(57)【要約】細胞死抑制活性強化タンパク質ＦＮＫまたはそれをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の提供。Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質またはそれをコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項２】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される請求項１記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項３】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択され、さらに第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が欠失、付加または置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質である請求項１または２に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項４】
抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項５】
抗癌治療の効果を低下させない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項６】
ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項７】
細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される請求項６記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
【請求項８】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項９】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される請求項８記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１０】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択され、さらに第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が欠失、付加または置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質である請求項８または９に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１１】
抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１２】
抗癌治療の効果を低下させない、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１３】
ＦＮＫタンパク質をコードする核酸の５’側に細胞膜通過ペプチドをコードする核酸が連結している請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１４】
細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される請求項１３記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
【請求項１５】
抗癌治療がＸ線照射である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１６】
抗癌治療が抗癌剤投与である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１７】
抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が、造血組織障害、消化管粘膜を含む消化器の障害、心臓障害、肺障害、腎障害、神経障害、口内炎、聴力障害、皮膚障害からなる群から選択される請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１８】
Ｘ線照射による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項１９】
抗癌剤投与による消化管粘膜を含む消化器の障害、造血組織障害、腎臓障害および聴覚障害からなる群から選択される副作用を予防または治療し得る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項２０】
抗癌剤投与による聴力障害を予防または治療し得る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項２１】
抗癌剤投与による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【請求項２２】
抗癌剤が５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）およびＣＤＤＰ（シスプラチン）からなる群から選択される、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞死抑制活性強化タンパク質ＦＮＫまたはそれをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤に関する。
【背景技術】  正常細胞は細胞周期や細胞増殖に関する機能に変化を来すと不死化、形態変化などの悪性形質を獲得し、癌化することが知られている。このため、この癌細胞を除去するために、化学療法及び放射線療法等を行うが、癌細胞であっても悪性形質以外は正常細胞と共通の性質を有するため、癌細胞のみならず、正常細胞にも毒性を示すことが多い。この正常細胞に対する毒性がすなわち化学療法及び放射線療法の副作用となって現れてくる。
副作用を受けやすい正常細胞は、骨髄細胞、毛母細胞、口腔粘膜や腸管粘膜などの消化管粘膜上皮細胞の幹細胞など活発に分裂・増殖する細胞である。このため、抗癌治療を行ったときには、骨髄抑制や、脱毛、消化管粘膜傷害を示す。例えば、シスプラチンなど代表的な抗癌剤は重大な副作用として、聴力障害が発生し、そのため抗癌剤の投与が継続できない場合が多々ある。また、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質またはアミノグリコシド系抗生物質でも副作用で聴力障害が発生することが報告されている（非特許文献１から３を参照）。このため、抗癌剤による消化管粘膜障害や聴力障害等の副作用を防ぐことが求められてきた。
この副作用を軽減するための方法として、サイクリン依存性キナーゼＩＩ阻害薬を用いたり（特許文献１等参照）、カスパーゼインヒビターを用いて正常細胞の細胞死を抑制したり（特許文献２等参照）、副作用が現れた時点で、抗癌治療を中止するなどして副作用の軽減に努めてきた。また、聴力障害に対しては、ＮＯＳ（Ｌ−アルギニンを基質とする酵素）阻害剤を腹腔内投与するなどして、聴力障害を予防及び治療方法について検討されてきた。
しかし、副作用によって抗癌治療を中止することは癌細胞の除去を断念することを意味するため、副作用の少ない抗癌治療が望まれている。
シスプラチンやアミノグリコシド系抗生物質による聴力障害にはアポトーシスが関与すると報告されているが（非特許文献１から５を参照）、アポトーシス自体をコントロールする試みは成されていない。また、モルモットモデルで誘導型一酸化窒素合成酵素を抑制し、聴力障害を軽減する報告は存在するが（非特許文献６参照）、その効果は十分でなかった。
【特許文献１】特表２００３−５０２３６２号公報
【特許文献２】特表２００３−５１１４６３号公報
【非特許文献１】Ｃｏｒｂａｃｅｌｌａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｎｏｖ；１９７（１−２）：１１−８
【非特許文献２】Ｄｅｈｎｅ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊｕｌ；１６９（１−２）：４７−５５
【非特許文献３】Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ＰＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｄｉｏｌ  Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．２００２  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；７（３）：１６５−７０
【非特許文献４】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００２；４８：８２−７
【非特許文献５】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２０００；１１：７３１−５
【非特許文献６】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２０００；１１：４０１
【発明の開示】
本発明は、細胞死抑制活性強化タンパク質ＦＮＫまたはそれをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の提供を目的とする。
本発明者は、先にアポトーシス抑制タンパク質であるＢｃｌ−ｘＬを改変してその活性を強化したタンパク質であるＦＮＫを開発した（特開２００１−１２０２８１号公報）。また、本発明者等は細胞死抑制活性強化タンパク質であるＰＴＤ−ＦＮＫが脱毛を防止することを見出し、特願２００５−７１５０１として既に出願している。また、骨髄細胞の保存のためにも本タンパク質が有用であることを見出し、特願２００５−７１８１９として出願をしている。
本発明者は、ＦＮＫの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用に対する効果について鋭意検討を行った。
ＦＮＫは、従来用いられてきたアポトーシス抑制タンパク質では得られない程の優れた効果を発揮する。また、ＦＮＫは、アポトーシスのみでなく、ネクローシスも含めた細胞死を抑制する（Ｚｏｎａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ  ＦＮＫ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１２，３８４−３９４（２００５））。従って、ＦＮＫが抑制する細胞死はアポトーシスに限定されない。ＦＮＫの改変元となったＢｃｌ−ｘＬは様々な生物種に存在するが、その配列は非常によく似ている。本件では、ラット由来のＦＮＫを用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかり、その他の生物種由来のＦＮＫでも同じような効果が予想される。従って、ＦＮＫを作製するにあたって、その改変元となるＢｃｌ−ｘＬの生物種は限定されない。
通常、タンパク質は細胞膜を通過できない。従って、細胞外からＦＮＫを投与するためには、細胞膜を通過させるための手段が必要となる。そのため、ＦＮＫのＮ末端側にＰＴＤ（細胞膜通過ドメイン）を連結させた。本件では、ＴＡＴをＰＴＤとして用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかった。従って、このＰＴＤは、細胞膜通過機能を有していればよく、特定の配列に限定されない。さらに、ＦＮＫをコードする核酸を細胞に導入する方法について検討を行った。
そして今回、これらの細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫが化学療法及び放射線療法による副作用の軽減に繋がることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
［１］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［２］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される［１］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［３］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択され、さらに第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が欠失、付加または置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質である［１］または［２］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［４］  抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用である［１］〜［３］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［５］  抗癌治療の効果を低下させない、［１］〜［４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［６］  ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、［１］〜［５］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［７］  細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される［６］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
［８］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［９］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される［８］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１０］  Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択され、さらに第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が欠失、付加または置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質である［８］または［９］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１１］  抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用である［８］〜［１０］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１２］  抗癌治療の効果を低下させない、［８］〜［１１］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１３］  ＦＮＫタンパク質をコードする核酸の５’側に細胞膜通過ペプチドをコードする核酸が連結している［８］〜［１２］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１４］  細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される［１３］の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表される、ペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
［１５］  抗癌治療がＸ線照射である［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１６］  抗癌治療が抗癌剤投与である［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１７］  抗癌治療の細胞死に基づく副作用が、造血組織障害、消化管粘膜を含む消化器の障害、心臓障害、肺障害、腎障害、神経障害、口内炎、聴力障害、皮膚障害からなる群から選択される［１］〜［１６］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［１８］  Ｘ線照射による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性基づく副作用の予防または治療剤。
［１９］  抗癌剤投与による消化管粘膜を含む消化器の障害、造血組織障害、腎臓障害および聴覚障害からなる群から選択される副作用を予防または治療し得る、［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［２０］  抗癌剤投与による聴力障害を予防または治療し得る、［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［２１］  抗癌剤投与による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、［１］〜［１４］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
［２２］  抗癌剤が５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）およびＣＤＤＰ（シスプラチン）からなる群から選択される、［１６］〜［２１］のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−２４１６８５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒト、ラット、マウス、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
図２は、ＰＴＤ−ＦＮＫによるシスプラチンの致死作用の軽減効果（生存率の上昇）を示す図である。
図３Ａは、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与がシスプラチンの抗癌活性（腫瘍体積縮小効果）を抑制しないことを示す図である。
図３Ｂは、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与がシスプラチンの抗癌活性（腫瘍体積縮小効果）を抑制しないことを示す（試験数を増やした場合）図である。
図４は、担癌マウスを用いた、イリノテカンと５−フルオロウラシルの抗癌活性に対するＰＴＤ−ＦＮＫ投与の影響の検討の結果を示す図である。
図５は、ＰＴＤ−ＦＮＫによるＸ線照射による副作用（腸粘膜障害）の軽減効果を示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図６は、ＰＴＤ−ＦＮＫによる５−ＦＵ投与による副作用（腸粘膜障害）の軽減効果を示す図である。
図７は、ＰＴＤ−ＦＮＫによる５−ＦＵ投与による副作用（腸粘膜障害）の軽減効果を示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図８は、ＰＴＤ−ＦＮＫによる５−ＦＵ投与による副作用（脾臓障害）の軽減効果を示す写真である。写真中のバーの長さは１００μｍである。
図９は、ＰＴＤ−ＦＮＫによる塩酸イリノテカイン投与による副作用（腸粘膜障害）の軽減効果を示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図１０は、ＰＴＤ−ＦＮＫによるシスプラチン投与による副作用（腎臓障害）の軽減効果を示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図１１は、ＰＴＤ−ＦＮＫによる５−ＦｕおよびＣＰＴ−１１投与による副作用（小腸炎症傷害）の軽減効果を示す図である。
図１２Ａは、担癌マウスにおける、腫瘍の存在様式を示す図である。
図１２Ｂは、ＰＴＤ−ＦＮＫが癌組織に取り込まれないことを示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図１３は、ＰＴＤ−ＦＮＫが骨髄中の細胞に取り込まれることを示す写真である。写真中のバーの長さは５０μｍである。
図１４は、ＰＴＤ−ＦＮＫとＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの副作用低減効果の比較を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の治療剤または予防剤が有効成分として含む細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫは、がん原遺伝子であるＢｃｌ−２遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６（４６７８）：１０９７−１０９９，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（２２）：７１６６−７１７０，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３（１４）：５２１４−５２１８，１９８６；Ｃｅｌｌ４７（１）：１９−２８，１９８６）と類似の構造を有するＢｃｌ−２ファミリーに属するＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（Ｃｅｌｌ  ７４（４）：５９７−６０８，１９９３）を改変することにより得られる。
ＦＮＫは、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。好ましくは３つが置換されている。ＦＮＫをコードする遺伝子は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子のコード領域において、第２２番目のＴｙｒをコードするトリプレットコドン（ｔａｃ）をＰｈｅをコードするコドン（ｔｔｔまたはｔｔｃ）に置換する塩基の置換、第２６番目のＧｌｎをコードするコドン（ｃａｇ）をＡｓｎをコードするコドン（ａａｔまたはａａｃ）に置換する塩基の置換および第１６５番目のＡｒｇをコードするコドン（ｃｇｇ）をＬｙｓをコードするコドン（ａａａまたはａａｇ）に置換する塩基の置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つの置換を有するように塩基配列を変異させることにより得られる。ＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の一例として、ラット由来のものをそれぞれ配列番号１および２に、ヒト由来のものをそれぞれ配列番号３および４に示す。
本発明で用いるＦＮＫはいかなる動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を改変したものでもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質が挙げられる。図１にヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアラインメントを示す。また、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５〜９に示す。図１において、いずれの動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列においても、第２２番目のアミノ酸はＴｙｒであり、第２６番目のアミノ酸はＧｌｎであり、１６５番目のアミノ酸はＡｒｇである。図１に示されている動物種以外の動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、これら３箇所のアミノ酸は保存されていると考えられ、本発明のＦＮＫタンパク質は由来動物種を問わず、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。また、本発明のＦＮＫタンパク質は、各種動物由来のＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質、またはＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質も包含する。１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加は、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１もしくは２個、１個のアミノ酸の欠失、置換または付加のいずれかである。図１に示すように、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌの間では２８番目、４０番目、４３番目、４５番目、１６８番目、１９３番目、２２０番目のアミノ酸のいずれかが異なる。このことは少なくともこれらのアミノ酸が置換、欠失等により変異してもＦＮＫの活性は保持されることを意味する。例として、２８番目のアミノ酸のセリンおよびトレオニンの間の置換、４０番目のアミノ酸のグルタミン酸およびグリシン間の置換、４３番目のアミノ酸のセリン、アラニンおよびプロリン間の置換、４５番目のアミノ酸のメチオニン、アルギニンおよびアラニン間の置換、１６８番目のアミノ酸のアラニン、セリンおよびトレオニン間の置換、ならびに１９３番目のアミノ酸のグルタミン酸およびアスパラギン酸間の置換、ならびに２２０番目のアミノ酸のバリンおよびロイシン間の置換が挙げられる。このようなタンパク質は、異種動物のＦＮＫタンパク質のハイブリッドタンパク質も包含する。例えば、ＦＮＫタンパク質のＮ端側半分がヒト由来のアミノ酸配列を有し、Ｃ端側半分が他種動物由来のアミノ酸配列を有するＦＮＫタンパク質が包含される。一般に、遺伝子には個体特異的な遺伝的多型が知られている。ヒトのＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、ＦＮＫタンパク質活性に影響を与えない部位にアミノ酸置換（遺伝的多型）がある場合があり、例えば、配列番号５に表すヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第７０番目のＧｌｙがＡｌａに置換されているものが知られている。本発明のＦＮＫタンパク質は、このような個体特異的なアミノ酸置換であって、ＦＮＫタンパク質活性に大きな影響を与えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をも包含する。
本発明のＦＮＫタンパク質は、本明細書に記載のＢｃｌ−ｘＬタンパク質もしくはＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列またはＢｃｌ−ｘＬ遺伝子もしくはＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報を基に、得ることができる。例えば、特開２００１−１２０２８１号公報には、ラット由来のＦＮＫタンパク質について記載されており、該公報の記載に従って本発明のＦＮＫタンパク質を得ることができる。
本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いるＦＮＫタンパク質のＮ末端側には、細胞膜通過ドメイン（ＰＴＤ）が連結していてもよい。
細胞膜通過ドメインはアルギニン、リシンを含む塩基性アミノ酸を種に含む細胞膜通過ペプチドからなり、アミノ酸の光学異性体（Ｄ体、Ｌ体）に依存しない。細胞膜通過ペプチドとしては種々のものが知られており、本発明においてはいかなる細胞膜通過ペプチドを用いることができる。
細胞膜通過ペプチドとして、６個から１２個、好ましくは７個から１１個、さらに好ましくは９個または１０個のアルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチド、５個から１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、ならびに前記アルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチドまたはアルギニンおよびリシンからなるペプチドにおいて、数個、好ましくは１個から８個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド等が挙げられる。例としてアルギニン９個からなるペプチド（Ｒ９、配列番号１０および１１）、アルギニン７個およびリシン２個からなるペプチド（Ｋ２Ｒ７、配列番号１２および１３）、アルギニン７個およびグリシン６個からなるペプチド（Ｒ７Ｇ６、配列番号１４および１５）等が挙げられる。これらの細胞膜通過ペプチドを連結するとき、ＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列の第１番目のメチオニンは残しておいてもよいし、除去してもよい。
また、細胞膜通過ペプチドとして、ＨＩＶ−１・ＴＡＴの細胞膜通過ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６および１７）やショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアの細胞膜通過ドメインＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１８）が挙げられる。その他、ＶＰ２２のＣ末端（２６７−３００）ペプチドＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＲＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１９）、ＨＩＶ−１／Ｒｅｖ（３４−５０）ペプチドＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号２０）、ＦＨＶ／ｃｏａｔ（３５−４９）ペプチドＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号２１）、Ｋ−ＦＧＦのＮ末端（７−２２）の疎水性領域ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２２）等が挙げられる。
また、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドの間にスペーサー配列を有していてもよい。スペーサー配列はアミノ酸数個からなりその配列には限定はないが、例えば、１個から５個、好ましくは１個から３個、さらに好ましくは１個のグリシンが挙げられる。
これらの細胞膜通過ペプチドは、それぞれの細胞膜通過ペプチドをコードするＤＮＡをＦＮＫをコードするＤＮＡと連結して融合ＤＮＡを作製し、この融合ＤＮＡを遺伝子工学の手法により大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等を介して、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。
細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質として、ヒトＦＮＫタンパク質にＫ２Ｒ７ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２３に、アミノ酸配列を配列番号２４に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ７Ｇ６ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ９ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２７に、アミノ酸配列を配列番号２８に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す）およびラットＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に示す）等が挙げられる。
さらに、本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤は、上記ＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を含む予防または治療剤を含む。この場合、ＦＮＫタンパク質は上記のすべての変異を有するＦＮＫタンパク質が包含される。
さらに、本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤は、ＦＮＫタンパク質をコードする核酸の５’側に上記の細胞膜通過ペプチド（ＰＴＤ）をコードする核酸を連結させた核酸を含む予防または治療剤を含む。該核酸は、上記のＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結しているタンパク質をコードする核酸である。
これらのＦＮＫタンパク質をコードする核酸およびＦＮＫタンパク質に細胞膜通過ペプチドを連結させたタンパク質をコードする核酸は、本明細書に記載のＢｃｌ−ｘＬをコードするＤＮＡもしくはＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ、ならびに細胞膜通過ペプチドのアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に得ることができる。例えば、特開２００１−１２０２８１号公報には、ラット由来のＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡについて記載されており、該公報の記載に従って本発明のＦＮＫタンパク質を得ることができる。例えば、配列番号１にヒト由来のＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号２にラット由来のＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡが記載されている。本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤が含むＤＮＡの一例として、配列番号１もしくは２に表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。また、配列番号１もしくは２に表されるＤＮＡに細胞膜通過ペプチドが連結したＤＮＡまたは該ＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡの一例として、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％  フォルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子  ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるＤＮＡが挙げられる。
本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いるＦＮＫタンパク質は、上記の細胞膜通過ペプチドを連結させる他に種々の方法で細胞に導入することができる。例えば、目的タンパク質と非共有結合的相互作用によって複合体を形成し細胞内に導入するペプチド性キャリアー、例えばＣｈａｒｉｏｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ社，カルフォルニア，ＵＳＡ）を用いることができる。また、本発明のＦＮＫタンパク質にポリアミノ基を結合させてもよい。また、リポソームに本発明のＦＮＫタンパク質を封入し、被治療動物に投与してもよい。この場合、リポソーム表面に糖鎖を結合させることにより、目的の細胞に導入することができる。さらに、公知の非ウイルスベクター、例えばセンダイウイルスの細胞融合活性を担う膜成分（エンベロープタンパク質）の活性を残したままウイルスの複製能を完全に不活化した  ＨＶＪ−Ｅベクター（石原産業株式社）を用いて導入することができる。その他、種々の公知のドラッグデリバリーシステムを用いてもよい。
本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いるＦＮＫタンパク質をコードする核酸およびＦＮＫタンパク質をコードする核酸に細胞膜通過ペプチドをコードする核酸を連結させた核酸は以下の方法により細胞に導入することができ、細胞内で発現させ、遺伝子治療を行うことができる。
核酸を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、遺伝子銃法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。また、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターを用いることができる。その調製法、投与法は例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９等に記載されている。
非ウイルスベクターを用いる場合は、公知の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的核酸を細胞に導入することができる。また、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥ  リポソーム法）、ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等により、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などの記載に従えばよい。ＨＶＪリポソーム法とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０，１４４０−１４４８（１９９３）；実験医学，１，１８２２−１８２６（１９９４）；蛋白質・核酸・酵素，４２，１８０６−１８１３（１９９７）等に記載の方法であり、好ましくはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ），４７９−４８２（１９９５）に記載の方法が挙げられる。ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターは、外来遺伝子を不活化したセンダイウイルスエンベロープに導入したものであり、ＷＯ０１／５７２０４号国際公開公報の記載に従い調製することが可能である。用いる発現ベクターは、生体内で目的核酸を発現させることのできるベクターであればいかなるものも用い得るが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）、ｐＶＡＸ１などの発現ベクターが挙げられる。
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクター等を用いることができる。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することができる。遺伝子治療剤の患者への導入は、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法によってもよいし、ヒトから細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法によってもよい。
細胞膜通過ペプチドをコードする核酸を連結させた核酸の場合、該核酸を導入した細胞を体内に戻した場合、細胞内で発現されたタンパク質は細胞膜通過ペプチドにより、細胞外へ分泌され、さらに他の細胞に入っていく。また、細胞膜通過ペプチドをコードする核酸を連結させた核酸を導入した細胞を、タンパク質は通過させるが、細胞は通過させないカプセルに入れて、被治療動物に投与または埋め込むこともできる。この場合、カプセル中でＰＴＤ−ＦＮＫが発現産生されカプセルから外に出て、体内に供給され、ＦＮＫの治療効果を発揮する。ＦＮＫによる治療が必要なくなった場合、前記カプセルを体内から取り出すことにより、ＦＮＫの過剰投与を防ぐことができる。タンパク質を通過させるが、細胞は通過させないカプセルとしては、多孔性の樹脂製カプセルを用いることができる。
本発明のＦＮＫタンパク質もしくはＰＴＤを連結したＦＮＫタンパク質またはそれらをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤が対象とする副作用として、Ｘ線照射による副作用、抗癌剤投与による副作用が含まれる。本発明において抗癌治療の細胞毒性とは、抗癌治療に用いる放射線や化学物質が正常細胞に障害を与えることをいい、障害の種類として細胞死、増殖能、ＤＮＡ合成能を含む細胞の各種機能の低下がある。抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用として、白血球減少、血小板減少、赤血球減少等の骨髄抑制あるいは脾臓障害を含む造血組織障害、腸管粘膜障害等の消化器障害、心膜炎、心筋炎症候群等の心臓障害（心毒性）、間質性肺炎、肺線維症等の肺障害（肺毒性）、尿細管障害、出血性膀胱炎等の腎臓障害（腎毒性）、末梢神経障害、中枢神経障害等の神経障害（神経毒性）、口内炎等の口腔粘膜障害、脱毛、聴力障害、皮膚障害等が挙げられる。Ｘ線照射による副作用としては特に、口腔粘膜を含む消化管粘膜の障害などの消化器障害が挙げられる。本発明において、消化管粘膜障害とは、口腔から肛門に至る消化管の粘膜の障害をいい、腸管粘膜障害や口腔粘膜障害等を含む。本発明の予防または治療剤が対象とする副作用をもたらす抗癌剤は、限定されず、抗癌剤の細胞毒性に基づく副作用のすべてが治療または予防対象となりえる。本発明が対象とする抗癌剤として、ニトロソウレア剤、窒素マスタード（サイクロフォスファミド等）、ダカルバジン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ブスルファン、イフォスファミド、塩酸ニムスチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ラニムスチン（ＭＣＮＵ）等のアルキル化剤；メトトレキセート、アミノプテリン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、カルモフール、シタラビン、ヒドロキシカルバミド、ゲムシタビン等の代謝拮抗剤；ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、エトポシド等の植物アルカロイド剤；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、クロモマイシン、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ドノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシンＣ等の抗癌抗生物質；ホルモン剤；レンチナン、ピシバニール、ベスタチン等の生物機能修飾物質；プロカルバジン；シスプラチン；カルボプラチンなどが例として挙げられる。
骨髄抑制は、上記のほとんどの抗癌剤治療の際の副作用であり、消化器障害は、特にシスプラチン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、窒素マスタード、サイクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）等の副作用であり、心毒性は特に、アドリアマイシン、ダウノマイシン、サイクロフォスファミド、シスプラチン、５−フルオロウラシル等の副作用であり、肺毒性は特にブレオマイシン、カルムスチン、マイトマイシンＤ、ブスルファン、メトトレキセート、プロカルバジン、サイクロフォスファミド等の副作用である。さらに、腎毒性は特にシスプラチン、マイトマイシンＣ、メトトレキセート、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等の副作用であり、神経毒性は特にビンクリスチン等の植物アルカロイド剤、シスプラチン、メトトレキセート、カルモフール等の副作用であり、口内炎は特にメトトレキセート、５−フルオロウラシル等の代謝拮抗剤、植物アルカロイド剤等の副作用であり、脱毛はすべての抗癌剤、特にアドリアマイシン、エトポシド等の副作用である。さらに、聴力障害は、シスプラチン等の抗癌剤やアミノグリコシド系抗生物質投与の副作用である。
本発明のＦＮＫタンパク質は、正常組織の正常細胞にのみ取り込まれ、腫瘍組織のガン細胞には取り込まれず、抗癌剤の治療効果を損なうことなく、正常細胞の抗癌治療による副作用を予防し、または治療し得る。また、本発明のＦＮＫタンパク質は骨髄中の細胞にも効率的に取りこまれ、骨髄抑制等の抗癌治療による副作用を予防し、または治療し得る。
本願発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、特に抗癌治療による副作用である聴力障害および抗癌治療による副作用である腸管粘膜障害や口内炎等の口腔粘膜障害を含む消化管粘膜障害の予防または治療に有効である。すなわち、本発明は抗癌剤投与等の抗癌治療による細胞死に基づく聴力障害または消化管粘膜障害の予防、治療剤を包含する。
聴力障害は、高音域に障害が現れ（高音障害型感音難聴）、抗癌剤投与を中止しても聴力は回復しない。このため、聴力障害は抗癌剤投与量を制限する要因になっている。抗癌剤投与量の増加に伴い聴力障害が出現しやすくなり、特に１日投与量で８０ｍｇ／ｍ２以上、総投与量で３００ｍｇ／ｍ２を超えると非常に出現しやすくなる。アミノグリコシド系抗生物質としては、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ハベカシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ミクロノマイシン、イセパシン、アルベカシン等が挙げられる。
シスプラチンやアミノグリコシド系抗生物質による内耳障害はアポトーシスが関与していると考えられており、アポトーシスが起きた時点での投与は障害の軽減には寄与しないと考えられる。従って、本発明の治療剤は、シスプラチンやアミノグリコシド系抗生物質投与から早期の内耳障害に効果がある。本願発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、特にシスプラチンによる障害に有効であり、本願発明はシスプラチン難聴の予防または治療剤を包含する。
本発明のＦＮＫまたはＰＴＤを連結したＦＮＫを有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、飴、トローチ、口腔内崩壊錠、口腔内粘膜への塗布若しくは添付剤などの口腔内に留まる剤形等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経口投与を挙げることができる。抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、ＦＮＫまたはＰＴＤを連結したＦＮＫを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。ＦＮＫは、そのタンパク質精製過程で７Ｍ  Ｕｒｅａ、２％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＤＴＴで処理していながら活性は保持しているので、一般的にタンパク質が変性すると予想されるような添加物、例えばイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アルコール等を使用することができる。また、必要に応じて、他の公知の成分、例えば、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤、抗酸化剤、防腐剤、着色剤、安定化剤、溶解補助剤、粘度調整剤、香料等を加えてもよい。その投与量は、症状、年齢、体重および投与経路に依存するであろうから、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定すべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験またはｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデル試験系から導かれる。一般的には１ｎｇ〜５ｍｇ／１ｋｇ体重の範囲で投与されることが望ましい。この１回投与量を１日１回あるいは数回に分けて投与する。
なお、本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の投与は、予防のために抗癌剤の投与等の抗癌治療の前、同時、後のいつでもよい。特に、抗癌治療数時間後、１日後および２日後の３回投与するのが望ましい。また、抗癌治療により出現した細胞毒性に基づく副作用の治療にも用いることができる。すなわち、本発明は抗癌剤投与等の抗癌治療後に初回投与し、その後２日間にわたって１日１回投与されることを特徴とする抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤を包含する。
ＦＮＫタンパク質またはＰＴＤを連結したＦＮＫタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤も上記のＦＮＫタンパク質またはＰＴＤを連結したＦＮＫタンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤と同様の形態で投与することができる。遺伝子治療を行う場合の核酸の有効用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験またはｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデル試験系から導かれるが、一般的には核酸として約１μｇ〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは約１０μｇ〜約５ｍｇ、より好ましくは約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲である。投与回数等は、ＦＮＫタンパク質またはＰＴＤを連結したＦＮＫタンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤と同様である。
また、本発明の聴力障害予防剤または治療剤により抗癌剤投与による聴力障害を改善することができる。すなわち、本発明の聴力障害予防剤または治療剤は、抗癌剤投与により障害を受けた聴力の改善剤でもある。
本発明は、ＦＮＫもしくはＰＴＤを連結したＦＮＫまたはそれらをコードする核酸を投与して、抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用を治療または予防する方法を包含する。本発明は、さらに抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の製造のためのＦＮＫもしくはＰＴＤを連結したＦＮＫまたはそれらをコードする核酸の使用をも包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】  抗癌剤投与による聴力障害の予防
シスプラチン（ＣＤＤＰ）による内耳障害モデル
以下の検討において、ラットＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたタンパク質（ＤＮＡ配列を配列番号３１にアミノ酸配列を配列番号３２に示す）を大腸菌で発現させ精製し、ＰＴＤ−ＦＮＫとして用いた。この発現及び精製に関しては、既に報告されている方法を用いて行った（Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１７１０７−１７１１２．（２００２））。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ系、４週齢、メス）をシスプラチン投与群（ｎ＝２０）、シスプラチン単回＋ＰＴＤ−ＦＮＫ（２．５ｍｇ／ｋｇ，１．２５ｍｇ／ｋｇ）３回投与群（それぞれｎ＝５）、およびシスプラチン＋Ｖｅｈｉｃｌｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅｅ／０．１％  ＳＤＳ）投与群に分け実験を行った。シスプラチン（ブリストル・マイヤーズ株式会社、東京）は１７ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。シスプラチン単回＋ＰＴＤ−ＦＮＫ（２．５ｍｇ／ｋｇ，１．２５ｍｇ／ｋｇ）３回投与群ではシスプラチン投与の３時間前、１日後および２日後にＰＴＤ−ＦＮＫ（２．５，１．２５ｍｇ／ｋｇ）を皮下に投与した。各群で投与前および７日後にケタラール（筋肉注射）で麻酔し、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）検査をＢｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐ．社（Ｍｕｎｄｅｋｅｉｎ，ＩＬ，ＵＳＡ）のＴｒａｖｅｌｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて防音室内で行った。両耳後部および頭頂部に針電極を挿入した。音刺激はクリックを用い、音圧（ｄＢＳＰＬ）を１００ｄＢＳＰＬより５ｄＢステップで減少させた。信号を２００回加算し、再現性の得られる最小音圧を聴力閾値とした。聴力閾値が３０ｄＢ以下のマウスを実験に使用した。
１週間後の生存率はシスプラチン投与群（図２，ＣＤＤＰ）、およびシスプラチン＋Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群（図２，ＶＥＨ）で４０％であったのに対し、シスプラチン単回＋ＰＴＤ−ＦＮＫ３回投与群（図２，ＦＮＫ  ２．５ｍｇ／ｋｇ，ＦＮＫ  １．２５ｍｇ／ｋｇ））では１００％であった。表１は、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与によるシスプラチン誘導聴力障害の軽減効果を示す表である。ＣＤＤＰはシスプラチンのみを投与した場合、およびＶＥＨはシスプラチンおよびＶｅｈｉｃｌｅ（３回投与）を投与した場合の結果を示す。ＦＮＫ  ２．５ｍｇ／ｋｇは、シスプラチンおよびＰＴＤ−ＦＮＫ（２．５ｍｇ／ｋｇを３回投与）を投与した場合、ＦＮＫ  １．２５ｍｇ／ｋｇは、シスプラチンおよびＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇを３回投与）を投与した場合の結果を示す。値は聴力レベル（ｄＢ）を平均値で表し、その標準偏差を＋／−で示した。（  ）内のｎは調べたマウスの個体数を示す。生き残ったマウスについて、シスプラチン投与群では１週間後聴力の有意な閾値上昇を認めた（ｎ＝８，ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０１，ｖｓ．ＣＤＤＰ投与前、ＦＮＫ  ２．５ｍｇ／ｋｇと１．２５ｍｇ／ｋｇの投与１週間後）（表１、ＣＤＤＰ）。シスプラチン＋Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群（ｎ＝２）でも聴力閾値の上昇を認めた（表１，ＶＥＨ）。シスプラチン＋ＰＴＤ−ＦＮＫ  ３回投与群では、いずれも聴力に変化は認められなかった（表１，ＦＮＫ  ２．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＮＫ  １．２５ｍｇ／ｋｇ））。
【表１】
2007024008.tif 000002
2007024008.tif 000003
【実施例２】  担癌マウスを用いた、シスプラチン（ＣＤＤＰ）の抗癌剤活性にたいするＰＴＤ−ＦＮＫ投与の影響の検討
ヒト肺上皮ガン細胞Ａ５４９（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）をヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ  Ｓｌｃ（メス、８週齢）の皮下に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍の大きさ（体積）は麻酔下（ネンブタール）に精密ノギスで長径と短径を測定し、常法に従い（長径）×（短径）２÷２の計算式で求めた。１００〜２００ｍｍ３の大きさの腫瘍を持つ担癌マウスにＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，１４０μｌ）あるいはｖｅｈｉｃｌｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ／０．１％ＳＤＳ，１４０μｌ）を皮下注射した。３時間後、シスプラチン（ＣＤＤＰ；１．５ｍｇ／ｋｇ，２５ｍｇ／ｍｌ濃度のシスプラチン注射液６０μｌに生理食塩水０．５ｍｌを加えた。参考文献：Ｓｉｒｏｔｎａｋ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６，４８８５−４８９２（２０００）の実験条件）を腹腔内に注射した（Ｄａｙ０）。ＣＤＤＰの腫瘍体積縮小効果を判定するために、ｖｅｈｉｃｌｅ皮下投与した担癌マウスに生理食塩水（０．５ｍｌ）だけを腹腔内に投与した。ＣＤＤＰ投与後、１日目、２日目と連続してＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，１４０μｌ）あるいはｖｅｈｉｃｌｅ（１４０μｌ）をそれぞれ皮下注射した。３日目（Ｄａｙ３）と７日目（Ｄａｙ７）に腫瘍の大きさを測定した。シスプラチン投与時（Ｄａｙ  ０）の腫瘍体積を１００％として、腫瘍体積の増加率として図３Ａに示した。図３Ｂは、マウスの試験数（ｎ）を増やしたものである。
なお、用いたＦＮＫタンパク質は実施例１と同様であった。
ＣＤＤＰを投与しないと、腫瘍体積は２倍（Ｄａｙ３）、３倍（Ｄａｙ７）に増加し、ｖｅｈｉｃｌｅには腫瘍体積縮小効果がないことが判った。（コントロールのマウスのうち一匹がＤａｙ３の麻酔で死亡してしまったため、Ｄａｙ７については２匹のデータである）
ＣＤＤＰ投与群では、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与してもｖｅｈｉｃｌｅ投与と同じで、Ｄａｙ３で増加率０，Ｄａｙ７で１．５倍となり、ＣＤＤＰの腫瘍体積縮小効果にＰＴＤ−ＦＮＫは影響を与えなかった。ＣＤＤＰ投与群と非投与群では統計的有意差（ＡＮＯＶＡによる解析で、Ｄａｙ３もＤａｙ７もｐ＜０．００５）があり、ＣＤＤＰ投与群の中で、ＦＮＫ投与群と非投与群との間には統計的有意差はなかった。
すなわち、ＰＴＤ‐ＦＮＫは担癌マウスに投与しても、抗癌剤の効果は抑制せず、抗癌剤による聴力障害を抑制することが確認できた。
参考例  担癌マウスを用いた、イリノテカンと５−フルオロウラシルの抗癌活性に対するＰＴＤ−ＦＮＫ投与の影響の検討
ヒト大腸癌細胞ＨＴ２９（５×１０６ｃｅｌｌｓ）をヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ  Ｓｌｃ（メス、５週齢）の皮下に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍の大きさ（体積）は麻酔下（ネンブタール）に精密ノギスで長径と短径を測定し、常法に従い（長径）×（短径）２÷２の計算式で求めた。１００ｍｍ３以上の大きさの腫瘍を持つ担癌マウスにＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，１４０μｌ）、あるいはｖｅｈｉｃｌｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２Ｍｇｌｙｃｉｎｅ／０．１％ＳＤＳ，１４０μｌ）を皮下注射した（Ｄａｙ  ０）。３時間後、ＣＰＴ−１１投与群では塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１；トポテシン注、第一製薬株式会社）を３０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内に注射し、５−ＦＵ投与群では５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，シグマＣａｔ．＃  Ｆ６６２７−１０Ｇ，投与量３０ｍｇ／ｋｇ）とｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ（Ｆｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，シグマＣａｔ．＃  Ｆ−７８７８，投与量５０ｍｇ／ｋｇ）の混合液を腹腔内に注射した。ＣＰＴ−１１および５−ＦＵの腫瘍体積縮小効果を判定するために、ｖｅｈｉｃｌｅ投与した担癌マウスに生理食塩水（大塚薬品）を腹腔内に注射した。Ｄａｙ  ３，７，１０にＤａｙ０と同様に、ＰＴＤ−ＦＮＫあるはｖｅｈｉｃｌｅを投与し、３時間後にＣＰＴ−１１あるいは５−ＦＵ混合液を投与した。腫瘍体積はＤａｙ  ７とＤａｙ  １４に測定したが、Ｄａｙ  ７では各種薬剤を投与する前に測定した。Ｄａｙ  ０の腫瘍体積を１００％として、腫瘍体積の増加率を図４Ｂに示した。
結果を図４に示す。ＣＰＴ−１１あるいは５−ＦＵを投与しないと腫瘍体積は２．５倍（Ｄａｙ  ７）、４倍（Ｄａｙ  １０）に増加した。ＣＰＴ−１１あるいは５−ＦＵを投与することで腫瘍体積の増加は半分以下に抑えられ、ＰＴＤ−ＦＮＫを投与してもこの抗癌剤の腫瘍体積縮小効果は抑制されなかった。図４にはＡＮＯＶＡ解析による統計的有意差の群を示した（＊，Ｐ＜０．０１；＊＊，Ｐ＜０．００１）。また、矢印で示したマウスは一回目の腫瘍体積測定中に死亡したマウスである。
【実施例３】  Ｘ線照射による消化管粘膜障害に対するＰＴＤ−ＦＮＫの軽減効果
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｎ，７週齢、雄）にＰＴＤ−ＦＮＫ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した（ｎ＝３）。対照として同じ容量の溶媒（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２Ｍ  グリシン／０．１％ＳＤＳ：Ｖｅｈｉｃｌｅ）を腹腔内に投与した（ｎ＝４）。３時間後にこれらのマウスを一つの紙箱（Ｗ２１０ｍｍ，Ｄ１７５ｍｍ，Ｈ３５ｍｍ）に入れ、Ｘ線外部照射用ＬＩＮＡＣ（直線加速器）ＥＸＬ−６ＳＰ（三菱電機株式会社）で２０ＧｙのＸ線を照射した。マウスを飼育ケージ内にもどし、毎日ＰＴＤ−ＦＮＫ（５ｍｇ／ｋｇ）あるいは溶媒を皮下に注入した。Ｘ線照射後５日目に、マウスから腸を摘出し、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に浸漬して固定した。パラフィン切片作製後、ヘマトキシリン・エオシン染色で小腸（空腸）粘膜組織を病理組織学的に評価した。
結果を図５に示す。図５Ａは、ＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの腸粘膜を示し、図５Ｂは非投与マウスの腸粘膜を示す。
対照群では、Ｘ線照射に伴う腸粘膜（腸絨毛）構造の破壊が顕著であり、粘膜固有層に位置する多数の毛細血管の拡張そして鬱血が認められた。ＰＴＤ−ＦＮＫ投与群では、対照群に比べて腸粘膜（腸絨毛）構造が維持され、粘膜固有層に位置する毛細血管の拡張そして鬱血が認められず、明らかにＸ線照射に伴う腸粘膜傷害を軽減した。
【実施例４】  ５−ＦＵ投与による消化管粘膜障害の軽減
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は骨髄などの造血組織および消化管に顕著な毒性を発揮する。５−ＦＵの大量投与による消化管毒性は小腸粘膜を破壊し、高度な下痢を引き起こす（参考文献：Ｚｈａｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０，２８５１−２８５９（２００４））。また、ヒトとは違いマウスでは脾臓は造血組織のひとつである。５−ＦＵによる小腸と脾臓に対する副作用（毒性）のＰＴＤ−ＦＮＫによる軽減効果を検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ（５Ｗ，メス）にＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，０．１５ｍｌ）を皮下に注射した（Ｄａｙ０）。対照（コントロール）マウスには実施例３と同じようにＶｅｈｉｃｌｅ（０．１５ｍｌ）を皮下に注射した。３時間後に５−ＦＵ  ２００ｍｇ／ｋｇをＰＴＤ−ＦＮＫ投与群及び対照群のマウスの皮下に注入した。５−ＦＵ注射液は５−ＦＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ６６２７−１０Ｇ）を生理食塩水（大塚製薬  大塚生食注）で溶解し、１０ｍｇ／ｍｌになるように調製した。翌日（Ｄａｙ１）及び翌々日（Ｄａｙ２）、Ｄａｙ０と同じようにＰＴＤ−ＦＮＫとＶｅｈｉｃｌｅをそれぞれのマウスに皮下注し、３時間後に５−ＦＵを皮下注し、連続２日投与群（ｎ＝３）と連続３日投与群（ｎ＝３）のマウスを作製した。５−ＦＵの最後の投与から２日後にマウスを灌流固定し、脾臓ならびに小腸（空腸）のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン＆エオシン染色し、病理組織学的に評価した。
また、３日間連続投与群に関しては、５−ＦＵ最終投与の翌日（Ｄａｙ  ３；各群マウス数ｎ＝３）および翌々日（Ｄａｙ  ４；各群マウス数ｎ＝３）にマウスを灌流固定し、小腸（空腸）のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン＆エオシン染色した。デジタルカメラで低倍率（対物１０倍）で染色像のｉｍａｇｅを各マウス（各切片）につき３枚とり、各群合計９枚のｉｍａｇｅ像の粘膜の厚さ（粘膜筋板から腸絨毛先端までの長さ）を解析した。１４０から１５８個の絨毛について計測し、その平均値と標準偏差値を図に示した。図６では５−ＦＵもＰＴＤ−ＦＮＫあるいはＶｅｈｉｃｌｅも投与していない正常マウスの小腸（空腸）（調べた絨毛数１１３）についての解析結果も合わせて示した。
結果を図６に示す。図６に示すように、ＦＮＫ投与で粘膜構造の破壊による粘膜の厚さの減少が抑制された。
図７にＰＴＤ−ＦＮＫ／５−ＦＵの腸管への影響を示す（ヘマトキシリン＆エオシン染色像）。図７ＡおよびＢは、２日連続投与した場合であり、図７ＡはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの腸粘膜を示し、図７Ｂは非投与マウスの腸粘膜を示す。また、図７ＣおよびＤは、３日連続投与した場合であり、図７ＣはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの腸粘膜を示し、図７Ｄは非投与マウスの腸粘膜を示す。
ＰＴＤ−ＦＮＫ非投与群（対照群）では、小腸の粘膜上皮の丈が非常に短縮し、結果として粘膜固有層が萎縮している。また、粘膜上皮細胞と腸腺の変性破壊が見られる。さらに平滑筋層では、非常に多数の空胞形性が観察されるが、いずれの症状もＰＴＤ−ＦＮＫ投与によって、改善が認められる。
図８にＰＴＤ−ＦＮＫ／５−ＦＵの脾臓への影響を示す。図８ＡおよびＢは、２日連続投与した場合であり、図８ＡはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの脾臓を示し、図８Ｂは非投与マウスの脾臓を示す。また、図８ＣおよびＤは、３日連続投与した場合であり、図８ＣはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの脾臓を示し、図８Ｄは非投与マウスの脾臓を示す。
何れの群でも脾臓自体の大きさの顕著な萎縮が見られる。特に白脾髄は染色性が失われ、著しい縮小が観察される。これはリンパ球形成の低下が原因と考えられる。同一倍率で撮影しているため３日間連続投与の写真をみるとその変化は明らかである。
これに対して、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与群では脾臓自体の大きさの萎縮はＶｅｈｉｃｌｅ投与群と顕著な差は認められなかったが、白脾髄の染色性が維持され、その縮小が抑制されているのが確認できる。
【実施例５】  ＣＰＴ−１１投与による消化管粘膜障害の軽減
ＣＰＴ−１１（塩酸イリノテカン）は白血球（好中球）減少と消化管に顕著な毒性を発揮する。ＣＰＴ−１１は生体内でｃａｒｂｏｘｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅにより活性代謝体ＳＮ−３８に変換され、ＤＮＡ一本鎖の切断の過程におけるＤＮＡ−トポイソメラーゼＩ複合体に結合して、複合体の安定化をもたらす。その結果、細胞周期が妨げられ、細胞死が起きる。ＳＮ−３８は肝臓でグルクロン酸抱合酵素によってグルクロン酸に抱合された形で胆汁中に排泄される。胆汁中に排泄されたＳＮ−３８／グルクロン酸抱合体は、腸内細菌叢の脱グルクロン酸抱合を受けてＳＮ−３８に再び変換され、腸管より再吸収される。この結果、ＳＮ−３８が肝臓の解毒酵素ＣＹＰ３Ａ４やＣＹＰ３Ａ５で活性のない誘導体に変換されない限り、ＳＮ−３８は腸肝循環する。このＳＮ−３８の腸肝循環が遅発性の下痢（腸管粘膜障害）の原因のひとつと考えられている（典拠：市川  度、消化器セミナー，ｐ３２−３４、田村和夫編、ヘルス出版）。ＣＰＴ−１１による遅発性下痢は致死的になるほどの激しいものである（参考文献：Ｚｈａｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０，２８５１−２８５９（２００４））。ＣＰＴ−１１による小腸粘膜に対する副作用（毒性）に対するＰＴＤ−ＦＮＫの軽減効果を検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ（５Ｗ，メス）にＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，０．１５ｍｌ）（ｎ＝３）を皮下に注射した（Ｄａｙ０）。対照マウス（ｎ＝３）には、実施例３と同じようにＶｅｈｉｃｌｅ（０．１５ｍｌ）を皮下に注射した。３時間後にＣＰＴ−１１（トポテシン注（塩酸イリノテカン注）第一製薬株式会社）２００ｍｇ／ｋｇ）をＰＴＤ−ＦＮＫ投与群及び対照投与群のマウスの腹腔内に注入した。翌日（Ｄａｙ１）及び翌々日（Ｄａｙ２），同じようにＰＴＤ−ＦＮＫとＶｅｈｉｃｌｅをそれぞれのマウスに皮下注し、３時間後にＣＰＴ−１１を腹腔内に注入した。Ｄａｙ３はＰＴＤ−ＦＮＫあるいはＶｅｈｉｃｌｅだけを皮下注した。Ｄａｙ５にマウスを灌流固定し、小腸（空腸）のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン＆エオシン染色し、病理組織学的に評価した。
その結果を図９に示す。図９ＡはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの腸粘膜を示し、図９Ｂは非投与マウスの腸粘膜を示す。
対照群では小腸の絨毛（粘膜上皮の丈）が非常に短縮し、各絨毛のおおくの粘膜上皮細胞が細胞質空胞変性して、至る所に細胞質空胞が形成されている。さらに、残存している粘膜上皮細胞の核は著しく核濃縮をおこしている。これに対して、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与群では、絨毛はｖｅｈｉｃｌｅ投与群と同じ程度に短縮しているが、粘膜上皮細胞に顕著な改善効果が認められた。具体的には、粘膜上皮細胞の空胞変性が著しく抑制され、粘膜構造が良く維持されている。
【実施例６】  シスプラチン投与による腎毒性の軽減
シスプラチンの毒性は、腎毒性と聴覚障害に代表される神経障害である。腎障害は腎尿細管のＣａ２＋代謝障害、重炭酸イオン等の塩類・グルコース・アミノ酸の能動輸送傷害、細胞内ミトコンドリアの呼吸増大などが原因とされている。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｒ系、５週齢、メス）にＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）を皮下に投与した。実施例１と同じように対照として等量のｖｅｈｉｃｌｅを皮下に投与した（ｎ＝１５）。３時間後にシスプラチン（ブリプラチン注、ブリストル・マイヤーズ株式会社）１７ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ１、Ｄａｙ２にＰＴＤ−ＦＮＫとｖｅｈｉｃｌｅをそれぞれに皮下投与した。翌日（Ｄａｙ３）に生存したマウス（ＰＴＤ−ＦＮＫ投与群６匹（生存率１００％）、対照群８匹（生存率５３．３％）から血液を採取した後、灌流固定し、腎臓のパラフィン切片を作製した。ヘマトキシリン・エオシン染色して、腎臓組織を病理組織学的に評価した。採取した血液から血清を調製し、血清中に存在する尿素窒素（ＢＵＮ）とクレアチニンをそれぞれ尿素窒素Ｂ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）とクレアチニンーテストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。測定方法はキットに添付されてきた説明書に従って、尿素窒素の測定では１／１０のスケールに、クレアチニンの測定では１／５０のスケールにそれぞれ使用する血清量と添加する試薬量を減じて行った。シスプラチン未投与の正常マウス（ｎ＝１２）についても血清中に存在する尿素窒素（ＢＵＮ）とクレアチニンを測定した。
図１０にヘマトキシリン・エオシン染色組織像を示す。図１０ＡはＰＴＤ−ＦＮＫを投与したマウスの腎臓を示し、図１０Ｂは正常マウスの腎臓を示し、図１０ＣはＰＴＤ−ＦＮＫ非投与マウスの腎臓を示す。
シスプラチンの投与により、実施例１にも示したようにＰＴＤ−ＦＮＫでは生存率が１００％であったにも関わらず、対照群では生存率が５３．３％に過ぎなかった。更に、シスプラチンによる近位尿細管の機能低下で尿細管に硝子円柱が形成され、さらには多くの尿細管が変性壊死してその構造がこわれている。広範囲にわたり、近位尿細管および遠位尿細管の上皮細胞において、刷子縁の喪失、核濃縮、核喪失が起こり変性壊死していることが判る（図１０Ｃ）。
これに対し、ＰＴＤ−ＦＮＫ投与群では、近位尿細管および遠位尿細管の上皮細胞の形態が保たれており、広範囲に渡って尿細管構造が良く維持されている。さらに、尿細管の硝子円柱の形成が著しく抑制されている（図１０Ａ）。
表２に血清中に存在する尿素窒素量とクレアチニン量の平均値と標準偏差を＋／−で示した。（  ）内のｎは測定したマウスの個体数を示す。
【表２】
2007024008.tif 000004
2007024008.tif 000005
血清尿素窒素値と血清クレアチニン値はともに腎機能障害の生化学的指標である。腎機能が低下するとこれらの値が上昇する。ＰＴＤ−ＦＮＫを投与しないシスプラチン投与群では血清尿素窒素値と血清クレアチニン値がともに正常値にくらべ著しく上昇したが、ＰＴＤ−ＦＮＫの投与によってこれらの上昇が有意に抑制された（ｐ＜０．０５，Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔｓ）。
以上のようにＰＴＤ−ＦＮＫはシスプラチンによる腎組織変性および腎機能障害を軽減した。
以上のように、ＰＴＤ−ＦＮＫを投与することによって、Ｘ線、抗癌剤（５−ＦＵ、塩酸イリノテカン、シスプラチン）等によって、消化管粘膜への障害、腎毒性、脾臓への毒性なの各種の副作用が明らかに軽減されることがわかった。
【実施例７】  ５−ＦｕおよびＣＰＴ−１１による小腸炎症傷害の生化学的定量（ＴＮＦαの定量）
抗癌剤の消化管毒性は小腸粘膜を破壊し、腸管の透過性の上昇、白血球の浸潤、および炎症性サイトカインの産生を引き起こす（Ｂｏｕｓｈｅｙ  ＲＰ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，６８７−６９３，２００１）。ＰＴＤ−ＦＮＫ投与で５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１による炎症性サイトカインＴＮＦαの産生上昇を抑制できるのかをＪｉｎｇｓｏｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅａｓｅａｃｈ  １０，２８５１−２８５９，２００４）の方法に従って検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ（５Ｗ，メス）にＰＴＤ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，０．１５ｍｌ）を皮下に注射した（Ｄａｙ  ０）。対照（コントロール）マウスには実施例４および実施例５と同じようにＶｅｈｉｃｌｅ（０．１５ｍｌ）を皮下に注射した。３時間後に５−ＦＵ  ２００ｍｇ／ｋｇ（皮下注射）、あるいはＣＰＴ−１１  ２００ｍｇ／ｋｇ（トポテシン注（塩酸イリノテカン注）第一製薬株式会社）（腹腔内注射）をＰＴＤ−ＦＮＫ投与群及び対照群のマウスに注入した。５−ＦＵ注射液は５−ＦＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ６６２７−１０Ｇ）を生理食塩水（大塚製薬  大塚生食注）で溶解し、１０ｍｇ／ｍｌになるように調製した。さらに、５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１によるＴＮＦαの産生上昇を確認するために、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与したマウスに生理食塩水を同体積注射した生理食塩水投与群を用意した。翌日（Ｄａｙ  １）及び翌々日（Ｄａｙ２）に、Ｄａｙ  ０と同じようにＰＴＤ−ＦＮＫとＶｅｈｉｃｌｅをそれぞれマウスに皮下注し、３時間後に５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１および生理食塩水を皮下注した。薬剤最終投与２日目のＤａｙ  ４（各群ｎ＝３）に、マウスを痲酔下に解剖し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４  １．１４ｇ／Ｌ，ＫＣｌ  ０．２ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ／Ｌ））で灌流して血液を除き、小腸の一部である空腸（ｍｉｄ−ｊｅｊｕｎｕｍ）２ｃｍを切り取った。さらに、切り取った腸管の内容物を除くために、長軸方向に外科用ナイフで３回切断し、生理食塩水と培地（ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＣＳ（Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ））で洗浄して、１ｍｌの培地内で１２時間ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で培養した。ＲＰＭＩ１６４０とＦＣＳ（Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ）社の製品を使用した。培養後、培地を卓上遠心機で遠心（１５，０００ｒｐｍ，５分）し、その上清を小分注して−８０℃で保存した。培地中のＴＮＦαをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のマウスＴＮＦα  ＥＬＩＳＡシステム（コード番号ＲＰＮ２７１８）キットを用いて測定した。測定手順はキットに添付されてきたマニュアルに従った。各培地上清につき６回ＥＬＩＳＡ（１００μｌ／回）の測定を行い、その平均値を各マウス空腸のＴＮＦα産生量（ｐｇ／ｍｌ−培地）とした。図１１には各群（使用したマウス数ｎ＝３）の平均値と標準偏差値を示した。
結果を図１１に示す。ＰＴＤ−ＦＮＫ投与で、Ｄａｙ４における５−ＦｕおよびＣＰＴ−１１による炎症性サイトカインＴＮＦαの産生を著しく抑制した。
【実施例８】  ＰＴＤ−ＦＮＫが癌組織に取り込まれないことの証明
実施例２と同じようにヒト肺上皮ガン細胞Ａ５４９をヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（メス、８週齢）の皮下に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３の大きさを持つ担癌マウスにＰＴＤ−ｍｙｃ−ＦＮＫ（１．２５ｍｇ／ｋｇ，１４０μｌ）（参考文献  Ａｓｏｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９，１７１０７−１７１１２，（２００２））を皮下に注射した。１，３，６，９時間後にマウスを灌流固定した。灌流はノボ・ヘパリン（５０単位／ｍｌ：アベンティス  ファーマ株式会社）を含むＰＢＳ溶液を用い、固定液は４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を含むＰＢＳで行った。灌流固定したマウスの腫瘍部位と隣接正常組織（皮膚と筋組織）を一緒に取り出した（図１２Ａ）。常法に従いパラフィン切片（５μｍ厚）を作製し、免疫組織化学染色を行った。一次抗体はＲａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｍｙｃ  Ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を希釈倍率１００で用いて、４℃で一晩反応させた。二次抗体およびペルオキシダーゼ反応による呈色反応はＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、キットに添付されたマニアルに従って行った。染色後、２０×対物レンズにてイメージ像を撮影した。
結果を図１２Ｂに示す。一般に増殖が活発な細胞（例えばガン細胞）はＭｙｃを発現していて、核に局在していることがわかっている。すべての写真で、腫瘍組織（右側）にび漫性点状の茶色に染色された陽性像は核内に存在する内因性Ｍｙｃによるものである。一方、ＴＡＴ−ｍｙｃ−ＦＮＫを皮下投与した群では、投与後３時間で腫瘍組織に隣接した骨格筋層（左側）の細胞質にび漫性の陽性像（茶色）の増加が認められ、その後経時的に減少した。このような細胞質の染色像はＴＡＴ−ｍｙｃ−ＦＮＫ非投与群（未処理（ＮＴ）およびＶｅｈｉｃｌｅ投与（Ｖ））のマウスでは認められなかった。以上の結果は、ＴＡＴ−ＦＮＫが正常組織には効率良く取り込まれるが、腫瘍組織のガン細胞には取り込まれないことを示している。
【実施例９】  ＰＴＤ−ＦＮＫが骨髄中の細胞に取り込まれることの証明
上記実施例で作製したＰＴＤ−ｍｙｃ−ＦＮＫを投与した担癌マウスを灌流固定（灌流はノボ・ヘパリン（５０単位／ｍｌ：アベンティス  ファーマ株式会社）を含むＰＢＳ溶液を用い、固定液は４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を含むＰＢＳ）後に背骨を摘出した。５％蟻酸で脱灰し、常法に従いパラフィン切片（５μｍ厚）を作製し、免疫組織化学染色を行った。一次抗体はＲａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｍｙｃ  Ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を希釈倍率１００で用いて４℃で一晩反応させた。二次抗体およびペルオキシダーゼ反応による呈色反応はＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、キットに添付されたマニアルに従って行った。染色後、イメージ像を撮影した。
結果を図１３に示す。骨髄中には赤血球、白血球、血小板の形成にあずかる各種幹細胞が存在し、内因性Ｍｙｃを発現している。ＴＡＴ−ｍｙｃ−ＦＮＫ非投与群（未処理（ＮＴ）およびＶｅｈｉｃｌｅ投与（Ｖ））で認められる染色像はび漫性点状の茶色に染色された陽性像で、これは核内に存在する内因性Ｍｙｃによるものである。一方、ＴＡＴ−ｍｙｃ−ＦＮＫを皮下投与した群では、投与後１時間で骨髄の細胞−特に巨大核細胞（血小板の前駆細胞）−の細胞質にび漫性の陽性像（茶色）が認められた。投与後３時間まで陽性像が増加し、その後経時的に減少した。このような染色像はＴＡＴ−ｍｙｃ−ＦＮＫ非投与群では認められなかった。以上の結果は、皮下投与したＴＡＴ−ＦＮＫが骨髄中の細胞にまで運搬されることを示している。
比較例  他のアポトーシス阻害剤との効果の比較：カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるシスプラチン致死作用への効果の検討
アポトーシスを阻害することによって抗癌剤の副作用を軽減する新規薬剤の開発において、新規カスパーゼ阻害剤について報告されている（特表２００３−５１１４６３号公報）。該公報に記載の新規カスパーゼ阻害剤を合成あるいは入手することが困難であるために、特表２００３−５１１４６３号公報の実施例１で使用されたＺ−ＶＤ−ｆｍｋに酷似したＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（製品名Ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｃａｔ＃６２７６１０）を比較試験のために用いた。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはカスパーゼ阻害剤としてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの実験に広く使用されている。投与量については、上述の特許公報のハムスターを用いた実施例の項目以降に記載されている腹腔内投与量２０ｍｇ／ｋｇを用いた。ここで、Ｗａｎｎｅｒらは０．２５ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）のＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋをマウスに静脈内投与することで抗Ｆａｓ抗体によって誘導される急性肝障害を軽減し、その死亡率を減少できたことを報告している（Ｗａｎｎｅｒ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９９；１３：１２３９−１２４８）。従って、本実施例で使用するＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの投与量２０ｍｇ／ｋｇは十分その効果を発揮することのできる量である。
本実施例はＰＴＤ−ＦＮＫとカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋとのシスプラチン致死作用に対する効果の比較検討である。従って、実施例１と同様にＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋを投与した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ系、４週齢、メス）をシスプラチン単回＋Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２０ｍｇ／ｋｇ）３回投与群とシスプラチン単回＋Ｖｅｈｉｃｌｅ３回投与群（それぞれｎ＝５）に分けた。シスプラチン（ブリストル・マイヤー株式会社）は１７ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。シスプラチン単回＋Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ３回投与群では、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋをジメチルスルフキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬株式会社）に溶かして１０ｍｇ／ｍｌの濃度とし、さらにＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ／ＤＭＳＯ溶液２８．４μｌに１２１．６μｌの生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬株式会社）を加えて０．１５ｍｌとして、シスプラチン投与の３時間前、１日後および２日後に皮下に投与した。シスプラチン単回＋Ｖｅｈｉｃｌｅ３回投与群では、ＤＭＳＯ溶液２８．４μｌに１２１．６μｌの生理食塩水を加えて０．１５ｍｌとし、シスプラチン投与の３時間前、１日後および２日後に皮下に投与した。シスプラチン投与後１週間の生存率を調べ、図２の結果と同時に記載した。
結果を図１４に示す。カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを投与群の一週間後の生存率は非投与群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と同じ４０％であった。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋにはシスプラチンによる致死作用を軽減する効果はなかった。これは、抗癌剤副作用の軽減効果についてＰＴＤ−ＦＮＫの優位性を示すものである。
【産業上の利用可能性】  実施例に示すように、Ｘ線照射や抗癌剤投与により抗癌治療を行った際の副作用により種々の障害を表すようになった被験体に本発明のＦＮＫまたはＰＴＤを連結したＦＮＫを投与することにより、抗癌治療による副作用を、抗癌治療の効果を妨げることなく、抑制することができる。さらに、ＦＮＫをコードする核酸を投与した場合も、同様の効果を持続させることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む癌細胞に取り込まれず抗癌治療の効果を損なわない、抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む癌細胞に取り込まれず抗癌治療の効果を損なわない、抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。
【国際調査報告】
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2007024008.tif 000053
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