(57)【要約】本発明は免疫学、内分泌学、及び腫瘍学の分野に関し、特に、決定された増殖因子及びホルモン因子に対する複合型免疫応答の生成に関する。本明細書中に概説される、増殖を調節する因子（ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ）と性ホルモン放出カスケード又は生殖に関与するホルモン（ＧｎＲＨ、ＬＨ、ＦＳＨ）との間の相乗効果は、腫瘤の減少及び生存時間の増加として表される抗腫瘍応答を刺激する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時投与、個別投与、又は逐次的投与を通しての新生物形成の治療のための薬学的組合せであって、化合物Ａ及び化合物Ｂを含み、ここで、前記化合物Ａ及び化合物Ｂは、以下からなる分子の群から選択される薬学的組合せ：
Ａ：
ａ．１．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＧｎＲＨ若しくはそのアナログ、又は抗ＧｎＲＨ抗体、又はＧｎＲＨレセプター（ＧｎＲＨ−Ｒ）、又はその変異改変体、又は誘導ペプチド、又は抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体
ａ．２．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えゴナドトロピン、又はそれらのアナログ、又はそれらの変異改変体、ヒト化されているか又はされていない、下垂体性抗ゴナドトロピン抗体、それらのＦａｇ、ｓｃＦＶフラグメント
ａ．３．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、下垂体性ゴナドトロピンレセプター、又はそれらの変異改変体、若しくは誘導ペプチド
ａ．４．ヒト化されているか又はされていない、下垂体性抗ゴナドトロピンレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
Ｂ：
ｂ．１．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えＥＧＦ又はその変異改変体、若しくは誘導ペプチド、又はＥＧＦ模倣ペプチド、又はＥＧＦアナログ
ｂ．２．ヒト化されているか又はされていない、抗ＥＧＦ抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．３．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、又はその変異改変体、若しくは誘導ペプチド
ｂ．４．ヒト化されているか又はされていない、抗ＥＧＦレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．５．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えＶＥＧＦまたはその変異改変体、若しくは誘導ペプチド、又はＶＥＧＦ模倣ペプチド、又はＶＥＧＦアナログ
ｂ．６．ヒト化されているか又はされていない、抗ＶＥＧＦ抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．７．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＶＥＧＦレセプター、又は変異改変体、又はＶＥＧＦレセプターからの誘導ペプチド
ｂ．８．ヒト化されているか又はされていない、抗ＶＥＧＦレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント、
ｂ．９．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えＴＧＦ又はその変異改変体、若しくは誘導ペプチド、又はＴＧＦ模倣ペプチド、又はＴＧＦアナログ
ｂ．１０．ヒト化されているか又はされていない、抗ＴＧＦレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント、
ｂ．１１．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＴＧＦレセプター（ＴＧＦ−Ｒ）又はその変異改変体、若しくは誘導ペプチド。
【請求項２】
Ａ群及びＢ群の分子が、結合体化又はキメラタンパク質の形成によって免疫増強キャリアタンパク質に結合される、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
ＧｎＲＨアナログペプチドが配列ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを有し、免疫増強キャリアタンパク質に結合されている、請求項１又は２に記載の組合せ。
【請求項４】
免疫増強キャリアタンパク質がナイセリアメニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｐ１及びＰ６４外膜タンパク質から選択される、請求項１又は２に記載の組合せ。
【請求項５】
免疫増強キャリアタンパク質が破傷風トキソイド（ＴＴ）Ｔヘルパーエピトープである、請求項１又は２に記載の組合せ。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の組合せであって、結合体化されたキメラタンパク質が以下の改変体：
ａ）キャリアタンパク質及びＥＧＦに結合したＧｎＲＨ
ｂ）キャリアタンパク質及びＶＥＧＦに結合したＧｎＲＨ
ｃ）キャリアタンパク質及びＴＧＦに結合したＧｎＲＨ
ｄ）キャリアタンパク質、ＥＧＦ、及びＴＧＦに結合したＧｎＲＨ
ｅ）キャリアタンパク質、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦに結合したＧｎＲＨ
の１つである、組合せ。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に規定される治療用組合せの１つを用いる治療を含む、複合型免疫応答の生成のための方法。
【請求項８】
組合せが同時に、別々に、又は逐次的に適用され得る、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として免疫学、内分泌学、及び腫瘍学の分野に関し、特に、増殖を調節する因子（ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ）、並びに性ホルモン及び／又は性ホルモン放出カスケードに関与するホルモン若しくは生殖ホルモンの組合せを含む薬学的組成物に関し、この組成物は新生物形成の処置のための複合型自己免疫応答を引き起こす。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）としても知られる）は、脳下垂体前葉の黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に関与する視床下部性ペプチドホルモンである。
【０００３】
視床下部系によって産生されるＧｎＲＨに加えて、他の脳の部位（Ｊｅｎｎｅｓ  Ｌ，Ｃｏｎｎ  Ｐ．Ｍ．「ラット脳におけるゴナドアトリピン放出ホルモン及びそのレセプター（Ｇｏｎｏｄａｔｒｉｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ）」Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９４，第１５巻、５１−７７頁）、並びにラット卵巣顆粒細胞（Ｐｅｎｇ  Ｃ．，Ｆａｎ  Ｎ．Ｃ．，Ｌｉｇｉｅｒ  Ｍ．，Ｖａａｎａｎｅｎ  Ｊ．，Ｌｅｕｎｇ  Ｐ．Ｃ．「ヒト顆粒膜黄体細胞におけるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）及びＧｎＲＨレセプターメッセンジャーリボ核酸の発現及び調節（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  （ＧｎＲＨ）  ａｎｄ  ＧｎＲＨ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ−ｌｕｔｅａｌ  ｃｅｌｌｓ）」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９４、第１３５巻、１７４０−１７４６頁）、精巣細胞（Ｄｉ  Ｍａｔｔｅｏ  Ｌ．，Ｖａｌｌａｒｉｎｏ  Ｍ．，Ｐｉｅｒａｎｔｏｎｉ  Ｒ．「カエル、ラナエスクレンタの脳、脳下垂体、及び精巣におけるＧｎＲＨ分子型の局在（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧｎＲＨ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｏｇ，Ｒａｎａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．１９９６，第２４７巻、３３−４０頁）、ヒト胎盤（Ｇｏｈａｒ  Ｊ．，Ｍａｚｏｒ  Ｍ．，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｒ．「妊娠中のＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ，１９９６，第２５９巻，１−６頁）、免疫系（Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．Ｊ．，Ｓｕｎ  Ｌ．，Ｗｉｌｄｅｒ  Ｒ．Ｌ．「リンパ器官におけるＧｎＲＨ及びＧｎＲＨレセプターｍＲＮＡの周期的発現（Ｃｙｃｌｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧｎＲＨ  ａｎｄ  ＧｎＲＨ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ）」Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９８，第６７巻、１１７−１２５頁）、及び脳下垂体（Ｂａｕｅｒ  Ｔ．Ｗ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ  Ｃ．Ｍ．，Ｃｈｉｌｄｓ  Ｇ．Ｖ．「ラット脳下垂体前葉におけるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  （ＧｎＲＨ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ）」Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，１９８１，第２９巻，１１７１−１１７８頁）でのＧｎＲＨ産生の証拠が存在する。
【０００４】
性腺摘出は、性腺ステロイドに依存する腫瘍の処置のために必要な周知の治療手順である。ＧｎＲＨアナログは、化学的去勢を通してのみならず、腫瘍細胞に対する直接的効果によってもまた、それらの抗腫瘍活性を発揮することができる（Ｃｏｕｉｌｌａｒｄ  Ｓ．，Ｌａｂｒｉｅ  Ｃ．，Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ａ．，Ｃａｎｄａｓ  Ｂ．，Ｐｏｕｌｉｏｔ  Ｆ．，Ｌａｂｒｉｅ  Ｆ．「ヒトＺＲ−７５−１乳癌異種移植片の増殖に対するデヒドロエピアンドロステロン及び抗アンドロゲンＥＭ−８００の効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｎｄｒｏｇｅｎ  ＥＭ−８００  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＺＲ−７５−１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｓ）」Ｊ．Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９８，５月２０日号、７７２−７７８頁；Ｋｏｌｌｅ  Ｓ．ら「ヒト前立腺癌および過形成における成長ホルモンの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９、第５巻、９１１−９１６頁）。
【０００５】
同様に、ＧｎＲＨアンタゴニスト（ＭＺ−４−７１）が、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、及びＤｕｎｎｉｎｇ  ＡＴ−１の増殖を抑制し得ることが報告された（Ａ  Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈら「成長ホルモン放出ホルモンのアンタゴニストによるアンドロゲン非依存性前立腺癌のインビボ増殖の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）」Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９７，第７５巻、第１１号、１５８５−１５９２頁）。
【０００６】
Ｄｕｎｎｉｎｇ細胞系Ｒ３３２７−Ｇは、現在十分に確立された方法として前立腺腫瘍の処置に一般的に関連した異なる研究において広範に使用されている。ＥＧＦレセプターはアンドロゲン腫瘍モデルＤｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７に感受性である前立腺において見い出されている（Ｄａｍｂｅｒ  Ｊ．Ｅ．，Ｂｅｒｇｈ  Ｂ．，Ｇａｆｖｅｌｓ  Ｍ．「ラット前立腺腺癌における上皮増殖因子レセプター含量：エンドクリン処理の効果（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｒａｔ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｃｒｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．１９９５，第２３巻、第２号、１１９−２５頁）。亜系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−ＧにおいてＥＧＦレセプターの発現がアンドロゲン制御下で協調的であることもまた示唆されてきた（「Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７  Ｇ前立腺腫瘍を有するラットの去勢後の成長因子の協調的損失（Ｃｏｏｒｄｏｎａｔｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７  Ｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）」Ｃｌｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９２，第９巻、第２号、４７−５０頁）。
【０００７】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、約６０４５Ｄａの分子量を有する５３アミノ酸のポリペプチドであり、これはインビトロ及びインビボにおいて上皮細胞及び間葉細胞の増殖を刺激する（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｇ．，「ヒト上皮増殖因子：単離並びに化学的及び生物学的特性（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９７５，第７２巻、１３１７頁）。ＥＧＦ作用は細胞膜における特異的レセプターを介して発揮される。ＥＧＦは最初にマウス顎下腺から精製された（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６２，第２３７巻、第１巻、５５５頁）。その後、類似の分子がヒト尿から得られた（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．「ヒト上皮増殖因子：単離並びに化学的及び生物学的特性（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １９７５，第７２巻、１３１７頁）。
【０００８】
ＥＧＦの生物的調節作用は、約１７０ＫＤａの糖タンパク質である膜レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）を介して行われ、その遺伝子はクローニング及び配列決定されている。このレセプターの細胞内ドメインは特異的チロシンキナーゼタンパク質活性と関連付けられており、悪性形質転換プロセスに特定の関連を示す癌遺伝子ｖ−ｅｒｂ−Ｂに対する構造的相同性を有する（Ｈｅｌｄｉｎｇ  Ｃ．Ｈ．Ｃｅｌｌ，１９８４，第３７巻、９−２０頁）。腫瘍細胞にＥＧＦ−Ｒが存在することから、ヒト乳癌に関連する保留された予測が支持される。約４０％の乳癌がＥＧＦに対する高親和性特異的結合部位を示す（Ｒｉｏｓ  Ｍ．Ａ．ら「上皮増殖因子及びエストロゲンのレセプター、乳癌を有する患者における再発の予測因子（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｒｅｌａｐｓｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８，第８巻、１７３−１７６頁）。分化マーカーとして、又は悪性細胞の潜在的な増殖能力の指示因子としてのＥＧＦ−Ｒを指し示すエストロゲンレセプターの存在との逆相関もまた存在する（Ｐｅｒｅｚ  Ｒ．，Ｐａｓｃｕａｌ  Ｍ．Ｒ．，Ｍａｃｉａｓ  Ａ．，Ｌａｇｅ  Ａ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １９８４，第４巻、１８９−１９３頁）。
【０００９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるエールリッヒ腹水腫瘍モデルにおいて展開された以前の研究（Ｌｏｍｂａｒｄｅｒｏ  Ｊ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  １９８７、第３３巻、４頁）はＥＧＦのインビボ阻害効果を実証し、この分子が生物学的応答の転換因子と考えられることの可能性を示唆した。
【００１０】
免疫効果を伴って、副作用を伴わずにＥＧＦ依存性腫瘍増殖を阻害する、キャリアタンパク質と結合された自系のＥＧＦを含むワクチン組成物が開発された（米国特許第５８９４０１８号：抗腫瘍活性を有する自系上皮増殖因子又はそのフラグメント若しくは誘導体を含むワクチン組成物及び悪性疾患の治療におけるその使用（Ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ，ｔｈｅｒｅｏｆ  ｈａｖｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ））。
【００１１】
以前の研究においては、Ｄｕｎｎｉｎｇ腫瘍は、腹側前立腺と比較して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はそのレセプターについての高レベルのｍＲＮＡを発現することが報告されていた（「去勢の前後での腹側前立腺及びＤｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７  ＰＡＰの腺癌における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びそのレセプターの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７  ＰＡＰ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ）」Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １９８８，第３６巻、第２号、７１−７９頁）。動物モデルにおけるアッセイは、アンドロゲン欠乏が血管退行をもたらし得ること、及びＶＥＧＦがアンドロゲンによって調節され得ることを示した。ヒト前立腺癌において、腺上皮によるＶＥＧＦの構成的産生はアンドロゲン除去治療のために抑制された。ＶＥＧＦの損失は、周囲内皮細胞を剥奪した血管における内皮細胞の選択的アポトーシスをもたらした（Ｌａｕｒａ  Ｅ．ら：「確立されたヒト腫瘍における未成熟血管の選択的除去は、血管内皮増殖因子の除去後に起こる（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｉｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｆｏｌｌｏｗｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９，第１０３巻、第２号、１５９−１６５頁）。
【００１２】
ＶＥＧＦは、内皮細胞の特異的な血管形成性かつ血管性の分裂促進因子であり、病原性の血管新生において役割を果たし、これは、癌及び関節リウマチを含む多数の臨床的病変と関連する。ＶＥＧＦはグリコシル化された、ジスルフィド結合を有するホモダイマーであり、異なるアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６）で発現され、ヒトにおいては１２１−２０６残基を含む（「１．９３Ａ分解能で精緻化された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の結晶構造：複数コピーの柔軟性及びレセプター結合（Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｒｅｆｉｎｅｄ  ｔｏ  １．９３Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｙ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９７，第５巻、第１０号、１３２５−１３３８頁）。
【００１３】
一般論として、腫瘍細胞は、外因性の増殖シグナルに対して劇的に低い依存性を示し、それら自体の増殖シグナルの多くを生成することができる。多くの様式で得られたこのシグナル非依存性は、組織中のいくつかの型の細胞の適切な挙動を確実にするように通常作動している、決定的に重要なホメオスタシスの挙動に損害を与える。
【００１４】
増殖シグナルの自律性に到達するために、細胞は、これらのシグナルの細胞間翻訳因子から作用まで、細胞外増殖シグナルを変化させる機構を作り出した（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｈ．及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｗ．「癌の品質証明（概説）（Ｔｈｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｒｅｖｉｅｗ））」Ｃｅｌｌ  ２０００，第１００巻、５７−７０頁）。増殖因子の大部分が１つの細胞型によって産生されて他の細胞型の増殖を刺激する（異型シグナル伝達のプロセス）のに対して、多くの癌細胞は、正のフィードバック連関を作ることによってそれらが応答する、増殖因子を合成する能力を取っている（自己分泌刺激）。
【００１５】
通常、それらの細胞質ドメインにおいてチロシンキナーゼ活性を有する特定の増殖因子に対するレセプターは、多くの種類の癌細胞において過剰発現され、結果として、それらは通常の濃度の増殖因子に対して過剰な応答を発生する。増殖因子レセプターの過剰発現はまた、リガンド非依存性のシグナル伝達も誘発し得る。リガンド非依存的なシグナル伝達は、同様に、レセプターの構造的変化によって達成され得る（ＥＧＦレセプターは、その細胞質ドメインを喪失し、かつ連続的にシグナル伝達し得る）。
【００１６】
ＳＯＳ−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードは、増殖因子の作用に起因するシグナル伝達において重要な役割を果たす。ヒト腫瘍の２５％はＲａｓタンパク質発現の調節において問題を有しているが、増殖シグナル伝達経路はすべてのヒトの腫瘍において変化している（ほぼ半分のヒト結腸癌腫が変異したｒａｓ癌遺伝子を有し、そして残りが他のシグナル伝達経路成分が欠損していると考えられている）。
【００１７】
線維芽細胞及び内皮細胞のような正常細胞は、腫瘍細胞の増殖において重要な役割を果たし得る。正常組織において、細胞は、それらの隣接する細胞のシグナル（傍分泌）又は全身性シグナル（内分泌）を通して増殖するように促される。それゆえに、腫瘍細胞増殖を説明するために、腫瘍の内部のいくつかの細胞間の従属栄養性シグナル伝達は、上述の自律的機構と同程度に重要であると見なされるべきである。この意味において、血管系によって供給される酸素及び他の栄養は、これらの機能並びに腫瘍細胞の生存のために必須である。
【００１８】
血管形成の持続を誘導する能力は、腫瘍発生の間の別個の段階（又は複数の段階）において、「血管形成スイッチ」を介して、血管静止状態から獲得されるようである。新血管形成は、巨視的腫瘍の形成に関連するクローン性拡大のための必要条件である。
【００１９】
細胞系における増殖因子の分裂促進的効果はＧｎＲＨアナログによって抵抗され得、これは、シグナル伝達分裂促進的経路との相互作用を示す。この仮説は、ＧｎＲＨアゴニストによる卵巣及び子宮内膜からのヒト腫瘍細胞において増殖因子によって誘導されるチロシンキナーゼ活性阻害（これは部分的にはＧｎＲＨ誘導されたホスホチロシンホスファターゼの活性化に起因する）によって実証された。
【００２０】
ＧｎＲＨアナログを用いる治療は、腫瘍細胞膜上の増殖因子レセプター（ＥＧＦ、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１））の劇的な減少、及び腫瘍中のＥＧＦ−ＲのｍＲＮＡレベルの急激な上昇と関連していた。さらに、特定の腫瘍系における抗増殖性活性並びにエストロゲン及びアンドロゲンについてのレセプター発現の変化が報告された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
四半世紀にわたる癌研究の進歩の助けにより、複数の相を有する悪性の劇的なプロセスとしての腫瘍形成を支持する確かな証拠が蓄積されてきた。悪性細胞遺伝子型の広範なカタログは、細胞生理学における本質的な変化を明らかにしている。これらの形質転換は、集合的に、異なる型の腫瘍における悪性増殖に組織を駆動する。従って、なお未解決である癌治療の重要な問題は、受動的な又は受動的な免疫応答の調節を達成することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、以前に記載された問題に対する解決策であり、増殖調節因子（ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ）並びに性ホルモン、及び／又は性ホルモン放出カスケードに関与するホルモン、又は生殖に関与するホルモン（ＧｎＲＨ、ＬＨ、ＦＳＨ）を含む新規な薬学的組成物を使用する。この組合せは、新生物形成の処置に対して有用であり、及び状況に応じて、この組合せの活性成分は同時に、別々に、又は逐次的に適用され得る。
【００２３】
前臨床試験において、上述の増殖因子及びホルモンに対する複合型の免疫応答の生成は、このような因子及びホルモンに対する免疫応答が独立して生成されたときに観察されるものよりもより良好な結果を可能にする。これらの結果は、この見積りが、異なる起源の新生物を有する患者の処置のためのより効果的な方法を構成することの証拠を提供する。なぜなら、腫瘤の減少及び生存時間の増加として表される抗腫瘍応答が促進されるからである。
【００２４】
さらに特定すると、本発明は、同時投与、個別投与、又は逐次的投与のための新生物形成の処置のための薬学的組合せに関し、前記組合せは化合物Ａ及び化合物Ｂを含み、ここで、前記化合物Ａ及び化合物Ｂは、以下からなる分子の群から選択される：
Ａ：ａ．１．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＧｎＲＨ又はそのアナログ、又は抗ＧｎＲＨ抗体、又はＧｎＲＨレセプター（ＧｎＲＨ−Ｒ）、又はその変異改変体、又は誘導ペプチド、又は抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体
ａ．２．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えのゴナドトロピン、又はそれらのアナログ、又はそれらの変異改変体、ヒト化されているか又はされていない、抗ゴナドトロピン抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ａ．３．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ゴナドトロピンレセプター又はそれらの変異改変体、又は誘導ペプチド
ａ．４．ヒト化されているか又はされていない、抗ゴナドトロピンレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
Ｂ：ｂ．１．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えのＥＧＦ、又はその変異改変体若しくは誘導ペプチド、又はＥＧＦ模倣ペプチド、又はＥＧＦアナログ
ｂ．２．ヒト化されているか又はされていない、抗ＥＧＦ抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．３．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、又はその変異改変体若しくは誘導ペプチド
ｂ．４．ヒト化されているか又はされていない、抗ＥＧＦレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．５．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えのＶＥＧＦ、又はその変異改変体若しくは誘導ペプチド、又はＶＥＧＦ模倣ペプチド、又はＶＥＧＦアナログ
ｂ．６．ヒト化されているか又はされていない、抗ＶＥＧＦ抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．７．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、ＶＥＧＦレセプター、又はそれらの変異改変体、又はＶＥＧＦレセプターからの誘導ペプチド
ｂ．８．ヒト化されているか又はされていない、抗ＶＥＧＦレセプター抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント、
ｂ．９．免疫増強キャリアタンパク質に結合されているか又は結合されていない、天然若しくは組換えのＴＧＦ、又はその変異改変体若しくは誘導ペプチド、又はＴＧＦ模倣ペプチド、又はＴＧＦアナログ
ｂ．１０．ヒト化されているか又はされていない、抗ＴＧＦ抗体、それらのＦａｂ、ｓｃＦＶフラグメント
ｂ．１１．ＴＧＦレセプター（ＴＧＦ−Ｒ）、又はその変異改変体若しくは誘導ペプチド。
【００２５】
好ましい製剤において、Ａ又はＢのプール中の分子を含むこの薬学的組合せは、結合体化（コンジュゲーション）又はキメラ分子の形成によって免疫増強キャリアタンパク質に結合される。さらに特定すると、Ａ分子の中で、ＧｎＲＨアナログペプチドが配列ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを有する。
【００２６】
選択された免疫増強キャリアタンパク質の別の発明の実現は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｐ１及びＰ６４外膜タンパク質又は破傷風トキソイド（ＴＴ）Ｔヘルパーエピトープの１つであり得る。
【００２７】
同様に、本発明は、結合体化されたタンパク質又はキメラタンパク質が以下の改変体の１つである薬学的組合せを言う：
（ｂ）キャリアタンパク質及びＥＧＦに結合したＧｎＲＨ
（ｃ）キャリアタンパク質及びＶＥＧＦに結合したＧｎＲＨ
（ｄ）キャリアタンパク質及びＴＧＦに結合したＧｎＲＨ
（ｅ）キャリアタンパク質、ＥＧＦ、及びＴＧＦに結合したＧｎＲＨ
（ｆ）キャリアタンパク質、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦに結合したＧｎＲＨ。
【００２８】
本発明は、組み合わせた免疫応答を生成する方法を提供し、この方法は、同時に、別々に、又は逐次的に適用される、本発明において規定される治療的組合せを用いる処置を含む。
【００２９】
以下の手順を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３０】
組合せ調製物の１つの成分として破傷風トキソイドＴヘルパーエピトープ（Ｄ３−１）に結合された変異型ＧｎＲＨを含む免疫原性調製物の獲得
ＧｎＲＨに対する抗体応答を満たすために、キャリアタンパク質（哺乳動物免疫去勢ワクチン、欧州特許第０９５９０７９号）と結合体化されたＧｎＲＨアナログペプチドを免疫化のために使用する。ＧｎＲＨアナログペプチド（ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）及びキャリアタンパク質（破傷風トキソイドＴヘルパーエピトープ）を、２つのグリシン残基をセパレーターとして使用して、固相方法及びＢｏｃ／Ｂｚｌストラテジーによって、「４−メチル−ベンズヒドリルアミン」（ＭＢＨ  Ａ−０．７５  ｍｍｏｌ／ｇ、ＢＡＣＨＥＭ，Ｓｗｉｓｓ）を使用して化学的に合成した。
【００３１】
ＧｎＲＨに対する体液性応答は、天然のＧｎＲＨ又はキャリアタンパク質に結合されたそのアナログのいずれかを用いる能動免疫を通して得られ得る。さらに、ＧｎＲＨアナログ、アゴニスト、又はアンタゴニストは、腫瘤を減少させる際に相乗効果を有する組合せ調製物においてこのようにして使用され得る。なぜなら、これらは、これらのレセプターが有する細胞中のＧタンパク質を通してのシグナル伝達を遮断又は損なうからである。抗ＧｎＲＨ抗体はまた、受動的免疫応答を生成するために組合せ成分として使用され得る。下垂体性ゴナドトロピン黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は同様に、自己免疫応答を産生する増殖因子と組み合わされた場合に、特定の種類の腫瘍においてある程度の相乗効果を有し得る。
【００３２】
組合せ調製物の１つの成分として、キャリアタンパク質に結合された組換えヒト上記増殖因子（ｈｒＥＧＦ）を含む免疫原性調製物の獲得
ＰＢＳ／ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ中の組換えヒト上皮増殖因子（ｈｒＥＧＦ）の溶液（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｄｉｃａｍｅｎｔ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｃｕｂａ，ＨＥＢＥＲＭＩＮ，Ｎｏ．１２６６）を同じ溶媒中のキャリアタンパク質溶液（組換えＰ６４、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜）と混合し、タンパク質１モルあたり１：５モルのｈｒＥＧＦの比率で、後で、０．０５％のグルタルアルデヒドを、０．０５から０．１％までの最終濃度で加えた。この混合物を１時間から３時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ／ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ中で、少なくとも３回透析溶液を交換して透析した（悪性疾患の治療における抗腫瘍活性を有する自系上皮増殖因子又はそのフラグメント若しくは誘導体を含むワクチン組成物、及びその使用、米国特許第５８９４０１８号）。
【００３３】
ＥＧＦに対する体液性応答はまた、免疫増強キャリアタンパク質に結合された、ＥＧＦ又はそのレセプターのペプチド免疫を介して受動的に、又は抗ＥＧＦ抗体若しくは抗ＥＧＦレセプターの直接的投与を用いて達成され得る。
【００３４】
ＥＧＦは、トランスフォーミング増殖因子、ＴＧＦと、その配列が約３０％共通している。これらは、膜レセプターの同じ結合部位について競合する。さらに、異なる型のヒト腫瘍におけるαＴＧＦ／ＥＧＦレセプター複合体が大量にあることが報告された。それ故に、ＴＧＦに対する体液性応答は、発癌において重要であり、これがＥＧＦについて記載される相乗効果において等しく重要であることが明らかである。
【００３５】
組合せ調製物の１つの成分としてキャリアタンパク質に結合されたヒト血管内皮増殖因子（ｈｖＶＥＧＦ）を含む免疫原性調製物の獲得
ＶＥＧＦに対する体液性応答は、キャリアタンパク質（ＫＬＨ、キーホールリンペットヘモシアニン）に結合体化されたＶＥＧＦペプチド（ｈＶＥＧＦ−ＫＬＨ）を使用する免疫によって達成される。ＫＬＨへのＨＶＥＧＦ１２１アイソフォーム結合体化をカルボジイミドカップリングを用いて作製した。
【００３６】
ＶＥＧＦに対する体液性応答はまた、免疫増強キャリアタンパク質に結合された、ＶＥＧＦ又はそのレセプターを介する免疫を通して受動的に、又は抗ＶＥＧＦレセプターの直接的投与によって達成され得る。
【００３７】
ＧｎＲＨ及びｈｒＥＧＦの組合せ免疫原性調製物の獲得
この組合せ免疫原性調製物は、７５０μｇのＤ３−１及び２５０μｇのｈｒＥＧＦ−Ｐ６４を０．５ｍｌの最終容量で混合することによって達成した。
【００３８】
ＧｎＲＨ及びｈＶＥＧＦの組合せ免疫原性調製物の獲得
この組合せ免疫原性調製物は、７５０μｇのＤ３−１及び１００μｇのｈＶＥＧＦ−ＫＬＨを０．５ｍｌの最終容量で混合することによって達成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明を、以下の実施例を用いて例証する。
【００４０】
１．コペンハーゲンラットにおける腫瘍細胞系Ｒ３３２７−Ｇの移植
腫瘍細胞系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｇを９から１２週齢のコペンハーゲンラット（各約１００ｇ体重）に移植し、これを、移植培地（ＲＰＭＩ  １６４０、無血清、０．５ｍｌ）中、動物あたり２×１０６個の細胞密度で、側腹部の弛緩した領域上で、異なる処置に供した。動物中で１００パーセントの接着効率を９０日後に達成した。
【００４１】
２．異なる処置下で腫瘍系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｇを移植したラットにおける抗腫瘍活性の判断基準としての生存時間の評価
以前に記載したように移植されたコペンハーゲンラットを使用して、１群あたり動物１０匹ずつの８つの群を作り、実験を形成した。
【００４２】
実験群は以下の通りである：
１．プラセボ動物（油性アジュバント中でＰＢＳを用いて免疫）
２．外科的に去勢した動物
３．ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）で処置した動物
４．ペプチドＤ３−１（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）で免疫した動物
５．ｈｒＥＧＦ−Ｐ６４で免疫した動物
６．ｈＶＥＧＦ−ＫＨＬで免疫した動物
７．Ｄ３−１＋ｈｒＥＧＦ−Ｐ６４の組合せ製剤で免疫した動物
８．Ｄ３−１＋ｈＶＥＧＦ−ＫＬＨの組合せ製剤で免疫した動物。
【００４３】
処置のために使用した免疫スキームは７回の投与（移植前の３回の投与及び移植後の４回の投与）を含み、２週間毎に以下を投与した：皮下で、脊椎のいずれかの側の４つの部位への、７５０μｇのＤ３−１、２５０μｇのｈｒＥＧＦ−Ｐ６４、１００μｇのｈＶＥＧＦ−ＫＬＨ、並びに、油性アジュバント（完全フロイントアジュバントを初回免疫において使用し、不完全フロイントアジュバントを追加の刺激において使用した）中での０．５ｍｌ容量でのＤ３−１＋ｈｒＥＧＦ−Ｐ６４の組合せ及びＤ３−１＋ｈＶＥＧＦ−ＫＬＨの組合せ。組合せ処置では、個別の処置に使用したものと同じ抗原投量を維持した。
【００４４】
ＤＥＳ処置は１ｍｌ／ｋｇ／日の割合で１週間に３回、実験が続く限り断続的に行い、細胞を接種した後で開始した。
【００４５】
免疫を腫瘍移植手順の３０から４５日前に開始し、７回の免疫が完了するまで続けた。従って、抗体力価として表されるＥＬＩＳＡアッセイにおける体液性応答は、細胞移植の前には各抗原についてカットオフ値より上であった。
【００４６】
治療効果の評価は、実験期間の間（１３ヶ月）１週間に１回行った。効果を各実験群における動物の生存時間として評価した、データを図１に示す。
【００４７】
３．異なる処置下で腫瘍細胞系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｇを移植したラットにおける抗腫瘍活性の判断基準としての腫瘍減少の評価
上記のようにコペンハーゲンラットを使用して、１群あたり動物１０匹の８つの群を作り、実験を形成した。
【００４８】
実験群は以下の通りである：
１．プラセボ動物（油性アジュバント中でＰＢＳを用いて免疫）
２．外科的に去勢した動物
３．ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）で処置した動物
４．ペプチドＤ３−１（ＧｎＲＨｍ１−ＴＴ）で免疫した動物
５．ｈｒＥＧＦ−Ｐ６４で免疫した動物
６．ｈＶＥＧＦ−ＫＨＬで免疫した動物
７．Ｄ３−１＋ｈｒＥＧＦ−Ｐ６４の組合せ製剤で免疫した動物
８．Ｄ３−１＋ｈＶＥＧＦ−ＫＬＨの組合せ製剤で免疫した動物。
【００４９】
以前と同様に、処置のために使用した免疫スキームは７回の投与（移植前の３回の投与及び移植後の４回の投与）を含み、２週間毎に以下を投与した：皮下で、脊椎のいずれかの側の４つの部位への、７５０μｇのＤ３−１、２５０μｇのｈｒＥＧＦ−Ｐ６４、１００μｇのｈＶＥＧＦ−ＫＬＨ、並びに、油性アジュバント（初回免疫における完全フロイントアジュバント、及びさらなる刺激における不完全フロイントアジュバント）中での０．５ｍｌ容量でのそれらの組合せ。
【００５０】
ＤＥＳ処置は１ｍｌ／ｋｇ／日の割合で１週間に３回、実験が続く限り断続的に行い、細胞を接種した後で開始した。
【００５１】
実験の評価を屠殺後（腫瘍系移植３ヶ月後）に行った。各処置の効果を評価するために、腫瘍を乾燥し、実験用天秤で秤量した。処置効果（Ｅ処置）を、１マイナス、処置動物における平均腫瘍重量（Ｐ処置）とプラセボ動物におけるの腫瘍平均重量（Ｐプラセボ）の比と見なした：
（Ｅ処置）＝１−（Ｐ処置／Ｐプラセボ）。    （１）
【００５２】
二重組合せ製剤の場合における予測された効果（Ｅ理論上）は、いずれの効果も相互に除外し合わない場合、以下に従って計算され得る（Ｃａｒｉｄａｄ  Ｗ．，Ｇｕｅｒｒａ  Ｂｕｓｔｉｌｌｏ，Ｅｒｎｅｓｔｏ  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  Ａｃｕｎａ，Ｒｏｌａｎｄｏ  Ｂａｒｒｅｒａ  Ｍｏｒｅｒａ，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｅｇａｎａ  Ｍｏｒａｌｅｓ．「Ｅｓｔａｄｉｓｔｉｃａ」、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｐｕｅｂｌｏ  ｙ  Ｅｄｕｃａｃｉｏｎ，１９８９）：
（Ｅ理論上）＝ＥＴ１＋ＥＴ２−（ＥＴ１×ＥＴ２）。    （２）
ここでＥＴ１は処置１効果であり、ＥＴ２は処置２効果である。
【００５３】
表１に示されるように、組合せ（組み合わせた調製物）について達成された実験効果は予測された理論的効果よりも高く、従って、腫瘍サイズを減少させる際にこれらの組合せの相乗効果が得られる。
【００５４】
表１  屠殺の時点（腫瘍系移植３ヶ月後）での腫瘍細胞系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｇを移植したコペンハーゲンラットに対する異なる処置の効果
【表１】
2006514036.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】異なる処置に供した、腫瘍系Ｄｕｎｎｉｎｇ  Ｒ３３２７−Ｇを移植したコペンハーゲンラットの生存時間評価を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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