(57)【要約】  本発明は、野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする改変パラミクソウイルス；改変パラミクソウイルスを作製する方法；前記作製方法により作製された改変パラミクソウイルスを提供する。  また、本発明は、細胞表面マーカーに特異的に結合するペプチドにウイルスの融合タンパク質が連結もしくは結合したキメラタンパク質；該キメラタンパク質をコードする核酸；該キメラタンパク質を細胞表面に発現しうる動物細胞；該キメラタンパク質をウイルス粒子表面に発現している改変パラミクソウイルス；組織ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする、改変パラミクソウイルス。
【請求項２】
受容体結合タンパク質がＨＮタンパク質であり、パラミクソウイルスがＨＶＪである、請求項１記載のウイルス。
【請求項３】
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む、請求項１または２記載のウイルス。
【請求項４】
請求項１または２記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
【請求項５】
改変パラミクソウイルスを作製する方法であって、以下のステップ：
（１）パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物細胞に導入するステップ、
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項６】
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、該タンパク質をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
パラミクソウイルスがＨＶＪである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
受容体結合タンパク質がＨＮタンパク質である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＨＶＪのＨＮタンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５記載の方法により得られた、改変ＨＶＪ。
【請求項１１】
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む動物細胞。
【請求項１２】
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、請求項１１記載の動物細胞。
【請求項１３】
配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されている、キメラタンパク質。
【請求項１５】
Ｆタンパク質由来のシグナルペプチド、および哺乳動物細胞で機能し得るシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドがＮ末端側に、直接またはリンカーペプチドを介して、さらに付加されたものである、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
Ｆタンパク質由来のシグナルペプチドを含む請求項１５記載のキメラタンパク質であって、該シグナルペプチドが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、キメラタンパク質。
（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２９で示されるアミノ酸配列
（４）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２９で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
【請求項１７】
パラミクソウイルスがＨＶＪである請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１７記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４９０〜５６５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４９０〜５６５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列
（４）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
【請求項１９】
細胞表面分子に特異的に結合するペプチドが該分子に対する単鎖抗体である、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
単鎖抗体がデスモグレイン３に対する抗体である、請求項１９記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
以下の（１）または（２）の、請求項２０記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチド部分がプロセシングにより切断されてウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在してデスモグレイン３に結合することができる、タンパク質
【請求項２２】
細胞表面分子に特異的に結合するペプチドがトランスフェリンである、請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項２３】
以下の（１）または（２）のアミノ酸配列を含む、請求項２２記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、ウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在して細胞膜上に発現されてトランスフェリン受容体と結合する機能を有するアミノ酸配列
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項２５】
以下の（１）または（２）の塩基配列からなる、請求項２４記載の核酸。
（１）配列番号２０に示す塩基配列
（２）配列番号２０に示す塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有し、デスモグレイン３に結合することができるタンパク質をコードする塩基配列
【請求項２６】
請求項２４記載の核酸を発現可能な形態で含み、該核酸がコードするキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドを細胞表面に発現し得る動物細胞。
【請求項２７】
請求項１４記載のキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをウイルス粒子表面に提示する改変パラミクソウイルス。
【請求項２８】
ＨＶＪである、請求項２７記載の改変パラミクソウイルス。
【請求項２９】
野生型に比べてＨＮタンパク質が低減または欠損されていることをさらなる特徴とする、請求項２８記載の改変パラミクソウイルス。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
【請求項３１】
組織ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法であって、以下の（１）〜（３）のステップを含む方法。
（１）パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、０〜３０残基からなるリンカーペプチド、さらにそのＮ末端に所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入すること
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させること
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離すること
【請求項３２】
核酸が動物細胞で機能し得るプロモーターの制御下に置かれ、且つ該細胞で機能し得るシグナルペプチドをコードする核酸が付加された形態である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスがＨＶＪである請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体結合タンパク質の量が低減した改変パラミクソウイルス、および受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を用いる改変パラミクソウイルスの作製方法に関する。具体的には、ＨＮタンパク質の量が低減した改変ＨＶＪ、およびｓｉＲＮＡを用いる改変ＨＶＪの作製方法に関する。
また、本発明は、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子機能解析や遺伝子治療のために、培養細胞や生体組織に遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法、非ウイルス法が開発されてきた（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２６０、ｐ．９２６−９３２、（１９９３）；Ｌｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌ．６、ｐ．１１２９−１１４４（１９９５））。一般に細胞へ遺伝子を導入するためには、ウイルス法が効果的である。しかし、ウイルスベクターを用いる方法は、親ウイルス由来の遺伝子導入とその発現の可能性、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変の可能性があり、安全性の面で問題がある。一方、リポソーム等を用いる非ウイルス法の多くは、細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より低いが、培養細胞や生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比べて劣る傾向にある。
ウイルスは変異を繰り返すことにより、最初は宿主を死滅させる病原体であっても、次第に宿主と共存をはかれるように機能を変え、それによって生き延びることが出来ていると考えられる。したがって１つのウイルスに限っても自然界には多くの変異体が存在し、それらの研究によって、ウイルスの持つ機能の分子レベルでの解明がなされてきたと言えるであろう。このことは基礎生物学的な観点から価値があるばかりでなく、抗ウイルスワクチンの開発などの医学的な見地からも重要視されてきた。自然発生的なウイルス変異株の分離は、時間がかかるばかりでなく、全くの偶然によってしか望みの変異株を得ることができない。
ＨＶＪ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ；Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）は、エンベロープを有し、その表面にはヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有する、パラミクソウイルス科に属するウイルスである。ＨＶＪは（−）鎖のＲＮＡをゲノムにもち、宿主細胞に感染後、（−）鎖から（＋）鎖ＲＮＡが複製され、それからウイルスタンパク質が大量に生産されウイルス粒子が作られて出芽し、新たなウイルス粒子ができあがる。ＨＶＪはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され（岡田、微研ジャーナル、１、ｐ．１０３−１１０、（１９５８））、細胞膜融合活性（以下融合活性とする）の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきた。融合はまずＨＮ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ）タンパク質が細胞表面のアセチル型シアル酸を認識し、シアリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、次いでＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。このＨＮタンパク質は赤血球凝集活性、溶血活性を有し、血液中に投与されたときは一時的に血液凝固能の低下を引き起こす。またこのウイルスは遺伝子導入やドラッグデリバリーのベクターとしても開発されているが、標的分子を挿入したＨＶＪを作製してもＨＮタンパク質が存在すると、特異性が減弱されることも予想される。
従って、このようなＨＮタンパク質等の受容体タンパク質による毒性が改善された、安全性の高いウイルスベクターの開発が望まれている。
また、ＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ；Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）は細胞融合をおこすマウスパラインフルエンザウイルスとして有名であり、その機能を利用して組み換えセンダイウイルスベクターやＨＶＪエンベロープベクター、ＨＶＪ−リポソームなどの遺伝子導入ベクターやドラッグデリバリーシステムが開発されてきた。その融合はＨＮ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ）タンパク質が細胞表面のアセチル型シアル酸を認識し、シアリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、次いでＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。したがってシアル酸をもつほとんど全ての細胞が融合の対象となる。ベクターとしては普遍性に富むが、一方では特異性がなく細胞毒性のある分子の導入には適さない。ベクター改良の大きな課題の１つは特異性の増強であり、具体的には標的導入を可能にすることである。すでに本発明者らのグループではアミノ基をもつ脂質を一部用いてリポソームを作製し、そのアミノ基に化学修飾した抗体分子を架橋剤を用いて結合させたｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅを作製し、これを不活性化ＨＶＪと融合してＨＶＪ−ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅを開発することに成功した（Ｔｏｍｉｔａ，Ｎら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．４、ｐ．５２７−５３５（２００２））。ラット腎臟のメサンジウム細胞のＴｈｙ−１抗原を認識するモノクローナル抗体を用いて作製したＨＶＪ−ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅを末梢血管から注入すると、本来肝臓や脾臟の網内系に集まるＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅが左右の腎臟のメサンジウムに集積し、９０％の糸球体に蛍光オリゴ核酸の導入が可能になった。このことはたとえＨＮタンパク質が存在していても、標的分子を挿入し、それが最初に認識されて特異的な細胞に結合すれば、そこで融合がおこり、特異的な導入が可能であることを示唆している。しかしこの抗体のようなタンパク質をリポソームに結合させる方法は複雑で、安定な結果を得るためには熟練を要する。
従って、組織・細胞特異性が高いウイルスベクター、および簡便かつ安定して該ウイルスベクターを得る方法の開発が望まれている。例えば、Ｈａｌｌａｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、ｖｏｌ．６５（１２）、ｐ．５２９２−５３００（２００５）には、麻疹ウイルスのＨタンパク質のＣ末端にインテグリンαｖβ３に結合するＭ２８Ｌエチスタチン分子を融合させるべくウイルスゲノムを改変し、インテグリンαｖβ３を有する癌細胞をターゲティングするウイルスを作製したことが報告されている。さらにまた、種々のウイルスベクターを改変してターゲティングウイルスベクターを作製する試みがなされている（特表２００１−５１５４９３号公報、特開２００２−３２０４７５号公報、特表２００５−５３２０７５号公報、特開２００２−３３０７７４号公報）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の第１の目的は、安全性の高いベクターとして利用可能な改変パラミクソウイルス及び該改変パラミクソウイルスを簡便に得る方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、薬剤を部位特異的に送達しうるパラミクソウイルスベクターおよびその新規作製方法を提供することである。
本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＶＪのＨＮタンパク質のＲＮＡをｓｉＲＮＡでノックアウトすれば、その抑制効果が有効である間に作られるウイルスにはＨＮタンパク質が欠損しており、さらにこのようなＨＮタンパク質の欠損したウイルスは赤血球凝集活性が低減していることを見出した。
更に、本発明者らは、センダイウイルスのような融合ウイルスは細胞外にウイルス粒子が放出される際、宿主細胞膜上に発現しているウイルス遺伝子由来の表面タンパク質を取り込むことに着目し、ウイルスゲノムではなく宿主細胞を改変して、ターゲティング分子を細胞外ドメインにもつウイルス遺伝子由来の表面タンパク質をその細胞膜上に発現させ、該細胞にウイルスを感染させてウイルス粒子を回収することを発想した。そこで、センダイウイルスの融合（Ｆ）タンパク質の膜貫通ドメインをコードする遺伝子と、表皮基底層に発現するタンパク質に対する単鎖抗体フラグメントの遺伝子とを含むキメラ遺伝子を導入した細胞を作製し、該細胞に野生型のセンダイウイルスを感染させると、該抗体フラグメントの抗原結合能を有するキメラＦタンパク質をウイルス表面上に提示したセンダイウイルスが得られることを見出した。
以上のような知見に基づき、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
［１］野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする、改変パラミクソウイルス。
［２］受容体結合タンパク質がＨＮタンパク質であり、パラミクソウイルスがＨＶＪである、［１］記載のウイルス。
［３］パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む、［１］または［２］記載のウイルス。
［４］［１］または［２］記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
［５］改変パラミクソウイルスを作製する方法であって、以下のステップ：
（１）パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物細胞に導入するステップ、
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ、
を含む、上記方法。
［６］パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、該タンパク質をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、［５］記載の方法。
［７］パラミクソウイルスがＨＶＪである、［５］記載の方法。
［８］受容体結合タンパク質がＨＮタンパク質である、［７］記載の方法。
［９］ＨＶＪのＨＮタンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、［８］に記載の方法。
［１０］［５］記載の方法により得られた、改変ＨＶＪ。
［１１］パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む動物細胞。
［１２］パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、［１１］記載の動物細胞。
［１３］配列番号３、４および５に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、ＨＶＪのＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ。
［１４］パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されている、キメラタンパク質。
［１５］Ｆタンパク質由来のシグナルペプチド、および哺乳動物細胞で機能し得るシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドがＮ末端側に、直接またはリンカーペプチドを介して、さらに付加されたものである、［１４］記載のキメラタンパク質。
［１６］Ｆタンパク質由来のシグナルペプチドを含む［１５］記載のキメラタンパク質であって、該シグナルペプチドが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、キメラタンパク質。
（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２９で示されるアミノ酸配列
（４）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２９で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
［１７］パラミクソウイルスがＨＶＪである［１４］記載のキメラタンパク質。
［１８］ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、［１７］記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４９０〜５６５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４９０〜５６５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列
（４）配列番号１１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
［１９］細胞表面分子に特異的に結合するペプチドが該分子に対する単鎖抗体である、［１４］記載のキメラタンパク質。
［２０］単鎖抗体がデスモグレイン３に対する抗体である、［１９］記載のキメラタンパク質。
［２１］以下の（１）または（２）の、［２０］記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、シグナルペプチド部分がプロセシングにより切断されてウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在してデスモグレイン３に結合することができる、タンパク質
［２２］細胞表面分子に特異的に結合するペプチドがトランスフェリンである、［１４］記載のキメラタンパク質。
［２３］以下の（１）または（２）のアミノ酸配列を含む、［２２］記載のキメラタンパク質。
（１）配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、ウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在して細胞膜上に発現されてトランスフェリン受容体と結合する機能を有するアミノ酸配列
［２４］［１４］〜［２３］のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
［２５］以下の（１）または（２）の塩基配列からなる、［２４］記載の核酸。
（１）配列番号２０に示す塩基配列
（２）配列番号２０に示す塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有し、デスモグレイン３に結合することができるタンパク質をコードする塩基配列
［２６］［２４］記載の核酸を発現可能な形態で含み、該核酸がコードするキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドを細胞表面に発現し得る動物細胞。
［２７］［１４］記載のキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをウイルス粒子表面に提示する改変パラミクソウイルス。
［２８］ＨＶＪである、［２７］記載の改変パラミクソウイルス。
［２９］野生型に比べてＨＮタンパク質が低減または欠損されていることをさらなる特徴とする、［２８］記載の改変パラミクソウイルス。
［３０］［２７］〜［２９］のいずれか記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
［３１］組織ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法であって、以下の（１）〜（３）のステップを含む方法。
（１）パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、０〜３０残基からなるリンカーペプチド、さらにそのＮ末端に所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入すること
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させること
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離すること
［３２］核酸が動物細胞で機能し得るプロモーターの制御下に置かれ、且つ該細胞で機能し得るシグナルペプチドをコードする核酸が付加された形態である、［３１］記載の方法。
［３３］ウイルスがＨＶＪである［３１］記載の方法。
本発明の改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の量が低減しており、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などを軽減することができるので、安全性の高いベクターとして利用可能である。本発明の改変パラミクソウイルスの作製方法によれば、このような改変パラミクソウイルスを簡便に得ることができる。
本発明のキメラタンパク質を有するパラミクソウイルスは、特定の組織・細胞に対する特異性が高く、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターとして有用である。また、該ウイルスの融合関連タンパク質、特に受容体結合タンパク質を欠損させることにより、さらに特異性の高いウイルスベクターとすることも可能である。また、本発明のターゲティングパラミクソウイルスの作製方法によれば、簡便かつ安定して、所望の組織または細胞をターゲティング可能なパラミクソウイルスを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの設計を示す。
図２は、ＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの効果を示す。
図３は、ｓｉＲＮＡによるＨＮノックダウンの経時変化を示す。
図４は、ｓｉＲＮＡ最適濃度の検討を示す。
図５は、ＨＮ−ｓｉＲＮＡのＨＮｍＲＮＡ特異性を示す。
図６は、ｓｉＲＮＡのウイルスタンパク質発現への影響を示す。
図７は、出芽ウイルス粒子数の検討を示す。
図８は、赤血球凝集活性の比較を示す。
図９は、等ウイルス粒子あたりの赤血球凝集活性を示す。
図１０は、組織ターゲティングＦタンパク質発現ベクターの作製を示す。
図１１は、ＧＦＰ融合Ｆタンパク質細胞内局在検討を示す（×１８００）。
図１２は、ＧＦＰ融合Ｆタンパク質の発現をウェスタンブロット法により検出した図である（上段）。下段には、それぞれのキメラタンパク質の模式図を示す。
図１３は、ウェスタンブロット法によるＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＨＶＪ上のＧＦＰ−Ｆの検出を示す。
図１４は、ｓｃＦｖ融合Ｆタンパク質発現ベクターの作製を示す。
図１５は、ｓｃＦｖ融合Ｆタンパク質のｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔでの発現を免疫染色により検出した図である。左から順に９６０倍、１９８０倍および２４６０倍で顕微鏡で観察した。
図１６は、ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔを用いて産生したＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＨＶＪ上のＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆの検出を示す。左図（Ｍｙｃ）は、抗Ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロット、中図（ＴＭＤ）はＦタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。右図は電子顕微鏡による観察結果であり、倍率は、左下のパネルは４２０００倍、および右上のパネルは５６０００倍である。
図１７は、Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆキメラタンパク質のデスモグレイン３に対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。
図１８は、Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＨＶＪによるマウスケラチノサイトｔａｒｇｅｔｉｎｇを示す。左列はデスモグレインを発現（Ｄｓｇ３（＋））しているＰＡＭ細胞、中列および右列は、ともにデスモグレインを発現（Ｄｓｇ３（−））していないＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、野生型のＨＶＪ（上段）またはＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＨＶＪ（キメラＨＶＪ：下段）を作用させた結果である。ＰＡＭ細胞においてのみ、野生型に比してキメラＨＶＪの方が多量に細胞表面に存在していることがわかる。
図１９は、表皮細胞におけるＦタンパク質の免疫染色を示す。７型コラーゲンノックアウトマウスの腹部水疱部分の皮膚断片に、野生型のＨＶＪ（上段）またはＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＨＶＪ（キメラＨＶＪ：下段）を作用させた結果である。野生型に比してキメラＨＶＪの方が多量に存在していることがわかる。
図２０は、皮膚組織切片（断面）におけるＦタンパク質の免疫染色を示す（４００倍）。
図２１は、キメラＦ／Ｔｆ遺伝子発現ベクターの作製を示す。
図２２は、Ｆ／Ｔｆタンパク質を発現し、且つＨＮタンパク質を欠損したＨＶＪの作製を示す。
図２３は、ＨＮタンパク質及びＦ／Ｔｆタンパク質の発現をウェスタンブロット法により検出した図である。上段がＨＮタンパク質を、下段がＦ／Ｔｆタンパク質を、それぞれ示す。Ｗ：野生型ウイルス、Ｃ：キメラウイルス、ｓｉ：ｓｉＲＮＡ処理。
図２４は、ＨＥＫ２９３細胞へのＨＮ欠損ＨＶＪ又はＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪの感染を、Ｆタンパク質の発現を指標に示した図である。
図２５は、Ｈｅｌａ細胞へのＨＮ欠損ＨＶＪ又はＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪの感染を、Ｆタンパク質の発現を指標に示した図である。
図２６は、Ｈｅｌａ細胞への野生型ＨＶＪ又はＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪの感染を、Ｆタンパク質陽性細胞数を指標に示したグラフである。白カラムは野生型ＨＶＪを、黒カラムはＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪを、それぞれ示す。
図２７は、Ｈｅｌａ細胞へのＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪウイルス感染のトランスフェリンによる阻害を示す。Ｔｆ：トランスフェリン。
図２８は、Ｈｅｌａ細胞へのＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪウイルス感染を、Ｆタンパク質陽性細胞数を指標に示したグラフである。白カラムは野生型ＨＶＪを、黒カラムはＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪを、それぞれ示す。
図２９は、Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープの癌特異的なターゲティングを示すグラフである。Ｗ：野生型ＨＶＪウイルスより作製したウイルスエンベロープにＱｄｏｔを封入したもの。Ｃ：Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪウイルスエンベロープにＱｄｏｔを封入したもの。３回の独立した実験を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．改変パラミクソウイルス及びその作製方法
本発明は、野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする、改変パラミクソウイルス（以下、本発明の改変パラミクソウイルスＩともいう）を提供する。
本発明において用いることのできるパラミクソウイルスとしては、パラミクソウイルス科に属し、受容体結合タンパク質を有するパラミクソウイルスが挙げられる。受容体結合タンパク質を有するパラミクソウイルスとしては、センダイウイルス（ＨＶＪ）、シミアンウイルス（ＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）、ニューカッスル病ウイルス等が挙げられる。特に限定されないが、本発明において用いることのできるパラミクソウイルスは、好ましくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）である。
受容体結合タンパク質とは、標的細胞への結合に関するタンパク質であり、使用されるパラミクソウイルスの種類に応じて、ＨＮ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｔｉｎｇ）タンパク質、Ｈタンパク質、Ｇタンパク質等が挙げられる。本発明において量が低減している受容体結合タンパク質は、好ましくはＨＮタンパク質である。ＨＮタンパク質は、赤血球凝集活性、溶血活性等を有することが知られており、また、ウイルスの特異性を減弱すると考えられている。
本発明の改変パラミクソウイルスＩにおいては、受容体結合タンパク質の量が低減している。受容体結合タンパク質の量の低減とは、本発明の改変パラミクソウイルスＩの受容体結合タンパク質の発現レベルが、野生型のパラミクソウイルスのものと比し、多くともおよそ０．６倍（例えば、０．５倍、好ましくは０．３倍、より好ましくは０．２倍、最も好ましくは０．１倍）以下に低減していることを意味する。好ましくは、本発明の改変パラミクソウイルスＩにおいては、受容体結合タンパク質が発現していない。本発明の改変パラミクソウイルスＩの受容体結合タンパク質の遺伝子は、該タンパク質の発現レベルが低減している限り変異していても変異していなくてもよい。変異している場合、当該変異は受容体結合タンパク質の量の低減に関与していない。
本発明の改変パラミクソウイルスＩにおいては、好ましくは、受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含むことにより、野生型に比べて受容体結合タンパク質の量が低減している。受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸としては、後述の本発明の改変パラミクソウイルスＩの作製方法において導入され得る各種核酸が好ましく例示される。
本発明の改変パラミクソウイルスＩにおいては、受容体結合タンパク質の量が低減しているので、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などが軽減している。受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響とは、例えば、ＨＮタンパク質による赤血球凝集活性、溶血活性等が挙げられる。従って、本発明の改変パラミクソウイルスＩは、安全性の高いベクター（ウイルスエンベロープベクター等）として利用可能である。
本発明の改変パラミクソウイルスＩをベクターとして用いる場合、標的細胞への感染能力を増強するため、標的細胞表面に発現しているマーカータンパク質に特異的に結合するポリペプチド等の標的分子が該ウイルスに付加していてもよい。
本発明の改変パラミクソウイルスＩは、公知のいかなる手法を組み合わせて作製してもよいが、好ましくは以下の方法が例示される。
従って、本発明はまた、以下のステップを含む改変パラミクソウイルスＩを作製する方法（以下、本発明の方法ともいう）を提供する：
（１）パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物細胞に導入するステップ、
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ。
上記ステップ（１）では、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が用意される。
パラミクソウイルスとしては、上記と同様のものが挙げられ、好ましくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）である。また、受容体結合タンパク質としては、上記と同様のものが挙げられ、好ましくはＨＮタンパク質である。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の好ましい一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
本発明で用いられるアンチセンス核酸の長さは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの場合、生理条件下でパラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約８０％以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はパラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端コード部位までの間に位置することが望ましい。好ましくは５’末端からコード領域のＮ末端コード部位までの領域であり、最も好ましくは開始コドン近傍の塩基配列である。また、標的配列は、それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構造を形成しないようなものを選択することが好ましい。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の別の好ましい一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムである。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーへッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡへリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
ｓｉＲＮＡとしては、後述の通り自ら合成したものを用いることができるが、市販のものを用いてもよい。
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約３〜約１０塩基）のリンカーを介して連結したＲＮＡとして合成し、導入する動物細胞内のダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡがそれぞれ別個のＵ６やＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡがＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、ｓｉＲＮＡを形成させてもよい。
好ましくは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである。より好ましくは、該核酸は、ＨＶＪのＨＮタンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである。具体的に、ｓｉＲＮＡとしては、ＨＮ−８９９（配列番号３）、ＨＮ−１１４２（配列番号４）およびＨＮ−１４２７（配列番号５）で示される配列からなるものが好ましい。
核酸を導入する動物細胞としては、パラミクソウイルスが感染し、細胞内でパラミクソウイルス粒子を再構成する限り、任意の動物に由来する細胞であり得るが、哺乳動物に由来する細胞が好ましい。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどである。具体的には、サル腎由来のＣＶ−１細胞やＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞などが挙げられる。
核酸を動物細胞に導入する方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
上記ステップ（２）では、パラミクソウイルスを、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を導入した動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウイルスとしては、再構成能を有する限り特に限定されず、野生型パラミクソウイルスであっても改変パラミクソウイルスであっても良い。改変パラミクソウイルスの場合、当該改変は受容体結合タンパク質の量の低減に関与していない。
感染したパラミクソウイルスは、動物細胞内で受容体結合タンパク質の発現の低減したパラミクソウイルスとして再構成する。
複製されたパラミクソウイルス粒子の単離は自体公知の方法で行われ、例えば細胞培養上清を回収・遠心分離するなどの方法によりなされる。
このようにして作製された改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の発現が低減している。受容体結合タンパク質の量の低減とは、本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現レベルが、野生型のパラミクソウイルスのものと比し、多くともおよそ０．６倍（例えば、０．５倍、好ましくは０．３倍、より好ましくは０．２倍、特に好ましくは０．１倍）以下に低減していることを意味する。最も好ましくは、本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質が発現していない。
本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の量が低減しているので、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などが軽減している。特に、本発明の改変パラミクソウイルスは、赤血球凝集活性が低減されていることから、生体内に投与した際に、野生型パラミクソウイルスを投与した場合に比べて、赤血球凝集が起こりにくい。
したがって、本発明の改変パラミクソウイルスＩは、安全性の高いベクター（ウイルスエンベロープベクター等）として利用可能である。
２．キメラタンパク質およびそれをコードする核酸
本発明で用いられるキメラタンパク質は、パラミクソウイルス由来の表面タンパク質の膜貫通ドメインと所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとを含むキメラタンパク質である。パラミクソウイルス由来の表面タンパク質としては、パラミクソウイルス由来受容体結合タンパク質および融合（Ｆ）タンパク質（以下、これらを包括して融合関連タンパク質という場合がある）等が挙げられ、より好ましくはＦタンパク質であり、特に好ましくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）由来Ｆタンパク質である。例えば、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４９０〜５６５で示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号４８７〜５６５示されるアミノ酸配列、あるいはアミノ酸番号５０１〜５２１で示される膜貫通部位（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ，Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０４８５５参照）を含む、その部分配列である。本明細書において「膜貫通ドメイン」とは、膜貫通部位を含み、かつ、パラミクソウイルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれるのに必要な、該部位の近傍配列をさらに含む、ウイルス表面タンパク質の機能的部分を意味する。膜貫通部位を含むことにより、動物細胞内で発現し、細胞膜に輸送された該キメラタンパク質は、該膜タンパク質の膜外領域（本明細書においては、ウイルス表面タンパク質のウイルス粒子外に露出した領域を膜外領域と称する）を細胞外に提示した状態で細胞膜上にとどまる。本発明に用いる膜貫通ドメインの好ましい例としては、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインである、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４９０〜５６５に示す配列およびこれに実質的に同一な配列からなるペプチドが挙げられる。また、本発明に用いる膜貫通ドメインとして好ましい別の例としては、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインである、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４８７〜５６５に示す配列およびこれに実質的に同一な配列からなるペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同一な配列」とは、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質全長について後述されるのと同様の意味である。具体的には、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４９０〜５６５又はアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５、４、３または２個）のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、パラミクソウイルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれる能力を保持するペプチドも、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインに包含される。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをその一部として含む。ここで、「所望の細胞表面分子」とは、後述する本発明の改変パラミクソウイルスをターゲティングしたい細胞表面に存在する分子を意味する。細胞表面分子は、本発明の改変パラミクソウイルスが標的とする細胞の表面に発現している限り、特に限定されず、公知のいかなる細胞表面タンパク質、糖鎖、脂質等も全て含まれる。好ましくは、細胞表面分子は、特定の細胞種に特異的に発現している細胞表面タンパク質である。好ましい細胞表面分子としては、例えば、デスモグレイン３（表皮基底細胞に発現）、β２インテグリン（好中球、マクロファージに発現）、α４インテグリン（リンパ球、線維芽細胞に発現）、αＩＩｂβ３インテグリン（血小板、巨核球に発現）、葉酸受容体（癌細胞に発現）、トランスフェリン受容体（癌細胞に発現）、ＨＥＲ２（転移性乳癌細胞に発現）、ＥＧＦＲ（非小細胞性肺癌細胞に発現）、ＬＤＬＲ（肝細胞に発現）、ＣＤ２０（悪性リンパ腫に発現）、ＣＥＡ（膵臓癌に発現）、Ｇｐ１００（メラノーマに発現）、ＰＳＭＡ（前立腺癌に発現）、ＡＦＰ（原発性肝癌、卵黄嚢腫瘍に発現）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはデスモグレイン３又はトランスフェリン受容体である。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとしては、例えば、各種細胞表面レセプターに対するリガンド、例えば、インテグリン類に対するＲＧＤ配列を有するペプチド（例：エチスタチン、フィブロネクチン等）、トランスフェリン受容体に対するトランスフェリン等、あるいは各種細胞表面分子に対する抗体（例えば、単鎖抗体等の単一の核酸によりコードされ得る抗体分子が好ましい）等が挙げられる。例えば、細胞表面分子がデスモグレイン３の場合、細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとしては、デスモグレイン３を認識する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドは、上記表面タンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端に付加される。該ペプチドは、ペプチドリンカーを介して膜貫通ドメインのＮ末端に付加されてもよい。かかるペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基からなる任意の長さのペプチドであってよく、用いられる表面タンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に生来存在するアミノ酸配列を含む、またはこれからなるものであってもよい。好ましくは、１〜３０残基、より好ましくは、１〜２５、１〜２０、１〜１５または１〜１０残基、さらには１〜５残基の長さのものが最も好ましい。このリンカーは、当業者が、膜貫通ドメインをコードする遺伝子および細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをコードする遺伝子の塩基配列によって、これらをインフレームに連結するために挿入される場合もある。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、該キメラタンパク質をウイルス粒子表面に提示する改変パラミクソウイルスの作製のため、該ウイルス複製の宿主細胞として用いられ得る所定の動物細胞の細胞膜に輸送され得るような形態で、発現することが望ましい。従って、該キメラタンパク質は、好ましくはそのＮ末端に、該キメラタンパク質を構成するウイルス表面タンパク質由来のシグナルペプチド、好ましくはＦタンパク質由来のシグナルペプチドを含むか、あるいは該所定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルペプチドが付加されたものである。必要に応じて、該シグナルペプチドは、上記と同様のペプチドリンカーを、好ましくはそのＣ末端に含むこともできる。かかるペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基からなる任意の長さのペプチドであってよく、Ｆタンパク質の生来のシグナルペプチドのＣ末端側に生来存在するアミノ酸配列、すなわち成熟Ｆタンパク質のＮ末端部分の配列を含む、またはこれからなるものであってもよい。好ましくは、１〜３０残基、より好ましくは、１〜２５、１〜２０、１〜１５または１〜１０残基、さらには１〜５残基の長さのものが最も好ましい。公知の表面タンパク質のシグナルペプチドは、種々のタンパク質データベース上で公開されており、また、該タンパク質のアミノ酸配列をもとに、例えばＫｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法などに基づいて容易に予測することができる（そのような解析ソフトウェアも多数市販されており、ウェブサイト上で一般に利用可能である）。例えば、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質のシグナルペプチドは配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５で示される領域であり（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ，Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０４８５５参照）、本発明のキメラタンパク質は、該領域を少なくとも含んでいることが好ましく、配列番号１１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２９、１〜３０または１〜３５のいずれかで示される領域をＮ末端側に含んでいるものなどが挙げられる。また、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜２５又はアミノ酸番号１〜２９で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５、４、３または２個）のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含み、かつ、所定の哺乳動物細胞においてシグナルペプチドとしての機能し得るアミノ酸配列からなるペプチドも、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質のシグナルペプチドに包含される。
所定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルペプチドとしては、例えば、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが用いられるが、それらに限定されない。
本発明のキメラタンパク質は、タンパク質の検出や精製等を容易にならしめるためのタグのアミノ酸配列を含んでいてもよい。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓ×６タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵｌタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を挙げることが出来る。タグの位置は、本発明のキメラタンパク質が膜貫通ドメインとしての機能を有し、所望の細胞表面分子に特異的に結合することが出来る限り特に限定されないが、好ましくは、キメラタンパク質のＣ末端又はシグナルペプチドのＣ末端である。
好ましい一実施態様において、本発明で用いられるキメラタンパク質は、パラミクソウイルスのような融合ウイルス由来の融合関連タンパク質の膜貫通ドメインを含む。ここで「融合関連タンパク質」は、融合ウイルスの表面に発現し、ウイルスと標的細胞との融合に関連するタンパク質であるかぎり特に制限されないが、例えば、Ｆタンパク質および受容体結合タンパク質（ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質、Ｇタンパク質等）が挙げられる。
特に好ましい一実施態様において、本発明は、パラミクソウイルス由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されているキメラタンパク質を提供する。パラミクソウイルスとしては、宿主細胞との融合を介して該細胞に感染する、パラミクソウイルス科に属するウイルスであれば特に制限はなく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス（ＭｕＶ）、パラインフルエンザウイルス１（ＰＩＶ１）、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、シミアンウイルス５（ＳＶ５）、ニューカッスルウイルス（ＮＤＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、パラミクソウイルス由来融合関連タンパク質として、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質が挙げられる。ＨＶＪ由来Ｆタンパク質は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質である。「配列番号１１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つウイルスと細胞との融合を媒介する活性を有するタンパク質である。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
また、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中の１〜２０個（好ましくは、１〜１５個、さらに好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは、１〜１５個、さらに好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは、１〜１５個、さらに好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列中の１〜２０個（好ましくは、１〜１５個、さらに好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それら欠失・付加・挿入・置換を組み合わせたアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失、付加、挿入または置換されている場合、その欠失、付加、挿入または置換の位置は特に限定されない。公知のバリアントとしては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ，Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０４８５５に示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインとしては、その膜貫通部位（配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号５０１〜５２１で示される領域）並びにＨＶＪの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれるのに必要なその近傍配列を含む限り、いかなるものであってもよい。後述する本発明の改変パラミクソウイルスはウイルスゲノム由来のインタクトなＦタンパク質をウイルス粒子表面に発現するので、本発明のキメラＦタンパク質は融合ペプチド（配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１１７〜１４１で示される領域）を含んでいる必要はない。特に好ましくは、本発明のキメラＦタンパク質に用いられるＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４９０〜５６５又はアミノ酸番号４８７〜５６５で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義である。
本発明のキメラＦタンパク質に含まれる、細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドは特に制限されず、上述した通りのものを用いることができるが、例えば、好ましい一実施態様において、本発明のキメラＦタンパク質は、抗デスモグレイン３単鎖抗体を含む。該抗体は、本発明の改変パラミクソウイルスＩＩがヒトへの遺伝子導入用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、キメラ抗体、より好ましくはヒト化抗体、最も好ましくは完全ヒト抗体であることが望ましい。該抗体ポリペプチドは、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインに連結され得る。特に好ましい一実施態様においては、抗デスモグレイン３単鎖抗体ポリペプチドは、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質のＦ２およびＦ１領域、より具体的には、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号３０〜４８９で示されるアミノ酸配列と置換されて、Ｆタンパク質のシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間に挿入される。
また、別の好ましい一実施態様において、本発明のキメラＦタンパク質は、トランスフェリンを含む。該抗体は、本発明の改変パラミクソウイルスＩＩがヒトへの遺伝子導入用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、ヒトトランスフェリンであることが望ましい。トランスフェリンは、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインに連結され得る。特に好ましい一実施態様においては、トランスフェリンは、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質のＦ２およびＦ１領域、より具体的には、配列番号１１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号３０〜４８６で示されるアミノ酸配列と置換されて、Ｆタンパク質のシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間に挿入される。
本発明のキメラタンパク質の例としては、ＨＶＪ由来のＦタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質である、配列番号２１に示すアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義であるが、実質的に同一の配列からなるタンパク質は、ＨＶＪ粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、デスモグレイン３を特異的に認識して結合する能力を保持する必要がある。このタンパク質は、デスモグレイン３を認識する単鎖抗体可変部フラグメント（ｓｃＦｖ）を膜外領域に含んでおり、かかるタンパク質を有するウイルスは、細胞表面にデスモグレイン３を提示している細胞に特異的にターゲティングすることが可能である。デスモグレイン３は表皮基底層の細胞に選択的に発現しているため、上記ウイルスは表皮基底層に特異的にターゲティングする。
本発明のキメラタンパク質の別の例としては、ＨＶＪ由来のＦタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質である、配列番号２５に示すアミノ酸配列又は配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義であるが、実質的に同一の配列からなるタンパク質は、ＨＶＪ粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、トランスフェリン受容体を特異的に認識して結合する能力を保持する必要がある。このタンパク質は、トランスフェリンを膜外領域に含んでおり、かかるタンパク質を有するウイルスは、細胞表面にトランスフェリン受容体を提示している細胞に特異的にターゲティングすることが可能である。トランスフェリン受容体は癌細胞に選択的に発現しているため、上記ウイルスは癌細胞に特異的にターゲティングする。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、本発明の改変パラミクソウイルスを製造する目的においては、パラミクソウイルスが感染し、ウイルスを複製し得る動物細胞の細胞膜上に発現することが必要である。従って、好ましくは、該キメラタンパク質は、該キメラタンパク質をコードする核酸を発現可能な形態で該動物細胞に導入することにより製造される。それゆえ、本発明はまた、本発明で用いられるキメラタンパク質をコードする核酸（以下、単に「本発明のキメラ核酸」ともいう）を提供する。
本発明のキメラ核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡあるいは両者のキメラのいずれでもよい。また、該キメラ核酸は１本鎖であっても２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、該キメラ核酸は二本鎖ＤＮＡでも二本鎖ＲＮＡでもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
本発明のキメラ核酸は、表面タンパク質に由来するペプチド部分および細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチド部分をコードする天然の塩基配列、または異なるコドンによりコードされたものを配置通りに連結したもの、あるいは該連結した配列に相補的な塩基配列からなる核酸とハイストリンジェント（ｈｉｇｈｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ該キメラタンパク質と同質の活性（即ち、キメラ核酸が導入された動物細胞内で発現して細胞膜上に輸送され、且つ該細胞内で複製し、再構成されたパラミクソウイルス粒子が細胞外に放出される際に該ウイルス粒子表面に取り込まれ、生成する改変パラミクソウイルスを所望の細胞表面分子を発現する標的細胞にターゲティングし得る活性）を保持するタンパク質をコードするものである。
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、該連結した配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝３）にて計算することができる。
上記ハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，６．３．１−６．３．６，１９９９）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄が挙げられる。また、中程度のストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、２×ＳＳＣ／３０℃の後、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／３０〜５０℃での一回以上の洗浄が挙げられる。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい一例としては、上記した、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質をコードする核酸が挙げられる。より好ましくは、該キメラ核酸は、配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸、あるいは、配列番号２０に示される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含み、かつ、ＨＶＪ粒子表面に取り込まれ得るとともに、デスモグレイン３を特異的に認識して結合する能力を保持するタンパク質をコードする核酸である。ここでハイストリンジェントな条件とは、上記と同義である。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい別の一例としては、上記した、配列番号２５に示されるアミノ酸配列又は配列番号２５に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号４０〜７９７で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質をコードする核酸が挙げられる。より好ましくは、該キメラ核酸は、配列番号２４に示される塩基配列又は配列番号２４に示す塩基配列中塩基番号１１８〜２３９１で示される塩基配列を含む核酸、あるいは、配列番号２４に示される塩基配列又は配列番号２４に示す塩基配列中塩基番号１１８〜２３９１で示される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含み、かつ、ＨＶＪ粒子表面に取り込まれ得るとともに、トランスフェリン受容体を特異的に認識して結合する能力を保持するタンパク質をコードする核酸である。ここでハイストリンジェントな条件とは、上記と同義である。
以下、本発明の好ましい一実施態様である、単鎖抗体と表面タンパク質もしくはそのフラグメントとのキメラタンパク質をコードするキメラ核酸について、その調製方法を示すが、当業者は、以下の記載および当該技術分野で周知慣用の技法を適宜組み合わせることにより、容易に他のキメラタンパク質をコードする核酸を製造することができる。
まず、公知の表面タンパク質のコード核酸の配列情報に基づいて、該表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸を、常法に従ってクローニングする。例えば、該核酸は、該表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだ核酸を、該表面タンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
得られた表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸は、後のキメラ核酸の作製を容易にするために、必要に応じて、リンカーや部位特異的変異誘発等を用いて適当な制限酵素サイトを導入することができる。
単鎖抗体をコードする核酸を得る方法としては、例えば、所望の細胞表面分子もしくはそのフラグメントを抗原として常法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製し（ここで免疫動物としてＫＭマウスＴＭなどのヒト抗体産生マウスを用いると、ヒト抗体産生ハイブリドーマを容易に得ることができる）、該ハイブリドーマからＲＮＡを抽出して、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の各可変領域に特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより可変領域遺伝子をクローニングした後、適当なリンカーを介して重鎖と軽鎖を連結する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲの過程で、単鎖抗体をコードする核酸の末端に、表面タンパク質やシグナルペプチドをコードする核酸とのライゲーションに適した制限酵素サイトを導入することができる。
得られた表面タンパク質をコードする核酸と、単鎖抗体をコードする核酸は、適当な制限酵素、リガーゼ等を用いて連結することができる。
本発明のキメラ核酸は、該キメラ核酸にコードされるキメラタンパク質が所定の動物細胞内で分泌経路に乗って細胞膜上へ輸送されるべく、好ましくはその５’末端に、上述のいずれかのシグナルペプチドをコードする核酸が連結されていることが好ましい。このようなシグナルペプチドをコードする核酸は、例えば、当該シグナルペプチドを含むタンパク質を発現する細胞（ウイルスを含む）から抽出したゲノム核酸もしくはｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりクローニングすることもできるが、公知の塩基配列情報に基づいて、化学合成することもできる。
得られたシグナルペプチドをコードする核酸は、単鎖抗体をコードする核酸もしくは表面タンパク質をコードする核酸と、適当な制限酵素、リガーゼ等を用いて連結することができる。
本発明のキメラ核酸を動物細胞に導入することにより、本発明のキメラタンパク質をその細胞膜上に発現する動物細胞を得ることができる。
また、上記動物細胞にパラミクソウイルスを感染させることにより、本発明のキメラタンパク質をウイルス粒子表面に発現している改変パラミクソウイルス（本発明の改変パラミクソウイルスＩＩ）を得ることもできる。
本発明の改変パラミクソウイルスＩＩは、そのウイルス表面に、標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合するペプチドにウイルス表面タンパク質が連結したキメラタンパク質を発現している。従って、該改変パラミクソウイルスは、標的組織・細胞に対する特異性が高く、薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソウイルスベクター（ウイルスエンベロープベクター等）として利用可能である。
更に、該改変パラミクソウイルスＩＩにおいて、上記本発明の改変パラミクソウイルスＩと同様の改変を加えることにより、
（１）パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されている、キメラタンパク質をウイルス粒子表面に提示しており、且つ
（２）野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質（ＨＮタンパク質等）の量が低減している、
改変パラミクソウイルスを得ることが出来る。ここで、「細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチド」は「受容体結合タンパク質」とは異なる。該ウイルスにおいては、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響が軽減されることにより、高い安定性が達成されているとともに、特定の組織・細胞に対する高い特異性が達成されており、極めて好ましい。
３．ターゲティングパラミクソウイルスの作製方法
本発明は、下記のステップを含む、ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法（以下、本発明の方法ともいう）を提供する：
（１）パラミクソウイルス由来のＦタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側に、０〜３０残基からなるリンカーペプチド、さらにそのＮ末端に所望の細胞の表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入するステップ、
（２）パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
（３）該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ。
ステップ（１）では、上記の本発明のキメラ核酸が、動物細胞内で発現しうる形態に調製され、導入される。具体的には、上記のように作製した本発明のキメラ核酸が、適当な発現ベクター中に組み込まれる。
発現ベクターとしては、動物細胞中で本発明のキメラタンパク質を産生できるものであれば特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、本発明のキメラ核酸、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、エンハンサー配列、本発明の核酸の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。また、プロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
ターミネーター領域、複製可能単位、エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、自体公知のものを用いることができる。
選択マーカーとしては、自体公知のものを用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の核酸は、通常の遺伝子工学的手法を用いて適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結されることにより、動物細胞内で発現しうる形態に調製される。
動物細胞としては、上述の核酸を発現し、細胞内でパラミクソウイルスが再構成する限り、特に制限されない。例えば、サル腎由来のＣＶ−１細胞やＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞などが挙げられる。
動物細胞に核酸を導入する方法は、該動物細胞において核酸が発現する限り特に限定されず、動物細胞の種類などにより適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
動物細胞を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２巻、５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８巻、３９６（１９５９））、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７３巻、１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
このようにして、本発明のキメラタンパク質は動物細胞内で発現し、該キメラタンパク質中のシグナルペプチドの作用により分泌経路に乗って、該動物細胞の細胞膜上に輸送される。
上記ステップ（２）では、パラミクソウイルスを、本発明のキメラタンパク質を発現する動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウイルスとしては、再構成能を有する限り特に限定されず、野生型パラミクソウイルスであっても改変パラミクソウイルスであってもよい。但し、本発明のキメラタンパク質が自体、細胞との融合活性を有しない場合、改変パラミクソウイルスは、少なくともＦタンパク質の融合活性を保持するものであることが望ましい。
感染したパラミクソウイルスは、動物細胞内で再構成されて細胞膜へと運ばれ、細胞膜の一部を取り込む形でエクトサイトーシス様に細胞外へと放出される。そのため、細胞外へ放出されたパラミクソウイルスは、細胞膜上に発現した本発明のキメラタンパク質をウイルス粒子表面上に提示した、改変パラミクソウイルスである。
上記した本発明の改変パラミクソウイルスの形成手順を考慮すれば、本発明のキメラタンパク質を動物細胞内で発現させることなく、適当な脂質（複合体）からなるリポソームに該キメラタンパク質を包埋したプロテオリポソームとして調製し、これを動物細胞と融合させることにより、該動物細胞の細胞膜上にキメラタンパク質を提示させ、これにパラミクソウイルスを感染させて同様にウイルスを複製、再構成させることも可能であることが理解される。
さらに、上記プロテオリポソームの利用を考慮すれば、本発明で用いられるターゲティング用のタンパク質は、細胞表面分子に特異的に結合し得る非ペプチド性成分（本明細書においては、核酸配列（コドン）によりコードされる２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むペプチド性物質も、ここでいう非ペプチド成分に包含されるものと定義する）をウイルス表面タンパク質とともに含むものであってもよい。例えば、葉酸受容体に特異的に結合する分子として葉酸が挙げられるが、葉酸分子とウイルス表面タンパク質もしくはそのフラグメントのアミノ末端または側鎖のアミノ基と葉酸のカルボキシル基との間でアミド結合を形成させることにより、あるいは側鎖のカルボキシル基と葉酸のアミノ基との間でアミド結合を形成させることによりウイルス表面タンパク質と葉酸とが共有結合したタンパク質コンジュゲートとすることができる。かかるタンパク質コンジュゲートをプロテオリポソームを利用して動物細胞の細胞膜上に提示させて、該動物細胞をパラミクソウイルスで感染させれば、複製し、再構成されて細胞外へ放出されたパラミクソウイルスは、該タンパク質コンジュゲートをウイルス表面に提示した改変パラミクソウイルスであり、葉酸受容体を発現する細胞をターゲティングするのに用いることができる。
細胞表面分子に特異的に結合し得る他の非ペプチド性成分において、ウイルス表面タンパク質のＮ末端やアミノ酸側鎖上の官能基と共有結合し得る構造でない場合には、例えば、イムノコンジュゲートの作製において通常用いられているような、公知のリンカーを介して結合させることも可能である。
上記ステップ（３）では、改変パラミクソウイルス粒子が単離される。該ウイルス粒子の単離は、自体公知の方法でなされ、例えば、細胞培養上清を回収・遠心分離するなどの方法によりなされる。
本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、そのウイルス表面に、標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合するペプチドにウイルス表面タンパク質が連結したキメラタンパク質を提示している。従って、該改変パラミクソウイルスは、標的組織・細胞に対する特異性が高い。該改変パラミクソウイルスは、また、薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソウイルスベクター（ウイルスエンベロープベクター等）として利用可能である。
本明細書において、ウイルスエンベロープベクターとは、ウイルスのゲノムをＵＶ照射、超音波処理、界面活性剤処理など種々の方法により失活させて、ウイルスの複製能を消失させたものをいう。ウイルスエンベロープベクターは、エンベロープ、即ち、ウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造を含む。かかるウイルスエンベロープベクターは、ウイルス粒子表面に存在するタンパク質を維持しているため、細胞に吸着可能であり、ウイルス粒子内に封入した物質（たとえば、タンパク質、核酸、低分子化合物）を細胞内に送達するベクターとして利用できる。
ウイルスからウイルスエンベロープベクターを調製する方法、およびウイルスエンベロープベクターに物質を封入する方法はいずれも既に公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００２  ｖｏｌ．６  ２１９−２２６などに記載されている。
例えば、Ｆタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側にトランスフェリンが融合した融合タンパク質を粒子表面に有するエンベロープベクターは、トランスフェリンの癌細胞特異的な結合能により、癌細胞特異的ターゲティングベクターとして、癌細胞にだけ物質を送達可能である。
また、Ｆタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端側にデスモグレイン３を認識する単鎖抗体可変部フラグメント（ｓｃＦｖ）が融合した融合タンパク質を粒子表面に有するエンベロープベクターは、該フラグメントの表皮基底層特異的な結合により、表皮基底層特異的ターゲティングベクターとして、表皮基底層にだけ物質を送達可能である。
上記ウイルスエンベロープベクターを用いて、物質を所望の細胞に送達する場合、ウイルス粒子内に物質が封入されたウイルスエンベロープベクターを単独で、または該ベクターと、安定化化合物、希釈剤、担体とを組み合わせて含む薬学的組成物として用いられる。
該薬学的組成物は、上記ウイルスエンベロープベクターが意図される目的を達成するのに有効な量の該ベクターを含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
該薬学的組成物は、ウイルスエンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
該薬学的組成物は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、および／または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは薬学的に不活性であり得る。
該薬学的組成物の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頸動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
ウイルスエンベロープベクターの投与量は、年齢その他の投与対象の条件、投与の目的、使用するベクターの種類等により適宜選択される。
本発明のウイルスを、ウイルスエンベロープベクターとしてヒトに投与する場合、１被験体あたり、通常４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のウイルスエンベロープベクターが投与され得る。「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。
正確な用量は、ベクターに含まれる物質の種類や治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
（１）ＨＮｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの作製
図１に示す５種類のＨＮ  ｍＲＮＡノックダウン用のｓｉＲＮＡは、ＳＭＡＲＴ  ｓｉＲＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてデザイン、合成された。その５種類のｓｉＲＮＡ（ＨＮ−２２３、ＨＮ−３４２、ＨＮ−８９９、ＨＮ−１１４２、ＨＮ−１４２７）は、それぞれＨＮ  ｍＲＮＡ上のＧＣＡＵＵＧＡＡＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＡ（２２３−２４１：配列番号１）、ＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＵ（３４２−３６０：配列番号２）、ＧＡＡＣＵＡＡＧＵＣＵＣＡＣＣＧＧＵＡ（８９９−９１７：配列番号３）、ＧＣＧＵＧＡＵＣＡＵＣＣＡＧＧＵＣＡＡ（１１４２−１１６０：配列番号４）、ＧＣＧＵＡＵＡＣＡＣＵＧＡＵＧＣＵＵＡ（１４２７−１４４５：配列番号５）を標的としている。また、コントロールとして使用しているｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡはランダムな配列（ＧＣＧＣＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＵＵＣＧ：配列番号６）からなる。
（２）ｓｉＲＮＡの効果の検出
合成されたｓｉＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）とＰｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を利用して、それぞれのプロトコールに従って種々の濃度でＬＬＣＭＫ２細胞に導入した。
導入の２４時間後に、培養細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（−）（ＰＢＳ）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ  Ｉｎｃ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で洗浄し、ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）０．０２の濃度に調整したＨＶＪを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ条件下で１時間インキュベーションし、ＨＶＪを感染させた。さらに２４時間後、該培養細胞からＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｋ．Ｋ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。３０μｇ全ＲＮＡを１％アガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）電気泳動により分画した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ｎｙｌｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にトランスファーした。ＨＮ及びＧ３ＰＤＨ  ｃＤＮＡをＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて３２Ｐ標識し、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ  Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の示す方法に従ってハイブリダイゼーションした後、ＫＯＤＡＫ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＳ  Ｆｉｌｍ（ＫＯＤＡＫ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に露光して解析した。
その結果を図２に示す。上記ｓｉＲＮＡのうち、ＨＮ−２２３、ＨＮ−３４２はほとんど効果を示さず、ＨＮ−８９９、ＨＮ−１１４２およびＨＮ−１４２７は、ＨＮタンパク質の転写を有意に阻害した。
（３）ｓｉＲＮＡによるＨＮノックダウンの経時的変化
ＨＮ−８９９を用いて、図３下段に示すようなタイムスケジュールで、ＨＶＪを感染させる時間を変えて、ｓｉＲＮＡの効果を経時的に検出した。その結果、図３にしめすように、ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後にＨＶＪを感染させて、その２４時間後にＲＮＡを回収するというタイムスケジュールが、最もＨＮタンパク質の転写が抑制されることがわかった。
（４）ｓｉＲＮＡ最適濃度の検討
ＨＮ−８９９のｓｉＲＮＡの濃度を、５０〜３２０ｐｍｏｌ／ｍｌで変化させて上記の通り導入後、上記に従ってＨＶＪ感染、ＲＮＡ回収を行い、ｓｉＲＮＡの濃度依存的な効果を検討した。図４に示すとおり、５０ｐｍｏｌ／ｍｌで充分な効果を示した。
（５）ｓｉＲＮＡのＨＮに対する特異性
図５に示すように、上記と同様の手法により、回収したＲＮＡについて、ＨＮタンパク質ｍＲＮＡ、Ｆタンパク質ｍＲＮＡおよびＭタンパク質ｍＲＮＡについて、ノーザンブロットによりそのｍＲＮＡ量を検出したところ、ＨＮ−８９９のｓｉＲＮＡは、ＨＮタンパク質特異的に転写を抑制した。
（６）ＨＶＪ感染細胞からの新規出芽ウイルス回収およびウェスタンブロット
ＨＶＪウイルスを感染させたＬＬＣＭＫ２細胞をＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＭＥＭにて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ条件下で４８時間培養した。培養上清から１００，０００×ｇ遠心によりウイルス粒子を回収し、ＰＢＳに懸濁した。
ＨＶＪを２×サンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／１０％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／４％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｉｌｓｕｌｆａｔｅ／１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ／０．００４％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）に溶解し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（１２％）で泳動後、ホライズブロット（水平積層式電気泳動転写装置、Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）にトランスファーした。次いで、メンブレンを５％スキムミルク（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ  Ｉｎｃ．）含有洗浄緩衝液（６８４ｍＭ  ＮａＣｌ／４ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）により室温で１時間ブロッキングした後、一次抗体（抗ＨＮ抗体は１，０００倍、抗Ｆ抗体は２００倍、抗Ｍ抗体は２，０００倍に５％スキムミルクで希釈）を室温で１時間反応させた。後に、洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄し、二次抗体（ＨＮとＭの場合は抗家兎ＩｇＧ抗体を、Ｆの場合は抗マウスＩｇＧ抗体を、いずれも２，０００倍に５％スキムミルクで希釈）を室温で１時間反応させた。二次抗体反応後、洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄して、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。
その結果を図６に示す。ＨＮ−８９９を導入した細胞から回収したＨＶＪでは、ＨＮはほとんど発現されていなかった。その一方、Ｆタンパク質、Ｍタンパク質はスクランブルｓｉＲＮＡ導入細胞から回収したＨＶＪより増大していた。
（７）ウイルス粒子数の比較
ｓｉＲＮＡ導入下でのＨＶＪ感染によるＨＶＪウイルス粒子産生数を検討するために、ウイルス粒子数の比較のためのリアルタイムＰＣＲによるウイルスゲノム定量を行った。ＨＶＪゲノム検出用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び蛍光ラベルプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅｌ．５によってデザインされた。プライマーの配列はＧＧＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡ（ＨＶＪ−１０７６９Ｆ：配列番号７）、ＴＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＴＣ（ＨＶＪ−１０８９７Ｒ：配列番号８）で、プローブの配列はＡＴＣＣＡＣＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴ（配列番号９）である。ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＩ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）を用いて回収した細胞由来ＨＶＪからＲＮＡゲノムを抽出し、更にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いてｃＤＮＡを合成した。上記プライマーとプローブ、及びＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ・７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲアッセイを行いゲノムの量を測定し、粒子数を算出した。結果を図７に示す。スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ＲＮＡ導入、ＨＮ−８９９  ｓｉＲＮＡ導入ともに、ＲＮＡを導入しない場合（ｎｏｒｍａｌ）に比べて、ウイルス粒子は多量に産生されていた。
（８）赤血球凝集（ＨＡ）活性の測定
ｓｉＲＮＡの導入、ＨＶＪの感染後、その等量の培養上清に存在する全てのウイルス粒子を回収してニワトリ赤血球の凝集活性を測定したところ、ＨＮ−８９９導入群では正常のＨＶＪの約１０分の１であった（図８）。なお、ここで、この凝集活性は、ＨＶＪ懸濁液の２倍希釈系列をつくり、それぞれに希釈液と等量の１％赤血球含有液を混和して赤血球凝集を観察し、以下の計算式でＨＶＪ懸濁液の力価（ＨＡＵ／ｍｌ）を求めて算出した。
ＨＡＵ／ｍｌ＝２ｎ×希釈倍率
ｎ：凝集反応を認める最大希釈数
希釈倍率：元のサンプルが希釈されている場合のその希釈倍率
次に、ウイルス粒子数あたりの赤血球凝集活性を測定した。図９に示すように、やはりＨＮ−８９９  ｓｉＲＮＡ導入細胞から得られたウイルスは、その赤血球凝集活性が低減していた。
［実施例２］
（１）ＨＶＪ−ＦとＧＦＰあるいはＤｓｇ−３−ｓｃＦｖとのキメラＦタンパク質発現ベクターの作製
図１０の（ｉ）〜（ｉｖ）に示すキメラＥＧＦＰ−Ｆタンパク質を発現するためのベクターを作製した。
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆプラスミドを、元来有しているＢｇｌＩＩ認識部位（２７９−２８４）を削除し、新たにＡｇｅＩ認識部位（８２−８７）およびＢｇｌＩＩ認識部位（３４６−３５１）を作製し、新たなプラスミドベクターを得た（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｍｕｔ）。これをＨｉｎｄＩＩＩ／ｘｈｏＩで切断し、得られたＦ断片を同様に切断したｐＣＹ４Ｂに挿入し、ｐＣＹ４Ｂ−Ｆｍｕｔを作製した。ｐＣＹ４Ｂ−Ｆｍｕｔ中のＢｇｌＩＩ切断部位（図１０中（ｉ））、ＡｇｅＩ−ＢｇｌＩＩ部位（図１中（ｉｉ））、ＡｇｅＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位（図１０中（ｉｉｉ））、およびＡｇｅＩ−ＥｃｏＮＩ部位（図１０中（ｉｖ））のそれぞれにＥＧＦＰを挿入するために、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲにより増幅させてＥＧＦＰｃＤＮＡ断片を得た。
ここで用いたＰＣＲプライマーは以下の通りである：
ＧＦＰ−ＢｇｌＩＩ−ｆ：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１２）
ＧＦＰ−ＢｇｌＩＩ−ｒ：５’−ＴＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧ−３’（配列番号１３）
ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ｆ：５’−ＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１４）
ＧＦＰ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧ−３’（配列番号１５）
ＧＦＰ−ＥｃｏＮＩ−ｒ：５’−ＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧ−３’（配列番号１６）。
図１０中（ｉ）のＢｇｌＩＩ切断部位挿入ＥＧＦＰｃＤＮＡ断片の取得には、ＧＦＰ−ＢｇｌＩＩ−ｆとＧＦＰ−ＢｇｌＩＩ−ｒを、図１０中（ｉｉ）のＡｇｅＩ−ＢｇｌＩＩ部位挿入ＥＧＦＰｃＤＮＡ断片の取得には、ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ｆとＧＦＰ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−ｒを、図１０中（ｉｉｉ）のＡｇｅＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位挿入ＥＧＦＰｃＤＮＡ断片の取得には、ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ｆとＧＦＰ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−ｒを、および図１０中（ｉｖ）のＡｇｅＩ−ＥｃｏＮＩ部位挿入ＥＧＦＰｃＤＮＡ断片の取得には、ＧＦＰ−ＡｇｅＩ−ｆとＧＦＰ−ＥｃｏＮＩ−ｒとを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。
ｐＣＹ４Ｂ−Ｆｍｕｔを、ＢｇｌＩＩ単独、ＡｇｅＩとＢｇｌＩＩ、ＡｇｅＩとＥｃｏ４７ＩＩＩまたはＡｇｅＩとＥｃｏＮＩで切断後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）により平滑末端化した後、上記増幅して得たＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）により室温にて５分間反応させることによりライゲーションさせ、図１０の（ｉ）〜（ｉｖ）に模式的に示すキメラＥＧＦＰ−Ｆタンパク質発現ベクターを作製した。
Ｆタンパク質のｃＤＮＡ配列を配列番号１０に示すが、上記（ｉ）では、３４５位と３４６位の間にＰＣＲ産物断片が挿入され、上記（ｉｉ）では８７〜３４５位が、上記（ｉｉｉ）では８７〜４５５位が、上記（ｉｖ）では８７〜１４６５位が、それぞれ対応するＰＣＲ産物断片と置換されている。
（２）上記ベクターの細胞内導入（トランスフェクション）とＧＦＰ免疫染色
トランスフェクション前日に６ｗｅｌｌプレートにカバーガラス（ＩＷＡＫＩ）を敷き、２×１０５のＬＬＣＭＫ２細胞を播種した。
トランスフェクション当日８００μｌのＤ−ＭＥＭ（−）に変えて３時間培養後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇのプラスミドＤＮＡを導入し、４時間後に１ｍＬのＤ−ＭＥＭ（＋）を加え、４８時間培養した。
固定は４％パラホルムアルデヒドで４℃・１５分間行い、一部は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで２分間インキュベーション後、５％スキムミルク／ＰＢＳで１時間ブロッキングした。
１次抗体Ａｎｔｉ−Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ＰｏＡｂ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ（ＭＢＬ）：１／２０００で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：１／１０００で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで３回洗浄した。カバーガラスで封入後、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）にて観察した。
図１１にその結果を示す。上段は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘでのインキュベーションを行わなかった場合であり、下段は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘでのインキュベーションを行った場合の結果である。ともに、ＥＧＦＰは赤色に染色されており、核がＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８により青色に染色されている。
図１１より判るとおり、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のキメラタンパク質は全て細胞内で発現されたが（図１１下段）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで細胞を透過化させないとＥＧＦＰで染色されるのは（ｉｖ）のみであり、（ｉｖ）のキメラタンパク質のみが細胞表面に局在していることが判る。
意図したとおりのキメラタンパク質が発現されていることは、抗ＧＦＰ抗体によるウェスタンブロットによって確認できた（図１２）。ウェスタンブロットの方法は以下のとおりである。
トランスフェクション４８時間後、２×１０５個の細胞を２０μＬのＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、サンプルを調製した。サンプルは１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ転写した。メンブレンは５％スキムミルク／ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，０．０２％  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）；ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１時間インキュベーションし、次に１次抗体１：２０００  Ａｎｔｉ−Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ＰｏＡｂ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ（ＭＢＬ），１：４００  ｆ２３６（抗Ｆ抗体），１：１５００抗ＨＮ抗体をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、室温で１時間インキュベーションした。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒでメンブレンを洗った後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ又はａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１：１０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で検出した。
図１２に示すとおり、意図したキメラタンパク質の分子量の位置にそれぞれのバンドが検出された。
したがって、Ｆタンパク質のＮ末端２９残基のトランスメンブランドメインのみがＧＦＰと融合したキメラタンパク質のみが細胞表面への局在が可能であることが判った。
（３）キメラＧＦＰ−Ｆタンパク質を有するＨＶＪの産生
上記キメラＧＦＰ−Ｆタンパク質発現ベクターを導入した細胞に、野生型のＨＶＪをｍ．ｏ．ｉ＝０．６で感染させた。ＭＥＭ培地で４８時間培養後、上清を回収し遠心（４４０ｇ、５分間）により細胞を除去しさらに上清を遠心（１０００００ｇ、２時間）し、得られたＨＶＪペレットをＰＢＳで洗浄後、適当量に懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後抗ＧＦＰ抗体によるウェスタンブロットに供した。その結果を図１３に示す。図１３のレーンは左から、ＨＶＪを感染させていない上記キメラＧＦＰ−Ｆタンパク質発現ベクター導入細胞（Ｆ−ＧＦＰ（細胞））、該導入細胞の培養上清（Ｆ−ＧＦＰ（培養上清））、該導入細胞に野生型のＨＶＪを感染させた後その上清から回収されたウイルス（Ｆ−ＧＦＰ＋ＨＶＪ）、遺伝子導入していないＬＬＣ−ＭＫ２細胞に野生型ＨＶＪを感染させた培養上清から回収されたウイルス（ＨＶＪ（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で生産））、およびコントロールとして鶏卵で産生させて精製したＨＶＪである。
図１３より、該導入細胞に野生型のＨＶＪを感染させた後その上清から回収されたウイルスは、ＧＦＰが検出された。さらに、Ｆタンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体でウェスタンブロットを行ったところ、上記ウイルスでもＦタンパク質が検出され、該抗体はキメラＧＦＰ−Ｆタンパク質は認識しないことから、該ウイルスは、野生型とキメラの両方のＦタンパク質を発現していることがわかった。さらに、ＨＮタンパク質も発現していた。
（４）ｓｃＦｖ融合キメラＦタンパク質発現ベクターの作製
上記の結果から、表皮基底層に発現するデスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｒｅｉｎ）３タンパク質を認識する単鎖抗体（ｍＤｓｇ３−ｓｃＦｖ）を用いて、表記基底層ターゲティングＨＶＪの作製を試みた（図１４）。デスモグレイン３タンパク質を認識する単鎖抗体のｃＤＮＡは配列番号１７に示している。これは、ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＡＫ７／ｓｃＦｖ（慶應大学医学部皮膚科天谷教授より供与）を鋳型に、
Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＡｇｅＩ−ｆ：５’−ＴＡＴＧＧＣＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号１８）および
Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−ＥｃｏＮＩ−ｒ：５’−ＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号１９）
のプライマー対を用いて、ＰＣＲで増幅することによって得た。
これを、先述のｐＣＹ４Ｂ−ＦｍｕｔのＡｇｅＩ−ＥｃｏＮＩ部位に挿入し、さらに検出を容易にするためにＣ末端にＭｙｃ−Ｔａｇが付くようにＤＮＡを設計した
（ｐＣＡＧＩｐｕｒｏ−Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆ）。
（５）恒常的遺伝子導入細胞（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）の作製
５×１０６個のＬＬＣＭＫ２細胞を、２３５μＬのＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁した。ｐＣＡＧＩｐｕｒｏ−Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆ  １５μｇを、１５μｌのＰＢＳに溶解した。細胞とＤＮＡを混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）内でＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５０Ｖ、９７５μＦでエレクトロポレーションを行った後、１００μＬずつ１０ｃｍディッシュに分注した。１０ｍＬ  ＭＥＭに対し９０μｇ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク）を加え３７℃で培養し、プラスミドＤＮＡの挿入された細胞を選択した。
選択された細胞を、抗Ｍｙｃ抗体で染色したところ、細胞膜上にキメラＤｓｇ３−ｓｃＦ−Ｆタンパク質が局在していた（図１５）。またウェスタンブロットによっても該キメラタンパク質のサイズの位置にバンドが確認された。
（６）Ｄｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆキメラ分子を持つＨＶＪの産生
次いで、キメラＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆタンパク質を持つＨＶＪの産生を試みた。
１５ｃｍディッシュにｓｔａｂｌｅ  ｆｏｒｍａｎｔ  ＬＬＣＭＫ２細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態で、ＭＯＩ＝０．４でＨＶＪを感染させた。ＭＥＭ（Ｐ／Ｓ）で４８時間培養後、上清を回収し遠心（４４０ｇ、５分間）により細胞を除去しさらに上清を遠心（１０００００ｇ、２時間）し、得られたＨＶＪペレットをＰＢＳで洗浄後、適当量に懸濁した。
得られたウイルスを抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体によるウェスタンブロット（図１６左図：Ｍｙｃ）、およびＦタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体によるウェスタンブロット（図１６中図：ＴＭＤ）に供したところ、所定のサイズにバンドが検出され、キメラタンパク質が確認された。
さらに、抗Ｍｙｃ抗体にて染色した該ウイルスを電子顕微鏡により観察した。
１００ＨＡＵのＨＶＪを４μＬのＭｉｌｌｉＱに懸濁し、電顕用グリッドに滴下して乾燥させた。３．７％ホルムアルデヒドで４℃、１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで３分間インキュベーション後、再びＰＢＳで３回洗浄した。１次抗体；Ａｎｔｉ−Ｍｙｃ−ｔａｇ（ＭＢＬ）１：１００で室温、１時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳで１：１００希釈したＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−１０ｎｍ（ＥＹ  ＲＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）で室温、１時間インキュベーションし、ｕｒａｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅで染色後、電子顕微鏡により観察した（図１６右図）。ウイルス表面にキメラタンパク質が染色された黒点が確認された。
（７）ＥＬＩＳＡによるＤｓｇ３−ｓｃＦｖ−Ｆ−ＨＶＪのＤｓｇ３親和性検討
次に、デスモグレイン３を認識するｓｃＦＶを持つ変異ＨＶＪのデスモグレイン３への結合をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡの方法は、以下のとおりである。
５０μＬのａｓｓａｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭＥＳＡＣＵＰデスモグレインテスト：ＭＢＬ）に各濃度のＨＶＪウイルスサンプルが含まれるように調製し、あらかじめｍＤｓｇ３を固相化した９６ｗｅｌｌプレート（慶應大学皮膚科天谷教授より供与）にアプライした。室温で１時間インキュベート後ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳＡＣＵＰデスモグレインテスト：ＭＢＬ）で４回洗浄し、１：１０希釈したｆ２３６で室温１時間インキュベーションした。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭＥＳＡＣＵＰデスモグレインテスト：ＭＢＬ）で１：９０００希釈したｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で室温１時間インキュベーションし、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＥＳＡＣＵＰデスモグレインテスト：ＭＢＬ）で１０分間反応後、ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＥＳＡＣＵＰデスモグレインテスト：ＭＢＬ）で反応を停止させた。Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（ＢＥＲＴＨＯＬＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
図１７に示すように、キメラ分子を有するＨＶＪでは野生型ＨＶＪに比べて、有意に結合が増強されていた。
（８）培養細胞へのＨＶＪ感染実験
該キメラタンパク質を有するＨＶＪの培養細胞への感染を試験した。
６ｗｅｌｌプレートにカバーガラス（ＩＷＡＫＩ）をしき、３×１０５のＬＬＣＭＫ２、５×１０５のＰＡＭ、または３×１０５のＮＩＨ３Ｔ３を播種した。翌日、終濃度４μｇ／ｍＬ  Ｔｒｙｐｓｉｎで３７℃、３０分間処理したウイルスサンプル（細胞由来野生型ＨＶＪ及びキメラＨＶＪ）をＭＯＩ＝０．６となるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、各細胞にアプライ後５分間感染させた。ＰＢＳで２回洗浄後、Ｄ−ＭＥＭ及びＭＥＭで２４時間培養後、ｆ２３６にて免疫染色した。
図１８にその結果を示す。試験した３種の細胞中、マウスケラチノサイト由来のＰＡＭ細胞のみで、キメラＦタンパク質が野生型に比べて多く発現していた。
（９）器官培養のキメラＨＶＪの感染実験
さらに、マウスの表皮組織への感染を試験した。この試験には、表皮組織の分離が容易であることから、７型コラーゲンノックアウトマウスを用いた。このマウスは、腹部皮膚に水泡があるため、表皮と真皮が分離しやすい。
出生直後の７型コラーゲンノックアウトマウスの水疱部分皮膚を切除し、Ｄ−ＭＥＭで満たした１０ｃｍディッシュ上で器官培養した。Ｔｒｙｐｓｉｎ処理したウイルスサンプル（（８）参照）を５×１０５ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／１００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭとなるように調製し、水疱内に注入。３７℃、５分間感染後、表皮と真皮を剥がしＰＢＳで洗浄しＤ−ＭＥＭで培養した。２４時間後にＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後ウイルスのゲノム由来Ｆタンパク質をｆ２３６で免疫染色した。
その結果、図１９に示すように、キメラＨＶＪの方が、野生型ＨＶＪより有意に表皮細胞に検出された。さらに、組織切片を同様に染色したところ、該キメラタンパク質の発現は、表皮規定細胞に限定的に局在していることがわかった（図２０）。
［実施例３］
（１）ウイルス粒子表面にトランスフェリンが提示され、且つＨＮタンパク質の発現が低減したＨＶＪの作製
図２１に示すように、ＨＶＪのＦタンパク質をコードする遺伝子を改変し、発現プラスミドｐＣＹ４Ｂに挿入した。Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）のＮ末端側にヒトトランスフェリンが連結された該ＴＭＤとヒトトランスフェリンとの融合タンパク質を発現するように組換えｐＣＹ４Ｂを構築した。ヒトトランスフェリンのｃＤＮＡを配列番号２２に示す。この際、その後の解析に便利なようにｍｙｃタグが融合タンパク質のＮ末端につくように挿入部位を設計した。ここで挿入した融合タンパク質の配列を、配列番号２５に示す。
配列番号２５で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜２９は、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質のシグナル配列に、アミノ酸番号３０〜３９は、ｍｙｃタグに、アミノ酸番号４０〜７１８は、ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列に、アミノ酸番号７１９〜７９７は、ＨＶＪ由来Ｆタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列に、それぞれ相当する。
このｍｙｃタグつきＦタンパク質ＴＭＤおよびヒトトランスフェリン融合タンパク質（Ｆ／Ｔｆ）発現ｐＣＹ４ＢをＬＬＣＭＫ２細胞に導入して、Ｆ／Ｔｆタンパク質を恒常的に産生する恒常的形質転換細胞を単離した。
該形質転換細胞に野生型ＨＶＪを感染させて複製させることにより、該細胞から産生されて細胞外に放出されるＨＶＪウイルス粒子は、その表面にはネイティブなＦタンパク質の他にＦ／Ｔｆを有しており（Ｆ／Ｔｆキメラウイルス）、トランスフェリン部分が粒子外に提示されることとなる（図２２）。
さらに、該細胞の産生するＨＶＪウイルスのＨＮタンパク質を欠損させるために、実施例１に示した方法と同様にＨＮ遺伝子の発現をｓｉＲＮＡ法により抑制した。
このようにして、産生させたウイルスは、ウイルス粒子表面にトランスフェリンが提示され、さらにＨＮタンパク質の発現が顕著に低減もしくは完全に欠失することとなる。
実際に、該細胞から産生されたウイルスを培地から回収し、常法にしたがって抗ＨＮ抗体によるウェスタンブロットに供したところ、ｓｉＲＮＡ処理をした細胞から回収したウイルスではＨＮタンパク質は検出されず、ＨＮタンパク質が欠損していた（図２３、上のパネル）。
さらに、常法に従って抗ｍｙｃ抗体でのウェスタンブロットに供したところ、Ｆ／Ｔｆ発現ｐＣＹ４Ｂで形質転換したＬＬＣＭＫ２細胞で産生されたＨＶＪウイルスは、期待した通り、抗ｍｙｃ抗体陽性のタンパク質を発現しているのに対し、ネガティブコントロールである野生型ＬＬＣＭＫ２細胞で産生させたＨＶＪウイルスでは抗ｍｙｃ抗体陽性のタンパク質は検出されなかった（図２３、下のパネル）。
この結果から、Ｆ／Ｔｆ発現ｐＣＹ４Ｂで形質転換したＬＬＣＭＫ２細胞で産生されたＨＶＪウイルスはＦ／Ｔｆタンパク質を有していることが示された。
（２）培養細胞へのＨＶＪ感染実験
続いて、（１）で産生されたウイルスの感染能力を調べた。
ＨＮタンパク質が欠損したＨＶＪ（ＨＮ欠損ＨＶＪ）およびＨＮタンパク質が欠損した上にＦ／Ｔｆを有するＨＶＪ（Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ）をそれぞれ、非癌細胞であるＨＥＫ２９３細胞に０．０５ＭＯＩまたは０．４ＭＯＩで感染させ、Ｆタンパク質の発現を抗Ｆタンパク質抗体で検出した。その結果、いずれのＨＶＪを感染させた場合でも、Ｆタンパク質ポジティブの細胞は非常に少数の細胞でしか観察されなかった（図２４）。
一方、ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞に同様に感染させたところ（図２５）、Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪを感染させた細胞（下のパネル）では、ＨＮタンパク質が欠損しただけでＦ／Ｔｆを有していないＨＮ欠損ＨＶＪ（上のパネル）に比べて、細胞表面にＦタンパク質を有する細胞が顕著に多かった。このＦタンパク質陽性細胞をカウントしてグラフに示す（図２６）。
これらの結果から、ＨＮタンパク質が欠損されてＦ／Ｔｆを有するＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪウイルスは、癌細胞に特異的に感染することがわかった。
（３）トランスフェリン依存性の確認
Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪウイルスの癌細胞への感染力の強さが、Ｆ／Ｔｆタンパク質が含有するトランスフェリン部分に依存していることを証明するために、トランスフェリン（２００μｇ／ｍｌ）存在下で、Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪを０．０５ＭＯＩでＨｅｌａ細胞に感染させた。その結果、Ｔｆ存在下では、Ｔｆ非存在下に比べて、Ｆタンパク質陽性細胞が明らかに減少しており（図２７下のパネル、および図２８）、トランスフェリンの存在によりＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪの感染が阻害されたことが示された。
この結果から、Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪの癌細胞への感染力が、Ｆ／Ｔｆタンパク質のトランスフェリンに依存していることが示された。
（４）Ｑｄｏｔ（登録商標）蛍光粒子を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ癌特異的送達試験
Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪのゲノムを失活させたＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪエンベロープによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌細胞特異的なターゲティングを試験した。Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪを、ＵＶ照射によりゲノムを失活させてＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪエンベロープを作製した。これを１０００ＨＡＵ／２００μｌ・ＰＢＳに懸濁し、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ＩＴＫ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔを最終濃度１μＭになるように添加してエレクトロポレーション（２５０Ｖ、９５０μＦ）に供し、Ｑｄｏｔ（登録商標）蛍光粒子をエンベロープ中に封入した。エレクトロポレーション後すぐに、ＤＭＥＭ  １ｍｌを添加し、軽く遠心し、凝集粒子を除去した後、２０４００×ｇで１５分高速遠心して、そのペレットを回収し、５００μｌの生理的食塩水に懸濁した。得られたＱｄｏｔ封入ＨＶＪエンベロープをＨｅｌａ細胞培養液中に添加した。これを蛍光検出したところ、細胞膜上にＱｄｏｔによる蛍光が認められ（データ示さず）、細胞表面にＨＶＪ−Ｅが吸着していることが示された。
このＱｄｏｔ封入Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープの癌特異的なターゲティングを調べた。
ヌードマウスにＨｅｌａ細胞（５×１０６）を皮下注射により移植し、癌組織が直径７〜８ｍｍにまでなったら、Ｑｄｏｔ封入Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープ５００ＨＡＵを尾静脈に注射した。４８時間後、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、Ｑｄｏｔの分布を精査した。Ｑｄｏｔ封入Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープを注射したマウスの移植癌組織にのみＱｄｏｔによる蛍光が認められ、Ｆ／Ｔｆタンパク質を有していないＱｄｏｔ封入ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープを注射した場合では癌組織に蛍光は認められなかった。癌組織を蛍光顕微鏡にて観察し、一つの視野内のＱｄｏｔ陽性細胞を数えた結果を図２９に示す。ＨＶＪ−Ｅを用いず、Ｑｄｏｔのみを注射した場合（Ｑ  ｏｎｌｙ）およびＦ／Ｔｆタンパク質を有していないＱｄｏｔ封入ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープを用いた場合（Ｗ１〜３）に比べて、Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープを用いた場合は約３０倍以上のＱｄｏｔ陽性細胞が認められた。
この結果から、Ｆ／Ｔｆ−ＨＮ欠損ＨＶＪ−エンベロープが癌に特異的にターゲティングされることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の量が低減しており、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などを軽減することができるので、安全性の高いベクターとして利用可能である。また、該改変パラミクソウイルスに、標的細胞表面に発現しているマーカータンパク質に特異的に結合するポリペプチド等の標的分子を付加すれば、特異性および安全性の高いベクターとして利用可能である。さらに、本発明の改変パラミクソウイルスの作製方法は、簡便かつ安定して改変パラミクソウイルスを得ることができる。また該方法を応用することにより、特定のウイルス機能をノックアウトした変異ウイルスを簡便に得ることができる。
また、本発明のキメラタンパク質もしくはタンパク質コンジュゲートを有するパラミクソウイルスは、組織・細胞特異性が高く、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターとして有用である。また、他の融合タンパク質を欠損させることにより、さらに特異性の高いウイルスベクターとすることも可能であり、疾病治療への応用が期待される。また、本発明のターゲティングパラミクソウイルスの作製方法によれば、簡便かつ安定して該ターゲティングパラミクソウイルスを得ることができる。
本出願は日本で出願された特願２００５−３３８４４９（出願日：２００５年１１月２４日）及び特願２００５−３３９４７４（出願日：２００５年１１月２４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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