(57)【要約】本発明は、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）から得られる新しいタンパク質をコードする単離された核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、そのようなベクターで形質転換されているアクレモニウム・クリソゲヌム宿主細胞、および、そのような形質転換された宿主細胞を使用してセファロスポリンＣを製造するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のみからなるタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子である、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号２に示される配列と異なる塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号３に示される配列と異なる塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号４に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号４に示される配列と異なる塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号２、配列番号３、配列番号４の塩基配列、および、遺伝暗号の縮重性のためだけにより前記塩基配列のいずれかと異なる塩基配列からなる群から選択される塩基配列のみからなる、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載される核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のｐｃｂＡＢ遺伝子、ｐｃｂＣ遺伝子、ｃｅｆＤ１遺伝子、ｃｅｆＤ２遺伝子、ｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子によりコードされるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つのさらなる核酸分子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
アクレモニウム・クリソゲヌムのｐｃｂＡＢ遺伝子およびｐｃｂＣ遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
アクレモニウム・クリソゲヌムのｃｅｆＤ１遺伝子およびｃｅｆＤ２遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
アクレモニウム・クリソゲヌムのｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１３】
宿主細胞を形質転換するために好適な、請求項８から１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
宿主細胞が微生物である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
微生物がアクレモニウム・クリソゲヌムである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項８から１５のいずれか一項に記載されるベクターで形質転換されている宿主細胞。
【請求項１７】
微生物である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
微生物がアクレモニウム・クリソゲヌムである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞によるセファロスポリンＣの産生を行わせるために好適な条件のもとで請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含むセファロスポリンＣの製造方法。
【請求項２０】
産生されたセファロスポリンＣを単離することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項２２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のみからなる、請求項２１に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）から得られる新しいタンパク質をコードする単離された核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、そのようなベクターで形質転換されているアクレモニウム・クリソゲヌム宿主細胞、および、そのような形質転換された宿主細胞を使用してセファロスポリンＣを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セファロスポリンＣは、糸状菌アクレモニウム・クリソゲヌム（本明細書中下記ではＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍとして示される）の工業的規模での発酵によって得られる天然の代謝産物である。この物質は、数多くの半合成セファロスポリン抗生物質のための重要な前駆体である。セファロスポリン物質クラスは非常に治療的に重要である。工業的セファロスポリン発酵の収率の増大は、本質的には、プロセス技術の改善に加えて、絶え間ない遺伝的な菌株改良に依存する。前記菌株改良の現代の方法でのますます重要になっているのは、産生を増大させる潜在的可能性を有する特定の遺伝子による産生菌株の形質転換である。知られているセファロスポリン生合成遺伝子の小さい一群が、セファロスポリン生合成の生化学的関係の知識により、菌株改良の潜在的可能性を有するのではないかと考えられ得る。増幅、すなわち、そのような既知遺伝子のコピー数を増大させることは、実際に、実験的には部分的ではあるが、産生菌生物の生産性の著しい改善を示している。しかしながら、菌株改良の潜在的可能性が科学的な妥当性評価から予測され得る既知遺伝子の群は非常に小さい。しかしながら、これらの既知の生合成遺伝子に加えて、産生を増大させる潜在的可能性を増幅によって同様に生じさせる未知の数多くのさらなる遺伝子が推測され得る。現在、セファロスポリン生合成に影響を及ぼす細胞プロセスの全体は依然としてほとんど理解されていないので、多くの場合、そのような遺伝子の機能は知られていない。従って、産生を増大させる潜在的可能性を有するさらなる遺伝子を同定するための方法は非常に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、これまで知られていないそのようなさらなる遺伝子を発見することが本発明の主要な目的である。従って、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍから得られる新しいタンパク質をコードし、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞の形質転換のために使用することができ、その結果、この宿主細胞が良好な収率でセファロスポリンＣをもたらすことができる核酸およびベクターを提供することが本発明の目的である。そのような形質転換された宿主細胞を提供することが本発明の別の目的である。最後に、前記形質転換された宿主細胞を使用するセファロスポリンＣの製造方法を提供することが本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおける新しい遺伝子（これは、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるこれまでに知られていないタンパク質をコードする）が本発明の枠組みにおいて見出された。この新しい遺伝子は、その生来的な状態では、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのゲノムにおいて同じ染色体に存在するＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの既知のｃｅｆＥＦ遺伝子（Ｓ．Ｅ．Ｓａｍｓｏｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５（１９８７）、１２０７〜１２１４）の（翻訳方向で読んだとき）約５．５ｋｂ（キロベース）下流に存在する。
【０００５】
この新しい遺伝子はＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株ＡＴＣＣ４８２７２において見出された（これはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＰＯ  Ｂｏｘ  １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１０８、米国）からこの番号で得ることができる）。
【０００６】
この菌株は、例えば、下記の産生菌として既に詳しく特徴づけられている：種々のセファロスポリン、特に、セファロスポリンＣ（Ｌ．Ｈ．ＭａｌｍｂｅｒｇおよびＷ．Ｓ．Ｈｕ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８（１９９２）、１２２〜１２８；Ｙ．Ｑ．Ｓｈｅｎ他、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４（１９８６）、６１〜６４）、イソペニシリンＮシンセターゼ（Ｉ．Ｊ．Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４（１９８４）、６１０〜６１２；Ｊ．Ｍ．Ｌｕｅｎｇｏ他、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４（１９８６）、４４〜４７）、デアセトキシ−セファロスポリンＣシンセターゼ（Ｙ．Ｑ．Ｓｈｅｎ他、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、６（１９８４）、４０２〜４０４）、および、ＡＣＶシンセターゼ（Ｊ．Ｚｈａｎｇ他、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（１９８９）、３６１〜３６７；Ｊ．ＺｈａｎｇおよびＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８（１９９２）、３６４〜３６９）。
【０００７】
しかしながら、この新しい遺伝子はまた、他のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株においても見出され、それらからも単離され得る。あるいは、本明細書中に示される核酸配列およびアミノ酸配列または核酸分子およびアミノ酸分子は合成（特に化学合成）することができる。
【０００８】
遺伝子は、長さが５２６アミノ酸のタンパク質をコードする（図１を参照のこと、配列番号１）。アミノ酸配列が図１に示される。遺伝子におけるコード領域は、図２および図４に示されるように、３つのイントロンによって遮られている。
【０００９】
従って、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（図１参照）を含むタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【００１０】
従って、このタイプの核酸分子は、例えば、示されたアミノ酸配列（配列番号１）に加えて、さらにさらなるアミノ酸を含むタンパク質、例えば、融合タンパク質をコードすることができる。そのような融合タンパク質は、例えば、単離された形態での新しいタンパク質の調製が所望される場合、一定の役割を果たし得る。融合部分は、例えば、安定性を増大させ得るか、または、精製を容易にし得る。
【００１１】
本発明の枠組み内において、本発明の核酸分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のみをコードする核酸分子、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列をもっぱらコードする核酸分子が好ましい。このタイプの核酸分子は、本明細書中下記に記載される、セファロスポリンＣを製造する目的のために都合良く用いることができる。従って、本発明はさらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする本発明の核酸分子に関する。
【００１２】
本発明の核酸分子は、好ましくはＤＮＡ分子であり、特に、単離されたゲノムＤＮＡ分子または対応するｃＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡ分子は、例えば、対応するｍＲＮＡ分子の逆転写によって調製することができ、または合成することができる。あるいは、核酸分子はＲＮＡ分子（特にｍＲＮＡ分子）であり得る。
【００１３】
本発明のＤＮＡ分子は、例えば、前記Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株ＡＴＣＣ４８２７２のゲノムのゲノムＤＮＡライブラリーを作製することにより調製することができる。Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの既知ｃｅｆＥＦ遺伝子と、さらには、ｃｅｆＥＦ遺伝子の下流側の少なくとも約１０ｋｂの配列とを含有するゲノムクローンが同定される。これは、ｃｅｆＥＦ遺伝子の知られている核酸配列（Ｓ．Ｅ．ｓａｍｓｏｎ他、上記参照）からその構造が推定され得る相同的プローブを用いたスクリーニングによって行うことができる。様々な適切な技術が文献から（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、米国）において）知られている。所望のＤＮＡ分子は、そのようなクローンの約２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに存在しており、そのようなフラグメントは、古典的な技術を使用して単離または調製することができる。図４には、そのようなフラグメントが示される。従って、本発明の好ましい実施態様は、配列番号４に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号４に示される配列と異なる塩基配列を含む本発明の核酸分子に関する。すなわち、本発明によれば、本発明はまた、示されたコドンの１つまたは複数が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）が変化しないような様式で１つまたは複数の他のコドンにより置換されることによって、具体的に示された配列とは異なるそのような核酸分子に関する。これはまた、下記に記載されるさらなる核酸分子にも適用される。配列番号４に示される核酸分子は、調節配列（例えば、プロモーターおよび停止コドンなど）を含有しており、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換のために、従って、セファロスポリンＣを製造するために、特にベクターにおいて都合良く使用することができる。
【００１４】
２．５ｋｂの言及されたＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントは、具体的には、新しい遺伝子のコード部分を含む。この部分が図２に示されており、この部分は３つのイントロンを含む。従って、本発明はさらに、上記で議論されたように、配列番号２に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号２に示される配列と異なる塩基配列を含む本発明の核酸分子に関する。従って、このタイプの核酸分子は、新しい遺伝子のコード部分のゲノムＤＮＡ配列に対応する。本発明のさらなる好ましい実施態様は、１つ、２つまたは３つすべてのイントロンの非存在によって配列番号２の核酸分子とは異なるそのような核酸分子である。
【００１５】
従って、さらに、本発明の核酸分子は、上記で議論されたように、配列番号３に示される塩基配列、または、遺伝暗号の縮重性のためだけにより配列番号３に示される配列と異なる塩基配列を含む核酸分子が好ましい。このタイプの核酸分子は、言及されたイントロンのいずれをもはや含まず、そのため、対応するｃＤＮＡ配列と同等と見なすことができる。
【００１６】
さらに、本発明の核酸分子は、言及されたｃＤＮＡ分子を含めて、例えば、全体または一部を合成することができる。本発明のＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子は、標準的な技術によって微生物Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍから単離することができ、または、合成的に製造することができる。適切なｍＲＮＡから、標準的な技術を使用して、対応するｃＤＮＡ分子を調製することが可能である。
【００１７】
前記核酸分子が、（例えば、融合タンパク質をコードするために）さらなる塩基配列を含有することは完全に可能であるが、好ましい実施態様は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および、上記で議論されたように、遺伝暗号の縮重性のためだけにより前記配列のいずれかと異なる塩基配列からなる群から選択される塩基配列からもっぱらなるか、またはそのような塩基配列のみからなる本発明の核酸分子に関する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明の核酸分子は、（コードされるタンパク質のＣ末端に対応する）コード領域の終端のすぐ後に、１つ以上の停止コドンをさらに含む。ＴＡＡとして同定されている天然に存在する停止コドンが好ましい。しかしながら、それ以外の停止コドンもまた使用することができる。
【００１９】
他の知られているタンパク質配列との類似性のために、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質（配列番号１）は、ヒドロラーゼとして、具体的にはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼとして特徴づけることができる。だが、このことは限定であるとして解釈すべきではない。しかしながら、本発明の主たる事柄は、新しいタンパク質の機能を記載することではなく、特に、好ましくはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主菌株を、特に、セファロスポリンＣを製造する目的のために形質転換するための、新しいタンパク質をコードする本発明の新しい遺伝子の使用または核酸分子の使用である（これはより詳しくは下記において例示される）。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の言及された核酸分子のいずれかを含むベクターに関する。好ましくは、そのようなベクターは、宿主細胞を形質転換するために好適である。そのような宿主細胞は、特に微生物であり、特にＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍである。そのようなベクターは、例えば、プラスミドの形態であり得るが、必要な場合には、本発明の核酸分子に加えて、さらなる配列、例えば、複製起点およびさらなる調節エレメント（プロモーター、転写終結シグナル、翻訳開始シグナル、翻訳終結シグナルなど）を含有し、その結果、形質転換が行われた後、本発明の核酸分子の発現を行わせることができる。形質転換が行われた後、本発明の核酸分子および同様に他のベクターエレメントは宿主細胞のゲノムに組み込まれ、新しい遺伝子のコード部分の増幅をもたらし得る。本発明のベクターは、好都合には、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸分子を含む。そのような塩基配列は、言及されたＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに対応し、調節配列（例えば、対応するプロモーターなど）を既に含んでいる。
【００２１】
このタイプのベクターは、本発明の核酸分子を好適な標準的なベクターにクローン化することによって、標準的な技術に従って作製することができる。
【００２２】
新しく見出された遺伝子に由来する記載された核酸分子に加えて、本発明のベクターは特に、既に知られ、かつ、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるセファロスポリン生合成に関与する遺伝子に由来する１つ以上のさらなる核酸分子を含有することができ、そのような核酸分子として、特に、ｐｃｂＡＢ（Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３（１９９１）、ｐｐ．２３５４〜２３６５）、ｐｃｂＣ（Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３（１９９１）、ｐｐ．２３５４〜２３６５）、ｃｅｆＤ１（Ｒ．Ｖ．Ｕｌｌａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７（２００２）、ｐｐ．４６２１６〜４６２２５）、ｃｅｆＤ２（Ｒ．Ｖ．Ｕｌｌａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７（２００２）、ｐｐ．４６２１６〜４６２２５）、ｃｅｆＥＦ（Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４（１９９２）、ｐｐ．３０５６〜３０６４）、およびｃｅｆＧ（Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４（１９９２）、ｐｐ．３０５６〜３０６４）が挙げられる。
【００２３】
従って、別の好ましい実施態様において、本発明のベクターは、上記で記載されたように、ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣ、ｃｅｆＤ１、ｃｅｆＤ２、ｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧのアクレモニウム・クリソゲヌム遺伝子によりコードされるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つのさらなる核酸分子をさらに含む。
【００２４】
好ましくは、本発明のベクターは、アクレモニウム・クリソゲヌムのｐｃｂＡＢ遺伝子およびｐｃｂＣ遺伝子によりそれぞれ対応してコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む。
【００２５】
さらに、本発明のベクターは、好ましくは、アクレモニウム・クリソゲヌムのｃｅｆＤ１遺伝子およびｃｅｆＤ２遺伝子によりそれぞれ対応してコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む。
【００２６】
さらに、本発明のベクターは、好ましくは、アクレモニウム・クリソゲヌムのｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子によりそれぞれ対応してコードされるタンパク質をコードする２つのさらなる核酸分子をさらに含む。
【００２７】
使用されるｐｃｂＡＢ配列は、好ましくは、図５に見出されるヌクレオチド配列に対応する。使用されるｐｃｂＣ配列は、好ましくは、図５に同様に見出されるヌクレオチド配列に対応する。使用されるｃｅｆＤ１配列は、好ましくは、図６に見出されるヌクレオチド配列に対応する。使用されるｃｅｆＤ２配列は、好ましくは、図６に同様に見出されるヌクレオチド配列に対応する。使用されるｃｅｆＥＦ配列は、好ましくは、図７に見出されるヌクレオチド配列に対応する。使用されるｃｅｆＧ配列は、好ましくは、図７に同様に見出されるヌクレオチド配列に対応する。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のベクターで形質転換されている宿主細胞に関する。この場合、そのようなベクターは、上記で記載されたように、本発明の新しい核酸分子と、さらには、適する場合、さらなる核酸分子とを含む。宿主細胞は、好ましくは微生物であり、特にＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍである。
【００２９】
このタイプの宿主細胞（特に、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの宿主細胞）は、標準的な方法に従って本発明のベクターで形質転換される。そのような方法が、例えば、Ｃ．ＮｏｗａｋおよびＵ．Ｋｕｃｋ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２５（１９９４）、ｐｐ．３４〜３４に記載される。
【００３０】
好都合には、本発明の形質転換されたＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞は、セファロスポリンＣを製造するために使用することができる。従って、本発明はまた、本発明のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞を、宿主細胞によるセファロスポリンＣの産生を行わせるために好適な条件のもとで培養することを含むセファロスポリンＣの製造方法に関する。
【００３１】
様々な好適な培養／発酵技術が、例えば、特にＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍについて、抗生物質の分野の当業者には知られており、長い間、セファロスポリンＣの製造において用いられている。
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明のプロセスはさらに、産生されたセファロスポリンＣを単離することを含む。本発明の形質転換されたＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞により産生されるセファロスポリンＣは、通常、微生物によって分泌され、様々な知られている技術によって、例えば、クロマトグラフィー技術によって培養上清から精製または単離することができる。
【００３３】
本発明により得られるセファロスポリンＣは、好ましくは、抗生物質特性を有するさらなる誘導体を得るために反応させることができる。
【００３４】
本発明の別の適用は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質に関する。そのようなタンパク質にはまた、述べられたように、所望される場合には、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する成熟タンパク質を切断によって得ることができる対応する融合タンパク質が含まれる。本発明のタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からもっぱらなるタンパク質、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列のみからなるタンパク質が好ましい。
【００３５】
本発明のタンパク質は、前記タンパク質をコードする核酸分子を含む本発明の好適な発現ベクターを含有する好適な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を、前記タンパク質の発現をもたらす条件のもとで培養することによって製造することができる。タンパク質は、様々な一般的な技術を使用して精製および単離することができる。特に本発明のｃＤＮＡが使用される好適な原核生物宿主細胞の例として、細菌細胞（例えば、大腸菌）がある。好適な真核生物宿主細胞の例として、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞がある。
【００３６】
本発明のそのようなタンパク質は、単離された形態で、例えば、セファロスポリンＣまたはその誘導体の合成的製造または半合成的製造において使用することができる。一般的な実施の一例として、反応が行われる合成カラムにおける固定化がある。
【００３７】
本明細書中で言及された参考文献は、本明細書とともに、参照してその全体が組み込まれる。
【００３８】
本発明は、下記の実施例によってより詳しく例示されるが、そのような実施例に限定されない。実施例は、特に、本発明の好ましい実施態様に関する。
【００３９】
（実施例）
本実施例において示される材料および試薬は、当業者には熟知のものであり、市販されているか、または容易に得ることができ、そして、製造者の説明書に従って使用することができる。
【実施例１】
【００４０】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍからの新しい遺伝子および新しいタンパク質の単離
セファロスポリン生合成遺伝子および隣接配列に対するＤＮＡ配列を、λクローンの助けをかりて構築することができる。そのようなλクローンは、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ４８２７２のＤＮＡインサートを含有するλ遺伝子バンクから単離することができる。λ遺伝子バンクの構築は、λプラークハイブリダイゼーションによるλ遺伝子バンクのスクリーニングが述べられているように、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他（上記参照）に述べられている。Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍから得られるセファロスポリン生合成遺伝子に関するＤＮＡ配列情報（これはこのスクリーニングのために要求される）を、データベース検索（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）によって得ることができる。このデータベース要求のために好適な検索項目の例には、検索されるクローンに存在するはずである適切な生合成遺伝子（ｃｅｆＥＦ）に対する名称がある。本発明の枠組みにおいて見出される遺伝子のクローニングを、ｃｅｆＥＦ遺伝子の配列情報を使用してプラークハイブリダイゼーションによって同定されるλクローンから始めることができる。ただし、この場合、このクローンは、ｃｅｆＥＦ遺伝子の停止コドンから下流側の少なくとも約１０ｋｂのＤＮＡ配列のＤＮＡインサートを含有しなければならない。本発明の遺伝子、従って、特に、配列番号２および配列番号４に示される本発明の核酸分子を完全に含む約２．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントが、その後のクローニングのためには不可欠である。このフラグメントは、例えば、下記の配列によって規定されるプライマーＰＣＲ１ｆおよびプライマーＰＣＲ１ｒを使用してＰＣＲによって確認することができる。
【００４１】
【化１】
2006514542.tif 000002
【００４２】
本発明の新しく発見された遺伝子または核酸分子をクローン化するために、約２．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントが、（ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照）に記載される）ベクターｐＣＮ３にクローン化される。このベクターは、アクレモニウム形質転換体の選択を可能にする改変されたチューブリン抵抗性遺伝子（ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照））によって識別される。ｐＣＮ３上の１個だけのＥｃｏＲＩ切断部位がクローン化のために利用される。連結は下記の３段階で行われる：
１）適合性のＥｃｏＲＩ切断部位を介してそれぞれの場合において２つのＤＮＡ分子を連結する。
２）突出端をクレノウ酵素で処理する。
３）改変された端部をさらなる連結によって連結する。
【００４３】
連結生成物は大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に形質転換され、さらなる形質転換工程のために十分な量を大腸菌において産生させられ、精製される。構築様式により、核酸分子を逆向きで含有するプラスミドを得ることもまた可能であり、しかしながら、原理的には、これらの構造は同じ機能性を有する。所望のプラスミドを含有する大腸菌クローンを、述べられたＰＣＲプライマー（ＰＣＲ１ｆおよびＰＣＲ１ｒ）を使用してＰＣＲによって確認することができる。得られるＰＣＲ産物は長さが２．５ｋｂである。これらのＰＣＲ分析は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを使用して、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。その後の配列決定および評価により、図２（配列番号２）および図４（配列番号４）に示される核酸配列がもたらされる。その後、図３（配列番号３）に示されるｃＤＮＡ配列、および同様に、図１（配列番号１）に示されるコードされるタンパク質のアミノ酸配列をその核酸配列から推定することができる。原理的には、配列決定、ならびに、図２および図４に示されるＤＮＡ配列との配列比較によって、クローニング産物を最終的に確認することが可能である。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドはプラスミド１として示され、下記において使用される。
【実施例２】
【００４４】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換
プラスミド１が、プロトプラスト形質転換のための標準的な手法によってＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ４８２７２（上記参照）に形質転換される。これらの方法は、例えば、ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照）に記載され、ベノミル含有栄養寒天における形質転換体の選択を伴う。この選択のために使用されるプラスミド１およびｐＣＮ３にそれぞれ存在する改変されたチューブリン遺伝子ＣＡ＿Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｙｒ）の性質は、選択のために要求されるベノミル含有栄養寒天が記載されるように、ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照）に記載される。このタイプの実験から得られる形質転換体は、例えば、プラスミド１の必須部分の存在について、ＰＣＲによってアッセイすることができる。下記のＰＣＲプライマーにより、そのようなアッセイが可能である：
【００４５】
【化２】
2006514542.tif 000003
【００４６】
得られるＰＣＲ産物は長さが８２７９ｂｐである。ＰＣＲ分析は、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムによって、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。
【００４７】
実際的には、ｐＣＮ３を有する形質転換体の集団が、プラスミド１を有する形質転換体の集団に加えて、コントロール目的のために提供される。これらの形質転換体は、下記のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ反応混合物において分析することができる：
【００４８】
【化３】
2006514542.tif 000004
【００４９】
得られるＰＣＲ産物は長さが２２９０ｂｐである。
【実施例３】
【００５０】
セファロスポリンＣの製造および単離
実施例２で得られた形質転換体は、フラスコでの発酵実験においてセファロスポリン産生について試験される。実際的には、それぞれの場合において、プラスミド１を有する約５００個の形質転換体のほぼ同じサイズの集団、および、ｐＣＮ３を有するコントロール形質転換体のほぼ同じサイズの集団が並行して比較される。この目的のために、これらのフラスコ発酵物の上清がＨＰＬＣ分析によって評価される。対応する方法が、その付随する分析を含めて、例えば、Ｌ．Ｋａｒａｆｆａ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５１（１９９９）、６３３〜６３８に記載される。統計学的に関係のある量のデータを得るために、これらの分析は数回（例えば、６回）繰り返され、この場合、それぞれの繰り返しは、それぞれの場合、個々に試験されている各菌株の数個（例えば、４個）の並行したフラスコ発酵物を含む。結果的には、このようにして、プラスミド１による形質転換に由来する菌株で、それと比較されているｐＣＮ３コントロール形質転換体の集団よりも明確に大きいセファロスポリン生産性を再現良く有する菌株を同定することが可能になる。
【００５１】
前記分析において使用されるＨＰＬＣカラムはまた、産生されたセファロスポリンＣの精製および単離において使用することができる。
【実施例４】
【００５２】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのｃｅｆＤ１遺伝子およびｃｅｆＤ２遺伝子を含むプラスミド２の構築
実施例１のプラスミド１は、続いて、ｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２の２つのセファロスポリン生合成遺伝子によって拡張される。これらの遺伝子はＲ．Ｖ．Ｕｌｌａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７（２００２）、ｐｐ．４６２１２〜４６２２５に記載される。両遺伝子は、５．８ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩフラグメントにおいて非常に接近して存在しており、好適なλクローンの助けをかりて提供される。そのようなλクローンは、アクレモニウム・クリソゲヌムＡＴＣＣ４８２７２のＤＮＡインサートを含有するλ遺伝子バンクから単離される。λ遺伝子バンクの構築は、λプラークハイブリダイゼーションによるλ遺伝子バンクのスクリーニングが述べれているように、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他（上記参照）に述べられている。生合成遺伝子のｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２のＤＮＡ配列情報（これはこのスクリーニングのために要求される）を、例えば、データベース要求（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）によって得ることができる。このデータベース要求のために好適な検索項目の例には、これら２つの生合成遺伝子（ｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２）の名称がある。これら２つの生合成遺伝子のクローニングが、ｃｅｆＤ１遺伝子およびｃｅｆＤ２遺伝子の配列情報を使用してプラークハイブリダイゼーションによって同定されるλクローンから始められる。ただし、この場合、前記クローンは少なくとも６ｋｂのＤＮＡ配列のＤＮＡインサートを含有する。これら２つの完全な生合成遺伝子（ｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２）を含む約５．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ制限フラグメントが、その後のクローニングのためには不可欠である。このフラグメントは、下記の配列によって規定されるプライマーＰＣＲ４ｆおよびプライマーＰＣＲ４ｒを使用してＰＣＲによって確認することができる：
【００５３】
【化４】
2006514542.tif 000005
【００５４】
実施例１のプラスミド１は、これら２つの生合成遺伝子（ｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２）を含有する、配列番号６に示される約５．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ制限フラグメントをプラスミド１にクローン化することによって拡張される。プラスミド１における１個だけのＳｍａＩ切断部位がクローン化のために利用される。５．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ制限フラグメントの２つの突出端はクレノウ酵素で処理され、ＳｍａＩ切断のプラスミド１と連結される。
【００５５】
連結生成物は大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に形質転換され、さらなる形質転換工程のために十分な量を大腸菌において産生させられ、精製される。構築様式により、核酸分子を逆向きで含有するプラスミドを得ることも可能であり、しかしながら、原理的には、これらの構造は同じ機能性を有する。所望のプラスミドを含有する大腸菌クローンを、述べられたＰＣＲプライマー（ＰＣＲ４ｆおよびＰＣＲ４ｒ）を使用してＰＣＲによって確認することができる。得られるＰＣＲ産物は長さが５．５ｋｂである。これらのＰＣＲ分析は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを使用して、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。原理的には、配列決定、および、図６に示されるＤＮＡ配列との配列比較によって、クローニング産物を最終的に確認することが可能である。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントを有するプラスミドはプラスミド２として示され、下記において使用される。
【実施例５】
【００５６】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのｐｃｂＡＢ遺伝子およびｐｃｂＣ遺伝子を含むプラスミド３の構築
実施例１のプラスミド１は、続いて、プラスミド３を得るために、ｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣの２つのセファロスポリン生合成遺伝子によって拡張される。現実には、ｐｃｂＡＢ遺伝子およびｐｃｂＣ遺伝子は、生合成遺伝子クラスターＩとして遺伝子的に密接に共役した形態で存在し、Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（１９９１）、ｐｐ．２３５４〜２３６５に記載される。両遺伝子は、約１６ｋｂのＳｎａＢＩ／ＢｆｒＩフラグメントにおいて非常に接近して存在しており、好適なλクローンの助けをかりて提供される。そのようなλクローンは、アクレモニウム・クリソゲヌムＡＴＣＣ４８２７２のＤＮＡインサートを含有するλ遺伝子バンクから単離される。λ遺伝子バンクの構築は、λプラークハイブリダイゼーションによるλ遺伝子バンクのスクリーニングが述べれているように、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他（上記参照）に述べられている。生合成遺伝子のｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣのＤＮＡ配列情報（これはこのスクリーニングのために要求される）を、例えば、データベース要求（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）によって得ることができる。このデータベース要求のために好適な検索項目の例には、これら２つの生合成遺伝子（ｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣ）の名称がある。これら２つの生合成遺伝子のクローニングが、ｐｃｂＡＢ遺伝子およびｐｃｂＣ遺伝子の配列情報を使用してプラークハイブリダイゼーションによって同定されるλクローンから始められる。ただし、この場合、前記クローンは少なくとも１６ｋｂのＤＮＡ配列のＤＮＡインサートを含有する。これら２つの完全な生合成遺伝子（ｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣ）を含む約１６ｋｂのＳｎａＢＩ／ＢｆｒＩ制限フラグメントが、その後のクローニングのためには不可欠である。このフラグメントは、下記の配列によって規定されるプライマーＰＣＲ５ｆおよびプライマーＰＣＲ５ｒを使用してＰＣＲによって確認することができる：
【００５７】
【化５】
2006514542.tif 000006
【００５８】
実施例１のプラスミド１は、これら２つの生合成遺伝子（ｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣ）を含有する、配列番号５に示される約１６ｋｂのＳｎａＢＩ／ＢｆｒＩ制限フラグメントをプラスミド１にクローン化することによって拡張される。プラスミド１における１個だけのＳｍａＩ切断部位がクローン化のために利用される。約１６ｋｂのＳｎａＢＩ／ＢｆｒＩ制限フラグメントの２つの突出端はクレノウ酵素で処理され、ＳｍａＩ切断のプラスミド１と連結される。
【００５９】
連結生成物は大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に形質転換され、さらなる形質転換工程のために十分な量を大腸菌において産生させられ、精製される。構築様式により、核酸分子を逆向きで含有するプラスミドを得ることも可能であり、しかしながら、原理的には、これらの構造は同じ機能性を有する。所望のプラスミドを含有する大腸菌クローンを、述べられたＰＣＲプライマー（ＰＣＲ５ｆおよびＰＣＲ５ｒ）を使用してＰＣＲによって確認することができる。得られるＰＣＲ産物は長さが１０．５ｋｂである。これらのＰＣＲ分析は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを使用して、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。原理的には、配列決定、および、図５に示されるＤＮＡ配列との配列比較によって、クローニング産物を最終的に確認することが可能である。ＳｎａＢＩ／ＢｆｒＩフラグメントを有するプラスミドはプラスミド３として示され、下記において使用される。
【実施例６】
【００６０】
Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子を含むプラスミド４の構築
実施例１のプラスミド１は、続いて、プラスミド４を得るために、ｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧのつのセファロスポリン生合成遺伝子によって拡張される。現実には、ｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子は、生合成遺伝子クラスターＩＩとして遺伝子的に密接に共役した形態で存在し、Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（１９９２）、ｐｐ．３０５６〜３０６４に記載される。両遺伝子は、約４．６ｋｂのＸｂａＩ／ＳｇｒＡＩフラグメントにおいて非常に接近して存在しており、好適なλクローンの助けをかりて提供される。そのようなλクローンは、アクレモニウム・クリソゲヌムＡＴＣＣ４８２７２のＤＮＡインサートを含有するλ遺伝子バンクから単離される。λ遺伝子バンクの構築は、λプラークハイブリダイゼーションによるλ遺伝子バンクのスクリーニングが述べれているように、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他（上記参照）に述べられている。生合成遺伝子のｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧのＤＮＡ配列情報（これはこのスクリーニングのために要求される）を、例えば、データベース要求（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）によって得ることができる。このデータベース要求のために好適な検索項目の例には、これら２つの生合成遺伝子（ｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧ）の名称がある。これら２つの生合成遺伝子のクローニングが、ｃｅｆＥＦ遺伝子およびｃｅｆＧ遺伝子の配列情報を使用してプラークハイブリダイゼーションによって同定されるλクローンから始められる。ただし、この場合、前記クローンは少なくとも４．６ｋｂのＤＮＡ配列のＤＮＡインサートを含有する。これら２つの完全な生合成遺伝子（ｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧ）を含む約４．６ｋｂのＸｂａＩ／ＳｇｒＡＩ制限フラグメントが、その後のクローニングのためには不可欠である。このフラグメントは、下記の配列によって規定されるプライマーＰＣＲ６ｆおよびプライマーＰＣＲ６ｒを使用してＰＣＲによって確認することができる：
【００６１】
【化６】
2006514542.tif 000007
【００６２】
実施例１のプラスミド１は、これら２つの生合成遺伝子（ｃｅｆＥＦおよびｃｅｆＧ）を含有する約４．６ｋｂのＸｂａＩ／ＳｇｒＡＩ制限フラグメントをプラスミド１にクローン化することによって拡張される。プラスミド１における１個だけのＳｍａＩ切断部位がクローン化のために利用される。４．６ｋｂのＸｂａＩ／ＳｇｒＡＩ制限フラグメントの２つの突出端はクレノウ酵素で処理され、ＳｍａＩ切断のプラスミド１と連結される。
【００６３】
連結生成物は大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に形質転換され、さらなる形質転換工程のために十分な量を大腸菌において産生させられ、精製される。構築様式により、核酸分子を逆向きで含有するプラスミドを得ることも可能であり、しかしながら、原理的には、これらの構造は同じ機能性を有する。所望のプラスミドを含有する大腸菌クローンを、述べられたＰＣＲプライマー（ＰＣＲ６ｆおよびＰＣＲ６ｒ）を使用してＰＣＲによって確認することができる。得られるＰＣＲ産物は長さが２．５ｋｂである。これらのＰＣＲ分析は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムを使用して、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。原理的には、配列決定、および、図７に示されるＤＮＡ配列との配列比較によって、クローニング産物を最終的に確認することが可能である。ＸｂａＩ／ＳｇｒＡＩフラグメントを有するプラスミドはプラスミド４として示され、下記において使用される。
【実施例７】
【００６４】
プラスミド２によるＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換
プラスミド２による形質転換が下記に例示される。しかしながら、プラスミド３およびプラスミド４をそれに従って使用することもまた可能であり、匹敵し得る結果が得られる（実施例９および実施例１０を参照のこと）。
【００６５】
プラスミド２が、プロトプラスト形質転換のための標準的な手法によってＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株（ＣＥＦ−６７６０５）に形質転換される。ＡＴＣＣ４８２７２（上記参照）などの利用可能なＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を代替として使用することもまた可能である。これらの方法は、例えば、ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照）に記載され、ベノミル含有栄養寒天における形質転換体の選択を伴う。ＮｏｗａｋおよびＫｕｃｋ（上記参照）は、プラスミド１およびｐＣＮ３にそれぞれ存在する、この選択のために使用される改変されたチューブリン遺伝子ＣＡ＿Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｙｒ）の性質、そしてまた、選択のために要求されるベノミル含有栄養寒天を記載する。そのような実験から得られる形質転換体は、プラスミド２の必須部分の存在について、ＰＣＲによってアッセイされる。下記のＰＣＲプライマーにより、そのようなアッセイが可能である：
【００６６】
【化７】
2006514542.tif 000008
【００６７】
得られるＰＣＲ産物は長さが９００１ｂｐである。ＰＣＲ分析は、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られるＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムによって、同様に提供されるＰＣＲ反応のための説明書に従って行うことができる。
【００６８】
実際的には、ｐＣＮ３を有する形質転換体の集団が、プラスミド２を有する形質転換体の集団に加えて、コントロール目的のために提供される。これらの形質転換体は、下記のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ反応混合物において分析することができる：
【００６９】
【化８】
2006514542.tif 000009
【００７０】
得られるＰＣＲ産物は長さが２２９０ｂｐである。
【実施例８】
【００７１】
実施例７による形質転換菌株からのセファロスポリンＣの製造および単離
実施例７で得られた形質転換体は、実施例３における記載のようにアッセイされ、セファロスポリンＣがそれに従って精製される。
【００７２】
アッセイされた５５０個の形質転換体の中で、７つの菌株（例えば、ＣＥＴ−９８１１８株）が、そのセファロスポリンＣ力価が、形質転換されていない出発株と比較して、１０％まで増大していることが見出された。そのような菌株は、工業的規模での製造目的のために使用することができる。
【実施例９】
【００７３】
プラスミド３によるＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換、ならびにその後のセファロスポリンＣの製造および単離
実施例７と同様に、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株（ＣＥＦ−６７６０５）がプラスミド３で形質転換される。ＡＴＣＣ４８２７２などの利用可能なＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を代替として使用することもまた可能である。
【００７４】
このようにして作製された形質転換体は実施例３の記載のようにアッセイされ、セファロスポリンＣがそれに従って精製される。形質転換されていない出発株と比較して増大したセファロスポリンＣの力価を有する菌株を、工業的規模での製造目的のために使用することができる。
【実施例１０】
【００７５】
プラスミド４によるＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換、ならびにその後のセファロスポリンＣの製造および単離
実施例７と同様に、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株（ＣＥＦ−６７６０５）がプラスミド４で形質転換される。ＡＴＣＣ４８２７２（上記参照）などの利用可能なＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を代替として使用することもまた可能である。
【００７６】
このようにして作製された形質転換体は実施例３の記載のようにアッセイされ、セファロスポリンＣがそれに従って精製される。形質転換されていない出発株と比較して増大したセファロスポリンＣの力価を有する菌株を、工業的規模での製造目的のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の核酸分子（図２または図４に示される核酸配列）から推定されるＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの新規なタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。配列はＮ末端からＣ末端に示される。
【図２】翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から最後のコードコドン（ＴＧＧ）までの、本発明の枠組みにおいて見出されるＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ遺伝子のゲノムクローンのコード領域の３つのイントロンを含むゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号２）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。
【図３】翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から最後のコードコドン（ＴＧＧ）までの、新しい遺伝子のコード領域のｃＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。
【図４−Ａ】新しい遺伝子のゲノムクローンのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントのゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号４）（配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される）。コード領域の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および翻訳停止コドン（ＴＡＡ）が、下線を付して太字で示される。イントロンが下線を付して示される。
【図４−Ｂ】新しい遺伝子のゲノムクローンのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントのゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号４）（配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される）。コード領域の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および翻訳停止コドン（ＴＡＡ）が、下線を付して太字で示される。イントロンが下線を付して示される。
【図５−Ａ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｂ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｃ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｄ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｅ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｆ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図５−Ｇ】生合成遺伝子のｐｃｂＣ（１３６６位から３５０位、逆向き配置）およびｐｃｂＡＢ（２５９８位から１３５１７位）を含む、ＳｎａＢ１およびＢｆｒ１に対する切断部位により特徴づけられる約１６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。言及された切断部位が下線を付して示される。
【図６−Ａ】生合成遺伝子のｃｅｆＤ１（２３７２位から１８０位、逆向き配置）およびｃｅｆＤ２（３８８８位から５１３３位）を含む、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩに対する切断部位により特徴づけられる約５．８ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号６）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＤ２内のイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図６−Ｂ】生合成遺伝子のｃｅｆＤ１（２３７２位から１８０位、逆向き配置）およびｃｅｆＤ２（３８８８位から５１３３位）を含む、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩに対する切断部位により特徴づけられる約５．８ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号６）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＤ２内のイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図６−Ｃ】生合成遺伝子のｃｅｆＤ１（２３７２位から１８０位、逆向き配置）およびｃｅｆＤ２（３８８８位から５１３３位）を含む、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩに対する切断部位により特徴づけられる約５．８ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号６）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＤ２内のイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図７−Ａ】生合成遺伝子のｃｅｆＥＦ（１１１８位から１２２位、逆向き配置）およびｃｅｆＧ（２０５８位から３５３４位）を含む、Ｘｂａ１およびＳｇｒＡＩに対する切断部位により特徴づけられる約４．６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号７）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＧ内の２つのイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図７−Ｂ】生合成遺伝子のｃｅｆＥＦ（１１１８位から１２２位、逆向き配置）およびｃｅｆＧ（２０５８位から３５３４位）を含む、Ｘｂａ１およびＳｇｒＡＩに対する切断部位により特徴づけられる約４．６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号７）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＧ内の２つのイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図７−Ｃ】生合成遺伝子のｃｅｆＥＦ（１１１８位から１２２位、逆向き配置）およびｃｅｆＧ（２０５８位から３５３４位）を含む、Ｘｂａ１およびＳｇｒＡＩに対する切断部位により特徴づけられる約４．６ｋｂ領域のＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡ配列を示す（配列番号７）。配列は５’から３’の向きで一本鎖の形態で示される。対応するコード領域の個々の翻訳開始コドンおよび個々の翻訳停止コドンが、下線を付して太字で示される。ｃｅｆＧ内の２つのイントロン、および言及された切断部位が下線を付して示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図５−Ｃ】
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【図５−Ｄ】
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【図５−Ｅ】
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【図５−Ｆ】
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【図５−Ｇ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図７−Ａ】
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【図７−Ｂ】
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【図７−Ｃ】
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【国際調査報告】
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