(57)【要約】  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲でイオン交換樹脂に接触させる工程を含む該オリゴペプチドの精製方法；（ａ）オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を、イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、および（ｂ）イオン交換樹脂に接触した該オリゴペプチドを溶出溶媒で流出させる工程を含む該オリゴペプチドの精製方法；弱酸性陽イオン交換樹脂を用いた上記の方法；弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いた上記の方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲でイオン交換樹脂に接触させる工程を含む該オリゴペプチドの精製方法。
【請求項２】
（ａ）オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を、イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、および（ｂ）イオン交換樹脂に接触した該オリゴペプチドを溶出溶媒で流出させる工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
イオン交換樹脂が弱酸性陽イオン交換樹脂である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
イオン交換樹脂がカルボキシル基またはフェノール性水酸基を有する樹脂である請求項３記載の方法。
【請求項５】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが４〜１４の範囲である請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが５〜１２の範囲である請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
イオン交換樹脂が弱塩基性陰イオン交換樹脂である請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
イオン交換樹脂がアミノ基、低級アルキルアミノ基およびジ低級アルキルアミノ基からなる群から選択される基を有する樹脂である請求項７記載の方法。
【請求項９】
イオン交換樹脂がアミノ基、メチルアミノ基およびジメチルアミノ基からなる群から選択される基を有する樹脂である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが０〜９の範囲である請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが１〜７の範囲である請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
中性アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その光学異性体であるＤ−アミノ酸、およびそれらのラセミ混合物、グリシンならびにβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
中性アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−チロシン、ＤＬ−アラニン、ＤＬ−バリン、ＤＬ−ロイシン、ＤＬ−イソロイシン、ＤＬ−チロシンおよびグルタミンからなる群から選ばれるアミノ酸である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
オリゴペプチドがジペプチドまたはトリペプチドである請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
オリゴペプチドがジペプチドである請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ジペプチドがＸ−Ｙ（式中、Ｘはアラニンを表し、ＹはＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−チロシン、ＤＬ−バリン、ＤＬ−ロイシン、ＤＬ−イソロイシン、ＤＬ−チロシンまたはグルタミンを表す）で表されるジペプチドである請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
オリゴペプチドを構成するアミノ酸がＬ−アミノ酸である請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
オリゴペプチドが（Ａ）無保護のＬ−アミノ酸に枯草菌由来のペプチド合成酵素を作用させて製造する方法で得られたオリゴペプチド、（Ｂ）Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸にＬ−アミノ酸アミドハイドラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｃ）Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸にジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｄ）アミノ酸エステルハイドラーゼを作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｅ）エンペドバクター属に属する細菌から得られた酵素を作用させて製造されたオリゴペプチド、および（Ｆ）化学合成により得られたオリゴペプチドからなる群から選ばれるオリゴペプチドである請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法を用いる工程を含むオリゴペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法で製造されたオリゴペプチド。
【請求項２１】
不純物としてアミノ酸を含有しない請求項２０記載のオリゴペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含有する溶液からオリゴペプチドを単離・精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴペプチドを製造する方法としては、例えば（ａ）無保護のＬ−アミノ酸から枯草菌由来のペプチド合成酵素を用いて製造する方法（非特許文献１参照）、（ｂ）Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸からＬ−アミノ酸アミドハイドラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を用いて製造する方法（特許文献１参照）、（ｃ）Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を用いて製造する方法（特許文献２〜４参照）、（ｄ）アミノ酸エステルハイドラーゼを用いて製造する方法（特許文献５参照）、（ｅ）エンペドバクター属に属する細菌から得られた酵素を用いて製造する方法（特許文献６〜９参照）などが知られている。また上記（ａ）の例として、（ｆ）枯草菌由来のジペプチド合成酵素遺伝子ｙｗｆｅとアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｌｄを発現した大腸菌をグルコースおよびアンモニア塩を含む培地中で基質アミノ酸の存在下に培養してジペプチドを生成する方法（例えば特許文献１０参照）なども知られている。さらに（ｇ）化学合成により製造する方法（非特許文献２参照）、上記（ａ）〜（ｆ）の方法に化学合成の手法を組み合わせて製造する方法などが知られている。これらの方法では、生成するオリゴペプチドと残留する不純物（例えば基質など）との分離が必要となる。特に、酵素を用いた製造法（例えば、上記（ａ）〜（ｆ））においては、生成するオリゴペプチドと基質の分離がしばしば問題となる。【０００３】
生成したオリゴペプチドと基質のアミノ酸との分離精製方法としては、例えばゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、合成吸着樹脂を用いたクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーによる分離精製方法、生成したオリゴペプチドの結晶化による精製方法などが知られている（例えば非特許文献２参照）。しかしながら、クロマトグラフィーによる精製方法では、担体や溶媒の選択に十分な検討が必要となったり、また満足いく精製を行うことが困難であることがしばしばある。さらに、一般に担体として用いる合成吸着樹脂などが高価であり、大スケールの商用生産には不向きである。また、結晶化による精製法では、中性アミノ酸を含む粗生成物からオリゴペプチドを単離・精製する場合、例えばロイシンなどの溶解度が低く結晶性の良いアミノ酸が含有している場合には、該アミノ酸を除去することが困難となることがある。【０００４】
比較的安価なイオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いる精製方法も知られている（例えば非特許文献２〜４など参照）。しかしながら、等電点が大きく異なる酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸を基質としたオリゴペプチドの分離精製には強酸性カチオン交換樹脂や強塩基性アニオン交換樹脂に該アミノ酸のみを吸着させることができるので有効であるが［例えば、イミノジカルボン酸およびグリシンを含む水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂で処理し、酸性物質であるイミノジカルボン酸を樹脂に吸着させ、グリシンを単離する方法（特許文献１１参照）が知られている］、等電点が近似している中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドと該中性アミノ酸との分離は難しい。【０００５】
一方、（１）数種のアミノ酸を含有する中性の水溶液を弱酸性陽イオン交換樹脂で処理し、塩基性アミノ酸を樹脂に吸着させ、塩酸で溶出することにより塩基性アミノ酸を分離する方法（特許文献１２参照）、（２）カツオ煮汁より、塩基性アミノ酸を含有するアンセリン（Ｎ−β−アラニル−Ｌ−１−メチル−ヒスチジン）およびカルノシン（Ｎ−β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）を弱酸性陽イオン交換樹脂に吸着させ、アンモニアで溶出することによりアンセリンおよびカルノシンを単離・精製する方法（特許文献１３参照）が知られている。これらは、塩基性アミノ酸または塩基性アミノ酸を含むジペプチドが該弱酸性陽イオン交換樹脂に吸着する性質を利用した方法である。
【特許文献１】国際公開第２００３／０１０１８７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３／０１０１８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００３／０１０３０７号パンフレット
【特許文献４】特開２００５−０４００３４号公報
【特許文献５】特開２００５−１６８４０５号公報
【特許文献６】特開２００５−２６９９０５号公報
【特許文献７】国際公開第２００４／０１１６５２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００４／０１１６５３号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００４／０２２７３３号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２００６／００１３７９号パンフレット
【特許文献１１】特開２００５−２９８３６６号公報
【特許文献１２】米国特許第２５４９３７８号明細書
【特許文献１３】特公平第６−９３８２７号公報
【非特許文献１】「ファインケミカル  平成１７年６月号」、シーエムシー出版、２００５年、ｖｏｌ.３４  Ｎｏ.６、ｐ．２５〜３５
【非特許文献２】「ペプチド合成の基礎と実験」、丸善株式会社、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典  著、１９８５年
【非特許文献３】「生物化学実験のてびき２  タンパク質の分離・分析法」、化学同人、泉美治、中川八郎、三輪谷俊夫共編、１９８５年、ｐ．１〜２０
【非特許文献４】「ダイヤイオンＩ基礎編（第１８版）」、三菱化学株式会社  イオン交換樹脂事業部、平成１５年１１月１日、ｐ．１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液からオリゴペプチドを簡便に単離・精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１）  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲でイオン交換樹脂に接触させる工程を含む該オリゴペプチドの精製方法。
（２）  （ａ）オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を、イオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する工程、および（ｂ）イオン交換樹脂に接触した該オリゴペプチドを溶出溶媒で流出させる工程を含む（１）記載の方法。
（３）  イオン交換樹脂が弱酸性陽イオン交換樹脂である（１）または（２）記載の方法。
（４）  イオン交換樹脂がカルボキシル基またはフェノール性水酸基を有する樹脂である（３）記載の方法。
（５）  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが４〜１４の範囲である（３）または（４）記載の方法。
（６）  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが５〜１２の範囲である（３）または（４）記載の方法。
（７）  イオン交換樹脂が弱塩基性陰イオン交換樹脂である（１）または（２）記載の方法。
（８）  イオン交換樹脂がアミノ基、低級アルキルアミノ基およびジ低級アルキルアミノ基からなる群から選択される基を有する樹脂である（７）記載の方法。
（９）  イオン交換樹脂がアミノ基、メチルアミノ基およびジメチルアミノ基からなる群から選択される基を有する樹脂である（７）記載の方法。
（１０）  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが０〜９の範囲である（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨが１〜７の範囲である（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）  中性アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その光学異性体であるＤ−アミノ酸、およびそれらのラセミ混合物、グリシンならびにβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸である（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  中性アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−チロシン、ＤＬ−アラニン、ＤＬ−バリン、ＤＬ−ロイシン、ＤＬ−イソロイシン、ＤＬ−チロシンおよびグルタミンからなる群から選ばれるアミノ酸である（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１４）  オリゴペプチドがジペプチドまたはトリペプチドである（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  オリゴペプチドがジペプチドである（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）  ジペプチドがＸ−Ｙ（式中、Ｘはアラニンを表し、ＹはＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−チロシン、ＤＬ−バリン、ＤＬ−ロイシン、ＤＬ−イソロイシン、ＤＬ−チロシンまたはグルタミンを表す）で表されるジペプチドである（１４）または（１５）記載の方法。
（１７）  オリゴペプチドを構成するアミノ酸がＬ−アミノ酸である（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）  オリゴペプチドが（Ａ）無保護のＬ−アミノ酸に枯草菌由来のペプチド合成酵素を作用させて製造する方法で得られたオリゴペプチド、（Ｂ）Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸にＬ−アミノ酸アミドハイドラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｃ）Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸にジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｄ）アミノ酸エステルハイドラーゼを作用させて製造されたオリゴペプチド、（Ｅ）エンペドバクター属に属する細菌から得られた酵素を作用させて製造されたオリゴペプチド、および（Ｆ）化学合成により得られたオリゴペプチドからなる群から選ばれるオリゴペプチドである（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）  （１）〜（１８）のいずれかに記載の方法を用いる工程を含むオリゴペプチドの製造方法。
（２０）  （１９）記載の方法で製造されたオリゴペプチド。
（２１）  不純物としてアミノ酸を含有しない（２０）記載のオリゴペプチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液からオリゴペプチドを簡便に単離・精製する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の中性アミノ酸としては、水に溶解した場合に中性付近のｐＨを示すアミノ酸であれば特に限定されないが、例えばＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、それらの光学異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチンなどがあげられる。【００１０】
本発明の精製方法に適応できるオリゴペプチドとしては、例えば２〜１０個のアミノ酸が直鎖または環状に繋がったオリゴペプチドがあげられ、具体的には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、シクロテトラペプチド、シクロペンタペプチド、シクロヘキサペプチド、シクロヘプタペプチド、シクロオクタペプチド、シクロノナペプチド、シクロデカペプチドなどがあげられる。２〜３個のアミノ酸からなるジペプチド、トリペプチドなどが好ましい。【００１１】
本発明の精製方法を適応できるオリゴペプチドを構成するアミノ酸の種類は、特に限定されないが、天然に存在するＬ−アミノ酸、それらの異性体であるＤ−アミノ酸、それらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチンなどがあげられ、これらのうち中性のアミノ酸が１つ以上含有していることが好ましく、中性のＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、それらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニンなどが１つ以上含有していることがより好ましい。構成されるアミノ酸は同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えばＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニンなどを１つ以上含有していることが好ましい。【００１２】
本発明のオリゴペプチドとしては、これら好ましい中性アミノ酸を同一または異なって１〜１０個含有するオリゴペプチドが好ましく、これら中性アミノ酸を同一または異なって１つ以上含有するジペプチド、トリペプチドなどがより好ましい。より具体的には、例えば式（１）Ｘａ−ＹＹ−ＺＺ（式中、ＸａはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表し、ＹＹおよびＺＺは同一または異なって天然に存在するＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、それらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチンなどを表す）で表されるトリペプチド、式（２）Ｘａ−ＹＹ（式中、ＸａおよびＹＹはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（３）Ｘａ−Ｙａ−ＺＺ（式中、ＸａおよびＺＺはそれぞれ前記と同義であり、ＹａはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表す）で表されるトリペプチド、式（４）Ｘａ−Ｙａ（式中、ＸａおよびＹａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（５）Ｘａ−Ｙａ−Ｚａ（式中、ＸａおよびＹａはそれぞれ前記と同義であり、ＺａはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表す）で表されるトリペプチド、式（６）Ｘａ−ＹＹ−Ｚａ（式中、Ｘａ、ＹＹおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）、式（７）ＸＸ−Ｙａ−Ｚａ（式中、ＸＸは天然に存在するＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、それらのラセミ混合物、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチンなどを表し、ＹａおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）表されるトリペプチドまたは式（８）ＸＸ−Ｙａ（式中、ＸＸおよびＹａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチドが好ましく、
式（９）Ｘｂ−ＹＹ−ＺＺ（式中、ＸｂはＬ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリンおよびＬ−トレオニンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表し、ＹＹおよびＺＺはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチド、式（１０）Ｘｂ−ＹＹ（式中、ＸｂおよびＹＹはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（１１）Ｘｂ−Ｙａ−ＺＺ（式中、Ｘｂ、ＹａおよびＺＺはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチド、式（１２）Ｘｂ−Ｙａ（式中、ＸｂおよびＹａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（１３）Ｘｂ−ＹＹ−Ｚａ（式中、Ｘｂ、ＹＹおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチドまたは式（１４）Ｘｂ−Ｙａ−Ｚａ（式中、Ｘｂ、ＹａおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチドがより好ましく、
式（１５）Ｘｃ−ＹＹ−ＺＺ（式中、ＸｃはＬ−アラニンを表し、ＹＹおよびＺＺはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチド、式（１６）Ｘｃ−ＹＹ（式中、ＸｃおよびＹＹはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（１７）Ｘｃ−Ｙａ−ＺＺ（式中、Ｘｃ、ＹａおよびＺＺはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチド、式（１８）Ｘｃ−Ｙａ（式中、ＸｃおよびＹａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（１９）Ｘｃ−ＹＹ−Ｚａ（式中、Ｘｃ、ＹＹおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチドまたは式（２０）Ｘｃ−Ｙａ−Ｚａ（式中、Ｘｃ、ＹａおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチドがさらに好ましく、
式（２１）Ｘｃ−Ｙｂ−ＺＺ（式中、ＸｃおよびＺＺはそれぞれ前記と同義であり、Ｙｂは同一または異なってＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシンまたはＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表す）で表されるトリペプチド、式（２２）Ｘｃ−Ｙｂ（式中、ＸｃおよびＹｂはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド、式（２３）Ｘｃ−Ｙｃ（式中、Ｘｃは前記と同義であり、ＹｃはＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−チロシン、ＤＬ−バリン、ＤＬ−ロイシン、ＤＬ−イソロイシン、ＤＬ−チロシンまたはグルタミンを表す）で表されるジペプチド、式（２４）Ｘｃ−ＹＹ−Ｚｂ（式中、ＸｃおよびＹＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｚｂは同一または異なってＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシンまたはＬ−グルタミンからなる群から選ばれるＬ−アミノ酸、その異性体であるＤ−アミノ酸、またはそれらのラセミ混合物、グリシンまたはβ−アラニンを表す）で表されるトリペプチド、式（２５）Ｘｃ−Ｙｂ−Ｚａ（式中、Ｘｃ、ＹｂおよびＺａはそれぞれ前記と同義である）、または式（２６）Ｘｃ−Ｙｂ−Ｚｂ（式中、Ｘｃ、ＹｂおよびＺｂはそれぞれ前記と同義である）で表されるトリペプチドがさらにより好ましい。【００１３】
また、上記式（１）〜（２６）で表されるオリゴペプチドのうち、構成されるアミノ酸がすべてＬ−アミノ酸であるオリゴペプチドがより好ましい。より具体的には、アラニルバリン、アラニルロイシン、アラニルイソロイシン、アラニルチロシン、アラニルグルタミンなどが好ましく、Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン、Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニル−Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンなどがより好ましい。【００１４】
本発明で用いられるオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液は、上記のオリゴペプチドに上記の中性アミノ酸を１つ以上含有する溶液であり、さらに他のアミノ酸、タンパク質、無機塩などのイオン性物質、糖あるいは色素などの非イオン性物質などを含有していても良い。しかしながら、本発明の精製方法を実施するにはイオン性物質の含有量は少ない方が好ましい。また、該溶液は、水溶液またはメタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノールなどを含有したアルコール性水溶液であることが好ましく、水溶液であることがより好ましい。【００１５】
該オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液は、例えば前記の（ａ）無保護のＬ−アミノ酸から枯草菌由来のペプチド合成酵素を用いて製造する方法、（ｂ）Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸からＬ−アミノ酸アミドハイドラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を用いて製造する方法、（ｃ）Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を用いて製造する方法、（ｄ）アミノ酸エステルハイドラーゼを用いて製造する方法、（ｅ）エンペドバクター属に属する細菌から得られた酵素を用いて製造する方法、（ｆ）枯草菌由来のジペプチド合成酵素遺伝子ｙｗｆｅとアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｌｄを発現した大腸菌をグルコースおよびアンモニア塩を含む培地中で基質アミノ酸の存在下に培養してジペプチドを生成する方法などにより得られる酵素反応溶液または培養液を遠心分離、膜分離またはろ過などにより菌体を除去した後、電気透析または強酸性陽イオン交換樹脂などにより脱塩することにより得ることができる。また、（ｇ）化学合成により製造する方法、上記（ａ）〜（ｆ）の方法に化学合成の手法を組み合わせて製造する方法などにより得られる粗生成物を水またはメタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノールなどのアルコールと水との混合溶媒に溶解することにより得ることもできる。【００１６】
本発明で用いられるイオン交換樹脂としては、特に限定されず、各種イオン交換樹脂を適宜用いることができるが、弱酸性陽イオン交換樹脂または弱塩基性陰イオン交換樹脂が好ましい。弱酸性陽イオン交換樹脂としては、例えば樹脂上に官能基としてカルボキシル基、フェノール性水酸基などを有する樹脂があげられ、より具体的には、例えばダイヤイオンＷＫ−４０（三菱化学社製）、ＭＡＣ３（ダウケミカル社製）、ＣＮＰ８０ｗｓおよびＣＮＰＬＦ（バイエル社製）、ＩＲＣ５０およびＩＲＣ７６（アンバーライト社製）などのアクリル系またはメタクリル系の樹脂、および該樹脂から調製される樹脂があげられる。これら弱酸性陽イオン交換樹脂のイオン形としては、Ｈ形が好ましい。弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば樹脂上に官能基として１級アミノ基、２級アミノ基または３級アミノ基を有する樹脂があげられる。具体的には、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基などを有する樹脂があげられ、より具体的には、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基などを有する樹脂があげられ、さらに具体的には、例えばダイヤイオンＷＡ−１０、２１、３０（三菱化学社製）などのアクリル系またはスチレン系の樹脂、および該樹脂から調製される樹脂があげられる。これら弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン形としては、Ｃｌ形が好ましい。また、本発明のオリゴペプチドの精製方法は、これらイオン交換樹脂を通常１種用いて行われるが、必要に応じ、上記の弱酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂に加え強酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂などから選ばれる２〜４種の複数のイオン交換樹脂を適宜組み合わせて用いることもできる。該組み合わせの例としては、樹脂上に有する官能基が異なる２〜４種のイオン交換樹脂の組み合わせなどがあげられ、例えば、強酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせ、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせ、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせ、強酸性陽イオン交換樹脂および弱酸性陽イオン交換樹脂の組み合わせ、強塩基性陰イオン交換樹脂および弱酸性陽イオン交換樹脂の組み合わせ、強酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせ、強塩基性陰イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせ、弱酸性陽イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂の組み合わせなどがあげられる。【００１７】
本発明のオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲でイオン交換樹脂に接触させる工程とは、例えば、イオン交換樹脂を充填したカラムにオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲で通塔する、イオン交換樹脂を分散させた水溶液などにオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を添加し有効ｐＨ範囲で混合する、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液にイオン交換樹脂を添加し有効ｐＨ範囲で混合するなどの手法により実施することができるが、イオン交換樹脂を充填したカラムにオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲で通塔することにより実施することが好ましい。【００１８】
イオン交換樹脂を充填したカラムにオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を通塔する場合には、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液は含有するオリゴペプチドや中性アミノ酸の濃度が低いことが好ましく、必要により水を加えて用いられる。
有効ｐＨ範囲とは、イオン交換樹脂を利用するための適当なｐＨ範囲のことで、用いるイオン交換樹脂の種類に応じ適当なｐＨ範囲が設定される。例えば弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる場合の該溶液のｐＨは４〜１４、好ましくは５〜１４、より好ましくは５〜１２、さらに好ましくは６〜１２、さらにより好ましくは７〜１０の範囲内である。また、例えば弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる場合の該溶液のｐＨは０〜９、好ましくは１〜９、より好ましくは１〜７、さらに好ましくは２〜７、さらにより好ましくは２〜６の範囲内である。【００１９】
用いるオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液のｐＨは、用いるイオン交換樹脂の種類に応じ最適なｐＨ（有効ｐＨ範囲）に調製するのがよく、例えば弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる場合の該溶液のｐＨは４〜１４、好ましくは５〜１４、より好ましくは５〜１２、さらに好ましくは６〜１２、さらにより好ましくは７〜１０の範囲内である。塩基性状態であることが好ましい。また、例えば弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる場合の該溶液のｐＨは０〜９、好ましくは１〜９、より好ましくは１〜７、さらに好ましくは２〜７、さらにより好ましくは２〜６の範囲内である。酸性状態であることが好ましい。従って、必要に応じて溶液のｐＨを、塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸などの酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニア水などの塩基を用いて上記の好ましい範囲内に調整することが好ましい。【００２０】
本発明で用いられるイオン交換樹脂の量は、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液中の総イオン量に対しイオン交換樹脂上の官能基（イオン交換基）の量が十分多くなるような量を用いるのが好ましく、例えば弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる場合は、溶液中の総カチオンの量に対しイオン交換基の量が多くなるように設定することが好ましく、弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる場合は、溶液中の総アニオンの量に対しイオン交換基の量が多くなるように設定することが好ましい。【００２１】
本発明の精製方法に用いられるオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液をイオン交換樹脂を充填したカラムに通塔する場合に用いられるカラムとしては、化学物質の精製に用いられるカラムであればどのようなものでもよいが、イオン交換樹脂をカラムに充填した際に、樹脂層高さ／カラム内径が大きくなるように選択することが好ましく、樹脂層高さ／カラム内径が３．５以上になるように選択することがより好ましい。【００２２】
本発明の精製方法に用いられるオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液をイオン交換樹脂を充填したカラムに通塔するには、例えば該溶液をイオン交換樹脂を充填したカラムの上部、いわゆるカラムベッド上層から通塔しても、カラムの下部、いわゆるカラムベッド下層から通塔しても良く、カラムベッド上層から通塔するのがより好ましい。通塔速度としては、空間速度２［１／時間］以下が好ましく、１［１／時間］以下がより好ましい。【００２３】
オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液をイオン交換樹脂を充填したカラムに通塔し、溶出溶媒で溶出させる場合の溶出溶媒としては、特に限定されないが、例えば水（脱イオンされていてもされていなくても良い）、濃度が０．０２〜６ｍｏｌ／Ｌの塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸などの酸性水溶液、濃度が０．０２〜６ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニアなどの塩基性水溶液、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液の溶媒と同じ組成の溶媒などが好ましい。とりわけ、弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる場合には、濃度が０．０２〜６ｍｏｌ／Ｌの塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸などの酸性水溶液が好ましく、弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる場合には、０．０２〜６ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニアなどの塩基性水溶液が好ましい。【００２４】
本発明の精製方法に従えば、例えば、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液をイオン交換樹脂を充填したカラムに通塔し、上記の溶出液を好ましくは連続的に通塔し、該オリゴペプチドをイオン交換樹脂に接触させ、該オリゴペプチドを溶出することにより、該オリゴペプチドを単離・精製することができる。オリゴペプチドを構成するアミノ酸が中性アミノ酸である場合には特に有効で、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液から中性アミノ酸を除去し、該オリゴペプチドを精製することができる。溶出液の通塔速度としては、空間速度０．３〜１０［１／時間］が好ましく、０．５〜２［１／時間］がより好ましい。【００２５】
本発明の精製方法は、上述したようにオリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液からオリゴペプチドとアミノ酸、塩、金属イオンなどを有効に分離することができ、特に構成されるアミノ酸に中性アミノ酸を含むオリゴペプチド、好ましくは中性アミノ酸から構成されるオリゴペプチドと中性アミノ酸との分離に有効である。
本発明の精製方法は、上述したカラムを利用した方法の他、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液とイオン交換樹脂の混合物を、必要により水などで希釈し、混合した後、ろ過などによりイオン交換樹脂を分離することによっても実施することができる。【００２６】
また、本発明の精製方法は、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミンなどの結晶性のよいアミノ酸を含有する溶液でも容易に実施できる。さらに、本発明の精製方法により得られた上記の溶出液やろ液は、ペプチドの製造で通常実施されている公知の方法、例えば脱塩、濃縮、結晶化などの操作を行うことによりオリゴペプチドを純度よく取得することができる。【００２７】
以上述べたように、本発明の精製方法は、中性アミノ酸をその構成アミノ酸として含むオリゴペプチドの製造方法において、１つの工程として含ませることができる。また、本発明の精製方法を１つの工程として含む製造方法により製造されたオリゴペプチドは、中性アミノ酸などの不純物の含有量が著しく小さいことが特徴である。
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
Ａｌａ−Ｉｌｅの精製
Ａｌａ−Ｉｌｅ  ２．７５ｇ、Ａｌａ  ２．５０ｇ、Ｉｌｅ  ０．４０ｇおよびＡｌａ−Ａｌａ  １．８９ｇを溶解した水溶液１０００ｍｌをＷＫ−４０（三菱化学社製）１０００ｍｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔した後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔した。分離の様子は、カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングにより観察した。Ａｌａ−Ｉｌｅが溶出される画分を集め、成分を分析したところ、Ａｌａ−Ｉｌｅが８３．１％の収率で含まれていた。ＩｌｅおよびＡｌａの除去率は、それぞれ９８．１％、１００．０％であった。
【実施例２】
【００２９】
Ａｌａ−Ｌｅｕの精製
Ａｌａ−Ｌｅｕ  １０．０ｇ、Ａｌａ  ０．８０ｇ、Ｌｅｕ  ０．９９ｇおよびＡｌａ−Ａｌａ  １．４９ｇを溶解した水溶液１０００ｍｌをＷＫ−４０（三菱化学社製）７２０ｍｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔した後、連続的にカラムベッド上層から０．０２ｍｏｌ／Ｌの塩酸を通塔した。分離の様子は、カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングにより観察した。Ａｌａ−Ｌｅｕが溶出される画分を集め、成分を分析したところ、Ａｌａ−Ｌｅｕが８５．９％の収率で含まれていた。ＬｅｕおよびＡｌａの除去率は、それぞれ９９．０％、９９．９％であった。
【実施例３】
【００３０】
Ａｌａ−Ｖａｌの精製
Ａｌａ−Ｖａｌ  ７．８４ｇ、Ａｌａ  ０．５３ｇ、Ｖａｌ  １．４９およびＡｌａ−Ａｌａ  １．２７ｇを溶解した水溶液８００ｍｌをＷＫ−４０（三菱化学社製）１０００ｍｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔した後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔した。分離の様子は、カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングにより観察した。Ａｌａ−Ｖａｌが溶出される画分を集め、成分を分析したところ、Ａｌａ−Ｖａｌが８６．０％の収率で含まれていた。ＶａｌおよびＡｌａの除去率は、それぞれ９５．０％、９６．７％であった。
【実施例４】
【００３１】
Ａｌａ−Ｔｙｒの精製
Ａｌａ−Ｔｙｒ  ７．８８ｇ、Ａｌａ  ０．５７ｇ、Ｔｙｒ  ０．２１およびＡｌａ−Ａｌａ  １．３０ｇを溶解した水溶液８００ｍｌをＷＫ−４０（三菱化学社製）１０００ｍｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔した後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔した。分離の様子は、カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングにより観察した。Ａｌａ−Ｔｙｒが溶出される画分を集め、成分を分析したところ、Ａｌａ−Ｔｙｒが８４．６％の収率で含まれていた。ＴｙｒおよびＡｌａの除去率は、それぞれ９６．２％、９７．７％であった。
【実施例５】
【００３２】
Ａｌａ−Ｖａｌの精製
Ａｌａ−Ｖａｌ  ５．３２ｇ、Ａｌａ  ０．８６ｇ、Ｖａｌ  １．１８およびＡｌａ−Ａｌａ  ３．７３ｇを溶解した水溶液５００ｍｌをＷＡ−２１（三菱化学社製）１０００ｍｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔した後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔した。分離の様子は、カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングにより観察した。Ａｌａ−Ｖａｌが溶出される画分を集め、成分を分析したところ、Ａｌａ−Ｖａｌが７４．５％の収率で含まれていた。ＶａｌおよびＡｌａの除去率は、それぞれ１００．０％、１００．０％であった。
【実施例６】
【００３３】
Ａｌａ−Ｌｅｕの製造方法
ＷＯ２００４／０５８９６０に記載の方法に従い得たＡｌａ−Ｌｅｕ（４４．７ｇ／ｌ）ならびにＡｌａ、Ｌｅｕなどの不純物および枯草菌由来のジペプチド合成酵素を発現させた大腸菌の細胞を含有する培養液４Ｌに硫酸を加えｐＨを３．０に調製した後、遠心分離により菌体を沈降させた。菌体が沈降した上澄み液を強酸性陽イオン交換樹脂ＳＫ−１Ｂ（Ｈ＋）（三菱化学社製）９Ｌを充填したカラムに空間速度１．０［１／時間］でカラムベッド上層から通塔後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔して該樹脂にＡｌａ−Ｌｅｕを吸着させた。さらに、カラムベッド上層から０．７mol/Lの水酸化ナトリウムを通塔し、該樹脂に吸着したＡｌａ−Ｌｅｕを溶出した。溶出液のうちＡｌａ−Ｌｅｕを含む画分を分取した。得られた画分には、上記培養液中の９２％のＡｌａ−Ｌｅｕが含まれていたが、含有するＡｌａ、Ｌｅｕなどの各不純物のＡｌａ−Ｌｅｕに対する割合に変化は見られなかった。この画分を、ＷＫ−４０（Ｈ＋）（三菱化学社製）１２Ｌを充填したカラムに空間速度０．５［１／時間］でカラムベッド上層から通塔後、連続的にカラムベッド上層から水を通塔した。カラム出口部にＵＶセンサーを取り付け、モニタリングを行い、Ａｌａ−Ｌｅｕを含む画分を分取した。この操作により不純物であるＬｅｕおよびＡｌａを、それぞれ９８．３％および９９．４％除去できた。この画分を晶析することにより、Ａｌａ−Ｌｅｕを９８．７ｇ得た。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により提供される、オリゴペプチドおよび中性アミノ酸を含む溶液を有効ｐＨ範囲でイオン交換樹脂に接触させる工程を含む該オリゴペプチドの精製方法は、オリゴペプチドの単離・精製方法として有用である。
【国際調査報告】
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