(57)【要約】  本発明は、標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に発現させるなどして導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法等を提供する。導入したドメインは、タンパク質フォールディング時のドメイン間相互作用に干渉し、この干渉作用によってフォールディングを阻害する。上記ドメインは、例えば、タンパク質の３次構造のモデリングによって決定されたドメインの中から選択することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を抑制する方法。
【請求項３】
上記ドメインは、タンパク質の３次構造のモデリングによって決定されたドメインの中から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記ドメインは、タンパク質の球状ドメインの中から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
上記ドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
上記ドメインおよび標的遺伝子（標的タンパク質）を目的細胞内で共発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
細胞内での標的遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質のドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
細胞内での疾患関連遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質のドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子治療薬。
【請求項９】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質が酵素である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がα―アミラーゼファミリーに属する酵素である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がシクロデキストリン合成酵素（CGTase）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項１３】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を調節する方法。
【請求項１４】
標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を促進する方法。
【請求項１５】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を促進する方法。
【請求項１６】
上記ドメインの代わりに、モチーフ、又は二次構造をとる部分ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１、２又は１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドメイン間相互作用を利用した遺伝子発現抑制法等に関し、より詳細には、細胞内でmRNAからの翻訳に伴って進行するタンパク質のフォールディング（folding：折りたたみ）におけるドメイン間相互作用に干渉するドメインを利用した遺伝子発現抑制法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内での遺伝子の発現を抑制する技術、換言すれば、最終的な遺伝子産物であるタンパク質の発現を抑制し、その細胞内での活性を調節する技術は、遺伝子の機能解析をはじめとする生命科学分野の諸研究にとって不可欠のものといえる。さらに、こうした技術は、研究利用のみにとどまらず、生体での特定遺伝子の発現を特異的に抑制することによって、その遺伝子にコードされるタンパク質の活性調節を利用した治療薬の開発にも応用可能である。例えば、エイズ、がん、各種遺伝子疾患など現状では治療困難な疾患に対して、疾患関連遺伝子の発現を抑制する遺伝子治療への応用が期待される。【０００３】
現在、遺伝子の発現を抑制する汎用的な方法として、RNA干渉（RNAi：RNA interference）を利用したものが知られている。RNAiは、siRNA（short interfering RNA）によってその配列特異的にmRNAが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である（後記の非特許文献１・２）。近年、この現象を利用したRNAi法による遺伝子機能解析が盛んに行われるようになっている。さらに、このRNAi法による遺伝子サイレンシングの配列特異性と発現抑制効果の高さから、上述した遺伝子治療への期待が高まっている。【０００４】
遺伝子の発現は通常、（１）ゲノムDNAからmRNAへの遺伝情報の転写、（２）スプライシング（真核細胞の場合）、（３）リボソームでのmRNAからアミノ酸配列への翻訳、さらに必要な場合は（４）糖鎖付加などの翻訳後修飾、の各プロセスを経て、最終的に本来の活性をもつタンパク質が細胞内で生産される一連のプロセスといえる。したがって、理論的には上記何れかのプロセスの進行を阻害することによって標的遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。上記RNAi法は、標的遺伝子のmRNAを特異的に分解することによって転写から翻訳への過程を阻害し、遺伝子の発現を抑制する方法といえるが、遺伝子発現の多様な抑制を実現するためには、RNAi法とは異なる過程を阻害する新規な遺伝子発現抑制法の開発が望まれる。【０００５】
上記（３）の翻訳過程においては、最終的に生産されるタンパク質がその活性に必要な３次構造を形成するため、リボソームでの翻訳と同時進行的に、既に翻訳されたポリペプチドのＮ末端側からタンパク質のフォールディングが進行する。下記の特許文献１は、このタンパク質のフォールディングを阻害する方法を提案しているが、実際にフォールディングを阻害した実施例は同文献に何ら開示されていない。一方、下記の非特許文献３には、ペプチド断片を用いてin vitroでタンパク質のリフォールディング（refolding）を阻害した実施例が示されているが、この方法は細胞内でタンパク質のフォールディングを阻害する方法とは本質的に相違する。さらに、下記の特許文献２〜４には、ペプチド等の化合物を用いて、アミロイドβ―ペプチド、プリオンタンパク質などの異常なフォールディングを抑制する方法が開示されているが、これらの方法は遺伝子発現を抑制する方法ではない。【０００６】
また、上記RNAi法以外の遺伝子発現抑制法として、変異体のドミナントネガティブ効果を利用した方法（例えば、下記の特許文献５）が挙げられるが、この方法を行うにはドミナントネガティブ効果を示す変異体の存在が必要である。
【特許文献１】国際公開第WO 99/40435号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO 96/39834号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO 01/34631号パンフレット
【特許文献４】特開2005-120002号公報
【特許文献５】特開2005-278485号公報
【非特許文献１】Nature 391:806-811 (1998)
【非特許文献２】Nature 411:494-498 (2001)
【非特許文献３】PNAS, Vol.86, No.9, 3060-3064 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題に鑑みなされたものであり、その課題・目的は、従来法とは異なる過程に着目した新規な遺伝子発現抑制法を提供すること、より具体的には、目的細胞内でのタンパク質のフォールディングを阻害することによる新規な遺伝子発現抑制法を提供すること、さらには、この方法を用いた遺伝子発現抑制剤および遺伝子治療薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来の遺伝子発現抑制法として前述のようにRNAi法が知られているが、本発明者はこの干渉という手法をタンパク質レベルでも応用できないかと考えた。つまり、タンパク質のフォールディングにおいて、mRNAから翻訳されたポリペプチド鎖はＮ末端側から順次折りたたまれ、安定な構造であるドメイン構造を形成していく。そして、このように順次形成される複数のドメイン間の相互作用を通じて、最終的にタンパク質はその活性に必要な３次構造（コンフォメーション）を獲得する。本発明者は、このドメイン間相互作用に干渉することでタンパク質のフォールディングは阻害されるのではないか、さらに、この干渉用物質として標的タンパク質自身のドメインに注目し、当該ドメインを細胞内に発現させることによってフォールディングが阻害され、正しい構造をとることができなかったタンパク質は、細胞内のプロテアーゼによって分解されるのではないか、すなわちこのようなドメイン干渉によって標的遺伝子の発現を特異的に抑制する効果が得られるのではないか、と考えた。【０００９】
そこで、シクロデキストリン合成酵素（CGTase）をモデルタンパク質として、このようなドメイン干渉による遺伝子発現抑制の可能性を検討した。その結果、後述するようにCGTaseを構成する４つのドメインのうち３つのドメインをCGTaseと共発現させた場合に当該酵素活性の顕著な抑制効果が認められ、２つのドメインを発現させた場合に実際にCGTaseの発現が抑制されていることが確認された。対照的に、これらの各ドメインをフォールディング後のCGTaseに添加しても活性の減少は認められなかったことから、これらドメインは干渉ドメイン（干渉ペプチド）として作用し、CGTaseのフォールディングを阻害したこと、さらに、解析を進めた結果ドメインによっては逆に当該ドメインの発現により標的タンパク質の活性発現を促進する効果があることなどを明らかにし、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の（１）〜（１６）の発明を包含する。
（１）  標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法。
（２）  標的タンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を抑制する方法。
（３）  上記ドメインは、タンパク質の３次構造のモデリングによって決定されたドメインの中から選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）  上記ドメインは、タンパク質の球状ドメインの中から選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の方法。
（５）  上記ドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の方法。
（６）  上記ドメインおよび標的遺伝子（標的タンパク質）を目的細胞内で共発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の方法。
（７）  細胞内での標的遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質のドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子発現抑制剤。
（８）  細胞内での疾患関連遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質のドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子治療薬。
（９）  標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質が酵素である、上記（１）又は（２）記載の方法。
（１０）  標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がα―アミラーゼファミリーに属する酵素である、上記（９）記載の方法。
（１１）  標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がシクロデキストリン合成酵素（CGTase）である、上記（１０）記載の方法。
（１２）  標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法。
（１３）  標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を調節する方法。
（１４）  標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を促進する方法。
（１５）  標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を促進する方法。
（１６）  上記ドメインの代わりに、モチーフ（超二次構造）、又は二次構造をとる部分ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする、上記（１）、（２）又は（１２）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】SWISS-MODELによりモデリングしたThermococcus sp. B1001株由来CGTaseの３次構造を示す図である。ドメインAは、Met1からTyr424までの領域、ドメインBは、Gly425からPro512までの領域、ドメインCは、Thr513からThr604 までの領域、ドメインDは、Asn605からArg712までの領域である。
【図２】共発現用ベクター構築のストラテジーを示す図である。CGTaseのそれぞれ４つの球状ドメインをコードする遺伝子断片をpETベクターに導入し、pET-A, pET-B, pET-C, pET-Dを作製した。さらにその下流にCGTaseをコードする遺伝子cgtA領域を挿入した。図中、BmはBamH I、NdはNde I、NcはNco I、BpはBpu1102 Iを示す。
【図３】SDS-PAGEによる発現の確認結果を示す図である。ドメインA, B, C, Dのいずれも予想されるサイズのバンドが見られ、ともに単独で発現していることが確認された。また、ドメインA, Bを共発現させたとき、CGTaseのバンドはみられなかった。ドメインC, Dを共発現させた場合ではCGTaseのバンドも確認できた。図中いずれも、Mは分子質量マーカー、レーン１は誘導前の菌体、レーン２は誘導後の菌体、レーン３は菌体破砕不溶性画分、レーン４は菌体破砕可溶性画分、レーン５は可溶性画分を80℃ 20分で熱処理し、遠心分離した上清画分、の結果を示す。また、pET-21aはpET-A, C, Dに対するネガティブコントロール、pET-8cはpET-Bに対するネガティブコントロール、CGTaseは83 kDa、ドメインAは49 kDa、ドメインBは9.7 kDa、ドメインCは10.1 kDa、ドメインDは12.0 kDa、である。
【図４】共発現による活性への影響を示すグラフである。IPTG誘導後の菌体破砕液の可溶性画分を用いてα-CD合成活性を測定した。CGTaseのみを発現させたとき（pCGTA）の活性値を100%とし、それぞれの割合をグラフで表した。それぞれのサンプルについて3回測定した。エラーバーは標準偏差をあらわす。
【図５】添加による活性への影響を示すグラフである。IPTG誘導により各ドメインを発現させた菌体破砕液の可溶性画分をCGTaseに添加し活性を測定した。空ベクター(pET-21aおよびpET-8c)の大腸菌破砕液の活性値とドメインA, B, Cを発現させた菌体破砕液添加の場合の活性値とを比較してグラフで表した。それぞれのサンプルについて3回測定した。エラーバーは標準偏差をあらわす。
【００１２】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
［１］ドメイン干渉による遺伝子発現抑制法
本発明は、上記のように、（１）標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法、表現を変えれば、（２）標的タンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を抑制する方法、を包含する。ここで、遺伝子の発現とは、当該遺伝子によってコードされ、本来の構造と活性をもつタンパク質が生産されることを意味し、タンパク質の発現も同様に、本来の構造と活性をもつタンパク質が生産されることを意味する。標的遺伝子（又は標的タンパク質）の発現を抑制するとは、このタンパク質の生産量を減少させることを意味する。【００１３】
ドメインを細胞内に導入する方法としては、後述のように、当該ドメインを目的細胞内で発現するベクターを構築し、この発現ベクターを細胞内に導入する方法が好適であるが、このようにドメインをコードするDNAを導入する方法以外に、ドメインタンパク質を直接細胞内に導入する方法も考えられる。【００１４】
本発明は、標的タンパク質自身が有するドメインと同じ構造のドメインを干渉タンパク質（干渉ペプチド）として作用させ、タンパク質フォールディング時のドメイン間相互作用に干渉させることにより、いわばドメイン干渉（ペプチド干渉）を利用してフォールディングを阻害する。【００１５】
ここで、ドメインとは、タンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域を意味する。タンパク質は、多くの場合、構造上複数の領域に分けることができ、これらの領域を通常ドメインと呼ぶ。これらの領域が機能単位である場合も多く、また、ドメイン同士が互いに寄り合い、ポケットを形成し、この窪みが他分子との結合部位になるなど、複数のドメインが構造上および機能上相互依存的な場合も多い。【００１６】
本発明のフォールディング干渉用ドメインは、標的タンパク質の３次構造のモデリングによって決定されたドメインの中から選択することができる。例えば、後述の実施例に示すように、SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）などを利用することによって構造のモデリングを行い、この構造をもとにドメインを決定することが可能である。【００１７】
また、本発明の干渉用ドメインを、標的タンパク質の球状ドメインの中から選択することは好ましい。ここで、球状ドメインとは外形的に構造上の独立性がより高い領域を意味し、少なくとも現在、種々のタンパク質で球状ドメインとして認められているドメインを含む意味である。球状ドメインのような構造のより安定したドメインを使用することにより、干渉タンパク質自身の安定性を確保することもでき、発現抑制効果の確実性を高めることが期待できる。【００１８】
また、タンパク質のフォールディングはＮ末端側から順次折りたたまれていくので、Ｎ末端側のドメイン（例えば、最もＮ末端側又はＮ末端側から２番目のドメイン）を本発明の干渉用ドメインとして使用することで、より効果的な発現抑制が期待できる。【００１９】
本発明の干渉用ドメインとして選択される領域の長さは、さほど厳密でなくてもよいと考えられ、例えば、構造のモデリングによって決定したドメインの長さよりＮ末端側又はＣ末端側に数残基長くても（あるいは短くても）本発明のドメイン干渉は生じ得る。また、構造のモデリングによって決定したすべてのドメインが、本発明の干渉用ドメインとして利用できるわけではないが、後述の実施例に示すように、４つのドメインのうち３つのドメインでドメイン干渉が生じたことから、比較的高い確率でドメイン干渉が生じると考えられる。【００２０】
本発明の干渉用ドメインとして用いるドメインの領域・長さを決定後、当該ドメインを目的細胞内で発現するようベクターを作製し、この発現ベクターを細胞内に導入することによって、干渉用ドメインを細胞内に発現させることができる。発現ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを使用することができ、特に限定されるものではない。また、目的細胞の種類、用途等に応じて使用するプロモーターを選択し、干渉用ドメインをコードするベクター上のDNA領域の上流に配置すればよい。【００２１】
後述の実施例では、ドメイン干渉を利用して大腸菌でのCGTaseのフォールディングを阻害したが、リボソームでの翻訳に伴って進行するタンパク質のフォールディングはすべての生物に共通にみられる基本的生命現象であり、また、生体内でフォールディングを助けるシャペロンは古細菌から哺乳類まで極めて良く保存されており、共通の仕組みでフォールディングが行われると考えられることから、ドメイン干渉を利用してフォールディングを阻害する本発明の方法は、古細菌や細菌での発現抑制に有効なだけではなく、真核細胞、植物細胞、動物細胞および哺乳類細胞での発現抑制にも有効と考えられる。【００２２】
後述の実施例で使用したCGTaseは、超好熱性始原菌Thermococcus sp. B1001株由来のCyclodextrin glucanotransferase (CGTase; EC 2.4.1.19)であり、耐熱性CGTaseである。配列表の配列番号１１には、この耐熱性CGTaseのDNA塩基配列およびアミノ酸配列が、配列番号１２には、そのアミノ酸配列がそれぞれ示される。これらの配列は、DDBJ/EMBL/GenBank databasesのアクセッション番号AB025721に記載される配列と基本的に同一であるが、シグナルペプチドに相当する領域が除かれている点、及びコドンを改変している点で相違する。すなわち、本CGTaseは、同アクセッション番号記載のアミノ酸配列のうち、アミノ末端側の２８残基がシグナル配列になっており、成熟状態の酵素では２９番目のバリンからの配列構造となる。後述のプラスミドpCGTAは、発現するCGTaseにおいて２〜２８番目のシグナルペプチド領域が除かれ、２９番目のバリンが２番目のアミノ酸になるように設計されている。また大腸菌での発現性を高めるためにAGT[Ser3]→AGC, CCC[Pro4]→CCG, TCA[Ser5]→TCT, CCA[Pro7]→CCG, GGG[Gly9]→GGCと変更されている。【００２３】
図１には、SWISS-MODELによりモデリングしたこの耐熱性CGTaseの３次構造が示されるが、同図に示すように、この酵素はドメインA, B, C, Dの４つの球状ドメインからなる。このうちドメインA, B, Dの３つのドメインで、ドメイン干渉による抑制効果が認められた（図４）。CGTaseは、α―アミラーゼファミリーに属する酵素であり、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、枝切り酵素など、類似の構造を有する他のα―アミラーゼファミリーに属する酵素も同様に、ドメイン干渉によって遺伝子発現を特異的に抑制できると考えられる。【００２４】
また、上記耐熱性CGTaseのように構造が極めて安定な（変性剤に対して耐性を示す）耐熱性タンパク質は、フォールディング時により強力にドメイン間相互作用する可能性がある。そうだとすると、フォールディングを阻害する本発明の方法は、このような耐熱性タンパク質の発現抑制により効果的であるといえる。もっとも、本発明を適用して発現抑制可能なタンパク質、遺伝子は特に制限されるものではない。【００２５】
本発明は、遺伝子の機能解析をはじめとする生命科学分野の様々な研究に利用可能である。その１つの利用態様として、前記ベクター、即ち、細胞内での標的遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質のドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターを、本発明の遺伝子発現抑制剤として利用する方法が挙げられる。【００２６】
さらに、本発明は、研究利用のみにとどまらず、生体での特定遺伝子の発現を特異的に抑制することによって、その遺伝子にコードされるタンパク質の活性調節を利用した治療薬の開発にも応用可能である。例えば、前記ベクターを本発明の遺伝子治療薬として用い、目的細胞内での疾患関連遺伝子の発現を抑制することによって、エイズ、がん、各種遺伝子疾患などに対する遺伝子治療に本発明を適用可能である。また、アルツハイマー病、プリオン病などタンパク質の異常なフォールディングが原因とされているコンフォメーション病の治療への応用も可能である。【００２７】
前記ベクターを本発明の遺伝子治療薬として用いる場合は、公知のＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）を利用し、例えば、前記ベクターをリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明の遺伝子治療薬を効率よく運ぶことができ効果的である。【００２８】
また、本発明を外来遺伝子の発現抑制に利用してもよい。この場合、例えば、干渉用ドメインおよび外来遺伝子を目的細胞内で共発現するよう構築されたベクターを用いて、干渉用ドメインを細胞内に導入する方法が挙げられる。この方法によれば、リボソーム周辺に干渉用ドメインを高濃度に発現させることができ、効果的な発現抑制が期待できる。【００２９】
［２］ドメイン導入による活性発現の促進効果とモチーフ等の利用
これまで、ドメイン導入による遺伝子発現抑制効果について説明したが、さらに、解析を進めた結果ドメインによっては逆に標的タンパク質の活性発現を促進する効果があることがわかってきた。例えば、後述のCGTaseを用いた実施例では、ドメインＣをCGTaseと共発現させることによってCGTaseの酵素活性値の上昇が認められた（図４）。このことから、細胞へのドメインＣの導入はCGTaseのフォールディングを促進し、結果としてその活性発現を高めたものと考えられる。【００３０】
このように、ドメイン領域によってはむしろ標的タンパク質の活性発現を高め、ドメイン干渉には活性発現の促進効果も認められるので、本発明は、ドメイン干渉を利用した前述の遺伝子発現抑制法のみならず、ドメイン干渉を利用した遺伝子発現促進法およびこれらを包括した概念である遺伝子発現調節法をも提供するものである。具体的には、（１）標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を促進（又は調節）する方法、および、（２）標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を促進（又は調節）する方法、を提供する。そして、本発明のこの促進法および調節法についても前述した抑制法と同様に、遺伝子発現促進剤あるいは遺伝子発現調節剤として利用可能であり、更に遺伝子発現の調節によって疾患の治療を図る遺伝子治療薬へ応用可能である。【００３１】
また、本発明の抑制法、促進法および調節法は、フォールディングに対するドメインの干渉作用を利用して遺伝子発現を調節するものであるが、この干渉作用はドメイン単位に限らず、より小さな構造単位であるモチーフ（超二次構造）、更には二次構造をとる部分ペプチドにおいても同様の干渉作用があると考えられる。したがって、本発明の上記各方法において、ドメインの代わりに、モチーフ、又は二次構造をとる部分ペプチドを使用してもよい。【００３２】
上記ドメイン干渉（又はモチーフ等のペプチド干渉）による発現促進効果は、ドメインや部分ペプチドがシャペロン様の効果を持っている可能性を示すと共に、これらの干渉作用によって遺伝子発現が調節されることは、対立遺伝子からの部分ペプチドによる干渉によって遺伝子の発現レベルが増減するという未知の生命現象の可能性を示唆するものといえる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例によって何ら限定されるものではない。【００３４】
［１］本実施例の目的
前述のように、本発明者は、RNAi法の干渉という手法をタンパク質レベルでも応用できないかと考え、本実施例では、ドメイン干渉によるフォールディング阻害の可能性を検討した。【００３５】
つまり、タンパク質の折りたたみを干渉するような部分ペプチドを発現させることで、翻訳されたタンパク質は正しい構造をとることができず、フォールディングが完了しない分子は、細胞内のプロテアーゼによって分解されると予想される。この干渉タンパク質として、標的タンパク質自身と同じアミノ酸配列を持ち、ある程度安定な構造をとれる様なタンパク質、すなわちドメイン単位に注目した。かなり以前からドメインはそれぞれ独立して折りたたまれることが知られている。例えば、免疫グロブリンのFabドメインは、それだけで折りたたまれた構造をつくる。つまり、ドメイン単位で干渉タンパク質を設計することは、それ自身の安定性を確保する意味でも望ましいと考えられる。翻訳途中のタンパク質のフォールディングにこのような干渉タンパク質がとり込まれることによって、正しい構造がとれなくなると予想される。この方法でフォールディングを阻害する干渉ドメインは、まったく同じアミノ酸配列をもつ標的タンパク質にのみ作用すると考えられ、このフォールディング干渉でもRNAi法と同様に高い特異性を持つ遺伝子発現の抑制が可能であると期待される。【００３６】
前述のように、CGTaseは４つの球状ドメインからなり、フォールディング時のドメイン間相互作用によって最終的に正しいコンフォメーションに収束する。この４つのドメインと同じアミノ酸配列を持つポリペプチドを翻訳中のCGTaseのフォールディングに干渉させることで、CGTaseは正しいコンフォメーションがとれなくなると推測される。細胞内で正しい構造をとれなくなったタンパク質はプロテアーゼによってすぐに分解されるだろう。結果として、特異的な遺伝子発現の抑制が起こると期待される。本実施例では、Thermococcus sp. B1001株由来のCGTaseをモデルタンパク質として、ドメイン干渉による特異的な遺伝子発現抑制の可能性について検討した。【００３７】
［２］実験材料・方法
［2-1］使用菌株・プラスミド・培地
本実施例で使用した菌株（Strains）およびプラスミド（Plasmids）は、表１に掲げるとおりである。また、培養には、Luria-Bertani培地を用いた。この培地の組成および調製法は表２に掲げるとおりである。【００３８】
【表１】
2007094391.tif 000002
【００３９】
【表２】
2007094391.tif 000003
【００４０】
［2-2］CGTaseの構造のモデリング、ドメインA, B, C, Dの決定
Thermococcus sp. B1001株のCGTaseのアミノ酸配列をもとに、SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）を用いて構造のモデリングを行った。この構造をもとにドメインA, B, C, Dをそれぞれ決定した。【００４１】
［2-3］発現ベクターの構築
E.coli TG1と、ベクターpET-21a (Novegen)、pET-8cを用いてクローニングを行った。発現ベクター構築は図２に示すストラテジーのとおりに行った。pCGTA（J. Biosci. Bioeng. 89:206-209 (2000)）を鋳型とし、PCR法にてB1001株のCGTaseの各ドメインに相当する遺伝子断片の増幅を行った。pETベクターに導入するため、プライマー上に制限酵素認識配列を挿入した。ドメインAの配列にはAf, Arプライマーを、ドメインBの配列にはBf, Brプライマーを、ドメインCの配列にはCf, Crプライマーを、ドメインDの配列にはDf, Drプライマーを使用した（各プライマー配列については、下記表３参照）。ドメインA, C, Dについては制限酵素Nde I, BamH Iで切断し、pET-21aに組み込み、それぞれpET-A, pET-C, pET-Dを作製した。ドメインBについては制限酵素Nco I, BamH Iで切断し、pET-8cに組み込み、pET-Bを作製した。pCGTAを鋳型とし、CGTA-f, CGTA-rプライマーを用いてPCR法によりCGTase遺伝子を増幅した。これを制限酵素BamH I, Bpu1102 Iで切断し、pET-A, pET-B, pET-C, pET-Dに組み込み、共発現用プラスミドpET-A-CGTA, pET-B-CGTA, pET-C-CGTA, pET-D-CGTAを作製した。【００４２】
【表３】
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【００４３】
［2-4］タンパク質発現
作製した発現ベクターによる大腸菌BL21(DE3)の形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLuria-Bertani培地で37℃にて振盪培養した。660 nmのOD値が0.3に達した際に終濃度0.1 mMとなるようIPTGを添加し、目的遺伝子の発現を誘導し、更に37℃で4時間振盪培養した。菌体を遠心分離(8000×g、10分)にて回収し、得られた菌体を緩衝液（50 mM Tris-HCl,1 mM CaCl2, pH 7.8）に懸濁して超音波破砕を行った。再び遠心分離(16,000×g、30分)して上清画分を回収し、これを粗酵素液として使用した。【００４４】
［2-5］活性測定
Lejeune, A.らの報告するメチルオレンジ法（Anal Biochem. 181:6-11 (1989)）を改良してシクロデキストリン（α-CD）合成活性を測定した。1450μlの反応溶液 (1%デンプン、0.035 mM メチルオレンジ、50 mM リン酸緩衝液 pH6.0)をそれぞれのCGTaseの反応至適温度で10分間保温した後、50μlの酵素液を加えた。10分後、6 N HClを75μl加え反応を停止した。これを16℃で30分以上保温した後、505 nmの吸光度を測定した。シクロデキストリン合成活性1Uは１分当たり1μmolのCDを合成する酵素量とした。【００４５】
［３］実験結果
［3-1］CGTaseの3次構造のモデリング
CGTaseのアミノ酸配列を用いて、SWISS-MODELにより3次構造をモデリングした。モデリングにはBacillus stearothermophilus のα-amylaseとmaltose、acarboseの複合体(1qho.pdb)及びmaltoseの複合体(1qhp.pdb)、Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1由来のCGTaseとmaltohexaose inhibitorの複合体 (1a47.pdb)、T. thermosulfurigenes EM1のCGTase(1ciu.pdb)、Bacillus circulans由来のcyclodextrin glycosyltransferaseの欠失変異体Δ145-150(4cgt.pdb)を鋳型に用いた。この3次構造をもとに、図１に示すように、4つのドメインを決定した。pCGTAの開始メチオニンを1番目とすると、ドメインAはMet1からTyr424まで、ドメインBはGly425からPro512まで、ドメインCはThr513からThr604まで、ドメインDはAsn605からArg712となった。これに基づいて発現用ベクターを構築した。【００４６】
［3-2］発現の確認
それぞれ構築した発現用プラスミドで形質転換された大腸菌BL21(DE3)を用いてB1001株のCGTaseと、その4つの球状ドメインそれぞれの誘導発現を行いSDS-PAGEによって発現の確認を行った（図３）。CGTase及びドメインA-DいずれについてもIPTG誘導により単独で発現させたとき、予想サイズのバンドが確認された。しかし、ドメインA, BとCGTaseを共発現させたとき、ドメインA, Bのバンドは確認されたが、CGTaseのバンドが現れなかった。一方、ドメインC, DについてはCGTaseのバンドも現れた。ドメインA, Bの共発現によるCGTaseのバンド消失の結果は、このタンパク質自身と同じアミノ酸配列を有するタンパク質によってその発現が抑制されたためと考えられる。すなわち、CGTaseのドメインAまたはBと同じ配列と構造を有するタンパク質が翻訳中のCGTaseとドメイン間相互作用することでフォールディング干渉が起こり、細胞内で正しい構造をとれなくなったCGTaseはプロテアーゼによって分解されたと考えられる。CGTaseのC末端側に存在するドメインC,Dと同じ構造をもつタンパク質については、作用するCGTaseの大部分が干渉する前に正しい構造をとるため、ドメインA, Bが作用したときと比べてプロテアーゼによる分解を受けにくく、CGTaseのバンドが残ったのではないかと考えた。特にドメインＣの干渉はフォールディングを促進し、結果として活性発現を高めたものと考えられる。【００４７】
［3-3］活性測定
それぞれの発現プラスミドで形質転換された大腸菌BL21(DE3)株をIPTG誘導し、CGTaseの各ドメインとCGTaseを共発現させた。集めた菌体を破砕して得られた粗酵素液を用いて、シクロデキストリン（CD）合成活性を測定した。pET-21a、 pET-8c（ネガティブコントロール）、各ドメインのみを単独で発現させた菌体破砕液可溶性画分について、CD合成活性は認められなかった(表４)。CGTaseを単独で発現させた大腸菌BL21(DE3) (pCGTA)の菌体破砕液可溶性画分のα-CD合成活性を100%として、それぞれのドメインを共発現させた菌体破砕液の活性と比較した(図４)。【００４８】
【表４】
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【００４９】
SDS-PAGEでCGTaseのバンドの消失が見られたドメインA, Bを共発現した菌体破砕液はCGTaseを単独で発現させたコントロールに対して活性が約30%に減少した。このことから、これらの干渉タンパク質がCGTaseの発現を抑制したということが示された。また、ドメインDはSDS-PAGEではCGTaseのバンドの消失は認められなかったが、ドメインA, Bを共発現させたものと同等の値までCGTase活性の減少がみられた。ドメインCについては抑制効果がみられなかった。この活性の減少が実際にフォールディング段階で働いているのかを調べるため、単独で発現させたドメインA, B, Cの菌体破砕液可溶性画分をCGTase酵素液に添加し、その活性を測定した。その結果を表５、図５に示す。得られたCGTaseに各ドメインを添加しても活性の減少は認められなかった。このことから、これらの活性の減少あるいは増加は干渉タンパク質によるフォールディングの阻害あるいは促進によって起きたことが示された。【００５０】
【表５】
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【００５１】
以上のように、Thermococcus sp. B1001株のCGTaseをモデルタンパク質として新規な遺伝子発現抑制法について検討し、CGTaseのドメインA, B, Dに相当するアミノ酸配列からなるタンパク質を大腸菌BL21(DE3)内で共発現させたところ、その菌体破砕液のCGTase活性は約30％にまで減少した。特にドメインA, BについてはSDS-PAGEによってタンパク質レベルにおいても発現が抑制されていることが確認された。また、これらの各ドメインタンパク質をフォールディング後のCGTaseに添加しても活性の減少は認められなかった。これらの結果から、これら干渉タンパク質は翻訳途中でCGTaseのフォールディングにおいて作用したことが示された。【００５２】
翻訳中のCGTaseはＮ末端側から順次ドメイン構造をとっていき、最終的にドメイン間相互作用により正しいコンフォメーションをとることでシクロデキストリン（CD）合成活性を持つ。このフォールディング中にそれぞれのドメインと同じ構造をもったタンパク質を共発現させ、フォールディング時に干渉させた結果、CGTaseは正しい構造をとれなくなり、プロテアーゼによって分解されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上のように、本発明は、標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に発現させるなどして導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法等に関するものであり、前述したとおり、遺伝子の機能解析をはじめとする様々な研究に利用可能であるばかりでなく、遺伝子治療などに用いることで種々の疾患治療に応用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月29日(2007.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
上記ドメインの選択にあたり、
（ａ）上記タンパク質の３次構造のモデリングを行うステップと、
（ｂ）上記モデリングによってタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを決定し、当該構造ドメインの中から、細胞内に導入するドメインを選択するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入し、当該タンパク質のフォールディングを阻害することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を抑制する方法であって、
上記ドメインの選択にあたり、
（ａ）上記タンパク質の３次構造のモデリングを行うステップと、
（ｂ）上記モデリングによってタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを決定し、当該構造ドメインの中から、細胞内に導入するドメインを選択するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
上記ドメインは、タンパク質の球状ドメインの中から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
上記ドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
上記ドメインおよび標的遺伝子（標的タンパク質）を目的細胞内で共発現するよう構築されたベクターを用いて、上記ドメインを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
細胞内での標的遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
細胞内での疾患関連遺伝子の発現を抑制するため、当該遺伝子がコードするタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを目的細胞内で発現するよう構築されたベクターからなる遺伝子治療薬。
【請求項９】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質が酵素である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がα―アミラーゼファミリーに属する酵素である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的遺伝子がコードするタンパク質、又は標的タンパク質がシクロデキストリン合成酵素（ＣＧＴａｓｅ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子がコードするタンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
上記ドメインの選択にあたり、
（ａ）上記タンパク質の３次構造のモデリングを行うステップと、
（ｂ）上記モデリングによってタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを決定し、当該構造ドメインの中から、細胞内に導入するドメインを選択するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性または発現を調節する方法であって、
上記ドメインの選択にあたり、
（ａ）上記タンパク質の３次構造のモデリングを行うステップと、
（ｂ）上記モデリングによってタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを決定し、当該構造ドメインの中から、細胞内に導入するドメインを選択するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
標的タンパク質のドメインを細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質の活性を促進する方法であって、
上記ドメインの選択にあたり、
（ａ）上記タンパク質の３次構造のモデリングを行うステップと、
（ｂ）上記モデリングによってタンパク質の立体構造上、まとまりをもった領域である構造ドメインを決定し、当該構造ドメインの中から、細胞内に導入するドメインを選択するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
上記ドメインの代わりに、モチーフ、又は二次構造をとる部分ペプチドを細胞内に導入することを特徴とする、請求項１、２又は１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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