(57)【要約】  本発明の目的は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる宿主細胞を提供することである。本発明によれば、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞。
【請求項２】
組み換え蛋白質産生用の宿主細胞として使用する、請求項１に記載の株化細胞。
【請求項３】
ネコ由来である、請求項１又は２に記載の株化細胞。
【請求項４】
外来の不死性獲得因子をコードする遺伝子を有する、請求項１から３の何れかに記載の株化細胞。
【請求項５】
外来の選択マーカー遺伝子を有する、請求項１から４の何れかに記載の株化細胞。
【請求項６】
無血清培地で増殖することができる、請求項１から５の何れかに記載の株化細胞。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４３を有する細胞である、請求項１から６の何れかに記載の株化細胞。
【請求項８】
発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を請求項１から７の何れかに記載の株化細胞に導入することにより得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項１から７の何れかに記載の株化細胞を用いて組み換え蛋白質を製造する方法。
【請求項１０】
請求項１から７の何れかに記載の株化細胞に外来遺伝子を導入して形質転換細胞を作成し、得られた形質転換細胞を培養して該外来遺伝子によりコードされる組み換え蛋白質を産生させ、産生した組換え蛋白質を回収することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
産生される組み換え蛋白質が糖鎖で修飾されている、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９から１１の何れかに記載の方法で産生される組み換え蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え蛋白質産生のための宿主細胞、及び該細胞の利用に関する。特に本発明は、哺乳動物から樹立された組み換え蛋白質産生のための宿主細胞、及び該細胞の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
機能が未知である遺伝子の機能解析においては、当該遺伝子によりコードされる組み換え蛋白質の入手が不可欠である。現在使用されている組み換え蛋白質の産生のための発現系としては、原核細胞系、真核細胞系、及び無細胞系のものが存在する。原核細胞系としては、大腸菌および関連細菌（例えば、E.coli, Pseudomonas 属細菌, Zymomonas 属細菌, Thermus 属細菌など）、枯草菌および関連細菌（例えば、放線菌, 乳酸菌, アミノ酸生産菌, 酢酸菌, 好熱性細菌など）を宿主とするものが挙げられる。また、真核細胞系としては、酵母、糸状菌、植物培養細胞、昆虫培養細胞（バキュロウイルスベクター）、及び動物培養細胞を宿主とするものが挙げられる。【０００３】
上記のうち、大腸菌・酵母等の微生物を用いた組換えタンパク質の大量生産系が確立され、その一部は医薬品としても使用されているが、真核細胞、特にヒトタンパク質は特有の糖鎖の付加やタンパク質合成後の複雑なプロセシングが活性に不可欠であることが知られており、微生物での機能タンパク質の生産が困難な場合がある。【０００４】
また、翻訳後修飾を受けないケースにおいても、大腸菌発現系でヒト遺伝子を発現させた場合、 codon usage・タンパク質高次構造の違いから封入体を形成することが多く、遺伝子は取得できてもその遺伝子産物（タンパク質）の取得までに膨大な時間を有することが、多くのケースでボトルネックとなっている。【０００５】
一方、昆虫細胞や動物培養細胞を用いて興味タンパク質の生産を行う場合、（１）生産量が少ない、（２）発現できる遺伝子が限られる、（３）コストが高い、などの問題を有するため、スクリーニングなどに供するためのタンパク質を入手するのに時間と労力を必要とする。【０００６】
また、動物細胞を用いて大規模タンパク質生産を行う際に、（１）一過性タンパク質発現の場合、短時間に目的のタンパク質を得ることができるが、一回のトランスフェクションで生産できるタンパク質の量は限られており、スケールアップが簡単ではなく、大量の細胞と導入試薬が必要である、（２）安定発現遺伝子導入株を作製することにより、長期に渡りタンパク質を高発現する細胞を得ることができるが、外来遺伝子の安定導入株の作製に長時間（数ヶ月）かかる、といった問題があった。【０００７】
一方、ネコの尿にはコーキシンと命名された分子量 60 kDaの糖タンパク質が約 1 mg/ml の高濃度で排泄される。コーキシンは遠位尿細管上皮細胞で作られ，アピカル膜から分泌されることが報告されている（非特許文献１）。【０００８】
【非特許文献１】Miyazaki, M., Kamiie, K., Soeta, S., Taira, H., and Yamashita, T.: Molecular cloning and characterization of a novel carboxylesterase-like protein that is physiologically present at high concentration in the urine of domestic cats (Felis catus) Biochem.J., 370, 101-110(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる宿主細胞を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ネコ由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
即ち、本発明によれば、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞が提供される。
好ましくは、本発明の株化細胞は、組み換え蛋白質産生用の宿主細胞として使用される。
好ましくは、本発明の株化細胞は、ネコ由来である。
好ましくは、本発明の株化細胞は、外来の不死性獲得因子をコードする遺伝子を有する。
好ましくは、本発明の株化細胞は、外来の選択マーカー遺伝子を有する。
好ましくは、本発明の株化細胞は、無血清培地で増殖することができる。
好ましくは、本発明の株化細胞は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４３を有する細胞である。【００１２】
本発明の別の側面によれば、発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を上記した本発明の株化細胞に導入することにより得られる形質転換体が提供される。【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の株化細胞を用いて組み換え蛋白質を製造する方法が提供される。
好ましくは、上記した本発明の株化細胞に外来遺伝子を導入して形質転換細胞を作成し、得られた形質転換細胞を培養して該外来遺伝子によりコードされる組み換え蛋白質を産生させ、産生した組換え蛋白質を回収することができる。
好ましくは、産生される組み換え蛋白質が糖鎖で修飾されている。【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法で産生される組み換え蛋白質が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細胞は、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞である。哺乳動物の例としては、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなどが挙げられるが、好ましくはネコである。【００１６】
本発明の細胞は、例えば、ネコの腎臓から採取することができる。ネコから摘出した腎臓をJoklik緩衝液(111 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 10 mM Na2HPO4, 5.4 mM KCl, 1 mM Mg2SO4, 11 mM グルコース)中で細断化し、細断した組織片をコラゲナーゼ消化液で処理し、ばらばらになった細胞から細胞塊を除き、遠心することにより細胞を回収する。次いで、細胞をイーグルMEM培地１（ニッスイ）に懸濁し、Percollの密度勾配遠心により、遠位尿細管細胞を分離し、回収することができる。細胞をイーグルMEM培地１で洗いPercollを除いた後、DME-F12培地に懸濁し、コラーゲンコートディッシュで培養する。【００１７】
上記のようにして単離した遠位尿細管由来細胞に、不死性獲得因子および選択マーカー遺伝子を導入することにより細胞を株化することができる。不死性獲得因子は、当該因子が細胞に導入されることにより、細胞が不死化される因子を意味し、例えば、Epstein-Barr virus (EBV)、Simian virus 40 (SV40) T antigen、SV40 large T antigen、adenovirus E1A、adenovirus E1B、human papillomavirus (HPV) E6、HPV E7、telomerase reverse transcriptase protein (hTERT）等の遺伝子を使用することができる。選択マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを使用することができ、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子などを使用することができる。不死性獲得因子をコードする遺伝子および選択マーカー遺伝子の導入は、通常のトランスフェクション法で行うことができる。トランスフェクション後に、培地を選択培地（例えば、薬剤耐性遺伝子を導入した場合には、当該薬剤を含有する培地）に交換し、選択マーカー遺伝子が安定に導入され、かつ安定に増殖できる細胞株を選択することにより、本発明の細胞株を樹立することができる。【００１８】
なお、本発明の細胞の一例である、以下の実施例で取得したＦＫＤ細胞（識別のための表示：ＦＫＤ）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６０５として、平成１７年（２００５年）７月２７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託され、平成１８年（２００６年）７月１９日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４３として、「特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約」の下の国際寄託に移管された。【００１９】
上記のようにして樹立された本発明の株化細胞は、動物細胞の通常の培養方法に従って培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、DMEM−F12培地などを用いることができる。または、これら培地に牛胎児血清等を添加した培地を用いることもできる。但し、本発明の細胞は、無血清培地でも増殖できるので、血清を添加する必要性はない。さらに、培地には、インシュリン、トランスフェリン、セリンなどを適宜添加してもよい。【００２０】
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％C02存在下等の条件下で行うことができる。また、培養中必要に応じて、ネオマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、collagen-coated dishの上で行ってもよい。【００２１】
目的とする組み換え蛋白質を本発明の細胞中で発現させるためには、まず、該組み換え蛋白質をコードする遺伝子を、適当な発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記遺伝子を挿入した発現ベクターを、本発明の細胞に導入する。【００２２】
発現ベクターとしては、本発明の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。【００２３】
発現ベクターとして、例えば、pCH110（PL社）、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社)、pcDNAI/AmP(invitrogen)、pREP4(invitrogen)、pCDNA3(invitrogen)、pCMVscript(stratagene)、pSG5(stratagene)、pZeoSV2(invitrogen)、pEF1/V5 HisA/B/C(invitrogen)、pEF-Bos-Myc、pREP4(invitrogen)、pBK-RSV(stratagene)等を例示することができる。【００２４】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００２５】
本発明の細胞への組換え発現ベクターの導入法としては、動物細胞にDNAを導入するための通常の方法を用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
また、組み換え蛋白質の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
本発明の細胞を用いて組み換え蛋白質を発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００２６】
発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を本発明の細胞に導入することにより得られる形質転換体を好適な培地で培養し、培養物中に目的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、目的蛋白質を製造することができる。かくして製造される蛋白質も本発明の範囲内である。【００２７】
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００２８】
形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、DMEM−F12培地などを用いることができる。または、これら培地に牛胎児血清等を添加した培地を用いることもできる。但し、本発明の細胞は、無血清培地でも増殖できるので、血清を添加する必要性はない。【００２９】
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％C02存在下等の条件下で1〜7日間行うことができる。また、培養中必要に応じて、ネオマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００３０】
本発明の形質転換体の培養物から、目的とする組み換え蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。【００３１】
例えば、組み換え蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００３２】
また、組み換え蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００３３】
組み換え蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００３４】
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ネコ尿細管細胞の単離
ネコ遠位尿細管由来上皮細胞は、組織培養の技術（第二版）日本組織培養学会編  朝倉書店  7-4腎細胞培養法（第141〜145頁）の方法に従って、以下の通り行った。ネコを麻酔し、無菌的に摘出した腎臓をJoklik緩衝液(111 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 10 mM Na2HPO4, 5.4 mM KCl, 1 mM Mg2SO4, 11 mM グルコース)中でメスで細断化した。100ml三角フラスコ中で、0.02％コラゲナーゼ消化液を細断した組織片1ｇに付き30ml加え、スターラーで30分撹拌した。上清液を捨て、新しい消化液を加え、さらに30分間反応させる。ばらばらになった細胞をガーゼろ過し細胞塊を除き、1000rpｍ×5分の遠心で細胞を回収した。細胞をイーグルMEM培地１（ニッスイ）に懸濁し、Percollの密度勾配遠心により、遠位尿細管細胞を分離し、回収した。細胞をイーグルMEM培地１で洗いPercollを除いた後、DME-F12培地にsuspendし、コラーゲンコートディッシュで培養した。【００３６】
実施例２：ＦＫＤ細胞の樹立
実施例１で単離した遠位尿細管由来細胞にpSV3-neo (ATCC37150)をLipofectamine-Plus（Invitrogen社）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、G418含メディウムに培地を交換し、安定変異導入株の選択を行った。得られたＦＫＤ細胞を図１に示す。増殖した細胞をパッセージし、液体窒素中で保存した。【００３７】
実施例３：ＦＫＤ細胞の継代培養（passage）
ＦＫＤ細胞をDMEM-F12（+supplement）培地、collagen-coated dishで37℃、5％CO2条件下で継代培養した。細胞が80〜90％コンフルエントのとき培地を取り除き、PBS/EDTAで洗浄し1mlのPBS/EDTAを加え37℃、5％CO2で5分間インキュベートした。続いて0.1％trypsin・PBS/EDTAで洗浄し同様にインキュベートした。その後、DMEM-F12（+supplement）培地で懸濁し、新しいcollagen-coated dishに希釈して培養した。Supplement(GIBCO ITS-X サプリメント)は、インシュリン、トランスフェリン、セリンを含んだものを使用した。【００３８】
実施例４：トランスフェクション実験（遺伝子導入効率，図２）
トランスフェクション効率の検討には、SV40プロモータにLacZを結合した発現ベクターpCH110（Pharmacia）を用いた。トランスフェクションは、Lipofectamine-Plus(Invitrogen)を用いて行った。細胞としては、ＦＫＤ細胞、COS細胞及びHeLa細胞を用いた。トランスフェクション24時間後、培地を除き1.5mlのPBSで1回リンスし、1.5mlのFixative solutionを加え10分間静置させることで細胞を固定した。細胞を1.5mlのPBSで2回リンスし、1.25mlのStaining solution(β-gal Staining Kit (Invitrogen))を加えてインキュベートした。3時間後、染色している細胞の割合から発現の効率を確認した。結果を図２に示す。本発明のＦＫＤ細胞は、COS細胞及びHeLa細胞より高い遺伝子導入効率を示した。【００３９】
実施例５：ＦＫＤ細胞、COS細胞の増殖曲線の作成（図３）
ＦＫＤ細胞について無血清培地・血清培地での細胞増殖および血清培地でのCOS細胞の細胞増殖を解析した。ＦＫＤ細胞はコンフルエントの6cm collagen-coated dish（4.0×106cell）を細胞数1：10（4.0×105 cell）になるように同dishにまいた。同様に血清培地の3.5cm dishにも1：10（1.6×105 cell）になるようにまいた。細胞はPBS/EDTA、0.1％trypsin・PBS/EDTA処理後、2mlの無血清培地で懸濁（血清培地の方は1mlの血清培地で懸濁）、回収して700rpm、10分間遠心した。その後上清を捨て、PBSとトリパンブルー溶液を加えよく攪拌し、懸濁液を血球計算盤にのせ1枚のdishにつき細胞数（生細胞、全細胞）を2回計測した。この際PBSとトリパンブルー溶液の量は観察する1区画（1mm×1mm）に細胞数約100個になるように計算して加えた。1日に2枚のdishの細胞数を計測して平均値を取り、これを24時間ごとに4日続けた。懸濁するPBS、トリパンブルー量は細胞が観察しやすいようにその日によって変えた。1区画の深さは0.1mmであるので、1区画の体積（0.1mm3）に104をかけて1ml中の細胞数を出し、これにPBSとトリパンブルー溶液量／1000（ml）をかけた値を懸濁した実際の細胞数とした。観察終了後、片対数グラフにプロットし増殖曲線を作製した。COS細胞についても3.5cm dishに1：10（1.6×105 cell）になるようにまき、4日間観察した。各細胞の増殖曲線の対数増殖期から細胞倍加時間（doubling time）を割り出した。【００４０】
結果を図３に示す。その結果、無血清培地のＦＫＤ、血清培地のＦＫＤ、血清培地のCOSの細胞倍加時間はそれぞれ、19.0、20.7、21.8時間であった。【００４１】
実施例６：マウスインターフェロンαのトランスフェクションと発現タンパク質の精製
直径10cmディシュ（collagen coated dish,IWAKI）でサブコンフルエント（約90％〜）まで培養したＦＫＤ細胞の培地を除き、12mlのDMEM-F12（+Supplement、ただしpenicillin/streptomycinは除いたもの）を加えてインキュベートした。それと同時進行で、マウスインターフェロン（以下IFNと省略）αの発現プラスミドでもあるpHGGS-Mu-IFNα1を12μg、それにOPTI-MEMを1.5ml加えたものをそれぞれ作製した。それらとは別にLipofectamine 2000（Invitrogen）を36μl、OPTI-MEMを1.5ml混ぜたものを作製した。5分間静置させ、DNA溶液にLipofectamine 2000溶液を加え20分間静置させた。20分後、インキュベートしていた細胞に加え攪拌し、8 時間後にDMEM-F12（+Supplement）10mlで培地の交換を行い、そのまま16時間インキュベートした。【００４２】
トランスフェクション終了24時間後培地を回収する作業を繰り返し、IFN精製のサンプルとして200mlの培地を回収した。回収した培地は、10mlサイズのシリンジにCPG（Controlled-Pore Glass）を詰めたCPGカラム（カラムサイズ10ml）に流し入れてカラムに吸着させた。この際流し入れる培地の流速は常に6〜10mlになるように注意した。200mlの培地を流し終わった後、100mlの1×PBSでカラム内を洗浄した。その後IFNを溶出するために、まずpH3.5の0.4M Glycine-HClを25ml流し入れ、次にpH2.0の0.4M Glycine-HClを25ml流し溶出した。マウスIFNαはpH2.0の溶液、IFNβはpH3.5の溶液で溶出される。本実験ではIFNαがＦＫＤ細胞内で合成されているはずなので、pH2.0の溶出画分にIFNαが溶出した。またIFNはガラスに吸着する性質があるので、溶出画分の容器はプラスチック製のものを使用した。【００４３】
溶出後、それぞれの25mlの溶出画分を1×PBSで透析した。その際1×PBSは2回交換した。透析後、AQUACIDE II（CALBIOCHEM）で濃縮し1×PBSで再び透析、Ultra-4
遠心式フィルターユニット（Amicon）で5000rpm、30min遠心して最終的にそれぞれの溶出画分を100μlまで濃縮した。【００４４】
それぞれの溶出画分20μlに対し5×SDS‐PAGEサンプル化バッファー（還元条件）を５μl加え、5分間boilしてサンプル化した。その後SDS‐PAGEを行った。その際、1５％ゲルの各レーンに25μl流し、15mAでサンプルが流れきるまで行った。泳動後のゲルと、blotting緩衝液に予め浸しておいた濾紙6枚とPVDFフィルターを下から濾紙3枚、PVDFフィルター、ゲル、濾紙3枚の順に重ね、1.5mA/cm2の定電流でトランスファーを1時間30分行った。トランスファー終了後Blocking緩衝液に浸しblocking処理を4℃で一晩行った。blocking処理後、一次抗体には抗マウスIFNαポリクローナル抗体（ウサギ）を500倍希釈して用い、フィルターをポリパック内で1時間、室温で反応させた。TBS-Tで洗浄（5分×5）したのち、二次抗体にはprotein A-HRP（2000倍希釈）を用い1時間室温で反応させた。TBS-Tで洗浄（5分×5）した、ECL plus（Amersham Biosciences）で反応させ、X線フィルムに感光させた。ウエスタンブロットによる解析の結果、糖鎖が付加したIFNαの位置にバンド（約２０ｋＤａ）が検出されたことから、糖鎖付加IFNαが分泌されたことが分かった。【００４５】
実施例７：IFNの生理活性測定（CPE (cytopathic effect) Assay，図４）
IFN発現ベクターをＦＫＤ細胞にトランスフェクションし、このトランスフェクションした培地をL細胞（Flow laboratories）に加え、ウィルス感染させる。その後細胞がウィルス感染によるCPEを起こさなければ培地中に活性を持つIFNが存在する、すなわち、活性型のIFNがＦＫＤ細胞外に分泌されているということがわかる。【００４６】
CPE assayを行うにあたり、L細胞にVSVを希釈して加え24時間後の細胞を観察した。その結果、100〜200倍希釈でCPEが十分に起こることが確認された。IFN発現ベクターをＦＫＤ細胞にトランスフェクションし、5日間培地を交換して回収した。その後3000rpmで5分間遠心し、上清を回収してサンプルとした。【００４７】
96 wellプレートに1:2になるようにL細胞をまいた。細胞が増殖したら、縦のレーンの一番上のwellに50μlのIFNを加え、10回攪拌した後下のwellに50μl移した。この操作を一番下のwellまで続け、3倍ずつ希釈されたIFNのレーンを作製した。上記のトランスフェクション後のサンプルについても同様の操作を行い、各レーンを作製した。【００４８】
6時間後各wellの培地を除き、0.5%NCS-MEMで200倍に希釈したVSVを各wellに100μlずつ加えた。このときVSVのcontrol wellも作製した。24時間培養後、このVSV control wellのL細胞がCPEを起こしていることが確認できたら、crystal violet dyeで染色して乾かし、青紫色に染色された生細胞の割合を観察した。各レーンのwellから細胞全体の50%が変性しているスポットを特定し、放出されているおよそのIFN量（unit/ml）を推定した。細胞外にIFNを放出することがCOS細胞では確認されているので、同様な操作をCOS細胞についても行い比較した。結果を図４に示す。ＦＫＤ細胞の50％CPEスポットはCOS細胞とほぼ同一であり、分泌量はCOS細胞と同等（10000U/ml）であると考えられた。【００４９】
実施例８：コーキシンのトランスフェクションとタンパク質の発現
コーキシン発現ベクターの作成は、pcDNA6.2/GW/D-TOPO（Invitrogen）を使用した。
インサートは、コーキシンのcDNA（なお、コーキシン遺伝子の塩基配列は、AB045377としてNCBIに登録されている）を鋳型として、
F-Primer：CACCATGAGTGGGATGTGGGTGCA  （配列番号１）
RV-Primer：TCAGGGGACAATGGTATTCA  （配列番号２）
でオープンリーディングフレーム全長をPCRで増幅し（PCRは、TOYOBOのKOD-Plusを利用）、ベクターの950ｎの位置に組み込んだ。【００５０】
Transfectionは、リポフェクション法を用いた。3cmdishでサブコンフルエント（約80％〜90％）まで培養したＦＫＤ細胞の培地を除き、1.5mlの5％FBS-DMEM-F12（−penicillin/streptomycin）を1.5ml加えてインキュベートした。それと同時進行で、CMV-cauxin（1μg/μl）を2μl、それにOPTI-MEMを250μl加えたものをそれぞれ作製した。それらとは別にLipofectamine 2000（Invitrogen）を6μl、OPTI-MEMを250μl混ぜたものを作製した。5分間静置させ、DNA溶液にLipofectamine 2000溶液を加え20分間静置させた。20分後、incubateしていた細胞に加え攪拌し、20 時間後にDMEM-F12及び5％FBS-DMEM-F12で培地の交換を行い、そのまま8時間インキュベートした。8時間後、培地（1.5ml）を回収し、それぞれのdishに1mlの可溶化バッファーを加えた。その後、5分間音波処理を行い、15000rpmで10分間遠心し上清を回収して細胞溶解液（900μl）とした。また、培地については3000rpm、5分の処理を行い、培地中に存在する死細胞を除いたものを作製した。【００５１】
実施例９：Glycopeptidase F（GPF）での処理（図５）
コーキシンC末ペプチド抗体で免疫沈降後、Glycosidase処理を行うサンプルに20μlのMQ水を加え攪拌し、そこから10μl別のチューブに移した。それに10μlのDenature buffer（＋2-ME）を100℃で3分間boilした。それに20μlのStabilized solution、52μlのMQ水を加えて攪拌し、続けて8μl（0.5mU/μl）のGPF(TAKARA)を加え攪拌し、37℃で20時間インキュベーションした。その後5×SDS‐PAGEサンプル化バッファー（還元条件）をそれぞれ25μl加え、5分間boilしてサンプル化した。その上清を回収し、SDS‐PAGEを行った。その際、10％ゲルの各レーンに10μl流し、15mAでサンプルが流れきるまで行った。泳動後、濾紙3枚、メンブレン、ゲル、濾紙3枚の順に重ね、1.5mA/cm2の定電流でトランスファーを1時間30分行った。トランスファー終了後Blocking緩衝液に浸しblocking処理を4℃で一晩行った。【００５２】
blocking処理後、一次抗体にはコーキシンC末ペプチド抗体（8000倍希釈）を用い、フィルターをポリパック内で1時間、室温で反応させた。TBS-Tで洗浄（5分×5）したのち、二次抗体にはprotein A-HRP（8000倍希釈）を用い、一次抗体と同様な処理をした。TBS-Tで洗浄（5分×5）した、ECL（Amersham Biosciences社より購入）で反応させ、X線フィルムに感光させた。結果を図５に示す。図５の結果から、本発明のＦＫＤ細胞で発現させたコーキシン蛋白質に糖鎖が付加されていることが確認された。【００５３】
実施例１０：ＦＫＤ細胞の浮遊培養
ＦＫＤ細胞を10cmディッシュ4枚にほぼコンフルエントになるまで培養した（培地：DMEM F-12 (10565-018, GIBCO ), 5％FCS)。培地を除去し、細胞を５ml PBS-EDTAで洗った後、1ml 0.1％trypsin/PBS-EDTAを加え、CO2インキュベータ内で４分間保温した。ディッシュから遊離した細胞をP1000のピペットマンで回収し、5mgのsoybean Trypsin Inhibitor (Wako 202-09221)を含む無血清培地 (OPTI PRO SFM, 12309-019, GIBCO) 10mlの入った50ml 遠心管に入れ、100gで4分間遠心した。上清を取り除き、細胞を10mlの無血清培地（上述のもの）に懸濁し、100gで4分間遠心した。上清を除いた後、10mlの無血清培地に再懸濁し、1ml Pluronic F-68 (11905-031, GIBCO)を含む 90mlの無血清培地が入ったスピナーフラスコ（Ｓ-フラスコ4500-250, TAITEC）に加え、CO2インキュベータ内（5％CO2, 37℃）においてスターラー回転数90rpmで培養を行った。浮遊培養開始後１日目から４日目までの細胞の様子を図６に示す。【００５４】
細胞数の測定は、培養液1mlを100g x 4min遠心して回収した細胞を、1ml PBS-EDTAで洗った後、1ml 0.1% trypsin/PBS-EDTAを加え室温で5minおき、細胞塊を分散させた後に血球測定板を用いて行った。浮遊培養開始後１日目から５日目までの細胞数の測定結果を図７に示す。図７に示す通り、浮遊培養開始後４〜５日目まで細胞の増殖が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の株化細胞は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる。従って、本発明の株化細胞は、組み換え蛋白質産生のための宿主細胞として有用である。特に、本発明の株化細胞を宿主細胞として用いることにより、低コストで、目的蛋白質を大量に、生理活性を有する形で製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、ＦＫＤ細胞を示す。
【図２】図２は、ＦＫＤ細胞、COS細胞、及びHeLa細胞における遺伝子導入効率を検討した結果を示す。各細胞にｌａｃＺを導入し、Ｘ−ｇａｌで染色したものを示す。細胞の密度は何れも同一である。
【図３】図３は、ＦＫＤ細胞及びCOS細胞の増殖を比較した結果を示す。菱形はＦＫＤ細胞（無血清）を示し、四角はＦＫＤ細胞（血清）を示し、三角はＣＯＳ細胞（血清）を示す。
【図４】図４は、ＦＫＤ細胞及びCOS細胞におけるMu IFN-α1の発現を検討した結果を示す。
【図５】図５は、糖蛋白質コーキシンの発現を検討した結果を示す。Cauxin遺伝子を発現させたFKD細胞抽出液にEndoF（糖鎖切断酵素）を添加した場合と添加しない場合について、抗Cauxin抗体によるウエスタンブロッティングを行った。なお、Endo F（Endoglycosidase F）は、N-グリコシド型糖鎖とタンパク質との結合部位（GlcNAc-Asn結合）を特異的に切断する。還元末端のGluNAcにフコースがα1-3結合している糖鎖以外は、糖鎖部分の構造にかかわりなく切断する。
【図６】図６は、ＦＫＤ細胞の浮遊培養の開始後１日目（ａ）、２日目（ｂ）、３日目（ｃ）及び４日目（ｄ）の細胞の様子を示す。
【図７】図７は、ＦＫＤ細胞の浮遊培養開始後１日目から５日目までの細胞数の測定結果を示す。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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