(57)【要約】（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、成長促進効果、耐暑性、耐乾燥性及び耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップにより、耐暑性が改良され及び／又は成長が促進された植物体を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップと
を含む、成長が促進された植物体を製造する方法。
【請求項２】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップと
を含む、耐暑性が改良された植物体を製造する方法。
【請求項３】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップと
を含む、耐暑性が改良され、かつ、成長が促進された植物体を製造する方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップと
を含む、耐乾燥性を有する植物体を製造する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、
前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップと
を含む、耐塩性を有する植物体を製造する方法。
【請求項６】
前記植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫植物を得るステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物体が単子葉植物である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
植物体が、イネ又はベントグラスである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項の方法により得られた植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐暑性が高められた又は成長が促進された植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に自然界に存在する植物は、種々の環境ストレス、例えば乾燥ストレス、高温ストレス、低温ストレス、塩ストレスなどにさらされている。特に地球環境の変化は、二酸化炭素濃度の増加とそれにともなう地球の温暖化、さらに作物などの耕作地の砂漠化などの要因となりつつある。そして、乾燥と高塩濃度化の環境ストレスが農作物の生産性を減少させる主要な環境要因となってきている。したがって、種々の環境ストレスに対する耐性を作物や園芸植物、緑化植物に付与することは、栽培の省力化、栽培可能な地域の拡大、砂漠の拡大防止や緑化にかかわる重要な課題と考えられる。【０００３】
近年、遺伝子工学的技術を用いて植物に環境ストレス遺伝子を導入することによって、塩や乾燥などに対するストレス耐性の向上を図ることができる可能性があり、このような技法によって耐乾燥性植物を作出する試みが進められている。【０００４】
例えば、コリンデヒドロゲナーゼ遺伝子及びベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の両者（特許文献１）、ＤＲＥＢ遺伝子（特許文献２及び特許文献３）、ベタイン合成酵素遺伝子（特許文献４）、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子（特許文献５）、ＹＫ１遺伝子（特許文献６）、真核藻類由来のグルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子（特許文献７）、ＳＲＫ２Ｃ遺伝子（特許文献８）、ポリアミン代謝関連遺伝子（特許文献９）などを植物に導入することにより、耐塩性、耐乾燥性、低温ストレス耐性を高めた植物を得る方法が知られている。【０００５】
発明者らは、以前、塩及び乾燥処理により顕著にタンパク質量が増加するタンパク質として、ＲＯ−２９２を同定している（特許文献１０）。このタンパク質をコードしていると考えられるＲＳＩ１は、アブシシン酸に非依存的に乾燥ストレス及び塩ストレスに応答することが確かめられた。しかし、このＲＳＩ１が耐暑性及び成長促進に関係していることは確認されていない。また、ＲＳＩ１を導入した形質転換植物に、耐乾燥性及び耐塩性が付与されることは確認されていない。
【特許文献１】特開平０８−２６６１７９号公報
【特許文献２】特開２０００−１１６２６０号公報
【特許文献３】特開２０００−１１６２５９号公報
【特許文献４】特開２００３−１４３９８８号公報
【特許文献５】特開２００４−１８０５８８号公報
【特許文献６】特開２００４−２６１１３６号公報
【特許文献７】特開２００５−０７３５０５号公報
【特許文献８】特開２００５−２５３３９５号公報
【特許文献９】特開２００５−２３７３８７号公報
【特許文献１０】特開２００３−３３４０８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記耐塩性及び耐乾性のような環境ストレス以外にも、低緯度地域など高温及び強光下でも生育できる植物が求められている。高温及び強光下でも生育できる性質、すなわち耐暑性は、耐塩性及び耐乾燥性とは直接の関連性は見いだされていない。【０００７】
近年では、特に農作物について、収量増加や生育時期の短縮を図り、食料生産の効率を上げる試みが行われている。さらに、生育時期の短縮は、園芸作物や芝生等にも求められる性質である。特に低緯度地域において、高温及び強光に耐性を持ちつつ、生育の早い植物を生成することは非常に意義がある。【０００８】
したがって、本発明は、成長の促進された植物及び耐暑性が高められた植物を生成することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、ＲＳＩ１（特許文献１０参照）遺伝子を植物に導入することによって、成長が促進され及び／又は耐暑性が高められた形質転換植物を提供することに成功した。【００１０】
すなわち、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、成長促成効果を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップとを含む、成長が促進された植物体を製造する方法を提供する。【００１１】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップとを含む、耐暑性が改良された植物体を製造する方法を提供する。【００１２】
また、さらに、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、成長促進効果及び耐暑性に関するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップとを含む、耐暑性が改良され、かつ、成長が促進された植物体を製造する方法を提供する。【００１３】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、  （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐乾燥性に関するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップとを含む、耐乾燥性を有する植物体を製造する方法を提供する。【００１４】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、  （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを、植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得るステップと、前記形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生させるステップとを含む、耐塩性を有する植物体を製造する方法を提供する。【００１５】
本発明の方法では、前記植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫植物を得るステップをさらに含んでもよい。【００１６】
本発明の方法において、植物体は、単子葉植物、特にイネ科植物を用いることができる。また、本発明は、上記の方法により得られた植物体にも関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明において、ＲＳＩ１遺伝子を植物に導入して、形質転換植物を得ることによって、耐暑性を示し、さらに成長が促進された植物を提供することができる。得られた植物は、遺伝子を導入していない植物と比べて、高温下や強光条件下でも生育可能であり、また、遺伝子を導入していない植物と比べて、草丈及び葉が大きくなり成長が促進される。この植物は、例えば、低緯度地域や、強光下における作物の栽培や、園芸植物の改良、農作物の品種改良などに応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明のストレス応答性を有する遺伝子が導入されたイネ科の形質転換体は以下の方法により作出することができる。
ストレス応答性遺伝子を包含する組換えＤＮＡの構築
本発明では、ＲＳＩ１タンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、植物細胞を植物体に再生させることによって、成長が促進された及び／又は耐暑性が改良された植物体を得ることができる。【００１９】
ＲＳＩ１タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、ＲＳＩ１遺伝子ともいう）は、具体的には、イネ由来のストレスに応答する根特異的遺伝子RSOｓPR10  [Plant Cell Physiology  ４５巻、５号、第５５０頁−５５９頁、２００４；特開２００３−３３４０８４号]に記載されたＤＮＡが挙げられる。【００２０】
本発明で用いられるＲＳＩ１遺伝子は、植物の根において塩化ナトリウム又は乾燥による処理によりその産生が誘導されるが、アブシジン酸によっては誘導されないタンパク質をコードする遺伝子として、本発明者により同定された。すなわち、ＲＳＩ１遺伝子は、植物体に対し、塩、乾燥などのストレス処理を行い、その処理によって特異的に発現するタンパク質を処理した葉もしくは根から単離し、遺伝子配列を解析することによって得られた遺伝子である。本発明は、ＲＳＩ１遺伝子が、さらに、耐暑性及び成長促進作用を付与する遺伝子であることが明らかにされたことにより完成されたものである。一般にこのような種々の環境変化（ストレス）に応答して発現するタンパク質は、ＰＲ（Pathogensis-related）タンパク質が挙げられ、環境ストレスに対する植物の生体防御タンパク質のひとつと考えられている。【００２１】
ＲＳＩ１タンパク質は、いわゆる「天然型」のタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１）のみならず、ＲＳＩ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、植物体に耐暑性及び／又は成長促成効果を付与する機能を有する変異タンパク質を含んでもよい。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、植物体に耐暑性及び／又は成長促成効果を付与する機能を有する変異タンパク質を含んでもよい。【００２２】
ＲＳＩ１タンパク質は、本発明者により配列決定されたタンパク質であり、配列番号２により表される。ＲＳＩ１タンパク質をコードする、イネ由来のＤＮＡは、配列番号１により表される。【００２３】
ＲＳＩ１タンパク質をコードするＤＮＡとして、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡを用いることができる。上記（ａ）〜（ｅ）のＤＮＡは、成長促進効果、耐暑性、耐乾燥性及び／又は耐塩性に関するタンパク質をコードするＤＮＡである。【００２４】
本発明のＲＳＩ１タンパク質をコードするＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＲＳＩ１遺伝子を有するイネ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、ＲＳＩ１遺伝子を有するイネ品種から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。【００２５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、ホモログ又はオルソログを用いることができる。変異は人為的に導入することもできる。塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界において生じ得る。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.&Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesisvia gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。このように天然型のＲＳＩ１タンパク質をコードするアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＲＳＩ１タンパク質（配列番号２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。【００２６】
配列番号２に記載のＲＳＩ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＲＳＩ１遺伝子の塩基配列（配列番号１）もしくはその一部をプローブとして、またＲＳＩ１遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＲＳＩ１遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＲＳＩ１タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。【００２７】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、 ０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指すが、特にこれらの条件に限定されるものではない。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件を用いることにより、相同性のより高いＤＮＡの単離を期待することができる。一方、ＲＳＩ１タンパク質と同等の機能を有する限り、よりストリンジェンシーの低い条件、例えば、より低い温度条件でハイブリダイゼーションを行ったり、塩濃度を高くしてハイブリダイゼーションを行っても良い。【００２８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、ＲＳＩ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５%以上）の配列の同一性を指す。【００２９】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268〈1990〉; Karlin S, AltschulSF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877〈1993〉）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403〈1990〉）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。【００３０】
植物細胞にＤＮＡを導入するためには、上記（ａ）〜（ｅ）のＤＮＡをベクターに組み込んで導入するのが好ましい。例えば、上記（ａ）〜（ｅ）のＤＮＡを恒常的にイネ細胞内で機能させるために、上流にプロモーターを連結させ、さらに、ターミネーターを下流に連結させて、ベクターＤＮＡに組み込むことができる。これらプロモーター等を最適化することは、当業者にとって容易なことである。【００３１】
本発明で利用するプロモーターは、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターのいずれのプロモーターを用いることができ、また、根や葉など組織又は器官特異的プロモーターを用いることも可能である。例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター［ザ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．）、第６巻、第３９０１頁 、１９８７年］、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター[プラント  モレキュラー  バイオロジー（Plant Mol. Biol.）第２３巻、第５６７頁、１９９３年]が挙げられ、ターミネーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターやノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターが挙げられるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであればこれらのものに限定されない。【００３２】
ストレス応答性遺伝子を包含するベクターが導入されたイネの選抜を容易にするために、ストレス応答性遺伝子と同時に選抜マーカー遺伝子を併用して導入しても良い。その際に使用する選抜マーカー遺伝子としては、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）、除草剤フォスフィノスリシンに耐性であるフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼおよびカナマイシン、ゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などから選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができるが、選抜マーカーとして機能する遺伝子であればこれらに限定されない。好ましくはハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を用いるのが良い。【００３３】
イネ科植物への遺伝子導入および形質転換植物体の作製
本発明は、任意の植物、すなわち、単子葉植物及び双子葉植物に適用することができ、好ましくは、単子葉植物、より好ましくはイネ科植物に導入することができる。イネ科植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、シバ類（ベントグラス、ノシバ、高麗シバ）、フェスク類（トールフェスク、レッドフェスク）が挙げられる。遺伝子導入に用いられるイネ科植物としては、種子、根、茎、葉などの各種器官の組織などが挙げられ、さらにカルス、プロトプラストなどの植物細胞などが挙げられるが、好ましくはカルスである。【００３４】
次に、イネ科植物への遺伝子導入および形質転換植物体の作製を行う。公知の遺伝子導入法でストレス応答性遺伝子を包含する組換えＤＮＡを導入できる。公知の遺伝子導入法としては、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法およびパーティクルガン法（モデル植物の実験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ編、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４巻、秀潤社、８９−９８頁、島本ら著１９９６年）、ウイスカー法（特許第3312867号）またはそれに準じた方法が挙げられ、これらの方法は、当業者には公知である。本発明で用いる遺伝子導入方法としては、アグロバクテリウム法が好ましい。【００３５】
遺伝子導入を行った組織片を、次のようにして調整した選抜培地に置床する。この選抜培地は、特定の基本培地に特定の植物ホルモン、酸素源、ビタミン類を加え、特定のゲル化剤を加えて固化した固体培地である。例えばＭＳ培地の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌ、さらにアセトシリンゴンを１〜５０ｍｇ／ｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／ｌ、好ましくは２〜４ｇ／ｌを加えて調整する。【００３６】
このような本発明の選抜工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２，４―Ｄ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。【００３７】
この選抜培地には、効率的に目的の形質転換細胞を選抜するために、選抜マーカー遺伝子の種類に応じた選抜薬剤を添加する。選抜薬剤としては、例えばハイグロマイシンを１０〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは３０〜５０ｍｇ／ｌの濃度で添加する。【００３８】
さらに、遺伝子導入処理の終了したアグロバクテリウム菌の除菌薬剤として、カルベニシリンを５０〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜３００ｍｇ／ｌの濃度で添加する。これを、１０〜３０℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で、暗所で、２０〜９０日間、好ましくは３０〜６０日間培養すると、組換えＤＮＡが導入されたカルスが選抜される。【００３９】
上記で培養した選抜カルスを次のようにして調整した植物体育成培地に置床する。この植物体育成培地は、特定の基本培地に特定の植物ホルモン、酸素源、ビタミン類を加え、特定のゲル化剤を加えて固化した固体培地である。例えばＭＳ培地の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌ、カルベニシリンを５０〜１０００ｍｇ／ｌ、好ましくは３００〜５００ｍｇ／ｌ、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／ｌ、好ましくは２〜４ｇ／ｌを加えて調整する。【００４０】
このような本発明の再生工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２，４―Ｄ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。【００４１】
これを、１０〜３０℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で、明所で、３０〜１２０日間、好ましくは３０〜６０日間培養すると、カルスから形質転換植物体が再生、育成される。ここに明所条件とは、照度が５００〜１００００ルクス、好ましくは５００〜２０００ルクスであり、光照射時間は１日５〜２４時間、好ましくは１４〜１８時間である。【００４２】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら (1992) Plant Physiol. 100:1503-1507）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（単子葉植物の超迅速形質転換法（特許第3141084号））など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。【００４３】
遺伝子の植物体への導入の確認
上記の工程で得られた形質転換細胞（カルス）および形質転換植物体に目的とするストレス応答性遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法もしくはサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。【００４４】
形質転換植物の耐暑性および成育の確認
ＲＳＩ１遺伝子を導入した形質転換植物の生育促進及び高温及び／又は強光ストレスに対する耐性は、簡易的な検定方法において確認することができる。【００４５】
本明細書において、成長又は生育が促進されたとは、葉の大きさ、草丈、茎の太さ、葉重、根の長さなどが、未処理の同種の植物と比べて、大きいことをいう。又は、未処理の植物と比べて、同じ期間内で、葉の大きさ、草丈、茎の太さ、葉重、根の長さなどが、より大きく成長できることをいう。【００４６】
本明細書において、耐暑性とは、強光ストレス及び／又は高温ストレスに対する耐性をいう。強光ストレスとは、植物の生育に適する光量を超える環境下に植物がおかれた場合に受けるストレスであり、植物の組織、細胞が強光により生理機能が損なわれて傷害が起こることをいう。高温ストレスとは、植物の生育に適する気温を超える環境に植物が置かれた場合に受けるストレスであり、植物の組織、細胞が高温により生理機能が損なわれて傷害が起きることをいう。耐暑性が高まるとは、未処理の同種の植物と比べて、より強光下及び／又は高温下で生育可能であることをいう。【００４７】
また、ＲＳＩ１遺伝子を導入した形質転換イネ科植物の生育評価試験は、２０〜３０℃で栽培することにより確認することができる。【００４８】
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。このようにして作出された植物体は、野生型植物体と比較して、成長が促進され及び／又は耐暑性が向上していると考えられる。本発明の手法を用いれば、イネなどの有用農作物の生産性を向上させることができ非常に有益である。【００４９】
本発明の態様例として、以下が挙げられる。
（１）ストレス応答性遺伝子が導入された形質転換植物。
（２）ストレス応答性遺伝子がイネ由来のタンパク質をコードする遺伝子である、（１）に記載の形質転換植物。
（３）イネ科植物である（１）および（２）に記載の形質転換植物
（４）耐乾燥性が改良された植物であることを特徴とする（１）に記載の形質転換植物。
（５）耐塩性が改良された植物であることを特徴とする（１）に記載の形質転換植物。
（６）耐暑性が改良された植物であることを特徴とする（１）に記載の形質転換植物。
（７）形質転換植物が成長が促進された植物であることを特徴とする（１）に記載の形質転換植物。
【実施例】
【００５０】
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー クローニング（Molecular  Cloning）  第２版」（J．Sambrookら、Cold  Spring  Habor  Laboratory  press，１９８９年）に記載されている方法に従った。【００５１】
＜実施例１：ＲＳＩ１遺伝子による形質転換イネの作製＞
（１）イネ由来のＲＳＩ１遺伝子を含有する組換えＤＮＡの構築
イネ由来のストレス応答性遺伝子（ＲＳＩ１）を、植物体に導入する遺伝子として用い、ＲＳＩ１遺伝子を植物体において恒常的に発現させるための発現ベクターを作製した。【００５２】
オープンリーディングフレームを含むように、上記ストレス応答性遺伝子ＲＳＩ１のＤＮＡの５’側および３’側にＰＣＲ法によって制限酵素サイトＢａｍＨＩを付与した。５’末端及び３’末端にＢａｍＨＩサイトを付与したＲＳＩ１を、ｐBluescriptIISK−ベクターに挿入した。これを制限酵素ＢａｍＨＩで処理しＲＳＩ１遺伝子を切り出した後、DNA  Blunting  Kit（タカラバイオ社製）により平滑末端化し、グラスミルク法で精製した。一方、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを保有する公知のイネ発現ベクターｐIG１２１−Hm（首都大学東京より入手）を制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩで切断した後、DNA  Blunting  Kit（タカラバイオ社製）により平滑末端化した。上記のＲＳI１遺伝子をｐIG１２１−Hmベクター内の３５Ｓプロモーターの下流にDNA  Ligation  Kit法（タカラバイオ社製）によりライゲーションした。このプラスミドベクターをｐBIH1−IGと命名した。【００５３】
組換えベクターｐBIH1−IGをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１）に公知の凍結融解法（例えば、「植物細胞工学」、１９９２年、第４巻、第3号、１９３頁〜２０３頁）により移行させたアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌EHA101/ｐBIH1−IG を作製した。
組換えベクターｐBIH1−IGは、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Sプロモーターとノパリンシンターゼ由来のNOSターミネーターの間に連結したストレス応答性遺伝子（RSI1）前記した３５Sプロモーターとアグロバクテリウム菌由来のターミネーターの間に連結したハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）およびアグロバクテリウム菌由来のノパリンシンターゼプロモーター（Pｎｏｓ）と前記のミネーターの間に連結したネオマイシンフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴ）を有する。【００５４】
（２）イネの組織への遺伝子の導入
イネ（品種：日本晴）の完熟種子を有効塩素濃度が１％の次亜塩素酸ナトリウム液で６０分間浸漬し滅菌後、１試験区あたり１００個の種子を、Ｎ６培地にショ糖３％、植物ホルモンとして２，４−Ｄを２  ｍｇ／ｌを加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３％を加えた固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり組織片２０個を置床している。これを２８℃で暗所にて３０日間培養し、カルスを誘導した。【００５５】
上記で得られた組換えベクターｐBIH1−IGを包含するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（EHA101/ｐBIH1−IG）をLB培地で２８℃で一晩培養した培養液に、上記に記載のイネのカルス１００個を２分間浸漬処理した。浸漬処理後、Ｎ６培地にショ糖３％、植物ホルモンとして２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴンを１０ｍｇ／ｌそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３％を加えた固体培地に置床した。２５℃の温度条件下で暗所にて３日間共存培養を行った。【００５６】
共存培養後のカルス１００個を、５０ｍｌ容の無菌の遠心管（内径２７ｍｍ、長さ１１５ｍｍ）に移しいれ、洗浄液（１／２無機塩濃度のＭＳ液体培地にカルベニシリン３００ｍｇ／ｌを加えたもの）３０ｍｌを加えて洗浄した。さらにこの操作を２回繰り返した後、無菌のろ紙を用いて余分な水分を取り除いた。洗浄された組織片は、Ｎ６培地にショ糖３％、植物ホルモンとして２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌ、カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３％を加えた固体選抜培地に置床した。２８℃の温度条件下で暗所にて１ヶ月毎に新しい選抜培地に移植した。【００５７】
（３）形質転換イネの再生
選抜培地に移植後、ハイグロマイシン抵抗性の形質転換カルスを形成させた。これらのカルスは、ＭＳ培地にショ糖３％、植物ホルモンとしてＮＡＡを１ｍｇ／ｌ、ＢＡを２ｍｇ／ｌ、カルベニシリンを３００ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３％を加えた固体再生培地に置床した。２８℃の温度条件下で明所（１０００ルックス、１６時間照明）培養した。その結果、ストレス応答性遺伝子ＲＳＩ１により形質転換されたイネ植物体が１９個体得られた。【００５８】
これらの植物体はすべて、十分に発根させた後に順化、鉢上げを行った。これらの形質転換植物体は、インキュベーター内で、２８℃の温度条件下で明所（２００００ルックス、１６時間照明）で栽培した。その後、当該形質転換植物体（Ｔ１世代）を閉鎖型温室内で栽培することにより、種子（Ｔ２世代）を収穫した。これらの後代種子は、選抜マーカーである抗生物質ハイグロマイシンを含有する培地上での抵抗性試験（分離比検定）を行い、ホモ系統（Ｔ３世代、Ｔ４世代）を取得した【００５９】
（４）導入遺伝子の解析
上記（３）で得られた形質転換植物の葉を遺伝子解析用の材料とした。イネの葉片１０ｍｇから公知のＣＴＡＢ法に従って全ＤＮＡを抽出した。これらはＰＣＲ法により導入遺伝子の確認を行った。用いたプライマーは、化学合成により作製した
（a）プライマーＮｏ.１（配列番号３に示す）
5’- GTGTGATCAGTAGGAAGTTG  -3’
（b）プライマーＮｏ.２（配列番号４に示す）
5’- ACCTCAAACACAAATCACTC  -3’
を組み合わせて用いた。【００６０】
上記において抽出した各形質転換イネの系統のＤＮＡ溶液の１μｌを鋳型とした。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（宝酒造（株）製、LA  PCR  Kit Ver.２.１）により調製した。【００６１】
ＰＣＲ法によるＤＮＡの上記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ASTEK社製、Program Temp ContolSystem PC‐700）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（Extention）を７２℃、３０秒分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。【００６２】
ＰＣＲ後、反応液の一部を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、バンドの有無および大きさを比較した。その結果、すべての植物体においてＲＳＩ１遺伝子の形質転換が確認された。【００６３】
（５）形質転換イネの環境ストレス耐性の検定
上記（３）で得られた形質転換イネのホモ固定系統（Ｔ４世代）と通常品種（日本晴）の種子を次の検定試験に用いた。
Ａ）耐塩性の検定
形質転換イネのホモ系統（系統番号：Ｓ３）および非形質転換イネ日本晴品種の種子各系統１０粒を、水道水中で発芽させた後、所定濃度の塩化ナトリウム（５０ｍＭ）を含む１／１０００濃度のハイポネックスを加え、１４日間、２７℃、１２時間明期、１２時間暗期の条件下でインキュベーター内で生育させた。そして１４日後にそれぞれの幼苗の草丈、根長を測定した。その結果を表１に示す。【００６４】
【表１】
2007086282.tif 000002
【００６５】
表１から、非形質転換イネは、５０ｍＭのＮａＣｌ溶液では草丈、根の伸長とも著しく抑制されたのに比べて、形質転換イネのＳ３系統は草丈および根長とも明らかに優っていて、塩に対する耐性が向上されていることがわかった。【００６６】
Ｂ）耐乾燥性の検定
形質転換イネのホモ系統（系統番号：Ｓ３）および非形質転換イネ日本晴品種の種子各系統４粒を、水道水の入った試験管内に１粒ずつ播種し、インキュベーター内の２８℃の温度条件下で明所（２００００ルックス、１２時間照明）で１４日間栽培した。その後、それぞれの幼苗体をクリーンベンチ内に５時間置いて、風乾処理を行い、その後再び生育培地に戻して上記と同様の条件で栽培を行った。そして７日後にそれぞれの幼苗体の生育株数および枯死株数を調査した。その結果を表２に示す。【００６７】
【表２】
2007086282.tif 000003
【００６８】
表２から、非形質転換イネは風乾処理によってほとんどが枯死したのに比べて、形質転換イネのＳ３系統は正常に成育し、乾燥に対する耐性が向上されていることがわかった。【００６９】
（６）形質転換イネの成長試験
形質転換イネのホモ系統（系統番号：Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ１９）および日本晴品種の種子５粒を、粒状培土（くみあい粒状培土）を充填したワグネルポット内で栽培し、閉鎖型温室内の条件下で栽培した。栽培開始後、止め葉が展開した時点で栽培を終了し、草丈を測定した。また第１２葉目を切り取り、葉重量の測定を行った。その結果を表３に示す。【００７０】
【表３】
2007086282.tif 000004
【００７１】
非形質転換イネに比べて、形質転換イネのＳ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ１９系統の草丈および葉重は明らかに大きく、生育が促進されていることがわかった。【００７２】
＜実施例２：ＲＳＩ１遺伝子による形質転換ベントグラスの作製＞
（７）イネ由来のストレス応答性遺伝子を含有するベントグラス遺伝子導入用組換えＤＮＡの構築
ＲＳＩ１遺伝子をベントグラス植物体において恒常的に発現させるための発現ベクターを作製した。上記ストレス応答性遺伝子ＲＳＩ１は、その塩基配列よりオープンリーディングフレームを含むようにＤＮＡの５’側および３’側にＰＣＲ法によって制限酵素サイトＢａｍＨIを付与された後、ｐBluescriptIISK−ベクターに挿入された。これを制限酵素ＢａｍＨIで処理しＲＳＩ１遺伝子を切り出した後、DNA  Blunting  Kit（タカラバイオ社製）により平滑末端化し、グラスミルク法によって精製した。一方、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを保有する公知の植物細胞形質転換用ベクターｐＢＩ２２１（Clontech社製）を制限酵素ＸｂａIおよびＳａｃIで切断した後、DNA  Blunting  Kit（タカラバイオ社製）により平滑末端化した。上記のＲＳＩ１遺伝子をベクターｐＢＩ２２１内の３５Ｓプロモーターの下流にDNA  Ligation  Kit法（タカラバイオ社製）によりライゲーションした。このプラスミドベクターをｐＢＩＨ２と命名した。【００７３】
（８）ベントグラスのカルス細胞への組換えベクターの導入
上記で得られた組換えベクターｐＢＩＨ２をベントグラスのカルス細胞へ導入を行った（特許第３３１２８６７号参照）。
まず、ベントグラス（品種：ペンクロス）の完熟種子から籾殻を取り除いた。得られた種子を７０％エタノール溶液に１分間、次いで次亜塩素酸ナトリウム１％（有効塩素濃度）溶液に６０分間浸漬して種子を殺菌処理した。公知のＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g／ｌ、カサミノ酸５００ｍｇ／ｌ、植物ホルモンとしてdicamba ６．６ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン０．５ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．８として、ゲルライト３ｇ／ｌを加えた固体培地に、上記で殺菌したベントグラス種子を置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり種子２５粒を置床している。これを２８℃で暗所にて６０日間培養し、カルスを誘導した。カルスが形成された後、それらのカルスを、孔１ｍｍのステンレスメッシュの篩を用いて、１ｍｍ以下のカルスをＰＣＶ（Packed Cell Volume；圧縮細胞量）として３ｍｌの量を得た。【００７４】
チタン酸カリウム製ウイスカＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ml容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、公知のＭＳ培地にショ糖３０g／ｌを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ液体培地０．５mlを、同チューブに加えてウイスカ懸濁液を得た。【００７５】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに１ｍｍ以下のベントグラスのカルスを２５０μｌ入れて攪拌した。カルスとウイスカ懸濁液との混合液を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、カルスとウイスカを沈殿させ、上清を捨て、カルスとウイスカの混合物を得た。
この混合物を入れたチューブに、前記の組換えベクター（すなわち前記の組換えベクターｐＢＩＨ２）の１０μｌ（１０μg）と、公知のハイグロマイシン耐性遺伝子を保有する組換えベクターｐＣＨ（Breeding Science:55 465-468(2005)）の１０μｌ（１０μg）（ハイグロマイシン耐性）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。【００７６】
次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
上記のようにして得られた、カルス細胞と、ウイスカと、本発明のＤＮＡ配列を有する組換えベクターとを含むチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄し、組換えベクターｐＢＩＨ２を導入した目的の形質転換カルスを得た。【００７７】
上記で組換えベクターを導入して得た形質転換カルスを、３．５cmシャーレに入れた。さらに、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g／ｌ、カサミノ酸５００ｍｇ／ｌ、植物ホルモンとしてdicamba ６．６ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン０．５ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．８に調整した液体培地を３ｍｌ加えた。その後に、２８℃、暗所に設置したロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ）上でカルス細胞を培養した。
培養６日目に、遺伝子導入操作を行ったカルス細胞を、公知のＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g／ｌ、カサミノ酸５００ｍｇ／ｌ、植物ホルモンとしてdicamba ６．６ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン０．５ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．８として、ゲルライト３ｇ／ｌおよび選抜用薬剤としてハイグロマイシン１００ｍｇ／ｌを添加してなる培地上に均一に広げた。培地上の細胞を、２８℃、暗所にて培養した。
３０日後に、ハイグロマイシン含有培地上で健全に生育している形質転換カルスを選抜した。【００７８】
（９）形質転換ベントグラスカルス細胞からの植物体の再生
上記で得られたハイグロマイシン耐性である形質転換培養細胞を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g／ｌ、カサミノ酸５００ｍｇ／ｌ、植物ホルモンとしてベンジルアデニン１ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．８として、ゲルライト３ｇ／ｌを添加してなる培地上に移植した。２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら形質転換培養細胞を培養した。３０日後に形成された再生植物体（幼芽）を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌを加えｐＨ５．８として、ゲルライト３ｇ／ｌを添加してなる培地を入れた試験管（直径４０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ）に移植した。移植された幼芽を１０日間培養して形質転換ベントグラス植物体を得た。こうして、ベントグラスのカルス３ｍｌから合計２個体（系統番号ＢＰＲ１、ＢＰＲ２）の形質転換体が作製された。【００７９】
（１０）導入遺伝子の解析
上記（９）で得られた形質転換ベントグラス植物の２個体の葉片１０ｍｇから公知のＣＴＡＢ法に従って全ＤＮＡを抽出した。これらはＰＣＲ法により導入遺伝子の確認を行った。用いたプライマーは、化学合成により作製した。
（a）プライマーNo.1（配列番号３に示す）
5’- GTGTGATCAGTAGGAAGTTG  -3’
（b）プライマーNo.2（配列番号４に示す）
5’- ACCTCAAACACAAATCACTC  -3’
を組み合わせて用いた。【００８０】
上記において抽出した各形質転換イネの系統のＤＮＡ溶液の１μｌを鋳型とした。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（宝酒造（株）製、LA  PCR  Kit Ver.２.１）により調製した。【００８１】
ＰＣＲ法によるＤＮＡの上記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ASTEK社製、Program Temp ContolSystem PC‐700）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（Extention）を７２℃、３０秒分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
PCR後、反応液の一部を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、バンドの有無および大きさを比較した。その結果、系統番号ＢＰＲ１の植物体においてＲＳＩ１遺伝子の形質転換が確認された。系統番号ＢＰＲ２においては、ＲＳＩ１遺伝子は検出されなかった。【００８２】
（１１）形質転換ベントグラスの生育試験
上記（９）で得られた、ＲＳＩ１遺伝子の導入が確認された形質転換ベントグラス植物体ＢＰＲ１と確認されなかったＢＰＲ２植物体を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g/lを加えｐＨ５．８として、ゲルライト３ｇ／ｌを添加してなる培地を入れた試験管（直径４０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ）に、移植した。各系統、３個体ずつ２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら培養した。培養開始３０日後に草丈、最大根長の測定を行い、平均値を求めた。その結果を表４に示す。ＲＳＩ１遺伝子の導入が確認された系統番号ＢＰＲ１植物体では、導入されなかったＢＰＲ２植物体に比べて、草丈、最大根長は明らかに大きく、生育が促進されていることがわかった。【００８３】
【表４】
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表４から、ＲＳＩ１遺伝子が導入されたＢＰＲ１は、ＲＳＩ１が導入されていないＢＰＲ２と比べて、草丈および根長とも明らかに優っていることがわかった。【００８４】
(１２）形質転換ベントグラスの耐塩性試験
上記（９）で得られた、ＲＳＩ１遺伝子の導入が確認された形質転換ベントグラス植物体ＢＰＲ1と確認されなかったＢＰＲ２植物体を、０、５０、１００、２００、３００ｍＭの濃度でＮａＣｌを添加した、１／１０濃度のＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０g／ｌを加えｐＨ５．８として、寒天８g／ｌを添加してなる培地を入れた試験管（直径４０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ）に、移植した。各系統、５個体ずつ２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら培養した。培養開始３０日後に草丈、最大根長の測定を行い、平均値を求めた。ＮａＣｌ濃度０ｍＭにおける草丈、最大根長の値を１００％として各ＮａＣｌ濃度区の草丈、最大根長の相対比を算出し、草丈、最大根長生育程度（％）を求めた。結果を表５に示す。ＲＳＩ１遺伝子の導入が確認された系統番号ＢＰＲ１植物体では、草丈、最大根長ともにＮａＣｌ濃度５０ｍＭでは９８％とほとんど抑制されず、１００ｍＭで約７０％、２００ｍＭ以上で３０％以下と生育阻害を受けたが、ＲＳＩ１遺伝子が導入されなかったＢＰＲ２植物体に比べて、ＮａＣｌ濃度増加に伴う草丈、最大根長の抑制程度は小さく、耐塩性が増強されていることがわかった。【００８５】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、耐塩性、耐乾燥性などの環境ストレスに対する抵抗性が増加し、生育が促進された、様々な環境ストレスを受ける地域での安定的な栽培が可能な環境ストレス耐性イネ科植物を提供される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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