(57)【要約】  本発明は、ＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体等のＭＥＴ受容体阻害物質を含有することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病予防治療剤を提供する。本発明の剤は、成人Ｔ細胞白血病の病気進行機構であるＨＧＦ−ＭＥＴ系の活性化を阻害し、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型がＴ細胞に感染することにより引きおこされる白血病である成人Ｔ細胞白血病の予防治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＴ受容体阻害物質を含有することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病予防治療剤。
【請求項２】
ＭＥＴ受容体阻害物質がＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の予防治療剤。
【請求項３】
ＮＫ４が以下のタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の予防治療剤；
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質。
【請求項４】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の予防治療剤。
【請求項５】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが組み換え発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第２項又は第４項に記載の予防治療剤。
【請求項６】
組み換え発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０又はプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の予防治療剤。
【請求項７】
組換え発現ベクターが宿主に組み込まれることによって、宿主が形質転換した形質転換体であることを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の予防治療剤。
【請求項８】
宿主が細菌、酵母、植物細胞又は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の予防治療剤。
【請求項９】
成人Ｔ細胞白血病が慢性期から急性期への移行時期にある成人Ｔ細胞白血病、又は急性期にある成人Ｔ細胞白血病であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の予防治療剤。
【請求項１０】
ＭＥＴ受容体阻害物質を、ヒトを含む哺乳動物に投与することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病の予防治療方法。
【請求項１１】
ＭＥＴ受容体阻害物質がＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の予防治療方法。
【請求項１２】
ＮＫ４が以下のタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の予防治療方法；
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質。
【請求項１３】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の予防治療方法。
【請求項１４】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが組み換え発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の予防治療方法。
【請求項１５】
組み換え発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０又はプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の予防治療方法。
【請求項１６】
組換え発現ベクターが宿主に組み込まれることによって、宿主が形質転換した形質転換体であることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の予防治療方法。
【請求項１７】
宿主が細菌、酵母、植物細胞又は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の予防治療方法。
【請求項１８】
成人Ｔ細胞白血病が慢性期から急性期への移行時期にある成人Ｔ細胞白血病、又は急性期にある成人Ｔ細胞白血病であることを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１７項のいずれか１項に記載の予防治療方法。
【請求項１９】
成人Ｔ細胞白血病を予防治療する医薬を製造するためのＭＥＴ受容体阻害物質の使用。
【請求項２０】
ＭＥＴ受容体阻害物質がＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の使用。
【請求項２１】
ＮＫ４が以下のタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の使用；
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質。
【請求項２２】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の使用。
【請求項２３】
ＮＫ４をコードするＤＮＡが組み換え発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第２０項又は第２２項に記載の使用。
【請求項２４】
組み換え発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０又はプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２５】
組換え発現ベクターが宿主に組み込まれることによって、宿主が形質転換した形質転換体であることを特徴とする請求の範囲第２３項又は第２４項に記載の使用。
【請求項２６】
宿主が細菌、酵母、植物細胞又は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の使用。
【請求項２７】
成人Ｔ細胞白血病が慢性期から急性期への移行時期にある成人Ｔ細胞白血病、又は急性期にある成人Ｔ細胞白血病であることを特徴とする請求の範囲第１９項〜第２６項のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＴ受容体阻害物質を含有する成人Ｔ細胞白血病予防治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人Ｔ細胞白血病は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ：ＨＴＬＶ−Ｉ）がＴ細胞に感染することにより引きおこされる白血病である。成人Ｔ細胞白血病を発症するのは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者１０，０００人あたり年間６人あまりで、大部分の人はＨＴＬＶ−Ｉに感染していても成人Ｔ細胞白血病を発症しない。しかし、成人Ｔ細胞白血病を発症した場合には、大部分の人が数年で死亡する。【０００３】
成人Ｔ細胞白血病は薬物治療薬として、現在ソブゾキサン（全薬工業株式会社製）やペントスタチン（財団法人  化学及血清療法研究所製）が使用され有効な症例もあるが、奏効率が低いのが現状である。これら薬物の他に、成人Ｔ細胞白血病の治療薬として、マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ−ＢＰ５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａ又はそのヒト化抗体（特許文献１参照）が知られている。また成人Ｔ細胞白血病の発症の機構解明や、成人Ｔ細胞白血病の診断及び治療法の開発を目的として、ヒト１４番染色体ｑ３２領域に存在する特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする成人Ｔ細胞白血病関連遺伝子（特許文献２参照）が知られている。しかし、成人Ｔ細胞白血病の有効な治療薬は実用化には至っていない。このように未だ成人Ｔ細胞白血病の有効な治療薬や治療方法は確立されておらず、更に効果的な成人Ｔ細胞白血病の治療薬や治療方法の開発が期待されている。【０００４】
一方、ＭＥＴ受容体阻害物質は、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；肝細胞増殖因子）が細胞表面に存在する受容体ＭＥＴとの特異的結合を阻害する物質である。ＭＥＴ受容体阻害物質としては、ＮＫ４が知られている。ＮＫ４はＨＧＦ（肝細胞増殖因子）のα鎖のＮ末端ヘアピン構造及び４個のクリングルドメインを有する分子内断片である。そして、このＮＫ４はｃ−ＭＥＴ／ＨＧＦ受容体に結合し、ＨＧＦアンタゴニストとしての活性を有することが知られている（非特許文献１参照）。【０００５】
また、ＮＫ４はインビトロ及びインビボにおいて癌細胞の浸潤を抑制することが示されている（非特許文献２参照）。さらに、ＮＫ４は血管新生の抑制機能も有しており、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ等の作用を介した内皮細胞の増殖を阻害することができる（非特許文献３を参照）。【０００６】
ＮＫ４は、このように癌の浸潤及び血管新生を抑制することができるため、癌の浸潤及び転移を抑制する癌治療薬として、及び加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症等の、血管新生をともなう疾患の治療薬として効果的であることが知られている（特許文献３参照）。【０００７】
しかし、ＨＧＦと成人Ｔ細胞白血病との関係やＮＫ４をはじめとするＭＥＴ受容体阻害物質と成人Ｔ細胞白血病との関係についての言及は認められない。
【特許文献１】特開２００４−０４３４４４号公報
【特許文献２】特開２００３−１１６５５８号公報
【特許文献３】特開２００４−１５５６６８号公報
【非特許文献１】Ｄａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２０，１−６，１９９７
【非特許文献２】Ｄａｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，３０４５−３０５４，１９９８
【非特許文献３】久場ら、分子癌治療第１巻第１号、２０００年、ｐ．４６−５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＭＥＴ受容体阻害物質を含有する成人Ｔ細胞白血病予防治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、成人Ｔ細胞白血病について鋭意研究を重ねた結果、成人Ｔ細胞白血病の慢性期から急性期への移行時期又は急性期にある患者においてＨＧＦの濃度が増加していること、及び急性期にある患者のＴ細胞においてＨＧＦの受容体であるＭＥＴ受容体遺伝子が発現していることを知見した。本発明者らはさらに研究を進め、例えば、ＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体等のＭＥＴ受容体阻害物質が成人Ｔ細胞白血病の予防又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）ＭＥＴ受容体阻害物質を含有することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病予防治療剤、
（２）ＭＥＴ受容体阻害物質がＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体であることを特徴とする上記（１）に記載の予防治療剤、
（３）ＮＫ４が以下のタンパク質であることを特徴とする上記（２）に記載の予防治療剤、
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質、
（４）ＮＫ４をコードするＤＮＡが配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（２）に記載の予防治療剤、
（５）ＮＫ４をコードするＤＮＡが組み換え発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする上記（２）又は（４）に記載の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤、
（６）組み換え発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０又はプラスミドであることを特徴とする上記（５）に記載の予防治療剤、
（７）組換え発現ベクターが宿主に組み込まれることによって、宿主が形質転換した形質転換体であることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載の予防治療剤、
（８）宿主が細菌、酵母、植物細胞又は哺乳動物細胞であることを特徴とする上記（７）に記載の予防治療剤、及び
（９）成人Ｔ細胞白血病が慢性期から急性期への移行時期にある成人Ｔ細胞白血病、又は急性期にある成人Ｔ細胞白血病であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の予防治療剤、
に関する。【００１１】
また、本発明は、ＭＥＴ受容体阻害物質を、ヒトを含む哺乳動物に投与することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病の予防治療方法、特に成人Ｔ細胞白血病の慢性期から急性期への移行時期にある成人Ｔ細胞白血病の予防治療方法、及び急性期にある成人Ｔ細胞白血病の予防治療方法、並びに成人Ｔ細胞白血病、特に慢性期から急性期への移行時期又は急性期にある成人Ｔ細胞白血病を予防治療する医薬を製造するためのＭＥＴ受容体阻害物質の使用に関する。
本明細書において、ＭＥＴ受容体は、単にＭＥＴと略記することもある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の例えば、ＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ又は抗ＨＧＦ抗体等のＭＥＴ受容体阻害物質を含有する成人Ｔ細胞白血病予防治療剤は、成人Ｔ細胞白血病、特に成人Ｔ細胞白血病患者の慢性期から急性期への移行時期及び急性期にある成人Ｔ細胞白血病に対して予防又は治療効果を発揮し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、健常人の末梢血細胞を、抗ＣＤ４抗体を用いるワンステップカラムで精製する前及び精製した後にＦＡＣＳ解析を行なった図である。
【図２】図２は、階層的ツーウェイクラスタリング分析の結果を樹図として示す図である。
【図３】図３は、ＡＴＬ患者の慢性期と急性期との間を対比したクラスタリング分析の結果を示す図である。それぞれのカラムは、別々の患者に対応し、それぞれは、発現を示したスケールに従い色づけされた遺伝子を並べた。
【図４】図４は、コレスポンデンス分析の結果を示し、３つの遺伝子発現パターンを３次元グラフに表した図である。
【図５】図５は、ＡＴＬの分類予測に使用される人工神経ネットワーク（ＡＮＮ）分析の行動経路（ｗｏｒｋ  ｐａｔｈ）を示す図である
【図６】図６は、急性期特異的遺伝子の発現プロファイルを示す図である。
【図７】図７は、ＤＮＡマイクロアレイとＭＥＴ発現レベルの相関を示す図である。
【図８】図８は、フローサイトメーターを用いて、ＡＴＬ細胞表面におけるＭＥＴ受容体タンパク質の発現を確認した図である。図中、実線は抗ＭＥＴ抗体結合細胞を示し、破線はコントロール抗体結合細胞を示す。ＩＤ＃１、ＩＤ＃５、ＩＤ＃８及びＩＤ＃４６は患者の番号を示す。
【図９】図９は、ＡＴＬ細胞内のＭＥＴｍＲＮＡと血清ＨＧＦの関係を示す図である。
【図１０】図１０は、ＭＥＴチロシンリン酸化に対するＨＧＦと抗ＨＧＦ抗体の関係を示した図である。
【図１１】図１１は、ＡＴＬ細胞増殖に対するＨＧＦ及び抗ＨＧＦ抗体の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
成人Ｔ細胞白血病は、ＨＴＬＶ−ＩがＴ細胞に感染することにより引きおこされる白血病であり、該ウイルスがＴ細胞に感染してから白血病が発症するまで多彩な症状や臨床経過をとることが知られている。成人Ｔ細胞白血病は、慢性期と急性期に大別される。慢性期としては、血液中の白血球数が増加し、多数の異常リンパ球が出現するが、その増殖は速くなく、症状をほとんど伴わず、無治療で経過を観察する期間等が挙げられる。急性期としては、血液中に花びらのかたちをした核を持つ異常リンパ球が多数出現し、急速に増殖し、リンパ節のはれや、皮疹、肝臓・脾臓等の臓器の腫大を伴ったり消化管や肺等に異常リンパ球が浸潤する期間等が挙げられる。急性期には、早急な治療が必要とされる。慢性期から急性期への移行時期としては、慢性期から急性期へ病状が進む時期等が挙げられる。該移行時期には、急性期と同様に早急な治療が必要とされる。
本発明における「成人Ｔ細胞白血病予防治療」としては、成人Ｔ細胞白血病の発症を予防し、発症した成人Ｔ細胞白血病を治療すること等が挙げられる。該予防治療には、成人Ｔ細胞白血病における慢性期から急性期への病状移行の抑制、慢性期における白血球増加の抑制又は異常リンパ球出現の抑制、あるいは急性期における異常リンパ球出現や増殖の抑制、リンパ節のはれの抑制、皮疹の抑制、臓器腫大の抑制又は消化管や肺等への異常リンパ球浸潤の抑制等が含まれる。【００１５】
本発明において、「ＭＥＴ受容体」とは、ｃ−Ｍｅｔと呼ばれるＨＧＦの高親和性チロシンキナーゼ受容体をいう。ＨＧＦは、標的細胞に発現しているＭＥＴ受容体に結合し、チロシンのリン酸化を介して生物活性を発揮し得る。ＭＥＴとしては、ＧｅｎＢａｎｋに例えばａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００２４５として登録されているもの等が挙げられる。「ＭＥＴ受容体阻害物質」としては、ＭＥＴ受容体とＨＧＦの結合により引き起こされるＨＧＦの生物活性の発揮を阻害する全てのものが挙げられ、ＭＥＴ受容体とＨＧＦとの結合を阻害するものだけでなく、ＭＥＴ受容体とＨＧＦとの結合後のチロシンのリン酸化を阻害するものや、チロシンのリン酸化後のＨＧＦの生物活性を阻害するもの等も包含される。ＭＥＴ受容体阻害物質としては、例えば、ＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡや抗ＨＧＦ抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＫ４としては、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなる蛋白質、例えばＧｅｎＰｅｐｔにａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＤ５５５６６として登録されている蛋白質等が挙げられる。ＮＫ４は、ｃ−ＭＥＴ／ＨＧＦ受容体に結合し、ＭＥＴ受容体阻害作用を有する。【００１６】
ＮＫ４としては、具体的には例えば配列表の配列番号：１（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＤ５５５６６）又は配列番号：２で表されるアミノ酸配列で示される蛋白質等が挙げられる。配列番号：２で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表される塩基配列の１３１番目から１３５番目までのアミノ酸が欠失しているものである。
ＮＫ４には、例えば、上記した配列表の配列番号：１又は配列番号：２で表される蛋白質のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が、欠失、置換又は／及び付加されたものであって、ＭＥＴ受容体阻害作用を有する蛋白質が含まれ、本発明のＮＫ４の範囲内である。
上記ＮＫ４のアミノ酸配列において、欠失、置換又は／及び付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個、好ましくは１個から約３０個、さらに好ましくは１個から約１０個、特に１個から数個（約５〜６個）のアミノ酸であることが好ましい。【００１７】
また、ＮＫ４には、例えば、配列表の配列番号：１又は配列番号：２で表される蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、好ましくは約７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有する蛋白質が含まれ、本発明のＮＫ４の範囲内である。【００１８】
さらに、Ｎ末端アミノ酸としてグルタミンの代わりに修飾アミノ酸残基ピログルタメートを有するものも、本発明のＮＫ４の範囲内である。【００１９】
かかるＮＫ４は、例えば特開２００３−２５０５４９号公報に記載の方法により製造することができる。【００２０】
ＮＫ４をコードするＤＮＡとしては、例えばＧｅｎＢａｎｋにａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＸ５２１８０３として登録されているＤＮＡ等が挙げられる。ＮＫ４をコードするＤＮＡの具体的配列としては、例えば配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＸ５２１８０３）又は配列番号：４で表される塩基配列等が挙げられる。配列番号：４で表される塩基配列は、配列番号：３で表される塩基配列の３９１番目から４０５番目までの塩基が欠失しているものである。【００２１】
本発明においては、上記の配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡの他にも、前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＴ受容体阻害作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡもＮＫ４をコードするＤＮＡの範囲内である。すなわち、種々の人為的処理、例えば、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによって、ＭＥＴ受容体阻害作用を有する蛋白質を産生できれば、該ＤＮＡはＮＫ４をコードするＤＮＡに包含される。【００２２】
具体的には、一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡとは異なる塩基配列を含有するＤＮＡであっても、ＭＥＴ受容体阻害作用を有する蛋白質を産生できれば本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡに包含される。【００２３】
なお、上記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡ等が挙げられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムと１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄後オートラジオグラフィーによって同定できるＤＮＡ等が挙げられる。【００２４】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法によって又はそれに準じて行うことができる。【００２５】
上記の配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：３又は配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列と少なくとも約７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡ等を挙げることができる。【００２６】
ＮＫ４をコードするＤＮＡは、組み換え発現ベクターに組み込まれていてもよい。組み換え発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）又は酵母由来プラスミド（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等）等が挙げられる。より好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルスが挙げられる。【００２７】
アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型若しくは５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。アデノウイルスは、感染効率が他のウイルスベクターに比べて高いこと、分裂していない細胞に感染することができること及び細胞のゲノムに組み込まれないこと等が知られており、この観点からアデノウイルスベクターを用いることが好ましい。【００２８】
ウイルスベクターは、ウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスが好ましい。アデノウイルスベクターは、少なくともＥ１領域が非機能的であることが好ましい。また、他の領域も改変してよく、特にＥ３領域（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）又は後期遺伝子Ｌ１からＬ５の任意のものを改変してもよい。複製欠失ウイルスのような改変ウイルスベクターは、公知の方法又は自体公知の方法により作成することができる。また、改変ウイルスベクターは、公知の方法又は自体公知の方法により回収・精製することができ、例えば、特表平１１−５１４８６６、特表平１１−５０６３１１、特表平９−５００５２４、特表平８−５０１７０３、特表平８−５０８６４８、特開平８−３０８５７５等に記載の改変ウイルスベクターを用いることもできる。【００２９】
ウイルスベクターの調製法、遺伝子の導入法は、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社（１９９６）、あるいは、別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社（１９９７）等にも記載されている。【００３０】
組み換え発現ベクターは、さらに宿主に組み込まれることによって宿主が形質転換された形質転換体であってもよい。【００３１】
宿主としては、ビフィズス菌、乳酸菌、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞又は哺乳動物細胞等が挙げられる。例えば、ビフィズス菌としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ等が挙げられる。乳酸菌としては、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。細菌としては、エッシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチラス属  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。【００３２】
酵母としては、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はパン酵母等が挙げられる。糸状菌としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ）又はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等が挙げられる。【００３３】
植物細胞としては、ワタ、トウモロコシ、ポテト、ソラマメ、ペチュニア、トマト又はタバコ等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞又はヒト胎児腎臓由来の２９３細胞［実験医学、第１２巻、ｐ．３１６（１９９４年）］等が挙げられる。【００３４】
ＮＫ４をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組み換え発現ベクター及び該ＤＮＡが組み込まれた組み換え発現ベクターが宿主に組み込まれて形質転換した形質転換体はそれぞれ、例えば、特開２００３−２５０５４９号公報に記載されている方法等により製造することができる。【００３５】
抗ＨＧＦ抗体としては、ＨＧＦを免疫原として得られた抗体であればいずれも好ましく用いることができる。抗ＨＧＦ抗体としては、例えばＨＧＦを免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体、ヤギモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体又はウサギモノクローナル抗体、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体  α鎖Ｈｙｂ−Ｔ６９１２、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体還元型α鎖Ｈｙｂ−Ｋ３１２１、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体  β鎖Ｈｙｂ−Ｔ７１５６、抗ラットＨＧＦモノクローナル抗体α鎖ＨＹｂ−Ｔ６９４２又は抗ラットＨＧＦ  ポリクローナル抗体等が挙げられる。また、遺伝子組み換えにより生産された抗体も好ましく用いることができる。
抗ＨＧＦ抗体は、公知の方法、例えば特開平１１−８３８５４に記載されている方法等によって製造することができる。【００３６】
本発明の成人Ｔ細胞白血病治療剤の製剤としては、投与形態にあった種々の製剤、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤若しくはマイクロカプセル剤等の固形剤又は注射剤等の液剤等を用いることができる。これら製剤は、常法、例えば第１４改正日本薬局方掲載の製剤総則等に従い製造することができる。例えば、本発明の成人Ｔ細胞白血病治療剤を含有する注射剤を製造する場合には、基剤として、通常注射剤に用いる基剤を用いることができる。該基剤としては、例えば、蒸留水と、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウム等の無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン又はグルコース等の水溶液、グリシン又はアルギニン等のアミノ酸水溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース水溶液との混合水溶液、あるいはゴマ油又はダイズ油等の植物油等が挙げられる。また、常法に従い、これらの基剤に、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、ブドウ糖、クエン酸ナトリウム、リン酸又はリン酸水素ナトリウム等の等張化剤；例えば塩酸、水酸化ナトリウム等ｐＨ調整剤；レシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤；又は、ベンジルアルコール等の無痛化剤等の助剤を添加してもよい。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤とすることもできる。【００３７】
本発明のＭＥＴ受容体阻害物質を含有する成人Ｔ細胞白血病予防治療剤を粉末、顆粒又は錠剤として製造する場合には、常法に従って医薬上許容される添加剤等を用いることにより製造することができる。添加剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン又は結晶セルロース等の賦形剤；例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸又はステアリン酸カルシウム等の滑沢剤；例えばデンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤；又は、例えばデンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液又はアルギン酸ナトリウム液等の結合剤等が挙げられる。また、顆粒剤及び錠剤には、適当なコーティング剤で剤皮を施してもよい。コーティング剤としては、例えばゼラチン、白糖、アラビアゴム又はカルナバロウ等が挙げられるが、例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等の腸溶性コーティング剤等も好ましく用いることができる。【００３８】
本発明のＭＥＴ受容体阻害物質を含有する成人Ｔ細胞白血病予防治療剤をカプセル剤として製造する場合には、上記粉末、顆粒又は錠剤に挙げた添加剤等を適宜選択し、ＭＥＴ受容体阻害物質と均等に混和したもの又はＭＥＴ受容体阻害物質と前記添加剤とを公知の方法で粒状としたもの、あるいはその粒状としたものを適当なコーティング剤で被覆したもの等をカプセルに充填するかあるいは適当なカプセル基剤（ゼラチン等）にグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。また、カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤又は放出制御カプセル剤等とすることもできる。本発明の成人Ｔ細胞白血病治療剤を腸溶性カプセル剤とする場合、ＭＥＴ受容体阻害物質と前記添加剤とを公知の方法で顆粒とし、該顆粒を腸溶性コーティング剤でコーティングしたものを通常のカプセルに充填するのが好ましい。また、ＭＥＴ受容体阻害物質と前記添加剤とを混和した粉末又は公知の方法で顆粒とした顆粒を腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル又は腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルに充填してもよい。【００３９】
また、本発明の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤をマイクロカプセル剤とする場合、例えばＮＫ４、ＮＫ４をコードするＤＮＡ若しくはＮＫ４をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを導入した宿主細胞、又は抗ＨＧＦ抗体等を芯物質として公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って前記芯物質を被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子としてマイクロカプセル剤を製造することができる。被膜物質としては、例えばカルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子が挙げられる。【００４０】
これら固形製剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル）］等を加えることができる。【００４１】
本発明の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。【００４２】
本発明である成人Ｔ細胞白血病予防治療剤の患者への投与方法としては、該予防治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法又はヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法を使用することができる［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、第３６巻、ｐ．２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、第１２巻、ｐ．１５（１９９４）］。本発明の予防治療剤については、ｉｎ  ｖｉｖｏ法により体内に投与するのが好ましい。本発明の予防治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏ法により体内に投与する場合は、注射（静脈内注射、皮下注射、髄腔内注射、筋肉内注射等）による投与又は経口投与等により投与することが可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与、筋肉内投与又は経口投与が好ましい。【００４３】
本発明の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤の投与量は、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができる。通常、成人Ｔ細胞白血病患者（体重６０ｋｇとして）に対し、ＭＥＴ受容体阻害物質の質量に換算して、通常、成人１日当たり、約１ｍｇ〜３００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜１００ｍｇを投与することができる。また、投与回数は、１日１回〜数回が適当である。【００４４】
また、本発明の成人Ｔ細胞白血病治療剤は、他の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤や抗腫瘍剤等と組み合わせて用いることができる。【００４５】
他の成人Ｔ細胞白血病治療剤としては、例えばソブゾキサン（全薬工業株式会社製）やペントスタチン（財団法人  化学及血清療法研究所製）等が挙げられる。抗腫瘍剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、その他の抗腫瘍剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ビタミン、抗菌性抗生物質又は化学療法剤等が挙げられる。【００４６】
アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド又はクロラムブチル等のアルキル化剤；例えば、カルボコン又はチオテパ等のアジリジン系アルキル化剤；例えば、ディブロモマンニトール又はディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤；例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシン又はラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤；ブスルファン；トシル酸インプロスルファン；又はダカルバジン等が挙げられる。【００４７】
代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン又はチオイノシン等のプリン代謝拮抗剤；例えば、フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン又はエノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤；例えば、メトトレキサート又はトリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤等；あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。【００４８】
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４’−エピドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン系抗生物質抗腫瘍剤；クロモマイシンＡ３；アクチノマイシンＤ等；あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。【００４９】
その他の抗腫瘍剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン等又はその塩若しくは複合体が挙げられる。また、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン又はヒドロキシウレア等も挙げることができる。【００５０】
抗腫瘍性植物成分としては、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン又はビンブラスチン等のビンカアルカロイド類；例えば、エトポシド又はテニポシド等のエピポドフィロトキシン類；あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子、インドメタシン等又はその塩若しくは複合体が挙げられる。【００５１】
細胞接着阻害剤としては、例えば、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を有する物質又はその塩若しくは複合体が挙げられる。マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、マリマスタット又はバチマスタット等あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。【００５２】
ホルモンとしては、例えばヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン又はメドロキシプロゲステロン等；あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣ又はビタミンＡ等；あるいはそれらの塩若しくは複合体等が挙げられる。【００５３】
また、本発明の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤は、骨髄移植療法等と組み合わせて用いることもできる。【００５４】
以下、本発明の実施例、製剤例及び試験例を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、以下の開示は本発明の好ましい実施例、製剤例及び試験例にすぎず、本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。以下の実施例、試験例において％は特に明記しない場合は質量％とする。
【実施例１】
【００５５】
１．ＮＫ４ｃＤＮＡの作製
ヒトのＭＲＣ−５線維芽細胞からＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用し、ｍＲＮＡを単離し、これを使用してＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＮＫ４ｃＤＮＡを単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液０．５μＬ（１５０ｎｇ）、１０×ＲＴ−ＰＣＲ溶液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］５μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μＬ、プライマー：１（１０ｍＭ）２μＬ、プライマー：２（１０ｍＭ）２μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５μＬ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μＬ、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ社製）０．５μＬ及びＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理Ｈ２Ｏ  ３５．２μＬを混合し、４２℃  ３０分、９５℃  ５分で逆転写反応を行い、９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １分のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃  ７分間反応させＮＫ４ｃＤＮＡを得た。このようにして得られたＮＫ４ｃＤＮＡをＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用してｐＣＲＩＩＴＭベクターにクローニングし、ｐＣＲＩＩ／ＮＫ４を得た。
なお、プライマー：１及びプライマー：２の配列は以下のとおりである。
プライマー：１、５’−ＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣ−３’  （配列表の配列番号５）
プライマー：２、５’−ＴＡＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＴＡＧＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＴＡＧ  −３’（配列表の配列番号６）【００５６】
２．ＮＫ４ｃＤＮＡの塩基配列決定
上記で得られたＮＫ４ｃＤＮＡを用いてＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（パーキンエルマー社製）で塩基配列決定のためのサンプルを作製した。塩基配列の決定に当たり、ＡＢＩ社製のＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ：３７７  オートシークエンサーを用い、蛍光標識ターミネーターを用いたサンガー法で塩基配列解析を行った。シークエンスによって２種類の塩基配列、配列番号：３及び配列番号：４が決定された。【００５７】
３．組換えアデノウイルス発現ベクターの構築
サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、実施例１で調製したＮＫ４ｃＤＮＡ及びＳＶ４０のポリ（Ａ）シグナル配列からなる発現カセットをシャトルプラスミドベクターｐＳＶ２＋［Ｋｏｒｓｔ  ＲＪ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，第６巻，ｐ．２７７−２８７（１９９５年）］に挿入することによって発現用カセットを構築した。この発現用カセットとＥ１Ａ及びＥ１Ｂ、Ｅ３の一部を欠くアデノウイルスタイプ５のゲノムからなるｐＪＭ１７（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＨＥＫ２９３細胞（ヒトの胚腎細胞）にカルシウム共沈法によりコトランスフェクトした。発現カセットの入った組換えアデノウイルスは、ウイルスＤＮＡの制限酵素消化によって生じるＤＮＡ断片の長さの違いにより目的ウイルスを選別し、ＮＫ４ｃＤＮＡを発現する組換えアデノウイルス発現ベクターＡｄＣＭＶ．ＮＫ４を構築した。【００５８】
４．組換え発現ベクターの構築
上記１で作製したｐＣＲＩＩベクターに組み込まれたＮＫ４ｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ／ＳｐｅＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）処理により切断末端を平滑化させた。得られたＮＫ４ｃＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、切断末端を平滑化しておいたＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲと混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合してＮＫ４発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４を得た。得られたＮＫ４発現ベクターはニワトリβ−アクチンプロモーターとウサギβ−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列の間にＮＫ４ｃＤＮＡを有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にサイトメガロウイルス初期プロモーターとポリ（Ａ）シグナル配列で連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。【００５９】
５．チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞への形質転換とその発現
上記ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４はＷｉｇｌｅｒらの方法［Ｃｅｌｌ，第１１巻，ｐ．２３３（１９７７年）］によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４プラスミドをそれぞれ２４０μＬの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ塩化ナトリウム及び１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）２４０μＬを攪拌しながら加えた。室温で３０分間攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿物を形成させた。続いて、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社製）と１％グルタミンとを含むα―ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社製）を用いて５×１０５個のＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿物を加え室温で２０分間放置した。さらに、３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさらに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社製）、２％グルタミンを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社製）を用いて安定なＮＫ４高生産株を得るために１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次追加させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたＮＫ４産生組換え細胞のクローン選別を行い、安定なＮＫ４生産株を得た。【００６０】
６．形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からの組換えＮＫ４の精製
上記５で得られたＮＫ４産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株をリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社製）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社製）で培養し、その培養上清より、組換えＮＫ４を精製した。
（１）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ＮＫ４産生チャイニーズハムスターＣＨＯ組換え細胞株の培養液１２Ｌに最終濃度０．０１％になるようにＴｗｅｅｎ  ８０を添加し、ステベックスＨＶフィルター（日本ミリポア社製）により濾過した。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ６．５）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラム体積５０ｍＬ）に添加した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．５Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出したピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ａとした。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
ヘパリン溶出液Ａを１００倍容の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ８．０）で３回透析を行った後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製、カラム体積  ４０ｍＬ）に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで溶出したピーク画分を集め、ＤＥＡＥ溶出液とした。
（３）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（２回目）
ＤＥＡＥ溶出液を１００倍容の緩衝液Ａで３回透析を行った後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラム体積  ５０ｍＬ）に添加した。０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．３Ｍから２．５Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により吸着物を溶出した。ＮＫ４のピーク画分を集め、ヘパリン溶出液Ｂとした。精製された組換えＮＫ４の収量は約１２ｍｇであり、培養上清液からの回収率は約５０％であった。
（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す。）
組換えＮＫ４を２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。精製組換えＮＫ４は非還元条件下［２−ＭＥ（−）］では約５０ｋＤａを示し、還元条件下［２−ＭＥ（＋）］では約６７ｋＤａを示した。【００６１】
［製剤例１］
生理食塩水１００ｍＬ中に実施例で調製した組換えＮＫ４（１ｇ）、マンニトール（１ｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含有する溶液を無菌的に調製し、１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の治療剤を凍結乾燥剤として調製した。【００６２】
［製剤例２］
０．０２Ｍ  リン酸緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍＬ中に、実施例で調製した組換えＮＫ４（１ｇ）及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に配合して、１ｍＬずつバイアルに分注した。次いで、各バイアル中の液剤を凍結乾燥して密封して、本発明の治療剤を凍結乾燥剤として調製した。【００６３】
［製剤例３］
注射用蒸留水１００ｍＬ中に、実施例で調製した組換えＮＫ４（１ｇ）、ソルビトール（２ｍｇ）、グリシン（２ｍｇ）及びポリソルベート８０（１０ｍｇ）を含む溶液を無菌的に調製し、１ｍＬずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の治療剤を凍結乾燥剤として調製した。【００６４】
［製剤例４］
ｐＣＡＧＧＳ−ＤＨＦＲ／ＮＫ４を導入したＣＨＯ細胞を注射用水で２×１０７細胞／ｍＬとなるよう懸濁した。別途２％アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。次いでこれらの２つの溶液を等量混合し、均質な懸濁液とし二重ノズル法によりマイクロカプセルを製造した。得られたマイクロカプセルの粒径は、１００ミクロンと４００μｍの間であった。【００６５】
［試験例］
自治医科大学に設置された厚生省の指針に準拠した形での倫理委員会の認可を受け本試験を行った。また患者からのサンプル採取は、説明書を患者に渡して担当医が説明し、同意書に患者あるいは代諾者が署名した患者に対して実施した。【００６６】
（１）末梢血のＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ）４陽性細胞の分画
成人Ｔ細胞白血病（以下、ＡＴＬと略記する。）はＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＣＤ４陽性細胞と略記する。）の腫瘍性増殖を特徴とする。そこで慢性期ＡＴＬ患者１９例、急性期ＡＴＬ患者２２例の末梢血からＣＤ４陽性分画のみを純化した。
発明者らは、慢性期又は急性期のＡＴＬ患者の末梢血から、以下の方法でＣＤ４陽性細胞を精製した。このＣＤ４陽性細胞は、健常人のボランティア（ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ）３例の末梢血からも同様に精製した。精製したＣＤ４陽性細胞は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在又は非存在下で活性化した。【００６７】
ＣＤ４陽性細胞の精製方法：
（１）ヒト末梢血約２０ｍＬを採血して、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；ファルマシア社製）を用いて末梢血単核球（ＭＮＣ）を分離した。
（２）ＭＮＣを遠心後、３％牛胎児血清と２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬに懸濁した。
（３）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社の磁気ビーズ結合型抗ヒトＣＤ４抗体溶液（ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を１００μＬ添加し、４℃にて３０分間静置した。
（４）上記（３）で静置後の細胞懸濁溶液を遠心分離し、３％牛胎児血清と２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したＰＢＳにて細胞を洗浄し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＭＳ  ｃｏｌｕｍｎ＋ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＳｅｐａｒａｔｏｒにてＣＤ４陽性細胞を純化した。【００６８】
次いで、上記で得たＣＤ４陽性細胞を、抗ＣＤ４抗体を用いるワンステップカラムで精製し、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞フラクションを得た。
得られた末梢血単核細胞（ＭＮＣ）をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖｅｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；蛍光自動細胞解析装置）を用いて解析した。健康なヒトにおいて、例えば、末梢血単核細胞（ＭＮＣ）は、様々なタイプの細胞から構成され、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性フラクションの割合は、２９．１％であったが、ワンステップカラム溶出後には、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞の割合は９８．８％にまで純化、精製された（図１）。
同様に、慢性期ＡＴＬ患者のＭＮＣにおけるＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞の割合は、２５．７％であったが、ワンステップカラム溶出後における純化ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞の割合は、９７．５％であった（データは示していない）。【００６９】
（２）階層的ツーウェイクラスタリング分析
得られた純化ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＨＧＵ１３３マイクロアレイ（約４４，０００のプローブセット＝約３３，０００種類の遺伝子に相当）によって解析した。
ＡＴＬ患者サンプルに共通する転写的にサイレントな遺伝子を、分析から除外するために、本発明者らは、まず３０％のＡＴＬ患者サンプル（ｎ＝１３）でＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ５．０ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で呼ぶ“Ｐｒｅｓｅｎｔ”を受け取ったプローブセットを選択した。全部で１５，１２１のプローブセットが、このセレクションウインドウ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）を通過した。これらプローブセットの発現プロファイルの類似点に基づき、４７人のサンプル全ては、階層的ツーウェイクラスタリング分析［Ｕ．Ａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９６巻，ｐ．６７４５（１９９９年）］に供され、該分析から被験体の樹状図を作成した（図２）。健常人（Ｎｏｒ）では、ＡＴＬ患者サンプルと異なる枝を形成した。また健常人サンプルでは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；２μＭ）刺激Ｔ細胞［Ｎｏｒ１〜３（＋）］とＰＨＡ非刺激Ｔ細胞［Ｎｏｒ１〜３（−）］との間で樹状図上異なることが判明した。しかし、慢性期及び急性期のＡＴＬ患者のサンプルは、この樹状図では互いに明らかな区別ができなかった。【００７０】
（３）Ｗｅｌｃｈの分散分析（ＡＮＯＶＡの分散分析）
慢性期及び急性期ＡＴＬ患者サンプルでのＡＴＬ細胞のトランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ；遺伝子発現プロファイル）を比較するため、いくつかのアプローチを試みた。最初の試みは、１５，１２１プローブセットに対するＷｅｌｃｈの分散分析（ＡＮＯＶＡの分散分析）であり、遺伝子発現レベルが慢性期と急性期とで大きく異なったものを抽出した。抽出したものは、２７プローブセット（２５の遺伝子に相当）であり、慢性期に対する急性期の有意差はＰ＜０．００１であった。次いで、慢性期と急性期との間で効果的な大きさ、すなわち平均発現密度で絶対的な差異［Ｓ．Ｍ．  Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，第４１２巻，ｐ．８２２（２００１年）］が≧１．０対数単位である遺伝子を選択した。２５の遺伝子に相当するトータル２７プローブセットを、最終的に同定した（図３）。図３から明らかなように、遺伝子発現レベルは慢性期と急性期で対照的であった。階層的クラスター分析を、これらのステージの関連遺伝子の発現に適用した。３つの遺伝子（ＦＯＳＬ２，ＰＯＥ４Ｂ，ＢＧＰ５；５プローブセット）が、慢性期に選択的に発現し、他の２２遺伝子は、急性期に選択的に発現した。【００７１】
（４）コレスポンデンス分析
次に、我々は、慢性期及び急性期の二つのステージ間での遺伝子発現に類似性及び差異を直接的に見ることができるように試みた。コレスポンデンス分析［Ｋ．Ｆｅｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９８巻，ｐ．１０７８１（２００１年）］を、上記２７プローブセットの発現データに関して行った。３つの遺伝子発現パターンにおける２７の特徴の複雑性を減少することに成功した。各サンプルについて計算した３次元座標に基づいて、３次元空間にプロットした。その結果を図４に示した。慢性期ＡＴＬ患者のＣＤ４陽性細胞が急性期ＡＴＬ患者のＣＤ４陽性細胞とは異なる位置にプロットされていることは、この図４から明らかであり、ＡＴＬ患者の慢性期と急性期の間に差異が存在することが明確となった。活性化していない健常人ＣＤ４陽性細胞及びＰＨＡで活性化された健常人ＣＤ４陽性細胞の両方は、急性期ＡＴＬ患者のＣＤ陽性細胞から離れてプロットされることも、また明らかとなった。【００７２】
（５）マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）解析病期診断アルゴリズム
次に、ＡＴＬ患者のＣＤ４陽性細胞についてのマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）解析病期診断アルゴリズムを開発することを試みた。方法は、１０％交差検証法（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）によって行った。すなわち、１５，１２１プローブセットを、図５に示す３つの重ならないグループに分割し、各グループは１０の人工神経ネットワーク（ＡＮＮ）に分割した。次いで、各グループの１０のＡＮＮのうち、９つのＡＮＮ（３７サンプル）をトレーニングデータとし、残っている１つのＡＮＮ（４サンプル）をテストデータとした。３つのグループについて１０ＡＮＮの各ＡＮＮが１回はテストデートとして選ばれるようこの操作を繰返した。そして、ＡＮＮの各セットで発現の病期診断に強く影響をした４４の予測遺伝子を選択した。同じ１０％交差検証法において該４４の遺伝子でテストしたところ、３７サンプルについての１エラーの予測を得た。最終的に、保留された４サンプルは、トレーニングされたＡＮＮを用いて試験され、４サンプルは全て正しく予測することに成功した。該４４の遺伝子を表１に示した。本解析により、４種類の遺伝子について発現量を測定するだけでＡＴＬの病期診断が可能となった。【００７３】
【表１】
2006132251.tif 000002
【００７４】
（６）ＭＥＴ発現レベルについての評価
次に本発明者らは、ＡＴＬ患者の急性期特異的遺伝子を単離することを試みた。本発明者らは、発現プロファイルが樹状図フォーマットで説明される６つの遺伝子（ＭＡＧＥ６，ＭＥＴ，ＫＩＲ２ＤＳ２，ＭＢＤ１，ＬＨＸ２，ＥＴＶ１）を単離した（図６）。図６から特にＡＴＬ患者の急性期特異的遺伝子としてｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）の受容体であるＭＥＴ遺伝子に注目した。ＭＥＴ遺伝子発現レベルは、全ての健常人のＴ細胞及び慢性期ＡＴＬサンプルにおいて活性化していない状態を示した。
なお、ＭＥＴｍＲＮＡの発現プロファイルは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認した。【００７５】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、以下の方法によりおこなった。
まず、検体細胞よりＱｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ純化カラムによりＲＮＡを調製した。さらにインビトロジェン社のＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを添加して、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡにＭＥＴ用プライマーセット：
５’−ＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＣ−３’（配列番号７）及び
５’−ＡＧＣＧＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＡＧＴＧＣＴＣ−３’（配列番号８）
を添加し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）によってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物は増幅反応中にＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によってリアルタイムに定量し、対数増殖期が始まるサイクル数Ｃｔ値を計測した。
また内部コントロール遺伝子グリセルアルデヒド３ホスフェート  デハイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｃＤＮＡ量測定のためには上記反応中のＭＥＴ用プライマーセットの変わりにＧＡＰＤＨプライマーセット：
５’−ＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴ−３’（配列番号９）；及び
５’−ＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＧ−３’（配列番号１０）
を用いて反応させた。最終的なＭＥＴｍＲＮＡ発現量は２ｎ（ｎ＝ＣｔＧＡＰＤＨ−ＣｔＭＥＴ）により算出した。【００７６】
ＭＥＴの発現レベルは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定されるＧＡＰＤＨｍＲＮＡの量に関係するＭＥＴｍＲＮＡの量と比較した。図７に見られるように、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数（ｒ２＝０．８５１、Ｐ＜０．０００１）は、ＤＮＡマイクロアレイと定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法でのＭＥＴ発現レベルに相関関係があることを示した（図７）。【００７７】
また、ＡＴＬ細胞表面のＭＥＴタンパク質陽性率（％）を、抗ＭＥＴ抗体を用いたＦＡＣＳｃａｎシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によるフローサイトメーターによって測定した。なお、コントロール抗体として正常ウサギＩｇＧを用いた（図８）。得られたＭＥＴタンパク質陽性率（％）をＭＥＴタンパク質量と見なし、これとＤＮＡマイクロアレイによって測定されたＭＥＴｍＲＮＡ量との相関を調べた。そのｍＲＮＡ量とＭＥＴタンパク質量との間に矛盾のないことを確認した。【００７８】
（７）ＡＴＬ細胞内のＨＧＦｍＲＮＡと血清ＨＧＦの測定
急性期ＡＴＬ患者におけるｍＲＮＡとタンパク質の両方のＭＥＴ特異的発現は、ＡＴＬ細胞がＭＥＴを介するパスウェイの活性を経由して潜在的な細胞分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を取得するという可能性を示した。ＨＧＦ−ＭＥＴのオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）回路の存在を試験するため、本発明者らは、マイクロアレイによってＡＴＬ細胞検体のＨＧＦ発現量と、上記定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと同様の測定法によって得られたＡＴＬ細胞内のＨＧＦｍＲＮＡ量とを比較した。なお、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応にはＨＧＦ用のオリゴヌクレオチドプライマーセット：
５’−ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１１）；及び
５’−ＡＧＧＡＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号１２）
を用いた。マイクロアレイ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの両方によってもＨＧＦｍＲＮＡをほとんど検出できなかった。そのため、次に本発明者らは、患者におけるＨＧＦタンパク質の血清レベルを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。その結果を図９に示した。ＨＧＦレベルは、健常人では０．２７±０．０８ｎｇ／ｍＬであり、癌患者では１〜２ｎｇ／ｍＬであることは知られている。それに対し、ＡＴＬ患者の血清、特に、急性期ＡＴＬ患者の血清中で顕著な高レベルのＨＧＦが検出された（図９）。
ＡＴＬ患者において、血清ＨＧＦがどのように増加されるかはまだ明らかでない。ＡＴＬは悪性の成熟活性Ｔ細胞であるので、腫瘍壊死因子アルファー（ＴＮＦα）やインターロイキン−１β（ＩＬ１β）等の種々のサイトカインが分泌されるということが知られている［Ｙ．Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，第２１巻，ｐ．４４３（１９９６年）］。これらのサイトカインは、繊維芽細胞におけるＨＧＦ発現の潜在的誘発物質でもあるので［Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１８８巻，ｐ．２３５（１９９２年）、Ｍ．Ｔａｍｕｒａ，Ｎ．Ａｒａｋａｋｉ，Ｈ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｈ．Ｔａｋａｄａ，Ｙ．Ｄａｉｋｕｈａｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６８巻，ｐ．８１４０（１９９３年）］、ＡＴＬ細胞は、ＴＮＦＡ又はＩＬ１Ｂを伴う繊維芽細胞の活性を通じて血清ＨＧＦレベルを間接的に上昇できる。
血清ＨＧＦとＭＥＴ発現の関係を図９に示した。患者の血清ＨＧＦの上昇がＡＴＬ細胞中でのＭＥＴ発現より先に起こることを示した。【００７９】
（８）ＭＥＴのチロシンリン酸化
ＡＴＬ急性期患者末梢血より樹立されたＡＴＬ細胞株であるＫＫ−１細胞を１ｍＬのプロテアーゼインヒビターを含む溶解液［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  β−グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４（オルトバナジン酸(Ｖ)ナトリウム）、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）５μＬ／ｍＬ］に懸濁した。その後ローテーターにて４℃、０．５〜１時間攪拌し、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍ，３０分間）。可溶画分を採取した。次いで可溶画分にｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、インキュベートした。遠心分離してｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを除去し、得られた上清に抗Ｍｅｔ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂ−２）を加え、免疫沈降させた。免疫沈降物をジチオスレイトールで還元後、７％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、エレクトロトランスファーによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜に転写されたリン酸化されたＭｅｔを、リン酸化チロシン認識抗体（ＵＢＩ  ７−２１１；コスモ・バイオ社製）を用いて検出した。
その結果を図１０に示す。ＨＧＦ刺激は、ＡＴＬ細胞において、ＭＥＴチロシンリン酸化を明らかに誘発した。ＨＧＦに対する抗体の添加は、ＭＥＴチロシンリン酸化を抑制し、ＡＴＬ細胞においてＨＧＦ−ＭＥＴ経路がこの抗体によって調節され得ることを示した。【００８０】
（９）ＭＴＳアッセイ
抗ＨＧＦ抗体の増殖抑制効果をみるためにＭＴＳアッセイ（細胞増殖試験）を行った。
９６穴プレートにＫＫ−１細胞を（３×１０５）個撒き、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）又はＨＧＦと抗ＨＧＦ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し２４時間培養した。ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）］を添加し、さらに１時間培養した。生成されたＭＴＳホルマザン産物を、９６ウェルプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定した。本方法によれば、４９０ｎｍにおけるＭＴＴホルマザン定量値は、培養液中の生細胞数に比例する。
その結果を図１１に示す。ＫＫ−１細胞において、ＨＧＦの添加は、ＡＴＬ細胞を増殖させ、抗ＨＧＦ抗体の添加は、該細胞増殖を抑制した。このことは、ＡＴＬ細胞においてＨＧＦ−ＭＥＴ経路がこの抗ＨＧＦ抗体によって調節され得ることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の成人Ｔ細胞白血病予防治療剤は、成人Ｔ細胞白血病の予防又は治療に有用である。
【図１】
2006132251.tif 000003
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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