(57)【要約】  細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物であって、該リガンド構築物が少なくとも１つの基材結合用官能基を有するリガンド構築物。本発明のリガンド構築物により、種々の人工基材へのリガンド構築物の固定化が容易になり、最適な基材に人工マトリクスを容易に調製でき、それにより細胞を安定して培養することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物であって、該リガンド構築物が少なくとも１つの基材結合用官能基を有するリガンド構築物。
【請求項２】
スペーサーの長さが１〜３００ｎｍである請求項１記載のリガンド構築物。
【請求項３】
スペーサーが核酸からなる請求項１又は２記載のリガンド構築物。
【請求項４】
スペーサーが複数の核酸からなり、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子がそれぞれ同一又は異なる核酸鎖に結合してなるものである、請求項３記載のリガンド構築物。
【請求項５】
核酸がデオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸又はそれらの誘導体である請求項３又は４記載のリガンド構築物。
【請求項６】
リガンド分子を、デオキシリボ核酸又はその誘導体の５’末端及び／又は３’末端に結合してなる請求項５記載のリガンド構築物。
【請求項７】
基材結合用官能基が、ビオチン又はその誘導体である請求項１〜６いずれかに記載のリガンド構築物。
【請求項８】
請求項１〜７いずれかに記載のリガンド構築物及び基材を含有する細胞培養用基材であって、該リガンド構築物が基材結合用官能基を介して基材部に固定化されてなる細胞培養用基材。
【請求項９】
基材部にアビジン、ストレプトアビジン又はそれらの誘導体が含まれる請求項８記載の細胞培養用基材。
【請求項１０】
リガンド構築物が基材表面１ｃｍ２当り０．１ｆｍｏｌ〜１６６×１０３ｆｍｏｌ固定化されてなる請求項８又は９記載の細胞培養用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死といった細胞機能を制御し得る細胞培養用材料に関する。詳しくは、基材に固定化されるための官能基を含み、細胞受容体に結合し得るリガンド分子をナノメートルオーダーで配列させ得るリガンド構築物、及び該構築物が官能基を介して基材部に固定化されてなる細胞培養用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を用いて様々な物質を評価する試みや細胞を医療に応用する試みが盛んに行われている。細胞を用いて様々な物質を評価する試みとして、例えば、薬物の薬効・薬理・毒性に関する試験を効率的に行うシステム、動物実験を代替する細胞を利用した評価システム、細胞を用いた各種センサー、細胞の増幅方法や分化の仕組みを探索するシステム等の開発が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
また、細胞を医療に応用する試みとして、例えば体外で培養した細胞を移植して治療したり、スキャホールド（細胞の足場となる生分解性の材料）を細胞と共に体内に埋め込み欠損部を再生させるといった細胞（再生）医療、バイオ人工臓器、患者個人の細胞を体外で評価することにより個々に最適な医療を提供するための診断方法等の開発が挙げられる（例えば、非特許文献２参照）。【０００４】
以上のような用途に細胞を利用するには生体外、すなわち人工的な基材の上で、細胞の機能、例えば、接着、増殖、分化、未分化、細胞死等を精緻に制御する技術が必要となる。本来の性質を失った細胞の使用は、例えば薬物の毒性を誤って解釈する、移植した細胞が生体内で機能しない等、上記の用途にとっては致命的な欠陥となる。このような問題点を解決するため、人工基材を種々改変する試みが活発になされている。その際に細胞、特に細胞表面受容体が認識できる細胞接着性のリガンド分子が重要な機能を担うことになる。【０００５】
リガンド分子として生体内から抽出した細胞外マトリクスであるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を用いて人工基材を被覆し、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究が古くから行われている（例えば、非特許文献２、３参照）。リガンド分子としてホルモンや増殖因子を用いて人工基材を被覆する方法でも同様の試みがなされている（例えば、非特許文献４参照）。【０００６】
しかし、抽出した細胞外マトリクスによって細胞の機能を制御する方法では、生体内から精製できる細胞外マトリクスの種類が限られる、微量の抽出困難な細胞外マトリクスを用いることができない、純度や不純物等の影響により再現性の高い結果を得ることが困難である、という問題がある。そのため、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再構成することは困難であった。【０００７】
以上の問題点を解決すること、細胞外マトリクスの作用を単純化して理解すること、さらには移植用材料として、抽出マトリクスに付き纏う病原体の混入の問題を解決するため、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリクスに含有され、かつ細胞表面受容体に認識され得る合成ペプチド分子（例えば、アミノ酸を一文字表記するとＲＧＤ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ等のアミノ酸配列）をリガンド分子として用い、密度及び種類を種々変更して人工基材上に被覆して細胞機能を制御する試みもなされている（例えば、非特許文献５、６参照）。しかし、単純な合成ペプチド分子でただ単に人工基材を被覆するだけでは、十分な細胞機能の制御は困難であった。【０００８】
上述したような方法と組み合わされる形で、微細加工された基材表面に細胞を相互作用させて細胞の機能を制御する試みもなされている。例えば、インクジェットリソグラフィー法（例えば、特許文献１，２参照）、光リソグラフィー法（例えば、特許文献３，４及び非特許文献７参照）、マイクロコンタクトプリンティング法（例えば、特許文献５，６、非特許文献８参照）等の手法を用い、リガンド分子を配列させて細胞機能を制御する試みがなされている。これらの微細加工による方法では細胞自体の配置等を制御することが主たる目的である。従って、人工基材を被覆しているリガンド分子は、抽出された細胞外マトリクスや合成ペプチド分子であって、当然ながら細胞の機能を十分に制御できているとは言えなかった。【０００９】
その一方で、例えば、ディルーロ（ＤＡ．Ｄｉ  Ｌｕｌｌｏ）らは、約３００ｎｍの長さを有するＩ型コラーゲン分子鎖上に、種々の細胞表面受容体に結合するリガンド部位がナノメートルオーダーで配列して存在することを報告している（非特許文献９）。この概念に従えば、上述したようなリガンド分子の結合密度や種類を単純に変化させて人工基材上に固定化する方法や、マイクロメートルオーダーの微細加工をそれに組み合わせる方法等のような従来の細胞機能の制御方法では、十分な細胞機能を導き出すことは困難であると考えられる。【００１０】
近年、ナノ構造を制御した表面によって細胞機能を制御する試みも実施され始めている。カーチス（ＡＳＧ．Ｃｕｒｔｉｓ）らのグループは高分子間の相分離による表面ナノトポグラフィーの制御に成功し、ナノ構造と細胞機能の相関性について検討を進めている（例えば、特許文献７、非特許文献１０参照）。しかし、この技術では、単に基材表面の凹凸構造をナノスケールで制御しているに過ぎず、種々のリガンド類をナノスケールで配列させることは困難である。【００１１】
エレクトロスピニング法等により調製したナノファイバーに細胞を接触させ、機能制御する試みも最近報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。しかし、本方法においても単に基材表面の凹凸構造をナノスケールで制御しているに過ぎず、任意のリガンド分子をナノスケールで配列させることはできない。【００１２】
ナノメートルスケールで任意の物質を任意の位置に付与する方法として、原子間力顕微鏡の探針にタンパク質等の溶液を付け基板にナノメータースケールの描画をする技術、ディップペンナノリソグラフィーが提案されている（例えば、非特許文献１２及び１３参照）。しかし、この技術でもライン幅及びドット径は３０から５０ｎｍであり、コラーゲン分子に観察されるようなナノスケールでのリガンド分子の配列を再現して調製することは微細性の観点から困難である。さらに言えば、このディップペンナノリソグラフィーでは細胞の培養に適した広い範囲への描画は困難であり、今のところ実用は困難である。【００１３】
以上の微細加工技術では限界のあるリガンド分子のナノスケールでの配列を実現できる方法として、ナノメーターの長さを有する高分子スペーサーによりリガンド分子を連結する技術（スペーサー法）が報告されている。ダイ（Ｗ．Ｄａｉ）らはフィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体のリガンド分子であるＲＧＤ分子又はラミニン中のリガンド分子であるＹＩＧＳＲ分子どうしを分子量が約３５００のポリエチレングリコール鎖を介して２分子結合させたリガンド構築物が細胞凝集剤として利用できることを報告している（例えば、非特許文献１４参照）。【００１４】
また、川崎らは、フィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体のリガンド分子であるＲＧＤと、そのシナジー配列であるＰＨＳＲＮを、平均分子量約２５００〜約３４００のポリエチレングリコール鎖を介して結合させたリガンド構築物を合成している。この分子をディッシュ上に固定し、細胞の伸展具合を観察している（非特許文献１５及び１６参照）。同様にフィブロネクチン中のリガンド分子であるＲＧＤとＥＩＬＤＶやラミニン中のリガンド分子であるＰＤＳＧＲとＹＩＧＳＲを結合させた分子を合成し、ガン転移抑制試験に用いている（例えば、非特許文献１７及び１８参照）。
【特許文献１】特開２００２−３５５０２５号公報
【特許文献２】特開２００２−３５５０２６号公報
【特許文献３】特開平７−３０８１８６号公報
【特許文献４】特開平１１−１５１０８６号公報
【特許文献５】特表２００２−３５５０３１号公報
【特許文献６】特表２００２−５０９００１号公報
【特許文献７】特表２００２−５０５９０７号公報
【非特許文献１】石川智久、堀江透  編集、創薬サイエンスのすすめ−ポストゲノム時代のパラダイムシフト、共立出版（２００２）
【非特許文献２】ＰＰ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献３】小出輝、林利彦  編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）
【非特許文献４】Ｙ．Ｉｔｏ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３３３（１９９９）
【非特許文献５】Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５（２００３）
【非特許文献６】Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３（２００３）
【非特許文献７】ＡＳ．Ｂｌａｗａｓ，ＷＭ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９，５９５−６０９（１９９８）
【非特許文献８】ＲＳ．Ｋａｎｅ，Ｓ．Ｔａｋａｙａｍａ，Ｅ．Ｏｓｔｕｎｉ，ＤＥ．Ｉｎｇｂｅｒ，ＧＭ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３６３−２３７６（１９９９）
【非特許文献９】ＧＡ．Ｄｉ  Ｌｕｌｌｏ，Ｓｍ．Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｋｏｒｋｋｏ，Ｌ．Ａｌａｋｏｋｋｏ，ＪＤ．Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（６），４２２３−４２３１（２００２）
【非特許文献１０】ＭＪ．Ｄａｌｂｙ，Ｄ．Ｇｉａｎｎａｒａｓ，ＭＯ．Ｒｉｅｈｌｅ，Ｎ．Ｇａｄｅｇａａｒｄ，Ｓ．Ａｆｆｒｏｓｓｍａｎ，ＡＳＧ．Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，７７−８３（２００４）
【非特許文献１１】ＸＭ．Ｍｏ，ＣＹ．Ｘｕ，Ｍ．Ｋｏｔａｋｉ，Ｓ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，１８８３−１８９０（２００４）
【非特許文献１２】Ｋ−Ｂ．Ｌｅｅ，Ｓ−Ｊ．Ｐａｒｋ，ＣＡ．Ｍｉｒｋｉｎ，ＪＣ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５，１７０２−１７０５（２００２）
【非特許文献１３】ＤＬ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｈｏｎｇ，Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ−Ｇｏｌｏｍｂ，ＣＡ．Ｍｉｒｋｉｎ，ＤＬ．Ｋａｐｌａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９８（２４），１３６６０−１３６６４（２００１）
【非特許文献１４】Ｗ．Ｄａｉ，Ｊ．Ｂｅｌｔ，ＷＭ．Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７９７−８０１（１９９４）
【非特許文献１５】Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）
【非特許文献１６】Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）
【非特許文献１７】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｎｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｙ．Ｋａｎｅｄａ，ｙ．Ｍｕ，ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＫＷ．Ｌｅｍ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，５９５−５９８（１９９７）
【非特許文献１８】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｍｕ，Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＴＪ．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，４８５−４８９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
以上に例示された先行技術のように、細胞機能を人工的に制御する技術として、ナノ構造を持つ人工的な環境と細胞を相互作用させる技術、ならびにスペーサー法を用いたリガンド分子のナノ配列化の技術に関しては知られていた。しかし、これまでは、細胞培養基材を作製する際にリガンド構築物と基材とを単なる物理的吸着により結合させていたため、使用できる基材が限定されるという欠点があった。その結果、例示した従来技術を用いている限りにおいては細胞に対して最適な基材が選択できず、目的とする細胞を安定して
培養することができないという問題点があった。【００１６】
従って本発明の目的は、種々の基材に固定化が可能なリガンド構築物、及び該構築物を固定化してなる細胞培養用基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
すなわち、本発明は、
［１］  細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物であって、該リガンド構築物が少なくとも１つの基材結合用官能基を有するリガンド構築物、及び
［２］  前記［１］に記載のリガンド構築物及び基材を含有する細胞培養用基材であって、該リガンド構築物が基材結合用官能基を介して基材部に固定化されてなる細胞培養用基材
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、リガンド構築物に対して人工基材への固定化のための基材結合用官能基を持たせることで、種々の人工基材へのリガンド構築物の固定化が容易になり、最適な基材に人工マトリクスを容易に調製できること、それにより細胞を安定して培養することができること、等の点で優れている。従って、本発明のリガンド構築物を用いれば、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、種々の材質の基材上に設計して再現性よく調製することができる。本発明の細胞培養用基材によれば、細胞機能を効果的に再現性よく制御することができ、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の１文字表記又は３文字表記により表される場合がある。かかる表記とアミノ酸との対応関係を以下に示す。Ａ又はＡｌａ：アラニン残基；Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基；Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基；Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基；Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基；Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基；Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基；Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基；Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基；Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基；Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基；Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基；Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基；Ｖ又はＶａｌ：バリン残基；Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基；Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基；Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。【００２０】
接着、増殖等の細胞機能の制御には、細胞表面の受容体が認識するリガンド分子が重要な機能を担う。かかる機能を発揮するためには、好ましくは、リガンド分子は、制御する細胞機能に応じて、ナノメートルオーダーで少なくとも２つの分子を正確に配列させることが望ましい。【００２１】
本発明のリガンド構築物は、細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、スペーサーを介して連結したものであり、さらに該リガンド構築物が基材に固定化するための１つ以上の基材結合用官能基を含有するものである。【００２２】
本発明のリガンド構築物において、リガンド分子の種類、数、リガンド分子間の距離等は、所望の細胞制御に関わる細胞表面受容体に応じて選択される。【００２３】
細胞表面受容体とリガンド分子との組み合わせ等については、例えば、小出輝ら編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）；林正男著、実験医学バイオサイエンス  新細胞接着分子の世界、羊土社（２００１）；関口清俊、鈴木信太郎、日本化学会編、多細胞体の構築と細胞接着システム、シリーズ・バイオサイエンス新世紀第８巻、共立出版（２００１）；左邉壽孝、月田承一朗編、実験医学増刊、細胞接着研究の最前線−シグナル伝達から癌転移への関与まで−、羊土社（１９９６）等を参照すればよい。【００２４】
なお、本発明のリガンド構築物は、リガンド分子がナノメートルオーダーで配列するものであることから、その構造を「ナノ構造」という場合がある。【００２５】
細胞表面受容体は、細胞の形質膜上に存在する受容体であって、リガンド分子との結合により細胞の機能に影響を与える受容体であれば特に限定はない。当該受容体としては、例えば、細胞外マトリクスの受容体、細胞間接着の受容体（「細胞間接着分子」ともいう）、ホルモン受容体、サイトカイン（増殖因子）受容体等が挙げられる。前記細胞間接着の受容体としては、例えば、ＮＣＡＭ、カドヘリン、セレクチン等が挙げられる。前記細胞表面受容体は、制御対象となる細胞機能に応じて最適なものを選択すればよい。【００２６】
本発明において、「細胞表面受容体に結合するリガンド分子」とは、細胞表面受容体に対して結合活性を有する合成又は天然の分子であって、細胞の機能、例えば接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死に対して影響を与える分子のことを指す。前記細胞表面受容体に結合する分子としては、例えば、セレクチンに対するリガンド分子である合成ペプチド「ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）」等が挙げられる。本発明では、例えば、細胞間接着の受容体に結合する分子をリガンド分子として用いることにより、細胞−細胞間相互作用を模倣することができるという優れた効果を発揮する。本発明の本質は、細胞表面受容体に結合するリガンド分子の種類やナノメートルオーダーでのそれらの配列を種々に変化させ、対象とするそれぞれの細胞に対して最も適した外的な環境を与える方法を提供するものであり、リガンド分子そのものについて特に限定はない。【００２７】
前記リガンド分子としては、例えば、本発明の目的を妨げないものであれば、細胞表面受容体と共に、特に限定されるものではないが、例えば、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体に結合する分子、サイトカイン（増殖因子）、ホルモン、抗体、糖類等が挙げられる。【００２８】
細胞外マトリクスとしては、例えば、小出輝、林利彦  編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）等に記載されているものが挙げられる。前記細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（プロコラーゲンも含む）、エラスチン、フィブロイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、アグリン、アンカリン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブリノーゲン、プロテオグリカン等が挙げられる。プロテオグリカンとして、例えばアグリカン、アグリン、パールカン、デュリン、フィブロモジュリン、ブレビカン等が挙げられる。以上のような細胞外マトリクスに由来する一部分の構造、すなわち生体内の細胞マトリクスのフラグメントや合成ペプチドを前記リガンド分子として用いてもよい。また、本発明においては、前記リガンド分子として、細胞外マトリクスに由来するもの以外の物質を用いてもよい。かかる物質としては、単純に細胞表面受容体に結合する物質として人工的に設計して合成された物質等が挙げられる。前記細胞外マトリクスは、何れもが以下に述べるように化学的に誘導体化されていてもよい。【００２９】
「細胞外マトリクスに由来する一部分の構造」とは、細胞外マトリクスの一部分を化学的又は酵素的に切断し精製後に得られるフラグメントであり、かつある特定の細胞表面受容体が結合可能な精製フラグメントのことを指す。前記フラグメントとしては、例えば、ＣＮＢｒ処理されて得られるＩ型コラーゲンの精製フラグメント（例えば、ＷＤ．  Ｓｔａａｔｚ，  ＪＪ．  Ｗａｌｓｈ，  Ｔ．  Ｐｅｘｔｏｎ，  ＳＡ．  Ｓａｎｔｏｒｏ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６５（９），  ４７７８−４７８１（１９９０）に記載されているようなフラグメント）や、ＣＮＢｒやさらに必要に応じてトリプシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のプロテアーゼで処理をしたＩＶ型コラーゲンの精製フラグメント（例えば、ＪＡ．  Ｅｂｌｅ，  Ｒ．  Ｇｏｌｂｉｋ，  Ｋ．  Ｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｋｕｈｎ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １２（１２），  ４７９５−４８０２（１９９３）に記載されている方法により得られる三重らせん構造を有するフラグメント、さらにはＥＣ．  Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ，  ＡＳ．  Ｃｈａｒｏｎｉｓ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０３（６），  ２４６７−２４７３（１９８６）に記載されているような方法により得られるＮＣ１ドメイン等が含まれる）、フィブロネクチンをトリプシン又はペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる細胞接着性のフラグメント（例えば、ＳＫ．  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｅ．  Ｈａｓｅｇａｗａ，  Ｔ．  Ｈａｓｅｇａｗａ，  ＫＭ．  Ｙａｍａｄａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０（２４），  １３２５６−１３２６０（１９８５）参照）等が挙げられる。その他の細胞外マトリクスにも同様のことが言え、当然ながら以上に例示したフラグメントのみに限定されるわけではない。【００３０】
「細胞外マトリクスに由来する一部分の構造である合成ペプチド」とは、細胞外マトリクスに含まれ、ある特定の細胞表面受容体が結合できる最小のアミノ酸配列を含有する化学的に合成されたオリゴペプチド全般のことを指す。特にフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン及びトロンボスポンジン等に共通して含まれ、細胞表面受容体が結合する最小のアミノ酸配列として、アミノ酸が３個結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列がよく知られている。このＲＧＤを含む合成ペプチド全般について、本発明におけるナノ構造を有するリガンド構築物に含まれるリガンド分子として用いることができ、特に限定されるものではない。【００３１】
以上のようなＲＧＤ配列を含む直鎖状の合成ペプチドであって、本発明におけるリガンド分子として用いることのできるさらに具体的なペプチド配列としては、特に限定されないが、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＶ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＦ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＹＰＣ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号：１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ（配列番号：２）、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号：３）、ＧＧＧＰＨＳＲＮＧＧＧＧＧＧＲＧＤＧ（配列番号：４）等が挙げられる。【００３２】
また、ＲＧＤ配列を含むペプチドを環状にすることで、細胞表面受容体への結合活性を制御することもできる。環状ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＰｅｎ＊ＧＲＧＤＳＰＣ＊Ａ、ＧＡＣ＊ＲＧＤＣ＊ＬＧＡ、ＡＣ＊ＲＧＤＧＷＣ＊Ｇ、シクロ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ）、シクロ（ＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＲＧＤｆＫ）、シクロ（ＲＧＤＥｖ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＬ）、シクロ（ＡＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＶ）等が挙げられる。なお、前記「Ｐｅｎ」は、ペニシラミンを示し、「＊」は、分子内でジスルフィド結合をしたシステイン残基を示す。また、ペプチド配列を示すアミノ酸一文字表記に含まれる小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。【００３３】
以上のペプチドは、生体内の細胞外マトリクスの多くに共通して含まれる機能モチーフの細胞外マトリクスに由来する最小のアミノ酸配列が利用でき、リガンド分子として用いる合成ペプチドに含有させることができる。前記リガンド分子としては、必要に応じて最適な合成ペプチドが選ばれ、特に限定されないが、フィブロネクチン由来の最小アミノ酸配列として、例えば、ＮＧＲ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ等の配列を含む合成ペプチド等が挙げられる。【００３４】
また、細胞外マトリクスの１つであるラミニン由来のアミノ酸配列として、例えば、ＬＲＧＤＮ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＣＤＰＧＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＹＦＱＲＹＬＩ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＡ（配列番号：５）等の配列を含む合成ペプチドが挙げられる。また、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、ラミニンに関して、例えば、野水基義、蛋白質  核酸  酵素、第４５巻、１５号、２４７５−２４８２（２０００）等に記載されているような細胞接着活性のあるペプチド配列、例えば、α１鎖に由来するＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号：６）やα１鎖Ｇドメインに由来するＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号：７）等を含む合成ペプチド等が挙げられる。【００３５】
同様に、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、細胞外マトリクスの１つであるＩ型コラーゲン由来のアミノ酸配列においては、例えば、ＤＧＥＡ、ＫＤＧＥＡ及びＧＰＡＧＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧ（配列番号：８）、ＧＥＲ、ＧＦＯＧＥＲ等を含む合成ペプチドが挙げられる。また、本発明においては、ＣＤ．  Ｒｅｙｅｓ，  ＡＪ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  ６５Ａ，  ５１１−５２３（２００３）  に記載されているように、これらのアミノ酸配列を含むペプチドが幾つか会合したような構造体をリガンド分子として用いてもよい。さらに、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、エラスチン由来のペプチド配列においては、例えば、ＶＡＰＧ、ＶＧＶＡＰＧ及びＶＡＶＡＰＧ等が挙げられ、トロンボスポンジン由来のペプチド配列においては、例えば、ＶＴＸＧを含む合成ペプチドが挙げられる。本発明においては、前記リガンド分子は、これらに限定されるものではない。【００３６】
細胞外マトリクスに由来するものでなくとも、単純に細胞表面受容体に結合する物質として人工的に設計して合成された物質も本発明におけるリガンド分子として用いることができる。なお、かかるリガンド分子は、結果的に、細胞外マトリクスに由来する一部分の構造モチーフを含む場合と、含まない場合がある。かかるリガンド分子としては、例えば、α５β１インテグリンに対するリガンド分子として、Ｃ＊ＲＲＥＴＡＷＡＣ＊（＊はジスルフィド結合したシステイン残基を表す）等が挙げられ、α６β１インテグリンに対しては、ＶＳＷＦＳＲＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号：９）等が挙げられ、αＭβ２インテグリンに対してはＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号：１０）等が挙げられる。さらに、ＧＡ．  Ｓｕｌｙｏｋ，  Ｃ．  Ｇｉｂｓｏｎ，  ＳＬ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｇ．  Ｈｏｌｚｅｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｗｉｅｓｎｅｒ，  Ｈ．  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４４（１２），  １９３８−１９５０（２００１）等に記載されているペプチドではない細胞表面受容体に結合する人工的な合成化合物も本発明のリガンド分子として利用可能である。【００３７】
また、細胞表面受容体のうち、例えば、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４等は、プロテオグリカンを含有することから、本発明においては、該プロテオグリカンに対して結合するペプチド配列をリガンド分子として用いることもできる。【００３８】
プロテオグリカンに対して結合するアミノ酸配列としては、例えば、ＢＢＸＢ、ＸＢＢＸＢＸさらにはＸＢＢＢＸＸＢＸ（Ｘは疎水性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸）等のコンセンサス配列が挙げられる。かかるアミノ酸配列としては、特に限定されないが、具体的には、例えば、ＫＲＳＲ、ＦＨＲＲＩＫＡ（骨シアロタンパク質に由来）、ＰＲＲＡＲＶ（フィブロネクチンに由来）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ等や、より長いペプチド配列として、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号：１１）（フィブロネクチンに由来）、ＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲ（配列番号：１２）（ビトロネクチンに由来）、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号：１３）（ラミニンに由来）、等が挙げられる。【００３９】
以上の例示以外にも、例えば、Ｕ．  Ｈｅｒｓｅｌ，  Ｃ．  Ｄａｈｍｅｎ，  Ｈ．  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２４，  ４３８５−４４１５（２００３）、ＪＡ．  Ｈｕｂｂｅｌｌ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １３，  ５６５−５７６（１９９５）、Ｈ．  Ｓｈｉｎ，  Ｓ．  Ｊｏ，  ＡＧ．  Ｍｉｋｏｓ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２４，  ４３５３−４３６４（２００３）及びＥ．  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，  Ｗ．  Ａｒａｐ，  Ｄ．  Ｒａｊｏｔｔｅ，  Ｊ．  Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ，  Ｒ．  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｊ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，  ４０（５），  ８８３−８８８（１９９９）等やそれらの引用文献に記載されているような直鎖状又は環状の合成ペプチドを本発明におけるリガンド分子として利用することができる。また、本発明においてリガンド分子として利用され得る全てのペプチド配列には、目的に応じて付加的なペプチド配列がそのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合していてもよい。合成ペプチドには、目的に応じて非天然型アミノ酸、化学的な修飾基、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸のどちらか一方又はその両方等が含まれていてもよい。【００４０】
ホルモンとしては、特に限定されないが、例えば、インスリンやアドレナリン等が挙げられる。サイトカインとしては、特に限定されないが、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。以上のホルモンやサイトカインについても本発明におけるリガンド分子として利用できるが、もちろんこれら例示に限定されるわけではない。【００４１】
ホルモンやサイトカインについても、それらの分子中に含まれ、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成されたアゴニストを用いてもよい。その例として、例えば骨形成因子（ＢＭＰ）においては、ＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩ（配列番号：１４）を用いると、ＢＭＰ−２と同様の性質を持たせることが可能である（例えば、Ｙ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｍ．  Ｔａｎｉｈａｒａ，  Ｋ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ａ．  Ｓａｉｔｏｕ，  Ｗ．  Ｓｕｆａｎ，  Ｙ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  ５０，  ４０５−４０９（２０００）参照）。また、同様にエリスロポエチンにおいてはＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（Ｘは数種のアミノ酸で置換可能な位置を示している）（ＮＣ．Ｗｒｉｎｇｔｏｎ，ＦＸ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｃｈａｎｇ，ＡＫ．Ｋａｓｈｙａｐ，ＦＰ．Ｂａｒｂｏｎｅ，ＬＳ．Ｍｕｌｃａｈｙ，ＤＬ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＷ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＬＫ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，ＷＪ．Ｄｏｗｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，４５８−４６３（１９９６）参照）が挙げられる。但し、これに限ったものではなく、本発明におけるリガンド分子としては何れもが使用できる。【００４２】
抗体としては、細胞表面受容体に対する抗体、特に好ましくはモノクローナル抗体を本発明のナノ構造を有するリガンド構築物におけるリガンド分子として用いることができる。様々な受容体に結合する抗体が利用でき限定されるわけではないが、例えば各種の抗インテグリン抗体、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４／ＣＳＰＧ等の細胞表面プロテオグリカンに対する抗体、抗カドヘリン抗体、抗セレクチン抗体等が挙げられる。抗体をリガンド分子として用いる場合には、抗体そのものを用いてもよいし、ペプシンやパパイン等のプロテアーゼ処理によって得られるフラグメント等を利用してもよい。【００４３】
細胞間接着分子のうち、ＮＣＡＭ、カドヘリン等は、細胞外でホモフィリック結合することが多く、それぞれの細胞膜外成分は細胞間接着の受容体に結合する分子である。したがって、前記細胞間接着の受容体に結合する分子は、前記リガンド分子として用いることができる。また、前記リガンド分子としては、セレクチンに対するリガンド分子のうち、合成ペプチドとしてＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）等が例示される。これも当然ながら以上の例示に限定されるわけではない。これらの細胞表面受容体に対するリガンド分子を用いる意義は、細胞−細胞間相互作用を本発明のリガンド構築物によって模倣する際に有効であることである。【００４４】
前記リガンド分子として、糖類も利用することができる。前記糖類としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のプロテオグリカンに含まれるグリコサミノグリカン類等の糖類が挙げられる。さらに、本発明においては、例えば、ガラクトース、ラクトース又は重合して接着性基質を形成することができる重合性ラクトースモノマー等、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖類を、リガンド分子として利用することができる。また、例えば、セレクチンに対しては、シアル酸とフコースを含むオリゴ糖であるシアリルルイスエックス（例えば、Ａ．  Ｖａｒｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９１，  ７３９０−７３９７（１９９４）参照）をリガンドとして用いることができる。【００４５】
前記したように、前記リガンド分子は、天然のリガンド分子に由来するもの以外の物質であっても、単純に細胞表面受容体に結合する人工的に設計して合成された物質であれば、本発明における「リガンド分子」として用いることができる。【００４６】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物に含まれるリガンド分子としては、例えば、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体に結合する分子、増殖因子（成長因子）、ホルモン、抗体、糖類等から、それぞれの細胞毎に最適なものが二つ以上選ばれる。なお、本発明の１つの目的、すなわち、リガンド分子の配列をナノメートルオーダーで制御し、それぞれの細胞に最適な環境を再現性よく提供する観点から、リガンド分子として天然由来のリガンド分子そのものを利用するよりは、それらのフラグメント、合成ペプチド分子、糖類及び人工的に設計して合成された物質等やこれらの複合体を利用することが好ましい。なお、特に限定するものではないが、利用性及び細胞機能制御への有効性が高いことから、リガンド分子がペプチドからなる場合、その鎖長としては、通常、アミノ酸３〜１５０残基程度であるのが好ましく、一方、糖鎖からなる場合、単糖１〜１００残基程度であるのが好ましい。【００４７】
本発明のリガンド構築物において、前記リガンド分子は、後述のスペーサーに共有結合又は非共有結合によって連結される。前記連結は、リガンド分子及びスペーサーに互いに官能基を導入し、それを利用して行うのが好適である。以下、リガンド分子に導入する官能基を「スペーサー結合用官能基」といい、スペーサーに導入する官能基を「リガンド分子結合用官能基」という。スペーサーとリガンド分子とを連結するための反応は、以下で説明するように種々のものが選択可能である。また、スペーサー結合用官能基は、特に限定されるものではない。さらに、リガンド分子結合用官能基も特に限定されるものではなく、使用するスペーサー結合用官能基に応じて適切なものを選択すればよい。【００４８】
本発明の要素の一つは、以上のように説明されるリガンド分子を二つ以上用いて、これらの分子がスペーサーを介して連結されている構造のリガンド構築物を調製し、細胞と接触させることによって細胞の機能制御を行うことにある。スペーサーは、隣り合うリガンド分子どうしの中間部分に配置され、隣り合うリガンド分子の間隔をあけて一つの分子として結合できるものを指す。【００４９】
本発明のリガンド構築物は、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子とスペーサーとが連結され、細胞の機能制御に対し適正なリガンド分子の配列を有するものであるが、１つのリガンド構築物におけるリガンド分子間の間隔（連結位置）や、リガンド分子の数等は、制御対象である細胞、細胞機能に応じて決定すればよい。【００５０】
リガンド分子間の間隔はスペーサー長、すなわちスペーサー分子が伸長した状態での長さで規定される。スペーサー長、すなわち隣り合うリガンド分子間の距離は、それぞれのリガンド分子やそれぞれの細胞によって最適な距離を選択すればよいが、好ましくは１〜３００ｎｍの範囲であり、より好ましくは５〜１００ｎｍの範囲である。【００５１】
本発明における「スペーサー」は、細胞に対して適合性を有する高分子化合物であれば特に限定なく利用できる。具体的には、例えば、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリサルコシン等のポリアミノ酸類、プルラン、デキストラン、アルギン酸、キトサン、水溶性セルロース誘導体（メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等）等の多糖類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等の合成高分子類、リボ核酸、デオキシリボ核酸、ペプチド核酸、それらの誘導体等の核酸類等やこれらの組み合わせが挙げられる。【００５２】
本発明のリガンド構築物を用いて細胞機能を効果的に再現性よく制御するには、リガンド分子の間隔をナノメートルオーダーで任意の距離に規定することが好ましい。リガンド分子の結合部位の特定が容易であり、さらにリガンド分子間の距離が精密に制御できる観点から、前記スペーサーとしては、ポリアミノ酸類、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール、及び核酸類がより好ましいスペーサーとして挙げられる。【００５３】
ポリアミノ酸類や核酸類の場合、合成段階で段階的・選択的にアミノ酸又は核酸モノマー単位を縮合させることができるため、以下に説明するようにリガンド分子の結合部位を精密に特定することが容易である。一方、合成高分子類のうちポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称することがある）及びポリプロピレングリコール（以下、ＰＰＧと略称することがある）は高分子鎖の両末端にのみリガンド分子等と結合し得る官能基を有するため、通常の側鎖に官能基を有する付加重合高分子とは異なり、やはりリガンド分子の結合部位を精密に特定することができる点で優れる。以上のスペーサーは分岐していてもよい。【００５４】
さらに実質的に鎖長が等しいスペーサーを調製できる点、分岐構造等の複雑な高次構造を調製することができる点、生化学的な伸長反応を応用することができるため長さが揃っていながらも１００ｎｍを超えるようなスペーサーを合成できる等の点から、核酸類がさらに好ましいスペーサーとして挙げられる。より具体的には、核酸類からなるスペーサー（以下、核酸スペーサーと略称することがある）として、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸又はそれらの誘導体が使用できる。核酸スペーサーはこれらの混合物からなるものでもよい。【００５５】
核酸スペーサーを有するリガンド構築物によれば、リガンド分子間の距離が実質的に均一に設定され得、また、従来技術と比較して、リガンド分子の種類と配列を変更することでこれまでには得られなかった種々の人工マトリクスを容易に調製できるという優れた効果を奏し得る。これにより、細胞機能を効果的に再現性よく人工的に制御することができ、ナノ構造を持つ人工的な環境と細胞とを相互作用させることができ、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えることができるという優れた効果を奏する。【００５６】
デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略称することがある）及びリボ核酸（以下、ＲＮＡと略称することがある）は、それぞれデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドがモノマー単位となって、３’→５’ホスホジエステル結合したポリマーである。「ペプチド核酸（以下、ＰＮＡともいう）」とは、例えば、ＰＥ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｍ．  Ｅｇｈｏｌｍ，  ＲＨ．  Ｂｅｒｇ，  Ｏ．  Ｂｕｃｈａｒｄｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４，  １４９７−１５００（１９９１）に記載されているようにＤＮＡやＲＮＡ類似の構造をもつ非天然の化合物をいう。前記ＰＮＡは、より具体的には、ヌクレオチドがリン酸ジエステルで結合した構造ではなく２−アミノエチル−グリシンをモノマー単位として含むペプチド結合により骨格を形成しているものを指す。本発明におけるスペーサーとして、以上のような基本骨格を有するポリマーを用いることで、リガンド分子の間隔を任意の距離に規定し、かつスペーサー部分の分子量が単一である細胞機能制御に適したナノ構造を有するリガンド構築物が提供できる。核酸スペーサーは先行技術のスペーサーと比較して、段階的・選択的にヌクレオチド等のモノマー単位を縮合させることができるため、長さの揃ったスペーサーが合成できる、分岐構造等複雑な高次構造を調製することができる、生化学的な伸長反応を応用することができるため長さが揃っていながらも１００ｎｍを超えるようなスペーサーを合成できる等の利点がある。核酸スペーサーはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡの混合物からなるものでもよい。【００５７】
本発明において核酸スペーサーとして使用する、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸の誘導体としては、以下のようなものを挙げることができる。【００５８】
細胞との接触条件において本発明のリガンド構築物自体の安定性を増加させること、本発明のリガンド構築物をエンザイムイムノアッセイ又は蛍光ラベル等によって定量分析すること、微粒子によりラベル化して電子顕微鏡等により観察すること等を可能とするため、以上の核酸スペーサーは化学的修飾を施されていてもよい。「化学的修飾」とは、リン酸部位、リボース部位又は２−アミノエチル−グリシン部位（ＰＮＡの場合）等の核酸の主鎖を化学的に改変したり、又は核酸塩基部位等に化学修飾を施すことをいう。核酸の主鎖を化学的に改変する例としては、構造的に不安定なデオキシリボ核酸やリボ核酸のリン酸部分をチオール化する等してヌクレアーゼに対する耐性を向上させたホスホロチオエート等の化学的修飾体（ＰＮＡに関してはこの誘導体は含まれないが、ＰＮＡ自体の分解耐性はもともと高いことが知られている）、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体及びアレクサ等の発色団（以上に加えて、例えば、栗原靖之、武内恒成、松田洋一編「ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール−蛍光の原理と実際：遺伝子解析からバイオイメージングまで」別冊実験医学、羊土社（１９９９）等に記載されている発色団が例示できる）、ビオチン、ブロモデオキシウリジンやジゴキシゲニン等の抗原部位等を導入した化学的修飾体が含まれる（導入法等は、例えば、高橋豊三著「ＤＮＡプローブ−技術と応用―」シーエムシー（１９８８）や高橋豊三著「ＤＮＡプローブＩＩ−新技術と新展開−」シーエムシー（１９９０）等に記載されているものを例示できる）。また、以下に述べるように核酸スペーサーの原料となる１本鎖の核酸を合成する段階で以上の化学的修飾が施されてもよい。前記化学的修飾は、それぞれ最適な製法で調製され、上述した目的に応じて選択できるため、以上の例示に限定されるものではない。【００５９】
核酸スペーサーは、以上のようにＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらの誘導体からなるものであって、一旦、リガンド構築物が形成された際には、その構造として１本鎖の状態でもよいし、少なくとも一部分が二重らせん、三重らせんとなった状態やそれらの組み合わせ、さらに、Ｋ．  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｔ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｙ．  Ｉｇａｍｉ，  Ｎ．  Ｋｉｍｉｚｕｋａ，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３７６（２００３）、ＮＣ．  Ｓｅｅｍａｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １７，  ４３７−４４３（１９９９）、ＣＭ．  Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４，  ６０９−６１８（２０００）、ＪＨ．  Ｇｕ，  ＬＴ．  Ｃａｉ，  Ｓ．  Ｔａｎａｋａ，  Ｙ．  Ｏｔｓｕｋａ，  Ｈ．  Ｔａｂａｔａ，  Ｔ．  Ｋａｗａｉ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．，  ９２，  ２８１６（２００２）等に記載されているような３本以上に分岐したものでもよい。さらにこれらの構造単位が組み合わさって、さらに大きな一次元的、二次元的又は三次元的な構造体を形成してもよい。【００６０】
以上に例示したように、リガンド構築物における核酸スペーサーがどのように複雑なスペーサー構造を有するにしても、スペーサー原料としては、１本鎖の核酸を用いることが好ましい。１本鎖の核酸は鎖長１５０塩基、より実用的には鎖長１００塩基程度まで化学的に合成することが可能（ほとんどがホスホアミダイト法による固相合成法を採用している）である。例えば、この化学合成の段階で位置特異的にリガンド分子を導入するためのリガンド分子結合用官能基を導入しておけば、後は当該官能基に対しスペーサー結合用官能基を結合してリガンド分子を連結すれば、容易にリガンド分子を所定の間隔をもってナノメートルオーダーで適正に配列させることができる。リガンド分子結合用官能基と、リガンド分子のスペーサー結合用官能基とは、互いに共有結合又は非共有結合を形成させて結合させればよい。【００６１】
核酸スペーサーへのリガンド分子の導入反応（すなわち核酸スペーサーに含まれるリガンド分子結合用官能基とリガンド分子に含まれるスペーサー結合用官能基の組み合わせ）としては、反応中において、核酸スペーサーやリガンド分子が安定に維持され、意図された部位同士で特異的に導入反応を行なえるものであれば、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。【００６２】
共有結合による導入反応としては、アミド結合形成反応、マイケル付加反応、チオエーテル形成反応、ディールスアルダー環化付加反応、シッフベース形成反応、チアゾリジン環形成反応等が挙げられる。【００６３】
前記アミド結合形成反応としては、例えば、カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基とを縮合させる方法、アミノ基と予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステルとを反応させる方法；チオエステル基とアミノ基とチオール基が残留したシステインとを反応させてアミド結合を形成させる方法等が挙げられる。【００６４】
前記マイケル付加反応としては、例えば、マレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等のα，β−不飽和カルボニル基とチオール基とを反応させる方法等が挙げられる。【００６５】
前記チオエーテル形成反応としては、例えば、ハロアセチル基等のハロゲン化アルキル基やエポキシ基、アジリジン基等とチオールとの反応等が挙げられる。前記ディールスアルダー環化付加反応としては、例えば、シクロペンタジエン等の共役ジエン類とキノン等のオレフィン類とを反応させる方法等が挙げられる。【００６６】
前記シッフベース形成反応としては、例えば、グリオキシル酸等のアルデヒド基とオキシアミノ基等のアミノ基を反応させる方法等が挙げられる。なお、前記シッフベース形成反応において、形成されるシッフベース基は、適切な還元剤で還元されていてもよい。【００６７】
前記チアゾリジン環形成反応としては、例えば、アミノ基及びチオール基が残留したシステインとアルデヒド基を反応させる方法等が挙げられる。【００６８】
非共有結合による導入反応としては、錯体形成反応（例えば、トリニトリロ酢酸−ニッケル錯体とオリゴヒスチジンの三元錯体形成を利用したＨｉｓ−Ｔａｇ形成反応、金−チオール結合反応等）、生物学的な認識反応（例えば、糖鎖−レクチン反応、アビジン−ビオチン反応、抗原−抗体反応等）等が挙げられる。【００６９】
導入反応は、リガンド分子結合用官能基とスペーサー結合用官能基との組み合わせを上記の反応様式で互いに結合し得るものとしておくことで行うことができる。そのような組み合わせは、上記を参照すれば適宜選択することができる。なお、以上の導入反応は、光、熱、振動、時間、脱保護等別の因子によって開始されるものであってもよい。【００７０】
スペーサー結合用官能基として、リガンド分子にもともと含有される反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を用いてもよく、リガンド分子にスペーサー結合用官能基を意図的に導入して用いてもよい。リガンド分子にスペーサー結合用官能基を導入する方法としては、スペーサー結合用官能基を含有し、かつリガンド分子に結合する官能基を同一分子中に含有する二官能性試薬を使って、リガンド分子を化学修飾する方法が挙げられる。ペプチドを含むリガンド分子を化学修飾する一つの方法は、リガンド分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用して二官能性試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、リガンド分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えば、ＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由に導入することが可能である。糖類を含むリガンド分子に関しても同様のことがいえ、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用いることができる。【００７１】
１本鎖の核酸、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらの誘導体の位置特異的にリガンド分子結合用官能基を導入する方法として、例えば、高分子学会／バイオ・高分子研究会編「高分子化学と核酸の機能デザイン」、バイオ・高分子研究法６、学会出版センター（１９９６）やＹ．Ｉｔｏ，Ｅ．Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８，１５５−１６６（２００４）及び該文献に記載された参考文献等に記載された方法等が利用できる。例示すると、リン酸部位やリボース又はデオキシリボース等を含む主鎖（ペプチド核酸においては２−アミノエチル−グリシン主鎖）や核酸塩基等の部分にリガンド分子結合用官能基を導入した化学的修飾体、５’末端や３’末端へリガンド分子結合用官能基を導入した化学的修飾体（ペプチド核酸においてはＮ末端及び／又はＣ末端に官能基を導入した化学的修飾体）が含まれる。以上のようにリガンド分子結合用官能基の核酸スペーサーにおける位置が特定できれば、以上の例示に限定されるものではない。【００７２】
核酸スペーサーとリガンド分子結合用官能基及び／又はリガンド分子とスペーサー結合用官能基との間にはリンカーが含有されていてもよい。リンカーの目的は、核酸スペーサーとリガンド分子の間の距離を僅かに隔離しておくことであって、核酸スペーサーとリガンド分子間の反応において立体障害等を低減させて導入反応を迅速に進行させる機能や、本発明のナノ構造を有するリガンド構築物を細胞と接触させた場合に細胞表面受容体とリガンド分子との結合反応を阻害しない機能等を発揮させるためである。通常、０．１〜５ｎｍ程度までの長さであれば、特に素材等は制限されるものではなく、例えば、アルキル鎖、ペプチド鎖、オキシエチレン鎖、オキシプロピレン鎖等やそれらが混合された構造であってもよい。但し、リンカーとしては以上の構造に限定されるわけではなく、目的により最適なものが選ばれる。リンカーは、例えば、リガンド分子結合用官能基、スペーサー結合用官能基の一部として核酸スペーサー及び／又はリガンド分子に導入しておけばよい。【００７３】
スペーサーとして核酸を用いて、核酸スペーサーを２本以上の核酸鎖で構成する場合、リガンド分子を核酸スペーサーに結合する工程として二つの方法が例示できる。すなわち、リガンド分子結合用官能基を有する１本鎖の核酸の段階でリガンド分子を、官能基を介して予め結合させる方法（以下、前変性法と呼ぶことがある）、リガンド分子結合用官能基が導入されて完成された核酸スペーサーに対してリガンド分子を後付する方法（以下、後変性法と呼ぶことがある）、がある。【００７４】
リガンド分子の前変性法をより詳細に説明するならば、リガンド分子結合用官能基を含む１本鎖の核酸の段階でリガンド分子を予め結合させ、次いで、さらに１本鎖の核酸（この核酸はリガンド分子結合用官能基を含んでも含まなくてもよい）を１種類以上組み合わせてリガンド分子が位置特異的に導入された核酸スペーサーを完成させる方法である。【００７５】
リガンド分子の後変性法はより詳細に説明するならば、リガンド分子結合用官能基を含む１本鎖の核酸に、さらに１本鎖の核酸（この核酸はリガンド結合用官能基を含んでも含まなくてもよい）を１種類以上組み合わせて核酸スペーサーを完成させる（この時点ではリガンド分子は導入されていない）。その後に、スペーサー結合用官能基を有するリガンド分子を導入する方法である。以上の前変性法、後変性法は必要に応じてどちらも選択できるが、調製の容易さを考慮すると前変性法がより好適に用いられる。【００７６】
以上のような構造的特長によって定義される本発明のナノ構造を有するリガンド構築物であるが、ヌクレオチド３０量体を超える長鎖スペーサーの合成し易さ等を考慮するとデオキシリボ核酸を核酸スペーサーとして利用するのが好ましい。特に、二重らせんのＤＮＡ鎖は、１０ヌクレオチドで３．４ｎｍの長さを有し、構造的にも明確であるため、特に、好ましくは、核酸スペーサーとして二重らせんのＤＮＡ鎖（以下、ｄｓＤＮＡともいう）を使用することが望ましい。【００７７】
より具体的に本発明のナノ構造を有するリガンド構築物の構造について以下に説明する。ｄｓＤＮＡからなる核酸スペーサーの中でリガンド分子を導入する好ましい位置としては、５’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）、及び３’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）等ｄｓＤＮＡスペーサーの末端部位や核酸塩基部位等ｄｓＤＮＡスペーサーの途中の任意の位置が挙げられる。二つのリガンド分子を含有する場合を記載すると、ｄｓＤＮＡ鎖の二つの５’末端にそれぞれリガンド分子が結合した分子、又は二つの３’末端にそれぞれリガンド分子が結合した分子、又はそれらの組み合わされた分子（例えば、５’末端と３’末端のそれぞれにリガンド分子が結合した分子等）が挙げられる。３つ以上のリガンド分子を導入する場合には空いている末端を利用することもできる。以上はあくまでも例示であってリガンドの導入位置としては特に限定されず、目的に応じて変更し得る。【００７８】
前変性法によりリガンド分子を導入するため、核酸スペーサーの原料となる１本鎖ＤＮＡ（以下、ｓｓＤＮＡともいう）にリガンド分子結合用官能基をＤＮＡの化学合成の段階で導入する。リガンド分子結合用官能基としては、上述したように種々のものが選択でき限定されるものではないが、高い反応選択性を発揮させる観点から、例示されたもののうちチオール基又はアミノ基を導入するのが好ましい。【００７９】
リガンド分子には、チオール基又はアミノ基と結合活性を有するスペーサー結合用官能基を導入しておくことが好ましい。前記核酸スペーサー結合用官能基としては、特に限定されないが、例えば、チオール基とマイケル付加反応させるためのマレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等、チオール基とチオエーテル形成反応をさせるためのハロアセチル基、エポキシ基、アジリジン基等が挙げられる。この中でもリガンド分子への導入のし易さ、安定性の点からマレイミド基やハロアセチル基が好適なスペーサー結合用官能基として例示できる。【００８０】
リガンド分子として、合成ペプチド分子を使用する場合についてさらに詳細に記す。合成ペプチド分子を合成する際に、リジン残基等のアミノ基側鎖やＮ末端のアミノ基等に対して、カルボン酸や、酸クロライド、活性エステル基等を有する二官能性試薬であるマレイミド誘導体（例えば、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミドブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等）又はハロアセチル誘導体（例えば、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸無水物等）を作用させることで、容易にリガンド分子に対してスペーサー結合用官能基を導入することができる。【００８１】
以上のような、ｓｓＤＮＡ及びリガンド分子を用いることで、前変性法によりリガンド分子が導入されたｓｓＤＮＡ（以下、このようにリガンド分子が導入されたｓｓＤＮＡを単にコンジュゲートと略称する場合がある）を調製することができる。この反応条件や精製方法等については特に限定されるものはなく、公知の方法が利用できる。以上のようにして得られたリガンド分子が導入された１本鎖のＤＮＡを原料として、その他のｓｓＤＮＡ（このｓｓＤＮＡはリガンド分子を結合していなくてもよい）とのハイブリダイゼーションや必要に応じてｄｓＤＮＡ（このｄｓＤＮＡはリガンド分子を結合していなくてもよい）とのライゲーション等を行うことにより本発明のリガンド構築物が得られる。また、コンジュゲートをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることで本発明のリガンド構築物を調製することもできる。【００８２】
なお、前記核酸スペーサーが複数の核酸からなる場合、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子はそれぞれ、同一又は異なる核酸に結合されていればよい。例えば、核酸スペーサーが２本鎖を形成する核酸からなるものであり、２つのリガンド分子が核酸の５’末端又は３’末端にそれぞれ結合する場合、該核酸スペーサーには、２つの５’末端及び３’末端が存在する。この場合、同一核酸の当該両末端にリガンド分子が結合するとリガンド分子は、同一の核酸に結合することになり、いずれか一方の核酸の５’末端にいずれか一方のリガンド分子が結合し、他方の核酸の５’末端に他方のリガンド分子が結合すると、リガンド分子は異なる核酸に結合することになる（例えば、図１参照）。【００８３】
以上に説明されたリガンド構築物は本発明の実施の一態様であり、以上に限定されるというわけではない。ｓｓＤＮＡにおけるリガンド分子結合用官能基の導入方法、部位及び官能基の種類、リガンド分子におけるスペーサー結合用官能基の導入方法、部位及び種類は既に述べたように目的により選ばれることは明白である。また、以上の概念を用いれば既に述べたように核酸スペーサー構造は単純な二重らせんだけではなく、種々の複雑な構造、例えば分岐構造や三次元構造、二次元的、三次元的に多重に核酸スペーサーが連結した構造等を持たせた本発明のリガンド構築物を作製できることも明白であろう。【００８４】
スペーサーとしてポリアミノ酸類を用いる場合についても核酸の場合と同様に、リガンド分子結合用官能基としてポリアミノ酸類にもともと含まれる反応性基か、又は意図的に導入された反応性基等を用いてもよいし、リガンド分子結合用官能基を化学修飾により前記反応性基に導入して用いてもよい。【００８５】
ポリアミノ酸類からなるスペーサーにリガンド分子結合用官能基を導入する方法としては、リガンド分子結合用官能基を含有し、かつスペーサー分子に結合する官能基を同一分子中に含有する２官能性試薬（以下、リガンド分子結合用官能基を含有する試薬と略称することがある）を使って、ポリアミノ酸類からなるスペーサーを化学修飾する方法が挙げられる。【００８６】
反応性アミノ酸残基を含むスペーサーを化学修飾する一つの方法は、スペーサー分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用してリガンド分子結合用官能基を含有する試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、スペーサーを化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えばＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由にリガンド分子結合用官能基を含有する試薬を導入することが可能である。【００８７】
以上のようにリガンド結合用官能基が導入されたポリアミノ酸類からなるスペーサーとスペーサー結合用官能基を有するリガンド分子とを反応させることでポリアミノ酸類をスペーサーとするリガンド構築物を得ることができる。【００８８】
スペーサーとして合成高分子のうちＰＥＧ又はＰＰＧを用いる場合について述べる。この場合も同様に、リガンド分子結合用官能基としてＰＥＧ又はＰＰＧ鎖にもともと含まれる高分子鎖両末端の反応性基か、又は意図的に導入された両末端の反応性基等を用いてもよいし、リガンド分子結合用官能基を化学修飾により両末端に導入して用いてもよい。【００８９】
すなわち、末端官能基をリガンド分子結合用官能基として用いることのできる直鎖状のＰＥＧ又はＰＰＧ鎖として、２つの末端反応性基が水酸基、アミノ基、カルボキシル基であるものや、一方の末端反応性基としてアミノ基及びもう一方の末端反応性基としてカルボキシル基を有するものが例示できる。【００９０】
また、以上の反応性基にリガンド分子結合用官能基を含有する試薬を使って、リガンド分子結合用官能基を結合させる方法も採用できる。以上のようにしてリガンド分子結合用官能基が導入されたＰＥＧ又はＰＰＧからなるスペーサーとスペーサー結合用官能基を有するリガンド分子と作用させることで、ＰＥＧ又はＰＰＧをスペーサーとするリガンド構築物を得ることができる。【００９１】
以上のように調製される本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は、単独で用いてもよいし、二種類以上のものを混合して用いてもよい。それぞれの細胞によって最適なものが選択される。【００９２】
本発明のリガンド構築物は、リガンド分子及びスペーサーに加え、基材への固定化に用いられる１つ以上の基材結合用官能基を含む。これにより基材の特性に依存することなく、基材表面に基材結合用官能基と結合する官能基（以下、リガンド構築物結合用官能基と略称することがある）を含有させておきさえすればリガンド構築物を基材に容易に固定化することが可能となる。【００９３】
基材へのリガンド構築物の固定化反応（即ち、基材結合用官能基とリガンド構築物結合用官能基の組み合わせ）としては、反応中にリガンド構築物や基材が安定に維持され、意図された部位どうしで特異的に導入反応を行えるものであれば、特に制限されるものではなく、共有結合を形成する組み合わせであってもよく、非共有結合を形成する組み合わせであってもよい。【００９４】
共有結合を形成する反応の例としては、前述した反応が同様に挙げられ、例えば、アミド結合形成反応、マイケル付加反応、チオエーテル形成反応、ディールスアルダー環化付加反応、シッフベース形成反応、チアゾリジン環形成反応等が挙げられる。これらの反応には、リガンド分子、リンカー及びスペーサーにもともと含有される反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を基材結合用官能基として用いてもよく、リガンド分子、リンカー及びスペーサーに基材結合用官能基を意図的に導入して基材結合用官能基として用いてもよい。一方、非共有結合を形成する反応の例としては、例えば、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン、抗原−抗体反応、糖鎖−レクチン反応等が挙げられる。中でも、本発明のリガンド構築物のような比較的高い分子量を持つ分子を基材に固定化するためには、比較的反応速度の速いものを選択することが好ましく、例えば、非共有結合による固定化反応を用いることが挙げられる。好ましい非共有結合による固定化反応としては、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン、抗原−抗体反応、糖鎖−レクチン反応等が挙げられ、中でも、生物学的な認識反応、特にアビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンの結合反応を用いることが固定化効率の点から、より好ましい反応として例示される。【００９５】
アビジンとは、卵白中に存在するビオチンと特異的に結合する塩基性蛋白質であり、分子量約６８０００程度の四量体である。ストレプトアビジンとはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉという微生物培養液由来の蛋白質であり、アビジン同様にビタミンの一種であるビオチンと高い結合能を有している。以下ではアビジン及びストレプトアビジンをまとめてアビジンと称する。【００９６】
アビジン又はビオチンのいずれが基材結合用官能基としてリガンド構築物に導入されてもよいが、リガンド構築物の調製の容易さからビオチンをリガンド構築物に導入するのが好ましい。ビオチンを導入する部位は、リガンド構築物のうちリガンド分子部位、リンカー及びスペーサー部位の何れでもよく、導入する数は１つ以上であればよい。【００９７】
また、本発明において、例えば、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステル、チオール基、ハロアセチル基、マレイミド基等のα，β−不飽和カルボニル基又はヒドラジン基を含みリンカーを介してビオチン基に連結されている分子等のビオチン誘導体もまた、基材結合用官能基又はリガンド構築物結合用官能基として用いることができる。ビオチン誘導体の具体例としては、ピアースバイオテクノロジー社から購入できるビオチン誘導体が挙げられ、商品名としてはＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＴＦＰ−ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＢＭＣＣ、ＰＥＯ−Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ  Ｂｉｏｔｉｎ、Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰ、５−（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＥＯ−ＬＣ−Ａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｃｙｔｉｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ等を例示することができる。【００９８】
また、アミノ酸残基が化学的に修飾されたもの（例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている方法により修飾することができる）や部位特異的にアミノ酸が置換されたもの等のアビジン（ストレプトアビジン）誘導体もまた、基材結合用官能基又はリガンド構築物結合用官能基として用いることができる。【００９９】
基材結合用官能基をリガンド分子部位又はスペーサー部位に導入する方法としては、基材結合用官能基を含有し、ならびにリガンド分子又は／及びスペーサー部位に結合する官能基を同一分子中に含有する２官能性試薬（以下、基材結合用官能基を含有する試薬と略称することがある）を使って、リガンド分子やスペーサーの合成中か、又は合成された後に共有結合を形成させる反応により修飾する方法が挙げられる。【０１００】
ペプチドからなるリガンド分子又はポリアミノ酸類からなるスペーサーに対して基材結合用官能基を修飾する方法の一つは、リガンド分子又はスペーサーを合成した後、又はリガンド分子とスペーサー（又はその原料）を連結させた後に、リガンド分子又はスペーサー（又はその原料）中にもともと存在するか、又は意図的に導入された反応性のアミノ酸残基に対して、基材結合用官能基を含有する試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法を用いることができる。また、リガンド分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端反応性のアミノ酸残基等に対して、例えばＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで基材結合用官能基を含有する２官能性試薬を任意に導入することが可能である。【０１０１】
糖類を含むリガンド分子の場合にも同様に、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用い、糖鎖に基材結合用官能基を含有する試薬を任意に導入することが可能である。【０１０２】
スペーサーがＰＥＧ又はＰＰＧの場合には、スペーサーの末端部分に基材結合用官能基を導入することが可能である。既に説明したようにＰＥＧ又はＰＰＧからなるスペーサーの末端反応性基はリガンド分子結合用官能基として用いられることもある。そのため基材結合用活性基をＰＥＧ又はＰＰＧからなるスペーサーの末端反応性基に導入する際には、基材結合用活性基を含有する試薬がさらにリガンド結合用官能基を有するものであるのが好ましい。【０１０３】
スペーサーとして核酸類を用いる場合についても同様に、核酸類にもともと含まれる反応性基か、又は意図的に導入された反応性基等に対して基材結合用官能基を含有する試薬を結合させて用いることができる。【０１０４】
また、リンカーを介する基材結合用官能基のリガンド構築物への導入方法としては、リンカー部位中にもともと存在するか、又は意図的に導入された反応性の官能基に対して、基材結合用官能基を含有し、且つ、リガンド分子及び／又はスペーサー部位に結合する官能基を同一分子中に含有する２官能性試薬（以下、基材結合用官能基を含有する試薬と略称することがある）を使って、リンカー部位の合成中か、又は合成された後に共有結合を形成させる反応により修飾する方法が挙げられる。【０１０５】
本発明のリガンド構築物は、接着依存性の細胞機能の制御に用いる場合は、基材に固定化された状態で使用することが好ましく、通常、生分解性又は生分解性でない材料からなる基材に固定化されて使用される。従って、本発明のリガンド構築物及び基材を含有する細胞培養用基材であって、該リガンド構築物が基材結合用官能基を介して基材部に固定化されてなる細胞培養用基材もまた、本発明の一態様として提供される。リガンド構築物が生分解性材料である基材に固定化される場合は、例えば、生体内への移植に用いた後、移植された材料が残らないことを想定している。それ以外の場合には、特に、生分解性材料である必要はなく、目的に応じて選択できる。【０１０６】
リガンド構築物が固定化される基材のうち、生分解性のものとしては、ポリエステル類（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、乳酸・グリコール酸及びポリエチレングリコールとの共重合体、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート等）、ポリオルトエステル類（例えば、ポリオール／ジケテンアセタール類付加物ポリマー類等）、ポリ無水物類（例えば、ポリ（無水セバシン酸）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキサン）、ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）メタン］及び以上のポリマーに含まれるモノマーどうしの共重合体等）、ポリアミノ酸類、ポリホスファゼン類、蛋白質（例えば、血清アルブミン、コラーゲン、絹フィブロイン、フィブロイン、アビジン、ストレプトアビジン等）、多糖類（例えば、アルギン酸、スターチ、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース等やこれらの誘導体）等が挙げられる。【０１０７】
リガンド構築物が固定化される基材のうち、生分解性でないものとしては一般的な高分子材料や無機材料が用いられる。付加重合系高分子として、例えば、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール誘導体、エチレン・ビニルアルコール共重合体及びその誘導体、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。重縮合系高分子として、例えば、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル類、ナイロン−６，６等のポリアミド類、ポリイミド類、ポリウレタン類等がある。無機系材料としては、チタン／酸化チタン、金等の金属類、ヒロキシアパタイト、ガラス、シリコン等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、目的に応じて最適な材料が選ばれる。また、以上の材料は、種々の改質処理、例えば、プラズマ処理、イオン注入処理、ラビング処理、化学的な酸化処理、加水分解処理等が施されていてもよい。【０１０８】
以上の基材は表面にコーティングが施されていてもよい。コーティング層として、例えば、グラフト化高分子層、単分子膜層（例えば、ケーネ（ＲＳ．Ｋａｎｅ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３６３−２３７６（１９９９）等に記載されている自己組織化単分子膜等が利用できる）、ハイドロゲル層（例えば、長田及び梶原編、「ゲルハンドブック」エヌ・ティー・エヌ、１９９７年）等に記載されているようなハイドロゲルがコーティングされた層）、タンパク質層（例えば、ポリアミノ酸類やタンパク質等がコーティングされた層）、吸着ポリマー層（例えば、ポリリジン、プルロニック（ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのブロックポリマー）、ポリ（２−メトキシエチルアクリレート）、多糖類等の親水性ポリマーがコーティングされた層）等が挙げられる。【０１０９】
以上に例示した基材やその改質処理及びコーティング層は、目的とする細胞により最適なものが選ばれるが、本発明の基材結合用官能基を有するリガンド構築物を固定化するために少なくともリガンド構築物結合用官能基を含むことが必要である。【０１１０】
リガンド構築物結合用官能基を本発明の細胞培養用基材の基材部に含有させる方法として、基材やコーティング層の反応性基、例えばポリエステル類の残留カルボキシル基、ポリアミド類や蛋白質の残留アミノ基、ポリアミノ酸類の反応性アミノ酸残基、多糖類の水酸基、アミノ基又はカルボキシル基等をリガンド構築物結合用官能基として利用してもよい。基材に対して、リガンド構築物結合用官能基と基材に結合する官能基とを含む２官能性試薬を、共有結合を形成する反応を用いて結合させてもよい。【０１１１】
基材にリガンド構築物結合用官能基を導入するために、固定化効率等の観点から、アビジンを使用することが好ましい。アビジンは蛋白質であるため、アビジンに含まれる反応性アミノ酸残基と基材そのものやコーティング層の官能基とをアミド形成反応等を利用して結合させることにより、アビジンを基材表面に含ませることもできる。また、アビジン等の蛋白質はポリスチレン等の疎水性表面に物理的に吸着することもよく知られており、このような方法を用いて基材表面に固定化し、基材表面に含ませることもできる。【０１１２】
アビジンのような蛋白質を、基材へアミド形成反応等を利用して結合させたり、基材表面に物理的に吸着させたりすると、構造が変化して結合活性が本来のものよりも低下する場合がある。本発明においてアビジンを表面に含有させるには、まずビオチンを基材に結合させた後、アビジンを基材に結合させる方法を採ってもよい。アビジンは１分子で４つのビオチンと結合することができるため、一部をアビジンの表面固定化に使用したとしても、残りの結合部位を、基材結合用官能基を有するリガンド構築物の固定化に使用することができる。【０１１３】
ビオチンを基材表面上に固定化させる際には、基材の反応性基に対して、共有結合を形成する反応又は非共有結合を形成する反応により導入することができる。結合の安定性等を考慮すると、固定化反応としては共有結合が好ましい。基材に対して、ビオチンと基材に結合する官能基を含む２官能性試薬（以下、ビオチンを含有する試薬と略称することがある）を反応させることにより得られる。【０１１４】
ビオチンを含有する試薬をさらに具体的に例示すると、例えば、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステル、チオール基、ハロアセチル基、マレイミド基等のα，β−不飽和カルボニル基又はヒドラジン基を含みリンカーを介してビオチン基に連結されているものが挙げられる。さらにより具体的には、ピアースバイオテクノロジー社から購入できるビオチン誘導体が挙げられ、商品名としてはＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＴＦＰ−ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＢＭＣＣ、ＰＥＯ−Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ  Ｂｉｏｔｉｎ、Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰ、５−（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＥＯ−ＬＣ−Ａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｃｙｔｉｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ等を、ビオチンを含有する試薬として使用することができる。【０１１５】
ビオチンを含有する試薬がアミノ基を含む場合には、基材の反応性基としてはカルボキシル基又はアルデヒド基が好ましく、基材への導入手段としては、それぞれアミド結合形成反応又はシッフベース形成反応を用いることができる。ビオチンを含有する試薬がカルボキシル基やカルボキシル基活性エステルを含む場合には、基材の反応性基としてはアミノ基が好ましく、前記導入手段としては、アミド結合形成反応を用いることができる。ビオチンを含有する試薬がチオール基を含む場合には、基材の反応性基としてはハロアセチル基やエポキシ基が好ましく、前記導入手段としては、チオエーテル形成反応を用いることができる。ビオチンを含有する試薬がハロアセチル基又はα，β−不飽和カルボニル基を含む場合には、材料やコーティング層の反応性基としてはチオール基が好ましく、前記導入手段としては、チオエーテル形成反応を用いることができる。【０１１６】
上記のようにしてビオチンが導入された基材に対して、水に溶解された状態でアビジンを一定時間作用させ結合させることで、アビジンを含有する基材が調製できる。具体的な反応条件の例としては、コーティング層やビオチンを含有する試薬の変質を防ぐため、温度は好ましくは６０℃以下、より好ましくは４０℃以下において、ｐＨが好ましくは３から１１の範囲、より好ましくは４から９の範囲において１時間以上反応という条件が挙げられる。ビオチンが導入された基材に添加するアビジン水溶液の濃度を制御することで、アビジンの表面密度を自由に変化させることができる。アビジンの表面密度は、リガンド構築物の固定化密度を確保する目的から０．１ｆｍｏｌ／ｃｍ２以上であることが好ましく、さらにアビジンは固定化するとビオチンへの結合活性が低下することを考慮すると１ｆｍｏｌ／ｃｍ２以上であることが好ましい。一方、アビジンの大きさ等を考慮すると、１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２程度以下が好ましい。但し、アビジンの固定化密度は表面の粗さやコーティング層の厚み等により変化することがある。【０１１７】
ナノ構造を有するリガンド構築物が固定化される基材は、例えば、編織布、不織布、綿状体、糸状体、中空糸、多孔体、球体、円筒体、フィルム、プレート及びこれらの複合構造（例えばマルチウェルプレート等が例示できる）になっていてもよく、それぞれの形状に含まれる糸、球、孔、円筒等の大きさはナノメートルサイズであってもよい。また、それぞれの基材に関して、公知の方法によってナノメートルサイズ以上の微細加工が施されていてもよく、例えば、Ｋ．Ｓａｔｏ，Ａ．Ｈｉｂａｒａ，Ｍ．Ｔｏｋｅｓｈｉ，Ｈ．Ｈｉｓａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋｉｔａｍｏｒｉ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９，１５−２２（２００３）にあるようなマイクロ流路が形成された回路や、非特許文献８等に記載されているようなマイクロメートルサイズの細胞接着領域と非接着領域が形成されたプレート等が挙げられる。本発明のリガンド構築物を先に例示した微細加工法、例えばインクジェットリソグラフィー法、光リソグラフィー法、マイクロコンタクトプリンティング法、ディップペンナノリソグラフィー法等の方法により、材料に対してマイクロメートルからナノメートルの大きさのドット状やライン状やこれらが組み合わされたパターンを描いて固定化してもよい。これらは必要に応じて選ばれる。【０１１８】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物の使用態様は以上のような基材に固定化されて使用される態様が好ましい。固定化のための方法としては、前記リガンド構築物が有する基材結合用官能基の種類に応じて、適宜、共有結合又は非共有結合による公知の方法が利用できるが、固定化の容易さから判断すると非共有結合による固定化が好適に用いられる。非共有結合による固定化には、例えば、上記のような方法等が利用できる。【０１１９】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物が基材に固定化される際、本発明のリガンド構築物の表面密度は対象とする細胞に応じて自由に選択でき、特に限定されるわけではない。ただし、リガンド構築物の表面密度は、本発明のリガンド構築物に含まれるスペーサーの長さよりも、以下の式によって規定されるリガンド構築物間の平均距離が短くならない範囲であることが好ましい。
平均距離＝１０００／（６．０２×表面密度）１／２
リガンド構築物間の平均距離の単位は、ナノメートル（ｎｍ）であり、リガンド分子の表面密度の単位は、１平方センチメートル当たりのフェムトモル（ｆｍｏｌ／ｃｍ２）である。以上の計算式によって、様々なスペーサーの長さに応じて最大の表面密度はその都度選択できるが、既に記載した好ましいスペーサーの長さの範囲から考えると、好ましいリガンド構築物の表面密度としては１６６ｐｍｏｌ／ｃｍ２（１６６×１０３ｆｍｏｌ／ｃｍ２）以下であり、より好ましくは６．６ｐｍｏｌ／ｃｍ２（６．６×１０３ｆｍｏｌ／ｃｍ２）以下であり、さらに好ましくは２．０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（２．０×１０３ｆｍｏｌ／ｃｍ２）以下である。表面密度の下限値は特に限定されないが、例えばＳＰ．Ｍａｓｓｉａ，ＪＡ．Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１４（５），１０８９−１１００（１９９１）等に記載されているように、細胞が接着できる最小の密度である０．１ｆｍｏｌ／ｃｍ２程度以上であることが好ましい。【０１２０】
本発明のリガンド構築物及びそれらを固定化した基材は必要に応じて滅菌することができる。滅菌方法も特に限定されず用途に応じていずれも採用でき、例えばオートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、電子線滅菌、濾過滅菌等が挙げられる。以上を組み合わせた方法、例えば予め滅菌された材料、基材に対して濾過滅菌したリガンド構築物を無菌条件下で固定化し、本発明のリガンド構築物及びそれらを固定化した材料を調製すること等も可能であり、必要に応じて最適な滅菌方法が選択できる。【０１２１】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は溶液状態で、又は基材に固定化された状態で細胞と相互作用させて培養することで目的を達成することができる。細胞の機能を発現させるためには、本発明のリガンド構築物に加えて培地が必要である。培地としては、用いる細胞の種類等に応じて変化するが、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地及びこれらの混合物（例えば、朝倉書店発行、日本組織培養学会編「組織培養の技術」第三版５８１頁）、並びにこれらの培地に血清成分（例えば、ウシ血清等）等を添加したものが挙げられる。細胞の培養は、少なくとも本発明のリガンド構築物の存在下に行えばよいが（例えば、これらの培地に本発明のリガンド構築物を溶液状態のまま添加したものを用いてもよい）、細胞機能の制御をより効果的に達成する観点からは、本発明の細胞培養用基材を用いて細胞を培養するのが好適である。従って、本発明は、別の一態様として、本発明のリガンド構築物の存在下に培養して得られた細胞、並びに本発明のリガンド構築物の存在下に細胞を培養する工程を有する細胞の調製方法を提供する。なお、細胞培養の具体的方法については、前記成書等を参照すればよい。【０１２２】
本明細書における「細胞機能」とは、例えば、接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死等目的に見合った細胞の状態を奏する細胞の能力をいう。本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は、細胞を用いて様々な物質を評価する機器において、その心臓部となる細胞の機能を制御する材料として利用することができる。また、細胞（再生）医療におけるスキャホールド部品等として利用できる。従って、以上のような多岐に渡る用途に依存して使用される細胞及び要求される機能も変わるため、特に細胞、制御対象の機能は目的に応じて決定すればよく特に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２３】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はそれらにより何ら限定されない。以下の実施例等において使用した測定方法又は評価方法をまとめて示す。なお、以下の記載において、特に明示されない限り「％」は容量％を意味する。【０１２４】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分析は以下のような条件で行った。カラムとして東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭを用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２１０ｎｍであった。条件ａでは、溶離液Ａとして０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略称することがある）を含有する５％アセトニトリル水溶液、溶離液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含有する３０％アセトニトリル水溶液を用い、溶離液ＡからＢへ２０分のリニアグラジエントをかけた。また、条件ｂでは、溶離液Ａとして０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する５％アセトニトリル水溶液、溶離液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含有する７２．５％アセトニトリル水溶液を用い、溶離液ＡからＢへ４５分のリニアグラジエントをかけた。【０１２５】
（逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製は以下のような条件で行った。カラムとして島津製作所製ＰＲＥＰ−ＯＤＳを用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２１０ｎｍで行った。溶離液Ａとして０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する１０％アセトニトリル水溶液、溶離液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含有する４０％アセトニトリル水溶液を用い、溶離液ＡからＢへ２４分のリニアグラジエントをかけることにより溶出させた。【０１２６】
（マススペクトルの測定）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ社製））により、マトリクスとして、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を用いてマススペクトルを測定した。【０１２７】
（逆相ＨＰＬＣによるリガンド分子が導入されたｓｓＤＮＡ（コンジュゲート）の分析）
逆相ＨＰＬＣによるコンジュゲートの分析は、以下のような条件で行った。カラムとして商品名：ＯｌｉｇｏＤＮＡ  ＲＰ（東ソー社製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２６０ｎｍで行った。溶離液Ａとして５％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂとして３０％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。溶離液Ａのみで５分間、その後に溶離液ＡからＢへ５０分のリニアグラジエントをかけた。【０１２８】
（ｓｓＤＮＡの濃度測定）
ｓｓＤＮＡ溶液２５μＬを、９７５μＬの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に添加して希釈した。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液のみでベース補正した分光光度計で、２６０ｎｍの吸光度を測定した。このとき測定される吸光度に４０を乗じた値をｓｓＤＮＡ溶液のＯＤ値とした。実施例で用いられるｓｓＤＮＡのＯＤあたりの重量（μｇ）はそれぞれ計算された値から算出できる。ｓｓＤＮＡの分子量を用いることで、前記のＯＤ値を、モル濃度に換算できる。【０１２９】
（ＤＮＡスペーサーを有するリガンド構築物の濃度測定）
以下の実施例で示されるリガンド構築物の濃度は、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ピアース社製）を用いて決定した。濃度既知のｄｓＤＮＡであるλＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。記載した測定値は、全て３回測定の平均値である。【０１３０】
（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
細胞の機能を制御する性能は、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力を比較することにより評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０重量％  ウシ胎仔由来血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ（ギブコ社製、α−ＭＥＭは、Ａｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの略称である）培地で培養した。その後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を９０％コンフルエント状態時にトリプシン処理により回収した。１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（シグマ社製）と５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（シグマ社製）と１０重量％  ＦＢＳ（シグマ社製）とを添加したα−ＭＥＭに、１９０００個／ｍＬとなるように、前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を再分散させた。その後、リガンド構築物を以下に示す方法により固定化した１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬとなるように前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種した。この時の細胞密度は、５０００個／ｃｍ２であった。３７℃、５容積％  ＣＯ２を含む湿潤空気中で前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。３日毎に培地の交換を行なった。播種した日から７日目にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。前記ＡＬＰ活性をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化度合の指標として、リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能を評価した。【０１３１】
培養後の細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳ  ０．５ｍＬに再分散した。得られた分散液を用い、細胞数を、ビルケルチルク氏血球計算盤で計数した。その後、分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性の測定を行なった。ＡＬＰ活性測定は、基質溶液〔商品名：ＦＡＳＴ  ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＴＡＢＬＥＴ  ＳＥＴＳ（シグマ社製）を溶解して使用した〕を用いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）法により行なった。ここで、基質であるｐＮＰＰが、ＡＬＰによりｐ−ニトロフェノールとなり黄色を呈することを利用し、一定時間に生じるｐ−ニトロフェノール量で酵素活性値を示した。既知量のｐ−ニトロフェノールをＰＢＳに溶解させたものを用いて検量線を作成し、生成したｐ−ニトロフェノール量を前記検量線を用いて定量した。また、細胞膜の溶解には、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００（シグマ社製）を用いた。９６ウェルプレートに、細胞液又は検量線溶液  １００μＬと、０．３％ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００  ５０μＬと、基質溶液  １００μＬとを入れ、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションして反応を行なった。得られた反応産物に、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液  ５０μＬを添加し、酵素反応を停止させた。その後、得られた産物について、マイクロプレートリーダー（デカン社製ジェニオス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。１個の細胞あたりのＡＬＰ活性（細胞１個あたりのｐ−ニトロフェノールの生成速度（ｆｍｏｌ／分／細胞））を算出した。【０１３２】
以下の実施例では本発明における最も単純な実施態様の１つを例示する。すなわち、リガンド分子として、ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来するリガンド分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来するリガンド分子））を用い、リガンド分子間を繋ぐスペーサーの構造として、相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡを用い、基材結合用官能基として、ビオチンを用いる態様について述べる。【０１３３】
二つのリガンド分子の導入位置は、ｄｓＤＮＡに二箇所存在する５’末端とした。また、基材結合用活性基であるビオチンの導入位置は、ＧＲＧＤＳリガンド分子とｄｓＤＮＡスペーサーの間とし、リンカーを介して導入した。ＤＮＡスペーサーの長さは、２０ｎｍ（２本鎖ＤＮＡとしてはそれぞれ６０量体）とした。以上の概念に従って設計されたリガンド構築物の構造（模式図）を以下に示す。該リガンド構築物を、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳと呼ぶ。合成プロセスの概略は図１の通りである。【０１３４】
【化１】
2007074747.tif 000002
【０１３５】
〔実施例１〕ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳの前変性法による調製
まず、ｓｓＤＮＡにリガンド分子が結合したコンジュゲートを合成した。以下の実施例では、リガンド分子に含有される核酸スペーサー結合用官能基としてマレイミド基を選択した。具体的には、ＫＤＧＥＡのＮ末端にマレイミド基を導入したマレイミド化ＫＤＧＥＡ、ＧＲＧＤＳのＮ末端にさらにアミノ酸であるリジンを導入してＫＧＲＧＤＳとしたペプチド分子に対して、リジンのε−アミノ基にマレイミド基、Ｎ末端にリンカーを介してビオチン基を導入したマレイミド化（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳを使用した。
また、ｓｓＤＮＡにはリガンド分子結合用官能基としてチオール基が５’末端に導入されているものを用いた。より具体的に構造を説明すると、５’末端のリン酸基に対して６−メルカプト−１−ヘキサノールのＯＨ部位が結合した状態となっている合成ｓｓＤＮＡである。合成された直後では５’末端のチオール部位は、チオール基を有する保護基とジスルフィド結合により保護されている。これを脱保護してチオール基を生成させ、マレイミド化ＫＤＧＥＡ又はマレイミド化（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳを導入してｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成する。【０１３６】
（マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成）
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（Ｆｍｏｃは９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌの略称である）が予め導入された樹脂（島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、合成反応を開始した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン（アプライドバイオシステムズ社製）／ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略称することがある）溶液を用いておこなった。また、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応は、レジン中のアミノ酸量に対して１０当量のＦｍｏｃ−ａａ（ａａは適切に保護されたアミノ酸を示す）と、縮合試薬として１０当量のＨＢＴＵ（島津製作所製，ＨＢＴＵは２−（１−Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略称である）、１０当量のＨＯＢｔ（ペプチド研究所製，ＨＯＢｔは１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅの略称である）及び２０当量のＤＩＥＡ（アプライドバイオシステムズ社製，ＤＩＥＡはＤｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅの略称である）をＤＭＦに溶解し添加することにより行い、ＫＤＧＥＡペプチドを樹脂上で合成した。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護し、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ（同仁化学製、ＧＭＢＳはＮ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である）と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させた後、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄した後、メタノール及びジエチルエーテルで洗って樹脂を減圧乾燥した。以上のように連結したマレイミド基含有ペプチドの切断には９０％トリフルオロ酢酸（ペプチド研究所製）／５％チオアニソール（アルドリッチ社製）／３％Ｈ２Ｏ／２％アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液と樹脂とを混合し、２時間室温で攪拌した後に樹脂を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られたペプチドは上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣ（条件ａ）でシングルピーク（保持時間１０．４分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定すると、ｍ／ｚ＝６８４．６０［Ｍ＋Ｈ］＋であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＫＤＧＥＡを得た。【０１３７】
（マレイミド化（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入された樹脂（島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、マレイミド化ＫＤＧＥＡと同様の方法でＧＲＧＤＳペプチドを樹脂上で合成した。ＧＲＧＤＳペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応により保護アミノ酸であるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ（ノババイオケム社製、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨはＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−１−（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘ−１−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを示す）を導入した。さらに、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応により保護アミノ酸であるＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ（ペプチド研究所製、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡはＦｍｏｃ−８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを示す）をリンカー部位として２回繰り返して導入した。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＢｉｏｔｉｎ−ＯＳｕ（ノババイオケム社製、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＳｕはＢｉｏｔｉｎ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒを示す）と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させた後、さらに１当量のＢｉｏｔｉｎ−ＯＳｕを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物をＤＭＦで洗浄した後、２％ヒドラジン／ＤＭＦ溶液によって脱保護し、リジン残基にε−アミノ基を生成させた。生成した遊離のε−アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ（同仁化学製、ＧＭＢＳはＮ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である）と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させた後、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄した後、メタノール及びジエチルエーテルで洗って樹脂を減圧乾燥した。以上のように連結したマレイミド基含有ペプチドの切断には９０％トリフルオロ酢酸（ペプチド研究所製）／５％チオアニソール（アルドリッチ社製）／３％Ｈ２Ｏ／２％アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液と樹脂とを混合し、２時間室温で攪拌した後にレジンを濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られた粗ペプチドは上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣ（条件ｂ）でシングルピーク（保持時間１４．８分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定すると、ｍ／ｚ＝１３０１．５６［Ｍ＋Ｈ］＋であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳを得た。【０１３８】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡは、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄの二種類である（図１参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（シグマジェノシス社製）を１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＴＥバッファー（１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと記載することもある）を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ＝８．０）に溶解させた。得られた溶液０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．２ｍＬ混合して、室温１６時間攪拌した。溶離液（０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０））により平衡化した商品名：ＮＡＰ−５カラム（ファルマシアバイオテク社製）により精製してチオール基が脱保護されたＨＳ−ＳＰ２０Ａを得た。２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した（表１を参照）。同様にＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄも脱保護してＨＳ−ＳＰ２０Ｄを得た（表１を参照）。【０１３９】
【表１】
2007074747.tif 000003
【０１４０】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及び（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａへのマレイミド化ＫＤＧＥＡの結合形成によってＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（図１を参照）を調製する方法について述べる。０．８ｍＬのＨＳ−ＳＰ２０Ａ溶液（濃度は１２．５ｎｍｏｌ／ｍＬ）と、ＨＳ−ＳＰ２０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡを０．８ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解した溶液を混合し、４℃で２４時間反応させた。この反応溶液を凍結乾燥後、０．５ｍＬの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。溶離液で平衡化したＮＡＰ−５（商品名）によりゲル濾過してＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａを精製した。なお、前記溶離液として、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を用いた。２６０ｎｍにおける吸光度を測定して、ＨＳ−ＳＰ２０Ａ（表１）のデータを利用して濃度を計算した（表２を参照）。同様にマレイミド化（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ２０Ｄのコンジュゲートである（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄを得た（表２を参照）。全てのコンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることを確認した。【０１４１】
【表２】
2007074747.tif 000004
【０１４２】
（ビオチン基を含有するリガンド構築物であるＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧ
ＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ、（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄ、ＳＰ２０Ｃ及び緩衝液を表３のように混合して、９４℃を３０秒間、次いで５５℃を３０秒間インキュベーションすることによりアニーリングさせた（図１参照）。このうち９０μＬの溶液を取り出し、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ社製）の酵素溶液９０μＬと混合し、１６℃で６０分間ライゲーション反応を行った。スピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳを得た。定法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出したところ、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳの核酸スペーサーがｄｓＤＮＡとして６０量体であることが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量したところ、２１．０μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると０．５７ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。【０１４３】
【表３】
2007074747.tif 000005
【０１４４】
〔製造例１〕
（ストレプトアビジンを固定化した表面１の調製）
シグマ社製のストレプトアビジン（以下、ＳＡと略称することがある）を１００μｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した。この溶液を、無処理ポリスチレン製１２ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社製）に０．５ｍＬ／ウェルとなるように加え、２７℃で１時間ＳＡを表面に吸着させた。各ウェルを１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジン固定化密度をピアース社製の蛋白質測定キット（商品名：ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）により測定すると、０．３２μｇ／ｃｍ２（５．３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）であった。なお、固定化されたＳＡ量とその固定化密度は、前記蛋白質測定キットにより測定される結合前と後のＳＡ溶液の蛋白質濃度から算出した。すなわち、ウェルあたりのＳＡ減少量（μｇ）が固定化されたＳＡ量に相当し、該固定化量をコーティング面積である４．５ｃｍ２（１２ウェルプレートの場合、０．５ｍＬのＳＡ溶液でコーティングするとコーティング面積は４．５ｃｍ２となるため）で除することで固定化密度が計算される。また、ＳＡの分子量を６万とし、単位面積あたりのモル密度を計算した。またブロッキング剤として、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製フラクションＶを用いた。以下、ＢＳＡと略称する）含有ＰＢＳ溶液を１ｍＬ／ウェルで添加し、２７℃で１時間、表面に吸着させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、ＳＡ固定化表面１を得た。【０１４５】
〔製造例２〕
（ＢＳＡコーティング層にＳＡを固定化した表面２の作製）
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液をデルタ処理１２ウェルプレート（ヌンク社製）に対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、室温で１時間、ＢＳＡを吸着させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、２０μＭのＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアース社製）を含むＰＢＳ溶液をウェルあたり０．５ｍＬ添加し、室温で２時間反応させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、１５μｇ／ｍＬのＳＡを含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加して室温で５時間ＳＡを吸着させた。固定化されたＳＡの密度を製造例１と同様の方法で測定すると、固定化されたストレプトアビジンの密度は０．４８μｇ／ｃｍ２（８ｐｍｏｌ／ｃｍ２）となった。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡコーティング層にＳＡを固定化した表面２を作製した。【０１４６】
〔製造例３〕
（ＢＳＡコーティング層にＳＡを固定化した表面３の作製）
３ｍｇのＢＳＡを２．８５ｍＬのＰＢＳに溶解した後、２０μｍｏｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（ピアース社製）を溶解した０．１５ｍＬのＤＭＦ溶液を加え、室温で１時間振盪して反応させた。反応後の溶液を透析膜に移し、３００ｍＬの０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ溶液に対して４℃で３回透析を行うことで、ビオチン化ＢＳＡを得た。２０μｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ溶液を、デルタ処理１２ウェルプレート（ヌンク社製）に対して、ウェルあたり０．５ｍＬ添加して室温で一晩静置し、プレートにビオチン化ＢＳＡを吸着させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を各ウェルに０．５ｍＬ加え、室温で１時間静置後、再びＰＢＳで３回洗浄した。次に１６．８μｇ／ｍＬのＳＡ含有ＰＢＳ溶液を１ウェルあたり０．５ｍＬ加え、室温で５時間振盪してＳＡを固定化させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡコーティング層にＳＡを固定化した基材を作製した。固定化されたＳＡの密度を製造例１と同様の方法で測定すると、０．５４μｇ／ｃｍ２（９ｐｍｏｌ／ｃｍ２）となった。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡコーティング層にＳＡを固定化した表面３を作製した。【０１４７】
〔製造例４〕
（アルギン酸ハイドロゲルコーティング層へＳＡを固定化した表面４の作成）
０．１％のアルギン酸ナトリウム（紀文フードケミファ製、商品名：ＮＳＰＨ）水溶液をガラスディッシュ（直径２．７ｃｍ）に対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して室温で乾燥させた。前記のウェルに１％の塩化カルシウム溶液を１ウェルあたり０．５ｍＬ加えて、室温で２時間アルギン酸を硬化させた。その後、１ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳを添加して３分間放置し、アスピレーションする洗浄操作を３回行ってアルギン酸ハイドロゲルコーティング層とした。２５０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む２０ｍＬ  ＤＭＦに、４１２ｍｇのＥＤＣ・ＨＣＬ（ペプチド研究所製）を溶解した。この溶液を１ウェルあたり１ｍＬ加えて、室温で２０時間反応させた。ディッシュあたり１ｍＬのメタノールで３回洗浄し、乾燥させた。１００ｍＭのエチレンジアミンを含有するＤＭＦを１ウェルあたり１ｍＬ加えて、室温で６時間反応させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、２０μＭのＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアース社製）を含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加し、室温で２時間反応させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、１５μｇ／ｍＬのＳＡを含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加して室温で５時間固定化させた。静置後、再び１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。固定化されたＳＡの密度を製造例１と同様の方法で測定すると、結合されたＳＡの密度は０．２８μｇ／ｃｍ２（４ｐｍｏｌ／ｃｍ２）であった。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、アルギン酸ハイドロゲルコーティング層にＳＡを固定化した表面４を有する基材を作製した。【０１４８】
〔実施例２〜５〕細胞培養用基材の調製
実施例１において調製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳをそれぞれの表面に対して表４に示した濃度となるように１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに溶解した。この溶液を０．２μｍのフィルターで濾過することにより滅菌し、製造例１〜４で調製した表面１〜４に対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。なお、リガンド構築物の固定化密度は本実施例に限定されず、該密度は仕込みのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳ濃度を増減させることによって、調整が可能である。その後、４℃において１２時間以上リガンド構築物を固定化させた。固定化反応前後のリガンド構築物溶液のｄｓＤＮＡ濃度を、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより測定した。両者の濃度の差から、添加したリガンド構築物が、それぞれの表面にどの程度固定化されているかを算出した。その結果を表４に示す。【０１４９】
【表４】
2007074747.tif 000006
【０１５０】
表４に示されるとおり、基材結合用官能基を含有するリガンド構築物は、リガンド構築物固定化用官能基を有する基材へ効率的に固定化された。なかでも、基材結合用官能基とリガンド構築物固定化用官能基の組み合わせとして、ストレプトアビジン−ビオチンの組合せを有する場合は、基材材料やコーティング層の種類に関わらず、高効率でリガンド構築物が固定化された。【０１５１】
〔試験例１〕
（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例２〜５で作製した細胞培養用基材の表面１〜４及びリガンド構築物を固定化していない表面１〜４を用いて、細胞の機能を制御する性能を評価した。評価は、上記の（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）に記載の通り、リガンド構築物が、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力（ＡＬＰ活性）を指標に行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して７日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表５に示す。【０１５２】
【表５】
2007074747.tif 000007
【０１５３】
表５に示されるとおり、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳを有する表面で培養されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、それらを有しない表面で培養された細胞に比べて、顕著に増幅されたＡＬＰ活性を示した。【０１５４】
〔比較製造例１〕
（マレイミド化ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入された樹脂（島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、実施例１のマレイミド化ＫＤＧＥＡと同様の方法で合成した。得られた粗ペプチドは上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間８．６分）であることを確認した（条件a）。また、マススペクトルによって、前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６５６．６１［Ｍ＋Ｈ］＋であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＧＲＧＤＳを得た。【０１５５】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡはＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄの二種類である（図２を参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（シグマジェノシス社製）を１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＴＥバッファー（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ＝８．０）に溶解させた。得られた溶液０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．２ｍＬ混合して室温１６時間攪拌した。溶離液により平衡化したファルマシアバイオテク社製ＮＡＰ−５カラムにより精製してチオール基が脱保護されたＨＳ−ＳＰ２０Ａを得た。なお、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を溶離液として用いた。２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した（表６を参照）。同様にＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄも脱保護してＨＳ−ＳＰ２０Ｄを得た（表６を参照）。【０１５６】
【表６】
2007074747.tif 000008
【０１５７】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａへのマレイミド化ＫＤＧＥＡの結合形成によってＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（図２を参照）を調製する方法について述べる。０．８ｍＬの１７．０ｎｍｏｌ／ｍＬ  ＨＳ−ＳＰ２０Ａ溶液と、ＨＳ−ＳＰ２０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡ（実施例１で調製）とを０．８ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。得られた溶液を混合し、４℃で２４時間反応させた。この反応溶液を凍結乾燥後、０．５ｍＬの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。溶離液で平衡化した商品名：ＮＡＰ−５によりゲル濾過してＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａを精製した。なお、溶離液は１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を使用した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定して、ＨＳ−ＳＰ２０Ａ（表６）のデータを利用して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａの濃度を計算した（表７を参照）。同様にマレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ２０ＤとのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄを得た（表７を参照）。全てのコンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることを確認した。【０１５８】
【表７】
2007074747.tif 000009
【０１５９】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ、ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄ、ＳＰ２０Ｃ、緩衝液及び水を表８のように混合した。得られた溶液を、９４℃を３０秒間、次いで５５℃を３０秒間インキュベーションすることによりアニーリングした。このうち９０μＬの溶液を取り出し、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ社製）の酵素溶液９０μＬと混合し、１６℃で６０分間ライゲーション反応を行った。得られた産物をスピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを得た。定法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出したところ、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡが６０量体であることが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量したところ、４８．０μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると１．３ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。【０１６０】
【表８】
2007074747.tif 000010
【０１６１】
〔比較例１〕
（ポリスチレンディッシュへのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの物理的吸着）
比較製造例１で調製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを０．９ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解した。得られた溶液を、製造例１で調製した表面１に対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。１２ウェルプレートの場合、１ウェルに液体を０．５ｍＬ入れると液体が覆う面積は約４．５ｃｍ２となる。従って、この場合のリガンド構築物が全て表面１に結合したときの密度は１００ｆｍｏｌ／ｃｍ２となる。その後、４℃において１２時間以上リガンド構築物を吸着させた。吸着前後のリガンド構築物溶液のｄｓＤＮＡ濃度を、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより測定した。両者の濃度の差から、添加したリガンド構築物が、表面１にどの程度固定化されているかを算出した。その結果、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳが固定化できていないことが分かった。【０１６２】
〔比較例２〕
（アルギン酸ハイドロゲルコーティング層へのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの物理
的吸着）
比較製造例１で調製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを０．９ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解した。得られた溶液を、製造例４で調製した表面４に対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。その後、４℃において１２時間以上リガンド構築物を吸着させた。吸着前後のリガンド構築物溶液のｄｓＤＮＡ濃度を、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより測定した。両者の濃度の差から、添加したリガンド構築物が、表面４にどの程度固定化されているかを算出した。その結果、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳが固定化できていないことが分かった。【０１６３】
以下の実施例では、リガンド分子として、ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来するリガンド分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来するリガンド分子））を用い、リガンド分子間を繋ぐスペーサーの構造として、相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡを用い、基材結合用官能基として、チオール基を用いる態様について述べる。【０１６４】
二つのリガンド分子の導入位置は、ｄｓＤＮＡに二箇所存在する５’末端とした。また、基材結合用活性基であるチオール基の導入位置は、ＧＲＧＤＳリガンド分子とｄｓＤＮＡスペーサーの間とした。ＤＮＡスペーサーの長さは、２０ｎｍ（２本鎖ＤＮＡとしてはそれぞれ６０量体）とした。以上の概念に従って設計されたリガンド構築物の構造（模式図）を以下に示す。該リガンド構築物を、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳと呼ぶ。【０１６５】
【化２】
2007074747.tif 000011
【０１６６】
〔実施例６〕ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳの前変性法による調製
まず、ｓｓＤＮＡにリガンド分子が結合したコンジュゲートを合成した。実施例１と同様に、核酸スペーサー結合用官能基を含むリガンド分子の一つとして、マレイミド化ＫＤＧＥＡ（実施例１）を用いた。もう一方の核酸スペーサー結合用官能基を含むリガンド分子としては、ＧＲＧＤＳのＮ末端にさらにシステインを導入して（Ｃ）ＧＲＧＤＳとしたペプチド分子に対して、システインのε−アミノ基にマレイミド基を導入したマレイミド化（Ｃ）ＧＲＧＤＳを使用した。これらを用いて実施例１と同様にｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成させた。なお、システインのチオール基を基材結合用活性基として用いる。【０１６７】
（マレイミド化（ＣＰ）ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入された樹脂（島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、実施例１のマレイミド化ＫＤＧＥＡと同様の方法でＧＲＧＤＳペプチドを樹脂上で合成した。ＧＲＧＤＳペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応により保護アミノ酸であるＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕｔｈｉｏ）−ＯＨ（ノババイオケム社製、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕｔｈｉｏ）−ＯＨはＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｔ−Ｂｕｔｙｌｔｈｉｏ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅを示す）を導入した。さらに、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、生成した遊離のε−アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳと、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させた後、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄した後、メタノール及びジエチルエーテルで洗って樹脂を減圧乾燥した。以上のように連結したマレイミド基含有ペプチドの切断には９０％トリフルオロ酢酸（ペプチド研究所製）／５％チオアニソール（アルドリッチ社製）／３％Ｈ２Ｏ／２％アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液と樹脂とを混合し、２時間室温で攪拌した後にレジンを濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られた粗ペプチドは上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣ（条件ａ）でシングルピーク（保持時間１９．２分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定すると、ｍ／ｚ＝８４７．６６［Ｍ＋Ｈ］＋であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化（ＣＰ）ＧＲＧＤＳを得た。なお、基材結合用活性基であるチオール基はこの時点では保護されたままである。【０１６８】
（（Ｃ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄの調製）
実施例１と同様にマレイミド化（ＣＰ）ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ２０Ｄのコンジュゲートである（ＣＰ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄを得た。コンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることを確認した。２６０ｎｍの吸光度から濃度を測定すると、１０．４ｎｍｏｌ／ｍＬであった。【０１６９】
（システイン基を含有するリガンド構築物であるＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（実施例１）、（ＣＰ）ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｄ、ＳＰ２０Ｃ及び緩衝液を表９のように混合して、９４℃を３０秒間、次いで５５℃を３０秒間インキュベーションすることによりアニーリングさせた。このうち９０μＬの溶液を取り出し、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ社製）の酵素溶液９０μＬと混合し、１６℃で６０分間ライゲーション反応を行った。スピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（ＣＰ）ＧＲＧＤＳを得た。定法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出したところ、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（ＣＰ）ＧＲＧＤＳの核酸スペーサーがｄｓＤＮＡとして６０量体であることが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。また、リガンド分子部分のチオール基を脱保護するため、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（ＣＰ）ＧＲＧＤＳ溶液０．１ｍＬに対して、０．０８Ｍジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．１ｍＬ混合して室温１６時間攪拌した。溶離液により平衡化したファルマシアバイオテク社製ＮＡＰ−５カラムにより精製してチオール基が脱保護されたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳを得た（溶離液は０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いた）。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量したところ、２１．７μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると０．５９ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
〔製造例５〕
（ＢＳＡコーティング層にマレイミド基を固定化した表面５の作製）
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液をデルタ処理１２ウェルプレート（ヌンク社製）に対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、室温で１時間、ＢＳＡを吸着させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄後、１ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ（ピアース社製、Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳはＮ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）−スルホスクシンイミドエステルを示す）を含むＰＢＳ溶液をウェルあたり０．５ｍＬ添加し、室温で１時間反応させた。１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡコーティング層にマレイミド基を固定化した表面５を作製した。【０１７２】
固定化されたマレイミド基の密度は以下のようにして測定した。３μＭのチオエタノールを含むＰＢＳ（１ｍＭのＥＤＴＡを含有）を１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、室温で１４時間反応させた。その後、ウェル中の溶液を０．３ｍＬ採取し、０．６ｍＭのＡＢＤ−Ｆ（同仁化学社製、ＡＢＤ−Ｆは４−フルオロ−７−スルファモイルベンゾフラザンを示す）を含む０．１ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）と１．７ｍＬ混合し、５０℃で５分間反応させた。氷冷し、０．１ＮのＨＣｌ水溶液を０．６ｍＬ添加して、蛍光強度（励起波長３８０ｎｍ／蛍光波長５１０ｎｍ）を測定した。固定化されたチオエタノール量は反応前と後のチオエタノール濃度から算出した。すなわち、ウェルあたりのチオエタノール減少量（ｐｍｏｌ）が固定化されたチオエタノール量に相当し、該固定化量をコーティング面積である４．５ｃｍ２（１２ウェルプレートの場合）で除することで固定化密度が計算される。測定の結果、チオエタノールの結合密度は１１９ｐｍｏｌ／ｃｍ２であり、このチオエタノールの結合密度はマレイミド基の固定化密度を表している。【０１７３】
〔実施例７〕細胞培養用基材の調製
実施例６において調製したチオール基が脱保護されたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳを表面５に対して表１０に示した濃度となるように１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに溶解した。この溶液を０．２μｍのフィルターで濾過することにより滅菌し、製造例５で調製した表面５に対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。なお、リガンド構築物の固定化密度は本実施例に限定されず、該密度は仕込みのチオール基が脱保護されたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳ濃度を増減させることによって、調整が可能である。その後、室温において７０時間以上リガンド構築物を固定化させた。固定化反応前後のリガンド構築物溶液のｄｓＤＮＡ濃度を、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより測定した。両者の濃度の差から、添加したリガンド構築物が、それぞれの表面にどの程度固定化されているかを算出した。
その結果を表１０に示す。【０１７４】
【表１０】
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【０１７５】
〔試験例２〕
（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例７で作製した細胞培養用基材の表面５及びリガンド構築物を固定化していない表面５を用いて、細胞の機能を制御する性能を評価した。評価は、上記の（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）に記載の通り、リガンド構築物が、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力（ＡＬＰ活性）を指標に行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して７日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表１１に示す。【０１７６】
【表１１】
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【０１７７】
表１１に示されるとおり、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｃ）ＧＲＧＤＳを有する表面で培養されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、それらを有しない表面で培養された細胞に比べて、顕著に増幅されたＡＬＰ活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明により、細胞機能を効果的に再現性よく制御することができるリガンド構築物、及び該構築物を固定化した細胞培養用基材が提供される。本発明は、例えば、薬物の薬効、薬理、毒性に関する試験の効率化による医薬品の開発支援、動物試験代替法、細胞を用いたバイオセンサー、研究用又は移植用の機能細胞の供給、細胞の機能発現の仕組みを探索する研究、細胞（再生）医療、患者の細胞を用いた診断、医薬品等有用物質の製造等の分野に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、スペーサーとして２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−（Ｂｉｏ）ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。
【図２】図２は、スペーサーとして２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列番号：１は、リガンドの配列を示す。
配列番号：２は、リガンドの配列を示す。
配列番号：３は、リガンドの配列を示す。
配列番号：４は、リガンドの配列を示す。
配列番号：５は、リガンドの配列を示す。
配列番号：６は、リガンドの配列を示す。
配列番号：７は、リガンドの配列を示す。
配列番号：８は、リガンドの配列を示す。
配列番号：９は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１０は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１１は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１２は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１３は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１４は、リガンドの配列を示す。
配列番号：１５は、リガンドの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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