(57)【要約】  本発明は、被験者由来の生体試料中のＣＸＣＬ１タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法、ならびに、該タンパク質または遺伝子に特異的に結合可能な抗体または核酸プローブを含む尿路上皮ガン診断用キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の生体試料中のＣＸＣＬ１タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法。
【請求項２】
前記タンパク質の量または前記遺伝子の発現量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の量または前記遺伝子の発現量が、対照試料のものと比べて有意に増大していることを指標にする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増大が２倍以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増大が３倍以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が免疫学的方法によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記測定がハイブリダイゼーションによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定が、前記タンパク質または前記遺伝子と結合可能な物質を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質と結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子と結合可能な物質が核酸プローブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸プローブが、配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体または核酸プローブが標識されている、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、試料中の該タンパク質を免疫学的に測定し、該タンパク質の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片からなるプローブを用いて、試料中の前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガンおよび尿道ガンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が血液、血漿、血清または尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が尿路上皮組織または細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
【請求項２１】
前記タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記タンパク質の断片が、少なくとも８個のアミノ酸からなるエピトープを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗体またはその断片が固相担体に結合されている、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
前記抗体またはその断片と結合可能な標識二次抗体をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記二次抗体の標識が酵素、蛍光または放射性標識である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体配列からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、もしくはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片、またはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
【請求項２８】
前記核酸が、配列番号１に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記核酸が固相担体に結合されている請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
前記固相担体がＤＮＡチップまたはマイクロアレイの基板である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
請求項２０または２７に記載のキットの、被験者における尿路上皮ガンのインビトロ検出のための使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路上皮ガンの検出または診断に有用なＣＸＣＬ１タンパク質、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子の発現、を測定することによる尿路上皮ガンの検出方法に関する。【０００２】
本発明はまた、尿路上皮ガンの検出のために使用される、該タンパク質あるいは遺伝子と結合可能な物質を含む該ガンの診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
尿路上皮ガンとは、膀胱ガンと腎盂ガン、尿管ガンなどの総称であり、これらのガンはいずれも尿路の移行上皮細胞がガン化したものであり、その性質は共通であると考えられる。尿路上皮ガンは尿路性器ガンでは前立腺ガンに次いで罹患者が多く、2001年の日本国厚生労働省大臣官房統計情報部「人口動態統計」では、膀胱ガンだけでも日本国の年間罹患数は男９７６５人、女３２４３人、死亡数は男３４５９人、女１５８７人に上る。腎盂ガン、尿管ガンは比較的少なく、死亡数はそれぞれ男女合わせて７９７人、７１３人とされている。【０００４】
膀胱ガンまたはその他の尿路上皮ガンの予防に関する研究はないが、膀胱ガンは５０歳以上に好発し、男性が女性の２〜３倍の頻度で発症する。また喫煙者は非喫煙者に比べて４倍程度発生率が高いと考えられている。膀胱ガンには大きく分けて２つのタイプがあり、表在性乳頭状ガンは比較的悪性度の低いガンで、膀胱の内腔（膀胱の内面）に突出するが根は浅く、表面は乳頭状（カリフラワーの様）で狭い茎を持つ。内視鏡的に治療できるが、半数以上の患者で膀胱内に再発する。ガンの深さは粘膜下に及ぶ場合もあるが、膀胱の筋肉層には達しない。これに対して浸潤性ガンは悪性度の高いガンで、根が広く、膀胱の壁深部まで浸潤する傾向があり、転移することもある。したがって膀胱摘出、抗ガン剤の使用、放射線療法など、体に負担のかかる治療が必要となる。【０００５】
膀胱ガンの症状で一番多いものは痛みのない血尿であるが、尿の回数が多い、排尿時の痛み、排尿後もスッキリしない、などの膀胱炎症状の場合もある。診断には尿検査（細胞診）、Ｘ線撮影、内視鏡などが利用される。しかしながら、早期診断に有用な血液や尿で利用可能な特異的で感度が高い腫瘍マーカーが存在せず、ガンが進行してしまってから検査によって発見となる場合が多い。また膀胱以外の部位で発生する尿路上皮ガンも同じ性質を持っている。したがって、尿路上皮ガン、特に膀胱ガンのための特異的で感度が高い腫瘍マーカーによる、簡便な検査方法の実用化が期待されている。【０００６】
膀胱ガンの検査・判定のための種々のマーカー及び方法が提案されている。例えばヌクレオホスミン/Ｂ２３(特許文献１)、ＨＵＲＰ(特許文献２)、ＣＹＰ４Ｂ１又はＣＹＰ４Ｂ２(特許文献３)などの遺伝子の発現レベルの変化によって膀胱ガンを判定する方法、尿検体中の特定のタンパク質の存在又は量によって判定する方法(特許文献４、特許文献５)、血液中の可溶性Ｆａｓ濃度を指標として判定する方法(特許文献６)などを挙げることができる。
【特許文献１】特開２００４−３３７１２０
【特許文献２】特開２００４−２４８５０８
【特許文献３】特開２００２−２３８５９９
【特許文献４】特開２００４−６１２８８
【特許文献５】特開平７−３０９８９５号公報
【特許文献６】特開２０００−１３１３２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、新規な尿路上皮ガン腫瘍マーカーを見出し、尿路上皮ガン、特に膀胱ガンを効果的に検出できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ＣＸＣＬ１タンパク質を腫瘍マーカーとして、これに特異的に結合する抗体、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子、その転写産物またはそのｃＤＮＡに結合可能な核酸、を用いることにより、尿路上皮ガンを有意に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００９】
＜発明の概要＞
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００１０】
（１）被験者由来の生体試料中のＣＸＣＬ１タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法。【００１１】
（２）前記タンパク質量または前記遺伝子の発現量を測定する、（１）に記載の方法。【００１２】
（３）前記タンパク質量または前記遺伝子の発現量が、対照試料のものと比べて有意に増大していることを指標にする、（１）または（２）に記載の方法。【００１３】
（４）前記増大が２倍以上である、（３）に記載の方法。【００１４】
（５）前記増大が３倍以上である、（３）に記載の方法。【００１５】
（６）前記測定が免疫学的方法によるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１６】
（７）前記測定がハイブリダイゼーションによるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１７】
（８）前記測定が、前記タンパク質または前記遺伝子と結合可能な物質を用いて行われる、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。【００１８】
（９）前記タンパク質と結合可能な物質が抗体またはその断片である、（８）に記載の方法。【００１９】
（１０）前記遺伝子と結合可能な物質が核酸プローブである、（８）に記載の方法。【００２０】
（１１）前記核酸プローブが、配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片からなる、（１０）に記載の方法。【００２１】
（１２）前記抗体または核酸プローブが標識されている、（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。【００２２】
（１３）前記タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、試料中の該タンパク質を免疫学的に測定し、該タンパク質の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、（１）〜（６）、（８）、（９）及び（１２）のいずれかに記載の方法。【００２３】
（１４）配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片からなるプローブを用いて、試料中の前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、（１）〜（５）、（７）、（８）、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。【００２４】
（１５）前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガンおよび尿道ガンからなる群から選択される、（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。【００２５】
（１６）前記試料が血液、血漿、血清または尿である、（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。【００２６】
（１７）前記試料が尿路上皮組織または細胞である、（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。【００２７】
（１８）前記タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有する、（１）〜（６）、（８）、（９）、（１２）、（１３）、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法。【００２８】
（１９）前記遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、（１）〜（５）、（７）、（８）、（１０）〜（１２）、（１４）〜（１７）のいずれかに記載の方法。【００２９】
（２０）ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。【００３０】
（２１）前記タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有する、（２０）に記載のキット。【００３１】
（２２）前記タンパク質の断片が、少なくとも８個のアミノ酸からなるエピトープを含む、（２０）または（２１）に記載のキット。【００３２】
（２３）前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から選択される、（２０）〜（２２）のいずれかに記載のキット。【００３３】
（２４）前記抗体またはその断片が固相担体に結合されている、（２０）〜（２３）のいずれかに記載のキット。【００３４】
（２５）前記抗体またはその断片と結合可能な標識二次抗体をさらに含む、（２０）〜（２４）のいずれかに記載のキット。【００３５】
（２６）前記二次抗体の標識が酵素、蛍光または放射性標識である、（２５）に記載のキット。【００３６】
（２７）配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体配列からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、もしくはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片、またはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。【００３７】
（２８）前記核酸が、配列番号１に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、（２７）に記載のキット。【００３８】
（２９）前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から選択される、（２７）または（２８）に記載のキット。【００３９】
（３０）前記核酸が固相担体に結合されている、（２７）〜（２９）のいずれかに記載のキット。【００４０】
（３１）前記固相担体がＤＮＡチップまたはマイクロアレイの基板である、（３０）に記載のキット。【００４１】
（３２）上記(２０）〜（３１）のいずれかに記載のキットの、被験者における尿路上皮ガンのインビトロ検出のための使用方法。【００４２】
＜用語の定義＞
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。【００４３】
核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質などの略号による表示は、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。【００４４】
本明細書において「ＣＸＣＬ１」（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  １、ＧＲＯ―α、ＧＲＯ―１、ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｌｐｈａ）タンパク質とは、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーに属するアミノ酸１０７残基からなる分子量約１．１ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、７回膜貫通型受容体であるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２のリガンドとして作用し、これらの受容体を発現する好中球、好塩基球、マスト細胞などの遊走を引き起こす（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａら、１９８８、ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ、第７巻、ｐ．２０２５−７１２０３３など）。またヒト悪性黒色腫での細胞分裂誘導因子としての活性が報告されている（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ，Ａら、１９８７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＳＡ、第８４巻、ｐ．７１８８−７１９２）。【００４５】
本明細書において「核酸」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含するものとして用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、核酸はポリヌクレオチドと互換的に使用される。【００４６】
本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡに相補的な配列のＤＮＡ鎖全長、及びその部分配列からなるＤＮＡ断片、を包含する。ｃＤＮＡは、ＲＮＡを鋳型にして、ポリＴプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ(逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応)によって合成されうる。【００４７】
本明細書において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（またはセンス鎖）または相補鎖（またはアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（または配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、スプライスバリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１で示される塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。【００４８】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体（すなわち、ホモログ）またはそれをコードする遺伝子としては、当該タンパク質またはそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生物種のタンパク質または遺伝子が例示でき、これらのタンパク質または遺伝子ホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｈｏｍｏｌｏＧｅｎｅ/）により同定することができる。具体的には特定のヒトアミノ酸または塩基配列をＢＬＡＳＴプログラム（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ.Ｓ.Ａ.、 １９９３年、第９０巻、ｐ.５８７３―５８７７、 ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｆｙが１００％を示す）配列の登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を取得することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとしては、ＢＬＡＳＴＮ（遺伝子）、ＢＬＡＳＴＸ(タンパク質)などが知られている。例えば、遺伝子検索の場合、上記ＢＬＡＳＴ検索からの登録番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＵｎｉＧｅｎｅ/）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することができる。またこの方法において、ＢＬＡＳＴプログラムの代わりにＦＡＳＴＡプログラム（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｅ．ｈｔｍｌ）を用いてもよい。【００４９】
なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。【００５０】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でｍＲＮＡが合成される。このｍＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。【００５１】
本明細書において「翻訳産物」とは、転写によって合成されたｍＲＮＡが、スプライシングなどの修飾を受ける/受けないにかかわらず、その情報を元に合成されたタンパク質を示す。ｍＲＮＡの翻訳過程においては、まずリボソームとメッセンジャーＲＮＡが結合し、次にｍＲＮＡの塩基配列に従ってアミノ酸がつながっていき、タンパク質が合成される。【００５２】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来する核酸を特異的に検出するために使用される核酸及び／またはそれに相補的な核酸を包含する。【００５３】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来する核酸を特異的に認識し、増幅する、連続する核酸及び／またはそれに相補的な核酸を包含する。【００５４】
ここで相補的な核酸（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列からなる核酸の全長配列、またはその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にある核酸を意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。【００５５】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。【００５６】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、同族体、あるいは遺伝暗号の縮重に基づく変異体、あるいは配列番号１で表される塩基配列またはその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加または挿入を含む変異体、あるいは該塩基配列またはその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、もしくは約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味し、一方、タンパク質またはペプチドの場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその部分配列おいて１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列またはその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、もしくは約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。【００５７】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２個以下の整数を意味する。【００５８】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質または遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。【００５９】
本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団、放射性同位元素などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、および塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体など、一方、タンパク質の場合、アセチル化、アシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ビオチン/アビジン化、ラベル化（例えば酵素、蛍光団、発光物質などのラベル）などの化学修飾誘導体を意味する。【００６０】
本明細書において「診断（または検出もしくは判定）用キット」とは、尿路上皮ガンの罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また尿路上皮ガンの予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには尿路上皮道ガンの罹患に関連して生体内、特に尿路上皮組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、これらのヌクレオチドが包含される。これらのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。またこれには該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を検出することができる抗体も包含される。【００６１】
本明細書において検出・診断対象となる「生体試料」とは、尿路上皮ガンの発生にともない本発明のタンパク質および／または遺伝子が発現変化する試料(または検体)であり、被験者から採取された試料を指す。具体的には、該試料には、尿路上皮組織及びその周辺のリンパ節、また転移が疑われる他臓器、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水などの体液、さらに細胞または臓器の抽出液などが含まれる。【００６２】
本明細書において「尿路上皮ガン」とは、腎杯、腎盂、尿管、膀胱、尿道にある移行上皮部に発生するガンを意味する。尿路上皮ガンの例としては、例えば、膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン、尿道ガンが挙げられ、本発明は特に、膀胱ガンの検出において好ましく使用される。【００６３】
本明細書において「被験者」とは、尿路上皮ガンをもつ動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。【００６４】
本明細書において「特異的」とは、特定のタンパク質または核酸のみを認識するか、あるいはそれらとのみ結合または反応することを意味する。
【発明の効果】
【００６５】
本発明により、尿路上皮ガンを容易にかつ高い信頼度で検出することが可能になった。例えば、患者の尿中のＣＸＣＬ１濃度/クレアチニン濃度の割合を測定するだけで、容易に尿路上皮ガンであるか否かを判定することができる。この場合、特に浸潤性腫瘍の検出に有効である。【００６６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-255370号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】膀胱ガン株化細胞および正常尿皮上皮細胞におけるＣＸＣＬ１のＲＴ−ＰＣＲ測定によるｍＲＮＡ発現量比較。
【図２】膀胱ガン株化細胞および正常尿皮上皮細胞の培養上清におけるＣＸＣＬ１タンパク質発現量。
【図３】膀胱ガン患者の尿中におけるＣＸＣＬ１タンパク質発現。
【図４】膀胱ガン患者の尿中におけるＣＸＣＬ１タンパク質発現量の測定。白丸は各々のデータの数値を示し、平均値と標準誤差を＋字で示した。*は危険率P＜０．００１で健常人（対照）と早期ガン患者（Ｔａ）の間に有意な差があることを示す。+は危険率P＜０．０１で早期ガン患者と進行ガン患者（Ｔ１以上）の間に有意な差があることを示す。
【図５】膀胱ガン患者の組織中におけるＣＸＣＬ１タンパク質発現の免疫染色図。進行ガン（ｐＴ２Ｇ３）およびリンパ節転移巣では強く染色が見られる。これに対して、正常尿路上皮組織（ｐＴａＧ１）では染色が見られなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
本発明者らは、今回、正常尿路上皮細胞と比較して膀胱ガン患者由来のガン細胞において発現が増強するタンパク質について、それぞれの細胞培養上清のプロテオーム解析によりスクリーニングを行った。その結果、全長ＣＸＣＬ１タンパク質について、正常尿路上皮細胞の培養上清よりもガン細胞の培養上清において多く検出されることを見出した。ここで、正常尿路上皮細胞とは、尿路上皮ガンに罹患していない腎摘出症例患者の正常尿管から得られた上皮細胞である。【００６９】
本発明者らはまた、膀胱ガン患者のガン摘出手術前と手術後の血液および尿中のＣＸＣＬ１タンパク質の量を免疫学的方法によって測定したところ、ＣＸＣＬ１タンパク質は、膀胱ガン摘出前の患者の血液および尿において、膀胱ガン摘出後に比べて高度に検出されることを見出した。【００７０】
本発明者らはさらに、膀胱ガン患者由来の細胞と正常尿路上皮細胞に発現しているｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、該ｔｏｔａｌＲＮＡ中のＣＸＣＬ１をコードする遺伝子の発現量をＤＮＡアレイ法および定量ＰＣＲ法によって測定し、膀胱ガン患者由来の細胞においてＣＸＣＬ１をコードするｍＲＮＡ量が正常細胞に比べて増加していることを見出した。【００７１】
したがって、本発明は、その一の態様において、被験者由来の生体試料中のＣＸＣＬ１タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法を提供する。【００７２】
本発明の方法では、一般に、生体試料中の上記タンパク質の存在または存在量、あるいは、上記遺伝子の発現または発現量が測定される。ここで、本発明における標的タンパク質または遺伝子は、被験者の種類(例えば人種)や個体に依存した多型性、スプライス変異などに起因した変異体も包含する。このようなタンパク質の存在や量、あるいは遺伝子の発現や発現量は、該タンパク質または遺伝子と特異的に結合可能な物質を用いて測定することができる。そのような物質には、以下で説明するような抗体、核酸プローブなどが含まれる。【００７３】
本発明で使用可能な抗体は、ＣＸＣＬ１タンパク質(好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質)を認識し、それに特異的に結合する、抗体またはその断片あるいは化学修飾誘導体(上に定義)である。抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖなどが含まれる。本発明の抗体は、前記タンパク質の少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸からなる１もしくは複数のエピトープに対する抗体である。特異的なポリクローナル抗体は、例えばアガロースなどの担体にＣＸＣＬ１タンパク質を結合したカラムに、該タンパク質を免疫したウサギなどの抗血清を通し、カラム担体に結合したＩｇＧ抗体を回収することを含む手法によって作製することができる。モノクローナル抗体は、後述する手法によって得ることができる。【００７４】
本発明で使用可能な核酸プローブは、配列番号１で表される塩基配列もしくはその変異体配列からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、もしくはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片、またはそれらの化学修飾誘導体(上に定義)を含む。【００７５】
本発明の方法では、その実施形態により、被験者からの生体試料中の上記タンパク質の存在量または上記遺伝子の発現量を測定する。該タンパク質の量または遺伝子の発現量が、対照試料のものと比べて有意に増大している場合、被験者が尿路上皮ガンに罹患していると判定される。ここで対照試料は、例えば正常もしくは健常な個体、あるいは尿路上皮ガンをもたない個体、からの対応する試料、例えば血液、尿などの体液、尿路上皮組織もしくは細胞などである。特に組織や細胞については、これらの試料から常法によりｍＲＮＡを回収し、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により生成・増幅されたｃＤＮＡ量(これは、標的遺伝子の発現量に対応する。)を決定するか、あるいは、該細胞を培養し、その培養上清中のＣＸＣＬ１タンパク質の濃度を測定することができる。【００７６】
対照試料に対する増大率は、通常２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上である。増大率が３倍以上であれば信頼度が増す。増大の程度は、測定された実測値の対比だけでなく、例えばある種の補正用物質(例えばクレアチニンなど)の量を基準にし、これに対する相対値の比較から決定することができる。【００７７】
尿路上皮ガンとしては、上記定義のとおり、例えば膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン、尿道ガンなどが含まれる。特に膀胱ガンの検出では、表在性腫瘍と比べて浸潤性腫瘍においてガンの検出信頼性が有意に高かった。それゆえ、本発明は、尿路上皮ガンのなかでも、転移を起こしやすい浸潤性腫瘍の検出により有効であるだろう。【００７８】
このように、本発明の尿路上皮ガンの検出方法は、プライマーまたはプローブを用いて試料中の尿路上皮ガン細胞から産生された、ＣＸＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子由来の核酸の発現量を測定すること、または尿路上皮ガン細胞によって産生された、試料中のＣＸＣＬ１タンパク質を、抗体を用いて免疫学的に測定することを含む。本発明の方法によって、被験者が尿路上皮ガンに罹患しているか否かを判定することができるだけでなく、尿路上皮ガン患者と非尿路上皮ガン患者の識別を可能にする。またさらに、本発明の方法によって試料中のＣＸＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子由来の核酸の発現量またはＣＸＣＬ１タンパク質を定量することにより、尿路上皮ガンの進行度を判定することも可能にする。【００７９】
本発明の実施形態により、本発明は、上記ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、試料中のＣＸＣＬ１タンパク質を免疫学的に定量することにより膀胱ガンに代表される尿路上皮ガンを検出する方法を提供する。【００８０】
あるいは、別の実施形態により、本発明は、ＣＸＣＬ１タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸、それと相補的な配列からなる核酸、これらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、あるいはそれらの核酸の１５塩基以上の断片を用いて、試料中のＣＸＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することにより膀胱ガンに代表される尿路上皮ガンを検出する方法を提供する。【００８１】
＜ＣＸＣＬ１遺伝子の検出＞
本発明において、尿路上皮ガンの検出方法のひとつとして、核酸をプライマーまたはプローブとして用いて試料中の尿路上皮ガン細胞から産生された、ＣＸＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。【００８２】
本発明において、尿路上皮ガンの存在及び/または不存在を判定するための、あるいは尿路上皮ガンを診断するために使用可能な核酸は、ヒト由来のＣＸＣＬ１遺伝子、その同族体、その転写産物またはｃＤＮＡ、あるいはその変異体または誘導体の存在、発現レベルまたは存在量を定性的及び/または定量的に測定することを可能にする。【００８３】
ＣＸＣＬ１遺伝子は、非ガン組織に比べて尿路上皮ガン組織においてその発現レベルが有意に増大する。それゆえ、本発明の組成物は、非ガン組織と尿路上皮ガン組織についてＣＸＣＬ１遺伝子の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に使用することができる。【００８４】
本発明で使用可能な核酸は、尿路上皮ガンに罹患した患者の生体組織において配列番号１で表される塩基配列を含む核酸及びその相補的核酸、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズする核酸及びその相補的核酸、ならびにそれらの核酸群の塩基配列において１５以上の連続した塩基を含む核酸群から選ばれた１または複数の核酸の組み合わせを含む。【００８５】
上記のポリヌクレオチドの断片は、各核酸の塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜３００塩基、１５〜２５０塩基、１５〜２００塩基、１５〜１５０塩基、１５〜１４０塩基、１５〜１３０塩基、１５〜１２０塩基、１５〜１１０塩基、１５〜１００塩基、１５〜９０塩基、１５〜８０塩基、１５〜７０塩基、１５〜６０塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基または１５〜２５塩基；２５〜配列の全塩基数、２５〜３００塩基、２５〜２５０塩基、２５〜２００塩基、２５〜１５０塩基、２５〜１４０塩基、２５〜１３０塩基、２５〜１２０塩基、２５〜１１０塩基、２５〜１００塩基、２５〜９０塩基、２５〜８０塩基、２５〜７０塩基、２５〜６０塩基、２５〜５０塩基または２５〜４０塩基；５０〜配列の全塩基数、５０〜３００塩基、５０〜２５０塩基、５０〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５０〜１４０塩基、５０〜１３０塩基、５０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、５０〜１００塩基、５０〜９０塩基、５０〜８０塩基、５０〜７０塩基または５０〜６０塩基；６０〜配列の全塩基数、６０〜３００塩基、６０〜２５０塩基、６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１４０塩基、６０〜１３０塩基、６０〜１２０塩基、６０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、６０〜９０塩基、６０〜８０塩基または６０〜７０塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。【００８６】
本発明で使用される上記核酸類またはその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。【００８７】
本発明の組成物としての核酸は、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。【００８８】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。【００８９】
本発明はまた、上記方法においてプローブ(及び、場合によりプライマー)として使用可能な核酸、その変異体及び/またはその断片の１つまたは複数を含む尿路上皮ガン診断（検出）用キットを提供する。【００９０】
本発明のキットは、好ましくは、上記に記載した核酸類から選択される１または複数の核酸またはその断片を含む。【００９１】
本発明のキットは、配列番号１で表される塩基配列を含む核酸、その相補的配列を含む核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの核酸の断片を少なくとも１つ含むことができる。【００９２】
好ましい実施形態では、前記核酸が、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である。【００９３】
好ましい実施形態では、前記断片は、１５以上、好ましくは３０以上、好ましくは５０以上、好ましくは６０以上、例えば５０〜１００、の連続した塩基を含む核酸であることができる。【００９４】
本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。【００９５】
本発明のキットに含まれる核酸、その変異体またはその断片は、個別にまたは任意に組み合わせて異なる容器に包装される。【００９６】
本発明のキットに含まれるプローブとしての核酸は、固相担体に結合されていてもよい。担体には、例えばＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップなどの基板が含まれる。すなわち、上記核酸を含むＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップも本発明の範囲内である。【００９７】
固相化されうる核酸は、上記で説明した本発明の全ての核酸である。例えば、そのような核酸は、以下の１または複数の核酸またはその断片を含むことができる。【００９８】
・配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、それらの変異体、または１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。【００９９】
・配列番号１で表される塩基配列を含む核酸。【０１００】
・配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸群、または１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。【０１０１】
・配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸群、または１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。【０１０２】
・配列番号１で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含む核酸。【０１０３】
本発明において、固相化される核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、あるいは１本鎖でもよいしまたは２本鎖でもよい。【０１０４】
標的遺伝子、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＷｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ(R) ＨＳ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣＨＩＰなどを挙げることができる。【０１０５】
ＤＮＡマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製した核酸プローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入した核酸を合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。核酸は、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成核酸を共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９―１１２３）。【０１０６】
ＤＮＡチップの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。【０１０７】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッターまたはアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、または基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウエルを持つプレートのおのおののウエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。【０１０８】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。【０１０９】
本発明のキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算された融解温度（Ｔｍ）−５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×(アデニン残基数+チミン残基数)＋４×(グアニン残基数+シトシン残基数)などが挙げられる。【０１１０】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。【０１１１】
＜ＣＸＣＬ１タンパク質の検出＞
本発明に係る尿路上皮ガンの別の検出方法として、抗体を用いて試料中の尿路上皮ガン細胞から産生された、ＣＸＣＬ１タンパク質の存在または量を測定する方法が挙げられる。【０１１２】
本発明において、尿路上皮ガンの存在及び/または不存在を判定するための、あるいは尿路上皮ガンを診断するために使用可能な抗体は、ヒト由来のＣＸＣＬ１遺伝子、その同族体、あるいはその変異体または誘導体の翻訳産物の発現レベルまたは存在量を定性的及び/または定量的に測定することを可能にする。【０１１３】
本発明において使用できる抗体としては、ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片と特異的に結合するものであれば特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用することができるが、モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。例えばモノクローナル抗体として２０３２６．１（ａｂ１０３７５、Ａｂｃａｍ社）などを使用することができ、ポリクローナル抗体もＡｂｃａｍ社などより市販されている。また、ＣＸＣＬ１タンパク質と特異的に結合する抗体は、以下に記載するような方法によって作製することもできる。【０１１４】
免疫原の調製
本発明において抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるためのタンパク質を調製する。免疫原タンパク質としては、ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片を用いる。本発明において免疫原として使用可能なＣＸＣＬ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）及び該タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）は、それぞれＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＰ＿００１５０２、ＮＭ＿００１５１１として公開されている。また従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのＣＸＣＬ１タンパク質断片を合成することができる。免疫原としてＣＸＣＬ１タンパク質断片を使用する場合は、ＫＬＨ、ＢＳＡなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。【０１１５】
またＣＸＣＬ１タンパク質は、ＣＸＣＬ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの情報を用い、公知のＤＮＡ組換え技術を利用して得ることができる。ＣＸＣＬ１タンパク質をコードするｃＤＮＡはｃＤＮＡクローニング法によって作製することができる。本発明において標的であるＣＸＣＬ１遺伝子が発現される単球、メラノーマ細胞、気道上皮細胞、ケラチノサイト、肺胞マクロファージなどの生体組織から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって目的のｃＤＮＡクローンを得ることができる。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ法によって増幅することもできる。プローブまたはプライマーは、配列番号１に示される塩基配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、合成しうる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。【０１１６】
ＣＸＣＬ１タンパク質は、例えば上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた原核または真核宿主細胞を培養することによって該細胞または培養上清から得ることができる。発現ベクターとしては大腸菌由来のプラスミド（ 例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＣ１１８、ｐＣ１１９、ｐＣ１８、ｐＣ１９など）、枯草菌由来のプラスミド（ 例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λ ｇｔ１１、λＺＡＰ等） が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。【０１１７】
ベクターにＣＸＣＬ１のｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターには、該タンパク質をコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。またポリペプチドの精製を容易にするために標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端につけた融合ポリペプチドとしてもよい。代表的な標識ペプチドには、６〜１０残基のヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＦＰタンパク質などが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。またＤＮＡ組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．（上記）に記載されている。ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。【０１１８】
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）などを用いることができる。宿主細胞への組換えベクターの導入方法は、それぞれの宿主へＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法、リポソームを用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、等が挙げられる。【０１１９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。哺乳類細胞などの形質転換体を培養する場合においても、それぞれの細胞に適した培地中で培養後、培養上清または細胞内に精算されたタンパク質を回収する。このとき培地には血清を含んでもよく、含まなくてもよいが、無血清培地での培養がより望ましい。ＣＸＣＬ１タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ＣＸＣＬ１タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。【０１２０】
標識ペプチドを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、その精製法として例えば限外ろ過、塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどを含む方法を挙げることができる。またこれに加えて、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＦＰといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合タンパク質の形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該タンパク質を調製すれば、単離・精製も容易である。ＣＸＣＬ１タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。【０１２１】
このようにして得られたタンパク質を認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に特異的に結合し得る。具体的には、ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片、その変異体タンパク質または融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。【０１２２】
より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含むが、これら抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。【０１２３】
本発明のタンパク質によってあらゆる態様の抗体が誘導される。該タンパク質の全部若しくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：   Ａ  Ｎｅｗ   Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。【０１２４】
次に、得られたタンパク質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、ムラミルペプチド、等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。【０１２５】
モノクローナル抗体の作製
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。【０１２６】
（２）細胞融合
また本発明によれば、各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）などが挙げられる。【０１２７】
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜 ２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。【０１２８】
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃ 、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。【０１２９】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、尿路上皮ガンに由来するＣＸＣＬ１タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。【０１３０】
（４）抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採取する。【０１３１】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。また本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた提供される。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明のポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質またはタンパク質断片を精製することにも使用することができる。【０１３３】
ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。【０１３４】
＜検出法＞
本発明の方法は、本発明の上記抗体を用いる測定法すなわち免疫学的測定法、またはＣＸＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する方法のいずれの方法も好ましい。【０１３５】
免疫学的測定法として例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応またはウェスタンブロット法が挙げられる。【０１３６】
遺伝子由来の核酸の発現量を測定する方法としては定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンブロット法、サザンハイブリダイゼーション法などが挙げられる。【０１３７】
本発明のタンパク質検出方法において被検対象となる試料としては、尿路上皮ガンに由来するＣＸＣＬ１タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子由来の核酸が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されるものではない。特に、尿、血液、血漿、血清のような体液試料において得られたＣＸＣＬ１タンパク質の測定値は、尿路上皮ガンの指標として有用である。このように、本発明の尿路上皮ガンの検出方法は、ガン組織だけでなく血液や尿において検出可能であることから、簡便な検出法として非常に有用である。【０１３８】
本発明のタンパク質検出方法を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法または発光免疫測定法等の標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明の抗体を固相化するか、または試料中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応を行うことが好ましい。【０１３９】
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックスまたは磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティックまたは試験片（テストストリップ）等の形状の不溶性担体を用いることができる。【０１４０】
固相化は、固相担体と本発明の抗体または試料成分とを物理的吸着法、化学的結合法またはこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。【０１４１】
本発明においては、本発明の抗体と、試料中の尿路上皮ガン細胞に由来するＣＸＣＬ１タンパク質との反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（ 例えばサンドイッチ法など） を利用することが好ましい。【０１４２】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β − ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼまたはビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、ＡｌｅｘａまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ等を、そして放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系またはジオキセタン化合物系等を用いることができる。【０１４３】
標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法または過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。測定の操作法は、公知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）により行うことができる。例えば、本発明の抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本発明の抗体と接触させて、ＣＸＣＬ１タンパク質−本発明の抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量または未結合標識抗体量より試料中のＣＸＣＬ１タンパク質量を測定することができる。【０１４４】
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体と試料とを反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、または時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化したＣＸＣＬ１タンパク質−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、または固相化した本発明の抗体−ＣＸＣＬ１タンパク質−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量または未結合標識二次抗体量より試料中のＣＸＣＬ１タンパク質量を測定することができる。【０１４５】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。【０１４６】
本発明の方法では、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応または粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液またはグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反応系に含ませてもよい。【０１４７】
以下に、本発明の検出法の好ましい実施形態の一例を示す。【０１４８】
最初に、本発明の抗体を一次抗体として不溶性担体に固定する。そして好ましくは、抗原が吸着していない固相表面を、抗原とは無関係のタンパク質（仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなど）によりブロッキングする。続いて、固定化された一次抗体と被検試料とを接触させる。次いで、上記一次抗体と異なる部位でＣＸＣＬ１タンパク質と反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からの信号を検出する。ここで用いる「一次抗体と異なる部位でＣＸＣＬ１タンパク質と反応する二次抗体」は、一次抗体とＣＸＣＬ１タンパク質との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はなく、免疫原の種類を問わず、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖなど）を用いることもできる。更に、二次抗体として複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。【０１４９】
またこれとは逆に、本発明の抗体に標識を付して二次抗体とし、本発明の抗体と異なる部位で、ＣＸＣＬ１タンパク質と反応する抗体を一次抗体として不溶性担体に固定し、この固定化された一次抗体と被検試料とを接触させ、次いで、二次抗体として標識を付した本発明の抗体とを接触させ、前記標識からの信号を検出してもよい。【０１５０】
また本発明の抗体は、上述したように、尿路上皮ガン細胞に由来するＣＸＣＬ１タンパク質と特異的に反応するため、ガンの診断薬として用いることができる。本発明の診断薬は、本発明の抗体を含むものであり、従って、本発明の診断薬を用いて、尿路上皮ガンへの罹患が疑われる個体から採取した試料中に含まれる尿路上皮ガン細胞に由来するＣＸＣＬ１タンパク質を検出することによって、該個体の尿路上皮ガンの罹患を診断することができる。【０１５１】
また本発明の診断薬は、免疫学的測定を行うための手段であればいずれの手段においても利用することができるが、当技術分野で公知の免疫クロマト用テストストリップなどの簡便な手段と組み合わせて用いることによって、さらに簡便かつ迅速にガンを診断することができる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部などから構成されるものであり、妊娠診断薬と同様の形態とすることができる。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の尿路上皮ガン細胞由来のＣＸＣＬ１タンパク質と本発明の抗体との反応が起こり、反応した複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が起こって、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストストリップは、例えば特開平１０−５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できるものである。また、本発明の診断薬と既知の尿路上皮ガンの腫瘍マーカーに対する診断薬とを組み合わせて使用することにより、さらに信頼性の高い診断が可能になる。【０１５２】
したがって、本発明はまた、ＣＸＣＬ１タンパク質またはその断片と特異的に反応する抗体またはその断片を含む尿路上皮ガン診断用キットに関する。本発明のキットにおいて抗体は、上記のような固相担体に結合されていてもよい。さらに本発明のキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのＣＸＣＬ１タンパク質等を含みうる。【０１５３】
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【０１５４】
（１）正常尿路上皮細胞培養上製中のプロテオーム解析
正常尿路上皮細胞は、腎摘症例患者由来の正常尿管から得た。正常尿管から抽出した尿路上皮細胞を１０ｃｍの培養皿内でＤｅｆｉｎｅｄ  ＫＳＦＭ培地によって培養を行った（Ｓｃｒｉｖｅｎ，Ｓ．Ｄ．ら、１９９７年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，第１５８巻，ｐ．１１４７−１１５２）。直径１０ｃｍの培養皿４枚に培養した尿路上皮細胞が９０％コンフルエントになった時点でＰＢＳ（−）で３回洗浄後、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換を行って２４時間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を超遠心（１５０，０００ｇ、３０分、４℃）処理して沈査を除いた後、遠心上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた遠心処理によって濃縮した（４，０００ｇ、２０分、４℃）。この結果、培養細胞上清４０ｍＬより１ｍｇのタンパク質を抽出した。【０１５５】
抽出したタンパク質の２００μｇをＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂＴＭ  ＰＦ２Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）逆相クロマトグラフィーで２６分画に分離し、トリプシン消化した後、Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）にて網羅的にタンパク質同定を行った。その結果約６００種類のタンパク質が同定され、うち約２０種類が増殖因子活性を持つことが推察された。【０１５６】
（２）発現遺伝子解析
膀胱ガン株化細胞（ＲＴ１１２、５６３７、Ｔ２４、ＥＪ）はそれぞれ１０％ウシ胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０、正常尿皮上皮細胞はｄｅｆｉｎｅｄ−ＫＳＦＭによって培養した。これらの細胞からそれぞれ、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、同社推奨のプロトコールによりｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。ＴｏｔａｌＲＮＡ  ３  ｍｉｃｒｏ  ｇより、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡをテンプレートとし、プロテオーム解析から見出された増殖因子のひとつであるＣＸＣＬ１、およびその受容体であるＣＸＣＲ２に対するプライマーをそれぞれ設計して、遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって検討し、アガロースゲル電気泳動によって分子量を指標として発現の有無を確認した（図１）。分子量マーカーとしてはＨｉ−Ｌｏ  ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ  （ＢＩＯＮＥＸＵＳ）を用いた。【０１５７】
ＣＸＣＬ１のｍＲＮＡ発現は浸潤性膀胱ガン由来の細胞株である５６３７、Ｔ２４では高度の発現が見られた。正常組織では発現が検出されるものの、その程度は浸潤性ガン由来の細胞株よりも低いことが見出された。【０１５８】
（３）培養上清中のＣＸＣＬ１濃度測定
膀胱ガン株化細胞（５６３７、Ｔ２４）はそれぞれ１０％ウシ胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０、正常尿路上皮細胞はｄｅｆｉｎｅｄ−ＫＳＦＭによって培養した。各細胞を９６穴プレート内で２４時間培養し、ほぼコンフルエントになった状態で培養液を交換した。さらに２４時間後に培養上清を回収した。各培養上清中のＣＸＣＬ１タンパク質濃度を、Ｈｕｍａｎ  ＧＲＯ  ａｌｐｈａ／ＣＸＣＬ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。その結果、正常尿路上皮細胞の培養上清ではＣＸＣＬ１は検出されなかったが、浸潤性ガン由来の細胞株である５６３７、Ｔ２４の培養上清では約５〜２０ｎｇ／ｍＬ以上の高濃度のＣＸＣＬ１が検出された（図２）。【０１５９】
（４）膀胱ガン患者尿中のＣＸＣＬ１濃度測定
浸潤性の膀胱ガン患者３名および健常対照１名より尿サンプルを得て、尿中のＣＸＣＬ１タンパク質濃度を、Ｈｕｍａｎ  ＧＲＯ  ａｌｐｈａ／ＣＸＣＬ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。各サンプルにおいて尿中クレアチニン濃度を用いて、ＣＸＣＬ１タンパク質濃度の補正を行ったところ、膀胱ガン患者において、健常対照者に比べて高値の尿中ＣＸＣＬ１タンパク質濃度が検出された（図３）。【０１６０】
（５）進行度別の膀胱ガン患者尿中のＣＸＣＬ１濃度測定
早期（Ｔａ）の膀胱ガン患者３２名、進行性（Ｔ１以上）の膀胱ガン患者３５名および健常対照４０名より尿サンプルを得て、尿中のＣＸＣＬ１タンパク質濃度を、Ｈｕｍａｎ  ＧＲＯ  ａｌｐｈａ／ＣＸＣＬ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。早期および進行性膀胱ガン患者において、健常対照者に比べて高値の尿中ＣＸＣＬ１タンパク質濃度が検出された（図４）。【０１６１】
（６）正常尿路上皮組織および膀胱ガンにおけるＣＸＣＬ１発現の測定
正常な尿路上皮組織および膀胱ガン組織を１０％中性ホルマリンによって固定し、パラフィン包埋した。このパラフィンブロックを５μｍの厚さの切片とし、脱パラフィン化と湿潤化し、スライドガラス上に固定した。内因性のペルオキシダーゼ活性を過酸化水素によって抑制した。スライドガラスをＰＢＳで洗浄した後、１％ウサギ血清を含むＰＢＳによって３０分間処理した。１次抗体として、抗ＣＸＣＬ１抗体（Ｇｒｏα（Ｃ−１５）：ＳＣ１３７４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社)を１：１５０に希釈して用い、４℃で一晩静置した。さらにヒストファインシンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（株式会社ニチレイバイオサイエンス、日本国）を用いて、ジアミノベンチジンによる発色を行った。さらに切片をヘマトキシリンによって軽く染色した。腫瘍細胞の細胞質の１０％以上が染色された場合をＣＸＣＬ１陽性と判断した。【０１６２】
正常な尿路上皮組織は染色されず、ＣＸＣＬ１の発現は認められなかったが、進行性（ｐＴ２Ｇ３）膀胱ガン組織およびリンパ節転移巣においては強度の染色が認められ、ＣＸＣＬ１が強く発現していることが示された（図５）。【０１６３】
したがって、本発明により、上記抗体または核酸プローブを用いて尿路上皮組織または細胞等におけるＣＸＣＬ１遺伝子の発現または発現量を測定し対照と比較することによっても、該遺伝子の発現の検出または発現量の増大を指標にして、早期または進行性の膀胱ガン等の尿路上皮ガンを効果的に検出できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明により、簡易かつ安価な方法で、尿路上皮ガンを効果的に検出することができるため、尿路上皮ガンの早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者尿を用いて尿路上皮ガンを非侵襲的に検出できるため、尿路上皮ガンを簡便かつ迅速に検出することが可能になる。【０１６５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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