(57)【要約】【課題】フコキサンチンを含むガン抑制剤の活性能力を高め、即効性を持たせることの出来るガン抑制剤及びガン抑制剤含有品及びガン抑制剤の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】ガン抑制剤は、シス体フコキサンチンを有効成分として含有することを特徴とする。前記シス体フコキサンチンを食品、サプリメント、ペット用食餌、サニタリー製品、化粧品又は薬品に添加してもよい。また、前記シス体フコキサンチンは、天然物から抽出し精製されたもの、有機合成によって得られたもの、微生物を介して合成されたものの群から選ばれた少なくとも一種の組み合わせによって得られたものであってもよい。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シス体フコキサンチンを有効成分として成ることを特徴とするガン抑制剤。
【請求項２】
前記シス体フコキサンチンは、天然物から抽出し精製されたシス体フコキサンチン及び有機合成によって得られたシス体フコキサンチン及び微生物を介して合成されたシス体フコキサンチンの群から選ばれた少なくとも一種のシス体フコキサンチンである請求項１に記載のガン抑制剤。
【請求項３】
前記シス体フコキサンチンは、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ７種類のモノシス体（mono-cis conformation）及び２箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ２１種類のダイシス体（di-cis conformation）及び３箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ３５種類のトリシス体（tri-cis conformation）及び４箇所以上の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ６４種類のマルチシス体（multi-cis conformation）の群から選ばれた少なくとも一種のシス体フコキサンチンである請求項１に記載のガン抑制剤。
【請求項４】
前記７種類のモノシス体は、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ９シス体及び１１シス体及び１３シス体及び１５シス体及び９’シス体及び１１’シス体及び１３’シス体である請求項３に記載のガン抑制剤。
【請求項５】
シス体フコキサンチンを可食品または可接触品に添加してなることを特徴とするガン抑制剤含有品。
【請求項６】
前記可食品が食品またはサプリメントまたはペット用食餌である請求項５に記載のガン抑制剤含有品。
【請求項７】
前記可接触品がサニタリー製品又は化粧品又は薬品である請求項５に記載のガン抑制剤含有品。
【請求項８】
前記シス体フコキサンチンは、天然物から抽出し精製されたシス体フコキサンチン及び有機合成によって得られたシス体フコキサンチン及び微生物を介して合成されたシス体フコキサンチンの群から選ばれた少なくとも一種のシス体フコキサンチンである請求項５に記載のガン抑制剤含有品。
【請求項９】
前記シス体フコキサンチンは、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ７種類のモノシス体（mono-cis conformation）及び２箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ２１種類のダイシス体（di-cis conformation）及び３箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ３５種類のトリシス体（tri-cis conformation）及び４箇所以上の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ６４種類のマルチシス体（multi-cis conformation）の群から選ばれた少なくとも一種のシス体フコキサンチンである請求項５に記載のガン抑制剤含有品。
【請求項１０】
前記７種類のモノシス体は、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ９シス体及び１１シス体及び１３シス体及び１５シス体及び９’シス体及び１１’シス体及び１３’シス体である請求項９に記載のガン抑制剤含有品。
【請求項１１】
全トランスフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製し、シス体フコキサンチンを有効成分とすることを特徴とするガン抑制剤の製造方法。
【請求項１２】
全トランス体又は全トランス体とシス体の混合物のフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製し、シス体フコキサンチンを有効成分とすることを特徴とするガン抑制剤の製造方法。
【請求項１３】
植物及び光合成細菌及び海藻及び海洋動物及び動物から抽出したフコキサンチンの群から選ばれた少なくとも一種のフコキサンチンを用いる請求項１１又は請求項１２に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１４】
有機化学合成によって得たフコキサンチン及び／又は微生物によって合成したフコキサンチンを用いる請求項１１又は請求項１２に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１５】
ワカメから抽出した全トランスフコキサンチンを用いる請求項１１又は請求項１２に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１６】
フコキサンチンを有機溶媒に溶解し、光照射及び／又は過熱操作でシス−トランス異性化を生じさせる請求項１１又は請求項１２に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１７】
溶液中及び／又はフコキサンチンの溶液を入れている容器を含む系を低酸素状態に保つ請求項１６に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１８】
光照射によって得られたシス体と全トランス体フコキサンチンの混合物からシス体フコキサンチンがリッチな分画を取得し、さらにこのシス体フコキサンチンリッチ分画からシス体フコキサンチンを単離・精製する請求項１６に記載したガン抑制剤の製造方法。
【請求項１９】
請求項１１〜請求項１６のいずれか一に記載したガン抑制剤の製造方法によって得られるガン抑制剤であって、ヒト白血病ガン又はヒト前立腺ガン又はヒト結腸ガンを含むヒトガン細胞への増殖抑制に用いられることを特徴とするガン抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シス体フコキサンチンを有効成分としたガン抑制剤及びガン抑制剤含有品及びガン抑制剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
褐藻や珪藻又はこれらを食糧とする海洋生物が保有するフコキサンチン（カロテノイドの一種）には、ガン細胞の増殖抑制作用をもつことが数多く報告されている。【０００３】
例えば、参照することによってその開示内容が、本願明細書に組み込まれている非特許文献1では、フコキサンチンをＧＯＴＯ細胞（ヒト神経芽細胞腫）に作用させたとき、添加したフコキサンチン量に依存してＧＯＴＯ細胞の増殖が抑制されること、つまりフコキサンチンの量が多いほどＧＯＴＯ細胞の増殖をより抑制することが報告されている。使用したフコキサンチンは海藻（学名：Hijikia fusiforme）から抽出・単離・精製したものを使用し、その純度は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用した分析において９２％であったと記載されている。【０００４】
具体的なガン細胞増殖抑制の結果は、培地（１０％の血清を含むDulbeco変法Eagle培地）に添加した１０μg/mLのフコキサンチン（筆者らは、その他２、５、２０μg/mLの濃度においても調査を行っているが、ガン細胞増殖抑制の具体的数値の記載が無く、グラフ化されているのみである為、これらのデータに関するここでの議論は省略する）によって、これを添加後５日目において、ＧＯＴＯ細胞の成長速度が対照群と比較して３８%に抑制されたことが報告されている。【０００５】
また、参照することによってその開示内容が、本願明細書に組み込まれている特許文献1には、「褐藻類から抽出されたフコキサンチンを有効成分とする抗腫瘍剤」が開示されている。より詳しくは、ワカメから抽出されたフコキサンチンを有効成分とする抗腫瘍剤であって、実施例として、肝臓癌を好発するマウスＣ３Ｈ／Ｈｅの八週齢の雄を用い、４４週間に渡ってフコキサンチン０．００１％添加飲料水を与えた群と、フコキサンチン無添加飲料水のコントロール群とを、共に各群１５匹で抗腫瘍活性試験について示している。【０００６】
その実験結果は、コントロール群では全個体が癌を発症したのに対し、フコキサンチン投与群では８６．７％に抑えられ、また発癌症個体一個当りのガン数も一個体あたり５．９３個に対し３．０７個と半分であり、抗腫瘍活性が見られている。それ故、「癌の予防及び治療など、癌に対する総合的な対策を可能にするものである」と結論している。【０００７】
その他にも、フコキサンチンのガン細胞増殖抑制作用については、数多くの文献（参照することによってその開示内容が、本願明細書に組み込まれている非特許文献２〜１５）がある。【０００８】
これらの文献では、フコキサンチンの様々な種類のヒトガン細胞やマウスへのガン抑制作用或いはガン細胞のアポトーシス誘導が報告されている。しかし、未だ嘗て、シス体フコキサンチンのガン抑制作用に関する報告は為されていない。褐藻類（例えばワカメ）に含まれる天然のフコキサンチン、抽出後のフコキサンチンの殆ど（約１００％）は全トランス体であり、これまで報告されてきたフコキサンチンのガン抑制作用は全トランス体フコキサンチンのガン抑制作用と見なせる。【０００９】
また、有機合成によって得られるフコキサンチンにおいても、そのフコキサンチンはシス体を選択的に合成するような合成スキームで無い限り、得られる異性体は基本的に全トランス体であるため、有機合成品を用いていたとしても、これまで報告されてきたフコキサンチンのガン抑制作用は全トランス体フコキサンチンのガン抑制作用と見なせる。【００１０】
以上要するに、シス体フコキサンチンのガン抑制作用に関しては非特許文献、特許文献どちらにおいても、これまで全く報告例が無いという現状である。【００１１】
全トランス体フコキサンチンと一部のシス体フコキサンチン（１３シス、１３’シス、９’シス、１３，９’ダイシス、１３，１３’ダイシス、９’，１３’ダイシス）の化学構造式についてはＮＭＲ分光法により確認されている（参照することによってその開示内容が、本願明細書に組み込まれている非特許文献１６）。これらの実験でその存在が明らかにされているシス体も含めて、数学的に可能なシス体構造の数が１２７種類（７Ｃ１+７Ｃ２+７Ｃ３+７Ｃ４+７Ｃ５+７Ｃ６+７Ｃ７）となる。図１２に全トランス体フコキサンチンの化学構造式を示す。図１３〜図１９はシス体フコキサンチンの化学構造式を示したものであるが、図１３は１５シス体、図１４は１３シス体、図１５は１１シス体、図１６は９シス体、図１７は１３’シス体、図１８は１１’シス体、図１９は９’シス体の化学構造式を示す。【００１２】
【非特許文献１】J. Okuzumi et al., Cancer Letters, 55 (1990) 75-81.
【非特許文献２】H. Nishino et al., Anti-Cancer Drugs, 3 (1992) 493-497.
【非特許文献３】J. Okuzumi et al., Cancer Letters, 68 (1993) 159-168.
【非特許文献４】H. Nishino, Environ. Mut. Res. Commun., 17 (1995) 123-126.
【非特許文献５】H. Nishino, Journal of Cellular Biochemistry, Supplement, 22 (1995) 231-235.
【非特許文献６】Y. Satomi et al., J. Kyoto Pref. Univ. Med., 105 (1996) 739-743.
【非特許文献７】H. Nishino, Environ. Mutagen Res., 19 (1997) 151-156.
【非特許文献８】H. Nishino, フリーラジカルの臨床, 13 (1998) 3-7.
【非特許文献９】J. M. Kim et al., Carcinogenesis, 19 (1998) 81-85.
【非特許文献１０】M. Hosokawa et al., Food Sci. Technol. Res., 5 (1999) 243-246.
【非特許文献１１】E. Kotake-Nara et al., Journal of Nutrition, 131 (2001) 3303-3306.
【非特許文献１２】M. Hosokawa et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1675 (2004) 113-119.
【非特許文献１３】A. Asai et al., Drug Metabolism and Disposition, 32 (2004) 205-211.
【非特許文献１４】M. Hosokawa, Bio Industry, 21 (2004) 52-57.
【非特許文献１５】E. Kotake-Nara et al., Cancer Letters, 220 (2005) 75-84.
【非特許文献１６】J. A. Haugan et al., Acta Chemica Scandinavica 46 (1992) 389.
【特許文献１】特開平１０−１５８１５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は以上の従来技術の問題点に鑑み、ガン抑制作用が高く、即効性を有するフキコサンチンを含む(fucoxanthin-containing)ガン抑制剤及びガン抑制剤含有品及びガン抑制剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題について鋭意検討を行った結果、特定のシス体構造を持つフコキサンチンは極めて高いガン抑制作用を有し、更に全トランス体フコキサンチンと比較して即効性が高いことを見出した。なお、このフコキサンチンはワカメなどの海藻に含まれている成分であり、日本人が古来より食しているものであることから、安全に利用できる。【００１５】
即ち、本発明のガン抑制剤は、シス体フコキサンチンを有効成分として成ることを特徴とする。【００１６】
また本発明のガン抑制剤含有品はシス体フコキサンチンを可食品または可接触品に添加してなることを特徴とする。【００１７】
前記可食品とは人間及び動物が摂食できる可能性を有する材料若しくは商品一般であり、例えば食品またはサプリメントまたはペット用食餌である。【００１８】
前記可接触品とは人間及び動物が接触する可能性のある材料若しくは商品一般であり、例えばサニタリー製品又は化粧品又は薬品である。【００１９】
前記シス体フコキサンチンは、天然物から抽出し精製されたシス体フコキサンチン及び有機合成によって得られたシス体フコキサンチン及び微生物を介して合成されたシス体フコキサンチンの群から選ばれた少なくとも一種の組み合わせによって得られたシス体フコキサンチンとすることができる。【００２０】
また前記シス体フコキサンチンは、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ７種類のモノシス体（mono-cis conformation）及び２箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ２１種類のダイシス体（di-cis conformation）及び３箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ３５種類のトリシス体（tri-cis conformation）及び４箇所以上の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ６４種類のマルチシス体（multi-cis conformation）の群から選ばれた少なくとも一種のシス体フコキサンチンとすることができる。【００２１】
前記７種類のモノシス体は、1箇所の炭素=炭素二重結合周りでシス体構造を持つ９シス体及び１１シス体及び１３シス体及び１５シス体及び９’シス体及び１１’シス体及び１３’シス体である。【００２２】
また本発明のガン抑制剤の製造方法は、全トランスフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製し、シス体フコキサンチンを有効成分とすることを特徴とする。【００２３】
さらにまたまた本発明のガン抑制剤の製造方法は、全トランス体又は全トランス体とシス体の混合物のフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製し、シス体フコキサンチンを有効成分とすることを特徴とする。【００２４】
植物及び光合成細菌及び海藻及び海洋動物及び動物から抽出したフコキサンチンの群から選ばれた少なくとも一種のフコキサンチンを用いる様にすることができる。【００２５】
有機化学合成によって得たフコキサンチン及び／又は微生物によって合成したフコキサンチンを用いる様にしてもよい。【００２６】
ワカメから抽出した全トランスフコキサンチンを用いてもよい。【００２７】
フコキサンチンを有機溶媒に溶解し、光照射及び／又は過熱操作でシス−トランス異性化を生じさせることができる。【００２８】
溶液中及び／又はフコキサンチンの溶液を入れている容器を含む系を低酸素状態に保つのが望ましい。【００２９】
光照射によって得られたシス体と全トランス体フコキサンチンの混合物からシス体フコキサンチンがリッチな分画を取得し、さらにこのシス体フコキサンチンリッチ分画からシス体フコキサンチンを単離・精製する様にしてもよい。【００３０】
加えて本発明のガン抑制剤は本発明のガン抑制剤の製造方法によって得られるガン抑制剤であって、ヒト白血病ガン又はヒト前立腺ガン又はヒト結腸ガンを含むヒトガン細胞への増殖抑制に用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のガン抑制剤及びガン抑制剤含有品及びガン抑制剤の製造方法によれば、特定のシス体フコキサンチンを用いることによって従来から用いられてきた全トランス体リッチなフコキサンチンよりも強いガン細胞増殖抑制効果を得ることが可能となる。また、即効性においても従来の全トランス体リッチなフコキサンチンよりも優れた効果を得ることが可能である。更に、食品、サプリメント、ペット用食餌、サニタリー製品、化粧品及び医薬品にシス体フコキサンチンを有効成分として含有させることによりガン抑制作用及びガン予防効果を高めることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について具体的に説明するが、本発明がこの実施するための最良の形態のみに限定されるものではない。強調したい点は、全トランス体フコキサンチンとシス体フコキサンチンのガン抑制作用に関する比較を行うことにより、ある特定のシス体構造を有するフコキサンチンが全トランス体フコキサンチンよりも高いガン抑制作用及び即効性を有するということである。【００３３】
（シス体フコキサンチンの調製）
図１は、全トランスフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製するフローチャートについて示したものである。全トランスフコキサンチンはワカメから抽出することができる。このシス体フコキサンチンの原料となる全トランス体又は全トランス体とシス体の混合物のフコキサンチンは、植物、光合成細菌、海藻、海洋動物、動物などから抽出したもの、有機化学合成によって得たもの、大腸菌等の微生物によって合成したもの、或いはこれらを組み合わせた手法によって得られたものなど、何れの手段によって得られたフコキサンチンであっても構わない。【００３４】
このフコキサンチンをフコキサンチンを溶解可能な有機溶媒、例えばメタノールに溶解し、光照射又は過熱又はその両方の操作でシス−トランス異性化を生じさせる。
フコキサンチンを溶解するための有機溶媒はメタノールに限られず、フコキサンチンを溶解可能な溶媒であれば何れの有機溶媒でも構わない。【００３５】
ここで注意しなければいけないことは、溶液中又はフコキサンチンの溶液を入れている容器中の気相中の酸素を出来る限り少なくしておくことである。フコキサンチンを含むカロテノイドは強力な抗酸化剤としても有名であり、これは裏を返せば、カロテノイド自身が酸化しやすいということである。従って、出来る限り酸化によるフコキサンチンの分解を防ぐために、低酸素状態に系を保つことが重要である。但し、光照射や加熱時間が短い場合にはこの限りではない。【００３６】
光照射によって得られたシス体と全トランス体フコキサンチンの混合物を濃縮し、溶剤を取り除き乾固物を得る。この乾固物をさらに溶解するために溶解に必要な最小量の溶剤、例えば７０％メタノール／アセトニトリル（70容量％がメタノール、30容量％がアセトニトリル）を加えた後、中低圧のカラムクロマトグラフィに供し、シス体フコキサンチンがリッチな分画を得ることができる。図２は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分取前のそのシス体リッチフコキサンチン分画のＨＰＬＣ分析結果について示し、フコキサンチンを特定する波長４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。【００３７】
このシス体フコキサンチンリッチ分画を例えば高速液体クロマトグラフィに供して、シス体を単離・精製する。図３は、ＨＰＬＣ分取後の精製全トランスフコキサンチンのＨＰＬＣ分析結果について示し、フコキサンチンを特定する波長４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。
同様に、図４は、ＨＰＬＣ分取後のシス体２フコキサンチンのＨＰＬＣ分析結果について示し、フコキサンチンを特定する波長４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。【００３８】
図３の全トランスフコキサンチンは、図１２に示す化学構造式を有する。図４のシス体２フコキサンチンは、図１３乃至図１９のいずれか一に示す化学構造式を有するもの、又はこれらを組み合わせたダイシス体、トリシス体或いはマルチシス体の何れかである。これらの試料を更にＨＰＬＣで精製することにより、純度１００％に限りなく近づけることが可能である。【００３９】
本発明者らによればシス体２フコキサンチンは増殖抑制能力が全トランス体フコキサンチンやシス体１フコキサンチンと比較して非常に高いという注目すべき研究結果が得られ、これは、特定のシス体構造にガン抑制作用を向上させる能力があることが見いだされた。【００４０】
また、シス体２フコキサンチンが全トランス体フコキサンチンよりも早く生残細胞数を減少させるという研究結果から、全トランス体フコキサンチンと比べて即効性が高いという知見も得られた。【００４１】
またこのシス体フコキサンチンの強いガン抑制作用は、特定のガン細胞だけに作用するのではなく、様々なガン細胞の増殖を抑制する可能性があり、シス体２フコキサンチンは、全トランス体フコキサンチンよりも、即効性が高く且つガン抑制作用の向上が見られ、更に様々なガン細胞増殖抑制も可能である。【００４２】
[実施例]
以下、本発明の実施例につき説明する。以下の実施例では乾燥ワカメから抽出したフコキサンチンのシス体フコキサンチンの４種類のヒトガン細胞（ＨＬ−６０：ヒト白血病ガン、ＬＮ−ＣａＰ：ヒト前立腺ガン、ＰＣ−３：ヒト前立腺ガン、Ｃａｃｏ−２：ヒト結腸ガン）への増殖抑制作用について具体的に説明する。【００４３】
（シス体フコキサンチンの調製）
図１の全トランスフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製するフローチャートに従い、ワカメから抽出した全トランスフコキサンチンをメタノールに溶解し、２時間の太陽光照射によって得られたシス体と全トランス体フコキサンチンの混合物を、エバポレータを用いて濃縮し、最終的に完全にメタノールを取り除き乾固物を得た。この乾固物の溶解に必要な最小量の７０％メタノール／アセトニトリルを加えた後、中低圧のカラムクロマトグラフィに供し、シス体フコキサンチンがリッチな分画を得た。
図２に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分取前のそのシス体リッチフコキサンチン分画のＨＰＬＣ分析結果について示す。図２には４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。【００４４】
このシス体フコキサンチンリッチ分画を高速液体クロマトグラフィに供して、シス体を単離・精製した。図３は、ＨＰＬＣ分取後の精製全トランスフコキサンチンのＨＰＬＣ分析結果について示し、４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。同様に、図４は、ＨＰＬＣ分取後のシス体２フコキサンチンのＨＰＬＣ分析結果について示し、４５０ｎｍの吸光度における溶出曲線の生データについて示している。【００４５】
図３及び図４に示されるＨＰＬＣのチャートの面積比から全トランス体フコキサンチンは９３％、シス体２フコキサンチンは８９％の純度で得られたことが解った。これらの試料を更にＨＰＬＣで精製することにより、純度１００％に限りなく近づけることが可能である。【００４６】
（ガン細胞増殖抑制試験Ａ：ＨＬ−６０細胞への増殖抑制試験）
図５は、シス体フコキサンチン添加によるＨＬ−６０細胞への増殖抑制試験のフローチャートを示す。ＲＰＭＩ培地中で５．０×１０４ cells/mLに濃度を調製したＨＬ−６０細胞を１８穴プレートに２mLづつに分けた。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次に、それぞれ２μLのコントロール（エタノール）、全トランス体フコキサンチン（１０mMエタノール溶液：終濃度１０μM）、シス体１フコキサンチン（１０mMエタノール溶液：終濃度１０μM）、シス体２フコキサンチン（１０mMエタノール溶液：終濃度１０μM）を前培養したＨＬ−６０細胞に添加した。ここで、試料の添加量が培地量の０．１％以下になるように調製した。試料を添加してから２４時間、４８時間後にそれぞれ試料を添加したＨＬ−６０細胞の入った培地から１００μＬを取り出し、トリプトファンブルー色素排除法によって生残細胞数を調べた。【００４７】
図６は、エタノール（コントロール）溶液、全トランス体フコキサンチンのエタノール溶液、シス体１フコキサンチンのエタノール溶液、及びシス体２フコキサンチンのエタノール溶液をＲＰＭＩ培地に添加した時の、ＨＬ−６０細胞の生残細胞数を経時的にプロットしたものである。【００４８】
コントロールと比較して、２４時間後の全トランス体フコキサンチン及びシス体１フコキサンチンを添加したＨＬ−６０細胞において、増殖抑制が見られた。ここで注目すべき結果は、シス体２フコキサンチンを添加したＨＬ−６０細胞において増殖抑制能力が全トランス体フコキサンチンやシス体１フコキサンチンと比較して非常に高くなったことである。【００４９】
試料を添加してから４８時間後に於いても、シス体２フコキサンチンを添加したＨＬ−６０細胞は全トランス体フコキサンチンやシス体1フコキサンチンと比較して低い生残細胞数値を示した。即ち、特定のシス体構造にガン抑制作用を向上させる能力があることが示された。【００５０】
更に、３７℃で培養する際にＲＰＭＩ培地中のシス体２フコキサンチンと全トランス体フコキサンチンがどの程度安定に存在しているかをＨＰＬＣで調べた。図７は、そのＲＰＭＩ培地中の全トランス体フコキサンチン及びシス体２フコキサンチンの異性化経時変化について示したものである。横軸は経過時間であり、縦軸はそれぞれの純度（％）について示す。【００５１】
図７に示したように、２４時間経過後においても、シス体２フコキサンチンと全トランス体フコキサンチンは、どちらも５０％以上存在していることが分かった。通常、シス体フコキサンチンは熱や光照射によって速やかに全トランス体となるが、本実施例の条件下ではガン抑制能力を発揮できる時間においても依然その存在が確認されている。従って、ガン抑制作用を全トランス体フコキサンチンよりも向上させた物質とはシス体２フコキサンチンであると言える。このことから、シス体２フコキサンチンが全トランス体フコキサンチンと比較して、よりガン抑制作用があることを確認できた。また、シス体２フコキサンチンが全トランス体フコキサンチンよりも早く生残細胞数を減少させることから、全トランス体フコキサンチンと比べて即効性が高いと見なすことができる。【００５２】
（ガン細胞増殖抑制試験Ｂ：ＬＮ−ＣａＰ、ＰＣ−３、Ｃａｃｏ−２細胞への増殖抑制試験）
図８は、シス体フコキサンチン添加によるＬＮ−ＣａＰ、ＰＣ−３、Ｃａｃｏ−２細胞への増殖抑制試験のフローチャートである。ＬＮ−ＣａＰ、ＰＣ−３細胞はＲＰＭＩ培地中で、Ｃａｃｏ−２細胞はＭＥＭ培地中で、２×１０４cells/ｍＬに濃度を調製したそれぞれの細胞を各ウェルに１００μＬづつ９６穴マイクロプレート中に分注した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。フコキサンチン添加用の高濃度フコキサンチンエタノール溶液（全トランス体、シス体２、コントロール=エタノール）を以下のようにして調製し、添加した。【００５３】
まず、終濃度１０μＭの１０００倍濃度（１０ｍＭ）のフコキサンチンエタノール溶液を調製する。次にこれを９１倍量のそれぞれで使用した培地で希釈し、得られた溶液の１０μＬを前培養した細胞に添加した。培地中のエタノールの濃度は０．１％以下になっている。９６穴マイクロプレートに取り分けた試料をプレートシェイカーで撹拌し、その後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で所定の時間培養した。測定の３時間前にＷＳＴ−１試薬を各ウェルに１０μＬずつ添加し、プレートシェイカーで均一に分散させた。【００５４】
さらに３時間培養後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度（対照波長：６５０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度の値を用いて、細胞生残率＝（（フコキサンチン添加した細胞溶液の吸光度）−（培地とフコキサンチンエタノール溶液の吸光度））/（（エタノールを添加した細胞溶液）−（培地+エタノール溶液の吸光度））の式から細胞生残率を見積もった。【００５５】
図９は、全トランス体フコキサンチンのエタノール溶液、シス体２フコキサンチンのエタノール溶液をＲＰＭＩ培地に添加した時の、ＬＮ−ＣａＰ細胞の細胞生残率を経時的に表したものである。図１０は、全トランス体フコキサンチンのエタノール溶液、シス体２フコキサンチンのエタノール溶液をＲＰＭＩ培地添加した時のＰＣ−３細胞の細胞生残率を経時的に表したものである。図１１は、全トランス体フコキサンチンのエタノール溶液、シス体２フコキサンチンのエタノール溶液をＭＥＭ培地に添加した時の、Ｃａｃｏ−２細胞の細胞生残率を経時的に表したものである。【００５６】
ＬＮ−ＣａＰ、ＰＣ−３、Ｃａｃｏ−２細胞の何れにおいても、フコキサンチン添加２４時間以降、シス体２フコキサンチンが添加された細胞は、全トランス体フコキサンチンが添加された群と比較して、より細胞増殖抑制が見られた。特にシス体フコキサンチン添加４８時間後においては、ほとんどのガン細胞が生残していないことを確認した。
従って、このシス体フコキサンチンの強いガン抑制作用は、特定のガン細胞だけに作用するのではなく、様々なガン細胞の増殖を抑制する可能性があることを示している。【００５７】
以上の実施例から、シス体２フコキサンチンは、全トランス体フコキサンチンよりも、即効性が高く且つガン抑制作用の向上が見られ、更に様々なガン細胞増殖抑制も可能であり、従来技術の課題を解決することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、シス体フコキサンチンを有効成分とするガン抑制剤に関するものである。従って、産業上の利用可能性は、医学の分野では勿論のこと、シス体フコキサンチンを食品素材等に添加することで機能性食品素材として用いることができ、農業の分野での活用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】全トランスフコキサンチンからシス体フコキサンチンを調製するフローチャートである。
【図２】ＨＰＬＣ分取前のシス体リッチフコキサンチン分画のＨＰＬＣ分析チャートである。
【図３】ＨＬ−６０細胞への添加前の全トランス体フコキサンチンのＨＰＬＣ分析チャートである。
【図４】ＨＬ−６０細胞への添加前のシス体２フコキサンチンのＨＰＬＣ分析チャートである。
【図５】シス体フコキサンチン添加によるＨＬ−６０細胞への増殖抑制試験のフローチャートである。
【図６】コントロール、全トランス体、シス体１、シス体２フコキサンチンをＰＲＭＩ培地に添加した際に於けるＨＬ−６０細胞の生残細胞数の経時変化を示す。
【図７】ＰＲＭＩ培地中の全トランス体・シス体２フコキサンチンの異性化経時変化を示す。
【図８】シス体フコキサンチン添加によるＬＮ−ＣａＰ、ＰＣ−３、Ｃａｃｏ−２細胞への増殖抑制試験のフローチャートである。
【図９】全トランス体、シス体２フコキサンチンをＰＲＭＩ培地に添加した際に於けるＬＮ−ＣａＰ細胞の細胞生残率の経時変化を示す。
【図１０】全トランス体、シス体２フコキサンチンをＰＲＭＩ培地に添加した際に於けるＰＣ−３細胞の細胞生残率の経時変化を示す。
【図１１】全トランス体、シス体２フコキサンチンをＭＥＭ培地に添加した際に於けるＣａｃｏ−２細胞の細胞生残率の経時変化を示す。
【図１２】全トランス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１３】１５シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１４】１３シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１５】１１シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１６】９シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１７】１３’シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１８】１１’シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１９】９’シス体フコキサンチンの化学構造式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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