(57)【要約】  本発明の遺伝子導入細胞は、レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含み、該レポーター蛋白質の発現が実質的にエストロゲン応答配列により制御されるレポーターベクターが安定的に導入されていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含み、該レポーター蛋白質の発現が実質的にエストロゲン応答配列により制御されるレポーターベクターが安定的に導入されていることを特徴とする遺伝子導入細胞。
【請求項２】
レポーターベクターが安定的に導入された細胞が、ヒト乳癌由来培養細胞株である請求項１又は2項に記載の細胞。
【請求項３】
レポーターベクターが安定的に導入された細胞が、内在的にエストロゲンレセプターを高発現しているヒト乳癌由来培養細胞株MCF7である請求項１〜3項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項４】
レポーター蛋白質が、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の蛋白質であることを特徴とする請求項１〜3項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項５】
レポーター蛋白質が、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも1種由来の蛋白質であり、かつ該蛋白質の半減期が２時間〜６時間程度であることを特徴とする請求項１〜3項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が、エストロゲンを処理した場合と、処理しない場合との間で比較して、レポーター遺伝子の発現量が可視化又は区別可能な程度に差異を有する請求項１〜５項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項７】
前記差異が、エストロゲンを処理しない場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度と、エストロゲンを処理した場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度との違いである請求項６項に記載の細胞。
【請求項８】
前記エストロゲンを処理した場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度を境に高い発現強度の細胞数が、前記レポーター遺伝子による可視化が可能な程度に十分存在する請求項１〜７項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞にエストロゲンを処理した場合、処理したエストロゲン濃度に依存してレポーター遺伝子の発現量が変化することを特徴とする請求項１〜７項のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０】
受託番号FERM BP-10610として寄託されている細胞である請求項１〜９項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０項のいずれか1項に記載の細胞を用いて、エストロゲンシグナルの応答性を可視化することによって評価するエストロゲンシグナル評価方法。
【請求項１２】
乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項１３】
前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする請求項１２記載の評価方法。
【請求項１４】
乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項１５】
乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲン（テ
ストステロン）を投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたエストロゲンシグナル、あるいは脂肪間質細胞由来の、アロマターゼ酵素によらないエストロゲンレセプター活性化機構の双方あるいはいずれかによって誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項１６】
前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする請求項１５記載の評価方法。
【請求項１７】
乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたエストロゲンシグナル、あるいは脂肪間質細胞由来の、アロマターゼ酵素によらないエストロゲンレセプター活性化機構の双方あるいはいずれかによって誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項１８】
アロマターゼ阻害剤による、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの阻害作用を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲン、およびアロマターゼ阻害剤を同時に投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、アロマターゼ阻害剤による、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナルの阻害作用を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項１９】
前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする請求項１８記載の評価方法。
【請求項２０】
アロマターゼ阻害剤による、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの阻害作用を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンとアロマターゼ阻害剤を投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、アロマターゼ阻害剤による、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナルの阻害作用を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０項のいずれか1項に記載の評価方法を用いて、前記アロマターゼ阻害剤を添加した後のエストロゲンシグナルの有無によって、当該アロマターゼ阻害剤が、前記患者に特異的な癌抑制作用があるか否かを解析する阻害剤の解析方法。
【請求項２２】
乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：前記上清を、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に添加する工程、
B：前記上清により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項２３】
乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加し、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞と前記乳癌組織細切物を培養する工程、
B：前記乳癌組織細切物により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含む評価方法。
【請求項２４】
化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能の分析を行うことを特徴とする細胞分析方法。
【請求項２５】
前記レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、前記レポーター遺伝子導入細胞と、前記化学物質産生細胞を共生培養することを特徴とする請求項２４記載の細胞分析方法。
【請求項２６】
化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞を、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞を含む組織を培養液中で細切した後に遠心により得られた上清とともに培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能の分析を行うことを特徴とする細胞分析方法。
【請求項２７】
既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能を定量的に分析することを特徴とする請求項２４〜２６項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項２８】
化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを前記酵素（C）を阻害する阻害剤とともに共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記阻害剤の奏効性を分析することを特徴とする細胞分析方法。
【請求項２９】
前記レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、前記化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて該培養容器に添加し、該培養容器に前記阻害剤を添加することによって、前記レポーター遺伝子導入細胞と、前記化学物質産生細胞とを前記阻害剤とともに共生培養することを特徴とする請求項２８記載の細胞分析方法。
【請求項３０】
化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞を、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞を含む組織を細切した後に遠心により得られた上清と、前記酵素（C）を阻害する阻害剤とともに培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記阻害剤の奏効性を分析することを特徴とする細胞分析方法。
【請求項３１】
既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記阻害剤の奏効性を定量的に分析することを特徴とする請求項２８〜３０項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３２】
前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、前記レポーター遺伝子導入細胞は乳癌由来であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３３】
前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、かつ該遺伝子によってコードされるレポーター蛋白質の半減期が２時間〜６時間程度であり、前記レポーター遺伝子導入細胞は乳癌由来であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３４】
前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター遺伝子導入細胞は請求項１〜１０項のいずれか１項に記載の遺伝子導入細胞であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３５】
分析は前記レポーター遺伝子発現量の平均値に基づいて行われることを特徴とする請求項２４〜３４項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３６】
前記レポーター遺伝子発現量は取得画像から計測されることを特徴とする請求項２４〜３５項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項３７】
前記レポーター遺伝子導入細胞は培養容器底面に単層状に培養され、前記化学物質産生細胞は前記培養容器底面から上方に距離Ｌをおいて培養表面を有するキバン上に単層状に共生培養され、培養容器の下方から対物レンズを介して前記レポーター遺伝子導入細胞の画像が取得される請求項３６に記載の細胞分析方法。
【請求項３８】
前記キバンは取り外し可能に構成されており、前記キバンが取り外された後に画像が取得される請求項３７に記載の細胞分析方法。
【請求項３９】
前記距離Ｌは少なくとも前記対物レンズの焦点範囲外となる値であり、前記キバンは取り外されずに画像が取得される請求項３７に記載の細胞分析方法。
【請求項４０】
前記レポーター遺伝子導入細胞の核は、導入されたレポーター蛋白質の分光特性とは異なる分光特性で標識され、核の蛍光または発光画像により前記レポーター遺伝子導入細胞が画像処理により認識されてレポーター蛋白質の発現量が評価されることを特徴とする請求項３６に記載の細胞分析方法。
【請求項４１】
核画像の輝度特性を処理し画像中の細胞を認識し、この画像処理により認識された核の領域を2値化処理し、得られた2値化画像に対応する領域の蛍光または発光量が各細胞毎に計測されてレポーター遺伝子の発現量が評価されることを特徴とする請求項４０に記載の細胞分析方法。
【請求項４２】
核の標識はレポーター蛋白質の分光特性よりも長波長の特性を有していることを特徴とする請求項４０又は４１に記載の細胞分析方法。
【請求項４３】
前記レポーター蛋白質は緑色蛍光蛋白質であることを特徴とする請求項３２〜４２項のいずれか１項に記載の細胞分析方法
【請求項４４】
核の標識はＤＲＡＱ５による請求項４０〜４３項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項４５】
マイクロプレートのウエル内部に分析のための化学物質（A）または/および前記阻害剤があらかじめ定量（ゼロを含む）されて各ウエルにそれぞれ固相状態で添着されており、所定の溶融液により前記化学物質（A）または/および前記阻害剤が溶解され、分析に供されることを特徴とする請求項２４〜４４項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【請求項４６】
レポーター遺伝子の発現量の計測は共生培養開始後２４〜９６時間までの間に行われることを特徴とする請求項２４〜４５項のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入細胞、当該遺伝子導入細胞を用いたエストロゲンシグナル評価方法、当該評価方法を利用した阻害剤の解析方法、及び細胞分析方法に関し、特に、レポーター遺伝子を利用した遺伝子導入細胞、当該遺伝子導入細胞を用いたエストロゲンシグナル評価方法、当該評価方法を利用した阻害剤の解析方法、及びレポーター遺伝子を利用した細胞分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンは、特定の細胞(主として内分泌細胞、一部の神経細胞)によって、生体内外の情報に応じて生産分泌され、体液を介してのその情報を他の細胞へ伝達する物質をいう。主として、ホルモンは、インスリン、グルカゴンなどのペプチドホルモン、アンドロゲン、エストロゲンなどのステロイドホルモン、及びアドレナリンなどのアミンホルモンの3種に分類される。どのホルモンも標的細胞のホルモンレセプターと結合し、その物理的性質を変化させることにより、細胞内の反応に変化を誘起する。アミン、ペプチドホルモンは、主として細胞膜上で作用し、細胞膜の機能変化又は第二メッセンジャーの生産調節を解して細胞内の代謝を制御し、ステロイドホルモンは主として細胞質内、または核内でレセプターと結合し、遺伝情報の発現などを制御する。【０００３】
これらのホルモンの情報は、機能発現、恒常性(ホメオスタシス)の維持など生物の正常な生活を保証する重要な要因である。【０００４】
これらのホルモン情報には、種々の反応、酵素等が関係しており、時にはカスケード反応によって複雑に制御されて、生体内での恒常性が維持されている。【０００５】
ところで、上述したホルモンの中でエストロゲンは、乳癌発生、増殖と深く関係する女性ホルモンである。乳癌は、現在世界的にみて女性において罹患率第１位のがんであり、その対策が急務となっている。乳癌の多くはホルモン（エストロゲン）依存的に増殖する性質を持つホルモン依存性腫瘍である。乳癌細胞が外界からエストロゲンを受容すると、癌細胞において、エストロゲン受容体（エストロゲンレセプター：ＥＲ）を介して細胞増殖に関わるシグナル伝達系が活性化され、結果、細胞増殖が促進されて癌が進展する。ゆえに、乳癌の病態の評価において、乳癌組織におけるエストロゲンレセプターを介したシグナル伝達の活性化（以下エストロゲンシグナル）を解析することは非常に有用である。
現在、乳癌に対する薬剤治療の第１選択肢は、エストロゲンアンタゴニストであるタモキシフェンに代表されるような、抗エストロゲン効果のある薬剤を投与する、いわゆるホルモン療法である。エストロゲンアンタゴニストは、癌細胞中のエストロゲン受容体に結合するが、本来のエストロゲンと異なり、細胞増殖に関するシグナル伝達系を活性化せず、ゆえに抗腫瘍効果を発揮する。
現在、乳癌症例に対するホルモン療法の適用性は、各癌症例の乳癌組織中の癌細胞におけるエストロゲン受容体（エストロゲンレセプター：ER）の発現の有無により評価され、ER発現陽性症例が適用とされる。これは乳癌組織におけるエストロゲンシグナルについて、癌細胞側がエストロゲンを受容する能力を保持しているかを評価していることになる。
さて、癌細胞の増殖には癌細胞自身の性質も重要であるが、癌細胞と癌細胞をとりまく間質細胞との相互作用も非常に重要であるとの知見が近年得られている。乳癌において増殖促進作用をもつエストロゲンは、閉経前は主に卵巣にて産生されるが、閉経後は卵巣機能退縮のため、一般に女性の血中エストロゲン濃度は閉経前と比較し急激に低下する。しかしながら、閉経後女性の乳癌組織においては、局所的に高濃度のエストロゲンが検出され、これは主として、乳腺組織中で、癌細胞をとりまく脂肪間質細胞（以下、脂肪間質細胞）において、アロマターゼと呼ばれる酵素により、アンドロゲンを基質としてエストロゲンが合成され、乳腺組織中に放出されることによると考えられている。
よって近年、特に閉経後の乳癌に対しては、この脂肪間質細胞のアロマターゼ活性を阻害し、間質細胞から癌細胞へのエストロゲン供給を阻害することにより乳癌増殖を抑えるアロマターゼ阻害剤による治療が試みられ、これが従来のエストロゲンレセプター自身を標的とするタモキシフェンのような薬剤による治療と同等あるいは同等以上の効果があることが明らかになっており、このアロマターゼ阻害剤が、閉経後乳癌ホルモン療法における第１選択薬剤になりつつある。
しかしながら、個々の症例についてアロマターゼ阻害剤が有効であるか、その適用の評価は、従来のタモキシフェン等のエストロゲンレセプター自体を標的とした薬剤の場合に行われていた癌細胞におけるエストロゲンレセプター発現の有無のみでは不十分であるのは明らかである。なぜなら、癌細胞をとりまく脂肪間質細胞が、主としてアロマターゼ酵素活性を持つからであり、これを測定可能な、良い奏功性予測法が望まれている。
従来、乳癌組織中のアロマターゼ酵素活性を測定する試みはいくつかなされてきている。Santnerらは、乳癌あるいは境界悪性乳腺組織の間質細胞におけるアロマターゼ酵素活性の測定を、同細胞をトリチウム標識のアンドロステネジオン存在下で培養し、トリチウムの放出を測定することにより算出している（Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 82(1), pp200-208, 2005）。またQing Luらは、乳癌組織中の上皮細胞あるいは間質細胞について、アロマターゼ酵素活性そのものを測定するのでなく、アロマターゼに対する抗体を用いた組織免疫染色、あるいはウエスタンブロッティングにて、アロマターゼ酵素蛋白質の発現量を定量することにより、アロマターゼ酵素活性定量の代替を試みている（Journal of Endocrinology, 137(7), pp3061-3067, 2005）。
【発明の開示】
【０００６】
しかしながら、いずれの場合も、乳癌脂肪間質細胞における主としてアロマターゼ活性を介した乳癌細胞増殖促進能を評価するには、前者手法ではRIを用いるため非常に煩雑であること、後者ではアロマターゼ酵素量のみの評価であり、酵素活性とは必ずしも相関しない可能性もある等、実際、臨床においてアロマターゼ阻害剤の奏功性を評価する実用手法としては不十分と考えられる。
【０００７】
上述したように、現在ホルモン療法においては、必ずしもホルモン情報を的確に把握して、ホルモン療法が行われているのではない。臨床的には、薬剤、阻害剤などを投与して初めて効能が判明する。薬剤などの奏効性は、患者ごとに特異的な場合が多く、ある患者に対して効能が作用しても、他の患者には作用しない場合も多い。一旦臨床的に投与するとその分治療期間が増し、投与された薬剤が有効でない場合は、無用な治療期間を延長させることにもなる。
したがって、予め個々の患者にエストロゲンシグナルを介したホルモン療法が有効か否かをより的確に予想できるような細胞の分析方法が提供されれば、有用な情報を提供し得ることなる。しかしながら、このような細胞分析方法に関してこれまで知られていない。
また、ホルモン療法の副作用は、化学療法に比べて一般的に極めて軽いのが特徴であるが、タモキシフェンの長期間使用者では子宮がんや血栓症のリスクが、選択的アロマターゼ阻害剤の場合には骨粗鬆症のリスクが高まるなどの副作用がある。よって、予め乳がん患者にホルモン療法が有効であるか否かの客観的な判断材料を提供できれば、無用な副作用を発生させることなしに、患者に特異的なかつ有効な処方を提供できる。このような客観的判断材料は、エストロゲンシグナルの動態をその作用発現の段階において把握できれば、提供可能であるが、このような判断材料はこれまで知られていない。
【０００８】
そこで、本発明は、上記状況を鑑み、乳癌の病態評価において非常に重要である、乳癌組織におけるエストロゲンシグナルを評価可能なアッセイ系の提供を目的とする。具体的には、エストロゲンシグナルを定量的に評価可能な、新規遺伝子導入細胞系の樹立を第一の目的とし、また同細胞系を用いた、乳癌ホルモン療法における新規薬剤であるアロマターゼ阻害剤の、個々の癌症例に対する治療奏功性を予測可能なアッセイ系を提供することを第二の目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、乳癌ホルモン療法における新規薬剤であるアロマターゼ阻害剤の、個々の癌症例に対する治療奏功性を予測可能なアッセイ系を提供する。
さらに、本発明は、乳癌の病態評価に非常に重要なエストロゲンシグナルの定量的な評価を可能とする新規遺伝子導入細胞系を提供すること、また同細胞系を用いた、乳癌ホルモン療法における新規薬剤である主としてアロマターゼ阻害剤の、個々の癌症例に対する治療奏功性を予測可能なアッセイ系を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、ホルモン情報など、細胞内での伝達事項を可視化し得る細胞分析方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
１．エストロゲンシグナルの定量的評価が可能な新規遺伝子導入細胞系の確立
エストロゲンシグナルを定量的に評価することを目的とし、新規細胞系を樹立した。具体的には、エストロゲンを受容し活性化されたエストロゲンレセプターが特異的に結合するDNA配列、すなわちERE（エストロゲン応答配列）を、レポーター遺伝子の転写調節領域に組み込んだレポーター遺伝子を構築し、エストロゲンレセプターを内在的に高発現しているヒト乳癌由来培養細胞株に安定的に導入した新規乳癌培養細胞系を樹立した。
レポーター遺伝子としてはオワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質（以下GFP）を第一に選択した。GFPは他の多くのレポーター蛋白質と異なり、基質を添加せずともその発現量を可視的に検出・定量することが可能である。そのため、レポーター蛋白質発現量の定量時に細胞を破壊する必要がなく、ゆえにレポーター遺伝子導入細胞において、刺激を与えてからの経時的なレポーター蛋白質発現量の推移を検出することが可能となる。このような性質は、本発明の目的に好適であり、今回GFPを選択した。
よって本発明では、互いに異なる性質をもつ複数種類のGFPを選択し、各々をレポーター遺伝子として、それぞれの転写調節領域にERE（エストロゲン応答配列）を組み込んだレポーター遺伝子を複数種類構築した。これらを内在性にエストロゲンレセプターを高発現している2種の乳癌細胞株（MCF7およびＴ４７Ｄ）に導入し、レポーター遺伝子が安定的にゲノム中に導入されたクローンを複数クローン分離、新規細胞系として樹立し、樹立した個々の細胞系につき、そのエストロゲンシグナルに対する反応性を検証した。
その結果、レポーター遺伝子に用いたGFPの種類によって、あるいは同一のレポーター遺伝子を導入して得られた細胞系においても、個々の細胞系によって、エストロゲンシグナルに対する反応性は異なることが明らかとなった。特にエストロゲンシグナルを定量的に評価する場合には、レポーター蛋白質であるGFPの性質が重要であり、その半減期が2〜６時間程度であるものでないと定量評価が困難であることが本発明の過程で判明した。さらに半減期が2〜６時間程度のGFPをレポーター遺伝子として用いた場合でも、クローンにより反応性が異なり、添加したエストロゲンの濃度依存的にGFPが検出されるクローンを選択し、本発明の細胞を確立するに至った。
【００１２】
乳癌症例のアロマターゼ阻害剤奏功性を予測可能なアッセイ系の構築
次に、前記で確立した細胞系を用い、乳癌症例におけるアロマターゼ阻害剤奏功性を予測可能なアッセイ系の構築を実施した。具体的には、アロマターゼを産生し、アンドロゲンを基質としてエストロゲンを産生することにより、乳癌組織中の局所的なエストロゲン濃度を高め、乳癌増殖促進に大きく寄与していると考えられる患者乳癌組織中の脂肪間質細胞と、ERE（エストロゲン応答配列）をレポーター遺伝子の転写調節領域に組み込んだレポーター遺伝子を安定的に導入した新規乳癌培養細胞系とを共生培養し、さらにこれにアロマターゼの基質となるアンドロゲンを添加して培養することにより、脂肪間質細胞の主にアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルに依存してレポーター蛋白質が発現し、間質細胞からのエストロゲンシグナルを定量的に評価可能なアッセイ系を構築した。
このアッセイ系を用いれば、患者癌組織中の脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価可能となり、これを指標として脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ活性を介した癌細胞増殖促進能を評価することが可能となった。
さらには、脂肪間質細胞と前記レポーター遺伝子を安定的に導入した乳癌細胞系を共生培養し、これにアロマターゼの基質であるアンドロゲンのみを投与した場合（場合（1））と、同一濃度のアンドロゲン（テストステロンを添加し、さらにアロマターゼ阻害剤を添加して培養した場合（場合（2））で、それぞれレポーター遺伝子導入乳癌培養細胞におけるレポーター蛋白質の発現量を比較することで、添加したアロマターゼ阻害剤の阻害効果を定量的に評価可能となり、これを指標として、その脂肪間質細胞をもつ癌症例に対するアロマターゼ阻害剤の抗腫瘍効果、奏功性を予測することが可能となった。
また本発明において、前記アッセイ系を構築・評価する過程で、レポーター蛋白質の定量により検出されるエストロゲンシグナルが、必ずしも脂肪間質細胞におけるアロマターゼ酵素遺伝子の発現量と相関しないことが明らかになった。これは従来から予想されている、外界からのエストロゲン以外にエストロゲン受容体活性化機構が存在することを示唆し、この未解明のエストロゲンシグナル活性化機構に基づくエストロゲンシグナルをも本アッセイ系にて評価可能であることを示唆している。よって、本アッセイ系においては、脂肪間質細胞からのアロマターゼ活性由来のエストロゲンシグルのみならず、エストロゲン以外の未解明の機構を介したエストロゲンシグナルをも定量的に評価可能であり、乳癌組織において癌細胞の増殖に関わる実質的なエストロゲンシグナルの定量が可能であることが判明した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、上記目的を達成すべく特定組織の細胞株同士の共生培養について鋭意研究した結果、本発明の細胞分析方法を完成するに至った。
【００１４】
本発明の遺伝子導入細胞は、レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含み、該レポーター蛋白質の発現が実質的にエストロゲン応答配列により制御されるレポーターベクターが安定的に導入されていることを特徴とする。
【００１５】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、レポーターベクターが安定的に導入された細胞が、ヒト乳癌由来培養細胞株であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、レポーターベクターが安定的に導入された細胞が、内在的にエストロゲンレセプターを高発現しているヒト乳癌由来培養細胞株MCF7であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、レポーター蛋白質が、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の蛋白質であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、レポーター蛋白質が、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも1種由来の蛋白質であり、かつ該蛋白質の半減期が２時間〜６時間程度であることを特徴とする請求項１〜3項のいずれか1項に記載の細胞。
【００１９】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記細胞が、エストロゲンを処理した場合と、処理しない場合との間で比較して、レポーター遺伝子の発現量が可視化又は区別可能な程度に差異を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記差異が、エストロゲンを処理しない場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度と、エストロゲンを処理した場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度との違いであることを特徴とする。
【００２１】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記エストロゲンを処理した場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度を境に高い発現強度の細胞数が、前記レポーター遺伝子による可視化が可能な程度に十分存在することを特徴とする。
【００２２】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記細胞にエストロゲンを処理した場合、処理したエストロゲン濃度に依存してレポーター遺伝子の発現量が変化することを特徴とする。
【００２３】
本発明の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、上記遺伝子導入細胞が、受託番号FERM  BP-10610として寄託されている細胞であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のエストロゲンシグナル評価方法は、請求項１〜１０項のいずれか1項に記載の細胞を用いて、エストロゲンシグナルの応答性を可視化することによって評価することを特徴とする。
【００２５】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法の好ましい実施態様において、前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲン（テ
ストステロン）を投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたエストロゲンシグナル、あるいは脂肪間質細胞由来の、アロマターゼ酵素によらないエストロゲンレセプター活性化機構の双方あるいはいずれかによって誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法の好ましい実施態様において、前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする。
【００３０】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたエストロゲンシグナル、あるいは脂肪間質細胞由来の、アロマターゼ酵素によらないエストロゲンレセプター活性化機構の双方あるいはいずれかによって誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の阻害作用の評価方法は、アロマターゼ阻害剤による、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの阻害作用を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲン、およびアロマターゼ阻害剤を同時に投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、アロマターゼ阻害剤による、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナルの阻害作用を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明の阻害作用の評価方法の好ましい実施態様において、前記A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することを特徴とする。
【００３３】
また、本発明の阻害作用の評価方法は、アロマターゼ阻害剤による、乳癌組織由来脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの阻害作用を定量的に評価する方法であって、
Ａ：脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンとアロマターゼ阻害剤を投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、アロマターゼ阻害剤による、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナルの阻害作用を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３４】
また、本発明の阻害剤の解析方法は、請求項１８〜２０項のいずれか1項に記載の評価方法を用いて、前記アロマターゼ阻害剤を添加した後のエストロゲンシグナルの有無によって、当該アロマターゼ阻害剤が、前記患者に特異的な癌抑制作用があるか否かを解析することを特徴とする。
【００３５】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法は、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：前記上清を、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に添加する工程、
B：前記上清により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法は、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加し、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞と前記乳癌組織細切物を培養する工程、
B：前記乳癌組織細切物により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３７】
また、本発明の細胞分析方法は、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能の分析を行うことを特徴とする。
【００３８】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、前記レポーター遺伝子導入細胞と、前記化学物質産生細胞を共生培養することを特徴とする。
【００３９】
また、本発明の細胞分析方法は、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞を、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞を含む組織を培養液中で細切した後に遠心により得られた上清とともに培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能の分析を行うことを特徴とする。
【００４０】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能を定量的に分析することを特徴とする。
【００４１】
また、本発明の細胞分析方法は、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを前記酵素（C）を阻害する阻害剤とともに共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記阻害剤の奏効性を分析することを特徴とする。
【００４２】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、前記化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて該培養容器に添加し、該培養容器に前記阻害剤を添加することによって、前記レポーター遺伝子導入細胞と、前記化学物質産生細胞とを前記阻害剤とともに共生培養することを特徴とする。
【００４３】
また、本発明の細胞分析方法は、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞を、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞を含む組織を細切した後に遠心により得られた上清と、前記酵素（C）を阻害する阻害剤とともに培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記阻害剤の奏効性を分析することを特徴とする。
【００４４】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記阻害剤の奏効性を定量的に分析することを特徴とする。
【００４５】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、前記レポーター遺伝子導入細胞は乳癌由来であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする。
【００４６】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、かつ該遺伝子によってコードされるレポーター蛋白質の半減期が２時間〜６時間程度であり、前記レポーター遺伝子導入細胞は乳癌由来であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする。
【００４７】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター遺伝子導入細胞は請求項１〜１０項のいずれか１項に記載の遺伝子導入細胞であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞であることを特徴とする。
【００４８】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、分析は前記レポーター遺伝子発現量の平均値に基づいて行われることを特徴とする。
【００４９】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター遺伝子発現量は取得画像から計測されることを特徴とする。
【００５０】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター遺伝子導入細胞は培養容器底面に単層状に培養され、前記化学物質産生細胞は前記培養容器底面から上方に距離Ｌをおいて培養表面を有するキバン上に単層状に共生培養され、培養容器の下方から対物レンズを介して前記レポーター遺伝子導入細胞の画像が取得されることを特徴とする。
【００５１】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記キバンは取り外し可能に構成されており、前記キバンが取り外された後に画像が取得されることを特徴とする。
【００５２】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記距離Ｌは少なくとも前記対物レンズの焦点範囲外となる値であり、前記キバンは取り外されずに画像が取得されることを特徴とする。
【００５３】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター遺伝子導入細胞の核は、導入されたレポーター蛋白質の分光特性とは異なる分光特性で標識され、核の蛍光または発光画像により前記レポーター遺伝子導入細胞が画像処理により認識されてレポーター蛋白質の発現量が評価されることを特徴とする。
【００５４】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、核画像の輝度特性を処理し画像中の細胞を認識し、この画像処理により認識された核の領域を2値化処理し、得られた2値化画像に対応する領域の蛍光または発光量が各細胞毎に計測されてレポーター遺伝子の発現量が評価されることを特徴とする。
【００５５】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、核の標識はレポーター蛋白質の分光特性よりも長波長の特性を有していることを特徴とする。
【００５６】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、前記レポーター蛋白質は緑色蛍光蛋白質であることを特徴とする。
【００５７】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、核の標識はＤＲＡＱ５によることを特徴とする。
【００５８】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、マイクロプレートのウエル内部に分析のための化学物質（A）または/および前記阻害剤があらかじめ定量（ゼロを含む）されて各ウエルにそれぞれ固相状態で添着されており、所定の溶融液により前記化学物質（A）または/および前記阻害剤が溶解され、分析に供されることを特徴とする。
【００５９】
また、本発明の細胞分析方法の好ましい実施態様において、レポーター遺伝子の発現量の計測は共生培養開始後２４〜９６時間までの間に行われることを特徴とする。
【００６０】
本発明によれば、本発明の遺伝子導入細胞とエストロゲンシグナルの指示細胞として乳癌組織由来の間質細胞又は当該細胞を含む乳癌組織とを共生培養することにより、あるいは乳癌組織の抽出物を遺伝子導入細胞に添加して培養することにより、乳癌の特性を解析することができるという有利な効果を奏する。
【００６１】
また、本発明の細胞分析方法によれば、予めホルモン情報など、細胞内での伝達事項を可視化し得る細胞分析方法を提供することが可能であるという有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、構築したエストロゲンシグナルレポーター遺伝子ERE-GFPの図を示す。
【図２】図２は、樹立したERE-GFP安定導入MCF7細胞系（ERE-GFP-Eシリーズ）、およびEREを含まないpd2EGFP-1ベクターのみをMCF7に安定導入した細胞系における、E2処理ならびに無処理群でのGFP発現の評価（蛍光顕微鏡による評価）を示す。
【図３】図３は、樹立したERE-GFP安定導入MCF7細胞系（ERE-GFP-Eシリーズ）、およびEREを含まないpd2EGFP-1ベクターのみをMCF7に安定導入した細胞系における、E2処理ならびに無処理群でのGFP発現の評価（フローサイトメーターによる評価）を示す。
【図４】図４は、ERE-GFP-E10細胞系においてE2添加により誘導されるGFP発現の評価と生細胞数の計測結果を示す。
【図５】図５は、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による乳癌におけるエストロゲンシグナル検出を示す。
【図６】図６は、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による乳癌各症例におけるエストロゲンシグナル検出を示す。
【図７】図７は、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による乳癌各症例におけるエストロゲンシグナル検出を示す。
【図８】図８は、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による乳癌各症例におけるエストロゲンシグナルの定量と、同脂肪間質細胞中のアロマターゼ遺伝子mRNA量の発現量との比較を示す。
【図９】図９は、各種アロマターゼ阻害剤存在下での、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養によるアロマターゼ阻害剤によるエストロゲンシグナル阻害効果の解析を示す。
【図１０】図１０は、手術摘出乳癌組織検体抽出上清を用いた、当該乳癌組織によるエストロゲンシグナル誘導の定量的検出を示す。
【図１１】図１１は、インサートウェルを用いた手術摘出乳癌組織検体細切物との共生培養による当該乳癌組織のエストロゲンシグナル誘導の定量的検出を示す。
【図１２】図１２は、２４ウエルを有するマイクロプレートを示す図である。
【図１３】図１３は、マイクロプレートの断面図である。
【図１４】図１４は、細胞画像解析方法の流れを示す図である。
【図１５】図１５は、画像解析の流れを示す図である。
【図１６】図１６は、二値化画像の細胞領域の分割の様子を示す図である。
【図１７】図１７は、複数細胞核の認識の様子を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。【００６４】
本願の遺伝子導入細胞には、レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含み、該レポーター蛋白質の発現が実質的にエストロゲン応答配列により制御されるレポーターベクターが安定的に導入されている。
本発明細胞を調製するに際し、ＤＮＡを導入する宿主細胞として用いることのできる細胞としては、例えば、ヒト乳癌由来培養細胞を挙げることができ、細胞としては、例えば、ヒト由来のMCF7細胞 、Ｔ４７Ｄ細胞などを挙げることができる。
ここで、エストロゲン認識配列とは、一般にエストロゲン応答配列（estrogen response element；ERE）と呼ばれる特定の塩基配列であって、エストロゲンレセプターによって転写活性が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在し、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体が、該配列を認識しここに結合してエストロゲン依存性に標的遺伝子の転写を促進する。このようなエストロゲン認識配列としては、具体的には例えば、PS2のERE、プログステロンレセプター、卵黄タンパク前駆体であるビテロゲニン、卵白タンパクのオバルブミンのRRE等が挙げられる。かかる塩基配列を有するＤＮＡは、化学合成するか、PCR法などにより増幅しクローニングする等により調製することができる。また、EREのコンセンサス配列[5'-AGGTCAnnnTGACCTT-3'（配列番号１）]を１回以上含む塩基配列からなるDNAを化学合成して用いてもよい。プロモーター配列としては、例えば、TK（チミジンキナーゼ）を用いることができる。【００６５】
本発明細胞を作製するに際し、宿主細胞(培養細胞)の形質転換に用いられるＤＮＡには、レポーター遺伝子の他に、宿主細胞で機能可能な細胞選択マーカー遺伝子を含むことができる。ここでレポーター遺伝子とは、レポーター蛋白質をコードする遺伝子を意味する。細胞選択マーカー遺伝子とは、該遺伝子を含むＤＮＡで形質転換された細胞を非形質転換細胞と見分ける際に目印となり得る表現形質をコードする遺伝子である。培養細胞内で機能可能なとは、培養細胞で前記形質を発現することができることを意味し、例えば、培養細胞で転写開始能を有するプロモーターの制御下にあって培養細胞で発現可能な状態にある遺伝子であって、培養細胞で有効な細胞選択用の表現形質をコードする遺伝子があげられる。培養細胞で有効な細胞選択マーカー遺伝子としては、例えば、培養細胞の増殖を抑制または阻害する薬剤に対する耐性を細胞に付与することの可能な遺伝子をあげることができ、具体的には例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子（ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子）などが挙げられ、形質転換細胞 の選抜がより短期間で行える点でブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子を好ましくあげることができる。ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子は、例えば、市販のプラスミドpUCSV-BSDなどから得ることができる。【００６６】
「レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含むDNA」は、例えばこれらの遺伝子を同一ベクター上に組込むことによって調製することができる。ベクターとしては、取扱い易く、ベクター分子内または分子間の遺伝子組換えや安定形質転換細胞における染色体からの脱落等が起こる頻度が低くなると期待される点から、コンパクトな大きさであることが望ましく、例えば、およそ２ｋｂ〜１０ｋｂ程度のプラスミドがあげられる。また、該ベクターに遺伝子を組込むにあたって大腸菌を宿主として使用すると効率よく操作を行うことができる点から、大腸菌ベクターとしての機能、すなわち大腸菌内で機能可能な複製起点、薬剤耐性遺伝子、遺伝子挿入用制限酵素認識部位等を有していることが好ましい。より具体的には例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子 ）を保有するプラスミドの該遺伝子の上流に、アフリカツメガエルのビテロゲニン遺伝子の5'上流領域に由来しエストロゲンレセプター認識配列を含む塩基配列からなるＤＮＡとマウスメタロチオネインＩ遺伝子由来の最小プロモーターとを組込み、さらに、該プラスミドに、例えばＳＶ４０初期プロモーターに接続されてなるブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子を組込むことにより、上記の構成のＤＮＡを調製することができる。【００６７】
また、本願の遺伝子導入細胞の好適な実施態様において、レポーター蛋白質が、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の蛋白質である。レポーター蛋白質としては、好ましくは、GFP、RFP等の蛍光蛋白質である。また、好ましい態様において、当該蛋白質の半減期は、２時間〜6時間程度である。【００６８】
これらの遺伝子を組み込むことにより、エストロゲンーエストロゲンレセプター複合体がエストロゲン認識配列に結合して発現する発現物質の発現量を可視化することが可能となる。ここでいう発現物質とは、癌増殖に関与する因子等を含む。【００６９】
また、本願の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記細胞が、エストロゲンを処理した場合と、処理しない場合との間で比較して、エストロゲン受容体の発現量が、前記レポーター遺伝子による可視化が可能な程度に差異を有する。これについて、図３を用いて詳細に説明する。図３は、樹立したERE-GFP安定導入MCF7細胞系（ERE-GFP-Eシリーズ）、およびEREを含まないpd2EGFP-1ベクターのみをMCF7に安定導入した細胞系における、E2処理ならびに無処理群でのGFP発現の評価#2━フローサイトメーターによる評価を示す図である。【００７０】
図３において、pdE２−GFP-4が、コントロールを示す。pdE２−GFP-4は、(エストロゲン認識配列)EREを欠く。ERE−GFP-E５、E10が本発明の細胞である。図３において、上図の−E2とは、エストロゲン無添加の場合、下図の+E2とは、エストロゲン添加の場合の、細胞数とレポーター遺伝子による蛍光強度との関係を示す。【００７１】
エストロゲンを処理した場合とは、図３にいう+E2の場合を、処理しない場合とは、-E2の場合を意味する。両者の間で比較して、エストロゲン認識配列への結合による発現物の発現量が、前記レポーター遺伝子による可視化が可能な程度に差異を有するとは、図３の-E2と+E2とを比較した場合に、細胞数が最大となる蛍光強度の差異を有するという意味である。当該蛍光強度の差異が十分広い方が、検出感度を増大させるという観点から好ましい。また、細胞数と蛍光強度とによって形成されるピークが鋭いほど、検出感度を増大させるという観点からも好ましい。この点、図３のE5とE10を比較した場合には、E10が鋭い形状を有しているのが分かる。【００７２】
また、エストロゲンを添加した場合(+E2)に、無添加と比較して蛍光強度の差が十分分かるように、差異を有することが好ましい。また、検出感度を増大させるという観点から、無添加の場合に蛍光強度がより低いことが好ましい。この点、図３のE5とE10を比較した場合、E10では無添加の時に蛍光強度がより低く、+E2時と無添加の時との間で蛍光強度の差がより大きいことが分かる。【００７３】
また、本願の遺伝子導入細胞の好ましい実施態様において、前記エストロゲンを処理した場合の細胞数が最大となるレポーター遺伝子発現強度を境に高い発現強度の細胞数が、前記レポーター遺伝子による可視化が可能な程度に十分存在する。これは、図３において、+E2下で、E5とE10を比較した場合に、E５の方は、-E2時の細胞数最大の発現強度の位置での発現強度も、+E2においても残存している。これに対して、E10においては、それほど残存せず、+E2時の細胞数最大の発現強度を境に左右ほぼ対照であり、かつ、最大の発現強度より大きい強度において、細胞数が多く、-E2での発現強度と明確に区別できる。したがって、E5とE10を比較すると、E10の方が検出感度が良好で良質の細胞であるということが言える。【００７４】
上述したE10は、平成１７年５月２５日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM  BP-10610として寄託されている。【００７５】
次に、本発明の細胞の調整方法について説明する。
本発明細胞を調製するには、例えば、前記した「レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含むＤＮＡ」を培養細胞 に導入し、安定形質転換細胞を選抜するとよい。具体的には例えば、まず、MCF7細胞 などの宿主細胞をシャーレに播き（105〜107細胞 ／直径6〜10cmシャーレ）、5〜10%程度の血清を含有するαMEM培地等を用いて、5% CO2および飽和湿度条件下に約37℃で数時間〜一晩程度培養する。このようにして培養した細胞へ、上記DNAを導入することができる。ＤＮＡ導入法としては、エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法、リポフェクション法等の一般的な方法があげられる。宿主細胞に導入されるDNAの純度としては、CsCl密度勾配遠心法で精製したプラスミドDNAまたはそれとほぼ同等の純度が望ましい。宿主細胞に導入されるDNAの形状としては、上記のようなレポーター遺伝子と細胞選択マーカー遺伝子とが組込まれたプラスミドのDNAが環状のまま宿主細胞へ導入されてもよいが、一般的には、各遺伝子の発現に影響を与えない領域に存在する制限酵素部位で切断されることにより直鎖状とされたＤＮＡが、宿主細胞に導入されるとよい。導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞を取得する例として、まず、前記のようにしてＤＮＡが導入された細胞を、通常の細胞培養液（培地）中で一日程度そのまま培養する。次に、細胞を常法（トリプシン処理等）に従って剥がして播き直した後、直ちに、宿主細胞へ導入された細胞選択マーカー遺伝子に対応する選択条件下に培養を開始する。即ち、細胞選択マーカー遺伝子が薬剤耐性付与遺伝子である場合は、形質転換細胞に耐性が付与される薬剤を培地に加え、形質転換細胞に由来するコロニーが適当な大きさになるまで該薬剤存在下で培養を続ける。この間必要に応じて、薬剤が添加された新しい培地への培地交換を1〜３回/週の割合で行う。このようにして得られたコロニーを複数に分割して植え直し、細胞を増殖させた後、その一部に、目的とするエストロゲンレセプターのリガンドの溶媒溶液を添加して２４時間程度培養した後、レポーター遺伝子の発現量を測定する。また、対照として、溶媒のみを添加した系の発現量を測定する。レポーター遺伝子 の発現量の測定法は、用いる個々のレポーター遺伝子の種類によるが、レポーター遺伝子 産物が培地に分泌される場合を除き、一般的には細胞溶解剤処理や超音波処理等で該細胞の細胞膜を破壊して細胞抽出液を調製し、該抽出液に含まれるレポーター遺伝子産物を定量する。例えば、レポーター遺伝子産物が酵素蛋白質である場合は、前記抽出液中の酵素蛋白質を該酵素に特異的な基質と反応させ、生ずる発光量、蛍光量、吸光度などを測定することによりレポーター遺伝子 産物による酵素活性を定量し、レポーター遺伝子産物量、ひいては、レポーター遺伝子の発現量の指標とする。このようにして細胞をリガンドと接触させた系のレポーター遺伝子の発現量が、溶媒のみを添加した系におけるレポーター遺伝子の発現量に対して少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上高い値を示した細胞を選択する。なお、このようにして得られた細胞が単一の形質転換細胞で構成されていない場合に���、該細胞を限界希釈培養し、単一の細胞からなるコロニーを選択してもよい。【００７６】
次に、本発明のエストロゲンシグナル評価方法について説明する。本発明のエストロゲンシグナル評価方法は、上記本発明の細胞を用いて、エストロゲンシグナルの応答性を可視化することによって評価する。【００７７】
まず、本発明のエストロゲンシグナル評価方法の原理について説明する。本発明の細胞は、エストロゲン認識配列に結合する転写因子が、当該エストロゲン認識配列に結合すると、当該結合によって、下流の遺伝子が発現される。この下流の遺伝子が、癌細胞を増殖させる要因となっていると考えられている。本発明の細胞において、エストロゲン認識配列の下流の遺伝子が発現されると共に、組み込まれたレポーター遺伝子も発現することから、当該レポーター遺伝子の発現強度を測定することにより、下流の遺伝子の発現の様子を可視化することが出来る。すなわち、エストロゲンシグナルを評価することができる。本発明の評価方法はこのような原理を利用したものである。【００７８】
エストロゲン認識配列に結合する転写因子として、代表的なものは、エストロゲンーエストロゲンレセプター複合体であるが、本発明者らの本発明による研究から、他の因子も関与していることが示唆された。【００７９】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、乳癌脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む。
この方法によれば、アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応を介して脂肪間質細胞により誘導されるエストロゲンシグナルを定量的に測定することが可能である。さらに、当該エストロゲンシグナルの評価結果から、癌症例ごとに異なるシグナルを見出すことができ、これらの評価結果を応用すれば、癌症例特異的な治療法への応用が期待できる。
なお、本発明の遺伝子導入細胞については、上述の説明をそのまま適用することができる。【００８０】
上記評価方法においては、A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することが好ましい。このようにして本発明の遺伝子導入細胞と乳癌組織由来脂肪間質細胞とを共生培養することにより、生体内に近い環境で、本発明の遺伝子導入細胞内のレポーター遺伝子の発現強度をより正確に測定することが可能となる。なお、インサートとしては、例えば、一般に細胞培養に用いられる多孔質メンブレンを備えたインサートを使用することができる。【００８１】
また、操作を簡略化し、より迅速にエストロゲンシグナルを評価できるという観点から、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養し、共生培養した上記２種の細胞にアンドロゲンを投与し培養する代わりに、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンとアロマターゼ阻害剤を投与し培養してもよい。【００８２】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、
乳癌脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって
Ａ：請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲンを投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたエストロゲンによって、ならびに脂肪間質細胞由来のアロマターゼ酵素によらないエストロゲンレセプター活性化機構によって誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナル強度を定量評価する工程、
を含む。【００８３】
本評価方法においても、前述した評価方法と同様に、生体内に近い環境で、本発明の遺伝子導入細胞内のレポーター遺伝子の発現強度をより正確に測定できるという観点から、A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することが好ましい。また、前述した評価方法と同様に、操作を簡略化し、より迅速にエストロゲンシグナルを評価できるという観点から、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養し、共生培養した上記２種の細胞にアンドロゲンを投与し培養する代わりに、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切した後に遠心により上清を得、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンとアロマターゼ阻害剤を投与し培養してもよい。【００８４】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する評価方法は、アロマターゼ阻害剤による、乳癌脂肪間質細胞に由来する、主としてアロマターゼ酵素活性を介したエストロゲンシグナルの阻害作用を定量的に評価する方法であって、
Ａ：請求項１ないし８のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養する工程、
Ｂ：共生培養した上記２種の細胞に、アロマターゼの基質であるアンドロゲン、およびアロマターゼ阻害剤を同時に投与し培養する工程、
Ｃ：脂肪間質細胞アロマターゼより産生され、培養液中に放出されたエストロゲンにより誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
Ｄ：前記Ｃにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、アロマターゼ阻害剤による、脂肪間質細胞の主としてアロマターゼ酵素活性によるエストロゲンシグナルの阻害作用を定量評価する工程、
を含む。
本評価方法によれば、各癌症例における各種アロマターゼ阻害剤のエストロゲンシグナル抑制効果を定量的に評価可能となり、各種アロマターゼ阻害剤を用いたホルモン療法に対する感受性を、各症例につき評価できる。【００８５】
本評価方法においても、前述した２種の評価方法と同様に、生体内に近い環境で、本発明の遺伝子導入細胞内のレポーター遺伝子の発現強度をより正確に測定できるという観点から、A工程において、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養することが好ましい。また、前述した２種の評価方法と同様に、操作を簡略化し、より迅速にエストロゲンシグナルを評価できるという観点から、請求項１ないし１０のいずれかの細胞と、乳癌組織由来脂肪間質細胞を共生培養し、共生培養した上記２種の細胞にアンドロゲンを投与し培養する代わりに、脂肪間質細胞を含む乳癌組織を細切した後に遠心により上清を得、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に、前記上清とアロマターゼの基質であるアンドロゲンとアロマターゼ阻害剤を投与し培養してもよい。【００８６】
ここで、アロマターゼとは、末梢の脂肪組織等に存在する酵素である。副腎皮質から産生されるアンドロゲンがアロマターゼによりエストロゲンに変換される。アロマターゼ阻害剤は、アンドロゲンからのエストロゲン合成を阻害するため、アロマターゼ阻害剤を利用して乳癌の増殖を抑えるホルモン療法が盛んに行われている。【００８７】
アロマターゼ阻害剤を本発明の細胞へ添加して、レポーター遺伝子の発現量が低下すれば、エストロゲン認識配列の下流の癌増殖に関与する遺伝子の発現の有無を評価することができる。なぜなら、癌増殖に関与する遺伝子の発現と、本発明の細胞のレポーター遺伝子の発現とは同期しているからである。【００８８】
したがって、本発明のエストロゲンシグナルの評価を行うことにより、癌細胞増殖因子の発現を抑制する、患者特異的アロマターゼ阻害剤を早期に発見することができる。【００８９】
すなわち、本発明の阻害剤の解析方法は、本発明のエストロゲンシグナルの評価方法を用いて、前記アロマターゼ阻害剤を添加した後のエストロゲンシグナルの有無によって、当該アロマターゼ阻害剤が、前記患者に特異的な癌抑制作用があるか否かを解析することができる。【００９０】
すなわち、エストロゲンシグナルがあれば、すなわち、レポーター遺伝子が発現すれば、アロマターゼ阻害剤が作用していないと判断することができ、逆にエストロゲンシグナルが無ければ、すなわち、レポーター遺伝子が発現しなければ、アロマターゼ阻害剤が作用していると判断することができ、このアロマターゼ阻害剤が、癌患者特異的に有効な阻害剤であることが分かる。【００９１】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を評価する方法は、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：乳癌組織を培養液中で細切した後に遠心により上清を得る工程、
B：前記上清を、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞に添加する工程、
B：前記上清により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含む。【００９２】
エストロゲン受容体は、EGF、IGF-1などの増殖因子によるリン酸化を介した経路でも活性化されることが知られており、これらの増殖因子の産生には脂肪間質細胞を含めた乳癌の微小環境が大きく影響する。本評価方法によれば、乳癌の微小環境によるエストロゲンシグナルの制御を把握することができ、総合的なエストロゲンシグナルを把握することが可能となる。また、同時に乳癌細胞に対する増殖作用の定量も可能で、エストロゲン以外の因子の解析にも有効である。さらに、エストロゲン受容体活性化能、乳癌増殖促進作用を個々の症例について簡便かつ迅速に把握することができ、ホルモン療法の奏効性の迅速な予測への応用も可能となる。【００９３】
また、本発明のエストロゲンシグナルの強度を評価する方法は、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量的に評価する方法であって、
A：請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞を培養容器の底面に培養し、乳癌組織を細切して得られた乳癌組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加し、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞と前記乳癌組織細切物を培養する工程、
B：前記乳癌組織細切物により誘導されたレポーター蛋白質を定量する工程、
C：前記Cにおいて定量されたレポーター蛋白質量から、乳癌組織によるエストロゲンシグナルの強度を定量評価する工程、
を含む。
本評価方法によれば、より生体内に近い環境で総合的なエストロゲンシグナルを迅速に把握することが可能となる。【００９４】
次に、本発明の細胞分析方法について説明する。本発明の細胞分析方法は、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能の分析を行う。化学物質（A）に特異的に応答するレポーター遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞とは、化学物質(A)の存在により、種々のカスケード反応を通じて、最終的に転写因子として当該転写因子の制御を受ける遺伝子と同期して発現するようにレポーター遺伝子が組み込まれている遺伝子導入細胞を意味する。
これによれば、化学物質(A)の存在に起因して、転写制御されるオペロンの発現状態をレポーター遺伝子を介して可視化することが可能となる。
このようなレポーター遺伝子導入細胞としては、例えば、癌細胞由来の培養細胞の染色体へ、レポーター遺伝子と当該培養細胞内で機能可能な細胞選択マーカー遺伝子を含むDNAが導入されたものを用いることができる。
例えば、遺伝子導入細胞が乳癌由来の場合ついて説明すると、遺伝子導入細胞には例えば上述した本発明の遺伝子導入細胞のように、レポーター蛋白質をコードする遺伝子を含み、かつ、該レポーター蛋白質のプロモーター領域の上流にエストロゲン応答配列（ERE: estrogen response element）を含み、該レポーター蛋白質の発現が実質的にエストロゲン応答配列により制御されるレポーターベクターが安定的に導入されている。なお、本発明の遺伝子導入細胞については、上述の説明をそのまま適用することができる。【００９５】
そして、本発明の細胞分析方法は、上記のように例示したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質産生細胞とを共生培養させる。当該化学物質産生細胞とは、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する細胞である。上記のレポーター遺伝子導入細胞と当該化学物質産生細胞とを共生培養させることにより、化学物質が提供される化学物質産生細胞と、当該化学物質に応答する機能を有する細胞との相互作用を、レポーター遺伝子を通じて可視化することができる。【００９６】
なお、好ましい態様において、生体内に近い環境で、レポーター遺伝子導入細胞内のレポーター遺伝子の発現強度をより正確に測定できるという観点から、レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて培養容器に添加することによって、レポーター遺伝子導入細胞と化学物質産生細胞とを共生培養してもよい。【００９７】
また、好ましい態様において、操作を簡略化し、より迅速にエストロゲンシグナルを評価できるという観点から、レポーター遺伝子導入細胞と化学物質産生細胞とを共生培養する代わりに、レポーター遺伝子導入細胞を、化学物質産生細胞を含む組織を細切した後に遠心により得られた上清とともに培養してもよい。【００９８】
例えば、好ましい実施態様において、既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記化学物質産生細胞による前記化学物質(A)の産生能を定量的に分析することができる。【００９９】
また、本発明の細胞分析方法の別の実施態様において、化学物質（A）に特異的に応答するレポーター蛋白をコードする遺伝子を導入したレポーター遺伝子導入細胞と、化学物質（A）の生成反応の基質（B）を取り込むとともに、化学物質（A）への転換をもたらす酵素（C）を発現し、最終的に化学物質（A）を産生して培養液中に放出する化学物質産生細胞とを前記酵素（C）を阻害する阻害剤とともに共生培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からのレポーター遺伝子発現量に基づいて、前記阻害剤の奏効性を分析することができる。【０１００】
なお、好ましい実施態様において、生体内に近い環境で、レポーター遺伝子導入細胞内のレポーター遺伝子の発現強度をより正確に測定できるという観点から、前記レポーター遺伝子導入細胞を培養容器底面に培養し、前記化学物質産生細胞を含む組織を細切して得られた組織細切物を、インサートを用いて該培養容器に添加することによって、前記レポーター遺伝子導入細胞と前記化学物質産生細胞とを前記阻害剤とともに共生培養してもよい。【０１０１】
また、好ましい実施態様において、操作を簡略化し、より迅速にエストロゲンシグナルを評価できるという観点から、前記レポーター遺伝子導入細胞と前記化学物質産生細胞とを前記阻害剤とともに共生培養する代わりに、上記の遺伝子導入細胞を、前記化学物質産生細胞を含む組織を細切した後に遠心により得られた上清と、前記阻害剤とともに培養してもよい。【０１０２】
好ましい実施態様において、既知量（ゼロを含む）の化学物質（A）を含む培養液を用いて前記レポーター遺伝子導入細胞を前記化学物質産生細胞フリーの状態で培養して得られたレポーター遺伝子発現量を比較値として用いることにより、前記阻害剤の奏効性を定量的に分析することができる。【０１０３】
上述した本発明の細胞分析方法において、好ましくは、前記化学物質（A）はエストロゲンであり、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、前記レポーター遺伝子導入細胞は乳癌由来であり、前記基質（B）はアンドロゲンであり、前記酵素（C）はアロマターゼであり、前記化学物質産生細胞は乳癌組織から単離した脂肪間質細胞である。なお、より好ましくは、前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子は、GFP, RFP等の蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼおよびβグルクロニターゼ等からなる群から選択される少なくとも１種由来の遺伝子であり、かつ該遺伝子によってコードされるレポーター蛋白質の半減期が２時間〜６時間程度である。さらにより好ましくは、前記レポーター遺伝子導入細胞は上述した本発明の遺伝子導入細胞である。なお、検出感度に優れているという観点から、本発明の細胞分析方法において、前記レポーター遺伝子導入細胞として、受託番号FERM  BP-10610として寄託されている細胞を使用するのが最も好ましい。【０１０４】
また、好ましい実施態様において、分析は前記レポーター遺伝子発現量の平均値に基づいて行われ、前記レポーター遺伝子発現量は取得画像から計測されることができる。【０１０５】
また、定量（ゼロを含む）したエストロゲンを培養液に添加して前記レポーター遺伝子導入細胞を培養し、前記レポーター遺伝子導入細胞からの蛍光または発光量を計測、比較することにより前記間質細胞のアロマターゼ産生能を定量的に分析することができる。これによって、エストロゲンの添加による化学物質産生能を影響を可視光化により把握することができる。また、アロマターゼ阻害剤の培養系に対する作用を可視化することができ、例えば、患者に投与する前に、患者特異的癌細胞に対して最も有効なアロマターゼ阻害剤を調べることができる。【０１０６】
別の態様において、前記レポーター遺伝子導入細胞は培養容器底面に単層状に培養され、
前記化学物質産生細胞は前記培養容器底面から上方に距離Ｌをおいて培養表面を有するキバン上に単層状に共生培養され、
培養容器の下方から対物レンズを介して前記レポーター遺伝子導入細胞の蛍光または発光画像が取得される。また、距離Lをおいて設置したのは、前記化学物質産生細胞からの自家蛍光または自家発光や照明用光源からの反射光が背景光となって、レポーター遺伝子導入細胞からのシグナル光のS/Nが低減するからである。前記距離Ｌは、好ましくは、レポーター遺伝子導入細胞からのシグナル光のS/Nが十分に高く保たれる必要性から、少なくとも前記対物レンズの焦点範囲外となる値である。この場合、前記キバンは取り外されずに蛍光または発光画像が取得される。【０１０７】
また、好ましい実施態様において、前記キバンは取り外し可能に構成されており、前記キバンが取り外された後に蛍光または発光画像が取得される。取り外し可能であれば、分析が容易に行われ、レポーター遺伝子導入細胞からのシグナル光のS/Nが全く低減することなく安定した蛍光または発光測光が可能となるからである。【０１０８】
また、レポーター遺伝子として蛍光タンパク質由来のものを使用する場合には、好ましくは、遺伝子導入される蛍光タンパク質の半減期は４時間以下である。【０１０９】
また、レポーター遺伝子導入細胞からのシグナル光を精度よく測光するにはレポーター遺伝子導入細胞を画像処理技術を用いて確実に認識することが重要である。なぜなら通常細胞培養環境中には死細胞や不純物等、蛍光を発する物質が多く含まれており、これらをシグナル光として検出してしまうと解析精度を大きく下げる結果となるからである。画像処理によりレポーター遺伝子導入細胞を細胞認識させるにはレポーター遺伝子からの光と分離して核を標識するとレポーター遺伝子導入細胞の画像処理での認識処理が行い易い。なぜなら、核は細胞質全体と異なり隣接する細胞との境界を共有することがないので容易に個々の細胞を区別できるからである。好ましくは、前記レポーター遺伝子導入細胞の核は、導入されたレポーター蛋白質の分光特性とは異なる分光特性で標識され、核の蛍光または発光画像により前記レポーター遺伝子導入細胞が画像処理により認識されてレポーター蛋白質の発現量が評価される。【０１１０】
さらに、好ましい実施態様において、画像処理によりレポーター遺伝子導入細胞を細胞認識させるにはレポーター遺伝子からの光と分離して核を標識するとレポーター遺伝子導入細胞の画像処理での認識処理が行い易いという観点から、画像処理により認識された核画像を２値化処理し、得られた２値化画像に対応する領域の蛍光または発光量が各細胞毎に計測されてレポーター遺伝子の発現量が評価される。また、通常蛍光や発光の分光波長特性は長波長側に尾をひく形となる。よって、細胞認識のための核からの光（蛍光/発光）がシグナル光として測光されないようにするためには核からの光は解析対象であるシグナル光の分光波長特性よりも長波長である方が有利である。かかる観点から、核の標識は、レポーター蛋白質の分光特性よりも長波長の特性を有していることが好ましい。そして、DRAQ5は標識に際して細胞を固定する必要がなく、蛍光波長が約６８０ｎｍと長波長であるのでこの分析方法の使用形態に最適である。かかる観点から、核の標識はＤＲＡＱ５によることが好ましい。【０１１１】
好ましくは、分析処理の自動化という観点から、マイクロプレートのウエル内部に分析のための化学物質（A）または/および前記阻害剤があらかじめ定量（ゼロを含む）されて各ウエルにそれぞれ固相状態で添着されており、所定の溶融液により前記化学物質（A）または/および前記阻害剤が溶解され、分析に供される。【０１１２】
また、本発明の細胞分析方法において、レポーター遺伝子の発現量の計測は共生培養開始後２４〜９６時間までの間に行われることが好ましい。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。【０１１４】
実施例１
エストロゲン応答配列（estrogen responsive element: ERE）を含むエストロゲンシグナルレポーター遺伝子・ERE-GFPの作製、およびERE-GFP安定導入MCF7細胞系の樹立
エストロゲンシグナルのレポーター遺伝子・ERE-GFPの作製は以下のように行った。すなわち、半減期が２時間程度である不安定型のオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質・GFP(Green Fluorescent Protein)をコードするGFP-1遺伝子を含む pd2EGFP-1ベクター(Clontech社)のマルチクローニングサイト（MCS）内のSmaIサイトに、図１に示すようなエストロゲン応答配列（AGCTAGGTCAGGATGACCTAGCTACAGCT）（配列番号２）および、HSV-TKフ゜ロモーター配列（GGCCCCGCCC  AGCGTCTTGTCATTGGCGAATTCGAACACGCAGATGCAGTCGGGGCGGCGCGGTCCCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAACAGCGTCAACAGCGTGCCGC）（配列番号３）を含む314bpからなるDNA断片（配列番号４）を定法に従い導入し、ERE-GFP遺伝子を作製した。【０１１５】
このERE-GFP遺伝子を、ヒト乳癌由来培養細胞株MCF7に遺伝子導入（トランスフェクション）し、同遺伝子がゲノム中に安定導入されたMCF7細胞系を分離・樹立した。MCF7細胞株はエストロゲンレセプターα(以下ER1とする)を高発現している細胞株として広く用いられており、10%FCSを含むRPMI-1640培養液で37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。【０１１６】
MCF7細胞株へのERE-GFP遺伝子の導入には、遺伝子導入試薬であるTrans IT LT-1キット（Cat#: V2304T/Takara酒造社）を用いた。遺伝子導入の具体的処理は同キットのプロトコールに従い実施した。無血清培地300μl にTrans IT-LT-1を5μl添加し、室温で5分混合した後、 1〜2μg/mlのDNA 1μlを加えてさらに室温で5分混合した。この溶液300μlを6cmシャーレで50%コンフルエントのMCF-7細胞に添加した。遺伝子導入処理から24時間後、培養液中にジェネティシンを最終濃度1mg/mlになるよう添加し、以降、3〜4日毎にジェネテシンを添加した培地で培地交換する。１個の細胞から形成されたコロニーをクローニングリングを用いて個別に採取し培養した。合計47系統のERE-GFP遺伝子安定導入MCF7細胞系を樹立した。またコントロールとして、ERE配列を導入しないpd2EGFP-1ベクターのみをMCF7に安定導入した細胞系も同様に樹立した。さらに半減期の長い安定型ＧＦＰをレポーター遺伝子として、その転写調節領域のＥＲＥを組み込んだレポーターベクターも構築し、これを同様にMCF7細胞に導入し、結果、安定して同レポーターベクターが導入された細胞系も樹立した。【０１１７】
実施例２
樹立したERE-GFP遺伝子安定導入MCF7細胞系47系統のエストロゲンシグナル応答性の評価
得られたERE-GFP遺伝子安定導入MCF7細胞系・４７系統（ERE-GFP-E1〜E47）につき、エストロゲンシグナルに対する応答性の評価を実施した。具体的には、各細胞系に17βestradiol（合成エストロゲン：E2）を処理し（+E2群）、誘導されたGFPの発現量が、17βestradiolの溶媒のみを処理した場合（-E2群）のGFP発現量と比較して、E2処理・無処理間でGFP発現量に大きな差異があるものをエストロゲン応答性が良好なクローンと評価し、選択した。【０１１８】
E2処理するに先立ち、各細胞系をトリフ゜シン処理して回収し、PBSで洗浄後60mmシャーレに約2X10５ 個播種し、10%FCS/RPMI1640培地中に含まれるエストロゲン様物質の影響を除去する目的で、チャコールデキストラン処理したFCS（DCC-FCS）を10%添加したフェノールレッド不含RPMI1640培地（PRF-RPMI）にて3~4日間培養した。培地交換した後E2を最終濃度10nMとなるよう培養液に添加し（+E2群）、さらに2日間培養した。また対照群としてE2の溶媒のみを添加した群も作製し（-E2群）、同様に2日間培養した。2日後、各細胞系につき+E2群および-E2群でのGFPの発現量を、蛍光顕微鏡下で観察、あるいはフローサイトメーター（Beckman Coulter社Epics XL）を用いて定量した。
結果を図２および図３に示す。樹立した47系統（ERE-GFP-E1〜E47）につきE2投与により誘導されるGFPの発現量を比較したところ、ERE-GFP-E10細胞系（受託番号：FERM BP-10610）がE2無処理にてGFPの発現量が低く、かつE2処理にてGFPがよく誘導され発現量が高いことが示され、エストロゲンにより誘導されるシグナル応答を評価する細胞系として最も好適であることが示された。またEREを含まないpd2EGFP-1ベクターのみをMCF7に安定導入した細胞系では（pdE2-GFP-4）、E2処理/無処理にかかわらず、GFPの発現は認められなかった。さらに半減期の長い安定型ＧＦＰをレポーター遺伝子としたレポーターベクターを導入し樹立した細胞系についても、E2処理と無処理の場合でＧＦＰの誘導の差異を解析した。解析結果を表１に示す。【０１１９】
【表１】
2006129735.tif 000002
表１に示すよう、半減期の長い安定型ＧＦＰをレポーターとした場合には、E2処理の有無によるＧＦＰ発現量の差異は検出できず、エストロゲンにより誘導されるシグナル応答を評価する細胞系として不適であることが示された。【０１２０】
実施例３
ERE-GFP-E10細胞系においてE2添加により誘導されるGFP発現の評価と生細胞数の計測
上記２においてエストロゲンにより誘導されるシグナル応答を評価する細胞系として最も好適であることが示されたERE-GFP-E10細胞系につき、様々な濃度でE2を添加した場合の生細胞数と、そのうちのGFP発現細胞数の計測を実施した。
チャコールデキストラン処理したFCSを10%添加したフェノールレッド不含RPMI1640培地（10%DCC-FCS/PRF-RPMI）にてERE-GFP-E10細胞を３日間培養後、細胞をトリプシン処理により分散し、1X104個/mLの細胞密度に調製した同細胞分散液1mlを24穴のマルチディッシュに播種して、E2をそれぞれ、最終濃度0,1,3,10,30,100,および300pMとなるよう培養液に添加した。添加後、さらに4日間細胞を培養し、各濃度のE2添加群につきMTTアッセイにより生細胞数の計測、および蛍光顕微鏡下でGFP発現細胞の計測を行った。
MTTアッセイでは、E2添加後4日目に5mg/mlのMTT溶液を1ウェルあたり100μl添加して3時間インキュベートした後、細胞溶液を回収し400Xgにて10分遠心し、得られた沈澱物をDMSOに溶解して、この溶解液につき560nmの吸光度を測定し生細胞数を測定した。
GFP発現細胞の計測は、MTTアッセイの場合と同様にE2添加後4日目に、細胞をトリプシン処理にて分散させ、これをスライドグラス上に滴下し、蛍光顕微鏡下で目視にてGFPをある一定量以上発現している細胞（GFP発現陽性細胞）をカウントし、100細胞あたりのGFP発現陽性細胞の割合を算出することで行った。
結果を図４Aに示す。ERE-GFP-E10細胞系において、E2添加により誘導されるGFP発現細胞の割合はE2添加濃度依存的に増加することが示された。すなわち3pM処理にて有意なGFP発現誘導が検出され、30pMで最大割合に達した。また生細胞数もE2添加濃度依存的に増加することが示され、これはMCF7細胞株において従来観察されているE2添加により細胞増殖活性が上昇するという従来の知見と一致した。図４Bは、E2を最終濃度3pMおよび1nM添加した後、1〜4日目にトリプシン処理にて細胞を分散させ、前記と同様に100細胞あたりのGFP発現陽性細胞の割合を算出した結果である。結果、添加したE2量によらず、E2添加後１日目からGFP発現が観察でき、2日目にGFP発現陽性細胞の割合は最高に達した。
以上より、樹立したERE-GFP-E10細胞においては、添加されたエストロゲンの濃度が3pM〜30pMの範囲内で濃度依存的にGFPの発現が誘導されることが示され、エストロゲンにより誘発されるシグナル応答の定量的な評価可能であることが示された。
実施例４
乳癌組織の取得と同組織からの脂肪間質細胞の分離・培養
手術により摘出した乳癌組織検体を分割し、一部を病理組織学的診断に供し、また一部を脂肪間質細胞の分離・培養に用いた。検体からの脂肪間質細胞の分離・培養は以下のように行った。すなわち、組織片をHBSSに浸漬しリンスした後、1mm３以下のサイズになるよう解剖ハサミにより細切した。これを1mg/mlのcollagenase、40mg/mlのBSA、2mg/mlのグルコース、1Ｘ antibiotic-antimycotic、および50μg/mLのgentamicinを添加したHBSS溶液中にて2-3時間、37℃にてインキュベートし、細胞をさらにばらばらに分散させた。この細胞分散溶液をナイロンメッシュにて濾過した後、分散した細胞を含む濾過液を遠心して細胞を沈澱させ、HBSSにより数回洗浄して、乳癌組織由来細胞を回収した。この細胞を10%FCS添加MEM-α培養液にけん濁し37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。翌日培地交換により非接着性の細胞を除去した。培養開始後7日〜10日目に脂肪間質細胞の増殖が確認され、その後は１週間に2回、培養液を除き、新しい培養液に交換した。【０１２１】
実施例５
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による乳癌脂肪間質細胞から誘導されるエストロゲンシグナル検出
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養は、チャコールデキストラン処理FCS10%添加フェノールレッド不含RPMI1640培地（10%DCC-FCS/PRF-RPMI）にて行った。なお採取した脂肪間質細胞は、エイジングによる影響を最小限にするため、培養開始後、2-3回の継代以内に使用した。【０１２２】
共生培養開始に先立ち、ERE-GFP-E10細胞を72時間10%DCC-FCS/PRF-RPMI培養液（以下エストロゲン枯渇培地）下で培養した。脂肪間質細胞は、同枯渇培地にて5X104個/mLの細胞密度に調製し、この細胞分散液1mlを24穴のマルチディッシュに播種し培養開始した。脂肪間質細胞をウェルに播種・培養開始後1日目に、1ウェルあたり5X104個のERE-GFP-E10細胞を脂肪間質細胞の上に添加し、さらに同時に、アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応の基質であるtestosteroneを最終濃度10-7pMになるよう添加して４日間、共生培養した。共生培養４日後、細胞をゆるやかなトリプシン処理にて分散させ、顕微鏡下でGFP発現陽性細胞を検出した。ERE-GFP-E10細胞と脂肪間質細胞とは、形態の違いにより顕微鏡下で判別可能であった。【０１２３】
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP-E10細胞との共生培養によるERE-GFP-E10細胞におけるGFP発現誘導の結果を図５に示す。アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応の基質であるtestosteroneを添加した場合に、乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP-E10細胞とを共生培養するとERE-GFP-E10細胞においてGFPの発現が誘導され、さらにGFP発現陽性細胞の割合が、共生培養した乳癌組織由来脂肪間質細胞の細胞数に依存して上昇することが確認された。
さらに、同様な手法を用いて、乳癌３症例からそれぞれ採取した脂肪間質細胞につき、testosteroneを添加、無添加、さらにtestosteroneと同時にアロマターゼの誘導剤であるデキソメタゾンを2X10-6M添加した場合での、ERE-GFP-E10細胞のGFP発現陽性細胞の割合を算出した。結果を図６に示す。脂肪間質細胞との共生培養において、アンドロゲン無添加と比較して、添加した場合で、ERE-GFP-E10細胞において、ＧＦＰ陽性細胞の割合の有意な上昇が見られた。さらにアロマターゼ誘導剤であるデキサメタゾンをさらに添加して群では、アンドロゲン単独の場合と比較し、さらにＧＦＰ陽性細胞の割合が上昇した。
以上より、脂肪間質細胞乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP-E10細胞とを、アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応の基質であるtestosteroneの存在下で共生培養すると、共生培養した脂肪間質細胞数に依存してERE-GFP-E10細胞におけるGFP発現陽性細胞の割合が増加することから、アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応を介して脂肪間質細胞により誘導されるエストロゲンシグナルを定量的に測定可能であることが示され、さらに誘導されるエストロゲンシグナルは癌症例により異なることが示された。またこのエストロゲンシグナルは、デキサメタゾン添加によりさらに増強されることから、主として脂肪間質細胞のアロマターゼ活性によるものであることが示された。【０１２４】
実施例６
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養による各癌症例ごとの乳癌脂肪間質細胞に誘導されるエストロゲンシグナル強度の解析
異なる乳癌症例について、それぞれ２箇所から採取された乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10とを共生培養し、個々の癌症例における脂肪間質細胞由来のエストロゲンシグナルの定量を実施した。共生培養は、チャコールデキストラン処理FCS10%添加フェノールレッド不含RPMI1640培地（10%DCC-FCS/PRF-RPMI）にて行った。なお採取した脂肪間質細胞は、エイジングによる影響を最小限にするため、培養開始後、2-3回の継代以内に使用した。
前記実施例と同様に、共生培養開始に先立ち、ERE-GFP-E10細胞を72時間10%DCC-FCS/PRF-RPMI培養液（以下、枯渇培地）下で培養した。脂肪間質細胞は、同枯渇培地にて5X104個/mLの細胞密度に調製し、この細胞分散液1mlを24穴のマルチディッシュに播種し培養開始した。脂肪間質細胞をウェルに播種・培養開始後1日目に、1ウェルあたり5X104個のERE-GFP-E10細胞を脂肪間質細胞の上に添加し、さらに同時に、アロマターゼ酵素によるエストロゲン生成反応の基質であるtestosteroneを最終濃度10-7pMになるよう添加して４日間、共生培養した。共生培養４日後、細胞をゆるやかなトリプシン処理にて分散させ、顕微鏡下でGFP発現陽性細胞を検出した。ERE-GFP-E10細胞と脂肪間質細胞とは、形態の違いにより顕微鏡下で判別可能であった。
乳癌12症例につき、各症例癌組織２箇所から採取した乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP-E10細胞との共生培養によるERE-GFP-E10細胞におけるGFP発現誘導の結果を図７に示す。なお、脂肪間質細胞の採取は、各症例につき、摘出した癌組織において、癌部と、癌部から2cm離れた部分の、２箇所よりそれぞれ採取した。結果、脂肪間質細胞により誘導されるエストロゲンシグナルは各癌症例にて異なり、さらに同一症例においても、採取した箇所によって異なることが明らかになった。これは、個々の乳癌症例により、脂肪間質細胞より誘導されるエストロゲンシグナルの強度が異なることを示唆し、従ってアロマターゼ阻害剤によるホルモン療法に対する感受性も異なる可能性があることが示唆された。【０１２５】
実施例７
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10との共生培養により定量された各癌症例ごとの乳癌脂肪間質細胞に誘導されるエストロゲンシグナル強度と同間質細胞におけるアロマターゼ遺伝子mRNAの発現量との比較
異なる乳癌症例から採取された乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10とを共生培養し、個々の癌症例における脂肪間質細胞由来のエストロゲンシグナルの定量を実施した。方法は、前記実施例と同様に実施した。また同一由来の脂肪間質細胞につき、定量的RT-PCR法を用いて、アロマターゼ遺伝子mRNAの発現量を解析した。
乳癌1０症例につき、各症例癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP-E10細胞との共生培養によるERE-GFP-E10細胞におけるGFP発現誘導の結果、および同脂肪間質細胞におけるアロマターゼ遺伝子mRNAの定量結果を図８に示す。結果、脂肪間質細胞により誘導されるエストロゲンシグナルは各癌症例にて異なること、さらにエストロゲンシグナルの強度とアロマターゼ遺伝子mRNAの発現量の解析結果とは必ずしも相関しないことが示された。これは、個々の乳癌症例により脂肪間質細胞より誘導されるエストロゲンシグナルの強度が異なること、またそのシグナル強度がアロマターゼ遺伝子mRNAの発現量と必ずしも相関しないことから、脂肪間質組織から誘導される実質的なエストロゲンシグナル強度は、単純に同脂肪間質組織中のアロマターゼ遺伝子mRNA量を定量しても評価できない可能性が示唆された。【０１２６】
実施例８
乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10の各種アロマターゼ阻害剤存在下における共生培養により誘導されるエストロゲンシグナル強度の解析と、各アロマターゼ阻害剤によるエストロゲンシグナル阻害効果の評価
乳癌４症例から採取された乳癌組織由来脂肪間質細胞とERE-GFP安定導入MCF7細胞系ERE-GFP-E10とを、テストステロンと同時にアロマターゼ阻害剤を４通りの濃度（0, 0.01, 0.03, および0.1μM）でそれぞれ添加した、合計４通りの条件下で共生培養し、個々の条件下における脂肪間質細胞由来のエストロゲンシグナルの定量を実施した。アロマターゼ阻害剤としては、アナストロゾール、レトロゾールおよびエグゼメスタンの３種を用い、それぞれにつき実験を行った。
結果を図９に示す。いずれの症例の脂肪間質細胞を用いた場合でも、添加したアロマターゼ阻害剤の濃度依存的に、GFP陽性細胞の割合は低下した。またそのＧＦＰ陽性細胞割合低下の様子は各癌症例により異なり、また同一の癌症例においても、添加したアロマターゼ阻害剤の種類により異なることが示された。以上より、脂肪間質細胞により誘導されるエストロゲンシグナルは各癌症例にて異なること、さらに各種アロマターゼ阻害剤によるエストロゲンシグナルの抑制効果は、症例ごとに異なることが示され、本手法により、各癌症例における各種アロマターゼ阻害剤のエストロゲンシグナル抑制効果を定量的に評価可能となり、各種アロマターゼ阻害剤を用いたホルモン療法に対する感受性を、各症例につき評価できる可能性があることが示唆された。【０１２７】
実施例９
手術摘出乳癌組織検体抽出上清を用いた、当該乳癌組織によるエストロゲンシグナル誘導の定量的検出
フェノールレッド不含有のRPMI1640培地中で乳癌組織（50mg/ml）をはさみで１〜２mm3に細切後、遠心（12000rpm、10分間）により上清を調製した。この上清を、20〜100％の濃度で、デキストラン-チャコール処理した血清（10%）を含む枯渇RPMI1640培地中でERE-GFP-E10細胞（3x104 細胞 /ml, 24ウェル培養ディッシュ）に添加し、4日間培養後、GFPを発現しているE10細胞を蛍光顕微鏡下でカウントし陽性率で示した。結果を、図１０に示す。図１０より、上清の濃度が増すにつれて、すなわち用量依存的にGFP発現陽性細胞が増加していることが分かる。また、症例（図１０中の#107、#108、#138、#140、#141、#142）によって、エストロゲンシグナルの強度が異なることが示された。【０１２８】
実施例１０
インサートウェルを用いた手術摘出乳癌組織検体細切物との共生培養による当該乳癌組織のエストロゲンシグナル誘導の定量的検出
乳癌組織によるGFPの発現誘導
フェノールレッド不含有のRPMI1640培地中で乳癌組織（50mg/ml）をはさみで１〜２mm3に細切した。得られた浮遊液をデキストラン-チャコール処理した血清（10%）を含む枯渇RPMI1640培地中でERE-GFP-E10細胞（3x104 細胞 /ml, 24ウェル培養ディッシュ）にインサートウェルを用いて添加し培養した。4日後、GFPを発現しているE10細胞を蛍光顕微鏡下でカウントし、陽性率で示した。結果を、図１１に示す。図１１より、症例（図１１中の#343、#344、#345、#358、#359）によって、エストロゲンシグナルの強度が異なることが示された。【０１２９】
実施例１１
次に、レポーター蛋白質をコードする遺伝子として蛍光蛋白質をコードする遺伝子を乳癌細胞に導入した蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞を用いて、乳癌組織から単離した間質細胞によるアロマターゼ産生能と、アロマターゼ阻害剤の奏効性を定量的に分析する方法について調べた。
図１２でマイクロプレート１は２４ウエル（Ａ１〜Ｄ６）を有しており、患者から手術により採取した乳癌組織から単離の間質細胞サンプルに対し、次のように割り当てる。
Ａ１〜Ａ６：脂肪間質細胞のエストロゲン産生能を評価するために以下のように各ウエルの試験条件を割り当てる。なお各ウエルにはアンドロゲンを含む共通の培養液が入っている。
Ａ１：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞のみ
Ａ２：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋エストロゲン（０．３ｐＭ）
Ａ３：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋エストロゲン（１ｐＭ）
Ａ４：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋エストロゲン（３ｐＭ）
Ａ５：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋エストロゲン（１０ｐＭ）
Ａ６：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞
Ｂ１〜３、Ｃ１〜３、Ｄ１〜３：アロマターゼ阻害剤Ｘ，Ｙ，Ｚの３種について奏功性を定量的に分析するために以下のように各ウエルの試験条件を割り当てる。
Ｂ１：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｘ（１０ｐＭ）
Ｂ２：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｘ（３０ｐＭ）
Ｂ３：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｘ（１００ｐＭ）
Ｃ１：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｙ（１０ｐＭ）
Ｃ２：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｙ（３０ｐＭ）
Ｃ３：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｙ（１００ｐＭ）
Ｄ１：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｚ（１０ｐＭ）
Ｄ２：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｚ（３０ｐＭ）
Ｄ３：蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞＋アロマターゼ阻害剤Ｚ（１００ｐＭ）
次にマイクロプレートの各ウエルに蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞および間質細胞をそれぞれ培養する方法について述べると以下のようである。
＜構成＞
図１３はマイクロプレートの部分断面図である。この図に示すように、蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞はマイクロプレート１の底面１ａに培養され、間質細胞はインサート２の培養表面を有するメンブレンからなるキバン部２ａにアンドロゲンを少なくとも含む培養液３により共生培養される。図示しない倒立方顕微鏡の対物レンズ４を介して蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞の蛍光画像が撮像される。対物レンズ４は蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞が培養されているマイクロプレートの底面１ａに照準されるとともに、各ウエルに対して図示しない電動ステージで駆動されて、顕微鏡に装着された図示しないカメラにより通常４〜１６枚程度の蛍光画像が撮像され、蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞の蛍光平均輝度が測光される。
なお、インサート２は取り外し可能に構成されており、撮像される前に取り外される。これにより、インサートキバン部２ａから生ずる迷光を無くすことができ、蛍光画像のバックグランドを低く抑えることができる。更に、インサートのキバン部２ａとマイクロプレート１の底面１ａとの距離を少なくとも対物レンズ４の焦点範囲外となるように設定すれば、インサート２を取り外すことなく蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞の蛍光画像を撮像することができ、本細胞分析の自動化を容易に実現できる(図１４参照)。
なお、本発明は上記実施例に限られるものではなく、様々な例が可能である。
本実施例では顕微鏡を使用して蛍光画像を取得し、得られた画像に基づいて蛍光発光量が評価されているが、フローサイトメータを使用して蛍光発光量を評価してもよい。【０１３０】
請求項４１〜４３記載の、レポーター蛋白質の発現量を定量的に評価する方法において、レポーター蛋白質として蛍光蛋白質を使用した実施例について、（図１５：画像解析の流れ）に沿った方法で説明する。【０１３１】
導入された蛍光蛋白質の発現量は、上記装置によって取得された細胞画像を解析し、画像中の各細胞の位置、あるいは境界領域を特定し、これら位置、あるいは境界によって囲まれた領域の画像の輝度値を算出することで定量化される。【０１３２】
細胞の認識は、蛍光蛋白質の画像とは別に取得された核画像を主に使って行われる。【０１３３】
細胞の認識は、核画像の輝度値を適当な輝度を閾値として二値化を行い、対象となる核領域を特定する。【０１３４】
まず二値化した画像中で有る程度のサイズを有した部分領域のみを選択する。サイズは、領域の最大幅や最小幅、あるいは領域に含むことができる最大の内接円の半径などによって決定される。【０１３５】
この選択により、例えば細胞核画像中に含まれるゴミなど非細胞領域が除かれる。【０１３６】
解析対象となる細胞の密度が疎である場合、核画像中で各細胞は単離されて観察されるので、上記方法で取得された各領域がそれぞれ単一の核に対応していると考えられ、それらをひとつの細胞として認識し、例えば核の中心位置などが取得される。【０１３７】
さらに、細胞の密度が密である場合複数の細胞が接して、あるいは重なって観察される領域がある。この場合、領域がどれだけ円に近いかという真円度を設定し、真円度の高い領域を単一細胞領域とし、低い領域を複数細胞領域として分ける。（図１６：二値化画像の細胞領域の分割）【０１３８】
複数細胞領域に対しては、以下の説明するような適当な方法によって、個々の細胞に分割され、単一細胞の位置や大きさが認識される。【０１３９】
複数の細胞を分割する方法としては例えば以下のような方法がある。（図１７：複数細胞核の認識）【０１４０】
複数の細胞核を含むと思われる二値化され、境界が特定された領域に対して、
細胞核の標準的な大きさとして設定された内接円が入るかを判定し、これら内接円のうち大きいものから領域を埋めていき、設定された核の大きさの最小値以上の値で、埋める操作ができなくなるまでを繰り返すことで、各単一の細胞の位置が特定される。【０１４１】
以上の操作により取得された細胞核の位置や細胞核の大きさ、細胞核の形態を
蛍光蛋白質画像と対照させることで、各細胞の蛍光発現量が定量化される。【０１４２】
取得された蛍光発現量は、平均化や、低い蛍光量をカットするなどの操作により統計的に処理せられ、阻害剤の奏効性判定の際の定量データとして提供される。
＜分析＞
ウエルＡ６（蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞）の蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞の蛍光平均輝度とウエルＡ１〜Ａ５の蛍光平均輝度とを比較することにより、エストロゲン産生能を定量的に分析することができることが判明した。更にウエルＡ６（蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞＋間質細胞）の蛍光蛋白質遺伝子導入乳癌細胞の蛍光平均輝度とＢ１〜３、Ｃ１〜３、Ｄ１〜３の蛍光平均輝度、更にウエルＡ１〜Ａ５の蛍光平均輝度とを相互に比較することにより、アロマターゼ阻害剤の奏功性を定量的に分析することができることが判明した。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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