(57)【要約】本発明は、擬微小重力培養における細胞足場材料を用いた軟骨組織構築方法に関する。本発明によれば、骨髄細胞からの軟骨組織構築において、その形状をコントロールしながら、擬微小重力環境下でより早く均一な組織構築を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
擬微小重力環境下において、骨髄細胞を細胞足場材料に播種して培養することを特徴とする軟骨組織の構築方法。
【請求項２】
前記細胞足場材料が、コラーゲンベースの細胞足場材料、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、Ｄ，Ｄ−Ｌ，Ｌポリ乳酸、およびヒアルロン酸から選ばれるポリマーベースの細胞足場材料、もしくはこれらの複合体からなる細胞足場材料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞足場材料が、コラーゲンベースの細胞足場材料、またはポリカプロラクトンもしくはポリグリコール酸ベースの細胞足場材料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コラーゲンが架橋されていることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の１／１０〜１／１００に相当する重力を物体に与える環境である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記擬微小重力環境が、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより擬微小重力環境を地上で実現する１軸回転式バイオリアクターを用いて得られるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１軸回転式バイオリアクターが、ＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
骨髄細胞の播種密度が１０６〜１０７／ｃｍ３、ＲＷＶの回転速度が直径５ｃｍベッセルに対して８．５〜２５ｒｐｍの条件下で培養が行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養液中にＴＧＦ−βおよび／またはデキサメタゾンを添加して培養が行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨髄細胞が軟骨組織の移植を必要とする対象から採取された細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンがタイプＩまたはタイプＩＩコラーゲンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬微小重力培養における細胞足場材料を用いた軟骨組織構築方法に関する。より詳しくは、擬微小重力環境下において、骨髄細胞をコラーゲンベースの細胞足場材料等に播種して培養することを特徴とする軟骨組織構築方法に関する
【背景技術】
【０００２】
細胞から三次元組織構築を行う場合、通常適当な足場材料を用いて３次元培養を行うか、攪拌培養を行う必要がある。しかし、従来の攪拌培養では、細胞に与えられる機械的刺激や損傷が強く、大きな組織を得ることは困難か、あるいは得られたとしても内部で壊死を起こしていることが多かった。
これに対し、重量を最適化するために設計された一連のバイオリアクターが存在する。そのひとつであるＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターは、ＮＡＳＡが開発したガス交換機能を備えた回転式バイオリアクターである。ＲＷＶバイオリアクターは、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養を行う１軸回転式のバイオリアクターである。バイオリアクター内は、回転による応力のため、地上の重力に比較して１００分の１程度の微小重力環境となり、細胞は培養液中に均一に懸濁された状態で増殖し、凝集して、大きな組織塊を形成することが可能となる。回転式バイオリアクターの中には、２軸式ｃｌｉｎｏｓｔａｔなどのように、多軸方向に回転するものもあるが、多軸回転式のバイオリアクターはずれ応力を最小化することができないため、理想的な擬微小重力環境を再現することが困難である。
発明者らは、既にＲＷＶを用いて特別な細胞足場材料を用いることなく骨髄由来間葉系幹細胞から軟骨３次元組織が再生できることを報告した（２００３年日本バイオマテリアル学会  予稿集ｐ２７１）。しかしながら、この方法では構築される軟骨組織の形状をコントロールすることができないため、患部に適した組織構築が望まれる臨床応用については自ずと限界がある。
一方、ＲＷＶを用いた細胞培養はこれまで種々の細胞について試されており、細胞足場材料（ＰＬＧＡ）と軟骨細胞とのコンポジットを造ることにより軟骨組織を構築できることが確認されている（Ｆｒｅｅｄ  ＬＥ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ＡＰ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｉ，Ｂａｒｒｙ  ＪＲ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ  Ｇ，Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９８  Ａｐｒ  １０；２４０（１）：５８−６５．）。しかしながら、細胞足場材料を用いたＲＷＶ回転培養において、骨髄細胞からの軟骨組織構築を試みた報告はない。
また、静置培養における細胞足場材料としては既に種々のものが知られているが、回転式バイオリアクター内で実現される擬微小重力環境下での細胞培養において、どのような細胞足場材料が好適であるかは静置培養の結果からは予測ができない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、骨髄細胞からの軟骨組織構築において、その形状をコントロールしながら、擬微小重力環境下においてより早く均一な組織構築を行う方法を提供することにある。
本発明者らは、種々の細胞足場材料について、ＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ−ｗａｌｌ  ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターを用いた擬微小重力環境下での骨髄細胞からの軟骨組織構築を試みた。その結果、コラーゲンスポンジを細胞足場材料として用いた場合にのみ、極めて優れた軟骨組織構築が可能になることを見出した。
すなわち、本発明は擬微小重力環境下において、骨髄細胞を細胞足場材料に播種して培養することを特徴とする軟骨組織の構築方法に関する。
細胞足場材料としては、たとえばコラーゲンベースの足場材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマーベースの足場材料を好適に用いることができる。
前記方法において、擬微小重力環境は時間平均して地球の重力の１／１０〜１／１００程度であることが好ましい。このような擬微小重力環境は、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより擬微小重力環境を地上で実現するバイオリアクターを用いて得ることができる。
前記バイオリアクターとしては、１軸回転式バイオリアクターが望ましく、例えばＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターを挙げることができる。ＲＷＶバイオリアクターを用いた場合の好適な培養条件は、例えば、播種密度１０６〜１０７／ｃｍ３、回転速度８．５〜２５ｒｐｍ（直径５ｃｍベッセル）程度であるが、これに限定されるものではない。
本発明の方法では、培養液中に、ＴＧＦ−β、デキサメタゾン等の軟骨分化誘導因子を添加することが好ましい。
本発明にかかる細胞足場材料はスポンジ状構造を有することが好ましい。またコラーゲンベースの足場材料を用いる場合は、コラーゲンとしてコラーゲンタイプＩあるいはタイプＩＩを用いることが望ましく、ポリマーベースの足場材料を用いる場合はポリカプロラクトンやポリグリコール酸ベースのものを用いることが望ましい。
本発明の１つの実施形態として、軟骨組織の移植を必要とする対象（患者）から採取された骨髄細胞を用いる方法が挙げられる。移植対象者から採取された骨髄細胞により構築される軟骨組織は、拒絶反応等の問題がないため、当該対象の軟骨欠損部の再生・修復に好適に用いることができる。
本発明によれば、骨髄細胞から、所望の形状を有する均一な軟骨組織をより早く構築することができる。したがって、整形外科における関節リウマチや変形性関節症の治療や形成外科における耳介軟骨の修復を目的とした再生医療等、臨床への応用可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１の実験プロトコルを示す。
図２は、２週間ＲＷＶバイオリアクターで培養して構築した軟骨組織の（Ａ）ヘマトキシリン・エオジン染色像、（Ｂ）サフラニン０染色像、（Ｃ）トルイジンブルー染色像を示す。
図３は、ＲＷＶバイオリアクターにより構築した軟骨組織のＧＡＧ量を示すグラフである。斜線：コラーゲンスポンジを用いた場合、白抜き：細胞を培養液に播種した場合（コントロール）。＊有意差あり＝ｐ＜０．０５
図４は、ＲＷＶバイオリアクターにより構築した軟骨組織の圧縮強度を示すグラフである。斜線：コラーゲンスポンジを用いた場合、白抜き：細胞を培養液に播種した場合（コントロール）。＊有意差あり＝ｐ＜０．０５
図５は、コラーゲンスポンジを用いて２週間ＲＷＶバイオリアクターで培養した構築した軟骨組織を（Ａ）抗コラーゲンタイプＩ抗体、および（Ｂ）抗コラーゲンタイプＩＩ抗体を用いて免疫染色した結果を示す。
図６は、細胞を培養液に播種して２週間ＲＷＶバイオリアクターで培養して構築した軟骨組織の（Ａ）外見写真と（Ｂ）サフラニン０染色像を示す。
図７は、コラーゲンスポンジを２週間（Ａ）静置培養、および（Ｂ）ＲＷＶ回転培養した後の位相差−蛍光（ＤＡＰＩ）顕微鏡像を示す。
図８は、培養２週間後のＯＰＬＡの（Ａ）トルイジンブルー染色像（ｘ４０）、および（Ｂ）ＳＥＭ像（ｘ３００）を示す。
図９は、培養２週間後のＨＡＰ−ＨＡの（Ａ）トルイジンブルー染色像（ｘ４０）、（Ｂ）ＳＥＭ像（ｘ２００）、および（Ｃ）位相差顕微鏡像（ｘ４０）を示す。
図１０は、ＲＷＶバイオリアクターを用いた軟骨組織構築におけるスキャホールド（コラーゲンスポンジ）の影響を、抗コラーゲンタイプＩ抗体を用いた免疫染色により評価した結果である。
コラーゲンスポンジなし：（Ａ）移植２週間後、（Ｂ）移植４週間後
コラーゲンスポンジあり：（Ｃ）移植２週間後、（Ｄ）移植４週間後
図１１は、ＲＷＶバイオリアクターを用いた軟骨組織構築におけるスキャホールド（コラーゲンスポンジ）の影響を、抗コラーゲンタイプＩＩ抗体を用いた免疫染色により評価した結果である。
コラーゲンスポンジなし：（Ａ）移植２週間後、（Ｂ）移植４週間後
コラーゲンスポンジあり：（Ｃ）移植２週間後、（Ｄ）移植４週間後
図１２は、ＲＷＶバイオリアクターを用いた軟骨組織構築におけるスキャホールド（コラーゲンスポンジ）の影響を、抗プロテオグリカン抗体を用いた免疫染色により評価した結果である。
コラーゲンスポンジなし：（Ａ）移植２週間後、（Ｂ）移植４週間後
コラーゲンスポンジあり：（Ｃ）移植２週間後、（Ｄ）移植４週間後
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００５−１７４９３２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．擬微小重力環境
本発明において、「擬微小重力環境」とは、宇宙空間等における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。すなわち、回転している物体は、地球の重力と応力のベクトル和で表される力を受けるため、その大きさと方向は時間により変化する。結局、時間平均すると物体には地球の重力（１ｇ）よりもはるかに小さな重力しか作用しないこととなり、宇宙空間によく似た「擬微小重力環境」が実現される。
前記「擬微小重力環境」は、細胞が沈降することなく均一に分散した状態で増殖分化し、３次元的に凝集して、組織塊を形成できるような環境であることが必要となる。言い換えれば、播種細胞の沈降速度に同調するように回転速度を調節して、細胞に対する地球の重力の影響を最小化することが望まれる。具体的には、培養細胞にかかる微小重力は、時間平均して地球の重力（１ｇ）の１／１０〜１／１００程度であることが望ましい。
２．バイオリアクター
本発明では、擬微小重力環境を実現するために、回転式のバイオリアクターを使用する。そのようなバイオリアクターとしては、例えば、ＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ：ＵＳ  ５，００２，８９０）、ＲＣＣＳ（Ｒｏｔａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ：Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、３Ｄ−ｃｌｉｎｏｓｔａｔ、ならびに特開平８−１７３１４３号、特開平９−３７７６７号、および特開２００２−４５１７３号に記載されているようなものを挙げることができる。これらのバイオリアクターの中には、１軸回転式のものと２軸以上の多軸回転式のものがあるが、本発明では１軸回転式のバイオリアクターを用いることが好ましい。多軸回転式（例えば、２軸式のｃｌｉｎｏｓｔａｔ等）では、ずれ応力（シェアストレス）を最小化することができず、またサンプル自体も回転するため、１軸回転式のようにベッセル内にふわふわと浮かんだ状態を再現することができないからである。このふわふわと浮かんだ状態が、特別な細胞足場材料なしに大きな３次元的組織塊を得るための重要な条件となる。なかでも、ＲＷＶおよびＲＣＣＳはガス交換機能を備えているという点で優れている。
本発明の実施例で用いられているＲＷＶは、ＮＡＳＡによって開発されたガス交換機能を備えた１軸回転式のバイオリアクターである。ＲＷＶは、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養を行う。バイオリアクター内には、回転による応力のため、実質的に地球の重力よりもはるかに小さい「微小重力環境」が実現される。この擬微小重力環境下において、細胞は培養液内に均一に懸濁され、最小のずり応力下で必要時間培養増殖され、凝集して組織塊を形成する。
ＲＷＶを用いた場合の好ましい回転速度は、ベッセルの直径および組織塊の大きさや質量に応じて適宜設定され、例えば直径５ｃｍのベッセルを用いた場合であれば８．５〜２５ｒｐｍ程度であることが望ましい。このような回転速度で培養を行うとき、ベッセル内の細胞に作用する重力は実質的に地上の重力（１ｇ）の１／１０〜１／１００程度となる。
３．骨髄細胞
本発明では軟骨組織構築の材料として骨髄細胞を用いる。本発明に用いられる骨髄細胞とは、骨髄由来の分化・増殖能力を有する未分化細胞であり、特に骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい。前記細胞は、樹立された培養細胞株のほか、軟骨組織の移植を必要とする対象（患者）の生体から単離された骨髄細胞を好適に用いることができる。該細胞は移植対象者から採取された後、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。さらに移植対象者から採取した培養は、凍結保存されたものであってもよい。つまり、予め採取した骨髄細胞を凍結保存しておき、必要に応じて利用することもできる。
４．細胞足場材料（スキャホールド）
本発明では、適当な足場材料を用いて細胞を培養する。用いられる足場材料としては、当該分野で公知のものであれば特に限定されず、たとえば、コラーゲンベースの細胞足場材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の細胞足場材料、またはそれらの複合体を挙げることができる。
ＲＷＶ回転培養では、回転による流れの力を受けるため、細胞足場材料は回転によって形状がくずれない程度の強度を有するとともに、回転によって接着した細胞がはがれないような細胞との接着力を有することが好ましい。
本発明で用いられる「コラーゲンベースの細胞足場材料」とは、主にコラーゲンから構成されるスキャホールドである。コラーゲンは細胞との接着性が高く、また架橋の導入により所望の力学的強度に調整できるため、ＲＷＶ回転培養の細胞足場材料として好適といえる。
用いられるコラーゲンとしては、骨や歯の有機質の大部分を占め、生体親和性が高いコラーゲンタイプＩあるいは軟骨基質の主成分であるタイプＩＩが好ましい。前記コラーゲンタイプＩおよびタイプＩＩは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法に従って適当な材料（例えば、タイプＩであれば豚やウシの皮膚をはじめとする動物の結合組織）から抽出・精製してもよい。精製したコラーゲンは凍結乾燥後、酢酸溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、ＨＥＰＥＳ等を添加してインキュベートすることにより、再構成コラーゲン線維として得ることもできる。
本発明では、コラーゲンを凍結乾燥してスポンジ状構造物としたものを用いることが望ましい。このスポンジ状の構造は、細胞培養の足場材料として必要な物理的特性をコラーゲンに与える。
スポンジ状構造物を得る場合、凍結乾燥の条件（例えば、温度、凍結時間、水中での凍結乾燥等）は、所望の細胞足場材料の構造、すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等に応じて、適宜調整することができる。また、得られた凍結乾燥物は、必要に応じて成形して利用することもできる。なお、「スポンジ状構造」とは、柔軟性を有する微小多孔質構造（数μｍ〜数１０μ程度の無数の孔（空隙）が存在する構造）を意味するものとする。本発明においては、スポンジ状構造物の空隙率は好ましくは４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％である。この範囲を超えると、細胞の侵入が不十分になるとともに、強度の低下を招くからである。
コラーゲン線維には必要に応じて架橋を施してもよい。架橋は、コラーゲン同士のどの部分を架橋するものであってもよいが、特にカルボキシル基と水酸基、カルボキシル基とε−アミノ基、ε−アミノ基同士を架橋することが好ましい。架橋は、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋、γ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いた物理的架橋など、いずれの方法で行ってもよい。特に、架橋剤を用いた化学的架橋は、架橋度のコントロールしやすさや、得られる架橋体の生体適合性という面から、特に好ましい。架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジド系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤の使用量は、コラーゲン１ｇに対して１０μｍｏｌから１０ｍｍｏｌ程度とすることが好ましい。
本発明で用いられる「ポリマー系の細胞足場材料」としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、Ｄ，Ｄ−Ｌ，Ｌポリ乳酸、およびヒアルロン酸等のポリマーから構成されるスキャホールドを挙げることができる。なかでも、ポリカプロラクトン（第６回日本組織工学会プログラム抄録集ｐ７９（２００３年６月発行）寺田伸一他、穏徐吸収性生分解性ポリマーを用いた耳介型軟骨組織の誘導）やポリグリコール酸は細胞との接着性が高く、適度な力学的強度を有することから、ＲＷＶ回転培養に好適である。
前記細胞足場材料には、本発明の目的と効果を損なわない限りにおいて、後述する軟骨細胞分化促進作用を有する薬剤や他の多孔質の硬材料：例えば、ハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ等が含まれていても良い。
５．細胞の培養条件
細胞の分化増殖に用いられる培地としては、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、骨髄細胞の培養に通常用いられる培地を、細胞の特性に合わせて適宜選んで用いることができる。また、これらの培地には、ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）やＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）等の抗生物質等を添加しても良い。
さらに培養液中には、軟骨細胞分化促進作用を有する、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６やシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦ−β等の骨形成液性因子から選ばれる１種または２種以上を、グリセリンリン酸、アスコルビン酸リン酸等のリン酸原とともに、添加してもよい。特に、ＴＧＦ−βとデキサメタゾンのいずれかまたは両方を適当なリン酸原とともに添加することが好ましい。この場合、ＴＧＦ−βは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ程度、デキサメタゾンは１００ｎＭを上限として加えられる。また、ＴＧＦ−βなどの増殖因子を加える代わりにＴＧＦ−βなどの増殖因子を含む多血小板血漿（ＰＲＰ；ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）を加えることも可能である。多血小板血漿の添加は、臨床応用を考えた場合、拒絶反応のない安全な方法という点で好適であると言える。
細胞の培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも４日、好ましくは７〜２８日である。
特に、ＲＷＶ（直径５ｃｍベッセル）を使用する場合、骨髄細胞を１０６〜１０７／ｃｍ３の播種密度でコラーゲンベースの細胞足場材料に播種し、前記した培養液を用いて８．５〜２５ｒｐｍの回転速度（直径５ｃｍのベッセル）で培養を行うとよい。この条件であれば、播種細胞の沈降速度とベッセルの回転速度が同調し、細胞に対する地球の重力の影響が最小化されるからである。
なお、スキャホールドを用いない場合はオーバーコンフルエントまで培養した細胞を播種してはじめて大きな軟骨組織塊を得ることができるが、コラーゲンスキャホールドを用いた場合にはオーバーコンフルエントまで培養しなくても軟骨組織塊を得ることができる。すなわち、スキャホールドを用いることにより、生体外での培養期間を２−３週間短縮（単層培養１週間と分化誘導１−２週間の短縮）することが可能となるが、これは臨床応用（移植）を考えた場合に極めて望ましい効果といえる。
６．本発明の利用
本発明の方法を再生医療に応用すれば、自己の骨髄細胞を利用した軟骨組織の再生が可能になる。すなわち、軟骨組織の移植を必要とする対象から採収した骨髄細胞をコラーゲンベースの細胞足場材料に播種して擬微小重力下で３次元的に培養して、所望の形状を有する軟骨組織を構築し、当該移植対象者の軟骨欠損部に適用することができる。構築された軟骨組織は拒絶反応の危険性がないうえ、自家軟骨細胞の使用に比較して正常組織の侵襲が少なく、培養により多数の軟骨細胞が得られるため、より広範な軟骨欠損の修復が可能になり、より安全な軟骨再生を可能にする。よって、本発明の方法は、基礎研究はもとより、関節リウマチや変形性関節症の治療を目的とした再生医療に利用することができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
［実施例１］コラーゲンスポンジを用いたＲＷＶバオイリアクターによるウサギ骨髄由来間葉系幹細胞からの軟骨組織構築
１．実験方法
（１）ウサギ骨髄由来間葉系幹細胞の調製
ウサギ骨髄由来間葉系幹細胞は、２週齢のＪＷ系家兎（雌）の大腿骨よりＭａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．，Ｓｏｄｅｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｈ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２５４，ｐ３１７−３３０）に従って採取した。採取した細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭで３週間にわたって培養し、増殖させた。
（２）ウサギ骨髄由来間葉系幹細胞の培養
上記のようにして調製したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞をコラーゲンスポンジ（ブタ皮膚より抽出精製したコラーゲンタイプＩを凍結乾燥し、架橋して作製したコラーゲンスポンジ）に１．５ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の濃度で播種し、１０−７Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｗａｋｏ製）、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ製）、４０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍｌ中で、３週間にわたってＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）による回転培養を行った。また、比較として、コラーゲンスポンジを使わずに、同濃度の細胞を直接上記培養液に播種して同様にＲＷＶバイオリアクターによる回転培養を行った。
ＲＷＶバイオリアクターによる回転培養は、直径５ｃｍのベッセルを用いて、回転数：８．０〜２４ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。回転数は、目視で組織塊が液中に浮いている状態になるように頻繁に調整した。培養中、細胞の呼吸により泡が生じるが、これは擬微小重力環境を乱すことから頻繁に除去した。図１に本実施例のプロトコルを示す。
２．評価方法
（１）組織染色
コラーゲンスポンジを用いた場合と、用いない場合（コントロール）のそれぞれで得られたＲＷＶ培養軟骨組織は、培養２週間後にヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）、サフラニン０、およびトルイジンブルーで組織染色を行い、軟骨基質産生能を評価した。まず、培養組織は、４％パラホルムアルデヒド，０．１％グルタルアルデヒドでマイクロウェーブ固定した後、翌日１０％ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で約１週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。５μｍの厚さで切片を作製した。次いで、各切片について脱パラフィン後、常法にしたがい、ヘマトキシリン・エオジン、サフラニン０、およびアルシアンブルー染色を行い観察した。結果を図２および図６に示す。
（２）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量の測定
コラーゲンスポンジを用いた場合と、用いない場合（コントロール）のそれぞれで得られたＲＷＶ培養軟骨組織のＧＡＧ量を、培養開始後１週間毎に測定した。測定は、Ｂｌｙｓｃａｎ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｌｔｄ．）を用いた色素定量により行った。結果を図３に示す。
（３）圧縮強度
コラーゲンスポンジを用いた場合と、用いない場合（コントロール）のそれぞれで得られたＲＷＶ培養軟骨組織の強度をＥＩＫＯ  ＴＡ−ＸＴ２ｉ（ＥＫＯ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）を使用して測定した。圧縮強度は、ＲＷＶ培養軟骨組織を２ｍｍ角に成形し、０．１ｍｍ／ｓｅｃの速度で圧縮し、その負荷（Ｐａ）と距離（ｍｍ）に基づくｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎ曲線から求めた。結果を図４に示す。
（４）免疫染色
コラーゲンスポンジを用いて２週間あるいは４週間培養して得られたＲＷＶ培養軟骨組織と、コラーゲンスポンジを用いることなく同様に培養して得られたＲＷＶ培養軟骨組織について、それぞれ抗コラーゲンタイプＩモノクローナル抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ製）、抗コラーゲンタイプＩＩモノクローナル抗体（第一ファインケミカル社製）、および抗プロテオグリカン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いた免疫染色を行った。結果を図５、および図１０〜１２に示す。
３．結果
（１）組織染色
ヘマトキシリン・エオジン染色、サフラニン０染色、トルイジンブルー染色による結果（培養２週）は極めて良好で、コラーゲンスポンジを用いて構築された軟骨組織は、最初のスポンジの形状をよく保持し、周辺部位を除いて均一な軟骨組織が構築されていることが確認された（図２）。
（２）ＧＡＧ量
ＧＡＧ量は、コラーゲンスポンジを用いた場合の方がコントロールに比べて有意に高かった（図３）。
（３）圧縮強度
圧縮強度は、コラーゲンスポンジを用いた場合の方がコントロールに比べてより早い時点（１週間程度）で高い強度に達し、その後その強度を維持した。（図４）。
（４）免疫染色
コラーゲンスポンジを用いて２週間ＲＷＶバイオリアクターで培養して構築した軟骨組織は、抗コラーゲンタイプＩ抗体ではほとんど染色されないが、コラーゲンタイプＩＩでは強く染色され、典型的な軟骨の特徴を示すことが確認された（図５）。
つぎに、コラーゲンスポンジ（スキャホールド）を用いた場合と用いない場合を比較した。抗タイプＩコラーゲン抗体を用いた免疫染色では、殆ど染色されず、培養時間やコラーゲンスポンジの有無にかかわらず、染色結果に大きな違いはみられなかった（図１０）。しかし、抗タイプＩＩコラーゲン抗体を用いた免疫染色では、２週間から４週間と培養時間が長くなるにつれて染色は強くなり、またコラーゲンスポンジを用いた場合のほうが、用いない場合よりも強い染色が確認された（図１１）。同様に、抗プロテオグリカン抗体を用いた免疫染色でも、２週間から４週間と培養時間が長くなるにつれて染色は強くなり、またコラーゲンスポンジを用いた場合のほうが、用いない場合よりも強い染色が確認された（図１２）。
すなわち、軟骨マーカータンパク質である、コラーゲンタイプＩＩとプロテオグリカンは、いずれもスキャホールド（コラーゲンスポンジ）を用いた場合のほうが高発現しており、スキャホールドの使用はより効果的な軟骨形成を可能にすることが確認された。
（５）外観等
細胞を培養液に播種して２週間ＲＷＶバイオリアクターで培養して構築した軟骨組織（コントロール）は培養するたびに形がまちまちで一定しなかった（図６Ａ）。また培養２週間後のサフラニン０染色像より、軟骨基質の分泌にムラがあり、均質な軟骨ができていない（特に中央部）ことが確認された（図６Ｂ）。
４．まとめ
以上の結果より、コラーゲンスポンジを足場としたＲＷＶ回転培養により、軟骨組織の形状がコントロールできるだけでなく、軟骨基質、強度の両面で優れた軟骨組織を構築できることが分かった。なお、スキャホールドを用いない場合はオーバーコンフルエントまで培養した細胞を播種してはじめて大きな軟骨組織塊を得ることができるが、コラーゲンスキャホールドを用いた場合にはオーバーコンフルエントまで培養しなくても軟骨組織塊を得ることができることが確認された。
［実施例２］コラーゲンスポンジを用いた場合における静置培養とＲＷＶ回転培養の比較
１．実験方法
ウシ関節軟骨を採取、スライスし、コラゲナーゼにより軟骨基質を除去した後、通常の細胞培養液（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養することにより、ウシ関節軟骨由来軟骨細胞を調製した。このウシ関節軟骨由来軟骨細胞をコラーゲンスポンジ（ブタ皮膚より抽出精製したコラーゲンタイプＩを凍結乾燥して作製したコラーゲンスポンジ）に１．５ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の濃度で播種し、１０−７Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｗａｋｏ製）、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ製）、４０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍｌ中で、３時間にわたって静置培養（ペレット培養）もしくはＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）による回転培養を行った。
静置培養は、１５ｍｌコニカルチューブに上記細胞懸濁液１０ｍｌを入れ、５０ｇで５分間遠心して作製したペレット組織を、３７℃、５％ＣＯ２条件下でペレット培養した。また、ＴＧＦ−βを添加しない条件下でも同様にしてペレット培養を行った。一方、ＲＷＶバイオリアクターによる回転培養は、実施例１と同様にして直径５ｃｍのベッセルを用いて、回転数：８．０〜２４ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。
２．結果
２週間培養したコラーゲンスポンジを核染色し、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ製）により観察した。その結果、静置培養ではコラーゲンスポンジ表面に細胞が集中し、内部への侵入が見られないが（図７Ａ）、ＲＷＶ回転培養ではコラーゲンスポンジ内部にも細胞が分布していることが確認された（図７Ｂ）。
［実施例３］ＲＷＶバイオリアクターを用いた軟骨組織構築における各種細胞足場材料の比較
１．実験方法
ＯＰＬＡ（Ｏｐｅｎ−Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＤ製）およびヒアルロン酸−ハイドロキシアパタイト複合多孔体（以下「ＨＡＰ−ＨＡ」と記載する）を細胞足場材料として、ＲＷＶバイオリアクターによる軟骨組織構築を行った。なお、ＯＰＬＡは、Ｄ，Ｄ−Ｌ，Ｌポリ乳酸から合成された合成ポリマースキャフォールド（スポンジ／非圧縮性）であり、公表されているポアサイズは１００〜２００μｍである。
実施例２と同様にして調製したウシ関節軟骨由来軟骨細胞をＯＰＬＡおよびＨＡＰ−ＨＡに１．５ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の濃度で播種し、１０−７Ｍ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｗａｋｏ製）、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ製）、４０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍｌ中で、２週間にわたってＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）による回転培養を行った。
２．結果
（１）ＯＰＬＡ
実施例１に従い、培養２週間後のＯＰＬＡのトルイジンブルー染色像を観察したところ、組織表面付近に比較的多く細胞が観察された（図８Ａ）。さらに、走査電子顕微鏡像（ＳＥＭ−４５００（ＨＩＴＡＣＨＩ））を用いた観察でも同様の結果が得られた。
（２）ＨＡＰ−ＨＡ
実施例１に従い、培養２週間後のＨＡＰ−ＨＡのトルイジンブルー染色像を観察した（図９Ａ）。また、位相差顕微鏡（ＩＸ７０：ＯＬＹＭＰＵＳ）および走査電子顕微鏡像（前掲）により観察した（それぞれ図９ＢおよびＣ）。いずれの結果においても、ＨＡＰ−ＨＡ多孔体への細胞の付着はコラーゲンスポンジに比べて弱いことが確認された。
３．まとめ
以上のとおり、コラーゲンスポンジに比較すると、スキャホールドとして汎用されているＯＰＬＡおよびＨＡＰ−ＨＡは、細胞の付着という点でＲＷＶ回転培養には適さないことが確認された。結果的に、試験した３種のスキャホールドのうち、コラーゲンスポンジがＲＷＶ回転培養のスキャホールドとして最も有用であった。
ＲＷＶ回転培養では、回転による流れの力を受けるため、足場材料には回転によって形状がくずれない程度の強度が必要なほか、回転によって接着した細胞がはがれないような細胞との接着力が必要とされる。コラーゲンは間葉系幹細胞との接着機構を有しているため、細胞との接着力が高く、またコラーゲンスポンジ（特に架橋コラーゲンスポンジ）は力学的強度が高い。一方、ＯＰＬＡは力学的強度に優れるものの細胞との接着力はコラーゲンに比べて劣る。また、ヒアルロン酸は軟骨組織構築にマトリックスとして重要な役割を有するが、細胞との接着には直接関与せず、今回用いたＨＬＡ−ＨＡは力学的強度があまり高いものでなかった。これらのことから、コラーゲンスポンジについて最もよい結果が得られたものと思われる。
現在、細胞足場材料として使用されているポリカプロラクトンやポリグリコール酸も細胞との接着性が高く、適度な力学的強度を有することが知られており、コラーゲンスポンジと同様の効果が期待される。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、自家軟骨を侵襲することなく、骨髄細胞から効率的に軟骨組織を構築することができる。本発明の方法は、基礎研究はもとより、整形外科における関節リウマチや変形性関節症の治療や形成外科における耳介軟骨の修復を目的とした再生医療に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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