(57)【要約】  ヒト細胞内において、Argonaute2遺伝子の転写産物mRNAを破壊することによって当該細胞死を誘導する18-30塩基の２本鎖RNAを提供する。この２本鎖RNAは、例えば、癌治療の有効な材料となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞内において、Argonaute2遺伝子の転写産物mRNAを破壊することによって細胞死を誘導する18-30塩基の２本鎖RNA。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第144-168位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる請求項１の２本鎖RNA。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第180-204位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第791-815位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第798-822位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA。
【請求項６】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第1233-1257位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの第1425-1443位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA。
【請求項８】
センス鎖RNAが配列番２のRNAであり、アンチセンス鎖RNAが配列番号３のRNAである請求項２の２本鎖RNA。
【請求項９】
センス鎖RNAが配列番４のRNAであり、アンチセンス鎖RNAがと配列番号５のRNAである請求項３の２本鎖RNA。
【請求項１０】
センス鎖RNAが配列番６のRNAであり、アンチセンス鎖RNAが配列番号７のRNAである請求項４の２本鎖RNA。
【請求項１１】
センス鎖RNAが配列番８のRNAであり、アンチセンス鎖RNAが配列番号９のRNAである請求項５の２本鎖RNA。
【請求項１２】
センス鎖RNAが配列番10のRNAであり、アンチセンス鎖RNAが配列番号11のRNAである請求項６の２本鎖RNA。
【請求項１３】
センス鎖RNAが配列番12のRNAであり、アンチセンス鎖RNAが配列番号13のRNAである請求項７の２本鎖RNA。
【請求項１４】
請求項１に記載の２本鎖RNAの有効量を含有する細胞死誘導剤。
【請求項１５】
請求項２から７に記載の２本鎖RNAから選択される１または２以上の２本鎖RNAを含有する請求項１４の細胞死誘導剤。
【請求項１６】
２本鎖RNAが請求項８から１３に記載の２本鎖RNAのいずれかである請求項１５の細胞死誘導剤。
【請求項１７】
請求項１４、１５または１６に記載の細胞死誘導剤を細胞に導入することを特徴とする細胞死誘導方法。
【請求項１８】
細胞がガン細胞である請求項１７の細胞死誘導方法。
【請求項１９】
細胞がガン新生血管内皮細胞である請求項１７の細胞死誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、細胞死を誘導する２本鎖RNAに関するものである。さらに詳しくは、本願発明は、ヒト細胞内においてArgonaute2遺伝子の転写産物mRNAを破壊することによって細胞死を誘導する21-30塩基の２本鎖RNAと、この２本鎖RNAを含有する細胞死誘導剤、さらにはガン細胞等の効果的な細胞死を誘導する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
RNAiについて：
RNAi（RNA interference）とは、ある遺伝子と相同な、センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA（double-strand RNA）が、その遺伝子の転写産物（mRNA）の相同部分を破壊するという現象であり、1999年に線虫を用いた実験によりはじめて提唱された（非特許文献１）。その後、マウス初期胚や哺乳動物培養細胞でもRNAiが起こることが示され、RNAiの誘導機構は哺乳動物細胞にも存在することが明らかにされた（非特許文献２）。そして2001年には、比較的短い（21-23bp）２本鎖RNA（small interfering RNA：siRNA）が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにRNAiを誘導できることが示されている（非特許文献３）。【０００３】
このように、siRNAは毒性を示すことなく特定の遺伝子発現を抑制することから、ヒト疾患の治療への有効性が期待されている。
RISCについて：
RISC（RNA-induced silencing complex：RNA誘導型サイレンシング複合体）は、RNA分解酵素活性を有する分子量250〜500kDaのタンパク複合体である。SiRNAを細胞へ導入すると、このタンパク質複合体と結合し、siRNA-タンパク質複合体がsiRNAと相同のmRNAに結合し、RISCヌクレアーゼ活性によりsiRNA−mRNAの結合部位が切断されて、標的遺伝子の発現が抑制（       gene silencing）される（例えば、非特許文献４−６）。
【非特許文献１】Fire, A. et al. Nature, 391:806-811, 1998
【非特許文献２】Ui-Tei, K. et al. FEBS Lett., 479:79-82, 2000
【非特許文献３】Elbashir, MS. Et al. Nature, 411:494-498, 2001
【非特許文献４】Martinez, J. et al. Cell, 110:563-574, 2003
【非特許文献５】Liu, J. et al. Science, 305:1437-1441, 2004
【非特許文献６】Rivas, F.V. et al. RNA 12:340-349, 2005
【発明の開示】
【０００４】
生体を正常な状態に保つため、不要あるいは有害な細胞（例えばガン細胞）を死滅させるための手段や薬剤の開発が精力的に進められている。しかしながら、正常細胞に毒性を示すことなく、不要・有害な細胞を選択的に死滅させるための効果的な手段や薬剤は極めて少ないのが現状である。
【０００５】
本願発明は、RNAiによる標的遺伝子の発現抑制を作用機序として、特定細胞を選択的に死滅させるために使用することのできる新しい２本鎖RNAを提供することを課題としている。
RISCは、前記のとおり、RNAiによるmRNA切断（gene silencing）のための不可欠の分子であるが、一方で、細胞の恒常性維持に深く関与している。
【０００６】
本願発明者らは、このRISCそれ自体の発現を抑制することによって、細胞の恒常性を破壊し、細胞死を誘導することが可能であるとの作業仮説のもと、鋭意研究の結果、RISCの構成タンパク質の一つであるArgonaute2（Ago2）タンパク質の発現をsiRNAで抑制させることによって細胞死が誘導されることを確認し、本願発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本願発明は、siRNAによってAgo2遺伝子の発現を抑制した場合であっても、siRNA-RISCによるgene-silencing活性は維持されたまま、RISCの恒常性維持機能を選択的に破壊して細胞死が誘導されるという新規な知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
本願発明は、第1の発明として、ヒト細胞内において、Argonaute2遺伝子の転写産物mRNAを破壊することによって細胞死を誘導する18-30塩基の２本鎖RNAを提供する。
【０００９】
第1発明の２本鎖RNAは、具体的には以下のとおりである。すなわち、配列番号１の塩基配列からなるArgonaute2遺伝子cDNAの：
(１)第144-168位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる請求項１の２本鎖RNA、
(２)第180-204位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA、
(３)第791-815位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA、
(４)第798-822位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA、
(５)第1233-1257位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA、
(６)第1425-1443位配列に相当するRNAを含むセンス鎖RNAと、そのアンチセンス鎖RNAとからなる２本鎖RNA、
である。
【００１０】
これらの２本鎖RNAは、さらに具体的には、
[1]センス鎖：      5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3'（配列番号２）
アンチセンス鎖：3'-UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5'（配列番号３）
[2]センス鎖：         5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3'（配列番号４）
アンチセンス鎖：3'-UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5'（配列番号５）
[3]センス鎖：        5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3'（配列番号６）
アンチセンス鎖：3'-UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5'（配列番号７）
[4]センス鎖：        5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3'（配列番号８）
アンチセンス鎖：3'-UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5'（配列番号９）
[5]センス鎖：        5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3'（配列番号10）
アンチセンス鎖：3'-UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5'（配列番号11）
[6]センス鎖：        5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3'（配列番号12）
アンチセンス鎖：3'-UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5'（配列番号13）、
である。
【００１１】
第２の発明は、第1発明の２本鎖RNAの有効量を含有する細胞死誘導剤である。
【００１２】
この第２発明は、具体的には、前記(1)から(6)の２本鎖RNAから選択される１または２以上の２本鎖RNAを含有する細胞死誘導剤であり、さらに具体的には、前記[1]から[6]の２本鎖RNAから選択される１または２以上の２本鎖RNAを含有する細胞死誘導剤である。
【００１３】
第３の発明は、前記の細胞死誘導剤を細胞に導入することを特徴とする細胞死誘導方法である。この第３発明の方法においては、細胞がガン細胞またはガン新生血管内皮細胞であることを好ましい態様としている。
【００１４】
本願発明によって、細胞死を誘導させるための新しい手段が提供される。本願発明の２本鎖RNAを、不要・有害な細胞に特異的に結合するデリバリー分子等に結合した状態で生体内に導入することによって、不要・有害な細胞を選択的に死滅させることが可能となる。単鎖の２本鎖RNAは細胞毒性がないことが確認されているので、デリバリー分子が認識しない正常細胞を死滅させることがない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、HT1080細胞に２本鎖RNAを導入し、各培養時間の後のArgonaute2 mRNAをRT-PCT法で測定した結果を示す泳動図である。各時間の左側がArgonaute2に対する２本鎖RNA、右側がコントロールの２本鎖RNAを細胞に導入した場合。図１Ｂはβ−アクチンの発現を同様に測定した結果であり、ＣはpGL3改変ベクターの同時トランスフェクションによりトランスフェクション効率を確認した結果である。
【図２】図２は、２本鎖ＲＮＡを細胞に導入したHT1080細胞の細胞生存率を経時的に示したグラフである。
【図３】図３は、２本鎖ＲＮＡを細胞に導入したHT1080細胞の細胞増殖率を経時的に示したグラフである。
【図４】図４上は、HUVEC細胞に２本鎖RNAを導入し、各培養時間の後のArgonaute2 mRNAをRT-PCT法で測定した結果を示す泳動図である。各時間の左側がsiAgo2、右側がコントロール（siNA）を細胞に導入した場合、左端レーンはLipofectamine2000単独処理である。図４下はβ−アクチンの発現を同様に測定した結果である。
【図５】図５は、２本鎖ＲＮＡを細胞に導入したHUVEC細胞の細胞生存率を経時的に示したグラフである。
【図６】図６は、２本鎖ＲＮＡを細胞に導入したHUVEC細胞の細胞増殖率を経時的に示したグラフである。
【図７】図７は、２本鎖ＲＮＡを細胞に導入したHUVEC細胞による血管類似構造体の形成を観察した顕微鏡像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本願発明の２本鎖RNAは、RISC構成タンパク質の一つであるAgo2タンパク質の遺伝子発現を抑制するものである。Ago2遺伝子のcDNA配列は公知（配列番号１）であり、この塩基配列に基づいて、２本鎖RNAを設計することができる。すなわち、配列番号１の任意領域に対応するRNA（センス鎖RNA）と、このセンス鎖RNAに相補的なRNA（アンチセンス鎖RNA）を作製する。具体的には、配列番号１の第114位〜領域、第180〜領域、第791〜領域、第1233〜領域、第1425〜領域などである。【００１７】
選択した領域から、AAで始まる配列であって長さが18〜30塩基のもの、あるいは、AAを５'側に加えたときの長さが18〜30塩基の配列を選択する。その配列のGC含量は、例えば30〜70%となるものを選択すればよく、50%前後が好ましい。また、そのGC分布に偏りがないものを選択するとよい。さらに、選択した配列の3'側にdT又はUの2残基のオーバーハングを加えるとよい。また、BLASTサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。【００１８】
このような条件を満たす配列からなる２本鎖RNAとして、本願発明は、以下の６種類の２本鎖RNAを提供する。
[1]センス鎖：      5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3'（配列番号２）
アンチセンス鎖：3'-UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5'（配列番号３）
[2]センス鎖：         5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3'（配列番号４）
アンチセンス鎖：3'-UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5'（配列番号５）
[3]センス鎖：        5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3'（配列番号６）
アンチセンス鎖：3'-UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5'（配列番号７）
[4]センス鎖：        5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3'（配列番号８）
アンチセンス鎖：3'-UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5'（配列番号９）
[5]センス鎖：        5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3'（配列番号10）
アンチセンス鎖：3'-UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5'（配列番号11）
[6]センス鎖：        5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3'（配列番号12）
アンチセンス鎖：3'-UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5'（配列番号13）
このような２本鎖RNAは、例えば、公知の方法（例えばCarruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術によりRNAを合成し、２本鎖にアニールさせることによって作製することができる。【００１９】
また、公知のDicer法によって２本鎖RNAを作製することもできる。すなわち、Ago2遺伝子cDNA（配列番号１）のコード領域をベクター等に組み込み、cDNAのセンス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAを転写させた後、アニーリングして２本鎖RNAを作製する。次に、RNase IIIファミリーに属するDicer Enzymeにより、この２本鎖RNAを３'末端側に２塩基の突出末端をもつ単鎖（18-30塩基）の２本鎖RNAにプロセッシングさせる。【００２０】
第２の発明は、前記のとおりの２補鎖RNAを、それが細胞死を誘導するのに有効な量、含有する細胞死誘導剤である。２本鎖RNAは単一種を含有するものであってもよいが、細胞死の誘導活性を向上させるためには、２種以上の２本鎖RNAを含有することが好ましい。【００２１】
この細胞死誘導剤は、２本鎖RNAを薬学的に許容できる担体と混合して調製することができる。担体としては、リポソーム、脂質小胞体、ミセル等、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料、または甘味料等を含む。【００２２】
この細胞死誘導剤は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。また、この細胞死誘導剤は、当業者にとって既知である任意の手段により、局所的または全身に投与することができる。投与量は、被投与者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などによって適宜に変更することができ、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、錠剤として投与する場合に0.1μg〜10g、好ましくは1μg〜1g、さらに好ましくは10μg〜100mgを１日に１〜５回投与することができる。【００２３】
この細胞死誘導剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、注射により直接投与する方法のほか、２本鎖RNAの発現ベクターを投与する方法を採用することもできる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を使用することができる。また、２本鎖RNAを保持させたリポソームなどのリン脂質小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入し、この細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する方法を採用することもできる。さらに、２本鎖RNAを目的の組織または器官に導入するためには、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。【００２４】
以上の方法によって２本鎖RNA、またはこの２本鎖RNAを含有する細胞死誘導剤を細胞に導入することによって、細胞死を誘導することができる。【００２５】
細胞死の対象は、生体の正常な機能に対して不要、または有害なガン細胞やガン新生血管内皮細胞等とすることができる。例えば、特定のガン細胞表面でのみ発現するタンパク質やガン細胞特異的な新生血管等を標的として、抗体やリポソーム等の担体を用いてガン細胞に２本鎖RNAを作用させ、ガン細胞のAgo2遺伝子発現を選択的に抑制させることによって、ガン細胞の死滅を誘導することができる。例えば、本願発明者らは、カチオニックリポソーム（TFL-3）の使用によって、肺内に生じた新生血管内皮細胞に選択的に治療用遺伝子を送達できることを示している（Li, W. et al., Int. J. Pharm. 276:67-74, 2004）。また、ファージディスプレイ法によって取得された、新生血管に高い集積性を持つ数種のペプチドでPEG末端を修飾した抗ガン剤封入リポソームが、高い腫瘍増殖抑制効果を発揮することも報告されている（Kondo, M. et al., Int. J. Cancer, 108:301-306, 2004; Assai, T. et al., FEBS Lett., 520:167-170, 2002）。またさらに、本願発明者らは、細胞内に移行後に速やかに細胞質内に２本鎖RNAを放出することのできる、内封薬物放出性をプログラムしたリポソームの開発にも成功している（Moreira, J.N. et al., Pharm. Res. 19:265-269, 2002）。これらの公知技術の使用によって、本願発明の２本鎖RNAを特定の細胞（例えばガン細胞やガン新生血管内皮細胞など）へ特異的に送達させることが可能であり、それらの細胞を選択的に死滅させることが可能である。【００２６】
標的の細胞に到達しなかった２本鎖RNAは担体とともに肝臓・脾臓のマクロファージにより取り込まれて分解されるため、正常細胞に対する毒性はない。【００２７】
なお、本願発明のその他の態様は、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の医薬組成物の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。【００２８】
以下、実施例を示して本願発明に係る２本鎖RNAの作用効果について詳しく説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
：HT1080細胞における２本鎖RNAのAgo2遺伝子発現抑制
以下の、Ago2を標的とする２本鎖RNA（siAgo2）を調製した。
[1]センス鎖：      5'-GGAGAACAAUCAAAUUACAGGCCAAAG-3'（配列番号２）
アンチセンス鎖：3'-UACCUCUUGUUAGUUUAAUGUCCGGUU-5'（配列番号３）
[2]センス鎖：         5'-UGGACAUCCCCAAAAUUGACAUCUAAG-3'（配列番号４）
アンチセンス鎖：3'-UAACCUGUAGGGGUUUUAACUGUAGAU-5'（配列番号５）
[3]センス鎖：        5'-ACAGAUUCCCAAAGGGUAAAGUUUAAG-3'（配列番号６）
アンチセンス鎖：3'-UAUGUCUAAGGGUUUCCCAUUUCAAAU-5'（配列番号７）
[4]センス鎖：        5'-CCCAAAGGGUAAAGUUUACCAAAGAAG-3'（配列番号８）
アンチセンス鎖：3'-UAGGGUUUCCCAUUUCAAAUGGUUUCU-5'（配列番号９）
[5]センス鎖：        5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAGAUAGCAG-3'（配列番号10）
アンチセンス鎖：3'-UACUUAGUACCAGUUUCUACUCUACUG-5'（配列番号11）
[6]センス鎖：        5'-GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU-3'（配列番号12）
アンチセンス鎖：3'-UUCGUGCCUUCAGGUAGACUU-5'（配列番号13）
また、コントロールとして、Luciferase遺伝子（pGL-3）を発現抑制することが既知の以下の２本鎖RNA（siNS：非特許文献３）を調製した。【００３０】
センス鎖：        5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号14）
アンチセンス鎖：3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'（配列番号15）
配列番号12、13のオリゴヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（siAgo2 [6]）とコントロールの２本鎖RNA（siNS）を、Lipofectamine2000を用いてヒト線維肉腫細胞HT1080に導入した。なお２本鎖RNAとLipofectamine2000の割合は1：5、２本鎖RNA濃度は12.5 nMである。24時間の導入処理の後、未導入の２本鎖RNAを除去し、RT-PCR法によりAgo2遺伝子のmRNA量を経時的に測定した。【００３１】
結果は図1に示したとおりである。siAgo2 [6]の細胞導入によって、コントロール（siNS）と比較して顕著なAgo2 mRNAの抑制が確認された（図１A）。【００３２】
また、２本鎖RNAによる発現抑制の特異性を確認するため、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの発現を測定した（図１B）。さらに、pDNAベクター（pGL3改変ベクター）を同時にトランスフェクションして、２本鎖RNAの細胞内導入効率を確認した（図１C）。その結果、非特異的な遺伝子発現の抑制はなく、またトランスフェクション効率にも問題がないことが確認された。【００３３】
さらに、前記の２本鎖RNAをLipofectamine2000を用いてHT1080細胞に導入し、細胞毒性、細胞増殖性の簡便な評価法として汎用されているMTT assayによって２本鎖RNAの細胞死誘導活性を評価した。その結果、図２に示したとおり、siAgo2 [6]を用いた場合、コントロール（siNS）と比較して細胞生存率は有意に減少した。【００３４】
また、細胞の実数を測定して細胞増殖の程度を検討した。その結果、図３に示したとおり、siAgo2 [6]を用いた場合には、コントロール（siNS）と比較して細胞増殖率は有意に減少した。【００３５】
なお、siAgo2 [1]−[5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。【００３６】
以上の結果から、本願発明の２本鎖RNAが、腫瘍細胞の細胞死誘導（あるいは増殖抑制）活性を有することが確認された。
【実施例２】
【００３７】
：HUVEC細胞における２本鎖RNAのAgo2遺伝子発現抑制
HUVEC（a human umbilical vein endothelial cell：ヒト臍帯血管内皮細胞）を用いた以外は、実施例１と同様にしてAgo2遺伝子のmRNA量を経時的に測定した。【００３８】
結果は図４に示したとおりである。siAgo2 [6]の細胞導入によって、コントロール（siNA）と比較して顕著なAgo2 mRNAの抑制が確認された（図４上）。【００３９】
また、β−アクチンの発現を測定した結果（図４下）、siAgo2 [6]の細胞内導入による非特異的な遺伝子発現の抑制はないことも確認された。【００４０】
さらに、実施例１と同様にして、２本鎖RNAを導入したHUVEC細胞の細胞生存率（図５）および細胞増殖率（図６）を測定し、本願発明の２本鎖RNA（siAgo2 [6]）がHUVEC細胞に対しても細胞死誘導活性を有することが確認された。【００４１】
なお、siAgo2 [1]−[5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。
【実施例３】
【００４２】
：HUVEC細胞によるtube formation assay
siAgo2 [6]を、Lipofectamine2000を用いてHUVEC細胞に導入した。24時間の導入処理の後のHUVEC細胞を、マトリゲルでコートした培養プレート上に撒き、血管類似構造体の形成を観察した（tube formation assay）。【００４３】
結果は図７に示したとおりであり、無処理、Lipofectamine2000単独およびコントロール（siNA導入）では血管類似構造体の形成が観察されたが、siAgo2 [6]を導入したHUVEC細胞で血管類似構造体の形成は阻害された。【００４４】
なお、siAgo2 [1]−[5]を用いた場合にも同様の結果が得られた。【００４５】
以上の結果から、本願発明の２本鎖RNAが、がん新生血管の伸展を有効に抑制することが確認された。
【図２】
2007088900.tif 000002
【図３】
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【図５】
2007088900.tif 000004
【図６】
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【図１】
2007088900.tif 000006
【図４】
2007088900.tif 000007
【図７】
2007088900.tif 000008
【配列表】
2007088900000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月30日(2007.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
ヒト細胞内においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ２遺伝子の転写産物ｍＲＮＡを破壊することによって細胞死を誘導する１８−３０塩基の２本鎖ＲＮＡの有効量を含有し、腫瘍細胞の細胞死誘導作用およびガン新生血管伸長抑制作用を有する薬剤であって、２本鎖ＲＮＡは以下の（１）から（６）の群：
（１）センス鎖ＲＮＡが配列番２のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号３のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ；
（２）センス鎖ＲＮＡが配列番４のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号５のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ；
（３）センス鎖ＲＮＡが配列番６のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号７のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ；
（４）センス鎖ＲＮＡが配列番８のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号９のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ；
（５）センス鎖ＲＮＡが配列番１０のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１１のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ；
（６）センス鎖ＲＮＡが配列番１２のＲＮＡであり、アンチセンス鎖ＲＮＡが配列番号１３のＲＮＡである２本鎖ＲＮＡ、
から選択される１または２以上である。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
請求項１４に記載の薬剤を細胞に導入することを特徴とする細胞死誘導方法。
【請求項１８】
細胞がガン細胞である請求項１７の細胞死誘導方法。
【請求項１９】
細胞がガン新生血管内皮細胞である請求項１７の細胞死誘導方法。
【国際調査報告】
2007088900.tif 000009
2007088900.tif 000010
2007088900.tif 000011
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