(57)【要約】本発明は、タンパク質等の分子間相互作用の測定方法および測定装置を提供する。本発明は、分子間相互作用を所望する分子のうち一つの分子を蛍光色素により標識し、他の分子を蛍光色素により標識しない状態でこれを含む溶液を準備する。その後、ウェルの底面の一領域に標識していない分子を含む溶液を固定化し、標識された分子を含む溶液を標識しない分子を含む固定化された溶液と反応させて、光を照射する。その結果、ウェルの底面の一領域と他の領域とにおける蛍光濃度に差が生じ、その蛍光濃度差を測定することにより分子間相互作用を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用の測定を所望する分子のうち一つの分子を蛍光色素により標識して少なくともこれを含む溶液を準備し、さらに他の分子を蛍光色素により標識しない状態でこれを含む溶液を準備する溶液準備工程と、
上方に開放されたウェルの底面の一領域に前記準備工程により準備された標識していない分子を含む溶液を固定化する固定化工程と、
前記準備工程により準備された標識された分子を含む溶液を前記ウェル内に貯留させ、前記固定化工程により固定化された溶液と反応させる反応工程と、
該反応工程により反応させた溶液に対して光を照射する照射工程と、
前記固定化工程で標識していない分子を含む溶液が固定化された前記ウェルの底面の一領域における蛍光濃度と、前記標識された分子を含む溶液が貯留された前記一領域以外の領域における蛍光濃度と、を比較測定する蛍光測定工程と、
を有することを特徴とする分子間相互作用測定方法。
【請求項２】
前記固定化工程は、前記ウェルの底面の一領域に所定の分子を固定化する工程と、前記標識されていない分子を含む溶液に該固定化された所定の分子と親和性を有する分子を含ませる工程と、前記ウェルの底面の一領域に前記標識されていない分子を含む溶液を滴下する工程とを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用測定方法。
【請求項３】
前記固定化工程は、前記ウェルの底面の一領域に前記標識されていない分子を含む溶液を滴下する工程と、滴下された溶液を乾燥させる工程とを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用測定方法。
【請求項４】
前記溶液準備工程において準備される溶液は、予め定められた濃度条件で複数設定され、それぞれ設定された濃度条件の溶液ごとに対応する蛍光濃度を測定することによって測定を所望する分子間の相互作用のうち適正な濃度条件・解離定数を算出する、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分子間相互作用測定方法。
【請求項５】
溶液を貯留可能な凹部を形成するウェルを有し、
該ウェル内の底面が、分子間相互作用の測定を所望する分子のうち一つの分子であって蛍光標識されていない分子を含む溶液を固定化するための一領域と、前記一つの分子との分子間相互作用の測定を所望する他の分子であって蛍光標識された分子を含む溶液を受容するための他の領域とで構成され、
前記一領域は、前記ウェルの底面上で前記蛍光標識されていない分子を含む溶液を固定化させた固層をなして形成され、前記他の領域は、前記ウェルの底面上から上方に中空である、ことを特徴とする分子間相互作用測定装置。
【請求項６】
前記固層は、前記ウェルの底面上に直接固定化された分子を含む層と、該層に滴下された前記蛍光標識されていない分子を含む溶液の層とで形成される、ことを特徴とする請求項５に記載の分子間相互作用測定装置。
【請求項７】
前記固層は、前記蛍光されていない分子を包含する溶液を前記ウェルの底面上で乾燥させることにより形成される、ことを特徴とする請求項５に記載の分子間相互作用測定装置。
【請求項８】
前記ウェルを縦方向および横方向にそれぞれ複数個、整列配置される、ことを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の分子間相互作用測定装置。
【請求項９】
前記一領域における前記固層は、該固層に包含される前記蛍光標識されていない分子との相互作用の測定を所望する分子であって蛍光標識された分子を含む溶液を前記他の領域に貯留させたときに、前記蛍光標識された分子の浸入は拒まないが、前記固層に包含される前記蛍光標識されていない分子の前記他の領域への侵入はなさないように構成されている、ことを特徴とする請求項５〜８に記載の分子間相互作用測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質相互間等の分子間相互作用を測定する方法及びその方法を利用した測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命活動の解明するために生体細胞中のタンパク質間等の分子間相互作用を検出ことが所望されている。この検出方法の一つとして従来より、酵素、構造タンパク質等の抗原性物質を、蛍光標識抗体と結合させ、蛍光顕微鏡下に検出する方法が存在し、一般に蛍光抗体法と称されている。この方法では、リガンドとなる分子を蛍光標識し、レセプターとなる抗原性物質への結合状態を蛍光発色により検出する方法である（リガンドとレセプターとが逆でも良いが、ここではリガンドに蛍光標識するとして説明する）。レセプターとリガンドとの結合を検出するには、レセプターと結合されたリガンドの蛍光発色を検出する必要があり、非結合の遊離リガンドによる発色を除外する必要がある。また、レセプターとリガンドとの結合作用は、レセプターとリガンドの結合体濃度、総リガンド濃度、総レセプター濃度、解離定数の相関により決定されるものであり、解離定数が小さい程、レセプターとリガンドとの結合が強い（分子間相互作用が強い）と理解されるところ、従来の方法では蛍光強度により各試料の結合体濃度自身を比較検証することはできるが、レセプターとリガンドの結合体濃度と、遊離リガンド濃度との比較検証が難しく、解離定数に依拠するレセプターとリガンドの結合強度の絶対的な検証が困難という問題があった。
また、このような問題を解決するために表面プラズモン共鳴を利用した分子間相互作用測定方法も存在する。この測定方法は、リガンドとなる分子を固定化し、固定化されたリガンドと相互作用するレセプター分子を反応させる方法であり、リガンドとレセプターとの間、すなわち分子相互作用の特異性、親和性の強弱、結合・解離の速さ、結合体濃度などの情報を得ることができる点で有利である。しかしながら、この測定方法では、専用の設備・施設が必須となり測定コストが高いこと、ノイズ除去が困難であること等の問題を有している。
例えば、「特開２０００−２８３９８４号公報」や「実験医学別冊  クローズアップ実験法  総集編」羊土社（２００２）、Ｂｉａｃｏｒｅを用いた低アフィニティー相互作用の検出、稲川淳一、ｐ１４３−１５０や「実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座３  ＧＦＰとバイオイメージング」羊土社（２０００）、蛍光相関分光法  金城政孝  吉田直人  野村保友、ｐ２１５−２２２に開示されている。
［発明が解決しようとする課題］
以上の事情に鑑みて本発明は提供されたものであり、一つの測定結果から分子間の結合強度、すなわち分子間相互作用を簡単に検証することができ、且つ測定コストを大幅に減少させることが可能な分子間相互作用測定方法及びこの測定方法を用いた測定装置を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の分子間相互作用測定方法によれば、相互作用の測定を所望する分子のうち一つの分子を蛍光色素により標識して少なくともこれを含む溶液を準備し、さらに他の分子を蛍光色素により標識しない状態でこれを含む溶液を準備する溶液準備工程と、上方に開放されたウェルの底面の一領域に前記準備工程により準備された標識していない分子を含む溶液を固定化する固定化工程と、前記準備工程により準備された標識された分子を含む溶液を前記ウェル内に貯留させ、前記固定化工程により固定化された溶液と反応させる反応工程と、該反応工程により反応させた溶液に対して光を照射する照射工程と、前記固定化工程で標識していない分子を含む溶液が固定化された前記ウェルの底面の一領域における蛍光濃度と、前記標識された分子を含む溶液が貯留された前記一領域以外の領域における蛍光濃度と、を比較測定する蛍光測定工程と、を有している。また、固定化工程は、ウェルの底面の一領域に所定の分子を固定化する工程と、標識されていない分子を含む溶液に該固定化された所定の分子と親和性を有する分子を含ませる工程と、ウェルの底面の一領域に標識されていない分子を含む溶液を滴下する工程とを有することが好ましいが、ウェルの底面の一領域に前記標識されていない分子を含む溶液を滴下する工程と、滴下された溶液を乾燥させる工程とを有する固定でも良い。さらに、上記溶液準備工程において準備される溶液は、予め定められた濃度条件で複数設定され、それぞれ設定された濃度条件の溶液ごとに対応する蛍光濃度を測定することによって測定を所望する分子間の相互作用のうち適正な濃度条件・解離定数（Ｋｄ）を算出しても良い。
また、本発明の分子間相互作用測定装置によれば、溶液を貯留可能な凹部を形成するウェルを有し、該ウェル内の底面が、分子間相互作用の測定を所望する分子のうち一つの分子であって蛍光標識されていない分子を含む溶液を固定化するための一領域と、該一つの分子との分子間相互作用の測定を所望する他の分子であって蛍光標識された分子を含む溶液を受容するための他の領域とで構成されている。上記一領域は、ウェルの底面上で蛍光標識されていない分子を含む溶液を固定化させた固層をなして形成され、他の領域は、前記ウェルの底面上から上方に中空である。また、固層は、前記ウェルの底面上に直接固定化された分子を含む層と、該層に滴下された前記蛍光標識されていない分子を含む溶液の層とで形成されることが好ましいが、蛍光されていない分子を包含する溶液を前記ウェルの底面上で乾燥させることにより形成されても良い。また、ウェルは、縦方向および横方向にそれぞれ複数個、整列配置されていることが好ましい。さらに、前記一領域における前記固層は、該固層に包含される前記蛍光標識されていない分子との相互作用の測定を所望する分子であって蛍光標識された分子を含む溶液を前記他の領域に貯留させたときに、前記蛍光標識された分子の浸入は拒まないが、前記固層に包含される前記蛍光標識されていない分子の前記他の領域への侵入はなさないように構成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【０００４】
本発明は、分子間相互作用を測定する方法と分子間相互作用の測定方法に使用する測定装置を提供している。この測定方法および測定装置によれば、相互作用するレセプター分子がウェル底面の一領域のみに固定化されて配設され、ウェル内の他の領域にはリガンド分子が存在することとなる（レセプター分子とリガンド分子とが逆、すなわちリガンド分子が一領域に固定化されても良い（以下、この場合を「他ケース」と記載する））。また、リガンド分子（他ケースの場合はレセプター分子）は蛍光色素によって標識される。従って、レセプター・リガンド間で相互に結合反応した場合、固定化された一領域においてはレセプター分子とリガンド分子の結合体および遊離状態のレセプター分子（他ケースの場合はレセプター分子とリガンド分子の結合体および遊離状態のリガンド分子）が包含されることとなり、ウェル内の他の領域においては遊離状態のリガンド分子（他ケースの場合は遊離状態のレセプター分子）が存在することとなる。このような状態で、蛍光色素を励起すべく光照射した場合、固定化された一領域で蛍光発色をなすのはレセプター・リガンド結合体であり、他の領域では遊離状態のリガンド分子（他ケースの場合は遊離状態のレセプター分子）である。従って、分子間相互作用が活発な場合には、固定化された一領域上における蛍光濃度が他の領域上における蛍光濃度に比して強くなり、濃度差を一見して視認することが可能となる。換言すれば、本発明を使用すれば、同一ウェル内で分子間相互反応（例えば、抗体・抗原結合反応）の状態を視認レベルで明確に測定することができ、且つ表面プラズモン共鳴法のような専門・高額な設備を用いる必要がなく大幅に測定コストを減じることが可能となる。さらに、原理的に本発明の測定方法および測定装置では、微小ウェル空間内（１ｍｍ以下）でも分子間相互作用を検出することが可能である。従って、多数穴を有するマイクロプレートの各ウェル等でも活用することができ、検出結果の視認容易性（上述）とも相まって分子間相互作用の適正条件を容易かつ迅速に検出することが可能となる。
なお、上記本発明の効果の説明では、ウェル内の２つの領域間における分子間相互作用についてレセプター分子とリガンド分子との間での相互作用により説明してきたが、本発明は広く分子間相互作用全般に利用できる。すなわち、レセプター分子とリガンド分子のように予め結合が予定されている分子間の相互作用測定のみならず、相互作用の有無が不明な分子間において相互作用するか否かを測定することができ、例えば、異なるタンパク質相互間、核酸相互間、タンパク質・核酸相互間等の相互作用の有無を測定することができる。特に、本発明の方法および装置では微少ウェル空間内（１ｍｍ以下）でも分子間相互作用を検出することが可能という効果を有しており、多数穴を有するマイクロプレートの各ウェル等でも活用することができ、検出結果の視認容易性（上述）とも相俟って多数種の分子（例えば、タンパク質）から相互に作用する分子をスクリーニングする等を容易かつ迅速に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、本発明の分子間相互作用測定装置に使用するマイクロプレートを示した図である。
図２は、図１のマイクロプレートに配設されるウェルの拡大断面図である。
図３は、図２の平面図である。
図４は、本実施形態での一の実験結果を示した平面図である。
図５は、本実施形態での他の実験結果を示したＳｃａｔｃｈａｒｄプロット図である。
図６は、他の本実施形態の実験工程を示す略図である。
図７は、他の本実施形態における実験結果の解析画像である。
図８は、図７の実験結果を示したＳｃａｔｃｈａｒｄプロット図である。
図９は、さらに他の本実施形態における実験結果の解析画像である。
図１０は、図９の実験結果を示したＳｃａｔｃｈａｒｄプロット図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
図１を参照すれば、本発明の分子間相互作用測定装置として使用されるマイクロプレート１の一例を示している（以下、本発明の分子間相互作用測定装置の実施形態をマイクロプレート１として説明する）１の一例を示している。具体的には、図１（ａ）は従来のマイクロプレートの側面図を示しており、図１（ｂ）は従来のマイクロプレートの平面図を示している。ここでマイクロプレートとは、臨床検査、ＤＮＡの分析や増幅等の試験や検査に広く利用されている容器であり、外形が略長方形状の基部３と、基部３に一体に取り付けられた円筒形等の筒形状のウエル２とを有している。また、ウエル２は、基部３に対し行又は列方向にマトリックス状に多数配設されている。
さらに、ウエル２は、図１（ｂ）の破線で示すように、通常の試験管と同様に、上方が基部３に開口され他方が閉鎖された円筒形等の凹部２ａを有する中空容器で、基部３に開口する部分に、基部３から突出した円形等のリム４が形成されている。このようにウエル２内には、試験や検査をする場合に、試料を収納できる構成になっている。
また、リム４は、基部３の上面よりわずかに突出しているが、これは試験中に試料の蒸発及び各ウエル２間での試料の混合（クロスコンタミネーション）を防止するために利用する。具体的には、リム４にキャップを装着したり、一面に粘着性フィルムを貼り付けて試料の混合を防止するが、リム４を設けることで、キャップまたは粘着フィルムとの密着性を向上させることができる。
ここで、図１に示すようなマイクロプレート１は、隣接するウエル２の行および列方向の中心間距離が標準化され、１枚のマイクロプレート１が有するウエル２の数は８行×１２列（９６個）、３行×８列（２４個）等で構成されている。また、ウエル２の下端は図１（ａ）の側面図に示すように平坦（又は略球形）の底面２ｂを有している。さらに、マイクロプレート１の基部３は図１のように平板状の他、平板の周縁部から下方に延びる側壁を有する形状（いわゆるスカート形状）のものがある。また、マイクロプレート１は、透明な合成樹脂やガラス等により形成されており、低蛍光物質で形成されていることが好ましい。ここまでで説明されるマイクロプレート１の特徴は従来型のマイクロプレートにおいても包摂されるものである。
ここで、本実施形態の特徴を説明する前提として本発明の分子間相互作用測定方法の基本原理について本実施形態における具体的実験例に基づいて説明する。まず、レセプター（受容体）とリガンドとの間の分子間相互作用について概説する。レセプターとは、細胞膜、細胞質または核内にある蛋白質で、これにリガンド（特異的な物質）、すなわち神経伝達物質、ホルモン、細胞増殖因子その他の物質を結合し、細胞の反応を開始させる働きを有している。このレセプターとリガンドとは、質量作用の法則に従い平衡状態に結合する。これをモデル式で示したものが以下に示される。
（数式）
2007024014.tif 000002
このモデル式からも明らかなようにレセプターとリガンドとの結合体濃度は、総リガンド濃度、総レセプター濃度、解離定数により与えられるものである。従って、結合体濃度（［Ｒ・Ｌ］）は、レセプター濃度が増加するとこれに従って増加し、逆に遊離リガンド（［Ｌ］）は、レセプター濃度が増加すると減少する性質を有することがわかっている。ここで、レセプターとリガンドとが結合し易い場合、すなわち分子間相互作用が強い場合とは解離定数が小さい状態である。また、解離定数はレセプターと対応するリガンドにより決定される固定値である。このことから鑑みてレセプターとリガンドとの両者の結合がし易い場合には、結合体濃度（［Ｒ・Ｌ］）に比して遊離リガンド濃度（［Ｌ］）が小さい状態であることが判る。従って、レセプターとリガンドとの結合のし易さ、すなわち分子間相互作用の強度を検証するには、レセプターとリガンドの結合体濃度と遊離リガンド濃度とを一の反応において同時に比較することが必要とされることが理解される。
次に、レセプターとリガンドの結合状態を測定するための基本原理について説明する。従来より知られている方法としてリガンドを蛍光標識する方法が存在する（レセプターを蛍光標識する場合も存在する）。とりわけ、代表的にレセプターに相当する試料中の抗原に対して蛍光標識した抗体を結合させ、蛍光顕微鏡で検出する方法が存在する。この方法では、抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の蛍光色素により標識し、蛍光検出する方法が一般的である。また、検出感度を増大させるため非標識抗体（一次抗体と称する）を抗原と反応させ、蛍光標識した抗体（二次抗体と称する）を、抗原と一次抗体との結合体に結合させ抗原を追跡する方法も存在し、マウス抗体と抗マウス抗体との結合等が揚げられる（後述するが本実施形態では、これを活用している）。
しかしながら、従来の方法のみでは既に分子間相互作用が判明している場合、例えば、特定のレセプター抗原の存在を試料内で検証するために対応するリガンド抗体を付与する場合には有利であるが、レセプターとリガンドの結合体濃度と遊離リガンド濃度との比較検証が困難であるため新たにレセプターとリガンドとの相互作用を検証するには不十分である。
これに対して本発明の測定方法および測定装置では、レセプターとリガンドの結合体濃度と遊離リガンド濃度との比較検証が容易に可能な構成を提供している。再びマイクロプレート１の説明に戻れば、図２ではウェル２内の底面２ｂ近傍の拡大断面図が示されている。この図２は、図１（ａ）の断面図と同一視である。また、図３は図２の平面図を略示しており、図１（ｂ）と同一視である。これらの図に示すようにウェル２内の底面はその一部の領域２ｄ、ここでは中心近傍に所望のレセプター分子を固体化させている。本実施形態においてはレセプター分子としてマウス抗体、リガンド分子として抗マウス抗体を用いており、マイクロプレート１のウェル底面２ｂの一領域２ｄにマウス抗体を所望濃度含む溶液を所定量（１μｌ）滴下し、固体化している。また、ウェル底面２ｂの他の領域２ｃは原始的にはブランクである。ここで、レセプター分子の固定化について言及すれば、ウェル底面２ｄに滴下された溶液を乾燥させて直接的に固定化する方法や、ウェル底面２ｄに所定分子を固定化させた後に該所定分子と親和性が高い分子を含む溶液をマウス抗体を含む溶液と混合させてウェル底面２ｄ上に滴下する方法等が存在する。とりわけ後者の方法は、乾燥によるタンパク質の変質を抑制することができる点で有利である。例えば、ウェル底面２ｄにグルタチオンやニッケルを固定した後に、マウス抗体を含む溶液にＧＳＴタンパク質や金属・ポリヒステジンペプチドを含ませたものをウェル底面２ｄ上に滴下する方法が提供される。この方法の原理は、滴下溶液内のＧＳＴタンパク質等とウェル底面２ｄ上のグルタチオン等との親和性により滴下溶液をウェル底面２ｄに固定化させるものである。
次に、このような状態で形成されたウェル２にリガンド分子を含む溶液を滴下し、ウェル２内に貯留する。このときウェル２内に貯留された溶液（及びウェル底面２ｄに固定化されたレセプター分子を含む溶液）を密閉することが好ましい。前述するように溶液が乾燥すると内部のタンパク質分子（ここではリガンド分子たる抗マウス抗体およびレセプター分子たるマウス抗体）が変質せしめるおそれがあり、これを抑制することができるからである。例えば、液層表面にミネラルオイルやセチルアルコールを滴下して表面被覆する方法やウェル２を物理的に密閉する方法が提供される。ここでは、リガンド分子として前述するようにマウス抗体に対応する抗マウス抗体を用いており、この抗マウス抗体をＦＩＴＣ等の蛍光色素で標識したものを含む所望濃度の溶液を準備し、ウェル２内に滴下して貯留させる。従って、ウェル内２ａでは、その底面の一領域２ｄではレセプターとしてのマウス抗体の一部にリガンドとしての抗マウス抗体が結合し他の部分ではマウス抗体のみ遊離された状態を形成し、他の領域２ｃでは遊離された抗マウス抗体のみが包摂されていることとなる（前述のモデル式参照）。このような状態で、ウェル底面２ｂを上方又は下方から所定強度の光照射すれば、抗マウス抗体に標識した蛍光色素が励起され発色する。その場合、蛍光強度はリガンド濃度に比例し、具体的には領域２ｄではマウス抗体と抗マウス抗体との結合体濃度（前述のモデル式における［Ｒ・Ｌ］）に比例し、領域２ｃでは遊離された抗マウス抗体濃度（前述のモデル式における［Ｌ］）に比例することとなる。従って、それぞれの濃度により領域２ｄ、２ｃとでの蛍光濃度に差が生じることとなり、領域２ｄの蛍光濃度が領域２ｃの蛍光濃度よりも大きければ大きいほどレセプターとしてのマウス抗体とリガンドとしての抗マウス抗体との結合強度が大きい（解離定数が小さい）ことが判別できる。従って、２つの分子間の相互作用が強いか否かを各領域２ｄ、２ｃの蛍光濃度差を一見するだけで測定することが可能となり、レセプターとリガンドの結合濃度［Ｒ・Ｌ］、解離定数Ｋが不明な場合であっても、総レセプター濃度、総リガンド濃度（それぞれ溶夜を準備する段階で既知である）が決定されれば、この条件に対応するレセプターとリガンドの結合強度を容易に理解することができる。
さらに、図１〜３に示す本実施形態のように多数のウェル２を配設するマイクロプレート１を用いれば、それぞれのウェルごとに異なる濃度のレセプター、リガンドを準備することで、両者を反応させた場合に種々の濃度条件における分子間相互作用を一見して理解することができる。このようなウェルごとの濃度条件の設定として、図１のマイクロプレート１で例示すれば、縦方向では行ごと（Ａ〜Ｈ行ごと）にリガンド濃度が大きく又は小さくなるように設定（溶液準備）し、横方向では列ごと（１〜１２列ごと）にレセプター濃度が大きく又は小さくなるように整列すれば、測定結果の理解に好適である。
なお、上述するようにレセプターとして領域２ｄにはマウス抗体を含む溶液を固定化させて、領域２ｃでは抗マウス抗体（ＦＩＴＣ標識有り）を含む溶液を貯留させて検証しており、その結果の一部を抜粋したものが図４に示している（実際には９６穴で検証したが発明の理解を助ける趣旨のもと一部のみを示すこととする）。この実験結果において、マウス抗体濃度は１０μｇ／ｍｌで統一されており、抗マウス抗体濃度は、左上方から下方に従って０．２５、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５μｇ／ｍｌ、右上方から下方に従って１．５、１．７５、２、３、４、５μｇ／ｍｌとなっている。この図から考察するに蛍光濃度は、マウス抗体濃度１０μｇ／ｍｌ、抗マウス抗体濃度０．４μｇ／ｍｌの条件の場合に大きく差が出ており、マウス抗体と抗マウス抗体の分子間相互作用が活発であることが理解される。
また、他の実験結果を用いた解離定数（Ｋｄ）の算出について説明する。図５を参照すれば、レセプター分子（ここではマウス抗体）とリガンド分子（ここでは抗マウス抗体）との結合を示したスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロットが提供されており、各ウェル２ごとのデータをそれぞれプロットし、これに基づく直線グラフが得られている。この縦軸［Ａ・Ｂ］／［Ａ］は、リガンド・レセプター結合分子と遊離リガンド分子との比値（［Ｒ／Ｌ］／［Ｒ］）を表示し、横軸［Ａ・Ｂ］は、リガンド・レセプター結合分子の濃度（［Ｒ・Ｌ］：ｍｏｌ／ｌ）を表示している。ここでスカッチャードプロットの特性に言及すれば、得られた直線の傾きは解離定数に反比例している。具体的には、傾き＝−１／Ｋｄ  となる。従って、図５から明らかなようにマウス抗体と抗マウス抗体との相互作用において得られた直線の傾きは、−２×１０８（＝ｘの係数）であるため、Ｋｄ＝０．５×１０−８と算出される。このようにして、各ウェル内の分子濃度を測定すれば解離定数Ｋｄを算出することができ、具体的な分子間相互作用を測定することができる。
次に、さらに詳細な他の追加実験結果について言及しておく。図６に示す参照番号は図２および図３に示す参照番号要素と同一を意味する。ここでは、ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（以下「Ｃｏｎ  Ａ」と称する）と糖タンパク質（ＲＮａｓｅＢ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：以下、「ＲＮａｓｅＢ」と称する）との相互作用を検出している。
まず、図６（ａ）に示すように１００μｇ／ｍｌの濃度のＣｏｎ  Ａをウェル２の中心の領域２ｄに１μｌ滴下した後に、風乾させて固定した。次に、図６（ｂ）に示すようにタンパク質回収率を向上させるためにブロッキング処理を行う。具体的には、ブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）として１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＢＳＡ（牛血清アルブミン）を６０μｌ程、ウェル２内の前記領域２ｄに加え、２０分程室温で培養（インキュベート）した。その後、図６（ｃ）に示すように洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を１００μｌ加え、１度目は加えられた洗浄液を直ちに捨て、さらに洗浄液を加えた後（２度目）、１０分程室温で培養した。次に、蛍光標識（ＦＩＴＣラベル）したＲＮａｓｅＢを０．５，１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５μｇ／ｍｌの濃度に振り分けて、それぞれ別途のウェル２に加えたあと室温で培養した。そして、２４時間程経過した後に測定および画像解析を行い上述と同様にスカッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔ）を作製した。その解析画像およびスカッチャードプロットがそれぞれ図７および図８に示されている。このようにして計測した結果、Ｃｏｎ  ＡとＲＮａｓｅＢの解離定数（Ｋｄ）は２．６×１０−６と算出され、文献値（１．６４×１０−６）と略一致することが理解されよう。
なお、図７の解析画像は、上から順に番号が付されており、それぞれＲＮａｓｅＢを０．５，１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５μｇ／ｍｌのものを示している。また、図８のスカッチャードプロットについては、各ウェル２ごとのデータをそれぞれプロットし、縦軸［Ａ・Ｂ］／［Ａ］は、リガンド・レセプター結合分子と遊離リガンド分子との比値（［Ｒ／Ｌ］／［Ｒ］）を表示し、横軸［Ａ・Ｂ］は、リガンド・レセプター結合分子の濃度（［Ｒ・Ｌ］）を表示しており、得られた直線の傾きが解離定数に反比例していることは既に言及したとおりである（このことは後述する図９および図１０も同様）。
次に図９に示す実験ではＡｕｒｏｒａキナーゼ抗体（以下、「Ａｕｒｏｒａ」と称する）とｈｉｓｔｏｎｅＨ３抗体（以下、「Ｈｉｓｔｏｎｅ」と称する）との相互作用を検出している。
まず、図６（ａ）に示すように１０μｇ／ｍｌの濃度のＨｉｓｔｏｎｅをウェル２の中心の領域２ｄに１μｌ滴下した後に、風乾させて固定した。次に、図６（ｂ）に示すようにブロッキング溶液として１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＢＳＡを６０μｌ程、ウェル２内の前記領域２ｄに加え、２０分程室温でインキュベートした。その後、図６（ｃ）に示すように洗浄液を１００μｌ加え、１度目は加えられた洗浄液を直ちに捨て、さらに洗浄液を加えた後（２度目）、１０分程室温でインキュベートした。次に、蛍光標識（ＦＩＴＣラベル）したＡｕｒｏｒａを１，２，３，４，５，６μｇ／ｍｌの濃度に振り分けて、それぞれ別途のウェル２に加えたあと室温で培養した。そして、２４時間程経過した後に測定および画像解析を行いスカッチャードプロットを作製した。その解析画像およびスカッチャードプロットがそれぞれ図９および図１０に示されている。このようにして計測した結果、ＡｕｒｏｒａとＨｉｓｔｏｎｅとの解離定数（Ｋｄ）は１．５×１０−７と算出され、この解離定数値を示す公知文献は存在しないため、この結果が新規発見とされる。なお、図７の解析画像は、上から順に番号が付されており、それぞれＡｕｒｏｒａを１，２，３，４，５，６μｇ／ｍｌに振り分けたものを示しており、図１０のスカッチャードプロットについては前述のとおりである。
以上、本発明の分子間相互作用測定装置としてマイクロプレート１を用いた実施形態を一例として説明してきたが、本発明はこれに限定されるものではなく、少なくとも１つのウェルの底面（平面でなくとも良い）の一部領域と他の領域とで包含する分子が異なっているように構成された他の装置であっても良く、また、上述の抗体での実例反応で検証したが本発明の思想に鑑みれば相互作用を所望する２つ以上の分子の測定全般に活用することができることが理解できよう。また、本実施形態では２つの分子間の相互作用の場合のみを例示したが、他の固体化領域以外のウェル内領域に貯留させる溶液に他のリガンド分子（非標識）を包含させて競合反応させる方法にも応用することができ、又反応感度を高めるために標識しない一次抗体を抗原（レセプター）に結合させ、所望する抗体（リガンド）を二次抗体として標識し抗原と一次抗体との結合体に結合させて反応させる方法に応用しても良く、いわゆる蛍光測定法（相互作用させる一方の分子を標識し、発する蛍光で測定する方法全般）に応用することができる。さらに、蛍光色素としてはＦＩＴＣに特に限定されるものでなく、他の蛍光色素、例えば、ｃｙ５のごときでも差し支えない。なお、本明細書においてレセプターとリガンドとの表現を用いてきたが、これは質量作用の法則（モデル式参照）における結合作用（平衡作用）に従って説明する便宜上用いたものであり、レセプターとリガンドとを逆に当てはめても良く、相互作用の有無が不明な分子間において相互作用するか否かを測定することであっても（例えば、異なるタンパク質相互間、核酸相互間、タンパク質・核酸相互間等の相互作用の有無を測定する）本発明の特徴（異なる分子が包含される領域を形成して反応させる構成）およびその思想を逸脱するものではないことが当業者には容易に理解できるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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