(57)【要約】  本発明は炎症性腸疾患の治療又は予防に用いる薬剤を提供することを目的とする。また、本発明はＴＮＦ−αの産生を抑制する薬剤を提供することを目的とする。  本発明は、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、グリシン、システイン、シスチン及びスレオニンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とする炎症性腸疾患治療又は予防薬を提供する。また、本発明は、ヒスチジン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、グリシン、システイン、シスチン及びスレオニンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とする炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項２】
リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びグルタミンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含有する請求項１記載の炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項３】
トリプトファンを含有する請求項１記載の炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項４】
さらに、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びグルタミンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含有する請求項３記載の炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項５】
アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンであり、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とする炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項６】
炎症性腸疾患がクローン病である、請求項１〜５のいずれか１項記載の炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項７】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項１〜５のいずれか１項記載の炎症性腸疾患治療又は予防薬。
【請求項８】
ヒスチジン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【請求項９】
アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンであり、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸を含む炎症性腸疾患を治療又は予防する薬剤に関するものである。また、本発明は、特定のアミノ酸を含むＴＮＦ産生を抑制する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患は、炎症を伴う腸疾患の総称であり、その主要な疾患としては潰瘍性大腸炎、クローン病などが挙げられる。潰瘍性大腸炎は、主として大腸粘膜或いは粘膜下層を侵し、しばしば、びらんや潰瘍を形成するびまん性非特異性炎症疾患である。臨床症状は、粘血便、腹痛、血便、水様便、発熱、食欲不振、悪心、嘔吐などである。潰瘍性大腸炎の治療用薬剤として、サラゾスルファピリジン、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）などが使用されているが、これらの薬剤では、潰瘍性大腸炎の治療が十分とは言えない。【０００３】
クローン病は、原因不明の特発性の慢性腸炎であり、小腸から大腸にかけて非特異的な炎症症状が表れる。繊維化や潰瘍を伴う肉芽腫性病変からなり、口腔から肛門まで全消化管に病変が現れる可能性がある。クローン病の臨床症状としては、腹痛、全身倦怠、下痢、下血・潜血陽性、発熱、体重減少、貧血、イレウス症状、腹部腫瘤、悪心、嘔吐、腹膜炎症状などが挙げられる。クローン病は、栄養障害の他、種々の消化器および腸管外症状、例えば、腸管狭窄、腸穿孔、腹部膿瘍、大出血などの重篤な症状を同時に引き起こし、腸手術などの処置を要することが多い。日本国内では栄養状態改善を目的に高カロリー輸液或いは経腸栄養療法が行われる。高カロリー輸液は、Bacterial translocationの危険性が高まる為、特に長期には経腸栄養療法が行われる。更に、薬剤による治療が試みられている。薬物療法は、主に、サラゾスルファピリジン、メトロニダゾール、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）などが投与される。最近では抗ＴＮＦ抗体の投与も臨床で使用され始めている。しかしながら、これらの薬剤の投与によっても、クローン病の治療はまだ不十分といえる。【０００４】
ＴＮＦ−αは、マクロファージ、マクロファージ系細胞（クッパー細胞）、好中球、好塩基球、好酸球、リンパ球、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、肥満細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、アストロサイト、ケラチノサイトなどから産生される炎症性サイトカインであり、クローン病などの多くの疾患の発症病理に深く関与していることが近年明らかとなっている。したがって、ＴＮＦ−αの作用を抑制することができれば、それらの疾患を治療することが可能になると考えられている。現在ステロイド性ホルモン剤や非ステロイド性抗炎症剤が一部の炎症性疾患に適用されているが、いずれもその作用点が多岐にわたり、特異的なＴＮＦ−α抑制作用でないため、有害な副作用が誘発されるおそれがある。特にステロイド剤の副作用は医療上の問題となっている。さらにペプチド性高分子化合物である抗ＴＮＦ−α抗体や可溶性ＴＮＦ−α受容体を用いた治療は慢性関節リウマチ及びクローン病などで良好な臨床結果を得ているが、結核、敗血症を含む重篤な感染症及び脱髄疾患の悪化があらわれることがあり、悪性腫瘍の発現も報告されている。更に、中和抗体形成が報告されており、充分な物とはいえない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は炎症性腸疾患の治療又は予防に用いる薬剤を提供することを目的とする。また、本発明はＴＮＦ−αの産生を抑制する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の目的を達成すべく、炎症性腸疾患及びＴＮＦ−αの産生について鋭意研究した結果、特定のアミノ酸を特定の量投与することにより、優れた効果が現れることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、グリシン、システイン、シスチン及びスレオニンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とする炎症性腸疾患治療又は予防薬を提供する。
本明細書において記載する個々のアミノ酸に関しては、D-型、L-型又はD,L混合物のいずれの形態をも含むものであるが、好ましくはL-型が使用される。また、個々のアミノ酸は遊離アミノ酸以外に、塩の形態であってもよい。更に個々のアミノ酸がペプチドの形態であっても良い。ペプチドの場合、好ましくはアミノ酸が20以下である。なお、アミノ酸の投与量は、遊離体換算で与えられるものとする。
また、本発明は、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンであり、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とする炎症性腸疾患治療又は予防薬を提供する。
さらに、本発明は、ヒスチジン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有し、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤を提供する。
またさらに、本発明は、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンであり、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与されることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の治療又は予防薬が適用される炎症性腸疾患は腸に関与する疾患であり、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病などの治療又は予防に有効である。
本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬は、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、グリシン、システイン、シスチン及びスレオニンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有する。１種又は２種以上のアミノ酸を含んでいてもよい。治療又は予防効果の観点から、本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬は、好ましくはリジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びグルタミンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有し、最も好ましくは、トリプトファンを含有する。トリプトファンに加えて、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びグルタミンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸を含んでいてもよい。
また、前記炎症性腸疾患治療又は予防薬は、前記アミノ酸が（２種以上の上記アミノ酸を含む場合には、その合計で）１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与される。治療又は予防効果の観点から、好ましくは、前記炎症性腸疾患治療又は予防薬は、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜1000mg/kgの量にて投与され、最も好ましくは、1〜500mg/kgの量にて投与される。
さらに、上記以外のアミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、セリン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギンなどを含んでいてもよい。【０００８】
また、別の態様では、本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬は、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンである。治療又は予防効果の観点から、本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬は、好ましくは、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.9〜1.5重量％のトリプトファン、４〜7.1重量％のリジン、２〜４重量％のヒスチジン、  ５〜９重量％のフェニルアラニン及び11〜20重量％のグルタミンであり、最も好ましくは、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、1.0〜1.3重量％のトリプトファン、4.5〜６重量％のリジン、2.4〜3.5重量％のヒスチジン、６〜８重量％のフェニルアラニン及び13〜17重量％のグルタミンである。
また、前記炎症性腸疾患治療又は予防薬は、前記アミノ酸が合計で１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与される。治療又は予防効果の観点から、好ましくは、前記炎症性腸疾患治療又は予防薬は、前記アミノ酸が合計で１日当たり0.1〜1000mg/kgの量にて投与され、最も好ましくは、１〜500mg/kgの量にて投与される。
さらに、上記以外のアミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、プロリン、セリン、チロシン、システイン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギンなどを含んでいてもよい。【０００９】
また、本発明の抑制剤は、マクロファージ、マクロファージ系細胞（クッパー細胞など）、好中球、好塩基球、好酸球、リンパ球、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、肥満細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、アストロサイト、ケラチノサイト等のＴＮＦ−α産生細胞からのＴＮＦ−αの分泌を抑制する。したがって、各種ＴＮＦ−αの産生を阻害することが有効な疾患、例えば、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、乏血性ショック、後乏血性再潅流障害、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症、肝炎、インスリン非依存性糖尿病、移植片の拒絶反応、対宿主性移植片病、癌、悪液質、関節炎（慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、その他の関節炎）、炎症性骨疾患、骨吸収病、ベーチェット症候群、感染性疾患（ＡＩＤＳにおける日和見感染症、大脳マラリア、ミコバクテリア感染症など）、自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性疾患、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）など）、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑らい、放射線による障害及び高酸素による肺胞の損傷などの治療又は予防剤として期待される。【００１０】
本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸を含有する。１種又は２種以上のアミノ酸を含んでいてもよい。
また、前記ＴＮＦ−α産生抑制剤は、前記アミノ酸が（２種以上の上記アミノ酸を含む場合には、その合計で）１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与される。抑制効果の観点から、好ましくは、前記ＴＮＦ−α産生抑制剤は、前記アミノ酸が１日当たり0.1〜1000mg/kgの量にて投与され、最も好ましくは、１〜500mg/kgの量にて投与される。
さらに、上記以外のアミノ酸、例えばリジン、メチオニン、グルタミン、グリシン、システイン、シスチン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、セリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン酸などを含んでいてもよい。【００１１】
また、別の態様では、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.5〜２重量％のトリプトファン、３〜９重量％のリジン、1.5〜５重量％のヒスチジン、４〜10重量％のフェニルアラニン及び９〜23重量％のグルタミンである。抑制効果の観点から、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、好ましくは、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、0.9〜1.5重量％のトリプトファン、４〜7.1重量％のリジン、２〜４重量％のヒスチジン、５〜９重量％のフェニルアラニン及び11〜20重量％のグルタミンであり、最も好ましくは、アミノ酸中の各アミノ酸含量が、1.0〜1.3重量％のトリプトファン、4.5〜６重量％のリジン、2.4〜3.5重量％のヒスチジン、６〜８重量％のフェニルアラニン及び13〜17重量％のグルタミンである。
また、前記ＴＮＦ−α産生抑制剤は、前記アミノ酸が合計で１日当たり0.1〜4000mg/kgの量にて投与される。抑制効果の観点から、好ましくは、前記ＴＮＦ−α産生抑制剤は、前記アミノ酸が合計で１日当たり0.1〜1000mg/kgの量にて投与され、最も好ましくは、１〜500mg/kgの量にて投与される。
さらに、上記以外のアミノ酸、例えばメチオニン、グリシン、システイン、シスチン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、セリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン酸などを含んでいてもよい。【００１２】
本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬及びＴＮＦ−α産生抑制剤は、適宜の剤形でよく、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等に調製される。
散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等に加える添加剤としては、賦形剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、軽質無水ケイ酸、トレハロースなど）、結合剤（例えば、デンプン糊液、ゼラチン溶液、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノールなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、コーティング剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセチルセルロース、白糖、酸化チタンなど）等があり、その他必要に応じて着色剤、矯味・矯臭剤等が加えられる。また、内用液剤に加えられる添加剤としては、保存剤（例えば、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、懸濁化剤または乳化剤（例えば、アラビアゴム、トラガント、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤など）、甘味・酸味剤（例えば、トレハロース、クエン酸など）等があり、その他必要に応じて着色剤、安定剤等が加えられ、これらに使用される溶剤は、主として精製水であるが、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール等も使用することができる。【００１３】
その他、デキストリン、蛋白質源、炭水化物源、ビタミン類、ミネラル、微量元素などの栄養成分を含んでいてもよい。蛋白質源としては、栄養供給のために有用な蛋白質であればよく、動物性、植物性いずれの蛋白質でもよい。動物性蛋白質としては、乳蛋白質が好ましく、特に、低乳糖乳蛋白質、カゼインなどが好ましい。植物性蛋白質としては分離大豆蛋白質などが好ましい。２種類以上の蛋白質を配合してもよい。また蛋白質源は、加水分解された蛋白質のペプチドでもよい。炭水化物源としては、糖類が好ましく、単糖、二糖及び多糖を挙げることができ、より具体的にはブドウ糖、果糖、マンノース、ガラクトース、ショ糖、砂糖（精製白糖でもよい）、麦芽糖、乳糖、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン、とうもろこしデンプン、大豆オリゴ糖、糖アルコール類などを挙げることができる。これら２種類以上の糖類を配合でもよい。炭水化物源として少なくとも砂糖、デキストリン、マルトデキストリン、とうもろこしデンプンのうちいずれか１種を含有することが好ましい。ビタミン類としては、ビタミンBl、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンH、葉酸、パントテン酸類、ニコチン酸類などが挙げられる。特に、ビタミンCとビタミンEが抗酸化剤としての特性に富み好ましい。ミネラルとしては、一般にこの分野で用いられる成分であれば特に制限は無い。具体的には、無機及び有機塩の形態のカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩素及びリンを挙げることができる。各無機及び有機塩については、既に上市されている輸液や経腸栄養剤に配合される有効成分と同じものを用いることができる。微量元素は、微量ではあるが生体にとって必要不可欠とされる金属元素である。具体的には、無機及び有機塩の形態の亜鉛、鉄、マンガン、銅、クロム、モリブデン、セレン、フッ素及びヨウ素などが挙げられる。各微量元素は、一日必要量を考慮して配合すればよい。【００１４】
本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬及びＴＮＦ−α産生抑制剤は、各有効成分をそのままか、または各剤形に応じた薬学的、製剤学的に許容される添加剤と混合・造粒し、もしくは適当な溶剤中に溶解して乳化または懸濁し、さらには適当な基剤と混合する等して、常法により調製することができる。
本発明の炎症性腸疾患治療又は予防薬及びＴＮＦ−α産生抑制剤は、経口又は非経口的に投与することができる。なお、上記のアミノ酸、添加剤、栄養成分などの含有量は、１日１回又は数回の服用によって、上述の１日当たりの投与量が達成できるように調整される。好ましい投与方法としては、経口、経腸（チューブを使用するなどした経胃、経十二指腸、胃ろう（ＰＥＧ）、浣腸が好ましい）、静脈内投与が挙げられる。
【実施例】
【００１５】
（炎症性腸疾患治療効果）
IL10遺伝子を欠損しているBalb/c系マウスを、IL10遺伝子を欠損しているC57BL/6系マウスより、７代バッククロスすることにより樹立した。IL10遺伝子を欠損しているBalb/c系マウスは、週齢を重ねることにより自然に大腸炎を発症し、下痢などの症状を示す。下痢症状などの観察により、大腸炎を発症したIL10遺伝子を欠損しているBalb/c系マウス（雄）より、脾臓、腸間膜リンパ節、仙骨リンパ節を採取した。単細胞化の後、およそ１×107個の細胞を、免疫不全マウスであるScidマウスにIP投与した（以下、実施例において、IP投与したScidマウスを「実験マウス」と呼ぶ）。その後、餌を実験食にした。実験食としては、普通食、あるいは下記表１〜５に示す普通食にアミノ酸を混合したものを用いた。細胞移入後、３週間の時点で解剖し、大腸を採取し、内容物を洗い流した後、重量を計測した。大腸重量増加抑制率は、次式により求めた。【００１６】
大腸重量増加抑制率＝（１−（その群の大腸重量−移入なし群の大腸重量）／（普通食の大腸重量−移入なし群の大腸重量））×100（％）【００１７】
結果を下記表１〜５に示す。なお、アミノ酸混合物Aは以下のアミノ酸からなる（重量％は遊離体換算で示す）。
L-イソロイシン：4.56重量％、
L-ロイシン：6.38重量％、
塩酸L-リジン：6.30重量％、
L-メチオニン：4.60重量％、
L-フェニルアラニン：6.18重量％、
L-トレオニン：3.71重量％、
L-トリプトファン：1.07重量％、
L-バリン：4.98重量％、
L-塩酸ヒスチジン：3.56重量％、
塩酸L-アルギニン：7.99重量％、
L-アラニン：6.38重量％、
L-アスパラギン酸マグネシウム・カリウム：7.35重量％、
L-アスパラギン酸ナトリウム一水和物：6.15重量％、
L-グルタミン：13.71重量％、
グリシン：3.58重量％、
L-プロリン：4.47重量％、
L-セリン：8.23重量％、及び
L-チロシン：0.78重量％。【００１８】
【表１】
2007004613.tif 000002
【００１９】
【表２】
2007004613.tif 000003
【００２０】
【表３】
2007004613.tif 000004
【００２１】
【表４】
2007004613.tif 000005
【００２２】
【表５】
2007004613.tif 000006
【００２３】
上記モデルは、腸炎に伴い細胞浸潤が起こるため、細胞浸潤の程度が大腸重量に反映され、炎症性腸疾患治療効果は大腸重量により評価することができる（Y. Ikenoue et al., International Immunopharmacology 5 (2005) 993-1006参照）。【００２４】
（ＴＮＦ−α産生抑制効果）
Total ＲＮＡ抽出
表６に示すアミノ酸を普通食に混合した実験食を実験マウスに与え、３週間後大腸を摘出した。大腸摘出サンプルは、Isogen（日本ジーン）500μLでホモジェナイズした。クロロホルム100μLで混合し、15,000rpm、４℃で遠心し、水層を回収し、これに等量の２−プロパノールを加え、15,000rpm、４℃で遠心した。ペレットを70（v/v）％エタノールで洗浄し、風乾後ＤＥＰＣ処理水で溶解した。【００２５】
ｃＤＮＡ合成
試薬はすべてInvitrogenのものを用いた。0.5μgのtotal ＲＮＡ、oligo(dT)0.5μgをＤＥＰＣ処理水12μLに溶解し、70℃で10分間加熱し、氷上で１分間冷却後、5 x 1st strand buffer ４μL、10mM dNTP mix １μL、100 mM DTT ２μLを加え、42℃で５分間反応させた。SuperScriptII １μL（200Ｕ）を加え、42℃で50分間、70℃で15分間反応を行った。【００２６】
SYBR Greenを用いた定量的RT-PCR
PCRベースの遺伝子発現測定はSYBR-Green PCR Mastermix（Applied Biosystems）及びABI PRISM 7700 Systemを用いて行った。SYBR-Green PCR MastermixはSYBR-Green及び耐熱性DNAポリメラーゼを含み、SYBR-Greenが、PCRにより増幅された二本鎖DNA特異的に結合することにより生じる蛍光をABI PRISM 7700 Systemにより検出する。有意な蛍光シグナルが初めて検出されたPCRサイクル数を比較することにより、サンプル間の遺伝子発現量を比較することができる。total RNA 10 ng相当のcDNAを定量的PCRのテンプレートとして用い、１サンプル当たりｎ＝２以上の測定を行った。SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）7.5μLに各遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーをそれぞれ7.5pmolずつ加え、水で15μLとした。PCR反応は95℃で10分間反応後、95℃で10秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間のサイクルを40サイクル繰り返して行った。なお、定量的RT-PCRに用いたPCRプライマー配列は以下のとおりである。
フォワードプライマー：ccaccacgctcttctgtcta（配列番号１）
リバースプライマー：agggtctgggccatagaact（配列番号２）
ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現抑制率は、次式により求めた。【００２７】
ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現抑制率＝（１−（その群の相対的ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量−移入なし群の相対的ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量）／（普通食の相対的ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量−移入なし群の相対的ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現量））×100（％）【００２８】
更に、Reg3γ, Groαに関しても、同様にmRNA量を測定した。
尚、PCRプライマーは以下のものを用いた。
Reg3γフォワードプライマー：aacagaggtggatgggagtg（配列番号３）
Reg3γリバースプライマー：gggtaccacagtgattgcct（配列番号４）
Groαフォワードプライマー：gctgggattcacctcaagaa（配列番号５）
Groαリバースプライマー：aagggagcttcagggtcaag（配列番号６）
結果を表６〜８に示す。【００２９】
【表６】
2007004613.tif 000007
【００３０】
【表７】
2007004613.tif 000008
【００３１】
【表８】
2007004613.tif 000009
【配列表】
2007004613000001.app
【国際調査報告】
2007004613.tif 000010
2007004613.tif 000011
2007004613.tif 000012
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