(57)【要約】本発明は、以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法を提供する：（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。  また、本発明は、ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法を提供する。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；
（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。
【請求項２】
該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
被検化合物が免疫抑制性化合物又はその誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）で評価された制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を、被検化合物の不在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能と比較する工程；
（４）制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を増大させた被検化合物を、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
【請求項１０】
工程（１）及び（３）におけるナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）及び（３）におけるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
工程（１）及び（３）において、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
工程（１）及び（３）において、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
被検化合物が免疫抑制性化合物又はその誘導体である、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１６】
該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
ラパマイシン化合物が培養開始から早くとも１週間以降に培地中に添加される、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
得られうる制御性Ｔ細胞が細胞接触に依存的な免疫抑制能を有する、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
得られうる制御性Ｔ細胞が細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
ラパマイシン化合物がラパマイシンである、請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
ラパマイシン化合物がエベロリムスである、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持する方法であって、該ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をラパマイシン化合物の存在下で培養することを特徴とする、方法。
【請求項２８】
ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項２９】
請求項１５記載の方法により得られ得る制御性Ｔ細胞であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの群から選択される少なくともいずれか１種の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ａ）ＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
【請求項３０】
以下の（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかの群から選択される少なくともいずれか１種の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤。
【請求項３２】
免疫抑制用である、請求項３１記載の剤。
【請求項３３】
以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫調節剤を製造する工程。
【請求項３４】
該免疫調節剤が免疫抑制用である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
【請求項３６】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、請求項３５記載の剤。
【請求項３７】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
【請求項３８】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、請求項３７記載の剤。
【請求項３９】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するための抗体及びラパマイシン化合物を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。
【請求項４０】
以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）前記非ヒト哺乳動物の末梢組織中に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導されたことを確認する工程。
【請求項４１】
以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）工程（１）の哺乳動物に被検化合物を投与する工程；
（３）工程（２）の哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を評価する工程；
（４）工程（３）で評価されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を、肝移植が施され、被検化合物が投与されていない非ヒト哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較する工程；
（５）末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増大させた化合物を選択する工程。
【請求項４２】
免疫調節剤を製造するための、請求項２９又は３０に記載の制御性Ｔ細胞の使用。
【請求項４３】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤を製造するための、ラパマイシン化合物の使用。
【請求項４４】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤を製造するための、ラパマイシン化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法、ラパマイシン化合物を用いる制御性Ｔ細胞の製造方法、免疫調節剤、免疫調節剤の製造方法、制御性Ｔ細胞製造用キット、制御性Ｔ細胞を誘導するための剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の術後、拒絶反応を抑制するために免疫抑制剤が使用される。ところが、免疫抑制剤により感染症が惹起されることがしばしばあり、移植後の患者の死亡原因の一番は、感染症である。このように、現在の移植医療は、その外科的手技は確立されたものの、拒絶抑制対策と感染症対策とが治療戦略上の矛盾を生み、この両者を両立させることが緊急の課題となっている。こうした状況下で、免疫寛容−すなわち免疫抑制剤を使用せずに移植臓器が十分に機能する状態−がどのようなメカニズムで成立するのか、また免疫寛容をどのようにして積極的に誘導するのかについての研究が移植医療の領域では大きな柱となってきている。これは、移植医療の研究が、臓器保存や手術法の改良というレベルを終了し、明瞭に第二層に入ったことを意味するものである。
近年、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞をＴｒｅｇ（ｓ）という場合がある）が臓器移植後の免疫寛容に重要な働きをしているとの知見が、動物実験のレベルで、急速に集積されつつある。本発明者らは、生体肝移植後に免疫寛容が自然に成立した患者において同細胞が増加していることを確認した（Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌ，４巻，２１１８頁，２００４）。また、マウスの系では、本発明者らにより、制御性Ｔ細胞をいったん分離して試験管内でドナー抗原特異的に培養し、再度体内に戻すいわゆる細胞養子免疫の手法を用いることで皮膚移植片が拒絶されないことが示されている（Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６巻，１１８９−１２０１頁，２００４）。これらのことから、ヒトの移植医療においても、免疫寛容を積極的に誘導する有効な方法として、制御性Ｔ細胞の試験管内での増殖、患者への移入、すなわち細胞養子免疫療法が考えられる。試験管内で制御性Ｔ細胞を増殖させた場合に、その制御能が維持されるということは細胞養子免疫療法を行ううえで、必須であり（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍａｒ；３（３），１９９−２１０，２００３）、ヒト制御性Ｔ細胞を免疫制御能を失うことなく試験管内で高倍率に増殖させるための幾つかの試行錯誤がなされている。
ヒトＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞は、インビボで、内在性の自己抗原に対する免疫寛容において、そしてより最近では臓器移植後の移植免疫寛容、妊娠の成立において、必須な役割を果たしていること、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、アレルギーの予防に有用であることが報告されている（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，５３１−５６２，２００４、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，３８９−４００，２００２、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，１９９−２１０，２００３．，Ｂｌｏｏｄ，１０３，２４１０−２４１６，２００４、Ｌａｎｃｅｔ，３６３，６０８−６１５，２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５，５６３−５６５．２００４）。インビボにおいて、ヒトＴｒｅｇｓは、細胞表面ＣＤ４＋及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋、ＦＯＸＰ３発現、細胞内ＣＴＬＡ−４、細胞表面ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲＩＩ、及び自己及びアロ抗原に対する不応答性／免疫抑制能等の特性に加えて、メモリー表現型−ＣＤ４５ＲＯ＋によって特徴付けられる（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７，１２４５−１２５３，２００１、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９３，１２８５−１２９４，２００１、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９３，１２９５−１３０２，２００１、Ｂｌｏｏｄ，９８，２７３６−２７４４，２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，１６２１−１６３０，２００２、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６，１６４３−１６５６，２００４、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，３２，６２２−６２９，２００４）。実験的には、胸腺細胞からＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞を除去したものを免疫不全宿主に対して養子移入すると、自己免疫疾患を発症し（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，５３１７−５３２６，１９９９）、また、あるげっ歯類モデルにおいては、移植前の胸腺摘出により、Ｔｒｅｇｓ介在性の移植免疫寛容が成立しなくなる（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７６，５８８−５９６，２００３）。これらの実験的証拠に一致して、高いレベルのＦＯＸＰ３を発現しているＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞がヒト胸腺中に存在している（Ｂｌｏｏｄ，１０２，４１０７−４１１４，２００３、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３５，３８３−３９０，２００５）。
本発明者らは、ヒト末梢中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞をＩＬ−２の存在下でアロＡＰＣで刺激すると、該細胞は増殖し、制御能を獲得し得ることを報告した（Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１，ｖｏｌ．５，ｐ．２５７，２００５）。この方法は、ヒト制御性Ｔ細胞を試験管内で増殖し、誘導することができる点で極めて画期的である。しかしながら、培養に用いる末梢中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞が、比較的小さい細胞集団であるため、大量の制御性Ｔ細胞を製造しようとする場合には、大量の採血を行って、培養開始時におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞の数を増やすか、或いは長期に亘る培養を必要とした。
一方、Ｒｏｎｃａｒｏｌｏらは、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞をラパマイシンの存在下で抗原により刺激すると、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞が選択的に増殖することを報告している（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．１２，ｐ．４７４３−４７４８，２００５）。この中で、単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をラパマイシンの存在下で刺激すると、該細胞は強く増殖し、その結果、抑制能を有し、高いパーセンテージのＣＤ４＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を生じることが示されている。一方、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をラパマイシンの存在下で刺激すると、抑制能を有さないＴ細胞集団を生じ、ＦＯＸＰ３発現は増強されないことが示されている。従って、Ｒｏｎｃａｒｏｌｏらの方法によれば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を増幅することは出来るが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造することはできない。該方法に用いる末梢中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、比較的小さい細胞集団であるため、その調製には大量の採血を行う必要がある。
そこで、採取することが容易なより大きいＴ細胞集団を用いて、制御性Ｔ細胞を効率よく製造する方法や、制御性Ｔ細胞を効率よく誘導する化合物の開発が求められていた。
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）により産生される大環状トリエン系の抗生物質であり、インビトロおよびインビボの両方における抗真菌活性、特にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する抗真菌活性を有することが見い出された［Ｃ．Ｖｅｚｉｎａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，２８，７２１（１９７５）、Ｓ．Ｎ．Ｓｅｇｈａｌら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，２８，７２７（１９７５）、Ｈ．Ａ．Ｂａｋｅｒら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，３１，５３９（１９７８）、米国特許第３，９２９，９９２号明細書、および米国特許第３，９９３，７４９号明細書］。さらに、ラパマイシンは、単独で（米国特許第４，８８５，１７１号）、あるいは、ピシバニルと組み合わせて（米国特許第４，４０１，６５３号）、抗腫瘍活性を有することが示されている。
ラパマイシンの免疫抑制効果は、ＦＡＳＥＢ，３，３４１１（１９８９）に開示されている。シクロスポリンＡやＦＫ−５０６などの大環状分子が免疫抑制剤として有効であることも示されており、移植拒絶反応を予防するのに有用である［Ｓ．Ｎ．Ｓｅｈｇａｌ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．，３５（Ｓｕｐｐｌ  ３Ａ），７Ｓ−１４Ｓ，２００３；Ｒ．Ｙ．Ｃａｌｎｅら，Ｌａｎｃｅｔ，１１８３（１９７８）；および米国特許第５，１００，８９９号明細書］。Ｌｕｏ  ＨＹらは、ラパマイシンが、実験的なアレルギー性脳脊髄炎モデル（すなわち、多発性硬化症のモデル）やアジュバント性関節炎モデル（すなわち、慢性関節リウマチのモデル）において有効であり、ＩｇＥ様抗体の形成を効果的に阻害したことを開示した（Ｌｕｏ  ＨＹら，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，６１（３）：４１０−４２０，１９９１）。
ラパマイシンは、全身性エリテマトーデス［米国特許第５，０７８，８９９号］、肺の炎症［米国特許第５，０８０，８９９号］、インスリン依存性糖尿病［米国特許第５，３２１，００９号］、皮膚の障害、例えば、乾癬［米国特許第５，２８６，７３０号］、腸の障害［米国特許第５，２８６，７３１号］、血管損傷後の平滑筋細胞増殖および内膜肥厚化［米国特許第５，２８８，７１１号および第５，５１６，７８１号］、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫［欧州特許出願第５２５，９６０  Ａ１号］、眼の炎症［米国特許第５，３８７，５８９号］、悪性癌腫［米国特許第５，２０６，０１８号］、心臓の炎症性疾患［米国特許第５，４９６，８３２号］および貧血［米国特許第５，５６１，１３８号］を予防または治療するのにも有用であることが示されている。
上記事情に鑑み、本発明は、採取することが容易なより大きいＴ細胞集団を用いて、制御性Ｔ細胞を効率よく製造する方法、及び制御性Ｔ細胞を効率よく誘導し得る化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を進めた。
まず、本発明者らは、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を長期間培養し、大量の制御性Ｔ細胞を製造することを試みた。すると、培養期間が長期に及ぶと、獲得される制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が徐々に低下してしまうという問題点が見出された。そこで、該問題点を解決すべく、培養条件の検討を重ねた結果、ラパマイシン化合物の存在下でナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養すれば、免疫抑制能の低下を防ぐことが可能であることを見出した。更に、驚くべきことに、ラパマイシン化合物を用いれば、制御性Ｔ細胞へ派生することが出来ないと考えられてきたナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞からも高い効率で制御性Ｔ細胞が誘導されることが判明した。以上の知見等から、本発明者らは、ラパマイシン化合物を用いれば、ＣＤ２５の発現の有無に関わらず、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造し得ること、そして該培養方法を用いれば制御性Ｔ細胞を効率よく誘導し得る化合物を探索し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に関する。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；
（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。
［２］該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、［１］記載の方法。
［３］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、［１］記載の方法。
［４］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、［１］記載の方法。
［５］該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、［１］記載の方法。
［６］該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、［１］記載の方法。
［７］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、［１］記載の方法。
［８］被検化合物が免疫抑制性化合物又はその誘導体である、［１］記載の方法。
［９］以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）で評価された制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を、被検化合物の不在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能と比較する工程；
（４）制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を増大させた被検化合物を、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
［１０］工程（１）及び（３）におけるナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、［９］記載の方法。
［１１］工程（１）及び（３）におけるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、［９］記載の方法。
［１２］工程（１）及び（３）において、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、［９］記載の方法。
［１３］工程（１）及び（３）において、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、［９］記載の方法。
［１４］被検化合物が免疫抑制性化合物又はその誘導体である、［９］記載の方法。
［１５］ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
［１６］該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、［１５］記載の方法。
［１７］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、［１５］記載の方法。
［１８］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、［１５］記載の方法。
［１９］該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、［１５］記載の方法。
［２０］該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、［１５］記載の方法。
［２１］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、［１５］記載の方法。
［２２］ラパマイシン化合物が培養開始から早くとも１週間以降に培地中に添加される、［１５］記載の方法。
［２３］得られうる制御性Ｔ細胞が細胞接触に依存的な免疫抑制能を有する、［１７］記載の方法。
［２４］得られうる制御性Ｔ細胞が細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有する、［１８］記載の方法。
［２５］ラパマイシン化合物がラパマイシンである、［１５］記載の方法。
［２６］ラパマイシン化合物がエベロリムスである、［１５］記載の方法。
［２７］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持する方法であって、該ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をラパマイシン化合物の存在下で培養することを特徴とする、方法。
［２８］ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の誘導方法。
［２９］［１５］の方法により得られ得る制御性Ｔ細胞であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの群から選択される少なくともいずれか１種の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ａ）ＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
［３０］以下の（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかの群から選択される少なくともいずれか１種の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
［３１］［２９］又は［３０］に記載の制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤。
［３２］免疫抑制用である、［３１］記載の剤。
［３３］以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫調節剤を製造する工程。
［３４］該免疫調節剤が免疫抑制用である、［３３］記載の方法。
［３５］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
［３６］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５−である、［３５］記載の剤。
［３７］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
［３８］該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋である、［３７］記載の剤。
［３９］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するための抗体及びラパマイシン化合物を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。
［４０］以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）前記非ヒト哺乳動物の末梢組織中に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導されたことを確認する工程。
［４１］以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）工程（１）の哺乳動物に被検化合物を投与する工程；
（３）工程（２）の哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を評価する工程；
（４）工程（３）で評価されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を、肝移植が施され、被検化合物が投与されていない非ヒト哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較する工程；
（５）末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増大させた化合物を選択する工程。
［４２］免疫調節剤を製造するための、［２９］又は［３０］に記載の制御性Ｔ細胞の使用。
［４３］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤を製造するための、ラパマイシン化合物の使用。
［４４］（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＯｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤を製造するための、ラパマイシン化合物の使用。
［４５］ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
［４６］以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫調節剤を製造する工程。
［４７］ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
［４８］ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
［４９］ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するための抗体及びラパマイシン化合物を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。
［５０］以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；
（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。
［５１］以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）で評価された制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を、被検化合物の不在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能と比較する工程；
（４）制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を増大させた被検化合物を、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
本発明のスクリーニング方法を用いれば、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物を得ることができる。該化合物は、制御性Ｔ細胞を誘導するという新たな機序の免疫抑制薬として、あるいはその開発のためのシーズとして有用である。
また、本発明の方法を用いれば、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から、制御性Ｔ細胞を効率よく製造することが可能である。ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は比較的大きなＴ細胞集団であり、その調製が容易である。本発明の方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の解析結果を示す図である。（Ａ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ａ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｂ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｌｏｗ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｃ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｄ）、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｅ）の定義を示す図である。（Ｂ）各細胞分画におけるＦＯＸＰ３発現レベルを示すグラフである。
図２は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞分画のナイーブ／メモリー及びＴｒｅｇに比較的特異性の高い表現型のヒストグラム解析を示す図である。表示された抗原に対する特異的抗体を用いた解析結果を実線で示す。それぞれの表現型のためのアイソタイプコントロールを点線で示す。
図３は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、単離されたばかりのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及び細胞数が１００−１５０倍程度まで増加した段階で回収されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株（ラパマイシン未処理）（Ｂ）の抑制効果を示す図である。棒グラフのレーンを左から順にレーン１−７と呼ぶ。レーン１（ＣＤ４）：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン２（４５ＲＡ＋２５＋）：同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン３〜７：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（又はＴ細胞株）（表示された割合（全ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対する割合）の数のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（又はＴ細胞株）が添加されている）。
図４は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の機能に対するラパマイシンの効果を示す図である。（Ａ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖を示す図である。縦軸は、細胞数を、培養開始時の細胞数を１としたときの相対値として示し、横軸は培養開始後の日数を示す。非処理：ラパマイシン不在下で培養。ｄａｙ０，７，３９：培養開始後それぞれの日数で、ラパマイシンが添加された。（Ｂ）全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、培養開始５０日後に回収されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の抑制効果を示す図である。レーン１（ＣＤ４）：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン２（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）：同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株、レーン３〜７：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株（表示された割合（全ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対する割合）の数のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株が添加されている）、非処理：ラパマイシン不在下で培養。ｄａｙ０，７，３９：培養開始後それぞれの日数で、ラパマイシンが添加された。
図５は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の機能に対するラパマイシンの効果を示す図である。（Ａ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖を示す図である。縦軸は、細胞数を、培養開始時の細胞数を１としたときの相対値として示し、横軸は培養開始後の日数を示す。非処理：ラパマイシン不在下で培養。ｄａｙ０，１９：培養開始後それぞれの日数で、ラパマイシンが添加された。（Ｂ）全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の効果を示す図である。レーン１（ＣＤ４）：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン２（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）：同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株、レーン３〜７：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株（表示された割合（全ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対する割合）の数のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株が添加されている）、非処理：ラパマイシン不在下で培養。ｄａｙ０，１９：培養開始後それぞれの日数で、ラパマイシンが添加された。
図６は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の表現型の相違を示すフローサイトメトリー解析結果である。表示された抗原に対する特異的抗体を用いた解析結果を太い実線で示す。それぞれの表現型のためのアイソタイプコントロールを点線で示す。
図７は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する抑制効果の細胞接触依存性を示すグラフである。左パネルはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株による抑制効果を、右パネルはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株による抑制効果を、それぞれ示す。ＡＰＣ：同種異系ＰＢＭＣ、ＣＤ４：全ＣＤ４＋Ｔ細胞、ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：Ｔ細胞株。四角で囲まれた構成要素が、トランスウェル上部のチャンバー内に配置された。
図８は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖に対するエベロリムスの効果を示す図である。縦軸は、細胞数を、培養開始時の細胞数を１としたときの相対値として示し、横軸は培養開始後の日数を示す。
図９は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、エベロリムス存在下又は不在下で培養されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の効果を示す図である。レーン１（Ｎ）：全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン２（Ｐ）：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン３（Ｔ）：同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株、レーン４〜８：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株（表示された割合（全ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対する割合）の数のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株が添加されている）。
図１０は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する、エベロリムス存在下又は不在下で培養されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の効果を示す図である。レーン１（Ｎ）：全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン２（Ｐ）：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞、レーン３（Ｔ）：同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株、レーン４〜８：同種異系ＰＢＭＣ＋全ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株（表示された割合（全ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対する割合）の数のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株が添加されている）。
図１１は、肝移植後の末梢血中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数の割合の変化を示すグラフである。■：小児、◆：成人。
発明の詳細な説明
（１．制御性Ｔ細胞の製造方法）
本発明は、ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法を提供するものである。
制御性Ｔ細胞とは、反応性Ｔ細胞（例えば全ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞等）と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化（増殖、サイトカイン産生等）を阻害し得る能力（免疫抑制能）を有するＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、生体内においては、通常、メモリー表現型（例えば、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−等）を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分画内に存在する。制御性Ｔ細胞自体は、Ｔ細胞受容体を介する刺激に対しては実質的な増殖反応を示さず、不応答性であり得る。
本発明の方法において使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、通常、哺乳動物由来のものである、哺乳動物としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞が製造され得る限り特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、より好ましくはヒトである。
本発明の方法において使用される該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、任意の組織、例えば末梢組織（例えば末梢血液、脾臓、リンパ節、腸管、肝臓等）、骨髄、胸腺、臍帯血等から調製することができる。調製が容易であることを考慮すれば、該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、好ましくは末梢血液又は脾臓中の細胞である。
本発明の方法において使用される該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブ表現型を有する。「ナイーブ表現型」とは、胸腺から移出し、抗原刺激を受けていないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）が有する表現型をいう。ナイーブ表現型としては、例えばヒト細胞の場合、ＣＤ４５ＲＡ陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋）、ＣＤ４５ＲＯ弱陽性又は陰性（ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−）、ＣＤ４５ＲＢ強陽性（ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋）、ＣＤ６２Ｌ強陽性（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋）、ＣＤ３８陽性（ＣＤ３８＋）等の表現型を挙げることが出来るが、これらに限定されない。本発明の方法において使用される該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えばヒトの場合、好ましくはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくとも１種のナイーブ表現型を有し、より好ましくはそれら全ての表現型を有し得る。該ＣＤ４＋Ｔ細胞がヒト以外の哺乳動物由来である場合においても、当該表現型はヒトと同様であり得るが、動物種が生来的に保有していないマーカー分子により表現型が定義されている場合には、当該表現型は解析から除外されるなど、種差が考慮され得る。
本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（抗原）発現の有無や強弱で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無や強弱で細胞の表現型が表記される。マーカー分子の発現の有無や強弱による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。このうち「強陽性」とは、特に断りのない限り、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に高い、マーカー分子の発現量の高い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に多いこと等をいう。「弱陽性」とは、特に断りのない限り、比較対照である他の細胞（又は細胞集団）と比べて、マーカー分子の発現量が相対的に低い、マーカー分子の発現量の低い細胞集団が相対的に多い、マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
ナイーブ表現型として、ＣＤ４５ＲＯ弱陽性（ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋）、ＣＤ４５ＲＢ強陽性（ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋）、ＣＤ６２Ｌ強陽性（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋）と表される場合、比較対照の細胞としてメモリーＴ細胞（胸腺から移出し、抗原刺激を受けた後に、生存しているＴ細胞）が意図される。比較対照のメモリーＴ細胞としては、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば図１Ａ中ｂでゲートされた領域に含まれるＴ細胞等）を挙げることができる。
本発明の方法に使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５の発現の有無により、ＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−細胞とに分類することができる。該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋細胞であってもよく、ＣＤ２５−細胞であってもよく、或いはＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−細胞の混合物であってもよい。
このうち、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３＋）、細胞内ＣＴＬＡ−４陽性（ＣＴＬＡ−４＋）、及びＴＮＦＲＩＩ＋からなる群から選択される少なくともいずれかの表現型を有し得る。これらの表現型は、上述の制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）の表現型であり得る。このうち、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＦＯＸＰ３の発現強度は、ｍＲＮＡの発現量として、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれと同等（約０．５〜２．０倍程度）か、それ以上であり得る。なお、ＦＯＸＰ３を用いた表現型の解析は、通常ｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ等で測定することにより行われる。
一方、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現強度は極めて弱く、該発現強度は、末梢中の制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）の通常約１／４以下、好ましくは約１／２０以下であり得る。また、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢中の制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）と比較すると、細胞内ＣＴＬＡ−４及び細胞表面ＴＮＦＲＩＩの発現が極めて弱く、細胞内ＣＴＬＡ−４の発現レベルはＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／３以下、好ましくは１／８以下であり得、細胞表面ＴＮＦＲＩＩの発現レベルはＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／３以下、好ましくは１／８以下であり得る。
本発明の方法に使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、単離・精製されていることが好ましい。該細胞の単離・精製は、上述の哺乳動物の組織（末梢組織（例えば末梢血液、脾臓、リンパ節、腸管、肝臓等）、骨髄、胸腺、臍帯血等）から、上述の表現型等に基づき、自体公知の方法により行うことができる。
例えば、ヒトのナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を単離・精製する場合、先ず、例えば末梢血液等より、単核球分画が調製される。単核球分画の調製は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｕｐｐｓａｌａ）等を用いた密度勾配遠心や、アフェレーシス等により行われる。次に、蛍光色素や磁気ビーズ等により標識された、目的とする細胞の細胞表面に特異的に発現している抗原（ＣＤ４、上述のナイーブ表現型のマーカー抗原（ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３８等）等）に対する特異的抗体により単核球分画を染色し、セルソーターや磁性カラム等を用いて目的とする分画を単離・精製する。高い精製度を達成するため、好ましくは、セルソーターが用いられる。
ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の中の、ＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５−細胞を更に単離・精製する場合も、蛍光色素や磁気ビーズ等により標識されたＣＤ２５に対する特異的抗体を用いて、上述と同様に行うことができる。
次に、提供されたナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞がラパマイシン化合物の存在下で培養される。
細胞培養は、リンパ球培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
本発明の方法における培養に用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ等を挙げることができる。また、リンパ球培養用等に改変された培地（例えばＡＬｙＳ５０５Ｎ等）を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
当該培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えば、有機酸（例えばピルビン酸ナトリウム等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
また、当該培地は、血清を含むことができる。血清としては、哺乳動物由来の血清であれば、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
制御性Ｔ細胞の製造効率を上げるため、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子の存在下で培養され得る。Ｔ細胞増殖因子としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等を挙げることが出来る。培地中に添加されるＴ細胞増殖因子の濃度は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えばＩＬ−２を用いる場合であれば、通常０．１〜１００００Ｕ／ｍｌ、例えば１〜５０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０〜２５００Ｕ／ｍｌ程度の濃度が例示される。
本明細書において、「物質Ｘの存在下での、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の培養」とは、物質Ｘの存在時に、培養物中にナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が含まれる場合のみならず、物質Ｘの存在時に、培養物中にナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は含まれないが、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から派生したＴ細胞であって、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なる表現型を有するＴ細胞が含まれる場合をも包含する。
また、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原存在下で培養され得る。抗原存在下で培養することにより、該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞が製造され得る。
抗原とは、培養細胞上の抗原受容体（例えばＴ細胞受容体）に認識され、該受容体を介して細胞を刺激し得る物質を包括的に意味する。抗原としては、例えばペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等の抗原分子のみならず、免疫学的非自己細胞、抗原受容体の構成分子（ＣＤ３、ＴＣＲβ、ＴＣＲα等）や副刺激分子（ＣＤ２８等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトＣＤ３抗体であるＯＫＴ−３等）やスーパー抗原などの抗原ミミックをも含む。ここで、免疫学的非自己細胞とは、同種同系（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）細胞以外の細胞をいい、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞及び異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞が含まれる。免疫学的非自己細胞は、好ましくは、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞である。
抗原刺激に用いられる抗原は、目的に応じて所望のものを選択することが可能である。
例えば、ある特定の免疫学的非自己細胞に特異的な制御性Ｔ細胞を製造しようとする場合は、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が、ラパマイシン化合物及び免疫学的非自己細胞の存在下で培養される。該免疫学的非自己細胞は、自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。免疫学的非自己細胞の種類は特に限定されず、所望の組織由来の細胞（例えば末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）等）を使用することが可能である。例えば、同種異系のドナーからの移植に先立ち、当該ドナー由来細胞に特異的なレシピエント制御性Ｔ細胞の製造が意図されている場合には、レシピエント由来のナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が、ラパマイシン化合物及びドナー由来の細胞の存在下で培養される。この場合、該ドナー由来の細胞は、移植されうる臓器と同一臓器由来の細胞であっても、異なる組織由来の細胞であってもよい。
また、ある特定の抗原分子（ペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等）に特異的な制御性Ｔ細胞を製造しようとする場合は、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が、ラパマイシン化合物及び当該抗原分子の存在下で培養される。抗原分子としては、例えば、組織適合抗原などの細胞及び組織由来抗原、アレルギー疾患の原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、又は人工臓器関連物質、又はそれらの変性物（例えば熱変性物等））などが挙げられる。組織適合抗原としては主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）や非主要組織適合抗原が挙げられる。アレルギーの原因物質には環境・花粉抗原、真菌抗原、食物抗原、人工抗原等が含まれ、例えば、環境・花粉抗原としてはダニ、ハウスダスト、スギ花粉、ブタクサ等、真菌抗原としてはカンジダ、アルテルナリア、アスペルギルス、クラドスポリウム、ペニシリウム等、食物抗原としては卵白、牛乳、大豆、小麦粉、ソバ粉、サバ、イワシ、アジ、エビ、カニ、ブタ肉、牛肉、トリ肉等、人工抗原としては薬剤、人工臓器等が挙げられる。また、自己免疫疾患の原因物質としては、疾患の原因となる自己抗体の対応抗原等が挙げられる。
この場合、該ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗原提示を確実に達成する目的で、抗原提示細胞の存在下で培養が行われてもよい。抗原提示細胞としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、通常は、培養に使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞と同種同系の抗原提示細胞（例えば、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が由来する個体から得られた抗原提示細胞）が用いられる。また、抗原提示細胞の種類は、抗原提示能を有し、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばＰＢＭＣ、樹状細胞等が用いられる。抗原提示細胞は、自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。
一方、培養に供される上記ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が有している抗原受容体のレパートリーの多様性を保持し、当該多様性を反映した制御性Ｔ細胞集団を製造しようとする場合には、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗原受容体の構成分子（ＣＤ３、ＴＣＲβ、ＴＣＲα等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトＣＤ３抗体であるＯＫＴ−３等）、副刺激分子（ＣＤ２８等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトＣＤ２８抗体）、スーパー抗原などの抗原ミミックによる刺激下で培養される（Ｂｌｏｏｄ，１０４，ｐ．８９５−９０３，２００４、Ｂｌｏｏｄ，１０４，ｐ．４５３−６１，２００４）。当該抗原ミミックは複数種類を組合せて用いることも可能であり、例えばＣＤ３を認識する作動性抗体と、ＣＤ２８を認識する作動性抗体との組み合わせ等が用いられ得る。当該抗原ミミックを使用することで、多様性を有する制御性Ｔ細胞集団を製造することが出来る。
また、複数種類の抗原を組合せて用いることも可能であり、例えば免疫学的非自己細胞と抗原受容体の構成分子を認識する作動性抗体との組み合わせ（同種異系細胞と抗ＣＤ３抗体との組み合わせ等）を用いることが可能である。
本発明の方法においては、ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が培養される。ラパマイシン化合物を用いることにより、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞株という場合がある）に免疫抑制能が誘導され、高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の低下が抑制され、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が高いレベルで維持され、或いは制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が増強される。
ここで、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物の不在下で培養することによっても制御性Ｔ細胞を得ることができるところ（Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１，ｖｏｌ．５，ｐ．２５７，２００５）、ラパマイシン化合物を用いることにより、特に、高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の低下が抑制され、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が高いレベルで維持され、或いは制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を増強することができる。
一方、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物の不在下で培養しても、制御性Ｔ細胞を得ることは困難であるが、ラパマイシン化合物を用いることにより、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞に免疫抑制能が誘導され、誘導された制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が高いレベルで維持され、或いは制御性Ｔ細胞の免疫抑制能が増強される。
本明細書において、「ラパマイシン化合物」なる用語は、基本的なラパマイシン核（以下に示す）を含有する免疫抑制性化合物の部類を定義する（ラパマイシン類ともいう）。ラパマイシン化合物としては、依然として免疫抑制性を保持しながら、ラパマイシン核の誘導体として化学的または生物学的に修飾されていてもよい化合物が挙げられる。従って、「ラパマイシン化合物」なる用語は、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシン核上の官能基が、例えば、還元または酸化により修飾されているラパマイシン化合物を包含する。また、「ラパマイシン化合物」なる用語は、ラパマイシン化合物の医薬上許容される塩を包含する。ラパマイシン化合物は、酸性または塩基性部分を含有することにより、かかる塩を形成することができる。
2007037544.tif 000002
ラパマイシンのエステルおよびエーテルはラパマイシン核の４２位および／または３１位におけるヒドロキシル基に関するもの、（２７−ケトンの化学的な還元後の）２７位におけるヒドロキシル基のエステルおよびエーテルであること、ならびに、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンは（４２−ヒドロキシル基の酸化後の）４２位におけるケトンに関するもの、およびラパマイシン核の２７−ケトンに関するものであることが好ましい。
ラパマイシンの好ましい４２−および／または３１−エステルおよびエーテルは、以下の特許（これらは出典を示すことによりすべて本明細書の一部をなす）に開示されている：アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）；アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）；フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）；アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号）；カルバメートエステル（米国特許第５，１１８，６７８号）；シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）；アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）；アセタール（米国特許第５，１５１，４１３号）；アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）；スルホネートおよびスルフェートエステル（米国特許第５，１７７，２０３号）；エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）；アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）；Ｏ−アリール、−アルキル、−アルケニルおよび−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）；カーボネートエステル（米国特許第５，２６０，３００号）；アリールカルボニルおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）；カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）；ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）；ヒンダード・エステル（米国特許第５，３８５，９０８号）；ヘテロ環式エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）；ｇｅｍ−二置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）；アミノアルカンエステル（米国特許第５，３８９，６３９号）；ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第５，３９１，７３０号）；カルバメートエステル（米国特許第５，４１１，９６７号）；カルバメートエステル（米国特許第５，４３４，２６０号）；アミジノカルバメートエステル（米国特許第５，４６３，０４８号）；カルバメートエステル（米国特許第５，４８０，９８８号）；カルバメートエステル（米国特許第５，４８０，９８９号）；カルバメートエステル（米国特許第５，４８９，６８０号）；ヒンダード・Ｎ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）；ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）；Ｏ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）；およびラパマイシンのＰＥＧエステル（米国特許第５，７８０，４６２号）。これらのエステルおよびエーテルの製造は、上記の特許に開示されている。
特表平８−５０２２６６号（米国特許第５，６６５，７７２号）には、下式（ＩＩ）で表される好適なラパマイシン化合物が開示されている。
2007037544.tif 000003
〔式中、Ｘは（Ｈ，Ｈ）またはＯ；
Ｙは（Ｈ，ＯＨ）またはＯ；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ、アルキル、チオアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアリールアルキル、ジヒドロキシアルキルアリールアルキル、アルコキシアルキル、アシルオキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アリールスルホンアミドアルキル、アリル、ジヒドロキシアルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルボアルコキシアルキルおよび（Ｒ３）３Ｓｉ（式中、Ｒ３はそれぞれ独立してＨ、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチルおよびフェニルから選択される）からなる群から選択されるものである；ここで、“アルコ（ａｌｋ−）”または“アルキル（ａｌｋｙｌ）”の語は、分枝鎖または直鎖Ｃ１−６アルキル、好ましくはＣ１−３アルキルを意味し、その炭素鎖は所望によりエーテル（−Ｏ−）架橋により中断されていてもよい；およびＲ４はメチルまたはＲ４とＲ１が一緒になってＣ２−６アルキレンを形成する；
但し、Ｒ１およびＲ２は両方ともにＨではない；およびＲ１が（Ｒ３）３Ｓｉまたはカルボアルコキシアルキルである場合、ＸおよびＹは両方ともにＯではない。〕
式（ＩＩ）の化合物は、好ましくはＸおよびＹが両方Ｏ、Ｒ２がＨ、Ｒ４がメチルおよびＲ１がＨ以外である４２−Ｏ−置換ラパマイシンである；最も好ましくは、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルおよびアミノアルキルから選択されたものである；特に４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、４２−Ｏ−（３−ヒドロキシ）プロピル−ラパマイシン、４２−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシンおよび４２−Ｏ−（２−アセトアミノエチル）−ラパマイシンである。
米国特許第５，２５８，３８９号には、下式（ＩＩＩ）で表される好適なラパマイシン化合物、あるいは医薬上許容されるそれらの塩が開示されている。
2007037544.tif 000004
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、以下から選択され：
（１）水素；
（２）フェニル；
（３）置換されたフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである；
（４）１−又は２−ナフチル；
（５）置換された１−又は２−ナフチルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである；
（６）ビフェニル；
（７）置換されたビフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである；
（８）Ｃ１−１０アルキル；
（９）置換されたＣ１−１０アルキルであって、１以上の置換基が以下から選択される：
（ａ）ヒドロキシ、
（ｂ）オキソ、
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｄ）フェニル−Ｃ１−３アルコキシ、
（ｅ）置換されたフェニル−Ｃ１−３アルコキシであって、フェニル上の該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｆ）−ＯＣＯ−Ｃ１−６アルキル、
（ｇ）−ＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は独立して以下から選択される
（ｉ）水素、
（ｉｉ）非置換又は以下から選択される１以上の置換基により置換されたＣ１−１０アルキル：
（ａ’）非置換又はＸ、Ｙ及びＺにより置換されたフェニル、
（ｂ’）−ＯＨ、
（ｃ’）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｄ’）−ＣＯ２Ｈ、
（ｅ’）−ＣＯ２−Ｃ１−６アルキル、
（ｆ’）−Ｃ３−７シクロアルキル、及び
（ｇ’）−ＯＲ１１、
（ｉｉｉ）非置換又は以下から選択される１以上の置換基により置換されたＣ３−１０アルケニル：
（ａ’）非置換又はＸ、Ｙ及びＺにより置換されたフェニル、
（ｂ’）−ＯＨ、
（ｃ’）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｄ’）−ＣＯ２Ｈ、
（ｅ’）−ＣＯ２−Ｃ１−６アルキル、
（ｆ’）−Ｃ３−７シクロアルキル、及び
（ｇ’）−ＯＲ１１、
（ｉｖ）又はＲ６及びＲ７及びそれらが付着したＮは、非置換又はＣ１−６アルキル又はフェニルにより置換された３−７員飽和ヘテロ環式環を形成することができ、該環はアジリジン、モルフォリン、チオモルフォリン、チオモルフォリン−オキシド、チオモルフォリン−ジオキシド、ピペリジン、ピロリジン、及びピペリジンからなる群から選択される、
（ｈ）−ＮＲ６ＣＯ−Ｃ１−６アルキル−Ｒ７、ここでＲ６は上で定義された通りである、
（ｉ）−ＮＲ６ＣＯ２−Ｃ１−６アルキル−Ｒ７、
（ｊ）−ＮＲ６ＣＯＮＲ６Ｒ７、
（ｋ）−ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、
（ｌ）−ＣＯＯＲ６、
（ｍ）−ＣＨＯ、
（ｎ）フェニル、
（ｏ）置換されたフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｐ）フェニルオキシ、
（ｑ）置換されたフェニルオキシであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｒ）１−又は２−ナフチル、
（ｓ）置換された１−又は２−ナフチルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｔ）ビフェニル、
（ｕ）置換されたビフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｖ）−ＯＲ１１、及び
（ｗ）−Ｓ（Ｏ）ｐ−Ｃ１−６アルキル；
（１０）Ｃ３−１０アルケニル；
（１１）置換されたＣ３−１０アルケニルであって、１以上の置換基が以下から選択される：
（ａ）ヒドロキシ、
（ｂ）オキソ、
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｄ）フェニル−Ｃ１−３アルコキシ、
（ｅ）置換されたフェニル−Ｃ１−３アルコキシであって、フェニル上の置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｆ）−ＯＣＯ−Ｃ１−６アルキル、
（ｇ）−ＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は上で定義された通りである、
（ｈ）−ＮＲ６ＣＯ−Ｃ１−６アルキルであって、Ｒ６は上で定義された通りである、
（ｉ）−ＣＯＯＲ６であって、Ｒ６は上で定義された通りである、
（ｊ）−ＣＨＯ、
（ｋ）フェニル、
（ｌ）置換されたフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｍ）１−又は２−ナフチル、
（ｎ）置換された１−又は２−ナフチルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｏ）ビフェニル、
（ｐ）置換されたビフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｑ）−ＯＲ１１、及び
（ｒ）−Ｓ（Ｏ）ｐ−Ｃ１−６アルキル；
（１２）Ｃ３−１０アルキニル；
（１３）置換されたＣ３−１０アルキニルであって、１以上の置換基が以下から選択される：
（ａ）ヒドロキシ、
（ｂ）オキソ、
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｄ）フェニル−Ｃ１−３アルコキシ、
（ｅ）置換されたフェニル−Ｃ１−３アルコキシであって、フェニル上の置換基がＸ，Ｙ及びＺである、
（ｆ）−ＯＣＯ−Ｃ１−６アルキル、
（ｇ）−ＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は上で定義された通りである、
（ｈ）−ＮＲ６ＣＯ−Ｃ１−６アルキル、ここでＲ６は上で定義された通りである、
（ｉ）−ＣＯＯＲ６、ここでＲ６は上で定義された通りである、
（ｊ）−ＣＨＯ、
（ｋ）フェニル、
（ｌ）置換されたフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｍ）１−又は２−ナフチル、
（ｎ）置換された１−又は２−ナフチルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｏ）ビフェニル、
（ｐ）置換されたビフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、及び
（ｑ）−ＯＲ１１；
ただし、Ｒ１及びＲ２は同時には水素でなく；
Ｒ１１は以下から選択され：
（ａ）−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−Ｍ＋、ここでＭ＋は正の電荷を有する無機又は有機の対イオンである、
（ｂ）−ＳＯ３−Ｍ＋、
（ｃ）−ＣＯ（ＣＨ２）ｑＣＯ２−Ｍ＋、ここでｑは１−３である、及び
（ｄ）−ＣＯ−Ｃ１−６アルキル−ＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は上で定義された通りであり、アルキルは無置換であるか又は以下から選択される１以上の置換基により置換されている：
（ｉ）ヒドロキシ、
（ｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ、
（ｉｉｉ）−ＮＲ１６Ｒ１７、ここでＲ１６及びＲ１７は独立して以下から選択される：
（ａ’）水素、及び
（ｂ’）Ｃ１−６アルキル、
（ｉｖ）−ＣＯＯＲ６、ここでＲ６は上で定義された通りである、
（ｖ）フェニル、
（ｖｉ）置換されたフェニルであって、該置換基がＸ、Ｙ及びＺである、
（ｖｉｉ）−ＳＨ、及び
（ｖｉｉｉ）−Ｓ−Ｃ１−６アルキル；
Ｘ、Ｙ及びＸは独立して以下から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）Ｃ１−７アルキル、
（ｃ）Ｃ２−６アルケニル、
（ｄ）ハロゲン、
（ｅ）−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は上で定義された通りであり、ｍは０から２である、
（ｆ）−ＣＮ、
（ｇ）−ＣＨＯ、
（ｈ）−ＣＦ３、
（ｉ）−ＳＲ８、ここでＲ８は水素、Ｃ１−６アルキル、トリフルオロメチル、またはフェニルである、
（ｊ）−ＳＯＲ８、ここでＲ８は上で定義された通りである、
（ｋ）−ＳＯ２Ｒ８、ここでＲ８は上で定義された通りである、
（ｌ）−ＣＯＮＲ６Ｒ７、ここでＲ６及びＲ７は上で定義された通りである、
（ｍ）Ｒ９Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、ここでＲ９は水素、Ｃ１−３アルキル、ヒドロキシ−Ｃ２−３アルキル、トリフルオロメチル、フェニル又はナフチルであり、ｍは上で定義された通りである、
（ｎ）−ＣＨ（ＯＲ１２）（ＯＲ１３）、ここでＲ１２及びＲ１３はＣ１−３アルキルであるか、又は合わさってエチル又はプロピルブリッジを形成する、
（ｏ）
2007037544.tif 000005
ここでＲ９及びｍは上で定義された通りである、
（ｐ）
2007037544.tif 000006
ここでＲ９及びｍは上で定義された通りである、及び
（ｑ）−ＯＲ１１；
または、隣接したＸ、Ｙ及びＺのいずれか２つが結合することにより、ジオキソルアニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、及びジオキサニルからなる群から選択される環を形成することができる。］
特表平９−５１２０１８（米国特許第５，３６２，７１８号）には、下式（ＩＶ）で表される好適なラパマイシン化合物、あるいは医薬上許容されるそれらの塩が開示されている。
2007037544.tif 000007
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素または−ＣＯ（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄＣＲ７Ｒ８Ｒ９；
Ｒ３およびＲ４は、各々独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、トリフルオロメチル、または−Ｆ；
Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１であるか、あるいは、Ｒ５およびＲ６は、一緒になって、Ｘまたは炭素数３〜８のシクロアルキル環（所望により、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０で一置換、二置換、もしくは三置換されている）を形成していてもよい；
Ｒ７は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１；
Ｒ８およびＲ９は、各々独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、または−ＣＯ２Ｒ１１であるか、あるいは、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、Ｘまたは炭素数３〜８のシクロアルキル環（所望により、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０で一置換、二置換、もしくは三置換されている）を形成していてもよい；
Ｒ１０は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリル、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリルエチル、トルフェニルメチル、ベンジル、炭素数２〜７のアルコキシメチル、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリルエトキシメチル、クロロエチル、またはテトラヒドロピラニル；
Ｒ１１は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、炭素数２〜７のアルキニル、または炭素数７〜１０のフェニルアルキル；
Ｘは、５−（２，２−ジ−（炭素数１〜６のアルキル））［１，３］ジオキサニル、５−（２−スピロ（炭素数３〜８のシクロアルキル））［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（炭素数１〜６のアルキル））［１，３］ジオキサニル、４−（２−スピロ（炭素数３〜８のシクロアルキル））［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（炭素数１〜６のアルキル））［１，３］ジオキサラニル、または４−（２−スピロ（炭素数３〜８のシクロアルキル））［１，３］ジオキサラニル；
ｂ＝０〜６；
ｄ＝０〜６；およびｆ＝０〜６ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が水素であることはなく、
さらに、Ｒ１またはＲ２のいずれかが少なくとも１つの−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、Ｘ、または−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０で置換された炭素数３〜８のシクロアルキル基を含有する。］
式（ＩＶ）において、炭素数１〜６のアルキル、炭素数２〜７のアルケニル、および炭素数２〜７のアルキニルという用語は、直鎖および分岐した炭素鎖のいずれをも含むものとする。式（ＩＶ）の化合物は１個以上の−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０基を含有するので、Ｒ３、Ｒ４、ｆ、およびＲ１０は同一または異なるものであり得る。同様に、他の包括的な置換基に関する説明が同一の構造について繰り返される場合、それらは同一または異なるものであり得る。Ｒ１が、一緒になってＸ［ここで、Ｘは５−（２，２−ジ−（炭素数１〜６のアルキル））［１，３］ジオキサニル］を形成するＲ８およびＲ９を含有し、Ｘのアルキル基が１個の炭素原子を含有し、かつ、ｄ＝０である化合物の場合、Ｒ１は次の構造を有する。
2007037544.tif 000008
同様に、Ｒ１が、一緒になってＸ［ここで、Ｘは４−（２−スピロ（炭素数３〜８のシクロアルキル））［１，３］ジオキサニル］を形成するＲ８およびＲ９を含有し、Ｘのシクロアルキル基が６個の炭素原子を有し、かつ、ｄ＝０である化合物の場合、Ｒ１は次の構造を有する。
2007037544.tif 000009
Ｘを含む式（ＩＶ）の化合物について、好ましい化合物としては、Ｘのアルキル基が、存在すれば、メチルであり、Ｘのシクロアルキル基が、存在すれば、シクロヘキシルであるものが挙げられる。
Ｒ１０が水素、アルキル、アルケニル、またはアルキニルでない場合には、Ｒ１０がアルコール保護基として機能し得る基であることを意味する。かくして、これらの基は、元来、生物活性であるだけでなく、遊離ヒドロキシル化された化合物の中間体である。Ｒ１０は、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリル、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリルエチル、トリフェニルメチル、ベンジル、炭素数２〜７のアルコキシメチル、トリ−（炭素数１〜６のアルキル）シリルエトキシメチル、クロロエチル、およびテトラヒドロピラニル基を包含する。他のアルコール保護基は、当業者に公知であり、式（ＩＶ）の化合物の一部であるとも見なされる。
式（ＩＶ）の化合物のうち、好ましいメンバーは、Ｒ２が水素であるもの；Ｒ２が水素、ｂ＝０、かつ、ｄ＝０であるもの；Ｒ２が水素、ｂ＝０、ｄ＝０、かつ、Ｒ８およびＲ９が、各々独立して、水素、アルキル、または−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０であるか、あるいは、一緒になって、Ｘを形成するものである。式（ＩＶ）の化合物のうち、特に好ましいメンバーとしては、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステルを挙げることが出来る。
従って、ラパマイシン化合物の例としては、上記特許のいずれか１つに開示されている、式：
2007037544.tif 000010
［式中、ＲＡおよびＲＢは、各々、水素およびエステルまたはエーテル形成基から選択される］
で示される化合物が挙げられる。
ラパマイシンの好ましい２７−エステルおよびエーテルは、米国特許第５，２５６，７９０号（これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）に開示されている。これらのエステルおよびエーテルの製造は、上記の特許に開示されている。
ラパマイシンの好ましいオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンは、米国特許第５，３７３，０１４号、第５，３７８，８３６号、第５，０２３，２６４号および第５，５６３，１４５号（これらは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）に開示されている。これらのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンの製造は、上記の特許に開示されている。４２−オキソラパマイシンの製造は、第５，０２３，２６３号（これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）に開示されている。
特に好ましいラパマイシン化合物としては、ラパマイシン［米国特許第３，９２９，９９２号］、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル［米国特許第５，３６２，７１８号］および４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン［米国特許第５，６６５，７７２号］（エベロリムス）が挙げられる。
適用可能なとき、医薬上許容される塩は、ラパマイシン化合物が適当な塩基性部分を含有する場合には、有機酸および無機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、および同様に公知の許容される酸から形成することができる。塩は、ラパマイシン化合物が適当な酸部分を含有する場合には、有機塩基および無機塩基、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、リチウム塩またはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、１〜６個の炭素原子を含有するアルキルアンモニウム塩または各アルキル基に１〜６個の炭素原子を含有するジアルキルアンモニウム塩、および各アルキル基に１〜６個の炭素原子を含有するトリアルキルアンモニウム塩から形成してもよい。
培地中に添加されるラパマイシン化合物の濃度は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞の製造を達成し得る限り特に限定されないが、通常約１〜１００ｎＭ、好ましくは約５〜２５ｎＭである。
ラパマイシン化合物を培地に添加する時期は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞の製造を達成し得る限り特に限定されず、培養開始時からラパマイシン化合物を添加してもよく、また培養の途中からラパマイシン化合物を添加してもよい。しかしながら、培養開始時からラパマイシン化合物を添加すると、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞（特に、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）又は該細胞から派生したＴ細胞の増殖が抑制され、培養後に得られる制御性Ｔ細胞の数が低下する場合があるので、培養の途中からラパマイシン化合物を添加することが好ましい。この場合、ラパマイシン化合物は、培養開始から例えば早くとも１週間以降に、好ましくは１５日以降に培地中に添加される。特に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる場合には、ラパマイシン化合物は、培養開始から３０日以降に培地中に添加されることがより好ましい。また、ラパマイシン化合物は、培養開始から例えば遅くとも１００日までに、好ましくは７０日までに、より好ましくは４０日までに、培地中に添加されることが好ましい。
また、ラパマイシン化合物の存在下で培養が行われる期間は、本発明の方法により制御性Ｔ細胞の製造を達成し得る限り特に限定されないが、該期間は通常１〜１００日、例えば３〜７０日、好ましくは５〜５０日、より好ましくは５〜１５日である。該期間が短すぎると、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞に免疫抑制能を誘導する、或いは制御性Ｔ細胞の高い免疫抑制能を維持するというラパマイシン化合物の効果が十分に発揮されない場合があり、また該期間が長すぎると、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞の増殖が抑制され、培養後に得られる制御性Ｔ細胞の数が低下する場合がある。
また、ラパマイシン化合物の存在下で培養することにより得られた細胞を、ラパマイシン化合物の不在下で更に培養してもよい。更なる培養の条件は、ラパマイシン化合物を添加しないことを除き、上述と同様であり得るが、好ましくは抗原の不在下で、Ｔ細胞が培養される。抗原不在下で培養することにより、Ｔ細胞の増殖を一端止めることができる。また、更なる培養の期間は、特に限定されないが、通常１〜２０日、例えば１〜１０日、好ましくは１〜３日である。この更なる培養により、細胞中に混入したラパマイシン化合物をより完全に除去することができる。
上述の様に培養することにより、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は増殖し、３０日間以上もの長期間に渡り、数として１０００倍以上にも増殖し得る。
培養の結果、培養物中に制御性Ｔ細胞が獲得される。
即ち、後述の実施例に示される様に、本発明の方法により獲得され得る細胞は、反応性Ｔ細胞と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得る能力（免疫抑制能）を有する。さらに、獲得される細胞は、不応答性の特性をも有し得る。
重要なことに、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗原存在下で培養された場合、獲得され得る制御性Ｔ細胞は、培養時に用いられた抗原に特異的であり得る。
ここで、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られうる制御性Ｔ細胞は、細胞接触に依存的な免疫抑制能を有する。即ち、この場合、得られうる細胞は、反応性Ｔ細胞との細胞接触が許容される条件で、当該反応性Ｔ細胞と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得る能力を有する。
一方、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られうる制御性Ｔ細胞は、細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有する。即ち、この場合、得られうる細胞は、反応性Ｔ細胞との細胞接触の有無に関わらず、当該反応性Ｔ細胞と共に培養され、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、当該反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得る。
獲得された細胞が、制御性Ｔ細胞としての機能を有しているか否かを確認してもよい。例えば、獲得された細胞が反応性Ｔ細胞（例えば全ＣＤ４＋Ｔ細胞）と共に培養され、抗原により刺激され、反応性Ｔ細胞の活性化が測定される。反応性Ｔ細胞の活性化の指標としては、通常、細胞増殖（例えば［３Ｈ］タイミジンの取込み）やサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ等）産生が用いられる。試験の結果、反応性Ｔ細胞の活性化が抑制された場合には、獲得された細胞が制御性Ｔ細胞としての機能を有していると判断することが出来る。
このとき、獲得された細胞が有する免疫抑制能が、細胞接触に依存的か否かを確認してもよい。例えば、以下の２つの条件；（Ａ）細胞接触が許容される条件、及び（Ｂ）細胞接触が阻害された条件で、獲得された細胞が反応性Ｔ細胞（例えば全ＣＤ４＋Ｔ細胞）と共に培養され、抗原により刺激され、反応性Ｔ細胞の活性化が測定される。（Ｂ）の条件は、例えば、チャンバーを、液性因子は通過できるが、細胞は通過できない程度の大きさの孔を有する膜により上下２段に仕切り（トランスウェル）、その一方に反応性Ｔ細胞を、他方に獲得された細胞を配置し、双方の細胞を抗原により刺激することにより、作製することができる。試験の結果、（Ａ）の条件のみで、反応性Ｔ細胞の活性化が抑制された場合には、獲得された細胞は細胞接触に依存的な免疫抑制能を有していると判断することができる。また、（Ａ）及び（Ｂ）の両方の条件で、反応性Ｔ細胞の活性化が抑制された場合には、獲得された細胞は細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有していると判断することができる。
また、刺激に用いられる抗原として、制御性Ｔ細胞の製造過程で使用された抗原と同一の抗原と、該抗原とは異なる抗原とを組合せて用いることにより、製造された制御性Ｔ細胞が、該抗原特異的であるか否かを確認することも可能である。
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、ＧＩＴＲ陽性（ＧＩＴＲ＋）及びＣＴＬＡ４陽性（ＣＴＬＡ４＋）からなる群から選択される少なくとも１種（好ましくは２種）の表現型を有し得る。該表現型は末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）のそれと共通である。
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）と比較して、高いＣＤ４５ＲＢ発現レベルを有し得る（ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＢ抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＢ発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約２５〜１００倍（例えば約５０倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＢ発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１．５〜２０倍（好ましくは約２〜１０倍（例えば約４倍））程度で有り得る。なお、フローサイトメトリー解析による発現レベルの比較は、縦軸に細胞数を、横軸に発現強度（蛍光強度）を取ったグラフ中のヒストグラムのピークにおける発現強度を比較することにより行うものとする。
即ち、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、ＧＩＴＲ＋、ＣＴＬＡ４＋及びＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋からなる群から選択される少なくともいずれか１種（好ましくは２種、より好ましくは３種）の表現型を有し得る。
また、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞の表現型のいくつかは、本発明の方法に使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の種類（例えば、ＣＤ２５の発現の有無等）やラパマイシン化合物を培地へ添加する時期等に応じて変わり得る。
例えば、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞はＣＤ２５陽性（ＣＤ２５＋）であり得るが、その発現強度は、本発明の方法にＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用する場合と、ＣＤ２５−Ｔ細胞を使用する場合とで異なる。
即ち、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）とほぼ同等のＣＤ２５発現レベルを有し得る（ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋とする）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ２５抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２５発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約５０〜２００倍（例えば約１００倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ２５発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／６〜６倍（好ましくは約１／３〜３倍（例えば約０．８倍））程度で有り得る。
一方、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）より低いＣＤ２５発現レベルを有し得る（ＣＤ２５ｌｏｗ＋）。例えば、上述と同様の条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ２５発現レベルは、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／１５〜１／２倍（好ましくは約１／１０〜１／３倍（例えば約１／５倍））程度で有り得る。
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現強度も、本発明の方法にＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用する場合と、ＣＤ２５−Ｔ細胞を使用する場合とで異なる。
即ち、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）より低いＣＤ６２Ｌ発現レベルを有し得る（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋とする）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌ抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約１００〜５００倍（例えば約３００倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現レベルは、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／１００〜１／２倍（好ましくは約１／５０〜１／３倍（例えば約１／６倍））程度で有り得る。
一方、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞等）とほぼ同等のＣＤ６２Ｌ発現レベルを有し得る（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋とする）。例えば、上述と同様の条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／６〜３倍（好ましくは約１／４〜２倍（例えば約１／３倍））程度で有り得る。
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋）であり得るが、その発現強度は、本発明の方法にＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用する場合と、ＣＤ２５−Ｔ細胞を使用する場合とで異なる。
即ち、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、使用されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）より低いＣＤ４５ＲＡ発現レベルを有し得る（ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋とする）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約１００〜１０００倍（例えば約６００倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／２０〜１／２倍（好ましくは約１／１０〜１／３倍（例えば約１／６倍））程度であり得る。
一方、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞は、使用されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞）とほぼ同等のＣＤ４５ＲＡ発現レベルを有し得る（ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋とする）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約１００〜１０００倍（例えば約６００倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／６〜６倍（好ましくは約１／３〜３倍（例えば約１倍））程度であり得る。なお、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現レベルは、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれとほぼ同等である（図１Ａ）。
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現強度も、本発明の方法にＣＤ２５＋Ｔ細胞を使用する場合と、ＣＤ２５−Ｔ細胞を使用する場合とで異なり得る。
即ち、本発明の方法にナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用する場合、得られ得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現は、実質的に陰性であり得る（ＣＤ４５ＲＯ−）。
一方、本発明の方法にナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用する場合、ラパマイシン化合物を培地へ添加する時期や培養期間等に応じてＣＤ４５ＲＯ発現強度が変わり得る。
即ち、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、培養開始時から、比較的長期間（例えば、５０日間以上）、ラパマイシン化合物の存在下で培養した場合、得られ得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現は、実質的に陰性であり得る（ＣＤ４５ＲＯ−）。
一方、ラパマイシン化合物を培養の途中（例えば培養開始から４０日後）から培地へ添加し、ラパマイシン化合物存在下での培養期間が比較的短い（例えば、５〜１５日間程度）場合には、得られ得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現は、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）と、末梢で天然に存在している制御性Ｔ細胞（例えば末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）との中間的なレベルであり得る（即ちＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋）。例えば、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を用いたフローサイトメトリー解析において、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現として、アイソタイプコントロール抗体を用いたときの約２００〜８００倍（例えば約４００倍）の蛍光強度を与え得る条件において、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ発現レベルは末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の通常約１／２００〜１／２０倍（好ましくは約１／１００〜１／３０倍（例えば約１／５０倍））程度で有り得る。
即ち、本発明の方法により得られ得る制御性Ｔ細胞は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの群から選択される少なくとも１種（好ましくは２種、より好ましくは３種、更に好ましくは４種）の表現型を有し得る：
（Ａ）ＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
ここで、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞は、上記（Ａ）又は（Ｂ）のいずれか１つの群から選択される少なくとも１種（好ましくは２種、より好ましくは３種、更に好ましくは４種）の表現型を有し得る。一方、本発明の方法においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した場合に製造され得る制御性Ｔ細胞は上記（Ｃ）の群から選択される少なくともいずれか１種（好ましくは２種、より好ましくは３種、更に好ましくは４種）の表現型を有し得る。
また、本発明は下記の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの群から選択される少なくとも１種（好ましくは２種、より好ましくは３種、更に好ましくは４種）の表現型を有する制御性Ｔ細胞を提供するものである：
（Ａ）ＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｂ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ２５ｈｉｇｈ＋
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
該制御性Ｔ細胞は、ＧＩＴＲ＋、ＣＴＬＡ４＋及びＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋からなる群から選択される少なくとも１種（好ましくは２種、より好ましくは３種）の表現型を更に有し得る。尚、各表現型の定義は上述の通りである。該制御性Ｔ細胞は単離・精製されていることが好ましい。該制御性Ｔ細胞は、上記本発明の方法により製造することが可能である。
（２．制御性Ｔ細胞を含有してなる免疫調節剤）
本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、強力な免疫抑制能を有するので、何らかの原因により生体内で免疫反応が異常に亢進している場合、生体内で望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫応答が起こることが将来的に予測される場合等に、患者に該制御性Ｔ細胞を投与すること等によって、患者の体内における異常に亢進した免疫反応を抑制し、望ましくない免疫反応を抑制し、あるいは望ましくない免疫反応を回避することが出来る。
例えば、同種異系のドナーからの臓器移植に先立ち、まず、レシピエント由来のナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物及びドナー由来の細胞の存在下で培養することで、当該ドナー由来細胞に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を移植の前後にレシピエントに投与することで、移植片に対する免疫寛容を誘導し、移植片に対する拒絶反応を回避し、移植片の生着を促進することが出来る。従って、本発明の免疫調節剤は現行の免疫抑制剤による副作用、細菌・ウイルス感染、特にＣ型肝炎患者において肝移植後Ｃ型肝炎再発を回避し得る。
また、自己免疫疾患の患者において、当該患者由来のナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物及び当該自己免疫疾患の原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、自己免疫反応を抑制することが出来る。
更に、アレルギー疾患の患者において、当該患者由来のナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物及びアレルギーの原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、アレルギー反応を抑制することが出来る。
不妊症の患者においては、当該患者由来のナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を、ラパマイシン化合物及びパートナー由来の細胞の存在下で培養することで、当該パートナー由来細胞（又は抗原）に特異的な制御性Ｔ細胞を製造する。そして、当該制御性Ｔ細胞を患者に投与することで、パートナー由来細胞（又は抗原）或いは、当該パートナー由来抗原を保持する胎児に対する免疫寛容を誘導し、胎児に対する拒絶反応を回避し、妊娠の維持を促進することができる。
即ち、本発明は、上記方法により製造され得る制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫調節剤を提供する。該剤は免疫抑制用であり得る。本発明の免疫調節剤は、臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患（花粉症、食品アレルギー、薬剤アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）、自己免疫疾患（多発性筋炎、慢性リュウマチ、全身性エリテマトーシス、全身性硬化症、水ほう症、皮膚エリテマトーシス、乾癬症、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病等）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
本発明の免疫調節剤は、常套手段に従って、有効量の上記制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合する等して、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の免疫調節剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫調節剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して投与することができる。
本発明の制御性Ｔ細胞の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０Ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、一日につき約６ｘ１０９個程度を上限とする有効量を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３．制御性Ｔ細胞製造用キット）
また、本発明は、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するための抗体及びラパマイシン化合物を含む、制御性Ｔ細胞製造用キットを提供する。該抗体は蛍光色素や磁気ビーズ等により標識されていてもよい。該抗体としては、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的に発現している抗原に対する特異的抗体（例えば抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ３８等抗体等）を挙げることができる。ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の中の、ＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５−細胞を更に単離・精製するために、上記抗体には、抗ＣＤ２５抗体が更に含まれ得る。当該キットは、更に上述の方法において用いられ得る種々の試薬（抗原、Ｔ細胞増殖因子、培地、培地のための添加物、血清、反応容器、本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法のプロトコールが記載された指示書など）を含むことが出来る。当該キットを用いれば、上述の方法に従い、簡便に制御性Ｔ細胞を製造することが可能である。
（４．制御性Ｔ細胞を誘導するための剤）
また、上述のように、本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法において、ラパマイシン化合物を用いることにより、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞に免疫抑制能が誘導され、制御性Ｔ細胞を獲得することができる。従って、本発明は、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する剤を提供するものである。該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋又はＣＤ２５−であり得るが、好ましくはＣＤ２５−である。本発明の剤は、活性成分としてラパマイシン化合物単独で、あるいは任意の他の有効成分との混合物として含有することができる。本発明の剤は、活性成分を医薬として許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造され得る。該担体としては、例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤、賦形剤、防腐剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤等を挙げることができる。本発明の剤は、等張な水溶液、粉末等の状態で、本発明の製造方法に用いる培地に添加されるなどして用いられる。
また、ラパマイシン化合物は、自体公知の方法により医薬として製剤化し、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するために用いることもできる。ラパマイシン化合物を含有する医薬製剤は、活性成分としてラパマイシン化合物単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を医薬として許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口を挙げることができる。投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。また、これら非経口剤には、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
ラパマイシン化合物の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り（体重６０Ｋｇとして）、約０．６〜５ｍｇを一日一回ないし数回投与する。また、経口投与の場合、成人一人当り（体重６０Ｋｇとして）、約２〜１５ｍｇを一日一回ないし数回投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
（５．制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤）
また、上述のように、本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法において、ラパマイシン化合物を用いることにより、高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の低下を抑制し、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を高いレベルで維持し、或いは制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を増強することができる。従って、本発明は、ラパマイシン化合物を含有する、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることにより制御性Ｔ細胞を製造する場合に、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を維持するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤を提供するものである。該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋又はＣＤ２５−であり得るが、好ましくはＣＤ２５＋である。ここで、「制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の維持」には、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の低下を抑制すること、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を高いレベルで維持すること、及び制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を増強することが包含される。本発明の剤は、有効量のラパマイシン化合物に加えて、更に医薬として許容される担体を含むことが出来る。該担体としては、上述の（４．制御性Ｔ細胞を誘導するための剤）の項に記載されたものと同様のものを挙げることが出来る。本発明の剤は、等張な水溶液、粉末等の状態で、本発明の製造方法に用いる培地に添加されるなどして用いられる。
（６．制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法）
本発明は、以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法を提供するものである：
（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；
（２）工程（１）で得られたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。
本発明のスクリーニング方法においては、まず、被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞が単離される（工程１）。該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋又はＣＤ２５−であり得るが、好ましくはＣＤ２５−である。被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
上述の様に、本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法において、ラパマイシン化合物を用いることにより、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又は該細胞から派生したＴ細胞に免疫抑制能が誘導される。従って、ラパマイシン化合物と同様の免疫抑制性化合物は、好適な被検化合物となり得る。免疫抑制性化合物とは、インビトロ又はインビボにおける免疫応答を抑制し得る化合物をいう。ラパマイシン化合物以外の該免疫抑制性化合物としては、例えば、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ等を挙げることが出来る。ラパマイシン化合物を用いれば高い効率で制御性Ｔ細胞を誘導し得ることから、免疫抑制性化合物の中でも、マクロライド系化合物（ラパマイシン化合物、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ等）は、好適な被検化合物となり得る。マクロライド系化合物とは、１４〜１６員環のラクトン環を有する化合物をいう。また、免疫抑制性化合物を化学的に修飾し、置換可能な位置の基を、他の基により置換することにより得られる誘導体も、好適な被検化合物となり得る。
工程１における培養条件は、ラパマイシン化合物不在下であってもよいことを除き、上記（１．制御性Ｔ細胞の製造方法）の項に記載された通りである。
次に、工程１で得られたＴ細胞の免疫抑制能が評価される（工程２）。Ｔ細胞の免疫抑制能は、例えば、細胞接触が許容される条件で、Ｔ細胞が反応性Ｔ細胞（例えば全ＣＤ４＋Ｔ細胞）と共に培養され、抗原により刺激され、反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する程度を測定することにより評価される。反応性Ｔ細胞の活性化の指標としては、通常、細胞増殖（例えば［３Ｈ］タイミジンの取込み）やサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ等）産生が用いられる。刺激に用いられる抗原として、工程１のＴ細胞の製造過程で使用された抗原と同一の抗原や該抗原とは異なる抗原を用いることが可能である。
次に、工程２における評価の結果、工程１で得られたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物が制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として獲得される（工程３）。本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、上記本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法において、ラパマイシン化合物に換わって制御性Ｔ細胞を誘導することが可能であるので、制御性Ｔ細胞を用いる医薬・医療の分野で有用であり、またナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するという新たな機序の免疫抑制薬として、あるいはその開発のためのシーズとして有用である。
（７．制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物のスクリーニング方法）
本発明は、以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物のスクリーニング方法を提供するものである：
（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）で評価された制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を、被検化合物の不在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能と比較する工程；
（４）制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を増大させた被検化合物を、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
「制御性Ｔ細胞の製造効率の増大」とは、制御性Ｔ細胞の製造において、得られ得る制御性Ｔ細胞の数及び／又は得られ得る制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を増大させることを意味する。
本発明のスクリーニング方法においては、まず、被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物から制御性Ｔ細胞が獲得される（工程１）。被検化合物としては、上記（６．制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法）と同様のものを挙げることができる。
上述の様に、本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法において、ラパマイシン化合物を用いることにより、高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制御性Ｔ細胞の免疫抑制能の低下を抑制し、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を高いレベルで維持し、或いは制御性Ｔ細胞の免疫抑制能を増強することができる。従って、ラパマイシン化合物と同様の免疫抑制性化合物は、好適な被検化合物となり得る。ラパマイシン化合物以外の該免疫抑制性化合物としては、例えば、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ等を挙げることが出来る。ラパマイシン化合物を用いれば高い効率で制御性Ｔ細胞を誘導し得ることから、免疫抑制性化合物の中でも、マクロライド系化合物（ラパマイシン化合物、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ等）は、好適な被検化合物となり得る。マクロライド系化合物とは、１４〜１６員環のラクトン環を有する化合物をいう。また、免疫抑制性化合物を化学的に修飾し、置換可能な位置の基を、他の基により置換することにより得られる誘導体も、好適な被検化合物となり得る。
工程１における細胞培養条件は、ラパマイシン化合物不在下であってもよいことを除き、上記（１．制御性Ｔ細胞の製造方法）の項に記載された通りである。
次に、工程１で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能が評価される（工程２）。制御性Ｔ細胞の数は自体公知の方法により測定することが出来る。また、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能は、例えば、細胞接触が許容される条件で、制御性Ｔ細胞が反応性Ｔ細胞（例えば全ＣＤ４＋Ｔ細胞）と共に培養され、抗原により刺激され、反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する程度を測定することにより評価される。反応性Ｔ細胞の活性化の指標としては、通常、細胞増殖（例えば［３Ｈ］タイミジンの取込み）やサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ等）産生が用いられる。刺激に用いられる抗原として、制御性Ｔ細胞の製造過程で使用された抗原と同一の抗原や該抗原とは異なる抗原を用いることが可能である。
次に、工程２で評価された制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能が、被検化合物の不在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能と比較される（工程３）。数及び／又は免疫抑制能の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物の不在下で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能は、被検化合物の存在下で得られた制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した値であることが好ましい。
比較の結果、制御性Ｔ細胞の数及び／又は免疫抑制能を増大させた被検化合物が、制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として獲得される（工程４）。本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、上記本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法にいて、ラパマイシン化合物に換わって制御性Ｔ細胞の製造効率を増大させることが可能であるので、制御性Ｔ細胞を用いる医薬・医療の分野で有用であり、また新たな機序の免疫抑制剤の開発のためのシーズとして有用である。
（８．ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法）
本発明は、以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供するものである：
（１）哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）前記哺乳動物の末梢組織中に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導されたことを確認する工程。
本発明の誘導方法に用いられる哺乳動物としては、上述の哺乳動物を挙げることが出来る。該哺乳動物の齢は特に限定されず、該哺乳動物は小児又は成体であり得るが、若齢であるほうがより多数のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導し得ることから、該哺乳動物は小児であることが好ましい。小児とは性成熟していない個体を、成体とは性成熟した個体を、それぞれいう。ヒトでは一般に、１８才以下の個体が小児、１８才より年上の個体が成体である。
本発明の誘導方法においては、まず哺乳動物に肝移植が施される（工程１）。移植される肝臓の遺伝型は、特に限定されず、免疫学的自己（即ち同種同系）又は免疫学的非自己（即ち同種異系又は異種異系）であり得るが、好ましくは免疫学的非自己であり、より好ましくは同種異系である。
肝移植には、同所性肝移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）と異所性肝移植（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）とが含まれるが、好ましくは同所性肝移植である。同所性肝移植は、宿主の肝臓を全て摘出した後で、移植肝の脈管を本来の解剖学的位置に再建する方法である。異所性肝移植は、宿主の肝臓を温存し、腹腔内に移植肝を本来の肝臓の位置とは異なる部位に移植する方法である。肝移植の方法は自体公知であり、例えば、Ｔａｎａｋａ  Ｋ，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．，２１７，８２−９１，１９９３等を参照のこと。
肝移植を施すと、その宿主の末梢組織中に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導され、末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が増加する。通常は、肝移植から１〜３月後に、末梢組織（例えば末梢血等）中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が１．２〜５倍程度に増加する。
次に、肝移植を受けた哺乳動物の末梢組織中に、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導されたことが確認される（工程２）。通常は、末梢組織（例えば末梢血等）中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（又は割合）を測定し、該細胞数（又は割合）を肝移植前の該細胞数（又は割合）と比較し、その数が増加したことが確認される。ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（又は割合）の検出は、例えば、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型に基づき、該表現型を検出し得る特異的抗体等を使用し、フローサイトメトリー等により行われる。
上記本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法における原材料であるナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、上記方法により大量に誘導することが可能となるので、上記制御性Ｔ細胞の製造において、少量のサンプル（末梢血等）から、大量の制御性Ｔ細胞を誘導することが可能となる。
（９．ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニング方法）
本発明は、以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニング方法を提供するものである：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）工程（１）の哺乳動物に被検化合物を投与する工程；
（３）工程（２）の哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を評価する工程；
（４）工程（３）で評価されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を、肝移植が施され、被検化合物が投与されていない非ヒト哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較する工程；
（５）末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増大させた化合物を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法に用いられる哺乳動物としては、上述の（８．ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法）と同様のものを挙げることが出来る。
本発明のスクリーニング方法においては、まず哺乳動物に肝移植が施される（工程１）。肝移植の態様は、上述の（８．ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法）と同様である。
次に、肝移植された哺乳動物に被検化合物が投与される（工程２）。該被検化合物としては、上記（６．制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法）と同様のものを挙げることができる。
次に、工程２の哺乳動物の末梢中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が評価される（工程３）。通常は、末梢組織（例えば末梢血等）中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（又は割合）を測定し、該細胞数（又は割合）を肝移植前の該細胞数（又は割合）と比較し、その数が増加したことが確認される。ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（又は割合）の検出は、例えば、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型に基づき、該表現型を検出し得る特異的抗体等を使用し、フローサイトメトリー等により行われる。評価の時期は肝移植から１〜３月後が好ましい。
次に、工程３で評価されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数が、肝移植を施され、被検化合物が投与されていない哺乳動物の末梢中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較される（工程４）。細胞数の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を投与されていない哺乳動物の末梢中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、被検化合物を投与された哺乳動物の末梢中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した値であることが好ましい。
比較の結果、末梢中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増大させた化合物が選択される（工程５）。該化合物は、肝移植による末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を増強し得る。該化合物によって、上記本発明の制御性Ｔ細胞の製造方法における原材料であるナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を大量に誘導することが可能となるので、上記制御性Ｔ細胞の製造において、少量のサンプル（末梢血等）から、大量の制御性Ｔ細胞を誘導することが可能となる。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０００５】
［実施例１］
〔１〕材料及び方法
（細胞調製）
健常ボランティア（ヒト）から静脈血が獲得された。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｕｐｐｓａｌａ）密度勾配遠心により単離された。細胞は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、フィコエリスリン（ＰＥ）抱合抗ＣＤ２５  ｍＡｂ、及びフルオレッセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）抱合抗ＣＤ４５ＲＡ  ｍＡｂにより、３０分間、４℃にて暗中で染色された後に、以下の６つの異なる細胞分画が、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて単離された（図１Ａ参照）。
（ａ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｂ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｃ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｌｏｗ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び
（ｆ）全ＣＤ４＋Ｔ細胞
上述の（ａ）〜（ｅ）に示された細胞分画は、図１Ａ中に示された定義に従って単離された。
全てのｍＡｂｓはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入された。それぞれの分画の純度は＞９８％であった。機能アッセイをするための細胞分離のために、ＣＤ４＋細胞が、プレートに結合した細胞を除去した後に、抗ＣＤ４  ｍＡｂマイクロビーズ及び磁性細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）システム磁性カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いて、積極（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ）単離された。ＣＤ４＋細胞の純度は＞９５％であった。
（ＦＡＣＳ解析）
対象者由来のＰＢＭＣ、或いは増殖されたＴ細胞株が、３０分間、４℃、暗中にて、多様な抗体とインキュベートされ、洗浄され、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター及びＦＡＣＳＤｉＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析された。使用された抗体は、ｐｅｒＣＰ抱合抗ＣＤ４  ｍＡｂ、ビオチン抱合抗ＣＤ２５  ｍＡｂ、ＦＩＴＣ抱合抗ＣＤ４５ＲＡ  ｍＡｂ、ＰＥ抱合抗ＣＤ４５ＲＢ  ｍＡｂ、抗ＣＤ４５ＲＯ  ｍＡｂ、抗ＣＤ６２Ｌ  ｍＡｂ、抗ＣＤ３８  ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ、及び抗ＴＮＦＲＩＩ  ｍＡｂである。ＣＴＬＡ−４の細胞内染色を行うために、細胞は、細胞表面染色、固定、及びＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による浸透化処理の後に、ＰＥ抱合抗ＣＴＬＡ−４により細胞内染色された。
全てのｍＡｂ、ストレプトアビジン−ＡＰＣは、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、又はＧｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅより購入された。
（細胞培養）
上述の様に分離されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４細胞／ｗｅｌｌ）が、９６ウェル丸底培養プレートに、１ウェルあたり２００μｌの増殖培地（２％ヒトＡＢ型血清が補充されたＡｌｙＳ５０５Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製））中で、ヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）の存在下、一細胞あたり４ビーズの割合で、抗ヒトＣＤ３及びＣＤ２８抱合ビーズで刺激された。ラパマイシン（２０ｎＭ，Ｓｉｇｍａ社製）が適宜添加された。３〜４日毎に、培地の半分がＩＬ−２を含有する新鮮な増殖培地と交換された。必要であれば、細胞が分けられ、繰り返し抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズで、１０〜１４日毎に再刺激された。機能アッセイの２日前に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズが磁気的に除去され、細胞がラパマイシンの不在下で１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２とともに培養された。３回の洗浄後、細胞は機能アッセイのために使用された。
（抑制アッセイ）
表示された数の、ヒト末梢血から単離されたばかりのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株、又は増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株が、単独で、又は自家のレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４個／ｗｅｌｌ）と共に、放射線照射（４０Ｇｙ）された同種異系のＰＢＭＣ（１ｘ１０＾５個／ｗｅｌｌ）により、丸底９６ウェルマイクロプレート中、増殖培地中で、刺激された。培養物は７日間インキュベートされ、最後の１６時間の間に［３Ｈ］タイミジン（２μＣｉ／ｗｅｌｌ）でラベルされた。その後細胞が回収され、［３Ｈ］タイミジン取込が１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）により測定された。
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡが、ＣＤ４＋Ｔ細胞分画から、Ｉｓｏｇｅｎ試薬（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用いて、製造者提供の指示書に従い抽出され、そして、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｘＭ−ＭＬＶ  ＲＴ緩衝液、４０ｎｇランダムプライマーｐ（ｄＮ）６、６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター、及び４０Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、２０μｌ反応溶液中で、３７℃で１時間インキュベートし、引き続き７０℃で１０分間加熱することによりｃＤＮＡが合成された。ＦＯＸＰ３  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ７７００シークエンス検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより定量された。ＦＯＸＰ３特異的プライマー及び内部蛍光Ｔａｑｍａｎプローブが、既述のようにデザインされた（Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１６，ｐ．１６４３−１６５６，２００４）。２０ｘプライマー及びＨＰＲＴのためのプローブ混合液は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入された。ＦＯＸＰ３  ｍＲＮＡの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ  ｍＲＮＡのそれにより標準化された。データはトリプリケイトウェルからの平均値で表された。標準偏差は＜５％であった。
〔２〕結果
（ＦＯＸＰ３  ｍＲＮＡ発現）
ＦＯＸＰ３の発現レベルが以下の６つの異なる細胞分画について測定された。
（ａ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｂ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｃ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｌｏｗ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び
（ｆ）全ＣＤ４＋Ｔ細胞
これらの細胞は、セルソーターを用いて、図１Ａに示されたゲートに従ってＰＢＭＣから単離された。ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋（ｂ）及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋（ａ）Ｔ細胞分画が、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｌｏｗ＋ＣＤ４＋（ｃ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−ＣＤ４＋（ｄ）、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋（ｅ）、及び全ＣＤ４＋（ｆ）Ｔ細胞分画と比較してより高いＦＯＸＰ３レベルを発現していた（図１Ｂ）。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞分画は、Ｔｒｅｇｓからは異なるものと考えられてきたにもかかわらず、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋細胞分画のそれよりさえも高いＦＯＸＰ３レベルを発現していた。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞分画では、ＦＯＸＰ３遺伝子の発現がほとんど認められず、制御性Ｔ細胞の混入はないと考えられた。異なった個体からの２回以上の試験が行われ、同様の結果が得られた。
（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型）
ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋（ａ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋（ｂ）、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋（ｅ）Ｔ細胞（図１Ａ参照）が、ナイーブ／メモリー細胞表現型、並びに細胞内ＣＴＬＲ−４及び細胞表面ＴＮＦＲＩＩについて調べられた（図２）。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ３８＋であり、典型的なナイーブ表現型を有することが確認された。一方、末梢中の制御性Ｔ細胞であるＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋（ｂ）Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋、及びＣＤ３８−を示した。末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の各マーカーの発現強度は、それぞれ、コントロール抗体使用時における蛍光強度と比較して以下の通りであった；ＣＤ４５ＲＯ：約４００倍、ＣＤ４５ＲＢ：約５０倍、ＣＤ６２Ｌ：約３００倍。これは、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、表現型としてはメモリー型であることを示している。また、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ３８＋であり、該表現型はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれと同等であった。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞内ＣＴＬＡ−４及びＴＮＦＲＩＩをほとんど示さなかった。この細胞分画とは異なり、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞に特異的な細胞内ＣＴＬＡ−４及びＴＮＦＲＩＩを示した。なお、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２５発現強度は、コントロール抗体使用時における蛍光強度の約１００倍、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現強度は、コントロール抗体使用時における蛍光強度の約６００倍であった。異なった個体からの２回以上の試験が行われ、同様の結果が得られた。
（増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的特性）
末梢から単離されたばかりのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をわずかに抑制した（図３Ａ）。
図４Ａに示すように、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下で、１０−１４日毎に抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズによる刺激により、高い効率で増殖し、培養物中の細胞数は培養開始から５０日で約３０００倍にまで増加した。細胞数が１００−１５０倍程度まで増加した後、ビーズを除去し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で２日間培養することにより得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図３Ｂ）。しかしながら、さらに増殖を続けると、該Ｔ細胞株の増殖抑制機能が減弱した（図４Ｂ、ラパマイシン未処理）。
ここで、ラパマイシンを培養開始時より添加することにより、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は抑制され、培養物中の細胞数は培養開始から５０日で約２０倍にしか増加しなかった（図４Ａ、ｄａｙ０）。ラパマイシン存在下で５０日間培養後、培養物からビーズ及びラパマイシンを除去し、培養物中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で更に２日間培養し、得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖抑制機能を調べた。その結果、該Ｔ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図４Ｂ、ｄａｙ０）。
ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をラパマイシン非存在下で増殖させた後で、培地にラパマイシンを添加した場合における、ラパマイシンのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖抑制機能に対する効果を検討した。ラパマイシンを培養開始７日後又は３９日後に添加すると、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖は、ラパマイシン添加時から抑制された（図４Ａ、ｄａｙ７，ｄａｙ３９）。ラパマイシンを培養開始７日後に添加すると、培養物中の細胞数は培養開始から５０日で約６０倍にしか増加しなかった。一方、ラパマイシンを培養開始から３９日後に添加すると、培養物中の細胞数は培養開始から５０日で約７００倍にまで増加した。培養開始から５０日後に、上述と同様に、培養物からビーズ及びラパマイシンを除去し、培養物中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で更に２日間培養し、得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖抑制機能を調べた。その結果、該Ｔ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図４Ｂ、ｄａｙ７，ｄａｙ３９）。
以上の結果から、ラパマイシン化合物を添加することにより、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、その免疫抑制能を高いレベルで維持しながら増殖させることが可能となることが示された。また、ラパマイシン化合物を培養の初期（ｄａｙ０，７）に添加するよりも、培養の後期（ｄａｙ３９）に添加するほうが、十分な細胞増殖と免疫制御能の維持が達成されることが示唆された。
（増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的特性）
ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズの刺激により、約３５日間で、１０００倍以上の数に増殖した（図５Ａ、非処理）。ラパマイシン不在下で約３５日間増殖後、ビーズを除去し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で更に２日間培養することにより得られたＴ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制しなかった（図５Ｂ、非処理）。
一方、ラパマイシンを培養開始時より添加することにより、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖はラパマイシン非存在下培養と比較すると若干抑制されるものの、培養物中の細胞数は培養開始から約３５日で約７００倍にまで増加した（図５Ａ、ｄａｙ０）。ラパマイシン存在下で約３５日間培養後、培養物からビーズ及びラパマイシンを除去し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で更に２日間培養することにより得られたＴ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図５Ｂ、ｄａｙ０）。
ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞をラパマイシン非存在下で増殖させた後で、培養物にラパマイシンを添加した場合における、Ｔ細胞株増殖及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖抑制機能に対するラパマイシンの効果を検討した。ラパマイシンを培養開始１９日後に添加しても、Ｔ細胞株の増殖に影響をほとんど与えなかった（図５Ａ、ｄａｙ１９）。培養開始から約３５日後に、上述と同様に、培養物からビーズ及びラパマイシンを除去し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で更に２日間培養することにより得られたＴ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図５Ｂ、ｄａｙ１９）。
以上の結果から、ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより、制御性Ｔ細胞を誘導し得ることが示された。また、ラパマイシン化合物を用いれば、ＣＤ２５の発現の有無に関わらず、ナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造し得ることが示された。
［実施例２］
〔１〕方法
（細胞培養）
実施例１と同様に分離されたヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４細胞／ｗｅｌｌ）が、９６ウェル丸底培養プレートに、１ウェルあたり２００μｌの増殖培地（２％ヒトＡＢ型血清が補充されたＡｌｙＳ５０５Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製））中で、ヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）の存在下、一細胞あたり４ビーズの割合で、抗ヒトＣＤ３及びＣＤ２８抱合ビーズで刺激された。ラパマイシン（２０ｎＭ，Ｓｉｇｍａ社製）が、培養開始から０又は４０日後に培地に添加された。３〜４日毎に、培地の半分がＩＬ−２を含有する新鮮な増殖培地と交換された。必要であれば、細胞が分けられ、繰り返し抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズで、１０〜１４日毎に再刺激された。培養開始から５０日後に細胞が回収され、ＦＡＣＳ解析のために使用された。
（ＦＡＣＳ解析）
増殖されたＴ細胞株が、３０分間、４℃、暗中にて、多様な抗体とインキュベートされ、洗浄され、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター及びＦＡＣＳＤｉＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析された。使用された抗体及び染色条件は、実施例１と同一である。
〔２〕結果
フローサイトメトリー解析結果を図６に示す。
ヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を用い、ラパマイシンをｄａｙ４０から培地に添加した場合に得られるＴ細胞株は、ヒト末梢血中に天然に存在している制御性Ｔ細胞（末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）と同様にＧＩＴＲ＋ＣＴＬＡ４＋であった。該Ｔ細胞株のＣＤ４５ＲＢ発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して高く（約４倍）（ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋）。該Ｔ細胞株のＣＤ２５発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とほぼ同等であり（約０．８倍）（ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋）、ＣＤ６２Ｌ発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも低かった（約１／６倍）（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ＋）。該Ｔ細胞株のＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯの発現強度は、培養開始時におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれらと、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれらとの中間的な値を示した（ＣＤ４５ＲＡｍｉｄ＋ＣＤ４５ＲＯｍｉｄ＋）。ＣＤ４５ＲＡ発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の約１／６倍であり、ＣＤ４５ＲＯ発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の約１／５０倍であった。
ヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を用い、ラパマイシンをｄａｙ０から培地に添加した場合に得られるＴ細胞株の表現型は、ＣＤ４５ＲＯが陰性である（ＣＤ４５ＲＯ−）ことを除き、ラパマイシンをｄａｙ４０から添加した場合に得られるＴ細胞株の表現型と同様であった。
ヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を用い、ラパマイシンをｄａｙ４０から培地に添加した場合に得られるＴ細胞株は、末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合と同様に、ＧＩＴＲ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋の表現型を有していた。該Ｔ細胞株のＣＤ２５発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞より低く（約１／５倍）（ＣＤ２５ｌｏｗ＋）、ＣＤ６２Ｌ発現は末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれとほぼ同等であった（約１／３倍）（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋）。該Ｔ細胞株のＣＤ４５ＲＡ発現強度は、培養開始時におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれとほぼ同等であった（約１倍）（ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋）。該Ｔ細胞株はＣＤ４５ＲＯ陰性であった（ＣＤ４５ＲＯ−）。
以上より、本発明の方法により製造され得る制御性Ｔ細胞は、末梢中で天然に存在している制御性Ｔ細胞（末梢血中ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）とは異なる表現型を有しており、また、その表現型は、本発明の方法に使用されるナイーブ表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の種類（例えば、ＣＤ２５の発現の有無等）やラパマイシンを培地へ添加する時期に応じて変わり得ることが示された。
［実施例３］
〔１〕方法
（細胞培養）
実施例１と同様に分離されたヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４細胞／ｗｅｌｌ）が、９６ウェル丸底培養プレートに、１ウェルあたり２００μｌの増殖培地（２％ヒトＡＢ型血清が補充されたＡｌｙＳ５０５Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製））中で、ヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）の存在下、一細胞あたり４ビーズの割合で、抗ヒトＣＤ３及びＣＤ２８抱合ビーズで刺激された。ラパマイシン（２０ｎＭ，Ｓｉｇｍａ社製）が、培養開始から４０日後に培地に添加された。３〜４日毎に、培地の半分がＩＬ−２を含有する新鮮な増殖培地と交換された。必要であれば、細胞が分けられ、繰り返し抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体抱合ビーズで、１０〜１４日毎に再刺激された。培養開始から５０日後に細胞が回収され、機能アッセイのために使用された。
（混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
実施例１と同様に末梢血全ＣＤ４＋Ｔ細胞が分離された。図に示された個数の増殖されたＴ細胞株が、５×１０４個の単離された末梢血全ＣＤ４＋Ｔ細胞及び１×１０５個の放射線照射（４０Ｇｙ）された同種異系のＰＢＭＣと、１０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）と共に、丸底９６ウェルマイクロプレート中、１０％ＦＢＳを含む増殖培地中で、それぞれ、刺激された。トランスウェル試験のために、１×１０６個の単離されたばかりの全ＣＤ４＋Ｔ細胞と１×１０６個のＴ細胞株が共培養されるか、全ＣＤ４＋Ｔ細胞とＴ細胞株が同種異系ＰＢＭＣ（３×１０６個）と共にチャンバーの底と上に分離培養された。培養物は４日間インキュベートされ、最後の１６時間の間に［３Ｈ］タイミジンでラベルされた。培養物が回収され、［３Ｈ］タイミジン取込が１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）により測定された。
〔２〕結果
Ｔ細胞株と全ＣＤ４＋Ｔ細胞とが接触し得る条件において、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、共に、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図７）。しかし、トランスウェルによりＴ細胞株と全ＣＤ４＋Ｔ細胞との接触を阻害すると、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株による全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の抑制は阻止されたが、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株は引き続き全ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した。
従って、本発明の方法において、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したときに得られる制御性Ｔ細胞は、細胞接触に依存して免疫抑制能を発揮するが、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したときに得られる制御性Ｔ細胞は、細胞接触に非依存的に免疫抑制能を発揮することが示された。
［実施例４］
〔１〕方法
（細胞培養）
ヒト末梢血中ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４細胞／ｗｅｌｌ）が、９６ウェル丸底培養プレートに、１ウェルあたり２００μｌの増殖培地（２％ヒトＡＢ型血清が補充されたＡｌｙＳ５０５Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製））中で、ヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）の存在下、１ｘ１０＾５細胞／ｗｅｌｌの放射線照射（４０Ｇｙ）された同種異系のＰＢＭＣで刺激された。
エベロリムス（１００ｎＭ又は１０００ｎＭ、ノバルティスファーマ社製）が、培養開始時から培地に添加された。エベロリムスは以下のように精製した：Ｃｅｒｔｉｃａｎ  ０．２５ｍｇ錠剤（ノバルティスファーマ社製）を粉砕し、アセトンに溶解させた。それから、溶液をろ過し、ろ過液を回転蒸発させて、沈殿物を真空乾燥した。得られた抽出物をＤＭＦに溶解し、ＨＰＬＣで分離（ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ１８  ４μｍ，１５０×２．１ｍｍ）した。分離後のエベロリムスを凍結乾燥し、精製した。
３〜４日毎に、培地の半分がＩＬ−２を含有する新鮮な増殖培地と交換された。必要であれば、細胞が分けられ、繰り返し放射線照射（４０Ｇｙ）された同種異系のＰＢＭＣで、１０〜１４日毎に再刺激された。培養開始から５０日後に細胞が回収され、機能アッセイのために使用された。
（抑制アッセイ）
表示された数の、増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株、又は増殖されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株が、単独で、又は自家のレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０＾４個／ｗｅｌｌ）と共に、培養に用いた同種異系のＰＢＭＣと同じ個体から得られた放射線照射（４０Ｇｙ）されたＰＢＭＣ（１ｘ１０＾５個／ｗｅｌｌ）により、丸底９６ウェルマイクロプレート中、増殖培地中で、刺激された。培養物は７日間インキュベートされ、最後の１６時間の間に［３Ｈ］タイミジン（２μＣｉ／ｗｅｌｌ）でラベルされた。その後細胞が回収され、［３Ｈ］タイミジン取込が１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）により測定された。
〔２〕結果
（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株の機能に対するエベロリムスの効果）
エベロリムス（１０００ｎＭ）を添加することにより、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は抑制された（図８Ａ）。しかし、エベロリムス存在下での培養により得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、コントロールと比較して、より強力にアロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した（図９）。
以上より、ラパマイシンと同様に、エベロリムスを添加することにより、
ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、その免疫抑制能を高いレベルで維持しながら増殖させることが可能となることが示された。
（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の機能に対するエベロリムスの効果）
驚くべきことに、エベロリムス（１００ｎＭ又は１０００ｎＭ）を添加することにより、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が増強された（図８Ｂ）。エベロリムス不含培養により得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、アロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を弱く抑制した（図１０、コントロール）。一方、エベロリムス存在下での培養により得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、コントロールと比較して、より強力にアロ抗原提示細胞による刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した（図１０）。
以上より、ラパマイシンと同様に、エベロリムスの存在下で、ナイーブ表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋）を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することにより、制御性Ｔ細胞を誘導し得ることが示された。特に、エベロリムスは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖を増強する点で優れていた。
また、ラパマイシンと同様に、エベロリムスを用いれば、ＣＤ２５の発現の有無に関わらず、ナイーブ表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋）を有するＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造し得ることが示された。
［実施例５］
（生体肝移植の患者の末梢血中におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加）
（方法）生体肝移植（同所性肝移植）の術前、術後経時的（１ヶ月，３ヶ月，６ヶ月，１年，２年；各ポイントで小児（年齢０〜１８歳）・成人（年齢３９〜６４歳）各々１０名）にｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎａｌに血液を採血し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分画の全リンパ球数に対する割合（％）をフローサイトメーターにて解析した。抗体としては、ＡＰＣ−抗ＣＤ４抗体、ＰＥ−抗ＣＤ２５抗体、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４５ＲＡ抗体があらかじめ適定して定められた至適量用いられた。
（結果）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分画は小児では肝移植後著明に増加し、術後３ヶ月でピークを認めた。一方、成人では、同分画は小児に見られたような著明な増加は認められなかったものの、該細胞分画の割合は緩やかに増加した（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物を得ることができる。該化合物は、制御性Ｔ細胞を誘導するという新たな機序の免疫抑制薬として、あるいはその開発のためのシーズとして有用である。
また、本発明の方法を用いれば、インビトロで哺乳動物の制御性Ｔ細胞を効率よく製造することが可能である。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。
本出願は日本で出願された特願２００５−２８９２２４（出願日：２００５年９月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月14日(2007.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）被検化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；
（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；
（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。
【請求項２】
該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
被検化合物が免疫抑制性化合物又はその誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１６】
該ナイーブ表現型がＣＤ４５ＲＡ＋である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が霊長類由来である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原存在下で培養される、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴ細胞増殖因子の存在下で培養される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
ラパマイシン化合物が培養開始から早くとも１週間以降に培地中に添加される、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
得られうる制御性Ｔ細胞が細胞接触に非依存的な免疫抑制能を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
ラパマイシン化合物がラパマイシンである、請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
ラパマイシン化合物がエベロリムスである、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項２９】
請求項１５記載の方法により得られ得る制御性Ｔ細胞であって、以下の（Ｃ）の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
【請求項３０】
以下の（Ｃ）の表現型を有する制御性Ｔ細胞：
（Ｃ）ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ＋、及びＣＤ２５ｌｏｗ＋。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の制御性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる、免疫抑制用免疫調節剤。
【請求項３２】
（削除）
【請求項３３】
以下の工程を含む、免疫調節剤の製造方法：
（１）ラパマイシン化合物の存在下で、（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得る工程；
（２）該制御性Ｔ細胞を医薬として許容される担体と混合し、免疫抑制用免疫調節剤を製造する工程。
【請求項３４】
（削除）
【請求項３５】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又は、ＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤であって、ラパマイシン化合物を含有する、剤。
【請求項３６】
（削除）
【請求項３７】
（削除）
【請求項３８】
（削除）
【請求項３９】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するための抗体及びラパマイシン化合物を含む、制御性Ｔ細胞製造用キット。
【請求項４０】
以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させる方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）前記非ヒト哺乳動物の末梢組織中の、ナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が増加したことを確認する工程。
【請求項４１】
以下の工程を含む、生体内においてナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニング方法：
（１）非ヒト哺乳動物に、肝移植を施す工程；
（２）工程（１）の哺乳動物に被検化合物を投与する工程；
（３）工程（２）の哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を評価する工程；
（４）工程（３）で評価されたナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数を、肝移植が施され、被検化合物が投与されていない非ヒト哺乳動物の末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較する工程；
（５）末梢組織中のナイーブ表現型を有するＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増大させた化合物を選択する工程。
【請求項４２】
免疫抑制用免疫調節剤を製造するための、請求項２９又は３０に記載の制御性Ｔ細胞の使用。
【請求項４３】
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋、（２）ＣＤ４５ＲＯｌｏｗ＋又はＣＤ４５ＲＯ−、（３）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ＋、及び（４）ＣＤ３８＋からなる群から選択される少なくともいずれかのナイーブ表現型を有するＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するための剤を製造するための、ラパマイシン化合物の使用。
【国際調査報告】
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