(57)【要約】  本発明は、骨代謝異常疾患の治療薬となり得る破骨細胞分化形成抑制剤を提供する。また当該破骨細胞分化形成抑制剤を探索するスクリーニング方法を提供する。本発明の破骨細胞分化形成抑制剤は、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効成分とする。また、本発明の破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法は、(a) 被験物質の存在下で、c-SrcとADAPとを接触させる工程、(b)c-SrcとADAPとの結合を測定する工程、および(c) c-SrcとADAPとの結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程から構成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）とc-Srcの結合を阻害する活性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
【請求項２】
上記ポリペプチドが、さらに細胞膜透過性配列を有するものである請求項１記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
【請求項３】
上記細胞膜透過性配列が配列番号２に記載するアミノ酸配列である、請求項２記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
【請求項４】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、請求項１記載の破骨細胞分化形成抑制剤。
【請求項５】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分とする請求項１記載の破骨細胞分化形成抑制剤：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）上記アミノ酸配列（配列番号４）の配列番号１に記載するアミノ酸配列以外の領域において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか１に記載するポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）上記アミノ酸配列（配列番号４）の配列番号１に記載するアミノ酸配列以外の領域において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるADAPとc-Srcの結合阻害剤。
【請求項８】
単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害することを特徴とする、破骨細胞の分化形成抑制方法。
【請求項９】
単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）との結合を阻害することを特徴とする、請求項８に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。
【請求項１０】
マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を抑制して、単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761との結合を阻害する請求項８に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。
【請求項１１】
単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）との結合を阻害することを特徴とする、請求項８に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。
【請求項１２】
ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制して、単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する請求項８に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。
【請求項１３】
請求項１に記載する破骨細胞分化形成抑制剤を用いてc-SrcとADAPとの結合を阻害する、請求項８に記載する破骨細胞の分化形成抑制方法。
【請求項１４】
下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質の存在下で、c-Src若しくはそのSH2ドメインを含む断片とADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptorprotein）若しくはそのc-Srcとの結合に関わる断片とを接触させる工程、
(b) 上記c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、および
(c) 上記c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
【請求項１５】
下記の工程を有する、請求項１４に記載するスクリーニング方法：
(a’) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）とを接触させる工程、
(b’) マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761の結合を測定する工程、および
(c’) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
【請求項１６】
下記の工程を有する破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）とを接触させる工程、
(2) マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を測定する工程、および
(3) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
【請求項１７】
下記の工程を有する、請求項１４に記載するスクリーニング方法：
(a”) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）とを接触させる工程、
(b”) ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771の結合を測定する工程、および
(c”) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
【請求項１８】
下記の工程を有する破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1’) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）とを接触させる工程、
(2’) ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を測定する工程、および
(3’) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。
【請求項１９】
骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の探索または取得方法である請求項１４、１６または１８に記載するスクリーニング方法。
【請求項２０】
骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または、歯周疾患である、請求項１９に記載するスクリーニング方法。
【請求項２１】
ADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）とc-Srcの結合を阻害する活性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効量、骨代謝異常疾患を有するかまたはその前状態にある被験者に投与することを含む、骨代謝異常疾患の予防または治療方法。
【請求項２２】
ADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）とc-Srcの結合を阻害する活性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの、破骨細胞分化形成抑制剤の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の代謝に関わる破骨細胞の分化形成に関して新たな知見を提供するものである。さらに本発明は、この新たな知見に基づいて、破骨細胞の分化形成を抑制するための物質（破骨細胞分化形成抑制剤）、並びに破骨細胞の分化形成を抑制することによって骨代謝を制御する方法、および骨代謝異常に起因する骨疾患を予防または治療する方法に関する。【０００２】
さらにまた本発明は、破骨細胞の分化形成を抑制し、骨代謝異常に起因する骨疾患の予防または治療剤として有効な成分をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨は、生体の支持組織であると同時に、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収が絶えず繰り返されている動的組織である。通常は、骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し、様々な骨疾患を引き起こす。骨疾患としては、例えば、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド治療による骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨大理石病等を挙げることができる。これらの骨疾患に罹患すると、その進行に伴って身体活動能力が低下し、ひいては腰痛・関節痛等の痛みを伴い、日常生活に支障をきたす場合も多い。近年、高齢化に伴って骨粗鬆症等の骨疾患が注目されつつあり、ＱＯＬ（Quality of life）向上のためにも、患者の症状に合わせた治療を行うべく、多様な治療薬が求められている。【０００４】
破骨細胞は、単球／マクロファージ系の造血細胞より分化する、骨吸収を担う巨大な多核細胞である。生体内において、破骨細胞の分化は、副甲状腺ホルモン（PTH）などの刺激を受けた骨芽細胞が、破骨細胞分化誘導因子であるRANKL（Receptor activator of NF-κB ligand）を発現し、またM-CSF（Macrtophage colony stimulating factor）を分泌することによって促進される。従来より、破骨細胞の分化課程や機能において重要な役割を果たす分子が多く同定されている（例えば、非特許文献１〜３など）。【０００５】
中でも、約60kDaの非受容体型チロシンキナーゼであるc-Srcについては、1991年にそのノックアウトマウスが作製され、破骨細胞機能不全によって大理石骨病を発症することが報告されている（非特許文献４）。c-srcノックアウトマウスでは破骨細胞は分化するものの、骨吸収能を有していないことから、c-Srcは破骨細胞の活性化（骨吸収能の獲得）を担う成分であると考えられている。c-srcノックアウトマウスの破骨細胞は、顕微鏡観察によるとTRAP（酒石酸耐性酸ホスファターゼ）陽性の細胞は存在するが細胞の形態は異常である。また、骨表面に接着しているが、破状縁と封鎖層が形成されず骨吸収ができない。このようなことから、c-Srcは、破骨細胞分化の骨吸収を行うための機能的な細胞骨格の形成に関わっていると推測される。しかし、その詳細は不明な点が多い。【０００６】
c-src遺伝子を欠失させたc-srcノックアウトマウスに見られる唯一の表現型は破骨細胞の形成・機能不全であり、破骨細胞の分化にのみ影響が生じることから（非特許文献４）、c-Srcの機能を阻害することによって生じる個体への影響は限定的であると予想される。【０００７】
このため、c-src遺伝子やその発現産物であるc-Src（タンパク質）を標的とした骨代謝異常に起因する疾患（骨代謝疾患）用の医薬品は、個体の発生や維持に影響することなく、破骨細胞に特異的に作用し、安全性の高い医薬品となりえるものと考えられる。【０００８】
従来より骨代謝異常である骨粗鬆症の治療薬として汎用されているビスホスフォネート等は基本的に細胞特異性がなく、また現在試験段階にある抗体医薬（RANK/RANKLに対する抗体）は標的タンパク質が発現する細胞組織全てに作用するため、依然として副作用という問題を抱えている。【０００９】
従って、c-src遺伝子やc-Src（タンパク質）を標的とした安全性の高い骨代謝疾患用医薬品の開発が望まれるところである。
【非特許文献１】Johnson RS, et.al., Cell.1992 Nov 13;71(4):577-586
【非特許文献２】Franzoso G, et.al., Genes Dev. 1997 Dec 15;11(24):3482-3496
【非特許文献３】Tondravi MM, et.al., Nature.1997 Mar 6;386(6620):81-84
【非特許文献４】Soriano, P., Cell 64 693-702, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述するように、破骨細胞は骨吸収活性を有し、脊椎動物における骨代謝に必須の細胞であり、その形成や活性の亢進は骨粗鬆症などの骨疾患、関節リューマチに伴う骨破壊などの要因になることが知られている。このため、破骨細胞の分化形成を制御する薬剤ならびに方法の開発は、高齢化社会における社会問題の一つである骨代謝疾患の解決策として有用であると考える。またその場合に、c-src遺伝子やc-Src（タンパク質）を標的とすることによって安全性の高い医薬品の開発が可能となる。【００１１】
本発明の目的は、c-Srcを標的分子として破骨細胞の分化形成を抑制する方法および抑制する物質（破骨細胞分化形成抑制剤）を提供することである。また本発明の目的は破骨細胞の分化形成を抑制することによって骨代謝を制御する方法、および骨代謝異常に起因する骨疾患を予防または治療する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、破骨細胞の分化形成を抑制し、骨代謝異常に起因する骨疾患の予防または治療剤の有効成分となりえる物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供することである。さらに本発明は、かかるスクリーニング方法に有効に利用することのできる物質を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
c-src遺伝子は破骨細胞の形成に必須な遺伝子であり、そのメカニズムは、c-src遺伝子の発現産物であるc-Src（タンパク質）が細胞内において標的タンパク質の特定部位のチロシン残基をリン酸化して結合することに基づくことが知られている。【００１３】
そこで本発明者らは、破骨細胞内においてc-Srcと特異的に結合するタンパク質（c-Src結合タンパク質）を網羅的に探索していたところ、ADAP（association of adhesion and degranulation-promoting adaptor protein）が当該タンパク質であることを見出した。さらに本発明者らは、ADAP上におけるc-Srcとの結合部位（マウスADAPp130の場合はチロシン残基807部位（Tyr807）、マウスADAPp120の場合はチロシン残基761部位（Tyr761）、ヒトADAPp130の場合はチロシン残基817部位（Tyr817）、ヒトDAPp120の場合はチロシン残基771部位（Tyr771））を特定すると同時に、ADAPの発現を阻害した細胞（ADAPノックダウン細胞）では、破骨細胞が分化せず多核細胞が形成されないことから、c-Srcとその結合タンパク質であるADAPとの結合を阻害することにより破骨細胞の分化形成が抑制できることを確認した。【００１４】
破骨細胞の形成は、骨粗鬆症などの骨疾患や関節リューマチに伴う骨破壊などの要因になる。c-SrcとADAP（マウスADAPp130の場合はTyr807部位、マウスADAPp120の場合はTyr761、ヒトADAPの場合はTyr817部位、ヒトADAPp120の場合はTyr771）との結合を特異的に阻害すると、破骨細胞におけるc-Srcの機能発現が阻止されて破骨細胞の分化形成が抑制され、その結果、骨代謝が制御でき、骨代謝異常に基づく骨疾患を改善することが可能であると考えられる。【００１５】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有するものである。【００１６】
Ｉ．破骨細胞分化形成抑制剤
（I-1）単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。【００１７】
（I-2）単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761との結合を阻害する物質を有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。【００１８】
（I-3）有効成分が、マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を抑制する作用を有する物質である（I-２）に記載する破骨細胞分化形成抑制剤。【００１９】
（I-4）単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する物質を有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。【００２０】
（I-5）有効成分が、ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制する作用を有する物質である（４）に記載する破骨細胞分化形成抑制剤。【００２１】
（I-6）ADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。【００２２】
（I-7）上記ポリペプチドが、さらに細胞膜透過性配列を有するものである（I-6）記載の破骨細胞分化形成抑制剤。【００２３】
（I-8）上記細胞膜透過性配列が配列番号２に記載するアミノ酸配列である、（I-7）記載の破骨細胞分化形成抑制剤。【００２４】
（I-9）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、（I-6）〜（I-8）記載の破骨細胞分化形成抑制剤。【００２５】
（I-10）下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分とする（I-6）記載の破骨細胞分化形成抑制剤：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）上記アミノ酸配列（配列番号４）の配列番号１に記載するアミノ酸配列以外の領域において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。【００２６】
（I-11）下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか１に記載するポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする破骨細胞分化形成抑制剤。【００２７】
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）上記アミノ酸配列（配列番号４）の配列番号１に記載するアミノ酸配列以外の領域において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００２８】
II．破骨細胞分化形成抑制剤
（II-1）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるADAPとc-Srcの結合阻害剤。【００２９】
（II-2）配列番号１のアミノ酸配列および細胞膜透過性配列からなるADAPとc-Srcの結合阻害剤。【００３０】
（II-3）上記細胞膜透過性配列が配列番号２に記載するアミノ酸配列である、（II-2）記載の結合阻害剤。【００３１】
（II-4）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるADAPとc-Srcの結合阻害剤。【００３２】
（II-5）下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドからなるADAPとc-Srcの結合阻害剤：
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）上記アミノ酸配列（配列番号４）の配列番号１に記載するアミノ酸配列以外の領域において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つADAPとc-Srcの結合を阻害する活性を有するポリペプチド。【００３３】
III．破骨細胞分化形成の抑制方法
（III-1）単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害することを特徴とする、破骨細胞の分化形成抑制方法。【００３４】
（III-2）単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）との結合を阻害することを特徴とする破骨細胞の分化形成の抑制方法。【００３５】
（III-3）マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を抑制して、単球由来のマクロファージ様細胞におけるマウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761との結合を阻害する（III-2）に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。【００３６】
（III-4）単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基(Tyr817)またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基(Tyr771)との結合を阻害することを特徴とする破骨細胞の分化形成の抑制方法。【００３７】
（III-5）ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制して、単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する（III-4）に記載する破骨細胞の分化形成の抑制方法。【００３８】
（III-6）（I-1）乃至(I-11)のいずれかに記載する破骨細胞分化形成抑制剤を用いてc-SrcとADAPとの結合を阻害する、（III-1）乃至(III-5)のいずれかに記載する破骨細胞の分化形成抑制方法。【００３９】
IV．骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物
（IV-1）単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効成分とする、骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４０】
（IV-2）単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）との結合を阻害する物質を有効成分とする、骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４１】
（IV-3）上記物質が、ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制する作用を有する物質である（IV-2）に記載する骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４２】
（IV-4）上記物質が、（I-6）乃至（I-11）のいずれかに記載する破骨細胞分化形成抑制剤である（IV-1）乃至（IV-3）のいずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４３】
（IV-5）骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または、歯周疾患である、（IV-1）〜（IV-4）のいずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４４】
V．骨代謝異常疾患の予防または治療方法
（V-1）単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効量、骨代謝異常疾患を有するかまたはその前状態にある被験者に投与することを含む、骨代謝異常疾患の予防または治療方法。【００４５】
（V-2）単球由来のマクロファージ様細胞におけるヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）との結合を阻害する物質を有効量、骨代謝異常疾患を有するかまたはその前状態にある被験者に投与することを含む、骨代謝異常疾患の予防または治療方法。【００４６】
（V-3）上記物質が、ヒトADAP p130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制する作用を有する物質である（V-2）に記載する骨代謝異常疾患の予防または治療方法。【００４７】
（V-4）上記物質が、（I-6）乃至（I-11）のいずれかに記載する破骨細胞分化形成抑制剤である、（V-1）乃至（V-3）のいずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物。【００４８】
（V-5）骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または、歯周疾患である、（V-1）〜（V-4）のいずれかに記載する骨代謝異常疾患の予防または治療方法。【００４９】
VI．破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法
（VI-1）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質の存在下で、c-Src若しくはそのSH2ドメインを含む断片とADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor  protein）若しくはそのc-Srcとの結合に関わる断片とを接触させる工程、
(b) c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、および
(c) c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【００５０】
（VI-2）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a’) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）とを接触させる工程、
(b’) マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761の結合を測定する工程、および
(c’) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【００５１】
（VI-3）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761とを接触させる工程、
(b) マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を測定する工程、および
(c) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【００５２】
（VI-4）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a”) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）とを接触させる工程、
(b) ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817番目またはヒトADAPp120のTyr771の結合を測定する工程、および
(c) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【００５３】
（VI-5）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1’)被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771とを接触させる工程、
(2’)ヒトADAPp130のTyr817番目またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を測定する工程、および
(3’) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【００５４】
（VI-6）骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の探索または取得方法である（VI-1）〜（VI-5）のいずれかに記載するスクリーニング方法。【００５５】
（VI-7）骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または、歯周疾患である、（VI-6）に記載するスクリーニング方法。【００５６】
VII．c-Src／ADAP結合阻害剤のスクリーニング方法
（VII-1）下記の工程を有する、c-Src／ADAP結合阻害剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質の存在下で、c-Src若しくはそのSH2ドメインを含む断片とADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor  protein）若しくはそのc-Srcとの結合に関わる断片とを接触させる工程、
(b) c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、および
(c) c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を選択する工程。【００５７】
（VII-2）下記の工程を有する、c-Src／ADAP結合阻害剤のスクリーニング方法：
(a’) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130の807番目のチロシン残基（Tyr807）またはマウスADAPp120の761番目のチロシン残基（Tyr761）とを接触させる工程、
(b’) マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761の結合を測定する工程、および
(c’) 上記結合を阻害する被験物質をc-SrcとADAPとの結合を阻害する物質として選択する工程。【００５８】
（VII-3）下記の工程を有する、c-Src／ADAP結合阻害剤のスクリーニング方法：
(a”) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130の817番目のチロシン残基（Tyr817）またはヒトADAPp120の771番目のチロシン残基（Tyr771）とを接触させる工程、
(b”) ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771の結合を測定する工程、および
(c”) 上記結合を阻害する被験物質をc-SrcとADAPとの結合を阻害する物質として選択する工程。【００５９】
（VII-4）骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分の探索または取得方法である（VII-1）〜（VII-3）のいずれかに記載するスクリーニング方法。【００６０】
（VII-5）骨代謝異常疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または、歯周疾患である、（VII-4）に記載するスクリーニング方法。【００６１】
なお、本発明でいう「結合」とは、その態様を特に制限するものではないが、好ましくは「会合」を挙げることができる。【００６２】
また本明細書で、マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761とは、マウスADAPp130（タンパク質）またはマウスADAPp120のN末端からそれぞれ807番目または761番目に位置するチロシン残基を意味する。またヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771とは、ヒトADAPp130（タンパク質）またはヒトADAPp120のN末端からそれぞれ817番目または771番目に位置するチロシン残基を意味する。
【発明の効果】
【００６３】
細胞の機能を制御する物質を探索あるいは開発し、医薬品としての可能性を探る場合には、その物質の効果の強さだけではなく、その作用点、すなわち標的分子が明確であり、その作用が目的とする病気、組織、細胞に特異的であることが望ましい。本発明が提供する破骨細胞分化形成抑制剤およびこれを有効成分とする骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物は、今までの知見から、破骨細胞に特異に作用するものと予想される。すなわち、c-srcをノックアウトした場合に破骨細胞の形成、機能にのみその影響が見られること、他のsrcファミリーをノックアウトしても破骨細胞への影響は見られないこと等から、本発明の医薬組成物が有する作用機序（c-SrcとADAPとの結合を阻害する機序）は、個体の発生や維持には影響を及ぼさず、破骨細胞にのみ効果を発揮するものと予想される。この点で本発明が提供する破骨細胞分化形成抑制剤、およびこれを有効成分とする医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対して安全性が高いものといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
Ｉ．破骨細胞分化形成抑制剤
本発明の破骨細胞分化形成抑制剤は、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質を有効成分とするものである。【００６５】
ここで「単球由来のマクロファージ様細胞」としては、破骨細胞へと分化し得る、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物の単球由来のマクロファージ様細胞であればよく、特に限定されない。具体的には、例えば、株化細胞ではRAW264、RAW264.7、RAW247 (Meiyanto E. et al., Biochem Biophys Res Commun., 282, p278-p283 (2001))などを挙げることができる。また生体に由来する「単球由来のマクロファージ様細胞」としては、骨髄細胞、脾臓細胞、またはコラーゲン関節炎や変形性関節炎等の破骨細胞形成過多が起きている炎症部位に由来する細胞等を挙げることができる。【００６６】
本発明の破骨細胞分化形成抑制剤が対象とする「破骨細胞」としては、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物の破骨細胞であれば特に限定されず、前記の「単球由来のマクロファージ様細胞」から分化形成される破骨細胞を挙げることができる。破骨細胞は、骨の表面に密着し、活性化に伴い酸や種々のプロテアーゼ等を分泌することにより骨吸収能を示す。【００６７】
本発明でいう破骨細胞への「分化形成」とは、細胞が形態的に破骨細胞の性質を示すように分化形成されること、または、その形態学的な変化を経て活性化され骨吸収作用を示すように分化形成されることを含む概念である。【００６８】
なお、本発明で「抑制」とは、「単球由来のマクロファージ様細胞」が「破骨細胞」に分化形成することを１００％抑制（阻止）する場合と、１００％阻止しなくても「単球由来のマクロファージ様細胞」が本来有する破骨細胞への分化形成能を低減させる場合の両方を含む。破骨細胞への分化は、破骨細胞の特徴である多核細胞の形成を観察することにより測定することができる。破骨細胞への分化形成を測定する方法としては、破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色法を用いることができるが、これに限定されない。【００６９】
かかる破骨細胞分化形成抑制作用を有する物質、すなわち本発明の破骨細胞分化形成抑制剤の有効成分としては、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAPとの結合を抑制する作用を有する物質を挙げることができる。【００７０】
ここでc-Srcは、当初ラウス肉腫ウイルスの癌遺伝子v-srcの正常細胞内のホモログとして発見されたc-srcの遺伝子産物である。これは約60kDaの非受容体型チロシンキナーゼであり、現在までに10個のファミリー（Src、Yes、Fgr、Yrk、Fyn、Lyn、Hck、Lck、Blk、Frk）が報告されている（Sheila M., et al., Annu.Rev.Cell.Dev. Biol.,1997, 13:513-609）。図１に、これらのSrcファミリータンパク質の一次構造の模式図を示す。Ｎ末端領域には各々のSrcファミリー間でアミノ酸配列が保存されていないユニークドメイン（SH4ドメイン）があり、この中には細胞膜との結合に必要な脂肪酸付加部位が存在する。これに続いて、プロリンに富んだ配列を認識してタンパク質と結合するSH3ドメイン、リン酸化されたチロシンを認識してタンパク質と結合するSH2ドメインが存在し、次いでキナーゼ活性を担うキナーゼドメイン（SH1ドメイン）がある。C末端付近には保存されたチロシン残基があり、Srcファミリーキナーゼ活性の適正な調節を担っている。このチロシン残基は、通常Cskファミリーのキナーゼによってリン酸化を受けており、SrcのキナーゼドメインはSH2ドメインと分子内結合し、閉じた構造をとる。このことがSrcのキナーゼ活性の負の調節に重要な役割をもつ。またSH3ドメインはSH2ドメインとキナーゼドメインの間にあるリンカー領域に結合することが知られている。これによってもキナーゼ活性が抑制される。また、逆に他の分子がSrcのSH3ドメイン、SH2ドメインに結合し、あるいはホスファターゼによってＣ末端のチロシン残基が脱リン酸化されることで、Src分子が開いた構造をとることによってキナーゼ活性が上昇することが知られている。【００７１】
c-Srcは、ヒトを始めとする哺乳動物を含む脊椎動物全般にわたり（例えば、マウス、ニワトリなど）存在するタンパク質であり、そのアミノ酸配列および塩基配列はいずれも公知である（ヒト由来c-src遺伝子：Anderson SK et al., Mol. Cell. Biol. 5:1122-1129 (1985)、およびTanaka A et al., Mol. Cell. Biol. 7:1978-1983 (1987)、マウス由来c-src遺伝子：Martinez R et al., Science 237: 411-415 (1987)、ニワトリ由来c-src遺伝子：Takeya. T and Hanafusa H, Cell 32:881-890 (1983) ）。例えば、ヒト由来のc-Srcおよびマウス由来のc-Srcはいずれもアミノ酸536個からなるタンパク質であり、そのアミノ酸150〜247の領域にSH2ドメインを有している。本発明が対象とするc-Srcは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物に由来するc-Srcであり、好ましくはヒト由来のc-Src、マウス由来のc-Src、ニワトリ由来のc-Srcを例示することができる。【００７２】
ADAPは、ヒトを始め、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物全般（例えば、マウス、ニワトリ等）にわたってＴ細胞や骨髄細胞に発現しているタンパク質である。ADAPは、当初Ｔ細胞受容体刺激とＴ細胞接着を支配するインテグリンの結合活性調節をつなぐものとして同定されたタンパク質であり、Ｔ細胞受容体によって誘導されるインテグリンのクラスター形成や接着を制御することが知られている（Erik J.Peterson et al., Science 293:2263-2265,2001）。ADAPは、タンパク質間相互作用を仲介すると考えられる多くの領域を有しており（例えば、図２参照）、インテグリンのリガンドの細胞内接着を増強する“inside-out”シグナルに重要な役割を担っていることが知られている（Griffiths，E．K．，et al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317-322; Peterson, E.L. (2003) Immmunol. Rev. 192, 113-121）。【００７３】
ADAPは、約130kDaの分子量を有するADAP（「ADAPp130」という）とそのスプライシング変異体である約120kDaの分子量を有するADAP（「ADAPp120」という）の２つのアイソフォームを有する。ADAPp120は胸腺で高く発現し、ADAPp130は成熟Ｔ細胞で高く発現するなど、組織局在性が認められるものの、破骨細胞では両方がいずれも発現している。なお、いずれも作用や機能は同じと考えられている（Veale M et al., J. Biol. Chem. 274:28427-28435 (1999) ）。【００７４】
図２にマウス由来のADAPp130の一次構造の模式図を示す。ADAPは、Ｎ末端側から、プロリンリッチ領域（Pro-rich）、EVH1(Ena/VASP-homology)-bindingドメイン（FPPPP）、ホスフォチロシン部位（Tyrosine）、及びSH3-likeドメインを有しており、ホスフォチロシン部位（Tyrosine）ではSrcファミリーに属するFynのSH2ドメインと結合し、EVH1-bindingドメイン（FPPPP）では、Ena/VASP（Drosophila enable/vasodilated phosphoprotein）ファミリータンパク質と結合することが知られている（Emily K Griffiths et al., Curr  Opin Immunol. 2002 Jun;14 (3) 317-322）。ADAPp120は、ADAPp130のホスフォチロシン部位（Tyrosine）とSH3-likeドメインとの間に位置する46アミノ酸が欠失した構造を有する。【００７５】
後述する配列表の配列番号５にマウスADAPp130のアミノ酸配列を、配列番号６にマウスADAPp120のアミノ酸配列を示す。また、配列番号７にヒトADAPp130のアミノ酸配列を、配列番号８にヒトADAPp120のアミノ酸配列を示す。図３にマウスADAPp130のアミノ酸配列とヒトADAPp130のアミノ酸配列の対比（alignment）を（640個のアミノ酸が一致する。同一性：77.2％）、また図４にマウスADAPp120のアミノ酸配列とヒトADAPp120のアミノ酸配列の対比（alignment）を（640個のアミノ酸が一致する。同一性：81.7％）を示す。これからわかるように、ADAPのアミノ酸配列は動物種間で比較的保存されている。【００７６】
本発明が対象とするADAPは、アイソフォーム（ADAPp130、ADAPp120）の別を問わない。またヒトを始めとする哺乳動物や脊椎動物に由来するADAPであれば、動物種の別も特に制限されない。通常、使用されるc-Srcの由来動物に対応して同じ動物に由来するADAPが使用される。好ましくはヒト由来のADAP（ADAPp130、ADAPp120）、マウス由来のADAP（ADAPp130、ADAPp120）、ニワトリ由来のADAP（ADAPp130、ADAPp120）である。【００７７】
後述する実験例に示すように、c-SrcとADAPとは、c-SrcのSH2ドメインとADAPのC末端領域のチロシン残基（マウスADAPp130の場合はTyr807、マウスADAPp120の場合はTyr761、ヒトADAPp130の場合はTyr817、ヒトADAPp120の場合はTyr771）を介して結合する。【００７８】
このため、本発明の破骨細胞分化形成抑制剤の有効成分として、好適には(1)マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761との結合を抑制する作用を有する物質、および(2)ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を抑制する作用を有する物質を挙げることができる。さらに、実験例に示すように、c-SrcとADAPとが結合するにはそのチロシン残基がリン酸化されることが必要である。このため、本発明の破骨細胞分化形成抑制剤の有効成分は、(3)マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を抑制する物質、および(4) ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を抑制する物質であってもよい。【００７９】
単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAPとの結合を抑制する物質としては、具体的にはc-SrcとADAPとの複合体形成を抑制する物質、ADAPとの結合に関わるc-SrcのSH2ドメインに選択的に結合してADAPとの結合を阻害する物質、ADAPのC領域にあるチロシン残基（マウスADAPp130の場合はTyr807、マウスADAPp120の場合はTyr761、ヒトADAPp130の場合はTyr817、ヒトADAPp120の場合はTyr771）に選択的に結合してc-Src との結合を阻害する物質、ADAPのC領域にあるチロシン残基（マウスADAPp130の場合はTyr807、マウスADAPp120の場合はTyr761、ヒトADAPp130の場合はTyr817、ヒトADAPp120の場合はTyr771）のリン酸化を抑制する物質、c-Srcのキナーゼ活性を抑制する物質などを挙げることができる。かかる物質として、より具体的にはc-SrcのSH2ドメインに対する抗体、ADAPのC領域にあるチロシン残基（マウスADAPp130の場合はTyr807、マウスADAPp120の場合はTyr761、ヒトADAp130Pの場合はTyr817、ヒトADAPp120の場合はTyr771）を含む領域に対する抗体、ADAPのC領域にある上記チロシン残基を含むその近傍のアミノ酸配列を有するペプチド、イノシトールリン脂質を含む脂質類、ADAPなどを挙げることができる。【００８０】
ここでADAPのC領域にある上記チロシン残基を含むその近傍のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、ADAPのC領域にある当該チロシン残基を含むチロシンリン酸化モチーフ（YDDI）を中心として少なくとも前後の４つのアミノ酸を含むアミノ酸配列（DGEIYDDIADGC：配列番号１）を有するペプチドを例示することができる。当該アミノ酸配列は、マウスおよびヒトの各ADAPp130およびADAPp120に共通して存在する配列であるため（マウスADAPp130：803-814領域、マウスADAPp120：757-768領域、ヒトADAPp130：813-824領域、ヒトADAPp120：767-778領域におのおの相当）、かかるアミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）は、マウスおよびヒトの各ADAPp130およびADAPp120に対して共通して、c-SrcとADAPとの結合を抑制する物質として使用することができる。【００８１】
なおかかるアミノ酸配列（配列番号１）を有するペプチド（ポリペプチド）としては、例えばマウスADAPp130のアミノ酸配列（配列番号５）において、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号１）の領域（803-814領域）を含むポリペプチドを挙げることができる。具体的には、マウスADAPp130の626-819領域からなるポリペプチド（配列番号４）を挙げることができる。なお、これらのポリペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列を有し、かつADAPとc-Srcとの結合を阻害する活性を有する限り、他の領域において１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００８２】
同様に、アミノ酸配列（配列番号１）を有するペプチド（ポリペプチド）として、例えばマウスADAPp120のアミノ酸配列（配列番号６）において、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号１）の領域（757-768領域）を含むポリペプチド、ヒトADAPp130のアミノ酸配列（配列番号７）において、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号１）の領域（813-824領域）を含むポリペプチド、およびヒトADAPp120のアミノ酸配列（配列番号８）において、少なくとも当該アミノ酸配列（配列番号１）の領域（767-778領域）を含むポリペプチドを挙げることができる。具体的には、マウスADAPp130の626-819領域からなるポリペプチド（配列番号４）に対応するポリペプチドとして、ヒトADAPp120の636-839領域からなるポリペプチド、マウスADAPp120の624-773領域からなるポリペプチド、およびヒトADAPp120の644-783領域からなるポリペプチドを挙げることができる。【００８３】
またこれらのポリペプチドも、配列番号１で示すアミノ酸配列を有し、かつADAPとc-Srcとの結合を阻害する活性を有する限り、他の領域において１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００８４】
また配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）は、さらに細胞膜透過性配列を有するものであってもよい。ここで細胞膜透過性配列とは、真核生物の細胞膜を透過できるタンパク質であり、Protein Trunsduction Domains（PTDｓ）を有するものをいう。これらは120kD以上の大型タンパク質をも細胞内に取り込ませる機能を有するアミノ酸配列であり、例えば、Drosophila Antennapedia transcription factor protein、HIV-1 Tat transcription factor protein、poly-arginineなどが知られている（Jehangir S.,et al., (2002)Current Opinion in Biotechnology,vol.13, pp.52-56）。かかる細胞膜透過性配列として、具体的には、HIV-1ウイルスのTatタンパク質の細胞膜透過活性領域のアミノ酸配列（配列番号２）を例示することができる（Schwarze R.S., et al.,(1999) Science, Vol.285,pp1569-1572）。当該細胞膜透過性配列を有する上記ペプチド（ポリペプチド）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。【００８５】
なお、本発明においてc-SrcとADAPとの結合を抑制する物質は、これらのペプチド（ポリペプチド）コードするDNAであってもよい。【００８６】
また、単球由来のマクロファージ様細胞におけるADAPの発現や産生を阻害することによって、結果としてc-SrcとADAPとの結合を抑制することもできる。本発明でいう単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAPとの結合を抑制する物質には、かかる単球由来のマクロファージ様細胞におけるADAPの発現や産生を抑制する物質を含めることができる。【００８７】
例えば、単球由来のマクロファージ様細胞におけるADAPの発現または産生を抑制する物質としては、ADAP遺伝子の転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳、及び／又は安定性を抑制する物質を挙げることができる。こうした物質として具体的には、ADAPをコードする遺伝子の塩基配列にハイブリダイズし、その転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳、及び／又は安定性を抑制し得るアンチセンス分子、リボザイム、及びＲＮＡｉエフェクターを例示することができる。【００８８】
本発明で用いられるアンチセンス分子は、ADAP遺伝子のプロモーターまたはその他の制御領域、エキソン、イントロンあるいはエキソン−イントロン境界に結合するように設計される。多くの効果的なアンチセンス分子は、イントロン／エキソン・スプライス接合部とハイブリダイズし得るように設計されている。よって、本発明で用いるアンチセンス分子も、ADAP遺伝子のイントロン／エキソン・スプライス接合部の50〜200塩基内の領域にハイブリダイズするように、当該領域に対して実質的に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。【００８９】
リボザイムは、RNAまたはRNA−タンパク質複合体であり、対象の遺伝子（mRNA）に部位特異的に結合してそれを切断することで、タンパク質への翻訳を阻害し、遺伝子機能の発現を抑制する機能を発揮する物質である。本発明で用いられるリボザイムは、ADAP遺伝子（DNA）から転写されたmRNAの任意領域とハイブリダイズするように当該領域に対して実質的に相補的な塩基配列を有し、そして結合した対象のオリゴヌクレオチド領域内のリン酸エステルを切断してADAPへの翻訳を阻害するように設計される。【００９０】
RNAiエフェクターは、RNAi（RNA干渉）の機能を発揮することによって、ADAPのDNAもしくはmRNA にハイブリダイズし、ADAPmRNAを特異的に分解し、またはADAP遺伝子の発現を特異的に抑制するものである。RNAiエフェクターとしては、si RNA（small interfering RNA）、stRNA（small temporally regulated RNA）及びshRNA（short hairpin RNA）等を挙げることができる。なお、ＲＮＡiエフェクターを利用したRNAi技術並びにその方法は、多比良和誠ら編,「RNAi実験プロトコール」,羊土社発行，2003年等に詳細に記載されており、その内容は援用により本発明の内容に組み込まれる。例えば、本発明で用いられるｓｉＲＮＡとして、「5'-AACCAACTTATGAGGAAAA-3'」（配列番号１１）または「5'-AAGCATGCTGTGACGTTAA-3'」（配列番号１２）を好適に使用することができる。【００９１】
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は、当業界で公知である、本発明で使用される抗体もこれに準じて調製することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratry, 1988; 米国特許第4,196,265号など）。本発明で好適に用いられる抗体として、抗c-Src抗体、抗c-Src/SH2ドメイン抗体、抗ADAP/SH3-likeドメイン抗体などを挙げることができる。【００９２】
II．破骨細胞分化形成の抑制方法
本発明の破骨細胞の分化形成抑制方法は、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害することによって実施することができる。なお、当該結合阻害には、c-SrcとADAPの結合を直接阻害する場合に限らず、ADAPのc-Srcとの結合部位のリン酸化を抑制する場合やADAPの発現や産生を阻害する場合など、結果としてc-SrcとADAPとの結合が妨げられる場合も含まれる（以下、同じ）。具体的には、c-SrcとADAPとの結合を阻害する作用を有するIで前述する破骨細胞分化形成抑制剤をc-SrcとADAPに対して用いることによって実施することができる。【００９３】
中でも好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来のc-Srcとヒト由来のADAPとの結合を阻害する物質であり、かかるものにはヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する物質、およびヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を阻害する物質が含まれる。かかる物質として、具体的には配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）を挙げることができ、その１例として、配列番号３に記載するアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。【００９４】
本発明の破骨細胞の分化形成抑制方法には、in vitroにおける破骨細胞の分化形成抑制方法、およびin vivoにおける破骨細胞の分化形成抑制方法の両方が含まれる。後者の場合、骨代謝異常またはその前状態にある被験者について、破骨細胞の分化形成を抑制して、骨代謝異常疾患の発生またはその進展を予防するか、骨代謝異常疾患を改善若しくは治療する方法としても有効に使用することができる。なお、被験者としては、ヒトやヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物を挙げることができる。かかる哺乳動物としては、具体的にマウス、ニワトリ、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを制限なく例示することができる。【００９５】
III．骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物
前述するように、破骨細胞の分化形成や活性の亢進は、骨粗鬆症等の骨代謝異常疾患の要因になることが知られている。よって、Ｉで前述するc-SrcとADAPとの結合を阻害する物質は、破骨細胞の分化形成を抑制する作用を有することに基づいて、骨代謝異常疾患の発症を予防し、また治療する薬物として有効に使用することができる。【００９６】
骨代謝異常疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または歯周疾患を例示することができる。【００９７】
本発明の骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物は、c-SrcとADAPとの結合を阻害する物質、すなわちＩで前述する破骨細胞分化形成抑制剤を有効成分として含む。本発明の有効成分として、好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来のc-Srcとヒト由来のADAPとの結合を阻害する物質であり、かかるものにはヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する物質、およびヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を阻害する物質が含まれる。かる物質として、具体的には配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）を挙げることができ、その１例として、配列番号３に記載するアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。【００９８】
本発明の医薬組成物は、有効量の有効成分（c-SrcとADAPとの結合を阻害する物質）とともに、その種類に応じて、自体公知の薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。当該医薬組成物は、所望の投与方法、例えば経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、腹腔内投与、または冠動脈もしくは冠状静脈洞投与などによって投与することができ、その投与経路に応じて、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、及びカプセル剤などの固体投与形態；溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、リポソーム製剤、注射剤、静注剤、点滴剤及びエリキシルなどの液剤投与形態；貼付剤、軟膏、クレーム及び噴霧剤などの外用投与形態に、調合、成形乃至調製することができる。【００９９】
これらの医薬組成物（医薬製剤）の調製に利用される担体としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される賦形剤、希釈剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、滑沢剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤などが例示できる。また添加剤としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される安定化剤、保存剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、着色剤、香料、風味剤、甘味剤などが例示できる。【０１００】
上記医薬組成物中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。投与量は、投与経路によっても異なるが、通常、１回投与あたりの有効成分の量に換算して、10ｐｇ〜100ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。【０１０１】
IV．骨代謝異常疾患の予防または治療方法
本発明の骨代謝異常疾患の予防または治療方法は、単球由来のマクロファージ様細胞におけるc-SrcとADAP（adhesion of degranulation-promoting adaptor protein）との結合を阻害する物質、すなわちＩで前述する破骨細胞分化形成抑制剤を有効量、骨代謝異常またはその前状態にある被験者に投与することによって実施される。【０１０２】
ここで好ましい破骨細胞分化形成抑制剤は、ヒト由来のc-Srcとヒト由来のADAPとの結合を阻害する物質であり、かかるものにはヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771との結合を阻害する物質、およびヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を阻害する物質が含まれる。かかる物質として、具体的には配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するペプチド（ポリペプチド）を挙げることができ、その１例として、配列番号３に記載するアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。【０１０３】
当該物質は、破骨細胞の分化形成を抑制して、骨代謝異常疾患の発生またはその進展を予防するか、骨代謝異常疾患を改善・治療するために有効な量を、薬学的に許容される担体もしくはその他の添加剤ととともに、医薬組成物の形態で使用することができる。これら医薬組成物の投与形態、投与経路、投与方法並びに当該医薬組成物の投与用量（有効成分の投与量）はIIIに前述する通りである。【０１０４】
対象とする骨代謝異常疾患は、IIIに記載するように、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または歯周疾患を例示することができる。また、投与対象とする被験者としても、IIIに記載する、ヒトやヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（マウス、ニワトリ、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）を挙げることができる。【０１０５】
Ｖ．スクリーニング方法
本発明は、破骨細胞の分化形成を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法で探索取得される物質は、c-SrcとADAPとの結合を阻害する作用を有することによって、破骨細胞の分化形成を抑制することができる。このため当該物質によれば、骨代謝異常疾患を予防または治療することができると期待される。従って、本発明の方法は、骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法であるともいえる。【０１０６】
本発明のスクリーニング方法は、基本的にはc-SrcとADAPとの結合を阻害する作用を有する物質を探索することからなるが、具体的には下記の方法を例示することができる。
（１）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質の存在下で、c-SrcとADAPとを接触させる工程、
(b) c-SrcとADAPの結合を測定する工程、および
(c) c-SrcとADAPとの結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１０７】
かかる工程により、c-SrcとADAPとの結合を阻害して破骨細胞の分化形成を抑制する作用を有する物質を取得することができる。【０１０８】
被験物質としては、制限はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、または無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的には、これらの被験物質またはこれらを含む組成物（例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物等を含む）を、対象のc-SrcおよびADAPと接触させることにより行うことができる。【０１０９】
スクリーニングに際して採用される被験物質とc-SrcおよびADAPとの接触条件は、特に制限されないが、通常、生理的環境下におけるin vitro実験系、または細胞内で行うことが好ましい。【０１１０】
本発明において用いるc-Srcは、その由来を特に制限されず、ヒト由来のもののほか、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（例えば、マウスやニワトリなど）に由来するc-Srcを用いることができる。c-Srcは全長のタンパク質であってもよいが、ADAPとの結合に関わるSH2ドメイン、または少なくともSH2ドメインを含む部分断片であってもよい。好ましくは、c-SrcのSH2ドメインを含み、かつキナーゼ活性を有するものである。【０１１１】
本発明において用いるADAPも、その由来を特に制限されない。ヒト由来のもののほか、ヒト以外の哺乳動物を含む脊椎動物（例えば、マウスやニワトリなど）に由来するADAPを用いることができるが、一緒に使用するc-Srcと同一の動物に由来するものを使用することが好ましい。アイソフォームの別も問わず、p130もp120のいずれのアイソフォームを使用してもよい。ADAP（ADAPp120、ADAPp130）は全長のタンパク質であってもよいが、c-Src との結合に関わるC末端に位置するSH3-likeドメイン、または少なくともSH3-likeドメインを含む部分断片であってもよい。また例えばマウスADAPp130の場合、c-Src との結合に関わるTyr807部位を有する部分断片、マウスADAPp120の場合、c-Src との結合に関わるTyr761部位を有する部分断片、またヒトADAPp130の場合、c-Src との結合に関わるTyr817部位を有する部分断片、ヒトADAPp120の場合、c-Src との結合に関わるTyr771部位を有する部分断片を用いることもできる。  このため、上記（１）のスクリーニング方法は、より詳細には下記（２）〜（４）のように記載することができる。【０１１２】
（２）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質の存在下で、c-Src若しくはそのSH2ドメインを含む断片とADAP若しくはそのc-Srcとの結合に関わる断片とを接触させる工程、
(b) 上記c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を測定する工程、および
(c) 上記c-Src若しくはその断片とADAP若しくはその断片との結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１１３】
（３）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a’) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761とを接触させる工程、
(b’) マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761の結合を測定する工程、および
(c’) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１１４】
（４）下記の工程を有する、破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(a”) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771とを接触させる工程、
(b”) ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771の結合を測定する工程、および
(c”) 上記結合を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１１５】
c-SrcとADAPとの結合の測定は、c-SrcとADAPとの結合の有無が評価できる方法であれば特に制限されない。例えば、被験物質の存在下でc-Src（又はc-SrcのSH2ドメイン）とADAP（又はADAPのSH3-likeドメイン）とを接触させた後、その反応液（混合液）を電気泳動にかけて分子量から結合の有無を評価する方法、c-Src（又はc-SrcのSH2ドメイン）あるいはADAP（又はADAPのSH3-likeドメイン）の抗体を用いて他のタンパク質の共沈の有無を評価する方法、c-Srcのチロシンキナーゼ活性を測定して評価する方法を例示することができる。【０１１６】
かかるスクリーニング方法による破骨細胞分化形成抑制剤（候補物質）の選別は、c-Src（c-SrcのSH2ドメインなどの部分断片を含む）とADAP（ADAPのSH3-likeドメインなどの部分断片を含む）との結合の有無を評価することによって行うことができる。この場合、被験物質の非存在下でc-Src（c-SrcのSH2ドメインなどの部分断片を含む）とADAP（ADAPのSH3-likeドメイン部分断片を含む）とを接触させて生じるc-SrcとADAPとの結合（コントロール）と対比することによって評価することもできる。c-SrcとADAPとが全く結合しない場合、およびコントロールに比して結合が低減した場合に、使用された被験物質を、破骨細胞分化形成抑制剤の候補物質として選別することができる。【０１１７】
なお、c-SrcとADAPとの結合の有無は、ADAPのC末端領域のチロシン残基（マウスADAPp130の場合Tyr807部位、マウスADAPp120の場合Tyr761部位、ヒトADAPp130の場合Tyr817部位、ヒトADAPp120の場合Tyr771部位）のリン酸化の有無を評価することによっても行うことができる。この場合、下記の（５）または（６）の方法により、ADAPのc-Srcとの結合部位におけるリン酸化の阻害活性を指標として破骨細胞分化形成抑制剤の候補物質を探索することができる。【０１１８】
（５）下記の工程を有する破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1) 被験物質の存在下で、マウスc-SrcのSH2ドメインとマウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761とを接触させる工程、
(2) マウスADAPp130のTyr807またはマウスADAPp120のTyr761のリン酸化を測定する工程、および
(3) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１１９】
（６）下記の工程を有する破骨細胞分化形成抑制剤のスクリーニング方法：
(1’) 被験物質の存在下で、ヒトc-SrcのSH2ドメインとヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771とを接触させる工程、
(2’) ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771のリン酸化を測定する工程、および
(3’) 上記リン酸化を阻害する被験物質を破骨細胞分化形成抑制剤として選択する工程。【０１２０】
ここでマウスADAPp130のTyr807、マウスADAPp120のTyr761、ヒトADAPp130のTyr817またはヒトADAPp120のTyr771におけるリン酸化の有無は、例えば抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロッティングによって測定することができる。【０１２１】
上記スクリーニングで選別される物質は、破骨細胞の分化形成を抑制する作用を有するものであり、骨代謝異常疾患の発症や進展を予防する医薬組成物または骨代謝異常疾患を改善する治療薬の有効成分として使用することが可能である。【０１２２】
なお、骨代謝異常疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形関節炎、関節炎、変形性腰椎症、全身性エリテマトーデス、糖尿病における骨減少症、慢性腎不全における骨密度低下、骨髄腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病、家族性拡張性骨溶解症（familial expansile osteolysis:FEO）、または歯周疾患を挙げることができる。【０１２３】
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに骨代謝異常疾患を有するモデル非ヒト動物を用いてスクリーニングをかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに骨代謝異常疾患を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに骨代謝異常疾患を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分を選別取得することができる。【０１２４】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子工学的操作によって、工業的に製造することができ、破骨細胞分化形成抑制剤または骨代謝異常疾患予防・治療用医薬組成物の調製に使用することができる。【０１２５】
上記のスクリーニング方法は、前述するように、その基本はc-SrcとADAPとの結合を阻害する作用を有する物質を探索することからなる。従って、上記のスクリーニング方法は、別の角度から、c-SrcとADAPとの結合を阻害する作用を有する物質（c-Src／ADAP結合阻害剤）をスクリーニングする方法と規定することができる。当該方法で得られるc-Src／ADAP結合阻害剤は、その作用に基づいて破骨細胞の分化形成を抑制することができる。このため当該物質によれば、骨代謝異常疾患を予防または治療することができると期待される。従って、本発明の方法もまた、骨代謝異常疾患の予防または治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法であるといえる。
【実施例】
【０１２６】
以下、本発明をより詳細に示すために実験例を示す。ここでは、本発明でいうc-SrcとADAPとの「結合」の好適な態様である「会合」を例にして記載するが、これに制限されるものではない。【０１２７】
下記の実験例において使用した材料と実験方法を説明する。【０１２８】
（１）細胞培養
（1-1）ヒト胚腎細胞株（HEK293細胞）は、10%FCSおよび抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）（Invitrogen）を用いて、37℃、5%CO2の条件下で培養する。【０１２９】
（1-2）マウス単球・マクロファージ系細胞株（RAW246細胞）は、10%FCS、非必須アミノ酸溶液（Gibco）およびグルタミン酸溶液を添加したEMEM（日水）を用いて、37℃、5%CO2の条件下で培養する。【０１３０】
（２）in vitro での破骨細胞形成
（2-1）RAW264細胞の分化誘導
in vitro で破骨細胞を形成するため、RAW264細胞を1.3×104 cells/cm2の密度に調製し、これにGSTとRANKLを、それぞれ最終濃度が250ng/mlおよび500ng/mlとなるように添加する（ Ishida, N., et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156.）。72時間培養後、培地を、GSTまたはRANKLを含む新鮮な培地に交換し、さらに24時間培養を継続する（培養条件：37℃、CO2濃度5%）。なお、可溶性組み換えRANKL（Receptor activator of NF-κB ligand）は、文献（Meiyanto, E., et al., (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278-283）の記載に従って調製する。【０１３１】
（2-2）骨髄細胞から破骨細胞形成
文献(Raab, M., et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 21170-21179)に記載する方法に従って、M-CSFで処理することによって、マウス骨髄細胞から破骨細胞の前駆細胞を生成した。具体的には、6週齢の雌のddYマウス（CLEA JapanあるいはJapan SLC）の骨髄から得られたマウス骨髄細胞を、10%の熱不活性化FCS、抗生物質、ヒトM-CSF（RIKEN DNA Bank）を安定に発現するNIH3T3/pCAhMCSF細胞(MCSF-CM)の１％培養上清を含むα-MEM（Invitrogen）中で一晩培養する。非接着性の細胞を回収し、10%のFCSおよび3%のMCSF-CMを含むα-MEM中に再プレートする。こうすることで骨髄マクロファージ（BMMs）が接着細胞として得られる。これを再プレートして、上記(2-1）で説明した条件を使用して、GSTまたはRANKLを添加して、破骨細胞になるように誘導する。【０１３２】
（2-3）破骨細胞形成の上記の両システムにおいて、RANKLを添加後、48時間後および96時間後に、それぞれ融合前の破骨細胞および多核の破骨細胞が得られる。破骨細胞の数の計測には、後述するTRAP染色が使用できる。【０１３３】
（３）TRAP染色
細胞をPBSで3回洗浄後、メタノールで30秒間固定し、乾燥させる。TRAP染色液を加え、37℃で１時間インキュベートし、その後滅菌水で洗浄し、メタノールで30秒間固定し、乾燥させる。酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性を有する赤く染色された細胞（TRAP陽性多核細胞）を計測する。なお、TRAP染色液は、0.026Mの酒石酸（in 0.1M 酒石酸、pH5.2）と12.5mg/ml naphthol AS-BI phosphate（in 0.1M 酢酸、pH5.2）を、24:1の割合で混ぜた液に、FAST GARNET GBC（2-アミノアゾトルエン）を加え、0.8μmフィルターで濾過して調製する。【０１３４】
（４）発現ベクターの調製
（4-1）全長c-Src（野生型）発現ベクター
全長c-SrcをコードするcDNAを、逆転写PCRによって得られたRAW264細胞のmRNAから調製し、これを発現ベクターpRc/CMV（Invitrogen）またはレトルウイルス発現ベクターpCX4-puro（ Akagi, T., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13567-13572）に導入して調製する。【０１３５】
（4-2）GST-U・SH3・SH2発現ベクターおよびGST-U・SH3発現ベクターc-SrcのSH3-SH2ドメイン（アミノ酸1-262）またはc-SrcのSH3ドメイン（アミノ酸1-149）をコードするcDNAを、上記と同様にして取得し、各々融合ベクター（pGEX-3X GST：Amersham Biosciences）に導入して、GST-U・SH3・SH2発現ベクターおよびGST-U・SH3発現ベクターを調製する。【０１３６】
（4-3）c-SrcのCA変異体（CA）発現ベクターおよびc-SrcのKD変異体（KD）発現ベクター
逆転写PCRによって得られたRAW264細胞のmRNAから全長c-SrcをコードするcDNAを調製し、これを発現ベクターpRc/CMV（Invitrogen）に導入する。次いで突然変異生成キット〔Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE）〕を用いて、527番目のチロシン残基をフェニルアラニンに、または295番目のリジン残基をメチオニンに置換して、それぞれc-Srcの触媒活性なCA変異体(CA)（SrcY527F）の発現ベクター、またはc-SrcのKD変異体（KD）（キナーゼ欠失体、SrcK295M）の発現ベクターを調製する。 【０１３７】
（4-4）ADAP（p130）発現ベクター
ADAP（p130）をコードするcDNAを、逆転写PCRによって得られたRAW264細胞のmRNAから調製し、これを発現ベクターpFLAG/CMV2（EASTMAN KODAK COMPANY）またはレトルウイルス発現ベクターpCX4-puroに導入して調製する。【０１３８】
（4-5）ADAPのC末端欠失変異体（ADAP1-326、ADAP1-614）発現ベクターおよび部位
特異的変異体（Y615F）発現ベクターADAPのC末端欠失変異体（ADAP1-326、ADAP1-614）発現ベクターは、上記方法で調製したADAP（p130）発現ベクター上のADAP遺伝子をEcoRIで消化するか（ADAPのアミノ酸1-326の切断）、あるいはBglIIで消化して（ADAPのアミノ酸1-614の切断）、ベクターを再結合することによって調製する。ADAPのYF-変異体（Y615F）発現ベクターは、上記方法で調製したADAP（p130）発現ベクターについて、突然変異生成キット〔Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE）〕を用いて、615番目のチロシン残基をフェニルアラニンに置換することによって調製する。【０１３９】
（4-6）ADAP発現抑制ベクター（pSuper-siADAP-1およびpSuper-siADAP-2）
si RNAの発現用に、マウスADAPに特異的な2つの標的配列を選択する；
siADAP-1用に、5'-AACCTACCTACGAGGAGAA-3'  (200〜218)（配列番号９）
siADAP-2用に、5'-AAGCCTGCTGCGATGTCAA-3'  (1514〜1532) （配列番号１０）
アニーリングされたオリゴヌクレオチドを、ネオマイシン耐性遺伝子を有する発現ベクターpSuper（Oligo Engine）に導入する（pSuper--siADAP-1およびpSuper-siADAP-2）。
またはレトロウイルス発現ベクターpSINsi-hU6（TaKaRa）に導入する。silent-ADAPをコードするベクターを生成するために、siADAP-1およびsiADAP-2に対する標的配列をそれぞれ5'-AACCAACTTATGAGGAAAA-3'（si ADAP-1）（配列番号１１）、5'-AAGCATGCTGTGACGTTAA-3'(siADAP-2) （配列番号１２）に変更する（下線部が変更部位）。【０１４０】
（５）HEK293細胞への遺伝子導入
HEK293細胞への遺伝子導入は、文献(Thomas, M., et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14640-14645)に記載する方法に従って、polyethylenimine（PEI25）法を使用して行った。具体的には、60mm径の培養皿あたり3×105個のHEK293細胞を播種し、37℃、CO2濃度5%、FCS入りD-MEMで一晩培養する。翌日、細胞が50-90％コンフルエントであることを確認して実験に使用する。プラスミドDNA 7.5μgに、5%のグルコース/PBS 7.5μl、及び3.3mM PEI25/5%グルコース/PBS 7.5μlを加えて、軽く混合して室温で20分間静置する。これを前日より培養しておいた60mm径の培養皿中の細胞に添加し、24-48時間後に細胞の溶解物を回収する。【０１４１】
（６）レトロウイルス感染
レトルウイルスの感染は、FuGENE 6（ロッシュ）を用いて、HEK293細胞を、pGL、pE-Eco（TaKaRa）およびレトロウイルス発現ベクターと共にトランスフェクションする。トランスフェクション後、２日目に上清を回収して、レトロウイルスを8,000×gで16時間遠心分離することによって濃縮する。【０１４２】
（７）ADAP-ノックダウン RAW264細胞
RAW264細胞をLipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、pSuper-siADAP-1およびpSuper-siADAP-2あるいは空のベクターでトランスフェクションし、ネオマイシンに耐性なクローンを単離することによって調製する。具体的には、35mm径の培養皿にRAW264細胞を30-50%コンフルエントになるように播き、37℃、CO2濃度5%、FCS入りE-MEMで一晩培養する。翌日、細胞が60-90％コンフルエントであることを確認して、リポフェクションを行う。【０１４３】
（８）細胞抽出液の調製
60mm径の培養皿に培養した細胞をPBSで３回洗浄後、Lysis buffer（50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、2mM EDTA、2mM Na3VO4、20mM NaF、1%Triton X-100）を200μl添加し、細胞を掻き取る。15,000rpmで20分間遠心分離後、上清をエッペンドルフチューブで回収し、細胞抽出液とする。【０１４４】
（９）免疫沈降、ウエスタンブロッティング、免疫染色
免疫沈殿とウェスタンブロットは、文献(Ishida, N., et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156)の記載に従って行う。抗体とタンパク質との複合体は、マウスIgGに対するウサギIgGフラクション（Rabbit IgG Fraction to Mouse IgG）（MP Biomedicals）を結合したProtein G SepharoseあるいはProtein A Sepharoseを用いて沈降させる。【０１４５】
（9-1）免疫沈降
１サンプルあたりウサギ抗マウスIgG抗体20ng、Pro-Aビーズ20μlを加え、Lysis bufferで最終500μlに調整し、4℃で一晩回転しながらインキュベートする。これと併行して、細胞抽出液135μlにLysis buffer 150μlを加え、更に抗Src抗体2μg、或いは抗FLAG抗体1μgを加えて、4℃で一晩インキュベートする。反応後、先のPro-AビーズをLysis bufferで5回洗浄し、2×サンプルバッファーを加えて、105℃で5分間インキュベートする。【０１４６】
（9-2）ウエスタンブロッティング
免疫沈降を行ったサンプルは等量ずつ、またADAPの発現量の確認には、各サンプル中のタンパク量が同一になるようにして、SDS-PAGEにより分離し、水槽型ブロッティング装置を用いて、PVDF膜にタンパク質を一晩かけて転写する。転写後、PVDF膜をPBSで洗浄し、5% BSA/PBSで１時間以上反応させる。PBSで洗浄し、PBSで5分、0.1％ Tween-20/PBS（PBST）で15分、PBSで5分間の順で、PVDF膜を洗浄した後、５％スキムミルク/PBSで3000倍に希釈した二次抗体を室温で1時間反応させる。PBSで5分、PBSTで15分、PBSで5分の順で、PVDF膜を洗浄する。ウエスタンブロッティングの検出は、Amersham Biosciences社から購入したヒツジ抗-マウスHRP結合IgGおよびECL検出キットを用いて行う。【０１４７】
（9-3）免疫染色
35mm径のプレートにガラスプレートを敷き、RAW264細胞から破骨細胞を誘導し、細胞培養を行う。PBSで２回洗浄し、4％ p-formaldehyde/PBSで15分間固定する。固定後、PBSで2回洗浄し、0.2％ TritonX-100/PBSで10分間ブロッキングを行う。PBSで２回洗浄し、5％Milk/PBSで１時間ブロッキングする。PBSで2回洗浄後、1:25の抗ADAP抗体（in 5% Milk/PBS）で１時間処理する。次いで、PBSで3回洗浄し、1:100の抗マウスIgG conjugated FITC (in 5% Milk/PBS)で１時間処理する。なお、アクチンと共染色する場合は、1:2500のrhodamine  phalloidin（in 5% Milk/PBS）を同時に加える。処理後、PBSで3回洗浄し、マウント剤を用いてスライドガラスに乗せる。これをマニュキュアでシールして、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡で観察する。【０１４８】
（9-4）なお、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、および免疫染色に使用する抗体は、以下の通りである。
・マウス抗-Srcモノクローナル抗体（OP-07）（CALBIOCHEM Oncogene Research Products）（単に「抗-Src抗体」という）
・マウス抗-β-アクチンモノクローナル抗体（AC-74）（Sigma) （単に「抗-β-アクチン抗体」という）
・マウス抗-FLAGモノクローナル抗体（M2）（Sigma) （単に「抗- FLAG抗体」という）
・マウス抗-ADAP抗体および抗-Cas抗体（BD Transduction Laboratories)
・マウス抗-ホスフォチロシン抗体（4G10）（Upstate Biotechnology）（単に「4G10」または「α-pTyr」という）
（１０）GST融合-Srcタンパク質を用いたプルダウンアッセイ、および質量分析
RAW264細胞の細胞溶解物は、RANKLの存在下で4日間RAW264細胞を培養することによって調製する（破骨細胞への分化誘導）。GSTを融合したc-SrcのSH3および／またはSH2ドメインを大腸菌中で発現して、定法に従ってGlutathione-Sepharose 4B（Amersham Biosciences）で精製する（GST融合Srcタンパク質）。精製したGSTまたはGST融合Srcタンパク質50μg、および細胞抽出物から得られたタンパク質（c-Src会合タンパク質）10mgを、40℃で6時間培養する。バッファーH（50mMトリス-HCl pH7.4、100mM NaCl、5mM MgCl2および10%のグリセリン）で4回洗浄した後、結合タンパク質を、500mM NaClを含むバッファーH 100μl中に溶出させる。 回収したタンパク質を濃縮して、10%のSDSポリアクリルアミドゲル（1mmの厚さ、および6cm長さ）にかけて分離する。タンパク質をSypro Ruby（Molecular Probes）で染色して、UV照明によって視覚化する。【０１４９】
得られたタンパク質を、文献(Kuwana, R., et al., (2002) Microbiology 148, 3971-3982)の記載に従って質量分析とデータ・ベース探索を行った。小スケールのプルダウンアッセイのために、破骨細胞を、GSTプルダウンバッファー（1% NP-40、25mM Hepes、150mM NaCl、1mM EDTA、10mM MgCl2、10%のグリセリン、2mM NaVO4、10mM NaFおよびプロチアーゼ阻害剤）にて溶解し、得られた溶解物をGST融合タンパク質とともにインキュベーションするた。 会合したタンパク質は、Glutathione-Sepharose4Bで沈降させる。 【０１５０】
（１１）免疫蛍光顕微鏡検査および画像解析
文献(Geng, L., et al., (2001) Proc. Nat. Acad.Sci. U.S.A. 98, 11527-11532)の記載に準じて、免疫染色を行う。 簡単に説明すると、 細胞をカバーグラス上において、2%のパラホルムアルデヒド（TAAB LABORATORIES）を含むPBSで10分間処理して固定し、0.1%のTritonX-100を含むPBSで10分間処理して透過する。5%のスキムミルク/5%FCS/PBSで30分間処理して、非特異性の結合をブロッキングした後、細胞を、抗-ADAP mAbと30分間インキュベーションする。その後、Alexa Fluor 488標識−ヤギ抗マウスIgG（Molecular Probes）と30分間インキュべーションする。カバースリップを、ガラススライド上のPERMAFLUOR（Immunotech）に乗せる。蛍光の画像は、共焦点レーザー顕微鏡LSM410（Carl Zeiss）で取得し、Adobe Photoshop 7.0（アドビ・システムズ）で処理する。【０１５１】
（１２）経時的顕微鏡検査法
12ウエルのプレート上の細胞を、RANKLで刺激して、２日間インキュベートして、前融合段階にある破骨細胞の前駆細胞を調製する。細胞を鉱油で覆って、5%のCO2大気中で37℃に維持して、Axiovert 200M（Carl Zeiss）を使用して観察する。位相差画像は、AxioVision3.1ソフトウェア（Carl Zeiss）を用いて10-15時間に亘って5分毎に検出する。泳動距離は、Sction Image Software （Scion Corporation）を使用して、連続のイメージ中の核の中心の転移をディジタル化することにより計算する。【０１５２】
実験例１    c-Src会合タンパク質の同定
（１）c-Src会合タンパク質を探索するために、GST融合Srcタンパク質とRAW264細胞から分化誘導した破骨細胞の細胞溶解物を用いて、in vitroプルダウンアッセイを行った。GST融合Srcタンパク質として、マウスSrcのSH3とSH2ドメインを有するもの（GST-U・SH3・SH2）を用いた。なお、破骨細胞の細胞溶解物は、RAW264細胞をRANKLの存在下で4日間培養して調製した細胞抽出液を、GSTプルダウンバッファー(1% NP-40、25mM Hepes、150mM NaCl、1mM EDTA、10mM MgCl2、10%のグリセリン、2mM NaVO4、10mM NaFおよびプロチアーゼ阻害剤)にて溶解して調製した。GST融合Srcタンパク質（GST-U・SH3・SH2）およびコントロール用のGSTは大腸菌内で発現して、定法に従ってGlutathione-Sepharose 4B(Amersham  Biosciences)を用いて精製して使用した。なお、GSTはコントロールベクターpGEX-3X から調製した。【０１５３】
具体的には、まず、精製したGST-Srcタンパク質またはGSTを50μg、および破骨細胞の細胞溶解物から調製したタンパク質10mgを、40℃で6時間インキュベーションした。 インキュベーション後、バッファーH(50mMトリス-HCl（pH7.4）、100mM NaCl、5mM MgCl2および10%のグリセリン)で4回洗浄した後、得られた会合タンパク質を、500mM NaClを含むバッファーH 100μl中に溶出させた。 回収した会合タンパク質を濃縮して、10%のSDSポリアクリルアミドゲル(厚さ1mm、長さ6cm)にかけて電気泳動により分離した。SDSポリアクリルアミドゲルをSypro Ruby（Molecular Probes）で染色して、分離したタンパク質をUV照明によって視覚化した。SDS-PAGE上のGST-Srcタンパク質（GST-U・SH3・SH2）に特有のバンドを同定し(図５Ａの右欄)、文献(Kuwana, R., et al., (2002) Microbiology 148, 3971-3982)の記載に従って質量分析にかけて、データ・ベース探索を行った。【０１５４】
その結果、図５Ａの右欄に示すように、10種類のタンパク質がc-Src会合タンパク質として同定された。これら同定されたタンパク質のうちADAPは、今回初めてc-Srcと相互作用することが明らかになったタンパク質である（それ以外のタンパク質については、文献13-16参照のこと）。ADAPは、当初、Fynを含む幾つかのタンパク質と結合することのできるアダプター・タンパク質として同定されたものであり、T細胞レセプターの活性下で「inside-out」シグナリングの役目を果たすことが知られている（Griffiths, E. K., et al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14, 317-322; Peterson, E. L. (2003) Immunol. Rev. 192, 113-121）。 【０１５５】
（２）上記で調製した破骨細胞（RAW246細胞）の細胞溶解物を、GST、並びにGST融合Srcタンパク質〔マウスSrcのSH3とSH2ドメインを有するもの（GST-U・SH3・SH2）とマウスSrcのSH3ドメインを有するもの（GST-U・SH3）〕とインキュベーションし、結合したタンパク質をADAPに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂに示すように、SrcのSH3ドメインのみではADAPと会合しなかったが、SH2ドインを含むSrcはADAPと会合した。このことから, ADAPは、c-SrcとのSH2ドメインを介して会合すること、すなわちSrcのSH2ドメインがADAPとの会合に必要であることがわかった。また、バンドが二重であることから、RAW264細胞はADAP の2つ のアイソフォーム（p120とp130）を発現していることが確認された( Veale, M., et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 28427-28435)。【０１５６】
なお、マウスのADAPのアイソフォームp130（マウスADAPp130）の構造模式図を図２に示す。またマウスADAPp130のアミノ酸配列を配列番号５に、マウスADAPp120のアミノ酸配列を配列番号６に示す。マウスADAPp120は、マウスADAPp130のアミノ酸627-672領域に位置する46アミノ酸残基が欠失したスプライシング変異体である。マウスと同様に、ヒトに由来するADAPにも2つ のアイソフォーム（p120とp130）が存在していることが知られている。ヒトADAPp130のアミノ酸配列を配列番号７に、ヒトADAPp120のアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、マウスADAPp130のアミノ酸配列とヒトADAPp130のアミノ酸配列を対比した図を図３に、マウスADAPp120のアミノ酸配列とヒトADAPp120のアミノ酸配列を対比した図を図４に示す。これからわかるように、マウスADAPp130とヒトADAPp130とはアミノ酸配列において77.2％の割合で同一性であり、マウスADAPp120とヒトADAPp120とはアミノ酸配列において81.7％の割合で同一である。このように、ADAPは各アイソフォームとも動物間で類似した構造を有している。【０１５７】
実験例２    ADAPのc-Src会合領域の同定と結合部位の決定 
（１）全長c-SrcとADAPp130のin vivoにおける会合を確認するため、HEK293細胞内で、フラグをつけたADAPと、野生型のcSrc（WT）、cSrc のCA変異体（Srcの負の調節部位に変異が与えられ、キナーゼ活性が恒常的にONになっている変異体／SrcY527F）（CA）、あるいはcSrc のKD変異体（Srcのリン酸基転移部位に変異が与えられ、キナーゼ活性が恒常的にOFFになっている変異体／cSrcK295M）（KD）とを強制発現させ、抗Src抗体で免疫沈降し、抗FLAG抗体（M2）でウェエスタンブロットした。結果を図６Ａの上パネルに示す。図６Ａ（上パネル）に示すように、野生型のcSrc（WT）とc-SrcのCA変異体（CA）の両方が、ADAPと共沈殿したのに対し、c-SrcのKD変異体（KD）は共沈殿しなかったことから、ADAPとの会合にはSrcのキナーゼ活性が必要であることが示唆された。【０１５８】
また、SrcとADAPを強制発現させた際のADAPのチロシンリン酸化状態を調べた。具体的にはHEK293細胞にSrcの各種変異体とADAPをトランスフェクションした後、抗FLAG抗体で免疫沈降し、抗チロシンリン酸化抗体（α-pTyr）でウェスタンブロットした（図６A、上から３番目のパネル）。その結果、ADAPを単独で細胞に発現させた場合およびc-SrcのKD変異体とともに発現させたADAPではチロシンリン酸化は認められなかったが、野生型-cSrc（WT）またはc-SrcのCA変異体（CA）とともに発現させたADAPではチロシンのリン酸化が確認された。【０１５９】
以上の結果から、ADAP上のチロシン残基のリン酸化がc-Srcとの会合に必須であること、c-Src のSH2ドメインとADAPのリン酸化されたチロシン残基とが会合すること、ADAP上のチロシン残基のリン酸化はSrcのキナーゼ活性に依存していることが示唆された。【０１６０】
（２）RAW264細胞を、SrcのKD変異体（SrcKD）あるいはSrcのCA変異体（SrcCA）を発現するレトロウイルスでトランスフェクションした。この感染細胞から調製した細胞溶解物を、抗チロシンリン酸化抗体（α-pTyr）で免疫沈降して、抗ADAP抗体とイムノブロッティングした(図６Ｂの上のパネル)。また、上記感染細胞の全細胞溶解物を、抗Src抗体（図６Ｂの中央のパネル）または抗ADAP抗体（図６Ｂの下のパネル）を用いてウェスタンブロットを行った。図６Ｂに示すように、内在性ADAPのSrcのキナーゼに依存したリン酸化は、RAW264細胞におけるレトロウイルスによるc-SrcのCA変異体あるいはKD変異体の発現によっても確認された（図６Ｂ)。このことから、c-SrcのSH2ドメインとキナーゼ活性の両方が、ADAPとの会合に不可欠であることが分かった。【０１６１】
（３）c-Srcとの会合に関わるADAP上のチロシン残基の同定
c-SrcのSH2ドメインはpTyr-hydrophilic-hydrpphilic-Ile/Proというアミノ酸モチーフを好んで認識することが知られている。ADAPのアミノ酸配列を調べたところ、ADAPにはこれらの配列に近いチロシン残基が８つ存在していた（図６Ｃの上カラムの矢印）。そこで、ADAPのC領域を欠失させた変異体（ADAP1-326：ADAPのC末端領域の327以降を欠如した異性体、ADAP1-614：ADAPのC末端領域の615以降を欠如した異性体）を作成し、c-Srcとの会合を確認した。【０１６２】
具体的には、HEK細胞に、SrcのCA異性体（CA）（SrcY527F）と、FLAGを付けた全長のADAP（full）、ADAP1-326、またはADAP1-614とをそれぞれ強制発現させた。そして抗Src抗体で免疫沈降させ、抗FLAG抗体でブロッティングした。その結果、全長のADAPではSrcとの相互作用が見られたが、ADAP1-614およびADAP1-326ではSrcとの相互作用は殆ど見られなかった（図６Ｃ中央カラム）。また、HEK細胞に、SrcのCA異性体（CA）（SrcY527F）と、FLAGを付けた全長のADAP（full）、ADAP1-326、またはADAP1-614とをそれぞれ強制発現させ、抗FLAG抗体で免疫沈降させて、チロシンリン酸化を認識する抗チロシンリン酸化抗体（α-pTyr）でブロッティングした。その結果、全長のADAPではチロシンのリン酸化が確認できたが、ADAP1-614ではリン酸化レベルは著しく低下し、ADAP1-326ではリン酸化は確認できなかった（結果示さず）。これらの結果から、ADAPのc-SRcとの会合に関係するリン酸化部位はアミノ酸615番目以降に存在し、c-SrcとADAPとの会合には、ADAPの615番目以降のC末端領域(アミノ酸615-819)が関与していることが明らかになった（図６Ｃ）。【０１６３】
（４）上記の知見に基づいて、予測サーバー（NetPhos 2.0：デンマークのTechnicalUniversity）を使用して、ADAPのC末端領域（アミノ酸615-819）に位置するチロシンキナーゼによるリン酸化部位を推定した。その結果、4つのチロシン残基（Tyr615、687、791および807）が、チロシンキナーゼによるリン酸化の推定部位であると推測された。これらの中で、既に615番目と687番目のチロシン残基（Tyr 615、Tyr687）は、それぞれADAPおよびSLP-76の認識部位であることが報告されている( Raab, M., et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 21170-21179)。 【０１６４】
そこで、これらの4つのチロシン残基（Tyr615、687、791および807）を各々フェニルアラニンに置換したADAP（Y687/791/807F：Tyr615はそのまま、687、791及び807番目のTyrをPheに置換）（Y615/791/807F：Tyr687はそのまま、615、791及び807番目のTyrをPheに置換）（Y615/687/807F：Tyr791はそのまま、615、687及び807番目のTyrをPheに置換）（Y615/687/791F：Tyr807はそのまま、615、687及び791番目のTyrをPheに置換）を用いて、それぞれc-Srcとの会合活性を測定した。具体的には、HEK細胞に、Srcと、空のベクター（V）、FLAGを付けた全長のADAP（WT）、または各種のYF置換体（Y687/791/807F、Y615/791/807F、Y615/687/807F：Tyr791、Y615/687/791F）とをそれぞれ強制発現させた。そして抗Src抗体で免疫沈降させ、抗FLAG抗体または抗Src抗体を用いてブロッッティングした。結果を図６Ｄに示す。図６Ｄに示すように全長ADAPとTyr807を有するYF変異体（Y615/687/791F）にのみ、Srcとの会合が認められた。この結果から、ADAPのSH3-likeドメインに続くC末端領域に存在するTyr807がSrcとの会合に必要であることが分かった。【０１６５】
この結果はマウスADAPp130に関する結果であるが、この結果から、ヒトADAPp130については、マウスADAPp130のTyr807に相当するTyr817が、Srcとの会合に必要であると考えられる。また、マウスADAPp130のスプライシング変異体であるマウスADAPp120についても同様に、マウスADAPp130のTyr807に相当するTyr761がSrcとの会合に必要であり、ヒトADAPp120についてもヒトADAPp130のTyr817に相当するTyr771がSrcとの会合に必要であると考えられる。【０１６６】
実験例３    ADAPの発現プロファイル、および破骨細胞の先駆細胞内でのc-Srcとの会合 
（１）RAW264細胞および骨髄細胞内でのADAPの発現プロファイルを検討した。なお、単核の前駆細胞は、RANKL刺激によってRAW264細胞内で24時間後に分化し、また 48時間後に細胞融合をし始める（Kumagai, N., et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768; Ishida, N., et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 41147-41156）。私たちは、既にc-srcがRANKL誘導可能な遺伝子で、両方の細胞（RAW264細胞および骨髄マクロファージ）の中で24時間後にc-Srcが検出可能になることを報告している（Kumagai, N., et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768）。【０１６７】
このようにRAW264細胞および骨髄マクロファージ（BMMs）はRANKL刺激によって分化が促進されるため、これらの細胞をRANKL刺激した24時間、48時間、72時間および96時間目に細胞溶解物を調製し、ADAPの発現量を、抗ADAP抗体または抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロッティングによって調べた。結果を図７Ａ上パネルに示す。RANKL刺激後、48時間目（前融合段階）および96時間目（多核細胞）の細胞（RAW264、BMMs）を、TRAP染色した結果を図７Ａ下パネルに示す。【０１６８】
この結果からわかるように、c-Srcの発現とは対照的に、ADAPの発現は、両方の細胞（RAW264細胞および骨髄マクロファージ（BMMs））ともに、RANKL刺激しない細胞（0時間のもの）でも認められ、また細胞が多核細胞段階に移行すると減少した(図７Ａの上パネル)。 ADAPのアイソフォームp130 の発現は、RAW264細胞よりも、骨髄マクロファージ（BMMs）でより卓越しているようであった(図７Ａ)。【０１６９】
（２）ADAPを発現しないHEK293細胞をネガティブコントロールとして使用した(図７Ｂのa、a’)。カバースリップの上でRANKL処理した後、 48時間（図７Ｂのb、b'）、96時間（図７Ｂのd、d’）のRAW264細胞、および同様にRANKL処理した後、48時間（図７Ｂのc、c’）の骨髄マクロファージ（BMM）細胞を、固定して、抗ADAP mAbおよびAlexa488-結合第2抗体(緑）で免疫染色した（図７Ｂの上パネル)。 位相差画像を図７Ｂの下パネルに示す。これからわかるように、多核細胞が、画像の中心（図７Ｂのd、d'の中の矢）で観察された。また、図中の鏃印は、葉状仮足または偽足の最先端におけるADAPの局在を示す。【０１７０】
これらの結果は、ADAPが成熟した破骨細胞よりも単球細胞において、主な役目を果たしていることを示唆している。実際、ADAPを細胞中で免疫染色すると、多核細胞では弱いシグナルしか検出されなかったが、単核球では明確なシグナルが検出された(図７Ｂ)。前融合段階の細胞では、ADAPの強いシグナルは、特に葉様仮細胞の最先端、および偽足の中に検出された(図７Ｂ)。【０１７１】
（３）次いで、分化細胞内で内在性のc-SrcがADAPと会合することを確認した。具体的には、骨髄細胞に由来する破骨細胞の前駆細胞（骨髄マクロファージ）から調製された溶解物（図８、BMMs-derivede pOC：右パネル）およびRAW264細胞から調製された溶解物（図８、RAW264 derivede pOC：右のパネル）から、抗Src抗体またはコントロールとして正常なマウスIgG（control IgG）を用いて免疫沈降（IP）を行った。 ウェスタンブロット(IB)を、抗ADAP抗体（上パネル）および抗Src抗体（下パネル）をそれぞれ用いて行った。結果を図８に示す。図８に示すように、RAW264細胞および骨髄細胞から調製された破骨細胞の前駆細胞（骨髄マクロファージ）の両方において、c-Srcの免疫沈降が認められた。このことから、分化細胞（破骨細胞）内で内在性のc-Src がADAPと複合体を形成することがわかる。 【０１７２】
実験例４    付着に依存したADAPのリン酸化 
上記の実験例からマウスの場合、ADAPのチロシン残基（Tyr807）のリン酸化がc-Src（SH2ドメイン）との会合に不可欠であることがわかった。そこで、ここではADAPのリン酸化が破骨細胞内でどのようにコントロールされているかを調べた。【０１７３】
具体的には前融合段階にあるRAW264細胞を、プレートから分離して懸濁し、ビトロネクチン（Vn）で被覆した培養皿（Vn被覆プレート）またはpoly-D-Lys（PDL）で被覆した培養皿（PDL被覆プレート）の上に積層して、60分間放置した。RAW264細胞（前融合段階）の懸濁液、Vn被覆プレートに積層したもの、PDL被覆プレートに積層したものからそれぞれ調製した細胞溶解物を、全てのチロシンをリン酸化したタンパク質に対する抗体（抗チロシンリン酸化抗体：α-pTyr）を用いて免疫沈降して、抗ADAP抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図９に示す。【０１７４】
図９に示すように、懸濁液の中でADAPは全くリン酸化されていなかった。Vn被覆プレートに付着させたADAPはリン酸化が認められたが、PDL被覆プレートに付着させたADAPはリン酸化しなかったことから、ADAPのリン酸化がインテグリン依存性であることが示唆された。この結果から、ADAPは、細胞粘着／接着プロセスに応答し、かつ機能するようである。 【０１７５】
実験例５    siRNAによるADAPの抑制は多核細胞の形成と細胞遊走を阻害する 
ここでは破骨細胞の前駆細胞におけるADAPの機能を検討した。
（１） RAW264細胞をADAP用のsiRNAsをコードする発現ベクターでトランスフェクトし、ADAPノックダウン細胞を単離した（siADAP cl.1およびsiADAP cl.2)。RAW264細胞の親株（parent）、空のベクター（vector）でトランスフェクトしたRAW264細胞、またはADAPノックダウン細胞（siADAP cl.1およびsiADAP cl.2）のそれぞれについて、抗ADAP抗体を用いて、ウェスタンブロットを行って、RAW264細胞内でのADAPの発現の抑制を確認した（図１０Ａの上パネル）。また、発現したタンパク質の量をモニターするために、β-actinに対する抗体（抗βアクチン抗体）を用いて同様にウェスタンブロットを行った（図１０Ａの下パネル）。【０１７６】
（２）空のベクター(vector）でトランスフェクトしたRAW264細胞、およびADAPノックダウン細胞（siADAP cl.1およびsiADAP cl.2）をそれぞれ4日間RANKLで刺激し、TRAP染色を行った。図１０Ｂの左パネルに、空のベクター(vector）でトランスフェクトしたRAW264細胞とADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2）における代表的なTRAP染色所見を示す。これら３つの細胞についてTRAP陽性を示す多核破骨細胞（MN細胞）の数を数え、空のベクタートランスフェクタント（vector）から誘導されたTRAP陽性破骨細胞の数を100％として、それと比較した（図１０Ｂの右パネル）。【０１７７】
その結果、siRNAで処理した細胞では、わずかしかMN細胞が検出されず、ADAPの発現を抑制することによってMN細胞の形成が抑制されることが示唆された（図１０Ｂの右パネル）。ADAPの発現は主に前融合細胞で検出されることから、これらの結果は、ADAPが多核細胞形成の過程に重要な役割を果たしていることを示している。 この現象は、アンチセンスのsrcを使用してc-srcの発現を抑えた時に観察される現象によく似ていた（機能的多核細胞の形成が有意に抑制された）（Kumagai, N., et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 758-768）。【０１７８】
（３）次いで、RAW264細胞の親株とADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞）を使用して、ビデオ・システムで、細胞遊走に対する影響を経時的に測定した。具体的には、RAW264細胞の親株（parent）あるいはADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞）をRANKLで刺激し、刺激から48時間後に5分ごと、細胞の画像を顕微鏡で経時的に測定した。50個の細胞の核の位置を各画像でラベルし、核中心の移動を画像中に連続してディジタル化した。 図１１に、この50細胞全体の移動量を定量化してプロッティングした結果を示す。【０１７９】
RAW264細胞（parent）の親株の60%以上は20-40μm/hrの速度で遊走した。しかし、siADAP処理したノックダウン細胞（siADAP cl.2細胞）の75%以上は、20μm/h未満の速度で遊走した。空のベクターによる感染細胞の遊走活性は、親細胞と同等であった。また、siADAP処理した他のノックダウン細胞（siADAP cl.1細胞）についても、遊走の遅延が認められた。 これらの結果は、前融合段階における破骨細胞の遊走活性に、ADAPが重要であることを示唆するものである。 【０１８０】
実験例６    RAW264細胞の親株、およびADAPノックダウン細胞の、Casのチロシンリン酸化 
この実験例は、in vitroでの破骨細胞形成におけるチロシンリン酸化を介したシグナルの重要性を理解するために、分化誘導RAW264細胞における細胞タンパク質のチロシン残基リン酸化のプロファイルを検討した。【０１８１】
（１）実験例５に記載する方法で調製した、RAW264細胞の親株（parent）、空のベクター（vector）でトランスフェクトしたRAW264細胞、またはADAPノックダウン細胞（siADAPcl.1およびsiADAP cl.2）のそれぞれの細胞溶解物（いずれも前融合段階の細胞を使用）を、4G10 phosphotyrosine抗体でイムノブロットした。結果を図１２Ａに示す。図１２Ａに示すように、4G10抗phosphotyrosine抗体と反応する、チロシンリン酸化タンパク質が、125-135 kDaの範囲に検出され、そのシグナルの強度は、RAW264細胞の親株あるいは空のベクタートランスフェクタンスに比して、ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.1およびcl.2）は弱かった。【０１８２】
（２）上記の方法で調製した各細胞溶解物を抗チロシンリン酸化抗体（αpTyr）で免疫沈降させ、抗Cas抗体でイムノブロットした（図１２Ｃ）。【０１８３】
（３）src-ノックダウン細胞から調製した細胞溶解物を、図１２Ｄの左のパネルに示すように分析した。この細胞溶解物は抗チロシンリン酸化抗体（αpTyr）で処理した後、抗Cas抗体に対してイムノブロットした（図１２Ｄの右の上パネル）。また細胞溶解物（whole cell lysate）を、抗Src抗体（図１２Ｄ右の中央パネル）および抗βアクチン抗体（図１２の右の下パネル）でイムノブロットした。【０１８４】
この結果からわかるように、125-135 kDaの範囲に検出されたチロシンリン酸化タンパク質は、Cas（Crk-associated substrate）に特異的な抗体（抗Cas抗体）で消耗されました。これは、ADAPが、細胞遊走を導くアクチン細胞骨格の構成にドッキング蛋白として重要な役割を果たすことを示唆している（Chodniewicz, D., et al., (2004) Biochim. Biophys. Acta. 1692, 63-76)。Casを消耗した溶解物を使用すると、シグナルは有意に減少した（図１２Ｂ）。このことから、Casが分化RAW264細胞においてチロシン−リン酸化タンパク質であることを示唆している。 Casは、インテグリンの関与の下、チロシン残基でリン酸化されることが示された。また、チロシンがリン酸化されたCasは、遊走細胞の葉様仮細胞の伸長部に集中することが示された (Chodniewicz, D., et al., (2004) Biochim. Biophys. Acta. 1692, 63-76)。 更に、CasとADAPの複合体の形成が示唆された(Hamid, N., et al., (1999) Microb. Pathog. 27, 231-242; Deleuil, F., et al., (2003) Cell. Microbiol. 5, 53-64)。実際に、ADAPノックダウン細胞におけるCasの燐酸化は、著しく減少し、その減少の程度は図１２Ｃで見られたものと比較可能であった。これらの結果は、ADAPがCasのリン酸化に重要であることを示している。【０１８５】
更に、Casのリン酸化はSrcノックダウン細胞の中で減少していることがわかった（図１２Ｄ）。ｃ-SrcはCasのリン酸化に関与しており、c-Srcは前述するようにチロシンのリン酸化を介してADAPに結合するので、これらの結果はc-SrcがADAPとの複合体の形成を介してCasに対して影響することを示唆している。 【０１８６】
実験例７    ｃ-SrcとADAPの結合阻害
（１）ADAPのC末端領域発現ベクターの構築
pFLAG-CMV2ベクターのHindIII部位にマウスADAPp130の全長タンパク質をコードするDNAを挿入し、全長ADAP発現ベクターを構築した。この発現ベクターをBamHIにより切断し、C末端を含む断片をｐFLAG-CMV2ベクターのBamHI部位に挿入することで、ADAPのC末端領域断片（626-819）の発現ベクターを得た。【０１８７】
（２）ADAPのC末端領域の細胞への導入
HEK293細胞にSrcのCA異性体（CA）（SrcY527F）と、FLAGを付けた全長のマウスADAP p130（full）、FLAGを付けたマウスADAPp130のC末端断片（626-819領域）を強制発現させた。ADAPのC末端断片の量は、DNAμｇ比で、全長ADAP p130に対し、それぞれ1:3、2:3、4:3に設定した。その後、各々の細胞溶解液を抗FLAG抗体あるいは抗Src抗体で免疫沈降し、抗リン酸化チロシン抗体あるいは抗FLAG抗体、抗Src抗体でブロッティングした。その結果、ADAPのC末端領域の発現量依存的にリン酸化されるADAPp130（full）の量が減少した（図１３、左・上段）。また、ADAPのC末端領域の発現量依存的にc-SrcとADAP p130(full)の結合が阻害された（図１３、右・上段）。以上のことから、ADAPのC末端領域が、ADAPp130（full）とSrcとの結合を競合阻害することが示された。【０１８８】
実験例８    TAT-ADAPポリペプチドによるADAPリン酸化の阻害
（１）TAT-ADAPポリペプチドの構築
c-Srcとの結合部位に当たるマウスADAPp130のTyr807を含むチロシンリン酸化モチーフ（YDDIに相当）を中心に、前後の4アミノ酸を含む12アミノ酸配列の領域（マウスADAPp130の803-814領域）を阻害活性領域として設計した（配列番号１）。この領域のN末端部位にHIV-1ウイルスのTatタンパク質が有する細胞膜透過活性領域（YGRKKRRQRRR：配列番号２）を付加し、TAT-ADAPポリペプチド（配列番号３）とした。【０１８９】
（２）TAT-ADAPポリペプチドの細胞への導入
SrcのCA異性体（CA）（SrcY527F）と、FLAGを付けた全長のマウスADAP p130（full）を強制発現させたHEK293細胞の培地にTAT-ADAPポリペプチドを添加し培養を行なった。添加するTAT-ADAPポリペプチドの量は、1.25、2.5、5、10（μM）に設定した。その後、各々の細胞溶解液を抗FLAG抗体で免疫沈降し、抗リン酸化チロシン抗体、抗FLAG抗体、抗Src抗体でブロッティングした。その結果、TAT-ADAPポリペプチドの量依存的に、リン酸化されるADAP（full）の量が減少した（図１４）。これまでの実験により、ADAPのリン酸化はSrcとの結合に必須であることが分かっている。従って、本実験の結果は、TAT-ADAPポリペプチドがADAP（full）のリン酸化を抑制してc-Srcとの結合を阻害することを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】c-Srcの構造を示す模式図である。
【図２】マウスADAP（adhesion and degranulation-promoting adaptor protein）のアイソフォームp130の構造と、それと関連するタンパク質を示す模式図である
【図３】マウス由来ADAPのアイソフォームp130のアミノ酸配列とヒト由来ADAPのアイソフォームp130のアミノ酸配列とを対比した図である。
【図４】マウス由来ADAPのアイソフォームp120のアミノ酸配列とヒト由来ADAPのアイソフォームp120のアミノ酸配列とを対比した図である。
【図５】図Ａは、GST-U-SH3・SH2についてプルダウンアッセイを行い、GST-U-SH3・SH2と結合するタンパク質を同定した結果を示す。図Ｂは、GST融合Srcドメイン（GST-U-SH3・SH2、GST-U-SH3）と結合したADAPのプルダウンアッセイの結果を示す（実験例１）。
【図６】実験例２においてADAPのc-Src-会合部位を同定した結果を示す。図Ａは、ADAPのc-Srcに対するリン酸化依存性の会合を示す。図Ｂは、Src変異体を発現するRAW264細胞におけるADAPのチロシンリン酸化を示す。図Ｃは、ADAPのC末端領域がc-Srcとの会合に関わっていることを示す。図Ｄは c-Srcとの会合に関係するADAP中のチロシン残基を同定した結果を示す。
【図７】RAW264細胞および破骨細胞の前記細胞におけるADAPの発現プロファイルを示す。図Ａは分化RAW264細胞におけるADAPの発現レベルを示す。図ＢはADAPの免疫染色の結果を示す。図中の鏃印は、葉状仮足または偽足の最先端におけるADAPの局在を示す。バー長さは20μm。
【図８】RAW264細胞および骨髄マクロファージ細胞の前駆細胞における、ADAPとc-Srcとの会合を示す。
【図９】ADAPの付着依存のチロシンリン酸化を示す。
【図１０】図ＡはsiRNA処理した細胞のADAP発現を示す。図Ｂは 多核細胞形成に対するADAPのノックダウンの影響を調べた結果を示す。左パネル下のバーの長さは50μm。
【図１１】ADAPノックダウン細胞（siADAP cl.2）の遊走の遅延を示す図である。
【図１２】図Ａ RAW264細胞におけるチロシンが燐酸化されたタンパク質を、図ＢはCasの減少を、図Ｃは ADAPノックダウン細胞におけるCasの燐酸化を、図ＤはSrcノックダウン細胞のCasの燐酸化をそれぞれ示す。
【図１３】実施例７においてc-SRCとADAPの結合阻害を調べた結果を示す図である。図左はADAPのC末端領域（図中：ADAP626-819）の発現量依存的に、c-SrcによるADAP p130(full)のチロシンリン酸化が抑制されていることを示す。図右はADAPのC末端領域（図中：ADAP626-819）の発現量依存的に、c-SrcとADAP p130(full)の結合が阻害されていることを示す。
【図１４】実施例８においてTat-ADAPポリペプチドによるADAPリン酸化の阻害を調べた結果を示す図である。図左はTat-ADAPのアミノ酸配列を示す図である。図右はTat-ADAPの添加量依存的に、c-SrcによるADAP p130(full)のチロシンリン酸化が抑制されていることを示す。
【図３】
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【図４】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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