【手続補正書】
【提出日】平成31年1月9日(2019.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を用いて、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析方法であって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離する工程と、
b) 該分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行する測定実行工程と、
c) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成する工程と、
d) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出工程と、
e) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する工程
とを備えることを特徴とするペプチド解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド解析方法において、
前記複数のクロマトグラムの同一保持時間に存在するピークの強度比を比較することにより、異性化しているアミノ酸が存在する部位を推定する異性化部位推定工程を
有することを特徴とする、ペプチド解析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチド解析方法において、
保持時間を第１軸、強度を第２軸とする座標軸に前記複数のクロマトグラムを表示する表示工程を
有することを特徴とする、ペプチド解析方法。
【請求項４】
ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置を含み、タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するためのペプチド解析装置であって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御部と、
b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
c) 前記複数のクロマトグラムの各々についてピークを検出するピーク検出部と、
d) 前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合であって、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する異性化判断部
とを備えることを特徴とするペプチド解析装置。
【請求項５】
タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸の異性化を解析するために、ＭＳ／ＭＳ測定が可能なクロマトグラフ質量分析装置の動作を制御するとともに該装置で得られたデータを処理する、コンピュータ上で動作するプログラムであって、
a) 解析目的であるタンパク質又はペプチドを含む試料をクロマトグラフによって時間的に分離し、その分離された試料に含まれるタンパク質又はペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のフラグメントイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を実行するように前記クロマトグラフ質量分析装置を動作させる分析制御機能部と、
b) 前記ＭＲＭ測定により得られたデータに基づき、前記複数のＭＲＭトランジションの各値におけるクロマトグラムを作成し、前記複数のクロマトグラムの各々に複数のピークが検出された場合において、前記複数のクロマトグラムに共通に、複数のピークがそれぞれ同一保持時間に存在するか否かを判定することにより、前記解析目的であるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸が異性化しているか否かを判断する異性化判断機能部
とを備えることを特徴とするペプチド解析用プログラム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明に係るペプチド解析方法の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は、本実施例に係るペプチド解析方法を実施するペプチド解析装置の概略構成図である。
図１に示すように、ペプチド解析装置は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１０と質量分析部（ＭＳ／ＭＳ部）２０とを含む液体クロマトグラフ質量分析システム（「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム」という）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ＭＳ／ＭＳ部２０において、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５にカラム１４からの溶出液が到達すると、該プローブ２５の先端において電荷が付与されながら溶出液が噴霧される。噴霧により形成された帯電液滴は付与された電荷による静電気力の作用によって分裂しながら微細化され、その過程で溶媒は気化し化合物由来のイオンが飛び出す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ＭＳ／ＭＳ部２０においてＭＳ／ＭＳ分析を行う際には、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に電源部３６からそれぞれ所定の電圧（高周波電圧と直流電圧とが重畳された電圧）が印加され、コリジョンセル３１内にはＣＩＤガス供給部３５から連続的に又は間欠的にＣＩＤガスが供給される。これにより、前段四重極マスフィルタ３０に送り込まれた各種イオンの中で、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するイオンのみが該フィルタ３０を通過し、プリカーサイオンとしてコリジョンセル３１に導入される。コリジョンセル３１内でプリカーサイオンはＣＩＤガスに衝突して開裂し、各種のプロダクトイオンが生成される。生成された各種プロダクトイオンが後段四重極マスフィルタ３３に導入されると、後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが該フィルタ３３を通過し、イオン検出器３４に到達して検出される。イオン検出器３４はパルスカウント型検出器を用いることができ、この場合、入射したイオンの数に応じた個数のパルス信号を検出信号として出力する。
イオン検出器３４の検出信号はデータ処理部４０に入力され、マススペクトルやマスクロマトグラムが作成されるとともに、後述するようなペプチド解析処理などが実行される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
あるタンパク質又はペプチドについてその一部のアミノ酸が異性化しているか否かを解析する場合、測定者はまず、標準ペプチドを用いて、上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いてＭＲＭモードでＭＳ／ＭＳ測定する際の測定条件の検討を行う（ステップＳ１）。なお、標準ペプチドとは、解析対象のタンパク質又はペプチドがＭＳ／ＭＳ部２０に導入されてイオン化される際に開裂が生じて生成される、構造が既知のペプチドであり、異性化していることが予想されるアミノ酸に関する複数種の異性体が含まれるものをいう。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
続いて、ＭＲＭトランジションの各値について作成されたクロマトグラムのピーク保持時間とピーク強度の関係を示すピークテーブルを作成し（ステップＳ５）、複数のクロマトグラムのそれぞれにおいて同じ保持時間に現れたピークを紐付ける（ステップＳ６）。そして、紐付けたピークの強度比を、標準ペプチドのピーク強度比と照合し（ステップＳ７）、両強度比の差が許容範囲を超えていれば（ステップＳ８にてＮｏ）、異性化ペプチドが存在しないと推定し（ステップＳ１３）、その結果を出力する（ステップＳ１２）。
一方、紐付けられたピークの強度比と標準ペプチドのピーク強度比の差が許容範囲内であれば（ステップＳ８においてＹｅｓ）、紐付けられたピークの保持時間を標準ペプチドについて得られたピークの保持時間と照合し（ステップＳ９）、その差が許容範囲内であれば、標準ペプチドと同じ種類の異性体（上述のＡｓｐの例では４種類の異性体）が実試料に含まれていると推定してその結果を出力する（ステップＳ１１、Ｓ１２）。また、許容範囲を超えているときは、標準ペプチドと同じではないが、実試料に異性体が含まれていると推定してその結果を出力する（ステップＳ１４、Ｓ１２）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
（２）４種類のストック溶液を混合し、この混合液を10%ＡＣＮにて希釈して各ペプチドの濃度が0.5μm/mLになるように調製し、これを試料とした。
（３）この試料を、0.2μL（カラムあたりの各異性体ペプチドの重量：0.1ng）ずつＬＣ部１０に導入してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実行する。
このときのＬＣ部１０における測定条件を表１に、ＭＳ／ＭＳ測定の測定条件を表２に示す。表１に示すように、ここでは、移動相Ａと移動相Ｂの組成を連続的に変化させながら試料に含まれるペプチドを分離するグラジエント分離を行っている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
１０…液体クロマトグラフ部
１４…カラム
２０…質量分析部
３０…前段四重極マスフィルタ
３１…コリジョンセル
３２…多重極イオンガイド
３３…後段四重極マスフィルタ
３４…イオン検出器
３５…ＣＩＤガス供給部
３６…電源部
４０…データ処理部
４１…データ収集部
４２…データ記憶部
４３…グラフ作成部
４４…定量分析部
５０…制御部
５２…入力部
５３…表示部