(57)【要約】  本発明は、RAIG2またはRAIG3、およびグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、RAIG2またはRAIG3とグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、RAIG2もしくはRAIG3アゴニストまたはアンタゴニストを含有してなる、糖・脂質代謝調節剤、膵臓・脳下垂体機能調節剤、インスリン分泌・血糖およびACTH分泌調節剤、並びに該調節異常が関与する疾患の予防・治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RAIG2もしくはその部分ペプチドおよび／またはRAIG3もしくはその部分ペプチドを含有してなる医薬または動物薬。
【請求項２】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項１記載の医薬または動物薬。
【請求項３】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項１記載の医薬または動物薬。
【請求項４】
インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項１記載の医薬または動物薬。
【請求項５】
糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項１記載の医薬または動物薬。
【請求項６】
RAIG2もしくはその部分ペプチドをコードする核酸および／またはRAIG3もしくはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる医薬または動物薬。
【請求項７】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項６記載の医薬または動物薬。
【請求項８】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項６記載の医薬または動物薬。
【請求項９】
インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項６記載の医薬または動物薬。
【請求項１０】
糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項６記載の医薬または動物薬。
【請求項１１】
RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸および／またはRAIG3をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる診断剤。
【請求項１２】
糖・脂質代謝異常の診断用である、請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
膵臓および／または脳下垂体機能異常の診断用である、請求項１１記載の剤。
【請求項１４】
インスリン分泌および／もしくは血糖異常、並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌異常の診断用である、請求項１１記載の剤。
【請求項１５】
糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の診断用である、請求項１１記載の剤。
【請求項１６】
RAIG2に対する抗体および／またはRAIG3に対する抗体を含有してなる診断剤。
【請求項１７】
糖・脂質代謝異常の診断用である、請求項１６記載の剤。
【請求項１８】
膵臓および／または脳下垂体機能異常の診断用である、請求項１６記載の剤。
【請求項１９】
インスリン分泌および／もしくは血糖異常、並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌異常の診断用である、請求項１６記載の剤。
【請求項２０】
糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の診断用である、請求項１６記載の剤。
【請求項２１】
RAIG2に対する中和抗体および／またはRAIG3に対する中和抗体を含有してなる医薬または動物薬。
【請求項２２】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項２１記載の医薬または動物薬。
【請求項２３】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項２１記載の医薬または動物薬。
【請求項２４】
インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項２１記載の医薬または動物薬。
【請求項２５】
肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項２１記載の医薬または動物薬。
【請求項２６】
RAIG2をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸および／またはRAIG3をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる医薬または動物薬。
【請求項２７】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項２６記載の医薬または動物薬。
【請求項２８】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項２６記載の医薬または動物薬。
【請求項２９】
インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項２６記載の医薬または動物薬。
【請求項３０】
肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項２６記載の医薬または動物薬。
【請求項３１】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、糖・脂質代謝調節物質のスクリーニング方法。
【請求項３２】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、膵臓および／または脳下垂体機能調節物質のスクリーニング方法。
【請求項３３】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌の調節物質のスクリーニング方法。
【請求項３４】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項３５】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドが、それを産生する真核細胞の形態で提供されることを特徴とする、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸またはRAIG3をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいはRAIG2に対する抗体もしくはRAIG3に対する抗体をさらに用いることを特徴とする、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
細胞内のCa2+濃度もしくはcAMP生成を指標とすることを特徴とする、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチド、およびグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、RAIG2またはRAIG3とグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法。
【請求項４１】
RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
細胞内のCa2+濃度もしくはcAMP生成を指標とすることを特徴とする、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を増強する物質を含有してなる医薬または動物薬。
【請求項４６】
RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を増強する物質がRAIG2もしくはRAIG3のアゴニストである、請求項４５記載の医薬または動物薬。
【請求項４７】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項４５または４６記載の医薬または動物薬。
【請求項４８】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項４５または４６記載の医薬または動物薬。
【請求項４９】
インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項４５または４６記載の医薬または動物薬。
【請求項５０】
糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項４５または４６記載の医薬または動物薬。
【請求項５１】
RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を阻害する物質を含有してなる医薬または動物薬。
【請求項５２】
RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を阻害する物質がRAIG2もしくはRAIG3のアンタゴニストである、請求項５１記載の医薬または動物薬。
【請求項５３】
糖・脂質代謝調節剤である、請求項５１または５２記載の医薬または動物薬。
【請求項５４】
膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、請求項５１または５２記載の医薬または動物薬。
【請求項５５】
インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、請求項５１または５２記載の医薬または動物薬。
【請求項５６】
肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、請求項５１または５２記載の医薬または動物薬。
【請求項５７】
哺乳動物におけるRAIG2および/もしくはRAIG3の発現または活性を調節することを含む、該動物における糖・脂質代謝、膵機能、脳下垂体機能、インスリン分泌、血糖並びに副腎皮質刺激ホルモン分泌からなる群より選択されるいずれかの調節方法。
【請求項５８】
RAIG2の発現もしくは活性を増強する物質および/またはRAIG3の発現もしくは活性を増強する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療方法。
【請求項５９】
RAIG2の発現もしくは活性を阻害する物質および/またはRAIG3の発現もしくは活性を阻害する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース受容体およびグルコース以外のそのリガンドの同定、並びにそれらの用途に関する。より詳細には、本発明は、グルコース受容体またはそのリガンドの新規医薬用途、並びに該受容体（およびそのリガンド）を用いた新規医薬候補化合物のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血糖の検知とインスリン分泌は、細胞内に取り込まれたグルコースがリン酸化を受けて生じたリン酸グルコースを細胞内で検知することにより行われるとされてきた。即ち、膵β細胞では、GLUT2によりグルコースが細胞内に取り込まれ、グルコキナーゼにより、グルコース-6-リン酸（G6P）になる。G6Pは、細胞質内（解糖系）やミトコンドリア内（TCA回路や呼吸鎖）で代謝されてATPが生成され、ATP/ADP比が上昇する。その結果、細胞膜のATP依存性K+チャネルが閉口して脱分極が起こり、電位依存性Ca2+チャネル（VDC）が開口して、細胞外から細胞内にCa2+が取り込まれ、Ca2+依存性のインスリン分泌顆粒の放出が引き起こされる。【０００３】
しかしながら、そのようなメカニズムでは、1,5-アンヒドログルシトール（糖尿病患者において尿中に失われるために血中濃度が顕著に低下し、病態の改善とともに回復することから、有用な糖尿病マーカーとして広く用いられている。以下、「1,5-AG」という場合もある）のように代謝されない糖によるインスリン分泌作用を説明することができず、グルコース代謝やエネルギー産生とインスリン分泌作用とは分離させ得るという事実とも矛盾していた。また、インスリン分泌が膵島内解糖産物の増加以前に起こるという事実とも矛盾があった。このような矛盾を説明する１つの仮説として、細胞表面における血糖を検知する受容体の存在が考えられるが、現在までにそのような受容体は同定されていない。【０００４】
既存の医薬品の約半数が細胞膜上の受容体を介して作用を発現することがわかっており、中でも７回膜貫通型のＧ蛋白質共役型受容体（以下、GPCRともいう）は特に大きな割合を占めていることから、最も可能性のある創薬ターゲットとして注目されている。
配列の相同性に基づいて分類されたオーファンGPCRのサブファミリー［G Protein-coupled Receptor, family C, group 5 (GPRC5), members A-D］が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。これらのうちGPRC5A、BおよびCはレチノイン酸によって発現が誘導されるので、それぞれRetinoic Acid-Inducible Gene (RIAG)-1、2および3とも呼ばれる。各レセプター同士は約30〜40%の相同性を示し、他のファミリーCに属するGPCRメンバーに比べて短いＮ末端ドメインを有することで特徴づけられている。RAIG2は主として中枢神経系で、RAIG3およびGPRC5Dは主として膵臓を含む末梢組織で、それぞれ発現していることが報告されている（非特許文献１〜４）。また、GPRC5Dの発現が抑制された肥満モデルマウスでは摂餌量が増加して血糖値が上昇したことから、該受容体の発現もしくは活性を増強することによる２型糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防・治療が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、これら受容体の生理的リガンドは依然として不明のままであり、それらの生理学意義は未だ十分に解明されていないのが現状である。
【特許文献１】国際出願公開第０３／０５５５０７号パンフレット（全文）
【非特許文献１】ロビンス (M.J. Robbins) ら, 「ブレイン・リサーチ. モレキュラー・ブレイン・リサーチ (Brain Res. Mol. Brain Res.)」 (蘭国), 第106巻, pp. 136-144 (2002年)
【非特許文献２】ブロイナー−オズボーン (H. Brauner-Osborne) およびクローグスガード−ラーゼン (P. Krogsgaard-Larsen), 「ジェノミクス (Genomics)」 (米国), 第65巻, pp. 121-128 (2000年)
【非特許文献３】ロビンス (M.J. Robbins) ら, 「ジェノミクス (Genomics)」 (米国), 第67巻, pp. 8-18 (2000年)
【非特許文献４】ブロイナー−オズボーン (H. Brauner-Osborne) ら, 「ビオキミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ (Biochim. Biophys. Acta)」 (蘭国), 第1518巻, pp. 237-248 (2001年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞表面の糖受容体を同定し、血中糖濃度の検出機構の存在を明らかにするとともに、該受容体とそのリガンドとを用いて、該受容体のアゴニストおよび/またはアンタゴニスト、即ち、糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧、高脂血症などの予防・治療薬として有効な医薬品候補化合物のスクリーニング系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、従来オーファン受容体とされていた２種類のGPCR、RAIG2およびRAIG3を細胞表面グルコース受容体として同定した。これらの受容体は、通常の血糖値に相当するグルコース濃度付近でインスリン分泌細胞からのインスリン分泌を引き起こした。また、本発明者らは、本受容体が、従来より糖尿病マーカーとして知られている1,5-AGとも反応して、インスリン分泌を誘導することを見出した。さらに、これらの受容体は、グルコース濃度に依存して脳下垂体における副腎皮質刺激ホルモン（以下、「ACTH」ともいう）の分泌を調節することも明らかにした。
また、本発明者らは、ショウジョウバエにおけるRAIG2ホモログ（bride of sevenless (boss)）が膵臓や脳下垂体に相当する臓器で発現していることに着目し、boss遺伝子の欠損突然変異体と該遺伝子を強制発現させたトランスジェニックとで、その血糖値を比較した結果、前者では野生型と比較して血糖値の上昇が認められたのに対し、後者ではこの上昇が抑制されることを見出した。このことから、BOSSもRAIG2やRAIG3と同様に血糖濃度を検知し、インスリンシグナルを調節していることが示唆された。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］RAIG2もしくはその部分ペプチドおよび／またはRAIG3もしくはその部分ペプチドを含有してなる医薬または動物薬、
［２］糖・脂質代謝調節剤である、上記［１］記載の医薬または動物薬、
［３］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［１］記載の医薬または動物薬、
［４］インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［１］記載の医薬または動物薬、
［５］糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［１］記載の医薬または動物薬、
［６］RAIG2もしくはその部分ペプチドをコードする核酸および／またはRAIG3もしくはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる医薬または動物薬、
［７］糖・脂質代謝調節剤である、上記［６］記載の医薬または動物薬、
［８］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［６］記載の医薬または動物薬、
［９］インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［６］記載の医薬または動物薬、
［１０］糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［６］記載の医薬または動物薬、
［１１］RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸および／またはRAIG3をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる診断剤、
［１２］糖・脂質代謝異常の診断用である、上記［１１］記載の剤、
［１３］膵臓および／または脳下垂体機能異常の診断用である、上記［１１］記載の剤、
［１４］インスリン分泌および／もしくは血糖異常、並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌異常の診断用である、上記［１１］記載の剤、
［１５］糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の診断用である、上記［１１］記載の剤、
［１６］RAIG2に対する抗体および／またはRAIG3に対する抗体を含有してなる診断剤、
［１７］糖・脂質代謝異常の診断用である、上記［１６］記載の剤、
［１８］膵臓および／または脳下垂体機能異常の診断用である、上記［１６］記載の剤、
［１９］インスリン分泌および／もしくは血糖異常、並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌異常の診断用である、上記［１６］記載の剤、
［２０］糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の診断用である、上記［１６］記載の剤、
［２１］RAIG2に対する中和抗体および／またはRAIG3に対する中和抗体を含有してなる医薬または動物薬、
［２２］糖・脂質代謝調節剤である、上記［２１］記載の医薬または動物薬、
［２３］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［２１］記載の医薬または動物薬、
［２４］インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［２１］記載の医薬または動物薬、
［２５］肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［２１］記載の医薬または動物薬、
［２６］RAIG2をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸および／またはRAIG3をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる医薬または動物薬、
［２７］糖・脂質代謝調節剤である、上記［２６］記載の医薬または動物薬、
［２８］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［２６］記載の医薬または動物薬、
［２９］インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［２６］記載の医薬または動物薬、
［３０］肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［２６］記載の医薬または動物薬、
［３１］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、糖・脂質代謝調節物質のスクリーニング方法、
［３２］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、膵臓および／または脳下垂体機能調節物質のスクリーニング方法、
［３３］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌の調節物質のスクリーニング方法、
［３４］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［３５］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドが、それを産生する真核細胞の形態で提供されることを特徴とする、上記［３１］〜［３４］のいずれかに記載の方法、
［３６］RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸またはRAIG3をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいはRAIG2に対する抗体もしくはRAIG3に対する抗体をさらに用いることを特徴とする、上記［３５］記載の方法、
［３７］インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、上記［３５］記載の方法、
［３８］細胞内のCa2+濃度もしくはcAMP生成を指標とすることを特徴とする、上記［３５］記載の方法、
［３９］レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、上記［３５］記載の方法、
［４０］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチド、およびグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、RAIG2またはRAIG3とグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
［４１］RAIG2もしくはその部分ペプチドまたはRAIG3もしくはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、上記［４０］記載の方法、
［４２］インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、上記［４１］記載の方法、
［４３］細胞内のCa2+濃度もしくはcAMP生成を指標とすることを特徴とする、上記［４１］記載の方法、
［４４］レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、上記［４１］記載の方法、
［４５］RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を増強する物質を含有してなる医薬または動物薬、
［４６］RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を増強する物質がRAIG2もしくはRAIG3のアゴニストである、上記［４５］記載の医薬または動物薬、
［４７］糖・脂質代謝調節剤である、上記［４５］または［４６］記載の医薬または動物薬、
［４８］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［４５］または［４６］記載の医薬または動物薬、
［４９］インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［４５］または［４６］記載の医薬または動物薬、
［５０］糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［４５］または［４６］記載の医薬または動物薬、
［５１］RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を阻害する物質を含有してなる医薬または動物薬、
［５２］RAIG2もしくはRAIG3の発現または活性を阻害する物質がRAIG2もしくはRAIG3のアンタゴニストである、上記［５１］記載の医薬または動物薬、
［５３］糖・脂質代謝調節剤である、上記［５１］または［５２］記載の医薬または動物薬、
［５４］膵臓および／または脳下垂体機能調節剤である、上記［５１］または［５２］記載の医薬または動物薬、
［５５］インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／または副腎皮質刺激ホルモン分泌調節剤である、上記［５１］または［５２］記載の医薬または動物薬、
［５６］肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である、上記［５１］または［５２］記載の医薬または動物薬、
［５７］哺乳動物におけるRAIG2および/もしくはRAIG3の発現または活性を調節することを含む、該動物における糖・脂質代謝、膵機能、脳下垂体機能、インスリン分泌、血糖並びに副腎皮質刺激ホルモン分泌からなる群より選択されるいずれかの調節方法、
［５８］RAIG2の発現もしくは活性を増強する物質および/またはRAIG3の発現もしくは活性を増強する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害からなる群より選択される疾患の予防・治療方法、および
［５９］RAIG2の発現もしくは活性を阻害する物質および/またはRAIG3の発現もしくは活性を阻害する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防・治療方法、
などを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
RAIG2およびRAIG3はグルコースおよび1,5-AGの受容体として機能し、血糖濃度を検知して膵臓におけるインスリン分泌や脳下垂体におけるACTH分泌を調節しているので、RAIG2もしくはRAIG3（あるいはさらにグルコース）を用いることにより、糖・脂質代謝および膵臓・脳下垂体機能の調節（例えば、インスリン分泌や血糖・ACTH分泌の調節など）、並びに糖・脂質代謝や膵臓・脳下垂体機能の異常が関与する疾患（例えば、糖尿病や肥満など）の予防・治療に有効な医薬もしくは動物薬候補化合物をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】RAIG3を過剰発現させたマウスインスリノーマMIN6細胞における各種グルコース濃度条件下でのインスリン分泌を示す図である。図中、**はp<0.01、***はp<0.001をそれぞれ示す。
【図２】RAIG2（ａ）およびRAIG3（ｂ）を過剰発現させたマウスインスリノーマMIN6細胞におけるグルコース（2.8 mMおよび20 mM）および2.8 mM グルコース＋0.6 mM 1,5-AG条件下でのインスリン分泌を示す図である。図中、*はp<0.05、**はp<0.01、***はp<0.001をそれぞれ示す。
【図３】RAIG2（またはRAIG3）に対するsiRNAを導入したマウス脳下垂体腫AtT-20/D16v-F2細胞における、低グルコース（2.8 mM）および高グルコース（20 mM）濃度条件下での、CRF刺激によるACTH分泌を示す図である。図中、*はp<0.05、***はp<0.001をそれぞれ示す。
【図４】野生型、boss欠損突然変異体、およびbossを強制発現させたトランスジェニック（HRP-Boss）のショウジョウバエのHemolympho中グルコースおよびトレハロス濃度を示す図である。図中、白ヌキバーはグルコース、ハッチ入りバーはグルコース＋トレハロス、黒塗りバーはトレハロスをそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いられるRAIG2およびRAIG3蛋白質は、それぞれ配列番号：２および配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
RAIG2およびRAIG3は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは臓器［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］等から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。【００１１】
配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００１２】
配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。【００１３】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド（即ち、グルコースや1,5-AG）結合活性およびインスリンやACTH等のホルモン分泌調節活性などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、リガンド結合活性やホルモン分泌調節活性などの活性は同等（例えば、約0.5〜約2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やホルモン分泌調節活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング方法において用いられる方法等に従って行うことができる。【００１４】
また、本発明のRAIG2（またはRAIG3）には、例えば、(1)配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3)配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。【００１５】
本発明のRAIG2は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒトRAIG2蛋白質（GenBankアクセッション番号：NP_057319）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NP_071865、XP_215095およびBAE89480として登録されているマウス、ラットおよびカニクイザルホモログ（それぞれヒトRAIG2に対して約85％、約85％および99.8％の同一性を有する）等］である。
本発明のRAIG3は、好ましくは、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するヒトRAIG3蛋白質（GenBankアクセッション番号：NP_061123）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NP_671750、XP_213518およびBAE89439として登録されているマウス、ラットおよびカニクイザルホモログ（それぞれヒトRAIG2に対して約89％、約90％および約95％の同一性を有する）等］である。【００１６】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のRAIG2（またはRAIG3）は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα-ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のRAIG2（またはRAIG3）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のRAIG2（またはRAIG3）には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。【００１７】
RAIG2（またはRAIG3）の部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したRAIG2（またはRAIG3）の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つRAIG2（またはRAIG3）と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はRAIG2（またはRAIG3）の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列のうち、リガンドであるグルコースや1,5-AGとの結合に関わる領域（例えばヒトRAIG2の場合、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号28-56、116-126、184-196および255-271で示される細胞外領域など）および該リガンドとの相互作用を介したシグナル伝達に関わる領域（例えば、三量体Ｇ蛋白質のαサブユニットと結合してそのGDP・GTP交換反応を促進する活性を有する領域（以下、「Gα活性化ドメイン」ともいう）など）を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記のリガンドとの結合に関与する領域とシグナル伝達に関与する領域を含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは100個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは200個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。【００１８】
一方、RAIG2（またはRAIG3）の部分アミノ酸配列を含むがRAIG2（またはRAIG3）と実質的に同質の活性を有しないペプチド、例えば、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列のうち、リガンドとの結合に関与する領域を含むが、シグナル伝達に関与する領域を含まない部分アミノ酸配列を有するものなどは、「本発明の部分ペプチド」には含まれない。しかしながら、かかるペプチドは、リガンドと結合することによりRAIG2（またはRAIG3）を介したシグナル伝達作用を遮断することができるので、該シグナル伝達作用を抑制したい場合等に有用であり得る。【００１９】
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、RAIG2（またはRAIG3）について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したRAIG2（またはRAIG3）と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【００２０】
本発明で用いられるRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００２１】
RAIG2（またはRAIG3）は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりRAIG2（またはRAIG3）またはその塩を調製することができる。【００２２】
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチド（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「RAIG2（またはRAIG3）」という）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。RAIG2（またはRAIG3）を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株) （1975年）
(4) 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学IV 205 (1977年)
(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【００２３】
このようにして得られたRAIG2（またはRAIG3）は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるRAIG2（またはRAIG3）が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にRAIG2（またはRAIG3）が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【００２４】
RAIG2（またはRAIG3）の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α-アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするRAIG2（またはRAIG3）の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のRAIG2（またはRAIG3）またはそのアミド体を取得する。【００２５】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。【００２６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約-20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。【００２７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。【００２８】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約-20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。【００２９】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。【００３０】
RAIG2（またはRAIG3）のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα-アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質（ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（ペプチド）とを製造し、この両蛋白質（ペプチド）を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のRAIG2（またはRAIG3）のアミド体を得ることができる。
RAIG2（またはRAIG3）のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記RAIG2（またはRAIG3）のアミド体の場合と同様にして得ることができる。【００３１】
本発明の部分ペプチドは、RAIG2（またはRAIG3）全長蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。【００３２】
さらに、RAIG2（またはRAIG3）は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からRAIG2（またはRAIG3）を分離精製することによって製造することもできる。RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。【００３３】
RAIG2（またはRAIG3）をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したRAIG2（またはRAIG3）と実質的に同質の活性（例：グルコースや1,5-AGへの結合活性、インスリンやACTHなどのホルモン分泌調節活性など）を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。
配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。【００３４】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００３５】
RAIG2をコードするDNAは、好ましくは配列番号：１で表される塩基配列で示されるヒトRAIG2蛋白質をコードする塩基配列を含有するDNA（GenBankアクセッション番号：NM_016235）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NM_022420、XM_215095およびAB172418として登録されているマウス、ラットおよびカニクイザルホモログ（それぞれヒトRAIG2 cDNAに対して約85％、約85％および約98％の同一性を有する）等］である。
RAIG3をコードするDNAは、好ましくは配列番号：３で表される塩基配列で示されるヒトRAIG3蛋白質をコードする塩基配列を含有するDNA［GenBankアクセッション番号：NM_018653］、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NM_147217、XM_213518およびAB172377として登録されているマウス、ラットおよびカニクイザルホモログ（それぞれヒトRAIG3 cDNAに対して約87％、約86％および約88％の同一性を有する）等）である。【００３６】
本発明の部分ペプチドをコードするDNAは、配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、（１）配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列の部分塩基配列を有するDNA、または（２）配列番号：１（または配列番号：３）で表される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記したRAIG2（またはRAIG3）と実質的に同質の活性（例：グルコースや1,5-AGとの結合活性、インスリンやACTHなどのホルモン分泌調節活性など）を有するペプチドをコードするDNAなどが用いられる。【００３７】
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAは、該RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、RAIG2（またはRAIG3）蛋白質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。【００３８】
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。【００３９】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。【００４０】
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、RAIG2（またはRAIG3）をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：pBR322、pBR325、pUC12、pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例：pUB110、pTP5、pC194）；酵母由来プラスミド（例：pSH19、pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。【００４１】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。【００４２】
上記したRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），60巻，160 (1968)〕、エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），9巻，309 (1981)〕、エシェリヒア・コリJA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），120巻，517 (1978)〕、エシェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，41巻，459 (1969)〕、エシェリヒア・コリC600〔ジェネティックス（Genetics），39巻，440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔ジーン (Gene)，24巻，255 (1983)〕、バチルス・サブチルス207-21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），95巻，87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913、NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。【００４３】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），315巻，592 (1985)〕。【００４４】
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いられる。【００４５】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），69巻，2110 (1972)やジーン（Gene），17巻，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），194巻，182-187 (1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），75巻，1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6巻，47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。【００４６】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜約40℃で、約6〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K.L.ら，プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），77巻，4505 (1980)〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G.A.ら，プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），81巻，5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で、約24〜約72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.，ネイチャー（Nature），195巻，788 (1962)〕に非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜約5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔サイエンス（Science），122巻，501 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔ヴィロロジー（Virology），8巻，396 (1959)〕、RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association），199巻，519 (1967)〕、199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），73巻，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを製造せしめることができる。【００４７】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。一方、膜画分からRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを抽出する場合は、上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する）などの方法が用いられる。また、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドが菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、膜画分あるいは培養上清中に含まれるRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。【００４８】
かくして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドの存在は、RAIG2（またはRAIG3）に対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。【００４９】
さらに、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドは、上記のRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.ら,“Transcription and Tranlation”, Hames B.D.およびHiggins S.J.編, IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製)やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM (TOYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B.ら, Nature, 179, 160-161 (1957)あるいはErickson A.H.ら, Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt,J.M.ら (1984) 前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Spirin A.S.ら, Science, 242, 1162-1164 (1988)）、透析法（木川ら、第21回日本分子生物学会、WID6）、あるいは重層法（PROTEIOSTM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書：TOYOBO社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開2000-333673）等を用いることができる。【００５０】
RAIG2（またはRAIG3）蛋白質、即ち配列番号：２（または配列番号：４）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、をコードする塩基配列またはその一部、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸とは、前述のRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、フレームの合わない塩基配列をも含む意味で用いられる。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の同一性または相補性を有することをいう。【００５１】
RAIG2（またはRAIG3）蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「本発明のアンチセンス核酸」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたRAIG2（またはRAIG3）をコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、RAIG2（またはRAIG3）遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンス核酸は、RAIG2（またはRAIG3）遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすることができ、mRNAの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。【００５２】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてRAIG2（またはRAIG3）蛋白質の翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、RAIG2（またはRAIG3） mRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、RAIG2（またはRAIG3）前駆ポリペプチドをコードする核酸の5’端ヘアピンループ、5’端6-ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ORF翻訳開始コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、RAIG2（またはRAIG3）遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、RAIG2（またはRAIG3） mRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるRAIG2（またはRAIG3）遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはDNA:RNAハイブリッドを形成してRNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。【００５３】
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにDNA：RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。【００５４】
アンチセンス核酸は、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸（RNA、DNA）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。【００５５】
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【００５６】
RAIG2（またはRAIG3） mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセンス核酸に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。RAIG2（またはRAIG3） mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。【００５７】
本明細書においては、RAIG2（またはRAIG3）のmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、本発明のアンチセンス核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。【００５８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、RAIG2（またはRAIG3） cDNA配列もしくはゲノミックDNA配列情報に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のDNA／RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。RNAi活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA／RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、siRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約3〜約10塩基）のリンカーを介して連結したRNA（shRNA）として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするDNAがそれぞれ別個のU6やH1などのPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したRNA鎖をコードするDNAがPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、siRNAを形成させてもよい。【００５９】
本発明のアンチセンス核酸の遺伝子発現阻害活性は、RAIG2（またはRAIG3）をコードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外のRAIG2（またはRAIG3）遺伝子発現系またはRAIG2（またはRAIG3）蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。【００６０】
本発明はまた、RAIG2（またはRAIG3）に対する抗体を提供する。該抗体は、RAIG2（またはRAIG3）に対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。RAIG2（またはRAIG3）に対する抗体は、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明する。【００６１】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記したRAIG2（またはRAIG3）蛋白質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「RAIG2（またはRAIG3）」という）、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
RAIG2（またはRAIG3）は、上記した通り、例えば、（a）哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）RAIG2(またはRAIG3)をコードするDNAを含有する形質転換体を培養、あるいは（d）RAIG2（またはRAIG3）をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（a）哺乳動物の組織または細胞からRAIG2（またはRAIG3）を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例：膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られたRAIG2（またはRAIG3）をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（b）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（a）の方法を用いて天然材料より精製したRAIG2（またはRAIG3）と同一の構造を有するもの、具体的には、RAIG2（またはRAIG3）のアミノ酸配列において少なくとも3個以上、好ましくは6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1）RAIG2（またはRAIG3）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプローブを用い、ヒトcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするDNAを単離するか、（2）RAIG2（またはRAIG3）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、哺乳動物由来のcDNAを鋳型としてPCR法により該抗原をコードするDNAを調製し、該DNAを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
（d）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（c）と同様の方法により調製した抗原をコードするDNAを挿入した発現ベクター（例えば、該DNAがT7、SP6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するRNAポリメラーゼおよび基質（NTPs）を含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。【００６２】
免疫原としては完全なRAIG2（またはRAIG3）蛋白質分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば3個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、いっそう好ましくは6個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば20個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは18個以下、より好ましくは15個以下、いっそう好ましくは12個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：1ないし数個）は置換可能な基（例：Cys、水酸基等）によって置換されていてもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を1ないし数個含むアミノ酸配列を有する。【００６３】
あるいは、RAIG2（またはRAIG3）を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（c）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293、COS7、CHO-K1、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、またはP388などが好ましく用いられる。RAIG2（またはRAIG3）を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例：RPMI1640）または緩衝液（例：Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。【００６４】
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約3,000以下）の抗原（即ち、RAIG2（またはRAIG3）の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。【００６５】
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン1に対し0.1〜100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。【００６６】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。【００６７】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。【００６８】
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、(i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ng〜μgオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。【００６９】
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5〜20%程度）添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。【００７０】
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。【００７１】
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。【００７２】
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。【００７３】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10〜80%程度、好ましくは30〜50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1程度であり、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【００７４】
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（EB）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。【００７５】
マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。【００７６】
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。【００７７】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7〜10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。【００７８】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。【００７９】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10〜14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7〜10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。【００８０】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I,131I,3H,14C）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。【００８１】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2〜3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。【００８２】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に106〜107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。【００８３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。【００８４】
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。【００８５】
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。【００８６】
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（VHおよびVL）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（CHおよびCL）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。【００８７】
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第6,331,415号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってmRNAもしくは全RNAを調製し、cDNAを合成する。該cDNAを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてVHおよびVLの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴDNA、アンチセンスプライマーとしてCHおよびCLのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴDNA（例えばBio/Technology, 9: 88-89, 1991参照））を用い、常法に従ってPCRでVHおよびVLをコードするDNAを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したRNAからRT-PCRによりCHおよびCLをコードするDNAを増幅・精製する。常法を用いてVHとCH、VLとCLをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖DNAおよびキメラＬ鎖DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、CHO細胞、COS細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：CMVプロモーター、SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするDNAは別個のベクターに挿入してもよいし、1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればFabが、ペプシンで分解すればF(ab’)2がそれぞれ得られる。【００８８】
また、マウスVHおよびVLをコードするDNAを適当なリンカー、例えば1〜40アミノ酸、好ましくは3〜30アミノ酸、より好ましくは5〜20アミノ酸からなるペプチド（例：[Ser-(Gly)m]nもしくは[(Gly)m-Ser]n（mは0〜10の整数、nは1〜5の整数）等）をコードするDNAを介して連結することによりscFvとすることができ、さらにCH3をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりminidodyモノマーとしたり、CH全長をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりscFv-Fcとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするDNAは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。【００８９】
マウスVHおよびVLをコードするDNAを1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりFvと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてVHおよびVLのFR中の適当なアミノ酸をCysに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりdsFvと呼ばれる二量体が形成される。【００９０】
（ii）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（CDR）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（FR））の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号および第5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のVHおよびVLをコードするDNAを単離した後、常法により自動DNAシークエンサー（例：Applied Biosystems社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編, 第5版, 1991参照) 等］を用いて解析し、両鎖のCDRおよびFRを決定する。決定されたFR配列に類似したFR配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループIおよびヒトＨ鎖サブグループIIもしくはIII（Kabatら，1991（上述）を参照）］のCDRコード領域を、決定された異種CDRをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を20〜40塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをDNAシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のFRと他の哺乳動物種由来のCDRを有するVHおよびVLをコードするDNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来CDRをヒト由来VHおよびVLに移植するには、PCRによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平5-227970号公報に記載の逐次CDR移植法等が挙げられる。このようにして得られるVHおよびVLをコードするDNAを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のCHおよびCLをコードするDNAとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。【００９１】
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてscFv、scFv-Fc、minibody、dsFv、Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。【００９２】
（iii）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ig）遺伝子をノックアウト（KO）した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。ヒトIgのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Tg）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトIgヒト抗体（HAHA）の産生は報告されていない。【００９３】
その後、Abgenix社［商品名：XenoMouose（Nat. Genet., 15: 146-156, 1997; 米国特許第5,939,598号等を参照）］やMedarex社［商品名：Hu-Mab Mouse（Nat. Biotechnol., 14: 845-851, 1996; 米国特許第5,545,806号等を参照）］が酵母人工染色体（YAC）ベクターを用いてより大きなヒトIg遺伝子を導入したTgマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトIg遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約80種のＶ断片、約30種のＤ断片および6種のＪ断片が様々に組み合わされたVDJエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約1.5Mb（14番染色体）、κＬ鎖が約2Mb（2番染色体）、λＬ鎖が約1Mb（22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ig遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、BAC、YAC等）に挿入可能なDNAは通常数kb〜数百kbであり、クローニングしたDNAを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。【００９４】
Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997）は、Ig遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（hCF）をマウスに導入して（染色体導入（TC）マウス）、完全長ヒトIg遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む14番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトIg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドES細胞を選択し、通常のKOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト14番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF14)）およびヒト2番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF2)）を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をKOされたマウス（KO(IgH)およびKO(Igκ)）を作製し、これら4系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルTC/KO）を樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブルTC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むhCF2がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。【００９５】
一方、前記Hu-Mab MouseはκＬ鎖遺伝子の約50%を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約10%しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つYACベクター（Igκ-YAC）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、TC(hCF14)マウスとHu-Mab Mouseとを交配してhCF14とIgκ-YACとを安定に保持するマウス（商品名：KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。【００９６】
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト22番染色体もしくはその断片を導入したTCマウス（TC(hCF22)）を作製し、これと上記ダブルTC/KOマウスやKMマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（HAC）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2000）。【００９７】
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Nat. Biotechnol., 20: 889-894, 2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。【００９８】
（iv）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はPCRによる変異がCDR以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のHAHA産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。【００９９】
ファージィスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来蛋白質を提示する方法としては、g3p、g6p〜g9pのコート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質として該コート蛋白質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはg3pもしくはg8pのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、1)ファージゲノムのコート蛋白質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコート蛋白質をすべて外来蛋白質との融合蛋白質として提示させるものの他、2)融合蛋白質をコードする遺伝子を野生型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現させるものや、3)融合蛋白質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コート蛋白質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、1)の場合は大きな外来蛋白質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには2)または3)のタイプが用いられる。【０１００】
具体的なベクターとしては、Holtら（Curr. Opin. Biotechnol., 11: 445-449, 2000）に記載されるものが例示される。例えば、pCES1（J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 1999参照）は、1つのラクトースプロモーターの制御下にg3pのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするDNAとg3pシグナルペプチドの下流にCH3をコードするDNA、His-tag、c-myc tag、アンバー終止コドン(TAG)を介してg3pコード配列とが配置されたFab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとg3pコート蛋白質上にFabを提示するが、アンバー変異を持たないHB2151株などで発現させると可溶性Fab抗体を産生する。また、scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えばpHEN1（J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばM13-KO7、VCSM13等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコート蛋白質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合蛋白質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるS-S結合を介してファージ表面のコート蛋白質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys社のCysDisplayTM技術）等も挙げられる。【０１０１】
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（non-immunized）ライブラリーは、正常なヒトが保有するVHおよびVL遺伝子をRT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のmRNA等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないIgM由来のmRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol., 14: 309-314, 1996参照）、MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994参照）、Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばCDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするDNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なscFvやFabを産生するVHおよびVL遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Morphosys社のHuCALライブラリー（J．Mol. Biol., 296: 57-86, 2000参照）、BioInvent社のライブラリー（Nat. Biotechnol., 18: 852, 2000参照）、Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照）等が挙げられる。
免疫（immunized）ライブラリーは、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてmRNAを調製し、RT-PCR法によってVHおよびVL遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。【０１０２】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（1011〜1013ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ／クローン）を考慮すれば、108〜1011クローン程度が適当であり、約108クローンのライブラリーで通常10-9オーダーのKd値を有する抗体をスクリーニングすることができる。【０１０３】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を3〜5回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（SPR）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原であるRAIG2（またはRAIG3）がオリゴペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、Tween等の界面活性剤を含むPBS（3-5回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（pH5）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コート蛋白質が提示されるので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはS-S結合の還元（例えば、前記したCysDisplayTMでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコート蛋白質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。【０１０４】
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例：ELISA、RIA、FIA等）やFACSあるいはSPRを利用した測定により抗原結合活性を確認する。【０１０５】
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。His-tagやc-myc tagを導入しておけば、IMACや抗c-myc抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。【０１０６】
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。【０１０７】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物からRAIG2（またはRAIG3）に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。【０１０８】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キャリアー蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜約20、好ましくは約1〜約5の割合でカプルさせる方法が用いられる。【０１０９】
また、ハプテンとキャリアー蛋白質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約1〜約6週毎に1回ずつ、計約2〜約10回程度行われる。【０１１０】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。【０１１１】
RAIG2（またはRAIG3）はグルコースや1,5-AGに対する受容体として機能し、血糖濃度に応答してインスリンやACTHなどのホルモン分泌を制御する。従って、RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチド、それをコードする核酸またはその一部、RAIG2（またはRAIG3）に対する抗体（以下、「本発明の抗体」という場合がある）、RAIG2（またはRAIG3）をコードする核酸に対するアンチセンス核酸（以下、「本発明のアンチセンス核酸」という場合がある）は、以下の用途を有している。【０１１２】
［１］糖・脂質代謝調節剤等
RAIG2（またはRAIG3）は血中のグルコースや1,5-AG濃度を検知して、膵臓におけるインスリン分泌を促進し、脳下垂体におけるACTHの分泌を低グルコース濃度下で促進／高グルコース濃度下で抑制するので、a）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチド、b）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNAを、1) 糖・脂質代謝調節剤、2) 膵臓および／または脳下垂体の機能調節剤、3) インスリン分泌促進および／もしくは血糖低下並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
例えば、生体内においてRAIG2（またはRAIG3）が減少しているために、リガンドであるグルコースや1,5−AGの生理作用が期待できない（即ち、RAIG2（またはRAIG3）欠乏症）患者がいる場合に、a）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを該患者に投与しRAIG2（またはRAIG3）量を補充したり、b）（i）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードする核酸（好ましくはDNA）を該患者に投与し、発現させることによって、あるいは（ii）対象となる細胞にRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードする核酸（好ましくはDNA）を導入し、発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるRAIG2（またはRAIG3）量を増加させ、グルコースや1,5−AGの作用を十分に発揮させることができる。【０１１３】
糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患としては、例えば、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられるが、それらに限定されない。【０１１４】
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドおよびそれをコードするDNA（以下、「本発明のDNA」という場合もある）は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、上記医薬として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、D-ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例：食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素、水不溶性レーキ色素（例：前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例：β-カロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。【０１１５】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例：経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例：直腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例：徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし100重量％である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例：乳糖，白糖，デンプン，D-マンニトールなど）、崩壊剤（例：カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例：α化デンプン，アラビアゴム，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤（例：タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポリエチレングリコール6000など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。【０１１６】
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる１種または２種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーE〔オイドラギットE（商品名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーL〔オイドラギットL（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーLD〔オイドラギットL-30D55（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーS〔オイドラギットS（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーRS〔オイドラギットRS（商品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットNE（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。【０１１７】
注射剤は、有効成分を分散剤（例：ポリソルベート80，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン，D-マンニトール，D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例：蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例：オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。【０１１８】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のDNAを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のDNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当な発現ベクター中に挿入した後、常套手段に従って投与することもできる。また、本発明のDNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。【０１１９】
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病常患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のDNAの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病常患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１２０】
一方、RAIG2（またはRAIG3）に対する中和抗体（本発明の中和抗体）は、グルコースや1,5−AGとRAIG2（またはRAIG3）との相互作用を阻害してRAIG2（またはRAIG3）の関与するシグナル伝達機能、例えば、インスリンやACTHなどのホルモン分泌調節活性を不活性化（すなわち中和）することができる。一方、RAIG2（またはRAIG3）をコードする塩基配列に相補的な塩基配列もしくはその一部を含む核酸（上述のようにリボザイムやsiRNAを含む；本発明のアンチセンス核酸）は、RAIG2（またはRAIG3）遺伝子の転写、転写産物のプロセッシングおよび／またはmRNAからの翻訳をブロックすることにより、RAIG2（またはRAIG3）の発現を阻害することができる。従って、(a)本発明の中和抗体または(b)本発明のアンチセンス核酸を、上記RAIG2（またはRAIG3）または本発明のDNAとは逆向きの1) 糖・脂質代謝並びに2) 膵臓および／または脳下垂体機能の調節剤、3) インスリン分泌抑制および／もしくは血糖上昇並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。上記疾患として、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられるが、それらに限定されない。【０１２１】
本発明の抗体および本発明のアンチセンス核酸は、それぞれ前記RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドおよび本発明のDNAと同様にして製剤化することができる。また、該アンチセンス核酸は、そのままで、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
本発明の抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１２２】
［２］遺伝子診断剤
RAIG2（またはRAIG3）をコードする核酸またはその一部（以下、「本発明のセンス核酸」という場合がある）および本発明のアンチセンス核酸は、プローブやプライマーとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるRAIG2（またはRAIG3）をコードするDNAまたはmRNAの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のセンスまたはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR-SSCP法（ゲノミックス（Genomics），第5巻，874〜879頁（1989年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第86巻，2766〜2770頁（1989年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーション等によりRAIG2（またはRAIG3）の発現低下が検出された場合は、例えば、RAIG2（またはRAIG3）の機能不全が関与する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。RAIG2（またはRAIG3）の機能不全が関与する疾患としては、例えば、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。
また、ノーザンハイブリダイゼーション等によりRAIG2（またはRAIG3）の発現過多が検出された場合は、例えば、RAIG2（またはRAIG3）の過剰発現が関与する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。RAIG2（またはRAIG3）の過剰発現が関与する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。【０１２３】
［３］RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる化合物のスクリーニング
本発明のセンスおよびアンチセンス核酸は、プローブまたはプライマーとして用いることにより、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の(1)血液、(2)特定の臓器、(3)臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるRAIG2（またはRAIG3） mRNA量を測定することによる、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。【０１２４】
RAIG2（またはRAIG3）mRNA量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧薬、血管作用薬、抗うつ薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、膵臓、脳下垂体など）、組織（例えば、膵島、下垂体腺組織など）あるいは細胞（例えば、膵β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。
得られた細胞等に含まれるRAIG2（またはRAIG3）mRNAは、例えば、通常の方法により該細胞等からmRNAを抽出し、例えば、TaqManPCRなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行なうことにより解析することもできる。
（ii）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドのmRNAを同様にして定量、解析することができる。【０１２５】
RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（30分前ないし24時間前、好ましくは30分前ないし12時間前、より好ましくは1時間前ないし6時間前）もしくは一定時間後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、細胞に含まれるRAIG2（またはRAIG3）mRNA量を定量、解析することにより行なうことができ、（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（1日後ないし7日後、好ましくは1日後ないし3日後、より好ましくは2日後ないし3日後）、該形質転換体に含まれるRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドのmRNA量を定量、解析することにより行なうことができる。【０１２６】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a）RAIG2（またはRAIG3）の発現量を増加させることにより、RAIG2（またはRAIG3）とグルコースや1,5-AGとの相互作用を介する細胞刺激活性（例えば、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を増強させる化合物、（b）RAIG2（またはRAIG3）の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、RAIG2（またはRAIG3）の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、RAIG2（またはRAIG3）の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。【０１２７】
RAIG2（またはRAIG3）は前述のとおり、血糖濃度を検知して膵臓からのインスリン分泌を促進して血糖を低下させ、また、血糖濃度に応じてCRF（コルチコトロピン放出因子）によるACTH分泌を制御しているので、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を変化させる化合物は、1) 糖・脂質代謝調節剤、2) 膵臓および／または脳下垂体の機能調節剤、3) インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
より具体的には、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を増加させる化合物は、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防・治療剤などとして使用することができる。一方、RAIG2（またはRAIG3）の発現量を減少させる化合物は、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌の予防・治療剤などとして使用することができる。
該化合物を上記医薬として使用する場合は、前記RAIG2（またはRAIG3）と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１２８】
［４］グルコース、1,5-AGの定量
RAIG2（またはRAIG3）は、グルコースや1,5-AGに対して結合性を有しているので、生体内におけるこれらの糖濃度を高感度に定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって実施することができる。すなわち、被検体をRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドと接触させることによって被検体中のグルコースや1,5-AG濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の(1)または(2)などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
(1)入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
(2)入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）【０１２９】
［５］RAIG2（またはRAIG3）とグルコースや1,5-AGとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング
RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを用いるか、または組換えRAIG2（またはRAIG3）の発現系を構築し、該発現系を用いたアフィニティーアッセイ系を用いることによって、RAIG2（またはRAIG3）とリガンドの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（a）RAIG2（またはRAIG3）を介して細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を有する化合物（アゴニスト）、（b）該細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（c）RAIG2（またはRAIG3）とリガンドとの結合力を増強する化合物、あるいは（d）RAIG2（またはRAIG3）とマスクリンとの結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）とを接触させた場合と（ii）RAIG2（またはRAIG3）と、グルコース（または1,5-AG）および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合におけるRAIG2（またはRAIG3）に対するグルコース（または1,5-AG）の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。【０１３０】
より具体的には、本発明は、
(1)標識したグルコース（または1,5-AG）をRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合と、標識したグルコース（または1,5-AG）および試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合における、標識したグルコース（または1,5-AG）のRAIG2（またはRAIG3）に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(2)標識したグルコース（または1,5-AG）を、RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合と、標識したグルコース（または1,5-AG）および試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合における、標識したグルコース（または1,5-AG）の該細胞または膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(3)標識したグルコース（または1,5-AG）を、本発明のDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合と、標識したグルコース（または1,5-AG）および試験化合物を本発明のDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合における、標識したグルコース（または1,5-AG）のRAIG2（またはRAIG3）に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、【０１３１】
(4)グルコース（または1,5-AG）を、RAIG2（またはRAIG3）を細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合と、グルコース（または1,5-AG）および試験化合物を、RAIG2（またはRAIG3）を細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合における、RAIG2（またはRAIG3）を介した細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を測定し、比較することを特徴とするRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
(5)グルコース（または1,5-AG）を、本発明のDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合と、グルコース（または1,5-AG）および試験化合物を、本発明のDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したRAIG2（またはRAIG3）に接触させた場合における、RAIG2（またはRAIG3）を介する細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を測定し、比較することを特徴とするRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。【０１３２】
以下に本発明のスクリーニング方法を具体的に説明する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるRAIG2（またはRAIG3）としては、上記したRAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、RAIG2（またはRAIG3）を産生する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のRAIG2（またはRAIG3）などが適している。【０１３３】
RAIG2（またはRAIG3）を製造するには、前述の方法が用いられるが、本発明のDNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするDNA断片にはcDNAが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成DNAを用いてもよい。RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドをコードするDNA断片を宿主動物（昆虫）細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該DNA断片を、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーター、昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；NPV）のポリヘドリンプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。
したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるRAIG2（またはRAIG3）は、それ自体公知の方法に従って精製したRAIG2（またはRAIG3）であってもよいし、RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞またはその細胞膜画分として用いてもよい。【０１３４】
上記スクリーニング方法において、RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞とは、RAIG2（またはRAIG3）を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
前記細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したRAIG2（またはRAIG3）と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。【０１３５】
RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞やその膜画分中のRAIG2（またはRAIG3）の量は、１細胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105〜107分子であるのがより好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのグルコース（または1,5-AG）結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。【０１３６】
RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の(1)〜(3)を実施するためには、例えば、適当なRAIG2（またはRAIG3）含有膜画分と標識したグルコース（または1,5-AG）が必要である。
RAIG2（またはRAIG3）含有膜画分としては、天然型のRAIG2（またはRAIG3）含有膜画分か、またはそれと同等の活性を有する組換えRAIG2（またはRAIG3）含有膜画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のグルコース（または1,5-AG）結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したグルコース（または1,5-AG）としては、常法に従って、例えば〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、などで標識されたものが用いられる。
具体的には、RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずRAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞またはその膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりRAIG2（またはRAIG3）標品を調製する。バッファーは、pH4〜10（望ましくはpH6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのRAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E-64（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。0.01〜10mlのRAIG2（またはRAIG3）懸濁液に、一定量（5000cpm〜500000cpm）の標識したグルコース（または1,5-AG）を添加し、同時に10-4M〜10-10Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（NSB）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約0℃から50℃、望ましくは約4℃から37℃で、約20分から24時間、望ましくは約30分から3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ-カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(B0）から非特異的結合量（NSB）を引いたカウント（B0-NSB）を100％とした時、特異的結合量（B-NSB）が、例えば、50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。【０１３７】
RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の(4)〜(5)の方法を実施するためには、例えば、RAIG2（またはRAIG3）を介する細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、cAMP産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、RAIG2（またはRAIG3）を膜上に発現した適当な細胞が必要である。RAIG2（またはRAIG3）を発現した細胞としては、天然型のRAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞株、前述の組換えRAIG2（またはRAIG3）類を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。【０１３８】
RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5-AG）の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、RAIG2（またはRAIG3）、RAIG2（またはRAIG3）を産生する細胞またはその膜画分などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
(1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
(2)RAIG2（またはRAIG3）標品
RAIG2（またはRAIG3）を発現させたCHO細胞を、12穴プレートに5×105個／穴で継代し、37℃、5％CO2、95％airで2日間培養したもの。
(3)標識グルコース（または1,5-AG）
市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識したグルコース（または1,5-AG）  水溶液の状態のものを4℃あるいは-20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
(4)グルコース（または1,5-AG）標準液
マスクリンを0.1％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで1mMとなるように溶解し、-20℃で保存する。【０１３９】
２．測定法
(1)12穴組織培養用プレートにて培養したRAIG2（またはRAIG3）発現CHO細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
(2)10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、標識マスクリン類を5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに10-3Mのマスクリン標準液を5μl加えておく。
(3)反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞（またはプレート）に結合した標識マスクリン類を0.2N NaOH-1％ SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA（和光純薬製）と混合する。
(4)液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次の式〔数１〕で求める。【０１４０】
〔数１〕
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
PMB：Percent Maximum Binding
B  ：検体を加えた時の値
NSB：Non-specific Binding（非特異的結合量）
B0 ：最大結合量【０１４１】
別の好ましい一実施態様においては、RAIG2（またはRAIG3）を細胞膜上に発現する細胞はさらに共役するGαを発現する。RAIG2（またはRAIG3）とそれぞれ共役するGαのファミリーは、リガンドであるグルコース（または1,5-AG）を作用させた場合に、RAIG2（またはRAIG3）のシグナル伝達作用が活性化されるか否かを検定することにより、同定することができる。好ましくは、RAIG2（またはRAIG3）およびその共役Gαを発現する細胞としては、本発明のDNAおよび該共役GαをコードするDNAをコトランスフェクトされた形質転換細胞が挙げられる。
グルコース（または1,5-AG）がRAIG2（またはRAIG3）に結合すると、該受容体のGα活性化ドメインと共役Gαの受容体結合領域とが相互作用してGαのコンフォメーション変化を生じ、GTP/GDP結合領域からGDPが解離して速やかにGTPを結合する。Gα-GTPは効果器に作用してその活性を促進または抑制する。一方、アンタゴニストが結合すると、受容体のコンフォメーション変化が起こらずGα活性化ドメインは不活性化状態にあるので、活性化型のGα-GTPレベルが減少し、効果器への作用が阻害される。ここで、GTPの代わりに、例えば、35S標識したGTPγS等のGαのGTPase活性によって加水分解を受けないGTPアナログを系に添加しておけば、試験化合物の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、GαにおけるGDP-GTP交換反応に及ぼす試験化合物の効果を評価することができ、RAIG2（またはRAIG3）のアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する物質をスクリーニングすることができる。即ち、試験化合物の存在下で放射活性が増加すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有する。【０１４２】
別の好ましい一実施態様においては、RAIG2（またはRAIG3）と共役Gαとの共発現系において、該Gαと相互作用する効果器の活性を、試験化合物の存在下及び非存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法が提供される。したがって、RAIG2（またはRAIG3）およびその共役Gαを発現する細胞はまた、該Gαからのシグナルを受容する効果器をさらに発現する。Gsファミリーに属するGα（Gαs）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、Gαs-1〜Gαs-4、あるいはGolf等が挙げられる。Giファミリーに属するGα（Gαi）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を抑制するものであり、例えば、Gαi-1〜Gαi-3、あるいはGz等が挙げられる。Gqファミリーに属するGα（Gαq）は、ホスホリパーゼＣを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、GqあるいはG16等が挙げられる。【０１４３】
効果器としてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系においては、Gαの効果器への作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にATPを添加し、生成するcAMP量を、抗cAMP抗体を用いてＲＩ（例えば、125Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α-32P］ATPを添加し、生成する［32P］cAMPをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されない。共役GαがＧαsの場合、試験化合物の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、試験化合物存在下でＡＣ活性が増加すれば該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有し、反対にＡＣ活性が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有する。一方、共役GαがGαiの場合は、試験化合物存在下でＡＣ活性が増加すれば該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有し、反対にＡＣ活性が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有する。【０１４４】
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、GαのＡＣへの作用は、細胞内のcAMP量を測定するか、あるいは細胞を［3H］アデニンで標識し、生成した［3H］cAMPの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内cAMP量は、試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、cAMP量をcAMP応答エレメント（CRE）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価する方法もある。即ち、CREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードするDNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内cAMP量を評価するというものである。
従って、共役GαがGαsの場合、試験化合物の存在下で細胞内cAMP量（もしくはCRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有し、反対にcAMP量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有する。一方、共役GαがGαiの場合、試験化合物の存在下で細胞内cAMP量（もしくはCRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有し、反対にcAMP量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有する。【０１４５】
一方、効果器としてホスホリパーゼＣ（以下、ＰＬＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、共役GαポリペプチドがGαqの場合）においては、Gαの効果器への作用は、ＰＬＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣ活性は、例えば、［3H］標識したホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸をＰＬＣ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。試験化合物の存在下及び非存在下でＰＬＣ活性を測定・比較し、試験化合物存在下でＰＬＣ活性が増加すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有し、反対にＰＬＣ活性が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有する。【０１４６】
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、GαのＰＬＣへの作用は、細胞に［3H］標識イノシトールを添加し、生成した［3H］標識イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のCa2+量を測定することによっても評価することができる。細胞内Ca2+量は、試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙げられる。【０１４７】
別の態様として、Ca2+によりアップレギュレートされるTPA（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート）応答エレメント（TRE）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することによりCa2+量を評価する方法もある。即ち、TREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードするDNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ca2+量を評価するというものである。
従って、試験化合物の存在下で細胞内Ca2+量（もしくはTRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニスト活性を有し、反対に細胞内Ca2+量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物はRAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニスト活性を有する。【０１４８】
GαsおよびGαiポリペプチドのＡＣと相互作用する領域（Ｃ末端の約5アミノ酸程度）をGαqの配列に置換したキメラGαを真核細胞で発現させることにより、RAIG2（またはRAIG3）の共役Gαにかかわらず、効果器としてホスホリパーゼＣを用いて、RAIG2（またはRAIG3）のアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングすることができる。【０１４９】
別の好ましい一実施態様においては、上記特許文献１に記載されるようにして、RAIG2（またはRAIG3）のＣ末端側に共役Gαを連結した融合蛋白質を、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの宿主真核細胞で発現させることにより、RAIG2（またはRAIG3）を恒常的に活性化することができる。この場合、グルコースや1,5−AGなどのリガンドを用いることなく、アゴニスト、インバースアゴニストをスクリーニングすることが可能である。【０１５０】
また、別の好ましい一実施態様においては、宿主細胞として酵母（例えば、パン酵母など）が用いられる。酵母は唯一のGPCRとして接合フェロモンα因子の受容体であるSTE2を有する。リガンドの刺激を受けると、STE2は共役GαであるGPA1を活性化してGβ/Gγと解離する。解離したGβ/GγからのキナーゼカスケードシグナルによりFUS1の発現が誘導され、接合が起こる。ここでSTE2を破壊して、代わりにRAIG2（またはRAIG3）を酵母で発現させ、さらにGPA1プロモーターの制御下にRAIG2（またはRAIG3）の共役Gαを共発現させれば、グルコース（または1,5−AG）の刺激によりRAIG2（またはRAIG3）があたかもSTE2と同様に細胞内シグナル伝達を媒介する。ここでGPA1プロモーターの制御下にRAIG2（またはRAIG3）と共役するGαを共発現させ、さらにFUS1に栄養要求性変異を相補する遺伝子やレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）などを融合させれば、容易にシグナルの活性化を検出することができる。この方法の詳細については、例えば、Yeast, 16: 11-22 (2000)等に記載されている。【０１５１】
上述の通り、RAIG2（またはRAIG3）はグルコース（または1,5−AG）濃度を検知して、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、また、脳下垂体細胞からのCRF刺激によるACTH分泌を制御している。したがって、RAIG2（またはRAIG3）を強制発現させたインスリン分泌細胞やACTH分泌細胞をグルコース（または1,5−AG）存在下で培養した場合と、グルコース（または1,5−AG）および試験化合物の存在下で培養した場合とで、インスリン分泌またはACTH分泌を比較することにより、RAIG2（またはRAIG3）のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
試験化合物の存在下にインスリン分泌が促進された場合には、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアゴニストとして、反対にインスリン分泌が阻害された場合には、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアンタゴニストとして、それぞれ選択することができる。一方、低グルコース（または1,5−AG）濃度において、試験化合物の存在下でACTH分泌が促進された場合は、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアゴニストとして、反対にACTH分泌が阻害された場合は、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアンタゴニストとして、それぞれ選択することができる。また、高グルコース（または1,5−AG）濃度において、試験化合物の存在下でACTH分泌が阻害された場合は、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアゴニストとして、反対にACTH分泌が促進された場合は、該試験化合物をRAIG2（またはRAIG3）のアンタゴニストとして、それぞれ選択することができる。【０１５２】
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a）グルコース（または1,5−AG）−RAIG2（またはRAIG3）相互作用を介して細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を有する化合物（アゴニスト）、（b）該細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（c）RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合力を増強する化合物、あるいは（d）RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
RAIG2（またはRAIG3）に対するアゴニストは、RAIG2（またはRAIG3）に対するグルコース（または1,5−AG）が有する生理活性と同様の作用を有しているので、グルコース（または1,5−AG）活性を増強する安全で低毒性な医薬として有用である。RAIG2（またはRAIG3）に対するアンタゴニストは、RAIG2（またはRAIG3）に対するグルコース（または1,5−AG）が有する生理活性を抑制することができるので、グルコース（または1,5−AG）活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合力を増強する化合物は、RAIG2（またはRAIG3）に対するグルコース（または1,5−AG）が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合力を減少させる化合物は、RAIG2（またはRAIG3）に対するグルコース（または1,5−AG）が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。【０１５３】
［６］RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾患の予防・治療剤
RAIG2（またはRAIG3）は前述のとおり、グルコース（または1,5−AG）の受容体として機能し、血糖濃度を検知して膵臓におけるインスリン分泌を促進し、脳下垂体におけるCRF刺激によるACTH分泌をグルコース濃度に応じて調節している。したがって、RAIG2（またはRAIG3）とグルコース（または1,5−AG）との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）は、1) 糖・脂質代謝調節剤、2) 膵臓および／または脳下垂体の機能調節剤、3) インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
より具体的には、RAIG2（またはRAIG3）のアゴニストは、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防・治療剤などとして使用することができる。一方、RAIG2（またはRAIG3）のアンタゴニストは、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌の予防・治療剤などとして使用することができる。【０１５４】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
RAIG2（またはRAIG3）のアゴニストの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
RAIG2（またはRAIG3）のアンタゴニストの投与量は、、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１５５】
［７］RAIG2（またはRAIG3）の定量
本発明の抗体は、RAIG2（またはRAIG3）を特異的に認識することができるので、被検液中のRAIG2（またはRAIG3）の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化蛋白質等の割合を測定することを特徴とする被検液中のRAIG2（またはRAIG3）の定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のRAIG2（またはRAIG3）の定量法を提供する。
上記（ii）においては、不溶化抗体と標識化抗体とが互いにRAIG2（またはRAIG3）との結合を妨害しないような抗原認識部位を有することが好ましい（例えば、一方の抗体がRAIG2（またはRAIG3）のＮ端部を認識し、他方の抗体がRAIG2（またはRAIG3）のＣ端部に反応する等）。【０１５６】
RAIG2（またはRAIG3）に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いてRAIG2（またはRAIG3）の測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。RAIG2（またはRAIG3）に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、RAIG2（またはRAIG3）量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。【０１５７】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコーン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のRAIG2（またはRAIG3）量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるRAIG2（またはRAIG3）の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はRAIG2（またはRAIG3）との結合にかかる部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、RAIG2（またはRAIG3）のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。【０１５８】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原と(Ｆ)と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０１５９】
これら個々の免疫学的測定法をRAIG2（またはRAIG3）の定量に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてRAIG2（またはRAIG3）の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、RAIG2（またはRAIG3）を高感度に定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内でのRAIG2（またはRAIG3）を定量することによって、RAIG2（またはRAIG3）の機能不全もしくは亢進に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するRAIG2（またはRAIG3）を特異的に検出するために使用することができる。また、RAIG2（またはRAIG3）を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のRAIG2（またはRAIG3）の検出、被検細胞内におけるRAIG2（またはRAIG3）の挙動の分析などに使用することができる。【０１６０】
［８］細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニング
本発明の抗体は、RAIG2（またはRAIG3）を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物の(1)血液、(2)特定の臓器、(3)臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）を定量することによる、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ii）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）を定量することによる、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物の(1)血液、(2)特定の臓器、(3)臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのRAIG2（またはRAIG3）の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のRAIG2（またはRAIG3）を確認することによる、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（iv）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのRAIG2（またはRAIG3）の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のRAIG2（またはRAIG3）を確認することによる、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。【０１６１】
細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、膵臓、脳下垂体など）、組織（例えば、膵島など）あるいは細胞（例えば、膵β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液など）等に懸濁し、界面活性剤（例えば、トリトンX-100TM、ツイーン20TMなど）などを用いて該細胞等を破壊し、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。【０１６２】
細胞膜画分とは、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、RAIG2（またはRAIG3）と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。【０１６３】
細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。【０１６４】
（ii）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作製し、細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）を定量することができる。【０１６５】
細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（30分前ないし24時間前、好ましくは30分前ないし12時間前、より好ましくは1時間前ないし6時間前）もしくは一定時間後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（1日後ないし7日後、好ましくは1日後ないし3日後、より好ましくは2日後ないし3日後）、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を定量することにより行なうことができる。【０１６６】
細胞膜画分に含まれるRAIG2（またはRAIG3）の確認は、具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、膵臓、脳下垂体など）、組織（例えば、膵島など）あるいは細胞（例えば、膵β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、常法に従って組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層でのRAIG2（またはRAIG3）の染色度合いを定量化することによって、細胞膜上のRAIG2（またはRAIG3）を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を確認することができる。
（iv）RAIG2（またはRAIG3）またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。【０１６７】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a）細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を増加させることにより、グルコース（または1,5−AG）−RAIG2（またはRAIG3）相互作用を介する細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内Ca2+取り込み、cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、ACTH分泌調節、食欲調節など）を増強させる化合物、（b）細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、RAIG2（またはRAIG3）の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、RAIG2（またはRAIG3）の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。【０１６８】
［９］細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予防・治療剤
RAIG2（またはRAIG3）は前述のとおり、グルコース（または1,5−AG）の受容体として機能し、血糖濃度を検知して膵臓におけるインスリン分泌を促進し、脳下垂体におけるCRF刺激によるACTH分泌をグルコース濃度に応じて調節している。したがって、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を変化させる化合物は、1) 糖・脂質代謝調節剤、2) 膵臓および／または脳下垂体の機能調節剤、3) インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
より具体的には、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を増加させる化合物は、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防・治療剤などとして使用することができる。一方、細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を減少させる化合物は、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌の予防・治療剤などとして使用することができる。【０１６９】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を増加させる化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
細胞膜におけるRAIG2（またはRAIG3）の量を減少させる化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１７０】
［１０］RAIG2（またはRAIG3）をコードするDNAを有する非ヒトトランスジェニック動物の作製
本発明は、外来性のRAIG2（またはRAIG3）をコードするDNA（以下、「本発明の外来性DNA」と略記する）またはその変異DNA（「本発明の外来性変異DNA」と略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のDNA転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより目的とするDNAを転移することによって作出することができる。また、該DNA転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性DNAを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のDNA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、C57BL/6系統，DBA2系統など、交雑系として、B6C3F1系統，BDF1系統，B6D2F1系統，BALB/c系統，ICR系統など）またはラット（例えば、Wistar，SDなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。【０１７１】
本発明の外来性DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のDNAではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のDNAをいう。
本発明の変異DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠失、他の塩基への置換などが生じたDNAなどが用いられ、また、異常DNAも含まれる。
該異常DNAとしては、異常なRAIG2（またはRAIG3）を発現させるDNAを意味し、例えば、正常なRAIG2（またはRAIG3）の機能を抑制する蛋白質等を発現させるDNAなどが用いられる。
本発明の外来性DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のDNAを対象動物に転移させるにあたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDNAを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のDNAを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト（例：ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のDNAを高発現するDNA転移哺乳動物を作出することができる。【０１７２】
本発明のDNAを担持させる発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のDNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、(1)ウイルス（例：シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するDNAのプロモーター、(2)各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1，K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP依存蛋白質キナーゼβIサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にTie2と略される）、ナトリウム・カリウム-ATPアーゼ（Na，K-ATPase）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、MHCクラスI抗原（H-2L）、H-ras、レニン、ドーパミンβ-水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）、ペプチド鎖延長因子1α（EF-1α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Thy-1、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（VNP）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（EF-1α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネターなどが用いられる。【０１７３】
その他、目的とする外来性DNAをさらに高発現させる目的で各DNAのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核DNAのイントロンの一部などをプロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3'下流に連結することも目的により可能である。
正常なRAIG2（またはRAIG3）の翻訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、脂肪組織、筋肉由来DNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーよりゲノムDNAの全てあるいは一部として、または前記臓器または組織由来のRNAより公知の方法により調製されたcDNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なRAIG2（またはRAIG3）の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異させた翻訳領域を作製することによって得ることができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるDNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流（および所望により転写終結部位の上流）に連結させる通常のDNA工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを有する。
本発明の外来性正常DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して、該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。
導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。【０１７４】
本発明の正常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を増強することにより最終的にRAIG2（またはRAIG3）の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常DNA転移動物を用いて、RAIG2（またはRAIG3）の機能亢進症や、RAIG2（またはRAIG3）が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常DNAを転移させた哺乳動物は、遊離したRAIG2（またはRAIG3）の増加症状を有することから、RAIG2（またはRAIG3）に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのDNAコンストラク卜は、通常のDNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを有するように繁殖継代することができる。【０１７５】
本発明の異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を阻害することにより最終的にRAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常DNA転移動物を用いて、RAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA高発現動物は、RAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症における異常RAIG2（またはRAIG3）による正常RAIG2（またはRAIG3）の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した異常RAIG2（またはRAIG3）の増加症状を有することから、RAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のDNA転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
(1)組織培養のための細胞源としての使用、
(2)本発明のDNA転移動物の組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、または産生されたRAIG2（またはRAIG3）を分析することによる、RAIG2（またはRAIG3）により特異的に発現あるいは活性化する蛋白質等との関連性についての解析、
(3)DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用しての、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(4)上記(3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
(5)変異RAIG2（またはRAIG3）の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のDNA転移動物を用いて、RAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症などを含む、RAIG2（またはRAIG3）に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、RAIG2（またはRAIG3）に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のDNA転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したDNA転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、RAIG2（またはRAIG3）産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、RAIG2（またはRAIG3）の作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のDNA転移動物を用いて、RAIG2（またはRAIG3）の機能不活性型不応症を含む、RAIG2（またはRAIG3）に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のDNA転移動物または本発明の外来性DNA発現ベクターを用いて、RAIG2（またはRAIG3）が関連する疾患のDNA治療法を検討、開発することが可能である。【０１７６】
［１１］RAIG2（またはRAIG3）をコードする遺伝子が不活性化された非ヒトノックアウト動物の作製
本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該DNAがレポーター遺伝子（例：大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のDNAが不活性化された該DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該DNAがレポーター遺伝子（例：大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAに人為的に変異を加えることにより、DNAの発現能を抑制するか、もしくは該DNAがコードしているRAIG2（またはRAIG3）の活性を実質的に喪失させることにより、DNAが実質的にRAIG2（またはRAIG3）の発現能を有しない（以下、本発明のノックアウトDNAと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ES細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該DNA配列の一部又は全部の削除、他DNAを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよい。【０１７７】
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のDNA不活性化ES細胞または本発明のノックアウトES細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはlacZ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、cat（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるDNA配列（例えば、poly A付加シグナルなど）を挿入し、完全なmRNAを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したDNA配列を有するDNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたES細胞について本発明のDNA上あるいはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のDNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列をプライマーとしたPCR法により解析し、本発明のノックアウトES細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのES細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス（C57BL/6とDBA/2とのF1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。【０１７８】
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法を、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のES細胞数（約50個）で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、G-バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF（1-10000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5％炭酸ガス、95％空気または5％酸素、5％炭酸ガス、90％空気）で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／EDTA溶液（通常0.001-0.5％トリプシン／0.1-5mM EDTA、好ましくは約0.1％トリプシン／1mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1-3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー（J. Embryol. Exp. Morphol.）、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロにおけるRAIG2（またはRAIG3）またはRAIG2（またはRAIG3）の細胞生物学的検討において有用である。【０１７９】
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のmRNA量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入されたターゲッティングベクター中の本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウトさせることができる。哺乳動物における組換えの多くは非相同的であるため、相同組換えを起こした細胞をスクリーニングする手段として、例えば、本発明のDNAの内部にネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を挿入するとともに、本発明のDNAの近傍にチミジンキナーゼ（tk）遺伝子を含むターゲッティングベクターを構築して胚幹細胞または卵細胞に導入し、挿入された薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子であればG418等）およびガンシクロビル存在下で生存する細胞を選択する方法が挙げられる。即ち、相同組換えにより本発明の挿入変異DNAが染色体上に組み込まれた場合、tk遺伝子は排除されるのでガンシクロビル耐性であるが、非相同組換えで組み込まれた場合はtk遺伝子も同時に組み込まれるためガンシクロビル感受性となる。また、tk遺伝子の代わりにジフテリア毒素遺伝子などを用いれば、ランダム挿入された細胞は該毒素の産生により死滅するので、単一の薬剤での選択が可能となる。
本発明のDNAがノックアウトされた細胞の最終的な確認は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析を用いて行なうことができる。
非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常ヘテロ発現不全個体であるので、当該ヘテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔から本発明の蛋白質のホモ発現不全個体を得ることができる。【０１８０】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でDNA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、遺伝子相同組換えにより本発明のDNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のDNAがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、RAIG2（またはRAIG3）により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、RAIG2（またはRAIG3）の生物活性の不活性化を原因とする疾患のモデルとなり得るので、これらの疾患の原因究明及び治療法の検討に有用である。【０１８１】
［１２ａ］本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾患の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。【０１８２】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、例えば、該試験動物の血糖値が約10％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上低下した場合、該試験化合物を耐糖能異常などの疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、RAIG2（またはRAIG3）の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患、例えば、1) 糖・脂質代謝調節剤、2) 膵臓および／または脳下垂体の機能調節剤、3) インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／またはACTH分泌調節剤、4) 糖・脂質代謝異常、膵臓および／または脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および／もしくは血糖値並びに／またはACTH分泌異常が関与する疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。【０１８３】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸など）や塩基（例：アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。【０１８４】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を医薬として使用する場合は、前記RAIG2（またはRAIG3）と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１８５】
［１２ｂ］本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、RAIG2（またはRAIG3）をコードするDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）で置換している場合、本来、RAIG2（またはRAIG3）の発現する組織で、RAIG2（またはRAIG3）の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド（X-gal）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にRAIG2（またはRAIG3）の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、RAIG2（またはRAIG3）を欠損するマウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）で洗浄後、X-galを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、lacZをコードするmRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸など）や塩基（例：有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。【０１８６】
本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、RAIG2（またはRAIG3）の発現を促進し、RAIG2（またはRAIG3）の機能を促進することができるので、例えば、RAIG2（またはRAIG3）の機能不全に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、RAIG2（またはRAIG3）の発現を阻害し、RAIG2（またはRAIG3）の機能を阻害することができるので、例えば、RAIG2（またはRAIG3）の発現過多に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
RAIG2（またはRAIG3）の機能不全に関連する疾患としては、例えば、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。一方、RAIG2（またはRAIG3）の発現過多に関連する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。【０１８７】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を医薬として使用する場合は、前記RAIG2（またはRAIG3）と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１８８】
このように、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のDNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、RAIG2（またはRAIG3）のプロモーター領域を含有するDNAを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にその蛋白質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、RAIG2（またはRAIG3）そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。【０１８９】
RAIG2のショウジョウバエホモログであるBOSSは、そのＮ末の細胞外ドメインが複眼合成に関与することが知られているが、RAIG2と相同性を有する７回膜貫通領域の生理機能については全く未知であった。後記実施例に示されるように、boss遺伝子の欠損突然変異体と該遺伝子を強制発現させたトランスジェニックとで、その血糖値を比較した結果、前者では野生型と比較して血糖値の上昇が認められたのに対し、後者ではこの上昇が抑制された。このことは、BOSSもRAIG2やRAIG3と同様に血糖濃度を検知し、インスリンシグナルを調節していることを強く示唆する。したがって、ショウジョウバエにおけるboss遺伝子欠損変異体、boss遺伝子ノックアウトハエ、boss遺伝子強制発現トランスジェニックハエなどの系は、ヒトなどの哺乳動物における糖・脂質代謝や糖尿病等の疾患の基礎研究における有用なツールとなり得る。【０１９０】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
DNA          ：デオキシリボ核酸
cDNA        ：相補的デオキシリボ核酸
A           ：アデニン
T           ：チミン
G           ：グアニン
C           ：シトシン
RNA         ：リボ核酸
mRNA        ：メッセンジャーリボ核酸
dATP        ：デオキシアデノシン三リン酸
dTTP        ：デオキシチミジン三リン酸
dGTP        ：デオキシグアノシン三リン酸
dCTP        ：デオキシシチジン三リン酸
ATP         ：アデノシン三リン酸
EDTA        ：エチレンジアミン四酢酸
SDS         ：ドデシル硫酸ナトリウム【０１９１】
Gly         ：グリシン
Ala         ：アラニン
Val         ：バリン
Leu         ：ロイシン
Ile         ：イソロイシン
Ser         ：セリン
Thr         ：スレオニン
Cys         ：システイン
Met         ：メチオニン
Glu         ：グルタミン酸
Asp         ：アスパラギン酸
Lys         ：リジン
Arg         ：アルギニン
His         ：ヒスチジン
Phe         ：フェニルアラニン
Tyr         ：チロシン
Trp         ：トリプトファン
Pro         ：プロリン
Asn         ：アスパラギン
Gln         ：グルタミン
pGlu        ：ピログルタミン酸
Me          ：メチル基
Et          ：エチル基
Bu          ：ブチル基
Ph          ：フェニル基
TC          ：チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド基【０１９２】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Tos         ：p-トルエンスルフォニル
CHO         ：ホルミル
Bzl         ：ベンジル
Cl2Bzl      ：2,6-ジクロロベンジル
Bom         ：ベンジルオキシメチル
Z           ：ベンジルオキシカルボニル
Cl-Z        ：2-クロロベンジルオキシカルボニル
Br-Z        ：2-ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc         ：t-ブトキシカルボニル
DNP         ：ジニトロフェノール
Trt         ：トリチル
Bum         ：t-ブトキシメチル
Fmoc        ：N-9-フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt        ：1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt       ：3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン
HONB        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC          ：N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド【０１９３】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトRAIG2 cDNAのコード配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトRAIG2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトRAIG3 cDNAのコード配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトRAIG3のアミノ酸配列を示す。【０１９４】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１９５】
実施例１
マウスインスリノーマMIN6細胞（大阪大学大学院医学系研究科 Ｇ６病態制御医学専攻 分子治療学講座 幹細胞制御学分野 宮崎 純一博士より分与された）を、15% ウシ胎仔血清（56℃、30分処理で非働化）、5 μl/l β-メルカプトエタノールおよび4.5 g/l グルコースを含むDMEMを加えた24 well plate中で、5% CO2/95%大気の雰囲気下、37℃で低密度で培養した。RAIG2およびRAIG3のcDNAは、ヒト脳または肝臓のcDNAライブラリーより、常法に従ってPCR法により得た。これをpIRES2-EGFP (CLONTECH社) に挿入した。24時間後に上記細胞にRAIG2またはRAIG3 cDNAを含む発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションはLipofectamin 2000 (Invitrogen)を用い、メーカーのマニュアルに従って行った。さらに48時間培養後、2.8 mM グルコース含有KRBB溶液［129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 4.8 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 2.5 mM CaCl2, 0.2% ウシ血清アルブミン（pHを7.4に調整）］で37℃、15分間保持して洗浄した。これを2回行った後、各濃度のグルコースや1,5-AG（和光純薬より購入）を含んだKRBB液0.5 mlを加え、37℃、1時間保持した。各10 μlの培養上清を取り、ELISA法によりインスリン量を測定した。測定には、Rat/mouse Insulin ELISA Kit (LINCO Research社製、セティ カンパニーリミテッド社より購入)を用いた。その結果、2.8 mMグルコースに比べて、20 mMグルコースでは、インスリンの放出が増加するが、RAIG3強発現細胞では、さらに増加した（図１）。また、10 mMグルコースでは、コントロールの細胞ではインスリン放出量が2.8 mMグルコースと変らないが、RAIG3強発現細胞では有意に放出量が増加した（図１）。RAIG2, RAIG3強発現細胞においては、2.8 mMグルコースに1,5-AGを0.6 mM添加することにより、20 mMグルコースに匹敵するインスリン放出を引き起こした（図２ａ, ｂ）。【０１９６】
実施例２
マウス脳下垂体腫AtT-20/D16v-F2細胞（ATCCより購入）は、CRFに反応してACTHを分泌する。これは低グルコース(2.8 mM)溶液中で起こるが、高グルコース(20 mM)によって抑制される。この細胞を10% ウシ胎仔血清（56℃３０分処理で非働化）および1 g/l グルコースを含むMEMを加えた24 well plate中で、10% CO2/95% 大気の雰囲気下、37℃で培養した。１時間後にRAIG2またはRAIG3のsiRNAをトランスフェクトした。siRNAは、Ambion社の設計したマウスRAIG2およびRAIG3に対するものをそれぞれ3種類購入して使用した。トランスフェクションは、HiPerFect Transfection Reagent (QIAGEN社製)を使用し、メーカーのマニュアルに従って使用した。それぞれの処理後に48時間培養後、2.8 mMグルコース含有KRBB溶液で37℃、15分間保持して洗浄した。これを2回行った後、各濃度のグルコースを含んだKRBB液を加え、10 nMのCRF（ペプチド研究所より購入。100 μM溶液を0.1 M酢酸で作製し、水で10倍に希釈したものを1/1000でKRBB液に加えて用いた）0.5 mlを加えて、37℃、1時間保持した。各50 μlの培養上清を取り、ELISA法によりACTH量を測定した。測定には、ACTH (Rat) EIA Kit (Peninsula Laboratories社製, セティ カンパニーリミテッド社より購入)を用いた。RAIG2の発現を抑制すると、低グルコースにおけるACTH放出が抑制された（図３）。一方、RAIG3の発現を抑制すると高グルコースによるACTH放出の抑制が緩和された（図３）。これらの結果から、RAIG2やRAIG3は、グルコースの濃度を検出し、CRFによるACTHの放出量を制御していると考えられた。【０１９７】
実施例３
野生型、boss欠損突然変異体、およびbossを強制発現させたトランスジェニックのショウジョウバエの３令幼虫（各4-5匹）を水洗し、濾紙上で乾燥させた後、Hemolympho（体腔液＝ヒトの血液・リンパ液に相当）0.5 μlを回収した。これに14.5 μlのPBSを加え、13,000ｘgで遠心して上清を回収した。各Hemolympho 1 μlに100μlのInfinity Glucose Reagent (ThermoDMA) を加え（トレハロス測定の場合はPig kidny trehalase (Sigma) 0.2μlを加えた）、37℃で12時間インキュベートした後、グルコースおよびトレハロス濃度を測定した。その結果、boss欠損変異体では血糖値が野生型と比較すると上昇しており（1.3倍）、強発現トランスジェニックではこの上昇が抑えられていた（図４）。【０１９８】
実施例４
生後３日目の雄のハエに飢餓ストレス（0.8% agar/PBS、２５℃で飼育）を与えて、生存率を測定した。エネルギー源が無い条件下では、boss欠損変異体は野生型より早く死ぬことが明らかとなった。48時間後の生存率は、野生型は62%生存していたのに対し、boss欠損変異体の生存率は29%に低下していた。逆に強発現トランスジェニックでは96%に上昇していた。boss欠損変異体では体内の脂肪の貯蓄が減少しており、これが原因と考えられる。boss欠損変異体で見られる血糖値の上昇、及び、飢餓条件下での生存率の低下は、ショウジョウバエでインスリンシグナルを抑えたときに見られる現象と一致している。このことから、BOSSもマウスのRAIG2やRAIG3と同様にグルコース及び1,5-AGの濃度を検出し、インスリンシグナルを調節することで糖代謝を制御していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明によれば、糖・脂質代謝や膵臓および／または脳下垂体機能の調節剤、インスリン分泌および／もしくは血糖並びに／またはACTH分泌の調節剤、糖・脂質代謝異常や膵臓および／または脳下垂体機能異常が関与する疾患の予防・治療剤、診断剤、さらに該疾患の予防・治療に有効な医薬もしくは動物薬候補化合物のスクリーニングのためのツールが提供される。【０２００】
本出願は、日本で出願された特願２００６−１０１０５７（出願日：平成１８年３月３１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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