(57)【要約】  早期膵癌の陽性率が高く、膵癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膵癌検出キットを提供することを目的とする。  ＡｐｏＣ−１蛋白からなる膵癌検出用腫瘍マーカー、およびＡｐｏＣ−１蛋白を検出するためのプロテインチップを含む膵癌検出用キットであることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｐｏＣ−１蛋白からなる膵癌検出用腫瘍マーカー。
【請求項２】
ＡｐｏＣ−１蛋白を至適条件下で検出するためのプロテインチップを含む膵癌検出用キット。
【請求項３】
前記プロテインチップは、請求項２記載の膵癌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵癌検出用マーカー、及び、該マーカーを用いた膵癌検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌の発生は、年々増加の傾向を辿っており、日本での発生率は１９８５年には１０万人中５．２人まで増加した。更に、１９９５年には膵癌による死亡数は１０万人中１４．７人となり、男性の癌による死因の第５位、女性の第７位を占めている（厚生統計協会：国民衛生の動向１９９７年）。【０００３】
膵癌は消化器癌のなかでも予後不良の癌として知られている。その理由としては、（１）早期発見が困難で、診断時既に進行癌となり切除率が低く、（２）生物学的悪性度が高く、早期に周囲神経叢、腹膜播種や肝転移をきたし、（３）有効な補助療法が確立されていないことなどが挙げられる。【０００４】
現状、局所進行膵癌に対しては拡大リンパ節郭清や門脈合併切除が試みられ、切除率の向上に寄与し、膵癌症例の１０〜１５％が外科的切除の対象となっている。しかしながら、生存率の改善には至っておらず、切除例でも５年生存率は５〜１０％といわれている。従って、膵癌を早期に診断し、外科的切除を行い治療成績の向上を図ることが、急務である。【０００５】
また、膵癌は非常に悪性であり、膵臓と離れた部位に転移（遠隔転移）をきたしやすく、この遠隔転移（特に、肝臓）のため、多くの患者は外科的切除の対象とならない。手術不能の患者の予後は更に悪く、５年生存率はほぼ０％である。このため、できる限り早期に診断し、切除を行うことが最も効果的な治療である。従って、早期に膵癌患者の発見方法を開発することが何より重要である。【０００６】
従来、膵癌の診断には画像診断としてＣＴスキャンや超音波検査を中心に行われている。しかしながら、この診断方法では膵癌は進行例として発見されることが大部分である。その理由は、例えば腹痛・背部痛・黄疸・食欲不振など膵癌自覚症状が出現した時には既に周囲臓器や遠隔転移をきたしている場合が多いためである。さらに、ＣＴスキャンや超音波検査では腫瘍径が２ｃｍ未満の小膵癌の発見は困難である。このため、外科的切除の対象となるのは全患者の１０〜１５％程度であり、仮に切除の対象となる患者でも高度に進行してしまっている患者が殆どである。【０００７】
更に一方で、膵癌の腫瘍の検出としてＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＰＡＮ−１、ＳＬＸ等各種腫瘍マーカーが用いられており、膵癌の診断に寄与している（例えば下記非特許文献１乃至４参照）。
【非特許文献１】張正和ら、“新しい腫瘍マーカーＣＡ１９−９の臨床的意義  膵癌症例を中心に”胆と膵、１９８５年、６巻、１１２９−１１３５頁
【非特許文献２】ＴＡＫＡＳＡＫＩら“Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡ１９−９  ａｎｄ  ＤＵ−ＰＡＮ−２  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８８年、４８巻、１４３５−１４３８頁
【非特許文献３】ＹＯＮＧ  Ｓ．  ＣＨＵＮＧら“Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｃａｎｃｅｒ、１９８７年、６０巻、１６３６−１６４３頁
【非特許文献４】河上浩康ら“各種消化器癌における血清ＳＬＸ（ｓｉａｌｙｌ  ＳＳＥＡ−１）測定の臨床的有用性”日本消化器病学会雑誌、１９８９年、８６巻、１１４１−１１４８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記腫瘍マーカーのうち最も特異性が高く感度も良好で、広く用いられているＣＡ１９−９であっても早期膵癌の陽性率は低く、病期Ｉの膵癌の検索は当該検査では不可能である。さらに、Ｌｅｗｉｓ抗原陰性患者ではＣＡ１９−９は仮に進行膵癌でも陰性となってしまうことがあるという問題点を有する（Ｈｉｒａｎｏら、“Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｅｒｕｍ  ＣＡ１９−９  ｌｅｖｅｌｓ”、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１９８７年、７９巻、１２６１〜１２６８頁）。更に、慢性膵炎や胆管炎、胆石症の患者でも高値を示してしまい、膵癌を確実に検出する腫瘍マーカーとしては課題が残っている。【０００９】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、より早期膵癌の陽性率が高く、膵癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膵癌検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、膵癌患者の手術前と外科的切除が行われ膵癌が切除された手術後の血清（各２０件）を比較検討していくうちに、ＡｐｏＣ−１蛋白が手術前の膵癌患者には発現しているのに対し、切除後の患者には殆ど発現されていないことを発見し、この蛋白が膵癌において腫瘍マーカーとして用いることが出来ることを見いだし、本発明を完成するに至った。この蛋白は膵癌の早期の患者でも発現しており、従来の腫瘍マーカーよりより鋭敏に広範囲に膵癌患者を検出することが可能である。【００１１】
即ち、本発明の一形態に係る膵癌検出用腫瘍マーカーは、ＡｐｏＣ−１蛋白からなることを特徴とする。これにより、従来の腫瘍マーカーより早期膵癌の陽性率が高く、膵癌をより確実に検出することが可能となる。これは例えば、プロテインチップシステム、ELISA法などを用いて検出することができる。ELISA法としては、例えば（Micheal D. Curry, Walter J McConathy, Jim D. Fesmire, and Peter
Alaupovic. “Quantitative Determination of Apolipoproteins C−1 and C−II in Human Plasma by Separate
Electroimmunoassays.”, Clin.Chem. １９８１年、２７巻、５４３−５４８頁、Caroline
Petit−Turcotte, Sheldon M. Stohl, et al.”Apolipoprotein
C−1 Expression in the Brain in Alzheimer’s Disease.”
Neurobiology of Disease ２００１年、８巻、９５３−９６３頁）等に記載の常法を用いることができる。【００１２】
また、本発明の他の一形態に係る膵癌検出キットは、プロテインチップシステムにおいて用いられ、膵癌のより確実な検出に寄与することができる。【００１３】
プロテインチップシステムとは、蛋白質の発現、相互作用、翻訳後修飾などの機能解析や、目的蛋白質の精製・同定などを効率的に行うことを目的として開発されたシステムのことをいい、蛋白質解析に適した様々な化学的性質を表面にもたせたプロテインチップと、測定に用いられるプロテインチップリ−ダ−と、測定・解析に使用するソフトウェアがインスト−ルされたコンピュ−タ−を有して構成される。【００１４】
プロテインチップシステムは、血清や尿、培養液細胞破砕液などクル−ドなサンプルから、プロテインチップに対するアフィニティ−を利用して目的蛋白質を捕捉し、その質量数を測定することができる。ラベルやタグを使わず、プロテインチップ上で簡便に蛋白質の解析ができ、少量のサンプルから短時間に結果を得ることができる利点がある。プロテインチップリ−ダ−には限定されるわけではないが、例えば時間飛行型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）が好適である。時間非行型質量分析計は、プロテインチップ表面に捕捉されている物質にレ−ザ−を照射し、イオン化させる。そのイオン化した物質は電場の中で加速され、飛行管の中を検出器に向かって飛行していく。このとき飛行する速度は分子量（正確には分子量をイオン化された電荷数で割った値）に比例する。従って、レ−ザ−が照射されてから検出器に到達するまでの時間を測定することにより、プロテインチップ表面に存在する物質の分子量を知ることができ、目的蛋白質を同定することができる。
【発明の効果】
【００１５】
以上、本発明により、より早期膵癌の陽性率が高く、膵癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膵癌検出キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明に係る膵癌検出用腫瘍マーカー、検出キットとしての効果について、実際の患者を対象とした具体的な例を用いて説明する。【００１７】
２００１年６月から２００３年１０月までに治癒手術が施行され、浸潤性膵管癌の病理組織診断のついた２０症例を対象症例とし、これらの術前、術後の血清をサンプルとして用いた。この２０症例を表１に示す。なお、この症例全てにおいて、術前の血清は補助療法（化学療法や放射線療法等）を施行しなかった血清を、術後の血清は手術の影響を考慮し、術後状態が安定した後、少なくとも術後３、４週間後の術後補助療法を行う前に採取した血清を用いた。なお、各血清は、採血後速やかに５分間、３０００回転数で遠心分離を行い、その上清を分注し−３０℃にて保存した。
【表１】
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【００１８】
プロテインチップシステムにおけるプロテインチップリ−ダ−としては時間飛行型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いた。プロテインチップとしてはＷＣＸ２（陽イオン交換チップ）（ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製）を用い、ＢｕｆｆｅｒとしてはｐＨ６．５（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｕｒｅａを用いた。サンプルの組成はｕｒｅａ;患者血清２０μｌ＋変性ｂｕｆｆｅｒ  ２０μｌ＋ｐＨ  ｂｕｆｆｅｒ  １６０μｌ（１／１０希釈）とし、プロテインチップの各スポットに１００μｌずつ投与し、それぞれ同一サンプルを２スポットずつ行った。そして各スポットに対しシナピン酸をＥＡＭ溶解液（５０％アセトノトリル／０．５％ＴＦＡ）に溶かして塗布した。これをプロテインチップ検出器であるＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて血清中にある蛋白を検出し、術前術後の蛋白比較（Serum protein profiling）を行い、同一個体間で術前上昇し術後低下するｐｅａｋ（蛋白）を見つけ、その候補蛋白として質量数およそ６６３０Ｄａのｐｅａｋを検出した。この代表的なｐｅａｋ例を図１に、この蛋白の術前、術後peak intensityを図２に示す。【００１９】
図１によると、ｐＨ６．５の条件下、ｕｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒにおいて術前から術後に有意にｐｅａｋが低下する質量がみいだされ、その質量数は６６３０Ｄａ（p＝０．００３８）であった。ｐｅａｋを有する患者を陽性と判定すると２０例中１８例（９０％）が膵癌陽性であると判定できた。なお従来の膵癌に対する特異的な腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９は２０例中１５例（７５％）の陽性にすぎず、また、ＣＥＡの陽性率は２例（１０％）にすぎなかった。その中で、症例２０はＬｅｗｉｓ抗原（ａ−，ｂ+）患者でＣＡ１９−９正常値であったが、この蛋白では陽性であり、更に、症例２及び３は早期の膵癌である病期Ｉで、両者ともこの蛋白では陽性であったが、症例３ではＣＡ１９−９は陰性であった。（表１参照）すなわち、この蛋白によると、早期の膵癌においてもより高い頻度で検出が可能で、従来のＣＡ１９−９に比しても鋭敏であり、しかもＬｅｗｉｓ抗原（ａ−，ｂ+）患者に対しても検出可能な膵癌検出用腫瘍マーカーとして用いることができることがわかった。【００２０】
そこで、上記の結果を踏まえ、血清から特異的蛋白質の精製を行い、膵癌検出用のマーカーと期待される蛋白質についての特定を行った。なおこの特異的蛋白質の精製は、至適ｐＨ（ｐＩ）の検討及び至適塩（ＮａＣｌ）濃度の検討を通じて行った。【００２１】
まず、ｕｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒにおいてｐＨを４．５，５．０，５．５，６．０と段階的にｐＨを上げていき、最も６６３０Ｄａのｐｅａｋが高くなる至適ｐＨ、すなわち最も単離、精製するのに適したｐＨを調べた。その結果、ｐＨ４．５の条件下で最もｐｅａｋが高かった。次に塩濃度を０、５０，１００，１５０，２００，３００，４００，５００ｍＭと段階的にあげていき、６６３０Ｄａのｐｅａｋが下がり始める塩濃度を調べた。その結果、５００ｍＭまで塩濃度をあげていってもｐｅａｋが下がり始めることはなかった。【００２２】
そして、上記至適な条件を踏まえてＦＰＬＣを行い、ｐｅａｋの高いＦＰＬＣ  ｆｒａｃｔｉｏｎをＨＰＬＣにかけた。ＦＰＬＣの条件は、ＮａＣｌを１５ｍＭずつ分離したｆｒａｃｔｉｏｎを作製し、１６５ｍＭ〜１０００ｍＭまで３０ｍＭごとのｆｒａｃｔｉｏｎを用い、ＮＰ  ２０  ｃｈｉｐにてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を行った。ＨＰＬＣの条件はリニア−グラディエントにてＢｕｆｆｅｒ;０．１％（Ａ）〜８０％（Ｂ）アセトニトリル、流量；２００μｌ/ｍｉｎで行い、分離カラムはＣ−１８を用いた。これにより精製された目的蛋白を、Ｎ末端アミノ酸シ−クエンスにてアミノ酸１５残基目までを解析し同定を行った結果、２つの蛋白はそれぞれ６６３０Ｄａの本体がｍａｔｕｒｅ型のＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−１（５７アミノ酸）（成熟型ＡｐｏＣ−１蛋白）、６４２０Ｄａの本体はｍａｔｕｒｅ型のＮ末端側のアミノ酸が２つ欠失したＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−１（５５アミノ酸）であることが判明した。この結果を図３〜９に示す。即ち、上記膵癌検出用腫瘍マーカーとして使用可能な蛋白は、ＡｐｏＣ−１蛋白であることが判明した。【００２３】
次に、この蛋白の血清値と臨床病理学的因子及び生存期間との関連を検討することにより、この蛋白と膵癌悪性度との相関がないかを検討した。ＡｐｏＣ−１蛋白のプロテインチップシステムによる解析で得られたpeak intensityのデ−タ−（図２参照）の術前値の中央値で血清ＡｐｏＣ−１高値群、低値群を２群にわけ、２群間をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて統計解析を行ったところ、ＡｐｏＣ−１血中濃度が高値の患者は無再発生存期間（p＝０．００１１；Logrank）及び生存期間（p＝０．００６２；Logrank）が共に有意に短いことが判明した（図１０参照）。【００２４】
以上、本膵癌検出用腫瘍マーカーによって、より早期膵癌の陽性率が高く、膵癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膵癌検出キットを実現することができる。さらに、この腫瘍マーカーの値は患者の生存期間と関連があり、膵癌悪性度にも密接な関係を認めることから、予後の指標となる可能性も併せ持つ既存の膵癌検出用腫瘍マーカーにはない特徴を有する。本発明の実施には少量の患者血清で十分であり、また−３０℃にて保存し、いつでも測定可能である。従って、プロテインチップ法とそのチップに用いること、より好ましくはＷＣＸ２（陽イオン交換チップ）を用いれば、陽性率も高く、早期の病期Ｉでも陽性で膵癌を検出可能である。なお膵癌検出用腫瘍マーカーとしてＡｐｏＣ−１を検出する時の好ましい条件は、ｐＨ３以上７以下であり、より好ましくはｐＨ６以上７以下である。【００２５】
なお、健常人の血清中にもＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−１は存在しており、現在まででは脂質代謝関与し、トリグリセリド転送リポ蛋白であるカイロミクロンやVLDLに多く認められ、肝臓の粗面小胞体内で合成され、血中平均濃度は約６mg/dlといわれている。ＡｐｏＣ−１の脂質関連の機能は他のアポリポ蛋白に比べ未解明の部分が非常に多く、（１）ApoE蛋白の形態を変化させLDL receptor(LDLR)やLDLR related proteinとリポ蛋白の結合を阻害すること、（２）LCAT活性を促進させる働きをもつこと等が示唆されている。（The interaction of human apolipoprotein C−I
with sub−micellar phospholipid. Benjamin W.
Atcliffe et al. Eur. J. Biochem. 2001;268: 2838−2846.）【００２６】
最近、ApoC−1遺伝子の癌への関連が大規模な遺伝子クラスタ−解析により１００種近くの候補の１つとしてあげられ、特に膵癌組織で発現が増強されるとの報告があり（Byungwoo et al. Cancer Research ２００２年、６１巻、１８３３〜１８３８頁）、他の臓器での正常部、癌部での遺伝子発現の相違についてNational Cancer Instituteのデ−タ−ベ−ス内 (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE/Viewer)
に登録されている。これらのことからもＡｐｏＣ−１は膵癌検出用腫瘍マーカーとなりうる可能性が非常に高く、さらに、膵癌患者血清中でのＡｐｏＣ−１値増加の原因として膵癌組織中での発現増強が遺伝子レベルに留まらず、蛋白レベルでも同様に認められればさらに膵癌特異的なマーカーとしての信憑性が揺るぎないものとなる。そこで、本発明者は実際にＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−１が膵癌の組織中で発現されているか否かを確認するために手術標本より得られた膵癌の癌部、非癌部の凍結標本を用いて膵癌組織及び正常膵組織のＡｐｏＣ−１遺伝子発現をRT−PCR、Real−time RT−PCRならびにＡｐｏＣ−１蛋白発現をWestern blot法、さらに今回プロテインチップ解析を行った全２０症例のホルマリン固定されたパラフィン包埋標本を用いて免疫染色法でＡｐｏＣ−１蛋白の腫瘍内局在を確認した。【００２７】
まず、膵癌組織、正常膵組織および膵癌細胞株のＡｐｏＣ−１遺伝子発現を確認するためにRT−PCRを行った。まず、凍結標本組織を粉砕しRNeasy Mini
Kit (キアゲン, Tokyo,
Japan)を用いtotal RNAを作成、その後T−Primed
First−Strand Kit
for reverse transcription−PCR (アマシャムバイオサイエンス, USA社)を使用しcDNAを作成した。さらにcDNAをAmpliTaq
Gold PCR Master Mix (バイオシステム, Foster City, CA社)を用い、３７サイクル、アニ−リング温度５８℃の条件下でRT−PCRを行った。得られたPCR産物を２％アガロ−スゲルにて電気泳動をおこなった。ＡｐｏＣ−１primerとしてForward−primer, 5’−CTCCAGTGCCTTGGATAAGC
−3’
Reverse−primer, 5’−TTGAGTTTCTCCTTCACTTTCTGA
−3’の配列を用い、ＡｐｏＣ−１PCR産物の長さは150bpとなるようデザインした。その結果、癌部では非癌部より明らかにＡｐｏＣ−１遺伝子が強発現していた。その結果を図１１に示す。【００２８】
次に手術で切除された膵癌の癌部、非癌部各１６検体の凍結標本を用いて上記と同様の過程でそれぞれcDNAを作成。その後、ＡｐｏＣ−１のmRNAレベルを定量化するためにLightCycler 装置とLightCycler−Fast Start DNA Master SYBR Green I kit and PCR amplifications (ロッシュダイアグノスティック, Tokyo, Japan社)を用いReal−time RT−PCRを行った。組織間のmRNA量を同一にするためにそれぞれのGAPDHのmRNA値比を算出した。その結果、すべての検体において癌部では非癌部よりＡｐｏＣ−１遺伝子の発現が増強しており（p＞０．０００１）（図１２参照）、同一個体内での癌部、非癌部１３対においては癌部では非癌部より平均値２５２倍、中央値３９．１倍の発現量の差を認めた。【００２９】
さらに、上記の検体のうち癌部、非癌部が同一個体からの対となる１３ペアを癌部のmRNA値(Tumor)を非癌部のＡｐｏＣ−１mRNA値(Normal)でわり、その値の中央値で高値群、低値群の２群に分け膵癌の悪性度との相関関係を検討したところ、高値群では低値群に比べ有意に生存期間が短く、前述のプロテインチップシステムによる血清中ＡｐｏＣ−１と膵癌患者の生存期間の関係と相関する結果となった（図１３参照）。ちなみにこの１３対の患者はプロテインチップシステム解析に用いた患者グル−プとは異なる群である。【００３０】
続いて、膵癌組織の癌部、非癌部および４種類の膵癌細胞株（MIA
PaCaII、PanC−1、CFPAC−1、AsPC−1）のＡｐｏＣ−１蛋白レベルを確認するためにＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。１次抗体としてMouse−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Apolipoprotein C−1  monoｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（CHEMICON INTERNATIONAL社）を用いた。コントロ−ルとしてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いた。【００３１】
膵癌、膵正常組織および培養細胞より蛋白を抽出した後、それぞれ２０μｇの蛋白量をアプライし１０〜２０％、および１５−２５％グラディエントゲル（DRC社）を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写し、０.５％スキムミルクにて非特異的反応をブロッキングした後１：５００に希釈した抗ApoC−1抗体を１次抗体として用いた。２次抗体として１：３０００に希釈したＧｏａｔ−ａｎｔｉMouse−ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用した。発色液としてＥＣＬ液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。その結果、ＡｐｏＣ−１蛋白発現は膵正常組織においては認められず、膵癌組織で発現しており、さらに４つの膵癌細胞株すべてにおいて発現を確認した（図１４参照）。【００３２】
次に、今回プロテインチップ解析を行った全２０症例を対象とし、免疫組織学的染色を行い、ＡｐｏＣ−１蛋白発現の膵癌組織中の発現及び局在を確認した。免疫染色は１０％ホルマリン固定され、パラフィン包理された組織標本を用い、ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダ−ゼ法（Ｄａｋｏ  ＬＳＡＢ２  ｋｉｔ，  Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ社）にて行った。その際、抗ＡｐｏＣ−１抗体の希釈濃度は１：１００で行った。その結果、非癌部特に正常膵管においてＡｐｏＣ−１蛋白は発現を認めず、癌部においては膵管癌の細胞質に特異的に発現していることが確認された（図１５参照）。【００３３】
以上より、本研究者は初めて膵癌組織中及び膵癌細胞株のＡｐｏＣ−１遺伝子および蛋白発現を実証することに成功し、さらに膵癌組織におけるＡｐｏＣ−１蛋白発現の局在も明らかとした。これらの研究結果はＡｐｏＣ−１蛋白が膵臓の癌化と密接に関係し、発現量の増大に伴い血中に逸脱し、その血清中の濃度を測定することにより鋭敏なかつ確実な膵癌の診断に大きく寄与できることとなる。さらに、膵癌の悪性度の指標としてもＡｐｏＣ−１蛋白を活用することができる。【００３４】
次に、実際にＡｐｏＣ−１蛋白が膵癌の癌化作用にどのように携わっているかを解明するために４種類の膵癌細胞株（MIA PaCaII、PanC−1、CFPAC−1、AsPC−1）で、RNAi(RNA interference)を用いＡｐｏＣ−１遺伝子を特異的に抑制するsiRNAを細胞株にtransfectionし検討した。ＡｐｏＣ−１遺伝子が真に抑制されているかを確認するために、Real−time RT−PCRを用いＡｐｏＣ−１RNAレベルを定量化し、ＡｐｏＣ−１蛋白レベルをWestern blotにて検討した。【００３５】
まず、RNAiを用いたＡｐｏＣ−１遺伝子の特異的な抑制を起こすためのsiRNAを２種類デザインし、より効果的にＡｐｏＣ−１遺伝子を抑制することのできるsiRNAを選択した。このOligonucleotideの配列は以下に示す通りである、Target  sequence, siRNA−2; CTG GAG GAC AAG GCT CGG
GAA。【００３６】
ここで、Real−time RT−PCRおよびWestern blot法は前述と同様の過程でおこなった。癌細胞で特異的に発現が認められるＡｐｏＣ−１にどのような癌化への作用が認められるかを検討する。RNAiを用いることにより特異的にＡｐｏＣ−１mRNAの発現を抑制することで、膵癌細胞株におけるＡｐｏＣ−１の機能解析を行った。【００３７】
まず、１０％FBS入りの培養液で１０x１０4 cells/ml の細胞浮遊液を作る。６well  plateに２ml（２０x１０4cells/well）ずつ細胞を撒き、顕微鏡で確認、翌日５０％confluentを目標にする。３７℃、５％CO2インキュベ−タ−にて２４時間培養する。
続いて、２４時間後以下の手順でsiRNA Transfectionを行う。
1. Oligoを解凍
2. Transfection
Reagentの調整
Lipofectamine2000（Invitrogen 
life 
technologies社）6μlをOpti−MEM medium(GIBCO, Invitrogen Corporation) 244μlで希釈し、室温で５分から１０分放置
3. Oligo
dilutionの調整
20nMのannilingしたOligo 10μl＜(200nM
final conc.の場合)、濃度により適宜調整する＞をOpti−MEM medium 240μlで希釈する。
4. Transfection
Reagent 250μlをoligo dilutionに加え、軽く混合しtotal 500μlとする。室温で１５分から２０分放置。
5. Opti−MEMを５0０μl加えtotal 1000μlにする。
6. plate培養液を吸引し、Opti−MEM medium 2mlで洗浄。
7. ５のTransfection
mixtureを細胞にふりかける。
8. 37℃、５％CO2インキュベ−タ−で４時間培養後、FBS1５０μl、DMEM350μl加え、total 1500μl(10%血清)とする。
その後適宜、細胞からcell lysateを用いmRNA、proteinを得、その後の実験に使用する。【００３８】
膵癌細胞株のＡｐｏＣ−１遺伝子がＡｐｏＣ−１siRNAにより特異的に抑制されているかを確認するために、上記の手順で行って得られたcDNAを用いReal−time RT−PCRを行った。その結果、４種類の膵癌細胞株すべてにおいて９０％前後の遺伝子抑制が認められた。さらにＡｐｏＣ−１蛋白レベルをWestern blotにて検討したところ、MIA PaCa IIにＡｐｏＣ−１siRNAをtransfectionし４８時間後の蛋白レベルは、siRNA oligo最終濃度２０ｎＭより発現が低下していることが確認できた（図１６参照）。【００３９】
ＡｐｏＣ−１の膵癌細胞株における細胞増殖への関わりを調べる目的でCell
proliferation assayを行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに０．５ｘ１０４個/１ｗｅｌｌの細胞を入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベ−トし、その後特異的ＡｐｏＣ−１siRNAを最終濃度２０nMとなるように、transfection用培養液に混入し、４時間後培養液を交換し、同条件下でインキュベ−トし細胞培養を行い、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４時間後にＣｅｌｌ  Counting  Ｋｉｔ−８  ［CCK−８］  （ DOJINDO  ,JAPAN社）を用いCell proliferation assayを行った。吸光度４５０ｎｍにて測定し、培養細胞に特異的ＡｐｏＣ−１siRNAを投与した細胞とコントロ−ルsiRNAを投与した細胞との増殖能を比較したところ特異的ＡｐｏＣ−１siRNAを投与した細胞の方がコントロ−ルの細胞より細胞増殖能が有意に抑制されるという結果を得た（図１７参照）。ネガティブコントロ−ルとしてnon−silencing  siRNA  (Luciferase;GL2)（キアゲン、Ｊａｐａｎ社）を使用した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】プロテインチップシステムを用いた膵癌術前術後血清の典型的なprotein peak（質量６０００〜７０００Da）を示す図。上が術前、下が術後の結果を示す。
【図２】質量数６６３０Ｄａの蛋白の術前術後における発現を検討した結果を示す図。
【図３】プロテインチップシステムを用いた解析において、ｐＨを変化させた場合における結果を示す図。
【図４】プロテインチップシステムを用いた解析において、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭ〜５００ｍＭまで段階的に変化させた場合における結果を示す図。
【図５】ＨＰＬＣのｐｅａｋを示す図。
【図６】ｐｅａｋの高いＨＰＬＣ  ｆｒａｃｔｉｏｎに対しＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて解析を行った結果を示す図。
【図７】２回目のＨＰＬＣのｐｅａｋを示す図。
【図８】ｐｅａｋの高いＨＰＬＣ  ｆｒａｃｔｉｏｎに対しＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて解析を行った結果を示す図。
【図９】Ｎ末端アミノ酸配列の分析結果を示す図。
【図１０】プロテインチップシステム解析で得られた術前血清におけるＡｐｏＣ−１蛋白のpeakintensity中央値で分けた２群間をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により無再発生存期間及び生存期間の解析を行った図。
【図１１】膵癌組織、正常膵組織および膵癌細胞株のＡｐｏＣ−１遺伝子発現をRT−PCRで検討した図。
【図１２】膵癌の癌部、非癌部各１６検体の凍結標本を用いてReal−time RT−PCRを行い、ＡｐｏＣ−１mRNAを定量化した図。
【図１３】ＡｐｏＣ−１mRNA値の中央値で２群間に分けたときの悪性度との相関を示す図。
【図１４】ＡｐｏＣ−１蛋白発現を膵正常および癌組織、４つの膵癌細胞株においてWesternblot法にて確認した図。
【図１５】、免疫組織学的染色を行い、ＡｐｏＣ−１蛋白発現の膵癌組織中の発現及び局在を確認した図。
【図１６】膵癌細胞株のＡｐｏＣ−１遺伝子をＡｐｏＣ−１siRNAにより特異的に抑制し、それをReal−time RT−PCRとWestern blot法を用いて確認した図。
【図１７】ＡｐｏＣ−１の膵癌細胞株における細胞増殖への関わりをCell proliferationassayにて検討した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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