(57)【要約】  精製工程において、四級アンモニウム塩による処理、有機溶媒（アルコール等）による処理を経ることなく、生体組織をタンパク質分解酵素処理と分子量分画処理し、濃縮又は凍結乾燥することにより精製されたヒアルロン酸組成物、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼ活性に耐性を有するヒアルロン酸組成物、当該組成物を有効成分とするグリコサミノグリカン分解抑制剤、前記組成物を含む医薬、食品、化粧品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（３）の工程により得られるヒアルロン酸組成物。
（１）生体組織をタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を分解する工程；
（２）（１）によって得た分解産物を分子量で分画して画分を得る工程；
（３）（２）によって得た画分からヒアルロン酸組成物を回収する工程。
【請求項２】
下記の性質を有するヒアルロン酸組成物。
(a)標準条件下で、ウシ精巣由来又はヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼと共存させた後、５分間煮沸処理し、遠心分離した上清をキャピラリー電気泳動で二糖分析すると、分解が認められない；
(b)ローリー法で分析すると、タンパク質含量が0.1%未満；
(c)日本薬局方記載の重金属試験法による重金属測定で、重金属含量が20ppm以下；
(d)日本薬局方記載の砒素試験法による砒素測定で、砒素含量が2ppm以下。
【請求項３】
下記の（１）〜（３）の工程を含むヒアルロン酸組成物の製造方法。
（１）生体組織をタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を分解する工程；
（２）（１）によって得た分解産物を分子量で分画して画分を得る工程；
（３）（２）によって得た画分からヒアルロン酸組成物を回収する工程。
【請求項４】
ヒアルロン酸組成物を有効成分とする、グリコサミノグリカン分解抑制剤。
【請求項５】
ヒアルロン酸組成物のグリコサミノグリカン分解抑制剤としての使用。
【請求項６】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸組成物を含む医薬。
【請求項７】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸組成物を含む食品。
【請求項８】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸組成物を含む化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品及び化粧品への適用がなされているヒアルロン酸において、ヒアルロニダーゼに対する耐性（酵素分解性）が高いヒアルロン酸組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにＤ−グルクロン酸β−１，３結合した二糖がβ−１，４結合で連続して結合したムコ多糖類の一種である。ヒアルロン酸は関節、硝子体、臍帯、軟骨、皮膚、気管、鳥類の鶏冠などの結合組織中にその構成成分として存在し、組織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調節などに重要な機能を果たしている。また、ヒアルロン酸は非常に大きい高分子物質であり、その溶液は強い粘弾性を持ち、保水作用を有するところから、化粧品、創傷治療剤、眼薬、関節炎治療薬等広い用途がある。【０００３】
ヒアルロン酸は、分子量について多分散性であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場合であっても優れた生体適合性を示すことが知られている。しかし、ヒアルロン酸は酵素による分解を受けやすいため、生体内に留置しても早期に消失してしまうという問題があり、かかる問題を解決するために化学修飾、化学架橋等の手法により調製した修飾ヒアルロン酸として酵素耐性を付与する技術が検討されてきた（特許文献１〜１０）。【０００４】
しかしながら生体内での生物安定性の改善された修飾ヒアルロン酸は、化学的反応性物質を用いるため、新たな修飾による毒性・生体不適合性等の危険性を本質的に抱え込まざるを得ないという課題が残っていた。【０００５】
一方、ヒアルロン酸の製造における一般的な精製法としては、動物組織抽出又は発酵法とも次のような工程が例示される。
（１）結合組織あるいは培地を含んでいる粗精製物にエタノールのような有機溶媒を加え、更に有機溶媒を使用して沈降物を収集し完全に洗浄する。
（２）ヒアルロン酸ナトリウム沈降物を塩化ナトリウム水溶液に再溶解させ、活性炭を加える。
（３）得られた懸濁液はケイソウ土濾過助剤を使用して濾過し、活性炭、微生物及び他の不溶性物質を除去する。
（４）清澄な濾液を塩化セチルピリジニウムで処理し、不溶性のヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成する。
（５）セチルピリジニウム塩を収集し、エタノールを含有する塩化ナトリウム水溶液に溶解させ、例えばエタノールのような有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収する。
（５）再度、ヒアルロン酸ナトリウムを塩化ナトリウム水溶液に再溶解させる。
（６）塩化セチルピリジニウムを添加して再びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成する。
（７）エタノールを含む塩化ナトリウム水溶液にヒアルロン酸塩を溶解させ、有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収する。
（８）塩化ナトリウム水溶液中に沈降物を溶解させ、得られた溶液を例えばフロリジルのようなケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させて不純物及び残留セチルピリジニウムイオンを除去する。
（９）溶液を濾過滅菌し、無菌エタノールのような無菌有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを沈降し取得する。【０００６】
しかし、このような第四級アンモニウム塩と有機溶媒による精製方法は煩雑であり、また、第四級アンモニウム塩や有機溶媒の残留を防ぐための操作も必要とされていた。【０００７】
【特許文献１】特開平３−１０５００３号公報
【特許文献２】欧州公開０３４１７４５号公報
【特許文献３】米国特許４,５８２,８６５号公報
【特許文献４】特公平６−３７５７５号公報
【特許文献５】特開平７−９７４０１号公報
【特許文献６】特開昭６０−１３０６０１号公報
【特許文献７】特開平６−７３１０３号公報
【特許文献８】特開平５−５８８８１号公報
【特許文献９】欧州公開０２１６４５３号公報
【特許文献１０】国際公開ＷＯ９５／２５７５１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒアルロン酸を医薬品や化粧品などとして利用する際に、化学的架橋や化学的修飾を行うと、哺乳類由来ヒアルロニダーゼ等の分解酵素に対する安定性は増すが、生体への影響を無視することはできなかった。従って、このような構造改変を行うことなく、しかもヒアルロン酸分解酵素に対して安定性が高いヒアルロン酸組成物が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を達成するべく、ヒアルロン酸自体の酵素安定性について鋭意検討してきた。その結果、ヒアルロン酸の製造工程の違いにより生物安定性（酵素に対する耐性）の異なるヒアルロン酸組成物が得られるという知見を得た。
すなわち、哺乳類由来のヒアルロニダーゼによる加水分解への抵抗性を示すヒアルロン酸組成物の製造法を見出し、本発明に想到した。【００１０】
本発明は、製造工程において（１）塩化セチルピリジニウム等の第四級アンモニウム塩を用いないこと（２）エタノール等の有機溶媒を添加する沈殿工程を用いないという特長を有する。【００１１】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）  下記の<1>〜<3>の工程により得られるヒアルロン酸組成物。
<1>生体組織をタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を分解する工程；
<2><1>によって得た分解産物を分子量で分画して画分を得る工程；
<3><2>によって得た画分からヒアルロン酸組成物を回収する工程。
（２）  下記の性質を有するヒアルロン酸組成物。
(a)標準条件下で、ウシ精巣由来又はヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼと共存させた後、５分間煮沸処理し、遠心分離した上清をキャピラリー電気泳動で二糖分析すると、分解が認められない；
(b)ローリー法で分析すると、タンパク質含量が0.1%未満；
(c)日本薬局方記載の重金属試験法による重金属測定で、重金属含量が20ppm以下；
(d)日本薬局方記載の砒素試験法による砒素測定で、砒素含量が2ppm以下。
（３）  下記の<1>〜<3>の工程を含むヒアルロン酸組成物の製造方法。
<1>生体組織をタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を分解する工程；
<2><1>によって得た分解産物を分子量で分画して画分を得る工程；
<3><2>によって得た画分からヒアルロン酸組成物を回収する工程。
（４）  ヒアルロン酸組成物を有効成分とする、グリコサミノグリカン分解抑制剤。
（５）  ヒアルロン酸組成物のグリコサミノグリカン分解抑制剤としての使用。
（６）  （１）又は（２）記載のヒアルロン酸組成物を含む医薬。
（７）  （１）又は（２）記載のヒアルロン酸組成物を含む食品。
（８）  （１）又は（２）記載のヒアルロン酸組成物を含む化粧品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼ分解耐性を有するヒアルロン酸組成物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明組成物のウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図２】本発明組成物のヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図３】医薬品として上市されているヒアルロン酸のヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理後にキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図４】本発明組成物の微生物由来ヒアルロニダーゼ（Streptomyces hyalurolyticus）処理後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図５】本発明組成物の微生物由来ヒアルロニダーゼ（Streptococcus dysgalactiae ）処理後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図６】本発明組成物をEDTA（エデト酸）処理した後、精巣由来ヒアルロニダーゼ処理をおこなった後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図７】本発明組成物の尿素又は塩酸グアニジン処理した後、ウシ又はヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理を行った後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図８】本発明組成物と対照物質１をそれぞれ、ウシ又はヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理した後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【図９】従来のヒアルロン酸と本発明組成物との混合物をウシ又はヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ処理をおこなった後のキャピラリー電気泳動から得られたチャートである。破線は酵素反応前、実線は酵素反応後のチャートを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明のヒアルロン酸組成物について詳説する。【００１５】
＜１＞  本発明組成物
本発明組成物は、分子量が多分散性の物性を示すことで知られているヒアルロン酸からなり、下記の(a)〜(d)記載の特性を有することを特長とする。【００１６】
(a)標準条件下で、ウシ精巣由来又はヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼと共存させた後、キャピラリー電気泳動法により処理後の組成物を二糖分析すると、分解が認められない。
(b)タンパク質含量が0.1%未満
(c)重金属含量が20ppm以下
(d)砒素含量が2ppm以下
以下、上記(a)から(d)の各特性について説明する。【００１７】
(a)本発明組成物は、ウシ精巣由来又はヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼと標準条件下で共存させた後、5分間煮沸処理し、遠心分離を行い、上清をキャピラリー電気泳動による二糖分析を行うと、分解が認められない特性を有する。【００１８】
本発明における「標準条件下」とは、本発明組成物を100μg/100μlで含む超純水に対して0.1mol/l酢酸緩衝液（pH4.0、0.1mol/lのNaClを含有する）10μl、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ又はヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ（1,000unit/ml）を含む超純水10μlを添加し、37度で10時間保温する条件をいう。【００１９】
本特性における「遠心分離」とは、12,000×ｇ、24度条件下で、5分間の遠心処理をいう。
また、本特性における「キャピラリー電気泳動による二糖分析」とは、後述の測定例９に記載された分析手法を指称する。【００２０】
(b)本発明組成物は、タンパク質含量が0.1%未満である。
本特性におけるタンパク質含量は、特にローリー法により測定した含量を指称する。ローリー法によるタンパク質含量の測定は、測定例５記載の方法により行うことができる。【００２１】
(c)本発明組成物は、重金属含量が20ppm以下である。
本特性における重金属含量は、特に日本局薬局方14・一般試験法の重金属試験法第２法に従って測定した結果、20ppm以下である特長を有する。測定の具体的方法は、測定例６に記載する。【００２２】
(d)本発明組成物は、砒素含量が2ppm以下である。
本特性における砒素含量は、特に日本局薬局方14・一般試験法の砒素試験法第３法に従って測定した結果、2ppm以下である特長を有する。測定の具体的方法は、測定例７に記載する。
また、本発明組成物は、更に下記何れかの性質を有することが好ましい。【００２３】
(e)性状は白色綿状粉末
(f)乾燥減量（60度、減圧5時間、五酸化リン）は５％以上９％未満
(g)ｐＨが5.8〜6.5
(h)極限粘度が12.9以上13.9未満
(i)重量平均分子量が60万以上120万以下
(j)グルクロン酸含量が30%以上50%未満【００２４】
(e)本発明組成物の性状は、白色綿状粉末である。
本発明組成物の乾燥物は、白色綿状粉末の性状を有する。【００２５】
(f)本発明組成物の乾燥減量（60度、減圧5時間、五酸化リン）は5%以上9%未満である。
本発明組成物の乾燥減量は、5%以上9%未満を示す。かかる乾燥減量の測定は、日本薬局方14に準じて、測定例１記載の方法により求めることができる。【００２６】
(g)本発明組成物のpHは5.8〜6.5である。
本発明組成物のpHは、5.8〜6.5である。かかるpHは、日本薬局方14のpH試験法に準じて、測定例２記載の方法により求めることができる。【００２７】
(h)本発明組成物の極限粘度は12.9dl/g以上13.9dl/g未満である。
本発明組成物の極限粘度は12.9dl/g以上13.9dl/g未満である。かかる極限粘度はウベローデ粘度計を用いて、日本薬局方14・一般試験法の粘度測定第１法に従い測定することができる。【００２８】
(i)本発明組成物の重量平均分子量は60万以上120万以下である。
本発明組成物の重量平均分子量は、60万以上120万以下である。かかる重量平均分子量はBiochem. Biophys. Acta. 42, 476(1960)に従い、極限粘度の数値から下記計算式に従って算出できる。【００２９】
（式１）
[η]＝3.6×10-4Ｍ０．７８  （ηは極限粘度を示し、Ｍは重量平均分子量を示す）【００３０】
(j)本発明組成物のグルクロン酸含量は30%以上50%未満である。
本発明組成物は、カルバゾール硫酸法により測定したグルクロン酸含量のが30％以上50％未満である。カルバゾール硫酸法によるグルクロン酸含量の測定は、以下の方法により行うことができる。【００３１】
すなわち、試料を乾燥し、その約50ｍｇを精密に量り、精製水を加え溶解し、全量を1000mlとする。この溶液1mlを試験管に取り、氷水中に冷却しながらホウ酸ナトリウム・硫酸試薬を5ml加え混和し、水浴中に10分間加熱する。直ちに氷水中で冷却し、カルバゾール試薬0.2mlを加え混和し、水浴中に15分間加熱し、放冷し、530nmにおける吸光度を測定する。あらかじめD−グルクロノラクトンの標準溶液を作成しておき、この検量線からグルクロン酸の量を算出することができる(D-グルクロノラクトン量に1.102を乗じ、グルクロン酸の量とする)。得られたグルクロン酸量から試料の中の割合を算出する。【００３２】
＜２＞  本発明組成物の調製
本発明組成物は、例えば以下の（１）〜（３）の工程によって得ることができる。【００３３】
（１）生体組織をタンパク質分解酵素で処理してタンパク質を分解する工程；
（２）分解産物を分子量で分画する工程；
（３）ヒアルロン酸組成物を回収する工程。【００３４】
（１）生体組織のタンパク質分解酵素によるタンパク質分解工程
本発明組成物は、生体組織からタンパク質を分解した抽出物から調製することができる。
生体組織としては、例えば鶏冠、臍帯、皮膚、気管等があげられ、何れもミンチにして使用することができる。鶏冠が取り扱いの容易性の面から好ましい。【００３５】
かかる生体組織を分解するタンパク質分解酵素としては、例えばプロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、パパイン、トリプシン等が挙げられ、何れも使用することができる。しかし、その中でも殊にプロナーゼが所望の分解性を示すことから好ましい。【００３６】
タンパク質分解酵素による反応の条件、反応時間は、当業者であれば使用するタンパク質分解酵素に合わせて適宜調整することができる。例えばプロナーゼをタンパク質分解酵素として使用する場合には、pH7〜8程度が好ましく、35〜60度程度の温度条件が好ましい。タンパク質分解酵素の使用量は、その種類により、当業者であれば調節し得るが、生体組織1kgに対して20万単位以上を使用することが好ましい。かかる量のタンパク質分解酵素を使用することで、タンパク質分解酵素による処理時間を5時間以下に短縮することが可能である。【００３７】
（２）分解産物を分子量により分画する工程
（１）で得られた分解産物を分子量分画する。分画分子量は、6,000〜50,000が挙げられ、8,000〜30,000がより好ましく、10,000〜20,000が最も好ましい範囲として挙げられる。かかる分画分子量は、入手の目的とするヒアルロン酸組成物の平均分子量に応じて、当業者であれば適宜調節することが可能である。【００３８】
かかる分子量分画の手法としては、例えば限外濾過、ゲル濾過等、既知の手法を適宜用いることができる。大量の試料も比較的容易に処理できることから、限外濾過が好ましい。【００３９】
なお、かかる分子量により分画する工程に先立ち、例えば濾過等の手法を用いて、未分解組織を除去したり、又はセライトや活性炭などに接触させて、分子量1,000以下のいわゆる夾雑物を除去する処理を行うことで、より夾雑物の少ないヒアルロン酸組成物を得ることができる。かかる処理は、当業者であれば適宜目的にあわせて選択し適用することが可能である。【００４０】
（３）ヒアルロン酸組成物を回収する工程
分子量分画を行った分画からのヒアルロン酸組成物の回収は、既知の方法により行うことができる。既知の方法の中でも特に、凍結乾燥が得られたヒアルロン酸組成物の変性を回避でき、また操作も簡易なため好ましい。【００４１】
かかる本発明組成物の調製法においては、精製の前後を問わず、第四級アンモニウム塩及び有機溶媒（アルコール類）と本発明組成物が接触しない点が、特長である。【００４２】
例えば、鶏冠からのヒアルロン酸の製造における一般的な精製法と本発明における組成物の製造法の違いは下記表１のようにまとめられる。【００４３】
【表１】
2007069621.tif 000002
【００４４】
＜３＞本発明抑制剤
本発明抑制剤は、本発明組成物を有効成分とする。【００４５】
本発明組成物はウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ及びヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼの分解活性に対する耐性を有している。従って、本発明組成物はこのようなグリコサミノグリカン分解酵素活性に由来するグリコサミノグリカン分解抑制剤として利用することができる。【００４６】
本発明抑制剤は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ）、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸の分解抑制剤として有用であるが、その中でも特にほ乳類型のエンド型ヒアルロニダーゼ（EC3.2.1.35）が作用する対象であるヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸の分解抑制剤として有用である。【００４７】
本発明抑制剤を他のグリコサミノグリカンと混合して、酵素による分解を抑制する場合の、本発明抑制剤の使用量は、他のグリコサミノグリカンに対して重量比で0.01％〜80％、好ましくは0.1％〜30％、より好ましくは0.5％〜20％が例示されるが、共存する酵素濃度（活性を抑制すべきグリコサミノグリカン分解酵素の濃度）に応じて適宜調整して使用することができる。【００４８】
本発明抑制剤を、医薬品、食品、化粧品に対して本発明抑制剤を添加して、本発明組成物が有するグリコサミノグリカン分解抑制作用を利用することが可能である。本発明組成物はヒアルロン酸によって形成されると考えられるが、ヒアルロン酸はナトリウム塩として既に薬局方にも収載され、また医薬品としても利用されている。従って、本発明抑制剤、本発明組成物の安全性もそれと同様である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、当然ながら本発明の技術的範囲は本実施例の範囲に限定されて解釈されるものではない。【００５０】
＜測定例１＞  乾燥減量の測定法
乾燥減量は日本薬局方14に準じ、試料0.1ｇを精密に量り五酸化リンを乾燥剤として、95℃、3時間減圧乾燥後の試料量より求める。【００５１】
試料をあらかじめ恒量にしたはかり瓶に取り、試料の表面を平らにしてから質量を0.1mｇの桁まで量る。試料を入れたはかり瓶を95℃に調製した減圧乾燥機に入れる。五酸化リンを適量入れ、減圧乾燥機内の圧力を0.1ｋPaまで減圧した後、3時間乾燥する。乾燥後、減圧乾燥器の圧力を徐々に大気圧に戻し、はかり瓶とふたをすみやかにデシケーターに移し室温まで冷却させる。冷却後、はかり瓶にふたをしてデシケーター内から取り出し、その質量を0.1mgの桁まで量る。乾燥前と乾燥後の試料量からその減量を質量百分率で算出する。【００５２】
＜測定例２＞  ｐHの測定法
ｐHは日本薬局方14のｐH試験法に準じ、試料0.1ｇに新たに蒸留水を煮沸し冷却した水50mlを加えて溶解した液をｐH電極法にて測定する。【００５３】
ｐHは、あらかじめ水に数時間以上浸したガラス電極とｐH計を用い測定する。
リン酸塩ｐH標準液とフタル酸塩ｐH標準液を用い、ｐH計の校正を行い、試料0.1ｇを新たに蒸留水を煮沸し冷却した水50mlを加え溶解した液を校正時と同じ温度にし、ｐH計にて測定する。【００５４】
＜測定例３＞  極限粘度の測定法
まず試料を0.05mol/lトリス緩衝液(ｐH8.0、0.1mol/lで食塩含む)に溶解し、0.02g/dl〜0.1ｇ/dlになるように希釈し、濃度を変えたものを10数検体用意する。次に、ウベローデ粘度計を準備し、試料溶液をウベローデ粘度計を用いて常法により極限粘度を測定する。【００５５】
＜測定例４＞  重量平均分子量の算出法
重量平均分子量は、T.C.Laurent,A.Pietuszklewicz,M.Ryan,. Biochim.Biophys.Acta.42,476(1960)の記載に基づき、極限粘度[η]から算出した。【００５６】
（式２）
[η]＝3.6×10-4M0.78          (Mは重量平均分子量を表す)【００５７】
＜測定例５＞  ローリー法によるタンパク質の測定
タンパク質はローリー法で測定する。試料約０．０８ｇを精密に量り、希水酸化ナトリウム試薬２ｍｌを正確に加え溶解したものを試料溶液とする。試料溶液１ｍｌを正確に量りアルカリ性銅試薬５ｍｌを正確に加え、２５℃で１０分間放置、フォリン試薬０．５ｍｌ加え２５℃で６０分間放置し、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定する。あらかじめ牛血清アルブミンの標準溶液を作成しておき、この検量線から試料溶液中のタンパク質量を算出する。【００５８】
＜測定例６＞  重金属含量の測定法
重金属は試料０．５を取り、日本薬局方１４・一般試験法の重金属試験法第２法に従って測定した。比較液には鉛標準液を用いた。【００５９】
試料０．５ｇを磁製のるつぼに量り、ゆるくふたをして弱く加熱して炭化する。冷後、硝酸２ｍｌ及び硫酸５滴を加え、白煙が生じなくなるまで注意して加熱した後、５００〜６００℃で強熱し、灰化する。冷後、塩酸２ｍｌを加え、水浴上で蒸発乾固し、残留物を塩酸３滴で潤し、熱湯１０ｍｌを加えて２分間加温する。次に、フェノールフタレイン試液１滴加え、アンモニア試液を液が微赤色となるまで滴加し、希塩酸２ｍｌを加えこの液をネスラー管に入れ、水を加えて５０ｍｌとし、試料液とした。【００６０】
試料及び鉛標準液（２０ｐｐｍで鉛を含有する）に硫化ナトリウム試液を１滴づつ加え、混和し、５分間放置した後、両管を白色の背景を用い、上方から観察して液の色を比較する。液の色を観察し、標準液よりも濃い場合には、より高濃度で重金属が含有されていることとなる。【００６１】
＜測定例７＞  砒素含量の測定法
砒素は試料０．５ｇを量り、磁製のるつぼに取る。これに対し、硝酸マグネシウム六水和物のエタノール（９５％）溶液を純水で50倍希釈して得た溶液（１０ｍｌ）を加え、エタノールに点火して燃焼させた後、徐々に加熱した後、強熱して灰化する。冷後、残留物に塩酸３ｍｌを加え、水浴上で加温して溶かし、試料液とする。この試料液をヒ素試験装置を用いて反応させ、液の色を観察して含量を測定する。予め調製した標準液（２ｐｐｍで砒素を含有する溶液）で観察された色はよりも濃い色が観察された場合には、それよりも高濃度で砒素を含有することを示す。【００６２】
＜測定例８＞  カルバゾール硫酸法を用いたグルクロン酸含量の測定法
グルクロン酸含量はカルバゾール硫酸法を用い測定する。試料を乾燥し、その約５０ｍｇを精密に量り、精製水を加え溶解し、全量を１０００ｍｌとした。この溶液１ｍｌを試験管に取り、氷水中に冷却しながらホウ酸ナトリウム・硫酸試薬を５ｍｌ加え混和し、水浴中に１０分間加熱する。直ちに氷水中で冷却し、カルバゾール試薬０．２ｍｌを加え混和し、水浴中に１５分間加熱し、放冷し、波長５３０ｎｍにおける吸光度を測定する。あらかじめＤ−グルクロノラクトンの標準溶液を作成しておき、この検量線からグルクロン酸の量を算出した。(Ｄ−グルクロノラクトン量に１．１０２を乗じ、グルクロン酸の量とする)得られたグルクロン酸量から試料の中の割合を算出する。【００６３】
＜測定例９＞  キャピラリー電気泳動による二糖分析
キャピラリー電気泳動装置（Beckman社の P/ACE 5010型）を用い、キャピラリー管（４０ｃｍ × ５０μｍ）を用いる。電気泳動用緩衝液は５０ｎｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）とし、キャピラリー管２５℃に保ち分析する。【００６４】
キャピラリーを超純水で加圧法により２分間洗浄後、加圧法により電気泳動用緩衝液で２分間洗浄し、キャピラリー内を泳動用緩衝液で満たした。加圧法により分析試料を１０秒間キャピラリー内に導入した後、電圧を印加した。印加電圧は２０ｋＶ、分析時間は１０分間とした。波長２００ｎｍにおける紫外線吸収を検出し、酵素分解を調べる。【００６５】
＜実施例1＞本発明組成物の調製
ニワトリから鶏冠２４ｋｇを切り出し、ミンチにしたのち、１６０Ｌの脱イオン水に懸濁した。食塩２．５ｋｇを加え、抽出タンク内で、１０５℃で３０分間、加熱しながら攪拌した。室温まで冷却した後、ｐＨを７．８に調整し塩化カルシウム５０ｇとプロナーゼ６５０万単位（科研製薬製）加え、５３℃で４時間攪拌した。この混合物にセライト（ゲムライトスーパー3H：白山工業製）２ｋｇと活性炭（白鷺ニューゴールド：武田製薬製）２ｋｇを加え、スパークラーフィルター（ニッセン製）を用い、No.5277（安曇濾紙製）とZ-800（安曇濾紙）を組み合わせ、ろ紙濾過することにより鶏冠からの抽出液１７０Ｌを得た。この抽出液を塩酸によりｐＨを４．８に調整し、活性炭（白鷺ニューゴールド：武田製薬製）２ｋｇを加え、スパークラーフィルター（ニッセン製）を用い、No.5277（安曇濾紙製）とZ-800（安曇濾紙）を組み合わせて、ろ紙濾過し、さらにｐＨを８．０に調整した。得られた溶液を２０℃で、限外濾過を一昼夜おこなった（限外濾過膜ACV-３０５０旭化成ケミカルズ製：分画分子量１３０００）。得られた限外ろ過液を凍結乾燥することにより１２０ｇの本発明組成物を得た。【００６６】
測定例１〜８記載の方法により測定した各特性は下記表２の通りだった。【００６７】
【表２】
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【００６８】
＜調製例＞対象物質１の調製
実施例１で得た本発明組成物2gを2mol/l食塩水溶液200mlに溶解後、10%塩化セチルピリジニウム600ml(w/w  2mol/lで食塩含む)を加え、これに食塩濃度が1.4mol/lになるように0.05%塩化セチルピリジニウム溶液を約340ml加えた。生じた沈殿を5,000×gで30分間、遠心分離し、上清1,000mlを得た。この上清の食塩濃度1.2mol/lになるように0.05%塩化セチルピリジニウム（東京化成工業製）溶液160mlを加え、生じた沈殿を遠心分離し、上清1,100mlを得た。この上清の食塩濃度が0.5mol/lになるように0.05%塩化セチルピリジニウム溶液1,540mlを加え、遠心分離を行い、上清2,510mlを得た。この上清の食塩濃度が0.1mol/lになるように0.05%塩化セチルピリジニウム溶液10,040mlを加え遠心分離した。得られた上清に15%エタノール(w/w)を含む2mol/l食塩溶液200mlに40℃加温溶解３倍量のエタノールを加え再び沈殿させた。生じた沈殿を遠心分離にて分離し沈殿物を超純水100mlに溶解、透析膜(透過分子量14,000：再生セルロース製)を用いて一昼夜透析した。得られた溶解液を凍結乾燥を行い、950mgの対照物質１（ヒアルロン酸）を得た。【００６９】
＜実施例２＞
本発明組成物100μgを含む超純水100μlに対し、0.1mol/l酢酸緩衝液（pH4.0、0.1mol/l食塩含む）10μlを加え、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ(シグマ社製：1mg/ml)を10μl加え37℃で10時間反応させ、反応液を５分間煮沸後、遠心分離（12,000×g、24℃、5分間）をおこない、上清を測定例９記載の方法で分析した（図１）。【００７０】
対照物質として下記表３のヒアルロン酸を使用した。【００７１】
【表３】
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【００７２】
その結果、本発明組成物のみが、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼに耐性を示すことが明らかになった。【００７３】
＜実施例３＞
実施例２におけるウシ精巣由来ヒアルロニダーゼを、ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ロッシュ社製）に代え、実施例２と同様の実験を行った（図２）。【００７４】
その結果、本発明組成物のみが、ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ耐性を示すことが明らかになった。【００７５】
また、市販のヒアルロン酸製剤（下記表４）を使用して上記手順に従って実験を行った結果も、同様に何れもヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼにより分解された（図３）。【００７６】
【表４】
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【００７７】
＜実施例４＞
ヒアルロン酸組成物20μgを含む超純水20μlに対し、0.1mol/l酢酸緩衝液（pH6.0）に溶解した微生物由来ヒアルロニダーゼ（Streptomyces hyalurolyticus ）(1mg/ml)を2μl加え60℃で10時間反応させ、反応液を5分間煮沸後、遠心分離（12,000×g、24℃、5分間）を行い、上清を測定例９記載の方法で分析した（図４）。【００７８】
対照としては実施例２と同じ物質を使用した。
その結果、本発明組成物も対照と同様に分解されることを示された。【００７９】
＜実施例５＞
ヒアルロン酸組成物100μgを含む超純水100μlに対し、0.1mol/l酢酸緩衝液（pH6.0）10μl加え、微生物由来ヒアルロニダーゼ（Streptococcus dysgalactiae ）(1mg/ml)を10μl加え37℃で10時間反応し、反応液を５分間煮沸後、遠心分離（12,000×g、24℃、5分間）をおこない、上清をキャピラリー電気泳動で分析した（図５）。
対照としては実施例２と同じ物質を使用した。【００８０】
その結果、本発明組成物も対照と同様に分解されることを示された。【００８１】
＜実施例６＞
ヒアルロニダーゼは金属イオンがその酵素活性を阻害することが知られている。そこで本発明組成物がウシおよびヒツジの精巣由来のヒアルロニダーゼによる酵素分解に対して耐性を持つことが金属イオンの影響の有無でないことを確認した。すなわち本発明組成物100μｇを含む超純水100μlに対して、100mmol/lエデト酸（キレート剤）を10μl加え25℃で10時間処理した後、実施例２と同様に酵素分解を行い、測定例９に従って分析した（図６）。対照としてナカライテスク社製のStreptcoccus zooepidemicus由来ヒアルロン酸その結果、分解産物は観測されなかった。
すなわち、本発明組成物のヒアルロニダーゼ耐性は、金属イオンの混入によるものではないことが判明した。【００８２】
＜実施例７＞
本発明組成物は第四級アンモニウム塩による処理、有機溶媒による分画等の処理を経ることなく単離されたものである。従って、鶏冠内での存在形態が保たれ、水素結合等に起因する立体的な高次構造を損なうことなく製造されている可能性が大きい。そこでタンパク質研究等において水素結合を切断することが知られている尿素又は塩酸グアジニンで処理し、水素結合のヒアルロニダーゼ耐性に与える影響を確認した。【００８３】
すなわち本発明組成物100μgに対して、6mol/lグアニジン溶液および8mol/l尿素溶液を100μl加え25℃10時間処理した後にそれぞれに10ｍｇの酢酸ナトリウムと1mlのエタノールを加えた。この液を-27℃で2時間保ち、12,000×ｇで10分間遠心分離し得られた沈殿物を0.1mol/l酢酸緩衝液（ｐH5.3）100μｌに溶解し、実施例２に従って酵素分解を行い、測定例９記載の方法で分析した（図７）。
その結果、本発明組成物は、塩酸グアジニンで処理した際に分解産物が観測された。【００８４】
このことは、本発明組成物のヒアルロニダーゼ耐性は、ヒアルロン酸分子内の水素結合に起因するとよくされた。すなわち、本発明組成物は従来のヒアルロン酸と水素結合による立体構造の点で相違すると考えられる。【００８５】
＜実施例８＞
本発明組成物と、調製例２で得られた対照物質１とを、実施例２及び３に則りヒアルロニダーゼで処理し、測定例９記載の方法で分解し、その分解性を比較した（図８）。【００８６】
その結果、対照物質１はウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ及びヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼの何れによっても分解されることが明かとなった。【００８７】
すなわち、本発明組成物を第四級アンモニウム塩及び有機溶媒で処理することにより、ヒアルロニダーゼ耐性がなくなること、かかる製造工程により生成物の特性に差が生じていることが判明した。【００８８】
＜実施例９＞
培養ヒアルロン酸（紀文フードケミファ社製、分子量１８４万）９０ｍｇと本発明組成物１０ｍｇを超純水４０ｍｌに溶解した後に凍結乾燥を行った。【００８９】
この混合物を用いて、実施例２及び３に則り、ウシおよびヒツジの精巣由来のヒアルロニダーゼを用いてそれぞれヒアルロニダーゼ処理を行い、測定例９記載の方法により分析した（図９）。【００９０】
その結果、混合物は本発明組成物を１０％しか含有しないにも拘わらず、ヒアルロニダーゼによる分解が抑制されていることが明らかとなった。【００９１】
また同様に、本発明組成物を5%添加した場合においても同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によって得られた哺乳類由来ヒアルロニダーゼに抵抗性を有するヒアルロン酸組成物は、ヒアルロン酸の分子構造の改変に起因する生体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な分解酵素に対する安定性において優位性を有し、医薬品、医薬部外品、化粧品あるいは飲食品の分野に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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