(57)【要約】本発明は、特別なスライドガラスを用いることになく観察位置を自由に変更可能で、高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な全反射試料照明装置を用いて、同一スライドガラス上で多数の細胞反応を高感度で高速に検出可能な顕微鏡細胞検査システムに関するものであり、パソコン（８０）からの指令によって、ステップモータ（５３、５４）を駆動してスライドガラス（２１）上の細胞試料（Ｓ）の観察位置を順に走査しながら、シャッター装置（７１）とシャッター装置（７２）の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路と落射蛍光顕微鏡の照明光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料（Ｓ）を照明し、落射蛍光顕微鏡が選択されたときには、フィルター装置（６６）を駆動して落射蛍光照明光源（６５）からの励起光の波長を選択するようにすることで、細胞試料（Ｓ）のＴＩＲＦ顕微鏡観察・検査と落射蛍光顕微鏡観察・検査とを交互に高速に切り換えて行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項２】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記放射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項３】
前記光路分割素子がダイクロイックミラーからなり、前記エバネッセント波発生用の光源から照明光の波長の光と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源とから照明光の波長の光とを、前記撮像素子側光路へ至ることを阻止し、細胞試料から生じた蛍光のみが前記撮像素子側光路へ至るようにしたことを特徴とする請求項１又は２記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項４】
前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間に励起波長を選択するフィルター装置が配置されており、前記制御装置からの指令により前記フィルター装置を透過する励起波長が選択されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項５】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項６】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介し前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムに関し、特に、全反射蛍光（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＩＲＦ）顕微鏡と落射蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡等の他の光学観察手法の顕微鏡とを組み合わせて同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出でき、創薬スクリーニング装置等への組み込みが可能な顕微鏡細胞観察・検査システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＩＲＦ顕微鏡法は、ナノスケールの局所励起を可能とする高ＳＮ比の観察手法である。細胞生物分野において細胞膜活性や単分子事象の観察（非特許文献１）に広く用いられる一方、電気化学分野でもコロイド粒子の電気的特性（非特許文献２）やブラウン運動（Ｋｉｈｍ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．ｉｎ  Ｆｌｕｉｄｓ，３７，ｐｐ．８１１−８２４，（２００４））の実験的解明に大きく貢献してきた。この手法の最大の特徴は、蛍光観察の際に、励起光源として、屈折率の異なる２物質界面での光の全反射に伴い発生するエバネッセント波を用いる点にある。図１３にそのエバネッセント波の発生の様子を示すが、屈折率ｎ１の物質１と屈折率ｎ２の物質２の界面に、屈折率の大きい物質２側から臨界角以上で光が入射するとその界面で光は全反射されるが、界面から屈折率の小さい物質１側に指数関数的に減衰するエバネッセント波が発生する。エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百ｎｍ程度の領域に僅かに染み出す光であるため、ＴＩＲＦ顕微鏡法においては、蛍光染色した試料とスライドガラスあるいはカバーガラス（以下、スライドガラスと称する。）の界面でエバネッセント波を発生させることで、試料の極一部に限定した高ＳＮ比の蛍光観察が可能となる。
現在、市販化されて一般に多く用いられているのは、主に図１４（ａ）に示すような対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡である。すなわち、倒立型にして対物レンズをスライドガラスの下方に油浸オイルを介して位置させ、その対物レンズを経てエバネッセント波発生用のレーザ光をスライドガラス下方から斜めに入射させ、スライドガラス上の試料が載置された界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、対物レンズ上方の空間が自由に扱えるため操作性と利便性に優れており、また、非常に明るい蛍光画像を得ることができる。しかし、高開口数油浸対物レンズを用いるという原理上の制約により、倍率が６０倍以上の高倍率観察に制限されてしまう。
一方、プリズムを介してレーザを入射する図１４（ｂ）に示すようなプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡も広く用いられている。この場合は、試料を２枚のスライドガラス間に挟み、上方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経てエバネッセント波発生用のレーザ光を上方のスライドガラスの上方に斜めに入射させ、そのスライドガラスの試料と接する界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、レーザ光を効率的に入射できることから高ＳＮ比の観察が可能であり、倍率の制約がないため低倍率観察も容易である。しかしながら、対物レンズ上方の空間が塞がれてしまい、試料の操作性や標本の自由度が著しく乏しい。
上述したように、現状では、例えば実験の過程で様々な試薬を混入して細胞が示す反応を複数の個体で同時に比較するといったニーズをＴＩＲＦ顕微鏡が満たしているとは言い難い。試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易でかつ低倍率観察を可能とするＴＩＲＦ顕微鏡システムの開発が期待されている。
過去の研究では、図１５（ａ）に示すように、入射プリズムとか放射プリズムをスライドガラス下面に接着して、入射プリズムからスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を放射プリズムを経て外へ出す方式が非特許文献３で提案され、また、図１５（ｂ）に示すように、スライドガラスの端を加工して傾斜端面としてこの傾斜端面からスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を傾斜端面に対向する端面から外へ出す方式が非特許文献４で提案されている。これらの方式は、標本上方の空間が自由であり低倍率観察も容易であるが、スライドガラス厚が制限されていて薄いため（前者は０．１７ｍｍ、後者は０．２ｍｍ）、多重全反射回数が多くなり、全反射による散乱光の発生、導波光の減衰、試料の蛍光退色が起きやすく、ＳＮ比が低下するという問題がある。さらに、レーザ光の入射位置と放射位置が固定されており、レーザ光の光路調整が難しく、また、試料観察位置の変更には、対物レンズの移動が必要であり、標本操作が容易でない。さらに、標本毎にプリズムをスライドガラスに接着したり、スライドガラスに加工を施す必要があることから、手間がかかり、汎用性も低い。
【非特許文献１】Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｄ．，Ｔｒａｆｆｉｃ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．７６４−７７４，（２００１）
【非特許文献２】Ｐｒｉｅｖｅ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｆｒｅｊ，Ｎ．Ａ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，６，ｐｐ．３９６−４０３，（１９９０）
【非特許文献３】Ｃｏｎｉｂｅａｒ，Ｐ．Ｂ．ａｎｄ  Ｂａｇｓｈａｗ，Ｃ．Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌ．２００，Ｐｔ  ３，ｐｐ．２１８−２２９，（２０００）
【非特許文献４】Ｔｅｒｕｅｌ，Ｍ．Ｎ．ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９５，ｐｐ．１９１０−１９１２，（２００２）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な全反射試料照明装置を用いて、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出可能な、複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを提供することである。
上記目的を達成する本発明の１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
本発明の別の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介し前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
これらの場合、前記光路分割素子がダイクロイックミラーからなり、前記エバネッセント波発生用の光源から照明光の波長の光と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源とから照明光の波長の光とを、前記撮像素子側光路へ至ることを阻止し、細胞試料から生じた蛍光のみが前記撮像素子側光路へ至るようにすることが望ましい。
また、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間に励起波長を選択するフィルター装置が配置されており、前記制御装置からの指令により前記フィルター装置を透過する励起波長が選択されることが望ましい。
本発明のもう１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
本発明のさらにもう１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出すること特徴とするものである。
本発明においては、全反射試料照明装置が、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な構成となっているので、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に落射蛍光顕微鏡法、共焦点蛍光顕微鏡法等の複数の観察手法を用いて観察・検査することができ、創薬スクリーニング等に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図である。
図２は図１の全反射試料照明装置の平面図である。
図３は本発明の１実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。
図４はプロテインキナーゼＣαと緑色蛍光タンパクとの融合タンパクを細胞に遺伝子導入して落射蛍光照明にて観察した所見を模式的に表した図である。
図５は図４の上の図と下の図に対応する落射蛍光顕微鏡像の変化の１実験例を示す図である。
図６は図４の上の図と下の図に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像の変化の１実験例を示す図である。
図７はＦｕｒａ２のカルシウム濃度と励起波長に対する蛍光特性を示す図である。
図８はＦｕｒａ２の２紫外励起波長による蛍光強度の変化を図３の落射蛍光顕微鏡を用いて、また、ＧＦＰの蛍光強度変化を図３のＴＩＲＦ顕微鏡を用いて測定した値の経時的変化を示す図である。
図９は図８に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像（ａ）と、励起波長３４０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｂ）と、励起波長３８０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｃ）の変化を示す図である。
図１０は本発明の他の実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。
図１１はニポウ方式の共焦点スキャナの構成を示す図である。
図１２はグルコーストランスポータの挙動を模式的に表した図である。
図１３はＴＩＲＦ顕微鏡法におけるエバネッセント波の発生の様子を示す図である。
図１４は市販の対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡とプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡におけるエバネッセント波発生原理を示す図である。
図１５は従来提案されているスライドガラス内で多重全反射させてエバネッセント波を発生させる方式を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に、本発明の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを実施例に基づいて説明する。その説明の前に、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムの最も重要な部分である全反射試料照明装置を実施例に基づいて説明する。図１は、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図であり、図２はその平面図である。この全反射試料照明装置は、試料載置台１を備えており、その中心に開口２が設けらており、開口２に面して試料載置台１には入射プリズム３が固定されている。また、開口２を挟んで入射プリズム３に面して放射プリズム４が入射プリズム３との間隔を調節可能に移動台５に取り付けられている。この移動台５は位置調節ネジ６により試料載置台１に対して入射プリズム３方向に移動調節可能に構成されている。そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とは、移動台５の位置に係わらずに同一高さで同一面になるように、入射プリズム３と放射プリズム４の形状と移動台５の移動機構が構成されている。
そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１との上に、細胞試料Ｓを支持するスライドガラス、この例ではスライドガラスチェンバー２０が透過面３３と透過面４１上に滴下した油浸オイル２５を介して自由に載せられる。
ここで、入射プリズム３は、反射鏡１２を介してレーザ１１からのエバネッセント波発生用のレーザ光１０を入射させるための透過面３１と、入射したレーザ光１０を反射する反射面３２と、反射面３２で反射されたレーザ光１０を射出する透過面３３とを有する反射プリズム形状のものであり、放射プリズム４は、スライドガラスチェンバー２０の底面のスライドガラス２１中を多重全反射により導波されたレーザ光１０をスライドガラス２１の外へ導く透過面４１と、透過面４１から入射したレーザ光１０を外へ放射する透過面４２とを有する透過プリズム形状のものである。
また、試料載置台１の上面には、Ｘ−Ｙステージ５０を介してスライドガラス把特機構５５が設けられており、この例では、パッド５６を介してスライドガラス把持機構５５がその挟む方向に働く弾性によりスライドガラスチェンバー２０を支持しており、Ｘ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向に平行なＸ方向に移動調節可能としており、また、Ｘ−Ｙステージ５０のＹ方向位置調節ネジ５２によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向と直角なＹ方向に移動調節可能としている。そして、Ｘ方向位置調節ネジ５１、Ｙ方向位置調節ネジ５２の回転はそれぞれステップモータ５３、５４によって所定量だけ制御されるようになっている。
このような構成であるので、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１の上に油浸オイル２５を介して載せるスライドガラスチェンバー２０あるいはスライドガラス２１を別の種類又は規格のものに交換しても、エバネッセント波発生用のレーザ光１０の入射位置は何ら調節する必要がない。したがって、その光源であるレーザ１１の位置も調節する必要がない。ただし、スライドガラス２１の厚みが異なることにより、スライドガラス２１の下面での反射位置が変化するので、位置調節ネジ６を調節して移動台５をＸ方向に移動させることで、放射プリズム４の位置を最適にして散乱光が発生しないようにすることができる。
そして、ステップモータ５３、５４を所定量回転させてそれぞれＸ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１とＹ方向位置調節ネジ５２を調節して、スライドガラス把持機構５５を入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とが形成するＸ−Ｙ平面内で任意に移動させてスライドガラスチェンバー２０の面内位置を任意に移動調節することにより、試料載置台１中心の開口２に面している顕微鏡対物レンズ６１の光軸に対して直交方向のスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節することができる。
以上の実施例に基づいて説明した本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置は、スライドガラス２１内でレーザ光１０を多重全反射させる点では、図１５（ａ）、（ｂ）で示した従来の多重全反射の方式のものと共通しているが、スライドガラス２１として通常の厚さ０．１７〜０．２ｍｍより厚いスライドガラスを用いることで、多重全反射の回数を最小限に抑えることができ、蛍光観察の際のＳＮ比の低下を防ぐことができる。上記実施例では、スライドガラス２１の試料Ｓが載っている上面での全反射回数は４回で、そのためエバネッセント波Ｅｖで照明される領域は、図２に示す飛び飛びの４か所となっている。
また、放射プリズム４の位置を最適に調節して多重全反射後にスライドガラス２１から出ていくレーザ光１０に基づく散乱光を発生しないようにすることができる。
そして、上からの試料の操作が容易で、他の光学観察手法との併用及び高ＳＮ比の低倍率観察が可能となる。標本容器には、上記実施例のような細胞培養用スライドガラスチェンバー２０も使用可能であり、スライドガラスに加工も一切不要であることから、汎用性も高い。
また、Ｘ−Ｙステージ５０の位置調節機構を介してスライドガラス２１上の観察位置を任意に自由に高速で変更可能であるので、スライドガラス２１の面内に位置する多くの細胞試料Ｓを高速で切り換えて観察することが可能となる。
なお、スライドガラス２１の厚みが変化する場合には、スライドガラス２１の上面での反射位置も変化する。結果として、顕微鏡対物レンズ６１の光軸からエバネッセント波Ｅｖで照明される領域が外れてしまことがある。そのため、スライドガラス２１の厚みを変化させた場合に観察を行うためには、エバネッセント波Ｅｖの照射位置のずれに合わせて、試料載置台試料載置台１、顕微鏡対物レンズ６１、反射鏡１２の何れかをＸ方向に移動調節させる必要がある。
さて、本発明は以上のような構成の全反射試料照明装置を用いて、スライドガラス２１上の同じ細胞試料Ｓに対して、ＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察あるいは共焦点蛍光顕微鏡観察を高速で切り換えて行うようにするものである。
図３は、その１実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。その構成を以下に説明する。
図１、図２の試料載置台１の中央に開口２が設けられており、その下に倒立型の顕微鏡対物レンズ６１が配置され、その顕微鏡対物レンズ６１の観察側光路中にはダイクロイックミラー６２が斜めに配置されている。そして、ダイクロイックミラー６２を透過した光路中に結像レンズ６３が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子６４が配置されている。
一方、斜めに配置されたダイクロイックミラー６２の入射側にはキセノンランプ等の落射蛍光照明光源６５が配置されている。そして、落射蛍光照明光源６５とダイクロイックミラー６２の間には、励起波長を選択するフィルター装置６６が配置されている。
さらに、図１、図２の全反射試料照明装置のエバネッセント波発生用のレーザ光１０を発生するレーザ１１と入射プリズム３の間の光路中にレーザ光１０を遮断・透過するシャッター装置７１が配置され、また、落射蛍光照明光源６５とダイクロイックミラー６２の間には、落射蛍光励起光を遮断・透過するシャッター装置７２が配置されている。
また、ダイクロイックミラー６２と結像レンズ６３の間には、不要な波長の蛍光等をブロックするバリアフィルター６７が配置されている。
そして、以上のシャッター装置７１、７２、フィルター装置６６、スライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節するステップモータ５３、５４（図２）はパソコン８０に接続されており、それらの切り換えあるいは位置制御がパソコン８０からの指令によって行われるようになっており、それらの動作に碁づいて撮像素子６４で撮像された細胞試料Ｓの蛍光像がパソコン８０に取り込まれ、所要の画像処理が行われるように構成されている。
図３の顕微鏡細胞観察・検査システムはこのような構成であるので、パソコン８０からの指令によって、ステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を順に走査しながら、シャッター装置７１とシャッター装置７２の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路と落射蛍光顕微鏡の照明光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料Ｓを照明し、落射蛍光顕微鏡が選択されたときには、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光の波長を選択するようにすることで、細胞試料ＳのＴＩＲＦ顕微鏡観察・検査と落射蛍光顕微鏡観察・検査とを交互に高速に切り換えて行うことができる。
しかも、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いている全反射試料照明装置は、特別なスライドガラスチェンバー２０あるはスライドガラス２１を用いなくても任意の汎用のものを用いることができ、かつ、光源のレーザ１１や顕微鏡の対物レンズ６１を移動させないで、スライドガラスチェンバー２０あるはスライドガラス２１上の観察・検査対象細胞試料Ｓを高速に任意の位置に変更できるので、例えばスライドガラス２１上の細胞試料Ｓに加える薬剤の濃度あるいは種類を位置毎に異なるように投与することで、同じ培養細胞に対する薬効等の作用を高速に検出することができる。
以下、図３の顕微鏡細胞観察・検査システムを用いた検出例を説明する。
図４は、多機能酵素の１つであるプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）と緑色蛍光タンパク（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）との融合タンパクを細胞に遺伝子導入して落射蛍光照明にて観察した所見を模式的に表した図である。ＰＫＣαは、図４（ａ）から（ｂ）に示すように、脱分極刺激により細胞質Ｃ内から細胞膜ＰＭへとその局在を移動させ、細胞膜ＰＭにて活性化される。図４（ｂ）の核Ｎを中心に放射方向へ向かう矢印がＰＫＣαの移動方向であり、また、図４の色の濃い部分はＰＫＣαの濃度が高い部分を示す。なお、図４（ａ）、（ｂ）において、上の図が平面図、下の図が側面図である。この局在の変化をＰＫＣ活性化の指標として、生きた細胞にてＧＦＰの空間的蛍光強度の変化として経時的にＰＫＣ活性をモニターすることが可能である。
上記現象は、図４（ａ）の上の図から（ｂ）の上の図への緑色蛍光の移動として、落射蛍光顕微鏡では２次元的に観察される。蛍光強度の変化としては、細胞質Ｃの緑色蛍光強度の減少と細胞膜ＰＭの緑色蛍光強度の増加という反対方向の変化として捉えられる。
これに対して、ＴＩＲＦ顕微鏡では、同じ現象を、図４（ａ）の下の図から（ｂ）の下の図への緑色蛍光の移動として、細胞の下方の細胞膜ＰＭ近傍（エバネエッセント場の生ずるガラス面より約１００ｎｍの範囲）のＧＦＰの指数関数的蛍光強度の増加として捉えることになり、ＳＮ比も格段に良くなる。
図５、図６はそれぞれ図４の上の図と下の図に対応する落射蛍光顕微鏡像とＴＩＲＦ顕微鏡像の変化を示しており、それぞれの図の（ａ）〜（ｃ）にわたって実際の細胞を用いて脱分極刺激のためのイオンＫ＋を入れたときの実験例を示す図である。図５、図６の右のグラフはそれぞれ関心領域（図の（ａ）の四角領域）における蛍光強度の変化を示しており、同じ現象を見ているが、異なる測定方法（落射蛍光顕微鏡検出、ＴＩＲＦ顕微鏡検出）により約１０倍の変化量の違いが生ずることが分かる。
ところで、カルシウム感受性色素Ｆｕｒａ２を用いたカルシウム濃度は、Ｆｕｒａ２が３４０ｎｍ、３８０ｎｍの２紫外波長で励起されときの蛍光波長である５１０ｎｍ付近の蛍光強度値の変化の比として測定される。図７にＦｕｒａ２のカルシウム濃度と励起波長に対する蛍光特性を示す。図中、Ｅｍは蛍光波長である。すなわち、脱分極刺激による細胞内のカルシウム濃度の上昇により、３８０ｎｍで励起された細胞内に負荷されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光波長は減少し、逆に３４０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光波長は増加する。したがって、細胞内カルシウム濃度の上昇に伴い、（３４０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光強度）／（３８０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光強度）の値は上昇する。
図８は、このＦｕｒａ２の２紫外励起波長による蛍光強度の変化を図３の落射蛍光顕微鏡を用いて、また、ＧＦＰの蛍光強度変化を図３のＴＩＲＦ顕微鏡を用いて１秒間隔で交互に測定した値の経時的変化を示してある。図８中、ＴＥＡは脱分極刺激のための薬剤（テトラエチルアンモニウム）の投与を示している。
すなわち、まず、図３において、パソコン８０からの指令によってステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの特定の観察位置を選び、次いで、シャッター装置７１を開き、シャッター装置７２は閉じて、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路を選び、その観察位置の細胞試料Ｓをスライドガラス２１中をレーザ光１０が多重全反射する間に発生するエバネッセント波Ｅｖで照明し、その蛍光像であるＰＫＣα−ＧＦＰ蛍光像を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に結像して撮像し、パソコン８０に取り込む。
次に、シャッター装置７１を閉じ、シャッター装置７２を開くと同時に、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光７５の波長を３４０ｎｍに選択し、顕微鏡対物レンズ６１を経てその励起光７５でその観察位置の細胞試料Ｓを落射照明し、その観察位置からの蛍光７６を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に撮像し、３４０ｎｍの励起光で励起された５１０ｎｍ蛍光波長の蛍光像をパソコン８０に取り込む。
次に、今度はシャッター装置７１を閉じま、シャッター装置７２を開いたまま、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光７５の波長を３８０ｎｍに選択し、顕微鏡対物レンズ６１を経てその励起光７５でその観察位置の細胞試料Ｓを落射照明し、その観察位置からの蛍光７６を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に撮像し、３８０ｎｍの励起光で励起された５１０ｎｍ蛍光波長の蛍光像をパソコン８０に取り込む。
この過程を特定の観察位置に対して繰り返すことにより、図８のような経時変化が得られる。
このように全く異なるパラメーター（多機能酵素とカルシウム濃度）の挙動を測定することにより、細胞の反応に対する感度と特異性を上昇させることが可能となる。なお、図８では、カルシウム濃度が上昇するとＰＫＣαの局在変化が生じているが、カルシウム濃度が上昇するからと言ってＰＫＣαの局在変化が生ずるとは限らず、上記現象は細胞の状態、投与する薬剤の濃度や種類に依存する。
図９は図８に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像（ａ）と、励起波長３４０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｂ）と、励起波長３８０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｃ）の変化を示しており、左が脱分極刺激する前（ｒｅｓｔｉｎｇ）、右が脱分極刺激したとき（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の蛍光像を示している。矩形枠内の変化が以上の説明と一致していることが分かる。
次に、図１０は、他の実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。その構成を以下に説明する。
図３の実施例と同様に、図１、図２の試料載置台１の中央に開口２が設けられており、その下に倒立型の顕微鏡対物レンズ６１が配置され、その顕微鏡対物レンズ６１の観察側光路中にはハーフミラー８１が斜めに配置されている。そして、ハーフミラー８１を透過した光路中に励起光カットフィルター８２とシャッター装置８５と結像レンズ６３が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子６４が配置されている。
一方、斜めに配置されたハーフミラー８１の反射側にはリレーレンズ８４を介してニポウ方式の共焦点スキャナ９０とそれを照明するレーザ１２０とが配置されており、共焦点スキャナ９０の出力側には結像レンズ１２９が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子１５１が配置されている。
また、顕微鏡対物レンズ６１はピエゾ素子８６により光軸方向位置が調節可能になっている。
さらに、図１、図２の全反射試料照明装置のエバネッセント波発生用のレーザ光１０を発生するレーザ１１と入射プリズム３の間の光路中にレーザ光１０を遮断・透過するシャッター装置７１が配置され、また、共焦点スキャナ９０とハーフミラー８１の間には、共焦点走査光を遮断・透過するシャッター装置８３が配置されている。
ここで、シャッター装置８３が開いているとき、レーザ１２０から発生した励起光としてのレーザ光は、ニポウ方式の共焦点スキャナ９０を通り、リレーレンズ８４を通って平行走査光となり、ハーフミラー８１で反射され、顕微鏡対物レンズ６１を介してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓ中の所定物体面上に集束される。レーザ光により励起され発光した細胞試料Ｓからの蛍光は、顕微鏡対物レンズ６１とハーフミラー８１とリレーレンズ８４を経由して共焦点スキャナ９０に戻ってきて、共焦点スキャナ９０中のダイクロイックミラー１２４で反射されて、結像レンズ１２９を経て撮像素子１５１上に細胞試料Ｓの所定物体面の蛍光像が得られる。
ニポウ方式の共焦点スキャナ９０は、例えば図１１に示すような構成である。図１１において、レーザ１２０からの励起光であるレーザ光１２１は、マイクロレンズディスク１２２に配置された各マイクロレンズ１２３により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１２４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクとも言う。）１２５に設けられた個々のピンホール１２６を通過し、リレーレンズ８４と顕微鏡対物レンズ６１を経て細胞試料Ｓの所定物体面に集光される。
細胞試料Ｓから発生した蛍光は再び顕微鏡対物レンズ６１とハーフミラー８１（図１０）とリレーレンズ８４を通り、ピンホールディスク１２５の個々のピンホール１２６上に集光される。個々のピンホール１２６を通過した蛍光はダイクロイックミラー１２４で反射され、結像レンズ１２９により、撮像装置のＣＣＤ等の撮像素子１５１上に蛍光画像を結像する。
ここで使用されるダイクロイックミラー１２４は、励起光１２１を透過し、細胞試料Ｓからの蛍光を反射するように設計されている。
マイクロレンズディスク１２２とピンホールディスク１２５は部材１２７で機械的に連結され、回転軸１２８の周りを一体で回転する。個々のマイクロレンズ１２３とピンホール１２６は、ピンホールディスク１２５上に形成された個々のピンホール１２６からの励起光が細胞試料Ｓの観察平面を走査するように配置されている。また、ピンホール１２６が並んでいる平面と、細胞試料Ｓの観察平面と、撮像装置の撮像素子１５１とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、撮像素子１５１上には細胞試料Ｓの光学的断面像、すなわち、共焦点画像が結像される。
そして、以上のシャッター装置７１、８３、８５、ニポウ方式の共焦点スキャナ９０、顕微鏡対物レンズ６１の細胞試料Ｓに対する物体面（観察平面）位置を調節するピエゾ素子８６、スライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節するステップモータ５３、５４（図２）はパソコン８０に接続されており、それらの切り換えあるいは位置制御がパソコン８０からの指令によって行われるようになっており、それらの動作に基づいて撮像素子６４、１５１で撮像された細胞試料Ｓの蛍光像がパソコン８０に取り込まれ、所要の画像処理が行われるように構成されている。
図１０の顕微鏡細胞観察・検査システムはこのような構成であるので、パソコン８０からの指令によって、ステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を順に走査しながら、シャッター装置７１及び８２とシャッター装置８３の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の観察光路と共焦点蛍光顕微鏡の観察光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料Ｓを照明し、共焦点蛍光顕微鏡が選択されたときには、ピエゾ素子８６を制御して顕微鏡対物レンズ６１の光軸方向の位置をビデオレートで調節して指定枚数だけ共焦点面を変えて各細胞断面内の蛍光像を撮像素子１５１で撮り、各断面の蛍光像をパソコン８０に取り込んで細胞試料Ｓの蛍光像を３次元構築する。
ＴＩＲＦ顕微鏡の観察光路を選んだ場合は、図３の場合と同様に、その観察位置の細胞試料Ｓをスライドガラス２１中をレーザ光１０が多重全反射する間に発生するエバネッセント波Ｅｖで照明し、その蛍光像を顕微鏡対物レンズ６１、ハーフミラー８１、励起光カットフィルター８２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に結像して撮像し、パソコン８０に取り込む。
このようにして、例えば共焦点蛍光顕微鏡で細胞内の各断面を撮像し、ＴＩＲＦ顕微鏡で細胞膜近傍を撮像することで、細胞内小器官や細胞質内と細胞膜間を移動するタンパク質集団の動きを蛍光タンパクを用いて捉えることができる。
なお、以上の実施例では、励起光源のレーザ１１、１２０として単波長のものを用い、蛍光波長も単波長を想定しているが、レーザーコンバインナーを用いて複数の励起波長を経時的にあるいは同時に重ね合わせ、また、各励起波長に対応する異なる波長の蛍光像を撮像するために、ＣＣＤカメラ（結像レンズ６３＋撮像素子６４、結像レンズ１２９＋撮像素子１５１）の前に蛍光分離装置を配置するか、カラーＣＣＤカメラを用いることにより、マルチカラーイメージが撮れるようにしてもよい。
以下に、図１０の顕微鏡細胞観察・検査システムを用いた検出例を説明する。ただし、複数の蛍光波長像を同時に撮像可能にしてある場合である。
図１２は、グルコーストランスポータの挙動を模式的に表した図である。体内の細胞への糖取り込み装置としてグルコーストランスポータ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）がある。筋肉や脂肪では、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ４（Ｇｌｕｔ４）が細胞に組み込まれており、図１２に示すように、細胞内小器官のゴルジー体からの顆粒により搬送される。インスリン刺激にて細胞内より細胞膜へと多数のＧｌｕｔ４が局在変化することにより、糖の取り込み速度が上昇する。このとき、図１２に示すように、Ｇｌｕｔ４と緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）との融合タンパクを遺伝子導入しておき、また、このＧｌｕｔ４を認識する認識抗体を予め赤色色素（ａｌｅｘａ５６８等）でラベルをしておき、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ認識抗体を細胞外に配置しておく。インスリン刺激にて細胞膜上へＧｌｕｔ４が出現すると、ＧＦＰの蛍光強度の上昇と共に、赤色色素でラベルした認識抗体がＧｌｕｔ４に結合し、確かに細胞膜上にＧｌｕｔ４が移動したということが、ＴＩＲＦ顕微鏡で確認できる。それと共に、再び細胞内に戻って行くＧｌｕｔ４の様子も共焦点蛍光顕微鏡で観察可能となる。Ｇｌｕｔ４の出て行く場所と戻っていく場所を比較することが可能である。その際、エバネッセント波の存在するＴＩＲＦ面でＧｌｕｔ４とその認識抗体との結合を確認、観察することができる。また、共焦点蛍光顕微鏡で細胞膜へ移動するＧｌｕｔ４と、細胞膜から戻ってくるＧｌｕｔ４の挙動を例えば共焦点面１〜１０等で観察する。このような蛍光像を連続的撮像するには、図１０の装置が有用となる。
なお、図３の装置と、図１０の装置を組み合わせて（例えば、図３の顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２の間にハーフミラー８１を配置することにより）、ＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようすることもできる。
以上の本発明の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを用いると、複数の細胞や生体高分子に関連したナノスケールの現象を低倍率で同時に観察・検査することが可能である。多数の細胞においてその細胞内小器官、細胞内タンパク輸送あるいは細胞内タンパクの局在変化等を同時あるいは略同時に観察・検査することにより、形態比較、タンパク輸送メカニズム解析や酵素活性の検出が容易に行えるため、細胞生物分野の研究や創薬スクリーニングに大きく貢献することができる。また、標本容器には市販されている細胞培養用のスライドガラスチェンバーを使用することができることから、汎用性は高い。また、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出できることにより、創薬スクリーニング装置として用いることができる。
【図１】
2007034796.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
2007034796.tif 000009
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月15日(2008.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項２】
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択されることを特徴とする請求項１記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項３】
前記光路分割素子がダイクロイックミラーからなり、前記エバネッセント波発生用の光源から照明光の波長の光と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源とから照明光の波長の光とを、前記撮像素子側光路へ至ることを阻止し、細胞試料から生じた蛍光のみが前記撮像素子側光路へ至るようにしたことを特徴とする請求項１又は２記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項４】
前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間に励起波長を選択するフィルター装置が配置されており、前記制御装置からの指令により前記フィルター装置を透過する励起波長が選択されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項５】
エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とする複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【請求項６】
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択されることを特徴とする請求項５記載の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムに関し、特に、全反射蛍光（Total Internal Reflection Fluorescence：ＴＩＲＦ）顕微鏡と落射蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡等の他の光学観察手法の顕微鏡とを組み合わせて同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出でき、創薬スクリーニング装置等への組み込みが可能な顕微鏡細胞観察・検査システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＩＲＦ顕微鏡法は、ナノスケールの局所励起を可能とする高ＳＮ比の観察手法である。細胞生物分野において細胞膜活性や単分子事象の観察（非特許文献１）に広く用いられる一方、電気化学分野でもコロイド粒子の電気的特性（非特許文献２）やブラウン運動（Kihm, K. D. et al., Exp. in Fluids, 37, pp.811-824, (2004)）の実験的解明に大きく貢献してきた。この手法の最大の特徴は、蛍光観察の際に、励起光源として、屈折率の異なる２物質界面での光の全反射に伴い発生するエバネッセント波を用いる点にある。図１３にそのエバネッセント波の発生の様子を示すが、屈折率ｎ1 の物質１と屈折率ｎ2 の物質２の界面に、屈折率の大きい物質２側から臨界角以上で光が入射するとその界面で光は全反射されるが、界面から屈折率の小さい物質１側に指数関数的に減衰するエバネッセント波が発生する。エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百ｎｍ程度の領域に僅かに染み出す光であるため、ＴＩＲＦ顕微鏡法においては、蛍光染色した試料とスライドガラスあるいはカバーガラス（以下、スライドガラスと称する。）の界面でエバネッセント波を発生させることで、試料の極一部に限定した高ＳＮ比の蛍光観察が可能となる。
【０００３】
現在、市販化されて一般に多く用いられているのは、主に図１４（ａ）に示すような対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡である。すなわち、倒立型にして対物レンズをスライドガラスの下方に油浸オイルを介して位置させ、その対物レンズを経てエバネッセント波発生用のレーザ光をスライドガラス下方から斜めに入射させ、スライドガラス上の試料が載置された界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、対物レンズ上方の空間が自由に扱えるため操作性と利便性に優れており、また、非常に明るい蛍光画像を得ることができる。しかし、高開口数油浸対物レンズを用いるという原理上の制約により、倍率が６０倍以上の高倍率観察に制限されてしまう。
【０００４】
一方、プリズムを介してレーザを入射する図１４（ｂ）に示すようなプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡も広く用いられている。この場合は、試料を２枚のスライドガラス間に挟み、上方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経てエバネッセント波発生用のレーザ光を上方のスライドガラスの上方に斜めに入射させ、そのスライドガラスの試料と接する界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、レーザ光を効率的に入射できることから高ＳＮ比の観察が可能であり、倍率の制約がないため低倍率観察も容易である。しかしながら、対物レンズ上方の空間が塞がれてしまい、試料の操作性や標本の自由度が著しく乏しい。
【０００５】
上述したように、現状では、例えば実験の過程で様々な試薬を混入して細胞が示す反応を複数の個体で同時に比較するといったニーズをＴＩＲＦ顕微鏡が満たしているとは言い難い。試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易でかつ低倍率観察を可能とするＴＩＲＦ顕微鏡システムの開発が期待されている。
【０００６】
過去の研究では、図１５（ａ）に示すように、入射プリズムと放射プリズムをスライドガラス下面に接着して、入射プリズムからスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を放射プリズムを経て外へ出す方式が非特許文献３で提案され、また、図１５（ｂ）に示すように、スライドガラスの端を加工して傾斜端面としてこの傾斜端面からスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を傾斜端面に対向する端面から外へ出す方式が非特許文献４で提案されている。これらの方式は、標本上方の空間が自由であり低倍率観察も容易であるが、スライドガラス厚が制限されていて薄いため（前者は０．１７ｍｍ、後者は０．２ｍｍ）、多重全反射回数が多くなり、全反射による散乱光の発生、導波光の減衰、試料の蛍光退色が起きやすく、ＳＮ比が低下するという問題がある。さらに、レーザ光の入射位置と放射位置が固定されており、レーザ光の光路調整が難しく、また、試料観察位置の変更には、対物レンズの移動が必要であり、標本操作が容易でない。さらに、標本毎にプリズムをスライドガラスに接着したり、スライドガラスに加工を施す必要があることから、手間がかかり、汎用性も低い。
【非特許文献１】Axelrod, D., Traffic, Vol.2, pp.764-774, (2001)
【非特許文献２】Prieve, D. C. and Frej, N. A., Langmuir, 6, pp.396-403, (1990)
【非特許文献３】Conibear, P. B. and Bagshaw, C. R., Journal of Microscopy, Vol. 200, Pt 3, pp.218-229, (2000)
【非特許文献４】Teruel, M. N. and Meyer, T., Science, Vol. 295, pp.1910-1912, (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な全反射試料照明装置を用いて、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出可能な、複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成する本発明の１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明の別の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には結像光学系と撮像素子が、他方の光路中には落射蛍光顕微鏡用の励起光源が配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間にそれぞれ照明光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源の照明光路とが選択的に開かれ、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とが前記撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と落射蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
【００１０】
これらの場合、前記光路分割素子がダイクロイックミラーからなり、前記エバネッセント波発生用の光源から照明光の波長の光と、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源とから照明光の波長の光とを、前記撮像素子側光路へ至ることを阻止し、細胞試料から生じた蛍光のみが前記撮像素子側光路へ至るようにすることが望ましい。
【００１１】
また、前記落射蛍光顕微鏡用の励起光源と前記光路分割素子との間に励起波長を選択するフィルター装置が配置されており、前記制御装置からの指令により前記フィルター装置を透過する励起波長が選択されることが望ましい。
【００１２】
本発明のもう１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記全反射試料照明装置の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記スライドガラスのレーザ光導入部に至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムは、エバネッセント波発生用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライドガラス内で多重全反射により導波させて前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する細胞試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置を備えており、
前記全反射試料照明装置は、前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムは前記光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持される前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節するスライドガラス位置調節機構を備えており、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるように前記全反射試料照明装置が構成され、
前記全反射試料照明装置の前記入射プリズムと前記放射プリズムの間の前記スライドガラスを見込む位置に、前記スライドガラスに対して垂直方向に顕微鏡対物レンズが配置され、
前記顕微鏡対物レンズの結像側には、光路分割素子を介して一方の光路中には、前記エバネッセント波発生用の光源からの照明光の波長の光を阻止するフィルターと第１の結像光学系と第１の撮像素子とが、他方の光路中には、共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナが配置されており、
前記共焦点スキャナの照明側には共焦点蛍光顕微鏡用の励起光源が、また、前記共焦点スキャナの出力側には第２の結像光学系と第２の撮像素子がそれぞれ配置されており、
前記エバネッセント波発生用の光源から前記入射プリズムに至る光路中と、前記共焦点スキャナと前記光路分割素子の間の光路中と、前記光路分割素子と前記第１の撮像素子の間の光路中とに、それぞれ照明光あるいは蛍光光を遮断・透過するシャッター装置が配置されており、
各々の前記シャッター装置の開閉による照明光路と撮像光路の切り換えと、前記スライドガラス位置調節機構によるスライドガラス位置調節と、前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置調節をする焦点調節機構とを制御する制御装置を備えており、
前記制御装置からの指令により前記スライドガラス位置調節機構を制御して前記スライドガラス上の細胞試料観察・検出位置が選択され、かつ、前記制御装置からの指令により前記シャッター装置各々の開閉が制御され、前記エバネッセント波発生用の光源の照明光路と前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路とが選択的に開かれ、前記共焦点蛍光顕微鏡用の共焦点スキャナの照明光路が開かれたときには、前記焦点調節機構を制御して前記顕微鏡対物レンズの光軸方向の位置を所定の複数位置に調節することにより、前記スライドガラス上の選択された細胞試料観察・検出位置の全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とがそれぞれ前記第１撮像素子、前記第２撮像素子を介して前記制御装置に取り込まれ、その全反射蛍光顕微鏡像と共焦点蛍光顕微鏡像とから細胞反応を検出することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明においては、全反射試料照明装置が、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な構成となっているので、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に落射蛍光顕微鏡法、共焦点蛍光顕微鏡法等の複数の観察手法を用いて観察・検査することができ、創薬スクリ−ニング等に資することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを実施例に基づいて説明する。その説明の前に、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムの最も重要な部分である全反射試料照明装置を実施例に基づいて説明する。図１は、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図であり、図２はその平面図である。この全反射試料照明装置は、試料載置台１を備えており、その中心に開口２が設けらており、開口２に面して試料載置台１には入射プリズム３が固定されている。また、開口２を挟んで入射プリズム３に面して放射プリズム４が入射プリズム３との間隔を調節可能に移動台５に取り付けられている。この移動台５は位置調節ネジ６により試料載置台１に対して入射プリズム３方向に移動調節可能に構成されている。そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とは、移動台５の位置に係わらずに同一高さで同一面になるように、入射プリズム３と放射プリズム４の形状と移動台５の移動機構が構成されている。
【００１６】
そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１との上に、細胞試料Ｓを支持するスライドガラス、この例ではスライドガラスチェンバー２０が透過面３３と透過面４１上に滴下した油浸オイル２５を介して自由に載せられる。
【００１７】
ここで、入射プリズム３は、反射鏡１２を介してレーザ１１からのエバネッセント波発生用のレーザ光１０を入射させるための透過面３１と、入射したレーザ光１０を反射する反射面３２と、反射面３２で反射されたレーザ光１０を射出する透過面３３とを有する反射プリズム形状のものであり、放射プリズム４は、スライドガラスチェンバー２０の底面のスライドガラス２１中を多重全反射により導波されたレーザ光１０をスライドガラス２１の外へ導く透過面４１と、透過面４１から入射したレーザ光１０を外へ放射する透過面４２とを有する透過プリズム形状のものである。
【００１８】
また、試料載置台１の上面には、Ｘ−Ｙステージ５０を介してスライドガラス把持機構５５が設けられており、この例では、パッド５６を介してスライドガラス把持機構５５がその挟む方向に働く弾性によりスライドガラスチェンバー２０を支持しており、Ｘ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向に平行なＸ方向に移動調節可能としており、また、Ｘ−Ｙステージ５０のＹ方向位置調節ネジ５２によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向と直角なＹ方向に移動調節可能としている。そして、Ｘ方向位置調節ネジ５１、Ｙ方向位置調節ネジ５２の回転はそれぞれステップモータ５３、５４によって所定量だけ制御されるようになっている。
【００１９】
このような構成であるので、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１の上に油浸オイル２５を介して載せるスライドガラスチェンバー２０あるいはスライドガラス２１を別の種類又は規格のものに交換しても、エバネッセント波発生用のレーザ光１０の入射位置は何ら調節する必要がない。したがって、その光源であるレーザ１１の位置も調節する必要がない。ただし、スライドガラス２１の厚みが異なることにより、スライドガラス２１の下面での反射位置が変化するので、位置調節ネジ６を調節して移動台５をＸ方向に移動させることで、放射プリズム４の位置を最適にして散乱光が発生しないようにすることができる。
【００２０】
そして、ステップモータ５３、５４を所定量回転させてそれぞれＸ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１とＹ方向位置調節ネジ５２を調節して、スライドガラス把持機構５５を入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とが形成するＸ−Ｙ平面内で任意に移動させてスライドガラスチェンバー２０の面内位置を任意に移動調節することにより、試料載置台１中心の開口２に面している顕微鏡対物レンズ６１の光軸に対して直交方向のスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節することができる。
【００２１】
以上の実施例に基づいて説明した本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置は、スライドガラス２１内でレーザ光１０を多重全反射させる点では、図１５（ａ）、（ｂ）で示した従来の多重全反射の方式のものと共通しているが、スライドガラス２１として通常の厚さ０．１７〜０．２ｍｍより厚いスライドガラスを用いることで、多重全反射の回数を最小限に抑えることができ、蛍光観察の際のＳＮ比の低下を防ぐことができる。上記実施例では、スライドガラス２１の試料Ｓが載っている上面での全反射回数は４回で、そのためエバネッセント波Ｅｖで照明される領域は、図２に示す飛び飛びの４か所となっている。
【００２２】
また、放射プリズム４の位置を最適に調節して多重全反射後にスライドガラス２１から出ていくレーザ光１０に基づく散乱光を発生しないようにすることができる。
【００２３】
そして、上からの試料の操作が容易で、他の光学観察手法との併用及び高ＳＮ比の低倍率観察が可能となる。標本容器には、上記実施例のような細胞培養用スライドガラスチェンバー２０も使用可能であり、スライドガラスに加工も一切不要であることから、汎用性も高い。
【００２４】
また、Ｘ−Ｙステージ５０の位置調節機構を介してスライドガラス２１上の観察位置を任意に自由に高速で変更可能であるので、スライドガラス２１の面内に位置する多くの細胞試料Ｓを高速で切り換えて観察することが可能となる。
【００２５】
なお、スライドガラス２１の厚みが変化する場合には、スライドガラス２１の上面での反射位置も変化する。結果として、顕微鏡対物レンズ６１の光軸からエバネッセント波Ｅｖで照明される領域が外れてしまことがある。そのため、スライドガラス２１の厚みを変化させた場合に観察を行うためには、エバネッセント波Ｅｖの照射位置のずれに合わせて、試料載置台試料載置台１、顕微鏡対物レンズ６１、反射鏡１２の何れかをＸ方向に移動調節させる必要がある。
【００２６】
さて、本発明は以上のような構成の全反射試料照明装置を用いて、スライドガラス２１上の同じ細胞試料Ｓに対して、ＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察あるいは共焦点蛍光顕微鏡観察を高速で切り換えて行うようにするものである。
【００２７】
図３は、その１実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。その構成を以下に説明する。
【００２８】
図１、図２の試料載置台１の中央に開口２が設けられており、その下に倒立型の顕微鏡対物レンズ６１が配置され、その顕微鏡対物レンズ６１の観察側光路中にはダイクロイックミラー６２が斜めに配置されている。そして、ダイクロイックミラー６２を透過した光路中に結像レンズ６３が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子６４が配置されている。
【００２９】
一方、斜めに配置されたダイクロイックミラー６２の入射側にはキセノンランプ等の落射蛍光照明光源６５が配置されている。そして、落射蛍光照明光源６５とダイクロイックミラー６２の間には、励起波長を選択するフィルター装置６６が配置されている。
【００３０】
さらに、図１、図２の全反射試料照明装置のエバネッセント波発生用のレーザ光１０を発生するレーザ１１と入射プリズム３の間の光路中にレーザ光１０を遮断・透過するシャッター装置７１が配置され、また、落射蛍光照明光源６５とダイクロイックミラー６２の間には、落射蛍光励起光を遮断・透過するシャッター装置７２が配置されている。
【００３１】
また、ダイクロイックミラー６２と結像レンズ６３の間には、不要な波長の蛍光等をブロックするバリアフィルター６７が配置されている。
【００３２】
そして、以上のシャッター装置７１、７２、フィルター装置６６、スライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節するステップモータ５３、５４（図２）はパソコン８０に接続されており、それらの切り換えあるいは位置制御がパソコン８０からの指令によって行われるようになっており、それらの動作に基づいて撮像素子６４で撮像された細胞試料Ｓの蛍光像がパソコン８０に取り込まれ、所要の画像処理が行われるように構成されている。
【００３３】
図３の顕微鏡細胞観察・検査システムはこのような構成であるので、パソコン８０からの指令によって、ステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を順に走査しながら、シャッター装置７１とシャッター装置７２の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路と落射蛍光顕微鏡の照明光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料Ｓを照明し、落射蛍光顕微鏡が選択されたときには、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光の波長を選択するようにすることで、細胞試料ＳのＴＩＲＦ顕微鏡観察・検査と落射蛍光顕微鏡観察・検査とを交互に高速に切り換えて行うことができる。
【００３４】
しかも、本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いている全反射試料照明装置は、特別なスライドガラスチェンバー２０あるはスライドガラス２１を用いなくても任意の汎用のものを用いることができ、かつ、光源のレーザ１１や顕微鏡の対物レンズ６１を移動させないで、スライドガラスチェンバー２０あるはスライドガラス２１上の観察・検査対象細胞試料Ｓを高速に任意の位置に変更できるので、例えばスライドガラス２１上の細胞試料Ｓに加える薬剤の濃度あるいは種類を位置毎に異なるように投与することで、同じ培養細胞に対する薬効等の作用を高速に検出することができる。
【００３５】
以下、図３の顕微鏡細胞観察・検査システムを用いた検出例を説明する。
【００３６】
図４は、多機能酵素の１つであるプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）と緑色蛍光タンパク（green fluorescent protein ：ＧＦＰ）との融合タンパクを細胞に遺伝子導入して落射蛍光照明にて観察した所見を模式的に表した図である。ＰＫＣαは、図４（ａ）から（ｂ）に示すように、脱分極刺激により細胞質Ｃ内から細胞膜ＰＭへとその局在を移動させ、細胞膜ＰＭにて活性化される。図４（ｂ）の核Ｎを中心に放射方向へ向かう矢印がＰＫＣαの移動方向であり、また、図４の色の濃い部分はＰＫＣαの濃度が高い部分を示す。なお、図４（ａ）、（ｂ）において、上の図が平面図、下の図が側面図である。この局在の変化をＰＫＣ活性化の指標として、生きた細胞にてＧＦＰの空間的蛍光強度の変化として経時的にＰＫＣ活性をモニターすることが可能である。
【００３７】
上記現象は、図４（ａ）の上の図から（ｂ）の上の図への緑色蛍光の移動として、落射蛍光顕微鏡では２次元的に観察される。蛍光強度の変化としては、細胞質Ｃの緑色蛍光強度の減少と細胞膜ＰＭの緑色蛍光強度の増加という反対方向の変化として捉えられる。
【００３８】
これに対して、ＴＩＲＦ顕微鏡では、同じ現象を、図４（ａ）の下の図から（ｂ）の下の図への緑色蛍光の移動として、細胞の下方の細胞膜ＰＭ近傍（エバネエッセント場の生ずるガラス面より約１００ｎｍの範囲）のＧＦＰの指数関数的蛍光強度の増加として捉えることになり、ＳＮ比も格段に良くなる。
【００３９】
図５、図６はそれぞれ図４の上の図と下の図に対応する落射蛍光顕微鏡像とＴＩＲＦ顕微鏡像の変化を示しており、それぞれの図の（ａ）〜（ｃ）にわたって実際の細胞を用いて脱分極刺激のためのイオンＫ+ を入れたときの実験例を示す図である。図５、図６の右のグラフはそれぞれ関心領域（図の（ａ）の四角領域）における蛍光強度の変化を示しており、同じ現象を見ているが、異なる測定方法（落射蛍光顕微鏡検出、ＴＩＲＦ顕微鏡検出）により約１０倍の変化量の違いが生ずることが分かる。
【００４０】
ところで、カルシウム感受性色素Ｆｕｒａ２を用いたカルシウム濃度は、Ｆｕｒａ２が３４０ｎｍ、３８０ｎｍの２紫外波長で励起されときの蛍光波長である５１０ｎｍ付近の蛍光強度値の変化の比として測定される。図７にＦｕｒａ２のカルシウム濃度と励起波長に対する蛍光特性を示す。図中、Ｅｍは蛍光波長である。すなわち、脱分極刺激による細胞内のカルシウム濃度の上昇により、３８０ｎｍで励起された細胞内に負荷されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光波長は減少し、逆に３４０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光波長は増加する。したがって、細胞内カルシウム濃度の上昇に伴い、（３４０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光強度）／（３８０ｎｍで励起されたＦｕｒａ２の５１０ｎｍ蛍光強度）の値は上昇する。
【００４１】
図８は、このＦｕｒａ２の２紫外励起波長による蛍光強度の変化を図３の落射蛍光顕微鏡を用いて、また、ＧＦＰの蛍光強度変化を図３のＴＩＲＦ顕微鏡を用いて１秒間隔で交互に測定した値の経時的変化を示してある。図８中、ＴＥＡは脱分極刺激のための薬剤（テトラエチルアンモニウム）の投与を示している。
【００４２】
すなわち、まず、図３において、パソコン８０からの指令によってステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの特定の観察位置を選び、次いで、シャッター装置７１を開き、シャッター装置７２は閉じて、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路を選び、その観察位置の細胞試料Ｓをスライドガラス２１中をレーザ光１０が多重全反射する間に発生するエバネッセント波Ｅｖで照明し、その蛍光像であるＰＫＣα−ＧＦＰ蛍光像を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に結像して撮像し、パソコン８０に取り込む。
【００４３】
次に、シャッター装置７１を閉じ、シャッター装置７２を開くと同時に、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光７５の波長を３４０ｎｍに選択し、顕微鏡対物レンズ６１を経てその励起光７５でその観察位置の細胞試料Ｓを落射照明し、その観察位置からの蛍光７６を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に撮像し、３４０ｎｍの励起光で励起された５１０ｎｍ蛍光波長の蛍光像をパソコン８０に取り込む。
【００４４】
次に、今度はシャッター装置７１を閉じま、シャッター装置７２を開いたまま、フィルター装置６６を駆動して落射蛍光照明光源６５からの励起光７５の波長を３８０ｎｍに選択し、顕微鏡対物レンズ６１を経てその励起光７５でその観察位置の細胞試料Ｓを落射照明し、その観察位置からの蛍光７６を顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に撮像し、３８０ｎｍの励起光で励起された５１０ｎｍ蛍光波長の蛍光像をパソコン８０に取り込む。
【００４５】
この過程を特定の観察位置に対して繰り返すことにより、図８のような経時変化が得られる。
【００４６】
このように全く異なるパラメーター（多機能酵素とカルシウム濃度）の挙動を測定することにより、細胞の反応に対する感度と特異性を上昇させることが可能となる。なお、図８では、カルシウム濃度が上昇するとＰＫＣαの局在変化が生じているが、カルシウム濃度が上昇するからと言ってＰＫＣαの局在変化が生ずるとは限らず、上記現象は細胞の状態、投与する薬剤の濃度や種類に依存する。
【００４７】
図９は図８に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像（ａ）と、励起波長３４０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｂ）と、励起波長３８０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｃ）の変化を示しており、左が脱分極刺激する前（ｒｅｓｔｉｎｇ）、右が脱分極刺激したとき（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の蛍光像を示している。矩形枠内の変化が以上の説明と一致していることが分かる。
【００４８】
次に、図１０は、他の実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。その構成を以下に説明する。
【００４９】
図３の実施例と同様に、図１、図２の試料載置台１の中央に開口２が設けられており、その下に倒立型の顕微鏡対物レンズ６１が配置され、その顕微鏡対物レンズ６１の観察側光路中にはハーフミラー８１が斜めに配置されている。そして、ハーフミラー８１を透過した光路中に励起光カットフィルター８２とシャッター装置８５と結像レンズ６３が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子６４が配置されている。
【００５０】
一方、斜めに配置されたハーフミラー８１の反射側にはリレーレンズ８４を介してニポウ方式の共焦点スキャナ９０とそれを照明するレーザ１２０とが配置されており、共焦点スキャナ９０の出力側には結像レンズ１２９が配置され、その結像面にＣＣＤ等の撮像素子１５１が配置されている。
【００５１】
また、顕微鏡対物レンズ６１はピエゾ素子８６により光軸方向位置が調節可能になっている。
【００５２】
さらに、図１、図２の全反射試料照明装置のエバネッセント波発生用のレーザ光１０を発生するレーザ１１と入射プリズム３の間の光路中にレーザ光１０を遮断・透過するシャッター装置７１が配置され、また、共焦点スキャナ９０とハーフミラー８１の間には、共焦点走査光を遮断・透過するシャッター装置８３が配置されている。
【００５３】
ここで、シャッター装置８３が開いているとき、レーザ１２０から発生した励起光としてのレーザ光は、ニポウ方式の共焦点スキャナ９０を通り、リレーレンズ８４を通って平行走査光となり、ハーフミラー８１で反射され、顕微鏡対物レンズ６１を介してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓ中の所定物体面上に集束される。レーザ光により励起され発光した細胞試料Ｓからの蛍光は、顕微鏡対物レンズ６１とハーフミラー８１とリレーレンズ８４を経由して共焦点スキャナ９０に戻ってきて、共焦点スキャナ９０中のダイクロイックミラー１２４で反射されて、結像レンズ１２９を経て撮像素子１５１上に細胞試料Ｓの所定物体面の蛍光像が得られる。
【００５４】
ニポウ方式の共焦点スキャナ９０は、例えば図１１に示すような構成である。図１１において、レーザ１２０からの励起光であるレーザ光１２１は、マイクロレンズディスク１２２に配置された各マイクロレンズ１２３により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１２４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクとも言う。）１２５に設けられた個々のピンホール１２６を通過し、リレーレンズ８４と顕微鏡対物レンズ６１を経て細胞試料Ｓの所定物体面に集光される。
【００５５】
細胞試料Ｓから発生した蛍光は再び顕微鏡対物レンズ６１とハーフミラー８１（図１０）とリレーレンズ８４を通り、ピンホールディスク１２５の個々のピンホール１２６上に集光される。個々のピンホール１２６を通過した蛍光はダイクロイックミラー１２４で反射され、結像レンズ１２９により、撮像装置のＣＣＤ等の撮像素子１５１上に蛍光画像を結像する。
【００５６】
ここで使用されるダイクロイックミラー１２４は、励起光１２１を透過し、細胞試料Ｓからの蛍光を反射するように設計されている。
【００５７】
マイクロレンズディスク１２２とピンホールディスク１２５は部材１２７で機械的に連結され、回転軸１２８の周りを一体で回転する。個々のマイクロレンズ１２３とピンホール１２６は、ピンホールディスク１２５上に形成された個々のピンホール１２６からの励起光が細胞試料Ｓの観察平面を走査するように配置されている。また、ピンホール１２６が並んでいる平面と、細胞試料Ｓの観察平面と、撮像装置の撮像素子１５１とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、撮像素子１５１上には細胞試料Ｓの光学的断面像、すなわち、共焦点画像が結像される。
【００５８】
そして、以上のシャッター装置７１、８３、８５、ニポウ方式の共焦点スキャナ９０、顕微鏡対物レンズ６１の細胞試料Ｓに対する物体面（観察平面）位置を調節するピエゾ素子８６、スライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を移動調節するステップモータ５３、５４（図２）はパソコン８０に接続されており、それらの切り換えあるいは位置制御がパソコン８０からの指令によって行われるようになっており、それらの動作に基づいて撮像素子６４、１５１で撮像された細胞試料Ｓの蛍光像がパソコン８０に取り込まれ、所要の画像処理が行われるように構成されている。
【００５９】
図１０の顕微鏡細胞観察・検査システムはこのような構成であるので、パソコン８０からの指令によって、ステップモータ５３、５４を駆動してスライドガラス２１上の細胞試料Ｓの観察位置を順に走査しながら、シャッター装置７１及び８２とシャッター装置８３の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の観察光路と共焦点蛍光顕微鏡の観察光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料Ｓを照明し、共焦点蛍光顕微鏡が選択されたときには、ピエゾ素子８６を制御して顕微鏡対物レンズ６１の光軸方向の位置をビデオレートで調節して指定枚数だけ共焦点面を変えて各細胞断面内の蛍光像を撮像素子１５１で撮り、各断面の蛍光像をパソコン８０に取り込んで細胞試料Ｓの蛍光像を３次元構築する。
【００６０】
ＴＩＲＦ顕微鏡の観察光路を選んだ場合は、図３の場合と同様に、その観察位置の細胞試料Ｓをスライドガラス２１中をレーザ光１０が多重全反射する間に発生するエバネッセント波Ｅｖで照明し、その蛍光像を顕微鏡対物レンズ６１、ハーフミラー８１、励起光カットフィルター８２を介して結像レンズ６３で撮像素子６４上に結像して撮像し、パソコン８０に取り込む。
【００６１】
このようにして、例えば共焦点蛍光顕微鏡で細胞内の各断面を撮像し、ＴＩＲＦ顕微鏡で細胞膜近傍を撮像することで、細胞内小器官や細胞質内と細胞膜間を移動するタンパク質集団の動きを蛍光タンパクを用いて捉えることができる。
【００６２】
なお、以上の実施例では、励起光源のレーザ１１、１２０として単波長のものを用い、蛍光波長も単波長を想定しているが、レーザーコンバインナーを用いて複数の励起波長を経時的にあるいは同時に重ね合わせ、また、各励起波長に対応する異なる波長の蛍光像を撮像するために、ＣＣＤカメラ（結像レンズ６３＋撮像素子６４、結像レンズ１２９＋撮像素子１５１）の前に蛍光分離装置を配置するか、カラーＣＣＤカメラを用いることにより、マルチカラーイメージが撮れるようにしてもよい。
【００６３】
以下に、図１０の顕微鏡細胞観察・検査システムを用いた検出例を説明する。ただし、複数の蛍光波長像を同時に撮像可能にしてある場合である。
【００６４】
図１２は、グルコーストランスポータの挙動を模式的に表した図である。体内の細胞への糖取り込み装置としてグルコーストランスポータ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）がある。筋肉や脂肪では、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ４（Ｇｌｕｔ４）が細胞に組み込まれており、図１２に示すように、細胞内小器官のゴルジー体からの顆粒により搬送される。インスリン刺激にて細胞内より細胞膜へと多数のＧｌｕｔ４が局在変化することにより、糖の取り込み速度が上昇する。このとき、図１２に示すように、Ｇｌｕｔ４と緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）との融合タンパクを遺伝子導入しておき、また、このＧｌｕｔ４を認識する認識抗体を予め赤色色素（ａｌｅｘａ５６８等）でラベルをしておき、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ認識抗体を細胞外に配置しておく。インスリン刺激にて細胞膜上へＧｌｕｔ４が出現すると、ＧＦＰの蛍光強度の上昇と共に、赤色色素でラベルした認識抗体がＧｌｕｔ４に結合し、確かに細胞膜上にＧｌｕｔ４が移動したということが、ＴＩＲＦ顕微鏡で確認できる。それと共に、再び細胞内に戻って行くＧｌｕｔ４の様子も共焦点蛍光顕微鏡で観察可能となる。Ｇｌｕｔ４の出て行く場所と戻っていく場所を比較することが可能である。その際、エバネッセント波の存在するＴＩＲＦ面でＧｌｕｔ４とその認識抗体との結合を確認、観察することができる。また、共焦点蛍光顕微鏡で細胞膜へ移動するＧｌｕｔ４と、細胞膜から戻ってくるＧｌｕｔ４の挙動を例えば共焦点面１〜１０等で観察する。このような蛍光像を連続的撮像するには、図１０の装置が有用となる。
【００６５】
なお、図３の装置と、図１０の装置を組み合わせて（例えば、図３の顕微鏡対物レンズ６１とダイクロイックミラー６２の間にハーフミラー８１を配置することにより）、ＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようすることもできる。
【００６６】
以上の本発明の複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システムを用いると、複数の細胞や生体高分子に関連したナノスケールの現象を低倍率で同時に観察・検査することが可能である。多数の細胞においてその細胞内小器官、細胞内タンパク輸送あるいは細胞内タンパクの局在変化等を同時あるいは略同時に観察・検査することにより、形態比較、タンパク輸送メカニズム解析や酵素活性の検出が容易に行えるため、細胞生物分野の研究や創薬スクリ−ニングに大きく貢献することができる。また、標本容器には市販されている細胞培養用のスライドガラスチェンバーを使用することができることから、汎用性は高い。また、同一スライドガラス上で数百以上の多数の細胞反応を高感度で高速に検出できることにより、創薬スクリーニング装置として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の顕微鏡細胞観察・検査システムで用いる全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図である。
【図２】図１の全反射試料照明装置の平面図である。
【図３】本発明の１実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。
【図４】プロテインキナーゼＣαと緑色蛍光タンパクとの融合タンパクを細胞に遺伝子導入して落射蛍光照明にて観察した所見を模式的に表した図である。
【図５】図４の上の図と下の図に対応する落射蛍光顕微鏡像の変化の１実験例を示す図である。
【図６】図４の上の図と下の図に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像の変化の１実験例を示す図である。
【図７】Ｆｕｒａ２のカルシウム濃度と励起波長に対する蛍光特性を示す図である。
【図８】Ｆｕｒａ２の２紫外励起波長による蛍光強度の変化を図３の落射蛍光顕微鏡を用いて、また、ＧＦＰの蛍光強度変化を図３のＴＩＲＦ顕微鏡を用いて測定した値の経時的変化を示す図である。
【図９】図８に対応するＴＩＲＦ顕微鏡像（ａ）と、励起波長３４０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｂ）と、励起波長３８０ｎｍでの落射蛍光顕微鏡像（ｃ）の変化を示す図である。
【図１０】本発明の他の実施例としてＴＩＲＦ顕微鏡観察と共焦点蛍光顕微鏡観察を併用できるようにした顕微鏡細胞観察・検査システムの構成を示す図である。
【図１１】ニポウ方式の共焦点スキャナの構成を示す図である。
【図１２】グルコーストランスポータの挙動を模式的に表した図である。
【図１３】ＴＩＲＦ顕微鏡法におけるエバネッセント波の発生の様子を示す図である。
【図１４】市販の対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡とプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡におけるエバネッセント波発生原理を示す図である。
【図１５】従来提案されているスライドガラス内で多重全反射させてエバネッセント波を発生させる方式を示す図である。
【符号の説明】
【００６８】
１…試料載置台
２…開口
３…入射プリズム
４…放射プリズム
５…移動台
６…位置調節ネジ
１０…エバネッセント波発生用のレーザ光
１１…レーザ
１２…反射鏡
２０…スライドガラスチェンバー
２１…スライドガラス
２５…油浸オイル
３１…入射プリズムの透過面
３２…入射プリズムの反射面
３３…入射プリズムの透過面
４１…放射プリズムの透過面
４２…放射プリズムの透過面
５０…Ｘ−Ｙステージ
５１…Ｘ方向位置調節ネジ
５２…Ｙ方向位置調節ネジ
５３、５４…ステップモータ
５５…スライドガラス把持機構
５６…パッド
６１…顕微鏡対物レンズ
６２…ダイクロイックミラー
６３…結像レンズ
６４…撮像素子
６５…落射蛍光照明光源
６６…フィルター装置
６７…バリアフィルター
７１、７２…シャッター装置
７５…落射蛍光照明光源からの励起光
７６…観察位置からの蛍光
８０…パソコン
８１…ハーフミラー
８２…励起光カットフィルター
８４…リレーレンズ
８３、８５…シャッター装置
８６…ピエゾ素子
９０…共焦点スキャナ
１２０…共焦点スキャナを照明するレーザ
１２１…レーザ光（励起光）
１２２…マイクロレンズディスク
１２３…マイクロレンズ
１２４…ダイクロイックミラー
１２５…ピンホールディスク（ニポウディスク）
１２６…ピンホール
１２７…部材
１２８…回転軸
１２９…結像レンズ
１５１…撮像素子
Ｓ…細胞試料
Ｅｖ…エバネッセント波
Ｃ…細胞質
ＰＭ…細胞膜
Ｎ…核
【国際調査報告】
2007034796.tif 000017
2007034796.tif 000018
2007034796.tif 000019
2007034796.tif 000020