(57)【要約】  天然資源からのプロテオグリカンの回収を、効率的かつ安価に行う方法を提供する。プロテオグリカンを含有する生物学的試料を0.0025N〜0.1Nのアルカリ溶液に浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。本発明は、従来の抽出方法に比べ、プロテオグリカンを未変成、未分解の状態で簡便かつ短時間で回収することができ、プロテオグリカンの製造コストを大きく減ずることができる。また、本発明の方法は、本来廃棄処分とされてきた魚類、鳥類及び哺乳類などの廃棄部位から産業上有用性の高いプロテオグリカンを回収することができ、産業廃棄物の有効利用並びに産業廃棄物自体の減量化にも貢献することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料を０．００２５Ｎ〜０．１Ｎのアルカリ溶液に浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。
【請求項２】
回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項３】
アルカリ溶液がアルカリ金属塩の溶液である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の製造方法。
【請求項４】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維又は皮である、請求の範囲第１項〜第３項の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である、請求の範囲第４項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品原料、医療用品材料、化粧品原料、食品材料、工業用材料等として有用なプロテオグリカンを、プロテオグリカンを含有する生物学的試料、例えば魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織から抽出し、製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、1本のコアタンパク質に数本から数十本の直鎖状の糖鎖が共有結合してなる、非常に複雑かつ多種の構造を有する糖タンパク質の総称であり、軟骨組織に存在するプロテオグリカンに含まれる糖鎖の代表的なものがコンドロイチン硫酸である。【０００３】
コンドロイチン硫酸は、保湿性、生体適合性あるいは潤滑性に優れる等の高い有用性から産業上注目されている成分であり、天然資源からの効果的な回収、製造法が種々開発されている。【０００４】
軟骨組織においては、コンドロイチン硫酸はそれ自体単独では存在せず、タンパク質との複合体すなわちプロテオグリカンの形で存在している。しかし、プロテオグリカンをそのまま抽出することは糖タンパク質複合体という複雑な構造故に困難な場合が多く、そのためプロテオグリカンのコアタンパク質部分を徹底的に分解してコンドロイチン硫酸だけを抽出しようという方法が主に採用されてきた。この方法の製造物はコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類である。【０００５】
一方、コンドロイチン硫酸としてではなく、プロテオグリカンそのままを回収、製造し利用する試みもなされている。特に、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織には、コンドロイチン硫酸を主要糖鎖とするプロテオグリカンが含まれている一方、これらの軟骨組織は通常廃棄処分となっていたことから、廃棄物の有効利用を兼ねた軟骨組織からのプロテオグリカンの製造法が幾つか提唱されている。【０００６】
例えば、サケ鼻軟骨からグアニジン塩酸を用いてプロテオグリカンを抽出する方法（特許文献１）や酢酸を用いる方法（特許文献２）等の方法が報告されている。しかしこれまでの方法は、いずれも抽出、精製コストが高く、残念ながら未だ実用化のレベルに達しているとは言えない。
【特許文献１】特開2001−172296号公報
【特許文献２】特開2002−69097号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、魚類、軟体動物、鳥類又は哺乳類、特にそれらの廃棄部位から低コストで経口摂取可能なプロテオグリカンを製造する方法の開発を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本来タンパク質及びタンパク質複合体の回収、製造には不適であったアルカリ溶液を一定の条件下で使用することにより、糖タンパク質複合体であるプロテオグリカンを効率よく軟骨組織その他のプロテオグリカンを含有する生物学的試料から回収することができることを見出し、下記の各発明を完成した。【０００９】
（１）プロテオグリカンを含有する生物学的試料を0.0025N〜0.1Nのアルカリ溶液に浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。【００１０】
（２）回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、（１）に記載の製造方法。【００１１】
（３）アルカリ溶液がアルカリ金属塩の溶液である、（１）又は（２）に記載の製造方法。【００１２】
（４）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維又は皮である、（１）〜（３）の何れかに記載の製造方法。【００１３】
（５）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である、（４）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、従来の抽出方法に比べ、プロテオグリカンを未変成、未分解の状態で簡便かつ短時間で回収することができ、プロテオグリカンの製造コストを大きく減ずることができる。また、本発明の方法は、本来廃棄処分とされてきた魚類、鳥類及び哺乳類などの廃棄部位から産業上有用性の高いプロテオグリカンを回収することができ、産業廃棄物の有効利用並びに産業廃棄物自体の減量化にも貢献することができる。【００１５】
また、本発明では、組織内に内包しているタンパク質分解酵素を失活させるためのタンパク質分解酵素阻害剤（インヒビター）の添加を必ずしも必要としない。かかるインヒビターの効果は全てのタンパク質分解酵素に有効ではない上に、インヒビター自身が人体に有害なものが多く、食品材料としてのプロテオグリカンを製造するに当たり、インヒビターを使用することは好ましくないが、本発明はインヒビターを必要とはせず、従って上記の問題を回避することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、一般に熱やアルカリに不安定なタンパク質を含むプロテオグリカンを、本来禁忌とされてきたアルカリ溶液を用いるという発想の下に抽出、製造する方法である。【００１７】
プロテオグリカンは糖質とタンパク質の複合体であるが、コアタンパク質とそのタンパク質に結合している糖鎖の結合力が弱く、簡単に分離してしまう性質を有している。そのため、その抽出や精製は一般に極めて困難であり、タンパク質だけからなるコラーゲンや糖質だけからなるコンドロイチン硫酸などの抽出とは異なる注意が必要である。このため、従来技術は、工程が複雑になる、あるいは手作業を伴う部分が多いなど、大量生産に向かないものであった。【００１８】
また、一般にタンパク質は熱や酸、特にアルカリに対して不安定であり、容易に変成、分解してしまうという性質を有している。この性質を利用し、タンパク質を積極的にアルカリを用いて分解する方法は知られているが、糖タンパク質複合体であるプロテオグリカンをタンパク質部分の分解を防ぎながらアルカリで抽出することは知られていない。【００１９】
本発明は、プロテオグリカンを含む生物学的試料、例えば魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維又は皮に対して適用することができるが、軟骨組織への適用が好ましい。本発明において使用される軟骨組織は、魚類、鳥類及び哺乳類、特にそれらの廃棄部位のいずれも利用することができる。本発明において軟骨組織とは、軟骨単独あるいは軟骨の周辺部位、例えば骨、筋肉繊維、皮等を含む組織のいずれも意味する。【００２０】
本発明においては、特に一般に氷頭とよばれている、サケの頭部にその平均重量で約６％含まれている鼻軟骨組織の利用が好ましい。北海道沿岸部で漁獲されたサケ（大半はシロサケである。）が、様々な加工品として処理される際、その頭部は不要とされることが多く、そのため切断された頭部は、一部魚粉に加工され利用されてはいるものの、その大半は産業廃棄物として廃棄処理されている。氷頭はその様な廃棄物から簡便、安価かつ安定的に入手することができる。【００２１】
また本発明では、氷頭の他、エイの軟骨組織、サメの軟骨組織等の魚類由来の軟骨組織、ニワトリの軟骨組織等の鳥類の軟骨組織、さらにはウシの喉軟骨や気管支軟骨、クジラの軟骨等の哺乳動物由来の軟骨組織も利用することができる。さらに、軟体動物であるイカやタコの表皮にもプロテオグリカンが存在することが知られており、これら軟体動物の表皮等も本発明で利用することができる。特に、スルメイカの表皮には硫酸を殆ど含まないコンドロイチン・タンパク質複合体が存在しており、またコンドロイチンはスルメイカ表皮中のムコ多糖の70％以上を占めることが報告されている（須山ら他共著、「イカの利用」、1980年11月発行、第93頁、恒星社）ことから、スルメイカの表皮は本発明におけるプロテオグリカンを含む生物学的試料の一例として有用である。上記のプロテオグリカンを含む生物学的試料の多くも産業廃棄物であり、その入手は容易である。これらの原料は、次に説明するアルカリ溶液への浸漬に先だって、表面積を増加させてプロテオグリカンの抽出量を上げるために、可能な限り細かく破砕することが好ましい。【００２２】
本発明で使用するアルカリ溶液は、アルカリ金属またはその塩の水溶液、アルカリ土類金属又はその塩の水溶液などを適宜使用することができるが、プロテオグリカンの抽出効率、後処理の簡便さ等から、アルカリ金属の水溶液、苛性ソーダ（ＮａＯＨ）、重曹、炭酸カルシウム、苛性カリの使用が好ましく、特に苛性ソーダの使用が好ましい。【００２３】
アルカリ溶液の濃度は、0.0025N〜0.1N、好ましくは0.01N〜0.05Nである。0.0025N〜0.01Nのアルカリ溶液を用いた場合の浸漬時間は、９時間以上とすることが好ましい。また、0.01N〜0.05Nのアルカリ溶液を用いる場合の浸漬時間は９時間程度とすることが好ましい。さらに0.05N〜0.1Nのアルカリ溶液を用いる場合の浸漬時間は９時間以下とすることが好ましい。また、0.01N〜0.1Nのアルカリ溶液を用いる場合には、抽出時間を２時間程度とすることで、プロテオグリカンのコアタンパク質の分解を抑制することも可能である。これらの条件により、より高分子のプロテオグリカンを回収、製造することができる。【００２４】
アルカリ溶液への軟骨組織の浸漬は、０℃〜室温、好ましくは０℃〜10℃、より好ましくは０℃〜４℃で行う。特に、浸漬温度を０℃〜４℃とすることにより、プロテオグリカンは殆ど分解されず、高分子の糖タンパク質複合体として抽出することができる。【００２５】
浸漬は、軟骨１重量部に対してアルカリ溶液２〜15重量部、好ましくは４〜12重量部、より好ましくは６〜12重量部を用いて行えばよい。好ましくは、ミキサーあるいはスターラーなどを用いて攪拌しながら浸漬する。【００２６】
軟骨組織からのプロテオグリカンの抽出は、例えばガランボス法（Johnら、ANALYTICAL BIOCHEMISTRY、1967年、第19巻、第119-132頁）によってウロン酸量を検出ないし定量することでモニターすることができるが、その他公知の方法によってウロン酸を検出し、モニターしてもよい。【００２７】
浸漬が終了したアルカリ溶液は、プロテオグリカンを抽出した後の残渣を多く含むので、これらを濾過、遠心分離その他の方法で取り除くことが好ましい。プロテオグリカンを含む抽出液はそのまま製品として利用してもよいが、プロテオグリカンの各種用途に対して求められる純度にまで適当な方法でプロテオグリカンを分離ないし精製することが好ましい。【００２８】
本発明において、プロテオグリカンの精製方法としては格別の方法を要するものではないが、好ましい方法として遠心分離法を挙げることができる。遠心分離操作によって、細かい固形物を沈殿残渣として、原料由来の油脂分を上面浮遊物として、それぞれ簡便に除去することができる。【００２９】
また、遠心分離法によって回収されるプロテオグリカンを含む液相を、さらにフィルターペーパーあるいは適当な分画分子量を有する限外濾過膜分離装置などを用いて濾過してもよい。排除分子量としては概ね５万〜100万の範囲であればよい。この操作において、分画分子量50万以上のものを使用すれば、液相からコラーゲンも除去することができ、プロテオグリカンの純度を上げることが可能である。また、プロテオグリカンを含む液相に水を加えて液相の粘度を下げることで、膜の通過を容易にするとともに、これを繰り返すことで、わずかに生じる魚臭を除去することも可能である。【００３０】
さらに、得られた濃縮液を食塩飽和エタノールに加えることで、ゲル状のプロテオグリカンを回収することもできる。このゲル状プロテオグリカンは真空凍結乾燥機を用いて固形物にしてもよい。あるいは、スプレードライヤーで乾燥させ、粉末状固形物とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】苛性ソーダならびに酢酸を用いたときのプロテオグリカンの回収量を示す図である。
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
−40℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものを200.00ｇ用意し、出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ０℃に冷却しておいた蒸留水2397.60ｇを入れ、さらに固形のカセイソーダ2.40ｇを投入し、総量2400.00ｇ（0.025N）のカセイソーダ水溶液を準備した。この抽出用容器に出発原料200.00ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００３４】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００３５】
抽出液をIWAKI CFS-400型の遠心分離機を用いて3500rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００３６】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  PREP/SCALE TFF膜（分画分子量１０万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００３７】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、200.00ｇの出発原料から、換算値でその3.32％に相当する6.64ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００３８】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。【００３９】
さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００４０】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質25.0％、灰分21.5％、炭水化物52．9％、脂質0.6％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約７.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、炭水化物が約52.9％であることから計算して、純度は約57％と推定される。またプロテオグリカンの分子量は約220万であった。【００４１】
上記の実施例に示す操作において、カセイソーダ溶液の濃度を0.0025Ｎ、0.025N、0.05Nに変えて、また苛性ソーダを0.666Nの酢酸に変えて24時間浸漬、抽出を行ったときのプロテオグリカンの回収量（ウロン酸量）の経時変化を調べた結果を図１に示す。【００４２】
＜実施例２＞
−40℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を通風又は減圧乾燥したもの24.00ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水2997.75ｇを入れ、さらに固形のカセイソーダ2.25ｇを投入し、総量3000.00ｇ（0.02Ｎ）のカセイソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料24.00ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００４３】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、鼻軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００４４】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００４５】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００４６】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、24.00ｇの出発原料から、換算値でその30.29％に相当する7.50ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００４７】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００４８】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質11.8％、灰分18.4％、炭水化物67.8％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝91.1％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約120万であった。【００４９】
＜実施例３＞
−40℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を通風又は減圧乾燥したもの17.90ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水2322.67ｇを入れ、さらに固形の苛性カリ2.33ｇを投入し、総量2325ｇ（0.018Ｎ）の苛性カリ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料17.90ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００５０】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、鼻軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００５１】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００５２】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００５３】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、17.90ｇの出発原料から換算値でその29.61％に相当する5.29ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００５４】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００５５】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質14.0％、灰分22.4％、炭水化物63.6％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝87.7％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約120万であった。【００５６】
＜実施例４＞
国内産鶏ヤゲン軟骨から手作業で肉片を除去した後、電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鶏ヤゲン軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を通風又は減圧乾燥したもの44.40ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水2997.75ｇを入れ、さらに固形の苛性ソーダ2.25ｇを投入し、総量3000.00ｇ（0.02Ｎ）の苛性ソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料44.40ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００５７】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００５８】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００５９】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００６０】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、44.40ｇの出発原料から換算値でその22.23％に相当する9.87ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００６１】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００６２】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質31.3％、灰分16.9％、炭水化物51.8％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝66.7％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約92万（16％）及び約46万（84％）であった。【００６３】
＜実施例５＞
ガンギエイ（カスベ）から手作業で摘出した軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を通風又は減圧乾燥したもの12.00ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水1678.74ｇを入れ、さらに固形の苛性ソーダ1.26ｇを投入し、総量1680.00ｇ（0.02Ｎ）の苛性ソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料12.00ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００６４】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００６５】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００６６】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００６７】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、12.00ｇの出発原料から換算値でその17.92％に相当する2.15ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００６８】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００６９】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質43.5％、灰分19.5％、炭水化物37.0％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝49.2％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約170万であった。【００７０】
＜実施例６＞
サメから手作業で摘出した軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、脱脂及び脱水を行った。処理後の軟骨を通風又は減圧乾燥したもの12.00ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水1678.74ｇを入れ、さらに固形の苛性ソーダ1.26ｇを投入し、総量1680.00ｇ（0.02Ｎ）の苛性ソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料12.00ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００７１】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００７２】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００７３】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００７４】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、12.00ｇの出発原料から換算値でその11.36％に相当する1.36ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００７５】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００７６】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質37.8％、灰分27.4％、炭水化物37.8％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝55.7％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約150万であった。【００７７】
＜実施例７＞
スルメイカ（真イカ）の表皮を手作業で剥離した後、アセトンに浸漬し、脱脂及び脱水を行った。処理後の表皮を通風又は減圧乾燥した後、はさみで細かく切断し、すり鉢で粉状に粉砕して乾燥表皮を調製した。10リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水5036.20ｇを入れ、さらに固形の苛性ソーダ3.80ｇを投入し、総量5040ｇ（0.02Ｎ）の苛性ソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に乾燥表皮33.70ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。【００７８】
浸漬終了後、内容物を1ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、表皮を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。【００７９】
抽出液を日立himacCF7D2型の遠心分離機を用いて3000rpm、20分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。【００８０】
さらに、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製  BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE（分画分子量10万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。【００８１】
得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（YAMATO  DX401）により、105℃、16時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ&D社  GF−400）で精密に測定した。その結果、33.70ｇの乾燥表皮から、その47.7％に相当する16.10ｇの乾燥固形分を得ることができた。【００８２】
また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、L-8500 Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。さらに高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムTSK-GEL G4000PWXL）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。【００８３】
これらの分析の結果、固形分中にタンパク質91.7％、灰分1.9％、炭水化物6.4％、脂質0.0％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約7.0％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンの推定純度は（炭水化物×0.07＋脂質）／（炭水化物＋タンパク質＋脂質）×100＝7.0％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約170万であった。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料を０．００２５Ｎ〜０．０５Ｎのアルカリ溶液に０〜１０℃で浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。
【請求項２】
回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項３】
アルカリ溶液がアルカリ金属塩の溶液である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の製造方法。
【請求項４】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維又は皮である、請求の範囲第１項〜第３項の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である、請求の範囲第４項に記載の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料を０．００２５Ｎ〜０．０５Ｎのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の溶液に０〜１０℃で浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。
【請求項２】
回収した溶液からプロテオグリカンを分離する工程をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項３】
溶液がアルカリ金属塩の溶液である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の製造方法。
【請求項４】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維又は皮である、請求の範囲第１項〜第３項の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である、請求の範囲第４項に記載の製造方法。
【国際調査報告】
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