(57)【要約】本発明は、脳血管および心臓血管の疾患および障害を治療および予防する方法並びに製剤を提供する。本発明は、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）のアゴニスト（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）を含む製剤と、ＮＯの前駆体（例えば、Ｌ−アルギニン）を含む製剤とを被験者へ投与することで、脳血管および／または心臓血管の疾患または障害の治療または予防が可能である、という発見に少なくとも一部基づくものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のコレステロールを低下させる方法であって、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンを含む徐放性製剤とを投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が徐放性製剤を構成している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者の総コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がシンバスタチンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
総コレステロールを約５０〜約１５０ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
総コレステロールを約８０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＬＤＬコレステロールを約４０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＬＤＬコレステロールを約６０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
被験者の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
中性脂肪を約３０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
中性脂肪を約４５〜約７５ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、総コレステロールを約５％〜約１５％多く低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、総コレステロールを少なくとも約５〜約２０ｍｇ／ｄＬ多く低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、ＬＤＬコレステロールを少なくとも約２〜約２０ｍｇ／ｄＬ多く低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、中性脂肪を少なくとも約５〜約５０ｍｇ／ｄＬ多く低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、中性脂肪を少なくとも約２０〜約３５ｍｇ／ｄＬ多く低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において一酸化窒素産生を増加させる方法であって、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において血管拡張を増加させる方法であって、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がシンバスタチンを含む、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｌ−アルギニンが徐放性製剤を構成している、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２１】
内皮機能を少なくとも約５〜約１５％増加させる、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２２】
内皮機能を少なくとも約７〜約１２％増加させる、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２３】
被験者が内皮機能不全を有する、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２４】
被験者にＬ−アルギニンを投与することを含む、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において一酸化窒素（ＮＯ）産生を増加させる方法であって、Ｌ−アルギニンによってＡＤＭＡの阻害作用を解消する、前記方法。
【請求項２５】
被験者にＬ−アルギニンを投与することを含む、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において血管拡張を増加させる方法であって、Ｌ−アルギニンによってＡＤＭＡの阻害作用を解消する、前記方法。
【請求項２６】
被験者が内皮機能不全を有する、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
Ｌ−アルギニンが徐放性製剤を構成している、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２８】
内皮機能を約５％〜約１５％増加させる、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２９】
内皮機能を約６％〜約１０％増加させる、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項３０】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項３１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がシンバスタチンを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することにより、内皮機能を約５％〜約１５％増加させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することにより、内皮機能を約７％〜約１２％増加させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
徐放性Ｌ−アルギニン組成物であって：
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、前記組成物。
【請求項３５】
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
Ｌ−アルギニンの徐放性組成物を製造する方法であって、
（ａ）Ｌ−アルギニンを造粒剤で造粒して顆粒を形成し；
（ｂ）顆粒を湿式磨砕し；
（ｃ）顆粒を乾燥させ；
（ｄ）顆粒を乾式磨砕し；
（ｅ）顆粒を少なくとも１種の徐放剤と配合する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３７】
工程（ｅ）が、顆粒を予備配合、配合および最終配合する工程を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
造粒工程に先立ち、Ｌ−アルギニンを結合剤と乾式混合することをさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
結合剤がポリビニルピロリドンを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）Ｌ−アルギニンを、ポリビニルピロリドンを含む造粒剤で造粒し（ここで、Ｌ−アルギニンは徐放性製剤の約５０重量％、ポリビニルピロリドンは徐放性製剤の約３〜約４重量％を構成する）；
（ｂ）顆粒を湿式磨砕し；
（ｃ）顆粒を乾燥させ；
（ｄ）顆粒を乾式磨砕し；
（ｅ）顆粒をヒドロキシプロピルメチルセルロースと配合する（ここで、ヒドロキシプロピルメチルセルロースは徐放性製剤の約３５重量％を構成する）、
ことを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
顆粒を微結晶セルロース、コロイド状二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウムと配合する（ここで、微結晶セルロースは徐放性製剤の約１０重量％、コロイド状二酸化ケイ素は徐放性製剤の約１％未満、ステアリン酸マグネシウムは徐放性製剤の約１重量％未満を構成する）ことをさらに含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
Ｌ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む、血管疾患もしくは血管障害の治療または予防に使用する棒状食品。
【請求項４３】
徐放性製剤がＬ−アルギニンの徐放性粒状物を含む、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をさらに含む、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４５】
被験者が摂取するとコレステロールを低下させる、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４６】
アルツハイマー病の治療または予防に使用される、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４７】
間欠性跛行の治療または予防に使用される、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４８】
被験者が摂取するとＣ−反応性タンパク質を低下させる、請求項４２記載の棒状食品。
【請求項４９】
被験者の血管疾患もしくは血管障害を予防または治療する方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５０】
被験者のコレステロールを低下させる方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５１】
被験者の一酸化窒素を増加させる方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５２】
被験者の血管拡張を増加させる方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５３】
被験者のアルツハイマー病を治療または予防する方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５４】
被験者の間欠性跛行を治療または予防する方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５５】
被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させる方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、前記方法。
【請求項５６】
棒状食品がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をさらに含む、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がシンバスタチンを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
被験者のコレステロールを低下させる方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項５９】
被験者の総コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
総コレステロールを約５０〜約１５０ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
総コレステロールを約８０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
ＬＤＬコレステロールを約４０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
ＬＤＬコレステロールを約６０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６４】
被験者の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６５】
中性脂肪を約３０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６６】
中性脂肪を約４５〜約７５ｍｇ／ｄＬ低下させる、請求項５８記載の方法。
【請求項６７】
徐放性製剤が、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６８】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
血管疾患もしくは血管障害を治療または予防する方法であって、被験者に、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７０】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
アルツハイマー病を治療または予防する方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７２】
徐放性製剤が、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬアルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
間欠性跛行を治療または予防する方法であって、被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７５】
徐放性製剤が、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
被験者のアテローム硬化症を治療または予防する方法であって、被験者に、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
被験者の血管拡張を増加させる方法であって、被験者に、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項８０】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
被験者の一酸化窒素産生を増加させる方法であって、被験者に、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む徐放性製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項８２】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
Ｃ−反応性タンパク質を低下させる方法であって、Ｌ−アルギニンを被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項８４】
Ｌ−アルギニンが徐放性製剤を構成している、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
徐放性製剤が、
（ａ）約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；
（ｂ）約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約３重量％未満の二酸化ケイ素；および
（ｆ）約３重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
徐放性製剤が、
（ａ）約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩を含む）；
（ｂ）約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；
（ｃ）約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；
（ｄ）約１０重量％の微結晶セルロース；
（ｅ）約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素を含む）；および
（ｆ）約１重量％未満のステアリン酸マグネシウム、
を含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させる方法であって、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンを含む徐放性製剤とを投与することを含む、前記方法。
【請求項８８】
Ｃ−反応性タンパク質を約１０％〜約５０％低下させる、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
Ｃ−反応性タンパク質を約２５％〜約３５％低下させる、請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、Ｃ−反応性タンパク質を約５０％〜約９０％多く低下させる、請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与する際にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を併用しない場合よりも、Ｃ−反応性タンパク質を約６５％〜約７５％多く低下させる、請求項８７記載の方法。
【請求項９２】
被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を投与する際にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を併用しない場合よりも、Ｃ−反応性タンパク質を約８０％〜約１２０％多く低下させる、請求項８７記載の方法。
【請求項９３】
被験者にＬ−アルギニンを含む徐放性製剤を投与する際にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を併用しない場合よりも、Ｃ−反応性タンパク質を約９５％〜約１０５％多く低下させる、請求項８７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／４２１，２５８号、発明の名称「脳血管および心臓血管の疾患および障害を治療するための方法および組成物」（２００２年１０月２４日出願）、米国仮特許出願第６０／５０７，３１２号、発明の名称「脳血管および心臓血管の疾患および障害を治療するための方法および組成物」（２００３年９月２９日出願）、および米国仮特許出願第６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号、発明の名称「徐放性Ｌ−アルギニン製剤並びに製造方法および使用方法」（２００３年１０月１７日出願）に対して優先権を主張する。上記仮出願それぞれの開示内容は、その全内容が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）と呼ばれる酵素のファミリーは、重要な生物学的２次メッセンジャーである一酸化窒素（ＮＯ）をＬ−アルギニンから合成する。ＮＯＳには複数の異なるアイソフォームがあり、例えば、構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）と誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）が挙げられる。ｃＮＯＳには、内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）と神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）の異なる２種類が存在する。ｅＮＯＳは、平滑筋弛緩の調節、血圧の降下および血小板凝集の阻害に関与する。ｅＮＯＳは内皮細胞に存在し、レセプター介在型の細胞内Ｃａ２＋上昇に応答してＮＯを短期間放出する。Ｍｉｃｈｅｌら、「一酸化窒素合成：何が、どこで、どのように、そして何故？」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００：２１４６−２１５２（１９９７）。ｎＮＯＳは長期間にわたる増強に重要であり、ニューロンからのＣａ２＋依存性放出を担っている。ｉＮＯＳは宿主防御において作用し、活性化マクロファージ細胞によって免疫応答時に産生され、血管平滑筋細胞で（例えば、各種サイトカイン、微生物産物および／または細菌内毒素によって）誘導され、また、一旦発現するとＮＯを長期間にわたって合成する。
【０００３】
内皮細胞におけるｃＮＯＳによる一酸化窒素の形成は、正常血圧の調節、内皮機能不全、例えば、高脂血症、動脈硬化、血栓症および再狭窄の予防において重要な役割を果たすと考えられている。機能的には、ｃＮＯＳは脳および内皮に存在する主要な合成酵素であって、基礎条件下で活性であり、レセプター介在型アゴニストまたはカルシウムイオノフォアに応答して生じる細胞内カルシウムの上昇によってさらに刺激される場合がある。ｃＮＯＳは同酵素の「生理学的」形態であると思われ、様々な生物学的過程において役割を果たしている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究では、ＮＯＳの活性が、一酸化窒素自体によるネガティブフィードバックで調節できることが示唆されている。心臓・脳・腎臓血管循環では、構成的に産生されたＮＯの主な標的は、血管平滑筋、心筋（筋細胞）および冠状血管平滑筋に見られる可溶性グアニル酸シクラーゼであると考えられている。
【０００４】
ｃＮＯＳとは異なり、誘導型のカルシウム依存性アイソフォームであるｉＮＯＳは、当初マクロファージにおける記述のみであった。現在では、多くの他の細胞型においても、適切な刺激に応答して一酸化窒素合成酵素の誘導が生じることが知られている。この誘導は、構成型の一酸化窒素合成酵素を通常は発現しない血管平滑筋細胞のような細胞、かなりのレベルの構成型アイソフォームを発現する心筋細胞のような細胞の双方において生じる。
【０００５】
ｉＮＯＳの基礎条件下での活性は無視できる程度であるが、リポ多糖および特定のサイトカインといった因子に応答して数時間のあいだ発現が生じる。誘導型の酵素は構成型よりも多量のＮＯを産生し、誘導されたＮＯＳは、高濃度のｉＮＯＳによって産生されたＮＯが細胞に対して毒性を示すことがあるため、同酵素の「病態生理学的」形態であると思われる。ｉＮＯＳの誘導はグルココルチコイドおよびある種のサイトカインによって阻害可能である。ｉＮＯＳの翻訳後調節については余り知られていない。ＮＯに起因する細胞傷害作用は、おそらくグアニル酸シクラーゼやサイクリックＧＭＰの形成とはほぼ無関係である。本分野における研究の多くは、Ｌ−アルギニンの各種誘導体を用いてｉＮＯＳ阻害剤を刺激することに焦点を置いている。
【０００６】
ＮＯは、分子状酸素とＬ−アルギニンのグアニジノ窒素からＮＯＳによる触媒反応で合成される比較的安定なフリーラジカルである。この酵素は多くの組織および細胞型に見られ、例えば、ニューロン、マクロファージ、肝細胞、平滑筋細胞、血管の内皮細胞および腎臓の内皮細胞に見られる。ＮＯはその放出点近傍で作用して標的細胞へ侵入し、細胞質内酵素であるグアニル酸シクラーゼを活性化して２次メッセンジャーであるサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）の形成を触媒する。ＮＯの形成から数秒以内に、ＮＯは亜硝酸または硝酸へ酸化される。Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ、レーニンジャーの新生化学、ｐ．８９２、第３版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００。
【０００７】
様々な血管作用薬や、さらには物理的な刺激にも応答して、内皮細胞は、内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）と呼ばれる短時間作用性の血管拡張剤（内皮由来一酸化窒素（ＥＤＮＯ）とも呼ばれる）を放出する。炎症および血小板凝集の産物、例えば、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、プリン類、およびトロンビンは、その作用の全てまたは一部を、ＮＯの放出を刺激することによって発揮する。内皮細胞に依存する弛緩のメカニズムは、冠状循環等の様々な血管床において重要である。Ｈｏｂｂｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９：１９１−２２０（１９９９）。ＮＯは直下の平滑筋へ容易に拡散し、グアニル酸シクラーゼを活性化してｃＧＭＰ濃度を上昇させることで血管平滑筋の弛緩を誘導する。
【０００８】
ＮＯは、内皮依存性の弛緩および可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化、中枢および末梢神経系における神経伝達、並びに、活性化マクロファージの細胞傷害性を担っている。血管系では、ＥＤＮＯは複数の作用をもっており、血小板凝集の阻害、炎症性細胞の付着、および平滑筋細胞の増殖などである。特に、ＥＤＮＯは血管緊張の重要な調節剤である。また、内皮機能の指標に慣用される血流依存性拡張も、主にＮＯによって媒介される。
【０００９】
ＮＯによる血管緊張の調節メカニズムは、例えばアセチルコリン、ブラジキニン、剪断応力等の刺激によって、血管系の内側を覆う内皮細胞上で開始される。ＮＯは、これらの内皮細胞に含まれるｅＮＯＳの触媒活性によってＬ−アルギニンから産生される。産生されたＮＯは内皮細胞を離れ、隣接する平滑筋細胞においてグアニル酸シクラーゼ活性を刺激する。グアニル酸シクラーゼの活性化は、ｃＧＭＰのレベルを上昇させて平滑筋細胞を弛緩させ、その結果血管を拡張させて血流を増加させる。Ｍｏｎｃａｄａら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：２００２−２０１２（１９９３）；Ｖａｌｌａｎｃｅら、Ｊ．Ｒｏｙｌ．Ｃｏｌｌ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  Ｌｏｎｄｏｎ  ２８：２０９−２１９（１９９４）。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、心臓血管、脳血管および末梢血管の疾患および障害が挙げられるが、これらに限定されない血管疾患および血管障害を治療および予防する方法を提供する。本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンの徐放性製剤との同時投与が、血管疾患および血管障害の治療および予防、特にコレステロールおよび中性脂肪の低減において相乗作用を示すという発見に少なくとも一部基づくものである。また、本発明は、Ｌ−アルギニンの徐放性製剤、および組成物に最適な放出プロファイルを付与する製造方法を提供する。さらに、前記製剤および製造方法は、簡便に圧縮可能であるが脆過ぎることのない組成物をもたらすものである。
【００１１】
１つの態様では、本発明は、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンを含む徐放性製剤とを投与することを含む、被験者のコレステロールを低下させる方法を提供する。各種実施形態では、前記方法は、総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび／または中性脂肪のレベルを低下させるものである。また、前記方法は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させるものである。さらに、前記方法は、単にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をＬ−アルギニンと併用せずに投与する場合よりも大幅に、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよび／または中性脂肪のレベルを低下させ、および／またはＨＤＬコレステロールを増加させるものである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することにより、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において一酸化窒素産生を増加させる方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを投与することにより、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において血管拡張を増加させる方法を提供する。本発明におけるこれらの態様の各種実施形態では、Ｌ−アルギニンは徐放性製剤として存在する。他の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はシンバスタチンである。ある実施形態では、被験者は内皮機能不全を有していてもよい。本発明におけるこれらの態様の他の実施形態では、前記方法は内皮機能を増加させるものである。
【００１３】
別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンを投与することにより、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において一酸化窒素（ＮＯ）産生を増加させる方法を提供し、本方法では、Ｌ−アルギニンによってＡＤＭＡの阻害作用を解消する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンを投与することにより、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において血管拡張を増加させる方法を提供し、本方法では、Ｌ−アルギニンによってＡＤＭＡの阻害作用を解消する。本発明におけるこれらの態様の各種実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）をＬ−アルギニンと同時投与する。ある実施形態では、Ｌ−アルギニンは徐放性製剤として存在する。本発明におけるこれらの態様の他の実施形態では、前記方法は内皮機能を増加させるものである。
【００１４】
別の態様では、本発明は、約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；約３重量％未満の二酸化ケイ素；および約３重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含む、徐放性Ｌ−アルギニン組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩である）；約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約１０重量％の微結晶セルロース；約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素である）；および約１重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含むものである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、Ｌ−アルギニンを造粒剤で造粒して顆粒を形成し；顆粒を湿式磨砕し；顆粒を乾燥させ；顆粒を乾式磨砕し；顆粒を少なくとも１種の徐放剤と配合することを含む、Ｌ−アルギニンの徐放性組成物を製造する方法を提供する。各種実施形態では、配合工程は、顆粒を予備配合、配合および最終配合することを含んでいてもよい。別の実施形態では、前記方法は、造粒工程に先立ち、Ｌ−アルギニンを結合剤と乾式混合することを含んでいてもよい。結合剤はポリビニルピロリドンであってよい。
【００１６】
本発明における本態様の特定の実施形態では、前記方法は、Ｌ−アルギニンをポリビニルピロリドンを含む造粒剤で造粒し（ここで、Ｌ−アルギニンは徐放性製剤の約５０重量％であり、ポリビニルピロリドンは徐放性製剤の約３〜約４重量％である）；顆粒を湿式磨砕し；顆粒を乾燥させ；顆粒を乾式磨砕し；顆粒をヒドロキシプロピルメチルセルロースと配合する（ここで、ヒドロキシプロピルメチルセルロースは徐放性製剤の約３５重量％である）ことを含む。前記方法は、顆粒を微結晶セルロース、コロイド状二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウムと配合する（ここで、微結晶セルロースは徐放性製剤の約１０重量％であり、コロイド状二酸化ケイ素は徐放性製剤の約１重量％未満であり、ステアリン酸マグネシウムは徐放性製剤の約１重量％未満である）ことをさらに含んでいてもよい。
【００１７】
別の態様では、本発明は、Ｌ−アルギニンの徐放性製剤（例えばＬ−アルギニンの徐放性粒状物）を含む、血管疾患もしくは血管障害の治療または予防に使用される棒状食品を提供する。前記棒状食品は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）を含んでいてもよい。各種実施形態では、前記棒状食品は、コレステロールを低下させ、Ｃ−反応性タンパク質を低下させ、アルツハイマー病を治療または予防することが可能であり、および／または、間欠性跛行を治療または予防することが可能である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者の血管疾患もしくは血管障害を予防または治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者のコレステロールを低下させる方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者の一酸化窒素を増加させる方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者の血管拡張を増加させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者のアルツハイマー病を治療または予防する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者の間欠性跛行を治療または予防する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を含む棒状食品を与えることを含む、被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させる方法を提供する。上述した態様のある実施形態では、前記棒状食品は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）を含んでいてもよい。
【００１９】
別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を投与することを含む、被験者のコレステロールを低下させる方法を提供する。各種実施形態では、前記方法は、被験者の総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび／または中性脂肪を低下させるものであってよく、および／または、被験者の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させるものであってよい。別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を投与することを含む、アルツハイマー病を治療または予防する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニンの徐放性製剤を投与することを含む、間欠性跛行を治療または予防する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験者にＬ−アルギニン（例えば徐放性Ｌ−アルギニン）を投与することを含む、Ｃ−反応性タンパク質を低下させる方法を提供する。本発明における上述の態様のある実施形態では、前記徐放性製剤は、約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；約３重量％未満の二酸化ケイ素；および約３重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含むものである。特定の実施形態では、前記徐放性製剤は、約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩である）；約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約１０重量％の微結晶セルロース；約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素である）；および約１重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含むものである。
【００２０】
その他の各種態様では、本発明は、約２５〜約７５重量％のＬ−アルギニンまたはその薬学的に許容し得る塩；約０．５〜約５重量％のポリビニルピロリドン；約５〜約４０重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約２〜約２０重量％の微結晶セルロース；約３重量％未満の二酸化ケイ素；および約３重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含む徐放性製剤を被験者に投与することを含む、血管疾患もしくは血管障害を治療または予防する方法、アテローム硬化症を治療または予防する方法、血管拡張を増加させる方法、および／または、一酸化窒素産生を増加させる方法を提供する。上述の態様の特定の実施形態では、前記徐放性製剤は、約５０重量％のＬ−アルギニン一塩酸塩（ここで、Ｌ−アルギニンはＬ−アルギニン一塩酸塩である）；約３〜約４重量％のポリビニルピロリドン；約３５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース；約１０重量％の微結晶セルロース；約１重量％未満のコロイド状二酸化ケイ素（ここで、二酸化ケイ素はコロイド状二酸化ケイ素である）；および約１重量％未満のステアリン酸マグネシウムを含むものである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンの徐放性製剤とを投与することを含む、被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させる方法を提供する。前記方法は、単にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を単独で、または、単にＬ−アルギニンを単独で投与する場合よりも大幅に、被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させるものである。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、心臓血管、脳血管および末梢血管の疾患および障害が挙げられるが、これらに限定されない血管疾患および血管障害を治療および予防する方法を提供する。本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンの徐放性製剤との同時投与が、血管疾患および血管障害（脳血管、心臓血管および末梢血管の疾患または障害を含む）の治療および予防、特にコレステロールの低減において驚くべき相乗作用を示すとうい発見に少なくとも一部基づくものである。また、徐放性Ｌ−アルギニンと、場合によってはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とを使用して、血管拡張を増加させ、ＮＯ産生を増加させ、かつ、Ｃ−反応性タンパク質を低下させることも可能である。別の実施形態では、本明細書に記載の製剤および方法を使用して、例えば、血管疾患もしくは血管障害の発症および／または事象の発生の危険性がある集団において、疾患、障害および／または事象の発症を遅らせることも可能である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンの徐放性製剤は、続けてまたは同時に被験者へ投与することができる。前記還元酵素阻害剤およびＬ−アルギニンは、１つの製剤中へ含有させてもよい。
【００２４】
また、本発明は、Ｌ−アルギニンの徐放性製剤、および組成物に最適な放出プロファイルを付与する製造方法を提供する。さらに、前記製剤および製造方法は、簡便に圧縮可能であるが脆過ぎることのない組成物をもたらすものである。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明の方法に使用する製剤は、少なくとも１種の徐放剤（本発明の目的には、制御放出と徐放とは区別なく使用可能）、例えば内皮一酸化窒素合成酵素の少なくとも１種の徐放性アゴニスト（例えばＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤および／またはＬ−アルギニン等の一酸化窒素の前駆体）を含む。別の実施形態では、Ｌ−アルギニンを被験者の全身へ徐々に放出させる。Ｌ−アルギニンを徐々に放出させることで、ＮＯの産生に必要なＬ−アルギニンをＮＯＳへ実質的に一定供給するＬ−アルギニンの血漿内薬物動態プロファイルが得られる。従って、前記製剤はｉｎ  ｖｉｖｏで徐々に溶解し、実質的に均一量のＬ−アルギニンを被験者にとって治療上有効であるべき期間放出する。別の実施形態では、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を被験者の全身へ徐々に放出させる。さらなる実施形態では、ＮＯの産生が長期間にわたって実質的に均一である。
【００２６】
本発明の別の態様では、血管疾患（心臓血管、脳血管、末梢血管の疾患および障害が挙げられるが、これらに限定されない）、間欠性跛行、重症虚血肢およびアルツハイマー病を治療する組成物を、食品の形態で提供する。このような食品形態の組成物を使用して血管拡張を増加させ、ＮＯ産生を増加させ、かつ、コレステロールを低下させることも可能である。好ましくは、前記食品は、特定保健用食品バー（prescription health bar）のような棒状である。食品の利用により、錠剤１錠に配合できる量よりも多量のＬ−アルギニンの供給が可能となる。本発明は、１ｇを超えるＬ−アルギニン、および必要に応じて他の物質を供給できる棒状食品を提供する。１つの実施形態では、Ｌ−アルギニンを即時放出製剤、例えばＬ−アルギニンの即時放出粒状物として棒状食品へ添加する。別の実施形態では、前記棒状食品は、例えばＬ−アルギニンの徐放性粒状物を含む徐放性製剤を含むものである。別の実施形態では、前記棒状食品は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤等の追加の物質をさらに含有する。好ましくは、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はシンバスタチン等のスタチンである。
【００２７】
定義
本発明のさらなる記述に先立ち、本明細書、実施例および特許請求の範囲中で使用する特定の用語を、便宜上ここに集める。
【００２８】
本明細書中では、特にことわらない限り、用語「被験者」には哺乳動物が含まれる。用語「哺乳動物」には、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書中では、用語「治療」とは、疾患もしくは障害を有する患者、疾患もしくは障害の症状を有する患者、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者へ治療薬または製剤を適用または投与すること、あるいは、このような患者由来の単離組織へ治療薬または製剤を適用または投与することをいい、疾患もしくは障害および／または事象を治癒、回復、緩和、軽減、改変、治療、予防、改善する、これらの発症を遅らせる、疾患もしくは障害の進行を遅らせる、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害および／または事象に対する素因を改善する、または、これらに作用することを目的とする。
【００３０】
本明細書中では、用語「血管疾患」または「血管障害」とは、通常、血管の疾患または障害をいい、心臓血管、脳血管および末梢血管の疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。心臓血管疾患は、心臓の血管の疾患をいう。例えば、Ｋａｐｌａｎ，Ｒ．Ｍ．ら、『健康および人の行動』中の「心臓血管疾患」、ｐｐ．２０６−２４２（マグローヒル、ニューヨーク、１９９３）を参照のこと。心臓血管疾患は、通常、例えば高血圧症（高血圧ともいう）、冠状心疾患、心臓発作およびリウマチ性心臓疾患を含む複数の状態のうちの１つである。末梢血管の疾患もしくは障害は、心臓外のいずれかの血管の疾患をいう。例えば、末梢血管疾患は、血液を脚および腕の筋肉へ運ぶ血管の狭窄を指すことがある。脳血管疾患は、血液を脳へ供給する血管の能力が侵される疾患をいう。
【００３１】
用語「アテローム硬化症」には、該当する医薬分野に従事している医師によって認識および理解されている血管の疾患および障害および病態が含まれる。アテローム硬化性の心臓血管疾患、冠状心疾患（冠状動脈疾患または虚血性心疾患としても知られる）、脳血管疾患および末梢血管疾患は、全てアテローム硬化症の臨床症状であり、従って、用語「アテローム硬化症」および「アテローム硬化性疾患」に含まれる。
【００３２】
本明細書中では、用語「同時投与」とは、２種以上の化合物を被験者へ投与する際の記述に使用する場合には、これらの化合物を、同一経路でも異なる経路でも投与可能であるが、各々の薬理作用がちょうど重なるように同時に（例えば混合物として）または続けて投与することを意味する。本明細書中では、特にことわらない限り、少なくとも２種の化合物の投与に該当する場合、用語「続けて」とは、これらの化合物を各々の薬理作用がちょうど重なるように投与することを意味する。ある実施形態では、複数の物質を実質的に並行して同時投与する。「実質的に並行して」とは、本発明の製剤を被験者に投与する際に、少なくとも１種の追加物質の投与と十分に近づけて投与することを意味し、これにより物質同士に相加作用、さらには相乗作用を発揮させることが可能であり、例えば、限定されるものではないが、ＮＯＳ活性、ＮＯ産生または血管拡張が増加する。
【００３３】
本明細書中では、用語「ＮＯの前駆体」には、天然型ＮＯの任意の基質前駆体、例えばＬ−アルギニンが含まれる。
用語「天然型ＮＯ」とは、本明細書中では、Ｌ−アルギニンの生体内変換またはＬ−アルギニン依存性経路によって産生される一酸化窒素をいう。用語「内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）」または「内皮由来一酸化窒素（ＥＤＮＯ）」は、「天然型ＮＯ」と区別なく用いることができる。
【００３４】
本明細書中では、用語「Ｌ−アルギニン」とは、Ｌ−アルギニンの他、ＮＯＳの基質として作用してＮＯの産生増加をもたらすその生化学的等価物の全て、例えばＬ−アルギニン塩酸塩、前駆体類およびその塩基性形態を指す。本用語には、Ｌ−アルギニンの薬学的に許容し得る塩が含まれる。
【００３５】
用語「薬学的に許容し得る塩」とは、無機酸および無機塩基並びに有機酸および有機塩基を含めた薬学的に許容し得る非毒性の酸または塩基から調製した塩をいう。適切な非毒性の酸としては、無機酸および有機酸、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸（ethenesulfonic acid）、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。特に好適なのは、塩酸、臭化水素酸、リン酸および硫酸であり、特に最も好適なのは塩酸塩である。
【００３６】
本発明の方法に使用するＬ−アルギニンは、塩基性および酸性のいずれでもあるため、薬学的に許容し得る非毒性の酸または塩基、例えば、無機酸および有機酸または無機塩基および有機塩基から塩を調製することが可能である。このような塩は、以下のいずれかのアニオンを含有し得る：アセテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、カンファースルホネート、シトレート、フマレート、グルコネート、臭化水素酸塩、塩酸塩、ラクテート、マレエート、マンデレート、ムケート（mucate）、ニトレート、パモエート、ホスフェート、スクシネート、スルフェート、タルトレート等。特に好適なのは、ベンゼンスルホネート、臭化水素酸塩、塩酸塩およびスルフェートである。このような塩は、以下のいずれかのカチオンを含有していてもよい：アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミンおよびプロカイン。
【００３７】
本明細書中では、用語「アゴニスト」または「ｅＮＯＳもしくはｃＮＯＳのアゴニスト」とは、基質の生体内変換、例えばＬ−アルギニンからＮＯへの変換を刺激する物質をいう。ｅＮＯＳまたはｃＮＯＳのアゴニストとしては、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が挙げられる。「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ）」は、コレステロールの生合成における律速反応を触媒するミクロソーム酵素である。「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は「スタチン」とも呼ばれている。
【００３８】
当該技術分野で記載されている天然由来または合成によって得られた化合物は数多くあり、これらはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害し、「スタチン」と呼ばれ、本発明の実施に有用な物質のカテゴリーを形成する。例としては、限定されないが、市販のもの、例えば、シンバスタチン（米国特許第４，４４４，７８４号）、ロバスタチン（米国特許第４，２３１，９３８号）、プラバスタチンナトリウム（米国特許第４，３４６，２２７号）、フルバスタチン（米国特許第４，７３９，０７３号）、アトルバスタチン（米国特許第５，２７３，９９５号）、セリバスタチン、ロスバスタチン、および多数の他のスタチン類、例えば、コンパクチン、ダルバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、ピタバスタチン、ＨＲ−７８０、ＧＲ−９５０３０、ＣＩ９８０、ＢＭＹ２２０８９、ＢＭＹ２２５６６、並びに例えば下記の文献に記載されているものが挙げられる：米国特許第５，６２２，９８５号、米国特許第５，１３５，９３５号、米国特許第５，３５６，８９６号、米国特許第４，９２０，１０９号、米国特許第５，２８６，８９５号、米国特許第５，２６２，４３５号、米国特許第５，２６０，３３２号、米国特許第５，３１７，０３１号、米国特許第５，２８３，２５６号、米国特許第５，２５６，６８９号、米国特許第５，１８２，２９８号、米国特許第５，３６９，１２５号、米国特許第５，３０２，６０４号、米国特許第５，１６６，１７１号、米国特許第５，２０２，３２７号、米国特許第５，２７６，０２１号、米国特許第５，１９６，４４０号、米国特許第５，０９１，３８６号、米国特許第５，０９１，３７８号、米国特許第４，９０４，６４６号、米国特許第５，３８５，９３２号、米国特許第５，２５０，４３５号、米国特許第５，１３２，３１２号、米国特許第５，１３０，３０６号、米国特許第５，１１６，８７０号、米国特許第５，１１２，８５７号、米国特許第５，１０２，９１１号、米国特許第５，０９８，９３１号、米国特許第５，０８１，１３６号、米国特許第５，０２５，０００号、米国特許第５，０２１，４５３号、米国特許第５，０１７，７１６号、米国特許第５，００１，１４４号、米国特許第５，００１，１２８号、米国特許第４，９９７，８３７号、米国特許第４，９９６，２３４号、米国特許第４，９９４，４９４号、米国特許第４，９９２，４２９号、米国特許第４，９７０，２３１号、米国特許第４，９６８，６９３号、米国特許第４，９６３，５３８号、米国特許第４，９５７，９４０号、米国特許第４，９５０，６７５号、米国特許第４，９４６，８６４号、米国特許第４，９４６，８６０号、米国特許第４，９４０，８００号、米国特許第４，９４０，７２７号、米国特許第４，９３９，１４３号、米国特許第４，９２９，６２０号、米国特許第４，９２３，８６１号、米国特許第４，９０６，６５７号、米国特許第４，９０６，６２４号および米国特許第４，８９７，４０２号。これら文献の各々の開示内容は本明細書に援用されるものとする。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物のクラスの他の任意のメンバーを本発明の方法に使用してもよい。２種以上のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を組み合わせて本発明の方法に用いるこ��もできる。
【００３９】
用語「ｅＮＯＳ活性」とは、本明細書中では、基質であるＬ−アルギニンからＮＯを生成する細胞の能力を意味する。ｅＮＯＳ活性の増加は、複数の異なる方法で行うことができる。例えば、ｅＮＯＳタンパク質量を増加させるか、または同タンパク質の活性を（タンパク質は一定レベルに維持したまま）増加させることにより、「活性」の増加が可能である。利用し得るタンパク質量を増加させるには、例えば限定されないが、ｅＮＯＳ遺伝子の転写を増加させる、ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの翻訳を増加させる、ｅＮＯＳ  ｍＲＮＡの安定性を増加させる、ｅＮＯＳを活性化させる、または、ｅＮＯＳタンパク質分解を減少させることで可能である。
【００４０】
細胞または組織におけるｅＮＯＳ活性は、様々な異なる方法で測定できる。直接測定としては、ｅＮＯＳの存在量を測定する。別の直接測定としては、ｅＮＯＳによるＬ−アルギニンのＬ−シトルリンへの変換量を測定するか、または組織の生理学的条件のような特定条件下でのｅＮＯＳによる一酸化窒素産生量を測定する。ｅＮＯＳ活性は間接的に測定することもでき、例えば、ＲＮＡの半減期を測定したり（上流指標）、ＮＯの存在に対する表現型応答を測定する（下流指標）。当該技術分野で採用されている表現型測定の１つは、アセチルコリンに応答する内皮依存性弛緩を測定するものであり、前記応答はｅＮＯＳ活性に左右される。サンプル中に存在するＮＯのレベルはＮＯメーターを用いて測定できる。上述の技術は全て当業者には周知である。
【００４１】
本発明の方法は、ＮＯ産生を増加させることにより、ｅＮＯＳ活性の正常なベースラインレベルを回復するだけでなく、このような活性を正常なベースラインレベル以上に増加させることが可能である。正常なベースラインレベルは、内皮細胞のＮＯＳ活性の変化を指し示す症状（例えば低酸素状態、高脂血症等）を示さない年齢別正常対照群における活性の量である。実際のレベルは、選択した特定の年齢群や、活性の評価に採用した特定の尺度に依存する。異常時には、内皮細胞のＮＯＳ活性（およびＮＯ産生）が正常レベル以下に低下する。従って、本発明の製剤は、このような異常時にＮＯ産生の正常なベースラインレベルを回復できるだけでなく、内皮細胞のＮＯＳ活性（およびＮＯ産生）を正常なベースラインレベルを遥かに上回るレベルまで増加させることができる。
【００４２】
用語「担体」とは、医薬組成物の混合物を調製する際に使用される希釈剤、賦形剤等を指す。
本明細書中では、用語「剤形」とは、被験者、例えば患者への単回投与または複数回投与に見合った量の有効成分を含有する医薬組成物を意味する。
【００４３】
単位「ｍｇ／Ｋｇ」は、本明細書中では、被験者の体重１Ｋｇ当たりの物質のｍｇを意味する。
本明細書中では、特に記載しない限り、用語「半減期」とは、生物の血漿中の薬物濃度を投与時の薬物濃度の約半分に低下させるのに要する時間を意味する。
【００４４】
本明細書中では、特にことわらない限り、用語「即時放出」とは、１種以上の薬物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出が外的要因によって遅延しないことを意味する。
本明細書中では、用語「医薬組成物」または「医薬製剤」とは、双方とも区別なく使用されるが、薬学的に許容し得る成分を含む組成物を意味する。
【００４５】
本明細書中では、用語「薬学的に許容し得る」とは、連邦監督機関または州政府機関によって審査されればおそらく認可される処方の種類、あるいは米国薬局方または他の一般に承認されている薬局方に動物、特にヒトでの使用について列挙されている処方の種類を意味する。
【００４６】
本明細書中では、特にことわらない限り、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、有効成分の生物活性の有効性を妨害せず、投与対象の被験者に対して毒性を示さない担体媒体を意味する。このような媒体および物質の薬学的に活性な製剤への使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または物質が活性化合物と不適合である限りを除き、本発明の方法に使用する製剤での使用は考慮のうちである。
【００４７】
本明細書中では、用語「薬学的に許容し得る塩」とは、薬学的に許容し得る非毒性の酸、例えば無機酸および有機酸から調製される塩をいう。
本明細書中では、特にことわらない限り、用語「徐放」は、薬物が一定の期間放出されるような、１種以上の薬物の持続放出パターンと定義する。本発明の目的には、徐放と制御放出とを区別なく使用する。
【００４８】
本明細書中では、用語「塩または複合体」は、限定されるものではないがファンデルワールス結合、イオン結合および／または水素結合を含めた少なくとも１種類の相互作用によって会合している２以上の化学的部分を含む化合物または組成物を記述するのに使用する。塩または複合体は固体として、または、液体中に存在してもよい。
【００４９】
本明細書中では、用語「重量％」とは、製剤中の成分量の記述に使用する場合には、製剤中の全成分の重量に対する特定成分の重量を意味する。
以下の小節では、本発明の各種態様をさらに詳細に記載する。
【００５０】
Ｉ．脳血管および心臓血管の疾患および障害の治療または予防方法に使用する製剤
本発明の方法は、被験者にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含む製剤とＬ−アルギニンを含む製剤とを同時にまたは続けて投与することを含む、被験者、例えばヒトの脳血管および／または心臓血管の疾患または障害を治療および予防する方法を含む。あるいは、Ｌ−アルギニンとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とを含む単一の製剤を被験者に投与する。
【００５１】
本発明の１つの実施形態には、Ｌ−アルギニンを徐放性製剤中に含む製剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を徐放性製剤中に含む製剤、またはＬ−アルギニンとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の双方を同一の徐放性製剤中に含む製剤が含まれる。１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と同時にまたは続けて投与することのできるＬ−アルギニン含有製剤を包含し、その際、前記製剤はＬ−アルギニンを実質的に一定濃度で長期間放出し、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は即時放出製剤中に存在する。別の実施形態では、本発明は、Ｌ−アルギニンを高濃度で徐放性製剤中に含む製剤を包含し、その際、薬物動態プロファイルはゼロ次放出動態（即ち時間に対して線形な放出速度）である。両クラスの薬物の放出特性を改変して、両者の組み合わせを１日１回の単回単位投与量（once daily single unit dosage）とする放出パターンを得ることもできる。
【００５２】
１つの実施形態では、本発明の方法に使用する製剤は、治療上有効な量のＬ−アルギニン、治療上有効な量のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、および少なくとも１種の徐放剤を含む。また、前記製剤は、投与、保存、審美等の面において製剤を改変するのに必要な追加の成分を含むこともできる。１つの実施形態では、本発明の製剤は、結合剤、充填剤および滑沢剤も含む。好適な実施形態では、前記製剤は、Ｌ−アルギニンを含む徐放性Ｌ−アルギニン処方、結合剤、１種以上の徐放剤、流動促進剤（glidant）および離型剤（release agent）または滑沢剤も含む。前記製剤は、充填剤および／または圧縮剤（compression agent）をさらに含んでいてもよい。本発明の徐放性製剤は、その放出プロファイルのおかげで、同一レベルの薬物を体内に維持するのに、即時放出剤または市販の徐放剤の場合に必要な投与量よりも少ない投与量の投与が可能になるため、特に有利である。徐放性Ｌ−アルギニンとスタチンとの併用投与は、スタチン、例えばシンバスタチンの有効性を増加させることも可能なため、本発明の製剤の使用によって、より少ない投与量のスタチンで同等の有益な作用を得ることも可能である。
【００５３】
Ｌ−アルギニンは当業者に公知の複数の供給元から市販されている。米国薬局方品等級のＬ−アルギニンは、例えば、シグマ−アルドリッチ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）などの各種供給元から市販されている。適切なアルギニンおよびアルギニン誘導体化合物としては、アルギニン塩、例えばアルギニンＨＣｌ、アスパラギン酸アルギニンまたはニコチン酸アルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。他のアルギニン化合物またはアルギニン誘導体は、アルギニンを含むジペプチド、例えばアラニン−アルギニン（Ａｌａ−Ａｒｇ）、バリン−アルギニン（Ｖａｌ−Ａｒｇ）、イソロイシン−アルギニン（Ｉｓｏ−Ａｒｇ）およびロイシン−アルギニン（Ｌｅｕ−Ａｒｇ）、並びにアルギニンを含むトリペプチド、例えばアルギニン−リジン−グルタミン酸（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）およびアルギニン−グリシン−アルギニン（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）から選ぶことも可能である。Ｌ−アルギニンは好ましくはＬ−アルギニン一塩酸塩である。
【００５４】
１つの実施形態では、Ｌ−アルギニンは製剤の約１０〜約７５重量％の量で存在する。別の実施形態では、Ｌ−アルギニンは製剤の約２５〜約７５重量％の量で存在する。好適な実施形態では、Ｌ−アルギニンは製剤の約５０重量％の量で存在する。
【００５５】
１種以上の徐放剤を使用することにより、Ｌ−アルギニンおよび／またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が長期間にわたって徐々に放出される。例えば、前記徐放剤は、血流中の高濃度または低濃度のＬ−アルギニンに伴う副作用を悪化させることもある濃度のピークまたは最低値をつくらない速度でＬ−アルギニンを放出させることが可能である。本発明の方法に使用する製剤に適した徐放剤としては例えばセルロース等の水和剤が挙げられ、当該水和剤は、水性環境に接触すると一部水和して、水和剤に覆われた物質の溶解を遅らせるゲル状のバリアを形成するものである。言い換えれば、前記徐放剤は、水に対して一過性のバリアを形成することで水を製剤へゆっくりと吸収させ、これにより製剤を水和し、その後有効成分、例えばＬ−アルギニンを徐放剤不含の製剤よりも実質的に遅い速度で放出する。また、前記徐放剤は、カプセルへ封入した際、または錠剤、丸剤もしくはジェルキャップへ圧粉または圧縮した際に、水が構造体へゆっくりと浸透するような粒子径で存在する。
【００５６】
１つの実施形態では、前記徐放剤としては、セルロースエーテル製品、ポリメタクリル酸メチルまたはポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、徐放剤としてはセルロース類、例えば、限定さるものではないがメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはこれらの組み合わせが挙げられる。好適な実施形態では、徐放剤としては、１種以上のヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。適切な徐放剤は、ダウ・ケミカル社からメトセル（登録商標）およびエトセル（登録商標）の商品名で市販されている。好適な実施形態では、徐放剤はメトセル（登録商標）Ｋ１００  Ｍ  ＣＲプレミアムおよび／またはメトセル（登録商標）Ｅ  ４Ｍ  ＣＲプレミアムである。
【００５７】
前記徐放剤は、典型的には、有効成分、例えばＬ−アルギニンまたはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を望ましい期間にわたって放出するのに十分な量で存在する。１つの実施形態では、徐放剤は製剤の約５〜約４０重量％の量で存在する。別の実施形態では、徐放剤は約５〜約７５重量％の量で存在する。さらに別の実施形態では、徐放剤は製剤の約１５〜約５０重量％の量で存在する。好適な実施形態では、徐放剤は製剤の約３５重量％の量で存在する。上記範囲の各々に含まれる範囲は全て、本発明の範囲内である。
【００５８】
１つの実施形態では、前記徐放剤は、図１に示すように、Ｌ−アルギニンを１０時間にわたって放出する。１つの実施形態では、前記製剤はＬ−アルギニンを実質的に均一に約４時間〜約２４時間にわたって放出する。別の実施形態では、本発明の製剤は、Ｌ−アルギニンを実質的に均一に約８時間〜約２４時間にわたって放出する。さらに別の実施形態では、前記徐放性Ｌ−アルギニン製剤は、Ｌ−アルギニンを実質的に均一に約１２時間〜約４８時間にわたって放出する。
【００５９】
別の実施形態では、本発明の方法に使用する製剤は、Ｌ−アルギニンを実質的に一定レベルに維持するのに十分な半減期（Ｔ１／２）およびＴｍａｘを実現する薬物動態プロファイルをもたらすよう、Ｌ−アルギニンを放出する。言い換えれば、１つの実施形態では、本発明の徐放性製剤は、循環Ｌ−アルギニンの定常状態が達成されかつ一定に維持されるようにＬ−アルギニンを放出する。１つの実施形態では、前記薬物動態プロファイルは、Ｔ１／２が約４時間〜約１２時間、Ｔｍａｘが約４時間となるようなものである。さらに別の実施形態では、Ｔ１／２は約４時間〜約８時間であり、Ｔｍａｘは約４時間である。
【００６０】
前記製剤において有用な結合剤としては、当業者に通常知られているものが挙げられる。結合剤としては、糖、例えばラクトース、スクロース、グルコース、デキストロースおよび糖蜜；天然ゴムおよび合成ゴム、例えばアラビアゴム、ガーゴム、アルギン酸ナトリウム、アイルランドゴケの抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガッティガムが挙げられるが、これらに限定されない。他の結合剤としては、ポリエチレンオキシドとポリエチレングリコールの混合物、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸、エチルセルロース、微結晶セルロース、カルボマー、ゼイン、デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、ゼラチン、α化デンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポビドン、およびこれらの混合物が挙げられる。好適な実施形態では、結合剤はポリビニルピロリドンのホモポリマーである。
【００６１】
１つの実施形態では、結合剤は製剤の約２０重量％未満の量で存在する。別の実施形態では、結合剤は製剤の約０．５〜約５重量％の量で存在する。好適な実施形態では、結合剤は製剤の約３〜約４重量％の量で存在する。
【００６２】
好適な実施形態では、前記徐放性Ｌ−アルギニン製剤には流動促進剤も含まれる。前記流動促進剤は、米国薬局方品等級の公知の流動促進剤のいずれであってもよく、例えば二酸化ケイ素が挙げられる。好適な実施形態では、流動促進剤はコロイド状の二酸化ケイ素である。
【００６３】
１つの実施形態では、流動促進剤は製剤の約３重量％未満の量で存在する。別の実施形態では、流動促進剤は製剤の２重量％未満の量で存在する。好適な実施形態では、流動促進剤は製剤の約１重量％未満の量で存在する。
【００６４】
前記製剤において有用な充填剤としては、当業者に通常知られているものが挙げられる。典型的な充填剤としては、ラクトース、スクロース、デキストロース、マンニトールおよびソルビトールなどの糖、乳清、第２リン酸カルシウム、第３リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他の充填剤としては、セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。微結晶セルロースは圧縮剤および充填剤としても機能することができる。好適な実施形態では、充填剤／圧縮剤は微結晶セルロースである。より好ましくは、微結晶セルロースは、アビセル（登録商標）ＰＨ  １０２の名称でダウ・ケミカル社より販売されているものである。
【００６５】
１つの実施形態では、前記充填剤は製剤の約５０重量％未満の量で存在する。別の実施形態では、充填剤は製剤の約２〜約２０重量％の量で存在する。好適な実施形態では、充填剤は製剤の約１０重量％の量で存在する。
【００６６】
賦形剤を添加して、製剤中に存在する固形分の量を増やすことができる。この目的に有用なことが分かっている賦形剤は、組み合わされることが多いが、リン酸ナトリウムまたカリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、クエン酸、酒石酸、ゼラチン、並びにデキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、マンニトールおよびデキストラン等の炭水化物、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、並びにポリエチレングリコール等のポリマーなどである。本明細書に記載した以外のものも当業者には公知である。
【００６７】
前記製剤において有用な離型剤または滑沢剤としては、当業者に通常知られているものが挙げられる。典型的な滑沢剤としては、ステアレート、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、硬化植物油（例えば硬化綿実油）、ステアリルフマル酸ナトリウム、パルミトステアリン酸グリセリル（glyceryl palmitostearate）、ベヘン酸グリセリル、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、鉱油、タルク、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、滑沢剤はステアリン酸マグネシウムである。他の実施形態では、滑沢剤は栄養素の最適な吸収および利用を保証するように選択する。
【００６８】
１つの実施形態では、滑沢剤は製剤の約２０重量％未満の量で存在する。別の実施形態では、滑沢剤は製剤の約２〜約２０重量％の量で存在する。好適な実施形態では、滑沢剤は製剤の約１０重量％の量で存在する。
【００６９】
崩壊剤としては、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、コーンスターチ、α化デンプン、微結晶セルロース、アルギン酸、アンバーライトイオン交換樹脂、ポリビニルピロリドン、多糖類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、アルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
前記圧縮剤は、製剤を錠剤、トローチ剤、ジェルキャップまたは他の固体投与形態へ成形可能にするものである。１つの実施形態では、圧縮剤は、製剤を錠剤、トローチ剤またはジェルキャップへ成形可能にするものである。圧縮剤としては、アビセル、ステアリン酸マグネシウム、ワックス、ガム、ｃｅｌｌｅｕｓｉｃｓ、ステアレート、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、圧縮剤は微結晶セルロースである。
【００７１】
１つの実施形態では、圧縮剤は製剤の約０．０１〜約５重量％の量で存在する。別の実施形態では、圧縮剤は約０．５％〜約３％の量で存在する。さらに別の実施形態では、圧縮剤は製剤の約１〜約２重量％の量で存在する。
【００７２】
１つの実施形態では、前記Ｌ−アルギニン処方には、被験者の体重当たり約５ｍｇ／Ｋｇ〜約４０ｍｇ／Ｋｇとなるのに十分な単位投与量のＬ−アルギニンが含まれる。別の実施形態では、Ｌ−アルギニン処方には、約２０ｍｇ／Ｋｇ〜約２５ｍｇ／Ｋｇとなるのに十分な単位投与量のＬ−アルギニンが含まれる。
【００７３】
別の実施形態では、Ｌ−アルギニンとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の両者が同一の徐放性製剤に含まれる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の量は、一部の阻害剤が他のものよりも効力が高いため、前記製剤中に存在する具体的な阻害剤に応じて変動する可能性がある。例えば、バイコール（登録商標）は錠剤当たり約０．１ｍｇ〜約０．８ｍｇの量で存在し、ゾコール（登録商標）は錠剤当たり約１０ｍｇ〜約８０ｍｇの量で存在する。当業者であれば、使用する具体的な阻害剤に基づいて治療量を決めることができる。１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はシンバスタチンであり、被験者の体重当たり約０．５ｍｇ／Ｋｇ〜約３ｍｇ／Ｋｇとなるのに十分な単位投与量で存在する。別の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はシンバスタチンであり、被験者の体重当たり約１．２ｍｇ／Ｋｇ〜約１．４ｍｇ／Ｋｇとなるのに十分な単位投与量で存在する。
【００７４】
さらに別の実施形態では、前記Ｌ−アルギニンおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を双方とも別々の徐放性製剤、例えば別々の錠剤として提供する。徐放性ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、例えば、メルク社（ローウェイ、ニュージャージー州）から市販されている。
【００７５】
本発明の方法に使用する製剤は、従来の医薬配合技術に応じた医薬担体を含んでいてもよい。前記担体は、経口投与に望ましい製剤の形状に応じて幅広く様々な形態をとることができる。経口剤形用に前記製剤を調製する際には、通常の医薬媒体のいずれを採用してもよい。最も好適な経口固体製剤は、錠剤およびジェルキャップである。あるいは、本発明の製剤はカプセルへ封入してもよい。この実施形態では、前記徐放性Ｌ−アルギニン粒状物と、場合によってはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とをカプセル内に封入してもよい。
【００７６】
投与が簡単なため、錠剤およびカプセル剤は最も有利な経口投与単位剤形に相当し、この場合には固形の医薬担体が用いられる。錠剤またはカプセル剤には、同一の錠剤またはカプセル内に様々な構成で封入されたＬ−アルギニン製剤とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤製剤とが含有されていてもよい。構成としては、２分割型等量混合（two-part half and half）錠またはカプセル、一方の製剤で他方を囲んだもの、一方の製剤をもう一方に分散させたもの、両製剤を混合した顆粒等が挙げられる。必要に応じて、錠剤またはカプセル剤を標準的な水性または非水性技術で被覆してもよい。
【００７７】
また、本発明の方法に使用する製剤は、他の薬学的に許容し得る成分、例えば当該技術分野で慣用されるものを含んでいてもよい。レミントン：製剤の科学と実践、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００を参照のこと。本発明の方法に使用する製剤に用いる追加成分としては、水、グリコール、油、アルコール、デンプン、糖、希釈剤、崩壊剤、保存剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、希釈剤、担体、安定化剤、着色剤、着香料、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。適切な希釈剤の例としては、水、エタノール、ポリオール、植物油、注射可能なオレイン酸エチル等の有機エステル、およびこれらの組み合わせが挙げられる。製剤はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分配剤（dispensing agent）等の補助剤を含有していてもよい。微生物の作用の抑制は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等が挙げられるが、これらに限定されない各種抗菌剤および抗真菌剤によって確保できる。糖、塩化ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない等張化剤を含むことも望ましい。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、前記製剤はさらに、少なくとも１種の他の薬剤と同時投与してもよい。薬剤のカテゴリーの例としては以下のものが挙げられる：アドレナリン作動薬；副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制薬；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アンモニア解毒剤；同化剤；興奮薬；鎮痛薬；アンドロゲン；麻酔薬；食欲抑制薬；アンタゴニスト；下垂体前葉抑制薬；駆虫薬；抗挫瘡薬；抗アドレナリン作動薬；抗アレルギー薬；抗アメーバ薬；抗アンドロゲン薬；抗貧血薬；抗狭心症薬；抗不安薬；抗関節炎薬；抗喘息薬；抗アテローム性動脈硬化薬；抗細菌薬；抗胆石薬（anticholelithic）；抗胆石誘発薬（anticholelithogenic）；抗コリン作動薬；抗凝固薬；抗球虫薬；抗痙攣薬；抗うつ薬；抗糖尿病薬；止瀉薬；抗利尿薬；抗嘔吐薬；抗てんかん薬；抗エストロゲン薬；抗線維素溶解薬；抗真菌薬；抗緑内障薬；抗血友病薬；抗出血薬；抗ヒスタミン薬；抗高脂血症薬；抗高リポ蛋白血症薬；抗高血圧薬；抗感染症薬；抗炎症薬；角化防止剤；抗マラリア薬；抗菌薬；抗片頭痛薬；細胞分裂抑制薬；抗カビ薬、制吐薬、抗新生物薬、抗好中球減少症薬、抗肥満薬（antiobessional agent）；抗寄生虫薬；抗パーキンソン病薬；抗蠕動薬、抗ニューモシスティス症薬；増殖抑制薬；抗前立腺肥大薬；抗原虫薬；鎮痒薬；抗精神病薬；抗リウマチ薬；抗住血吸虫薬；抗脂漏薬；分泌抑制薬；鎮痙薬；抗血栓薬；鎮咳薬；抗潰瘍薬；抗尿結石薬；抗ウイルス薬；食欲抑制薬；前立腺肥大治療薬；血糖調整薬；骨吸収阻害薬；気管支拡張薬；炭酸脱水酵素阻害薬；心抑制薬；心保護薬；強心薬；心臓血管薬；胆汁分泌促進薬；コリン作動薬；コリンエステラーゼ不活性化因子；コクシジウム抑制薬；認知補助薬（cognition adjuvant）；抑制薬；利尿薬；ドーパミン作動薬；外部寄生生物撲滅薬；催吐薬；酵素阻害薬；エストロゲン；線維素溶解薬；蛍光薬；遊離酸素ラジカルスカベンジャー；胃腸運動性エフェクター（gastrointestinal motility effector）；グルココルチコイド；性腺刺激成分；養毛剤；止血薬；ヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニスト；ホルモン；コレステロール低下薬；血糖降下薬；脂質低下薬；降圧薬；イメージング剤；免疫剤；免疫調節薬；免疫調整薬；免疫増強薬；免疫抑制薬；不能症治療補助薬；角質溶解薬；ＬＮＲＩＩアゴニスト；肝臓障害治療薬；黄体融解素；精神機能増強薬（mental performance enhancer）；気分調整薬；粘液溶解薬；粘膜保護剤；散瞳薬；鼻粘膜充血除去薬；神経筋遮断薬；神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；非ホルモン系ステロール誘導体；分娩促進薬；プラスミノーゲン活性化因子；血小板活性化因子アンタゴニスト；血小板凝集阻害剤；増強剤；プロゲスチン；プロスタグランジン；前立腺増殖阻害剤；プロチロトロピン；向精神薬；放射性薬剤；調整剤；弛緩薬；再分配剤（repartitioning agent）；殺疥癬虫薬；硬化薬；鎮静薬；選択的アデノシンＡ１アンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニン阻害剤；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ステロイド；刺激薬；抑制薬；症候性多発硬化症；協力薬；甲状腺ホルモン；甲状腺阻害剤、甲状腺ホルモン模倣薬；精神安定薬、脳虚血治療薬；パジェット病治療薬；不安定狭心症治療薬；尿酸排泄薬；血管収縮薬；血管拡張剤；傷薬；創傷治癒剤；またはキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【００７９】
薬剤の別の例としては、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）が挙げられる。ＡＣＥは、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩＩへの変換を触媒する酵素である。ＡＣＥ阻害剤としては、アミノ酸およびその誘導体、ジペプチドおよびトリペプチドを含むペプチド、並びにＡＣＥに対する抗体が挙げられ、これらはＡＣＥの活性を阻害することによりレニン−アンジオテンシン系に干渉し、その結果、昇圧物質であるアンジオテンシンＩＩの形成を低減または排除する。ＡＣＥ阻害剤は、高血圧、うっ血性心不全、心筋梗塞および腎臓疾患を治療するために医学的に使用されてきたものである。ＡＣＥ阻害剤として有用であることが知られている化合物のクラスとしては、アシルメルカプトおよびメルカプトアルカノイルプロリン類、例えばカプトプリル（米国特許第４，１０５，７７６号）およびゾフェノプリル（zofenopril）（米国特許第４，３１６，９０６号）；カルボキシアルキルジペプチド類、例えばエナラプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、リジノプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、キナプリル（米国特許第４，３４４，９４９号）、ラミプリル（米国特許第４，５８７，２５８号）およびペリンドプリル（米国特許第４，５０８，７２９号）；カルボキシアルキルジペプチド模倣体、例えばシラザプリル（米国特許第４，５１２，９２４号）およびベナザプリル（米国特許第４，４１０，５２０号）；ホスフィニルアルカノイルプロリン類、例えばフォシノプリル（米国特許第４，３３７，２０１号）およびトランドロプリル（trandolopril）が挙げられる。エストロゲンはＮＯＳ発現をアップレギュレートするが、ＡＣＥ阻害剤は発現には作用せず、その代わりＬ−アルギニンに対するＮＯＳの作用効率に影響を及ぼす。従って、様々な方法で活性を増加させることが可能である。通常、活性の増加は、本発明の還元酵素阻害剤によって、細胞内に存在する活性な酵素の量を本発明の還元酵素阻害剤で処置していない細胞に存在する量よりも増加させることにより行う。
【００８０】
ＩＩ．予防および治療方法
１つの態様では、本発明は、脳血管および／または心臓血管の疾患または障害の危険性のある被験者に、Ｌ−アルギニンを含む製剤とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）を含む製剤とを続けてまたは同時に投与するか、あるいはＬ−アルギニンとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とを含む単一の製剤を投与することにより、被験者の血管疾患または血管障害、例えば脳血管および／または心臓血管の疾患または障害を予防する方法を提供する。脳血管および／または心臓血管の疾患または障害（事象を含む）の危険性のある被験者は、例えば、アテローム硬化症に対する素因、アテローム硬化症の症状、または、例えば喫煙、高血圧、糖尿病、家族歴、遺伝的要因、高コレステロールレベル、加齢およびアルコール摂取等の危険因子の有無などにより特定できる。
【００８１】
本発明の方法で予防剤として使用される製剤の投与は、脳血管および／または心臓血管の疾患または障害の発症に特徴的な症状が発現する前に行うことができ、その結果、脳血管および／または心臓血管の疾患または障害を予防し、その進行を遅らせ、または、その発症を遅らせる。
【００８２】
その全内容は本明細書に援用される国際特許出願公開第ＷＯ００／５６４０３号、発明の名称「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤によるＩＩＩ型内皮細胞一酸化窒素合成酵素のアップレギュレーション」に記載されているように、ＮＯＳ活性のアップレギュレーションはコレステロール合成の低下には依存せず、特にｏｘ−ＬＤＬ形成の低下には依存しない。従って本発明は、患部の細胞または組織においてｅＮＯＳ活性の回復またはこのような活性の増加が望ましい場合には常に有用である。前記組織は、栄養素を組織へ供給する血管系の細胞、およびｅＮＯＳを発現する組織の細胞の双方を含むものと定義する。
【００８３】
一酸化窒素合成酵素活性は、不能症、心不全、胃および食道の運動障害、例えば腎臓高血圧および進行性腎臓疾患等の腎臓障害、インシュリン欠乏症などの多くの病態に関与している。このような病態を有する個体は、ＮＯ産生の亢進により恩恵を受ける可能性がある。例えば、肺高血圧の個体は、多くの場合、肺血管における一酸化窒素合成酵素の発現量が低下しており、一酸化窒素の吸入が臨床上有効である。従って本発明は、肺高血圧の治療に特に有用である。また、低酸素によってｅＮＯＳ活性の阻害が引き起こされることも判明した。従って本発明は、低酸素に起因する病態を有する被験者の治療に有用である。また、驚くべきことに、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が脳卒中後に生じるＩＤ脳損傷の低減に有用であることも明らかとなった。
【００８４】
前記被験者は、低酸素に起因する異常なまでに低レベルのｅＮＯＳ活性を特徴とする病態を有するおそれがある。他の実施形態では、被験者は、化学的に誘導された異常なまでに低レベルのｅＮＯＳ活性を含む病態を有するおそれがある。さらに他の実施形態では、被験者は、サイトカインによって誘導された異常なまでに低レベルのｅＮＯＳ活性を含む病態を有するおそれがある。特定の重要な実施形態では、被験者は肺高血圧を有するか、または肺高血圧の危険性が異常なまでに上昇している。他の重要な実施形態では、被験者は虚血発作を経験しているか、または虚血発作の危険性が異常なまでに上昇している。さらに他の重要な実施形態では、被験者は心不全または進行性腎臓疾患を有する。さらに他の重要な実施形態では、被験者は慢性的に低酸素状態に曝されている。
【００８５】
さらに重要な実施形態では、被験者は血栓事象を経験しているか、または血栓症の危険性が異常なまでに上昇している。さらに他の実施形態では、被験者は動脈硬化の危険性が異常なまでに上昇しているか、または動脈硬化を有する。他の重要な実施形態では、被験者は心筋梗塞を発症する危険性が異常なまでに上昇しているか、または心筋梗塞を経験している。さらに別の実施形態では、被験者は再潅流傷害の危険性が異常なまでに上昇している。好適な実施形態では、再潅流傷害の危険性が上昇している被験者は、臓器移植のレシピエントである（例えば心臓、腎臓、肝臓等）。他の重要な実施形態では、被験者はホモシスチン尿症を有する。特定の他の重要な実施形態では、被験者は、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性遺伝性脳動脈症（cerebral autosonial dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leucoencephalopathy；ＣＡＤＡＳＩＬ）症候群を有する。さらに重要な実施形態では、被験者は神経系の変性障害を有する。好適な実施形態では、神経系の変性障害を有する被験者は、アルツハイマー病を有する。
【００８６】
他のある実施形態では、本発明の治療を必要とする被験者が、虚血発作の危険性が異常なまでに上昇している場合には、このような被験者に対する治療としてはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を除外する。
【００８７】
他の実施形態では、本発明の方法および組成物（例えばＬ−アルギニン徐放性製剤、Ｌ−アルギニン棒状食品等）を使用してアルツハイマー病を治療または予防することができる。さらに別の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して間欠性跛行を治療または予防することができる。さらに別の実施形態では、本発明の製剤および組成物を使用して血管拡張を増加させることができる。
【００８８】
好適な実施形態では、本発明の方法を使用して被験者のコレステロールレベルを低下させることができる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを被験者に投与することで、総コレステロールの低下が可能である。１つの実施形態では、前記方法は、総コレステロールを約５０〜約１５０ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。別の実施形態では、前記方法は、総コレステロールを約８０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとを被験者に投与することで、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの低下が可能である。１つの実施形態では、前記方法は、ＬＤＬコレステロールを約４０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。別の実施形態では、前記方法は、ＬＤＬコレステロールを約６０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。本発明の方法は、被験者の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させるのにも役立つ。さらに、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとの投与により、被験者の中性脂肪を低下させることができる。１つの実施形態では、本発明の方法は、被験者の中性脂肪を約３０〜約１００ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。別の実施形態では、本発明の方法は、中性脂肪を約４５〜約７５ｍｇ／ｄＬ低下させるものである。
【００８９】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとの同時投与は、被験者のコレステロールレベルを低下させる際に相乗作用を示す。本発明の方法および組成物は、他の既知の方法および組成物に比べ、驚くべき有意な量でコレステロールレベルを下げることが判明した。特に、本発明に従うＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と徐放性Ｌ−アルギニンとの同時投与は、既存の方法に比べ、有意に中性脂肪およびＬＤＬレベルを低下させる。また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と徐放性Ｌ−アルギニンとの同時投与は、既存の方法に比べ、有意にＨＤＬを増加させる。１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とＬ−アルギニンとの同時投与により、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の単独投与と比較して、総コレステロールが約５％〜約１５％多く低下する。別の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とＬ−アルギニンとの同時投与により、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の単独投与と比較して、総コレステロールが約５〜約２０ｍｇ／ｄＬ多く低下する。さらに別の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とＬ−アルギニンとの同時投与により、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の単独投与と比較して、ＬＤＬコレステロールが約２〜約２０ｍｇ／ｄＬ多く低下する。さらに別の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とＬ−アルギニンとの同時投与により、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の単独投与と比較して、中性脂肪が約５〜約５０ｍｇ／ｄＬ、あるいは約２０〜約３５ｍｇ／ｄＬ多く低下する。
【００９０】
別の実施形態では、本発明の方法を使用して被験者のＣ−反応性タンパク質を低下させることができる。Ｃ−反応性タンパク質は、急性損傷、感染または他の炎症刺激に応答して体内で放出される急性期反応物質である。これまでの研究で、Ｃ−反応性タンパク質と冠状動脈疾患との間に正の相関関係があることが判明している。Ｒｉｄｋｅｒ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８（１２）：ｅ８１−８５（２００３）；Ｂｌａｋｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５（５）：Ｒ１２５０−１２５２（２００３）。１つの実施形態では、前記方法は、Ｃ−反応性タンパク質を約１０％〜約５０％、または約２５％〜約３５％低下させるものである。
【００９１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とＬ−アルギニンとの同時投与は、Ｃ−反応性タンパク質を低下させる際に相乗作用を示す。１つの実施形態では、前記方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をＬ−アルギニンの徐放性製剤と併用しない場合と比較して、Ｃ−反応性タンパク質を約５０％〜約９０％、または約６５％〜約７５％多く低下させるものである。別の実施形態では、前記方法は、Ｌ−アルギニンの徐放性製剤をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と併用しない場合と比較して、Ｃ−反応性タンパク質を約８０％〜約１２０％または約９５％〜約１０５％多く低下させるものである。
【００９２】
さらに、本発明の方法を使用して、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）が上昇している被験者において一酸化窒素産生および／または血管拡張を増加させることができる。非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）は、ｅＮＯＳの内在性競合阻害剤である。血漿ＡＤＭＡレベルの上昇には内皮機能不全が伴う。スタチン類は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは内皮ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現を刺激し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは内皮依存性のＮＯ介在型血管拡張を亢進する。従って、スタチン類（例えばシンバスタチン）は、ＡＤＭＡが上昇した患者の内皮機能を亢進することができる。理論に拘束させるつもりはないが、ＡＤＭＡの阻害作用はＬ−アルギニンによって解消されると考えられる。
【００９３】
Ｌ−アルギニンと、場合によってはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）とをＡＤＭＡが上昇した被験者へ投与することにより、本発明の方法は一酸化窒素産生および／または血管拡張を増加させることができる。このような同時投与により、内皮機能が約５％〜約１５％、あるいは約７％〜約１２％増加可能である。本発明の１つの実施形態では、前記被験者は内皮機能不全を有する。
【００９４】
いずれの投与形態でも、送達される化合物の実際の量、および本明細書に記載する有利な薬物動態プロファイルを達成するのに必要な投与スケジュールは、化合物（および／またはその活性代謝産物）のバイオアべイラビリティなどの要因、治療対象の障害、望ましい治療用量、および当業者には明らかと思われる他の要因にある程度依存する。実際の送達量および投与スケジュールは、当業者であれば過度の実験をすることなく容易に決定することができ、投与化合物および／またはその活性代謝産物の血漿レベルを監視し、投与量または投与スケジュールを必要に応じて望ましい薬物動態プロファイルを達成するよう調整すればよい。
【００９５】
本明細書中に記載するような本発明の方法に使用する製剤、またはその薬学的に許容し得る付加塩もしくは水和物は、望ましくない副作用を回避または低減するために、本発明に従って様々な投与経路または投与形態で被験者に送達することができる。１つの実施形態では、被験者は動物である。別の実施形態では、被験者は哺乳動物である。さらに別の実施形態では、被験者はヒトである。最適な経路は、所定のいずれの場合でも、治療対象の病態の性質および重篤度に依存する。本発明の好適な投与経路は、経口経路である。本発明の組成物は、簡便には単位剤形で存在し、薬学の分野で周知のいずれかの方法で調製可能である。前記組成物を投与するための技術および製剤は、レミントン：製剤の科学と実践、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００に記載されている。
【００９６】
本発明の製剤は、通常、所期の目的を達成するため、例えば、脳血管および／または心臓血管の疾患または障害を治療および／または予防するのに有効な量で使用する。治療上有効な量とは、疾患、障害、疾患もしくは障害に関連する症状、または疾患もしくは障害に対する素因を治療するのに有効な量を意味する。前述したように、用語「治療」とは、疾患もしくは障害を有する患者、疾患もしくは障害の症状を有する患者、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者へ治療薬または製剤を適用または投与すること、あるいは、このような患者由来の単離組織へ治療薬または製剤を適用または投与することをいい、疾患もしくは障害および／または事象を治癒、回復、緩和、軽減、改変、治療、改善する、これらの発症を遅らせる、疾患もしくは障害の進行を遅らせる、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害および／または事象に対する素因を改善する、または、これらに作用することを目的とする。治療上有効な量の決定は、特に本明細書中の詳細な説明を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９７】
本発明での使用に適した医薬製剤としては、Ｌ−アルギニンおよび／またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が治療上有効な量、即ち所期の目的を達成するのに有効な量で含有される製剤が挙げられる。通常、有効量とは、単回または複数回で所望の応答を生じる医薬品の量である。疾患の進行を一時的に遅らせるだけでもよい。別の実施形態では、疾患の進行を永久に止める、または疾患もしくは病態の発症を遅らせる、または疾患もしくは病態を発症しないようにする。任意の特定の疾患に対する投与量の影響は、常法によって監視できる。このような量は、当然のことながら、治療対象の特定の病態、病態の重篤度、年齢、体調、体型および体重を含めた個々の患者のパラメータ、治療の期間、同時併用療法の性質（もしあれば）、具体的な投与経路、並びに、保健従事者の知見および専門知識内の類似の要因に依存する。
【００９８】
通常、活性化合物の用量は１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇである。１つの実施形態では、約５０〜約５００ｍｇ／ｋｇの用量が適切であると予想される。別の実施形態では、投与は経口投与であって、１日当たり１回または数回投与する。
【００９９】
当然のことながら、Ｌ−アルギニンおよび／またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の実際の量は、中でも、被験者の状態並びに被験者の体重および代謝に依存する。例えば、ＩＣまたはＡＤに罹患した被験者に投与する場合、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、ジェルキャップ、トローチ剤またはカプセル剤には、とりわけ正常組織への不十分な血流による有害作用を改善するのに有効な量、即ち、治療対象の被験者において症状の発症を予防する、または治療対象の被験者の既存の症状を軽減する、または治療対象の被験者を延命させるのに有効な量のＬ−アルギニンおよび／またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が含有される。有効量の決定は、特に本明細書中の詳細な説明を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１００】
ヒトに用いる場合の治療上有効な量は、モデル動物からも推定できる。例えば、ヒトへの用量は、動物において有効であることが判っている濃度となるように定めることができる。
【０１０１】
治療上有効な用量は、ヒトの薬物動態データからも推定できる。いずれの特定の理論にも拘束されるわけではないが、効力は、投与薬物および／またはその活性代謝産物の適用用量に被験者が合計でどれだけ曝されたかに関係していると考えられ、血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）の測定により判定される。従って、本発明の方法に従って投与される用量では、投与化合物（および／またはその活性代謝産物）のＡＵＣは、治療対象の適応症に有効であることが知られている用量のＡＵＣの約５０％以内であり、有効であると予想される。投与化合物（および／またはその活性代謝産物）のＡＵＣが、既知の有効用量のＡＵＣの約７０％、約８０％、さらには約９０％以上の範囲内である用量が好適である。このような物質の毒性および治療上の効力は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手法、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を致死させる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を測定する手法によって判定できる。毒性作用と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。治療指数が大きい製剤が好適である。毒性のある副作用を示す製剤が使用される場合もあるが、未感染細胞に起こり得る傷害を最小限にし、かつ、これにより副作用を軽減するためには、このような製剤を患部組織の部位へターゲティングさせる送達システムの設計に注意を払うべきである。
【０１０２】
ヒト用の投与量範囲を定める際に、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを利用することができる。１つの実施形態では、本発明のこのような製剤の投与量は、毒性を殆どまたは全く示さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量はこの範囲内で、使用する剤形および利用する投与経路に応じて変動可能である。本発明の治療または予防方法に使用する製剤のいずれであっても、最初に細胞培養アッセイから治療上有効な用量を推測することができる。用量は、モデル動物において、ＩＣ５０（即ち、症状を最大の場合の半分に阻害する試験化合物の濃度；細胞培養物で判定）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するように定めればよい。このような情報を利用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に求めることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定すればよい。
【０１０３】
上述の方法、特に、投与化合物および／またはその活性代謝産物の血中濃度および持続期間に基づいて用量を調整し、被験者において最大効力を達成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０４】
ＩＩＩ．製造方法
Ｌ−アルギニン顆粒をマトリックス内へ効率的かつ実質的に封入または被覆することにより、本発明の組成物の徐放特性が向上することが判明した。セルロース系マトリックスの場合には、水と接触すると、マトリックスは一部水和してＬ−アルギニンの放出速度を制御するゲル層を形成する。Ｌ−アルギニン顆粒を効率的に被覆または封入することで、溶解に対して一過性のバリアを作り、Ｌ−アルギニンの送達を持続させる。マトリックス中にはかなりの間隙があるため、Ｌ−アルギニンは急速に溶解してしまう。本発明の方法では、直接圧粉で製造した製品よりも特性の向上した製品が得られる。さらに、本発明の方法は、流動化分散（fluidization dispersions）を含む方法（これらの方法は時間と費用がかかる）よりも有利である。
【０１０５】
有効かつ効率的な被覆にとって重要な点は、本発明の造粒、磨砕および配合工程を行うことにある。図５を参照すると、好適な実施形態では、Ｌ−アルギニンを造粒する工程（工程１１０）、Ｌ−アルギニンを磨砕する工程（工程１２５、１４０）、Ｌ−アルギニンを残りの成分と配合する工程（工程１４５、１５０、１５５）、および、成分を圧縮して錠剤を形成する工程（工程１６０）を含む方法に従って錠剤を製造する。好ましくは、前記方法は、成分を選別する工程（工程１０５）および／または磨砕工程時にＬ−アルギニンを乾燥させる工程（工程１３５）のいずれかまたは双方をさらに含む。
【０１０６】
成分を使用前に選別する場合（工程１０５）、＃２０および／または＃３０メッシュのスクリーンを使用して、成分の一部または全部を選別することができる。好適な実施形態では、造粒前に顆粒を選別し（工程１０５）、磨砕前に再度選別する（図示せず）。選別の結果、被覆および／または圧粉に有利な範囲で粒度分布の狭い顆粒が得られる。
【０１０７】
造粒工程は、より均一な粒子が得られる点で有利である。当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて、活性物質をペレット化または造粒することができる。ペレット化または造粒は、通常、サイズを大きくする（size-enlargement）プロセスと定義され、小さな粒子を集めてより大きな永続性の集合体とするものであり、元々の粒子は依然として判別可能であって自由に流動できる状態にある。造粒に先立ち、結合剤を活性物質へ添加して造粒プロセスを向上させることができる。他の添加剤も造粒時に添加可能である。これらの添加剤としては、例えば、甘味剤、着香剤、着色剤、酸化防止剤等が挙げられる。
【０１０８】
場合によっては、水または他の溶剤を添加して造粒プロセスを支援することができる。水または溶剤の添加量は、例えば造粒プロセスの選択に依存し、当業者であれば容易に決定できる。水または他の溶剤は、造粒プロセス時の任意の適切な時点で添加すればよい。例えば、結合剤を溶剤（例えば水）と混合して造粒剤とし、次いで造粒剤を活性物質上へ噴霧することが可能である。あるいは、造粒剤の粘度が高すぎで活性物質上へ均一に噴霧できない場合には、まず結合剤を活性物質と配合し、次いで水または他の溶剤を噴霧して均一なパターンの活性物質顆粒またはペレットを製造するのが望ましい。
【０１０９】
任意の適切な造粒法を用いて活性物質を含む粒子を製造することができる。湿式造粒および／または乾式造粒法が使用可能である。
乾式造粒とは、熱および溶剤を用いない処方物の造粒をいう。乾式造粒技術としては、一般にスラッギングやロール圧粉が挙げられる。スラッギングは、処方物を乾式配合し、処方物を圧縮機上で大型の錠剤またはスラグへ圧縮することからなる。得られた錠剤またはスラグを磨砕して顆粒を得る。ローラー圧粉はスラッギングに似ているが、ローラー圧粉では、打錠機の代わりにローラー圧粉機を使用する。例えば、医薬造粒技術ハンドブック、Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｉｋｈ編、Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１０２−１０３頁（１９９７）を参照のこと。乾式造粒技術は特定の場合、例えば、活性物質が熱または溶剤の影響を受けやすい場合に有用である。
【０１１０】
あるいは、湿式造粒が利用可能である。湿式造粒では、典型的には溶剤および結合剤を処方物へ添加して大型の顆粒集合体を得る。造粒時の温度は任意の適切な値に設定でき、通常は、処方物のどの成分の融点も超えない温度である。典型的には、混合物を約３５℃〜約６５℃の温度で約２０〜約９０分間造粒する。好適な実施形態では、混合物を約２０分未満、より好ましくは約１〜約１０分間室温で造粒する（実施例８参照）。次いで顆粒を典型的には適切な期間（例えば１時間以上）自然乾燥させる。
【０１１１】
好ましくは、活性物質を高剪断ミキサー造粒（「ＨＳＧ」）または流動床造粒（「ＦＢＧ」）によって造粒する。これらの造粒プロセスはいずれも顆粒またはペレットを大型化させるものであるが、使用装置およびプロセス操作の機構が異なっている。これらの造粒技術は市販の装置を使用して行うことができる。
【０１１２】
ＨＳＧでは、配合および湿式マッシングを、インペラーおよびチョッパーによる高速の機械撹拌で行う。湿潤材料の混合、高密度化および凝塊形成は、インペラーによって発生した剪断力および圧粉力を利用して行う。チョッパーの主な機能は、塊を細かく細断し、液体結合剤の分配を助けることである。液体結合剤は、より均一な液体分布を達成するため、ボウル内へ注ぐか、または、粉末へ噴霧する。
【０１１３】
一方、流動化は、気体と接触させることで細かな固体を流体様状態へ変化させる操作である。特定の気体速度では、粒子は流体に乗り、飛沫同伴を起こさずに自由に移動するようになる。このような流動床は激しく沸騰している流体に似ており、固体粒子は、気体速度と共に激しさを増す著しい乱流運動を受ける。従って流動床造粒は、結合剤溶液を流動化粉体床上へ噴霧して大型の顆粒を形成することにより顆粒を流動床で製造するプロセスである。結合剤溶液は、例えば、任意の適切な方法で設置されたスプレーガン（例えば上部または下部）から噴霧可能である。噴霧位置および噴霧速度は、活性物質の性質および使用する結合剤に依存する場合があり、当業者であれば容易に決定できる。
【０１１４】
本発明の好適な方法では、Ｌ−アルギニンの造粒（工程１１０）には、Ｌ−アルギニンをポビドンなどの結合剤と予備混合して配合物を形成する工程（工程１１５）および配合物を造粒剤（造粒用ビヒクル）と共に造粒機で造粒する工程（工程１２０）が含まれる。造粒剤は、例えば、精製水に溶解したポビドンであってよい。好ましくは、Ｎｉｒｏ  ＰＭＡ  ６５高剪断造粒機等の高剪断造粒機を使用する。造粒機を利用すれば、Ｌ−アルギニンと結合剤との混合、および造粒用ビヒクルを配合物上へ噴霧しながらの配合物の造粒の双方を行うことができる。
【０１１５】
処方物の１以上の成分を造粒した後、場合によっては、造粒後の処方物を磨砕することができる。磨砕は、任意の適切な市販の装置（例えば０．０３９インチのスクリーンを備えたＣｏＭｉｌ）を用いて行うことができる。スクリーンのメッシュサイズは、所望の顆粒のサイズに応じて選択することができる。造粒後の活性物質を磨砕した後、必要に応じてさらに乾燥（例えば空気中）させてもよい。
【０１１６】
好適な実施形態では、Ｌ−アルギニンの磨砕には、当該技術分野で周知の技術に従って、湿潤顆粒を磨砕する工程または湿式磨砕工程（工程１２５）、顆粒を乾燥させる工程（工程１３０）、乾燥顆粒を磨砕する工程または乾式磨砕工程（工程１４０）が含まれる（一般には、米国特許第５，１４５，６８４号および欧州特許出願第４９８，４８２号を参照のこと、いずれの開示内容も本明細書に援用されるものとする）。ＣｏＭｉｌ等の磨砕機を使用して顆粒を湿式磨砕および乾式磨砕することができる。１つの実施形態では、磨砕機は、湿式磨砕用には’３７５Ｑスクリーンを、乾式磨砕用には’０６２Ｒスクリーンを備えたものである。乾燥工程は、Ａｅｒｏｍａｔｉｃ製Ｓ−２流動床乾燥機等の床乾燥機（bed dryer）にて、顆粒を所望の乾燥減量（ＬＯＤ）レベル（例えば３％ＬＯＤ以下）まで乾燥させることにより行うことができる。前記乾燥工程は、所望のＬＯＤに達するまで数段階行うことができる（工程１３５）。
【０１１７】
Ｌ−アルギニンと残りの成分との配合には、予備配合工程（工程１４５）、配合工程（工程１５０）および最終配合工程（工程１５５）が含まれる。予備配合工程には、Ｌ−アルギニン／ポビドン顆粒と充填剤および流動促進剤、例えば微結晶セルロースおよびコロイド状二酸化ケイ素との配合が含まれる。予備配合工程は、例えば８クォートＶ−ブレンダーにて、約５分間２５ｒｐｍで配合することにより行うことができる。配合工程には、この配合物に１種以上の徐放剤、例えば１種以上のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および充填剤、例えば微結晶セルロースを添加することが含まれる。配合工程は、例えば、２立方フィートＶ−ブレンダーにて、約２０分間２５ｒｐｍで配合することにより行うことができる。最終配合工程には、離型剤／滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム）を２立方フィートＶ−ブレンダー内の配合物へ添加し、約５分間２５ｒｐｍで配合することが含まれる。
【０１１８】
上述のように処方物を調製した後、処方物を圧縮して（工程１６０）錠剤形態とする。この錠剤成形は、任意の適切な手段により、圧縮力を利用してまたは圧縮力なしで行うことができる。例えば、造粒工程後の処方物の圧縮は、好ましくは処方組成物が滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）によって十分に滑らかになっている場合には、任意の打錠機（例えば、表面が平滑な０．７４８”×０．３８０”の楕円形凸状の成形型を備えたマネスティー  ベータプレス）を用いて行うことができる。この工程を実施するには数多くの代替手段が利用可能であり、本発明は任意の特定の装置の使用に限定されない。圧縮工程は、回転式打錠機を用いて行うことができる。回転式打錠機は、錠剤形成のために複数の貫通孔、即ちダイを備えた回転板を有する。処方物をダイへ挿入し、その後プレス成形する。
【０１１９】
あるいは、成型によって錠剤を製造することも可能である。成型錠剤は、適切な機械にて、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状の配合材料混合物を成型することにより製造可能である。
【０１２０】
錠剤の直径および形状は、造粒組成物の成形または圧縮用に選択された金型、ダイおよびパンチに依存する。錠剤は円板形、楕円形、長楕円形、円形、円柱形、三角形等であってよい。錠剤に刻み目をつけて崩壊を促進してもよい。上面または下面に記号または文字を型押し（エンボスまたはデボス）することもできる。
【０１２１】
圧縮力は、プレスの種類／モデル、錠剤製品に望まれる物性（例えば所望の硬度、破砕性等）、所望の錠剤外観およびサイズ等に基づいて選択できる。典型的には、印加される圧縮力は、圧縮後の錠剤の硬度が少なくとも約２ｋｐとなるようなものである。これらの錠剤は一般に、包装、輸送または利用者による扱いに対して十分な硬度および強度をもたらす。必要に応じて、より高い圧縮力を錠剤に印加して錠剤硬度を上げることができる。しかしながら、圧縮力は、錠剤内の活性物質含有粒子を変形（例えば亀裂または崩壊）させないように選択するのが好ましい。好ましくは、印加される圧縮力は、圧縮後の錠剤の硬度が約１０ｋｐ未満となるようなものである。ある実施形態では、錠剤を約３ｋｐ〜約７ｋｐ、場合によっては約３ｋｐ〜約５ｋｐ、または、約３ｋｐの硬度に圧縮するのが好ましいと考えられる。
【０１２２】
典型的には、最終錠剤の重量は約５０ｍｇ〜約２０００ｍｇ、より典型的には約２００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または、約４００ｍｇ〜約７００ｍｇとなる。
本発明の製剤を製造する特定の処方および方法は、徐放性Ｌ−アルギニン組成物に独特の利点を付与する。特に、本発明の製剤および方法は、望ましい徐放溶解プロファイルを達成する組成物をもたらす。最適には、徐放性Ｌ−アルギニン製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物放出を少なくとも１４時間まで持続させるものであり、好ましくは、約１時間で約１０％〜約４０％、約４時間で約３０％〜約７０％、約６時間で約５５％〜約７５％、約８時間で約６５％〜約８５％、約１２時間で約７５％〜約９５％、１４時間で約８０％〜約１００％が放出される。図７から明らかなように、本発明の製剤はこのような最適な溶解を達成する。さらに、実施例８および実施例１４に示すように、溶解および安定性の試験からは、本発明の製剤が、製造の１ヵ月および２ヵ月後に最適な溶解プロファイルを示すことが明らかである。
【０１２３】
さらに、本発明の製剤および方法は、脆過ぎることのない徐放性Ｌ−アルギニン組成物をもたらす。さらに本発明の製剤および方法は、簡便に製造できるほど十分に圧縮可能な徐放性Ｌ−アルギニン組成物をもたらす。
【０１２４】
必要に応じて、他の改変を錠剤の実施形態に盛り込むことができる。例えば、本発明の錠剤マトリックスにより活性物質の放出を改変することも、任意の公知技術、例えば各種被膜の適用により可能である（例えばアンバーライトＩＲＰ−６９等とのイオン交換複合体）。本発明の錠剤はＧＩ運動低下薬を含有することもでき、また、当該薬物と同時投与することもできる。活性物質を改変してプロドラッグを生成することもでき、プロドラッグは、酵素分解または加水分解等によってｉｎ  ｖｉｖｏで活性化合物を解放する生物活性化合物を化学修飾することで得られる。追加の層または被膜は拡散バリアとして作用し、薬物放出の速度とタイミングを制御するさらなる手段となり得る。
【０１２５】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばシンバスタチン）および／または追加の物質が含まれる場合には、好ましくは、これらの物質を配合工程で添加する（工程１４５、１５０、１５５）。錠剤に徐放性Ｌ−アルギニン製剤とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤製剤とが含まれる場合、前記錠剤は、Ｌ−アルギニン製剤をゆっくりと放出するコア、次いで少なくとも１種のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含む製剤からなる外側被覆または被膜を有していてもよい。あるいは、前記錠剤は、Ｌ−アルギニン製剤、例えば徐放性Ｌ−アルギニン製剤とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤製剤とで１つの表面を共有していてもよい。
【０１２６】
Ｌ−アルギニンをＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と続けてまたは同時に投与する場合には、各錠剤、カシェ剤、トローチ剤またはカプセル剤には約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が含有される。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の量は使用する特定のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に依存する。
【０１２７】
本発明の別の態様では、心臓血管疾患および／または脳血管疾患の治療組成物を食品の形態で提供する。好ましくは、前記食品は医療用健康食品バーのような棒状である。食品の利用により、錠剤１錠に配合できる量よりも多量のＬ−アルギニンの供給が可能となる。例えば、１ｇを超えるＬ−アルギニンを錠剤１錠に配合するのは困難である。従って、Ｌ−アルギニンを１ｇを上回る量で送達するには複数の錠剤が必要である。本発明は、１ｇを超えるＬ−アルギニン、および必要に応じて他の物質を供給できる棒状食品を提供する。１つの実施形態では、Ｌ−アルギニンを即時放出製剤、例えばＬ−アルギニンの即時放出粒状物として棒状食品へ添加する。好ましくは、前記棒状食品には、例えばＬ−アルギニンの徐放性粒状物を含む徐放性製剤が含まれる。好適な実施形態では、前記粒状物には味覚マスキング用の成分、例えば味付け用の被膜が含まれる。別の実施形態では、前記棒状食品はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤等の追加の物質をさらに含有する。好ましくは、前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はシンバスタチン等のスタチンである。Ｌ−アルギニンとスタチン類とを食品用ビヒクルの形態で組み合わせることにより、節制と製剤投与の手軽さがもたらされる。また、食品の利用は、より高い用量が望ましい場合に、複数のＬ−アルギニン錠剤を摂取する必要を減らすこともできる。
【０１２８】
１つの実施形態では、棒状食品は約１〜約８０ｇのシンバスタチンと約１〜約１０ｇのＬ−アルギニンとを有する。好適な実施形態では、合計で少なくとも約１０ｍｇのシンバスタチンと棒状食品当たり約４ｇのＬ−アルギニンまたはその塩とを、糖分、果実成分、タンパク質、ビタミン類およびミネラル類と共に有する棒状食品を提供する。前記棒状食品の重量は約２５〜約１００ｇの範囲である。特定のプロセスでは、糖分と果実ペーストとを高温で合わせ、次いで、得られたシロップを冷ましたものと残りの副成分とを合わせることにより前記棒状食品を製造する。副成分をシロップに配合した後、Ｌ−アルギニンおよびシンバスタチンを添加するが、特にタンパク質増量剤と合わせて増量する。そして、食品成分（food agents）、特に、果実片または所望の食感と風味を与える他の粒子状の食用成分、および大豆タンパク質を添加する。得られた生成物は保存安定性があり、風味が良い点で望ましい官能特性を有し、シンバスタチンおよびＬ−アルギニンと一緒にしても健康によい成分配合となっている。Ｌ−アルギニンおよびＬ−リジンを用いた棒状の健康食品を製造するための方法および処方は、例えば、その全内容が本明細書に援用される米国特許第６，０６３，４３２号に記載されている。
【０１２９】
本発明の別の態様は、上述の棒状食品を製造する方法である。前記方法には、図５の工程１１０について上述した通りＬ−アルギニンを造粒することが含まれる。好ましくは、前記造粒工程には、予備混合工程（工程１１５）および造粒工程（工程１２０）が含まれる。好ましくは、前記方法には、上述の湿式磨砕工程（工程１２５）も含まれる。このような棒状食品は、Ｌ−アルギニンを例えば先に詳述したような適切な賦形剤と共に湿式造粒することにより得られる。得られた粒状物はそのままで、または味覚マスキング用のセルロース系材料で被覆して用いる。
【０１３０】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、限定と解釈すべきではない。本出願中で引用した全ての参考文献、特許および公開公報の開示内容は、本明細書に援用されるものとする。
【実施例１】
【０１３１】
錠剤製剤１
約２５０ｇのＬ−アルギニンをミキサーに入れ、１００ｒｐｍにてゆっくり混合しながら１００ｇのユードラジットＲＳ  ３０Ｄ低透過性メタクリル酸水性ポリマー分散液（ローム・アメリカ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を添加して湿潤塊を形成した。湿潤塊を１８−２０篩に通し、５０℃で２４時間乾燥させた。得られた乾燥Ｌ−アルギニン粒状物（２５０ｇ）を８４ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロース（ダウ・ケミカル社、ダンベリー、コネティカット州）および３ｇのステアリン酸マグネシウムと共に乾式混合し、配合物を形成した。得られた配合物を圧縮し、７／１６凹形パンチを用いて錠剤とした。
【実施例２】
【０１３２】
錠剤製剤２
２５０ｇのＬ−アルギニンをミキサーに入れ、ゆっくり混合しながら８４ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロースおよび３ｇのステアリン酸マグネシウムを添加した。得られた配合物を圧縮し、７／１６凹形パンチを用いて錠剤とした。
【実施例３】
【０１３３】
カプセル製剤１
２５０ｇのＬ−アルギニンをミキサーに入れ、ゆっくり混合しながら１００ｇのユードラジットＲＳ  ３０Ｄ低透過性メタクリル酸水性ポリマー分散液を添加して湿潤塊を形成した。湿潤塊を１８−２０篩に通し、５０℃で２４時間乾燥させた。得られた乾燥Ｌ−アルギニン粒状物（２５０ｇ）を８４ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロースおよび３ｇのステアリン酸マグネシウムと共に乾式混合し、配合物を形成した。得られた配合物を００号ゲルカプセルへ封入した。
【実施例４】
【０１３４】
カプセル製剤２
２５０ｇのＬ−アルギニンをミキサーに入れ、ゆっくり混合しながら８４ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロースおよび３ｇのステアリン酸マグネシウムを添加した。得られた配合物を００号ゲルカプセルへ封入した。
【実施例５】
【０１３５】
錠剤製剤３
２５０ｇのＬ−アルギニンおよび５０ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロースを混合し、キッチンエイド（登録商標）ミキサーを用いて低速で１０分間均質化し、乾燥配合物を形成した。この乾燥配合物に、１１５ｇのユードラジットＲＳ  ３０Ｄ低透過性メタクリル酸水性ポリマー分散液を５ｇずつ塊が均一に湿潤するまで添加した。湿潤塊を１２メッシュの篩、次いで２０メッシュの篩に通し、その後、水分含有量が１重量％になるまで３０℃で２４時間乾燥させた。得られた乾燥Ｌ−アルギニン粒状物を７ｇのステアリン酸マグネシウムと乾式混合し、次いでマネスティー  ベータプレスを用いて圧縮し、７／１６凹形パンチを用いて錠剤とした。
【実施例６】
【０１３６】
徐放性錠剤の製造
約１０００ｇのＬ−アルギニンおよび約２００ｇのメトセルＫ１００  Ｍ  ＣＲメチルセルロースをＧＰ−１高剪断ミキサー（造粒機）内で約５分間１００ｒｐｍにて混合した。次いで約１３８ｇのユードラジットＲＳ  ３０Ｄ低透過性メタクリル酸水性ポリマー分散液を、２００ｒｐｍおよび１．５バールの圧力でインペラーを動かしながら添加した。混合物を１分間２００ｒｐｍにて造粒した。次いで造粒物を、ＭＰ−１流動床造粒機内で４５℃の入口温度、１００ＣＭＨの風量にておよそ２％の水分含有量まで乾燥させた。次いで乾燥顆粒を、サイズ５５Ｒスクリーンおよび円形インペラーを備えたＣｏｍｉｌ１９７Ｓを用いて９０％の速度で磨砕した。８クォートＶ−ブレンダー内にて、約２７ｇのステアリン酸マグネシウムを磨砕後の顆粒に添加し、２分間混合した。次いでこの材料を、７／１６”の標準的な凹形の成形型を備えたマネスティー  ベータプレスを用いて可能な最高硬度まで圧縮し、目標重量６８２．５ｍｇの錠剤とした。錠剤を７５ｃｃのＨＤＰＥボトルに手作業で包装した（ボトル当たり６０錠）。
【０１３７】
ＢｉｏＥｎｅｒｇｙ（ウォレン、ニュージャージー州）より購入した市販の徐放性Ｌ−アルギニン錠剤に対する前記錠剤の放出プロファイルを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて作成した。図７は両製剤の放出プロファイルを示すチャートである。
【実施例７】
【０１３８】
Ｌ−アルギニンの薬物動態の評価
Ｌ−アルギニンの徐放性錠剤対即時放出カプセル剤の薬物動態を評価するため、無作為４元クロスオーバー試験（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｓｔｕｄｙ）を１４人の健常成人被験者に絶食条件下で行った。本明細書中、「健常」とは、心臓血管危険因子をもたない高コレステロール血症ではない被験者を意味する。本試験では、実施例６の徐放性Ｌ−アルギニン錠剤（Ｌ−アルギニンＳＲ）と、Ｍｏｎｔｉｆｆ（ロサンゼルス、ＣＡ）より購入した市販の即時放出Ｌ−アルギニンカプセル剤（Ｌ−アルギニンＩＲ）とを比較した。
【０１３９】
本試験の目標は、徐放性Ｌ−アルギニンの薬物動態パラメータを求めることである。下記の表Ｉに示すように、各薬物動態パラメータに対して行った対応のある両側ｔ検定からのｐ値に基づくと、ＣｍａｘおよびＴｍａｘについては治療間で統計上の有意差が認められた。予想通り、徐放性Ｌ−アルギニン錠剤では、即時放出カプセル剤に比べてＣｍａｘは低く（１４．９μｇ／ｍＬ対２４．１μｇ／ｍＬ）、Ｔｍａｘは長かった（４．４時間対１．４時間）。
【０１４０】
【表１】
2006514100.tif 000002
【実施例８】
【０１４１】
改良型徐放性Ｌ−アルギニン錠剤の製造
表ＩＩに、改良型徐放性錠剤を製造するために集めた成分、および各成分の使用量を示す。
【０１４２】
【表２】
2006514100.tif 000003
ステアリン酸マグネシウムを除く全ての成分を＃２０メッシュのスクリーンで選別した。ステアリン酸マグネシウムは＃３０メッシュのスクリーンで選別した。およそ半量のポビドン（ポリビニルピロリドン）を精製水に溶解し、造粒剤として取り置いた。Ｌ−アルギニンと残りのポビドンを４分間、Ｎｉｒｏ  ＰＭＡ  ６５高剪断造粒機にて乾式混合し、次いで造粒剤を噴霧して約６．５分間造粒した。次いで湿潤顆粒を、’３７５Ｑスクリーンを備えたＣｏＭｉｌ磨砕機で磨砕した。次いで磨砕後の顆粒をＡｅｒｏｍａｔｉｃ製Ｓ−２流動床乾燥機で３％以下のＬＯＤまで乾燥させた。次いで乾燥後の顆粒を、’０６２Ｒスクリーンを備えたＣｏＭｉｌで磨砕した。次いで、およそ半量の微結晶セルロースとコロイド状二酸化ケイ素とを８クォートＶ−ブレンダーで５分間、２５ｒｐｍにて配合し、２立方フィートＶ−ブレンダーへ移した。残りの微結晶セルロースとヒドロキシプロピルメチルセルロースも２立方フィートＶ−ブレンダーへ添加し、２０分間２５ｒｐｍにて配合した。次いで、ステアリン酸マグネシウムを２立方フィートＶ−ブレンダーへ添加し、５分間２５ｒｐｍにて配合した。最後に、表面が平滑な０．７４８”×０．３８０”の楕円形凸状の成形型を備えたマネスティー  ベータプレスを用いて配合物を圧縮し、１０００ｍｇの目標重量を有する錠剤とした。図６は本方法のフローの概略図である。
【０１４３】
製造プロセス時に標準的なインプロセス制御、試験および規格を使用することができ、本実施例に使用したものを下記の表ＩＩＩに示す。
【０１４４】
【表３】
2006514100.tif 000004
標準的な放出方法および規格を使用することができ、本実施例に使用したものを下記の表ＩＶに示す。
【０１４５】
【表４】
2006514100.tif 000005
さらに、上記の検討からは、本発明の徐放性Ｌ−アルギニン製剤にとって望ましい物理特性、例えば破砕性および含量均一性が明らかとなった。
【０１４６】
【表５】
2006514100.tif 000006
【実施例９】
【０１４７】
Ｌ−アルギニンＳＲ（シンバスタチン有り、なし）とシンバスタチン（Ｌ−アルギニンＳＲ有り、なし）の薬物動態の評価
Ｌ−アルギニンＳＲ（シンバスタチン有り、なし）とシンバスタチン（Ｌ−アルギニンＳＲ有り、なし）の薬物動態を検討した。実施例６のＬ−アルギニンＳＲ錠剤、およびＢｉｏＥｎｅｒｇｙ（ウォレン、ニュージャージー州）より購入した市販のシンバスタチン錠剤を使用した。
【０１４８】
表ＶＩに見られるように、各薬物動態パラメータに対して行った対応のある両側ｔ検定からのｐ値に基づくと、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−１０およびＴｍａｘについては治療間で統計上の有意差は認められなかった。表ＶＩＩに示すように、Ｌ−アルギニンＳＲは、シンバスタチンの単回投与薬物動態に対しては統計上有意な作用を及ぼさない。
【０１４９】
【表６】
2006514100.tif 000007
【０１５０】
【表７】
2006514100.tif 000008
【実施例１０】
【０１５１】
マウスの梗塞サイズに及ぼすシンバスタチンとＬ−アルギニンとの併用投与の効果
梗塞サイズに及ぼすシンバスタチンおよびＬ−アルギニン双方の投与の効果をマウスで検討した。マウスには、生理食塩溶液に図３に示す量で溶解したシンバスタチン、およびシンバスタチン＋Ｌ−アルギニンを含む腹腔注射剤を投与した。これらマウスの梗塞サイズの結果（対照群と比較）を図２および図３に示す。
【実施例１１】
【０１５２】
シンバスタチンとＬ−アルギニンとの併用の用量最適化
シンバスタチンとＬ−アルギニンとの併用投与の用量最適化をマウスで検討した。マウスには、図４に示すようにシンバスタチンおよびＬ−アルギニンのレベルを変えて注射した。本検討の結果も図４に示す。統計解析より、最適な併用範囲は１．２〜１．４ｍｇ／Ｋｇのシンバスタチンと約２０〜２５ｍｇ／ＫｇのＬ−アルギニンであると予測された。
【実施例１２】
【０１５３】
ＡＤＭＡレベルの上昇した患者では、シンバスタチンによる内皮依存性血管拡張の改善がＬ−アルギニン徐放性製剤との併用で亢進する
スタチン類は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは内皮ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現を刺激し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは内皮依存性のＮＯ介在型血管拡張を亢進する。非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）はｅＮＯＳの内在性競合阻害剤である。血漿ＡＤＭＡレベルの上昇には内皮機能不全が伴う。ＡＤＭＡの阻害作用がＬ−アルギニン徐放性製剤の補足によって解消される場合に限り、ＡＤＭＡが上昇した患者の内皮機能がシンバスタチンによって亢進されることが判明した。
【０１５４】
ＡＤＭＡレベルの上昇した１５名の臨床上無症状の年配被験者に、無作為順にて、シンバスタチン（４０ｍｇ／日）、実施例８に記載の通り調製したＬ−アルギニン徐放性製剤（３ｇ／日）または両者の組み合わせを、それぞれ３週間、治療間に少なくとも３週間のウォッシュアウト期間を設けた３期クロスオーバーデザインにて投与した。内皮依存性の血管拡張は、コンピュータ援用画像解析を用いて上腕動脈の超音波診断により評価し、ＡＤＭＡおよびＬ−アルギニンの血漿濃度は、認可されているＨＰＬＣ法により求めた。
【０１５５】
試験終了後の１５名の患者を解析したところ、徐放性Ｌ−アルギニン単独またはシンバスタチンとの併用のいずれにおいても、内皮依存性血管拡張の割合が治療前の測定値から上昇したことが判明した。併用によって、内皮依存性血管拡張の治療前の割合からの変化が、シンバスタチン単独（ｐ＜０．０２５）の場合の変化に比べ、３．８７％と顕著に増加した。内皮依存性血管拡張の割合の変化は、併用した場合と徐放性Ｌ−アルギニン単独の場合との間でその差は小さかった。ニトログリセリンによる内皮非依存性の血管拡張は、いずれの治療にも影響されなかった。Ｌ−アルギニン徐放性製剤は、単独またはシンバスタチンとの併用のいずれの場合でも、血漿Ｌ−アルギニン／ＡＤＭＡ比を顕著に改善した（それぞれ、ベースライン８２．３±４．０に対し、１０２．８±９．２および１０２．６±１０．８、各々ｐ＜０．０５）。これらの結果を図８にまとめる。
【０１５６】
シンバスタチンは、ＡＤＭＡレベルの上昇によってｅＮＯＳがブロックされた被験者では内皮機能を亢進しないが、シンバスタチンと経口Ｌ−アルギニン徐放性製剤との併用は、内皮機能に対して相乗作用を示す。ＮＯ介在型の作用はスタチン類の治療効果において主要な役割を果たすと考えられるため、Ｌ−アルギニン徐放性製剤との併用は、ＡＤＭＡ濃度が上昇した患者において考慮すべきものである。
【実施例１３】
【０１５７】
シンバスタチンとＬ−アルギニン徐放性製剤との併用治療によるコレステロールレベルの改善
実施例１２に記載の試験において、総コレステロール（ＴＣ）、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪の変化を治療の前後で分析した。本分析の結果を図９に示す。結果から明らかなように、本発明の徐放性Ｌ−アルギニンとシンバスタチンとの同時投与により、シンバスタチンの単独投与よりも大幅に、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよび中性脂肪が低下し、ＨＤＬコレステロールが増加する。
【実施例１４】
【０１５８】
ＨＰＬＣによる徐放性アルギニンＨＣｌ  ５００ｍｇ錠剤におけるアルギニンＨＣｌの溶解放出の測定
移動相を以下のように調製した。まず、約０．９ｇの１−ペンタンスルホン酸ナトリウム塩一水和物および３．５ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物を適当な容器に計り取り、１リットルのｐＨ３．３緩衝溶液を調製した。約１００ｍＬの脱イオン水を添加して溶解した。リン酸を添加してｐＨを３．３に調整した。続いて、８５０ｍＬのｐＨ３．３緩衝液を１５０ｍＬのメタノールと合わせて適当な容器に入れ、混合した。混合物を０．４５μｍのナイロンメンブランフィルターで濾過した。最後に、混合物を使用前に脱気した。
【０１５９】
溶解媒体（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）を以下のように調製した。まず、２０．０ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨをピペットで１０００ｍＬメスフラスコへ取り、脱イオン水で希釈して０．２ＭのＮａＯＨを調製した。続いて、５４．４４ｇのリン酸二水素カリウム無水物を適当な容器に計り取り、２０００ｍＬの脱イオン水で溶解および希釈した。８９６ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨを前記容器へ添加し、脱イオン水で８０００ｍＬに希釈した。最後に、混合物を使用前に脱気した。
【０１６０】
溶解サンプルを以下のように調製した。６錠のアルギニンＨＣｌ  ５００ｍｇ錠剤（実施例８に記載の通りに調製）の重量を測定した。各錠剤を９００ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）と共にステンレス鋼製のシンカーへ入れた。続いて、前記シンカーをＵＳＰ装置２（パドル）の容器へ投入し、直ちに７５ｒｐｍにて約３７℃±０．５℃で回転させた。前記容器から溶液１０ｍＬを１、２、４、６、８、１０、１２および１４時間の時点で抜き取り、各時点でそれぞれの溶解分析を行った。これらのサンプル溶液の各々を０．４５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターで濾過した。濾液を分析用ＨＰＬＣバイアルに採取した（但し、最初の１〜２ｍＬは廃棄）。１０μｍの全流式フィルターを使用して、予め３７℃±０．５℃に温めた１０ｍＬの溶解媒体を各サンプリング時点後に溶解容器へ戻した。実験者は、サンプル溶液が室温では最大１日安定であり、４℃では最大３日間安定であることを認めたはずである。
【０１６１】
アルギニンＨＣｌの標準溶液を以下のように調製した。２８±２ｍｇのアルギニンＨＣｌ標準品を５０ｍＬメスフラスコに正確に計り取った。前記標準品を溶解媒体で溶解し、所定の容量へ希釈した。
【０１６２】
ＨＰＬＣは、ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を用い、２１０ｎｍのＵＶにて検出して行った。前記カラムの温度を周囲温度に設定した。一般に、運転時間は９分、注入量は１０μＬ、流速は０．８ｍＬ／分、移動相は上述の通り調製したｐＨ３．３緩衝液／メタノール（８５／１５、ｖ／ｖ）とした。
【０１６３】
各試験を以下のように進めた。溶解媒体を１回注入した後、アルギニンＨＣｌ標準溶液を５回連続して注入し、最後に各サンプル溶液を１回ずつ注入した。サンプルを６回注入するたびに、および、一連の運転の最後にアルギニンＨＣｌ標準溶液を再度注入した。運転全体における系の変動（ｄｒｉｆｔ）（即ち、アルギニンＨＣｌ標準溶液の５回連続注入時の平均値と比較した標準溶液の回収率）は、約９７％〜約１０３％となるはずである。
【０１６４】
アルギニンの放出率を求める際には、実験者は、使用標準溶液を注入した際のアルギニンＨＣｌピークのＵＳＰテーリング（trailing）ファクター（Ｔ）が２未満となるよう注意しなければならない。Ｔは以下のように算出する：
Ｔ＝Ｗ．０５／２ｆ
式中、Ｗ．０５はベースラインから５％のピーク高におけるアルギニンＨＣｌピークのピーク幅であり、ｆはピークの極大からピークの立ち上りまでの距離であり、前記距離はベースラインから５％のピーク高の地点で測定。
【０１６５】
アルギニンＨＣｌの放出率は以下のように算出する：
【０１６６】
【数１】
2006514100.tif 000009
式中、ｎは測定回数の総数であり、Ｖｒは各測定のための溶解媒体の容量（１０ｍＬ）であり、Ｖは溶解媒体の初期容量（９００ｍＬ）であり、Ｃｓは使用標準溶液中のアルギニンＨＣｌの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、Ｃｉは各サンプル溶液中のアルギニンＨＣｌの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり（ここで、ｉ＝ｌ〜ｉ＝ｎ−１である）、Ｒｕはサンプル溶液より得られたアルギニンＨＣｌピークのピーク面積応答であり、Ｒｓは使用標準溶液の連続注入より得られたアルギニンＨＣｌピークの平均ピーク面積応答であり、ＬＣはアルギニンＨＣｌの表示量（５００ｍｇ）である。
【０１６７】
放出率を１、２、４、６、８、１０、１２および１４時間の時点で算出した。表ＶＩおよび表ＶＩＩＩに各種溶解試験の結果をまとめる。
【０１６８】
【表８】
2006514100.tif 000010
【実施例１５】
【０１６９】
シンバスタチンによるｅＮＯＳ発現の調節
下記のプロトコールを使用して、シンバスタチンに依存するｅＮＯＳ機能の増加機構を培養ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を用いて検討し、ｅＮＯＳ機能のアップレギュレーションにおいて、タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成と、タンパク質の移動または活性化とを区別した。
【０１７０】
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ−ｃ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ウォーカーズビル、メリーランド州）を下記の手順に従って培養した。ＥＢＭ−２／ＥＧＭ−２培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中の内皮細胞を約８０％〜約９０％コンフルエントになるまで増殖させた。各フラスコの細胞を５ｍｌの培地で洗浄した後、１５ｍｌの培地を各細胞へ添加した。細胞をセルスクレーパーで剥し、５０ｍｌのコニカルチューブに移した。細胞を８００ＲＭＰで８分間遠心分離してペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを冷１×ＰＢＳで洗浄した。
【０１７１】
細胞を以下のようにホモジナイズした。前記ペレットをほぐし、４００μｌの１０×ホモジナイゼーション緩衝液（ｐＨ７．４の２５０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＥＧＴＡ）を添加した。２７Ｇの針を用いて約１０回サンプルをホモジナイズした。ホモジネートを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。続いてペレットを３０〜４５μｌの１×ホモジナイゼーション緩衝液中に再懸濁した。
【０１７２】
細胞を以下のようにアッセイした。適切なサイズのカラム中でＲｅｓｉｎ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（バイオ・ラッドラボラトリーズ、ハーキュリーズ、ＣＡ）をベッド体積の５倍の０．５Ｎ  ＮａＯＨで洗浄することにより、樹脂スラリーを調製した。カラムを２０倍容量の水で洗浄した。樹脂を停止／平衡化緩衝液（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）にて、溶出液が停止／平衡化緩衝液の０．０５ｐＨ単位に収まるまで平衡化させた。得られた溶液を４℃にて、停止／平衡化緩衝液の５０％スラリーとして保存した。さらに、６０２μｌのトリスを予め重量を測定したＮＡＤＰＨの５ｍｇバイアルへ添加することにより、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に溶解した新鮮な１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨを調製した。０．０６９ｍｇのカルモジュリンを４．１ｍＬの水に添加することにより、１μＭのカルモジュリン溶液を調製した。８μＭのＣａＣｌ水溶液も同様に調製した。５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、６μＭ  ＢＨ４、２μＭフラビンアデニンジヌクレオチドおよび２μＭフラビンアデニンモノヌクレオチドを合わせることにより、２×反応緩衝液を調製した。続いて、２５μｌの２×反応緩衝液、５μｌの１０ｍＭ  ＮＡＤＰ、５μｌの８ｍＭ  ＣａＣｌ２、４μｌのカルモジュリン溶液および１μｌの１４Ｃアルギニンを合わせることにより、各サンプルにつき反応混合物を調製した。４０μｌの反応混合物と５μｌのサンプルまたは対照を１．５ｍｌの遠心管中で合わせた。前記遠心管を１時間３７℃でインキュベートした。
【０１７３】
まず、１ｍｌピペットの先端を切り落として先端の最小直径を広げることにより、カラムを作製した。２５０μｌの樹脂スラリー（上述の通りに調製）を各カラムへピペットで移した（フィッシャーサイエンティフィック社、Ｇｌｅｎｌａｋｅ、ＩＬ）。カラムを４００μｌの停止／平衡化緩衝液（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）で２回洗浄した。
【０１７４】
インキュベーション後、約４００μｌの停止／平衡化緩衝液（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）を各サンプルおよび対照へ添加した。この混合物の４００μｌを平衡化の終わったカラムへ添加した。各カラムを４００μｌの停止／平衡化緩衝液で洗浄した。４００μｌのカラム溶出液を、４ｍｌのシンチレーション液を入れたシンチレーションバイアルへ移した。得られた溶液をボルテクサー上で十分に混合した。シンチレーションカウンター（βカウンター、ベックマン・コールター社、フラートン、カリフォルニア州）を使用して所望のカウントを得た。バックグラウンド（緩衝液対照）を各サンプルから差し引いたりして結果を計算した。サンプル値は、毎分当たりのカウントまたは未処理細胞に対する割合として示す。
【０１７５】
標識Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリンへの変換より相対的なｅＮＯＳ機能を測定し、非処理細胞で産生されたシトルリンに対する割合として示した。図１０には、ｅＮＯＳ機能の測定に先立ちＨＡＥＣを１．０または０．３μＭのシンバスタチンと共に２４時間インキュベートした実験のデータを示す。未処理細胞を同時に培養し、これを利用して相対的なｅＮＯＳ機能を計算した。図１０から、培養内皮細胞におけるｅＮＯＳ機能のレベルがシンバスタチンによって上昇することが明らかである。
【０１７６】
データを総合したところ、シンバスタチンが内皮細胞におけるｅＮＯＳの発現および機能に作用することが明らかである。ｅＮＯＳ機能のアップレギュレーションにおいてタンパク質合成が必要であること、ｅＮＯＳに特異的なｍＲＮＡと機能の双方がシンバスタチンによって増加することは、ｅＮＯＳ遺伝子転写の薬物によるモジュレーションのモデルと整合している。
等価事例
当業者であれば、通常の実験の範囲内で、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に相当する多くの等価事例を認識し、確認することが可能である。このような等価事例は特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、Ｌ−アルギニンおよびシンバスタチンを含む製剤の放出パターンを表したグラフである。
【図２】図２は、未処置マウス脳と対比した、Ｌ−アルギニンおよびシンバスタチンで処置したマウス脳における梗塞サイズのＮＭＲ画像の写真である。
【図３】図３は、Ｌ−アルギニン、シンバスタチン、Ｌ−アルギニンおよびシンバスタチンの双方で処置したマウスにおける梗塞体積を表した棒グラフである。
【図４】図４は、Ｌ−アルギニンおよび各種レベルのシンバスタチンで処置したマウスにおける総梗塞体積を表した棒グラフである。
【図５】図５は、徐放性Ｌ−アルギニン錠剤の製造方法を表したフローチャートである。
【図６】図６は、徐放性Ｌ−アルギニン錠剤の製造方法を表したフローチャートである。
【図７】図７は、徐放性Ｌ−アルギニン製剤の性能を比較した棒グラフである。
【図８】図８は、シンバスタチンを本発明の徐放性Ｌ−アルギニン組成物と併用して、および併用しないで投与した際の、ヒトの内皮依存性血管拡張に及ぼす作用を比較したチャートである。
【図９】図９は、ヒトのコレステロールレベルに及ぼす、シンバスタチンと本発明の徐放性Ｌ−アルギニン組成物との相乗作用をまとめたチャートである。
【図１０】図１０は、培養ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）に及ぼすシンバスタチンの効果を未処理培養ＨＡＥＣと比較して示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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