(57)【要約】  培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明にかかる樹脂製細胞培養容器は、少なくとも細胞が培養される面に、厚さ０．００２μｍ〜５μｍの無機膜１を備え、乾燥状態２０℃での酸素透過率が５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下のものである。これにより、樹脂製細胞培養容器から、培養液中への毒性物質の放出を抑止し、培養が難しいとされる細胞種においても、その生存率を飛躍的に高められる樹脂製細胞培養容器を提供できる。
2007097273.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも細胞が培養される面に、厚さ０．００２μｍ〜５μｍの無機膜を備え、乾燥状態２０℃での酸素透過率が５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下である樹脂製細胞培養容器。
【請求項２】
透明性を有することを特徴とする請求項１に記載の樹脂製細胞培養容器。
【請求項３】
前記無機膜が酸化ケイ素であることを特徴とする請求項１または２に記載の樹脂製細胞培養容器。
【請求項４】
細胞培養容器の最表面の全体または一部に親水性または疎水性の有機膜または無機膜を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹脂製細胞培養容器。
【請求項５】
前記細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の樹脂製細胞培養容器。
【請求項６】
基板上にパターンを形成するステップと、
前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、
前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、
前記細胞容器の少なくとも細胞が培養される面に無機膜を形成するステップとを備えた樹脂製細胞培養容器の製造方法。
【請求項７】
前記無機膜を形成するステップが真空蒸着法であることを特徴とする請求項６に記載の樹脂製細胞培養容器の製造方法。
【請求項８】
前記基板上にパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さまたは深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項６または７に記載の樹脂製細胞培養容器の製造方法。
【請求項９】
前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、パターンの位置を合わせるためにマスク位置を合わせるステップを備えることを特徴とする請求項８に記載の樹脂製細胞培養容器の製造方法。
【請求項１０】
前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、異なるパターンのマスクを用いることを特徴とする請求項８または９に記載の樹脂製細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹脂製細胞培養容器およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、アポトーシス（apoptosis）と、ネクローシス（necrosis）に大別される。アポトーシスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことをいう。他方、ネクローシスとは、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死、すなわち壊死（えし）をいう。【０００３】
壊死は、生物の組織の一部分が死ぬことである。壊死は通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の組織が再生したり線維化したりすることで補われる。【０００４】
このような細胞についての試験・研究には、組織から単離した細胞を培養する必要がある。近年、この細胞培養は、創薬開発、薬剤の産生、再生医療での基礎試験、薬物の効果判定等、多様な目的で実施され、バイオテクノロジー関連分野において欠かせない方法となっている。細胞培養器で培養される細胞の接着能は、細胞の増殖能にとって極めて重要な因子であるため、研究開発のスピードを左右する。また、培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、試験コストにも直接影響する。【０００５】
プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等の細胞培養容器で細胞を培養する場合、培養細胞から排出される炭酸ガスなどによるｐＨ変化は、培養細胞の活性に大きく影響することが知られている。このため、従来の長期間培養においては、研究者が定期的に培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。【０００６】
また、特許文献１には、細胞培養容器の表面に、相当直径が１０ｎｍ〜１ｍｍである突起群が形成されていることを特徴とする細胞培養容器が提案されている。これは、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに、細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐものである。
【特許文献１】特開２００５−１６８４９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織の壊死や、神経細胞や心筋、肝臓細胞といった培養が難しいとされる組織の細胞死を抑制するためには、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。特に、培養が難しいとされる培養種では、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に配置した細胞数に対する生存率は２０〜４０％程度である。【０００８】
また、特許文献１に示す方法によれば、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進することはできる。しかしながら、プラスチック材料から、低分子量成分、可塑剤、重合触媒等の添加剤またはプラスチック材料の熱成形時に材料が分解したガスが培養液中に放出されるのを防止することはできない。これらの放出成分は、培養細胞に対して極めて毒性が高く、細胞死をもたらす直接の原因となる。そのため、新鮮な培養液の供給の前に、細胞培養容器の表面から、毒性物質が培養液中に放出されることを防止する必要がある。特に、神経細胞や心筋細胞等の培養が難しい細胞種では、プラスチック材料よりも、ガラス材料が使用されている。なぜなら、プラスチック製の細胞培養容器を使用した場合、最初に配置した細胞の８０％近くが死滅してしまうからである。同様に、市販されているプラスチック製シャーレ、容器内に固定されたプラスチック製プレート、ウェルプレート等の細胞培養容器においても、毒性物質の培養液中への放出が防止できていない問題点を有している。【０００９】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであり、培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかる樹脂製細胞培養容器は、少なくとも細胞が培養される面に、厚さ０．００２μｍ〜５μｍの無機膜を備え、乾燥状態２０℃での酸素透過率が５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下のものである。【００１１】
本発明にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法は、基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、前記細胞容器の少なくとも細胞が培養される面に無機膜を形成するステップとを備えたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる樹脂製細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図２Ａ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図２Ｂ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図３Ａ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｂ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｃ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｄ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｅ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｆ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｇ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｈ】本発明の実施の形態２にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例４にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
【符号の説明】
【００１４】
１  無機膜
２  凹部
３  第１の凸部
４  第２の凸部
５  ２段の凸部
６  第１の凸部の側壁
７  第２の凸部の側壁  
１１  基板
１２  第１レジスト層
１３  マスクＡ
１４  第２レジスト層
１５  マスクＢ
１６  レジストパターン
１７  導電性膜
１８  金属構造体
１９  樹脂製成型品
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者らは、鋭意研究した結果、樹脂製細胞培養器の表面に対し、規定値内のガス透過率を有する無機材料を形成することで、プラスチック材料から、培養液中への毒性物質の放出を抑止し、培養が難しいとされる細胞種においても、その生存率を飛躍的に高められる細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について図を用いて説明する。【００１６】
発明の実施の形態１
図１は、実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示した断面図である。実施の形態１にかかる細胞培養容器は、細胞を培養する面に無機膜1を備えている。【００１７】
樹脂製細胞培養容器の少なくとも細胞を培養する面に被覆する無機膜１の厚みは、毒性物質の培養液中への放出を防止するため、０．００２μｍ〜５μｍが好ましく、０．００５μｍ〜１μｍがより好ましい。０．００２μｍ以下では毒性物質の培養液中への放出防止が困難となり、５μｍ以上では成膜時間が長くなり、高コストとなるため実用に適さない。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、毒性物質の培養液中への放出を防止するため、５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下が好ましく、２５０ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下がより好ましい。酸素透過率が低ければ、細胞培養容器から培養液中への毒性物質の放出をより抑制できる。一方、膜厚を厚くする必要があるため、成膜時間が長くなり、高コストとなる。そのため、用途に応じ適宜選択することが好ましい。【００１８】
無機膜１の形成法について述べる。以下にあげる方法は一例であり、これに限定されるものではない。無機膜１の形成法には、真空装置を用いたスパッタリング法、真空蒸着法、電子線蒸着法、電気メッキ、無電解メッキ、カニゼンメッキ等による無機材料形成法があげられる。形成した無機膜１の均一性、緻密性が要求される場合は、スパッタリング法が好ましいが、設備費が高額であることおよび０．１μｍ以上の膜厚になると膜応力により、剥離しやすい傾向がある。真空蒸着法は、設備費も比較的安価であり、膜応力も低くなるため厚膜化が可能であるが、膜厚の均一性、緻密性は、スパッタリング法に劣る。スパッタリング法または真空蒸着法で形成可能な無機膜１は、一例として、Ｃｕ、Ａｌ、Ａｕ、Ａｇ、ＳｉＯ２、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｒ等があげられる。これらの無機膜１は、分子構造でガス透過率が大きく異なるプラスチック材料と異なり、一定の膜厚とすることで、所望のガス透過率を達成することができる。【００１９】
培養細胞の観察では、倒立顕微鏡を用いた透過光観察が主流である。このため、細胞培養容器に被覆する無機膜には、波長４５０ｎｍ〜６００ｎｍの可視光を散乱させないこと、すなわち透明性が要求される。毒性物質の培養液中への放出の防止と透明性を両立する範囲として、膜厚を４００ｎｍ以下とするか、ＳｉＯ２等の透明無機材料を用いることが好ましい。【００２０】
透過光観察を可能にするため、樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長３００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率を８０％以上、ヘイズ値を１０％以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いるか、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物には、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。【００２１】
蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光（励起光）は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できない。したがって、細胞培養容器には高い光透過性が要求される。蛍光（蛍光放射光）を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率８０％以上、ヘイズ値１０％以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、結晶性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好ましい。【００２２】
自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルから発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。【００２３】
自家蛍光の影響を受けないためには、波長２３０ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。【００２４】
微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。【００２５】
細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、細胞培養面への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。有機膜を被覆する方法として、例えば、スピンコート法、ディッピング法により、細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン、ポリリジン等を塗布する方法、蒸着重合、プラズマ重合等が挙げられる。無機膜を被覆する方法として、例えば、スパッタリング法、蒸着法等が挙げられる。また、細胞培養容器の一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることができる。【００２６】
スパッタリング法、蒸着法等の無機膜形成法は、油浸レンズ観察法への適用もできる。通常、油浸レンズに使用するオイルには、細胞を培養するガラスプレートおよび光学レンズと光学物性を適合させるため、有機溶剤が配合されている。有機溶剤は、樹脂製細胞培養容器に浸透し、白化や溶解の問題を発生させるため、適用できない可能性がある。無機材料は、ガスバリヤー効果と同時に、耐有機溶剤性を有するため、油浸レンズのオイルが接触する細胞培養容器の底面に、無機膜を形成することで、油浸レンズ観察法への適用も可能となり、樹脂製細胞培養容器の適用範囲を広げることができる。透過光観察を行う場合、膜厚を４００ｎｍ以下とするか、ＳｉＯ２等の透明無機材料を用いることが好ましい。【００２７】
発明の実施の形態２
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器を用いることもできる。実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成について図２Ａおよび図２Ｂを用いて説明する。図２Ａは、実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図２Ｂは、図２ＡのIIＢ−IIＢ'断面図である。【００２８】
細胞培養容器には、図２Ａに示すように、複数のマイクロ空間構造を構成する凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは、図２Ｂに示すように、２段の階段状に形成されている。すなわち、細胞培養容器の細胞を培養する面に、格子状に形成された第１の凸部３と、その上に形成された直方体状の第２の凸部４からなる２段の凸部５が形成されている。この２段の凸部５により形成される空間が凹部２となる。すなわち、凹部２は、第１の凸部３により完全に囲まれた凹部と第２の凸部４により形成される凹部とからなる。第１の凸部３の側壁６および第２の凸部４の側壁７は底面に対して略垂直に形成されている。さらに、細胞培養容器の表面全体に無機膜１が形成されている。【００２９】
第１の凸部３は、図２Ａに示すように矩形状の凹部２の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の凸部４は、隣接する凹部２の間の第１の凸部３の上に島状に配置されている。第２の凸部４は、矩形状の凹部２の四辺のそれぞれに設けられている。そのため、凹部２は完全には仕切られておらず、矩形状の凹部２の４つの頂点部分において、隣接する凹部２と連通している。なお、凹凸パターンを２段以上の階段状に形成することが好ましいが、１段でもよい。【００３０】
上記の複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製細胞培養容器の少なくとも細胞を培養する面に、所望の厚さおよび酸素透過率を有する無機膜１を形成することで、細胞の接着能、増殖機能に加え、細胞の伸展方向や形態の制御試験等、幅広い用途に提供することができる。また、この細胞培養容器は、従来のパターン付きガラス製プレートと対比しても充分に高い精度を発揮することができる。さらに、安価に形成することができるため、その利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に、特に適している。【００３１】
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備える。【００３２】
詳細には以下の通りである。
（i）基板上への第１レジスト層の形成
（ii）基板とマスクＡとの位置合わせ
（iii）マスクＡを用いた第１レジスト層の露光
（iv）第１レジスト層の熱処理
（v）第１レジスト層上への第２レジスト層の形成
（vi）基板とマスクＢとの位置合わせ
（vii）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光
（viii）第２レジスト層の熱処理
（ix）レジスト層の現像
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
（x）さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより形成する。
（xi）この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する
ことによって、細胞培養容器が製造される。
（v）〜（viii）の工程は任意であり、省略できる。一方、（v）〜（viii）の工程を複数回繰り返すこともできる。【００３３】
レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの構造体を得ようとした場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。【００３４】
光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光分解型のポジ型レジストは光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００３５】
光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００３６】
（i）基板１１上への第１レジスト層１２の形成について説明する。
図３Ａに基板１１上に第１レジスト層１２が形成された状態を示す。成形品形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、基板１１上へ第１レジスト層１２を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板１１上に第１レジスト層１２を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。【００３７】
基板１１上に第１レジスト層１２を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。【００３８】
第１レジスト層１２として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、ＵＶ露光装置を使用した場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好ましい。【００３９】
第１レジスト層１２として用いるレジストがウェットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。【００４０】
例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。【００４１】
第１レジスト層１２にポジ型レジストを使用した場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。【００４２】
（ii）基板１１とマスクＡ１３との位置合わせについて説明する。
第１レジスト層１２のパターンと、第２レジスト層１４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクＡ１３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板１１とマスクＡ１３の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板１１とマスクＡ１３の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板１１に位置マークを作製し、マスクＡ１３にはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。【００４３】
（iii）マスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光について説明する。
図３Ｂに示される工程で使用するマスクＡ１３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスクＡ１３によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、樹脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクＡ１３の寸法、および精度を規定する必要がある。マスクＡ１３の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスクＡ１３のパターン形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクＡ１３製作費が高額となるため、樹脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。【００４４】
マスクＡ１３の材質は温度膨張係数、ＵＶ透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、第１レジスト層１２および第２レジスト層１４の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを使用したシミュレーションもその解決策の一つである。【００４５】
露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂製プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。【００４６】
露光時間や露光強度等の露光条件は第１レジスト層１２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を使用した場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。【００４７】
（iv）第１レジスト層１２の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガ型レジストを使用した場合のみに熱処理を行う。化学増幅系ネガ型レジストとは、主に、２成分系または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。【００４８】
第１レジスト層１２の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層１４の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。【００４９】
（v）第１レジスト層１２上への第２レジスト層１４の形成について説明する。
図３Ｃに第２レジスト層１４が形成された状態を示す。この第２レジスト層１４の形成は、上記（i）において説明した第１レジスト層１２の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層１２と第２レジスト層１４の現像終了時、第２レジスト層１４のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。【００５０】
（vi）基板１１とマスクＢ１５との位置合わせについて説明する。
基板１１とマスクＢ１５との位置合わせは、上記（ii）について説明した、基板１１とマスクＡ１３との位置合わせと同様の方法による。【００５１】
（vii）マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光について説明する。
マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光は、上記（iii）において説明したマスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光と同様の方法による。図３Ｄに第２レジスト層１４の露光の様子を示す。【００５２】
（viii）第２レジスト層１４の熱処理について説明する。
第２レジスト層１４の熱処理は、上記（iv）において説明した第１レジスト層１２の熱処理と同様の方法による。また、第２レジスト層１４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層１２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層１４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。【００５３】
（ix）レジスト層１２および１４の現像について説明する。
図３Ｅに示す現像工程では、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン１６が形成される。【００５４】
細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。【００５５】
なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することができる。【００５６】
（x）金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン１６に沿って金属を形成し、金属構造体１８のマイクロ空間構造面をレジストパターン１６に沿って形成することにより、金属構造体１８を得る工程である。【００５７】
図３Ｆに示すように、この工程では予めレジストパターン１６に沿って導電性膜１７を形成する。導電性膜１７の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜１７に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。【００５８】
図３Ｇに示すように、導電性膜１７を形成した後、レジストパターン１６に沿って金属をメッキにより形成し、金属構造体１８を形成する。メッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。【００５９】
金属構造体１８はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体１８はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体１８の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。メッキにより形成した金属構造体１８はレジストパターン１６から分離される。【００６０】
（xi）成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図３Ｈに示すように、前記金属構造体１８を型として、樹脂成形品１９を形成する工程である。樹脂成形品１９の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体１８を型として射出成形で樹脂成形品１９を形成する場合、金属構造体１８の形状を高い転写率で樹脂成形品１９に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を用いる方法がある。【００６１】
樹脂成形品１９の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂成形品１９の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。【００６２】
以下に、本発明にかかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、形成する無機膜１の材質・厚さ、酸素透過率を変量し、培養細胞の細胞生存率すなわち接着能および増殖能を解析したものである。無機膜１の厚さは、株式会社アルバック製の表面形状測定器（ＤＥＫＴＡＫ３０３０）による触針法にて測定した。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、東洋精機のガス透過率測定装置（型式：ＮＯ．５７１）を用いて測定した。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計（型式：ＨＡ−ＴＲ）を用いて測定した。具体的には、全光線透過率をＪＩＳ  Ｋ６７１４に準拠した方法で２回測定し、その平均値を求めた。また、細胞の接着能は、比色分析法であるCrystal Violet法で解析した。細胞の増殖能は、比色分析法であるＭＴＴ法で解析し、比較例１を１００％とした。【００６３】
Crystal Violet法は、Crystal Violetが生細胞に取り込まれることを利用した比色分析法である。具体的には、５．０×１０５個のラット脳海馬神経細胞をインキュベーター内で２時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊（死んでいる）細胞とを区分した。次に、Crystal Violetで染色した後、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate)溶液を用いて基板に付着している細胞を溶解し、波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、比較例１と比較した。【００６４】
ＭＴＴ法は、ＭＴＴ（テトラゾリウム塩の一種）が細胞内の脱水素酵素による反応によって、ホルマザンに変化することを利用した染色法である。細胞が元気な場合は酵素活性が高く、ホルマザンへの還元が高く、ホルマザン濃度が高くなる。この濃度差を吸光度として細胞数計測に利用したものである。具体的には、５．０×１０５個のラット脳海馬神経細胞をインキュベーター内で３時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊（死んでいる）細胞とを区分した。インキュベーター内で４８時間かけて培養した後、ＭＴＴを含む培養液と交換しさらに３時間培養を続けた。そして、イソプロパノールを加えてホルマザンを溶解、波長５７０ｎｍの吸光度を測定し、比較例１と比較した。【００６５】
［比較例１］
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ（φ９０ｍｍ、深さ２０ｍｍ、板厚１．０ｍｍ）を使用した。無機膜１による被覆は実施しなかった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、６５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。培養される面の突起形状は、幅１０ｎｍ、アスペクト比０．０５であった。全光線透過率８６％、ヘイズ値２．７％であった。【００６６】
［比較例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。無機膜１による被覆は実施しなかった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、９５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率９１％、ヘイズ値２．１％であった。【００６７】
［比較例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、ニッケル（Ｎｉ）膜を形成した。膜厚は、０．００１μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、７５０ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率８８％、ヘイズ値５．７％であった。【００６８】
［比較例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、アルミ（Ａｌ）膜を形成した。膜厚は、０．００１μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、１５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率８２％、ヘイズ値７．９％であった。【００６９】
［実施例１］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、アルミ（Ａｌ）膜を形成した。膜厚は、０．０２μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、７５ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率２１％、ヘイズ値１．９％であった。【００７０】
［実施例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）膜を形成した。膜厚は、０．１０μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、１０ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率９０％、ヘイズ値３．８％であった。【００７１】
［実施例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）膜を形成した。膜厚は、２．０μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、０．５ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率８７％、ヘイズ値５．５％であった。【００７２】
［実施例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、高さ２０μｍの複数の側壁によって形成されたマイクロ空間構造を有するプレートを作製した。図４は、実施例４にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。これは、図２に示す第1の突起３が無く、第２の突起４のみを有する構成である。この第２の突起４の寸法が、幅１０μｍ、長さ６０μｍ、高さ２０μｍであり、配列ピッチは縦・横ともに１００μｍである。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）膜を形成した。膜厚は、０．３μｍであった。乾燥状態２０℃での酸素透過率は、１５ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。光学物性値は、全光線透過率８６％、ヘイズ値７．７％であった。【００７３】
以上の比較例および実施例の結果を表１にまとめて示す。【００７４】
【表１】
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【００７５】
無機膜１の厚みが０．００２μｍ以下、乾燥状態２０℃での酸素透過率が５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａより大きい場合、比較例１よりも接着能および増殖能はともに低下した。接着能に比べ、増殖能は、さらに低下した。比較例３および４では、無機膜１の厚さが薄いため、透明性が保持されている。一方、表面被覆が不完全であるために酸素透過率が高い。特に、比較例４の真空蒸着法では、膜厚が変動するため、表面被覆が不完全になりやすい。そのため、細胞培養容器からの毒性物質の培養液中への放出を防止することができず、培養細胞の細胞生存率が向上しなかったと考えられる。また、増殖能の低下が顕著であるのは、毒性物質が培養液中に長時間放出されたためであると考えられる。【００７６】
実施例では、無機膜１の厚みを０．００２μｍ〜５μｍ、乾燥状態２０℃での酸素透過率を５００ｆｍｏl／ｍ２・ｓ・Ｐａ以下とすることで、比較例１よりも飛躍的に高い細胞生存率を示した。実施例３および４では、無機膜１を酸化ケイ素（ＳｉＯ２）膜とすることで、高い透明性と細胞生存率のいずれの性能も満足しており、透過光での細胞観察用途に特に適している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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