(57)【要約】連続して伸張反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供する。プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させ、蛍光標識ｄＮＴＰを、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませて、プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、蛍光標識ｄＮＴＰを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識ｄＮＴＰを連続的に取り込ませることによって、結合した蛍光標識ｄＮＴＰの３’末端から標的核酸に相補的な核酸を伸長させる、核酸合成法。当該核酸合成法によって、標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程を含み、ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識ｄＮＴＰの蛍光を順次検出することによって、標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
2007135760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含む、核酸合成法。
【請求項２】
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、請求の範囲第１項に記載の核酸合成法。
【請求項３】
前記陰イオン性の蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５４６、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ）４８８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、請求の範囲第２項に記載の核酸合成法。
【請求項４】
１分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたシーケンスすべき標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記シーケンスすべき標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を順次検出することによって、前記標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【請求項５】
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは複数種用意され、複数の前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドそれぞれは、塩基ごとに異なる蛍光標識を有するものである、請求の範囲第４項に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【請求項６】
前記シーケンスすべき標的核酸及び前記ＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化されており、
前記基板における、前記シーケンスすべき標的核酸又は前記ＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させ、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが取り込まれた際に、前記取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドにおける、前記エバネッセント場によって励起された蛍光を検出する、請求の範囲第４項に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【請求項７】
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、請求の範囲第４項に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【請求項８】
前記陰イオン性の蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５４６、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ）４８８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、請求の範囲第７項に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を合成する技術に関する。また、本発明は、生物の核酸を解析する技術に関する。特に、本発明は、１分子の核酸を解析する技術に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼβを用いた核酸合成法及び１分子シーケンス法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  β）に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のＤＮＡシーケンス法の代表例として、４色蛍光と電気泳動とを用いた、所謂サンガー法がある。また、ＤＮＡ１分子を解析する手法のとして、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１００，３９６０−３９６４，（２００３）に記載されているような、Ｑｕａｋｅらによって行われた、ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた手法がある。
【特許文献１】米国特許第６，８１８，３９５号明細書
【非特許文献１】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２００３年、第１００巻、ｐ．３９６０−３９６４
【発明の開示】
【０００３】
発明の目的
サンガー法では、前処理が複雑であること；一度に読める塩基数は高々８００塩基程度であること；及び、解析時間が１サンプルあたり数時間かかること、などの問題がある。
Ｑｕａｋｅによる方法では、以下の問題がある。
まず、鋳型ＤＮＡ上の１種類の塩基を解析するために、異なる蛍光で標識された４種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、順に４種類の溶液を流し、デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していくために、多くの解析時間を必要とする。
また、クレノウフラグメントが用いられているが、当該酵素は蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドを数塩基以上連続して取り込むことができないため、解析塩基長が数塩基以下に限られ、従って、実用的でない。
さらに、クレノウフラグメントは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がわずかながら存在することから、合成した塩基を取り除き再び合成しはじめるため、正確な塩基情報を得ることができない。
そこで本発明の目的は、連続して伸張反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼβを核酸重合酵素として用いることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の（１）〜（８）の発明を含む。
下記（１）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法に向けられる。
（１）  プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含む、核酸合成法。
（２）  前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、（１）に記載の核酸合成法。
（３）  前記陰イオン性の蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５４６、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ）４８８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（２）に記載の核酸合成法。
下記（４）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法を用い、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することにより、１分子シーケンスを行う方法に向けられる。
（４）  １分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたシーケンスすべき標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記シーケンスすべき標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を順次検出することによって、前記標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
（５）  前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは複数種用意され、複数の前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドそれぞれは、塩基ごとに異なる蛍光標識を有するものである、（４）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
すなわち、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰから選ばれる少なくとも２種のデオキシリボヌクレオチドの蛍光標識体であり、蛍光標識が、デオキシリボヌクレオチドの塩基によって異なるように設計されたものである。
さらに、下記（６）に記載の発明は、全反射蛍光顕微鏡技術を用いた高速１分子シーケンス法に向けられる。
（６）  前記シーケンスすべき標的核酸及び前記ＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化されており、
前記基板における、前記シーケンスすべき標的核酸又は前記ＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させ、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが取り込まれた際に、前記取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドにおける、前記エバネッセント場によって励起された蛍光を検出する、（４）又は（５）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
（７）  前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、（４）〜（６）のいずれかに記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
（８）  前記陰イオン性の蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５４６、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ）４８８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（７）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
本発明により、連続して伸張反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＴＩＲＦＭを用いた本発明の１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
図２は、実施例１において、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
図３は、比較例１において、核酸重合酵素としてｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
図４は、比較例２において、核酸重合酵素としてＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
図５は、実施例２で用いられた光学系を示す図である。
図６は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ）１分子が検出されたことを示す結果である。
図７は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Ａｌｅｘａ４８８）１分子が検出されたことを示す結果である。
図８は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Ｃｙ３．５）１分子が検出されたことを示す結果である。
図９は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Ｃｙ５）１分子が検出されたことを示す結果である。
図１０は、実施例３において行われた１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
図１１は、実施例３において、１分子シーケンスが達成されたことを示す結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜核酸合成法＞
本発明の核酸合成法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用い、核酸重合酵素としてポリメラーゼβを用いる。テンプレートとなる標的核酸及びプライマーとなるオリゴヌクレオチドについては、特に限定されるものではない。そして、これらの成分を、通常の核酸合成反応条件下に供する。このことによって、プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体が形成され、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれ、プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ結合する。
本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドに対する取り込み活性が大変高いことが発明者らによって見出されている。例えば従来から用いられてきた核酸重合酵素のクレノウフラグメントのように、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み及び合成が数塩基で停止することが無く、連続的に取り込み及び合成を行うことができる。
また、多くの核酸重合酵素は校正機能としての３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、すなわち合成した塩基を自ら削り取る機能を有している。しかしながら、本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、従来から修復酵素として知られているものであり、そのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がない。このため、標的核酸にはじめに結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から、標的核酸に相補的な核酸を安定的に伸張させることができる。
蛍光標識すなわち蛍光官能基の種類としては特に限定されるものではない。ＤＮＡポリメラーゼβへの取り込み活性という観点からは、例えば陰イオン性の蛍光色素であることが好ましい。陰イオン性の蛍光色素としては、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８・５３２・５４６、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｃｙ３．５・５・５．５、Ｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎなどが挙げられる。
本発明の核酸合成法の応用形態の例として、プライマーオリゴヌクレオチド或いは標的核酸のいずれか一方を基板などに固定することによって、これまで安定して伸張固定できなかった、長い蛍光修飾ＤＮＡの伸張固定が可能になる。
本発明の核酸合成法の応用形態の他の例として、通常の核酸複製系に適用し、且つ蛍光検出を行うことによって、複製開始位置或いは複製開始配列を決定することができる。すなわち、複製起点のマッピングを行うことが可能になる。蛍光検出を行う場合は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように、蛍光標識を選択することが好ましい。この場合、取り込まれた蛍光標識を検出することによって、シーケンスを行うことが可能になる。このことは、後述の１分子シーケンス法にて詳述する。
＜１分子シーケンス法＞
本発明の１分子シーケンス法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチド、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用い、上述の核酸合成法において記載したように、核酸合成を行う。そして、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することによって、テンプレートとなる標的核酸のシーケンスを行う。蛍光標識は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように選択する。
蛍光検出の手段としては特に限定されるものではないが、単塩基分解能で検出を行うことができる手段を用いると良い。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の例としては、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１００，３９６０−３９６４，（２００３）に記載されている方法が挙げられる。この方法においては、必要な種類（通常４種）の蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用意し、それら必要な種類の溶液を１種類ずつ順に流し、洗浄することを繰り返すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していく。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の他の例としては、全反射蛍光顕微鏡技術（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＩＲＦＭ）を用いる方法が挙げられる。この場合、シーケンスすべき標的核酸及びＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化される。そして、この基板における、シーケンスすべき標的核酸又はＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させる。核酸合成反応によって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれたときに、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光標識がエバネッセント場によって励起される。このように励起された蛍光を検出する。
ＴＩＲＦＭを用いる方法について、具体例を模式的に図１に示す。図１においては、ＤＮＡポリメラーゼβが基板（透明基板）上に固定されており、プライマーを用い、テンプレートとなる標的核酸（鋳型ＤＮＡ）の複製を行う。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼβでなく標的核酸のほうを基板に固定してもよい。そして、必要な種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、それぞれに異なった波長の蛍光を発する修飾を施すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドとして使用する。
蛍光分子を励起するために、全反射照明を行い、基板の表面にエバネッセント場を発生させる。エバネッセント光が染み出すエリアは基板の表面から約２００ｎｍ以内に限定され、それより遠い領域は非照明領域となる。このため、その限定された領域において生じる蛍光現象の観察を、バックグラウンド蛍光の少ない状態で高感度に行うことが可能になる。
蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドは、検出用のカメラでは捉えきれない速度でブラウン運動を行っているため、通常は、照明範囲内にある蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは認識することができない。一方、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれると、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドはそのブラウン運動が抑えられるため、検出用カメラで認識することが可能になる。このことによって、取り込まれたデオキシリボヌクレオチドと、取り込まれていないデオキシリボヌクレオチドすなわち溶液中を漂う遊離のデオキシリボヌクレオチドを区別することができる。
さらに、励起された蛍光分子は、励起光によって生成した活性酸素の働きにより、次の蛍光分子が取り込まれて発光するまでに消光する、もしくは次の蛍光分子が取り込まれて発光し消光する以前に前の蛍光分子が消光する。このため、読みたい蛍光分子のみを検出することができる。このようにして、発光した蛍光分子の波長及び／又は強度を順に読み取ることによって、標的核酸のシーケンスを行う。ＴＩＲＦＭを用いるシーケンスは、核酸合成における酵素反応を実時間スケールで観察することにより行われる。このため、高速なシーケンスを達成することができる。その速さは、例えば、毎秒１０〜５０塩基程度である。
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる基板としては、核酸伸張を行うための反応溶液より高い屈折率を有し、なお且つ、基板と反応液との界面でレーザーを全反射させたときに、反応液側にエバネッセント場を生じることができるようなものが用いられる。基板は、少なくとも光を透過させる材質から構成されるものが用いられる。例えば、ガラス基板や、ポリカーボネート、ＰＭＭＡなどの樹脂から構成される基板など、高い光透過率を有する材質から構成される基板を好適に用いることができる。
基板への固定化方法としては、特に限定されず、当業者によって適宜選択される。具体的には、例えば、アビジンとピオチンとの結合、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン抗体との結合、アミノ基とカルボキシル基とをＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）やＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を介した共有結合などの、官能基間でのリンカー試薬を用いることにより形成する結合などを利用して適宜行われる。標的核酸を固定化させる場合は、１０〜２０ｂｐ程度のプライマー配列を介して固定するとよい。
また、ＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる場合は、その活性を失わない状態で固定化するとよい。そのためには、ＤＮＡポリメラーゼβを、アフィニティータグ融合タンパク質として発現させることによる方法を用いると良い。アフィニティータグとしては、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、６ｘＨｉｓ（ヒスチジン）、アビジンなどが挙げられる。このとき、それぞれ、ＧＳＴと抗ＧＳＴとの結合、６ｘＨｉｓと６ｘＨｉｓ抗体もしくはＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）との結合、アビジンとビオチンとの結合を利用して固定化が行われる。
【実施例】
【０００６】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔１．核酸重合酵素による蛍光標識デオキシリボヌクレオチド取り込み活性比較〕
下記実施例１及び比較例１及び２において、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドの、核酸重合酵素への取り込み活性の比較を行った。
［実施例１］
実施例１では、鋳型ＤＮＡとしてプライマー配列とアデニンからなる核酸（５’−ＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡ  ＣＣＣＴＣ  ＡＣＧＣＴ  ＧＣＣＡＴ  ＣＣＴＣＣ−３’；配列番号１）とジゴキシゲニンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（５’ＤＩＧ−ＧＧＡＧＧ  ＡＴＧＧＣ  ＡＧＣＧＴ  ＧＡＧＧＧ−３’、配列番号２）を用い、核酸重合酵素として、仔牛由来のＤＮＡポリメラーゼβを用い、基質として、異なる蛍光分子によって標識された２２種のｄＵＴＰに対する取り込み活性について、シーケンスゲル解析した。２２種のｄＵＴＰそれぞれの蛍光標識は、以下のとおりである。
・ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ
・Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８
・Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ
・ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ
・Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
・Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ
・ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８
・Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４
・ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ
・Ｃｙ３
・Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ  Ｂ
・Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ
・Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ
・ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０
・Ｃｙ５
・Ｃｙ５．５
・Ｎａｐｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
・Ｃｙ３．５
シーケンスゲル解析では、はじめに鋳型ＤＮＡとプライマーオリゴヌクレオチドを混合し、室温で５分間静置してアニーリングさせた。プライマーオリゴヌクレチドをアニーリングさせた鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼβ、及び上記蛍光標識したｄＵＴＰを反応バッファーに含む混合溶液１０ｕＬ（最終濃度：０．１μＭプライマーオリゴヌクレチド／鋳型ＤＮＡ、１０μＭ  ＤＮＡポリメラーゼβ、１０μＭ蛍光標識ｄＵＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ塩化マグネシウム、１５ｖ／ｖ％グリセロール）を、３７℃で５分間反応させた。反応終了後に、反応停止液７μＬ（９５ｖ／ｖ％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、０．１ｗ／ｖ％ＸｙｌｅｎＣｙａｎｏｌＦＦ、０．１ｗ／ｖ％ＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌＢｌｕｅ）を上記混合溶液に添加し、９５℃で５分間加熱し、その後氷上に置き急冷した。
反応により伸張したプライマーオリゴヌクレオチドを解析するために、シーケンスゲル板により電気泳動を行った。上記で反応／停止させた溶液３μＬをシーケンスゲル（組成：８ｗ／ｖ％ポリアクリルアミド、１２Ｍ尿素、１ｘＴＢＥ）のウェルに入れ、３時間泳動した。泳動後、ナイロンメンブレンをゲルに直接載せて３０分間静置して、泳動したプライマーオリゴヌクレオチドをゲルからナイロンメンブレンに転写した（コンタクトブロッティング）。転写されたナイロンメンブレンをＵＶクロスリンカーにより２００ｍＪ／平方ｃｍで１分間照射して、プライマーオリゴヌクレオチドの固定化を行った。
プライマーオリゴヌクレオチドを化学発光により検出するため、以下の操作を行った（以下全て室温での操作）。プライマーオリゴヌクレオチドが固定されたナイロンメンブレンを洗浄バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で１分間振とうした後、ブロッキング溶液（０．１Ｍマレイン酸、ｐＨ７．５、１０％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、品番１０９６１７６）で３０分間振とうし、その後、アルカリフォスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体溶液（濃度：０．７５Ｕ／μＬ）をブロッキング溶液で１０００倍希釈した溶液で１時間振とうした。
次に洗浄バッファーで１０分間振とうし、この洗浄バッファーの洗浄操作を３回繰り返した。メンブレンを検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ９．５）で２分間振とうした。化学発光基質であるＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液（濃度：２５ｍＭ）を検出バッファーで１０００倍希釈した溶液を、上記操作を行ったメンブレン全体に滴下し、１５分間静置する。その後Ｘ線フィルムに感光し、撮影・現像を行った。この結果を、図２に示す。
＜比較例１＞
比較例１では、核酸重合酵素としてｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：０．１μＭプライマーオリゴヌクレチド／鋳型ＤＮＡ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、１０μＭ蛍光標識ｄＵＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、７ｍＭ塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図３に示す。
＜比較例２＞
比較例２では、核酸重合酵素として、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ機能を遺伝子工学的に欠損させたもの；アマシャム社製）を用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：０．１μＭプライマーオリゴヌクレチド／鋳型ＤＮＡ、２Ｕ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０、１０μＭ蛍光標識ｄＵＴＰ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図４に示す。
〔取り込み活性比較の評価〕
核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた実施例１の方法では、ポリメラーゼβが連続して蛍光標識ｄＵＴＰを取り込むことができたことを示す結果が得られた。図２が示すように、特に、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）シリーズなどの疎水性が高い蛍光標識や、陽イオン性、中性の蛍光標識を有するｄＵＴＰよりも、陰イオン性の蛍光標識を有するｄＵＴＰのほうが取り込み活性に優れていることが分かった。
一方、核酸重合酵素としてｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた比較例１では、Ｃｏｕｍａｒｉｎｅを標識したｄＵＴＰとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を標識したｄＵＴＰとを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、また核酸重合酵素としてＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いた比較例２の方法では、Ｃｏｕｍａｒｉｎｅを標識したｄＵＴＰを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、５塩基以下で完全に合成反応が停止してしまったことが分かる。
以上のことから、ＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドを連続して取り込むことが可能であることが実証された。
〔２．リアルタイム蛍光検出〕
［実施例２］
実施例２では、実施例１でＤＮＡポリメラーゼβへの取り込みが良かった、Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ（励起：４０２ｎｍ、蛍光：４４３ｎｍ）、Ａｌｅｘａ４８８（励起：４９５ｎｍ、蛍光：５１９ｎｍ）、Ｃｙ３．５（励起：５５０ｎｍ、蛍光：５７０ｎｍ）、Ｃｙ５（励起：６５０ｎｍ、蛍光：６６７ｎｍ）の４種類の蛍光色素を用い、蛍光分子１分子のリアルタイム検出を行った。このとき用いた光学系を、図５に示す。この光学系においては、全反射型蛍光顕微鏡の一例として対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡（倒立型）を用いた。
図５が示すように、この光学系においては、４種類の蛍光色素それぞれを励起するために、波長が４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、及び６３３ｎｍの４種類のレーザー光源（１１）（１２）（１３）（１４）を導入した。レーザー光源（１１）（１２）（１３）（１４）から放出されたレーザー光は、それぞれλ／４偏光板（２１）（２２）（２３）（２４）によって円偏光に変換された。変換されたレーザー光は、それぞれダイクロイックミラー（Ｍ１）によって、４種類のレーザー光が同軸となるように光軸調整された。
同軸の光路に導かれたレーザー光は、透明基板としてのカバーガラス（５０）表面でのエバネッセント場の照明領域を調整するために配置されたビームエキスパンダ（３０）によって、ビーム径を調整した。続いて、ビーム径を調整されたレーザー光は、適宜配置された完全反射ミラー（Ｍ２）及びダイクロイックミラー（Ｍ１）に反射することによって光路を変え、倒立型顕微鏡の対物レンズ（４０）へ入射した。対物レンズ（４０）とカバーガラス（５０）との間には、油浸対物レンズ用オイル（４１）を満たし油浸を行った。レーザー光が対物レンズ（４０）で屈折し、カバーガラスへ臨界角（６１．０度）より大きい角度で入射するように（全反射現象を生じるように）光軸調整することにより、カバーガラス（５０）表面上の試料に対してエバネッセント光を照射した。
対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡においては、開口数が１．４よりも大きい対物レンズを使うと、ガラスの屈折率（１．５２）と水の屈折率（１．３３）とで決まる臨界角（６１．０度）より大きい角度でレーザー光を入射すると全反射現象を生じさせることができる。図５の光学系では、対物レンズ（４０）として、開口数１．４５、倍率１５０倍のものを用いてエバネッセント場を発生させた。
蛍光色素試料溶液は、最終濃度１ｎＭとなるようにＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）に溶解し、当該試料溶液１０μＬを、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍのカバーガラス（５０）上に載置し、その上から同じカバーガラスによってカバーして観察を行った。カバーガラス（５０）表面はコーティングなどは行わず、表面に非特異的に吸着した蛍光色素１分子を観察した。
全反射現象を生じさせることにより得られた１分子の蛍光色素の蛍光像は、完全反射ミラー（Ｍ２）とともに適宜配置されたダイクロイックミラー（Ｍ１）により、波長ごとに４種類に分けられた。図５の光学系では、光路（Ｐ１）：Ｃｏｕｍａｒｉｎ、光路（Ｐ２）：Ａｌｅｘａ４８８、光路（Ｐ３）：Ｃｙ３．５、及び光路（Ｐ４）：Ｃｙ５の蛍光色素が観察できるように、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したダイクロイックミラー（Ｍ１）を用いた。同様に、バンドパスフィルター（６１）（６２）（６３）（６４）についても、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したものを用いた。
波長毎に分割された１分子蛍光像は非常に微弱な光であるため、ＥＢ−ＣＣＤカメラ（８１）（８２）で検出できるように、イメージインテンシファイア（Ｉ．Ｉ．と略される）（７１）（７２）を挿入し光量の増幅を行った。２台のＥＢ−ＣＣＤカメラ（８１）（８２）で得られた１分子蛍光像はビデオフレーム（３０フレーム毎秒）でデジタルビデオ（ＤＶ）フォーマットでビデオレコーダ（９１）（９２）に録画した。２台のビデオレコーダ（９１）（９２）は、録画のタイミングを合わせるために同期させた。
４種類の１分子の蛍光色素をリアルタイムで検出した例を図６〜９に示す。当該光学システムで目的の波長の蛍光色素１分子だけが観察できていることを確認するために、４種類のレーザー（波長：４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍ）を同時に入射した状態で、４種類の色素（Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）ごとに観察を行った。
それぞれの蛍光色素を順に観察すると、該当する１つの画面にのみ検出されていることが判る（図６〜９中では、蛍光色素１分子の蛍光像を白い矢印で示した）。図６〜９のそれぞれにおける４つの画面は、リアルタイムで検出したものである。図６ではＣｏｕｍａｒｉｎｅの青い蛍光のみ、図７ではＡｌｅｘａ４８８の緑の蛍光のみ、図８ではＣｙ３．５のオレンジの蛍光のみ、図９ではＣｙ５の赤い蛍光のみを検出できることが実証された。
〔３．１分子シーケンス〕
［実施例３］
鋳型ＤＮＡとして、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）とが交互に１０塩基連続した配列を有する核酸（５’−ＧＡＧＡＧ  ＡＧＡＧＡ  ＣＣＣＴＣ  ＡＣＧＣＴ  ＧＣＣＡＴ  ＣＣＴＣＣ−３’；配列番号３）とビオチンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（５’Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＡＧＧ  ＡＴＧＧＣ  ＡＧＣＧＴ  ＧＡＧＧＧ−３’；配列番号４）を用い、基質として、Ｃｙ３．５で標識されたｄＣＴＰ（Ｃｙ３．５−ｄＣＴＰ）とＣｙ５で標識されたｄＵＴＰ（Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）との２種類を用い、シーケンスを行った。
鋳型ＤＮＡには、図１０に示すように、プライマー配列を介してビオチンが標識されている。そして、当該ビオチン標識を、アビジンコートされたカバーガラスに結合させることによって、鋳型ＤＮＡをカバーガラスに固定させている。この状態で、Ｃｙ３．５−ｄＣＴＰとＣｙ５−ｄＵＴＰとＤＮＡポリメラーゼβとを含む混合溶液１０μＬ（最終濃度：１０μＭ  ＤＮＡポリメラーゼβ、０．５ｎＭ  Ｃｙ３．５−ｄＣＴＰ、０．５ｎＭ  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ塩化マグネシウム）を流し込むことによってＤＮＡ合成反応を開始し、蛍光の検出を行った。また、反応温度を室温にし、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの濃度を０．５ｎＭにすることで、ＤＮＡポリメラーゼβの反応効率を下げてビデオフレームで観察できる遅い合成速度となるようにした。
実時間観察による蛍光の検出の様子を、図１１に示す。取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを分かりやすくするために、各蛍光波長ごとに得られた白黒画像に疑似カラーを付け重ね合わせた画像とした。疑似カラーは、Ｃｙ５−ｄＵＴＰを赤とし、またＣｙ３．５−ｄＣＴＰを緑とした。図１１に示すように、時間の経過とともに赤（Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）、緑（Ｃｙ３．５−ｄＣＴＰ）、赤（Ｃｙ５−ｄＵＴＰ）・・・と蛍光が交互に切り替わって検出されている。すなわち、鋳型ＤＮＡの配列をＡ、Ｇ、Ａ・・・と読むことができ、シーケンスが達成できたことが実証できた。
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他の色々な形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
［配列表］
2007135760.tif 000003
2007135760.tif 000004
【図１】
2007135760.tif 000005
【図５】
2007135760.tif 000006
【図１０】
2007135760.tif 000007
【図２】
2007135760.tif 000008
【図３】
2007135760.tif 000009
【図４】
2007135760.tif 000010
【図６】
2007135760.tif 000011
【図７】
2007135760.tif 000012
【図８】
2007135760.tif 000013
【図９】
2007135760.tif 000014
【図１１】
2007135760.tif 000015
【国際調査報告】
2007135760.tif 000016
2007135760.tif 000017
2007135760.tif 000018
2007135760.tif 000019