(57)【要約】本発明は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤を提供する。また、本発明は、シノビオリンに候補物質を接触させて候補物質がシノビオリンの自己ユビキチン化を阻害するか否かを評価し、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害した候補物質を増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤として選択することを特徴とする、前記治療剤のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤。
【請求項２】
シノビオリンの自己ユビキチン化がシノビオリン同士の相互作用により生じるものである、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
シノビオリン同士の相互作用が、シノビオリン膜貫通タンパク質のホモ４量体の形成である、請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
シノビオリンの自己ユビキチン化の阻害は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質が、シオビオリンのＲＩＮＧドメインに結合することにより生じるものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項５】
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質が、変異型シノビオリン及び／又は大腸菌由来タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項６】
増殖性疾患が関節症、関節リウマチ、線維症、動脈硬化及び癌からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項７】
神経系疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項８】
アレルギー性疾患が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、ダニアレルギー疾患、花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項９】
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を患者に投与することにより、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つを治療及び／又は予防する方法。
【請求項１０】
増殖性疾患が関節症、関節リウマチ、線維症、及び動脈硬化及び癌からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
神経系疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項９記載の治療剤。
【請求項１２】
アレルギー性疾患が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、ダニアレルギー疾患、花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項９記載の方法。
【請求項１３】
シノビオリンに候補物質を接触させて候補物質がシノビオリンの自己ユビキチン化を阻害するか否かを評価し、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害した候補物質を増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤として選択することを特徴とする、前記治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤のスクリーニング方法に関する。また、本発明はシノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下ＲＡともいう）における滑膜の異常増殖は、関節破壊の中心的な役割を果たしているため、その自立的な増殖のメカニズムを解明することは、ＲＡの根本的治療に重要であると考えられる。そこで発明者らは、そのメカニズムを解明することを目的として、抗滑膜細胞抗体を作製し、ヒト滑膜細胞ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングを行った。その結果、小胞体上でタンパク質の品質管理に関連するＲＩＮＧ−Ｈ２型Ｅ３ユビキチンリガーゼである「シノビオリン」のクローニングに成功した（ＷＯ０２／０５２００７）。
シノビオリンを過剰発現させたマウスは、その約３０％に滑膜細胞の増殖を伴う関節症を自然発症した。それに対して、シノビオリンのヘテロＫＯマウスは、２型コラーゲン誘導関節炎に対して抵抗性を示し、これが滑膜細胞のアポトーシス亢進に起因していることが示された。これらのことから、発明者らは、滑膜細胞の異常増殖が、シノビオリンに依存した小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）の機能亢進に由来し、その結果として関節炎に至るというモデルを提唱した。実際、シオビオリンがＥ３ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。しかし、自己ユビキチン化とシノビオリンとの関係は不明な点も多かった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤を提供する。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリン同士の直接的な相互作用であるホモ４量体が形成されることにより、シノビオリンのユビキチン化が起こることが確認され、シノビオリンの酵素活性（自己ユビキチン化活性及び基質ユビキチン化活性）を阻害することが、増殖性疾患の治療に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤。
シノビオリンの自己ユビキチン化は、例えばシノビオリン同士の相互作用により生じるものを例示することができる。さらに、シノビオリン同士の相互作用としては、シノビオリン膜貫通タンパク質のホモ４量体の形成が挙げられる。ここで、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質は、シノビオリンのＲＩＮＧドメインに結合することにより生じるものであってもよい。シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質としては、変異型シノビオリン及び／又は大腸菌由来タンパク質などが挙げられる。また、増殖性疾患としては、関節症、関節リウマチ、線維症、動脈硬化及び癌からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。神経系疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。アレルギー性疾患としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、ダニアレルギー疾患、花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
（２）シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を患者に投与することにより、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つを治療及び予防する方法。
ここで、増殖性疾患としては、関節症、関節リウマチ、線維症、動脈硬化及び癌からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。神経系疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。アレルギー性疾患としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、ダニアレルギー疾患、花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
（３）シノビオリンに候補物質を接触させて候補物質がシノビオリンの自己ユビキチン化を阻害するか否かを評価し、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害した候補物質を増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤として選択することを特徴とする、前記治療剤のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、野生型及びＣ３０７Ｓ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ染色した図である。
図２は、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ野生型あるいはＣ３０７Ｓ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）をＭＢＰあるいはＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓと組み合わせて、ＧＳＨセファロース樹脂を用いたプルダウンアッセイを行ったことを示す図である。
図３は、トロンビン処理で得たＳｙｎｏ  ΔＴＭ野生型のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム画分を、ウェスタンブロット法及び銀染色法を用いて解析した図である。
図４は、グルタルアルデヒドを用いた架橋反応によるＳｙｎｏ  ΔＴＭオリゴマーの検出を行ったことを示す図である。
図５は、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭとのインビトロ結合活性に必要なアミノ酸領域の決定に用いた欠失変異体を示す図である。
図６は、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭとのインビトロ結合活性に必要なアミノ酸領域の決定を行ったことを示す図である。
図７は、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭとのインビトロ結合活性におけるＥＤＴＡの影響を調べた図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤（以下、増殖性疾患等の治療剤と記載する場合もある。）に関する。また、本発明は、増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤のスクリーニング方法に関する。以下に、本発明を詳細に説明する。
＜シノビオリンの自己ユビキチン化：ホモ４量体形成＞
本発明の増殖性疾患等の治療剤は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することを特徴とする。
シノビオリンとは、ＲＡ患者の滑膜組織で発現しているタンパク質であり、ＲＡ疾患の主因である滑膜組織の異常増殖に密接に関連している。また、シノビオリンは、タンパク質構造予測システムから、自己ユビキチン化活性があるＲＩＮＧフィンガーモチーフを有するＥ３ユビキチンライゲースをコードすることが分かっている。シノビオリンをコードする塩基配列を配列番号１で示し、シノビオリンを構成するアミノ酸配列を配列番号２で示した。
「ユビキチン化」とは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）及びユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同して、基質となるタンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程を意味する。このユビキチン化の生理的意義は、従来、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として認識されていた。そして、その後の研究により、現時点でのユビキチン化の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられている。
本明細書において「自己ユビキチン化」とは、シノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することにより、シノビオリン自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼによることなく自らユビキチンを結合させることを意味する。また、シノビオリンの自己ユビキチン化は、内在性のシノビオリンの完全長の分子で観察されるだけでなく、シノビオリンの細胞内部分のみとタグタンパク質の融合したシノビオリンにおいても生起される。
このように、シノビオリンは、その基質タンパク質に対してユビキチンを付加する反応を触媒する酵素であり、シノビオリンのユビキチン化反応には、ＲＩＮＧドメインにおける、シノビオリン同士の直接的な相互作用が重要である。以下に、組換えシノビオリン同士の相互作用の生化学的な解析による、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を分子レベルで説明する。
シノビオリンと変異型シノビオリン又は大腸菌由来タンパク質などの夾雑タンパク質との間に、相互作用が存在し、それには、ＲＩＮＧドメインが関与する。このことを確認するためには、以下の方法を用いることができる。すなわち、Ｎ末端にＧＳＴタグ、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されたシノビオリンの膜貫通ドメイン欠失領域（Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ）野生型（ｗｔ）、及びＲＩＮＧドメインに変異を有する変異体、例えばシノビオリンのアミノ酸配列において第３０７番目のシステインがセリンに変異した変異体（Ｃ３０７Ｓ変異体）をそれぞれ作製する。
これらについて、ＧＳＨレジンによる精製後にＮｉ−ＮＴＡレジンによる精製を行い、精製度の変化を観察すればよい。
この方法によれば、野生型について、ＧＳＨレジンによる精製後にＮｉ−ＮＴＡレジンによる精製を行っても、精製度の変化は認められないにも関わらず、Ｃ３０７Ｓ変異体は、大きな精製度の上昇が認められる。
また、上記のとおりシノビオリンのユビキチン化反応は、以下のように確認することもできる。
すなわち、亜鉛イオンの配位を除去してＲＩＮＧドメインの機能を阻害したときに、シノビオリン同士で相互作用が起こるか否かを検出すればよい。亜鉛イオンを除去するには、ＥＤＴＡ等のキレート剤を用いることができる。このようなキレート剤存在下でプルダウンアッセイを行うことにより、そのアッセイ結果からシノビオリン同士の相互作用の有無を観察することができる。
ここで、シノビオリンと、変異型シノビオリン又は大腸菌由来タンパク質との相互作用は、ユビキチン化活性に影響を与える。つまり、自己ユビキチン化が阻害されることになる。
このことを確認するためには、それらの精製画分の自己ユビキチン化活性を比較すればよい。この方法によれば、野生型については大きな変化は見られないが、Ｃ３０７Ｓ変異体については、ＧＳＨ精製画分に自己ユビキチン化活性が検出されなかったにも関わらず、ＧＳＨ／Ｎｉ精製画分は弱いながらも活性が検出される。ＧＳＨ／Ｎｉ精製画分に活性が検出されることは、ＧＳＨ精製画分に共存していたシノビオリンの分解産物あるいは大腸菌由来たんぱく質がＣ３０７Ｓ変異体と相互作用し、自己ユビキチン化を阻害することを意味する。
さらに、シノビオリン同士の直接的な結合をＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓとのプルダウンアッセイにより解析することもできる。「ＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓ」とは、Ｎ末にＭＢＰタグ、Ｃ末にＨｉｓタグが付加されたシノビオリンの膜貫通ドメイン欠失領域（Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ）を意味する。野生型については、両画分により同程度のＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓの沈降がみられる。一方、Ｃ３０７Ｓ変異体については、ＧＳＨ精製画分ではほとんどＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓの沈降が検出されないにも関わらず、ＧＳＨ／Ｎｉ精製画分を用いた場合は、わずかに沈降が認められる。このことは、Ｃ３０７Ｓ変異によりシノビオリン同士の相互作用が弱まり、夾雑タンパク質との弱い相互作用の影響がユビキチン化反応に阻害的に働いていること、また、夾雑タンパク質が除かれることにより不完全ではあるがシノビオリン同士の相互作用が復帰し、反応に適した構造をとることを示すものである。
さらに、シノビオリンはホモ４量体を形成している。このことを確認するためには、Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ野生型をゲルろ過カラムで分画し、その分子量を測定すればよい。Ｓｙｎｏ  ΔＴＭの計算上の分子量は約４０，３００であるので、Ｓｙｎｏ  ΔＴＭが約１８０ｋＤａの位置に溶出すれば、Ｓｙｎｏ  ΔＴＭは、ホモ４量体を形成しているといえる。
以上の解析手法は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質をスクリーニングするために採用することができる。
例えば、シノビオリンに候補物質を接触させて、当該候補物質がシノビオリンの自己ユビキチン化を阻害するか否かを評価する。シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害した候補物質は、増殖性疾患等の治療剤として選択することができる。上記Ｃ３０７Ｓ変異体、あるいは後述する大腸菌由来タンパク質などは、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質として選択される。また、シノビオリンを分泌する細胞に候補物質を接触させて自己ユビキチン化を測定することもできる。自己ユビキチン化が起こったか否かを確認する方法としては、シノビオリン同士の相互作用を測定することが挙げられる。シノビオリン同士の相互作用を測定する方法として、シノビオリンの４量体形成を確認する方法が挙げられる。４量体形成は、上記のように、分子量を測定することにより確認できる。例えば、シノビオリンタンパク質をゲルろ過カラムで分画し、その分子量を測定すればよい。また、異なるタグをつけたシノビオリンを調製して細胞内で発現させて、タグの存在を確認することによっても、シノビオリンの相互作用を測定することもできる。この場合、１つのタンパク質から複数のタグの存在が見出された場合に、シノビオリンの相互作用が起こったといえる。
＜シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質＞
上記のように、シノビオリンの自己ユビキチン化のメカニズムの特徴としては、シノビオリンがホモ４量体を形成することである。従って、このシノビオリンのホモ４量体の形成を阻害することにより、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる。
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する候補物質としては、特に限定されるものではなく、天然又は人工的に合成されたペプチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ等）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。
上記したように、シノビオリンと相互作用しうる変異型シノビオリンあるいは大腸菌由来タンパク質などの夾雑タンパク質は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する物質として選択される。
ここで、夾雑タンパク質とは、完全長シノビオリンあるいは完全長のシノビオリン細胞質領域以外のタンパク質をいう。
変異型シノビオリンとは、完全長シノビオリンのタンパク質分解酵素による分解産物あるいはシノビオリンタンパク質合成途上で生じるＣ末端欠損ペプチドをいう。例えば、シノビオリンのアミノ酸配列（配列番号２）において第３３９〜第６１７番目のアミノ酸残基が欠失したペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
大腸菌由来タンパク質とは、シノビオリンタンパク質以外のタンパク質であって、シノビオリンに相互作用することで共に精製されてくる大腸菌のタンパク質をいう。
＜増殖性疾患等の治療剤＞
シノビオリンのユビキチン化反応には、シノビオリン同士の直接的な相互作用が重要であるため、その直接的な相互作用を阻害する薬剤である本発明の薬剤は、シノビオリン酵素活性阻害に基づいた増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤として有用である。
（１）増殖性疾患とは、上記のように細胞の異常増殖が原因で発症する疾患をいい、例えば、関節リウマチ、線維症、動脈硬化又は癌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
関節症とは、関節を侵す疾患であり、糖尿病に見られる神経障害性関節症である糖尿病性関節症、ジャクー関節症、変形性関節症、脊髄ろう性関節症などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＡは、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の炎症性疾患である。滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）は、関節の滑膜で１〜６層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞であり、滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。ＲＡ患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。しかしながら、細胞の増殖性疾患のひとつとして考えられているＲＡの病因は、未解明のままである。また、現在、市販されているＲＡ治療薬のうち、ステロイド薬、非ステロイド薬は、いずれも効果は一時的で関節の痛みや腫れは抑えられても、ＲＡ自体が治癒することはまれである。また、抗リウマチ薬は、ＲＡを劇的に改善するものの、副作用に留意して使用する必要がある。本発明の増殖性疾患等の治療剤は、細胞の増殖の抑制をも特徴とするものであり、不完全長のシノビオリン等を有効成分とするため、副作用がなく、ＲＡ治療薬として好ましい。
線維症とは、器官や組織の正常な成分である線維組織の形成とは対照的に、修復又は反応過程として線維組織が形成される疾患をいい、先天性線維症、嚢胞性線維症、心内膜線維症、間質性線維症、肺線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織増殖症、口腔粘膜下線維症、中心静脈周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成、後腹膜線維症、外膜下線維症、シンマーズ線維症、アフリカ心内膜線維症などが挙げられるが、これらに限定されない。
動脈硬化とは、動脈が固くなる現象をいい、アテローム性動脈硬化症、ｍ▲ｏ▼ｎｃｋｅｂｅｒｇ動脈硬化症、細動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。
癌とは、様々な悪性新生物の総称であり、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）、などが挙げられるが、これらに限定されない。。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
癌抑制遺伝子として、ｐ５３が知られている。正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内のｐ５３が活性化して、その結果細胞増殖が阻止されることから、ｐ５３の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。事実、ｐ５３は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこのｐ５３の欠損変異が起こっている。また、このような変異が起こっていない場合でも、ｐ５３の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。したがって、癌の進行を抑えるにはｐ５３を有効に機能させることが必要である。発明者らは以前、シノビオリンホモノックアウト動物を作製し、シノビオリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与しているｐ５３の活性化が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につながることを見出した。本発明の増殖性疾患等の治療剤は、自己ユビキチン化を阻害することにより、シノビオリンの機能を阻害し、ｐ５３の活性化を促進させることができるため、抗癌剤としても有用である。
（２）  神経系疾患は、神経の障害、外傷に起因する疾患であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害及び脊髄損傷などが挙げられるが、これらに限定されない。
シノビオリンは、小胞体ストレスによって発現が誘導されるＨｅｒｐ（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  １）とよばれるタンパク質と相互作用を有することが知られている（Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｎｏｖ  ２２；２７１（４７）：２９６５９−２９６６５）。Ｈｅｒｐは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の原因遺伝子とされているプレセニリン（ＰＳ）と相互作用をもちβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）の膜内切断に関わるタンパク質分解酵素であるγ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の活性を上昇させる（Ｓａｉ  Ｘ，Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｙ，Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ｋａｗａｉｃｈｉ  Ｍ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  ＢＤ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｋ，Ｋｏｍａｎｏ  Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１５）：１２９１５−１２９２０）。ところで、セクレターゼの酵素活性を阻害する物質は、アルツハイマー病等の神経系疾患の治療薬として注目され、世界中でスクリーニングが行われている。従って、シノビオリンの相互作用を阻害するような物質は、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進するため、アルツハイマー病等の神経系疾患の治療剤として、好ましい。
（３）アレルギー性疾患は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、ダニアレルギー疾患、花粉症及び食物アレルギー疾患などが挙げられるがこれらに限定されない。本発明者らは、以前シノビオリンヘテロノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してＩＬ−４及びＩｇＥの産生が抑制されることを見出した。すなわち、シノビオリンの機能を阻害すると、アレルギー性疾患に深く関与しているＩＬ−４及びＩｇＥの産生が抑制され、シノビオリンの機能阻害がアレルギー性疾患治療につながることを見出した。従って、シノビオリンの相互作用を阻害するような物質はアレルギー性疾患の治療剤として好ましい。
（４）本発明の増殖性疾患等の治療剤を使用する場合は、適用部位は特に限定されず、血管、関節、皮膚、目、鼻、腫瘍等を対象として適用される。また、本発明において、上記疾患の種類は１種類に限定されるものではなく、複数種の疾患が併発したものでも、適用の対象となる。
本発明の増殖性疾患等の治療剤は、異常な細胞の増殖を抑制する必要がある哺乳動物にも投与することができる。投与の対象となる哺乳動物としては、例えばヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
本発明の増殖性疾患等の治療剤の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤もしくはシロップ剤等による投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤、座剤もしくは点眼剤等、経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。
賦形剤としては、例えば、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェエノール類が挙げられ、さらに、チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
上記添加物等は、本発明の増殖性疾患等の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された本発明の有効成分を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の増殖性疾患等の治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０μｇである。但し、上記増殖性疾患等の治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の増殖性疾患等の治療剤の効果は、以下のように試験を行い、検討することができる。
培養細胞に種々の濃度の本発明の増殖性疾患等の治療剤を添加する。一定時間培養後、細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてタンパク分離後、ウエスタンブロッティングによりシノビオリンのポリマー形成阻害を観察することができる。培養細胞は滑膜細胞、ガン細胞など適宜選択することができる。
このように、シノビオリン同士の直接的な結合である、ＲＩＮＧドメインにおけるホモ４量体の形成を阻害することにより、シノビオリンの自己ユビキチン化が阻害されシノビオリンの発現が阻害される。シノビオリンの発現が抑制されると、細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスが亢進することが知られている。したがって、本発明は、シノビオリンのホモ４量体形成を制御することにより、神経細胞を保護することを目的とした薬剤としても有用でありうる。具体的には、神経系疾患である、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、末梢神経障害、脊髄損傷などの治療に有用である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓ野生型及びＣ３０７Ｓ変異体の自己ユビキチン化活性
本実施例は、大腸菌を用いたタンパク質発現系により発現したＧＳＴ−シノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓ野生型，Ｃ３０７Ｓ及びＫ３０３Ｒ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）について、それらのインビトロ自己ユビキチン化活性及びＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓとの直接結合をプルダウンアッセイにより検出することを目的とする。
（１）野生型及びＣ３０７Ｓ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ染色した（図１Ａ）。得られた野生型（ｗｔ）及びＣ３０７Ｓ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）の量を変化させて（２５、５０ｎｇ）インビトロユビキチン化反応系に添加し、インビトロユビキチン化反応を行った。反応後、タンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写して抗ＨＡ抗体により膜上のユビキチン化タンパク質を検出した（図１Ｂ）。
その結果、野生型のＧＳＨ精製画分及びＧＳＨ／Ｎｉ精製画分は両者とも同等の自己ユビキチン化活性を示した。一方、Ｃ３０７Ｓ変異体の場合は、ＧＳＨ精製画分は自己ユビキチン化活性を示さなかったにも関わらず、ＧＳＨ／Ｎｉ精製画分は弱いながらも自己ユビキチン化活性を示した（図１Ｂ）。
これらの結果は、シノビオリンの自己ユビキチン化にはＲＩＮＧドメインが関与することを意味する。
（２）ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ野生型あるいはＣ３０７Ｓ変異体のＧＳＨ−セファロース樹脂精製画分（ＧＳＨ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂精製画分（ＧＳＨ／Ｎｉ）（各１μｇ）をＭＢＰあるいはＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓ（１μｇ）と組み合わせて、ＧＳＨセファロース樹脂を用いたプルダウンアッセイを行った。反応後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写してＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色した（図２）。
その結果、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓ野生型のＧＳＨ精製画分あるいはＧＳＨ／Ｎｉ精製画分とＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓを組み合わせた場合にＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓの沈降が認められた。一方、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓ  Ｃ３０７Ｓ変異体については、ＧＳＨ精製画分を用いた場合に沈降が認められなかったにも関わらず、ＧＳＨ／Ｎｉ精製画分を用いた場合に弱いながらもＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓの沈降が認められた（図２）。
これらの結果は、Ｃ３０７Ｓ変異によりシノビオリン同士の相互作用が弱まり、夾雑タンパク質との弱い相互作用の影響がユビキチン化反応に阻害的に働いていること、また、夾雑タンパク質が除かれることにより不完全ではあるがシノビオリン同士の相互作用が復帰し、反応に適した構造をとることを意味する。
【実施例２】
【０００７】
Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ野生型の分子量の推定
本実施例は、シノビオリンΔＴＭ野生型の分子量を、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより推定し、それらの溶液中における存在状態についての解析を行うことを目的とする。
ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ野生型（ｗｔ）、Ｃ３０７Ｓ及びＫ３０３Ｒ変異体（Ｃ３０７Ｓ、Ｋ３０３Ｒ）をＧＳＨセファロース樹脂に吸着、洗浄後、トロンビンを添加した。反応後、得られた反応液（各０．１３ｍｇ／ｍｌ，７５μｌ，１０μｇ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ（ｂｅｄ  ｖｏｌ．２４ｍｌ）カラムにかけ、カラム用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ−４０）を用いて分画した（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ，０．５ｍｌ）。得られた画分中に含まれるタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写して抗Ｓｙｎｏ  １０Ｄａ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した（図３Ａ）。また、それらの精製画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色法により染色した（図３Ｂ）。
その結果、いずれの場合も１８０ｋＤａの溶出位置である２５番目の画分をピークとして溶出が認められた（図３Ａ、３Ｂ）。
これらの結果は、シノビオリンはホモ４量体を形成していることを意味する。
【実施例３】
【０００８】
グルタルアルデヒドを用いた架橋反応によるＳｙｎｏ  ΔＴＭオリゴマーの検出
本実施例は、グルタルアルデヒドを用いた架橋反応によるシノビオリンのオリゴマー形成について検討し、シノビオリンΔＴＭ同士の分子間相互作用の解析を目的とする。
ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭをトロンビン処理して得られたＳｙｎｏ  ΔＴＭ領域を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いて精製した。精製画分を終濃度０．１％となるようにＮＰ−４０を添加したＰＢＳ１Ｌを用いて透析後、１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離し、得られた上清を試料とした。試料１０μｌにグルタルアルデヒドを添加し（各終濃度０．０１、０．０２及び０．０４％）、２５℃で反応時間（０．５、１及び２時間）を変化させて反応させた。この場合の反応液量は１２．５μｌである。反応後、タンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓｙｎｏ  １０Ｄａ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した（図４）。
その結果、いずれのグルタルアルデヒド濃度、反応時間においても約１３０ｋＤａの位置にシグナルが検出された。また、グルタルアルデヒド濃度が０．０２及び０．０４％の場合には、さらに２５０ｋＤａ以上の泳動位置にシグナルが検出された（図４）。これにより、１３０ｋＤａ及び２５０ｋＤａのシグナルから、グルタルアルデヒドによりそれぞれＳｙｎｏ  ΔＴＭの二量体及び四量体が形成されたことが示された。
【実施例４】
【０００９】
ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓとのインビトロ結合活性に必要なアミノ酸領域の決定
プルダウンアッセイで検出されるＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓとのインビトロ結合活性に必要なアミノ酸領域を決定し、その相互作用様式及び意義を解明することを目的とする。
（１）ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ（２３６−６１７）−Ｈｉｓ及びその欠失変異体（２３６−３３８、３３９−４７８、４７９−６１７、ｄＰｒｏ）（図５）を各１００ｎｇずつ用いて、ＧＳＨセファロース樹脂によるプルダウンアッセイを行った。反応後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後してＰＶＤＦ膜上に転写し、抗ＭＢＰ抗体（図６Ａ）及びＣＢＢ染色（図６Ｂ）を行って検出した。
（２）ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓとのインビトロ結合活性におけるＥＤＴＡの影響を検討するため、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓのプルダウンアッセイ系に濃度を変化させたＥＤＴＡ（各３０、１００、３００、１０００、３０００μＭ）を添加した。反応後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＰＶＤＦ膜上に転写し、抗ＭＢＰ抗体（図７Ａ）及びＣＢＢ染色（図７Ｂ）を行って検出した。
その結果、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ（２３６−６１７）−Ｈｉｓ及びＲＩＮＧドメインを含むＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ（２３６−３３８）−Ｈｉｓを用いた場合にシグナルが検出された（図６）。プルダウンアッセイで検出されるＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓとの相互作用は、３０μＭのＥＤＴＡの存在により阻害された。このことからＲＩＮＧドメインに配位される亜鉛イオンが相互作用に重要であることが示された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
シノビオリンのユビキチン化反応には、シノビオリン同士の直接的な相互作用が重要である。本発明の増殖性疾患、神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの治療剤は、このシノビオリン同士の直接的な相互作用を阻害する薬剤であるため、シノビオリンの酵素活性阻害に基づいたＲＡ治療薬として有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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