(57)【要約】  蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、電気化学的方法により高速で行うことができる測定方法を提供するものであり、測定対象の蛋白質を含有する試料溶液１に、作用電極５及び対電極４を接触させ、前記作用電極５と前記対電極４との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析するようにした。
2007114252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、作用電極及び対電極を接触させ、前記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析する蛋白質の測定方法。
【請求項２】
蛋白質は、アルブミン、免疫抑制酸性蛋白質、ペプシン、ヘモグロビン、及び、Ｃ反応性蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の蛋白質の測定方法。
【請求項３】
作用電極は、導電性ダイヤモンド電極又はカーボン電極である請求項１記載の蛋白質の測定方法。
【請求項４】
導電性ダイヤモンド電極は、１３族又は１５族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項５】
導電性ダイヤモンド電極は、ホウ素、窒素、及び、リンからなる群から選択される少なくとも一種の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項６】
導電性ダイヤモンド電極は、ボロンドープダイヤモンド電極である請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項７】
導電性ダイヤモンド電極は、８族、９族又は１０族のいずれかの族に属する元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項８】
導電性ダイヤモンド電極は、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、及び、イリジウムからなる群から選択される少なくとも一種の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項９】
予め作成された測定対象の蛋白質の濃度と電流値との検量線と、得られた電流値とを対比することにより、得られた電流値から試料溶液中の測定対象の蛋白質の濃度を算出する請求項１記載の蛋白質の測定方法。
【請求項１０】
作用電極と対電極との間に印加する電圧は、最大電流値を与える電圧である請求項１記載の蛋白質の測定方法。
【請求項１１】
測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、更に参照電極を接触させて、作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御する請求項１記載の蛋白質の測定方法。
【請求項１２】
導電性ダイヤモンド電極を陰極還元して再生する工程を有する請求項３記載の蛋白質の測定方法。
【請求項１３】
試料溶液中の測定対象の蛋白質を検出するための測定装置であって、
作用電極及び対電極を内蔵するセルと、
前記作用電極及び前記対電極に電圧を印加する手段と、
当該印加電圧下における電流値を測定する手段と、
得られた電流値から前記蛋白質を検出する情報処理装置と、を備えている蛋白質の測定装置。
【請求項１４】
作用電極は、導電性ダイヤモンド電極である請求項１３記載の蛋白質の測定装置。
【請求項１５】
導電性ダイヤモンド電極は、ボロンドープダイヤモンド電極である請求項１４記載の蛋白質の測定装置。
【請求項１６】
セルは更に参照電極を内蔵しており、
更に作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御する手段を備えている請求項１３記載の蛋白質の測定装置。
【請求項１７】
導電性ダイヤモンド電極を、陰極還元により再生する手段を備えたものである請求項１４記載の蛋白質の測定装置。
【請求項１８】
分離手段を備えている請求項１３記載の蛋白質の測定装置。
【請求項１９】
一定流速のキャリア溶液を作用電極に接触させておき、そこに測定対象である蛋白質を注入して、前記作用電極及び対電極と接触させ、前記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析する蛋白質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、電気化学的方法により高速で行うことができる測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルブミンは血漿中に最も多く含まれる蛋白質であるが、アルブミンを微量に含む尿はミクロアルブミン尿と呼ばれ、糖尿病性腎症の初期にみられる尿である。糖尿病性腎症の発症及び進展の防止には、尿蛋白が明らかな陽性を示す前に対策を立てることが重要であることから、ミクロアルブミン尿の有無を早期に判定することは、糖尿病性腎症の早期発見に極めて有効である。【０００３】
尿中アルブミン量を測定する方法としては、例えば、特許文献１に示すように、抗プレアルブミンと抗プレアルブミンの抗体が結合した感作(結合)ラテックスとを凝集反応させて判定を行うラテックス凝集法がある。具体的には、特許文献１記載のアルブシュア（エーザイ株式会社の商品名）のようなアルブミン検出試薬を用いると、尿中アルブミンが３０ｍｇ／Ｌ以上のときには抗ヒトアルブミンヤギ抗体が完全に中和されるため、アルブミン感作ラテックスを加えても凝集せず、尿中アルブミンが存在しないか、あるいは、３０ｍｇ／Ｌ未満のときには抗ヒトアルブミンヤギ抗体は中和されずに残るため、アルブミン感作ラテックスとの抗原抗体反応によって凝集する。この性質を利用すれば、ごく微量のアルブミンを測定することができる。
【特許文献１】特開平４−６９５７２
【特許文献２】特開２００３−２９４６７９
【特許文献３】特開２００３−２９４６８０
【特許文献４】特開２００３−２９４６８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ラテックス凝集法をはじめとする免疫測定法では抗ヒトアルブミン抗体を含有する試薬が必要であるが、抗体を含有する試薬は製品ごとの品質のばらつきが大きく、安定して高精度かつ高感度の測定を行うことが難しい。また、安定して高精度かつ高感度の測定を行うためには厳密な試薬の管理が必要であるが、厳密な試薬管理は物的、人的な面から医療機関の負担となっている。【０００５】
一方、例えば、特許文献２乃至４に記載のように、電気化学的に活性な酵素を測定対象たるアルブミンの抗体に結合させた酵素結合抗体を用いて、その電気化学的な反応を測定することによって間接的にアルブミンの量を測定する方法も知られているが、アルブミンは電気化学的な活性は高くはないので、電気化学的な方法により直接測定することは困難であると考えられていた。さらに電気化学的な測定方法では、蛋白質の電極表面への吸着による測定への悪影響も懸念される。【０００６】
また、各種の担癌患者血中に見出される免疫抑制物質である免疫抑制酸性蛋白質（以下ＩＡＰともいう。）は、一種の急性相反応物質として担癌患者において高率に濃度の増加を示し、進行期に応じて高値を呈することから、臓器非特異的な腫瘍マーカーとすることが可能である。更に、ＩＡＰについてはその免疫抑制活性の観点から、悪性疾患における補助免疫化学療法の有効性予測の指標とする試みも報告されている。【０００７】
一方、Ｃ反応性蛋白質（以下ＣＲＰともいう。）は、体内で炎症や生体組織の破壊が生じているときに数値が増加する蛋白質であり、肺炎球菌のＣ多糖体と結合する。炎症により数値が上昇することから様々な疾患に対するマーカー蛋白質として使用される。また、血管の炎症などに鋭敏に反応するために心筋梗塞などの血管性疾患に対するマーカーとしても注目されている。心筋梗塞などは予知が困難であり、ＣＲＰにより診断法が確立することが期待されている。【０００８】
これに対し、本発明は、これら種々の蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、電気化学的方法により高速で行うことができる測定方法を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明に係る蛋白質の測定方法は、測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、作用電極及び対電極を接触させ、前記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析するものであることを特徴とする。【００１０】
本発明に係る蛋白質の測定方法は、本発明者が、蛋白質のような高分子物質も導電性ダイヤモンド電極等を用いれば電気化学的に測定可能であることを初めて見出したことによるものである。本発明に係る蛋白質の測定方法は、電気化学的な分析法であるので、従来広く用いられているラテックス凝集法等の抗原抗体反応に基づく免疫測定法のように、抗体を含む試薬を必ずしも使用しない。このため、免疫測定法のような試薬の品質がばらつくことによる測定精度や感度の低下を懸念することなく、安定して高精度かつ高感度の分析を行うことができる。また、抗体を含む試薬を必ずしも使用しないため分析操作が極めて簡便であり瞬時に分析結果を得ることができる。更に、少量のサンプルで分析が行え、測定装置の小型化を図ることもできる。本発明に係る蛋白質の測定方法は、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用いることにより低濃度の蛋白質も高い感度で検出することができる。
【発明の効果】
【００１１】
このように本発明によれば、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、蛋白質の検出を高速で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はウシ血清アルブミンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示すボルタモグラムである。
【図２】図２はウシ血清アルブミンを測定した後のダイヤモンド電極に対して陰極還元を施した結果を示すボルタモグラムである。
【図３】図３は免疫抑制酸性蛋白質を測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示すボルタモグラムである。
【図４】図４はヘモグロビンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示すボルタモグラムである。
【図５】図５はペプシンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示すボルタモグラムである。
【図６】図６はＣ反応性蛋白質を測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示すボルタモグラムである。
【図７】図７は本発明の一実施形態を示す電気化学測定装置の概要図である。
【図８】図８は図７に示す電気化学測定装置のフローセルの構成を示す概要図である。
【図９】図９はフローインジェクション測定により得られた、アルブミン濃度（横軸）と電流値（縦軸）との関係を示す検量線である。
【図１０】図１０はテトロドトキシンの濃度を変えて直線掃引（２０ｍＶ／ｓ）により得られたサイクリックボルタンメトリー測定により得られたボルタモグラムである。
【図１１】図１１は最大電流を与える電圧を印加して得られた、テトロドトキシン濃度（横軸）と電流値（縦軸）との関係を示す検量線である。
【符号の説明】
【００１３】
１・・・試料溶液
２・・・ポンプ
３・・・フローセル
４・・・対電極
５・・・作用電極
６・・・参照電極
７・・・ポテンショガルバノスタット
８・・・情報処理装置
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において測定対象となる蛋白質としては特に限定されないが、本発明は分子量が１０，０００以上である高分子蛋白質に好適であり、例えば、アルブミン、ＩＡＰ、ペプシン、ヘモグロビン、ＣＲＰ等を高精度かつ高感度に測定することができる。また、本発明によれば、テトロドトキシン等の天然毒も測定可能である。【００１５】
本発明に係る蛋白質の測定方法では、作用電極として導電性ダイヤモンド電極やカーボン電極が用いられる。【００１６】
前記導電性ダイヤモンド電極としては、１３族又は１５族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものが挙げられ、なかでも、ホウ素、窒素、及び、リンからなる群から選択される少なくとも一種の元素を混入したものが好ましく、特に、ホウ素を混入したボロンドープダイヤモンド電極が好適である。【００１７】
また、前記導電性ダイヤモンド電極としては、８族、９族又は１０族のいずれかの族に属する元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものを使用することもでき、このような導電性ダイヤモンド電極としては、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、及び、イリジウムからなる群から選択される少なくとも一種の元素が混入されたものが挙げられる。【００１８】
本発明に係る蛋白質の測定方法において、得られた電流値から試料溶液中の測定対象である蛋白質の濃度を算出するには、予め作成された測定対象の蛋白質の濃度と電流値との検量線と、得られた電流値とを対比することによる。【００１９】
前記作用電極と対電極との間に印加する電圧は、最大電流値を与える電圧であることが好ましい。【００２０】
本発明に係る蛋白質の測定方法において、作用電極が導電性ダイヤモンド電極である場合は、更に導電性ダイヤモンド電極を陰極還元して再生する工程を有してもよい。【００２１】
ダイヤモンドはあらゆる酸、塩基などに侵されないため、導電性ダイヤモンド電極に対してもピラニア洗浄などの強力な洗浄を行うことが可能であるが、酸や塩基を使用することは危険性、環境負荷等の観点から適当ではなく、蛋白質の酸化により表面が被毒した導電性ダイヤモンド電極を再生する方法としては安全で環境への負荷も少ない陰極還元を用いることが好ましい。【００２２】
陰極還元により導電性ダイヤモンド電極を再生させるには、例えば、電解質を溶解させた水溶液を使用し、導電性ダイヤモンド電極へマイナスの高電位を印加して電極表面から水の電気分解による水素を発生させることによる。【００２３】
水素を発生させると、金属電極ではｐＨなどの条件によっては電極が溶解又は不活性化してしまい、一方グラッシーカーボン電極（以下ＧＣ電極ともいう。）では水素発生による発泡により電極の物理的破壊が起こる。しかしながら、導電性ダイヤモンド電極では水素発生による物理的、化学的ダメージは生じない。【００２４】
水素発生により導電性ダイヤモンド電極から付着蛋白質を除去するメカニズムとしては、以下のようなことが挙げられる。
（１）水素発生により、溶液のｐＨとは別に電極表面を酸性環境にすることができ、酸性環境下において蛋白質が分解される。
（２）水素発生の際、化学的に活性な水素ラジカルが発生し、この水素ラジカルにより蛋白質が化学的に分解される。
（３）常温常圧において気体である水素が発生することにより気泡が発生し、この気泡により蛋白質が物理的に剥離される。
以上の３つのメカニズムにより陰極還元による導電性ダイヤモンド電極の再生が可能になる。【００２５】
なお、インシュリン等の分子量約６０００以下の低分子蛋白質を測定対象とした場合は、蛋白質の吸着による導電性ダイヤモンド電極の感度低下は３〜４回程度の測定の後に生じるが、ＣＲＰ等の分子量１００００以上の高分子蛋白質を測定対象とした場合は、１回の測定で導電性ダイヤモンド電極の感度低下が生じる。これは、分子量が大きいほど電極への吸着が著しいためと思われる。また、導電性ダイヤモンド電極を再生するための陰極還元においても、インシュリン等の低分子蛋白質を測定対象とした場合は１Ｖ程度の比較的低電圧で再生可能であるのに対して、ＣＲＰ等の高分子蛋白質を測定対象とした場合では３Ｖ程度の高電圧が必要となる。【００２６】
本発明に係る蛋白質の測定方法は、作用電極及び対電極を用いる二電極法によるものでもよいが、高感度及び高精度の測定を行う場合は、更に参照電極を用いる三電極法によるのが好ましく、測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、更に参照電極を接触させることにより、作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御してもよい。【００２７】
図１は、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡともいう。）を測定対象とし、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用いて、以下の条件のもとでサイクリックボルタンメトリー測定を行った結果のうち、ｐＨ７におけるものを示したボルタモグラムである。
試料溶液；３００ｍｇ／ｄｌ  ＢＳＡ（０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）  ｐＨ２、７、１０）
参照極；Ａｇ／ＡｇＣｌ
対極；白金
ポテンシオスタット；ＨＳＶ−１００（北斗電工製）
ここで点線はキャリア溶液であるＰＢＳによるバックグラウンドを示している。【００２８】
図１に示すとおり、０．７５Ｖ付近にはっきりとした酸化ピークが確認できたが、サイクルを重ねるごとに酸化電流が小さくなった。これはボロンドープダイヤモンド電極表面にＢＳＡが吸着したことに起因すると考えられた。【００２９】
このため、ＢＳＡを測定した後のダイヤモンド電極に対して陰極還元を施し、電極の復活を試みた。１Ｍ  ＰＢＳを溶液として使用し−３Ｖ、１０ｍｉｎの条件にて陰極還元を行ったところ、図２に示すように、電極の活性が回復することが明らかとなった。【００３０】
更に、ＩＡＰを対象として電気化学測定を行ったところ、図３に示すように、ｐＨ７においてＢＳＡと同様の酸化ピークが得られた。【００３１】
その他にヘモグロビン、ペプシン、ＣＲＰの３種類のタンパク質について、それぞれＢＳＡと同様にｐＨ２、７、１０の条件でサイクリックボルタンメトリー測定を行ったところ、図４、５、６に示すように、明瞭な酸化ピークが確認された。【００３２】
本発明に係る蛋白質の測定方法は、例えば以下のような構成を有する測定装置によって実施することができる。即ち、試料溶液中の測定対象の蛋白質を検出するための測定装置であって、作用電極及び対電極を内蔵するセルと、前記作用電極及び前記対電極に電圧を印加する手段と、当該印加電圧下における電流値を測定する手段と、得られた電流値から前記蛋白質を検出する情報処理装置とを備えている蛋白質の測定装置である。【００３３】
当該測定装置において、作用電極は、導電性ダイヤモンド電極であることが好ましく、なかでも、ボロンドープダイヤモンド電極がより好ましい。【００３４】
また、本測定装置は、セルが更に参照電極を内蔵しており、更に作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御する手段を備えているものであってもよい。【００３５】
ところで、一度測定を行うとダイヤモンド電極に蛋白質が吸着して電極としての能力を失うが、その場合には陰極還元を行い吸着した蛋白質を除去することにより電極を再生することが可能である。本発明に係る測定装置は、このように導電性ダイヤモンド電極が陰極還元により再生されたものであっても良い。【００３６】
また、一定流速のキャリア溶液を作用電極に接触させておき、そこに測定対象である蛋白質を注入して、前記作用電極及び対電極と接触させ、前記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析するようにしてもよい。このようにすれば、蛋白質の電極表面への吸着が生じにくく、連続した測定が可能となり、さらにその測定可能濃度域は人体の血中濃度に近いので好ましい測定方法となる。【００３７】
以下、本発明に用いる電気化学測定装置の一実施形態を図面を参照して説明する。【００３８】
図７は本発明に係る蛋白質の測定方法を実施するための装置の一実施形態を示すものであり、電気化学測定用のフローセルを用いた液体注入型の電気化学測定装置（フローインジェクション分析装置）の概略を示している。【００３９】
フローインジェクション分析は、定量ポンプ等を用いて制御された連続流れをつくりだし、この流れの中で種々の反応、分離や試料注入等を行い、末端に設置したフローセルを備えた検出器により溶液中の成分を分析する方法である。【００４０】
図７に示す電気化学測定装置は、流路の上流側から、対電極４、作用電極５及び参照電極６が内蔵されたフローセル３、ポンプ２が配置されており、対電極４、作用電極５及び参照電極６は、ポテンショガルバノスタット７に接続され、更にポテンショガルバノスタット７には情報処理装置８が接続されている。【００４１】
図７に示す電気化学測定装置を用いて測定対象である蛋白質の濃度を測定する場合、まず、ＰＢＳなどのキャリア溶液が流れている中に、測定対象の蛋白質を含む試料溶液１を、ポンプ２によってフローセル３に送る。フローセル３内において、内蔵された対電極４、作用電極５及び参照電極６が試料溶液１に接触した状態で、作用電極５と対電極４との間に電圧が印加されることにより電気化学的反応が起こる。当該電気化学的反応によって生じた電流値（電気信号）はポテンショガルバノスタット７に伝達し各電極における信号の制御・検出が行われる。ポテンショガルバノスタット７で検出された信号は情報処理装置８により解析され、各種蛋白質の検出、濃度の測定が行われる。測定が終了した試料溶液１は電気化学測定装置外に排出される。【００４２】
前記試料溶液１としては、アルブミン、ＩＡＰ、ペプシン、ヘモグロビン、ＣＲＰ等の蛋白質を含有するものを挙げることができる。このうち、糖尿病性腎症のマーカーとなるアルブミンを含有するものとしては、例えば全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。前記電気化学測定装置を用いてアルブミンを測定する方法は、従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定方法のように、抗アルブミン抗体を含む測定試薬を必ずしも使用せずに測定を行うことができる。このため、測定試薬の品質のばらつきによる測定精度や測定感度の低下を懸念することなく、安定して高い精度及び感度で測定を行うことができる。また、抗アルブミン抗体を含む測定試薬を使用せずに測定することも可能となり、測定装置の構造及び操作も簡便なものとすることができる。【００４３】
更に、前記電気化学測定装置はフグ毒であるテトロドトキシン等の天然毒を含有する試料溶液１を測定対象とすることもできる。テトロドトキシンはナトリウムイオンの経路であるナトリウムチャンネルに結合してその神経情報の伝達を妨げることにより、神経や筋肉の麻痺を引き起こすものである。本発明に係る測定方法によれば、簡便にテトロドトキシンの有無が測定できるので、フグを食す際の安全性を高めることができる。テトロドトキシンを含有する試料溶液１としては、例えばフグの組織をペースト状にし緩衝液に懸濁させたもの等を挙げることができる。【００４４】
前記ポンプ２としては一定速度で試料溶液１をフローセル３に送ることができるものであれば特に限定されず、例えば液体クロマトグラフィー用ポンプ等を用いることができる。【００４５】
前記フローセル３は、図８に示すように、作用電極５、対電極４、及び、参照電極６が、試料溶液１が流れる流路３１内に露出され、試料溶液１と接触できるよう構成されている。作用電極５が導電性ダイヤモンド電極である場合、ダイヤモンド薄膜が、流路３１内に露出され、試料溶液１と接触する。試料溶液１は、流路３１の流入口３２から入り、図中の矢印のように流れ、流出口３３に至る。そして、作用電極５と対電極４との間に電圧が印加されることにより、試料溶液１中で電気化学的反応が起こる。作用電極５の形態は、マイクロ電極であってもよく、回転電極であってもよい。【００４６】
前記作用電極５としては、導電性ダイヤモンド電極やカーボン電極を用いることができる。【００４７】
ダイヤモンドは本来優れた絶縁体である。しかしながら、１３族や１５族の不純物を添加することによって、半導体〜金属様の導電性を示すようになる。本発明では、半導体〜金属様の導電性を示すダイヤモンドを電極として使用する。【００４８】
このようなダイヤモンドに導電性を付与するために混入する物質としては、上記の通り１３族及び１５族の元素が挙げられ、より好ましくはホウ素、窒素、リンが挙げられ、更に好ましくはホウ素である。高濃度でホウ素をドープしたボロンドープダイヤモンド電極は、電位窓が広く（酸化電位及び還元電位が広い）、他の電極材料と比較してバックグラウンド電流が低いといった有利な性質を有している。また、ボロンドープダイヤモンド電極は、化学的耐性、耐久性、電気伝導度、耐腐食性等にも優れている。【００４９】
これらのダイヤモンドに導電性を付与するために混入する物質の添加量は、ダイヤモンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば１×１０−２〜１０−６Ωｃｍ程度の導電性を与える量であることが好ましく、当該添加量は一般的には製造工程において制御される。【００５０】
導電性ダイヤモンドそれ自体を基材の支持によらず電極とすることも可能であるが、基材上に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成し、この薄膜に導線を接続させ、電極とすることが好ましい。基材としては、Ｓｉ（例えば、単結晶シリコン）、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＣ、Ｓｉ３Ｎ４、ＺｒＯ２、ＭｇＯ、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、ｃＢＮ、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、ＳｉＣ、単結晶ダイヤモンドが好適に用いられる。【００５１】
導電性ダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、１〜１００μｍ程度の厚さが好ましく、より好ましくは５〜５０μｍ程度である。【００５２】
本発明においては、導電性ダイヤモンド電極は、マイクロ電極の形態をとっていてもよい。ここで、マイクロ電極形態のダイヤモンド電極とは、Ｐｔ等の細線の末端を鋭利に切断し、電解研磨により末端を更に鋭利にした後、その末端表面に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成した構成のものをいう。【００５３】
導電性ダイヤモンド薄膜は、化学気相成長法により製造することができる。化学気相成長法とは、気相中で気体原料を化学反応させて物質を合成する方法であり、ＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法と一般に呼ばれる。この方法は、半導体製造プロセスにおいて広く利用されており、本発明における導電性ダイヤモンド薄膜の製造にも合目的な改変のもと利用可能である。【００５４】
ダイヤモンドの化学気相合成は、メタン等の含炭素気体と水素を混合したものを原料気体として、それを励起源により励起させ、基板上に供給して堆積させることにより行われる。【００５５】
励起源としては、熱フィラメント、マイクロ波、高周波、直流グロー放電、直流アーク放電、燃焼炎等が挙げられる。また、これらを複数組み合わせて核生成密度を調整し、大面積化や均一化をはかることも可能である。【００５６】
原料としては、炭素が含まれており、励起源により分解・励起されて、Ｃ、Ｃ２等の活性な炭素、及び、ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ２等の炭化水素ラジカルを生じさせる種々の化合物を用いることができ、好ましい具体例としては、気体としてＣＨ４、Ｃ２Ｈ２、Ｃ２Ｈ４、ＣＯ、ＣＦ４、液体としてＣＨ３ＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、（ＣＨ３）２ＣＯ、固体として黒鉛、フラーレン等が挙げられる。【００５７】
化学気相合成法において、ダイヤモンドに導電性を付与する物質の添加は、例えば添加物質のディスクを系内に置き、炭素源原料と同様に励起させ、炭素気相に添加物質を導入する方法、炭素源に予め添加物質を添加し、系内に炭素源と共に導入し、励起源により励起し、炭素気相に添加物質を導入する方法等により行うことができる。なかでも、後者の方法が好ましい。とりわけ、炭素源としてアセトン、メタノール等の液体を用いる場合、これに酸化ボロン（Ｂ２Ｏ３）を溶解してボロン源とする方法が、ボロンの濃度の制御が容易で、かつ簡便であることから好ましい。化学気相合成法において、炭素源にホウ素を添加する場合、１０〜１２，０００ｐｐｍ程度が一般的であるが、１，０００〜１０，０００ｐｐｍ程度が好ましい。【００５８】
化学気相合成法としては、プラズマ化学気相合成法が好適に用いられる。このプラズマ化学気相合成法は、化学反応を引き起こす活性化エネルギーが大きく、反応が速いとの利点を有する。更に、この方法によれば、熱力学的に高温でなければ存在しない化学種を生成して、低い温度での反応が可能となる。プラズマ化学気相合成法による導電性ダイヤモンド薄膜の製造は、例えば、Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１４５（１９９８）１８７０に記載の方法に従って行うことができる。【００５９】
本発明で用いるボロンドープダイヤモンド電極は、例えば、次に説明するようなマイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法を用いた製造方法により製造することができる。具体的な製造方法としては、以下の通りである。まず、水素ガスが充満したチャンバー内に水素プラズマを生成し、そこにボロン種を溶解したアセトンとメタノールの混合ガスを導入し、炭素源を導入し、例えばシリコン基板等の導電性（又は半導電性）基板上に気相成長させる。基板としてはシリコン基板｛Ｓｉ（１００）｝を用い、基板表面をテクスチャー処理（例えば、０．５μｍのダイヤモンド粉による研磨）した後、基板を成膜装置のホルダーにセットする。成膜用ソースとしては、アセトンとメタノールの混合物（液体で、混合比は体積比９：１）を用い、この混合物に酸化ホウ素（Ｂ２Ｏ３）をホウ素／炭素（Ｂ／Ｃ）比で１０４ｐｐｍとなるように溶解する。そして、この成膜用ソースにキャリアーガスとして純Ｈ２ガスを通した後、チャンバー内に導入し、予め別ラインで水素（例えば、５３２ｍｌ／ｍｉｎ）を流して所定圧力（例えば、１１５Ｔｏｒｒ＝１１５×１３３．３２２Ｐａ）となるように調整する。そして、２．４５ＧＨｚのマイクロ波電力を注入し、放電させた後、電力が５ｋＷとなるように調整する。そして、安定したところで、成膜用ソースにキャリアーガスとして純Ｈ２ガス（例えば、１５ｍｌ／ｍｉｎ）を流して成膜を行う。【００６０】
上記のマイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法を用いた製造方法により、成膜速度１〜４μｍ／時で、約３０μｍの厚さとなるまでダイヤモンド薄膜の成膜を行ったところ、基板の加熱は行わなかったが、定常状態において約８５０〜９５０℃の温度となっていることが観察された。また、得られたダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルをとると、１３３３ｃｍ−１に単一ピークのみが観察された。また、電気伝導度は約１０−３Ωｃｍ程度であり、０．５Ｍ硫酸中においてサイクリックボルタモグラムを測定した結果、−１．２５〜＋２．３Ｖ（対ＳＨＥ（標準水素電極））と、広い電位窓を有することが確認できた。【００６１】
前記作用電極５として導電性ダイヤモンド電極を用いる場合、８族、９族又は１０族のうちいずれかの族に属する元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものを使用してもよい。前記元素としては、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、イリジウム等が好適に用いられる。【００６２】
ダイヤモンドに前記元素を導入するには、イオン注入法を用いることができる。イオン注入法により製造された金属−ダイヤモンド複合電極は、安定性が高く超音波洗浄等によっても金属が剥離せず、また、金属の分散性にも優れている。【００６３】
前記作用電極５としてカーボン電極を用いる場合は、例えばグラッシーカーボン電極が好適に用いられる。グラッシーカーボン電極は、電気伝導度がよく、化学薬品に安定で、ガスを通さないという熱分解グラファイトと同様な性質を有し、しかも安価で、水素発生や酸素発生に対して過電圧が比較的大きい等の特徴を有する。【００６４】
前記対電極４としては、例えば白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、ＳｎＯ２等を用いることができる。【００６５】
前記作用電極５と対電極４との間に印加する電圧は、測定効率及び精度の観点から、最大電流値を与える電圧であることが好ましい。ここで、最大電流値を与える電圧とは、例えばサイクリックボルタンメトリーにより、最大電流値を与える電圧である。また、最大電流値を与える電圧は、回転電極法又はマイクロ電極法により求めることもできる。回転電極法又はマイクロ電極法によれば、測定条件等による測定誤差の可能性をより排除できる点で有利である。【００６６】
前記参照電極６としては公知のものを利用することができ、標準水素電極、銀塩化銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等を用いることができる。【００６７】
前記電気化学測定装置は、対電極４、作用電極５及び参照電極６が備わった三電極法による測定を行うものであるが、本発明に係る測定方法を行うための電気化学測定装置としては、作用電極５及び対電極４のみを備えた二電極法によるものであってもよい。三電極法の方が、作用電極５と対電極４との間に印加する電圧の絶対値を制御することができるので、精度及び感度の高い測定を行うことが可能であるが、二電極法によれば、用いる電極が作用電極５及び対電極４の２種類の電極ですむので、フローセル３の構造を単純化、小型化することができ、測定セルをチップ化し使い捨てとすることも可能で、より簡便な測定を行いうる。【００６８】
蛋白質の測定に際しては、まず、測定対象の蛋白質を含有しないキャリア溶液のみをフローセル３に流し、いわゆるバックグラウンド電流をできるだけ小さくし、かつ安定させる。ここで、ダイヤモンド電極はバックグラウンド電流が小さいことを特長とする。次に、試料溶液１を前記キャリア溶液に混合させてフローセル３に流す。なお、前記キャリア溶液がフローセル３に流れ込む流路は図示していない。【００６９】
次いで、前記作用電極５と対電極４との間に電圧を印加することにより、測定対象の蛋白質が作用電極５上で酸化又は還元され、酸化還元反応に伴う電流が発生する。この電流（電気信号）はポテンショガルバノスタット７に伝達し、ポテンショガルバノスタット７で検出された信号は情報処理装置８により解析される。
この情報処理装置８は、ＣＰＵ、内部メモリ、ＨＤＤ等の外部記憶装置、モデム等の通信インタフェース、ディスプレイ、マウスやキーボードといった入力手段等を有する。そして、前記内部メモリや外部記憶装置等の所定領域に設定したプログラムにしたがって電気信号を解析し、蛋白質の検出や濃度の算出を行う。かかる情報処理装置８は、汎用のコンピュータであってもよく、専用のものであってもよい。【００７０】
図9は、作用電極５としてボロンドープダイヤモンド電極、対電極４として白金、参照電極６として銀／塩化銀電極を用い、一定流速の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を電極と接触させておいたところへＢＳＡを注入するフローインジェクション測定（以下ＦＩＡともいう。）で得られたＢＳＡの濃度（横軸）と電流値（縦軸）との関係を示す検量線である。当該ＦＩＡでは、はじめに印加する電位を０．４〜１．０Ｖまで０．１Ｖ刻みで変化させＳ／Ｂ比を測定したところ、０．８ＶにてＳ／Ｂ比が最大となったため、測定は全て０．７Ｖにて行った。その結果濃度５ｍｇ／ｄｌ〜３０００ｍｇ／ｄｌの範囲において直線な検量線が得られた。ＦＩＡによれば、作用電極にアルブミンが吸着しにくいため、検量線に示すようにアルブミン濃度と電流との間に良い比例関係が得られる。また、測定可能な濃度域が人体の血中濃度域に近い値であるため、好ましい測定方法の１つである。【００７１】
図１０は作用電極５としてボロンドープダイヤモンド電極、対電極４として白金、参照電極６としてＳＣＥ（飽和カロメル電極）を用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でのテトロドキシンの濃度を変えて直線掃引（２０ｍＶ／ｓ）により得られたサイクリックボルタンメトリーによるボルタモグラムを示す。測定対象がテトロドトキシンである場合の最大電流値は１．３７Ｖ付近にあった。また、図１１は、１．３７Ｖの電圧を印加して、既知の濃度のテトロドトキシン溶液を測定して得られた濃度（横軸）と電流値（縦軸）との関係を示す検量線である。【００７２】
導電性ダイヤモンド電極を用いて低分子物質の検出を行うことは既に報告されていたが、導電性ダイヤモンド電極を用いて蛋白質等の高分子物質を検出することが可能であるか否かは従来全く知られていなかった。上記の通り、導電性ダイヤモンド電極により、アルブミン、ＩＡＰ、ペプシン、ヘモグロビン、ＣＲＰ等の蛋白質やテトロドトキシン等の天然毒を測定することも可能であることは本発明者により初めて見出された知見である。【００７３】
本発明に係る測定方法を実施するに際しては、試料溶液１に含まれる夾雑物を除去するための前処理操作が行われてもよい。前記前処理操作としては、例えば、カラム処理操作や遠心分離操作等を挙げることができる。試料溶液１から共雑物を除去するための前処理操作を行うことにより、測定精度や測定感度を更に向上することが可能となる。【００７４】
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではなく、例えば、セルがフロー型であるもの以外にバッチ型の電気化学測定装置を使用してもよい。【００７５】
また本発明に係る電気化学測定装置が、ＨＰＬＣ等の分離手段を備えていて、目的蛋白質の分離・精製を行なった後、引き続き分離・精製した目的蛋白質画分の分析を行なうことが可能なように構成してあってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によって、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、種々の蛋白質の検出、濃度測定を高速で行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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