(57)【要約】  本発明の目的は、免疫系を統合できる樹状細胞の機能を制御することで、癌、自己免疫疾患、アレルギー、感染症などの疾患あるいは疾病を予防あるいは改善することを目的として、活性化形質細胞様樹状細胞に特異的に発現する膜分子を同定することである。本発明によれば、以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質が提供される。（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列；又は（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列：【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列：
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質からなる樹状細胞の機能制御剤。
【請求項３】
Ｉ型インターフェロンの産生を増大させるために使用する、請求項２に記載の樹状細胞の機能制御剤。
【請求項４】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列：
【請求項６】
請求項４又は５に記載のＤＮＡを含む、組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のＤＮＡ又は請求項６に記載の組み換えベクターを有する、形質転換体。
【請求項８】
請求項１に記載の蛋白質又はその断片に特異的に免疫結合する抗体。
【請求項９】
免疫学的に形質細胞様樹状細胞を認識する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の蛋白質の細胞外領域を認識する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項８から１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
請求項８から１１の何れかに記載の抗体を用いて、ヒトまたは他の動物由来の形質細胞様樹状細胞を分離する方法。
【請求項１３】
請求項８から１１の何れかに記載の抗体を用いて形質細胞様樹状細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化した形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid Dendritic Cells; PDC）の膜分子、該膜分子をコードするDNA、該膜分子に対する抗体、並びに該抗体を用いた形質細胞様樹状細胞の分離法および検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（DC）は、生体内では骨髄に存在するCD34陽性細胞を前駆細胞として分化・成熟し、抗原提示細胞（APC）として、免疫応答の誘導、維持、拡大、調節において重要な役割を担っていることが知られている。プロフェッショナル APCであるDCは、自然免疫反応による刺激を受けて活性化し、抗原特異的獲得免疫反応を惹起するばかりでなく、自ら様々なサイトカインを産生することによって感染時の自然免疫反応においても重要な役割を果たす。DCにおいては各TLRの発現は、MoDC、末梢血中のmyeloid DC（MDC）、plasmacytoid DC（PDC）間で明らかに異なり、リガンドを作用させた場合に産生されるサイトカインやケモカインレセプターの発現も異なることが明らかとなっている（非特許文献２０及び２１）。またPDCにおいてCpG+CD40Lで大量のIL-12p70を産生するという報告もあり（非特許文献２２）、実際の生体内において、どのDCサブセットがどのような自然免疫反応を受けて、autocrine/paracrineに作用するサイトカインの影響でどのようなphenotypeを有するDCへと成熟化していくのか、興味がもたれるところである。【０００３】
1990年代に入って、DCを前駆細胞からサイトカインで分化・誘導できるようになり、大量のDCを扱えるようになって分子・細胞・生体レベルにおいてDCの免疫応答における役割の重要性が明らかになってくると共に、免疫制御の標的として注目されるようになった。  DCの重要な機能は、自然免疫反応を受けるとともに抗原の細胞内への取り込み作用（食作用）及びその抗原の情報をT細胞に伝えてT細胞を刺激活性化することである。【０００４】
このDCにおける抗原取込能から抗原提示能という機能変化は、前述の自然免疫の反応を受けて獲得免疫を発動する部分を担っていると言っても過言ではない。この機能変化に伴って細胞表面上に提示される膜分子の変化が起こることは想像に難くないが、この成熟化（maturation）の過程でどのような事象が起こっているかを考えた場合に、細胞膜表面上に新たに発現した分子の発現はすべてｍRNAの発現から起こるとは限らないという事実が存在する。例えば未熟な（Immature）段階から発現が見られるHLA-DRが成熟化に伴ってmRNA及びタンパク質の発現量の変化をほとんど伴わずに細胞内から細胞膜表面上に移動（translocation）するということが知られている。また、実際のmRNAの発現量とタンパク質の発現量を比較した場合にほとんど相関がない場合や、mRNAは発現しているのにタンパク質として翻訳されていない場合も存在する。これまで遺伝子側からは増幅可能なこと、大量に解析することが可能なこと、ハンドリングが容易なこと、数々の手法が編み出せることなどから精力的に解析がなされてきたが、実際に発現しているタンパク質の変化を追うことができれば、そのような変化は細胞内の事象をよりよく反映しており現実に近いものということができるというのも事実である。【０００５】
DCに関しては、上述の知見に加えて、DCにいくつかのサブセットが存在することも明らかになっているが、そのようなサブセットは成熟、未成熟で機能が異なることが知られている。しかしサブセット間でのそのような機能の違いが何に起因するのか、その答えは得られていない。少なくとも細胞内シグナリングに関与すると考えられる膜分子、特にDCの成熟化に伴って発現する膜分子の解明が待たれるところである。【０００６】
（１）樹状細胞活性化によるNKT cell activationやCTL inductionをtriggerとした抗腫瘍効果、（２）樹状細胞機能変化に伴うTh1/Th2のバランスシフトによる自己免疫疾患、アレルギーの予防・制御効果、（３）樹状細胞成熟化抑制によるバクテリアやウイルスの感染症などの予防・抑制効果、（４）in vivo/ex vivo depletionによる活性化PDC除去による（１）（２）（３）の改善などが期待される。上記（１）〜（４）に記載の現象およびメカニズムは、B7ファミリー分子によるT細胞活性化、CD40による樹状細胞成熟化、innate immune responseを受けるToll-like receptorを入り口とした自然免疫系および獲得免疫系の発動などが知られているが、これら事象で全てを語れるわけではない、【０００７】
【非特許文献１】Science, 284, 1313-1318 (1999)
【非特許文献２】Trends Cell Biol, 11, 304-311 (2001)
【非特許文献３】J Biol Chem, 274, 17406-17409 (1999)
【非特許文献４】J Immunol, 163, 2382-2386 (1999)
【非特許文献５】Science, 282, 2085-2088 (1998)
【非特許文献６】Nature, 410, 1099-1103 (2001)
【非特許文献７】Int Immunol, 13, 933-940 (2001)
【非特許文献８】Science, 303, 1529-1531 (2004)
【非特許文献９】Nature, 408, 740-745 (2000)
【非特許文献１０】Immunity, 11, 115-122 (1999)
【非特許文献１１】J Immunol, 166, 5688-5694 (2001)
【非特許文献１２】Nat Immunol, 2, 835-841 (2001)
【非特許文献１３】Nature, 413, 78-83 (2001)
【非特許文献１４】J Immunol, 167, 5887-5894 (2001)
【非特許文献１５】J Immunol, 164, 554-557 (2000)
【非特許文献１６】Cell, 103, 909-918 (2000)
【非特許文献１７】J Biol Chem, 276, 37692-37699 (2001)
【非特許文献１８】J Immunol, 164, 4991-4996 (2000)
【非特許文献１９】Nature, 410, 1103-1107 (2001)
【非特許文献２０】J Exp Med, 194, 863-869 (2001)
【非特許文献２１】Eur J Immunol, 31, 3388-3393 (2001)
【非特許文献２２】Eur J Immunol, 31, 3026-3037 (2001)
【非特許文献２３】J Leucocyte Biol, 59, 208-218 (1996)
【非特許文献２４】Biochem Biophys Res Commun, 231, 1-6 (1997)
【非特許文献２５】Science, 261, 609-612 (1993)
【非特許文献２６】J Immunol, 161, 2762-2771 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、免疫系を統合できる樹状細胞の機能を制御することで、癌、自己免疫疾患、アレルギー、感染症などの疾患あるいは疾病を予防あるいは改善することを目的として、活性化形質細胞様樹状細胞に特異的に発現する膜分子を同定することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、Plasma Membrane Focused Proteomicsと名付けた新しい細胞膜調製法、細胞膜分子同定法により、樹状細胞上に発現する細胞表面分子を網羅的に同定した結果、活性化マウス形質細胞様樹状細胞(PDC)に特異的に細胞膜表面上に発現する分子を見出した。マウスに発現する該膜分子をバイオインフォマティックスにより同定し、全長cDNAをクローニングし、該膜分子を特異的に認識するモノクローナル抗体を樹立した。マウス脾細胞に存在する各種免疫担当細胞における発現を確認したところ、resting/naiveの白血球においては該膜分子の発現は認められないものの、bulkの白血球をLPSで刺激するとCD11c陽性の一部の細胞集団が該膜分子を高発現することを見出した。より詳細に細胞表面の表現系を確認したところ、B220陽性、CD11b陰性、Gr-1陽性、MHCclassII陽性、B7-2陽性の均一集団であった。このことから該膜分子は活性化形質細胞様樹状細胞に特異的あるいは優位に発現していること膜分子であることが明らかとなった。生体内においては活性化形質細胞様樹状細胞は主にウイルス感染を引き金として大量のI型インターフェロンあるいは、IL-12を産生することで知られる細胞で特に抗ウイルスに必須の細胞である。またSLEやクローン病などの自己免疫疾患患者においてはI型インターフェロンの血中濃度が異常に高まっていることが知られており、PDCの活性化がこれら自己免疫疾患の引き金になっているという報告もある。本発明の知見は、新たな免疫メカニズムを解明するとともに新しい創薬の切り口になり得るものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列：【００１１】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質からなる樹状細胞の機能制御剤が提供される。本発明の樹状細胞の機能制御剤は、好ましくは、Ｉ型インターフェロンの産生を増大させるために使用することができる。【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列：【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを含む、組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する、形質転換体が提供される。【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質又はその断片に特異的に免疫結合する抗体が提供される。
好ましくは、本発明の抗体は、免疫学的に形質細胞様樹状細胞を認識する。
好ましくは、本発明の抗体は、上記した本発明の蛋白質の細胞外領域を認識する。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を用いて、ヒトまたは他の動物由来の形質細胞様樹状細胞を分離する方法が提供される。【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を用いて形質細胞様樹状細胞を検出する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
（１）本発明の新規膜分子及びそれをコードするＤＮＡ
上述したように、本発明は、本発明の膜分子（A）がDCにおいて成熟化に伴って発現が上昇するという知見に基いている。【００１８】
本発明のマウス樹状細胞膜分子は、マウス骨髄細胞をGM-CSF存在下培養することにより誘導したマウス骨髄由来未成熟樹状細胞（DC）をリポポリサッカライドで刺激し、その可否に基いて成熟DCを得たのち、細胞膜を調製し、その可溶性タンパク質についてコンカナバリンAセファロースクロマトグラフィー、小麦胚アグルチニンセファロースクロマトグラフィー、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの手法を用いて膜タンパク質を分画し、LC/MS(特にApplied Biosystems社製QTRAP)による微量分析にかけて同定された（後述の実施例１〜５参照）。さらにLC/MS法で同定された複数の部分アミノ酸配列に基づくプライマーを合成し、マウス成熟DC由来cDNAライブラリーを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い本発明の膜分子の遺伝子断片を増幅し取得し、この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより本発明の膜分子（A）の遺伝子を含むクローンを選抜し、その塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を決定した（後述の実施例６参照）。【００１９】
本発明の膜分子（A）は、ハイドロパシープロット解析［J. Exp. Med.、157巻、105-132頁、1982年］、シグナル配列予測解析［Protein Eng.、10巻、1-6頁、1997年］の結果、いずれもシグナル配列を有するI型膜蛋白質であることが示唆された。【００２０】
膜分子（A）
本膜分子は229アミノ酸残基からなり、ハイドロパシープロット解析（図１）及びシグナル配列予測解析の結果から、23アミノ酸残基のシグナル配列、169アミノ酸残基の細胞外領域、20アミノ酸残基の膜貫通領域、17アミノ酸残基の細胞内領域から構成されていると考えられる。さらにホモロジー検索並びにモチーフ検索の結果から、ジスルフィド結合形成に必要なシステイン（Cys）残基の位置から1つのIgドメイン（IgV set）を有すると予想され、潜在的なアスパラギン結合型糖鎖付加部位が３ヶ所存在する（108位、109位および179位のアスパラギン残基）。また細胞膜貫通領域にはリジン（Lys）残基が存在することからイオン結合により何らかのアダプター分子と会合していることが予想される。【００２１】
本発明の膜分子群は、遺伝子クローニングおよびDNA組換え技術を利用することによって、大量合成が可能である。そのための一般的な技術として、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)やAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989)に記載されるような標準技術を使用できる。【００２２】
上記標準技術によりヒト成熟DCからmRNAを取り出しcDNAライブラリーを作製する。配列番号１に記載された配列に基き合成した特異的プローブを用いて該ライブラリーをスクリーニングし目的のcDNAを得ることができる。あるいは、配列番号１に記載された配列に基づいて目的分子の成熟配列を含む配列を増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、該cDNAライブラリーを鋳型にしてPCRを行い、目的のcDNAを増幅することができる。PCRは自動サーマルサイクラー(automated thermal cycler)を用いて実施するのがよく、その反応は、耐熱性ポリメラーゼ（Taqなど）、鋳型DNAおよびプライマーの存在下、DNAの変性（例えば94℃, 15〜30秒）、プライマーのアニーリング（例えば55℃,30秒〜１分）、および4種類の基質（dNTP）の共存下での伸長反応（例えば72℃,30秒〜10分）を1サイクルとして約25〜40サイクル実施し、さらに70〜75℃で５〜15分加熱することによって行うことができる。プライマーのサイズは通常少なくとも15ヌクレオチドである。【００２３】
上記した手法により、本発明の膜分子（A）をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。本発明の膜分子（A）をコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。【００２４】
変異体
上記した配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する膜分子に加えて、本発明はさらに、配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列、並びに配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列から成る蛋白質（以下、変異体蛋白質とも称する）を提供する。【００２５】
本明細書で言う「１個もしくは複数個」のアミノ酸残基とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸残基を意味する。【００２６】
本明細書中で使用する「相同性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または塩基配列間での配列の同一性または類似性を意味し、配列は例えば対角線図形法や頻度分布法などを含む慣用的方法で比較しうる。【００２７】
本明細書中で使用する「樹状細胞の機能を制御し得る」という用語は、本発明の天然型膜分子（A）と同じかまたは実質的に同じような、樹状細胞の機能を制御し得る機能を有していることを意味する。樹状細胞の機能を制御し得る機能の具体例としては、Ｉ型インターフェロンの産生を増大させる機能などを挙げることができる。【００２８】
上記したような変異体蛋白質をコードするＤＮＡも本発明の範囲内である。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列において1個もしくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ樹状細胞の機能を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。【００２９】
本明細書で言う「１個もしくは複数個」の塩基とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の塩基を意味する。【００３０】
本明細書で言う「ストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、0.5M NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA, 65℃でハイブリダイゼーションを行い、その後に0.1×SSC/0.1% SDS, 68℃で洗浄を行った場合に検出される塩基配列などが挙げられる。【００３１】
本発明の変異体蛋白質は天然型膜分子の機能の全部または一部を有することができる。天然型膜分子と高い相同性(８０％以上)を有し、かつ樹状細胞の機能を制御し得る能力を有している限り、いかなる変異体も本発明の範囲内である。このような変異体は例えば、部位特異的突然変異法、PCR法などを用いて天然型膜分子に対し所望の改変（欠失、置換、挿入および/または付加）を導入することによって製造することができる（上記のMolecular Cloning、およびCurrent Protocols in Molecular Biologyを参照）。そのような改変として、例えば保存的アミノ酸間の置換、例えば酸性アミノ酸（アスパラギン酸とグルタミン酸）間、塩基性アミノ酸（リジンとアルギニン）間、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）間の置換が挙げられる。【００３２】
本発明の変異体を天然源等から得る場合には、塩基配列に基づいてプローブを作製し、中度または高度のストリンジェント条件化でのハイブリダイゼーションの後、高ストリンジェント条件下で洗浄することによって目的の変異体をコードする遺伝子を取り出し、これを適当なベクターに組み込み、発現させることによって目的の変異体を得ることができる。高ストリンジェント条件の例は、0.5M NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA, 65℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.1×SSC/0.1% SDS, 68℃での洗浄である（上記のCurrent Protocols in Molecular Biologyを参照）。ハイブリダイゼーション条件は温度およびイオン強度を適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が高いほど、またイオン強度が低いほどストリンジェンシーが高まる。したがって当業者は適するハイブリダイゼーション条件を選択可能である。本発明には、塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％の相同性を有する、上記変異体をコードするDNAも包含される。【００３３】
本発明の蛋白質（本発明の膜分子（A））は、樹状細胞の機能を制御することができることから、樹状細胞の機能制御剤として用いることができ、例えば、樹状細胞の機能を制御して、Ｉ型インターフェロンの産生を増大させるために使用することができる。【００３４】
樹状細胞の機能制御剤として用いる場合、本発明の蛋白質の投与法および投与剤型は特に制限されないが、静脈、動脈内投与、筋内投与、経口投与、座剤投与などであり、薬学的に許容可能な賦形剤や希釈剤と組み合わせて経口用または非経口用に処方することができるが、好ましくは非経口投与である。投与は1日あたり1回かまたは数回に分けて行い、投与量は患者の重篤度、年齢、性別、体重などの条件に応じて決定され、副作用を併発しない範囲であることが好ましく、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。【００３５】
（２）本発明の組み換えベクター及び形質転換体
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。【００３６】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、適当な転写/翻訳調節配列（例えば、プロモーター等）に機能的に連結されている。発現ベクターの種類としては、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなどが挙げられる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。【００３７】
転写/翻訳調節配列には、使用する宿主/ベクター系に応じて選択されたプロモーターおよびエンハンサーを含めることができる。プロモーターとして、細菌系では例えばPL, PR, Ptrp, Placなど、酵母系では例えばPHO5, GAP, ADH, AOX1プロモーターなど、動物細胞ではSV40初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ヒートショックプロモーターなどを挙げることができる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。【００３８】
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。【００３９】
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。【００４０】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。【００４１】
発現ベクターは、宿主に応じて種々のものが市販または寄託されており、あるいは文献等の刊行物に記載されており、それらを使用できる。例えば細菌用としてpQE（キアゲン社）、pBluescript II SK+（ストラタジーン社）、pET（ノバジェン社）などである。【００４２】
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の蛋白質を発現できれば任意の細胞を使用できる。宿主細胞としては、原核細胞、酵母類、動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は植物細胞などが使用可能である。【００４３】
原核細胞の例としては、例えば、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属などが挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。【００４４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属またはピチア属などの細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。【００４５】
動物細胞の例としては、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などが挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。【００４６】
真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。【００４７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。【００４８】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。【００４９】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。【００５０】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。【００５１】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は適当な培養培地中で培養されて目的遺伝子を発現させ、産生した本発明の膜分子を培地中から、または宿主細胞中から回収する。細胞から回収する場合には、培養終了後、細胞を遠心分離等により分離し、水性緩衝液に懸濁し、音波処理、フレンチプレス、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。膜分子の単離精製は、タンパク質の精製に用いられる一般的方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、HPLC、電気泳動法、脱塩法、有機溶媒沈殿法などを任意に組み合わせて行うことができる。【００５２】
（３）本発明の抗体
本発明の抗体は、上記（１）に記載した本発明の蛋白質又はその断片に特異的に免疫結合する抗体である。【００５３】
本明細書中で使用する本発明の抗体に関する「特異的に免疫結合する」という用語は、本発明の抗体が本膜分子のみが有するエピトープと免疫学的に交差反応し、TREMファミリーなどの他のタンパク質と交差反応しないことを意味する。このようなエピトープは、例えば本発明の膜分子のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列とを整列比較することによって、本質的に異なる配列部分（連続する少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸）を選択することによって決定できる。【００５４】
上記の特性を有するいずれの抗体も本発明に包含されるが、目的の抗体を得るための抗原エピトープは、本膜分子群のアミノ酸配列において抗原性の高い領域、表在性がある領域、二次構造をとらない可能性のある領域、他のタンパク質（特に各膜分子が属するファミリーの他のタンパク質）とホモロジーがないか又は低い領域から選択されうる。ここで抗原性の高い領域は、Parkerらの方法［Biochemistry、25巻、5425-5432頁（1986年）］によって推定可能である。表在性がある領域は、例えばハイドロパシーインデックスを計算しプロットすることによって推定可能である。二次構造をとらない可能性のある領域は、例えば、ChouとFasmanの方法［Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.、47巻  45-148頁（1978年）］によって推定可能である。さらに、特に各膜分子が属する他のタンパク質とホモロジーがないか又は低い領域は、各膜分子のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列との相同性比較によって推定可能である。【００５５】
上記の手法で推定された本膜分子の部分アミノ酸配列を基に、ペプチド合成法を利用することによって該アミノ酸配列からなるペプチドを合成することができる。目的のペプチドは、例えば、R.B. Merrifield［Science、232巻、341-347頁（1986年）］によって開発された固相ペプチド合成に基いた市販のペプチド合成機を使用して合成し、保護基を脱離後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製する。得られた精製ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）やアルブミンなどのキャリヤタンパク質と結合し免疫原として使用することができる。【００５６】
さらに、遺伝子組換え本膜分子を免疫原として本膜分子に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を公知の手法により作製することもできる。この場合、本膜分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または他のタンパク質に関して用いられる「組換え」という用語は、これらのタンパク質が宿主細胞内で組換えDNAによって生産されたものであることを意味する。宿主細胞としては、原核生物（例えば大腸菌のような細菌）及び真核生物（例えば酵母、CHO細胞、昆虫細胞等）のいずれも使用され得る。【００５７】
本発明の「抗体」はペプチド抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよい。「抗体」は、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫に用いられたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、産生するであろうリンパ球を引き出すために、皮下、腹腔内、または筋肉内の経路によって、抗原あるいは抗原発現細胞により免疫化することによって得られる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、所望のヒト抗体を取得してもよい［Proc. Natl. Acad. Sci. USA、97巻、722-727頁（2000年）、国際公開WO96/33735、WO97/07671、WO97/13852、WO98/37757参照］。そのかわりに、リンパ球をin vitroで免疫化してもよい。宿主動物から得られた血清から、抗原に結合する画分を集め、精製することにより、ポリクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体を作製することができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice、59-103頁、Academic press、1986年）。例えば本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法［Nature、256巻、495頁（1975年）］を用いても、組換えDNA法（Cabillyら、米国特許第4816567号）を用いても作製することができる。【００５８】
抗原タンパク質は本膜分子のタンパク質の全てまたは部分配列をコードするDNAを、大腸菌や酵母、昆虫細胞、動物細胞などで発現させることにより調製することができる。遺伝子組換え本膜分子は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製し、この精製標品を免疫原として用いる。【００５９】
また、本発明の抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは(Fab')2やFabなどの抗体断片であってもよい。【００６０】
また、定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体（例えばマウス-ヒトキメラ抗体；Cabillyら、米国特許4816567及びMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、6851頁 （1984年））、定常領域および超可変領域（または、Complementary-determining region；CDR）を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒト化抗体（Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、4285頁、1992年及びCarterら、BioTechnology、10巻、163頁、1992年）も本発明の抗体に含まれる。【００６１】
また、このようにして得られた本発明の抗体に対する抗体、すなわち抗イディオタイプ抗体もまた本発明に含まれる。【００６２】
このようにして得られた本膜分子に対する各種抗体は、その特徴を生かすことができる様々な用途に使用可能である。本膜分子が、成熟DC及び活性化した形質細胞様樹状細胞に特異的に発現が見られる分子であることを利用して、本抗体を蛍光性物質（ローダミン、フルオレサミンなど）で標識し、周知のFACSを用いて目的のDC及び形質細胞様樹状細胞を検出・分離したり、mo-DCのin vitroでの分化を確認することができる。さらに、本膜分子は成熟DC及び活性化した形質細胞様樹状細胞において発現量が上昇するタンパク質であることから、本抗体を用いてFACSにより未成熟DCと成熟 DCを分離したり、活性化した形質細胞様樹状細胞を分離することもできる。本膜分子の検出に関しては、FACSでの検出にとどまるものではない。例えばウェスタンブロッティングにおいて本抗体を１次抗体として作用させることにより検出可能であることが予想されるし、タンパク質レベルでの発現確認を行うことができる。また本抗体を固相(ポリスチレンビーズ、マイクロタイターウエル表面、ラテックスビーズなど)に結合して不均一系で、あるいは均一系で、免疫学的反応を行って相同な膜分子を検出、定量（蛍光抗体法、ELISA、ラジオイムノアッセイなどの方法使用）することができる。この場合、免疫学的反応は競合反応であってもよいし非競合反応であってもよい。また2つ以上の抗体(モノクローンまたはポリクローン)を用いるサンドイッチ法による反応も使用できる。上記における検出、定量のためには、当業界で公知のいずれの免疫学的手法も用いることができる。【００６３】
その他、本膜分子の機能を評価する用途にも使用可能である。成熟DCは強力なAPCであり、MHCクラスII分子を介したCD4陽性のT細胞を刺激活性化及びMHCクラスI分子を介したCD8陽性細胞障害性T細胞を刺激活性化することが知られている。これら機能を制御し得るか否かを確認するために、アロジェニックMLR（Mixed Lymphocyte Reaction）での機能を抑制しうるか否かの確認、抗原特異的にCTLを誘導した場合にその機能を抑制しうるか否かの確認、さらにDCの抗原提示に関わる分子か否かの確認等のin vitroでのアッセイにも使用可能である。【００６４】
本発明の抗体はさらに、in vivoで免疫応答を制御するために使用することもできる。本膜分子群は、前述したとおり、副刺激に関与する分子であると予想され、T細胞活性化に関わる膜分子であると予想される。このため、本発明の抗体が本膜分子群とT細胞上のリガンドとの結合を阻害する抗体であればT細胞活性化を抑制することが期待される。このように本膜分子群の機能制御可能な抗体を作用させることでDCの機能さらにはT細胞の機能を制御することによる免疫応答を制御し得ることが期待される。【００６５】
さらには本膜分子および本膜分子のリガンドの可溶化型分子（すなわち、細胞外領域に相当する分子）およびこれら分子に対する抗体にも免疫応答を制御する活性が期待される。【００６６】
本発明の抗体類または本膜分子の可溶化型分子を用いて本膜分子のリガンドを取得することも可能である。可溶化型本膜分子リガンドは直接本膜分子に作用し、DC上の本膜分子を介したシグナルを制御し得る。また、本膜分子のリガンドと本膜分子の相互作用をモジュレートできる低分子物質や本膜分子のリガンド及び本膜分子に関わる細胞内シグナル経路をモジュレートする低分子物質もシグナルの制御に有用である。【００６７】
本発明の抗体類または本膜分子の可溶化型分子、本膜分子のリガンドの可溶化型分子、上記低分子を治療に用いる場合には、例えば癌、自己免疫疾患、臓器移植、感染症、アレルギーなどの疾患の治療に適用可能である。【００６８】
投与法および投与剤型は特に制限されないが、静脈、動脈内投与、筋内投与、経口投与、座剤投与などであり、薬学的に許容可能な賦形剤や希釈剤と組み合わせて経口用または非経口用に処方することができるが、好ましくは非経口投与である。投与は1日あたり1回かまたは数回に分けて行い、投与量は患者の重篤度、年齢、性別、体重などの条件に応じて決定され、副作用を併発しない範囲である。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって限定されないものとする。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって限定されないものとする。
実施例１ DCの細胞膜の調製
細胞膜タンパク質の場合、元々発現量が低いこと、またハンドリングが難しいことが挙げられる。これを解決する手段の一つとして、より純度の高い細胞膜を取得する方法を確立することが必要である。細胞膜表面をコートし、これを均一に破砕することで、比重の重くなった細胞膜を密度勾配遠心により取得する方法で純度の高い細胞膜を調製した［J. Biol. Chem.、258巻、10062-10072頁（1983年）］。【００７０】
ターゲットとしている膜分子の発現量の少なさとハンドリングの難しさから、大量のマウスDCを集めるために骨髄細胞をGM-CSF存在下培養することで骨髄細胞由来未成熟DCを大量調製した。LPS（リポポリサッカライド）刺激あり、なしを同数の細胞で実施し、同数（5×108細胞）の未成熟DCと成熟DCを得た。【００７１】
実施例２ タンパク質の高感度検出とin gel digestion
Mannら［Anal. Chem.、68巻、850-858頁（1996年）］の手法に従って銀染色によりタンパク質を検出した。酵素消化法についてはトリプシンを用いたin gel digestion法［Anal. Chem.、224巻、451-455頁（1995年）］により行い、以下で使用する分析サンプルとした。【００７２】
実施例３ 膜タンパク質の分画
実施例１で得られた細胞膜より界面活性剤を用いて細胞膜タンパク質を可溶化した後、コンカナバリンAセファロースにアプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した。これら素通り画分をConA FTと称した。吸着画分はメチル-alpha-D-グルコピラノシドと界面活性剤を含有した緩衝液で溶出した（ConA EL）。ConA FTは小麦胚アグルチニンセファロースに再度アプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した。これら素通り画分をWGA FTと称した。吸着画分はN-アセチルグルコサミンと界面活性剤を含有した緩衝液で溶出した（WGA EL）。ConA EL、WGA EL、WGA FTを分子同定サンプルとした。これら画分をSDS-PAGEにて展開した後、実施例２の手法によりタンパク質を検出し、短冊状に切ったゲルをin gel digestionして分析サンプルとした。【００７３】
実施例４ LC/MSによる微量分析
LC/MS(Applied Biosystems社製QTRAP)を用いて、実施例3で得たサンプルを分析した。95％溶液A（0.1％ギ酸）および5％溶液B（0.08％ギ酸、80％アセトニトリル）で平衡化したPepMap逆相カラム（内径0.075ｍｍ×長さ150ｍｍ）（LCパッキングス社製）にかけ、180ナノリットル/分の流速で、5分洗浄後、67.5分かけて溶液Bの比率を50％まで直線的に上げることにより順次溶出しMSに導入した。MSに導入されたサンプルは次の繰り返しサイクルでデータ取得を行い、その配列情報を得ることとした。1. Full MS Scan：m/z=0〜2000のレンジでの親イオンの分子量の観測。2. Zoom MS Scan：Full MS Scanで同定された親イオンの価数の観測。3. MS/MS Scan：Zoom MS Scanで測定された分子にHeガスをあてた場合に生じる娘イオンの観測。理論的なb,yシリーズとどれだけの本数がどれだけの強度でマッチングするかをスコア化してランクをつける同定法（SEQUESTアルゴリズム）により同定した［アメリカン・ソサイアティ・フォー・マス・スペクトロメトリー、5巻、976-989頁（1994年）］。【００７４】
実施例５ 本膜分子の同定
実施例４の手法により同定された分子のうち、新規分子である本膜分子が同定された。同定対象となったフラグメントはm/z=649.33及びm/z=749.91の２価イオンであり、そのMS/MSのパターンは本膜分子の２ヶ所の部分アミノ酸配列（11残基および15残基）IDNLCYPFVSK（配列番号３）及びGSSVVSTPDIIPATR（配列番号４）に非常に良く帰属された。これら部分配列のnon-redundant DNA databaseに対するホモロジーサーチの結果、これら部分配列を有する塩基配列は他に存在しないことが明らかとなった。【００７５】
実施例６ 本膜分子の遺伝子クローニング
実施例５で同定された部分アミノ酸配列（配列番号３及び配列番号４）をマウス遺伝子データベースに対してサーチを実施したところ、同一遺伝子をコードしていると考えられる３つの異なるｃDNAであるAK080114、AK089248、AK089332が完全に一致する部分配列を有する遺伝子であることが判明した。そこで、実施例5で明らかとなった部分アミノ酸配列に対応する遺伝子配列をもとにプライマーを合成し、マウス成熟DCのcDNAライブラリを鋳型としてRT-PCRを実施した。プライマーはそれぞれ22merおよび25merで、センスプライマー5'- CTCCCCTCCTTTCTTGCTCAAC -3'（配列番号５）とアンチセンスプライマー5'- TCAGGAGTTACTGTTGTGTGCCTTC -3'（配列番号６）を用いた。この結果、約800bp弱の本膜分子の遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより本膜分子の遺伝子を含むクローンを選抜し、塩基配列を決定した。推定open reading frame構造を配列番号２に、推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。得られた遺伝子配列完全に一致する既知遺伝子は報告がなかった。【００７６】
本膜分子の推定アミノ酸配列の一次構造についてKyteとDoolittleの方法（J. Exp. Med.、157巻、105-132頁、1982年）に従い、ハイドロパシープロット解析を行なった（図１）。その結果、本膜分子はN末端にシグナル配列を有するI型の細胞膜貫通タンパク質であることが明らかとなった。本膜分子（Ａ）は２２９アミノ酸残基からなり、ハイドロパシープロット解析結果から23アミノ酸残基のシグナル配列、169アミノ酸残基の細胞外領域、20アミノ酸残基の膜貫通領域、17アミノ酸残基の細胞内領域を有していると予想される。さらにホモロジー検索並びにモチーフ検索の結果から細胞外領域は３ヶ所のアスパラギン結合型糖鎖付加部位、２ヶ所のイムノグロブリン（Ig）ドメイン形成に必要なシステイン残基を持つ１つのイムノグロブリン様の構造を有していた。また、この細胞外のIgドメインはV set構造であることが類推された。さらに、膜分子（Ａ）には細胞内領域にシグナルを伝達し得るモチーフを有しないものの、膜貫通領域にリジン残基を有することから、アダプター分子と会合していることが予想され、この会合したアダプター分子を介してシグナルを伝達することが予想された。【００７７】
実施例７ 本膜分子の可溶化型組換え体の作製
ハイドロパシープロット解析（図２）の結果から、細胞外ドメインと考えられる領域とヒトIgG1のFc領域を結合させた組換え体を作製した。なおヒトIgG1のFc領域は各種細胞表面上に存在するFc gamma receptorへの結合を防ぐために3ヶ所のアミノ酸置換を行った。具体的には細胞外領域として（Ａ）の配列番号１のアミノ酸１９２位までを選択した。この可溶化型組換え体のアミノ酸配列を配列番号７に示す。Fc領域でアミノ酸置換を行った部位は配列番号７に示す212位（Ala→Leu）、213位（Glu→Leu）、379位（Asp→Val）に相当する。この遺伝子をＣＭＶプロモータ制御下293T細胞で一過性に発現させ、得られた培養上清からFc領域に結合性を有するプロテインＡを結合させた樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより発現産物を精製した。（図２）【００７８】
実施例８ 本膜分子に対する特異的モノクローナル抗体の樹立
実施例７に記載の組換え体をラットに免疫後がん細胞とフュージョンすることにより特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。スクリーニングは実施例７に記載の組換え体を固層化しELISA法により反応性を有するクローンを選抜するとともに、該膜分子（A）を強制的に発現させた細胞に対する反応性をフローサイトメーター（BD Bioscience社製）で解析することで特異的モノクローナル抗体を樹立した。【００７９】
具体的にはWhisterラットに実施例７に記載の組換え体をコンプリートフロイントアジュバント（Difco社製）とエマルジョン化した後１匹あたり1mg腹腔内に免疫する。免疫14日後、脾臓を摘出し、脾細胞を遊離する。得られた脾細胞はミエローマ細胞とポリエチレングリコールにて懸濁しフュージョンした後、HAT培地中で培養することによりセレクションを行う。立ち上がってきたハイブリドーマについて限外希釈法によりモノクローンにする。各モノクローンの上清について、上記スクリーニングを行うことにより該膜分子（A）に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマの無血清培養上清よりProteinGに対するアフィニティ精製によりモノクローナル抗体の精製を行う。【００８０】
実施例９ 本膜分子に会合するアダプター分子の同定
該膜分子（A）は細胞膜貫通領域にリジン残基を有することから、イオン結合的にアダプター分子と会合していることが示唆される。そこで実施例８に記載の方法により樹立したモノクローナル抗体を用いて、該膜分子（A）に会合するアダプター分子の検索を、フローサイトメーターを用いて行った。【００８１】
具体的には下流にIRES-GFPを繋いだ該膜分子（A）と各アダプター分子の全長遺伝子をそれぞれ発現ベクターに挿入し、FuGENE6（ロシュ社製）を用いたリポフェクション法により293T細胞に共トランスフェクションする。トランスフェクション後6〜24時間の293T細胞について、GFP陽性の該膜分子（A）発現細胞について細胞表面での発現をフローサイトメーター（BD Bioscience社製）により解析する。【００８２】
該膜分子（A）は単独では細胞表面に発現しないものの、アダプター分子DAP12あるいはDAP10と共発現させることにより細胞膜表面に発現することが確認された（図３）。この結果は該膜分子（A）の細胞表面への発現および該膜分子（A）からのシグナル伝達にはDAP12ないしDAP10が必須であるアダプター分子であることを強く示唆するものである。【００８３】
実施例１０ マウス脾細胞へのモノクローナル抗体の反応性の検索
実施例８に記載の技術により樹立されたモノクローナル抗体を用いて該膜分子（A）の発現の局在を確認した。該モノクローナル抗体をビオチン化した後マウス脾臓由来白血球に作用させ、フィコエリスリン結合アビジンを反応させることにより該膜分子（A）の発現細胞を確認した。【００８４】
具体的にはB6マウスより脾臓を摘出し、白血球を調製する。この細胞を大腸菌由来粗精製リポポリサッカライド（Sigma社製）にて24時間刺激する。モノクローナル抗体のビオチン化はSulfo-NHS-AC-biotin（同仁堂社製）と20mM Hepes-NaOH（pH8.5）中で1時間氷中にて反応させることにより標識する。未刺激脾細胞と刺激脾細胞について該膜分子（A）の発現をビオチン標識モノクローナル抗体を用いてフローサイトメーター（BD Bioscience社製）により解析する。【００８５】
未刺激の細胞では反応性のある細胞は確認できなかった。一方マウス脾臓由来白血球を24時間活性化させた細胞ではCD11c陽性の細胞の一部が反応性を有することが確認された（図４）。該モノクローナル抗体に反応性を有する細胞集団を突き止めるためにさらに詳細な細胞表面マーカーの解析を実施した。その結果、本細胞集団は、B220陽性、CD11b陰性、Gr-1陽性であることが明らかとなり、形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid Dendritic Cells; PDC）であることが明らかとなった（図５）。さらにMHC クラスII、B7-2、CD1が陽性であることから成熟化していることが明らかとなった。該膜分子（A）は成熟化PDC特異的に発現する細胞表面分子であることが明らかとなった。このような分子はこれまで知られていない。【００８６】
実施例１１ 該膜分子（A）の発現上昇をもたらす因子の検索
実施例９に記載のように本膜分子は活性化形質細胞様樹状細胞特異的に発現が見られる分子であることが明らかになったことから、該膜分子（A）の発現上昇をもたらす形質細胞様樹状細胞を活性化し得る因子の検索を行った。脾細胞よりMACSビーズによる濃縮とフローサイトメーターによるソーティングにより、CD11c陽性PDCA-1陽性B220陽性の形質細胞様樹状細胞を調製した。【００８７】
具体的には、脾細胞をPDCA-1ビーズ（Miltenyi Biotec社製）と反応させLSカラム（Miltenyi Biotec社製）を用いてPDCA-1陽性細胞を濃縮した後、APC標識CD11c、PE標識PDCA-1、FITC標識B220にて染色後、FACS Vantage SE（BD Bioscience社製）にてCD11c陽性PDCA-1陽性B220陽性の形質細胞様樹状細胞をソーティングにより調製する。【００８８】
種々の自然免疫活性化物質を検索した結果、Toll-like Receptor９（TLR9）のシグナル伝達経路により活性化をもたらすCpGのうち、CpG-Aと呼ばれる一群が該膜分子（A）の発現上昇をもたらすことが明らかとなった（図６）。CpG-AはD19と呼ばれる配列（配列番号８）（ggTGCATCGATGCAgggggG;小文字はフォスフォロチオエート結合、8番目と9番目のCGはフォスフォジエステル結合、8番目と9番目のCGはCpGモチーフ、下線はパリンドロームを表す）を用いた。CpG-Aは各種CpG-ODNの中でもPDCに作用して、大量のＩ型インターフェロン（IFN）を産生させる一群であることから、該膜分子（A）はPDCより大量のＩ型IFNを産生させる機能に関わることが強く示唆された。【００８９】
実施例１２ 該膜分子（A）に対するアゴニスティック抗体を作用させることによるPDCの機能変化
PDCは骨髄細胞をFlt3 Ligand存在下培養することにより誘導できることが知られている（骨髄細胞由来PDC）。この系を用いて誘導した骨髄細胞由来PDCをCpG-Aにより刺激することにより活性化PDCを得た。実施例９に記載のように該膜分子（A）はDAP12をアダプター分子として、下流のシグナルを伝えることが明らかとなったが、この下流にはMAPキナーゼの一種であるpERK1/2がカスケード上にあることが知られている。取得した該膜分子（A）に対するモノクローナル抗体を活性化PDCに作用させ、pERK1/2のリン酸化を指標にアゴニスティック活性の検索を実施した。【００９０】
具体的にはマウス大腿骨より骨髄細胞を採取し、Flt3 Ligand（25ng/ml）存在下、10日間培養することにより骨髄細胞由来DCを得る。このDCフラクションをAPC標識CD11c、PE標識PDCA-1、FITC標識B220にて染色後、FACS Vantage SE（BD Bioscience社製）にてCD11c陽性PDCA-1陽性B220陽性の骨髄細胞由来形質細胞様樹状細胞をソーティングにより調製する。得られた骨髄細胞由来形質細胞様樹状細胞をCpG-A（1ug/ml）により刺激し、タイムコースをとって細胞を調製する。SDS-PAGEにより展開後、PVDF膜に転写し、pERK1/2の発現及びリン酸化を特異抗体（Cell Signaling社製）により、ウエスタンブロッティング法により確認する。【００９１】
その結果、アゴニスティック活性を有するモノクローナル抗体が存在することが明らかとなった（図７）。次にこの該膜分子（A）に対するアゴニスティックモノクローナル抗体を固層化したプレート上で、様々な濃度のCpG-A存在下、脾臓由来PDCを培養した。その結果、該膜分子（A）からのシグナルによりＩ型IFNの産生が増強されることが明らかとなった（図７）。特に低濃度のCpG刺激においては10倍から100倍の産生量をもたらす。生理的環境下におけるウイルス感染を考えた場合、初期感染時にもたらされる自然免疫活性化物質の量はごく限られたものであることが予想され、少量の自然免疫活性化物質の反応を増強・増幅することは生体防御を考える上で非常に重要であることが考えられる。該膜分子（A）はこのような増幅因子であることが上記結果から強く示唆される。【００９２】
実施例１３ 本膜分子とＩ型インターフェロンレセプターとの関係解明
PDCからのＩ型IFN産生にはそのレセプターの発現が重要であることが知られている。Ｉ型インターフェロンレセプター（IFNαβR）からの刺激によりＩ型IFNの産生に必須の転写因子であるIRF7の発現が増強され、Positive Feedback Amplification Loopが成立するためである。そこでIFNαβRのノックアウトマウスにおける該膜分子（A）の発現上昇を確認した。【００９３】
具体的にはマウス脾細胞より実施例１０及び実施例１１に記載の手法により該膜分子（A）の発現をフローサイトメーターにより確認する。【００９４】
その結果、IFNαβRのノックアウトマウスにおいては発現上昇が見られないことが明らかとなった（図８）。この結果は実施例１２とあわせて、該膜分子（A）がPositive Feedback Amplification Loopにより発現上昇がもたらされる分子であることを示しており、この発現上昇がＩ型IFN産生に重要であることを示唆するものである。【００９５】
実施例１４ 本膜分子のレセプターコンプレックスの同定
該膜分子（A）と細胞外ドメインで48％のアミノ酸一致を示すTREM-1の結晶構造解析の結果をもとにホモロジーモデリングにより立体構造予測を実施した（図９）。TREM-1がユニークなhead to tailの二量体を形成しているのと同じように、該膜分子（A）も似たようなhead to tailの二量体を形成し得ることが示唆された。リガンド結合部位については通常ループ部分（図９の赤色部分）に存在することが報告されている。驚くべきことにTREM-1および該膜分子（A）の予想されるリガンド結合部位は分子の側面に位置することが明らかとなった。この結果は該膜分子（A）が膜上の他の分子と会合することを強く示唆するものである。【００９６】
実施例１５ 本膜分子に対する会合分子の同定
実施例１４に記載の知見から該膜分子（A）に会合する分子の同定を試みた。骨髄細胞由来PDCの細胞膜表面をビオチン化後、細胞を界面活性剤にて可溶化し、該膜分子（A）に対するポリクローナル抗体による免疫沈降した。サンプルはSDS-PAGEによる電気泳動後、PVDF膜にトランスファし、HRPをコンジュゲートしたアビジンにより検出した。【００９７】
具体的には実施例１２に記載の手法により調製した骨髄細胞由来形質細胞様樹状細胞を実施例１０に記載のビオチン化試薬を用いてPBS中で1時間氷中にて反応させることにより細胞表面をビオチン化する。細胞表面がビオチン化された骨髄細胞由来形質細胞様樹状細胞を1％NP-40含有PBSにより可溶化する。ここに実施例８に記載の抗体を添加し4℃にてo/n反応させた後、ProteinGアガロースにて抗体及び抗原のコンプレックスを免疫沈降により回収する。回収されたサンプルはサンプルバッファー添加後、95℃、5分間煮沸した後、検出用サンプルとして供される。【００９８】
その結果220kDaと100kDaに該膜分子（A）に対する会合分子と予想されるバンドを検出した（図１０の左図）。次に実施例１および実施例３に記載の手法により膜分子を調製後、該膜分子（A）に対するポリクローナル抗体による免疫沈降を実施し、SDS-PAGEによる電気泳動後、実施例２に記載の手法によりタンパク質を検出した。その結果、上記と同じ位置に候補となるバンドを検出した。バンドを切り出し、APIによる消化後、実施例４に記載の同定手法により分子を同定した。その結果、220kDaのバンドはPlexin-A1、100kDaのバンドはNeuropilin-1であることが明らかとなった（図１０の右図）。【００９９】
実施例１６ 本膜分子とPlexin-A1およびNeuropilin-1の会合状態の解析
実施例１５に記載の事実に基づいて、該膜分子（A）とPlexin-A1およびNeuropilin-1の会合状態の解析を実施した。該膜分子（A）全長遺伝子およびDAP12、Plexin-A1、Neuropilin-1を異なるタグ配列を付加した全長遺伝子を様々な組み合わせでトランスフェクションした。【０１００】
具体的にはFLAGタグを付加したDAP12、Mycタグを付加したPlexin-A1、HAタグを付加したNeuropilin-1、及び該膜分子(A)の全長遺伝子を発現ベクターに挿入した。実施例９に記載の手法により293T細胞に各遺伝子が発現することをそれぞれの特異抗体を用いて、実施例１２に記載のウエスタンブロッティングの手法により確認した。各発現ベクターを種々の組み合わせにより293T細胞に共トランスフェクションし、該膜分子（A）に対する抗体で実施例１５に記載の手法により免疫沈降した。回収されたサンプルはそれぞれの特異抗体を用いて実施例１２に記載のウエスタンブロッティングの手法により共沈を確認した。【０１０１】
該膜分子（A）に対する抗体による免疫沈降とタグ配列に対する検出の結果、該膜分子（A）はPlexin-A1と会合しており、Neuropilin-1はPlexin-A1と会合していることが示唆された。これら結果は図１１に示す２種類のレセプター複合体が存在し得ることを示唆している。さらにPlexin-A1のdeletion mutantの解析の結果、該膜分子（A）はPlexin-A1の細胞膜直上のイムノグロブリンドメインと会合していることが示唆された。【０１０２】
実施例１７ 本膜分子複合体に対するリガンドの免疫担当細胞における発現
Plexin-A1単独およびPlexin-A1/Neuropilin-1複合体に対するリガンドとして前者は膜型SemaphorinであるSema6Dが、後者は可溶化型SemaphorinであるSema3Aであることが報告されている。RT-PCRおよびDNAマイクロアレイによりSema6DならびにSema3Aの発現を免疫担当細胞で確認した。【０１０３】
各細胞特異的な細胞表面マーカーで細胞を染色した後、実施例１１に記載のようにセルソーターにより細胞を分離する。具体的には、例えば、CD3陽性のT細胞、CD19陽性のB細胞、NK1.1陽性CD3陰性のNK細胞、CD11c陽性CD11b陽性B220陰性のconventional DC、CD11c陽性CD11b陰性B220陽性のplasmacytoid DC、などである。これら細胞からRNeasy kit（キアゲン社製）を用いてtotal RNAを調製する。得られたtotal RNAはOne step RT-PCR kit（Invitrogen社製）により特異的な遺伝子の発現を確認するのに用いられる。また相補的なRNA合成後にはDNAマイクロアレイ（Affimetrix社製）により全体の遺伝子の発現確認に用いられる。【０１０４】
その結果、Sema3Aは発現が見られないものの、Sema6Dに関しては、NK細胞、NKT細胞、T細胞、B細胞のようなエフェクター細胞のみならず、活性化上皮細胞、PDC自身も発現していることが明らかとなった（図１２）。【０１０５】
実施例１８ Sema6D刺激によるPDCの機能変化
実施例１７に記載のように該膜分子（A）はレセプターコンプレックスを形成していることが明らかとなり、これに対するリガンドのひとつであるSema6Dが免疫担当細胞に発現していることを明らかにした。そこで、Sema6Dの細胞外ドメインをIgフュージョン（配列番号９及び１０、テキストファイルとして添付）の組換え体として発現させ、これを固層化したプレート上で様々な濃度のCpG-A存在下、脾臓由来PDCを培養した。【０１０６】
Sema6Dの細胞外ドメインとヒトIgG1のFcドメインとをフュージョン（以下Sema6DIg）し、pFastBacベクター（Invitrogen社製）にてバキュロウイルスのシステムによりSf9細胞により発現させた。無血清培養上清よりProteinA Sepharose（Amersham Bioscience社製）を用いてアフィニティ精製により組換え体を調製する。Sema6DIgを10μg/mlの濃度で96穴プレートに固層化し、実施例１１に記載の方法により調製したPDCを1x105個ずつ蒔種する。CpG-Aを0.01μM、0.1μM、1μMの濃度で加えることによりPDCを刺激し、培養24時間後のIFNalphaの濃度をELISA（PBL Biomedical Laboratories社製）により測定する。【０１０７】
その結果、該膜分子（A）からのシグナルによりＩ型IFNの産生が増強されることが明らかとなった（図１３）。特に低濃度のCpG刺激においては10倍から100倍の産生量をもたらす。生理的環境下におけるウイルス感染を考えた場合、初期感染時にもたらされる自然免疫活性化物質の量はごく限られたものであることが予想され、少量の自然免疫活性化物質の反応を増強・増幅することは生体防御を考える上で非常に重要であることが考えられる。該膜分子（A）に対するリガンドとしてSema6Dがこのような増幅に寄与していることが上記結果から強く示唆される。【０１０８】
実施例１９ in vivoにおける本膜分子の発現解析
実施例９から実施例１８に記載のように該膜分子（A）がin vitroにおいて活性化PDC特異的に発現しＩ型IFNの産生を制御する分子であることが明らかとなった。そこでin vivoにおける該膜分子（A）の発現を蛍光顕微鏡あるいは共焦点レーザー顕微鏡により確認した。【０１０９】
CpG-Aをfootpadに免疫後の鼠頚リンパ節（図１４、１５）あるいはiv投与後の脾臓（図１６、１７）を取得し、免疫組織染色を実施した。B細胞を特異的に染める抗IgM抗体、T細胞を特異的に染める抗CD3抗体、PDCを特異的に染める抗PDCA-1抗体、活性化PDCを特異的に染める抗該膜分子（A）抗体を用いた。【０１１０】
具体的には採取した臓器をTissue Tek OCT（サクラ社製）に馴染ませた後、-80℃で凍結する。凍結組織はクリオスタット（Leica Microsystems社製）にて薄切りし組織切片を作製する。組織切片はそれぞれの領域を染めるために抗CD3-ビオチン（T細胞領域、BD Bioscience社製）、抗IgM-ビオチン（B細胞領域、BD Bioscience社製）、抗PDCA-1-FITC（PDC、Miltenyi Biotech社製）、抗該膜分子（A）-ビオチン（活性化PDC）、ストレプトアヴィジン-Q-Dot605（QUANTUMDOT社製）を用いて染色を行う。染色像の観察には蛍光顕微鏡（ニコン社製）あるいは共焦点レーザー顕微鏡（BioRad社製）を用いる。【０１１１】
図１４に示すようにCpG-A投与によりPDCは局所リンパ節にmigrationするとともに活性化し、T細胞領域に浸潤していることが確認され、図１５においてはT細胞と活性化PDCの細胞相互作用も確認された。また図１６に示すように脾臓においてはPDCはクラスターを形成することが確認され、このPDCクラスターは図１７に示すように活性化PDCを取り巻くように非活性化PDCが存在することが確認された。実施例１７に記載のようにPDC自身もSema6Dが発現していることから、このPDCクラスターは効率的なＩ型IFNの産生に寄与すると考えられる。【０１１２】
実施例２０ PDC-TREMとDAP12の会合解析
実施例９に記載のPDC-TREMとDAP12の会合を確認するために、DAP12ノックアウトマウス脾細胞におけるPDC-TREMの発現を実施例１０に記載と同様の手法で確認したところ、活性化された後の脾細胞においては、もはやPDC-TREMの発現は確認できないことから、PDC-TREMはDAP12と会合していることが予想された（図１８）。さらにマウス骨髄をFlt3リガンド存在下10日間培養することにより誘導したPDC（FL-PDC）においてもCpG-A刺激によりPDC-TREMの発現上昇が見られることが明らかとなった（図１９）。さらにCpG-A刺激FL-PDCにおいてPDC-TREMと会合しているDAP12はリン酸化していることが確認された（図２０）。これらの結果は、PDC-TREMがDAP12と会合し、DAP12がシグナル伝達に関わるアダプターであることを強く示唆するものである。【０１１３】
実施例２１ PDC-TREMの発現上昇をもたらす因子の検索
実施例１１に記載のようにCpG-A刺激によりPDCにおけるPDC-TREMの発現上昇を確認することができたが、他の種々の刺激によるPDC-TREMのPDCにおける発現上昇を解析した（図２１）。その結果、PEIを用いて導入したPolyUやDOTAPを用いて導入したCpG-BではPDCにおけるPDC-TREMの発現上昇が見られるものの、CpG-B、純度の高いLPS やPEIを用いて導入したPolyAでは発現上昇は認められなかった。この結果はＩ型IFN産生性のPDCにおいてPDC-TREMの発現上昇が認められることと相関していることから、PDC-TREMがPDCにおけるＩ型IFN産生機構に関与することを強く示唆するものである。【０１１４】
実施例２２ PDC-TREMに対するブロッキング抗体を作用させることによるPDCの機能変化
PDC-TREMに対する特異的モノクローナル抗体を用いてCpG-AあるいはPolyU刺激FL-PDCからのＩ型IFN産生能ならびに炎症性サイトカイン産生にもたらす影響を解析した。その結果モノクローナル抗体1B5は、FL-PDCからのＩ型IFN産生を1/10〜1/100程度に抑制することが明らかとなった（図２２）。一方TNFalpha、IL-6、IL-12といった炎症性サイトカインについては、抗体処理による産生性に変化は見られなかった（図２３）。これらの結果は、PDC-TREMがPDCにおけるＩ型IFN産生の調節に関して特異的に関与する分子であることを強く示唆するものである。また、CpG-AあるいはPolyU刺激FL-PDCからのＩ型IFN産生能ならびに炎症性サイトカイン産生に影響を及ぼさない特異的モノクローナル抗体4A6も樹立した。【０１１５】
実施例２３ PDC-TREM下流のシグナル伝達経路の解明
実施例９及び１０、実施例２０及び２２に記載のようにPDC-TREMはDAP12と会合していると考えられる。このことからDAP12下流のシグナル伝達に関わると予想される分子群がPDCにおけるＩ型IFN産生に関与するか否かを刺激後の各分子のリン酸化を指標に確認した。図２２に示すように1B5がＩ型IFN産生を特異的に抑制することから1B5あるいは4A6処理したCpG-A刺激FL-PDCにおけるSyk、PI3K、Erk1/2のリン酸化を経時的に確認した。その結果、CpG-A刺激後3-9時間において、これら分子のリン酸化が抑制することを見出した（図２４）。さらにこのリン酸化の抑制はIFNalphaのmRNAの発現量と時間的に相関する（図２５）ことから、PDC-TREM下流のシグナル伝達経路は、Ｉ型IFN産生に関与することが強く示唆された。さらに、Ｉ型IFN産生増強に関与し、IRF7と結合することが知られているシグナル伝達分子IKKalphaのリン酸化についても1B5により抑制されることを確認した（図２４）。また、PI3KやMEK1/2（Erk1/2の直上に位置）の特異的インヒビターであるWortmanninやU0126によってFL-PDCにおいてCpG-A刺激によってもIFNalphaの産生がほとんど見られない（図２６）ことや、PI3Kp85ノックアウトマウスの骨髄細胞より誘導したFL-PDCにおいてCpG-A刺激によってもIFNalphaの産生がほとんど見られない（図２７）ことから、PDC-TREMおよびその下流のシグナル伝達経路がPDCにおけるＩ型IFN産生に重要な役割を果たしていることが示唆される。【０１１６】
実施例２４ Sema6D刺激によるシグナル伝達経路の解明
実施例１７および１８に記載のようにPDC-TREMはPlexinA1とレセプターコンプレックスを形成し、PDC-TREM/PlexinA1のリガンドのひとつと考えられるSema6DがPDCからのＩ型IFN産生を増強することが明らかとなった。そこでSema6D刺激によるPI3K、Erk1/2のリン酸化を経時的に確認したところ、実施例２３でリン酸化の抑制が確認されたPI3K、Erk1/2の3-9時間におけるリン酸化の亢進が確認され、Sema6D依存的なリン酸化は1B5で抑制され4A6では抑制されないことが明らかとなった（図２８）。この結果は、Sema6DがPDC-TREM依存的にPI3K、Erk1/2といったシグナル伝達分子をリン酸化し、Ｉ型IFN産生に寄与することを強く示唆するものである。【０１１７】
実施例２５ ウイルス感染時の生体防御反応におけるPDC-TREMの役割の解明
PDCがTLR9やTLR7といった種々のウイルス由来核酸を認識するレセプターを発現し、リガンド認識に伴い大量のＩ型IFNを発現することで抗ウイルス生体防御反応の役割の中心を担うことが知られている。PDC-TREMがPDCにおいてTLR刺激後高発現し、Ｉ型IFN産生に関与するという事実（実施例１３、１８、２２、２４）から、DNAウイルスとして単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）、RNAウイルスとして水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus; VSV）を用いてこれらウイルスに対する生体防御反応に関わるか否かを検証した。FL-PDCをin vitroにおいてHSVあるいはVSV刺激により産生されるIFNalphaは、生ウイルス、UV不活性化ウイルスいずれにおいても1B5により80%以上抑制されることが明らかとなった（図２９、３０、３１、３２）。一方、IL-12, IL-6といった炎症性サイトカインの産生はほとんど変わらなかった（図２９、３０、３１、３２）。そこで in vivoにおいてもPDC-TREMがIFNalphaの産生に関与するか否かを確認した。1B5腹腔内投与後、静注によりウイルス感染させたマウスの血中のサイトカイン濃度を測定したところ、in vitroと同様にin vivoにおいても産生されるIFNalphaは、生ウイルス、UV不活性化ウイルスいずれにおいても1B5により80%以上抑制されることが明らかとなった（図３３、３４、３５、３６）。一方、IL-12, IL-6といった炎症性サイトカインの産生はほとんど変わらなかった（図３３、３４、３５、３６）。さらに、ウイルス感染に対する抵抗性を生存率で確認した。ヒト感染モデルにのっとって経膣内感染させたHSV-2に対する生存抵抗性を1B5を用いて検証したところ、1B5投与マウスにおいて有意に死亡が確認された（図３７）ことから、ウイルスに対する生体防御反応にはPDC-TREMによるPDCからのＩ型IFN産生が重要であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、活性化（成熟化）したPDCを他の血球系細胞から選択的に高い純度で分離することができるのみならず、成熟DCと未成熟DCとの分離も可能とすることから、DC療法への該細胞の供給を可能とする。分離されたDCは、抗原をパルスしたのち、再び患者に戻すことにより癌ワクチンとして利用するなどの用途が期待される。またPDCは強力なI型インターフェロン産生細胞（Interferon Producing Cell; IPC）としても知られ、血中のI型インターフェロンの産生が高まることにより増悪するSLEなどの自己免疫疾患等への治療応用も期待される。また、本膜分子に対する抗体、あるいは本膜分子の可溶化型分子を用いてDCとT細胞との相互作用を阻害することで免疫応答を制御し得ることも期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、KyteとDoolittleの方法を用いた本膜分子のハイドロパシープロット解析を示す。
【図２】図２は、組換え体の発現と精製を示す。DTT+ (モノマー０): 60 kDa、DTT- (ダイマー): 120 kDa、プロテインAセファロースを用いて精製、銀染色、5/20勾配ゲル、1: インプット、2: フロースルー、3: 溶出液
【図３】図３は、該膜分子（A)の発現細胞集団のフローサイトメーターによる解析を示す。
【図４】図４は、該膜分子（A）に会合するアダプター分子の検索を示す。
【図５】図５は、該膜分子（A)陽性細胞集団のフローサイトメーターによる詳細な解析を示す。
【図６】図６は、CpG-AによるPDC-TREM（以下、図面中のPDC-TREMとは、本発明の膜分子膜分子（A）のことを示す）の発現上昇を示す。
【図７】図７は、アゴニスト抗体がPDC-TREMを活性化して、Ｉ型IFN をPDCから用量依存的に産生することを示す。
【図８】図８は、PDC-TREMが、IFNabR 欠損マウスのCpG-A 刺激PDCでは発現しないことを示す。
【図９】図９は、PDC-TREMの構造モデルの推定を示す。PDC-TREM head-to-tailダイマーは、head-to-headダイマーと比較して、膜に関して異なる方向を採るために受容体を必要とするようである。
【図１０】図１０は、膜分子（A）に対する会合分子の同定を示す。（左の図）SDS-PAGE 分離、PVDF膜に転写、Avidin-HRPで検出；1: 正常ラットIgGで免疫沈降；2: 抗-PDC-TREMで免疫沈降；avidin-HRPで検出（右の図）SDS-PAGE 分離、APIでゲル消化、MALDI-TOF/MSでＰＭＦ；1: 正常ラットIgGで免疫沈降、2: 抗-PDC-TREMで免疫沈降、銀染色で検出
【図１１】図１１は、膜分子（A）レセプター複合体の解析を示す。
【図１２】図１２は、Sema6D及びSema3Aの免疫担当細胞における発現解析を示す。
【図１３】図１３は、Sema6DはPDCに作用しI型IFNの産生を増強することを示す。
【図１４】図１４は、CpG-A投与後に成熟PDCがLNに移行することを示す。
【図１５】図１５は、CpG-A投与後のLNにおける成熟PDCとT/NKT細胞の直接的相互作用を示す。
【図１６】図１６は、PDCのクラスターが、CpG-A投与後に赤脾髄に局在することを示す。
【図１７】図１７は、成熟PDCがクラスターの中心に局在することを示す。
【図１８】図１８は、WTあるいはDAP12ノックアウトマウス由来CpG-A刺激脾細胞におけるPDC-TREMの発現を示す。
【図１９】図１９は、FL-CDCあるいはFL-PDCにおけるCpG-A刺激後のPDC-TREMの発現を示す。
【図２０】図２０は、CpG-A刺激FL-PDCにおいてDAP12がPDC-TREMと会合しリン酸化していることを示す。
【図２１】図２１は、種々の刺激後の脾細胞中のPDCにおけるPDC-TREMの発現を示す。
【図２２】図２２は、1B5あるいは4A6処理したCpG-AあるいはPolyU刺激FL-PDCにおけるIFNalphaの産生を示す。
【図２３】図２３は、1B5あるいは4A6処理したCpG-A刺激FL-PDCにおける炎症性サイトカインの産生を示す。
【図２４】図２４は、1B5あるいは4A6処理したCpG-A刺激FL-PDCにおけるシグナル伝達分子のリン酸化を示す。
【図２５】図２５は、1B5あるいは4A6処理したCpG-A刺激FL-CDCあるいはFL-PDCにおけるIFNaplha4の相対的mRNA量を示す。
【図２６】図２６は、PI3KあるいはMek1/2インヒビター存在下CpG-A刺激したFL-PDCにおけるIFNalphaの産生を示す。
【図２７】図２７は、WTあるいはPI3Kp85ノックアウトマウス由来CpG-A刺激FL-PDCにおけるIFNalphaの産生を示す。
【図２８】図２８は、Sema6D存在下CpG-A刺激FL-PDCにおけるIFNalphaの産生を示す。
【図２９】図２９は、1B5あるいは4A6処理した生HSV刺激FL-PDCにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの産生を示す。
【図３０】図３０は、1B5あるいは4A6処理した生VSV刺激FL-PDCにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの産生を示す。
【図３１】図３１は、1B5あるいは4A6処理したUV不活性化HSV刺激FL-PDCにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの産生を示す。
【図３２】図３２は、1B5あるいは4A6処理したUV不活性化VSV刺激FL-PDCにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの産生を示す。
【図３３】図３３は、1B5あるいはrat IgG2a投与し、生HSVを感染させたマウスにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの血中濃度を示す。
【図３４】図３４は、1B5あるいはrat IgG2a投与し、生VSVを感染させたマウスにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの血中濃度を示す。
【図３５】図３５は、1B5あるいはrat IgG2a投与し、UV不活性化HSVを感染させたマウスにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの血中濃度を示す。
【図３６】図３６は、1B5あるいはrat IgG2a投与し、UV不活性化VSVを感染させたマウスにおけるIFNalphaおよび炎症性サイトカインの血中濃度を示す。
【図３７】図３７は、1B5あるいはrat IgG2a投与し、生HSVを感染させたマウスの生存率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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