(57)【要約】  本発明は、DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物、およびコンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物、並びにそれらの作製方法に関する。また本発明は、前記リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物に候補物質を投与することを含む、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物。
【請求項２】
コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物。
【請求項３】
齧歯類である、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
マウスである、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損させることを含む、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を作製する方法。
【請求項６】
DNase II遺伝子をコンディショナルに欠損可能とすることを含む、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を作製する方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の非ヒト動物に候補物質を投与することを含む、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
候補物質がTNF-αの作用を阻害する物質から選択される、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物およびその作製方法に関する。具体的には、本発明は、DNase IIおよびインターフェロン（IFN）タイプI受容体遺伝子を欠損するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物およびコンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物、並びにそれらの作製方法に関する。また本発明は、リウマチ性関節炎の治療または予防薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性関節炎は、人口の約1%が罹患する滑膜関節の慢性炎症性疾患である。患者の関節ではTNFαやIL-6などのサイトカインが大量に発現しており、これらが関節に存在する滑膜細胞の異常増殖を誘導し、骨に異常をもたらすと考えられている（非特許文献１）。リウマチの治療薬としては、抗TNF抗体や抗IL-6抗体が使用され成功をおさめているが（非特許文献２、３）、リウマチ性関節炎の患者においてTNFαやIL-6遺伝子が活性化される原因は現在のところ不明である。【０００３】
プログラム細胞死および赤血球形成では、大量の染色体DNAが分解される（非特許文献４）。DNase IIはマクロファージに豊富なリソソーム酵素であり、マクロファージが貪食したアポトーシス細胞の染色体DNAや、赤血球前駆細胞から放出される核を分解する。本発明者らは以前、DNase II-/-マウスが胚段階で死滅すること、およびこのマウスは赤血球形成に欠陥があり、貧血症の徴候を示すことを見いだした（特許文献１、非特許文献５）。これは、胎児肝に存在する大量の未分解DNAを保有するマクロファージから産生されるIFNにより赤血球前駆細胞が死滅するためと考えられた（非特許文献６、７）。また、DNase IIとIFNタイプI受容体（IFN-IR）遺伝子の両方を欠損するDNase II-/-IFN-IR-/-マウスは、メンデルの法則にしたがい誕生することがわかった（非特許文献８）。【０００４】
リウマチ性関節炎の治療薬の開発においては、リウマチ性関節炎を発症する動物モデルが必須である。現在、マウスにコラーゲンを注射してリウマチ性関節炎を発症させる方法がよく用いられている。しかしながらこのモデルはヒトの病態との違いも多く、より適切にヒトの病態を反映した動物モデルが必要とされている。【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３０６０２２号公報
【非特許文献１】Feldmann, M., Brennan, F. M. ＆ Maini, R. N. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu. Rev. Immunol. 14, 397-440 (1996)
【非特許文献２】Feldmann, M. ＆ Maini, R. N. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned？ Annu. Rev. Immunol. 19, 163-196 (2001)
【非特許文献３】Feldmann, M. Development of anti-TNF therapy for rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Immunol. 2, 364-371 (2002)
【非特許文献４】Nagata, S. DNA degradation in development and programmed cell death. Annu. Rev. Immunol. 23, 853-875 (2005)
【非特許文献５】Kawane, K. et al. Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the mouse fetal liver. Science 292, 1546-1549 (2001)
【非特許文献６】Kawane, K. et al. Impaired thymic development in mouse embryos deficient in apoptotic DNA degradation. Nat. Immunol. 4, 138-144 (2003)
【非特許文献７】Krieser, R. J. et al. Deoxyribonuclease IIa is required during the phagocytic phase of apoptosis and its loss causes lethality. Cell Death Differ. 9, 956-962 (2002)
【非特許文献８】Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H. ＆ Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005)
【０００６】
以上の文献は、引用により本明細書に含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、リウマチ性関節炎のよい病態モデルとなる非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物およびコンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物、並びにそれらの作製方法を提供する。また本発明は、本発明のリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物に候補物質を投与することを含む、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のリウマチ性関節炎非ヒトモデル動物は、ヒトにおけるリウマチ性関節炎と良く似た症状を示すことから、リウマチ性関節炎の治療薬の開発およびその発症メカニズムの解明に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】図１ａは、野生型DNase II遺伝子、ターゲティングベクター、ターゲット化アレル (3 lox)、floxアレル、Creによる欠失後のアレル (delta（Δ）)、およびDNase II-/-マウス作製時に構築したDNase II-ヌルアレル（null）（Kawane, K. et al. Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the mouse fetal liver. Science 292, 1546-1549 (2001) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）の略図である。黒い部分はDNase II遺伝子のエクソンを表す。三角はloxP配列を表す。PGKプロモーター誘導性ネオマイシン耐性遺伝子（Neo）およびジフテリア毒素-A フラグメント (DT-A)をコードするDNAを四角で示す。図１ｂのサザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを野生型アレルの下に示す。代表的制限酵素(B, Bam HI; E, Eco RV; Sm, Sma I; H, Hind III; X, Xho I; SI, Sac I; Nc, Nco I; Nr, Nru I; および SII, Sac II)の認識部位を一部示す。ベクター構築中または組換え中に破壊された認識部位はかっこ内に示す。1.0-kbのサイズマーカーが示されている。
【図１ｂ】図１ｂは、Cre-loxシステムによるDNase II遺伝子の欠失を示す。左：DNase II3lox/+アレルを有するES細胞クローンにより作製したキメラマウスを、C57/B6 マウスと交配した。これらマウスをE2a-Creを有するトランスジェニックマウスと交配し、DNase II3lox/+アレルを有するマウスを作製した。DNase II+/+マウス(レーン 1)およびDNase II3lox/+マウス(レーン 2)から尾のDNAを単離し、Sac Iにて消化し、プローブ（配列番号１５）を使用してサザンハイブリダイゼーションを行った。野生型(WT)およびターゲット化アレル (3 lox)のバンドを矢印で示す。右：4-6週齢のDNase IIflox/-Mx1-CreTマウス(レーン 3)またはDNase II+/+Mx1-CreTマウス (レーン 2)にポリ(I:C)を投与した。2ヶ月後、DNAを脾臓から単離し、Nco Iで消化し、サザンハイブリダイゼーションにより分析した。ポリ（I:C）未投与のDNase IIflox/-マウス由来のDNA(レーン 1)を野生型およびlox アレルのコントロールとして分析した。コンディショナルに欠失したアレル (delta)、ヌルアレル (null)、および野生型またはfloxアレル (WT or flox)を矢印で示す。
【図１ｃ】図１ｃは、DNase IIΔ/-マウスにおけるDNase II遺伝子の発現を示す。4-6週齢のDNase IIflox/-マウスにポリ(I:C)を投与した。示した時点で骨髄および脾臓からRNAを単離し、DNase II mRNAをリアルタイムPCRにより定量し、βアクチンに対する相対値として示した。各群のマウスは3〜5匹であり、それらの平均値をS.D.と共にプロットした。
【図２ａ】図２ａは、12.5ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびポリ(I:C)投与の8-10ヶ月後のDNase IIflox/-マウス(DNase IIΔ/-)の前肢および後肢足蹠における関節の膨潤を示す。12.5-15.0ヶ月齢のIFN-IR-/-マウスの前肢および後肢足蹠をコントロールとして示す。
【図２ｂ】図２ｂは、時間依存的な関節炎の発症を示す。左：野生型(n= 3-4)、IFN-IR-/-(n= 5-8)およびDNase II-/-IFN-IR-/-(n= 9-10) マウスの関節は示した月齢において調べた。また、DNase IIflox/-(n= 8-10)およびDNase IIflox/+(n=11-15)同腹子にポリ(I:C)またはPBS (n=5)を注射し、示した期間後に前肢および後肢足蹠を調べた。関節炎の重症度にスコアを付し、平均値をS.D.とともにプロットした。右：13ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの関節炎のスコアを雄雌別にプロットした。
【図２ｃ】図２ｃは、15ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの後肢のMRIを示す。T1強調イメージ(T1WI)、T2強調イメージ(T2WI)および脂肪抑制T2強調イメージ (T2WISUP)を示す。
【図２ｄ】図２ｄは、15.5ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびポリ(I:C)投与の10ヶ月後のDNase IIflox/-マウス(DNase IIΔ/-)の後肢のX線写真を示す。
【図３ａ】図３ａは、8-16.5ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスまたはポリ(I:C)投与の10ヶ月後のDNase IIflox/-マウスの関節のパラフィン切片 (HE染色)または凍結切片 (TRAPおよび免疫組織学染色)を、ヘマトキシリンおよびエオジン（HE）、TRAP、抗CD68抗体または抗CD4抗体で染色した結果を示す。抗体によるシグナルはDABにより可視化した。P, パンヌス; B, 骨; C, 軟骨; BM, 骨髄。倍率：100倍または200倍。スケールバー＝50μm。
【図３ｂ】図３ｂは、7.5-13.5ヶ月齢のコントロール(野生型およびIFN-IR-/-)、DNase II-/-IFN-IR-/-マウス、ポリ(I:C)投与DNase IIflox/+マウス（ポリ(I:C)コントロール）、およびポリ(I:C)投与DNase IIΔ/-マウスの関節における各種サイトカインの発現を示す。TNFα、IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-β、IFN-γ、IL-10、TGF-β、およびMMP-3のmRNAをリアルタイムPCRで定量し、GAPDH mRNAに対する値として示した。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図３ｃ】図３ｃは、7.5-16.5ヶ月齢のコントロール、DNase II-/-IFN-IR-/-マウス、ポリ(I:C)投与DNase IIflox/+マウス（ポリ(I:C)コントロール）、およびポリ(I:C)投与DNase IIΔ/-マウスの血清における、IL-18、MMP-3、抗CCP抗体、リウマチ因子（RF）、および抗dsDNA抗体のレベルを示す。一部の血清学的パラメータは3〜7.5週齢のMRL-lprマウスについても調べた。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図４ａ】図４ａは、4-8週齢のIFN-IR-/-マウスおよびDNase II-/-IFN-IR-/-マウス、並びにポリ(I:C)投与の10ヶ月後のDNase IIflox/-マウス(DNase IIΔ/-）の骨髄、脾臓および胸腺の切片をヘマトキシリンおよびエオジン (HE)またはDAPIで染色したものを示す。HE染色およびDAPI染色の白い部分は、DNase II遺伝子の欠損により分解されずにマクロファージ内に残った赤芽球由来の核DNAを表す。倍率：200倍。スケールバー＝50μm。
【図４ｂ】図４ｂは、DNase II欠損マウスの血清中のDNAの存在を示す。左：3種類の月齢のコントロールおよびDNase II-/-IFN-IR-/-マウス、ならびにDNase IIΔ/-マウスの血清中のDNA濃度をPicoGreenキットにより測定した。各群は2〜6匹のマウスよりなり、その平均濃度をS.D.とともにプロットした。右：6週齢のIFN-IR-/-およびDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの血清を15μl使用し、1.0%アガロースゲル電気泳動により分析した。マーカーDNAのサイズを塩基対(bp)で示す。
【図４ｃ】図４ｃは、1.0-1.5、2.0-2.5および7.5-16.5ヶ月齢のコントロールおよびDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの脾臓重量を示す。4〜7匹のマウスの平均値を平行線で示す。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図４ｄ】図４ｄは、図中の月齢の、コントロール、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびポリ(I:C)投与後のDNase IIΔ/-およびDNase IIflox/+ (コントロール)同腹子の血清におけるTNFα濃度を示す。各群につき3〜6匹のマウスの血清中のTNFα濃度をELISAにより測定した。平均値を平行線にて示す。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図４ｅ】図４ｅは、図中の月齢の、コントロール、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびポリ(I:C)投与後のDNase IIΔ/-およびDNase IIflox/+ (コントロール)同腹子の骨髄におけるTNFαの発現を示す。TNFαmRNAをリアルタイムPCRにより定量し、そのレベルをβアクチン mRNAに対する値として示した。平均値を平行線で示す。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図４ｆ】図４ｆは、2ヶ月齢のIFN-IR-/-およびDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの骨髄の凍結切片におけるマクロファージを抗CD68抗体で染色した結果を示す。スケールバー＝50μm。
【図４ｇ】図４ｇは、1.5ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの骨髄の凍結切片をヤギIgGまたはヤギ抗マウスTNFα抗体(抗TNFα抗体)により染色し、次いでウサギ抗ヤギIgGにより染色した結果を示す。DAPI染色の結果も示されている。スケールバー＝50μm。
【図５ａ】図５ａは、抗TNF-α抗体による関節炎の予防を示す。DNase II+/-IFN-IR-/-マウスとDNase II-/-IFN-IR-/-マウスを交配し、2匹の雌のマウスより2種類の同腹子の系統を得た（同腹マウス群AおよびB）。各系統の同腹子の遺伝子型は、DNase II-/-IFN-IR-/-およびDNase II+/-IFN-IR-/-であった。1ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスに、抗TNF-α mAbまたはPBSを週2回腹腔内投与した。示した月齢において関節炎の臨床スコアを調べた。
【図５ｂ】図５ｂは、2ヶ月齢のDNase II+/-IFN-IR-/-マウス（コントロール）、抗TNF-α抗体投与DNase II-/-IFN-IR-/-マウス、およびPBS投与DNase II-/-IFN-IR-/-マウスにおける血清MMPレベルを示す。各群4匹のマウスを解析し、平均値を平行線で示した。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図５ｃ】図５ｃは、2〜4ヶ月齢のDNase II+/-IFN-IR-/-マウス、抗TNF-α抗体投与DNase II-/-IFN-IR-/-マウス、およびPBS投与DNase II-/-IFN-IR-/-マウスの前肢関節におけるTNF-α、IL-1β、IL-6、およびMMP-3 mRNAのレベルを示す。mRNAはリアルタイムPCRにより定量し、GAPDH mRNAに対する値として示した。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図５ｄ】図５ｄは、臨床スコア2.5〜6.0の5〜13ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスに対する抗TNF-α mAbの効果を示す。抗体は週2回投与し、3週間の投与の後に血清MMP-3レベルを測定した。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【図５ｅ】図５ｅは、DNase II+/-IFN-IR-/-マウス（コントロール）、あるいは抗TNF-α抗体またはPBS投与6週間後のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスにおけるTNF-α、IL-1β、IL-6、およびMMP-3 mRNAを示す。Welchのt検定を行い、P値を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を提供する。本明細書および特許請求の範囲において、非ヒト動物に関して「DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する」とは、その非ヒト動物においてDNase IIおよびIFNタイプI受容体をコードする内在性遺伝子またはその発現調節領域の全体または一部が欠失し、または他の配列と置換され、正常なDNase IIおよびIFNタイプI受容体の発現が阻害されていることを意味する。【００１２】
本発明における「非ヒト動物」には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットおよびウサギが含まれるが、これらに限定されない。中でも、マウス、ラット等の齧歯類が本発明に特に好適に使用される。【００１３】
DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する非ヒト動物は、公知の方法にしたがい作製することができる。例えば、まずいずれか一方の遺伝子を欠損するマウスを得るため、その遺伝子または発現調節領域の全部または一部を他の配列（例えばネオマイシン耐性遺伝子）の挿入によって改変したターゲティングベクターを作製する。次に、このベクターをエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等によりES細胞に導入し、相同組換えが起こった細胞を選択する。ターゲティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子等を含ませることにより、非相同組換えを起こした細胞を効率的に排除することができる。選択したES細胞クローンをマウス胚盤胞にインジェクションするか、あるいは桑実胚に凝集させ、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交配させると、一方のアレルにおいてその遺伝子を欠損するマウス（+/-）が得られる。そして、このヘテロ接合体同士を交配させると、両方のアレルにおいてその遺伝子を欠損するマウス（-/-）が得られる。DNase II遺伝子およびIFNタイプI受容体遺伝子の両方を欠損するマウスは、DNase II+/-マウスとIFN-IR-/-マウスを何度か交配させることにより作製することができる。【００１４】
DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する非ヒト動物は、例えば、ENU (N-ethyl-N-nitrourea) などの変異誘発物質を用いて、マウスのゲノムに網羅的に変異を導入し、その中から目的の遺伝子に変異が導入されている変異マウスを見つけ出すことによっても得ることができる(Chen, Y., Yee, D., Dains, K., Chatterjee, A., Cavalcoli, J., Schneider, E., Om, J., Woychik, R. P., and Magnuson, T. (2000). Genotype-based screen for ENU-induced mutations in mouse embryonic stem cells. Nat Genet 24, 314-317.；Munroe, R. J., Bergstrom, R. A., Zheng, Q. Y., Libby, B., Smith, R., John, S. W., Schimenti, K. J., Browning, V. L., and Schimenti, J. C. (2000). Mouse mutants from chemically mutagenized embryonic stem cells. Nat Genet 24, 318-321.、これら文献は引用により本明細書に含まれる)。また、遺伝子トラップ法により非ヒト動物の染色体遺伝子座位に無作為にベクターDNAを導入し、その後、変異遺伝子を同定することによっても作製可能である(Nord, A. S., Chang, P. J., Conklin, B. R., Cox, A. V., Harper, C. A., Hicks, G. G., Huang, C. C., Johns, S. J., Kawamoto, M., Liu, S., et al. (2006). The International Gene Trap Consortium Website: a portal to all publicly available gene trap cell lines in mouse. Nucleic Acids Res 34, D642-648. 、本文献は引用により本明細書に含まれる)。【００１５】
DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する非ヒト動物は、成長するにつれてヒトのリウマチ性関節炎と良く似た症状を発症する。したがって、DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損する非ヒト動物は、リウマチ性関節炎のモデル動物として有用である。【００１６】
本発明はまた、コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有するリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を提供する。本明細書および特許請求の範囲において、「コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する」とは、一定の条件により欠損を誘導できるように構築されたDNase II遺伝子が内在性DNase II遺伝子のかわりに導入されていることを意味する。【００１７】
DNase II遺伝子をコンディショナルに欠損させるためのシステムは、公知のいずれのシステムであってもよく、例としてCre-loxPシステムが挙げられる。Cre-loxPシステムによりコンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する非ヒト動物は、その全てまたは一部が2つのloxP配列に挟まれているDNase II遺伝子を含むターゲティングベクターを用いて作製することができる。本発明においてloxPが導入されたDNase II遺伝子のアレルを「flox」と表す。DNase IIflox/-非ヒト動物においてCreレコンビナーゼを一過性に発現させると、部位特異的組換えによりloxP配列の間の配列が欠失し、DNase II遺伝子を欠損する非ヒト動物を得ることができる。Creレコンビナーゼは、Creレコンビナーゼを発現するアデノウィルスベクターを使用することにより、または誘導性Creレコンビナーゼ遺伝子（例えば、IFN誘導プロモーターの支配下にあるCre遺伝子）をトランスジーンとして有するDNase IIflox/-非ヒト動物においてCreレコンビナーゼの発現を誘導することにより、作用させることができる。【００１８】
目的の遺伝子をコンディショナルに欠損するための他のシステムとしては、例えばFRT配列およびFlpリコンビナーゼを使用するシステムが挙げられる（Rodriguez, C. I., Buchholz, F., Galloway, J., Sequerra, R., Kasper, J., Ayala, R., Stewart, A. F., and Dymecki, S. M. (2000). High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nat Genet 25, 139-140. 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。【００１９】
コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する非ヒト動物においてDNase II遺伝子の欠損を誘導すると、その非ヒト動物は、欠損誘導後の時間に依存してヒトのリウマチ性関節炎と良く似た症状を発症する。したがって、コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する非ヒト動物は、リウマチ性関節炎のモデル動物として使用可能である。【００２０】
DNase II遺伝子の欠損を誘導する時期は、欠損誘導後の非ヒト動物が適当な期間生存し、かつヒトリウマチ性関節炎様の関節炎を発症する限り特に制限されない。欠損誘導時期は、非ヒト動物の種類により適宜変更されうる。非ヒト動物がマウスの場合、DNase II遺伝子の欠損は、例えば1ヶ月-2ヶ月齢のマウスにおいて行うことができる。【００２１】
本発明はまた、本発明のリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物に候補物質を投与することを含む、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。ある態様において、本発明のスクリーニング方法は、１）本発明のリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物に候補物質を投与する工程、２）候補物質を投与した非ヒト動物の病態を非投与動物の病態と比較する工程、３）病態を改善する候補物質を選択する工程、を含む。【００２２】
候補物質は、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する可能性のある物質であれば特に制限されず、例えば微生物、植物または動物の細胞抽出物または培養上清、合成低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体などである。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等、ライブラリーの形態で提供されてもよい。候補物質の作用機序は特に限定されないが、例えば候補物質はTNF-αの作用を直接的または間接的に阻害する物質である。【００２３】
候補物質はいずれの投与経路により投与してもよく、例えば経口投与、静脈内投与、または腹腔内投与である。候補物質の投与は、非ヒト動物における関節炎の発症前または発症後のいずれであってもよい。好ましくは、候補物質は、関節炎の発症後に投与する。コンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有する非ヒト動物の場合、候補物質の投与は、DNase II遺伝子の欠損の誘導前であっても誘導後であってもよく、また、DNase II遺伝子の欠損誘導後関節炎の発症前であっても発症後であってもよい。好ましくは、候補物質は、DNase II遺伝子の欠損の誘導後であって関節炎の発症後に投与する。【００２４】
候補物質を投与した非ヒト動物において調べる病態としては、例えば以下が挙げられる：
関節の膨潤および／または変形；
関節炎；
関節組織におけるサイトカイン（例えばIL-6、TNFまたはIL-β）またはMMP-3の発現；
血清中のリウマチ因子、抗CCP抗体、またはMMP-3の濃度；
血清中のDNA濃度；
血清中のTNF-αまたはIL-18の濃度。
これらのうち複数を組み合わせて調べても良い。【００２５】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これら実施例はいかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２６】
材料および方法
1.マウス
１）DNase II-/-IFN-IR-/-マウス
DNase II-/-IFN-IR-/-マウスは、DNase II+/-マウスとIFN-IR-/-マウスを何度か交配させ、得られたDNase II+/-IFN-IR-/-マウス同士を交配させることにより作製した（Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H. ＆ Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。DNase II+/-は、DNaseIIのエクソン1-5および6の一部をネオマイシン耐性遺伝子と置き換えたターゲティングベクターを用いて作製した（Kawane, K. et al. Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the mouse fetal liver. Science 292, 1546-1549 (2001) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。IFN-IR-/-マウスは、Muller らにより、IFN-IR遺伝子のエクソン3にネオマイシン耐性遺伝子を導入したターゲティングベクターを用いて作製された（Muller, U., Steinhoff, U., Reis, L. F., Hemmi, S., Pavlovic, J., Zinkernagel, R. M., and Aguet, M. (1994). Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense. Science 264, 1918-1921. 、本文献は引用により本明細書に含まれる）（本マウスは、M.Aguet, Swiss Institute for Experimental Cancer Research, Epalinges, Switzerlandより供与された）。【００２７】
２）DNase IIflox/- Mx1-CreTマウス
DNase II遺伝子のエクソン3〜5を欠失するように、コンディショナルターゲティングベクターを設計した（図１ａ）。DNase II遺伝子のイントロン5に存在するHind IIIサイトに、loxP配列に挟まれたPGKプロモーター誘導性ネオマイシン耐性遺伝子（neo）を有するneo-loxPカセット（Dr. J. Takedaより供与）を挿入した。エクソン1および2を含むSma Iフラグメント（0.44 kb）を、対応する配列に加えて1つのloxP配列を有するDNAフラグメントと置き換えた。tkプロモーターにより誘導されるジフテリア毒素A-フラグメント(DT-A)を、ベクターの3’末端に挿入した。【００２８】
loxPが導入されたDNase II遺伝子のアレルを有するマウスを作製するため、直線化したターゲティングベクターをR1マウスのES細胞にエレクトロポレーションにより導入した。G418 (150μg/ml)耐性のES細胞クローンのうち相同組換えを起こした細胞をPCRにより選択した。陽性クローンをBDF1マウスの桑実胚と凝集させ、DNase II3lox/+マウスを作製した。DNase II3lox/+マウスをE2a-Creトランスジェニックマウス（下記参照）と交配してNeoカセットを除去し、得られたDNase IIflox/+ E2a-CreT（モザイク）マウスをDNase II+/-マウスと交配してDNase IIflox/+マウスおよびDNase IIflox/-マウスを作製した。その後、Mx1-Creマウスと交配させることにより、Mx1-CreトランスジーンをDNase IIflox/+マウスまたはDNase IIflox/-マウスに導入し、DNase IIflox/- Mx1-CreTマウスを得た。4-6週齢のDNase IIflox/- Mx1-CreTマウスに、ポリ(I:C)(Sigma)を1.5μg/g（体重）にて1日おきに3回腹腔内投与し、IFN遺伝子を活性化した。【００２９】
３）その他
E2a-Creトランスジェニックマウス（Williams-Simons, L. ＆ Westphal, H. EIIaCre -- utility of a general deleter strain. Transgenic Res. 8, 53-54 (1999)）およびMx1-Creトランスジェニックマウス（Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. ＆ Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science 269, 1427-1429 (1995)）は、Jackson Laboratoryより入手した。Rag2-/-マウス（Shinkai, Y. et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 68, 855-867 (1992) 、これら文献は引用により本明細書に含まれる）は、Dr. Shinkaiより提供された。MRL-lpr マウスは、日本SLC株式会社より購入した。DNase II-/-IFN-IR-/-Rag2-/-マウスは、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスとRag2-/-マウスを交配させて作製した。【００３０】
２．リアルタイムPCR
マウスの四肢を足首関節から外し、ポリトロンホモジナイザーによりホモジナイズした。トータルRNAを、ISOGENキット (Nippongene)により調製し、RNaseフリーDNase I (Qiagen)で処理した後、RNAeasyキット(Qiagen)によりさらに精製した。RNA (2μg)を全量20μlにてSuperscript III (Invitrogen)およびプライマーとしてoligo(dT)を用いて逆転写し、LightCycler (Roche Diagnostics)を用いてリアルタイムPCRを行った。使用したPCRプライマーは以下の通りである：TNF-α（5'-CACAGAAAGCATGATCCGCGACGT-3'（配列番号１）および5'-CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTTCT-3'（配列番号２））；IFN-γ（5'-CTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCTG-3'（配列番号３）および5'-TGACGCTTATGTTGTTGCTGATGGCCTG-3'（配列番号４））；IL-1β（5'-CCAGCTTCAAATCTCACAGCAG-3'（配列番号５）および5'-CTTCTTTGGGTATTGCTTGGGATC-3'（配列番号６））；IL-6（5'-ACAACGATGATGCACTTGCAGA-3'（配列番号７）および5'-GATGAATTGGATGGTCTTGGTC-3'（配列番号８））；DNase II（5'-GAGACGGTGATCAAGAACCAA-3'（配列番号９）および5'-AATTTTGCCAGAACTGGACCT-3'（配列番号１０））；βアクチン（5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'（配列番号１１）および5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'（配列番号１２））；GAPDH（5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'（配列番号１３）および5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'（配列番号１４））。【００３１】
３．関節炎の臨床評価
前肢および後肢関節の膨潤に対して、以下のようにスコアを付けた：0（膨潤なし）; 1（軽度の膨潤）; 2（重度の膨潤または肢または指の変形）。スコアを合計して、合計スコア（最大8）を各マウスについて示した。MRI(磁気共鳴映像法)を行うため、ペントバルビタールナトリウム(Dainippon Pharmaceutical)を腹腔内投与してマウスに麻酔をかけた。1H-MRIは、小動物用のコイルを設計し、Signa Horizon LX 3T (General Electric)を用いて3.0 Tにて行い、T1、T2および、脂肪抑制T2強調MRI画像を得た。ピクセルサイズは 0.12 x 0.12 x 1.50 mm3 (厚さ1.50 mm)であった。肢のX線撮影は、MX-20 Specimen Radiography system (Faxitron X-ray)を用いて行い、高速X線用フィルム(Fuji Photo Film)上に現像した。【００３２】
４．組織学
パラフィン切片を調製するため、組織を4% スクロース含有0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2)中で4%パラホルムアルデヒドにより固定し、パラフィンに包埋した。脱灰のため、パラフィン固定前に関節をモース液 (10% クエン酸ナトリウムおよび22.5% ギ酸)において室温にて24時間インキュベートした。この組織ブロックより4μmの厚さの切片を調製した後、脱パラフィン化し、ヘマトキシリンおよびエオジン（HE）、またはDAPI (Dojindo)にて染色した。【００３３】
凍結切片については、パラホルムアルデヒド固定組織を20% スクロース含有PBS中に置き、OCTコンパウンド (SAKURA)で包埋し、急速冷凍し、厚さ6μmの切片を調製し、MASコートガラススライド(Matsunami)にマウントした。固定後、10% EDTA (pH 7.4)において11日間4℃でインキュベートして、関節を脱灰した。TRAP (Tertrate Resistant Acid Phosphatase)染色は、Acid Phosphatase Leukocyte kit (Sigma Diagnostics)を用いて行った。免疫組織化学染色のため、切片を冷アセトンで固定し、Peroxidase Blocking Reagent (Dako)で10分間処理した。非特異的結合部位をブロッキング液（5% ヤギ血清および1% BSA含有PBS)にてブロッキングした後、ブロッキング液で希釈したビオチン標識一次モノクローナル抗体により切片を染色した。その切片をさらに、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) (Roche)および基質としての3,3’-ジアミノベンジンテトラクロライド (DAB) (DAB Kit, Zymed)とともにインキュベートし、Mayerのヘマトキシリン (WAKO)で対比染色した。使用したモノクローナル抗体は、抗CD68抗体 (FA-11; Serotec)、抗Gr1抗体 (RB6-8C5; Biolegend)、および抗CD4抗体 (H129.19; Beckton Dickinson)である。【００３４】
TNFαの組織化学染色のため、切片を冷アセトン中で固定し、0.1% サポニン含有HEPES緩衝生理食塩水(HBSS)にて洗浄した。非特異的結合部位を5%ウサギ血清および1% BSA（HBSS中）にてブロッキングした後、その切片を4℃にて一晩ヤギ抗TNFα抗体 (L-19; Santa Cruz)とインキュベートした。シグナルは、ビオチン標識ウサギ抗ヤギIgG抗体 (Vector)により検出し、その後、Cy3標識ストレプトアビジン(Sigma) とインキュベートした。切片をDAPI（0.5μg/ml）含有Fluorsaveとともにマウントし、蛍光顕微鏡(Olympus)により観察した。【００３５】
５．サイトカインおよび自己抗体に対するELISA
TNFα、IL-18、リウマチ因子、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）-3の血清レベルは、それぞれBeckton Dickinson、MBL、Shibayagi、およびR＆D systemsのELISAキットにより測定した。抗dsDNA抗体および抗環状シトルリン化ペプチド（CCP）抗体は、マウスイムノグロブリンに対するペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体 (Cappel) を検出抗体として使用したことを除き、MESACUP DNA-II test kit (MBL)およびDIASTAT（登録商標） Anti-CCP ELISA kit（Axis-Shield）を用いて測定した。【００３６】
６．フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析は、FACScan フローサイトメーター (Becton Dickinson)を用いて行い、データは CELLQuest ソフトウェア (Quest Software)を用いて分析した。CD4 (RM4-5)、CD8a (53-6.7) 、Ter119 (Ter119)およびCD69 (H1.2F3)に対するフィコエリスリン (PE)またはフルオレセインイソチオシアネート (FITC)結合モノクローナル抗体 (Beckton Dickinson)を使用した。【００３７】
７．血清中のDNAの分析
血清中のDNAを定量するため、血清を溶解用緩衝液(100 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 8.5）、5 mM EDTA、0.2% SDS、200 mM NaClおよび100μg/ml プロテイナーゼ K含有)にて4倍に希釈し、55℃で4時間インキュベートした。次いで、DNA濃度をPicoGreen kit (Molecular Probe)およびSPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices)により励起波長480 nmおよび放射波長520 nmにて測定した。各試料をDNase Iで処理し、DNase I処理後に得られた値をバックグラウンドとして差し引いた。ある場合には、溶解液中のDNAをフェノール/クロロホルムにより抽出し、アガロースゲル電気泳動により分析した。【００３８】
８．抗TNF-α抗体の投与
抗TNF-α中和モノクローナル抗体（mAb）を産生するラットハイブリドーマMP6-XT22は、Dr. K. Okumuraより提供された。このハイブリドーマをGIT培地（Nihon Seiyaku）中で培養し、（NH4)2SO3を用いた分画によりモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体（20μg/g（体重））を週２回腹腔内投与し、最後の投与の３日後に臨床パラメータを評価した。【００３９】
結果
１．誘導性のDNase II遺伝子の欠失
この度、以下に示すように、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスが年を経るにつれて多発性関節炎を発症することが明らかとなった。DNase II遺伝子だけを欠失しているマウスが関節炎を発症するかを調べるため、相同組換えによりDNase II遺伝子座位にloxPが導入されたマウスを作製した（図１ａ）。このマウスを、IFN誘導プロモーターであるMx1の支配下にあるCre遺伝子を有するMx1-Cre マウスと交配し、DNase IIflox/- Mx1-CreTマウスを作製した。このマウスにポリ(I:C)を投与してIFNを誘導すると、loxPが導入されたDNase II遺伝子の領域は、2ヶ月以内に完全に消失した（図１ｂ）。そして、脾臓および骨髄において、DNase II mRNAが検出されなくなった（図１ｃ）。このことは、DNase IIflox/-マウスにおいて、ポリ(I:C)投与によりDNase II遺伝子が効率的に不活化されたことを示唆する。これ以降、ポリ(I:C)投与DNase IIflox/-マウスをDNase IIΔ/-マウスと呼ぶ。【００４０】
２．DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスにおける関節炎の発症
成体マウスにおけるDNase II遺伝子の不活化は致死的ではなかった。しかしながら、DNase IIΔ/-マウスは、時間依存的に慢性多発性関節炎を発症した（図２）。DNase IIΔ/-マウスとDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの関節の膨潤は同程度であった（図２ａ）。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスは2-3ヶ月齢で、DNase IIflox/-マウスはポリ(I:C)投与から2-3ヶ月後に、前肢および後肢が膨潤し始めた。膨潤は、はじめに指に、次いで足に、最後に手首および足首に発症した。個々の変異マウスの膨潤のタイムコースはかなり異なっていたが、最終的には全てのマウスが発症した。変異マウスは、膨潤が進行するにつれて次第に握力がなくなり、関節が変形した。【００４１】
疾患の発症に、雄マウスと雌マウスの間で明らかな差は見られなかった（図２ｂ）。これは、ヒト若年性リウマチ性関節炎において明らかな性差がないことと一致する（Moroldo, M. B. et al. Juvenile rheumatoid arthritis affected sibpairs: extent of clinical phenotype concordance. Arthritis Rheum. 50, 1928-1934 (2004) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。【００４２】
関節患部のMRIにより、T2強調イメージにおいて足根骨および指節骨の周囲に高強度のシグナルが観察された（図２ｃ）。これらの高強度領域はまた、脂肪抑制T2強調イメージでも観察された。このことは、これら関節で大規模な炎症が起きていることを示唆する。実際、X線検査により、肋軟骨下の骨の破壊、侵食、および変形が明らかとなった（図２ｄ）。【００４３】
３．DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスにおける関節炎の特徴決定
DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスはいずれも、膨潤関節の組織像においてパンヌス形成を伴う重度の滑膜炎および絨毛増加が見られた（図３ａ）。パンヌスは、関節腔を満たし、軟骨を侵食し、骨を破壊し、また骨髄に浸透することもあった。パンヌスではCD68+マクロファージが優位を占め、それらのうち先端部にはTRAP陽性破骨細胞が存在した。CD4+T細胞およびGr1+好中球の亜滑膜組織への浸潤もまた観察された（図３ａ、およびデータ非提示）。異常な炎症は関節に限定され、皮膚、肝臓、唾液腺、消化管、および血管の明らかな障害はほとんどのマウスにおいて認められなかった（データ非提示）。【００４４】
ヒトリウマチ性関節炎患者の関節では、炎症性サイトカインおよびケモカインが高度に発現していることが知られている（Feldmann, M., Brennan, F. M. ＆ Maini, R. N. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu. Rev. Immunol. 14, 397-440 (1996)；Firestein, G. S., Alvaro-Gracia, J. M. ＆ Maki, R. Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 144, 3347-3353 (1990)；Saxne, T., Palladino, M. A., Jr., Heinegard, D., Talal, N. ＆ Wollheim, F. A. Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum. Arthritis Rheum. 31, 1041-1045 (1988) 、これら文献は引用により本明細書に含まれる）。関節患部由来のRNAのリアルタイムPCRでの分析により、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスにおけるTNFα、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β、およびIFN-γのmRNAレベルは、コントロールマウスより5〜100倍高いことが示された（図３ｂ）。DNase II欠損マウスの関節のIL-18mRNAレベルは、コントロールマウスと同程度か、わずかに高い程度であった（図３ｂ）。しかしながら、IL-18タンパク質のレベルはDNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスの血清において非常に高く（図３ｃ）、このことはIL-18の発現が転写後に調節されていることを示唆する。【００４５】
MMP-3は、ヒトRA患者の滑膜細胞から産生され、細胞外マトリクスの崩壊に関与することが示唆されている（Manicourt, D.H., Fujimoto, N., Obata, K. ＆ Thonar, E.J. Levels of circulating collagenase, stromelysin-1, and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1 in patients with reumatoid arthritis. Relationship to serum levels of antigenic keratan sulfate and systemic parameters of inflammation. Arthritis Rheum. 38, 1031-1039 (1995). 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスの関節におけるMMP-3 mRNAレベルはコントロールマウスより25倍以上高く（図３ｂ）、血清中のタンパク質レベルもまた2〜3倍高かった（図３ｃ）。【００４６】
ヒトRA患者において特異的に観察される抗CCP抗体、およびリウマチ因子もまた、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスの血清において高レベルに検出された（図３ｃ）。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスにおける抗dsDNA抗体は、野生型マウスの約3倍であったが、この値は、全身性エリテマトーデス（SLE）様自己免疫疾患を発症するlprマウス（Cohen, P.L. ＆ Eisenberg, R.A. Lpr and gld: single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Annu. Rev. Immunol. 9, 243-269 (1991). 、本文献は引用により本明細書に含まれる）よりも10倍低かった。【００４７】
これらの結果は、DNase II欠損マウスがヒトリウマチ性関節炎のよいモデルとなることを支持する。【００４８】
４．DNase II遺伝子の欠損による関節炎の発症メカニズム
Ａ．DNase II欠損マウスの病理学的解析
DNase II遺伝子の欠損がいかにして関節炎の発症につながるかを調べるため、さらに変異マウスの組織および血液試料を調べた。大人のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスの骨髄および脾臓において、未分解DNAを有する多くの異常マクロファージが見られた（図４ａ）。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスの他の組織、例えば胸腺にも、同様の異常マクロファージが存在した（図４ａ）。【００４９】
DNAはさらに、DNase II遺伝子欠損マウスの血清にも見られた。4-6週齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの血清には、約10μg/mlのDNAが含まれ、これはマウスが成長するにつれて減少した（図４ｂ）。DNase IIΔ/-マウスの血清にもまた、低いものの有意なレベルのDNAが含まれていた。DNase II遺伝子欠損マウスにおける血清DNAは、アガロースゲル電気泳動において2つのバンドを示した（図４ｂ）。主要なバンドのサイズ (180 bp)は、アポトーシス細胞死において生じるDNAの単位サイズに相当した。これは、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスの血清中のDNAがアポトーシス細胞を貪食したマクロファージから漏出したものであることを示唆する。【００５０】
DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスには、弱い貧血（ヘマトクリット: 40-45）および軽度の成長遅延が見られた（データ非提示）。これらマウスは１ヶ月齢から脾腫を発症し、それはマウスが成長するにつれて顕著になった。7.5-16.5ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの脾臓の重量は、コントロールマウスの約5倍以上であった（図４ｃ）。この脾腫は、赤脾髄の拡大によるものであった（データ非提示）。実際、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスの脾臓におけるTer119+赤血球細胞はコントロールマウスの脾臓の5倍であり、全脾細胞の約70%をしめた。赤血球の産生は本来、骨髄で行われる。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスおよびDNase IIΔ/-マウスでの脾臓、特に赤脾髄の拡大は、造血の能力が骨髄では不足し、脾臓も動員されていることを示している。【００５１】
リウマチ性関節炎の病因にはサイトカインが影響しうることから（Feldmann, M., Brennan, F. M. ＆ Maini, R. N. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu. Rev. Immunol. 14, 397-440 (1996) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）、次に前記モデルにおけるサイトカインの関与を調べた。DNase II-/-IFN-IR-/-マウスのTNFαの血清濃度は、4-6週齢（明らかな関節の異常が見られるよりも前）において、コントロールマウス (20 pg/ml未満)よりも高かった(約100 pg/ml)（図４ｄ）。同様の高濃度のTNFαが、DNase IIΔ/-マウスにおいても観察された。これに対して、他のサイトカイン、例えばIL-6、IL-1β、IFNγ、GM-CSFおよびIL-4は、DNase II変異マウスの血清には検出できなかった。【００５２】
本発明者らは以前、DNase II-/-マウス胚の肝臓がIFNだけでなくTNFαも構成的に発現していることを報告している（Okabe, Y., Kawane, K., Akira, S., Taniguchi, T. ＆ Nagata, S. Toll-like receptor-independent gene induction program activated by mammalian DNA escaped from apoptotic DNA degradation. J. Exp. Med. 202, 1333-1339 (2005) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。リアルタイムPCRによる分析により、1ヶ月齢のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの骨髄におけるTNFαmRNAレベルは同一齢のコントロールマウスの2倍であることが示された。これらマウスにおけるTNFαmRNAレベルは、まだ最終的な赤血球形成が活発である2-2.5ヶ月齢においてさらに増加した。同様の高レベルのTNFαmRNAは、DNase IIΔ/-マウスの骨髄においても見られた（図４ｅ）。【００５３】
骨髄の免疫組織化学的分析により（図４ｆ）、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスにおけるCD68+マクロファージの数はコントロールマウスにおける数とそれほど変わらないことがわかった。しかしながら、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスのマクロファージには強いCD68の発現が見られ、未分解DNAを有するマクロファージが活性化されていることが示唆された（Ramprasad, M. P., Terpstra, V., Kondratenko, N., Quehenberger, O. ＆ Steinberg, D. Cell surface expression of mouse macrosialin and human CD68 and their role as macrophage receptors for oxidized low density lipoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14833-14838 (1996) 、本文献は引用により本明細書に含まれる）。TNFαは、これらの未分解DNAを有するCD68+マクロファージにおいて産生されていた（図４ｇ）。【００５４】
Ｂ．抗TNF-α抗体によるリウマチ性関節炎の予防および改善
関節炎誘導中のTNF-α阻害効果について調べるため、4週齢DNase II-/-IFN-IR-/-マウスまたはDNase II+/-IFN-IR-/-同腹子に抗TNF-α中和モノクローナル抗体を週２回投与した。PBSを投与されたDNase II-/-IFN-IR-/-マウスは、8〜14週齢で関節炎を発症しはじめた（図５ａ）。これに伴い、血清MMP-3レベルが顕著に上昇した（図５ｂ）。一方、抗TNF-α mAbを投与されたマウスは、この週齢において関節炎を発症せず、その血清MMP-3レベルはDNase II+/-IFN-IR-/-コントロールマウスと同程度であるか、わずかに高い程度であった。関節におけるサイトカインmRNAの発現により、抗TNF-α mAbの保護作用が確認された。すなわち、抗TNF-α mAbは、DNase II-/-IFN-IR-/-マウスの関節におけるTNF-α、IL-1β、およびIL-6 mRNAの発現をほぼ完全に抑制した（図５ｃ）。抗TNF-α mAbは、関節におけるMMP-3 mRNAについても同様の作用を示した。【００５５】
次に、関節炎を発症した後のDNase II-/-IFN-IR-/-マウスにおける抗TNF-α mAbの治療効果について検討した。関節炎の臨床スコアが2.5〜6であるDNase II-/-IFN-IR-/-マウス4匹に抗TNF-α mAbを週2回投与し、血清MMP-3レベル（ヒトにおいて抗TNF-α療法により減少することが知られている（Brennan, F.M. et al. Reduction of serum matrix metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 3 in rheumatoid arthritis patients following anti-tumour necrosis factor-alpha(cA2) therapy. Br. J. Rheumatol. 36, 643-650 (1997)）、本文献は引用により本明細書に含まれる）をモニターした。図５ｄに示すように、投与3週間後、血清MMP-3レベルは投与前のレベルの約1/3に減少した。2匹のマウスにおいて、関節の臨床スコアの顕著な減少が見られた。【００５６】
続いて、すべてのマウスから肢関節を切除し、mRNAレベルについて調べた。図５ｅに示すように、PBSを投与されたDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの関節におけるTNF-α、IL-6、IL-1β、およびMMP-3 mRNAのレベルはDNase II+/-IFN-IR-/-コントロールマウスの5〜30倍であったが、抗TNF-α mAbを投与されたDNase II-/-IFN-IR-/-マウスの関節ではこれらmRNAは有意に低下していた。【００５７】
これらの結果は、未分解DNAを有するマクロファージにより産生されるTNF-αがリウマチ性関節炎発症の引き金となっていることを示唆する。【００５８】
結論
本研究は、DNase IIおよびIFNタイプI受容体遺伝子を欠損するマウスおよびコンディショナルに欠損可能なDNase II遺伝子を有するマウスが、リウマチ性関節炎のよいモデルとなることを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月5日(2007.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮａｓｅ  ＩＩおよびＩＦＮタイプＩ受容体遺伝子を欠損しており、時間依存的にリウマチ性関節炎を発症する、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物。
【請求項２】
コンディショナルに欠損可能なＤＮａｓｅ  ＩＩ遺伝子を有しており、ＤＮａｓｅ  ＩＩの欠損誘導後にリウマチ性関節炎を発症する、リウマチ性関節炎モデル非ヒト動物。
【請求項３】
齧歯類である、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
マウスである、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
ＤＮａｓｅ  ＩＩおよびＩＦＮタイプＩ受容体遺伝子を欠損させることを含む、請求項１記載のリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を作製する方法。
【請求項６】
ＤＮａｓｅ  ＩＩ遺伝子をコンディショナルに欠損可能とすることを含む、請求項２記載のリウマチ性関節炎モデル非ヒト動物を作製する方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の非ヒト動物に候補物質を投与することを含む、リウマチ性関節炎の処置または予防作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
候補物質がＴＮＦ−αの作用を阻害する物質から選択される、請求項７記載の方法。
【国際調査報告】
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