(57)【要約】  神経細胞の極性形成前後で発現変動し、かつ、軸索の形成・伸長に重要な軸索先端の成長円錐に存在する新規分子としてSingarが同定された。このSingarは脳に特異的に発現し、その発現量は個体において軸索の形成が盛んな時期に大きく上昇する。Singarは軸索先端の成長円錐に強い濃縮が認められ、また、Singarの発現を培養神経細胞で抑制すると複数の軸索の形成が誘導された。このようにSingarの抑制は軸索形成を誘導することから、Singarの発現または活性を抑制することによって、神経細胞において軸索の形成または伸長を誘導、促進することができる。
2007049690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞でのSingarの発現または活性を抑制することによって、神経軸索の形成または伸長を誘導する方法。
【請求項２】
上記Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡを神経細胞に導入することを特徴とする、請求項１記載の神経軸索形成／伸長誘導法。
【請求項３】
Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または当該ＲＮＡを神経細胞で発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターからなる神経軸索形成／伸長誘導剤。
【請求項４】
上記ＲＮＡが、ヒト、ラットまたはマウス由来のSingar遺伝子の発現を抑制するものである、請求項３記載の神経軸索形成／伸長誘導剤。
【請求項５】
Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または当該ＲＮＡを神経細胞で発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターからなる神経再生用遺伝子治療薬。
【請求項６】
上記ＲＮＡが、ヒト、ラットまたはマウス由来のSingar遺伝子の発現を抑制するものである、請求項５記載の神経再生用遺伝子治療薬。
【請求項７】
Singarの発現または活性を抑制する物質を探索することを特徴とする、神経再生用治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
Singarと相互作用する物質を探索するステップを含む、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
神経細胞に対して試験物質を投与し、Singarの発現量を低下させる物質を探索するステップを含む、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
神経細胞に対して試験物質を投与し、軸索の形成誘導を指標にSingarの発現または活性を抑制する物質を探索するステップを含む、請求項７記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳特異的に発現するタンパク質であるSingarの発現または機能を抑制することにより、神経細胞における軸索の形成または伸長を誘導、促進する方法に関する。本発明は、とりわけ新たな神経再生技術の開発に貢献し得るものであり、たとえば脳卒中や脊髄損傷などで引き起こされる中枢神経および末梢神経の障害に対する有効な治療法として、軸索再生医療技術の確立およびその研究開発段階において利用することができるものである。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、細胞自体に極性すなわち方向性を有する細胞である。つまり、複数の樹状突起と単一の軸索を持ち、他の神経細胞からの情報を樹状突起において受け取り、細胞体で統合を行い、活動電位という形に変換して軸索上を細胞体側からシナプス末端側に伝達する。そして、シナプス末端において神経伝達物質を放出することにより標的細胞に情報を伝達している。この現象が、高等生物において記憶、学習、運動などの高次生命活動の根幹を担っている。しかし、神経細胞の極性形成および維持の分子機構は未知の部分が多くなぞに包まれている（極性形成に関する研究については、たとえば下記の非特許文献１参照）。【０００３】
神経細胞の極性形成の分子機構を明らかにすることは、発生段階などにおける神経軸索の形成および伸長、ひいては神経回路網形成の分子メカニズムを解明することにつながる。神経細胞の極性形成は一面において神経軸索の形成であるから、極性形成に関与する分子を同定することによって、同分子を神経軸索の形成、伸長に利用できる可能性がある。さらに同分子を新たな神経再生技術の開発に利用し、たとえば切断あるいは変性した神経軸索再生の治療法の開発に利用できる可能性がある。【０００４】
このような治療法の開発は重要である。たとえば脳卒中や外傷などで引き起こされる中枢神経および末梢神経の障害は、軸索再生に関して有効な薬物治療法がないため、治療が困難な現代の難病のひとつであり、現在リハビリテーションによる機能回復が主な医療手段である。特に中枢神経の軸索はいったん障害を受けると再生することができないため、患者は一生車椅子等の不自由な生活を強いられることが多く、その障害は患者や家族、社会にとって重い負担となる。
【非特許文献１】Dotti, C.G., Sullivan, C.A., Banker, G.A. (1988) The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第１の課題は、２次元電気泳動法および質量分析法等のプロテオーム解析を用いて神経細胞の極性形成前後で発現変動し、かつ、軸索の形成・伸長に重要な軸索先端の成長円錐に存在する分子を同定し、同分子の機能解析を行うことによって、神経細胞における軸索の形成または伸長を誘導、促進する新たな方法を開発、提供することである。本発明の第２の課題は、この方法に使用することができ、また中枢神経および末梢神経の障害に対する神経再生治療においても利用可能な神経軸索の形成（又は伸長）誘導剤を提供することである。さらに本発明の第３の課題は、上記分子を標的、プローブとした、神経再生用治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、独自に開発した高感度２次元電気泳動法（Inagaki N. and Katsuta K, Curr. Proteomics 1, 35-39, 2004）をベースとしたプロテオミクスを用いて、ラット海馬培養神経細胞のタンパク質のスクリーニングを行い、軸索形成に伴って発現量が上昇するタンパク質を網羅的に解析した。その結果、分子量５７ｋＤの新規タンパク質（Singar）を同定した。さらにこの分子について解析を進めた結果、（１）脳特異的に発現し、軸索の形成が盛んな生後４日目から１週間目に発現の上昇が見られること、（２）Singarは、神経突起の伸長を制御する成長円錐に強い濃縮が認められること、（３）培養神経細胞におけるSingarの発現量をＲＮＡｉを用いて抑制すると複数の軸索の形成が誘導されること、（４）Singarには少なくとも２つのスプライシングバリアントが存在すること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
即ち、本発明は、産業上および医学上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｇ）の発明を含むものである。
Ａ）  神経細胞でのSingarの発現または活性を抑制することによって、神経軸索の形成または伸長を誘導する方法。
Singarについては後に詳しく説明するが、ゲノム上のSingar遺伝子によってコードされるタンパク質を意味し、複数のスプライシングバリアント、およびＳＮＰ等によってアミノ酸置換が生じている変異タンパク質が含まれる。
上記Singarの「発現または活性を抑制する」方法としては、（１）Singar遺伝子の転写後に抑制する方法（たとえば後述のＲＮＡｉ法によるノックダウン法）、（２）プロモーター活性を低下させる等して、Singar遺伝子の転写を選択的に阻害又は抑制する方法、（３）Singarのスプライシング，翻訳、翻訳後修飾の何れかのプロセスを選択的に阻害し、Singarタンパク質の発現を特異的に抑制する方法、および、（４）Singarタンパク質の活性を阻害又は抑制する作用を持つ物質（Singarに対する抗体その他低分子化合物など）を神経細胞に投与することによって、Singarの活性を阻害・抑制する方法、などを挙げることができ、これらの方法を組み合わせてもよい。
また、Singarの発現または活性を抑制する方法としては、神経細胞におけるSingarの発現量（又は活性）を実質的に低下させる方法であればよく、Singarの発現（又は活性）を完全に抑制するものでなくてもよい。【０００８】
Ｂ）  上記Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡを神経細胞に導入することを特徴とする、上記Ａ）記載の神経軸索形成／伸長誘導法。
上記ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA：「short interfering RNA」「small interfering RNA」等とも呼ばれる。）であってもよいし、ＲＮＡｉ発現ベクター（「ｓｉＲＮＡ発現ベクター」等とも呼ばれる。）であってもよい。ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ発現ベクターは、抑制対象となるSingarの遺伝子配列をもとに公知の方法にしたがって設計することができる（たとえばAmbion TechNotes 9(1): 3-5 (2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8): 5515-5520 (2002)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) : 6047-6052 (2002)、Nature Biotechnology 20 : 505-508 (2002)など参照）。また、ＲＮＡｉ発現ベクターは、（１）１本のＲＮＡで適当な長さのヘアピン構造をもつｄｓＲＮＡを対象細胞内で発現させるように設計されたもの、（２）センス鎖、アンチセンス鎖それぞれを対象細胞内で発現させ、会合させるように設計されたもの、のいずれであってもよい。
神経細胞へのＲＮＡの導入は、常法にしたがって行うことができるが（たとえばNature 411:494-498 (2001)、Science 296:550-553 (2002)など参照）、本発明以降に新たに開発された方法を使用するものであってもよい。【０００９】
Ｃ）  Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または当該ＲＮＡを神経細胞で発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターからなる神経軸索形成／伸長誘導剤。
「ＲＮＡｉ発現ベクター」は、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを使用することができ、神経細胞内で機能するプロモーター（たとえばＵ６又はＨ１プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼIII系のプロモーター、あるいはＲＮＡポリメラーゼII系のプロモーターなど）を発現させるｓｉＲＮＡの配列の上流に組み入れたものを使用すればよい。【００１０】
Ｄ）  上記ＲＮＡが、ヒト、ラットまたはマウス由来のSingar遺伝子の発現を抑制するものである、上記Ｃ）記載の神経軸索形成／伸長誘導剤。
ヒト、ラット、およびマウス由来のSingarのｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列については、それぞれ、配列表の配列番号５−６、７−１０、１−４に示され、これらの配列情報をもとにターゲット配列を決定し、Singarタンパク質の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ発現ベクターの設計と調製が可能である。【００１１】
Ｅ）  Singarの発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または当該ＲＮＡを神経細胞で発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターからなる神経再生用遺伝子治療薬。
上記遺伝子治療薬は、切断あるいは変性した神経細胞、神経組織の軸索再生治療に利用することができる。【００１２】
Ｆ）  上記ＲＮＡが、ヒト、ラットまたはマウス由来のSingar遺伝子の発現を抑制するものである、上記Ｅ）記載の神経再生用遺伝子治療薬。【００１３】
Ｇ）  Singarの発現または活性を抑制する物質を探索することを特徴とする、神経再生用治療薬のスクリーニング方法。
上記スクリーニング方法としては、たとえば、（１）アフィニティーカラム法やYeast-two-hybrid法、免疫沈降法などのbinding assayによってSingarと相互作用（結合）する物質を探索し、更にその中からSingarの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法、（２）同様の方法によりSingarと相互作用（結合）する内在性の物質を探索し、更に当該物質とSingarとの結合を阻害する物質をスクリーニングする方法、（３）神経細胞に対して試験物質を投与し、Singarの発現量を低下させる物質をウエスタンブロット法などでスクリーニングする方法、（４）神経細胞に対して試験物質を投与し、軸索の形成誘導を指標にSingarの発現または活性を抑制する物質をスクリーニングする方法、などを挙げることができる。
【発明の効果】
【００１４】
上記Singarは、後述の実施例に示すように、神経細胞でその発現量を抑制すると複数の軸索の形成を誘導する作用等が認められた。このようにSingarの抑制は神経軸索の形成を誘導するため、中枢神経や末梢神経における軸索再生治療の標的分子となりうる点で、医学・薬学の分野における応用が可能である。第一に、Singarの発現抑制によって神経細胞での軸索形成を促進するため、障害を受けた患者の神経細胞、神経組織にSingarの発現を特異的に抑制するＲＮＡを導入することによって、神経軸索の再生を引き起こさせることが可能と考えられる。また、本発明のスクリーニング方法により、たとえばSingarと相互作用し、Singarの機能・活性を抑制する分子を見出せば、同分子は神経再生治療薬の開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】解析の結果明らかになったSingar（Singar1およびSingar2）の構造を概略的に示す図である。図中の数字は、アミノ酸残基の番号を示す。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、抗Singar抗体を用いて各種臓器におけるSingarの発現の有無および発現時期の特異性を調べた結果を示す図である。（ａ）脳（Brain）、心臓（Heart）、肝臓（Liver）、脾臓（Spleen）、腎臓（Kidney）、肺（Lung）、骨格筋（Skeletal Muscle）および胎盤（Placenta）の各種臓器でのSingarの発現を調べた結果、（ｂ）胎生１５日（Ｅ１５）から成体期（adult）にかけてラット脳でのSingarの発現を調べた結果、（ｃ）培養神経細胞でのSingarの発現を経時的に（培養開始後１２時間（12h）から２８日（28day）まで）調べた結果、である。
【図３】（ａ）および（ｂ）は、抗Singar抗体を用いて培養海馬神経細胞におけるSingarの発現およびその分布を調べた結果を示す図である。（ａ）はSingarを免疫染色した神経細胞の全体図（原図ではSingarが緑色で表示）、（ｂ）は軸索成長円錐付近の拡大図であり、左はSingarの免疫染色像（原図では緑色で表示）、中央は抗アクチン抗体によるアクチンの免疫染色像（原図では赤色で表示）、右はSingarの免疫染色像とアクチンの免疫染色像とを重ね合わせたものである。
【図４】Singar遺伝子の発現を抑制するため設計したｓｉＲＮＡターゲット配列およびコントロールに用いたｓｃＲＮＡ配列を示す図である。
【図５】ｓｉＲＮＡによってSingar（Singar1およびSingar2）の発現量が抑制されたことを示す図である。mycタグを付加したSingar1およびSingar2をそれぞれヒト腎臓由来のHEK293細胞に発現させ、RNAiの導入によって発現量がどのように変化するか、抗myc抗体（Anti-myc）を用いたウエスタンブロットにて解析した。図中、「-」はRNAiを導入しなかったもの、「Si」はRNAiを導入したもの、「Sc」はコントロールであるscRNAを導入したもの、である。実験では、抗アクチン抗体でアクチン（actin）の発現量を調べ、タンパク質のロード量が揃っていることを確認した。siRNAによりSingar1およびSingar2の発現量が抑制される一方、コントロールのscRNAでは抑制されないことがわかる。
【図６】ラット海馬培養神経細胞においてSingarの発現量を抑制したときに複数の軸索が形成されたことを示す図である。矢印は、軸索を示す。原図では神経細胞が緑色で表示される。
【図７】ラット海馬培養神経細胞においてSingarの発現量を抑制したときに複数の軸索形成割合が上昇したことを示すグラフである。図中、「Control」はRNAiを導入しなかったもの、「ScRNA」はコントロールであるscRNAを導入したもの、「SiRNA」はRNAiを導入したもの、である。「＊」は「Control」「ScRNA」と比べ有意差があることを示す。
【図８】免疫沈降法を用いてSingar1と相互作用するタンパク質を解析した図である。矢印で示されたSingar1結合タンパク質はβ-tubulinと同定された。コントロール細胞は、コントロールの発現ベクターをHEK293細胞に導入した細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的態様等について詳しく説明する。
図１には、本発明者による解析の結果明らかになったSingarタンパク質の模式的構造が示される。Singarタンパク質には、少なくとも２つのスプライシングバリアントSingar1およびSingar2が存在する。ここで「スプライシングバリアント」とは、ゲノム上の同一遺伝子（Singar遺伝子）からの転写後、alternative splicingにより形成された互いに異なるｍＲＮＡからそれぞれ翻訳されたタンパク質を意味する。アミノ酸配列が短い方のSingar1は全長４６９個のアミノ酸からなる一方、アミノ酸配列が長い方のSingar2は全長４８７個のアミノ酸からなる。両者の相違は、図１に示すように、Singar2が有している５９〜７６番目のアミノ酸配列（EDSWEDLTDLVEQVRADPの１８個のアミノ酸）の有無である。Singar1およびSingar2のいずれも、新規ドメインであるＲＵＮ（Rap2 interacting protein 8, UNC-14, NESCA homology）領域と、２箇所のCoiled-coil（図中、C.C.1とC.C.2）領域とを有する構造になっている。【００１７】
後述のように、脳にはSingar1およびSingar2の両方が発現しているため、本発明においてはSingar1およびSingar2の両方を抑制することが好ましいが、神経軸索の形成又は伸長を誘導・促進することができる限り、一方の発現または活性を抑制する方法であってもよい。【００１８】
配列番号１−２には、マウス由来Singar1のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が示される。これらの配列はDDBJ/EMBL/GenBank databasesのアクセッション番号「CT010404」（GI:31542481）に開示されている。配列番号３−４には、マウス由来Singar2のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が示され、これらの配列は同データベースのアクセッション番号「BC058259」（GI:34849578）に開示されている。さらに、配列番号５−６には、ヒト由来Singar1のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が示され、これらの配列は同データベースのアクセッション番号「BC051716」（GI:30704843）に開示されている。なお、Singarの機能については、これらのデータベースに殆ど示されていない。【００１９】
配列番号７−８には、ラット由来Singar1のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が示される。これらの配列は同データベースのアクセッション番号「BC089952」（GI:58477176）に開示されている。他方、配列番号９−１０には、本発明者によって決定されたラット由来Singar2のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が示される。これらラット由来のSingar2遺伝子・タンパク質は本発明者によってはじめてクローニングされた新規遺伝子・新規タンパク質である。【００２０】
本発明の「Singar」には、上記ヒト、マウスおよびラット由来のSingarが含まれることは勿論であるが、ＳＮＰ等によって遺伝子配列が一部異なるもの、さらに、アミノ酸置換が生じているものも含まれる。また、マウスおよびラット以外に、実験動物として使用される他の哺乳動物由来のSingarの発現または活性を抑制することによって、神経軸索の形成または伸長を誘導する方法であってもよい。【００２１】
上記Singarについて、クローニングしたラット由来Singarを発現させ、またこれをもとに抗Singar抗体を作製して解析を進めた結果、以下の知見が得られた（実験方法等の詳細は後述の実施例において説明する）。
（１）抗Singar抗体を用いたウエスタンブロット解析によりラット各種臓器における発現の有無および発現時期の特異性を調べたところ、Singarは脳に特異的に発現し、発現時期については軸索の形成が盛んな生後４日目（Ｐ４）から１週間目（Ｐ７）の脳で発現の上昇が見られた（図２（ａ）（ｂ））。
（２）培養神経細胞においても、培養開始後、軸索が形成され伸長する時期に発現の上昇が見られた（図２（ｃ））。
（３）Singarにはリン酸化体が存在し（図２（ｃ））、リン酸化によって機能調節されると考えられる。
（４）Singarは、胎生１８日のラット海馬より調製した培養神経細胞では伸長しつつある軸索先端の成長円錐に強い濃縮が認められ、アクチンと共局在していた（図３）。また、成長円錐のほかに細胞体および樹状突起にも局在していた。
（５）培養海馬神経細胞におけるSingarの発現量をＲＮＡｉを用いて抑制すると複数の軸索の形成が誘導された（図６・７）。【００２２】
また、本発明者は先に、神経成長円錐局在分子Shootin1を神経細胞で過剰発現させることによって神経軸索の形成又は伸長を誘導する新たな方法を開発・提案しているが（ＷＯ２００６／０１６４２９国際公開パンフレット参照）、この誘導作用は、上記Singarを共発現させることによって低下した。【００２３】
これらの結果から、Singarは軸索の成長円錐等に存在して神経軸索の形成に重要な役割を果たすことが示された。特にSingarの発現量を抑制することによって軸索の形成が誘導されたことから、Singarの発現または活性を抑制することによって、神経細胞における軸索の形成または伸長を誘導、促進することができる。【００２４】
Singarの発現を抑制する方法としては、たとえば前述のように、Singarの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡをウイルスベクター等のベクターを用いて神経細胞に導入し、細胞内発現させる方法が挙げられる。また、このＲＮＡｉ発現ベクターを神経再生用治療薬として、障害を受けた神経細胞の再生に利用することができる。神経細胞へのｓｉＲＮＡの導入はin vivo、ex vivoのいずれかの方法が考えられ、in vivoの場合は障害を受けた神経細胞に効率よく選択的にｓｉＲＮＡを導入するため、ベクターや核酸を生体の特定部位や特定細胞に運搬するよう提案された公知の担体やドラッグデリバリーシステムを使用することができる。【００２５】
後述の実施例では、図４に示されるターゲット配列に対するｓｉＲＮＡを設計し、ベクターを用いて同ｓｉＲＮＡを細胞内発現させることでSingarタンパク質の発現を抑制したが、Singarタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡとしてはこのｓｉＲＮＡに限定されるものではなく、前述のようにSingar遺伝子配列をもとにSingar蛋白発現を抑制し得る他の配列のｓｉＲＮＡを設計することが可能である。また、本発明の方法において、必ずしもSingarタンパク質の発現を完全に抑制する必要はなく、細胞内のSingarタンパク質の発現量を実質的に低下させるものであればよい。さらに、Singarの発現または活性を抑制することにより、神経軸索の形成・伸長を誘導する本発明の方法を、他の軸索誘導方法（たとえば前記Shootin1を用いた軸索誘導方法など）と組み合わせて用いてもよい。【００２６】
Singarの発現または活性を抑制するその他の方法としては、Singarに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムあるいは抗体などを神経細胞に導入する方法などのほか、Singarの発現または活性を抑制する物質を神経細胞に投与する方法を挙げることができる。そのため、Singarの発現または活性を抑制する物質を探索するスクリーニング方法は有用であり、このようなスクリーニング方法も本発明に含まれる。【００２７】
本発明のスクリーニング方法としては、遺伝子・タンパク質の発現量、タンパク質の活性変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。in vitroおよびin vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、cell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、Singar遺伝子・タンパク質は、ヒト由来のもののほか、ラット、マウスその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、Singarタンパク質の高次構造の情報を利用してインシリコ・スクリーニングを行ってもよい。【００２８】
本発明のスクリーニング方法としては、前述のように、（１）Singarと相互作用（結合）する物質を探索し、更にその中からSingarの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法、（２）Singarと相互作用（結合）する内在性の物質を探索し、更に当該物質とSingarとの結合を阻害する物質をスクリーニングする方法、（３）神経細胞に対して試験物質を投与し、Singarの発現量を低下させる物質をスクリーニングする方法、（４）神経細胞に対して試験物質を投与し、軸索の形成誘導を指標にSingarの発現または活性を抑制する物質をスクリーニングする方法、などを挙げることができる。【００２９】
たとえば、Singarは神経細胞においてリン酸化、および脱リン酸化されることによって活性制御されていると考えられるが、このようなリン酸化酵素や脱リン酸化酵素とSingarとの結合を阻害する物質を探索することによって、Singarの活性を抑制する物質を効率よくスクリーニングすることが期待できる。また、培養神経細胞でSingarの発現を抑制することによって複数の軸索の形成が誘導された（図６）ことから、培養神経細胞に対して同様の形態変化（軸索の形成誘導）を生じさせる物質を探索することによって、Singarの発現又は活性を抑制する物質を効率よくスクリーニングすることが期待できる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例１：ラットSingar遺伝子のクローニング〕
本発明者は近年、高感度の２次元電気泳動法を開発した（Inagaki N. and Katsuta K, Curr. Proteomics 1, 35-39, 2004）。この方法を用いてラット培養海馬神経細胞の約6,200個のタンパク質をスクリーニングし、神経軸索形成に伴って発現量が上昇する277個のタンパク質スポットを検出した。【００３１】
また同様に約5,200個のタンパク質をスクリーニングして200個の神経軸索に濃縮するタンパク質スポットを検出した。以上の二つの異なるスクリーニングで共通して検出されたタンパク質のひとつをMALDI-TOF/MS質量分析装置にて解析し、分子量５７ｋＤの新規タンパク質Singar（Singar1）を同定するとともに、当該タンパク質をコードする新規遺伝子をクローニングした。このようにしてクローニングしたSingar（Singar1）遺伝子のｃＤＮＡ配列、および同遺伝子によってコードされるSingar（Singar1）タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９−１０に示される。【００３２】
ゲノム情報の解析および後述のイムノブロット解析の結果から、Singarタンパク質には２つのスプライシングバリアントSingar1およびSingar2が存在することがわかった（図１参照）。また前述のように、マウス由来Singar（Singar1およびSingar2）、ヒト由来Singar（Singar1）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列についても同定した。【００３３】
〔実施例２：ラット各臓器におけるSingarの組織発現の解析〕
抗Singar抗体の作製および精製
上記方法によってクローニングしたラットSingarのGST融合タンパク質を大腸菌にて発現させ、Glutathion Sepharose 4Bカラムを用いて精製した。精製タンパク質よりプロテアーゼを用いてGSTを切断除去し、得られたSingarをウサギに免疫して常法に従い抗体を作製した。また得られた抗体はSingarをリガンドとしてカラム精製を行い、以下の実験には精製抗体を用いた。【００３４】
イムノブロッティング
Wistar系ラット各種組織よりSDS化サンプルを調製して15μgずつ各サンプルを10%ポリアクリルアミドゲルにて分離した。その後タンパク質をPVDF膜に転写し、上記抗Singar抗体（1000倍希釈）、HRP標識抗ウサギIgG抗体（2000倍希釈）およびECL試薬（アマシャムバイオサイエンス）にてSingarの検出を行った。その結果、図２（ａ）に示すように、Singarは脳に特異的に発現していた。発現時期については胎生期（Ｅ１５・Ｅ１８）では発現量は少なく、軸索の形成が盛んな生後４日目（Ｐ４）から１週間目（Ｐ７）にかけて発現の上昇が見られ、成体期（adult）においてもSingarは発現していた（同図（ｂ））。培養神経細胞でのSingarの発現時期についても調べた結果、培養後まだ軸索形成されていない時期（培養開始後１２時間（12h））では発現量は少なく、軸索が形成され伸長する時期（培養開始後６２時間（62h）から７日目（7day））に発現の上昇が見られた（同図（ｃ））。【００３５】
図２に示すように、抗Singar抗体を用いたウエスタンブロットでは３本のバンドが検出された。このうち最も上のバンドは、分子量がより大きいSingar2を検出したものである。他方、下の２本のバンドはSingar1を検出したものであるが、このうち上側のバンドは、脱リン酸化酵素を作用させると消失するため、Singar1のリン酸化体を検出したものと考えられる。【００３６】
〔実施例３：Singarのラット培養海馬神経細胞における細胞内分布の解析〕
ラット培養海馬神経細胞の調製
胎生18日目のWistar系ラットの海馬を摘出し、パパインを用いて酵素消化を行って分離神経細胞を調製した。得られた神経細胞はpoly-D-lysineおよびlamininコートされたカバーグラス上に培養液（Neurobasal Medium、B-27 supplement 、1 mM グルタミン、2.5μM cytosine β-D-arabinofuranoside）中、37℃、5％CO2の条件下で培養した。
ラット培養海馬神経細胞の免疫染色
培養3日目のラット培養海馬神経細胞を3.7％ホルマリンにて氷上で10分間固定し、−20℃メタノールにて10分間膜透過処理を行った。その後一次抗体として前記抗Singar抗体（5000倍希釈）にて４℃１昼夜反応を行い、さらに２次抗体としてALEXA488標識抗ウサギIgG抗体（1000倍希釈）にて室温１時間反応を行いSingarの可視化を行った。その結果が図３に示される。同図（ｂ）に示すように、胎生１８日のラット海馬より調製した培養神経細胞では、伸長しつつある軸索先端の成長円錐にSingarの強い濃縮が認められ、アクチンと共局在していた。また、成長円錐のほかに細胞体および樹状突起にも局在していた（同図（ａ））。【００３７】
〔実施例４：ＲＮＡｉを用いたSingarの発現抑制による神経軸索形成の誘導〕
Singarの発現量を抑制するため、いくつかのｓｉＲＮＡを設計した。このうち２つのｓｉＲＮＡは、ラットSingar1 mRNAの開始コドンから395番目の塩基より19塩基と、846番目の塩基より19塩基をそれぞれターゲット配列として選択した（図４）。これらの配列は前記配列情報をもとに既知の遺伝子配列などとの類似性を解析し、本発明者が選択した。また、コントロールとしてｓｃＲＮＡ配列を設計した。このｓｃＲＮＡには、後者のターゲット配列に対するＲＮＡと同じアミノ酸をコードし、ヌクレオチド配列の異なるものを使用した。【００３８】
上記ｓｉＲＮＡによって細胞内でのSingar（Singar1およびSingar2）の発現量が抑制されるかどうか、ウエスタンブロットにて解析した。その結果を図５に示す。実験では、mycタグを付加したSingar1およびSingar2をそれぞれヒト腎臓由来のHEK293細胞に発現させ、上記ｓｉＲＮＡの導入によって発現量がどのように変化するか、抗myc抗体（Anti-myc）を用いたウエスタンブロットによって解析した。また、抗アクチン抗体でアクチン（actin）の発現量を調べ、タンパク質のロード量が揃っていることを確認した。図中、「-」はＲＮＡを導入しなかったもの、「Si」は上記ｓｉＲＮＡを導入したもの、「Sc」はコントロールであるｓｃＲＮＡを導入したもの、である。同図に示すように、ｓｉＲＮＡによってSingar1およびSingar2の発現量が抑制される一方、コントロールのｓｃＲＮＡでは抑制されないことがわかる。【００３９】
次に、上記ｓｉＲＮＡをLipofectamine2000（インビトロジェン）を用いて添付のプロトコールに従ってラット海馬培養神経細胞に導入し、Singarの発現量を抑制したときに、神経軸索の形成にどのような影響を与えるか、解析を行った。ｓｉＲＮＡの導入は調製した分離神経細胞に行い、その後カバーグラス上に撒いて培養を６日間行った。その結果を図６および図７に示す。【００４０】
上記ｓｉＲＮＡによってSingarの発現量を抑制すると、図６に示すように、複数の軸索の形成が誘導された。図７は実験結果をまとめたグラフであり、図中、「Control」はＲＮＡを導入しなかったもの、「ScRNA」はコントロールであるｓｃＲＮＡを導入したもの、「SiRNA」は上記ｓｉＲＮＡを導入したもの、である。上記ｓｉＲＮＡを導入すると、複数の軸索が形成される割合は有意に上昇した。【００４１】
また、本発明者は先に、神経成長円錐局在分子Shootin1を神経細胞で過剰発現させることによって神経軸索の形成又は伸長を誘導する新たな方法を開発・提案しているが（ＷＯ２００６／０１６４２９国際公開パンフレット参照）、この誘導作用は、上記Singarを共発現させることによって低下した。【００４２】
以上の結果から、Singarは軸索先端の成長円錐等に存在して神経軸索の形成に重要な役割を果たすことが示された。特にSingarの発現量を抑制することによって軸索の形成が誘導されたことから、Singarの発現または活性を抑制することによって、神経細胞における軸索の形成または伸長を誘導、促進することができる。【００４３】
Singarの作用機構についてはいくつかのことが考えられるが、１つは前述のようにSingarはリン酸化されることから、Singarは、神経細胞内でのシグナル伝達機構においてリン酸化によって機能調節されていると考えられる。また、アクチンと共局在することから、細胞骨格の形成、維持等に関与していると考えられる。さらに、軸索成長円錐では比較的リン酸化体が多く見られることから、Singarは樹状突起等では軸索の形成や伸長を抑制する作用を有する一方、軸索成長円錐ではリン酸化によって不活化されている可能性が考えられる。【００４４】
〔実施例５：Singarを抑制する物質の候補としてSingarと相互作用するタンパク質のスクリーニング〕
免疫沈降法を用いたSingar結合タンパク質の探索
Flagタグを付加したSingar1（Flag-Singar1）をHEK293細胞に発現させ、細胞抽出液から抗Flag抗体を用いてFlag-Singar1を免疫沈降した。その後、沈降物にFlagペプチドを加えてFlag-Singar1を溶出し、共に溶出されたSingar1結合タンパク質をSDS-PAGEにて分離し銀染色法により染色した（図８）。Flag-Singar1発現細胞に特異的に見られたタンパク質バンドのひとつ（矢印）を切り出し、質量分析法によって同定したところ、Singar結合タンパク質としてβ-tubulinが同定された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
以上のように、本発明は、新たな神経再生技術の開発に利用することができる。たとえば脳卒中や脊髄損傷などで引き起こされる中枢神経および末梢神経の障害に対する有効な治療法として、軸索再生医療技術の確立およびその研究開発段階において利用することができる。より詳細には、障害を受けた患者の神経細胞に、Singarの発現を抑制するＲＮＡをウイルス等のベクターを介して導入することによって神経軸索の再生を促す治療法に利用したり、SingarをプローブとしてSingarの発現又は活性を抑制する物質を探索することによって神経軸索再生治療薬の開発に利用する、といった臨床面、医薬開発面での様々な利用が期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：マウス由来Singar1のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列
配列番号２：マウス由来Singar1のアミノ酸配列
配列番号３：マウス由来Singar2のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列
配列番号４：マウス由来Singar2のアミノ酸配列
配列番号５：ヒト由来Singar1のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列
配列番号６：ヒト由来Singar1のアミノ酸配列
配列番号７：ラット由来Singar1のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列
配列番号８：ラット由来Singar1のアミノ酸配列
配列番号９：ラット由来Singar2のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列
配列番号１０：ラット由来Singar2のアミノ酸配列
配列番号１１：Singar遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのターゲット配列１
配列番号１２：Singar遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのターゲット配列２
配列番号１３：ｓｃＲＮＡ配列
【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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