(57)【要約】  本発明は、除草剤に対して高い抵抗性を有するｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼを提供することを目的とする。  本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の遺伝子を提供する：（ａ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドを含む、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドを含む、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドからなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子。
【請求項３】
デトシルピラゾレートの該ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が４．０５μＭ以上である、請求項１または２の遺伝子。
【請求項４】
オウレン由来である請求項１から３いずれかの遺伝子。
【請求項５】
以下の（ｃ）または（ｄ）のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性であるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項７】
デトシルピラゾレートの該ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が４．０５μＭ以上である、請求項５または６のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項８】
オウレン由来である請求項５から７のいずれかのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９の組換えベクターを含む形質転換植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０の形質転換植物細胞を含む形質転換植物。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかの遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換した植物細胞を再分化させて植物体を得る工程を含むｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤抵抗性植物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１の形質転換植物を栽培する圃場における雑草の駆除方法であって、該形質転換植物を実質的に変化させることなく、かつ、標的とする雑草を駆除するのに有効量のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤を圃場に施用することを含む方法。
【請求項１４】
ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤がピラゾレートである請求項１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤抵抗性酵素、特に、ｐ−ヒドロキシピルビン酸ジオキシゲナーゼを標的とする除草剤に抵抗性の酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ−ヒドロキシピルビン酸ジオキシゲナーゼ（以下、ＨＰＰＤと称する）は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸(以下、ＨＰＰと称する)と分子酸素とからのホモゲンチジン酸(２,５-ジヒドロキシフェニル酢酸)の形成を触媒する。植物においては、この酵素は、プラストキノン、α−トコフェロール（ビタミンＥ）等の生合成に関与している（図１）。さらに、この酵素は最近、いくつかの除草剤の分子標的であることが判明した。【０００３】
植物のＨＰＰＤをコードする遺伝子（以下、ＨＰＰＤ遺伝子と称することもある）の全長あるいは部分配列は、ニンジン、シロイヌナズナ、オオムギ、トウモロコシ、イネ、ニシキジソ、アベナ、コムギ、ビロードキビ類、シンクリノイガ、ライグラス、オニウシノケグサ、アキノエノコログサ、オヒシバ、ソルガムにおいて明らかになっている（非特許文献１）。【０００４】
ＨＰＰＤを阻害する除草剤は、植物におけるプラストキノンの生合成を阻害し、その結果カロチノイドの減少、葉緑体の発達停止および白化が起こる。また、植物におけるプラストキノン含量の低下は、光合成電子伝達系にも影響を及ぼし、植物の生育抑制症状を引き起こすと考えられている。【０００５】
プラストキノン生合成系のもう一つの産物であるトコフェロールは、フリーラジカルの消去剤として作用する。したがって、植物におけるトコフェロール含量の低下は、脂質過酸化を引き起こし、これはネクロシス症状を導く。また、トコフェロール含量の低下は植物の光合成能力の低下を引き起こすと考えられている。【０００６】
ＨＰＰＤ阻害剤はこのような様々な作用により、雑草を枯死させると考えられる。したがって、ＨＰＰＤは、強力な除草剤の分子標的としてきわめて有効である。【０００７】
ＨＰＰＤを阻害する除草剤は、化学構造にしたがって、トリケトン（シクロヘキサンジオン）系、イソキサゾール系、ピラゾール系およびビシクロオクタンジオン（ＢＯＤ）系の４系統に分類される。この中でも、ピラゾール系のピラゾレートは高い除草活性を有することが知られている。ピラゾレートは、加水分解されて、その除草剤としての活性本体のデトシルピラゾレート（以下、ＤＴＰと称する）となる（図２）。また、ビシクロオクタンジオン（ＢＯＤ）系のベンゾビシクロンも、その加水分解物が活性本体である。【０００８】
ＨＰＰＤを標的とする除草剤に対して抵抗性の酵素が報告されている（特許文献１および２）。特許文献１に開示のＨＰＰＤは除草剤抵抗性の度合いは従来公知のＨＰＰＤと比較して２−４．５倍ときわめて低い。特許文献２に開示のＨＰＰＤも従来公知のＨＰＰＤと比較して数倍の抵抗性に過ぎないと考えられ、また、該ＨＰＰＤは野生型ＨＰＰＤに突然変異を導入した変異型酵素である。突然変異を導入しなくても高い除草剤抵抗性を有する植物由来のＨＰＰＤは知られていない。【０００９】
また、従来知られているＨＰＰＤ抵抗性植物を作成する方法は、いずれもＨＰＰＤを植物体内で過剰発現させることにより、酵素量を増加させて抵抗性を付与するというものであった。酵素自体が高い除草剤抵抗性を有する植物由来の野生型の酵素を用いることによる、除草剤抵抗性植物の作成方法は今まで成功していない。【００１０】
さらに、ＨＰＰＤ遺伝子は、トコフェロールおよびプラストキノン生合成系の遺伝子としても有用であるため、除草剤抵抗性植物の作成に有用であるだけでなく、トコフェロールやプラストキノンのような有用化合物生産のための遺伝子としても有用である。
【特許文献１】特表２００４−５２８８２１号公報
【特許文献２】特表２００１−５２２６０８号公報
【非特許文献１】植物の生長調節、vol.27、No.2、p146-155、2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、きわめて高い除草剤抵抗性を有するＨＰＰＤを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはオウレン培養細胞がピラゾレートの活性本体であるＤＴＰ（デトシルピラゾレート）に対して抵抗性を有することを見いだし、オウレンからＨＰＰＤ遺伝子を単離した。本発明者らはさらに、該ＨＰＰＤ遺伝子を大腸菌で発現させ、その活性を測定した結果、ＤＴＰに対して、従来知られているＨＰＰＤの約５００倍高い抵抗性を示すことを明らかにした。該ＨＰＰＤは、ベンゾビシクロンの加水分解物に対しても高い抵抗性を示した。【００１３】
すなわち本発明は、
以下の（ａ）または（ｂ）の遺伝子を提供する：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドを含む、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。【００１４】
本発明による除草剤抵抗性ＨＰＰＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ)は塩基番号１〜１２９０からなる。したがって、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１〜１２９０からなる遺伝子を提供する。なお、該ＯＲＦと終止コドンの３塩基を含むコード領域は、ヌクレオチド１〜１２９３からなる。本発明は、配列番号１の塩基番号１〜１２９０に相当する領域を含む限り、いずれの遺伝子もその範囲に含む。【００１５】
本発明は、配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ＨＰＰＤをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も提供する。なお、本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。【００１６】
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ除草剤抵抗性ＨＰＰＤをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も提供する。ここで、「１もしくは数個の塩基または塩基対」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数の塩基または塩基対を意味する。【００１７】
本発明はまた、配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで７０％以上の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性ＨＰＰＤをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も提供する。ヌクレオチド配列の相同性は好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、さらに好ましくは、９２％以上、９５％以上、９８％以上である。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTN検索により決定することができる。【００１８】
さらに本発明は、以下の（ｃ）または（ｄ）のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素を提供する：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性であるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。【００１９】
上記の「１もしくは数個のアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。また、変異タンパク質は、公知の変異タンパク質作製法等により人為的に導入された変異を有するタンパク質、および、天然に存在する同様の単離された配列番号２と比較して変異を有するタンパク質を含む。【００２０】
本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性ＨＰＰＤとして作用するタンパク質、ならびに、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで７２％以上の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性ＨＰＰＤとして作用するタンパク質を提供する。さらに本発明は、本発明のＨＰＰＤ遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。ここで、「１もしくは数個のアミノ酸」なる語は上記の通りの意味である。アミノ酸配列の相同性は好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９８％以上である。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTP検索により決定することができる。【００２１】
本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤは、ＨＰＰＤを標的とする除草剤、例えば、ピラゾール系のピラゾレート（その活性本体であるＤＴＰ）、およびビシクロオクタンジオン系のベンゾビシクロン、に対する除草剤抵抗性を植物に付与するのに有用である。【００２２】
好ましくは本発明によって提供される除草剤抵抗性ＨＰＰＤは、デトシルピラゾレート（ＤＴＰ）の、該ＨＰＰＤに対するＩＣ５０が４．０５μＭ以上のもの、例えば４．０５〜１０．０３μＭのものである。
好ましくは本発明によって提供される除草剤抵抗性ＨＰＰＤはオウレン由来である。【００２３】
本発明はまた、本発明のＨＰＰＤ遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換植物細胞、および、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物を提供する。【００２４】
形質転換される植物の具体例としては、ダイズ、イネ、ナタネ、ワタ、ジャガイモ、トマト、タバコ、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどが挙げられ、好ましくはダイズ、イネである。【００２５】
さらに本発明は、ＨＰＰＤ遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換した植物細胞を再分化させて植物体を得る工程を含むＨＰＰＤ阻害除草剤抵抗性植物の製造方法を提供する。
ここで、「形質転換植物」なる語は、形質転換された植物体、植物器官、植物組織および植物培養細胞のすべてを含む。【００２６】
本発明はまた、形質転換植物を栽培する圃場における雑草の駆除方法であって、該形質転換植物を実質的に変化させることなく、かつ、標的とする雑草を駆除するのに有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤を圃場に施用することを含む方法を提供する。好ましくは該ＨＰＰＤ阻害除草剤はピラゾレートおよびベンゾビシクロンである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のＨＰＰＤ遺伝子を用いて、ＨＰＰＤを阻害する除草剤に対して植物に抵抗性を付与することが可能である。ＨＰＰＤを阻害する除草剤は非選択的阻害剤として知られていることから、本発明のＨＰＰＤ遺伝子は広範囲の作物に除草剤抵抗性を与え得る。また、ＨＰＰＤはプラストキノンやトコフェロール生合成系の重要な酵素であるため、本発明のＨＰＰＤ遺伝子はこれら有用化合物生合成系の代謝工学にも有用でありうる。【００２８】
また、本発明により、除草作業の軽減が期待される。さらに、本発明のＨＰＰＤ遺伝子を含む組み換え微生物あるいは、組み換え植物は、トコフェロール／プラストキノン等の有用ビタミン類の生産において有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＨＰＰＤに触媒される反応およびプラストキノン生合成の阻害を示す図である。
【図２】図２は、ＨＰＰＤ阻害剤の構造を示す図である。ａ：ピラゾレートは加水分解され、活性型のデトシルピラゾレート（ＤＴＰ）となる。ｂ：トリケトン型のＨＰＰＤ阻害剤。
【図３】図３は、タバコ培養細胞の生長に対するＤＴＰの効果を示す図である。タバコにおいてＤＴＰは顕著な生育阻害を示した。
【図４】図４は、オウレン培養細胞の生長に対するＤＴＰの効果を示す図である。オウレンにはＤＴＰは阻害作用を示さなかった。
【図５】図５は、オウレンから単離されたＨＰＰＤと他生物種から単離されたＨＰＰＤ配列の部分比較を示す図である。図中、三角は、鉄結合残基を示す。また、活性部位を枠で示す。
【図６】図６は、ＨＰＰＤの系統樹を示す図である。
【図７】図７は、大腸菌で発現させたオウレンＨＰＰＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：コントロールベクター（pET-21d)、レーン３：ＨＰＰＤ。矢印は予測された組換えＨＰＰＤの産生を示す。
【図８】図８は、組換えＨＰＰＤによる反応産物のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図９】図９は、ニンジン培養細胞由来のＨＰＰＤに対するピラゾレートならびにＤＴＰの阻害効果を示す図である。阻害剤のないときの活性は4.9nmolホモゲンチジン酸／分／mgタンパク質である。○はピラゾレート、●はＤＴＰを示す。この図からニンジンのＨＰＰＤに対するＤＴＰのＩＣ５０は13nMであることがわかる（Hiroshi Matsumoto et al., 2002)。
【図１０】図１０は、オウレンＨＰＰＤに対するＤＴＰの効果を示す図である。阻害剤を含まない場合の酵素活性は3.8nmol／分／mgタンパク質であった。阻害曲線から、オウレンＨＰＰＤのＩＣ５０は6.75μM（ニンジンの場合の約５００倍）であることがわかる。
【図１１】図１１は、オウレンＨＰＰＤに対するベンゾビシクロン加水分解物の効果を示す図である。阻害曲線から、オウレンＨＰＰＤのＩＣ５０は1.2μMであることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明において、除草剤抵抗性ＨＰＰＤとは、ＨＰＰＤを標的とする除草剤、例えばＤＴＰの、ＨＰＰＤに対するＩＣ５０が、従来知られているニンジン由来のＨＰＰＤ（Garcia, I et al., Biochemical Journal (1997) vol.325, 761-769）に対するＩＣ５０の１０倍以上、好ましくは５０倍以上、より好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは５００倍以上であるＨＰＰＤを意味する。ここで、ＩＣ５０とは、ＨＰＰＤ酵素活性を５０％阻害する除草剤、例えばＤＴＰの濃度である。したがって、本発明のＨＰＰＤを含まない雑草等の植物を枯死させるのに実質的に十分な濃度の除草剤を施用した場合であっても、本発明のＨＰＰＤを有する植物、好ましくは農業用有用な作物は、枯死しない。したがって本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤは、有用な作物を枯死させることなく、雑草のみを除草することを可能とするものである。【００３１】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のＨＰＰＤ遺伝子
本発明は、除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子を提供する。
本発明者らは、キンポウゲ科のセリバオウレン（Coptis japonica）の培養細胞からＨＰＰＤ遺伝子を単離し、その配列決定を行った（配列番号１）。【００３２】
本発明のＨＰＰＤ遺伝子は好ましくは、配列番号１に示す塩基配列の塩基第１〜第１２９３からなるポリヌクレオチドであるが、この部分に相当する部分が含まれる限り、いずれの遺伝子であってもよい。配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、オウレン培養細胞から従来公知の方法によって調製したcDNAライブラリーから得ることが出来る。【００３３】
本発明はまた、配列番号２の除草剤抵抗性ＨＰＰＤとして作用するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ここで「除草剤抵抗性ＨＰＰＤとして作用するタンパク質と機能的に同等タンパク質」とは、配列番号２のタンパク質と同等の生物学的機能を有する、即ち、ＨＰＰＤ酵素活性を有し、かつ、先に定義した除草剤抵抗性を示すタンパク質であることをいう。【００３４】
本発明の遺伝子には、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする突然変異体、誘導体、バリアントおよびホモログが含まれる。【００３５】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする遺伝子を調製するための方法は当業者によく知られており、例えば、部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. Methods in Enzymology, 154: 350-367(1987)）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように本発明のＨＰＰＤ（配列番号２）をコードするアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、天然のものであっても、配列番号２の除草剤抵抗性ＨＰＰＤと同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。また、塩基配列の変異によって、タンパク質中のアミノ酸が変化しない場合（縮重変異）もある。このような縮重変異体も本発明の遺伝子に含まれる。本発明のＨＰＰＤ遺伝子を構成するDNAの、配列番号１の配列と比較して変異した塩基の数は、アミノ酸レベルにおいて、３０アミノ酸以内、好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）の変異をもたらすものである。【００３６】
本発明のＨＰＰＤ遺伝子を獲得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法が採用される。例えば、該遺伝子は、ゲノムDNA、cDNAライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子には、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製方法は、当業者に周知である。本発明のＨＰＰＤをコードするゲノムDNAは、例えば、植物細胞または組織からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、本発明のタンパク質をコードするDNA（配列番号１）を基に調製したプローブを用いて、該ライブラリーのスクリーニング（例えば、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーション）を行う方法により調製することが可能である。【００３７】
また、本発明のＨＰＰＤ遺伝子は、配列番号１の配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行う方法によって調製することも可能である。また、本発明のＨＰＰＤをコードするcDNAは、例えば、植物細胞または組織から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、該ライブラリーのスクリーニング（例えば、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーション）を行う方法により、また、PCR法により調製することが可能である。【００３８】
本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子は、例えば、トコフェロール／プラストキノン生合成経路を増強することにより、トコフェロール／プラストキノン等の有用ビタミン類の大量生産に利用することが可能である。【００３９】
除草剤抵抗性ＨＰＰＤをコードする遺伝子の全長cDNAの単離方法
本発明のＨＰＰＤ遺伝子は、オウレン培養細胞由来である。したがってオウレン由来の該ＨＰＰＤ遺伝子を用いて、オウレン以外の植物から除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子の全長cDNAをクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。ここで、得られた遺伝子が除草剤抵抗性ＨＰＰＤとしての機能を有するタンパク質をコードするか否かは、当業者により一般的に行われているようにして判定できる。まず、得られた遺伝子にコードされるタンパク質が、ＨＰＰと酸素からホモゲンチジン酸の生成を触媒するＨＰＰＤ酵素活性を有するか否かは、当業者に周知の酵素活性測定方法により確認することができる。次いで、種々の濃度の除草剤、例えばＤＴＰの存在下にＨＰＰＤ酵素活性を測定し、その酵素活性を５０％阻害する除草剤の濃度（ＩＣ５０）を決定することにより判定できる。ＨＰＰＤ酵素活性の測定、および、ＤＴＰに対するＩＣ５０の評価は実施例に記載のように行うことが出来る。【００４０】
本発明の遺伝子は定法に従い、多くの植物から単離することができる。また、本発明の遺伝子は、ホスファイトトリエステル法(H.Hunkapiller et al.,Nature、vol.310、p.105-111、1984)等の一般的な方法により、化学合成して得ることもできる。【００４１】
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている植物からＨＰＰＤ遺伝子を取得する場合、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に対して相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。例えば、BLASTN等のアルゴリズムによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。【００４２】
また、ゲノムがデータベース化されていない植物からＨＰＰＤ遺伝子を取得する場合、例えば、従来公知のDNAライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニングベクターを使用してゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを調製する工程と、配列番号１のポリヌクレオチドの少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、該プローブにハイブリダイズする断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明のＨＰＰＤ遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、ＨＰＰＤ遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポリヌクレオチドの長さは、100bp以上が好ましい。【００４３】
より具体的には、本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. Journal of Molecular Biology, 98, 503(1975)）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science, 230, 1350-1354(1985)、Saiki, R. K. et al. Science, 239,487-491(1988)）が挙げられる。即ち、本発明のＨＰＰＤ遺伝子（配列番号１）もしくはその一部をプローブとして、また該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、植物細胞から該遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離することが可能である。このようにハイブリダイゼーション技術やPCR技術により単離しうる、本発明の除草剤抵抗性ＨＰＰＤと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた本発明に含まれる。【００４４】
このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、上記のように、6M尿素、 0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSCの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子を効率的に単離することができる。こうして単離された遺伝子は、アミノ酸レベルにおいて、本発明のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と高い相同性を有すると考えられる。ここで、高い相同性とは、アミノ酸レベルで、少なくとも７２％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５%以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、FASTA検索 （Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やBLASTP検索により決定することができる。【００４５】
形質転換細胞の作製方法
本発明の遺伝子を発現する形質転換植物を作製する方法は、本発明のＨＰＰＤ遺伝子を適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることを含む。【００４６】
また、本発明の形質転換細胞は、本発明のＨＰＰＤ遺伝子または組換えベクターが導入された細胞である。ここで、「遺伝子または組換えベクターが導入された」とは、公知の遺伝子操作技術により、遺伝子または組換えベクターが、例えばプロモーターの作用により、発現可能に宿主内に導入されることを意味する。【００４７】
本発明の形質転換細胞は、本発明のＨＰＰＤ遺伝子を直接宿主に導入すること、あるいは該遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定されず、例えば、除草剤抵抗性植物の作成のためには植物、有用ビタミン類生合成のためには酵母、大腸菌などの微生物などが挙げられる。なお、形質転換は一過性でもよいが、好ましくは安定にＨＰＰＤ遺伝子が組み込まれるものである。【００４８】
得られた遺伝子は、植物に導入する場合は、植物にて発現を引き起こすことができるプロモーターに連結して使用する。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター（CaMV35Sプロモーター）、ノパリンシンセターゼのプロモーター、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小サブユニットのプロモーター等が挙げられる。【００４９】
本発明の形質転換細胞を作製するには当業者に公知の種々の方法を用いればよい。かかる方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法などが挙げられる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al., Plant Physiol. 100:1503-1507(1995)参照）。例えば、形質転換植物体を作出する方法としては、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して植物材料に遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）などを挙げることができる。【００５０】
一旦、ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから得た繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を用いて該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の遺伝子が導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びにそれら由来の繁殖材料も含まれる。【００５１】
本発明において使用することができるベクターとしては、従来から微生物や植物などの形質転換に使用されているベクターを挙げることができる。かかるベクターは、本発明の遺伝子またはその断片の他に、遺伝子の発現を可能とする構成的または誘導性プロモーター、形質転換体の選抜を容易にする薬剤抵抗性遺伝子、アグロバクテリウムのバイナリ−ベクター系に使用される複製開始点などを含んでいてもよい。【００５２】
より具体的には、大腸菌などの微生物へ導入される場合には、pBluescript系のベクターや、pETベクターなどを使用することができる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で導入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での構成的遺伝子発現を導くプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや誘導性プロモーター（例えば、エチレン応答性PR5dプロモーター、水分ストレス誘導性rd29Aプロモーター等）を有するベクターを用いることも可能である。また、薬剤抵抗性遺伝子としてはアンピシリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子などを挙げることができる。【００５３】
複製開始点としては、Ti又はRiプラスミド由来の複製開始点などを挙げることができる。プロモーターに連結されたDNAは、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法等を用いて、植物細胞に直接導入することが可能である。また、該DNAを、植物への遺伝子導入用プラスミドベクターに組込み、植物感染能のあるウィルスや細菌を介して間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウィルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ジェミニウィルス、タバコモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が使用でき、また、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、A.ツメファシエンスと略す）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等を使用することができる。A.ツメファシエンスを用いるアグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合のプラスミドとして、例えばpBI101、pBI121(いずれもClontech社)等が挙げられる。【００５４】
本発明においてベクターが導入される植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。【００５５】
本発明の、ＨＰＰＤ遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換した植物を再分化させて植物体を得る工程を含むＨＰＰＤ阻害除草剤抵抗性植物の製造方法によれば、高い除草剤抵抗性を有する植物を得ることが出来る。【００５６】
さらに、本発明により、オウレンおよびその他種々の植物（例えば、ケシ科植物（ハナビシソウ、ケシ）、イネ科植物（イネ、トウモロコシ）、ナス科植物（トマト、ジャガイモ）、マメ科植物（ダイズ）など）から、トコフェロール／プラストキノンを大量産生させることも可能である。【００５７】
本発明のタンパク質、それをコードする遺伝子およびその利用法
本発明のタンパク質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性ＨＰＰＤ酵素として作用するタンパク質、または、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで７２％以上の相同性を示し、かつ、除草剤抵抗性ＨＰＰＤ酵素として作用するタンパク質が含まれる。【００５８】
また、本発明のタンパク質に、タンパク質の精製や検出等を容易にするための公知のHAやFlag等のタグを末端に融合させてもよいし、異種タンパク質と融合させてもよい。また、本発明のタンパク質はN-グリコシル化などの各種修飾を受けていてもよい。【００５９】
本発明によるタンパク質は下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、植物細胞を含む様々な起源から単離、精製したものでもよい。【００６０】
組み換えＨＰＰＤを調製する一般的方法は、本発明のＨＰＰＤ遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製することを含む。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。融合タンパク質としては、例えば、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグとの融合タンパク質（Novagen社のpETシリーズ）などが挙げられる。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M.& Higa, A. Journal of Molecular Biology, 53, 158-162(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, 166, 557-580(1983)）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を、マルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、アフィニティー精製により容易に回収することが出来る。【００６１】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質またはその一部をウサギなどの動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質またはその一部で免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００６３】
本発明者らは、オウレン培養細胞が、タバコ培養細胞よりもＤＴＰに対してより抵抗性であることを見いだした。図３は、タバコ培養細胞のＤＴＰの存在下での生育、図４はオウレン培養細胞のＤＴＰの存在下での生育を表すグラフである。【００６４】
かかる知見に基づき、本発明者らはオウレン細胞からＨＰＰＤをコードする全長cDNAを単離した。本発明者らはオウレン由来のＨＰＰＤcDNAのヌクレオチド配列を提供する。該ヌクレオチド配列(1293bp)は分子量47.3kDaの430 アミノ酸残基からなるタンパク質をコードし、その他の種からのＨＰＰＤと類似の特異的Ｃ末端領域を有する。【００６５】
大腸菌において発現させた組換えＨＰＰＤ遺伝子は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）をホモゲンチジン酸に変換した。これはこの遺伝子が機能的ＨＰＰＤをコードすることを示す。組換えＨＰＰＤの酵素学的な分析により、ＤＴＰ（除草剤ピラゾレートの活性本体である）に対するＩＣ５０値は6.75μMであり、ＨＰＰについてのKm値は43μMであることが示された。このＩＣ５０値は従来報告されている種々の植物由来のＨＰＰＤについての値と比べて劇的に高く、本発明のＨＰＰＤの除草剤抵抗性は従来既知の植物（ニンジン）由来のＨＰＰＤと比べて約５００倍高かった。また、除草剤ベンゾビシクロンの加水分解物に対するＩＣ５０値は1.2μMであった。【００６６】
実験手順
植物材料
オウレン培養細胞(156-SMT)およびタバコNII細胞を使用した。オウレン細胞は、10 μMのナフタレン酢酸および0.01 μMの6-ベンジルアデニンを含有するＬＳ（Linsmaier-Skoog）液体培地で培養した。タバコ細胞は10 μMのNAA および1μMのカイネチンを含有するＬＳ液体培地で培養した。懸濁培養細胞を100 mlの三角フラスコ、20 mlの培地中で回転振盪培養器、90 rpm.にて25℃、オウレン細胞は暗所、タバコ細胞は3000 lux、16-時間明条件の条件に維持した。除草剤ＤＴＰを様々な濃度でメタノール溶液として液体培地に添加した。培養細胞の生育はＤＴＰによる３週間の処理の後に１つの100 ml 三角フラスコ中の総組織新鮮重量として測定した。【００６７】
試薬
ｐ−ヒドロキシピルビン酸はAldrichから購入した。ホモゲンチジン酸はSigmaから購入した。ＤＴＰは三共製薬より譲り受けた。ベンゾビシクロン加水分解物は、エス・ディー・エス・バイオテックより入手した。【００６８】
オウレンのcDNAライブラリーからのＨＰＰＤの全長cDNAの単離
オウレン培養細胞からcDNAライブラリーを調製し、配列決定した。1014のESTを配列決定し、これらの配列をBLASTXサーチを利用してその機能を推定した(http;//www.ncbi.nih.gov/BLAST. (E. Dubouzet et. al))。BLASTXサーチにより、本発明者らはＨＰＰＤをコードするESTクローンを見いだした。このクローンのさらなる配列情報を得るために全長cDNA 配列を決定することとした。【００６９】
オウレンからＨＰＰＤの全長cDNAを単離するために5'RACEをGeneRacerキット(Invitrogen)を用いて行った。遺伝子特異的リバースプライマー(5'CATGCGTAGCGACACATCGCGCGGGGT3')を先に見いだしたESTのヌクレオチド配列に基づいて設計した。PCR 断片を単離し、pGEM T easyベクター(Promega)にサブクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。【００７０】
推定タンパク質配列のアラインメント分析
推定タンパク質配列をClustal W とBoxshade(www.ch.embnet.org/software/BOX form.html.)を用いてアラインメントした。Clustal Wは系統樹の算出にも用いた。【００７１】
オウレンＨＰＰＤ遺伝子を含む発現ベクターpET21dの構築
全長オウレンＨＰＰＤ cDNAのPCR増幅を用い、トランジットペプチドを含まない成熟オウレンＨＰＰＤ用大腸菌用発現ベクターをpET21d中に構築した。PCRには以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
フォワードプライマー、5'TACTAACCATGGTTCCCAGCACAGCCTCCA3'（配列番号３）（これにはATG翻訳開始コドンを含むNcoI 制限部位を含めた(下線);
リバースプライマー、5'TATGAATTCTCAAATGCAACTATGCAGCAACA3'（配列番号４）（これはcDNA の３’末端と相補的であり、TGA 停止コドンの6bp 後に、EcoRI制限部位を含めた(下線）。【００７２】
PCRを以下の条件で行った:最初の変性工程、2分、94℃; 15秒、94℃の変性、30秒、56℃のアニーリング、2分、68℃のDNA伸長からなるサイクルを30サイクル、そして最後の68℃、5分の伸長、これにはKOD-plus DNAポリメラーゼ(東洋紡)を用いた。PCR断片をNcoI およびEcoRI 制限酵素で切断したpET21dベクター(Novagen)にサブクローニングした。オウレンＨＰＰＤ cDNA断片をpET21d中T7ポリメラーゼプロモーターの制御下においた。DNAインサートの両鎖を配列決定し、PCR増幅中に突然変異が導入されていないことを確認した。【００７３】
大腸菌における組換えオウレンＨＰＰＤの発現
オウレンＨＰＰＤ発現プラスミド(pET21d)を大腸菌BL21 (DE3)に導入した。これら組換え大腸菌細胞を100 mMのアンピシリンを含むＬＢ培地100 ml中で30℃で120rpmにて培養した。ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド）を大腸菌のOD600が0.6となった時点で終濃度1 mMとなるように添加した。細胞をさらに8時間30℃で培養した。【００７４】
細胞を14,000 rpm、5分、4℃の遠心分離によって回収した。ペレットを5mlの抽出バッファー(50 mM Tris-HCI、10 % グリセロール、5 mM 2-メルカプトエタノール)に再懸濁し、Handy Sonic(UR-ZOP, TOMY SEIKO co. LTD)で超音波処理した(出力設定５で15秒ｘ6回)。粗抽出物を14,000 rpmで5分遠心分離し、細胞フリーの上清を得た。沈降したタンパク質を14,000 rpm、5分の遠心分離で除いた。上清をPD-10カラム(Amersham Bioscineces)で脱塩し、ＨＰＰＤ酵素活性の測定に用いた。【００７５】
タンパク質の電気泳動分析
組換えタンパク質を10%アクリルアミドを含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。タンパク質サンプルを2XSDS-PAGE試料液(0.125 M Tris-HCl, pH6.8, 20% グリセロール、10% ２−メルカプトエタノール、4% SDS)で処理した。展開したゲルをクーマシーブリリアントブルーR-250で染色した。タンパク質濃度を標準としてウシ血清アルブミンを用いるブラッドフォード法により測定した。【００７６】
組換えオウレンＨＰＰＤの酵素活性アッセイ
ＨＰＰＤ活性をHPLCおよびLC-MSで測定した。100μLの標準酵素反応混合物は以下からなるものであった：100 mMリン酸カリウムバッファー、pH 6.5、50 mMアスコルビン酸、10 μL (37.18 μgの脱塩タンパク質)の酵素調製物および200μMのｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸(pH7.7)。ただしｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸濃度は動力学パラメーターの測定にあたっては2μM -200μMの様々な濃度とした。【００７７】
除草剤ＤＴＰを該溶液に0.5% ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液として添加した。反応混合物を5分、30℃でインキュベートした。反応をトリクロロ酢酸(終濃度2%)の添加により停止させた。タンパク質が沈降した後、反応生成物を逆相HPLC （島津製作所LC-10Aシステムを装備）を用いて定量した。【００７８】
TCA上清 (50μ1または20μl)をCl8カラムに注入し、流速0.8 mL/分で溶出した。移動相は10mM酢酸-メタノール(85:15 [Vol/Vol])であった。ＨＰＰＤ活性のアッセイは、形成されたホモゲンチジン酸の量のHPLC および280 nm のUV吸光度による測定に基づくものとした。ホモゲンチジン酸の定量はピーク面積の測定により行った。検量線を用いてピーク面積をホモゲンチジン酸量に変換した。生成物であるホモゲンチジン酸の形成はLC-MS(LC-MS-2010, 島津製作所、ネガティブモード、溶媒は20 mM 酢酸アンモニウムpH 5.5、流速は0.5m1/分)で確認した。【００７９】
粗酵素の動力学定数を基質濃度を変動させることによって判定した。データはKaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA)を用いて非線形最小二乗反復法によってミカエリスメンテン式に適合させた。【００８０】
ベンゾビシクロン加水分解物を用いたＨＰＰＤ阻害実験
ベンゾビシクロン加水分解物を用いたＨＰＰＤ阻害実験は、以下の点を除いては、ＤＴＰを用いた上記阻害実験と同様にして行った。
様々な濃度の阻害剤ベンゾビシクロン加水分解物と、酵素溶液(100 mMリン酸カリウムバッファー、pH 6.5、50 mMアスコルビン酸、10 μL (37.18 μgの脱塩タンパク質)の酵素調製物）を、３０℃で５分間インキュベーションし、阻害剤と酵素との反応を十分に行った後、基質（200μMのｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸(pH7.7))を酵素溶液に添加し、酵素反応を１０分間行った。生成物であるホモゲンチジン酸の形成はLC-MS(LC-MS-2010, 島津製作所、ネガティブモード、溶媒は20 mM 酢酸アンモニウムpH 5.5、流速は0.5m1/分)で確認した。【００８１】
結果
ＤＴＰによる培養細胞の生育阻害
ＤＴＰによるタバコ、オウレンの培養細胞に対する生育阻害を調べた。タバコ培養細胞に対してＤＴＰは顕著な生育阻害を示し、３、３０、１００μＭのＤＴＰは、細胞重量をそれぞれ５０．８、２３．８、５．５％にまで減少させた（図３）。一方、ＤＴＰは、オウレン培養細胞に対しては１００μＭまでの濃度において、ほとんど生育阻害を示さなかった（図４）。したがって、オウレン培養細胞はＨＰＰＤを標的とする除草剤であるＤＴＰに対して抵抗性を有することが明らかとなった。このことはオウレン培養細胞のＨＰＰＤが除草剤抵抗性であることを示唆するものであった。【００８２】
ＨＰＰＤ様クローンの配列分析
cDNAライブラリーを大量のアルカロイドを産生するオウレン細胞から調製し、その1014の ESTを得た。BLASTサーチ(hppt://www.ncbi.nlmgov/blast/）によりこれら配列決定されたクローンの中にはＨＰＰＤのクローンが含まれていることが示された。このＨＰＰＤクローン中のcDNAインサートは約1539bpの長さであり、その3’末端にポリ(A)テイルを有していた。いくつかのアミノ酸ドメインはオウレンＨＰＰＤクローンのDNAインサートの推定アミノ酸配列とシロイヌナズナ配列との間で高度に保存されており、これら２つのドメイン配列は互いに80%の同一性を示した。これらの結果から、本発明者らは、オウレンＨＰＰＤのインサートはＨＰＰＤのＣ末端部分をコードする部分cDNAであると推測した。それが全長cDNAであるかを調べるために、本発明者らはcDNA-特異的プライマーとオウレン培養細胞から単離したトータルRNAを用いた5'RACEにより全長cDNAを単離した。【００８３】
単離されたオウレンＨＰＰＤは2183bp長であり430-アミノ酸ポリペプチド(分子量47.3 kDa)をコードするORFを含んでいた。オウレンＨＰＰＤのORFは208bpの5'非翻訳領域と194bpのポリ(A)を含む3'非翻訳領域に挟まれていた。【００８４】
オウレンＨＰＰＤとその他の種のＨＰＰＤのアラインメント(図５)により、他の植物のＨＰＰＤとの高い同一性が示され、シロイヌナズナとの同一性が最高であり71.0 %であった。ヒト (30.5%)およびS. avermilitis (32.4%)との同一性は低かった。オウレンを含む様々な種のＨＰＰＤ配列はタンパク質のC-末端領域での保存性が高かった。トウモロコシとシロイヌナズナからのタンパク質の活性部位であると考えられているアミノ酸残基はオウレンＨＰＰＤ配列においても存在していた。そしてその他の植物由来のＨＰＰＤと同様にオウレンＨＰＰＤもまたアミノ酸のN-末端延長を有していたが、このオウレンにおける延長はその他の植物におけるものより短かった。植物のＨＰＰＤは少なくとも30 アミノ酸の延長を有する点で細菌および哺乳類のＨＰＰＤとN-末端において顕著に異なっていると考えられている。これら残基は細胞内区画への標的化シグナル、即ち、葉緑体への輸送シグナルである可能性がある。【００８５】
系統樹によると、ＨＰＰＤの原核生物と真核生物の両方の形態は同じタンパク質ファミリーのメンバーであることが示された。オウレンＨＰＰＤ、シロイヌナズナＨＰＰＤおよびA. theophrastiのＨＰＰＤは同一クラスター内にある(図６)。【００８６】
大腸菌におけるＨＰＰＤの全長cDNAの発現
アミノ酸配列により、単離されたcDNAはオウレンＨＰＰＤをコードすることが示唆された。このクローンの実体を確認するために、組換えタンパク質を大腸菌で産生した。本発明者らはＨＰＰＤの活性を調べるために大腸菌において組換えタンパク質を産生する発現ベクターを構築した。本発明者らは成熟ポリペプチドを産生させるために大腸菌用発現ベクターpET-21dにおける開始コドンに適合するように cDNA にNcoI部位を導入した。このコンストラクトを次いで大腸菌細胞に導入し、組換えタンパク質の産生を誘導した。大腸菌酵素粗抽出液をPD-10カラムで脱塩し、脱塩した溶液をＨＰＰＤ活性の検出に用いた。SDS/PAGE分析は明らかにトランスジェニックな発現が誘導されたことを示した。サブユニットの分子量はおよそ51 kDaであると評価された(図７)。【００８７】
pET-HPPDコンストラクトを担持する大腸菌は液体培地と固体培地の両方で暗褐色を示したのに対し、空のpET-21dベクターを担持する大腸菌はそのような暗褐色を示さなかった (データ示さず)。同様の暗褐色の着色は他の起源のＨＰＰＤによっても観察されている。この色素は、組換えＨＰＰＤによって合成されたホモゲンチジン酸の酸化的重合の産物である。反応混合物をHPLC分析にかけたところ明らかに、組換え大腸菌酵素粗抽出液は、ホモゲンチジン酸標準と全く同じ挙動を示す化合物を産生していることが示された(図８)。空のpET-21dベクターを含むコントロールの大腸菌可溶化液では同じ位置でこのピークを生じなかった。【００８８】
これらの結果により、単離したオウレンＨＰＰＤ cDNAが機能的なＨＰＰＤをコードしていることが示された。LC-MS分析により、ホモゲンチジン酸が組換え大腸菌酵素粗抽出液によってｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸から産生されていることが確認された。【００８９】
組換えＨＰＰＤの特徴付け
ＨＰＰＤ活性が確認されたので、本発明者らはさらに脱塩した組換え酵素を用いてＨＰＰＤの酵素的特性を特徴づけた。
まず、本発明者らはｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質として用いてＨＰＰＤ反応についてのpH 条件を至適化した。様々なpHでの酵素アッセイにより、ホモゲンチジン酸へのＨＰＰの変換反応の最適pHはおよそ6.5であることが判明した。タイムコース研究により、ホモゲンチジン酸の蓄積は10μlの脱塩酵素(37.2 μg タンパク質)と200μMのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸の存在下では少なくとも10分間直線的であることが判明した。最適温度は30℃であった。【００９０】
次に、組換えＨＰＰＤの基質親和性をＨＰＰを基質としてHPLC分析により測定した。基質濃度を変動させたところ、反応はミカエリスメンテン型の動力学にしたがうものであった。動力学パラメーターであるKmは43.2μMであると評価され、これはその他の植物からのＨＰＰＤについて報告されている値よりも高かった。【００９１】
ＤＴＰによるＨＰＰＤ活性の阻害
ＤＴＰはＨＰＰＤ阻害剤として作用することが知られている。Matsumoto et al. (2002)は、ニンジン培養細胞からの高度に活性な抽出物を用いたＨＰＰＤアッセイにより、ＤＴＰがＨＰＰＤをＩＣ５０値13 nmol/Lにて阻害することを示した（図９）。【００９２】
ＤＴＰの組換えオウレンＨＰＰＤに対する効果を検出するために、本発明者らは様々な濃度のＤＴＰの0.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液を酵素反応液に添加した後、該酵素を添加した。ＤＴＰはニンジン細胞抽出物よりも高い濃度にて組換えオウレンＨＰＰＤに対する阻害を示した。ＤＴＰはオウレンＨＰＰＤをＩＣ５０値6.75μMにて阻害した（図１０）。これは、オウレンのＨＰＰＤがニンジンのＨＰＰＤよりも除草剤ピラゾレートの活性本体ＤＴＰに対する抵抗性が約５００倍高いことを示す。【００９３】
ベンゾビシクロン加水分解物を用いたＨＰＰＤ阻害実験
ベンゾビシクロン加水分解物の組換えオウレンＨＰＰＤに対する効果を検出するために、本発明者らは様々な濃度のベンゾビシクロン加水分解物溶液を酵素反応液に添加した後、基質となるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を添加した。酵素活性は、ホモゲンチジン酸のピークエリア面積を元に、阻害剤ベンゾビシクロン加水分解物なしのときの活性を100%とした相対活性として表示した。ベンゾビシクロン加水分解物はオウレンＨＰＰＤをＩＣ５０値1.2μMにて阻害した（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のＨＰＰＤは、除草剤抵抗性を示し、非常に有用なものである。本発明のＨＰＰＤおよびＨＰＰＤ遺伝子は、プラストキノン／トコフェロールの生産に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月14日(2007.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドを含む、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子、
ここで、デトシルピラゾレートの該除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０は、０．６５μＭ以上である。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列の第１〜１２９３塩基からなるポリヌクレオチドからなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子。
【請求項３】
デトシルピラゾレートの該ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が４．０５μＭ以上である、請求項１または２の遺伝子。
【請求項４】
オウレン由来である請求項１から３いずれかの遺伝子。
【請求項５】
以下の（ｃ）または（ｄ）のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ除草剤抵抗性であるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素、
ここで、デトシルピラゾレートの該除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０は、０．６５μＭ以上である。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項７】
デトシルピラゾレートの該ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が４．０５μＭ以上である、請求項５または６のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項８】
オウレン由来である請求項５から７のいずれかのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９の組換えベクターを含む形質転換植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０の形質転換植物細胞を含む形質転換植物。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかの遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換した植物細胞を再分化させて植物体を得る工程を含むｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤抵抗性植物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１の形質転換植物を栽培する圃場における雑草の駆除方法であって、該形質転換植物を実質的に変化させることなく、かつ、標的とする雑草を駆除するのに有効量のｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤を圃場に施用することを含む方法。
【請求項１４】
ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害除草剤がピラゾレートである請求項１３の方法。
【請求項１５】
デトシルピラゾレートの該除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が、１．３μＭ以上である、請求項１、２または４のいずれかの遺伝子。
【請求項１６】
デトシルピラゾレートの該除草剤抵抗性ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素に対するＩＣ５０が、１．３μＭ以上である、請求項５、６または８のいずれかのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素。
【国際調査報告】
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