(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって：（ａ）ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ−６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで；（ｂ）工程（ａ）で選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ−６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学的スクリーニング工程、を含む、前記方法を提供する。本発明はさらに、当該方法により同定されたＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ−６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで
（ｂ）工程（ａ）で選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ−６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学的スクリーニング工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ポジティブスクリーニング工程（ａ）で使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞が、マウスまたはヒト由来である、請求項１の方法。
【請求項３】
ポジティブスクリーニング工程（ａ）で使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞が、マウス由来のＭ１細胞に由来するクローンである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
ポジティブスクリーニング工程（ａ）で使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞が、遺伝子工学的に作成された細胞である、請求項１または２のいずれかの方法。
【請求項５】
ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物の標的分子が、ＳＴＡＴ３を介する経路の構成因子である、請求項１ないし４のいずれかの方法。
【請求項６】
ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物の標的分子が、Ｒａｓを介する経路の構成因子である、請求項１ないし４のいずれかの方法。
【請求項７】
ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物の標的分子が、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路の構成因子である、請求項１ないし４のいずれかの方法。
【請求項８】
生化学的スクリーニング工程（ｂ）の生化学的手段が、ウエスタンブロット法、キナーゼアッセイ、転写活性測定アッセイ、表面プラズモン共鳴法、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブロット法、およびＲＴ−ＰＣＲ法からなる群より選択されるいずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いて行われる、請求項１ないし６のいずれかの方法。
【請求項９】
ポジティブスクリーニング工程（ａ）と生化学的スクリーニング工程（ｂ）の間に、工程（ａ）で選択された化合物から、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含む、請求項１ないし７のいずれかの方法。
【請求項１０】
ネガティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により増殖する細胞が、ヒト由来である、請求項８の方法。
【請求項１１】
ネガティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により増殖する細胞が、ＩＬ−６依存性腫瘍性細胞株である、請求項８または９の方法。
【請求項１２】
以下の式（１）−（６）からなる群より選択される、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物：
式（１）：
【化１】
2007060715.tif 000015
［式中、
Ｒ1は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、またはハロゲンであり；そして
Ｒ2は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基でありである］；
式（２）：
【化２】
2007060715.tif 000016
［式中、
Ｒ1は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、またはハロゲンであり；そして
Ｒ2は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基でありである］；
式（３）：
【化３】
2007060715.tif 000017
［式中、
Ｒ1は、水素または（Ｃ1−Ｃ10）アルキルである］；
式（４）：
【化４】
2007060715.tif 000018
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ4は、水素またはハロゲンである］；
式（５）：
【化５】
2007060715.tif 000019
［式中、
Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ同一または異なる、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基である］；
および、
式（６）：
【化６】
2007060715.tif 000020
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンである］。
【請求項１３】
以下の式（７）−（１３）からなる群より選択される、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物：
式（７）
【化７】
2007060715.tif 000021
式（８）
【化８】
2007060715.tif 000022
式（９）
【化９】
2007060715.tif 000023
式（１０）
【化１０】
2007060715.tif 000024
式（１１）
【化１１】
2007060715.tif 000025
式（１２）
【化１２】
2007060715.tif 000026
および、
式（１３）
【化１３】
2007060715.tif 000027
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法、並びに当該スクリーニング方法によって同定されたＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、初めＢ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導するサイトカインとして発見され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞など種々の細胞種で産生、分泌されることが知られている。ＩＬ−６が細胞膜上に存在する受容体ＩＬ−６Ｒαと結合すると、ＩＬ−６Ｒαは、細胞膜貫通タンパク質であるｇｐ１３０と会合するとともにｇｐ１３０どうしの二量体化を引き起こす。ｇｐ１３０の細胞内領域にはＪＡＫ（Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーに属するＪＡＫ１、ＪＡＫ２などの因子が構成的に会合しており、ｇｐ１３０どうしの二量体化によりｇｐ１３０に会合するＪＡＫどうしも近接し、ＪＡＫは互いにチロシン残基をリン酸化することにより活性化すると考えられている。活性化されたＪＡＫは、さらにｇｐ１３０の細胞内領域のチロシン残基、および様々なシグナル分子をリン酸化することにより、これらの分子を活性化する。【０００３】
ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ファミリーのメンバーは、リン酸化チロシン残基を認識するＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメインを有しており、そのドメインによりチロシン残基がリン酸化されたｇｐ１３０に結合し、ＪＡＫによりチロシン残基のリン酸化を受ける。リン酸化されたＳＴＡＴは、ｇｐ１３０から遊離し、その後遊離したＳＴＡＴのＳＨ２ドメインが他のＳＴＡＴのリン酸化チロシン残基に結合することにより、ＳＴＡＴホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。二量体化したＳＴＡＴは、核内に移動して、他の遺伝子調節タンパク質とともに種々の遺伝子の応答配列に結合して、標的遺伝子の転写を促進する。また、ＳＴＡＴのリン酸化と同様に、ＳｈｃおよびＳｈｐもまたｇｐ１３０上でリン酸化を受けることが知られている。これらの分子の下流には、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路、並びにＲａｓ／ＭＡＰＫの経路があり、細胞の生存、分化等に様々な局面に影響を及ぼす（非特許文献１−４）。【０００４】
これまでに、ＩＬ−６のシグナル伝達系の分子は、多発性骨髄腫、キャスルマン腫瘍、慢性関節リウマチなど多くの病態において、活性化されていることが知られていることから、ＩＬ−６のシグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する阻害薬は、これらの疾患の治療薬となると期待される。特に、ＳＴＡＴ３は多くの癌細胞で活性化されており、またその活性化が細胞のトランスフォーメーションに関与していることが知られていることから、ＳＴＡＴ３の阻害剤はスペクトラムの広い抗癌剤となりうると考えられる。さらに、ＪＡＫ２の恒常的活性型変異が多くの骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）症例の原因になっていることも報告されている（非特許文献５−８）。【０００５】
これらのことから、ＩＬ−６のシグナル伝達を阻害する化合物を効率よくスクリーニングする方法は、癌をはじめとする様々な疾患に対する薬剤の開発につながりうるものである。【０００６】
従来、ＩＬ−６シグナル阻害薬に限らず、低分子化合物ライブラリーのスクリーニングは多くの場合、例えば細胞増殖の抑制する化合物の選択などのようなネガティブスクリーニングに頼っていた（非特許文献９−１１）
したがって、ネガティブスクリーニングのみに依存せずに、効率よくＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法が希求されている。
【非特許文献１】Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｋ，  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｙ，  Ｎａｋａｅ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔ３  ｉｎ  ＩＬ−６−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍ１  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９６；１５：３６５１−３６５８．
【非特許文献２】Ｋａｗａｓｈｉｍａ，  Ｔ．，  Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｋ．，  Ｓａｔｏｈ，  Ｔ．，  Ｋａｎｅｋｏ，  Ａ．，  Ｉｋｅｄａ，  Ｙ．，  Ｋａｚｉｒｏ，  Ｙ．，  Ｎｏｓａｋａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｔ．  （２０００）．  ＭｇｃＲａｃＧＡＰ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ９６，  ２１１６−２１２４．
【非特許文献３】Ｋａｗａｓｈｉｍａ，  Ｔ．，  Ｍｕｒａｔａ，  Ｋ．，  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．，  Ｔｏｎｏｚｕｋａ，  Ｙ．，  Ｍｉｎｏｓｈｉｍａ，  Ｙ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｓ．，  Ｋｕｍａｇａｉ，  Ｈ．，  Ｔｓｕｒｕｇａ，  Ｈ．，  Ｉｋｅｄａ，  Ｙ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  ＳＴＡＴ５  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ１  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｐ６５．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７，  ３６５２−３６６０．
【非特許文献４】Ｔｏｎｏｚｕｋａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  １０４（１２）  ３５５０−７（２００４）
【非特許文献５】Ｊａｍｅｓ  Ｃ，  Ｕｇｏ  Ｖ，  Ｌｅ  Ｃｏｕｅｄｉｃ  ＪＰ，  Ｓｔａｅｒｋ  Ｊ，  Ｄｅｌｈｏｍｍｅａｕ  Ｆ，  Ｌａｃｏｕｔ  Ｃ，  Ｇａｒｃｏｎ  Ｌ，  Ｒａｓｌｏｖａ  Ｈ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｒ，  Ｂｅｎｎａｃｅｕｒ−Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ  Ａ，  Ｖｉｌｌｅｖａｌ  ＪＬ，  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ  ＳＮ，  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ  Ｎ，  Ｖａｉｎｃｈｅｎｋｅｒ  Ｗ．  Ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｌｏｎａｌ  ＪＡＫ２  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ  ｖｅｒａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００５；４３４：１１４４−１１４８．
【非特許文献６】Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ  Ｒ，  Ｐａｓｓａｍｏｎｔｉ  Ｆ，  Ｂｕｓｅｒ  ＡＳ，  Ｔｅｏ  ＳＳ，  Ｔｉｅｄｔ  Ｒ，  Ｐａｓｓｗｅｇ  ＪＲ，  Ｔｉｃｈｅｌｌｉ  Ａ，  Ｃａｚｚｏｌａ  Ｍ，  Ｓｋｏｄａ  ＲＣ．  Ａ  ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ２  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００５；３５２：１７７９−１７９０．
【非特許文献７】Ｌｅｖｉｎｅ  ＲＬ，  Ｗａｄｌｅｉｇｈ  Ｍ，  Ｃｏｏｌｓ  Ｊ，  Ｅｂｅｒｔ  ＢＬ，  Ｗｅｒｎｉｇ  Ｇ，  Ｈｕｎｔｌｙ  ＢＪ，  Ｂｏｇｇｏｎ  ＴＪ，  Ｗｌｏｄａｒｓｋａ  Ｉ，  Ｃｌａｒｋ  ＪＪ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｓ，  Ａｄｅｌｓｐｅｒｇｅｒ  Ｊ，  Ｋｏｏ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＪＣ，  Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｓ，  Ｍｅｒｃｈｅｒ  Ｔ，  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ  Ａ，  Ｆｒｏｈｌｉｎｇ  Ｓ，  Ｄｏｈｎｅｒ  Ｋ，  Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ，  Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ  Ｐ，  Ｍｅｓａ  ＲＡ，  Ｔｅｆｆｅｒｉ  Ａ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＤ，  Ｅｃｋ  ＭＪ，  Ｓｅｌｌｅｒｓ  ＷＲ，  Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  Ｍ，  Ｇｏｌｕｂ  ＴＲ，  Ｌｅｅ  ＳＪ，  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ＤＧ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２００５；７：３８７−３９７．
【非特許文献８】Ｚｈａｏ  Ｒ，  Ｘｉｎｇ  Ｓ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｆｕ  Ｘ，  Ｌｉ  Ｑ，  Ｋｒａｎｔｚ  ＳＢ，  Ｚｈａｏ  ＺＪ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ＪＡＫ２  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｖｅｒａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００５；２８０：２２７８８−２２７９２．
【非特許文献９】Ｒｏｓａｎｉａ  ＧＲ，  Ｍｅｒｌｉｅ  Ｊ  Ｊｒ，  Ｇｒａｙ  Ｎ，  Ｃｈａｎｇ  ＹＴ，  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ，  Ｈｅａｌｄ  Ｒ．  Ａ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｇｇ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９；９６：４７９７−４８０２．
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｔａ  Ｋ，  Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，  Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｔａｍｉｔｓｕ  Ｋ，  Ｉｒｉｅ  Ｍ，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｈ，  Ｓｕｚｕ  Ｓ，  Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ，  Ｋａｍｉｈｉｒａ  Ｓ，  Ｎｏｓａｋａ  Ｔ，  Ａｓａｎｏ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＧＴＰ−１４５６４，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  （ＦＬＴ３）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００３；２７８：３２８９２−３２８９８．
【非特許文献１１】Ｗｉｎｔｅｒ−Ｖａｎｎ  ＡＭ，  Ｂａｒｏｎ  ＲＡ，  Ｗｏｎｇ  Ｗ，  ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚ  Ｊ，  Ｙｏｒｋ  ＪＤ，  Ｇｏｏｄｅｎ  ＤＭ，  Ｂｅｒｇｏ  ＭＯ，  Ｙｏｕｎｇ  ＳＧ，  Ｔｏｏｎｅ  ＥＪ，  Ｃａｓｅｙ  ＰＪ．  Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５；１０２：４３３６−４１．
【非特許文献１２】Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ７２（５）  １８２６−１８２８  （１９８８）
【非特許文献１３】Ｂｕｒｇｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｊ．  ２（１）  ４２−５３  （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。【０００８】
本発明の方法は、
（ａ）ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ−６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで
（ｂ）工程（ａ）で選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ−６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学的スクリーニング工程、を含む。【０００９】
本発明の方法において、ポジティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞は、好ましくはマウスまたはヒト由来であり、さらに好ましくはマウス由来のＭ１細胞に由来するクローンまたは遺伝子工学的に作成された細胞である。【００１０】
本発明の方法において、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物の標的分子は、好ましくはＳＴＡＴ３を介する経路の構成因子、Ｒａｓを介する経路の構成因子またはＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路の構成因子である。【００１１】
本発明の方法において、生化学的スクリーニング工程の生化学的手段は、好ましくはウエスタンブロット法、キナーゼアッセイ、転写活性測定アッセイ、表面プラズモン共鳴法、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブロット法、およびＲＴ−ＰＣＲ法からなる群より選択されるいずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いて行われる。【００１２】
さらに本発明の方法において、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリーニング工程の間に、ポジティブスクリーニング工程で選択された化合物から、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含む。【００１３】
本発明の方法において、ネガティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により増殖する細胞は、好ましくはヒト由来であり、さらに好ましくはＩＬ−６依存性腫瘍性細胞株である。【００１４】
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法により、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を同定するに至り、本発明を想到した。【００１６】
Ｉ．  ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法
本発明は、（ａ）：ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ−６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する、ポジティブスクリーニング工程、次いで、（ｂ）：工程（ａ）で選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ−６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する、生化学的スクリーニング工程、を含むＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらにスクリーニングの精度を高めるために、ポジティブスクリーニング工程（ａ）と生化学的スクリーニング工程（ｂ）の間に、工程（ａ）で選択された化合物から、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含んでもよい。【００１７】
具体的には、本発明者らが発明したＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法は、ポジティブスクリーニング工程においては、ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞の、ＩＬ−６の刺激による死滅を阻害する化合物を同定することにより行われる。このポジティブスクリーニング工程は、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を添加した場合に限り細胞が増殖してくるので、化合物の細胞毒性よる偽性陽性が発生する可能性はきわめて少ない。実際、パイロットとして行ったポジティブスクリーニング工程を通過した化合物は０．１４２％以下であった。【００１８】
また、以下の実施例で記載するように、ポジティブスクリーニング工程を通過した化合物１８種類のうち、３種類の化合物２，１３および１６はＩＬ−６によるＳＴＡＴ３の活性化を特異的に抑えた。よって１８種類のうち３種類はＳＴＡＴ３の活性化を、４種類はＩＬ−６シグナル伝達系の別の分子の活性化を阻害していると考えられる。いずれもＩＬ−６依存性ヒトレンネルトＴ細胞リンパ腫細胞株（ＫＴ−３細胞）の増殖を抑制した。このことから、ポジティブスクリーニング工程を通過した化合物のうち、最終的にポジティブであった化合物の割合は３８．９％（７／１８）という、高い値となった。これらはいずれも、ポジティブスクリーニングの有効性を示すものである。
また、生化学的スクリーニング工程においてはウエスタンブロット等の生化学的手段用いることによって、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに確実に選択することができる。そして、ポジティブスクリーニング工程により選択された化合物がＩＬ−６シグナル伝達系のどの部分（サイトカイン・レセプター・キナーゼ・転写因子等）の活性化を阻害しているかを検討することが可能である。【００１９】
さらにまた、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリーニング工程の間に、ネガティブスクリーニング工程をＩＬ−６の刺激により増殖する細胞の増殖抑制を指標として行い、ＩＬ−６シグナル伝達系を抑制する化合物を絞り込むことも可能である。【００２０】
「ＩＬ−６シグナル伝達系」とは、分泌性タンパク質であるＩＬ−６が受容体ＩＬ−６Ｒαに結合し、それにより活性化した細胞内のＪＡＫが他のタンパク質をリン酸化することを発端とするシグナルカスケードをいう。図１に示されるように、ＳＴＡＴを介する経路、Ｒａｓを介する経路、並びにＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路等が知られている。したがって、本発明の態様において、本発明の「ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子」は、図１に示されたいずれかの任意の分子、または複数の分子からなる分子群を含む。好ましくはＳＴＡＴ３を介する経路の構成因子、Ｒａｓを介する経路の構成因子、またはＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路の構成因子である。【００２１】
「構成因子の活性化を阻害する」とは、特に限定されず、構成因子のリン酸化・脱リン酸化の阻害、キナーゼ・ホスファターゼ活性の阻害、他の因子との結合阻害、および核内移行の阻害等、構成因子の正常な機能（生物学的機能）を阻害する全ての態様を含むものとする。「阻害」は、完全に阻害する場合の他、構成因子の活性化を一部阻害する場合、活性化を減少させる場合も含む。【００２２】
ｉ）ポジティブスクリーニング工程
本発明のスクリーニング方法のポジティブスクリーニング工程は、ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を用い、ＩＬ−６で刺激したときに当該細胞の死滅を抑制する化合物を選択する。【００２３】
本発明のポジティブスクリーニング工程の好ましい態様において、使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞は、マウスまたはヒト由来である。【００２４】
また、本発明のポジティブスクリーニング工程のさらに好ましい態様において、使用するＩＬ−６の刺激により死滅する細胞は、マウス由来のＭ１細胞に由来するクローンまたは、遺伝子工学的に作成された細胞である。【００２５】
「ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞」とは、細胞培養の過程において、培養培地中にＩＬ−６を添加することにより、完全に死滅する細胞を言う。当業者はこのような細胞を容易に理解・把握することができ、公知の培養細胞からの選抜、修飾等により、あるいは公知の細胞から遺伝子工学的に容易に作成することが可能である。限定される訳ではないが、好ましくは、マウスまたはヒト由来である。より好ましくは、マウス由来のＭ１細胞に由来するクローン（Ｍ１クローン）、または遺伝子工学的に作成された細胞である。ここで、Ｍ１クローンとは、既知のマウス白血病細胞Ｍ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９２等）からＩＬ−６の添加により死滅しやすいクローンを選択することによって獲得されるクローンをいう。このＭ１クローンは、培養培地中のＩＬ−６濃度が１０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７．５  ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５  ｎｇ／ｍｌの条件で死滅することを指標に選択することができる。【００２６】
また、「遺伝子工学的に作成された細胞」とは、ＳＴＡＴ３、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２またはＥｌｋ−１などのように、ＩＬ−６シグナル伝達系の下流に存在する転写因子により転写が制御されるプロモーター配列の下流に、自殺遺伝子を配置する構成のＤＮＡ構築体を有するように遺伝子工学的手法によりに作成された細胞をいう。自殺遺伝子は、ＨＳＶ−ｔｋのように細胞毒性のある物質を作り出す遺伝子、またはｐ５３のようなアポトーシスを誘導する遺伝子でもよい。このような、特定のプロモーター配列の下流に目的の遺伝子を組み込んだ構築体を作成し、一過的に発現させる方法、またはゲノム中に挿入し構成的に発現させる方法は、当該技術分野において周知である。【００２７】
また、「細胞の死滅を抑制する」とは、限定されるわけではないが、培養している細胞のうち、１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは９０％以上が生存することをいう。
細胞の生存率は、ＦＡＣＳを用いる方法（実施例に記載）、トリパンブルーを用いて染色する方法など、当該技術分野における通常の知識を用いることによって測定可能である。【００２８】
本ポジティブスクリーニング工程では、ＩＬ−６の刺激により死滅する細胞を培養する培地中に化合物を２０μＭ、好ましくは５μＭ、より好ましくは１．２５μＭ、さらに好ましくは０．３μＭの濃度で添加し、その後にＩＬ−６を５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、当該細胞が生存する化合物を選択することにより、化合物ライブラリーからＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。【００２９】
従来行われていたネガティブスクリーニング（ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する化合物を選択するスクリーニング）では、細胞増殖の抑制が化合物の作用によるものなのか細胞抑制によるものなのかが不明であるという問題点があった。しかしながら、本発明のポジティブスクリーニング工程により選択されてきた化合物は、細胞毒性を有さず、且つＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する機能を有する化合物であるといえる。これは、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物は、抗癌剤等として医薬組成物に用いられることが期待されるものであるから、これらの特性は望ましい。【００３０】
ｉｉ）生化学的スクリーニング工程
本発明の生化学的スクリーニング工程は、上記スクリーニング工程等により選択された化合物について、生化学的手段により、ＩＬ−６シグナル伝達系のいずれかの構成因子の活性化を阻害する化合物をさらに選択する。【００３１】
本発明の方法の生化学的スクリーニング工程の一態様において、生化学的手段は、ウエスタンブロット法、キナーゼアッセイ、転写活性測定アッセイ、表面プラズモン共鳴法、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブロット法、およびＲＴ−ＰＣＲ法からなる群より選択されるいずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いて行われる。【００３２】
ここで「生化学的手段」とは、生化学分野の研究で利用されうる免疫学的手段および物理学的手段を含む手段をいう。「免疫学的手段」とは、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、細胞染色法など、抗体を用いた手段をいう。例えば、ウエスタンブロット法では、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子のリン酸化状態、または核内におけるタンパク質量の増減などを決定することができる。「物理学的手段」とは、表面プラズモン共鳴等、タンパク質や化合物等の物理学的特性を利用することにより、それらの結合強度等、生化学的に重要なパラメーターを測定する手段をいう。【００３３】
表面プラズモン共鳴とは、タンパク質と化合物等の結合の動態を調べることができる手段である。具体的には、化合物の水溶液と固定したタンパク質等で被覆したバイオセンサー表面との境界から出る反射光を関知して結合相互作用を検出する。化合物の水溶液は、タンパク質等と相互作用するか否かでその濃度が変化し、そこでこの微少な減少率（共鳴シグナル）を測定することにより、化合物タンパク質間の相互作用の程度を測定することができる。具体的には、ＢＩＡ  ｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）による方法が一般的であり、これにより目的の化合物とタンパク質間の相互作用および解離定数（Ｋｄ）等を求めることができる。【００３４】
しかしながら「生化学的手段」は、これらの方法に限られず、既知の細胞内シグナル分子の活性を測定する方法、例えばキナーゼアッセイ、または転写活性測定アッセイ等が含まれる。【００３５】
キナーゼアッセイとは、特定のキナーゼの機能を調節する物質の影響を測定するために行われるアッセイである。即ち、キナーゼ活性を有するタンパク質の化合物による阻害の度合いを決定することができる。キナーゼアッセイは、適切な緩衝液中に目的の化合物、キナーゼ活性を有するタンパク質、キナーゼの基質およびＡＴＰを添加し、一定時間のキナーゼ反応後に残存したＡＴＰ量を同定することにより行うことができる。ＡＴＰの検出方法は、定量的であればいずれの方法によってもよく、例えばルシフェリンが酵素ルシフェラーゼの作用を受けてＡＴＰを利用して、酸化ルシフェリンに変化する際の発光量を測定することにより行うことができる。あるいは、キナーゼ活性に対する目的の化合物の影響の定量化は、蛍光色素、発光色素または放射性同位元素を用いて行ってもよく、例えば［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いることで、基質の結合したγ−32Ｐの量をシンチレーションカウンターを用いることにより測定することも可能である。【００３６】
転写活性測定アッセイとは、遺伝子の転写レベルの調節を解析するアッセイであり、あるいは標的遺伝子を活性化する転写因子やその上流の構成因子の活性化を測定するアッセイでもある。具体的には、ルシフェラーゼアッセイまたはＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）アッセイなどが知られている。これらの方法は、標的遺伝子の転写調節に至るシグナル伝達系の構成因子の活性化を測定するために、目的とする遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子またはＣＡＴ遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性を測定するものである。具体的なルシフェラーゼアッセイの手順は実施例に例示する。【００３７】
また、免疫沈降法、細胞染色法、ジーンチップによる遺伝子発現解析、ノーザンブロット法、およびＲＴ−ＰＣＲ法とは、当該技術分野で通常行われる実験手法であり、公知である。【００３８】
ｉｉｉ）ネガティブスクリーニング工程
本発明のスクリーニング方法は、ポジティブスクリーニング工程と生化学的スクリーニング工程の間に、ポジティブスクリーニング工程で選択された化合物から、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を用い、当該細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する化合物を選択する、ネガティブスクリーニング工程をさらに含んでもよい。【００３９】
本発明のネガティブスクリーニング工程の一態様において、ネガティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により増殖する細胞は、好ましくはヒト由来である。【００４０】
本発明のネガティブスクリーニング工程の好ましい態様において、ネガティブスクリーニング工程で使用するＩＬ−６の刺激により増殖する細胞は、ＩＬ−６依存性腫瘍性細胞株である。【００４１】
「ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞」とは、限定されるわけではないが、細胞培養の過程において、培養培地中に５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を添加することにより、増殖する細胞をいう。
好ましくはヒト由来であり、より好ましくはＩＬ−６依存性腫瘍性細胞株である。さらに好ましくは、ヒトレンネルトＴ細胞リンパ腫細胞株ＫＴ−３細胞（非特許文献１２）（入手先；西本憲弘先生、大阪大学大学院生命機能研究科・免疫制御学講座）またはヒト骨髄腫細胞株ＩＮＡ−６細胞（非特許文献１３）（入手先；Ｍａｒｔｉｎ  Ｇｒａｍａｔｚｋｉ，  Ｍ．Ｄ．、Ｄｉｒｅｃｔｏｒ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２ｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｉｅｌ  Ｓｃｈｉｔｔｅｎｈｅｌｍｓｔｒ．１２２４１０５  Ｋｉｅｌ  Ｇｅｒｍａｎｙ）である。【００４２】
本ネガティブスクリーニング工程では、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞を培養する培地中にＩＬ−６を１−２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２−１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。その後、化合物を０．１−５０μＭ、好ましくは１−２５μＭ、さらに好ましくは２−１０μＭの濃度で添加する。当該細胞が増殖することを阻害する化合物を選択することにより、ポジティブスクリーニングにより選択された化合物から、さらにＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。【００４３】
「細胞のＩＬ−６依存的増殖を抑制する」とは、対照実験における細胞増殖に比べて、増殖している細胞の割合が、少なくとも５０％以下、好ましくは２５％以下、さらに好ましくは１０％以下、より好ましくは１％以下である。細胞の増殖率は、ＦＡＣＳを用いる方法（実施例に記載）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みを測定する方法等により測定可能である。【００４４】
従来は本ネガティブスクリーニング工程を初めに行うことにより、化合物の細胞毒性により細胞増殖が阻害される化合物も選択されてきていた。しかしながら、本発明では、本ネガティブスクリーニング工程をポジティブスクリーニング工程の後に行うことにより、この可能性を排除している。【００４５】
また本発明のネガティブスクリーニング工程の好ましい態様において、ＩＬ−６の刺激により増殖する細胞はヒト由来である。これは、ポジティブスクリーニング工程が非ヒト細胞で行われた場合、ポジティブスクリーニング工程により選択された化合物が、ヒト細胞においてＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物であるかを決定するために重要である。【００４６】
ＩＩ．  ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物
本発明は、上記スクリーニング方法により同定されたＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を提供する。【００４７】
ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物は、以下の式（１）−（６）の構造式を有する、
式（１）：【００４８】
【化１】
2007060715.tif 000002
【００４９】
［式中、
Ｒ1は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、またはハロゲンであり；そして
Ｒ2は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基でありである］；
式（２）：【００５０】
【化２】
2007060715.tif 000003
【００５１】
［式中、
Ｒ1は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、またはハロゲンであり；そして
Ｒ2は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基でありである］；
式（３）：【００５２】
【化３】
2007060715.tif 000004
【００５３】
［式中、
Ｒ1は、水素または（Ｃ1−Ｃ10）アルキルである］；
式（４）：【００５４】
【化４】
2007060715.tif 000005
【００５５】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ4は、水素またはハロゲンである］；
式（５）：【００５６】
【化５】
2007060715.tif 000006
【００５７】
［式中、
Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ同一または異なる、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシ基または（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ基である］；
および、
式（６）：【００５８】
【化６】
2007060715.tif 000007
【００５９】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンであり；そして
Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、それぞれ同一または異なる、水素またはハロゲンである］。【００６０】
本明細書中で後述する実施例では、実際に以下の化合物が、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子、ＳＴＡＴ３の活性化を阻害する化合物（化合物Ｎｏ．１，２，７，１０，１３，１４および１６）として選択された。【００６１】
化合物Ｎｏ．１【００６２】
【化７】
2007060715.tif 000008
【００６３】
化合物Ｎｏ．２【００６４】
【化８】
2007060715.tif 000009
【００６５】
化合物Ｎｏ．７【００６６】
【化９】
2007060715.tif 000010
【００６７】
化合物Ｎｏ．１０【００６８】
【化１０】
2007060715.tif 000011
【００６９】
化合物Ｎｏ．１３【００７０】
【化１１】
2007060715.tif 000012
【００７１】
化合物Ｎｏ．１４【００７２】
【化１２】
2007060715.tif 000013
【００７３】
化合物Ｎｏ．１６【００７４】
【化１３】
2007060715.tif 000014
【００７５】
よって、式（１）の化合物において、好ましくは、Ｒ1はメチル基であり、そしてＲ2はメトキシ基である。また好ましくは、Ｒ1は塩素であり、そしてＲ2は水素である。【００７６】
式（２）の化合物において、好ましくは、Ｒ1は塩素であり、そしてＲ2はメトキシ基である。【００７７】
式（３）の化合物において、好ましくは、Ｒ1はｎ−オクチル基である。【００７８】
式（４）の化合物において、好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3はフッ素であり、そしてＲ4は塩素である。【００７９】
式（５）の化合物において、好ましくは、Ｒ1は塩素であり、そしてＲ2、Ｒ3、およびＲ4はメトキシ基である。【００８０】
式（６）の化合物において、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3はフッ素であり、そしてＲ4、Ｒ5、およびＲ6もフッ素である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ＩＬ−６シグナル伝達系を示す。
【図２】図２は、化合物Ｎｏ．１，２，４，７，１０，１３，１４および１６が、ＫＴ−３細胞のＩＬ−６依存的増殖を阻害することを示す。具体的には、ネガティブスクリーニング工程での各化合物によるＫＴ−３細胞の細胞増殖の阻害活性を、ＦＡＣＳにより測定した結果を示す。黒線の枠内に囲まれた領域にプロットされる細胞が増殖している細胞であり、横に全体における割合を％で示す。ＩＬ−６は５ｎｇ／ｍｌ、化合物Ｎｏ．４は２μＭであり、その他の化合物は１０μＭであった。
【図３】図３は、化合物Ｎｏ．１３および１６がＭ１細胞におけるＳＴＡＴ３のＩＬ−６に誘導されるチロシンリン酸化を阻害することを示す。具体的には、生化学的スクリーニング工程で、化合物Ｎｏ．１，２，７，１０，１３，１４または１６を１０μＭで処理し、その３０分後に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で処理し、処理後１時間によるＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を、Ｍ１細胞を用いたウエスタンブロットにより検討した結果を示す。化合物Ｎｏ．１３および１６で明らかなＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害が観察された。
【図４】図４は、化合物Ｎｏ．２、１３および１６がＳＴＡＴ３のＩＬ−６に誘導される転写活性を阻害することを示す。生化学的スクリーニング工程で、２０μＭの化合物Ｎｏ．２，１３，または１６での処理後１時間で、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で処理し、その処理後１６時間にアッセイにかけた。化合物による処理から１７時間後、ＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を、２９３Ｔ細胞を用いたウエスタンブロットにより検討した結果を示す。化合物Ｎｏ．１３および１６だけでなくＮｏ．２でも明らかなＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害が観察された。
【図５】図５は、生化学的スクリーニング工程で、化合物Ｎｏ．２，１３，または１６によるＳＴＡＴ３の転写活性の阻害を、２９３Ｔ細胞を用いたルシフェラーゼアッセイにより検討した結果を示す。実験系は図４と同様である。化合物Ｎｏ．２、１３および１６においてＳＴＡＴ３のＩＬ−６に誘導される転写活性の阻害が観察された。
【図６】図６は、化合物Ｎｏ．２がＳＴＡＴ３のＩＬ−６に誘導されるチロシンリン酸化を阻害するが、ＥＲＫ１／２のリン酸化は阻害しないことを示す。生化学的スクリーニング工程で、化合物Ｎｏ．２のＳＴＡＴ３リン酸化阻害効果をタイムコースを追って検討した。ＩＬ−６は１０ｎｇ／ｍｌであり、化合物Ｎｏ．２は５μＭであり、そしてＤはＤＭＳＯである。
【図７】図７は、化合物Ｎｏ．１３および１６がＳＴＡＴ３のＩＬ−６に誘導されるチロシンリン酸化を阻害することを示す。生化学的スクリーニング工程で、化合物Ｎｏ．１３および１６のＳＴＡＴ３リン酸化阻害効果をタイムコースを追って検討した。ＩＬ−６は１０ｎｇ／ｍｌであり、化合物は１０μＭである、ＤはＤＭＳＯである。
【図８】図８は、様々なタンパク質のチロシンリン酸化およびＥＲＫ１／２のリン酸化がＭ１細胞において化合物Ｎｏ．４処理の後に誘導されたことを示す。化合物Ｎｏ．４の２μＭで、１４時間処理した。
【図９】図９は、ＭＥＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫおよびＡｋｔのリン酸化がＭ１細胞において化合物Ｎｏ．４により誘導されなかったことを示す。化合物Ｎｏ．４の２μＭで、１４時間処理した。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。【００８３】
Ｉ．ポジティブスクリーニング（一次スクリーニング）
Ｍ１クローンの作成
マウス白血病細胞Ｍ１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地中にて限界希釈法により２００クローン単離した。続いてその中で増殖の速いものを２０クローン単離した。それらについて１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地にマウスＩＬ−６を５ｎｇ／ｍｌで添加し７２時間後にＦＡＣＳにて評価を行い、最も死滅しやすい細胞（生存率１％以下）を選択した。【００８４】
スクリーニング手順
マウス白血病細胞Ｍ１細胞を３８４ウェルプレートを用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地５０μｌ中に２０００個／ウェルでまき、Ｂｌａｎｋおよび１２７００種類の化合物を各々１ｍＭＤＭＳＯ溶液としたものを２μｌ（最終濃度２μＭ）添加し、マウスＩＬ−６を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加した。７２時間培養後に細胞数測定用ＷＳＴ−８キット溶液（ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＲＥＡＧＥＮＴＳ  ＳＥＲＩＥＳ−３）を５μｌ添加した。２時間培養後、ＯＤ４５０ｎｍにて吸光度を測定し生細胞数を算出した。このプライマリーハイスループットスクリーニングにより７４種類の化合物が陽性となった。それらについてＤＭＳＯを用いずに直接溶解し最終濃度を２０／５／１．２５／０．３μＭの４段階にて、プライマリースクリーニングと同様に、マウスＩＬ−６最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加後の生細胞数の評価をおこなった。また化合物を各々添加しマウスＩＬ−６を添加しないサンプルも同様に作製し、７２時間培養後に生細胞数を測定した。それにより各々の化合物について細胞毒性を評価した。そして７４種類の中で１８化合物が細胞毒性をもたない濃度においてＩＬ−６が誘導する細胞死を抑制することが判明し、一次スクリーニング陽性とした。【００８５】
ＩＩ．ネガティブスクリーニング（二次スクリーニング）
一次スクリーニングにより、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害することが予測された１８種類の化合物（Ｎｏ．１−１８）について、ネガティブスクリーニングを行った。【００８６】
スクリーニング手順
ネガティブスクリーニングには、ＩＬ−６の刺激により増殖する性質を有することが知られている、ヒト腫瘍性細胞株ＫＴ−３細胞を用いた。【００８７】
ＫＴ−３細胞を十分量まで増殖させ、ヒトＩＬ−６（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地中に、１×１０5細胞／ウェルで６ウェルプレートにまいた。３時間培養後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および１８種類の化合物（Ｎｏ．１−１８）を、それぞれ最終濃度１０μＭ（Ｎｏ．４のみは２μＭ）で添加し４８時間培養した。【００８８】
フローサイトメトリーによる解析
上記処理を行ったヒト腫瘍性細胞株ＫＴ−３細胞を、１×１０6細胞／１００μｌ程度となるように１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で懸濁した。次いで、この細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＦＳＣ、ＳＳＣドットプロットを得た。図２に結果の一例を示す。黒線で囲まれた領域内のものが増殖をしている細胞である。化合物も溶媒も加えない細胞（コントロール）および化合物の溶媒であるＤＭＳＯのみを加えた細胞では、それぞれ５７％および５５％の細胞増殖が見られた。一方、化合物Ｎｏ．１，２，４，７，１０，１３，１４および１６では、細胞増殖の抑制が観察された。【００８９】
結果
一次スクリーニングにより選択された１８種類の化合物（Ｎｏ．１−１８）のうち、本ネガティブスクリーニング工程により８種類の化合物（Ｎｏ．１，２，４，７，１０，１３，１４および１６）が選択された。【００９０】
ＩＩＩ．生化学的スクリーニング（三次スクリーニング）
ウエスタンブロッティング（Ｍ１細胞）
培養ディッシュの１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地中で培養している指数的に増殖しているＭ１細胞に、最終濃度１０μＭとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および化合物Ｎｏ．１，２，７，１０，１３，１４または１６を添加し、３０分間培養した。次いで、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにマウスＩＬ−６を添加するものと添加しないものに等分し、さらに１時間培養した。その後、Ｍ１細胞を溶解バッファー（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００μＭ  Ｎａ3ＶＯ4、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．４ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、３μｇ／ｍＬ  アプロチニン、２μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍＬ  ロイペプチン）により１×１０7細胞／ｍｌの濃度で溶解し、氷上に３０分間置いた。細胞溶解物を１２０００ｇで１５分間遠心分離することにより沈殿物を取り除いた。【００９１】
こうして得られた試料を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により電気泳動した。次いで、メタノール等に１０〜２０秒浸した後にトランスファーバッファー（２５ｍＭ  ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、１０％  メタノール、０．１％  ＳＤＳ）に浸したＰＶＤＦメンブレンの転写膜上に、上記泳動後のゲルを乗せ、トランスファーバッファーを浸み込ませた濾紙５枚ずつにより挟み込み、セミドライ型転写法によりタンパク質を転写膜に転写した。【００９２】
転写後、転写膜をブロッキングバッファー（５％  ＢＳＡ、１％  ＢＳＡ、０．１％  ＮａＮ3）に浸し、３０分以上振盪した。次いで、ＰＢＳＴ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に置換して振盪しながら洗浄を、５分ずつ３回行った。一次抗体として抗ＳＴＡＴ３ポリクローナル抗体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カルフォルニア州サンタクルズ）および抗リン酸化ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体（Ｂ−７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をいずれも１：１０００の希釈倍率によりＰＢＳＴで希釈し、メンブレンを浸して６０分間振盪した。【００９３】
その後、ＰＢＳＴに置換して振盪しながら洗浄を、５分ずつ３回行った。二次抗体としてＨＲＰＯ標識抗ウサギもしくはマウスＩｇＧ抗体を１：５０００の希釈倍率により希釈し、メンブレンを浸して３０分間振盪した。その後、ＰＢＳＴに置換して振盪しながら洗浄を、５分ずつ３回行った。【００９４】
次いで、公知の発色方法により発色工程を行い、バンドを検出した。これによる結果を図３に示す。ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を検討したところ、化合物Ｎｏ．１３および１６において明らかなＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化の阻害が観察された。【００９５】
ウエスタンブロッティング（２９３Ｔ細胞）
培養ディッシュの１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養している指数的に増殖している２９３Ｔ細胞に、最終濃度２０μＭとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および化合物Ｎｏ．１，２，４，７，１０，１３，１４または１６を添加し、１時間培養した。次いで、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるようにマウスＩＬ−６を添加するものと添加しないものに等分し、さらに１６時間培養した。その後、２９３Ｔ細胞を溶解バッファーにより１×１０7細胞／ｍｌの濃度で溶解し、氷上に３０分間置いた。細胞溶解物を１２０００ｇで１５分間遠心分離することにより沈殿物を取り除いた。【００９６】
以下のウエスタンブロット工程は、上述の方法により行った。これによる結果を図４に示す。ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を検討したところ、化合物Ｎｏ．２、１３および１６において明らかなＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化の阻害作用が観察された。【００９７】
ルシフェラーゼアッセイ
１２ウェルプレート中の１×１０6細胞／ウェルの濃度の２９３Ｔ細胞に、ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）遺伝子のプロモーター配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターベクター（２μｇ）とＥＦ１遺伝子のプロモーターをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に連結したインターナルコントロールベクター（０．１μｇ）を、製造業者の取扱説明書にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ベセズダ）によりトランスフェクションした。トランスフェクションから２３時間後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および化合物Ｎｏ．１，２，４，７，１０，１３，１４および１６を最終濃度２０μＭで添加した。化合物添加から１時間後、それぞれの化合物を加えたものにつき、刺激を与えない細胞と与える細胞に等分し、刺激を与える細胞には最終濃度１０ｎｇ／ｍｌでヒトＩＬ−６を添加した。１６時間後、それぞれの細胞から細胞抽出液を作成し、Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ホタルルシフェラーゼのウミシイタケルシフェラーゼに対する比活性を測定した。【００９８】
結果を図５に示す。化合物Ｎｏ．２、１３および１６においては、明らかなＳＴＡＴ３による転写活性の阻害作用が観察された。【００９９】
化合物Ｎｏ．２の解析
培養ディッシュの１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ培地中で培養している指数的に増殖しているＭ１細胞に、ＤＭＳＯのみおよび最終濃度が５μＭの化合物Ｎｏ．２をおのおの添加した。その直後に、マウスＩＬ−６を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、それぞれ０、３０分、１、３、６、および２４時間後に細胞抽出液を１×１０7細胞／ｍｌの濃度で作成した。【０１００】
それぞれの試料について、上述のウエスタンブロット法に従い、ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を検討した。結果を図６に示す。化合物Ｎｏ．２で処理した細胞では化合物の添加後３、６、２４時間で明らかなＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化の阻害が観察された。一方、化合物Ｎｏ．２は、ＩＬ−６刺激が誘導するＳＴＡＴ３を介する経路とは別経路であるＥＲＫ１／２のリン酸化には影響を与えないことが明らかとなった。この結果から考慮すると、化合物Ｎｏ．２はＳＴＡＴ３を介する経路を特異的に阻害していると思われる。【０１０１】
化合物Ｎｏ．１３、１６の解析
化合物Ｎｏ．２の場合と同様の方法で、化合物Ｎｏ．１３、１６（最終濃度は１０μＭ）についても同様の実験を行った。結果を図７に示す。化合物Ｎｏ．１３、１６で処理した細胞では化合物の添加後３時間以降でＳＴＡＴ３にチロシンリン酸化が阻害されることが明らかとなった。【０１０２】
化合物Ｎｏ．４の解析
化合物Ｎｏ．４はステロイド系の骨格を有していた。このような化合物を有する化合物は、細胞の分化や死滅を非特異的に抑える活性を有することが知られている。【０１０３】
化合物Ｎｏ．４の効果について、いくつかのタンパク質についてチロシンリン酸化を検討した。具体的には、Ｍ１細胞を用いて最終濃度２μＭの化合物Ｎｏ．４を添加し、１４時間培養した。その後、上述のウエスタンブロットと同様の方法でタンパク質のチロシンリン酸化を検討した。【０１０４】
結果を図８に示す。ＳＴＡＴ３については、化合物Ｎｏ．４の存在によりチロシンリン酸化ＳＴＡＴ３のタンパク質量は変化しなかったが、ＥＲＫ１／２については、化合物Ｎｏ．４の存在によりチロシンリン酸化ＥＲＫ１／２のタンパク質量が顕著に増加していた。また、リン酸化チロシンに特異的に結合するモノクローナル抗体４Ｇ１０を使用したところ、化合物Ｎｏ．４がタンパク質のチロシンリン酸化を非特異的に顕著に亢進することが明らかとなった。【０１０５】
また、同様の実験系で異なるタンパク質についてチロシンリン酸化を検討した。結果を図９に示す。化合物Ｎｏ．４は、ＭＥＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、Ａｋｔについては、チロシンのリン酸化を亢進しなかった。しかし、上記実験と同様に、ＥＲＫについてはチロシンリン酸化が亢進していた。【０１０６】
ＥＲＫは、細胞増殖および細胞生存に関与することが知られているキナーゼである。したがって、ポジティブスクリーニングにおいて、化合物Ｎｏ．４は、非特異的にＥＲＫを活性化することによってＭ１クローンの細胞死を抑えたのであって、本発明の目的とするＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を特異的に阻害する化合物ではなく、本スクリーニング法における稀なバックグラウンドの一例と考えられる。【０１０７】
本スクリーニングによる結果物
本スクリーニング方法のポジティブおよびネガティブスクリーニング工程により、化合物Ｎｏ．１，２，７，１０，１３，１４および１６の７種類が選択された。本実施例の生化学的スクリーニング工程は、ＩＬ−６シグナル伝達系の中でも主にＳＴＡＴ３について解析を行い、少なくとも化合物Ｎｏ．２，１３および１６がＳＴＡＴ３のリン酸化に影響を及ぼすことが明らかとなった。これら以外の化合物に関しても、ポジティブおよびネガティブスクリーニング工程より選択されてきているため、ＳＴＡＴ３を介する経路、Ｒａｓを介する経路、並びにＰＩ３ＫおよびＡｋｔを介する経路を含む、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害していると考えられる。【０１０８】
考察
本願発明により、ＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法が提供され、実際にＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物が得られた。本願発明の方法を用いて、他の化合物ライブラリーをスクリーニングすることで、さらなるＩＬ−６シグナル伝達系の構成因子の活性化を阻害する化合物を同定することが可能である。また、こうして同定された化合物が、癌をはじめとするＩＬ−６シグナル伝達系が関係する疾患の治療薬をなることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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