(57)【要約】本発明は、酵母の代謝物及び遺伝子発現レベルの解析結果に基づき、醸造時の鮮度維持に重要な亜硫酸の生産を高め、且つ異臭の原因の一つである硫化水素の生産を増加させない酵母を育種する方法、および該酵母を用いた品質の高い酒類の製造方法に関する。すなわち、酵母の硫化水素及び亜硫酸生成経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量を増大させることにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種する方法、並びに該酵母を用いた酒類の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成経路の代謝流量を増大させることにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種する方法。
【請求項２】
ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、及びＭＥＴ１６から選ばれる１以上の遺伝子の発現量又は該遺伝子産物の活性を増加させることにより、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つ
ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、及びＭＥＴ１７から選ばれる１以上の遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を増加、ならびに／あるいは、ＴＨＲ１及び／又はＴＨＲ４遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を減少させることにより、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＥＴ１４遺伝子産物の活性を増加させ、且つＨＯＭ３遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で育種された、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母株。
【請求項５】
請求項４に記載の酵母株を用いることを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で製造される酒類。
【請求項７】
下記の工程を含む、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種する方法：
１）含硫アミノ酸アナログを含む鉛含有プレート上で茶褐色コロニーを形成する変異株を単離する、
２）単離された変異株のうち、亜硫酸生産量が増加している変異株を選抜する、
３）選抜された変異株をスレオニンアナログ含有培地で増殖させた後、鉛含有プレート上で白色コロニーを形成する変異株を単離する、
４）単離された変異株のうち、親株に比較して亜硫酸生産量が増加している変異株を選抜する。
【請求項８】
含硫アミノ酸アナログが、エチオニン、セレノメチオニン又はＳ−エチルシステインであり、スレオニンアナログがヒドロキシノルバリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法で育種された、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母株。
【請求項１０】
受付番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８６で特定される酵母株。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の酵母株を用いることを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で製造される酒類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の代謝物及び遺伝子発現レベルの解析結果に基づき、醸造時の鮮度維持に重要な亜硫酸の生産を高め、且つ異臭の原因の一つである硫化水素の生産を増加させない酵母を育種する方法を提供する。さらに、この酵母を用いた品質の高い酒類の製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
亜硫酸は、高い抗酸化作用を持つ化合物であり、食品や飲料、医薬品などの分野では、酸化防止剤として広く利用されている。ビール醸造においても、製品に含まれる亜硫酸濃度の上昇に依存して品質保持期間が長期化することが知られており、鮮度の維持に重要な役割を果たしている。つまり、ビールなどの製品中で亜硫酸含量を高めることができれば、香味が安定化した製品を提供することができる。
一方、硫化水素は、「腐った卵」様の臭いを有する物質であり、ビール醸造においては、製品のオフフレーバーの原因となるだけでなく、オフフレーバ−原因物質の前駆体となる場合がある。そのため、酵母の硫化水素生産能は低いほうが望ましいとされる。つまり、硫化水素の生成を抑えることができれば、ビールなどの製品中で、異臭の少ない、香味安定性に優れた製品を提供することができる。
従来法では、遺伝子組換えの技術を用いて、硫酸イオン還元経路（硫酸イオン→ＡＰＳ（ａｄｅｎｙｌｙｌｓｕｌｆａｔｅ）→ＰＡＰＳ（ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｙｌｙｌｓｕｌｆａｔｅ）→亜硫酸→硫化水素）のＭＥＴ３遺伝子やＭＥＴ１４遺伝子の高発現による亜硫酸生産量増加（例えば非特許文献１参照）、及びＭＥＴ１０遺伝子破壊（例えば非特許文献２参照）又はＭＥＴ２遺伝子破壊による亜硫酸生産量増加（例えば非特許文献３参照）の報告例がある。また、硫化水素については、特許第２００５３９８号「酵母硫化水素生成抑制遺伝子及び当該遺伝子を導入した醸造用酵母」に、ＮＨＳ５遺伝子の導入によって酵母の硫化水素生成能を低下させる方法が記載され（特許文献１）、特許第３５１４５０７号「硫化水素生成能が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法」に、ＭＥＴ２５（＝ＭＥＴ１７）遺伝子を構成的に発現させることによって酵母の硫化水素生成能を低下させる方法が記載されている（特許文献２）。さらに、特開２００５−６５５７２号「亜硫酸耐性を有する及び／又は硫化水素産生能の低下した酵母の造成方法」には、酵母にＳＳＵ１遺伝子の転写量及び／又は発現量を増大させることで、亜硫酸耐性を付与させ、硫化水素生産量を低下させる方法が記載されている（特許文献３）。しかしながら、これらの手法はいずれも１つの遺伝子の発現を増加若しくは減少させる方法であり、亜硫酸と硫化水素の生産量の微妙な調節はできていなかった。
非遺伝子工学的手法による硫化水素臭非生産酵母の育種としては、特開平８−２１４８６９号「硫化水素臭非生産酵母の育種方法」に、メチオニンアナログに対する耐性を付与させることにより硫化水素低生産酵母を選抜した報告がある（特許文献４）。醸造法に工夫をすることにより硫化水素生産を抑える方法として、麦汁組成の改変、発酵温度の制御、又は発酵時の通気の制御により硫化水素を抑える試みもなされてきたが、これらの方法では亜硫酸の低生産がおこるという問題があった。一方、亜硫酸生産を増加させる醸造法として、醸造時の麦汁の組成の改変、発酵温度の制御、又は発酵時の通気の制御により亜硫酸生産を増加させる試みもなされたが、これらの方法では、酵母の増殖の遅延による発酵不良、及び硫化水素の高生産がおきた。このように、従来法では、亜硫酸と硫化水素の生成において、一方が減少すると他方も減少するという連動の問題があった。
また、以上のように、従来法ではビール本来の味、香味が変化し、ビール製造上好ましくないことが起こってしまうために、実用化という点でも問題があった。
数多くの酵母菌株の中から、亜硫酸生産能の高い菌株や、硫化水素生産能の低い菌株を選抜することは一般的に行われてきたことである。しかしながら、菌株の選抜には、発酵試験が必要であり、それには多くの時間がかかるため、あまり効率のよい選抜法ではなかった。
近年、様々な生物種においてゲノム上の遺伝子あるいは遺伝子以外の領域のＤＮＡ断片を膜上、あるいはガラス上に固定化したＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップなどを用いて、網羅的な遺伝子解析が可能になってきた。例えばビール酵母については、ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いた醸造発酵中の遺伝子発現解析が報告されている（非特許文献４）。
また、細胞内の代謝産物について、キャピラリー電気泳動−質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）により網羅的且つ直接に定量することができるようなメタボローム解析を行うことが可能になってきた。キャピラリーに試料を注入し、その両端に高電圧を印加すると、全ての陽イオン性物質は陰極方向に、また陰イオン性物質は陽極方向に移動するが、この手法は、その移動速度の違いによって各物質を分離し、その後、キャピラリーの末端に接続した質量分析計により各物質をその固有の質量数で選択的に検出するものである。この方法により、例えば、枯草菌における炭素源の変化による細胞内代謝物質の変動（非特許文献５）、イネの葉における代謝産物の一昼夜にわたる濃度変動（非特許文献６）が調査されている。
突然変異による育種方法については、ＵＶ（紫外線）照射、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＭＮＮＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ‘−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）などの人工的な変異処理法が知られており、例えばＥＭＳ処理については栄養要求性変異株が取られている（非特許文献７）。しかしながら、これらの変異原誘発による方法を用いて目的の形質の変異株を得ることができても、目的の遺伝子以外の部位にもランダムに変異が入り、目的の形質以外の形質も変化してしまい、その結果、例えば醸造に必要な発酵特性を失う可能性がある。一方で、微生物集団の中には非常に低頻度で自然発生的に突然変異が起こるが、それらの変異株を的確に選択分離することができれば人工的な変異処理をしなくてもよい。
【特許文献１】特許第２００５３９８号公報
【特許文献２】特許第３５１４５０７号公報
【特許文献３】特開２００５−６５５７２号公報
【特許文献４】特開平８−２１４８６９号公報
【非特許文献１】Ｃ．Ｋｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ，，Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｂｒｅｗ．Ｃｏｎｖ，Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，，Ｌｉｓｂｏｎ，ｐ．２０１−２０８，１９９１
【非特許文献２】Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｖｏｌ．１４，ｐ．１５８７−１５９１，１９９６
【非特許文献３】Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｋｉｅｌｌａｎｄ−Ｂｒａｎｄｔ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｖｏｌ．５０，ｐ．７５−８７，１９９６
【非特許文献４】Ｋ．Ｏｌｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｆｅｍｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２，ｐ．５３６−５７３，２００２
【非特許文献５】Ｔ．Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．２２３３−２２３９，２００２
【非特許文献６】Ｓ．Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．４０，ｐ．１５１−１６３，２００４
【非特許文献７】Ｇ．Ｌｉｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｌ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．４９１−４９９，１９６５
【発明の開示】
【０００３】
ビールや発泡酒、その他の雑酒、ワイン、焼酎、ウイスキーの醸造において、酵母はアルコール発酵を行うのみならず、様々な香気成分を生成する。酵母の菌株と麦汁成分、発酵制御法の組み合わせによって、ビールや発泡酒、その他の雑酒の香味に特徴を持たせるので、特徴的な酵母の菌株を選抜することは、適切な醸造管理を行う上で欠かせない技術である。しかしながら、目的とする香味を作るような酵母を選抜することは、膨大な菌株の発酵試験を行う必要が有り、時間も手間も非常にかかる上に、菌株ストックに所望の菌株があるとは限らない。
亜硫酸は、ビールや発泡酒、ワインの品質保持期間に影響を与える重要な物質であり、また硫化水素は、ビールや発泡酒、ワインにおいて、製品の香味上好ましくない特徴の原因となる香気成分である。また、硫化水素は他の硫黄系オフフレーバー原因物質の前駆体となる場合もあるため、その量を調節すれば、他のオフフレーバーの調節も可能となる。しかし、従来の醸造法においては一方を減少させれば他方も減少してしまうという、トレードオフの連動現象がみられるため、非遺伝子工学的手法によりこれを断ち切るのは困難であった。
以上の状況をふまえ、本発明は、醸造用酵母において硫化水素生産を増加させずに亜硫酸を高生産させる育種法を提供することを目的とする。さらに、本発明はさまざまな比率の亜硫酸生産量と硫化水素生産量を有する酵母を育種し、目的に応じた多様な酵母の育種を可能にすることを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため亜硫酸、硫化水素の生産量が共に低いパン酵母、及び亜硫酸、硫化水素の生産量が共に多い実用下面発酵酵母における含硫アミノ酸の生合成経路について、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、及びキャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたメタボローム解析を行った。その結果、実用下面発酵酵母ではパン酵母に比べて硫酸イオン還元経路の中間代謝産物である亜硫酸、硫化水素生産量が高くなっていること、またアスパラギン酸からホモシステインを合成する経路の中間代謝産物であるホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリンの細胞内濃度が低くなっていることを見出した。
この知見に基づき、実用下面発酵酵母での硫化水素生産の律速は、ホモシステイン合成において硫化水素以外の基質であるＯ−アセチルホモセリンの細胞内量であるとの仮説を建てた。そして、パン酵母に２０種類のアミノ酸をそれぞれ単独で添加したときの亜硫酸と硫化水素生産量を測定したところ、システインとスレオニンを添加したときにこれらの生産量が増大することを確認した。さらに、パン酵母にスレオニンを添加したときのＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析とＣＥ−ＭＳ、ＧＣ、ＨＰＬＣを用いたメタボローム解析により、スレオニンを添加すると細胞内のＯ−アセチルホモセリン量が低下し、且つ硫酸イオン還元経路において亜硫酸より上流に位置する中間代謝物を作る酵素遺伝子の発現が増大することを確認した。かくして、硫化水素生産の律速は、ホモシステイン合成において硫化水素以外の基質であるＯ−アセチルホモセリンの細胞内量であるとの上記仮説を検証した。
一方、実用下面発酵酵母において、ＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子の破壊などによって、硫酸イオン還元経路において亜硫酸より上流に位置する中間代謝物を作る酵素を増大させると、亜硫酸生産量及び硫化水素生産量がともに増加するが、亜硫酸生産量のほうがより影響を受け、硫化水素生産量に比べて相対的に亜硫酸生産量が増加する。また、ＨＯＭ３遺伝子の過剰発現などによって、アスパラギン酸からホモシステインを合成する経路に位置する遺伝子発現を増大させると、亜硫酸生産量、及び硫化水素生産量がともに減少するが、硫化水素生産量のほうがより影響を受け、亜硫酸生産量に比べ相対的に硫化水素生産量が減少する。
すなわち、醸造用酵母において、硫酸イオン還元経路上の酵素を増大させることにより、亜硫酸生産量を増大させることができ、且つアスパラギン酸からホモシステインを合成する経路の酵素を増大させることにより、Ｏ−アセチルホモセリンの細胞内濃度を増大させ、硫化水素生産量を減少させることができる。つまり、これらを組み合わせれば、硫化水素生産量を増加させることなく亜硫酸生産量のみを増加させる代謝制御が可能となる。
ところで、最終産物によるフィードバック阻害が起こるような代謝経路については、そのフィードバック阻害を解除することにより、代謝流量を増大させることができる。そのようなフィードバック阻害の解除は、例えば、最終産物によって阻害される酵素における最終産物が酵素に結合できなくなるような変異、代謝経路上の酵素の遺伝子のプロモーター領域の変異、あるいは当該酵素の過剰発現により、実現することができる。
発明者らは、硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、その最終産物である含硫アミノ酸のアナログ（例えばメチオニンであればエチオニン）に対する耐性株を取得すれば、当該含硫アミノ酸合成に関与するフィードバック阻害が解除され、硫酸イオン還元経路の代謝酵素が増強され、中間産物である亜硫酸、硫化水素含有量が共に増加した株が取得できると考えた。そして、まずエチオニン耐性株を取得し、エチオニン耐性株の中から硝酸鉛含有寒天培地で茶褐色を呈する硫化水素高生産株を取得した。次いで、得られた硫化水素高生産株の亜硫酸量を測定し、亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産となるエチオニン耐性株を取得した。
次いで、そのような亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産株について、スレオニンのアナログであるヒドロキシノルバリンに対する耐性株を取得することで、アスパラギン酸からホモシステインを合成する経路を増強すれば、培養液中の硫化水素含有量が減少し、最終的には亜硫酸高生産、且つ硫化水素低生産となると考えた。そして、ヒドロキシノルバリン含有培地中で増殖する変異株を取得し、これらの中から硝酸鉛含有寒天培地でコロニーが白色を呈する硫化水素低生産株を選択した。次いで、得られた硫化水素低生産株の亜硫酸生産量を測定し、高亜硫酸生産能を保持した株を選抜した。
こうして、２段階でそれぞれ異なるアミノ酸のアナログに対する耐性株を取得することにより、硫化水素生産量を増加させず、亜硫酸生産量のみ親株よりも増加させた酵母の育種法を考え、２種類の醸造用酵母において目的の変異株を単離することに成功した。
本発明は、上記の知見と成果に基づいてなされたものであり、酵母の硫化水素及び亜硫酸生成経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインの合成経路の代謝流量を増大させることにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種する方法に関する。
第１の実施形態において、本発明の方法は、特定遺伝子の発現量やその遺伝子産物の活性を制御することにより酵母株を育種する方法を提供する。
すなわち、ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、及びＭＥＴ１６から選ばれる１以上の遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を増加させることにより、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つ
ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、及びＭＥＴ１７から選ばれる１以上の遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を増加、ならびに／あるいは、ＴＨＲ１及び／又はＴＨＲ４遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を減少させることにより、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量を増大させて目的の酵母株を取得する。例えば、ＭＥＴ１４遺伝子産物の活性を増加させ、且つＨＯＭ３遺伝子の発現量を増加させることにより、所望の酵母株を取得することができる。
なお、遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性は、遺伝子プロモーターの変異、遺伝子量の増減、遺伝子産物の阻害及び／又は安定化因子の調節、発酵条件の変動、培地条件による遺伝子産物量の増減や比活性の制御、ならびにフィードバック阻害の制御等によりコントロールすることができる。
第２の実施形態において、本発明の方法は、下記の工程を含む：
１）含硫アミノ酸アナログを含む鉛含有プレート上で茶褐色コロニーを形成する変異株を単離する、
２）単離された変異株のうち、亜硫酸生産量が増加している変異株を選抜する、
３）選抜された変異株をスレオニンアナログ含有培地で増殖させた後、鉛含有プレート上で白色コロニーを形成する変異株を単離する、
４）単離された変異株のうち、親株に比較して亜硫酸生産量が増加している変異株を選抜する。
上記工程１）で用いられる含硫アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、セレノメチオニン又はＳ−エチルシステインが挙げられ、スレオニンアナログとしてはヒドロキシノルバリンが挙げられる。
本発明はまた、本発明の方法によって育種された、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母株を提供する。本発明の酵母株の亜硫酸生産量は、親株に比較して風味を損なわない程度に増加していることが望ましい。
本発明の酵母株の一例としては、受付番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８６として、２００６年１月１９日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に国際寄託されている酵母株を挙げることができる。
本発明はまた、本発明の方法で育種された酵母株を用いた酒類の製造方法、及び該方法によって製造される酒類を提供する。上記方法で製造される酒類は、親株を用いて製造される酒類に比較して、硫化水素含量が増加することなく、亜硫酸含有量のみが増加する。よって、鮮度維持に優れ、品質の高い酒類となる。
本発明の方法によれば、硫化水素生産量を増加させることなく、亜硫酸生産量の高い酵母を育種することができる。さらに、本発明では２段階で酵母を育種することにより、さまざまな比率の亜硫酸生産量と硫化水素生産量を有する酵母を育種でき、目的に応じた多様な酵母の育種が可能となる。また、本発明の酵母を用いることで、醸造時の鮮度維持を高め、且つ異臭の原因を抑えることが可能となり、品質の高い酒類の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、パン酵母細胞内の含硫アミノ酸代謝経路と各酵素をコードする遺伝子を示した図である。大枠の四角は酵母の細胞を表す。
図２は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内アスパラギン酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図３は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内ホモセリンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図４は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内Ｏ−アセチルホモセリンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図５は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の培地中の総亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図６は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図７は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内ホモシステインの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図８は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内メチオニンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図９は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内スレオニンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図１０は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内Ｓ−アデノシルホモシステインの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図１１は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１の細胞内Ｓ−アデノシルメチオニンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図１２は、パン酵母Ｓ２８８Ｃと実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１のメチオニン合成に関与する遺伝子の発現量の経時的な変化を示すグラフである。パン酵母については、０時間目のＳ２８８Ｃの遺伝子発現量をコントロールにして、６、２４、４８時間後のＳ２８８Ｃの各遺伝子の発現量を相対的な比率で示した。下面発酵酵母については、０時間目のＫＢＹ０１１の遺伝子発現量をコントロールにして、６、２４、４８時間後のＫＢＹ０１１の各遺伝子の発現量を相対的な比率で示した。
図１３は、パン酵母Ｓ２８８Ｃにおけるスレオニンの添加時、及び非添加時の細胞内ホモセリンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図１４は、パン酵母Ｓ２８８Ｃにおけるスレオニンの添加時、及び非添加時の細胞内Ｏ−アセチルホモセリンの経時的な濃度変化を示すグラフである。ＯＤ６００＝３０量の酵母菌体から抽出したサンプルを５０μＬの水に懸濁し、ＣＥ−ＭＳによる分析を行い、濃度を測定した。
図１５は、パン酵母Ｓ２８８Ｃにおけるスレオニンの添加時、及び非添加時の経時的な培地中の遊離亜硫酸の濃度変化を示すグラフである。
図１６は、パン酵母Ｓ２８８Ｃにおけるスレオニンの添加時、及び非添加時の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図１７は、パン酵母ＤＢＹ７２８６とそのｙｎｌ３１１ｃ破壊株におけるＳｃＭｅｔ１４、及びＬｇＭｅｔ１４タンパク質の安定性を示した図である。
図１８は、パン酵母ＳＹＴ００１株とｙｎｌ３１１ｃ破壊株の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図１９は、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１、及びその減数体であるＢ４３の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２０は、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１、及びその減数体であるＢ４３の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２１は、Ｂ４３においてＬｇ型Ｓｃ型各一つずつの該遺伝子を破壊した株の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２２は、Ｂ４３においてＬｇ型Ｓｃ型各一つずつの該遺伝子を破壊した株の培地中の硫化水素の経日的な濃度変化を示すグラフである。
図２３は、Ｂ４３においてＬｇ型Ｓｃ型各一つずつの該遺伝子を破壊した株の鉛含有培地での硫化水素生産量を測定した図である。寒天培地は２０℃で４日間培養した。
図２４は、Ｂ４３においてＬｇ型の該遺伝子を過剰発現した株の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２５は、Ｂ４３においてＬｇ型の該遺伝子を過剰発現した株の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２６は、Ｂ４３においてＬｇ型の該遺伝子を過剰発現した株の鉛含有培地での硫化水素生産量を測定した図である。寒天培地は２０℃で４日間培養した。
図２７は、醸造用酵母ＶＴＴ−Ａ６９０２５、及びＶＴＴ−Ａ６９０２５より単離したエチオニン耐性の亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産株、及びＹＭＯ７３の鉛含有培地での硫化水素生産量を測定した図である。寒天培地は２０℃で４日間培養した。
図２８は、醸造用酵母ＶＴＴ−Ａ６９０２５、及びＹＭＯ７３の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図２９は、醸造用酵母ＶＴＴ−Ａ６９０２５、及びＹＭＯ７３の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図３０は、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１、及びＫＢＹ０１１より単離したエチオニン耐性の亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産株、及びＹＭＯ１０６の鉛含有培地での硫化水素生産量を測定した図である。寒天培地は２０℃で４日間培養した。
図３１は、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１、及びＹＭＯ１０６の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図３２は、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１、及びＹＭＯ１０６の培地中の硫化水素の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図３３は、Ｂ４３株でＹＮＬ３１１Ｃを破壊した株の作製法と、各遺伝子の破壊を確認するために行ったＰＣＲの結果を示す。
図３４は、Ｂ４３株、及びＹＭＯ３１１３株の培地中の遊離亜硫酸の経時的な濃度変化を示すグラフである。
図３５は、Ｂ４３株、Ｂ４３株でＹＮＬ３１１Ｃを破壊した株、及びＢ４３株でＹＮＬ３１１Ｃを破壊した株にＳｃＨＯＭ３遺伝子を過剰発現させたＹＭＯ３１１３株の鉛含有培地での硫化水素生産量を測定した図である。寒天培地は２０℃で４日間培養した。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００６−１５２７８号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の要旨は、酵母の硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインの合成経路の代謝流量を増大させることにより、硫化水素生産量を増加させることなく、亜硫酸生産量のみ親株よりも増加した酵母を育種することにある。
一般に、特定の合成経路の代謝流量を改変するためには、その代謝経路に関与する遺伝子上の突然変異株を単離する方法と、その代謝経路に関与する遺伝子の過剰発現あるいは破壊という遺伝子操作による方法がある。以下、遺伝子操作により目的とする酵母を取得する方法と、突然変異株を単離することにより目的とする酵母を育種する方法について、それぞれ詳述する。
１．遺伝子操作による酵母の育種方法
本発明の第１の実施形態では、特定遺伝子の発現を制御あるいは指標として、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量のみ増加した酵母を取得する。
上記方法は、以下の２段階からなる：
ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を増加させることにより、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量が増大した酵母株を取得し（第１段階）、
ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、及びＭＥＴ１７遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を増加、ならびに／あるいは、ＴＨＲ１、ＴＨＲ４遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性を減少させることにより、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量が増大した酵母株を取得する（第２段階）。
ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６遺伝子は、硫酸イオンから亜硫酸を生成する経路に関与する酵素をコードする遺伝子である。したがって、これらの遺伝子が高発現あるいは該遺伝子がコードする酵素の活性が増加すれば、亜硫酸及び硫化水素合成経路の代謝流量の増大が期待できる（図１参照）。
ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、及びＭＥＴ１７遺伝子は、アスパラギン酸からホモシステインを生成する経路に関与する酵素をコードし、その発現あるいは酵素活性の増加により、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量の増大が期待できる（図１参照）。一方、ＴＨＲ１及びＴＨＲ４遺伝子は、ホモセリンからスレオニンを生成する経路に関与する酵素をコードし、その発現あるいは酵素活性の減少により、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量の増大が期待できる（図１参照）。
なお、遺伝子の発現量又は当該遺伝子産物の活性は、遺伝子プロモーターの変異、遺伝子量の増減、遺伝子産物の阻害及び／又は安定化因子の調節、発酵条件の変動、培地条件による遺伝子産物量の増減や比活性の制御、ならびにフィードバック阻害の制御等によりコントロールすることができる。
発明者らは、ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、及びＭＥＴ１７遺伝子が破壊された酵母株は硫化水素高生産株となることを確認した。また、醸造用酵母において、ＭＥＴ１４の分解に関与する因子であるＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子を破壊するとＭＥＴ１４遺伝子産物が安定化され、その結果硫酸イオン還元経路上の酵素が増大し、亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産となった。次いで、このＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子を破壊した株においてＨＯＭ３遺伝子を過剰発現させたところ、アスパラギン酸からホモシステインを合成する経路の酵素が同時に増大され、硫化水素生産量が親株と変わらず、亜硫酸生産量が増加した酵母を取得できることを確認した。
かくして、遺伝子操作によって、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量が増大し、且つ、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量が増大した酵母株を育種することにより、目的とする酵母株を取得できる。
なお、上記した遺伝子−ＳＵＬ１、ＳＵＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、及びＭＥＴ１６、ならびにＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、ＭＥＴ１７、ＴＨＲ１及びＴＨＲ４遺伝子の正式名称とＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒを以下に記載する。
【表１】
2007086592.tif 000002
これらの遺伝子は、それぞれ酵母における硫酸イオンから硫化水素の合成経路、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成量を予測するマーカーとして、硫化水素低生産、且つ亜硫酸高生産である酵母のスクリーニングに利用できる。
２．突然変異株の単離による酵母の育種方法
本発明の第２の実施形態では、突然変異株を単離することにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量のみ増加した酵母を取得する。
上記育種方法は、以下の２段階４工程からなる：
（１）硫化水素高生産能を有する含硫アミノ酸アナログ耐性株の取得し、（２）このうち亜硫酸高生産株を選抜し（第１段階）、
（３）ホモシステイン合成経路が増強され、その結果硫化水素代謝量が高いスレオニンアナログ耐性株を取得し、（４）このうち亜硫酸高生産株を選抜する（第２段階）。
第１段階では、硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、その最終産物である含硫アミノ酸のアナログに対する耐性株を取得することにより、当該含硫アミノ酸合成に関与するフィードバック阻害が解除され、中間産物である亜硫酸、硫化水素含有量が共に増加した株を取得する。
含硫アミノ酸アナログ耐性を有し、且つ硫化水素高生産株は、具体的には以下の方法で取得できる。即ち、酵母を適当な液体培地で培養し、遠心分離等により酵母菌体を得、含硫アミノ酸アナログ、グルコース、無機窒素源、ビタミン類、無機塩類、硝酸鉛及び寒天を含む培地（以後、含硫アミノ酸アナログ含有鉛最少培地という）で当該酵母を培養し、得られる茶褐色のコロニーを硝酸鉛、グルコース、酵母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム及び寒天を含む培地（以後、硝酸鉛含有培地という）でシングルコロニー分離を行い、茶褐色のコロニーを分離、選抜する。この分離作業は好ましくは３回以上行うのが良い。得られた硝酸鉛含有培地で再現性良く茶褐色コロニーを形成する株を培養し、良好な増殖を示し、且つ適当な液体培地で、嫌気攪拌培養を行い、親株より硫化水素、亜硫酸が共に増加した株を高亜硫酸・高硫化水素生産含硫アミノ酸アナログ耐性株として選抜すればよい。
ここで、「含硫アミノ酸」とは、メチオニンあるいはシステイン等酵母生体内に含まれる硫黄含有アミノ酸を示す。「含硫アミノ酸アナログ」とは、特に限定的ではないがエチオニン、セレノメチオニン、Ｓ−エチルシステイン等の酵母生体内に通常は存在しない、含硫アミノ酸の構造類似体を言う。
含硫アミノ酸アナログ含有培地における含硫アミノ酸アナログの使用濃度は、酵母の含硫アミノ酸アナログに対する耐性が、目的とする酵母株により異なるので限定的ではないが、エチオニンがＤＬ−エチオニンである場合、２．５ｍｇ／ｍｌ以上、好適には５〜２０ｍｇ／ｍｌが推奨される。エチオニン含有鉛培地におけるエチオニン以外の他の培地成分はアミノ酸を含まない合成培地であれば特に限定されないが、市販の合成培地、例えばＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．１７％に硫酸アンモニウム０．５％、グルコース２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％を添加したものが好適に利用できる。含硫アミノ酸アナログ含有鉛最少培地における酵母の培養条件は、酵母が生育できる条件であれば良く、特に限定されないが、通常は２０℃、１０日間程度の好気状態が推奨される。
硫化水素生産量は、例えば、硝酸鉛を含有した寒天培地を使用することにより目視で確認することができる。即ち、被検体酵母株が硫化水素を生成すると、培地中の硝酸鉛と反応し硫化鉛がコロニーの回りに生成され、コロニーの色が茶褐色となるので、コロニーがより茶褐色のものを選抜すれば、硫化水素高生産株が得られ、コロニーが薄茶色から白色のものを選抜すれば、硫化水素低生産株が得られる（Ｇ．Ｊ．Ｃｏｓｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅ，Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．１２，ｐ９３９−９４１，１９９６）。
なお、酵母菌体を得るための培地は酵母が増殖でき、菌体を収得できれば特に限定されない。好適にはＹＰＤ１０（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース１０％）が用いられる。培養温度は酵母が増殖できれば限定されないが、通常は１８〜２５℃、好適には２０℃が推奨される。液体培地での培養方法も特に限定されず、静置培養あるいは振とう培養何れでも良い。液体培地に生育した菌体の集菌方法も特に限定されないが、通常は３０００ｒｐｍ程度の遠心分離により行われる。このとき、得られる菌体を滅菌水で１回以上洗浄することが望ましい。
第２段階では、得られた亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産株について、スレオニンアナログに対する耐性株を取得することで、アスパラギン酸からホモシステインを合成する経路が増強され（すなわち、硫化水素代謝の律速が外れ）、硫化水素低生産株を取得する。
スレオニンアナログ含有最少培地で増殖し、且つ硫化水素低生産株は、具体的には以下の方法で取得できる。即ち、酵母を適当な液体培地で培養し、遠心分離等により酵母菌体を得、スレオニンアナログ、グルコース、無機窒素源、ビタミン類、及び無機塩類を含む培地（以後、スレオニンアナログ含有最少培地という）で当該酵母を培養する。
ここで、「スレオニンアナログ」とは、特に限定するものではないがヒドロキシノルバリン等の酵母生体内に通常は存在しない、スレオニンの構造類似体を言う。
次に、取得されたスレオニンアナログ耐性酵母の中から、硫化水素生産が特に抑圧された株を、硝酸鉛含有寒天培地を使用して選抜する。前述したように、被検酵母株が硫化水素を生成すると、培地中の硝酸鉛と反応し硫化鉛がコロニーの回りに形成され、コロニーが茶褐色になるので、コロニーが白色であるものを選択することにより、目的の硫化水素低生産酵母が選抜できる。硝酸鉛含有培地としては、酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％（以後硝酸鉛含有寒天培地という）が使用できる。硝酸鉛含有寒天培地での酵母の培養条件は、酵母が良好に生育すればよく、特に限定されないが、通常は１８〜２５℃で４〜８日間培養すればよい。好適には好気状態で２０℃、５日間の培養が推奨される。
得られた白色のコロニーを形成する酵母株は、さらに硝酸鉛含有培地で３回以上培養し、良好な増殖を示すものを選択することが好ましい。そして、適当な液体培地で、嫌気攪拌培養を行い、親株と比べて硫化水素生産量が増加しておらず、且つ亜硫酸生産量が増加した株を目的の酵母株として選抜する。
かくして、含硫アミノ酸アナログを含む鉛含有プレート上で茶褐色コロニーを形成する変異株を単離し、このうち亜硫酸生産量の多い株を選抜し（第１段階）、次いで、スレオニンアナログ含有最少培地で増殖させた後、鉛含有プレート上で白色コロニーを形成する変異株を単離し、得られた硫化水素低生産株の亜硫酸生産量を測定して、高亜硫酸生産能を保持した株を選抜する（第２段階）ことにより、目的の酵母株を育種することができる。
３．酒類の醸造
本発明の方法で得られる酵母株は、従来の酵母に比べて、醸造時の鮮度維持に重要な亜硫酸の生産量が高く、且つ異臭の原因の一つである硫化水素の生産量が高くない。そのため、本発明の酵母株を用いて醸造される酒類は、風味がよく品質に優れる。即ち、本発明は、本発明の酵母株を用いた酒類の製造方法と、該方法によって製造される酒類も提供する。
本発明の酵母を用いて醸造される「酒類」としては、ビール、発泡酒、その他の雑酒、ワインを挙げることができる。ビールとは麦芽から調整した糖液にホップで苦味をつけ、酵母で発酵、熟成させた、比較的低アルコール性の、清澄な発泡性飲料である。発泡酒は、麦芽を原料の一部とした酒類で発泡性を有する雑酒を意味する。その他の雑酒は、麦芽以外の原料を用いて酵母で発酵、熟成させた酒類である。ワインはブドウの実を原料としアルコール発酵させてつくる飲料である。
酒類の製造方法は、例えばビールの場合であれば、原料である麦芽を大麦からつくる製麦工程、麦芽から麦汁をつくる仕込み工程、酵母によるアルコール発酵と熟成が進行する発酵工程、できたビールを濾過し容器詰めするパッケージング工程からなる。酒類の製法についての詳細は、発酵ハンドブック（共立出版社、栃倉辰六郎、山田秀明、別府輝彦、左右田健次監修）を参照されたい。
酒類中の硫化水素は、例えば以下の方法で定量できる。即ち、得られる醸造酒をサンプリングし、バイアル中で硫化水素を気化させ、バイアルのヘッドスペースにある硫化水素をガスクロマトグラフィーにより化学発光硫黄検出器（ＳＣＤ）を用いて定量する（Ａ．Ｋ．Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｊ．Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇｅｏｒｇｅ，Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｏｓｔｅｒ  ＃７５）。本発明における硫化水素生産量の比較は、用いた親株により異なるが、試験開始後１日目もしくは２日目の生産量で比較する。
また、酒類中の亜硫酸は、例えば以下の方法で定量できる。即ち、得られる醸造酒をサンプリングし、フィルターを通して菌をろ過した後、ホルムアルデヒドと反応させ、安定なヒドロキシメタンスルホン酸に導き、ＨＰＬＣに注入し、ポストカラムにより蛍光検出し定量する（島津製作所アプリケーションニュース、Ｎｏ．Ｌ２５８）。本発明における亜硫酸生産量の比較は、用いた親株により異なるが、２日目もしくは３日目の生産量で比較する。
ビール用麦汁を原料として含硫アミノ酸アナログ耐性株、含硫アミノ酸アナログ耐性、且つスレオニンアナログ耐性株、及びそれらの親株を用い、ビールを醸造し、ビール中の硫化水素濃度を比較した。その結果、醸造酵母であるＫＢＹ０１１で醸造したビール中には１４．７ｐｐｍの遊離亜硫酸（５０時間後）が検出されたが、上記方法で取得したエチオニン耐性、且つヒドロキシノルバリン耐性で選抜された変異株の遊離亜硫酸量は３９．２ｐｐｍ（５０時間後）であった。また、硫化水素生産量については親株と変異株の間で有意な差が見られなかった。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を示し本発明の効果をさらに具体的に説明するが、本発明はこれ等により何ら限定されるものではない。
１．仮説を建てるまでの知見
亜硫酸及び硫化水素生産能が高い下面発酵酵母とそれらの生産能が低いパン酵母について、同じ条件にて発酵試験を行い、各サンプルの遺伝子発現レベルと代謝産物レベルを解析し、発現制御を受けているところはどこか、代謝のボトルネックがどこにあるかを読み取り、亜硫酸、及び硫化水素の生成経路における律速段階を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。
寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖した実用下面発酵酵母Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ  ＫＢＹ０１１株（キリンビール株式会社所有菌株ストックより入手）あるいはパン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株（キリンビール株式会社所有菌株ストックより入手、Ｈ．Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１８２，ｐ４２４９−４２５６，２０００）のシングルコロニーを、それぞれ５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて１日間培養した。その培養液をそれぞれＹＰＤ１０（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース１０％）５００ｍｌに植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．４％、硫酸アンモニウム０．２％、グルコース１０％液体培地（以後、ＳＤ最少培地という）に植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、１０００ｍＬ容瓶にてＳＤ最少液体培地１０００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養を開始後、０、６、１２、２２、４６、７０、９４、１１８、１４２、１６６時間後の計１０ポイントでサンプリングを行い、細胞濃度（ＯＤ）、培養液密度測定による糖消費量、亜硫酸生産量、及び硫化水素生産量を測定し、同じサンプルをＣＥ−ＭＳによるメタボローム分析、ＨＰＬＣによるアミノ酸分析、及びＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に供した。結果を図２から図１１に示す。
下面発酵酵母とパン酵母で、各代謝物を比較したところ、ピークの時刻が異なる代謝物と、同じ時刻にピークを示すが、濃度が異なる代謝物の二つに分かれることがわかった。前者には、硫化水素、ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン等が含まれていた。また、後者については、下面発酵酵母におけるホモセリンやＯ−アセチルホモセリン等の濃度が、パン酵母のそれらと比較して低いことが明らかとなった。これらの結果から、下面発酵酵母における亜硫酸と硫化水素生産能の高さは、ホモシステイン生成基質であるＯ−アセチルホモセリンと硫化水素の中で、Ｏ−アセチルホモセリン濃度が低いために、硫化水素が使用されずに蓄積するためと考えられた。
また、下面発酵酵母とパン酵母について遺伝子発現レベルを比較すると、硫黄系物質代謝経路上ではＭＥＴ１６、ＭＥＴ１０、ＨＯＭ３、ＭＥＴ２の遺伝子に発現パターンに違いが観察された。結果を図１２に示す。
これらの結果から、下面発酵酵母とパン酵母における代謝物のボトルネックは、ホモセリンからＯ−アセチルホモセリンの経路にあり、遺伝子発現調節の違いは、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ１０、ＨＯＭ３、ＭＥＴ２遺伝子でみられることが確認された。かくして、下面発酵酵母とパン酵母における、代謝のボトルネックと遺伝子発現調節の相違をＣＥ−ＭＳによるメタボローム解析とＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析によって確認した。
以上の知見に基づき、下面発酵酵母とパン酵母における代謝物のボトルネックはＯ−アセチルホモセリンであり、硫化水素生成の律速はＯ−アセチルホモセリンにあるとの仮説を建てた。
また、ＭＥＴ１４の過剰発現で見られるように、亜硫酸生産量を増加させるには亜硫酸までの代謝経路の遺伝子を増加させればよいことが知られており、亜硫酸生成の調節には、硫酸イオンから亜硫酸までの代謝流量が重要であることが考えられる（Ｕ．Ｅ．Ｂ．Ｄｏｎａｌｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓｔａｈｌ，Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．１９，ｐ４７５−４８４，２００２）。
２．仮説の検証
Ｏ−アセチルホモセリンが硫化水素生産の律速であるかどうかを証明するために、パン酵母へのスレオニンの添加・非添加の発酵試験を行い、そのサンプルを遺伝子発現レベルと代謝産物レベルで解析した。具体的には以下の実験を行った。
寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖したパン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃのシングルコロニーを、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて１日間培養した。その培養液をＹＰＤ１０（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース１０％）４０００ｍｌに植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．４％、硫酸アンモニウム０．２％、グルコース１０％液体培地（以後、ＳＤ培地という）に植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、５０００ｍＬ容瓶にてＳＤ最少液体培地４５００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養を開始後、０、６、２４、４８時間後の計４ポイントでサンプリングを行い、細胞濃度（ＯＤ）、培養液密度測定による糖消費量、亜硫酸生産量、及び硫化水素生産量を測定し、同じサンプルをＣＥ−ＭＳによるメタボローム分析、ＨＰＬＣによるアミノ酸分析、及びＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に供した。結果を図１３から１６、及び表２に示す。
【表２】
2007086592.tif 000003
2007086592.tif 000004
表２はスレオニンを添加した実験で、０時間（スレオニン添加前）の酵母をコントロールとして、６、２４、４８時間後に発現量が２倍以上上昇した遺伝子数と遺伝子名、及び６回の発現量比較データの平均値と標準偏差を示す。メチオニントランスポーターをコードする遺伝子ＭＵＰ１、及びスレオニンを加水分解する酵素をコードするＣＨＡ１遺伝子は、スレオニン添加後４８時間目まで常に発現が誘導されていた。一方、メチオニン合成に関与する遺伝子群（ＭＥＴ５，ＭＥＴ１４，ＭＥＴ１７，ＭＥＴ３，ＭＥＴ３２）は、スレオニン添加後２４時間目では発現が誘導されていたが、６、４８時間目では誘導されていなかった。硫化水素生産のパターンを見ると２４時間目で最も高く、メチオニン合成系遺伝子の発現誘導と硫化水素生成量が一致しており、両者で相関が見られた。また、Ｏ−アセチルホモセリン量は６時間目で最も高く、硫化水素生産よりも若干早い時間にピークが現れていた。この結果は下面発酵酵母とパン酵母の比較の実験結果と一致していた。以上の結果から、スレオニンを添加すると細胞内のＯ−アセチルホモセリン量が減少し、硫化水素生産量が増加したことが示され、仮説と合致した結果が得られた。
パン酵母は約６０００の遺伝子を持っており、これらの遺伝子については、網羅的な遺伝子破壊株が作製されている。そして、これらの酵母全遺伝子破壊株のセットは既にＯＰＥＮ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社より市販されている。ＢＹ４７４２を親株とした非必須遺伝子の破壊株のセットを用いて、鉛含有寒天培地で茶褐色のコロニーを形成する硫化水素高生産変異株を単離するため、約５０００株の網羅的なスクリーニングしたところｈｏｍ３、ｈｏｍ２、ｈｏｍ６、ｍｅｔ２、ｍｅｔ１７、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株が同定された。ＨＯＭ３、ＨＯＭ２、ＨＯＭ６、ＭＥＴ２、ＭＥＴ１７の各遺伝子は、Ｏ−アセチルホモセリン代謝、もしくは合成に関わる遺伝子であり、Ｏ−アセチルホモセリン合成が硫化水素生産と密接な関係にあることが示された。
ＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子はＭＥＴ１４遺伝子と相互作用をすることが酵母ツーハイブリッドシステムによる網羅的解析で報告されている（Ｐ．Ｕｅｔｚ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０３，ｐ６２３−６２７，２０００）。Ｙｎｌ３１１ｃは哺乳類のＦボックスタンパク質であるＳＫＰ２と相同性が有り、細胞内タンパク質のユビキチン化に関与していることが示唆されている。今回、Ｙｎｌ３１１ｃがＭｅｔ１４タンパク質の安定化に関係しており、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株ではＭｅｔ１４タンパク質が安定となっていることを見出した。
つまり、５’末端にｃ−Ｍｙｃエピトープを付加したＳｃＭＥＴ１４、及びＬｇＭＥＴ１４遺伝子をｐＹＥＳ２．０のガラクトース誘導性プロモーターの下流に連結したプラスミドを構築し、ウラシル要求性のパン酵母ＤＢＹ７２８６（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７７，ｐ３１０７９−３１０８８，２００２）にそれぞれ導入した。形質転換体をＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ０．６７％、ガラクトース１０％液体培地（以後、ガラクトース含有最少培地という）２０ｍｌ中で１日間３０℃で好気攪拌培養後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。再度、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ０．６７％、グルコース１０％液体培地（以後、グルコース含有最少培地という）に懸濁した。その後、１２．５時間後まで３０℃で好気攪拌培養し、サンプリングを行った。各サンプリング時間の培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプリングバッファーに懸濁し、等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ社、モノクローナル抗体）を用いたウェスタンブロッティングにより、ＳｃＭｅｔ１４、及びＬｇＭｅｔ１４タンパク質の安定性を確かめた。結果を図１７に示す。この結果から、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株はＭＥＴ１４遺伝子過剰発現と同じ効果を示すことが確認された。
そこで、野生型パン酵母ＳＹＴ００１株（ウラシル要求性ｕｒａ３変異をもつＤＢＹ７２８６を、野生型パン酵母ＵＲＡ３遺伝子断片で形質転換することによりＵＲＡ３＋となった株）とそのＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子を破壊した株（ＳＹＴ００１のＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子をＧ４１８耐性マーカー遺伝子を挿入することにより破壊した株）において、酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース１０％、硫酸アンモニウム０．０２％の培地において、嫌気攪拌培養を行い、亜硫酸生産量をＨＰＬＣを用いて測定した。結果を図１８に示す。その結果、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株では硫化水素以外に亜硫酸も高生産になっていることが確認された。つまり、パン酵母の遺伝子破壊株のスクリーニングで単離されたｙｎｌ３１１ｃ破壊株の解析結果は、「硫化水素生成の律速段階はＯ−アセチルホモセリンである」という仮説に反することなく、「亜硫酸生成の調節には、硫酸イオンから亜硫酸までの代謝流量が重要である」という事実を支持するものであった。
３．変異株育種法までの知見
下面発酵酵母は、Ｓｃ型、Ｌｇ型遺伝子をそれぞれ約２セット持った４倍体に近い異質倍数性を示すため、下面発酵酵母で遺伝子の完全破壊を行うには４つの遺伝子を破壊する必要があり、完全破壊株の作製は困難である。そこで、下面発酵酵母を減数分裂させて、親株と性質が類似した減数体を選抜することで、以降の遺伝子破壊株を作製するための元株を取得した。そして、ＫＢＹ０１１からＫＢＹ０１１と似た亜硫酸・硫化水素生産量を示す減数体としてＢ４３を選抜した。結果を図１９、２０に示す。
次に、Ｂ４３を用いて、ｈｏｍ３、ｔｈｒ１、ｍｅｔ１７、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株を作製した。破壊株の作製に当たり、それぞれＨＯＭ３、ＴＨＲ１、ＭＥＴ１７、ＹＭＬ３１１Ｃ遺伝子のＬｇ型遺伝子であるＬｇＨＯＭ３、ＬｇＴＨＲ１、ＬｇＭＥＴ１７、ＬｇＹＭＬ３１１Ｃ遺伝子の全長のクローニングを行った。これらの遺伝子のクローニングは、クローンの両末端の塩基配列が決定されたＫＢＹ０１１由来のゲノムＤＮＡが挿入されたコスミドの中から、Ｓｃ型の各遺伝子の配列を元にした相同性検索を行い、各遺伝子の全長が入ったコスミドクローンを同定した。次いで、そのコスミドクローン中の該塩基配列を決定し、その配列情報を元にプライマーを設計し、ＰＣＲにより各遺伝子の全長を単離した。これら各遺伝子のコード領域の塩基配列を各々配列番号１〜４に示す。破壊株の作製において、Ｓｃ型遺伝子の破壊はＧ４１８耐性マーカーを該遺伝子のコード領域に挿入することにより行い、また、Ｌｇ型遺伝子の破壊はブラストサイジンＳ耐性マーカーを該遺伝子のコード領域に挿入することにより行った。これらの株の亜硫酸、硫化水素生産量をＹＰＤ１０培地を用いた嫌気攪拌培養により測定した。また、硫化水素生産量については鉛含有培地においてもその生産量を測定した。その結果を図２１から２３に示す。ｈｏｍ３、ｍｅｔ１７、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株については、親株Ｂ４３と比べて亜硫酸、硫化水素生産量ともに増加した。但し、ｙｎｌ３１１ｃ破壊株の硫化水素生産量は他の２つの破壊株と比べると微増にとどまった。
Ｂ４３を用いてＬｇＨＯＭ３、ＬｇＴＨＲ１、ＬｇＭＥＴ１７遺伝子の過剰発現株を作製した。過剰発現用のプラスミドの作製に当たり、ｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のガラクトース誘導性プロモーターをパン酵母由来のＰＧＫプロモーターにＧ４１８耐性を賦与するマーカー遺伝子を連結したものに置き換え、さらにｐＹＥＳ２．０のＮｈｅＩ切断部位に酵母由来のＧＡＰプロモーター、ＰＧＫターミネーターの発現カセットを挿入し、目的の遺伝子を酵母で過剰発現させるためのプラスミド（ｐＹＥＳ２−ＰＧＫ−Ｇ４１８）を作製した。このｐＹＥＳ２−ＰＧＫ−Ｇ４１８の発現カセット部位に、ＬｇＨＯＭ３、ＬｇＴＨＲ１、ＬｇＭＥＴ１７遺伝子の全長をそれぞれ挿入することにより、各遺伝子の過剰発現用のプラスミドを作製した。
このプラスミドを用いて作製したＬｇＨＯＭ３、ＬｇＴＨＲ１、ＬｇＭＥＴ１７遺伝子の各過剰発現株の亜硫酸、硫化水素生産量を３００μｇ／ｍｌＧ４１８含有ＹＰＤ１０培地を用いた嫌気攪拌培養により測定した。また、硫化水素生産量については４００μｇ／ｍｌＧ４１８鉛含有培地においてもその生産量を測定した。その結果を図２４から図２６に示す。ＬｇＨＯＭ３とＬｇＭＥＴ１７遺伝子の過剰発現株では硫化水素生産量が激減し、亜硫酸生産量も低下した。ＬｇＴＨＲ１遺伝子の過剰発現株では硫化水素生産量が増加し、亜硫酸生産量も若干増加した。
以上の遺伝子破壊株と過剰発現株の結果から、硫黄系物質代謝制御に関して、アスバラギン酸からホモシステインへの生合成系の遺伝子の過剰発現では硫化水素生産量に与える影響が大きく、硫酸イオンから硫化水素への還元に関与する遺伝子の過剰発現は亜硫酸生産量に与える影響が大きいことがわかった。
以上の知見に基づき、酵母の硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成経路の代謝流量を増大させることにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種することができると考え、仮説の実証を含めて、以下の実施例１〜３に示す試験を行った。
実施例１
実用下面発酵酵母ＶＴＴ−Ａ６９０２５株（キリンビール株式会社酵母ストックより入手）より、以下の方法によりＤＬ−エチオニン耐性株を取得した。即ち、寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖したＶＴＴ−Ａ６９０２５のシングルコロニーを、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて３日間培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、これに滅菌水１０ｍＬを添加後良く攪拌し、再度遠心分離し菌体画分を得る操作を繰り返し、菌体を洗浄した。
得られた洗浄菌体ペレットを５ｍＬの滅菌水に懸濁し、その１５０μＬをＤＬ−エチオニン１０ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％、グルコース２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％を添加した寒天培地へ塗布した。小型シャーレ１枚の寒天培地に２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの酵母を塗布したところ、２０℃、１０日間の培養にて平均２００個のエチオニン耐性のコロニーが得られた。合計で約５．８ｘ１０１０ｃｅｌｌｓの酵母を塗布し、６５４個のエチオニン耐性、且つ茶褐色のコロニーが得られた。得られたコロニーを酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％の硝酸鉛含有寒天培地、及びＤＬ−エチオニン１０ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％、グルコース２％、及び寒天２％を添加したエチオニン含有寒天培地へそれぞれ塗布し、ＤＬ−エチオニン耐性株であり、且つ硫化水素高生産株として１６２株を得た。シングルコロニー分離した後、これを硝酸鉛含有寒天培地、及びエチオニン含有寒天培地にそれぞれ塗布し、ＤＬ−エチオニン耐性株であり、且つ硫化水素高生産株である４３株を選抜した。これらの株は再現性良くＤＬ−エチオニン含有寒天培地で生育し、硝酸鉛含有寒天培地で硫化水素高生産性を示す茶褐色コロニーを形成した。
得られたＤＬ−エチオニン耐性、且つ硫化水素高生産株４３株の中から１０株について、ＹＰＤ１０液体培地を用いて、硫化水素生産量、及び亜硫酸生産量を測定し、親株の亜硫酸生産量と比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、再度ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、２５０ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地２００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養３日後の培地中の亜硫酸生産量をＨＰＬＣを用いて測定した。調査した菌株の中で、特に亜硫酸生産量が多かった株を３株（ＹＭＯ１２、ＹＭＯ２２２、及びＹＭＯ４３３株）を選び、再度同様の嫌気攪拌培養を行った。その際、亜硫酸生産量以外に、発酵の経過を調査するために細胞濃度（ＯＤ）と培養液密度測定による糖消費量を測定した。また、硫化水素生産量をＧＣを用いて測定した。
以上の結果、ＹＭＯ１２、ＹＭＯ２２２、及びＹＭＯ４３３株がエチオニン耐性を示すと共に、亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産能を持つことが確認された。
次に、ＹＭＯ２２２株より、以下の方法にしたがって、硫化水素低生産となるようなＤＬ−ヒドロキシノルバリン耐性株を取得した。
寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖したＹＭＯ２２２のシングルコロニーを、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて３日間培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、これに滅菌水１０ｍＬを添加後良く攪拌し、再度遠心分離し菌体画分を得る操作を繰り返し、菌体を洗浄した。
得られた洗浄菌体ペレットを５ｍＬの滅菌水に懸濁し、その１００μＬを５ｍＬのＤＬ−ヒドロキシノルバリン１００ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％、及びグルコース２％を添加した培地へ加え、２５℃で５日間好気培養を行い、培養液を１００００倍に希釈後、その１００μＬを酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％の硝酸鉛含有寒天培地に塗布した。小型シャーレ１枚の寒天培地に１．５ｘ１０３ｃｅｌｌｓの酵母を塗布したところ、２０℃、７日間の培養にて平均１〜２個の薄茶色のコロニーが得られた。合計で約１．４ｘ１０５ｃｅｌｌｓの酵母を塗布し、１７２個の薄茶色のコロニーが得られた。得られたコロニーを再度、硝酸鉛含有寒天培地へ塗布し、取得株が薄茶色コロニーを形成することを確認した。シングルコロニー分離した後に硝酸鉛含有寒天培地に塗布し、硫化水素低生産株として４１株を選抜した。これらの株は再現性良く硝酸鉛含有培地で硫化水素低生産性を示す薄茶色コロニーを形成した。
得られたＤＬ−エチオニン耐性、ＤＬ−ヒドロキシノルバリン耐性、且つ硫化水素低生産株の中から１３株を選び、ＹＰＤ１０液体培地を用いて、亜硫酸生産量を測定し、親株による亜硫酸生産量と比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、再度ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で４日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、２５０ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地２００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養３日後の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。
調査した菌株の中で、特に亜硫酸生産量が多かったＹＭＯ７３株について、親株のＶＴＴ−Ａ６９０２５株と共に、ＹＰＤ１０液体培地を用いて再度同様の嫌気攪拌培養を行い、亜硫酸生産量と硫化水素生産量を比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％で、ＹＰＤ１０液体培地５００ｍＬに植菌し、２０℃で４日間嫌気攪拌培養し酒母とした。引き続き再度酒母量を０．５％として、５００ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地５００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。また、その際、亜硫酸生産量以外に、発酵の経過を調査するために細胞数の変化の比較と、細胞培養液の密度の変化を測定し糖切れの比較をした。培養３日間の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。また、硫化水素生産量をＧＣを用いて測定した。以上の実験は３回行い、その中の１例の結果を図２７から図２９に示す。
以上の結果、エチオニン耐性を示すと共に、ヒドロキシノルバリン耐性となる変異株であるＹＭＯ７３株は硫化水素生産能が低下しているとともに、亜硫酸生産能が増加していることが示された。このＹＭＯ７３株は、受付番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８６として、２００６年１月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託されている。
実施例２
実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１株より、以下の方法によりＤＬ−エチオニン耐性株を取得した。即ち、寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖したＫＢＹ０１１のシングルコロニーを、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて３日間培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、これに滅菌水１０ｍＬを添加後良く攪拌し、再度遠心分離し菌体画分を得る操作を繰り返し、菌体を洗浄した。
得られた洗浄菌体ペレットを５ｍＬの滅菌水に懸濁し、その２００μＬをＤＬ−エチオニン１０ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）、硫酸アンモニウム０．５％、グルコース２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％を添加した寒天培地へ塗布した。小型シャーレ１枚の寒天培地に２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの酵母を塗布し、２０℃、１４日間の培養にて平均２００個のエチオニン耐性のコロニーが得られた。合計で約１．４ｘ１０８ｃｅｌｌｓの酵母を塗布し、１４個のエチオニン耐性、且つ茶褐色のコロニーが得られた。得られたコロニーを酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％の硝酸鉛含有寒天培地、及びＤＬ−エチオニン１０ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）、０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％、グルコース２％、及び寒天２％を添加した寒天培地にそれぞれ塗布し、取得株がＤＬ−エチオニン耐性株であり、且つ硫化水素高生産株であることを確認した。次に、１４株をシングルコロニー分離した後、硝酸鉛含有寒天培地、及びエチオニン含有培地にそれぞれ塗布し、硫化水素高生産、且つＤＬ−エチオニン耐性を示す１３株を選抜した。これらの１３株は再現性良くＤＬ−エチオニン含有培地で生育し、硝酸鉛含有培地で硫化水素高生産性を示す茶褐色コロニーを形成した。
得られたＤＬ−エチオニン耐性、且つ硫化水素高生産株１３株中の３株について、ＹＰＤ１０液体培地を用いて、亜硫酸生産量、及び硫化水素生産量を測定し、親株による亜硫酸生産量と比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、再度ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、２５０ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地２００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養３日後の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。また、硫化水素生産量をＧＣを用いて測定した。以上の結果、上記３株はエチオニン耐性を示すと共に、亜硫酸高生産、且つ硫化水素高生産能を持つことが示された。
次に、上記３株のうちＹＭＯ２株より、硫化水素低生産となるような株を取得するために、以下の方法によりＤＬ−ヒドロキシノルバリン耐性株を取得した。即ち、寒天２％を添加したＹＰＤ寒天培地に増殖したＹＭＯ２株のシングルコロニーを、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２０℃にて３日間培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、これに滅菌水１０ｍＬを添加後良く攪拌し、再度遠心分離し菌体画分を得る操作を繰り返し、菌体を洗浄した。
得られた洗浄菌体ペレットを５ｍＬの滅菌水に懸濁し、その１００μＬを２０ｍＬのＤＬ−ヒドロキシノルバリン１０ｍｇ／ｍＬ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ）０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％、及びグルコース２％を添加した培地へ加え、２０℃で３日間好気培養を行い、培養液２００μＬを酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％の硝酸鉛含有寒天培地に塗布した。小型シャーレ１枚の寒天培地において、２０℃、７日間の培養にて、合計で１．０ｘ１０８ｃｅｌｌｓの酵母を塗布し、１０個の薄茶色のコロニーが得られた。得られたコロニーを再度、硝酸鉛含有寒天培地へ塗布し、取得株が薄茶色コロニーを形成することを確認した。
得られたＤＬ−ヒドロキシノルバリン耐性、且つ硫化水素低生産株１０株について、ＹＰＤ１０液体培地を用いて、亜硫酸生産量を測定し、親株による亜硫酸生産量と比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％で、再度ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％として、２５０ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地２００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。培養３日後の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。
調査した菌株の中で、特に亜硫酸生産量が多かったＹＭＯ１０６株について、親株と共にビール用麦汁を用いて同様の嫌気攪拌培養を行い、亜硫酸と硫化水素生産量を比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％（ｗ／ｖ）で、ビール用麦汁５００ｍＬに植菌し、２０℃で３日間嫌気攪拌培養し酒母とした。引き続き再度酒母量を０．５％（ｗ／ｖ）として、１０００ｍＬ容瓶にて麦汁９００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。その際、亜硫酸生産量以外に、発酵の経過を調査するために細胞数の変化の比較と、細胞培養液の密度の変化を測定し糖切れの比較をした。培養３日間の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。また、硫化水素生産量をＧＣを用いて測定した。得られた結果を図３０から図３２に示す。図３１、３２に示されるよう、醸造用酵母であるＫＢＹ０１１で醸造したビール中には１４．７ｐｐｍの遊離亜硫酸（５０時間後）が検出されたが、エチオニン耐性、且つヒドロキシノルバリン耐性で選抜された変異株ＹＭＯ１０６で醸造したビール中の遊離亜硫酸量は３９．２ｐｐｍ（５０時間後）であった。また、硫化水素生産量については親株と変異株との間で有意な差が見られなかった。
以上の結果、エチオニン耐性を示すと共に、ヒドロキシノルバリン耐性として単離したＹＭＯ１０６株は、硫化水素生産量が若干低下し、且つ亜硫酸高生産が増加していることが確認された。
実施例３
次いで、酵母の硫化水素及び亜硫酸代謝経路において、硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させ、且つＯ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成経路の代謝流量を増大させることにより、親株に比較して硫化水素生産量が増加することなく、亜硫酸生産量が増加している酵母を育種することを考え、遺伝子組換え体を用いた実験を行った。そして、実用下面発酵酵母ＫＢＹ０１１株より胞子形成、減数分裂をさせ、単離した減数体Ｂ４３において、以下の方法により遺伝子組み換え体を取得した。硫酸イオンから硫化水素の合成経路の代謝流量を増大させるためにＭｅｔ１４タンパク質を安定化させるＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子の破壊を、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの合成経路の代謝流量を増大させるためにＨＯＭ３遺伝子の過剰発現を順次行った。
定法に従い、電気穿孔法による形質転換で、ＬｇＹＮＬ３１１Ｃ、ＳｃＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子を順次破壊し、Ｂ４３に本来存在しているＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子の完全破壊株を作製した。この遺伝子が完全に破壊されていることはＰＣＲにより確認した。結果を図３３に示す。オーレオバシジンＡ耐性マーカーを持つプラスミドｐＡＵＲ１０１に、プロモーターとしてパン酵母のＧＰＤ由来のものを使用し、ターミネーターとしてパン酵母のＰＧＫ由来のものを使用した発現カセットにＳｃＨＯＭ３遺伝子全長を挿入することによりＳｃＨＯＭ３過剰発現用プラスミドｐＡＵＲ−ＳｃＨＯＭ３を作製した。ｐＡＵＲ−ＳｃＨＯＭ３を用いて、ＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子を完全に破壊したＢ４３株を形質転換し、ＹＭＯ３１１３株を得た。
ＹＭＯ３１１３株について、ＹＰＤ１０液体培地を用いて、亜硫酸生産量を測定し、親株による亜硫酸生産量と比較した。培養方法は以下の通りである。即ち、寒天培地より親株を含む酵母株を、ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で３日間好気攪拌培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ５分）し、菌体画分を得、滅菌水に懸濁した。酵母添加量を０．５％で、再度ＹＰＤ１０液体培地に植菌し、２０℃で４日間嫌気攪拌培養し酒母とした。酒母量を０．５％として、２５０ｍＬ容瓶にてＹＰＤ１０液体培地２００ｍＬを２０℃にて嫌気攪拌培養し、発酵した。その際、亜硫酸生産量以外に、発酵の経過を調査するために細胞数の変化の比較と、細胞培養液の密度の変化を測定し糖消費量の比較をした。そして、培養４日間の培地中の亜硫酸量をＨＰＬＣを用いて測定した。得られた結果を図３４に示す。また、硫化水素生成量については、酵母エキス０．５％、ペプトン０．３％、グルコース４％、硫酸アンモニウム０．０２％、硝酸鉛０．１％、及び寒天２％の硝酸鉛含有寒天培地で２０℃、４日間培養し、そのコロニーの色を目視することにより行った。得られた結果を図３５に示す。
以上の結果、ＹＭＯ３１１３株は、硫化水素生産量は親株と変わらず、且つ亜硫酸高生産能を持つことが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、硫化水素生産量を増加させることなく、亜硫酸生産量の高い酵母を育種することができる。これにより、醸造時の鮮度維持に必要な亜硫酸量を高め、且つ異臭の原因である硫化水素を抑えることが可能となり、品質の高い酒類等の製造が可能となる。したがって、本発明は酒類をはじめとする食品、医薬、その他の製造に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１−ＫＢＹ０１１株由来のＬｇＨＯＭ３遺伝子のコード領域
配列番号２−ＫＢＹ０１１株由来のＬｇＴＨＲ１遺伝子のコード領域
配列番号３−ＫＢＹ０１１株由来のＬｇＭＥＴ１７遺伝子のコード領域
配列番号４−ＫＢＹ０１１株由来のＬｇＹＮＬ３１１Ｃ遺伝子のコード領域
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３３】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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