(57)【要約】この発明は、試験系において、癌遺伝子産物Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子産物ｐ５３との存在下で薬剤候補を添加すること、Ｒｄａ９とｐ５３との結合を制御することができる生物活性薬剤を選抜することを含む、癌治療薬をスクリーニングするための方法、並びに、前記結合を制御可能にする癌治療薬に関する。
2007145365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験系において、癌遺伝子産物Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子産物ｐ５３との存在下で薬剤候補を添加すること、Ｒｄａ９とｐ５３との結合を制御することができる生物活性薬剤を選抜することを含む、癌治療薬をスクリーニングするための方法。
【請求項２】
前記薬剤候補が、小分子、核酸、ペプチド、蛋白質、糖類及び脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記系が、真核及び原核生物由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制御が、抑制又は亢進のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤候補が、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域を中和する抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤候補が、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤候補が、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ核酸、又はそれの核酸を含むベクターＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
Ｒａｄ９蛋白質の生物機能又はＲａｄ９遺伝子の発現を制御し、これによってＲａｄ９とｐ５３との結合を増強又は抑制してｐ５３の活性を抑制又は増強することができる、かつＲａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用する生物活性薬剤を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、Ｒａｄ９に対する抗体又は抗体フラグメントである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記薬剤が、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するＲＮＡｉ核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記薬剤が、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記薬剤が、リポソームに封入されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療薬に関する。具体的には、本発明は、癌遺伝子Ｒａｄ９の機能を制御し、これによって癌抑制遺伝子ｐ５３の活性を亢進させる癌治療用組成物に関する。
本発明はまた、そのような癌治療用薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期事象の適正な順番を維持するシグナル伝達経路である。ＤＮＡが損傷を受けるか、或いは複製が阻害された後、細胞応答は、進化的に保存されたシグナル伝達経路の活性化によって起こる。この経路は、細胞周期の進行を遅らせ、かつ損傷ＤＮＡの修復を誘導する。これらのシグナル伝達経路は蛋白質センサーを含み、このセンサーは、異常なＤＮＡ構造を認識しキナーゼを活性化し、これによってリン酸化カスケードを誘発し、最終的に細胞周期停止及びＤＮＡ修復に導く（非特許文献１）。この細胞周期監視機構がうまくいかないと、ゲノムが不安定になり、ついには、哺乳動物において癌が形成される（非特許文献２）。
ヒトＲａｄ９（ｈＲａｄ９）蛋白質は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｒａｄ９のヒトホモログであり、チェックポイントｒａｄ遺伝子（ｒａｄ１；，ｒａｄ３＋，ｒａｄ９＋，ｒａｄ１７＋，ｒａｄ２６＋及びｈｕｓ１＋）の構成員である。これらのｒａｄ遺伝子類は、Ｓ期（ＤＮＡ修復）及びＧ２期（ＤＮＡ損傷）チェックポイントに必要なものである（非特許文献３）。
Ｒａｄ９は当初酵母の放射線照射に対する感受性を制御する因子として同定された。ＤＮＡに損傷が生じるとＲａｄ９は同じくチェックポイント蛋白質であるＲａｄ１及びＨｕｓ１と三量体を形成しＤＮＡの損傷部位を取り囲み、損傷修復のシグナルを下流の因子に伝達する。その際、Ｒａｄ９のＣ末端にある９箇所以上のリン酸化部位でのリン酸化がシグナル伝達に重要と考えられている（非特許文献４）。Ｒａｄ９はまた、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  βを活性化し、損傷修復に関与する一方、抗アポトーシス蛋白Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ｘＬと抑制的に結合しアポトーシスを誘導する（非特許文献５及び６）。チェックポイントとはＤＮＡ損傷の認識から細胞周期調節までのメカニズムを指すが、Ｒａｄ９は、チェックポイントから、損傷修復とアポトーシスの相反する経路の分岐点に存在し機能する分子であることが示唆される。しかしながら、特にヒトにおいては解明されていない未知の部分が多く存在している。
Ｒａｄ９の癌におけるデータとしてＲａｄ９遺伝子が第１１番染色体長腕１３領域に位置していることが挙げられる。この領域には少なくとも４種の癌遺伝子が存在すると考えられているが、これまで２種の癌遺伝子が同定されているのみである。また、臨床的に頭頸部癌、食道癌、乳癌ではこの領域の遺伝子増幅がしばしば認められ、遺伝子増幅により生存率が低下するとの証拠がある（非特許文献７）。しかし、遺伝子増幅により癌遺伝子が過剰発現し、生存率の低下につながるとされているものの、遺伝子増幅と発癌あるいは癌細胞増殖の関連の詳細は不明である。また、現在のところＲａｄ９が臨床的に生存率に関与するという証拠もない。
ｐ５３の遺伝子はヒトの癌の６０％以上になんらかの変異を認めるという他に類を見ない重要な癌抑制遺伝子である。ＤＮＡが損傷を受けた場合、損傷を認識後、ｐ５３蛋白質が増加又は活性化し、種々の遺伝子の転写を通じてアポトーシスの誘導、細胞周期抑制、細胞分裂抑制、ＤＮＡ複製、損傷修復等に関与し、ゲノムの安定性をもたらす（非特許文献８）。したがってｐ５３の機能を制御することで癌の増殖、転移の抑制が可能になると考えられる。
ｐ５３の転写標的の中でも公知の機能として重要なものがＰ２１遺伝子である。ｐ５３がＰ２１プロモーターにあるｐ５３結合部位に結合することでＰ２１の発現が誘導され、ＣｙｃｌｉｎＥ及びｃｄｋ２の抑制と、細胞周期を抑制し、損傷を修復する時間的猶予が与えられる（非特許文献９、１０及び１１）。ｐ５３は、細胞周期の進行の負の調節因子であり、かつ細胞周期のＧ１期からＳ期への移行を制御する（非特許文献１２）。一方、ｈＲａｄ９は、Ｐ２１プロモーターのｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列に特異的に結合し、転写レベルでＰ２１を調節する（非特許文献１３）。
さらに、Ｒａｄ９と細胞周期蛋白質ＰＰ５との結合を利用した生物活性薬剤のスクリーニング法が特許文献１に記載されている。
さらにまた、特許文献２に、ＡＴＭ、ＡＴＲ、又はＡＴＭもしくはＡＴＲにより調節される蛋白質の活性化がＡＩＭ３の結合によって仲介されることが記載されている。ＡＴＭもしくはＡＴＲにより調節される蛋白質には、ｐ５３、ＲＡＤ９などの多数の物質が含まれている。
ｈＲａｄ９は、細胞周期の制御に関与することが示唆されるが、その機能や機序は実際のところ不明であるし、また、上記のｐ５３経路におけるＲａｄ９の関与もまたこれまで不明である。
【特許文献１】米国特許出願第２００３０２２１１５４６Ａ１明細書
【特許文献２】米国特許出願第２００６００４６２５０Ａ１明細書
【非特許文献１】Ｇ．Ｋ．Ｄａｓｉｋａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：７８８３−７８９９，１９９９
【非特許文献２】Ｃ．Ｌｅｎｇａｕｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６４３−６４９，１９９８
【非特許文献３】Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：７８１−７８７，１９９６
【非特許文献４】Ｒ．Ｐ．Ｓｔ  Ｏｎｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２６６２０−２６６２８，２００３
【非特許文献５】Ｍ．Ｎ．Ｔｏｕｅｉｌｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：３３１６−３３２４，２００４
【非特許文献６】Ｋ．Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：１−６，２０００
【非特許文献７】Ｈ．Ｔｓｕｄａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：３１０４−８，１９８９
【非特許文献８】Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３−３３１，１９９７
【非特許文献９】Ｗ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、Ｃｅｌｌ  ７５：８１７−８２５，１９９３
【非特許文献１０】Ｊ．Ｈａｒｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：８０５−８１６，１９９３
【非特許文献１１】Ａ．Ｎｏｄａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１１：９０−９８，１９９４
【非特許文献１２】Ｍ．Ｂ．Ｋａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ  ７１：５８７−５９７，１９９２
【非特許文献１３】Ｙ．Ｙｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １５：８８６４−８８６９，２００４
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、Ｒａｄ９とｐ５３との生物学的な相互作用を明らかにし、癌治療に利用することを目的とする。
本発明者らは、Ｒａｄ９の機能が、意外にも、ある種の蛋白質結合活性を通して発揮されること、その具体的な蛋白質結合標的がｐ５３であることを見出し、Ｒａｄ９とｐ５３との結合の制御が、Ｐ２１の転写を介したチェックポイント制御に関連するという証拠を得て、本発明を完成させた。この一連の研究から、次のような結果を得た。
（１）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、或いは変異型Ｒａｄ９との競合反応、を用いてＲａｄ９を抑制すると、Ｐ２１  ｍＲＮＡの発現が増強した。
（２）ルシフェラーゼアッセイにより、Ｒａｄ９の導入がＰ２１プロモーター活性を抑制した。
（３）免疫沈降により、Ｒａｄ９がｐ５３と直接結合した。
（４）Ｒａｄ９がＰ２１遺伝子のプロモーター領域のｐ５３結合部位に結合し、紫外線照射によりその結合は増加した。
（５）紫外線照射後のＲａｄ９のフォーカス（ｆｏｃｕｓ）形成から、Ｒａｄ９のＣ末端のリン酸化がＤＮＡ損傷に対するＲａｄ９の反応に重要であった。
上記の結果から、これまで詳細が不明であった、ＤＮＡ損傷後のＲａｄ９の活性化からｐ５３経路を経て細胞のアポトーシス誘導に至る経路が示され、細胞のＤＮＡ損傷が修復に向かうか、或いはアポトーシスによる細胞死に向かうかの決定に関与していることが明らかになった。
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、試験系において、癌遺伝子産物Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子産物ｐ５３との存在下で薬剤候補を添加すること、Ｒｄａ９とｐ５３との結合を制御することができる生物活性薬剤を選抜することを含む、癌治療薬をスクリーニングするための方法を提供する。
本発明の実施形態によれば、前記薬剤候補は、小分子、核酸、ペプチド、蛋白質、糖類及び脂質からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態によれば、前記系は、真核及び原核生物由来の細胞を含む。
本発明の別の実施形態によれば、前記制御は、抑制又は亢進のいずれかである。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤候補は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域を中和する抗体である。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤候補は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体である。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤候補は、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ核酸、又はそれの核酸を含むベクターＤＮＡである。
本発明はまた、第２の態様において、Ｒａｄ９蛋白質の生物機能又はＲａｄ９遺伝子の発現を制御し、これによってＲａｄ９とｐ５３との結合を増強又は抑制してｐ５３の活性を抑制又は増強することができる、かつＲａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用する生物活性薬剤を含む、癌を治療するための医薬組成物を提供する。
本明細書中で使用する「Ｒａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用する」なる用語は、細胞内のＲａｄ９遺伝子、その転写物又は翻訳産物と直接的に作用してＲａｄ９蛋白質又は遺伝子の生物機能や発現をポジチブに又はネガチブに制御することを意味する。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分には、以下に例示するものが包含され、例えば米国特許出願第２００６００４６２５０Ａ１明細書に記載されるＡＩＭ３蛋白質、その変異体、及びそれらをコードする核酸は含まれない。
本発明の実施形態によれば、前記薬剤は、Ｒａｄ９に対する抗体又は抗体フラグメントである。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤は、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡである。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤は、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するＲＮＡｉ核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡである。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体である。
本発明の別の実施形態によれば、前記薬剤は、リポソームに封入されている。
本発明に係る用語は、以下の定義を含む。
本明細書で使用する「Ｒａｄ９」は、哺乳動物、好ましくはヒト由来のＲａｄ９蛋白質又はそれをコードする核酸（すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）を指す。Ｒａｄ９遺伝子は癌遺伝子の１つであり、また、Ｒａｄ９は、ＤＮＡに損傷が生じたときに、ＤＮＡ損傷の修復を指令する蛋白質であるし、或いは、抗アポトーシス蛋白質と抑制的に結合したときに、細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する蛋白質である。
本明細書で使用する「ｐ５３」は、その遺伝子が癌抑制遺伝子であり、ＤＮＡが損傷を受けた場合、ｐ５３蛋白質が増加又は活性化し、種々の遺伝子の転写を通じてアポトーシスの誘導、細胞周期抑制、細胞分裂抑制、ＤＮＡ複製、損傷修復等に関与し、ゲノムの安定性をもたらすという生物機能を有しており、それゆえ、ｐ５３の機能を制御することで癌の増殖、転移の抑制が可能になる。ｐ５３は、Ｐ２１遺伝子の発現誘導を制御しており、詳しくは、Ｐ２１プロモーター領域にあるｐ５３結合部位にｐ５３が結合することによって、Ｐ２１の転写が開始されＰ２１の発現が誘発される。ｐ２１は、サイクリン依存性キナーゼ阻害分子であり、細胞周期の抑制に導く。
本発明は、Ｒａｄ９蛋白質がｐ５３蛋白質と結合してｐ５３の機能を制御しているという新しい知見に基づいており、このような結合の制御を通して、ｐ５３が関与する生物機能、例えばＤＮＡ複製又はＤＮＡ損傷修復、アポトーシス、細胞分裂抑制などの制御、或いは、ｐ５３依存性Ｐ２１遺伝子の発現の制御、ひいては、細胞周期の抑制へと導いてＤＮＡ損傷の修復、そしてゲノムの安定化が達成される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−１６４８９０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｐ２１遺伝子発現産物の発現に及ぼすＵＶ誘導性作用を示す。具体的には、ＵＶ照射後のＰ２１  ｍＲＮＡ及びｐ２１蛋白質の経時変化を示す。２９３細胞を、２０Ｊ／ｍ２のＵＶで処理し、処理後図示された０〜７２時間の種々の時間に細胞を回収した。図１Ａは、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｐ２１  ｍＲＮＡ対Ｇ３ＰＤＨの比をデンシトメトリーで算出した結果を示す。図１Ｂは、蛋白質を抽出し、抗Ｐ２１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す。
図２は、Ｐ２１トランスアクチベーションに対するｈＲａｄ９野生型又は突然変異体発現の影響を示す。図２Ａは、野生型Ｒａｄ９プラスミド又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞の細胞溶解物を使用して行ったウエスタンブロッティング（ＷＢ）の結果を示す。図２Ｂは、Ｐ２１プロモーター−ルシフェラーゼレポーター系を利用したｈＲａｄ９によるＰ２１転写アッセイの結果を示す。相対活性はＦｉｒｅｆｌｙ対Ｒｅｎｉｌｌｅの比として図示した。各カラムは、次のように同時トランスフェクトされた２９３細胞を意味する。カラム１，ｐＵＣ１９及びｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ；カラム２，ｐＵＣ１９及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム３，ｈＨｕｓ１及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター（Ｐ２１−Ｌｕｃ）；カラム４，ｈＲａｄ１及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム５，野生型Ｒａｄ９及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム６，Ｒａｄ９−Ｓ２７２Ａ及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム７，Ｒａｄ９−８Ａ及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム８，Ｒａｄ９−９Ａ及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム９，Ｐ５３及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム１０，野生型Ｒａｄ９及びｐ５３及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム１１，Ｒａｄ９−Ｓ２７２Ａ及びｐ５３及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム１２，Ｒａｄ９−８Ａ及びＰ５３及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター；カラム１３，Ｒａｄ９−９Ａ及びＰ５３及びＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーター。
図３は、ｓｉＲＮＡを利用したｈＲａｄ９及びｐ５３のノックダウン実験の結果を示す。図３Ａは、示された抗体を使用したウエスタンブロット分析の結果を示す。ＥＣＬシグナルは、デンシトメーターで検出され、また、強度比は図に示されている。図３Ｂは、ｓｉＲＮＡを用いたｈＲａｄ９のノックダウン実験の結果を示す。ｈＲａｄ９及びＰ５３をｓｉＲＮＡ（それぞれｓｉＲａｄ９又はｓｉＰ５３）を使用してノックダウンし、ＵＶで処理した、或いは処理しなかった。細胞を回収したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＰ２１ｍＲＮＡをアッセイした。Ｐ２１  ｍＲＮＡ対Ｇ３ＰＤＨの比をデンシトメトリー法で算出し、図示した。
図４は、ｈＲａｄ９とｐ５３との間の相互作用を示す。図４Ａは、２９３細胞の細胞溶解物を、材料と方法に記載したように、免疫沈降に使用した。抗ｃ−ｋｉｔ抗体を、免疫沈降の陰性コントロールとして使用した。図４Ｂは、ＦＬＡＧで標識された野生型Ｒａｄ９プラスミド又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞の細胞溶解物を使用して免疫沈降を行ったときの結果を示す。抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降及び抗ｐ５３抗体によるイムノブロットを示す。図４Ｃは、ＵＶに曝露したあとのＲａｄ９／ｐ５３複合体の経時変化を示す。２９３細胞を２０Ｊ／ｍ２ＵＶで処理し、処理後０〜７２時間目の時間に細胞を回収した。その後、２９３細胞の細胞溶解物を用いて免疫沈降を行った。上のパネルは、抗ｐ５３抗体による免疫沈降及び抗ｈＲａｄ９抗体による免疫ブロットを示す。中のパネルは、抗ｈＲａｄ９抗体による免疫沈降及び抗ｐ５３抗体によるイムノブロットを示す。下のパネルは、抗ｈＲａｄ９抗体による免疫沈降及び抗リン酸化ｐ５３（ｓｅｒ−１５）抗体によるイムノブロットを示す。
図５は、ｈＲａｄ９によるプロモーター結合がＵＶ照射後に増大することを示す。図５Ａは、処理された又は処理されない２９３細胞からの核抽出物を用いてＥＭＳＡを行った結果を示す。レーン１、核抽出物を含まず、下流ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列を含む３０ｂｐオリゴ；レーン２、処理なしの、核抽出物；レーン３、競合体として冷３０ｂｐオリゴを添加した核抽出物；レーン４、抗ｐ５３抗体を添加した核抽出物；レーン５、抗ｈＲａｄ９抗体を添加した核抽出物；レーン６、ＵＶ処理の６時間後の核抽出物；レーン７、抗ｐ５３抗体を添加した、ＵＶ処理の６時間後の核抽出物；レーン８、抗ｈＲａｄ９抗体を添加した、ＵＶ処理の６時間後の核抽出物。図５Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、Ｐ２１プロモーター部位のＣｈＩＰアッセイ結果を示す。２９３細胞を野生型Ｒａｄ９プラスミド又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドでトランスフェクトし、ＵＶ処理あり又はＵＶ処理なしで細胞を回収した。その後、抗ｈＲａｄ９抗体又は抗ｐ５３抗体を使用するＣｈＩＰアッセイを行った。免疫沈降ＤＮＡ対インプットＤＮＡの比をデンシトメトリーで算出し、グラフに示した。図５Ｂは、抗ｈＲａｄ９抗体で免疫沈降するＣｈＩＰアッセイを示し、ＤＮＡはＰ２１下流結合部位に対するプライマーで増幅される。図５Ｃは、抗ｐ５３抗体による免疫沈降を示し、ＤＮＡはＰ２１下流結合部位に対するプライマーで増幅される。図５Ｄは、抗ｈＲａｄ９抗体による免疫沈降を示し、ＤＮＡはＰ２１上流部位に対するプライマーで増幅される。図５Ｅは、抗ｐ５３抗体による免疫沈降を示し、ＤＮＡはＰ２１上流部位に対するプライマーで増幅される。
図６は、ＤＮＡ損傷応答におけるｈＲａｄ９の役割を示す。図６Ａは、ＵＶ誘導核フォーカス中のγＨ２ＡＸ及びＲａｄ９のコロニー化を示す。図６Ｂは、ＵＶ処理後のｈＲａｄ９のフォーカス形成率を示す。２９３細胞を野生型Ｒａｄ９プラスミド又はリン酸化Ｒａｄ９プラスミドをトランスフェクトし、ＵＶ処理の１時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定した。免疫蛍光染色を行い、ｈＲａｄ９のフォーカス形成をもつ細胞の割合を分析した。図６Ｃは、リン酸化Ｃｈｋ１とアポトーシスの経時変化を示す。２０Ｊ／ｍ２のＵＶで２９３細胞を処理し、処理後０〜７２時間目の種々の時間で細胞を回収した。抗リン酸化Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ−３１７）抗体及び抗Ｃｈｋ１抗体を用いるウエスタンブロッティングを行った。リン酸化Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ−３１７）対全Ｃｈｋ１の比をデンシトメトリーで算出し図示した。並行して、ＤＡＰＩで細胞を染色したのち、アポトーシスを計数し、アポトーシスをもつ細胞の割合を示した。リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）、Ｐ２１  ｍＲＮＡ（図１Ａ）及びｐ２１蛋白質（図１Ｂ）もまた示されている。図６Ｄは、ｐ５３依存性ｐ２１活性化のモジュレーションの様式を示す。ＤＮＡを外因性遺伝子毒素、非スケジュール複製などで損傷したのち、ＡＴＲ／ＡＴＭ、又はγＨ２ＡＸ及び９−１−１複合体のフォーカス、により損傷が感受性となる。ｐ５３は蓄積し、ｈＲａｄ９との関連するＰ２１プロモーターのｐ５３コンセンサス配列と結合する。Ｐ２１は、リン酸化ｈＲａｄ９により十分に転写され、ＤＮＡ損傷の１〜３時間後にチェックポイント応答が活性化される。これに対して、Ｐ２１転写は、リン酸化欠損状態のｈＲａｄ９で阻害され、細胞周期停止が抑制され、アポトーシスの誘導に導く。Ｒａｄ９のＣ末端リン酸化は、Ｃｈｋ１の活性化の役割を演じると推定され、Ｃｈｋ１の活性は、ＤＮＡ損傷又はアポトーシスの２４時間後にＧ２／Ｍチェックポイントの活性化を誘導する。
図７は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片である変異型（ｍｔ１、ｍｔ２、ｍｔ３、ｍｔ４及びｍｔ５）Ｒａｄ９の、該野生型（ＷＴ）Ｒａｄ９の前記結合領域における、存在位置を示す概略図（図７Ａ）、並びに、各変異型Ｒａｄ９発現プラスミド（レポーター遺伝子ＦＬＡＧを含む）をＭＲＣ５細胞に導入したときの変異型（ｍｔ１〜ｍｔ５）Ｒａｄ９の発現を示すウエスタンブロット（図７Ｂ）である。図中、ＰＣＮＡフォールド（ｆｏｌｄ）は核内増殖抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ）様構造を表し、モック（ｍｏｃｋ）は、野生型又は変異型Ｒａｄ９発現プラスミドを含まないコントロールを表す。
図８は、ＭＲＣ５細胞に野生型（ＷＴ）Ｒａｄ９又は変異型（ｍｔ１〜ｍｔ５）Ｒａｄ９発現プラスミドを導入したときの、ｐ５３−Ｒａｄ９結合（図８Ａ）及びｐ２１発現の変化（図８Ｂ）を示す。図中、モック（ｍｏｃｋ）は、野生型又は変異型Ｒａｄ９発現プラスミドを含まないコントロールを表し、ＩＢはイムノブロット、ＩＰは免疫沈降をそれぞれ表す。
図９は、癌細胞への野生型Ｒａｄ９又は変異型（ｍｔ１〜ｍｔ５）Ｒａｄ９発現プラスミドの導入時の該細胞のアポトーシスの割合（％）を示す。癌細胞として、図９Ａは頭頸部扁平上皮癌細胞株ＭＭＳＩ−１を使用したときの結果を、図９Ｂは子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞を使用したときの結果をそれぞれ示す。図中、モック（ｍｏｃｋ）は、野生型又は変異型Ｒａｄ９発現プラスミドを含まないコントロールを表す。
図１０は、頭頸部扁平上皮癌細胞株ＭＭＳＩ−１又は子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞に、Ｒａｄ９ｓｉＲＮＡ（配列番号１８）を導入したときの該細胞のアポトーシスの割合（％）を示す。図中、モック（ｍｏｃｋ）は、野生型又は変異型Ｒａｄ９発現プラスミドを含まないコントロールを表す。
図１１は、ＭＲＣ５細胞に、抗癌剤エトポシド（ＶＰ１６）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）又はドキソルビシン（ＤＯＸ）を投与したときの、免疫沈降法によって測定されたｐ５３−Ｒａｄ９結合の変化を示す。図中、モック（ｍｏｃｋ）は、野生型又は変異型Ｒａｄ９発現プラスミドを含まないコントロールを表し、ＩＢはイムノブロット、ＩＰは免疫沈降をそれぞれ表す。
図１２は、抗Ｒａｄ９抗体によるｐ５３−Ｒａｄ９結合の変化を示す。図中、ＧＳＴはグルタチオンＳトランスフェラーゼを表し、＋は、実験系（レーン１、２及び３）に含まれた図に示した物質を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明を、添付の図面を参照しながらさらに説明する。
本発明者らは、ヒト胎児腎糸球体細胞株である２９３細胞を用いて、紫外線（ＵＶ）照射後、ｐ５３の活性化の指標であるＳｅｒ１５のリン酸化と、ｐ５３の転写標的のＰ２１のｍＲＮＡの経時変化を検討した。ｐ５３のリン酸化は照射５分後に亢進し、１２時間後まで高値を示し、一方Ｐ２１ｍＲＮＡは紫外線照射後３０分から３時間で発現の上昇を認めた（図１）。これらより、細胞内ではＤＮＡ損傷５分後から１時間後にチェックポイントが活性化することが示唆された。
Ｐ２１プロモーター活性化におけるＲａｄ９とリン酸化の役割を調べるために、２９３細胞にｐ５３のプラスミド、或いはＲａｄ９のプラスミドを導入し、ルシフェラーゼアッセイでＰ２１プロモーター活性を測定した。その結果、ｐ５３を発現させるとコントロール（カラム１）に比較してＰ２１のプロモーター活性が著明に上昇した（カラム３）のに対し、Ｒａｄ９を単独で発現させた細胞（カラム２）ではＰ２１プロモーター活性の上昇が低く抑えられた（図２）。一方、ｐ５３とＲａｄ９の両者を発現させるとその中間の活性を示した（カラム４）。これらのことから、Ｒａｄ９はｐ５３と競合する形でｐ２１を活性化すると考えられる。
また、９つあるＲａｄ９のリン酸基の一つＳｅｒ２７２に変異をつくったプラスミドとｐ５３をともに強発現させた場合（カラム５）、Ｓｅｒ２７２以外の８カ所を変異させたプラスミドとｐ５３を共に発現させた場合（カラム６）、９カ所のリン酸基全てを変異させたプラスミドとｐ５３を共に発現させた場合（カラム７）、いずれも野生型（ＷＴ）のＲａｄ９とＰ５３の強発現に比較してＰ２１の転写は低く抑えられた（図２）。これらより、Ｒａｄ９はリン酸化を通じてｐ５３と関連し、機能している可能性が示唆された。
つぎに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いてＲａｄ９あるいはｐ５３をノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）し、ＲＴ−ＰＣＲでＰ２１  ｍＲＮＡの発現を検討した。コントロール（カラム１、４）に比較してｐ５３のｓｉＲＮＡ導入ではＰ２１  ｍＲＮＡの発現抑制を認めた（カラム２、５）のに対し、Ｒａｄ９  ｓｉＲＮＡ導入後はＰ２１  ｍＲＮＡの上昇を認めた（カラム３、６）（図３）。従ってＲａｄ９はＰ２１の転写に関し抑制的に働くことが示唆された。
さらに、ｐ５３とＲａｄ９の直接的な相互作用の有無を確認するために免疫沈降を行った。その結果、Ｒａｄ９とｐ５３は直接結合し、また紫外線照射後の経時変化を検討すると両者の結合自体には大きな変化がないものの、結合しているｐ５３のＳｅｒ１５でのリン酸化は５分から６時間で亢進した（図４）。従って、ｐ５３とＲａｄ９はＤＮＡ損傷のない時点で既に結合しているが、損傷応答により結合している蛋白がリン酸化修飾を受け、機能的な調節を受けていると考えられた。
頭頸部癌細胞株（ＭＭＳＩ−１）で免疫組織染色を行ったところ、コントロールの２９３細胞に比較して頭頸部癌細胞株（ＭＭＳＩ−１）では、Ｒａｄ９は核に強い発現を認めた。また、Ｒａｄ９と同じ領域に遺伝子を持つＣｙｃｌｉｎＤ１も強い発現を認めた。一方、Ｐ２１はごく軽度の発現を認めるのみであった。これらの結果からも頭頸部癌においてはＲａｄ９の強発現とチェックポイント異常があることが示唆された。
以上の事実から、Ｒａｄ９はｐ５３と相互作用しながらＰ２１を競合的に、かつ抑制的に制御していると考えられた。ＤＮＡ損傷を認識した後、通常の状態ではＲａｄ９はリン酸化修飾を受けながらｐ５３を制御し、Ｐ２１の転写を通じてチェックポイントの活性化と損傷修復へ働くと考えられる。公知の事実として、Ｒａｄ９のリン酸化によりチェックポイント蛋白Ｃｈｋ−１が活性化することも知られている。一方Ｒａｄ９がリン酸化されない状態、すなわち細胞の損傷が大きな状態では、Ｐ２１の転写がより一層抑制され、細胞周期が進行すると共にアポトーシスへ誘導すると考えられる。従って、Ｒａｄ９はリン酸化修飾を通じてｐ５３と相互作用し、ＤＮＡ損傷を受けた細胞の生と死を運命付ける重要な機能を持つといえる（図６Ｄ）。
さらにまた、Ｒａｄ９のリン酸化部位に変異のあるＲａｄ９を２９３細胞に導入し、アポトーシスの誘導を検討した。ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でプラスミドの発現を確認した。野生型（ＷＴ）に比較して９カ所のリン酸化部位を変異させたプラスミド（Ｒａｄ９−９Ａ）では、泳動度の大きなＲａｄ９が強く発現しているのが確認できた。紫外線照射２４時間後でのアポトーシスは約２倍（ＷＴ６．５％、Ｒａｄ９−９Ａ  １２．５％）となり、Ｒａｄ９の制御によりアポトーシスの誘導が促進することが示唆された。
要約すると、Ｒａｄ９とｐ５３とは、各蛋白質がリン酸化されるか否かに関わらず、結合するが、この結合を通して、Ｒａｄ９は、ｐ５３の生物学的作用（もしくは生物学的活性）を抑制的に調節している。Ｒａｄ９がリン酸化されない状態で、Ｒａｄ９がｐ５３と結合すると、Ｐ２１の転写が抑制され、かつ細胞周期が進行し、細胞のアポトーシスが誘導される。一方、細胞のＤＮＡ損傷に伴ってＲａｄ９がリン酸化されると、チェックポイント蛋白質であるＣｈｋ１が活性化されてチェックポイントが活性化され、並びに、Ｒａｄ９とｐ５３の結合が阻害、抑制又は解離すると、Ｐ２１の転写が増大し、細胞周期の抑制が起こり、これらの事象によりＤＮＡ損傷の修復へと導かれる。
本発明は、ＤＮＡが損傷を受けたとき、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を制御することによって、すなわち、今回得られた（Ｒａｄ９がｐ５３を抑制的に制御する）知見から、癌遺伝子Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子ｐ５３の結合を阻害、抑制又は解離することによって、癌抑制遺伝子ｐ５３の活性は強く発揮されることが期待され、癌医療のための診断方法、治療方法の開発へ応用可能となる。例えば、正常細胞が、紫外線、放射線などの有害な高エネルギー線の影響下でＤＮＡ損傷を受けたとき、ゲノムを安定化し癌化を防止する該ＤＮＡ損傷の修復のために本発明を利用することができるし、或いは、細胞が例えば癌細胞であるときには、本発明によりアポトーシスを誘導することができる。
したがって、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を制御する物質は、それが抑制的であろうと亢進的であろうと、癌の治療薬として有用である。本発明は、以下に説明するように、そのような癌治療薬の新規スクリーニング法を提供するとともに、抗体（例えば、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域を中和する抗Ｒａｄ９抗体又は抗ｐ５３抗体など）、核酸（例えば、Ｒａｄ９遺伝子の発現（或いは、転写及び翻訳）を抑制する、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ核酸、これらの核酸をコードするＤＮＡを発現可能に含むベクターなど）、或いは、Ｒａｄ９のｐ５３結合領域の模倣体（例えば、該結合領域由来の５以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上のアミノ酸を含むＲａｄ９蛋白質断片、その変異体など）、などを含む癌治療のための医薬組成物を提供する。
＜癌治療薬のスクリーニング＞
本発明は、その第１の態様において、試験系において、癌遺伝子産物Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子産物ｐ５３との存在下で薬剤候補を添加すること、Ｒｄａ９とｐ５３との結合を制御することができる生物活性薬剤を選抜することを含む、癌治療薬をスクリーニングするための方法を提供する。
本発明では、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を生じさせることが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系であれば、いずれの試験系も使用できる。このような試験系の１つの例は、Ｒａｄ９蛋白質とｐ５３蛋白質を用意し、生理的ｐＨ（ｐＨ７〜７．５、通常７．４）、塩類含有緩衝液中、室温〜約３７℃の温度で両蛋白質を混合するような系である。緩衝液は、例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）などであるが、これに限定されない。緩衝液は、蛋白質を安定化する物質、例えばグリセロール、糖類、Ｒａｄ９−ｐ５３結合に影響しない他の蛋白質、ポリペプチド又はペプチドなどを含んでもよい。
Ｒａｄ９は、哺乳動物由来のＲａｄ９、好ましくはヒトＲａｄ９である。ヒトＲａｄ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４５８４（配列番号１及び２参照）に示されており、ヒトＲａｄ９は３９２アミノ酸から構成されている。ヒト以外の哺乳動物のＲａｄ９は、例えばマウスＲａｄ９（ＮＭ＿０１１２３７）、ラットＲａｄ９（ＮＭ＿００１０３００４２）などを含む。本発明の方法で使用可能なＲａｄ９は、ヒトＲａｄ９が好ましいが、ヒトＲａｄ９のヌクレオチド又はアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する、かつヒトｐ５３と結合可能である、ヒトＲａｄ９ホモログ、変異体又は類似体であってもよい。
Ｒａｄ９は、リン酸化されていてもよいし、或いはリン酸化されていなくてもよい。Ｒａｄ９のリン酸化は、リン酸化酵素、例えばプロテインキナーゼＣδ（Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２００３，２２：１４３１−１４４１）、ＡＴＲ（Ｐ．Ｒｏｏｓ−Ｍａｔｔｊｕｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：２４４２８−２４４３７）、ｃｄｃ２（Ｒ．Ｐ．Ｓｔ．Ｏｎｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：２６６２０−２６６２８）などによって行うことができる。
ｐ５３は、哺乳動物由来のｐ５３、好ましくはヒトｐ５３である。ヒトｐ５３のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５４６（配列番号３及び４参照）に示されており、ヒトｐ５３は３９４アミノ酸から構成されている。ヒト以外の哺乳動物のｐ５３は、例えばマウスｐ５３（ＮＭ＿０１１６４０）、ラットｐ５３（ＮＭ＿０３０９８９）などを含む。本発明の方法で使用可能なｐ５３は、ヒトｐ５３が好ましいが、ヒトｐ５３のヌクレオチド又はアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する、かつヒトＲａｄ９と結合可能である、ヒトｐ５３ホモログ、変異体又は類似体であってもよい。
Ｒａｄ９及びｐ５３蛋白質の合成は、公知の遺伝子組換え技術を用いて、例えば次のようにして行うことができる。
ヒトＲａｄ９をコードするｃＤＮＡのクローニングは、例えばＢ．Ｈｏｗａｒｄら，（Ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ９＋ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｇｅｎｅ）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６，９３（２４）：１３８９０−１３８９５に記載されている。具体的には、ヒト胎児脳（ｈｕｍａｎ  ｉｎｆａｎｔ  ｂｒａｉｎ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ１８２７５Ｒ１８２７５）からｃＤＮＡライブラリーを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってヒトＲａｄ９  ｃＤＮＡを増幅することができる。Ｈｏｗａｒｄら（上記）によれば、ＰＣＲは、１μｇのＤＮＡ；１００ｐｍｏｌのプライマー；０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）；２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；及び１×Ｔａｑ緩衝液（ＢＲＬ）；全量１００μｌを用いる、９５℃で５分のプレインキュベーションのあと、９４℃で１分（変性），５７℃で３０秒（アニーリング），７２℃で２分（伸長）を１サイクルとして３５サイクル、その後７２℃１０分の最終伸長からなる。
ヒトｐ５３をコードするｃＤＮＡのクローニング及び発現は、例えばＥ．Ｈａｒｌｏｗら，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐ５３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８５，５（７）：１６０１−１６１０、及びＧ．Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉら，（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｐ５３  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐ５３  ｇｅｎｅ）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８４，２０：３２５７−３２６２によって記載される手法によって行うことができる。簡単に説明すると、例えばＨａｒｌｏｗら（上記）によって記載されるように、Ａ４３１細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）由来のｃＤＮＡライブラリーからクローン化するか、或いは、配列番号３に示されるｐ５３のヌクレオチド配列に基づいて作製されたプライマーを用いたＰＣＲによって上記ｃＤＮＡライブラリーから増幅することができる。ＰＣＲ条件は、上記と同様である。
蛋白質合成のために、適当なベクター／宿主系を用いるＤＮＡ発現が利用できる。ベクターにＲａｄ９又はｐ５３をコードするＤＮＡを挿入し、適当な宿主細胞に導入し、適当な培地にて培養し発現させる。必要に応じて、前記コードＤＮＡの５’末端にシグナルペプチドをコードするＤＮＡを連結することができる。また、前記ＤＮＡのいずれかの末端には、ヒスチジンタグ（例えばＨ６〜Ｈ１０タグ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼなどのタグや蛍光性、発光性蛋白質をコードするＤＮＡを連結し、目的蛋白質の精製を容易にすることができる。
ベクターは、細菌系ベクター、酵母系ベクター、真菌系ベクター、昆虫系ベクター、植物系ベクター及び動物系（例えば哺乳動物系、鳥類系など）ベクターを含む。ベクターの例は、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＢＲ系などのプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど、Ｔｉプラスミドベクター／アグロバクテリウム系などを含み、市販のベクターを好ましく使用できる。ベクターには、制御配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど、例えばＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｐ２１遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなど）、選択マーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシイン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ４、ＡＤＥ２などの栄養要求性相補遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）、リボソーム結合部位又はシャイン−ダルガルノ配列、複製起点、ターミネーター、マルチプルクローニングサイト、ポリＡシグナルなどのエレメントを適宜選択して含むことができる。
宿主細胞は、例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス菌などの細菌、酵母菌（例えばサッカロマイセス属、ピチア属、メタノール資化性酵母など）、担子菌、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞など）、植物細胞、哺乳動物細胞（例えば２９３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨｅＬａなど）を含む。
宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、ボンバードメント法、プロトプラスト又はスフェロプラスト法、リポフェクション法、ウイルス感染法などの公知の方法で行うことができる。
別の試験系には、真核細胞、例えば上に例示したような、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト由来の正常細胞系統又は腫瘍細胞系統を使用する系が含まれる。或いは、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌なども使用可能である。
真核又は原核細胞を使用する試験系の場合、例えば、Ｒａｄ９及びｐ５３をコードするＤＮＡを上に例示したようなベクターに発現可能に組み込み、このベクターを細胞に導入し、これらの蛋白質をコードするＤＮＡを同時発現しうるようにした系が含まれる。各ＤＮＡは、異なるベクターに別個に組み込まれてもよいし、或いは、同一のベクターに同時発現しうるような形態で組み込まれてもよい。ベクターには、上と同様のエレメントを含むことができる。エレメントとして、少なくともプロモーター、複製起点、ターミネーター、選択マーカー、マルチプルクローニングサイト及びリボソーム結合部位を含むことが好ましい。細胞を使用する試験系は、上記のように形質転換又はトランスフェクションされた細胞を適当な培地で培養することを含む。
真核細胞を使用する試験系の別の例は、Ｒａｄ９及びｐ５３をコードするゲノムＤＮＡを含む発現ベクターを用いる相同組換え法によって細胞ゲノムに導入して得られた系である。ここで、ゲノムＤＮＡとは、Ｒａｄ９又はｐ５３遺伝子を指し、エクソンとイントロンから構成される。この場合、使用する細胞は、前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞と同種のものが好ましい。すなわち、ヒトＲａｄ９及びｐ５３ゲノムＤＮＡであればヒト細胞系統を使用し、マウスＲａｄ９及びｐ５３ゲノムＤＮＡであればマウス細胞系統を使用するのがよい。ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどのウイルス由来の強力プロモーターの制御下に前記ゲノムＤＮＡを配置し、或いは放射線、光又は化学物質誘導性プロモーター（例えば、ｗｗｗ．ｎｉｒｓ．ｇｏ．ｊｐ／ｒｅｐｏｒｔ／ｎｉｒｓ＿ｎｅｗｓ／２００４１０／ｈｉｋ０１ｐ．ｈｔｍｌ；ｕｎｉｔ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｒｃｇ／ｒｃｇ−ｇｂ／ｓｇ２．ｈｔｍｌなど）の制御下に前記ゲノムＤＮＡを配置し、随意に転写を起こすことができるような系がより好ましい。また、このような細胞には、紫外線や放射線の照射によってＤＮＡ損傷を起こしたときにＰ２１の転写レベルが変化するようなヒトやマウス由来の細胞系統が含まれる。このような細胞には、例えばヒトＭＲＣ５細胞（ヒト肺線維芽細胞株；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、マウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞などが含まれる。
本発明で使用可能な試験系は、上記細胞のライセート（溶解物）であってもよい。
上で述べたような遺伝子組換え技術の具体的手法は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，２００３などに詳細に記載されており、本発明において利用可能である。
本発明の方法では、上記の試験系で、薬剤候補の存在下で、Ｒａｄ９とｐ５３を同時発現させ、これらの蛋白質間の結合の抑制又は亢進を測定する。
薬剤候補は、例えば、Ｒａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用し、これによってＲｄａ９とｐ５３との結合を制御することが予想される物質から選択され、特に限定されないが、例えば小分子（好ましくは有機小分子）、核酸、ペプチド、蛋白質、糖類、脂質などからなる群から選択されうる。
薬剤候補の例は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を抑制又は阻害する抗体、例えば前記結合に関わる領域を中和する抗体を含む。このような抗体は、Ｒａｄ９又はｐ５３に対する抗体又はその抗体フラグメントであり、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を抑制又は阻害することが可能であるものを選抜する。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ペプチド抗体又はそれらのフラグメント（Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２など）、或いは合成抗体（例えばＦｖ、ｓｃＦｖなど）などである。抗体又は抗体フラグメントの作製は、公知の方法で行うことができる。
ポリクローナル抗体は、蛋白質又はポリペプチド又はペプチドを、フロイントアジュバント又は非フロイントアジュバント、アルミニウム化合物（例えばａｌｕｍ）などのアジュバントと一緒に乳化形態で、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどの非ヒト哺乳動物に免疫し、約２週間置きにブーストし、血中の抗体力価を確認したのち、放血し、抗血清を得ることができる。必要に応じて、抗血清をさらに、硫安分画、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどで処理し、ＩｇＧ画分を得ることができる。
モノクローナル抗体は、上記のようにマウスなどの非ヒト動物に免疫したのち、脾臓、脾臓細胞又はリンパ節を摘出し、リンパ球とミエローマ細胞との融合を行い、ハイブリドーマを作製する。ＨＡＴ培地で抗体産生ハイブリドーマを選択し、非ヒト動物の腹腔内に移植するか、或いはハイブリドーマを適当な動物細胞培養に供して、ハイブリドーマを培養し、腹水又は培養液からモノクローナル抗体を回収し、抗体力価又は親和性（結合定数又は解離定数）を測定する。
ヒト抗体は、公知のヒト抗体産生哺乳動物（例えばＫＭマウス（キリンビール／メダレックス社）、Ｘｅｎｏマウス（アブジェニックス社）、ヒト抗体産生ウシ（キリンビール／ヘマテック社）など）に免疫し、抗血清から得ることができる。
ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を用いて、マウス抗体の可変領域由来の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をコードするＤＮＡと、ヒト可変領域をコードするＤＮＡとを結合し、ベクターに組み込み、哺乳動物細胞に形質転換して得ることができる（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．らＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，１９９１；Ｃａｔｅｒ，Ｐ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１１４９−１１５４，１９９２；及びＳａｔｏ，Ｋ．，らＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５１−８５６，１９９３など）。
薬剤候補の別の例は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上、８以上、１０以上或いは１５以上、例えば２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体である（図７Ａ）。このような断片は、ｐ５３への結合についてＲａｄ９蛋白質と拮抗可能なアンタゴニスティックな（ポリ）ペプチド又は作用性アゴニスティック（ポリ）ペプチドである。なお、変異体は、該Ｒａｄ９蛋白質断片の配列において１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加からなる変異を含むペプチドである。或いは、変異体は、該Ｒａｄ９蛋白質断片の配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、より好ましくは９７％以上、９８％以上の同一性を有する配列を含むペプチドである。例えば、置換は、構造的、疎水的又は電気的性質が類似したアミノ酸間の保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換には、例えば酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、非極性の疎水性アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン）、或いは、極性の非荷電性アミノ酸（セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン）間の置換が含まれる。
薬剤候補のさらに別の例は、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ核酸、又はそれの核酸を含むベクターＤＮＡである。
アンチセンス核酸は、Ｒａｄ９  ｍＲＮＡ配列に相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ或いはその断片である。Ｒａｄ９  ｍＲＮＡ配列は、例えば配列番号２によってコードされるヌクレオチド配列、又は配列番号１に示されるコード領域のヌクレオチド配列、に対応するＲＮＡ配列である。断片のサイズは、１５塩基以上から全長未満であり、好ましくは２５塩基から１００塩基である。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）核酸は、Ｒａｄ９遺伝子の発現を抑制する小分子ＲＮＡであり、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）などを含む。これらのＲＮＡｉ核酸は、そのサイズが１８〜２５塩基であり、二本鎖ＲＮＡからなる。ｓｉＲＮＡは、Ｒａｄ９遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列及びその相補的配列からなり、一方、ｍｉＲＮＡは、Ｒａｄ９遺伝子の遺伝子間領域（非コード領域、例えばイントロン領域）に対応する部分配列及びその相補的配列からなる。前駆体ｍｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖の間にステムループ配列（例えば天然ｍｉＲＮＡ由来の配列）を含むことができる。これらの核酸は、標的ＲＮＡの切断又は標的ＲＮＡの翻訳抑制を行う活性を有している。Ｒａｄ９遺伝子の配列又は遺伝子間配列に基づいて種々の配列を、例えばＤ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７７：７１７４−７１８１，２００３が記載するような標的部位の選択法（例えば、約５０％ＧＣ含量となる配列、開始コドンから５０〜１００塩基下流の配列など）に従って推定し、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成することができる。或いは、Ｒａｄ９遺伝子配列をヌクレアーゼでランダムに切断したのち、ｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡを合成して得られる核酸ライブラリーでもよい。
ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態であってもよい。このようなベクターは、タカラバイオ、コスモバイオ、Ｅｖｒｏｇｅｎ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社などから市販されており、このベクターにＲａｄ９  ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを組み込むことによって薬剤候補を作製することができる（例えば、ｐＳＩＮｓｉ、ｐＢＡｓｉ、ｐＵ６−ｓｉＲＮＡ、ｐＨ１−ｓｉＲＮＡ、ｐ２ＦＰ−ＲＮＡなど）。このようなベクターには、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）／Ｅプロモーター又はＳＶ４０初期プロモーター、カナマイシン耐性遺伝子／ネオマイシン耐性遺伝子、ポリＡシグナル、停止コドン、複製起点などのエレメントが含まれうる。
ＲＮＡｉに関しては、実験医学「ＲＮＡｉのサイエンス」Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４，２００４，羊土社；蛋白質核酸酵素ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１０：１３８１−１３８６，２００１，三共出版；現代化学，２００６年４月，５６−６０，東京化学同人（東京、日本）などに記載されている。
さらに別の薬剤候補には、小分子が含まれる。そのような小分子は、薬剤として知られている又は知られていない物質が含まれる。薬剤として公知の物質には、市販された又は市販されていない抗癌剤、例えばアルキル化薬（例えばシクロホスファミド、メルファラン、イソホスファミド、シクロホスファミド、ブスルファンなど）、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート、フルオロウラシル、テガフール、シタラビン、ヒドロキシカルバミドなど）、抗生物質系（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イダルビシンなど）、植物アルカロイド系（例えばビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセルなど）、白金製剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなど）などが含まれる。本発明の方法において、例えば、細胞として種々の異なる初代癌細胞又は腫瘍細胞株を使用するとき、どの抗癌剤が、どのタイプの癌に有効であるかを推定することができし、或いは非癌細胞を使用するときにも、Ｒａｄ９−ｐ５３結合の減少を指標にして抗癌効果のある薬剤を選抜することができる（図１１）。
生物活性薬剤の選抜は、Ｒａｄ９とｐ５３の結合又はその結合レベルを検出又は定量することによって行うことができる。例えば、試験系から経時的にサンプリングし、細胞の場合には細胞溶解後に、（非変性ポリアクリルアミドゲル）電気泳動、ウエスタンブロッティングなどの手法によって結合レベルの検出、定量を行うことができる。検出のために、抗Ｒａｄ９抗体及び抗ｐ５３抗体を使用することができる。これらの抗体は、Ａｌｅｘｉｓ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社などから入手可能である。或いは、試験系が細胞を含む場合、紫外線などの照射によりＤＮＡ損傷を引き起したのち、Ｐ２１の転写レベルを測定することによって候補薬剤を選抜することができる。この方法は、Ｐ２１の活性化がｐ５３依存的であるという知見に基づいている（Ｗ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、Ｃｅｌｌ  ７５：８１７−８２５，１９９３）。Ｒａｄ９とｐ５３の間の結合を抑制する薬剤は、ｐ５３依存性Ｐ２１活性化を増大し、これによってＤＮＡ損傷の修復に導く。対照的に、この結合を亢進する薬剤は、Ｐ２１活性化を抑制し、Ｒａｄ９の非リン酸化状態でアポトーシスを誘導する。この場合は、試験系の細胞が例えば腫瘍細胞であれば、そのアポトーシスが起こるため、生細胞数をカウントすることによって薬剤を評価することも可能である。
＜医薬組成物＞
本発明はまた、Ｒａｄ９蛋白質の生物機能又はＲａｄ９遺伝子の発現を制御し、これによってＲａｄ９とｐ５３との結合を増強又は抑制してｐ５３の活性を抑制又は増強することができる、かつＲａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用する生物活性薬剤を含む、癌を治療するための医薬組成物を提供する。
有効成分としての薬剤の例は、（１）Ｒａｄ９に対する抗体又は抗体フラグメント、（２）Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡ、（３）Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するＲＮＡｉ核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡ、（４）Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片又はその変異体を含む。
上記の（１）から（４）の薬剤の例及び作製は、上述のとおりである。
薬剤の例は、Ｒａｄ９に対するヒト抗体又はヒト化抗体である。このような抗体は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域のエピトープを認識する抗体であることが好ましく、Ｒａｄ９に対する抗体の中から、上記の試験系を用いて、結合を抑制する抗体を選択することによって容易に得ることができる。
薬剤の別の例は、Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来する５以上、好ましくは８以上、１０以上又は１５以上、例えば２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上のアミノ酸残基を有するＲａｄ９蛋白質断片、或いはその変異体である。このような断片は、ｐ５３との結合について、Ｒａｄ９と競合的にｐ５３に結合しうるペプチド又はポリペプチドである。Ｒａｄ９を適当なプロテアーゼで切断してランダムなペプチド又はポリペプチドを作製し、上記試験系に掛けて、Ｒａｄ９とｐ５３との結合を抑制するアンタゴニスティックな（ポリ）ペプチド、或いはＲａｄ９と類似の活性をもつアゴニスティックな（ポリ）ペプチドを選択することができる。Ｒａｄ９蛋白質断片の例は、配列番号４１の塩基配列によってコードされるポリペプチド（変異型（ｍｔ１）Ｒａｄ９）、配列番号４２の塩基配列によってコードされるポリペプチド（変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９）、配列番号４３の塩基配列によってコードされるポリペプチド（変異型（ｍｔ３）Ｒａｄ９）、配列番号４４の塩基配列によってコードされるポリペプチド（変異型（ｍｔ４）Ｒａｄ９）、配列番号４５の塩基配列によってコードされるポリペプチド（変異型（ｍｔ５）Ｒａｄ９）などを含む。さらに、変異体は、該Ｒａｄ９蛋白質断片の配列において１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加からなる変異を含むペプチドである。或いは、変異体は、該Ｒａｄ９蛋白質断片の配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、より好ましくは９７％以上、９８％以上の同一性を有する配列を含むペプチドである。置換の例は、上記の保存的置換を含む。
薬剤のさらに別の例は、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するアンチセンス核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡ、或いは、Ｒａｄ９遺伝子の転写及び発現を抑制するＲＮＡｉ核酸又は該核酸を含むベクターＤＮＡである。上記のとおり、これらのＲＮＡｉ核酸は、そのサイズが約１８〜約２５塩基であり、二本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを包含する。ｓｉＲＮＡは、Ｒａｄ９遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列及びその相補的配列からなり、一方、ｍｉＲＮＡは、Ｒａｄ９遺伝子の遺伝子間領域に対応する部分配列及びその相補的配列からなり、ヘアピン構造を有する。これらの核酸は、標的ＲＮＡの切断又は標的ＲＮＡの翻訳抑制を行う活性を有している。Ｒａｄ９遺伝子の配列又は遺伝子間配列（例えば配列番号４１〜４５に示される塩基配列）に基づいて種々の配列を、例えばＤ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７７：７１７４−７１８１，２００３が記載するような標的部位の選択法（例えば、約５０％ＧＣ含量となる配列、開始コドンから５０〜１００塩基下流の配列など）に従って推定し、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成することができる。
ｓｉＲＮＡの例は、限定されないが、以下の配列に対応するオリゴリボヌクレオチドである。
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本発明で使用されるｓｉＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよく、一本鎖の場合にはアンチセンス鎖であり、二本鎖の場合にはセンス鎖とアンチセンス鎖からなる。これらの鎖は、安定性を確保するために、その３’末端にオーバーハング、例えばＴＴからなるジヌクレオチドを含むことができる。
本発明の医薬組成物における薬剤の量は、特に限定されないが、１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。
投与形態は、液体形態又は固体形態のいずれでもよい。固体形態には、凍結乾燥形態を含み、使用直前に、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、リンゲル液などに溶解してもよい。或いは、薬剤をリポソームに封入してもよい。リポソームとしては、細胞内に薬剤が移行しやすいようにするために、正電荷リポソーム（例えば正電荷コレステロールなど）が好ましく使用できる（中西守ら，蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，１５９０−１５９６，１９９９，共立出版（東京、日本）；Ｔ．Ｓ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４４１，１１１−１１４，２００６）。
投与する方法は、経口又は非経口投与、好ましくは非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所投与などを含む。局所投与としては、患部に直接注入する方法が含まれる。
医薬組成物には、有効成分のほかに、担体（例えば、希釈剤及び賦形剤）、及び添加剤を含むことができる。添加剤は、安定剤、保存剤、界面活性剤、緩衝剤、結合剤などの医薬業界で通常使用されるような剤を含む。希釈剤には、例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、リンゲル液などを含む。
癌としては、悪性腫瘍、転移性癌などを含み、以下のものに限定されないが、例えば肺癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、口腔癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、大腸癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、骨癌、舌癌などが含まれる。
以下に、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。
【実施例】
【０００６】
＜材料と方法＞
細胞培養
ヒト胚性腎臓由来の細胞株２９３を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＵＶ照射のために、６０％〜７０％コンフルエントの単層細胞をＰＢＳで洗浄し、殺菌ランプ（ＧＬ−１５；ＮＩＰＰＯ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）が放出するＵＶＣを照射した。対照細胞を、照射細胞と同様に、しかし照射なしで、ＵＶＣ曝露源に取り込んだ。ＵＶに曝露後、指定された時間に細胞を検杳した。免疫蛍光染色のために、カバースリップ上で成長させた２９３細胞を１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、２×１０分間ＰＢＳで洗浄し、氷上で０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で５分間透過させた。サンプルを、１５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ中で室温、３０分間ブロックした。サンプルを、抗γＨ２ＡＸ抗体及び抗Ｒａｄ９抗体と一緒に１６時間インキュベートし、３×５分間ＰＢＳ中で洗浄し、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８第２抗体及び抗ウサギＣｙ３第２抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに室温、１．５時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中、３×５分間洗浄し、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。サンプルをＤＡＫＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ）を用いて固定した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０デジタルカメラとＤＰｍａｎａｇｅｒソフトウエアを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡を用いて蛍光画像を撮った。定量分析のために、対物１００倍の倍率で画像処理中に目視でフォーカスを数えた。単一実験では、少なくとも１００細胞まで、細胞を計数した。アポトーシスアッセイのために、２９３細胞を２０Ｊ／ｍ２のＵＶに曝露した。４％ホルムアルデヒドによる固定とＤＡＰＩによる染色後に、有糸分裂細胞を視覚化し、蛍光顕微鏡を用いて計数した。明瞭な凝集クロマチン及び／又は断片化核をもつ細胞がアポトーシス細胞であると決定した。
抗体及びプラスミド
マウス抗Ｒａｄ９抗体（Ａｌｅｘｉｓ）、抗Ｃｈｋ１抗体、抗リン酸化Ｃｈｋ１抗体（Ｓｅｒ−３１７）及び抗ｐ５３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗リン酸化Ｈ２ＡＸ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び抗リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。
本発明者らは、野生型Ｒａｄ９プラスミド、及び、従来記載されたものと同じ以下の未標識Ｒａｄ９突然変異体、すなわち、１）Ｒａｄ９−Ｓ２７２Ａ（先に同定されたＤＮＡ損傷誘導リン酸化部位であるＳｅｒ−２７２がＡｌａに変換された）、２）Ｒａｄ９−９Ａ（Ｓｅｒ−２７２，Ｓｅｒ−２７７，Ｓｅｒ−３２８，Ｓｅｒ−３３６，Ｓｅｒ−３４１，Ｓｅｒ−３５５，Ｓｅｒ−３７５，Ｓｅｒ−３８０及びＳｅｒ−３８７を含むすべてのリン酸化部位が、Ａｌａ残基に変換された）、並びに、３）Ｒａｄ−８Ａ（Ｓｅｒ−２７２を保持するがすべての残りのリン酸化部位がすべてＡｌａ残基に変換された）を用いた（Ｐ．Ｒｏｏｓ−Ｍａｔｔｊｕｓら，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４４２８−２４４３７）。
ＦＬＡＧで標識したｈＲａｄ９発現ベクターは、次の手法で作製した。ＦＬＡＧで標識したｈＲａｄ９発現ベクターを作製するために野生型、あるいはリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドをＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｃｌｅｎｔａｑシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲをかけ増幅を行った。その際、５’−ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  Ｇ−３’（配列番号３３）および５’−ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ−３’（配列番号３４）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。増幅したＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを切り出しゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製した試料を制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩで切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧベクターのクローニング部位に結合させ、ＦＬＡＧで標識したｈＲａｄ９発現ベクターを作製した。
ＷＷＰ−Ｌｕｃ−Ｐ２１プロモーターベクター（Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ博士から恵与された；Ｗ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら，（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：８１７−８２５）を、ルシフェラーゼアッセイのために使用した。Ｈｕｓ１及びＲａｄ１の発現プラスミド（Ｓ．Ｌ．Ｘｉａｎｇら，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８７，９３２−９４０）を、ルシフェラーゼアッセイのために使用した。ｐｃＤＮＡ−ｐ５３発現プラスミドは、Ｊ．Ｙｏｋｏｔａ博士から恵与された（Ｙ．Ｂ．Ｐａｒｋら，（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．１３３，１０５−１１１）。
Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来するＲａｄ９蛋白断片の発現ベクター作製法
野生型Ｒａｄ９プラスミドをＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｃｌｅｎｔａｑシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲにかけ増幅を行った。その際、下記の（１）と（Ａ）および（Ｂ）と（２）、（Ｃ）と（Ｄ）、（Ｃ）と（Ｅ）、（１）と（Ｅ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
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増幅したＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを切り出しゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製した試料を制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩで切断した後、上記ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧベクターのクローニング部位に結合させ、Ｒａｄ９蛋白断片発現ベクターを作製した。
増幅されたＰＣＲ産物（Ｒａｄ９蛋白質欠失変異体をコードするＤＮＡ）は、下記のＤＮＡ配列によってコードされている。
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トランスフェクション
プラスミドのトッラスフェクションのために、２９３細胞を、製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いてトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ導入のために、ヒトＲａｄ９及びヒトｐ５３に対する二本鎖ｓｉＲＮＡをＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。２９３細胞を、２４時間間隔で２回、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いてｓｉＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。示されるように、２回目の導入後、細胞サンプルを集めた。
ＲＴ−ＰＣＲ
２９３細胞をＵＶで処理した。ＩＳＯＧＥＮプロトコル（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用いてＲＮＡを抽出した。１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ中で細胞を濯ぎ、室温で５分間インキュベートしたのち、０．２ｍｌのクロロホルムを添加した。懸濁液を１５秒間攪拌し、２分間保存し、遠心により２相に分離した。ついで、上の水相を０．５ｍｌのイソプロピルアルコールと混合し、室温で１０分間インキュベートした。遠心によりＲＮＡをペレット化し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄した。ＲＮＡをジエチルピロカーボネート処理水に再懸濁し、濃度を３２０ｎｍで測定した。ＲＴのために、５μｇのＲＮＡを１μＬのオリゴｄＴ、１μＬの各１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び６μＬのジエチルピロカーボネート処理水と一緒に合わせた。この混合物を６５℃、５分間インキュベートし、２μＬの１０×逆転写酵素第１鎖バッファー、４μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＬの０．１Ｍジチオトレイトール、１μＬのジエチルピロカーボネート処理水、１μＬのＲＮアーゼ及び０．２μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴと一緒にした。ＲＴ混合物を４８℃で５０分間、ついで７０℃で１５分間インキュベートした。得られたｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。Ｐ２１を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドは、３３５ｂｐの増幅産物について５’−ＡＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＧＴ−３’（上流；配列番号５）及び５’−ＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡ−３’（下流；配列番号６）（Ｅ．Ｚａｐａｔａら，（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２，１３４３−１３５３）を使用した。また、Ｇ３ＰＤＨを増幅するために、オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（上流；配列番号７）及び５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＴＡ−３’（下流；配列番号８）が４５１ｂｐの増幅産物のために使用された（Ａ．Ｔａｎａｋａら，（２００１）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１７，８９−９８）。Ｐ２１のＰＣＲ条件は、９４℃１分の初期変性、その後の、９４℃８秒、５３℃３０秒及び７２℃１分を含んだ。３７サイクル後、ＰＣＲ産物は通常、電気泳動で検出可能であった。Ｇ３ＰＤＨについては、ＰＣＲ条件は、９４℃１分の初期変性、その後の、９４℃１０秒、６０℃１５秒及び７２℃１分を含んだ。２８サイクル後、ＰＣＲ産物は通常、電気泳動で検出可能であった。各ＤＮＡに対応するバンドの強度は、デンシトメトリー分析（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって定量された。
蛋白質研究
ウエスタンブロッティングのために、２９３細胞を溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１０％グリセロール及び０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて抽出した。透明な抽出物をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファー中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜に転写し、標準法でイムノブロッティングを行い、増強化学ルミネッセンスシステム（ＥＣＬ，Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でシグナルを検出した。各蛋白質に対応するバンドの強度は、デンシトメトリー分析（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって定量した。免疫沈降のために、２９３細胞をＩＰ−溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％ＮＰ４０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて回収し、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを用いて予め透明にした後の細胞溶解物の５００μｇサンプルを、３μｇの特異抗体と一緒に一晩インキュベートした。抗原−抗体複合体をプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上に固定化し、ビーズを溶解バッファー中で５回洗浄した。結合蛋白質を煮沸で溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングに掛けた。
プロモーター研究
ルシフェラーゼプロモーターアッセイのために、トランスフェクトした細胞を完全成長培地中で２４時間培養し、ルシフェラーゼアッセイのために回収し、入手可能なプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがって実施した。ルシフェラーゼ活性は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ（Ｔｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ）ルミノメーター上で測定された。電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のために、ｐ５３／Ｒａｄ９結合部位を含む相補的オリゴを商業的に合成した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これらのプローブの末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベルした。２９３細胞の核蛋白質抽出物（１０μｇ）を、２×１０５ｃｐｍのプローブと、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１２％グリセロール及び０．１μｇの非特異的競合体ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する結合バッファー中でインキュベートした。結合反応混合物を氷上に集めて、室温、３０分間インキュベートした。ＤＮＡ−蛋白質複合体を５％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ゲルを真空で乾燥し、オートラジオグラフィーのために使用した。スーパーシフト実験のために、抗体を、４℃、２０分間核抽出物と一緒に予めインキュベートした。競合結合反応のために、２００ｎｇの冷プローブをインキュベーション中に添加した。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイのために、約１×１０６細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、１％ホルムアルデヒドで３７℃１０分間固定し、２００μｌのＳＤＳ−溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１％ＳＤＳ］中に再懸濁し、氷上で１０秒間パルスを用いて３回音波処理してクロマチンを２００〜１，０００ｂｐの平均長に破壊した。音波処理した細胞懸濁液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各上清２０μＬを、１μＬの５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌの添加後に６５℃４時間過熱し、これをインプットとして使用した。上清の残部を、１μｇの抗Ｒａｄ９抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は抗ｐ５３抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれかを含む３００μＬのクロマチン免疫沈降希釈バッファー［１６７ｍＭ  ＮａＣｌ、１６．７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＳＤＳ、及び１．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］に添加した。４℃１６時間のインキュベーション後に、混合物を、１２μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの存在下で１時間１５μＬのプロテインＡアガロースビーズと一緒に振とうした。免疫沈降物を４種の異なるバッファーで洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３及び１％ＳＤＳで溶離した。溶出物を加熱処理し、プロテイナーゼＫで消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、最後に、２０μＬのＴＥ（ｐＨ８）に再懸濁した。ＰＣＲには、２μＬの最終懸濁液を用い、またヒトＰ２１ｗａｆ１プロモーターの種々の領域に対応するプライマーを使用した。下流Ｐ２１ｗａｆ１プロモータープライマーは、５’−ＧＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＴＡＧＡＧＧ���３’（配列番号９）及び５’−ＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＴＴＣＡ−３’（配列番号１０）であり（Ｇ．ＫｏｕｔｓｏｄｏｎｔｉｓとＤ．Ｋａｒｄａｓｓｉｓ，（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，９１９０−９２００）、また、上流Ｐ２１ｗａｆ１プロモータープライマーは、５’−ＣＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１１）及び５’−ＴＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１２）である（Ｇ．ＫｏｕｔｓｏｄｏｎｔｉｓとＤ．Ｋａｒｄａｓｓｉｓ，（２００４））。
＜実施例１＞  Ｐ２１はＵＶ処理直後に活性化される
数個の従来の研究から、Ｐ２１などのｐ５３下流遺伝子の発現増大に導く哺乳動物細胞において、遺伝子毒性ストレスが、野生型ｐ５３蛋白質の安定化及び一時的蓄積を誘導することが示された（Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８，３２３−３３１；Ｗ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら，（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５，８１７−８２５）。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、初めに、Ｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルを調べた。ＵＶでの処理後、ＵＶ照射後の種々の時間に２９３細胞を回収した。全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを、逆転写反応を用いて合成した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、各ＤＮＡに対応するバンドの強度をデンシトメトリー分析によって定量した。図１Ａに示されたような結果が得られた。Ｐ２１ｍＲＮＡ発現のレベルは、ＵＶ照射の３０分後に実質的に増加し、１時間目に最大レベルに達したことが観察された。ｍＲＮＡレベルは低いものであったが、ＵＶへの曝露の７２時間後まで依然として検出可能であった。各時点に等しい蛋白質を用いて、ウエスタンブロッティングを行い、ｐ２１蛋白質の経時変化を調べた。図１Ｂに示されるように、ｐ２１の実質的な蓄積が、ＵＶへの曝露の３時間、１２時間及び２４時間後に認められた。
これらの結果から、Ｐ２１転写及びｐ２１蛋白質蓄積が起こり、Ｇ１／ＳチェックポイントがＵＶ照射後に活性化されて、ＵＶ誘導ＤＮＡ損傷から細胞が保護された。これらの結果に基づいて、以下の実験は、ＵＶ照射後１０分と６時間との間の時点で行われた。
＜実施例２＞  Ｐ２１活性化に対するｈＲａｄ９とｐ５３の競合
Ｐ２１プロモーター−ルシフェラーゼレポーター系を用いて、ヒトＲａｄ９（以下、ｈＲａｄ９という）によるｐ２１の制御の機能的態様を評価した。野生型Ｒａｄ９プラスミドのほかに、Ｒａｄ９リン酸化突然変異体を用いて、ｈＲａｄ９のリン酸化がＳ期又はＧ２／Ｍチェックポイント活性化のために必要であるため（Ｐ．Ｒｏｏｔｓ−Ｍａｔｔｊｕｓら，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４４２８−２４３７）、このリン酸化がＰ２１の活性化のために必要であるかどうかを調べた。野生型又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９の発現を確認するために、ウエスタンブロッティングを行った。
野生型Ｒａｄ９は、低移動蛋白質画分と一緒に十分検出可能に発現されており（図２Ａ、レーン２）、このことは、Ｒａｄ９のリン酸化型を示している。Ｒａｄ９−Ｓ２７２Ａもまた、類似の低移動蛋白質画分とともによく発現されたことから、この蛋白質はおそらくＲａｄ９の異なるリン酸化状態に対応し、Ｓ２７２残基でのリン酸化を欠くものであるだろう（図２Ａ、レーン３）。Ｒａｄ９−８Ａ及びＲａｄ９−９Ａのトランスフェクションの結果、野生型Ｒａｄ９と比べてリン酸化が低いものであった（図２Ａ、レーン２、４及び５）が、このことは、リン酸化欠損型突然変異体が過剰発現されることを示している。
その後、ルシフェラーゼに融合したＰ２１のプロモーター領域（ＷＷＰ−Ｌｕ−Ｐ２１プロモーター）を、２９３細胞中にプラスミドを用いて同時トランスフェクションした。インサート非含有の発現ベクターがプロモーター非含有のｐＧＬ３−ｂａｓｉｃと結合する際には、バックグランドレベルは低い（図２Ｂ、カラム１）。Ｐ２１プロモーターは、転写開始部位から５’側約２ｋｂ上流領域内に少なくとも２つのｐ５３結合コンセンサス配列を含むため（Ｗ．Ｓ．ＥＬ−Ｄｅｉｒｙら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，２９１０−２９１９）、ｐ５３の過剰発現は、予想通り、ルシフェラーゼ活性を誘導した（図２Ｂ、カラム９）。野生型Ｒａｄ９の過剰発現もまた、ｐ５３ほどは強くはないが、ルシフェラーゼ活性を誘導した（図２Ｂ、カラム５）。ｐ５３と野生型Ｒａｄ９の共発現により、高レベルのルシフェラーゼ活性が誘導された（図２Ｂ、カラム１０）が、そのレベルは、それぞれの蛋白質が過剰産生されるときに観察されたレベルの中間であった。Ｒａｄ９からＰ２１プロモーターへの活性伝達特性は報告されている（Ｙ．Ｙｉｎら，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １５，８８６４−８８６９）が、本実験は、ｈＲａｄ９がＰ２１の顕著な転写活性を発揮させないようであるということを示した。
各リン酸化欠損型プラスミドを用いて測定されたルシフェラーゼ活性は、野生型Ｒａｄ９を用いたときの活性に匹敵した（図２Ｂ、カラム５〜８）。これに対して、ｐ５３とともに共発現されたときには、リン酸化欠損型Ｒａｄ９突然変異体を用いたときの活性は、野生型Ｒａｄ９とともに共発現したときよりも低かった（図２Ｂ、カラム１０〜１３）。このことから、ｈＲａｄ９は、ｐ５３依存性Ｐ２１活性化に関与していることが示された。
さらに、ｈＲａｄ９とは対照的に、ｈＨｕｓ１及びｈＲａｄ１はｐ５３のような強い活性を示し、これは、チェックポイント活性化におけるＨｕｓ１及びＲａｄ１の役割（Ｍ．Ａ．Ｂｕｒｔｅｌｏｗら，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２５９０３−２５９０９；Ｖ．Ｐ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚら，２００３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １８，１６３３−１６３８）と適合し、並びに、それらがＰ２１の転写の活性化に間接的又は直接的な役割を果たす可能性を示唆している。
＜実施例３＞  内因性ｈＲａｄ９のノックダウンがＰ２１の転写を増大する
紫外線（ＵＶ）への曝露に応答してＰ２１を転写するｈＲａｄ９の役割を定めるために、ｓｉＲＮＡを用いて内因性ｈＲａｄ９をノックダウンした。ウエスタンブロットによる各内因性ｐ５３又はＲａｄ９蛋白質のノックダウンの確認後（図３Ａ）、細胞をｓｉＲＮＡで処理し、２０Ｊ／ｍ２ＵＶに曝露し、全ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｐ２１  ｍＲＮＡのレベルを測定した。図３Ｂに示されるように、Ｒａｄ９  ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；製品Ｎｏ．ｓｃ−３６３６４）のトランスフェクションにより、Ｐ２１  ｍＲＮＡのレベルが増加した（カラム３）が、ｐ５３  ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；製品Ｎｏ．ｃｓ−２９４３５）によるトランスフェクションでは、モック処理と同程度のレベルのＰ２１  ｍＲＮＡを示した（カラム２）。ＵＶ処理後、モック処理細胞は、ＵＶ（−）対照と比較してＰ２１  ｍＲＮＡの増加を示し（カラム４）、また、ｐ５３  ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの結果、Ｐ２１  ｍＲＮＡの明らかな低下が生じた（カラム５）。ｐ５３  ｓｉＲＮＡのノックダウンと対照的に、Ｒａｄ９  ｓｉＲＮＡノックダウンにより、ＵＶ曝露後、Ｐ２１  ｍＲＮＡの増加が生じた（カラム６）。このレベルはＵＶ（−）実験と類似したレベルであり、このことから、Ｒａｄ９がＵＶ誘導Ｐ２１応答の基本プラットフォームの付与に関与している可能性が示唆される。
上記の結果から、ｈＲａｄ９のノックダウンによりＰ２１のトランスアクチベーションが生じることが示され、また、ｈＲａｄ９がＵＶ照射によって誘導されたＤＮＡ損傷に応答して、Ｐ２１のｐ５３依存性トランスアクチベーションのモジュレーションにある役割を演じている可能性が示唆され、さらにまた、ｈＲａｄ９が、ルシフェラーゼアッセイによって示されるように、Ｐ２１プロモーターのｐ５３結合コンセンサスを介してｐ５３依存性ｐ２１活性化との機能的連関に関与していることが示唆された。
＜実施例４＞  ｐ５３とＲａｄ９との結合
上記の実験から得られたデータから、ｈＲａｄ９はｐ５３依存性Ｐ２１プロモーターの活性化を抑制すること、ｈＲａｄ９のノックダウンによりｐ５３依存性Ｐ２１プロモーターの活性化が刺激されることが示された。したがって、内因性ｈＲａｄ９が内因性ｐ５３とどのように関係しているかを調べた。
免疫沈降を行い、ｈＲａｄ９がｐ５３と相互作用するかどうかを確認した。簡単に説明すると、２９３細胞を回収し、細胞溶解物を抗Ｒａｄ９抗体又は抗ｐ５３抗体と一晩インキュベートした。抗原−抗体複合体をプロテインＧセファロースビーズに固定化し、結合した蛋白質を煮沸により溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに掛けた。図４Ａに示されるように、ｈＲａｄ９はｐ５３と共に免疫沈降した。Ｒａｄ９のリン酸化がｐ５３との結合に影響するかを調べるために、野生型又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、免疫沈降を行った。
その結果、Ｒａｄ９がｐ５３と結合すること、そして、この結合は野生型である又はリン酸化欠損型突然変異体（Ｒａｄ９−Ｓ２７２Ａ、Ｒａｄ９−８Ａ及びＲａｄ９−９Ａ）であるに関わらないことが判明した（図４Ｂ）。ｈＲａｄ９とｐ５３との結合がＵＶ照射後一時的に変化するのかどうかを確かめるために、経時変化を調べた。
図４Ｃに示されるように、Ｓｅｒ−１５でのｐ５３のリン酸化はＵＶ照射後に増加したが、ｈＲａｄ９との相互作用はほとんど変化がなかった。さらに、ｐ５３の他のリン酸化部位（Ｓｅｒ−６、Ｓｅｒ−９、Ｓｅｒ−２０、Ｓｅｒ−３７、Ｓｅｒ−４６、Ｓｅｒ−３９２）も調べたが、いずれもｈＲａｄ９とｐ５３との相互作用に無関係であった。
上記の結果から、ｈＲａｄ９とｐ５３との結合は、ｈＲａｄ９及びｐ５３の各々のリン酸化に影響を及ぼさないが、これらの蛋白質の結合表面のアミノ酸残基がリン酸化事象に関与する可能性は否定できないことが示された。
＜実施例５＞  ｈＲａｄ９のリン酸化はｐ５３のＤＮＡ結合親和性に影響する
ＵＶ処理後のＰ２１プロモーターのｐ５３コンセンサス結合部位に対するｈＲａｄ９／ｐ５３の親和性の変化を調べた。従来報告されたように、ｈＲａｄ９は、Ｐ２１プロモーター中のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列に特異的に結合し、転写レベルのＰ２１を調節する（Ｙ．Ｙｉｎら，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １５，８８６４−８８６９）。本実験では、ＥＭＳＡを実施し、ｈＲａｄ９のｐ５３コンセンサス特異的結合を確認した。また、ＵＶ処理後のプロモーター結合の変化を評価するためにＥＭＳＡを行った。
そのために、従来報告されたようなｐ５３結合配列を含むオリゴプローブを使用した（Ｙ．Ｙｉｎら，（２００４））。これらのプローブの末端を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでラベルした。２９３細胞から抽出した核蛋白質を、結合バッファー中で、オリゴプローブとインキュベートした。ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡ−蛋白質複合体を分離し、ゲルをフィルムに露出した。スーパーシフト実験のために、抗体を核抽出物とプレインキュベートした。また、競合結合反応のために、インキュベーションの間に冷プローブを添加した。
図５Ａに示されるように、その結果から、下流ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列を含む３０ｂｐオリゴと、２９３細胞からの核抽出物とのインキュベーションによりバンドのシフトが生じたことがわかる（レーン２）。このバンドは明らかにＵＶ照射後に増加した（レーン６）。このバンドは、競合体として過剰の冷３０ｂｐオリゴを添加したときには排除されたことから、特異的な蛋白質−プローブ相互作用が存在することを示している（レーン３）。また、Ｐ２１プロモーターのバンドは、抗Ｒａｄ９抗体の添加により消失したことから、ｈＲａｄ９がＰ２１プロモーターのｐ５３コンセンサス結合部位に結合することが示された（レーン５及び８）。抗Ｒａｄ９抗体の添加と対照的に、抗ｐ５３抗体の添加は、本実験では上記バンドの消失又はスーパーシフトがほとんどないことを示した（レーン４及び７）。これらの結果は、本実験では抗ｐ５３抗体の特異性によるものであり、従来の研究（Ｙ．Ｙｉｎら，（２００４））で観察されたスーパーシフトとは対照的である、と推定される。
上記の結果から、ｈＲａｄ９は、Ｐ２１プロモーターのｐ５３コンセンサス結合部位に結合すること、この結合はＵＶ照射に対して増加することが証明された。
ｐ５３結合部位に対するｈＲａｄ９／ｐ５３複合体の親和性がＵＶ照射後に増大するかどうか、また、ｈＲａｄ９のリン酸化が結合部位に対する親和性に影響を与えるかどうか、を評価するためにＣｈＩＰアッセイを行った。２９３細胞を野生型又はリン酸化欠損型Ｒａｄ９プラスミドで形質転換し、ＵＶ照射で処理するか又は未処理とした。処理後、細胞を１％ホルムアルデヒドで架橋し、音波処理してクロマチンを平均長２００〜１，０００ｂｐに破壊した。音波処理された細胞懸濁液を、抗Ｒａｄ９抗体又は抗ｐ５３抗体を含むクロマチン免疫沈降希釈バッファーに添加した。１６時間インキュベーションしたのち、混合物をプロテインＡアガロースと一緒に振とうした。免疫沈降物を溶出し、溶出物からＤＮＡを抽出した。ヒトＰ２１ｗａｆ１プロモーターの種々の領域に相当するプライマーを用いるＰＣＲで上記ＤＮＡを増幅した。
図５Ｂ及び図５Ｃに示されるように、上記の結果から、ｈＲａｄ９とｐ５３はＵＶ処理後に増加様式で下流部位に結合すること、ただし、結合部位に対する親和性の低いＲａｄ９−９Ａプラスミドでトランスフェクトされた細胞を除く全ての場合に上記結合が認められた。Ｒａｄ９の結合は、ｐ５３の結合よりもかなり小さいように思われたが、これは、Ｒａｄ９抗体の特性の結果であると認められる。上流部位でｈＲａｄ９（図５Ｄ）及びｐ５３（図５Ｅ）で類似の結果が得られた。これらの結果から、ｈＲａｄ９のリン酸化はコンセンサス部位に対するｐ５３親和性の調節にある役割を演じていることが示された。
＜実施例６＞  ｈＲａｄ９のリン酸化はＤＮＡ損傷後のフォーカス形成に必要である
従来の研究から、ＤＮＡ損傷が生じると９−１−１複合体がＤＮＡ損傷フォーカスを形成することが示されている（Ｖ．Ｐ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１８，１６３３−１６３８；Ｍ．Ａ．Ｂｕｒｔｅｌｏｗら，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２６３４３−２６３４８；Ｉ．ＨｉｒａｉとＨ．Ｇ．Ｗａｎｇ、（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２５７２２−２５７２７）。Ｒａｄ９のリン酸化がＤＮＡ損傷部位のフォーカス形成に影響するかを調べるために、免疫組織化学を行った。カバースリップ上で成長させた２９３細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定した。ＦＣＳ中でサンプルをブロックし、抗γＨ２ＡＸ抗体又は抗Ｒａｄ９抗体とともに一晩インキュベートし、抗マウスＡｌｅｘａ４８８第２抗体及び抗ウサギＣｙ３第２抗体と一緒にインキュベートした。つぎに、細胞をＤＡＰＩで染色した（図６Ａ）。
図６Ｂに示されるように、その結果から、ＵＶ曝露の１時間後に、モック処理した、又は野生型Ｒａｄ９プラスミドもしくはＲａｄ９−Ｓ２７２Ａプラスミドをトランスフェクトした、２９３細胞がそれぞれ８０％、８６％及び８０％の割合でフォーカス形成したことが示された。一方、Ｒａｄ９−８Ａプラスミド及びＲａｄ９−９Ａプラスミドをトランスフェクトした細胞は、それぞれ３４％及び３２％でフォーカス形成した。これらの結果から、Ｒａｄ９のリン酸化は、ＵＶ処理でＤＮＡが損傷を受けたのち、フォーカス形成に必要であることが示された。これらのデータは、Ｐ２１転写の調節が、ｈＲａｄ９のリン酸化欠損型突然変異体を使用した実験でのｈＲａｄ９のフォーカス形成に類似していることを示唆した。Ｐ２１はＧ１／Ｓチェックポイントに関与するが、従来の報告から、ｈＲａｄ９のリン酸化がＨＵ、ＩＲ及びＵＶ処理後にＳからＧ２のチェックポイントにおけるＣｈｋ１活性化のために必須であることが報告されているし（Ｐ．Ｒｏｏｓ−Ｍａｔｔｊｕｓら，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４４２８−２４４３７）、また、Ｃｈｋ１が、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｇｌｎに富むドメインに位置する２つの残基（Ｓｅｒ−３１７及びＳｅｒ−３４５）でリン酸化されることが報告されている（Ｊ．Ｂａｒｔｅｋら，（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，７９２−８０４）。本実験では、ＵＶ照射後のアポトーシス誘導の全経時変化を評価するために、Ｓｅｒ−３１７でのＣｈｋ１のリン酸化の経時変化をウエスタンブロッティングで調べた。アポトーシスの誘導は、細胞をＵＶに曝露し４％ホルムアルデヒドで固定したのち、２９３細胞を使用し、かつＤＡＰＩでの蛍光染色を用いて評価した。明暸に凝集したクロマチン及び／又は断片化した核を含む細胞がアポトーシス細胞であると決定した。
図６Ｃに示されるように、その結果から、Ｓｅｒ−３１７でのＣｈｋ１のリン酸化の増大がＵＶ照射の１２時間以上あとに明暸であったことが示された。その後、ＵＶで細胞を処理すると、アポトーシスが誘導され、ＵＶ照射の３６時間後に、細胞の約２１％がアポトーシスによって死滅したが、対比的にＵＶ未照射の細胞では２％であった。これらの結果から、ｐ５３のリン酸化、Ｐ２１  ｍＲＮＡ及びｐ２１蛋白質の増加が、ＤＮＡ損傷の１〜３時間後に認められ、ＵＶ照射の３６時間後に明らかにアポトーシスが増大したが、これはＣｈｋ１がリン酸化された直後であった。このことから、Ｇ１／Ｓチェックポイントから放出された損傷細胞は、ＳからＧ２のチェックポイントによって生存可能であり、アポトーシスの誘導を誘発し、Ｒａｄ９はＧ１／Ｓでのみ、しかしＳ又はＧ２で、チェックポイントの広範な機能を発揮する可能性があることを示唆した。
＜実施例７＞  Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来するＲａｄ９蛋白断片の発現ベクターの作製
上記Ｒａｄ９とｐ５３との結合領域に由来するＲａｄ９蛋白断片の発現ベクター作製法の項に従って、Ｒａｄ９蛋白質断片である変異型（ｍｔ１、ｍｔ２、ｍｔ３、ｍｔ４及びｍｔ５）Ｒａｄ９（それぞれ配列番号４１〜４５の塩基配列を有する）発現プラスミド（レポーター遺伝子ＦＬＡＧを含む）を作製し、その発現を、変異型（ｍｔ１〜ｍｔ５）Ｒａｄ９の各々をＭＲＣ５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）に導入しウエスタンブロット（抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）を使用）によって確認した（図７Ｂ）。
＜実施例８＞  変異型Ｒａｄ９がＲａｄ９−ｐ５３結合及びｐ２１発現に及ぼす影響
培養ＭＲＣ５細胞（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養）に野生型（ＷＴ）と変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドを導入し、免疫沈降法（抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）と抗ｐ５３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用）でｐ５３とＲａｄ９の結合を調べた。変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９を導入後はコントロール（ｍｏｃｋ）に比較してｐ５３と内因性Ｒａｄ９（矢印）の結合が減少した（図８Ａ）。
培養ＭＲＣ５細胞に野生型（ＷＴ）、変異型（ｍｔ１〜５）Ｒａｄ９プラスミドの各々を導入し、ウエスタンブロットでｐ２１遺伝子の発現を調べた。その結果、変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドを導入した場合、ｐ２１の発現が亢進した（図８Ｂ）。
上の結果から、変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドの導入により、ｐ５３と内因性Ｒａｄ９（矢印）の結合が減少するとともにｐ２１の発現が亢進し、造腫瘍性が減少（２次発癌が減少）することが示された。
＜実施例９＞  癌細胞への変異型Ｒａｄ９プラスミド導入時のアポトーシスの変化
頭頸部扁平上皮癌細胞株ＭＭＳＩ−１（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養）に野生型（ＷＴ）、変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドの各々を導入し、免疫蛍光染色でプラスミドの発現を確認し、ＤＡＰＩによる染色でアポトーシスを検討した。その結果、コントロール（ｍｏｃｋ）に比較して特に変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドを導入した場合、アポトーシスが有意に亢進した（１．６％と４．３％）（図９Ａ）。
一方、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養）を用いて上記と同様の実験を行った。その結果、ＭＭＳＩ−１と同様、変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドを導入するとアポトーシスが有意に亢進した（４．０％と１１．６％）（図９Ｂ）。
上の結果から、癌細胞に変異型（ｍｔ２）Ｒａｄ９プラスミドを導入するとき、アポトーシスが亢進し、癌細胞増殖に抑制的に働くことが示された。
＜実施例１０＞  癌細胞へのＲａｄ９  ｓｉＲＮＡ導入時のアポトーシスの変化
頭頸部扁平上皮癌細胞株ＭＭＳＩ−１及び子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞にＲａｄ９  ｓｉＲＮＡ（配列番号１８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって導入し、ＤＡＰＩによる染色でアポトーシスを検討した。その結果、コントロール（モック）と比較していずれもＲａｄ９  ｓｉＲＮＡを導入するとアポトーシスが有意に亢進した（ＭＭＳＩ−１で２．８％と７．８％、ＨｅＬａで３．０％と１２．０％）（図１０））。
上の結果から、癌細胞にＲａｄ９  ｓｉＲＮＡを導入するとアポトーシスが亢進し、癌細胞増殖に抑制的に働くことが示された。
＜実施例１１＞  抗癌剤によるｐ５３−Ｒａｄ９結合の変化
培養ＭＲＣ５細胞に、エトポシド（ＶＰ１６）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）を投与し、４時間後に回収、免疫沈降で内因性のｐ５３−Ｒａｄ９結合を検討した（ＭＲＣ５の内因性の蛋白結合を検討しました）。その結果、エトポシド、カンプトテシン、シスプラチンでは両者の結合が亢進する一方、ドキソルビシンでは両者の結合が減少した（図１１）。
したがって、ドキソルビシンにより両者の結合は減少し、結合変化による薬剤効果が期待できると考えられる。
＜実施例１２＞  抗Ｒａｄ９抗体によるｐ５３−Ｒａｄ９結合の変化
［３５Ｓ］で標識したｐ５３蛋白質（［３５Ｓ］ｐ５３）とＧＳＴタグを結合させたＲａｄ９蛋白質（ＧＳＴ−Ｒａｄ９）をＮＥＴＮ緩衝液中で試験管内で反応させた。その結果、［３５Ｓ］ｐ５３とＲａｄ９の結合していないＧＳＴ蛋白単独を発現させた場合は両者の結合は認められない（レーン１）が、［３５Ｓ］ｐ５３とＧＳＴ−Ｒａｄ９を反応させると両者の結合が確認された（レーン２）（図１２）。一方、ＧＳＴ−Ｒａｄ９を抗Ｒａｄ９抗体で反応させた後に［３５Ｓ］ｐ５３と反応させると、ＧＳＴ−Ｒａｄ９と［３５Ｓ］ｐ５３の結合は減少した（レーン３）。
したがって抗Ｒａｄ９抗体を投与することによりＲａｄ９−ｐ５３結合は減少し、中和抗体により両者の結合制御が可能になると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、Ｒａｄ９とｐ５３との結合の制御を通して、ｐ５３の生物機能を制御し、これによって、例えば癌の増殖や転移の抑制が可能になる。また、このような結合を制御する、癌治療薬としての生物活性薬剤のスクリーニングも可能になる。
本発明により、Ｒａｄ９とｐ５３との結合の制御を通して、ｐ５３の生物機能を制御し、これによって、例えば癌の増殖や転移の抑制が可能になる。また、このような結合を制御する、癌治療薬としての生物活性薬剤のスクリーニングも可能になる。癌のタイプの６０％以上と関わりをもつｐ５３の活性を制御することが可能な薬剤は、癌治療に有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月14日(2008.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
癌遺伝子産物Ｒａｄ９と癌抑制遺伝子産物ｐ５３とが存在する試験系において薬剤候補を添加し、該薬剤候補の中から、リン酸化されたＲａｄ９又はリン酸化されないＲａｄ９とｐ５３との直接的結合を制御することができる生物活性薬剤を選抜することを含む、癌治療薬をスクリーニングするための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
Ｒａｄ９蛋白質の生物機能又はＲａｄ９遺伝子の発現を制御し、これによって、リン酸化されたＲａｄ９又はリン酸化されないＲａｄ９とｐ５３との直接的結合を増強又は抑制してｐ５３の活性を抑制又は増強し、癌細胞のアポトーシス又はＤＮＡ損傷の修復を誘導することができる、かつＲａｄ９遺伝子、その転写産物又は翻訳産物と相互作用する生物活性薬剤を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【国際調査報告】
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