(57)【要約】アンチコドンにＣＵＡ又はＣＣＣＧを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡであって、終結因子と競合することなく、非天然アミノ酸を高効率でタンパク質に導入することができるｔＲＮＡの提供を目的とする、５’末端がＧであり、該５’末端のＧに対合する塩基がＣであり、該Ｃの３’側に隣接する塩基がＡであるトリプトファン用ｔＲＮＡ変異体であって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体または３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基が挿入された、アンチコドンとしてＣＵＡまたはＣＣＣＧを有し終止コドンまたは４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体であって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２】
５’末端がＧであり、該５’末端のＧに対合する塩基がＣであり、該Ｃの３’側に隣接する塩基がＡである請求項１記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項３】
５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目である請求項２記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項４】
原核細胞由来のｔＲＮＡである請求項１〜３のいずれか１項に記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項５】
大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡである請求項４記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡ変異体であって、終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項７】
３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項１〜６のいずれか１項に記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項８】
５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目であり、さらに５’末端から７４番目にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項７記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項９】
アミノ酸でアミノアシル化された請求項１〜８のいずれか１項に記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１０】
アミノ酸が非天然アミノ酸、修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体である、請求項９記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１１】
アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される請求項１０記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１２】
アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１３】
タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のｍＲＮＡであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンが終止コドンであるｍＲＮＡおよび請求項１〜１２のいずれか１項に記載の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体を用い、終止コドンに該ｔＲＮＡ変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
【請求項１４】
アンチコドンとして４塩基からなる配列を有し、４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体であって、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１５】
アンチコドンとしてＣＣＣＧを有し、４塩基コドンＣＧＧＧに対合する請求項１４に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１６】
フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体である請求項１４または１５に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１７】
酵母由来のｔＲＮＡである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１８】
配列番号４０で表される塩基配列からなる酵母由来のｔＲＮＡ変異体であって、４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１９】
アミノ酸でアミノアシル化された請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２０】
アミノ酸が非天然アミノ酸、修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体である、請求項１９記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２１】
アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される請求項２０記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２２】
アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２３】
タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のｍＲＮＡであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンが４塩基コドンであるｍＲＮＡおよび請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体を用い、４塩基コドンに該ｔＲＮＡ変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
【請求項２４】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
１つの４塩基コドンおよび１つの終止コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンおよび終止コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合したアミノ酸および請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｔＲＮＡ変異体が結合したアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法。
【請求項２５】
４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体である請求項２４記載のタンパク質の製造方法。
【請求項２６】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識アミノ酸等の非天然アミノ酸をタンパク質に導入するためのｔＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
機能性基を蛋白質表面に導入する場合、一般に用いられるのが蛋白質の特定残基への化学修飾である。この化学修飾は簡単であり、一度に多数の特定の残基を修飾できるというメリットがある反面、修飾部位および／または修飾数の制御の再現性という点では優れた結果が得られ難いという課題もある。近年の遺伝子工学の発展により、蛋白質中のアミノ酸残基の置換が可能となり、蛋白質合成系を改変することで、アミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸を蛋白質中に導入することが可能となり、機能性基を担持する蛋白質を再現性よく合成することが可能となった。
蛋白質合成においてアミノ酸はまずｔＲＮＡの３’末端に結合し、次に蛋白質合成の場であるリボソームへ運ばれる。リボソームではコドンからアミノ酸への翻訳が行われる。非天然型アミノ酸を結合させたｔＲＮＡを用いることによって非天然型アミノ酸を蛋白質に組み込むことができる。
非天然アミノ酸をタンパク質へ導入する方法として、導入したい部位のコドンを終止コドンＵＡＧに置換しておき、アンチコドンにＣＵＡを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡ存在下で翻訳する方法がある（非特許文献１から４参照）。これら方法において、ｔＲＮＡとして酵母フェニルアラニン用ｔＲＮＡ（非特許文献１および２参照）、大腸菌アスパラギン用ｔＲＮＡ、デトラヒメナグルタミン用ｔＲＮＡ（非特許文献３参照）、大腸菌グリシン用ｔＲＮＡ（非特許文献４参照）などが用いられていた。
しかし、アンチコドンにＣＵＡを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡは、ＵＡＧを翻訳する際に終結因子と競合するため、非天然アミノ酸の導入の効率は高くなかった。
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ．１８２．１９８９
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，８３−８８，１９８９
【非特許文献３】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３，１０３３−１０３８，１９９６
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，ｐ．８０１３，１９８９
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、アンチコドンにＣＵＡを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡであって、終結因子と競合することなく、非天然アミノ酸を高効率でタンパク質に導入することができるｔＲＮＡの提供を目的とする。
本発明者は、終止コドンＵＡＧを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に効率良く導入することのできるｔＲＮＡを種々の生物種由来のｔＲＮＡの中から探索し、Ｔｒｐ用のｔＲＮＡであってアンチコドンにＣＵＡを持つものが効率良く導入できることを見い出した。また、それを改変して、Ｔｒｐ用のｔＲＮＡであってアンチコドンにＣＵＡを持ち、５’にＧを持ち、その５’のＧに対合する塩基（通常は７２番と定義される）がＣでその次の塩基がＡであるものが、より効率良く導入でき、かつ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による天然アミノ酸の付加を受けないことを見い出した。さらにこれらのｔＲＮＡのうち、ＧＧＧＡＧＡＧＵＡＧ  ＵＵＣＡＡＵＧＧＵＡ  ＧＡＡＣＧＵＣＧＧＵ  ＣＵＣＵＡＡＡＡＣＣ  ＧＡＧＣＧＵＵＧＡＧ  ＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣ  ＣＵＵＵＣＵＣＵＣＣ  ＣＡＣＣＡ（配列番号１）の配列を有するマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）Ｔｒｐ  ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）が最も適していることを見い出した。これらに加えて、ｔＲＮＡの３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入することによって、非天然アミノ酸の導入効率を向上させることができることを見い出した。本発明は、以上のｔＲＮＡを用いることで終結因子との競合する場合でも非天然アミノ酸を効率良く導入することができるよう、上記課題を解決したものである。
すなわち、本発明の以下のとおりである。
［１］  トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体であって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［２］  ５’末端がＧであり、該５’末端のＧに対合する塩基がＣであり、該Ｃの３’側に隣接する塩基がＡである［１］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［３］  ５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目である［２］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［４］  原核細胞由来のｔＲＮＡである［１］〜［３］のいずれかの終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［５］  大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡである［４］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［６］  配列番号１で表される塩基配列からなるマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡ変異体であって、終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［７］  ３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された［１］〜［６］のいずれかの終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［８］  ５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目であり、さらに５’末端から７４番目にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された［７］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［９］  アミノ酸でアミノアシル化された［１］〜［８］のいずれかの終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１０］  アミノ酸が非天然アミノ酸またはその誘導体である、［９］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１１］  アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される［１０］の終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１２］  アミノ酸が蛍光標識されたものである［９］〜［１１］のいずれかの終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１３］  タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のｍＲＮＡであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンが終止コドンであるｍＲＮＡおよび［１］〜［１２］のいずれかの終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体を用い、終止コドンに該ｔＲＮＡ変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
［１４］  アンチコドンとして４塩基からなる配列を有し、４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体であって、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１５］  アンチコドンとしてＣＣＣＧを有し、４塩基コドンＣＧＧＧに対合する［１４］の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１６］  フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体である［１４］または［１５］の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１７］  酵母由来のｔＲＮＡである［１４］〜［１６］のいずれかの４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１８］  配列番号４０で表される塩基配列からなる酵母由来のｔＲＮＡ変異体であって、４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［１９］  アミノ酸でアミノアシル化された［１４］〜［１８］のいずれかの４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［２０］  アミノ酸が非天然アミノ酸、修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体である、［１９］の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［２１］  アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される［２０］の４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［２２］  アミノ酸が蛍光標識されたものである［１９］〜［２１］のいずれかの４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
［２３］  タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のｍＲＮＡであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンが４塩基コドンであるｍＲＮＡおよび［１４］〜［２２］のいずれかの４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体を用い、４塩基コドンに該ｔＲＮＡ変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
［２４］  蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
１つの４塩基コドンおよび１つの終止コドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンおよび終止コドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合したアミノ酸および［１］〜［１２］のいずれかのｔＲＮＡ変異体が結合したアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法。
［２５］  ４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが［１４］〜［２２］のいずれかの４塩基コドンに対合するｔＲＮＡ変異体である［２４］のタンパク質の製造方法。
［２６］  無細胞翻訳系でタンパク質を合成する［１３］の方法。
［２７］  無細胞翻訳系でタンパク質を合成する［２３］の方法。
［２８］  無細胞翻訳系でタンパク質を合成する［２４］の方法。
［２９］  無細胞翻訳系でタンパク質を合成する［２５］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３２９１１５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡの作製方法の概要を示す図である。
図２は、蛍光標識アミノ酸の導入評価方法の概要を示す図である。
図３Ａは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｂは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｃは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｄは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｅは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｆは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｇは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図３Ｈは、大腸菌由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図４は、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを加えた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光イメージであり、大腸菌由来ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図５は、大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体の構造を示す図である。
図６Ａは、大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示し、アミノ酸を付加していないｔＲＮＡを用いた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図６Ｂは、大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示し、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図６Ｃは、大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示し、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図７Ａは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｃは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｄは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｅは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｆは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｇは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図７Ｈは、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡの構造を示した図である。
図８は、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図９は、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体の構造を示す図である。
図１０Ａは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、アミノ酸を付加していないｔＲＮＡおよび蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。図１０Ａ中、ＢＦＬＡＦは、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを示し、ｎｏ  ＡＡは、アミノ酸を付加していないｔＲＮＡを示す。
図１０Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図１１Ａは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体の構造を示す図である。
図１１Ｂは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体の構造を示す図である。
図１２Ａは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図１２Ｂは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真である。
図１３Ａは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、アミノ酸を付加していないｔＲＮＡおよび蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。図１３Ａ中、ＢＦＬＡＦは、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを示し、ｎｏ  ＡＡは、アミノ酸を付加していないｔＲＮＡを示す。
図１３Ｂは、種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図１４Ａは、４塩基コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入方法の概要を示す図である。
図１４Ｂは、４塩基コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入の結果を示す写真である。
図１５Ａは、４塩基コドン法および本発明のｔＲＮＡ変異体を用いた終止コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入方法の概要を示す図である。本法において、ＵＡＧ以外の部位に蛍光標識アミノ酸を導入することはない。
図１５Ｂは、４塩基コドン法および本発明のｔＲＮＡ変異体を用いた終止コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入の結果を示す写真である。
図１６Ａは、ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の化学構造を示す図である。
図１６Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対するＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の導入と、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体によるＣＧＧＧに対するＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真であり、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図１６Ｃは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対するＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の導入と、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体によるＣＧＧＧに対するＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図１７は、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものの構造を示す図である。
図１８Ａは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す写真であり、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図１８Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図１９Ａは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによる、２番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合のリン酸化チロシンの導入の結果を示す写真であり、図１９Ａはリン酸化チロシンを付加したｔＲＮＡを用いた場合の抗リン酸化チロシン抗体によるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
図１９Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによる、２番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合のリン酸化チロシンの導入の結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質のウエスタンブロットのバンド強度を示す図である。
図２０Ａは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによる、Ｎ末端にＴ７ｔａｇを持ち８３番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合の、リン酸化チロシンの導入の結果を示す写真であり、リン酸化チロシンを付加したｔＲＮＡを用いた場合の抗Ｔ７ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
図２０Ｂは、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体で、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものによる、Ｎ末端にＴ７ｔａｇを持ち８３番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合の、リン酸化チロシンの導入の結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質のウエスタンブロットのバンド強度を示す図である。
図２１は、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体で、アンチコドンに４塩基ＣＣＣＧを持ち、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したもの（７３．１Ａ、７３．１Ｃ、７３．１Ｇ、７３．１Ｕ）の構造を示す図である。
図２２Ａは、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体で３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものにより、ストレプトアビジンの８３番目に導入した４塩基コドンＣＧＧＧに対して蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す写真であり、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図２２Ｂは、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体で３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものにより、ストレプトアビジンの８３番目に導入した４塩基コドンＣＧＧＧに対して蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
図２３Ａは、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体で３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものにより、Ｎ末端にＴ７ｔａｇ配列を持ちその直後にＣＧＧＧを導入したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合の、ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す写真であり、蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す写真である。
図２３Ｂは、酵母由来フェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体で３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したものにより、Ｎ末端にＴ７ｔａｇ配列を持ちその直後にＣＧＧＧを導入したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いた場合の、ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸を導入した結果を示す図であり、各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のｔＲＮＡは、トリプトファン用ｔＲＮＡであって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体である。該ｔＲＮＡ変異体は、微生物由来のトリプトファンに対応したｔＲＮＡのアンチコドンをＣＵＡに改変することにより得ることができる。微生物としては、大腸菌、マイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、バシルス・ハロドランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｏｕｒａｎｎｓ）、バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・プネウモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびスタフィロコッカス・アウレウス  Ｎ３１５（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５）が好ましい。天然に見出される大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）のトリプトファンに対応したｔＲＮＡの構造をそれぞれ図３Ａ〜図３Ｈおよび図７Ａ〜図７Ｈに示す。この中でも大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体が好ましく、特にマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体が好ましい。公知のアンチコドンとしてＣＵＡを有するｔＲＮＡを用いた場合に、終結因子と競合が生じ導入効率が悪くなるのに対して、上記本発明のｔＲＮＡに標識アミノ酸等の非天然アミノ酸を結合させて、タンパク質に導入する場合は、競合することなく効率的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入することができる。
さらに、本発明のｔＲＮＡは、上記トリプトファン用ｔＲＮＡであって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体をさらに変異させた変異体を含む。該変異体は、ｔＲＮＡの塩基配列の５’末端の塩基をＧに置換し、ｔＲＮＡがクローバー葉構造をとった場合に、前記５’末端のＧに対合する塩基をＣに置換し、該Ｃの３’側に隣接する塩基をＡに置換した変異体である。通常、前記５’末端のＧに対合する塩基は５’末端から７２番目の塩基である。すなわち、本発明のｔＲＮＡ変異体は、典型的には７２番目の塩基をＣに置換し、７３番目の塩基をＡまたはＧに置換したものである。このうち７３番目の塩基をＡに置換したものが特に好ましい。本発明において、５’末端の塩基をＧに置換し、７２番目の塩基をＣに置換し、７３番目の塩基をＡまたはＧに置換したｔＲＮＡ変異体をそれぞれ、Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３またはＧ１−Ｃ７２，Ｇ７３と表現する。このようなｔＲＮＡ変異体に標識アミノ酸等の非天然アミノ酸を結合させて、タンパク質に導入する場合、さらに非天然アミノ酸の導入効率が高くなり、さらに、Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３の場合は、ｔＲＮＡに天然アミノ酸が付加することなくさらに非天然アミノ酸の導入効率が高くなる。
例えば、本発明のｔＲＮＡとして、マイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシルス・ハロドランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｏｕｒａｎｎｓ）、バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・プネウモニア  １（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １）、マイコプラズマ・プネウモニア  ２（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ２）およびスタフィロコッカス・アウレウス  Ｎ３１５（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５）由来のトリプトファン用ｔＲＮＡであって、アンチコドンとしてＣＵＡを有し終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体であって、５’末端がＧであり、５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目である終止コドンに対合するｔＲＮＡ変異体が挙げられる。それぞれの配列を配列番号１、２、４、５、６、１８、１９、２０および２５に示す。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来トリプトファン用ｔＲＮＡの構造を図５に示し、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡの構造を図９に示す。図５および図９において、５’末端の塩基をＧに置換し、５’末端と対合する７２番目の塩基をＣに置換し、さらにＣに置換した塩基の３’側の塩基を置換することを示している。
以上に加えて、本発明のｔＲＮＡは、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかの１個の塩基を挿入した変異体を含む。上記の本発明のｔＲＮＡは、３’末端のＣＣＡ配列の直前すなわち通常７３番目には、５’末端の塩基とは対合しない１個の塩基が存在する。３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかの１個の塩基を挿入した変異体は、通常７２番目の塩基をＣに置換し、通常７３番目の塩基をＡまたはＧに置換し、さらに７４番目の塩基としてＡ、Ｇ、Ｃ又はＵのいずれかを挿入したものを含む。ｔＲＮＡの種類によっては、ループ部分やステム部分などの塩基数が異なるため、５’末端の塩基と対合する塩基が７２番目にならない場合があり、すなわち上記の５’末端から７２番目、７３番目及び７４番目の置換部位の塩基番号が数個、例えば、１個、２個、３個、４個または５個ずれる場合がある。ｔＲＮＡが立体構造をとった場合に、５’末端および５’末端の塩基に対合する塩基が置換し、その塩基の一つ３’側の塩基が置換されており、非天然アミノ酸の導入効率が上昇している限り、本発明の変異ｔＲＮＡに包含される。言い換えれば、本発明の変異ｔＲＮＡは典型的な通常のｔＲＮＡ、例えば大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡまたはマイコプラズマカプリコム由来トリプトファン用ｔＲＮＡの５’末端から７２番目の塩基に相当する塩基が置換され、さらにその塩基の一つ３’側の塩基、すなわち大腸菌由来トリプトファン用ｔＲＮＡまたはマイコプラズマカプリコム由来トリプトファン用ｔＲＮＡの５’末端から７３番目の塩基に相当する塩基が置換された変異ｔＲＮＡである。ここで、７２番目の塩基に相当する塩基とは５’末端の塩基に対合する位置にある塩基を意味し、７３番目の塩基に相当する塩基とは７２番目の塩基の一つ３’側の位置にある塩基を意味する。
本発明では、ＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したｔＲＮＡ変異体を７３．１Ａ、７３．１Ｃ、７３．１Ｇまたは７３．１Ｕ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕはそれぞれ挿入した塩基の種類を示す）と表現する。このようなｔＲＮＡ変異体に標識アミノ酸等の非天然アミノ酸を結合させてタンパク質に導入する場合、非天然アミノ酸の導入効率が高くなる。
例えば、本発明のｔＲＮＡ変異体として、マイコプラズマ・カプリコラム由来のトリプトファン用のｔＲＮＡ変異体であって、ＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したｔＲＮＡ変異体が挙げられる。
また、本発明の変異ｔＲＮＡは、４塩基コドンＣＧＧＧを用いて非天然アミノ酸を導入するための４塩基コドンに対合する変異ｔＲＮＡを含む。例えば、該変異ｔＲＮＡはアンチコドンに４塩基ＣＣＣＧを有する、酵母由来のフェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体であり、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ又はＵのいずれかの１個の塩基を挿入したｔＲＮＡ変異体である。
上記ｔＲＮＡの変異体は、配列情報に基づいて合成することができる。また、上記ｔＲＮＡの変異体は上記微生物由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ等のｔＲＮＡに変異を導入して作製することができる。変異体の作成は、公知の遺伝子工学の技法を用いて行うことができる。
例えば、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）など）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
本発明はさらに、上記ｔＲＮＡをアミノ酸またはその類似体でアミノアシル化したアミノアシルｔＲＮＡを包含する。アミノアシル化に用いるアミノ酸またはその類似体は限定されないが、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸またはそれらの誘導体がある。また、リン酸化やメチル化、アセチル化などの翻訳後修飾によって生じる修飾化アミノ酸も含まれる。
「非天然アミノ酸」とは、同一分子内にアミノ骨格を有する天然に存在しない人工のあらゆる化合物を指し、種々の標識化合物をアミノ酸骨格に結合させることにより作製することができる。「アミノ酸骨格」はアミノ酸中のカルボキシル基、アミノ基、およびこれらを連結している部分を含有する。
非天然アミノ酸の一例として、標識化合物と結合したアミノ酸である「標識化アミノ酸」が挙げられる。例えば、側鎖にベンゼン環等の芳香環を含むアミノ酸骨格を有するアミノ酸に標識化合物を結合させたアミノ酸がある。また、機能を考慮した場合、光応答性アミノ酸、光スイッチアミノ酸、蛍光プローブアミノ酸、蛍光標識アミノ酸等がある。
また、アミノ酸の誘導体としては、ヒドロキシ酸、メルカプト酸、カルボン酸等が挙げられる。
本発明において用いる標識化合物は、当業者には公知の色素化合物、蛍光物質、化学／生物発光物質、酵素基質、補酵素、抗原性物質およびタンパク質結合性物質である。
蛍光標識化合物としては、可視光域内（４００〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。
ルシフェリン、ルミジェン等の化学もしくは生物発光物質またはその誘導体も標識化合物として本発明に用いることができる。
さらに、補酵素類、抗原性を有する物質および特定のタンパク質に結合することが判っている物質などの中から、対象とするタンパク質に付与したい機能に応じて適宜選んで、それを標識化合物として本発明に用いることができる。例えば、特定の酵素に対する基質（例えば、アルカリホスファターゼまたはβガラクトシダーゼに対する基質等）を導入すれば、その酵素による呈色反応を利用して検出することができる。また、抗原性を有する物質、特定のタンパク質に結合することが判っている物質で標識されたタンパク質は、抗体または結合するタンパク質を用いた間接的検出法に用いることができる、および、精製が簡便であるという利点を有している。例えば、本発明の方法を用いてビオチンで標識した機能性タンパク質は、ビオチンを介してアビジンまたはストレプトアビジンと結合するという機能を有しており、この機能を利用すれば、本発明の方法によりまたは化学的に蛍光化合物等で標識したアビジンもしくはストレプトアビジンとの結合を利用して特定の物質の検出系を確立することが可能である。この他、種々の色素、ならびに、さまざまな生化学的、化学的、免疫化学的な検出方法で検出可能な物質を標識化合物に用いることができることが、当業者には理解できる。
アミノ酸と標識化合物とはスペーサーを介してまたは介さず連結することができる。「スペーサー」という用語は、標識化アミノ酸分子におけるアミノ酸部と標識化合物とを連結している部分を指す。即ち、標識化アミノ酸分子内のアミノ酸側鎖と標識化合物が直接結合しているのではなく、アミノ酸側鎖と標識化合物との間に１つ以上の原子が存在する場合、該標識化アミノ酸のアミノ酸部と標識化合物はスペーサーを介して連結しているという。スペーサーは、その主鎖部分にＣ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいればよい。またスペーサーの主鎖構造は、上記原子が２〜１０個、好ましくは３〜８個、さらに好ましくは５、６または７個が直鎖状に結合したものが好ましく、直鎖構造内には、二重結合が１つ以上含まれていてもよい。さらに、スペーサーは、ベンゼン環および／またはシクロヘキシル環などの環状構造を１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、有していてもよい。また、ベンゼン環やシクロヘキシル環などの環状構造、もしくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソプテン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
標識化合物の種類によっては、導入されたタンパク質内においてその機能をより効果的に発揮するために、スペーサーを介してアミノ酸と結合することが有利なものもある。例えば、標識化合物の種類によっては、スペーサーを介して結合している方が、導入されたタンパク質内での該標識化合物への立体障害が軽減されるということが考えられる。
さらに、本発明の標識化アミノ酸は、アミノ酸部の側鎖に芳香環を有し、該芳香環に、スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに、標識化合物が結合しているものが好ましい。
本明細書で用いる「芳香環」とは、一般的に、あらゆる不飽和環状化合物を指す。したがって、５もしくは６員の複素芳香環、または２個以上、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個の環構造を含む多環性化合物も含む。特に、芳香環はベンゼン環であることが好ましい。天然型アミノ酸のうち、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはその側鎖に芳香環を含有する天然型芳香族アミノ酸であり、該芳香環に標識化合物が（スペーサーを介してまたはスペーサーを介さずに）結合したものは、本発明の非天然アミノ酸の好ましい例として挙げることができる。
芳香環を有するアミノ酸と標識化合物の結合およびスペーサーを介した芳香環を有するアミノ酸と標識化合物との結合は、適当な官能基どうしの結合を利用すればよい。タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、天然型あるいは非天然型アミノ酸の、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基など種々の官能基のいずれかに標識化合物を、スペーサーを介して、または介さずに結合する。アミノ基標識用プローブとしてスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、ＮＢＤ−ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物が、チオール基標識用プローブとしてアルキルハライド、マレイミド、アジリジンなどの化合物が、カルボキシル基標識用プローブとしてジアゾメタン化合物、脂肪族臭化物、カルボジイミドなどが利用できる。例えば、標識化合物にスペーサーを介して、または介さずに、スクシンイミドエステルを導入し、かつアミノ酸の芳香環にアミノ基を導入しアミド結合により両者を結合させることができる。芳香環にアミノ基を導入したアミノ酸として、例えばアミノフェニルアラニンが挙げられる。この際に用いる官能基は、適宜選択導入できるし、結合方法も適宜選択できる。この際、アミド結合形成反応をｐＨ５程度で行なうことで、他にアミノ基が存在していても、アミノフェニルアラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。あるいは、他のアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、反応後脱Ｂｏｃ化すればよい。この方法は、例えば、「新生化学実験講座１  タンパク質  ＶＩ  構造機能相関」の記載等を参照すればよい。
アミノ酸骨格を形成する原子に芳香環が直接結合していても、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳのうちの少なくとも１種の１、２、または３個の原子を介して間接的に結合していてもよい。芳香環はベンゼン環である場合、ベンゼン環上にスペーサーまたは標識化合物が結合する位置は、アミノ酸骨格の位置に対して、パラ位またはメタ位であると、リボゾームへの取り込み効率がより高くなり、より好ましく、特にパラ位であることが好ましい。
前述のように、芳香環の官能基にスペーサーを介してまたは介さずに標識化合物を結合させる。アミノフェニルアラニンの場合、パラアミノフェニルアラニン、メタアミノフェニルアラニンが好ましい。
ｔＲＮＡにアミノ酸を結合させ、アミノアシルｔＲＮＡを作製するためには、必要な特定の基を結合させておく必要がある。例えば、アミノ酸のカルボキシル基にジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）を結合させておけば、３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠落させたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ（−ＣＡ））と結合させ、人工アミノアシルｔＲＮＡを作製することができる。人工アミノアシルｔＲＮＡの作製は、ＷＯ２００４／００９７０９国際公開パンフレット等の記載に従って行うことができる。例えば、アミノ酸のαアミノ基をＢｏｃ基で、側鎖官能基をＢｏｃもしくはＯｔＢｏｃで保護し、Ｂｏｃ−アミノ酸をシアノメチルエステル化した後、ｐｄＣｐＡと反応させるか、縮合剤カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）を用いてＢｏｃアミノ酸とｐｄＣｐＡを反応させる方法により、アミノアシルｐｄＣｐＡを作製することができる。ｔＲＮＡ（−ＣＡ）との連結はＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いればよい。
本発明のｔＲＮＡを用いたタンパク質へのアミノ酸またはその誘導体の導入は、アミノ酸またはその誘導体を導入しようとするタンパク質をコードするＤＮＡの導入部位に相当するコドン位置に終止コドンＴＡＧを導入したＤＮＡとアミノ酸またはその誘導体を結合させた本発明のアミノアシルｔＲＮＡを用いて細胞内または無細胞翻訳系でタンパク質を合成することにより行うことができる。
無細胞翻訳系による合成は、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることにより行うことができる（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，（１９８８）“Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，１１６２；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）“Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６）。無細胞タンパク質合成系は、ｍＲＮＡの有する遺伝情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみをさす場合もあるし、ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡを合成する無細胞転写系と前記無細胞翻訳系の両方を包含するものをさす場合もある。無細胞翻訳系においては、生物抽出液が用いられる。生物抽出液とは、リボソーム、２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニル−ｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、３種類の翻訳開始因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、３種類の翻訳伸長因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＦ−Ｇ、ＥＦ−Ｔｕ、ＥＦ−Ｔｓ）、３種類の翻訳終結因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）、リボソームリサイクリング因子（ＲＲＦ）、ＲＮＡポリメラーゼ等のタンパク質合成に必要な成分を含む生物の抽出液をいう。ここに挙げた以外のタンパク質を効率的な翻訳のために添加してもよく、当業者ならばより効率的な添加のために如何なるタンパク質を添加すればよいか決定できる。生物抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のもの、動物細胞や昆虫細胞由来のものいずれを用いてもよい。生物抽出液はフレンチプレスによる破砕またはグラスビーズを用いた破砕等によって得ることができる。大腸菌由来微生物抽出液としてはＳ３０エクストラクトがあり、例えばＰｒａｔｔらの方法により得ることができる（Ｐｒａｔｔ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．，１７９−２０９［１９８４］）。Ｓ３０エクストラクトは、リボソーム、２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニル−ｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、３種類の翻訳開始因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、３種類の翻訳伸長因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＦ−Ｇ、ＥＦ−Ｔｕ、ＥＦ−Ｔｓ）、３種類の翻訳終結因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）、リボソームリサイクリング因子（ＲＲＦ）等を含む。無��胞タンパク質合成系は、上記生物抽出液の他、ＡＴＰ再生系、プロモーターおよび発現させようとするタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドまたは発現させようとするタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡアーゼ阻害剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等のエネルギー源、緩衝剤、アミノ酸、塩類、抗菌剤等を含んでいてもよく、それぞれの濃度は適宜決定すればよい。
ＡＴＰ再生系は限定されず、公知のリン酸ドナーおよびキナーゼの組合せを用いることができる。この組合せとして例えば、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）−ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組合せ、クレアチンリン酸（ＣＰ）−クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の組合せ、アセチルリン酸（ＡＰ）−アセテートキナーゼ（ＡＫ）の組合せ等が挙げられ、これらの組合せでＡＴＰ再生系を無細胞タンパク質合成系に加えればよい。
無細胞タンパク質合成系には製造しようとするタンパク質をコードするｍＲＮＡも必要である。該ｍＲＮＡは無細胞タンパク質合成系に核酸を転写する系、すなわち該タンパク質をコードするｍＲＮＡを産生する系を包含させてもよい。この場合は、ＤＮＡを添加する。また、別途ｍＲＮＡを鋳型ＤＮＡよりＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた転写等により合成し、得られたｍＲＮＡを本発明の無細胞タンパク質合成系に含ませてもよい。ｍＲＮＡの産生は、適当なプロモーターおよび該プロモーターの下流に位置する製造しようとするタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドならびに該プロモーターに作用するＲＮＡポリメラーゼにより達成できる。ここで、用いるプラスミドは限定されず、公知のものが用いられ、公知の遺伝子工学的手法により、適当なプロモーターやリボソーム結合部位等を導入して用いることができる。当業者ならば、本発明で用いるプラスミドを適宜選択し、また自ら設計して構築することができる。プロモーターは無細胞タンパク質合成系で用いる微生物が有する内在性のプロモーターを用いてもよいし、外来性のプロモーターを用いてもよい。プロモーターとしては、上記Ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターやＴａｃプロモーターが効率の面で優れており好適に用いられる。
市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）やＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞翻訳系に適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、ｐＥＸＰ１やｐＥＸＰ２が挙げられる。
本発明のｔＲＮＡを用いることにより、タンパク質の任意の位置に蛍光物質で標識したアミノ酸等の非天然アミノ酸を導入することができ、蛍光標識タンパク質を製造することができる。例えば、ＰＤＩＰＹ  ＦＬ−アミノフェニルアラニンをストレプトアビジンのＴｙｒ８４部位に導入し、蛍光標識ストレプトアビジンを作製することができる。
また、タンパク質の任意の２ヶ所の位置に蛍光共鳴エネルギー移動の供与体および受容体となる蛍光標識アミノ酸を導入することでタンパク質を他の分子との相互作用の検出を行うことができる。この場合、一方の蛍光標識アミノ酸を４塩基コドン法で導入すればよい。４塩基コドン法は、Ｈｏｈｓａｋａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７８−９７７９，１９９６およびＨｏｈｓａｋａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，３４−４０，１９９９の記載に従って実施することができる。この場合のタンパク質として分子と相互作用することにより立体構造が変化するあらゆるタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質として、例えば、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、タンパク質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、レコベリン、マルトース結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等が挙げられる。タンパク質と相互作用する分子は、タンパク質ごとに決まっており、タンパク質、核酸、糖、イオン等のその他の有機または無機の低分子量分子が含まれる。例えば、タンパク質がカルモジュリンの場合、カルモジュリン結合タンパク質やカルシウムイオンが挙げられる。また、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼにはｃＧＭＰ、マルトース結合タンパク質にはマルトースが挙げられる。さらに、ステロイドホルモン受容体やＤＮＡ結合タンパク質には、それぞれのタンパク質に特異的なステロイドホルモンやＤＮＡが挙げられる。蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる物質としては、ＢＯＤＩＰＹ化合物、ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。例えば、エネルギー供与体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、エネルギー受容体としてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８を選択すればよい。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体の組み合わせとして、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８６、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＣｙ３、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、Ａｌｅｘａ４８８とＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８とＣｙ５、などでもよい。
本発明のタンパク質において、立体構造に変化が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにタンパク質中に含ませる必要がある。
このためには、タンパク質中の特定の部位に蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。蛍光標識アミノ酸を導入する位置は、蛍光標識アミノ酸を導入するタンパク質によって異なるが、天然タンパク質のアミノ酸配列に基づいて立体構造を解析し、立体構造上近接する位置にあるアミノ酸部位に蛍光標識アミノ酸を導入すればよい。タンパク質の立体構造は、例えば市販のタンパク質立体構造解析ソフトウェアを用いることにより予測することができる。あるいは、エネルギー供与体とエネルギー受容体のどちらか一方をタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に導入しておき、もう一方をタンパク質の内部の数〜数十ヶ所に導入して、その中から本発明に適した導入位置を特定すればよい。
例えば、タンパク質がカルモジュリンである場合、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８）で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に導入すればよい。一方、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸および，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸で標識したアミノ酸をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の１１３番目とＮ末端、または１４８番目とＮ末端に導入した場合は、タンパク質が他の分子と相互作用しても充分な蛍光共鳴エネルギー移動の効率の変化が起こらない。このようにして得られた、本発明のタンパク質を用いてタンパク質と該タンパク質と他の分子の相互作用を検出することができる。本発明のタンパク質に他の分子を相互作用させることにより、本発明のタンパク質の立体構造が変化し、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化する。該状態のタンパク質にエネルギー供与体の励起光を照射すると、エネルギー供与体とエネルギー受容体の間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるが、エネルギー受容体とエネルギー供与体の距離および配向が変化することにより、ＦＲＥＴの効率も変化する。これを測定することによりタンパク質の構造変化を検出することができる。
励起光の光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンイオンレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｌａｓｅｒ）（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
上記タンパク質は以下のようなタンパク質である。
１．  蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質、
２．  蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸の一方がタンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し、もう一方がＮ末端およびＣ末端以外の部位に存在する上記１のタンパク質、
３．  蛍光物質で標識したアミノ酸を４塩基コドン法により導入した上記１または２のタンパク質、
４．  タンパク質と結合し得る分子が、タンパク質、核酸、糖および低分子量分子からなる群から選択される上記１〜３のいずれかのタンパク質、
５．  エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、可視光域に励起波長および発光波長を有する蛍光物質である上記１〜４のいずれかのタンパク質、
６．  エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質が、その化学構造に４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンを基本骨格として含む分子又はその塩もしくはその誘導体である上記５のタンパク質、
７．  エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩である上記６のタンパク質、
８．  エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質がｐ−アミノフェニルアラニンのパラ位アミノ基に結合している上記１〜７のいずれかのタンパク質、
９．  タンパク質が、カルモジュリンである上記１〜８のいずれかのタンパク質、
１０．  エネルギー供与体となる蛍光物質およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記９のカルモジュリン、
１１．  エネルギー供与体となる蛍光物質が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、エネルギー受容体となる蛍光物質が，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩であり、それらの蛍光物質で標識したアミノ酸が、カルモジュリンがカルモジュリン結合タンパク質およびカルシウムイオンと相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るカルモジュリン上の位置に存在する、上記１０のカルモジュリン、ならびに
１２．  ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩ならびに，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸又はその塩をそれぞれカルモジュリンのアミノ酸配列の４０番目とＮ末端、またはカルモジュリンのアミノ酸配列の９９番目とＮ末端に含むカルモジュリン。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡの作製方法
それぞれのｔＲＮＡの塩基配列に基づいて、３個のオリゴヌクレオチドを化学合成した。Ｔ７プロモーターとｔＲＮＡの１〜３１番目までの塩基配列を含むプライマーと、ｔＲＮＡの２４〜４６番目までの塩基配列を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ（ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ，０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，１．２５ｕｎｉｔｓ  ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、５０ｎｍｏｌのそれぞれのプライマーを５０μＬ中に含む）により２本鎖ＤＮＡを得た。この反応液の１μＬを鋳型として、Ｔ７プロモーター配列（ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）（配列番号３２）を持つプライマーと、ｔＲＮＡの３９〜７４番目の塩基配列を含むプライマーを用いて、上記と同じ条件でＰＣＲを行ない、ｔＲＮＡ（−ＣＡ）遺伝子を作製した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
次に、ｔＲＮＡ（−ＣＡ）を転写反応により合成した。反応液１００μＬは、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＤＴＴ，４ｍＭ  ＮＴＰ，２０ｍＭ  ＧＭＰ，２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，４０ｕｎｉｔｓ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，１ｕｎｉｔ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，４００ｕｎｉｔｓ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０μｇ  ｔＲＮＡ（−ＣＡ）遺伝子を含む。反応液を３７℃、１８時間反応させて、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製）によりｔＲＮＡ（−ＣＡ）を精製した。
続いて、５ｘＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ  ｐＨ７．５，７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１６．５ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＡＴＰ）４μＬ、２００μＭ  ｔＲＮＡ（−ＣＡ）２．５μＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液２μＬ、０．１％  ＢＳＡ  ０．４μＬ、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．２μＬ、水９．９μＬを混合し、４℃で２時間反応させた。３Ｍ  ＡｃＯＫ  ｐＨ４．５を１０μＬ、水７０μＬを加え、等量のフェノール／クロロホルム＝１／１（０．３Ｍ  ＡｃＯＫ  ｐＨ４．５で飽和させたもの）を加え撹拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、撹拌、遠心した。上層を回収し、エタノール３００μＬを加え、軽く混合し、−２０℃で１時間置いた。１５０００ｒｐｍ  ３０ｍｉｎ  ４℃で遠心した後、上清を除き、−２０℃で保存してある７０％  ＥｔＯＨ  ２００μＬを加え、１５０００ｒｐｍ  ４℃で５秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。１ｍＭ  酢酸カリウムｐＨ４．５２μＬに溶解させた。
【実施例２】
【０００７】
蛍光標識アミノ酸の導入評価
反応液（１０μＬ）に、５５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２１０ｍＭ  グルタミン酸カリウム，６．９ｍＭ  酢酸アンモニウム，１．７ｍＭ  ジチオスレイトール，１．２ｍＭ  ＡＴＰ，０．２８ｍＭ  ＧＴＰ，２６ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸，１ｍＭ  スペルミジン，１．９％  ポリエチレングリコール−８０００，３５μｇ／ｍＬ  葉酸，１２ｍＭ  酢酸マグネシウム，０．１ｍＭ  ２０種類のアミノ酸、ストレプトアビジンｍＲＮＡ（終止コドンＵＡＧがＴｙｒ８３部位に導入されたもの）８μｇ／μＬを１μＬ、大腸菌抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２μＬ、蛍光標識アミノ酸−ｔＲＮＡ溶液を１μＬ混合した。３７℃で１時間翻訳反応を行なった。
翻訳反応液１μＬに、水９μＬと２×サンプルバッファー１０μＬを加え、９５℃５分間加熱した。このうちの５μＬを１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、この電気泳動ゲルを蛍光スキャナー（日立ソフトウェアエンジニアリング社製  ＦＭＢＩＯ−ＩＩＩ）で観察した。４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出により、蛍光標識アミノ酸の導入を確認し、その導入効率を定量した。また同一の電気泳動ゲルを用いて、抗Ｔ７ｔａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）によりウエスタンブロット分析を行なった。
Ｔｙｒ８３部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号３３）。開始コドンから本来の終止コドンまでを示してある。下線部は挿入した終止コドンを示す。
2007055429.tif 000002
【実施例３】
【０００８】
大腸菌由来ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入
大腸菌由来ｔＲＮＡ配列を持ちアンチコドンをＣＵＡに置換した２２種類のｔＲＮＡを、実施例１に記述の方法で作製した。続いて実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。
図４に蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを加えた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光イメージを示す。図４に示すように、大腸菌ｔＲＮＡの中では、トリプトファンｔＲＮＡが非天然アミノ酸の導入に適していることがわかった。
図６Ａにアミノ酸を付加していないｔＲＮＡを用いた場合のウエスタンブロッティングの結果、図６Ｂは蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光イメージ、図６Ｃは各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図６Ａ〜図６Ｃに示すように、Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３およびＧ１−Ｃ７２，Ｇ７３は高い導入活性を有する。ただし、Ｇ１−Ｃ７２，Ｇ７３は蛍光標識非天然アミノ酸を付加していなくても、完全長タンパク質が生成することから、翻訳系内で天然アミノ酸が付加されていると考えられる。従って、天然アミノ酸の付加を受けないＧ１−Ｃ７２，Ａ７３が最適である。
【実施例４】
【０００９】
マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入
マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ配列を持ちアンチコドンをＣＵＡに置換した３０種類のｔＲＮＡを、実施例１に記述の方法で作製した。続いて実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。
図８にマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す。図８に示すようにマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体の中でもトリプトファン用ｔＲＮＡが非天然アミノ酸の導入に適していることがわかった。
図１０Ａにアミノ酸を付加していないｔＲＮＡおよび蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージを、図１０Ｂに各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体は、全ての変異体において大腸菌トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）よりも高い導入活性を示した。特に、蛍光標識アミノ酸を付加していないときに完全長タンパク質がほとんど生成しないＧ１−Ｃ７２，Ａ７３が最適である。
【実施例５】
【００１０】
種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入
種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ配列を持ち、Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３の変異を導入してアンチコドンをＣＵＡに置換した３１種類のｔＲＮＡを、実施例１に記述の方法で作製した。続いて実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。図１１Ａ及び図１１Ｂに種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ、Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３の変異を導入してアンチコドンをＣＵＡに置換した３１種類のｔＲＮＡ変異体の配列を示す（配列番号１〜３１）。図１１Ａ及び図１１Ｂ中では、ＵをＴと表現してある。なお、配列番号１〜３１においては、７３番目の塩基はＡであるが、Ｇであっても（Ｇ１−Ｃ７２，Ｇ７３）、本発明の効果を奏することができる。
図１２Ａ及び図１２Ｂに種々の生物体由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体によるＵＡＧに対する蛍光標識アミノ酸の導入の結果を示す。
図１３Ａにアミノ酸を付加していないｔＲＮＡおよび蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を、図１３Ｂに各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂに示すように、マイコプラズマ・カプリコラムを含む８種類のトリプトファン用ｔＲＮＡが高い導入活性を示した。この中では、蛍光標識アミノ酸を付加していないときに完全長タンパク質がほとんど生成しないマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）が最も適している。
【実施例６】
【００１１】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入
（１）４塩基コドン法のみによる導入
酵母フェニルアラニン用ｔＲＮＡを用いて、実施例１に記載の方法でＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ（アンチコドンにＡＣＣＣを有する）、および、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有する）を作製した。続いて、マルトース結合タンパク質のｍＲＮＡ（Ｎ末端部分にＣＧＧＧ、Ｃ末端部分にＧＧＧＵを有する）を用いて、実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の二重導入を行なった。ただし、電気泳動ゲルの蛍光検出は、４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出に加えて５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出でも行なった。
図１４Ａに４塩基コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入方法の概要を示し、図１４Ｂに４塩基コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入の結果を示す。ＣＣＣＧを有するｔＲＮＡは、ＣＧＧＧを有する遺伝子に対してのみ蛍光標識アミノ酸を導入した。一方、ＡＣＣＣを有するｔＲＮＡは、ＧＧＧＵを有しない遺伝子に対しても蛍光標識アミノ酸を導入した。すなわち、この遺伝子では蛍光表域アミノ酸が４塩基コドンＧＧＧＵ以外の部位へも導入されてしまうため、４塩基コドンの代わりに終止コドンＵＡＧの使用を試みた。
Ｎ末端部分にＣＧＧＧ、Ｃ末端部分にＧＧＧＵを有するマルトース結合タンパク質のｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号３４）。開始コドンから本来の終止コドンまでを示してある。下線部は挿入したコドンを示す。
2007055429.tif 000003
（２）４塩基コドン法および本発明のｔＲＮＡ変異体を組合せた導入
酵母フェニルアラニン用ｔＲＮＡを用いて、実施例１に記載の方法でＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＣＣＧを有する）を作製した。一方、マイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）を用いて、実施例１に記載の方法でＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ（アンチコドンにＣＵＡを有する）を作製した。続いて、マルトース結合タンパク質のｍＲＮＡ（Ｎ末端部分にＣＧＧＧ、Ｃ末端部分にＵＡＧを有する）を用いて、実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の二重導入を行なった。ただし、電気泳動ゲルの蛍光検出は、４８８ｎｍ励起／５２０ｎｍ検出に加えて５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出でも行なった。
図１５Ｂに４塩基コドン法および本発明のｔＲＮＡ変異体を用いた終止コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入方法の概要を示し、図１５Ｂに４塩基コドン法および本発明のｔＲＮＡ変異体を用いた終止コドン法によるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への蛍光標識アミノ酸の二重導入の結果を示すマイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）は、ＵＡＧを有する遺伝子に対してのみ蛍光標識アミノ酸を導入できた。また、その導入効率も４塩基コドンＧＧＧＵと同程度であった。これより、２種類の蛍光標識アミノ酸を導入するためにＣＧＧＧとＵＡＧの組合せも良好であることがわかった。
Ｎ末端部分にＣＧＧＧ、Ｃ末端部分にＵＡＧを有するマルトース結合タンパク質のｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号３５）。開始コドンから本来の終止コドンまでを示してある。下線部は挿入したコドンを示す。
2007055429.tif 000004
2007055429.tif 000005
【実施例７】
【００１２】
ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸の導入
マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）を用いて、実施例１に記載の方法でＴＡＭＲＡ−Ｘ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡを作製した。続いて、２番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡ（ＳＡ２ＵＡＧ）を用いて、実施例２に記載の方法でＴＡＭＲＡ標識アミノ酸の導入を行なった。ただし、電気泳動ゲルの蛍光検出は、５３２ｎｍ励起／６０５ｎｍ検出で行なった。比較のために、アンチコドンに４塩基ＣＣＣＧを持つ酵母フェニルアラニン用ｔＲＮＡにより、２番目の部位をＣＧＧＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いて同様に導入を行なった。図１６ＡにＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸（ＴＡＭＲＡＸＡＦ）の化学構造を示す。図１６Ａ中、「５、６」の部分は、５と６の位置に結合したものの混合物であることを示す。また、図１６Ｂに蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果を示す。さらに、図１６Ｃに導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図１６Ｂおよび図１６Ｃに示すように、マイコプラズマ・カプリコラム由来ｔＲＮＡ変異体（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３変異体）は、実施例４に記載のＢＯＤＩＰＹ  ＦＬを有する蛍光標識アミノ酸の場合と同様に、ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識アミノ酸も効率良く導入できた。また、４塩基コドンＣＧＧＧに対してアンチコドンに４塩基ＣＣＣＧを持つ酵母フェニルアラニン用ｔＲＮＡにより導入した場合よりも高い導入活性を示した。
２番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号３６）。開始コドンから本来の終止コドンまでを示してある。下線部は導入したＵＡＧを示す。
2007055429.tif 000006
2007055429.tif 000007
また、２番目の部位をＣＧＧＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号３７）。開始コドンから終止コドンまでを示してある。下線部は導入したＣＧＧＧを示す。
2007055429.tif 000008
【実施例８】
【００１３】
３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したｔＲＮＡ変異体による非天然アミノ酸の導入
（１）マイコプラズマ・カプリコラム由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ変異体
マイコプラズマ・カプリコラム由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体であって、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したものを、実施例１に記載の方法で作製した。本発明において、このような変異ｔＲＮＡを１塩基伸長ｔＲＮＡと呼ぶことがあり、例えばマイコプラズマ・カプリコラム由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体であって、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したものを、ＭｙｃＷの１塩基伸長ｔＲＮＡと呼ぶことがある。続いて実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。図１７に使用したｔＲＮＡ変異体の構造を示す（配列番号１及び３８）。図１７右（配列番号３８）が、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したものである。図１８に１塩基伸長ＭｙｃＷによるＳＡ８３ＵＡＧへのＢＦＬＡＦの導入の結果を示し、図１８Ａに蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果、図１８Ｂに各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂに示すように、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したｔＲＮＡは元のｔＲＮＡと同程度の高い導入活性を示した。またこの結果は、マイコプラズマ・カプリコラム由来のトリプトファン用ｔＲＮＡ（Ｇ１−Ｃ７２，Ａ７３）変異体が、蛍光標識アミノ酸以外にもリン酸化チロシンを効率良く導入できることを示す。
さらに、蛍光標識アミノ酸の代わりにリン酸化チロシンを使用して、実施例１に記載の方法でｔＲＮＡを作製した。続いて実施例２に記載の方法でリン酸化チロシンの導入評価を行なった。ただし蛍光イメージングは行なわず、抗リン酸化チロシン抗体または抗Ｔ７ｔａｇ抗体によるウエスタンブロットのみを行なった。図１９に１塩基伸長ＭｙｃＷによるＳＡ２ＵＡＧへのリン酸化チロシン（ｐＴｙｒ）の導入の結果を示し、図１９Ａに２番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡとリン酸化チロシンを付加したｔＲＮＡを用いた場合のウエスタンブロットの結果、図１９Ｂに導入タンパク質のウエスタンブロットのバンド強度を示す。図１９Ａおよび図１９Ｂに示すように、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したｔＲＮＡは元のｔＲＮＡと同程度の高い導入活性を示した。
一方、図２０Ａに８３番目の部位をＵＡＧに置換したストレプトアビジンのｍＲＮＡ（ＳＡ８３ＵＡＧ）とリン酸化チロシンを付加したｔＲＮＡを用いた場合のウエスタンブロットの結果、図２０Ｂに導入タンパク質のウエスタンブロットのバンド強度を示す。図２０Ａおよび図２０Ｂに示すように、３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれか１個を挿入したｔＲＮＡは元のｔＲＮＡよりも高い導入活性を示し、特にＣを１個挿入したものが効率が良い。
（２）酵母由来のフェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体
アンチコドンにＣＣＣＧを有する酵母由来のフェニルアラニン用ｔＲＮＡ変異体（ＹＦ（ＣＣＣＧ））であって、末端に塩基を挿入あるいは削除したものを、実施例１に記載の方法で作製した。続いて実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。ただしストレプトアビジンのｍＲＮＡとしては、Ｔｙｒ８３部位にＵＡＧの代わりにＣＧＧＧを含むものを用いた。図２１に使用したｔＲＮＡ変異体の構造を示す（配列番号３９および４０）。図２２Ａに蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果、図２２Ｂに各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図２２Ａおよび図２２Ｂに示すように、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したｔＲＮＡ、および、ＣＣＡ配列の直前の１個の塩基を削除したｔＲＮＡは、元のｔＲＮＡと同程度の高い導入活性を示すものがあった。
さらに、Ｎ末端にＴ７ｔａｇ配列を持ちその直後にＣＧＧＧを導入したストレプトアビジンのｍＲＮＡを用いて、実施例２に記載の方法で蛍光標識アミノ酸の導入評価を行なった。図２３Ａに蛍光標識アミノ酸を付加したｔＲＮＡを用いた場合の蛍光イメージングの結果、図２３Ｂに各変異体を用いた場合の導入タンパク質の蛍光バンド強度を示す。図２３Ａおよび図２３Ｂに示すように、３’末端のＣＣＡ配列の直前に１個の塩基を挿入したｔＲＮＡは、元のｔＲＮＡよりも高い導入活性を示すものがあった。
Ｎ末端にＴ７ｔａｇ配列を持ちその直後にＣＧＧＧを導入したストレプトアビジンのｍＲＮＡ配列を以下に示す（配列番号４１）。開始コドンから終止コドンまでを示してある。下線部は挿入したＣＧＧＧコドンを示す。
2007055429.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００１４】
非天然アミノ酸をタンパク質に導入することで、タンパク質の機能改変や構造機能解析が行なわれている。非天然アミノ酸をタンパク質に導入するための手法として、導入したい部位のコドンを終止コドンＵＡＧに置換しておき、アンチコドンにＣＵＡを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡ存在下で翻訳する方法があった。しかし、このｔＲＮＡがＵＡＧを翻訳する際には終結因子との競合が生じる。これまで用いられてきた酵母Ｐｈｅ用ｔＲＮＡなどでは、この終結因子との競合が強く生じ、非天然アミノ酸の導入の効率が低下していた。
そこで、終止コドンＵＡＧを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に効率良く導入することのできるｔＲＮＡを種々の生物種由来のｔＲＮＡの中から探索し、さらにそれを改変することで、効率良く非天然アミノ酸を導入できるｔＲＮＡを見い出した。このｔＲＮＡを用いることで、蛍光標識非天然アミノ酸を導入した蛍光標識タンパク質を合成すること（ＷＯ２００４／００９７０９  Ａ１）や、タンパク質の特定部位に蛍光共鳴エネルギー移動の供与体と受容体となる蛍光標識非天然アミノ酸を導入することでタンパク質と他の分子との相互作用の検出することを、より効率良く行なうことが可能である。
例えば、蛍光標識非天然アミノ酸ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−アミノフェニルアラニンをＴｙｒ８３部位に導入したストレプトアビジンを合成することや、４塩基コドンＣＧＧＧと組み合わせてマルトース結合タンパク質へ蛍光共鳴エネルギー移動の供与体と受容体となる蛍光標識非天然アミノ酸を導入することができる。
導入するアミノ酸は蛍光標識非天然アミノ酸に限定されず、あらゆるアミノ酸あるいはヒドロキシ酸などのアミノ酸類似体であってタンパク質へ導入されるものについて適用できる。また、ｔＲＮＡは異なる生物種においても翻訳活性を示すことから、本ｔＲＮＡが使用できるのは大腸菌無細胞翻訳系に限定されず、あらゆる生物種由来の無細胞翻訳系あるいは細胞内での翻訳に使用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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2007055429.tif 000022
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2007055429.tif 000026
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2007055429.tif 000031
【図３Ｈ】
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【図７Ａ】
2007055429.tif 000033
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2007055429.tif 000037
【図７Ｆ】
2007055429.tif 000038
【図７Ｇ】
2007055429.tif 000039
【図７Ｈ】
2007055429.tif 000040
【図１０Ｂ】
2007055429.tif 000041
【図１３Ｂ】
2007055429.tif 000042
【図１４Ａ】
2007055429.tif 000043
【図１５Ａ】
2007055429.tif 000044
【図１６Ａ】
2007055429.tif 000045
【図１６Ｃ】
2007055429.tif 000046
【図１７】
2007055429.tif 000047
【図１８Ｂ】
2007055429.tif 000048
【図１９Ｂ】
2007055429.tif 000049
【図２０Ｂ】
2007055429.tif 000050
【図２１】
2007055429.tif 000051
【図２２Ｂ】
2007055429.tif 000052
【図２３Ｂ】
2007055429.tif 000053
【図２】
2007055429.tif 000054
【図４】
2007055429.tif 000055
【図５】
2007055429.tif 000056
【図６Ａ】
2007055429.tif 000057
【図６Ｂ】
2007055429.tif 000058
【図６Ｃ】
2007055429.tif 000059
【図８】
2007055429.tif 000060
【図９】
2007055429.tif 000061
【図１０Ａ】
2007055429.tif 000062
【図１１Ａ】
2007055429.tif 000063
【図１１Ｂ】
2007055429.tif 000064
【図１２Ａ】
2007055429.tif 000065
【図１２Ｂ】
2007055429.tif 000066
【図１３Ａ】
2007055429.tif 000067
【図１４Ｂ】
2007055429.tif 000068
【図１５Ｂ】
2007055429.tif 000069
【図１６Ｂ】
2007055429.tif 000070
【図１８Ａ】
2007055429.tif 000071
【図１９Ａ】
2007055429.tif 000072
【図２０Ａ】
2007055429.tif 000073
【図２２Ａ】
2007055429.tif 000074
【図２３Ａ】
2007055429.tif 000075
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月9日(2007.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファン用ｔＲＮＡ変異体であって、アンチコドンとしてＣＵＡを有しＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体であって、５’末端がＧであり、該５’末端のＧに対合する塩基がＣであり、該Ｃの３’側に隣接する塩基がＡである、ＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接するＡの位置が５’末端から７３番目である請求項１記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項４】
原核細胞由来のｔＲＮＡである請求項１または３に記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項５】
大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡである請求項４記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるマイコプラズマ・カプリコラム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）由来のｔＲＮＡ変異体である、請求項１記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項７】
３’末端のＣＣＡ配列の直前にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項１および３〜６のいずれか１項に記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項８】
５’末端のＧに対合するＣの位置が５’末端から７２番目であり、該Ｃの３’側に隣接する、Ａの位置が５’末端から７３番目であり、さらに５’末端から７４番目にＡ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項７記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項９】
アミノ酸でアミノアシル化された請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１０】
アミノ酸が非天然アミノ酸、修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体である、請求項９記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１１】
アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される請求項１０記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１２】
アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体。
【請求項１３】
タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のｍＲＮＡであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンがＵＡＧコドンであるｍＲＮＡおよび請求項１および３〜１２のいずれか１項に記載のＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡ変異体を用い、ＵＡＧコドンに該ｔＲＮＡ変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
１つの４塩基コドンおよび１つのＵＡＧコドンが挿入されたタンパク質のｍＲＮＡを調製する工程であって、４塩基コドンおよびＵＡＧコドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するｍＲＮＡの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡが結合したアミノ酸と請求項１および３〜１２のいずれか１項に記載のｔＲＮＡ変異体が結合したアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記ｍＲＮＡおよびアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法。
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項２４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月7日(2008.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファン用tRNA変異体であって、アンチコドンとしてCUAを有しUAGコドンに対合するtRNA変異体であって、5’末端がGであり、該5’末端のGに対合する塩基がCであり、該Cの3’側に隣接する塩基がAである、UAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項２】
5’末端のGに対合するCの位置が5’末端から72番目であり、該Cの3’側に隣接するAの位置が5’末端から73番目である請求項１記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項３】
原核細胞由来のtRNAである請求項１または２に記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項４】
大腸菌またはマイコプラズマ・カプリコラム（Mycoplasma capricolum）由来のtRNAである請求項３記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列からなるマイコプラズマ・カプリコラム（Mycoplasma capricolum）由来のtRNA変異体である、請求項１記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項６】
3'末端のCCA配列の直前にA、C、GまたはUのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項１〜５のいずれか１項に記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項７】
5’末端のGに対合するCの位置が5’末端から72番目であり、該Cの3’側に隣接するAの位置が5’末端から73番目であり、さらに5'末端から74番目にA、C、GまたはUのいずれかの１個の塩基が挿入された請求項６記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項８】
アミノ酸でアミノアシル化された請求項１〜７のいずれか１項に記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項９】
アミノ酸が非天然アミノ酸、修飾化アミノ酸またはそれらの誘導体である、請求項８記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項１０】
アミノ酸の誘導体がヒドロキシ酸、メルカプト酸およびカルボン酸からなる群から選択される請求項９記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項１１】
アミノ酸が蛍光標識されたものである請求項８〜１０のいずれか１項に記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体。
【請求項１２】
タンパク質に所望のアミノ酸を導入する方法であって、アミノ酸を導入しようとするタンパク質のmRNAであって導入しようとするアミノ酸の導入位置に対応するコドンがUAGコドンであるmRNAおよび請求項１〜１１のいずれか１項に記載のUAGコドンに対合するtRNA変異体を用い、UAGコドンに該tRNA変異体を割り当てることによりタンパク質にアミノ酸を導入する方法。
【請求項１３】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸およびエネルギー受容体となる蛍光物質で標識した蛍光標識アミノ酸を含むタンパク質であって、該タンパク質と結合し得る分子と結合したときに立体構造が変化しエネルギー供与体蛍光物質とエネルギー受容体蛍光物質の距離および配向が変化するような位置に２種類の蛍光標識アミノ酸が存在し蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化し得るタンパク質の製造方法であって、
１つの４塩基コドンおよび１つのUAGコドンが挿入されたタンパク質のmRNAを調製する工程であって、４塩基コドンおよびUAGコドンを挿入する位置が前記タンパク質が他の分子と相互作用したときに蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化するように距離および配向が変化し得るタンパク質上の位置に対応するmRNAの位置である工程、
蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２種類の蛍光物質でそれぞれ標識した２種類のアミノ酸であって、前記４塩基コドンに対するアンチコドンを有するtRNAが結合したアミノ酸と請求項１〜１１のいずれか１項に記載のtRNA変異体が結合したアミノ酸を調製する工程、ならびに
前記mRNAおよびアミノ酸結合tRNAを用いてタンパク質を合成する工程とを含む製造方法。
【請求項１４】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
無細胞翻訳系でタンパク質を合成する請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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