(57)【要約】  血管内皮細胞にバソヒビンを強制発現させ、４種の断片（４２ｋＤ，３６ｋＤ，３２ｋＤ，２７ｋＤ）を見出した。これらの断片について解析を行うことにより、血管新生抑制作用を有する低分子量型バソヒビンを見出した。該低分子量型バソヒビンは、血管新生が関連する血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患、癌等の種々の疾患の治療薬等として有用である。また、該低分子量型のバソヒビンは、血管新生のマーカーとしても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列の連続した３６４個以下のアミノ酸からなり、３１９位のＬｙｓから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項２】
該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、請求項１記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項３】
該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、請求項１記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項４】
該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、請求項１記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項５】
該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、請求項１記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項６】
該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから７７位のＭｅｔまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、請求項１記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換したポリペプチドであって、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項８】
下記の工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドに結合する物質のスクリーニング方法；
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程。
【請求項９】
下記の工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質との結合を調節する結合活性調節物質のスクリーニング方法；
（ａ）被検物質の存在下又は非存在下、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと該ポリペプチドの結合物質を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程。
【請求項１０】
下記の工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法；
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドの発現量の変化を検出する工程。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌の治療剤である請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制作用を有するポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩、それらの溶媒和物又は該ポリヌクレオチドその誘導体、それらの製薬上許容される塩、それらの溶媒和物を含有する医薬組成物に関する。また、該ポリペプチドを用いた各種物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において細胞が生存するためには、血液より供給される酸素及び栄養素が必要であり、増殖の盛んな組織においては血管新生も盛んである。血管新生は、生理的に組織の再生に関与しているばかりでなく、病理的に細胞増殖の盛んな疾患にも関与していることが知られている。該疾患としては、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等が報告されている（非特許文献１）。さらに、悪性新生物細胞の増殖時に血管新生が見られることから、癌による血管新生のモデルとして血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）で処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）が報告されている（非特許文献２）。【０００３】
上述の種々の疾患に関与する遺伝子の研究がこれまで行われてきているが、その発症機構は、完全には解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。この様な状況の下、上記疾患の発症に関わる新規遺伝子の同定及び同遺伝子を用いた疾患の診断方法が待望されていた。【０００４】
その後、血管新生抑制作用を有するポリペプチドとして、配列番号：２に記載の３６５個のアミノ酸からなるポリペプチド（以下、バソヒビン（Vasohibin）と称する。）が見出された（特許文献１及び非特許文献３）。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）は、ＫＩＡＡ１０３６として、非特許文献４に開示されている。
【特許文献１】ＷＯ０２／０９０５４６
【非特許文献１】Nature，４０７，２４９（２０００）．
【非特許文献２】Cancer Research，５５，５２９６−５３０１（１９９５）．
【非特許文献３】The Journal of Clinical Investigation，１１４（７）８９８−９０７（２００４）．
【非特許文献４】DNA Research，６（３）１９７−２０５（１９９９）．
【非特許文献５】Biochemical and Biophysical Research Communications，３２７，７００−７０６（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バソヒビンが血管新生抑制作用を有することは知られていたが、医薬品の活性成分として好適な、より低分子量の血管新生抑制作用を有するポリペプチドが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、バソヒビン（４４ｋＤ）を血管内皮細胞において強制発現することにより、４種の断片（４２ｋＤ，３６ｋＤ，３２ｋＤ，２７ｋＤ）を見出した。さらに、それらの断片について解析を行った結果、血管新生抑制作用を発揮する上で必要な配列が、配列番号：２記載の３１８位のアルギニンよりもＣ端側のアミノ酸配列、つまり、３１９位から３６５位までのアミノ酸配列であることを見出した。【０００７】
本発明により、バソヒビンよりも低分子量で、かつ、血管新生抑制作用を有するポリペプチドを提供することが可能となった。本発明において提供する低分子量型のバソヒビンは、バソヒビンと同様に血管新生抑制作用を有しており、血管新生が関連する血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患、癌等の種々の疾患の治療薬等として有用である。通常、タンパク製剤を作製する場合、活性成分であるポリペプチドは、より低分子量であることが望ましく、本発明の低分子量型バソヒビンは、非常に有用である。また、低分子量型のバソヒビンは、血管新生のマーカーとしても有用である。【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列の連続した３６４個以下のアミノ酸からなり、３１９位のＬｙｓから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（２）該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、（１）記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（３）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、（１）記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（４）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（５）該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（６）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから７７位のＭｅｔまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換したポリペプチドであって、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物、
（８）下記の工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドに結合する物質のスクリーニング方法；
（ａ）（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程、
（９）下記の工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質との結合を調節する結合活性調節物質のスクリーニング方法；
（ａ）被検物質の存在下又は非存在下、（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドと該ポリペプチドの結合物質を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程、
（１０）下記の工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法；
（ａ）（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリペプチドの発現量の変化を検出する工程、
（１１）（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含む医薬組成物、
（１２）血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌の治療剤である（１１）に記載の医薬組成物、を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物は、血管新生抑制作用を有し、バソヒビンに比べて低分子量であるため、医薬組成物に用いる活性成分として、非常に有用である。また、本発明のポリペプチドを用いることにより、本発明のポリペプチドに結合する物質等のスクリーニングを行うことができる。該スクリーニングによって得られた化合物は血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Arg29Ala置換による42kD Vasohibinタンパク質のプロセッシング阻害
【図２】Arg76Ala置換による36kD Vasohibinタンパク質のプロセッシング阻害
【図３】Arg76Ala置換による32kD及び27kD Vasohibinタンパク質のプロセッシング阻害
【図４】Vasohibinタンパク質のプロセッシング・パターン
【図５】In vivo血管新生に対するVasohibin(77-365)タンパク質の抑制効果
【図６】In vivo血管新生に対するVasohibin(77-318)タンパク質の抑制効果
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。【００１２】
「血管新生」とは、既存の血管から血管内皮細胞が出芽し、組織に進入する形で毛細血管が形成される現象を意味する。形成過程は１）プロテアーゼによる血管基底膜の消化、２）血管内皮細胞の遊走・増殖、３）管腔形成の順に進行する。【００１３】
「血管新生」が関連する疾患としては、「血管性疾患」、「炎症性疾患」、「眼内血管新生性疾患」、「生殖器官系疾患」、「中枢神経系疾患」、「癌」等が例示される。【００１４】
「血管性疾患」としては、動脈硬化、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害、血管奇形等が例示される。【００１５】
「炎症性疾患」としては、肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨髄炎、滑膜炎、骨破壊、軟骨破壊、リウマチ、喘息、サルコイドーシス、クロウー深瀬症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化、組織癒着等が例示される。【００１６】
「眼内血管新生性疾患」としては、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性等が例示される。【００１７】
「生殖器官系疾患」としては、子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能過亢進、濾胞性嚢胞等が例示される。【００１８】
「中枢神経系疾患」としては、網膜症、脳卒中、血管性痴呆、アルツハイマー病等が例示される。【００１９】
「癌」としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍等の種々の悪性新生物が例示され、卵巣癌及び大腸癌等が包含され、さらにこれら癌の転移をも包含する。【００２０】
「本発明のポリペプチド」とは、
（１）配列番号：２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列の連続した３６４個以下のアミノ酸からなり、３１９位のＬｙｓから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、（１）記載のポリペプチド；
（３）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、（１）記載のポリペプチド；
（４）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド；
（５）該ポリペプチドが、７７位のＭｅｔから３１８位のＡｒｇまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド； 
（６）該ポリペプチドが、３０位のＡｒｇから７７位のＭｅｔまでのいずれかのアミノ酸から始まり、３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列からなるものである、（１）記載のポリペプチド；を包含する。【００２１】
すなわち、本発明のポリペプチドは、配列番号：２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列の連続した３６４個以下のアミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。また、３１９位〜３６５位の連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。例えば、上記（４）、（５）、（６）の態様のものが好ましい。特に、（６）の態様のものが好ましい。上記本発明のポリペプチドは全て血管新生抑制作用を有する。具体的なものとしては、３０位のＡｒｇから始まり３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列で表されるポリペプチド、７７位のＭｅｔから始まり３６５位のＶａｌで終わるアミノ酸配列で表されるポリペプチド等が挙げられる。【００２２】
本発明のポリペプチドは、「上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換したポリペプチドであって、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド」も包含する。【００２３】
１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法等により欠失又は置換することができる程度の数のアミノ酸であり、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１、２または３個のアミノ酸残基を意味している。欠失又は置換によっても、血管新生抑制作用を有する限り、本発明のプリペプチドに包含される。【００２４】
本発明のポリペプチドの「血管新生抑制作用」は、公知の方法により測定することが可能である。例えば、後述する実施例３記載の方法により測定することができる。【００２５】
本発明のポリペプチドの「誘導体」とは、実質的に本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性、すなわち血管新生抑制作用を有するポリペプチドを意味する。該ポリペプチドの誘導体のＣ末端はカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルのいずれであってもよい。例えば、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られた変異体ポリペプチド等が挙げられる。
修飾基としては、蛍光性を呈する官能基、ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基などが挙げられる。また、天然由来の本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基（例えば、β−アラニンなど）であってもよい。蛍光性を呈する官能基としては、エオシンやフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などが挙げられる。ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基としては、β−アラニン残基などに代表されるスペーサー基などが挙げられる。かかる官能基は末端に存在することが好ましい。【００２６】
本発明のポリペプチドの「製薬上許容される塩」としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩、又は酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が用いられる。【００２７】
本発明ポリペプチド又は上記塩の「溶媒和物」としては、本発明のポリペプチドに対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。好ましくは水和物である。【００２８】
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する物質のスクリーニング方法に関する。「結合する物質」とは本発明のポリペプチドに結合する任意の物質であり、このような結合する物質としては、例えば、低分子物質、受容体及び抗体等のポリペプチドが挙げられる。結合物質のスクリーニング方法は、当技術分野で公知となっている技術を適宜適応することにより行うことができ、バイオアッセイ及び結合アッセイ等が例示される。【００２９】
本発明はさらに、「結合活性調節物質のスクリーニング方法」に関する。「結合活性調節」とは、本発明のポリペプチドとそれに対する結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、「結合活性」は、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）により評価される。「結合活性調節物質」とは、本発明のポリペプチドとそれに対する結合物質との結合活性を増強あるいは減少させる物質であり、アゴニストやアンタゴニストが例示される。このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリペプチド等が挙げられる。「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイ及び結合アッセイ等が例示される。【００３０】
また、本発明は、「発現調節物質のスクリーニング方法」に関する。発現量とは、目的の細胞等において、本発明のポリペプチドが発現される量を意味する。発現量は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いた、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法方法等の免疫学的測定方法等を含む適切な方法で測定することにより評価することができる。「発現調節」とは、上記の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量を増加又は減少させることを意味する。「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される、本発明のポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量を増加又は減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリペプチド等が例示される。「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により発現調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイ及び結合アッセイ等が例示される。【００３１】
本発明の「医薬組成物」とは、少なくとも、本発明のポリペプチド、その製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含有していればよく、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等の治療剤に用いることができる。また、本発明のポリペプチドは、ＰＥＧ化されていてもよく、糖鎖が付加されていてもよい。【００３２】
「治療方法」とは、前述の医薬組成物を投与することにより特定疾患、例えば、血管新生に関連する疾患である、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等疾患を治療する方法である。【００３３】
また、本発明のポリペプチドは、血管新生及びそれに関連する各種疾患のマーカーとなりうる。本明細書において、「マーカー」とは、生体試料から血管新生及びそれに関連する各種疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等を検出又は定量するために使用される物質を意味する。【００３４】
本発明のポリペプチドの「検出又は定量」は、免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いて達成することができる。【００３５】
本発明のポリペプチドを血管新生及びそれに関連する各種疾患のマーカーとして使用する場合、本発明のポリペプチドを検出又は定量する方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法が挙げられる。【００３６】
本発明のポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌を検出又は定量することができる。本発明のポリペプチドは、前記疾患のマーカーとなり得ることから、該抗体を用いた疾患の検出又は定量方法は、前述のポリペプチドの検出又は定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を含む方法により達成することができる。【００３７】
本発明は、標準試薬として、本発明のポリペプチドを含むことを特徴とする血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌の診断用キットも含有する。このキットは、さらに、本発明のポリペプチド又はその断片に対する抗体を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドは、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌のマーカーであるから、前述の免疫学的測定方法による検出又は定量方法に基づき、免疫学的に測定することができる。【００３８】
その他、本発明は、
（I）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター、及び
（II）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生を誘導するための発現ベクター、を含有する。これらについて、以下、「本発明のベクター」と称することもある。【００３９】
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００４０】
本明細書において「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。【００４１】
本発明は、本発明のポリペプチド若しくはその塩に対する中和抗体又は本発明のポリペプチドに対するアプタマーを含有する血管新生誘導剤も含有する。【００４２】
「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部又はその断片、誘導体、結合体、修飾体等も包含される。好ましくは、本発明のポリペプチド又はその断片を認識する抗体であり、より好ましくは、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。【００４３】
「アプタマー」とは、標的タンパク質と特異的に結合する能力を持った核酸分子を意味する。本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。アプタマーの塩基の長さは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するために必要な長さを有していれば、特に限定はしないが、例えば、１０〜２００塩基、好ましくは、２０〜１５０塩基、より好ましくは３０〜１５０塩基、さらに好ましくは５０〜１５０塩基のものである。
アプタマーは、例えば、インビトロセレクション法によって取得することができる。「インビトロセレクション法」とは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の機能を有する（例えば、標的物質に特異的に吸着し得る）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施することによって、特定の機能を有する核酸分子を取得する方法である。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから、アプタマーを取得したい場合、上記吸着能を有する核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。【００４４】
「血管新生抑制剤」は、新規血管新生抑制作用を持つ、本発明のポリペプチドの働きを利用又は促進することによって血管新生を抑制する働きを持つ。本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を含有するものと、本発明のポリペプチド等を使用したスクリーニングによって得られた、該ポリペプチドの血管新生抑制作用を促進する働きを持つ化合物又はその塩等を含有するものが挙げられる（以下、「本発明の血管新生抑制剤」と称することもある）。該血管新生抑制剤は、前記疾患の中で、血管新生が起こることにより症状が重篤になり得る疾患の予防剤又は治療剤として使用することができる。該血管新生抑制剤が有効である疾患としては、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生物等が挙げられる。【００４５】
「血管新生誘導剤」は、新規血管新生抑制作用を持つ、本発明のポリペプチドの働きを抑制することによって血管新生を誘導する働きを持つ。本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を認識する中和抗体又はアプタマーを含有するもの、本発明のポリペプチド等を使用したスクリーニングによって得られた、該ポリペプチドの血管新生抑制作用を抑制する働きを持つ化合物又はその塩等を含有するものが挙げられる（以下、「本発明の血管新生誘導剤」と称することもある）。該血管新生誘導剤は、前記疾患の中で、血管新生が起こることにより症状が軽減し得る疾患の予防剤又は治療剤として使用することができる。該血管新生誘導剤が有効である疾患としては、損傷の治癒、炎症の修復、虚血性心疾患や末梢性血管疾患、動脈硬化等が挙げられる。【００４６】
以下に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の遺伝子」と称することもある。）の取得方法、本発明のポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドに結合する物質のスクリーニング方法、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質との結合を調節する結合活性調節物質のスクリーニング方法、該ポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法について、詳細に説明する。【００４７】
本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母及び大腸菌での組換えポリペプチドの生産技術、分子生物学的手法、発現したポリペプチドの分離精製法、分析法及び免疫学的手法が採用される。【００４８】
本発明の遺伝子の取得方法
ヒトの脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、バソヒビンをコードするＤＮＡを取得する。また、オリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするバソヒビンをコードするＤＮＡを調製することができる。こうして得られたバソヒビンをコードするＤＮＡを適切な制限酵素で切断することにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。【００４９】
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ストラタジーン社製）等を用いる方法が挙げられる。【００５０】
また、アミノ酸配列に基づいて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。【００５１】
本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。
バソヒビンをコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該ポリペプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片、又は全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のポリペプチド遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００５２】
（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のプリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００５３】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３-２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ-１（プロメガ社製）、ｐＱＥ-８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ-ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８-１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０７）、ｐＴｒｓ３２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０８)、ｐＧＨＡ２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-４００)、ｐＧＫＡ２(ＦＥＲＭ  Ｂ-６７９８)、ｐＰＡ１（特開昭６３-２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３-２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）等を例示することができる。【００５４】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００５５】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００５６】
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株等が、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株等が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株等が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株等が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株等が、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株等が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株等が例示される。【００５７】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法等があげられる。【００５８】
（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーター等が挙げられる。
宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種及びＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種等が挙げられる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍy  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法等が挙げられる。【００５９】
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）等を用いることができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００６０】
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。【００６１】
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）。【００６２】
（ｉｖ）植物細胞を宿主として用いる場合
宿主として植物細胞又は植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。【００６３】
宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。【００６４】
（ｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）等が、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ等が挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．等に記載の方法が用いられる。【００６５】
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクター及び昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりポリペプチドを発現することができる。
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞等が挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）等が、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）等が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｃｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）等を挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）等も用いることができる。【００６６】
（ｖｉ）培養方法
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００６７】
形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。【００６８】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００６９】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００７０】
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下等の条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）等を用いることができる。【００７１】
（ｖｉｉ）製造方法
本発明のポリペプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリペプチドを単離・精製することにより製造することができる。本発明のポリペプチドの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。
本発明のポリペプチドが溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離する。本発明のポリペプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は菌体をＳＴＥ溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
本発明のポリペプチドの分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等を含んでいてもよい。
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組み合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法等の各種電気泳動等が例示される。【００７２】
本発明のポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。【００７３】
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧ等が例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、本発明のポリペプチドとプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドとＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。【００７４】
本発明のポリペプチドは、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器をにより化学合成することができる。
本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドのコルジン活性は、公知の測定法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８，９８９３−９８９８（１９８３）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，５８−６５（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，４３３−４４０（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７０，６３０−６４６（１９８９）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７４，１４−２５（１９８９）．、特開平６−１８１７５９）に準じて測定することができる。【００７５】
変異型ポリペプチドの作製方法
本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失又は置換は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。１若しくは数個のアミノ酸が欠失又は置換は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ  ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．等に記載の方法に準じて調製することができる。【００７６】
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリペプチドの全長、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチド含むポリペプチドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）や牛チログロブリン（ＢＴＧ）等に結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）及び不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター等を用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））等に従って作製することができる。
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラム等の各種クロマトグラフィーを単独又は組み合わせることで行うことができる。【００７７】
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
モノクローナル抗体は、（ｉ）で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓又はリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウス又はラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従って作製することができる。
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。【００７８】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）．、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）．）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）．）等が用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ  ８−アザグアニンを含む正常培地（１．５ｍＭ  グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ジェンタマイシン及び１０％  ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地））で継代し、細胞融合を行う３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０７個以上用いる。【００７９】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で調製した抗体産生細胞と（ｂ）で調製した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地又はＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３ｇリン酸二ナトリウム、０．２１ｇリン酸一カリウム、７．６５ｇＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０８当たり、ポリエチレングリコール溶液（２ｇ  ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ  ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０−４Ｍ  ヒポキサンチン、１．５×１０−５Ｍ  チミジン及び４×１０−７Ｍ  アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））等に記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。【００８０】
本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法
本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリペプチド又はその部分ペプチドに対する抗体を直接又は間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックス等に結合した標識体を用いることにより該ポリペプチド又はその部分ペプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、１２５Ｉ等の放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法等が例示される。
また、そのような測定方法として、ウェスタンブロット法及び免疫組織染色等も例示される。
また、そのような本発明のポリペプチドの検出方法あるいは測定方法において、該ペプチドまたはその部分ペプチドに対する抗体の代わりに、該ペプチドまたはその部分ペプチドに対するアプタマーを使用することができる。
さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドを定量することもできる。
免疫学的検出方法に使用する抗体は固相支持体に固定されていても良く、結合したポリペプチドを、レポーター基を有する２次抗体又は試薬を用いて検出することもできる。また、本発明のポリペプチドをレポーター基で標識し、抗体及び試料と共に反応させた後、固定抗体と結合させられる、競合法によっても検出できる。試料の本発明のポリペプチドによる同標識ポリペプチドと抗体との結合を阻害する程度は、試料の固定抗体との反応性により示され、試料中の本発明のポリペプチドの濃度を算出することができる。固相支持体としては、抗体が付着しできる、当業者に公知の任意の物質であれば何れのものでもよく、例えば、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース膜等のメンブレン、ビーズ、ディスク、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス又はポリスチレン又はポリ塩化ビニル等の可塑性物質が挙げられる。磁性粒子又は繊維光学センサー（ＵＳ  ５３５９６８１等）も用いることが可能である。抗体の支持体への固相方法は、当該分野に公知の方法を用いることができる。本明細書において、「固相」とは、吸着等の物理的方法又は抗体と支持体上の官能基との共有結合による化学的方法による固定を意味する。抗体と支持体上の官能基は直接結合しても良いが、架橋剤等を介して結合してもよい。【００８１】
物理的方法による固定は、適切な緩衝液中で適宜希釈した抗体を支持体、好ましくは、マイクロタイタープレート又はメンブレンと適切な時間の間接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日の間である。ポリスチレン又はポリ塩化ビニル等のプラスチック製のマイクロタイタープレートの各ウェルに約１０ｎｇから約１μｇ、好ましくは、約１００〜２００ｎｇの抗体を添加し抗体を固定する。
化学的方法による固定は、支持体と抗体の官能基、例えば、水酸基又はアミノ基の両方に反応する二官能性試薬と支持体を反応させることにより達成され得る。例えば、抗体は、適切なポリマーコートを有する支持体に、ベンゾキノンを用いるか又は支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合により、共有結合することで固相することができる。このような手法は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１）Ａ１２〜Ａ１３を参照して行うことができる。
抗体を固相した支持体は他のポリペプチドの物理的吸着を阻害するために当業者に公知の方法で、適切なブロッキング剤、例えば、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマアルドリッチ社製）等により処理をおこなう。
抗体固相支持体と試料を反応させ、本発明のポリペプチドと抗体を結合させる。試料は、適切な希釈液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等で適宜希釈してもよい。試料と抗体の反応時間は、癌を有する個体から得られた試料中の本発明のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間で、好ましくは、結合ポリペプチド及び非結合ポリペプチドとの間の平衡に達成する結合レベルの少なくとも９５％の結合レベルに達成する時間である。平衡に達成する時間は、経時的に結合レベルを測定することにより容易に決定することができる。結合ポリペプチド以外は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）等で固相支持体を洗浄することにより除去することができる。標識された２次抗体と固相支持体を反応させる。標識としては、好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性同位体、発色物質、蛍光物質等が用いられる。抗体と標識との結合は、当業者に公知の方法により行うことができる。２次抗体は、固相抗体と本発明のポリペプチドとの複合体に結合するのに十分な時間反応を行う。適切な時間は、結合レベルを経時的に測定することにより容易に決定することができる。非結合２次抗体は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）等で固相支持体を洗浄することにより除去することができる。２次抗体の標識を検出する方法は、標識の種類によって異なる。標識として放射性同位体を用いる場合、シンチレーションカウンターやオートラジオグラフィーによる検出が用いられる。標識として色素、発色物質及び蛍光物質等を用いる場合、分光光度計による検出が用いられる。標識として酵素を用いる場合、それに対する基質を添加し、一定時間反応後における生成物を分光光度計等で検出する。標識と２次抗体は直接結合されていても良いが、アビジン−ビオチン等により間接的に結合したものを用いてもよい。その場合、一方を２次抗体に結合し、他方を標識することにより検出することが可能となる。【００８２】
また、本発明のポリペプチドはフロースルー試験又はストリップ試験で検出することができる。抗体をニトロセルロース膜等のメンブランに固定したものに、フロースルー試験においては、試料を添加し、試料がメンブレンを通過すると、ポリペプチドが固相抗体に結合して免疫複合体を形成し、標識２次抗体を含む溶液がメンブレンを通過すると該免疫複合体に結合する。ストリップ試験においては、試料を添加し、試料が標識抗体を含む領域を通過すると、ポリペプチドが標識抗体と結合して免疫複合体を形成し、固相抗体を含む領域を通過すると該免疫複合体が結合し、固相抗体領域で検出される２次抗体の量が、癌の有無を示す。検出部位での標識は、視覚で確認でき、確認できない場合は陰性であることが示される。メンブレンに固相される抗体の量は、好ましくは、約２５ｎｇ〜約１μｇであり、より好ましくは約５０ｎｇ〜約１μｇである。【００８３】
疾患の検出方法
本発明のポリペプチドは、血管新生モデルで発現が増加していることから血管新生が関連する疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等の診断に利用することができる。さらに、該ポリペプチドの発現が卵巣癌及び大腸癌組織中で増加していることを見出し、それらの癌の診断に利用することができる。患者における癌の存在又は非存在は、生物学的試料、例えば、患者から取得した癌又は正常組織生検、切除組織、血液、リンパ節、血清、尿又は他の組織、これらのホモジェネート又は抽出物等から本発明のポリペプチドを特異的に検出し、その発現量を健常者又は正常組織と比較することにより決定することができる。
疾患の検出方法としては、該ポリペプチドの免疫学的検出方法等が例示される。
該ポリペプチドの免疫学的検出方法として、該ポリペプチドと反応する異なるエピトープを認識する２種類の抗体のうち一方を直接又は間接的に酵素で標識したものを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法や１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した該ポリペプチドとそれを認識する抗体を用いる競合ＲＩＡ法等を挙げることができる。【００８４】
癌の存在又は非存在は、正常者試料と患者試料において検出した本発明のポリペプチドを測定し、比較することによって達成され得る。一般的に、非癌組織から確立された癌を有さない患者由来の試料から得られる本発明のポリペプチドの平均値をカットオフ値とし、試料からの本発明のポリペプチドの検出値とカットオフ値を比較する。一般的に、検出値がカットオフ値に標準偏差の三倍値を加えた値を越える場合、その試料は癌について陽性と考えられる。また、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｅｎｅ  １０６−１０７，（１９８５）．（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ）の方法に従うＲｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐａｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを用いて決定される。【００８５】
診断用キット
本発明の診断用キットは、本発明のポリペプチドを標準試薬として含有する。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて免疫学的手法によっても血管新生が関連する疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は卵巣癌及び大腸癌等の癌の診断を行なうことができる。【００８６】
結合物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドに対する結合物質を探索又はスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明のポリペプチドと被検物質とを接触させることを特徴とする該ポリペプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、例えば、天然又は化学的に合成された化学物質、タンパク質、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル等の哺乳動物の組織抽出物、細胞培養物等が用いられる。これらの被検物質を本発明のポリペプチドと共に添加し、血管内皮細胞のＤＮＡ合成活性等を測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを用いるか、組換え型ポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いるか、又は本発明のポリペプチドに結合して細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性又は抑制する活性、細胞遊走活性等を測定するか、血管内皮細胞の管腔形成を顕微鏡等で視覚的に測定する方法等が例示される。
まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリペプチドとしては、本発明のポリペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリペプチドが適している。本発明のポリペプチドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするポリペプチド部分をコードするＤＮＡ断片には、通常、相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター等の下流に組み込むのが好ましい。発現したポリペプチドの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７，１９５５５〜１９５５９（１９９２）．に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、本発明の結合物質スクリーニング方法において、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリペプチドもしくはその部分ペプチドであってもよいし、該ポリペプチドを含有する細胞又はその細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をアガロースゲル等に固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。本発明のポリペプチドを含有する細胞としては、本発明のポリペプチドを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。
本発明のポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、適当なポリペプチド画分と、標識した被験物質が必要である。ポリペプチド画分としては、天然型のポリペプチド画分か、又はそれと同等の活性を有する組換え型ポリペプチド画分等が望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用等を示す。標識した被験物質としては、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ等で標識したものが例示される。
具体的には、本発明のポリペプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を行なうには、まず、本発明のポリペプチドを含有する細胞又は細胞の膜画分を、スクリーニング方法に適したバッファーに懸濁することによりポリペプチド標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレート等の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチン等の各種タンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍlの該ポリペプチド溶液に、一定量、好ましくは、５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍの３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ等で標識した被験物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、好ましくは４℃から３７℃で、２０分から２４時間、好ましくは３０分から３時間で行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験物質を本発明のマーカーに対する結合物質として選択することができる。
本発明のポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、該ポリペプチドを介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性又は抑制する活性、細胞遊走活性等を公知の方法又は市販の測定用キットを用いて測定することができる。また、血管内皮細胞の管腔形成を顕微鏡等で視覚的に測定する方法により測定することもできる。具体的には、まず、ポリペプチドを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。結合物質のスクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、被験物質等を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。【００８７】
結合活性調節物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに対する結合活性調節物質を探索又はスクリーニングするための試薬として有用である。該ポリペプチドと結合物質との結合活性調節物質、すなわち、結合性を変化させる物質のスクリーニング方法としては、本発明のポリペプチドを発現する組換え体発現系を構築し、バイオアッセイ系又は結合アッセイ系を用いることによって、結合物質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる物質、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を効率よくスクリーニングすることができる。このような物質には、（ａ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性又は抑制する活性、細胞遊走活性等を促進する活性又は抑制する活性等の増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のマーカーと結合物質を接触させた場合及び（ｉｉ）本発明のポリペプチドと結合物質及び被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドとの結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、（ｉ）及び（ｉｉ）の場合において、該ポリペプチドと結合物質との結合量を、例えば、細胞刺激活性等を測定することにより比較することを特徴とする。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法として、具体的には、（ａ）標識した結合物質を本発明のポリペプチド等に接触させた場合、及び、標識結合物質及び被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチド等に対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性を変化させる結合活性調節物質をスクリーニング方法、（ｂ）本発明のポリペプチド等を含有する細胞又は細胞培養液と標識結合物質を接触させた場合及び標識結合物質及び被検物質を接触させた場合における、該細胞又は細胞培養液における該ポリペプチド等に対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、（ｃ）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリペプチド等と標識結合物質を接触させた場合及び標識結合物質及び被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチド等に対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法等が挙げられる。【００８８】
発現調節物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対する発現調節物質を探索又はスクリーニングするための試薬として有用である。
すなわち、本発明の発現調節物質スクリーニング方法は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞、又は（ｉｉ）形質転換体等に含まれる本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドのｍＲＮＡ量あるいはタンパク質量を測定することにより、本発明のマーカーの発現調節物質のスクリーニングを行うことができる。【００８９】
具体的には、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等に対して、薬剤、例えば、抗癌剤等を投与し、一定時間経過した後、血液、特定の臓器、例えば、脳、腎臓、大腸、卵巣等、あるいは臓器から単離した組織又は細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例えば、当該分野において周知の抽出方法によりｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲ等の手法を用いることにより定量、又は周知のノーザンブロット法により解析することもできる、又は（ｉｉ）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。【００９０】
本発明は上記スクリーニング方法に使用することのできる「スクリーニングキット」も含有する。該スクリーニングキットには少なくとも本発明のポリペプチド、本発明の遺伝子、該遺伝子を保持してなる核酸構築物、該遺伝子が導入された細胞、本発明のポリペプチドの抗体又はアプタマー等が含まれている。【００９１】
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
−  本発明のポリペプチドを含有してなるキット、
−  本発明の遺伝子を含む核酸構築物を含有してなるキット、
−  本発明の遺伝子が導入された細胞を含有してなるキット、
−  本発明のポリペプチドに対する抗体又はその断片を含有してなるキット、
−  本発明のポリペプチドに対するアプタマーを含有してなるキット、等が挙げられる。【００９２】
また、各キットには、所望により、本発明のスクリーニング方法に好適に使用されうる前記プローブ及び／又はプライマー対を含有させてもよい。さらには、所望により検出用試薬、緩衝液、標準物質、本発明のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含有させてもよい。【００９３】
医薬組成物
本発明のポリペプチド、該ポリペプチドの中和抗体、該ポリペプチドのアプタマー、若しくは上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物等から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物（血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤）は、予防又は治療剤として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。本発明の医薬組成物は、血管新生関連疾患に対し、本発明のポリペプチドの発現そのもの（血管新生抑制作用を持つ）又は該ポリペプチドの発現に対する作用（例えば、該発現に対して促進的又は抑制的に働く）を介して治療又は予防効果を発揮する。本発明のポリペプチドが血管内皮細胞のＤＮＡ合成を抑制すること、細胞遊走活性を抑制することからＤＮＡ合成阻害剤及び細胞遊走活性阻害剤も包含される。本発明のポリペプチド含有する医薬組成物は、治療薬として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。【００９４】
本発明の医薬組成物は、前記ポリペプチド、中和抗体、アプタマー又は化合物を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。【００９５】
錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含むＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のアルコール類、ポリソルベート８０やＨＣＯ−５０等非イオン性界面活性剤等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。【００９６】
また、上記医薬組成物は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等の安定剤、ベンジルアルコール、フェノール等の保存剤、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等の哺乳動物に対して投与することができる。【００９７】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。【００９８】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。【００９９】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等が挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリン等が例示される。該物質及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【０１００】
本発明の医薬組成物の薬理評価は、例えば、血管新生関連疾患モデルマウスに、本発明の医薬組成物を投与し、非投与動物に比べ、投与動物において、血管新生関連疾患の改善が見られた場合を指標として評価する方法により行なうことができる。【０１０１】
また、本発明の医薬組成物は、食品又は飼料に添加して用いてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を１種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本発明の医薬組成物が配合された食品及び飼料は、血管新生が関係する疾患の予防及び／又は治療のための健康補助用機能性食品として有用である。【０１０２】
本発明の遺伝子若しくは上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物（核酸又はその誘導体）等から選択される少なくとも一つを含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター又は血管新生を誘導するための発現ベクターは、血管新生関連疾患に対し、治療又は予防効果を発揮する。【０１０３】
本発明の発現ベクターの作製方法、細胞における発現方法等は上記「本発明の遺伝子の取得方法」及び「本発明のポリペプチドの作製方法」に記載の発現ベクターと同様である。【０１０４】
本発明の発現ベクターは安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含む哺乳動物の細胞内でタンパク質を発現でき、かつ、安全性の高いＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクター又はプラスミドベクターを用いるのが好ましい。遺伝子治療に好ましいウイルスベクターとしては，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が挙げられる。遺伝子治療に好ましいプラスミドとしては、ｐＣＡＧＧＳ[Gene,108,193-200(1991)]、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）等が挙げられる。【０１０５】
本発明の発現ベクターの患者への導入方法としては、該ベクターを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。【０１０６】
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与される。例えば、病変の認められる組織に直接局所投与するか又は静脈、動脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エアロゾル的等により投与することも可能である。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与が好ましい。また、病変の見られる組織の直接注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコンピューター断層撮影等の当該技術分野で利用できる任意のものを使用して病変の見られる組織を撮影し、例えば、定位注射により本発明のベクターを投与することができる。【０１０７】
なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにシグナル配列を付加することにより、分泌タンパク質となり、局所投与する必要は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌されたタンパク質が遠く離れた標的臓器に作用し、血管新生抑制作用を生ずる。従って、病理組織以外の正常組織内又は正常細胞内への投与も可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい。【０１０８】
本発明のベクターの製剤（遺伝子治療剤）の形態としては、上記の各投与形態にあった種々の製剤形態をとることができる。例えば、有効成分である本発明のＤＮＡを含有する注射剤とした場合、当該注射剤は常法により調整することができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられ得る。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調整してもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用事溶解用製剤とすることもできる。【０１０９】
製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができるが、通常患者（体重６０ｋｇとして）においては一般に本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。【０１１０】
治療方法
前述の医薬組成物が血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌の治療剤となり得ることから、該医薬組成物を適宜・適切な方法で投与することにより、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は癌等の疾患を治療する方法が提供される。そのような方法としては、前述の医薬組成物を、治療に際して最も効果的な投与方法を使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与を挙げることができる。【０１１１】
前述で調製された治療剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等の哺乳動物に対して投与することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与方法としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、１回若しくは複数回投与すること等が挙げられる。投与期間も特に限定されるものではない。【０１１２】
以下実施例は、例示のために提供され、そして限定するためではない。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｐｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）．に記載されている方法を用いた。
【実施例１】
【０１１３】
アミノ酸置換によるVasohibinタンパク質のプロセッシング部位の解析
J. Clin. Invest. 114: 898-907, (2004)に記載のプラスミドｐFLAG14-KIAA1036よりバソヒビンｃDNAを、3xFLAGタグを接続した形で切り出し、レトロウイルスベクターpMXに挿入し、pMX1036とした。プラスミドpMX1036を鋳型として、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社）により、バソヒビンｃDNAがコードしている配列番号：2のアミノ酸のうち、29、76、94、96、130、148、296、299、302、318、334、335、338、341、342位のアルギニン、及び、79、83、90、103位のリジンをそれぞれアラニンに置換することにより、合計19種類のアミノ酸置換体バソヒビン発現レトロウイルスベクターを作製した。これらのプラスミド各２μgをそれぞれパッケージング・ベクターpCLampho（IMGENEX社）0.2 μgと共にFuGENE6試薬（Roche Diagnostics 社）により2.5x105個のHEK293細胞に導入し、10％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Sigma社）中にて48時間培養した。培養液を回収後、同培地により2倍に希釈し、10 μgポリブレンを加え、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）由来血管内皮細胞株に48時間感染させた。同細胞をRIPAバッファー（10 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, 0.1% Triton X100）に懸濁後、14500 x gにて10分遠心した上清を細胞抽出液とした。ウェスタンブロットは10μgの細胞抽出液をLaemliの方法にしたがって、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜（テフコ社）に電気的に転写した後、2％ブロッキング試薬（Amersham  BioSciences社）と0.05％TritonX-100を含んだTBS(0.15 M NaClを含むTris-HCl, pH 7.4)中にてブロッキングし、HRP標識した抗Vasohibin mAbと反応させた。0.05％TritonX-100を含んだTBSにて15分間4回洗浄後、ECL-Advance試薬（Amersham BioSciences社）によって化学発光させ、それをHyperfilmECLフィルム（Amersham BioSciences社）に感光させることによって検出した。アミノ酸置換体におけるVasohibinタンパク質の分子量の変化は変異を加えない野生型Vasohibinタンパク質のものと比較することにより検討した。その結果、配列番号：２の29位のアルギニンをアラニンを置換した場合、野生型Vasohibinタンパク質の場合に検出された42kDのバンドが44kDにシフトした（図1）。従って、細胞内で発現した野生型Vasohibinタンパク質は29位と30位の間で切断を受けていることが示唆された。また、配列番号：2の76位のアルギニンをアラニンに置換した場合、野生型Vasohibinタンパク質の場合に検出された36kDのバンドが消失した（図2）。従って、野生型Vasohibinタンパク質は細胞内において配列番号：2の76位と77位の間で切断を受けていることが示唆された。また、野生型の場合にわずかに検出される32kD及び27kDのバンドも配列番号：2の76位のアルギニンをアラニンに置換した場合には検出されなくなり、これらの断片も配列番号：2の76位と77位の間での切断により生じていることが示された（図３）。以上の知見より、動物細胞内でのVasohibinタンパク質のプロセッシングは図4のパターンで行われるものと考えられる。
【実施例２】
【０１１４】
Vasohibin(77-365)及びVasohibin(77-318)のバキュロウイルスベクターを用いた発現
Vasohibin(77-365)（配列番号：2の77位から365位のアミノ酸からなる領域）とVasohibin(77-318)（配列番号：2の77位から318位のアミノ酸からなる領域）をコードするｃDNAを、昆虫細胞発現用ベクターであるpFASTBac１（インビトロジェン社）に挿入し、昆虫細胞発現用プラスミドpFASTBac-Vh(77-365)とpFASTBac-Vh(77-318)を構築した。昆虫細胞での発現にはBac-To-Bac Baculovirus Expression Systems  (インビトロジェン社)を使用し、操作等も付属のマニュアルに従った。すなわち、構築したpFASTBac-Vh(77-318)とpFASTBac-Vh(77-365)プラスミドをDH10Bac E.coli に形質転換し、組換えBacmidDNAを得た。次にこのBacmidDNAをCELLFECTIN試薬（インビトロジェン社）によってSf9細胞に遺伝子導入し、組換えバキュロウイルスを得た。このウイルス溶液0.5 ｍｌを１.5×１０６個／mlの濃度で50mlのSf9細胞に感染させるという割合で使用することとした。感染後７６時間培養し、遠心によって細胞を回収した。Vasohibin(77-318)タンパク質とVasohibin(77-365)タンパク質の昆虫細胞による発現確認は、このSf9細胞の抽出液とHRP標識した抗Vasohibin モノクローナル抗体（mAb, 4E12）を利用したウェスタンブロットによって行った。初めに、細胞を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて１回洗浄した後、5 mlのLysis 溶液（0.15 M NaCl，0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、0.1 mM amidinophenyl methansulufonyl fluride hydrochloride、0.1% NP-40を含む、50 mM Tris-HCl, pH 7.4）にて懸濁後、MICROCON（HEART SYSTEMS社製）にて超音波処理を氷冷しながら１５秒間４回行った後、14,500 x gにて20分間遠心し、上清に等量のLysis溶液を加えたものをライセート溶液とした。ウェスタンブロットは0.5μｌをLaemliの方法にしたがって、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜（テフコ社）に電気的に転写した後、５％スキムミルクを含んだTBS中にてブロッキングし、HRP標識した抗Vasohibin mAbと反応させた。0.05％TritonX-100を含んだTBS(0.15 M NaClを含むTris-HCl, pH 7.4)にて10分間３回洗浄後、ECL-Plus試薬（Amersham BioSciences社）によって化学発光させ、それをHyperfilmECLフィルム（Amersham BioSciences社）に感光させることによって検出した。タンパク質精製のために、抗Vasohibin抗体固相ゲルを調製した。方法はAminoLink Immobilization Kit (PIERCE社)のキットを使用し、操作等も付属のマニュアルに従った。タンパク質の精製はライセート溶液を0.05% Tween 20を含むTBSにて平衡化した抗Vasohibin抗体カラムに添加後、同溶液にて洗浄を行い、溶出液（0.02% Tween 20を含む6 mM HCl, pH 2.2）（0.5ml/画分）にて溶出し、ただちに1 M Tris-HCl, pH 8.0にて中和（溶出液0.5 mlに対し、7μl）することによって行った。各画分のウェスタンブロットあるいはSDS-PAGE後のBio-Safe Coomassie（Bio-Rad社）による染色によりVh(77-318)タンパク質とVh(77-365)タンパク質は、それぞれ約27kDaと約33kDaの単一バンドが確認された。
【実施例３】
【０１１５】
本発明のタンパク質によるin vivoにおける血管新生抑制効果
Vasohibin(77-365)タンパク質あるいはVasohibin(77-318)タンパク質が血管新生抑制能を有するかをJ. Immunol.１７０：５７０４−５７１１,（２００３）及びFASAB J. １８：３００−３１０,（２００４）に記載の方法に従いマウスの角膜マイクロポケット・アッセイにより検討した。０．３μgのハイドロン試薬（IFN Sciences社）に８０ngのFGF-2 タンパク質（fibroblast growth factor-2, BD Biosciences社）を混合し、さらに５ngのVasohibin(77-365)タンパク質あるいはVasohibin(77-318)タンパク質を加え、ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスの角膜に移植した。７日後、角膜に伸長した新生血管を写真撮影し、画像解析ソフトNational Institutes of Health（NIH）imageにより血管新生の定量分析を行った。その結果、FGF-2によって誘導される血管新生はVasohibin(77-365)タンパク質の存在下では有意に抑制されたが（図５）、Vasohibin(77-318)タンパク質の存在下では抑制されなかった（図６）。従って、野生型Vasohibinタンパク質あるいはそれに由来するポリペプチドが血管新生抑制活性を有するには、配列番号：2の319位から365位までのアミノ酸が必要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明のポリペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物等は血管新生抑制剤として使用することができる。該ポリペプチド等に対する中和抗体又はアプタマーは、血管新生誘導剤として使用することができる。また、該ポリペプチド、抗体等を用いて、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤をスクリーニングすることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号：１は、バソヒビンタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。【０１１８】
配列番号：２は、バソヒビンタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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