(57)【要約】本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、ＮＫＴ細胞刺激剤を提供する。上気道粘膜下に投与することにより、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、免疫反応を刺激することが可能である。また、上気道粘膜下に投与することにより、ＮＫＴ細胞を選択的に頸部リンパ節に誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、ＮＫＴ細胞刺激剤。
【請求項２】
ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
上気道粘膜が鼻腔粘膜である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤。
【請求項５】
ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、請求項４記載の剤。
【請求項６】
上気道粘膜が鼻腔粘膜である、請求項４記載の剤。
【請求項７】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、インターフェロンγ産生誘導剤。
【請求項８】
ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、請求項７記載の剤。
【請求項９】
上気道粘膜が鼻腔粘膜である、請求項７記載の剤。
【請求項１０】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、免疫刺激剤。
【請求項１１】
ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、請求項１０記載の剤。
【請求項１２】
上気道粘膜が鼻腔粘膜である、請求項１０記載の剤。
【請求項１３】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、ＮＫＴ細胞を刺激する方法。
【請求項１４】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、頸部リンパ節内にＮＫＴ細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、インターフェロンγ産生を誘導する方法。
【請求項１６】
ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、免疫反応を刺激する方法。
【請求項１７】
上気道粘膜下に投与されるＮＫＴ細胞刺激剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
【請求項１８】
上気道粘膜下に投与される頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
【請求項１９】
上気道粘膜下に投与されるインターフェロンγ産生誘導剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
【請求項２０】
上気道粘膜下に投与される免疫刺激剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上気道粘膜下に投与されるＮＫＴ細胞刺激剤等に関する。より具体的には、本発明はＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、ＮＫＴ細胞刺激剤（又は頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤、インターフェロンγ産生誘導剤、免疫刺激剤等）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部扁平上皮癌のうち、ＩＩＩ期、ＩＶ期の進行癌に対しては、原則として手術、放射線、化学療法による三者併用療法が行なわれる。手術治療は、特に１９８０年代後半以降、遊離皮弁、腸管、血管柄付骨による自家組織移植が普及し、拡大切除が比較的容易となり、機能や形態の保持にも一定の効果が得られ、局所コントロールは大きく前進した［岡本美孝、進行頭頸部癌の治療−対応と問題点、耳鼻臨床９４：５７７−５８５，２００１］。内頸動脈や頭蓋底浸潤癌も絶対切除が可能となった［岡本美孝、内頸動脈浸潤癌への挑戦、耳鼻展４２：２３２：２３９，１９９９、Ｃｈａｚｏｎｏ  Ｈ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｚ，Ｏｇｉｎｏ  Ｊ，Ｅｎｄｏ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｔ，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  Ｔ，Ｎｕｋｕｉ  Ｈ，Ｈａｄｅｉｓｈｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｉ  Ｎ，Ｅｘｔｒａ−ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｂｙｐａｓｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １７：２６０−２６５，２００３］。ただ、切除範囲が広がれば、再建手術による機能や形態の保持にも限界があり、患者のＱＯＬも低下が目立つ。また、ＩＶ期では、照射、化学療法併用も治療成績の向上には不可欠であるが、ＩＶ期の中でもＮ２ｃ，Ｎ３症例や、頸動脈浸潤症例では、拡大切除によっても治療成績は不良で５年生存率は５０％を下回った［Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｉｎｕｇａｍｉ  Ａ，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｚ，Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  Ｍ，Ｋｏｎｎｏ  Ａ，Ｔｏｇａｗａ  Ｋ，Ｋｕｒｉｂａｙａｓｈｉ  Ｋ，Ｏｇａｗａ  Ｔ，Ｋａｎｎｏ  Ｉ，Ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２０：５４−５９，１９９６］。拡大切除を先行し、その後に照射・化学療法を併用した治療では生存率が大幅に向上したが、逆に喉頭などの機能保存は困難であった。
一方、国内でも１９８５年の白金製剤の導入後、化学療法の高い効果が期待され、ｎｅｏ−ａｄｊｕｖａｎｔあるいはａｄｊｕｖａｎｔ療法として用いられた［Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｋｏｎｎｏ  Ａ，Ｔｏｇａｗａ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｔ，Ｔａｍａｋａｗａ  Ｙ，Ａｍａｎｏ  Ｙ，Ａｒｔｅｒｉａｌ  ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５３：３６９−３７５，１９８６、Ｔｏｍｕｒａ  Ｎ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｗａｔａｒａｉ  Ｊ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｔｏｇａｗａ  Ｋ，Ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ．Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａ  ３７：５２−５６，１９９６］。しかし、欧米でのランダム化試験の結果、ｎｅｏ−ａｄｊｕｖａｎｔ治療は機能の保全には一定の効果を示しても、照射単独治療と比較して生存率の改善には寄与しないことが、約１０年前までにほぼ結論付けられている［Ｒｉｓｃｈｉｎ  Ｄ，Ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｂａｔｅ：Ｄｏｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｍａｉｎ  ａ  ｗｏｒｔｈｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ？  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ：３００−３０４，２００３］。現在、ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔの照射・化学療法が３者併用療法の中心治療として注目されているが、照射単独療法に比較して機能保持の可能性が高いばかりでなく、生存率の向上にも寄与していることがランダム化試験で報告されている［Ａｄｅｌｓｔｅｉｎ  ＤＪ，Ｌａｖｅｒｔｕ  Ｐ，Ｓａｘｔｏｎ  ＪＰ，Ｓｅｃｉｃ  Ｍ，Ｗｏｏｄ  ＢＧ，Ｗａｎａｍａｋｅｒ  ＪＲ，Ｅｌｉａｃｈａｒ  Ｉ，Ｓｔｒｏｍｅ  Ｍ，Ｌａｒｔｏ  ＭＡ，Ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ８８：８７６−８８３，２０００］。ただ、生存率の向上の程度は０〜８％であり、５年生存率も２０〜４０％程度であり、さらに多くの試験ではＮ２ｃ、Ｎ３、あるいは進行Ｔ４症例を試験対象から除いているものが多い。また、ｓａｌｖａｇｅ手術の成績は不良である［Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅ  ＡＡ，Ｇｏｅｐｆｅｒｔ  Ｈ，Ｍａｏｒ  Ｍ，Ｐａｊａｋ  Ｔ，Ｗｅｈｅｒ  Ｒ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｍ，Ｇｌｉｓｓｏｎ  Ｂ，Ｔｒｏｔｔｉ  Ａ，Ｒｉｄｇｅ  ＪＡ，Ｃｈａｏ  Ｃ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｇ，Ｌｅｅ  ＤＪ，Ｌｅａｆ  Ａ，Ｅｎｓｋｙ  Ｊ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｊ，Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｏｒｇａｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９：２０９１−２０９８，２００３］。
このように進行頭頸部扁平上皮癌の治療は手術にせよ、放射線、化学療法にせよ大きな問題がある。その成績の向上、さらには患者負担の軽減をはかるためには新たな治療戦略が不可欠である［岡本美孝、頭頸部癌の治療：問題点と今後の展望、千葉医学７９：１−５，２００３］。従来の細胞免疫治療は安全性は高いが、その効果は非常に限られたものしか得られていなかった。
ＮＫＴ細胞は同一の細胞表面にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＮＫ細胞レセプター（ＮＫＲ）をともに発現しているユニークな細胞であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とは区別される第４のリンパ球として最初に報告されている［Ｆｏｗｌｋｅｓ  ＢＪ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ  ＡＭ，Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ  Ｈ，Ｗｅｓｏｎ  ＭＡ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＲＨ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｂｅｔａ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｖ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８７  Ｓｅｐ  １７−２３；３２９（６１３６）：２５１−４、Ｂｕｄｄ  ＲＣ，Ｍｉｅｓｃｈｅｒ  ＧＣ，Ｈｏｗｅ  ＲＣ，Ｌｅｅｓ  ＲＫ，Ｂｒｏｎ  Ｃ，ＭａｃＤｏｎａｌ  ｄ  ＨＲ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８７  Ａｕｇ  １；１６６（２）：５７７−８２、Ｉｍａｉ  Ｋ，Ｋａｎｎｏ  Ｍ，Ｋｉｍｏｔｏ  Ｈ，Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９８６  Ｎｏｖ；８３（２２）：８７０８−１２］。ＮＫＴ細胞のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、極めて限定されたα鎖（マウスでＶα１４−Ｊα２８１、ヒトではＶα２４−ＪαＱ）およびβ鎖（マウスでＶβ８、Ｖβ７あるいはＶβ２、ヒトではＶβ１１）から構成されており［Ｄｅｌｌａｂｏｎａ  Ｐ，Ｐａｄｏｖａｎ  Ｅ，Ｃａｓｏｒａｔｉ  Ｇ，Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ  Ｍ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，Ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖ  ａｌｐｈａ  ２４−Ｊ  ａｌｐｈａ  Ｑ／Ｖ  ｂｅｔａ  １１  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａｌｌ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｂｙ  ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＣＤ４−８−  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９４  Ｓｅｐ  １；１８０（３）：１１７１−６、Ｐｏｒｃｅｌｌｉ  Ｓ，Ｇｅｒｄｅｓ  Ｄ，Ｆｅｒｔｉｇ  ＡＭ，Ｂａｌｋ  ＳＰ，Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖ  ａｌｐｈａ  ２４−Ｊ  ａｌｐｈａ  Ｑ  ＴＣＲ  ａｌｐｈａ  ａｒｅ  ＣＤ４−  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ＴＣＲ  ｂｅｔａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６  Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；４８（１−２）：６３−７、Ｍａｋｉｎｏ  Ｙ，Ｋａｎｎｏ  Ｒ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ  Ｋ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖ  ａｌｐｈａ  １４＋  ＴＣＲ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ＮＫ１．１＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  Ｊｕｌ；７（７）：１１５７−６１、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｔｏｋｕｈｉｓａ  Ｔ，Ｍａｓｕｄａ  Ｋ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｐｅｒｋｅｓ  Ａ，Ｋｏｙａｓｕ  Ｓ，Ｍａｋｉｎｏ  Ｙ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖ  ａｌｐｈａ  １４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６  Ｏｃｔ  １；９３（２０）：１１０２５−８、Ｍａｋｉｎｏ  Ｙ，Ｋａｎｎｏ  Ｒ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｌｐｈａ１４＋  ＮＫ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６  Ｊｕｎ  ２５；９３（１３）：６５１６−２０］、認識する分子もＭＨＣクラスＩ類似の抗原提示分子であるＣＤ１ｄ分子であることが明らかにされている［Ｂｅｎｄｅｌａｃ  Ａ，Ｌａｎｔｚ  Ｏ，Ｑｕｉｍｂｙ  ＭＥ，Ｙｅｗｄｅｌｌ  ＪＷ，Ｂｅｎｎｉｎｋ  ＪＲ，Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ  ＲＲ，ＣＤ１  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ＮＫ１＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５  Ｍａｙ  １２；２６８（５２１２）：８６３−５、Ａｄａｃｈｉ  Ｙ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｚｉｊｌｓｔｒａ  Ｍ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖ  ａｌｐｈａ  １４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎｏｎ−ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９５  Ｆｅｂ  １４；９２（４）：１２００−４］。最近、糖脂質の１つであるα−ガラクトシルセラミドをＣＤ１ｄに提示することによってＮＫＴ細胞を特異的に活性化させることができることが示された［Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔｏｕｒａ  Ｉ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ，Ｍｏｔｏｋｉ  Ｋ，Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｒ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，ＣＤ１ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｄ  ＴＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｌｐｈａ１４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７  Ｎｏｖ  ２８；２７８（５３４３）：１６２６−９、Ｃｕｉ  Ｊ，Ｓｈｉｎ  Ｔ，Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，Ｔｏｕｒａ  Ｉ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｋａｎｎｏ  Ｍ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｖａｌｐｈａ１４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＩＬ−１２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｊｅ��ｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７  Ｎｏｖ  ２８；２７８（５３４３）：１６２３−６］。リガンドによって活性化されたＮＫＴ細胞は、迅速に大量のＩＦＮγとＩＬ−４を産生し、パーフォリン／グランザイムＢを介した強力な細胞傷害活性を発揮する。さらにその後、さまざまな免疫反応が誘起され、その結果として強い抗腫瘍作用が発揮されるというユニークな作用機構を有することが明らかになった。α−ガラクトシルセラミドは、マウスの各種肝転移モデルにおいてＮＫＴ細胞依存的に顕著な抗腫瘍効果を発揮したことが報告されている［Ｍｏｒｉｔａ  Ｍ，Ｍｏｔｏｋｉ  Ｋ，Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｔｏｒｉ  Ｔ，Ｓａｋａｉ  Ｔ，Ｓａｗａ  Ｅ，ＹａｍａｊｉＫ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ１６−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９５  Ｊｕｎ  ９；３８（１２）：２１７６−８７、Ｎａｋａｇａｗａ  Ｒ，Ｍｏｔｏｋｉ  Ｋ，Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｉｉｊｉｍａ  Ｒ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，Ｓｈｉｍｏｓａｋａ  Ａ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎ２６  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ＫＲＮ７０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８  Ｍａｒ  １５；５８（６）：１２０２−７、Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔｏｕｒａ  Ｉ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，Ｈａｒａｄａ  Ｍ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｙ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｌｉｋｅ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｖａｌｐｈａ１４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８  Ｍａｙ  １２；９５（１０）：５６９０−３］。また、α−ガラクトシルセラミドは、マウスＮＫＴ細胞のみならず、ヒトＮＫＴ細胞も特異的に活性化できることが見出された［Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｋａｍａｄａ  Ｎ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ，Ｈａｒａｄａ  Ｍ，Ｏｇｕｒａ  Ｎ，Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｉｉｚａｓａ  Ｔ，Ｅｎｄｏ  Ｈ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｔ，Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｈ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｇａｎｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｖ  ａｌｐｈａ２４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｏｃｔ  １５；５９（２０）：５１０２−５］。これらの結果にもとづき、固形癌の患者を対象にしたα−ガラクトシルセラミドのＩＶ投与による第１相治験がオランダにて実施されている［Ｇｉａｃｃｏｎｅ  Ｇ，Ｐｕｎｔ  ＣＪ，Ａｎｄｏ  Ｙ，Ｒｕｉｊｔｅｒ  Ｒ，Ｎｉｓｈｉ  Ｎ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｍ，ｖｏｎ  Ｂｌｏｍｂｅｒｇ  ＢＭ，Ｓｃｈｅｐｅｒ  ＲＪ，���ａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ＨＪ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ  ＡＪ，Ｒｏｅｌｖｉｎｋ  Ｍ，Ｂｅｉｊｎｅｎ  Ｊ，Ｚｗｉｅｒｚｉｎａ  Ｈ，Ｐｉｎｅｄｏ  ＨＭ，Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｇａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｄｅｃ．８：（１２）；３７０２−９］。
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ＤＣ）は、Ｔ細胞依存性の免疫応答において最も強力な抗原提示細胞である。癌患者では、腫瘍から分泌されるＩＬ−１０やＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）などによって、ＤＣの成熟、活性化および動員が阻害されていると言われている。しかし、ＤＣの前駆細胞を体外に取り出して成熟過程へと誘導して、さらに腫瘍特異的抗原をパルスして腫瘍抗原特異的免疫能を与えた後に、癌患者に再輸注するならば、前記の生体内でのＤＣの成熟、活性化の抑制状況を打破して、有効な治療となることが期待されている。既に、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎細胞癌などに対しＤＣによる癌ワクチン療法（ＤＣ療法）の臨床試験が開始されており、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導や腫瘍縮小効果を認めたという予備的な報告がなされている。ＤＣ療法に伴う副作用としては、悪寒、発熱等が報告されている。世界的には、副作用として自己抗体の出現（抗甲状腺抗体など）や慢性関節リウマチを発症したという報告はあるが、他に重篤な副作用、合併症は報告されておらず、ＤＣ療法は比較的安全な治療法であると考えられる。しかし、腫瘍特異的な分子を利用する一般的なＤＣ療法では、その特異性があるために限られた腫瘍にしか有効性が期待されず、またＭＨＣに拘束されるという点で、異なったＭＨＣの患者や、患者の腫瘍細胞においてＭＨＣクラスＩ分子の発現低下がみられる場合にはＣＴＬの標的とはなり得ない等の課題を有する。
他方、前述のα−ガラクトシルセラミドの抗腫瘍作用機構に基づけば、α−ガラクトシルセラミドをパルスされたＤＣを坦癌マウスに移入することにより抗腫瘍効果が得られることが予想された。動物を用いた検討結果より、悪性腫瘍転移モデルにおいてα−ガラクトシルセラミドを投与する時期を遅らせた場合は、転移抑制効果が認められなくなるが、α−ガラクトシルセラミドをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を担癌マウスに投与すると、投与時期をある程度遅らせてもほぼ完全に肺または肝転移が抑制されることが示された［Ｔｏｕｒａ  Ｉ，Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｏｃｈｉａｉ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９  Ｓｅｐ  １；１６３（５）：２３８７−９１］。このことは、生体内で効率良くＮＫＴ細胞を活性化するためには、α−ガラクトシルセラミドを単に投与するよりも、ＤＣに提示された形で投与した方が良いことを示唆している。
しかも、本治療法が利用するＣＤ１ｄ分子−ＮＫＴ細胞抗原受容体の系は万人で共通であるため、誰のＮＫＴ細胞でもα−ガラクトシルセラミドによって活性化することが可能である。また、活性化したＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現とは無関係に細胞傷害活性を起こすことから、癌特異的ペプチドをパルスするようなＤＣ療法の欠点を補完する利点を有すると考えられる。
千葉大学倫理委員会にて承認された「肺癌再発例ならびに進行肺癌患者を対象にしたα−Ｇａｌａｃｔｓｙｌ  Ｃｅｒｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）パルス細胞を用いた治療法」の安全性試験により、α−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞療法が安全に施行可能であることが判明した。また、「肺癌再発症例ならびに進行期肺癌症例を対象とした活性化ＮＫＴ細胞を用いた臨床研究」の安全性試験により活性化ＮＫＴ細胞の静脈投与が安全に施行可能であることが判明した。
これまで、肺癌の再発例を中心にα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の静脈投与による検討がなされている。第１相試験では移入細胞数をレベル１として５ｘ１０７／ｍ２、レベル２として２．５ｘ１０８／ｍ２、レベル３として１ｘ１０９／ｍ２とエスカレーションして試験が行われた。この結果、試験参加症例全１１例のうち、レベル３の細胞数を投与された一例に末梢血ＮＫＴ細胞の増加が観察された［Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ａ，Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ，Ｆｕｃｈｉｄａ  Ｈ，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ  Ｋ，Ｏｔｓｕｊｉ  Ｍ，Ｉｉｚａｓａ  Ｔ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｔ，Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｍａｒ  １；１１（５）：１９１０−７］。しかしながら、レベル１およびレベル２のα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の数量では、末梢血中のＮＫＴ細胞数の増加等の免疫応答は得られていない。
上述の様に、α−ガラクトシルセラミド等のＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与することにより、ＮＫＴ細胞リガンドを直接生体内へ投与する場合と比較して、より効率よくＮＫＴ細胞を刺激し、免疫を刺激し、腫瘍等の疾患を処置することが可能であるが、そのような効果を達成するためには、相当数の抗原提示細胞を用いる必要があり、その調製に大量の試薬を消費し、結果として費用がかさんでしまうという問題があった。また、（ａ）抗原提示細胞を調製するために、患者から大量の単核球細胞を採取する必要がある、（ｂ）大量の抗原提示細胞を点滴静注するため、投与に時間がかかる、等の理由により、患者に対する肉体的負担も大きい。そこで、用いる抗原提示細胞の数を減らしつつ、優れたＮＫＴ細胞刺激作用、免疫刺激作用、抗腫瘍作用等の効果を達成し得るような、抗原提示細胞の投与方法の開発が求められていた。
一方、本発明者らは、抗原をパルスされた樹状細胞を鼻腔粘膜下に投与することにより、樹状細胞が高選択的に頸部リンパ節に移行することを報告している。また、正常非転移頸部リンパ節内にはＮＫＴ細胞は検出されないが、頭頸部癌が転移した頸部リンパ節内には多数のＮＫＴ細胞が検出されたことを確認している（堀口茂俊、岡本美孝ら、「鼻粘膜樹状細胞の生体内移動」、耳鼻咽喉科免疫アレルギー、２１巻、２号、ｐ．１０−１１、２００３、千葉大学ＣＯＥ報告書、咽頭癌に対する細胞免疫療法ならびに重粒子治療の導入、ｐ．１１６−１１８、２００５）。従って、頭頸部癌が頸部リンパ節へ転移する前に、リンパ節内へＮＫＴ細胞を積極的に誘導し、頸部リンパ節内におけるＮＫＴ細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させる方法の開発が望まれる。
上記事情に鑑み、本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞療法において、出来るだけ少ない数の抗原提示細胞数を用いて、効率的且つ強力に、ＮＫＴ細胞を刺激し、免疫を刺激し、癌等の疾患を処置し得る、抗原提示細胞の投与方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ＮＫＴ細胞を選択的に頸部リンパ節内に誘導し、頸部リンパ節内におけるＮＫＴ細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させる方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００３】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞を上気道粘膜下へ投与することにより、通常頸部リンパ節内には存在しないＮＫＴ細胞が選択的に頸部リンパ節に誘導されることを見出した。更に該投与方法を用いれば、頸部リンパ節以外の組織（末梢血等）においても、極めて少量の抗原提示細胞により、効率的にＮＫＴ細胞が刺激され、全身的な免疫応答が刺激され得ることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下に関する。
（１）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、ＮＫＴ細胞刺激剤。
（２）ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、上記（１）記載の剤。
（３）上気道粘膜が鼻腔粘膜である、上記（１）記載の剤。
（４）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤。
（５）ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、上記（４）記載の剤。
（６）上気道粘膜が鼻腔粘膜である、上記（４）記載の剤。
（７）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、インターフェロンγ産生誘導剤。
（８）ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、上記（７）記載の剤。
（９）上気道粘膜が鼻腔粘膜である、上記（７）記載の剤。
（１０）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする、免疫刺激剤。
（１１）ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、上記（１０）記載の剤。
（１２）上気道粘膜が鼻腔粘膜である、上記（１０）記載の剤。
（１３）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、ＮＫＴ細胞を刺激する方法。
（１４）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、頸部リンパ節内にＮＫＴ細胞を誘導する方法。
（１５）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、インターフェロンγ産生を誘導する方法。
（１６）ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を、上気道粘膜下に投与することを含む、免疫反応を刺激する方法。
（１７）上気道粘膜下に投与されるＮＫＴ細胞刺激剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
（１８）上気道粘膜下に投与される頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
（１９）上気道粘膜下に投与されるインターフェロンγ産生誘導剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
（２０）上気道粘膜下に投与される免疫刺激剤を製造するための、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の使用。
本発明の剤を用いれば、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、免疫反応を刺激し、癌等の疾患を治療し得る。これにより、抗原提示細胞の調製に用いる試薬を大幅に節約することが可能となり、治療全体のコストが軽減する。また、抗原提示細胞の調製のために患者から採取される単核球細胞の量を大幅に減らすことが可能となり、また抗原提示細胞の投与にかかる時間が短縮されるので、患者への負担が軽減する。更に、治療に要するＮＫＴ細胞リガンドの量も大幅に減少するので、治療における安全性がより向上する。
更に、本発明の剤を用いれば、ＮＫＴ細胞を選択的に頸部リンパ節内に誘導し、頸部リンパ節内におけるＮＫＴ細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、投与された樹状細胞表面のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８６の発現を示す。ゲート中の数字は、陽性細胞の割合を示す（％）。
図２は、末梢血中のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）（上段）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞）（下段）を示す。ゲート中の数字は、各ゲート内の細胞数の割合を示す（％）。矢印は、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与を示す。
図３は、末梢血１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を示す。
図４は、エリスポット法で得られた、末梢血単核球分画に含まれる、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によりγインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。
図５は、投与された樹状細胞表面のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８６の発現を示す。ゲート中の数字は、陽性細胞の割合を示す（％）。
図６は、末梢血中のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）（上段）およびＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞）（下段）を示す。ゲート中の数字は、各ゲート内の細胞数の割合を示す（％）。矢印は、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与を示す。
図７は、末梢血１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を示す。
図８は、エリスポット法で得られた、末梢血単核球分画に含まれる、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によりγインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。
図９は、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の鼻腔粘膜下投与によるＮＫＴ細胞の頸部リンパ節内への誘導を示す。
図１０は、末梢血及びリンパ節中のＮＫＴ細胞の検出結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする剤（ＮＫＴ細胞刺激剤、頸部リンパ節内ＮＫＴ細胞誘導剤、インターフェロンγ産生誘導剤又は免疫刺激剤）を提供するものである。上気道粘膜下に投与することにより、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、インターフェロンγ産生を誘導し、免疫反応を刺激し得る。また、上気道粘膜下にＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与することにより、頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞を誘導することが出来る。
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示された下記の「ＮＫＴ細胞リガンド」を認識する。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３，ｐ．８７０８−８７１２，１９８６；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８，ｐ．７５１８−７５２２，１９９１；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８０，ｐ．１０９７−１１０６，１９９４）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
「ＮＫＴ細胞リガンド」とは、ＣＤ１分子上に提示されたときに、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体により特異的に認識され、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「ＮＫＴ細胞リガンド」としては、例えば、α−グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６，ｐ．１７８６−１７８９，２００４）、ＯＣＨ（Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：５３１，２００１）等を挙げることができる。α−グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、ＷＯ９３／０５０５５、ＷＯ９４／０２１６８、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／２４１４２、およびＷＯ  ９８／４４９２８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，ｐ．１６２６−１６２９，１９９７等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（本明細書中、α−ガラクトシルセラミド又はα−ＧａｌＣｅｒと称する）が好ましい。
本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ＮＫＴ細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
また、本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その溶媒和物（水和物等）をも含む意味として用いられる。
抗原提示細胞とは、抗原をリンパ球に提示してリンパ球の活性化を促す細胞をいう。通常、抗原提示細胞は、Ｔ細胞やＮＫＴ細胞に抗原を提示し得る樹状細胞又はマクロファージである。特に、樹状細胞は、強力な抗原提示能力を有しており、細胞表面上に発現されたＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ様分子（ＣＤ１等）、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ等を介して抗原を提示し、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞を活性化させ得るので、本発明に好ましく用いられる。本発明において、抗原提示細胞は、ＮＫＴ細胞リガンドをＮＫＴ細胞に確実に提示し得るように、ＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）発現細胞であることが好ましい。
抗原提示細胞としては、任意の哺乳動物由来のものを用いることが出来る。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
本発明の剤に含有される抗原提示細胞の遺伝子型は、特に限定されないが、通常、本発明の剤が投与される対象と同種同系、同種異系又は異種異系であり、好ましくは同種同系又は同種異系である。拒絶反応を回避するために、抗原提示細胞は、本発明の剤が投与される対象と同種同系であることが好ましく、本発明の剤が投与される対象由来（即ち、自家樹状細胞）であることがより好ましい。
抗原提示細胞は自体公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血等）から単離することが可能である。例えば抗原提示細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により樹状細胞を単離することができる。抗原提示細胞として樹状細胞を単離する場合には、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーとして、例えば、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ様分子（ＣＤ１等）、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ、ＣＤ８α、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＦＤＬ−Ｍ１、ＤＥＣ−２０５等を用いることが出来る。
また、抗原提示細胞は、上述の哺乳動物の骨髄細胞や単核球等を適切な抗原提示細胞分化条件で培養することにより製造することもできる。例えば、骨髄細胞はＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−４）の存在下で約６日間程度培養されることにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞：ＢＭＤＣ）へと分化する（Ｎａｔｕｒｅ，４０８，ｐ．７４０−７４５，２０００）。また、末梢血液中の単核球（特に単球、マクロファージ等）をＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−２及び／又はＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞を得ることが出来る（文献名：Ｍｏｔｏｈａｓｉ  Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｓ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｍａｇａｒａ  ＫＫ，Ｍｉｋｕｎｉ  Ｏ，Ｋａｍａｄａ  Ｎ，Ｉｉｚａｓａ  Ｔ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｖａｌｐｈａ２４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２，Ｎｏｖ．１０；１０２（２）：１５９−１６５．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３，Ｍａｙ  １０；１０４（６）：７９９）。
「抗原提示細胞へのＮＫＴ細胞リガンドのパルス」とは、ＮＫＴ細胞リガンドを抗原提示細胞表面に、該リガンドがＮＫＴ細胞へ提示され得るように、配置することをいう。より具体的には、ＮＫＴ細胞リガンドを、抗原提示細胞表面に発現されたＣＤ１分子上に提示させることを意味する。抗原提示細胞へのＮＫＴ細胞リガンドのパルスは、ＮＫＴ細胞リガンドを抗原提示細胞へ接触させることにより達成することが出来る。例えばＮＫＴ細胞リガンドを含有する生理的な培養液中で抗原提示細胞が培養される。この場合、培養液中のＮＫＴ細胞リガンドの濃度は、ＮＫＴ細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍｌである。また、培養液としては、例えば、適切な添加物（血清、アルブミン、緩衝剤、アミノ酸等）を含んでいてもよい基礎培地（最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）などを挙げることが出来る。培養液のｐＨは通常約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。更に、培養後に抗原提示細胞を、ＮＫＴ細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄し、フリーのＮＫＴ細胞リガンドを除去することにより、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞が単離される。
本発明の剤は、有効成分としてＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、本発明の剤は、有効量の活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
本発明の剤は、通常は、注射剤、点滴剤等の剤型で提供される。本発明の剤は、好ましくは、受容者の体液（血液等）と等張な滅菌水性担体中に、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞が懸濁された懸濁液である。該水性担体としては、生理食塩水、ＰＢＳ等を挙げることが出来る。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することもできる。
本発明の剤中に含まれるＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の濃度は、通常、約１×１０５〜１×１０１０個／ｍｌ、好ましくは約２×１０５〜１×１０９個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。
本発明の剤は安全であり、任意の哺乳動物に投与することが出来る。哺乳動物としては、上述の哺乳動物を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
本発明の剤は、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする。上気道粘膜とは、鼻腔から気管に至る上気道（鼻腔、咽頭、扁桃、喉頭、気管等）の表面に存在する粘膜をいう。鼻腔粘膜には免疫担当細胞や血管が豊富に存在するため、本発明の剤は、好ましくは鼻腔粘膜下に投与される。鼻腔粘膜は、上・中・下鼻甲介粘膜、上・中・下鼻道粘膜、鼻中隔粘膜等からなるが、免疫担当細胞が豊富に存在し、且つ、投与が容易であることから、本発明の剤は、より好ましくは下鼻甲介粘膜下に、更に好ましくは下鼻甲介粘膜前方粘膜下に投与される。「粘膜下投与」とは、有効成分を粘膜上皮下の固有層内に注入することをいう。
本発明の剤の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、疾患の種類、疾患の重篤度、ＮＫＴ細胞リガンドの種類等により異なるが、通常、１回の投与につき、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の数として、通常１×１０６〜１×１０９個／ｍ２、好ましくは１×１０７〜１×１０９個／ｍ２の用量で投与される。しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。
本発明の剤を用いれば、頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞を誘導することが出来る。この選択性は厳格であって、樹状細胞が投与される上気道粘膜の部位と同じ側（ｉｐｓｉｌａｔｅｌｒａｌ）の頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞が誘導される。例えば、右側の鼻腔粘膜下にＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与すると、右側の頸部リンパ節に選択的にＮＫＴ細胞が誘導される。リガンドによって活性化されたＮＫＴ細胞は、迅速に大量のインターフェロンγとＩＬ−４を産生し、パーフォリン／グランザイムＢを介した強力な細胞傷害活性を発揮し、さらにその後さまざまな免疫反応を誘起し、その結果として強い抗腫瘍作用が発揮されるというユニークな作用機構を有することが報告されている［Ｍｏｒｉｔａ  Ｍ，Ｍｏｔｏｋｉ  Ｋ，Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｔｏｒｉ  Ｔ，Ｓａｋａｉ  Ｔ，Ｓａｗａ  Ｅ，Ｙａｍａｊｉ  Ｋ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ１６−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９５  Ｊｕｎ  ９；３８（１２）：２１７６−８７、Ｎａｋａｇａｗａ  Ｒ，Ｍｏｔｏｋｉ  Ｋ，Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｉｉｊｉｍａ  Ｒ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，Ｓｈｉｍｏｓａｋａ  Ａ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎ２６  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ＫＲＮ７０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８  Ｍａｒ  １５；５８（６）：１２０２−７、Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｋｏｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔｏｕｒａ  Ｉ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，Ｈａｒａｄａ  Ｍ，Ｋｏｓｅｋｉ  Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｙ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｌｉｋｅ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｖａｌｐｈａ１４  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８  Ｍａｙ  １２；９５（１０）：５６９０−３］。従って、本発明の剤を用いれば、頸部リンパ節内におけるＮＫＴ細胞を介した免疫反応を選択的に誘導することができるので、本発明の剤は、頭頸部領域の悪性腫瘍（鼻・副鼻腔癌、咽頭癌、口腔癌、喉頭癌、甲状腺癌、唾液腺癌等）、上気道におけるアレルギー疾患（鼻アレルギー等）等の予防・治療に有用であり得る。
また、本発明の剤を用いれば、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、ＮＫＴ細胞の増殖や、サイトカイン（インターフェロンγ、ＩＬ−４等）産生を誘導することができる。特に、本発明の剤を用いれば、頸部リンパ節のみならず、末梢血中のＮＫＴ細胞をも極めて効率的に刺激することが可能となる。従って、本発明の剤を用いれば、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的に免疫反応を刺激することが可能であり、腫瘍、アレルギー等の疾患を予防・治療し得る。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
（対象症例）
以下の基準を満たす頭頸部癌患者が選択された。
選択基準；
１．頭頸部進行癌症例（ＩＩＩ、ＩＶ期）
２．年齢：２０〜８０歳
３．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｔｕｓ：０〜２
４．下記の検査値を満たしている症例（登録前４週間以内の測定結果）
白血球数≧３，０００／ｍＬ、血小板数≧７５，０００／ｍＬ、血清クレアチン≦１．５ｍｇ／ｄＬ、総ビリルビン≦１．５ｍｇ／ｄＬ、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）≦２．５Ｘ基準値上限
５．本人または代諾者からの文書による同意が得られている症例
６．末梢血にＮＫＴ細胞が存在する症例（１０個以上／末梢血１ｍｌ）
除外基準；
１．本臨床研究に参加する４週以内に化学療法あるいは放射線療法を施行している症例
２．予後が６ヶ月に満たないと考えられる症例
３．活動性の感染症を有する症例
４．肝炎及びその既往を有する症例
５．ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体又はＨＴＬＶ−１抗体が陽性の症例
６．同時性重複癌の症例
７．重篤な心疾患のある症例（ＮＹＨＡ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ以上）
８．併用薬としてコルチコステロイドを使用している症例
９．妊娠あるいは妊娠の可能性のある女性。授乳期の女性。
１０．アルブミン過敏症の既往を有する症例
１１．自己免疫疾患を有する症例
１２．医学的、心理的要因もしくは他の要因により、担当医が本臨床研究への参加を不適当と判断した症例
（方法）
α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の調製
上記基準に合致した頭頸部癌患者から末梢血を採取（約１００ｍｌ）した。さらに密度勾配遠心により単核球を分離した。投与量に十分と考えられる単核球細胞（残りは凍結保存）を、８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎｅＴｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｉｍｍｕｎａｓｅ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）及び５％自己血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中で７〜１４日間培養した。投与前日に１００ｎｇ／ｍｌ  α−ＧａｌＣｅｒ（ＫＲＮ７０００；Ｋｉｒｉｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ）を加えて１日間培養しα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞（ＤＣ）とした。細胞を洗浄後、２．５％アルブミン加生理食塩水に懸濁し同一患者の鼻腔粘膜に粘膜下投与した。
投与経路及び用量
α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞を、２．５％アルブミン加生理食塩水に浮遊し（約０．２ｍｌ）、患者の下鼻甲介の基部粘膜下に輸注した。樹状細胞投与量は、１ｘ１０８個／ｍ２とした。
５週間にわたる試験期間のうち、ｄａｙ７及びｄａｙ１４に、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞を鼻腔粘膜下に投与した。
（評価項目）
ＮＫＴ細胞数評価
投与前後５週間にわたり毎週採血を行い、末梢血ＮＫＴ細胞の増減を評価した。該評価は下記抗体を用いたフローサイトメトリーにより行った。ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞をＮＫＴ細胞とした。末梢血１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数を測定し、経時的に比較した。また、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞をＮＫ細胞とし、コントロールとしてＮＫ細胞数を経時的に測定した。
抗ヒトＶα２４マウスモノクローナル抗体（Ｃ１５；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）
抗ヒトＶβ１１マウスモノクローナル抗体（Ｃ２１；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）
抗ヒトＣＤ３マウスモノクローナル抗体（ＵＣＴＨ１；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）
抗ヒトＣＤ５６マウスモノクローナル抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）
ＮＫＴ細胞機能評価
投与前後５週間にわたり毎週採血を行い、末梢血単核球を分離し凍結保存した。６週目に細胞を解凍し、エリスポット法でα−ガラクトシルセラミドでγインターフェロン産生細胞の頻度を測定した。エリスポットアッセイは、キット（ＭＡＢＴＥＣＨ社製）及びニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、製造者の指示書に従い行った。細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ  α−ＧａｌＣｅｒを含む無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で１８時間培養することにより刺激された。発色はＢＣＩＰ／ＮＢＴシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。スポットのカウントはコンピューター画像解析によって客観的に計測された。
（結果）
症例１：５４歳  男性。中咽頭癌（Ｔ４Ｎ２ｃＭ１）の再発例。
樹状細胞のプロファイル
投与した樹状細胞のプロファイルとして、細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、及びＣＤ８６の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ、それぞれの表面抗原の強発現が確認された（図１）。
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
図２にフローサイトメトリー法で得られた末梢血中のＮＫＴ細胞（上段）およびＮＫ細胞（下段）を示す。さらに１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を測定した（図３）。鼻腔粘膜下へα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の一回投与により、末梢血ＮＫＴ細胞の数量が増加した。一方、末梢血ＮＫ細胞の数量は、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与による顕著な変化は認められなかった。
２）機能変化
図４にエリスポット法で得られた、末梢血単核球分画に含まれる、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によりγインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。末梢血ＮＫＴ細胞数に呼応するように、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与に応答して、γインターフェロン産生細胞数が増加した。
症例２：４８歳  女性。左上顎癌（Ｔ３ＮＯＭＯ）の再発例。
樹状細胞のプロファイル
投与した樹状細胞のプロファイルとして、細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、及びＣＤ８６の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ、それぞれの表面抗原の発現が確認された（図５）。
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
図６にフローサイトメトリー法で得られた末梢血中のＮＫＴ細胞（上段）およびＮＫ細胞（下段）を示す。さらに１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を測定した（図７）。鼻腔粘膜下へα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の一回投与により、末梢血ＮＫＴ細胞の数量が増加した。一方、末梢血ＮＫ細胞の数量は、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与による顕著な変化は認められなかった。
２）機能変化
図８にエリスポット法で得られた、末梢血単核球分画に含まれる、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によりγインターフェロンを産生した細胞数の変化を示す。末梢血ＮＫＴ細胞数に呼応するように、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の投与に応答して、γインターフェロン産生細胞数が増加した。
これまで、肺癌の再発例を中心にα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の静脈投与による検討がなされている［Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ａ，Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ，Ｆｕｃｈｉｄａ  Ｈ，Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ  Ｋ，Ｏｔｓｕｊｉ  Ｍ，Ｉｉｚａｓａ  Ｔ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｔ，Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｍａｒ  １；１１（５）：１９１０−７］。それによると、第１相試験では移入細胞数をレベル１として５ｘ１０７／ｍ２、レベル２として２．５ｘ１０８／ｍ２、レベル３として１ｘ１０９／ｍ２とエスカレーションして試験が行われた。この結果、試験参加症例全１１例のうち、レベル３の細胞数を投与された一例に末梢血ＮＫＴ細胞の増加が観察されている。しかしながら、レベル１およびレベル２のα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の数量では末梢血にＮＫＴ細胞の増加する免疫応答は得られていない。
これに対して、実施例に示すように、α−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞を上気道粘膜下へ投与すると、わずか１×１０８／ｍ２の用量で、末梢血中のＮＫＴ細胞の数の増加が認められた。更に、数量のみならず、機能的にもＮＫＴ細胞のα−ＧａｌＣｅｒに対するサイトカイン（インターフェロンγ）産生応答が増強された。
以上の結果より、ＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞を上気道粘膜下に投与することにより、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的に末梢中のＮＫＴ細胞を刺激し得ることが示された。
［実施例２］
実施例１と同様に調製されたα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞を、２．５％アルブミン加生理食塩水に浮遊し（約０．２ｍｌ）、頭頸部癌患者の左側鼻腔内の下鼻甲介の基部粘膜下に輸注した。樹状細胞投与量は、１ｘ１０８個／ｍ２とした。投与から２日後に、バイオプシーにより左右の頸部リンパ節からリンパ球を採取し、実施例１と同様にフローサイトメトリーにより、採取されたリンパ球内にＮＫＴ細胞が含まれるか否かを試験した。ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞をＮＫＴ細胞とした。
その結果、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞が投与された部位と同じ側の頸部リンパ節内にＮＫＴ細胞の存在が認められたが、反対側の頸部リンパ節内にはＮＫＴ細胞の存在が認められなかった（図９）。
以上の結果より、α−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞の上気道粘膜下投与により、ＮＫＴ細胞が選択的に頸部リンパ節に誘導されることが示された。
［参考例１］
実施例１及び２と同様に、頭頸部癌患者の末梢血及び非転移頸部リンパ節よりリンパ球を採取し、フローサイトメトリーにより、採取されたリンパ球内にＮＫＴ細胞が含まれるか否かを試験した。ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞をＮＫＴ細胞とした。
その結果、末梢血中のリンパ球中にはＮＫＴ細胞の存在が認められたが、非転移リンパ節内にはＮＫＴ細胞は検出されなかった（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の剤を用いれば、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、免疫反応を刺激し、癌等の疾患を治療し得る。これにより、抗原提示細胞の調製に用いる試薬を大幅に節約することが可能となり、治療全体のコストが軽減する。また、抗原提示細胞の調製のために患者から採取される単核球細胞の量を大幅に減らすことが可能となり、また抗原提示細胞の投与にかかる時間が短縮されるので、患者への負担が軽減する。更に、治療に要するＮＫＴ細胞リガンドの量も大幅に減少するので、治療における安全性がより向上する。
更に、本発明の剤を用いれば、ＮＫＴ細胞を選択的に頸部リンパ節内に誘導し、頸部リンパ節内におけるＮＫＴ細胞を介した抗腫瘍免疫を活性化させることが可能となる。
本出願は日本で出願された特願２００５−２９４１２４（出願日：２００５年１０月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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