(57)【要約】高度に分岐したグルカンを製造する方法、およびそのような方法に使用する組成物を提供することを課題とする。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のブランチングエンザイムまたはそのホモログを、アミロペクチンまたはアミロースに作用させることによって、上記課題が解決された。
2007088676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロースに作用させてアミロース中の糖を転移させる工程を包含し、
ここで、該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上であり、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中のα−１，６結合の数が全結合の数の１０％以上である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって製造された、グルカン。
【請求項６】
グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；
（ａ）請求項１に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程；および
（ｂ）工程（ａ）において製造されたグルカンに枝切り酵素を作用させる工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
グルカンであって、該グルカンは、
重量平均分子量が１７０万以上であり、
該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上である、
グルカン。
【請求項８】
請求項７に記載のグルカンであって、ここで
重量平均分子量が２００万以上である、
グルカン。
【請求項９】
請求項７に記載のグルカンであって、ここで
重量平均分子量が５００万以上である、
グルカン。
【請求項１０】
請求項７に記載のグルカンであって、ここで
前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、グルカン。
【請求項１１】
請求項７に記載のグルカンであって、ここで
前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の２０％以上である、グルカン。
【請求項１２】
グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロペクチンに作用させてアミロペクチン中の糖を転移させる工程を包含し、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカンが、２００万以上の重量平均分子量を有する、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカンの重量平均分子量が、アミロペクチンの重量平均分子量の９０％以上である、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上である、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法によって製造された、グルカン。
【請求項１９】
グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；
（ａ）請求項１２に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程；および
（ｂ）工程（ａ）において製造されたグルカンに枝切り酵素を作用させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
グルカンを製造するための組成物であって、該組成物は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログを含み、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。
【請求項２２】
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分岐かつ高分子量のα−グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−グルカンは、α−Ｄ−グルコースの重合体である。α−グルカンは、自然界に種々の形態で存在する。α−グルカンの中でも、グリコーゲンおよびアミロペクチンが代表的である。グリコーゲンとアミロペクチンは、α−１，４結合とα−１，６結合を有するグルコースの重合体であるが、分子内のこれら結合の存在割合などのために、グリコーゲンとアミロペクチンとの構造的特性および物理的特性は互いに大きく異なる。【０００３】
例えば、α−グルカンにα−１，６結合を増やすと、粘度、溶解度、生体での消化・吸収の速度などの物性が変化することが公知である。従って、所望の構造を有するα−グルカンを得るためには、種々の酵素反応を触媒する酵素が必要となる。【０００４】
一般に、α−グルカンの分岐を増やすと、水溶性溶媒への溶解度と溶液安定性が増加する。また、α−グルカンを高分子化すると、粘性が高くなると考えられる。従って、例えば、溶液安定性に優れ、かつ高い粘性を有するα−グルカンを得るためには、高分岐かつ高分子量のα−グルカンを製造することが、必要であると考えられる。さらに、高分岐かつ高分子量のα−グルカンを製造した後に、イソアミラーゼを作用させると、枝部分のグルコースが切断されるので、高分岐かつ高分子量のα−グルカンの製造が容易になれば、グルコースオリゴマーの製造が容易にできるという産業上の利点もある。【０００５】
短い分岐鎖を有する分岐グルカンを製造する方法としては、例えば、カキなどの天然の供給源から単離する方法（非特許文献１）、および、従来公知のブランチングエンザイムを用いて比較的長い分岐鎖を有する分岐グルカンを調製した後にβアミラーゼで処理し、その比較的長い分岐鎖を切断する方法（非特許文献２）が公知である。しかし、天然の供給源より単離することは、量的な制限および費用の点で工業的利用には適さない。また、２段階の酵素反応を行うことは、１段階の酵素反応に比べて、費用・時間等の点で劣る。そのため、１段階の酵素反応で、短い分岐鎖を有する分岐グルカンを製造する方法が望まれる。【０００６】
従来公知の方法では、１段階で、高分岐かつ高分子量のα−グルカンを製造することは困難であった。例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の、α−１，６結合を増やすことが公知のブランチングエンザイムを用い、アミロースを基質とした場合には、分岐鎖の鎖長が長いポリマーのみが得られ、多数の短鎖分岐鎖を有する高分岐かつ高分子量のα−グルカンを製造することは、困難であった。一方、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のブランチングエンザイムを、アミロペクチンに作用させると、アミロペクチンが低分子化されるため、高分岐かつ高分子量のα−グルカンを製造することが困難であった。【０００７】
そのため、従来法では、１段階の酵素反応で、所望の性質を有する高分岐かつ高分子量のα−グルカンを含む多種多様なα−グルカンを製造することが、困難であった。【０００８】
また、従来法では、高度に分岐したアミロペクチンを製造することができなかった。例えば、従来公知のブランチングエンザイムをアミロペクチンに作用させると、酵素反応によって低分子化が生じ、その結果、２００万以上の分子量を有し、かつ、分岐が増加したアミロペクチンを生成することができなかった（非特許文献３）。そのため、増加した分岐を有し、溶液安定性に優れ、かつ高い粘性を有するアミロペクチンが求められている。【０００９】
（糖質関連酵素の分類）
天然に存在する糖質（グリコシド）には、構成糖の種類、結合様式、重合度の違いなどにより多種多様な物質が存在している。それに伴って、糖質を基質とする酵素にも、多様な種類が存在する。このような糖質関連酵素の分類法として、近年Ｈｅｎｒｉｓｓａｔらの分類法がよく用いられている（非特許文献４を参照）。彼らの分類法は、まず糖質関連酵素をアミノ酸一次配列を基に４種類（グリコシダーゼおよびトランスグリコシダーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；ポリサッカリドリアーゼ；糖質エステラーゼ）に大別し、それぞれのグループ内のタンパクを、さらに細かくファミリーに分類する。例えばグリコシダーゼおよびトランスグリコシダーゼが属する、糖質加水分解酵素（グリコシドヒドロラーゼ、ＧＨ）のグループは、現在約１００種類のファミリーに分けられている（ＧＨ１〜ＧＨ１０４ファミリー）。【００１０】
（α−アミラーゼファミリー酵素群）
上記の分類法でＧＨ１３ファミリーに分類されるグループには、デンプンおよびグリコーゲンの分解や合成に関与するタンパクで、通常「α−アミラーゼファミリー（非特許文献５）」として知られているタンパク群が属している。α−アミラーゼファミリーは、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）を始め、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；α−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）など、α−１，４グルコシド結合の加水分解反応や転位反応を行う酵素群と、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；ブランチングエンザイム（ＥＣ  ２．４．１．１８）など、α−１，６グルコシド結合の加水分解や転位反応を行う酵素群、およびそれらの全反応を触媒可能なネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）などが属している。【００１１】
栗木らによるネオプルラナーゼを用いた解析から、α−アミラーゼファミリーの酵素群は、構造上の類似性にとどまらず、触媒機構においても共通性が存在することが示されている。これらの結果を踏まえて、現在、α−アミラーゼファミリーは、以下の４つの条件を満たす酵素からなると定義されている。ｉ）α−グルコシド結合に作用する。ｉｉ）α−グルコシド結合を加水分解し、α−アノマーの単糖あるいはオリゴ糖を生成する。もしくは転移反応により新たなα−グルコシド結合を形成する。ｉｉｉ）一次構造上に４つの高度に保存された領域が存在し、全ての触媒部位および重要な基質結合部位が、この領域内に存在する。ｉｖ）触媒部位として、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐ残基を持ち、これらはタカ−アミラーゼＡの、Ａｓｐ−２０６、Ｇｌｕ−２３０、およびＡｓｐ−２９７に相当する。【００１２】
（ＧＨ５７ファミリーに属するα多糖加水分解・糖転移酵素）
近年になって、ある種の超好熱菌がもつα−アミラーゼ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、アミロプルラナーゼ（α−アミラーゼおよびプルラナーゼの両活性をもつ酵素）などについての一次構造解析が行われた結果、これらがＧＨ５７ファミリーに分類されるタンパク群であり、ＧＨ１３ファミリーに属するα−アミラーゼファミリータンパクとは構造的に全く類似性をもたないことが判明した。ＧＨ５７ファミリーに属するタンパク群の一次構造に基づいた系統学的解析の結果（非特許文献６）、ＧＨ５７ファミリーには７つのサブファミリーが存在することが判明した。この内、４種類のサブファミリーについては酵素活性が実験的に判明しているタンパクが存在していおり、それらはα−アミラーゼ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミロプルラナーゼと各々別種の活性を示す酵素であった。他方、残りの３種類のサブファミリーについては、サブファミリー内に酵素活性が実験的に調べられているタンパクは存在していなかった。【００１３】
（ブランチングエンザイム）
ブランチングエンザイム（（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカン：１，４−α−Ｄ−グルカン  ６−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．４．１．１８）（本明細書においては、「ＢＥ」とも記載する）は、αグルカン中のα−１，４グルコシド結合を切断し、α−１，６グルコシド結合へと繋ぎ変える転移反応を触媒する酵素である。ＢＥは、動物、植物、糸状菌類、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒している。現在までに知られているブランチングエンザイムは、全てα−アミラーゼファミリーに属し、ＧＨ１３ファミリーに分類されるタンパクである。
ＧＨ１３ファミリーに分類される馬鈴薯由来ＢＥの触媒作用は、１９７０年代に詳細に調べられており、ＢＥが分子間枝作り反応（図１Ａ）を触媒することが証明されている。また、ＢＥが環状化反応（図１Ｂ）を触媒することは、１９９０年代後半に証明された。この環状化反応の証明により、分子内枝作り反応（図１Ｃ）が触媒されることも、論理的に推定された。すなわち、α−１，４−グルコシド結合を切断して、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移してα−１，６−グルコシド結合を形成する、というミクロな観点から見ると、これら３つの反応は同一であるといえるためである。なお、従来、ＢＥは、グリコシドヒドロラーゼファミリー１３（ＧＨ１３）（α−アミラーゼファミリー）の一員とされ、α−アミラーゼと基本的に同一のメカニズムにより、単一の活性中心においてα−１，４−グルコシド結合の切断および６位ＯＨ基への転移を触媒すると考えられていた。
【非特許文献１】Ｒａｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２２７，１８３−１９４（１９９２）
【非特許文献２】Ｒｙｏｙａｍａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８，２３３２−４０（２００４）
【非特許文献３】Ｋａｗａｂａｔａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，４９，２７３−２７９（２００２）
【非特許文献４】Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６（１９９１）
【非特許文献５】Ｋｕｒｉｋｉ  Ｔ，  Ｉｍａｎａｋａ  Ｔ，  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：５５７−５６５（１９９９）
【非特許文献６】Ｚｏｎａ，Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：２８６３−２８７２，（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
所望の物性および生理学的活性を有するα−グルカンを製造するためには、多種多様なα−グルカンの製造方法の確立が求められる。しかしながら、酵素学的特徴付けをされた上記に記載の従来の酵素では、高度に分岐したα−グルカン、特に短鎖分岐鎖を有する高度に分岐したα−グルカンの調製をすることが困難であった。【００１５】
従って、十分に高度に分岐し、特に短鎖分岐鎖を有するα−グルカンの調製方法の確立、およびその調製のための組成物が求められている。これら方法および組成物によって製造されるα−グルカンを提供することもまた、求められている。【００１６】
従って、これら方法、組成物、ポリペプチド、α−グルカンを提供することが、本願発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（以下「ＴＫ１４３６」ともいう）は、グリコシドヒドロラーゼファミリー５７（ＧＨ５７）に分類されるが、その具体的な機能は、従来未知であった。【００１８】
本発明者らは、予想外に、ＴＫ１４３６にブランチングエンザイム活性があることを見出した。さらに、本発明者らは、予想外に、ＴＫ１４３６を用いることによって、高度に分岐したα−グルカン、特に短鎖分岐鎖を有する高度に分岐したα−グルカンの調製をすることが可能であることを見出して、本発明を完成させた。【００１９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（項目１）  グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロースに作用させてアミロース中の糖を転移させる工程を包含し、
ここで、該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上であり、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
（項目３）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、方法。
（項目４）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中のα−１，６結合の数が全結合の数の１０％以上である、方法。
（項目５）  項目１に記載の方法によって製造された、グルカン。
（項目６）  グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；
（ａ）項目１に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程；および
（ｂ）工程（ａ）において製造されたグルカンに枝切り酵素を作用させる工程、
を包含する、方法。
（項目７）  グルカンであって、該グルカンは、
重量平均分子量が１７０万以上であり、
該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上である、
グルカン。
（項目８）  項目７に記載のグルカンであって、ここで
重量平均分子量が２００万以上である、
グルカン。
（項目９）  項目７に記載のグルカンであって、ここで
重量平均分子量が５００万以上である、
グルカン。
（項目１０）  項目７に記載のグルカンであって、ここで
前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、グルカン。
（項目１１）  項目７に記載のグルカンであって、ここで
前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の２０％以上である、グルカン。
（項目１２）  グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロペクチンに作用させてアミロペクチン中の糖を転移させる工程を包含し、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、方法。
（項目１３）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカンが、２００万以上の重量平均分子量を有する、方法。
（項目１４）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカンの重量平均分子量が、アミロペクチンの重量平均分子量の９０％以上である、方法。
（項目１５）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
（項目１６）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の５％以上である、方法。
（項目１７）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の１０％以上である、方法。
（項目１８）  項目１２に記載の方法によって製造された、グルカン。
（項目１９）  グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；
（ａ）項目１２に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程；および
（ｂ）工程（ａ）において製造されたグルカンに枝切り酵素を作用させる工程、
を包含する、方法。
（項目２０）  グルカンを製造するための組成物であって、該組成物は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログを含み、
そしてここで、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、１分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有し、そして、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であり、少なくとも４００アミノ酸残基を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドである、組成物。
（項目２１）  項目２０に記載の組成物であって、ここで、前記配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。
（項目２２）  配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、従来公知のＧＨ１３ファミリーに属すブランチングエンザイムの反応機構を模式的に示す図である。
【図２】図２は、ブランチングエンザイムを反応する前のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図３】図３は、ブランチングエンザイムＴＫ１４３６ΔＨを反応させた後であって、イソアミラーゼを反応させる前のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図４】図４は、ブランチングエンザイムＴＫ１４３６ΔＨ、および、イソアミラーゼを反応させた後のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図５】図５は、ＡｑＢＥを反応させた後であって、イソアミラーゼを反応させる前のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図６】図６は、ＡｑＢＥ、および、イソアミラーゼを反応させた後のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図７】図７は、ＴＫ１４３６ΔＨおよびＡｑＢＥのそれぞれをアミロペクチンに反応させた後の生成物の重量平均分子量を示すグラフである。
【図８】図７は、ＴＫ１４３６ΔＨおよびＡｑＢＥのそれぞれをアミロペクチンに反応させた後の生成物の分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。
【図９】図９は、従来公知であったブランチングエンザイムの反応機構を模式的に示した図である。図中、水平線はα−１，４−結合で連なったグルコースの分子鎖を示し、矢印は、α−１，６−結合（分岐結合）を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムの反応機構を模式的に示した図である。図中、水平線はα−１，４−結合で連なったグルコースの分子鎖を示し、矢印は、α−１，６−結合（分岐結合）を示す。
【図１１】図１１は、ＴＫ１４３６ΔＨの最適温度および最適ｐＨを示すグラフである。
【図１２−１】図１２は、ＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムについてＢＬＡＳＴ検索を行った結果である。
【図１２−２】図１２−２は、図１２−１のつづきである。
【図１３−１】図１３は、ＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムについてＢＬＡＳＴ検索を行った結果である。
【図１３−２】図１３−２は、図１３−１のつづきである。
【配列表フリーテキスト】
【００２１】
配列番号１    ＴＫ１４３６のＢＥ  核酸配列
配列番号２    ＴＫ１４３６のＢＥ  アミノ酸配列
配列番号３    ＴＫ１４３６ΔＨのＢＥ  アミノ酸配列
配列番号４    Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号５    Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＧＥ５由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号６    Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号７    Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号８    Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号９    Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１０  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１１  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１２  Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１３  Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ  ２ＣＰ−Ｃ由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１４  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１５  Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１６  Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１７  Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１８  Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号１９  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２０  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２１  Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２２  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２３  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＮＡＴＬ２Ａ由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２４  Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ２５５−１５由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２５  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１９８６由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２６  Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２７  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１３７５由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２８  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆ１１由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号２９  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＡＦ２１２２／９７由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３０  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３１  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３２  Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３３  Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３１３由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３４  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３５  Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  Ｊ−１０−ｆｌ由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３６  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
配列番号３７  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓ由来のＴＫ１４３６ホモログのアミノ酸配列
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２３】
（Ｉ．酵素反応基質）
本発明の製造方法は、ＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムを用いる酵素反応工程を包含する。その酵素反応において使用される基質に関連する事項ついて、以下に説明する。【００２４】
本明細書において使用する場合、「グルカン」と「グルコースの重合体」と「グルコースポリマー」とは、互換可能に用いられ、α−１，４−グルコシド結合によって結合した直鎖状または環状分子、あるいは、グルコースがα−１，６−グルコシド結合およびα−１，４−グルコシド結合した分岐状または環状分子を含む、重合度２０以上のグルコースのポリマーをいう。グルカンとしては、アミロペクチンおよびアミロースが挙げられるが、これらに限定されない。澱粉を構成する成分は、アミロペクチンおよびアミロースである。【００２５】
本発明の製造方法の原料（すなわち、酵素反応基質）としては、主にグルカンが、用いられる。基質であるグルカンは単一の分子量の純粋な物質であっても、様々な分子量の分子の混合物であってもよい。基質以外に、基質として作用しないグルコースを含む混合物を溶液に添加してもよい。工業的には、種々の分子量の分子の混合物を原料糖として用いることが多い。本発明で基質として用いられるグルカンの分子量に上限はない。本発明で基質として用いられるグルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、ＢＥによる反応速度が２０％以下に低下しない程度に修飾された誘導体であってもよいが、修飾されていないことが好ましい。【００２６】
本発明で基質として用いられるグルカンは、天然のアミロースであってもよい。天然のアミロースは、若干の分岐構造を有する場合がある。酵素反応基質として用いられる澱粉の例としては、例えば、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉などの地下澱粉；コーンスターチ（ワキシーコーンスターチ、ハイアミロースコーンスターチなど）、小麦澱粉、米澱粉（例えば、もち米澱粉、粳米澱粉）、サゴ澱粉、豆澱粉などの地上澱粉が挙げられる。【００２７】
本明細書において使用する場合、グルコースの「オリゴマー」とは、α−１，４−グルコシド結合によって結合した、重合度が２〜２０のグルコース鎖をいう。【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「アミロペクチン」とは、デンプンに含まれる、分岐したＤ−グルコースの重合体であり、クラスター構造をとるグルコースの重合体である。各々のクラスター単位は、α−１，６−グルコシド結合によって一緒に連結された、平均重合度約１２〜約２４のα−１，４−グルコシド結合した鎖からなる。クラスター単位は、約３０〜約１００の重合度の、より長いα−１，４−グルコシド結合鎖によってさらに一緒に連結される。一般に、天然に存在するアミロペクチンは、鎖状分子であり、平均単位鎖長（ＣＬ）が約２０〜２５であり、α−１，６結合比率は４〜５％であり、重合度は１０５〜１０６（分子量１０７〜１０８）であり、ヨウ素最大吸収波長λｍａｘは５３０〜５５０ｎｍであるが、必ずしもこれらに限定されない。これに対して、天然に存在するグリコーゲンの場合は、一般に、球状分子であり、平均単位鎖長（ＣＬ）が約１０〜１４であり、α−１，６結合比率は７〜１０％であり、重合度は〜１０５（分子量〜１０７）であり、ヨウ素最大吸収波長λｍａｘは４３０〜４６０ｎｍであり、極限粘度（η）は５〜１０ｍｇ／ｇである。本明細書において使用する場合、用語「アミロース」とは、α−１，４結合によって連結された、本質的に直鎖のＤ−グルコースの重合体である。【００２９】
本明細書において使用する場合、「グルカン」の「分岐鎖」とは、別の分岐鎖に対して、α−１，６結合によって連結されたグルコースのオリゴマーをいう。従って、本明細書における「分岐鎖」とは、別の分岐鎖の６位のグルコースに対して１位で結合するグルコースから開始し、そのグルコースに結合する一連のグルコースを含む部分をいう。従って、本明細書において使用する場合、「五単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の６位のグルコースに対して１位で結合するグルコースから開始し、さらに４つのグルコースがα−１，４結合した部分をいう。同様に、本明細書において使用する場合、「四単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の６位のグルコースに対して１位で結合するグルコースから開始し、さらに３つのグルコースがα−１，４結合した部分をいい、「六単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の６位のグルコースに対して１位で結合するグルコースから開始し、さらに５つのグルコースがα−１，４結合した部分をいい、そして、「十単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の６位のグルコースに対して１位で結合するグルコースから開始し、さらに９つのグルコースがα−１，４結合した部分をいう。グルカンの分岐鎖は、例えば、α−１，４結合およびα−１，６結合を有するアミロペクチンのようなグルカンに対して、イソアミラーゼのような枝切り酵素を反応させた後に、グルコースのオリゴマーとして遊離される部分である。【００３０】
本明細書において使用する場合、「グルコース」の「短鎖分岐鎖」とは、グルカンの分岐鎖であって、二単糖〜五単糖からなるものをいう。【００３１】
本明細書において使用する場合、本発明によって製造される「グルカン」は、好ましくは、１分子中の、五単糖からなる短鎖分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数と比較して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、または６０％以上であるグルカン、あるいは、１分子中の、六単糖からなる短鎖分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数と比較して、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であるグルカンをいう。【００３２】
本明細書において使用する場合、ｎ単糖からなる分岐鎖の「モル数」とは、グルカンを枝切り酵素で処理することによって切断され遊離する分岐中で、グルコースの重合度がｎの分岐のモル数をいう。このモル数の比率は、ＨＰＡＥＣ分析によって決定することができる。【００３３】
グルカンのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物であり、その分子量は重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｗは、（Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，２００３．５０（前出））に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。【００３４】
（ＩＩ．ブランチングエンザイムの活性測定）
ＧＨ１３ファミリーに分類される、従来公知のブランチングエンザイムは、ブランチングエンザイム活性を有することが公知である。ＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムの機能を評価するための手法として、これら両活性の測定方法を、以下に記載する。【００３５】
（１．ＢＥ活性）
ブランチングエンザイムのブランチングエンザイム活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０）に記載される。ＢＥのブランチングエンザイム活性は、例えば、以下のようにして測定される。まず、５０μＬの基質液（０．１２％（ｗ／ｖ）アミロース（ＴｙｐｅＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））に５０μＬの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、そのＢＥの反応至適温度で行う。１０分間ＢＥを作用させた後、１ｍＬの０．４ｍＭ塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、１ｍＬのヨウ素液を添加し、よく混合した後、６６０ｎｍの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に０．４ｍＭ塩酸溶液を添加したものを同時に調製する。基質液は、１００μＬの１．２％（ｗ／ｖ）アミロースＴｙｐｅＩＩＩ溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、さらに７００μＬの蒸留水を添加してよく混合することにより調製する。ただし、緩衝液のｐＨは、そのＢＥの反応至適ｐＨに合わせる。ヨウ素液は０．１２５ｍＬのストック溶液（２．６重量％Ｉ２、２６重量％ＫＩ水溶液）に０．５ｍＬの１規定塩酸を混合し、蒸留水で６５ｍＬとすることにより調製する。酵素液のＢＥ活性は以下の計算式により求める。【００３６】
ＢＥ活性（単位（Ｕ）／ｍＬ）
＝｛（対照液６６０ｎｍ吸光度−サンプル液６６０ｎｍ吸光度）／対照液６６０ｎｍ吸光度｝×１００／１０×２０。  【００３７】
（酵素反応）
ブランチングエンザイムの反応至適温度は、ブランチングエンザイムが由来する生物種などに依存して変化するが、好ましくは、約４５℃以上であり、約１１０℃以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＢＥ活性測定を温度のみ変化させて行い、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約４５℃以上であり、約５０℃以上であり、さらに好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上である。反応至適温度に上限はないが、好ましくは約１１０℃以下であり、約９０℃以下であり、約８５℃以下であり、さらに好ましくは約８０℃以下であり、特に好ましくは約７５℃以下である。【００３８】
ブランチングエンザイムは、好ましくは、超好熱性菌、高度好熱性菌、好熱性菌または中温性菌由来、より好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来（例えば、ＫＯＤ１株由来）のＢＥである。本明細書中では、「好熱性菌」とは、生育最適温度が約５０℃以上であり、約４０℃以下ではほとんど増殖しない微生物をいう。好熱性菌は、中等度好熱性菌および高度好熱性菌に分けられる。「中等度好熱性菌」とは、生育最適温度が約５０℃〜約７０℃である微生物をいう。「高度好熱性菌」とは、生育最適温度が約７０℃以上である微生物をいう。さらに、高度好熱性菌のうち、生育最適温度が約８０℃以上である微生物を、「超好熱性菌」という。対照的に、「中温性菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物をいい、特に、生育最適温度が約２０℃〜約４０℃である微生物をいう。【００３９】
本発明のグルカン合成能力を有するＢＥを産生する微生物は、限定されることはないが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属に属する。また、本発明のグルカン合成能力を有するブランチングエンザイムを産生する微生物としては、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＧＥ５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ  ２ＣＰ−Ｃ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＮＡＴＬ２Ａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ２５５−１５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１９８６、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１３７５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆ１１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＡＦ２１２２／９７、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  Ｊ−１０−ｆｌ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓが挙げられるが、これに限定されない。本願発明のブランチングエンザイムは、好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓに由来する。【００４０】
（ＩＩＩ．ホモログ）
本明細書において使用する場合、タンパク質の「ホモログ」とは、元のタンパク質の機能の少なくとも１つを有し、そして、その一次構造が類似するものをいう。ホモログの同定方法としては、例えば：（ａ）元のタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；（ｂ）元のタンパク質とＢＬＡＳＴなどの相同性検索によって、相同であると判断されるポリペプチド；（ｃ）元のタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド；（ｄ）元のタンパク質に対して、アミノ酸配列上で保存的置換を有する、ポリペプチド；および（ｅ）元のタンパク質のアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、本願発明のフラグメントは、元のタンパク質の活性の少なくとも１つ（例えば、（ｉ）アミロースと反応した場合に、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性）を保持する。【００４１】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。ポリペプチドフラグメントは、元のタンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側、または、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方からアミノ酸配列を欠失させたポリペプチドであり得る。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、５００、７５０、１０００、１２００、１５００、１６００、１９００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。好ましくは、本願発明のフラグメントは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有する。【００４２】
本明細書において、「ＢＬＡＳＴ」とは、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌの略称である（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）。ＢＬＡＳＴを用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する場合、特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る：
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００４３】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）される。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価することが好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。好ましくは、フィルターとしては、Ｌｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを用いる。好ましくは、上記に特記した以外は、通常は、デフォルトのパラメーターを用いる。【００４４】
好ましくは、上記条件でＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号２に記載されるアミノ酸を参照配列とした場合、Ｅ値が、１ｅ−２０以下、１ｅ−２２以下、４ｅ−３９以下、または８ｅ−５２以下であり、かつ、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４５０アミノ酸残基を有するポリペプチドが、本明細書の「ホモログ」に該当する。好ましくは、このようにして選択された本明細書のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有する。【００４５】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有すること）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または、２個以下などであり得る。このような「置換、付加または欠失」を有する本願発明のホモログは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有する。【００４６】
このようなホモログをコードする核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。【００４７】
本明細書中において、本願発明のホモログを作製するために、アミノ酸の置換、付加または欠失の他に、１または数個のアミノ酸配列の修飾もまた行うことができる。このような修飾を受けた本願発明のホモログは、好ましくは、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有する。【００４８】
本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明の配列番号１に記載の核酸配列を有する核酸をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのような核酸を得ることができる。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。【００４９】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。【００５０】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株の天然のブランチングエンザイムをコードする核酸配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２に示す。以下、このブランチングエンザイムをＴＫ１４３６ともいう。ＴＫ１４３６のＣ末端に存在するヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３に示す（以下、「ＴＫ１４３６ΔＨタンパク」ともいう）。【００５１】
本発明において、ＴＫ１４３６タンパク質は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株から単離・生成されたポリペプチドのみならず、同一のアミノ酸配列を有する、組換え産生されたポリペプチド、および化学合成されたポリペプチドの両方を包含する。【００５２】
これらのＴＫ１４３６のホモログの核酸配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明のホモログは、例示した配列を有するポリペプチド以外にも、（ｉ）アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または（ｉｉ）アミロペクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも１つの活性を有するポリペプチドを包含する。【００５３】
ブランチングエンザイムの改変は、当該分野で周知の方法を用いて行うことができる。【００５４】
（ＩＶ．ブランチングエンザイムの調製）
本発明の方法において使用するブランチングエンザイムは、ブランチングエンザイムを産生する天然の微生物から単離されてもよい。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓなどから天然のＢＥを単離し得る。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株のブランチングエンザイムについての手順を以下に示す。【００５５】
人工海水（１．６％ＮａＣｌ、０．２４％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．４８％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．４８％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０８％ＮａＨＣＯ３、０．０１６％ＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．０４％ＫＣｌ、０．０３３６％ＫＨ２ＰＯ４、０．００４％ＮａＢｒ、０．００１６％ＳｒＣｌ２・６Ｈ２０、０．０００８％Ｆｅ（ＮＨ４）２Ｈ（Ｃ６Ｈ５０７）２）、０．５％酵母エキス及び０．５％トリプトンからなる培地１００ｍｌを培養ボトルに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２ａｔｏｍ、２０分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を０．１％添加し、この培地にＫＯＤ１株を接種して培養を行なう。培養は８５℃で約１６時間嫌気的に行なう。培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより菌体を回収する。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する操作を２回繰り返して菌体を洗浄する。菌体を超音波破砕後、遠心操作により無細胞抽出画分を回収する。【００５６】
次に上記の無細胞抽出画分より陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行う。陰イオン交換クロマトグラフィーは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、試料をカラムに付与し、カラムを同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌまで塩濃度を徐々に上昇させ、ＢＥ画分を溶出させる。疎水カラムＲＥＳＯＲＣＥ  ＰＨＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１Ｍ硫安、緩衝液で平衡化し、陰イオンカラムより溶出されるＢＥを含む試料をカラムに付与し同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）まで塩濃度を徐々に低下させ、ＢＥ画分を溶出させる。ゲルろ過クロマトグラフィーを行うため、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ＹＭ−３０（日本ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、濃縮する。ゲルろ過クロマトグラフィーはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｈｐａｔｅ（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で平衡化後、濃縮試料をカラムに付与し同緩衝液でＢＥ画分のピークを分離する。【００５７】
あるいは、本発明の方法において使用するＢＥは、ＢＥをコードする核酸配列を含む核酸分子を適切な宿主細胞に導入してＢＥを発現させ、この発現されたＢＥをこの宿主細胞またはその培養液から精製することによって入手され得る。また、組換え発現に用いる核酸配列としては、ＴＫ１４３６の核酸配列（配列番号１）のみならず、ＴＫ１４３６のＣ末端に存在するヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフを欠損させたＴＫ１４３６ΔＨタンパク（配列番号３）をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。さらに、ＴＫ１４３６のホモログをコードする核酸配列も、組換え発現に用いることができる。【００５８】
ＴＫ１４３６のホモログをコードする核酸分子（遺伝子ともいう）は、当業者に周知の方法によって、その由来する生物から単離されうる。さらに、ＤＮＡフラグメントの核酸配列を基に合成されたプライマーを用い、ＧＨ５７型ＢＥを発現する生物種（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、または、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属に属する微生物、あるいは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＧＥ５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ  ２ＣＰ−Ｃ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＮＡＴＬ２Ａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ２５５−１５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１９８６、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１３７５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆ１１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＡＦ２１２２／９７、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２、Ｃｈｌｏｒｏｆｌ��ｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  Ｊ−１０−ｆｌ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．またはｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓなどが挙げられるが、これに限定されない。）のゲノムＤＮＡなどを鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直接ＢＥ遺伝子を増幅することもできる。【００５９】
あるいは、公知のアミノ酸配列（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列）をコードする核酸配列情報に基づいて化学合成されてもよい。【００６０】
本発明の方法で用いられるＢＥのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、上記の対照アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（すなわち、対照核酸配列）と比較してある一定の数まで変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照核酸配列の５’末端もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、１塩基ずつ点在していてもよく、数塩基連続していてもよい。【００６１】
本発明で用いられるＢＥをコードする核酸配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表（例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６  第１７号，８２０７頁（１９８８））に従って大腸菌での発現のために最適にすることができる。【００６２】
上記のようにして改変された核酸配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが作製され得る。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。【００６３】
本明細書において核酸分子について言及する場合、「ベクター」とは、目的の核酸配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された核酸配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。【００６４】
本明細書において、「発現ベクター」とは、ＢＥをコードする核酸配列を目的の細胞中で発現し得るベクターをいう。【００６５】
次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入してＢＥが発現される。【００６６】
本明細書において酵素の「発現」とは、その酵素をコードする核酸配列が、インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。【００６７】
発現ベクターを導入する細胞（宿主ともいう）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、ＢＥの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。【００６８】
本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。【００６９】
（Ｖ．他の酵素）
（１．枝切り酵素）
本発明の製造方法は、ブランチングエンザイムの反応と同時に、またはブランチングエンザイムの反応後に、枝切り酵素を作用させることにより、短鎖分岐由来のグルコースオリゴマーを生産する工程をさらに包含し得る。枝切り酵素とは、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）と、プルランによく作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ  ３．２．１．４１）との２つに分類される。イソアミラーゼおよびプルラナーゼのいずれも本発明の方法において用いられ得る。当該分野で公知の任意の枝切り酵素が使用され得る。【００７０】
（ＶＩ．本発明のグルカンの製造方法）
本発明のグルカンの製造方法において酵素反応基質として使用するグルカンとしては、アミロースおよびアミロペクチンが挙げられるが、これに限定されない。【００７１】
本発明の製造方法の酵素反応基質として使用するアミロースの重合度は、特に限定されることはないが、２０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは７５以上、なおより好ましくは１００以上、さらにより好ましくは１５０以上である。【００７２】
また、本発明の製造方法の酵素反応基質として使用するアミロペクチンの重合度は、特に限定されることはないが、２００以上、好ましくは１，０００以上、より好ましくは５，０００以上、より好ましくは１０，０００以上、よりこのましくは、５０，０００以上、さらにより好ましくは１００，０００以上である。また、任意の分岐の程度を有するアミロペクチンを、本発明において用いることができる。従って、本発明において使用するアミロペクチン内の、α−１，４結合とα−１，６結合との比率は、特に制限されることはない。【００７３】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量および所望の分岐の程度の、グルカンが得られることを容易に理解する。【００７４】
反応開始時の溶液中に含まれるブランチングエンザイムの量は、反応開始時の溶液中のアミロースおよび／またはアミロペクチンに対して、代表的には、約２０Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、なおより好ましくは約１，０００Ｕ／ｇ基質以上、さらにより好ましくは、約１０，０００Ｕ／ｇ基質以上または約１００，０００Ｕ／ｇ基質以上である。【００７５】
ＢＥの使用量は、ＢＥを基質（例えば、アミロースおよび／またはアミロペクチン）に作用させる時間と関係がある。使用量が少なくとも反応時間を長くすれば反応は進み、使用量が多ければ反応時間が短くとも反応が進むからである。よって酵素量と反応時間との積が、反応物の生成に対して大きな影響を有する。【００７６】
本明細書中では、「Ｕ・時間／ｇ基質」とは、基質１ｇあたりの酵素使用量（Ｕ／ｇ基質）と反応時間（時間）との積を示す。ＢＥの使用量と反応時間との積は、約５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、好ましくは約１００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、より好ましくは約１６０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１７０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１８０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、より好ましくは約２００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、さらにより好ましくは約２５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、なおより好ましくは約３００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上であり、なおより好ましくは約３５０，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上である。約４００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約５００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約６００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約７００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上、約８００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以上のような量・時間で作用させても好適な結果が得られ得る。基質に対してＢＥを多量に、あるいは長時間作用させることにより、本発明のグルカンが生成される。作用させるＢＥの量と時間との積に特に上限はないが、あまりにも多量のＢＥをあまりにも長時間作用させると製造コストが高価になりすぎる場合がある。製造コストなどを考慮すれば、作用させるＢＥの量と時間との積は例えば、約１０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約８，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約５０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約１０，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約８，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約５，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下、約１，０００，０００Ｕ・時間／ｇ基質以下などであり得るが、これ以上であっても、反応を行うことは、可能である。【００７７】
本発明の製造方法に用いる溶媒は、ＢＥの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。【００７８】
なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の製造方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、アミロースおよび／またはアミロペクチンなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。【００７９】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記ＢＥを調製する際にＢＥに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。【００８０】
本発明のグルカンを合成能力を有するＢＥと、基質（例えば、主にアミロースおよび／またはアミロペクチンなどのα−グルカン）とを含む溶液中には、ＢＥとこの基質との間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、ＢＥを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。【００８１】
本発明の製造方法においては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、本発明のグルカンの合成能力を有するブランチングエンザイムと、基質（例えば、アミロースおよび／またはアミロペクチン）とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、ブランチングエンザイムを含む溶液と、基質を含む溶液とを混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。反応溶液のｐＨは、使用するＢＥが活性を発揮し得るｐＨであれば任意に設定され得る。反応溶液のｐＨは、使用するＢＥの至適ｐＨ付近であることが好ましい。反応溶液のｐＨは、代表的には約２以上であり、好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上であり、特に好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約６以上であり、最も好ましくは約７以上である。反応溶液のｐＨは、代表的には約１３以下であり、好ましくは約１２以下であり、さらに好ましくは約１１以下であり、特に好ましくは約１０以下であり、特に好ましくは約９以下であり、最も好ましくは約８以下である。１つの実施形態では、反応溶液のｐＨは、代表的には、使用するＢＥの至適ｐＨの±３以内であり、好ましくは至適ｐＨの±２以内であり、さらに好ましくは至適ｐＨの±１以内であり、最も好ましくは至適ｐＨの±０．５以内である。【００８２】
短鎖分岐として生成された部分をグルコースオリゴマーとして調製する場合、必要に応じて、枝切り酵素を、ブランチングエンザイムと同時に、および／または、ブランチングエンザイムによる反応後に、反応溶液に添加してもよい。【００８３】
枝切り酵素を使用する場合、その量は、反応開始時の溶液中の基質（アミロースおよび／またはアミロペクチン）に対して、代表的には約１０Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５０Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１００Ｕ／ｇ基質以上である。反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、特に上限はないが、反応開始時の溶液中のα−グルカンに対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。枝切り酵素の使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。【００８４】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のＢＥ活性が、反応至適条件で測定した活性の約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約２０℃以上であり得、約１００℃以下であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるＢＥの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、さらにより好ましくは約５０℃以上であり、さらにより好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは６５℃以上である。反応温度は、約９０℃以下好ましくは約８５℃以下であり、さらにより好ましくは約８０℃以下であり、より好ましくは約７５℃以下である。【００８５】
上記酵素反応は、当該分野において周知の種々の方法を用いて停止することが可能である。酸・アルカリを用いるｐＨの変化、１００℃程度での過熱、プロテアーゼ処理などが挙げられるが、これに限定されない。例えば、塩酸（例えば、１Ｎ程度）を数％（ｖ／ｖ）加えて１００℃１０分加熱することによって反応を停止することが可能である。【００８６】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間以上であり、より好ましくは約２時間以上であり、さらにより好ましくは約４時間以上であり、最も好ましくは約６時間以上である。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約１００時間以下、より好ましくは約７２時間以下、さらにより好ましくは約３６時間以下、最も好ましくは約２４時間以下である。【００８７】
（ＶＩＩ．本発明に従って生成されるグルカン）
（１．アミロースを原料（酵素反応基質）として用いる場合）
本発明に従って、アミロースを酵素反応基質として生成されたグルカンは、従来公知のブランチングエンザイムであるＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムを用いて生成されたグルカンと比較して、例えば、以下からなる群から選択される特徴を有する：
（１）α−１，６グルコシド結合含量／全糖量が多い。α−１，６グルコシド結合の含量は、分岐の数を示すものである。従って、本発明に従って、より高度に分岐したグルカンを得ることが可能となる。例えば、本発明に従って製造されたグルカンは、グルカン中のα−１，６結合が全糖の１０％以上、１０．２％以上、１０．５％以上、１０．７％以上、１１％以上、または、１１．２％以上である；
（２）より短いグルコースオリゴマー分岐鎖を含む。例えば、本発明に従って生成されたグルカン中では、一分子中の、五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。また、本発明に従って、生成されたグルカン中では、一分子中の、六単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である；
（３）分子量が大きい。例えば、本発明に従って生成されたグルカンの分子量は、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、２５，０００以上、５０，０００以上、１００，０００以上、２００，０００以上、３００，０００以上、４００，０００以上、および５００，０００以上であるが、これらに限定されない；ならびに、
（４）還元糖／全糖量が少ない。還元糖の増加は、グルカンの加水分解が生じたことを示す。従って、本発明に従って、より高分子の、高度に分岐したグルカンを得ることが可能になる。例えば、本発明に従って生成されたグルカンでは、還元糖／全糖量（％）が、３．２％以下、３．０％以下、２．８％以下、２．６％以下、２．４％以下、２．２％以下である。【００８８】
（２．アミロペクチンを原料（酵素反応基質）として用いる場合）
本発明に従って、アミロペクチンを酵素反応基質として生成されたグルカンは、従来公知のブランチングエンザイムであるＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムを用いて生成されたグルカンと比較して、例えば、以下の特徴を有する：
（１）分子量が大きい。ＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムを用いると、比較的低分子の分岐環状デキストリンを生じるため、生成されたアミロペクチンの低分子化が生じる。これに対して、本発明の製造方法を用いる場合、生成されるグルカンの分子量は、原料（酵素反応基質）として用いたアミロペクチンと実質的に同一であり、例えば、ＭＡＬＬＳ法で測定した場合に、１７０万以上、２００万以上、５００万以上、７００万以上、または、１，０００万以上の重量平均分子量を有する。例えば、生成されたグルカンの重量平均分子量は、原料（酵素反応基質）として用いたアミロペクチンの重量平均分子量の、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上である；
（２）より短いグルコースオリゴマー分岐鎖を含む。例えば、本発明に従って、生成されたグルカン中において、五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であるグルカンを生成することができる。また、本発明に従って、生成されたグルカン中において、六単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であるグルカンを生成することができる；
（３）より高度に分岐する。本発明に従って生成されたグルカンの重量平均分子量は、原料（酵素反応基質）として用いたアミロペクチンの重量平均分子量と実質的に同一である（例えば、ＭＡＬＬＳ法で測定した場合に、１７０万以上、２００万以上、５００万以上、７００万以上、または、１，０００万以上の重量平均分子量を有する）。その一方で、上記方法では、生成物の低分子化は生じない。そのため、一分子当たりの分岐数は、顕著に増加する。ＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムを用いると、生成グルカンの顕著な低分子化が生じるため、一分子当たりの分岐数は、本発明の場合より、格段に少ない。【００８９】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９０】
（実施例１：ＴＫ１４３６ΔＨ発現ベクターの調製）
ＴＫ１４３６全長タンパクの発現ベクターを調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主内にて発現させたところ、非常に凝集しやすく、精製・解析が困難であった。そこで、ＴＫ１４３６のＣ末端に存在するヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフを欠損させたＴＫ１４３６ΔＨタンパク質（配列番号３）の調製を以下のとおりに、行った。【００９１】
（１．染色体ＤＮＡの調製）
ＴＫ１４３６は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来である。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに受託番号ＪＣＭ  １２３８０で、そして、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に受託番号はＢＡＡ−９１８で寄託されている。従って、必要な場合、これら寄託菌を用いることができる。【００９２】
人工海水（１．６％ＮａＣｌ、０．２４％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．４８％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．４８％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０８％ＮａＨＣＯ３、０．０１６％ＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．０４％ＫＣｌ、０．０３３６％ＫＨ２ＰＯ４、０．００４％ＮａＢｒ、０．００１６％ＳｒＣｌ２・６Ｈ２０、０．０００８％Ｆｅ（ＮＨ４）２Ｈ（Ｃ６Ｈ５０７）２）、０．５％酵母エキス及び０．５％トリプトンからなる培地１００ｍｌを培養ボトルに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２ａｔｏｍ、２０分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を０．１％添加し、この培地にＫＯＤ１株を接種して培養を行なった。培養は８５℃で約１６時間嫌気的に行なった。培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより菌体を回収した。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する操作を２回繰り返して菌体を洗浄した。【００９３】
洗浄後の菌体５ｇをＴＥ緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１．６ｍｌに懸濁し、この懸濁液に１０％ドデシル硫酸ナトリウム２０μｌとプロテイナーゼＫ  ２０μｌを添加し、５５℃で１時間反応させた。次に、前記懸濁液に中性フェノールを１ｍｌ添加して１０分間混合した。得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層と等量（約１．５ｍｌ）のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソプロピルアルコール）（５０：４８：２％（ｖ／ｖ））を添加して１０分間混合し、得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層にエタノール約３ｍｌと３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液１５０μｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。そして、静置後の混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより核酸の沈殿を得た。【００９４】
この沈殿に７０％エタノールを５ｍｌ添加し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行って核酸をリンスした。上清を除去後、沈殿を乾燥させ、該乾燥した沈殿にＴＥ緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を４００μｌ添加して核酸を溶解した。次に、得られた核酸溶液４００μｌにリボヌクレアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を４μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後の核酸溶液に前記ＰＣＩを４００μｌ添加して５分間混合した。この混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層部分を取り出した。そして、前記ＰＣＩの添加、遠心分離、水層部分の取り出し操作を再度行なった。取り出した水層部分（約４００μｌ）にエタノール約３ｍｌと３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液４０μｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。【００９５】
静置処理した溶液を２０，０００×gで１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を得た。この沈殿に７０％エタノールを０．５ｍｌ添加し、次いで２０，０００×gで１０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿を乾燥させ、ＴＥ緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を２００μｌ添加することにより染色体ＤＮＡを得た。【００９６】
（２．ＰＣＲクローニング）
ＴＫ１４３６ΔＨを含むＤＮＡ断片を作製するため、以下の操作を行なった。すなわち、ＮｄｅＩの認識配列（下線部）を含むオリゴＤＮＡ【００９７】
【化１】
2007088676.tif 000003
とＢａｍＨＩの認識配列（下線部）および終止コドンを導入する配列（二重下線部）を含むオリゴＤＮＡ【００９８】
【化２】
2007088676.tif 000004
を合成して、それぞれのオリゴＤＮＡを用いて、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＴＫ１４３６ΔＨを含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ（４００ｎｇ）、各オリゴＤＮＡ２０ｐｍｏｌ及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液中で、まず９４℃で１８０秒間反応させ、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で６０秒間のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で３００秒間反応させた。得られた増幅断片について、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化を行った。つぎに、プラスミドｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、その後上記の増幅断片と結合させ、ＴＫ１４３６ΔＨ発現プラスミドｐ１４３６ＤＨを作製した。シーケンスによりＴＫ１４３６ΔＨの塩基配列の確認を行った。【００９９】
（３．ＴＫ１４３６ΔＨの発現）
上記で作製したｐ１４３６ＤＨを用いて、大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の形質転換を行い、得られた遺伝子組換え大腸菌を用いてＴＫ１４３６ΔＨの発現を行った。前培養した形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に１％植菌した。ＯＤ６６０≒０．４の時にＩＰＴＧ（終濃度０．１  ｍＭ）を添加し、５時間培養後、集菌を行った。菌体を超音波破砕後、遠心操作により無細胞抽出画分を回収した。【０１００】
（４．ＴＫ１４３６ΔＨの精製）
次に上記の無細胞抽出画分について８０℃１０分間の熱処理を行い、遠心分離により熱安定性可溶性画分を得た。上記画分より陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行った。陰イオン交換クロマトグラフィーは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、ＴＫ１４３６ΔＨを含む試料をカラムに付与し、カラムを同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌまで塩濃度を徐々に上昇させ、ＴＫ１４３６ΔＨ画分を溶出させた。疎水カラムＲＥＳＯＲＣＥ  ＰＨＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１Ｍ硫安、緩衝液で平衡化し、陰イオンカラムより溶出したＴＫ１４３６ΔＨを含む試料をカラムに付与し同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）まで塩濃度を徐々に低下させ、ＴＫ１４３６ΔＨ画分を溶出させた。ゲルろ過クロマトグラフィーを行うため、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ＹＭ−３０（日本ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、濃縮した。ゲルろ過クロマトグラフィーはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で平衡化後、濃縮試料をカラムに付与し同緩衝液でＴＫ１４３６ΔＨ画分のピークを分離した。【０１０１】
上記のように、本実施例において、ＴＫ１４３６のＣ末端に存在するＨｅｌｉｘ−ｈａｉｒｐｉｎ−Ｈｅｌｉｘ（ＨｈＨ）モチーフを欠損させたＴＫ１４３６ΔＨタンパクを用いたところ、全長タンパク質では困難であった精製・解析が容易になった。この原因は、全長タンパク質が非常に凝集性が高いためであった。ＨｈＨは、通常ＤＮＡとの結合に関与すると考えられている。そのため、ＤＮＡとの結合に関連する配列を欠失することによって、ブランチングエンザイムの精製・解析が容易になったということは、全く予測されなかった。【０１０２】
（実施例２：アミロースを酵素反応基質として用いた、本発明のグルカンの製造）
（１．反応生成物の分析方法）
（１．１．グルカンのＭｗの決定）
得られたグルカンのＭｗは、当該分野で公知の方法によって確認され得るが、本実施例においては、以下の方法で測定した。【０１０３】
まず、合成したグルカンを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、グルカン約１μｇ〜約３００μｇ分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた。【０１０４】
詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ８０６ＭＨＱ（内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工製）を用い、ガードカラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ−Ｐａｃｋ  ＳＢ−Ｇ（内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍ、昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。分子量が約１万以上のグルカンは、Ｓｈｏｄｅｘ製のプルランＰ−５０（ＧＦＣ（水系ＧＰＣ）用標準試料ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２に含まれている）のピーク頂点が、９．３分になるように配管を調整した上記ＨＰＬＣシステムにおいて、１１分より前に溶出される。具体的には、シグナルの出始めの位置から１１分までに溶出される示差屈折計と多角度光散乱検出器の両シグナルを含むように、ピークとしてとり、それらのシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、Ｍｗを求めた（ＭＡＬＬＳ法）。この分析法においては、上記シグナルよりも後のシグナルを収集しないので、分子量が約１万以下のグルカンを除外している。このように、本実施例においてＭＡＬＬＳ法に従って決定されるＭｗは、反応液中のグルカン全体のＭｗではなく、分子量約１万以上のグルカンのＭｗである。さらに、ＨＰＬＣカラムと検出器との間の配管の長さ、太さなどを変更した場合、分子量約１万以上のグルカンの溶出時間は変化し得る。このような場合、当業者は、上記プルランＰ−５０を用いることにより、本発明の方法に従ってＭＡＬＬＳ法によりＭｗを決定するための適切な溶出時間を適切に設定し得る。【０１０５】
（１．２．分岐鎖長分布分析）
反応液が５０μＬである場合は、１μＬの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）と、２．５μＬの０．１ｍｇ／ｍＬ  イソアミラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）または蒸留水を加え、３７℃で一晩保温した。反応液の用量に応じて、添加する試薬の量を比例して変化させた。１００℃５分加熱して反応を止め、１０μＬの１Ｎ  ＮａＯＨを添加して氷上で冷却した。この溶液１０μＬをＨＰＡＥＣ分析にかけた。ＨＰＡＥＣ分析（高速液体アニオン交換クロマトグラフィー）は、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９５，９１−１０１に記載に従い、以下の方法で行う：
ＨＰＡＥＣ分析を、ＰＡＤ（モデルＰＡＤ−ＩＩ）を用いるＤｉｏｎｅｘ  ＤＸ−３００システム（Ｄｉｏｎｅｘ、ＣＡ）によって行った。カラムは、ＰＡ−１００ガードカラムを備えるＣａｒｂｏｎＰａｃ  ＰＡ−１００（４ｍｍ×２５０ｍｍ）である。０．２〜０．５％（ｗ／ｖ）グルカンを含むサンプル２５μｌを、以下の濃度勾配を用い、１ｍｌ／分で、注入および溶出した：０〜２分、９５％（ｖ／ｖ）溶媒Ａおよび５％（ｖ／ｖ）溶媒Ｂ；２〜３７分、プログラム３の曲線勾配を用いて、３０％（ｖ／ｖ）まで、溶媒Ｂの割合を増加する；３７〜４５分、プログラム７の曲線勾配を用いて、８５％（ｖ／ｖ）まで、溶媒Ｂの割合を増加する；４５〜４７分、１５％（ｖ／ｖ）溶媒Ａおよび８５％（ｖ／ｖ）溶媒Ｂ。溶媒Ａは１５０ｍＭ  ＮａＯＨであり、溶媒Ｂは１Ｍ  酢酸ナトリウムを含む１５０ｍＭ  ＮａＯＨである。溶出される溶液について、ＰＡＤ（ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）応答を記録する。曲線勾配プログラム３および７は、予め作製され、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−３００システムにインストールされているプログラムである。【０１０６】
分岐鎖の鎖長の相対的モル数の分析は、上記ＨＰＡＥＣ法によって得られたＰＡＤ（ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）応答の結果を、ＫｏｉｚｕｍｉおよびＦｕｋｕｄａ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５８５（１９９１）２３３−２３８に記載の方法に適用することによって、可能である。具体的には、鎖長毎に単離した短鎖グルカンを、ＨＰＡＥＣ法によって分離し、モル数ベース（例えば、１ｎｍｏｌあたり）のＰＡＤ応答値を測定し、各鎖長の相対的検出器応答（ＲＤＲ）とする。次に、サンプルのＨＰＡＥＣ法による測定結果中の各ピークの値を、ピークの鎖長に対応するＲＤＲで除算することにより、モル数を算出する。【０１０７】
（１．３．還元糖量の測定）
還元糖量の測定は、Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．，ら、Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｓｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ２４０，  ２５３−２６３  （１９９３）に記載の方法に従った。具体的には、２００μｌのサンプルに対して、１００μｌの試薬１（０．１％  フェリシアン化カリウム）および１００μｌの試薬２（０．４８％  Ｎａ２ＣＯ３  −  ０．９２％  ＮａＨＣＯ３  −  ０．０６５％  ＫＣＮ）を添加し、１００℃で１５分間過熱し、０℃に冷却し、０．５ｍｌの試薬３（５０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４中の０．３％硫酸鉄（ＩＩ)アンモニウム）を添加し、室温にて２０分間放置し、Ａ１７５を測定した。【０１０８】
（１．４．全糖量の測定）
全糖量の測定は、福井作蔵著  生物化学実験法１  還元糖の定量法  第２版  学会出版センター１９９０に記載の方法を用いた（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．ら、（１９５６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８，３５０−３５６）。具体的には、２００μｌのサンプルに２００μｌの５％フェノール溶液を添加し、混合後、濃硫酸１ｍｌを添加し、室温にて１０分間放置した。その後、３０℃で２０分間保温し、Ａ４９０を測定した。【０１０９】
（２．ブランチングエンザイムによる反応）
５０ｍｇ／ｍＬのアミロース（ＡＳ３０  重量平均分子量３００００。ＤＭＳＯに溶解）２００μＬに、４００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）と１４００μＬの蒸留水を加えて混合し、基質液とした。基質液６００μＬに、ＴＫ１４３６ΔＨまたはＡｑＢＥ（Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のブランチングエンザイム）（０．４ｍｇ／ｍＬ）溶液１５０μＬを加えて、反応を開始した。反応は７０℃で３０分行い、１Ｎ  ＨＣｌを１２μＬ加えて１００℃１０分加熱することにより、停止した。【０１１０】
この反応液の分岐鎖長分布分析の結果、ＴＫ１４３６ΔＨ反応物からは、イソアミラーゼ処理により、グルコース４個以上からなる分岐鎖が遊離した。より詳細には、ブランチングエンザイム反応前のアミロースは、α−１，６結合を含まないことから、枝切り酵素を反応させても分岐鎖が遊離しなかった（図２）。ブランチングエンザイムＴＫ１４３６ΔＨを、７０℃で３０分反応させたところ（イソアミラーゼ処理なし）、若干の短鎖グルカンが遊離した（図３）。イソアミラーゼ処理後、四単糖からなる短鎖分岐鎖が遊離し、特に五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の約７０％程度であった（図４）。これに対して、ＧＨ１３ファミリーに属する、Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓのブランチングエンザイムを反応させた場合も（イソアミラーゼ処理なし）、若干の短鎖グルカンが遊離した（図５）。さらに、イソアミラーゼ処理をした後には、四単糖からなる短鎖分岐鎖が遊離した（図６）。しかし、グルカン中の、五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の約７％程度であった。【０１１１】
この結果から、ＴＫ１４３６ΔＨによるα−１，６−結合合成が確認できた。また、ＴＫ１４３６ΔＨは、ＡｑＢＥと比較して、短い分岐鎖（五単糖からなる分岐鎖）を多く合成できることが分かった。【０１１２】
次に、同反応液の還元糖量、全糖量およびイソアミラーゼ処理後の還元糖量を測定することにより、α−１，６−結合合成量を算出した（表１）。α−１，６−結合合成量は、グルカンの分岐の程度を示す指標である。【０１１３】
【表１】
2007088676.tif 000005
この結果から、ＴＫ１４３６ΔＨは、従来公知のブランチングエンザイムであるＡｑＢＥと比較して、より高度に分岐したグルカンを生成することが実証された。【０１１４】
さらに、合成された分岐糖の分子量をＭＡＬＬＳ法により算出した（表２）。【０１１５】
【表２】
2007088676.tif 000006
以上のように、ＴＫ１４３６ΔＨが、高分子α−グルカンを合成できることが確認された。【０１１６】
（実施例３：アミロペクチンを酵素反応基質として用いた、本発明のグルカンの製造）
５０ｍｇのワキシーコーンスターチ（ＷＣＳ；三和澱粉製）に１００μｌ  蒸留水を添加し、充分に攪拌した。次いで、９００μｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、攪拌し、沸騰湯浴中で、２０分間加熱した。８．９ｍｌ  蒸留水を添加してよく撹拌し、沸騰湯浴中で、さらに１０分間加熱した。この溶液に、１００μｌの１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して攪拌し、基質液とした。【０１１７】
基質液を８００μＬ／チューブで分注した。すなわち、各チューブは、４ｍｇのＷＣＳを含んでいた。次いで、ＴＫ１４３６ΔＨ溶液、またはＡｑＢＥ溶液２００μＬを添加して、７０℃で１６時間反応させた。酵素希釈液は０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）であった。反応時間が１６時間になった時点で１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応液のｐＨを３〜４に下げ、さらに１００℃で１０分加熱することにより、反応を停止させた。【０１１８】
反応停止後、反応液を０．４５μｍのフィルターによりろ過し、含まれる生産物のＭｗをＭＡＬＬＳ法によって測定した（図７）。ＡｑＢＥと異なり、ＴＫ１４３６ΔＨは、アミロペクチンの分子量をほとんど低下させないことが明らかとなった。また、得られた生産物の分岐鎖長分布を調べたところ、ＴＫ１４３６ΔＨは、二単糖〜五単糖からなる分岐鎖を生成したが、ＡｑＢＥは、六単糖からなる分岐鎖を生成した（図８）。以上の結果から、ＴＫ１４３６ΔＨは、分子量をほとんど低下させないにもかかわらず、アミロペクチンの分岐結合（特に短分岐鎖）を増加させることが分かった。【０１１９】
実施例２および３の結果から、ＴＫ１４３６ΔＨは、通常型ＢＥと比較し、高分岐度のグルカンであって、短分岐を含むグルカンを合成できること、アミロペクチンの分子量を低下させること無く、分岐結合（特に短分岐）を増加させることができることが実証された。【０１２０】
以上の結果を模式的に図９および１０に示す。【０１２１】
（実施例４：ＴＫ１４３６ΔＨの最適温度および最適ｐＨ）
ＴＫ１４３６ΔＨの最適温度および最適ｐＨを以下のように求めた。【０１２２】
（１．最適温度）
酵素溶液として、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）溶液中にＴＫ１４３６ΔＨタンパクが０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているタンパク溶液を、以下の濃度（０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５ｍｇ／ｍｌ）となるように純水で希釈したものを使用した。基質溶液としては、０．１２％アミロース（Ｓｉｇｍａ社製）を１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．５）中に溶解させたものを使用した。上記の酵素溶液４０μｌと基質溶液４０μｌを混合し、３０℃〜１００℃でインキュベートすることにより反応を開始した。なお、酵素溶液と基質溶液との混合により、ｐＨは７．０となる。反応開始１０分後、４０μｌの反応液に４００μｌの４ｍＭ塩酸を加えて反応を停止させた。その後、４００μｌの発色液（５ｍｇ／ｍｌヨウ素、０．５ｍｇ／ｍｌヨウ化カリウム、７．６９ｍＭ塩酸）を添加し、６６０ｎｍの吸光度（Ａｓａｍｐｌｅ）を測定した。活性が高いほど、吸光度の減少が顕著となる。また同時に、酵素溶液の代わりに酵素非添加溶液を用いた際の吸光度（Ａｂｌａｎｋ）の測定を行った。次に反応に使用した０．００１ｍｇ／ｍｌから０．００５ｍｇ／ｍｌの５点の酵素濃度について、以下の式を用いて活性値（Ａｃｔ）の算出を行った：
Ａｃｔ＝（Ａｂｌａｎｋ−Ａｓａｍｐｌｅ）／Ａｂｌａｎｋ
その後、グラフの横軸に酵素濃度、縦軸に活性値（Ａｃｔ）をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより各条件における酵素の相対活性（％）を算出した。その結果を図１１Ａに示す。【０１２３】
（２．最適ｐＨ）
使用する基質溶液は、以下のように作製した。０．１２％アミロース（Ｓｉｇｍａ社製）を１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む緩衝液に溶解させた。使用した緩衝液（各１００ｍＭ）は以下の通りである：クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５、４．０、４．５）、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０）、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０）、トリス塩酸（ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０）、ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０、９．５、１０．０）。最適温度測定で用いたものと同じ酵素溶液（ただしタンパク濃度は以下の通り：０．００２、０．００４、０．００６、０．００８、０．０１ｍｇ／ｍｌ）各４０μｌを上記の各基質溶液４０μｌと混合後、６０℃にてインキュベートを行った。反応開始１０分後、４０μｌの反応液に４００μｌの４ｍＭ塩酸を加えて反応を停止させた後、４００μｌの発色液（５ｍｇ／ｍｌヨウ素、０．５ｍｇ／ｍｌヨウ化カリウム、７．６９ｍＭ塩酸）を添加し、６６０ｎｍの吸光度（Ａｓａｍｐｌｅ）を測定した。活性が高いほど、吸光度の減少が顕著となる。また同時に、酵素溶液の代わりに酵素非添加溶液を用いた際の吸光度（Ａｂｌａｎｋ）の測定を行った。次に反応に使用した０．００２ｍｇ／ｍｌから０．０１ｍｇ／ｍｌの５点の酵素濃度について、以下の式を用いて活性値（Ａｃｔ）の算出を行った：
Ａｃｔ＝（Ａｂｌａｎｋ−Ａｓａｍｐｌｅ）／Ａｂｌａｎｋ
その後、グラフの横軸に酵素濃度、縦軸に活性値（Ａｃｔ）をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより各条件における酵素の相対活性（％）を算出した。その結果を図１１Ｂに示す。【０１２４】
（実施例５：ＢＬＡＳＴの評価）
機能が実験的に確認されていないタンパク質について、ＢＬＡＳＴ検索を用いる機能推定が妥当か否かを検討した。【０１２５】
（１．ＧＨ１３に属する従来型ブランチングエンザイムについて）
従来公知のＧＨ１３ファミリーに属するブランチングエンザイムであるＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓのブランチングエンザイム（通常型ＢＥ）のアミノ酸配列を用いて、ＮＣＢＩのＨＰ上のＢｌａｓｔ実行ソフトによりＢｌａｓｔｐ検索（対照データベース：Ｓｗｉｓｓ  Ｐｌｏｔ）を行った。マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用した。その結果を、図１２に示す。【０１２６】
点線より上に示し下線を付した、上位のタンパク質は明白にブランチングエンザイムである。例えば、点線より上に示したタンパク中、最下位の、ＧＬＧＢ＿ＯＲＹＳＡは米由来ブランチングエンザイムであり、その活性は実験的にも確認されている。このＧＬＧＢ＿ＯＲＹＳＡのＥ値は、４ｅ−３９である。それより下位のタンパク質は、ブランチングエンザイム以外のタンパク質である。これら点線より上に記載されるグループ、点線より下に記載されるグループの間にはＥ値において大きな差異がある。【０１２７】
従って、Ｅ値を用いて、タンパクの酵素活性を推定することは妥当であるといえる。特に、Ｅ値が１ｅ−２２以下、４ｅ−３９以下、または８ｅ−５２以下のタンパク質が対照タンパク質と同じ活性を有すると推定することは妥当であるといえる。【０１２８】
（２．ＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムについて）
次に、ＧＨ５７ファミリーに属するブランチングエンザイムであるＴＫ１４３６のアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を行った。マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用した。その結果を、図１３に示す。【０１２９】
図１３から明らかなように、Ｅ値が８ｅ−５２以下のグループ（波線より上で、下線を付した）、１ｅ−２２以下のグループ（点線より上で、下線を付した）と、３ｅ−４以上のグループ（点線より下）に大きく分かれた。また、ＧＨ１３に属する大腸菌由来のブランチングエンザイムのＥ値は、８０と非常に高い値を示した。【０１３０】
このようにＥ値の結果に明確な「ギャップ」があり、しかも、ブランチングエンザイムではあるが、本発明のグルカンを生成しないブランチングエンザイムでのＥ値が非常に高い値であることから、Ｅ値が１ｅ−２２以下、４ｅ−３９以下、または８ｅ−５２以下以下のグループは、ＴＫ１４３６と同様に本発明のグルカンを生成することができるブランチングエンザイムであり、Ｅ値が１ｅ−２０以上のグループは、それ以外の酵素であることが示された。【０１３１】
Ｅ値が１ｅ−２０以下のブランチングエンザイムは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＧＥ５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ  ２ＣＰ−Ｃ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ３９０７３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＮＡＴＬ２Ａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ２５５−１５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１９８６、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＣＣＭＰ１３７５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆ１１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＡＦ２１２２／９７、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒ．  ＭＩＴ  ９３１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  Ｊ−１０−ｆｌ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓ由来のブランチングエンザイムであり、それぞれのアミノ酸配列を、配列番号４〜３７に示した。これらの酵素は、本発明において配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログとして利用することが可能である。【０１３２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明に従って、従来法では生成することができなかった、高度に分岐したグルカンであって、短分岐を有するグルカンの製造方法が提供される。また、本発明に従って、そのような方法に使用するための組成物および改変タンパク質が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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