(57)【要約】  本発明は、メタボリックシンドロームの予防・改善、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善並びに高インスリン血症、脂質代謝異常、脂肪肝、高脂血症及び動脈硬化の予防・治療に有効であり、かつ安全性の高い組成物（医薬品、食品）を提供する。本発明は、有効かつ安全な脂質代謝遺伝子発現改善剤を提供する。  本発明は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とするメタボリックシンドローム予防・改善用組成物、血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物並びに抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症、抗脂肪肝及び抗動脈硬化用組成物を提供する。本発明は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする脂質代謝遺伝子発現改善剤を提供する。
2007069744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、メタボリックシンドローム予防・改善用組成物。
【請求項２】
メタボリックシンドローム改善用組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物。
【請求項４】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、抗動脈硬化用組成物。
【請求項５】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物。
【請求項６】
血中ＨＤＬコレステロールレベル改善用組成物である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
医薬品である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
食品である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、メタボリックシンドロームの予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、メタボリックシンドロームの予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１３】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１４】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、動脈硬化の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、動脈硬化の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１５】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１６】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、脂質代謝遺伝子発現改善剤。
【請求項１７】
脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、請求項１６記載の改善剤。
【請求項１８】
前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、請求項１６記載の改善剤。
【請求項１９】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、メタボリックシンドロームの予防・改善方法。
【請求項２０】
メタボリックシンドロームの改善方法である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・治療方法。
【請求項２２】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、動脈硬化の予防・治療方法。
【請求項２３】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善方法。
【請求項２４】
血中ＨＤＬコレステロールレベルの改善方法である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が医薬品である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が食品である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、脂質代謝遺伝子発現改善方法。
【請求項３１】
前記脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
メタボリックシンドローム予防・改善用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項３４】
メタボリックシンドローム改善用組成物の製造のための、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項３６】
抗動脈硬化用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項３７】
血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項３８】
血中ＨＤＬコレステロールレベル改善用組成物の製造のための、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記組成物が医薬品である、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記組成物が食品である、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
脂質代謝遺伝子発現改善剤の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項４５】
前記脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、請求項４４記載の使用。
【請求項４７】
請求項１、２、７〜１１のいずれか１項に記載のメタボリックシンドローム予防・改善用組成物、及び該組成物をメタボリックシンドローム予防・改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項４８】
請求項３、７〜１１のいずれか１項に記載の抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物、及び該組成物を抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項４９】
請求項４、７〜１１のいずれか１項に記載の抗動脈硬化用組成物、及び該組成物を抗動脈硬化用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項５０】
請求項５〜１１のいずれか１項に記載の血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物、及び該組成物を血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項５１】
請求項１６〜１８に記載の脂質代謝遺伝子発現改善剤、及び該剤を、脂質代謝遺伝子発現改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該剤に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドローム予防・改善用組成物、動脈硬化、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症、脂肪肝の予防・治療用組成物、血中高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロールレベル低下予防・改善用組成物及び脂質代謝遺伝子発現改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病とよばれている主な疾患に高血圧、高脂血症、動脈硬化などがあるが、これらの疾患は、肥満、特に内臓に脂肪が蓄積した肥満が主な原因の１つであると考えられている。肥満は脂肪摂取量の増大や身体活動量の低下などの生活習慣が大きな原因とされている。とりわけ近年の高脂肪食の摂取などによる脂肪摂取量の著しい増加により、肥満が発症する頻度が上がっている。
肥満や内臓脂肪蓄積により、さまざまな病態が引き起こされた状態はメタボリックシンドロームとよばれており、近年注目されている生活習慣病の１つである。メタボリックシンドロームは耐糖能異常やインスリン抵抗性を基盤とすることから、成人病の危険因子として注目されている。【０００３】
また、体脂肪量とインスリン抵抗性は有意な正の相関を示し、肥満のモデル動物（ｏｂ／ｏｂマウスやＺｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙラット）では、肥満とともに著しい高インスリン血症が見られることが証明されている。臨床的にも、肥満者では空腹時の血中インスリン値が高く、グルコース負荷後のインスリン反応も亢進している。すなわち、血糖曲線を一致させて肥満者と非肥満者を比較すると、どの時点でも肥満者のインスリン値は高い（非特許文献１）。さらに、インスリン抵抗性によるインスリンの過剰な分泌は、脂肪細胞において脂肪合成を亢進させて肥満を助長し、脂肪細胞より放出された遊離脂肪酸の肝臓への供給が増加し、また抹消組織に取り込まれなかったグルコースの肝臓への供給も増加することにより、肝臓での中性脂肪の合成が亢進し、脂肪肝、高脂血症、脂質代謝異常を引き起こすことが知られている。また高インスリン血症が交感神経活性を亢進やレニン・アンジオテンシン系の活性化、腎尿細管におけるNa再吸収作用の亢進、欠陥平滑筋組織のNa、Ca蓄積、血管平滑筋増殖の亢進などを引き起こし血圧を上昇させることも知られている。【０００４】
肥満が発症する頻度が高くなりつつある現代社会において、肥満、内臓脂肪蓄積に伴って発症することが多い前述のようなメタボリックシンドローム、並びに高インスリン血症、高脂血症、脂質代謝異常、脂肪肝などの疾患は、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞などの成人病につながる可能性が高いとされ問題となっている。そのため、これらの疾患に対する有効かつ安全な医薬・治療方法の開発が望まれている。【０００５】
一方、分岐鎖アミノ酸は、肝障害を有する患者における耐糖能異常を改善することがすでに報告されている（特許文献１）。しかしながら、分岐鎖アミノ酸が血中インスリン値を低下させること、及び肝臓内の脂肪変性を改善することに関する報告はこれまでなされていない。また、分岐鎖アミノ酸が、脂質代謝遺伝子の発現を改善するとの報告もこれまでなされていない。【０００６】
また血中ＨＤＬコレステロールレベルは後でも述べるようにメタボリックシンドロームの診断基準のひとつであり、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下は心血管イベントのリスクファクターであることが疫学的に明らかとなっている。フィブラートやスタチン系の高脂血症治療薬あるいはこれらにナイアシンを組み合わせる治療によりＨＤＬコレステロールレベルが改善され心血管イベントが軽減されたとする成績が報告されている（非特許文献２）。また、コレステロールエステル輸送蛋白（ＣＥＴＰ）阻害剤のような新しい機作でＨＤＬコレステロールレベルを改善する薬剤も研究開発されている。しかしながら分岐鎖アミノ酸が血中ＨＤＬコレステロールレベルを改善することは知られていない。
【特許文献１】特開２００３−１７１２７１号公報
【非特許文献１】Fujioka S, Matsuzawa Y, Tokunaga K, et al. Contribution of intra-abdominal fat accumulation to the impairment of glucose and lipid metabolism in human obesity. Metabolism 36: 54 1987
【非特許文献２】Assmann G, Gotto AM Jr. HDL cholesterol and protective factors in atherosclerosis. Circulation 109 (Suppl III): III8-14 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、有効かつ安全なメタボリックシンドローム予防・改善用組成物、動脈硬化、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症、脂肪肝などの予防・治療用組成物及び血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物などを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物が、血中インスリン値を低下させること、血中ＨＤＬコレステロールレベルを改善すること、肝臓中の脂肪変性を改善すること、肝肥大化・肝ＴＧ含量を改善すること、血中ＴＮＦ−αを抑制すること及び脂質代謝遺伝子の発現を改善することを見出し、さらに研究を進めて、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである：
（１）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、メタボリックシンドローム予防・改善用組成物。
（２）メタボリックシンドローム改善用組成物である、上記（１）記載の組成物。
（３）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物。
（４）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、抗動脈硬化用組成物。
（５）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物。
（６）血中ＨＤＬコレステロールレベル改善用組成物である、上記（５）記載の組成物。
（７）イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の組成物。
（８）医薬品である、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の組成物。
（９）食品である、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の組成物。
（１０）前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、上記（９）記載の組成物。
（１１）前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、上記（１０）記載の組成物。
（１２）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、メタボリックシンドロームの予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、メタボリックシンドロームの予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１３）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１４）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、動脈硬化の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、動脈硬化の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１５）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有し、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１６）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、脂質代謝遺伝子発現改善剤。
（１７）脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、上記（１６）記載の改善剤。
（１８）前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、上記（１６）記載の改善剤。【００１０】
（１９）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、メタボリックシンドロームの予防・改善方法。
（２０）メタボリックシンドロームの改善方法である、上記（１９）記載の方法。
（２１）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症又は脂肪肝の予防・治療方法。
（２２）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、動脈硬化の予防・治療方法。
（２３）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善方法。
（２４）血中ＨＤＬコレステロールレベルの改善方法である、上記（２３）記載の方法。
（２５）イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、上記（１９）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）前記組成物が医薬品である、上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２７）前記組成物が食品である、上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２８）前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、上記（２７）記載の方法。
（２９）前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、上記（２８）記載の方法。
（３０）イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物の有効量を、投与対象に投与することを含む、脂質代謝遺伝子発現改善方法。
（３１）前記脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、上記（３０）記載の方法。
（３２）前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、上記（３０）記載の方法。【００１１】
（３３）メタボリックシンドローム予防・改善用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（３４）メタボリックシンドローム改善用組成物の製造のための、上記（３３）記載の使用。
（３５）抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（３６）抗動脈硬化用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（３７）血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（３８）血中ＨＤＬコレステロールレベル改善用組成物の製造のための、上記（３７）記載の使用。
（３９）イソロイシン、ロイシン及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、上記（３３）〜（３８）のいずれか１項に記載の使用。
（４０）前記組成物が医薬品である、上記（３３）〜（３９）のいずれか１項に記載の使用。
（４１）前記組成物が食品である、上記（３３）〜（３９）のいずれか１項に記載の使用。
（４２）前記食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、上記（４１）記載の使用。
（４３）前記保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、上記（４２）記載の使用。
（４４）脂質代謝遺伝子発現改善剤の製造のための、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（４５）前記脂質代謝遺伝子が、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子又はＰＰＡＲ−γ遺伝子である、上記（４４）記載の使用。
（４６）前記脂質代謝遺伝子が、ＡＣＯ遺伝子である、上記（４４）記載の使用。
（４７）上記（１）、（２）、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載のメタボリックシンドローム予防・改善用組成物、及び該組成物をメタボリックシンドローム予防・改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
（４８）上記（３）、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用組成物、及び該組成物を抗高インスリン血症、抗脂質代謝異常、抗高脂血症又は抗脂肪肝用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
（４９）上記（４）、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗動脈硬化用組成物、及び該組成物を抗動脈硬化用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
（５０）上記（５）〜（１１）のいずれか１項に記載の血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用組成物、及び該組成物を血中ＨＤＬコレステロールレベル低下予防・改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
（５１）上記（１６）〜（１８）に記載の脂質代謝遺伝子発現改善剤、及び該剤を、脂質代謝遺伝子発現改善用途に使用することができる、又は使用すべきであることを記載した、該剤に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のイソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物は、メタボリックシンドロームに対して優れた予防・改善効果を有する。また、本発明のイソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物は、動脈硬化、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症、脂肪肝などの予防・治療に優れた効果を有する。さらに、本発明のイソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物は、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善に優れた効果を有する。また、本発明のイソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物は、脂質代謝遺伝子の発現の異常に対して優れた改善効果を有する。
また、本発明の組成物は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く副作用がほとんどないため、医薬品及び食品として極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１の結果を示す、実験食開始後６週目の飽食時の血中インスリン値を示したグラフである。図中の記号「＊」は有意差を示す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図２】図２は、実施例１の結果を示す、実験食開始後６週目の空腹時の血中インスリン値を示したグラフである。
【図３】図３は、実施例１の結果を示す、実験食開始後８週目の空腹時の血中インスリン値を示したグラフである。図中の記号「＊」は有意差を示す（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ検定、ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、実施例２における肝組織標本の脂肪変性スコアを示したグラフである。図中の記号「＊＊」は有意差を示す（ｐ＜０．０１）。
【図５】図５は、実施例３におけるＣＰＴ−１遺伝子の発現量（ＣＰＴ−１／ＧＡＰＤＨ）を示したグラフである。図中の記号「＊」は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、実施例３におけるＰＰＡＲ−α遺伝子の発現量（ＰＰＡＲ−α／ＧＡＰＤＨ）を示したグラフである。図中の記号「＊」は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、実施例３におけるＰＰＡＲ−γ遺伝子の発現量（ＰＰＡＲ−γ／ＧＡＰＤＨ）を示したグラフである。図中の記号「＊」は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、実施例５における、投与開始日（Ｄａｙ０、給餌直前の薬剤投与あり）の血糖値（上段左、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）、血中インスリン値（上段右、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）の変動、および、投与開始９日目（Ｄａｙ９、給餌直前の薬剤投与なし）の血糖値（下段左、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）、血中インスリン値（下段右、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）の変動を示すグラフである。各グラフ中、＊は有意差を示す（ｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、実施例５における、剖検時肝重量（体重比肝重量）を示すグラフである。グラフ中、＊＊は有意差を示す（ｔ検定、＊＊：ｐ＜０．０１  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図１０】図１０は、実施例５における、剖検時肝臓中ＴＧ含量（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，ｎ＝５）（ＺＦｒａｔ）を示すグラフである。グラフ中、＊は有意差を示す（ｔ検定、＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図１１】図１１は、実施例５における、剖検時肝臓中ＣＰＴ−１ｍＲＮＡの定量結果（左図、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，ｎ＝５）、および肝臓中ＡＣＯｍＲＮＡの定量結果（右図、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，ｎ＝５）を示すグラフである。各グラフ中、＊は有意差を示す（ｔ検定、＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図１２】図１２は、実施例５における、血漿中ＴＮＦ−α量（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，ｎ＝５）を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の組成物は、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする。
本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの改善及び予防（発生抑制）などに有効である。
本発明において「メタボリックシンドローム」とは、
必須項目として、ウエスト径が男性８５ｃｍ以上、女性９０ｃｍ以上（この数字は、腹部ＣＴ画像で内臓脂肪を測定した場合、断面積１００ｃｍ２に相当）であって、かつ選択項目として
１．血圧：≧１３０ｍｍＨｇ（最高）及び／又は≧８５ｍｍＨｇ（最低）
２．中性脂肪（ＴＧ）値：≧１５０ｍｇ／ｄＬ及び／又はＨＤＬコレステロール値：＜４０ｍｇ／ｄＬ
３．空腹時血糖値：≧１１０ｍｇ／ｄＬのうち２項目以上に該当する場合をいう。なお、この定義は、日本肥満学界、日本糖尿病学会、日本動脈硬化学会などの８学会が発表したメタボリックシンドロームの診断基準（日本内科学会雑誌、９４（４）、１８８、２００５年）に規定されている。
本発明において、メタボリックシンドロームを改善するとは、必須項目の数値を上記未満に改善するか、又は選択項目のうち２つ以上の項目を上記の範囲から外れるように改善することをいう。
メタボリックシンドロームは、一般に、過栄養、運動不足という現代の先進国に見られる典型的な生活習慣によってもたらされる生活習慣病であり、糖尿病、高脂血症、高血圧症、肥満症、インスリン抵抗性が基本的な構成要因であり、これらが動脈硬化症の高リスクになるという疾患概念である。この病態は現在のところ、以下のようにして形成されると考えられている。すなわち、肥満によって蓄積した内臓脂肪から遊離脂肪酸が門脈を通して肝へ流入しさらには全身の血流にのる。その結果、インスリン抵抗性に大きな役割を持つ肝、骨格筋において、中性脂肪が肝細胞、骨格筋細胞内に蓄積し、インスリン抵抗性が生じ、高インスリン血症、糖尿病、高脂血症、脂肪肝、高血圧という多彩な病態さらには動脈硬化の発症に至る。しかし、この病態進行は典型的なものであって、本発明におけるメタボリックシンドロームはこれに限定されるものではない。【００１５】
本発明の組成物は血中インスリン値を低下させるため、高インスリン血症、高脂血症、脂肪肝、動脈硬化などの予防又は治療に有効である。
本発明において「高インスリン血症」とは、血液中のインスリン量が正常値よりも異常に高い状態のことをいう。
高インスリン血症を呈すると、肝臓に脂肪変性をきたし、インスリン抵抗性、糖代謝異常、脂質代謝異常などの症状を引き起こす。例えば、肥満、脂肪肝、アルコール性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの患者がこのような症状を有する。本発明の組成物はかかる症状の予防・治療にも有効である。また血中のインスリン濃度が高い状態が続くと脂肪合成を亢進し、高ＴＧ血症を引き起こすが、高ＴＧ血症はコレステロールエステル転送タンパクにより低ＨＤＬ血症を伴いやすい。さらにＨＤＬコレステロールの減少は動脈硬化を引き起こす。従って、本発明の組成物は、血中インスリン値を低下させるため動脈硬化の予防・治療にも有効である。【００１６】
本発明の組成物はさらに脂肪変性を改善するため、脂肪肝、脂質代謝異常の予防・治療にも有効である。
本発明において、「脂肪肝」とは肝重量の５％を超える脂肪の沈着がある状態を言う。
脂肪肝の成因は、一般に、食事性脂肪又は脂肪酸の肝臓への輸送量の増加、ミトコンドリアでの脂肪酸の合成増加又はβ酸化の減少、肝細胞からのトリグリセライドの細胞外への輸送の低下、過剰の炭水化物の肝への輸送などが考えられているが、本発明においては、これらに限定されない。【００１７】
また、本発明において「脂質代謝異常」とは、脂質代謝にかかわる酵素の活性やそれら酵素の遺伝子あるいは酵素を調節する遺伝子の発現に異常がある状態をいう。脂質代謝にかかわる酵素としては、例えば、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−オキソアシルＣｏＡチオラーゼ、カルニチン−パルミトイル−トランスフェラーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼなどがある。これらの酵素を調節する遺伝子としては、例えば、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−δなどがある。【００１８】
また、本発明において「高脂血症」とは、血液中に溶けている脂質（血中脂質）の値が必要量よりも異常に多い状態をいう。血中脂質にはコレステロール、中性脂肪（トリグリセライド）、リン脂質、遊離脂肪酸などがある。血中のインスリン濃度が高い状態が続くと高脂血症を招くため、本発明の組成物は、血中インスリン値を低下させるので高脂血症の予防・治療に有効である。【００１９】
また、本発明において「動脈硬化」とは、動脈壁が肥厚し、弾性を失った状態をいう。「動脈硬化」には、アテローム動脈硬化、細動脈硬化、メンケベルグ型動脈硬化などが含まれる。
最も多いタイプのアテローム動脈硬化は、脂肪性物質が沈着して形成されたアテロームと関連した動脈硬化である。ＨＤＬコレステロールは、動脈硬化部分にたまったコレステロールを抜き取ったり、種々の組織などで余った脂肪や蛋白を受け取って肝臓へ戻したりする作用を有しているため、動脈硬化に対しては予防的に働く。従って血中ＨＤＬコレステロールレベルが減少していると動脈硬化を招く。本発明の組成物は該レベルを改善させるので、動脈硬化の予防・治療に有効である。【００２０】
また、本発明において「血中ＨＤＬコレステロールレベルの改善」とは、正常値に比し低下している血中ＨＤＬコレステロールレベル（血中ＨＤＬコレステロール濃度）を上昇させることを言い、好ましくは４０ｍｇ／ｄＬ未満となっている血中ＨＤＬコレステロールレベルを４０ｍｇ／ｄＬ以上に上昇させることをいう。またより好ましくは総コレステロール及び／又はＬＤＬコレステロールレベルの上昇は伴わないかむしろ低下させ、総コレステロール／ＨＤＬコレステロール比及び／又はＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロール比を低下させることをいう。【００２１】
本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用可能であるが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
また、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができ、塩の形態も本発明に包含される。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシン及びバリンの医薬品として許容される塩を選択することが好ましい。本明細書において、「イソロイシン」、「ロイシン」、「バリン」なる用語は、それらの塩をも包含する概念である。
イソロイシン、ロイシン及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。
イソロイシン、ロイシン及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物又は炭酸化物、あるいはアンモニア等の無機塩基；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。【００２２】
本発明の組成物は、イソロイシン、ロイシン及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有するが、イソロイシン、ロイシン、バリンの配合比は、それぞれ重量比で、通常、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７の範囲であり、特に好ましくは１：１．９〜２．２：１．１〜１．３の範囲である。有効な効果を得るために、上記の範囲であることが好ましい。【００２３】
本発明の組成物は、医薬及び食品（飲食品）などとして有用である（以下、本発明の医薬、本発明の食品ともいう。）。投与対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ等）等が挙げられる。【００２４】
ここで、本発明の医薬の投与形態は特に限定されないが、経口投与、直腸投与、注射、輸液による投与等の一般的な投与経路を経ることが出来る。経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液等、また注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤型を採用することができる。【００２５】
これらの医薬は、常法により製剤化することができる。製剤上の必要に応じて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、溶剤、滅菌水及び一価又は多価アルコール、グリセロール等を挙げることができる。【００２６】
本発明の医薬の投与量は、対象患者の年齢、体重もしくは病態、剤形、又は投与方法などによっても異なるが、通常１日量として、イソロイシン０．５〜３０ｇ、ロイシン１〜６０ｇ、バリン０．５〜３０ｇを目安とする。一般の成人（体重６０ｋｇとして）の場合、好ましくは、１日量として、イソロイシン２〜１０ｇ、ロイシン３〜２０ｇ、バリン２〜１０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５〜７ｇ、バリン３〜４ｇであり、イソロイシン、ロイシン及びバリンの総量としては１日当たり通常２ｇ〜５０ｇ程度、好ましくは４〜２０ｇ程度である。該１日量を通常１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。【００２７】
本発明の有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量（摂取量）について算出する際、その値は、本発明が目的とする疾患の治療又は予防等の目的で使用される薬剤の有効成分の量として前記の算定方法が決められているので、これとは別目的で、例えば、通常の食生活の必要から、あるいは別の疾患の治療目的のために、摂取又は投与される分岐鎖アミノ酸については、前記算定に含める必要はない。
例えば、通常の食生活から摂取される一日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を、前記本発明における有効成分の１日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。【００２８】
本発明の有効成分であるイソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれが単独で、若しくは任意の組み合わせで製剤に含有されていてもよく、又は全てが１種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。即ち、本発明の医薬は、複数の分岐鎖アミノ酸を同時に含有する製剤であってもよく、又、それぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよい。これらの形態全てを包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸を含有する態様が、簡便に投与できて好ましい。【００２９】
本発明において、「重量比」とは、製剤中のそれぞれの成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシン及びバリンの各有効成分を１つの製剤中に含めた場合には、個々の含有量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独で又は任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤に含められる各有効成分の重量の比である。【００３０】
また本発明において、実際の投与量の比は、投与対象（例えば患者など）あたりの各有効成分１回投与量あるいは１日投与量の比である。例えば、イソロイシン、ロイシン及びバリンの各有効成分を１つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独で又は任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、１回あるいは１日投与した各製剤中の各有効成分の合計量の比が重量比に相当する。【００３１】
本発明の医薬には、他の薬剤、例えば、動脈硬化治療剤、糖尿病治療剤、高脂血症治療剤、高血圧治療剤、肝臓病治療剤などを配合してもよい。【００３２】
さらに、本発明の組成物は、食品の形態でも簡便に使用することができる。本発明の食品は、本発明の有効成分を含む一般的な食事形態であれば如何なるものでも良い。例えば、適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、例えば、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等に混ぜて飲食することができる。【００３３】
また、本発明の食品には、厚生労働省の規定する保健機能食品又はダイエタリーサプリメントが含まれる。この保健機能食品には、特定保健用食品及び栄養機能食品なども含まれる。本発明の食品には、メタボリックシンドロームの改善・予防（発生抑制）、動脈硬化症、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症及び脂肪肝の予防・改善、血中ＨＤＬコレステロールレベルの低下予防・改善などの用途に用いるものであるという表示を付した食品、さらには、かかる用途に用いるものである旨を記載した書類（いわゆる能書き）などをパッケージとして包含する食品なども含まれる。【００３４】
さらに、本発明の食品には、濃厚流動食や、食品補助剤が含まれる。食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなどもこれに含まれる。【００３５】
本発明の食品中の有効成分の配合量は、食品１００ｇあたりイソロイシン、ロイシン及びバリンの総量として通常０．１ｇ〜５０ｇ程度の範囲である。本発明の食品の摂取量は、体型、体質、年齢などにより異なるが、一般的には成人１日当たり、イソロイシン、ロイシン及びバリンの総量として通常１〜２５ｇ程度、好ましくは１〜１０ｇ程度となる範囲である。【００３６】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、イソロイシン、ロイシン、バリンを１：２：１．２の比で含有する製剤の急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスの経口投与において１０ｇ／ｋｇ体重以上である。【００３７】
さらに、本発明の組成物は、脂質代謝遺伝子の発現を正常化する改善剤としても有効である。本発明の改善剤によって発現が改善される脂質代謝遺伝子としては、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子、ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子、ＰＰＡＲ−δ遺伝子、ＰＰＡＲ−γ遺伝子、ＡＣＯ（アシルＣｏＡオキシダーゼ）遺伝子などが挙げられる。ＣＰＴ−１遺伝子、ＰＰＡＲ−α遺伝子、ＡＣＯ遺伝子の発現が促進されることによって、脂肪酸のβ酸化が亢進され、脂肪蓄積が抑制される。また、ＰＰＡＲ−γ遺伝子の発現が誘導されることによりインスリン抵抗性が改善される。
本発明の組成物を脂質代謝遺伝子発現改善剤として使用する場合の、有効成分の３種の分岐鎖アミノ酸の配合比、投与対象、投与形態、投与量などは、前記本発明の医薬についての記載に準じる。【００３８】
本発明の組成物は、脂肪蓄積の抑制、インスリン抵抗性の改善効果を有するので、脂肪蓄積、インスリン抵抗性が発症・進行に関与すると考えられる疾患（例えば、メタボリックシンドローム、高インスリン血症、脂質代謝異常、高脂血症、脂肪肝、動脈硬化等）の予防・治療・改善に有効であると言える。【００３９】
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
血中インスリン値の低下
ＳＤ系雄性ラット（体重２００〜３００ｇ）に０．０５％フェノバルビタール水を自由飲水させ１週間予備飼育後、四塩化炭素とオリーブオイルを１：１（容量比）で混和した溶液（１ｍＬ／ｋｇ体重）を週２回背部に皮下投与することにより慢性肝炎を惹起させた。四塩化炭素投与開始３週目に採血し、血漿中ＡＬＴ、ＡＳＴを測定し、体重、ＡＬＴ、ＡＳＴの平均値が群間で等しくなるよう１０匹ずつ２群に群分けを行った。それぞれノーマルダイエット（ＮＤ）あるいはＮＤ＋６．２５％分岐鎖アミノ酸（以下、ＢＣＡＡと略記する。）添加食に切り替え、以下剖検時まで自由摂取にて飼育した。１日摂取量は約１．２〜１．９ｇであった。各実験食の組成を表１に示す。なお、同週齢のラットにオリーブオイルのみ（０．５ｍＬ／ｋｇ体重）の皮下投与を行い終始ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母製）の自由摂取及び０．０５％フェノバルビタール水の自由飲水で飼育した群をノーマル（ｎｏｒｍａｌ）群（ｎ＝４）とした。【００４１】
【表１】
2007069744.tif 000003
【００４２】
実験食開始後６週目及び８週目に、尾静脈より採血し、飽食時インスリン及び空腹時インスリン値を測定した。結果（平均値±標準偏差）を図１〜３に示す。
図１〜３から明らかなように、本発明の組成物（ＮＤ＋ＢＣＡＡ群）は飽食時及び空腹時の血中インスリン値をＮＤ群に対して顕著に低下させた。特に、本発明の組成物の摂取開始後６週目飽食時及び８週目空腹時の血中インスリン値の低下が有意であった（図１、３）。【００４３】
（実施例２）
脂肪変性の改善
実施例１で用いたラットを、実験食開始後９週目に以下の手順で剖検を行った。エーテル麻酔下において放血死させた後、肝臓を採取し、一部はホルマリン固定、また、一部は液体窒素にて凍結した。ホルマリン固定した肝臓は、パラフィン包埋後、組織切片を作製しＨＥ染色後顕微鏡にて観察した。
剖検時の肝臓組織標本を顕鏡し、脂肪変性のスコア化を行った。スコアは１点〜４点まで脂肪変性の程度により点数化しその合計（平均値±標準偏差）を図４に示した（０点；ｎｅｇａｔｉｖｅ  １点；ｍｉｎｉｍａｌ  ２点；ｓｌｉｇｈｔ  ３点；ｍｏｄｅｒａｔｅ  ４点；ｍａｒｋｅｄ）。ノーマル群では脂肪変性は全く認められなかったのに対し、四塩化炭素の投与により高度な脂肪変性が認められた（ＮＤ群）。一方、本発明の組成物の投与により脂肪変性は有意に改善された（ＮＤ＋ＢＣＡＡ群）。【００４４】
（実施例３）
脂質代謝遺伝子の発現量
実施例２において液体窒素で凍結した肝臓を、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いて添付のマニュアル通りにｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ（１μｇ）にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｘＢｕｆｆｅｒ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ付属品）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ付属品）を添加し、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは５ｎｇ／μＬに調製し、ＳＹＢＲ（ＡＢＩ）１０μＬを添加した後、下記のプライマーを用いてＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ（ＡＢＩ７７００）を行った。【００４５】
GAPDH forward          5'-gat ctc gct cct gga aga tg（配列番号１）
GAPDH reverse          5'-atg act cta ccc acg gca ag（配列番号２）
CPT-1 forward          5'-tat ttt cca gtg ccc ctt tg（配列番号３）
CPT-1 reverse          5'-act gtt cag cca gca cct ct（配列番号４）
PPAR-α forward        5'-ctc gtg cag gtc atc aag aa（配列番号５）
PPAR-α reverse        5'-cag ccc tct tca tct cca ag（配列番号６）
PPAR-γ forward        5'-cca agg tgc tcc aga aga tg（配列番号７）
PPAR-γ reverse        5'-gca gag ggt gaa ggc tca ta（配列番号８）【００４６】
肝臓内のｍＲＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲにてＣＰＴ−１、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＧＡＰＤＨを定量した結果を、ＧＡＰＤＨの値で割り返して表示した（図５〜７、（平均値±標準偏差））。その結果、四塩化炭素の投与により、ＣＰＴ−１、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γの発現量は低下した（ＮＤ群）が、本発明の組成物の投与でＣＰＴ−１、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γの発現量は顕著に上昇（改善）した（ＮＤ＋ＢＣＡＡ群）。特に、本発明の組成物の投与によるＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γの発現量の上昇（改善）は有意であった（図６、７）。【００４７】
（実施例４）
血中ＨＤＬコレステロールの改善
ＳＤ系雄性ラット（体重１６０〜１９０ｇ）に０．０５％フェノバルビタール水を自由飲水させ１週間予備飼育後、四塩化炭素とオリーブオイルを１：１（容量比）で混和した溶液（１ｍＬ／ｋｇ体重）を週２回背部に皮下投与することにより慢性肝炎を惹起させた（四塩化炭素群）。なお、対照として同週齢のラットに四塩化炭素を投与せず終始ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母製）及び０．０５％フェノバルビタール水の自由飲水で飼育した群（ノーマル群）を設けた。
四塩化炭素投与開始後３カ月目に尾静脈より採血し、血清中アルブミンが３．０〜３．７ｇ／Ｌ（ノーマル群３．９〜４．４ｇ／Ｌ）となる四塩化炭素群のラットを５匹ずつ２群に群分けを行った。それぞれ通常食（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母製）あるいはＣＲＦ−１＋２．５％ＢＣＡＡ添加食（イソロイシン：ロイシン：バリンを重量比１：２：１．２で混合したものをＣＲＦ−１に２．５％添加したもの）に切り替え１カ月間自由摂取にて飼育した（四塩化炭素−ＣＲＦ１群、四塩化炭素−ＣＲＦ１＋ＢＣＡＡ群）。１日摂取量は約０．５〜０．８ｇであった。実験食開始後１カ月目に剖検し、下大静脈より採血し血漿中の各種血液生化学指標（トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール）を測定した。【００４８】
結果を表２に示す。血漿中のトリグリセリド、総コレステロールには群間で有意な差は見られなかった。血漿中のＨＤＬコレステロールは、ノーマル群に対し四塩化炭素−ＣＲＦ１群で有意に低下した。本発明の組成物の投与により、血漿中ＨＤＬコレステロールレベルは有意に改善（上昇）した（四塩化炭素−ＣＲＦ１＋ＢＣＡＡ群）。【００４９】
【表２】
2007069744.tif 000004
【００５０】
本系においては四塩化炭素群で３カ月目に低下した血清アルブミン、フィッシャー比がＢＣＡＡ添加食群では有意に改善し、またＡＳＴ、ＡＬＴ高値も低下傾向を示すことが確認されている。従って、ＢＣＡＡ投与は肝炎・肝硬変の肝機能改善のみならず、ＨＤＬコレステロールも改善することが示された。
また表２から、四塩化炭素−ＣＲＦ１＋ＢＣＡＡ群では総コレステロールレベルが減少傾向を示し、総コレステロール／ＨＤＬコレステロール比が低下していることが示された。【００５１】
（実施例５）
Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ雄性ラット（５週令）を明暗逆転条件（明期（時刻）２２：００〜１０：００）において１日２回（時刻１０：３０〜１１：３０、１６：３０〜１７：３０）に制限された給餌下で２週間馴化飼育した後、給餌直前、給餌直後、給餌終了１時間後、尾静脈より採血を行い、血糖値と血中インスリン値を測定し、それらの値及び体重を指標に、各群が等しくなるように１群５匹ずつ２群に群分けを行った。その後、剖検日前日（４週間）まで、１群（コントロール群）にはｖｅｈｉｃｌｅである蒸留水を１０ｍＬ／ｋｇ体重、２群（ＢＣＡＡ群）にはＢＣＡＡ（イソロイシン：ロイシン：バリンを重量比１：２：１．２で混合したもの、本発明の組成物）０．３ｇ／１０ｍＬ／ｋｇ体重を給餌直前（時刻１０：３０と１６：３０の１日２回）に強制経口投与を行った。
投与開始日（Ｄａｙ０）に薬剤投与直前（時刻１０：３０）、給餌直後（時刻１１：３０）、給餌終了１時間後（時刻１２：３０）尾静脈より採血を行い、血糖値と血中インスリン値を測定した。また投与開始９日目（Ｄａｙ９）に、薬剤は投与せず給餌直前（時刻１０：３０）、給餌直後（時刻１１：３０）、給餌終了１時間後（時刻１２：３０）尾静脈より採血を行い、血糖値と血中インスリン値を測定した。また、実験食開始４週目に剖検を行い、エーテル麻酔下において採血し、放血死させた後、肝臓を採取し、重量を測定後液体窒素にて凍結した。凍結した肝臓は後日、一部はｍＲＮＡの定量に、また一部はＴＧの定量に使用した。ｍＲＮＡの定量は、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いて添付のマニュアル通りｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ（１μｇ）にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｘＢｕｆｆｅｒ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ付属品）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ付属品）を添加しｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは５ｎｇ／μＬに調製し、ＳＹＢＲ（ＡＢＩ）１０μＬを添加し、下記のプライマーを用いてＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ（ＡＢＩ７７００）を行った。【００５２】
GAPDH forward          5'-gat ctc gct cct gga aga tg（配列番号１）
GAPDH reverse          5'-atg act cta ccc acg gca ag（配列番号２）
CPT-1 forward          5'-tat ttt cca gtg ccc ctt tg（配列番号３）
CPT-1 reverse          5'-act gtt cag cca gca cct ct（配列番号４）
ACO forward            5'-gaa gtt ggt ggg tgg tat gg（配列番号９）
ACO reverse            5'-cga aca agg tcg aca gag gt（配列番号１０）【００５３】
ＴＧの定量は、以下のとおり行った。すなわち、液体窒素下で破砕した肝臓（０．２〜０．３ｇ）の重量を測定し氷冷メタノールを０．５ｍＬ入れ、粉砕機にて粉砕した後、クロロホルムを１ｍＬ添加し４℃で一晩放置した。濾紙でこして残渣を除きクロロホルム−メタノール（容量比２：１）溶液を追加して５ｍＬまでメスアップした後、０．９％  ＮａＣｌを１ｍＬ添加した。振とう機で１０分間振とう後、室温で１〜２時間放置し、２層に分離した上層（水層）は吸引して取り除いた。クロロホルム−メタノール（容量比２：１）溶液を追加して５ｍＬまでメスアップした後、２０μＬずつガラス試験管に分注し、５０℃の恒温漕に２０分入れてクロロホルム−メタノールを完全にとばした。１％ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ（容量比）２０μＬに溶解したものをサンプルとし、ＴＧ−Ｅテストワコー（和光純薬）にて添付のプロトコールの指示通り測定した。
また採取した血液は、血漿分離後ＴＮＦ−αを測定した。ＴＮＦ−αはｒａｔ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いて、添付のプロトコールの指示に従い測定した。【００５４】
結果１（血糖値、血中インスリン値の変動）
投与開始日（Ｄａｙ０、給餌直前の薬剤投与あり）、および、投与開始９日目（Ｄａｙ９、給餌直前の薬剤投与なし）における給餌直前（時刻１０：３０）、給餌直後（時刻１１：３０）、給餌終了１時間後（時刻１２：３０）の血糖値、血中インスリン値の測定結果（変動）を図８に示す。
Ｄａｙ０においてＢＣＡＡ群の給餌直後の血糖値はコントロール群と比較して有意に低下した（図８上段左グラフ）。この時の血中インスリン値は変化がなかった（図８上段右グラフ）ので、ＢＣＡＡ（本発明の組成物）による血糖降下作用はインスリンの分泌に依存しないことが明らかとなった。
Ｄａｙ９においてＢＣＡＡ群の血糖は、直前に薬剤投与を行っていないにもかかわらず、コントロール群と比較して低値を推移し、特に給餌１時間後においては有意に低下していた（図８下段左グラフ）。またＤａｙ９の血中インスリン値においては給餌１時間後のＢＣＡＡ群において有意に低値を示し（図８下段右グラフ）、ＢＣＡＡ（本発明の組成物）の投与により食後の高インスリン状態が改善されることが明らかになった。【００５５】
結果２（肝重量、ＴＧ含量、ＣＰＴ−１およびＡＣＯｍＲＮＡの定量）
肝重量、ＴＧ含量、ＣＰＴ−１およびＡＣＯｍＲＮＡの測定結果を図９〜１１に示す。
図９に示すように、Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙラットの肝臓は、コントロール群から明らかなように脂肪蓄積が顕著で腫大しているが、ＢＣＡＡ（本発明の組成物）投与により肝肥大化の有意な抑制が認められた。図１０に示すように、ＢＣＡＡ群（本発明の組成物）において肝ＴＧ含量が有意に抑制されていた。従って、肝肥大化抑制の一因として、ＢＣＡＡによる脂肪蓄積の抑制が考えられる。図１１に示すように、ＢＣＡＡ群（本発明の組成物）において両遺伝子のｍＲＮＡはコントロール群と比較して有意に上昇していた。以上より、ＢＣＡＡ（本発明組成物）はミトコンドリア、およびペルオキシソームのβ酸化を亢進することにより脂肪を燃焼させ、肝への脂肪の蓄積を抑制することが示唆された。【００５６】
結果３（血漿中ＴＮＦ−αの定量）
血漿中ＴＮＦ−αの定量を行ったところ、ＢＣＡＡ群において低下傾向を認めた。結果を図１２に示す。
ＴＮＦ−αはインスリン抵抗性の起因物質のひとつである可能性が注目されている。すなわち、肥満およびインスリン抵抗性ではＴＮＦ−αが高値であり、ｐ５５ＴＮＦ受容体の下流のスフィンゴミエリナーゼ活性化によるセラミド産生を介してＩＲＳ−１のセリンリン酸化を促進しインスリン作用を減弱させると考えられている。
以上より、ＢＣＡＡ（本発明の組成物）の投与によるＴＮＦ−αの抑制が、インスリン抵抗性を改善したとも考えられる。【００５７】
本出願は、日本で出願された特願２００５−３６２７０５及び特願２００６−１２１１７４を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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