(57)【要約】  本発明は、ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る抗PAC1モノクローナル抗体、該抗体を含むPAC1活性調節剤（特に活性阻害剤）、該抗体を含むPAC1の生理活性の亢進が関連する疾患予防・治療剤、該抗体を含むPAC1活性の異常が関連する疾患の診断剤、並びに該抗体およびPAC1発現細胞を用いる、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る抗PAC1モノクローナル抗体。
【請求項２】
PAC1の細胞外領域を認識する請求項１記載の抗体。
【請求項３】
PAC1のPACAPとの結合を阻害する請求項２記載の抗体。
【請求項４】
PAC1の生理活性を阻害する請求項３記載の抗体。
【請求項５】
PAC1のPACAPとの結合を阻害しない請求項２記載の抗体。
【請求項６】
他の抗PAC1モノクローナル抗体のPAC1との結合を促進する請求項５記載の抗体。
【請求項７】
他の抗PAC1モノクローナル抗体がPAC1のPACAPとの結合を阻害するものである、請求項６記載の抗体。
【請求項８】
さらに変性したPAC1を認識し得る請求項１記載の抗体。
【請求項９】
請求項１記載の抗体を含むPAC1活性調節剤。
【請求項１０】
請求項４記載の抗体を含むPAC1活性阻害剤。
【請求項１１】
PAC1の生理活性の亢進が関連する疾患の予防・治療用である、請求項１０記載の剤。
【請求項１２】
請求項１記載の抗体を含むPAC1検出剤。
【請求項１３】
PAC1活性の異常が関連する疾患の診断用である、請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
請求項１記載の抗体およびPAC1発現細胞を用いることを特徴とする、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原決定基の異なる複数の、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドI型受容体（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type1 receptor（以下、「PAC1」と略記する））に対する新規抗体およびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
PAC1は下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide（以下、「PACAP」と略記する））の受容体であり、７回膜貫通タイプのG蛋白共役型受容体（GPCR）の１つである。PACAPは、PAC1に結合することで、中枢・末梢神経系において種々の生理活性を有することが知られている。即ち、PACAP−PAC1シグナル経路における障害が、中枢神経系においてはうつ病、精神行動機能障害、性的機能障害、日内リズムの光同調障害等に関わっており、末梢においても糖尿病または高インスリン血症等のインスリン分泌障害等に関わっているとの知見が得られている。このことから、PAC1は上記疾患及び障害治療のための創薬ターゲットとなり得る。【０００３】
GPCRに代表される膜蛋白質は創薬の標的となるため、その構造と機能の解明は重要である。蛋白質の立体構造解析のためには蛋白質の結晶化が必要となるが、膜蛋白質は、それを可溶化する界面活性剤により疎水性領域が覆われているために、結晶の生成に寄与し得る蛋白質表面が制限され、良質な結晶を得ることはきわめて困難である。PAC1についても、立体構造解析を可能とするような良好な結晶は未だ得られていない。【０００４】
膜蛋白質の結晶化を容易ならしむべく、その親水性部分が結晶格子形成に十分な分子間相互作用を生じ得るように、膜蛋白質に特異的な抗体を利用して親水性部分のサイズを大きくすることが試みられている。但し、この手法を実施するには、目的の膜蛋白質の親水性部分を認識し、且つ該膜蛋白質が本来の生理機能を発揮し得る構造（ネイティブな構造）を認識し得るモノクローナル抗体が不可欠である。膜蛋白質のネイティブな構造を認識し得る抗体を取得する手段の１つとして、該膜蛋白質を発現する細胞やその膜画分をそのまま抗原として用い、動物を免疫する方法が行われているが、GPCRは細胞膜表面での発現量が少ないために、目的の抗体が得られる可能性はきわめて低い。PAC1についても、これまでに報告されている抗体（非特許文献１ないし３）は、いずれも変性した非生理的な構造を有するPAC1しか認識し得ない。【０００５】
上述のように、PAC1は中枢神経系から末梢神経に広く分布し、多様な生理作用を発揮するPACAPの受容体であることから、PAC1のネイティブな構造を認識し得る抗体は、PAC1に結合してPACAPの生理活性を調節する物質として、それ自体医薬品の候補となり得る。抗体はその特異性の高さと血中半減期の長さから、副作用が少なく薬効持続性が長いという医薬品としての優れた特性を備えている。PAC1は細胞表面受容体であることから、治療用抗PAC1抗体はPAC1の細胞外領域を認識するものであることが望ましいが、公知の抗PAC1抗体はいずれも細胞質側のC末端領域を認識するものである。
従って、ネイティブな構造を有するPAC1の細胞外領域を認識し得る抗PAC1モノクローナル抗体が強く望まれている。【０００６】
膜蛋白質のネイティブな構造を認識し得る抗体を取得する別の手段として、精製した膜蛋白質標品を抗原とする方法が考えられる。上述のように、膜蛋白質をネイティブな構造を保持したままで精製するためには、界面活性剤による可溶化が必要になる。PAC1をジギトニンを用いて可溶化し、精製したことは既に報告されている（非特許文献４）。しかしながら、この方法で得られる精製PAC1は、界面活性剤により疎水性領域が覆われるために、抗原決定基となり得る部分が非常に制限されてしまい、抗原としては適さない。即ち、結晶化において直面するのと同様の問題が、PAC1のネイティブな構造を認識し得る抗体の取得をも困難にしている。 
【非特許文献１】Rong-Ming Lyuら，「ザ・ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」，（米国），第275巻，pp.36134-36142，2000年
【非特許文献２】Solveig Schulzら，「クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin. Cancer Res.）」，（米国），第10巻，pp.8235-8242，2004年
【非特許文献３】S.T. Andersonら，「ジャーナル・オヴ・ニューロエンドクリノロジー（J. Neuroendocrinol.）」，（米国），第17巻，pp.298-305，2005年
【非特許文献４】Tetsuya Ohtakiら,「ザ・ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」，（米国），第273巻，pp.15464-15473，1998年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ネイティブな構造を有するヒトPAC1を認識し得る新規抗PAC1抗体を提供すること、及び該抗体を用いることによりPAC1活性の異常が関連する疾患の予防・治療もしくは診断剤を提供すること、並びにPAC1の発現を調節する物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、PAC1の可溶化に用いる界面活性剤の種類や配合比などを鋭意検討した結果、抗体作製のための抗原として適したPAC1精製物を得ることに成功した。さらに、これを用いて、ネイティブな構造を有するヒトPAC1の細胞外領域を認識する、性質の異なる複数のマウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体を作製することに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る抗PAC1モノクローナル抗体；
［２］PAC1の細胞外領域を認識する上記［１］記載の抗体；
［３］PAC1のPACAPとの結合を阻害する上記［２］記載の抗体；
［４］PAC1の生理活性を阻害する上記［３］記載の抗体；
［５］PAC1のPACAPとの結合を阻害しない上記［２］記載の抗体；
［６］他の抗PAC1モノクローナル抗体のPAC1との結合を促進する上記［５］記載の抗体；
［７］他の抗PAC1モノクローナル抗体がPAC1のPACAPとの結合を阻害するものである、上記［６］記載の抗体；
［８］さらに変性したPAC1を認識し得る上記［１］記載の抗体；
［９］上記［１］記載の抗体を含むPAC1活性調節剤；
［１０］上記［４］記載の抗体を含むPAC1活性阻害剤；
［１１］PAC1の生理活性の亢進が関連する疾患の予防・治療用である、上記［１０］記載の剤；
［１２］上記［１］記載の抗体を含むPAC1検出剤；
［１３］PAC1活性の異常が関連する疾患の診断用である、上記［１２］記載の剤；
［１４］上記［１］記載の抗体およびPAC1発現細胞を用いることを特徴とする、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング法；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規抗PAC1抗体は、ネイティブな構造を有するPAC1の細胞外領域を認識し得るので、in vivoでPAC1に結合し、またその活性を調節することができ、従って、PAC1活性の異常が関連する疾患、例えばうつ病、精神行動機能障害、性的機能障害、日内リズムの光同調障害等の予防・治療剤として、さらに上記疾患及び糖尿病、高インスリン血症等のインスリン分泌障害などの診断剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】SM1200/CHS混合ミセル系を用いた膜画分可溶化の前後における、Sf9細胞試料とPACAPとの見かけの結合親和性を示す図である。
【図２】膜画分（A）及び膜画分可溶化液（B）のスキャッチャード解析を示す図である。
【図３】膜画分可溶化液のPACAPに対する結合親和性を示す図である。
【図４】アフィニティー吸着によって得られた各溶出画分のPACAPに対する結合親和性を示す図である。
【図５】ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって得られた各溶出画分のPACAPに対する結合親和性（Ａ）、並びにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって得られたMain画分、Sub1画分及びSub２画分のPACAPに対する見かけの結合親和性（Ｂ）を示す図である。
【図６】ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより得られたMain画分（Ａ）及びアフィニティークロマトグラフィー溶出画分（Ｂ）についてのスキャッチャード解析を示す図である。
【図７】実施例２で得られたマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体（Ａ）及びそのFab断片（Ｂ）の抗原PAC1受容体に対する結合親和性を示す図である。
【図８】実施例２で得られたマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体（Ａ）及びそのFab断片（Ｂ）による、PACAPのPAC1への結合阻害を示す図である。
【図９−１】実施例２で得られたマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体による、GTP-γSのPAC1への結合活性化阻害を示す図である（Ａ〜Ｃ）。
【図９−２】実施例２で得られたマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体による、GTP-γSのPAC1への結合活性化阻害を示す図である（Ｄ、Ｅ）。
【図１０−１】実施例２で得られた別個の２種類のマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体を用いた、競合ELASA（直接吸着法）の結果を示す図である（Ａ〜Ｆ）。
【図１０−２】実施例２で得られた別個の２種類のマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体を用いた、競合ELASA（直接吸着法）の結果を示す図である（Ｇ〜Ｌ）。
【図１０−３】実施例２で得られた別個の２種類のマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体を用いた、競合ELASA（直接吸着法）の結果を示す図である（Ｍ〜Ｒ）。
【図１０−４】実施例２で得られた別個の２種類のマウス抗ヒトPAC1モノクローナルIgG抗体を用いた、競合ELASA（直接吸着法）の結果を示す図である（Ｓ〜Ｖ）。
【００１２】
本発明は、ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る新規抗PAC1抗体（以下、「本発明の抗体」ともいう）を提供する。ここで「ネイティブな構造（native structure）」とは、PAC1が本来の生理機能を発揮し得る状態における構造、即ち、生体の細胞膜に天然に存在する状態でとり得るいずれかの構造を意味する。PAC1はGPCRであるので、活性化状態（即ち、PACAPや他のPAC1アゴニストが結合した状態）と不活性化状態（リガンドが結合していないか、アンタゴニストが結合した状態）とで構造が変化するが、いずれの状態における構造も、本発明における「ネイティブな構造」に該当する。【００１３】
本発明の抗体は、ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る限り、PAC1のいずれの部分を抗原決定基とするものであってもよいが、精製PAC1/界面活性剤複合体が免疫原として好ましく用いられることから、好ましくはPAC1の親水性領域（即ち、N末端領域、細胞外第1〜3ループ領域、細胞質第1〜3ループ領域、C末端領域）のいずれかを認識するものであり、より好ましくは、細胞外領域（即ち、N末端領域、細胞外第1〜3ループ領域）のいずれかを認識するものである。細胞外領域を認識する本発明の抗体はインタクトな細胞の表面上に発現するPAC1に結合することができるので、抗体医薬としての用途において特に有利である。【００１４】
本発明の抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。【００１５】
また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2、Fv、VH等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、dsFv、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。【００１６】
PAC1に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【００１７】
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、PAC1またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる。【００１８】
PAC1またはその部分ペプチドは、例えば、（a）ヒト、サル、ラット、マウス、ニワトリなどの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）PAC1またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（d）PAC1またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。【００１９】
本発明に用いられるPAC1蛋白質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
PAC1は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは臓器［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］等から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。【００２０】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００２１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。【００２２】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド（即ち、PACAP）結合活性およびシグナル伝達活性（例えば、アデニル酸シクラーゼ刺激活性(cAMP産生上昇)、共役3量体Ｇ蛋白質へのGTP誘導体結合活性、ホスホリパーゼC刺激活性(細胞内Ca濃度上昇)等）などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル伝達活性などの活性は同等（例えば、約0.5〜約2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル伝達活性の測定は、自体公知の方法（例えば、WO 03/055507を参照）に準じて行なうことができる。【００２３】
また、本発明で用いられるPAC1には、例えば、(1)配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3)配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。【００２４】
本発明で用いられるPAC1は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒトPAC1蛋白質（GenBankアクセッション番号：NP_001109）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NP_031433およびNP_598195として登録されているマウスおよびラットオルソログ（それぞれヒトPAC1に対して約87.5％および約87.3％の同一性を有する）等］である。【００２５】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明で用いられるPAC1は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα-ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるPAC1がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるPAC1には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質［例えばヒトPAC1の場合、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号28、40、97、280及び355で示されるAsn残基が可能性のある糖鎖付加部位として挙げられる（GPCR database (http://br.expasy.org/uniprot/PACR_HUMAN) に基づく）］などの複合蛋白質なども含まれる。【００２６】
PAC1の部分ペプチドは、上記したPAC1の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つPAC1と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はPAC1の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、PAC1の部分ペプチドとして、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、リガンドであるPACAPとの結合に関わる領域［例えばヒトPAC1の場合、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1-135、186-207、272-289および352-365で示される細胞外領域（GPCR database (http://br.expasy.org/uniprot/PACR_HUMAN) に基づく）など］や、PACAPとの相互作用を介したシグナル伝達に関わる領域［例えば、三量体Ｇ蛋白質のαサブユニット（Gα）と結合してそのGDP-GTP交換反応を促進する活性を有する領域（例えば、細胞質第3ループ領域）等］を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。PAC1の部分ペプチドのサイズに特に制限はないが、例えば10個以上、好ましくは30個以上、より好ましくは100個以上、より好ましくは200個以上のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。【００２７】
また、PAC1の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、PAC1について前記したと同様のものが挙げられる。PAC1の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものもPAC1の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、PAC1の部分ペプチドには、上記したPAC1と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【００２８】
本発明で用いられるPAC1またはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００２９】
PAC1は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりPAC1またはその塩を調製することができる。後述するように、本発明の好ましい態様においては、PAC1は、上記細胞膜含有画分から、適当な界面活性剤を用いてPAC1/界面活性剤複合体として精製される。【００３０】
PAC1またはその部分ペプチド（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「PAC1」という）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。PAC1を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株) （1975年）
(4) 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学IV 205 (1977年)
(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【００３１】
このようにして得られたPAC1は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるPAC1が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にPAC1が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【００３２】
PAC1の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α-アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするPAC1の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のPAC1またはそのアミド体を取得する。【００３３】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。【００３４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド，N,N-ジメチルアセトアミド，N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約-20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。【００３５】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。【００３６】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約-20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。【００３７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。【００３８】
PAC1のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα-アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質（ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（ペプチド）とを製造し、この両蛋白質（ペプチド）を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のPAC1のアミド体を得ることができる。
PAC1のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記PAC1のアミド体の場合と同様にして得ることができる。【００３９】
PAC1の部分ペプチドは、PAC1全長蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。【００４０】
後述するように、本発明において免疫原として用いられるPAC1またはその部分ペプチドは、ネイティブな構造（部分ペプチドにあっては、PAC1の本来の生理機能と同質の機能を発揮し得る状態における構造）を保持し得るべく、界面活性剤との複合体として調製されることが好ましい。したがって、上記のようにして化学的に合成されたPAC1またはその部分ペプチドは、好ましくは、動物への免疫に先立って、適当な界面活性剤と混合することにより、その疎水性領域が界面活性剤ミセルで覆われた複合体に調製される。【００４１】
さらに、PAC1は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からPAC1を分離精製することによって製造することもできる。PAC1またはその部分ペプチドをコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
PAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。PAC1またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、PAC1またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。【００４２】
PAC1をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号：１で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したPAC1と実質的に同質の活性（例：リガンド結合活性、シグナル伝達活性など）を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。【００４３】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００４４】
PAC1をコードするDNAは、好ましくは配列番号：１で表される塩基配列で示されるヒトPAC1蛋白質をコードする塩基配列を含有するDNA（GenBankアクセッション番号：NM_001118）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ（例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NM_007407およびNM_133511として登録されているマウスおよびラットオルソログ等）である。【００４５】
PAC1の部分ペプチドをコードするDNAは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含み、且つPAC1と同等の生理活性を有するペプチドをコードするものであればいかなるものであってもよい。具体的には、PAC1の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、（１）配列番号：１で表される塩基配列の部分塩基配列または（２）配列番号：１で表される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ前記したPAC1と実質的に同質の活性（例：リガンド結合活性、シグナル伝達活性など）を有するペプチドをコードするDNAなどが用いられる。【００４６】
PAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAは、該PAC1またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、PAC1蛋白質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。【００４７】
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。【００４８】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。【００４９】
PAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、PAC1をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。【００５０】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、PAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。【００５１】
上記したPAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、PAC1またはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1，エシェリヒア・コリJM103，エシェリヒア・コリJA221，エシェリヒア・コリHB101，エシェリヒア・コリC600などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114，バチルス・サブチルス207-21などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。【００５２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。【００５３】
動物細胞としては、例えば、COS-7、Vero、CHO、CHO(dhfr-)、CHO-K1、L、AtT-20、GH3、FL、HEK293、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、P388などの細胞が用いられる。【００５４】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻，2110 (1972)やGene，17巻，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194巻，182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology, 6巻，47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology，52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。【００５５】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜約40℃で、約6〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で、約24〜約72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Mediumに非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜約5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM），ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM），RPMI 1640培地，199培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にPAC1またはその部分ペプチドを製造せしめることができる。【００５６】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からPAC1またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、膜画分からPAC1またはその部分ペプチドを抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー法、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する）などの方法が用いられる。
このようにして得られた膜画分中に含まれるPAC1またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。【００５７】
かくして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するPAC1またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。【００５８】
後述するように、本発明の好ましい態様においては、PAC1は、上記膜画分から、適当な界面活性剤を用いてPAC1/界面活性剤複合体として精製される。【００５９】
さらに、PAC1またはその部分ペプチドは、上記のPAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、PAC1またはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.ら, “Transcription and Translation”, Hames B.D.およびHiggins S.J.編, IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製)やRTS 500 Rapid Translation System (Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM (TOYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B.ら, Nature, 179, 160-161 (1957)あるいはErickson A.H.ら, Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt,J.M.ら (1984) 前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Spirin A.S.ら, Science, 242, 1162-1164 (1988)）、透析法（木川ら、第21回日本分子生物学会、WID6）、あるいは重層法（PROTEIOSTMWheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書：TOYOBO社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開2000-333673）等を用いることができる。【００６０】
後述するように、本発明において免疫原として用いられるPAC1またはその部分ペプチドは、ネイティブな構造（部分ペプチドにあっては、PAC1の本来の生理機能と同質の機能を発揮し得る状態における構造）を保持し得るべく、界面活性剤との複合体として調製されることが好ましい。したがって、上記のようにして無細胞系で合成されたPAC1またはその部分ペプチドは、好ましくは、動物への免疫に先立って、適当な界面活性剤と混合することにより、その疎水性領域が界面活性剤ミセルで覆われた複合体に調製される。【００６１】
PAC1の部分ペプチドは、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約3,000以下）の抗原を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。【００６２】
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン1に対し0.1〜100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。【００６３】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。【００６４】
あるいは、PAC1を発現する温血動物もしくは昆虫細胞自体またはその細胞膜含有画分を、抗原として直接用いることもできる。温血動物もしくは昆虫細胞としては、内在的にPAC1を産生する細胞、PAC1をコードするDNAで形質転換した細胞などを用いることができるが、内在性PAC1は発現量が少ないことから、外来性PAC1を強制的に大量発現させた形質転換細胞を用いることがより好ましい。膜画分は、種々の公知の方法を用いてリポソームと融合させ、プロテオリポソームとして用いることもできる。例えば、膜画分とリポソームを適切な割合で混合した後に、凍結融解を繰り返す方法、脂質混合液から作製されたフィルム上に膜画分を含む水溶液を置いた後、水和法により膜蛋白質を脂質二重層に移行させる方法等が本目的に使用できる。好ましくは、凍結融解法である。得られたプロテオリポソームは、超音波処理法、ホモジナイザー法、濾過法（エクストルーダー法）等によりサイジングすることができる。これらの細胞または膜画分は、培地（例：RPMI1640）または緩衝液（例：Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。【００６５】
本発明の好ましい実施態様においては、免疫原として用いるPAC1またはその部分ペプチドは、適当な界面活性剤との複合体として提供される。
PAC1またはその部分ペプチド（以下、界面活性剤との複合体調製の説明においては、両者を包括して「PAC1」と略記する）を、ネイティブな構造を保持したまま単離・精製するためには、界面活性剤による可溶化が必要となる。膜蛋白質を変性させずに可溶化するために、マイルドデタージェントと呼ばれる一連の非イオン性もしくは両イオン性界面活性剤が用いられる。ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得る抗体を効率よく得るためには、抗原提示能に優れたPAC1/界面活性剤複合体を免疫原として用いる必要があるが、これにはミセルのサイズが大きく影響する。本発明者らは、サイズの異なる種々の界面活性剤の中から、炭素数８〜１２のアルキル鎖を有するスクロースモノアルキレート、好ましくはβ-D-フルクトピラノシル-α-グルコピラノシドモノドデカノエート（SM1200）か、あるいは炭素数８〜１２のアルキル-β-D-マルトシド、好ましくはドデシル-β-D-マルトシド（DDM）等を、抗原提示能に優れたPAC1/界面活性剤複合体を提供し得るものとして見出した。また、例えば、コレステロールヘミサクシネート（CHS）等の両親媒性物質を併用することにより、PAC1/界面活性剤複合体の抗原提示能をさらに向上させることができる。界面活性剤と両親媒性物質の配合比は特に制限はないが、例えばSM1200とCHSとの混合ミセルを用いる場合、１０：１〜１０：３の配合比とすることが好ましい。可溶化剤として用いる界面活性剤の濃度は、通常約０．５〜約５％(w/w）の範囲である。【００６６】
PAC1としては、上記PAC1を発現する温血動物もしくは昆虫細胞（好ましくは、外来性PAC1を強制発現させた形質転換細胞）の細胞膜含有画分を用いることが好ましい。これに蛋白質濃度が約１〜約５mg/mLの濃度となるように上記界面活性剤（両親媒性物質との混合ミセルを含む）溶液を添加し、約４〜約２０℃で約０．５〜約２４時間インキュベートして膜蛋白質を可溶化させる。PAC1の精製は、例えば、PACAPを固相化した水不溶性担体（例えば、ガラスビーズ、樹脂、ゲルなど）に上記反応液を接触させ、PACAP-PAC1のアフィニティーを利用してPAC1/界面活性剤複合体を担体に捕捉することにより行うことができる。あるいは、組換えPAC1を用いる場合は、N末端もしくはC末端にタグ配列（例：His-タグ、GST-タグ、Myc-タグ、MBP-タグ等）を連結しておいてもよい。PAC1とタグとの連結部に適当なペプチダーゼ認識部位を付加しておくこともできる。【００６７】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
上記のようにして調製された免疫原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。【００６８】
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、(i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ｎｇ〜μｇオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。【００６９】
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5〜20%程度）添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。【００７０】
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。【００７１】
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。【００７２】
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。【００７３】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10〜80%程度、好ましくは30〜50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。【００７４】
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1程度であり、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【００７５】
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（EB）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。【００７６】
マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。【００７７】
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。【００７８】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7〜10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。【００７９】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。【００８０】
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。【００８１】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。【００８２】
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10〜14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7〜10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。【００８３】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I、131I、3H、14C）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。【００８４】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。【００８５】
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2〜3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。【００８６】
ハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養することができる。
in vitroでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
in vivoでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に106〜107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。【００８７】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。【００８８】
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。【００８９】
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（VHおよびVL）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（CHおよびCL）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。【００９０】
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第6,331,415号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってmRNAもしくは全RNAを調製し、cDNAを合成する。該cDNAを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてVHおよびVLの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてCHおよびCLのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばBio/Technology, 9: 88-89, 1991参照））を用い、常法に従ってPCRでVHおよびVLをコードするDNAを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したRNAからRT-PCRによりCHおよびCLをコードするDNAを増幅・精製する。常法を用いてVHとCH、VLとCLをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖DNAおよびキメラＬ鎖DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、CHO細胞、COS細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：CMVプロモーター、SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするDNAは別個のベクターに挿入してもよいし、1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。【００９１】
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればFabが、ペプシンで分解すればF(ab’)2がそれぞれ得られる。
また、マウスVHおよびVLをコードするDNAを適当なリンカー、例えば1〜40アミノ酸、好ましくは3〜30アミノ酸、より好ましくは5〜20アミノ酸からなるペプチド（例：[Ser-(Gly)m]nもしくは[(Gly)m-Ser]n（mは0〜10の整数、nは1〜5の整数）等）をコードするDNAを介して連結することによりscFvとすることができ、さらにCH3をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりminibodyモノマーとしたり、CH全長をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりscFv-Fcとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするDNAは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
マウスVHおよびVLをコードするDNAを1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりFvと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてVHおよびVLのFR中の適当なアミノ酸をCysに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりdsFvと呼ばれる二量体が形成される。【００９２】
（ii）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（CDR）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（FR））の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。【００９３】
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号および第5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のVHおよびVLをコードするDNAを単離した後、常法により自動DNAシークエンサー（例：Applied Biosystems社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編, 第5版, 1991参照) 等］を用いて解析し、両鎖のCDRおよびFRを決定する。決定されたFR配列に類似したFR配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループIおよびヒトＨ鎖サブグループIIもしくはIII（Kabatら，1991（上述）を参照）］のCDRコード領域を、決定された異種CDRをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を20〜40塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをDNAシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のFRと他の哺乳動物種由来のCDRを有するVHおよびVLをコードするDNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来CDRをヒト由来VHおよびVLに移植するには、PCRによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平5-227970号公報に記載の逐次CDR移植法等が挙げられる。このようにして得られるVHおよびVLをコードするDNAを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のCHおよびCLをコードするDNAとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。【００９４】
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてscFv、scFv-Fc、minibody、dsFv、Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。【００９５】
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。【００９６】
（iii）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ig）遺伝子をノックアウト（KO）した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトIgのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Tg）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて、ヒトモノクローナル抗体が作製された。これらのヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ、被験者における抗ヒトIgヒト抗体（HAHA）の産生は報告されていない。【００９７】
その後、Abgenix社［商品名：XenoMouse（Nat. Genet., 15: 146-156, 1997; 米国特許第5,939,598号等を参照）］やMedarex社［商品名：Hu-Mab Mouse（Nat. Biotechnol., 14: 845-851, 1996; 米国特許第5,545,806号等を参照）］が酵母人工染色体（YAC）ベクターを用いてより大きなヒトIg遺伝子を導入したTgマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトIg遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約80種のＶ断片、約30種のＤ断片および6種のＪ断片が様々に組み合わされたVDJエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約1.5Mb（14番染色体）、κＬ鎖が約2Mb（2番染色体）、λＬ鎖が約1Mb（22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ig遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、BAC、YAC等）に挿入可能なDNAは通常数kb〜数百kbであり、クローニングしたDNAを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。【００９８】
Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997）は、Ig遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（hCF）をマウスに導入して（染色体導入（TC）マウス）、完全長ヒトIg遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む14番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトIg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドES細胞を選択し、通常のKOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト14番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF14)）およびヒト2番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF2)）を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をKOされたマウス（KO(IgH)およびKO(Igκ)）を作製し、これら4系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルTC/KO）を樹立することができる。【００９９】
上記のようにして作製されるダブルTC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むhCF2がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。【０１００】
一方、前記Hu-Mab MouseはκＬ鎖遺伝子の約50%を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約10%しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つYACベクター（Igκ-YAC）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、TC(hCF14)マウスとHu-Mab Mouseとを交配してhCF14とIgκ-YACとを安定に保持するマウス（商品名：KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。【０１０１】
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト22番染色体もしくはその断片を導入したTCマウス（TC(hCF22)）を作製し、これと上記ダブルTC/KOマウスやKMマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（HAC）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2000）。【０１０２】
（iv）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はPCRによる変異がCDR以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のHAHA産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。【０１０３】
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、g3p、g6p〜g9pのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはg3pもしくはg8pのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、1)ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、2)融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、3)融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、1)の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには2)または3)のタイプが用いられる。【０１０４】
具体的なベクターとしては、Holtら（Curr. Opin. Biotechnol., 11: 445-449, 2000）に記載されるものが例示される。例えば、pCES1（J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 1999参照）は、1つのラクトースプロモーターの制御下にg3pのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするDNAとg3pシグナルペプチドの下流にCH3をコードするDNA、His-tag、c-myc tag、アンバー終止コドン(TAG)を介してg3pコード配列とが配置されたFab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとg3pコートタンパク質上にFabを提示するが、アンバー変異を持たないHB2151株などで発現させると可溶性Fab抗体を産生する。また、scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えばpHEN1（J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991）等が用いられる。【０１０５】
一方、ヘルパーファージとしては、例えばM13-KO7、VCSM13等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるS-S結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys社のCysDisplayTM技術）等も挙げられる。【０１０６】
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（non-immunized）ライブラリーは、正常なヒトが保有するVHおよびVL遺伝子をRT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のmRNA等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないIgM由来のmRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol., 14: 309-314, 1996参照）、MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994参照）、Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。【０１０７】
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばCDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするDNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なscFvやFabを産生するVHおよびVL遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Morphosys社のHuCALライブラリー（J．Mol. Biol., 296: 57-86, 2000参照）、BioInvent社のライブラリー（Nat. Biotechnol., 18: 852, 2000参照）、Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照）等が挙げられる。【０１０８】
免疫（immunized）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてmRNAを調製し、RT-PCR法によってVHおよびVL遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。【０１０９】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（1011〜1013ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ／クローン）を考慮すれば、108〜1011クローン程度が適当であり、約108クローンのライブラリーで通常10-9オーダーのKd値を有する抗体をスクリーニングすることができる。【０１１０】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を3〜5回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（SPR）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、Tween等の界面活性剤を含むPBS（3-5回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（pH5）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはS-S結合の還元（例えば、前記したCysDisplayTMでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。【０１１１】
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、抗体価測定法（例：ELISA、RIA、FIA等）やFACSあるいはSPRを利用した測定により抗原結合活性を確認する。【０１１２】
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。His-tagやc-myc tagを導入しておけば、IMACや抗c-myc抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。【０１１３】
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。【０１１４】
上記のいずれかの方法によって得られる本発明の抗体は、PAC1のPACAPとの結合を阻害するものであっても、阻害しないものであってもよい。本発明の抗体がPAC1のPACAPとの結合を阻害するか否かは、例えば、PAC1を固相化した担体（PAC1発現細胞自体やその細胞膜画分であってもよい）に、本発明の抗体の存在下および非存在下で、標識したPACAPを含む溶液を接触させてインキュベートした後、液相を除去し、固相上に結合した標識量を測定して、両条件下で比較することにより検定することができる。抗体の存在下で固相に結合する標識量が低下すれば、該抗体はPAC1のPACAPとの結合を阻害し、標識量に変化がなければ、該抗体はPAC1のPACAPとの結合を阻害しないと判定することができる。あるいは、PACAPをセンサーチップ上に固定化して、表面プラズモン共鳴によりPAC1とPAC1/抗PAC1抗体複合体のPACAPへの結合を測定・比較することによっても、PAC1とPACAPの結合阻害の有無を検定することができる。また該抗体存在下、膜画分や精製受容体に標識したPACAPを作用させ、ガラスフィルターに受容体とともに吸着する標識量によって、該抗体のPAC1のPACAPとの結合の阻害性を評価することができる。
例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体#135E、#130D、122B等は、PAC1のPACAPとの結合を阻害するのに対し、#2C等は該結合を阻害しない。【０１１５】
PAC1のPACAPとの結合を阻害する本発明の抗体は、PACAP-PAC1のシグナル伝達を遮断するので、PAC1のシグナル伝達活性を阻害する中和抗体である。本発明の抗体がPAC1のシグナル伝達活性を阻害するか否かは、より直接的には、抗体の存在下および非存在下におけるPAC1のエフェクター活性調節作用を比較することにより測定することができる。例えば、抗体の存在下および非存在下において、例えば、1)PAC1およびアデニル酸シクラーゼ（AC）を細胞膜上に含む細胞もしくはその膜画分にPACAPおよびATPを添加し、生成するcAMP量を、抗cAMP抗体を用いて放射性物質（例：125I）、酵素（例：アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ）、蛍光物質（例：FITC、ローダミン）等で標識したcAMPとの競合イムノアッセイにより測定する方法、2)上記細胞もしくはその膜画分に[α-32P]ATPを添加し、生成する[32P]cAMPをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法、3)cAMP応答エレメント（CRE）の制御下にあるリポーター遺伝子（例：ルシフェラーゼ遺伝子）を導入した形質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法、4)PAC1を含む膜画分に[35S]GTPγS（GαサブユニットのGTPase活性によって加水分解を受けないGTPアナログ）を添加し、膜に結合した放射活性を測定する方法等が挙げられる。あるいは、上記1)〜4)に代えて、1a)PAC1およびホスホリパーゼC（PLC）を細胞膜に含む細胞もしくはその膜画分にホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸（PIP）を添加し、生成するイノシトールリン酸（IP3）量を測定する方法、2)PAC1およびPLCを細胞膜に含む細胞内のCa2+量を測定する方法、3)Ca2+によりアップレギュレートされるTPA（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート）応答エレメント（TRE）の制御下にあるリポーター遺伝子を導入した形質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法等を用いることができる。尚、細胞内Ca2+量は、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができる。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙げられる。
例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体#130Dは、完全抗体（IgG）分子でIC50が10-7MのオーダーでPAC1・G蛋白質のGTP-γS結合作用を既存のペプチド性拮抗剤PACAP(6-38)NH2より強く阻害する、強力な中和抗体である。本抗体を産生するハイブリドーマ（PC1-SM-130D）は、2006年8月4日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（IPOD）（〒305-8566  茨城県つくば市東1-1-1  中央第6）に受領されている（受託番号：FERM BP-10655）。【０１１６】
一方、上記のようにして得られうる本発明の抗体は、PACAPと拮抗的にPAC1に結合してPACAPと同様のアゴニスト活性を示したり、PAC1の任意の細胞外領域に結合してPAC1の構造を変化させ、恒常的に活性化された状態にし得るものであってもよい。そのような抗体も、上記と同様の方法により、スクリーニングすることができる。【０１１７】
本発明の抗体はまた、他の抗PAC1モノクローナル抗体のPAC1との結合を阻害するものであっても、阻害しないものであってもよい。本発明の抗体が他の抗PAC1モノクローナル抗体のPAC1との結合を阻害するか否かは、例えば、上記PAC1とPACAPの結合阻害の検定について例示された方法において、PACAPの代わりに当該他の抗PAC1モノクローナル抗体を用いることによって検定することができる。
例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体#2Cは、上述のように自体PAC1のPACAPとの結合を阻害しないが、#34C、#66A等のPAC1との結合を促進する。従って、これらの抗体は、#2Cと併用することにより、単独の場合よりも強力にPAC1活性を中和し得ると考えられる。【０１１８】
本発明の抗体は、ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得るだけでなく、変性したPAC1をも認識することができる。従って、本発明の抗体は、ウエスタンブロット分析のような変性したPAC1蛋白質を検出する場合にも有効に利用することができる。【０１１９】
本発明は、本発明の抗体を用いることを特徴とする、PAC1活性調節剤、PAC1の異常が関連する疾患の予防・治療、およびPAC1活性の異常が関連する疾患の診断剤を提供する。【０１２０】
上述のように、本発明の抗体は、PAC1のネイティブな構造を認識してこれに結合し、PAC1の活性を調節することができるため、PAC1活性調節剤として使用することができる。ここで、PAC1活性とは、PACAPの結合により惹起されるPAC1を介した細胞内シグナル伝達活性をいい、PAC1活性を調節するとは、該シグナル伝達活性を減少または上昇させることをいう。【０１２１】
PACAPおよびPAC1の各種臓器における生物学的および薬理学的効果については、例えば、Pharmacol. Rev., (米国), 2000年, 第52巻 (第2号), pp. 269-324等に詳述されている。例えば、PACAPは中枢神経系においては、神経伝達物質や神経調節因子としての作用の他、神経栄養因子としての作用や神経発生の調節機能が示唆されている。したがって、その受容体であるPAC1の生理作用を増強する本発明の抗体は、中枢における脳浮腫や痴呆症状の改善などの予防・治療薬として使用することができる。またPACAP遺伝子欠損マウスの解析から、種々の刺激への反応性の変化が認められ、不安レベルの低下や好奇心の亢進が認められるので、その受容体であるPAC1の生理活性を阻害する本発明の抗体（例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体#135E、#130D、#122B等）は、中枢におけるPAC1の生理活性の亢進が関連する疾患、例えば、鬱や不安などの予防・治療剤として使用することができる。
一方、PACAPは末梢においては、インシュリン分泌作用や雌における妊娠の維持作用を有することが遺伝子導入および欠損マウスの解析から明らかになっているので、その受容体であるPAC1の生理活性を増強する本発明の抗体は、末梢におけるPAC1の生理活性の低下が関連する疾患、例えば、糖尿病や妊娠不全症などの予防・治療剤として使用することができる。【０１２２】
本発明の抗体は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、上記予防・治療剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、pH調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。【０１２３】
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。【０１２４】
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。【０１２５】
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。【０１２６】
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。【０１２７】
安定化剤の好適な例としては、ヒト血清アルブミン（HSA）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられる。【０１２８】
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、D-ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。【０１２９】
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【０１３０】
pH調節剤の好適な例としては、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸または塩基が挙げられる。【０１３１】
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。【０１３２】
保存剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。【０１３３】
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。【０１３４】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。【０１３５】
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の抗体含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし100重量％である。【０１３６】
例えば、注射剤は、抗体を分散剤（例：ポリソルベート80，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン，D-マンニトール，D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例：蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例：オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定化剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、必要に応じて、例えばメンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行い、通常、アンプル等の適当な容器に充填される。【０１３７】
注射剤は、上記液剤を真空乾燥などによって粉末とし、用時溶解（分散）して使用することもできる。真空乾燥法の例としては、凍結乾燥法、スピードバックコンセントレーター（SAVANT社）を用いる方法などが挙げられる。凍結乾燥を行う際には、-10℃以下に冷却されたサンプルを用いて、実験室ではフラスコ中で、工業的にはトレイを用いて、あるいはバイアル中で凍結乾燥させることが好ましい。スピードバックコンセントレーターを用いる場合は、0〜30℃程度で、約20mmHg以下、好ましくは約10mmHg以下の真空度で行われる。乾燥させる液剤中には、リン酸塩などの緩衝剤を添加してpHを3〜10程度とすることが好ましい。真空乾燥により得られる粉末製剤は長期間安定な製剤として、用時注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解、もしくはオリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油、プロピレングリコール等に分散することにより注射剤とすることができる。【０１３８】
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤などと併用してもよい。例えば、PAC1の生理活性を阻害する抗体を欝、不安などの予防・治療剤として用いる場合には、該疾患の予防・治療活性を有する他の薬剤、例えば、イミプラミン、クロミプラミン、アミトリプチリン、マプロチリン、フルボキサミン、パロキセチン、フルオキセチン、ミルナシプラン等の抗欝薬、及び、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、オキサゼパム、ブロマゼパム、ロラゼパム、アルプラゾラム、クロチアゼパム、エチゾラム等の抗不安薬などを併用することができる。また、例えば、PAC1の生理活性を増強する抗体を、脳浮腫、痴呆症状、糖尿病、妊娠不全症などの予防・治療剤として用いる場合には、該疾患の予防・治療活性を有する他の薬剤、例えば、グリセロール、果糖、マンニトール、ステロイド等の抗脳浮腫薬、ドネペジル、アマンタジン、チアプリド等の痴呆症状改善薬、インシュリン、トルブタミド、グリクロピラミド、グリベンクラミド、メトホルミン、エパルレスタット、ボグリボース、アカルボース、トログリタゾン等の抗糖尿病薬、及び、クエン酸クロミフェン、セキソビット、下垂体性性腺刺激ホルモン（HMG）、胎盤性性腺刺激ホルモン（HCG）等の妊娠不全症治療薬などを併用することができる。【０１３９】
本発明の抗体と上記他の薬剤とを併用する場合、例えば（１）公知の製剤学的製造法に準じ、所望により適宜製剤学的に許容され得る賦形剤等と共に単一剤に製造する、（２）それぞれを所望により製剤学的に許容され得る賦形剤等を用いて各製剤とし同時または時差を設けて組み合わせて使用（併用）する、または（３）それぞれを常法により適宜賦形剤と共にそれぞれ製剤化したものをセット（キット剤等）等としてもよい。（２）の場合、本発明の目的が達成される限り、各製剤の投与回数は異なっていてもよい。このような製剤中の有効成分の含有量は、各々の有効成分の有効量の範囲内あるいは製剤学的、薬理学的に許容される範囲内であればよい。具体的には通常約0.01〜約100重量％である。
あるいは、本発明の抗体と上記他の薬剤とを、必要に応じて適当なリンカーを介して連結し、イムノコンジュゲートとすることにより、本発明の抗体は、自体予防・治療薬として作用するだけでなく、併用薬剤を標的細胞（即ち、PAC1発現細胞）にターゲッティングする効果をも奏する。【０１４０】
本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、うつ病の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を1回量として、通常約0.01〜約20mg/kg体重程度、好ましくは約0.1〜約10mg/kg体重程度、さらに好ましくは約0.1〜約5mg/kg体重程度を、3週に1回程度〜週2回程度、好ましくは2週に1回〜週1回程度の間隔で、静脈注射、好ましくは点滴静注により投与するのが好都合である。点滴静注の場合、1回投与を、例えば約30〜約180分、好ましくは約60〜約120分かけて行う。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体と他の薬剤とを組み合わせて用いる場合には、個々の薬物の最少推奨臨床投与量を基準とし、投与対象、投与対象の年齢および体重、症状、投与時間、投与方法、剤型、薬物の組み合わせなどにより、適宜選択することができる。 【０１４１】
本発明の抗体は、PAC1を特異的に認識することができるので、被験液中のPAC1の検出・定量、特にサンドイッチ免疫測定法による検出・定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被験液および標識化蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化蛋白質等の割合を測定することを特徴とする被験液中のPAC1の定量法、（ii）被験液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被験液中のPAC1の定量法を提供する。
上記（ii）においては、不溶化抗体と標識化抗体とが互いにPAC1との結合を妨害しないような抗原認識部位を有することが好ましい（例えば、一方の抗体がPAC1のＮ端部を認識し、他方の抗体が細胞外ループ部を認識する等）。【０１４２】
本発明の抗体は、ネイティブな構造を有するPAC1を認識し得るので、組織染色等によるin situ検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分などいかなるフラグメントを用いてもよい。PAC1に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。【０１４３】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、[125I]、[131I]、[3H]、[14C]などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。【０１４４】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被験液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被験液中のPAC1量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。【０１４５】
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるPAC1の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体はPAC1との結合にかかる部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、PAC1のN端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはN端部以外、例えば細胞外ループ部を認識する抗体が用いられる。【０１４６】
本発明の抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被験液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被験液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法が用いられる。
イムノメトリック法では、被験液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０１４７】
これら個々の免疫学的測定法をPAC1の定量に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてPAC1の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、PAC1を高感度に定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内でのPAC1を定量することによって、PAC1活性の亢進もしくは低下に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被験体中に存在するPAC1を特異的に検出するために使用することができる。また、PAC1を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各画分中のPAC1の検出、被験細胞内におけるPAC1の挙動の分析などに使用することができる。【０１４８】
上記のように、本発明の抗体を用いることにより、被験動物（例えば、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ等）におけるPAC1活性の異常（亢進または低下）が関連する疾患、例えば、欝、不安、精神行動機能障害、性的機能障害、（日内リズムの光同調障害）、脳浮腫、痴呆症状、糖尿病や高インスリン血症等のインスリン分泌障害、妊娠不全症などの診断が可能となる。より具体的には、本発明は、本発明の抗体を用いて、生体試料中のPAC1発現量を測定することによる、PAC1活性の異常が関連する疾患の診断方法を提供する。ここで「診断」とは、発症の有無を判定することだけでなく、将来発症する可能性が高いか否かを予測することや、既に発症が判明している被験動物における病態の進行度の評価なども含む意味で用いられる。【０１４９】
本発明の方法に用いられる生体試料としては、被験動物由来のものであればいかなるものであってもよく、例えば、体液（例：血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、関節液、精液、尿、汗、涙など）、種々の細胞・組織片等が挙げられるが、被験動物への侵襲が少ないという点で体液が好ましいが、PAC1が膜蛋白質であることを考慮すると、細胞含有試料であることが望ましい。従って、疾患が疑われる部位の細胞もしくは組織片（生検サンプル）、あるいは血液、血球細胞などが好ましい。【０１５０】
生体試料中のPAC1の定量は、上記したいずれかの方法により行うことができる。測定の結果、PAC1量が正常値に比べて有意に増加している場合に、被験動物はPAC1活性の亢進に関連する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。逆に、PAC1量が正常値に比べて有意に減少している場合に、被験動物はPAC1活性の低下に関連する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。【０１５１】
上述のように、本発明の抗体はPAC1の定量に用いることができるので、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明の抗体およびPAC1発現細胞を用いることを特徴とする、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、および当該スクリーニング方法によって得られる物質を提供する。【０１５２】
すなわち本発明は、例えば、（i）非ヒト哺乳動物の(1)血液、(2)特定の臓器、(3)臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるPAC1を定量することによる、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、（ii）PAC1またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるPAC1を定量することによる、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、（iii）非ヒト哺乳動物の(1)血液、(2)特定の臓器、(3)臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのPAC1の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のPAC1を確認することによる、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、（iv）PAC1またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのPAC1の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のPAC1を確認することによる、PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。【０１５３】
細胞膜画分に含まれるPAC1の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、膵臓、脳下垂体など）、組織（例えば、膵島など）あるいは細胞（例えば、膵β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液など）等に懸濁し、界面活性剤（例えば、トリトンX-100TM、ツイーン20TMなど）などを用いて該細胞等を破壊し、さらに遠心分離や濾過、カラム画分などの手法を用いて細胞膜画分を得る。【０１５４】
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の画分には、画分遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による画分法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、PAC1と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。【０１５５】
細胞膜画分に含まれるPAC1は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。【０１５６】
（ii）PAC1またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作製し、細胞膜画分に含まれるPAC1を定量することができる。【０１５７】
PAC1の発現を調節する物質のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（30分前ないし24時間前、好ましくは30分前ないし12時間前、より好ましくは1時間前ないし6時間前）もしくは一定時間後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与後一定時間経過後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、細胞膜におけるPAC1の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被験物質を培地中に混合させ、一定時間培養後（1日後ないし7日後、好ましくは1日後ないし3日後、より好ましくは2日後ないし3日後）、細胞膜におけるPAC1の量を定量することにより行なうことができる。【０１５８】
細胞膜画分に含まれるPAC1の確認は、具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、膵臓、脳下垂体など）、組織（例えば、膵島など）あるいは細胞（例えば、膵β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、常法に従って組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層でのPAC1の染色度合いを定量化することによって、細胞膜上のPAC1を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるPAC1の量を確認することができる。
（iv）PAC1またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。【０１５９】
上記スクリーニング方法を用いて得られる物質は、PAC1の発現を調節する（細胞膜におけるPAC1の量を変化させる）作用を有する化合物であり、具体的には、（a）PAC1の発現を増加させる（細胞膜におけるPAC1の量を増加させる）ことにより、PACAP−PAC1相互作用を介する細胞刺激活性（例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生促進、イノシトールリン酸産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、インスリン分泌促進など）を増強させる物質、（b）PAC1の発現を減少させる（細胞膜におけるPAC1の量を減少させる）ことにより、該細胞刺激活性を減弱させる物質である。
該物質としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これらの物質は新規物質であってもよいし、公知物質であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる物質は、PAC1の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる物質は、PAC1の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。【０１６０】
PAC1の発現を調節する物質は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、上記医薬として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、D-ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例、食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素、水不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、β-カロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。【０１６１】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし100重量％である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例、乳糖，白糖，デンプン，D-マンニトールなど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例、α化デンプン，アラビアゴム，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤（例、タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポリエチレングリコール6000など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。【０１６２】
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる１種または２種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーE〔オイドラギットE（商品名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーL〔オイドラギットL（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーLD〔オイドラギットL-30D55（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーS〔オイドラギットS（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーRS〔オイドラギットRS（商品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットNE（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。【０１６３】
注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソルベート80，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム，グリセリン，D-マンニトール，D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例、蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例、オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。【０１６４】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。【０１６５】
PAC1の発現を調節する物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えばうつ病患者（体重60ｋｇとして）に対しては、一日につき通常約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えばうつ病常患者（体重60kgとして）に対しては、一日につき通常約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、ヒト60kg当たりに換算した量を投与することができる。【０１６６】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基【０１６７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基及び試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2Bzl          ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド【０１６８】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１６９】
実施例１  SM1200/CHS混合ミセル系を用いたヒトPAC1の精製
ヒトPAC1を発現させたSf9細胞培養液（14 L）から、定法どおりポリトロン法にて膜画分を調製した。蛋白質濃度を2 mg/mLに希釈した後、1.5% シュークロースモノラウレート (SM1200, Dojindo, S023） 及び0.3% コレステリルヘミサクシネート トリス塩 (CHS, Sigma, C6013) を含む可溶化液を用いて、4℃で緩やかにローテーションして可溶化した。可溶化前後のPAC1の見かけの親和性を図１に、膜画分および可溶化後のスキャッチャード解析を図２に示す。図１は可溶化に用いた膜画分2 mg/mLを基準に、希釈を横軸としてプロットしているので、一定量の膜画分を可溶化した前後での受容体の総親和性(受容体数と平衡定数（Kd）の積に比例)を反映したものとなっている。スキャッチャード解析の比較から、膜画分の88%受容体が可溶化されたことがわかった（図２）。
次に、可溶化液を3倍に希釈した後、Avidin-Affgel / Biotinyl PACAP38を30当量添加して、アフィニティー吸着を行った（図３）。
その後、アフィニティー担体をカラムに充填し、カラム体積の15倍量である約900 mLで洗浄を行い、酸性条件にて溶出液を5分毎に約5 mLずつチューブに分取した。溶出画分の親和性を図４に示す。画分7-16 (洗浄液を含めて約70 mL) を収集し、アミドブラックを用いて蛋白定量を行ったところ、15 μg/mLであった。【０１７０】
引き続き、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるPAC1の精製・濃縮を試みた。上記アフィニティークロマトグラフィー溶出液70 mL (蛋白質1050 μg) を内径1 cmのカラムを用いて900 μLのヒドロキシアパタイト担体を充填した。流速は約6.6 mL/hr (range 6) に設定し、カラム体積の10倍量である約9 mLで洗浄を行い、溶出液を4分毎に約0.44 mLずつ分取した。溶出画分の親和性を図５Ａに示す。この内、画分7-11をMain画分として採取し、画分12-14をSub1画分、画分6, 15-17をsub2画分として採取し、それらの見かけの親和性をアフィニティークロマトグラフィー後のPAC1受容体溶液 (AF(initial)) の結果とともに図５Ｂに示す。
Main 画分及びアフィニティークロマトグラフィー溶出画分についてスキャッチャード解析を行い、各画分の特性を解析した (図６)。これによりヒトPAC1が精製されたことが確認された。精製したPAC1受容体試料はMain、sub画分を併せて約1 mgであった。【０１７１】
実施例２  マウス抗ヒトPAC1モノクローナル抗体の作製
上記実施例１で精製されたPAC1受容体（以下、「SM1200/CHS可溶化PAC1受容体」と称する）を抗原として、初回にフロイント完全アジュバントと、2回目以降はフロイント不完全アジュバントと等容量混合して作製したエマルジョンを、BALB/Cマウス (6週齢, 雌) の皮下に10 μgずつ1週間毎に4回の免疫を行った。試験採血の後、抗体価上昇が認められたマウスを選択して、10 μgの抗原による最終免疫 (静脈内投与) を行い、4日後に脾臓を摘出した。脾臓細胞をほぐした後、滅菌ガーゼでろ過し、免疫生物研究所製Cat. No. 33612 TIL MediaI (10% FCS含有) に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3×63.Ag8.653（P3X63）を用いた（ATCC CRL1580）。細胞融合は、原法（Nature, 256: 495, 1957）を改変して行った。即ち、脾臓細胞およびP3X63をそれぞれ血清を含有しないTIL MediaIで2度洗浄し、脾臓細胞とP3X63数の比率を10:1になるよう混合して、1500回転で5分間遠心を行って細胞を沈澱させた。上清を十分に除去した後、沈澱を軽くほぐし、45%-ポリエチレングリコール（PEG）4000（免疫生物研究所社製Cat. No. 33331）を1.0 mL加え、37℃温水槽中で5分間静置して融合を行った。融合後細胞に毎分2 mLの割合で、TIL MediaI (10% FCS含有) を添加し、合計40 mLのTIL MediaI (10% FCS含有) を加えた後800回転で5分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物をTIL MediaI (10% FCS含有) にP3X63が1 mL当り2×106個になるように浮遊させ、96穴マルチディッシュ（Coaster社製）に1ウェルあたり0.1 mLずつ播種した。播種後、細胞をCO2インキュベーター中、37℃、5% CO2/95% 大気の雰囲気下で培養した。24時間後HAT（ヒポキサンチン1×10-4M、アミノプテリン4×10-7M、チミジン1.6×10-5M）を含んだCat. No. 33251 HAT MediaI (10% FCS含有)（HAT培地）を1ウェル当り0.1 mLずつ添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択培養は、培養開始3、6、9日後に旧液を0.1 mL捨てた後、0.1 mLのHAT培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認められ、培養液が黄変したとき（約1×106細胞/mL）上清を採取し、抗体価を測定した。【０１７２】
実施例３  精製マウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体の抗原との親和性
抗原SM1200/CHS可溶化PAC1受容体をMAXISORPに2-5 μg/mLになるように50 μL/ウェルずつ導入して一晩作用させ、その後25% ブロックエースを含むブロック液を300 μL入れてブロッキングした。PBSで3回洗浄した後、実施例２で得られた抗体および常法により作製した各クローンのFabの溶液を、種々の濃度で室温で1.5時間作用させ、その後西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRPO) 標識ヤギ抗マウスIgG抗体 (American Qualer, A106PU) を1000倍希釈にて室温で1時間作用させ、0.05% Tween20を含むPBSで3回洗浄した。その後、HRPO基質 (TMB Peroxidase Substrate 2-component Kit, 50-76-00, KPL社製) を50 μLずつ分注して発色させ、1N 硫酸を50 μLずつ分注して反応停止後、プレートリーダー（マルチスキャン；ラボシステムズ）を用いて450 nmの吸光度を測定した。測定結果を図７に、親和性データを表１に示す。【０１７３】
【表１】
2008018472.tif 000002
【０１７４】
サブクラスの同定
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ロシュ・ダイアグノスティックス, 1493027) を用いて、ハイブリドーマ培養上清をD-PDSで30倍に希釈して150 μLチューブに添加して評価した。同定された各抗体クローンのサブクラスを表１に示す。【０１７５】
実施例４  マウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体による受容体のリガンド結合阻害
精製SM1200/CHS可溶化PAC1受容体 (0.4 mg/mL) を、TED-DG buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Digitonin, 0.5 mM PMSF, 10 μg/mL Pepstatin A, 20 μg/mL Leupeptin, 4 μg/mL E-64) によって200,000倍に希釈し、100 μLずつ5 mL ポリエチレンチューブ (Falcon, 352053) に分注した。実施例２で得られた抗PAC1モノクローナル抗体のダルベッコPBS（D-PBS）溶液を、種々の濃度で10 μLずつ添加し、15-30分間25℃でインキュベートした後に、125I-PACAP27 (2 nM) を5 μL添加してさらに1時間25℃でインキュベートした。その後、ポリエチレンイミン処理したGF/Fグラスフィルター (Whatman) を用いて吸引ろ過し、フィルター上に捕捉された125I-PACAP27の放射活性をγカウンターにより検出した。測定は3回行った。抗体の代わりにD-PBSを添加したものを100% bound、終濃度10-7Mになるようにcold PACAP27を添加したものを0% boundとして、% of controlで評価した。結果を図８及び表２に示す。【０１７６】
【表２】
2008018472.tif 000003
【０１７７】
実施例５  マウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体による受容体活性阻害GTP-γS結合活性評価
PAC1受容体遺伝子を導入し発現させたチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞をポリトロン法にて破砕し、20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、5 mM MgCl2、150 mM NaCl、1 μM GDP、1% BSAを含む緩衝液にて150倍に希釈し、100 μLとした。実施例２で得られたマウス抗PAC1モノクローナル抗体を、種々の濃度でそれぞれ10 μL添加した後、15分、25℃にてインキュベートした。続いて5 nM PACAP27を10 μL添加し、さらに10 nM GTPγ-35Sを10 μL添加して、60分25℃にてインキュベートした。その後、水で湿らせたGF/Fグラスフィルター (Whatman) を用いて吸引ろ過し、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.05% CHAPS、0.1% BSAを含む洗浄用緩衝液1.5 mLで2回洗浄した。フィルター上に捕捉されたGTPγ-35Sの放射活性を液体シンチレーターにより検出した。測定は２回行った。抗体の代わりにD-PBSを添加したものを100% bound、終濃度1.5×10-6MになるようにアンタゴニストPACAP6-38を添加したものを0% boundとして、% of controlで評価した。結果を図９−１〜９−２に示す。
この系ではアンタゴニストPACAP(6-38)NH2の阻害がIC50 10-7 M程度となっており、文献値 (Eur. J. Biochem. 207, 239 (1992)) で報告されたIC502 nMと比べて50倍程度弱く見積もられている。この系での評価ではIgG 130DがIC50 10-7 Mオーダーの阻害、122B、135E、45Aおよび66Aが10-6Mオーダーの阻害となり、このうち130D、122B、135Eおよび45AはアンタゴニストPACAP(6-38)NH2よりGTP-γS結合阻害度が大きい。【０１７８】
実施例６  ２つのマウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体による競合ELISA
精製SM1200/CHS可溶化PAC1受容体を2 μg/mLとなるように10 mM リン酸ナトリウム(pH 8.0), 100 mM NaCl bufferで希釈した溶液を、96穴MAXSORP plateに50 μLずつ添加し、一晩固相化した。このプレートをブロッキング液 (25% Block Ace及び0.1% NaN3を含有するPBS) 320 μLにて一晩処理し、ブロッキングを行った。該プレートをPBSにて2回洗浄後、PBSに溶解した実施例２で得られた第一のマウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体をPBSにて4段階以上に希釈し、該希釈液を40 μL添加した（n=2）。同仁のビオチン化キット (Biotin Labeling Kit - NH2) を用いてビオチン化した第二のマウス抗ヒトモノクローナルPAC1抗体を、1 μg/mL (但し、2C、66Aおよび135Eはそれぞれ5μg/mL、2μg/mLおよび0.2μg/mL) となるように20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.0)、0.4 M NaCl、2 mM EDTA、10% Block Ace、0.2% BSA、0.05% CHAPSを含む緩衝液で希釈し、10 μLずつ添加した (終濃度0.2 μg/mL)。室温で2時間反応させた後、0.05% Tween 20を含むD-PBSで１回洗浄し、D-PBSで2回洗浄した。次に、Avidin-HRP (Dako, P034) を20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.0)、0.4 M NaCl、2 mM EDTA、1.0% BSAにて4000倍希釈して50 μLずつ添加し、室温で1.5時間、揺動条件で反応させた。PBSTにて3回洗浄の後、2 component system試薬を50 μL添加してHRP反応を実施し、3-7分の呈色反応の後、50 μLのH2SO4を添加して反応を停止し、プレートリーダーを用いて450 nmにて呈色定量した。結果を図１０−１〜１０−４及び表３に示す。【０１７９】
【表３】
2008018472.tif 000004
【０１８０】
この測定において、同一のbiotin化抗体と無標識抗体との競合をpositive controlとして評価し、このときと同程度のdynamic rangeにて、displaceされるものを互いに阻害する（− 表3）として評価した。この系を設定したときは、この(−)か、もしくはbiotin化抗体の結合を妨げない(null)の2種類の結果のみが得られると考えていた。しかしながら、逆に無標識抗体の添加により、biotin化抗体の結合が強く促進されるもの(++)も見いだされた。特にIgG-2CとIgG-34CおよびIgG-2CとIgG-66Aは共存することで、お互いの結合を促進し合った。一方、IgG-34CとIgG-66Aはお互いに結合を阻害し合った。IgG-2C,IgG-45A,IgG-95C,IgG-122B,IgG-130DおよびIgG-135Eの6種はお互いに阻害し、従ってお互いに抗原結合部位が重なりあうことが判明した。これらの抗体の抗原への結合部位はPAC1の細胞外に露出した領域と考えられる。細胞表面に発現する受容体に結合しないIgG-39Cはその他の抗体とは阻害や促進を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明の抗PAC1抗体は、PAC1活性を調節し得ることから、PAC1の生理活性の亢進が関連する疾患の予防・治療剤、およびPAC1活性の異常が関連する疾患の診断剤として極めて有用である。また、本発明の抗体はPAC1の発現を調節する物質のスクリーニングにも有用である。【０１８２】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本で出願された特願2006-216282（出願日：平成18年8月8日）を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図８】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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