(57)【要約】  本発明の目的は、歯根の形成を促進可能であり、歯科治療における様々な場面において好適な、歯根形成促進剤、及び、歯根形成促進方法を提供することにある。即ち、本発明は、線維芽細胞増殖因子の一員である、ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする歯根形成促進剤、及び、ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の歯根形成促進方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする歯根形成促進剤。
【請求項２】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の歯根形成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯根の形成（伸長）が望まれる様々な歯科領域の場面において好適な、歯根形成促進剤、及び、歯根形成促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
偶発的な外傷等による歯の脱臼は、特に小児において、しばしば観察される。脱臼した歯は、可及的に速やかに整復固定を行うことが推奨されているが、歯の内部に存在する神経及び血管に富む歯髄組織が変性をきたし、失活してしまうことが往々にして認められる。このような場合、失活壊死した歯髄組織を除去し、その歯髄腔に水酸化カルシウムを充填するという治療方法が、従来から一般に行われている（例えば、非特許文献１参照）。
ここで、従来から、歯科領域において、歯根の根尖部の更なる伸長を図る治療方法は、アペキソジェネシスと呼ばれており、これに対して、硬組織による根尖部の閉鎖のみを図る治療方法は、アペキシフィケーションと呼ばれている。アペキソジェネシスとアペキシフィケーションは、結果として、歯根の伸長を図れたか否かによって、呼び方が相違する。歯を口腔内に長く、安定して保持するためには、歯槽骨に植立している歯根の面積が大きいことが望ましく、そのため、前記のような脱臼歯の治療において、特に小児の歯のような歯根未完成歯については、歯根伸長を図ることのできるアペキソジェネシスを期待して治療が行われる。
しかし、前記したような従来の治療方法では、アペキソジェネシスはおろか、アペキシフィケーションでさえ図れない症例にしばしば遭遇する。【０００３】
また近年、歯の欠損部に自らの歯を移植する、歯の自家移植が積極的に行われている。その際、移植歯としては第三大臼歯（親知らず、智歯）を用いることが多く、また、歯根が完成していない第三大臼歯を用いることもしばしばある。特に、歯根が完成していない第三大臼歯を移植歯として用いる場合、実際に移植歯が機能を果たすかどうかは、移植歯の歯根がどれだけ伸長するか、また、伸長した歯根が、周囲の歯槽骨や歯周靭帯によりどれだけ支持されるかに左右される。このため移植歯における歯根の伸長や、周囲組織による支持を積極的に誘導するような方法の開発が必要である。【０００４】
歯根の形成（伸長）を促進させることのできる技術としては、これまでにＦＧＦ２を歯根面等に投与する方法が開発されている（特許文献１〜２）。しかしながら、生体内における歯根の形成には、種々の因子が関与していると考えられ、前記したような脱臼歯の治療、歯の自家移植、あるいは歯周疾患の治療など、歯科領域における様々な場面において、より有用なさらなる因子の同定が望まれている。【０００５】
【非特許文献１】Ｉｎｔ  Ｄｅｎｔ  Ｊ．２００５  Ｏｃｔ；５５（５）：２９３−３０１
【特許文献１】特開平７−１７８７６号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０８２３２１号パンフレット
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、前記従来の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、歯科領域における様々な場面において好適な、優れた歯根形成促進剤、及び、歯根形成促進方法を提供することを目的とする。
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らは、骨組織誘導能を有することが知られている数種の生理活性物質、具体的には、ＢＭＰ２、ＦＧＦ２、及びＦＧＦ１８について、哺乳動物の歯根未完成歯における歯根形成促進作用（歯根伸長誘導作用）を検討したところ、これらの中で、特にＦＧＦ１８が、顕著に優れた歯根形成促進作用を有していることを見出した。さらに、ＦＧＦ１８ノックアウトマウスを利用した機能相補実験により、ＦＧＦ１８と同じくＦＧＦ８サブファミリーに属するＦＧＦ８が、ＦＧＦ１８の機能を相補することを見出した。これらの結果から、本発明者らは、ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を歯根の伸長において効果的に使用しうることを想到し、本発明の完成に至った。
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質が積極的な歯根形成促進作用を有することは、従来全く知られていなかった画期的な事実であり、その用途としては、歯科領域において、現状では効果的な治療方法の存在しない、アペキソジェネシス（歯根の根尖部の更なる伸長を図る治療方法）の期待される症状への適用など、その限りない可能性が期待される。
【０００８】
なお、本明細書中において、歯根の「形成」とは、歯根の新たな形成のみを意味するものではなく、既にある歯根の「伸長」をも意味するものであり、また逆に、歯根の「伸長」とは、既にある歯根の伸長のみを意味するものではなく、歯根の新たな「形成」をも意味するものである。したがって、本明細書中において、「形成」及び「伸長」は同意義である。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする歯根形成促進剤である。
＜２＞  ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の歯根形成促進方法である。
【００１０】
本発明によれば、前記従来の諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、歯科領域における様々な場面において好適な、優れた歯根形成促進剤、及び、歯根形成促進方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＦＧＦ１８含浸ビーズが埋入された摘出歯の、腎臓皮膜下への移植培養方法を示した図である。
【図２】図２は、各生理活性物質（ＢＭＰ２、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１８）含浸ビーズが埋入された摘出歯における、移植培養後の歯根形成（伸長）量を示した図である。
【図３】図３は、ＦＧＦ１８含浸ビーズが埋入された摘出歯の、移植培養後の軟Ｘ線写真像である。
【図４】図４は、ＦＧＦ１８含浸ビーズが埋入された摘出歯の、移植培養後の各種組織染色像である。図中の表記は、Ｂ：骨、Ｃ：セメント質、Ｄ：象牙質、ＰＬ：歯根膜、ＣＢ：セメント芽細胞、ＯＢ：骨芽細胞を各々示すものである。
【図５】図５は、ＦＧＦ１８含浸ビーズが埋入されたＧＦＰマウス由来摘出歯の、移植培養後のＧＦＰ陽性を示す骨の形成を示した図である。
【図６】図６は、各生理活性物質（ＦＧＦ２、ＦＧＦ１８）含浸ビーズが埋入された摘出歯における、培養後の移植歯と周囲の骨及び新生血管の形成状態を示した図である。
【図７】図７は、歯根形成を続けるマウス及びラットの切歯歯髄（歯根部を含む）における内在性ＦＧＦ１８の発現を示した、電気泳動像である。
【図８】図８は、生理活性物質（ＦＧＦ８）含浸ビーズが埋入された摘出歯における、培養後の移植歯と周囲の骨及び新生血管の形成状態を示した図である。図中の白線は伸長した歯根の外形を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（歯根形成促進剤）
本発明の歯根形成促進剤は、ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有し、更に必要に応じて、適宜その他の成分を含有する。【００１３】
＜ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質＞
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はその構造上の類似性から、７種類のサブファミリーに分類されている。ＦＧＦ１８は、ＦＧＦ８やＦＧＦ１７と並んでＦＧＦ８サブファミリーの一員であり、骨組織誘導能を有する生理活性物質として知られているが、歯根に対する作用は従来全く知られていなかった。
本発明者らにより、前記ＦＧＦ１８が優れた歯根形成促進作用を有することがはじめて見出された。また、ＦＧＦ１８ノックアウトマウスを利用した機能相補実験により、ＦＧＦ１８と同じくＦＧＦ８サブファミリーに属するＦＧＦ８がＦＧＦ１８の機能を相補することも見出された。したがって、本発明において、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質は、前記歯根形成促進剤の有効成分として使用される。【００１４】
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のもの、その他の哺乳動物由来のものなどを使用することができる。ヒトの治療に用いる場合には、これらの中でも、ヒト由来のものであることが、特に好ましい。なお、ヒトＦＧＦ１８を配列番号：１〜２に、ヒトＦＧＦ８を配列番号：３〜４に、ヒトＦＧＦ１７を配列番号：５〜６に示した。
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質としては、生体等から抽出及び精製されたものであってもよく、また、公知の組換えタンパク質生産技術などを利用して、微生物や培養細胞等から産生されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液などであっても、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質として使用することができる。
また、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質としては、市販品を使用してもよい。前記市販品は、例えば、ぺプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）社、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社などから入手可能である。【００１５】
また、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質としては、その生理活性を有し、かつ歯根形成促進作用を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、天然のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。前記実質的に同一のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列中、数個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたもので、かつ、天然由来の蛋白質の生理活性を有するものをいう。また、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質としては、天然の蛋白質の生理活性を有し、かつ歯根形成促進作用を有するものであれば、前記ポリペプチドの断片であってもよい。また、天然の蛋白質の生理活性を有し、かつ歯根形成促進作用を有するものであれば、そのＮ末端及び／又はＣ末端が修飾されていてもよい。【００１６】
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。【００１７】
前記歯根形成促進剤における前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質の含有量としては、特に制限はなく、前記歯根形成促進剤の所望の剤型などに応じて、適宜選択することができるが、前記歯根形成促進剤中、０．０２５〜３．０質量％が好ましく、０．１〜１．０質量％がより好ましく、０．２５〜０．５質量％が特に好ましい。【００１８】
＜その他の成分＞
前記歯根形成促進剤は、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質そのものであってもよいし、更にその他の成分を含有することもできる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。前記薬学的に許容され得る担体としても、特に制限はなく、前記歯根形成促進剤の所望の剤型などに応じて、適宜選択することができ、例えば、一般に歯科治療領域で使用される薬剤に用いられる、溶剤、等張化剤、乳化剤、懸濁剤、安定化剤、充填剤などが挙げられる。
前記薬学的に許容され得る担体の中でも、具体的には、ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質と親和性を有するヘパリンを含有した、ヘパリン含有吸収性ビーズ、ヘパリン含有吸収性ジェルなどが好ましい。前記ヘパリン含有吸収性ビーズ、ヘパリン含有吸収性ジェルなどとしては、市販品を使用することができ、例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社などから入手することができる。
また、前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記歯根形成促進剤における前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質（有効成分）の含有量が所望の範囲内となるように、目的に応じて適宜選択することができる。【００１９】
＜剤型＞
前記剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の剤型から適宜選択することができ、例えば、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質と前記担体とを任意に組み合わせた、液剤、乳剤、ゲル剤等の外用剤、注入剤、貼布剤、注射剤、粉剤などが挙げられる。前記剤型の製造方法としても、特に制限はなく、公知の製造方法の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
前記剤型の中でも、具体的には、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させた前記ヘパリン含有吸収性ビーズ、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させたヘパリン含有吸収性ジェルなどの型が好ましい。
前記剤型として、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させたヘパリン含有吸収性ビーズやジェルを選択することにより、前記歯根形成促進剤に、徐放性を付与することができる。このことにより、前記歯根形成促進剤を所望の部位に適用した際に、前記歯根形成促進剤が、流出等によって、短時間で適用部位から失われてしまうことがなく、有効成分である前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を、比較的長期間、好ましくは２〜３日間継続して、所望の適用部位に作用させることができる点で、有利である。【００２０】
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させたヘパリン含有吸収性ビーズの製造方法としては、特に制限はなく、例えば、後述する実施例に示すように、市販品として入手したヘパリン含有吸収性ビーズに、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて希釈したＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質の溶液を添加し、インキュベートすることによって、得ることができる。
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させたヘパリン含有吸収性ジェルの製造方法としても、特に制限はなく、例えば、ヘパリンとＩ型コラーゲンがＰＢＳ中で静電気的に結合する性質を利用して、Ｉ型コラーゲンを主成分とするコラーゲンゲルにヘパリン溶液を添加し、インキュベートすることによって、得ることができる（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８６）８８２：１−５参照）。【００２１】
また、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質の溶液の量や前記担体の種類等を任意に組み合わせることによって、前記歯根形成促進剤に所望の程度の徐放性を付与することができ、このことにより、各患者の症状等に応じて、有効成分である前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を所望の期間、適用部位に作用させることが可能となる。【００２２】
（歯根形成促進方法）
本発明の歯根形成促進方法は、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を哺乳動物に投与することを含み、更に必要に応じて、その他の工程を含む。
前記歯根形成促進方法において、哺乳動物の投与に使用する前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質の形態としては、特に制限はなく、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質をそのまま使用してもよいが、前記歯根形成促進剤の好ましい剤型（ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を含浸させたヘパリン含有吸収性ビーズや、ジェルの型）で使用することが、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を比較的長期間、哺乳動物の投与部位に作用させることが可能であるという点で、特に好ましい。【００２３】
＜哺乳動物＞
前記歯根形成促進剤（ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質）の投与対象となる前記哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ペット動物、家畜動物、実験動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、イヌ、ネコ）などが挙げられる。【００２４】
＜投与＞
前記歯根形成促進剤（ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質）の投与部位としては、結果として対象とする歯根の形成促進に作用可能な部位であれば、特に制限はなく、例えば、歯髄中、歯根面、歯槽骨面、それらの近傍部位などが挙げられる。また、前記歯根形成促進剤（ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質）の投与方法としても、特に制限はなく、前記歯根形成促進剤の剤型等に応じて、公知の投与方法の中から適宜選択することができ、例えば、歯髄中への埋入、注入、歯根面や歯槽骨面への塗布などが挙げられる。【００２５】
前記歯根形成促進剤（ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質）の投与量としても、特に制限はなく、投与対象個体の症状、体質、他薬剤の投与の有無、年齢、体重、など、様々な要因を考慮して適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人の場合、１投与部位における投与１回あたり、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質（有効成分）の量として、０．０１〜１．０ｍｇが好ましく、０．０５〜０．５ｍｇがより好ましく、０．１〜０．３ｍｇが特に好ましい。また、他の哺乳動物への投与量としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して適宜選択することができ、例えば一般的には、前記したヒト成人への投与量を参照し、体重あたりで換算した量を投与することができる。これらの中でも、投与対象個体の体重１ｋｇあたり２．５μｇを投与することが、特に好ましい。また、１日あたりの投与回数としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して、適宜選択することができる。【００２６】
［効果］
前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有する本発明の歯根形成促進剤は、優れた歯根形成促進作用を有するため、哺乳動物に投与することによって、該哺乳動物の歯根形成を促進することができる。また、本発明の歯根形成促進剤は、有効成分である前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質の量や前記担体の種類等を任意に組み合わせることにより、所望の程度の徐放性を付与することができ、投与部位に所望の期間、作用させることが可能である。また、本発明の歯根形成促進剤は、安全性に問題の無いＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として使用することから、安全性にも優れるものである。
したがって、前記ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を利用した本発明の歯根形成促進剤及び歯根形成促進方法は、歯根形成の促進が望まれる歯科領域の様々な場面において、広く臨床応用の可能性が期待されるものであり、例えば、以下（１）〜（７）のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）小児歯科領域において、歯根形成過程で外傷や感染などで障害を受け、成長が阻害された歯根未完成歯の伸長を誘導することができる。
（２）矯正歯科領域において、矯正治療に伴う過剰な矯正力を原因とした、吸収歯根の再生を誘導することができる。
（３）一般歯科領域において、歯根嚢胞等の根尖病巣により吸収された歯根の再生を誘導することができる。
（４）一般歯科領域において、歯根破折等の治療として行う意図的再稙術における歯根−歯周組織の再生を誘導することができる。
（５）口腔外科領域において、第３大臼歯（親知らず、智歯）や過剰歯の自家移植における歯根−歯周組織の形成を促進することができる。
（６）再生医学領域において、凍結保存した歯胚の自家移植における歯根−歯周組織の再生を誘導することが期待できる。
（７）一般歯科領域において、歯周病等により吸収されたセメント質、歯根膜及び歯槽骨の再生を誘導することが期待できる。【００２７】
また、本発明の歯根形成促進剤及び歯根形成促進方法は、後述する実施例において示されるように、歯根の形成促進作用のみならず、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の、周囲組織の形成促進作用をも有するものであり、歯科領域の様々な場面において、更に広く臨床応用の可能性が期待されるものである。
また、本発明の歯根形成促進剤及び歯根形成促進方法は、歯根の根尖部の更なる伸長を図るアペキソジェネシスを目的とする治療方法への適用のみならず、硬組織による根尖部の閉鎖のみを図る、アペキシフィケーションを目的とした治療方法にも適用可能であり、更に広く臨床応用の可能性が期待されるものである。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００２９】
（実施例１：ＦＧＦ１８）
＜ＦＧＦ１８含浸ヘパリン含有吸収性ビーズの調製＞
本発明の歯根形成促進剤の好ましい一形態である、ＦＧＦ１８を含浸させたヘパリン含有吸収性ビーズを、以下のようにして調製した。
ＦＧＦ１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を、２５０μｇ／ｍｌの濃度となるように、ダルベッコ変法リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）を用いて希釈した。また、ヘパリン含有吸収性ビーズとして、ヘパリンアクリルビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）を準備し、前記ヘパリンアクリルビーズを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。洗浄後のヘパリンアクリルビーズに、希釈した前記ＦＧＦ１８溶液を添加し、３７℃で４５分間、インキュベートすることにより、ＦＧＦ１８をヘパリンアクリルビーズに含浸させた。得られたＦＧＦ１８含浸ヘパリンアクリルビーズは、使用直前まで４℃にて保管し、使用直前にＤ−ＰＢＳを用いて余剰のＦＧＦ１８を洗浄した後、下記の歯髄への埋入に供した。【００３０】
＜歯髄への埋入＞
歯根形成直前の、生後５日齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、エーテル麻酔後に断頭屠殺した。下顎を摘出後、下顎第１臼歯を、歯小嚢ごと摘出した。ＦＧＦ１８含浸ヘパリンアクリルビーズを、摘出歯一個あたり１粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
また、陰性対照として、Ｄ−ＰＢＳのみを、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。【００３１】
＜移植培養＞
ＦＧＦ１８含浸ヘパリンアクリルビーズを埋入した摘出歯、及び、陰性対照としてＤ−ＰＢＳのみを埋入した摘出歯を、ホストマウスの腎臓皮膜下に移植して、培養した。３週間後、ホストマウスを頸骨脱臼にて屠殺し、腎臓を摘出して、培養後の摘出歯（移植歯）を回収した。なお、成体マウスの器官において、腎臓及び前眼房は免疫応答の非常に少ない組織であることが知られており、前記移植培養実験においては特にヌードマウスを用いる必要はないため、ホストマウスとしては、１０〜１５週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを使用した。
回収された培養後の移植歯における歯根形成（伸長）を、実体顕微鏡下にて観察した。前記移植培養方法を図１に示し、培養後の移植歯、周囲の骨及び新生血管の観察結果を図３〜６に示す。
また、回収された培養後の移植歯の歯根形成（伸長）量（μｍ）を、実体蛍光顕微鏡システムＶＢＧ−２５（キーエンス社製）を用いてデジタル画像上にて観察しつつ、付属の自動計測ソフトを用いて計測した。結果を図２に示す。【００３２】
（比較例１：ＢＭＰ２）
前記ＦＧＦ１８の代わりに、ＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄ社製）を使用して、５００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように希釈し、また、含浸させるビーズとして、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌアガロースビーズ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、比較例１のＢＭＰ２含浸アガロースビーズを調製した。
比較例１のＢＭＰ２含浸アガロースビーズを、実施例１と同様にして、歯髄への埋入及び移植培養に供し、培養後の移植歯の歯根形成（伸長）量を計測した。結果を図２に示す。【００３３】
（比較例２：ＦＧＦ２）
前記ＦＧＦ１８の代わりに、ＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、比較例２のＦＧＦ２含浸ヘパリンアクリルビーズを調製した。
比較例２のＦＧＦ２含浸ヘパリンアクリルビーズを、実施例１と同様にして、歯髄への埋入及び移植培養に供し、培養後の移植歯の歯根形成（伸長）量を計測した。結果を図２に示す。また、培養後の移植歯と周囲の骨、及び新生血管を観察した。結果を図６に示す。【００３４】
［結果（実施例１、比較例１〜２）］
図２の結果から、Ｄ−ＰＢＳのみを使用した陰性対照群（図２中、ＰＢＳ）、及び、比較例１としてＢＭＰ２を使用した実験群（図２中、ＢＭＰ−２）では、わずかな歯根の伸長のみが観察された。また、比較例２としてＦＧＦ２を使用した実験群（図２中、ＦＧＦ−２）では、陰性対照群及びＢＭＰ２を使用した実験群と比較すると、やや有意に歯根の伸長が促進されたが、その程度はＦＧＦ１８を使用した実験群と比較すると劣るものであった。一方、実施例１としてＦＧＦ１８を使用した実験群（図２中、ＦＧＦ−１８）では、他の実験群と比較して、顕著に歯根の伸長が促進された。
なお、図２中、各「○」は、各実験群における個々の移植歯サンプルの測定値を示し、「＊」は、各実験群における全移植歯サンプルの平均値を示した。【００３５】
また、実施例１でＦＧＦ１８含浸ヘパリンアクリルビーズが投与され、歯根伸長が促進された全移植歯サンプルにおいて、形成された歯根の周囲に、骨の形成が観察された。これを軟Ｘ線写真撮影し、内部に歯根伸長が確認されたかどうかを検討したところ、形成された骨内部の移植歯牙に、歯根の伸長が認められた（図３）。また、形成された歯根と周囲の骨との間には、歯周靭帯様の線維芽細胞が存在していることが、ＨＥ染色による組織学的観察によって確認された（図４、左）。なお、図４の左においては、図中の矢印部分に、埋入されたＦＧＦ１８含浸ヘパリンアクリルビーズを示す。また、これらの歯周靭帯様の線維芽細胞は、歯周靭帯のマーカー遺伝子であるペリオスチン（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）遺伝子を発現していることが、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって確認された（図４、中）。更に、周囲の骨の表面には、骨シアロタンパク質（Ｂｏｎｅ  ｓｉａｒｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＳＰ）陽性の細胞が存在していることも、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって確認された（図４、右）。図４の中及び右においては、図中の濃い色の部分が、それぞれの遺伝子の発現細胞を示す。
また、緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）マウスの歯胚をドナー歯としてＦＧＦ１８を投与した場合には、移植歯の周囲において形成される周囲の骨（図５、左）は移植歯の組織に由来することが、蛍光実体顕微鏡ＭＺＦＬＩＩＩ（ライカ社製）によって確認された（図５、右）。【００３６】
また、図６の結果から、Ｄ−ＰＢＳのみを使用した陰性対照群（図６左、ＰＢＳ：血管新生（＋−））、及び、比較例２としてＦＧＦ２を使用した実験群で血管新生が顕著でなかった群（図６右、ＦＧＦ２：血管新生（＋−））では、わずかな歯根の伸長のみが観察された。また、比較例２としてＦＧＦ２を使用した実験群で血管新生が顕著であった群（図６右から２番目、ＦＧＦ２：血管新生（＋＋））では、陰性対照群及びＦＧＦ２を使用した実験群で血管新生が顕著でなかった群と比較すると、有意に歯根の伸長及び周囲の骨形成が促進されたが、その程度はＦＧＦ１８を使用した実験群と比較するとやや劣るものであった。一方、実施例１としてＦＧＦ１８を使用した実験群（図６左から２番目、ＦＧＦ１８：血管新生（＋−））では、血管新生は顕著でなかったにも関わらず、他の実験群と比較して、顕著に歯根の伸長や周囲の骨の形成が促進された。【００３７】
これらの結果から、ＦＧＦ１８を有効成分とする本発明の歯根形成促進剤は、優れた歯根形成（伸長）促進作用を有し、かつ、形成された歯根を支持する、歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進作用をも有していることが示された。【００３８】
（参考例１：内在性ＦＧＦ１８遺伝子の発現）
また、参考例１として、歯根形成段階の哺乳動物の歯根部（歯髄を含む）における、内在性ＦＧＦ１８発現の有無を調べた。
歯根形成を続けることで知られているマウス（１０週齢）より切歯を抜去し、実体顕微鏡下で、歯冠部及び歯根部の歯髄と根尖部組織を分離した。得られた歯冠部及び歯根部の歯髄と根尖部組織サンプルは、ＲＮａｓｅ阻害活性を有するＲＮＡｌａｔｅｒ（キアゲン社製）を用いて、保存した（４℃）。
得られた歯冠部及び歯根部サンプルから、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出には、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ（富士写真フイルム社製）を用いた。即ち、溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）の存在下で、使い捨てプラスチック製乳棒（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｐｅｓｔｌｅ）を用いて、歯冠部及び歯根部サンプルを、硬組織を含めて完全に破砕し、得られた破砕液を遠心した。遠心後、得られた上清を、所定量のエタノールと混和した後、前記ＱｕｉｃｋＧｅｎｅのカラムにアプライした。抽出したＲＮＡは、分光光度計にて、濃度及び２６０／２８０比を測定した。次いで、３００ｎｇのＲＮＡを用いて、歯冠部及び歯根部サンプルのｃＤＮＡを作製した。なお、ｃＤＮＡ作製には、前記２６０／２８０比が１．８以上のＲＮＡサンプルを使用した。ｃＤＮＡ作製のための逆転写には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。各サンプル中のＦＧＦ−１８発現量は、定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）法により調べた。ＦＧＦ１８特異的プライマーは、インターネットの設計ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ参照）を用いて、作製した。定量的ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で行った。また、ＦＧＦ１８の発現量は、内部標準であるβ−アクチンの発現量に対する相対的な発現量として、比較検討した。
また、歯根形成段階のラット（６週齢）を用いて、前記マウスの場合と同様にして、歯冠部及び歯根部の歯髄における内在性ＦＧＦ１８の発現を調べた。結果を図７に示す。【００３９】
定量的ＰＣＲの結果、マウス及びラットの歯根形成中の歯根部（歯髄を含む）において、内在性ＦＧＦ−１８の遺伝子発現が確認された（図７）。なお、この、哺乳動物の歯根形成途中の歯根部（歯髄を含む）に、ＦＧＦ１８が特異的に発現しているという事実は、従来知られておらず、本発明者らによる全く新しい知見である。【００４０】
（実施例２：ＦＧＦ８）
前記ＦＧＦ１８の代わりに、ＦＧＦ８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、本発明の歯根形成促進剤の好ましい一形態である、実施例２のＦＧＦ８含浸ヘパリンアクリルビーズを調製した。
実施例２のＦＧＦ８含浸ヘパリンアクリルビーズを、実施例１と同様にして、野生型マウスからの摘出歯胚の歯髄への埋入及び移植培養に供し、培養後の移植歯と周囲の骨を軟Ｘ線撮影によって観察した。また、野生型マウスからの摘出歯胚の代わりに、ＦＧＦ１８遺伝子破壊マウスの胎児から胎齢１８．５日に摘出した歯胚を使用して、同様に実験を行った。結果を図８に示す。【００４１】
［結果（実施例２）］
実施例２として、野生型マウスからの摘出歯胚にＦＧＦ８を使用した実験群（図８右、Ｗｔ）では、歯根の伸長が観察され、このことから、ＦＧＦ８にも、ＦＧＦ１８同様の歯根伸長促進効果が確認された。また、ＦＧＦ１８遺伝子欠損マウスからの摘出歯胚にＦＧＦ８を使用した実験群（図８左、ＦＧＦ１８−／−）でも、同様に歯根の伸長が観察され、ＦＧＦ８は、ＦＧＦ１８の生理機能を補完する活性を持つことが示された。【００４２】
前記実施例１、比較例１、及び比較例２の結果から、ＦＧＦ１８を有効成分として含有する本発明の歯根形成促進剤は、歯根の形成促進、及び、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進に、非常に有効であることが示された。
また、更に、参考例１の結果により、ＦＧＦ１８が、歯根形成段階の哺乳動物の歯根形成に関与している、重要な因子であることがはじめて明らかとなり、この事実からも、ＦＧＦ１８を有効成分として含有する本発明の歯根形成促進剤が、優れた歯根形成促進作用を有することが、より確実に実証された。
また、実施例２の結果から、ＦＧＦ８についても、ＦＧＦ１８と同様な歯根形成促進作用を有していることが示された。このことから、ＦＧＦ８ファミリーに属する蛋白質（ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８）の、歯根形成促進、及び、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進に対する有効性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の歯根形成促進剤及び歯根形成促進方法は、歯根形成の促進が望まれる歯科領域の様々な場面において、広く臨床応用の可能性が期待されるものであり、例えば、以下（１）〜（７）のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）小児歯科領域において、歯根形成過程で外傷や感染などで障害を受け、成長が阻害された歯根未完成歯の伸長を誘導することができる。
（２）矯正歯科領域において、矯正治療に伴う過剰な矯正力を原因とした、吸収歯根の再生を誘導することができる。
（３）一般歯科領域において、歯根嚢胞等の根尖病巣により吸収された歯根の再生を誘導することができる。
（４）一般歯科領域において、歯根破折等の治療として行う意図的再稙術における歯根−歯周組織の再生を誘導することができる。
（５）口腔外科領域において、第３大臼歯（親知らず、智歯）や過剰歯の自家移植における歯根−歯周組織の形成を促進することができる。
（６）再生医学領域において、凍結保存した歯胚の自家移植における歯根−歯周組織の再生を誘導することが期待できる。
（７）一般歯科領域において、歯周病等により吸収されたセメント質、歯根膜および歯槽骨の再生を誘導することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月13日(2007.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする歯根形成促進剤。
【請求項２】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ１８である、請求項１に記載の歯根形成促進剤。
【請求項３】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ８である、請求項１に記載の歯根形成促進剤。
【請求項４】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ１７である、請求項１に記載の歯根形成促進剤。
【請求項５】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の歯根形成促進方法。
【請求項６】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ１８である、請求項５に記載の歯根形成促進方法。
【請求項７】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ８である、請求項５に記載の歯根形成促進方法。
【請求項８】
ＦＧＦ８サブファミリーに属する蛋白質がＦＧＦ１７である、請求項５に記載の歯根形成促進方法。
【国際調査報告】
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