(57)【要約】  水性媒体中に脂質成分を供給し、該媒体を蛋白成分に接触させ、及び該媒体のｐＨを、該媒体中の蛋白の等電点付近未満の値に調節する工程を含む増大した酸化安定性を示す蛋白安定化脂質システムの製造方法。それによって、最終製品への外来の食品添加物の必要性を低減又はなくすことができる。
2006514541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体中に脂質成分を供給し、
該媒体を蛋白成分に接触させ、及び
該媒体のｐＨを、該媒体中の蛋白の等電点付近未満の値に調節する工程を含む、増大した酸化安定性を示す蛋白安定化脂質システムの製造方法。
【請求項２】
脂質成分が、脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、トリグリセライド及びそれらの機能誘導体、カロテノイド、テルペン、抗酸化剤、着色剤、風味油、食用油、脂溶性ビタミン、栄養素、機能性食品及びそれらの組み合わせから選択される請求項１の方法。
【請求項３】
脂質成分がオメガ−３脂肪酸及びカロテノイドの少なくとも１種を含む請求項１の方法。
【請求項４】
蛋白成分が、乳製品蛋白、植物性蛋白、オバルブミン、糖蛋白、ムコ蛋白、リン蛋白、血清アルブミン、コラーゲン及びそれらの組み合わせから選択される請求項１の方法。
【請求項５】
乳製品蛋白が、ホエー蛋白分離物、スウィート・ホエー、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン及びそれらの組み合わせから選択される請求項４の方法。
【請求項６】
蛋白成分がホエー蛋白分離物であり、脂質成分がオメガ−３脂肪酸である請求項５の方法。
【請求項７】
蛋白成分が、脂質成分を乳化するのに十分量である請求項１の方法。
【請求項８】
蛋白成分が、水性媒体中に存在し、かつ脂質成分と水性媒体との間の界面に存在する請求項７の方法。
【請求項９】
安定化システムが、食品、飲料及び医薬品から選択される組成物に組み込まれる請求項１の方法。
【請求項１０】
蛋白成分及び脂質成分を含む蛋白−脂質エマルジョン製品を提供し、
該蛋白−脂質エマルジョン製品のｐＨを、蛋白−脂質エマルジョン製品の等電点付近未満の値に調節する工程を含み、これにより、蛋白−脂質エマルジョン製品が正の正味電荷を有する、蛋白−脂質組成物の酸化安定性を高めるｐＨの使用方法。
【請求項１１】
さらに、蛋白成分及び脂質成分を、安定な蛋白−脂質エマルジョン製品を形成するのに少なくとも一部分は十分な圧力で均質化することを含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
脂質成分が、エマルジョン製品を含む水性媒体の約３０〜４０重量％である請求項１０の方法。
【請求項１３】
蛋白−脂質エマルジョン製品が蛋白成分と脂質成分とを含み、前記エマルジョン製品が約２５部の脂質成分に対して少なくとも約１部の蛋白成分を含む請求項１０の方法。
【請求項１４】
蛋白−脂質エマルジョン製品が、牛乳蛋白とオメガ−３脂肪酸とを含む請求項１１の方法。
【請求項１５】
エマルジョン製品が、食品、飲料及び医薬品から選択される組成物に取り込まれる請求項１０の方法。
【請求項１６】
脂質成分と水溶液とから水性−脂質システムを形成し、
該システムを蛋白成分と接触させ、及び
該システムのｐＨを、システム中の蛋白の等電点付近未満の値に調節する工程を含む脂質の酸化安定性を増大させるための蛋白の使用方法。
【請求項１７】
脂質成分が、脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、トリグリセライド及びそれらの機能誘導体、カロテノイド、テルペン、抗酸化剤、着色剤、風味油、食用油、脂溶性ビタミン、栄養素、機能性食品及びそれらの組み合わせから選択され、蛋白成分が、乳製品蛋白、植物性蛋白、オバルブミン、糖蛋白、ムコ蛋白、リン蛋白、血清アルブミン及びそれらの組み合わせから選択される請求項１６の方法。
【請求項１８】
乳製品蛋白が、ホエー蛋白分離物、スウィート・ホエー、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン及びそれらの組み合わせから選択される請求項１７の方法。
【請求項１９】
蛋白成分が、脂質成分を乳化するのに十分量である請求項１６の方法。
【請求項２０】
蛋白及び脂質成分が、エマルジョン製品を提供し、該エマルジョン製品が、食品、飲料及び医薬品から選択される組成物に組み込まれる請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６０／４０６，８０５号（２００２年８月２９日出願）の優先権を主張し、ここにその内容を全て組み込む。
米国政府は、この発明についてＮＲＩ競争プログラム/ＵＳＤＡからの許可番号２００１−４５２６ ＯＧＣＡ＃ １０１Ａ １２２にしたがってこの発明に対する特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
栄養的に有益な脂質を有する食品の栄養強化に対する興味が高まっている。残念なことに、これらの適用は、脂質が酸化により劣化する傾向にあるという事実によって制約を受ける。実際、脂質の酸化に対する感受性は、食品のエマルジョンにおける質的な劣化が主な要因となる。そのような食品の質的劣化は、味、食感、賞味期限、外観及び栄養学的プロファイルの望ましくない変化を含む。
【０００３】
最近の技術では、外来の食品用抗酸化剤によって安定化される脂質を有するバルク形態の脂質を利用している。それにもかかわらず、これらのバルクの脂質は、緩やかな酸化安定性を示すのみである。さらに、乾燥した及びカプセル化された脂質が用いられている。しかし、この技術は、必要とされる材料がほとんど脂質を含まないこと及び一旦その材料が水を含む食品中に入れられた場合の抗酸化剤による保護が損失を受けることによって制約を受ける。
【０００４】
近年、実際の食品においては、水中油型エマルジョン中の脂質がより一般的であるため、バルクの脂質ではなく、水中油型のエマルジョン中の脂質の酸化に多くの研究が集中している。水中油型のエマルジョン中での酸化に関する多くの研究では、モデルエマルジョンは、これらの界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＤＴＡＢ、ブリジ）の全てが食品用途で許可を受けていないにもかかわらず、合成界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、ブリジ及びトウィーン）を用いて調製されている。
【０００５】
これらの合成界面活性剤と異なり、蛋白質は、物理的に安定したエマルジョンを形成することができる一般に安全と認められている食品添加物を意味する。例えば、ホエー蛋白が乳化する特性が、何年も研究されている。ホエー蛋白安定化エマルジョンの安定性において、ホエー蛋白安定化エマルジョン中のホエー蛋白の重合、エマルジョン液滴表面でのホエー蛋白と一般に用いられている界面活性剤との間の相互作用、及びｐＨ、ＣａＣｌ2、ショ糖、熱処理及び蛋白濃度の影響が報告されている。
【０００６】
蛋白質がどのように酸化反応に影響を及ぼし得るかについてさらに理解することは、水中油型のエマルジョン用の新たな抗酸化剤の方策を開発するために必要である。特に、水を含む食品、飲料又は医薬品に、栄養的に有益でかつ有用な脂質を供給することができ、外来の酸化防止添加物を必要とせずに酸化に対して安定化することができる、環境において安定したシステムが必要である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】０．２％のホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョンのゼータ電位に対するｐＨの影響。データ・ポイントは平均（ｎ＝５）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【図２】２０℃での、０．２％のホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョン中での、脂質ハイドロパーオキシド（ａ）及びヘッドスペース・プロパナール（ｂ）の形成に対するｐＨの影響。データ・ポイントは平均（ｎ＝３）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【図３】０．２％のホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョンでの、脂質ハイドロパーオキシド（ａ）及びヘッドスペース・プロパナール（ｂ）の形成に対する温度の影響。データ・ポイントは平均（ｎ＝３）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【図４】０．２％蛋白質でスウィート・ホエー粉末（ＳＷ）によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョンでの、脂質ハイドロパーオキシド（ａ）及びヘッドスペース・プロパナール（ｂ）の形成に対する温度の影響。データ・ポイントは平均（ｎ＝３）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【図５】３７℃でのホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）、スウィート・ホエー粉末（ＳＷ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）又はα−ラクトグロブリン（α−Ｌａ）からの０．２％蛋白質によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョンでの、脂質ハイドロパーオキシド（ａ）及びヘッドスペース・プロパナール（ｂ）の形成。データ・ポイントは平均（ｎ＝３）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【図６】０．２％のホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）によって安定化された５％サーモン水中油型エマルジョンでの、脂質ハイドロパーオキシド（ａ）及びヘッドスペース・プロパナール（ｂ）の形成におけるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の影響。ＷＰＩをＮＥＭと反応させ、エマルジョンの形成の前に透析した。データ・ポイントは平均（ｎ＝３）±標準偏差を表わす。いくつかのエラー・バーがデータ・ポイント内にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の要旨
先のものに照らして、本発明の目的は、改善された酸化安定性で設計された広範な蛋白安定化エマルジョン製品及び／又はそれらの製造方法ならびに用途を提供することであり、それによって、上述したそれらを含む従来技術の不足及び欠点を克服することができる。
本発明の目的は、水を含む食品、飲料又は医薬品に一旦組み込まれた時点で、酸化安定性を維持する種々のエマルジョンを提供することであり、それによって、外来の食品用抗酸化剤の必要性を低減又はなくすことができる。
【０００９】
本発明の関連する目的は、より詳しくは、種々の蛋白安定化脂質システムを提供することであり、それは、多面的な酸化防止剤の保護を与え、バルク脂質材料に比較して少量の非脂質材料を含む。
本発明の他の目的は、酸化に対して蛋白安定化されたカチオン性エマルジョン製品の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、与えられた蛋白−脂質エマルジョン製品中の脂質成分の酸化安定性を高めるためにｐＨを用いる方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、本発明の環境に及び酸化的に安定なエマルジョン製品を用いて、食品、飲料又は医薬品の脂質強化方法を提供することであり、それによって、最終製品への外来の食品添加物の必要性を低減又はなくすことができる。
従って、本発明の目的は、種々の蛋白安定化水中油型のエマルジョン／組成物を提供することであり、それにより、上述したそれらを含む従来技術の不足及び欠点を克服することができる。本発明の１以上の観点はある目的に合致し得るし、さらに、１以上の他の観点は、ある他の目的をもたらし得ることが当業者に理解されるであろう。各目的は、全ての場合において、本発明の全ての観点に等しく当てはまれないかもしれない。そのため、これら及び他の目的は、本発明のいずれか１つの観点について選択的に捕らえることができる。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴、利益及び利点は、この要旨及び好ましい実施形態の記載で明らかになり、食品科学とエンジニアリングの分野の知識を有し、経験がある当業者に容易に明らかになるであろう。そのような目的、特徴、利益及び利点は、これに伴う実施例、データ及びそれらを描いた合理的な推論とともに得られるように、上述から明らかになるであろう。
一つには、本発明は、カチオン性蛋白乳化成分によって、脂質成分／物質が酸性水性相に分散された場合、水性媒体中の脂質の酸化安定性を増加させる蛋白を用いる方法に関する。
【００１２】
好ましくは、脂質成分は、限定されないが、特定の食品によって要求されるような脂肪酸、トリグリセリド及びそれらの各誘導体、カロテノイド、テルペン、抗酸化剤、着色剤、風味油（例えば、ペパーミント、シトラス、ココナッツ又はバニラ）、栄養素及び栄養補給食品又は脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＥ）；飲料又は医薬の最終用途を含む。従って、本発明は、炭化水素、アルキル、アルコール、アルデヒド、酸、アミン、糖質又はそれらの組み合わせのような分子を含む種々の分子量の脂質を包含する広範囲の脂質成分を意図する。本発明の広い観点と一致して、脂質成分は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、菜種、オリーブ、ピーナッツ、藻類、魚又はそれらの組み合わせのような他の食用油をさらに含んでいてもよい。種々のより好ましい実施形態では、脂質成分は、オメガ−３脂肪酸又はカロテノイドを含むか、含有してもよい。より一般的には、そのような脂質成分は、いずれかのポリ不飽和脂肪酸を含む又は含有することができる。
【００１３】
蛋白成分は、本発明のエマルジョン製品／組成物に環境的及び酸化的安定性を提供する役割を果たす。
蛋白乳化成分は、特定の最終用途によって影響されるような脂質成分の分散性をもたらし、エマルジョン又はシステム中の蛋白の等電点未満のエマルジョンｐＨで正の正味電荷を有する蛋白を含む。このシステムｐＨで、蛋白乳化成分はカチオン性であり、全体として正の正味電荷を有するエマルジョン液滴をもたらす。蛋白成分は、それらのアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）に基づいて、蛋白成分の全体の正の正味電荷、従って、エマルジョン液滴のカチオン性の性質を最大限にするために、選択することができる。
【００１４】
限定されることなく、蛋白成分は、乳製品蛋白質、植物性蛋白質、オバルブミン、糖蛋白質、ムコ蛋白質、燐蛋白質、血清アルブミン、コラーゲン及びそれらの組み合わせのいずれか１つを含むことができる。例えば、コラーゲンは、特定の源及び加水分解の方法によって、ｐＨ約７．５から約８まで、比較的高い等電点が与えられた本発明の方法論において特に有用かもしれない。よって、それらから誘導された蛋白−脂質組成物は、高い酸性が有害となり得る場合に、システム中で酸化を阻害するために用いることができる。
【００１５】
また、一つには、本発明は、蛋白−脂質システムを形成する方法に指向し、そのシステムは、酸化に対して安定化された脂質が、そこに分散されている。その方法は、（１）最終製品に望まれる栄養的又は物理的性質の選択によってのみ制約される水性媒体中の脂質成分を準備し、（２）その媒体と蛋白成分と接触させ、及び（３）その組成物が全体として正の電荷を有するように及び／又はここで記載された物理的安定性及び抗酸化特性を有効にするために十分な正の電荷を蛋白成分に与えるために、その媒体中の蛋白成分のほぼ等電点未満の値に、その媒体のｐＨを調節することを含むことができる。あるいは、エマルジョン製品が形成される前に、蛋白成分又は脂質成分のｐＨ調節が起こるように、脂質成分を蛋白成分に接触させる前にｐＨ調節を生じさせることができることは明らかであろう。
【００１６】
必要のためにのみ与えられる蛋白成分の濃度は、所望の分散特性の求めに合わせて本発明の水中油型のエマルジョン／組成物を安定化するために十分量とする。また、例えば、以下の実施例で例証されるように、エマルジョン製品は、約２５部の脂質成分に対して少なくとも約１部の蛋白成分で、蛋白成分と脂質成分とを含むことができる。あるいは、本発明は、水性媒体中、約３０から４０重量パーセントまでの脂質を含み、従来のバルク脂質と比較して、ほとんど脂質を含まない材料を含む組成物を提供することができる。
【００１７】
いかなる理論又は実施例に限定されることなく、一旦エマルジョン製品が最終製品に組み込まれると、静電気的にプロ酸化（prooxidative)金属／金属イオンをはねつけるカチオン性エマルジョン液滴の能力も手伝って、脂質／油脂成分は、より一層の酸化安定性を示し、酸化促進剤（prooxidant）と基質（例えば、脂質／油脂成分）との間の相互作用又は接触を低減する。従って、エマルジョンのｐＨが蛋白成分の等電点より酸性となるため、脂質／油脂成分の酸化の阻害が増大することが観察される。この抗酸化作用は、本発明の水中油型エマルジョンシステムでは、抗酸化材料の添加を必要とせずに表わされる。
【００１８】
さらに、本発明の蛋白安定化システム／製品の抗酸化作用は、また、（１）フリーラジカルを不活性化する役割を果たすことができる蛋白成分のアミノ酸の組成物、（２）脂質過酸化物−遷移金属相互作用を物理的に最小限にするエマルジョン液滴の界面で、厚膜の粘弾性膜を形成する蛋白成分の能力及び／又は（３）キレート酸化促進剤金属イオン又は酸化の二次産物のクエンチに対する蛋白成分の能力に影響されるかもしれない。従って、本発明は、最終用途によって要求される酸化安定性及び分散性に依存する蛋白成分の設計、選択又は変形を含む。
【００１９】
種々の好ましい実施形態では、蛋白安定化成分は、限定されないが、ホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）、スウィート・ホエー（ＳＷ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌａ）又はα−ラクトグロブリン（α−Ｌａ）を含む乳製品蛋白である。しかし、本発明の広範な観点と一致して、多くの他の蛋白を使用することができる。例えば、植物性蛋白質（例えば、大豆蛋白など）、オバアルブミン、糖蛋白、ムコ蛋白、燐蛋白（例えば、カゼイン、ビテリンなど）、血清アルブミン又は同様の蛋白成分で調製された水中油型エマルジョンが、蛋白成分の等電点未満のｐＨで酸化安定性を示すであろう。あるいは、ここに名前が挙げられた油脂又は脂質基質のいずれかを、まず、炭水化物成分に組み込み、続いて乳化し、上述したような蛋白成分を用いることにより酸化に対して安定化することができる。本発明の他の変形は、脂質／油脂成分の乳化及び安定化のためにここに記載された種類の部分的変性蛋白の使用を含むでもよい。
【００２０】
一つには、さらに、本発明は、蛋白−脂質組成物の酸化安定性を増強するためにｐＨを使用する方法に指向する。その方法は、（１）蛋白成分及び脂質成分を含む水性蛋白−脂質エマルジョン製品を準備し、（２）その水性蛋白−脂質エマルジョン製品中の蛋白の等電点より小さい値に、蛋白−脂質エマルジョン製品のｐＨを調節し、それによって、エマルジョン製品は、正の正味電荷を有し、ここに記載された種類の酸化安定性の増強を示す。その方法は、安定した蛋白−脂質エマルジョン製品を形成するのに十分な圧力で、蛋白成分及び脂質成分を均質化することを含んでもよい。
【００２１】
一つには、また、本発明は、水含有最終製品の酸化に対して安定化された栄養的及び物質的に有効な脂質成分を供給する方法に指向する。そのような方法は、（１）ここに記載されるような蛋白安定化エマルジョン製品の設計及び製造、ならびに（２）最終製品へのエマルジョン製品の組み込みを含む。特に、この方法は、環境的及び酸化的に安定なオメガ−３脂肪酸、カロテノイド、風味油、食用油又はこれらの組み合わせあるいは、ここに記載された脂質成分のいずれかを有する食品、飲料又は医薬品の強化のために使用することができる。
【００２２】
発明の実施例
以下の限定されない実施例及びデータは、本発明の組成物、複合体及び方法についての種々の観点及び特徴を表わし、多面的な酸化防止の保護を与える蛋白安定化エマルジョン脂質の合成、ならびに、食品の合成におけるそれらの使用を含み、そのような組成物は、ここで述べられた方法論によって有効となる。従来との比較において、本発明の組成物及び方法は、それらに対して、驚くべき、予想外かつ相反する結果及びデータを提供する。もちろん、これらの実施例は、本発明が、ここに示された脂質又は蛋白材料、条件、特性等の特定の組み合わせに限定されることなく、実証の目的のみで含まれていることを理解すべきである。種々の他の方法論及び／又はこの発明の範囲と一致する構成の実施形態を用いることによって、同程度の有用性及び利点を得ることができる。
【００２３】
一般的な方法
ＷＰＩ、β−Ｌｇ及びα−Ｌａを、ダビスコ・フード・インターナショナル社から入手し、ＳＷをクラフト・フード社から得た。蛋白質はそれ以上の精製なしで使用した。ＷＰＩ及びＳＷの蛋白含量は、それぞれ９７．６及び１２．１ ｗｔ％であった。ＷＰＩの主な蛋白成分は、５５〜６１％のβ−ラクトグロブリン、１９〜２２％α−ラクトアルブミン及び６〜８％のウシ血清アルブミンであった。α−Ｌａ粉末のα−ラクトアルブミン含量は、９０．６ｗｔ％であり、β−Ｌｇ粉末のβ−ラクトグロブリン含量は９５．０ｗｔ％であった。示された蛋白濃度及び組成物データの全ては、それぞれ製造者から得た。イミダゾール、酢酸ナトリウム、Ｎ−エチルマレイミド、硫酸鉄及びクメン・ハイドロパーオキシドは、シグマ・ケミカル社から購入した。他のすべての試薬は分析用又は純粋なものであった。
【００２４】
サーモンオイルの調製：サケの切り身を地方の食料品店から購入した。新鮮なサケの切り身を手でちぎり、刻んで、５℃にて２０分間、１５０００ｇで遠心分離した。得られた油脂をデカントし、使用まで−８０℃で保存した。そのサーモンオイルは、薄層クロマトグラフィー（Mei, L.; Decker, E. A.; McClements, D. J. Evidence of iron association with emulsion droplets and its impact on lipid oxidation. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5072-5077）によって測定されたように、９９％以上のトリアシルグリセロールを含有していた。
【００２５】
脂質酸化の測定
ハイドロパーオキシドの測定：エマルジョン（５ｍＬ）を、軽く密封したねじ蓋試験管に入れ、種々の温度（４．０℃、２０．０℃及び３７．０℃）で酸化した。渦流（１０秒間、３回）によってエマルジョン０．３ｍＬとイソオクタン／２−プロパナール（３：１、ｖ／ｖ）の１．５ｍＬとを混合することにより、脂質ハイドロパーオキシドを測定し、１０００ｇでの２分間の遠心分離により、有機溶媒相を分離した。その有機溶媒相（２００μｌ）を２．８ｍＬのメタノール／１−ブタノール（２：１、ｖ／ｖ）に加え、続いて、３．９４Ｍのチオシアン酸アンモニウム１５μＬ及び鉄イオン溶液（０．１３２ＭのＢａＣｌ2及び０．１４４ＭのＦｅＳＯ4を混合して調製）１５μＬを加えた。その溶液の吸光度を、鉄の添加後２０分で、５１０ｎｍで測定した。ハイドロパーオキシド濃度は、クメン・ハイドロパーオキシドで得られた標準曲線を用いて決定した。
【００２６】
プロパナールの測定：エマルジョンサンプル（１ｍＬ）を１０ｍＬのヘッドスペース・バイアルに入れ、ポリ（テトラフルオロエチレン）／ブチル・ラバー壁で密閉した。ヘッドスペース・プロパナールを、ヒューレット・パッカード１９３９５Ａのヘッドスペース・サンプラーを装備したシマズ１７Ａガスクロマトグラフ装置を用いて測定した。ヘッドスペース条件は、以下の通りである。サンプル温度４０℃、サンプルのループ及びトランスファー・ラインの温度１１０℃、気圧調節１０ｓ、排出１０ｓ、注入１．０分間。アルデヒドを、ＨＰメチルシリコン（ＤＢ−１）石英シリカ毛管カラム（５０ｍ、内径０．３１ｍｍ、膜厚１．０３μｍ）で７０℃にて等温で分離した。スプリットレスのインジェクター温度は１８０℃であり、溶出化合物を２００℃にて、水素炎イオン化検出器で検出した。
【００２７】
濃度を、真性プロパナールから得られた標準曲線を用いてピーク面積から決定した。
統計分析：分析を３重で測定した。統計分析は、シュチューデントｔ−テストを使用して行った（Snedecor, G. W.; Cochran, G.W. Statistical Methods, 8th ed.; Iowa State University Press; Ames, IA, 1989）。
【００２８】
実施例１ａ
エマルジョンの調製及び特徴づけ
単峰性の小滴粒度分布で製造された小滴のみならず、最小の検出可能な水相タンパクを有するタンパクのこの濃度でエマルジョンが安定したため、０．２ｗｔ％のＷＰＩは、５％水中油型のエマルジョンを安定化するのに適していることが示されている（Donnelly, J. L.; Decker, E. A.; McClements, D. J. Iron-catalyzed oxidation of menhaden oil as affected by emulsifiers. J. Food Sci. 1998, 63, 997-1000）。限定されることなく、例証の目的のため、そのような蛋白及び脂質濃度を以下の実験で用いた。
【００２９】
水中油型エマルジョンを、５．０ｗｔ％のサーモンオイル、０．２％蛋白（ＷＰＩ、ＳＷ、α−Ｌａ又はβ−Ｌｇ）及び９４．５％の５ｍＭのアセテート−イミダゾール緩衝液（ｐＨ ３．０）を用いて調製した。ＷＰＩにおけるメルカプト基の役割を研究する実験で、ＷＰＩを、２５℃にて１５分間、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ、３．４５ミリモルＮＥＭ／ｇ蛋白）と反応させた。４℃での連続的な攪拌で６時間及び１２時間後の計２回、６〜８０００分子量をカットオフする透析管で、ＷＰＩ溶液対５ｍＭアセテート−イミダゾール緩衝液（ｐＨ３．０，ＷＰＩ溶液対緩衝液＝１：１００）の透析によって、過剰のＮＥＭを除去した。水中油型エマルジョンを、小型ホモジナイザー（Ｍ１３３／１２８１−０、バイオスペック・プロダクツ・インク）を用いて２分間、脂質と水相とを混合することによって調製した。その後、粗エマルジョンを２段階ＡＰＶラボ１０００ホモジナイザーで、高圧により５０００ｐｓｉで４回ホモジナイズした。ホモジナイズの後、そのエマルジョンのｐＨを０．１Ｍ塩酸及び／又は水酸化ナトリウムで調節した。エマルジョンの粒度分布を、コールターＬＳ２３０レーザー光分散装置で測定した。最終エマルジョンの平均粒径は、０．７３から０．８０μｍの範囲であった。液滴粒度分布を、エマルジョンの安定性をモニターするために定期的にチェックした。
【００３０】
実施例１ｂ
ＺＥＭ５００３ゼータマスター（モールヴァン装置）の測定チャンバに、希釈水中油型エマルジョン（１：１０００）の数滴を直接注入することにより、エマルジョン液滴電荷（ゼータ電位、ζ）を測定した。ゼータ電位の測定を、注入ごとの５回の読み取りで、２回の別個の注入の平均として記録した。
【００３１】
【表１】
2006514541.tif 000003
実施例１ｃ
先の実施例で記載されたそれらと類似の方法を用いて、以下の限定されない脂質（Ａ）及び蛋白（Ｂ）成分の種々の組み合わせえを含むエマルジョンを使用して、本発明による方法を行った。
【００３２】
【表２】
2006514541.tif 000004
このようなエマルジョンの組み合わせは、ここに提供されたような又は既知技術の単純な改変を用いて、過度の実験を行うことなく、当業者によって理解されるであろうように、調製することができる。同様に、本発明の方法論とともに有用なエマルジョンは、所望のカチオン性特性、等電点及び／又は最終用途のために、既知の合成技術によって製造され、特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、アスパラギンな酸、グルタミン酸等）の組み込みで設計された種々のポリペプチドを含むことができる。
【００３３】
実施例２
水中で安定化されたＷＰＩは、ｐＩ５．１を有している（Kinsella JE; Whitehead DM）。
ホエー中の蛋白：化学、物理及び機能特性。Advances in food and nutrition research Vol. 33 ; Kinsella, JE, Ed. Academic Press: San Diego, CA. , 1989; pp 343-438において、ＷＰＩが水中油型エマルジョンの形成中に脂質の液滴表面に吸着する場合、ｐＩは、蛋白構成が変化し、アミノ酸が新たな環境にさらされるにつれて変化する可能性がある。
ＷＰＩのｐＩが水中油型エマルジョン中の脂質液滴に対するその吸着によって変化したかどうかを決定するために、液滴の電気的な変化（ゼータ電位）をｐＨの関数として測定した。エマルジョン液滴におけるＷＰＩのｐＩは、約４．８であると認められた（図１）。これは、約４．８より上のｐＨで、ＷＰＩで安定化されたエマルジョンの液滴が、負に荷電され、一方、ｐＨ＜４．８では液滴は正に荷電されることを意味する。
【００３４】
実施例３
ＷＰＩ安定化水中油型エマルジョン中での脂質酸化速度に対するｐＨの作用
図２ａ及び２ｂは、ＷＰＩ安定化サーモン水中油型エマルジョン中での脂質ハイドロパーオキシド及びプロパナールの形成がｐＨの上昇とともに増加することを示す。エマルジョンは、液滴の凝析に対して非常に不安定であったので、ｐＨ５．０では測定を行わなかった。液滴において正味電荷が低いことは、静電反発力が興味ある相互作用を克服するのに十分でないことを意味するからである。
【００３５】
脂質酸化速度は、ＷＰＩのｐＩ未満のｐＨで非常に低かった。ｐＨ３．０及び４．０で、脂質ヒドロパーオキシド濃度は、インキュベーションの８７時間後に、それぞれ２ｍｍｏｌ／ｋｇ油脂から５６及び９３ｍｍｏｌ／ｋｇ油脂に増加した。これは、初期のハイドロパーオキシド濃度が高く（それぞれ、２２及び４４ｍｍｏｌ／ｋｇ油脂）、８７時間後のハイドロパーオキシド濃度が１６１及び３４０ｍｍｏｌ／ｋｇ油脂であるｐＨ６．０及び７．０に匹敵する（図２ａ）。
【００３６】
また、プロパナール形成は、ｐＨ３．０及び４．０の双方でエマルジョンに対する全インキュベーション期間中、１０μＭ未満の残存濃度でのＷＰＩのｐＩ未満のｐＨで低かった。これは、プロパナール濃度が、インキュベーションの８７時間後のｐＨ６．０及び７．０で１１４及び２４０μＭであった、高いｐＨのエマルジョンに匹敵する（図２ｂ）。ＷＰＩ安定エマルジョン液滴のｐＩ未満のｐＨ値で酸化速度が低いのは、鉄の酸化促進を防止する正に荷電されたエマルジョン液滴の能力の少なくとも一部であり、よって酸化を阻害するためであると考えられ、一方、負に荷電されたエマルジョン液滴は、鉄を引き付け、酸化を促進する。
【００３７】
アニオン性エマルジョン液滴によって脂質酸化が促進されたこと及びカチオン性エマルジョン液滴によって阻害されたことは、合成界面活性剤ＳＤＳによって安定化された負荷電エマルジョン液滴は鉄を結合することができ、よって、酸化を促進し、一方、ＤＴＡＢによって安定化された正荷電エマルジョン液滴は鉄と結合せず、より酸化的に安定していたことを報告する先行技術に合致している。ＷＰＩ安定化エマルジョン液滴のｐＨとｐＩとの間の差が増加するにつれて、脂質酸化の阻害（ｐＨ３．０はｐＨ４．０に匹敵する）又は加速（ｐＨ７．０はｐＨ６．０に匹敵する）が増加した。
【００３８】
実施例４
ＷＰＩ安定化水中油型エマルジョン中での脂質酸化速度に対する保存温度の作用
保存温度は、ＷＰＩ又はスウィート・ホエー（ＳＷ）で安定化したサーモン水中油型のエマルジョンの酸化安定性に重大な影響を有しており、保存温度が増加するにつれて（４〜３７℃）、ｐＨ３．０で脂質酸化を増加させる（図３ａ及び３ｂ、４ａ及び４ｂ）。酸化安定性に対する温度の影響は、５日間の保存後に、ＷＰＩとＳＷについて、脂質ハイドロパーオキシド濃度で、２０℃に対して３７℃でそれぞれ５倍及び６倍となり、３７℃で相当明らかとなった（図３ａ及び４ａ）。プロパナール濃度は、５日間の保存後に、ＷＰＩとＳＷについて、２０℃に対して３７℃でそれぞれ約２０倍及び９倍であった（図３ｂ及び４ｂ）。
【００３９】
実施例５
ホエー蛋白の異なる源によって安定したエマルジョンの酸化安定性の差の比較
図５ａ及び５ｂは、ＷＰＩ、ＳＷ、β−Ｌｇ及びα−Ｌｇで安定したサーモン水中油型エマルジョンにおいて、脂質ハイドロパーオキシド及びヘッドスペース・プロパナールの形成を示す。エマルジョンは、すべて０．２％の蛋白質及び５．０％のサーモン・オイルを用いて調製した。酸化速度は、蛋白質のｐＩ未満のｐＨ（３．０及び４．０）で生じる脂質酸化を強力に阻害する４つ蛋白質すべてについて、安定したエマルジョン中において、ｐＨの増加に伴って増加した（データは示さない）。カチオン性蛋白安定化エマルジョン液滴の生成は、酸化的に安定したエマルジョンを製造するための潜在的な方法であるので、異なるホエー蛋白安定化エマルジョン間の比較を、ｐＨ３．０で測定した。これらのエマルジョンは、酸化速度を加速するために、３７℃でインキュベートし、これにより、ｐＨ３．０でサンプルの酸化安定性における差を測定することがより容易になった。
【００４０】
酸化安定性は、脂質ハイドロパーオキシド及びヘッドスペース・プロパナールの双方の形成によって測定したように、ＷＰＩ安定化エマルジョンよりＳＷ安定化エマルジョンの方がより顕著であった（図５ａ及び５ｂ）。ＳＷは、ミネラル、クエン酸塩、リン酸塩、ラクトース及び低分子量ペプチドのような、純粋なＷＰＩで検出されない多数の成分を含むであろう。ＳＷ安定化エマルジョンのより大きな酸化安定性は、これらの成分が酸化に変化を起こすという能力による。例えば、クエン酸塩、リン酸塩及びカゼインリン酸ペプチドは、鉄とキレートを作り、かつ潜在的に脂質酸化を阻害することが知られている。しかし、ＳＷで調製されたエマルジョンが、保存の数日後において透明な血清層を形成することによって示されるように、物理的安定性が低かったことは注目されるべきである。
【００４１】
実施例６ａ
ｐＨ３．０で水中油型エマルジョン中の脂質酸化を阻害する界面吸着ホエー蛋白の能力についてのさらなる見識を得るために、食品で一般に使用される市販のホエー蛋白成分（ＷＰＩとＳＷ）の有効性を、純粋なホエー蛋白（α−Ｌａ及びβ−Ｌｇ）と比較した。ｐＨ３．０で蛋白質安定化エマルジョンにおいて、酸化は遅いと予想されたので、サンプルを３７℃で保存した。
【００４２】
β−Ｌｇは、脂質ハイドロパーオキシド形成を阻害することに最も有効であり、一方、β−Ｌｇ及びＳＷは、ヘッドスペース・プロパナールの形成を阻害することに最も有効であることが認められた（図４ａ及び図４ｂ）。蛋白安定化エマルジョン中で酸化速度を変化させるホエー蛋白の能力は、エマルジョン液滴の正の電荷が、β-Ｌｇ＞α−Ｌａ＞ＷＰＩ＞ＳＷの順序であるが（表１）、一方、脂質酸化の阻害が、β−Ｌｇ≧ＳＷ＞ ＷＰＩ≧α−Ｌａの順序であったために、カチオン性エマルジョン液滴を生成するそれらの能力と単独では関連するものではなかった。これは、他の因子もまた、脂質酸化を阻害する吸着蛋白の能力に影響を及ぼすことを示唆する。
【００４３】
実施例６ｂ
遊離スルフヒドリル基は、それらのフリーラジカルの捕集能力のために、ホエー蛋白の抗酸化能に関連している。これによって、β−Ｌｇ（１つの遊離スルフヒドリルを有している）で安定化されたエマルジョンが、α−Ｌａ（遊離スルフヒドリルを有していない）で安定化されたエマルジョンよりもより酸化的に安定であるかということを説明することができる。
【００４４】
ホエー蛋白中の遊離スルフヒドリルがエマルジョン中で脂質酸化を阻害することに関与することができたか否かを評価する目的で、スルフヒドリル基を阻害するためにＷＰＩをＮＥＭとインキュベートした。その後、コーン水中油型エマルジョンを、ＷＰＩ及びＮＥＭ処理ＷＰＩを用いて調製し、酸化速度を比較した（図６ａ及び６ｂ）。脂質ハイドロパーオキシドの形成について、未処理ＷＰＩに比較して、ＮＥＭ処理ＷＰＩでほとんど差は認めることができなかった（図６ａ）。ヘッドスペース・ヘキサノールの形成は、ＮＥＭの存在下でより低かった（図６ｂ）。ＷＰＩスルフヒドリル基が酸化を阻害する場合、ＮＥＭはシステインの抗酸化活性を阻害するため、ＮＥＭ処理サンプルは、より速い酸化が予想されるであろう。この実施例のデータは、おそらく、限定されることなく、遊離スルフヒドリル基は、少なくとも実験されたシステムにおいて、酸化速度において寄与するかもしれないが、重要な役割を果たすものではないことを示唆する。
【００４５】
また、ホエー蛋白は、非スルフヒドリル経路（例えば、チロシン）によって、フリーラジカルを捕捉することができ、当該分野において理解されているメカニズムは、さらに、ホエー蛋白の熱変性によって影響を受ける。したがって、蛋白源が異なる程度で熱処理された場合、源が異なるホエー蛋白によって安定化されたエマルジョンの酸化速度における差は、少なくとも一部において、アミノ酸組成における差又はアミノ酸にさらされることにおける差のためかもしれない。あるいは、源が異なるホエー蛋白は、種々の厚みの界面層を有するエマルジョンを生成するかもしれない。先の研究は、厚い界面領域を生成する従来の界面活性剤で形成されたエマルジョンは、酸化速度の遅延を示すであろうことを示している。従って、ここで用いた異なる源のホエー蛋白が、界面厚さを変化させてエマルジョンを生成する場合、これによって、観察された酸化速度における差を説明することができる。
【００４６】
実施例７
上述したように、本発明は、一連の食品、飲料あるいは医薬組成物への酸化的に安定な脂質の組み込み／供給のために用いることができる。限定されることなく、実施例１ｃを参照すると、蛋白質（Ａ：Ｂ）エマルジョンは、包装又は缶詰にされた野菜、肉及び魚、ソース及びトッピング、調味料、果物及び野菜ジュース、炭酸入り飲料、栄養飲料／濃縮物、乳製品又は大豆飲料、チーズ、ヨーグルト、ソース及び料理に供給又は組み込むことができる。
【図１】
2006514541.tif 000005
【図２】
2006514541.tif 000006
【図３】
2006514541.tif 000007
【図４】
2006514541.tif 000008
【図５】
2006514541.tif 000009
【図６】
2006514541.tif 000010