(57)【要約】タンパク質、特に糖タンパク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質を固定化の際に使用する。具体的には、例えば、導入された不飽和官能基との共重合反応に強固にタンパク質を固定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質。
【請求項２】
糖タンパク質が抗体である請求項１記載の修飾糖タンパク質。
【請求項３】
糖タンパク質にビニル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
【請求項４】
糖タンパク質に還元末端を付与し、次いでビニル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の修飾糖タンパク質が固定された高分子材料。
【請求項６】
請求項１又は２記載の修飾糖タンパク質と重合性モノマーとを重合することにより得られる高分子材料。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の修飾糖タンパク質が搭載されたプロテインチップ。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の修飾糖タンパク質が搭載されたμ−ＴＡＳチップ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のチップを含むプロテインセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質、とりわけ支持体等に固定するのに適した、修飾された糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムプロジェクトの進展により、生物の膨大な遺伝子情報が明らかとなり、その機能の解析が進められている。その機能解析のツールとして、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）と呼ばれるデバイスを使用する方法が一般化しつつある。現在、ＤＮＡチップでは、例えば、ある生理的特徴を備えた細胞とコントロール細胞との間で、細胞内で発現している遺伝子情報をｍＲＮＡ量で比較し、その生理的特徴と遺伝子発現との相関を解析している。しかし、実際に細胞内で機能的に発現しているタンパク質とｍＲＮＡ量との相関は必ずしも高くないことから、目的情報をタンパク質レベルで直接、解析する手法も注目されている。例えば、タンパク質−医薬品の相互作用、タンパク質−タンパク質間の相互作用は、新規の医薬品開発、副作用の減弱化において重要な情報となる。
一方、タンパク質を直接解析するには、適当な担体にタンパク質を固定する必要がある。タンパク質の固定化方法としては、担体にカルボキシル基を露呈させ、タンパク質のアミノ基とカップリングさせる方法（アミノカップリング法：特開平５−３４０９４８号公報）、担体をチオール化し、カルボキシル基をＰＤＥＡ等で修飾したタンパク質とジスルフィド結合を通してカップリングさせる方法（チオールカップリング法）等が知られている。また、上記共有結合による固定ではなく、タンパク質にＨｉｓ−Ｔａｇを導入し、それをＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）で処理した担体にＮｉ２＋を通して結合させる方法も知られている。
上記固定化方法は、例えば、プロテインチップに代表される、固定されたタンパク質との相互作用を調べるためのデバイスを製造する際に適用することできる。その場合、前記デバイスは微量のタンパク質を確実に固定できることが要求され、且つ、得られるデバイスの検出感度が高いことが望まれる。
【発明の開示】
【０００３】
しかし、上述のアミノカップリングによるタンパク質の固定化方法では、酸性タンパク質は固定することができないという制限が生じる。また、チオールカップリングによる固定化方法では、酸性タンパク質は固定化できるものの、多量のタンパク質を必要とする。さらには、Ｈｉｓ−Ｔａｇを用いる固定化方法では、最初は固定されるものの徐々に解離するという問題があった。さらには、タンパク質のランダム位置への化学修飾により、タンパク質が本来の機能（酵素活性、他分子への結合能力等）を損なう虞もある。
したがって、上述の方法は、微量のタンパク質を活性中心が露呈した状態で配向させ、且つその機能を保持したままで支持体に固定するには未だ不十分といえる。
そこで本発明は、上記問題点を解決した修飾糖タンパク質を提供する。
本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、抗体に代表される糖タンパク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入することにより、微量のタンパク質を活性中心が露呈した状態で配向させ、且つその機能を保持したままで糖タンパク質を固定できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質。
上記糖タンパク質としては、例えば抗体が挙げられる。
（２）糖タンパク質にビニル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
（３）糖タンパク質に還元末端を付与し、次いでビニル化剤を作用させることを含む、糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質の製造方法。
（４）前記修飾糖タンパク質が固定された高分子材料。
（５）前記修飾糖タンパク質と重合性モノマーとを重合することにより得られる高分子材料。
（６）前記修飾糖タンパク質が搭載されたプロテインチップ。
（７）前記修飾糖タンパク質が搭載されたμ−ＴＡＳチップ。
（８）前記プロテインチップ又はμ−ＴＡＳチップを含むプロテインセンサー。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願２００６−０２０４４９号及び特願２００６−２４９８４４号の内容を包含する。
本発明は、「糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質」である。
本発明において、「糖タンパク質」とは、糖鎖を結合したタンパク質の総称であり、糖部分が２〜６種類の単糖から構成され、タンパク質と共有結合した複合タンパク質を意味する。具体的にはアルブミン等の血清タンパク質、エリスロポエチン等の造血因子、抗体やインターフェロン等の免疫調節物質、ＴＰＡ等の酵素類、フィブロネクチン、コラーゲン等、様々な種類を例示することができる。但し、これらの種類に限定されるものではなく、あらゆる糖タンパク質を本発明において使用することができる。
本発明では、上記糖タンパク質の糖鎖部の還元末端に不飽和官能基を導入する。導入される不飽和官能基としては、（メタ）アクリル基、（メタ）アクリロイル基、マレオイル基、フマロイル基、ベンゾイル基、２−ナフトイル基、フタロイル基、イソフタロイル基、テレフタロイル基、ニコチノイル基、イソニコチノイル基、２−フロイル基、オレオイル基、シンナモイル基、ベンジロイル基、アントラニロイル基、プロピオロイル基等が挙げられる。これら不飽和官能基の導入は、ビニル化剤を反応させることにより実施することができる。ビニル化剤としては、例えば（メタ）アクリル酸ヒドラジド、マレイン酸モノヒドラジド、マレイン酸ジヒドラジド、フマル酸モノヒドラジド、フマル酸ジヒドラジド、ベンゾヒドラジド、プロピオロヒドラジド、オレオヒドラジド、シンナモヒドラジド、２−ナフトイルヒドラジド、フタル酸モノヒドラジド、フタル酸ジヒドラジド、イソフタル酸モノヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、テレフタル酸モノヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド、ニコチン酸ヒドラジド、イソニコチン酸ヒドラジド、２−フロイルヒドラジド、アントラニロイルヒドラジドなどが挙げられる。したがって、例えば糖鎖部の還元末端に（メタ）アクリル基を導入する場合は、糖タンパク質の還元末端に（メタ）アクリル酸ヒドラジドを反応させることにより、不飽和官能基を導入することが可能となる。
ここで、糖タンパク質とビニル化剤との反応において、使用するビニル化剤は、反応率を考慮してその使用量を決定すればよい。経済性を考慮すると、糖タンパク質に対して、等モル〜５０倍モルを使用することが好ましい。また、反応に際し、触媒として塩基性化合物を利用することにより、反応速度、反応収率等が向上する。但し、塩基性化合物の使用に際しては、不飽和官能基が導入される糖タンパク質の安定性等を加味して当該塩基性化合物を決定することが好ましい。
塩基性化合物は、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ（土類）金属、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ（土類）金属炭酸化合物、ナトリウムメチラート、マグネシウムメチラート等のアルカリ（土類）金属アルコキシ化合物、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水素化物、さらにはトリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン等の有機３級アミン等が挙げられる。また、それらを組み合わせて用いることも可能である。
経済性の観点から、好ましくは炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを使用することが好ましい。また、使用量は糖タンパク質に対して等モル〜１００倍モルの範囲が好ましい。
反応温度は、反応速度、反応率等を考慮して任意に設定することができ、限定されるものではないが、例えば１０℃〜３０℃が好ましい。
また、本発明においては、糖タンパク質に還元末端を付与し、次にビニル化剤を作用させることも可能である。上記ビニル基の導入反応に際し、糖タンパク質を予め修飾しておくことも可能である。例えば、糖タンパク質を構成している糖の一部を過ヨウ素酸により酸化、開環し、アルデヒド基を露呈させた糖タンパク質を合成する。過ヨウ素酸による開環反応の詳細に関しては、例えば、一般的な実験書等に記載されており、糖タンパク質の安定性を考慮し、反応条件を設定することができる。次いで、過剰量の過ヨウ素酸をエチレン等で除去し、透析処理を行い精製する。次に精製した糖タンパク質に上記ビニル基を有する化合物（例えばヒドラジン誘導体）を反応させることにより、糖タンパク質にビニル基を導入することができる。
上記の反応により調製された修飾糖タンパク質は、透析等の方法により単離・精製することができる。
糖鎖の還元末端に不飽和官能基が導入されたことの確認手法は特に限定されるものではなく、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーにより確認することができる。
本発明の修飾糖タンパク質は、糖鎖部に不飽和官能基が導入されているため、不飽和官能基を利用して共重合反応により、強固に修飾糖タンパク質を支持体に固定できることが可能である。
例えば、アクリルアミドに代表される重合性モノマーと、本発明の修飾糖タンパク質とを共重合することにより、糖タンパク質が支持体に固定（包含）された高分子材料を得ることができる。より具体的には、前記重合性モノマー、架橋剤及び本発明の修飾糖タンパク質を含むゲル前駆体溶液を共重合反応に供することにより、修飾糖タンパク質がポリマーのネットワークに固定された高分子材料（ゲル状物）を作製することができる。
さらに、（メタ）アクリル基、（メタ）アクリロイル基等の官能基が表面に露呈したプラスチック、ガラス、金属等の支持体に対して、本発明の修飾糖タンパク質を反応させることにより、糖タンパク質の固定が可能となる。
例えば、ガラス表面にメタクリル基を導入する方法としては、メタクリル末端を有するシランカップリング剤による処理等が挙げられる。これらの支持体としては、例えば平面状、線状、円状等、いずれの形態でも良い。
上述では、１種類の糖タンパク質を支持体に固定する方法を例示したが、本発明は、例えば、複数種の糖タンパク質を同一支持体に固定したもの、いわゆるタンパク質チップ（プロテインチップ）、バイオチップと総称されるデバイスを製造する際に使用することもできる。
また、マイクロ化学チップ、各種センサー等を製造する際にも使用することもできる。
本発明においては、上述のゲルを管状体の中空部に充填し、ゲルを充填した管状体を作製することにより、その管状体をタンパク質の解析ツールとして使用することができる。また、本発明においては、タンパク質が固定されたゲルを平面基盤上に搭載することにより、平面基盤上の複数の区画に固定化ゲルが配置されたプロテインチップを製造することができる。平面基盤としては、複数の溝又は貫通孔を有するものを使用することもできる。その場合、溝又は貫通孔によって形成された区画に、重合前又は重合開始直後のタンパク質を含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施させ、架橋することにより、基盤上にタンパク質を固定したゲルを配置させたチップを作製することできる。
各区画に保持されるタンパク質の種類は、区画毎に異なっていてもよい。また、同一種類の固定化ゲルを複数個、グループ化してチップ上に配置しても良い。
本発明において、管状体は、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等を例示することができる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。本発明において用いることができる繊維としては特に限定されるものではなく、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。
天然繊維以外の中空繊維は、特殊なノズルを用いて公知の方法、例えば、馬蹄型やＣ型ノズル、２重管ノズルなどを用いた紡糸法で製造することができる。
上記の通り調製された管状体は、タンパク質を保持する基本単位となる。管状体を使用する場合、例えば、上記の中空管状体を複数本集束し、該集束物の各管状体の中空部にタンパク質を固定化したゲルを充填し、管状体の長手方向に対して交差する方向に集束物を輪切りする要領でスライスすることにより、薄片を作製することができる。この薄片の製法は、ＤＮＡなどの生体関連物質を固定化したマイクロアレイの製法と同様に適用することが可能である（ＷＯ  ００／５３７３６号公報参照）。なお、本発明においては、個々の管状体にゲルを充填させた後に管状体を集束しても良い。
この際、管状体はランダムに配列させてもよいが、規則的に配列させて接着剤等で固定することにより、例えば縦横に管状体が規則的に配列した配列体を得ることができる。「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる管状体の本数が一定となるように、集束物を順序よく配列させることをいう。
配列体の作製は、例えば以下の通り行う。すなわち、規則的に孔を形成する多孔板を２枚用意して、一方の多孔板の孔の位置と他方の多孔板の孔の位置とが対応するように両方の孔に中空管状体を通す。次に、当該多孔板同士の間隔を調整する。但し、管状体を孔に通す作業と多孔板同士の間隔を調整する作業の順序は逆でもよい。そして、管状体に張力を与え、張力を与えた状態で管状体間（管状体集束物の隙間）に樹脂を充填して集束した管状体を固定し、配列体を得る（特開２００１−２３９５９４号公報）。
配列体の断面形状は特に限定されるものではなく、例えば、管状体を規則的に配列させることにより断面を正方形又は長方形に形成してもよく、中空管状体を同心円状に配列させて断面を円形に形成してもよい。
本発明においては、上述の配列体を長手方向（中空管状体の軸方向）と交差する方向、好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、薄片を得る。切断方法として、例えばミクロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常１〜５，０００μｍ、好ましくは１０〜２，０００μｍである。
得られた薄片は、修飾糖タンパク質を固定化したゲルを保持するプロテインチップとして使用する。
プロテインチップ中のゲルに固定されている修飾糖タンパク質は、該タンパク質と結合する物質（これらを測定対象という）のキャプチャープローブとして機能する。従って、本発明のプロテインチップは、測定対象物質を検出するためのキットとして使用することができる。例えば、検出の目的物質を含む検体を調製し、これをプロテインチップに添加してゲルに固定されている修飾糖タンパク質と反応させる。
より具体的には、プロテインチップに固定される修飾糖タンパク質が抗体であるとすると、測定対象となる抗原を蛍光標識しておいて、プロテインチップ中の抗体と反応させる。その後洗浄して未反応の抗原を除去し、蛍光強度を検出する。蛍光強度は、任意の装置（例えば市販の検出器）を用いて検出することができる。本発明の修飾糖タンパク質が固定されたゲルは、反応性が良好であり、プロテインチップの一区画あたりの蛍光強度が均一になる。その結果、高感度な検出結果を得ることができる。
さらに、本発明の修飾糖タンパク質は、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれるマイクロ流体デバイスに適用することができる。μ−ＴＡＳとは、流体試料の注入、混合、撹拌、分離及び抽出を行う機構部品、並びに流路及び溜池などの流体分析に必要な要素を小型化及び集積化したデバイスである。μ−ＴＡＳは手のひらサイズ以下のサイズで作製できるため、測定試料の微量化、反応時間の短縮、ディスポーザブル化、低コスト化等が可能である。
μ−ＴＡＳは、シリコンウエハー、ガラス、各種プラスチップ材料上に分析標準液貯蔵区画、フローセル、センサー区画等を設けたものである。したがって、μ−ＴＡＳは、分析装置のすべての構成要素を支持体上に集積させたチップとして使用することができる。
前記μ−ＴＡＳは、ＣＡＤ等によるパターン設計、各種エッチング法によるパターン形成、各種バルブ、ポンプ、ミキサー、ディスペンサー、センサー部材の設置等により製造することができる。センサー区画への修飾糖タンパク質は、シランカップリング剤等を利用することにより強固に固定することができる。
上記のようにして作製されたプロテインチップ及びμ−ＴＡＳチップは、タンパク質の検出用デバイスであるプロテインセンサーとして使用することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【０００５】
［実施例１］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）糖鎖への還元末端付与（アルデヒド化ＩＬ６抗体の作製）
ＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製  ＃ＭＡＢ２０６）２０ｍｇをｐＨ４．５の０．１Ｍクエン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解した。次いで過ヨウ素酸ナトリウム５０ｍｇを添加して、攪拌下、室温で４５分間、反応させた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になるように添加し、５℃で７時間攪拌して反応させた。反応後、反応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行ない、アルデヒド化ＩＬ６抗体溶液を得た。
（２）メタクリル酸ヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水物のモル比は、１：５である。
（３）メタクリル化ＩＬ６抗体の調製
（１）で調製したアルデヒド化ＩＬ６抗体溶液に、２５ｍＭ炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（２）で調製したメタクリル酸ヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行った。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してメタクリル化ＩＬ６抗体を得た。
メタクリル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたメタクリル化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５１，０００に現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ６抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
［実施例２］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）メタクリル酸ヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水物のモル比は、１：５である。
（２）メタクリル化ＩＬ６抗体の調製
ＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｍｇを、２５ｍＭ  炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（１）で調製したメタクリル酸ヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行った。その後、透析内液にｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて、５℃で７時間還元反応を行った。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行い、メタクリル化ＩＬ６抗体を得た。
メタクリル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたメタクリル化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，７００現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ６抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
［実施例３、４］
本実施例では、実施例１及び２により得られたメタクリル基が導入されたＩＬ６抗体のアクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、アルデヒド基が導入されたＩＬ６抗体（アルデヒド化ＩＬ６抗体）（比較例１）及び無修飾のＩＬ６抗体（比較例２）のアクリルアミドゲルへの固定及び評価も行った。
表１に示したゲル前駆体水溶液（３種類）を調製し、マイクロピペットにてガラススライド上に各０．１μｌ滴下した。
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて１５分間静置することにより、ＩＬ６抗体が固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとくＩＬ６抗体が固定されたタンパク質チップを作製した。
【表１】
2007086619.tif 000002
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行った。
ここで利用する評価法は、タンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の評価法として一般的に用いられる方法である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ｖｏｌ．２８９，ｐ．１７６０）。
はじめに、０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液にて、アクリルアミドゲル中に固定されずに存在するＩＬ６抗体を洗浄、除去する。
続いて、蛍光標識化されたＣｙ５ＴＭ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ（モレキュラープローブから購入）４０μｇ／ｍｌ溶液を上記タンパク質チップに供し、チップ上に固定されたＩＬ６抗体と結合させる。
さらに、０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液にて、未結合のＣｙ５ＴＭＬａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉｂｏｄｙを洗浄、除去する。
最後に、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー［ＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳＩＶ（ＧＥＮＯＭＩＣ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製）］を使用し測定した。結果は表２に示す。
【表２】
2007086619.tif 000003
以上より、メタクリル基が導入されたＩＬ６抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値は、メタクリル基を導入していないＩＬ６抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値の約５０〜１００倍であった。
よって、メタクリル基が導入されたＩＬ６抗体をアクリルアミドモノマーと共重合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したままで固定できていることが示唆される。
［実施例５］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）糖鎖への還元末端付与（アルデヒド化ＩＬ３抗体の作製）
ＩＬ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｍｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解した。次いで過ヨウ素酸ナトリウム５０ｍｇを添加して、攪拌下、室温で４５分間、反応させた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になるように添加し、５℃で７時間攪拌して反応させた。反応後、反応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行ない、アルデヒド化ＩＬ３抗体溶液を得た。
（２）メタクリル酸ヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水物のモル比は、１：５である。
（３）メタクリル化ＩＬ３抗体の調製
（１）で調製したアルデヒド化ＩＬ３抗体溶液に、２５ｍＭ  炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（２）で調製したメタクリル酸ヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行った。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してメタクリル化ＩＬ３抗体を得た。
メタクリル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ３抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたメタクリル化ＩＬ３抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５１，０００に現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ３抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
［実施例６］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）メタクリル酸ヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとメタクリル酸無水物のモル比は、１：５である。
（２）メタクリル化ＩＬ３抗体の調製
ＩＬ３体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｍｇを、２５ｍＭ  炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（１）で調製したメタクリル酸ヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行った。その後、透析内液にｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて、５℃で７時間還元反応を行った。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行い、メタクリル化ＩＬ３抗体を得た。
メタクリル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ３抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたメタクリル化ＩＬ３抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，７００現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ３抗体にメタクリル基が導入されたことを示唆する。
［実施例７、８］
本実施例では、実施例５ならびに６により得られたメタクリル基が導入されたＩＬ３抗体のアクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、アルデヒド基が導入されたＩＬ３抗体（比較例３）及び無修飾のＩＬ３抗体（比較例４）のアクリルアミドゲルへの固定及び評価も行った。
表３に示したゲル前駆体水溶液（３種類）を調製し、マイクロピペットにてガラススライド上に各０．１μｌ滴下した。
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて１５分間静置することにより、ＩＬ３抗体が固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとくＩＬ３抗体が固定されたタンパク質チップを作製した。
【表３】
2007086619.tif 000004
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行った。
ここで利用する評価法は、前述記載のタンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ｖｏｌ．２８９，ｐ．１７６０）。
本方法により、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー［ＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳＩＶ（ＧＥＮＯＭＩＣ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製）］を使用し測定した。結果は表４に示す。
【表４】
2007086619.tif 000005
以上より、メタクリル基が導入されたＩＬ３抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値は、メタクリル基を導入していないＩＬ３抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値の約４０〜８０倍であった。
よって、メタクリル基が導入されたＩＬ３抗体をアクリルアミドモノマーと共重合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したままで固定できていることが示唆される。
［実施例９］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）糖鎖への還元末端付与（アルデヒド化ＩＬ６抗体の作製）
ＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｍｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ  クエン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解した。次いで過ヨウ素酸ナトリウム５０ｍｇを添加して、攪拌下、室温で４５分間、反応させた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になるように添加し、５℃で７時間攪拌して反応させた。反応後、反応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行ない、アルデヒド化ＩＬ６抗体溶液を得た。
（２）フタル酸モノヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、５ｍＭのフタル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとフタル酸無水物のモル比は、１：２．５である。
（３）フタルロイル化ＩＬ６抗体の調製
（１）で調製したアルデヒド化ＩＬ６抗体溶液に、２５ｍＭ  炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（２）で調製したフタル酸モノヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行った。反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してフタロイル化ＩＬ６抗体を得た。
フタロイル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたフタロイル化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５１，５００に現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ６抗体にフタロイル基が導入されたことを示唆する。
［実施例１０］
糖タンパク質の糖鎖部に不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質の調製
（１）フタル酸モノヒドラジドの調製
１ｍＭヒドラジン水溶液１０μｌ、５ｍＭのフタル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。反応液中のヒドラジンとフタル酸無水物のモル比は、１：２．５である。
（２）フタロイル化ＩＬ６抗体の調製
ＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｍｇを、２５ｍＭ  炭酸緩衝液を添加してｐＨを９．０に調整した。次に（１）で調製したフタル酸モノヒドラジド１ｇを加えて、５℃で２０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行った。その後、透析内液にｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて、５℃で７時間還元反応を行った。反応後、反応液を２０ｍＭ  燐酸緩衝液ｐＨ＝７．３を外液として５℃で一晩透析を行い、フタロイル化ＩＬ６抗体を得た。
フタロイル化処理を行わないアルデヒド化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，５００に現れたが、上述の方法で得られたフタロイル化ＩＬ６抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１５０，９００現れた。本結果は上述の方法により、ＩＬ６抗体にフタロイル基が導入されたことを示唆する。
［実施例１１、１２］
本実施例では、実施例９ならびに１０により得られたフタロイル基が導入されたＩＬ６抗体のアクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、フタロイル基が導入されたＩＬ６抗体（比較例５）及び無修飾のＩＬ６抗体（比較例６）のアクリルアミドゲルへの固定及び評価も行った。
表５に示したゲル前駆体水溶液（３種類）を調製し、マイクロピペットにてガラススライド上に各０．１μｌ滴下した。
滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて１５分間静置することにより、ＩＬ６抗体が固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとくＩＬ６抗体が固定されたタンパク質チップを作製した。
【表５】
2007086619.tif 000006
上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行った。
ここで利用する評価法は、前述記載のタンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ｖｏｌ．２８９，ｐ．１７６０）。
本方法により、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー［ＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳＩＶ（ＧＥＮＯＭＩＣ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製）］を使用し測定した。結果は表４に示す。
【表６】
2007086619.tif 000007
以上より、フタロイル基が導入されたＩＬ６抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値は、フタロイル基を導入していないＩＬ６抗体が固定されたスポットに起因する蛍光値の約３５〜７０倍であった。
よって、フタロイル基が導入されたＩＬ６抗体をアクリルアミドモノマーと共重合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したままで固定できていることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明により、不飽和官能基を有する修飾糖タンパク質が提供される。糖タンパク質の糖鎖部に、不飽和官能基を導入した修飾糖タンパク質を使用することにより、微量のタンパク質を活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したままで固定することができる。
【国際調査報告】
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