(57)【要約】本発明はアスペルギルス属に属し、一般式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＫＩ−２３４２物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−２３４２物質を採取することを含む、ＦＫＩ−２３４２物質である。得られたＦＫＩ−２３４２物質はがん細胞を特異的に阻害すため、ＤＮＡ傷害性の抗がん剤や放射線による治療において、その作用を増強させ、副作用が軽減されることが期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［Ｉ］
2007097010.tif 000023
（式中、Ｒ１はＣＨ３−またはＣＨ３ＣＨ２−、Ｒ２はＣＨ３−またはＨ−、ｎは１〜３を示す）で表される、ＦＫＩ−２３４２物質。
【請求項２】
一般式
2007097010.tif 000024
で表されるＦＫＩ−２３４２Ａ物質。
【請求項３】
一般式
2007097010.tif 000025
で表されるＦＫＩ−２３４２Ｂ物質。
【請求項４】
一般式
2007097010.tif 000026
で表されるＦＫＩ−２３４２Ｃ物質。
【請求項５】
一般式
2007097010.tif 000027
で表されるＦＫＩ−２３４２Ｄ物質。
【請求項６】
一般式
2007097010.tif 000028
で表されるＦＫＩ−２３４２Ｅ物質。
【請求項７】
一般式
2007097010.tif 000029
で表されるＦＫＩ−２３４２Ｆ物質。
【請求項８】
ＦＫＩ−２３４２Ａ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項９】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ａ物質を作用させる請求の範囲８記載の方法。
【請求項１０】
ＦＫＩ−２３４２Ｂ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項１１】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ｂ物質を作用させる請求の範囲１０記載の方法。
【請求項１２】
ＦＫＩ−２３４２Ｃ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項１３】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ｃ物質を作用させる請求の範囲１２記載の方法。
【請求項１４】
ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項１５】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ｄ物質を作用させる請求の範囲１４記載の方法。
【請求項１６】
ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項１７】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ｅ物質を作用させる請求の範囲１６記載の方法。
【請求項１８】
ＦＫＩ−２３４２Ｆ物質を作用させることによるがん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法。
【請求項１９】
ＤＮＡに傷害を与える抗がん剤の存在下にＦＫＩ−２３４２Ｆ物質を作用させる請求の範囲１８記載の方法。
【請求項２０】
アスペルギルス属に属し、一般式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＫＩ−２３４２物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−２３４２物質を採取することを含む、ＦＫＩ−２３４２物質の製造法。
【請求項２１】
アスペルギルス属に属し、式［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表されるＦＫＩ−２３４２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＫＩ−２３４２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−２３４２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ物質を採取することを含む、ＦＫＩ−２３４２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ物質の製造法。
【請求項２２】
アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１９５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞がＤＮＡ障害を受けたときにそれを修復する機構である。具体的にはＤＮＡに傷害を与える抗がん剤存在下Ｇ２チェックポイントを特異的に阻害することでＤＮＡ障害型の抗がん剤のがん細胞特異性を高め、副作用を軽減する新規化合物ＦＫＩ−２３４２物質およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年の厚生労働書の資料によると、日本において平成１６年（２００４年）の死因別にみた死亡率は「がん」が死因のトップを占め、３人に１人がその一生のうちに「がん」にかかり、４人に１人が「がん」により亡くなると報告されている。現在がんはわが国の死因の第一位を占めている。がんに対する化学療法に関しては、現在臨床で用いれている抗がん剤は、作用様式やその由来などにより、５−ＦＵなどの代謝拮抗剤、シスプラチンなどのアルキル化剤、ブレオマイシンやマイトマイシンなどの抗がん性抗生物質などに分類されている。これらの中で、細胞のＤＮＡに損傷を与え細胞を殺す作用を持つアルキル化剤や抗がん性抗生物質は、ある一定の濃度に達すると作用時間が短くても確実に効果を示すが、正常細胞への攻撃も避けられず、臓器障害や骨髄障害による貧血、嘔吐、脱毛といった薬物有害反応が生じる。
また、近年がんの研究が盛んに行われるようになり、様々なことが明らかとなってきている。特に正常細胞とがん細胞ではＤＮＡ修復機構が異なることが明らかとなりＤＮＡに障害が生じた場合、正常細胞ではＧ１チェックポイントとＧ２チェックポイントによってＤＮＡが修復されるが、がん細胞では多くの場合、Ｇ２チェックポイントのみに依存してＤＮＡ修復している。このことから、ＤＮＡに障害を与える抗がん剤存在下Ｇ２チェックポイントを特異的に阻害することができれば、がん細胞のみがＤＮＡを修復できなくなり細胞死へと誘導されると考えられる（Ｓｕｇａｎｕｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３巻  ｐ．５８８７−５８９１  １９９９年）
【発明の開示】
【０００３】
かかる実情において、抗がん剤のがん細胞への特異性を高める薬剤を提供することはがん治療において有用であると考える。すなわち、抗がん剤のがん細胞への特異性を高める薬剤は、ＤＮＡ障害性の抗がん剤や放射線によるがん治療において、その作用を増強させ、副作用が軽減されることが期待できる。
本発明者らは微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、新たに土壌から分離したＦＫＩ−２３４２菌株の培養液中に、Ｇ２チェックポイントを阻害することによりＤＮＡ傷害型の抗がん剤のがん細胞特異性を高める物質（以下Ｇ２チェックポイント阻害物質と称す）が生産されることを見い出した。次いで、該培養液から活性物質を分離、精製した結果、後述の一般式［Ｉ］、具体的には式［ＩＩ］−［ＶＩＩ］で示される化学構造を有する物質を見い出した。これら［ＩＩ］−［ＶＩＩ］で示される物質は従来全く知られていないこから、本物質をＦＫＩ−２３４２Ａ物質、ＦＫＩ−２３４２Ｂ物質、ＦＫＩ−２３４２Ｃ物質、ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質およびＦＫＩ−２３４２Ｆ物質と夫々称することとし、その総称をＦＫＩ−２３４２物質と称することとした。本発明では、このようながん細胞と正常細胞のＤＮＡ修復機構の違いに着目し、既存の抗がん剤のがん細胞への特異性を高めることを可能としたＦＫＩ−２３４２物質およびその製造法を提供することを目的としている。
本発明は上述したような知見にもとづいて完成されたものであり、下記一般式［Ｉ］
2007097010.tif 000002
（式中ｎは１〜３、Ｒ１はＣＨ３−またはＣＨ３ＣＨ２−、Ｒ２はＣＨ３−またはＨ−）で表されるＦＫＩ−２３４２物質を提供するものである。
また本発明は、一般式［Ｉ］で表される化合物において、ｎ、Ｒ１、Ｒ２が夫々下記
ｎ      Ｒ１            Ｒ２        化合物番号
ＦＫＩ−２３４２Ａ    １      ＣＨ３−        ＣＨ３−      ［ＩＩ］
ＦＫＩ−２３４２Ｂ    ２      ＣＨ３−        Ｈ−          ［ＩＩＩ］
ＦＫＩ−２３４２Ｃ    ２      ＣＨ３ＣＨ２−  Ｈ−          ［ＩＶ］
ＦＫＩ−２３４２Ｄ    ２      ＣＨ３−        ＣＨ３−      ［Ｖ］
ＦＫＩ−２３４２Ｅ    ３      ＣＨ３−        Ｈ−          ［ＶＩ］
ＦＫＩ−２３４２Ｆ    １      ＣＨ３ＣＨ２−  Ｈ−          ［ＶＩＩ］
で表されるＦＫＩ−２３４２Ａ〜Ｆ物質を提供するものである。
更に本発明は、細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する作用を有する一般式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質または一般式［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で夫々表されるＦＫＩ−２３４２Ａ〜Ｆ物質を提供するものである。
また、本発明は、一般式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質、または一般式［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表されるＦＫＩ−２３４２Ａ〜Ｆ物質を作用させることによる、がん細胞のＧ２チェックポイントを特異的に阻害する方法を提供するものである。
また、本発明は、アスペルギルス属に属し、前述の一般式［Ｉ］、具体的には［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＫＩ−２３４２物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−２３４２物質を採取するＦＫＩ−２３４２物質の製造法を提供するものである。
また、本発明は、アスペルギルス属に属し、前述の一般式［Ｉ］、具体的には［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有するアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＫＩ−２３４２またはその変異株であるＦＫＩ−２３４２物質の製造法を提供するものである。
また、本発明は、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＫＩ−２３４２菌株を提供するものである。
前記の一般式［Ｉ］、具体的には式［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表される新規ＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する微生物（以下「ＦＫＩ−２３４２物質生産菌」と称する）はアスペルギルスに属するが、本発明のＦＫＩ−２３４２物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明のＦＫＩ−２３４２物質を生産するために使用される菌株の好適な一例としては、本発明者らによって長崎市の土壌より新たに分離されたアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＫＩ−２３４２株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと以下のとおりである。
１．形態的特徴
本菌株は、ツァペック・イーストエキス寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖２０％入りツァペック・イーストエキス寒天培地などで良好に生育し、各寒天培地での分生子の着生は良好であった。
ツァペック・イーストエキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有していた。分生子柄は基底菌糸より直生し、その長さは、１０００−２０００×８．８−１６μｍで基部には逆Ｔ字型の足細胞を生じる。分生子柄の先端は、球形から亜球形に肥大し、直径３２．５−５０μｍの頂嚢を形成する。アスペルギラは、複列性で、メトレ（７−９×３．５−５μｍ）とアンプル型のフィアライド（５．５−８×３−４μｍ）からなる。アスペルギラは頂嚢の全体を覆う。フィアライドの先端からは分生子が形成され、培養時間の経過とともに連鎖状となる。分生子は、球形から亜球形、褐色から黒色、大きさ３−４μｍで表面は粗面であった。
２．培養性状
各種寒天培地上で、２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察結果を次表に示す。
2007097010.tif 000003
2007097010.tif 000004
なお、本菌株はツアペック・イーストエキス寒天培地、５℃で１４日間培養したが、生育しなかった。３７℃では、良好な生育を示し、分生子の着生も良好であった。
３．生理的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ３〜８、温度２４〜４１℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ２〜９、温度１４〜４３．５℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
４．結論
上記ＦＫＩ−２３４２株の形態的特徴、培養性状及び生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）属に属する一菌株と同定し、アスペルギルス・ニガーＦＫＩ−２３４２と命名した。
国際寄託
本菌株はアスペルギルス  ニガーＦＫＩ−２３４２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＦＫＩ−２３４２）として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号（郵便番号２９２−０８１８）に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕｔｉｏｎ  ＮＩＴＥ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ（ＮＰＭＤ））に２００６年２月１３日に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１９５が付与された。
本発明で使用されるＦＫＩ−２３４２物質生産菌としては、前述のアスペルギルス  ニガーＦＫＩ−２３４２菌株が好ましい例として挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどを用いる人工的変異処理にに容易に変異するものである。これらの処理より取得できる人工的変異株は勿論、細胞融合株、遺伝子操作株、自然変異株も含め、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に属し、前記の式［ＩＩ］〜［ＶＩＩ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明を実施するに当たっては、先ずアスペルギルス  ニガーに属するＦＫＩ−２３４２物質生産菌を培地に培養することにより行われる。上記ＦＫＩ−２３４２物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。上記の同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他ＦＫＩ−２３４２物質の生産に好適なものが適宜に添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物と同様に、通気攪拌培養するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者とも同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメンターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み窓、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。
培養温度は、本ＦＫＩ−２３４２物質生産菌が本ＦＫＩ−２３４２物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は４〜７日程度である。このようにして得られたＦＫＩ−２３４２物質は、培養菌体および培養濾液に存在する。培養物から目的とするＦＫＩ−２３４２物質を採取するには、全培養物をアセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒で留去後、続いて残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。
上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、ＦＫＩ−２３４２物質を分離、精製することができる。
本発明のＦＫＩ−２３４２物質の理化学的性状について説明する。
ＦＫＩ−２３４２Ａ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１１Ｈ１６Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２４５．１０２５  実測値２４５．１０２４
（３）分子量：２４４
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２４４を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）２０３ｎｍ（ε  ６，０００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４５０、２９５６、１７３５、１４３８、１２６１、１２０７ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋１．８（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000005
2007097010.tif 000006
以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ａ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ａ物質は下記式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2007097010.tif 000007
ＦＫＩ−２３４２Ｂ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１２Ｈ１８Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２５９．１１８２  実測値２５９．１１８３
（３）分子量：２５８
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２５８を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）２０４ｎｍ（ε  ８，９００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４８２、２９５２、１７３１、１７１６、１４３８、１２０９ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝−１．７（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000008
2007097010.tif 000009
以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ｂ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ｂ物質は下記式［ＩＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2007097010.tif 000010
ＦＫＩ−２３４２Ｃ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１３Ｈ２０Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２７３．１３３８  実測値２７３．１３３５
（３）分子量：２７２
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２７２を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）２０１ｎｍ（ε  ７，７００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４４８、２９３１、１７３１、１７１６、１２６１、８０２ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝−６．０（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000011
以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ｃ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ｃ物質は下記式［ＩＶ］で表される化学構造であることが決定された。
2007097010.tif 000012
ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１３Ｈ２０Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２７３．１３３８  実測値２７３．１３４２
（３）分子量：２７２
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２７２を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）２０２ｎｍ（ε  １７，０００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４５５、２９５２、２８６１、１７３７、１４３８、１２０７ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋３．０（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000013
2007097010.tif 000014
以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質は下記式［Ｖ］で表される化学構造であることが決定された。
2007097010.tif 000015
ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１４Ｈ２２Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２８７．１４９５  実測値２８７．１４９８
（３）分子量：２８６
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２８６を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）１９８ｎｍ（ε  １２，９００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４８２、２９３３、２８５７、１７１６、１４３８、１２０３ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋４．９（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000016
以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質は下記式［ＶＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2007097010.tif 000017
ＦＫＩ−２３４２Ｆ物質
（１）性状  ：黄色シロップ状
（２）分子式：Ｃ１１Ｈ１６Ｏ６
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値２４５．１０２５  実測値２４５．１０３４
（３）分子量：２４４
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］２４４を実測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定
λｍａｘ（ε）１９９ｎｍ（ε＝１１，０００）
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定
νｍａｘ３４４２、２９５６、１７１６、１４４４、１２４３、１２０３ｃｍ−１
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＝−３．１（ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、クロロホルムや酢酸エチルに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）値は下記に示すとおりである。ただし、ｓはシングレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレット、Ｊ値は結合定数を示す。
2007097010.tif 000018
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以上のように、ＦＫＩ−２３４２Ｆ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−２３４２Ｆ物質は下記式［ＶＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
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ＦＫＩ−２３４２物質の生物学的性状について説明する。
がん細胞を用いた抗がん剤処理によるＧ２期停止活性測定方法は菅沼らの方法
（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３巻，５８８７−５８９１ページ，１９９９年）に従った。
１．Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いたＧ２チェックポイント阻害活性
細胞培養及び評価方法
ヒトリンパ腫由来のＪｕｒｋａｔ細胞は、７５ｃｍ３培養フラスコを用いてＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＩＷＡＫＩ社）５００ｍｌに非動化した牛胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）５０ｍｌとペニシリン（１００００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）混液（インビトロジェン社）５ｍｌを加えた培地で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、アスピレーターで上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、これにｂｌｅｏｍｙｃｉｎ（日本化薬社）あるいはｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度がそれぞれ４０μＭまたは０．５μＭとなるように細胞懸濁に添加した。この懸濁液は、あらかじめＦＫＩ−２３４２Ａ物質〜Ｆ物質を添加し風乾させた９６穴マルチプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）の各ウエルに２００μｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）加えられ、３７℃で２０時間培養した。
ＦＡＣＳによる細胞周期測定法
２０時間培養後の細胞を１０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、アスピレーターで上清を除いた。Ｋｒｉｓｈａｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（Ｗａｋｏ社）５００ｎｇ，ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ社）１．５ｍｌ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ社）１０ｍｇとｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社）２５ｍｇと滅菌水５００ｍｌに溶解したもの）を各ｗｅｌｌに２００μｍ加えた後、アルミホイルで遮光し、振とう機で軽く振とうしながら室温で１時間放置してＤＮＡを染色した。細胞周期の測定はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用し、細胞１０，０００個を計測することでｓｕｂＧ１、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合を解析ソフトウェアＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔを用いて算出した。
活性
ＦＫＩ−２３４２Ａ物質〜Ｆ物質の実験結果をＧ２／Ｍ期の細胞を指標にして求めた。Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ処理によってＧ２期に停止した細胞数を１００％としたときそのＧ２期の細胞数を５０％にする薬剤濃度をＩＣ５０（ｂｌｅｏ）、同様にｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ処理によってＭ期に停止した細胞数を５０％にする薬剤濃度をＩＣ５０（ｃｏｌ）として算出し、そのＧ２期細胞に対する特異性も選択性として第１表に示した。
このようにＦＫＩ−２３４２物質はＩＣ５０（ｂｌｅｏ）は１．２μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに対しＩＣ５０（ｃｏｌ）は１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌと測定され、抗がん剤によるＧ２期停止作用（Ｇチャックポイント）を選択的に阻害することが明らかとなった。特に、ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質及びＥ物質のＩＣ５０（ｂｌｅｏ）はそれぞれ２５μｇ／ｍｌ及び１．２μｇ／ｍｌと測定されたのに対し、ＩＣ５０（ｃｏｌ）は１７５μｇ及び１０μｇ／ｍｌと測定され、この両濃度間にはそれぞれ７倍および８倍の差が認められ、両物質は非常に選択的にＧ２チェックポイント阻害することが明らかとなった。
【表１】
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２．ＨＣＴ−１１６細胞を用いたＧ２チェックポイント阻害活性
細胞培養及び評価方法
ヒト大腸癌由来のＨＣＴ−１１６細胞は、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（インビトロジェン社）５００ｍｌに非動化した牛胎児血清（ＦＢＳ）５００ｍｌとペニシリン（１００００単位）／ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを加えた培地）を用いて７５ｃｍ２の培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）に１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞液１５ｍｌとに、０．５％ＣＯ２、３７℃で培養し、３日後に継代を行った。
２４穴マルチプレート（ＩＷＡＫＩ社、日本国）にＨＣＴ−１１６細胞が１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、各ウエル５００μｌ添加し、３７℃、２４時間培養した。その後、培地を除去し、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地で調製した２７μＭのｂｌｅｏｍｙｃｉｎあるいは０．５μＭのｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを各ウエルに２５０μｌ添加し、さらに、０．５％ＤＭＳＯに溶解させたＦＫＩ−２３４２Ａ物質〜Ｆ物質を２５０μｌ添加した（最終濃度ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  １３μＭ、ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ  ０．２５μＭ、０．２５％ＤＭＳＯ）。そのプレートを０．５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。培養後、上清は１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに回収し氷上に保存した。プレート上の細胞は、ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液１５０μｌを添加し、３７℃、１０分間培養することで剥離させた。細胞を剥離させた後ただちに３００μｌの培地を加えてｔｒｙｐｓｉｎを失活させ、これを氷上で保存しておいた上清と混和した。１０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、上清をアスピレーターで除き２００μｌのＫｒｉｓｈａｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔを加え、氷上で１時間静置した後ＦＡＣＳを用いて測定を行った。
ＦＡＣＳによる細胞周期測定法
細胞周期の測定はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用し、細胞１０，０００個を計測することで、ｓｕｂＧ１、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合を解析ソフトウェアｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔを用いて算出した。
活性
ＦＫＩ２３４２Ａ物質〜Ｆ物質の実験結果をＧ２／Ｍ期の細胞を指標にして求めた。Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ処理によってＧ２期に停止した細胞数を１００％としたとき、そのＧ２期の細胞数を５０％にする薬剤濃度をＩＣ５０（ｂｌｅｏ）、同様にｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ処理によってＭ期に停止した細胞数を５０％にする薬剤濃度をＩＣ５０（ｃｏｌ）として算出し、そのＧ２期細胞に対する特異性も選択性として第２表に示した。
ＦＫＩ−２３４２物質のＩＣ５０（ｂｌｅｏ）は２μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌに対し、ＩＣ５０（ｃｏｌ）は２０μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌと測定され、Ｇ２チエックポイントを選択的に阻害した。これらのうち、特にＦＫＩ−２３４２Ｄ物質及びＥ物質のＩＣ５０（ｂｌｅｏ）はそれぞれ２５μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌを測定されたのに対し、ＩＣ５０（ｃｏｌ）は１００μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌ及と測定され、この両濃度比（ＩＣ５０（ｃｏｌ）／ＩＣ５０（ｂｌｅｏ））には４倍および１０倍の差が認められ、両物質ともＧ２チェックポイントを非常に選択的に阻害することが明らかとなった。
以上、ＦＫＩ−２３４２Ａ物質〜Ｆ物質はヒトリンパ腫由来のＪｕｒｋａｔ細胞およびヒト大腸由来のＨＣＴ−１１６細胞の両細胞において選択的にＧ２チェックポイントを阻害することが明らかとなった。またその活性と選択性は、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質が優れたものであった。
【表２】
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【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０００５】
培養
種培養は５００ｍｌ三角フラスコ２本にそれぞれ１００ｍｌのＧＰ培地（グルコース  ２％、イーストエキス  ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ポリペプトン  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％およびアガー  ０．１％）を入れ、高圧蒸気滅菌後、ＬｃＡ培地（グルコース０．１％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０８％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＫＣｌ  ０．０２％、ＮａＮＯ３  ０．２％、イーストエキス  ０．０２％およびアガー  １．５％）で保存したＦＫＩ−２３４２株を一白金耳接種し、２７℃で３日間振盪培養した。本培養は３０Ｌ  ｊａｒ  ｆａｒｍｅｎｔｅｒ（ＭＩＴＳＵＷＡ社、日本国）１基を用いて２０Ｌの培地を仕込み、これに種培養液を終濃度１％となるように植菌した。培養条件は培養濃度を２７℃、培養日数を６日間とし、回転数２５０ｒｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎで通気攪拌培養した。
単離精製
７日間生産培養した培養液２０Ｌを等量のアセトンで抽出し、減圧濾過後アセトンを留去した。これを２０Ｌの酢酸エチルで２回抽出し、その酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧乾固することで、褐色油状物質２０．４ｇを得た。これらを少量のクロロホルムに溶かし、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフイー（８０ｇ、３９ｉ．ｄ．×１８０ｍｍ）を行った。溶出はクロロホルム−メタノール溶媒系で段階溶出（各溶媒量５００ｍｌ、クロロホルム：メタノール＝１００：０、１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、１：１、０：１００）し、活性をクロロホルム：メタノール＝５０：１の溶出画分（Ｆｒ．４）に確認したため、この画分を減圧濃縮し、褐色油状物質５７９ｍｇを得た。
更にこれをメタノールに溶解させ、高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）を用いて以下の条件で精製を行った。カラ厶は、センシュー科学社製ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）を用い、溶媒はアセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ含有）濃度を２０％から５５％へ５０分間上昇させた。また、８．０ｍｌ／ｍｉｎの流速において２１０ｎｍの波長で検出を行った。ＦＫＩ−２３４２Ｄ物質、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質およびＦＫＩ−２３４２Ｆ物質はそれぞれ４０．８分、４２．０分および２４．０分のピークを示したため繰り返し分取した。そのアセトニトリル水溶液を水層にまで減圧下で濃縮し、酢酸エチルにて抽出を行い、濃縮乾固することでＦＫＩ−２３４２Ｄ物質を１５．０ｍｇ、ＦＫＩ−２３４２Ｅ物質を３．８９ｍｇ、ＦＫＩ−２３４２Ｆ物質を６．３６ｍｇ得た。
また、Ｆｒ．４−１、Ｆｒ．４−２、Ｆｒ．４−３はさらに液体クロマトグラフィーを用いて精製を行った。Ｆｒ．４−１の精製には、カラムにセンシュー科学社製ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）を用い、流速は８．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒は３０％アセトニトリル（０．０５％Ｈ３ＰＯ４含有）水溶液、検出は２１０ｎｍの波長で行った。その結果１７分に溶出したピークを繰り返し分取し、アセトニトリル水溶液を水層にまで減圧下で濃縮後、酢酸エチルにて抽出を行ない、濃縮乾固することでＦＫＩ−２３４２Ａ物質を７．３５ｍｇ得た。
次にＦｒ．４−２の精製にセンシュー科学社製ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（４．６ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）カラムを用い、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒は３５％アセトニトリル（０．０５％Ｈ３ＰＯ４含有）水溶液、検出は２１０ｎｍの波長で行った。その結果７．２分に溶出したピークを繰り返し分取し、アセトニトリル水溶液を水層にまで減圧下で濃縮後、酢酸エチルにて抽出を行ない、濃縮乾固することでＦＫＩ−２３４２Ｂ物質を４７．５ｍｇ得た。
最後にＦｒ．４−３の精製には、センシュー科学社製ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）カラムを用い、流速は８．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶媒は３０％アセトニトリル（０．０５％Ｈ３ＰＯ４含有）水溶液、検出は２１０ｎｍの波長で行った。その結果２４分に溶出したピークを繰り返し分取し、アセトニトリル溶液を水層にまで減圧下で濃縮後、酢酸エチルにて抽出を行ない、濃縮乾固することでＦＫＩ−２３４２Ｃ物質を７．３６ｍｇ得た。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明は、アスペルギルス属に属し、一般式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−２３４２物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＫＩ−２３４２物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−２３４２物質を採取することを含む、ＦＫＩ−２３４２物質である。得られたＦＫＩ−２３４２物質はがん細胞を特異的に阻害すため、ＤＮＡ傷害性の抗がん剤や放射線による治療において、その作用を増強させ、副作用が軽減されることが期待される。
【国際調査報告】
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