(57)【要約】  生物に与える影響が既知の複数の化学物質を各化学物質投与群に、被検化学物質を被検化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に各投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、タンパク質及びそのタンパク質から生成した修飾タンパク質のスポットのシグナル強度を測定して少なくとも２つのスポットについてシグナル強度比を算出する工程と、被検化学物質投与群のシグナル強度比を各化学物質投与群のシグナル強度比と比較する工程と、を有する被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物に与える影響が既知の複数の化学物質を各化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に各化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度を測定して、１のタンパク質及びそのタンパク質から生成した修飾タンパク質のスポットから選択した少なくとも２つのスポットのシグナル強度比を算出して蓄積する工程と、
被検化学物質を被検化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に被検化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度を測定して、一のタンパク質及びそのタンパク質から生成した修飾タンパク質のスポットから選択した少なくとも２つのスポットのシグナル強度比を算出する工程と、
被検化学物質投与群において算出した少なくとも１のシグナル強度比を、各化学物質投与群において対応するタンパク質又は修飾タンパク質のスポットから算出したシグナル強度比と比較する工程と
を有する被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。
【請求項２】
媒体を媒体対照群に投与し、所定期間経過後に媒体対照群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＣ）を測定する工程と、
生物に与える影響が既知の複数の化学物質を前記媒体に溶解して調製した化学物質溶液を各化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に各化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＸ）を測定して前記複数のスポット毎にシグナル強度（αＸ）を媒体対照群のシグナル強度（αＣ）で除したシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）を算出し、前記複数のスポットから選択した少なくとも２つのスポットの間でシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）の比を算出して蓄積する工程と、
被検化学物質を前記媒体に溶解して調製した被検化学物質溶液を被検化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に被検化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質から翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＥ）を測定して前記複数のスポット毎にシグナル強度（αＥ）を媒体対照群のシグナル強度（αＣ）で除したシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）を算出し、前記複数のスポットから選択した少なくとも２つのスポットの間でシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）の比を算出する工程と、
被検化学物質投与群において算出した少なくとも１のシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）の比を、各化学物質投与群において対応するタンパク質又は修飾タンパク質のスポットから算出したシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）の比と比較する工程と、
を有する被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。
【請求項３】
被検化学物質投与群において算出したシグナル強度補正値の比を、各化学物質投与群において算出したシグナル強度補正値の比と比較する工程において、被検化学物質投与群と化学物質投与群との間でのシグナル強度補正値の比の比較が、化学物質投与群を化学物質が生物に与える影響により２群以上の群に分類し、群間で有意差検定を行うことにより特徴的な修飾を受けて生成した修飾タンパク質を選定して、その修飾タンパク質のシグナル強度補正値を用いて行うものである請求項２に記載の被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。
【請求項４】
生物に与える影響が発がん性、薬効、又は毒性である、請求項１乃至３のいずれかに記載の被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検化学物質を生体に投与したときに産生する異なる修飾を受けたタンパク質の産生割合を、他の化学物質を投与したときの産生割合と比較することにより、被検化学物質が生物に与える影響を予測する予測方法に関する。異なる修飾を受けたタンパク質は、生体内で翻訳後修飾又はトランケーションなどのプロセシングにより産生する。
【背景技術】
【０００２】
生体内でのタンパク質の発現は細胞の生理的な状態と関連することが知られている。比較プロテオーム解析では、サンプル中に存在するタンパク質は、まず二次元電気泳動を用いて分離される。次いで、分離されたタンパク質のスポットが与えるシグナル強度が比較され、タンパク質の発現量が比較される。【０００３】
タンパク質は、ＲＮＡの遺伝情報に基づいて翻訳された後、リン酸化や糖鎖付加などのいわゆる翻訳後修飾を受けることがある。翻訳後修飾等により修飾されたタンパク質は、修飾基の種類やその結合部位、修飾基の数等の違いにより、等電点がわずかに異なる。その結果、修飾されたタンパク質を二次元電気泳動を用いて分離すると、修飾されたタンパク質は連続した複数のスポットとして検出される。タンパク質の発現だけでなく、その翻訳後修飾についても解析することは、細胞の状態を知るうえで重要である。【０００４】
近年、質量分析装置によりタンパク質を解析する方法が急速に発達し、質量分析装置を用いて糖鎖結合部位を決定する方法（非特許文献１、２）や、網羅的にリン酸化ペプチドを同定する方法（非特許文献３）が提案されている。非特許文献１〜３に記載の方法によれば、網羅的にリン酸化されたタンパク質を同定することや、糖鎖付加している部位を同定することが可能となってきている。【０００５】
リン酸化されたタンパク質を定量する技術としては、安定同位体でラベル化したアミノ酸を使用する方法が知られている。この方法は、安定同位体でラベル化したアミノ酸が含まれる培地中で細胞を培養した後、当該細胞中のリン酸化タンパク質を選択的に取り出して質量分析装置で解析する方法である。リン酸化タンパク質の精製には、抗チロシンリン酸化抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーなどが使用される。しかし、この方法では、タンパク質から生成したリン酸化タンパク質の増減に関する情報しか得ることができない。従って、翻訳後修飾やトランケーションなどのプロセシングで修飾されたタンパク質や、プロセシングの対象となるタンパク質自体の増減を、網羅的に定量、比較することは従来困難である。
【非特許文献１】アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）1999, 71,1431-1440、（1433頁）
【非特許文献２】ネーチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）2003, 21, 667-672、(672頁)
【非特許文献３】ネーチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）2001, 19, 379-382、(382頁)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子が翻訳されて産生するタンパク質を二次元電気泳動により分離したときに電気泳動用ゲル上に複数の一連のスポットが検出される場合がある。この場合は、タンパク質自体の発現量の変化と、翻訳後修飾やプロセシングによる発現量の変化とを包含した解析を行うことになる。従来、タンパク質の翻訳後修飾やプロセシングにより修飾を受けたタンパク質のみに着目した研究はある。しかし、翻訳により産生されたタンパク質及びその後の修飾を受けたタンパク質の発現量の変化について網羅的に解析を行うことは行われていない。【０００７】
本発明は、翻訳されて産生するタンパク質及び前記タンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションにより修飾を受けた修飾タンパク質の発現量を網羅的に解析することにより、被検化学物質が生体に及ぼす影響を予測する方法を提供することを目的とする。生体に及ぼす影響としては、化学物質の薬効、毒性、発がん性等が例示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、二次元電気泳動を用いた定量プロテオミクス解析により、リン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾やトランケーションなどのプロセシングに基づいて産生される同一タンパク質由来の修飾タンパク質に基づく複数のスポットを用いて、修飾タンパク質の発現量比の測定を行うことを試みた。検討を行った結果、本発明者らは、生物に与える影響が既知の化学物質と被検化学物質との間で当該発現量比を比較することにより、被検化学物質が生物に与える影響を予測することができることを見出し、本発明を完成するに到った。【０００９】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。【００１０】
〔１〕  生物に与える影響が既知の複数の化学物質を各化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に各化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度を測定して、１のタンパク質及びそのタンパク質から生成した修飾タンパク質のスポットから選択した少なくとも２つのスポットのシグナル強度比を算出して蓄積する工程と、
被検化学物質を被検化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に被検化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度を測定して、一のタンパク質及びそのタンパク質から生成した修飾タンパク質のスポットから選択した少なくとも２つのスポットのシグナル強度比を算出する工程と、
被検化学物質投与群において算出した少なくとも１のシグナル強度比を、各化学物質投与群において対応するタンパク質又は修飾タンパク質のスポットから算出したシグナル強度比と比較する工程と
を有する被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。【００１１】
〔２〕  媒体を媒体対照群に投与し、所定期間経過後に媒体対照群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＣ）を測定する工程と、
生物に与える影響が既知の複数の化学物質を前記媒体に溶解して調製した化学物質溶液を各化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に各化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質が翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＸ）を測定して前記複数のスポット毎にシグナル強度（αＸ）を媒体対照群のシグナル強度（αＣ）で除したシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）を算出し、前記複数のスポットから選択した少なくとも２つのスポットの間でシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）の比を算出して蓄積する工程と、
被検化学物質を前記媒体に溶解して調製した被検化学物質溶液を被検化学物質投与群に投与し、所定期間経過後に被検化学物質投与群から採取したタンパク質を二次元電気泳動により分離し、分離した少なくとも１のタンパク質及びそのタンパク質から翻訳後修飾又はトランケーションによる修飾を受けて生成した修飾タンパク質の複数のスポットのうち少なくとも２つのシグナル強度（αＥ）を測定して前記複数のスポット毎にシグナル強度（αＥ）を媒体対照群のシグナル強度（αＣ）で除したシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）を算出し、前記複数のスポットから選択した少なくとも２つのスポットの間でシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）の比を算出する工程と、
被検化学物質投与群において算出した少なくとも１のシグナル強度補正値（αＥ／αＣ）の比を、各化学物質投与群において対応するタンパク質又は修飾タンパク質のスポットから算出したシグナル強度補正値（αＸ／αＣ）の比と比較する工程と、
を有する被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。【００１２】
〔３〕  被検化学物質投与群において算出したシグナル強度補正値の比を、各化学物質投与群において算出したシグナル強度補正値の比と比較する工程において、被検化学物質投与群と化学物質投与群との間でのシグナル強度補正値の比の比較が、化学物質投与群を化学物質が生物に与える影響により２群以上の群に分類し、群間で有意差検定を行うことにより特徴的な修飾を受けて生成した修飾タンパク質を選定して、その修飾タンパク質のシグナル強度補正値を用いて行うものである〔２〕に記載の被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。【００１３】
〔４〕  生物に与える影響が発がん性、薬効、又は毒性である、〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の被検化学物質の生物に与える影響の予測方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明においては、同一タンパク質に由来するタンパク質又は修飾タンパク質の発現量比を測定し、生物に与える影響が既知の化学物質投与群と被検化学物質投与群との間で比較を行う。この比較により、被検化学物質の薬効、毒性、発がん性などの被検化学物質が生体に及ぼす影響を予測することができる。【００１５】
本発明の予測方法においては、被検化学物質の生物に与える影響を評価するための長期にわたる動物実験を行う必要がない。１〜９０日程度の短期間の動物実験で、被検化学物質の生物に与える影響が精度よく予測できる。従って、本発明は化学物質のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１における同一タンパク質由来のスポット数とその数のスポットが検出されたタンパク質数の関係を示すグラフである。
【図２】実施例１における発がん性の予測に使用したデータのセット数と予測率の関係を示すグラフである。
【図３】実施例１において算出した発がん物質のトータルスコアを示すグラフである。
【図４】実施例１において算出した発がん物質のトータルスコアを示すグラフである。
【図５】実施例１において算出した非発がん物質のトータルスコアを示すグラフである。
【図６】実施例１において最も高い予測率を与えたデータセットのレファレンスゲル上の位置を示すスキャナー取込み図である。
【図７】実施例３において最も高い予測率を与えたデータセットのレファレンスゲル上の位置を示すスキャナー取込み図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の被検化学物質の生物に与える影響の予測方法は、以下の手順で行う。【００１８】
まず、生物に与える影響が既知の化学物質、あるいは被検化学物質を媒体に溶解した溶液を調製する。次に、生物に与える影響が既知の化学物質を溶解した化学物質溶液を化学物質投与群に投与するとともに、被検化学物質を溶解した被検化学物質溶液を被検化学物質投与群に投与する。更に、前記化学物質溶液又は被検化学物質溶液の調製に使用した媒体を、媒体対照群に投与する。所定期間が経過した後、各群の試験動物の組織を採取する。【００１９】
化学物質投与群に投与する生物に与える影響が既知の化学物質の数は、生物に与える影響を有する化学物質と有していない化学物質とを含む、少なくとも２物質以上である。予測の精度を高めるため５物質以上とすることが好ましく、１０物質以上とすることがより好ましい。【００２０】
生物に与える影響が既知の化学物質の投与及び後述するデータ解析とその蓄積は、被検化学物質及び媒体の投与及びそれに続くデータ解析と同時に行っても良い。生物に与える影響が既知の化学物質の投与及びその後のデータ解析と蓄積は、被検化学物質を投与する前に予め行っておいてもよい。又は、被検化学物質及び媒体の投与及びそれに続くデータ解析の後に行っても良い。【００２１】
化学物質溶液、被検化学物質溶液、又は媒体の各群への投与は、例えば１日若しくは所定時間間隔毎に１〜数回（好ましくは１日１回）、１〜９０日程度の所定期間反復して連続投与する。【００２２】
各群への各溶液又は媒体の投与方法は特に制限されず、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等の汎用的な方法を使用できる。【００２３】
試験動物には、ラット、マウス、イヌ、サル、モルモット、ウサギ等が使用できる。【００２４】
化学物質溶液、被検化学物質溶液、又は媒体を投与開始後、各群の試験動物の組織を採取するまでの期間としては特に制限はないが、１〜９０日程度が例示でき、より迅速に試験する観点から１〜２８日程度とすることが好ましい。採取する試験動物の組織には、臓器、血液、尿等が含まれる。【００２５】
試験動物の組織からタンパク質を抽出し、必要に応じて精製を行った後、二次元電気泳動に供するためのサンプルを調製する。サンプルの調製方法としては、従来使用されている調製方法や抽出方法を適宜選択して使用できる。【００２６】
例えば、各群から採取した細胞は、あらかじめ超音波処理、ダウンス型ホモジナイザー、ポッター-エルベジェム型ホモジナイザー、フレンチプレスなどの機械的処理や、界面活性剤、酵素などの化学的処理を行う。これらの処理により、細胞を溶解させた細胞溶解液を調製する。調製した細胞溶解液は、そのまま１次元目の電気泳動に供することが可能である。核、ミトコンドリア、原形質膜等の特定の細胞部分画分をサンプルとする場合には、調製した細胞溶解溶液から示差遠心分離やその他公知の方法で所望の細胞小器官を単離する。また、液相等電点フォーカシングなどの前分画手法を利用することも可能である。【００２７】
二次元電気泳動における１次元目の電気泳動の等電点（ｐI）の範囲は、市販されているさまざまな固定化ｐH勾配ストリップ（IPG(Immobilized pH Gradient) Strips：アマシャム バイオサイエンス社など）のうちから、サンプルに適した分離ｐH域のものを選択して設定できる。【００２８】
一次元目の電気泳動を行う際のゲルへのサンプル添加方法は、カップローディング法、ペーパーローディング法や膨潤液に混合して添加する方法などから選択できる。【００２９】
また、二次元目の電気泳動は、縦型電気泳動システムや水平型電気泳動システムなどから適宜選択することができる。ゲルは、市販されているプレキャストアクリルアミドゲルや自作したアクリルアミドゲルなどが使用できる。ゲルは、単一％ゲル又はグラジェントゲルが使用できる。【００３０】
電気泳動後、ゲル上のタンパク質の検出には、ＳＤＳゲルに用いる銀染色やクーマシー染色などの検出法が使用できる。電気泳動前にサンプルの蛍光染色を行なった場合には、ＣＣＤカメラタイプの蛍光スキャナーなどをタンパク質の検出に使用できる。また、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐなどの放射性同位元素を使用して、in vivoでラベルしたタンパク質のサンプルを使用する場合には、オートラジオグラフィーやフルオログラフィーを使用できる。オートラジオグラフィーによるタンパク質の検出では、ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムもしくはリン光蓄積スクリーン（フォスファースクリーン）を用いてゲル上のタンパク質の位置を記録する。フルオログラフィーを使用する場合には、ゲルを乾燥する前にゲルに蛍光物質を取り込ませておく。【００３１】
上述した方法でタンパク質を検出した後、スキャナーなどを使用してゲル上の検出画像をデータ化してとりこみ、画像解析ソフトでスポットを検出する。各スポット毎にシグナル強度を測定し、タンパク質の定量をおこなう。使用する画像解析ソフトは、例えば、市販されているPDQuest（バイオ・ラッド社）、GELLAB II+（スキャナリティクス社）やDecyder（GEヘルスケア社）などを挙げることができる。【００３２】
検出したスポットに含まれるタンパク質は質量分析装置により同定することが可能であるが、より簡便な方法として以下の方法が適用できる。【００３３】
あらかじめ同等のタンパク質を含むサンプルを用いて、同じ条件で二次元電気泳動による分離を行い、参照用のゲル（レファレンスゲル）を作成する。レファレンスゲルの各スポットに含まれるタンパク質を同定し、レファレンスゲルの画像データと同定したタンパク質の情報を参照用のデータ（レファレンスマップ）として保存しておく。各スポットに含まれるタンパク質の同定は、例えばトリプシンなどの酵素を用いてインゲル消化し、得られたペプチド混合物について質量分析装置を用いて解析することにより行う。レファレンスマップと実際に電気泳動により得られるゲルの画像データとを画像解析ソフトを用いて照合し、マッチングすることによりスポットに含まれるタンパク質を同定することができる。使用できる画像解析ソフトは、上述した市販のソフトPDQuest、GELLAB II+、Decyder等である。【００３４】
但し、質量分析装置を用いる同定では、翻訳後修飾の種類を同定する必要はない。同一タンパク質から生成したと考えられるゲル上の連続する複数のスポット間で、スポットに含まれるタンパク質が同一のタンパク質から生成したものであるかどうかが判明すれば十分である。なお、タンパク質の修飾についての詳細な解析は、質量分析装置を用いた修飾部位の同定など公知の方法により実施することが可能である。【００３５】
上述したようにゲル上に出現した一連の各スポット毎にそのシグナル強度を測定して各スポットのタンパク質の定量を行う。次いで、各スポットのシグナル強度を媒体対照群のシグナル強度で除した値（シグナル強度補正値）を算出する。その後、一のタンパク質とそのタンパク質から生成した修飾タンパク質の間、又は同一タンパク質から生成し、異なる修飾を受けた修飾タンパク質の間で、各スポットのシグナル強度補正値の比（発現量比）を算出する。【００３６】
各スポットのシグナル強度は、スポットが与えるシグナルのピーク高さ、面積、容積のいずれを採用することも可能である。【００３７】
修飾タンパク質間のシグナル強度補正値の比の算出方法の一例につき、タンパク質α１から二次元電気泳動後にもとのタンパク質α１とそのタンパク質が修飾された修飾タンパク質α２が検出された場合を例に以下説明する。媒体対照群におけるα１のシグナル強度をα１Ｃ、α２のシグナル強度をα２Ｃ、化学物質Ｘを投与したＸ投与群におけるα１のシグナル強度をα１Ｘ、α２のシグナル強度をα２Ｘとする。Ｘ投与群において、修飾タンパク質α１とα２の間のシグナル強度補正値の比は、例えば対数を演算子として下記式（ｉ）で表される。【００３８】
ｌｏｇ２（α２Ｘ／α２Ｃ）−ｌｏｇ２（α１Ｘ／α１Ｃ）      （ｉ）
ここで、Ｘ投与群と媒体対照群の間でα１、α２の割合に変化がない場合、α１Ｘ／α１Ｃとα２Ｘ／α２Ｃの値は等しい値となり、（ｉ）の値は０となる。この場合、化学物質Ｘは生体に対する刺激がないと推定される。逆に、Ｘ投与群と媒体対照群の間でα１、α２の割合に差がある場合には、（ｉ）の値の絶対値は増加する。この場合は、化学物質Ｘは生体に対する刺激があると推定される。【００３９】
上記算出例においては、１のタンパク質から１の修飾タンパク質が生成した場合について記載したが、１のタンパク質から２以上の修飾タンパク質が生成した場合も同様にシグナル強度補正値の比が算出できる。【００４０】
本発明は、生物に与える影響が既知の化学物質投与群と被検化学物質投与群との間で、タンパク質及びそのタンパク質が修飾を受けて産生した修飾タンパク質の産生割合の比較を網羅的に行うものである。化学物質投与群と被検化学物質投与群との間での比較は、各群においてタンパク質とそのタンパク質由来の修飾タンパク質のペア、又は同一タンパク質由来の修飾タンパク質のペアについてシグナル強度補正値の比を算出し、その比を照合する。【００４１】
被検化学物質（Ｅ）投与群におけるα１のシグナル強度をα１Ｅ、α２のシグナル強度をα２Ｅとすると、α１、α２についてのシグナル強度補正値はそれぞれα１Ｅ／α１Ｃ、α２Ｅ／α２Ｃである。従って、シグナル強度補正値の比の照合は、例えば化学物質Ｘ投与群についてのシグナル強度補正値の比（α２Ｘ／α２Ｃ）／（α１Ｘ／α１Ｃ）と、被検化学物質Ｅ投与群についてのシグナル強度補正値の比（α２Ｅ／α２Ｃ）／（α１Ｅ／α１Ｃ）について行う。【００４２】
化学物質投与群と被検化学物質投与群との間でシグナル強度補正値の比を照合するペアの数は、少なくとも１以上とするが、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上である。照合は、生物に与える影響がある化学物質を投与した群と、生物に与える影響がない化学物質を投与した群との間で統計的に有意差があるペアを選択して行うことが望ましい。照合するペアは、同一タンパク質由来の複数のスポットから選択したペアが２以上含まれていてもよい。被検化学物質投与群の統計学的手法で選定された修飾タンパク質ペアの発現量の差を用いて、例えばスコア法、ＳＶＭ法、クラスタ解析、決定木等により生物に与える影響を予測もしくは判別することにより行う。【００４３】
なお、各溶液の調製に使用する媒体が同じ場合や媒体の影響が無視できる場合等には、媒体対照群のシグナル強度は考慮しなくてもよい。この場合には、生物に対する影響が既知の化学物質Ｘ投与群と被検化学物質Ｅ投与群との間で、α１、α２間のシグナル強度比（例えば、ｌｏｇ２（α２Ｘ／α１Ｘ）とｌｏｇ２（α２Ｅ／α１Ｅ））を比較すればよい。【００４４】
上記説明は、同一タンパク質に由来する２つのスポット間のシグナル強度比又はシグナル強度補正値の比について比較を行う場合を例にしたものである。本発明においては、同一タンパク質由来に由来する３つ以上のスポットを選択し、これらのシグナル強度比又はシグナル強度補正値の比から３つ以上のタンパク質又は修飾タンパク質の産生割合を同時に算出して比較することも可能である。
【実施例】
【００４５】
実施例１
（１）比較サンプルおよび対照サンプルの二次元電気泳動
表１〜３に示す化学物質をそれぞれ媒体に溶解し、溶液を調製した。化学物質とその物質番号、発がん性、使用した媒体、試験動物に投与した用量を表１〜３に示す。【００４６】
【表１】
2007034907.tif 000002
【００４７】
【表２】
2007034907.tif 000003
【００４８】
【表３】
2007034907.tif 000004
【００４９】
日本チャールス・リバー社から入手した５週令の雄性ラット（Ｆ３４４、ＳＰＦ系統）を３匹／群に分けた。化学物質投与群のラットには表１〜３に示す化学物質を溶解した溶液を、媒体対照群には媒体のみを強制経口投与した。投与は１日１回とし、２８日間行った。投与開始から２９日目に各個体の肝臓を採取した。肝臓から断片を切り出し、-20℃で保存した。ラットの肝臓から採取したタンパク質をBradford法により定量した。その後、化学物質投与群から採取した比較サンプル、媒体対照群から採取した対照サンプル、比較サンプルと対照サンプルを混合したプールサンプルに対し、タンパク質100mgあたり各々200pmolのCy5、Cy3、Cy2（DMF溶液、1ml）を0℃で添加し、氷上にて30分間ラベリング反応を行った。反応終了後に過剰量のLysine溶液（10mM Lysis buffer 溶液,1ml）を添加して10分間保持し、反応を終了させた。更に、等倍のx2 サンプルバッファー（8M ウレア、4%(w/v) CHAPS、20mg/ml DTT、2%(v/v) Pharmalytes）を添加して10分間氷上に保持した。【００５０】
次いで、得られたサンプルを混合したのち、若しくは各々を別々に2次元電気泳動を行った。【００５１】
1次元目電気泳動は、Multiphor II（アマシャム バイオサイエンス社）にて、IPG(Immobilized pH Gradient) Strips (24cm, pI3-10L)（アマシャム バイオサイエンス社）を用いて行った。サンプルはカップローディングホルダーからタンパク質100mgを添加した。フォーカシングは、トータルで40kVh行った。電気泳動後、平衡化溶液（50mM Tris, pH8.8、6Mウレア、30％グリセロール、2％SDS）に0.25%(w/v) DTTを添加したA液及び4.5% (w/v) ヨードアセトアミドを添加したB液で各々10分間ずつ平衡化を行った。引き続き、2次元目電気泳動を行った。2次元目電気泳動は、Ettan DALT IIシステム（アマシャム バイオサイエンス社）にて、12%均一ゲルを低蛍光ガラスに挟んで自作したものを用いて行った。泳動は、3W（15℃）で1晩実施した。【００５２】
（２）比較サンプルおよび対照サンプルの二次元電気泳動ゲルの解析
泳動後のゲルは、直ちにMaster Imager（アマシャム バイオサイエンス社）にて各々のCyに応じた波長で画像の取り込みを行った。Cy5、Cy3、Cy2の励起波長をそれぞれ625nm、480nm、425nmに設定し、蛍光波長をそれぞれ680nm、540nm、480nmに設定した。【００５３】
電気泳動前に混合したサンプルの場合には、取り込んだ画像のスポット認識と同一ゲル内のCy間での定量比較は、Decyder-DIAソフト（アマシャム バイオサイエンス社）を使用した。ラット肝タンパク質のレファレンスマップ（ラット肝724スポットを同定したインハウスで作成した2-Dデータベース）とのスポットマッチングは、Decyder-BVAソフト（アマシャム バイオサイエンス社）にて実施した。Cyラベル後に各サンプルの電気泳動を別々に行なった場合には、各スポットの定量およびスポットマッチングはPDQuest（バイオ・ラッド社）を用いて行なった。【００５４】
（３）レファレンスマップの作成
レファレンスマップを作成するための、スポットの質量分析装置を用いた同定は、次の手順に従って行った。【００５５】
(a)質量分析用のゲル作成
1次元目電気泳動は、Multiphore II（アマシャムバイオサイエンス社）にて,IPG(Immobilized pH Gradient) Strips (24cm, pI3-10L) （アマシャムバイオサイエンス社）を用い、サンプルはカップローディングホルダーからタンパク質を添加した。フォーカシングは、トータルで40kVh行った。電気泳動後、平衡化溶液（50mM Tris, pH8.8、6Mウレア、30％グリセロール、2％SDS）に0.25%(w/v) DTTを添加したA液及び4.5% (w/v) ヨードアセトアミドを添加したB液の各々で10分間ずつ平衡化を行った。2次元目電気泳動は、平衡化後、Ettan DALT IIシステム（アマシャム バイオサイエンス社）にて12%均一ゲルを低蛍光ガラスに挟んで自作したものを用いて行った。泳動は、3W（15℃）で1晩実施した。【００５６】
(b)酵素消化
ピッキングしたゲルプラグを、トリプシン（プロメガ社）で酵素消化（室温、1晩）し、消化したペプチド断片をゲル内からアセトニトリル水溶液（アセトニトリル/水/ギ酸=50/45/5）で抽出した。【００５７】
(c)ペプチドの分離、質量分析による同定
L-columnを装着した液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社）により分離し、分離したペプチドをESI（エレクトロスプレーイオン化）型の質量分析装置（マイクロマス社）によりMS/MSを行い、タンパク質の同定に供した。液体クロマトグラフィーによる分離および質量分析装置によるMS/MSの条件は以下に示した条件で行った。また、MSデータ解析用ソフトとしてMascot（マトリックス社）を用いて、得られたMS/MSデータをNCBInrやSwissProtなどの公共データベースに対して該当するタンパク質を検索した。【００５８】
（４）二次元電気泳動で検出される特定のタンパク質の翻訳後修飾やトランケーションなどの定量比較
質量分析装置により同定したラット肝レファレンスマップ中で、同一タンパク質から複数のスポットが検出されたタンパク質は127種類であった。同一タンパク質から検出されたスポット数とタンパク質数の関係を図１に示す。【００５９】
この127タンパク質とその修飾タンパク質のスポットについて、比較サンプルの発現量（αＸ）と対照サンプルの発現量（αＣ）の比（αＸ／αＣ）の２を底とする対数値（ｌｏｇ２（αＸ／αＣ））を算出した。次いで、同一タンパク質に由来するスポット間で、対数値の差を計算した。対数値の差の計算は、同一タンパク質に由来するスポットの全ての組み合わせについて行った。【００６０】
化学物質としてN-ニトロソモルフォリンを投与した場合について、ｌｏｇ２（αＸ／αＣ）の差の絶対値が上位10位までのタンパク質名と、データベースNCBInr又はSwissProtにおいて当該タンパク質に付されているNo.、絶対値の算出に使用したスポットNo.を表４に示す。但し、スポットNo.は、二次元電気泳動で観察された全２７４３スポットについて、レファレンスゲルの酸性、高分子量の部分から塩基性、低分子量側の部分へむかって各スポットに順に付した番号である。【００６１】
【表４】
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【００６２】
（５）スコア法による発がん性の予測
スコア法による発がん性の予測式の作成は以下の手順に従って実施した。【００６３】
(a)表１〜３に示す発がん物質４４物質、非発がん物質２４物質の計６８物質について、（３）に記載の方法に従って、同一タンパク質から複数のスポットが検出されたタンパク質１２７種類について、比較サンプルと対照サンプルの発現量比の２を底とする対数値（ｌｏｇ２（αＸ／αＣ））の差を複数スポット間の全ての組み合わせについて計算した。【００６４】
(b)これら対数値の差のデータの中で、発がん物質グループと非発がん物質グループ間で統計的に有意差があるものをWelchのｔ値で選択した。ここで、同一タンパク質由来の修飾タンパク質のペアが複数存在する場合には、それらの中で最も大きいウエルチのｔ値を与える修飾タンパク質のペアのデータのみを残した。従って、発がん性の予測に使用されるデータは、同一のタンパク質からはひとつのスポットセットのみを使用した。さらに対数値の差の値を以下の３カテゴリーに分類し、それぞれに-1、0、1のスコア値をわりあてた。【００６５】
１：対数値の差の値がＸより大きい
０：対数値の差の値が−Ｘ以上Ｘ以下
−１：対数値の差の値が−１より小さい
なお、Ｘの値は、最終的な予測率が最も高くなる値に設定した。【００６６】
(c)対数値の差のデータにおいて、測定した発がん物質グループ、非発がん物質グループで各々スコアを積算し、発がんおよび非発がん物質グループのスコアを算出した。【００６７】
発がん物質グループのスコアが、非発がん物質グループのスコアより小さくなる場合には、該当するタンパク質の翻訳後修飾データのスコア値に-1を掛けて、全ての翻訳後修飾データについて、非発がん物質グループのスコアが発がん物質グループのスコアより小さくなるようにした。【００６８】
(d)本スコア法における発がん物質の予測は、各物質において選択した翻訳後修飾データのスコアを積算したトータルスコアが０より大きいものを発がん物質、０以下のものを非発がん物質と判定した。【００６９】
(e)最も高い予測率が得られるまで、(b)のスレシュホールド値および翻訳後修飾データセットを調製し(a)-(d)の操作を繰り返した。【００７０】
発がん物質４４、非発がん物質２４、計６８物質に関して、上記(a)-(e)の操作を行い予測率の最も大きくなるスポットセットを選択した。図２および表５にデータのセット数と予測率の結果を示す。図３〜５に最も高い予測率を与えた３２セットを使用した場合の発がん物質および非発がん物質のトータルスコアを示す。また最も高い予測率を与えた３２セットのタンパク質名、予測に使用したスポットＮｏ．、ウエルチのｔ値を表６，７に、３２セットのレファレンスゲル上の位置を図６に示す。なお、図６において各スポットに引き出し線で記した数字は、各スポットのスポットＮｏ．である。【００７１】
本スコア法の有効性の検証は、スコア算出に用いるセットを選択する為に用いた発がん物質と非発がん物質の発がん性を、検証手法の一つであるリーブ  ワン  アウト（Leave one out）法に従って予測することにより行った。発がん物質と非発がん物質の全６８物質（トレーニングセット）の中から任意の１物質を除いた６７物質（テストセット）を用い、データセットを選択した。このデータセットを用いて除外した１物質の発がん性を予測するクロスバリデーションを行った。この場合のテストセットの予測率は、８９．４％であった。【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【００７４】
【表７】
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【００７５】
実施例２（Support Vector Machine(SVM)を用いた発がん性の予測）
実施例１の（１）〜（３）で得られた対数値の差のデータを使用して、SVMによる発がん性の予測を行った。発がん性の予測式の作成は以下の手順に従って実施した。【００７６】
(a)発がん物質グループと非発がん物質グループの間で、特徴的な変動を示す翻訳後修飾データをウエルチのｔ値で選択した。【００７７】
Support Vector Machine（SVM）を用い、以下の手順で発がん性予測式を作成した。SVMは、フリーソフトSVMlight（URL http://svmlight.joachims.org/ から入手）を使用した。選定した翻訳後修飾データのセットを用いて以下の条件でSVMlightを用いて学習させ、予測式を作成した。
条件：カーネルオプションは、リニアを使用した。また、分割に使用した超平面は、biased hyperplaneを用いた。【００７８】
(b)予測式の有効性を検証する為に、予測式を作成する為に用いた両物質グループ（トレーニングセット）の発がん性予測と、物質のリーブ  ワン  アウト（Leave one out）によるクロスバリデーションを行なった。【００７９】
(c)最も高い予測率を示す翻訳後修飾データセットが得られるまで、(a),(b)の手順を繰り返し行った。【００８０】
発がん性予測式を、(a)〜(c)の手順に従って作成した。ウエルチのｔ値の上位２５セットを使用した際にトレーニングセットにおける最も高い予測率８０．３％が得られた。この予測結果を、表８〜１１に示す。検証のために行なったテストセットの予測率は、７７．３％であった。【００８１】
【表８】
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【００８２】
【表９】
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【００８３】
【表１０】
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【００８４】
【表１１】
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【００８５】
*1  翻訳後修飾データの中でウエルチのｔ値、上位25セットを使用した場合のトレーニングセットの予測結果。予測率は80.8%。【００８６】
*2  + は、発がん物質。- は非発がん物質を示す。【００８７】
*3  +1 CORRECT は発がん物質を発がんとして予測した正解。-1 CORRECTは非発がん物質を非発がん物質として予測した正解。-1 は、発がん物質を非発がん物質と予測した不正解、1 は、非発がん物質を発がん物質と予測した不正解。【００８８】
実施例３（病理所見の判別）
病理所見を翻訳後修飾のデジタルデータを用いて判別した。判別は以下の手順に従って行なった。【００８９】
(a)肝細胞肥大の所見に特徴的な翻訳後修飾の抽出
２８日間反復投与後の肝において、肝細胞肥大の病理所見が見られた１０物質（クロフィブレート、ジ（2-エチルヘキシル）フタレート、フェノバルビタール、ヘキサクロロベンゼン、α-ヘキサクロロシクロヘキサン、サフロール、1,4-ジクロロベンゼン、フラン、dl-メントール、ヨードホルム）と肝細胞肥大の所見の見られなかった２０物質（四塩化炭素、2,4-ジアミノトルエン、キノリン、ジエチルニトロサミン、2-ニトロプロパン、N-ニトロソモルホリン、アルドリン、アジピン酸ジ(2-エチルヘキシル)、エチニルエストラジオール、トリクロロエチレン、ブチル化ヒドロキシアニソール、1,4-ジオキサン、メチルカルバメート、2,6-ジアミノトルエン、8-ヒドロキシキノリン、D-マンニトール、L-アスコルビン酸、2-クロロエタノール、2-(クロロメチル)ピリジン塩酸塩、4-ニトロ-o-フェニレンジアミン）の間で、特徴的な変動を示す翻訳後修飾データをウエルチのｔ値で選択した。【００９０】
(b)判別用の式のSVMを用いた作成
Support Vector Machine（SVM）を用い、以下の手順で肝細胞肥大診断用の式を作成した。SVMは、フリーソフトSVMlight（URL http://svmlight.joachims.org/ から入手）を使用した。選定した翻訳後修飾データのセットを用いて以下の条件でSVMlightを用いて学習させ、予測式を作成した。
条件：カーネルオプションは、リニアを使用した。また、分割に使用した超平面は、biased hyperplaneを用いた。【００９１】
(c)診断式の有効性を検証する為に、診断式を作成する為に用いた両物質グループ（トレーニングセット）の肝細胞肥大の診断と、物質のリーブ  ワン  アウト（Leave one out）によるクロスバリデーションを行なった。【００９２】
(d)  最も高い診断正答率を示す翻訳後修飾データセットが得られるまで、(a)〜(c)までの手順を繰り返し行った。【００９３】
肝細胞肥大の判別式を、(a)〜(d)の手順に従って作成した。ウエルチのｔ値の上位２０セットを使用した際にトレーニングセットにおける最も高い正答率９０．０％が得られた。判別式の作成に使用したスポットNo.、当該スポットのタンパク質名、ウエルチのｔ値を表１２に、使用したスポットのレファレンスゲル上の位置を図７に示す。判別結果は、表１３に示す通りである。検証のために行ったテストセットの正答率は、８６．７％であった。これらの結果から、本発明により被検化学物質の生物に与える影響を予測できることが明らかとなった。【００９４】
【表１２】
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【００９５】
【表１３】
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【００９６】
*1  翻訳後修飾データの中でウエルチのｔ値、表６に示した上位20セットを使用した場合のトレーニングセットの予測結果。予測率は90.0%。【００９７】
*2  + は、肝細胞肥大の所見有り。- は肝細胞肥大の所見無し。【００９８】
*3  +1 CORRECT は肝細胞肥大の所見があったものを肝細胞肥大として診断した正解。-1 CORRECTは肝細胞肥大の所見が無かったものを症状無しとして診断した正解。-1 は、肝細胞肥大の所見があったものを症状なしと診断した不正解、1 は、肝細胞肥大の所見が無かったものを症状ありと診断した不正解。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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