(57)【要約】  配列番号１に示される酵母野生型Ｍｐｒ１のアミノ酸配列の６３位〜６５位および１１７位に少なくとも１のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１を提供する。本発明の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１は、野生型Ｍｐｒ１と比して酸化ストレスに対してより強い耐性を有する。本発明はさらに、該変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該遺伝子にて形質転換された酵母を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される酵母野生型Ｍｐｒ１のアミノ酸配列の６３位〜６５位および１１７位に少なくとも１のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【請求項２】
少なくとも１のアミノ酸置換をアミノ酸配列の６３位〜６５位に有する、請求項１記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【請求項３】
変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１が、Ｌｙｓ６３がＡｒｇと置換されたもの、Ｐｈｅ６５がＬｅｕに置換されたもの、Ｌｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものおよびＰｈｅ６５がＬｅｕに置換されかつＬｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものからなる群から選択される、請求項１記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号１１〜１４からなる遺伝子から選択される、請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４または５記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項４または５記載の遺伝子を含む形質転換酵母。
【請求項８】
野生型Ｍｐｒ１の遺伝子が請求項４または５記載の遺伝子にて置き換えられている、請求項６記載の形質転換酵母。
【請求項９】
酵母が、実験室用酵母、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母からなる群から選択される、請求項７または８記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
酵母がサッカロミセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に属する、請求項７〜９いずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
酵母が野生型γグルタミン酸リン酸化酵素遺伝子のＡｓｐ１５４部位がＡｓｎで置換されてなるプロリン多産生型酵母である、請求項１０記載の酵母。
【請求項１２】
野生型アセチルトランスフェラーゼの配列において、Ｍｐｒ１の６３〜６５位および１１７位に対応する部位の少なくとも１のアミノ酸が置換されており、かつ野生型アセチルトランスフェラーゼより強い抗酸化能を示す変異型アセチルトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスに対してより耐性の強い、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者が先に酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Σ1278b系統株に見いだした新規遺伝子ＭＰＲ1（非特許文献１）はアミノ酸プロリンの毒性アナログであるアゼチジン−２−カルボン酸（ＡＺＣ）をアセチル化して解毒する、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｍｐｒ１）をコードしている（図１）（非特許文献２）。【０００３】
ＡＺＣはプロリンのパーミアーゼによって細胞内に入り、タンパク質合成の際にプロリンと競合して取り込まれる。その結果、構造が異常になり、機能を失ったタンパク質が蓄積し、生育が阻害される。ＭＰＲ1を発現する細胞ではＡＺＣは細胞質でＮアセチル化され、新生タンパク質に取り込まれないため、ＡＺＣ耐性を獲得すると考えられる（非特許文献３）。【０００４】
ホモロジー検索の結果、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeやS. cerevisiaeの同胞種S. paradoxusにもＭＰＲ1と同様の機能を有するホモログ遺伝子（ppr1+, Spa MPR1）を見いだしたことから（非特許文献４および５）、ＭＰＲ1は酵母に広く存在すると考えられる。しかしながら、興味深いことに酵母のゲノム解析に用いられたS. cerevisiae S288C株や清酒酵母にはＭＰＲＩは存在しない。ＭＰＲ1はΣ１２７８ｂ株の染色体１４番のサブテロメ付近に存在する。染色体１０番のサブテロメア付近にも８５番目残基だけが異なるホモログ遺伝子（ＭＰＲ２）が存在しているが、両遺伝子の機能に差はない（非特許文献１）。Ｓ２８８Ｃ株とΣ１２７８ｂ株を比較した場合に塩基置換や欠失が見られる遺伝子はあるが、Σ１２７８ｂ株にのみ存在し、かつ表現型が明確な遺伝子はＭＰＲ1以外に報告されていない。【０００５】
ＡＺＣは自然界にほとんど存在せず、ＭＰＲ1産物（Ｍｐｒ１）の本来の基質とは考えにくい。このため本発明者らは細胞内基質の同定も含めてＭｐｒ１の生理機能を解析した（非特許文献６）。まず、ＭＰＲ1・ＭＰＲ２両破壊株の細胞を過酸化水素や熱ショックなどの酸化ストレスにさらすと、野生株に比べて生存率が低下し、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）レベルが増加した。一方、ＭＰＲ１とＭＰＲ２を元々保持しないS. cerevisiae２８８Ｃ株にＭＰＲ１を多コピーで導入すると、酸化ストレス下の生存率は上昇しＲＯＳレベルも減少した。したがって、Ｍｐｒ１は細胞内の酸化レベルを低下することが示された。次に、プロリン代謝中間体Δ１−ピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）を蓄積する株（ＰＵＴ２破壊株）では、生育阻害とＲＯＳレベルの増加が観察されたため、ＰＵＴ２破壊株におけるＭｐｒ１の役割を調べた。その結果、ＰＵＴ２破壊株のＭＰＲ１とＭＰＲ２を破壊すると、生育は強く阻害され、ＲＯＳレベルも上昇したが、ＭＰＲ１を過剰発現させるとＲＯＳレベルは低下した。また、組換え酵素を用いた解析から、Ｍｐｒ１はＰ５Ｃ、またはＰ５Ｃと平衡関係にあるグルタミン酸−γ−セミアルデヒド（ＧＳＡ）をアセチル化することも判明した。以上の結果から、Ｐ５Ｃが細胞内に蓄積するとＲＯＳが生じ、細胞毒性を示すこと、およびＭｐｒ１はＰ５Ｃ／ＧＳＡのアセチル化によってＲＯＳレベルを調節し、酸化ストレスを緩和することが示唆された（図２）（非特許文献６）。【０００６】
酵母は発酵生産環境において、低温、凍結、乾燥、酸化、高浸透圧、高エタノール濃度、偏栄養など様々なストレスを受けている。このようなストレスを長時間受けると、細胞内タンパク質中の非共有結合が切断され、表面に疎水性アミノ酸が露出し、正常な構造や機能を失った「異常タンパク質」が生成するため、酵母の有用な機能が制限されてしまう。特に、酸化ストレスは熱ショックや過酸化水素、冷凍（冷凍-解凍）傷害、高エタノールなど様々な要因によって生じ、酵母細胞の生育を妨げる大きな要因となっている。発酵食品、醸造食品分野においては、酸化ストレスに対する耐性の高い酵母の育種が望まれている。【０００７】
これまでに発明者らはアミノ酸の１つであるプロリンが、冷凍や乾燥・酸化等のストレスから酵母を防御する性質を有することを見出している（特許文献１）。さらに発明者らは遺伝子工学的手法によって、プロリン分解酵素をコードする遺伝子を破壊した酵母株が細胞にプロリンを蓄積することでエタノール耐性となることを見出している（特許文献２）。【０００８】
【特許文献１】特開平９−２３４０５８号公報
【特許文献２】特開２００６−６７８０６号公報
【非特許文献１】H. Takagiら、J. Bacteriol., 182, 4249-4256 (2000).
【非特許文献２】M. Shichiriら J. Biol. Chem., 276, 41998-42002 (2001).
【非特許文献３】C. HoshikawaらProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 11505-11510 (2003).
【非特許文献４】Y. Kimuraら、Yeast, 19, 1437-1445 (2002).
【非特許文献５】M. Nomuraら J. Biochem., 133, 67-74 (2003).
【非特許文献６】M. Nomura ら Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 12616-12621 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１を改変し、抗酸化能の向上した変異型Ｍｐｒ１を得ることを目的とする。更に本発明は、該変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子にて酵母を形質転換することにより、抗酸化能の向上した酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、配列番号１に示される野生型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１のアミノ酸配列の６３位〜６５位および１１７位に少なくとも１のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１を提供する。【００１１】
本発明において「野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す」とは、変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子を導入した酵母が野生型Ｍｐｒ１を有する酵母と比して、ＡＺＣストレス、熱ショックストレス、過酸化水素ストレス、冷凍ストレスおよびエタノールストレスからなるストレスの１つ以上において、より高い耐性を示すことを意味する。これらのストレスに対する耐性は、実施例に記載のストレス感受性試験によって確認することができる。【００１２】
本発明はさらに、上記変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該遺伝子にて形質転換された酵母を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１は、野生型酵素と比して抗酸化力が高い。即ち、冷凍解凍処理や高濃度のエタノール等、種々の刺激によって加えられる酸化ストレスに対してより高い耐性を有する。従って、本発明の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１を発酵食品産業等において用いられている酵母に導入することにより、冷凍ストレスやエタノールストレスに対して、優れた耐性能力を備えた酵母が得られ、例えば長期保存可能な冷凍パン生地の開発や各種アルコール飲料の効率的生産等に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｍｐｒ１によるアゼチジン−２−カルボン酸（ＡＺＣ）のアセチル化機構を示す。
【図２】Ｍｐｒ１による酸化ストレス時の細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）レベル調節機構のモデル図である。
【図３】ＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーの構築方法を示す模式図である。
【図４Ａ】ストレス無し条件下における、ＭＰＲ１非保持および野生型ＭＰＲ１保持株の生育状況の結果を示す。
【図４Ｂ】ＡＺＣストレス下における各株の生育状況を示す。
【図４Ｃ】熱ショックストレス付与後の各株の生育状況を示す。
【図４Ｄ】過酸化水素ショック下における各株の生育状況を示す。
【図５】Ｍｐｒ１とアセチルトランスフェラーゼスーパーファミリーの一次構造を比較した図である。
【図６Ａ】変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、ストレス無し条件下における生育状況を示す。
【図６Ｂ】変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、ＡＺＣストレス下における生育状況を示す。
【図６Ｃ】変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、熱ショックストレス後の生育状況を示す。
【図６Ｄ】変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、過酸化水素ストレス下における生育状況を示す。
【図７Ａ】本発明の変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、ストレス無し条件下における生育状況を示す。
【図７Ｂ】本発明の変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、ＡＺＣストレス下における生育状況を示す。
【図７Ｃ】本発明の変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、熱ショックストレス後の生育状況を示す。
【図７Ｄ】本発明の変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、過酸化水素ストレス下の生育状況を示す。
【図７Ｅ】本発明の変異型ＭＰＲ１多コピー導入株のストレス耐性試験において、エタノールストレス下における生育状況を示す。
【図８】過酸化水素処理後の酵母の細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの変化を示す。
【図９】過酸化水素処理後の酵母の生存率の変化を示す。縦軸の生存率は対数で表示している。
【図１０】本発明の変異型ＭＰＲ１酵素を４５℃に置いた時の、酵素活性の経時変化を示す。
【図１１】本発明の変異型ＭＰＲ１酵素を過酸化水素（０．５Ｍ）存在下に置いた時の、酵素活性の経時変化を示す。
【図１２】野生型Ｍｐｒ１を導入したプロリン蓄積型酵母を過酸化水素処理した後の細胞内ＲＯＳレベルの変化を示す。
【図１３】野生型Ｍｐｒ１を導入したプロリン蓄積型酵母の過酸化水素処理後の生存率を示す。
【図１４】本発明の変異型Ｍｐｒ１を導入したプロリン蓄積型酵素の過酸化水素処理後のＲＯＳレベルを示す。
【図１５】本発明の変異型Ｍｐｒ１を導入したプロリン蓄積型酵素の過酸化水素処理後の生存率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の変異型Ｍｐｒ１は、配列番号１にて示される配列の、６３〜６５位、および１１７位の少なくとも１のアミノ酸が置換され、かつ抗酸化活性が配列番号１で示される野生型酵素のものより高いものである。【００１６】
本発明において特に好適に用いられるのは、配列番号１において６３位のリシンがアルギニンへと置換されたもの（Ｋ６３Ｒ、配列番号７）、６５位のフェニルアラニンがロイシンへ置換されたもの（Ｆ６５Ｌ、配列番号８）、１１７位のロイシンがバリンへ置換されたもの（Ｌ１１７Ｖ、配列番号９）、および６５位のフェニルアラニンと１１７位のロイシンがそれぞれロイシン、バリンへ置換されたもの（Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ、配列番号１０）が例示される。【００１７】
本発明は上記アミノ酸配列をコード化する遺伝子もまた提供する。本発明の遺伝子としては配列番号２で示される野生型ＭＰＲ１のＤＮＡ配列のうち、６３〜６５位のアミノ酸に対応するコドンおよび１１７位のアミノ酸に対応するコドンのうちの１以上が、置換されるアミノ酸をコードするように改変されているものが例示されるが、これに限定されない。具体的には配列番号７〜１０に示される変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子である配列番号１１〜１４のＤＮＡ配列が例示される。【００１８】
本発明はさらに、本発明の遺伝子を酵母に導入することにより、抗酸化能が向上された形質転換酵母を提供する。
本発明の遺伝子が導入される酵母としては特に限定的ではなく、いかなる用途のいかなる酵母であってもよい。また該酵母は内在性のＭＰＲ１もしくは同等の機能を有するそのホモログ遺伝子を有していているものであっても有していないものであってもよい。【００１９】
酵母としては例えば、清酒酵母、アルコール酵母、葡萄酒発酵酵母、パン酵母等と呼ばれる、発酵・醸造食品の製造において用いられる酵母が例示される。好適には、サッカロミセス属、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエに属する酵母が対象となる。【００２０】
本発明の方法にて形質転換される酵母としては、他の有益な性質を有するよう、別途遺伝子操作やその他の方法によって改変された酵母も挙げられる。有益な性質を有するように改変された酵母としては、例えば本願発明者による特開２００６−６７８０６に記載のプロリン分解酵素遺伝子が破壊された酵母が例示される。この酵母は細胞内にプロリンを蓄積し、その結果高いエタノール耐性を有するものである。【００２１】
酵母への遺伝子の導入は、対象となる酵母に応じて従来公知の方法のいずれを用いてもよく、特に限定されない。酵母へ遺伝子を導入する方法は例えば「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」（羊土社）、及び「生物化学実験法３９  酵母分子遺伝子実験法」（学会出版センター）等の教科書の記載に順じて行えばよい。【００２２】
具体的には、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)をＰＣＲ法等の公知の方法によって調製し、これを酵母で発現可能なプロモーターの下流に接続して遺伝子カセットを作成し、酵母発現のためのベクターとすればよい。本発明は本発明の変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子を含む係るベクターもまた提供する。【００２３】
本発明のベクターは、例えばＰＣＲにより調製された遺伝子の両端に適切な制限酵素サイトを付加し、当該制限酵素で切断し、これを別途適切な制限酵素で切断したプラスミドベクターへＤＮＡライゲースを用いて導入することによって構築することができる。プラスミドに導入されたＤＮＡは大腸菌を用いることによって容易に増幅、単離、精製が可能である。【００２４】
酵母プロモーターとしては、酵母における発現に用いることが知られているものであれば、いずれのプロモーターを用いてもよく、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＯＸ１等のプロモーターが例示される。特に好適には、ＧＡＬ１およびＡＤＨ１が例示される。【００２５】
本発明のベクターは、複製開始点、例えば２μｍＤＮＡ由来のもの、選択マーカー、例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３，ＴＲＰ１等を含んでいることが好適であり、さらに必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列等を含んでいてもよい。酵母用ベクターとして、種々の市販品があり、宿主となる酵母に応じて適宜選択すれすればよい。【００２６】
酵母が内在性のＭＰＲ１遺伝子あるいはそのホモログを有している場合には、内在性のＭＰＲ１あるいはそのホモログ遺伝子と本発明の変異型ＭＰＲ１遺伝子を置き換えても、あるいは内在性遺伝子と本発明の変異型ＭＰＲ１遺伝子とを共存させてもよい。【００２７】
内在性のＭＰＲ１あるいはそのホモログと本発明の変異型ＭＰＲ１遺伝子を共存させる場合、もしくは酵母がＭＰＲ１あるいはそのホモログを有していない場合には、自律複製するプラスミドベクターを用いて形質転換を行えばよい。自律複製するプラスミドベクターとしては、例えば実施例で用いたｐＡＤ４（ＬＥＵ２マーカー）やｐＹＥＳ２（ＵＲＡ３マーカー）等の２μｍプラスミド由来の複製開始点を有しているベクターが例示される。【００２８】
酵母染色体の内在性ＭＰＲ１を、本発明の変異型Ｍｐｒ１をコードする遺伝子で置き換える場合には、酵母における選択マーカー遺伝子を含むが、自律複製配列を持たないプラスミドベクターを用いればよい。かかるベクターを用いると、染色体上のＭＰＲ１もしくはそのホモログ配列とプラスミドの配列が相同組み換えを起こし、プラスミドが染色体ＤＮＡに挿入されたものが形質転換体として得られる。かかるプラスミドベクターとしては市販のものが知られており、Ｓｔｒａｔａｇｅｎe社のｐＲＳ４０５（ＬＥＵ２マーカー）、pＲＳ４０６（ＵＲＡ３マーカー）などが例示される。かかるプラスミドベクターを用いる場合には、予めＭＰＲ１の内部をユニークな制限酵素で１個所切断し、直鎖状にしたプラスミドを用いて形質転換すればよい。【００２９】
本発明はまた、野生型アセチルトランスフェラーゼの配列において、Ｍｐｒ１の６３〜６５位および１１７位に対応する部位の少なくとも１のアミノ酸が置換されており、かつ野生型アセチルトランスフェラーゼより強い抗酸化能を示す変異型アセチルトランスフェラーゼ、および該変異型アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、および該遺伝子にて形質転換された酵母を提供する。【００３０】
特に好適な例としては、野生型アセチルトランスフェラーゼのＭｐｒ１の６３位に対応する部位のアミノ酸がアルギニンであるもの、６５位に対応する部位のアミノ酸がロイシンであるもの、および１１７位に対応する部位のアミノ酸がバリンであるものが示される。【００３１】
ここで野生型アセチルトランスフェラーゼとしては、アセチルトランスフェラーゼスーパーファミリーに属する酵素、特にS.ｐaradoxus、Schizosaccharomyces pombeに存在するＭＰＲ１ホモログ遺伝子（Spa MPR1、ppr1+)（配列番号４および６）によりコードされる酵素（配列番号３および５）が例示されるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００３２】
本発明者は、ＭＰＲ１遺伝子へランダム変異を導入した遺伝子を調製し、これをＭｐｒ１非保持酵母に導入した。得られた形質転換酵母から、熱ショックストレス、ＡＺＣストレスおよび過酸化水素ストレスに対して野生株より高い耐性を示すクローンをスクリーニングし、本発明の高機能化アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１を得た。【００３３】
実験材料と方法
１）  材料
ｉ）  菌株
<出芽酵母  Saccharomyces cerevisiae>
S288C 系統株
CKY8  (MATα ura3-52 leu2-3,112 )
CKY263  (MATa ura3-52 leu2-3,112 GAL )
(Chris A. Kaiser（Massachusetts Institute of Technology）から分譲)【００３４】
<大腸菌  Escherichia coli>
JM109：
recA1 end1 gyrA96 thi1 hsdR17 sup E44 relA1
Δ(lac-proAB)/F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ ΔM15]
（タカラバイオより購入）【００３５】
DH5α：
F−λ- φ80lac Z ΔM15 Δ(laczYA-argF)U169 deoR
recA1 endA1 hsdR17(rK- mK+) supE44 thi-1 gyrA96
（タカラバイオより購入）【００３６】
（ｉｉ）プラスミド
ｐＡＤ４（九州工業大学  仁川純一先生から分譲）
２μｍＤＮＡの複製起点、酵母での選択用マーカーＬＥＵ２、およびＥ．ｃｏｌｉでの複製起点、選択用マーカーのアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。また、マルチクローニングサイトの上流にＡＤＨ１プロモーター、下流にＡＤＨ１ターミネーターが存在している。【００３７】
ｐＹＥＳ２(Invitrogen社から購入)
２μｍＤＮＡの複製起点、酵母での選択用マーカーＵＲＡ３、およびＥ．  ｃｏｌｉでの複製起点、選択用マーカーのアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。また、マルチクローニングサイトがＧＡＬ１プロモーター下流に存在しており、転写終結シグナルはＣＹＣ１遺伝子に由来する。【００３８】
ｐＭＨ１  （発明者が構築）
ｐＹＥＳ２のＢａｍＨＩサイトにＭＰＲ１のゲノミックＤＮＡを含むＳａｕ３ＡＩ断片（約５．４ｋｂ）を組み込んだプラスミド。ＭＰＲ１のゲノミックＤＮＡは非特許文献１に記載のとおり、ＡＺＣ耐性変異株であるＦＨ５０６のゲノミックＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで消化することによって得られた。【００３９】
ｐＡＤ−ＭＰＲ（発明者が構築）
ｐＡＤ４のＨｉｎｄIII−ＳａｃＩサイトにＭＰＲ１のＯＲＦ  を含むＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ断片（約７００ｂｐ）を組み込んだプラスミド。ＭＰＲ１がグルコース存在下でＡＤＨ１プロモーターによって強制的に発現する。【００４０】
ｐＧＡＬ−ＭＰＲ（発明者が構築）
ＭＰＲ１のゲノミックＤＮＡからＭＰＲ１のＯＲＦを含むＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩ断片（約９３０ｂｐ）を切り出し、ｐＹＥＳ２のＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩサイトに組み込んだプラスミド。ＭＰＲ１がガラクトース存在下でＧＡＬ１プロモーターによって強制的に発現する。【００４１】
２）  培地
ＹＰＤ培地  （酵母用完全培地）
【表１】
2008007475.tif 000002
【００４２】
ＳＤ培地  （（ＮＨ４）２ＳＯ４が窒素源の酵母用最少培地）
【表２】
2008007475.tif 000003
【００４３】
ＳＧ培地  （（ＮＨ４）２ＳＯ４が窒素源、ガラクトースが炭素源の酵母用最少培地）
【表３】
2008007475.tif 000004
【００４４】
ＳＣ培地  （ＳＤ培地に合成に必要な物質を添加した酵母用完全合成培地）
【表４】
2008007475.tif 000005
*Drop-out mixtureは、下記のアミノ酸混合物より必要に応じて特定のアミノ酸を取り除き、残りをよく混合したもの。【００４５】
【表５】
2008007475.tif 000006
【００４６】
なお、これらの培地には必要に応じて寒天（２％）および／または栄養源（ウラシル、ロイシン等）を添加した。また、酵母の培養は３０℃で行った。液体培地にて酵母を培養する場合、アルミキャップを用いた試験管、もしくはシリコ栓を用いた坂口フラスコで培養した。【００４７】
LB培地(大腸菌用完全培地)
【表６】
2008007475.tif 000007
なお、必要に応じてアンピシリン（Amp）（５０μｇ/ml）、寒天（２％）を添加した。【００４８】
３）  ＤＮＡ  オリゴマー
本研究に用いたDNAオリゴマーの合成は、北海道システムサイエンス社およびオペロン社に依頼した。以下にそれらの名称と配列を示す。
143(+)-9              20mer  
5’-GCT CGA GAA GCT TCG AAT GC-3’（配列番号１５）
143(-)-4              22mer
5’-CGA CGC GTC GTT ATT CGT TCT T-3’  （配列番号１６）
F65L(+)             45mer
5'-attaactatctttttaaattgcttaatttggaaattgaaagtggc-3'  （配列番号１７）
F65L(-)             45mer
5'-gccactttcaatttccaaattaagcaatttaaaaagatagttaat-3'  （配列番号１８）
L117V(+)            45mer
5'-attaactatctttttaaattgcttaatttggaaattgaaagtggc-3'  （配列番号１９）
L117V(-)            39mer
5'-cttgatgtagaatgtgcccaggagaactgaattccagtc-3'  （配列番号２０）
pYES2(++)           20mer
5'-GTT ACA TGC GTA CAC GCG TC-3’  （配列番号２１）
pYES2(-)            21mer
5'-GGA TCG GAC TAC TAG CAG CTG-3’  （配列番号２２）
pAD4(++)            20mer
5'-TCG TCA TTG TTC TCG TTC CC-3’  （配列番号２３）
pAD4(-)             21mer
5'-GTT TTA AAA CCT AAG AGT CAC-3’  （配列番号２４）
HindIII-MPR(+)      26mer
5'-GGC CAA GCT TAG ATG GAT GCG GAA TC-3’  （配列番号２５）
SacＩ-MPR(-)        30mer
5'-CCC CGA GCT CTG TCT ATG ATT ATT CCA TGG-3'  （配列番号２６）【００４９】
４）ストレス感受性テスト
各菌株を液体培地で対数増殖期まで３０℃で培養した。得られた培養液を１００〜１０４倍まで段階的に希釈し、２μｌをＳＤまたはＳＧ寒天培地上へスポッティングした。スポッティングした培地を各ストレス条件下で培養した。【００５０】
（ｉ）ＡＺＣストレス
０．５〜１mg／mlのＡＺＣ濃度に調整したＳＤまたはＳＧ寒天培地に２μＬの培養液をスポッティングし、３０℃で培養した。
（ii）熱ショックストレス
ＳＤまたはＳＧ寒天培地に２μｌの培養液をスポッティングした後、５０℃で１〜２時間熱ショックを与え、その後３０℃で培養した。
（iii）過酸化水素ストレス
１〜２ｍＭの過酸化水素濃度に調整したＳＤまたはＳＧ寒天培地に２μｌの培養液をスポッティングし、２０℃で培養した。
（ｉｖ）エタノールストレス
５〜１０％のエタノール濃度に調整したＳＤまたはＳＧ寒天培地に２μｌの培養液をスポッティングし、２０℃で培養した。
５）Ｅｒｒｏｒ‐ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によるＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーの構築
以下の組成でＰＣＲ反応を行うＥｒｒｏｒ‐ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法でＭＰＲ１遺伝子断片を増幅した。なおＰＣＲ反応キットはPｒｏｍｅｇａ社製を用いた。
2008007475.tif 000008
*dNTP mix
dNTPに含まれる塩基A,G,C,Tのいずれかの濃度バランスを1/3または1/5まで落として混合した。dATP,dTTPについては1/3、dCTP,dGTPについては1/5の低濃度で反応を行った。
例）dATPを1/5にした場合
【表８】
2008007475.tif 000009
【００５１】
Ｅｒｒｏｒ‐ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲでランダム変異を導入したＭＰＲ１遺伝子断片（約９３０ｂｐ）は、ＰＣＲ産物を内在性のＨｉｎｄIII、ＭｌｕIサイトで切断したのち、アガロースゲル電気泳動し、ゲルから抽出することによって得られた。ＤＮＡ断片のアガロースゲルからの抽出にはQIAEX II Agarose Gel Extraction kit（QIAGEN社）を用いた。このようにして得た変異ＭＰＲ１遺伝子断片をｐＹＥＳ２のＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩサイトに組み込み、約６０，０００の形質転換コロニーからプラスミドを調製して、ＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーを作製した（図３）。次に、ＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーを用いて、Saccharomyces cerevisiaeのS288C 系統株に導入した。【００５２】
６）Ｆ６５Ｌ変異およびＬ１１７Ｖ変異を有する変異型ＭＰＲ１遺伝子保持株の作製
F65LおよびL117V各々の変異体遺伝子はｐAD4-MPRを鋳型として、部位特異変異導入PCR法により作製した。
Quik Change（登録商標） SL Site-Directed Mutagenesis Kitを使用し、以下の組成と反応条件でPCR反応をおこなった。【００５３】
（組成）
【表９】
2008007475.tif 000010
dH2Oでトータル 50μlに調整し、pfuTurbo DNA polymerase(2.5U/μl)を1μl加えてPCR反応させる。【００５４】
PCR反応条件：
95℃ 1分→[95℃ 50秒→ 60℃ 50秒→62℃ 9分]ｘ18サイクル→68℃ 7分→4℃ ∞【００５５】
PCR後の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、690b部分のバンドを切り出し、QIAquik gel extraction kit （QIAGEN）を用いて精製を行なった。
精製したDNA断片をHindIII、SacIで制限酵素処理後、同じく制限酵素処理したｐAD4ベクターのマルチクローニングサイトにライゲーションさせた。
このようにして得た変異ＭＰＲ１遺伝子断片をｐＡＤ４のＨｉｎｄIII−ＭｌｕＩサイトに組み込み、Saccharomyces cerevisiaeのS288C 系統株に導入した。【００５６】
７）  過酸化水素処理後の細胞生存率の測定
各菌株を２ｍｌのＳＣ−Ｌｅｕ培地およびＳＤ培地に植菌し、３０℃で対数増殖期まで振とう培養した。３，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎの遠心分離により集菌した。得られた細胞をＯＤ６００が１．０になるように４ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁した。この細胞懸濁液に過酸化水素を最終濃度３ｍＭあるいは６ｍＭとなるように添加し、３０℃で振とうさせた。過酸化水素未処理(０時間)および処理開始から２時間、４時間後にそれぞれ１ｍｌずつの細胞懸濁液を取ってマイクロチューブに分注した。細胞懸濁液を段階的に希釈し、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。その後３０℃で培養し、過酸化水素０時間後のサンプルから生育してきたコロニーの数を１００％として、各生存率を算出した。【００５７】
８）  過酸化水素処理後の細胞内ＲＯＳレベルの測定
細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを測定するために、細胞内酸化感受性プローブとして２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）  (Molecular Probes  社)を使用した。Ｈ２ＤＣＦＤＡは細胞内エステラーゼによって酵素的に脱アセチル化され、ＤＣＦＨに変換される。その後、ＲＯＳによって酸化され、高度の蛍光物質ＤＣＦを生じるため、その蛍光強度を蛍光分光光度計により測定した。【００５８】
５０ｍｌのＳＣ−Ｌｅｕ培地およびＳＤ培地で対数増殖期まで培養した菌体を滅菌水で遠心洗浄後、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）にＯＤ６００＝１．０になるように懸濁した。この懸濁液４０ｍｌに５ｍＭ  Ｈ２ＤＣＦＤＡを最終濃度０．０１ｍＭになるように添加して、３０℃で１５ｍｉｎインキュベートした後、３００ｍＭ過酸化水素を最終濃度３ｍＭあるいは６ｍＭになるように添加し、３０℃で振とうさせた。過酸化水素未処理（０分）および開始から３０分、６０分後において、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）により菌体を回収した。回収した菌体は滅菌水で洗浄し、５００μｌの滅菌水に懸濁した。この菌体懸濁液に、ガラスビーズ（０．５ｍｍ）を加え、マルチビーズショッカー（安井器械社製、ＭＢ６０１Ｕ）を用いて、菌体を破砕し（１分オン、１分オフ、５サイクル、０℃）、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分）後の上清を回収した。この上清５０μｌと滅菌水４５０μｌの混合液に５０４ｎｍの励起波長を照射し、放出された蛍光波長（５２４ｎｍ）を蛍光分光光度計（日立社製、Ｆ４５００）で測定した。【００５９】
菌体破砕液の上清のタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ社のタンパク質定量試薬を用いて定量し、細胞内ＲＯＳレベルをタンパク質（ｍｇ）あたりの蛍光強度として次の式のように表した。【００６０】
【数１】
2008007475.tif 000011
なお、結果は０分の蛍光強度を１００％とし、これに対する相対蛍光強度により示した。【００６１】
９）Ｍｐｒ１酵素の精製
ＪＭ１０９をＭ９ＣＡ（ＣＡ：0.2％）培地5ｍｌに植菌し、OD600＝0.7になるまで37度で培養を行なう。IPTGを最終濃度0.1ｍMになるように添加し18℃でさらに18時間培養する。培養後、氷冷し、遠心（8000rpmで5分）により集菌したものにLysis bufferを加え、洗菌する。遠心（8000rpmで5分）し、5ｍｌのLysis bufferを加え、懸濁する。これを超音波破砕し、15000rpmで10分間遠心分離する。上清をlysis bufferで平衡化したNi-NTA column（QIAGEN 樹脂懸濁液２ｍｌを使用）にかける。素通り画分を回収し、wash buffer10ｍｌで洗浄し、また画分を回収した。さらに5ｍｌのelution bufferで溶出したものを精製酵素として用いた。【００６２】
１０）酵素活性の測定
精製された野生型Ｍｐｒ１およびK63R,F65L/L117V,F65L,L117V−変異型Ｍｐｒ１について、酵素活性を測定した。酵素活性は5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)法によって測定した。アセチルCoAおよびAZCを基質としたMpr1の酵素反応ではCoAを生じるが、このCoAはSH基と反応して412 nmで強い吸光を示すTNBを生成することを 利用している。
1ｍMのDTNB溶液、Mpr1（約0.6〜0.2μg／ml）、0.025ｍM〜0.15ｍMのアセチルCoAあるいは0.5ｍM〜5ｍMのAZCを含む反応液を30℃で、412ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化（ABS）を測定した。基質各濃度(S)あたりのΔABS/min（反応速度）を求め、Michaelis-Mentenの変換式（式１）のグラフ([S]/v-[S]プロット)を作り、Ｋｍ、Ｖｍａｘを求めた。
[S]/v = 1/v[S]+Km/V・・・（式１）【００６３】
１１）酵素安定性の測定
野生型Ｍｐｒ１およびＫ６３Ｒ，Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ，Ｆ６５Ｌ，Ｌ１１７Ｖの変異型Ｍｐｒ１について、以下のようにして温度安定性の解析を行なった。精製した酵素を４５℃ウォーターバスにてインキュベートし、５分ごとに取り出しDTNB法にてΔABSを測定した。インキュベート開始０分の時の酵素の４１２nmにおける吸光度を100％としたときの、各処理時間ごとの残存活性（％）を計算し、横軸を処理時間、縦軸を残存活性（％）としたグラフを作成し、野生型酵素との安定性の比較を行なった。
また、過酸化水素安定性の解析も行なった。過酸化水素処理は0.5Mの濃度で行い、その後２５℃ウォーターバスでインキュベートし、熱安定性の測定と同様に残存活性を算出した。【００６４】
１２）プロリン蓄積型酵母へのＭｐｒ１の導入
発明者らは先に、配列番号２８に示すプロリン合成酵素（ＰＲＯ１：γグルタミンリン酸化酵素、Li W.,and Brandriss CM., J. Bacteriol., 174, 4148-4156, 1992, NCBI accession # M85293）のＡｓｐ１５４をＡｓｎへと置換することによって、酵母中へプロリンを蓄積させることができることを開示した（特開２００４−２５１４６６）。このプロリン蓄積型酵母へ、本願発明の変異型Ｍｐｒ１をさらに組み込んだ酵母の抗酸化能について調べた。
INVDput1（InvSc1酵母(Invitrogen社より購入)をベースに、PUT1遺伝子をHIS3遺伝子で置換したもの。 Terao Y., et al., Applied and Environmental Microbiology, 2003, Vol.69, No. 11, pp6527-6532）を、野生型γグルタミン酸リン酸化酵素の154位のアスパラギン酸（D）がアスパラギン（N）に置換された変異PRO1をコードする遺伝子を組み込んだｐUV2ベクター（ｐUV−D154Npro1）、および野生型PRO2遺伝子を組み込んだｐTV3ベクター（ｐTV-PRO2）で形質転換した（InvDput1(pUV-D154Npro1)(pTV-PRO2)；以下、単に“プロリン蓄積型酵母”という）。プロリン蓄積型酵母のセレクションはSD培地にロイシンを添加した選択培地によって行なった。
上記６）と同様の方法にて野生型Mpr1及び各変異型Mpr1遺伝子を組み込んだｐAD4ベクター（各々、pAD-Mpr1(WT), pAD-MPR1-K63R, pAD-Mpr1-F65L, pAD-Mpr1-L117Vという）を調製し、プロリン蓄積型酵母をこのベクターで各々形質転換し、各種プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株を得た。これらの形質転換酵母はロイシンを含まないSD培地で培養することでセレクションした。【００６５】
１３）プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株の細胞内プロリン含有率の測定
プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株内のプロリン含有率は、公知の方法により測定できる。具体的には、酵母培養液の乾燥重量に対するプロリンの量の比率で求められる。
酵母の乾燥重量は、5ｍｌのSD培地で30℃、60時間培養した後の培養液の600nmにおける吸光度（OD600）を測定し、以下の式（２）によって算出した。
培養液５ｍｌあたりの乾燥重量（ｇ）＝OD600の値／978.45    ---式（２）【００６６】
プロリンの含有量は、アミノ酸アナライザー（JEOL社製  AminoTac）によって測定した。まず、各酵母株を5ｍｌのSD培地で30℃、60時間培養した後4,000rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。生理食塩水で２回洗浄後、細胞を0.5ｍｌの滅菌水に懸濁し、100℃で10分間の熱水処理を行なった。12,000rpmで5分間遠心し、採取した上清100μｌを0.02N  HClで2~5倍希釈し、フィルター滅菌後アミノ酸アナライザーで測定した。標品として１ｍｌのアミノ酸混合標準液（各アミノ酸2.5μmol/mlを含有する）をフィルター滅菌したものを用いた。
プロリン蓄積型―Mpr導入株について生存率やROS量の測定を行う際には、上記のようにしてプロリンの含有量を算出し、野生型酵母と比較して、プロリンが蓄積されていることを確認した。野生型酵母におけるプロリン含有量が酵母乾燥重量に対して平均0.014%程度であるのに対し、プロリン蓄積型酵母およびプロリン蓄積型―Mpr導入株ではその約40〜60倍のプロリンの蓄積が起こっている。
【００６７】
１４）プロリン蓄積型−Ｍｐｒ１導入株の過酸化水素処理後のＲＯＳレベルの測定
上記８）と同様の方法によって、過酸化水素処理後のＲＯＳレベルを測定した。【００６８】
１５）プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株の過酸化水素処理後の生存率の測定
前述の方法を用いて、各種プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株を最終濃度６ｍＭの過酸化水素で処理し、生存率を測定した。【００６９】
１６）プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株の各種ストレス耐性測定
前述と同様にして、各種プロリン蓄積型―Ｍｐｒ１導入株をＳＧ＋Ｌｅｕ培地あるいはＳＤ培地に段階希釈してスポッティングし、ＡＺＣストレス下とエタノールストレス下での生存率を調べた。【００７０】
１７）  その他
大腸菌からのプラスミド調製には、アルカリＳＤＳ法をベースにしたQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いた。その他、大腸菌の形質転換、ＤＮＡの制限酵素による切断、連結などの遺伝子操作は「バイオマニュアルシリーズＩ  遺伝子工学の基礎技術」（羊土社）、及び「バイオ実験イラストレイテッド」（秀潤社）に、酵母の取り扱いや遺伝子操作は「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」（羊土社）、及び「生物化学実験法３９  酵母分子遺伝子実験法」（学会出版センター）に準じた。【００７１】
［結果］
１）Ｍｐｒ１のストレス耐性確認
Ｍｐｒ１は、ＡＺＣのアセチル化による無毒化のほかに、熱ショックや過酸化水素処理によって細胞内に生じる活性酸素種  （ＲＯＳ）  のレベルを下げて、酵母を酸化ストレスから保護していることが報告されている。まず始めにＭｐｒ１保持株がＭｐｒ１非保持株に比べて、ストレス耐性およびＡＺＣ耐性が高いかをストレス感受性テストで確認した。ＭＰＲ１およびＭＰＲ２を保持していない  S. cerevisiae  Ｓ２８８Ｃ  系統株  （ＣＫＹ８）にｐＡＤ４（ベクター）、ｐＡＤ−ＭＰＲ（インサートにＭＰＲ１のＯＲＦのみを含み、ＡＤＨ１プロモーターで強制的に発現させるプラスミド）、またはｐＭＨ１（ＭＰＲ１のＯＲＦを含む５．４ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片を有し、ＭＰＲ１自身のプロモーターで発現を調節するプラスミド）を導入した。その後、スポットによるストレス感受性テストを行った。結果を図４に示す。ＭＰＲ１・ＭＰＲ２非保持株（ｐＡＤ４）に比べて、ＭＰＲ１保持株（ｐＡＤ−ＭＰＲおよびｐＭＨ１）はＡＺＣおよび５０℃  の熱ショック、過酸化水素（２ｍＭ）ストレスに対して耐性を示した。【００７２】
２）  高機能化Ｍｐｒ１のスクリーング
高機能化Ｍｐｒ１保持株を取得するため、スクリーングを行った。スクリーニングは、ＣＫＹ２６３にＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーを導入して得た形質転換株について行った（変異ＭＰＲ１多コピー導入株）。ネガティブコントロールとしてはＣＫＹ２６３にｐＹＥＳ２を導入したもの（ＭＰＲ１・ＭＰＲ２非保持株）を用い、コントロールには同菌株にｐＧＡＬ−ＭＰＲを導入したもの（ＭＰＲ１多コピー導入株）を用いた。【００７３】
ｉ）ＡＺＣストレス
ＡＺＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｌ含有ＳＧ＋Ｌｅｕ培地にて培養した。ネガティブコントロールであるＭＰＲ１・ＭＰＲ２非保持株のみならず野生型ＭＰＲ１多コピー導入株でも著しく生育の遅れが示された。ランダム変異導入株において野生型ＭＰＲ１多コピー導入株より生育が早いクローンを選択した。その結果、約９１，０００個の形質転換体から、２９個のＡＺＣ耐性クローンが取得された。得られたクローンから、導入した変異ＭＰＲ１遺伝子の変異部位をシークエンスにより特定したところ、３種類の変異型Ｍｐｒ１（Ｋ６３Ｒ，Ｇ１４２Ｓ，Ｑ１７９Ｒ）が取得された。【００７４】
ｉｉ）過酸化水素刺激耐性
過酸化水素濃度３ｍＭ含有ＳＧ＋Ｌｅｕ培地にて培養した。この条件は、ネガティブコントロールであるＭＰＲ１・ＭＰＲ２非保持株のみならず野生型ＭＰＲ１多コピー導入株でもコロニーが形成されない。ＭＰＲ１ランダム変異ライブラリーによる形質転換株を同条件にて培養し、約６６，５００個の形質転換株より、５個の過酸化水素耐性が向上したクローンを取得し、変異を特定したところ、4種類の変異型Ｍｐｒ１（Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ，Ｉ１８４Ｍ，Ｅ２２４Ｖ）が取得された。【００７５】
上記スクリーニングで得られた各変異型Ｍｐｒ１および野生型Ｍｐｒ１と相同性が高い他のアセチルトランスフェラーゼと一次構造を比較し、得られた変異型Ｍｐｒ１の変異点を確認した。図５にその結果を示す。Ｇ１４２Ｓ−Ｍｐｒ１はアセチルＣｏＡ結合コンセンサス配列を含むモチーフＡ内での置換であり、Ｑ１７９Ｒ、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ，Ｉ１８４Ｍ−Ｍｐｒ１もアセチルトランスフェラーゼスーパーファミリーに保存されている特徴的な配列内での置換であることが確認された。【００７６】
スクリーニングにて取得された変異型Ｍｐｒ１クローンからプラスミド（変異型ｐＧＡＬ−ＭＰＲ）を抽出した。ｐＧＡＬ−ＭＰＲでＭＰＲ１遺伝子を強制的に発現させるためには、Ｃ源をガラクトースとした培地で発現を誘導する必要があり、増殖スピードが遅く、生育が安定しない。増殖の効率を上げるため、グルコースで発現を誘導するｐＡＤ４ベクターに変異型ＭＰＲ１を組み込んだ各種変異型ｐＡＤ４−ＭＰＲ１を作製した。ｐＡＤ４−ＭＰＲ１-Ｋ６３ＲおよびｐＡＤ４−ＭＰＲ１−Ｆ６５Ｌ/Ｌ１１７ＶはＭＰＲ−Ｋ６３ＲとｐＧＡＬ-ＭＰＲ-Ｇ６５Ｌ/Ｌ１１７Ｖを鋳型にして、各々の変異型ＭＰＲ１のＯＲＦをＰＣＲで増幅し、ｐAD4のHindIII-SacIサイトに組み込んで作製した。ｐＡＤ４−ＭＰＲ１−Ｆ６５ＬおよびｐＡＤ４−ＭＰＲ１−Ｌ１１７ＶはｐＡＤ４−ＭＰＲを鋳型とした部位特異的変異導入ＰＣＲ法によって増幅した変異遺伝子断片をHindIIIおよびSacIで制限酵素処理し、ｐＡＤ４のHindIII-SacIサイトに組み込んで作製した。ＣＫＹ８株を変異型pＡＤ-ＭＰＲ1で形質転換し、ストレス感受性テストを行った。まず、野生型ＭＰＲ１多コピー導入株とＫ６３Ｒ-変異型ＭＰＲ１導入株、およびＦ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１導入株をＳＤ＋Ｕｒａ培地で各形質転換体を対数増殖期まで培養し、その培養液を段階的に希釈した後、培地にスポットした。【００７７】
結果を図６に示す。ＡＺＣストレスによるスクリーニング系で取得したＫ６３Ｒ−Ｍｐｒ１導入株がＡＺＣ（１ｍｇ／ｍｌ）、熱ショック（２時間）、過酸化水素ストレス（２ｍＭ）のすべてにおいてコントロールである野生型ＭＰＲ１多コピー導入株（ｐＡＤ−ＭＰＲ１）より高い耐性を示した。特に、過酸化水素刺激（２ｍＭ）に対する耐性は著しく高かった。過酸化水素ストレス誘導培地を用いたスクリーニング系で取得したＦ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ、Ｅ２２４Ｖ  −Ｍｐｒ１については、ＡＺＣストレスに対する耐性の向上は認められなかったが熱ショック、過酸化水素で耐性が向上する傾向が見られた。この結果を踏まえ、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１としてＫ６３ＲおよびＦ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖを選択し、その抗酸化能をさらに解析した。【００７８】
３）高機能化候補変異  Ｍｐｒ１の解析
（ｉ）変異型Ｍｐｒ１の酸化ストレス下におけるスポット解析
Ｋ６３Ｒ−変異型Ｍｐｒ１、および、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１と野生型のＭＰＲ１の多コピー導入株におけるストレス耐性を、ＡＺＣ（１ｍｇ／ｍｌ）、熱ショック（５０℃、１．５時間）、過酸化水素（１ｍＭ）、エタノール（５％）の各ストレス条件下におけるスポット感受性テストにて調べた。【００７９】
使用した菌株はネガティブコントロールとしてＣＫＹ８にｐＡＤ４を導入したもの（ＭＰＲ１・ＭＰＲ２非保持株）、コントロールとして同菌株にｐＡＤ−ＭＰＲを導入したもの（ＭＰＲ１保持株）、及び同菌株に変異型ｐＡＤ−ＭＰＲを導入したものを用いた。各菌株をＳＤ＋Ｕｒａ液体培地で対数増殖期まで培養した後、段階的に希釈し、２μｌを各ストレスＳＤ＋Ｕｒａ寒天培地にスポッティングし、「実験材料と方法」に記載したプロトコルに従って培養し、各ストレスに対する感受性（耐性）を調べた。【００８０】
結果を図７に示す。ＡＺＣストレスによるスクリーニング系で取得したＫ６３Ｒ変異型ＭＰＲ１導入株（ｐＡＤ−ＭＰＲ−Ｋ６３Ｒ）は、野生型ＭＰＲ１と比較して、すべてのストレス条件下（ＡＺＣ、熱ショックおよび過酸化水素）で顕著に高い耐性を示した。過酸化水素のスクリーニング系で取得したＦ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ変異型ＭＰＲ１(ｐＡＤ-ＭＰＲ-Ｆ６５Ｌ/Ｌ１１７Ｖ)については、ＡＺＣ、熱ショック、エタノールストレスに対する耐性は野生型ＭＰＲ１とほとんど差が認められなかったが、過酸化水素ストレスに対しては野生型と比べて強い耐性を示した。【００８１】
（ｉｉ）変異Ｍｐｒ１のＨ２Ｏ２処理後の生存率比較
ＣＫＹ８株を野生型ＭＰＲ１および変異型ＭＰＲ１（Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ、Ｆ６５ＬおよびＬ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１）で形質転換した株における過酸化水素処理後の細胞生存率を調べた。実験方法については「実験材料と方法」に記載のごとくＯＤ６００が１．０になるようにリン酸カリウムバッファーに調整して、最終濃度３ｍＭ（Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ/Ｌ１１７Ｖ）あるいは６ｍＭ（Ｆ６５Ｌ、Ｌ１１７Ｖ）過酸化水素水で各時間処理後、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。その後、過酸化水素０時間後のコロニーの数を１００％として、各生存率を算出した。3ｍＭ過酸化水素処理の結果を図８に示す。【００８２】
野生型ＭＰＲ１多コピー導入株（ｐＡＤ−ＭＰＲ）はＭＰＲ１非導入株（ｐＡＤ４）に比べて、生存率の低下が過酸化水素処理２時間まで低く抑えられていた。そしてさらに、変異型ＭＰＲ１多コピー導入株（Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１）は、野生型ＭＰＲ１多コピー導入株（ｐＡＤ−ＭＰＲ）に比べ、より一層強く生存率の低下が抑えられた。特に、Ｋ６３Ｒ−Ｍｐｒ１については野生型に比べて、著しく生存率の低下が抑制されていた。また、Ｆ６５Ｌ、Ｌ１１７Ｖ-変異型Ｍｐｒ１多コピー導入株においても生存率が上昇していた（data not shown）。
【００８３】
（ｉｉｉ）変異Ｍｐｒ１のＨ２Ｏ２処理後の細胞内ＲＯＳレベルの変化
続いて、ＣＫＹ８株において変異型Ｍｐｒ１が過酸化水素処理後のＲＯＳのレベルの上昇に及ぼす影響を野生型Ｍｐｒ１と比べた。細胞内ＲＯＳのレベルについては、細胞内酸化物感受性プローブであるＨ２ＤＣＦＤＡを用いて調べた。Ｈ２ＤＣＦＤＡは、主に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシルラジカル（ＨＯＯ・）、ペルオキシニトライトアニオン（ＯＮＯＯ−）を検出することができる。まず、各菌株を対数増殖期まで培養し、リン酸カリウムバッファーにＯＤ６００＝１．０になるように調整した後、「実験材料と方法」に記載のごとくＨ２ＤＣＦＤＡを添加し、過酸化水素処理後の細胞内ＲＯＳのレベルを測定した。【００８４】
Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ/Ｌ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１多コピー導入株結果を表10および図９に示す。野生型ＭＰＲ１多コピー導入株（ｐＡＤ−ＭＰＲ）はＭＰＲ１非導入株（ｐＡＤ４）に比べて、過酸化水素処理後の細胞内のＲＯＳレベルの上昇が低く抑えられていた。Ｋ６３Ｒ変異型Ｍｐｒ１は、野生型ＭＰＲ１多コピー導入株と比べて、過酸化水素６０分処理後のＲＯＳレベルの上昇が約２４％低く抑えられていた。Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ変異型Ｍｐｒ１については、野生型ＭＰＲ１多コピー導入株と比べて生存率の低下は抑えられたが、ＲＯＳレベルはＭＰＲ１非導入株と同等であった。Ｆ６５Ｌ、Ｌ１１７Ｖ-変異型Ｍｐｒ１多コピー導入株について６ｍＭの過酸化水素処理後のＲＯＳレベルを調べたところ、両株とも細胞内ＲＯＳレベルが低下していた（data not shown）。【００８５】
【表１０】
2008007475.tif 000012
【００８６】
上記のとおり、Ｋ６３Ｒ、Ｆ６５Ｌ、Ｌ１１７Ｖ−変異型Ｍｐｒ１を導入した株では、野生型Ｍｐｒ１導入株よりＲＯＳレベルが減少し、生存率の低下も著しく抑えられ、酸化ストレス耐性の向上が認められた。即ち酸化ストレス（過酸化水素ストレス）条件下で、ＲＯＳレベルの制御効率を上げ、それによって、さらに生存率の低下を抑制していると考えられる。また、Ｆ６５Ｌ／Ｌ１１７Ｖ変異型Ｍｐｒ１についても、酸化ストレス耐性が向上する傾向が見られた。
上記２つの変異型酵素のアミノ酸置換部位（Ｋ６３Ｒ，Ｆ６５Ｌ）は一次構造上、近接していることから、配列番号１のアミノ酸配列において６３〜６５位がＭｐｒ１の抗酸化能において重要であることが示される。【００８７】
４）変異型酵素の触媒活性と安定性
野生型と各変異型のMpr1酵素を精製し、AZCおよびアセチルCoAを基質とした場合の触媒活性と熱および過酸化水素処理に対する安定性を測定した。結果を表１１、図１０、及び表１２に示す。
キネティクスの解析から（表１１、変化を矢印で示す）、K63R変異型Mpr1は基質であるAZC、アセチルCoAの双方に対するKm値が低下し、触媒活性が上昇していることがわかった。また、F65L変異型Mpr1はAZCに対するKm値が低下し、触媒活性が上昇していた。
L117V変異型Mpr1はアセチルCoAに対するKm値が低下し、触媒活性が上昇していた。さらに、F65L/L117V二重変異型Mpr1は野生型と同等の触媒活性を示した。
45℃条件下の温度安定性を測定したところ（図１０）、F65L/L117V、F65L各変異型Mpr1が野生型以上の安定性を示した。K63R変異型Mpr1は野生型と同等の安定性であり、L117V変異型Mpr1は野生型よりも安定性が低下していた。
過酸化水素処理に対する安定性では（図１１）、F65L/L117V、L117V各変異型Mpr1が野生型以上の安定性を示した。K63R変異型Mpr1は野生型と同等の安定性であり、F65L変異型Mpr1は野生型よりも安定性が低下していた。【００８８】
【表１１】
2008007475.tif 000013
【００８９】
【表１２】
2008007475.tif 000014
【００９０】
５）プロリン蓄積型―野生型Ｍｐｒ１導入酵母
プロリン蓄積型酵母に野生型Mpr1を導入した酵母について、６mＭの過酸化水素下の細胞内ROSレベルの変化と生存率を測定した。結果を図１２および１３に示す。プロリン蓄積型酵母に野生型Mpr1を導入した形質転換酵母においては、プロリン蓄積型酵母と比してＲＯＳレベル、生存率の有意差は無かった。【００９１】
６）プロリン蓄積型−変異型Ｍｐｒ１導入酵母
プロリン蓄積型酵母に各種変異型Mpr１を導入した酵母について、６mＭ過酸化水素下でのROSレベルの変化と生存率を測定した。結果を図１４および１５に示す。各変異型Mpr1を導入したプロリン蓄積型酵母では、細胞内ROSレベルが野生型Mpr1を導入したものよりも低く抑えられた。また生存率では、特にL117V変異型Mpr1を導入した株で、生存率の顕著な上昇が見られた。
【図１】
2008007475.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2008007475.tif 000023
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2008007475000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月11日(2008.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
配列番号１に示される野生型Ｍｐｒ１のアミノ酸配列の、Ｌｙｓ６３がＡｒｇと置換されたもの、Ｐｈｅ６５がＬｅｕに置換されたもの、Ｌｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものおよびＰｈｅ６５がＬｅｕに置換されかつＬｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【請求項４】
請求項３または１３に記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号１１〜１４からなる遺伝子から選択される、請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４または５記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項４または５記載の遺伝子を含む形質転換酵母。
【請求項８】
野生型Ｍｐｒ１の遺伝子が請求項４または５記載の遺伝子にて置き換えられている、請求項６記載の形質転換酵母。
【請求項９】
酵母が、実験室用酵母、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母からなる群から選択される、請求項７または８記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する、請求項７〜９いずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
酵母が野生型γグルタミン酸リン酸化酵素遺伝子のＡｓｐ１５４部位がＡｓｎで置換されてなるプロリン多産生型酵母である、請求項１０記載の酵母。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
配列番号１に示される野生型Ｍｐｒ１のアミノ酸配列の、Ｌｙｓ６３がＡｒｇと置換されたもの、およびＰｈｅ６５がＬｅｕに置換されかつＬｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月25日(2008.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１３に記載の変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号１１および１４からなる遺伝子から選択される、請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４または５記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項４または５記載の遺伝子を含む形質転換酵母。
【請求項８】
野生型Ｍｐｒ１の遺伝子が請求項４または５記載の遺伝子にて置き換えられている、請求項６記載の形質転換酵母。
【請求項９】
酵母が、実験室用酵母、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母からなる群から選択される、請求項７または８記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する、請求項７〜９いずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
酵母が野生型γグルタミン酸リン酸化酵素遺伝子のＡｓｐ１５４部位がＡｓｎで置換されてなるプロリン多産生型酵母である、請求項１０記載の酵母。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
配列番号１に示される野生型Ｍｐｒ１のアミノ酸配列の、Ｌｙｓ６３がＡｒｇと置換されたもの、およびＰｈｅ６５がＬｅｕに置換されかつＬｅｕ１１７がＶａｌへ置換されたものからなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、野生型Ｍｐｒ１より高い抗酸化能を示す、変異型アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１。
【国際調査報告】
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2008007475.tif 000041
2008007475.tif 000042
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