(57)【要約】本発明は、新規癌予防・治療標的分子の同定および該分子をターゲットとする癌予防・治療剤、即ち、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体、上記タンパク質のアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくは上記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）、上記タンパク質の発現および／または活性を調節する物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、癌の予防・治療剤を提供する。また、本発明は、上記タンパク質（好ましくはそれを産生する細胞）および上記タンパク質に対する抗体もしくは上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる、細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項２】
癌の予防・治療用である請求項１記載の剤。
【請求項３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項４】
癌の予防・治療用である請求項３記載の剤。
【請求項５】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項６】
癌の予防・治療用である請求項５記載の剤。
【請求項７】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法。
【請求項８】
癌の予防・治療のためである請求項７記載の方法。
【請求項９】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用。
【請求項１０】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
癌の予防・治療物質のスクリーニング用である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項１６】
癌の予防・治療用である請求項１５記載の剤。
【請求項１７】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項１８】
癌の予防・治療用である請求項１７記載の剤。
【請求項１９】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項２０】
癌の予防・治療用である請求項１９記載の剤。
【請求項２１】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法。
【請求項２２】
癌の予防・治療のためである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用。
【請求項２４】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
癌の予防・治療物質のスクリーニング用である請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項３０】
癌の予防・治療用である請求項２９記載の剤。
【請求項３１】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項３２】
癌の予防・治療用である請求項３１記載の剤。
【請求項３３】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤。
【請求項３４】
癌の予防・治療用である請求項３３記載の剤。
【請求項３５】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法。
【請求項３６】
癌の予防・治療のためである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用。
【請求項３８】
癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項４０】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
癌の予防・治療物質のスクリーニング用である請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な癌予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤に関する。詳細には、本発明は、新規標的タンパク質の発現および／または活性を抑制する物質を含有してなる癌予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤に関する。また、本発明は、該標的タンパク質またはそれをコードする遺伝子の発現を検出し得る物質を含有してなる癌の診断剤に関する。さらに、本発明は、該標的タンパク質またはそれをコードする核酸を用いた癌予防・治療、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  分子生物学の急速な進歩により、癌細胞の増殖あるいは悪性化の分子機構が明らかにされつつある。そして、それらの機構に関与する分子標的とその機能の解明を通じて、機能を制御することによって治療に結びつけようとする分子標的治療という新しいコンセプトによる研究が始まり、これまでにハーセプチン、グリベック、イレッサなどの新しい分子標的薬が開発され、一定の成果を収めてはいる。しかしながら、これらの薬剤の有効性はあくまで限定的であることから、癌治療のための新たな創薬ターゲット分子の探索は依然として重要な課題である。
癌において、遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価されうることが予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（ｉ）その発現量を低下させる、（ｉｉ）機能を抑制する、（ｉｉｉ）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１２４６）は、ヒトＭＨＣクラスＩＩＩ領域にあると予想された遺伝子の一つである。ヒト単球系白血病細胞株Ｕ９３７由来ｃＤＮＡから単離されており、１３３アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６７０６９）。さらに、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３３４７８）がマウス組織由来のｃＤＮＡからクローニングされており、１３５アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿２５８４３９）。このマウス遺伝子はＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対して塩基配列で約７７％、アミノ酸配列で約６７％の相同性を有している。ＬＹ６Ｇ６ＤはＬＹ−６ファミリーに属する分子であり、ＧＰＩと結合し細胞膜上に局在すると予想されている。
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子は、癌の診断等に有用なタンパク質の一つである（ＷＯ  ２００３／０２４３９２号公報）、大腸癌の診断等に有用なタンパク質である（ＷＯ  ２００３／０８３０７４号公報およびＷＯ  ２００４／０４６３４２号公報）と報告されている。しかし、これらの特許文献では、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子は、いずれも３８２アミノ酸からなるタンパク質をコードすると予想しており、また、それらのタンパク質の存在および有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。
ＰＴＰＲＯ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｏ）遺伝子は１９９５年、ヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリーより単離された遺伝子である。以後、ＰＴＰＲＯ遺伝子としては６つのバリアント（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２８４８，０３０６６７，０３０６６８，０３０６６９，０３０６７０，０３０６７１）、タンパク質としては１２１６アミノ酸よりなるアイソフォームａ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１０９５９２）、１１１８アミノ酸よりなるアイソフォームｂ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２８３９）、４０５アミノ酸よりなるアイソフォームｃ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１０９５９４，１０９５９６）および３７７アミノ酸よりなるアイソフォームｄ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１０９５９３，１０９５９５）の４つのアイソフォームが報告されている。ＰＴＰＲＯタンパク質は、アイソフォームによってＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩモチーフを含む細胞外と予想される部分の長さ、及び細胞内にあると考えられる連続する２８アミノ酸の有無が違うものの、共通して１つの細胞膜貫通部位と１つのチロシンフォスファターゼ活性部位とを持つ受容体型チロシンフォスファターゼと予想されている。受容体型チロシンフォスファターゼファミリーのメンバーの機能については、ＰＴＰαのように一種類の分子が、ある研究グループによると癌形成に対し促進的に働くと報告され、ある研究グループによると癌形成に対し抑制的に働くだろう報告されるという具合に、現時点で癌形成に対する作用について、見解の統一は行われていない。
ＰＴＰＲＯについては、造血細胞の生理的ターンオーバーに際しアポトーシスを誘導すると示唆する報告、Ｂ細胞の増殖過程においてＧ０／Ｇ１アレストを促進する事により増殖を制御すると示唆する報告、肺がんにおいて遺伝子発現が減少しており、癌抑制因子として働くのではないかとする報告（ＰＮＡＳ（２００４），１０１：１３８４４−１３８４９）がある。先行特許としては、ＰＴＰＲＯは、大腸癌、子宮癌で遺伝子発現が正常組織に比べて増加しており、診断と治療に有用な遺伝子の一つであると報告されている（ＷＯ  ２００３／０５７１６０号公報）。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子は、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法を用いてＳｋｐ１遺伝子と相互作用する遺伝子と配列の相同性が高いことを指標として、ＥＳＴライブラリーより部分的に見出された遺伝子である（Ｗｉｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，２０，１１８０−１１８２）。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子は、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１２１７１）およびそのスプライシングバリアントである、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１３０４６５）およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００６６１６）よりなり、それぞれ３３２アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３６３０３）、３２９アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿５６９７３２）および２６６アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００６６１７）よりなるタンパク質をコードしている。これらＴＭ４ＳＦ１７ａ、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ、ＴＭ４ＳＦ１７ｃの他、さらにスプライシングバリアントが知られており、本明細書においてはＴＭ４ＳＦ１７ｄ（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９６ＦＶ３）と称している（以下、ＴＭ４ＳＦ１７ａ乃至ＴＭ４ＳＦ１７ｄ遺伝子および新規に発見されるそれらのバリアントをＴＭ４ＳＦ１７遺伝子と総称することもある）。また、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２８８４１）がマウス組織由来のｃＤＮＡからクローニングされており、２７０アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０８３１１７）。このマウス遺伝子は、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子に対して塩基配列で約９１％、アミノ酸配列で約９６％の相同性を有している。ＴＭ４ＳＦ１７はＦＢＸ２３という異名を持ち、４回膜貫通型分子ファミリーであるテトラスパニンスーパーファミリーに属しており、細胞膜上に局在すると予想されている。
ＴＭ４ＳＦ１７は、癌の診断等に有用なタンパク質の一つである（ＷＯ  ２０００／５６８９１号公報、ＷＯ  ２００１／７７１７３号公報）と報告されている。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。
【発明の開示】
上述の通り、癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な新規薬剤が切望されている。癌細胞において、有意に発現が変動し得る遺伝子は数多く知られているが、それらの中で、どの遺伝子およびその発現産物が、癌治療における創薬ターゲットとなり得るかについては、依然として不明な点が多い。したがって、本発明の目的は、癌分子標的治療の新規ターゲットとなり得る分子を同定し、該標的分子の発現や機能を制御することによる癌の予防・治療手段を提供することであり、また、該標的分子を用いて癌予防・治療活性を有する物質をスクリーニングする手法を提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子を見出した。さらに、これらの遺伝子に対するｓｉＲＮＡが癌細胞の増殖を抑制することを見出し、該遺伝子が癌予防・治療のための標的となり得ることを実証した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（２）  癌の予防・治療用である上記（１）記載の剤、
（３）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（４）  癌の予防・治療用である上記（３）記載の剤、
（５）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（６）  癌の予防・治療用である上記（５）記載の剤、
（７）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法、
（８）  癌の予防・治療のためである上記（７）記載の方法、
（９）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用、
（１０）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である上記（９）記載の使用、
（１１）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法、
（１２）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、上記（１１）記載の方法、
（１３）  配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（１２）記載の方法、
（１４）  癌の予防・治療物質のスクリーニング用である上記（１１）記載の方法、
（１５）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（１６）  癌の予防・治療用である上記（１５）記載の剤、
（１７）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（１８）  癌の予防・治療用である上記（１７）記載の剤、
（１９）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（２０）  癌の予防・治療用である上記（１９）記載の剤、
（２１）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法、
（２２）  癌の予防・治療のためである上記（２１）記載の方法、
（２３）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用、
（２４）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である上記（２３）記載の使用、
（２５）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法、
（２６）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、上記（２５）記載の方法、
（２７）  配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（２６）記載の方法、
（２８）  癌の予防・治療物質のスクリーニング用である上記（２５）記載の方法、
（２９）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（３０）  癌の予防・治療用である上記（２９）記載の剤、
（３１）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（３２）  癌の予防・治療用である上記（３１）記載の剤、
（３３）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、
（３４）  癌の予防・治療用である上記（３３）記載の剤、
（３５）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害方法、
（３６）  癌の予防・治療のためである上記（３５）記載の方法、
（３７）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤の製造のための、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性阻害物質の使用、
（３８）  癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤が癌の予防・治療用である上記（３７）記載の使用、
（３９）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質のスクリーニング方法、
（４０）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、上記（３９）記載の方法、
（４１）  配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（４０）記載の方法、
（４２）  癌の予防・治療物質のスクリーニング用である上記（３９）記載の方法、
などを提供する。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質やこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌組織に特異的に発現し、癌の診断マーカーとなり得る。さらに、上記タンパク質に対する抗体、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、上記タンパク質の発現および／または活性を調節する物質は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。また、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記抗体などは、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療物質（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療物質）、癌細胞のアポトーシス促進物質、癌細胞の増殖阻害物質などのスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、各種癌組織由来ｍＲＮＡおよび周辺正常組織由来ｍＲＮＡを用いて作製した、ＬＹ６Ｇ６Ｄの遺伝子発現プロファイルを示す。
図２は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現細胞株ＳＷ４８０におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与の結果を示す。図２Ａ：ｓｉＲＮＡ投与により、ヒト肺癌細胞株ＳＷ４８０の細胞増殖が抑制されたことを示す；図２Ｂ：ｓｉＲＮＡ投与により、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が低下したことを示す。
図３は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭにおけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与の結果を示す。図３Ａ：ｓｉＲＮＡ投与により、ヒト肺癌細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭの細胞増殖が抑制されたことを示す；図３Ｂ：ｓｉＲＮＡ投与により、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が低下したことを示す。
図４は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子を発現しない細胞株ＨＣＴ１１６におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与の結果を示す。図４Ａ：ｓｉＲＮＡ投与により、ヒト肺癌細胞株ＨＣＴ１１６の細胞増殖は抑制されないことを示す；図４Ｂ：ｓｉＲＮＡ導入効率を、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量により示す。
図５は、ＬＹ６Ｇ６Ｄを一過性発現させた時の細胞増殖および細胞内シグナル伝達経路への影響を示す。図５Ａ：ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質を発現させることにより細胞増殖が促進されたことを示す。図５Ｂ：ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現による細胞増殖促進作用がＰＩ３Ｋ阻害剤で抑制されたことを示す。図５Ｃ：ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現によりＡｋｔリン酸化能が亢進されたことを示す。
図６は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株においてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質がＧＰＩを介して細胞膜表層に局在されることを示す。図６Ａ：ＦＡＣＳｃａｎを用いた解析結果を示す。図６Ｂ：ウエスタンブロット解析結果を示す。
図７は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株においてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が糖鎖修飾を受けることを示す。
図８は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭおよびＳＷ４８０におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与により、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が減少したことを示す。
図９は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現ヒト大腸癌細胞株においてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が発現していることを示す。
図１０は、平板培養におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株の増殖速度がＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の発現量と正相関することを示す。
図１１は、ＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株を用いた細胞染色法においてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が細胞膜に局在することを示す。
図１２は、三次元的培養におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株のミトコンドリア呼吸能がＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量と正相関することを示す。
図１３は、ヒト正常組織あるいはヒト大腸癌組織におけるＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の発現プロファイルを示す。
図１４は、各種癌組織由来ｍＲＮＡおよび周辺正常組織由来ｍＲＮＡを用いて作製した、ＴＭ４ＳＦ１７の遺伝子発現プロファイルを示す。
図１５は、ＴＭ４ＳＦ１７タンパク質が翻訳後修飾を受けることを示す。
図１６は、組換えＴＭ４ＳＦ１７  ｂ−３ｘＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄタンパク質が糖鎖修飾を受けることを示す。
図１７は、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａおよびｂタンパク質が細胞膜に局在することを示す。
図１８は、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅおよびｉｓｏｆｏｒｍ  ｆおよびｉｓｏｆｏｒｍ  ｈタンパク質のアミノ酸配列と、それをコードするｃＤＮＡ配列、およびその他のスプライスバリアントとの比較を模式的に示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で用いられるタンパク質（本発明のタンパク質と称することもある）は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明のタンパク質は、ヒトや他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など］等から単離・精製されるタンパク質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
本発明で用いられるタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質である。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などが挙げられる。ここで「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に凖じて行うことができるが、例えば、後述する本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法において用いられる方法等に従って行うことができる。
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本発明で用いられるタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６７０６９．２）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿２５８４３９．１として登録されているマウスホモログ）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１０９５９２．１）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３５３４６．２として登録されているマウスホモログ）、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３６３０３）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０８３１１７として登録されているマウスホモログ）、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿５６９７３２）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００６６１７）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９６ＦＶ３）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、などがあげられる。
本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つ該タンパク質と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定は、前記した本発明で用いられるタンパク質の場合と同様に行うことができる。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは１５０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、本発明で用いられるタンパク質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作製のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは遊離体であってもよいし、塩であってもよい（本明細書において、特にことわらない限り同様である）。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から、自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、本発明で用いられるタンパク質を調製することができる。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質（ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたタンパク質（ペプチド）は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などが挙げられる。
上記方法で得られるタンパク質（ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質（ペプチド）が塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに凖じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜約４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドは、本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質または該部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに凖じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号：１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１２４６）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３３４７８として登録されているマウスホモログ）、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３０６６７）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１１２１６として登録されているマウスホモログ）、配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１２１７１）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２８８４１として登録されているマウスホモログ）、配列番号：７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１３０４６５）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００６６１６）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡあるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１３で表される塩基配列を含有するＤＮＡあるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１５で表される塩基配列を含有するＤＮＡあるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡあるいは他の哺乳動物におけるそのホモログなどが挙げられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列の部分塩基配列、または配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとは、前記と同意義を示す。また、ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質およびその部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕、２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７（１９７７）〕などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−３、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒト２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６巻，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜約８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜約４３℃で約３〜約２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜約４０℃で約６〜約２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜約８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜約３５℃で約２４〜約７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜約６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜約５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜約４０℃で約１５〜約６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ  Ｊ．Ｍ．ら，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ  Ｆ．Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ  Ａ．Ｈ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川ら，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭＷｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記することがある）は、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ、特に好ましくはＩｇＧが挙げられる。
また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドは、上記した通り、例えば、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウス、ニワトリなどの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（ｄ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（ａ）温血動物の組織または細胞から本発明のタンパク質を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた本発明のタンパク質をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明のタンパク質と同一の構造を有するもの、具体的には、該タンパク質のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（２）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
免疫原としては完全な本発明のタンパク質分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば２０個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：１ないし数個）は置換可能な基（例：Ｃｙｓ、水酸基等）によって置換されていていもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
あるいは、本発明のタンパク質を発現する温血動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。温血動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現する天然の温血動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約３，０００以下）の抗原（即ち、本発明のタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ｉｇ抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、（ｉ）後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ｉｉ）後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは（ｉｉｉ）体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ｎｇ〜μｇオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、４〜１２週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；５〜２０％程度）添加培地に浮遊させて４〜１０日間程度ＣＯ２インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば０．０５〜５μｇが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（１〜２週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後４〜１０日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が、ラット骨髄腫細胞としてはＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３等が、ヒト骨髄腫細胞としてはＳＫＯ−００７、ＧＭ  １５００−６ＴＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６等が挙げられる。
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。ＰＥＧの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００が好ましい。ＰＥＧ濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。ＰＥＧの希釈用溶液としては無血清培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）、５〜２０％程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりＤＭＳＯ（例：１０〜２０％程度）を添加することもできる。融合液のｐＨとしては、例えば４〜１０程度、好ましくは６〜８程度が挙げられる。
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス等が挙げれらる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のＥＢウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないＥＢシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えＥＢウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
マーモセット由来のＢ９５−８細胞はＥＢウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）添加培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約１０７細胞／ｍＬ）で浮遊させて、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常０．５〜２時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はＥＢウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にＩｇＧを提示しなくなるので、抗ＩｇＧ抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、５〜２０％ＦＣＳを含む動物細胞用培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約０．１ｍＭ、約０．４μＭおよび約０．０１６ｍＭ等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、１０−７〜１０−３Ｍ程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は１０〜１４日以内に死滅するので、融合２週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後４〜６週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後１週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合７〜１０日後にヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）添加完全培地（例：１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）の添加または交換を行う。融合後８〜１４日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が１ｍｍ程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のＩｇＧに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやＦＡＣＳを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して９６ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓ添加ＲＭＰＩ１６４０）中に３０細胞／ｍＬの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに０．１ｍＬ（３細胞／ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を１０細胞／ｍＬに希釈して別のウェルに同様にまき（１細胞／ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を３細胞／ｍＬに希釈して別のウェルにまく（０．３細胞／ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで２〜３週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、１０細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常２回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば１０５〜１０６細胞／ｍＬ程度に保ちながら、また、ＦＣＳ濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（ＭＯＰＣ）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、５〜１０日後に１０６〜１０７細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、２〜５週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ、ＱＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
本発明の抗体を癌予防・治療に利用する場合、該抗体は抗腫瘍活性を持つものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の抗腫瘍活性の程度について調べる必要がある。抗腫瘍活性は、抗体の存在下および非存在下における癌細胞の増殖、アポトーシス誘導などを比較することにより測定することができる。
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第６，３３１，４１５号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってｍＲＮＡもしくは全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてＶＨおよびＶＬの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてＣＨおよびＣＬのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９，１９９１参照））を用い、常法に従ってＰＣＲでＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。常法を用いてＶＨとＣＨ、ＶＬとＣＬをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖ＤＮＡおよびキメラＬ鎖ＤＮＡを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするＤＮＡは別個のベクターに挿入してもよいし、１個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル由来のＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やＴｉベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればＦａｂが、ペプシンで分解すればＦ（ａｂ’）２がそれぞれ得られる。
また、マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを適当なリンカー、例えば１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、より好ましくは５〜２０アミノ酸からなるペプチド（例：［Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）ｍ］ｎもしくは［（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ］ｎ（ｍは０〜１０の整数、ｎは１〜５の整数）等）をコードするＤＮＡを介して連結することによりｓｃＦｖとすることができ、さらにＣＨ３をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｍｉｎｉｂｏｄｙモノマーとしたり、ＣＨ全長をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｓｃＦｖ−Ｆｃとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするＤＮＡは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを１つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりＦｖと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてＶＨおよびＶＬのＦＲ中の適当なアミノ酸をＣｙｓに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりｄｓＦｖと呼ばれる二量体が形成される。
（ｉｉ）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ））の配列がヒト由来であり、ＣＤＲの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを単離した後、常法により自動ＤＮＡシークエンサー（例：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｂａｔら，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ編，第５版，１９９１参照）等］を用いて解析し、両鎖のＣＤＲおよびＦＲを決定する。決定されたＦＲ配列に類似したＦＲ配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループＩおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩもしくはＩＩＩ（Ｋａｂａｔら，１９９１（上述）を参照）］のＣＤＲコード領域を、決定された異種ＣＤＲをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のＦＲと他の哺乳動物種由来のＣＤＲを有するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来ＣＤＲをヒト由来ＶＨおよびＶＬに移稙するには、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平５−２２７９７０号公報に記載の逐次ＣＤＲ移植法等が挙げられる。このようにして得られるＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、Ｆｖなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
（ｉｉｉ）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウト（ＫＯ）した非ヒト温血動物に機能的なヒトＩｇ遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトＩｇのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Ｔｇ）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスＩｇ遺伝子を通常のＫＯ技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７：３９１−３９７，１９９６を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトＩｇヒト抗体（ＨＡＨＡ）の産生は報告されていない。
その後、Ａｂｇｅｎｉｘ社［商品名：ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：１４６−１５６，１９９７；米国特許第５，９３９，５９８号等を参照）］やＭｅｄａｒｅｘ社［商品名：Ｈｕ−Ｍａｂ  Ｍｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−８５１，１９９６；米国特許第５，５４５，８０６号等を参照）］が酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いてより大きなヒトＩｇ遺伝子を導入したＴｇマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトＩｇ遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約８０種のＶ断片、約３０種のＤ断片および６種のＪ断片が様々に組み合わされたＶＤＪエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約１．５Ｍｂ（１４番染色体）、κＬ鎖が約２Ｍｂ（２番染色体）、λＬ鎖が約１Ｍｂ（２２番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ｉｇ遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）に挿入可能なＤＮＡは通常数ｋｂ〜数百ｋｂであり、クローニングしたＤＮＡを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３−１４３，１９９７）は、Ｉｇ遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（ｈＣＦ）をマウスに導入して（染色体導入（ＴＣ）マウス）、完全長ヒトＩｇ遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む１４番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む２番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスＥＳ細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトＩｇ遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドＥＳ細胞を選択し、通常のＫＯマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト１４番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ１４））およびヒト２番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ２））を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をＫＯされたマウス（ＫＯ（ＩｇＨ）およびＫＯ（Ｉｇκ））を作製し、これら４系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルＴＣ／ＫＯ）を樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブルＴＣ／ＫＯマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むｈＣＦ２がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
一方、前記Ｈｕ−Ｍａｂ  ＭｏｕｓｅはκＬ鎖遺伝子の約５０％を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約１０％しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つＹＡＣベクター（Ｉｇκ−ＹＡＣ）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、ＴＣ（ｈＣＦ１４）マウスとＨｕ−Ｍａｂ  Ｍｏｕｓｅとを交配してｈＣＦ１４とＩｇκ−ＹＡＣとを安定に保持するマウス（商品名：ＫＭマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト２２番染色体もしくはその断片を導入したＴＣマウス（ＴＣ（ｈＣＦ２２））を作製し、これと上記ダブルＴＣ／ＫＯマウスやＫＭマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１０８６−１０９０，２０００）。
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：８８９−８９４，２００２参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
（ｉｖ）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はＰＣＲによる変異がＣＤＲ以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のＨＡＨＡ産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ｆｆバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、ｇ３ｐ、ｇ６ｐ〜ｇ９ｐのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはｇ３ｐもしくはｇ８ｐのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、１）ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、２）融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、３）融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、１）の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには２）または３）のタイプが用いられる。
具体的なベクターとしては、Ｈｏｌｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：４４５−４４９，２０００）に記載されるものが例示される。例えば、ｐＣＥＳ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２１８−１８２３０，１９９９参照）は、１つのラクトースプロモーターの制御下にｇ３ｐのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとｇ３ｐシグナルペプチドの下流にＣＨ３をコードするＤＮＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を介してｇ３ｐコード配列とが配置されたＦａｂ発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとｇ３ｐコートタンパク質上にＦａｂを提示するが、アンバー変異を持たないＨＢ２１５１株などで発現させると可溶性Ｆａｂ抗体を産生する。また、ｓｃＦｖ発現型ファージミドベクターとしては、例えばｐＨＥＮ１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばＭ１３−ＫＯ７、ＶＣＳＭ１３等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるＳ−Ｓ結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術）等も挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、正常なヒトが保有するＶＨおよびＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のｍＲＮＡ等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないＩｇＭ由来のｍＲＮＡのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、ＣＡＴ社のライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４，１９９６参照）、ＭＲＣ社のライブラリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５，１９９４参照）、Ｄｙａｘ社のライブラリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９（上述）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４：７９６９−７９７４，２０００参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばＣＤＲ３等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なｓｃＦｖやＦａｂを産生するＶＨおよびＶＬ遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６：５７−８６，２０００参照）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：８５２，２０００参照）、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３９３８，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７２：２１９−２３３，２００３参照）等が挙げられる。
免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（１０１１〜１０１３ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（１００〜１，０００ファージ／クローン）を考慮すれば、１０８〜１０１１クローン程度が適当であり、約１０８クローンのライブラリーで通常１０−９オーダーのＫｄ値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を３〜５回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、ＢＳＡ溶液などのブロッキング液（１−２回）、Ｔｗｅｅｎ等の界面活性剤を含むＰＢＳ（３−５回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（ｐＨ５）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：０．１Ｍ塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはＳ−Ｓ結合の還元（例えば、前記したＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等）やＦＡＣＳあるいはＳＰＲを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：ＨＢ２１５１株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。Ｈｉｓ−ｔａｇやｃ−ｍｙｃ  ｔａｇを導入しておけば、ＩＭＡＣや抗ｃ−ｍｙｃ抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜約２０、好ましくは約１〜約５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約１〜約６週毎に１回ずつ、計約２〜約１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、該目的ポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。ここで「相同性」とは、前記した本発明のＤＮＡの場合と同義である。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表わされる塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドともいう）は、クローン化した、あるいは決定された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子（以下、単に本発明の遺伝子ともいう）の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができるか、あるいは本発明の遺伝子に関連するＲＮＡとの相互作用を介して本発明の遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の遺伝子に関連するＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の遺伝子に関連するＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、アンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、結果として本発明のタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１０〜約４０塩基、特に約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、本発明の遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンスポリヌクレオチドの好ましい標的領域として選択されうるが、本発明の遺伝子内の如何なる領域も対象として選択されうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡである本発明の遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスポリヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくは配列番号：１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，８巻，２４７頁または３９５頁，１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。本発明のタンパク質のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡへリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
本明細書においては、本発明のタンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含されるものとして定義される。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、本発明の遺伝子のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約３〜約１０塩基）のリンカーを介して連結したＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡがそれぞれ別個のＵ６やＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡがＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、ｓｉＲＮＡを形成させてもよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の本発明の遺伝子発現系、または生体内や生体外の本発明のタンパク質翻訳系を用いて調べることができる。
以下に、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、単に本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、上述の本発明の抗体、上述の本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの用途を説明する。
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、癌組織における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
さらに、本発明のタンパク質の発現および／または活性を阻害することにより、癌細胞のアポトーシスが促進され、癌細胞の増殖が抑制され、癌細胞の運動性が抑制されるので、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体、あるいは上記タンパク質の発現および／または活性を阻害する物質（例、低分子化合物）を含有する医薬は、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害および／または運動性阻害剤、従って、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療および／または転移抑制剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療および／または転移抑制剤）として使用することができる。尚、本明細書において「癌細胞」とは、将来的に癌化するように方向づけられている細胞をも含む概念として用いられる。
（１）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体（中和抗体）は、本発明のタンパク質の活性を中和することができるため、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）として使用することができる。本発明において中和とは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）、癌細胞の増殖シグナルの阻害（狭義の中和活性）、アポトーシスの誘導など（これらに限定されない）を包括した概念として定義される。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、促進剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
（２）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該遺伝子の発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明の遺伝子の機能や作用を抑制し、癌細胞のアポトーシスを誘導することができるので、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）として使用することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤、アポトーシス促進剤、増殖阻害剤などとして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜約１００ｍｇ投与する。
本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むポリヌクレオチド（本発明のセンスポリヌクレオチドともいう）および本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明の遺伝子の発現状況を調べるための診断用ヌクレオチドプローブ（もしくはプライマー）として使用することもできる。
（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進しており、さらに、本発明のタンパク質の発現および／または活性を阻害すると、癌細胞がアポトーシスを起こし、癌細胞の増殖が抑制され得る。従って、本発明のタンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩は、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）として使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、該タンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、該タンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、
（ａ−１）単離された本発明のタンパク質の活性を、被験物質の存在下と非存在下とで比較する方法と、
（ａ−２）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質の活性を比較する方法とに大別される。
上記（ａ−１）のスクリーニング方法において用いられる本発明のタンパク質は、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの製造方法を用いて、単離・精製することができる。
上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられる本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、それを生来発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、例えば、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ等が挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
上記（ａ−１）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質、または（ｉｉ）本発明のタンパク質および被験物質を、本発明のタンパク質により細胞増殖シグナルが活性化される温血動物細胞と接触させ、該細胞における細胞増殖またはアポトーシス誘導を測定することによって行うことができる。また、上記（ａ−１）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、該本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における細胞増殖またはアポトーシス誘導を測定することによって行うことができる。
アポトーシス（細胞死）誘導を指標とする場合には、細胞を適当な培地または緩衝液に懸濁し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらに酸化ストレス（例：Ｈ２Ｏ２添加）等の刺激を加えて、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３７℃で約６〜約７２時間インキュベートした後で、アポトーシス（細胞死）誘導率を測定する。
アポトーシス（細胞死）は、例えば、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いた形態学的観察により膜のブレッビング（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、細胞サイズの縮小化、クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化等を検出することにより調べることができる。例えば、マルチウェルプレート中で細胞を培養し、プレートから剥離した細胞あるいは膜のブレッビングを生じた細胞を顕微鏡下で計数し、視野中の全細胞に占める死細胞の割合（％）を計算する。数視野で観察を行ってそれらの平均値を細胞死誘導率とする。また、トリパンブルー、エリスロシンＢ、ネグロシン、エオシンＹ、フルオレッセンジアセテート、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド等の色素を用いて死細胞を染色、顕微鏡下で計数することによっても細胞死誘導率を導出することができる。さらに、ＤＡＰＩやヘキスト３３３４２等の蛍光色素を用いてＤＮＡを染色し、蛍光顕微鏡下でクロマチン凝縮の起こっている細胞を計数することもできる。あるいは、断片化されたＤＮＡの３’末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてビオチンや蛍光色素などで標識したｄＵＴＰを付加させ（ＴＵＮＥＬ法）、強く染色された細胞数を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて計数することにより、アポトーシス誘導率を算出することもできる。
また、粒子サイズ測定装置（例：Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ等）を用いて細胞サイズ分布を測定することにより縮小化・断片化した細胞数を計数し、アポトーシス誘導率を計算することができる。あるいは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて細胞サイズの縮小・アポトーシス小体への断片化を検出することにより、生死細胞を分離、細胞死誘導率を算出することもできる。
さらには、常法を用いて細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動してＤＮＡの断片化の度合をデンシトメーターなどを用いて測定することにより、生化学的にアポトーシスを検出することもできる。あるいは、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）が生細胞によりホルマザンに還元されることを利用して、マイクロプレートリーダーを用いて５７０〜６３０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することにより細胞死誘導率を算出することもできる。
例えば、上記（ａ−１）のスクリーニング方法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質の活性が、被験物質の非存在下における活性に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害された場合に、該被験物質を、本発明のタンパク質の活性阻害物質として選択することができる。
上述のように、本発明のタンパク質の発現を阻害する物質は、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害、従って癌の予防・治療に有効である。
すなわち、本発明はまた、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における該タンパク質の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のタンパク質の発現量は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド（即ち、前記した本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（本発明のセンスポリヌクレオチドともいう）、あるいは本発明のアンチセンスポリヌクレオチド）を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ｂ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いて測定、比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質の量を、本発明の抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
例えば、本発明のタンパク質のｍＲＮＡ量またはタンパク質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、Ｆａｓ、抗癌剤など）あるいは物理化学的ストレス（例えば、ＵＶ、活性酸素、虚血など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、本発明のタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質またはそれをコードするｍＲＮＡを、上記（ｉ）と同様にして定量、解析することができる。
本発明のタンパク質の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物に対して、薬剤あるいは物理化学的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、該動物から単離した細胞に含まれる本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量、または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより、あるいは
（ｉｉ）形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡ量または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより行うことができる。
被験物質としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記（ｃ）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、試料液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質を検出することにより試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法等が挙げられる。
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体は本発明のタンパク質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として本発明のタンパク質のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
試料液としては、本発明のタンパク質が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、本発明のタンパク質が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清から本発明のタンパク質を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中の本発明のタンパク質と標識した本発明のタンパク質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中の本発明のタンパク質と固相化した本発明のタンパク質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中の本発明のタンパク質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化した本発明のタンパク質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中の本発明のタンパク質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、細胞における本発明のタンパク質の生産量を感度よく定量することができる。
例えば、上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質の発現量（ｍＲＮＡ量またはタンパク質量）が、被験物質の非存在下における場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害された場合、該被験物質を、本発明のタンパク質の発現阻害物質として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に本発明のタンパク質ともいう）を含有する。本発明のタンパク質は上述のいずれかの方法を用いて、単離・精製されたものであってもよいし、あるいは上述のように、それを産生する細胞（温血動物細胞）の形態で提供されてもよい。
本発明のスクリーニングキットは、上記本発明のタンパク質を産生する細胞における該タンパク質の発現量を測定するために、上述の本発明の抗体、あるいは本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含有することもできる。
該スクリーニングキットは、上記に加えて、任意で、反応緩衝液、ブロッキング液、洗浄用緩衝液、標識試薬、標識検出試薬などを含むことができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質（遊離体であっても塩の形態であってもよい）は、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の治療・予防剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）として、低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該阻害物質の１回投与量は、投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（４）癌の診断剤
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被験液中の本発明のタンパク質の定量などに使用することができる。したがって、上述の本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の発現阻害物質のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の代わりに、被験温血動物から採取した生体試料（例、血液、血漿、尿、生検など）を用いてイムノアッセイを実施することにより、該動物体内における本発明のタンパク質の発現の度合を調べることができ、ひいては癌の診断に用いることができる。イムノアッセイの結果、該試料中の本発明のタンパク質の増加が検出された場合は、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。
同様に、前記した本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現過多などの遺伝子診断剤、特に癌の診断剤として有用である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは対応するアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されない。
本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施することができる。
例えば、被験温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、本発明のタンパク質の発現増加が検出された場合、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。
（５）本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。
例えば、強力な抗原提示細胞（例、樹状細胞）を本発明のタンパク質存在下に培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
また、本発明のタンパク質は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど）、防腐剤（例、チメロサールなど）、無痛化剤（例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン（例、インターロイキン−２などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために該タンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素）による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人（体重６０ｋｇ）に皮下的に注射剤として投与する場合、１回当たり通常０．１〜３００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３００ｍｇ程度である。ワクチン製剤の投与回数は１回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約２週間〜約６ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を２〜４回投与することもできる。
（６）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中ＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、または
ＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行うことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（７）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行うことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１、ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作製すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ              ：アデニン
Ｔ              ：チミン
Ｇ              ：グアニン
Ｃ              ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＬＹ６Ｇ６ＤをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ＬＹ６Ｇ６Ｄのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＰＴＰＲＯをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ＰＴＰＲＯのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＴＭ４ＳＦ１７ａをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＴＭ４ＳＦ１７ａのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｂをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｃをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｃのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｄをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｄのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｅをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｅのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｆをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｆのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｈをコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ＴＭ４ＳＦ１７ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号２０と共にｓｉＲＮＡ−１を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２０〕
配列番号１９と共にｓｉＲＮＡ−１を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２１〕
配列番号２２と共にｓｉＲＮＡ−２を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２２〕
配列番号２１と共にｓｉＲＮＡ−２を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２３〕
配列番号２４と共にｓｉＲＮＡ−３を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２４〕
配列番号２３と共にｓｉＲＮＡ−３を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：２５〕
プライマーＬＹ−ＨｉｎｄＡＴＧの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
プライマーＬＹ−ＴＡＧＸｂａの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
プライマーＬＹ−ＣｏＫｏＡＴＧの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
プライマーＬＹ−ＯｒＫｏＡＴＧの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
プライマーＬＹ−ＴＡＧＸｂａの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
プライマーＤＥＳＮＨＥ−Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
プライマーＤＥＳＮＨＥ−Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
合成ＤＮＡ  Ｈｉｓ−ＦＮｄｅＢａｍの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
合成ＤＮＡ  Ｈｉｓ−ＲＮｄｅＢａｍの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
ＬＹ６Ｇ−ＦＮＤＥの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ＬＹ６Ｇ−ＲＮＨＥの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
合成ＤＮＡ  ＨＡＴ−Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
合成ＤＮＡ  ＨＡＴ−Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ｓｉＲＮＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ｓｉＲＮＡ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
プライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
プライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
プライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
プライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
プライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
プライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
プライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
プライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
プライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
プライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
プライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
プライマー１２の塩基配列を示す。
【実施例】  以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で組織培養ディッシュから剥がし、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｔ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ａｍａｘａ社）の添付プロトコールに従い、トランスフェクションした。
具体的には、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を持つｓｉＲＮＡ−１を配列番号１９と配列番号２０のＲＮＡ断片をハイブリダイズさせることにより作製した。同様の方法で、ｓｉＲＮＡ−２を配列番号２１と配列番号２２のＲＮＡ断片を用い、ｓｉＲＮＡ−３を配列番号２３と配列番号２４のＲＮＡ断片を用いて作製した。上記のＲＮＡ断片は３’末端を２’−デオキシチミジンで２塩基付与したものを使用した。作製した３種のｓｉＲＮＡを等量ずつ混和しトランスフェクションに供した（以下、ｓｉＲＮＡ−Ｃと略する）。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なＲＮＡｉ効果を示さないことが保証されているｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社、以下ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。１００万個の細胞をＴ溶液（Ａｍａｘａ社）１００μｌで懸濁し、４０ｐｍｏｌのＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたは４０ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを添加し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ社）Ｔ−２０プログラムでｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。細胞を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）［培養培地］で洗浄した後、培養培地中、３７℃で、２４時間培養した。培養後、細胞を回収し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレートに播種し、培養培地中で、さらに５日間培養した。細胞培養液にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１ウェル当たり１０μＬ添加し、さらに３時間培養した。反応後の培養液を６２０ｎｍの吸光度を参照波長にとり、４５０ｎｍの吸光度を計測することにより、ミトコンドリア呼吸活性を測定した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて約２３％発光強度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した（図２Ａ）。
実施例２
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例１のトランスフェクション２４時間後に回収した細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の第２エクソンの一部と第３エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１μＬを加え、反応液量２０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に比してＬＹ６Ｇ６ＤのｍＲＮＡ発現量は５３％低下していた。これらの結果より、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の発現量の低下によりヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された（図２Ｂ）。
実施例３
ＰＴＰＲＯ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト肺癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌由来細胞株ＨＴ−２９を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４日間培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＰＴＰＲＯ遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を持つ３種のｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社）を混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、実施例１で使用したｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを用いた。２３０ｐｍｏｌのＰＴＰＲＯ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または２３０ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを含む３μＬの溶液を、ＨＴ−２９細胞１００万個を懸濁したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒ（Ａｍａｘａ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１００μＬと混合した後、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗ−０１７によりトランスフェクションした。この混合液をＨＴ−２９細胞培養液４ｍＬに全量添加し、２４時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を１ウェル当たり５千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレートに播種し、ＨＴ−２９細胞培養液中で、５％炭酸ガス気流中、３７℃で、さらに２日間培養した。Ｃｅｌｌ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（和光純薬）を１ウェルあたり１０μＬ添加し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で、さらに２時間放置した後、４５０ｎｍの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、ＰＴＰＲＯ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて約２０％吸光度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
実施例４
ＰＴＰＲＯ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるＰＴＰＲＯ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例３で用いたヒト大腸癌由来細胞株ＨＴ−２９を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で４日間培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＰＴＰＲＯ遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４０ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬ、ＰＴＰＲＯ遺伝子の第１５エクソンの一部と第１６エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を１μＬを加え、反応液量２０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＰＴＰＲＯ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に比してＰＴＰＲＯのｍＲＮＡ発現量は７０％低下していた。これらの結果より、ＰＴＰＲＯ遺伝子の発現量の低下によりヒト大腸癌由来細胞株ＨＴ−２９の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。
実施例５
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子全てのｍＲＮＡを切断する活性を持つ３種のｓｉＲＮＡを混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、実施例１で使用したｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを用いた。４ｐｍｏｌのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または４ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．２μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと混合した後、室温で２０分間放置した。上記混合液をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養液に全量添加し、更に２４時間培養を継続した後、培地を交換した。これらの細胞を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、３７℃で、さらに３日間培養した。培地を除去後、プレートを−８０℃で３０分間以上静置し、室温で５分間放置した。０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェルあたり２００μＬ添加し、１５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて約２３％蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。
実施例６
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例５で用いたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地に懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、実施例５の方法に準じてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約１００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の第１エクソンの一部と第２エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に比してＴＭ４ＳＦ１７のｍＲＮＡ発現量は９１％低下した。これらの結果より、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子もしくはＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子の発現量の低下によりヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。
実施例７
癌におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の発現亢進
癌患者より摘出した癌組織由来ｍＲＮＡ、および周辺正常組織由来ｍＲＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法を行うことにより、遺伝子発現プロファイルを作製した。遺伝子発現プロファイル解析の結果、当該遺伝子が癌組織において高発現していることが見出された。特に結腸直腸癌において、周辺正常組織に対する顕著な発現亢進が観察された（図１）。
実施例８
ヒト大腸癌培養細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量の検討
以下で使用されるヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＣＯＬＯ  ２０５、ＣＯＬＯ  ２０１、ＨＣＴ−１５、ＳＷ  ６２０、ＳＷ  ４８０、ＬｏＶｏ、ＳＷ  １１１６、ＳＷ  ８３７、ＳＷ  ９４８、ＨＣＴ−８、ＨＣＴ  １１６、ＬＳ  １２３、ＬＳ  １７４Ｔ、ＳＮＵ−Ｃ１、Ｃａｃｏ−２およびＨＴ−２９の１９株は、ＡＴＣＣより購入した。上記記載の細胞株１９株よりＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の添付プロトコールに従い、ランダムプライマーを用いた逆転写反応でｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲ反応を行うことにより、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の発現量の検討を行った。
該反応は上記トータルＲＮＡ  ４ｎｇより得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の第２エクソンの一部と第３エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。その結果、ヒト大腸癌細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量はＷｉＤｒ、ＣＯＬＯ  ２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ  ８３７、ＨＣＴ  １１６、ＬＳ１２３、ＬＳ  １７４Ｔ、Ｃａｃｏ−２およびＨＴ−２９の９株が検出限界以下であったが、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＣＯＬＯ  ２０１、ＨＣＴ−１５、ＳＷ  ６８０、ＳＷ  ４８０、ＳＷ  １１１６、ＳＷ  ９４８、ＨＣＴ−８、およびＳＮＵ−Ｃ１の１０株で発現が認められた。そして、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量がβ−アクチン遺伝子発現量の約１％と高発現しているＣＯＬＯ  ３２０ＤＭが見出された。
実施例９
ヒト正常組織およびヒト癌細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量の検討
Ｈｕｍａｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてヒト正常組織およびヒト癌細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量を検討した。ヒト正常組織としてＡｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ、Ｂｒａｉｎ（Ｗｈｏｌｅ）、Ｂｒａｉｎ（ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、Ｂｒａｉｎ（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）、Ｂｒａｉｎ（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、Ｂｒａｉｎ（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）、Ｃｏｌｏｎ、Ｈｅａｒｔ、Ｋｉｄｎｅｙ、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ、Ｌｉｖｅｒ、Ｌｕｎｇ、Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ、Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ、Ｏｖａｒｙ、Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｇｌａｎｄ、Ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ、Ｓｍａｌｌ、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｓｐｌｅｅｎ、Ｔｅｓｔｉｓ、Ｔｈｙｍｕｓ、Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｇｌａｎｄ、Ｕｔｅｒｕｓ、Ｆｅｔａｌ  Ｂｒａｉｎ、Ｆｅｔａｌ  ＫｉｄｎｅｙおよびＦｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒを用いた。ヒト癌細胞株としてＭｅｌａｎｏｍａ（Ｇ３６１）、Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ａ５４９）、Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｄａｕｄｉ）、Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＭＯＬＴ−４）、Ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＨＬ−６０）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＰＣ−３）およびＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＳＷ４８０）を用いた。上記のｃＤＮＡ  １．５ｎｇを鋳型とし、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量および内部標準としてβ−アクチン遺伝子発現量を実施例８に記載した方法に従い定量的ＰＣＲ法により計測した。その結果、β−アクチン遺伝子発現量に対するＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量は、ヒト癌細胞株Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＳＷ４８０）で０．５８％と高かった。一方、ヒト正常組織ではＴｅｓｔｉｓの０．４５％やＰｒｏｓｔａｔｅの０．１５％を除いてほとんどが０．１％を下回るか検出限界以下であった。
これらの結果より、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子はヒト正常組織ではほとんど発現が認められないことが示された。
実施例１０
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０  ＤＭの細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭを、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり１千６百個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種すると同時に、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、実施例１で作製したＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を持つｓｉＲＮＡ−２をトランスフェクションに供した。コントロールとしては、実施例１で使用したｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを用いた。２ｐｍｏｌのＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたは２ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．１２μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬを混合し、この混合液を９６穴平底組織培養プレートの１ウェルに全量添加し、室温で２０分間放置した。次に、９６穴平底組織培養プレートに１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁した細胞を１ウェル当たり１千６百個の細胞密度で播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で、一晩培養した。トランスフェクション１日後、培地を交換し、さらに、３日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１ウェル当たり１００μＬ添加し、遮光下で、３０分間攪拌し、発光強度を計測することにより、細胞内ＡＴＰ含量を測定した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて約２９％発光強度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した（図３Ａ）。
実施例１１
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０ＤＭのｍＲＮＡ発現量低下
実施例１０のトランスフェクション１日後に回収した細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量および内部標準としてβ−アクチン遺伝子発現量の測定は、トータルＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを鋳型とし、実施例８に記載した方法に従い定量的ＰＣＲ法により計測した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に比してＬＹ６Ｇ６ＤのｍＲＮＡ発現量は７７％低下していた（図３Ｂ）。これらの結果より、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現量の低下によりヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭの細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。
実施例１２
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６におけるオフターゲット効果と導入効率の確認
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子を発現しないヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含む。ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり１千６百個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種すると同時に、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。並行してＧＡＰＤＨ遺伝子に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ＧＡＰＤＨ遺伝子量の低下により導入効率の確認を行った。
具体的には、実施例１で作製したＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を持つｓｉＲＮＡ−２をトランスフェクションに供した。コントロールとしては、実施例１で使用したｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを用いた。導入効率の確認用としてＧＡＰＤＨ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。２ｐｍｏｌのＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．０８μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬを混合し、この混合液を９６穴平底組織培養プレートの１ウェルに全量添加し、室温で２０分間放置した。次に、９６穴平底組織培養プレートに１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁した細胞を１ウェル当たり１千６百個の細胞密度で播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で、一晩培養した。トランスフェクション１日後、培地を交換し、さらに３日間培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、−８０℃で３０分間以上静置させ、室温で５分間放置した後、０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェル当たり２００μＬ添加し、１５分間攪拌させた。励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて蛍光強度は１０４％と差がなかった（図４Ａ）。
一方、トランスフェクション１日後に回収した細胞を、実施例１０の方法に準じてトータルＲＮＡを抽出および逆転写反応させた。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを鋳型とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量をＨｕｍａｎ  ＧＡＰＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、内部標準としてβ−アクチン遺伝子発現量を実施例８と同様の定量的ＰＣＲ法により計測した。その結果、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べてＧＡＰＤＨ遺伝子発現量が８４％低下しており、本実験におけるｓｉＲＮＡ導入効率は良好であった（図４Ｂ）。
上記の結果で、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡがＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子を発現しない細胞において増殖抑制を誘発しなかったことから、実施例１１で記載したＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与による細胞増殖抑制の誘発作用がオフターゲット効果によるものでないことが示された。
実施例１３
組換え型完全長ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、ＬＹ−ＨｉｎｄＡＴＧ：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡ  ＡＡＣＣＣＣＡＧＴＴ  ＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：２５）とＬＹ−ＴＡＧＸｂａ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴ  ＣＣＧＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＴＣＣ−３’（配列番号：２６）のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。該反応液２０μｌは、０．５μＬの上記ｃＤＮＡ、１Ｕ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）、各０．５μＭの上記プライマー、４００μＭ  ｄＮＴＰｓ、および１０μｌ  ２ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を含む組成とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分を３５サイクル繰り返し、さらに７２℃・７分間伸長反応を行った。得られたＰＣＲ反応産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ＰＣＲクロニニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングし、プラスミドＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを得た。塩基配列を解析した結果、配列番号：１で表されるｃＤＮＡの塩基配列を有していた。
上記で得たプラスミドＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩにて処理した。これらをアガロースゲル電気泳動で分離後、ＬＹ６Ｇ６Ｄをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片とｐｃＤＮＡ３．１（＋）に相当するＤＮＡ断片をそれぞれ回収し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択し、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を有するプラスミドＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を得た。
上記で得たプラスミドＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を鋳型とし、コザック配列を含むＬＹ−ＣｏＫｏＡＴＧ：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡ  ＡＡＣＣＣＣＡＧＴＴ  ＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：２７）あるいはＬＹ−ＯｒＫｏＡＴＧ：５’−ＡＣＴＧＣＧＡＴＧＡ  ＡＡＣＣＣＣＡＧＴＴ  ＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：２８）とＬＹ−ＴＡＧＸｂａ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴ  ＣＣＧＣＴＣＣＡＣＡ  ＧＴＣＣ−３’（配列番号：２９）のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。該反応液５０μＬは、１．６３ｎｇの上記ｃＤＮＡ、１Ｕ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、各０．３μＭの上記プライマー、３００μＭ  ｄＮＴＰｓ、および１ｍＭ  硫酸マグネシウムを含む組成とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分を２５サイクル繰り返した。ＰＣＲ反応産物の３’端にｄＡＴＰを付加するため、５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を添加して７２℃・７分間保温した。得られたＰＣＲ反応産、物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングし、プラスミドＣｏＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯおよびＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを得た。
上記で得たプラスミドＣｏＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯおよびＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを制限酵素ＳＰｅＩおよびＸｂａＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＳＰｅＩおよびＸｂａＩにて処理した。これらをアガロースゲル電気泳動で分離後、ＬＹ６Ｇ６Ｄをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片とｐｃＤＮＡ３．１（＋）に相当するＤＮＡ断片をそれぞれ回収し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択し、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を有するプラスミドＣｏＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）およびＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を得た。
実施例１４
組換え型ポリヒスチジンタグ付き分泌型ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の大腸菌用発現ベクターの構築
ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓ発現用プラスミドの作製にあたり、先ず目的遺伝子のＮ末端とＣ末端のどちらにも６×Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を付加させることのできるタグ付きの発現用ベクターを作製した。すなわち、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−３ａ（ＭＥＲＣＫ社）の２２９ｂｐに存在するＮｈｅ  Ｉ制限酵素切断サイトがなくなるように、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のプロトコールに従って、ＤＥＳＮＨＥ−Ｆ：５’−ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ  ＴＧＧＣＧＴＧＣＴＣ  ＣＴＡＧＣＧＣＴＡＴ  ＡＴＧＣＧ−３’（配列番号：３０）とＤＥＳＮＨＥ−Ｒ：５’−ＣＧＣＡＴＡＴＡＧＣ  ＧＣＴＡＧＧＡＧＣＡ  ＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧ  ＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：３１）をプライマーとしてｐＥＴ−３ａを鋳型にＰＣＲ反応を行って、変異を導入したｐＥＴ３ａ−ｄｅｓＮｈｅを作製した。次にｐＥＴ−３ａの制限酵素サイトＮｄｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉの間に、開始コドン＋６×Ｈｉｓ配列＋Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素切断サイド＋６×Ｈｉｓ配列＋終始コドンとなるように、合成ＤＮＡ  Ｈｉｓ−ＦＮｄｅＢａｍ：５’−ＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣ  ＡＴＣＡＴＣＡＴＣ  ＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡ  ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ  ＣＡＴＣＡＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：３２）とＨｉｓ−ＲＮｄｅＢａｍ：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴ  ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ  ＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡ  ＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴ  ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ  ＣＡ−３’（配列番号：３３）を作製し、それぞれを１０ｍＭになるようにＴＥで希釈後、等量を混合し、９５℃・１０ｍｉｎ加熱後徐冷してアニーリングを行った。上記で得られたｐＥＴ３ａ−ｄｅｓＮｈｅを制限酵素Ｎｄｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルより抽出した。この制限酵素処理した発現用ベクターとアニーリング溶液を混合しＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）で連結させて、６×Ｈｉｓ−ｔａｇを付加した大腸菌発現用ベクターｐＥＴ３−ＨＨを作製した。
次に、Ｃ末端６×Ｈｉｓ−ｔａｇ付加用としてＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の５’末端側にＮｄｅ  Ｉと３’端側にＮｈｅ  Ｉの制限酵素切断サイトを付加するようなプライマーを用いＰＣＲ反応を行い、上記で作製したｐＥＴ３−ＨＨに挿入することによりＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓ発現用ベクターを作製した。すなわち、ＬＹ６Ｇ−ＦＮＤＥ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＣＣ  ＧＡＡＴＧＣＧＧＴＧ  ＣＴＡＣＡＡ−３’（配列番号：３４）とＬＹ６Ｇ−ＲＮＨＥ：５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＴＧ  ＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣ  ＣＣＡＧＧＴ−３’（配列番号：３５）を用い、実施例１３で得たプラスミドＬＹ６Ｇ６Ｄ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を使用して、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で９８℃・１０ｓｅｃ、６０℃・１０ｓｅｃ、７２℃・３０ｓｅｃのＰＣＲ反応を３５回行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により分離し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで回収後、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングしてｐＣＲ４／ＬＹ６Ｇ６Ｄを得た。塩基配列を確認後、ｐＣＲ４／ＬＹ６Ｇ６Ｄ及び発現用ベクターｐＥＴ３−ＨＨを制限酵素Ｎｄｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）とで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔでＤＮＡ断片と発現用ベクターを回収し、制限酵素Ｎｄｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉで処理したＤＮＡ断片と発現用ベクターをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈで連結させ、Ｃ末端に６×Ｈｉｓ−ｔａｇを付加させたＬＹ６Ｇ６Ｄ発現用ベクターｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓを作製した。
組換え型ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質の調製は、上記で作製したｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ９Ｄ−ＨｉｓプラスミドをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に形質転換させて行った。形質転換して得られた大腸菌を２００ｍＬのＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．０１％アンピシリン）に接種し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液を３Ｌの主発酵用培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０２４％硫酸マグネシウム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩化チアミン、１．５％ソルビトール、１．５％カザミノ酸、０．０１％アンピシリン）を仕込んだジャー培養槽に移植して、３７℃、通気量３Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数２００ｒｐｍで培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、培養温度を２０℃に下げた後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、さらに４時間培養を行うことでＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓの誘導発現を行った。培養終了後、培養液を５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心分離を行い、ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓ発現大腸菌を得た。ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓ発現大腸菌を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁後、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）を用いて１００ＭＰａで２回処理した。この破砕液を超遠心分離（１０，０００×Ｇ、３０ｍｉｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）し、得られた上清を予めＰＢＳで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ社）カラムに通液して吸着させた後、５０ｍＭ  イミダゾールを含むＰＢＳで洗浄後２５０ｍＭ  イミダゾールを含むＰＢＳで溶出させた。この溶出液を２Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調整し、さらに１０％グリセロールを添加した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ５Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）で濃縮を行った。濃縮後の溶液を、予め１０％グリセロールを含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムでゲルろ過を行い、精製ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質とした。タンパク質濃度は、ＢＳＡをスタンダードとしてＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて測定した。
実施例１５
組換え型ＨＡＴタグ付き分泌型ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の大腸菌用発現ベクターの構築
実施例１４で作製した発現用ベクターｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨｉｓのＨｉｓの部分を切り出し、合成ＤＮＡで作製したＨＡＴ（ヒスチジンアフィニティータグ）を挿入してＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴ発現用プラスミドを作製した。すなわち、合成ＤＮＡ  ＨＡＴ−Ｆ：５’−ＣＴＡＧＣＡＡＧＧＡ  ＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣ  ＣＡＣＡＡＴＧＴＣＣ  ＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡ  ＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴ  ＧＣＣＣＡＣＡＡＣＡ  ＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号：３６）とＨＡＴ−Ｒ：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴ  ＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣ  ＡＴＧＡＧＣＧＴＧＣ  ＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴ  ＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧ  ＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡ  ＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：３７）を作製し、それぞれを１０ｍＭになるようにＴＥで希釈後、等量を混合し、９５℃・１０ｍｉｎ加熱後徐冷してアニーリングを行った。上記で作製したｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓを制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルより抽出した。この制限酵素処理した発現用ベクターとアニーリング溶液を混合しＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈで連結させて、ＨＡＴを付加した大腸菌発現用ベクターｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴを作製した。
組換え型ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴタンパク質の調製は、上記で作製したｐＥＴ３／ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴプラスミドをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて行った。形質転換して得られた大腸菌を２００ｍＬのＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．０１％アンピシリン）に接種し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液を３Ｌの主発酵用培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０２４％硫酸マグネシウム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩化チアミン、１．５％ソルビトール、１．５％カザミノ酸、０．０１％アンピシリン）を仕込んだジャー培養槽に移植して、３７℃、通気量３Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数２００ｒｐｍで培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、培養温度を２０℃に下げた後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、さらに４時間培養を行うことでＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴの誘導発現を行った。培養終了後、培養液を５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心分離を行い、ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴ発現大腸菌を得た。ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴ発現大腸菌を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁後、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて１００ＭＰａで２回処理した。この破砕液を超遠心分離（１０，０００×Ｇ、３０ｍｉｎ）し、得られた上清を予めＰＢＳで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムに通液して吸着させた後、２５ｍＭ  イミダゾールを含むＰＢＳで洗浄後２５０ｍＭ  イミダゾールを含むＰＢＳで溶出させた。この溶出液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ５Ｋで濃縮後、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムでゲルろ過を行い、精製ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴタンパク質とした。タンパク質濃度は、ＢＳＡをスタンダードとしてＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。
実施例１６
抗ＬＹ６Ｇ６Ｄウサギポリクローナル抗体の作製と精製
実施例１４で調製した組換え型ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質を免疫原として抗ＬＹ６Ｇ６Ｄウサギポリークローナル抗体を作製した。
ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質のＰＢＳ溶液とフロインド完全アジュバントとを等量混合して作製したエマルションを、家兎（日本白色種、雌、３ｋｇ）３羽の背部皮下および皮内に１羽あたりＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質として０．１ｍｇずつ免疫した。２回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバントを用いたタンパク質エマルションを同様に調製し、２週間毎に７回追加免疫した。免疫前および４回目と６回目の免疫１週間後に耳静脈より試験採血し、ＬＹ６Ｇ６Ｄ−Ｈｉｓタンパク質をコートしたイムノプレードを用いたＥＬＩＳＡにより血清抗体価の上昇を確認した。最終免疫の１週間後に３羽のウサギより麻酔下頚動脈採血を行い、それぞれ７７．６ｍＬ、７７．０ｍＬ、７１．７ｍＬの抗血清を取得した。
上記で得られた抗血清を１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で２倍希釈し、プロテインＡセルロファイン（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社）カラムに供した。カラムを１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２５Ｍグリシン・塩酸緩衝液、ｐＨ２．５で溶出し、溶出液を速やかに１Ｍトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ９で中和した。中和した溶出液を実施例１５で作製した組換え型ＬＹ６Ｇ６Ｄ−ＨＡＴタンパク質をＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に固定化し作製した抗原カラムに供した。カラムを１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５、１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４、そして１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３で段階的に溶出し、これらの溶出液を速やかに１Ｍトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ９で中和した。分画分子量１万の膜を装着したビバスピン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いてＰＢＳに置換すると共にし、抗ＬＹ６Ｇ６Ｄウサギポリクローナル抗体（Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３）を取得した。
実施例１７
ＬＹ６Ｇ６Ｄ一過性発現による細胞増殖への影響
プラスミド発現ベクター導入によりＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質を一過性発現させ、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が細胞の増殖速度に及ぼす影響を調べた。
具体的には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌由来ＨＣＴ１１６細胞５０万個を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２ｍＬに懸濁し、６穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で１日培養した。次に、１μｇのコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）あるいは、実施例１３で作製したＬＹ６Ｇ６Ｄ発現ベクター、（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＣｏＬＹ６Ｇ６Ｄ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５０μＬと、３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  ２５０μＬを混合し、室温で２０分間放置した。この混合液を培養液に滴下し、８時間培養した後、培地を交換し、さらに１日培養を継続した。
各プラスミドのトランスフェクション２日後の細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、２千個の細胞を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地に懸濁し、９６穴平底組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種し、陰性コントロールとしてＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路阻害剤のＬＹ２９４００２を２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、ＭＡＰＫ経路阻害剤のＰＤ９８０５９を１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路阻害剤のＳＢ２０３８５を１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、または、ＪＮＫ経路阻害剤のＳＰ６００１２５を１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭとなるように加えた。各細胞内シグナル伝達経路阻害剤についても０．１％ＤＭＳＯとなるようにした。５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間培養した後、実施例１２に記載した方法に従い細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、陰性コントロール群において、ＬＹ６Ｇ６Ｄ発現ベクター（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＣｏＬＹ６Ｇ６Ｄ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ）導入細胞はマントロールベクター導入細胞に比べて蛍光強度が１．３４倍および１．７０倍と増加しており、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）を示した（図５Ａ）。この増殖促進作用はＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路阻害剤のＬＹ２９４００２によって用量依存性に抑制された（図５Ｂ）。
実施例１８
ＬＹ６Ｇ６Ｄ一過性発現によるＡＫＴリン酸化への影響
実施例１７の方法に従いプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）あるいはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄを導入し、トランスフェクション１日後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、牛胎仔血清を含まないＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地でさらに一晩培養した。次に、培養液を除去し、１０％牛胎仔血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地を添加して５分間あるいは１５分間、５％炭酸ガス気流下、３７℃で保温した。１０％牛胎仔血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地で保温した細胞と保温前の細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、氷冷した２００μＬ改変ＲＩＰＡ緩衝液〔５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５％ＳＤＳ、０．２５％デオキシコール酸、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−１（Ｓｉｇｍａ社）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−２（Ｓｉｇｍａ社）〕を添加し４℃で１５分間放置した。この改変ＲＩＰＡ緩衝液を回収し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。これら無細胞抽出液のタンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定し、タンパク質濃度が揃うように改変ＲＩＰＡ緩衝液で希釈した後、５倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを５分の１容量混合し、９５℃で５分間加熱し、２０μＬを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットＰ膜（ＡＴＴＯ社）に転写した後、ブロッキング溶液〔５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％スキムミルク〕中に１時間室温放置した。次に、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）あるいはウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を、５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ＢＳＡ溶液で２千倍希釈し、室温にて２時間反応させた。続いて、ブロッキング溶液で１万倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ社）中で１時間室温放置した。検出にはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用い、５添付プロトコールに従いリン酸化Ａｋｔあるいは総Ａｋｔタンパク質を検出した。その結果、牛胎仔血清で１５分間処理したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄ導入細胞は同処理ｐｃＤＮＡ３．１（＋）導入細胞に比べてリン酸化Ａｋｔ量が増加していた。一方、総Ａｋｔ量は変わらなかった（図５Ｃ）。
これらの結果から、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質はＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を活性化させることで、細胞増殖を促進させる機能を有していることが示された。
実施例１９
組み換型完全長ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質安定発現細胞株の樹立
実施例１７においてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＣｏＬＹ６Ｇ６ＤあるいはｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＯｒＬＹ６Ｇ６Ｄをトランスフェクションし２日間培養した細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を分散し、１０％牛胎仔血清、８００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地［Ｇ４１８選択培地］に懸濁し、Ｔ−１５０組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した。３日または４日ごとにＧ４１８選択培地を交換しながら５％炭酸ガス気流下、３７℃で１０日間培養を継続した。Ｇ４１８耐性細胞を１ウェル当たり０．８個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレートに播種し、１個の細胞が増殖してコロニーを形成したウェルから細胞を回収し、４８穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した。細胞密度が５０％以上になるまで培養を継続した後、６穴組織培養プレートに播種した。細胞密度が５０％以上になるまで培養を継続し、各クローンをセルバンカー（ＺＥＮＯＡＱ社）に懸濁し、−８０℃で保存した。一方で、１２穴組織培養プレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した各クローンをＰＢＳで洗浄後、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ細胞を分散させ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞を懸濁し、終濃度１μｇ／ｍＬとなるように実施例１６で得たＲ２抗体を加え、氷中に２時間放置した。次に、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含むＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）で懸濁し、氷上にて１時間放置した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）で再び懸濁した後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析し、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質を細胞表層に局在する安定発現細胞株として高発現クローン（Ｃ０３、Ｃ１２およびＯ０３）、中発現クローン（Ｃ０１およびＯ３０）および低発現クローン（Ｃ０７）の計６クローンを得た。
実施例２０
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質がＧＰＩアンカー型細胞膜タンパク質であることの証明（ＰＩ−ＰＬＣ処理）
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質がＧＰＩ（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）を介して細胞表層に局在するかを調べた。具体的には、実施例１９で得たＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株６クローン（Ｃ０１、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ１２、Ｏ０３およびＯ３０）をサブコンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳで洗浄した細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、１００万個の細胞を再度ＰＢＳで洗浄した後、ｌｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＰＩ−ＰＬＣ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｓｐｅｓｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｌｉｐａｓｅ  Ｃ、Ｓｉｇｍａ社）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ溶液１００μＬあるいはＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ溶液１００μＬに懸濁し、３７℃で、９０分間反応させた。
上記で反応させた５０万個の細胞をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に懸濁し、終濃度３μｇ／ｍＬとなるように実施例１６で得たＲ２抗体を加え、氷中に１時間放置した。次に、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含むＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）で懸濁し、氷上にて１時間放置した。次にＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析した。その結果、全てのＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株において、ＰＩ−ＰＬＣを反応させることにより染色強度が低下した（図６Ａ）。
一方、上記で反応させた５０万個の細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔６２．５ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルーおよび２％２−メルカプトエタノール〕に懸濁し、９５℃で５分間加熱した後、２０μＬを１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットＰ膜（ＡＴＴＯ社）に転写した後、ブロッキング溶液〔５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルク〕中に１時間室温放置した。次に、実施例１６で得たＲ２抗体を３μｇ／ｍＬの濃度となるように５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ＢＳＡ溶液で希釈し、４℃にて２時間保温させた。続いて、ブロッキング溶液で１０万倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ社）中で１時間室温放置した。検出にはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用い、添付プロトコールに従いＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質を検出した。その結果、全てのＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株で認められた分子量１５ｋＤから２０ｋＤのＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的なバンドが、ＰＩ−ＰＬＣを反応させたことにより減少した（図６Ｂ）。
上記の結果からＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質がＧＰＩを介して細胞表層に局在していることが明らかとなった。
実施例２１
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の糖鎖修飾の検討
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の生化学的な特徴付けるため糖鎖修飾について調べた。具体的には、実施例１９で得たＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現株Ｃ０３クローンを２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、１００万個の細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５の低張液で懸濁し、氷上２０分間放置し、細胞を破裂させた。破砕させた細胞を低張液で３回洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳおよび０．４％２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁し、９５℃で５分間加熱した後、ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＤＥＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＯＮ  ＫＩＴ（ＰＲＯＺＹＭＥ社）の処方に従い、１）酵素なし、２）Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、３）Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）およびＳｉａｌｉｄａｓｅ  Ａ、４）Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ＡおよびＯ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅを加え、３７℃、４時間反応させた。５倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔３１２．５ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、４０％グリセロール、５％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルーおよび１０％２−メルカプトエタノール〕を５分の１容量で混合し、９５℃で５分間加熱した後、２μＬを１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。検出は実施例２０記載の方法に準拠した。その結果、分子量約１５ｋＤから約２０ｋＤにかけて出現したＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的なバンドが１５ｋＤへと集束された。
この結果からＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質はシアル酸を含有するＮ−ｌｉｎｋｅｄ糖鎖およびＯ−ｌｉｎｋｅｄ糖鎖の修飾を受けることが示された（図７）。
実施例２２
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０  ＤＭおよびＳＷ４８０のタンパク質発現量低下
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭまたはヒト大腸癌細胞株ＳＷ  ４８０を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）［培養培地］で懸濁し、７５万個の細胞密度で１０ｃｍφ組織培養ディッシュ（ＢＤファルコン社）に播種すると同時に、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。具体的には、実施例１で作製したＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を持つｓｉＲＮＡ−２をトランスフェクションに供した。コントロールとしては、実施例１で使用したｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを用いた。４００ｐｍｏｌのＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたは４００ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．２５ｍＬと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１５μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．２５ｍＬを混合液し、この混合液を１０ｃｍφ組織培養ディッシュに全量添加し、室温で２０分間放置した。放置後の１０ｃｍφ組織培養ディッシュに各培養培地に懸濁した細胞を７５万個の細胞密度で播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で、一晩培養した。トランスフェクション１日後に培地を交換し、さらに１日間培養した細胞を１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、実施例２１に記載した方法で細胞を破裂させ、０．５％ＳＤＳおよび１％２−メルカプトエタノールを含む水溶液に懸濁し、９５℃で１０分間加熱した後、ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＤＥＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＰＲＯＺＹＭＥ社）の処方に従い、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５０ｍＭ  リン酸緩衝液となるように加えた後、さらにＮ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ＡおよびＯ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅを添加し、３７℃、４時間反応させた。次に、５倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを５分の１容量で混合し、９５℃で５分間加熱した後、２５μＬを１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。検出は実施例１６で得たＲ２抗体を５μｇ／ｍＬの濃度として実施例２０に記載した方法に準拠した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的な分子量１５ｋＤバンドがＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ投与により減少した（図８）。
この結果から、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質のダウンレギュレーションが細胞増殖の抑制を誘発することが示された。
実施例２３
大腸癌細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量の解析
ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子発現細胞株におけるＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の発現を調べた。具体的には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＳＮＵ−Ｃ１、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でサブコンフルエントまで培養し、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、２００万個の細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例２１に記載した方法に従い細胞を破裂させ、０．５％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁し、９５℃で１０分間加熱した。次にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１％となるように加えた後、ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＤＥＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＰＲＯＺＹＭＥ社）の処方に従いＮ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ＡおよびＯ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅを加え、３７℃、４時間反応させた。５倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを５分の１容量で混合し、９５℃で５分間加熱した後、２０μＬを１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。検出は実施例１６で得たＲ２抗体を３μｇ／ｍＬの濃度として実施例２０に記載の方法に準拠した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の発現細胞株ＳＮＵ−Ｃ１、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１およびＳＷ４８０においてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的な分子量１５ｋＤバンドが検出された。一方、ＬＹ６Ｇ６Ｄ遺伝子の非発現細胞株ＨＣＴ１１６ではそのバンドは検出されなかった（図９）。
実施例２４
ＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株の細胞増殖速度（平板培養）
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質が細胞の増殖速度に影響を及ぼすか調べた。実施例１９で得たＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株６クローン（Ｃ０１、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ１２、Ｏ０３およびＯ３０）をサブコンフルエントになるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で組織培養ディッシュから剥がし、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（プロメガ社）、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で培養させた。１日培養した細胞あるいは３日培養した細胞を実施例１２に記載した方法に従い細胞内ＤＮＡ含量を測定し、細胞内ＤＮＡ含量が培養開始１日目に対する３日目の倍数を算出し増殖速度とした。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量（実施例２０におけるＰＩ−ＰＬＣ非処理細胞のＦＡＣＳｃａｎ解析結果）と細胞増殖との間で正の相関関係（Ｒ＝０．８４４５）を示した（図１０）。
実施例２５
ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の局在性検討（細胞染色）
１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養培地で２か月馴化培養した実施例１９で得たＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株クローンＣ１２とヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で組織培養ディッシュから剥がし、上記培養培地に懸濁し、ポリ  Ｄ−リシンコート８穴チャンバースライド（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で２日間培養させた。その後、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンを用いて室温で２０分５間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳを加えて室温で５分間透徹した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加え、室温で１時間ブロッキングした。実施例１６で得たＲ２抗体を１μｇ／ｍＬ含むブロッキング溶液を加え、４℃で２時間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含むブロッキング溶液を加え、室温で１時間放置した後、ＰＢＳで４回洗浄した。ＤＡＰＩを含む封入剤で核を染色した。蛍光顕微鏡下でＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質の染色部位を観察した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質は細胞が隣接している箇所ほど細胞の輪郭が強く染色された（図１１）。
実施例２６
ＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株の細胞増殖速度（三次元的培養）
１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養培地で２か月馴化培養した実施例１９で得たＬＹ６Ｇ６Ｄ安定発現細胞株６クローン（Ｃ０１、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ１２、Ｏ０３およびＯ３０）とアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６とで三次元的培養における細胞増殖能および馴化後におけるＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量を比較した。具体的にはサブコンフルエントになるまで培養した各細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で組織培養ディッシュから剥がし、上記培養培地に懸濁し、１ウェル当たり１万５千個の細胞密度で９６穴スフェロイド培養プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社）に播種し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で４日間培養させた。その後、５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴを含むＰＢＳを１０μｌ加え、さらに４時間培養した後、培養液を抜き取り、０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロパノールを加え、遮光して室温で１時間攪拌した。６９０ｎｍを対照に取り、５４０ｎｍの吸光度を計測することにより、ミトコンドリア呼吸能を測定した。一方、サブコンフルエントになるまで培養した各細胞を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで分散し、２μｇ／ｍＬの実施例１６で得たＲ２抗体を４℃で１時間、５μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を４℃で３０分間放置し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析した。その結果、ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量とミトコンドリア呼吸能との間で正の相関関係（Ｒ＝０．９３５）を示した（図１２）。
実施例２７
ヒト大腸癌組織および正常組織におけるＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量の解析
Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社）およびＴｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社）を用いてヒト大腸癌組織および正常組織ＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質発現量を検討した。ヒト大腸癌組織サンプルとしてＣｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒを７サンプル、Ｒｅｃｔｕｍ  ｃａｎｃｅｒを４サンプル用いた。ヒト正常組織としてＣｏｌｏｎとＲｅｃｔｕｍが２サンプル、Ｂｒｅａｓｔ、Ｌｕｎｇ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｏｖａｒｙ、Ｂｒａｉｎ、Ｔｅｓｔｉｓ、Ｈｅａｒｔ、Ｌｉｖｅｒ、Ｋｉｄｎｅｙ、Ｋｉｄｎｅｙ、ＳｔｏｍａｃｈおよびＳｐｌｅｅｎが各１サンプル用いた。上記組織抽出液のタンパク質濃度が３．３ｍｇ／ｍＬとなるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔６２．５ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルーおよび２％２−メルカプトエタノール〕で希釈し、９５℃で１０分間加熱変性させた後、４５μｇのタンパク質をＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＤＥＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＰＲＯＺＹＭＥ社）の処方に従い、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液となるように加え、次に、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ＡおよびＯ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅを加え、３７℃、３時間反応させた。５倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔３１２．５ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、４０％グリセロール、５％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルーおよび１０％２−メルカプトエタノール〕を５分の１容量で混合し、９５℃で５分間加熱した後、１０μＬを１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットＰ膜（ＡＴＴＯ社）に転写した後、ブロッキング溶液〔５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ＢＳＡ〕中に１時間室温放置した。次に、ブロッキング溶液に３μｇ／ｍＬとなるように希釈した実施例１６で得たＲ２抗体を室温で２時間保温させた。続いて、５０ｍＭ  トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルクで２千倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を室温で１時間保温した。検出にはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用い、添付プロトコールに従いＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質を検出した。これらの結果より、ヒト大腸癌組織の１１サンプル中４サンプルにおいてＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的な分子量１５ｋＤバンドが検出された。一方、いずれのヒト正常組織サンプルにおいてもＬＹ６Ｇ６Ｄタンパク質に由来する特異的な分子量１５ｋＤバンドは検出されなかった（図１３）。
実施例２８
癌におけるＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現亢進
癌患者より摘出した癌組織由来ｍＲＮＡ、および周辺正常組織由来ｍＲＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法を行うことにより、遺伝子発現プロファイルを作製した。遺伝子発現プロファイル解析の結果、当該遺伝子が癌組織において高発現していることが見出された。特に乳癌、肺癌、および卵巣癌において、周辺正常組織に対する顕著な発現亢進が観察された（図１４）。
実施例２９
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子全てのｍＲＮＡを切断する活性を持つ３種のｓｉＲＮＡを混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なＲＮＡｉ効果を示さないことが保証されているｓｉＲＮＡ（以下ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。４ｐｍｏｌのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または４ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．２μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと混合した後、室温で２０分間放置した。上記混合液をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養液に全量添加し、更に２４時間培養を継続した後、培地を交換した。これらの細胞を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、３７℃で、さらに３日間培養した。培地を除去後、プレートを−８０℃で３０分間以上静置し、室温で５分間放置した。０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェルあたり２００μＬ添加し、１５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて約２３％蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した（表１）。
実施例３０
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例２９で用いたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地に懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、実施例２９の方法に準じてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約１００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の第１エクソンの一部と第２エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に比してＴＭ４ＳＦ１７のｍＲＮＡ発現量は９１％低下した。これらの結果より、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子もしくはＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子の発現量の低下によりヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された（表１）。
実施例３１
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子全てのｍＲＮＡを切断する活性を持つ２種のｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２をトランスフェクションに供した。これらｓｉＲＮＡは、示した塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡと、それに相補的な塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡをアニールさせて使用した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なＲＮＡｉ効果を示さないことが保証されているｓｉＲＮＡ（以下ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。１ｐｍｏｌのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または１ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．１μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと混合した後、室温で２０分間放置した。上記混合液をＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞培養液に全量添加し、更に２４時間培養を継続した後、培地を交換した。これらの細胞を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、３７℃で、さらに４日間培養した。培地を除去後、プレートを−８０℃で３０分間以上静置し、室温で５分間放置した。０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェルあたり１７５μＬ添加し、１５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対する２種のｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて、ｓｉＲＮＡ１で約２８％（Ｐ＝０．０１１４）、ｓｉＲＮＡ２で約２１％（Ｐ＝０．１０７０）蛍光強度が低下した（表１）。
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実施例３２
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩの細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩを、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子全てのｍＲＮＡを切断する活性を持つ２種のｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２をトランスフェクションに供した。これらｓｉＲＮＡは、示した塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡと、それに相補的な塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡをアニールさせて使用した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なＲＮＡｉ効果を示さないことが保証されているｓｉＲＮＡ（以下ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。１ｐｍｏｌのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または１ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．１μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと混合した後、室温で２０分間放置した。上記混合液をＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩ細胞培養液に全量添加し、更に２４時間培養を継続した後、培地を交換した。これらの細胞を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、３７℃で、さらに３日間培養した。培地を除去後、プレートを−８０℃で３０分間以上静置し、室温で５分間放置した。０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェルあたり１５０μＬ添加し、１５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対する２種のｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳにおいてはｓｉＲＮＡ１で約６４％（Ｐ＝０．０００２）、ｓｉＲＮＡ２で約５７％（Ｐ＜０．０００１）、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩにおいてはｓｉＲＮＡ１で約４１％（Ｐ＝０．００７２）、ｓｉＲＮＡ２で約４０％（ｐ＝０．００８６）蛍光強度が低下した（表１）。
実施例３３
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与によるヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ−４７Ｄの細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ−４７Ｄを、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
具体的には、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子およびＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子全てのｍＲＮＡを切断する活性を持つ２種のｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２をトランスフェクションに供した。これらｓｉＲＮＡは、示した塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡと、それに相補的な塩基配列の３’末端にｄＴｄＴのオーバーハングをつけた一本鎖オリゴＲＮＡをアニールさせて使用した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なＲＮＡｉ効果を示さないことが保証されているｓｉＲＮＡ（以下ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。１ｐｍｏｌのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、または１ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．１μＬを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μＬと混合した後、室温で２０分間放置した。上記混合液をＨＣＣ１９３７およびＴ−４７Ｄ細胞培養液に全量添加し、更に２４時間培養を継続した後、培地を交換した。これらの細胞を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、３７℃で、さらに３日間培養した。培地を除去後、プレートを−８０℃で３０分間以上静置し、室温で５分間放置した。０．２５％ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ならびに５％ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む水溶液を１ウェルあたりＨＣＣ１９３７の場合１７５μＬまたはＴ−４７Ｄの場合１５０μＬ添加し、１５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対する２種のｓｉＲＮＡを投与した細胞はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与細胞に比べて、ＨＣＣ１９３７においてはｓｉＲＮＡ１で約３６％（Ｐ＝０．０１９５）、ｓｉＲＮＡ２で約２５％（Ｐ＝０．０１２４）、Ｔ−４７ＤにおいてはｓｉＲＮＡ１で約２４％（Ｐ＝０．００６１）、ｓｉＲＮＡ２で約２８％（Ｐ＝０．０７４３）蛍光強度が低下した（表１）。
実施例３４
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与による乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６でのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例３１で用いたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、実施例３１の方法に準じてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約１５０ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の第１エクソンの一部と第２エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に対してＴＭ４ＳＦ１７のｍＲＮＡ発現量はｓｉＲＮＡ１で約１０２％、ｓｉＲＮＡ２で約９１％低下していた。これらの結果より、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子もしくはＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子の発現量の低下によりヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された（表１）。
実施例３５
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与による乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩでのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例３２で用いたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩを１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、１ウェル当たり２千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、実施例３２の方法に準じてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓでは約２００ｎｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩでは約１２０ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ’ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の第１エクソンの一部と第２エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に対してＴＭ４ＳＦ１７のｍＲＮＡ発現量はＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳにおいてはｓｉＲＮＡ１で約９３％、ｓｉＲＮＡ２で約８９％、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩにおいてはｓｉＲＮＡ１で約９４％、ｓｉＲＮＡ２で約６４％低下していた。これらの結果より、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子もしくはＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子の発現量の低下によりヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩの細胞増殖抑制が誘発されたことが示された（表１）。
実施例３６
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｓｉＲＮＡ投与による乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ−４７ＤでのＴＭ４ＳＦ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例３３で用いたヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ−４７Ｄを１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、実施例３３の方法に準じてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ＨＣＣ１９３７では約４００ｎｇ、Ｔ−４７Ｄでは約８５ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして４ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子の第１エクソンの一部と第２エクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含むＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５μＬを加え、反応液量１０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
ＴＭ４ＳＦ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、陰性対照として用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ投与群に対してＴＭ４ＳＦ１７のｍＲＮＡ発現量はＨＣＣ１９３７においてはｓｉＲＮＡ１で約１１２％、ｓｉＲＮＡ２で約８５％、Ｔ−４７ＤにおいてはｓｉＲＮＡ１で約７６％、ｓｉＲＮＡ２で約７４％低下していた。これらの結果より、ＴＭ４ＳＦ１７ａ遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１７ｂ遺伝子もしくはＴＭ４ＳＦ１７ｃ遺伝子の発現量の低下によりヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ−４７Ｄの細胞増殖抑制が誘発されたことが示された（表１）。
【表１】
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実施例３７
組換え型Ｃ末端３ｘＦＬＡＧタグ付きＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９由来のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー２（配列番号：４１）を用いたＡＴＧから７２６ｂｐの断片１と、プライマー３（配列番号：４２）およびプライマー４（配列番号：４３）を用いた２９１ｂｐからｉｓｏｆｏｒｍ  ｂの終止コドン直前の９８７ｂｐまでの断片２についてそれぞれＰＣＲを行った。ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂと一致する配列の他に、プライマー１には制限酵素ＥｃｏＲＩ、プライマー４には制限酵素ＸｂａＩの認識配列６ｂｐを付加した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ約５０ｎｇを鋳型として使用し、ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）０．２μＬ、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー２（配列番号：４１）、またはプライマー３（配列番号：４２）およびプライマー４（配列番号：４３）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを４０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離し、断片１および断片２それぞれで予測される長さに相当するＤＮＡ断片を確認した。上記ＰＣＲ産物のうち反応液１５μＬをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し８μＬの産物を得た。このうち４μＬを用いてＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７）のうちＡＴＧから７２６ｂｐの断片１を有するクローンと、２９１ｂｐからｉｓｏｆｏｒｍ  ｂの終止コドン直前の９８７ｂｐまでの断片２をそれぞれ含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターを得た。
断片１を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター約１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で分離し、断片１をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。同様にして断片２を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター約１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で分離し、断片２をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。同時にｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（ＳＩＧＭＡ社）約１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。このベクターと断片１および断片２を用いて、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７）を有する動物細胞用発現ベクターｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ｂを得た（以下、これをｂ−３Ｆまたはｂ−３ｘＦＬＡＧと称することもある）。
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実施例３８
組換え型Ｃ末端３ｘＦＬＡＧタグ付きＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
実施例３７で作製したＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂベクターを鋳型とし、ＰＣＲによってＴＭ４ＳＦ１７ｉｓｏｆｏｒｍ  ａをプライマー１（配列番号：４０）およびプライマー５（配列番号：４４）を用いた断片３と、プライマー６（配列番号：４５）およびプライマー４（配列番号：４３）を用いた断片４についてそれぞれＰＣＲを行った。この反応における反応液の組成は上記ベクター約４００ｎｇを鋳型として使用し、ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）０．２μＬ、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー５（配列番号：４４）、またはプライマー６（配列番号：４５）およびプライマー４（配列番号：４３）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離し、断片３および断片４それぞれで予測される長さに相当するＤＮＡ断片を確認した。上記ＰＣＲ産物のうち反応液１７μＬをＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製しそれぞれ８μＬの産物を得た。これを用いて、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａ全長を増幅するＰＣＲ反応を行った。この反応液の組成は、断片３精製産物１μＬおよび断片４精製産物０．３μＬを混合したものを鋳型として使用し、ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）０．２μＬ、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー４（配列番号：４３）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを２５回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離し、予測される長さに相当するＤＮＡ断片を確認した。ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質（配列番号：６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５）を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターを得た。
ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａ配列を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター約２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。同時にｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（ＳＩＧＭＡ社）約０．３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。このベクターと上記断片を用いて、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＥＣＯＳＤＨ５α（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質（配列番号：６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５）を有する動物細胞用発現ベクターｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ａを得た（以下、これをａ−３Ｆまたはａ−３ｘＦＬＡＧと称することもある）。
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実施例３９
組換え型Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付きＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂ  ｉｎ  ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４を約２．５μｇ用いて制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩおよびＸｂａ  Ｉで切断し、断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製したものを鋳型とし、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａを用いてプライマー７（配列番号：４６）およびプライマー８（配列番号：４７）を用いたＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応液の組成は、上記精製断片約１２０ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）０．４μＬ、プライマー７（配列番号：４６）およびプライマー８（配列番号：４７）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を２μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離して予測される長さの断片が増幅されていることを確認した後、蒸留水にて５０倍希釈し、次のプライマー９（配列番号：４８）およびプライマー８（配列番号：４７）を用いたＰＣＲ反応の鋳型とした。このＰＣＲ反応液の組成は、上記希釈ＰＣＲ産物１μＬを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）０．４μＬ、プライマー９（配列番号：４８）およびプライマー８（配列番号：４７）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を２μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。産物はアガロースゲル電気泳動で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。この断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）によりｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯべクターに組み込み、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎ末側に１ｘＦＬＡＧを持ち、Ｃ末は終始コドンを持つＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするＣＤＮＡ配列（配列番号４：７）を含むｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターを得た。
このｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター約２．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で分離し、断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。同時にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）約１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。このベクターと上記の断片を用いて、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎ末側に１ｘＦＬＡＧを持ち、Ｃ末は終始コドンを持つＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｂを得た（以下、これをＦ−ｂまたはＦＬＡＧ−ｂと称することもある）。
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実施例４０
組換え型Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付きＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｄタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ｉｓｏｆｏｒｍ  ｄは、ｉｓｏｆｏｒｍ  ｃの２１１−２１３の３アミノ酸がかけた配列のｉｓｏｆｏｒｍである（図１８）。Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付きＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を持つｐｃＤＮＡ３．１（＋）を鋳型とし、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａを用いてプライマー９（配列番号：４８）およびプライマー１０（配列番号：４９）を用いたＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応液の組成は、上記精製断片約３００ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）０．４μＬ、プライマー９（配列番号：４８）およびプライマー１０（配列番号：４９）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を２μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３分のサイクルを３０回繰り返した。産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、この断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。同時にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）約１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。このベクターと上記の断片を用いて、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＥＣＯＳ  ＤＨ５α（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎ末側に１ｘＦＬＡＧを持ち、Ｃ末は終始コドンを持つＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｄタンパク質（配列番号：１２）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１１）を有する動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｄを得た（以下、これをＦ−ｄまたはＦＬＡＧ−ｄと称することもある）。
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実施例４１
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３での組換えＴＭ４ＳＦ１７タンパク質ａ−３ｘＦＬＡＧ、ｂ−３ｘＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄの強制発現
実施例３８、３７、３９および４０で作製した動物細胞用発現ベクターｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ａ（ａ−３ｘＦＬＡＧ）ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ｂ（ｂ−３ｘＦＬＡＧ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｂ（ＦＬＡＧ−ｂ）またはｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｄ（ＦＬＡＧ−ｄ）を用いてヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３細胞に組換えタンパク質を一過性に強制発現させた。具体的には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり３００００個の細胞密度で６−ｗｅｌｌ培養ディッシュ（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、動物細胞用発現ベクターをトランスフェクションした。
具体的には３μＬのＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社）を９７μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合したものに、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ａ、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ｂ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｂまたはｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＦＬＡＧ−ＴＭ４ＳＦ１７ｄを１μｇ加え室温で１５分放置した。上記混合液を、予め約４時間前に培地を交換しておいたＨＥＫ２９３細胞の各ウェルの培養液に全量添加し、更に３７℃で２４時間または４８時間または７２時間培養した。コントロールとしては、ベクターを加えずに同様の反応を行った。培養終了後は培地を除去後、細胞を０．５％ＥＤＴＡ−Ｎａおよび０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で回収、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１ｍＬ当たり５，０００，０００細胞となるように、５％の２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５℃で５分間加熱することで細胞溶解液とした。これらのサンプルについてウエスタンブロットを行い、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＳＩＧＭＡ社）で検出した。その結果、ａ−３ｘＦＬＡＧおよびｂ−３ｘＦＬＡＧおよびＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄタンパク質の発現が確認された。これらのタンパク質は全て推測される分子量よりやや分子量の低い位置に検出された。また、さらに分子量の低い位置に複数のバンドが検出されたものもあった。以上のことから、いずれのベクターを使用しても組換えＴＭ４ＳＦ１７タンパク質がＨＥＫ２９３細胞に発現していることが示され、また、ＴＭ４ＳＦ１７タンパク質が分解などの翻訳後修飾を受けている可能性が示唆された（図１５および表２）。
【表２】
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実施例４２
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３での強制発現ＴＭ４ＳＦ１７タンパク質ＦＬＡＧ−ｂ、ｂ−３ｘＦＬＡＧおよびＦＬＡＧ−ｄの糖鎖修飾
実施例４１のようにして調製したｂ−３ｘＦＬＡＧおよびＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄタンパク質を含む細胞溶解液を用いて、組換えＴＭ４ＳＦ１７タンパク質の糖鎖修飾について検討した。コントロール、ｂ−３ｘＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄを強制発現させ、１ｍＬ当たり５，０００，０００細胞となるように５％の２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５℃で５分間加熱することで調製した細胞溶解液を２０μＬ用意した。脱糖鎖反応にはＥｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＲＯｚｙｍｅ社）を用いた。５μＬの５ｘ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＲＯｚｙｍｅ社）を加え９５℃で１０分間加熱した。室温に戻した溶液に２．５μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液を加え、混合した後、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  ＡおよびＯ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅを各０．５μＬずつ加えて、３７℃で５時間保温した。ここに５ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加え９５℃で１０分間加熱した後、ウエスタンブロットに供した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＳＩＧＭＡ社）で組換えＴＭ４ＳＦ１７タンパク質を検出したところ、脱糖鎖処理の前後では各サンプルにおいて最大の分子量の位置が低分子側に移動していた。これより、組換えＴＭ４ＳＦ１７  ｂ−３ｘＦＬＡＧおよびＦＬＡＧ−ｂおよびＦＬＡＧ−ｄタンパク質は糖鎖修飾を受けていることが示された（図１６）。
実施例４３
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３での強制発現ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａおよびｂタンパク質の細胞膜への局在
実施例３８および３７で作製した動物細胞用発現ベクターｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ａおよびｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ｂを用いてヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３細胞に組換えタンパク質を一過性に強制発現させた。具体的には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、ディッシュ当たり６７００００個の細胞密度で６ｃｍ径組織培養ディッシュ（ＢＤファルコン社）に播種した。３７℃で一晩培養した後、動物細胞用発現ベクターをトランスフェクションした。
具体的には６μＬのＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社）を１９４μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合したものに、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ａまたはｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４−ＴＭ４ＳＦ１７ｂを２μｇを加え室温で１５分放置した。上記混合液を、予め４時間前に培地を交換しておいたＨＥＫ２９３細胞培養液に全量添加し、更に３７℃で４８時間培養した。コントロールとしては、ベクターを加えずに同様の反応を行った。培地を除去後、細胞をＰＢＳ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でピペッティングにより回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、５００μＬのＰＢＳ（−）に懸濁した。ｂｉｏｔｉｎラベル化にはＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。５００μＬの細胞懸濁液にｂｉｏｔｉｎ−７−ＮＨＳ（Ｒｏｃｈｅ社）を終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１５分放置した。その後、２５μＬのｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社）を加え、４℃で１５分保温した。細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後５００μＬのＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．２５％デオキシコール酸、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で細胞を溶解させ、遠心上清をｂｉｏｔｉｎラベル化ｌｙｓａｔｅとして得た。このうち１００μＬを４％の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＷＡＫＯ社）を含むＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）１００μＬと混合し、９５℃で５分間加熱することでＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルとした。残りの４００μＬについて、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで平行化したＭ２−ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社）を結合したａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）１００μＬスラリーと混合し、４℃で終夜混合した。ビーズをＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、２％の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＷＡＫＯ社）を含む２倍希釈Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）１００μＬを加えて９５℃で５分間加熱した。遠心後、上清を免疫沈降サンプルとした。これらのｂｉｏｔｉｎラベル化ｌｙｓａｔｅおよび免疫沈降サンプルについてウエスタンブロットを行い、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＳＩＧＭＡ社）およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で検出した。その結果、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体によりＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａおよびｂタンパク質の発現が確認された。また、免疫沈降サンプルから同じ分子量の位置にｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎでバンドが検出されたことから、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａおよびｂタンパク質が細胞膜上に局在していることが示された（図１７）。
実施例４４
ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅおよびｉｓｏｆｏｒｍ  ｆの同定
実施例３７においてＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂをクローニングしたが、その際同時に新規ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅおよびｉｓｏｆｏｒｍ  ｆが同定された。ヒト肺がん細胞株Ａ５４９由来のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー２（配列番号：４１）を用いたＰＣＲ反応と、プライマー３（配列番号：４２）およびプライマー４（配列番号：４３）を用いたＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ約５０ｎｇを鋳型として使用し、ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）０．２μＬ、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー２（配列番号：４１）、またはプライマー３（配列番号：４２）およびプライマー４（配列番号：４３）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９４℃・１分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを４０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離し、それぞれのＰＣＲ反応で予測される長さに相当するＤＮＡ断片を確認したが、同時に予測断片より長い断片が確認された。上記ＰＣＲ産物のうち反応液１５μＬをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し８μＬの産物を得た。このうち４μＬを用いてＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、プライマー１（配列番号：４０）およびプライマー２（配列番号：４１）を用いたＰＣＲ反応からはＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７）のうちＡＴＧから７２６ｂｐの断片１を有するクローンと、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質（配列番号：６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：５）のうちＡＴＧから７３５ｂｐの断片５を有するクローンが得られた。また、プライマー３（配列番号：４２）およびプライマー４（配列番号：４３）を用いたＰＣＲ反応からは、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７）のうち２９１ｂｐからｉｓｏｆｏｒｍ  ｂの終止コドン直前の９８７ｂｐまでの断片２を有するクローンの他に、これまでに知られていない新規のＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍの部分配列、断片６を持つクローンが見出された。これはＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質（配列番号：６）の配列において、ｅｘｏｎ  ８に続くｉｎｔｒｏｎに当たる配列がｍＲＮＡに転写されているため、ｉｎｔｒｏｎ配列の先頭にある終止コドンによってペプチドがＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａタンパク質（配列番号：６）より短くなったものである。断片５と断片６が連続したｍＲＮＡになっているｉｓｏｆｏｒｍが存在すると考え、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅとした。ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅタンパク質の���７３アミノ酸配列（配列番号：１４）と、それをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１３）を示した。また、断片１と断片６が連続したｍＲＮＡになっているｉｓｏｆｏｒｍが存在すると考え、ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｆとした。ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｆタンパク質の２７０アミノ酸配列（配列番号：１６）と、それをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１５）を示した。また、その他のスプライシングバリアントと比較した模式図を図１８に示した。
実施例４５
ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｈの同定
ヒト大腸がん細胞株ＳＷ４８０由来のＨｕｍａｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を鋳型とし、プライマー１１（配列番号：５０）およびプライマー１２（配列番号：５１）を用いてＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ約５０ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）０．４μＬ、プライマー１１（配列番号：５０）およびプライマー１２（配列番号：５１）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを４００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を２μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲは、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３分のサイクルを３０回繰り返した。産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。この断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製物を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、これまでに知られていない新規のＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍの配列を持つクローンが見出された。これはＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂタンパク質（配列番号：８）の配列から、ｅｘｏｎ８に当たる部分が欠失した配列である。これをＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｈとした。ＴＭ４ＳＦ１７  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｈタンパク質の３０８アミノ酸配列（配列番号：１８）と、それをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１７）を示した。また、その他のスプライシングバリアントと比較した模式図を図１８に示した。
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【産業上の利用可能性】  本発明で用いられるタンパク質やそれらをコードするポリヌクレオチドは、癌組織に特異的に発現し、癌の診断マーカーとなるだけでなく、それらの活性および／または発現を抑制することにより、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害効果が得られるので、上記タンパク質に対する抗体、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、上記タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、上記タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩などは、癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。また、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記抗体などは、癌の予防・治療物質、癌細胞のアポトーシス促進物質、および／または癌細胞の増殖阻害物質のスクリーニングにも有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００５−２３０７９７（出願日：２００５年８月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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