(57)【要約】  本発明は、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でもγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生産することができる乳酸菌、並びにＧＡＢＡを含有する培養物の製造方法を提供する。具体的には、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でもＧＡＢＡ生産能を有する乳酸菌ラクトバチルス・レニニを醤油諸味から単離し、この乳酸菌をＬ−グルタミン酸および／またはその塩類を含有する培地に接種し、培養を行うことにより、ＧＡＢＡ含有培養物を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でγ-アミノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
【請求項２】
培養開始時の培地中に乳酸が１〜４％、食塩が８〜１２％共存する条件下でγ-アミノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・レニニ（Lactocabillus rennini）である請求項１または２記載の乳酸菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の乳酸菌をＬ−グルタミン酸および／またはその塩類を含有する培地に接種し、培養を行うことを特徴とするγ-アミノ酪酸含有培養物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養開始時の培地中に乳酸が存在する条件下でもγ-アミノ酪酸（以下「ＧＡＢＡ」という）を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌、さらにこれを用いたγ-アミノ酪酸を含有する培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡは血圧降下作用、利尿作用、精神安定作用などの生理効果があることから、現在注目されているアミノ酸であるが、ＧＡＢＡを含む食品は一部の野菜やお茶、米などに限られており、含量も少ないことから、ＧＡＢＡ発酵性乳酸菌を利用したＧＡＢＡ製造方法がいくつか提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。これらＧＡＢＡ生産乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヒルガルディ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、エンテロコッカス・カゼリフラバス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・プランタラム、ストレプトコッカス・サーモフィラスなどが知られており、Ｌ−グルタミン酸もしくはＬ−グルタミン酸塩から、脱炭酸反応によりＧＡＢＡを生産する能力を持っている。【０００３】
しかし、これらの乳酸菌はホエーパウダー、脱脂乳、カゼイン、ペプトンなどの高価な成分を培地に必要とし、コスト面からの生産性が良くない（例えば、特許文献１または４参照）。また、安価な材料である醤油麹やグルテンを酸で分解あるいは酵素、麹で分解し、溶出したグルタミンをグルタミナーゼによりグルタミン酸に変換させたものを培地とする場合は、中和で発生する食塩や酵素分解時に汚染対策として添加する食塩が乳酸菌のＧＡＢＡ生産を阻害してしまう。耐塩性ＧＡＢＡ生産乳酸菌もいくつか報告されているが、ＧＡＢＡ発酵至適食塩濃度が１２．５〜１８％と非常に高塩である（例えば、特許文献５参照）。生活習慣病にならないよう、減塩を心がける食生活が推進されていることを考えると、高食塩含有食品や調味料は望ましいものではない。また、ＧＡＢＡには血圧降下作用を期待する面があり、これと高濃度食塩を組み合わせることは本来の意味を失ってしまう。【０００４】
以上のことから、乳酸菌によるＧＡＢＡ生産には麹やグルテンのような安価な材料を低塩で分解して使用することが理想的ではあるが、低塩では野生菌による汚染が問題となる。汚染は培養初期の段階で起こり、その結果アルコールが生産されたりｐＨが低下してしまうと、ＧＡＢＡ生産乳酸菌の生育が阻害され、目的のＧＡＢＡが充分量得られない。これら低塩での野生菌による汚染を防ぐための手段として、食品の防腐剤として一般によく利用されるエタノール、酢酸、乳酸を利用する方法があるが、エタノール、酢酸は汚染菌も抑制するがＧＡＢＡ生産乳酸菌も抑制してしまう。一方、乳酸菌は自ら乳酸を作るため、乳酸に対して他の菌よりも耐性が高い。【０００５】
そこで、我々は乳酸を防腐剤として利用することを考えたが、食塩存在下で培養開始時に乳酸を添加するとＧＡＢＡ生産乳酸菌は生育できない、あるいは生育するもののＧＡＢＡ生産を行わなくなってしまうことが新たな問題として浮上した。【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２１００７５号公報
【特許文献２】特開２００４−２１５５２９号公報
【特許文献３】特開２００５−１０２５５９号公報
【特許文献４】特許第３４２６１５７号公報
【特許文献５】特許第２７０４４９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でＧＡＢＡ生産が可能な乳酸菌を提供すること、並びにＧＡＢＡを含有する培養物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、培養開始時から乳酸と食塩が共存する状態でもＧＡＢＡを生産することができる乳酸菌を醤油諸味から単離し、これを利用することで問題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）に関する。
（１）培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でγ-アミノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（２）培養開始時の培地中に乳酸が１〜４％、食塩が８〜１２％共存する条件下でγ-アミノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（３）乳酸菌がラクトバチルス・レニニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｎｎｉｎｉ）である上記（１）または（２）記載の乳酸菌。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の乳酸菌をＬ−グルタミン酸および／またはその塩類を含有する培地に接種し、培養を行うことを特徴とするγ-アミノ酪酸含有培養物の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安価な材料を用い、野性菌に発酵を阻害されることなく、安定にＧＡＢＡを生産する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株の分子系統樹を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る乳酸菌は、ラクトバチルス属に属する菌株であり、例えば、醤油諸味から単離された乳酸菌を用いることができる。本発明の乳酸菌は、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でＧＡＢＡを生産する能力を有し、乳酸が１〜４％、食塩が８〜１２％共存する条件下でＧＡＢＡを生産することができる。この乳酸菌は、ラクトバチルス・レニニであることが好ましく、例えば、ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４株やラクトバチルス・レニニ  ＫＧ４３株などが挙げられる。
ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２００６年２月７日付にて国内寄託され（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１７７）、２００６年９月１日付にてブダペスト条約に基づき国際寄託に移管されている（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１７７）。
また、ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ４３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２００７年１月３１日付にてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−３０９）。【００１２】
乳酸菌を醤油諸味から単離するのは、次のような方法による。すなわち、醤油諸味２５ｇをストマッカー処理し、得られた液汁をダーラム管を入れたＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地（５．５％ＭＲＳブロス、０．５％バクトソイトン、０．５％グルタミン酸ナトリウム、８％食塩、５％食添用乳酸  ｐＨ５．１）に適量加え、３０℃で静置培養を行う。ダーラム管にガスの発生が確認された培養液をＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地で適当に希釈し、さらにそれをＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ寒天培地に塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）にいれ３０℃で７日間培養する。得られたシングルコロニーを再度ダーラム管を入れたＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地に接種し、ガス発生が確認された菌を選抜する。【００１３】
上記の方法でＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株の７株を単離した。これら７株のうち、ＫＧ３４、ＫＧ４３両株の菌学的性質を調べ、その結果を表１に示した。比較対照としてラクトバチルス・レニニの標準菌であるラクトバチルス・レニニ  ＤＳＭＺ２０２５３のデータも記載した。標準菌ラクトバチルス・レニニ  ＤＳＭＺ２０２５３はグルタミン酸の脱炭酸能を持たず、ＧＡＢＡを生産しないことがわかる。【００１４】
【表１】
2007097374.tif 000002
【００１５】
また、本発明の乳酸菌ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子）の全塩基配列を以下の方法で決定した。
乳酸菌ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株をＭＲＳ−Ｓｏｙｔｏｎｅ培地（ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ ５．５％， Ｓｏｙｔｏｎｅ ０．５％， ＮａＣｌ ８％, グルタミン酸ナトリウム  ０．５％， ｐＨ５．１）に植菌し、３０℃で４日間培養した。ゲノムＤＮＡの抽出にはＧｅｎとるくんTM（酵母用）（タカラバイオ株式会社）を使用した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により１６Ｓ  ｒＤＮＡの全領域を３本に分けて増幅した。それぞれの断片をシークエンスし、つなぎ合わせることで全領域の配列を得た。サーマルサイクラーにはタカラ  サーマルサイクラー  ＭＰを、ＤＮＡシークエンサーにはＡＢＩプリズム３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステム社）を使用した。得られたそれぞれの１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１および２に示した。【００１６】
得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列から本菌と近縁と考えられる種の相同性検索を行い、近縁種との１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を用いて近隣結合法により分子系統樹を作製し、本菌の近縁種および帰属分類群の検討を行った。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴで検索の結果、本菌はラクトバチルス・レニニの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と最も高い相同性（約９９．５％）を示し、系統樹でもラクトバチルス・レニニと同じクラスターを形成した。この結果より、本菌はラクトバチルス・レニニと判断された。作製した系統樹は図１に示した。【００１７】
本発明の乳酸菌は食塩や乳酸が非存在下でＬ−グルタミン酸もしくはＬ−グルタミン酸塩からＧＡＢＡを生産する能力を有するが、培養開始時の培地中に１〜４％の乳酸と８〜１２％の食塩が共存する条件下でもＧＡＢＡを生産することができる（実施例２参照）。また、培養開始時以外においては、培地中に０〜４％の乳酸と０〜１２％の食塩が共存する条件下でＧＡＢＡを生産することができる。【００１８】
本発明のＧＡＢＡ含有培養物の製造方法は、Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩類を含有する培地に、上記性質を有する乳酸菌を接種・培養し、ＧＡＢＡを含有する培養物を製造する方法である。本発明で用いる乳酸菌は、醤油諸味から単離培養され、継代培養されたものを用いるが、醤油諸味に含まれている同種の乳酸菌をそのままで、あるいは、新たに単離して用いるようにしてもよい。また、凍結乾燥菌体、凍結保存株、および、液体培養液のうちのいずれを使用しても良い。【００１９】
本発明で用いる培地は、ＧＡＢＡを生産するため、グルタミン酸を含有している必要がある。培地中に含有させるグルタミン酸は、化学的にはアミノ酸の一種であるＬ−グルタミン酸が好ましいが、調味料としての用途を持つ食品添加物であるグルタミン酸やグルタミン酸ナトリウム、その他のグルタミン酸塩、さらに食品蛋白質を酸や酵素で加水分解して得られるグルタミン酸のいずれを用いても構わない。また、調味料、水産加工品、トマトなど、遊離グルタミン酸を含む食品をそのままで用いても構わない。なお、より多量のＧＡＢＡを含有した培養物を得る場合には、より多量のグルタミン酸を含有する培地を用いることが必要である。【００２０】
また、本発明で用いる培地は、乳酸菌の生育のために、上記したグルタミン酸の他に、ブドウ糖、果糖、麦芽糖などの糖質や、酵母エキス、肉エキス等のビタミンやミネラルを含む食品、もしくは、麹および麹消化物などから１つ以上を含有することが好ましい。さらに、乳化剤や安定剤、ｐＨ調整剤などの食品添加物を用いても構わない。培地に用いることができる麹および麹消化物としては、例えば、小麦、大麦、ライ麦、はと麦、押し麦、キヌア、粟、稗、黍、米、とうもろこしなどの穀類、大豆、小豆、インゲン豆、ルーピン豆、ガラス豆、レンズ豆などの豆類のうちから１つ、もしくは、２つ以上の原料を変性処理したものに麹菌を作用させたもの、あるいは、麹菌の酵素を作用させたタンパク加水分解物が挙げられる。望ましくは、しょうゆ、しょうゆ諸味、味噌、豆類等のタンパク加水分解物等である。【００２１】
本発明における乳酸菌の接種は、上記したＧＡＢＡ生産能を有するラクトバチルス・レニニを、グルタミン酸源、食塩、および、糖源を含む培地にて、２５〜３５℃、４８〜９６時間、初発ｐＨ４．０〜７．０で培養した種乳酸菌を、本培養培地の容量に対して、１／１０００〜１／１０容程度接種して行う。【００２２】
本発明において、培養に使用できる装置は、洗浄や加熱殺菌を行うことができ、食品の製造に使用できれば、大きさや材質を問わないが、雑菌が混入しにくい衛生的な構造をしたものが望ましい。培養条件は、乳酸菌の菌学的性質（表１参照）より、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、初発ｐＨは４．０〜７．０が好ましい。培養期間は、Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩類などのグルタミン酸源を目標のＧＡＢＡ濃度にまで変換できるよう充分な期間行うことが必要とされるが、例えば、１〜４週間が好ましい。【００２３】
このようにして、加工食品などの原材料として広い用途を持つＧＡＢＡ含有培養物を得ることができる。例えば、本発明の方法で得られるＧＡＢＡ含有培養物は、ＧＡＢＡ増強原料として、そのまま各種の調味料や飲食物に添加して用いることも可能である。【００２４】
また、圧搾、濾過、濃縮、乾燥などの処理工程によりＧＡＢＡ含有量をさらに高めて利用することもできる。上記濾過工程としては、濾紙、濾布などを用いた通常の食品加工用の圧搾、濾過設備を使用して行うことができ、珪藻土やセルロース、活性炭などの食品用濾過助剤を用いることができる。濃縮工程は、真空濃縮機、減圧濃縮機、蒸留釜、凍結濃縮機などの設備を用いることができる他、単純に加熱により培養物中の水分を蒸発させる方法を用いることができる。また、乾燥工程としては、噴霧乾燥や凍結乾燥を効率的かつ衛生的な方法により行うことが好ましい。さらに、ＧＡＢＡの含有量をより高めた培養物を得るために、上記工程以外にも、液体クロマトグラフィーなどの方法を用いるようにすることもできる。【００２５】
このようにＧＡＢＡ含有培養物を処理することにより、ＧＡＢＡを含有した液状または粉末状の食品を得ることができ、これらを各種食品へ配合したり二次加工することにより、ＧＡＢＡを増強した調味料や飲食物が容易に得られる。二次加工では、賦形剤、甘味料、増粘剤、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖類、糖質、塩類などの、通常食品に用いられている成分を含むことができる。【００２６】
なお、得られた培養物や培養物を加えた調味液、および、飲食品中のＧＡＢＡの含有量の測定は、高速液体クロマトグラフィー、アミノ酸測定機等の分析機器や、酵素を用いた分析試薬などを用いて行うことができる。【００２７】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
＜乳酸菌の獲得＞
各種発酵食品から被験試料を適量サンプリングし、ダーラム管を入れたＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地（５．５％ＭＲＳブロス、０．５％バクトソイトン、０．５％グルタミン酸ナトリウム、８％食塩、５％食添用乳酸  ｐＨ５．１）に適量加え、３０℃で静置培養を行った。ダーラム管にガスの発生が確認された培養液をＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地で適当に希釈し、さらにそれをＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ寒天培地に塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学株式会社）にいれ３０℃で７日間培養した。得られたシングルコロニーを再度ダーラム管を入れたＭＲＳ−ＳＯＹＴＯＮＥ培地に接種し、ガス発生が確認されたサンプルについてＧＡＢＡを測定した。なお、同一分離源から分離された菌はＲＡＰＤ法により固体識別を行い、同一菌を複数選択しないようにした。ＧＡＢＡは日立高速アミノ酸分析計Ｌ−８８００にて測定した。その結果、ＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株がＧＡＢＡ生産していることが判明した。なお、ＫＧ３４株、ＫＧ４３株の生理学的性質は表１に、ＫＧ３４株、ＫＧ４３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は配列番号１および２に示した。ＫＧ３４株、ＫＧ４３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は１００％一致していた。【００２９】
（実施例２）
＜耐塩性、耐乳酸性の確認＞
ダーラム管を入れたＭＲＳ−Ｓｏｙｔｏｎｅ培地（５．５％ＭＲＳブロス、０．５％Ｓｏｙｔｏｎｅ、０．５％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ５．１）を基本に、食塩を８％および１２％、食添用乳酸を０％、１％および４％に変化させた培地を用いて、培養開始時の培地中に食塩と乳酸が存在する条件でのＫＧ３４、ＫＧ４３、Ｓ１、ＫＧ３１、ＫＧ６４、ＫＧ−１８−４、ＫＧ４−１４−１株のＧＡＢＡ生産性を確認した。また、その際、公知のＧＡＢＡ生産乳酸菌との比較を行った結果を表２に示した。【００３０】
【表２】
2007097374.tif 000003
【００３１】
（実施例３）
＜ＧＡＢＡ含有培養物（調味液）の製造方法＞
小麦グルテン７０ｇと醤油麹１００ｇに温水１６０ｍｌを加えて、さらにグルタミナーゼとしてキャンディダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ）ｋｍ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−８８９７）の３６時間通気撹拌培養した培養液（培地組成：グルコース６％、酵母エキス１％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．１％、ｐＨ５．５、培養温度３０℃）を５ｍｌ添加して５０℃で２４時間グルテンの分解および分解により生じたグルタミンのグルタミン酸への変換を行った。得られた分解物に終濃度８％となるように食塩を加え、さらに終濃度１％となるように食添用乳酸を加えた後、３０℃にまで温度を下げ、ラクトバチルス・レニニ  ＫＧ３４株およびＫＧ４３株をおおよそ１０６個／ｍｌになるように接種し、３０℃で７日間静かに撹拌しながら培養を行った。得られた培養物をろ過し、清澄な液を得た。ＫＧ３４株を接種した培養液のＧＡＢＡ含有量は１３．０ｍｇ／ｍｌ、ＫＧ４３株で１９．５ｍｇ／ｍｌであった。対照として公知のＧＡＢＡ生産菌ラクトバチルス・ブレビスＮＢＲＣ３３４５で同様の試験を行ったが、最終的に得られた清澄液のＧＡＢＡ濃度は２．０ｍｇ／ｍｌであり、充分なＧＡＢＡ生産は行われなかった。【００３２】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００６年２月２１日出願の日本特許出願（特願２００６−０４３８３６）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、安価な材料を用い、野性菌に発酵を阻害されることなく、安定にＧＡＢＡを生産する方法を提供することができる。
【図１】
2007097374.tif 000004
【配列表】
2007097374000001.app
【国際調査報告】
2007097374.tif 000005
2007097374.tif 000006
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