、CRM197の抗腫瘍効果について検討を重ねた結果、CRM197が膀胱癌、大腸癌、あるいは、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌に有効であることを見出した。【０００７】
本発明は、以下の癌治療薬に関する。
１．  HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質を有効成分とする癌治療薬であって、前記有効成分がジフテリア毒素の変異体であってHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性を有し、かつ、ジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないポリペプチドであり、癌が大腸癌、膀胱癌および腹膜播種転移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬。
２．  膀胱癌治療薬である、項1に記載の癌治療薬。
３．  大腸癌治療薬である、項1に記載の癌治療薬。
４．  腹膜播種性転移癌の治療薬である、項１に記載の癌治療薬。
５．  腹膜播種性転移癌が、胃癌または膵癌から転移した腹膜播種転移癌である項４に記載の癌治療薬。
６．  有効成分がCRM197である、項１〜５のいずれかに記載の癌治療薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、膀胱癌、大腸癌、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌を有効に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】腹膜播種モデル。1 x 107のヒト胃癌細胞株MKN28、MKN45、MKN74細胞をヌードマウス腹腔内に接種。CRM197を腹腔内に計5回(50mg / kg / week)投与し、接種後6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した。
【図２】ヒト膀胱癌細胞株KK47（5×106細胞）をヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種７日後より50 mg/kg/week量のCRM197を腹腔内に投与した(矢印)。CRM197を投与しないヌードマウスを対照実験とした。
【図３】ヒト大腸癌細胞株HT29、HCT116（5×106細胞）をヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種７日後より50 mg/kg/week量のCRM197を腹腔内に投与した(矢印)。CRM197を投与しないヌードマウスを対照実験とした。
【図４】腹膜播種モデル。1 x 107のヒト膵癌細胞株PANK1をヌードマウス腹腔内に接種。CRM197を腹腔内に計5回(50mg/kg/week)投与し、接種後6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質、特にジフテリア毒素の変異体であってHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないポリペプチドを有効成分として含む、大腸癌、膀胱癌、あるいは、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌からなる群から選ばれる少なくとも１種の癌を治療するための治療薬に関する。【００１１】
前記物質としては、ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを含むポリペプチドを好ましく例示できる。特に好ましい前記物質は、CRM197及びDT52E148Kのいずれかである。本明細書において、CRM197の番号は、配列番号1のアミノ酸配列においてシグナル配列（1〜25）を除いた26位のアミノ酸（Gly)を1番として番号付けしている。【００１２】
ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインは、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害することができる。前記ポリペプチドとしては、ジフテリア毒素の触媒作用ドメインの１又は複数（例えば数個もしくは十数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、該触媒作用の一部もしくは全てが損なわれたポリペプチドが、低毒性のために好ましい。なお、ジフテリア毒素の25個のシグナル配列は付いていても付いていなくてもよい。【００１３】
本発明の１つの好ましい実施形態において、前記物質は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの、HB-EGFのEGFレセプターへの結合を阻害する活性を有するポリペプチドを包含する：
（ａ） ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ） （ａ）のポリペプチドのレセプター結合ドメインの１若しくは複数（例えば数個もしくは数十個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合ポリペプチド。【００１４】
なお、レセプター結合ドメインは、一般的には378番目からC末端(535番目)までの領域を指すが、C末端側53アミノ酸程度でもレセプター結合能がかなりあるという報告がなされている（J. Biol. Chem. 265, 7331-7337, 1990）。【００１５】
CRM197、DT52E148Kなどのジフテリア毒素の変異体は、低毒性であるため、本発明の癌治療薬の有効成分として好ましい。【００１６】
本発明の物質の毒性レベルとしては、CRM197と同じかそれ以下であることが副作用を排除し、安全性を高める観点から好ましい。しかし、該毒性が、制癌剤の効果に寄与することが本発明により示唆されるため、CRM197と同程度の極めて低レベルの毒性を有することも、制癌効果を高める観点から好ましい。したがって、製剤処方にあわせて、適宜ジフテリア毒素の毒性レベルを選択することができる。【００１７】
ジフテリア毒素の毒性は、ADPリボシル化に必須である触媒作用ドメインに変異を持たせること、または、触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させることにより調整することができる。これに加えて、触媒作用ドメインとレセプター結合ドメインの間に存在する膜貫通ドメインに変異を持たせたものも、触媒作用ドメインを細胞質内に送り込むことができないので無毒または低毒性になる。したがってこの部分に変異を起こしたジフテリア毒素も制癌剤として使える可能性がある。【００１８】
本発明の有効成分のHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において、レセプター結合ドメインに対応する378番目から535番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有している。【００１９】
本発明の有効成分となる好ましい物質としては、(i)ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを保持しつつ触媒作用ドメインに変異（一部又は全部の置換、欠失、挿入または付加）を持たせたジフテリア毒素変異体が挙げられる。このような変異体の具体例としては、CRM197、DT52E148K及びGST-DTが挙げられる。これらはジフテリア毒素の毒性を実質的に持たず、HB-EGFのEGFレセプターへの結合を阻害する。CRM197は、25個のシグナル配列を除いてカウントした場合の52番目のGlyがGluに変異した変異体であり、DT52E148Kは、前記変異に加えてシグナル配列を除いてカウントした場合の148番目のGluがLysに変異した変異体である。また、GST-DTはGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ) にジフテリア毒素のシグナル配列を除いてカウントした場合の378番目から535番目を含む蛋白質である。CRM197のアミノ酸配列（最初の25個の配列がシグナル配列を表す）を配列番号1に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号2に表す。【００２０】
ここで、CRM197については、ジフテリア毒素の毒性を有さない、即ちADPリボシル化活性を有さないとの報告が既になされている（T. Uchida and A.M. Pappenheimer Jr. (1972) Science 175, 901-903）。また、148Eに変異を有する148K変異体が極めて弱い活性しか持たないことは知られており(J.T.Barbieri and R.J. Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651)、52E変異体であるCRM197にさらに148Kの変異を入れたダブルミュータントであるDT52E148Kは、さらに安全な変異体として好ましい。【００２１】
レセプター結合ドメインを含む断片は、プラスミドに組み込まれたCRM197をコードする遺伝子(Pβ197)を鋳型にして、PCR法にてレセプター結合ドメイン部分のDNA配列を合成して、これをGST融合タンパク質やヒスチジンタグを合成させるための発現ベクター（pGEX-3X、pQE-30）のマルチクローニングサイトに挿入し、得られたプラスミドを大腸菌に組み込み、プラスミドがコードする遺伝子を大腸菌で合成させることで作成できる。【００２２】
また、触媒作用ドメインに変異を有する変異体は、以下のようにして作成することができる。プラスミドに組み込まれたCRM197をコードする遺伝子(Pβ197)を鋳型にして、変異を持たせたい部位をプライマーとして、PCR法にてCRM197領域を合成する。プライマーは、変異を持つように点突然変異を導入したものを合成し、使用する。合成したDNAを、大腸菌用の遺伝子発現ベクター（pET-22b）に組み込み、大腸菌に形質導入を行い、変異体を大腸菌で発現させて、作成することができる。【００２３】
本発明の治療剤は、膀胱癌および大腸癌の原発巣、あるいは胃癌と膵癌の転移巣（腹膜播種転移癌）の治療に有効である。【００２４】
本発明の治療薬は、EGFファミリーの増殖因子の中でもとりわけHB-EGFの発現が亢進している癌の治療に有効である。【００２５】
本発明の治療薬は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。【００２６】
前記治療薬は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。胃癌、膵癌の腹膜播種性転移等腹腔内に播種する悪性腫瘍に適用する場合には、腹腔内に注射により投与することが、癌細胞に直接運搬される点で好ましい。【００２７】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。【００２８】
前記治療薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。【００２９】
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。【００３０】
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。【００３１】
前記本発明の治療薬に含まれる有効成分の量は、治療薬の製剤形態または投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。【００３２】
本発明の治療薬は、ヒトを含む哺乳動物、特にヒトに投与することができる。【００３３】
本発明の治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、体重１ｋｇあたり１μgから５０ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、１週間に１度ずつ６−８週にわたって投与してもよいし、又は一日おきに２−３週間にわたって投与してもよいし、又は１０日から１４日間毎日投与してもよい。【００３４】
本願の癌治療薬と併用可能な制癌剤としては、タキソール、タキソテール、５−ＦＵ、シスプラチン、カルボプラチン、アドリアマイシン、カンプトテンシンなどが例示される。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
（実施例１）
腹膜播種モデル。1 x 107のヒト胃癌細胞株MKN28、MKN45、MKN74細胞をヌードマウス腹腔内に接種。CRM197を腹腔内に計5回(50mg / kg / week)投与し、接種後6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した（図1）。
（実施例２）
ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験を行った。【００３６】
RPMI+10%FBSで培養したヒト膀胱癌細胞株KK47を、EDTA/PBS(-)で洗浄し、0.25%トリプシンで回収した。RPMI+10%FBSで2回、RPMI(血清なし)で2回洗浄し、5×106細胞ずつRPMI(血清あり)250μLへ添加し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種７日後より50 mg/kg/week量のCRM197を腹腔内に投与した。週1回を3週に渡って投与した。CRM197を投与しないヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図2に示す。ここで、腫瘍体積は、できた腫瘍の長径、短径を１週間ごとに測定し、長径×短径×短径×1/2で求めた。
（実施例３）
ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験を行った。【００３７】
RPMI+10%FBSで培養したヒト大腸癌細胞株HT29、HCT116（American Type Culture Collection (ATCC)から入手可）を、EDTA/PBS(-)で洗浄し、0.25%トリプシンで回収した。RPMI+10%FBSで2回、RPMI(血清なし)で2回洗浄し、5×106細胞ずつRPMI(血清あり)250μLへ添加し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種７日後より50 mg/kg/week量のCRM197を腹腔内に投与した。週1回を3週に渡って投与した。CRM197を投与しないヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図3に示す。ここで、腫瘍体積は、できた腫瘍の長径、短径を１週間ごとに測定し、長径×短径×短径×1/2で求めた。
（実施例４）
腹膜播種モデル
1 x 107のヒト膵癌細胞株PANK1をヌードマウス腹腔内に接種。CRM197を腹腔内に計5回(50mg/kg/week)投与し、接種後6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した（図4）。【００３８】
これら実施例の結果から、いずれの場合も、CRM197の投与により、腫瘍の成長が抑えられることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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