(57)【要約】  少量の核内受容体タンパク質含有試料を用いた場合でも、効率的でかつ正確に核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析が可能な方法を提供する。  核内受容体タンパク質含有試料を、核内受容体タンパク質の一種に対して特異的でありかつ高親和性のモノクローナル抗体を結合させた支持体を用いた免疫沈降反応に付し、免疫沈降反応により分離されたタンパク質複合体を解析することを特徴とする、核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体タンパク質含有試料を、核内受容体タンパク質の一種に対して特異的でありかつ高親和性のモノクローナル抗体を結合させた支持体を用いた免疫沈降反応に付し、免疫沈降反応により分離されたタンパク質複合体を解析することを特徴とする、核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析方法。
【請求項２】
支持体が、磁性粒子である請求項１記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項３】
磁性粒子が、非特異的タンパク質吸着の少ない磁性粒子である請求項２記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項４】
磁性粒子の表面に親水性ポリマーを有する請求項２又は３記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項５】
親水性ポリマーが多糖類である請求項４記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ＫＤ値＝３×１０−８Ｍ以下である請求項１〜５のいずれか１項記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項７】
分離された核内受容体タンパク質複合体の解析手段が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるものである請求項１〜６のいずれか１項記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項８】
核内受容体タンパク質が、ＧＲ、ＭＲ、ＰＲ、ＡＲ、ＥＲα、ＥＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＥＡＲ２、ＴＲ２、ＴＲ４、ＧＣＮＦ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、ＴＲα、ＴＲβ、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγ、ＶＤＲ、ＬＸＲα、ＬＸＲβ、ＦＸＲ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＳＦ−１、ＬＲＨ−１、ＥＲＲα、ＥＲＲβ、ＥＲＲγ、ＮＧＦＩ−Ｂα、ＮＧＦＩ−Ｂβ、ＮＧＦＩ−Ｂγ、ＲＯＲα、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ、ＴＬＸ、ＰＮＲ、ＤＡＸ１及びＳＨＰである請求項１〜７のいずれか１項記載のプロテオミクス解析方法。
【請求項９】
核内受容体蛋白質が、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ、ＰＰＡＲγ、ＬＸＲα、ＥＲα及びＴＬＸである請求項１〜７のいずれか１項記載のプロテオミクス解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年に国際的なヒトゲノムプロジェクトが開始され、２００１年に、国際共同研究機関及びセレラ社によりヒトゲノムの概要が発表された。その結果、遺伝子解析による医学的、あるいは生物学的な研究が促進され、遺伝子による疾患の診断法や治療法が開発されるに至った。しかし、昨今の研究において、遺伝子解析のみでは解明できない生命現象も多いことが確認されている。その理由の一つが、タンパク質複合体の存在である。タンパク質は、複数のタンパク質が結合し、機能を示す。従って、タンパク質複合体が原因となる疾患などのメカニズムは、一つの遺伝子発現を解析しただけで解明することは不可能である。【０００３】
このような複合体を形成するタンパク質の例として、核内受容体がある。核内受容体は、ヒトゲノム解析の結果４８種存在することがわかっている。リガンドが明らかにされた受容体の情報から、癌、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、免疫機能障害等の疾患に関連があることが示唆され、一方で、リガンドがいまだ不明な受容体も多く存在する。従って、核内受容体は生活習慣病をはじめとした多くの疾患に対する治療薬の分子標的として期待されている。【０００４】
例えば、核内受容体であるＨＮＦ４には、α及びγの２種類が存在する。ＨＮＦ４αはグルコースや脂質の代謝調節、内胚葉の発生などに関与する。また、ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることも知られている。この核内受容体は、選択的スプライシングに加え、Ｐ１及びＰ２プロモーターに由来する多数のアイソフォームが存在する。Ｐ１プロモーター由来のＨＮＦ４αが肝臓、小腸、大腸、及び腎近位尿細管で発現し、Ｐ２プロモーター由来のＨＮＦ４αは、胃及び膵臓で発現していることが明らかにされている（非特許文献１）。一方、ＨＮＦ４γは、ＨＮＦ４−Ｌｉｋｅ受容体の一つであり、その機能は未知である。しかし、その構造がＨＮＦ４αと関連があり、さらにＨＮＦ４αと共に膵臓のランゲルハンス島で発現する。ＨＮＦ４γの発現は、ヒトの膵臓、腎臓、精巣、及び大腸で報告されている。ＨＮＦ４γのＮ末端のドメインは、ＨＮＦ４αのものに比べて比較的長く、ＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインの付近にある。ＨＮＦ４γのＣ末端のＦドメインは、ＨＮＦ４αと３７％の相同性を持つ。【０００５】
また、ＬＸＲαも核内受容体の１つであり、レチノイン酸を介して組織特異的な標的遺伝子発現を調整する。転写活性のため、この受容体は「ホルモン応答部位」とよばれる、標的遺伝子を発現させる位置を含んだ構造を持つ。ＬＸＲαによる遺伝子活性は、９−シス−レチノイン酸を含んだレチノイドによってのみ誘導される。ＬＸＲαの作用は、脂質代謝と輸送である（非特許文献２）。【０００６】
ＰＰＡＲも転写因子として作用する核内ホルモン受容体のサブファミリーの一つであり、ＲＸＲとヘテロダイマーを形成して様々な遺伝子の転写を調整する。この受容体には、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγの３種類のサブタイプが知られている。ＰＰＡＲγは、脂肪細胞の分化に関与すると言われている。ＰＰＡＲγとＲＸＲαのリガンド結合ドメインが、ＲＸＲαのリガンドである９−シス−レチノイン酸、ＰＰＡＲγのアゴニストであるＧＩ２６２５７０、及びコアクチベーターと複合体を形成するという事実が結晶構造を用いて明らかにされている（非特許文献３）。この結晶構造により、ＰＰＡＲγとＲＸＲαのヘテロダイマーの活性化には、９−シス−レチノイン酸が必要であることが理解できる。【０００７】
Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ）とは、リガンドにより活性化する転写因子であり、ホルモンやＤＮＡとの結合に重要ないくつかのドメインを有する。Ｗａｌｔｅｒらがクローニングし（非特許文献４）、Ｇｒｅｅｎｅらがヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞を使用して、ｃＤＮＡ配列を解明した（非特許文献５）。ヒトＥＲのアイソフォームには、ＥＲαとＥＲβの２種類があり、それぞれ異なる組織や細胞で発現する。ＥＲのアイソフォームは、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇにより生じ、いくつかの組織で癌化、又はエストロゲンに対する応答の調整に関与する。【０００８】
ＴＬＸも同様に核内受容体の１つであり、脊椎動物の前脳で発現するオーファン受容体として発見され、脳で高い発現量が確認されている。ＴＬＸは、中枢神経系における神経の発生に関与する。また、網膜形成における基礎的なプログラムにも関与し、網膜の分化の際には、神経細胞の数と、網膜形成の終期におけるグリア細胞の分化をコントロールする（非特許文献６）。【０００９】
これらの核内受容体タンパク質は、核内受容体タンパク質同士でのホモあるいは、ヘテロ複合体を形成するばかりでなく、さらに、コファクターとも複合体を形成する。核内受容体のリガンドに依存した転写制御は、ｐ１６０／ＣＢＰ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＨＡＴ）とＤＲＩＰ／ＴＲＡＰ／ＳＭＣＣ複合体の、２つのシグナル伝達経路が存在し、両者で制御されていることが知られている。また、４８種の核内受容体のうち、ＥＲαの機能には、巨大なコアクチベーターの複合体が必要であること、さらに、ＴＦＴＣ（ＴＢＰ−ｆｒｅｅ  ＴＡＦ（ＩＩ）−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）タイプのＨＡＴ複合体が、核内受容体の機能に必要なコアクチベーターの複合体であることなど（非特許文献７）が報告されているが、多くの核内受容体に関し、各種の機能を発揮する際にどのような複合体を形成しているのかについては未だ充分解析されていない。
従って、核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析は、核内受容体が関与している疾病のメカニズムの解明や治療薬の開発のために極めて重要である。【００１０】
タンパク質複合体を構成する個々のタンパク質の同定の手段としては、２次元電気泳動法やプロテインチップ法によりタンパク質を分離し、次いで質量分析により解析する方法が知られている。しかし、２次元電気泳動法は試料となるタンパク質が少ない場合に解析が困難であり、また、電気泳動であるため解析に時間がかかるという欠点があった。プロテインチップ法は、多数の種類のタンパク質を同時に同定できるというメリットがあるが、コストが高く、精度や再現性が悪いという欠点があった。【００１１】
核内受容体のプロテオミクスに限定した場合、解析対象の核内受容体複合体が微量であるため、解析用試料の調達が困難を極めていた。そのため、現状では核内受容体遺伝子を組み込んだ細胞を培養することにより、核内受容体複合体を調製してプロテオミクス解析を行ってきたが、本来の天然における核内受容体複合体の解析であるか否か疑問視されている。
【非特許文献１】Ｎｕｃｌ  Ｒｅｃｅｐｔ．，１（１）：５，２００３．
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１１８９６−１１９０１（２００２）．
【非特許文献３】Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ５：５４５−５５５（２０００）．
【非特許文献４】Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２２８６−２２９１（２００５）．
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１１５０−１１５４（１９８６）．
【非特許文献６】Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４（３７）：８１２４−８１３４（２００４）．
【非特許文献７】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．９（３）：５５３−５６２（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、天然型の少量の核内受容体タンパク質含有試料を用いた場合でも、効率的でかつ正確に核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析が可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本発明者は、種々検討した結果、核内受容体タンパク質の一種に対して特異的で高親和性のモノクローナル抗体を結合させた支持体、特に磁性粒子を用いて免疫沈降反応を行えば、全く意外にも、目的とする核内受容体タンパク質を有する複合体が効率良く分離できること、さらには分離されたタンパク質複合体をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析すれば、微量の試料でも精度が高く、効率的にプロテオミクス解析が可能になることを見出した。さらに、その結果が、従来法である遺伝子組み換え体である核内受容体発現細胞を用いたプロテオミクス解析とは異なることも見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、核内受容体タンパク質含有試料を、核内受容体タンパク質の一種に対して特異的でありかつ高親和性のモノクローナル抗体を結合させた支持体を用いた免疫沈降反応に付し、免疫沈降反応により分離されたタンパク質複合体を解析することを特徴とする、核内受容体タンパク質複合体のプロテオミクス解析方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、非特異的タンパク質吸着が少なく、かつモノクローナル抗体の親和性が高いことから、簡便な手段で核内受容体タンパク質含有試料から、目的とする核内受容体タンパク質を含む複合体を高純度で分離できる。
また、解析手段として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いることにより、免疫沈降法によって得られたタンパク質と複合体を形成する別のタンパク質を同定することが可能となる。例えば、核内受容体の場合、転写因子として機能し、複合体形成が必須であることが相次いで報告されている。このような複合体を形成するタンパク質を同定することにより、複合体の新たな機能を推定することも可能である。核内受容体を中心とした複合体タンパク質の研究において、本発明方法は、天然の少量の試料で解析可能な手法であることから有用な実験手法となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】高親和性の抗ＨＮＦ４αモノクローナル抗体を用いて、ＨＮＦ４αを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図２】高親和性の抗ＰＰＡＲγモノクローナル抗体を用いて、ＰＰＡＲγを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図３】高親和性の抗ＬＸＲαモノクローナル抗体を用いて、ＬＸＲαを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図４】高親和性の抗ＴＬＸモノクローナル抗体を用いて、ＴＬＸを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図５】高親和性の抗ＨＮＦ４γモノクローナル抗体を用いて、ＨＮＦ４γを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図６】高親和性の抗ＥＲαモノクローナル抗体を用いて、ＥＲαを特異的に免疫沈降することができたことを示す図である。
【図７】高親和性抗ＨＮＦ４α抗体結合支持体を用いた免疫沈降において、非特異的物質の吸着量が少ない支持体の方がプロテオミクス解析に望まれることを示す図である。
【図８】高親和性抗ＨＮＦ４α抗体結合磁性粒子を用いたＨｅｐＧ２細胞抽出液に対する免疫沈降において、特異的なバンドが検出できたことを示す図である。
【図９】プルダウンアッセイにより、ＨＮＦ４αとプロテオミクス解析で検出されたＨＮＦ４γが相互作用することを確認した図である。
【図１０】免疫沈降法により、ＨＮＦ４αとγが相互作用することを確認した図である。
【図１１】高親和性ＨＮＦ４γ抗体による免疫沈降法により、ＨＮＦ４γが検出されたことを示す図である。
【図１２】高親和性ＨＮＦ４γ抗体免疫沈降法により、ＨＮＦ４αが検出されたことを示す図である。
【図１３】磁性粒子（２）より、磁性粒子（３）が同程度の非特異吸着量で回収量が向上しており、磁性粒子（３）がよりプロテオミクス解析に適当である可能性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の解析対象である核内受容体には４８種類あるが、これらは以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に記載される遺伝子配列を含み、かつその遺伝子配列に基づく核タンパク質である。
ＧＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ３，ｇｒｏｕｐ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＮＲ３Ｃ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ５，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１７６、ＭＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ３，ｇｒｏｕｐ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ３Ｃ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９０１、ＰＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＧＲ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９２６、ＡＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｆｅｍｉｎｉｚａｔｉｏｎ；ｓｐｉｎａｌ  ａｎｄ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＲ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００００４４、ＥＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＥＳＲ１），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１２５、ＥＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＥＲ  ｂｅｔａ）（ＥＳＲ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１４３７、ＲＸＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＲＸＲＡ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００２９５７、ＲＸＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ（ＲＸＲＢ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２１９７６、ＲＸＲγ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｇａｍｍａ（ＲＸＲＧ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００６９１７、ＨＮＦ４α（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４，ａｌｐｈａ（ＨＮＦ４Ａ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００４５７、ＨＮＦ４γ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４，ｇａｍｍａ（ＨＮＦ４Ｇ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４１３３、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ（Ｃｈｉｃｋｅｎ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩ，ＥＡＲ３，ＣＯＵＰ−ＴＦＡ；ＮＲ２Ｆ１））：ＮＭ＿００５６５４，ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ（Ｃｈｉｃｋｅｎ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ）：ＮＭ＿００５６５４、ＥＡＲ２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ２，ｇｒｏｕｐ  Ｆ，ｍｅｍｂｅｒ  ６，ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ：５２２８０２２），ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ）：ＢＣ０６３０１８、ＴＲ２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ２，ｇｒｏｕｐ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ２Ｃ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００３２９７、ＴＲ４（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉ���ｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ２，ｇｒｏｕｐ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ２Ｃ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００３２９８、ＧＣＮＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ６，ｇｒｏｕｐ  Ａ，  ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ６Ａ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０３３３３４、ＲＥＶ−ＥＲＢα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ１Ｄ１），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２１７２４、ＲＥＶ−ＥＲＢβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ１Ｄ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５１２６、ＴＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒａｌ（ｖ−ｅｒｂ−ａ）ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ，ａｖｉａｎ）（ＴＨＲＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１９９３３４、ＴＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒａｌ（ｖ−ｅｒｂ−ａ）ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２，ａｖｉａｎ）（ＴＨＲＢ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００４６１、ＲＡＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＲＡＲＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９６４、ＲＡＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ（ＲＡＲＢ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９６５、ＲＡＲγ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｇａｍｍａ（ＲＡＲＧ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９６６、ＰＰＡＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ５，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５０３６、ＰＰＡＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｄｅｌｔａ（ＰＰＡＲＤ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００６２３８、ＰＰＡＲγ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲＧ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ４，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５０３７、ＶＤＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ（１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００３７６、ＬＸＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＮＲ１Ｈ３），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５６９３、ＬＸＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ１Ｈ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７１２１、ＦＸＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＮＲ１Ｈ４），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５１２３、ＰＸＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ１Ｉ２），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２２００２、ＣＡＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，ｇｒｏｕｐ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＮＲ１Ｉ３），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５１２２、ＳＦ−１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ５，ｇｒｏｕｐ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ５Ａ１），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４９５９、ＬＲＨ−１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ５，ｇｒｏｕｐ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ５Ａ２），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００３８２２、ＥＲＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＥＳＲＲＡ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４４５１、ＥＲＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＥＳＲＲＢ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４４５２、ＥＲＲγ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（ＥＳＲＲＧ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１４３８、ＮＧＦＩ−Ｂα：ＮＭ＿００２１３５，ＮＧＦＩ−Ｂβ：ＮＭ＿００６１８６，ＮＧＦＩ−Ｂγ：ＮＭ＿００６９８１、ＲＯＲα（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ（ＲＯＲＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１３４２６１、ＲＯＲβ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ（ＲＯＲＢ），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００６９１４、ＲＯＲγ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃ（ＲＯＲＣ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００５０６０、ＴＬＸ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ２，ｇｒｏｕｐ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ２Ｅ１），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００３２６９、ＰＮＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ２，ｇｒｏｕｐ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＮＲ２Ｅ３），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０１６３４６、ＤＡＸ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ０，ｇｒｏｕｐ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＮＲ０Ｂ１），ｍＲＮＡ）��ＮＭ＿０００４７５、ＳＨＰ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ０，ｇｒｏｕｐ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＮＲ０Ｂ２），ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２１９６９。【００１８】
これらのうち、本発明方法は、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ、ＰＰＡＲγ、ＬＸＲα、ＥＲα、及びＴＬＸの解析に、特に有用である。【００１９】
タンパク質複合体とは、複数のタンパク質が結合し、機能を示すタンパク質のことである。例えばクロマチンの場合、ヒストンタンパク質の八量体にＤＮＡが１．７５回転巻きつき、ヌクレオソームと呼ばれる構造を作る。この構造が多数形成され、リンカーヒストンによって凝縮され、クロマチンとなる。クロマチン構造の形成は、ＤＮＡの複写や転写、あるいは修復といった様々な遺伝子の制御に関与し、最近では、ヒストンタンパク質の複合体が、これらの機能に深く関与することが報告されている（Ｃｅｌｌ  １１６：５１−６１（２００４））。本発明の解析対象である核内受容体タンパク質も複合体を形成していることが知られているが、前記４８種のタンパク質が、どのようなタンパク質とどのような形で複合体を形成しているのかについては充分解明されていない。【００２０】
本発明においては、核内受容体タンパク質の一種に対して特異的であり、かつ高親和性のモノクローナル抗体を結合させた支持体を用いる。【００２１】
１．支持体
本発明に用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロース、セファロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、粒子などの形状で用いることが可能である。抗核内受容体モノクローナル抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができるが、磁性粒子を用いることが好ましい。【００２２】
磁性粒子は、非特異的タンパク質の吸着が少ないこと及び抗体を結合させるに必要な官能基を有することが望まれる。非特異的タンパク質の吸着の少ない粒子を得るには磁性粒子の表面を親水性のポリマーで被覆することにより低減可能である。【００２３】
本発明の磁性粒子において、特に制限はないが、好ましくは磁性粒子の表面にＦｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成された母粒子に重合により該磁性体層上にポリマー層を形成した磁性粒子を用いることができる。磁性粒子の表面に親水性ポリマーを導入する方法として、（１）磁性粒子の存在下で、親水性モノマー又は親水性モノマーとその他の共重合性モノマーを液体中で重合させる方法、（２）磁性体表面の官能基に親水性ポリマーを結合させる方法等が挙げられる。【００２４】
（１）の方法としては、磁性粒子の存在下、主原料としての親水性モノマー、必要に応じて官能基を有する共重合性モノマーや他の共重合性モノマー、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などを添加し、液体中で重合させる。親水性モノマーとしては、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリオキシアルキレン（Ｃ２−Ｃ４）基含有（メタ）アクリレート、エポキシ基含有（メタ）アクリレート、ホスホリルコリン類似基含有単量体などをあげることができる。官能基を有する共重合性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無水マレイン酸、クロトン酸などのモノ又はジカルボン酸化合物をあげることができる。他の共重合性モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、などのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを挙げることができる。
（２）の方法としては、磁性体粒子表面に導入されたカルボキシル基又はアミノ基などに対し、アミノ基又はカルボキシル基を持つ親水性ポリマーをカルボジイミドなどの公知の方法により結合させる方法が挙げられる。【００２５】
本発明の磁性粒子は、非特異的なタンパク質の吸着が完全に抑制されることが理想であるが、可能な限り非特異的吸着を減少させるには、磁性体層に親水性ポリマーを結合させる方法が挙げられる。具体的には、ヒドロキシエチルメタクリレート／メタクリル酸共重合体、グリセリンモノメタクリレート／メタクリル酸共重合体などの合成ポリマー、デンプン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、グリコーゲン、シクロデキストリン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、アルギン酸、イヌリン、グルコマンナン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸などの多糖類などを結合させる方法を挙げることができる。【００２６】
２．モノクローナル抗体
本発明で用いられるモノクローナル抗体は核内受容体タンパク質の一種に特異的に結合し、かつ高い親和性を有するモノクローナル抗体であることが望ましい。さらに、好ましくは免疫沈降可能なモノクローナル抗体であることが望ましい。結合部位ならびにその由来及び形状は問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知のモノクローナル抗体を用いることができる。【００２７】
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、公知の手段を用いて得ることができる。本発明で使用される抗核内受容体タンパク質モノクローナル抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。【００２８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、核内受容体又はそれらの断片ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００２９】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用される核内受容体タンパク質は、その遺伝子を発現することによっても得ることができる。すなわち、核内受容体タンパク質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から目的の核内受容体タンパク質を公知の方法で精製する。
次に、この精製核内受容体タンパク質を感作抗原として用いるが、核内受容体タンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドは核内受容体タンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、核内受容体タンパク質の一部を発現ベクターに組込んで得ることもできる。部分ペプチドとして用いる核内受容体タンパク質の部分及び大きさは限られない。【００３０】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、あるいはウサギ、サル、鶏等が使用される。【００３１】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００３２】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００３３】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。【００３４】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。【００３５】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を使用することもできる。【００３６】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００３７】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞の所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１，０００〜６，０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００３８】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。【００３９】
目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。【００４０】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００４１】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００４２】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。【００４３】
３．高親和性モノクローナル抗体の選択
抗体の親和性を測定する方法として、公知の方法であるスキャッチャードプロット、ＢＩＡｃｏｒｅなどが知られているが、より好ましくはＢＩＡｃｏｒｅを使用した方法が望ましい。具体的には、抗マウスポリクローナル抗体を結合させたＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップにモノクローナル抗体を結合させ、抗原を含む緩衝液を流しながら抗原抗体結合反応のシグナル、及び抗原を含まない緩衝液を流しながら抗原抗体解離反応のシグナルをそれぞれ測定することにより親和性を計算する。本発明に用いられるモノクローナル抗体の親和性は、ＫＤ値＝３×１０−８Ｍ以下、さらに８×１０−９Ｍ以下、特に３×１０−９Ｍ以下であるのが好ましい。【００４４】
４．プロテオミクス解析
核内受容体タンパク質含有試料とは、核内受容体タンパク質が含まれる可能性のある生体から分離した試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿、又は、生物の体から採取された細胞などから得られる試料である。【００４５】
本発明においては、核内受容体タンパク質含有試料を前記モノクローナル抗体結合支持体と反応させ、免疫沈降反応を行う。具体的には、抗核内受容体タンパク質モノクローナル抗体を支持体に固定し、ここに試料を加え、インキュベートを行い抗核内受容体タンパク質モノクローナル抗体と核内受容体タンパク質を結合させ、免疫沈降した抗原抗体反応物を固液分離する。固液分離手段は、支持体として磁性粒子を用いた場合には磁石により行えばよい。すなわち、磁石により反応容器内に免疫反応物を保持したまま洗浄すれば、固液分離が容易に行われる。【００４６】
分離された核内受容体タンパク質複合体の解析方法としてＮ末端アミノ酸配列分析、Ｅｄｍａｎ法による内部配列決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるＰＭＦ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）分析、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどが知られているが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用した解析法が好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析（ＭＳ）を組み合わせた方法であり、タンパク質試料のプロテアーゼ消化物を分離し、各ペプチドの内部断片の分子量を測定することで、タンパク質同定に必要なアミノ酸配列の情報を得ることができる。また、この方法は、タンパク質の混合物質で解析が可能であること、データの質が良くタンパク質同定の確度が高いこと、オンライン化による作業の効率化、などといった利点が得られる。具体的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定方法例は以下の通りである。電気泳動を行わずサンプルをそのままトリプシン等のタンパク質消化酵素で消化するか、あるいはサンプルを電気泳動後、タンパク質染色したゲルからバンドを切り出し、タンパク質を抽出してトリプシン等のタンパク質消化酵素で消化する。次いで、消化サンプルを逆相カラム等のＨＰＬＣで分画後精密ＭＳ／ＭＳで測定し、データベースサーチによりタンパク質を同定する。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４８】
実施例１  リコンビナント核内受容体タンパク質のクローニング
（１）ＨＮＦ４α
ＨＮＦ４αのｍＲＮＡはＣａｃｏ−２細胞からＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏケミカル）を用いて抽出した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、クローニングした。ｃＤＮＡを合成するためには、ｍＲＮＡにランダムヘキサマーをアニーリングさせ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行った。次いで、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを行い、全長ｃＤＮＡのクローニングを行った。ＰＣＲに用いたプライマーはフォワードプライマーに配列番号１とリバースプライマーに配列番号２に示されるプライマーを用いた。ＰＣＲ産物はＴＡベクター（プロメガ）にサブクローニングして、ｃＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉで切断した断片をｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）に挿入した。作製した組換え体については、ダイターミネーター法（ＡＢＩ）により遺伝子の配列を確認した。【００４９】
（２）ＥＲα
ＥＲαのｃＤＮＡクローニングについては、ＨＮＦ４αと同様の方法を用いた。ＭＣＦ−７より抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを調製し、フォワードプライマーに配列番号９９とリバースプライマーに配列番号１００を用いてＰＣＲを行い、全長ｃＤＮＡをクローニングした。全長ｃＤＮＡをＴＡベクターにサブクローニングし、ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ―ＢａｍＨＩにより切り出し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。作製した組換え体については、ダイターミネーター法（ＡＢＩ）により遺伝子の配列を確認した。【００５０】
（３）ＴＬＸ
ＴＬＸについて、ＨＮＦ４αと同様の方法を応用しフォワードプライマーに配列番号２５とリバースプライマーに配列番号２６を用いＨｅｐＧ２細胞をライブラリーとしクローニングした。【００５１】
実施例２  リコンビナント完全長核内受容体タンパク質溶液の調製
（１）ＨＮＦ４α
ＣＨＯ細胞におけるリコンビナント完全長ＨＮＦ４αタンパク質の調製は、以下の手順で行った。１０ｃｍ  ｄｉｓｈに０．８ｘ１０６個のＣＨＯ細胞を撒き込み、翌日、ＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ（ｃａｔ：１８１４４４３））を用いて、８μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。４８時間後、細胞をセルスクレーパーで剥がして回収し、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ）で細胞を溶解した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ／Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ｃａｔ：５００−０００６）を用いて２．５ｍｇ／ｍＬの濃度にタンパク量を調製し、５ｘＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えて１００℃、１０分間加熱し、ライセートを得、核内受容体完全長タンパク質溶液とした。【００５２】
（２）ＥＲα
リコンビナント完全長ＥＲαタンパク質の調製は、リコンビナント完全長ＨＮＦ４αタンパク質の調製に準じて実施した。【００５３】
（３）ＴＬＸ
ＴＬＸについても同様の操作にてリコンビナント完全長ＴＬＸタンパク質を得た。【００５４】
実施例３  核内受容体タンパク質断片ペプチド発現ウイルスの取得
ＨＮＦ４αのアミノ酸配列３８０〜４４８番目までのペプチドはＡｕｔｏｇｒａｐｈｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のｇｐ６４融合タンパク質として作製した。ＨＮＦ４αのアミノ酸配列３８０番目〜４４８番目の部分長ｃＤＮＡについては、フォワードプライマーとして、配列番号３、リバースプライマーとして配列番号４を用い、全長ＨＮＦ４αｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより得た。ｇｐ６４遺伝子の融合タンパク質となるように組換え体遺伝子の作製を行った。【００５５】
作製した組換え体遺伝子をバキュロウイルスのＤＮＡに挿入することで、組換え体遺伝子の発現を行った。すなわち、トランスファーベクターとバキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ）（インビトロジェン）をＳｆ９細胞に挿入することにより組換体ウイルスを作製した。次いで、Ｓｆ９細胞の培養にはＧｒａｃｅ’Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉａ、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を用い、組換え後７２から１２０時間２７℃で培養し、培養上清中に組換えウイルスを産生し、プラークアッセイ法によりウイルスの精製を行った。プラークアッセイ法は次のように実施した。１０％ＦＢＳの培地に１００ｍｍディッシュに５×１０６の細胞を培養し、１０倍希釈のウイルス液系列を作製したものを感染させ、一時間後に培地を取り除き、寒天入り培地をのせた。２７℃で６日間培養し、ニュートラルレッドで染色を３時間行った後、パスツールピペットでプラークを採り、１ｍＬの培地に入れて攪拌しウイルスを溶出した。この操作を２度行うことにより、ウイルスの精製をおこなった。精製ウイルスを２×１０６個のＳｆ９細胞に感染させ、１０日間２７℃で培養を行った。さらに、５００ｍＬの２×１０６個Ｓｆ９細胞／ｍＬサスペンジョンカルチャーに、ウイルス液の上記５ｍＬを懸濁した。１０日間培養後、遠心操作１，０００×ｇ、２０分を行い、上清のウイルス液を得た。タイターは上記プラークアッセイ法で測定し、ＭＯＩＩを５になるように、ウイルス液を５００ｍＬの２×１０６個Ｓｆ９細胞／ｍＬサスペンジョンカルチャーに感染させた。続いて、ｇｐ６４融合タンパク質として発現させるために、培養３日後に、４５，０００×ｇで３０分の遠心操作を行い、沈澱画分にあるウイルスを得た後、ＰＢＳで懸濁し、精製バキュロウイルス発現物を得た。同様の方法を応用し、残り４７種類の核内受容体のうち下記４３種類の核内受容体蛋白質につき、該当するｃＤＮＡあるいは該当する核内受容体発現細胞より調製したｃＤＮＡライブラリーを用いて、表１及び表２に示す番号のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて下記の部分ペプチドのアミノ酸配列に該当するｃＤＮＡの増幅を行って、ｇｐ６４融合蛋白質として発現させた精製バキュロウイルスを得た。【００５６】
すなわち、ＴＲβ（アミノ酸配列２〜１００番）、ＰＰＡＲα（アミノ酸配列４〜９６番）、ＰＰＡＲγ（アミノ酸配列３〜１０８番）、ＲＯＲα（アミノ酸配列１３６〜２３６番）、ＬＸＲα（アミノ酸配列２〜９７番）、ＶＤＲ（アミノ酸配列９１〜２１０番）、ＴＬＸ（アミノ酸配列８１〜１８０番）、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ（アミノ酸配列６〜８１番）、ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ（アミノ酸配列４３〜６４番）、ＥＲＲα（アミノ酸配列９８〜１７１番）、ＥＲＲβ（アミノ酸配列４〜１００番）、ＥＲＲγ（アミノ酸配列２〜１００番）、ＥＲβ（アミノ酸配列２〜８８番）、ＰＸＲ（アミノ酸配列１６１〜２８０番）、ＬＲＨ−１（アミノ酸配列１〜１２番）、ＮＧＦＩ−ｂα（アミノ酸配列２〜２４８番）、ＮＧＦＩ−ｂγ（アミノ酸配列２〜９９番）、ＲＯＲβ（アミノ酸配列１〜２６番）、ＲＯＲγ（アミノ酸配列２〜３０番）、ＴＲ２（アミノ酸配列４〜１１０番）、ＴＲ４（アミノ酸配列５〜１０４番）、ＧＣＮＦ（アミノ酸配列２８〜５８番）、ＡＲ（アミノ酸配列２〜５３番）、ＭＲ（アミノ酸配列２〜９９番）、ＬＸＲβ（アミノ酸配列２〜８６番）、ＲＸＲα（アミノ酸配列２〜１３３番）、ＲＸＲγ（アミノ酸配列２〜１３７番）、ＲＡＲα（アミノ酸配列１〜５６）、ＲＡＲβ（アミノ酸配列２〜７９番）、ＲＡＲγ（アミノ酸配列２〜８８番）、ＦＸＲ（アミノ酸配列３０３〜４０３番）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα（アミノ酸配列２〜１３０番）、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ（アミノ酸配列４〜１０１番）、ＧＲ（アミノ酸配列２〜６０番）、ＰＲ（アミノ酸配列２〜９９番）、ＥＡＲ２（アミノ酸配列１３〜４４番）、ＥＲα（アミノ酸配列２〜１８０番）、ＤＡＸ１（アミノ酸配列１〜８０番）、ＰＰＡＲβ（アミノ酸配列１〜６０番）、ＲＸＲβ（アミノ酸配列９〜１８７番）、ＴＲα（アミノ酸配列２〜５１番）、ＰＮＲ（アミノ酸配列２〜４５番）及びＮＧＦＩ−Ｂβ（アミノ酸配列２〜９９番）の精製バキュロウイルスを得た。【００５７】
実施例４  核内受容体タンパク質断片ペプチドの大腸菌による取得
ＨＮＦ４γ、ＣＡＲ、ＳＦ−１については、大腸菌を用いたタンパク発現により抗原を得た。ＨＮＦ４γのアミノ酸配列９６〜４０８番目のアミノ酸の部分長ｃＤＮＡについては、表２に示すフォワードプライマー配列番号７５及びリバースプライマー配列番号７６を用い、実施例３と同様にしてＰＣＲを行う事により得た。次いで、ＧＳＴ融合タンパク質として部分長発現物の作製を行った。ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ断片を、公知のＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに挿入し、タンパク質発現に適した大腸菌にトランスフォームした。その大腸菌をＬＢ培地中で、６００ｎｍの吸光度が０．５に至るまで培養し、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて３時間培養し、菌体を遠心により回収した。その後、常法により精製を行い、抗原タンパク質を得た。同様に、ＣＡＲＲ（アミノ酸配列７６〜３４８番）、ＳＦ−１（アミノ酸配列２２０〜４６１番）についてもそれぞれ表２に示すフォワードプライマー配列番号３１及び３３ならびにリバースプライマー配列番号３２及び３４を用いて精製抗原を得た。【００５８】
【表１】
2007055283.tif 000002
【００５９】
【表２】
2007055283.tif 000003
【００６０】
実施例５  核内受容体タンパク質に対する抗体の作製
ＨＮＦ４αのアミノ酸配列３８０〜４４８番目までの配列を組み込んだ精製バキュロウイルス発現物（ｇｐ６４−ｆｕｓｉｏｎ発現ウイルス粒子）を免疫原とした。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に、１００μｇ／匹の投与量を２週間間隔で３回免疫した後、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマの培養上清について、免疫抗原（ｇｐ６４発現ウイルス粒子）固相ＥＬＩＳＡと野生型ウイルス粒子固相ＥＬＩＳＡで行い、免疫抗原に対してのみ反応するものを一次選択した。【００６１】
ＥＬＩＳＡ法の概略は、免疫原及び野生型のウイルス粒子０．５μｇ／ｗｅｌｌを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（ＥＣＬ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｃａｔ：ＮＡ９３１Ｖ））の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０ｎｍの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。【００６２】
一次選択されたバイブリドーマについて、免疫抗原と野生型の各ウイルス粒子を用いたウエスタンブロットを行い二次選択した。ウエスタンブロットの概略は、免疫原及び野生型のウイルス粒子を０．６μｇ／ｌａｎｅとなるようにアプライして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写し、転写膜をブロッキング後、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。次にＨＲＰ標識抗マウス抗体を反応させ、ＥＣＬ検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を添加後に得られた化学発光について、Ｘ線フイルムを感光させて検出した。免疫抗原のＨＮＦ４α発現物に特異的なバンドのみと反応する株として二次選択されたものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種し、マウス腹水を得た。そのようにして得たマウス腹水を硫安塩析法で精製し、精製モノクローナル抗体を得た。同様にして、実施例３で作製した４３種類の核内受容体部分ペプチド配列を組み込んだ精製バキュロウイルス発現物（ｇｐ６４−ｆｕｓｉｏｎ発現ウイルス粒子）を免疫原とし抗体作製を行った。また、実施例４で作製した大腸菌調製タンパク質である部分長ＨＮＦ４γ、ＣＡＲ及びＳＦ−１については抗原量として１００μｇ／匹を用いて抗体作製した。尚、一次選択のＥＬＩＳＡでは抗原固相濃度は１μｇ／ｍＬを使用し、二次スクリーニングでのウエスタンブロティングは実施例７に示す方法に準じた。続いて、得られた抗体産生ハイブリドーマをマウスに接種し、腹水を得た後、硫安塩析法で精製し、精製モノクローナル抗体を得た。すなわち、ＴＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＲＯＲα、ＬＸＲα、ＶＤＲ、ＴＬＸ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＥＲＲα、ＥＲＲβ、ＥＲＲγ、ＥＲβ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＬＰＨ−１、ＮＧＦＩ−ｂα、ＮＧＦＩ−ｂ−ｂγ、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ、ＴＲ２、ＴＲ４、ＧＣＮＦ、ＡＲ、ＭＲ、ＬＸＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲγ、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、ＦＸＲ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、ＧＲ、ＰＲ、ＨＮＦ４γ、ＥＡＲ２、ＥＲα、ＳＦ−１、ＤＡＸ１、ＰＰＡＲβ、ＲＸＲβ、ＴＲα、ＰＮＲ及びＮＧＦＩ−Ｂβの精製モノクローナル抗体を得た。【００６３】
さらなる抗体の純度を要する場合には、下記方法にて精製した。すなわち、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて行った。ハイブリドーマを無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ；  ＧＩＢＣＯ社）で培養し、培養上清中に抗体を産生させた。その培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出は中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。【００６４】
実施例６  核内受容体複合体含有溶液及び核内受容体溶液の調製
（１）ＨＮＦ４α
Ｒｏｅｄｅｒらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｍａｒ  １１；１１（５）：１４７５−８９．）に従い、ＨＮＦ４α複合体含有溶液及び天然型核内受容体溶液を調製した。具体的には、ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＦＢＳ／ペニシリン・ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地、３７℃５％ＣＯ２条件で培養し、コンフルエントの状態の細胞を冷ＰＢＳ／０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦで洗浄し、セルスクレイパーにて回収した。回収した細胞を２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで沈殿させ、５ｃｐｖ分のＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９  ａｔ  ４℃），１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＫＣｌ１０ｍＭ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁後、氷上にて１０分間静置した。２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで沈殿させ、２ｃｐｖ分のＢｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁後、ダウンスホモジナイザー４０ストロークで細胞を破砕した。１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎにて遠心で沈殿させ、１ｃｐｖ分のＢｕｆｆｅｒ  Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），２５％ｖ／ｖ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．４２Ｍ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，２μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍＬ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）に懸濁後、ダウンスホモジナイザー２０ストロークで細胞を破砕した。４℃で３０分間転倒混和後、１５，０００ｒｐｍ，４５ｍｉｎで上清を取り、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），１０％ｖ／ｖ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１Ｍ  ＫＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，２μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍＬ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）で５時間透析した。次いで、１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎで上清を取り、ＨＮＦ４α複合体含有溶液及び核内受容体溶液とした。【００６５】
（２）ＥＲα
ＥＲα複合体含有溶液の調製は、以下のとおり行った。即ち、ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳ／ペニシリン・ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地、３７℃５％ＣＯ２条件で培養後、活性炭処理を施した１０％ＦＢＳ／ペニシリン・ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドフリー）培地で続けて培養し、コンフルエントの状態の細胞を冷ＰＢＳで洗浄、セルスクレイパーにて回収した。以下、回収した細胞に実施例６（１）ＨＮＦ４αと同様の処理を行い、ＥＲα複合体含有溶液とした。【００６６】
（３）その他核内受容体
ＨＮＦ４γ及びＬＸＲαについてもＨｅｐＧ２細胞を用い、実施例６（１）ＨＮＦ４αと同様に調製した。ＰＰＡＲγについては、０．２５μＭのデキサメタゾン刺激で分化した３Ｔ３細胞を用いて実施例６（１）ＨＮＦ４αと同様に調製した。【００６７】
実施例７  核内受容体に対する高親和性モノクローナル抗体によるウエスタンブロティング
多数得られた核内受容体に対する抗体について、該当する核内受容体タンパク質を用いたウエスタンブロットを行って、完全長タンパク質を認識できるか否かを確認した。【００６８】
ウエスタンブロットの概略は、核内受容体のリコンビナント完全長発現物を強制発現させたＣＨＯ細胞あるいは該当するタンパク質発現細胞株のライセートと、陰性コントロールとしての宿主ＣＨＯ細胞のライセートを、６μｇ／ｌａｎｅとなるようにアプライして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜（アマシャムバイオサイエンス社製）にゲルを転写し、転写膜をブロッキング後、該当するハイブリドーマの培養上清あるいは精製抗体を反応させた。次にＨＲＰ標識抗マウス抗体を反応させ、ＥＣＬ検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を添加後に得られた化学発光について、Ｘ線フイルムを感光させて検出し、完全長核内受容体タンパク質を認識する抗体を選択した。【００６９】
実施例８  抗核内受容体モノクローナル抗体の親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００を使用し、ＨＮＦ４α完全長タンパク質を認識するモノクローナル抗体の親和性を測定した。センサーチップは抗マウスイムノグロブリン抗体を結合させたＣＭ５チップを作製し使用した。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２）を使用した。測定温度は２５℃で行った。フローセル１はコントロールとし、フローセル２からフローセル４に各抗体を結合させた。結合／解離反応の測定は、ＨＢＳ−ＥＰで希釈したＧＳＴ融合ＨＮＦ４αＥＦドメインタンパク質を全てのフローセルに一定時間流して結合反応を、その後ＨＢＳ−ＥＰバッファーを一定時間流すことで解離反応を見ることにより行った。速度論の計算はＨＮＦ４αＧＳＴ融合タンパク質の各濃度での結合／解離センサーグラムをＢＩＡｅｖａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅで行った。同じ抗原で得られたいくつかの抗ＨＮＦ４αモノクローナル抗体のうち、Ｈ１４１５抗体がＫＤ＝約１×１０−９Ｍという最も高い親和性を示した（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１９２としてハイブリドーマ寄託）。このことは、Ｈ１４１５抗体を用いると高効率にＨＮＦ４αの解析ができる可能性を示唆している。同様にして、他の抗核内受容体モノクローナル抗体についても親和性を測定し、高親和性抗核内受容体モノクローナル抗体を選択した。【００７０】
実施例９  核内受容体に対する高親和性モノクローナル抗体を用いた免疫沈降
実施例７で高親和性と確認された抗ＨＮＦ４αモノクローナル抗体を使用して、免疫沈降を行った。免疫沈降において、抗原のネガティブコントロールとしてｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを使用し、抗体のネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧを使用した。３５Ｓメチオニンをラベルした核内受容体タンパク質抗原を、ＴＮＴ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白発現させた。この発現タンパク質溶液（３５Ｓ  メチオニンラベルのＨＮＦ４α）５０μＬと、抗核内受容体マウスモノクローナル抗体及び陰性コントロール用のマウスＩｇＧ各々１０μｇ，及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）２０μＬを混合し、４℃で２時間反応させた後、粒子画分と上清画分に分離した。粒子画分（免疫沈降画分）を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），１４２．５ｍＭ  ＫＣｌ，０．２％  ＮＰ４０で洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），３％ＳＤＳ，２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔａｎｏｌ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で溶出せしめ、溶出物と上清画分をそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動パターンをオートラジオグラフィーで検出した。ＨＮＦ４γ、ＬＸＲα、ＰＰＡＲγ、抗ＥＲα抗体、及びＴＬＸについても、同様な操作で免疫沈降の可否を検討した。図１〜図６に示すように、今回使用した高親和性抗ＨＮＦ４α抗体を始めとし、抗ＬＸＲα抗体、抗ＰＰＡＲγ抗体、抗ＥＲα抗体、抗ＴＬＸ抗体及び抗ＨＮＦ４γ抗体を用いた免疫沈降において、該当する核内受容体タンパク質を特異的に回収できることが示された。【００７１】
実施例１０  磁性粒子（１）の作製
１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナル  オブポリマーサイエンス  ポリマーレター  エディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒ  Ｅｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に下記核粒子を作製した。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。
核粒子１；スチレン／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
（平均粒径３．５μｍ、ＣＶ値２．５％）【００７２】
２．磁性体層の形成
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍ）を得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子１０ｇに、疎水化された磁性体を１０ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−Ｏ型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で３分間処理し、磁性体層の形成を得た。【００７３】
３．ポリマー層の形成
得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ及び重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液２５ｇ及びアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液２５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、１時間にわたり連続添加して反応させた。続いて、グリシジルメタクリレート１５ｇ及びパーブチルＯ  １．５ｇ、エマルゲン１５０の０．５％水溶液２５ｇ及びＳＤＳの０．５％水溶液２５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、１時間にわたり連続添加して反応させた。その後、メタクリル酸４．５ｇの５０％水溶液を添加し、１時間反応の後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。磁気精製にて、粒子分散液を蒸留水に置換した。得られた磁性核粒子（１）の粒径は４．２μｍ、粒子比重は１．４ｇ／ｃｍ３であった。【００７４】
実施例１１  磁性粒子（２）の作製
１．磁性体層のアミノ化
上記実施例１０の２で得られた磁性体被覆磁性粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ及び重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液２５ｇ及びアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液２５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、１時間にわたり連続添加して反応させた。続いて、グリシジルメタクリレート１５ｇ及びパーブチルＯ  １．５ｇ、エマルゲン１５０の０．５％水溶液２５ｇ及びＳＤＳの０．５％水溶液２５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、１時間にわたり連続添加して反応させ、さらに温度を３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。得られた磁性粒子１ｇ分を純水１００ｍＬに分散し、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を１０分間照射して分散させてから、５０℃にて６時間加熱攪拌し、その後、磁気分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで２回、水／メタノール混合物（３／１、容積比）で３回洗浄した後、乾燥させることによりアミノ化磁性粒子を得た。【００７５】
２．親水性ポリマーの結合
このアミノ化磁性粒子０．５ｇに、純水２０ｍＬに溶解した日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩ＡＰＰ−８４（平均分子量１７，０００でグルコース単位１個当たり平均０．７個のカルボキシル基を含有）０．５ｇを加え、間接超音波を３０分間照射して分散させた。次に、この分散液を氷冷し、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの５ｗｔ％水溶液５ｍＬを加え、氷冷下で１２時間攪拌した。純水１０ｍＬで１０回洗浄し磁性粒子（２）を得た。得られた磁性粒子（２）の粒径は４．３μｍ、粒子比重は１．４ｇ／ｃｍ３であった。【００７６】
実施例１２  磁性粒子（３）の作製
実施例１０の１、２において以下の核粒子２を用いた以外は、実施例１０と同様な処理を行い、磁性体被覆粒子３０ｇを得た。
核粒子２；スチレン／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
（平均粒径１．５μｍ、ＣＶ値２．２％）
次に、ＳＤＳを０．２５重量％及びエマルゲン１５０を０．２５重量％含む水溶液（以下、「分散剤水溶液」という）３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、磁性体被覆磁性粒子１５ｇを投入し分散した後、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。分散剤水溶液１５０ｇに、メチルメタクリレート２７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート３ｇ、及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、分散剤水溶液７５ｇに、グリシジルメタクリレート  １３．５ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート１．５ｇ、及びパーロイル３５５  ０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この１Ｌセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌ  硫酸６０ｍＬを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子を得た。
次に、上記２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子を真空乾燥して得られた乾燥粒子１．０ｇを１０ｍＬのピリジンで洗浄してから５ｍＬのピリジンに分散させた後、２５ｍＬのピリジンに３ｇの無水コハク酸を溶解した溶液を加え、６０℃で２時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、蒸留水で洗浄して、磁性粒子（３）を得た。この磁性粒子（３）の平均数粒子径は２．９μｍであった。【００７７】
実施例１３  磁性粒子の非特異的吸着量の確認
磁性粒子（１）、（２）、（３）ならびにプロテインＧセファロース粒子各１ｍｇを２ｍＬマイクロチューブにとり、１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡとする）ＰＢＳを１００μＬ加え１０分間撹拌した。磁性粒子については磁気分離により、プロテインＧセファロース粒子に関しては遠心により、上清を捨てた後、５００μＬの０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用い、磁気分離あるいは遠心により洗浄操作を５回行った。洗浄後の磁性粒子及びプロテインＧセファロース粒子に、タンパク質溶出液として０．５％ＳＤＳを４０μＬ加え、５分間撹拌後、磁気分離あるいは遠心により上清を回収した。この上清をＳＤＳ電気泳動にかけ、銀染色を行って粒子に吸着した非特異吸着蛋白量を定量した。その結果、磁性粒子（２）及び磁性粒子（３）において非特異的物質の吸着量が極めて少なく、次いで磁性粒子（１）が少なく、プロテインＧセファロース粒子では非特異的物質の吸着量が多いことが確認できた。【００７８】
実施例１４  高親和性抗体結合磁性粒子（１）の作製
実施例１０で得られた粒子１００ｍｇを１５ｍＬ試験管に採取し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（以下Ｂｕｆｆｅｒ−Ａ）１０ｍＬにて３回洗浄を行った。洗浄後の粒子をＢｕｆｆｅｒ−Ａ  ５ｍＬに分散し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（同仁化学研究所製）１０ｍｇを加え室温にて１５分間撹拌した。磁気分離により上清を除去した後、Ｂｕｆｆｅｒ−Ａ  ５ｍＬに分散し、抗体１ｍｇを加え室温にて撹拌し、２時間反応を行った。反応終了後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０  １０ｍＬにて３回洗浄を行った後、リン酸緩衝塩溶液１０ｍＬに分散し、高親和性抗体結合磁性粒子（１）を得た。【００７９】
実施例１５  高親和性抗体結合磁性粒子（２）の作製
実施例１１で得られた磁性粒子（２）を用いる以外は実施例１０と同様の方法で、高親和性抗体結合磁性粒子（２）を得た。【００８０】
実施例１６  高親和性抗体結合磁性粒子（３）の作製
実施例１２で得られた磁性粒子（３）を用いる以外は実施例１０と同様の方法で、高親和性抗体結合磁性粒子（３）を得た。【００８１】
実施例１７  免疫沈降における粒子への非特異的タンパク質吸着の検討
抗体の親和性と非特異的タンパク質吸着の関連を検討するため、実施例８で確認された高親和性抗ＨＮＦ４α抗体であるＨ１４１５と抗マウスＩｇＧ（ＮＭ  ＩｇＧ）抗体を、実施例１１で作製した磁性粒子（２）と市販品であるプロテインＧセファロース粒子のそれぞれに結合させ、実施例６で調製したＨＮＦ４αを含む試料とＨＮＦ４αを含まないＨｅＬａ細胞から作製した試料を用い免疫沈降を行い、タンパク質染色及びウエスタンブロッティングを実施した。ウエスタンブロッティングの結果は、ＨＮＦ４αを含有している試料において、抗ＨＮＦ４α抗体を結合させた粒子では、磁性粒子とプロテインＧセファロース粒子のいずれもが特異的に回収されたが、ＨＮＦ４αを含有していない場合、ＨＮＦ４αのバンドがいずれの粒子においても確認できなかった。しかし、タンパク質染色の結果では、ウエスタンブロッティングの結果とは異なっていた。すなわち、磁性粒子で明確なバンドが検出されたが、プロテインＧセファロース粒子ではバックグラウンドが高く、バンドが不明瞭であった。この結果は、磁性粒子（２）の方がプロテインＧセファロース粒子よりも、非特異的なタンパク質の吸着が少ないことを示唆している。（図７）。【００８２】
この結果より、免疫沈降によるタンパク質の分離・抽出を行う場合、非特異的なタンパク質の吸着の少ない粒子を使用する必要性が示され、また磁性粒子（２）はプロテインＧセファロース粒子よりもタンパク質の非特異的な吸着が少ない為、目的のタンパク質を高純度で分離・抽出できることが示唆された。【００８３】
実施例１８  高親和性抗体結合磁性粒子（２）を用いた核内受容体結合複合体の解析
１．免疫沈降
（１）ＨＮＦ４α
高親和性抗体結合磁性粒子（２）を用いた免疫沈降により回収した核内受容体複合体を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定できるか否かを検討するため、抗ＨＮＦ４α抗体であるＨ１４１５結合磁性粒子及び正常マウスＩｇＧ結合磁性粒子を用い、実施例６の（１）で調製したＨｅｐＧ２核抽出液に対し免疫沈降を行い、タンパク質染色を実施した（図８）。正常マウスＩｇＧ結合磁性粒子には認められないＨ１４１５結合磁性粒子に特異的なバンド（図８の矢印のバンド）が観察されることから、その特異的バンドを切り出した。【００８４】
（２）ＥＲα
高親和性ＥＲα抗体結合磁性粒子及び、対照として正常マウスＩｇＧ結合磁性粒子を用い、実施例６の（２）で調製したＭＣＦ−７核抽出液に対し免疫沈降を行なった。その後、各磁性粒子を洗浄、回収後、ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えて１００℃、１０分間加熱し、免疫沈降物を得た。この免疫沈降物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、試料添加位置より数ｍｍ泳動した後、泳動された沈降物が存在する領域のゲルを切り出した。【００８５】
２．ゲル内消化
切り出したゲル片に１０％メタノール及び７％酢酸水溶液を加え、２０時間後に酢酸除去を目的に超純水を１ｍＬ加え３０分間静置することにより脱色を行った。超純水を取り除いた後、還元液（１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で１時間インキュベートすることにより還元操作を行った後、アルキル化液（４−ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）を加え、遮光、室温で１時間静置することによりアルキル化操作を行った。続いて、２０％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ含有超純水を１ｍＬ加え３０分間静置した後、液を取り除いた。さらに、超純水１ｍＬを加え３０分静置する作業を３回繰り返すことにより、反応停止操作を行った。次いで、脱水液（５０％アセトニトリル，０．１Ｍ重炭酸アンモニウム）を加え、室温で３０分間静置し、液を取り除いた後、凍結乾燥させることにより、脱水操作を行った。脱水試料にトリプシン０．１μｇ／μＬを１ｍＬ加え、４℃で１０分間静置後、Ｄｉｇｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、超純水、アセトニトリル、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２）を加え３７℃で一晩反応させることにより酵素消化を行った。液を一度回収した後、抽出液（６０％アセトニトリル，０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、室温で３０分間振とうした後、回収した液と合わせ、凍結乾燥することによりペプチド抽出操作を行った。これをＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解したものを試料溶液として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析に用いた。【００８６】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析
（１）ＨＮＦ４α
得られた分析結果からデータベースサーチによりタンパク質の同定を行ったところ、いくつかのバンドが確認できた。その中の１つとして、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ４αのファミリータンパク質であるγが同定された。このことは高親和性抗体を用いることで核内受容体タンパク質自体を回収することが示され、さらに、その複合体も解析が可能であることを示す。また前述のとおり公知の粒子では非特異吸着が多いため特異的バンドの比較が困難であったが、親水性ポリマーを結合させることにより非特異吸着を減少させた粒子を用いることによりこの方法が可能になったことを示している。【００８７】
（２）ＥＲα
得られた測定結果からデータベースサーチによりタンパク質同定を行ない、抗ＥＲα抗体結合磁性粒子を使用して得られた免疫沈降物に対してのみ同定されるタンパク質として表３の結果を得た。その中の１つとしてＥＲαが同定された。また、ＥＲαとの相互作用が示唆されるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成タンパク質（ＥＭＢＯ  Ｊ．Ａｕｇ  １；２１（１５）：４０９４−１０３（２００２）．）なども同定されており、このことは高親和性抗体を用いることでその結合相手であるＥＲαタンパク質自体を回収できることが示されると共に、ＨＮＦ４α同様、その複合体も解析が可能であることを示している。【００８８】
【表３】
2007055283.tif 000004
【００８９】
実施例１９  ＨＮＦ４αと複合タンパク質の相互作用の確認
１．トランスフェクションしたＣＨＯ細胞さらに高親和性抗体結合磁性粒子（２）によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定された複合体タンパク質が実際に相互作用するか否かを詳細に検討するため、強制発現によるプルダウンアッセイと、公知の方法によるＨｅｐＧ２の免疫沈降サンプルをウエスタンブロッティングにより解析した。プルダウンアッセイは、ＨＮＦ４αとＦＬＡＧタグがついたＨＮＦ４γをトランスフェクション試薬としてＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を用いトランスフェクションしたＣＨＯ細胞から細胞抽出液を作製した。すなわち、ＲＰＭＩ培地４００μＬにＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１を１６μＬ添加し、室温で１５分間静置後プラスミドを添加し、室温で１５分間静置後ＣＨＯ細胞培養ディッシュに添加し４８時間培養させた。次いで、細胞を冷ＰＢＳ／０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦで洗浄し、セルスクレイパーにて回収した。回収した細胞を２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで沈殿させ、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４７），１％  ＮＰ−４０，２５ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＦ，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，２μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍＬ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍＬ  ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ）に懸濁後、Ｂｅｎｏｚｏｎａｃｅ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）をＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒの１／５００倍量加えて氷上にて３０分間静置した。１５，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎで上清を取り細胞破砕液とした。その細胞破砕液をサンプルとして用いて抗ＨＮＦ４α抗体と抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社）で免疫沈降を行い、通常の方法でＨＲＰ標識した抗ＨＮＦ４α抗体、もしくは抗Ｆｌａｇ抗体を用いてイムノブロッティングで検出した。ＨｅｐＧ２の免疫沈降は実施例６で調製したＨｅｐＧ２核抽出液を抗ＨＮＦ４α抗体で免疫沈降を行い、ＨＲＰ標識抗ＨＮＦ４α抗体もしくは抗ＨＮＦ４γヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いてイムノブロッティングで検出した（図９〜図１０）。結果として、プルダウンアッセイでも公知の免疫沈降法でもＨＮＦ４αとＨＮＦ４γの相互作用を確認することができた。今まで両者の相互作用を示唆するデータは報告されていたが、実際の相互作用が確認された例はなく、今回初めて確認することができた。この結果から、高親和性抗体結合磁性粒子を用いた免疫沈降サンプルに対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析方法は、核内受容体複合体を解析するために有効であることが示された。【００９０】
実施例２０  高親和性抗ＨＮＦ４γ抗体結合粒子を用いたＨＮＦ４γと複合体を形成するタンパク質の解析
高親和性抗ＨＮＦ４γ抗体結合プロテインＧセファロース粒子を用いて、実施例６で調製したＨｅｐＧ２核抽出液を免疫沈降し、ビオチン標識高親和性抗ＨＮＦ４γ抗体でイムノブロッティングを行った。その結果、ＨＮＦ４γに相当する分子量の位置にバンドが検出された（図１０）。実施例１７にて、ＨＮＦ４αとＨＮＦ４γが複合体を形成することが証明されていることから、上記免疫沈降試料と同一試料について、ＨＲＰ標識抗ＨＮＦ４αヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によるイムノブロッティングを行った。その結果、ＨＮＦ４αの分子量に相当する位置にバンドが検出された（図１１）。今回のこの試験ではＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてはいないが、免疫沈降により複合体を形成しているＨＮＦ４αが検出されたことから、高親和性抗ＨＮＦ４γ抗体結合磁性粒子を用いることによりプロテオミクス解析が可能であることを示唆している。【００９１】
実施例２１  天然型核内受容体溶液使用によるプロテオミクス解析に対する強制発現核内受容体溶液を使用した場合の差異
天然型の核内受容体と強制的に発現させた核内受容体では形成される複合体構成タンパク質が異なるか否かを解析するため、高親和性抗ＨＮＦ４α抗体結合磁性粒子によるＨｅｐＧ２細胞内の天然型ＨＮＦ４α複合体のプロテオミクス解析とＨｅｐＧ２に強制的に発現させたＦｌａｇタグ融合型ＨＮＦ４α複合体の抗Ｆｌａｇ抗体結合アガロース粒子によるプロテオミクス解析結果を比較した。【００９２】
１．免疫沈降
天然型ＨＮＦ４αに関しては、実施例１６のＨＮＦ４αの解析方法と同様の操作を行い、タンパク質染色を行わずに免疫沈降されたタンパク質をそのままトリプシン消化に用いた。Ｆｌａｇタグ融合型ＨＮＦ４αに関してはＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＦｌａｇタグ融合型ＨＮＦ４αを発現させ核抽出液を調整し、抗Ｆｌａｇ抗体結合アガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社）で免疫沈降を行い、Ｆｌａｇペプチド（ＳＩＧＭＡ社）により溶出し、溶出タンパクをそのままトリプシン消化に用いた。【００９３】
２．トリプシン消化
免疫沈降されたタンパクをトリクロロ酢酸により沈殿させ、１０％アセトニトリル，０．１Ｍ重炭酸アンモニウムで再溶解し、還元液（１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）を加え、３７℃で１時間インキュベートすることにより還元操作を行った後、アルキル化液（４−ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）を加え、遮光、室温で１時間静置することによりアルキル化操作を行った。その後トリプシン０．１μｇ／μＬの濃度で加え３７℃で一晩反応させることにより酵素消化を行った。消化後凍結乾燥することによりペプチド抽出操作を行った。これをＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解したものを試料溶液として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析に用いた。【００９４】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析
得られた測定結果からデータベースサーチによりタンパク質同定を行なった。天然型ＨＮＦ４αに関しては、抗ＨＮＦ４α抗体結合磁性粒子を使用して得られた免疫沈降物に対してのみ同定されるタンパク質として表４の結果を得た。Ｆｌａｇタグ融合型ＨＮＦ４αに関しては、抗Ｆｌａｇ抗体結合アガロースビーズを使用して得られた免疫沈降物に対してのみ同定されるタンパク質として表５の結果を得た。天然型ＨＮＦ４αで同定されたタンパク質にはＨＮＦ４γの他、すでにＨＮＦ４αとの相互作用が報告されているＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＷＳ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５  Ａｐｒ  ８；３２９（２）：６５３−６０．）、また他の核内受容体との相互作用が報告されているＳＦＰＱ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ａｐｒ；２１（７）：２２９８−３１１．）などがあった。一方、Ｆｌａｇタグ融合型ＨＮＦ４αで同定されたタンパク質にはＨＮＦ４γはあるものの、その他ＨＮＦ４αと複合体を形成している可能性があるようなタンパク質が同定されなかった。これらの結果から、天然型と強制発現の核内受容体複合体は異なる可能性が示唆された。すなわち、強制発現物を用いた核内受容体プロテオミクス解析は正確な解析結果を得ることが困難であると思われる。従って、正確な解析結果を得るためには、少量の試料でプロテオミクス解析が可能な非特異的結合が少ない高親和性抗体結合磁性粒子を用いた天然型核内受容体複合体のプロテオミクス解析が必要であると考えられる。【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
実施例２２  磁性粒子の種類による免疫沈降性能の差異
異なる方法で調整された非特異吸着の少ない磁性粒子（２）と（３）の性能を比較するため、抗体結合磁性粒子（２）と（３）を実施例１７と同様の方法で比較した。タンパク質染色の結果、抗体結合磁性粒子（２）と（３）はほぼ同程度の低非特異吸着量であった。ウエスタンブロッティングの結果、どちらもＨＮＦ４αが特異的に回収され、バンドの濃さを定量したところ磁性粒子（３）が磁性粒子（２）の約１．５倍の回収量であった。この結果は磁性粒子（３）がよりプロテオミクス解析に適当であることを示している（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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