(57)【要約】【課題】リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをより確実にスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、光反応性リガンドが有する固定化機能を利用して、固相に光反応性リガンドを固定化し、光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄し、固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法。【選択図】図4
2007083793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、
光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
光反応性リガンドを固相に固定化し、
光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄し、
固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法。
【請求項２】
光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
光反応基がジアジリン基である請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
光反応性リガンドの固相への固定化をビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Hisタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて行う請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがHisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいずれかである請求項4に記載の方法。
【請求項６】
固相が磁気ビーズ、または基板である請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を、磁気ビーズを回収することで行う請求項6に記載の方法。
【請求項８】
洗浄は、界面活性剤を用い行う請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する請求項1〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを増殖させ、増殖させたタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを用いて、
請求項１に記載された光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を少なくとも1回行う、
請求項1〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングするために用いるキットであって、
光反応基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する固相を含む前記キット。
【請求項１３】
光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である請求項1２に記載のキット。
【請求項１４】
光反応基がジアジリン基である請求項1２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
光反応性リガンドを固定化する固相は、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Hisタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて光反応性リガンドを固定化するものである請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがHisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいずれかである請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
固相が磁気ビーズ、または基板である請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄するための洗浄剤をさらに含む請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれかの方法において使用される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
光反応基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む、光反応基を有する光反応性リガンドを作製するためのキット。
【請求項２１】
光反応基を有する化合物は、以下の一般式（Ｃ）で示されるフェニルジアジリン化合物である請求項２０に記載のキット。
【化１】
2007083793.tif 000030
（上記式中、Ｒ6は、ハロゲン原子、またはスルホン酸エステル残基であり、Ｒ7は、炭素数1〜6のアルキルチオスルホニル基または炭素数1〜6のアルキルチオ基であり、Ｒ8は、Ｈまたは炭素数1〜6のアルキル基であり、ｎは１〜６の整数である。）
【請求項２２】
リガンド標識物質は、ビオチン、ヒスチジンタグ（Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原である請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む、バリデーションするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００６年１月２３日出願の日本特願２００６−１４３１４号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、フェニルジアジリンなどの光反応基を利用し、提示ファージを効率的に単離するパニング法に関する。この方法を以下、フォトパニング法と呼ぶ。本発明は、このフォトパニング法を利用した、リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドを効率的にスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、このスクリーニングする方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質やペプチドをファージ表面に提示し、目的のタンパク質やペプチドを提示したファージをスクリーニングする技術は、1985〜1990年にかけて完成された。（G． P. Smith (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228, 1315-1317.（非特許文献1），S. E. Cwirla, E. A. Peters, R. W. Barrett, W. J. Dower (1988) Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73, 305-318 （非特許文献2），S. F. Parmley, G. P. Smith. (1990) Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 （非特許文献3））【０００４】
提示ファージはかなり強力な変性条件でも生存可能であり、生物を扱うというよりはタンパク質分子を扱うかのように利用でき、さらに容易にそれを発現する遺伝子を容易に単離できることから、バイオテクノロジー分野で広く利用されている。提示ファージのスクリーニング法として最もよく利用されるパニング法は、砂金などを選鉱なべで洗ってより分けるという意味をもつ「pan」からきているもので、目的の提示ファージをリガントとのアフィニティーでより分け、その後、目的ファージが濃縮されたファージ集団を増殖させる。これを繰り返すことで、目的の提示ファージが次第に濃縮され、単離できるという方法である(図2参照)。ファージは数時間以内に1010個を超えるほどの飛躍的な増殖効率であるため、１日で数回のパニング操作が可能である。近年、この高速なスクリーニング能力を利用して、抗体医療のシードを探し出す基礎技術として、抗体を提示したファージのパニング法が期待されている。【０００５】
本発明者らは、これまでジアジリン誘導体を光反応基として、独自の高速光アフィニティー法の開発を行ってきた。光アフィニティー法は光反応を利用して特異的なリガンドと相手のタンパク質を非可逆的につなぎとめる技術である。ジアジリンは、他の光反応基に比べ、この非可逆的結合を有利に起こす特徴を持つ。（Y. Sadakane, Y. Hatanaka (2004) Multifunctional photoprobes for rapid protein identification. In F. Darvas, A. Guttman and G. Dorman eds., Chemical Genomics, Marcel Dekker Inc., New York. Pp199-214（非特許文献4）、Y. Hatanaka, Y. Sadakane (2002) Photoaffinity labeling in drug discovery and developments: Chemical gateway for entering proteomic frontier.  Curr. Top. Med. Chem. 2, 271-288（非特許文献5）、畑中保丸  構造生物学的有機化学：光アフィニティラベルによる蛋白質機能構造のプロービング、有機合成化学会誌,56(7)、581-590,1998（非特許文献6）、M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D-Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14, 849-852.（非特許文献7）、M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hatanaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, G. D. Holman (2002) Improvement in the properties of 3-phenyl-3-trifluoromethyldiazirine based photoreactive bis-glucose probes for GLUT4 following substitution on the phenyl ring. Chem. Pharm. Bull. 50, 1004-1006（非特許文献8）、Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000（非特許文献9）、Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins. J. Am. Chem. Soc. 120, 453-454, 1998（非特許文献10）、特開2000-319262号公報（特許文献１））。【０００６】
本発明者らは、光反応基の特徴と提示ファージパニングとの組み合わせによる技術革新を期待し予備的な実験を行った。化学的選択性のある官能基をもつ光反応基を固相上に固定化し、この官能基を頼りに糖鎖リガンドまたはペプチドリガンドを導入した固相を製作した。この予備的な実験結果から提示ファージを固相上に共有結合で固定化できること、また、この固相上からファージを回収できることが明らかになった。しかし、この方法は固相上に固定化できた光反応性リガンドの量に限界があったため、固定化されたリガンド量は1cm2あたり数千個の提示ファージを一度にスクリーニングできる量に留まった。このため、固相上のリガンド量が不十分なことが影響したと考えられるファージ捕捉量の不足が問題となり、実際のパニングに使用するにはその数百倍の面積が必要なため、実用的技術として確立するには至らなかった。（Y. Sadakane, H. Nakashima, J. -J. Park, K. Nakagomi, Y. Hatanaka (2002) EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS. Photomedicine and Photobiology 23, 83-84（非特許文献11），Y. Sadakane, H. Nakashima, J.-J Park, Y. Hatanaka (2002) Preparation of solid photo-crosslinking matrix and application to photo-panning of displayed phages. Photomedicine and Photobiology 24, 85-86.（非特許文献12））
【非特許文献１】G． P. Smith (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228, 1315-1317.
【非特許文献２】S. E. Cwirla, E. A. Peters, R. W. Barrett, W. J. Dower (1988) Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73, 305-318
【非特許文献３】S. F. Parmley, G. P. Smith. (1990) Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382
【非特許文献４】Y. Sadakane, Y. Hatanaka (2004) Multifunctional photoprobes for rapid protein identification. In F. Darvas, A. Guttman and G. Dorman eds., Chemical Genomics, Marcel Dekker Inc., New York. Pp199-214
【非特許文献５】Y. Hatanaka, Y. Sadakane (2002) Photoaffinity labeling in drug discovery and developments: Chemical gateway for entering proteomic frontier.  Curr. Top. Med. Chem. 2, 271-288
【非特許文献６】畑中保丸  構造生物学的有機化学：光アフィニティラベルによる蛋白質機能構造のプロービング、有機合成化学会誌,56(7)、581-590,1998
【非特許文献７】M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D-Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14, 849-852.
【非特許文献８】M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hatanaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, G. D. Holman (2002) Improvement in the properties of 3-phenyl-3-trifluoromethyldiazirine based photoreactive bis-glucose probes for GLUT4 following substitution on the phenyl ring. Chem. Pharm. Bull. 50, 1004-1006
【非特許文献９】Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000
【非特許文献１０】Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins. J. Am. Chem. Soc. 120, 453-454, 1998
【非特許文献１１】Y. Sadakane, H. Nakashima, J. -J. ParkJ, K. Nakagomi, Y. Hatanaka (2002) EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS. Photomedicine and Photobiology 23, 83-84
【非特許文献１２】Y. Sadakane, H. Nakashima, J.-J Park, Y. Hatanaka (2002) Preparation of solid photo-crosslinking matrix and application to photo-panning of displayed phages.. Photomedicine and Photobiology 24, 85-86.
【特許文献１】特開2000-319262号公報上記非特許文献１〜１２および特許文献１の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
目的の提示ファージを単離する技術であるパニング法は、それまで知られていたスクリーニング法に比べれば画期的であり、様々な分野で応用できると考えられた。しかし、実際には使用範囲は限られている。これには、主に二つの原因があるとされる。１つ目は、目的の提示ファージを単離できるかは、リガンドと提示したタンパク質やペプチドとの親和性で決まってしまうことである。実際のパニング法では、両者間の親和性がかなり強くないと、再現性の良いパニング操作ができず、濃縮効率も安定しないことが知られている。これに対する改善策として、主に提示ファージ発現系の改良が進められており、発現するタンパク質数を増やすなどの工夫がなされている。しかし、一般的な手法とはなっていない。２つ目は、パニング操作後に行うファージの増幅で、ファージ間で生長差が生じることである。特に、タンパク質など大きな分子をファージに提示させると生長差が顕著となり、圧倒的に野生型に近いファージがマジョリティーとなることが知られている。これらの理由で数回のパニング操作を繰り返すうちに目的の提示ファージはどこかにいってしまい、野生型のファージが最終的に単離されてしまうといった問題があることが長い間指摘されている。【０００８】
上記の問題点を解決するためには、リガンドと提示ファージ間の親和性に頼らない選別法を開発し、非特異的な結合で残ってしまう野生株に近いファージを徹底的に排除する必要がある。この解決法を実現する手段として、光反応基を利用したパニング法を着想した。本発明者らは予備的な実験として、提示ファージが固相上に配列した光反応性リガンドにより固定化できることを既に明らかにしている。しかし、この方法は固相上に固定化できた光反応性リガンドの量に限界があったため、標準的なファージライブラリーを対象としたパニングに使用する目的には、その数百cm2の固相面積が必要なため、実用的技術として確立するには至らず、方法論的可能性を示唆するに留まった。【０００９】
本発明は、上記の解決法を実現することを目的とし、タンパク質やペプチドなどをファージ表面に提示したファージライブラリーから、目的のタンパク質やペプチドを提示したファージをスクリーニングする方法である。充分量の光反応性リガンドを介し、ファージライブラリーから目的の提示ファージを効率よくマトリックス上に特異的に釣り上げ、かつ確実に単離できる実用的方法を提供し、リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドを、従来法に比べてより確実にスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来のパニング法において、光反応性のリガンドを利用することで、目的の提示ファージを効率よく、かつ確実に単離できることを見いだして本発明を完成させた。【００１１】
上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
[1]光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、
光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
光反応性リガンドを固相に固定化し、
光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄し、
固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法。
[2]光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である[1]に記載の方法。
[3]光反応基がジアジリン基である[1]または[2]に記載の方法。
[4]光反応性リガンドの固相への固定化をビオチン−アビジンまたはストレプトアビジン系、Hisタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて行う[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがHisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいずれかである[4]に記載の方法。
[6]固相が磁気ビーズ、または基板である[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を、磁気ビーズを回収することで行う[6]に記載の方法。
[8]洗浄は、界面活性剤を用い行う[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを増殖させ、増殖させたタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを用いて、[1]に記載された光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を少なくとも1回行う、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[11]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する[10]に記載の方法。
[12]光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングするために用いるキットであって、
光反応基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する固相を含む前記キット。
[13]光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である[12]に記載のキット。
[14]光反応基がジアジリン基である[12]または[13]に記載のキット。
[15]光反応性リガンドを固定化する固相は、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Hisタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて光反応性リガンドを固定化するものである[12]〜[14]のいずれかに記載のキット。
[16]（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがHisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいずれかである[15]に記載のキット。
[17]固相が磁気ビーズ、または基板である[12]〜[16]のいずれかに記載のキット。
[18]光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄するための洗浄剤をさらに含む[12]〜[17]のいずれかに記載のキット。
[19][1]〜[11]のいずれかの方法において使用される、[12]〜[18]のいずれかに記載のキット。
[20]光反応基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む、光反応基を有する光反応性リガンドを作製するためのキット。
[21]光反応基を有する化合物は、以下の一般式（Ｃ）で示されるフェニルジアジリン化合物である[20]に記載のキット。
【化１】
2007083793.tif 000003
（上記式中、Ｒ6は、ハロゲン原子、またはスルホン酸エステル残基であり、Ｒ7は、炭素数1〜6のアルキルチオスルホニル基または炭素数1〜6のアルキルチオ基であり、Ｒ8は、Ｈまたは炭素数1〜6のアルキル基であり、ｎは１〜６の整数である。）
[22]リガンド標識物質は、ビオチン、ヒスチジンタグ（Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原である[20]または[21]に記載のキット。
[23]タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む、バリデーションするためのキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来のパニング法と比較して約1000倍もの濃縮効果をもつパニング法を提供できる。光反応性のリガンドは、それと親和性のある提示ファージを共有結合で捉えることが可能である。この不可逆的な結合により、強力な洗浄を行っても、目的の提示ファージを逃すことがなく、かつ、非特異的に吸着した提示ファージのほとんどを取り除くことが可能となる。提示ファージを捉える光反応は、光反応基がジアジリン基である場合、360nm付近の光で効率良く、しかも極めて速くおこる。また、この光反応は、提示ファージにダメージを与えることはなく、パニング法に必要なファージの増殖能には影響を与えない。【００１３】
さらに、強力な洗浄操作が可能となることで、従来のパニング法の洗浄のように経験的な感が必要となくなる。その結果、リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをより効率的に、かつ確実にスクリーニングすることができる。さらに、提示ファージの単離操作を機械化することが可能である。特に、近年、開発が進められている抗体提示ファージの単離法として、パニング操作の機械化は経済的にも意味があるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［スクリーニング方法］
本発明は、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法であり、この方法は、
(1)光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、
(2)光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
(3)光反応性リガンドを固相に固定化し、
(4)光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄し、
(5)固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む。【００１５】
[光反応性リガンド]
本発明において、光反応性リガンドは、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージが提示するタンパク質またはペプチドに対するリガンドであって、光反応基を有するものである。ここで、リガンドとは、例えば、ペプチドまたはタンパク質であり、より具体的には、元の配列にシステイン残基を１つ含むペプチドまたは、システイン残基を１つ導入したペプチド、および、適切部位に光反応性アミノ酸を導入したペプチドがある。さらに、S-S結合に関与していないシステイン残基を含むタンパク質、または、遺伝子改変法などで、新たにシステイン残基を導入したタンパク質がある。これらの性質を満たしていれば、任意の配列のペプチドやタンパク質をリガンドとすることができる。【００１６】
また、光反応基は、特定波長の光照射で反応性の高い中間体をとる化学反応基であり、その中間体は最寄りの分子と共有結合を結び、安定化する性質をもつ。光反応基の例としては、例えば、ジアジリン基、アジド基、カルボニル基などを挙げることができる。本発明では、光反応基は、ジアジリン基であることが好ましい。【００１７】
光反応基を装着したリガンドを光反応性リガントと呼び、光反応性リガントとしては、例えば、光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸および光反応性糖鎖を挙げることができる。【００１８】
［光反応性ペプチドリガンドの作製方法］
光反応性ペプチドリガンドは、リガンドとなり得るペプチドに光反応基を導入することで調製することができる。リガンドとなり得るペプチドへの光反応基の導入は、以下の２つの方法を挙げることができる。【００１９】
１つは、システイン残基を介して、光反応基を導入する方法であり、もう１つは、光反応性アミノ酸を利用して製作する方法である。ペプチドリガンドにシステイン残基を含む配列では、それを介して光反応基を導入することができる。また、システイン残基を含まない配列のリガンドでは、任意の位置にシステイン残基を導入して、光反応基を結合させることができる。光反応性アミノ酸を利用すれば、ペプチド合成機などを使用し光反応性ペプチドを合成することができる。【００２０】
以下に光反応性カルモジュリン結合ペプチドリガンドを例に、光反応性ペプチドリガンドの調製方法をさらに説明する。【００２１】
カルモジュリン結合ペプチド（17残基）をテンプレートに、2種類の光反応性カルモジュリン結合ペプチドリガンドを製作した例である。
光反応性ペプチドリガンドは、以下の配列１のカルモジュリン結合ペプチドをもとに製作した。このペプチドはカルモジュリンタンパク質を認識し特異的に結合することが確かめられている。配列２および配列４で示した、製作方法の異なる２つの光反応性ペプチドを合成した。１つは、N末端から3つ目のトリプトファンを、光反応性アミノ酸tmd(Phe)で置き換えたペプチドを合成し、N末端をビオチン化した光反応性ペプチドである。（配列２）。配列２の下にその化学構造を示した。tmd(Phe)（化合物１）のアミノ基にFmoc保護基を付けたFmoc-tmd(Phe)（化合物２）を用い、ペプチド合成機で光反応性ペプチドを製作した。もう１つは、N末端から3つ目のトリプトファンを、システインに置き換えたペプチドを合成し（配列３）、N末端をビオチン化した後、化合物３に示されるジアジリンをチオール結合で導入した光反応性ペプチドである（配列４）。合成した2種類の光反応性カルモジュリン結合ペプチドは、HPLCで精製し使用した。【００２２】
【化２】
2007083793.tif 000004
【００２３】
【化３】
2007083793.tif 000005
【００２４】
〔光反応性タンパク質リガンドの製作方法〕
光反応性タンパク質リガンドは、カルモジュリンに光反応基を装着することで製作できる。タンパク質リガンドは、Cys残基を導入した組換えカルモジュリンタンパク質（分子量約2万）を大腸菌で製作し、作製したタンパク質に光反応基を装着する。光反応基を導入する部位を変えた3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質リガンドの作製例を以下に示す。【００２５】
システイン残基に特異的に結合するジアジリンチオスルフォネート（diazirine thiosulfonate）（化合物３）を、遺伝子改変で導入したシステイン残基へ装着することで作製した。光反応基の導入部位の異なる3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質を製作した。カルモジュリンとその結合ペプチドであるMLCK断片ペプチドの立体構造解析結果（PDB: ICDL）から、26、75、115番目のアミノ酸がMLCK断片ペプチドを中心にそれぞれ別の位置にあることがわかる。それぞれのアミノ酸をシステインに変換して、化合物３を装着した。その後、それぞれをビオチン化した。下記の（模式図１）はカルモジュリンタンパク質と115番目のリジンの位置を示している。カルモジュリンはもともとシステイン残基を含まないタンパク質である。遺伝子を改変で、N末端に６個のヒスチジンをもち、26、75、115番目のアミノ酸をシステインに変異させたカルモジュリンを大腸菌で作製した（模式図２）。６個のヒスチジンは発現タンパク質の精製に必要なタグである。カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとSタグ提示ファージを用いて、実施例において、評価実験を行った。【００２６】
【化４】
2007083793.tif 000006
【００２７】
具体的には、精製した発現タンパク質（2mg/ml）0.5mLと化合物3(1mol/L)0.015mLとアセトニトリル0.5ｍLを混ぜ、4℃で一晩おき、模式図３に示したタンパク質を製作した。余分な試薬はゲルろ過で除いた。精製した光反応性カルモジュリンとビオチンOSuをpH9.0の条件下で4℃一晩静置し、ビオチン化光反応性カルモジュリンを製作した。余分な試薬はゲルろ過で取り除いて、ビオチン化光反応性カルモジュリンを得た。（模式図４）カルモジュリン1分子にビオチンが何個ついているかは、ビオチン量を2-hydroxyazobenzene-4'-carboxylic acid (HABA)を使用した定量法で決定し、カルモジュリン量と比較することによって測定することができる。【００２８】
[光反応性核酸]
光反応性核酸リガンドは、例えば、光反応基を有する DNA、RNA、PNAなど少なくとも1つの核酸のリン酸基がチオリン酸基を有する核酸に光反応基を装着したものであることができる。【００２９】
光反応性核酸リガンドは、少なくとも1つの核酸のリン酸基がチオリン酸基とチオリン酸基のチオール基と反応性の基を有するフェニルジアジリン化合物とを反応させることで製作することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて、チオリン酸基を有するものは、公知であり、下記文献に記載の公知の方法により適宜合成できる。（Zon, G.; Geiser, T.G. (1991) Phosphorothioate oligonucleotides: chemistry, purification, analysis, scale-up and future directions. Anticancer Drug Des. 6:539-568. および  Caruthers, M.H.; Beaton, G.; Wu, J.V.; Wiesler, W. (1992) Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides and deoxyoligonucleotide analogs. Methods Enzymol. 211:3-20. 参照、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。）【００３０】
核酸はあらかじめ公知の方法で、ビオチンタグを装着した核酸誘導体とすることができる。（S. Agrawal; C. Christodoulou; MJ Gait (1986) Efficient methods for attaching non-radioactive labels to the 5' ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides  Nucleic Acids Res. 14: 6227 - 6245. 「Nonisotopic DNA probe techniques」(ed. L.J Kricka) Academic Press, New York  参照、その全記載は、ここに特に開示として援用される。）【００３１】
光反応基であるフェニルジアジリン化合物は、例えば、以下の一般式（Ｃ）で示される化合物であることができる。【００３２】
【化５】
2007083793.tif 000007
【００３３】
上記式中、Ｒ6は、ハロゲン原子(例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ)、またはスルホン酸エステル残基である。スルホン酸エステル残基は、具体的には、メタンスルホニル基あるいはトルエンスルホニル基であることができる。Ｒ7は、炭素数1〜6のアルキルチオスルホニル基または炭素数1〜6のアルキルチオ基である。アルキルチオスルホニル基は、ＲＳＯ2−で示され、Ｒは例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルであることができる。アルキルチオ基は、ＲＳ−で示され、Ｒは例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルであることができる。Ｒ8は、Ｈまたは炭素数1〜6のアルキル基であることができ、アルキル基は、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルであることができる。ｎは１〜６の整数であり、好ましくは1〜4の整数であり、より好ましくは１である。【００３４】
上記のチオール反応性基を有するフェニルジアジリン化合物と核酸誘導体とを、例えば、50：１〜100：１程度のモル比で混合する。さらに、この混合物に、核酸誘導体に対して50〜100倍のモル比のジイソプロピルエチルアミンを加え、反応はジメチルスルオキシド中、37℃で行うことができる。但し、ジイソプロピルエチルアミンの代りに、N-メチルモルホリン、トリエチルアミン等を用いることもできる。反応溶媒としては、ジメチルスルホキシドの代りに、メタノール、ジメチルホルムアミド等を用いることもできる。反応温度は、37℃を含む、例えば、4〜70℃の範囲とすることができる。【００３５】
フェニルジアジリン化合物の濃度は、例えば、0.1〜0.5mMの範囲とすることが適当である。反応時間はフェニルジアジリン化合物の種類によるが、例えば、数10分から数時間程度であることができる。反応後は液体窒素中で保存し、過剰な反応を起こさないようにすることが好ましい。産物であるフェニルジアジリン付加核酸誘導体は、例えば、高速液体クロマトグラフィーで精製することができる。高速液体クロマトグラフィー以外も、例えば、電気泳動等で精製することもできる。【００３６】
[光反応性糖鎖]
光反応性糖鎖リガンドは、アルデヒド末端をもつ様々な単糖またはオリゴ糖であることができる。単糖では、ピラノース環、フラノース環をもつ、例えば、グルコピラノース（グルコース）、グルコフラノースや、エピマーであるガラクトース、マンノースなどが例としてあげられる。オリゴ糖では、マルトース、スクロース、ラクトースなどの二糖類から、ルイスＸなどの多糖類が例としてあげられる。アルデヒド末端を有する糖であれば、光反応性糖鎖リガンドを製作できるので、上記の例に限定される意味ではない。【００３７】
光反応性糖鎖リガンドは、糖鎖のアルデヒド末端に、以下の論文に示された方法で、光反応基とビオチンを同時に装着することができる。（Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000（非特許文献９）参照）【００３８】
[タンパク質提示ファージ]
タンパク質提示ファージは、リガンドと相互作用をすると予想されるまたは期待されるタンパク質を表面に提示するファージである。タンパク質は、単独（一種類）であっても、多種類であってもよい。例えば、任意の提示タンパク質がcDNAライブラリーをもとに提示されたファージの集団であってもよく、これを、「ライブラリー」と呼ぶ。【００３９】
ファージの表面に任意のタンパク質やペプチドを提示できる。例えば、「タンパク質提示ファージ」には、ファージの足に提示するタイプ（M13型）と、頭部（図1）に提示するタイプ（T7型）がある。本発明ではいずれの「タンパク質提示ファージ」を用いることもできる。「タンパク質提示ファージ」を用いることで、特定の受容体タンパク質に親和性をもつタンパク質を探し出すことができる。同様に、ペプチド提示ファージを用いることで、特定のリガンドに親和性をもつペプチドを探し出すことができる。【００４０】
タンパク質またはペプチド提示ファージの調製方法は、常法により行うことができる。提示したいタンパク質及びペプチドは、cDNAを元に製作することができる。cDNAは、臓器などから調製したmRNAから製作することができる。特定の臓器などからcDNAを調製し、タンパク質またはペプチドを提示できるファージ集団（ライブラリー）は、市販品として購入することも可能である。また、ファージに提示されるタンパク質として抗体を挙げることができ、抗体タンパク質を提示したファージは、ファージ抗体とも呼ばれる。ファージ抗体をスクリーニングする場合には、ファージ抗体のライブラリーを用いることができる。【００４１】
以下に本発明のフォトパニング法について説明する。
まず、本発明のフォトパニング法について図3を参照して概略説明する。
1.フォトパニング法では光反応性リガンドを使用する(一番左のステップ)。
2.リガンドに親和性のある提示ファージを親和性によりリガンドに結合させ、その瞬間に光照射を行うと、リガンドと提示ファージが共有結合で結ばれる(左から2つめのステップ)。
3.如何なる洗浄条件でも、この非可逆的結合（共有結合）で結ばれたファージは取り除かれることはない。強烈な洗浄により、共有結合で捉えられていない非特異的結合ファージ（リガンドに結合していないファージなど）は取り除かれる(左から3つめのステップ)。
4.捉えられた提示ファージを大腸菌で増殖させ、最初のファージ試料とし、フォトパニングを繰り返すことができる。(左から4つめのステップ)。【００４２】
さらに、本発明のフォトパニング法を、図4を参照しながら詳細に説明する。尚、本発明のフォトパニング法には、主に、（Ａ）光反応性カルモジュリン結合ペプチドで、カルモジュリン提示ファージを単離するフォトパニング法と（Ｂ）光反応性カルモジュリンタンパク質で、カルモジュリン結合ペプチドを提示したファージを単離するフォトパニング法があるが、図４では、（Ａ）の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを用いる方法を例に、説明する。【００４３】
［混合］（図４、模式図５）
本発明の方法では、上記光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージを液相中で混合する。液相での混合は、以下のように行うことができる。即ち、リガンドと目的とするタンパク質が、生理的に結合できるような条件を満たす溶液を使用する。そこに、光反応性リガンドとタンパク質提示ファージを加え、攪拌させ、混合する。結合を促進させるために、混合後、例えば、37℃で10〜60分程度静置することもできる。これにより、選択効率の向上が可能になる。【００４４】
光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージとを液相中で混合すると、光反応性リガンドとタンパク質提示ファージのタンパク質との親和性が一定以上であれば、相互作用をして複合体を形成することができる。複合体は、タンパク質とリガンド間で生じる、水素結合、疎水性相互作用などの弱い結合(相互作用)で成り立っている。【００４５】
[活性光照射] （図４、模式図６）
上記混合工程で形成した複合体は、光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射することで、光反応性リガンドとタンパク質提示ファージとは、共有結合される。これにより、弱い結合(相互作用)で成り立っていた複合体が、共有結合という強い結合で成り立つものとなる。活性光の照射は、以下のように行うことができる。【００４６】
［光の照射条件］
活性光の波長は、使用する光反応基で異なるがジアジリンの場合は、360nmが最大波長の光を使用する。実験では、市販のUV-Aランプを用いて活性光を照射した。このランプは、最大波長360nmをもつランプである。光反応基がジアジリン以外の場合、各光反応基の種類に応じて照射する活性光の波長は適宜選択できる。【００４７】
溶液中で形成された複合体に、活性光をあて共有結合を形成する。360nmの光は溶液には、ほとんど吸収されず、光をさえぎることなく各成分へ照射が行き届くと考えられる。光照射は溶液の上部と下部の両方から、それぞれ例えば、30W/m2の強度で照射し光反応を促進することができる。光の強度は、溶液の組成等を考慮して適宜決定できる。【００４８】
ジアジリンの光化学的性質により、比較的短い照射時間で共有結合を形成できる。照射時間は、評価実験（１）実験１の図６で検討した結果から、1分で充分であるが、より共有結合形成を完全なものにするために例えば、2分間とすることが適当である。但し、2分間に限定される意図ではない。この条件で、活性光を10分間、ファージに照射しても、その後のファージの生存率には変化がなかった。したがって、照射時間は、例えば、10分間以下の範囲で適宜決定することができる。【００４９】
次いで、共有結合した複合体が有する光反応性リガンドを固相に固定化する。固定化は、例えば、ビオチン−アビジン系、Hisタグ−ニッケルキレート系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、抗原−抗体反応系などを用いて行うことができる。【００５０】
あらかじめ光反応性リガンドを固定化しておいたものでは、結合する提示ファージとの自由な接触が阻害され、パニング効率が減少すると考えられる。そこで、本発明では、例えば、光反応性リガンドを例えば、ビオチン化し、このタグを用いてアビジンで固定化する方法を用いることができる。これにより、光反応性リガンドと提示ファージが溶液中で自由に接触できるようになり、特異的な提示ファージとの親和性による結合を促進できると考えられる。【００５１】
固相は、例えば、磁気ビーズ、基板等であることができる。さらに固相は、上記固定化に利用できるいずれかの機能を有するものである。例えば、光反応性リガンドがビオチンを有する場合、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであることができる。それ以外の固相としては、光反応性リガンドがHisタグを有する場合、固相はニッケルを被覆したものであり、光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有する場合、固相はホウ素を被覆したものであり、光反応性リガンドが抗原を有する場合、固相は抗体を被覆したものであることができる。【００５２】
［固定化アビジンの性状］（図４、模式図７）
複合体は、例えば、光反応性リガンドに導入されているビオチンをタグとして、固定化アビジンで回収できる。固定化アビジンには様々な種類があるが、例えば、ポリスチレンプレートに固定化されているアビジン、及び磁気ビーズに固定化されているアビジンを用いることができる。ビオチン−アビジン系以外の系による固定化でも同様である。【００５３】
〔プレート固定化アビジン〕
プレート固定化アビジンはプレート上で洗浄するため、バックグランドは非常に少なく、安定した回収効率を示す。磁気ビーズと比較しても1/10倍程度のバックグランドが得られる。（結果は評価実験（５）表３を参照）【００５４】
但し、固定化できるリガンド量に限りがあり、ライブラリーのスクリーニングには向かないことがある。プレート固定化アビジンは市販されているアビジン固定化プレートは96ウェルなどの形態をとっており、プレート上に固定化されているアビジン量は、少なく（60 pmol/well）、そのため、固定化できる光反応性リガンド量も少なくなってしまう傾向がある。回収するビオチン量に比べて、数倍は多いアビジン量を使用することが一般的であるので、せいぜい30 pmolのリガンドしか使用できない。溶液量を200μLで行うとき、リガンドの濃度は0.15μmol/Lとなる。カルモジュリンとカルモジュリン結合タンパク質のKdは10-7〜10-8であるので、この濃度で分離が可能である。結合タンパク質のKdが、10-7よりも小さなリガンドとの組み合わせには、アビジン磁気ビーズを使用することが好ましい。【００５５】
プレート固定化アビジンでは、光反応性リガンドを十分量使用できないため、提示ファージのライブラリーなど、大量のファージからスクリーニングするとき、または、親和性が低いリガンドを使用するときには、アビジン磁気ビーズの使用が好ましい。【００５６】
〔アビジン磁気ビーズ〕
アビジン磁気ビーズは、低いバックグランドと大量のアビジン固定化量を併せ持つ磁気ビーズが本発明のフォトパニング法には最適である。例えば、NEB社のStreptavidin Magnetic Beads（ストレプトアビジン磁気ビーズ）メーカコード#S1420Sを使用することができる。アビジン磁気ビーズでは、提示ファージ溶液を完全に取り除くことが可能で、非特異的結合の提示ファージ（バックグランド）が低い。おおよそ1000〜10000個までバックグランドを減らせる。【００５７】
徹底的な洗浄ができない従来のパニング法では、同じ磁気ビーズを使用しても1000倍程度多いファージ数がバックグランドになる（結果は評価実験（７）表５を参照）。アビジンの固定化量を1000 pmol/mgとし、磁気ビーズを1mg程度使用することにすると、アビジンは1000 pmolであり、ビオチンは500 pmol程度回収ができる。溶液量を200μLで行うとき、リガンドの濃度は2.5μmol/Lとなる。これにより、結合タンパク質のKdが、10-6程度のリガンドでも使用できる。この濃度を実現したことにより、かなり多くのリガンド−受容体タンパク質のスクリーニングに利用できる。【００５８】
アビジン磁気ビーズは、操作が容易なため、操作時間が短縮および再現性が向上され、機械化が可能となる。さらに10％BSAを加えて磁気ビーズとの非特異的吸着を軽減することが好ましい。【００５９】
（図４、模式図７）固定化アビジンに磁気ビーズを使用することで、低いバックグランドと安定した回収を実現した。固定化量が多いことで、低い親和性（Kd=10-6）の提示ファージでも回収できる。【００６０】
次いで、光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄する。この洗浄は、光反応性リガンドと共有結合していないタンパク質提示ファージを共有結合した複合体から分離するためのものである。洗浄には、界面活性剤を用いることが好ましい。洗浄の方法および条件は、固相に、大量の洗浄溶液を加えて、数分間、攪拌させた後に溶液を捨てる。この操作を通常、5回程度、繰り返すことができる。【００６１】
［提示ファージの洗浄条件と回収］（図４、模式図８〜10）
［洗浄条件の決定］（図４、模式図８）
光反応性リガンドと共有結合した提示ファージを単離するための洗浄条件は、提示ファージの性状及び洗浄に使用する界面活性剤の洗浄効率等を考慮して適宜決定できる。【００６２】
提示ファージの中には、アルカリや酸に対して弱いものがあるので、緩衝液を使用し、pHは例えば、8.8とすることが適当である。このpHはトリス緩衝液がもっとも緩衝能力が発揮できるpHである。但し、他の緩衝液も使用することはできる。【００６３】
さらに、塩濃度を高めにして、イオン的な結合を排除することが好ましい。そのため、例えば、0.2〜1mol/L程度の塩化ナトリウムを用いることができる。後述するが、高濃度の塩化ナトリウムと界面活性剤SDSと共存させると沈殿を生じる場合があるので、0.25mol/L程度の塩化ナトリウム濃度を用いることが好ましい場合がある。【００６４】
また、カルモジュリンとその結合ペプチドとの結合には、カルシウムイオンが必須であるので、これを排除するために、そのキレート剤、例えば、EDTAを併用することが適当である。【００６５】
界面活性剤としては、例えば、SDS、Triton-X100、Tween20等を用いることができ、界面活性剤による洗浄効率を考慮して、適宜決定できる。尚、本発明者らの実験によれば、非特異的なファージの除去にはSDSが一番適しているとの結果が得られた。SDSの濃度は、0.１〜1％の範囲とすることができ、以後のステップへの持込みによる回収と増幅への影響を考慮すると、0.5％であることが好ましい。【００６６】
SDSの使用により、アビジンを固定化している磁気ビーズが、容器に吸着することがなくなり、より簡単に洗浄溶液を除去できるという利点がある。界面活性剤を使用しない場合、この容器への吸着により洗浄溶液をとる際に、少量の磁気ビーズを吸い上げてしまうことが常である。【００６７】
最終的に洗浄溶液として、例えば、50 mM Tris-HCl (pH8.8), 0.25 M NaCl, 50 mM EDTA, 0.5 % SDSを用いることが好ましい。但し、この洗浄溶液に限定する意図ではない。【００６８】
共有結合していない提示ファージは、この溶液を用いて3回洗浄すれば数千個程度にすることができる。より確実に洗浄するために、実験ではSDS溶液を含む洗浄液で4〜7、好ましくは5〜6回洗浄する。また、次のステップへのSDSの影響を抑えるために、最後にSDSを含まない洗浄液で1回洗浄することが好ましい。但し、洗浄の回数は、スクリーニングの系に応じて適宜決定することができる。【００６９】
洗浄後、固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージを回収する。これにより、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質、特に、特異的な相互作用を有するタンパク質をスクリーニングすることができる。回収したタンパク質提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質を同定することができる。【００７０】
ただし、本発明では、上記回収したタンパク質提示ファージを増殖させ、増殖させたタンパク質提示ファージを用いて、再度図３で示した工程を少なくとも1回繰り返すことが好ましい。より好ましくは上記図３で示した工程を2〜10回の範囲で繰り返す。【００７１】
回収したタンパク質提示ファージを増殖させ、再度、光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージの回収を行うことで、特異的な相互作用を有するタンパク質をより高い選択性で回収することができる。【００７２】
回収したタンパク質提示ファージを増殖は、例えば、以下のように行うことができる。回収したファージ溶液を、適切な宿主となる大腸菌株に感染させる。これを、LB培地などの溶液中で増殖させ、宿主を溶菌させることにより、ファージを増殖する。【００７３】
［ファージの回収と増幅］（図４、模式図９）
T７ファージを提示ファージとした場合は、提示するタンパク質やペプチドは頭部に発現されるため、リガンドと共有結合が生じた場合にも、感染に必要な足部はインタクトな状態である。【００７４】
そこで、共有結合で捉えた提示ファージの回収と増幅は、磁気ビーズに固定化された状態で行うことが適当である。徹底的な洗浄後、磁気ビーズに捕らえられた提示ファージ（模式図８）を、10倍ごとに希釈し、0.5〜1mLの大腸菌溶液に入れ、5〜10分間混合しながら感染させ、トップアガーと混合し、プレートにまく。感染時間は15分間を超えないようにすることが、正確なファージ数を測定するという観点から適当である。【００７５】
足部にタンパク質やペプチドを発現するT13ファージを使用する場合には、模式図８の状態で、トリプシンなどのプロテアーゼで処理し、ファージとリガンドを切り離す必要があるが、この方法は一般的な方法であり実施可能である。【００７６】
最終的に回収したタンパク質提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質を同定することができる。【００７７】
［ファージ溶液の調製］（図４、模式図10）
磁気ビーズに捉えられた提示ファージの残りをすべて大腸菌溶液に入れ、感染・増幅を、常法に従い行う。増幅したファージ溶液を使用し、再度、模式図５からフォトパニングを繰り返す。本発明の方法は、1日に例えば、2回のフォトパニングが可能である。【００７８】
［キット］
本発明は、以下の３つのキットを包含する。
（ａ）光反応基を有する光反応性リガンド作製用キット
（ｂ）パニング用キット
（ｃ）バリデーション用キット【００７９】
（ａ）光反応基を有する光反応性リガンド作製用キット
本発明の光反応基を有する光反応性リガンドを作製するためのキットは、光反応基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む。【００８０】
光反応基を有する化合物は、例えば、一般式（Ｃ）で示されるフェニルジアジリン化合物であることができ、一般式（Ｃ）で示されるフェニルジアジリン化合物は、上記本発明のスクリーニング方法で示した化合物である。また、リガンド標識物質は、例えば、ビオチン、ヒスチジンタグ（Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原であることもできる。光反応装着溶液は、光反応基を有する化合物とリガンドとなる物質によって適宜選択される。【００８１】
光反応基を有する光反応性リガンド作製用キットにより光反応性ペプチドとタンパク質の作製する手順を例示する。
(1)システイン残基を含むビオチン化ペプチドまたは、SS結合していないフリーなシステイン残基を含むタンパク質を用意する。
(2)キットのジアジリンチオスルフォネートを、キット付属の光反応装着溶液に溶かし、ペプチドまたはタンパク質と混合する。
(3)ペプチドの場合は数時間、タンパク質の場合は10時間程度室温もしくは37℃で静置する。
(4)ペプチドの場合は高速液体クロマトグラフー(HPLC)により、タンパク質の場合はゲルろ過により光反応性リガンドを精製する。ペプチドリガンドの場合は、HPLC装置の使用が適しているが、モノメリックビオチンにより、光反応性リガンドを精製することもできる。
(5)光反応性タンパク質を、キットのタンパク質ビオチン化試薬でビオチンを装着する。
(6)光反応性ビオチン化タンパク質は、ゲルろ過により精製する。なお、ゲルろ過による精製が適しているが、モノメリックビオチンにより精製することもできる。【００８２】
（ｂ）パニング用キット
本発明のパニング用キットは、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングするために用いるキットである。このキットは、光反応基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する固相を含む。【００８３】
本発明のキットに含まれる光反応性リガンドは、本発明のスクリーニング方法において説明した光反応性リガンドと同一である。光反応性リガンドは、例えば、光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖であることができる。また、光反応性リガンドが有する光反応基は、例えば、ジアジリン基であることができる。【００８４】
光反応性リガンドを固定化する固相についても、本発明のスクリーニング方法において説明した光反応性リガンドを固定化する固相と同一である。そのような固相は、例えば、磁気ビーズ、または基板であることができる。さらに、光反応性リガンドを固定化する固相は、例えば、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Hisタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて光反応性リガンドを固定化するものであることができる。【００８５】
光反応性リガンドおよび固相の組み合わせは、より具体的には、（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがHisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいずれかであることができる。【００８６】
本発明のキットは、光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄するための洗浄剤をさらに含むことができる。洗浄剤は、例えば、界面活性剤を含む水溶液であることができ、界面活性剤の例は、本発明のスクリーニング方法において説明した物であることができる。上記洗浄剤は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡをさらに含むものであることもできる。【００８７】
本発明のパニング用キットは、前記本発明のスクリーニング方法に使用することができるものである。【００８８】
上記パニング用キットは、より具体的には、
(b1)固相
(b2)血清含有アルブミン水溶液
(b3)洗浄溶液
(b4)ファージ回収溶液
を含むことができる。【００８９】
固相は、前記の通り、アジビン、ストレプトアビジン、ニッケル、ホウ素または抗体が被覆されたものであり、固相の担体は、磁気ビーズまたは基板であることができる。好ましい固相は、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズである。ファージ回収溶液としては、緩衝液を適宜使用できる。【００９０】
本発明のパニング用キットを使用し、タンパク質提示ファージを用いてフォトパニングを行う手順を例示する。
ここで使用されるファージは、例えば、T7ファージであり、T７ファージライブラリーおよび感染用大腸菌は、別途準備する。
(1)光反応性ビオチン化リガンドとT7ファージライブラリーが相互作用する条件を満たす溶液中で混合、静置する。
(2)紫外線ランプ（強度30W/m2）を用い、活性光を１〜10分照射する。
(3)キットの10％血清含有アルブミン水溶液を最終濃度1％になるように加え、キットのストレプトアビジン磁気ビーズを使用したリガンド量の2倍以上のモル比のストレプトアビジンをもつ量を混合する。
(4)室温で10〜30分、振とうする。
(5)キットの洗浄溶液1mL程度を加え、5分間振とうする。
(6)磁気ビーズを、磁気スタンドで回収する。
(7)回収した磁気ビーズに、洗浄溶液1mL程度を加え5分間振とう後、磁気スタンドで回収する。
(8)上記の操作を4〜６回繰り返す。
(9)回収した磁気ビーズに、キットのファージ回収溶液1mL程度を加え5分間振とう後、磁気スタンドで回収する。
(10)回収した適当量の磁気ビーズを感染用大腸菌と混合し、感染用大腸菌が溶菌するまで3〜5時間、37℃で振とうする。
(11)増幅した適当量のファージ溶液と光反応性ビオチン化リガンドとを混合し、本操作（手順2番目から）を2〜５回、繰り返す。【００９１】
（ｃ）バリデーション用キット
本発明のバリデーション用キットは、タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む。タンパク質提示ファージ希釈溶液は、例えば、タンパク質が、例えば、カルモジュリンの場合、野生ファージ10万個中に１つのカルモジュリン提示ファージを含む割合で混合した溶液であることができる。そして、光反応性リガンド溶液は、例えば、光反応性ビオチン化カルモジュリン結合ペプチド溶液であることができる。本発明のバリデーション用キットを用いてのバリデーションの手順は、上記したパニングの手順に従い、ライブラリーファージの代わりにカルモジュリン提示T7ファージ希釈溶液を使用し、光反応性ビオチン化リガンドとして光反応性ビオチン化カルモジュリン結合ペプチド溶液を用いて行なう。
【実施例】
【００９２】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
例１
光反応性ペプチドリガンドの作製
カルモジュリンタンパク質を認識し特異的に結合することが確かめられている、前記配列１のカルモジュリン結合ペプチドをもとに２種類の光反応性ペプチドリガンドを製作した。【００９３】
〔光反応性アミノ酸を使用した製作法（配列２）〕
配列１（LKWKKLLKLLKKLLKLG）（配列番号１）のN末端から3つ目のトリプトファンを、tmd(Phe)で置き換えたペプチドを合成した。合成はペプチド合成機を用いたFmoc−固相合成法で行った。その後、合成したペプチドが固相にある状態で、N末端のアミノ基にビオチンサクシイミドを反応させることにで、ビオチン化ペプチドを合成した。固相から合成ペプチドを強酸で解離し、HPLCで目的のビオチン化光反応性ペプチドを精製した。また、本合成に必要なFmoc−tmd(Phe)は、以下のように合成した。【００９４】
Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000（非特許文献９）に記載の方法により、4-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzaldehyde(12)を合成した。
その後、以下に示す方法L-4'-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]phe  nylalanine(15)を合成した。
さらに、アミノ基をFmoc化することで、Fmoc−tmd(Phe)を合成した。【００９５】
【化６】
2007083793.tif 000008
【００９６】
4-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzyl alcohol (13)
化合物(12) (3.3 g, 15.4 mmol)をEtOH 7 mLに溶かし0℃で撹拌しながらNaBH4 (0.626 g, 16.5 mmol)をEtOH 7 mL中に懸濁したものを加えた。加え終わったのち室温に戻し４時間撹拌した。これに氷上で1M HClをゆっくり加えて過剰の試薬を分解した後、Etherで抽出し、Ether層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane:Ether = 1:1) により精製して、淡黄色の油状物質 (13) を得た。【００９７】
収量 3.21g (96%)
1H-NMR (CDCl3)
σ: 7.39 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.71 (s, 2H), 1.87(bs, 1H)【００９８】
3-[4-(Bromomethyl)phenyl]-3-(trifluoromethyl)-3H-diazirine (14)
化合物 (13) (344.0 mg, 1.59 mmol)をCH2Cl2 2 mLに溶かし、CBr4 (658.2 mg, 1.985 mmol)を加えた。０℃に冷やしPh3P (474 mg, 1.807 mmol)をゆっくりと加えた。室温まで戻し1時間撹拌した後で、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (Hexane) で精製して、無色の油状物質(14)を得た。【００９９】
収量  401.8mg (90％)
1H-NMR (CDCl3)
σ: 7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.46 (s, 2H).【０１００】
L-4'-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]phenylalanine (15)
tert-Butylglycinate benzophenone imine (1.136 g, 3.839 mmol)と、不斉触媒のO(9)-Allyl-N-9-anthracenylmethylcinchonidium bromide[9] (0.2127 g, 0.351 mmol, 0.1 eq)をCH2Cl2 9 mLに溶かした。化合物(14) (1.419 g, 5.085 mmol, 1.5 eq.)を加えアルゴンガス雰囲気下、室温で撹拌した。反応混合液を-78℃に冷却しながら2-tert-Butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhirdo-1,3,2-diazaphosphorine (1.41 g, 5.139 mmol, Aldrich)を数秒間で滴下し、-78℃で7時間反応させた。室温に戻し減圧蒸留した後、残査をEtherで希釈し蒸留水で２回、飽和食塩水で１回洗った。油層を硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hexane:EtOAc = 7:1)で精製し、黄色の油状物質を得た。【０１０１】
収量  1.89g (95%)
1H-NMR (CDCl3)
σ: 7.57 (d, 2H, J = 6.9 Hz ), 7.39-7.27 (m, 6H), 7.06 (q, 4H, J = 8.4 Hz )
6.59 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 4.09 (q, 1H, J = 8.6, 4.6 Hz), 3.26-3.11 (m, 2H)
1.44 (s, 9H).【０１０２】
得られた黄色の油状物質 (75 mg, 0.152 mmol)を0℃でTFA 1mLに溶かし、室温で２時間撹拌した。(TLC, Hexane:AcOEt = 7:1)で反応終了を確認後、TFAを減圧溜去し、残渣をCH2Cl2で希釈し水で3回抽出した。水層を凍結乾燥して白色の固体 (15) を得た。【０１０３】
収量 (TFA塩として)  53.4 mg (91%)
1H-NMR (CD3OD)
σ: 7.46 (d, 2H, J = 7.9 Hz ), 7.27 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.84 (dd, 1H, J = 8.2, 4.5 Hz), 3.38 (m,1H), 3.10 (d, 1H, J = 4.5, 8.2 Hz).
光学純度 (e.e.)【０１０４】
その後、L-4'-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]phenylalanine(15)をFmoc体に誘導した。そして、HPLCによりその光学純度を確認した。適量をMeOHに溶かした後、キラルカラム(Sumichiral OA-3300 2.5μm 4.6 mmφ×25 cm)を用いて0.01 M Ammonium Acetate/MeOH、流速1 mL/minで溶出させ、360 nmのジアジリン由来のUV吸収により検出した。
e.e. = 98%
[a]D +22.4° (c = 0.52, EtOH)【０１０５】
〔ジアジリンチオフォスフェートを利用した製作法（配列４）〕
配列１（LKWKKLLKLLKKLLKLG）（配列番号１）のN末端から3つ目のトリプトファンを、システインに置き換えたペプチドを合成した（配列３）。合成はペプチド合成機を用いたFmoc−固相合成法で行った。その後、合成したペプチドが固相にある状態で、N末端のアミノ基にビオチンサクシイミドを反応させることにで、ビオチン化ペプチドを合成した。固相から合成ペプチドを強酸で解離し、HPLCで目的のビオチン化ペプチドを精製した。化合物３に示されるジアジリンと、精製したペプチドを30％アセトニトリルを含む溶液中で混合し、ペプチド内のシステイン残基と化合物３をチオール結合させた。HPLCで目的のビオチン化光反応性ペプチドを精製した（配列４）。本合成に必要な化合物３は、 M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D-Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14, 849-852.（非特許文献７）に記載の方法で行った。具体的には、上記の化合物14の合成法に示してある。【０１０６】
例２
ビオチン化光反応性カルモジュリンの作製
遺伝子改変によりシステイン残基を１つ加えたカルモジュリンタンパク質を製作した。具体的には、ヒト脳ｃDNAライブラリーから、PCR法により、CaM２プライマー（５'-CTTAGGAGAATGCCTAACAGATG-３）（配列番号２）とCaM3プライマー（5'-CTGCAGGTCTTCATTTTGCAGTC-3'）（配列番号３）とで、カルモジュリンタンパク質の一部遺伝子を増幅し、この断片を新たにプライマーとして、CaM１プライマー（5'-GGATCCCCATGGCTGATCAGCTGACCGAAG-3'）（配列番号４）とで、カルモジュリン遺伝子を増幅した。このメガプライマー法により、カルモジュリンタンパク質の115番目のリジンをシステインに改変したカルモジュリンを製作する遺伝子を得た。本増幅断片を、pQE32ベクター（キアゲン社）に挿入し、大腸菌に形質転換した。この遺伝子が入った大腸菌を単離し、LB培地で大量に培養した。その後、大腸菌を破砕し、HISタグ精製カラムで、カルモジュリンタンパク質を精製した。26番、75番のアミノ酸をCys残基に替えたカルモジュリンも、同様の方法で製作した。【０１０７】
精製した発現タンパク質（2mg/ml）0.5mLと化合物3(1mol/L)0.015mLとアセトニトリル0.5ｍLを混ぜ、4℃で一晩おき、模式図３に示したタンパク質を製作した。本方法で必要となる化合物３は、上記の〔ジアジリンチオフォスフェートを利用した製作法（配列４）〕に記載した方法で合成した。【０１０８】
余分な試薬はゲルろ過で除いた。精製した光反応性カルモジュリンとビオチンOSuをpH9.0の条件下で4℃一晩静置し、ビオチン化光反応性カルモジュリンを製作した。余分な試薬はゲルろ過で取り除いて、ビオチン化光反応性カルモジュリンを得た。（模式図４）【０１０９】
ビオチン化光反応性カルモジュリンであることかは以下の方法により特定した。
電気泳動により精製したサンプルを分離し、メンブレンに転写した後、アビジン−HRP試薬を用いたウエスタンブロット法により確認した。【０１１０】
例３
［製作した光反応性リガンドを評価する実験］
［評価実験（１）］
評価実験１として、光反応性カルモジュリン結合ペプチド（配列２）が、カルモジュリンタンパク質を認識し、光照射により共有結合で結ばれた複合体を形成する能力があるか、検討した。【０１１１】
光反応性カルモジュリン結合ペプチド（配列２）とカルモジュリンを１：１の比率で混ぜ、カルシウム存在下37℃で10分間静置した。その後、30W/m2の強度の紫外線（ピーク波長360nm）を1分間照射し、光反応を誘導した。その試料を、HPLCで解析したのが図５である。上段は紫外線照射した試料で、下段は紫外線照射しなかった試料である。図５中の矢印で示されたピークは質量分析の結果から、インタクト(intact)CaM：もともとのカルモジュリンタンパク質、架橋(crosslinked)CaM：カルモジュリンと光反応性カルモジュリン結合ペプチドとの複合体、DA-CBP：光反応性カルモジュリン結合ペプチドである。MALDI-TOF MASSでの 2410の質量増加はちょうど、カルモジュリン結合ペプチドのそれと一致する。【０１１２】
HPLCの分析条件では、親和性のみで結合した複合体は解離してしまうことが、「図５光照射なし」の結果からわかる。また、「図５光照射60秒」の結果から、カルモジュリンタンパク質とその結合ペプチドが共有結合で複合体を形成していることがわかる。紫外線の様々な照射時間での「図５光照射60秒」中の複合体のピークを定量し、複合体形成の効率を測定した結果を図６で示す。1分間の紫外線照射で最大の効率が得られることが明らかになった。最初のカルモジュリンタンパク質量の３％程度が複合体を形成した。【０１１３】
評価実験１と同様にカルモジュリンタンパク質とその結合タンパク質の複合体を製作し、SDS-PAGEで解析した結果を図７に示す。図７上段の電気泳動では、紫外線の照射時間を変え、試料を調製した結果を示す。図７右に簡単に方法が記した。還元剤存在下高熱処理を行っているので、共有結合で結ばれた複合体以外は解離してしまう。また、光反応性カルモジュリンペプチドに装着されたビオチンをアビジン化HRP酵素で検出したため、分子量の小さな結合ペプチド、およびビオチンを持たないカルモジュリン単独では検出できない。カルモジュリンタンパク質の複合体形成には、カルシウムが必要であることがわかっており、EGTA存在下では、複合体を検出できなかった。図７下段の電気泳動では、カルモジュリンアンタゴニストによる阻害実験を行った結果を示す。100μmol/L TFPで複合体形成は阻害される。この阻害の濃度依存性は、カルモジュリン機能阻害のそれと良く一致している。【０１１４】
〔まとめ〕
評価実験（１）より、製作した光反応性カルモジュリン結合ペプチドは、カルモジュリンを特異的に認識し、共有結合で結ばれた複合体を形成することが明らかとなった。【０１１５】
［評価実験（２）］
評価実験２として、光反応性カルモジュリンタンパク質（模式図３）が、カルモジュリン結合ペプチドを認識し、光照射により共有結合で結ばれた複合体を形成する能力があるか、検討した。【０１１６】
光反応性カルモジュリンタンパク質（模式図３）とビオチン化カルモジュリン結合ペプチドを１：１の比率で混ぜ、37℃で10分間静置した。その後、30W/m2の強度の紫外線（ピーク波長360nm）を1分間照射し、光反応を誘導した。その試料をSDS-PAGEで解析したのが図８である。紫外線の有無、カルシウムの有無を図８の下に示している。高熱処理を行っているので、共有結合で結ばれた複合体以外は解離してしまう。また、カルモジュリンペプチドに装着されたビオチンをアビジン化HRP酵素で検出したため、分子量の小さな結合ペプチド自身は検出できない。CBB染色によりすべての条件でも、ほぼ同じ量のカルモジュリンがあることがわかるが、化学発光で検出されているのは、紫外線とカルシウムがともにある条件のときだけである。【０１１７】
〔まとめ〕
評価実験（２）より、光反応性カルモジュリンタンパク質（模式図３）は、カルモジュリン結合ペプチドを認識し、複合体を形成する能力があることが明らかになった。【０１１８】
例４
［フォトパニング法の標準的方法］
光反応性カルモジュリン結合ペプチドを使用して構築したフォトパニング法の手順を以下に示す。
(1)提示ファージ溶液(108〜109個)、50ｍM Tris/HCl (pH7.4), 1mM CaCl2で構成される溶液200μLを調製する。
(2)光反応性カルモジュリン結合ペプチド（具体的には配列２、または配列４）を最終濃度10μMになるように加え、良く混ぜる。
(3)３７℃で10分間静置する。（提示ファージとリガンドペプチドとの親和性による結合を促進するため）
(4)ポリスチレン製の底が平らな９６穴プレートに移しかえる。このとき、１穴あたり100μLを越えないように分注する。
(5)30W/m2の強度のUV-Aランプを上下に配置した照射装置で、２分間光を照射する。
(6)９６穴プレートからマイクロチューブへ溶液を移しかえる。
(7)10％ウシ血清アルブミン（BSA）を200μL加え、１分間振とうする。（磁気ビーズとの非特異的吸着を軽減するため）
(8)アビジン固定化磁気ビーズ（NEB社）を100〜250μL加え、２分間振とうする。（この量の磁気ビーズで、約250〜1000 pmolのビオチンを吸着することが可能である。）
(9)15000rpm(約20000g)で５秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に立て、上清を静かに取り除く。
(10)洗浄溶液（50mM Tris/HCl (pH8.8)、0.25M NaCl、 50mM EDTA、 0.5% SDS）を1ｍL加え、５分間激しく、振とうする。
(11)15000rpm(約20000g)で５秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に立て、上清を静かに取り除く。
(12)(10)、(11)の操作を合計５回繰り返す。
(13)50mM Tris/HCl (pH8.8) 、0.25M NaCl, 50mM EDTAを含む溶液1ｍLを加え、５分間激しく、振とうする。
(14)15000rpm(約20000g)で５秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に立て、上清を静かに取り除く。
(15)200〜500μLのSMバッファー（0.1M NaCl, 8mM MgCl2, 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.01% ゼラチン）で磁気ビーズ（沈殿）を懸濁する。
(16)10倍希釈系列希釈の懸濁液を調製し、その50μLをとり500μLの大腸菌溶液（株名：BLT5403、OD600＝1程度の増殖）と混ぜ、5分間静置する。
(17)50℃に保温しておいた3ｍLのトップアガー（LB培地（トリプトン10ｇ、イーストエクストラクト5ｇ、NaCl 5gを１Lの水で溶解したもの）に0.7％アガーを含むもの）と混ぜ、LBプレート（LB培地に1.5％アガーを入れて、プレート内で固めておいたもの）にまく。
(18)37℃で2時間程度静置し、プラーク数を測定する。
(19)(15)の残りの懸濁液を、10ｍLの大腸菌溶液と混ぜ、37℃で振とうしながら3時間程度培養する。液が透けてきたら、大腸菌を遠心で取り除き、上清を回収する。
このファージ溶液を用いて、(1)からの操作を繰り返す。【０１１９】
［フォトパニング法の評価実験］
評価実験（３）［光反応性ペプチドリガンドの種類とパニング効率］
配列２と配列４の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを用いてフォトパニングを行い、カルモジュリン提示ファージの選別効率を比較した。（表１）カルモジュリン提示ファージ（108個）およびSタグ提示コントロールファージ（108個）を上記のフォトパニング標準的方法に従い、100 pmolの光反応性リガンドを使用して選別した。磁気ビーズに捕らえられたファージの数を測定した。カルモジュリン提示ファージ数が、コントロールのファージ数に対して何倍捕らえられるかで、実験結果を評価する。【０１２０】
【表１】
2007083793.tif 000009
【０１２１】
〔まとめ〕
磁気ビーズに捉えられたカルモジュリン提示ファージとコントロールファージの数を比較すると、配列２を使用したフォトパニングで1000倍、配列4を使用した場合は2000倍の選択効率があることがわかる。両者ともに十分な選択効率を持つ。【０１２２】
評価実験（４）［光反応性ペプチドリガンド量と効率］
配列２の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを使用し、リガンドの量を変えて選別効率を比較した。（表２）使用したアビジン磁気ビーズの量は100μLで、250 pmolのビオチンを吸着する能力をもつ。【０１２３】
【表２】
2007083793.tif 000010
【０１２４】
〔まとめ〕
磁気ビーズが吸着できる以上の量のリガンドを使用した1000 pmolの実験では選別効率が悪い。それ以下のリガンド量を使用するときには、効率にはあまり影響しない。【０１２５】
評価実験（５）［アビジン磁気ビーズとアビジンプレートの比較］
提示ファージを回収する固定化アビジンとして、磁気ビーズとプレートとを比較した。（表３）
使用したプレートは96穴のアビジン固定化プレート（ピアス社製）を使用した。【０１２６】
【表３】
2007083793.tif 000011
【０１２７】
〔まとめ〕
カルモジュリン提示ファージ数とコントロールファージ数を比較するとき、磁気ビーズでは1000倍、アビジンプレートでは1800倍の差があった。【０１２８】
評価実験（６）［フォトパニング法の効率決定］
カルモジュリン提示ファージとコントロールファージを、以下の表にあるような様々な割合で混合した。各実験で109個程度のファージを使用した。配列２の光反応性リガンド（10 pmol）、磁気ビーズ100μLを用いてフォトパニングを行った。磁気ビーズに捕らえられたファージ数を測定した。さらに、カルモジュリン遺伝子をプローブにしてプラークハイブリダイゼーションを行った。カルモジュリン提示ファージのプラークを陽性のプラークとし全部のプラーク数と比較して、その割合を計算した。（表４）【０１２９】
【表４】
2007083793.tif 000012
【０１３０】
〔まとめ〕
磁気ビーズに捕らえられたファージの数は、カルモジュリン提示ファージの割合が少なくなるにしたがって減少していく。
1,500個中に1個の割合でカルモジュリンファージが存在する条件でも、磁気ビーズに捉えられたファージはほとんどがカルモジュリン提示ファージであった。
1:15,000（0.0066％）の実験を例にとると、15,000個中に1個の割合で存在していたカルモジュリン提示ファージが、フォトパニングによって400個中333個（84％）の割合に増加した。0.0066％が84％へ増えたので、84÷0.0066＝12727となり、約12700倍濃縮できたことになる。同様に、1:150,000では13500倍、1:1,500,000では15000倍に濃縮できたことになる。
このフォトパニング法により、1回の操作で約13000倍程度濃縮することができた。（図９で概略を説明）【０１３１】
評価実験（７）［フォトパニング法と従来のパニング法との比較(1)］
従来のパニング法と効率を比較するため、配列１のN末をビオチン化したカルモジュリン結合ペプチドを製作した。このペプチド（10μmol/L）を使用し、フォトパニングの標準的方法に従い（ただし、光照射は行わない）カルモジュリン提示ファージとコントロールファージがどれだけ磁気ビーズ（100μL）に捕らえられたかを測定した。（表５）洗浄は、1ｍM CaCl2を含むTBS（50mM Tris/HCl (pH7.4), 0.25M NaCl）に0.05％もしくは、0.5％の界面活性剤Tween-20を加え調製した洗浄液で行った。再現性をみるために、同一条件の実験（(1)と(2)）を2回行った。【０１３２】
【表５】
2007083793.tif 000013
【０１３３】
〔まとめ〕
磁気ビーズで捕らえられたカルモジュリン提示ファージ数は、従来法、フォトパニング法の区別なく、あまり変化がない。しかしながら、コントロールファージの数をみるとき、従来のパニング法では、フォトパニング法にくらべ1000倍程度多く捕らえられている。フォトパニング法が従来法に比べ、効率的に目的のファージを選別できるのは、このバックグランドの差による。(1)と(2)の実験を比較してみると、従来のパニング法は再現性が悪いことがわかる。【０１３４】
評価実験（８）［フォトパニング法と従来のパニング法との比較(2)］
カルモジュリン提示ファージとコントロールファージを、以下の表にあるような様々な割合で混合した。各実験で108個程度のファージを使用した。配列１のN末をビオチン化したカルモジュリン結合ペプチド（10 pmol）、および配列２の光反応性リガンド（10 pmol）を使用した。磁気ビーズは25μLで行った。【０１３５】
磁気ビーズに捕らえられたファージ数をそれぞれのリガンドについて測定した。
各ファージを適宜希釈し、プレート1枚に100〜400個のファージプラークを出現させ、その上に5 mLのSMバッファーを加え、２時間振とうした。この溶液2μLに対して、カルモジュリン遺伝子を増幅するように設計したプライマーを用いてPCRを行い、カルモジュリン提示ファージの有無を各希釈系列で確認した。（表６および図１０）【０１３６】
【表６】
2007083793.tif 000014
【０１３７】
〔まとめ〕
磁気ビーズに捕らえられたファージの数は、従来法では大きな変化は見られないが、フォトパニング法ではカルモジュリン提示ファージの割合が少なくなるに従って、減少していった。フォトパニング法では、バックグランドのファージ数が少なくなるので、このような結果となる。カルモジュリン遺伝子のPCRの結果より、従来法は(3)1:1,000の混合ファージからの選別において、少なくとも300個中に1個のカルモジュリン提示ファージが存在することがわかる。一方、フォトパニング法では(6)1:1,000,000の混合ファージからの選別においても、少なくとも400個中に1個のカルモジュリン提示ファージが存在することがわかる。以上のPCRの結果より、フォトパニング法は従来法に比べ、少なくとも1000倍の選別効率をもつことが明らかになった。（図１１で概略を説明）【０１３８】
例５
［ライブラリースクリーニング実験］
［実験の方法］
cDNA提示ファージライブラリーからカルモジュリン提示ファージを、フォトパニング法と従来のパニング法で単離する実験を行った。（図１２参照）ヒト脳cDNA発現ライブラリーおよびヒト肝臓cDNA発現ライブラリーを使用した。ヒト脳cDNAライブラリー中にはカルモジュリン遺伝子が多く含まれているとされている。両者ともノバジェン社より購入、概ね109個の提示ファージからスクリーニングをはじめた。配列２の光反応性カルモジュリン結合ペプチド、もしくは配列１のN末をビオチン化したペプチドをリガンドとして使用した。最終濃度はいずれも10μmol/Lとした。フォトパニング法では、光照射を2分間行った。アビジン磁気ビーズは50μL使用した。上記のビオチン化リガンドの12.5倍量のビオチン結合能力をもつ。従来法では、評価実験（７）で使用したTBS-0.05％Tw-Ca2+を洗浄溶液として、5回洗浄した。パニング後のファージ溶液の一部を適宜希釈し、磁気ビーズ上に捕らえられたファージ数を測定した（図１２、ファージ数測定(2)）。【０１３９】
その際に出来るプレートを使用し、メンブレンを製作し、カルモジュリン遺伝子断片をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションを行って、カルモジュリン提示ファージ数を測定した（図１２、プラークハイブリ）。さらに、同じプレート上にSMバッファーを少量入れ、プレートからファージ溶液を製作した。この溶液をもとにして、カルモジュリンを特異的に増幅するプライマーを用いてPCRを行いカルモジュリン提示ファージの有無を確認した（図１２、PCR(2)）上記操作で残ったパニング後のファージ溶液を増幅した。増幅後、ファージ数を測定し（図１２、ファージ数測定(1)）、一部を使用しPCRによりカルモジュリン提示ファージの有無を確認した（図１２、PCR(1)）。【０１４０】
［実験の結果］
〔評価実験（９）フォトパニング法（ヒト脳ライブラリー）光照射の有無〕
ヒト脳cDNAライブラリーから、カルモジュリン提示ファージをスクリーニングした。配列２のリガンドを使用し、光照射の有無で結果を比べた。【０１４１】
【表７】
2007083793.tif 000015
【０１４２】
フォトB(1)-2（光あり）の段階で選別したファージを個別に、カルモジュリン遺伝子を増幅するPCR法で確認した（図１３）。Mのレーンはマーカーである。フォトB(1)-1（光あり）からフォトB(1)-3（光あり）で選別したファージ溶液を適度に希釈し、200〜300個程度のプラークが出現するように培養した。そこに、ニトロセルロースメンブレンを置き、適切な操作ののち、カルモジュリン遺伝子をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションを行った（図１４）。黒く見える点が、カルモジュリンを提示しているファージである（陽性クローンと呼ぶ）。【０１４３】
再現性を確かめるために、同一の実験をおこなった（表８）。選別したファージ溶液を希釈し、プラークを形成させ、１つのプラークから得たファージをテンプレートとして、カルモジュリン遺伝子をPCRで増幅した（図１５）。各サイクルで10個ずつ確認した。【０１４４】
【表８】
2007083793.tif 000016
【０１４５】
増殖後のファージ溶液をテンプレートにPCRでカルモジュリン遺伝子を増幅した結果を示す（図１６）。選別したファージ溶液を適度に希釈し、数百個程度のプラークが出現するように培養し、SMバッファーを加えてファージ溶液を製作した。このファージ溶液をテンプレートに、PCRでカルモジュリン遺伝子を増幅した結果を示す（図１７）。各電気泳動下の数値は、使用したプレート上に出現したプラーク数のおおよその数を示す。【０１４６】
〔まとめ〕
フォトB(1)-1,2（光あり）に比べて、フォトB(1)-3（光あり）のパニングの数（表7）が、100倍に増えている。これは、ファージ溶液がカルモジュリン提示ファージに均一化されたこと、すなわち割合が100％近くなったことを示す。
表７のプラークハイブリダイゼーションの結果は、図１４の結果から測定された。1回目のフォトパニングで0.5％、2回目で60％、3回目で99％がカルモジュリン提示ファージとなっており、上記のファージ数の急激な増加結果と一致する。【０１４７】
カルモジュリン遺伝子を個別のファージをテンプレートに増幅したPCR（図１３）により、フォトB(1)-2で選別されたファージは、43個が陽性であり、43／60個つまり約70％がカルモジュリン提示ファージであることがわかる。この割合は、ほぼプラークハイブリダイゼーションで求めた結果と一致する。増幅したファージをテンプレートに行った実験（図１６：フォトB(1)と(2)）でも、2回目のフォトパニング（光あり）でカルモジュリン遺伝子の増幅が観察できる。しかし、（光なし）では増幅しなかった。各パニング段階で、数百個のファージ中にカルモジュリン提示ファージが存在すか調べた実験（図１７：フォトB(1)と(2)）から、（光あり）で2回目から目的の提示ファージが得られることがわかる。（光なし）では3回パニングを行っても、カルモジュリン提示ファージは見られなかった。【０１４８】
以上の結果より、カルモジュリン提示ファージの濃縮には、光照射が必要であることがわかる。光反応により形成された共有結合が、パニングの効率を上昇させることが明らかになる。
また、表8および図１５の実験から、フォトパニング法でカルモジュリン提示ファージを単離するとき、1回目で０／１０（０％）、2回目で７／１０（70％）、３回目で９／１０（90％）となり、前回の表７での結果とほぼ同じとなった。
再現性が優れていると言える。【０１４９】
〔評価実験（10）従来法（ヒト脳ライブラリー）〕
従来法で、カルモジュリン提示ファージの単離を試みた。再現性を確認するために、同様の実験を2回行った。
使用したリガンドは、配列１のN末をビオチン化したものである。【０１５０】
【表９】
2007083793.tif 000017
【０１５１】
【表１０】
2007083793.tif 000018
【０１５２】
〔まとめ〕
パニング後のファージ数は各サイクルで10倍程度変化しているが、再現性がない。表10のプラークハイブリダイゼーションの結果より、カルモジュリン提示ファージが濃縮されていないことがわかる。増幅したファージをテンプレートに行った実験（図１６：従来B(5)と(6)）でも、カルモジュリン遺伝子は増幅されない。各パニング段階で、数百個のファージ中にカルモジュリン提示ファージが存在するか調べた実験（図１７：従来B(5)と(6)）では、従来B(5)において4回目にカルモジュリン遺伝子が増加されたものの、5回目には消えており再現性がない。このシステムを使用する限り、従来のパニング法ではカルモジュリン提示ファージを濃縮することは出来ない。【０１５３】
〔評価実験（11）フォトパニング法（ヒト肝臓ライブラリー）〕
カルモジュリンの発現量が低いとされる、ヒト肝臓cDNAから作られたライブラリーを使用し、フォトパニング法を評価した。実験方法は、評価実験（８）と同じである。【０１５４】
【表１１】
2007083793.tif 000019
【０１５５】
〔まとめ〕
表11のプラークハイブリダイゼーションの結果から、肝臓cDNAより3回目のフォトパニングで21％、4回目で92％の割合までカルモジュリン提示ファージを濃縮できることがわかる。これは、図１８のPCRで行った結果、2回目で10％、3回目で20％、4回目で90％と良く一致している。表11のファージ数の急激な増加が、4回目で起こることと、カルモジュリン提示ファージの占有割合とが、良く一致している。増幅したファージをテンプレートとして行った実験（図１６：フォトL(4)）で、３回目のフォトパニングから、カルモジュリン遺伝子が見えてきている。各パニング段階で、数百個のファージ中にカルモジュリン提示ファージが存在するかを調べた実験（図１７：フォトL(4)）でも、３回目のフォトパニングから、カルモジュリン遺伝子が見えてきている。フォトパニング法は、発現量の少ないライブラリーからでもカルモジュリン提示ファージを濃縮し、ほぼ100％にすることができた。以上の結果をまとめて図19に示す。【０１５６】
［光反応性カルモジュリンタンパク質をリガントとしたフォトパニング法］
［評価実験（12）光反応基をつける部位による影響］
光反応基の導入部位の異なる3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質でフォトパニング法の効率を比較した（表12）。カルモジュリンとその結合ペプチドであるMLCK断片ペプチドの立体構造解析結果（PDB: ICDL）から、26，75，115番目のアミノ酸がMLCK断片ペプチドを中心にそれぞれ別の位置にあることがわかる。それぞれのアミノ酸をシステインに変換して、化合物３を装着した。その後、それぞれをビオチン化した。カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとSタグ提示ファージを用いて、評価実験を行った。方法に関しては、前述の標準的な方法に従った。使用した光反応性カルモジュリンリガンド量は30pmol、使用した磁気ビーズ量は100μLである。【０１５７】
【表１２】
2007083793.tif 000020
【０１５８】
〔まとめ〕
光反応基を結合させる部位を変えても、選別効率にあまり影響を与えなかった。【０１５９】
［評価実験（13）フォトパニング法と従来法との比較(1)］
カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとコントロールファージとで、パニングを行い、磁気ビーズにどれだけのファージが捉えられるか比較し、フォトパニング法と従来法の選別効率を比較した。光反応性リガンドとしてはビオチン化した115−光反応性カルモジュリンを使用し、従来法ではビオチン化したカルモジュリンタンパク質を使用した。従来法は、ペプチドリガンドでの実験（評価実験（７））と同様におこなった。【０１６０】
【表１３】
2007083793.tif 000021
【０１６１】
フォトパニング法では、コントロールファージの100倍量のカルモジュリン結合ペプチド提示ファージを捉えることができる。一方、従来法では4倍程度であった（表13）【０１６２】
〔まとめ〕
タンパク質をリガントとした場合にも、ペプチドリガンドを使用したときと同様に、フォトパニング法は従来法に比べ、目的ファージを効率よく選別できる。【０１６３】
［評価実験（14）フォトパニング法と従来法との比較(2)］
カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとコントロールファージを以下の表14のように様々な割合で混合した。各実験では合計ファージ数が、108個程度になるようにそろえた。フォトパニング法では、ビオチン化した光反応性カルモジュリンタンパク質を、また、従来法ではビオチン化したカルモジュリンタンパク質をリガンドとして使用した。磁気ビーズに捕らえられたファージ数を測定した（表14）【０１６４】
【表１４】
2007083793.tif 000022
【０１６５】
従来法においては、結合能力のあるファージ割合が減少しても、磁気ビーズに捉えられるファージ数には変化がないが、フォトパニング法では割合が減少するに従い、捕らえられたファージ数が減少していった。【０１６６】
選別したファージ溶液を適度に希釈し、数百個程度のプラークが出現するように培養し、SMバッファーを加えてファージ溶液を製作し、このファージ溶液をテンプレートに、PCRでカルモジュリン結合ペプチドの遺伝子を増幅した（図２０）。各電気泳動上の数字は、表14で示されている(1)から(4)の試料に対応している。また、下の数値は、使用したプレート上に出現したプラーク数の数を示す。カルモジュリン結合ペプチドのコード領域だけでは、増幅される遺伝子が短くなり、電気泳動での検出が困難になるため、ペプチドをコードする領域と近隣のファージゲノム領域とにプライマーを製作し、PCRを行った。【０１６７】
フォトパニング法では、1:100〜1:100,000までの希釈のすべてでカルモジュリン結合ペプチド提示ファージが検出されているのに対して、従来法では1:10,000の希釈では検出ができなかった。
フォトパニング法でPCRによる検出限界が不明なことと、プレート上のファージ数にばらつきがあるので、正確には決められないが、フォトパニング法は従来法に比べ、選別効率は、少なくとも100倍以上であると思われる。【０１６８】
希釈試料からフォトパニング法で捕らえたファージ溶液中のカルモジュリン結合ペプチド提示ファージの数を、プラークハイブリダイゼーションで決定し、図21に示す。ハイブリ写真上部の数字は、表14の(1)〜(4)に対応する。また、下段には陽性プラーク数／全体プラーク数と（  ）内に濃縮倍率を示した。1:100,000に希釈したファージ溶液から、680個中10個のカルモジュリン結合ペプチド提示ファージが回収された。よって濃縮効率は1470倍と見積もられる。【０１６９】
〔まとめ〕
フォトパニング法は従来法に比べ100倍以上の濃縮効率をもつことが明らかになり、1回のフォトパニングで1470倍の濃縮に成功した。【０１７０】
［評価実験（15）ライブラリーのスクリーニング実験］
ヒト脳および肝臓のcDNAライブラリーから、カルモジュリンに結合するタンパク質を単離する目的で、スクリーニングを行った。フォトパニング法では、ビオチン化した光反応性カルモジュリンタンパク質を、従来法ではビオチン化したカルモジュリンタンパク質を、それぞれリガンドとして30pmol使用し、スクリーニングを行った。ライブラリーは概ね109個からスクリーニングを始めた。2回目以降は、各回に対応する表中の「増殖後の濃度」の１／２０量で行った。
アビジン磁気ビーズは、100μL使用した。従来法では、評価実験（７）で使用した洗浄条件で行った。フォトパニング法でヒト脳ライブラリーをスクリーニングしたものが、表15、表17、表18で示されている。従来法でヒト脳ライブラリーをスクリーニングしたものが、表16で示されている。フォトパニング法でヒト肝臓ライブラリーをスクリーニングしたものが、表19で示されている。【０１７１】
【表１５】
2007083793.tif 000023
【０１７２】
【表１６】
2007083793.tif 000024
【０１７３】
【表１７】
2007083793.tif 000025
【０１７４】
【表１８】
2007083793.tif 000026
【０１７５】
【表１９】
2007083793.tif 000027
【０１７６】
〔まとめ〕
フォトパニング法では、サイクルが増えるごとにパニング後のファージの数が増加する。【０１７７】
［評価実験（16）単離したファージ遺伝子のシーケンス］
各表にゴジックで示されたサイクル、フォトB(7)-4，フォトB(7)-5，従来法（−）B(8)-5，フォトB(9)-4，フォトB(10)-4，フォトL(11)-4，フォトL(11)-5でのファージをプレート上で単離した。単離したファージ数は，全部で230個であった。これらをテンプレートにしてインサート部分をPCRで増幅した（例：図２２）このうち、400bp以上のDNAを選びPCR断片を回収した。全部で228断片回収した。回収した228断片について、5'末端よりDNAシーケンスを読んだ。
複数個回収されたファージもしくはカルモジュリン結合タンパク質として報告のある遺伝子をもつファージについて、表20にまとめた。【０１７８】
【表２０】
2007083793.tif 000028
【０１７９】
上表のNo1, 2, 10, 11, 18は，すでにカルモジュリン結合タンパク質として報告のあるものである。シーケンスの結果、ファージは各タンパク質において、カルモジュリン結合部位を含む領域を、フレームどおり発現していることがわかった。【０１８０】
上表のNo3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17については、カルモジュリンターゲットデータベース(Calmodulin Target Database (http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/flash.htm))のカルモジュリン結合解析により「８」以上の判定を受けた配列を含んでいる。同データベースは、Yap KL, Kim J, Truong K, Sherman M, Yuan T, Ikura M. J Struct Funct Genomics. 2000;1(1):8-14.で報告されたもので、カルモジュリンへの結合能力を評価できる。
図２３は、No3のAC092953について同データベースで解析した結果である。配列の下の数字が8以上の部分が、カルモジュリンと結合すると考えられる。
No3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17においては、自然には存在しないペプチドと考えられる。すなわち、反対鎖で読まれているもの、フレームシフトをおこしているもの、タンパク質にはならないと報告されているものなどである。【０１８１】
No.4および6に関しては、カルモジュリン結合能力は同データベースでは確認されていない。しかしながら、この２つのファージについては、簡易的なフォトパニング法において、カルモジュリン結合活性が示されている（表21）。【０１８２】
【表２１】
2007083793.tif 000029
【０１８３】
〔まとめ〕
複数個単離されたファージは、すべてがカルモジュリンと結合することが予想された。シーケンスを読んだ228個のファージから、124個のカルモジュリン結合活性のあるファージが回収できたことになる。フォトパニング法により、約55％の陽性ファージを得る選別効率が得られたことがわかる。【０１８４】
［評価実験（17）ライブラリースクリーニングの評価］
単離されたカルモジュリン結合タンパク質について、各フォトパニングサイクルで回収できているかどうか、各遺伝子に特異的なPCRで確認した。図２４は、パニング後増幅したファージ溶液をテンプレートにPCRを行ったものである。電気泳動の上部には各サンプル情報が示されている。「L」はライブラリーをテンプレートにしたものである。図２５は、選別したファージ溶液を適度に希釈し、プラークを出現させ、SMバッファーを加えてファージ溶液を製作した。このファージ溶液をテンプレートに、各遺伝子ついてPCRで増幅した結果を示す。各電気泳動下の数値は、使用したプレート上に出現したプラーク数のおおよその数を示す。両図において、(9)および(7)はフォトパニング法での結果であり、(8)は従来法での結果である。【０１８５】
〔まとめ〕
おおむね、フォトパニング法（(7)と(9)）では各遺伝子でサイクル数が増加するに従い、検出頻度が上昇している。従来法（(8)）では、ほとんどの遺伝子が検出されない。2回のフォトパニング法（(7)と(9)）を比べるとき、再現性が良い。ライブラリースクリーニングの結果を図２６にまとめて示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、タンパク質やペプチドが関連する創薬分野および抗体医療分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】タンパク質提示ファージの模式図。
【図２】従来のパニング法の概略説明図。
【図３】本発明のフォトパニング法の概略説明図。
【図４】本発明のフォトパニング法の説明図。
【図５】例3におけるHPLCの解析結果。
【図６】例3における複合体形成効率の測定結果。
【図７】例3の評価実験（１）におけるSDS-PAGEでの解析結果。
【図８】例3の評価実験（２）におけるSDS-PAGEでの解析結果。
【図９】フォトパニング法による1回の操作での濃縮程度の説明図。
【図１０】評価実験（８）においてカルモジュリン提示ファージの有無を各希釈系列で確認した結果。
【図１１】評価実験（６）フォトパニング法と従来法との選別効率対比結果。
【図１２】例5における、cDNA提示ファージライブラリーからカルモジュリン提示ファージをフォトパニング法と従来のパニング法で単離する実験の模式図。
【図１３】例5における、カルモジュリン遺伝子のPCR法での増幅確認結果。
【図１４】例5における、カルモジュリン遺伝子をプローブとしたプラークハイブリダイゼーション結果（注：写真はすべてのプラークを載せているわけではない）。
【図１５】カルモジュリン遺伝子のPCR法での増幅確認結果。
【図１６】カルモジュリン遺伝子のPCR法での増幅確認結果。
【図１７】カルモジュリン遺伝子のPCR法での増幅確認結果。
【図１８】カルモジュリン遺伝子のPCR法での増幅確認結果。
【図１９】例５のまとめ。
【図２０】カルモジュリン結合ペプチド提示ファージの有無を各希釈系列で確認した結果。
【図２１】フォトパニング法で捕らえたファージ溶液中のカルモジュリン結合ペプチド提示ファージの数のプラークハイブリダイゼーションでの決定結果。
【図２２】インサート部分のPCRでの増幅結果。
【図２３】No3のAC092953について、カルモジュリンターゲットデータベースで解析した結果。
【図２４】パニング後増幅したファージ溶液をテンプレートにPCRした結果。
【図２５】ファージ溶液をテンプレートにして各遺伝子ついてPCRで増幅した結果。
【図２６】フォトパニング法(本発明)によるカルモジュリン結合タンパク質のスクリーニングの概要。本発明のスクリーニング方法は、優れた再現性と選択効率で様々なクローンを網羅的に解析できる。
【図１】
2007083793.tif 000031
【図２】
2007083793.tif 000032
【図３】
2007083793.tif 000033
【図４】
2007083793.tif 000034
【図５】
2007083793.tif 000035
【図６】
2007083793.tif 000036
【図７】
2007083793.tif 000037
【図８】
2007083793.tif 000038
【図９】
2007083793.tif 000039
【図１０】
2007083793.tif 000040
【図１１】
2007083793.tif 000041
【図１２】
2007083793.tif 000042
【図１３】
2007083793.tif 000043
【図１４】
2007083793.tif 000044
【図１５】
2007083793.tif 000045
【図１６】
2007083793.tif 000046
【図１７】
2007083793.tif 000047
【図１８】
2007083793.tif 000048
【図１９】
2007083793.tif 000049
【図２０】
2007083793.tif 000050
【図２１】
2007083793.tif 000051
【図２２】
2007083793.tif 000052
【図２３】
2007083793.tif 000053
【図２４】
2007083793.tif 000054
【図２５】
2007083793.tif 000055
【図２６】
2007083793.tif 000056
【配列表】
2007083793000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月15日(2007.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアジリン基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、
光反応性リガンドのジアジリン基に対する活性光を照射し、
光反応性リガンドを磁気ビーズに固定化し、
光反応性リガンドを固定化した磁気ビーズを界面活性剤を用いて洗浄し、
磁気ビーズに固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法。
【請求項２】
光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
光反応性リガンドの磁気ビーズへの固定化をビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Ｈｉｓ  タグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて行う請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、磁気ビーズはアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがＨｉｓタグを有し、磁気ビーズはニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、磁気ビーズはホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、磁気ビーズは抗体を被覆したものであるのいずれかである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
磁気ビーズに固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を、磁気ビーズを回収することで行う請求項１、２、４または５に記載の方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する請求項１〜２、４、５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを増殖させ、増殖させたタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを用いて、
請求項１に記載された光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を少なくとも１回行う、
請求項１〜２、４、５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージのＤＮＡを同定することで、タンパク質またはペプチドを同定する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングするための請求項１〜２、４、５、７、９〜１１のいずれかの方法において使用されるキットであって、
ジアジリン基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する磁気ビーズと光反応性リガンドを固定化した磁気ビーズを洗浄するための洗浄剤を含む前記キット。
【請求項１３】
光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖である請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
光反応性リガンドを固定化する磁気ビーズは、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン系、Ｈｉｓタグ−ニッケル系、ホウ素−ヒドロキサム酸キレート系、または抗原−抗体系を用いて光反応性リガンドを固定化するものである請求項１２〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
（１）光反応性リガンドがビオチンを有し、磁気ビーズはアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり、（２）光反応性リガンドがＨｉｓタグを有し、磁気ビーズはニッケルを被覆したものであり、（３）光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、磁気ビーズはホウ素を被覆したものであり、及び（４）光反応性リガンドが抗原を有し、磁気ビーズは抗体を被覆したものであるのいずれかである請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
ジアジリン基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む、ジアジリン基を有する光反応性リガンドを作製するためのキットであって、
前記光反応性リガンドは、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングするための請求項１〜２、４、５、７、９〜１１のいずれかの方法において使用されるものである、前記キット。
【請求項２１】
ジアジリン基を有する化合物は、以下の一般式（Ｃ）で示されるフェニルジアジリン化合物または（１）〜（３）で示されるフェニルジアジリン化合物である請求項２０に記載のキット。
【化１】
2007083793.tif 000057
（上記式中、Ｒ６は、ハロゲン原子、またはスルホン酸エステル残基であり、Ｒ７は、炭素数１〜６のアルキルチオスルホニル基または炭素数１〜６のアルキルチオ基であり、Ｒ８は、Ｈまたは炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎは１〜６の整数である。）
【化２】
2007083793.tif 000058
【請求項２２】
リガンド標識物質は、ビオチン、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原である請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む、リガンドであるペプチドをバリデーションするためのキットであって、
前記バリデーションは、請求項１に記載のスクリーニング方法において、ジアジリン基を有する光反応性リガンドとタンパク質提示ファージの液相中での混合を、前記タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を用いて行い、かつ磁気ビーズに固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージを回収し、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質をスクリーニングすることで行い、前記タンパク質がカルモジュリンであり、前記タンパク質提示ファージ希釈溶液は、野生ファージ１０万個中に１つのカルモジュリン提示ファージを含む割合で混合した溶液であり、
光反応性リガンド溶液は、ジアジリン基を有する光反応性カルモジュリン結合ペプチド溶液である、
前記キット。
【請求項２４】
光反応性リガンドが有する標識物質は、ビオチン、ヒスチジンタグ、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原である請求項２３のキット。
【国際調査報告】
2007083793.tif 000059
2007083793.tif 000060
2007083793.tif 000061