(57)【要約】【課題】複雑で高価な装置を用いることなく、1つの細胞等の生体物質に対する、2以上の物質の結合性を評価できる方法を提供する。【解決手段】基板表面に固定された複数の生体物質と、複数種の生体物質と結合性を有する生体物質結合性物質との結合性を評価する方法。（ａ１）消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と固定された複数の生体物質とを接触させ、（ｂ１）固定された複数の生体物質に対して消光性蛍光物質に対する励起光を照射し、（ｃ１）励起光により蛍光を発した消光性蛍光物質からの蛍光により、消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質を検出し、（ｄ１）蛍光を発した消光性蛍光物質を消光し、（ａ２）消光性蛍光物質標識した第2の生体物質結合性物質と、消光後の固定された複数の生体物質とを接触させる。以後、（ｂ２）励起光照射、（ｃ２）生体物質検出、および（ｄ２）消光を行う。【選択図】
2007055302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に固定された複数の生体物質と、複数種の生体物質と結合性を有する生体物質結合性物質との結合性を評価する方法であって、
（ａ１）消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と前記固定された複数の生体物質とを接触させ、
（ｂ１）前記固定された複数の生体物質に対して消光性蛍光物質に対する励起光を照射し、
（ｃ１）励起光により蛍光を発した消光性蛍光物質からの蛍光により、消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質を検出し、
（ｄ１）上記蛍光を発した消光性蛍光物質を消光し、
次いで、（ａ２）消光性蛍光物質標識した第2の生体物質結合性物質と、消光後の前記固定された複数の生体物質とを接触させ、
以後、（ｂ２）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ２）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ２）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を行う、上記方法。
【請求項２】
（ｄ２）の後に、（ａ３）消光性蛍光物質標識した第3以降の生体物質結合性物質と、消光後の固定された複数の生体物質との接触、（ｂ３）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ３）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ３）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を順次、第3以降の生体物質結合性物質の種類数だけ繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体物質が、細胞、組織、ウイルス、細菌、また、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、ホルモンおよびそれらの産生物から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
生体物質結合性物質が、抗体、抗原、リガンド、ホルモン、タンパク質、核酸、脂質、および糖鎖から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
消光性蛍光物質がフィコエリスリン(PE)、フルオレセイン、またはアロフィコシアニン（APC）である請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
消光性蛍光物質の消光を、水銀ランプ、またはハロゲンランプの光照射により行う請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
消光性蛍光物質に対する励起光は、単波長の光である請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
単波長の光がレーザー光である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
基板表面に固定された複数の生体物質についての、生体物質結合性物質との結合性の評価結果である蛍光に関するデータを、コンピューターに保存し、保存データから、所望の結合性を有する生体物質を選択する請求項1〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
選択した生体物質を基板表面から取り出して、次の操作に用いる請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
生体物質が細胞であり、細胞と細胞表面マーカーとの結合性の評価に用いる請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか１項の方法を用いて、生体物質に特異的結合性を有する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法に関する。本発明の方法は、生体物質に対する特異的結合性を有する物質をスクリーニングする方法にも適用できる。
【背景技術】
【０００２】
これまでは多種類の抗体で組織や細胞を染色して解析する場合には、異なる蛍光色素でそれぞれの抗体を標識し、それらの蛍光標識抗体を用いて組織や細胞を染色し、それぞれの蛍光色素を識別して検出できる検出器（光電子倍増管と光学フィルターの組合せなど）を搭載した装置を用いて解析する必要があった。そのような装置は一般的に高価であり、また、解析できる色素の数にも限りがあった。このような装置の例としてフローサイトメータがある。(リンパ球機能検索法  矢田純一、藤原道夫  編著  中外医学社（東京）(非特許文献1))
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
フローサイトメータで細胞を解析する場合には、細胞が常にシース液の中を高速で流れているため、同じ細胞を２度観察することができない。従って、フローサイトメータの場合には搭載されているレーザーの種類および光学フィルターと光電子倍増管との組合せがいくつあるかにより、何種類の蛍光色素を識別できるかが決まっていた。【０００４】
そこで、本発明の目的は、複雑で高価な装置を用いることなく、1つの細胞等の生体物質に対する、2以上の物質の結合性を評価できる方法を提供することにある。【０００５】
上記目的を達成するために本発明者らは種々の検討を行った。その結果、フローサイトメータでよく用いられる橙色の蛍光を発する蛍光蛋白であるPhycoerythrin (PE)等で標識したサンプルは、蛍光顕微鏡下（水銀ランプ下）で観察すると数分で消光して蛍光が消えてしまうという現象を積極的に利用し、簡易な蛍光観察装置を用いて、PE標識された複数の抗体(生体物質結合性物質)を用いて、複数の生体物質の検出を行うことができることを見いだした。即ち、PE標識された細胞表面マーカー蛋白に対する抗体を複数種類用い、まず、一つのPE標識抗体1を用いて細胞を染色しスキャナーで観察する。観察後、蛍光顕微鏡下でPEを消光させる。次に、別のPE標識抗体2を用いて細胞を染色しスキャナーで観察する。観察後、蛍光顕微鏡下でPEを消光させる。このように、染色・観察・消光のサイクルを繰り返すことにより、同じ細胞を無限の種類の抗体を用いて細胞表面蛋白の発現などの解析をすることが可能になることを見いだして、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
[1]基板表面に固定された複数の生体物質と、複数種の生体物質と結合性を有する生体物質結合性物質との結合性を評価する方法であって、
（ａ１）消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と前記固定された複数の生体物質とを接触させ、
（ｂ１）前記固定された複数の生体物質に対して消光性蛍光物質に対する励起光を照射し、
（ｃ１）励起光により蛍光を発した消光性蛍光物質からの蛍光により、消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質を検出し、
（ｄ１）上記蛍光を発した消光性蛍光物質を消光し、
次いで、（ａ２）消光性蛍光物質標識した第2の生体物質結合性物質と、消光後の前記固定された複数の生体物質とを接触させ、
以後、（ｂ２）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ２）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ２）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を行う、上記方法。
[2]（ｄ２）の後に、（ａ３）消光性蛍光物質標識した第3以降の生体物質結合性物質と、消光後の固定された複数の生体物質との接触、（ｂ３）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ３）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ３）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を順次、第3以降の生体物質結合性物質の種類数だけ繰り返す、[1]に記載の方法。
[3]生体物質が、細胞、組織、ウイルス、細菌、また、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、ホルモンおよびそれらの産生物から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である[1]または[2]に記載の方法。
[4]生体物質結合性物質が、抗体、抗原、リガンド、ホルモン、タンパク質、核酸、脂質、および糖鎖から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]消光性蛍光物質がフィコエリスリン(PE) 、フルオレセイン、またはアロフィコシアニン（APC）である[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]消光性蛍光物質の消光を、水銀ランプ、またはハロゲンランプの光照射により行う[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]消光性蛍光物質に対する励起光は、単波長の光である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]単波長の光がレーザー光である[7]に記載の方法。
[9]基板表面に固定された複数の生体物質についての、生体物質結合性物質との結合性の評価結果である蛍光に関するデータを、コンピューターに保存し、保存データから、所望の結合性を有する生体物質を選択する[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]選択した生体物質を基板表面から取り出して、次の操作に用いる[9]に記載の方法。
[11]生体物質が細胞であり、細胞と細胞表面マーカーとの結合性の評価に用いる[10]に記載の方法。
[12][1]〜[11]のいずれか１項の方法を用いて、生体物質に特異的結合性を有する物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００７】
１  PEを検出できる装置であれば、それ以外の色素を検出できないものであっても、複数のマーカーについて解析できる。解析装置が安価になる。
２  解析できるマーカーの数は理論的には無限である。但し、実際には、細胞、サンプルのダメージ等によって、解析できるマーカーの数は制限される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法は、基板表面に固定された複数の生体物質と、複数種の生体物質と結合性を有する生体物質結合性物質との結合性を評価する方法である。
本発明の方法を適用される生体物質は、特に制限はないが、例えば、細胞、組織、ウィルス、細菌、また、タンパク質、核酸、脂質、糖鎖、ホルモンおよびそれらの産生物から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質であることができる。【０００９】
生体物質は、基板表面に固定されたものである。観察する細胞のアドレスが固定されていることで、複数回の励起、蛍光検出および消光の繰り返しから、複数の生体物質結合性物質に対する結合性を容易に決定できるからである。フローサイトメータのように細胞が常に移動している場合は、複数の抗体で染色した時に、それぞれの抗体が同じ細胞に結合したのか、別の細胞に結合したのかをチェックできない。観察する細胞等の生体物質のアドレスが固定されているものの例としては、たとえば、組織切片、付着細胞のプレパラート、マイクロウェルアレイチップに播種された浮遊細胞（リンパ球など）を挙げることができる。【００１０】
生体物質が細胞の場合、例えば、特開2004−173681号公報、特開2004−187676号公報に記載の方法で作成されたマイクロウェルアレイチップであることができる。あるいは現代化学、2002、No.372,p.2053-2063に記載されたプロテインチップ、細胞チップなどを挙げることもできる。【００１１】
また、生体物質結合性物質にも特に制限はないが、例えば、抗体、抗原、リガンド、ホルモン、タンパク質、核酸、脂質、および糖鎖から成る群から選ばれる少なくとも1種の物質であることができる。【００１２】
本発明で用いられる生体物質結合性物質は、消光性蛍光物質標識したものである。消光性蛍光物質は、レーザー光のような単波長の光(低エネルギーの光)では、消光しないが、水銀ランプのような高いエネルギーの光、あるいは長時間の光照射により、構造等が変化して、蛍光性を示さなくなる物質であればよい。そのような物質としては、例えば、フィコエリスリン(PE)、フルオレセイン(例えば、Fluorescein isothiocyanate（FITC）)、またはアロフィコシアニン（APC）等を挙げることができる。さらに、PE の他の例として、PC5を挙げることもできる。PC5はPEとCy5を結合させたものであり、PEが励起されて出したオレンジの蛍光でCy5を励起し、Cy5の蛍光を検出するものである。PC5も消光性蛍光物質として使用できる。【００１３】
消光性蛍光物質で標識した生体物質結合性物質は、例えば、生体物質結合性物質がタンパク質の場合、以下のように調製できる。タンパク質に対するPE標識は、まず、PEにSATA（N-succinimidyl-S-acetylthioacetate）を結合させる。次に、タンパク質にGMBS（γ-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester）を結合させる。最終的にSATAとGMBSを介してPEとタンパク質を結合させる。
(参考文献)Current Protocols in Immunology/ edited by John E. Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strober. Published by Greene Publishing Associated and Wiley-Interscience, New York【００１４】
PC5で標識した生体物質結合性物質の調製は、例えば、生体物質結合性物質がタンパク質の場合、SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridylthio)-propionate)を用いる方法で実施できる。(参考文献)Annals New York Academy of Science, 677: 185-193, 1993; The Journal of Cell biology 93:981-986, 1982【００１５】
FITCで標識した生体物質結合性物質の調製は、例えば、生体物質結合性物質がタンパク質の場合、FITC on Celiteを用いる方法で実施できる。具体的には、タンパク質溶液（１mg相当）に1mgのFITC on Celite 10% (Sigma F1628)を添加し、室温で３０分間インキュベーションする。その後10000rpm  １分間遠心することによりCeliteを除去する。その後、タンパク質溶液をPBSで透析することにより、FITC標識タンパク質を作成することができる。また、FITCそのものをアミノ酸であるリジンあるいはN末端のアミノ基に結合させることもできる。N末端はどのタンパク質にもあるので、この方法では、ほとんどのタンパク質を標識できるということになる。【００１６】
本発明の方法では、
（ａ１）消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と固定された複数の生体物質とを接触させ、
（ｂ１）前記固定された複数の生体物質に対して消光性蛍光物質に対する励起光を照射し、
（ｃ１）励起光により蛍光を発した消光性蛍光物質からの蛍光により、消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質を検出し、
（ｄ１）上記蛍光を発した消光性蛍光物質を消光する。【００１７】
上記（ａ１）〜（ｃ１）により、第1の生体物質結合性物質と結合性を示す生体物質を特定することができる。尚、（ａ１）における消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と固定された複数の生体物質との接触の後、遊離状態の生体物質結合性物質を除去するために、生体物質が固定されたチップ等の表面を洗浄することが適当である。洗浄は、例えば、以下のように行うことができる。まず、生体物質が固定されたチップ等の表面にのっているPBSや培地などのバッファーをピペットなどを用いて取り除き、そこへ新しいバッファーを添加する。そのバッファーを取り除き、そこへ新しいバッファーを添加する。この操作を数回繰り返すことにより、遊離状態の生体物質結合性物質を除去できる。【００１８】
洗浄終了後、（ｂ１）および（ｃ１）において、固定された複数の生体物質に対して消光性蛍光物質に対する励起光を照射することで、生体物質に結合した生体物質結合性物質からの蛍光を検出して、生体物質結合性物質に対する結合性を示す生体物質を特定することができる。【００１９】
消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質と固定された複数の生体物質との接触は、例えば、消光性蛍光物質標識した第1の生体物質結合性物質を含有する溶液を複数の生体物質を固定したチップの表面に供給することで行うことができる。接触の条件(例えば、温度、時間、雰囲気、添加剤の存在)は、生体物質結合性物質と生体物質の種類に応じて適宜設定することができる。【００２０】
（ｄ１）では、蛍光を発した消光性蛍光物質を消光する。消光は、例えば、水銀ランプを照射することで行うことができる。水銀ランプの照度や照射時間は、消光性蛍光物質の消光特性を考慮して適宜決定できる。【００２１】
次いで、（ａ２）消光性蛍光物質標識した第2の生体物質結合性物質と、消光後の前記固定された複数の生体物質とを接触させ、
以後、（ｂ２）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ２）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ２）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を行う。【００２２】
第2の生体物質結合性物質は、第1の生体物質結合性物質と異なる物質であるが、第2の生体物質結合性物質を標識する消光性蛍光物質は、第1の生体物質結合性物質を標識する消光性蛍光物質と同一であることができる。両者が同一であっても、（ｄ１）において消光操作を施しているので、（ｂ２）における消光性蛍光物質に対する励起光の照射では、第1の生体物質結合性物質を標識した消光性蛍光物質は蛍光を発することがなく、第2の生体物質結合性物質と結合性を示す生体物質が判別できる。第2の生体物質結合性物質の生体物質への接触、励起光の照射、蛍光の検出、消光性蛍光物質の消光は、（ａ１）〜（ｄ１）と同様に行うことができる。（ａ１）〜（ｃ１）および（ａ２）〜（ｃ２）の操作により、第1の生体物質結合性物質に対して結合性を示す生体物質、および第２の生体物質結合性物質に対して結合性を示す生体物質を判別することができる。【００２３】
本発明の方法においては、上記（ｄ２）の後に、（ａ３）消光性蛍光物質標識した第3以降の生体物質結合性物質と、消光後の固定された複数の生体物質との接触、（ｂ３）消光性蛍光物質に対する励起光の照射、（ｃ３）消光性蛍光物質からの蛍光による消光性蛍光物質標識した生体物質結合性物質と結合した生体物質の検出、および（ｄ３）蛍光を発した消光性蛍光物質の消光を順次、第3以降の生体物質結合性物質の種類数だけ繰り返すことにより、３つ以上の生体物質結合性物質について、同一の生体物質を用いて、その結合性を評価することができる。（ａ３）〜（ｄ３）は、（ａ１）〜（ｄ１）と同様に実施することができきる。【００２４】
第3の生体物質結合性物質は、第2の生体物質結合性物質と異なる物質であるが、第3の生体物質結合性物質を標識する消光性蛍光物質は、第2の生体物質結合性物質を標識する消光性蛍光物質と同一であることができる。両者が同一であっても、（ｄ２）において消光操作を施しているので、（ｂ３）における消光性蛍光物質に対する励起光の照射では、第2の生体物質結合性物質を標識した消光性蛍光物質は蛍光を発することがなく、第3の生体物質結合性物質と結合性を示す生体物質が判別できる。この関係は、第3以降の生体物質結合性物質と消光性蛍光物質についても同様である。【００２５】
上記方法によって、基板表面に固定された複数の生体物質についての、生体物質結合性物質との結合性の評価結果である蛍光に関するデータが得られる。これらのデータは、例えば、コンピューターに保存することができる。さらに、コンピューターに保存したデータから、所望の結合性を有する生体物質を選択することもできる。【００２６】
また、このようにして選択された所望の結合性を有する生体物質は、基板表面から取り出して、次の操作に用いることができる。次の操作は、生体物質の種類に応じて異なるが、例えば、生体物質がBリンパ球であり、生体物質結合性物質が抗原の場合、次の操作は、Bリンパ球からの抗体遺伝子のクローニングであることができる。あるいは生体物質がBリンパ球であり、生体物質結合性物質が抗原の場合、次の操作は、抗原特異的Bリンパ球を増殖させ、ハイブリドーマを作成することであることができる。生体物質がTリンパ球であり、生体物質結合性物質がMHC／ペプチド複合体四量体の場合、次の操作は、Tリンパ球からのT細胞受容体遺伝子のクローニングであることができる。あるいは抗原特異的Tリンパ球を増殖させ、細胞株を樹立することであることができる。生体物質が組織であり、生体物質結合性物質が自己抗体の場合、次の操作は、自己抗体が結合した組織中の細胞からの自己抗原遺伝子のクローニングであることができる。生体物質ががん組織であり、生体物質結合性物質ががん抗原特異的抗体の場合、次の操作は、がん組織からのがん細胞の分離・解析であることができる。【００２７】
また、本発明の方法は、生体物質が細胞であり、生体物質結合性物質が細胞表面マーカーに対する抗体の場合、細胞と細胞表面マーカーに対する抗体との結合性の評価に用いることができる。本発明の方法を利用することで細胞の種類の特定、細胞のサブセットの特定、細胞の活性化、不活性化状態の解析、細胞のがん化など細胞の悪性度の解析などが可能になる。【００２８】
さらに本発明は、上記本発明の方法を用いて、生体物質に特異的結合性を有する物質をスクリーニングする方法を提供できる。具体的には、生体物質が細胞増殖因子受容体を発現している細胞で、その細胞増殖因子受容体に結合する物質をスクリーニングする場合、蛍光標識した様々な物質(候補物質)を次々に細胞と接触させることにより細胞増殖因子受容体に結合する分子を同定することができる。逆に、蛍光標識した受容体のリガンドを用意し、それを細胞と接触させる際に蛍光標識していない様々な分子を作用させ、蛍光標識リガンドの細胞への結合を阻害する物質を生体物質に特異的結合性を有する物質としてスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００２９】
実施例1
蛍光消光法
図１  T細胞の多重染色【００３０】
1.  細胞調製
ヒト末梢血より比重遠心法を用いてリンパ球を調製した。【００３１】
2.  細胞アレイ
1.1  直径10μm、深さ約15μmのマイクロウェルが45,000ウェル規則正しく配置されたマイクロウェルアレイチップに2x 104/μLのヒト末梢血リンパ球懸濁液50μL添加し、２〜３分静置後３回程度ピペッティングにて攪拌した。
1.2  チップ上のバッファーをピペットを用いて除去し、そこへバッファーを50μL添加し、ピペットを用いて軽く撹拌後バッファーを除去した。これをさらに２回程度繰り返し、ウェルに入らなかった細胞を除去した。最終的にバッファーを50μL添加し、細胞をカバーガラスで覆った。その後さらに３回程度バッファーを交換した。
1.3  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、チャンネル1（ 励起波長532nm、蛍光波長585nm）およびチャンネル2（励起波長473nm、蛍光波長535nm）、でスキャンし、蛍光を測定した（図１A）。【００３２】
3.  蛍光抗体による細胞の染色および観察
3.1  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、PBSにより200倍希釈したPE標識CD3抗体（ベックマンコールター、東京）を50μL添加し、5分間遮光した状態で、室温で静置した。
3.2  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、次にPBSを50μL添加した。この操作をさらに2回繰り返した。
3.3  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定した（図１B）。【００３３】
4.  蛍光の消光
4.1  蛍光顕微鏡（BX51WI、オリンパス）下にチップを設置し、観察しながら蛍光を消光させた（1視野につき数十秒程度、全体で数分程度）。
4.2  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定し、蛍光の消光を確認した（図１C）。【００３４】
5.  細胞の2種類目の蛍光抗体による染色および観察
5.1  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、PBSにより400倍希釈したPE標識CD4抗体（IOtest、フランス）を50μL添加し、5分間遮光した状態で、室温で静置した。
5.2  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、次にPBSを50μL添加した。この操作をさらに2回繰り返した。
5.3  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定した（図１D）。【００３５】
6.  蛍光の消光
6.1  蛍光顕微鏡下にチップを設置し、観察しながら蛍光を消光させた（1視野につき数十秒程度、全体で数分程度）。
6.2  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定し、蛍光の消光を確認した。【００３６】
7.  3種類目の蛍光抗体による細胞の染色および観察
7.1  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、PBSにより250倍希釈したPE標識CD8抗体（IOtest、フランス）を50μL添加し、5分間遮光した状態で、室温で静置した。
7.2  カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、次にPBSを50μL添加した。この操作をさらに2回繰り返した。
7.3  チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定した（図１E）。【００３７】
図1の蛍光測定結果を以下にまとめて説明する。
A  染色する前の末梢血リンパ球の蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。
B  PE標識CD3抗体を用いてリンパ球を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。CD3抗体が結合していない細胞群の右横にCD3抗体が結合した細胞群が観察される。すなわち、T細胞が観察される。
C  上記細胞のPEの蛍光を消光させ、スキャナーで観察した結果。PEの蛍光が消失していることが観察される。
D  上記Cの細胞にPE標識CD4抗体を用いてリンパ球を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。CD4抗体が結合していない細胞群の上にCD4抗体が結合した細胞群が観察される。
E  上記Dの細胞のPEの蛍光を消光させ、次にPE標識CD8抗体を用いてリンパ球を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。CD8抗体が結合していない細胞群の上にCD8抗体が結合した細胞群が観察される。
F  上記DおよびEで解析した結果を同時に示したもの。細胞アレイでは細胞の位置（アドレス）が固定されているため、個々の細胞におけるDおよびEでの測定結果を個々の細胞で重ね合わせて表示した。末梢血リンパ球中のCD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の細胞群が示されている。【００３８】
蛍光の消光、PE標識目的抗体による細胞の染色、蛍光の測定は繰り返し行うことができる。抗体の希釈は適宜調整できる。タイトレーション後の決定が望ましい。フローサイトメータに較べると、スキャナーで解析した場合、ネガティブのシグナルとポジティブのシグナルの分離度が少し落ちるので、抗体の希釈率を決める場合はあらかじめそのことを考慮して決めることが好ましい。【００３９】
実施例２
蛍光消光法
図２  Bリンパ球（B細胞）の多重染色【００４０】
1.  細胞調製
Hen egg lysozyme (HEL)に結合する抗体（HyHEL10）の遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（HyHEL10-tgマウス）の脾臓をPhosphate buffered saline (PBS)中ですりつぶし、脾細胞を調製した。HyHEL10-tgマウスのほとんどのB細胞の細胞表面にはHEL特異的抗体が発現している。また、脾細胞中にはB細胞が約５０％程度含まれている。【００４１】
2.  Fluo-4の細胞への導入
脾細胞をLoading buffer(PBS, HEPES 20mM pH7.6, NaCl 137mM, KCl 2.7mM, CaCl2/2H2O 1.8mM, MgCl2 0.1mM, Glucose 1.1mM, BSA 0.2%)中で1μM Fluo-4-AM（Molecular Probes、オランダ）、1μM Pluronic F127(Molecular Probes、USA)と混和した後、30分間室温で遮光振盪。その後、Loading bufferで細胞を3回洗浄し細胞内へ負荷されなかったFluo-4-AMを除去した後、10%FCS/RPMI溶液に置換した。Fluo-4はスキャナーでチップを読み取ったときにマイクロウェル中に細胞が入っているかいないかの判断に用いる。【００４２】
3.  細胞アレイ
1.1 直径10μm、深さ約15μmのマイクロウェルが45,000ウェル規則正しく配置されたマイクロウェルアレイチップに2x 104/μLのHyHEL10-tgマウスの脾細胞懸濁液50μL添加し、２〜３分静置後３回程度ピペッティングにて攪拌した。
1.2 チップ上のバッファーをピペットを用いて除去し、そこへバッファーを50μL添加し、ピペットを用いて軽く撹拌後バッファーを除去した。これをさらに２回程度繰り返し、ウェルに入らなかった細胞を除去した。最終的にバッファーを50μL添加し、細胞をカバーガラスで覆った。その後さらに３回程度バッファーを交換した。
1.3 チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、channel1: 励起波長532nm、蛍光波長585nm、channel2:励起波長473nm、蛍光波長535nmでスキャンし、蛍光を測定した。この測定によりFluo-4で標識されたB細胞が検出される（図２A）。【００４３】
4.  蛍光標識抗原による細胞の染色および観察
4.1 カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、PBSにより2μg/mLのビオチン標識HELを50μL添加し、遮光した状態で、5分間室温で静置した。
4.2 カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、次にPBSを50μL添加した。この操作をさらに2回繰り返した。
4.3 次に、カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、PBSにより1500倍希釈したPE標識ストレプトアビジン（BD Pharmingen、USA）を50μL添加し、遮光した状態で、5分間室温で静置した。
4.4 カバーガラスをかけたまま、バッファーを除去し、次にPBSを50μL添加した。この操作をさらに2回繰り返した。
4.5 チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、channel1: 励起波長532nm、蛍光波長585nmでスキャンし、蛍光を測定した。この測定によりHEL特異的B細胞が検出される（図２B）。【００４４】
5.  蛍光の消光
5.1 蛍光顕微鏡（BX51WI、オリンパス）下にチップを設置し、観察しながら蛍光を消光させた（1視野につき数十秒程度、全体で数分程度）。
5.2 チップを蛍光スキャナー（CRBIOIIe-FITC、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）、横浜）に挿入し、channel1: 励起波長532nm、蛍光波長585nmスキャンし、蛍光を測定し、蛍光の消光を確認した。【００４５】
6.  蛍光抗体による細胞の染色および観察
同様に蛍光抗体による細胞の染色および消光を繰り返すことにより、マウスB細胞に発現するB220（図２C & D）およびCD19（図２E & F）の発現を測定した。【００４６】
図2の結果を以下にまとめて説明する。
A   HyHEL10-tgマウスの脾細胞をFluo-4で標識し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。Fluo-4陽性の細胞が陰性細胞の上に観察されている。Fluo-4陽性細胞と陰性細胞との境界は明確ではない。
B  ビオチン標識HELおよびPE標識ストレプトアビジンを用いて上記脾細胞を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。縦軸は細胞のFluo-4の蛍光を、横軸はビオチン標識HELおよびPE標識ストレプトアビジンによる細胞の蛍光を示してある。HELが結合したHELに対する抗体を細胞表面に発現したB細胞が右斜め上に観察される。
C  上記細胞のPEの蛍光を消光させ、PE標識B220抗体を用いてリンパ球を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。縦軸は細胞のFluo-4の蛍光を、横軸はPE標識B220抗体が結合した細胞の蛍光を示してある。B220抗体が結合したB細胞が右斜め上に観察される。
D  BおよびCで解析した結果を示してある。細胞アレイでは細胞の位置（アドレス）が固定されているため、個々の細胞におけるBおよびCでの測定結果を個々の細胞で重ね合わせて表示した。横軸にビオチン標識HELおよびPE標識ストレプトアビジンが結合した細胞の蛍光が、縦軸にPE標識B220抗体で染色された細胞の蛍光が示してある。B220抗体はマウスのB細胞マーカーであり、B220陽性の細胞のほとんどはHELを結合している（右斜め上の細胞群）。一部HELが結合しているが、B220陰性の細胞群が観察される。
E  上記Dの細胞のPEの蛍光を消光させ、次にPE標識CD19抗体を用いてリンパ球を染色し、蛍光をスキャナーを用いて解析した結果。縦軸は細胞のFluo-4の蛍光を、横軸はPE標識CD19抗体が結合した細胞の蛍光を示してある。CD19陽性B細胞が右斜め上に観察される。
F  BおよびEで解析した結果を示してある。細胞アレイでは細胞の位置（アドレス）が固定されているため、個々の細胞におけるBおよびEでの測定結果を個々の細胞で重ね合わせて表示した。横軸にビオチン標識HELおよびPE標識ストレプトアビジンが結合した細胞の蛍光が、縦軸にPE標識CD19抗体で染色された細胞の蛍光が示してある。CD19はマウスのB細胞マーカーであり、CD19陽性の細胞のほとんどはHELを結合している（右斜め上の細胞群）。一部HELが結合しているが、CD19陰性の細胞群が観察される。【００４７】
実施例３
蛍光消光法
図３  脾細胞の染色後の消光【００４８】
マウス脾細胞にビオチン化抗マウスCD4抗体を加え４℃１５分反応させた後バッファーで３回洗浄することで標識した。その後、各試験管に等量ずつ分注し、ストレプトアビジン標識のPE, FITC, PC5の各溶液を添加し、４℃１５分間反応させた後バッファーにて３回洗浄した。各々の蛍光色素はtitrationを行い適切な濃度を用いた。各々の蛍光で標識された脾細胞を細胞チップ（45,000ウェル)にアレイし、蛍光強度をスキャンし、１クラスター（900ウェル）につき解析を行った（０秒時点）。その後蛍光顕微鏡下で同１クラスターを15秒間隔で蛍光下観察した後に、スキャナーでのスキャン及び解析操作を繰り返した。蛍光強度で5000以下の変化のない群は蛍光標識されていない細胞、もしくは細胞がアレイされていないウェルを示す。【００４９】
図３に、各蛍光色素の消光の様子を示す。縦軸には蛍光強度、横軸には蛍光を照射開始してからの時間（秒）を示す。【００５０】
その結果、PEは他の蛍光色素に比べ蛍光強度が強く均一であり、かつ速やかで均一な消光が観察された。PC５もPEとほぼ同等の消光効果であったが、細胞の検出がやや不均一であった。FITCも緩徐ではあるが消光が確認されたが、完全な消光には60秒以上を要した。またPEの消光効果はその後２時間（7,200秒）の観察期間中蛍光の回復は認められなかった。この結果、PC５及びFITCもPEとほぼ同等に本発明の方法に使用できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、細胞等の生体物質が関与する種々の分野における、生体物質
と生体物質結合性物質との結合性の評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例1におけるヒトT細胞の多重染色結果。（T細胞多重染色/human PBMC/loadingなし/シリコンチップ(45000wel)）
【図２】実施例2におけるマウスB細胞の多重染色結果。（B細胞多重染色/HEL-Tg mouse spleen/Fluo4 loading/シリコンチップ(45000wel)）
【図３】実施例3におけるマウス脾細胞の多重染色結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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