(57)【要約】  簡便で、且つ高感度なレポーターアッセイ方法を提供することを目的とする。  分泌型発光酵素をレポータータンパク質として用いて、外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第１工程と、
第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、宿主に導入した外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。
【請求項２】
上記外来遺伝子は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されているか、又は上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されていることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項３】
上記外来遺伝子は、上記宿主で発現していることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項４】
上記外来DNA断片は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項５】
上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項６】
上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、請求項５記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項７】
上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項６記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項８】
上記分泌型発光酵素が、上記宿主において機能する分泌シグナルペプチドと分泌型発光酵素の成熟タンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項９】
上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項１記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１０】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１１】
上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請求項９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１２】
分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主に導入する第１工程と、
第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、上記分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を評価することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。
【請求項１３】
上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項１２記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１４】
上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、請求項１３記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１５】
上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項１４記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１６】
上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項１２記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１７】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項１６記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１８】
上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請求項１６記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項１９】
分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第１工程と、
第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、化学的又は物理的変化を測定することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。
【請求項２０】
第１工程の後に、上記形質転換体を化学的又は物理的変化の対象に曝露する工程を含むことを特徴とする、請求項１９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２１】
上記化学的又は物理的変化応答性の外来DNA断片が、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、請求項１９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２２】
上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質と相互作用する外来DNA断片が、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、請求項１９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２３】
上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質が外来遺伝子によってコードされるものであることを特徴とする、請求項２２記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２４】
上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項１９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２５】
上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項２４記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２６】
上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項２５記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２７】
上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項１９記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２８】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項２７記載のレポーターアッセイ方法。
【請求項２９】
上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請求項２７記載のレポーターアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、分泌型発光酵素をレポータータンパク質として使用するレポーターアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーターアッセイとは、例えば、プロモーターなどの転写開始に必要なDNA配列によってレポータータンパク質をコードする遺伝子(以下、「レポーター遺伝子」という)から転写されたmRNAの合成量を直接又は間接的に測定するための方法である。一般的に、レポーターアッセイでは、プロモーターの3'下流に特定のレポーター遺伝子を連結し、これをプラスミドとして、あるいは染色体に挿入することにより、形質転換体を構築する。【０００３】
レポーターアッセイにおいて、通常、プロモーターの3'下流に連結した特定のレポーター遺伝子から合成されるmRNAを定量することは容易ではない。そこで、そのmRNAの情報を読み取って合成されるタンパク質の量を測定対象にすることが多い。この際、合成されたタンパク質の量を簡便に測定するために、レポータータンパク質として酵素を用い、その酵素活性値を、最初のmRNA合成量の相対値を意味する値とみなす方法が一般的である。レポーターアッセイにおいては、最終的に測定される酵素活性が最初のプロモーターの転写活性と相関があると、一般に受け入れられている。【０００４】
ところで、従来、レポーターアッセイの必要性のある研究は多い。このような研究としては、例えば、特定のプロモーターの制御メカニズムの解明、あるいはそのプロモーターの制御に関与するシグナル伝達の上流の因子の同定などが挙げられる。【０００５】
また、特定の化学物質の存在や量を調べるために、レポーターアッセイが使用されている。例えば、ダイオキシンレセプタータンパク質(Aryl hydrocarbon receptor (AhR))が知られている。当該レセプタータンパク質は、ダイオキシンに結合するとCYP1A1(Cytochrome P450 isozymeの1つ)などの遺伝子の転写活性を促進する機能を有する。ダイオキシンとダイオキシンレセプタータンパク質との複合体は、核へ移行し、ターゲット配列(XREと呼ばれる配列など)に結合し、当該ターゲット配列に連結した遺伝子の転写を活性化することとなる。そこで、ダイオキシンレセプタータンパク質を発現する細胞を用意する。一方、ダイオキシンレセプタータンパク質のターゲット配列をプロモーター内に有するレポータープラスミドを用意する。当該レポータープラスミドにおいては、プロモーターの3'下流に所定のレポーター遺伝子が存在する。次いで、レポータープラスミドをダイオキシンレセプタータンパク質を発現する細胞に導入する。当該細胞の培養液にダイオキシンを添加すると、ダイオキシンが細胞内へ浸透し、ダイオキシンレセプターと結合する。このダイオキシンとダイオキシンレセプタータンパク質との複合体が核へ移行し、レポータープラスミドに存在するターゲット配列に結合することで、レポーター遺伝子の転写が活性化される。このように、レポーター遺伝子からmRNAの転写、レポータータンパク質への翻訳というステップを経て、ダイオキシンの存在や量が、レポータータンパク質の生産や生産量として知りうる(Kawanishi, M., Sakamoto, M., Ito, A., Kishi, K., Yagi, T. (2003) Mut. Res. 540, 99-105)。その他に、内分泌撹乱物質(以下、「環境ホルモン」という)とそれに結合するエストロジェンレセプターの組み合わせによって、環境ホルモンを検知するシステムも開発されている。【０００６】
また、タンパク質間の相互作用を調べる代表的な方法として、ツーハイブリッドシステムと呼ばれる実験系が広く用いられている。当該実験系も基本的にはレポーターアッセイを利用している(Jung, J., Ishida, K., Nishihara, T. (2004) Life Sci. 74, 3065-3074)。【０００７】
以上に説明したレポーターアッセイを利用したシステムを考慮すると、細胞内で転写活性化が引き起こされる系について、全てレポーターアッセイにより測定可能なシステムとすることができる。【０００８】
また、遺伝子の変異をレポーターアッセイを用いて検知する方法も提案されている。まず、ヒトなどからPCRなどによって調製した目的の遺伝子をレポーター遺伝子と融合させる。次いで、当該融合遺伝子を発現させることで、目的の遺伝子に存在する異常な終止コドンなどを、レポータータンパク質の存在や酵素活性を検出することによって検知する(Zhang, C.L., Tada, M., Kobayashi, H., Nozaki, M., Moriuchi, T. Abe, H. (2000) Oncogene 19, 4346-4353)。さらには、分泌に必要なシグナルペプチドを有するタンパク質を選抜するために、レポーターアッセイを用いる方法が開示されている(特許文献１)。【０００９】
レポーターアッセイを構成する構成要素は、大きく2つに分類できる。第1の構成要素は、転写活性化を引き起こすための構成要素であり、基本的には、プロモーター又は転写活性化・抑制に関与するDNA配列を含むプロモーター、及びプロモーターの転写活性化を促進するレセプター・コアクチベーターなどから構成される。場合によっては、例えば、上記のように遺伝子の変異の検出にレポーターアッセイを使用する場合には、異常な終止コドンなどを有する遺伝子が当該第1構成要素となる。【００１０】
第2の構成要素は、転写活性化を測定可能にするための構成要素であり、基本的にはレポータータンパク質からなる。第1の構成要素は、測定する対象によって様々であるが、第2の構成要素は、基本的に汎用性がある。すなわち、特定のレポータータンパク質は、様々なレポーターアッセイに共通して用いることが可能である。このように、より優れたレポータータンパク質を開発すれば、従来のレポーターアッセイにおいて使用されているレポータータンパク質に代えて使用することで、高度なレポーターアッセイを開発できる。【００１１】
レポーターアッセイは、従来、大腸菌、酵母、培養細胞など様々な宿主を用いて構築されている。基本的な原理は共通するが、宿主の選択において特に考慮すべき点は、解析対象のプロモーター等の活性化(転写活性化)を再構築できるかどうか、またレポータータンパク質が発現するかどうかである。例えばレポーターアッセイを用いてヒトにおけるダイオキシン応答を調べる場合には、ヒトダイオキシンレセプターを発現する形質転換体を構築する。その場合に、宿主として原核生物である大腸菌を用いると、ヒトタンパク質の発現が一般に困難であることに加え、細胞内環境が真核細胞であるヒト細胞とは大きく異なるために、レポーターアッセイに使用できる適切な形質転換体を構築することができない。一方、培養細胞はヒト細胞と環境がよく似ているために、レポーターアッセイに使用する宿主としてよく用いられる。しかしながら、培養細胞の培養には、一般に高価なウシ胎児血清を用いるためにコストが高く、さらに増殖速度が微生物に比べ非常に遅いために実験に時間がかかるという問題点がある。【００１２】
一方、これら大腸菌や培養細胞に比して、酵母は増殖が早く、培養に使用する培地も安価である。さらに酵母はヒトと同じ真核細胞であるため、ヒトの細胞内環境とよく似ており、ヒトタンパク質を生産させることが容易であることが知られている。これらの利点から、酵母を利用した様々なレポーターアッセイが提案されている。代表的なものとしては、例えば、ダイオキシンや環境ホルモンの検出のためのレポーターアッセイ、タンパク質相互作用解析のためのツーハイブリッド法が挙げられる。【００１３】
酵母を利用したレポーターアッセイでは、従来よりレポータータンパク質として大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼが用いられてきた。また、最近ではホタルルシフェラーゼやウミシイタケルシフェラーゼもレポータータンパク質として使用されている(非特許文献１)。これらレポータータンパク質はいずれも、それぞれの酵素活性を指標に、レポータータンパク質量を測定するものである。さらに、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein; GFP）及びその変異体もレポータータンパク質として使用されている。GFPの場合には蛍光強度によって、レポータータンパク質量を測定する(非特許文献２)。【００１４】
上記に列挙したレポータータンパク質は、いずれも細胞内で発現するタンパク質である。GFP以外の上記レポータータンパク質の生産量を酵素活性として評価するためには、遠心分離操作による細胞の回収と、超音波、界面活性剤、有機溶媒などによる細胞の破砕（あるいは細胞浸透性の亢進操作）が必須となる。これらの操作は、数多くのサンプルを処理するには適していない。すなわち、これらレポータータンパク質を用いている限り、多数のサンプルを処理する、いわゆるハイスループットアッセイを構築することはできない。【００１５】
一方で、ホタルルシフェラーゼを細胞内あるいはペルオキシソーム内に発現させて、培地を介して基質であるルシフェリンを取り込ませるという手法が報告されている(非特許文献３)。しかしながら、当該手法では、基質の取り込みが律速となり、十分な活性を期待できない。また、GFPをレポータータンパク質として用いたレポーターアッセイでは、細胞内でGFPが発現しているまま測定ができ、細胞の回収や破砕が不要であるというメリットはある。しかしながら、GFPをレポータータンパク質として用いると、蛍光強度を測定する際に、その特性によりバックグランドが高いという問題がある。このバックグランドは、培地に存在する蛍光物質や酵母菌体による散乱光などである。一方、このバックグラウンドを避ける方法としては、FACSと呼ばれるフローサイトメーターを用いる方法が挙げられるが、装置自体が極めて高価である。【００１６】
以上に説明したように、酵母を利用したレポーターアッセイにおいて使用することができる、高感度で且つ簡便性を備えたレポータータンパク質は現在報告されていない。簡便性の点で理想的なレポータータンパク質は、細胞の集菌と破砕を必要としない分泌型タンパク質である。また、高感度の点で理想的なレポータータンパク質は、測定原理においてバックグランドが低く、発光を生じるタンパク質が最も適している。【００１７】
ところで、特許文献２及び非特許文献４では、Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子がクローニングされ、当該ルシフェラーゼが哺乳動物細胞において、非常に効率よく細胞外に分泌されることが開示されている。しかしながら、酵母を利用したレポーターアッセイにおいて、Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼや他の分泌型ルシフェラーゼを含め、分泌型発光酵素をレポータータンパク質として使用した例はこれまでに報告されていない。
【特許文献１】特表2003-530106号公報
【特許文献２】特開2004-187652号公報
【非特許文献１】Harger, J.W.及びDinman J.D.,「RNA」, 2003年, 第9巻, p.1019-1024
【非特許文献２】Bovee, T.F.H., Helsdingen, R.J.R., Koks, P.D., Kuiper, H.A., Hoogenboom, R.L.A.P., Keijer, J.,「Gene」,2004年, 第325巻, p.187-200
【非特許文献３】Leskinen P., Virtaq, M., Karp, M.,「Yeast」,2003年, 第20巻, p.1109-1113
【非特許文献４】Nakajima Y., Kobayashi, K., Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. 「Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry」, 2004年, 第68巻, p.565-570
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、上述した実情に鑑み、簡便で、且つ高感度なレポーターアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、特に培養物又は培養上清をそのままレポーターアッセイに使用することを検討した。培養物をそのまま使用して、レポーターアッセイを行うためには、レポータータンパク質として分泌型発光酵素を使用することが必要となる。【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体の培養物又は培養上清を当該分泌型発光酵素の基質と接触させた後、分泌型発光酵素の酵素活性を測定することで、宿主に導入した外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を効率的に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２１】
本発明は以下を包含する。【００２２】
（１）分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第１工程と、第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、宿主に導入した外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。【００２３】
（２）上記外来遺伝子は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されているか、又は上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されていることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００２４】
（３）上記外来遺伝子は、上記宿主で発現していることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００２５】
（４）上記外来DNA断片は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００２６】
（５）上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００２７】
（６）上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、（５）記載のレポーターアッセイ方法。【００２８】
（７）上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、（６）記載のレポーターアッセイ方法。【００２９】
（８）上記分泌型発光酵素が、上記宿主において機能する分泌シグナルペプチドと分泌型発光酵素の成熟タンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００３０】
（９）上記宿主が酵母であることを特徴とする、（１）記載のレポーターアッセイ方法。【００３１】
（１０）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、（９）記載のレポーターアッセイ方法。【００３２】
（１１）上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、（９）記載のレポーターアッセイ方法。【００３３】
（１２）分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主に導入する第１工程と、第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、上記分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を評価することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。【００３４】
（１３）上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、（１２）記載のレポーターアッセイ方法。【００３５】
（１４）上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、（１３）記載のレポーターアッセイ方法。【００３６】
（１５）上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、（１４）記載のレポーターアッセイ方法。【００３７】
（１６）上記宿主が酵母であることを特徴とする、（１２）記載のレポーターアッセイ方法。【００３８】
（１７）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、（１６）記載のレポーターアッセイ方法。【００３９】
（１８）上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、（１６）記載のレポーターアッセイ方法。【００４０】
（１９）分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第１工程と、第１工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触させる第２工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第３工程とを含み、上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、化学的又は物理的変化を測定することを特徴とする、レポーターアッセイ方法。【００４１】
（２０）第１工程の後に、上記形質転換体を化学的又は物理的変化の対象に曝露する工程を含むことを特徴とする、（１９）記載のレポーターアッセイ方法。【００４２】
（２１）上記化学的又は物理的変化応答性の外来DNA断片が、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、（１９）記載のレポーターアッセイ方法。【００４３】
（２２）上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質と相互作用する外来DNA断片が、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、（１９）記載のレポーターアッセイ方法。【００４４】
（２３）上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質が外来遺伝子によってコードされるものであることを特徴とする、（２２）記載のレポーターアッセイ方法。【００４５】
（２４）上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、（１９）記載のレポーターアッセイ方法。【００４６】
（２５）上記分泌型ルシフェラーゼがウミホタルルシフェラーゼであることを特徴とする、（２４）記載のレポーターアッセイ方法。【００４７】
（２６）上記ウミホタルルシフェラーゼがCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであることを特徴とする、（２５）記載のレポーターアッセイ方法。【００４８】
（２７）上記宿主が酵母であることを特徴とする、（１９）記載のレポーターアッセイ方法。【００４９】
（２８）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、（２７）記載のレポーターアッセイ方法。【００５０】
（２９）上記酵母の形質転換体を、pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、（２７）記載のレポーターアッセイ方法。
【発明の効果】
【００５１】
本発明により、簡便で、且つ高感度なレポーターアッセイ方法が提供される。特に本発明によれば、酵母と分泌型ルシフェラーゼ等の分泌型発光酵素とを利用することで、効率的にレポーターアッセイを行うことができる。【００５２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-169768号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、CLucを発現する形質転換体からCLucを分泌発現させる際の培養条件を検討した結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、各種pHの緩衝液で希釈したCypridinaルシフェリン希釈溶液を用いてCLuc活性を測定した結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各種最終濃度のTris-HCl(pH 7.4)で希釈したCypridinaルシフェリン希釈溶液を用いてCLuc活性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、反応溶液において各種最終濃度のルシフェリンに対して、段階的に希釈したCLucを発現する形質転換体の培養上清を用いて、CLuc活性を測定した結果を示す。
【図４】図４は、CLucを発現する形質転換体の培養上清を各温度で一定時間インキュベーションした後に測定したCLuc活性の相対残存活性を示す。
【図５】図５は、CLucを発現する形質転換体の培養上清のCLuc活性測定における直線性及びダイナミックレンジを検討した結果を示す。
【図６】図６は、CLucの活性測定時におけるCLucに対する各種化学物質の阻害効果を検討した結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、様々な濁度のCLucを発現する形質転換体の培養液又は培養上清を用いてCLuc活性(RLU)を測定した結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、CLucを発現する形質転換体の培養液及び培養上清を用いてCLuc活性(RLU/OD)を測定した結果を示す。
【図８】図８は、CLucを発現する形質転換体の培養液をサンプリング後、25℃で所定の時間インキュベートした後にそれぞれの培養液サンプルを用いてCLuc活性を測定した結果を示す。
【図９】図９は、96穴ディープウェルプレートで培養したTDH3プロモーターに連結したαCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、CLuc活性を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、下部に示された各種プロモーターに連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、mCLuc活性を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、下部に示された各種プロモーターに連結したβ-ガラクトシダーゼをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、リアルタイムPCR法によって測定され、TDH3 mRNA量によって標準化されたmCLuc mRNA量を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、下部に示された各種プロモーターに連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、銅イオン存在下及び非存在下においてmCLuc活性を測定した結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、下部に示された各種プロモーターに連結したβ-ガラクトシダーゼをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、銅イオン存在下及び非存在下においてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、下部に示された各種プロモーターに連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、ガラクトース存在下及び非存在下においてmCLuc活性を測定した結果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、下部に示された各種プロモーターに連結したβ-ガラクトシダーゼをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、ガラクトース存在下及び非存在下においてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果を示す。
【図１５】図１５は、左パネルに示された様々な長さのTDH3プロモーター（これらのプロモーター配列には図に示されたような既知のcis配列がそれぞれ存在する）に連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、mCLuc活性を測定した結果を示す。
【図１６】図１６は、左パネルに示された様々な長さのGAL1プロモーター（これらのプロモーター配列には図に示されたような既知のcis配列がそれぞれ存在する）に連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、mCLuc活性を測定した結果を示す。
【図１７】図１７は、下部に示されたDNA（ラットApoE 遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域に相当する）をαCLucをコードするDNAのαファクター分泌シグナルペプチド DNAと成熟CLuc DNAとの間に挿入したレポータープラスミドを有する形質転換体の培養液を用いて、CLuc活性を測定した結果を示す。なお、ApoE(+)は終止コドンを含まないDNA、ApoE(-)は終止コドンを含むDNA、ApoE(+/-)は両者を当量混合したDNAを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、本発明を詳細に説明する。【００５５】
本発明に係るレポーターアッセイ方法は、分泌型発光酵素をレポータータンパク質として用いて、外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価する方法である。本方法においては、先ず、分泌型発光酵素をコードする遺伝子(以下、「分泌型発光酵素遺伝子」という)を宿主に導入する。次に、得られた形質転換体の培養物又は培養上清を、分泌型発光酵素の酵素反応が生じうる条件下で、当該分泌型発光酵素の基質と接触させた後、分泌型発光酵素の酵素活性を測定する。本方法では、当該酵素活性に基づいて、宿主に導入した外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することとなる。【００５６】
ここで、分泌型発光酵素とは、細胞膜外又は細胞壁外へ分泌される酵素であって、基質の分解により光を発する反応を触媒する酵素を意味する。本発明に係るレポーターアッセイ方法で使用することができる分泌型発光酵素/基質としては、例えば、分泌型ルシフェラーゼ/ルシフェリン、及び分泌型ホスファターゼ/1,2-ジオキセタン誘導体が挙げられる。【００５７】
分泌型ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸素分子による酸化を触媒する。この際、発生する反応エネルギーによって酸化生成物(オキシルシフェリン)が励起状態で生成され、それが基底になる時に発光する。分泌型ルシフェラーゼとしては、例えば、ウミボタル近縁種Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼ(cDNA：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２)及びVargula hilgendorfii由来のルシフェラーゼ(cDNA：配列番号３、アミノ酸配列：配列番号４)などのウミホタルルシフェラーゼ、ヒオドシエビOplophorus gracilirostris由来のルシフェラーゼ(cDNA：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６)、並びにカイアシ類Metridia longa由来のルシフェラーゼ(cDNA：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８)が挙げられ、分泌効率の高さの点から、特にCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼが好ましい。【００５８】
また、分泌型ホスファターゼは、発光基質である1,2-ジオキセタン誘導体(CDP-Star, CSPD；Applied Biosystems社)の脱リン酸化を触媒する。この際、脱リン酸化された基質は自発的にアダマンタノンと蛍光体とに分解され、反応エネルギーによって励起状態で生成された蛍光体が基底状態になる時に発光する。分泌型ホスファターゼとしては、例えばヒト胎盤アルカリホスファターゼ(SEAP；cDNA：配列番号９、アミノ酸配列：配列番号１０)が挙げられる。【００５９】
一般的に、分泌型発光酵素を含む分泌タンパク質は、N末端に分泌シグナルペプチドを有する前駆体の形態で合成される。この前駆体は、膜貫通の過程でシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質となる。本発明において、成熟タンパク質とは、細胞膜外又は細胞壁外に分泌されたタンパク質のことを意味する。成熟タンパク質は、一般的には分泌シグナルペプチドが除去されていることが多い。なお、本発明では、成熟タンパク質には、分泌シグナルペプチドが除去されていない場合であっても、分泌シグナルペプチドとして推定される配列を除いたものも含まれる。【００６０】
本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素は、実際に細胞膜外又は細胞壁外に分泌される限り、分泌シグナルペプチドと非分泌型発光酵素との融合タンパク質であってもよい。また、分泌型発光酵素としては、本来の分泌シグナルペプチドに置き換えて、選択した宿主において分泌シグナルペプチドとして機能することが知られている分泌シグナルペプチドを分泌型発光酵素の成熟タンパク質のN末端に連結した融合タンパク質を、分泌型発光酵素として使用してもよい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のαファクターの分泌シグナルペプチド(cDNA：配列番号１１、アミノ酸配列：配列番号１２)は、酵母において高い分泌効率をもたらすことが知られている。また、酵母における分泌シグナルペプチドとしては、例えば、インベルターゼの分泌シグナルペプチドが挙げられる。一方、Cypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼの分泌シグナルペプチドは、配列番号２に示されるCypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、1番目〜18番目のアミノ酸配列である。そこで、例えば、宿主として酵母を選択した場合には、Cypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼの成熟タンパク質のN末端にαファクターの分泌シグナルペプチドを連結した融合タンパク質(cDNA：配列番号１３、アミノ酸配列：配列番号１４)を分泌型発光酵素として使用することができる。【００６１】
上述した分泌型発光酵素遺伝子の塩基配列及びその対応するアミノ酸配列は、上記の配列番号に示される塩基配列及びその対応するアミノ酸配列に限定されない。各分泌型発光酵素は、上記の配列番号に示されるアミノ酸配列において1又は数個(例えば1〜10個、1〜5個)のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ分泌され、各酵素が有する酵素活性を有するものであればよい。また、形質転換対象の宿主のコドン利用頻度等を参照し、上述の配列番号に示される分泌型発光酵素遺伝子の塩基配列を最適化したものを分泌型発光酵素遺伝子とすることができる。このような分泌型発光酵素遺伝子としては、例えばCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼ遺伝子(cDNA：配列番号１)をサッカロミセス・セレビシエにおける使用に最適化した合成遺伝子(cDNA：配列番号１５)が挙げられる。なお、当該遺伝子によりコードされるルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号２)と同一である。【００６２】
本発明に係るレポーターアッセイ方法における外来遺伝子は、いかなるタンパク質、ペプチドをコードする遺伝子であっても良い。本発明では、外来遺伝子の種類に応じて、以下のように、例えば第１実施形態〜第３実施形態に分けることができる。【００６３】
第１実施形態として、アミノ酸配列における異常な終止コドンの存在や欠失、置換、付加等の変異の存在によるタンパク質の安定性、機能などを評価した場合には、当該評価対象のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子となる。また、タンパク質をコードする遺伝子の異常を評価したい場合には、ヒトの血液サンプルなどから調製したDNAやRNAに由来する目的のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子となる。これらの場合、外来遺伝子は、分泌型発光酵素遺伝子の5'上流側に連結されるか、又は分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されることとなる。特に、分泌型発光酵素の機能を失いにくいという点から、分泌型発光酵素遺伝子において分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子を連結することが好ましい。本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝子がこのような位置関係にあることにより、分泌型発光酵素の酵素活性値を外来遺伝子の発現、活性又は機能と相関させることができる。例えば、特定の正常なタンパク質をコードする遺伝子を対照の外来遺伝子とする。一方、遺伝子に異常な終止コドンなどが存在するか否かを評価する遺伝子(以下、「試験遺伝子」という)を外来遺伝子とする。そして、対照の外来遺伝子を用いた際の酵素活性値に比べ、試験遺伝子を用いた際の酵素活性値が低いか又は全くないことによって、試験遺伝子に異常が存在することが塩基配列を決定することなく評価することができる。【００６４】
第２実施形態では、外来の転写因子や転写抑制因子などをコードする遺伝子が当該外来遺伝子として挙げられる。なお、この場合、転写調節機能を調べたいタンパク質が宿主由来である場合には、「外来遺伝子」は宿主由来の遺伝子であっても良い。あるいは、該遺伝子を他の転写因子又は転写抑制因子をコードする遺伝子の全部あるいは一部と連結し、融合タンパク質をコードする遺伝子を外来遺伝子としてもよい。例えば、本発明に係るレポーターアッセイ方法を酵母を用いたツーハイブリッドシステムに使用する場合には、おとり(bait)タンパク質をコードする遺伝子と、おとりタンパク質と相互作用するか否か試験されるタンパク質(試験タンパク質)をコードする遺伝子とが外来遺伝子となる。この場合には、外来遺伝子は、分泌型発光酵素遺伝子とは直接連結されることなく、同一プラスミドの別の位置、別のプラスミド又は染色体上に存在し、宿主で発現することとなる。本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて、外来遺伝子によりコードされるタンパク質自身の転写調節機能、あるいはツーハイブリッドシステムにおいてはおとりタンパク質と試験タンパク質との相互作用の強さを評価することができる。さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて、ワンハイブリッドシステムにおいては転写活性化に係わるDNA結合能、コファクターやRNAポリメラーゼとの相互作用などの強さを評価することができる。【００６５】
第３実施形態として、本発明に係るレポーターアッセイ方法を、多数のタンパク質の中から細胞膜又は細胞壁に固定されるタンパク質(以下、「細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質」という)をスクリーニングする際に使用する場合には、スクリーニング対象のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子となる。これらの場合、外来遺伝子は、分泌型発光酵素遺伝子の5'上流側又は3'下流側に連結される。ここでは、分泌型発光酵素が細胞膜又は細胞壁外で細胞膜又は細胞壁に固定されるように、外来遺伝子に対して分泌型発光酵素遺伝子を連結する。当該外来遺伝子が細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質をコードする遺伝子である場合には、分泌型発光酵素と共に細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質が宿主の細胞膜又は細胞壁に固定されることとなる。固定された分泌型発光酵素の酵素活性値に基づいて、外来遺伝子によりコードされる細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質をスクリーニングすることができる。【００６６】
また、細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質は、N末端又はC末端のいずれかのみが細胞膜外又は細胞壁外に存在する場合がある。そこで、上述した本発明に係るレポーターアッセイ方法を用いたスクリーニングに準じて、細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質においてC末端又はN末端のいずれが細胞膜又は細胞壁の外側に存在するかを、分泌型発光酵素の酵素活性値によって評価することができる。さらには、上述した本発明に係るレポーターアッセイ方法を用いたスクリーニングに準じて、分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質の発現レベルを評価することができる。【００６７】
一方、外来DNA断片としては、例えばプロモーター、一般にcis-配列と呼ばれる転写を活性化又は抑制する配列を含むDNA断片及び合成DNAが挙げられる。さらには、mRNAの安定性に寄与する配列や翻訳効率に影響を与える配列を含むDNA断片であってよい。本発明に係るレポーターアッセイ方法において、外来DNA断片として使用するプロモーターは、いずれの生物由来のプロモーター又は人工のcis配列の組み合わせであっても良いし、あるいはプロモーターとしての機能を有する限り、人工的な配列を含めていかなる配列であってもよい。例えば、外来DNA断片がプロモーターである場合には、分泌型発光酵素遺伝子の5'上流側にプロモーターを連結する。この場合、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値を外来DNA断片として用いたプロモーターの相対的な転写活性化値として評価することができる。また、外来DNA断片が転写活性化又は転写抑制を引き起こすcis配列、mRNAの安定性に関わる配列、翻訳効率に影響を与える配列である場合には、分泌型発光酵素遺伝子との相対的位置は機能する限り、いかなる位置であってもよい。この場合、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて、外来DNA断片として用いた上述した配列の転写制御機能(例えば、転写活性化又は転写抑制)、mRNAの安定性への寄与度又は翻訳効率への影響度を評価することができる。なお、他の外来DNA断片は、分泌型発光酵素遺伝子に対して制御しうる位置に連結する。【００６８】
宿主としては、宿主内で分泌型発光酵素遺伝子及び外来遺伝子又は外来DNA断片が機能できるものであれば特に限定されるものではないが、酵母、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属等に属する細菌、COS細胞等の動物細胞、Sf9等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属する植物が挙げられる。また酵母としては、いずれの酵母であってもよいが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）が挙げられ、特にサッカロミセス・セレビシエが好ましい。【００６９】
本発明に係るレポーターアッセイ方法では、先ず分泌型発光酵素遺伝子及び外来遺伝子又は外来DNA断片を準備する。分泌型発光酵素遺伝子、外来遺伝子及び外来DNA断片(以下、「遺伝子等」という)は、例えば、これら遺伝子等を有する生物のゲノムDNA等を鋳型として、該領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いたPCRによって容易に得ることができる。【００７０】
一旦、遺伝子等の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって遺伝子等を得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって遺伝子等の変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。【００７１】
なお、遺伝子等に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)）などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。【００７２】
次いで、分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来DNA断片を連結する場合には、分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来DNA断片を連結したDNAを準備する。また、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来DNA断片を挿入する場合には、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来DNA断片を挿入したDNAを準備する。このようなDNAは、上述のように連結又は挿入したDNA自体であってもよく、当該DNAを含むベクターなどであってよい。【００７３】
分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来DNA断片を連結する方法は、それぞれ精製された分泌型発光酵素遺伝子及び外来遺伝子又は外来DNA断片を適当な制限酵素で切断し、連結する方法が採用される。また分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝子又は外来DNA断片のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCRなどを用いたin vitro法または酵母などを用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。【００７４】
また、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間への外来遺伝子又は外来DNA断片の挿入は、上述した分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来DNA断片を連結する方法に準じて行うことができる。【００７５】
分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝子又は外来DNA断片とが連結したDNA又は分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来DNA断片を挿入したDNA(以下、「本発明に係るDNA」という)を含むベクターは、適当なベクターに本発明に係るDNAを挿入することにより得ることができる。使用するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるDNA断片であってもよい。【００７６】
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13などのYEp系、YCp50などのYCp系等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。【００７７】
ベクターに本発明に係るDNAを挿入する方法は、上述した分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来DNA断片を連結する方法に準じて行うことができる。【００７８】
さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、本発明に係るDNA又は本発明に係るDNAを含むベクター(以下、「本発明に係るベクター等」という)を宿主中に導入することにより形質転換体を作製する。同様に、分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝子とが例えば別個のベクター等に存在する場合には、分泌型発光酵素遺伝子を有するベクター及び外来遺伝子を有するベクターをそれぞれ同じ宿主中に導入することにより形質転換体を作製する。【００７９】
酵母への本発明に係るベクター等の導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、YIp系などのベクターあるいは染色体中の任意の領域と相同なDNA配列を用いた染色体への置換・挿入型の酵母の形質転換法であっても良い。さらに酵母への本発明に係るベクター等の導入方法は、一般的実験書または学術論文などに記載されたいかなる方法によってもよい。【００８０】
細菌への本発明に係るベクター等の導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。【００８１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係るベクター等の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。【００８２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に係るベクター等の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。【００８３】
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞などが用いられる。植物への本発明に係るベクター等の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法およびPEG法等が挙げられる。【００８４】
本発明に係るベクター等が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。【００８５】
次いで、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、得られた形質転換体を生育可能な条件下で培養する。さらに、本方法において、形質転換体の培養物をそのまま酵素活性の測定に供する場合には、分泌型発光酵素が失活しない条件下で培養することとなる。例えば、分泌型発光酵素としてCypridina noctiluca由来のルシフェラーゼなどの分泌型ルシフェラーゼを導入した形質転換酵母の培養において、酵母が生育し且つ当該ルシフェラーゼが失活しないように、温度は、例えば4〜37℃、好ましくは20〜30℃に設定する。また培地のpHは、例えば3.5〜6.5、好ましくは5.5〜6.0に設定すればよい。培養時間は、分泌型発光酵素の活性が測定可能であれば良く、例えば1〜120時間、好ましくは対数増殖期である1〜24時間である。【００８６】
さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、形質転換体の培養後、得られる培養物又は培養上清を、分泌型発光酵素の酵素反応が生じうる条件下で、分泌型発光酵素の基質と接触させる。ここで、酵素反応が生じる条件とは、分泌型発光酵素の活性中心に基質が特異的に結合して複合体が生成され、酵素反応が進む条件を意味する。また、ここで、接触とは、培養物又は培養上清中の分泌型発光酵素と基質とが近接し、酵素反応が生じる状態を意味する。また、本発明に係るレポーターアッセイ方法において培養物とは、形質転換体を含む培養液や培地を意味する。本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素が培地中に分泌されるため、形質転換体を含む培養液や培地をそのまま使用することができる。あるいは、本発明に係るレポーターアッセイ方法において、形質転換体を遠心分離等によって分離した培養上清を使用してもよい。【００８７】
例えば、Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼなどの分泌型ルシフェラーゼを有する形質転換体の培養物又は培養上清と基質(ルシフェリン)とを接触させる条件として、温度は、例えば0〜40℃、好ましくは15〜30℃に設定する。またpHは、例えば4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0に設定すればよい。接触時間(反応時間)は、例えば1秒〜30分間、好ましくは1秒〜30秒間である。特に種々の緩衝液で希釈した基質溶液を培養物又は培養上清に添加することで、培養物又は培養上清のpHを分泌型発光酵素の酵素活性が高いpHにシフトすることができる。例えば、分泌型ルシフェラーゼを含む培養物又は培養上清に対して、2M以下(好ましくは50mM〜200mM)で、且つpH3.5〜9.0(好ましくはpH7.0〜8.0)のトリス塩酸緩衝液(Tris-HCl)などの緩衝液で希釈したルシフェリン溶液を添加することで、上述した接触時のpHを設定することができる。【００８８】
培養物又は培養上清に対する基質の濃度は、分泌型発光酵素と基質に応じて適宜決定することができるが、例えば分泌型ルシフェラーゼを有する形質転換体の培養物又は培養上清の濁度（例えば600 nmにおける吸光度)0.05以上に対して、基質であるルシフェリンを0.1μM以上、好ましくは1.25〜2.5μMの終濃度となるように添加する。【００８９】
次いで、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、分泌型発光酵素の酵素活性を測定する。測定方法は、分泌型発光酵素に応じて適宜選択することができる。例えば、分泌型ルシフェラーゼを分泌型発光酵素として使用した場合には、形質転換体の培養物又は培養上清と基質との混合物を、ルミノメーターを用いた発光測定に供し、相対発光強度(RLU)として酵素活性を測定する。また、好ましくは、活性測定時に酵素活性を補正して測定値を標準化するために、培養液又は培養上清の濁度（例えば600 nmにおける吸光度）を測定し、相対発光強度を濁度で除することによって補正した値(RLU/OD)を、酵素活性値とすることができる。あるいは、相対発光強度を標準化するために、形質転換体に含まれるATP量を測定し、この値で相対発光強度を除する方法も好ましい。さらに、形質転換体において、同時に別の酵素やタンパク質を発現させて、その酵素又はタンパク質量を測定し、その値で相対発光強度を除して補正する方法でもよい。また、基質が異なったり、発光スペクトルが異なるなどの性質を利用して、発光を見分けることができる限り、他の発光酵素や本発明に係る分泌型発光酵素の変異体を発現させて、その発光酵素由来の発光で除して補正する方法でもよい。【００９０】
また、例えば、宿主がサッカロミセス・セレビシエなどの微生物である場合、形質転換体は寒天培地において生育し、コロニーを形成する。そこで、例えば分泌型ルシフェラーゼを分泌型発光酵素として使用した場合には、形質転換体を含む寒天培地にルシフェリンを添加した後、コロニーの発光強度を、例えばCCDカメラなどを有する発光検出器を用いて測定することによって酵素活性を測定することができる。【００９１】
本発明に係るレポーターアッセイ方法では、このようにして得られた分泌型発光酵素の酵素活性値を外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能と相関させる。【００９２】
以上に説明したように、本発明に係るレポーターアッセイ方法によれば、簡便且つ高感度なレポーターアッセイを行うことができる。また、本発明に係るレポーターアッセイ方法ではバックグランドが低い高感度な発光測定法を効率よく使用できるので、アッセイ系の微量化が可能となる。本発明に係るレポーターアッセイ方法では、集菌や細胞破砕を行うことなく培養物のサンプリングのみで測定サンプルを調製できる。そのため、ロボットによる自動化が可能である。すなわち、例えば96穴ディープウェルプレートを用いて、1プレート当たり96種の形質転換体を培養し、マニュアルあるいはロボットにより培養物の一部を発光測定用プレートに分注することにより、そのままマイクロプレート対応のルミノメーターで酵素活性を測定できる。また、補正のための濁度は、同じ96穴ディープウェルプレートから吸光度測定用プレートに培養物を一部分注し、マイクロプレートリーダーにて測定可能である。他の補正方法を利用する場合においても、発光、蛍光又は吸光マイクロプレートリーダーを用いることができる。このように、本発明に係るレポーターアッセイ方法によって、レポーターアッセイをハイスループットアッセイとして行うことが可能になり、さらにロボティクスによる自動処理も可能となる。さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法を用いれば、ツーハイブリッドシステムにおいてタンパク質間相互作用の簡便な定量的評価が可能となる。また、ダイオキシンや環境ホルモンなどの安価で高感度なバイオアッセイの開発が可能となる。さらに、創薬上有用な分泌タンパク質の網羅的スクリーニングにも利用できる。また、ヒト膜結合型レセプターや核内レセプターなどを発現させた酵母を利用し、これらのレセプターと酵母の細胞内シグナル伝達系をカップリングさせることにより、新薬のリード化合物のハイスループットスクリーニングにも利用できる。また、従来の方法では1サンプル１シャーレのように手間がかかった遺伝子変異検出も、1枚の96穴プレートで96サンプル同時に解析できるなど、遺伝子変異解析のハイスループット化にも寄与できる。【００９３】
さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法は、高感度であるために、スケールダウンが可能である。例えば、本発明における形質転換酵母を、1μmから1 mm程度の流路と酵母が流出するのを防ぐメンブランフィルター、狭窄流路あるいはナノピラーを設け、培地のみが流れるように作製したチップあるいはキャピラリーにセットする。あるいは、菌体を含む培養液を流れるようにしたチップ又はキャピラリーでもよい。次いで、培地に放出された分泌型発光酵素に対して基質を流路に流入させ、酵素反応を生じさせる。このように、本発明に係るレポーターアッセイ方法を、μTAS(Micro total analysis systems)やLab-on-a-chipと呼ばれるオンチップ分析に利用することが可能である。【００９４】
また、以上に説明した本発明に係るレポーターアッセイ方法に準じて、分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を評価することができる。すなわち、分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主に導入し、当該分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を定量的に評価することができる。この場合、分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の5'上流側に、分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結する。【００９５】
分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子を用いた場合には、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値を分泌シグナルペプチドの相対的な分泌活性値として評価することができる。あるいは、酵素活性値が得られることによって、分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子として機能を有すると評価することができる。【００９６】
また、分泌タンパク質をコードする遺伝子を用いた場合には、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値を相対的な分泌タンパク質発現量として評価できる。あるいは、酵素活性値が得られることによって、分泌タンパク質をコードする遺伝子であると評価することができる。【００９７】
さらに、本発明に係るレポーターアッセイ方法に準じて、化学的又は物理的変化を測定することができる。ここで、化学的又は物理的変化としては、例えば、化学物質又は生理活性物質の検出及び濃度変化並びに温度変化が挙げられる。例えば、環境ホルモン等の生理活性物質を検出するか、あるいは当該物質の濃度変化を測定する際には、これらの物質に応答性のプロモーターや転写制御に関与するDNA断片を外来DNA断片とする。例えば、ダイオキシンを検出する際には、ダイオキシンレセプターとダイオキシンとの複合体が結合する配列と一般的なプロモーターとを連結したものを外来DNA断片とする。これら外来DNA断片を分泌型発光酵素遺伝子に連結する。次いで当該外来DNA断片とダイオキシンレセプターを発現する遺伝子ユニットとを共に宿主細胞に導入することによって、ダイオキシンを検知するためのレポーターアッセイ方法とすることができる。この場合、分泌型発光酵素の発光量によって、ダイオキシンの濃度を測定できる。同様に、例えば温度変化についても、それを検知するタンパク質を利用することによって、温度変化を検知するためのレポーターアッセイ方法を確立することが可能である。例えば、高温の検知はHeat shock factor(HSF)と呼ばれる温度依存性転写因子を利用することで、分泌型発光酵素の活性に基づいて検知可能である。【００９８】
本方法では、上述した化学的又は物理的変化に応答性のプロモーターや転写制御に関与するDNA断片を外来DNA断片とする。これら外来DNA断片に分泌型発光酵素遺伝子を連結したDNAを宿主に導入し、発現させる。次いで、化学的又は物理的変化の対象に宿主を曝露する。曝露後、分泌型発光酵素の活性を測定する。陰性対照と比較して、分泌型発光酵素の活性が変動した場合には、供試対象に応答して外来DNA断片の発現が変化したことを示す。このようにして得られた分泌型発光酵素の酵素活性値は、化学的又は物理的変化の相対的な測定値として評価することができる。あるいは、上述した化学的又は物理的変化に応答性のタンパク質(以下、「応答性タンパク質」という)と相互作用する外来DNA断片を宿主に導入し、発現させる。なお、外来DNA断片には、分泌型発光酵素遺伝子が連結されている。また、応答性タンパク質が宿主に存在しない場合には、応答性タンパク質をコードする遺伝子を外来遺伝子として宿主に導入し、発現させる。次いで、化学的又は物理的変化の対象に宿主を曝露する。曝露後、分泌型発光酵素の活性を測定する。陰性対照と比較して、分泌型発光酵素の活性が変動した場合には、応答性タンパク質が化学的又は物理的変化を検出し、外来DNA断片との相互作用が変化したことを示す。このようにして、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値は、化学的又は物理的変化の相対的な測定値として評価することができる。【００９９】
本方法では、転写量の変動を伴う限り、適切なプロモーターや転写制御に関与するDNA断片などを外来DNA断片として使用できる。必要に応じて1つ又は複数の応答性タンパク質（例えばダイオキシンレセプターに代表されるようなレセプター）をコードする遺伝子を同時に発現させる。あるいは、宿主が有するシグナル伝達系を利用するなどの方法を併用する。【０１００】
化学物質又は生理活性物質の検知・測定の場合には、適切なレセプターをコードする遺伝子を宿主に導入し、細胞内、核内又は細胞膜上に発現させる。また、それらレセプターが化学物質又は生理活性物質を検知した際にそのシグナルが転写活性に影響を与えるように、必要に応じて適切なシグナル伝達系に関与するタンパク質をコードする遺伝子を宿主で発現させる。さらに転写調節に関与する適切なDNA断片又はプロモーターを外来DNA断片として分泌型発光酵素遺伝子に連結し、宿主に導入し、発現させる。これらのレセプターやシグナル伝達因子等は、宿主由来のもの、外来のもの、他のタンパク質との融合タンパク質、又は機能を有する限り人工的に作出したタンパク質でもよい。また、分泌型発光酵素遺伝子に連結する外来DNA断片は、転写調節の機能を有する限り、導入すべき宿主に由来するもの、外来のもの、人工的に設計された配列のいずれでもよい。【０１０１】
これまでにダイオキシンレセプター、環境ホルモンレセプター（エストロジェンレセプター）、Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)など数多くの化学物質に対するレセプターが知られている。すなわち、極めて多くの化学物質又は生理活性物質のバイオアッセイ法として、本レポーターアッセイ方法は利用が可能である。さらには、ヒスタミンレセプターなどの細胞膜上のレセプターも数多く知られている。よって、例えば本来結合する物質が特定できていない、いわゆるオーファンレセプターを本レポーターアッセイ方法と組み合わせることにより、創薬上極めて重要なリガンド探索などに用いることができる。このようなリガンド探索では、膨大な数の候補物質を試す必要があり、ハイスループット性を要求されることから、本レポーターアッセイ方法が適している。【０１０２】
さらにまた、本発明に係るレポーターアッセイ方法に準じて、スプリットアッセイを行うことができる。分泌型発光酵素を適切な場所で2つに分割するようにデザインをし、実際に2つの断片(以下では、「N末端側断片」と「C末端側断片」という)として宿主で発現させた場合、これら2つの断片が空間的に適切に会合すると分泌型発光酵素の活性が復活する。本発明ではこの現象を用いて、細胞膜上での細胞膜タンパク質間の会合能を判定する(スプリットアッセイ)。【０１０３】
本方法では、外来遺伝子として2種の細胞膜タンパク質をコードする遺伝子(以下、「細胞膜タンパク質遺伝子」という)を会合能の判定対象とする。まず、2種の発現カセットを作製する。第1の発現カセットは、一方の細胞膜タンパク質遺伝子と分泌型発光酵素のN末端側断片をコードするDNA断片とを連結したものである。より具体的には、第1の発現カセットには、細胞膜タンパク質の細胞外末端に分泌型発光酵素のN末端側断片が連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子が含まれている。第2の発現カセットは、他方の細胞膜タンパク質遺伝子と分泌型発光酵素のC末端側断片をコードするDNA断片とを連結したものである。第1の発現カセットと同様に、第2の発現カセットには、細胞膜タンパク質の細胞外末端に分泌型発光酵素のC末端側断片が連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子が含まれている。【０１０４】
次いで、これら2種の発現カセットを宿主に導入し、それぞれの融合遺伝子を発現させる。次に、分泌型発光酵素の活性を測定する。分泌型発光酵素の酵素活性が得られた場合には、細胞膜上で2種の細胞膜タンパク質が互いに会合したと判定することができる。一方、分泌型発光酵素の酵素活性が得られない場合には、細胞膜上で2種の細胞膜タンパク質が互いに会合しない可能性が示唆される。【０１０５】
以上のようにして、本発明に係るレポーターアッセイ方法によれば、2種の細胞膜タンパク質の会合能を判定することができる。なお、本発明に係るレポーターアッセイ方法では、細胞膜タンパク質遺伝子に代えて、細胞壁タンパク質をコードする遺伝子を外来遺伝子とすることで、細胞壁上での2種の細胞壁タンパク質の会合能を判定することもできる。
【実施例】
【０１０６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。【０１０７】
〔実施例１〕Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼの酵母における分泌発現と培養液の至適pHの検討
（１）Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼを有する形質転換体(形質転換酵母)の作製
Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼ(配列番号２に示すアミノ酸配列：以下、「CLuc」という)をコードするcDNA(配列番号１)を用いて、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにおいて当該酵素を分泌発現させた。また、CLucを分泌発現させるための培地のpHの条件について検討した。【０１０８】
まず、CLuc cDNAを含むプラスミド(以下、「pcDNA-CL」という)を用いて、pcDNA-CLからCLucの分泌シグナルペプチド(配列番号２に示すCLucのアミノ酸配列において、1〜18番目のアミノ酸配列)を除く成熟タンパク質をコードするcDNA(以下、「成熟型CLuc cDNA」という)をpolymerase chain reaction(PCR)法によって増幅した。【０１０９】
一方、出芽酵母のαファクターの分泌シグナルペプチド(配列番号１２に示すアミノ酸配列)をコードするDNA(配列番号１１:以下、「αファクター分泌シグナルペプチドDNA」という)は、サッカロミセス・セレビシエ S288CゲノムDNA（Invitrogen社より購入）を鋳型として増幅した。【０１１０】
次いで、成熟型CLuc cDNAとαファクター分泌シグナルペプチドDNAとを連結し、αファクター分泌シグナルペプチドをN末端に有する成熟型CLuc（配列番号１４に示されるアミノ酸配列：以下、「αCLuc」という）をコードする遺伝子(配列番号１３)を作製するために、overlap PCR法を行った。【０１１１】
成熟型CLuc cDNAを増幅するためのプライマー(alpha-luci-F及び3'Xba I-luci)の配列は、以下の通りであった。【０１１２】
alpha-luci-F ; GAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGACTGTCCTTACGAACC（配列番号１６）
3'Xba I-luci ; CCCTGTCTAGACTATTTGCATTCATCTGGTAC（配列番号１７）
alpha-luci-Fは、αファクター分泌シグナルペプチドをコードするDNAの3’末端から19bpのDNA配列の下流に、成熟型CLucの最初のコドン（配列番号２に示すCLucのアミノ酸配列において、19番目のアミノ酸に相当）を含めて下流20 bpを連結した配列である。また、3'Xba I-luciはCLucの終止コドンを含めて上流21bpの相補的な配列である。【０１１３】
成熟型CLuc cDNAを増幅するPCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液)200μM、MgSO4100μM、鋳型としてpcDNA-CL 10 ng並びにKOD Plus buffer (1 X)及びKOD plus DNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒(変性)、48℃で30秒(アニーリング)及び68℃で2分(伸長)のサイクルを35サイクル並びに第3ステップ：68℃で3分で行った。【０１１４】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動によって分析し、成熟型CLuc cDNAを含む約1.6 kbのDNA断片を確認した。以下では、このDNA断片を「DNA断片A」と呼ぶ。【０１１５】
一方、出芽酵母のαファクター分泌シグナルペプチドDNAを増幅するためのプライマー(5'Sma I-alpha及びalpha-luci-R)の配列は以下の通りであった。【０１１６】
5'Sma I-alpha ; GGGTCCCGGGATGAGATTTCCTTCAATTT（配列番号１８）
alpha-luci-R ; GGTTCGTAAGGACAGTCCTGAGCTTCAGCCTCTCTTTTC（配列番号１９）
5'Sma I-alphaは、αファクター分泌シグナルペプチドの開始コドンATGを含めて下流28 bpであり、一方、alpha-luci-Rは上記alpha-luci-F(配列番号１６)の相補的な配列である。【０１１７】
αファクター分泌シグナルペプチドDNAを増幅するPCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエ S288CゲノムDNA 1 ng、プライマーとして5'Sma I-alphaとalpha-luci-Rを用い、第2ステップの伸長反応時間を30秒、第3ステップを1分としたこと以外は、上記成熟型CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。【０１１８】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動によって分析し、αファクター分泌シグナルペプチドDNAを含む約250 bpのDNA断片を確認した。以下では、このDNA断片を「DNA断片B」と呼ぶ。【０１１９】
DNA断片Bの下流にDNA断片Aを連結するために、プライマー5'Sma I-alpha(配列番号１８)と3'Xba I-luci(配列番号１７)を用いてoverlap PCR法を行った。【０１２０】
overlap PCRは、鋳型として上記DNA断片Aを含むPCR反応液及びDNA断片Bを含むPCR反応液をそれぞれ蒸留水で100倍に希釈した溶液1μlずつを用い、プライマーとして5'Sma I-alpha(配列番号１８)と3'Xba I-luci(配列番号１７)を用い、第2ステップのアニーリング温度を50℃、伸長反応時間を2分、第3ステップを3分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。【０１２１】
得られたPCR産物を、GenElute PCR clean-up kit (Sigma)を用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNAを50μl反応液中、Sma I 20 Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、DNAを再度GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。【０１２２】
次いで、溶出したDNAを50μl反応液中、Xba I 20Uで18時間切断した。Xba I で切断後、DNAをGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このようにして、αファクター分泌シグナルペプチドDNAの下流に成熟型CLuc cDNAが連結したDNA断片が得られた。以下では、このDNA断片をDNA断片Cと呼ぶ。【０１２３】
一方、pUG35(http://mips.gsf.de/proj/yeast/info/tools/hegemann/gfp.html)を、Xba IとSac Iで切断し、T4 DNA polymeraseで平滑末端化した後、自己環状化させることによってpUG35-MET25+MCSを作製した。次いで、pUG35-MET25+MCSをCla I及びXho Iで切断し、アガロース電気泳動により、ベクター断片（約5.1 kbp)を回収した。一方、このベクター断片を環状化させるため、下記のオリゴDNAを合成し、アニーリングさせることでリンカーDNAを作製した。【０１２４】
MCS リンカー F: CCGCTCGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACATCGATGG（配列番号２０）
MCS リンカー R: CCATCGATGTCGACGAGCTCGCGGCCGCTCGAGCGG（配列番号２１）
なお、作製したリンカーDNAは、XhoI-NotI-SacI-SalI-ClaIの制限酵素サイトを含んでいる。【０１２５】
アニーリングの後、XhoI及びClaIで該リンカーDNAの両末端を切断した。ついで、上記ベクター断片とリンカーDNAとを、DNA Ligation Kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep Kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より目的のプラスミド（以下、「pUG35-MET25-EGFP3+MCS」という）を調製した。【０１２６】
さらに、pUG35-MET25-EGFP3+MCSプラスミド2μgを50μl反応液中、Sma I 50 Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、DNAをGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、得られたDNAを50μl反応液中、Xba I 50Uで18時間切断した。Xba Iで切断後、DNAをアガロース電気泳動に供し、pUG35-MET25-EGFP3+MCSプラスミドのベクター断片（約5 kb）を回収した。以下では、このベクター断片をDNA断片Dと呼ぶ。【０１２７】
DNA断片CとDNA断片Dとを、DNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute Plasmid MiniPrep kit (Sigma)を用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドのSpe I及びXba Iの切断パターンにより、αCLucをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保有した形質転換体を判別した。【０１２８】
さらに、得られたプラスミド溶液について、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit ver.3.1（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列の解析を行い、プラスミドが、予想されるαCLucをコードする塩基配列と一致する塩基配列を有することを確認した。そこで、αCLucをコードする塩基配列を含むプラスミドが由来する形質転換体より、プラスミド（以下、「pCLuRA」という）を調製した。【０１２９】
次に、pCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのTDH3(系統的遺伝子名：YGR192C)遺伝子のプロモーター(配列番号２２：以下、「TDH3プロモーター」という)を、αCLucをコードするDNAの5'上流側に位置するように組み込んだ。ここで、TDH3プロモーターとは、TDH3遺伝子の5’上流側の非翻訳領域、すなわち、TDH3遺伝子とTDH3遺伝子の5’上流隣接遺伝子であるPDX1遺伝子とに挟まれる領域である(酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照)。【０１３０】
TDH3プロモーターを単離するためのPCRのプライマー(5'TDH3_BamHI及び3'TDH3)の配列は以下の通りであった。【０１３１】
5'TDH3_BamHI ; GGGTGGATCCCGAGTTTATCATTATCAATAC（配列番号２３）
3'TDH3 ; TCGAAACTAAGTTCTTGGTG（配列番号２４）
5'TDH3_BamH1プライマーは、TDH3オープンリーディングフレーム(ORF) 5'上流のPDX1 ORFの終始コドンの3'下流21塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'TDH3プライマーはTDH3 ORF 開始コドンより5'上流20塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０１３２】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエ S288CゲノムDNA 1 ng、プライマーとして5'TDH3_BamHI(配列番号２３)と3'TDH3(配列番号２４)を用い、第2ステップのアニーリング温度を52℃、伸長反応時間を30秒、第3ステップを1分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。【０１３３】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動によって分析し、約650 bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物を、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このようにして得られたTDH3プロモーターのDNA断片を、以下では「DNA断片E」と呼ぶ。【０１３４】
一方、pCLuRA 2μgを50μl反応液中、Sma I 50 Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、DNAをGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、得られたDNAを50μl反応液中、BamHI 50Uで18時間切断した後、アガロース電気泳動に供し、ベクター断片（約5 kb）を回収した。以下では、このベクター断片を「DNA断片F」と呼ぶ。【０１３５】
DNA断片EとDNA断片Fとを、DNA Ligation Kit ver.2を用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドの制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保有した形質転換体を判別した。TDH3プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドが由来する形質転換体より、プラスミド（以下、「pCLuRA-TDH3」という）を調製した。【０１３６】
pCLuRA-TDH3を用いてサッカロミセス・セレビシエ YPH500株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation kit（BIO101）を用いた。【０１３７】
得られた形質転換体を、ウラシルを含まない合成寒天培地（SD+KHLWadeプレート；0.67％ Yeast nitrogen base without amino acids（DIFCO）、2％ グルコース、0.02 mg/ml 硫酸アデニン、0.02 mg/ml トリプトファン、0.02 mg/ml ヒスチジン、0.03 mg/ml リシン、0.03 mg/mlロイシン、1.5% 寒天）に塗布し、30℃で3日間培養した。【０１３８】
3日間の培養後、pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を得た。当該pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体が、αCLucを発現することとなる。【０１３９】
（２）形質転換体からのCypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼの分泌発現と培養液の至適pHの検討
上記のように得られたpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を、ウラシルを含まない合成培地(SD+KHLWade;0.67％ Yeast nitrogen base without amino acids（DIFCO）、2％ グルコース、0.02 mg/ml 硫酸アデニン、0.02 mg/ml トリプトファン、0.02 mg/ml ヒスチジン、0.03 mg/ml リシン、0.03 mg/mlロイシン）(以下では単に「SD培地」という)に接種して30℃で培養した。また、種々のpH（pH4.0、5.0、6.0、6.5）に調整した100 mMリン酸カリウム緩衝液を含むSD培地を調製し、同様にpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を接種して30℃にて培養した。【０１４０】
培養後、600 nmにおける吸光度がおよそ0.4〜0.6に達した時点で、培養液を一部採取し、遠心分離により菌体を除去し、培養上清を調製した。この培養上清にpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたCLucが存在していると考えられるので、培養上清中のCLuc活性を測定した。【０１４１】
CLuc活性測定にはベルトールド社LB960ルミノメーターを用いた。発光測定用のCypridinaルシフェリン(ルシフェラーゼに対する基質)は、50%エタノール-5 mM HCl溶液に溶解された66μM又は100μMの保存液を100 mM Tris-HCl（pH 7.4）で2.5μMに用時希釈して用いた。【０１４２】
CLucによるCypridinaルシフェリンの分解による発光強度は、上記のように調製された培養上清20μlに対し、2.5μM Cypridinaルシフェリン希釈溶液80μlを添加し、5秒間の積算により測定した。この測定値を、培養液の600 nmにおける吸光度で除することによって、酵母菌体数を補正したCLuc活性とした。結果を図１に示す。【０１４３】
図１において、縦軸のRLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を600 nmの吸光度で除した値である。また、横軸のサンプルは、以下のサンプルを示す。【０１４４】
「緩衝液なし」：100 mMリン酸カリウム緩衝液を加えないSD培地においてpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を培養したサンプル。【０１４５】
「pH4.0」、「pH5.0」、「pH6.0」及び「pH6.5」：それぞれ、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH6.5に調整した100 mMリン酸カリウム緩衝液を含むSD培地でpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を培養したサンプル。【０１４６】
さらに図１においては、各サンプルのRLU/ODの値は平均値と標準偏差で示している。【０１４７】
図１に示すように、緩衝液(100 mMリン酸カリウム緩衝液)を加えず、pHが次第に低下する通常のSD培地においては、pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体は増殖するものの、培養上清中においてCLuc活性は検出されなかった。また、pH6.5に調整した緩衝液を含むSD培地においては、pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体は生育又は増殖しなかった。一方で、培地のpHが変動しないようにpH4.0、pH5.0又はpH6.0の緩衝液を加えたSD培地においては、培養上清中のCLuc活性を検出することが可能であった。特に、pH6.0の緩衝液を加えたSD培地、すなわち、培地のpHが6.0である場合、培養上清中のCLuc活性が最大値であり、最適であった。なお、これらの培養上清サンプル中のCLuc活性測定は、CLucの活性が最大となるpH 7.4で行った。以上のように、形質転換体(形質転換酵母)が増殖し、CLucが失活しない培養条件を確立した。【０１４８】
〔実施例２〕CLuc活性測定時におけるpH及び塩濃度の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際のCLuc活性測定時におけるpH及び塩濃度の条件について検討した。【０１４９】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたαCLucを含む培養上清の調製は、実施例１と同様に行い、培地のpHは6.0とした。【０１５０】
CLuc活性測定時のpHを設定するために、Cypridinaルシフェリンは種々のpHの緩衝液(最終濃度100mMのリン酸カリウム緩衝液(KPi)又はトリス塩酸緩衝液(Tris-HCl))で2.5μMに希釈した希釈溶液を用いた。なお、当該Cypridinaルシフェリン希釈溶液は、培養上清に対して4倍量加えた。CLuc活性測定は、実施例１と同様に行った。結果を図２Ａに示す。【０１５１】
あるいは、各種の最終濃度のTris-HCl(pH7.4)で希釈した2.5μm Cypridinaルシフェリン希釈溶液を培養上清に対して4倍量加えて、実施例１と同様にCLuc活性測定を行った。結果を図２Ｂに示す。【０１５２】
図２Ａ及びＢにおいて、縦軸のRLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を600 nmの吸光度で除した値である。各サンプルのRLU/ODの値は平均値と標準偏差で示している。また、図２Ａにおいて、「SD」は緩衝液を含まないSD培地で希釈したCypridinaルシフェリン希釈溶液を用いたサンプル、「DDW」は水で希釈したCypridinaルシフェリン希釈溶液を用いたサンプルである。【０１５３】
図２Ａ及びＢから判るように、CLuc(αCLuc)は、活性測定時のルシフェリン希釈溶液の塩濃度やpHによって活性が変化することが示された。特に、100 mM Tris-HCl (pH7.0〜8.0)で希釈したルシフェリン希釈溶液を用いることにより、最大のCLuc活性を得られた。【０１５４】
〔実施例３〕CLuc活性測定時におけるルシフェリン濃度の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際のCLuc活性測定時におけるルシフェリン濃度について検討した。【０１５５】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたαCLucを含む培養上清の調製は、実施例１と同様に行い、培地のpHは6.0とした。Cypridinaルシフェリンは100mM Tris-HCl（pH 7.4）で種々の濃度に希釈したものを用い、反応溶液において最終濃度0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μMになるように希釈した。なお、各種Cypridinaルシフェリン希釈溶液中では、保存液とする際に溶解に使用したエタノールの濃度が同濃度になるように調整した。【０１５６】
一方、pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体の培養上清は100 mMリン酸緩衝液を含むSD培地を用いて、原液から10倍、100倍、1000倍、10000倍に段階的に希釈したものを用いた。すなわち、培養上清原液の濃度を100％とした場合、10倍、100倍、1000倍、10000倍希釈したものは、それぞれ培養上清濃度が10％、1％、0.1％、0.01％となる。【０１５７】
以上のように調製した培養上清に対して各種Cypridinaルシフェリン希釈溶液を4倍量加えて、実施例１と同様にCLuc活性測定を行った。結果を図３に示す。【０１５８】
図３において、各プロットは、反応溶液において各種最終濃度のルシフェリンに対する、培養液上清原液を100％として、段階的に希釈した培養上清を用いた結果を示す。縦軸のRLUはルミノメーターにおける相対発光強度を示す。【０１５９】
図３に示したとおり、CLuc活性は、ミカエリス-メンテン式に合致する濃度反応曲線が得られた。その活性は反応溶液中のルシフェリン最終濃度約1μM以上で飽和に達することが分かった。【０１６０】
そこで、以下の実施例において、反応溶液においてルシフェリン最終濃度が2μMとなるように添加して、CLuc活性測定を行うこととした。【０１６１】
〔実施例４〕酵母培養上清中のCLucの安定性の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際の酵母培養上清中におけるCLucの安定性について検討した。【０１６２】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたαCLucを含む培養上清の調製及びCLuc活性の測定は実施例１に従った。調製した培養上清は0℃、25℃、40℃又は50℃にてそれぞれ0分、15分、30分、60分インキュベートし、その後、CLuc活性を測定した。結果を図４に示す。【０１６３】
図４において、各プロットは、各温度における一定時間のインキュベーションに対する各サンプルの相対残存活性の平均と標準偏差を示す。縦軸は、インキュベーションなしのサンプルのCLuc活性を100%とした相対残存活性である。【０１６４】
図４に示したとおり、CLucの酵素としての安定性は極めて高く、本発明におけるハイスループットアッセイ法において必要とされるサンプリング後15分を過ぎても室温保存の状態において安定であることが証明された。【０１６５】
〔実施例５〕CLuc活性測定における測定可能範囲の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際の酵母培養上清中におけるCLuc活性の測定可能範囲（ダイナミックレンジ）について検討した。【０１６６】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたαCLucを含む培養上清の調製およびCLuc活性の測定は実施例１に従った。なお、調製した培養上清を、100 mMリン酸緩衝液を含むSD培地を用いて1000倍まで段階希釈し、CLuc活性測定に使用した。すなわち、培養上清原液の濃度を100％とした場合、培養上清濃度が0.01％となる培養上清までを調製した。結果を図５に示す。【０１６７】
図５において、各プロットは、段階的に希釈した培養上清サンプル(培養上清濃度％)に対するRLUの平均と標準偏差を示す。縦軸のRLUはルミノメーターにおける相対発光強度を示す。なお、図に示すCV値は、3回の繰り返し測定における変動係数(標準偏差/平均×100)である。【０１６８】
図５に示したとおり、CLucの活性は、103の範囲において直線性が成立することが分かった。これにより、CLucを利用したレポーターアッセイ系では最大1000倍までの変化を定量的に測定することが可能であると証明された。【０１６９】
〔実施例６〕CLuc活性測定における各種化学物質の影響の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際の酵母培養上清と共に、CLuc活性測定において共存する化学物質のCLuc活性測定に与える影響について検討した。【０１７０】
検討に用いた各種化学物質(DTT、CuSO4、メナジオン(Menadione)、ジアミド、H2O2、エタノール、NaCl、ソルビトール、ガラクトース、ラフィノース、スクロース、マンノース)は、酵母の遺伝子発現を誘導できることが知られている(Audrey P. Gasch, Paul T. Spellman, Camilla M. Kao Orna Carmel-Harel, Michael B. Eisen, Gisela Storz, David Botstein及びPatrick O. Brown (2000) Mol. Biol. Cell. 11,4241-4257、Varela JC, Praekelt UM, Meacock PA, Planta RJ, Mager WH., (1995) Mol Cell Biol. 15:6232-45、Macreadie IG, Horaitis O, Verkuylen AJ, Savin KW.(1991) Gene.104:107-11)。本実施例では、各種化学物質を酵母の遺伝子発現を十分に誘導できることが知られている濃度より段階希釈して使用した。【０１７１】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌されたαCLucを含む培養上清の調製およびCLuc活性の測定は実施例１に従った。【０１７２】
調製した培養上清20μlに各種濃度に調整した化学物質を2μl添加した後CLuc活性を測定した。結果を図６に示す。【０１７３】
図６では、培養上清に添加した各種濃度の化学物質に対する相対残存活性を示す。各サンプルの相対残存活性は、化学物質を加えないサンプルのCLuc活性を100％として、平均及び標準偏差で示している。【０１７４】
図６に示したとおり、CLucは、高濃度のCuSO4や高濃度のエタノール以外、酵母の遺伝子発現を活性化するような化学物質に対し酵素活性が抑制されないことが明らかとなった。これによりCLucをレポータータンパク質としたレポーターアッセイ系が広範囲にわたる化学物質に対応することが証明された。【０１７５】
〔実施例７〕濁度によるCLuc生産量の補正方法の検討
CLucの生産量は、酵母内のプロモーター活性と酵母細胞数に依存する。従って、酵母のプロモーターの強さを、CLuc活性を用いて測定するには、酵母細胞数を補正する必要がある。そこで、一種類の形質転換酵母について、様々な菌体密度の培養液を調製し、CLucの活性を測定すると共に菌体密度の指標である濁度（600 nmの吸光度）で補正することができるかどうか検討した。【０１７６】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を実施例１と同様に培養した。30℃で約48時間培養し、定常期に達した時点で培養液を得た。この培養液を、1/100から1/1000に新しい培地で希釈し、再び30℃でおよそ20時間培養を続けた。【０１７７】
培養後、培養上清の調製およびCLuc活性の測定を、実施例１に従って行った。また、培養液又は培養上清から200μlを採取し、培養液又は培養上清の濁度をテカン社サンライズリモートを用いて600 nmの吸光度(OD)にて測定した。結果を図７Ａ及びＢに示す。【０１７８】
図７Ａは、様々な濁度の培養液又は培養上清に対する相対発光濃度を示す。縦軸のRLUは、ルミノメーターにおける相対発光濃度を示す。【０１７９】
一方、図７Ｂは、図７Ａに示した菌体を含む培養液及び培養液から遠心分離して得た培養上清の全てのサンプルに対するRLU/ODの平均値と標準偏差を示す。縦軸のRLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を600 nmの吸光度で除した値である。【０１８０】
図７Ｂに示したとおり、培養液又は培養上清のRLUを濁度で補正することによって、同一のプロモーター(TDH3プロモーター)を有する酵母を培養した培養液又は培養上清からは、ほぼ同じ値のRLU/ODの結果を得ることができた。すなわち、酵母の増殖フェーズを揃えることなく、酵母の増殖フェーズが多少異なっていても、本発明に係る方法を用いてプロモーター活性を評価できることが示された。さらに、培養上清における測定結果と、菌体を含む培養液の測定結果とには良好な相関が認められ、本測定系は菌体の遠心分離を必要としないことが証明された。【０１８１】
〔実施例８〕培養液サンプリング後のCLuc活性の安定性
本発明に係る方法を用いて、96穴フォーマットによるハイスループットアッセイを実施するためには、培養液を採取した後、ルミノメーターによるCLuc活性を96サンプル全て測定している間に、CLuc活性値が変動しないことが求められる。【０１８２】
そこで培養液サンプリング後のCLuc活性の安定性を検討するために、実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を、実施例１に従って培養し、酵母培養液を一部採取した(サンプリング)後、25℃で0、10、20、30分インキュベートした。インキュベーション後、それぞれの培養液サンプルにおいて、CLuc活性を実施例１に従って測定した。結果を図８に示す。【０１８３】
図８においては、サンプリング後すぐに測定したサンプルのCLuc活性を100%として、相対残存活性で示した。図８では、各サンプルの相対残存活性を平均と標準偏差で示している。【０１８４】
図８に示したように、サンプリング後、培養液を25℃で30分間インキュベーションしても、CLuc活性はほとんど変化しなかった。すなわち、ルミノメーターで96サンプルを測定するために必要な時間である30分間、サンプリング後、室温で放置しても、培養液中のCLucの活性はほとんど変化しなかった。従って、本発明に係る方法はハイスループット測定が可能なレポーターアッセイ系であることが示された。【０１８５】
〔実施例９〕96穴ディープウェルプレートを用いたCLuc発現酵母の同時培養を含めたハイスループットレポーターアッセイ法の確立
本発明に係る方法をハイスループットアッセイ化するには、形質転換酵母の培養も96穴フォーマットで行う必要がある。そこで、同一の形質転換酵母を96穴ディープウェルプレートで96サンプル個々に培養し、それらが示す濁度で補正されたCLucの活性が一致するかどうかを調べた。【０１８６】
実施例１で作製したpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を実施例１に従って30℃で培養して、定常期に達した培養液を得た。この培養液を新しい培地で1/100に希釈した後、96穴ディープウェルプレートの全てのウェルに1 mlずつ植菌し、再び30℃でおよそ16時間培養を続けた。各ウェルから酵母培養液を一部採取した後、25℃で0、10、20、30分インキュベートした後に、それぞれの培養液サンプルにおいて、CLuc活性を実施例１に従って測定した。結果を図９に示す。【０１８７】
図９は、96穴ディープウェルプレートにおいて独立に培養し、CLuc活性を測定した場合のRLU/ODの平均値と標準偏差を示す。図９において、縦軸のRLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を600 nmの吸光度で除した値である。【０１８８】
図９に示したとおり、96穴ディープウェルプレートを培養に用いることにって多数のサンプルを同時培養した場合においても濁度で補正されたCLucの活性値はほとんど同じであった。したがって、本発明に係る方法はハイスループット測定が可能なレポーターアッセイ系であることが示された。【０１８９】
〔実施例１０〕塩基配列を酵母用に改変したCLucをコードするDNAの調製
CLucを出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにおいてレポーター酵素として用いるために、CLucをコードするDNAを再デザインした。そのためにまず、Akashiらの論文（Genetics 164: 1291-1303 (2003)）における酵母のコドン利用頻度を参考にして、CLucのアミノ酸配列を酵母の最適コドンを用いて塩基配列に変換した。次いで、このように決められたCLucをコードする塩基配列内に含まれる、酵母転写因子が結合する可能性のあるcis配列をウェブサイトYeast Promoter Database;SCPD(http://cgsigma.cshl.org/jian/)を用いて検索した。この検索により見いだされた酵母転写因子が結合する可能性があるcis配列について、コードするアミノ酸配列が変わらないように1又は数個の塩基を置換した。同様な潜在的cis配列の探索をGenomatix社が提供する制御領域解析用ウェブサイト(http://www.genomatix.de/）を用いて行った。これら2種のcis配列データベースを繰り返し用いて、潜在的cis配列の探索と塩基置換による除去を繰り返し、最終的に可能な限り潜在的転写因子結合配列を減らしたCLucをコードするDNAの配列をデザインした(配列番号１５)。以下、この配列を「mCLuc DNA」と呼ぶ。mCLuc DNAは、CLuc cDNA(配列番号１)と塩基配列が異なるが、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は、CLuc(配列番号２)と同一である。ただし、以下では、mCLuc DNAによりコードされるタンパク質を「mCLuc」と呼ぶ。【０１９０】
（１）mCLuc DNAの各DNA断片の作製
mCLuc DNAを構成する二本鎖の全てのDNA配列を、以下に示す28本の合成DNAとして依頼合成により作製した。これらは、14組の一部相補的な配列を有する一本鎖DNAのペアであり、これらのペアごとにアニールさせ、DNAポリメラーゼを用いて伸長反応により二本鎖とした。【０１９１】
1組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０１９２】
native_signal_1F:CATGAAGACCTTGATCTTGGCTGTCGCTTTGGTCTACTGTGCTACTGTTCACTGTCAAGACTGTCCATAC（配列番号２５）
CLuc_mature_1R:GATACATTCACCTTCTTTAGCTTCACAAGAGGTAGGGACAGTGTTCGGTGGGTCTGGTTCGTATGGACAG（配列番号２６）
native_signal_1Fは、mCLuc DNAの開始コドンを含めてより3'側に69bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_1Rは、mCLuc DNAの60bpから129bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには、10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は、各々の合成DNA 3μM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液)200μM、MgSO4 100μM、KOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、42℃で30秒（アニーリング）及び68℃で30秒（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で1分で行った。【０１９３】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０１９４】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片1」と呼ぶ。【０１９５】
2組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０１９６】
CLuc_mature_2F:TGAATGTATCGATTCTTCTTGTGGTACTTGTACCAGGGACATATTGTCTGACGGTTTGTGTGAAAACAAG（配列番号２７）
CLuc_mature_3R:TGCCGCTTCAACTCTGCATTCGATAACGTATTGGCACATTCTACAACAAGTCTTGCCAGGCTTGTTTTCA（配列番号２８）
CLuc_mature_2Fは、mCLuc DNAの120bpより189bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_3Rは、mCLuc DNAの180bpから249bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには、10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は、上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０１９７】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０１９８】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片2」と呼ぶ。【０１９９】
3組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２００】
CLuc_mature_4F:TGAAGCGGCAGGGTGGTTCAGGACTTTTTACGGTAAACGTTTCCAATTCCAAGAACCAGGTACTTACGTC（配列番号２９）
CLuc_mature_5R:ATCAAGATTCTCTAATGTTATGGATACTTTCCAATCTCCACCTTTGGTACCTTGGCCTAAGACGTAAGTA（配列番号３０）
CLuc_mature_4Fは、mCLuc DNAの240bpより309bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_5Rは、mCLuc DNAの300bpから369bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２０１】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２０２】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片3」と呼ぶ。【０２０３】
4組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２０４】
CLuc_mature_6F:GAATCTTGATGGCACTAAGGGTGCTGTCTTAACTAAAACCCGGTTAGAAGTCGCTGGTGATATTATCGAC（配列番号３１）
CLuc_mature_7R:GGCGATGATAGGATCAGCACCACCATTAACAGTAATCGGATTCTCAGTAGCTTGAGCGATGTCGATAATA（配列番号３２）
CLuc_mature_6Fは、mCLuc DNAの360bpより429bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_7Rは、mCLuc DNAの420bpから489bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２０５】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２０６】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片4」と呼ぶ。【０２０７】
5組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２０８】
CLuc_mature_8F:TATCATCGCCAACCCTTATACTATCGGTGAGGTTACCATCGCCGTCGTTGAGATGCCAGGCTTTAACATT（配列番号３３）
CLuc_mature_9R:TCTGACAGAACGACCACCCAAGATGTCGATGACGATCAACTTGAAGAACTCGATTACGGTAATGTTAAAG（配列番号３４）
CLuc_mature_8Fは、mCLuc DNAの480bpより549bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_9Rは、mCLuc DNAの540bpから609bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２０９】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２１０】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片5」と呼ぶ。【０２１１】
6組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２１２】
CLuc_mature_10F:TTCTGTCAGAATCGCTCCAGACACTGCTAACAAGGGTATGATCTCTGGTTTGTGTGGCGATCTCAAGATG（配列番号３５）
CLuc_mature_11R:GTTAATCTTAGGTTGGATAGCTAGCTGCTCAGGATCTGAAGTGAAATCAGTGTCCTCCATCATCTTGAGA（配列番号３６）
CLuc_mature_10Fは、mCLuc DNAの600bpより669bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_11Rは、mCLuc DNAの720bpから789bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２１３】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２１４】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片6」と呼ぶ。【０２１５】
7組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２１６】
CLuc_mature_12F:TAAGATTAACCAAGAGTTCGATGGGTGTCCGTTATACGGTAATCCTGATGACGTCGCTTACTGTAAAGGC（配列番号３７）
CLuc_mature_13R:TATGGTATAGTAGTAAAAGTTGATAGGATTCCTACAAGAATCTTTGTATGGTTCCAACAAGCCTTTACAG（配列番号３８）
CLuc_mature_12Fは、mCLuc DNAの720bpより789bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_13Rは、mCLuc DNAの780bpから849bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２１７】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２１８】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片7」と呼ぶ。【０２１９】
8組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２２０】
CLuc_mature_14F:CTATACCATATCTTGTGCTTTCGCCAGGTGCATGGGGGGAGACGAGCGTGCATCTCATGTTTTGTTGGAC（配列番号３９）
CLuc_mature_15R:AGTGTGACCAGACAAGACACAAGTACCTCTAGTTTCTGGAGCAGCACAAGTCTCTCTGTAGTCCAACAAA（配列番号４０）
CLuc_mature_14Fは、mCLuc DNAの840bpより909bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_15Rは、mCLuc DNAの900bpから969bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２２１】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２２２】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片8」と呼ぶ。【０２２３】
9組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２２４】
CLuc_mature_16F:TGGTCACACTTTCTACGACACTTTCGACAAGGCTAGGTACCAATTCCAAGGGCCGTGCAAGGAAATACTA（配列番号４１）
CLuc_mature_17R:ATCCACGTTACGGTGAGAGACCTTGACGTCCCAAGTGTTCCAGAAGCAGTCCGCAGCCATTAGTATTTCC（配列番号４２）
CLuc_mature_16Fは、mCLuc DNAの960bpより1029bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_17Rは、mCLuc DNAの1020bpから1089bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２２５】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２２６】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片9」と呼ぶ。【０２２７】
10組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２２８】
CLuc_mature_18F:TAACGTGGATTCTTACACTGAAGTCGAAAAGGTCAGGATTCGTAAGCAGTCCACTGTCGTCGAATTGATC（配列番号４３）
CLuc_mature_19R:TTGAGAGGAATATGGCACAGAAACGGCTTCACCACCGACCAAGATTTGCTTACCGTCAACGATCAATTCG（配列番号４４）
CLuc_mature_18Fは、mCLuc DNAの1080bpより1149bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_19Rは、mCLuc DNAの1140bpから1209bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２２９】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２３０】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片10」と呼ぶ。【０２３１】
11組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２３２】
CLuc_mature_20F:TTCCTCTCAAAACACTTCAATATACTGGCAAGACGGTGACATCTTAACCACTGCTATCTTGCCAGAAGCC（配列番号４５）
CLuc_mature_21R:GTCGAATGGGTCTCTAATATGAACAACTAATAGCTGCTTGAAGTTGAACTTGACGACCAAGGCTTCTGGC（配列番号４６）
CLuc_mature_20Fは、mCLuc DNAの1200bpより1269bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_21Rは、mCLuc DNAの1260bpから1329bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２３３】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２３４】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片11」と呼ぶ。【０２３５】
12組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２３６】
CLuc_mature_22F:CCCATTCGACGGTAAGACTTGTGGTATCTGTGGTAACTACAATCAGGACTTCTCTGACGATTCTTTCGAC（配列番号４７）
CLuc_mature_23R:TGGCTTTTGTTCTTCAGTACAACCAGGTGGATTCGGTGTTAGATCGCAAGCACCTTCAGCGTCGAAAGAA（配列番号４８）
CLuc_mature_22Fは、mCLuc DNAの1320bpより1389bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_23Rは、mCLuc DNAの1380bpから1449bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２３７】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２３８】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片12」と呼ぶ。【０２３９】
13組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２４０】
CLuc_mature_24F:ACAAAAGCCAGAAGCTGAACGTTTGTGCAACAGTTTATTCGCTGGTCAATCCGATTTGGACCAAAAGTGT（配列番号４９）
CLuc_mature_25R:CCAAAAGTGTAACGTCTGTCACAAGCCAGACAGAGTTGAAAGATGTATGTACGAATACTGTTTGAGAGGT（配列番号５０）
CLuc_mature_24Fは、mCLuc DNAの1440bpより1509bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_25Rは、mCLuc DNAの1500bpから1569bpまでの70bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２４１】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約130bpのDNA断片を確認した。【０２４２】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片13」と呼ぶ。【０２４３】
14組目の合成DNAペアの配列は以下の通りであった。【０２４４】
CLuc_mature_26F:TTTGAGAGGTCAACAAGGTTTCTGTGACCATGCTTGGGAGTTCAAGAAGGAGTGCTATATCAAGCACGGC（配列番号５１）
CLuc_mature_27R:CCTACTTGCACTCATCTGGGACCTCTAAGGTATCGCCGTGCTTG（配列番号５２）
CLuc_mature_26Fは、mCLuc DNAの1560bpより1629bpまでの70bpの長さを有する合成DNAであり、一方、CLuc_mature_27Rは、mCLuc DNAの1620bpから1663bpまでの終始コドンTAGを含む44bpの相補鎖の合成DNAである。この2つの合成DNAには10bpの相補的な配列が含まれている。この2つの合成DNAを用いたDNA伸長反応は上記DNA断片1の作製と全く同じ条件で行った。【０２４５】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約100bpのDNA断片を確認した。【０２４６】
得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で100倍に希釈し、これを「DNA断片14」と呼ぶ。【０２４７】
（２）mCLuc DNA断片の連結
上記（１）で得られたDNA断片1〜14を、オーバーラップPCR法を用いて連結した。【０２４８】
2-1. DNA断片1とDNA断片2との連結
上記native_signal_1F(配列番号２５)とCLuc_mature_3R(配列番号２８)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片1とDNA断片2とを連結した。【０２４９】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP（4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、鋳型としてDNA断片1及びDNA断片2を各々1μlずつ、並びにKOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、42℃で30秒（アニーリング）及び68℃で30秒（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で1分で行った。【０２５０】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片15」と呼ぶ。【０２５１】
2-2. DNA断片3とDNA断片4との連結
上記CLuc_mature_4F(配列番号２９)とCLuc_mature_7R(配列番号３２)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片3とDNA断片4とを連結した。【０２５２】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片3及びDNA断片4を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２５３】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片16」と呼ぶ。【０２５４】
2-3. DNA断片5とDNA断片6との連結
上記CLuc_mature_8F(配列番号３３)とCLuc_mature_11R(配列番号３６)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片5とDNA断片6とを連結した。【０２５５】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片5及びDNA断片6を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２５６】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片17」と呼ぶ。【０２５７】
2-4. DNA断片7とDNA断片8との連結
上記CLuc_mature_12F(配列番号３７)とCLuc_mature_15R(配列番号４０)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片7とDNA断片8とを連結した。【０２５８】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片7及びDNA断片8を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２５９】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片18」と呼ぶ。【０２６０】
2-5. DNA断片9とDNA断片10との連結
上記CLuc_mature_16F(配列番号４１)とCLuc_mature_19R(配列番号４４)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片9とDNA断片10とを連結した。【０２６１】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片9及びDNA断片10を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２６２】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片19」と呼ぶ。【０２６３】
2-6. DNA断片11とDNA断片12との連結
上記CLuc_mature_20F(配列番号４５)とCLuc_mature_23R(配列番号４８)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片11とDNA断片12とを連結した。【０２６４】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片11及びDNA断片12を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２６５】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約250bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約250bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片20」と呼ぶ。【０２６６】
2-7. DNA断片13とDNA断片14との連結
上記CLuc_mature_24F(配列番号４９)とCLuc_mature_27R(配列番号５２)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片13とDNA断片14とを連結した。【０２６７】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片13及びDNA断片14を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２６８】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約230bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約230bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片21」と呼ぶ。【０２６９】
2-8. DNA断片16とDNA断片17との連結
上記CLuc_mature_4F(配列番号２９)とCLuc_mature_11R(配列番号３６)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片16とDNA断片17とを連結した。【０２７０】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片16及びDNA断片17を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２７１】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約490bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約490bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片22」と呼ぶ。【０２７２】
2-9. DNA断片18とDNA断片19との連結
上記CLuc_mature_12F(配列番号３７)とCLuc_mature_19R(配列番号４４)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片18とDNA断片19とを連結した。【０２７３】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片18及びDNA断片19を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２７４】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約490bpの断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約490bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片23」と呼ぶ。【０２７５】
2-10. DNA断片20とDNA断片21との連結
上記CLuc_mature_20F(配列番号４５)とCLuc_mature_27R(配列番号５２)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片20とDNA断片21とを連結した。【０２７６】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片20及びDNA断片21を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-1のPCRと同様の条件で行った。【０２７７】
得られたPCR産物を2％アガロース電気泳動により分析し、約470bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を2％アガロースゲルにより電気泳動し、約470bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片24」と呼ぶ。【０２７８】
2-11. DNA断片15とDNA断片22との連結
上記native_signal_1F(配列番号２５)とCLuc_mature_11R(配列番号３６)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片15とDNA断片22とを連結した。【０２７９】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、鋳型としてDNA断片15及びDNA断片22を各々1μlずつ、並びにKOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、42℃で30秒（アニーリング）及び68℃で1分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で2分で行った。【０２８０】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約730bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を1％アガロースゲルにより電気泳動し、約730bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片25」と呼ぶ。【０２８１】
2-12. DNA断片23とDNA断片24との連結
上記CLuc_mature_12F(配列番号３７)とCLuc_mature_27R(配列番号５２)とをプライマーとして用いたPCRによりDNA断片23とDNA断片24とを連結した。【０２８２】
これらプライマーを用いたPCRは、鋳型としてDNA断片23及びDNA断片24を各々1μlずつ用いた以外は、上記2-11のPCRと同様の条件で行った。【０２８３】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約950bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を1％アガロースゲルにより電気泳動し、約950bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した後、蒸留水により100倍に希釈した。これを「DNA断片26」と呼ぶ。【０２８４】
2-13. DNA断片25とDNA断片26との連結
下記のプライマーを用いたPCRによりDNA断片25とDNA断片26とを連結した。【０２８５】
nativeCLuc_5'SmaI:CATACCCGGGATGAAGACCTTGATTTTGGC（配列番号５３）
mCLuc_3'XbaI:CCCTGTCTAGACTACTTGCACTCATCTG（配列番号５４）
nativeCLuc_5'SmaIは、5'側にSma Iサイトを付加し、mCLuc DNAの開始コドンATGを含み、3'側に20bpの配列である。mCLuc_3'XbaIは、mCLuc DNAの終始コドンTGAを含め5'上流側19bpに相補的な配列の5'側にXba Iサイトを付加した配列である。【０２８６】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、鋳型としてDNA断片25及びDNA断片26を各々1μlずつ、並びにKOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、42℃で30秒（アニーリング）及び68℃で2分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で4分で行った。【０２８７】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約1600bpのDNA断片を確認した。続いて、得られたPCR産物全量を1％アガロースゲルにより電気泳動し、約1600bpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。これを「DNA断片27」と呼ぶ。【０２８８】
（３）mCLuc DNAを含むプラスミドの作製
3-1. DNA断片27のpZErO-2プラスミドへの組み込み
添付プロトコルに従って、pZErO-2プラスミド(Invitrogen製)1μgをEcoR Vで直鎖化し、フェノール・クロロホルム抽出後、20μlの蒸留水に溶解し、使用した。【０２８９】
上記直鎖化したpZErO-2プラスミドとDNA断片27とを、DNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。次いで、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、DNA断片27が挿入されたプラスミド(以下、「pZErO-2-mCLuc」という)を保持した形質転換体を判別した。【０２９０】
3-2. mCLuc DNA断片の調製
上記3-1により得られたpZErO-2-mCLucを保持する大腸菌を、LBカナマイシン（50μg/ml）含有液体培地50mlに接種し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、GenElute Plasmid midi prep kitを用いて、添付プロトコルに従いプラスミドDNAを調製し、OD260nmの吸光値を測定して、DNA濃度を定量した。【０２９１】
得られたDNAのうち5μgを50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Xba I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。これを「mCLuc DNA断片」と呼ぶ。【０２９２】
3-3. pCLuRA+Hind III-Sal Iの調製
pCLuRAのMCSの最も5'端に位置するSpe Iサイトより5'側50bpの位置にHind III及びSal Iサイトを付加するため、以下のプライマーを用いて、pCLuRAを鋳型としたインバースPCRを行った。【０２９３】
Inverse_SalI_F:CCCTGTCGACAAGCGCGCAATTAACCCTC（配列番号５５）
Inverse_HindIII-Sal_R:CCCTGTCGACCCTAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC（配列番号５６）
Inverse_SalI_Fは、Spe Iサイトより5'側50bp上流の位置より3'下流20bpに一致する塩基配列を含んでおり、その5'側にSal Iサイトを付加してある。また、Inverse_HindIII-Sal_Rは、Spe Iサイトより5'側50bp上流の位置より5'上流21bpの塩基配列に相補的な配列を含んでおり、その5'側にHind IIIサイトとSal Iサイトを付加してある。【０２９４】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP（4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、5％ DMSO、鋳型としてpCLuRA 10ng、KOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、52℃で30秒（アニーリング）及び68℃で8分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で10分で行った。【０２９５】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約7kbpのDNA断片を確認した。得られたPCR産物はGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。溶出されたDNA溶液は50μl反応液中、Sal I 50Uで18時間切断した。Sal Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。【０２９６】
得られた溶出液の一部をDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、目的の配列の付加されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。【０２９７】
このプラスミドDNAを50μl反応液中、Hind III 50Uで18時間切断した。Hind IIIで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Sal I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。これを「pCLuRA+Hind III-Sal I DNA断片」と呼ぶ。【０２９８】
3-4. SV40 poly(A)X2 DNA断片の調製
SV40 poly(A)シグナルをタンデムに2つ連結したDNA断片(以下、「SV40 poly(A)X2 DNA断片」という)を作製するために、以下の2種類のプライマーペアによりPCRを行った。【０２９９】
polyA_HindIII_F: CCCTAAGCTTAGACATGATAAGATACATTG（配列番号５７）
polyA_SacII_R: CCTACCGCGGTTACCACATTTGTAGAGG（配列番号５８）
polyA_HindIII_Fは、SV40 poly(A)シグナルの5'端より3'側に20bpの配列の5'側にHind IIIサイトを付加したプライマーである。polyA_SacII_Rは、SV40 poly(A)シグナルの3'端より5'側に20bpの塩基配列に相補的な配列の5'側にSac IIサイトを付加したプライマーである。【０３００】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、鋳型としてSV40 genome DNA (Invitrogen製) 10ng、KOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、52℃で30秒（アニーリング）及び68℃で1分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で2分で行った。【０３０１】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約500bpのDNA断片を確認した。得られたPCR産物はGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。溶出されたDNA溶液は50μl反応液中、Sac II 50Uで18時間切断した。Sac IIで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「SV40 poly(A)_5'」と呼ぶ。【０３０２】
また、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【０３０３】
polyA_SacII_F: CCTACCGCGGAGACATGATAAGATACATTG（配列番号５９）
polyA_SalI_R: CCCTGTCGACTTACCACATTTGTAGAGG（配列番号６０）
polyA_SacII_Fは、SV40 poly(A)シグナルの5'端より3'側に20bpの配列の5'側にSac IIサイトを付加したプライマーである。polyA_SalI_Rは、SV40 poly(A)シグナルの3'端より5'側に20bpの塩基配列に相補的な配列の5'側にSal Iサイトを付加したプライマーである。【０３０４】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）200μM、MgSO4 100μM、鋳型としてSV40 genome DNA (Invitrogen製) 10ng、KOD Plus Buffer (1X)及びDNAポリメラーゼ1Uを含む反応溶液50μlを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、52℃で30秒（アニーリング）及び68℃で1分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で2分で行った。【０３０５】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約500bpのDNA断片を確認した。得られたPCR産物はGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。溶出されたDNA溶液は50μl反応液中、Sac II 50Uで18時間切断した。Sac IIで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「SV40 poly(A)_3'」と呼ぶ。【０３０６】
得られたSV40 poly(A)_5'及びSV40 poly(A)_3'を、DNA Ligation Kitを用いて連結した。ライゲーション反応終了後、反応産物1μlを鋳型として、polyA_HindIII_Fプライマー(配列番号５７)及びpolyA_SalI_Rプライマー(配列番号６０)を用いて、上記SV40 poly(A)_5'を作製するときと同様の条件でPCRを行った。【０３０７】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、目的のDNA断片と思われる約1kbpのバンドを確認した。全てのPCR産物を1％アガロース電気泳動し、約1kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。【０３０８】
このDNA断片と前述の直鎖化したpZErO-2プラスミド1μlとを、DNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、SV40 poly(A)X2 DNA断片が挿入されたプラスミド(以下、「pZErO-2-SV40 poly(A)X2」という)を保持した形質転換体を判別した。【０３０９】
pZErO-2-SV40 poly(A)X2を50μl反応液中、Hind III 50Uで18時間切断した。Hind IIIで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Sal I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約1kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「SV40 poly(A)X2 DNA断片」とした。【０３１０】
3-5. pCLuRA+SV40 poly(A)X2の作製
pCLuRA+Hind III-Sal I DNA断片とSV40 poly(A)X2 DNA断片とを、DNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、目的の遺伝子をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。このプラスミドDNAを「pCLuRA+SV40 poly(A)X2」と呼ぶ。【０３１１】
3-6. pUG35-MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2の作製
pCLuRA+SV40 poly(A)X2を50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Xba I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約6kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「pUG35-MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2」と呼ぶ。【０３１２】
3-7. pmCLuRAの構築
前述のmCLuc DNA断片とpUG35-MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2とを、DNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、目的の遺伝子をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。目的の位置にmCLuc DNA断片が挿入されたプラスミドを「pmCLuRA」と呼ぶ。【０３１３】
〔実施例１１〕mCLucを用いたレポーターアッセイとβ-ガラクトシダーゼを用いたレポーターアッセイとの比較
（１）mCLuc DNAの5'上流側に各プロモーターを連結したプラスミド(レポータープラスミド)の作製
1-1. pmCLuRAの切断
pmCLuRAを50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約7kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「pmCLuRA Bam HI-Sma I断片」と呼ぶ。【０３１４】
また、同様に、pmCLuRA 5μgを50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Spe I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約7kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「pmCLuRA Spe I-Sma I断片」と呼ぶ。【０３１５】
1-2. ACT1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのACT1（系統的遺伝子名：YFL039C）遺伝子のプロモーター（配列番号６１：以下、「ACT1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、ACT1プロモーターとは、ACT1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、ACT1遺伝子とACT1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるYPT1遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照)。【０３１６】
ACT1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'ACT1_Spe I及び3'ACT1）の配列は以下の通りであった。【０３１７】
5'ACT1_Spe I: CCCATTACTAGTACAAGCGCGCCTCTACC（配列番号６２）
3'ACT1: TGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCTTG（配列番号６３）
5'ACT1_Spe Iプライマーは、ACT1 ORF 5'上流のYPT1 ORFの終始コドンの3'下流17塩基にSpe I制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'ACT1プライマーは、ACT1 ORF開始コドンより5'上流27塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３１８】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエ S288CゲノムDNA 1ng、プライマーとして5'ACT1_Spe I（配列番号６２）及び3'ACT1（配列番号６３）を用い、第2ステップのアニール温度を48℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０３１９】
得られたPCR産物を1%アガロースゲル電気泳動によって分析し、約670bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Spe I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「ACT1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３２０】
次いで、ACT1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Spe I-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、ACT1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。ACT1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-ACT1」という）を調製した。【０３２１】
1-3. ADH1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのADH1（系統的遺伝子名：YOL086C）遺伝子のプロモーター（配列番号６４：以下、「ADH1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、ADH1プロモーターとは、ADH1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、ADH1遺伝子とADH1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるYOL085C遺伝子とに挟まれる領域である(酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３２２】
ADH1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'ADH1_BamH I及び3'ADH1）の配列は以下の通りであった。【０３２３】
5'ADH1_BamH I :CCCAGGATCCGTATACTAGAAGAATGAGCC（配列番号６５）
3'ADH1: TGTATATGAGATAGTTGATTGTATG（配列番号６６）
5'ADH1_Bam HIプライマーは、ADH1 ORF 5'上流のYOL085C ORFの終始コドンの3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'ADH1プライマーは、ADH1 ORF開始コドンより5'上流25塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３２４】
PCRは、プライマーとして5'ADH1_Bam HI（配列番号６５）及び3'ADH1（配列番号６６）を用い、第2ステップのアニール温度を52℃とした以外は、上記1-2においてACT1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３２５】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約1100bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「ADH1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３２６】
次いで、ADH1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、ADH1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。ADH1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-ADH1」という）を調製した。【０３２７】
1-4. CYC1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのCYC1（系統的遺伝子名：YJR048）遺伝子のプロモーター（配列番号６７：以下、「CYC1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、CYC1プロモーターとは、CYC1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、CYC1遺伝子とCYC1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるANB1遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３２８】
CYC1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'CYC1_BamH I及び3'CYC1）の配列は以下の通りであった。【０３２９】
5'CYC1_BamH I :CCCAGGATCCGTTTTAGTGTGTGAATGAAA（配列番号６８）
3'CYC1: TATTAATTTAGTGTGTGTATTTGTG（配列番号６９）
5'CYC1_Bam HIプライマーは、CYC1 ORF 5'上流のANB1 ORFの終始コドンの3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'CYC1プライマーは、CYC1 ORF開始コドンより5'上流25塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３３０】
PCRは、プライマーとして5'CYC1_Bam HI（配列番号６８）及び3'CYC1（配列番号６９）を用いた以外は、上記1-3においてADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３３１】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約950bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「CYC1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３３２】
次いで、CYC1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、CYC1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。CYC1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-CYC1」という）を調製した。【０３３３】
1-5. TEF1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのTEF1（系統的遺伝子名：YPR080W）遺伝子のプロモーター（配列番号７０：以下、「TEF1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、TEF1プロモーターとは、TEF1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、TEF1遺伝子とTEF1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるMRL1遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３３４】
TEF1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'TEF1_BamH I及び3'TEF1）の配列は以下の通りであった。【０３３５】
5'TEF1_BamH I: CCCAGGATCCACAATGCATACTTTGTACG（配列番号７１）
3'TEF1: TTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGC（配列番号７２）
5'TEF1_Bam HIプライマーは、TEF1 ORF 5’上流のMRL1 ORFの終始コドンの3'下流19塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'TEF1プライマーは、TEF1 ORF開始コドンより5'上流28塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３３６】
PCRは、プライマーとして5'TEF1_Bam HI（配列番号７１）及び3'TEF1（配列番号７２）を用いた以外は、上記1-3においてADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３３７】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約580bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「TEF1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３３８】
次いで、TEF1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TEF1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TEF1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TEF1」という）を調製した。【０３３９】
1-6. CUP1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのCUP1（系統的遺伝子名：YHR053C）遺伝子のプロモーター（配列番号７３：以下、「CUP1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、CUP1プロモーターとは、CUP1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、CUP1遺伝子とCUP1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるYHR054C遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３４０】
CUP1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'CUP1_BamH I及び3'CUP1）の配列は以下の通りであった。【０３４１】
5'CUP1_BamH I: CCCAGGATCCTAAGCCGATCCCATTAC（配列番号７４）
3'CUP1: TTTATGTGATGATTGATTGATTGATTGTAC（配列番号７５）
5'CUP1_Bam HIプライマーは、CUP1 ORF 5'上流のYHR054C ORFの終始コドンの3'下流17塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'CUP1プライマーは、CUP1 ORF開始コドンより5'上流30塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３４２】
PCRは、プライマーとして5'CUP1_Bam HI（配列番号７４）及び3'CUP1（配列番号７５）を用いた以外は、上記1-3においてADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３４３】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約460bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「CUP1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３４４】
次いで、CUP1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、CUP1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。CUP1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-CUP1」という）を調製した。【０３４５】
1-7. GAL1プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのGAL1（系統的遺伝子名：YBR020W）遺伝子のプロモーター（配列番号７６：以下、「GAL1プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、GAL1プロモーターとは、GAL1遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、GAL1遺伝子とGAL1遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるGAL10遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３４６】
GAL1プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'GAL1_Spe I及び3'GAL1）の配列は以下の通りであった。【０３４７】
5'GAL1_Spe I: CCCAACTAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAG（配列番号７７）
3'GAL1: GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAG（配列番号７８）
5'GAL1_Spe Iプライマーは、GAL1 ORF 5'上流のGAL1 ORFの終始コドンの3'下流20塩基にSpe I制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'GAL1プライマーは、GAL1 ORF開始コドンより5'上流24塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３４８】
PCRは、プライマーとして5'GAL1_Spe I（配列番号７７）及び3'GAL1（配列番号７８）を用いた以外は、上記1-3においてADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３４９】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約450bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Spe I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「GAL1プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３５０】
次いで、GAL1プロモーターDNA断片とpmCLuRA Spe I-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、GAL1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。GAL1プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-GAL1」という）を調製した。【０３５１】
1-8. HSP12プロモーターの単離及びそのpmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス・セレビシエのHSP12（系統的遺伝子名：YFL014W）遺伝子のプロモーター（配列番号７９：以下、「HSP12プロモーター」という）を組み込んだ。ここで、HSP12プロモーターとは、HSP12遺伝子の5'上流側の非翻訳領域、すなわち、HSP12遺伝子とHSP12遺伝子の5'上流隣接遺伝子であるYFL015W-A遺伝子とに挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベースhttp://www.yeastgenome.org/参照）。【０３５２】
HSP12プロモーターを単離するためのPCRのプライマー（5'HSP12_BamH I及び3'HSP12）の配列は以下の通りであった。【０３５３】
5'HSP12_BamH I: GGGTGGATCCGATCCCACTAACGGCCCAG（配列番号８０）
3'HSP12: TGTTGTATTTAGTTTTTTTTGTTTTGAG（配列番号８１）
5'HSP12_Bam HIプライマーは、HSP12 ORF 5'上流のYFL015W-A ORFの終始コドンの3'下流17塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、3'HSP12プライマーは、HSP12 ORF開始コドンより5'上流30塩基の相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０３５４】
PCRは、プライマーとして5'HSP12_Bam HI（配列番号８０）及び3'HSP12（配列番号８１）を用いた以外は、上記1-3においてADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。【０３５５】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約610bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「HSP12プロモーターDNA断片」と呼ぶ。【０３５６】
次いで、HSP12プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、HSP12プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。HSP12プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-HSP12」という）を調製した。【０３５７】
1-9. TDH3プロモーターのpmCLuRAへの組み込み
実施例１において単離されたTDH3プロモーターDNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TDH3プロモーターをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TDH3」という）を調製した。【０３５８】
（２）mCLuc DNAを含む各レポータープラスミドを用いた酵母（サッカロミセス・セレビシエYPH500株）の形質転換
pmCLuRA-ACT1、pmCLuRA-ADH1、pmCLuRA-CYC1、pmCLuRA-TDH3、pmCLuRA-TEF1、pmCLuRA-CUP1、pmCLuRA-GAL1及びpmCLuRA-HSP12の8つのプラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation (BIO101)を用いた。【０３５９】
得られた形質転換体をウラシルを含まない合成寒天培地（SD+KHLadeW）に塗布し、30℃で3日間培養した。【０３６０】
3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。【０３６１】
（３）mCLucによる各プロモーターの活性測定
上記（２）で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体1クローン当たり3コロニーを、SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩培養した。一晩の培養によりStationary phaseに達した培養液を、各ウェルに1mlずつの同培地を添加した96穴ディープウェルプレートにそれぞれ5μlずつ接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から16時間後に、培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い、600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から各プロモーターの活性を数値化した。すなわち、相対発光強度を600nmの吸光度で除して得られるmCLuc活性が各プロモーターの転写活性の相対値を意味する。結果を図１０に示す。図１０において、「cell」は酵母細胞を含んだ培養液を用いて測定したmCLuc活性を、「sup.」は培養液を15,000 rpmで遠心分離して得た培養上清を用いて測定したmCLuc活性を示す。また、「Promoter (−)」は、プロモーターを含まないプラスミドを有する形質転換体の結果を示す。【０３６２】
（４）β-ガラクトシダーゼレポータープラスミド(pGALuRA)の構築
β-ガラクトシダーゼを用いたレポータープラスミドを構築するため、以下のプライマーを用いたPCRにより、β-ガラクトシダーゼ cDNAの調製を行った。【０３６３】
LacZ_5'SmaI_F: GGGTCCCGGGATGACCGGTTCCGGAGCTTG（配列番号８２）
LacZ_3'XbaI_R: CCCTGTCTAGATTACGCGAAATACGGGCAG（配列番号８３）
LacZ_5'SmaI_Fプライマーは、β-ガラクトシダーゼ ORFの開始コドン3'下流20塩基にSma I制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。一方、LacZ_3'XbaI_Rプライマーは、β-ガラクトシダーゼ ORF終始コドンより5'上流19塩基の相補的な配列である。【０３６４】
PCRは、鋳型としてpJM133 DNA(Genes Develop., 7, 833-843 (1993)) 10ng、プライマーとしてLacZ_5'SmaI_F（配列番号８２）及びLacZ_3'XbaI_R（配列番号８３）を用い、第2ステップのアニール温度を52℃、伸長反応時間を4分、第3ステップを8分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０３６５】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約3.3kbpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Xba I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「β-ガラクトシダーゼDNA断片」と呼ぶ。【０３６６】
このβ-ガラクトシダーゼDNA断片とpUG35-MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2 1μlとをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid miniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、β-ガラクトシダーゼをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。β-ガラクトシダーゼをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pGALuRA」という）を調製した。【０３６７】
続いて、pGALuRAを保持する大腸菌を、LBアンピシリン（50μg/ml）含有液体培地50mlに接種し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、GenElute Plasmid midi prep kitを用いて、添付プロトコールに従ってプラスミドDNAを調製し、OD260nmの吸光値を測定して、DNA濃度を定量した。【０３６８】
得られたDNAのうち5μgを50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約7kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「pGALuRA Bam HI-Sma I断片」と呼ぶ。【０３６９】
また、同様にpGALuRA 5μgを50μl反応液中、Sma I 50Uで18時間切断した。Sma Iで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Spe I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液の全てを1％アガロース電気泳動し、約7kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。得られたDNA断片を20μlの蒸留水に溶解した。このDNA断片を「pGALuRA Spe I-Sma I断片」と呼ぶ。【０３７０】
（５）pGALuRAへの各種プロモーターの組み込み
上記（１）のpmCLuRAへの各種プロモーターの組み込みと同様に、ACT1プロモーターDNA断片、ADH1プロモーターDNA断片、CYC1プロモーターDNA断片、TDH3プロモーターDNA断片、TEF1プロモーターDNA断片、CUP1プロモーターDNA断片、GAL1プロモーターDNA断片及びHSP12プロモーターDNA断片をそれぞれpGALuRAに組み込んだ。得られたプラスミドを、それぞれ「pGALuRA-ACT1」、「pGALuRA-ADH1」、「pGALuRA-CYC1」、「pGALuRA-TDH3」、「pGALuRA-TEF1」、「pGALuRA-CUP1」、「pGALuRA-GAL1」及び「pGALuRA-HSP12」と呼ぶ。【０３７１】
（６）β-ガラクトシダーゼをコードするDNAを含む各レポータープラスミドを用いた酵母（サッカロミセス・セレビシエYPH500株）の形質転換
pGALuRA-ACT1、pGALuRA-ADH1、pGALuRA-CYC1、pGALuRA-TDH3、pGALuRA-TEF1、pGALuRA-CUP1、pGALuRA-GAL1及びpGALuRA-HSP12の8つのプラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation (BIO101)を用いた。【０３７２】
得られた形質転換体をウラシルを含まない合成寒天培地（SD+KHLadeW）に塗布し、30℃で3日間培養した。【０３７３】
3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。【０３７４】
（７）細胞破砕上清サンプルの調製
上記（６）で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体1クローン当たり3コロニーを、SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩培養した。一晩の培養によりStationary phaseに達した培養液100μlを、20mlの同培地に添加し、30℃で振盪培養した。培養開始から16時間後に、培養液の一部を回収し、OD600を測定し、対数期に達した細胞を回収した。回収された細胞を500μlのCelLytic (Sigma)に再撹拌し、タングステンビーズ存在下で約1時間、4℃でボルテックスし、細胞の破砕を行った。細胞の破砕後、遠心分離により上清を得た。得られた上清(抽出液)をLowryら(J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951))の変法を用いてタンパク質濃度の定量を行った。【０３７５】
（８）β-ガラクトシダーゼアッセイ
上記（７）で得られた抽出液を使用し、β-ガラクトシダーゼアッセイをRose and Botein（1983, Methods Enzymol. 101: 167-180）の方法を用いて行った。抽出液に対し、Zバッファーを加え、ブレーキングバッファーで液量を合わせた。28℃で5分間インキュベート後にONPG（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド）溶液を添加して反応を開始した。反応液が黄色を呈すまで28℃でインキュベートした後、Na2CO3溶液で反応を呈させ、420nmの吸光値を測定した。得られた値に基づいて、OD420 X1.7 / (0.0045 X タンパク質量 X 抽出液量 X 時間)の計算式によりプロモーター活性を算出した。すなわち、β-ガラクトシダーゼ活性が各プロモーターの転写活性の相対値を意味する。結果を図１１に示す。図１１において、「Promoter (−)」は、プロモーターを含まないプラスミドを有する形質転換体の結果を示す。【０３７６】
（９）mCLucを用いたレポーターアッセイとβ-ガラクトシダーゼを用いたレポーターアッセイとの比較
図１０及び図１１から判るように、mCLucをレポーター酵素として測定した各プロモーターの相対活性は、β-ガラクトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来型の方法で測定したそれらのプロモーターの相対活性とよく相関していた。この結果から、mCLucをレポーター酵素として用いる方法は、β-ガラクトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来法と同様な結果を与え、代替できることがわかった。さらには必要な培養液の量、測定プロトコルの簡便さにおいて、従来のβ-ガラクトシダーゼ法よりもハイスループットアッセイに適していることがわかった。【０３７７】
〔実施例１２〕mCLucによるレポーターアッセイの結果と細胞内mRNA量測定結果との比較
実施例１１におけるレポータープラスミドpmCLuRAを用いたアッセイ結果が細胞内でのmRNAの発現量を反映した結果であることを、mCLuc mRNA量を定量することで検討した。【０３７８】
（１）サンプルの調製
実施例１１で得られたpmCLuRA-ACT1、pmCLuRA-ADH1、pmCLuRA-CYC1、pmCLuRA-TDH3、pmCLuRA-TEF1、pmCLuRA-CUP1、pmCLuRA-GAL1及びpmCLuRA-HSP12のそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体1クローン当たり3コロニーを、SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩培養した。一晩の培養によりStationary phaseに達した培養液100μlを、20mlの同培地に接種し、30℃で約16時間振盪培養した。OD600の値がmid-log phaseに達したところで、培養をやめ、細胞を回収し、-80℃で保管した。RNAを、QIAGEN社のRNeasy mini kitを用いて調製した。得られたtotal RNAを、TOYOBO社のReverTra Aceを用いて逆転写を行い、cDNAを合成した。【０３７９】
（２）対照プラスミドの作製
リアルタイムPCRでのmRNAの測定に必要な対照遺伝子としてTDH3遺伝子を選択し、そのORFをpZErO-2にクローニングし、対照プラスミドとした。下記に示すプライマーを用いたPCRにより、TDH3遺伝子を得た。【０３８０】
TDH3_CDS_F: ATGGTTAGAGTTGCTATTAACGGTTTCG（配列番号８４）
TDH3_CDS_R: TTAAGCCTTGGCAACGTGTTCAACCAAG（配列番号８５）
TDH3_CDS_Fプライマーは、TDH3 ORFの開始コドンから3'下流28bpの配列である。一方、TDH3_CDS_Rプライマーは、TDH3 ORFの終始コドンから5'上流28bpの相補的な配列である。【０３８１】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてTDH3_CDS_F（配列番号８４）及びTDH3_CDS_R（配列番号８５）を用い、第2ステップのアニール温度を55℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０３８２】
得られたPCR産物を1％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約1kbpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。【０３８３】
得られたDNAと前述の直鎖化したpZErO-2とを、DNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3 ORFをコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。このプラスミドを「pZErO-2-TDH3 ORF」と呼ぶ。【０３８４】
（３）リアルタイムPCR
以下のリアルタイムPCR用の2つのプライマーは、ABI社のプライマー設計用ソフトウェアPrimer Expressを用いて設計した。【０３８５】
mCLuc_RT_F: GGGCCGTGCAAGGAAAT（配列番号８６）
mCLuc_RT_R: GACGTCCCAAGTGTTCCAGAA（配列番号８７）
mCLuc_RT_Fプライマーは、mCLuc ORFの開始コドンから3'下流、1009bpから1025bpまでの塩基配列である。一方、mCLuc_RT_Rプライマーは、mCLuc ORFの開始コドンから3'下流、1045bpから1066bpまでの相補的な塩基配列である。【０３８６】
これに対し、対照プラスミドの定量に用いたTDH3遺伝子検出用の以下の2つのプライマーもまた、ABI社のプライマー設計用ソフトウェアPrimer Expressを用いて設計した。【０３８７】
TDH3_RT_F: CTGCTAAGGCTGTCGGTAAGGT（配列番号８８）
TDH3_RT_R: TGAAAGCCATACCGGTCAACT（配列番号８９）
TDH3_RT_Fプライマーは、TDH3 ORFの開始コドンから3'下流、632bpから653bpまでの塩基配列である。一方、TDH3_RT_Rプライマーは、TDH3 ORFの開始コドンから3'下流、674bpから694bpまでの相補的な塩基配列である。【０３８８】
リアルタイムPCRは、ABI社のPower SYBR Green PCR Master Mixを用いて、反応液20μl(10μlのマスターミックス、各々のプライマー50nM及びcDNA 5ng)で行った。PCRは、第1ステップ：95℃で10分、並びに第2ステップ：95℃で15秒（変性）及び60℃で60秒（アニール・伸長）の40サイクルで行った。結果を図１２に示す。図１２に示す結果は、対照プラスミドの値を内部標準とし、mCLuc mRNAの量の相対定量を行った結果である。【０３８９】
図１０及び１２から判るように、mCLucをレポーター酵素として得られた結果は、リアルタイムPCRによって測定したmCLuc mRNA量とよく相関していた。このことから、mCLucをレポーター酵素としたレポーターアッセイは転写活性を測定するために優れた測定系であることが示された。【０３９０】
〔実施例１３〕mCLucを用いたレポーターアッセイにおける化学物質によるプロモーター誘導の測定
（１）CuSO4誘導実験
サッカロミセス・セレビシエのCUP1（系統的遺伝子名：YHR053C）遺伝子は銅イオンの存在下においてその発現が誘導されることが知られている(Gene, 48, 13-22 (1986))。すなわち、CUP1プロモーターは、銅イオン誘導性プロモーターである。そこで、pmCLuRA-CUP1を用いて、mCLucにおいてその誘導が観察されるかどうか検討を行った。また、β-ガラクトシダーゼを用いて同様の実験を行い、比較検討した。【０３９１】
上記に示したpmCLuRA-CUP1及びpGALuRA-CUP1をそれぞれ有する形質転換体を、各3クローンずつSD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩、30℃でStationary phaseに達するまで振盪培養した。【０３９２】
次いで、pmCLuRA-CUP1を有する形質転換体を含む培養液5μlを、各ウェルに1mlずつ0.025mM CuSO4含有SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地又はCuSO4非含有SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地を添加した96穴ディープウェルプレートに接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から8時間後に、培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い、600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から、実施例１１と同様に各プロモーターの活性を数値化した。なお、対照として、pmCLuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実験を行った。結果を図１３Ａに示す。【０３９３】
一方、pGALuRA-CUP1を有する形質転換体を含む培養液100μlを、0.025mM CuSO4含有SD+LHLadeW 200mM KPi合成液体培地又はCuSO4非含有SD+LHLadeW 200mM KPi合成液体培地20mlに接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から16時間後に、培養液の一部を回収し、OD600を測定することで、対数期に達した細胞を回収した。次いで、実施例１１と同様に、β-ガラクトシダーゼアッセイを行い、プロモーター活性を数値化した。なお、対照として、pGALuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実験を行った。結果を図１３Ｂに示す。【０３９４】
（２）ガラクトース誘導実験
サッカロミセス・セレビシエのGAL1（系統的遺伝子名：YBR020W）遺伝子は、グルコース非存在・ガラクトース存在下においてその発現が誘導されることが知られている（West, R.W.J. et al., Mol. Cell. Biol., 4: 2467-2478 (1984)）。すなわち、GAL1プロモーターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。そこで、pmCLuRA-GAL1を用いてmCLucにおいてその誘導が観察されるかどうか検討を行った。また、β-ガラクトシダーゼを用いても同様の実験を行い、比較検討した。【０３９５】
上記に示したpmCLuRA-GAL1及びpGALuRA-GAL1をそれぞれ有する形質転換体を、各3クローンずつSD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩、30℃でStationary phaseに達するまで振盪培養した。【０３９６】
次いで、pmCLuRA-GAL1を有する形質転換体を含む培養液20μlを、各ウェルに1mlずつ2％ガラクトース含有SC+KHLadeW(SC+KHLadeWは実施例１におけるSD+KHLWadeからグルコースを除いたもの) 200mM KPi合成液体培地又はSD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地を添加した96穴ディープウェルプレートに接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から32時間後に、培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い、600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から、実施例１１と同様に各プロモーターの活性を数値化した。なお、対照として、pmCLuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実験を行った。結果を図１４Ａに示す。【０３９７】
一方、pGALuRA-GAL1を有する形質転換体を含む培養液500μlを、2％ガラクトース含有SC+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地又はSD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地20mlに接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から32時間後に、培養液の一部を回収し、OD600を測定することで、対数期に達した細胞を回収した。次いで、実施例１１と同様に、β-ガラクトシダーゼアッセイを行い、プロモーター活性を数値化した。なお、対照として、pGALuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実験を行った。結果を図１４Ｂに示す。【０３９８】
（３）化学物質によるプロモーター誘導の測定結果
図１３Ａ及びＢ並びに図１４Ａ及びＢに示されたとおり、CUP1プロモーターの銅イオンによる転写誘導とGAL1プロモーターのガラクトースによる転写誘導では、mCLucをレポーター酵素として測定した測定法と、β-ガラクトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来法でよい相関を示した。この結果から、mCLucをレポーター酵素として用いる方法は、β-ガラクトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来法と同様な化学物質によるプロモーターの転写誘導結果を与え、代替できることがわかった。さらには必要な培養液の量、測定プロトコルの簡便さにおいて、従来のβ-ガラクトシダーゼ法よりもハイスループットアッセイに適していることがわかった。【０３９９】
〔実施例１４〕mCLucを用いたレポーターアッセイにおけるプロモーター内の転写活性化に関わるcis配列探索
（１）TDH3プロモーター欠失突然変異体の作製
サッカロミセス・セレビシエのTDH3（系統的遺伝子名：YGR192C）遺伝子のプロモーターは、その塩基配列の中に、発現調節に重要ないくつかの制御配列を有する（JBC, 1994, 269: 6153-6162及び図１５参照）。そこで、それらの配列を除去したときに、それに対応したプロモーター活性を、mCLucを用いて検出できるかどうか検討した。【０４００】
1-1. mCLuc DNAの5'上流側にTDH3プロモーター(-471)を連結したプラスミドの作製
TDH3プロモーター(-471)は、TDH3 ORFの開始コドンより5'上流-486bpから-474bpに存在するFermentable carbon source-dependent upstream activation sequence(UAS1*1)を除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４０１】
以下のプライマーと3'TDH3プライマー(配列番号２４)を用いたPCRによりTDH3プロモーター(-471)を得た。【０４０２】
TDH3-471_F: AAGAGGATCCAATGGAGCCCGCTTTTTAAG（配列番号９０）
TDH3-471_Fプライマーは、TDH3 ORFの5'上流471塩基より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４０３】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてTDH3-471_F（配列番号９０）及び3'TDH3（配列番号２４）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４０４】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約470bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「TDH3プロモーター（-471）DNA断片」と呼ぶ。【０４０５】
TDH3プロモーター（-471）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーター（-471）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TDH3プロモーター（-471）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TDH3(-471)」という）を調製した。【０４０６】
1-2. mCLuc DNAの5'上流側にTDH3プロモーター(-423)を連結したプラスミドの作製
TDH3プロモーター(-423)は、TDH3 ORFの開始コドンより5'上流-448bpから-436bpに存在するFermentable carbon source-dependent upstream activation sequence (UAS1*2)と上記UAS1*1とを除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４０７】
以下のプライマーと3'TDH3プライマー（配列番号２４）とを用いたPCRによりTDH3プロモーター(-423)を得た。【０４０８】
TDH3-423_F: AAGAGGATCCAGAATCCCAGCACCAAAATA（配列番号９１）
TDH3-423_Fプライマーは、TDH3 ORFの5'上流423塩基より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４０９】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてTDH3-423_F（配列番号９１）及び3'TDH3（配列番号２４）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４１０】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約420bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「TDH3プロモーター（-423）DNA断片」と呼ぶ。【０４１１】
TDH3プロモーター（-423）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーター（-423）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TDH3プロモーター（-423）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TDH3(-423)」という）を調製した。【０４１２】
1-3. mCLuc DNAの5'上流側にTDH3プロモーター(-411)を連結したプラスミドの作製
TDH3プロモーター(-411)は、TDH3 ORFの開始コドンより5'上流-431bpから-419bpに存在するFermentable carbon source-dependent upstream repression sequence (URS)と上記UAS1*1及びUAS1*2とを除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４１３】
以下のプライマーと3'TDH3プライマー（配列番号２４）とを用いたPCRによりTDH3プロモーター(-411)を得た。【０４１４】
TDH3-411_F: AAGAGGATCCTGTTTTCTTCACCAACCATC（配列番号９２）
TDH3-411_Fプライマーは、TDH3 ORFの5'上流411塩基より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４１５】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてTDH3-411_F（配列番号９２）及び3'TDH3（配列番号２４）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４１６】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約410bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「TDH3プロモーター（-411）DNA断片」と呼ぶ。【０４１７】
TDH3プロモーター（-411）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーター（-411）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TDH3プロモーター（-411）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TDH3(-411)」という）を調製した。【０４１８】
1-4. mCLuc DNAの5'上流側にTDH3プロモーター(-295)を連結したプラスミドの作製
TDH3プロモーター(-295)は、TDH3 ORFの開始コドンより5'上流-305bpから-297bpに存在するNon-fermentable carbon source-dependent upstream activation sequence (UAS2)と上記UAS1*1、UAS1*2及びURSとを除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４１９】
以下のプライマーと3'TDH3プライマー（配列番号２４）とを用いたPCRによりTDH3プロモーター(-295)を得た。【０４２０】
TDH3-295_F: AAGAGGATCCGGAGTAAATGATGACACAAG（配列番号９３）
TDH3-295_Fプライマーは、TDH3 ORFの5'上流295塩基より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４２１】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてTDH3-295_F（配列番号９３）及び3'TDH3（配列番号２４）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４２２】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約290bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「TDH3プロモーター（-295）DNA断片」と呼ぶ。【０４２３】
TDH3プロモーター（-295）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、TDH3プロモーター（-295）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。TDH3プロモーター（-295）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-TDH3(-295)」という）を調製した。【０４２４】
（２）各欠失突然変異体TDH3プロモーターを有するレポータープラスミドを用いた酵母（サッカロミセス・セレビシエYPH500株）の形質転換
pmCLuRA-TDH3(-471)、pmCLuRA-TDH3(-423)、pmCLuRA-TDH3(-411)、pmCLuRA-TDH3(-295)及びpmCLuRA-TDH3(図１５では、「-698」に相当する)の5つのプラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation (BIO101)を用いた。【０４２５】
得られた形質転換体をウラシルを含まない合成寒天培地（SD+KHLadeW）に塗布し、30℃で3日間培養した。【０４２６】
3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。【０４２７】
（３）各突然変異体TDH3プロモーターの活性測定
上記（２）で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体1クローン当たり3コロニーを、SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩培養した。一晩の培養によりStationary phaseに達した培養液を、各ウェルに1mlずつの同培地を添加した96穴ディープウェルプレートにそれぞれ5μlずつ接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から16時間後に、培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い、600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から、実施例１１と同様に各プロモーターの活性を数値化した。結果を図１５に示す。【０４２８】
（４）GAL1プロモーター欠失突然変異体の作製
サッカロミセス・セレビシエのGAL1（系統的遺伝子名：YBR020W）遺伝子のプロモーターは、その塩基配列の中に、発現調節に重要な4つのGAL4結合領域(図１６では、「GAL4」に相当する)を有する（Giniger, E. et al., Cell, 40: 767-774 (1985); Johnston and Davis, Mol. Cell. Biol. 4: 1440-1448 (1984); Yocum, R. R. et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1985-1998 (1984)及び図１６参照）。そこで、これらの配列を除去したときに、それに対応したプロモーター活性をmCLucを用いて検出できるかどうか検討した。【０４２９】
4-1. mCLuc DNAの5'上流側にGAL1プロモーター(-396)を連結したプラスミドの作製
GAL1プロモーター(-396)は、GAL1 ORFの開始コドンより5'上流-451bpから-397bpに3回繰り返し配列になっているGAL4結合領域を除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４３０】
以下のプライマーと3'GAL1プライマー(配列番号７８)とを用いたPCRによりGAL1プロモーター(-396)を得た。【０４３１】
GAL1-396_F: AAGAGGATCCTGCGTCCTCGTCTTCACCGG（配列番号９４）
GAL1-396_Fプライマーは、GAL1 ORF 開始コドンより5'上流396bpの位置より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４３２】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてGAL1-396_F（配列番号９４）及び3'GAL1（配列番号７８）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４３３】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約390bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「GAL1プロモーター（-396）DNA断片」と呼ぶ。【０４３４】
GAL1プロモーター（-396）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、GAL1プロモーター（-396）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。GAL1プロモーター（-396）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-GAL1(-396)」という）を調製した。【０４３５】
4-2. mCLuc DNAの5'上流側にGAL1プロモーター(-288)を連結したプラスミドの作製
GAL1プロモーター(-288)は、GAL1 ORFの開始コドンより5'上流-349bpから-332bpに独立して存在するGAL4結合領域と上記3回繰り返しGAL4結合領域を除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。【０４３６】
以下のプライマーと3'GAL1プライマー(配列番号７８)とを用いたPCRによりGAL1プロモーター(-288)を得た。【０４３７】
GAL1-288_F: AAGAGGATCCGAAAAATTGGCAGTAACCTG（配列番号９５）
GAL1-288_Fプライマーは、GAL1 ORF 開始コドンより5'上流288bpの位置より3'下流20塩基にBam HI制限酵素サイトを5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については、酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）を参照されたい。【０４３８】
PCRは、鋳型としてサッカロミセス・セレビシエS288CゲノムDNA 1ng、プライマーとしてGAL1-288_F（配列番号９５）及び3'GAL1（配列番号７８）を用い、第2ステップのアニール温度を54℃、伸長反応時間を1分、第3ステップを2分とした以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合(実施例１)と基本的に同じ条件で行った。【０４３９】
得られたPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、約390bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Bam HI 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「GAL1プロモーター（-288）DNA断片」と呼ぶ。【０４４０】
GAL1プロモーター（-288）DNA断片とpmCLuRA Bam HI-Sma I断片とをDNA Ligation kitを用いて連結・環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、GAL1プロモーター（-288）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。GAL1プロモーター（-288）をコードするDNAが挿入されたプラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA-GAL1(-288)」という）を調製した。【０４４１】
（５）各欠失突然変異体GAL1プロモーターを有するレポータープラスミドを用いた酵母（サッカロミセス・セレビシエYPH500株）の形質転換
pmCLuRA-GAL1(-396)、pmCLuRA-GAL1(-288)及びpmCLuRA-GAL1(図１６において、「-451」に相当する)の3つのプラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation (BIO101)を用いた。【０４４２】
得られた形質転換体をウラシルを含まない合成寒天培地（SD+KHLadeW）に塗布し、30℃で3日間培養した。【０４４３】
3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。【０４４４】
（６）各欠失突然変異体GAL1プロモーターの活性測定
上記（５）で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体1クローン当たり3コロニーを、SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、一晩培養した。一晩の培養によりStationary phaseに達した培養液を、各ウェルに1mlずつの2％ガラクトース含有SC+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地を添加した96穴ディープウェルプレートにそれぞれ20μlずつ接種し、30℃で振盪培養した。培養開始から32時間後に、培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から、実施例１１と同様に各プロモーターの活性を数値化した。結果を図１６に示す。比較として、TDH3プロモーターに連結したmCLucをコードするDNAを有する形質転換体の培養液を用いて、CLuc活性を測定した結果を示す。【０４４５】
（７）プロモーター内の転写活性化に関わるcis配列探索の結果
図１５及び１６に示されたとおり、TDH3プロモーター及びGAL1プロモーター内の転写活性化に関わると考えられるcis配列の有無により、mCLucをレポーター酵素として測定した値が大きく変化した。このプロモーター断片とmCLucレポーターアッセイの測定値の相関は、JBC, 1994, 269: 6153-6162記載の結果とよく一致した。この結果から、mCLucをレポーター酵素として用いる方法は従来法と同様なプロモーターを順次短縮することによって転写活性化に関わる配列を検討する実験に用いることができることがわかった。【０４４６】
〔実施例１５〕CLucを用いた遺伝子変異検査法の確立
遺伝子に突然変異が起こった際に、時としてその結果として、その位置あるいは塩基の挿入や欠失の場合には3'下流において、本来アミノ酸をコードしているコドンが終止コドンとなる場合がある（「nonsense変異」と呼ばれる）。その結果、本来のタンパク質の全長ではなく、その一部のみが生産されることがあり、これが疾病の原因となるケースが多数知られている。これは多くの場合、タンパク質の一部のみでは、十分に本来の機能を果たさないためである。ヒトを初めとして様々な動物の個体において、このようなnonsense変異などタンパク質の正常な翻訳を妨げる遺伝子異常を検査する方法として、CLucを用いて、より簡便で測定感度の高い方法を確立した。【０４４７】
具体的には、CLucを用いたレポーターアッセイによって、ラットのApo E遺伝子（配列番号９６：J. Biol. Chem. 261, 13777-13783 (1986)）の第3エキソン（配列番号９６に示す塩基配列において第2567番目〜第3402番目の塩基配列）に起こったnonsense変異を検出する方法を開発した。【０４４８】
配列番号９７に示す塩基配列は、ラットのApo E遺伝子の第3エキソンのコード領域と3'末端に終止コドンを含む配列である。【０４４９】
以下の実験では、ラットのApo E遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域の全アミノ酸配列をコードするDNA(配列番号９７に示す塩基配列において第1番目〜第723番目の塩基配列；以下、「ApoE(+)」と呼ぶ）を正常DNAモデルとして、ApoE(+)に終止コドンを付加したDNA（配列番号９７に示す塩基配列において第1番目〜第726番目の塩基配列；以下、「ApoE(-)」と呼ぶ）をnonsense変異モデルDNAとして用いて、2本の相同染色体上のApoE遺伝子が双方ApoE(+)である場合、双方ApoE(-)である場合、一方がApoE(+)で他方がApoE(-)である場合の3ケースを判別した。【０４５０】
（１）プラスミドpCLuTrの構築
遺伝子異常を検査するためのプラスミドベクターの確立のため、実施例１で作製したプラスミドpCLuRAにおいて、αCLucをコードするDNAのαファクター分泌シグナルペプチドDNAと成熟型CLuc DNAとの間に制限酵素サイトを導入した。そこで、以下のプライマーを用いたPCRを行った。【０４５１】
aCL_inv_5'-Hind-Sph: CCCTAAGCTTATCGCATGCCAGGACTGTCCTTACGAACCTGATCCAC（配列番号９８）
aCL_inv_3'-Hind: GGGTAAGCTTGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAG（配列番号９９）
aCL_inv_5'-Hind-Sphプライマーは、αCLucをコードするDNA（配列番号１３）の第268番目の塩基（成熟型CLucの最初のコドンの1bp目）から28bpの配列の5'側にHind IIIとSph Iの制限酵素サイトを付加した配列である。一方、aCL_inv_3'-Hindプライマーは、αCLucをコードするDNA（配列番号１３）の第242番目の塩基から26bp（αファクター分泌シグナルペプチドDNA（配列番号１１）の3'末端側から26bp）の相補的な配列で、その5'側に1塩基GとHind III制限酵素サイトを付加した配列である。この1塩基のGは、下記のin vivo recombinationステップにおいて外来DNA断片（下記では、ApoE(+)又はApoE(-)）との間で相同組換えが起こらず、開環したレポータープラスミド（下記では、「pCLuTr Hind III-Sph I DNA断片」）が自己環状化した際にCLucが発現しないようフレームシフトを起こさせるために配置した。in vivo recombinationステップにおいて外来DNA断片との間で相同組換えが起こった場合には、この1塩基のGはプラスミドには残らないために、CLucの融合タンパク質が発現する。【０４５２】
PCRは、aCL_inv_5'-Hind-Sphプライマー（配列番号９８）及びaCL_inv_3'-Hindプライマー（配列番号９９）を用いて、反応液中に5% DMSOを加え、鋳型としてpCLuRA-TDH3プラスミド 10ngを用いて、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、52℃で30秒（アニーリング）及び68℃で8分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で10分で行った以外は成熟型CLuc cDNAを合成した場合（実施例１）と基本的に同じ条件で行った。【０４５３】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約7kbpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。得られたDNA溶液は50μl反応液中、Hind III 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「pCLuTr DNA断片」と呼ぶ。【０４５４】
次いで、pCLuTr DNA断片をDNA Ligation kitを用いて連結・自己環状化させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、pCLuTr DNA断片が環状化したプラスミド（以下、「pCLuTr」と呼ぶ）を保持した形質転換体を判別した。このpCLuTrを保持した形質転換体より、pCLuTrを調製した。【０４５５】
pCLuTr 5μgを50μl反応液中、Hind III 50Uで18時間切断した。Hind IIIで切断後、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。次いで、DNAを50μl反応液中、Sph I 50Uで18時間切断し、GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。この溶出液全てを1％アガロース電気泳動し、約7kbpのバンドを切り出し、フェノール・クロロホルムを用いたゲル抽出法によりDNA断片を抽出した。このDNA断片を「pCLuTr Hind III-Sph I DNA断片」と呼ぶ。【０４５６】
（２）ラットApo E遺伝子の第3エキソンに存在するコード領域のモデルDNAの調製
酵母のin vivo recombinationを利用して、ラットApo E遺伝子の第3エキソンに存在するコード領域をpCLuTr Hind III-Sph I DNA断片に組み込むことができるように、以下のプライマーを用いたPCRにより、pCLuTr Hind III-Sph I DNA断片の両末端約40bpと相同な配列を有するラットApo E遺伝子の第3エキソンに存在するコード領域を調製した。【０４５７】
ApoE-aCL_gapF: GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGTACTGATGGAGGACACTATG（配列番号１００）
ApoE-aCL_gapR: GAACTGTGTTTGGTGGATCAGGTTCGTAAGGACAGTCCTGTTGATTCTCCAGGGGCACTG（配列番号１０１）
ApoE-aCL_gapFプライマーは、αCLucをコードするDNA（配列番号１３）の第229番目の塩基から39bp（αファクター分泌シグナルペプチドDNA（配列番号１１）の3'末端側から39bp）の3'側にラットApo E遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域（配列番号９７）第1番目の塩基から21bpを付加した配列である。一方、ApoE-aCL_gapRプライマーは、αCLuc ORFの開始コドンより268bp（成熟型CLucの最初のコドンの1bp目）から3'下流40bpの相補的な配列の3'側にラットApo E 遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域（配列番号９７）の第704番目〜第723番目の塩基配列の相補的な配列を付加した配列である。【０４５８】
PCRは、ApoE-aCL_gapFプライマー（配列番号１００）及びApoE-aCL_gapRプライマー（配列番号１０１）を用い、反応液には5% DMSOを加え、ラットゲノムDNA 10 ngを鋳型とし、第1ステップ：94℃で2分、第2ステップ：94℃で15秒（変性）、50℃で30秒（アニーリング）及び68℃で1分（伸長）のサイクルを35サイクル、並びに第3ステップ：68℃で2分で行った以外は、上記成熟型CLuc cDNAを合成した場合（実施例１）と基本的に同じ条件で行った。【０４５９】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約800bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「ApoE (+)」とした。【０４６０】
次に、ApoE-aCL_gapFプライマー（配列番号１００）及び以下のプライマーを用いたPCRにより、pCLuTr Hind III-Sph I DNA断片の両末端約40bpと相同な配列を有するラットApo E遺伝子の第3エキソンに存在するコード領域（終止コドンを含む）を調製した。【０４６１】
ApoE-aCL_gapR_NC: GAACTGTGTTTGGTGGATCAGGTTCGTAAGGACAGTCCTGTCATTGATTCTCCAGGGGCACTG（配列番号１０２）
ApoE-aCL_gapR_NCプライマーは、αCLuc ORFの開始コドンより268bpから3'下流40bpの相補的な配列の3'側にラットApo E遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域（配列番号９７）の第704番目〜第726番目の塩基配列の相補的な配列を付加した配列である。【０４６２】
PCRは、ApoE-aCL_gapFプライマー（配列番号１００）及びApoE-aCL_gapR_NCプライマー（配列番号１０２）を用いた以外は、上記Apo E(+)のPCRと同様である。【０４６３】
得られたPCR産物を1％アガロース電気泳動により分析し、約800bpのDNA断片を確認した。そこで、得られたPCR産物をGenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水40μlで同キットのカラムからDNAを溶出した。このDNA断片を「ApoE (-)」とした。【０４６４】
次いで、得られたApo E(+)又はApo E(-)のDNA断片を含む溶液を、それぞれ段階希釈して、1％アガロースゲル電気泳動を行った。得られた電気泳動像よりバンドの強度を数値化し、Apo E(+)(終始コドンを含まない)及びApo E(-)(終始コドンを含む)のDNA断片が同濃度になるように希釈を行った。得られた希釈DNA断片のOD 260を測定し、DNA濃度の定量を行った。さらに、Apo E(+)及びApo E(-)のDNA断片をそれぞれ等量混合し、Apo E(+/-)(Apo E(+)とApo E(-)とが1対1)を作製した。【０４６５】
（３）CLucを用いた遺伝子異常検査法の確立
サッカロミセス・セレビシエYPH500株1コロニーを、2倍濃縮YPD液体培地に植菌し、30℃で一晩振盪培養した。さらに、その培養液10μlをYPD培地100mlに接種し、30℃で振盪培養した。OD600の値が0.6に達したところで培養をやめ、細胞を回収し、蒸留水に再撹拌した後、再び細胞を回収した。得られた細胞を、直前に調製したLiAc-TE Buffer(100 mM Tris-HCl/10mM EDTA (pH8.0) ：1M Li acetate：water＝1：1：8）1 mlにピペットにて懸濁した。これを酵母コンピテントセルとした。【０４６６】
コンピテントセル1mlに対し、pCLuTr Hind III-SphI DNA断片3μgとherring sperm DNA(Clontech社)100μlを加え、よく混和し、96穴PCRチューブの各ウェルに10μlずつ分注した。加えて、10-50 ng/μlに調製した上記ApoE(+)、ApoE(-)、又はApoE(+/-)溶液を1μl添加した。また、陰性コントロールとして、いずれのDNA溶液も加えないサンプルを用いた。直前に調製したPEG溶液（100 mM Tris-HCl/10mM EDTA (pH8.0) ：1M Li acetate：50％ Polyethylene glycol 4000＝1：1：8）を60μlずつ、96穴PCRチューブの各ウェルに分注し、よく混和した。30℃で30分間のインキュベーション後、DMSO 7μlを添加してよく混和し、42℃で15分間インキュベーションした。次いで、速やかに氷中にて冷却した。この溶液にSD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液を1ウェルあたり130μl添加し、よく攪拌した（これを「トランスフォーメーションミックス」と呼ぶ）。96穴ディープウェルプレートにSD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液1mlを添加しておき、そこに上記トランスフォーメーションミックスを50μl接種し、30℃において160r/minで5日間培養した。【０４６７】
次いで、全てのウェルがstationary phaseに達したのを確認し、別の96穴ディープウェルプレートにSD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液1mlを添加しておき、上記培養液を10μl接種して、約16時間培養した。この培養液の一部を回収し、実施例１の方法に従い、600nmの吸光度（OD600）及びルミノメーターの相対発光強度（RLU）を測定した。得られた値から、相対発光強度（RLU）を600nmの吸光度で除して得られる値を計算した。結果を図１７に示す。なお、図１７において、「No insert」は、陰性コントロールの結果を示す。【０４６８】
図１７に示すように、CLucは、ラットApo E遺伝子の第3エキソンにコードされるタンパク質との融合タンパク質として発現させても、分泌され、且つその活性を有していることが分かった。また、Apo E(+)(終始コドンを含まない配列)を用いたときの濁度で補正されたCLuc活性に対し、Apo E(-)(終始コドンを含む配列)の濁度で補正されたCLuc活性は非常に小さく、またApo E(+/-)の濁度で補正されたCLuc活性はApo E(+)のほぼ半分の値を示した。この結果より、CLucを用いたレポーターアッセイによって、Apo E遺伝子の第3エキソンの遺伝子異常に関して情報がないラットゲノムDNAを出発材料として用い、上記のモデルDNAを用いた場合と比較することによって、Apo E遺伝子の第3エキソンに含まれるコード領域の遺伝子変異を簡便に検出することが可能であることがわかった。【０４６９】
また、本実施例で用いた酵母のin vivo recombinationを利用したプラスミド構築／酵母形質転換体作製法は、非常に簡便であり、CLucを用いたレポーターアッセイにおいて、プロモーター、遺伝子などいかなるDNAであっても、多数・多種類のDNAを迅速にレポータープラスミドに組み込むことができると考えられ、CLucを用いたレポーターアッセイをハイスループット化できることが示された。また、上記の操作は基本的に分注操作のみから構成されているため、分注ロボット（例えばベックマン社BIOMEK200）を用いた自動化にも成功している。
【配列表フリーテキスト】
【０４７０】
配列番号１３は、融合タンパク質をコードする遺伝子である。【０４７１】
配列番号１４は、融合タンパク質である。【０４７２】
配列番号１５は、合成遺伝子である。【０４７３】
配列番号１６〜１９、２３、２４、５３〜６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０〜９５及び９８〜１０２は、プライマーである。【０４７４】
配列番号２０及び２１は、オリゴDNAである。【０４７５】
配列番号２５〜５２は、合成DNAである。【０４７６】
配列番号９７は、ラットのApo E遺伝子の第3エキソンのコード領域と3'末端に終止コドンを含む配列である。【０４７７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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