(57)【要約】本発明のβキチンの製造方法は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）およびセレン（Ｓｅ）を含有する培地であって、該培地中のリンおよび窒素の質量比（Ｐ／Ｎ）が０．１以上であり、ケイ素および窒素の質量比（Ｓｉ／Ｎ）が０．１以上であり、そして窒素（Ｎ）を１６０ｐｐｍ以上含む培地を用いて、βキチンを生産し得る藻類を培養する工程を含む。セレン（Ｓｅ）は０．０８ｐｐｍから０．００８ｐｐｂの濃度で培地中に含有されることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
βキチンの製造方法であって、
窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）およびセレン（Ｓｅ）を含有する培地を用いて、βキチンを生産し得る藻類を培養する工程を含み、該培地中のリンおよび窒素の質量比（Ｐ／Ｎ）が０．１以上であり、ケイ素および窒素の質量比（Ｓｉ／Ｎ）が０．１以上であり、そして窒素（Ｎ）の濃度が１６０ｐｐｍ以上である、方法。
【請求項２】
前記藻類が、タラシオシラ属に属する藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地中の前記セレン（Ｓｅ）の濃度が０．０８ｐｐｍから０．００８ｐｐｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地中の前記リン（Ｐ）の濃度が２０ｐｐｍ以上、そして前記ケイ素（Ｓｉ）の濃度が６０ｐｐｍ以上である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βキチンの製造方法に関する。さらに詳しくは、藻類、特にタラシオシラ属に属する藻類を用いて、βキチンを効率よく製造する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンが１，４結合した天然多糖であり、キトサンは、キチンの脱アセチル化物である。キチン・キトサンは、カニやエビなどの甲殻から抽出されるほか、藻類からも製造されている（例えば、ＷＯ９５／１５３４３（特表平９−５０６１２６号公報））。
キチン・キトサンは、種々の特性、例えば、抗菌性、保湿性、増粘性、生体適合性などを有しており、そのため、医用材料、医薬、化粧品、繊維、食品、農業などの分野に利用されている（平成１５年度  特許流通支援チャート（化学１９）「キチン・キトサン利用技術」，２００４年３月，独立行政法人  工業所有権総合情報館）。
キチンは、キチンを構成するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基のアセトアミド基同士の間で、あるいはアセトアミド基と水酸基との間で形成される水素結合により、独特の結晶構造を形成している。キチンには、キチン分子が互い違いに整列したαキチン、およびキチン分子が同一方向に並行に整列したβキチンがある。なお、αキチンおよびβキチンは、それぞれα−キチンおよびβ−キチンと表記される場合がある。αキチンとα−キチンとが同一であり、そしてβキチンとβ−キチンとが同一であることは、当業者には十分理解されている。
天然に生産されるキチンは、上記甲殻から製造されるキチンに代表されるように、最も安定な固いα結晶構造である場合が多い。
他方、βキチンは、比較的ルーズな構造、すなわち、シート状のキチン分子鎖が積層された構造を有しており、包接化合物を形成し得ることが報告されている（キチン・キトサン研究，第８巻第２号，１８６頁，２００２年およびキチン・キトサン研究，第９巻第２号，１００頁，２００３年）。このような包接化合物は、新たなドラッグデリバリーシステムの構築などの、キチンの新規な用途に貢献し得る。βキチンは、イカの軟甲から調製されるか、あるいはＷＯ９５／１５３４３に記載された方法で珪藻類から製造されることが知られている。しかし、珪藻類によるβキチンの生産量は低く、その供給量に限界がある。
ところで、藻類の培養は、一般に海水、人工海水などに、窒素、リンなどの化合物を添加し、自然光あるいは人工光を照射して行われる場合が多い。例えば、特開２００４−１８７６７５号公報には、キートセラス属、フェオダクチルム属などに属する珪藻を高濃度で培養することができる培地を提供することによって、珪藻を水産種苗に対する餌料として実用化したことが記載されている。しかし、これらは、藻類の増殖の効率にのみ重点をおき、藻類の培養によるβキチンの製造の効率については、言い換えれば、βキチンの製造に適した培地に関しては、全く記載がない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、藻類を培養してβキチンを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
本発明は、βキチンの製造方法を提供し、当該方法は、
窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）およびセレン（Ｓｅ）を含有する培地を用いて、βキチンを生産し得る藻類を培養する工程を含み、当該培地中のリンおよび窒素の質量比（Ｐ／Ｎ）が０．１以上であり、ケイ素および窒素の質量比（Ｓｉ／Ｎ）が０．１以上であり、そして窒素（Ｎ）が１６０ｐｐｍ以上である。
１つの実施態様では、上記藻類は、タラシオシラ属に属する藻類である。
別の実施態様では、上記培地中の上記セレン（Ｓｅ）の濃度は０．０８ｐｐｍから０．００８ｐｐｂである。
さらに別の実施態様では、上記培地中の上記リン（Ｐ）の濃度は２０ｐｐｍ以上、そして上記ケイ素（Ｓｉ）の濃度は６０ｐｐｍ以上である。
本発明によれば、培養した藻類中のβキチンの濃度が、従来の方法に比べて、５倍以上の濃度となるため、βキチンを効率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１、比較例１、および比較例２においてタラシオシラを３０℃で培養した場合における、培養液中の細胞数の経時変化を示すグラフである。
図２は、実施例１、比較例１、および比較例２においてタラシオシラを３０℃で培養した場合における、培養液中のβキチン量の経時変化を示すグラフである。
図３は、実施例２および比較例３においてタラシオシラを２５℃で培養した場合における、培養液中の細胞数の経時変化を示すグラフである。
図４は、実施例２および比較例３においてタラシオシラを２５℃で培養した場合における、培養液中のβキチン量の経時変化を示すグラフである。
図５は、実施例３〜７および比較例４においてタラシオシラを３０℃で培養した場合における、培養液中のβキチン量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本明細書において、キチンというときは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのポリマーであるポリ−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンのみならず、そのポリマーの一部のアセチル基が脱離した、ポリ−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体をも含むことを意味する。
（βキチンを生産し得る藻類）
本発明の方法に用いるβキチンを生産し得る藻類としては、例えば、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、コアミケイソウ（Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ）属、またはタイコケイソウ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属に属する藻類が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの中でもタラシオシラ属の藻類が好ましく用いられる。タラシオシラ属に属する藻類としては、タラシオシラ・ニッツショイデス（Ｔ．ｎｉｔｚｓｃｈｏｉｄｅｓ）、タラシオシラ・エスティバリス（Ｔ．ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ）、タラシオシラ・アンタークティカ（Ｔ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、タラシオシラ・デシフェンス（Ｔ．ｄｅｃｉｐｈｅｎｓ）、タラシオシラ・エクセントリカ（Ｔ．ｅｃｃｅｎｔｒｉｃａ）、タラシオシラ・フロリダナ（Ｔ．ｆｌｏｒｉｄａｎａ）、タラシオシラ・フルビアティリス（Ｔ．ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ）、タラシオシラ・グラビダ（Ｔ．ｇｒａｖｉｄａ）、タラシオシラ・グイラーディー（Ｔ．ｇｕｉｌｌａｒｄｉｉ）、タラシオシラ・ヒアリナ（Ｔ．ｈｙａｌｉｎａ）、タラシオシラ・ミニマ（Ｔ．ｍｉｎｉｍａ）、タラシオシラ・ノルデンスキオルディー（Ｔ．ｎｏｒｄｅｎｓｋｉｏｌｄｉｉ）、タラシオシラ・オセアニカ（Ｔ．ｏｃｅａｎｉｃａ）、タラシオシラ・ポリコルダ（Ｔ．ｐｏｌｙｃｈｏｒｄａ）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、タラシオシラ・ロチュラ（Ｔ．ｒｏｔｕｌａ）、タラシオシラ・ツビフェラ（Ｔ．ｔｕｂｉｆｅｒａ）、タラシオシラ・ツミダ（Ｔ．ｔｕｍｉｄａ）、タラシオシラ・ワイスフロギイ（Ｔ．ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）などが挙げられる。
これらの藻類は、海洋植物プランクトンコレクションセンター（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ；ＣＣＭＰ）から入手できる。
（βキチンを生産するための培地）
本発明の方法に用いる培地は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）およびセレン（Ｓｅ）を含有し、該培地中のリンおよび窒素の質量比（Ｐ／Ｎ）が０．１以上であり、そしてケイ素および窒素の質量比（Ｓｉ／Ｎ）が０．１以上であり、そして窒素（Ｎ）を１６０ｐｐｍ以上の濃度で含む。
藻類の増殖およびβキチンの生産の観点から、本発明に用いる培地には、上述のように、窒素（Ｎ）が１６０ｐｐｍ以上の濃度で含まれる。窒素（Ｎ）は、好ましくは２００ｐｐｍ以上、より好ましくは３００ｐｐｍ以上の濃度で含有される。リン（Ｐ）は、好ましくは２０ｐｐｍ以上、より好ましくは３０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは４０ｐｐｍ以上の濃度で含有される。ケイ素（Ｓｉ）は、好ましくは６０ｐｐｍ以上、より好ましくは８０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以上の濃度で含有される。
上記窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含む化合物としては、藻類の培養に一般的に用いられる化合物が用いられる。窒素を含む化合物としては、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなど）、硝酸塩（例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなど）が用いられる。リンを含む化合物としては、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなどが挙げられる。窒素およびリン酸を含む化合物、例えば、リン酸アンモニウムなども用いられる。ケイ素を含む化合物としては、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウムなどが挙げられる。これらの化合物は例示であり、上記に制限されない。
本発明の方法に用いる培地は、セレン（Ｓｅ）を含有する。藻類の増殖およびβキチンの生産を効率よく行うために、セレン含有培地中には、好ましくは０．０８ｐｐｍから０．００８ｐｐｂ、より好ましくは０．０８ｐｐｍから０．０８ｐｐｂのセレンが含まれている。このとき、セレン含有培地を用いる藻類の培養液中のセレンの濃度は、好ましくは０．０７５ｐｐｍから０．００７５ｐｐｂ、より好ましくは０．０７５ｐｐｍから０．０７５ｐｐｂとなる。
また、本発明の方法に用いる培地中には、必要に応じて、藻類の培養に通常用いられる微量金属類（例えば、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｃａ、Ｍｇなど）、ビタミン類（ビタミンＢ１２、ビオチンなど）などが添加される。
本発明に用いる培地のｐＨは、６から９の範囲であることが好ましい。
（βキチンの培養生産）
上記βキチンを生産し得る藻類を、上記培地中で培養することにより、βキチンが生産される。培養は、二酸化炭素を通気しつつ、光照射を行うことにより行われる。培養温度は、藻類が生育できる温度であれば特に制限はないが、一般には、１５〜３５℃である。タラシオシラ属の藻類の場合は、２５〜３２℃、好ましくは３０℃前後の温度で培養する。培養時間に特に制限はない。
培養終了後、βキチンは、例えば、以下の工程：培養液を機械的に振盪して藻体からβキチン棘条を脱離させる工程；遠心分離などの分離手段で藻体を沈殿させ、藻体を除去する工程；得られた藻体除去液をアルカリ溶液（例えば、水酸化カリウム溶液）に分散する工程；および、分散液から、例えば、メンブレンフィルターを用いて、固形物を回収する工程；を含む工程により回収される。回収された粗βキチンは、当業者が通常用いる精製手段によってさらに精製される。
【実施例】
【０００６】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例に限定されないことはいうまでもない。
以下の実施例および比較例に用いた培地組成を表１に示す。
【表１】
2007046517.tif 000002
各培地は、セレンの濃度のみが異なっており、他の成分およびその濃度は同一である。
藻体量およびβキチン量は、以下のように測定した。
（藻体量の測定）
培養液中の藻体量を、エルマ血球計算盤（ＥＲＭＡ  ＩＮＣ製）を用いて、以下のように測定した。培養開始時および培養を開始してから４８時間までの間は、血球計算盤の計算室内に培養液の原液をパスツールピペットにて注入し、計算室内の細胞数を顕微鏡（倍率；１０×１０）にて測定した。培養開始後７２時間目以降は、１／４濃度の人工海水を用いて１０倍希釈した培養液を同様の方法で測定した。
（βキチン量の測定）
藻体中のβキチン量を、以下のようにして測定した。５ｍＬの培養液を機械的に振盪して、藻体からβキチン棘条を脱離させた。振盪後、１，５００ｇにて２０分間遠心分離した。培養液が粘稠であり、藻体を完全に分離できないため、上清をデカンテーションにて回収し、それをさらに２，０００ｇで２０分間遠心分離し、βキチン棘条が含まれている上清を回収した。上清を１１，０００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収した。この沈殿物には、βキチン棘条、タンパク質、灰分などが含まれている。得られた沈殿物に５質量％水酸化カリウム溶液を添加し、沈殿を分散させ、室温で１２時間放置して、不純物であるタンパク質を溶解した。βキチン棘条は水酸化カリウム溶液に溶解せず、分散していた。次いで、このβキチンの分散液を、孔径１．０μｍの四フッ化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）メンブレンフィルターにてろ過し、βキチンを回収した。回収したβキチンをメタノールに再分散して、６０℃で２時間保持した。再度、βキチンをＰＴＦＥメンブレンフィルターにてろ過した。ろ取物を０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に分散し、１時間煮沸して灰分を溶解させた後、βキチンをろ過回収した。回収したβキチンを０．３４質量％亜塩素酸ナトリウム溶液に分散して、８０℃で２時間保持した。この分散液をろ過して不溶物を回収し、１質量％フッ化水素酸溶液に分散し、室温で１２時間放置した後、さらにろ過して回収し、室温で乾燥することによって、精製βキチンの水和物を得た。このβキチン水和物を１０５℃で２時間乾燥し、得られた無水物の重量を測定し、これをβキチン量とした。
［実施例１］
表１に記載の培地Ａを、容量１．５Ｌのガラス製扁平培養ビンに１Ｌ入れ、これに１．０ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を添加して、培養液Ａを調製した。この培養液Ａに、予めセレン（Ｓｅ）を含まない培地Ｂで培養した５０ｍＬのタラシオシラ・ワイスフロギイ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）ＣＣＭＰ１０５１株を接種した。そして、温度を３０℃に維持し、かつ蛍光灯を用いて約２００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光量子量を有する光を照射しながら、３容量％の炭酸ガスを混合した空気を培養液中に吹き込み、培養液を攪拌しながら１６８時間まで培養した。培養液中の細胞数およびβキチン量の経時変化を、それぞれ図１および２に示す。なお、実施例１における培養液中のセレン濃度は、０．０００７５ｐｐｍである。
（比較例１）
培地Ａの代わりに培地Ｂ（セレンを含まない）を用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして、タラシオシラ・ワイスフロギイＣＣＭＰ１０５１株を培養した。培養液中の細胞数およびβキチン量の経時変化を、それぞれ図１および２に示す。
（比較例２）
ＷＯ９５／１５３４３に記載された培地を用いたこと以外は、上記実施例１と同様にタラシオシラ・ワイスフロギイＣＣＭＰ１０５１株を培養した。なお、ＷＯ９５／１５３４３に記載された培地は、海水をベースとし、ＮａＮＯ３を７５ｍｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを５ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏを３０ｍｇ／Ｌ、およびセレン（Ｓｅ）化合物を０．００１３ｍｇ／Ｌ含み、そして実施例１に記載されたと同種の微量元素も含む。培養液中の細胞数およびβキチン量の経時変化を、それぞれ図１および２に示す。なお、比較例２における培養液中のセレン濃度は、０．０００７５ｐｐｍである。
実施例１と比較例２（ＷＯ９５／１５３４３と同じ培地）とを比較すると、いずれも培地にセレン（Ｓｅ）を含んでいるにもかかわらず、セレン以外の培地成分を特定の割合とした実施例１は、タラシオシラの増殖が促進され、かつβキチンの生産効率が上昇したことがわかる。また、実施例１および比較例１の結果から、同一組成の培地にセレン（Ｓｅ）を含有させることにより、タラシオシラの増殖が促進され、かつβキチンの生産効率が上昇したことがわかる。
これらのことから、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、およびケイ素（Ｓｉ）を特定の割合で含む培養培地に、セレン（Ｓｅ）を添加することにより、タラシオシラの増殖が促進され、かつβキチンの生産効率も向上されるという効果が得られることがわかる。
［実施例２］
培養温度を２５℃にしたこと以外は、上記実施例１と同様にして培養した。培養液中の細胞数およびβキチン量の経時変化を、それぞれ図３および図４に示す。
（比較例３）
培地Ａの代わりに培地Ｂを用い、そして培養温度を２５℃にしたこと以外は、上記実施例１と同様にして培養した。培養液中の細胞数およびβキチン量の経時変化を、それぞれ図３および図４に示す。
図３および４から、培地にセレン（Ｓｅ）を含有させることにより、タラシオシラの増殖が促進され、かつβキチンの生産効率が上昇することがわかる。
［実施例３］
培地Ａの代わりに培地Ｃを用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。なお、実施例３における培養液中のセレン濃度は、０．０７５ｐｐｍである。
［実施例４］
培地Ａの代わりに培地Ｄを用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。なお、実施例４における培養液中のセレン濃度は、０．００７５ｐｐｍである。
［実施例５］
上記実施例１と同様にして、２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。なお、実施例５における培養液中のセレン濃度は、０．０００７５ｐｐｍである。
［実施例６］
培地Ａの代わりに培地Ｅを用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。なお、実施例３における培養液中のセレン濃度は、０．０７５ｐｐｂである。
［実施例７］
培地Ａの代わりに培地Ｆを用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。なお、実施例３における培養液中のセレン濃度は、０．００７５ｐｐｂである。
（比較例４）
培地Ａの代わりに培地Ｂ（Ｓｅを含まない）を用いたこと以外は、上記実施例１と同様にして、２３３時間まで培養した。培養液中のβキチン量の経時変化を、図５に示す。
図５からわかるように、２３３時間の培養では、セレンを含む培地で培養したタラシオシラのほうが、βキチンの生産量が多かった。また、セレン（Ｓｅ）を０．０７９ｐｐｍ〜０．００７９ｐｐｂの濃度で含む培地で培養した場合は、すなわち、培養液中のセレン濃度が０．０７５ｐｐｍ〜０．００７５ｐｐｂである場合は、培養時間にかかわらず、セレンを含まない場合よりも、タラシオシラによるβキチン生産量が多かった。細胞数についても、セレン濃度が高いほど多くなる傾向が見られた（データは示さず）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、βキチンを効率よく生産することができる。βキチンは、医用材料、医薬、化粧品、繊維、食品、農業などの新たなドラッグデリバリーシステムの構築などに用いることができるため、これらの分野の発展に貢献し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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