(57)【要約】  プロテアーゼによりアルブミンを効率良く分解するためのアルブミン変性剤の提供。  炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含むアルブミン変性剤とする。アルブミン変性剤の存在下、試料中のアルブミンをプロテアーゼで分解し、得られたアルブミン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させ、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、アルブミンに対する糖化アルブミンの割合（ＧＡ（％））を決定する。
2007049762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン変性剤であって、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含むことを特徴とするアルブミン変性剤。
【請求項２】
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテートおよび塩化ラウリルトリメチルアンモニウムからなる群から選択された少なくとも一つの第四級アンモニウムまたはその塩を含む請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項３】
炭素数１４以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含む請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項４】
炭素数１４以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩の混合物を含む請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項５】
炭素数１６以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含む請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項６】
炭素数１４〜１８の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含む請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項７】
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウムおよびココナットアミンアセテートからなる群から選択された少なくとも一つの第四級アンモニウムまたはその塩を含む請求項３記載のアルブミン変性剤。
【請求項８】
請求項１記載のアルブミン変性剤を含むアルブミン変性用組成物であって、さらにプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼは、前記第四級アンモニウム０．０２〜２０ｍｍｏｌ当たり１〜１，６００，０００Ｕ含まれるアルブミン変性用組成物。
【請求項９】
請求項１記載のアルブミン変性剤を含むアルブミン変性用組成物であって、さらにプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼは、前記第四級アンモニウム０．０２〜２０ｍｍｏｌ当たり１〜５００，０００Ｕ含まれるアルブミン変性用組成物。
【請求項１０】
請求項１記載のアルブミン変性剤を含むアルブミン変性用組成物であって、さらにプロテアーゼを含み、試料１ｍｌあたり０．００３〜４ｍｍｏｌの前記第四級アンモニウム及び１〜６０，０００Ｕの前記プロテアーゼを添加して使用するアルブミン変性用組成物。
【請求項１１】
請求項１記載のアルブミン変性剤を含むアルブミン変性用組成物であって、さらにプロテアーゼを含み、試料１ｍｌあたり０．００３〜４ｍｍｏｌの前記第四級アンモニウム及び１〜３５，０００Ｕの前記プロテアーゼを添加して使用するアルブミン変性用組成物。
【請求項１２】
糖化アルブミンの測定に用いる請求項１記載のアルブミン変性剤。
【請求項１３】
糖化アルブミンの測定に用いる請求項３記載のアルブミン変性剤。
【請求項１４】
アルブミンの分解方法であって、アルブミンを含む試料にプロテアーゼを添加する工程、及び、前記プロテアーゼの添加前、添加と同時、または、添加の後に請求項１に記載のアルブミン変性剤を添加する工程を含み、前記プロテアーゼの添加濃度が、１〜１，６００，０００Ｕ／Ｌであるアルブミンの分解方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼの添加濃度が、１〜５００，０００Ｕ／Ｌである請求項１４記載のアルブミンの分解方法。
【請求項１６】
アルブミンの分解方法であって、アルブミンを含む試料にプロテアーゼを添加する工程、及び、前記プロテアーゼの添加前、添加と同時、または、添加の後に請求項１に記載のアルブミン変性剤を添加する工程を含み、前記プロテアーゼの添加量が、前記試料１ｍｌ当たり１〜６０，０００Ｕであるアルブミンの分解方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼの添加量が、前記試料１ｍｌ当たり１〜３５，０００Ｕである請求項１６記載のアルブミンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン変性剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血球中の糖化アルブミン（ＧＡ）は、生体内血糖値の過去の履歴（約２〜３週間）を反映していることから、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。糖化アルブミンは、アルブミンのリジン残基のε-アミノ基が糖化されており、その量（％）は、総アルブミン量に対する糖化アルブミン量の割合（％）で表される。【０００３】
糖化アルブミンの測定方法としては、一般に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法等があげられるが、簡便且つ安価な方法として、以下のような酵素法が実用化されている。この方法は、まず、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）をアルブミンの糖化部分に作用させ、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記アルブミンの糖化量に対応する。この反応液に、さらにペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する発色基質とを添加し、ＰＯＤを触媒として過酸化水素と発色基質との間で酸化還元反応させる。そして、前記発色基質の発色程度を測定してアルブミンの糖化量を求め、糖化量と総アルブミン量とから糖化アルブミンの割合（以下、「ＧＡ（％）」ともいう）を算出できる。【０００４】
前述のように、糖化アルブミンは、リジン残基のε-アミノ基の糖化が特徴であるため、ＦＡＯＤが糖化されたリジン残基に効率良く作用することが望まれている。このＦＡＯＤはタンパク質には直接作用し難いことから、通常、プロテアーゼ処理によってアルブミンの分解物を調製し、これにＦＡＯＤを作用させている。【０００５】
しかしながら、血液試料中のアルブミンは、精製された試薬レベルのアルブミンと異なり、例えば、ビリルビンやリポタンパク質等の様々な物質が結合しているため、プロテアーゼによって、ＦＡＯＤが作用し易いような断片を得ることが困難である。このため、血清や血漿等の試料中におけるアルブミンを測定する際には、試料に多量のプロテアーゼを添加して反応性を高める必要があるが（特許文献１）、これによって以下のような問題が生じている。
・多量のプロテアーゼの存在によって、糖化アルブミンの測定に使用する他の試薬中の酵素等が失活する。
・多量のプロテアーゼが含まれる場合、その試薬のごく一部が、他の測定試薬に混在するだけで、他の試薬における酵素や抗体が失活し、他の測定試薬が使用できなくなる。
・多量のプロテアーゼを添加するために、高濃度プロテアーゼ溶液が必要となるが、プロテアーゼが自己消化し、安定性が低下する。
・ドライ系の測定を目的とする場合、例えば、試験片の作製に必要な高濃度のプロテアーゼ溶液の調製が困難である。
・多量のプロテアーゼによりコストが高くなる。
【特許文献１】国際公開第２００２／０６１１１９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、プロテアーゼによりアルブミンを効率良く分解するためのアルブミン変性剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アルブミン変性剤であって、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明は、プロテアーゼによって試料中のアルブミンを分解する方法であって、本発明のアルブミン変性剤の存在下、試料のプロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。【０００９】
また、本発明の糖化アルブミンの測定方法は、プロテアーゼにより試料中のアルブミンを分解する工程、得られたアルブミン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させる工程、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、アルブミンにおける糖化アルブミンの割合を決定する工程とを含み、前記アルブミンの分解工程において、本発明のアルブミン変性剤の存在下で試料のプロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。【００１０】
なお、本発明において、「アルブミン」とは、糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンの両方を意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアルブミン変性剤を用いれば、メカニズムは不明であるが、アルブミンを変性できるため、その存在下でプロテアーゼ処理を行うことによって、効率良くアルブミンの分解を行うことができる。このため、例えば、少ないプロテアーゼで十分なアルブミン分解が実現でき、従来のようにプロテアーゼを多量に使用することによる問題も回避できる。したがって、このようなアルブミン変性剤を用いる本発明のアルブミン分解方法ならびに糖化アルブミンの測定方法によれば、従来よりも効率よく糖化アルブミンの測定を行うことができ、糖尿病の診断や治療等、医療分野において極めて有用であるといえる。また、このように、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩がアルブミンを変性でき、これによってアルブミンの分解がプロテアーゼにより効率よく行われることは、本発明者らが初めて見出したことである。このため、前述のような第四級アンモニウムを含む本発明のアルブミン変性剤は、前述のような医療分野において極めて有用な試薬となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例において、アルブミンの分解程度を表す吸光度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のアルブミン変性剤は、前述のように炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩（以下、あわせて「第四級アンモニウム」ともいう）を含むことを特徴とする。【００１４】
前記炭化水素基の炭素数は、１２以上であればよく、好ましくは１４以上、より好ましくは１６以上である。また、炭素数の上限は、特に制限されない。例えば、炭素数１４〜１８の炭化水素基が好ましい。また、本発明のアルブミン変性剤は、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩の混合物を含んでもよい。例えば、本発明のアルブミン変性剤は、炭素数１４以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウムまたはその塩の混合物を含むアルブミン変性剤を好ましく含む。【００１５】
前記炭化水素基は、例えば、直鎖または分枝のアルキル、直鎖または分枝であり置換基を有するアルキル、置換基を有するアリール等があげられ、前記置換基は、互いに同一であるかまたは異なり、前記置換基は、例えば、ハロゲン、直鎖もしくは分枝アルキル、フェニル、ヒドロキシ、直鎖もしくは分枝Ｃ1〜Ｃ6アルコキシであり、前記アリールは、例えば、フェニルまたはシクロヘキシルである。また、これらに代えて、直鎖または分枝鎖アルキルカルボニルであってもよい。【００１６】
第四級アンモニウムの具体例としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（Ｃ6Ｈ5−ＣＨ2−Ｎ+(ＣＨ3)2−Ｒ  Ｃｌ-；Ｒ＝Ｃ8Ｈ17〜Ｃ18Ｈ37）、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム（（ＣＨ3）3Ｃ−ＣＨ2−Ｃ(ＣＨ3)2−Ｃ6Ｈ4−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2-ＣＨ2−Ｎ+(ＣＨ3)2−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5  Ｃｌ-）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート（ＲＮＨ2・ＣＨ3ＣＯＯＨ；Ｒ＝Ｃ8〜Ｃ18）、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等があげられる。これらの化合物は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を使用してもよい。【００１７】
また、本発明のアルブミン変性剤は、前述の第四級アンモニウムを含んでいればよく、これのみから構成されてもよいし、他の化合物をさらに含んでもよい。本発明において、このように本発明のアルブミン変性剤が前述の第四級アンモニウムまたはその塩のほかに他の化合物を含んでいるものを本発明のアルブミン変性用組成物ともいう。他の化合物としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）等のキレート剤；アセチルトリプトファン等のカルボン酸；ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ等のスルホン酸系等の緩衝剤があげられる。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。【００１８】
本発明のアルブミン変性剤および本発明のアルブミン変性用組成物の形態は、例えば、液体でもよいし、粉体、固体等でもよい。本発明のアルブミン変性剤における前記第四級アンモニウムの含有量は特に制限されないが、例えば、後述する試料や反応液等に添加した際、必要とされる濃度になるように設定すればよい。【００１９】
つぎに、本発明のアルブミンの分解方法は、前述のように、本発明のアルブミン変性剤または本発明のアルブミン変性用組成物の存在下、試料のプロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。【００２０】
本発明において、試料に対するアルブミン変性剤または本発明のアルブミン変性用組成物の添加順序は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼの添加前、添加と同時、添加後のいずれであってもよい。また、本発明のアルブミン変性用組成物は、プロテアーゼを含むものであってもよい。【００２１】
前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（天野エンザイム社製）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。【００２２】
プロテアーゼ処理の反応液における前記第四級アンモニウムの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜３ｍｍｏｌ／Ｌである。血漿試料１ｍｌ当たりの第四級アンモニウムの添加割合は、例えば、０．００３〜４ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０１５〜０．６ｍｍｏｌである。なお、本発明のアルブミン変性剤および本発明のアルブミン変性用組成物における第四級アンモニウムの含有量は、前述のように特に制限されず、試料に添加した際、プロテアーゼ処理の反応液における第四級アンモニウムの添加割合を上述のような範囲に調整できる含有量であることが好ましい。【００２３】
前記反応液におけるプロテアーゼの添加割合は、例えば、０．０１〜２０，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１，６００ＫＵ／Ｌあり、より好ましくは１〜５００ＫＵ／Ｌである。血漿試料１ｍｌあたりのプロテアーゼの添加割合は、例えば、１〜８，０００ＫＵの範囲であり、好ましくは１〜２４０ＫＵであり、より好ましくは１〜６０ＫＵであり、さらにより好ましくは１〜３５ＫＵである。ここで、ＫＵは、１０3×Ｕ（酵素単位）である。酵素単位Ｕは、使用するプロテアーゼの製造業者が提供する酵素単位Ｕを用いてもよく、または、１Ｕが、３０℃、１分間にミルクカゼイン（例えば、メルク社製）を分解して１μｇのチロシンの相当する呈色を示すプロテアーゼ活性度と定義される酵素単位Ｕであってもよい。すなわち、プロテアーゼ溶液を、適当な酵素希釈溶液（例えば、２０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  酢酸カルシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム）に適度に（例えば、１０〜２０Ｕとなるように）希釈し、この液１ｍＬを試験管にとり３０℃に加温する。これに予め３０℃の加温しておいた基質（０．６％  ミクルカゼイン）溶液を５ｍＬ加える。１０分後、５ｍＬの反応停止液（０．１１Ｍ  トリクロル酢酸、０．２２Ｍ  酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ  酢酸）を加え反応を停止させる。その後、そのまま３０℃、３０分加温を続けて沈殿を凝集させ、フィルター（例えば、東洋ろ紙Ｎｏ．１３１（９ｃｍ））でろ過してろ液を得る。このろ液２ｍＬに、５ｍＬの０．５５Ｍ  炭酸ナトリウム溶液、１ｍＬの３倍希釈フォリン試薬を加え３０℃、３０分反応した後６６０ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度と、別途Ｌ−チロシンを用いて作成した標準曲線とを使用してプロテアーゼの酵素活性度を測定する。その結果、３０℃、１分間に基質（ミルクカゼイン）を分解して１μｇのチロシンの相当する呈色を示すプロテアーゼ活性度に相当するプロテアーゼの量を１Ｕと定義できる。なお、本発明のアルブミン変性用組成物がプロテアーゼを含む態様である場合、第四級アンモニウム及びプロテアーゼの含有量は、前述のように特に制限されず、試料に添加した際、プロテアーゼ処理の反応液における第四級アンモニウムおよびプロテアーゼの添加割合を上述のような範囲に調整できる含有量であることが好ましい。【００２４】
プロテアーゼ処理の条件は特に制限されないが、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間（特に上限）は制限されないが、例えば、０．１〜６０分程度でプロテアーゼ処理を行うことが可能であり、例えば、０．５〜５分処理を行うことが好ましい。本発明の方法によれば、本発明のアルブミン変性剤（第四級アンモニウム）を添加しない従来の方法に比べて、約１／１０以下に分析時間を短縮することが可能である。【００２５】
前記プロテアーゼ処理は、例えば、緩衝液中で行うことが好ましく、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。また、プロテアーゼ反応液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲であり、例えば、前述のような緩衝液によってｐＨを調整してもよい。【００２６】
プロテアーゼ処理の際、本発明のアルブミン変性剤に加えて、さらに、前述のような化合物を共存させてもよい。前記化合物の添加割合は、特に制限されないが、例えば、以下のような条件があげられる。【００２７】
つぎに、本発明の糖化アルブミン測定方法は、前述のように、プロテアーゼにより試料中のアルブミンを分解する工程、得られたアルブミン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させる工程、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、アルブミンに対する糖化アルブミンの割合を決定する工程とを含み、前記アルブミンの分解工程において、本発明のアルブミン変性剤の存在下で試料のプロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。【００２８】
前記ＦＡＯＤとしては、例えば、アミノ酸側鎖のアミノ基（ε-アミノ基）が糖化された糖化アミン（例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチド）を基質として、過酸化水素を発生する反応を触媒する酵素が好ましい。このような触媒反応は、下記式（１）で表すことができる。【００２９】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  Ｏ2
→  Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ2−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ2      …（１）【００３０】
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。【００３１】
前記式（１）において、ε-アミノ基が糖化されている糖化アミンのＲ2は、下記式（２）で示すことができる。【００３２】
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7    …（２）【００３３】
前記式（２）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。【００３４】
また、前記式（２）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（３）で示すことができる。なお、下記式（３）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。【００３５】
−（ＣＯ−ＣＲ3Ｈ−ＮＨ）n−Ｈ        …（３）【００３６】
また、前記式（２）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（４）で示すことができる。なお、下記式（４）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。【００３７】
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ          …（４）【００３８】
なお、本発明におけるＦＡＯＤは、前記式（１）において示されるε-アミノ基が糖化された糖化アミンに加えて、α‐アミノ基が糖化された糖化アミンをも基質とする触媒機能を有していてもよい。【００３９】
ＦＡＯＤの中でも、ε-アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ-Ｓ」という）としては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会  平成１２年度  「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀  他」）等があげられる。また、ε-アミノ基が糖化された糖化アミンおよびα-アミノ基が糖化された糖化アミンの両方に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ-αＳ」）としては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）等があげられる。【００４０】
以下に、本発明の糖化アルブミン測定方法の一例を示すが、これには制限されない。【００４１】
まず、前述と同様にして、本発明のアルブミン変性剤の存在下で、アルブミン含有試料をプロテアーゼ処理する。前記試料の種類は、特に制限されないが、例えば、全血、血漿、血清、溶血試料等があげられる。【００４２】
そして、前記プロテアーゼ処理により得られたアルブミン分解物をＦＡＯＤで処理する。これによって、アルブミン分解物におけるε‐アミノ基の糖化部分にＦＡＯＤが作用し、前記式（１）に示すように過酸化水素が生成される。【００４３】
ＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。ＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、６〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜３８℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０．１〜６０分、好ましくは０．１〜５分である。【００４４】
ＦＡＯＤ処理の反応液におけるＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０．０１〜５０ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ＫＵ／Ｌである。また、血漿試料１ｍｌ当たりのＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０．０１〜１０ＫＵの範囲であり、好ましくは０．０４〜１．５ＫＵである。【００４５】
つぎに、前記アルブミン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定する。この酸化還元反応の測定は、例えば、前記式（１）の反応によって生じる過酸化水素量や、前記反応で消費される酸素量の測定によって行うことができる。【００４６】
前記過酸化水素量は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と酸化により発色する基質（以下、「発色基質」）とを用いて、これらと発生した過酸化水素との反応により前記発色基質を発色させ、この発色程度の測定によって算出することができる。なお、過酸化水素量は、ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、電気的手法等によって測定することもできる。【００４７】
前記酸化により発色する基質（発色基質）としては、特に制限されず、例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ"，Ｎ"−ヘキサ（3-スルホプロピル）−４，４'，４"−トリアミノトリフェニルメタンヘキサナトリウム塩（例えば、商品名ＴＰＭ−ＰＳ、同仁化学社製）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組合せた基質等があげられる。トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。中でも、前述の第四級アミンの還元力によっても、酸化により発色した色素が消失し難いことから、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよびＴＰＭ-ＰＳが好ましい。【００４８】
ＰＯＤ反応は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行われることが好ましく、前述のような緩衝液が使用できる。ＰＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、５〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０．１〜５分である。【００４９】
ＰＯＤ反応液におけるＰＯＤの添加割合は、例えば、０．０１〜６００ＫＵ/Ｌの範囲である。前記反応液における発色基質の添加割合は、例えば、０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．００１〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。【００５０】
このように発色基質を用いた場合は、例えば、その発色（例えば、反応液の吸光度）を分光光度計で測定すればよい。過酸化水素量はアルブミンの糖化量（糖化アルブミン量）に対応するため、測定した吸光度から糖化アルブミンの濃度を算出できる。そして、下記式より、試料中の全アルブミン濃度に対する糖化アルブミン濃度の割合（１００分率）を算出できる。この割合は、一般に、ＧＡ（％）として表記できる。なお、アルブミン量（濃度）は、従来公知の方法や、市販の試薬キットによって測定できる。【００５１】
ＧＡ（％）＝（糖化アルブミン濃度/アルブミン濃度）×１００【００５２】
吸光度からの糖化アルブミン濃度の算出は、例えば、既知糖化アルブミン量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。例えば、糖化アルブミン量が既知であるアルブミン標準液について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の測定値と既知糖化アルブミン量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、糖化アルブミン濃度が算出できる。【００５３】
以上のような糖化アルブミンの測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組合せで各処理を同時に行ってもよい。また、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色基質の添加順序も特に制限されない。【００５４】
１  ：  プロテアーゼ処理＋アルブミン分解物のＦＡＯＤ処理
２  ：  ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
３  ：  プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理【００５５】
また、本発明の糖化アルブミンの測定方法においては、他のタンパク質による影響を低減するため、例えば、本発明のアルブミン変性剤または本発明のアルブミン変性用組成物の添加前に、プロテアーゼとＦＡＯＤとを試料に添加し（さらに、ＰＯＤを添加してもよい）、前処理としてのプロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理を行ってもよい。試料中に他の糖化タンパク質が存在すると、プロテアーゼ処理によって他の糖化タンパク質も分解され、その分解物にＦＡＯＤが作用して過酸化水素が発生し、その量をも測定することとなり、測定誤差が生じる場合がある。このような場合、予め試料に前記前処理を行っておけば、本発明の変性剤または変性用組成物の添加によりアルブミンを変性させ、その分解を促進する前に、他の糖化タンパク質はすでに前処理用プロテアーゼと前処理用ＦＡＯＤにより処理されるため、他の糖化タンパク質による影響を軽減できる。【００５６】
前処理用プロテアーゼとアルブミン分解用のプロテアーゼは、同じ種類であっても異なる種類であってもよい。同じ種類のプロテアーゼを使用する場合には、前処理用およびアルブミン用として、その都度、試料に添加してもよいし、前処理用プロテアーゼを添加してから、他のタンパク質に作用させるために一定時間おいた後、さらにプロテアーゼを添加することなく、本発明のアルブミン変性剤または本発明のアルブミン変性用組成物の添加によりアルブミン分解を促進させてもよい。また、異なる種類のプロテアーゼを使用する場合には、前処理用として、例えば、他の糖化タンパク質を選択的に分解するプロテアーゼを使用することもできる。ＦＡＯＤは、同じ種類であることが好ましく、前処理用に添加したＦＡＯＤをそのまま利用してアルブミン分解物と反応させてもよいし、前処理用およびアルブミン分解物の処理用として、その都度添加することもできる。【００５７】
本発明の糖化アルブミンの測定方法を簡便に行うために、上述のアルブミン変性剤、酵素や基質等を複数の混合試薬としてキット化することも可能である。下記表１に、混合試薬の組合せを例示するが、これには制限されない。なお、各試薬は、試料に対して番号順（第１→第２）に添加していけばよい。下記表１のとおり、本発明のアルブミン変性用組成物は、第１試薬（組み合わせ２）にも第２試薬（組み合わせ１、３〜５）にもなることができる。【００５８】
【表１】
2007049762.tif 000003
【００５９】
また、本発明のアルブミン変性剤である第四級アンモニウムは、さらに、発色基質である１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）の液体での安定性を向上することもできる。このため、第四級アンモニウムを、発色基質を含む試薬に添加しておくことも好ましい。これによって、発色基質の安定化を向上させ、且つ、試料への添加によってアルブミンを変性してプロテアーゼによるアルブミン分解を促進することもできる。【００６０】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
第四級アンモニウムの存在下で血漿試料のプロテアーゼ処理を行い、アルブミン分解の効率の向上を確認した。【００６２】
＜第１試薬：Ｒ１＞
Ｔｒｉｃｉｎｅ                          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ(ｐＨ８)
ＦＡＯＤ（アークレイ社製、以下同じ）      ２．５ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ                                        ２ＫＵ／Ｌ【００６３】
＜第２試薬：Ｒ２＞
添加剤                                                ０．２ｇ／Ｌ
メタロプロテアーゼ（アークレイ社製、以下同じ）    １３００ＫＵ／Ｌ
発色試薬                                      ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
（商品名ＤＡ‐６７、和光純薬社製）【００６４】
＜第２試薬への添加剤＞
実施例
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム※1  （ナカライテスク社製）
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム※2  (商品名コータミン８６Ｐコンク：花王社製)
臭化セチルトリメチルアンモニウム
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
塩化ベンザルコニウム
塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム
塩化ベンゼトニウム
臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（ナカライテスク社製）
ココナット アミンアセテート  (商品名アセタミン２４：花王社製)
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム  (商品名コータミン２４Ｐ：花王社製)
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム
比較例
臭化ベンジルトリエチルアンモニウム
臭化ベンジルトリメチルアンモニウム
塩化テトラエチルアンモニウム
アミポール（ベタイン型両性界面活性剤)（商品名アミポール：日華化学社製）【００６５】
＜血漿試料＞
健常者の血漿を所定の希釈倍率（０倍、２倍、４倍）となるように精製水で希釈したものを試料とした。試料における血漿の含有率によって、未希釈の試料は「１．０」、２倍希釈の試料は「０．５」、４倍希釈の試料は「０．２５」とし、コントロールの精製水は、「０」と表記する。【００６６】
＜測定方法＞
血漿試料１．２μＬと前記第１試薬（Ｒ１）７８μＬを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、前記第２試薬（Ｒ２）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ0）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ5）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）によって測定し、その差（Ａ5−Ａ0）を求めた。これらの結果を下記表２に示す。また、第２試薬の添加剤として塩化ステアリルトリメチルアンモニウムを使用した場合の吸光度の経時変化を図１に示す。【００６７】
【表２】
2007049762.tif 000004
【００６８】
前記表２に示すように、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第四級アンモニウム塩を用いた実施例１は、それ以外の第四級アンモニウムや界面活性剤を使用した比較例１と比べて、アルブミンの分解が格段に効率良く行われていることがわかる。また、比較例１では、血漿試料の種類（血漿の含有率）によって吸光度の差がほとんど見られなかった。これに対して、実施例１では、希釈倍率が低い程、すなわち試料中の血漿含有率が高い程、高い吸光度を示す結果となり、試料中の血漿含有率と吸光度増加は相関関係を示した。このことから、実施例１の第四級アンモニウムによって、アルブミンが変性し、プロテアーゼによる分解が効率よく行われていることがわかる。さらに、図１に示すように、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムを使用した実施例では、第２試薬の添加直後において、コントロールよりも吸光度の増加が見られた。つまり、第四級アンモニウムを添加すると、迅速にプロテアーゼによる分解が行われ。このことから、第四級アンモニウムの添加時点は特に制限されず、プロテアーゼ処理時に共存さえしていればよいといえる。【００６９】
（比較例２）
さらに、添加剤として各種界面活性剤（下記表３記載）を使用して、プロテアーゼによるアルブミン分解の効率向上を確認した。【００７０】
＜第１試薬＞
ＭＯＰＳ                      ３０ｍｍｏｌ／Ｌ(ｐＨ７．５)
ＦＡＯＤ                          １０ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ                              ２ＫＵ／Ｌ
界面活性剤                          ２ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌ【００７１】
＜第２試薬＞
メタロプロテアーゼ                  １０，０００ＫＵ／Ｌ
発色試薬                            ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
（商品名ＴＰＭ‐ＰＳ、同仁化学社製）
ＣａＣｌ2                            ５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭＯＰＳ                              １５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）【００７２】
＜血漿試料＞
健常者の血漿を所定の希釈倍率（０倍、１／３倍、２倍、４倍）となるように精製水で希釈したものを試料とした。試料における血漿の含有率によって、未希釈の試料は「１．０」、１／３倍希釈の試料は「０．７５」、２倍希釈の試料は「０．５」、４倍希釈の試料は「０．２５」とし、コントロールの精製水は、「０」と表記する。【００７３】
＜測定方法＞
血漿試料１．２μＬと前記第１試薬７８μＬを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、前記第２試薬２６μＬを添加して３７℃で５分間インキュベートした。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ0）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ5）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ5−Ａ0）を求めた。これらの結果を下記表３に示す。【００７４】
【表３】
2007049762.tif 000005
【００７５】
前記表３に示すように、各種界面活性剤をプロテアーゼと共存させても、アルブミン分解の効率の向上は確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上のように、本発明のアルブミン変性剤によれば、その存在下でプロテアーゼ処理を行うことによって、効率良くアルブミンの分解を行うことができる。このため、例えば、少ないプロテアーゼで十分なアルブミン分解が実現でき、従来のようにプロテアーゼを多量に使用することによる問題も回避できる。したがって、このようなアルブミン変性剤を用いる本発明のアルブミン分解方法ならびに糖化アルブミンの測定方法によれば、従来よりも効率よく糖化アルブミンの測定を行うことができ、糖尿病の診断や治療等、医療分野において極めて有用であるといえる。
【図１】
2007049762.tif 000006
【国際調査報告】
2007049762.tif 000007
2007049762.tif 000008
2007049762.tif 000009
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