(57)【要約】肥満および／または糖尿病の予防および／または治療に寄与しうる、新規な薬剤、肥満および／または糖尿病などの病態解明などの目的に使用しうるトランスジェニック動物およびその作製に使用しうる核酸分子などを提供する。  本発明の一つの態様は、ＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させたトランスジェニック非ヒト動物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
相同組換えにより破壊されたＫＲＡＰ遺伝子を含む、請求の範囲１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
改変された脂質代謝および／または糖代謝を有する、請求の範囲１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
エネルギー消費の亢進、インシュリン感受性の亢進および／または血中ホルモン濃度の異常を示す、請求の範囲１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
ゲノム内のＫＲＡＰ遺伝子と相同組換え可能であって、非ヒト動物細胞内でＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させうる、単離された変異型ＫＲＡＰ遺伝子核酸分子。
【請求項６】
変異が、少なくとも１つのエクソンの欠損である、請求の範囲５記載の核酸分子。
【請求項７】
変異が、エクソン１１〜１６の少なくとも１つを含む領域の欠損である、請求の範囲６記載の核酸分子。
【請求項８】
請求の範囲５〜７のいずれか１項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
トランスジェニック動物作製用または遺伝子治療用の発現ベクターである、請求の範囲８記載のベクター。
【請求項１０】
請求の範囲８または９記載のベクターを導入された宿主細胞。
【請求項１１】
ＫＲＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を有し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰ遺伝子の発現を阻害しうる、単離された干渉性核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも一部が二本鎖である、請求の範囲１１記載の干渉性核酸分子。
【請求項１３】
ＫＲＡＰタンパクまたはその一部に対して特異的に結合し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰタンパクの機能を阻害しうる、結合性タンパク。
【請求項１４】
請求の範囲１１〜１３のいずれか１項記載の干渉性核酸分子または結合性タンパクを含む、脂質代謝および／または糖代謝改変剤。
【請求項１５】
エネルギー消費亢進剤、肥満の予防または解消剤、またはインシュリン感受性亢進剤である、請求の範囲１４記載の脂質代謝および／または糖代謝改変剤。
【請求項１６】
ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパク質の発現または機能を阻害することにより、哺乳類細胞、組織または非ヒト動物において脂質代謝および／または糖代謝の改変を誘起する方法。
【請求項１７】
脂質代謝および／または糖代謝の改変が、エネルギー消費の亢進、肥満の予防または解消、インシュリン感受性の亢進、および／または血中ホルモン濃度の異常である、請求の範囲１６記載の方法。
【請求項１８】
ＫＲＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を有し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰ遺伝子の発現を阻害しうる干渉性核酸分子、および／またはＫＲＡＰタンパクまたはその一部に対して特異的に結合し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰタンパクの機能を阻害しうる結合性タンパクを用いてＫＲＡＰ遺伝子の発現またはＫＲＡＰタンパクの機能を阻害する工程を含む、請求の範囲１６または１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、動物において、エネルギー消費の亢進、インシュリン感受性の亢進、肥満の予防または解消、および／または血中ホルモン濃度の異常を誘起することができる核酸分子およびそれを含む薬剤、そのような核酸分子を含むトランスジェニック動物、エネルギー消費の亢進、インシュリン感受性の亢進、肥満の予防または解消、および／または血中ホルモン濃度の異常を誘起する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】  現在までに、哺乳動物の肥満に関与するいくつかの遺伝子が知られている。これらの遺伝子を正または負に改変することにより、抗肥満または肥満を呈する動物が作製されている。そのような改変の標的遺伝子としては、たとえば、内分泌性シグナル因子として全身性に機能し得るレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＦＧＦ１９、ニューロペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ）、アンギオポエチン関連成長因子（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）や、遺伝子発現を広範囲に変動させて機能を発揮する転写制御因子ＰＧＣ１α（ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １α）、ＣＢＰ（ＣＲＥＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＲＸＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α）、細胞内脂質代謝関連酵素ＡＣＣ２（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ２）、ＳＣＤ１（ｓｔｅａｌｏｙｌ  ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ１）、細胞内シグナル制御因子ＳＨＩＰ２、ＰＴＰ１Ｂ、Ｓ６キナーゼ、ＳＯＣＳ−６、ミトコンドリア機能タンパクＵＣＰ（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの種々のタンパク種をコードするものが挙げられる。これらのタンパクには、機能がよく分からないものや多機能性のもの（発現する細胞によって異なったり、相互作用するタンパクによって異なる作用を示したりするもの）も多く存在する。特にｃ−Ｃｂｌは、元々、癌関連遺伝子として研究されてきたが、発現細胞・状況によって細胞内でさまざまなシグナルを制御するものであり、この欠損マウスがエネルギー消費亢進・抗肥満・糖代謝変化を示すことが知られている。また、ＦＧＦ１９の発現を増強させたトランスジェニックマウスやＦＧＦ１９投与マウス（ＦＧＦは血中を回って遠隔に作用する液性因子である）でも、ＦＧＰ１９による抗肥満効果が示され、肥満・糖尿病治療の観点から注目されている（非特許文献１〜３１）。【０００３】  ＫＲＡＰ（Ｋｉ−ｒａｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子は、活性化されたＫｉ−ｒａｓによってアップレギュレートされる癌関連遺伝子の一つとして近年同定された（非特許文献３２）。この遺伝子によってコードされるタンパクは、コイルド・コイル領域を有していることがわかっていたが、その生理的な発現部位および機能は不明であった。【０００４】
【非特許文献１】Ｓｌｅｅｍａｎ  ＭＷ，Ｗｏｒｔｌｅｙ  ＫＥ，Ｌａｉ  ＫＭ，Ｇｏｗｅｎ  ＬＣ，Ｋｉｎｔｎｅｒ  Ｊ，Ｋｌｉｎｅ  ＷＯ，Ｇａｒｃｉａ  Ｋ，Ｓｔｉｔｔ  ＴＮ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ，Ｗｉｅｇａｎｄ  ＳＪ，Ｇｌａｓｓ  ＤＪ．Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＳＨＩＰ２  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００５  Ｆｅｂ；１１（２）：１９９−２０５．
【非特許文献２】Ｏｈ  Ｗ，Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ  Ｌ，Ｋｏｒｄａｒｉ  Ｐ，Ｇｕ  Ｚ，Ｓｈａｉｋｅｎｏｖ  Ｔ，Ｃｈｉｒａｌａ  ＳＳ，Ｗａｋｉｌ  ＳＪ．Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆａｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ｆｅｂ  １；１０２（５）：１３８４−９．
【非特許文献３】Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ  Ｌ，Ｏｈ  Ｗ，Ｋｏｒｄａｒｉ  Ｐ，Ｗａｋｉｌ  ＳＪ．Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｒｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ／ｈｉｇｈ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｄｉｅｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｓｅｐ  ２；１００（１８）：１０２０７−１２．
【非特許文献４】Ｊｉａｎｇ  Ｇ，Ｌｉ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｆ，Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ  Ｋ，Ｄａｌｌａｓ−Ｙａｎｇ  Ｑ，Ｗｕ  Ｍ，Ｒｏｎａｎ  Ｊ，Ｅｓａｕ  Ｃ，Ｍｕｒｐｈｙ  Ｃ，Ｓｚａｌｋｏｗｓｋｉ  Ｄ，Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  Ｒ，Ｄｏｅｂｂｅｒ  Ｔ，Ｚｈａｎｇ  ＢＢ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−１．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５  Ａｐｒ；１１５（４）：１０３０−８．
【非特許文献５】Ｄｏｂｒｚｙｎ  Ａ，Ｎｔａｍｂｉ  ＪＭ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｉｎ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ．２００４  Ｆｅｂ；１４（２）：７７−８１．Ｒｅｖｉｅｗ．
【非特許文献６】Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ  Ｌ，Ｍａｔｚｕｋ  ＭＭ，Ａｂｏ−Ｈａｓｈｅｍａ  ＫＡ，Ｗａｋｉｌ  ＳＪ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆａｔ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１  Ｍａｒ  ３０；２９１（５５１３）：２６１３−６．
【非特許文献７】Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｔ，Ｏｉｋｅ  Ｙ，Ｋａｍｏｎ  Ｊ，Ｗａｋｉ  Ｈ，Ｋｏｍｅｄａ  Ｋ，Ｔｓｕｃｈｉｄａ  Ａ，Ｄａｔｅ  Ｙ，Ｌｉ  ＭＸ，Ｍｉｋｉ  Ｈ，Ａｋａｎｕｍａ  Ｙ，Ｎａｇａｉ  Ｒ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｓ，Ｓａｈｅｋｉ  Ｔ，Ｎａｋａｚａｔｏ  Ｍ，Ｎａｉｔｏｈ  Ｔ，Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ，Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  Ｃｒｅｂｂｐ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｆｅｂ；３０（２）：２２１−６
【非特許文献８】Ｕｍ  ＳＨ，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ｆ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ，Ｐｉｃａｒｄ  Ｆ，Ｊｏａｑｕｉｎ  Ｍ，Ｓｔｉｃｋｅｒ  Ｍ，Ｆｕｍａｇａｌｌｉ  Ｓ，Ａｌｌｅｇｒｉｎｉ  ＰＲ，Ｋｏｚｍａ  ＳＣ，Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｇ．Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓ６Ｋ１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｇｅ−ａｎｄ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｗｈｉｌｅ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００４  Ｓｅｐ  ９；４３１（７００５）：２００−５．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  １１．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ．２００４  Ｓｅｐ  ２３；４３１（７００７）：４８５．
【非特許文献９】Ｆｕ  Ｌ，Ｊｏｈｎ  ＬＭ，Ａｄａｍｓ  ＳＨ，Ｙｕ  ＸＸ，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｅ，Ｒｅｎｚ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＭ，Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｒ，Ｃｏｒｐｕｚ  Ｒ，Ｍｏｆｆａｔ  Ｂ，Ｖａｎｄｌｅｎ  Ｒ，Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｌ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｊ，Ｓｔｅｐｈａｎ  ＪＰ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＴＡ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １９  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｄ  ｌｅｐｔｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊｕｎ；１４５（６）：２５９４−６０３．
【非特許文献１０】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｅ，Ｆｕ  Ｌ，Ｊｏｈｎ  Ｌ，Ｈｕｌｔｇｒｅｎ  Ｂ，Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｒｅｎｚ  Ｍ，Ｓｔｅｐｈａｎ  ＪＰ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ  Ｌ，Ｆｒｅｎｃｈ  Ｄ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＴＡ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１９  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００２  Ｍａｙ；１４３（５）：１７４１−７．
【非特許文献１１】Ｍｏｌｅｒｏ  ＪＣ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＴＥ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＰＣ，Ｃｏｕｚｅｎｓ  Ｍ，Ｈｅｒｚｏｇ  Ｈ，Ｔｈｉｅｎ  ＣＢ，Ｌａｎｇｄｏｎ  ＷＹ，Ｗａｌｄｅｒ  Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＡ，Ｂｏｗｔｅｌｌ  ＤＤ，Ｊａｍｅｓ  ＤＥ，Ｃｏｏｎｅｙ  ＧＪ．ｃ−Ｃｂｌ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ，ｈｉｇｈｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４  Ｎｏｖ；１１４（９）：１３２６−３３．
【非特許文献１２】Ｌｉｎ  Ｊ，Ｗｕ  ＰＨ，Ｔａｒｒ  ＰＴ，Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ  ＫＳ，Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  ＣＹ，Ｍｏｏｔｈａ  ＶＫ，Ｊａｇｅｒ  Ｓ，Ｖｉａｎｎａ  ＣＲ，Ｒｅｚｎｉｃｋ  ＲＭ，Ｃｕｉ  Ｌ，Ｍａｎｉｅｒｉ  Ｍ，Ｄｏｎｏｖａｎ  ＭＸ，Ｗｕ  Ｚ，Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＰ，Ｆａｎ  ＭＣ，Ｒｏｈａｓ  ＬＭ，Ｚａｖａｃｋｉ  ＡＭ，Ｃｉｎｔｉ  Ｓ，Ｓｈｕｌｍａｎ  ＧＩ，Ｌｏｗｅｌｌ  ＢＢ，Ｋｒａｉｎｃ  Ｄ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ．Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ＣＮＳ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ．２００４  Ｏｃｔ  １；１１９（１）：１２１−３５．
【非特許文献１３】Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｓ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｔ，Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ  Ｍ，Ｉｗａｋｉ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｙ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｏ，Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｍ，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｉ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４  Ｄｅｃ；１１４（１２）：１７５２−６１．
【非特許文献１４】Ｋｒｅｂｓ  ＤＬ，Ｕｒｅｎ  ＲＴ，Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ，Ｒａｋａｒ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  ＪＧ，Ｓｔａｒｒ  Ｒ，Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ＤＰ，Ｈａｎｚｉｎｉｋｏｌａｓ  Ｋ，Ｅｙｌｅｓ  Ｊ，Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＬＭ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＲＪ，Ｎｉｃｏｌａ  ＮＡ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＳＥ，Ｂａｃａ  Ｍ，Ｈｉｌｔｏｎ  ＤＪ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＷＳ．ＳＯＣＳ−６  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ４，ａｎｄ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＯＣＳ−６  ｇｅｎｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｍｉｌｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ｊｕｌ；２２（１３）：４５６７−７８．
【非特許文献１５】Ｌｅｏｎｅ  ＴＣ，Ｌｅｈｍａｎ  ＪＪ，Ｆｉｎｃｋ  ＢＮ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＰＪ，Ｗｅｎｄｅ  ＡＲ，Ｂｏｕｄｉｎａ  Ｓ，Ｃｏｕｒｔｏｉｓ  Ｍ，Ｗｏｚｎｉａｋ  ＤＦ，Ｓａｍｂａｎｄａｍ  Ｎ，Ｂｅｒｎａｌ−Ｍｉｚｒａｃｈｉ  Ｃ，Ｃｈｅｎ  Ｚ，Ｈｏｌｌｏｓｚｙ  ＪＯ，Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  ＤＭ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＲＥ，Ｓａｆｆｉｔｚ  ＪＥ，Ａｂｅｌ  ＥＤ，Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ  ＣＦ，Ｋｅｌｌｙ  ＤＰ．ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ：ｍｕｓｃｌｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｂｎｏｒｍａｌ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ａｐｒ；３（４）：ｅ１０１．
【非特許文献１６】Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  Ｋ，Ｐｏｕｌｉｎ  Ｆ，Ｋｏｈａｒａ  Ｍ，ＤｅＭａｒｉａ  ＣＴ，Ｃｈｅｎｇ  Ａ，Ｗｕ  Ｚ，Ｇｉｎｇｒａｓ  ＡＣ，Ｋａｔｓｕｍｅ  Ａ，Ｅｌｃｈｅｂｌｙ  Ｍ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ，Ｈａｒｐｅｒ  ＭＥ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ＭＬ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ．Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｏｒ  ４Ｅ−ＢＰ１．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００１  Ｏｃｔ；７（１０）：１１２８−３２．
【非特許文献１７】Ｃｏｈｅｎ  Ｐ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，Ｓｏｃｃｉ  ＮＤ，Ｈａｇｇｅ−Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ａ，Ｌｉｅｄｔｋｅ  Ｗ，Ｓｏｕｋａｓ  ＡＡ，Ｓｈａｒｍａ  Ｒ，Ｈｕｄｇｉｎｓ  ＬＣ，Ｎｔａｍｂｉ  ＪＭ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ．Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−１  ｉｎ  ｌｅｐｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌｏｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２  Ｊｕｌ  １２；２９７（５５７９）：２４０−３．
【非特許文献１８】Ｎｔａｍｂｉ  ＪＭ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，Ｓｔｏｅｈｒ  ＪＰ，Ｌａｎ  Ｈ，Ｋｅｎｄｚｉｏｒｓｋｉ  ＣＭ，Ｙａｎｄｅｌｌ  ＢＳ，Ｓｏｎｇ  Ｙ，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ，Ａｔｔｉｅ  ＡＤ．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−１  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２  Ａｕｇ  ２０；９９（１７）：１１４８２−６．
【非特許文献１９】Ｃｌｉｎｅ  ＧＷ，Ｖｉｄａｌ−Ｐｕｉｇ  ＡＪ，Ｄｕｆｏｕｒ  Ｓ，Ｃａｄｍａｎ  ＫＳ，Ｌｏｗｅｌｌ  ＢＢ，Ｓｈｕｌｍａｎ  ＧＩ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊｕｎ  ８；２７６（２３）：２０２４０−４．
【非特許文献２０】Ｐｉｃａｒｄ  Ｆ，Ｇｅｈｉｎ  Ｍ，Ａｎｎｉｃｏｔｔｅ  Ｊ，Ｒｏｃｃｈｉ  Ｓ，Ｃｈａｍｐｙ  ＭＦ，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ  ＢＷ，Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ，Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．ＳＲＣ−１  ａｎｄ  ＴＩＦ２  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｅｌｌ．２００２  Ｄｅｃ  ２７；１１１（７）：９３１−４１．
【非特許文献２１】Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ  Ｈ，Ｗａｔａｓｅ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｏｇｕｒａ  Ｈ，Ｙａｍａｎｏ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｍａｅｎｏ  Ｈ，Ｉｍａｋｉ  Ｊ，Ｋｉｋｕｙａｍａ  Ｓ，Ｗａｄａ  Ｅ，Ｗａｄａ  Ｋ．Ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｂｏｍｂｅｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ−３  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｎｏｖ  １３；３９０（６６５６）：１６５−９．
【非特許文献２２】Ｋｕｓｈｉ  Ａ，Ｓａｓａｉ  Ｈ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｈ，Ｔａｋｅｄａ  Ｎ，Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ−Ｙ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８  Ｄｅｃ  ２２；９５（２６）：１５６５９−６４．
【非特許文献２３】Ｉｍａｉ  Ｔ，Ｊｉａｎｇ  Ｍ，Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ，Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｄ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｕｐｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）ｉｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｊａｎ  ２；９８（１）：２２４−８．
【非特許文献２４】Ｄｕｂｅ  ＭＧ，Ｂｅｒｅｔｔａ  Ｅ，Ｄｈｉｌｌｏｎ  Ｈ，Ｕｅｎｏ  Ｎ，Ｋａｌｒａ  ＰＳ，Ｋａｌｒａ  ＳＰ．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｅｐｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｌｏｃｋｓ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ，ｈｙｐｅｒｌｅｐｔｉｎｅｍｉａ，ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ：ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００２  Ｊｕｎ；５１（６）：１７２９−３６．
【非特許文献２５】Ｚｈｏｕ  Ｚ，Ｙｏｎ  Ｔｏｈ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｚ，Ｇｕｏ  Ｋ，Ｎｇ  ＣＰ，Ｐｏｎｎｉａｈ  Ｓ，Ｌｉｎ  ＳＣ，Ｈｏｎｇ  Ｗ，Ｌｉ  Ｐ．Ｃｉｄｅａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｌｅａｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００３  Ｓｅｐ；３５（１）：４９−５６．
【非特許文献２６】Ｏｉｋｅ  Ｙ，Ａｋａｏ  Ｍ，Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｋ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｔ，Ｍｏｒｉｓａｄａ  Ｔ，Ｉｔｏ  Ｙ，Ｕｒａｎｏ  Ｔ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ  Ｙ，Ｍａｅｋａｗａ  Ｈ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｍｉｙａｔａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｓ，Ｓａｋａｉ  Ｊ，Ｎａｋａｇａｔａ  Ｎ，Ｔａｋｅｙａ  Ｍ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｏｇａｗａ  Ｙ，Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｔ，Ｓｕｄａ  Ｔ．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００５  Ａｐｒ；１１（４）：４００−８．
【非特許文献２７】Ｍａ  Ｔ，Ｓｏｎｇ  Ｙ，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ａ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＥＪ，Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＣＪ，Ｖｅｒｋｍａｎ  ＡＳ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｌｉｖａ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａｑｕａｐｏｒｉｎ−５  ｗａｔｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｌ  １６；２７４（２９）：２００７１−４
【非特許文献２８】Ｅｎｅｒｂａｃｋ  Ｓ，Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ  Ａ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＥＭ，Ｇｕｅｒｒａ  Ｃ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｈ，Ｈａｒｐｅｒ  ＭＥ，Ｋｏｚａｋ  ＬＰ．Ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｅ  ｃｏｌｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｂｅｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｍａｙ  １；３８７（６６２８）：９０−４．
【非特許文献２９】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｅ，Ｆｕ  Ｌ，Ｊｏｈｎ  Ｌ，Ｈｕｌｔｇｒｅｎ  Ｂ，Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｒｅｎｚ  Ｍ，Ｓｔｅｐｈａｎ  ＪＰ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ  Ｌ，Ｆｒｅｎｃｈ  Ｄ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＴＡ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１９  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００２  Ｍａｙ；１４３（５）：１７４１−７．
【非特許文献３０】Ｆｕ  Ｌ，Ｊｏｈｎ  ＬＭ，Ａｄａｍｓ  ＳＨ，Ｙｕ  ＸＸ，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｅ，Ｒｅｎｚ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＭ，Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｒ，Ｃｏｒｐｕｚ  Ｒ，Ｍｏｆｆａｔ  Ｂ，Ｖａｎｄｌｅｎ  Ｒ，Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｌ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｊ，Ｓｔｅｐｈａｎ  ＪＰ，Ｔｓａｉ  ＳＰ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＴＡ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １９  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｄ  ｌｅｐｔｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊｕｎ；１４５（６）：２５９４−６０３．
【非特許文献３１】Ｋｌａｍａｎ  ＬＤ，Ｂｏｓｓ  Ｏ，Ｐｅｒｏｎｉ  ＯＤ，Ｋｉｍ  ＪＫ，Ｍａｒｔｉｎｏ  ＪＬ，Ｚａｂｏｌｏｔｎｙ  ＪＭ，Ｍｏｇｈａｌ  Ｎ，Ｌｕｂｋｉｎ  Ｍ，Ｋｉｍ  ＹＢ，Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ，Ｓｔｒｉｃｋｅｒ−Ｋｒｏｎｇｒａｄ  Ａ，Ｓｈｕｌｍａｎ  ＧＩ，Ｎｅｅｌ  ＢＧ，Ｋａｈｎ  ＢＢ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｂ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ａｕｇ；２０（１５）：５４７９−８９．
【非特許文献３２】Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  Ｊ，Ｋｏｍｉｙａ  Ｍ，Ｂａｂａ  Ｉ，Ｎａｉｔｏ  Ｎ，Ｓａｓａｚｕｋｉ  Ｔ，Ｓｈｉｒａｓａｗａ  Ｓ．Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＫＲＡＰ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（２００４）４９：４６−５２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、肥満および／または糖尿病の予防および／または治療に寄与しうる、新規な薬剤、肥満および／または糖尿病などの病態解明などの目的に使用しうるトランスジェニック動物およびその作製に使用しうる核酸分子などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、ＫＲＡＰが生理的発現によって肝臓、膵臓に多く分布し、心臓、骨格筋を除く多くの器官・組織にもユビキタスに存在することを見出した。さらに、本発明者らは、ＫＲＡＰ遺伝子を破壊された動物が、脂質代謝および糖代謝の変化を示し、脂肪量の少ない動物となることを見出し、本発明を完成した。【０００７】  本発明は、
〔１〕ＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させたトランスジェニック非ヒト動物；
〔２〕相同組換えにより破壊されたＫＲＡＰ遺伝子を含む、前記〔１〕記載のトランスジェニック非ヒト動物；
〔３〕改変された脂質代謝および／または糖代謝を有する、前記〔１〕記載のトランスジェニック非ヒト動物；
〔４〕エネルギー消費の亢進、インシュリン感受性の亢進および／または血中ホルモン濃度の異常を示す、前記〔１〕記載のトランスジェニック非ヒト動物；
〔５〕ゲノム内のＫＲＡＰ遺伝子と相同組換え可能であって、非ヒト動物細胞内でＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させうる、単離された変異型ＫＲＡＰ遺伝子核酸分子；
〔６〕変異が、少なくとも１つのエクソンの欠損である、前記〔５〕記載の核酸分子；
〔７〕変異が、エクソン１１〜１６の少なくとも１つを含む領域の欠損である、前記〔６〕記載の核酸分子；
〔８〕前記〔５〕〜〔７〕のいずれか１項記載の核酸分子を含む、ベクター；
〔９〕トランスジェニック動物作製用または遺伝子治療用の発現ベクターである、前記〔８〕記載のベクター；
〔１０〕前記〔８〕または〔９〕記載のベクターを導入された宿主細胞；
〔１１〕ＫＲＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を有し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰ遺伝子の発現を阻害しうる、単離された干渉性核酸分子；
〔１２〕少なくとも一部が二本鎖である、前記〔１１〕記載の干渉性核酸分子；
〔１３〕ＫＲＡＰタンパクまたはその一部に対して特異的に結合し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰタンパクの機能を阻害しうる、結合性タンパク；
〔１４〕前記〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の干渉性核酸分子または結合性タンパクを含む、脂質代謝および／または糖代謝改変剤；
〔１５〕エネルギー消費亢進剤、肥満の予防または解消剤、またはインシュリン感受性亢進剤である、前記〔１４〕記載の脂質代謝および／または糖代謝改変剤；
〔１６〕ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパク質の発現または機能を阻害することにより、哺乳類細胞、組織または非ヒト動物において脂質代謝および／または糖代謝の改変を誘起する方法；
〔１７〕脂質代謝および／または糖代謝の改変が、エネルギー消費の亢進、肥満の予防または解消、インシュリン感受性の亢進、および／または血中ホルモン濃度の異常である、前記〔１６〕記載の方法；
〔１８〕ＫＲＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的な配列を有し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰ遺伝子の発現を阻害しうる干渉性核酸分子、および／またはＫＲＡＰタンパクまたはその一部に対して特異的に結合し、細胞、組織または個体においてＫＲＡＰタンパクの機能を阻害しうる結合性タンパクを用いてＫＲＡＰ遺伝子の発現を阻害する工程を含む、前記〔１６〕または〔１７〕記載の方法、
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】  本発明の核酸分子等の投与または本発明の方法によれば、ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパクの発現または機能を阻害することにより、動物において人為的に脂質代謝および糖代謝の改変やエネルギー消費の亢進をもたらすことができ、さらには肥満の予防または解消、および／または糖尿病の予防または治療をもたらすことができる。特に、本発明によれば、高脂肪食の摂取のような食事に起因する肥満を抑制することができる。一方、ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパクの発現または機能の阻害による不利な影響は見出されていない。【０００９】  本発明のトランスジェニック動物は、脂質代謝および糖代謝が改変されており、特にエネルギー消費の亢進が起こる結果、野生型と比較して体が小さく、脂肪量が少ないという特徴を有する。したがって、体重制御および肥満のメカニズム、糖代謝などの研究、たとえば肥満、糖尿病などの病態解明のための研究においてモデル動物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】［図１］は、ヒト（上段）およびマウス（下段）のＫＲＡＰ遺伝子産物のアミノ酸配列の比較を示す図である。太い下線を付した部分がコイルド・コイル・モチーフである。
［図２］は、マウスＫＲＡＰ遺伝子のターゲティングされた破壊を示す図である。パネル（Ａ）：エクソン８〜１７を含むマウスＫＲＡＰ遺伝子の一領域（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｌｏｃｕｓ）を、関連する制限酵素部位とともに模式的に示す。パネル（Ｂ）：ネオマイシン（ｎｅｏ）カセットを含むターゲティング構築物（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）を示す。相同組換えを意図したゲノム遺伝子（Ａ）との対応位置関係を点線で示す。パネル（Ｃ）：相同組換えによって生成すると予測される変異対立遺伝子（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｏｃｕｓ）を示す。パネル（Ｄ）左：ＥｃｏＲＶで消化した尾ＤＮＡを用いたサザン・ブロットの写真である。中央：野生型（＋／＋）と比較した、変異体（−／−）肝臓におけるＫＲＡＰ  ｍＲＮＡの特異的欠失を示すノーザン・ブロットの写真である。下はβ−アクチンである。右：野生型（＋／＋）と比較した、変異体（−／−）肝臓におけるＫＲＡＰタンパクの特異的欠失を示すウェスタン・ブロットの写真である。下はβ−チューブリンである。
［図３］は、野生型（Ｗｔ）、ヘテロ接合体（Ｈｔ）およびＫＲＡＰノックアウトマウス（Ｋｏ）についての生育曲線（縦軸：体重、横軸：週齢）を示すグラフ（それぞれ平均±ｓｅ；ｎ＝５〜１４／群）である。左：雄、右：雌。
［図４］は、野生型（Ｗｔ）およびＫＲＡＰノックアウトマウス（Ｋｏ）についての器官重量の比較を示す図である。２０週齢の雄（ｎ＝９）についての平均±ｓｅ、縦軸は組織重量／体重の百分率である。ＷＡＴ＝白色脂肪組織、ｌｉｖｅｒ＝肝臓、ＢＡＴ＝褐色脂肪組織、ｋｉｄｎｅｙ＝腎臓、ｈｅａｒｔ＝心臓。
［図５］は、普通食を与えた２２週齢の雄を１６時間絶食させた後に作製した、野生型（Ｗｔ）およびＫＲＡＰノックアウトマウス（Ｋｏ）についての組織切片のＨＥ染色像を示す写真である。ＷＡＴ＝白色脂肪組織、ＢＡＴ＝褐色脂肪組織、Ｌｉｖｅｒ＝肝臓。スケールバーは５０μｍ。
［図６］は、食餌を与えた状態での野生型（Ｗｔ）およびＫＲＡＰノックアウトマウス（Ｋｏ）についての肝臓のトリグリセリドおよびグリコーゲンの相対量を示す図である。左：トリグリセリド、右：グリコーゲン。
［図７］は、マウス個体当り（左）または体重で標準化した（右）摂食量の比較を示す図である（ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝７）、ＫＲＡＰ−／−（ｎ＝９））。値は平均±ｓｅである。星印はＰ＜０．０５の有意差、「Ｎ．Ｓ．」は野生型マウスと比較して有意差なし、をそれぞれ示す。
［図８］は、普通食下での２２週齢の雄のマウスについての１日のエネルギー消費プロフィール（パネル（Ａ））および呼吸商（ＲＱ）（パネル（Ｂ））を示す図である。値は平均±ｓｅである（ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝７）、ＫＲＡＰ−／−（ｎ＝９））。星印はＰ＜０．０５の有意差を示す。パネル（Ｃ）：体重当りの総エネルギー消費の測定値である。
［図９］は、グルコース寛容試験の結果を示す図である。縦軸：血中グルコース濃度、横軸：注射後の時間。普通食で維持した１６週齢の雄マウスを用いた。ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝１０）、ＫＲＡＰ−／−（ｎ＝１０）（平均±ｓｅ）。星印はＰ＜０．０１の有意差を示す。
［図１０］は、インシュリン感受性試験の結果を示す図である。左：血中グルコース濃度、右：注射時を１００％とした百分率で示した血中グルコース濃度。星印は有意差を示す（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１）。
［図１１］は、給餌下でのＫＲＡＰ＋／＋（黒カラム）、ＫＲＡＰ−／−（白カラム）およびＫＲＡＰ＋／−（斜線カラム）マウスの血中グルコースレベルを示す図である。
［図１２］は、給餌下（ｆｅｄ）および１５時間絶食下（１５ｈ  ｆａｓｔ）でのＫＲＡＰ＋／＋（黒カラム）およびＫＲＡＰ−／−（白カラム）マウスの血中ケトン体レベルを示す図である。縦軸は血中ケトン体濃度を示す。
［図１３］は、高脂肪食を与えた場合の体重調節を表す図である。パネル（Ａ）：マウスの体重曲線、パネル（Ｂ）：４週間での体重増加量、パネル（Ｃ）：４週間での体重増加量を開始時の体重割りで表示したグラフ、パネル（Ｄ）：ＷＡＴ重量の体重割り表示。星印は有意差を示す（＊：Ｐ＜０．００１；＊＊：Ｐ＜０．０１）。
［図１４］は、高脂肪食を与えた期間の摂食量を表す図である。左：１日当りの摂食量（ｇ）、右：それを体重割で表示したもの。星印は有意差を示す（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．００１）。
［図１５］は、高脂肪食を与えた場合のエネルギー消費を示す図である。星印は有意差を示す（＊：Ｐ＜０．０５）。
［図１６］は、組織におけるいくつかの遺伝子の発現についてのノーザン・ブロットの結果を示す図である。組織：Ｌｉｖｅｒ＝肝臓、Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ＝骨格筋、ＷＡＴ＝白色脂肪組織、ＢＡＴ＝褐色脂肪組織；動物：Ｗ＝野生型（＋／＋）、Ｋ＝ＫＲＡＰノックアウトマウス（−／−）；遺伝子：ＡＣＣ１＝アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ１、ＡＣＣ２＝アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ２、ＡＣＯ＝アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、ＵＣＰ２＝アンカップリングプロテイン２、β−Ａｃｔｉｎ＝βアクチン、ＬＰＬ＝リポプロテインリパーゼ、ＨＳＬ＝ホルモン感受性リパーゼ、ＰＰＡＲγ＝ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、Ｌｅｐｔｉｎ＝レプチン、ａＰ２＝脂肪細胞脂肪酸結合蛋白質、３６Ｂ４＝酸性リボソームリン酸化蛋白質Ｐ０、ＵＣＰ１＝アンカップリングプロテイン１、ＰＧＣ１α＝ＰＰＡＲγ−コアクチベーター１α。なお、肝臓および骨格筋については、各２匹の野生型およびＫＲＡＰノックアウトマウスについてのデータを示す。
［図１７］は、自発運動量の測定結果を示す図である。ＷＴ＝野生型、ＫＯ＝ＫＲＡＰノックアウトマウス。パネル（Ａ）：縦軸はカウントされた移動行動の回数、横軸は時刻および明暗条件を表す。パネル（Ｂ）：「ｄａｒｋ」（暗）および「ｌｉｇｈｔ」（明）各条件下における総カウント数を示す。
［図１８］は、高脂肪食を与えた場合の肝臓への影響を示す図である。ＷＴ＝野生型、ＫＯ＝ＫＲＡＰノックアウトマウス。パネル（Ａ）：肝臓の外観を示す写真である。パネル（Ｂ）：組織トリグリセリド含量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  本発明において、「ＫＲＡＰ遺伝子」は、ポリペプチドとして発現可能なＫＲＡＰをコードするホモログおよび対立遺伝子をすべて含む。このような遺伝子は、少なくともマウスおよびヒトについて公知であり（たとえば図１）、そのような公知の配列に基づいて設計されたプローブを用いてストリンジェントな条件下で所望のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。「ストリンジェントな条件」とは、たとえば５０％ホルムアミド、１２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション条件およびこれと同等のストリンジェンシーの条件をいう。【００１２】  たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００００６８として登録されているマウスのゲノミック遺伝子（配列表の配列番号１）のコード領域または登録番号ＡＢ１２０５６５として登録されているマウスのｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の全長（配列番号２および３）、あるいはＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ１１６９３７として登録されているヒトのｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の全長（配列番号４および５）に対して、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴサーチを使用したホモロジー検索において６０％以上のヌクレオチド同一性または５０％以上のアミノ酸同一性を有するもの、好ましくは８０％以上のヌクレオチド同一性または７０％以上のアミノ酸同一性を有するもの、さらに好ましくは９０％以上のヌクレオチド同一性または８０％以上のアミノ酸同一性を有するものは、本発明に関して「ＫＲＡＰ」タンパクをコードする遺伝子に含まれる。【００１３】  「野生型」ＫＲＡＰ遺伝子とは、このようなＫＲＡＰ遺伝子のうち、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている上記のマウスまたはヒトＫＲＡＰ遺伝子、またはそれらと実質的に同等の発現・機能を有する天然型のＫＲＡＰ遺伝子をいう。【００１４】  「変異型」ＫＲＡＰ遺伝子とは、上記のようにして得られるＫＲＡＰ遺伝子（特に天然型または野生型の遺伝子）と比較して、ヌクレオチド配列の一部が改変されていることによって量的または質的に異なるＫＲＡＰ遺伝子発現をもたらす任意のＫＲＡＰ遺伝子をいう。【００１５】  本発明においては、ゲノム内のＫＲＡＰ遺伝子と相同組換え可能な程度の相同性または同一性を保持するものであって、非ヒト動物細胞内でＫＲＡＰ遺伝子の発現を低減または欠如させうる変異型ＫＲＡＰ遺伝子が用いられる。このような変異型ＫＲＡＰ遺伝子としては、たとえば、少なくとも１つのエクソンの欠損を有するもの、フレームシフトを生じる変異を有するものなどが挙げられるが、これらに限られない。欠損の例としては、変異がＫＲＡＰ遺伝子のＣ末端側の半分の領域に存在するもの、さらに具体的には、エクソン１１〜１６の少なくとも１つを含む領域の欠損が挙げられ、エクソン１１〜１６のすべてを含む領域を欠損していることができる。あるいは、欠損は、たとえばコード領域の５〜９５％、２０〜８０％、または３５〜７０％程度であることができる。コード領域の欠損は、ＫＲＡＰ機能の破壊をもたらす限りにおいて少なくても良く、相同組換え可能な程度のコード領域および／または非コード領域が残存する限りにおいて広範であることができる。【００１６】  このような変異型ＫＲＡＰ遺伝子核酸分子を適当なベクターに挿入することにより、遺伝子導入用のベクター、たとえば相同組換え用のベクターを作製することができる。好ましくは、核酸分子はＤＮＡであり、ベクターは、変異型ＫＲＡＰ遺伝子核酸分子と選択可能なマーカー遺伝子（たとえばＧ４１８耐性を付与するｎｅｏ遺伝子）とを含む。【００１７】  本発明のトランスジェニック動物の作製においては、このようなベクターを一般的な方法で宿主細胞（たとえばマウス胚盤胞）に導入する。トランスジェニック動物の作製方法は、当業者には充分公知であり、当業者は公知の方法を任意に選択して本発明のトランスジェニック動物の作製のために適宜採用することができる。【００１８】  本発明のトランスジェニック動物は、ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパクの発現が作製に使用した宿主（野生型ＫＲＡＰ遺伝子を有する）動物におけるものと比較して有意に低減または欠如していることを定法により確認することによって特定することができる。さらに、たとえば実施例において後述するアッセイ方法などを用いて、脂質代謝（特にエネルギー消費の亢進）、糖代謝（特にインシュリン感受性の亢進）、これらに関連する各種血中ホルモン濃度の変動などを確認することによっても、本発明のトランスジェニック動物を特定することができる。【００１９】  本発明のトランスジェニック動物は、肥満、糖尿病などを含む疾患およびメタボリックシンドロームの発症機序の解明、さらにはその治療などの目的のために各種の実験においてモデル動物として使用することができる。さらには、ＫＲＡＰ遺伝子の機能自体の解明のためにも使用することができる。【００２０】  本発明にしたがって、上記のような変異型ＫＲＡＰ遺伝子を含むベクターを用いることにより、エクスビボ遺伝子治療も可能となる。すなわち、一般的な遺伝子治療においては、欠陥遺伝子を含む治療対象由来の細胞に対し、機能的な遺伝子をインビトロで導入し、この遺伝子操作された細胞を治療対象に戻すことが行われるが、本発明においては、機能的なＫＲＡＰ遺伝子を含む治療対象由来の細胞に対し、上記のような変異型ＫＲＡＰ遺伝子をインビトロで導入する工程、およびこの遺伝子操作された細胞を治療対象に戻す工程を含む。このような方法に使用される遺伝子治療用ベクターもまた本発明の範囲内である。このような遺伝子治療用ベクターには、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスのようなベクターが使用され、その作製方法も当業者に充分公知である。【００２１】  本発明は、ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパク質の発現または機能を阻害することにより、哺乳類細胞、組織または非ヒト動物において脂質代謝および／または糖代謝の改変を誘起する方法を提供する。ＫＲＡＰ遺伝子またはタンパク質の発現または機能を阻害するために、たとえば、ＫＲＡＰ遺伝子の塩基配列に基づいて設計された干渉性核酸分子（たとえばアンチセンスＲＮＡ；ＲＮＡ干渉を起こしうる、二本鎖部分を含む短い（たとえば１８〜２００塩基）ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含む二本鎖核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ＫＲＡＰタンパクに特異的に結合する結合性タンパク分子（ここで、「タンパク」はポリペプチドをも含む用語として使用される；たとえばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体の各種フラグメント、ヒト化抗体など）を使用することができる。これらの各種の干渉性核酸分子の設計および製造方法、抗体または抗体フラグメントなどの結合性タンパク分子の調製方法は、当業者には充分公知である。【００２２】  これらの干渉性核酸分子および／または結合性タンパク分子を、脂質代謝および／または糖代謝改変剤、たとえばエネルギー消費亢進剤、肥満の予防または解消剤、またはインシュリン感受性亢進剤として、単独で、組み合わせて、または生理的に許容されうる適切な担体と配合して、動物に投与することにより、エネルギー消費亢進、肥満の予防または解消、またはインシュリン感受性亢進などの効果を得ることができる。このような目的のために使用可能な生理的に許容されうる担体および製剤方法は、製薬技術の当業者には充分公知である。適切な投与量は、動物種、個体の体重・年齢・性別・一般的な健康状態などによって広い範囲で変動しうるが、当業者は、適切な動物を選択して実験することにより、適宜決定することができる。
【実施例】
【００２３】 １．ＫＲＡＰターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターの構築を、図２を参照して説明する。１２９／ＳＶマウスゲノミックライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から、マウスＫＲＡＰ  ｃＤＮＡプローブ（配列表の配列番号１における塩基番号２９６２〜３７５９）を用いてＫＲＡＰ遺伝子のゲノミックＤＮＡを単離した。第一に、単離したゲノミックＤＮＡからＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを調製し、３’アームとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫのＳａｌＩ部位に入れた。第二に、単離したゲノミックＤＮＡからＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを調製し、５’アームとしてＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位に入れた。第三に、ＥｃｏＲＩ部位にｐＧＫｎｅｏカセットを入れた。最後に、ＳａｌＩ部位にＸｈｏＩ−ＳａｌＩでジフテリアトキシンＡフラグメントカセットを入れた。このようにして、図２のパネル（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＫＲＡＰ遺伝子のエクソン１１〜１６（コード領域の５５％）を含む７．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント（配列表の配列番号１における塩基番号２０５９８〜２８８６７を、反対の転写方向を有するｐＧＫｎｅｏカセットで置き換え、ターゲティングベクターを構築した。このターゲティング構築物の５’および３’アームは、それぞれ２．３ｋｂ（配列表の配列番号１における塩基番号１８２８８〜２０５９７）および６．４ｋｂ（配列表の配列番号１における塩基番号２７８７６〜３４３４８）のゲノミックＤＮＡからなっていた。ジフテリアトキシンＡフラグメントカセット（ＤＴＡ−Ａ）が３’ゲノミックアームに隣接していた。このターゲティングベクターをＳａｌＩで線状化した。【００２４】 ２．ＫＲＡＰノックアウトマウスの作製
胚性幹（ＥＳ）細胞に、前記の線状化したターゲティングベクターを電気穿孔法により導入し、組換え体をフィーダー細胞（胚性線維芽細胞）上でＧ４１８で選択した。この変異体胚性幹細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞（胞胚）にマイクロインジェクションし、得られた雄性キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。ヘテロ接合性（ＫＲＡＰ＋／−；「Ｈｔ」と略称することがある）のマウスを交配してＫＲＡＰノックアウト（ＫＲＡＰ−／−；「Ｋｏ」と略称することがある）マウスを得た。【００２５】  観察された子孫のゲノタイプ比は予想されたメンデル比と一致した。したがって、ＫＲＡＰ遺伝子の破壊によって胚発生が影響を受けなかったことが示された。また、ＫＲＡＰ（−／−）マウスは稔性であった。【００２６】  動物の尾から抽出したゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化し、外部プローブ（３５０ｂｐのＸｂａＩフラグメント、配列表の配列番号１における塩基番号１５７８６〜１６１４０；図２、パネル（Ｃ）「Ｐｒｏｂｅ  Ａ」で示す）とハイブリダイズさせた。野生型（ＫＲＡＰ＋／＋；「Ｗｔ」と略称することがある）では２１．０ｋｂの制限フラグメント、変異型（−／−）では８．０ｋｂのフラグメント、ヘテロ接合体（−／＋）では両方のフラグメントが検出された（図２、パネル（Ｄ）の左の写真）。【００２７】  さらに、ｎｅｏプローブを用いて相同組換え体を確認し、組込み部位が１箇所であることを確認した。【００２８】  野生型（＋／＋）および変異体（−／−）肝臓から常法にしたがって総ＲＮＡを抽出し、配列表の配列番号１における塩基番号２９６２〜３７５９をプローブとして用いてノーザン・ブロットを行った（図２（Ｄ）中央）。ＫＲＡＰ（−／−）においては、ＫＲＡＰ  ｍＲＮＡが特異的に欠失していた（内部対照として用いたβ−アクチンは同等の発現を示した）。【００２９】  野生型（＋／＋）および変異体（−／−）肝臓ライセートを調製し、ウェスタン・ブロットを行った。マウス組織を、ＲＩＰＡ緩衝液〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、プロテアーゼ・インヒビター・カクテル（Ｒｏｃｈｅ）〕中で超音波で破砕した。この液を、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心して抽出液を得、プロテイン・アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク量を測定した。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して展開し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。このブロットを、ブロッキング緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％ノンファット・スキムミルク、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮａＮ３、ｐＨ７．５）中でブロッキングし、アフィニティ精製した抗ＫＲＡＰ抗体とともに４℃で一晩インキュベートした（希釈倍率１：２，０００）。これを、ＨＲＰ−コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧヤギ二次抗体およびＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて発色させた。【００３０】  検出に使用した抗ＫＲＡＰ抗体は、以下のようにして調製した。ｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を指示書にしたがって用いて、組換えヒトＫＲＡＰ（配列表の配列番号４におけるアミノ酸１０３９〜１２���６）を細菌融合タンパクとして発現させた。この融合タンパクは、非変性性緩衝液中で可溶性であり、グルタチオン−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製された。この組換えＫＲＡＰタンパクをウサギに注射し、追加免疫を行った後、抗血清を得た。抗血清を、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に組換えタンパクを架橋して調製したアフィニティカラムを用いて精製した。
結果を図２（Ｄ）右）に示す。ＫＲＡＰ（−／−）においては、ＫＲＡＰタンパクが特異的に欠失していた（内部対照として用いたβ−チューブリンは同等の発現を示した）。【００３１】 ３．体重変化の測定
温度調節された施設内（２３℃）で、１２時間の明暗サイクルで動物を維持した。マウスは、標準的げっ歯類飼料（ＣＥ−２（日本クレア）；以下「普通食」ということがある）および水に随意にアクセス可能とした。ヘテロ接合性のマウスを交配して得たＫＲＡＰ＋／＋、＋／−、および−／−の動物について体重を毎週記録した。【００３２】  結果を図３に示す。ＫＲＡＰ−／−仔の体重は、出生時から少なくとも出生後５日間以内は同腹子ＫＲＡＰ＋／＋および＋／−マウスと有意に異ならなかった。普通食を与えた場合、ＫＲＡＰ−／−マウスは、＋／＋および＋／−マウスの両方よりも体重が少なかった。この差は、雄（図３、左）雌（図３、右）両方について３週齢で生じていた。【００３３】 ４．器官重量の測定
週齢を一致させた（２０週齢）雄性ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝９）およびＫＲＡＰ−／−（ｎ＝９）マウスを安楽死させ、精巣上体の白色脂肪組織（ＷＡＴ）、肝臓、肩甲骨間の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、腎臓および心臓の湿潤重量を測定した。【００３４】  結果を図４に示す。ＷＡＴおよび肝臓の相対重量（ｇ／ｇ  ｂｏｄｙ）は、ＫＲＡＰ＋／＋マウスよりもＫＲＡＰ−／−マウスにおいて少なかった。一方、ＢＡＴ、腎臓および心臓については有意差は認められなかった。【００３５】 ５．形態学的観察
２２週齢の雄性マウスのＷＡＴ、ＢＡＴおよび肝臓を、絶食１６時間後に得た。これらの組織の断片をＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、エタノール中で脱水し、パラフィンに包埋した。切片を脱パラフィンし、再水和し、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色し、光学顕微鏡で観察した。【００３６】  結果を図５に示す。ＨＥ染色したＷＡＴおよびＢＡＴ中のＫＲＡＰ−／−の脂肪細胞（白く見えているもの）は、ＫＲＡＰ＋／＋の脂肪細胞と比較して、明らかに大きさが低減していた。ＫＲＡＰ−／−マウスの肝臓の染色では、脂質液胞（ｌｉｐｉｄ  ｖａｃｕｏｌｅｓ）がほとんど観察されなかった。【００３７】 ６．組織トリグリセリドおよびグリコーゲン含量の測定
普通食の標準的な給餌条件下の２０週齢の雄性マウスの肝臓のトリグリセリド含量を、Ｆｏｌｃｈら（Ｆｏｌｃｈ  Ｊ，Ｌｅｅｓ  Ｍ，Ｓｌｏａｎｅ  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＧＨ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９５７  Ｍａｙ；２２６（１）：４９７−５０９）の抽出プロトコールおよび酵素的トリグリセリドＥテスト（和光純薬工業）を用いてアッセイした。肝臓グリコーゲンの測定については、同じマウス由来の肝臓を３％（ｗ／ｗ）過塩素酸中でホモジナイズし、ホモジネートをアミログルコシダーゼとともに４０℃で２時間インキュベートしてグリコーゲンを加水分解した。次に、生じられたグルコース残基を、酵素的グルコースＣＩＩテスト（和光純薬工業）を用いて測定した。【００３８】  結果を図６に示す。形態学的観察から、ＫＲＡＰ−／−の肝臓においてはトリグリセリド含量が低いことが示唆されたが、実際、肝組織トリグリセリドの抽出および測定によれば、ＫＲＡＰ−／−の肝臓はＫＲＡＰ＋／＋の肝臓と比較して４０％少ないトリグリセリドを含有していた。一方、肝臓のグリコーゲン含量については、両ゲノタイプ間に有意差は見られなかった。【００３９】 ７．摂食量の測定
２２週齢の雄性マウスを、個別にメタボリックケージに入れた。予め重量を測定した普通食をマウスに２４時間提供した。試験開始前に体重を測定した。２４時間の期間の終了後、餌くずを含む残りの餌を重量測定し、１日当りの摂食量（ｇ／ｄａｙ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）を算出した。
結果を表１および図７に示す。【００４０】
【表１】
2007010999.tif 000002
【００４１】  ＫＲＡＰ＋／＋マウスの体重は、ＫＲＡＰ−／−マウスよりも有意に重かった（Ｐ＜０．００１）。摂食量は、餌の消費を体重について調整した場合、ＫＲＡＰ−／−マウスの方がＫＲＡＰ＋／＋マウスよりも有意に多かった。これらの結果は、ＫＲＡＰ−／−マウスにおける体重増加の遅延が摂食量によるものではないことを示す。【００４２】 ８．エネルギー代謝の研究
エネルギー代謝の同時測定のため、週齢を一致させた（２２週齢）雄性野生型マウス（ｎ＝７）およびＫＲＡＰ−／−（ｎ＝９）マウスを１日個別にメタボリックケージに入れた（Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｍ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｙ，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｎ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎ  ｌａｔｅｒ  ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｍａｌｅ  Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ  ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｆｏｏｄ，Ｊ  Ｎｕｔｒ．１９８７  Ｏｃｔ；１１７（１０）：１７５１−８；Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｍ，Ｋａｎａｉ  Ｓ，Ｉｃｈｉｍａｒｕ  Ｙ，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ａ，Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｋ．，Ｔｈｅ  ｄｉｕｒｎａｌ  ｒｈｙｔｈｍ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｂｅｓｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ，Ｊ  Ｎｕｔｒ．２０００  Ｏｃｔ；１３０（１０）：２５６２−７）。自動Ｏ２−ＣＯ２分析機（ＮＥＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｍｏｄｅｌ  ＩＨ２６，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、呼気中の酸素消費量および二酸化炭素生成量を連続的に測定した。１時間当りおよび１日当りのエネルギー消費を算出した。【００４３】  結果を図８に示す。１日当りのエネルギー消費は、ＫＲＡＰ−／−マウスにおいてＫＲＡＰ＋／＋マウスよりも大きく（Ｐ＜０．０１）、ＫＲＡＰ−／−マウスでは２９２９．３±１６３．１ｋＪ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ、ＫＲＡＰ＋／＋マウスでは２２５７．２±１５２．２ｋＪ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔであった。代謝測定中の呼吸商（ＲＱ）については、両ゲノタイプ間で有意差はなく（Ｐ＝０．３７）、ＫＲＡＰ＋／＋マウスでは０．９０±０．０３、ＫＲＡＰ−／−マウスでは０．８８±０．０２であった。これらの結果は、ＫＲＡＰの欠損がエネルギー消費の亢進をもたらしたことを示す。ＫＲＡＰ−／−マウスにおいて燃焼に使用されたエネルギーの供給源は、少なくとも普通食では正常であった。摂食量およびエネルギー消費についての測定から、マウスにおけるＫＲＡＰの欠損によって代謝ターンオーバーが明白に増強されたことを示した。【００４４】 ９．腹腔内グルコース寛容試験およびインシュリン感受性試験
一晩絶食した動物に対し、２ｇ／ｋｇ体重の用量のグルコースを用いて、腹腔内グルコース寛容試験を行った。インシュリン感受性試験は、３時間絶食させた動物に０．７５Ｕ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔの用量でインシュリンを注射して行った。尾静脈血を、注射後１５、３０、６０、９０および１２０分の時点に採取し、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｘｔｒａ（アボット・ジャパン（株））を用いるグルコース定量に使用した。【００４５】  結果を図９および１０に示す。グルコース投与の６０、９０および１２０分後、ＫＲＡＰ−／−マウスのグルコースレベルは、ＫＲＡＰ＋／＋マウスと比較して有意に低かった（図９）。また、インシュリン感受性試験においては、インシュリン注射により、ＫＲＡＰ−／−マウスではＫＲＡＰ＋／＋マウスと比較して有意に低いグルコースレベルがもたらされた（図１０）。【００４６】  これらの結果は、普通食で維持したＫＲＡＰ＋／＋マウスと比較して、ＫＲＡＰ−／−マウスは、よりグルコース寛容かつインシュリン感受性が強いことを示す。【００４７】 １０．臨床生化学的測定
普通に給餌された状態で動物の眼窩後の洞静脈から血液を採取した。血液は、遠心分離（３，０００ｇ、１５分、４℃）にかけるまで氷上に保ち、血清を採取して、これを分析に使用する時まで−７０℃で保存した。血清中のインシュリン、レプチン、アディポネクチンおよびサイロキシン（Ｔ４）濃度を、ＥＬＩＳＡキット（それぞれＳｈｉｂａｙａｇｉ  Ｃｏ．，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｔｓｕｋａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｔｅｃｈ．Ｃｏ．）を用いて測定した。トリグリセリド、総コレステロールおよび非エステル化遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）は、酵素的アッセイによって測定した（和光純薬工業）。尾静脈血を用いてＭｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｘｔｒａを使ってグルコースおよびケトン体の定量を行った。
結果を表２、３および図１１および１２に示す。【００４８】
【表２】
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【００４９】  普通食を与えた、示したゲノタイプの１５週齢の雄マウス（ｎ＝１０）および３４週齢の雌マウス（ｎ＝８〜９）についての平均±ｓｅで表す。【００５０】
【表３】
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【００５１】  普通食を与えた、示したゲノタイプの１５週齢の雄マウス（ｎ＝１０）および３４週齢の雌マウス（ｎ＝１１）についての平均±ｓｅで表す。【００５２】  普通食を与えられたＫＲＡＰ＋／＋およびＫＲＡＰ−／−マウスにおける血清コレステロールおよび遊離脂肪酸レベルは、有意差がなかった。血清トリグリセリドレベルは、統計学的有意差は認められなかったものの、ＫＲＡＰ−／−マウスの方が低い傾向が見られた。ＫＲＡＰ−／−マウスは、軽度の低血糖症および低減された循環インシュリン濃度を示した。【００５３】  ケトン体は飢餓状態におけるエネルギー源として脂肪を分解して産生される。ＫＲＡＰ−／−マウスにおいて、非絶食下で野生型と変わらず低値であることは、ケトアシドーシスでない（飢餓状態のような異常はない）ことを示す。また、絶食下においてケトン体濃度が上昇しているので、ＫＲＡＰ−／−マウスにおいても脂肪分解およびＮＥＦＡからケトン体への変換は異常ないことが示唆された。【００５４】  レプチンは、摂食量の低減と無関係に脂肪減少を増大する循環性ホルモンであるため、このホルモンの血清中レベルを測定した。レプチンは、ＫＲＡＰ−／−マウスにおいて実際は低減していた。【００５５】  アディポネクチンは、脂肪由来ホルモンであり、肥満に付随するインシュリン寛容および糖尿病において役割を有すると考えられている。アディポネクチンは、ＫＲＡＰ＋／＋マウスにおいて増大していた。ＫＲＡＰ−／−マウスは、増大されたエネルギー消費を示したが、その血清サイロキシン（Ｔ４）レベルはＫＲＡＰ＋／＋マウスよりも低かった。そのうえ、給餌された状態でケトン体形成が野生型と同等であったことは、ＫＲＡＰ−／−マウスに飢餓状態のような異常がないことを支持し、それは、体重について標準化した場合にＫＲＡＰ−／−マウスがＫＲＡＰ＋／＋よりも多量に摂食することと一致している。【００５６】 １１．高脂肪食を与えた場合の体重の調節
週齢を一致させた（２３週齢）雄性ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝７）およびＫＲＡＰ−／−（ｎ＝６）マウスに予め重量を測定した高脂肪食飼料（「Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２」、粗脂肪含量が約３２％、総カロリーに占める脂肪由来カロリーの比率が約６０％；日本クレア）を４週間与えた。これらのマウスは、２３週齢まで普通食で育てた。２日毎に体重を測定し、２日毎に餌くずを含む残りの餌の重さを測定し、１日当りの摂食量（ｇ／ｄａｙ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）を概算した。高脂肪食を与えた４週間の期間終了後、これらのマウスについて前記と同様のエネルギー代謝測定を行った。【００５７】  結果を図１３〜１５に示す。図１３、パネル（Ａ）は、マウスの体重曲線、パネル（Ｂ）は４週間での体重増加量、パネル（Ｃ）は４週間での体重増加量を開始時の体重割りで表示したグラフ、パネル（Ｄ）は精巣上体白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量の体重割である。この結果から、本発明のマウスは、高脂肪食を与えた場合も、体重当りの体重増加量が野生型と比較して有意に少ないこと、したがって、ＫＲＡＰ遺伝子の変異は食餌に起因する肥満を防ぐ効果を有することが明らかである。【００５８】  図１４は、高脂肪食を与えた期間の摂食量を示す。左が１日当りの摂食量（ｇ）、右がそれを体重割で表示したものである。本発明のマウスは、野生型と比較して摂食量は多いが、体重増加は少ないことがわかる。【００５９】  図１５は、エネルギー消費量についての結果を表す。通常食の場合と同様に、本発明のマウスにおいては、エネルギー消費が亢進していた。【００６０】 １２．臨床生化学的測定（２）
前記「１０．臨床生化学的測定」において使用したものと同じ血清試料について、血清中のトリヨードチロニン（Ｔ３）、成長ホルモン（ＧＨ）およびグルカゴン濃度を、ＲＩＡキット（それぞれＥｎｄｏｃｒｉｎｅｔｅｃｈ．Ｃｏ．，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙａｎａｉｈａｒａ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．）を用いて測定した。アルブミン濃度は、酵素的アッセイによって測定した（和光純薬工業）。
結果を表４に示す。【００６１】
【表４】
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【００６２】  表４中の各測定値は、普通食を与えた１５週齢の雄マウス（ｎ＝８〜１０）についての平均±ｓｅで表す。
普通食を与えられたＫＲＡＰ＋／＋およびＫＲＡＰ−／−マウスにおける血中ＧＨ、グルカゴンおよびアルブミン濃度には、有意差は認められなかった。このことより、ＫＲＡＰ−／−マウスで見られる成長遅延は、ＧＨ分泌異常が原因ではないと考えられる。また、ＫＲＡＰ−／−マウスは、軽度の低減されたＴ３濃度を示した。このことより、ＫＲＡＰ−／−マウスで見られるエネルギー代謝率亢進は、甲状腺機能亢進が原因ではないと考えられる。【００６３】 １３．組織遺伝子発現の比較
ＫＲＡＰ＋／＋およびＫＲＡＰ−／−マウスの肝臓、骨格筋、精巣上体白色脂肪および肩甲骨間褐色脂肪組織から、常法にしたがって総ＲＮＡを抽出し、ノーザン・ブロットに供した。プローブとして、マウス肝臓総ＲＮＡまたはマウス精巣上体白色脂肪総ＲＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なって得られたｃＤＮＡ断片を用いた。【００６４】
【表５】
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【００６５】  表中、ＡＣＣ１＝アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ１；ＡＣＣ２＝アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ２）；ＡＣＯ＝アシル−ＣｏＡオキシダーゼ；ＵＣＰ２＝アンカップリングプロテイン２；β−Ａｃｔｉｎ＝βアクチン；ＬＰＬ＝リポプロテインリパーゼ；ＨＳＬ＝ホルモン感受性リパーゼ；ＰＰＡＲγ＝ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ；Ｌｅｐｔｉｎ＝レプチン；ａＰ２＝脂肪細胞脂肪酸結合蛋白質；３６Ｂ４＝酸性リボソームリン酸化蛋白質Ｐ０；ＵＣＰ１＝アンカップリングプロテイン１；ＰＧＣ１α＝ＰＰＡＲγ−コアクチベーター１αを表す。【００６６】  結果を図１６に示す。普通食を与えられたＫＲＡＰ−／−マウスの肝臓におけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）１およびＡＣＣ２の発現量は、ＫＲＡＰ＋／＋のそれと比べて低かった。肝臓におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）、アンカップリングプロテイン（ＵＣＰ）２および内部標準のβ−アクチンは差がなかった。骨格筋、精巣上体白色脂肪および肩甲骨間褐色脂肪組織における脂質代謝関連遺伝子・エネルギー代謝関連遺伝子（リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）；ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）；ＰＰＡＲγ−コアクチベーター１α（ＰＧＣ１α））は、調べた限りでは目立った異常は認められなかった。【００６７】 １４．自発運動量測定
自発運動量は、２４時間個別に飼育された状態でＤｉｇｉｔａｌ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名；バイオリサーチセンター株式会社、装置型番：ＮＳ−ＤＡＳ−８−Ａ）および実験動物用自発運動量センサー（商品名；ニューロサイエンス社、装置型番：ＮＳ−ＡＳ０１）を用いて測定した。試験中はマウスが自由に餌（普通食）と水を摂取できる状態とした。センサーは０．５秒以上の移動変化があった場合に１カウント（移動行動）刻む。【００６８】  結果を図１７に示す。ＫＲＡＰ＋／＋マウスと比較して、ＫＲＡＰ−／−マウスは夜間（暗期）に有意な運動量の亢進が認められた。昼間（明期）も、有意差は認められなかったが、同様の傾向が見られた。得られたエネルギー代謝の結果は、ＫＲＡＰ−／−マウスでは昼夜を問わずエネルギー代謝率が同等に亢進していることを示し、これは運動量曲線とは完全に一致しない。したがって、運動異常によってエネルギー消費亢進しているのではないこと、得られた運動量増加傾向は単にＫＲＡＰ−／−マウスが低体重であるがためにＫＲＡＰ＋／＋マウスより機敏に運動していること、が示唆される。また、顕著な神経性行動異常を示唆するような行動は観察されなかった。【００６９】 １５．高脂肪食を与えた場合の肝臓組織トリグリセリド含量
週齢を一致させた（１９週齢）雄性ＫＲＡＰ＋／＋（ｎ＝７）およびＫＲＡＰ−／−（ｎ＝６）マウスに高脂肪食試料（「Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２」（前述）；日本クレア）を８週間与えた後、肝臓を摘出して組織トリグリセリド含量を、前記「６．組織トリグリセリドおよびグリコーゲン含量の測定」におけるのと同様にして測定した。【００７０】  結果を図１８に示す。肝臓の概観の写真が示すようにＫＲＡＰ＋／＋マウスでは脂肪肝の像を呈したが、ＫＲＡＰ−／−マウスでは健康的な状態を保持していた。肝臓トリグリセリド含有量の測定結果からも、ＫＲＡＰ−／−マウスの肝臓ではトリグリセリド蓄積が見られなかった。この結果は、ＫＲＡＰ−／−マウスがエネルギー代謝率亢進を示し、精巣上体白色脂肪組織重量が少ないこと、並びに肝臓において脂肪合成関連遺伝子であるＡＣＣ１やＡＣＣ２の発現量が低いことと一致する。この結果から、ＫＲＡＰ遺伝子の変異は、食事に起因する肥満を防ぐ効果をもたらすことが明らかである。【００７１】  この出願は、平成１７年７月２１日出願の日本特許出願、特願２００５−２１０７４４に基づくものであり、特願２００５−２１０７４４の明細書および特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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