(57)【要約】  植物の耐虫性を制御する遺伝子であるGrh5を特定し、利用することを課題とする。ツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子Grh5を単離するためにGrh5の高精度マッピングを行い、染色体3上に座乗するGrh5遺伝子を特定した。本発明は、植物に耐虫性を付与する機能を有するGrh5遺伝子を提供する。本発明はまた、耐虫性植物品種への改良方法を提供する。本発明により改良される植物の好ましい例はイネである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）又は（g）のポリヌクレオチド：
（a）配列番号：1又は2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1又は2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（c）配列番号：1又は2に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（d）配列番号：1又は2に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（e）配列番号：3に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（g）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と少なくとも80％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
イネ属植物由来である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項3に記載のベクターにより形質転換された、形質転換植物体又はその一部。
【請求項５】
イネ属植物である、請求項4に記載の形質転換植物体又はその一部。
【請求項６】
請求項1に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、植物の耐虫性を高める方法。
【請求項７】
イネ属植物の耐虫性を高める方法である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1又は2に記載ののポリヌクレオチドを用いることにより改良された、耐虫性イネ品種。
【請求項９】
請求項8に記載の耐虫性イネ品種を利用することにより得られる、収穫物。
【請求項１０】
植物における請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドの全部又は一部の存在の有無を検出することを含む、植物の耐虫性を評価する方法。
【請求項１１】
植物における請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドの全部又は一部の存在の有無を検出することを含む、植物品種の判定方法。
【請求項１２】
下記の（e'）、（f'）又は（g'）のタンパク質：
（e'）配列番号：9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（f'）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するタンパク質；
（g'）配列番号:9に記載のアミノ酸配列と少なくとも80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の新規遺伝子に関する。より詳細には、イネ属植物から単離された耐虫性に関与する遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ツマグロヨコバイ（英名：Green Rice Leafhopper, GRH、学名：Nephotettix cincticeps UHLER）等の吸汁性昆虫は、イネの重要害虫であり、イネの収量に大きな影響を与える。ツマグロヨコバイ類（Nephotettix）はアジア及びアフリカに広く分布しており、日本では、ツマグロヨコバイ、九州・沖縄のタイワンツマグロヨコバイ及びクロスジツマグロヨコバイ、並びに沖縄のマラヤツマグロヨコバイの4種が発見されている。【０００３】
ツマグロヨコバイは、葉に群がって汁を吸う。吸汁は、多発すると虫の排泄物にすす病が発生して、葉が黒く汚れることがあるが、吸汁自体による実害は少ない。しかしながら、ツマグロヨコバイは、吸汁時にウイルスやマイコプラズマを媒介する。特に萎縮病（わい性症わい化病等と称されることもある。）のウイルスを媒介することによる被害が多大なものとなっている。萎縮病ウイルスに一旦感染すると防除する手段はないことから、萎縮病被害を防ぐためにはツマグロヨコバイを防除する必要がある。【０００４】
これまで、ツマグロヨコバイ抵抗性に関与する６つの遺伝子（Grh1〜6遺伝子）がイネ染色体上にマッピングされてきた。Grh1遺伝子は、染色体5の動原体領域の近くに位置づけられている（非特許文献1）。また、Grh2遺伝子及びGrh4遺伝子は、それぞれ染色体11及び3に座乗し、両遺伝子が存在すると強い殺虫活性を示すことが知られており（非特許文献2、3）、Grh2の遺伝子座からは2つの遺伝子（Grh2a遺伝子及びGrh2b遺伝子）が同定されている（特許文献1）。さらに、Grh3遺伝子は、染色体6の動原体領域に隣接して存在することが分かっており（非特許文献4）、Grh5遺伝子が染色体8の長腕上に位置づけられ（非特許文献5）、栽培品種SML 17由来のGrh6が染色体4の短腕上に位置づけられている（非特許文献6）。
【特許文献１】特願2005-334948号
【非特許文献１】Tamura K, Fukuta Y, Hirae M, Oya S, Ashikawa I, Yagi T (1999) Mapping of the Grh1 locus for green rice leafhopper resistance in rice using RFLP markers. Breed Sci 49:11-14
【非特許文献２】Fukuta Y, Tamura K, Hirae M, Oya S (1998) Genetic analysis of resistance to green rice leafhopper (Nephotettix cincticeps Uhler) in rice parental line, Norin-PL6, using RFLP markers. Breed Sci 48:243-249
【非特許文献３】Yazawa S, Yasui H, Yoshimura A, Iwata N (1998) RFLP mapping of genes for resistance to green rice leafhopper (Nephotettix cincticeps Uhler) in rice cultivar DV85 using near isogenic lines (In Japanese with English summary). Sci Bull Fac Agr Kyushu Univ 52:169-175
【非特許文献４】Saka N, Toyama T, Tuji T, Nakamae H, Izawa T (1997) Fine mapping of green ricehopper resistant gene Grh-3(t) and screening of Grh-3(t) among green ricehopper resistant and green leafhopper resistant cultivars in rice (In Japanese). Breed Sci 47(suppl 1):55
【非特許文献５】D. Fujita, K. Doi, A. Yoshimura and H. Yasui 2003. Mapping of a new resistance gene for green rice leafhopper introgressed from Oryza rufipogon Griff. into cultivated rice, Oryza sativa L. Rice Genetics Newsletter 20:79-80
【非特許文献６】Tamura K, Fukuta Y, Hirae M, Oya S, Ashikawa I, Yagi T (2004) RFLP mapping of a new resistance gene for green rice leafhopper in Kanto PL10. Rice Genet Newslett 21:62-64
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
安定な耐虫性品種を育成するためには、耐虫性機構の解明が不可欠である。【０００６】
本発明者らは、Grh5遺伝子を単離するためにGrh5遺伝子の高精度マッピングを行い、候補ゲノム領域からNBS-LRR（Nucleotide-Binding Site domain-Leucine-Rich Repeat）タイプの一の遺伝子を特定し、本発明を完成した。【０００７】
本発明は、Grh5遺伝子又はそのホモログ、すなわち下記の（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）及び（g）を提供する。
（a）配列番号：1又は2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1又は2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（c）配列番号：1又は2に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（d）配列番号：1又は2に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（e）配列番号：3に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド；
（g）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と少なくとも80％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド。ただし本発明の範囲からは、公知の配列を有するポリヌクレオチド及びタンパク質は除かれる。【０００８】
本発明は、イネ由来の、耐虫性に関与するGrh5遺伝子を提供する。Grh5遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：1に、Grh5遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：2に、そしてcDNAに対応したアミノ酸配列を配列番号：3に示す。【０００９】
本発明においては、配列番号：1の塩基配列に関しては、3つのエクソン部分（塩基位置1-1,057、2,950-3,578、及び7,151-9,076）からなる一部を用いることができる。【００１０】
本発明でいう「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、6M尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じ、本発明には、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4％ SDS、0.1×SSC又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を適用してもよい。それぞれの条件において、温度は約40℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば約50℃、さらに約65℃としてもよい。【００１１】
また、本発明で「1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列」というときの置換等されるヌクレオチドの個数は、その塩基配列からなるポリヌクレオチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度であるか、同一又は性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、所望の機能を消失しないであろう。また、本発明で「1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度であるか、同一又は性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、所望の機能を消失しないであろう。このような塩基配列又はアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手段には、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350、 1987）がある。【００１２】
本発明には、配列番号：1又は2に記載の塩基配列と高い同一性を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチドが含まれる。塩基配列に関し、高い同一性とは、少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の配列の同一性を指す。また、本発明には、配列番号：9に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチドが含まれる。アミノ酸配列に関し、高い同一性とは、少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の配列の同一性を指す。塩基配列又はアミノ酸配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873、 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF、 et al: J Mol Biol 215: 403、 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。【００１３】
本発明のポリヌクレオチドは、天然の植物組織材料から調製することができる。本発明のポリヌクレオチドを調製するためには、ハイブリダイゼーション技術（Southern EM: J Mol Biol 98: 503、 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki RK、 et al: Science 230: 1350、 1985、Saiki RK、 et al: Science 239: 487、 1988）を利用することができる。例えば、Grh5領域のゲノム塩基配列（配列番号：1）、Grh5 cDNAの塩基配列（配列番号：2）、又は、その一部をプローブとして、また、Grh5領域のゲノム塩基配列、Grh5 cDNAの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からGrh5遺伝子と高い同一性を有するポリヌクレオチドを単離することができる。【００１４】
本発明のポリヌクレオチドには、DNAおよびRNAが含まれ、DNAにはゲノムDNA、cDNA及び化学合成DNAが含まれる。DNAは、一本鎖及び二本鎖であり得る。ゲノムDNA及びcDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、Grh5遺伝子（本明細書において本発明を説明するとき、本発明のポリヌクレオチドのうちGrh5遺伝子（配列番号：1又は2）を例に説明することがあるが、特別な場合を除き、その説明はGrh5遺伝子のホモログにも当てはまる。）を有するイネ品種からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1又は2）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1又は2）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRを行って調製することも可能である。cDNAは、例えば、Grh5遺伝子を有するイネ品種から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAPなどのベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またPCRを行うことにより調製できる。【００１５】
本明細書において、植物の形質又は遺伝子の機能に関し、「耐虫性」というときは、特別な場合を除き、半翅目昆虫（吸汁性昆虫）に吸汁された際に殺虫活性を有することをいう。「耐虫性」には、ツマグロヨコバイ属（Nephotettix）の昆虫（例えば、タイワンツマグロヨコバイ、クロスジツマグロヨコバイ、マラヤツマグロヨコバイ）に吸汁された際の殺虫活性が含まれ、イネ萎縮病防除上好ましいと考えられる他の性質、例えばイネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性等を有しているか否かにかかわらず、少なくとも前記の殺虫活性を有している限り、本明細書でいう「耐虫性」がある場合に含まれる。【００１６】
また、「耐虫性」には、トビイロウンカ属（Nilaparvata）の昆虫（例えば、トビイロウンカ、トビイロウンカモドキ、ニセトビイロウンカ）に吸汁された際の殺虫活性が含まれる。トビイロウンカ（英名：Brown Planthopper, BPH、学名：Nilaparvate lugens STAL）は、イネの最も重要な害虫であり、その名が示すとおり、茶褐色をした小さな虫である。ウイルスを媒介することもあるが、多く発生すると、吸汁により、夏の終わりから秋にかけて水田の中に穴があいたように突然イネが枯れ、一般に坪枯れと呼ばれる被害をもたらす。トビイロウンカは、イネの株元付近で吸汁することが多く、坪枯れがおこるまで発生に気がつかないこともある。南アジアの品種を中心にトビイロウンカに対する抵抗性が見出されており、これまでに19個以上のトビイロウンカ抵抗性遺伝子が同定されている（Adv. Agron. 45: 223-274（1991)）ほか、いくつかの量的形質遺伝子座（QTL）が検出されてきた（Plant Breeding 124: 93-95 (2005)）。【００１７】
他の吸汁性の昆虫の例としては、セジロウンカ（Whitebacked planthopper (WBPH), Sogatella furcifera Horvath）及びそれと同じ属に属する昆虫、並びにヒメトビウンカ（Small brown planthopper (SBPH), Laodelphax striatellus (Homoptera:Delphacidae）及びそれと同じ属に属する昆虫がある。【００１８】
本明細書において、耐虫性を「付与（する）」というときは、特別な場合を除き、耐虫性のない植物に耐虫性を与えること、及び植物の耐虫性を高めることをいう。【００１９】
耐虫性の評価には、当業者に公知の手法、例えば、ツマグロヨコバイの幼虫の生存・死亡を調べる抗生作用検定（本明細書の実施例参照）、及び虫の寄主選好反応を利用した非選好性検定がある。前者の方法においては、幼虫死亡率以外に、幼虫死亡の有無、発育遅延、成虫死亡等、昆虫防除上好ましいと考えられる他の要素を判断に加えてもよい。【００２０】
ツマグロヨコバイの幼虫を用いる方法においては、幼虫死亡率（NM）で、耐虫性の程度を表すことができる。例えば、70%以上である場合を「抵抗性」とし、NM30%未満の場合を「感受性（S）」とすることができる。本明細書で「抵抗性」又は「感受性」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。なお、実験条件や環境条件により、10％程度の違いが生じることもある。幼虫死亡率が30％未満であっても、死亡した場合があるということは、その個体において抵抗性が発現していることを意味しうる。【００２１】
対象となるポリヌクレオチドが「耐虫性を付与する機能を有するポリヌクレオチド」であるか否かの判断を行う際に、試験ポリヌクレオチドを導入する宿主となる植物は、ツマグロヨコバイに対して感受性であることが好ましい。また、この判断をするに際しては、当業者であれば、周知の手法にしたがって、適当な数の実験を企画することができる。【００２２】
本発明はまた、本発明のGrh5遺伝子又はそのホモログ（以下、単に「本発明のGrh5遺伝子」という。）を含む組み換えベクター、そのようなベクターにより形質転換された形質転換植物体又はその一部を提供する。【００２３】
本発明のGrh5遺伝子を利用して形質転換植物体を作製する場合には、本発明のGrh5遺伝子を適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明者らにより単離された耐虫性遺伝子Grh5は、植物に耐虫性を付与する機能を有し、この遺伝子を耐虫性でない植物品種に導入し、発現させることによりそれらの品種の耐虫性を高めることが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わずに耐虫性が制御された品種が得られる点で有用である。【００２４】
本明細書で「植物体」というときは、特別な場合を除き、植物個体の意味で用いておりその子孫及びクローンを含む。また植物体に関して「その一部」というときは、特別な場合を除き、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。植物体又はその一部は、繁殖材料も含む。【００２５】
本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、植物細胞内で挿入物の機能を発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。【００２６】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。【００２７】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S、 et al: Plant Physiol 100: 1503、 1995）。【００２８】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg、 Eds） pp.66-74、 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki S、 et al: Plant Physiol 100: 1503、 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P、 et al: Biotechnology 9: 957、 1991）、及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y、 et al: Plant J 6: 271、 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。【００２９】
ゲノム内に本発明のGrh5遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に植物体を量産することも可能である。【００３０】
なお、本発明で「形質転換植物（体）」というときは、特別な場合を除き、本発明の方法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形質転換植物（体）（T0世代）のみならず、該形質転換植物より得られた後代（T1世代等）の植物（体）も、新たに付与された耐虫性が維持されている限り含む。【００３１】
本発明の形質転換の対象となる植物は、特に限定されないが、好ましくは被子植物であり、より好ましくは単子葉植物網に属する植物であり、さらに好ましくはツユクサ亜網に属する植物であり、最も好ましくはイネ科（Poaceae（Gramineae））に属する植物、例えばイネ（Oryza）、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、イヌムギ、ハトムギ、サトウキビ、トウモロコシ、モロコシ、アワ、キビ、ヒエいずれかの属に属する植物である。イネ科に属する植物のうちでは、好ましくはイネ属に属する植物であり、より好ましくはイネ（Oryza sativa L.）であり、さらに好ましくは、ツマグロヨコバイ感受性の品種、例えば日本晴、台中65号、トヨニシキ、晴々、あそみのり、星の光等が好ましい。【００３２】
日本の育成品種のほとんどはツマグロヨコバイ及びトビイロウンカに感受性なので、形質転換の対象となりうる。他の日本の育成品種の例としては、水稲・粳（うるち）である、あきたこまち、関東２０５号、キヌヒカリ、きらら３９７、コシヒカリ、ササニシキ、どんとこい、月の光、農林６号、農林８号、農林２２号、はえぬき、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、ほしのゆめ、ほのか２２４及びユメヒカリ；並びに水稲・糯（もち）である、朝紫、おどろきもち、近畿糯３９号、クスタカモチ、クレナイモチ、こがねもち、サイワイモチ、札系糯９６１２１、大系糯１０７６、台中糯７０号、たかやまもち、ヒデコモチ、マンゲツモチ、モチミノリ及びわたぼうし等がある。【００３３】
本発明はさらに、本発明のベクターを植物組織に導入し、形質転換体を得る工程；該形質転換体を再生し、形質転換植物体を得る工程；及び該形質転換植物体のうち耐虫性の高くなったものを選抜する工程を含む、植物を改良する方法を提供する。この本発明の改変方法は、イネ等の植物の育種（品種改良）に適用することができる。【００３４】
本発明はまた、本発明のGrh5遺伝子により改良された、耐虫性イネ品種、例えば、感受性イネ品種に由来し、本発明のGrh5遺伝子を用いて形質転換することを含む育成過程により、改良されたイネ品種を提供する。本発明はまた、そのような改良イネ品種の繁殖材料、及びそのような改良イネ品種を利用することにより得られる、収穫物も提供する。【００３５】
本発明により改良された耐虫性を有する植物は、植物病原性糸状菌、細菌への効果を有する可能性がある。【００３６】
本明細書でいう「繁殖材料」とは、特別な場合を除き、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されるもの（「種苗」ということもある。）をいい、例えば、種子、苗、細胞、カルス、幼芽がある。本明細書でいう「収穫物」とは、特別な場合を除き、通常の意味で用いており、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されないもの、例えば、植物がイネ属に属するものである場合、収穫物には、刈穂、もみ、玄米、精米された米が含まれる。【００３７】
本発明はまた、植物における本発明のGrh5遺伝子の全部又は一部の存在の有無を検出することを含む、植物の耐虫性を評価する方法、及び植物における本発明のGrh5遺伝子のポリヌクレオチドの全部又は一部の存在の有無を検出することを含む、植物の品種の判定方法を提供する。これらの方法における本発明のGrh5遺伝子の検出には、当業者にはよく知られたPCR法やDNAアレイを用いる方法を利用することができる。これらの検定には、本発明のGrh5遺伝子の塩基配列の一部を利用したオリゴヌクレオチドを利用することができる。このオリゴヌクレオチドは、本発明のGrh5遺伝子の塩基配列と、本発明のGrh5遺伝子を機能可能に有さない植物の本発明のGrh5遺伝子に対応するゲノム領域の塩基配列とを、コンピュータを用いて比較することにより、設計することができる。本発明はまた、本発明のGrh5遺伝子の塩基配列情報を利用した、植物の耐虫性評価又は植物品種の判定のためのオリゴヌクレオチドの、設計方法も提供する。【００３８】
本発明の方法による植物の耐虫性の評価及び植物品種の識別は、遺伝子レベルで行うものであり、植物をある程度生長させて表現型により判断する育成試験に比較して、極めて迅速であり、簡便である。【００３９】
本発明はまた、本発明のGrh5遺伝子又はそのホモログによってコードされる、下記の（e'）、（f'）又は（g'）のタンパク質を提供する。
（e'）配列番号：3に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（f'）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するタンパク質；
（g'）配列番号:3に記載のアミノ酸配列と少なくとも80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ植物に耐虫性を付与する機能を有するタンパク質。【００４０】
このようなタンパク質の調製及び機能の確認は、当業者であれば、本明細書の記載及び／又は周知の知見に基づいて、充分に行うことができる。【００４１】
従来、イネの品種改良は、(1)交雑による変異の創出、(2)放射線や化学物質による突然変異誘起などによって増大させた遺伝変異の中から、収量性や生物ストレス耐性などに関する有用変異を保有する系統を選抜する、等の方法により行われてきた。これらの方法には長期間を要し、各種形質の評価と選抜に多大な労力を要するなど問題点が多かった。さらに、変異の程度や方向性を制御できない点は従来の交雑育種の限界であった。しかしながら、本発明者らが単離したGrh5遺伝子を利用することにより，イネに耐虫性を付与することができ，イネ栽培における殺虫剤使用の低減をはかることができる。さらに、本発明の耐虫性遺伝子の利用により、イネの重要害虫であるツマグロヨコバイなどの吸汁性昆虫発生地域におけるイネ収量の安定化を実現することができる。本発明は、食糧の安定供給に貢献しうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図1は、T65/W1962//T65に由来するBC1F1世代におけるGRH幼虫死亡率の頻度を示したグラフである。W1962は高い幼虫死亡率を示し、T65は全く示さないが、BC1F1世代の24個体がGRH抵抗性であり、22個体が感受性であった。
【図２】図2は、染色体8の連鎖マップ上のGRH抵抗性を付与するqGRH-8遺伝子の位置を示す図である。T65/W1962//T65に由来するBC1F1世代を、ゲノム全体に広く分布する合計100のSSRマーカーを用いて解析した。GRH抵抗性を制御するsingle major QTL（LOD=35.1）が、表現型変異に対して貢献度95.2％で、染色体8上に特定された。
【図３】図3は、BC4F1の解析により推定されるBC4F1植物の遺伝子型を表した図である。BC4F1個体から選択された抵抗性植物を解析し、SSRマーカーを用いて染色体セグメントを確認した。白色部分はT65に由来する染色体セグメント、黒色部分はW1962に由来する染色体セグメントを表す。W1962由来の染色体セグメントが、染色体2、3、4、8及び9のそれぞれに1つずつの5つの領域中に確認できた（図3）。
【図４】図4は、BC4F2世代におけるGRH幼虫死亡率の頻度を示したグラフである。BC4F2世代の幼虫死亡率は、死亡率0-40％の29の個体と、死亡率60-100％の65の個体とに分離した。白色、斜線、黒色は、それぞれ順に、RM3754においてT65ホモ接合対立遺伝子、ヘテロ接合対立遺伝子、W1962ホモ接合対立遺伝子を有する個体を表す。
【図５】図5は、染色体8上のGrh5遺伝子の位置を示す連鎖マップである。
【図６】図6は、GRH抵抗性遺伝子に関する種々のNILにおけるGRHの幼虫死亡率の平均値を示したグラフである。異なるアルファベット（a, b, c）の付された平均値は、Tukey-Kramer testに従った5％レベルでの有意差があったことを示す。
【図７】図7は、W1962に由来するGrh5遺伝子の高精度連鎖マップと物理マップを示した図である。
【図８Ａ】図8Aは、Grh5遺伝子（ゲノムDNA）の塩基配列を示した図である。
【図８Ｂ】図8Bは、Grh5 cDNAの塩基配列及びGrh5遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示した図である。
【００４３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
［Grh5遺伝子のマッピング］
1. 方法：
1.1. 植物材料：
ツマグロヨコバイ感受性の栽培イネO. sativaである日本型品種台中65号(T65)と、抵抗性供与親としてアジアに分布する野生イネO. rufipogon（W1962）とを交雑したBC1F1世代についてツマグロヨコバイに対する抵抗性を評価し、QTL解析のために用いた。また、BC1F1個体を、T65を反復親として繰り返し戻し交雑してBC3F1世代を得た。145のBC3F1個体のうち、9の抵抗性個体を選抜し、さらにT65により戻し交雑した。抵抗性のBC4F1個体の自殖後代であるBC4F2世代をマッピングに用いた。【００４５】
1.2. ツマグロヨコバイ抵抗性評価：
1991年に、福岡県粕屋郡粕屋町で採集したツマグロヨコバイ個体群を供試した。同個体群は、25℃±1℃、16時間-8時間の明-暗条件で、ツマグロヨコバイ感受性である水稲品種日本晴を餌として、累代飼育した。抗生試験は、岸野・安藤の方法（Kishino K, Ando Y (1978) Insect resistance of the rice plant to green rice leafhopper Nephotettix cincticeps, UHLER. 1. Laboratory technique for testing the antibiosis (In Japanese with English abstract). Jap J Appl Ent Zool 22:169-177）を改変して用いた。幼苗の抗生試験においては、播種後約2週間目に、試験管内に1〜2齢幼虫を7〜10頭を放飼した。また、止め葉下の最上位展開葉に、1〜2齢幼虫を7〜10頭を放飼した。BC1F1世代（46個体）の幼苗、及び止め葉段階にあるBC3F1世代（145個体）及びBC4F1世代（94個体）の展開葉を供試した。幼虫放飼後、4日目における幼虫死亡率を求めて抵抗性の評価を行った。QTL解析はBC1F1世代における幼虫死亡率の結果に基づいて行った。【００４６】
1.3. SSRマーカーを用いたゲノタイピング：
46のBC1F1個体及び94のBC4F1個体の全DNAを、CTAB法（Murray and Thompson 1980）により個体植物の葉から抽出した。BC1F1個体及び94のBC4F1個体におけるSSR座の遺伝子型は、PCR System-9700（PerkinElmer, Massachusetts）を用いたPCRにより決定した。15μlのPCR反応溶液（50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl2, 200μM dNTP, 0.2 μM primer, 1 unit of Taq polymerase (Takara, Japan) 及び5-10 μg/ml of 鋳型ゲノムDNAを含む。）を、94℃で5分の最初の変性ステップに続いて、94℃30秒、55℃30秒及び72℃30秒を35サイクル繰り返した。PCR産物は、2.5％アガロースゲル、0.5xTBE、160V、1時間の電気泳動により分離した。ゲルは、エチジウムブロマイドで染色し、UV照射下で撮影した。【００４７】
1.4. 連鎖マップの構築及びQTL解析：
BC1F1世代の遺伝マップを、12のイネ染色体に配座する合計100のSSRマーカーを用いて構築した。得られたマップは、1,504cMに渡り、マーカー間の平均間隔は15.1cMであった。遺伝子座の連鎖及びマップ距離は、Mapmaker/Exp 3.0（Lander et al.1987）を用いて決定した。BC1F1世代の幼虫死亡率及びゲノタイプデータをQTL解析に用いた。WindowsTM QTL Cartographer V2.0（Wang et al. 2004）を用いて、Simple interval マッピングを行った。1,000 permutation testを実施することにより、QTL検出のためのLODスコアのcritical thereshold値を計算したところ、有意レベル0.05で、LOD=20.4であった。【００４８】
1.5. GRH抵抗性遺伝子のマッピング：
BC4F2世代をGRH抵抗性遺伝子及びSSRマーカーの連鎖解析に用いた。BC4F2個体のGRH抵抗性の遺伝子型は、BC4F2の表現型とSSRマーカーの遺伝子型から決定した。確認されていないBC4F2個体におけるGRH抵抗性の遺伝子型は、F3後代テストによって確認した。さらに詳細な連鎖解析は、染色体8上の、RM1615、RM502、RM3754、RM3761、RM6845、RM3155、RM4154を含むSSRマーカーを用いて行った。【００４９】
1.6. GRH抵抗性遺伝子についてのNIL間の幼虫死亡率の比較：
Grh5-NILを含む5つのNILについて、幼苗段階のT65を感受性コントロールとしてGRH抵抗性を評価した。GRH抵抗性遺伝子Grh1遺伝子のNIL（BC3F4）は、GRH抵抗性遺伝子を一切もたない感受性T65と抵抗性のインディカ品種IR24との交雑により得た。Grh2遺伝子及び／又はGrh4遺伝子のNIL（BC6F5）は、感受性のT65と、Grh2遺伝子とGrh4遺伝子の双方を有する高抵抗性のインディカ品種DV85との交雑により、T65による連続戻し交雑とマーカー選抜(MAS)により得た。Grh5-NILは、MASによりBC4F4後代から選択した。GRH抵抗性に関するこれらのNILは、幼苗段階でGRHを放飼され、それらの葉の抵抗性を放飼後4日の幼虫死亡率を算出することにより比較した。この実験は少なくとも3回繰り返し、Tukey-Kramer testを用いて統計的に解析した。【００５０】
2. 結果：
2.1. GRH抵抗性に関するQTLの検出：
BC1F1世代を用いたQTL解析の実施により、W1962中のGRHに対する抵抗性の遺伝的なベースが明らかになった。W1962は高い幼虫死亡率（95.8％）を示したが、T65は全く示さなかった（幼虫死亡率0％）。BC1F1世代の24個体がGRH抵抗性であり、22個体が感受性であった（図1）。この分離比は、単一優性遺伝子モデル (χ2=0.09）について期待される1:1の比とよく一致した。【００５１】
BC1F1世代は、ゲノム全体に広く分布する合計100のSSRマーカーを用いて解析した。GRH抵抗性を制御するsingle major QTL（LOD=35.1）が、表現型変異に対して貢献度95.2％で、染色体8に特定された（表1及び図2）。【００５２】
【表１】
2007116958.tif 000002
【００５３】
このQTL、qGRH-8遺伝子は、染色体8の長腕上のRM502-RM3155に挟まれた7.0cMの間隔中に存在した。qGRH-8遺伝子の位置におけるW1962の対立遺伝子は、GRHの幼虫死亡率を向上させる効果を示した。他の有意なQTLは検出されなかった。【００５４】
2.2. GRH抵抗性遺伝子のマッピング：
戻し交雑とMASによりqGRH-8遺伝子をもつ近似同質世代を得た。GRHに対して抵抗性を示す合計145のBC3F1植物個体をT65で戻し交雑した。BC4F1個体から選択された抵抗性植物を解析し、437のSSRマーカーを用いて染色体セグメントを確認した。W1962に由来する染色体セグメントが、qGRH-8遺伝子を含めて、染色体2、3、4、8及び9のそれぞれに1つずつの5つの領域中に確認できた（図3）。SSRマーカー位置に基づく染色体セグメントの遺伝的距離を計算する際、W1962から移入された染色体セグメントのトータルサイズは約49.7cMであった。BC4F1植物を自家受粉しGRH抵抗性遺伝子マッピングのために解析した。BC4F2世代の幼虫死亡率は、死亡率0-40％の29の個体と、死亡率60-100％の65の個体とに分離した（図4）。この分離比は、3:1の比によく一致し、BC4F2世代において、GRH抵抗性を制御する単一優性遺伝子が存在することを示した。【００５５】
BC4F2世代は、染色体8のqGRH-8遺伝子領域付近のSSRマーカーを用い、GRH抵抗性についてさらに解析した。GRH抵抗性は、染色体8上のSSRマーカー位置、RM3754及びRM3761と完全に共分離（co-segregate）した。図4に示したように、RM3754においてT65ホモ接合対立遺伝子を有する29個体（白色）は低い幼虫死亡率（0-40％）を表し、RM3754においてW1962ホモ接合対立遺伝子（黒色）又はヘテロ接合（斜線）は高い幼虫死亡率（60-100％）を表した。【００５６】
確認されていないBC4F2個体におけるGrh5遺伝子の遺伝子型を、BC4F3後代の表現型を評価することによって確認した。F3テストにより、抵抗性を示すBC4F2個体におけるGrh5遺伝子位置のW1962ホモ接合対立遺伝子からヘテロ接合対立遺伝子を識別した。Grh5遺伝子、RM1615及びRM6845遺伝子型を用いて連鎖解析を行った（表2）。【００５７】
【表２】
2007116958.tif 000003
【００５８】
その結果、Grh5遺伝子は、SSRマーカーRM1615及びRM6845と連鎖していることが分かった。合計10個体が、RM1615からRM6845の間隔における組換え体であると認められ、そのうちの1個体が2箇所で組換えが生じた個体であった。7個体がRM1615からGrh5遺伝子の間隔における組換え体であり、4個体がGrh5遺伝子からRM6845の間隔における組換え体であると認められた。RM1615からRM6845の間、RM1615からGrh5遺伝子の間、及びGrh5遺伝子からRM6845の間の遺伝的距離は、順に、4.9cM、3.8cM、及び2.2cMであった。抵抗性遺伝子 Grh5遺伝子は、RM1615及びRM6845の間に位置し、SSRマーカー位置 RM3754及びRM3761と共分離（co-segregate）した（図5）。【００５９】
2.3. GRH抵抗性遺伝子についてのNIL間の幼虫死亡率の比較：
Grh5/ Grh5-NILをMASによりBC4F4世代から選択した。BC4F4世代中のgrh5/grh5を有する個体は、幼虫放飼後5日以上植物が維持されるかどうかで中度抵抗性植物（放飼後4日では感受性を示すが、放飼後5日では中度抵抗性（幼虫死亡率30-70%）の表現型へ変化したものを中度抵抗性植物とした。）と感受性植物とに分かれた（データは示さず）。この結果から、W1962は放飼後4日以内に高い抵抗性を示すので、O. rufipogon（W1962）は、Grh5以外に弱い効果をもつ別の抵抗性遺伝子を有することが示唆された。【００６０】
W1962から導入された染色体セグメントは、選択されたBC4F1植物中の染色体2、3、4、8及び9に確認された（図3）。SSRマーカーを用いて、染色体2、3、4及び9上に維持されているセグメントについてBC4F4世代中のgrh5/grh5を有する個体を解析した。マイナー抵抗性遺伝子が、染色体4上のSSRマーカーと共分離した。この結果から、中度抵抗性植物は、grh5/grh5という遺伝的背景において、染色体4上にマイナー遺伝子を有することが示唆された。染色体4上には、LODスコアが1を超えるQTLは検出されなかったが、その位置はBC1F1世代におけるピークLOD値を示した。grh5/grh5の遺伝的背景において、マイナー遺伝子を有する植物はT65より高い幼虫死亡率（55.7％）である中度抵抗性を示した。しかしながら、Grh5/ Grh5の遺伝的背景においては、マイナー抵抗性遺伝子の効果はメジャー抵抗性遺伝子であるGrh5遺伝子によってすっかりマスクされ、マイナー抵抗性遺伝子の位置における異なる遺伝子型間で、表現型の違いは見られなかった。【００６１】
マイナー抵抗性遺伝子を除いたGrh5-NILをMASを用いてBC4F4世代から選択した。Grh5-NILと他のGRH抵抗性遺伝子のNILとを比較するため、入手可能なすべてのGRH遺伝子のNILについて抗生試験により評価した。各NILの平均幼虫死亡率を図6に示した。Grh2/Grh2; Grh4/Grh4についてのNILの幼虫死亡率が最も高く、100％であった。次いで、Grh5/Grh5-NIL（幼虫死亡率86.9％）、Grh1/Grh1-NIL（幼虫死亡率82.2％）の幼虫死亡率が高く、これらは高度抵抗性に分類された。Grh2/Grh2-NILはそれよりやや低い抵抗性を示し（幼虫死亡率74.6％）、Grh4/Grh4-NILは、T65（幼虫死亡率6.9％）とほぼ同等の極めて低い抵抗性（幼虫死亡率3.9％）を示した（図6）。
【実施例２】
【００６２】
［高精度連鎖マップを利用したGrh5遺伝子の単離］
方法：
Grh5遺伝子分離集団3,185個体を用いて、高精度連鎖地図を作成した。材料としてツマグロヨコバイ抵抗性の野生イネO. rufipogon(W1962)と感受性供与親である日本型品種台中65号(T65)を花粉親として得られたF1に、台中65号を4回戻し交雑し、抵抗性個体を選抜した。BC4F2世代にGrh5領域がヘテロ型である個体を選抜し、その自殖後代であるBC4F3世代約3,185個体をマッピングに用いた。【００６３】
結果：
Grh5遺伝子の高精度連鎖地図を作成した結果、Grh5遺伝子の候補領域は、日本晴ゲノム塩基配列上で約23.4kの領域に特定された（図7）。【００６４】
この候補領域内に、NBS-LRR（Nucleotide-Binding Site domain-Leucine-Rich Repeat）領域をもつ候補遺伝子が1つ存在した。
【実施例３】
【００６５】
[配列解析]
完全長cDNAを取得し、塩基配列を解読した。【００６６】
Grh5遺伝子は、全長9,076bp（配列番号:1）、3個のエクソン（塩基位置1-1,057、2,950-3,578、及び7,151-9,076）から形成されることが分かった。また、全長3,612bpのcDNA（配列番号:2）に対応する1203個のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしていることが分かった（図8）。【００６７】
アミノ酸配列について、NCBIのBlast 2 sequence を用いて解析したところ、Grh2a及びGrh2b（前掲特許文献1）との同一性は、それぞれ順に16.0%及び19.3%であり、いもち病抵抗性遺伝子（Pib）との同一性は、48.8%であった。
【図１】
2007116958.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007116958.tif 000014
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