(57)【要約】  本発明の目的は、肝臓への指向性の向上及び効率的な薬効発現を可能とする、薬物担体の構成成分である新規有用なガラクトース誘導体、当該誘導体を含有する薬物担体、及び当該担体と医薬とを含有する医薬組成物を提供することにある。  本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるガラクトース誘導体、当該誘導体とカチオン性脂質とを含有する薬物担体及び当該担体と医薬（好ましくは、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸）とを含有する医薬組成物に関するものである。【化６】2007099981.tif 000008  式（Ｉ）中、Ｒ１は水素、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル、又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルを表す。Ｒ２は炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表す。【選択図】なし
2007099981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）で表されるガラクトース誘導体。
【化５】
2007099981.tif 000007
式（Ｉ）中、Ｒ１は水素、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル、又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルを表す。Ｒ２は炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表す。
【請求項２】
ガラクトース誘導体がＮ−［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミド又はＮ，Ｎ−ジ［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミドである、請求項１に記載のガラクトース誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれかに記載のガラクトース誘導体とカチオン性脂質とを必須の構成成分として含有する薬物担体。
【請求項４】
カチオン性脂質が２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールである、請求項３に記載の薬物担体。
【請求項５】
更にリン脂質を構成成分とする、請求項３又は４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
医薬を包含する、請求項３〜５のいずれかに記載の薬物担体を含有する医薬組成物。
【請求項７】
医薬が、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸又は水溶性陰イオン化合物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
オリゴ核酸が、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイムアプタマー、非コードＲＮＡである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
癌の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ウイルス性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
炎症性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
代謝性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
神経疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞の膜表面上には、アシアロ糖タンパク質を認識するレセプターが存在する。かかるレセプターは、アシアロ糖タンパク質中のガラクトース残基を認識し、アシアロ糖タンパク質を肝細胞に取り込む機能を有している（例えば、非特許文献１を参照）。【０００３】
このような基質特異性を利用して、リポソームを構成する脂質にガラクトースを付加させることにより、リポソームの肝臓への指向性の向上が検討されているが、いずれも充分満足できる結果は得られていない（例えば、特許文献１ないし２を参照）。【０００４】
一方、近年、ＲＮＡ干渉［ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（以下、「ＲＮＡｉ」という）］を利用したｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）といわれる核酸医薬が注目され、盛んに研究されている（例えば、特許文献３ないし４を参照）。ｓｉＲＮＡは、単独で人体に投与しても細胞内に移行し難いため、例えば、適当な担体に包含して投与する必要がある。【０００５】
【特許文献１】特開平６−２７１５９７号
【特許文献２】特開平９−２３５２９２号
【特許文献３】国際公開第０２／０５５６９２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０５５６９３号パンフレット
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｐｉｅｓｓ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１９９０年、２９巻、ｐ．１０００９−１００１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、主として、新規有用なガラクトース誘導体、それを必須構成成分として含有する薬物担体、及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ある特定の化学構造を有するガラクトース誘導体を、薬物担体の構成成分として用いることにより、肝臓への指向性及び含有されている医薬の薬効発現が有意に向上することを見出し、本発明を完成した。【０００８】
本発明としては、例えば、下記１〜３に記載の発明を挙げることができる。
１．次の一般式（Ｉ）で表されるガラクトース誘導体（以下、「本発明誘導体」という）。
【化１】
2007099981.tif 000003
式（Ｉ）中、Ｒ１は水素、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル、又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルを表す。Ｒ２は炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表す。
２．上記１に記載のガラクトース誘導体とカチオン性脂質とを必須の構成成分として含有する薬物担体（以下、「本発明担体」という）。
３．医薬を包含する上記２の薬物担体を含有する医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。【０００９】
Ｒ１に係る炭素数１〜１０のアルキルとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルが好ましく、特にメチル、エチルが好ましい。置換されている当該アルキルとしては、アルコキシアルキル、ハロゲン化アルキルを挙げることができる。
かかるアルコキシアルキルとしては、例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、エトキシメチル、エトキシエチルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜４のアルコキシアルキルが好ましく、特にメトキシエチル、エトキシエチルが好ましい。ハロゲン化アルキルのアルキル部分は、上記アルキルと同義である。また、ハロゲン化アルキルのハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化メチル、塩化エチル、フッ化メチル、臭化メチル、トリフルオロメチルを挙げることができる。【００１０】
Ｒ２に係る炭素数１０〜３０の飽和の脂肪酸残基としては、例えば、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、セロトイル、モンタノイル、メリソイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の飽和の脂肪酸残基が好ましく、特にステアロイルがより好ましい。また、炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪酸残基としては、例えば、オレオイル、リノレオイル、アラキドノイル、ネルボノイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の不飽和の脂肪酸残基が好ましく、特にオレオイルがより好ましい。【００１１】
好ましい本発明誘導体としては、例えば、Ｎ−［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミド、Ｎ，Ｎ−ジ［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミドを挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、肝臓への指向性を示す。縦軸は放射活性（ｄｐｍ）を示し、横軸は実施例１に係る本発明化合物の含有量（ｍｇ）を示す。
【００１３】
【図２】図２は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」という）のレプリコンの複製抑制活性を示す。縦軸は、コントロールの産生量を１００％とした場合のＮＳ５Ａ蛋白質の産生量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、白抜きのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が３０ｎＭである細胞の結果を示し、黒塗りのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が１００ｎＭである細胞の結果を示す。
【００１４】
【図３】図３は、ＨＣＶのレプリコンの複製抑制活性を示す。縦軸は、コントロールの産生量を１００％とした場合のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ蛋白質（以下、「ＮＰＴＩＩ蛋白質」という）の産生量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、白抜きのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が３０ｎＭである細胞の結果を示し、黒塗りのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が１００ｎＭである細胞の結果を示す。
【００１５】
【図４】図４は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生抑制活性を示す。縦軸は、コントロールの産生量を１００％とした場合のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、白抜きのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が３０ｎＭである細胞の結果を示し、黒塗りのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が１００ｎＭである細胞の結果を示す。
【００１６】
【図５】図５は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生抑制活性を示す。縦軸は、コントロールの産生量を１００％とした場合のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、白抜きのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が３０ｎＭである細胞の結果を示し、黒塗りのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が１００ｎＭである細胞の結果を示す。
【００１７】
【図６】図６は、細胞毒性を示す。縦軸は、コントロールの細胞数を１００％とした場合の細胞数（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、白抜きのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が３０ｎＭである細胞の結果を示し、黒塗りのカラムは、ｓｉＲＮＡの処理濃度が１００ｎＭである細胞の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
Ｉ．本発明誘導体の製造方法【００１９】
本発明誘導体（Ｉ）は、下記一般式（１）で表されるアミン誘導体と下記一般式（２）で表されるカルボン酸誘導体とを適当な溶媒に溶解し、適当な縮合剤の存在下、反応させることにより製造することができる。適当な溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、これらの混合溶媒を挙げることができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。反応温度は０〜８０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。【００２０】
【化２】
2007099981.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同義である。）
【００２１】
Ｒ１が水素又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルであるアミン誘導体（１）は、Ｄ−（＋）−ラクト−ス（３）と適当なアンモニウム塩（例えば、四ほう酸アンモニウム四水和物、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム）とを適当な溶媒に溶解し、酸性条件下、還元剤を作用させることにより製造することができる。適当な溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）、これらの混合溶媒を挙げることができる。酸としては、例えば、酢酸、塩酸、トシル酸を挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウム、シアノ水素化ほう素酸ナトリウム、水素化アルミニウムリチウムを挙げることができる。反応温度は、０〜８０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜１００時間の範囲内が適当である。
なお、Ｒ１が水素であるアミン誘導体（１）を製造する場合には、１当量のＤ−（＋）−ラクト−スに対して、アンモニウム塩を１〜１０当量の範囲内で用いるのが適当である。また、Ｒ１が１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルであるアミン誘導体（１）を製造する場合には、１当量のアンモニウム塩に対して、Ｄ−（＋）−ラクト−スを２当量以上用いるのが適当である。【００２２】
【化３】
2007099981.tif 000005
（式中、Ｒ３は水素又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルを表す。）
【００２３】
Ｒ１が置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキルであるアミン誘導体（１）は、上述したＲ１が水素又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルであるアミン誘導体（１）の製造方法において、アンモニウム塩の換わりに、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキルアミンを用いることにより製造することができる。
かかるアルキルアミンのアルキル部分としては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜４の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルが好ましく、特にメチル、エチルが好ましい。置換されているアルキルアミンとしては、例えば、アルコキシアミンを挙げることができる。かかるアルコキシアミンとしては、例えば、メトキシメチルアミン、メトキシエチルアミン、エトキシメチルアミン、エトキシエチルアミンを挙げることができる。【００２４】
【化４】
2007099981.tif 000006
（式中、Ｒ４は置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキルを表す。）
【００２５】
Ｒ１が水素である本発明誘導体（Ｉ）は、上述した本発明誘導体（Ｉ）の製造方法において、アミン誘導体として、Ｒ１が水素であるアミン誘導体（１）とＲ１が１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルであるアミン誘導体（１）とを含有するアミン誘導体を用い、反応後、適当な溶媒を用いて抽出することによっても製造することができる。使用する溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）、これらの混合溶媒を挙げることができる。【００２６】
II．本発明担体【００２７】
本発明担体は、本発明誘導体とカチオン性脂質とを必須の構成成分とするものであって、後述する医薬を細胞内に送達しうる性質を有するものである。具体的には、リポソームや脂肪乳剤等の形態をとることができる。【００２８】
本発明担体の必須の構成成分であるカチオン性脂質としては、医薬上許容されるカチオン性脂質であれば特に制限はされないが、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、Ｎ−{１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル}−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII−テトラメチル―Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII―テトラパルミチルスペルミン、２，３−ジオレイロキシ−Ｎ−{２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル}−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールが好ましい。【００２９】
本発明担体における本発明誘導体とカチオン性脂質との配合比率は、カチオン性脂質１重量部に対して、本発明誘導体０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００３０】
本発明担体には、必須の構成成分である本発明誘導体及びカチオン性脂質以外にリン脂質を更に加えることができる。かかるリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。【００３１】
更にリン脂質を加える場合、本発明担体における本発明誘導体とリン脂質との配合比率は、リン脂質１重量部に対して、本発明誘導体０．０１〜１００重量部の範囲内が適当であり、０．１〜１０重量部の範囲内が好ましく、０．３〜２重量部の範囲内がより好ましい。また、カチオン性脂質１重量部に対して、本発明誘導体とリン脂質との和が、０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００３２】
本発明担体の分散液は、本発明誘導体及びカチオン性脂質、又は本発明誘導体、カチオン性脂質及びリン脂質を混合し、常法により、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。【００３３】
III．本発明組成物【００３４】
本発明組成物に用い得る「医薬」としては、例えば、水溶性陰イオン性化合物、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質を挙げることができる。具体的には、核酸化合物である二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡあるいはオリゴ核酸、酸性糖であるヘパラン硫酸やデキストラン硫酸等、サイトカイン類、サイクリックＡＭＰ、ＡＴＰやＩＰ３等のセカンドメッセンジャー類、ペニシリン類やセファロスポリン類、ビタミンＣやレチノール類等のビタミン類、その他酸性基をもった既知の医薬、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レバミゾール、ペスタチン、レチノイックアシッド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、アデニンアラビノシド（Ａｒａ−Ａ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、アジドチミジン（ＡＺＴ）等を挙げることができる。【００３５】
二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．ホモポリマー・ホモポリマー複合体
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸、
ポリイノシン酸・ポリ（５−ブロモシチジル酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（２−チオシチジル酸）、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリシチジル酸、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリ（５−ブロモシチジル酸）、
ポリ（２’−アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸、
ポリイノシン酸・ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）。
２．ホモポリマー・コポリマー複合体
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、４−チオウリジン酸）。
３．合成核酸とポリカチオンとの複合体
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸・ポリ−Ｌ−リジン。
４．その他
ポリイノシン酸・ポリ（１−ビニルシチジル酸）。【００３６】
オリゴ核酸としては、一分子内に１０〜５０、好ましくは１５〜３０、より好ましくは１８〜２５の核酸塩基を有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの誘導体を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマー、非コードＲＮＡを挙げることができる。【００３７】
上記オリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。かかる修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基をＨ、ＯＲ５、Ｒ５、Ｒ６ＯＲ５、ＳＨ、ＳＲ５、ＮＨ２、ＮＨＲ５、Ｎ（Ｒ５）２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒ５はアルキル又はアリールを表す。また、Ｒ６はアルキレンを表す。【００３８】
Ｒ５のアルキルとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。かかるアルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。かかるアルコキシとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルコキシを挙げることができる。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、特に炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。
Ｒ５のアリールとしては、例えば、炭素数６〜１０のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。それらの中で、特にフェニルが好ましい。【００３９】
Ｒ６のアルキレンとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルキレンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。【００４０】
リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。【００４１】
本発明組成物中に含まれる本発明担体と医薬との重量比（本発明担体／医薬）は、医薬の種類、本発明担体における本発明誘導体とカチオン性脂質との配合比率等によって異なるが、０．０１〜１０００の範囲内が適当であり、１０〜３００の範囲内が好ましく、１００〜２００の範囲内がより好ましい。更に、含有医薬がオリゴ核酸である場合には、０．０１〜１００の範囲内が適当であり、１〜３０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。【００４２】
本発明組成物には、上述した本発明担体と医薬以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。【００４３】
本発明組成物は、本発明担体の分散液に医薬を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、本発明担体の製造過程において、医薬を加えることによっても調製することができる。上述した添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。【００４４】
本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。液剤の場合、本発明組成物中に含まれる本発明担体の濃度は、０．００１〜２５％ｗ／ｖの範囲内が適当であり、０．０１〜５％ｗ／ｖの範囲内が好ましく、０．１〜２％ｗ／ｖの範囲内がより好ましい。【００４５】
上記凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。【００４６】
本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。【００４７】
本発明組成物は、例えば、癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経疾患の治療に用いることができる。【００４８】
本発明組成物の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができる。例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、直腸内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与、胸腔内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜投与が好ましい。また、本発明組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤として投与することができる。【００４９】
例えば、本発明組成物の医薬としての用量は、医薬の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与形態、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して医薬量として、１日当たり０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは０．１ｍｇ〜５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。更に、本発明組成物に含有されている医薬がオリゴ核酸である場合には、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また、１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００５０】
以下に、参考例、実施例、比較例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。【００５１】
実施例１  Ｎ−［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミドの合成
工程１  １−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルアミン、ジ［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］アミンの混合物の合成
２０ｇのラクト−ス１水和物及び２２ｇの四ほう酸アンモニウム四水和物を、３００ｍＬのメタノール、８０ｍＬのＨ2Ｏ及び１００ｍＬの酢酸の混合液に懸濁し、１００ｍＬの７％シアノヒドリドほう酸ナトリウム／メタノール溶液を滴下し、室温で終夜攪拌した。その反応液を７０℃で更に３時間攪拌した後、その反応液を減圧下で濃縮した。その残渣にメタノールを加え、不溶物をろ取し、そのろ取した不溶物を減圧下で乾燥した。得られた粉末を少量のＨ2Ｏに溶解し、その溶液を、５００ｍＬの陽イオン交換樹脂［ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０Ｗ×２（ピリジン型）］を充填したカラムに通し、カラムを十分に水洗した。次に、カラムに３％アンモニア水を通し、得られた溶出液を減圧下で濃縮して、１２ｇの目的の混合物を得た。
工程２  Ｎ−［１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イル］オレアミドの合成
４．９ｇのオレイン酸、４．３６ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを１００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、室温で１５分間攪拌した。その反応液に、上記工程１で得られた５．５ｇの混合物を加え、更に５０ｍＬのジメチルホルムアミドを加えた。その溶液を室温で３時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にジクロロメタン/メタノール（２/１）の混合液を加えて遠心分離し、上清のジクロロメタン/メタノール（２/１）の混合液を回収した。この操作を更に３回行い、回収したジクロロメタン/メタノール（２/１）の混合液を減圧下で濃縮した。残渣に、２４ｍＬのＨ2Ｏ、６０ｍＬのメタノール及び３０ｍＬのジクロロメタンを加えて溶解し、更に３０ｍＬのジクロロメタン及び３０ｍＬのＨ2Ｏを加えてよく混合した。その後、遠心分離して水層を回収し、凍結乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１．３ｇの目的物（本発明誘導体）を得た。【００５２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝６０８．２８７（［Ｍ+Ｈ］+）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝６３０．４４８（［Ｍ+Ｎａ］+）【００５３】
実施例２  本発明担体の分散液の調製（１）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、２０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び８０ｍｇの卵黄レシチン（和光純薬工業社製。以下同じ。）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、４．９２０ｍＬの１０％マルトース及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。その後、４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００５４】
実施例３  本発明担体の分散液の調製（２）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、４０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び６０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例２と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５５】
実施例４  本発明担体の分散液の調製（３）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、６０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び４０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例２と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５６】
実施例５  本発明担体の分散液の調製（４）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、８０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び２０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例２と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５７】
実施例６  本発明担体の分散液の調製（５）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、１００ｍｇの実施例１に係る本発明化合物を用い、実施例２と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５８】
実施例７  本発明担体の分散液の調製（６）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、２０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び８０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（日本油脂社製。以下同じ。）に、４．９２０ｍＬの１０％マルトース及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで分散させた。その後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００５９】
実施例８  本発明担体の分散液の調製（７）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、６０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び４０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリンを用い、実施例７と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６０】
実施例９  本発明担体の分散液の調製（８）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、２０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び８０ｍｇの大豆レシチン（和光純薬工業社製。以下同じ。）に、４．９２０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサー分散させた。その後、４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００６１】
実施例１０  本発明担体の分散液の調製（９）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、６０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び４０ｍｇの大豆レシチンを用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６２】
実施例１１  本発明担体の分散液の調製（１０）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、２０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び８０ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（日本油脂社製。以下同じ。）に４．９２０ｍＬの５％Ｄ−マンニトール及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。その後、４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００６３】
実施例１２  本発明担体の分散液の調製（１１）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、６０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び４０ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリンを用い、実施例１１と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６４】
実施例１３  本発明担体の分散液の調製（１２）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、２０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び  ８０ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（日本油脂社製。以下同じ）に４．９２０ｍＬの５％グルコース及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。その後、４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００６５】
実施例１４  本発明担体の分散液の調製（１３）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、６０ｍｇの実施例１に係る本発明化合物及び４０ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを用い、実施例１３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６６】
比較例１  比較対照用担体の分散液の調製（１）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及び１００ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例２と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００６７】
比較例２  比較対照用担体の分散液の調製（２）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及び１００ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリンを用い、実施例７と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００６８】
比較例３  比較対照用担体の分散液の調製（３）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及び１００ｍｇの大豆レシチンを用い、実施例９と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００６９】
比較例４  比較対照用担体の分散液の調製（４）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及び１００ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリンを用い、実施例１１と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００７０】
比較例５  比較対照用担体の分散液の調製（５）
６０ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及び１００ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを用い、実施例１３と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００７１】
試験例１  肝臓への指向性の評価
（１）核酸溶液の調製
配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡとから構成される、トリチウム標識されたｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｔ７  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、トリチウム標識された［２５’８−３Ｈ］アデノシン５’−３リン酸アンモニウム塩（アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませることにより調製した。なお、かかる核酸溶液中のｓｉＲＮＡの濃度は２０μＭであった。また、比活性は６．４×１０５ｄｐｍ／μｇであった。
８．７５μＬの上記工程で調製した核酸溶液に、配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡとから構成される、トリチウム標識されていないｓｉＲＮＡを、２０μＭの濃度で含有する核酸溶液を３４１．２５μＬ添加して、比活性が１．６×１０４ｄｐｍ／μｇである核酸溶液を調製した。
（２）組成物の調製
１０μＬの上記（１）で調製した、比活性が１．６×１０４ｄｐｍ／μｇである核酸溶液に９０μＬの１０％マルトースを添加し、２μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液を調製した。また、実施例２〜６又は、比較例１に係る担体の分散液に、１０％マルトースを加えて希釈し、４２９μｇ／ｍＬの担体分散液を調製した。
各担体分散液（４２９μｇ／ｍＬ）に対して、等量の核酸溶液（２μＭ）を添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合した。その後、１５分間室温で静置し、１５秒間の超音波処理を行い、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。
（３）実験方法
６ウェルプレートに、ヒト肝細胞癌由来の細胞株であるＨｕＨ−７細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。培地を交換した後、１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が１００ｎＭとなるように、１００μＬの上記（２）で調製した組成物を添加し、更に培養を行った。組成物添加から８時間後、１ｍＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という）で細胞を２度洗浄し、４００μＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社製）で細胞を剥離させ、エッペンドルフチューブに回収した。細胞の取り残しが無いよう、回収後のウェルに、更に８００μＬのＰＢＳを加え、上記と同じチューブに続けて回収した。これを３０００ｒｐｍで２分間遠心した後、８００μＬの上清を除き、残った全量をシンチレーションバイアルへ移した。各バイアルに４ｍＬの液体シンチレーションカクテル（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏｒ  Ｐｌｕｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を加えてよく混合し、液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて放射活性を測定した。
（４）試験結果
その結果、図１に示すように、実施例１に係る本発明化合物の含有量に依存して、肝臓への指向性が高くなることが判った。【００７２】
試験例２  薬理活性の評価（１）
実施例７又は８に係る本発明担体とＨＣＶの複製を抑制する活性を有するｓｉＲＮＡとを含有する本発明組成物の薬理活性を、ＨＣＶの非構造蛋白質であるＮＳ５Ａ蛋白質の産生量を指標として評価した。
（１）核酸溶液の調製
配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡを、濃度が１００μＭになるように注射用水にそれぞれを溶解させ、オリゴＲＮＡの原液を調製した。その後、各２０μＬを試験管内で混合し、更に、これに６０μＬの注射用水を添加して、２０μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液を調製した。
なお、上記２つのオリゴＲＮＡの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
（２）組成物の調製
１０μＬの上記（１）で調製した核酸溶液（２０μＭ）に９０μＬの１０％マルトースを添加し、２μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液を調製した。また、１．３μＬの実施例７、８又は比較例２に係る担体の分散液に９８．７μＬの１０％マルトースを添加し、４２８．８ｍｇ／ｍＬの担体分散液を調製した。
１００μＬの核酸溶液（２μＭ）と１００μＬの担体分散液（４２８．８ｍｇ／ｍＬ）とを試験管内で混合し、４℃で１５分間静置後、超音波処理を行い、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。この組成物を適宜１０％マルトースにより希釈して以下の実験に用いた。
（３）実験方法
６ウェルプレートに、ＨＣＶのレプリコンを保持しているＨｕＨ−７細胞［かかる細胞の詳細については、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０００年、２９３巻、ｐ．９９３−９９９）を参照されたい。］を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２０時間培養した。その後、１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように、１００μＬの上記（２）で調製した組成物を添加し、更に同条件下で９６時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、細胞溶解液を調製した。
総蛋白質量が５μｇである細胞溶解液を熱変性させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜（以下、「ＰＶＤＦ膜」という）(ミリポア社製)に電気転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を抗ＮＳ５Ａポリクローナル抗体(Ｖｉｒｏ  Ｇｅｎ社製)及びＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下、「ＨＲＰ」という）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で染色した。染色後のＰＶＤＦ膜をＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて化学発光させ、ＮＳ５Ａ蛋白質に対応するバンドの発光強度をイメージングアナライザー(ＢｉｏＲａｄ社製)で定量し数値化した。また、抗α−アクチンモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、α−アクチン蛋白質に対応するバンド強度も同様に算出した。
ＮＳ５Ａ蛋白質に対応するバンドの定量値をα−アクチン蛋白質に対応するバンドの定量値で除したものを単位蛋白質量あたりのＮＳ５Ａ蛋白質の産生量とした。
（４）評価方法
評価は、１０％マルトースを添加した細胞の単位蛋白質量あたりのＮＳ５Ａ蛋白質の産生量を１００％として、各本発明組成物を添加した細胞のＮＳ５Ａ蛋白質の産生量を比較することにより行った。なお、ＮＳ５Ａ蛋白質の産生量が少ないほど、ＨＣＶのレプリコンの複製が抑制されていることを示している。
（５）試験結果
その結果、図２に示すように、実施例７及び８に係る本発明担体を用いた場合、比較例２に係る担体を用いた場合よりも強く、ＨＣＶのレプリコンの複製を抑制していることが判った。【００７３】
試験例３  薬理活性の評価（２）
実施例９又は１０に係る本発明担体とＨＣＶの複製を抑制する活性を有するｓｉＲＮＡとを含有する本発明組成物の薬理活性を、ネオマイシン耐性遺伝子の産物であるＮＰＴＩＩ蛋白質の産生量を指標として評価した。
（１）組成物の調製
実施例９、１０又は比較例３に係る担体の分散液と、上記試験例２で調製した核酸溶液（２μＭ）を用い、試験例２と同様にして、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。この組成物を適宜１０％マルトースにより希釈して以下の実験に用いた。
（２）実験方法
１２ウェルプレートに、ＨＣＶのレプリコンを保持しているＨｕＨ−７細胞［かかる細胞の詳細については、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０００年、２９３巻、ｐ．９９３−９９９）を参照されたい。］を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日培養プレートから培地を吸引除去し、０．９ｍＬの培地を加えて培地交換を行った。１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように、１００μＬの上記（１）で調製した組成物を添加し、更に同条件下で９６時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、蛋白質抽出液を調製した。その蛋白質抽出液中のＮＰＴＩＩ蛋白質の量を市販の測定キット（ＰａｔｈｏＳｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＮＰＴＩＩ、Ａｇｄｉａ社製）を用いて測定した。蛋白質抽出液の調製には、キットに付属の抽出用緩衝液を用いた。また、抽出した蛋白質中の総蛋白質量を、市販のキット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて測定した。
（３）評価方法
評価は、１０％マルトースを添加した細胞の単位蛋白質量あたりのＮＰＴＩＩ蛋白質の産生量を１００％として、各本発明組成物を添加した細胞のＮＰＴＩＩ蛋白質の産生量を比較することにより行った。なお、ＮＰＴＩＩ蛋白質の産生量が少ないほど、ＨＣＶのレプリコンの複製が抑制されていることを示している。
（４）試験結果
その結果、図３に示すように、実施例９及び１０に係る本発明担体を用いた場合、比較例３に係る担体を用いた場合よりも強く、ＨＣＶのレプリコンの複製を抑制していることが判った。【００７４】
試験例４  薬理活性の評価（３）
実施例１１又は１２に係る本発明担体とヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとを含有する本発明組成物の薬理活性を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を指標として評価した。
（１）組成物の調製
配列番号５の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号６の塩基配列を有するオリゴＲＮＡとから構成される、ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を注射用水で希釈し、２０μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液を調製した。１０μＬの核酸溶液（２０μＭ）に９０μＬの１０％マルトースを添加し、２μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する核酸溶液を調製した。また、１．３μＬの実施例１１、１２又は比較例４に係る担体の分散液に９８．７μＬの１０％マルトースを添加し、４２８．８ｍｇ／ｍＬの担体分散液を調製した。
１００μＬの核酸溶液（２μＭ）と１００μＬの担体分散液（４２８．８ｍｇ／ｍＬ）とを試験管内で混合し、４℃で１５分間静置後、超音波処理を行い、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。この組成物を適宜１０％マルトースにより希釈して以下の実験に用いた。
（２）実験方法
１２ウェルプレートに、ＨｕＨ−７細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。翌日培養プレートから培地を吸引除去し、０．９ｍＬの培地を加えて培地交換を行った。１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように、１００μＬの上記（１）で調製した組成物を添加し、更に同条件下で２４時間培養した。その後、培養プレートから培地を吸引除去し、０．９ｍＬの培地を加えて培地交換を行い、更に、同条件下で２４時間培養した。培養後、培養上清中のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の量を市販のキット（Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。
（３）評価方法
評価は、１０％マルトースを添加した細胞のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を１００％として、各本発明組成物を添加した細胞のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を比較することにより行った。
（４）試験結果
その結果、図４に示すように、実施例１１及び１２に係る本発明担体を用いた場合、比較例４に係る担体を用いた場合と同等か、あるいはそれよりも強く、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生を抑制していることが判った。【００７５】
試験例５  薬理活性の評価（４）
実施例１３又は１４に係る本発明担体とヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとを含有する本発明組成物の薬理活性を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を指標として評価した。
（１）組成物の調製
実施例１３、１４又は比較例５に係る担体の分散液と、上記試験例４で調製した核酸溶液（２μＭ）を用い、試験例４と同様にして、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。この組成物を適宜１０％マルトースにより希釈して以下の実験に用いた。
（２）試験方法
１２ウェルプレートに、ヒト肝臓癌由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。翌日培養プレートから培地を吸引除去し、０．９ｍＬの培地を加えて培地交換を行った。１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように、１００μＬの上記（１）で調製した組成物を添加し、更に同条件下で２４時間培養した。その後、培養プレートから培地を吸引除去し、０．９ｍＬの培地を加えて培地交換を行い、更に、同条件下で２４時間培養した。培養後、培養上清中のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の量を市販のキット（Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。
（３）評価方法
評価は、１０％マルトースを添加した細胞のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を１００％として、各本発明組成物を添加した細胞のヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生量を比較することにより行った。
（４）試験結果
その結果、図５に示すように、実施例１３及び１４に係る本発明担体を用いた場合、比較例５に係る担体を用いた場合よりも強く、ヒトＶＥＧＦ−Ａ蛋白質の産生を抑制していることが判った。【００７６】
試験例６  細胞毒性の評価
（１）組成物の調製
実施例２、４、６又は比較例１に係る担体の分散液と、上記試験例２で調製した核酸溶液（２μＭ）を用い、試験例２と同様にして、１μＭの濃度でｓｉＲＮＡを含有する組成物を調製した。この組成物を適宜１０％マルトースにより希釈して以下の実験に用いた。
（２）実験方法
９６ウェルプレートに、ＨｕＨ−７細胞を３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。その後、１ウェルにつき、ｓｉＲＮＡの最終濃度が３０ｎＭ又は１００ｎＭとなるように、１１．１μＬの上記（１）で調製した組成物を添加した。その後、同条件下で９６時間培養した後、細胞数を市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて測定した。
（３）評価方法
評価は、１０％マルトースを添加した細胞の細胞数を１００％として、各本発明組成物を添加した細胞の細胞数を比較することにより行った。
（４）試験結果
その結果、図６に示すように、実施例２、４、６に係る本発明担体の細胞に対する毒性は、比較例１に係る担体と同程度であることが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月10日(2007.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）で表されるガラクトース誘導体。
【化５】
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式（Ｉ）中、Ｒ１は水素、又は１−（Ｄ）−デオキシラクチト−１−イルを表す。Ｒ２は炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表す。
【国際調査報告】
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