(57)【要約】  ｃＲＮＡの収率の低下を防止することができるｃＲＮＡの調製方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、（ａ）逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び前記一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させ、（ｂ）前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下で接触させ、（ｃ）前記反応液から前記固体支持体を分離し、（ｄ）前記固体支持体から二本鎖ｃＤＮＡを溶離させ、（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製するための転写反応を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とするｃＲＮＡの調製方法。
（ａ）逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び前記一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させる工程
（ｂ）前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下で接触させる工程
（ｃ）前記反応液から前記固体支持体を分離する工程
（ｄ）前記固体支持体から二本鎖ｃＤＮＡを溶離させる工程
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製するための転写反応を行う工程
【請求項２】
前記工程（ｂ）において、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下かつアンモニウムイオンの存在下で、前記反応液と前記固体支持体とを接触させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）で分離した前記固体支持体をアンモニウムイオンの存在下で洗浄する工程を前記工程（ｄ）の前に含むことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体が粒子であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記粒子が磁性体粒子であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、磁石を使用して前記反応液から前記磁性体粒子を分離することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ｃＲＮＡがマイクロアレイ解析用サンプルである請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＲＮＡの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡアレイを用いた解析（例えば遺伝子発現解析）は、例えば、解析対象であるサンプル核酸とＤＮＡアレイとを接触させ、サンプル核酸のハイブリダイズの有無を検出することにより行われる。遺伝子発現解析は、総ＲＮＡ内に含まれるｍＲＮＡの定量を目的とした解析であるが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ法等の増幅方法を利用してサンプル核酸を調製する場合、プライマーの設定の仕方によっては、調製されたサンプル核酸量が鋳型であるｍＲＮＡ量の反映しない（定量性が損なわれる）可能性がある。また、ｍＲＮＡは非常に不安定で壊れ易いため、極端な温度変化が生じる増幅方法を利用してサンプル核酸を調製する場合、十分量のサンプル核酸を調製できない可能性がある。【０００３】
これらの問題点を解消する方法としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）２４プライマーを用いた逆転写反応が開発された。この逆転写反応を利用したサンプル核酸の調製方法は次の通りである。まず、生体材料等からｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを調製する。次いで、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）で処理し、一本鎖ｃＤＮＡを調製する。次いで、一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製する。次いで、インビトロ転写反応により二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製する。こうして調製されたｃＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ等の増幅方法によって調製されたサンプル核酸よりも定量性が保たれており、細胞内のｍＲＮＡ量を反映しているため、遺伝子発現解析の精度が向上する。【０００４】
一方、核酸精製技術として、Ｃｈａｒｇｅ Ｓｗｉｔｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ，登録商標）と呼ばれる技術が知られている（特許文献１，特許文献２，非特許文献１）。ＣＳＴにおいては、カチオン性基を表面に有する固体支持体（例えば磁性体粒子）と核酸とを、酸性条件下で接触させる。カチオン性基を表面に有する固体支持体と核酸とを、酸性条件下で接触させると、カチオン性基が正に帯電し、負に帯電している核酸がカチオン性基に静電的に結合する。固体支持体と核酸とを接触させる際、塩濃度を調節することにより、正に帯電したカチオン性基に結合できる核酸のサイズを調節することができる。したがって、固体支持体を分離することにより所望のサイズの核酸を単離することができる。正に帯電したカチオン性基に静電的に結合している核酸は、アルカリで処理してカチオン性基の電荷を中和することにより溶離させることができる。
【特許文献１】特表２００４−５０１０５４号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９９／２９７０３号パンフレット
【非特許文献１】インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社 Ｃｈａｒｇｅ Ｓｗｉｔｈ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ カタログＮｏ．ＣＳ１２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後の反応液にＲＮａｓｅＨが変性又は失活せずに残存していると（例えば、有機溶媒、タンパク質変性剤等が反応液に含有されてない場合、反応液にはＲＮａｓｅＨが変性又は失活せずに残存している）、カチオン性基を表面に有する固体支持体を用いて、当該反応液から二本鎖ｃＤＮＡを単離する際、ＲＮａｓｅＨが固体支持体に結合し、単離された二本鎖ｃＤＮＡにＲＮａｓｅＨが混入してしまうため、二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製する際、ｃＲＮＡがＲＮａｓｅＨによって分解され、ｃＲＮＡの収率が低下することを見出した。【０００６】
そこで、本発明者は、逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後の反応液から、カチオン性基を表面に有する固体支持体を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製する方法であって、ｃＲＮＡの収率の低下を防止することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明のｃＲＮＡの調製方法は、下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とする。
（ａ）逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び前記一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させる工程
（ｂ）前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下で接触させる工程
（ｃ）前記反応液から前記固体支持体を分離する工程
（ｄ）前記固体支持体から二本鎖ｃＤＮＡを溶離させる工程
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製するための転写反応を行う工程【０００８】
反応液にＲＮａｓｅＨが変性又は失活せずに残存している場合（例えば、有機溶媒、タンパク質変性剤等が反応液に含有されてない場合）、カチオン性基を表面に有する固体支持体を用いて反応液から二本鎖ｃＤＮＡを単離する際、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨが固体支持体に結合し、単離された二本鎖ｃＤＮＡにＲＮａｓｅＨが混入してしまうため、二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製する際、ｃＲＮＡがＲＮａｓｅＨによって分解され、ｃＲＮＡの収率が低下してしまうが、本発明のｃＲＮＡの調製方法においては、カチオン性基を表面に有する固体支持体を用いて反応液から二本鎖ｃＤＮＡを単離する前に、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させるので、ＲＮａｓｅＨによるｃＲＮＡの収率の低下を防止することができる。【０００９】
本発明のｃＲＮＡの調製方法では、前記工程（ｂ）において、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下かつアンモニウムイオンの存在下で、前記反応液と前記固体支持体とを接触させることが好ましい。これにより、正に帯電したカチオン性基に対するｄＮＴＰの結合を防止することができるので、正に帯電したカチオン性基に二本鎖ｃＤＮＡを効率よく結合させることができる。【００１０】
本発明のｃＲＮＡの調製方法は、前記工程（ｃ）で分離した前記固体支持体をアンモニウムイオンの存在下で洗浄する工程を前記工程（ｄ）の前に含むことが好ましい。これにより、固体支持体に結合したｄＮＴＰを離脱させることができる。【００１１】
本発明のｃＲＮＡの調製方法において、前記固体支持体が粒子であることが好ましい。これにより、固体支持体を反応液中に分散させることができるので、固体支持体表面に存在するカチオン性基と二本鎖ｃＤＮＡとの反応性を向上させることができる。【００１２】
本発明のｃＲＮＡの調製方法において、前記粒子が磁性体粒子であることが好ましい。これにより、磁石を用いて液体中に分散している固体支持体を捕集し、固体支持体を液体から容易に分離することができるので、ｃＲＮＡの調製の自動化を実現することができる。【００１３】
本発明のｃＲＮＡの調製方法において、前記工程（ｃ）において、磁石を使用して前記反応液から前記磁性体粒子を分離することが好ましい。これにより、磁石を用いて液体中に分散している固体支持体を捕集し、固体支持体を液体から容易に分離することができるので、ｃＲＮＡの調製の自動化を実現することができる。【００１４】
本発明のｃＲＮＡの調製方法において、前記ｃＲＮＡがマイクロアレイ解析用サンプルであることが好ましい。すなわち、本発明のｃＲＮＡの調製方法は、マイクロアレイ解析用サンプルの調製に適している。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後の反応液から、カチオン性基を表面に有する固体支持体を用いて二本鎖ｃＤＮＡを単離する前に、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させるので、ＲＮａｓｅＨの混入によるｃＲＮＡの収率の低下を効果的に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図２】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図３】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図４】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図５】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図６】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図７】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図８】Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を示す図である。
【図９】ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイを用いたサンプルの測定結果を示す図である。
【図１０】サンプルのプロファイル間の相関関係をｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔにて比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
工程（ａ）
工程（ａ）は、逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び前記一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させる工程である。【００１８】
逆転写反応は、ｍＲＮＡを鋳型として行われる。ｍＲＮＡは、例えば、生物試料、環境試料等から常法に従って調製することができる。生物試料としては、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物、細菌培養物等）が挙げられ、環境試料としては、例えば、土壌、水、空気等が挙げられる。生物試料が由来する生物は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、酵母、カビ、細菌、ウイルス等が挙げられる。ｍＲＮＡは、例えば、生物試料、環境試料等をグアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等により調製することができる。【００１９】
逆転写反応を行うにあたり、まずｍＲＮＡの高次構造を分解する。この際の反応温度は通常６５〜７５℃、好ましくは７０℃であり、反応時間は通常５〜１５分、好ましくは１０分である。【００２０】
逆転写反応による一本鎖目のｃＤＮＡの合成は常法に従って行うことができる。この際、反応温度は通常３７〜４５℃、好ましくは４２℃であり、反応時間は通常３０〜１２０分、好ましくは１２０分である。逆転写反応は、プライマー及び逆転写酵素を用いて行われる。逆転写反応に用いられるプライマーは、鋳型ＲＮＡにアニーリングできる限り特に限定されるものではなく、例えば、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマー、ランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）等が挙げられる。逆転写用プライマー（例えば、発現解析に一般的に使用されるオリゴｄＴプライマー）の塩基長は、通常２０〜５０塩基、好ましくは４０塩基である。プライマーは２００ｐｍｏｌ付近（通常１５０〜２５０ｐｍｏｌ、好ましくは２００ｐｍｏｌ）の最終濃度で使用されるのが好ましい。逆転写反応に用いられる逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）等が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ（例えば、サーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ））等を使用することができる。なお、実施例では最も一般的に使用されているＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使用した。【００２１】
逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理することにより、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドのうちｍＲＮＡが分解され、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖目のｃＤＮＡを合成することができる。二本鎖目のｃＤＮＡは常法に従って合成することができる。一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する際、ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼ等を通常１０Ｕ/μＬの濃度で使用することができる。この際、反応温度は通常１４〜２０℃、好ましくは１６℃であり、反応時間は通常１２０〜１５０分、好ましくは１２０分である。ＲＮａｓｅＨによる処理は常法に従って行うことができる。ＲＮａｓｅＨの濃度は、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドの濃度等に応じて適宜調節することができるが、通常１〜５ユニット／μＬ、好ましくは２ユニット／μＬである。【００２２】
逆転写反応及び一本鎖ｃＤＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの調製には、ＤＮＡ合成の基質として、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）が使用される。なお、「ｄＮＴＰ」は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰのうち１種又は２種以上の混合物を意味し得るが、通常は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの混合物を意味する。【００２３】
逆転写反応により調製されたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応、及び一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応を行った後の反応液には、二本鎖ｃＤＮＡ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、ＲＮａｓｅＨ等が含まれる。反応液は通常緩衝液であり、有機溶媒、タンパク質変性剤等は含まれていないため、ＲＮａｓｅＨは変性又は失活せずに反応液に残存している。なお、「反応液」には、反応直後の反応液の他、反応直後の反応液に所望の処理（例えば、濃縮、希釈、精製等）を施したものも含まれる。【００２４】
ＲＮａｓｅＨを失活させる方法は特に限定されるものではない。例えば、発現解析用市販試薬には、通常、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ等の還元剤が含有されているので、こうした還元剤の存在下、通常６０〜７０℃、好ましくは６５℃で、通常５〜１５分間、好ましくは１０分間、反応液を加熱することにより、反応液に含まれるＲＮａｓｅＨを失活させることができる。すなわち、ＲＮａｓｅＨを失活させるために、還元剤等を新たに反応液に添加することは必ずしも必要ではなく、発現解析用市販試薬に含まれている還元剤を利用してＲＮａｓｅＨを失活させることができる。【００２５】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下で接触させる工程である。
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。【００２６】
固体支持体の形状、材質等は特に限定されるものではないが、粒子であることが好ましく、磁性体粒子であることがさらに好ましい。粒子は液体中に分散可能であるので、固体支持体として粒子を用いることにより、粒子表面に存在するカチオン性基と二本鎖ｃＤＮＡとの反応性を向上させることができる。また、固体支持体として磁性体粒子を用いることにより、磁石を用いて液体中に分散している粒子を捕集し、粒子を液体から容易に分離することができるので、ｃＲＮＡの調製の自動化を実現することができる。【００２７】
固体支持体の形状としては、粒子の他、例えば、平板、棒状、紐状、テープ状、糸状等が挙げられる。粒子は通常球状であるが、不定形であってもよい。粒子の大きさは特に限定されるものではないが、粒径は通常０．０５〜０．１μｍ、好ましくは０．０８μｍである。【００２８】
固体支持体の材質としては、例えば、ガラス、シリコン、セラミックス、水不溶性ポリマー（例えば、ポリスチレン等のポリスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレート等のアクリル樹脂（メタクリル樹脂）、ポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリカーボネート等の合成樹脂；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質等）、これらの複合材料等が挙げられる。磁性体粒子は、水酸化鉄、酸化鉄水和物等の磁性体を含む。【００２９】
カチオン性基が存在する固体支持体の「表面」とは、液体と接触し得る面を意味し、固体支持体の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体が浸潤し得る固体支持体の内面（内部表面）（例えば、固体支持体が有する細孔の内部表面）も含まれる。【００３０】
カチオン性基は、ｐＨが酸性（通常ｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ５．０）に変化すると正に帯電することができるとともに、ｐＨが中性及びアルカリ性（通常ｐＨ７．５以上、好ましくはｐＨ８．５）に変化すると電気的に中性になることができる官能基であり、その種類は特に限定されるものではないが、カチオン性基としては、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。【００３１】
カチオン性基を表面に有する固体支持体としては、市販されているもの（例えば、ＣＳＴ ＰＣＲ ＣｌｅａｎＵｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，Ｃａｔ：ＣＳ１２０００）を使用してもよいし、常法に従って固体支持体の表面にカチオン性基を化学結合させたものを使用してもよい。【００３２】
反応液と、カチオン性を表面に有する固体支持体とは、カチオン性基が正に帯電するｐＨで接触させる。
カチオン性基が正に帯電するｐＨは、カチオン性基の種類に応じて異なるが、通常ｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ５．０である。ｐＨの調整は、リン酸、酢酸、クエン酸等の弱酸を用いて行うことができる。【００３３】
反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下で接触させることにより、正に帯電しているカチオン性基に対して負に帯電している一本鎖ｃＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡが静電的に結合する。【００３４】
反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを接触させる際、塩濃度を調節することにより、カチオン性基に静電的に結合する核酸のサイズを調節することができる。すなわち、塩濃度を調節することにより、カチオン性基に対するプライマー等の核酸の結合を抑制し、カチオン性基に対する二本鎖ｃＤＮＡの結合を効率よく生じさせることができる。【００３５】
工程（ｂ）において、カチオン性基が正に帯電するｐＨ条件下かつアンモニウムイオンの存在下で、反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを接触させることが好ましい。これにより、正に帯電したカチオン性基に対するｄＮＴＰの結合を防止することができるので、正に帯電したカチオン性基に二本鎖ｃＤＮＡを効率よく結合させることができる。【００３６】
アンモニウムイオンは、反応液と固体支持体とが接触しているいずれかの時点で存在すればよい。すなわち、アンモニウムイオンは、反応液と固体支持体とを接触させる前に予め添加しておいてもよいし、反応液と固体支持体とを接触させている間に添加してもよい。【００３７】
アンモニウムイオンの供給源としては、例えば、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができる。アンモニウムイオンの濃度は特に限定されるものではなく、二本鎖ｃＤＮＡの濃度、ｄＮＴＰの濃度等に応じて適宜調節することができるが、通常５０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭである。アンモニウムイオンの濃度が５０ｍＭ未満であると正に帯電したカチオン性基に対するｄＮＴＰの結合を十分に防止できないおそれがある一方、アンモニウムイオンの濃度が５００ｍＭを超えると濃度増加分に対応した効果が期待できないおそれがある。アンモニウムイオンの供給源として硫酸アンモニウムを用いる場合、反応液に残留する硫酸イオンを除去するために、塩化マグネシウム等を反応液に添加することが好ましい。【００３８】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、前記反応液から前記固体支持体を分離する工程である。
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。【００３９】
工程（ｂ）により、カチオン性基に二本鎖ｃＤＮＡが静電的に結合するので、反応液から固体支持体を分離することにより、二本鎖ｃＤＮＡを単離することができる。固体支持体の分離は常法に従って行うことができる。固体支持体が磁性体粒子である場合には、磁石を用いて効率よく固体支持体を分離することができる。【００４０】
固体支持体を分離した後、固体支持体を洗浄することが好ましい。これにより、固体支持体に付着している二本鎖ｃＤＮＡ以外の物質を除去することができる。固体支持体の洗浄は、カチオン性基に静電的に結合している二本鎖ｃＤＮＡが離脱しないような条件で行われる。固体支持体の洗浄は常法に従って行うことができ、洗浄液としては、例えば、滅菌水、蒸留水等のｐＨ７．０以下に調整した水溶液等を使用することができる。固体支持体が磁性体粒子である場合には、磁石を用いることにより、洗浄液への分散及び洗浄液からの捕集を効率よく行うことができる。【００４１】
固体支持体を分離した後、固体支持体をアンモニウムイオンの存在下で洗浄することが好ましい。これにより、固体支持体に結合したｄＮＴＰを離脱させることができる。アンモニウムイオンの供給源としては、例えば、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができる。アンモニウムイオンの濃度は特に限定されるものではなく、二本鎖ｃＤＮＡの濃度、ｄＮＴＰの濃度等に応じて適宜調節することができるが、通常５０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭである。アンモニウムイオンの供給源として硫酸アンモニウムを用いる場合、固体支持体をアンモニウムイオンの存在下で洗浄した後、固体支持体をマグネシウムイオンの存在下で洗浄することが好ましい。固体支持体に付着した硫酸イオンを除去するためである。マグネシウムイオンの供給源としては、例えば、塩化マグネシウム等を用いることができる。【００４２】
工程（ｄ）
工程（ｄ）は、前記固体支持体から二本鎖ｃＤＮＡを溶離させる工程である。
工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に行われる（但し、工程（ｃ）の後に固体支持体を洗浄する場合、工程（ｄ）は当該洗浄の後に行われる）。
固体支持体からの二本鎖ｃＤＮＡの溶離は、例えば、固体支持体をｐＨ８．０以上に調整したバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣl等）等のアルカリで処理し、固体支持体の表面に存在するカチオン性基を電気的に中性に戻すことにより行うことができる。【００４３】
工程（ｅ）
工程（ｅ）は、前記二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製するための転写反応を行う工程である。
二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを調製するための転写反応は常法に従って行うことができる。転写反応には、例えば、in vitro転写系を使用することができる。in vitro転写反応としては、例えば、チューブ内にビオチン化したＵＴＰをｄＮＴＰミックスとともに精製したｃＤＮＡに加え、さらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを加え、転写反応をチューブ内で行う方法等が挙げられる。in vitro転写系を用いた転写反応における反応温度は、通常３５〜４０℃、好ましくは３７℃であり、反応時間は通常４時間〜１６時間、好ましくは１４時間である。転写反応においてｃＲＮＡ合成の基質として、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ等のＮＴＰが用いられる。【００４４】
こうして調製されたｃＲＮＡは、マイクロアレイ解析用サンプルとして使用することができる。例えば、マイクロアレイ（ＤＮＡアレイ等）を用いた遺伝子発現解析のためのサンプルとして使用することができる。マイクロアレイによる解析は、例えば、解析対象であるｃＲＮＡサンプルとマイクロアレイとを接触させ、ｃＲＮＡサンプルのハイブリダイズの有無（例えば蛍光）を検出することにより行うことができる。
【実施例】
【００４５】
〔試験例１〕
（１）二本鎖ｃＤＮＡの調製
逆転写反応を利用して二本鎖ｃＤＮＡの調製を行った。
逆転写反応は、ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｉｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｉｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ ２４反応分，ＧＥヘルスケア／アマシャム・バイオサイエンス社製 Ｃａｔ．３２００１２）を使用して行い、作業手順は、ＣｏｄｅＬｉｎｋ ＵＳＥＲ ＧＵＩＤＥ Ｒｅｖ．２００４−０９ ｖｅｒ１．２を参照した。【００４６】
逆転写反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製に必要とされるＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）としては、広く一般的に使われている市販品、総ＲＮＡ（Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ，Ａｍｂｉｏｎ社製，Ｃａｔ．７９１０）を使用した。逆転写反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製に必要とされる１サンプル当たりのＲＮＡの収量は、総ＲＮＡに換算して１〜１５μｇ程度、ｍＲＮＡに換算して０．２〜２μｇ程度が最適とされており、今回の試験においては総ＲＮＡを２μｇ調製し、この総ＲＮＡを使用して逆転写反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製を行った。【００４７】
逆転写反応による第一鎖ｃＤＮＡの調製には、２μｇの総ＲＮＡに、Ｔ７ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー（５０μＭ）、発現解析用バクテリア由来コントロールｍＲＮＡ（０．５ｐｇ／μＬ）及びＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水を加え、７０℃で１０分間の熱処理を行い、熱処理後すぐに４℃で２〜４分間（好ましくは３分間）の冷却処理を行い、第一鎖ｃＤＮＡ用合成バッファー、ｄＮＴＰミックス（５〜１０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及び逆転写反応酵素（２００Ｕ／μＬ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を添加し、３７℃〜５０℃（好ましくは４２℃）で６０〜１２０分間（好ましくは１２０分間）の保温処理を行った。【００４８】
逆転写反応による第二鎖ｃＤＮＡの調製には、第一鎖ｃＤＮＡ溶液に、第二鎖ｃＤＮＡ用合成バッファー、ｄＮＴＰミックス（５〜１０ｍＭ，好ましくは５ｍＭ）、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（１０Ｕ／μＬ）、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１０Ｕ／μＬ)、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来Ｌｉｇａｓｅ（１０Ｕ／μＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水及びＲＮａｓｅＨ（１〜５Ｕ／サンプル）を添加した後に、１５〜１７℃（好ましくは１６℃）で１２０〜１５０分間（好ましくは１２０分間）の保温処理を行った。【００４９】
（２）二本鎖ｃＤＮＡの精製
逆転写反応により調製した二本鎖ｃＤＮＡの精製には、サンプルと等量の有機溶媒（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、核酸を水層中に分離し、酢酸アンモニウム及びエタノールで洗浄した後、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水にて抽出する方法が広く一般的に行われているが、方法１では、ＣｏｄｅＬｉｎｋ ＵＳＥＲ ＧＵＩＤＥ Ｒｅｖ.２００４−０９ ｖｅｒ１．２を参照して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０４／２８１０６）を使用して逆転写反応により調製した二本鎖ｃＤＮＡの精製を行った。また、方法２では、自動化による簡便性及びサンプル間汚染防止を達成するために、磁性体粒子試薬であるＣＳＴ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＳＴ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（販売元）／ＤＲＩ社製，Ｃａｔ．ＣＳ１２０００）及び自動核酸抽出機Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−１２ＧＣ（以下「１２ＧＣ」という）（プレシジョン・システム・サイエン社製，Ｃａｔ．Ａ１００６）を使用し、逆転写反応による二本鎖cＤＮＡの精製を行った。【００５０】
［方法１］
逆転写反応により調製した二本鎖ｃＤＮＡ溶液に対し、５倍量のＢｕｆｆｅｒ ＰＢを添加し、ピペッティングでよく混合した後、Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢと混合した二本鎖ｃＤＮＡ溶液（ｃＤＮＡ／Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢ溶液）を、キット付属の２ｍＬ遠心チューブにセットしたＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに注入した。ｃＤＮＡ／Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢ溶液を注入した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを１００００×ｇで６０秒間遠心処理した。ｃＤＮＡ／Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢ溶液を添加したＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを遠心処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを通過し、２ｍＬ遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを搭載した。７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＥをＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに添加し、１００００×ｇで６０秒間遠心処理を行った。Ｂｕｆｆｅｒ ＰＥ溶液を添加したＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを遠心処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを通過し、２ｍＬ遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを搭載した。再度、１００００×ｇで６０秒間で遠心処理を行った。遠心処理後、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを新しい１．５ｍＬチューブに搭載し、３０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水をスピンカラム内のメンブレンに添加し、６０秒間静置した後、１００００×ｇで６０秒間遠心処理を行った。さらに再度３０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水をスピンカラム内のメンブレンに添加し、３０〜６０秒間、好ましくは６０秒間静置した後、１００００×ｇで６０秒間遠心処理を行い、総量６０μＬの二本鎖ｃＤＮＡ溶液を確保した。【００５１】
［方法２］
１２ＧＣ専用の試薬カートリッジの所定のウェルに、１００μＬのＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ウェル１）、２０μＬのＣＳＴ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（ウェル２）、７００μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １（１００ｍＭ 硫酸アンモニウム）（ウェル３）、７００μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ 塩化マグネシウム）（ウェル４）、７００μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ３（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水）（ウェル５）、及び１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）（ウェル６）を搭載した後、１２ＧＣ用プロトコールに従い、逆転写反応により調製した二本鎖ｃＤＮＡの精製を実施した。１２ＧＣによるｃＤＮＡの精製工程は以下の通りである。【００５２】
ウェル１内のｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒのうち８０μＬをチップ内に吸引した後、二本鎖ｃＤＮＡ溶液を含有するサンプル・チューブに吐出させた。吐出後１５回ほどチップによる吸引吐出を繰り返すことにより攪拌を行い（以下、攪拌工程において同様）、サンプル・チューブ内の溶液をチップ内に吸引した後、磁性ビーズを含有するウェル２に吐出させた。吐出後３００回の攪拌によりｃＤＮＡを磁性ビーズに吸着させた。ウェル２内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収した後、磁性ビーズのみを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １（１００ｍＭ 硫酸アンモニウム）を含有するウェル３に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより洗浄した（攪拌回数８０回）（以下洗浄工程において同様）。洗浄後、ウェル３内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収した後、磁性ビーズのみを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ 塩化マグネシウム）を含有するウェル４に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより洗浄した（攪拌回数８０回）。洗浄後、ウェル４内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収し、磁性ビーズのみを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ３（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水）を含有するウェル５に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより洗浄した（攪拌回数８０回）。洗浄後、ウェル５内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収し、磁性ビーズのみを保持するチップ内に、ウェル６内のＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）のうち６０μＬを吸引した後、磁性ビーズをＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒとともにウェル７に吐出させた。チップによる吸引吐出を繰り返すことにより、磁性ビーズから二本鎖ｃＤＮＡを解離させた。【００５３】
（３）ｃＲＮＡ合成前のサンプル調製
ｃＲＮＡ合成（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＩＶＴ）前のサンプル調製には、ｃＤＮＡ量が極力少なくなるように精製を行い、そのままの量のｃＤＮＡをｃＲＮＡの合成試薬と混合する方法が現在最も広く行われており、本実施例でもこの方法を使用した。ｃＤＮＡ精製量は通常１０〜３０μＬであるが、本実施例では６０μＬにて精製を完了し、精製物を遠心濃縮器にて１０μＬ程度に濃縮し、次工程（ｃＲＮＡ合成）に使用した。遠心濃縮器としてはＤＮＡプチＶａｃ（ＷＡＫＥＮＹＡＫＵ社製，Ｃａｔ．ＰＶ１２００）を使用した。条件は、１８００〜２０００ｒｐｍ、０．０６Ｍｐａ及び５５℃に設定し、この条件により約２５分で６０μＬの溶液を１０μＬほどに濃縮した。【００５４】
（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（ＩＶＴ）によるｃＲＮＡの調製
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によるｃＲＮＡの調製には、精製した二本鎖ｃＤＮＡを、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｒＮＴＰミックス（Ｔ７ ＡＴＰ，Ｔ７ ＧＴＰ，Ｔ７ ＣＴＰ，Ｔ７ ＵＴＰ／各２５ｍＭ）、１００ｍＭ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ）、１０ｍＭ Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ＵＴＰ、及び２５００Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添加し、３７℃で４〜一晩（約１６時間）（好ましくは１４時間）で処理する方法が広く一般的に行われているが、本実施例では、ＣｏｄｅＬｉｎｋ ＵＳＥＲ ＧＵＩＤＥ Ｒｅｖ．２００４−０９ ｖｅｒ１．２のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０４／２８１０６）の手順に従い、以下の通りに行った。【００５５】
濃縮した二本鎖ｃＤＮＡを、１０×Ｔ７ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬ、２５ｍＭ Ｔ７ ＡＴＰ ４．０μＬ、２５ｍＭ Ｔ７ ＧＴＰ ４．０μＬ、２５ｍＭ Ｔ７ ＣＴＰ ４．０μＬ、２５ｍＭ Ｔ７ ＵＴＰ ３．０μＬ、１０ｍＭ Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ＵＴＰ ７．５μＬ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔ． Ｎｏ．ＮＥＬ５４３）及び１０×Ｔ７ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ４．０μＬと混合し、３７℃で１４時間で反応させた。【００５６】
（５）ｃＲＮＡの精製
ｃＲＮＡの精製は以下の方法３又は４によって行った。
［方法３］
まずＩＶＴ反応液にＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水を加えて１００μＬにし、３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴを添加してよく混合した。混合後、２５０μＬの１００％エタノールを添加してさらによく混合した。混合後、全量又は半分量をＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに添加して８０００×ｇ前後で１５秒間〜３０秒間ほど遠心処理を行った。遠心後、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを通過し、２ｍＬ遠心チューブ内に残った溶液を除去した。半分量を添加した場合は同工程をもう一度行った。５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥをＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに添加し、８０００×ｇで１５秒間遠心処理を行った。遠心後、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを通過し、２ｍＬ遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再度５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥをＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに添加し、８０００×ｇで１５秒間遠心処理を行った。遠心後、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを通過し、２ｍＬ遠心チューブ内に残った溶液を除去した。溶液除去後、ミニスピンカラムを遠心処理により乾燥させるため、再度遠心器に搭載し、８０００×ｇで２分間遠心処理を行った。エタノール溶液が十分に蒸発したことを確認した上で、５０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水をＲＮｅａｓｙミニスピンカラムのメンブレンに添加し、１０分間静置した後、８０００×ｇで１分間遠心処理を行い、再度、５０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水をＲＮｅａｓｙミニスピンカラムのメンブレンに添加し、１０分間静置した後、８０００×ｇで１分間遠心処理を行い、最終的に１００μＬのｃＲＮＡ溶液を確保した。【００５７】
［方法４］
磁性体粒子試薬であるＭａｇａＺｏｒｂ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ-Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｃｏｒｔｅｘ社製，Ｃａｔ．ＭＢ２００１，ＭＢ２００４，ＭＢ２００８）及び自動核酸抽出機Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−１２ＧＣ（プレシジョン・システム・サイエン社製，Ｃａｔ．Ａ１００６）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により二本鎖cＤＮＡから合成されたｃＲＮＡの精製を行った。
１２ＧＣ専用の試薬カートリッジの所定のウェルに、３００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ウェル１）、４０μＬのＭａｇａＺｏｒｂ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ）（ウェル２）、１０００μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １（ウェル３）、１０００μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を１／２に希釈）（ウェル４）、１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水）（ウェル５）を搭載した後、１２ＧＣ用プロトコールに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により二本鎖cＤＮＡから合成されたｃＲＮＡの精製を実施した。１２ＧＣを用いたｃＲＮＡの精製工程は以下の通りである。【００５８】
ウェル１内のＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒのうち２００μＬをチップ内に吸引した後、ｃＲＮＡ溶液を含有するサンプル・チューブに吐出させた。吐出後１５回ほどチップによる吸引吐出を繰り返すことにより攪拌を行い、サンプル・チューブ内の溶液をチップ内に吸引した後、ウェル１に吐出させ、ウェル１の残りのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、１５回の攪拌を行った。攪拌後、全量をチップ内に吸引し、磁性ビーズを含有するウェル２に吐出させた。吐出後６００回の攪拌によりｃＲＮＡをビーズに吸着させた。ウェル２内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収した後、磁性ビーズのみを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ１を含有するウェル３に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより洗浄した（攪拌回数５０回）。洗浄後、ウェル３内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収し、磁性ビーズのみを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ２を含有するウェル４に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより洗浄した（攪拌回数５０回）。洗浄後、ウェル４内の溶液を吸引し、磁性ビーズをチップ内面に吸着させることにより磁性ビーズを回収し、磁性ビーズのみを、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを含有するウェル５に吐出させ、チップによる吸引吐出を繰り返すことにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により二本鎖ｃＤＮＡから合成されたｃＲＮＡを磁性ビーズから解離させた。【００５９】
（６）ｃＲＮＡの収率
精製ｃＲＮＡの濃度及び収量を以下のように算出した。精製ｃＲＮＡ ２μＬにＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ滅菌水 ９８μＬを添加して全量１００μＬ（５０倍希釈）とし、１００μＬのうち６０μＬをガラス・セルに添加し、分光光度計ＤＵ５３０ Ｌｉｆｅ ＳＣＩＥＮＣＥ ＵＶ／Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製，Ｃａｔ．ＤＵ５３０）を用いて２２０ｎｍから３２０ｎｍの間における吸光度を測定した。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下の場合は希釈率を２０倍に下げて同様の操作を行った。ｃＲＮＡの濃度は２６０ｎｍにおける吸光度値から以下のように計算した。なお、３２０ｎｍにおける吸光度値で２６０ｎｍにおける吸光度値を補正してから上記計算式からｃＲＮＡ濃度を算出した。
ｃＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）＝２６０ｎｍにおける吸光度値×希釈率×１０／セル光路長（ｍｍ）×４０（μｇ／ｍＬ）
なお、光路長１０ｍｍのセルを用いて２６０ｎｍにおける吸光度値＝１の時、ｃＲＮＡ濃度は４０μｇ／ｍＬとなる。また、今回の方法では希釈率は５０となる。【００６０】
ｃＲＮＡ収量は、算出したｃＲＮＡ濃度に対して、精製ｃＲＮＡ溶液の全回収量（μＬ）を掛けることにより算出した。
精製ｃＲＮＡの純度を以下のように算出した。精製ｃＲＮＡ ２μＬに１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）９８μＬを添加して全量１００μＬ（５０倍希釈）とし、１００μＬのうち６０μＬをガラス・セルに添加し、分光光度計ＤＵ５３０ Ｌｉｆｅ ＳＣＩＥＮＣＥ ＵＶ／Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製，Ｃａｔ．ＤＵ５３０）を用いて２２０ｎｍから３２０ｎｍの間における吸光度を測定した。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下の場合は希釈率を２０倍に下げて同様の操作を行った。ｃＲＮＡの純度は、３２０ｎｍにおける吸光度値で２６０ｎｍにおける吸光度値を補正した後、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの吸光度比から計算した。【００６１】
精製ｃＲＮＡのサイズ分布を以下のように確認した。精製ｃＲＮＡのサイズ分布測定には、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ Ｋｉｔ （ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ Ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ社製，Ｃａｔ．５０６５−４４７６）にサンプルを添加し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ社製，Ｃａｔ．Ｇ２９３８Ｃ）を用いて測定した。測定に必要なｃＲＮＡサンプルの調製は、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ アッセイ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００３の手順に従った。測定に必要なｃＲＮＡサンプルの濃度調整もＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ アッセイ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００３の基準を従って行い、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐに添加後、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに搭載し、測定を行った。【００６２】
方法２及び方法４を組み合わせた方法を以下「自動精製法（磁性体粒子法）」といい、方法１及び方法３を組み合わせた方法を以下「従来法（スピン・カラム法）」という。なお、自動精製法（磁性体粒子法）におけるＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、ｃＲＮＡ合成試薬の性能確認で使われたｃＲＮＡを方法３によって精製したものであり、従来法（スピン・カラム法）におけるＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、ｃＲＮＡ合成試薬の性能確認で使われたｃＲＮＡを方法４によって精製したものである。【００６３】
自動精製法（磁性体粒子法）に関する結果を表１に、従来法（スピン・カラム法）に関する結果を表２に示す。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図１に示す。【００６４】
【表１】
2007066665.tif 000002
【００６５】
【表２】
2007066665.tif 000003
【００６６】
表１及び２に示すように、自動精製法（磁性体粒子法）における精製ｃＲＮＡの濃度及び収率は、従来法（スピン・カラム法）における精製ｃＲＮＡの濃度及び収率の半分以下になってしまうことが確認できた。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果（図１）でも、自動精製法（磁性体粒子法）におけるｃＲＮＡの濃度は、従来法（スピン・カラム法）におけるｃＲＮＡの濃度よりも極端に劣った。しかしながら、自動精製法（磁性体粒子法）におけるＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌと従来法（スピン・カラム法）におけるＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとはほぼ同様の結果であり、自動精製法（磁性体粒子法）では、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの合成段階、あるいはｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの精製段階においてに何らかの問題が起こっていると考えられた。【００６７】
〔試験例２〕
方法１及び３を組み合わせた従来法（スピン・カラム法）とともに、方法１及び方法４を組み合わせた自動精製法（磁性体粒子法）の変法を実施し、精製ｃＲＮＡの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。【００６８】
自動精製法（磁性体粒子法）の変法に関する結果を表３に、従来法（スピン・カラム法）に関する結果を表４に示す。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図２に示す。【００６９】
【表３】
2007066665.tif 000004
【００７０】
【表４】
2007066665.tif 000005
【００７１】
表３及び４に示すように、自動精製法（磁性体粒子法）の変法と従来法（スピン・カラム法）との間に顕著な差は見られなかった。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果（図２）でも、自動精製法（磁性体粒子法）の変法と従来法（スピン・カラム法）との間に顕著な差は見られなかった。この結果から、自動精製法（磁性体粒子法）におけるｃＲＮＡの収率の低下は、ｃＤＮＡ精製後からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の間に生じた問題が起因していることが判明した。【００７２】
〔試験例３〕
試験例２の結果を踏まえ、方法１及び３を組み合わせた従来法（スピン・カラム法）とともに、方法２及び方法３を組み合わせた自動精製法（磁性体粒子法）の変法を実施し、精製ｃＲＮＡの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。【００７３】
自動精製法（磁性体粒子法）の変法に関する結果を表５に、従来法（スピン・カラム法）に関する結果を表６に示す。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図３に示す。【００７４】
【表５】
2007066665.tif 000006
【００７５】
【表６】
2007066665.tif 000007
【００７６】
表５及び６に示すように、自動精製法（磁性体粒子法）の変法における精製ｃＲＮＡの濃度及び収率は、従来法（スピン・カラム法）における精製ｃＲＮＡの濃度及び収率よりも劣っており、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果（図３）でも両者の差が濃淡に表れた。試験例２の結果と併せると、ｃＤＮＡ精製時からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応時の間にｃＲＮＡ合成を阻害するものが存在していることが判明した。この結果を受け、最も考えられる原因として二本鎖ｃＤＮＡ合成時に使われる試薬にＲＮａｓｅＨが使用されていることに着目した。従来法（スピン・カラム法）では、有機溶媒によりＲＮａｓｅＨが化学的に分解されているのに対し、自動精製法（磁性体粒子法）で使用される磁性粒子試薬にはＲＮａｓｅＨを分解する成分が含まれていないことが挙げられる。この他、ｃＤＮＡ精製時にｃＤＮＡの回収率が悪いこと等も原因として考えられる。【００７７】
〔試験例４〕
試験例３の結果を踏まえ、方法１及び３を組み合わせた従来法（スピン・カラム法）とともに、方法２、方法１及び方法３を組み合わせた自動精製法（磁性体粒子法）の変法（方法２による二本鎖ｃＤＮＡの精製の後、さらに方法１による二本鎖ｃＤＮＡの精製を行う）を実施し、精製ｃＲＮＡの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。【００７８】
自動精製法（磁性体粒子法）の変法に関する結果を表７に、従来法（スピン・カラム法）に関する結果を表８に示す。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図４に示す。【００７９】
【表７】
2007066665.tif 000008
【００８０】
【表８】
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【００８１】
表７及び８に示すように、自動精製法（磁性体粒子法）の変法では、従来法（スピン・カラム法）と同等又はそれ以上のｃＲＮＡの収率が得られた。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果（図４）でも、自動精製法（磁性体粒子法）の変法と従来法（スピン・カラム法）との間に顕著な差は見られなかった。この結果から、このことから自動精製法（磁性体粒子法）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応でのｃＲＮＡ合成不良は、ＲＮａｓｅＨの混入が原因である可能性が高いことが判明した。【００８２】
〔試験例５〕
簡便かつ効率よくＲＮａｓｅＨを変性するために、二本鎖ｃＤＮＡ合成時に各試薬に還元剤として配合されている０．１ＭのＤＴＴに着目した。一般的に６０〜７０℃（好ましくは６５℃）で１０分間保温すると、ＤＴＴの働きによりＲＮａｓｅＨを変性又は失活させることが可能である。【００８３】
方法１及び３を組み合わせた従来法（スピン・カラム法）とともに、方法２及び方法４を組み合わせた自動精製法（磁性体粒子法）を実施し、精製ｃＲＮＡの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。自動精製法（磁性体粒子法）においては、方法２により二本鎖ｃＤＮＡを精製する前にサンプルを６５℃で１０分間保温することにより、サンプル中に含まれるＲＮａｓｅを変性又は失活させた。【００８４】
自動精製法（磁性体粒子法）に関する結果を表９に、従来法（スピン・カラム法）に関する結果を表１０に示す。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図５に示す。【００８５】
【表９】
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【００８６】
【表１０】
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【００８７】
表９及び１０に示すように、自動精製法（磁性体粒子法）において、方法２により二本鎖ｃＤＮＡを精製する前にサンプルを６５℃で１０分間保温することにより、従来法（スピン・カラム法）以上のｃＲＮＡの収率が得られた。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果（図５）でも、自動精製法（磁性体粒子法）と従来法（スピン・カラム法）との間に顕著な差は見られなかった。この結果から、自動精製法（磁性体粒子法）において、方法２により二本鎖ｃＤＮＡを精製する前にサンプルを６５℃で１０分間保温することにより、精製ｃＲＮＡを効率よく調製できることが判明した。【００８８】
〔試験例６〕
（１）ｃＲＮＡの調製
実施例１に準じ、方法１及び３を組み合わせた従来法（スピン・カラム法）とともに、方法２及び方法４を組み合わせた自動精製法（磁性体粒子法）を実施した。自動精製法（磁性体粒子法）においては、実施例５に準じ、方法２により二本鎖ｃＤＮＡを精製する前にサンプルを６５℃で１０分間保温することにより、サンプル中に含まれるＲＮａｓｅを変性又は失活させた。
なお、総ＲＮＡとしては、Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製，Ｃａｔ．７９１０）の代わりに、Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製，Ｃａｔ．７９７６）を使用した（総ＲＮＡの使用量：２μｇ）。また、増幅用試薬としては、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ Ｂｉｏｔｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ（Ａｍｂｉｏｎ社製，Ｃａｔ．１７９１）を使用した（ＩＶＴ時間：４時間）。【００８９】
従来法（スピン・カラム法）により精製したサンプルＭのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図６に、自動精製法（磁性体粒子法）により精製したサンプルＡ１及びＡ２のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるサイズ分布測定結果を図７及び８に示す。また、サンプルＭ、Ａ１及びＡ２の収量及び純度を表１１に示す。【００９０】
【表１１】
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【００９１】
（２）ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイを用いたサンプルの測定
ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイを用いたサンプルＭ、Ａ１及びＡ２の測定は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｎｕａｌ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社）に従って行った。すなわち、ｃＲＮＡサンプルを約３５〜２００塩基長に断片化した後、ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒをｅｕｋａｒｙｏｔｉｃＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイにインサートし、プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション後、断片化したｃＲＮＡサンプルをプローブアレイにインサートし、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ｃＲＮＡサンプルがインサートされたアレイをＦｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００／４５０に搭載し、アレイを洗浄した後、蛍光固定化を行い、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｅｒ又はＧｅｎｅｃｈｉｐ ｓｃａｎｎｅｒ ３０００によりシグナルを読み取った。測定結果を図９に示す。【００９２】
図９の上側のグラフにおいて、４〜１３は発光度合を示しており、数字が大きくなるほど発光が強いことを示す。横棒グラフは、その発光度合におけるアレイ上のスポット分布を示しており、スポットの多くは発光度合６〜８に収束していることが分かる。また、図９の下側の表は、上側のグラフの結果を数字にて表示したものであり、全スポット数を１００％として各発光度合（３．４９０〜１３．７２７）の割合を累積したものである。全スポットのうち約６５％が発光度合５．８７２〜８．３２３にあり、全スポットのうち５０％が７．１０３にある。【００９３】
さらに、サンプルＭ、Ａ１及びＡ２についてｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイで発現プロファイルを取得し、サンプルＭとＡ１、サンプルＭとＡ２、及びサンプルＡ１とＡ２におけるプロファイル間の相関関係をscatter plot にて比較した結果を図１０に示す。また、サンプルＭとＡ１間、サンプルＭとＡ２間、及びサンプルＡ１とＡ２間におけるそれぞれの相関係数を表１２に示す。【００９４】
【表１２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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