(57)【要約】脂肪吸引物から新たに単離された脂肪由来幹細胞および培養された脂肪由来幹細胞の詳細な特徴付けを行うこと。本発明は、未分化多能性幹細胞の培養方法、および単離または培養された多能性幹細胞に関する。特に、本発明は、脂肪由来幹細胞の新規な長期培養増殖法、およびそれを用いて得られる脂肪由来幹細胞に関する。本発明は、新たに単離されたヒト由来の脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞の調製方法を提供する。好ましくは、上記培養は、少なくとも２週間行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された多能性幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
【請求項２】
培養された多能性幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
【請求項３】
培養された脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
【請求項４】
少なくとも２週間培養された、請求項２または３に記載の細胞。
【請求項５】
少なくとも１０週間培養された、請求項２または３に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも２０週間培養された、請求項２または３に記載の細胞。
【請求項７】
新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞の調製方法。
【請求項８】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも２週間培養する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも１０週間培養する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも２０週間培養する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地を用いて行われる、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記培養の基本培地が、Ｍ−１９９培地である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脂肪由来幹細胞を調製する方法であって、
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および
前記脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程、
前記単離した脂肪由来幹細胞を培養する工程
を包含し、
前記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地を用いて行われる、
方法。
【請求項１４】
前記培養のための基本培地が、Ｍ−１９９培地である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゼラチンで被覆した基板上で接着培養を行う、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養を少なくとも２週間行う、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
培地交換を少なくとも週２回、細胞継代を少なくとも週１回行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜１７のいずれかに記載の方法によって調製された脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現する、細胞。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか、または請求項１８に記載の細胞を含有する、再生医療用材料。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか、または請求項１８に記載の細胞を使用する工程を包含する、再生医療用材料の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか、または請求項１８に記載の細胞を含有する、ヒトもしくは動物の疾患の治療、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器の再生に使用するための薬剤。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか、または請求項１８に記載の細胞を被験体に投与する工程を包含する、ヒトもしくは動物の疾患を治療するため、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器を再生するための方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞を含む組成物であって、該組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含む、組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、ＣＤ１０５の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、ＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞を含む組成物を調製する方法であって、
Ａ）新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を
包含する、方法。
【請求項２８】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも２週間培養する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂肪由来幹細胞を１〜２週間培養する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも１０週間培養する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪由来幹細胞を少なくとも２０週間培養する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地を用いて行われる、
請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂肪由来幹細胞は、
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および
前記脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程
によって、単離される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂肪吸引物は、液体部分を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記脂肪吸引物を得る工程は、液体部分を分離する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化多能性幹細胞の培養方法、および単離または培養された多能性幹細胞に関する。特に、本発明は、脂肪由来幹細胞の新規な長期培養増殖法、およびそれを用いて得られる脂肪由来幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医学においては、幹細胞移植により目的とする組織及び臓器を修復し、再生する技術の開発が進められている。多能性幹細胞は、増殖し、継代を繰り返す自己複製能、および多種の成熟細胞（例えば、骨細胞、心筋細胞、血液細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、骨髄細胞など）に分化する分化能（多能性）とを有している。生体から取り出された多能性幹細胞を培養し、更に分化誘導させた後、再度、生体内に戻すことにより、組織及び臓器を修復し、再生することができると考えられている。多能性幹細胞としては、一般的に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞などが知られている。【０００３】
脂肪組織から単離された間質−血管画分細胞は、線維芽細胞様の形態を有する脂肪生成前駆体であることが知られており（Ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９７６；５８：６９９−７０４：非特許文献１）、脂肪前駆細胞、血管間質系細胞などと呼ばれてきた。本明細書中以下では、脂肪組織から単離された接着間質細胞を脂肪由来間質（または幹）細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  （ｏｒ  ｓｔｅｍ）  ｃｅｌｌｓ）（ＡＳＣ）と呼ぶ。モノクローナル（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５：非特許文献２）またはポリクローナル（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ２００１；７：２１１−２２８：非特許文献３）の細胞培養研究によって、ヒトＡＳＣが脂肪吸引物から得られ、中胚葉起源または外胚葉起源の多数の系統に分化することが明らかにされている。ヒトＡＳＣは、脂肪生成、軟骨形成（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００２；２９０：７６３−７６９：非特許文献４）、骨形成（Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０００；２４  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ４１−４４：非特許文献５）、および筋原性（Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ２００２；１０９：１９９−２０９：非特許文献６）の系統のような間葉系統のみでなく、神経原性（Ｓａｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００２；２９４：３７１−３７９：非特許文献７）、血管形成（Ｐｌａｎａｔ−Ｂｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４；１０９：６５６−６６３：非特許文献８）、および造血性（Ｃｏｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００３；３０１：１０１６−１０２２：非特許文献９）の系統へも分化することが、多数のインビトロおよびインビボの研究によって示されている。【０００４】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）は、大容量（例えば、５００ｍｌ＜）の脂肪吸引物を処理することによって、十分な数のＡＳＣが得られるため、細胞培養を行うことなく臨床的に使用され得る。新たに単離した細胞（ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を使用することにより、実際の処置においてより高い安全性および有効性が導かれ得る。実際、新たに単離したＡＳＣは、骨損傷（Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００４；３２：３７０−３７３：非特許文献１０）、直腸膣瘻孔（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００３；１８：４５１−４５４：非特許文献１１）を処置するため、または軟部組織増大術ようないくつかの臨床試験において既に使用されている。【０００５】
脂肪吸引術は、最も人気のある美容形成術の１つであり、毎年８０万を超える施術が世界中で行われていると推定される。脂肪吸引術は、臨床的に大容量の脂肪組織を取得可能であり、ＡＳＣを回収するための典型的な方法であると考えられている。しかしながら、現時点において、脂肪吸引物は、臨床的な状況で使用されるものとして十分に研究されていない。【０００６】
脂肪吸引物は、脂肪部分および液体部分から構成される。脂肪部分は、カニューレと減圧との相互動作によって「寸断されて」いる吸引された脂肪組織を意味する。一方、液体部分は、脂肪部分とともに吸引された液体を意味する。液体は、主に、（１）神経および血管を損傷せずに脂肪吸引を促進するために、前もってその部位に注入された生理食塩水、（２）末梢血、および（３）脂肪組織に由来する細胞または組織断片から構成されている。【０００７】
これまで、脂肪吸引物のうちの脂肪部分は調べられてきたが、液体部分はほとんど研究対象とされてこなかった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０３５７３８パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／０４２７３０パンフレット
【非特許文献１】Ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９７６；５８：６９９−７０４
【非特許文献２】Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５
【非特許文献３】Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ２００１；７：２１１−２２８
【非特許文献４】Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００２；２９０：７６３−７６９
【非特許文献５】Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０００；２４  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ４１−４４
【非特許文献６】Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ２００２；１０９：１９９−２０９
【非特許文献７】Ｓａｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００２；２９４：３７１−３７９
【非特許文献８】Ｐｌａｎａｔ−Ｂｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４；１０９：６５６−６６３
【非特許文献９】Ｃｏｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００３；３０１：１０１６−１０２２
【非特許文献１０】Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００４；３２：３７０−３７３
【非特許文献１１】Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００３；１８：４５１−４５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のような状況下で、臨床的な状況で使用されるものとしての脂肪吸引物について、さらに詳細な研究が行われることが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、脂肪吸引物の脂肪部分のみならず、液体部分についても細胞の供給源としての詳細な特徴付けを行った。その結果、脂肪吸引物の液体部分からも相当数の脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）が単離され得ることを見出した。【００１０】
さらに、本発明者らは、新たに単離されたＡＳＣと培養されたＡＳＣとの比較実験を行った。その結果、予想外にも、本発明者らのインビトロ培養条件を用いることにより、ＡＳＣの長期培養（例えば、２０週）後においてもなお、ＣＤ３４およびＣＤ１０５の発現能を維持したＡＳＣが、脂肪吸引物の脂肪部分および液体部分の両方から得られることを見出した。また、脂肪部分および液体部分から得られたＡＳＣを、分化誘導培地で培養し、これらが脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の系統に沿って類似の分化能を有することを確認した。【００１１】
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものであり、以下のような特徴を有する単離された多能性幹細胞、培養された多能性幹細胞、培養された脂肪由来幹細胞、脂肪由来幹細胞の調製方法、および上記幹細胞の再生医療等における使用を提供する。
（１）単離された多能性幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
（２）培養された多能性幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
（３）培養された脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る、細胞。
（４）少なくとも２週間培養された、上記（２）または（３）に記載の細胞。
（５）少なくとも１０週間培養された、上記（２）または（３）に記載の細胞。
（６）少なくとも２０週間培養された、上記（２）または（３）に記載の細胞。
（７）新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞の調製方法。
（８）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも２週間培養する、上記（７）に記載の方法。
（９）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも１０週間培養する、上記（７）に記載の方法。
（１０）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも２０週間培養する、上記（７）に記載の方法。
（１１）上記培養の基本培地が、Ｍ−１９９培地である、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）接着培養を行う、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地において行われる、上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）上記培地が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜２００ＩＵ  ペニシリン、
５０〜２００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子、
を含有する、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記培養のための培地が、
７〜１５％  ウシ胎仔血清
７０〜１５０ＩＵ  ペニシリン
７０〜１５０ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
２〜７μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
１〜５ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（１４）に記載の方法。
（１６）上記培養が、
１０％  ウシ胎仔血清
１００ＩＵ  ペニシリン
１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
５μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
２ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地において行われる、上記（１５）に記載の方法。
（１７）脂肪由来幹細胞を調製する方法であって、
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および
上記脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程、
上記単離した脂肪由来幹細胞を培養する工程
を包含し、
上記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地において行われる、
方法。
（１８）上記脂肪由来幹細胞を単離する工程が、上記脂肪吸引物の脂肪部分から、脂肪由来幹細胞を単離することを含む、上記（１７）に記載の方法。
（１９）上記脂肪由来幹細胞を単離する工程が、上記脂肪吸引物の液体部分から、脂肪由来幹細胞を単離することを含む、上記（１７）に記載の方法。
（２０）上記培養のための基本培地が、Ｍ−１９９培地である、上記（１７）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）上記培養のための培地が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜２００ＩＵ  ペニシリン、
５０〜２００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子、
を含有する、上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）上記培養のための培地が、
７〜１５％  ウシ胎仔血清
７０〜１５０ＩＵ  ペニシリン
７０〜１５０ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
２〜７μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
１〜５ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（２１）に記載の方法。
（２３）上記培養のための培地が、
１０％  ウシ胎仔血清
１００ＩＵ  ペニシリン
１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
５μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
２ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（２２）に記載の方法。
（２４）脂肪吸引物の液体部分を用いて脂肪由来幹細胞を調製する方法であって、
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程
上記脂肪吸引物の液体部分から、脂肪由来幹細胞を単離する工程、および
上記単離した脂肪由来幹細胞を培養する工程
を包含する、方法。
（２５）上記脂肪由来幹細胞を単離する工程が、
上記液体部分を遠心分離してペレットを回収すること、
上記ペレットから赤血球を溶血除去すること、および
密度勾配遠心分離法により、上記赤血球を除去したペレットから脂肪由来幹細胞を単離することを含み、
上記液体部分を酵素処理することを含まない、上記（２４）に記載の方法。
（２６）上記培養のための基本培地が、Ｍ−１９９である、上記（２４）または（２５）に記載の方法。
（２７）上記培養のための培地が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（２４）〜（２６）のいずれかに記載の方法。
（２８）上記培養のための培地が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜２００ＩＵ  ペニシリン、
５０〜２００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子、
を含有する、上記（２７）に記載の方法。
（２９）上記培養のための培地が、
７〜１５％  ウシ胎仔血清
７０〜１５０ＩＵ  ペニシリン
７０〜１５０ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
２〜７μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
１〜５ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（２８）に記載の方法。
（３０）上記培養のための培地が、
１０％  ウシ胎仔血清
１００ＩＵ  ペニシリン
１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、
５μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
２ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する、上記（２９）に記載の方法。
（３１）ゼラチンで被覆した基板上で接着培養を行う、上記（１７）〜（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）上記培養を少なくとも２週間行う、上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）上記培養を少なくとも１０週間行う、上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３４）上記培養を少なくとも２０週間行う、上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３５）培地交換を少なくとも週２回、細胞継代を少なくとも週１回行う、上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載の方法。
（３６）上記（１７）〜（３５）のいずれかに記載の方法によって調製された脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現する、細胞。
（３７）上記（１）〜（６）のいずれか、または上記（３６）に記載の細胞を含有する、再生医療用材料。
（３８）上記（１）〜（６）のいずれか、または上記（３６）に記載の細胞を使用する工程を包含する、再生医療用材料の製造方法。
（３９）上記（１）〜（６）のいずれか、または上記（３６）に記載の細胞を含有する、ヒトもしくは動物の疾患の治療、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器の再生に使用するための薬剤。
（４０）上記（１）〜（６）のいずれか、または上記（３６）に記載の細胞を含有する、ヒトもしくは動物の疾患を治療するため、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器を再生するための方法。
（４１）多能性幹細胞を含む組成物であって、該組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含む、組成物。
（４２）上記組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含む、（４１）に記載の組成物。
（４３）上記組成物は、ＣＤ１０５の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含む、（４１）に記載の組成物。
（４４）上記組成物は、ＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含む、（４１）に記載の組成物。
（４５）ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞を含む組成物を調製する方法であって、Ａ）新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、方法。
（４６）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも２週間培養する、（４５）に記載の方法。
（４７）上記脂肪由来幹細胞を１〜２週間培養する、（４５）に記載の方法。
（４８）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも１０週間培養する、（４５）に記載の方法。
（４９）上記脂肪由来幹細胞を少なくとも２０週間培養する、（４５）に記載の方法。
（５０）上記培養が、
５〜２０％  ウシ胎仔血清
５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、
１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子
を含有する培地を用いて行われる、（４５）〜（４９）のいずれか１項に記載の方法。
（５１）上記脂肪由来幹細胞は、
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および
上記脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程
によって、単離される、（４５）に記載の方法。
（５２）上記脂肪吸引物は、液体部分を含む、（５１）に記載の方法。
（５３）上記脂肪吸引物を得る工程は、液体部分を分離する工程をさらに包含する、（５１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の単離または培養された多能性幹細胞は、ＣＤ３４またはＣＤ１０５のような臨床的に重要な表面マーカーを発現することができるため、脂肪再生、骨再生、心筋再生、血管再生、難治性潰瘍などの再生医療に使用するのに有利である。ＣＤ３４は広く幹細胞の未分化状態を代表するマーカーと考えられており、間葉系マーカーであるＣＤ１０５との両陽性細胞は、間葉系細胞・組織の再生に有効であると期待されているため。【００１３】
本発明のＡＳＣの調製方法により得られるヒト由来のＡＳＣは、長期培養増殖された後もＣＤ３４およびＣＤ１０５のような臨床的に重要な表面マーカーを発現することができる。このような性質を有するＡＳＣは、脂肪再生、骨再生、心筋再生、血管新生、難治性潰瘍などの再生医療への応用において、有利な材料を提供し得る。【００１４】
本発明の多能性幹細胞の調製方法により、ＣＤ３４、ＣＤ１０５のような臨床的に重要な表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞が大量に調製することができるため、再生医療等に使用し得る材料が有利に提供され得る。【００１５】
通常行われる脂肪吸引では吸引脂肪は日常的に廃棄されている組織であるが、本発明により有効利用が可能である。さらに、これまで廃棄されていた液体部分の有効利用という利点も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】脂肪吸引物の脂肪部分または液体部分から単離された脂肪由来間質細胞（ＡＳＣ）を示す写真およびグラフである。
【図２】継代３〜５の接着ＰＬＡ細胞または接着ＬＡＦ細胞を用いた細胞分化分析の結果を示す写真およびグラフである。
【図３−１】図３は、新たに単離されたＬＡＦ細胞のＣＤ３４およびＣＤ４５発現を示すグラフおよび写真（ａおよびｂ）である。
【図３−２】図３−２は、図３−１の続きである。
【図４−１】図４は、新たに単離したか、または２週間培養したＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のフローサイトメトリーのデータの比較を示す図（ａ〜ｎ）である。
【図４−２】図４−２は、図４−１の続きである。
【図４−３】図４−３は、図４−２の続きである。
【図４−４】図４−４は、図４−３の続きである。
【図４−５】図４−５は、図４−４の続きである。
【図４−６】図４−６は、図４−５の続きである。
【図４−７】図４−７は、図４−６の続きである。
【図４−８】図４−８は、図４−７の続きである。
【図４−９】図４−９は、図４−８の続きである。
【図４−１０】図４−１０は、図４−９の続きである。
【図４−１１】図４−１１は、図４−１０の続きである。
【図４−１２】図４−１２は、図４−１１の続きである。
【図４−１３】図４−１３は、図４−１２の続きである。
【図４−１４】図４−１４は、図４−１３の続きである。
【図５−１】図５は、新たに単離した、または培養したＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の代表的な細胞表面マーカーの発現の連続的な変化を示す図（ａ〜ｔ）である。
【図５−２】図５−２は、図５−１の続きである。
【図５−３】図５−３は、図５−２の続きである。
【図５−４】図５−４は、図５−３の続きである。
【図５−５】図５−５は、図５−４の続きである。
【図５−６】図５−６は、図５−５の続きである。
【図５−７】図５−７は、図５−６の続きである。
【図５−８】図５−８は、図５−７の続きである。
【図５−９】図５−９は、図５−８の続きである。
【図５−１０】図５−１０は、図５−９の続きである。
【図５−１１】図５−１１は、図５−１０の続きである。
【図５−１２】図５−１２は、図５−１１の続きである。
【図５−１３】図５−１３は、図５−１２の続きである。
【図５−１４】図５−１４は、図５−１３の続きである。
【図５−１５】図５−１５は、図５−１４の続きである。
【図５−１６】図５−１６は、図５−１５の続きである。
【図５−１７】図５−１７は、図５−１６の続きである。
【図５−１８】図５−１８は、図５−１７の続きである。
【図５−１９】図５−１９は、図５−１８の続きである。
【図５−２０】図５−２０は、図５−１９の続きである。
【図６】新たに単離されたＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のＣＤ３４陽性細胞の比率の変動を２０週間まで示した図である。
【図７】新たに単離されたＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のＣＤ１０５陽性細胞の比率の変動を２０週間まで示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００１８】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００１９】
用語「細胞」は、当該分野におけるその最も広義の意味で本明細書において使用され、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有し、そして細胞のような生物体を外界から隔離する膜構造に包まれる、多細胞生物の組織の構成単位をいう。本発明の方法において、任意の細胞が対象として使用され得る。本発明で使用される細胞の数は、光学顕微鏡により計数することができる。光学顕微鏡を使用して計数する場合は、核の数が計数される。組織を組織切片スライスとし、次いでヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色し、細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を識別する。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であってもよい。細胞の供給源の例としては、単一の細胞培養物；正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織；あるいは正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるが、それらに限定されない。このような供給源自体が、細胞として使用され得る。【００２０】
本明細書において使用される脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）およびそれに対応する物質は、生物が脂肪細胞またはそれに対応する細胞を有しさえすれば、任意の生物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）に由来し得る。１つの実施形態において、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。【００２１】
本明細書において使用される場合、「幹細胞」とは、単分化能性、多能性、または全能性を有する、分化細胞の前駆体（または前駆細胞）をいう。幹細胞は、特定の刺激に応答して分化され得る。代表的に、幹細胞は、損傷された組織を再生することができる。本明細書で使用される幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、あるいは他の前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。上述の能力を有している限り、幹細胞は、人工的に作製した細胞（例えば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）であってもよい。胚性幹細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立され、最近は再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、相対的に限定されたレベルの分化能を有する。組織幹細胞は、組織中に存在し、未分化な細胞内構造を有する。組織幹細胞は、より高い核／細胞質比を有し、そしてわずかな細胞内オルガネラを有する。ほとんどの組織幹細胞は、多能性を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合、幹細胞は、好ましくは組織幹細胞であり得るが、状況に応じて胚性幹細胞も使用され得る。【００２２】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。【００２３】
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」とは、子孫にあたる細胞が特定の分化形質を発現することが明らかな場合、分化形質を発現していない未分化な親細胞をいい、多能性未分化細胞だけでなく単分化能性未分化細胞も含む。例えば、子孫にあたる細胞が、血管内皮細胞である場合、その前駆細胞を血管内皮前駆細胞という。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。しかし、幹細胞の分化により得られる前駆細胞は、その幹細胞から見ると「分化細胞」に対応するということができる。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」または「ＬＡＦ」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。【００２４】
いわゆる吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（脂肪吸引物の脂肪部分）から単離された細胞は、回収した起源にちなんでＰＬＡ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）細胞と呼ばれている（例えば、Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５）。そこで、本明細書中でも同様に、脂肪吸引物の脂肪部分から単離した細胞を、ＰＬＡ細胞という。また、本明細書中、脂肪吸引物の液体部分から単離された細胞を、ＬＡＦ（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ  ａｓｐｉｒａｔｅ  ｆｌｕｉｄ：脂肪吸引物液）細胞という。【００２５】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来前駆細胞」は、脂肪吸引より得られた、幹細胞および他の前駆細胞をいい、他の前駆細胞は、この脂肪吸引により得られた、末梢血由来の幹細胞または血管間質細胞（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ））のようなものである。脂肪由来前駆細胞は、脂肪組織または脂肪吸引法により得られた任意の多能性前駆細胞または単分化能性前駆細胞の集団を意味する。この細胞としては、脂肪由来血管間質細胞（＝脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、脂肪由来間質細胞）、脂肪由来幹細胞、脂肪幹細胞、内皮前駆細胞、造血性幹細胞などが挙げられる。このような幹細胞を単離するためのいくつかの技術が、例えば、Ｎａｋａｔｓｕｊｉら「幹細胞研究プロトコール［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ／Ｃｌｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ］」、Ｙｏｄｏｓｈａ（２００１）；ＷＯ００／５３７９５；ＷＯ０３／０２２９８８；ＷＯ０１／６２９０１に記載されるように知られている。これらの文献は、その関連部分において、参考として本明細書中に援用される。本明細書中において使用される場合、用語「脂肪由来前駆細胞」とは、これらの公知な単離方法により得られた脂肪組織由来幹細胞を含む、全ての脂肪組織由来幹細胞をいう。本明細書中で使用される場合、「前駆細胞」は、多能性未分化細胞だけでなく、単分化能性未分化細胞も含む。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。【００２６】
これまで、脂肪吸引物のうちの脂肪部分のみが調べられてきたが、本発明者らは、予備的な研究を通して、脂肪吸引物の液体部分からも有意な量の前駆体細胞が単離され得ることを認識した。さらに、新たに単離した脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）は、培養されたＡＳＣよりも、細胞ベースの治療のためのツールとして好ましい（特に、臨床試験の初期段階で）ことから、脂肪組織から新たに単離された細胞の特徴付けも詳細になされるべきである。【００２７】
細胞の起源は、外胚葉、内胚葉および中胚葉に分類される。外胚葉起源の幹細胞は、主に脳に存在し、これには神経幹細胞が含まれる。内胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、これには血管幹細胞およびその分化細胞、造血幹細胞およびその分化細胞、間葉系幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、これには肝幹細胞およびその分化細胞、膵幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどの胚葉由来であってもよい。好ましくは、間葉系幹細胞が使用され得る。【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「間葉系幹細胞」とは、間葉に見出される幹細胞をいう。本明細書では、用語「間葉系幹細胞」は、「ＭＳＣ」と略され得る。間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる、星状または不規則な突起をもち、上皮組織間の間隙をうめる遊離細胞の集団をいう。間葉はまた、細胞と結合する細胞内接着因子とともに形成された組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、および脂肪細胞への分化能とを有する。間葉系幹細胞は、患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、あるいは軟骨細胞または骨芽細胞に分化させるために使用される。間葉系幹細胞はまた、歯槽骨；関節症等の骨、軟骨、または関節などの再建材料として使用されておいる。間葉系幹細胞に対する大きな需要が存在している。また、間葉系幹細胞は、血球、リンパ系細胞へも分化し得る。従って、間葉系幹細胞に対する需要がますます高まっている。【００２９】
語句「脂肪吸引由来物質」とは、脂肪吸引が行われた際に生成する任意の物質をいう。代表的に、このような脂肪吸引由来物質は、脂肪組織および脂肪吸引物を含む。【００３０】
語句「脂肪吸引物」とは、脂肪吸引が行われる際に生成する液体をいう。このような脂肪吸引物は、以下：（１）脂肪吸引時に一緒に吸引された液体（例えば、トゥメセント液および血液を含む）または、（２）吸引脂肪を溶液（例えば、生理食塩水）で洗浄する際に生じた廃液、をいう。【００３１】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）」とは、組織間に位置されるか、あるいは、疎性結合組織または毛細血管周辺の一群として脂肪組織を形成し、そして大量の脂質を含む細胞をいう。脂肪細胞（Ｆａｔ  Ｃｅｌｌ）としては、黄色脂肪細胞（ｙｅｌｌｏｗ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が挙げられる。これらの細胞は、本明細書中において等価に使用され得る。細胞内の脂肪は、スダンＩＩＩ（Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ）または四酸化オスミウムを用いて容易に検出され得る。【００３２】
本明細書において使用される場合、用語「組織」とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞の集合体をいう。通常「組織」は、同じ起源の細胞の集合体であるが、その細胞が同一の機能および／または形態を有する限り、異なる起源の細胞の集合体であり得る。従って、本発明の幹細胞が組織再生に使用される場合、２以上の異なる起源の細胞の集合体から構成され得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は、形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別される。あるいは、組織は、構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに区別され得る。このように組織は、種々の分類に区別される。任意の組織が、本明細書中において処置される標的として意図され得る。【００３３】
任意の臓器が、本発明の(処置等の)標的となり得る。本発明により標的とされる組織または細胞は、任意の臓器由来であり得る。本明細書において、用語「臓器」とは、特定の機能が行われる個体生物の特定の部分に位置する独立的な構造体をいう。多細胞生物（例えば、動物、植物）において、臓器は、特定の様式において空間的に配列された複数の組織からなり、各組織は多数の細胞から構成される。そのような臓器の例としては、血管系に関連する臓器が挙げられる。１つの実施形態において、本発明により対象とされる臓器としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、任意の臓器が標的として使用され得る。好ましくは、間葉系の組織（例えば、脂肪、骨、靭帯など）が標的とされ得るが、これらに限定されない。【００３４】
本明細書において使用される場合、細胞、組織、臓器などに関連する用語「所望の部位に対応する」とは、本発明における移植または再生などを目的とするときの、目的とする部位から取得したか（例えば、心臓であれば、心臓由来の細胞）または目的とする部位に存在する細胞などと実質的に同じ性質を有する細胞など（例えば、心臓細胞へと分化させた細胞）を示す。従って、所望の部位に対応する細胞は、実質的に同一の特徴（例えば、細胞表面マーカーなど）を有することによって確認することができる。【００３５】
そのような所望の部位に対応する細胞を判別するために有用なマーカーの例としては、（１）脂肪：細胞質内におけるトリグリセリドの存在、ＯｉｌＲｅｄ−Ｏ染色、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ＝ＧＰＤＨ）活性、細胞質内のＧＬＵＴ４  、Ａｐ２（脂肪酸結合タンパク質）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＰＰＡＲγ１，２（ペルオキシソーム増殖活性化レセプターγ１，２）、およびレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）の発現；（２）骨細胞、骨組織：アルカリホスファターゼの存在、ある程度の骨石灰化（カルシウムの沈着）の確認；およびオステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、またはオステオネクチン（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）の発現；（３）軟骨細胞、軟骨組織：ムコ多糖の存在、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン−４−サルフェート（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ−４−ｓｕｌｆａｔｅ）の発現／存在；（４）骨格筋細胞：細胞質内のミオシンの豊富な存在；などが挙げられるが、これらに限定されない。【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」および「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」とは、本明細書中で互換的に使用され、本発明の細胞、組成物、医薬などを、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、体内に移入することを意味する。本明細書において「移植片」とは、体内に移入される本発明の組織片、細胞、組成物、医薬などを意味する。本発明において、治療部位（例えば、骨など）への導入のための以下の方法、形態および量が使用され得：本発明の医薬は、損傷部位へ直接注入、貼付後および縫合、挿入などされる。本発明の脂肪由来前駆細胞と分化細胞との組み合わせは、同時に（例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物として一緒に投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、分化促進因子）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。【００３７】
本明細書において使用される場合、用語「レシピエント」（受容者）とは、移植される細胞などを受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植される細胞などを提供する個体は、「ドナー」（供与者）と呼ばれる。レシピエントとドナーとは同じであっても異なっていてもよい。【００３８】
本発明において使用される細胞は、自系由来（自己由来）でも、同種異系由来（非自己由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応の観点から、自己由来の細胞が好ましい。拒絶反応が問題でない場合、同種異系細胞が使用され得る。【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態」とは、分化細胞が関与する任意の疾患、障害または異常状態をいう。このような分化細胞としては、好ましくは、間葉系細胞であることが好ましいが、これに限定されない。【００４０】
１つの実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、循環器系（血液細胞など）のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびそれらの化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期およびそれ以降）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期およびそれ以降）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期およびそれ以降）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など；心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋／心膜疾患、先天性心疾患（例えば、心房中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴など）、動脈疾患（例えば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（例えば、静脈瘤）、リンパ管疾患（例えば、リンパ浮腫）などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４１】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、神経系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、痴呆症、脳卒中およびその後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷が挙げられるが、これらに限定されない。【００４２】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、免疫系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、Ｔ細胞欠損症、白血病などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４３】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、運動器および骨格系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、骨折、骨粗鬆症、関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、筋ジストロフィー、骨形成不全症、骨軟骨異形成症が挙げられるが、これらに限定されない。【００４４】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、皮膚系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、無毛症、黒色腫、皮膚悪性リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疱症、膿疱症、皮膚炎、湿疹などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４５】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、内分泌系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、視床下部／下垂体疾患、甲状腺疾患、副甲状腺（上皮小体）疾患、副腎皮質／髄質疾患、糖代謝異常、脂質代謝異常、タンパク質代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝異常（フェニールケトン尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症）、無アルブミン血症、アスコルビン酸合成能欠如、高ビリルビン血症、高ビリルビン尿症、カリクレイン欠損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレッシン分泌異常、侏儒症、ウオルマン病（酸リパーゼ（Ａｃｉｄ  ｌｉｐａｓｅ）欠損症）、ムコ多糖症ＶＩ型などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４６】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、呼吸器系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、肺疾患（例えば、肺炎、肺癌など）、気管支疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４７】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、消化器系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、食道疾患（例えば、食道癌など）、胃／十二指腸疾患（例えば、胃癌、十二指腸癌など）、小腸疾患／大腸疾患（例えば、結腸ポリープ、結腸癌、直腸癌など）、胆道疾患、肝臓疾患（例えば、肝硬変、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型など）、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝癌、アルコール性肝障害、薬物性肝障害など）、膵臓疾患（急性膵炎、慢性膵炎、膵臓癌、嚢胞性膵疾患など）、腹膜／腹壁／横隔膜疾患（ヘルニアなど）、ヒルシュスプラング病などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４８】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、泌尿器系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、腎疾患（例えば、腎不全、原発性糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎障害、腎臓癌など）、膀胱疾患（例えば、膀胱炎、膀胱癌など）などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４９】
別の実施形態において、本発明が対象とする疾患および障害は、生殖器系のものであり得る。そのような疾患または障害の例としては、男性生殖器疾患（例えば、男性不妊、前立腺肥大症、前立腺癌、精巣癌など）、女性生殖器疾患（例えば、女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮癌、子宮内膜症、卵巣癌、絨毛性疾患など）などが挙げられるが、これらに限定されない。【００５０】
本明細書において使用される場合、「診断、予防、処置または予後のために有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技術を用いて種々のパラメータを参酌することにより、当業者により決定され得る。【００５１】
別の実施形態において、本発明は、美容目的の治療、処置または改善において使用され得る。そのような美容目的は、純粋に健常状態への美容目的と同様に、手術後または外傷後の変形および先天性の変形に対する美容治療も含まれる。本発明は例えば、乳房の組織増大術（豊胸術）、頬や上下眼瞼の陥凹に対する組織増大術、および顔面半側萎縮症、顔面神経麻痺後の組織萎縮、漏斗胸などへの組織増大術に適用され得るが、これらに限定されない。さらに本発明は、鼻形成術、整鼻術、オトガイ形成術（組織増大術）、前額形成術（組織増大術）、小耳症など耳介変形／奇形に対する耳介軟骨形成術へ適用され得るが、これらに限定されない。【００５２】
本発明が医薬として使用される場合、その医薬は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。当該分野において公知な任意の薬学的に受容可能なキャリアが、本発明の医薬において使用され得る。【００５３】
薬学的に受容可能なキャリアまたは適切な処方材料としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞および他の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般に使用される他の物質を補充することが可能である。【００５４】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくはレシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるが、これらに限定されない。【００５５】
適切なキャリアの例としては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤が、所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらはさらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【００５６】
本発明の医薬組成物の一般的な調製法を以下に記載する。動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物なども、公知の技術により製造することができる。【００５７】
本発明の細胞などは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと配合され、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊インヒビター、吸収促進剤、吸収剤、保湿剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物も、必要に応じて使用され得る。本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合され得る。非経口の投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。全身投与される場合、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当該技術の範囲内である。【００５８】
本発明の医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤をさらに含み得る。【００５９】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。頻度の例としては、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）が挙げられる。好ましくは、投与は、経過を見ながら１週間〜１ヶ月に１回施される。投薬量は、処置される部位が必要とする量を見積もることによって、確定され得る。【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「指示書」は、医薬を投与する方法または診断のための方法などを、医師、患者など投与を行う人または投与される人、診断する人（例えば、医師、患者など）または診断される人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与するための適切な方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供される。この指示書は、これに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供される電子媒体（例えば、ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。【００６１】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用可能なアッセイもしくは機器を使用する標準的な臨床検査の結果または意図される処置に関連する疾患（例えば、骨疾患、心臓疾患、神経疾患など）に特徴的な臨床症状の消滅あるいは美容状態の回復（例えば、外見の回復など）によって支持され得る。治療は、分化細胞の欠損などに関連する疾患（例えば、神経疾患）の再発または美容状態の損傷により再開され得る。【００６２】
本発明はまた、１つ以上の医薬組成物を満たした１つ以上の容器を備える医薬品パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属され得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注射用デバイスを備え得る。【００６３】
毒性研究が、種々の動物モデル（例えば、マウス、ウサギ、または非げっ歯類）を用いて行われ得る。これらの動物モデルにおいて、一般状態、体重、摂餌量、飲水量などの観察、ならびに、血液検査、血液化学的検査、尿検査、および眼科学的検査などの検査が行われる。各種検査は、当該分野において周知であり、例えば、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。【００６４】
血液学的検査：赤血球数、白血球数、血小板数、血色素量、ヘマトクリット、血液像（白血球型別百分率）、その他網赤血球数、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、などの測定が行われる。例えば、血液細胞組成物は、以下のように測定される：（１）薬剤がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、測定されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球数および白血球数、血液細胞組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンおよびコントロールは、毒性が存在するか否かを示す。【００６５】
血液化学的検査：血清（血漿）タンパク、アルブミン、Ａ／Ｃ比、タンパク分画、ブドウ糖、コレステロール、トリグリセリド、ビリルビン、尿素窒素、クレアチニン、トランスアミナーゼ（ＡＳＡＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＡＴ（ＧＰＴ））、アルカリホスファターゼ、電解質（ナトリウム、カリウム、塩素、カルシウム、無機リンなど）の測定。【００６６】
尿検査：尿量、ｐＨ、タンパク、糖、ケトン体、ビリルビン、潜血、沈渣、比重又は浸透圧、電解質（ナトリウム，カリウムなど）の測定。【００６７】
眼科学的検査：肉眼および検眼鏡を使用し、前眼部、中間透光体、眼底を分析する。【００６８】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究が行われ得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常疾患または毒性の直接的な証拠のために、全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、その組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす医薬は、主要な器官に対する有害作用を有する医薬と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その医薬は好ましくない。【００６９】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態が説明される。以下の実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。本明細書中を参酌して、本発明の範囲を逸脱することなく、変更および修正を行い得ることが、当業者に明らかに理解される。【００７０】
脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から単離され得る。具体的には、例えば、（１）吸引された脂肪を、１リットルの分液漏斗を使用して生理食塩水でよく洗浄する；（２）下層の生理食塩水から上層の吸引脂肪が十分に分離されたことを確認し、その下層を捨てる。この手順は、その生理食塩水が肉眼で見たときに実質的に透明になるまで繰り返される；（３）０．０７５％のコラゲナーゼ／ＰＢＳを、吸引された脂肪の量と等量添加し、続いてよく攪拌しながら３７℃にて３０分間インキュベートする；（４）等量の１０％血清補充ＤＭＥＭを、上記のサンプルに添加する；（５）このサンプルを、１２００×ｇにて１０分間遠心分離する；（６）生じるペレットを、０．１６ＭのＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳに懸濁し、続いて室温にて１０分間インキュベートする；（７）このサンプルを、１００μｍ直径メッシュを使用して吸引濾過する；そして（８）生じる濾液を、１２００×ｇにて５分間遠心分離する。上記プロトコールは、製剤の量に依存して、当業者によりスケールアップまたはスケールダウンされ得る。【００７１】
他方、脂肪由来前駆細胞は、脂肪吸引物の液体部分（脂肪吸引液）から、例えば以下のように単離され得る：（１）脂肪吸引物の液体部分を調製する；（２）その液体部分を遠心分離し、細胞画分を得る；（３）その細胞画分を密度勾配遠心分離し、比重に基づいて細胞の分離を行う；そして（４）赤血球よりも比重の軽い細胞層から細胞を回収する。吸引液の液体部分は、生理食塩水またはリンゲル注射液を使用して調製され得る。この遠心分離は、約８００×ｇ以下、あるいは約４００×ｇ以上の速度にて行われ得る。その密度勾配遠心分離は、約３７０×ｇ〜１，１００×ｇの速度にて行われる。この密度勾配遠心分離は、約１．０７６ｇ／ｍｌ〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重（２０℃）を有する媒体を使用して行われる。この密度勾配遠心分離法において使用される媒体は、ＦｉｃｏｌｌＴＭ、ＰｅｒｃｏｌｌＴＭまたはスクロースであり得る。回収される細胞層の比重は、約１．０５０〜１．０７５の範囲であり得る。この細胞層は、ピペットを使用して収集され得る。【００７２】
脂肪吸引方法は、当業者に周知である技術を用いて、実施することができる。脂肪吸引方法に用いられる装置としては、ケイセイ脱脂吸引機サルポンプＳＡＬ  ７６−Ａ（ケイセイ医科工業（株）、東京都文京区本郷３−１９−６）が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトの場合、０．０００１％アドレナリン入り生理食塩水などの液体を、予定吸引脂肪量の等量から２倍量、脂肪組織内に注入し、その後、内径２〜３ｍｍのカニューレ（金属製吸引管）を用いて、−２５０〜９００ｍｍＨｇ程度の陰圧で吸引することによって行う。【００７３】
吸引した脂肪細胞を洗浄するために使用される液体として通常は、生理食塩水が用いられる。しかし、生理食塩水以外にも、単離すべき幹細胞に悪影響を与えない液体であれば、任意の液体が使用可能である。具体的には、例えば、リンゲル液、および哺乳動物培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、およびＭＣＤＢ１５３など）のような、任意の等張液が、本発明において使用可能である。【００７４】
脂肪吸引物から幹細胞を調製する場合、必要に応じて、脂肪吸引物にコラゲナーゼなどの酵素処理を行なうことが可能である。しかし、脂肪吸引物中に含まれるコラーゲンの量は、脂肪組織と比較して相対的に少ないため、幹細胞調製の原料として脂肪吸引物を用いる場合、コラゲナーゼ処理に必要とされる時間、および／または酵素処理に必要とされる酵素量が、脂肪組織の場合よりも、相対的に低い。【００７５】
脂肪吸引物を遠心分離して細胞画分を得る工程においては、細胞画分と、その他の成分（例えば、血漿、手術時に注入した生理食塩水、麻酔薬、止血薬、破壊された脂肪細胞から漏出した脂質成分）とを分離する任意の条件を用いることができる。例えば、４００〜８００×ｇでの５〜１５分程度の遠心分離を用いることが可能である。【００７６】
比重による遠心分離により細胞を単離する工程においては、例えば単離された細胞画分を、密度勾配遠心分離にかけることができる。任意の密度勾配遠心分離のために使用可能な媒体が、この媒体として使用され得る。好ましい媒体は、１．０７６〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重を有し得る。さらに、好ましい媒体のｐＨは、４．５と７．５との間である。媒体中の好ましいエンドトキシンレベルは、０．１２ＥＵ／ｍｌ以下である。代表的な媒体としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンとの共重合物）、およびパーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク株式会社、東京）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、東京）などの名称で市販されている。パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、東京）という名称で市販されている。【００７７】
比重による遠心分離の条件は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳを媒体として用いる場合、４００×ｇ、３０〜４０分が用いられ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を媒体として用いる場合、３７０ｃｇ、約３０分が用いられる。リンフォプレップを媒体として用いる場合、条件としては８００×ｇ、約２０分または１１００×ｇ、約１０分が挙げられるが、これらに限定されない。【００７８】
比重による遠心分離が用いられるときに、最も多い細胞は、通常赤血球細胞であり、赤色の細胞層として確認することができる。幹細胞は、赤血球よりも比重が軽いため、幹細胞を分離する場合には、赤血球よりも軽い細胞層を収集する。好ましくは、比重１．０５０〜１．０７５の範囲の細胞層を収集する。【００７９】
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５〜１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、試験され得る。【００８０】
さらに、層に分離した細胞の回収は、例えば、ピペットを用いて行なうことができる。【００８１】
比重による遠心分離においては、セルセパレーター（例えば、血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）を使用することが可能である。【００８２】
脂肪組織が細胞から分離される条件は、脂肪組織が細胞から分離され、かつ細胞の単離を促進する条件であり得る。このような条件としては、例えば、Ｗａｋｏより入手可能なコラゲナーゼ（細胞分散のためのコラゲナーゼ、０３２−１０５３４）を添加するような、細胞外マトリクスの分解が挙げられるが、これに限定されない。このようなコラゲナーゼは、濃度０．０７５％にてＰＢＳ中に溶解し、この溶液を３７℃まで温めて脂肪と等量を添加する。そのサンプルを３７℃にて８０ｒｐｍで３０分間攪拌するために、アジテーターが使用される。【００８３】
好ましくは、本発明の方法は、高度の幹細胞純度を達成するために、血球細胞を除去する工程をさらに包含する。しかし、このような血球細胞は、続いてディッシュ上で培養し、この細胞集団を継代し、８０％を超える（好ましくは、９０％を超える）幹細胞を生じさせることにより除去され得る。これもまた、先行技術からは予想されていなかった驚くべき効果である。このような血球細胞は、血球細胞を分解する成分を添加する工程を包含する血球除去工程により、除去され得る。【００８４】
（幹細胞マーカーの長期維持）
本発明者らは、将来の臨床試験のために、脂肪吸引物の液体部分から新たに単離された細胞および培養された細胞の特徴付けを行い、吸引脂肪由来のものと比較した。さらに、細胞表面マーカーの発現プロフィールにおける長期的な変化を、両方の細胞集団について決定した。【００８５】
その結果、予想外にも、本発明者らは、本発明者らの使用した培養条件下で、長期培養（例えば、２０週）後においてもなお、ＣＤ３４およびＣＤ１０５の発現能を維持したＡＳＣ（以下、特に断らない限り、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の両方を含むものとする）が、脂肪吸引物の脂肪部分および液体部分の両方から得られることを見出した。ＣＤ３４は、最も確立されている幹細胞マーカーであり、ＣＤ３４＋細胞は、臨床的な応用が期待できるものである。ＣＤ１０５は、間葉系幹細胞関連マーカーとして知られており、ＡＳＣの脂肪、軟骨、および骨の様な間葉系起源の系統への分化に寄与していると考えられる。
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）の調製方法）
したがって、本発明は、臨床的に有用なヒト由来の培養されたＡＳＣ、およびそのようなＡＳＣを調製するための新規な方法を提供する。この方法は、典型的には、以下の工程を包含する：
ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および
前記脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程、
前記単離した脂肪由来幹細胞を培養する工程。【００８６】
本明細書中、「ヒトドナー」とは、脂肪を提供するヒトを意味する。典型的には、脂肪吸引術を受けているヒト（男性および女性を含む）であり、より典型的には、体型改善などの目的で脂肪吸引術を受けている健常女性である。脂肪吸引術を受けるドナーには、十分なインフォームドコンセントが行われていることが好ましい。【００８７】
本明細書中、「脂肪吸引物」とは、脂肪吸引術により得られた吸引物のことを意味する。脂肪吸引術は、通常、体型改善等の目的で、カニューレと呼ばれる吸引管を、身体の皮下脂肪の厚い部分（例えば、腹部、腰部、大腿など）に挿入し、脂肪を吸引除去するものである。脂肪吸引物は、既に記載したように、「脂肪部分」と「液体部分」とから構成される。「脂肪部分」は、典型的には、カニューレと減圧との相互動作によって「寸断されて」いる吸引された脂肪組織を意味する。一方、「液体部分」は、脂肪部分とともに吸引された液体を意味する。液体は、主に、（１）神経および血管を損傷せずに脂肪吸引を促進するために、前もってその部位に注入された生理食塩水、（２）末梢血、および（３）脂肪組織に由来する細胞または組織断片などから構成されている。本発明のＡＳＣの調製方法では、脂肪吸引物のうちの脂肪部分および液体部分のいずれも使用し得る。【００８８】
得られた脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞の単離は、典型的には、Ｚｕｋら（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕ  Ｅｎｇ  ２００１；７：２１１−２２８）の方法またはその改変方法を用いて、以下のように行い得る。【００８９】
脂肪部分を使用する場合、脂肪部分からの材料は、まず、細胞外マトリックスから細胞を解離するために、コラゲナーゼのような酵素で処理される。次いで、遠心分離によって成熟脂肪細胞、結合組織などをペレットから分離し、回収したペレットを赤血球溶解緩衝液で処理した後フィルター（例えば、孔径１００μｍ）を通して赤血球および非細胞成分を除去する。次いで、フィルターを通過したろ過液から密度勾配遠心分離法によって目的のＡＳＣ（すなわち、ＰＬＡ細胞）を濃縮単離する。得られたＡＳＣはさらにフィルターを通して不純物を除いても良い。【００９０】
液体部分を使用する場合、液体部分からの液体は、直接、遠心分離にかけられてペレットが回収される。そのペレットを赤血球溶解緩衝液で処理した後フィルターに通して赤血球および非細胞成分を除去する。次いで、フィルターを通過したろ過液から密度勾配遠心分離法によって目的のＡＳＣ（すなわち、ＬＡＦ細胞）を濃縮単離する。液体部分を使用する場合には、脂肪部分を使用する場合のような酵素処理が要らないという利点がある。【００９１】
本発明のＡＳＣの調製方法において、脂肪吸引物から単離されたＡＳＣは、さらに培養され、増殖される。培養のための手順は、常法に従う（例えば、新生化学実験講座（１８）「細胞培養技術」、日本生化学会編、第１版、第１刷、１９９０、東京化学同人等を参照）。細胞は、懸濁液中、または固定培養基上で培養することができる。好ましくは、細胞は、基板（例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、プレート等）上に接着されてインビトロで培養される。プラスチック製品は細胞が接着しやすいように表面処理された製品を使用してもよい。また、必要に応じて、接着を十分なものとし、効率の良い培養を実現するために、任意の細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン等）で代表される細胞接着因子を使用してもよい。その際、一般的には、培養容器の接着面に細胞外マトリックスをコートする。細胞外マトリックスは、当業者にとって公知の方法で使用前に培養容器の接着面にコートされてもよいし、または細胞外マトリックスが予めコートされている製品を、当業者に周知の業者から商業的に入手しても良い。【００９２】
本発明のＡＳＣの調製方法において、細胞培養に使用する培地は、基本培地と添加物とから構成される。基本培地は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン等のようなアミノ酸、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ等のような無機塩、ニコチンアミドのようなビタミン、緩衝液、その他の成分を含む。本発明のＡＳＣの調製方法において、基本培地として典型的には、Ｍ−１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９５０；７３：１）が使用される。Ｍ−１９９培地は、主に哺乳動物の正常細胞を培養するための基本培地として慣用されており、当業者に周知の供給業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなど）から粉末または液体で市販されている。他に本発明のＡＳＣの調製方法において使用し得る基本培地としては、イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグルの基本培地（ＢＭＥ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３倍地などが挙げられる。これらの培地は、当業者に周知の供給業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなど）から、粉末または液体として商業的に入手可能である。【００９３】
本発明のＡＳＣの調製方法において、好ましくは、細胞培養に必要とされる栄養素や因子などの供給源となる添加物が、細胞の増殖能および／または生存性の刺激または維持の目的で基本培地に添加されて使用される。そのような添加物の好適な例としては、血清、細胞成長因子、抗生物質などが挙げられる。【００９４】
本発明において使用され得る「血清」の種類としては、ウシ胎仔血清、ウシ新生仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清などが挙げられるが、とりわけ、ウシ胎仔血清が好ましい。好ましくは、非動化された血清が使用される。血清は、２〜２５％程度の濃度で培地に添加されて使用され得、通常５〜２０％程度の濃度で培地に添加されて使用される。より好ましくは、血清濃度は、７〜１５％程度であり、最も好ましくは、１０％程度である。【００９５】
本発明において使用され得る「細胞成長因子」の例としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＢ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられるが、とりわけ、酸性線維芽細胞増殖因子（酸性ＦＧＦ）が好ましい。さらに、ヘパリンなどが、酸性ＦＧＦの作用を増強するために添加され得る。細胞成長因子は、培地中で、０．０５〜２０ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で使用され得、好ましくは、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ程度の濃度、より好ましくは、１〜５ｎｇ／ｍｌ程度の濃度、最も好ましくは、２ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で使用され得る。ヘパリンが酸性ＦＧＦとともに使用される場合、ヘパリンは、０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で培地に添加され得、好ましくは、１〜１０ｎｇ／ｍｌ程度の濃度、より好ましくは、２〜７ｎｇ／ｍｌ程度、最も好ましくは５ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で使用され得る。【００９６】
「抗生物質」としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどが使用され得るが、本発明において使用する抗生物質としては、とりわけ、ペニシリンおよびストレプトマイシンが好ましい。本発明において、抗生物質は、２０〜４５０ＩＵまたは２０〜４５０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度で使用され得、好ましくは、５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ程度の濃度、より好ましくは、５０〜２００ＩＵまたは５０〜２００ｍｇ／ｍｌ程度の濃度、さらにより好ましくは、７０〜１５０ＩＵまたは７０〜１５０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度、最も好ましくは、１００ＩＵまたは１００ｍｇ／ｍｌ程度の濃度で、使用され得る。【００９７】
本発明で使用される培地に添加してもよい他の添加物としては、例えば、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、ペプトン、ＥＧＦ（ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）のようなタンパク質、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなど）、ビタミン（例えば、パントテン酸、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸アミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンなど）などが挙げられる。【００９８】
したがって、本発明で使用される培養培地の典型的な例は、５〜２０％  ウシ胎仔血清、５０〜２００ＩＵ  ペニシリン、５０〜２００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子を補充されたＭ−１９９培地である。【００９９】
本発明のＡＳＣの調製方法において、単離した脂肪由来幹細胞の培養に要する期間は、少なくとも１週間であり、好ましくは、少なくとも２週間、より好ましくは、少なくとも３週間、より好ましくは、少なくとも４週間、より好ましくは、少なくとも５週間、より好ましくは、少なくとも６週間、より好ましくは、少なくとも７週間、より好ましくは、少なくとも８週間、より好ましくは、少なくとも９週間、より好ましくは、少なくとも１０週間、最も好ましくは、少なくとも２０週間である。長期間培養することによって、所望の細胞を大量に得ることができる。【０１００】
好ましくは、培地交換を少なくとも週２回、細胞継代を少なくとも週１回行う。培地は、通常同じ組成のもので交換するが、これに限定されず、組成を変更した新たな培地（例えば、血清濃度、細胞性成長因子の濃度等を変更した新たな培地）を用いて培地交換を行っても良い。【０１０１】
通常、上記培養は、哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、好ましくは、３７℃程度(例えば、３５〜３８℃)の温度で、例えば、湿潤大気中、５％ＣＯ２雰囲気下で行われる。【０１０２】
なお、本発明で使用するＡＳＣの培養方法は、脂肪吸引術によって得られる脂肪吸引物から単離された脂肪由来幹細胞に対して使用し得るのみならず、他の方法（例えば、一般的な外科的切除術）で得た脂肪から単離された脂肪由来幹細胞に対しても使用し得ることは、当業者に理解され得る。また、ヒト由来の脂肪由来幹細胞に限定されず、他の哺乳動物（例えば、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等）、鳥類、またはは虫類等に由来する脂肪由来幹細胞に対しても、本発明の方法が適用され得ることは、当業者に理解され得る。【０１０３】
したがって、本発明は別の態様において、新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞の調製方法を提供する。【０１０４】
本明細書中、細胞について、「新たに単離された（ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、当該細胞が、ドナー（例えば、ヒトドナー）から得られた脂肪または脂肪吸引物から適切な方法によって単離されたままの細胞であって、培養増殖されていない細胞のことをいうものとする。なお、新たに単離された脂肪由来幹細胞は、脂肪吸引術によって得られた脂肪吸引物から単離されたものに限定されない。また、脂肪由来幹細胞は、ヒト由来のものに限定されない。【０１０５】
（組成物）
１つの局面において、本発明はまた、多能性幹細胞を含む組成物であって、該組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含む、組成物を提供する。ここで、本発明は、このような組成物において、長期保存可能なものを提供することができることを見出した。好ましくは、この組成物は、５〜２０％  ウシ胎仔血清、５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子を含有する培地を用いて培養された（たとえば、２〜２０週間）ものであり得る。【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含み得る。このような細胞を含む組成物は、従来得ることが難しかった。【０１０７】
ある実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ１０５の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも５０％含むものであり得る。間葉系幹細胞で、このような特性を有する幹細胞はこれまで提供されてこなかった。このような細胞は、未分化能を有する細胞の比率が高いという点で多大な効果を奏する。【０１０８】
ある実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現し得る多能性幹細胞を少なくとも１０％含むものであり得る。
間葉系幹細胞で、このような特性を有する幹細胞はこれまで提供されてこなかった。このような細胞は、未分化能を有する細胞の比率が高いという点で多大な効果を奏する。【０１０９】
別の局面において、本発明はまた、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞を含む組成物を調製する方法であって、Ａ）新たに単離された脂肪由来幹細胞を培養する工程を包含する、方法を提供する。ここで、この方法では、脂肪由来幹細胞を少なくとも２週間培養することが好ましいがこれに限定されない。あるいは、この方法では、脂肪由来幹細胞を１〜２週間培養してもよい。１〜２週間の培養により、ＣＤ３４陽性細胞を多量に（たとえば、２０％、あるいは５０％）含有する組成物が提供された。【０１１０】
別の実施形態では、本発明の方法では、脂肪由来幹細胞を少なくとも１０週間、あるいは少なくとも２０週間培養する。長期培養でもＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞を含む組成物が提供されたことは予想外の顕著な効果といえる。【０１１１】
好ましい実施形態では、本発明の組成物生産方法における培養は５〜２０％  ウシ胎仔血清、５０〜４００ＩＵまたは５０〜４００ｍｇ／ｍｌ  抗生物質、１〜１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、および０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ  酸性線維芽細胞増殖因子を含有する培地を用いて行われ得る。このような培養環境を用いることによって、長期培養可能という効果を与えることが予測されることから、これと等価な条件であれば、どのような環境を用いてもよい。【０１１２】
１つの実施形態では、脂肪由来幹細胞は、ヒトドナー由来の脂肪吸引物を得る工程、および脂肪吸引物から、脂肪由来幹細胞を単離する工程
によって、単離される。より好ましい実施形態では、この方法で用いられる脂肪吸引物は、液体部分を含む。液体部分から、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ１０５＋脂肪由来幹細胞を含む組成物を調製することができたのは、驚くべきことである。【０１１３】
したがって、本発明では、脂肪吸引物を得る工程は、液体部分を分離する工程をさらに包含する。この液体部分を分離する工程は、本明細書において他の場所において詳述されている任意の方法を用いることができる。
（培養増殖された脂肪由来幹細胞）
本発明のＡＳＣの調製方法により調製されたＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞はいずれも、長期間培養した後でもＣＤ３４やＣＤ１０５を発現し得る。このような性質は、臨床的な適用において非常に有用である。【０１１４】
多くの研究によって、ヒトＡＳＣの特徴付けが行われており、新たに単離されたＡＳＣ、または２週間未満の期間培養されたＡＳＣがＣＤ３４＋であるが（例えば、Ｐｌａｎａｔ−Ｂｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４；１０９：６５６−６６３）、従来の培養方法によって２週間を超えて培養したヒトＡＳＣにおいて、ＣＤ３４発現は見出されなかったことが報告されている（例えば、Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５）。これに対して、本発明は、ＣＤ３４＋のＡＳＣが、１０〜２０週間の培養後においてもなお１０〜２０％で存在することを示した（図５）。【０１１５】
本発明は、ＣＤ３４＋のＡＳＣが長期培養期間にわたって拡大され得ることを、初めて示すものである。本発明の培養プロトコルを使用して、例えば、脂肪吸引物から得られたＣＤ３４＋のＡＳＣを、４週間培養することによって、１０４〜１０７倍まで拡大することが可能である。この事実は、細胞ベースの治療への臨床的適用に対するヒトＡＳＣの価値をさらに高いものとする。【０１１６】
したがって、本発明はまた、単離された多能性幹細胞または培養された多能性幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方を細胞表面マーカーとして発現し得る細胞を提供する。より特定的には、本発明は、培養された脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方を細胞表面マーカーとして発現し得る細胞を提供する。特に、本発明は、長期間（例えば、少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、さらに好ましくは少なくとも４週間、さらに好ましくは少なくとも５週間、さらに好ましくは少なくとも６週間、さらに好ましくは少なくとも７週間、さらに好ましくは少なくとも８週間、さらに好ましくは少なくとも９週間、さらに好ましくは少なくとも１０週間、さらにより好ましくは少なくとも２０週間）培養増殖されたヒト由来の脂肪由来幹細胞であって、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、またはこれらの両方を細胞表面マーカーとして発現し得る細胞を提供する。【０１１７】
（疾患の治療または再生医療における本発明の細胞の使用）
本発明はまた、別の態様において、多能性幹細胞を被験体に投与する工程を包含する、ヒトもしくは動物の疾患を治療するため、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器を再生するための方法を提供する。そのような疾患としては、難治性潰瘍・褥瘡・熱傷をはじめとする皮膚疾患、骨欠損・骨変性を伴う骨疾患、軟骨変形・欠損・変性を伴う軟骨疾患、脂肪萎縮・変性を伴う脂肪疾患、心筋梗塞・拡張型心筋症をはじめとする心臓疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィーをはじめとする筋疾患、脊髄損傷・脳梗塞・パーキンソン病をはじめとする中枢神経系疾患、美容を目的とする組織増大・アンチエイジング治療などなどが挙げられる。また、本発明は、脂肪再生、骨再生、心筋再生、血管新生、軟骨再生、骨髄再生、神経再生、骨格筋再生などの再生医療に使用され得る。【０１１８】
本発明の多能性幹細胞は、様々な方法で被験体に投与することができる。例えば、胃腸管の壁への局所注入を経て、全身または門脈循環系へ投与することにより、あるいは任意の他の実践的手段により、移植することができる。ヒトの胃腸障害のような障害の治療における多能性幹細胞の使用は、動物モデルを使用することにより実証することができる。【０１１９】
本発明は、宿主に対して異種のドナー組織から調製された多能性幹細胞の使用をも包含する。しかしながら一般に、異種移植がうまくいくためには、移植される組織に対する免疫応答を低減するか、または排除する幾つかの方法を用いることが好ましい。したがって、被移植者は、通常、例えば、シクロスポリンのような免疫抑制薬の使用により、あるいは局所塗布される免疫抑制薬を用いた局所免疫抑制ストラテジーにより、免疫抑制され得る。免疫抑制の方法はこれらに限定されず、他の方法（例えば、幹細胞における相同組換えを用いた遺伝子置換またはノックアウト法）も使用され得る。なお、長期に培養された本発明のＡＳＣにおいてはクラス２ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）の発現が低下しており（参考文献：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，２００５）、免疫抑制剤の使用がなくても、自己以外のＡＳＣの移植拒絶が起こらないことも予想される。【０１２０】
本発明の多能性幹細胞は、部位特異的な様式（すなわち、局所的に）あるいは全身的に、送達され得る。細胞は、周囲領域の完全性を維持する任意の方法を用いて、好ましくは局所注入により、特定領域に投与され得る。細胞はまた、全身または門脈循環系に投与され得る。【０１２１】
本発明はまた、本発明の多能性幹細胞を含有する、ヒトもしくは動物の疾患の治療、またはヒトもしくは動物の細胞、組織、もしくは臓器の再生に使用するための薬剤を提供する。この薬剤は、多能性幹細胞に加えて、多能性幹細胞の成長および分化を促進する成長因子（例えば、塩基性もしくは酸性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ａＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＢＢ）、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）など）、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン）、抗炎症剤等を含むことができる。さらに、所望の場合には、多能性幹細胞は、当業者に周知の技術により、カプセル化することができる。【０１２２】
幹細胞はそのままで移植治療に用いることもできるが、所望の細胞へ誘導し、一定の臓器の形へとデザインしていくために、種々の組織工学的な技術を使用し得る。例えば、本発明の多能性幹細胞は、足場材料（細胞外マトリックスの役割を果たす）とともに被験体に投与され得る。したがって、本発明の再生医療用材料または薬剤は、多能性幹細胞とともに足場材料をさらに含み得る。足場材料を使用することによって、インビトロまたはインビボで、幹細胞を一定の形態へと増殖・分化させることを容易にすることができる。【０１２３】
本発明において使用し得る足場材料としては、例えば、コラーゲン、アルブミン、フィブリンなどのタンパク質、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸又はグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニンなどの合成項分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びそれらの誘導体などの多糖が挙げられる。また、これらの材料の混合物及び共重合体なども同様に本発明において使用され得る。足場材料の形態は、特に限定されず、例えば、スポンジ状、メッシュ状、不織布状、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、ペースト状などの形態をとることができる。足場材料は、生分解性の材料でできていてもよく、また、幹細胞、細胞成長因子等を一定期間（例えば、１〜３週間）にわたって生体内で徐放可能な材料であってもよい。【０１２４】
（分化細胞を調製するための方法）
本発明の幹細胞を用いて、種々の分化細胞および／または前駆細胞を得ることができる。具体的な手順は、以下に説明される。【０１２５】
１つの局面において、本発明は、幹細胞から分化細胞を調製するための方法を提供する。幹細胞から得られる分化細胞としては、最終的に分化した細胞のみならず、前駆細胞も含まれる。【０１２６】
脂肪吸引物由来の幹細胞から分化細胞を調製する方法としては、（１）培養培地中に分化誘導剤（例えば、デキサメサゾン）を添加する方法、および（２）所望の部位に対応する分化細胞とともに培養する方法が挙げられる。【０１２７】
（培養培地中に分化誘導剤を添加することにより、幹細胞の分化を誘導する方法）
本発明の細胞混合物は、所望の部位に対応する分化細胞への分化を促進する因子をさらに含み得る。この因子は、所望の部位に対応する分化細胞への分化を促進することが知られているかまたは確認されている任意の因子であり得る。好ましい分化誘導剤の例としては、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（例えば、亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。【０１２８】
本発明の細胞混合物については、混合される細胞の維持および所望の部位に対応する分化細胞への分化を維持する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液の例としては、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（例えば、亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどの１つまたはその組み合わせを含ませておいてもよい。【０１２９】
脂肪吸引物由来の幹細胞の脂肪細胞への分化誘導の条件としては、例えば、イソブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン、およびインドメタシンを添加したＤＭＥＭ培地中でその幹細胞を培養することが挙げられるが、これに限定されない。【０１３０】
脂肪吸引物由来の幹細胞の軟骨細胞への分化誘導の条件としては、例えば、インスリン、アスコルベート−２−ホスフェート、およびＴＧＦ−β１を添加したＤＭＥＭ培地中でその幹細胞を培養することが挙げられるが、これに限定されない。【０１３１】
脂肪吸引物由来の幹細胞の骨細胞への分化誘導の条件としては、例えば、デキサメタゾン、アスコルベート−２−ホスフェート、β−グリセロホスフェートを添加したＤＭＥＭ培地中でその幹細胞を培養することが挙げられるが、これに限定されない。【０１３２】
脂肪吸引物由来の幹細胞の筋細胞への分化誘導の条件としては、例えば、１０％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）と５％のウマ血清（ＨＳ）とを含むＤＭＥＭ培地に、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾンを添加した培地中でその幹細胞を培養することが挙げられるが、これに限定されない。【０１３３】
（幹細胞と、所望の部位に対応する分化細胞とを、同時に培養することによる分化誘導）
この幹細胞と所望の部位に対応する分化細胞との同時培養により、所望の性質を、好ましくは均質に含有する分化細胞を一定量以上で提供することができる。この方法は、Ａ）ａ）脂肪由来前駆細胞と、ｂ）所望の部位に対応する分化細胞とを混合して混合物を得る工程；およびＢ）この脂肪由来前駆細胞の分化が生じるに十分な条件で、この混合物を培養する工程、を包含する。【０１３４】
所望の部位に対応する分化細胞もまた、当該分野において周知の技法を用いて調製することができる。あるいは、そのような分化細胞は、市販の細胞株（例えば、ＡＴＣＣなどから分譲される細胞株など）を用いることができる。分化細胞は、移植を目的とする被検体から初代培養された細胞（例えば、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞など）を用いてもよい。そのような初代培養および細胞株の培養方法は、当該分野において周知であり、例えば、ＡＭＢＯマニュアル  細胞研究法［ＡＭＢＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄ］、畠中  寛・淺野  朗  共編、ＴａＫａＲａ；バイオ実験イラストレイテッド（６）すくすく育て細胞培養［Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ−Ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗ  ｑｕｉｃｋｌｙ］、渡邊利雄編、秀潤社（１９９６）などに記載されており、本明細書においてその内容が援用される。【０１３５】
本発明において、分化細胞としては、所望の部位に対応するものであれば、どのような細胞を用いてもよいが、好ましくは、間葉系細胞が用いられ、そのような間葉系細胞としては、例えば脂肪細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、膵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような分化細胞は、同定された細胞であってもよいが、その細胞の性質が未知であったとしても、例えばＦＡＣＳのような分別技術を用いて所望の部位に対応する細胞を調製するために使用され得る。【０１３６】
所望の部位に対応する細胞の決定に有用なマーカーの例としては、（１）脂肪：細胞質内におけるトリグリセリドの存在、ＯｉｌＲｅｄ−Ｏ染色、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ＝ＧＰＤＨ）活性、細胞質内のＧＬＵＴ４  、Ａｐ２（脂肪酸結合タンパク質）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＰＰＡＲγ１，２（ペルオキシソーム増殖活性化レセプターγ１，２）、およびレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）の発現；（２）骨細胞、骨組織：アルカリホスファターゼの存在、骨石灰化（カルシウムの沈着）の程度を確認する；オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオネクチン（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）の発現；（３）軟骨細胞、軟骨組織：ムコ多糖の存在、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン−４−サルフェート（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ−４−ｓｕｌｆａｔｅ）の発現／存在；（４）骨格筋細胞：細胞質内のミオシンの豊富な存在などが挙げられるが、これらに限定されない。ＦＡＣＳの使用方法は、フローサイトメトリー自由自在［Ｍａｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ］  細胞工学別冊（秀潤社）、中内編、１９９９などに記載されており、本明細書においてその内容を参考として援用する。【０１３７】
本発明の細胞混合物には、所望の部位に対応する分化細胞への分化を促進する因子がさらに含有され得る。そのような因子は、所望の分化細胞への分化を促進することが知られているかまたは確認された任意の因子であり得る。好ましい分化促進因子としては、例えば、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、αＦＧＦ・βＦＧＦ・ＥＧＦ・ＩＧＦ・ＴＧＦ−β・ＥＣＧＦ・ＢＭＰ・ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３８】
本発明の細胞混合物については、混合される細胞の維持および所望の部位に対応する分化細胞への分化を維持する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液の例としては、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせを含ませておいてもよい。【０１３９】
従って、別の局面において、本発明は、脂肪吸引物由来の幹細胞と、所望の部位に対応する分化細胞とを含む、細胞混合物を提供する。このような混合物は、細胞移植に有用であり、従来の細胞単独を用いた移植に比べて、各々の成分が少なくてすむという利点もある。さらに、従来技術と比べて有利な点としては、例えば、（１）組織外で再生組織を作る必要がない；（２）より確実に、より大きな組織の再生が可能である；（３）簡便かつ短時間の処理により実現が可能である；（４）皮膚など臓器を切開する手術を必要とせず、針を用いるだけで細胞および／または組織を投与（移植）することが可能であることが挙げられるが、これらに限定されない。【０１４０】
本発明の細胞混合物は、好ましくは脂肪の幹細胞の分化が生じるに十分な条件に供された後のものであるが、本発明はそれに限定されない。分化条件に供された後の細胞混合物は、そのまま移植に使用されても、組織または器官に分化させてもよい。【０１４１】
（細胞移植組成物）
別の局面において、本発明は、細胞移植のための組成物（例えば、組織片、および移植片、ならびにこれらを含む組成物）を提供する。この移植は、所望の部位に対応する分化細胞の欠損または劣化などに伴う疾患、障害または異常状態を処置または予防するため、あるいは美容状態を処置または改善するためであれば、任意の目的で使用することができる。このような移植の場合、好ましくは、移植は、所望の部位に移植されるがそれに限定されず、最終的に所望の部位の処置または予防が可能なのであれば、本発明の細胞含有組成物は、任意の部位に投与または移植することができる。【０１４２】
脂肪吸引物由来の幹細胞と、分化細胞との混合比率は、所望の分化が生じる限り、どのような比率でもよいが、通常、約１：１０〜約１０：１であり、好ましくは、約１：５〜約５：１であり、より好ましくは、約１：２〜約２：１であり、最も好ましくはほぼ等量で含有される。この細胞組成物において、移植のために使用される分化細胞および脂肪吸引物由来の幹細胞は、本明細書において、「分化細胞を調製するための方法」において説明したような任意の形態または態様をとり得る。【０１４３】
この分化細胞および脂肪由来前駆細胞は、移植されるべき宿主に対して、それぞれ異種、同種異系または同系である。好ましくは、同種異系または同系であり、より好ましくは同系であるが、本発明はそれに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、同系であれば、免疫拒絶反応が抑制できるからである。しかし、拒絶反応が予測される場合は、本発明は、拒絶反応を回避する工程をさらに包含し得る。拒絶反応を回避する手順は、当該分野において公知である（例えば、新外科学体系、第１２巻、臓器移植（心臓移植・肺移植、技術的・倫理的整備から実施に向けて［Ｎｅｗ  Ｗｈｏｌｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．１２，Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｈｅａｒｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ・Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｆｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｏｒａｃｔｉｃｅ）］（改訂第３版）、中山書店などを参照のこと）。そのような方法の例としては、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられるが、これらに限定されない。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）；「タクロリムス」（プログラフ）；「アザチオプリン」（イムラン）；「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）；「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）がある。予防的免疫抑制療法として世界中で行われている方法は、シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモンの３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の薬剤と同時期に投与されることが望ましいが、本発明はこれに限定されない。免疫抑制効果が達成される限り、免疫抑制剤は本発明の再生法／治療法の前または後にも投与され得る。【０１４４】
上記分化細胞および脂肪由来前駆細胞は、それぞれ異種、同種異系または同系であり、好ましくは、同種異系または同系であり、より好ましくは同系である。理論に束縛されることは望まないが、同種異系または同系（好ましくは同系）の方が、分化細胞と脂肪吸引物由来の幹細胞とが均一の細胞集団と形成しやすいからである。【０１４５】
上記の細胞混合物または組成物は、医薬として提供され得る。このような医薬は、所望の部位に対応する分化細胞の欠損または劣化に関連する疾患、障害または異常状態を処置または予防するため、あるいは美容状態を処置または改善するために使用され得る。本発明の医薬には、細胞混合物またはそれを含む組成物のほか、薬学的に受容可能なキャリアが含まれていてもよい。そのようなキャリアとしては、本明細書において記載される任意のキャリアが選択され得、その用途に応じて当業者により使用され得る。当業者は、本発明に含ませるべき成分を改変することができる。【０１４６】
（細胞混合を用いた治療および予防法）
別の局面において、本発明は、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法、および美容状態を処置または改善するための方法を提供する。これらの方法は、Ａ）ａ）脂肪由来前駆細胞；およびｂ）所望の部位に対応する分化細胞、を含む組成物を提供する工程、ならびにＢ）被検体にその組成物を投与する工程、を包含する。この方法において、移植に使用される分化細胞および脂肪吸引物由来の幹細胞は、本明細書において、「分化細胞を調製するための方法」において説明したような任意の形態および態様をとり得る。【０１４７】
本発明の技術分野において公知な投与方法を含む任意の投与方法が、使用され得る。例えば、上記組成物は、シリンジ、カテーテル、チューブなどを用いて注入されるが、これらに限定されない。好ましくは、投与経路の例としては、局所注入（皮下注入、筋肉や脂肪など臓器内注入）、静脈内注入、動脈内注入、組織上投与などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの移植による処置方法または予防方法は、例えば、以下の従来技術と比べて有利な点を有するが、これらに限定されない：（１）組織外で再生組織を作る（エキソビボ産生）必要がない；（２）より確実に、より大きな組織の再生が可能である；（３）簡便かつ短時間の処理により実現が可能である；（４）皮膚など臓器を切開する手術を必要とせず、針を刺すことによって細胞および組織を投与（移植）することが可能である、など。【０１４８】
（使用）
別の局面において、本発明は、ａ）脂肪由来前駆細胞と、ｂ）所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するため、あるいは美容状態を処置または改善するための医薬の調製のための使用を提供する。移植のための細胞混合物において用いられる分化細胞および脂肪由来前駆細胞は、本明細書において、「分化細胞を調製するための方法」において説明したような任意の形態をとり得る。【０１４９】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【０１５０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０１５１】
以下に、実施例に基づいてより具体的に本発明を説明する。以下に説明される実施例は、例示目的のみのために提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明によっても下記実施例によっても限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬またはＳｉｇｍａから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより作成された「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ   ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｎｏ．  ８６−２３，  １９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、事前に同意を得た上で実験を行った。【０１５３】
（実施例１：幹細胞の調製および同定）
１．材料および方法
（ヒト組織のサンプリング）
本発明者らは、ＩＲＢ推奨のプロトコルを用いたインフォームドコンセントの後に、腹部および大腿部の脂肪吸引術を受けている２１歳から５９歳までの健常女性のドナーからの脂肪吸引物（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ）を得た。脂肪吸引物は２つの部分、すなわち、浮遊脂肪部分（吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）とも呼ばれる）および残りの液体部分に分けられた（図１ａを参照）。いずれの部分も、それぞれ、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のための細胞供給源として使用した。【０１５４】
（細胞の単離）
全ての化学薬品を、特に断らない限り、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから購入した。【０１５５】
ＰＬＡ細胞を、脂肪吸引物の脂肪部分から、Ｚｕｋおよびその共同研究者（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕ  Ｅｎｇ  ７：２１１−２８；２００１）の方法を改変した手順を使用して分離した。簡単に説明すると、吸引した脂肪を、シェーカー上で０．０７５％コラゲナーゼを含有するＰＢＳ中、３７℃で３０分間消化した。成熟脂肪細胞および結合組織を遠心分離（８００ｇ、１０分間）によってペレットから分離した。ペレットを、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中にて、５分間室温で再懸濁した。そのペレットを再懸濁し、１００μｍのメッシュ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濾過した。【０１５６】
ＬＡＦ細胞を、脂肪吸引物の液体部分から取った。その吸引液を、遠心分離し（４００ｇ、１０分間）、そして得られたペレットを、赤血球溶解緩衝液中で、５分間室温で再懸濁した後、１００μｍのメッシュで濾過した。【０１５７】
次いで、それらのペレットを密度勾配遠心分離のために、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で処理した。遠心分離（８００ｇ、２０分間）の後、勾配界面にある細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして１００μｍメッシュで濾過した。新たに単離したＬＡＦ細胞のフローサイトメトリー用には、密度勾配遠心分離を行わなかった。有核細胞数を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて計数した。【０１５８】
（接着細胞の細胞培養）
新たに単離したＰＬＡ細胞またはＬＡＦ細胞を、５×１０６有核細胞／１００ｍｍゼラチン被覆ディッシュの密度で培地にプレートし、３７℃で湿潤大気中５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。その培養培地は、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ  ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌ  ヘパリン、２ｎｇ／ｍｌ  酸性ＦＧＦを含有するＭ−１９９であった。倍加時間の測定のためだけに、１５％ＦＢＳを含有する異なる血清濃度を有する同じ培地もまた使用した。初代細胞を、それらがコンフルエンスに達するまで７日間培養し、そして「継代０」と規定した。培地を２日おきに取り替え、細胞を毎週継代した。７日間の初代培養の後、付着した細胞をトリプシン処理によって継代し、同じ培地中に２，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレートした。倍加時間を、播種の３日後および５日後の接着細胞数を用いて計算した。【０１５９】
（培養したＰＬＡ細胞またはＬＡＦ細胞の分化の誘導）
脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の系統に沿って分化をする能力を、試験した。ＰＬＡ細胞またはＬＡＦ細胞を継代３〜５で播種してから７日後、細胞分化を培養培地を交換することによって開始した。１０％ＦＢＳを含有するコントロール培地（１００ＩＵのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に維持した細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。脂肪生成の分化のために、コンフルエントな培養物を、０．５ｍＭ  イソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、１μＭ  デキサメタゾン、１０μＭ  インスリン（Ｓｉｇｍａ）、および２００μＭ  インドメタシンを補充した１０％ＦＢＳを含有するコントロール培地とともに、４週間インキュベートした。固定した細胞（４％  パラフォルムアルデヒドで１０分間）を、６０％  イソプロパノール中で洗浄し、引き続いて、１５分間Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏとともにインキュベートし、脂質の液滴を可視化した。次いで、細胞をイソプロパノールで洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色した。軟骨形成の分化のために、コンフルエントな培養物を、６．２５μｇ／ｍｌ  インシュリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、および５０ｎＭ  アスコルビン酸−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を補充した１％ＦＢＳを含有するコントロール培地とともに、４週間インキュベートした。固定した細胞（４％パラフォルムアルデヒドで１０分間）を、３％酢酸で洗浄し、引き続いて、１％  Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ８  ＧＸ（Ｓｉｇｍａ）、３％酢酸とともに３０分間インキュベートし、細胞外マトリックスを可視化した。次いで、細胞を３％酢酸で洗浄し、そして０．１％  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、５％  Ａｌ２（ＳＯ４）３溶液で対比染色した。骨形成の分化のために、細胞を、０．１μＭ  デキサメタゾン、５０μＭ  アスコルビン酸−２−ホスフェート、および１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を補充した１０％ＦＢＳを含有するコントロール培地中で、４週間インキュベートした。固定した細胞（４％パラフォルムアルデヒドで１０分間）を洗浄し、暗所で２．５％硝酸銀とともに２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１５分間照明下に置き、２分間０．５％ヒドロキノンとともにインキュベートし、そして２分間５％チオ硫酸ナトリウムとともにインキュベートして、石灰化した沈着物を可視化した。次いで、細胞を洗浄し、０．１％  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、５％  Ａｌ２（ＳＯ４）３溶液で対比染色した。【０１６０】
軟骨形成の分化に関して、コロニー形成ユニット分析もまた、細胞内脂質を用いてコロニーを定量化するために行った。１５０個の細胞を、１００ｍｍの培養皿にプレートし、１０〜１４日間培養し、続いて、２週間、軟骨形成の培地とともにインキュベートし、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏで上記のように染色した。染色に関して陽性または陰性のコロニーの数を、顕微鏡下で計数した。【０１６１】
（フローサイトメトリーおよび選別）
新たに単離したＰＬＡ細胞またはＬＡＦ細胞を、表面分子または細胞内分子の発現について、フローサイトメトリーを使用して試験した。培養したＰＬＡ細胞またはＬＡＦ細胞もまた、１、２、４、６、８、１０、または２０週目で試験した。蛍光色素と結合させた下記のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を使用した：抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１０−ＰＥ、ＣＤ１３−ＰＥ、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３６−ＰＥ、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ４９ｄ−ＰＥ、ＣＤ４９ｅ−ＰＥ、ＣＤ５４−ＰＥ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ５７−ＦＩＴＣ、ＣＤ６２Ｅ−ＰＥ、ＣＤ６２Ｐ−ＰＥ、ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ９０−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７−ＰＥ、ＣＤ１３５−ＰＥ、ＣＤ１４４−ＰＥ、ＣＤ−１５１−ＰＥ、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥ、Ｔｉｅ−２−ＰＥ、（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ５９−ＰＥ（Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ７１−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＰＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、ＣＤ１３３−ＰＥ、Ｆｌｋ−１−ＰＥ（Ｔｅｃｈｎｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）。無関係のコントロールＭＡｂｓを、全ての蛍光色素に対してインキュベートした。細胞を、直接結合体化させたＭＡｂｓで３０分間コーティングし、洗浄し、そして１％パラフォルムアルデヒド中で固定した。細胞を、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。次いで、データ収集および分析を行った（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。無関係の抗体を使用して陽性である細胞が０．１％を越えないように、関連するＭＡｂｓおよび無関係のＭＡｂｓの組み合わせを用いた染色に基づいて、ゲートを設定した。細胞の選別およびその後の分析を、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行った。【０１６２】
（統計学的分析）
結果を、平均値±ＳＥＭとして表した。Ｗｅｌｃｈのｔ−テストを使用して、各パラメーターを比較した。【０１６３】
２．脂肪吸引物の脂肪部分および液体部分由来の間質細胞の単離および細胞拡大
脂肪吸引物の脂肪部分と比較して、液体部分は、脂肪吸引術の際に吸引部位から放出された末梢血をより多量に含んでおり、その容量は、患者間で変動していた（図１ａ）。脂肪部分をコラゲナーゼ消化に供した後、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）断片および切片を除去するためにフィルターにかけた。一方、液体部分を遠心分離し、混入している赤血球を溶解するために処理した。培養皿にプレートした後、培養培地を交換することによって非接着細胞を捨てた。接着ＰＬＡおよび接着ＬＡＦ細胞の両方が、線維芽細胞様の形態を示し、類似の倍加時間で増殖することが見出されたが、より少数の接着細胞が、ＰＬＡ細胞よりもＬＡＦ細胞から回収された（図１ｂ）。【０１６４】
新たに単離されたＰＬＡ細胞（ｎ＝２８）およびＬＡＦ細胞（ｎ＝２８）の正規化された数を計数し、それらはサンプル（脂肪吸引物）（１リットルの脂肪部分を含む）当たり、それぞれ１．３１±０．５０×１０９（平均±Ｓ．Ｅ．）および１．５５±０．７９×１０９（Ｐ＝０．４０１）であったが（図１ｃ）、細胞数は、患者間でかなり変動していた。細胞収量は、単離された細胞数を、処理された脂肪吸引物に含まれる脂肪部分の容量（リットル）で割り算することによって正規化した。赤血球の混入は、新たに単離されたＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の両方において見られたが、ＬＡＦ細胞は、赤血球溶解緩衝液または密度勾配遠心分離で処理した後でさえ、明らかに末梢血に由来する細胞をより多く含んでいた。細胞培養の１週間後、接着ＰＬＡ細胞（ｎ＝２８）および接着ＬＡＦ細胞（ｎ＝２８）の正規化した数は、それぞれ、９．７±１．７×１０７および３．０±０．６×１０７（Ｐ＜０．００１）であった（図１ｄ）。したがって、細胞収量においては、新たに単離されたＰＬＡ細胞とＬＡＦ細胞との間に有意な差違はなかったが、１週間培養された接着ＰＬＡ細胞と接着ＬＡＦ細胞との間には、有意な差違が存在した。【０１６５】
ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞を、１０％（各々、ｎ＝１４）または１５％のＦＢＳ（各々、ｎ＝１５）を含有する培養培地において培養し、継代０の細胞を使用して倍加時間を測定した。ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の倍加時間は、１５％ＦＢＳと共に培養した場合に２８．５±１．７時間および３１．０±２．６時間、１０％ＦＢＳと共に培養した場合に、４３．３±２．８時間および４０．２±３．０時間であった。統計学的な有意性は、ＰＬＡ細胞（ｐ＜０．００１）およびＬＡＦ細胞（ｐ＜０．０５）の両方において、２つの血清濃度間で見出されたが、いずれの血清濃度においてもＰＬＡ細胞とＬＡＦ細胞との間には見出されなかった（図１ｅ）。【０１６６】
３．ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のインビトロでの分化
ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の多分化能を比較するために、細胞分化を、継代３〜５の細胞を用いて、その細胞を４週間、脂肪生成、軟骨形成、または骨形成のための培地で培養することによって誘導した。結果は、両方の細胞集団が、脂肪生成（図２ａ）、軟骨形成（図２ｂ）、および骨形成（図２ｃ）の系統に沿って類似の分化能を有することを示した。コロニー形成ユニット分析により、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏに対して陽性の染色を示す細胞の割合（％）が、ＰＬＡ細胞の２９．０±７．６％、およびＬＡＦ細胞の２４．１±４．３％であることが示された（Ｐ＝０．１２）（図２ｄ）。【０１６７】
４．新たに単離されたかまたは培養されたＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞のフローサイトメトリーによる分析
フローサイトメトリー分析により、新たに単離したＬＡＦ細胞が、細胞表面マーカーの発現において、新たに単離したＰＬＡ細胞とは有意に異なることが明らかになった。新たなＰＬＡ細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ３４、およびＣＤ９０発現に関して陽性の細胞をより高い割合で含有し、造血性起源のＣＤ４５＋細胞はわずかにしか含有しない。一方、新たなＬＡＦ細胞においては、ＣＤ３１＋細胞およびＣＤ４５＋細胞がより高い割合で存在し、このことは、新たなＬＡＦ細胞が、新たなＰＬＡ細胞よりも、末梢血由来の血管内皮細胞および細胞集団を多数含有することを示唆する。新たなＬＡＦ細胞の前方および測方散乱特性（ＦＳＣおよびＳＳＣ）によってプロットしたＦＡＣＳ図において、顆粒球、単球、およびリンパ球に対応する３つのＣＤ４５＋細胞クラスターが存在する（図３ａ）。ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ４５−細胞は、単球に対応するクラスター上に位置する（図３ａ）。【０１６８】
ＬＡＦ細胞に含まれている接着間質細胞の起源をさらに調べるために、ＣＤ３４およびＣＤ４５についての二重色分析を行った。それにより、ＣＤ３４＋細胞のほとんどは、ＣＤ４５−であることが明らかになった。これは、ＣＤ３４＋細胞の大部分が、末梢血由来ではなく、脂肪組織由来であることを示唆する（図３ｂ）。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞は、培養皿上で増殖したが、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞は増殖しなかった。これは、新たに単離したＬＡＦ細胞が、脂肪組織由来の接着間質細胞を含有することを示唆する（図３ｂ）。【０１６９】
図４は、新たに単離したかまたは培養したＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の代表的なＦＡＣＳデータを示す。５人の患者からのサンプルを用いた。示されるように、新たに単離したＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞は、細胞表面マーカーの明確に区別されるプロフィールを示した。これに対して、２週間培養したＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞は、極めて類似した発現プロフィールを示した。これらの差違は、新たに単離したＬＡＦ細胞が、末梢血由来の細胞を大きな割合で含んでいるという事実から生じると考えられる。【０１７０】
図５は、細胞表面マーカーの発現の連続的な変化を示す。プレートした後、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の両方の表面マーカー発現プロフィールが著しく変化し、２つの細胞集団の接着細胞が、極めて類似した発現プロフィールを示した。ＣＤ３４＋細胞は、ＰＬＡ細胞において割合が増大し、ＣＤ１３，ＣＤ２９（β１インテグリン）、ＣＤ４４、ＣＤ７３、およびＣＤ９０（Ｙｈｙ−１）のような間葉マーカーを均一に発現した。ＣＤ１０、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、およびＣＤ１５１もまた、１週間よりも長く培養されたＰＬＡ細胞において均一に発現された。新たに単離したＰＬＡまたはＬＡＦ細胞の１週間培養物では、それぞれ、間葉系幹細胞関連マーカーの１つであるＣＤ１０５（エンドグリン（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ））の、１．２±０．６から６４．１±９．７へ（Ｐ＜０．００１）、または１．４±０．７から７４．６±７．６へ（ｐ＜０．００１）の劇的な変化が生じた（図５）。ＣＤ１０５発現の統計学的な有意性は、接着ＰＬＡ細胞と接着ＬＡｆ細胞との間には観察されなかった。ＣＤ４５、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、およびＣＤ１３３／ＡＣ１３３（幹細胞関連マーカーの１つ）は、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞において有意に割合が減少した。いずれの細胞集団も、１週目においてＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｅ（Ｅセレクチン）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐセレクチン）、ＣＤ６９、ＣＤ１３５、ＣＤ１４４（ＶＥカドヘリン）について、２週目を過ぎた培養後においてＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ５７、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１３３、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２について、陰性であった。【０１７１】
培養時間の経過とともに、ＣＤ３４発現は減少したが、１０〜２０％の細胞は、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞における１０週間の培養後においてさえ、ＣＤ３４発現を維持していた（図５）。ＣＤ３４＋細胞を選別し、同じ培養プロトコルで培養したが、細胞の約半分が、培養２週間後にＣＤ３４に対して陰性であることが見出された（図３ｂ）。これは、ＣＤ３４＋細胞の中には、培養によってＣＤ３４発現を失ったものと、ＣＤ３４発現を失わずに増殖したものがあることを示唆する。接着ＰＬＡ細胞および接着ＬＡＦ細胞におけるＣＤ３４発現は、それぞれ、２０週（継代１９）および１０週（継代９）まで確認した。さらに、間葉マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、およびＣＤ９０）ならびに他のマーカー（ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ１０５、およびＣＤ１５１）の発現の維持が、接着ＰＬＡ細胞および接着ＬＡＦ細胞において、それぞれ２０週および１０週まで観察された。表面マーカー発現における顕著な変化は、接着ＰＬＡ細胞と接着ＬＡＦ細胞との間で、最初の２週間の後の培養期間を通じて観察されなかった。これらをまとめると、接着ＰＬＡ細胞および接着ＬＡＦ細胞は、本発明の培養方法によって、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関連する表面マーカーを失うことなく、拡大され得ることが示唆される。これらの事実は、接着ＰＬＡ細胞および接着ＬＡＦ細胞が、極めて類似した表面マーカー発現プロフィールを最初の１〜２週間の後の培養期間を通じて有することを明らかにし、両方の細胞集団がＡＳＣと呼ばれ得ることを示唆する。したがって、ＡＳＣは、脂肪吸引物の脂肪部分からだけではなく、液体部分からも単離され得ることが強く示された。【０１７２】
（実施例２：長期培養の効果の確認実験）
上記実施例に準じて幹細胞の単離を行い、２０週間ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞の長期培養による影響を調べた。図６および図７は２０週間までの、それぞれＣＤ３４陽性細胞比率およびＣＤ１０５陽性細胞比率を示すグラフを示す。示されるように、予想外にも、ＣＤ３４陽性細胞が１０−２０％程度２０週間経っても維持されていることが確認された。ＣＤ１０５陽性細胞については、５０％程度維持されていることが判明した。ＣＤ３４は一般的にはＤＭＥＭで培養され、１〜２週間でＣＤ３４は完全にネガティブになることが多く報告されている（Mizuno, J Nippon Med Sch 2003; 70（5）428-431)）。また、最初からＣＤ３４（−）と報告している論文も存在する（Mizuno,J Nippon Med Sch 2003; 70（5）428-431)）。したがって、この細胞は、長期培養後でも未分化性を保っていると結論付けた。【０１７３】
したがって、本発明において、ＣＤ３４の挙動に関して、従来知られていた間葉系幹細胞とは異なる特徴を有することが明らかとなった。【０１７４】
（実施例３：コンフルエントに近い条件での増殖のアッセイ）
本実施例において、実施例１および２で調製した細胞を分化誘導条件に曝すと、種々の分化細胞への分化誘導を生じることを示す。【０１７５】
使用されたプロトコールは、以下の通りである：
１）骨への分化
収集された細胞を、ＤＭＥＭ培地において１．８×１０７細胞／皿の濃度にて、６０ｍｍ皿上で培養する。１０日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地（組成：骨生成性培地の例は、１０％  ＦＢＳおよび５％馬血清を含むＤＭＥＭに、１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルベート−２−ホスフェート、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、および１％  ＡＢＡＭを添加する培地であり得る）とを交換し、２２日間培養する。この細胞を、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を用いて観察する。【０１７６】
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色：
培養培地を捨て、目的のサンプルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。この洗浄するサンプルを、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定する。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、暗所で２０分間、２．５％硝酸銀と接触させる。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、蛍光灯の下に１５分間放置する。このサンプルを、０．５％ヒドロキノンと２分間インキュベーションし、続いて５％チオ硫酸ナトリウムと２分間インキュベーションする。次いで、このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、ヌクレアファーストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｒｅｄ）で２分間染色する。次いで、このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、マウントクイック（大道産業、日本）と共にマウントし、顕微鏡で観察する。【０１７７】
２）軟骨への分化
収集された細胞を、ＤＭＥＭ培地において１．８×１０７細胞／皿の濃度にて、６０ｍｍ皿上で培養する。１０日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地（組成：軟骨生成性培地の例は、１％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭに、６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、５０ｎＭアスコルベート−２−ホスフェート、および１％  ＡＢＡＭを添加する培地であり得る）とを交換し、２２日間培養した。この細胞を、アルシアンブルー染色を用いて観察する。【０１７８】
アルシアンブルー染色：
目的のサンプルから培地を捨てる。このサンプルを、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定する。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、３％アセテートで３分間洗浄する。このサンプルを、アルシアンブルー染色溶液（組成：脂肪生成培地の例は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、１０μＭインスリン、２００μＭインドメタシン、および１％ＡＭＡＭを添加した培地であり得る）に、３０分間浸す。このサンプルを、３％アセテートで３分間洗浄する。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、ヌクレアファーストレッドで２分間染色する。次いで、このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。次いで、このサンプルを、マウントクイック（大道産業、日本）と共にマウントし、顕微鏡で観察する。【０１７９】
３）脂肪への分化
収集された細胞を、ＤＭＥＭ培地において１．８×１０７細胞／皿の濃度にて、６０ｍｍ皿上で培養した。１０日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地（組成：脂肪生成培地の例は、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭに、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、１０μＭインスリン、２００μＭインドメタシン、および１％  ＡＭＡＭを添加した培地であり得る）とを交換し、１２日間培養する。この細胞を、オイルレッドＯ染色を用いて観察する。【０１８０】
オイルレッドＯ染色：
培養培地を捨て、目的のサンプルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。この洗浄したサンプルを、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定する。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、６０％イソプロピルアルコールに１分間浸す。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、ヘマトキシリンに１０分間浸す。このサンプルを、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。次いで、このサンプルを、炭酸リチウムに数秒間浸し、次いでｍｉｌｌｉＱ水で洗浄する。このサンプルを、マウントクイック（大道産業、日本）と共にマウントし、顕微鏡で観察する。【０１８１】
１）オイルレッドＯ染色溶液を、以下のように調製する：
オイルレッドＯ  ０．３ｇを、１００ｍｌの９９％イソプロピルアルコールに溶解する。使用に際して、この溶液を６：４の割合でｍｉｌｌｉＱ水と混合し、そのまま３０分間攪拌する。この混合溶液を、使用前に濾過する。【０１８２】
２）炭酸リチウム溶液
３ｍｌの炭酸リチウム飽和溶液（１００ｍｌ当たり１．５４ｇの炭酸リチウム）を、１００ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に加える。【０１８３】
このような実験を通じて、実施例１または実施例２において調製された幹細胞は、良質な多能性を示すことが理解される。【０１８４】
（実施例４：分化培地での分化）
本実施例において、分化培地を使用する場合、種々の分化細胞への分化を誘導することを示す。【０１８５】
使用されたプロトコールは、以下の通りである：
１）骨への分化
収集された細胞を、分化誘導培地（組成：骨生成性培地の例は、１０％  ＦＢＳおよび５％ウマ血清を含むＤＭＥＭに、１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルベート−２−ホスフェート、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、および１％  ＡＢＡＭを添加した培地であり得る）において１．８×１０７細胞／皿の濃度にて、６０ｍｍ皿上に播種する。２２日間培養後、このサンプルをｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で評価した。ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は、上記実施例で説明したように行う。
２）脂肪への分化
収集された細胞を、分化誘導培地（組成：脂肪生成培地の例は、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭに、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、１０μＭインスリン、２００μＭインドメタシン、および１％  ＡＭＡＭを添加した培地であり得る）において１．８×１０７細胞／皿の濃度にて、６０ｍｍ皿上に播種する。２５日間培養後、このサンプルを、オイルレッドＯ染色を用いて評価する。オイルレッドＯ染色は、上記実施例１７で説明したように行う。【０１８６】
以上の実験を通じて、実施例１または実施例２において調製された幹細胞は、コンフルエントに近い状態への培養なしで分化誘導培地を用いて、良質な多能性を示すことが理解される。【０１８７】
特定の好ましい実施形態が本明細書中で説明されたが、添付の特許請求の範囲以外に、このような実施形態が本発明の範囲を制限すると解釈されることを意図しない。本明細書中で引用された全ての特許、公開特許出願および刊行物は、あたかも本明細書中にその全体が示されたかのように、参考として援用される。本発明の範囲および精神を逸脱せずに、種々の改変が当業者に明らかであり、そして当業者により容易になされ得る。従って、本明細書に添付の特許請求の範囲は、本明細書の記載により制限されることを意図されず、むしろ特許請求の範囲は広く解釈されることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明は、臨床的に有用な性質を維持したＡＳＣを大量に供給し得ることから、医療分野（特に、脂肪再生、骨再生、心筋再生、血管新生、難治性潰瘍など）等への適用に有用である。本発明は、簡便な方法で取得できる脂肪吸引物由来の幹細胞が、再生医療に応用できることを証明した。従って、当業者は、医薬品業界などにおける本発明の産業上の利用可能性を容易に見出す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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