(57)【要約】  担体粒子のパールチェイン化を利用した親和性物質の測定方法において、特定の粒子径を有する担体粒子を利用することによって、血球成分が共存していても、担体粒子を特異的に計数することができる。血清や血漿を分離することなく、全血試料をそのまま測定サンプルとして利用することができる。したがって血液成分の分析にあたり、血清や血漿を分離する必要が無い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程(1)〜(3)または(1')〜(3')を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)または(1')がこの媒体の存在下で行われ、かつ工程(１)または(1')における担体粒子が血球成分と識別可能な体積の凝集塊を与える大きさである測定方法；
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程、または
(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、
(2')工程(1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および、
(3')工程(2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程。
【請求項２】
血球成分と識別可能な体積が、４０〜１００μm３の体積に対して、少なくとも１０％以上の体積の違いである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体粒子の平均粒子径が０．５〜２．４μmまたは６〜２０μmである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
担体粒子の平均粒子径が、１〜２μmである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
電圧パルスが、検体に含まれる血球成分を実質的に崩壊しない条件で印加される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
電圧パルスが交流電圧であり、その電圧が、１０〜５０V/mmの電解強度である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
電圧パルスが交流電圧であり、その電圧が、１５〜３０V/mmの電解強度である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
電圧パルスが交流電圧であり、その周波数が１００KHz〜１０MHzである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
電圧パルスが交流電圧であり、その周波数が４００KHz〜１MHzである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程(2)または(2')において、凝集塊または担体粒子の三次元情報を、物理的に測定する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
三次元情報を物理的に測定するための方法が、電気抵抗法、レーザー回析散乱法、および三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれかの方法である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程 (2)または(2')において、電場を停止後に担体粒子を計数することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程 (2)または(2')において、電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希釈する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電圧パルスを複数回与えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
電圧パルスを印加後に、担体粒子を分散させてから次の電圧パルスを印加する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数回の電圧パルスが、異なる方向の電圧パルスである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
担体粒子の反応液中における濃度が、０．１〜１w/v%である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
担体粒子の反応液中における濃度が、０．２〜０．５w/v%である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は担体粒子の凝集反応を利用した親和性物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的特異的反応性物質の存在を検出または測定する方法としては、例えば、酵素免疫測定法、あるいは放射線免疫測定法などが従来から用いられている。これらの方法は高感度であり精度も高い。しかし酵素、あるいは放射性同位元素を標識として使用するため試薬が不安定である。また放射性同位元素の利用にあたっては、保管および保存上の規制があることから、測定において細かい配慮や技術を要求される。そのため、より簡便な測定方法が求められていた。またこれらの方法は測定に比較的長時間を要するため、緊急な検査に対応することが難しい。これらの背景のもとで、高感度且つ迅速な測定方法が盛んに研究されるようになった。【０００３】
１９７０年以降、免疫学的反応を担体粒子の凝集を指標として測定する分析方法が実用化された。この方法は、担体粒子の凝集の程度を光学的に測定することによって、定量的な分析を可能とした。担体粒子としてラテックス粒子を利用した、免疫学的粒子凝集反応を光学的に測定する方法は、ラテックス凝集比濁法(Latex Agglutination Turbidimetry)と呼ばれている。これらの分析方法における反応温度は、一般的には３７〜４５℃の範囲で行われ、撹拌翼などによって撹拌することにより特異的凝集反応が進行する。このとき測定（反応）に要する時間は、およそ１０〜２０分で、酵素免疫測定法、あるいは放射線免疫測定法に比べ迅速である。一方、測定感度、あるいは測定範囲については、酵素免疫測定法等に比べ劣るといわれている。【０００４】
ラテックス凝集法における粒度分布測定法も公知である（非特許文献１／Cambiaso CL J Immunol Methods. 1977;18(1-2):33-44.、非特許文献２／松沢ら, 化学と工業 Vol.36, No.4, p206-208, 1983）。ラテックス凝集比濁法が、粒子懸濁液の光の透過度を測定するのに対して、粒度分布測定法においては分散した個々の粒子の状態や数が測定される。カンビアソらの報告においては、粒子径０．８μmのラテックスに抗体を結合させた試薬と抗原とを３７℃で２０分間反応させた。反応後の粒子数を計数し、凝集による粒子数の減少のレベルに基いて抗原を測定した。粒子数は、レーザー散乱光を原理とした計数機で測定した。【０００５】
一方、松沢らは、粒子径１μmのラテックス粒子に抗体を結合させた試薬を抗原と６時間反応させた。反応後、電気抵抗法により平均粒子容積を計測して、抗原を測定した。しかし、実用化されて普及したのはシースフローによるレーザー散乱法を用いたＰＡＭＩＡシステム（シスメックス株式会社）のみである。ＰＡＭＩＡでは、粒子径０．７８μmのラテックス粒子が使用されている。４５℃で１５分間の反応後にラテックス粒子を計数して免疫測定を行うものである。ＰＡＭＩＡは、ラテックス凝集比濁法に比べ高感度化されているが、放射免疫測定法(RIA)や酵素免疫測定法(EIA)といった高感度免疫測定に比べると感度は劣るといわれている。【０００６】
ラテックス凝集比濁法においては、一般に粒子径０．０５〜０．６μmのラテックス粒子が用いられている。ラテックス凝集粒度分布解析法の場合は、このように小さい粒子では、測定妨害物質の影響を受けやすい。たとえば、血液や尿などの体液中には、脂質、蛋白、血球成分などが共存する。これらの共存物質は担体粒子との識別が難しい。そのため担体粒子を正しく計数できない場合がある、これらの測定妨害物質の影響を避けるために、比較的大きい粒子が使用されてきた。一方で、松沢らのように１μm程度の粒子径になると、凝集反応が起こりにくくなるため、０．８μm程度のラテックス粒子が用いられていた。また、松沢らが平均粒子容積を計測するのに使用したアパーチャー（細孔）の口径は３０μmである。このサイズではアパーチャーの詰まりの影響を受けやすい。しかし、これより大きい口径のアパーチャーでは０．８〜１μmの粒子の検出はできなくなる。【０００７】
更に、生物学的特異的凝集反応を促進し、また形成する凝集塊を検出しやすくするために、反応系に交流電圧を印加する方法が公知である（特許文献１／特開平７−８３９２８号）。この方法は、担体粒子の生物学的特異的凝集反応により生物学的特異的反応性物質の存在を検出又は測定する方法であって、１０mM以上の塩の共存下に５〜５０V/mmの電界強度になるように交流電圧を該反応系に印加することを特徴とするものである。【０００８】
電場(electric field)の中の担体粒子は、電場に沿って並ぶ（パールチェイン化）。その後電場を停止すると並んでいた担体粒子は再分散する。パールチェイン化の際に生物学的特異的反応性物質が存在すると、電場を停止後も担体粒子の再分散が起こらず、パールチェイン化した担体の存在がなおも認められる。前記測定方法は、この現象を利用している。すなわち、電場においては、生物学的特異的反応性物質の反応が促進される。そして電場を停止後に担体粒子を再分散させれば、反応生成物を検出することができる。パールチェイン化を利用した免疫学的測定方法は、担体粒子を三次元情報を指標として計数することによって、更にその測定精度が改善された（特許文献２／ＰＣＴパンフレットＷＯ２００４／１１１６４９）。
【特許文献１】特開平７−８３９２８
【特許文献２】ＷＯ２００４／１１１６４９
【特許文献３】特開平１０−４８２１４
【特許文献４】特開２００２−１０７３６５
【特許文献５】ＷＯ２００１／９６８６８
【非特許文献１】Cambiaso CL J Immunol Methods. 1977;18(1-2):33-44.
【非特許文献２】松沢ら, 化学と工業 Vol.36, No.4, p206-208, 1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
担体粒子を利用する方法に限らず、一般に、血液試料の分析においては、血球成分を分離した血清、あるいは血漿がサンプルとして利用される。その理由の一つは、血球成分によって、測定が妨害されるためである。たとえば、担体粒子の凝集を光学的に検出するとき、サンプルに赤血球などの着色成分が存在すると、測定結果に干渉する恐れがある。あるいは、パールチェイン化を利用したイムノアッセイのように、粒子を計数する工程を含む方法においても、血球成分を誤って担体粒子として計数する可能性がある。【００１０】
血球成分の分離には、遠心分離操作や、フィルターを使った分離操作が必要である。もしも全血をサンプルとして利用しうるイムノアッセイ法が提供されれば、このような操作を省略することができる。特に、緊急性の高い検査においては、全血をサンプルとして利用しうるイムノアッセイ法を実現できれば有用である。【００１１】
このような課題を解決するために、溶血させた全血試料を利用して、担体粒子の凝集を光学的に測定する方法が提案された（特開平10-48214）。これらの方法においては、界面活性剤が溶血剤として利用されている。しかし界面活性剤は、免疫学的な反応を阻害する恐れが有った。あるいは、免疫反応後に溶血剤を添加して溶血させる方法（特開2002-107365）においては、免疫学的反応に及ぼす界面活性剤の影響は小さいかもしれない。しかし溶血によって生成する細胞成分が、光学的な測定に干渉する可能性を否定できない。
更に、凝集粒子と非凝集粒子を光学的に計数する方法において、血球よりも小さい担体粒子を利用することによって、全血試料をサンプルとする試みが公知である（ＰＣＴパンフレットＷＯ２００１／９６８６８；公表２００４−５０３７７９）。この方法においては、溶血剤は利用されない。パールチェイン化を利用した免疫学的測定方法においても、全血試料をサンプルとしうる方法が実現できれば有用である。
すなわち本発明は、パールチェイン化を利用した親和性物質の測定方法において、血球成分を含む試料をサンプルとして用いるための方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、血球成分の干渉を受けにくい測定方法について、研究を重ねた。そして、特定の粒子径を有する担体粒子を選択することによって、血球成分の存在下であっても、凝集した、あるいは凝集しなかった担体粒子を特異的に計数できることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の測定方法に関する。
〔１〕次の工程(1)〜(3)または(1')〜(3')を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)または(1')がこの媒体の存在下で行われ、かつ工程(１)または(1')における担体粒子が血球成分と識別可能な体積の凝集塊を与える大きさである測定方法；
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程、または
(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、
(2')工程(1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および、
(3')工程(2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程。
〔２〕血球成分と識別可能な体積が、４０〜１００μm３の体積に対して、少なくとも１０％以上の体積の違いである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕担体粒子の平均粒子径が０．５〜２．４μmまたは６〜２０μmである〔２〕に記載の方法。
〔４〕担体粒子の平均粒子径が、１〜２μmである〔３〕に記載の方法。
〔５〕電圧パルスが、検体に含まれる血球成分を実質的に崩壊しない条件で印加される〔１〕に記載の方法。
〔６〕電圧パルスが交流電圧であり、その電圧が、１０〜５０V/mmの電解強度である〔５〕に記載の方法。
〔７〕電圧パルスが交流電圧であり、その電圧が、１５〜３０V/mmの電解強度である〔６〕に記載の方法。
〔８〕電圧パルスが交流電圧であり、その周波数が１００KHz〜１０MHzである〔１〕に記載の方法。
〔９〕電圧パルスが交流電圧であり、その周波数が４００KHz〜１MHzである〔８〕に記載の方法。
〔１０〕工程(2)または(2')において、凝集塊または担体粒子の三次元情報を、物理的に測定する〔１〕に記載の方法。
〔１１〕三次元情報を物理的に測定するための方法が、電気抵抗法、レーザー回析散乱法、および三次元画像解析法からなる群から選択されたいずれかの方法である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕工程 (2)または(2')において、電場を停止後に担体粒子を計数することを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔１３〕工程 (2)または(2')において、電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希釈する工程を含む〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕電圧パルスを複数回与えることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔１５〕電圧パルスを印加後に、担体粒子を分散させてから次の電圧パルスを印加する工程を含む、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕複数回の電圧パルスが、異なる方向の電圧パルスである〔１４〕に記載の方法。
〔１７〕担体粒子の反応液中における濃度が、０．１〜１w/v%である〔１〕に記載の方法。
〔１８〕担体粒子の反応液中における濃度が、０．２〜０．５w/v%である〔１７〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、血球成分を含んだ試料中の親和性物質を、パールチェイン化を利用したイムノアッセイによって測定することができる方法を提供する。本発明においては、血球成分の共存下であっても、親和性物質を測定することができる。そのため、たとえば全血試料をサンプルとして、血球成分を分離することなく、血液中の親和性物質を測定することができる。血球成分の分離は時間と手間を要する操作である。したがって、たとえば緊急な検査において、全血をサンプルとして利用しうる測定方法の提供は有用である。【００１４】
一方、パールチェイン化を利用したイムノアッセイは、担体粒子の免疫学的な凝集が電場によって強化される。その結果、通常の条件では凝集反応には不向きとされる、比較的大きな担体粒子を使いながら、効率的な免疫学的反応を実現できる。大きな担体粒子の使用は、測定精度の向上に貢献する。また、パールチェイン化を利用したイムノアッセイは、微量の試料を使い、短時間で、しかも高い感度で親和性物質を検出できる方法でもある。したがって、パールチェイン化を利用したイムノアッセイによって、全血を試料とする測定方法を実現した本発明の意義は大きい。【００１５】
また本発明の測定方法においては、血球成分の共存下であっても、担体粒子を特異的に計数することができる。そのため、本発明においては、血球成分を破壊する必要がない。したがって、免疫学的な反応に干渉する恐れのある溶血剤は、本発明には不要である。【００１６】
更に、本発明の好ましい態様においては、血球成分の体積で測定値を補正し、測定対象物質の血清濃度を決定することもできる。全血中に占める血球成分の割合は、被検者間で大きな違いがある。あるいは同じ被検者であっても、血球成分の割合の変動幅は大きい。たとえば血清濃度では違いがなくても、血球成分の割合が違う場合には、全血中の物質濃度には違いが生じる。つまり、血球成分が多い被検者の全血中の物質濃度は、血球成分が少ない被検者に比較して低くなる。そのため、血液中の物質濃度は、しばしば血清濃度に基づいて比較される。血清濃度は、血球成分の割合の影響を除いた数値なので、被検者間の数値を、より正しく比較することができる。
さて、本発明の好ましい態様においては、担体粒子の計数と同時に、反応液に含まれる血球成分の体積を決定することができる。決定された血球成分の体積に基づいて、測定対象物質の測定値を補正すれば、その血清濃度を明らかにすることができる。つまり、本発明の好ましい態様においては、全血をサンプルとして用いたとしても、血清分離操作無しで測定対象物質を分析することができ、更に血清濃度を求めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】全血に含まれる血球成分の体積を測定した結果を示す図である。図中、縦軸は計数された粒子を、横軸は粒子の体積を示す。
【図２】（Ａ）は、本発明に基づく装置の構成を示す図である。また（Ｂ）は、パルス印加槽の断面を示す図である。
【図３】本発明の方法により、抗原抗体反応をパールチェイン化により促進させ、全血試料の免疫測定を行った結果を示す図である。図中、縦軸は計数された粒子を、横軸は粒子の体積を示す。
【図４】パールチェイン化を行わずに、全血試料の免疫測定を行った結果を示す図である。図中、縦軸は計数された粒子を、横軸は粒子の体積を示す。
【図５】８０℃で０〜６０秒インキュベーションしたときの、血球の崩壊を観察した結果を示す図である。図中、縦軸は計数された粒子を、横軸は粒子の体積を示す。
【図６】６０℃で０〜９０秒インキュベーションしたときの、血球の崩壊を観察した結果を示す図である。図中、縦軸は計数された粒子数を、横軸は粒子の体積を示す。
【符号の説明】
【００１８】
１：分注＋攪拌手段
２：温度コントロール機構
３：反応槽
４：電極（パルス印加手段）
５：希釈手段
６：粒度分布測定手段
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、次の工程(1)〜(3)または(1')〜(3')を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)または(1')がこの媒体の存在下で行われ、かつ工程(１)または(1')における担体粒子が血球成分と識別可能な体積の凝集塊を与える大きさである測定方法に関する。
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程、または
(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、
(2')工程(1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および、
(3')工程(2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程。【００２０】
本発明において親和性物質、および親和性物質との結合活性を有する結合パートナーとは、結合反応を構成することができるあらゆる物質の組み合わせを含む。すなわち、ある物質とある物質とが結合するとき、一方が親和性物質であり、他方は結合パートナーである。本発明における親和性物質および結合パートナーは、天然の物質であることもできるし、人工的に合成された化合物であってもよい。また親和性物質および結合パートナーは、精製された物質であることもできるし、不純物の共存も許容される。更に、親和性物質および結合パートナーは、細胞やウイルスの表面に存在していてもよい。【００２１】
本発明において、親和性物質と結合パートナーとの結合反応の例として、たとえば次のような反応を示すことができる。これらの反応を構成する物質は、いずれも本発明における親和性物質または結合パートナーとすることができる。
抗原またはハプテンと抗体との反応（免疫反応）
相補的な塩基配列を有する核酸間のハイブリダイゼーション
レクチンとそのレセプターとの反応
レクチンと糖鎖の反応
リガンドとレセプターの反応
DNAと転写調節因子の反応【００２２】
上記結合反応の中で、本発明における好ましい結合反応として、たとえば免疫反応を示すことができる。免疫反応を構成する抗原として、次のような物質を示すことができる。これらの抗原は、抗原分子そのもののみならず、その断片や、細胞表面に存在した状態であっても良い。なおこれらの物質は抗原物質の例であり、これら以外の抗原物質に本発明を応用できることは言うまでも無い。たとえば、ラテックス、血球等を担体として使用する免疫学的凝集反応に基づく測定が可能な抗原性物質は、いずれも本発明における親和性物質とすることができる。【００２３】
腫瘍マーカー：
ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＰＳＡ等
凝固線溶糸マーカー：
プロテインＣ、プロテインＳ、アンチトロンビン（ＡＴ）III、ＦＤＰ、ＦＤＰ−Ｄ−ダイマー等
感染症マーカー：
ＣＲＰ、ＡＳＯ、ＨＢｓ抗原等
ホルモン：
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、インシュリン等
組織成分：
ミオグロビン、ミオシン、ＢＮＰ（脳ナトリウム利尿ペプチド;Brain Natriuretic Peptide）、ヘモグロビン等
その他：
ＤＮＡ等の核酸など【００２４】
抗原性物質とそれを認識する抗体は、いずれかを親和性物質として、そして他方を結合パートナーとして利用することができる。本発明において親和性物質とは、当該物質を測定対象とするときに、親和性物質と呼ぶ。他方、結合パートナーとは、親和性物質を測定するためにプローブとして利用することができる、当該親和性物質に対する結合活性を有する物質を言う。したがって、抗原を測定するときには、抗体を結合パートナーとして利用することができる。逆に、抗体を測定するときには、該抗体が認識する抗原を結合パートナーとして利用することができる。たとえば、ラテックス、血球等を担体として使用する免疫学的凝集反応に基づく測定が可能な抗体は、いずれも本発明における親和性物質とすることができる。ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）、ＨＢｃ（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、ＨＩＶ（ＡＩＤＳウイルス）、ＴＰ（梅毒）等に対する抗体が、免疫学的凝集反応によって測定されている。【００２５】
親和性物質と結合パートナーとの反応を担体粒子の凝集を指標として測定するためのいくつかの反応原理が公知である。これらの反応原理は、いずれも本発明に応用することができる。以下に担体粒子の凝集を指標とする、親和性物質と結合パートナーとの反応を利用した測定原理を例示する。【００２６】
直接凝集反応：
測定対象物質と担体粒子上の結合パートナーとの反応による、担体粒子の凝集が検出される。たとえば、抗原分子を結合パートナーである抗体によって測定する場合が、この原理に含まれる。あるいは逆に、抗原を結合した担体粒子の凝集を指標として、親和性物質である抗体を測定する場合も、この原理に含まれる。直接凝集反応においては、通常、凝集のレベルと測定対象物質である親和性物質の量は正比例する。すなわち、凝集塊の形成レベルが高いときには、親和性物質のレベル（すなわち濃度）が高い。逆に、凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルが高いときには、親和性物質のレベル（すなわち濃度）は低い。【００２７】
凝集阻止反応：
ハプテンと呼ばれる低分子抗原は、担体粒子の凝集に必要な抗原を介した架橋構造を作りにくい。そのため、直接凝集反応の原理ではハプテンを検出することができない。そこで、複数分子のハプテンまたはそのエピトープを含む断片を担体に結合したポリハプテンと、担体粒子上の抗体との結合による凝集反応が利用される。ポリハプテンは、複数の抗体分子を架橋することができるので、担体粒子を凝集させる。しかしハプテンが存在すると、ポリハプテンと抗体との反応が阻止され、担体粒子の凝集が阻止される。凝集阻止のレベルは、ハプテンの存在と正比例する。言い換えれば、測定対象物質の量と、凝集反応のレベルは逆比例する。すなわち、凝集塊の形成レベルが高いときには、親和性物質のレベル（すなわち濃度）が低い。逆に、凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルが高いときには、親和性物質のレベル（すなわち濃度）は高い。【００２８】
ハプテンに分類される測定対象抗原には、以下のような成分が挙げられる。
ホルモン：
エストロゲン、エストラジオール
薬剤：
テオフィリン【００２９】
本発明においてハプテンを凝集阻止反応の原理に基づいて測定するためには、ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成分が必要である。ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成分を、本発明においては凝集試薬と言う。凝集試薬は、抗体との特異的な親和性を有し、かつ抗体との結合によって担体粒子を架橋する作用を有する試薬と定義される。先に述べたポリハプテンは、ハプテンの測定において凝集試薬として用いることができる。【００３０】
直接凝集反応であれ、凝集阻止反応であれ、予め一定量の親和性物質を含む標準試料について同じ反応系で測定して、凝集塊あるいは凝集しなかった担体粒子のレベルを測定して標準曲線、または回帰式を作成しておくことができる。試料の測定によって得られた凝集塊の形成レベルおよび凝集しなかった担体粒子のレベルのいずれかを、標準曲線あるいは回帰式に適用すれば、試料中の親和性物質のレベルを決定することができる。【００３１】
本発明において、結合パートナーは、担体粒子に結合して用いられる。本発明の担体粒子としては、ラテックス粒子、カオリン、金コロイド、ゼラチン、リポソーム等が挙げられる。ラテックス粒子としては、凝集反応において一般に用いられているものが使用できる。ポリスチレン系ラテックス、ポリビニルトルエン系ラテックス、ポリメタクリレート系のラテックス粒子が公知である。好ましい粒子担体はポリスチレン系ラテックス粒子である。官能基を有するモノマーの共重合によって、ラテックス粒子表面に官能基を導入したラテックス粒子を用いることもできる。たとえば、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2 、−ＳＯ3等の官能基を有するラテックス粒子が公知である。官能基を有するラテックス粒子には、結合パートナーを化学的に結合させることができる。【００３２】
また本発明において、血球成分とは、血液中に存在する固形成分を言う。具体的には、赤血球、白血球、あるいは血小板などが、血球成分に含まれる。成人の血液１mm３における各血球成分の数とその大きさは次のとおりである。なお赤血球数は、女性では４５０万個、幼児では６９０万個と、成人男性とは異なる。
赤血球  約500万個（男性） 大きさ約8μｍ、厚さ約2μm
白血球  平均約7,500個     大きさ約6〜14μm
血小板  約14〜36万個      大きさ約2〜3μm(直径約2μmで円盤状)
したがって、血球成分を含む媒体とは、これらの血液中に存在する固形成分を含む媒体を言う。具体的には、血球成分を含む媒体には、たとえば以下のような媒体が含まれる。中でも、全血は、本発明における媒体として好ましい。
全血、
全血を希釈したもの、あるいは
全血の血球成分を含む分画【００３３】
本発明においては、血球成分の共存下での担体粒子の特異的な計数を実現するために、特定の粒子径を有する担体粒子が用いられる。すなわち本発明における担体粒子は、血球成分と識別できる体積を有する凝集塊を与える大きさとなるように選択される。本発明における体積の識別とは、三次元情報を指標として粒子の大きさに基づいて、凝集した担体粒子および凝集していない担体粒子の両方、またはいずれかを計数するときに、これらの担体粒子と、血球成分とを識別できることを言う。【００３４】
本発明における凝集塊とは、数個の担体粒子の凝集によって形成される。より具体的には、２〜１５、好ましくは２〜８個の担体粒子の凝集によって形成される凝集塊が、血球成分と識別できる大きさを有する。パールチェイン化を利用したイムノアッセイにおいて、免疫学的な反応によって形成される凝集塊は、その大部分が２個あるいは３個の担体粒子で構成されている（図３参照）。また測定対象物質の分子量が大きい、あるいは濃度が高い場合には、更に多くの数の粒子によって凝集塊が形成される場合もある。たとえば、５〜１０個程度の担体粒子からなる凝集塊が形成されることもある。したがって、２〜８個の担体粒子の凝集によって形成される凝集塊が血球成分と識別できれば、凝集塊の大部分を、血球成分と識別できることを意味する。すなわち、２〜８個の担体粒子の凝集によって形成される凝集塊が血球成分と識別できる状態は、凝集塊と血球成分とを実質的に識別できるといってよい。【００３５】
本発明において、血球成分との識別が可能な体積とは、たとえば、４０μm３よりも、小さい体積を言う。あるいは１００μm３よりも大きい体積であっても、血球成分との識別は可能である。すなわち、本発明における好ましい凝集塊の体積は、４０μm３以下、または１００μm３以上の体積を言う。本発明において、識別可能な体積とは、４０〜１００μm３の体積に対して、たとえば１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上の体積の差を有することを言う。【００３６】
４０〜１００μm３の体積を有する血球成分は主に赤血球である。成人では血液１mm３あたり、男性では約５００万個、女性では約４５０万個、幼児では約６９０万個の赤血球が含まれる。白血球の体積は赤血球に比べ、やや大きい。白血球の数は、成人の血液１mm３に平均７５００個と少ないので、血液成分の大部分は赤血球と言える。ポリスチレンラテックスビーズにより校正されたコールターカウンターを用いて、全血の体積分布を計測した結果の一例を図１に示す。ここで約５０μm３の位置に見られピークが赤血球である。これよりもやや大きめの位置にわずかに存在する分布が主に白血球のピークである。【００３７】
数個の担体粒子によって形成される凝集塊が血球成分と識別可能な体積を与えるためには、担体粒子の平均粒径は、具体的には、０．５〜２．４μm、または６〜２０μmの範囲から選択することができる。この範囲よりも小さい担体粒子は、血球成分との識別は可能なものの、パールチェインを形成しにくい場合がある。効果的にパールチェインを形成させるためには、たとえば１μm以上の大きさを有する担体粒子が好ましい。したがって、血球成分よりも小さい凝集塊を与える担体粒子は、好ましくは１〜２μmの粒子径を有する。たとえば１〜１．８μmの粒子径を有する担体粒子は、本発明における好ましい担体粒子である。最も好ましい粒子は１．４〜１．８μmである。このようなサイズは、効率的にパールチェイン化される大きさである。またこの範囲の粒子径を有する担体粒子を利用すれば、２〜８個の担体粒子からなる凝集塊を、明確に血球成分と識別することができる。また、誘電分極が大きい楕円形粒子を用いることにより、より小さい担体粒子を使用することもできる。担体粒子（１〜２μm）の数と凝集塊の体積、並びに血球成分との体積の差の関係を以下にまとめた。
担体粒子      凝集塊の体積      血球成分の体積との差
２個        1.05〜 8.38μm３      ７９〜９７％
５個        2.62〜20.93μm３      ４８〜９３％
８個        4.19〜33.49μm３      １６〜９０％【００３８】
他方、２０μmを大きく越える大きさを有する担体粒子は、場合によって試薬の保存安定性あるいは分散性が低下することがある。そのため、使用時には予め均一化するための操作が必要となることがある。また大きな担体粒子によって形成された凝集塊は、希釈や担体粒子の運動に伴って、崩壊しやすい傾向がある。崩壊を防ぐために、後に述べるような結合強化剤の使用は有用である。【００３９】
パールチェイン化を利用したイムノアッセイにおける担体粒子の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、一般的に、０．５〜２０μmが好ましいとされていた。本発明者は、血球成分を含むサンプルの測定を可能とするために、更に、血球成分との識別が可能な凝集塊を与え、かつパールチェイン化を利用したイムノアッセイの利点を維持することができる条件を探索し、本発明を完成した。【００４０】
公知のラテックス凝集比濁法における担体粒子が０．０５〜０．６μmであるのと比べ、本発明の方法においては１μm以上の大きなサイズの粒子を利用するのが望ましい。電圧パルスを印加(apply)する工程の利用によって凝集反応が促進される結果、大きなサイズの粒子であっても短時間で十分な反応が進行するためである。担体粒子が大きいことは、以下のような利点につながる。まず、粒子を計測するためのアパーチャーサイズを大きくすることができる。その結果、アパーチャーが詰まりにくくなる。また、担体粒子が大きくなることによって、体液に含まれる測定妨害物質との識別が容易になる。その結果、測定精度が向上する。これらのパールチェイン化を利用するイムノアッセイの利益は、本発明においても失われない。【００４１】
結合パートナーと粒子担体は、それぞれの素材に応じた方法によって結合させることができる。当業者は、両者の結合方法を適宜選択することができる。たとえばラテックス粒子には、抗原や抗体、あるいはそれらの断片などの蛋白質を物理吸着することができる。表面に官能基を有するラテックス粒子においては、当該官能基との共有結合が可能な置換基を化学的に結合させることができる。たとえば、−ＣＯＯＨを有するラテックスには、蛋白質の−ＮＨ2を結合させることができる。【００４２】
結合パートナーを結合させた担体粒子は、必要に応じてブロッキングすることができる。具体的には、担体粒子表面を不活性蛋白質で処理することによって、担体粒子表面に対する非特異的な蛋白質の結合を防止することができる。不活性蛋白質としては、ウシ血清アルブミンや脱脂粉乳などを用いることができる。更に、担体粒子の分散性を向上させるために、分散媒に界面活性剤や糖類を加えることができる。また、微生物の繁殖を防ぐために、粒子担体に抗菌剤を添加することもできる。【００４３】
本発明は、親和性物質と担体粒子を含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む。電界中に担体粒子を整列させ、凝集反応を行わせる方法は公知である（特開平７−８３９２８号）。すなわち、親和性物質と担体粒子を含む反応液に電圧パルスを印加することにより、担体粒子を電界に沿って整列させることができる。
このとき、凝集阻止反応の原理を利用する場合には、親和性物質と担体粒子は、凝集試薬の共存下で整列させられる。凝集試薬は、担体粒子と測定対象親和性物質との接触の後に接触させることができる。あるいは予め測定対象親和性物質と凝集試薬を混合した後に担体粒子を添加することによって、３つの成分を同時に接触させることができる。【００４４】
電圧パルスには交流成分、または直流成分を利用することができる。両者を任意に組み合わせることもできる。反応液は電気分解を起こしやすいので交流電圧が好ましい。交流電圧には、方形波、矩形波、あるいは正弦波等を用いることができる。反応液（試薬）のイオン強度により、交流電圧の電源周波数を任意に設定することができる。交流電圧は波高値で示したとき、１０〜５０V/mmの電解強度が得られるように印加する。電解強度が５V/mmよりも小さいと担体のパールチェイン化が起こりにくく、したがって凝集反応の促進が不十分となる。電解強度が５０V/mmを超えると反応液の電気分解が起こりやすく、凝集反応の測定が困難となる場合がある。より好ましくは１５〜３０V/mmの電界強度が得られるように印加する。【００４５】
一般的なパールチェイン化を利用するイムノアッセイにおいては、通常５０KHz〜１MHzが好ましい周波数とされている。しかし血球成分が共存する本発明の方法においては、低い周波数は、血球成分の破壊の原因となる可能性がある。低い周波数では、電流が反応液中を流れやすくなるためである。したがって、本発明においては、たとえば１００KHz〜１０MHz、好ましくは４００KHz〜１MHzの周波数を利用することができる。【００４６】
本発明において、電圧パルスとは通常、定常状態から電圧が遷移し、有限の時間だけ持続してもとの状態にもどる波または波形を有する電圧をいう。交流電圧は、代表的な電圧パルスである。交流電圧は電圧の平均値が０であるような時間の周期関数である。たとえば正弦波、矩形波、方形波、あるいはのこぎり波などを有する電圧は明らかに振幅が周期的であり、交流電圧に含まれる。一般に、交流電圧においては、任意の１周期において、正電位側の面積と負電位側の面積は等しく、両者の合計は０となる。各面積は、横軸（電位差が０）と上側の曲線、あるいは下側の曲線によって規定される面積である。本発明においては、反応液の電気分解を防ぐために、電圧パルスが印加される。したがって、反応液の電気分解が起こらない、あるいは起きたとしても実質的に反応に干渉しないレベルに抑制できる場合には、正電位と負電位の合計が０でない電圧パルスを用いることもできる。【００４７】
本発明において、方形波、あるいは矩形波の電圧パルスは、正電位／電位差０／負電位を繰り返し、かつ正電位および負電位の少なくとも一方は、電圧が一定の状態を含む電源を言う。そして方形波、あるいは矩形波の、電位差が０の状態から次の０の状態に至る間の時間がパルス幅である。なお方形波とは、縦軸を電圧、横軸を時間とするグラフに電圧の変化を描いたときに、ほぼ四角形の形状となる電圧パルスを言う。四角形には、正方形と長方形が含まれる。これに対して矩形波は、正方形を含まない長方形の形状の電圧パルスである。したがって、矩形波は方形波に含まれる。本発明において、好ましいパルス幅は、通常５０μsec以下である。好ましいパルス幅として、０．１〜１０μsecを例示することができる。【００４８】
方形波あるいは矩形波を構成する電位差が０の状態の時間は、制限されない。一般的には電位差が０となるのは、正電位と負電位の間の移行の瞬間である。しかし、電位差が０の状態がより長い時間継続するような電圧パルスを本発明に用いることもできる。たとえば、０．１〜１０μsecのパルス幅を有する正電位／負電位の繰り返しの間に、０．１〜１００μsecの電位差が０の状態を含むことができる。【００４９】
本発明において、電圧パルス印加時の反応液の温度は限定されない。通常０〜２０℃、たとえば０〜１５℃、好ましくは１〜８℃、あるいは２〜４℃とすることができる。電圧パルスの印加によって反応液の温度は上昇する。したがって反応液の温度を低く保つためには、冷却手段を利用するのが有利である。局所的に低温環境を作り出すための好適な冷却手段として、たとえばペルチェ素子を示すことができる。ペルチェ素子とは、ペルチェ（Jean Charles A. Peltier）によって見出されたペルチェ効果を利用した半導体で構成される電子素子である。N型とP型の半導体に直流電流を流すと、半導体の片方で温度が吸収され、他方で放熱が起きる（熱交換現象）。温度が吸収される側の温度は低下し、冷却される。市販のペルチェ素子は、通常、−１０℃前後の冷却能力を有している。ペルチェ素子の冷却能力は、半導体に供給する電流によって自由に制御することができる。したがって、電圧パルスを印加している間、温度センサーで反応液の温度を監視し、必要に応じてペルチェ素子を作動させることによって、所定の温度範囲に反応液の温度を維持することができる。【００５０】
あるいはまた、電圧パルス印加時に反応液を十分に冷却し、電圧パルスの印加後も反応液の温度が所定の範囲にある場合には、電圧パルス印加時の冷却は必ずしも必要ではない。たとえば電圧パルスの印加終了時の反応液の温度が２０℃以下であれば、印加の間の冷却無しでも、必要な温度条件を満たすことができる。予め十分に反応液を冷却し、更に必要に応じて、反応液がおかれる環境の温度上昇を抑制することができれば、電圧パルス印加の間の積極的な冷却は必須ではない。【００５１】
本発明において、電圧パルスを印加する反応液は、予めインキュベートすることができる。インキュベートのための条件は後に述べる。反応液が３７〜９０℃の高温でインキュベートされた場合には、電圧パルスを印加する前に十分に冷却する。通常、反応液の体積は１mL以下なので、反応液はきわめて短時間で冷却することができる。高温でインキュベートした反応液を冷却し、０〜２０℃において電圧パルスを印加するという条件は、本発明における好ましい条件である。【００５２】
電圧パルス印加時の温度上昇が凝集反応に阻害的に作用するメカニズムは、次のように考えることができる。電圧パルスを印加された反応液中では、担体粒子の整列と分散が繰り返されている。担体粒子上の結合パートナーと反応液中の親和性物質（または凝集試薬成分）との接触の機会を増やすためには、担体粒子の分散が有効である。同時に、複数の担体粒子を親和性物質（または凝集試薬成分）との結合によって架橋し、凝集塊を形成するためには、担体粒子の整列が有効である。しかし反応液における担体粒子の動きが激しい場合には、担体粒子が十分に整列できない可能性がある。反応液の温度が上昇した状態は、反応液に含まれる担体粒子のブラウン運動が激しくなって、電圧印加時の担体粒子の整列が難しくなっている状態であると言える。その結果、電圧の印加による担体粒子の整列が阻害され、凝集反応が阻害される。本発明に基づいて電圧パルス印加時の反応液の温度が制御された場合には、電圧印加による担体粒子の整列効果が十分に得られ、温度上昇による凝集反応の阻害を抑制することができる。【００５３】
電圧パルスを印加された反応液における担体粒子の動きを抑制するために、反応液の粘度を高めることも有効である。一般的な凝集反応の反応液は、０．７５mPas（パスカル・秒、あるいはポアズP）未満である。このような粘度においては、担体粒子の動きは抑制されず、凝集反応が阻害される場合がある。これに対して本発明者は、０．８mPas以上の粘度において、凝集反応を効率的に進められることを確認した。すなわち本発明は、特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法において、電圧を印加している間の反応液の粘度を０．８mPas以上とすることを特徴とする方法を提供する。より具体的には、前記工程(1)-(3)あるいは(1')-(3')を含む親和性物質の測定方法であって、反応液の粘度が０．８mPas以上である方法が本発明によって提供される。【００５４】
本発明において、反応液の粘度は、通常０．８mPas以上、たとえば１〜３mPas、好ましくは１〜２mPasである。反応液の粘度は、粘度を調節することができる化合物の添加によって調節することができる。粘度を調節することができる化合物としては、親和性物質と結合パートナーとの結合に干渉しない任意の化合物を利用することができる。たとえば、牛血清アルブミン、カゼイン、グリセリン、スクロース、あるいは塩化コリン等を添加することによって、反応液の粘度を高めることができる。これらの化合物の添加量は、たとえば０．０５〜５％から適宜選択することができる。より好ましくは０．１〜３％、更に好ましくは０．３〜１％である。また、反応液の組成が同じであっても、反応液の温度が低下すれば、一般に、粘度は高まる。したがって、反応液の粘度を高めるという意味でも、低温条件下での電圧パルスの印加は有効である。【００５５】
当業者は、これらの化合物を反応液に添加し、電圧パルスを印加する温度条件下でその粘度を測定することにより、適当な添加量を設定することができる。液体の粘度を決定する方法は公知である。一般的には回転式粘度計、超音波式粘度計、または振動式粘度計などが用いられる。【００５６】
本発明においては、反応液に対して任意の方向から電圧パルスを印加することができる。たとえば、複数の異なる方向の電圧パルスを印加することもできる。具体的には、たとえば２組の電極を組み合わせて、反応液に電圧パルスを印加することができる。あるいは、反応液に対して電極を移動させることによって、異なる方向の電圧パルスを与えることができる。たとえば、電極を回転させることによって、任意の角度の電圧パルスを与えることができる。移動させる電極の数は、１組であってもよいし、２組以上の電極を移動させることもできる。【００５７】
本発明において、反応液中における担体粒子の濃度は、ラテックス粒子の場合、通常、０．１〜１w/v％、好ましくは０．２〜０．５w/v％の範囲から選択することができる。担体粒子の反応液における濃度は、サンプルとなる血球成分を含む媒体、ラテックス粒子を含む試薬溶液、そして必要に応じて添加される希釈液などの割合と濃度に応じて調節される。たとえば０．１〜１w/v％という担体粒子の濃度は、一般的な担体粒子の凝集を指標とするイムノアッセイにおいては、高い濃度である。このような高い担体粒子濃度は、非特異的な凝集や、凝集していない粒子を凝集塊として計数する誤った結果をもたらす原因となる。しかし本発明においては、免疫反応の後に、凝集した粒子あるいは凝集しなかった粒子が、その三次元情報を指標として計数される。三次元情報を指標とすることによって、誤った計数結果を防止することができる。たとえば、単なる担体粒子の重なりを凝集塊として計数するような誤りは、三次元情報を指標とすることによって防止される。【００５８】
本発明において、反応液には凝集反応を促進する塩を添加することができる。たとえば、１０mM以上の比較的高い濃度で塩を添加することにより、凝集反応を促進することができる。ただし塩の濃度が反応系中に６００mM以上の濃度で存在すると反応液の電気分解が起こり易くなるので好ましくない。より好ましい塩の濃度は１０〜３００mM、最も好ましい塩の濃度は２５〜１５０mMである。生体試料自身が凝集反応を促進する塩を含有している可能性がある場合には、反応液中の最終塩濃度が上記の範囲に入るように試薬の塩濃度を調整すると良い。なお電圧パルスとして直流成分を用いる場合では約６mMの塩濃度の反応液でも電気分解が起こるため、塩の存在下では生物学的特異的凝集反応の測定は困難である。【００５９】
本発明における塩は、生物学的特異的凝集反応を促進するものの中から選択され得る。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウムが挙げられるがこれに限定されるものではない。モル電気伝導度が１０mM、２５℃の水溶液において１００cm2/(Ω・mol)以上の値を示す塩は、本発明に用いる塩として好ましい。より具体的には、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化アンモニウム等を好ましい塩として示すことができる。【００６０】
本発明において血球成分を含む媒体は原液でもよく、又は自動希釈して測定に使用される。希釈倍率は任意に設定することができる。反応に必要な試薬が複数種類となるときには、複数の試薬を順に添加することもできる。ここで言う複数の試薬を構成する試薬としては、たとえば以下のような試薬を示すことができる。
本発明において、非特異反応の原因となる物質を、予め分解、および／または吸収するための試薬を用いることができる。このような試薬は、非特異抑制剤を含む試薬として有用である。非特異抑制剤を含む試薬は、担体粒子を含む試薬と組み合わされて、複数の試薬を構成する。非特異抑制剤を含む試薬は、たとえば、予め検体と混合することができる。非特異抑制剤は、例えば、従来周知のものを使用することができる。【００６１】
イムノアッセイにおいて、非特異反応の原因となるさまざまな物質が試料中に含まれることが明らかにされている。たとえば、リューマチ因子などのグロブリン類は、イムノアッセイを構成する免疫反応に干渉することがある。グロブリン類のイムノアッセイへの干渉を防止するために非特異抑制剤が用いられる。たとえば、グロブリン類を認識する抗体によって、その非特異作用を吸収することができる。リューマチ因子はＩｇＧやＩｇＭ由来のグロブリンである。したがって、抗ヒトＩｇＧ抗体、あるいは抗ヒトＩｇＭ抗体を使用して、リューマチ因子を吸収することができる。また、非特異原因物質の分解によって干渉を防ぐ方法も公知である。具体的には、グロブリン類を還元によって分解し、その干渉作用を抑制できることが知られている。グロブリン類は、ジチオスレイトール、あるいは2-メルカプトエタノールなどによって還元される。【００６２】
また、異なる結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子を含む試薬を２種類以上組み合わせることができる。このような構成によって、異なる種類の測定対象親和性物質を同時に測定することができる。各試薬は、それぞれ個別に添加することができる。あるいは、予め複数の試薬を混合した後に、検体と混合することもできる。【００６３】
検体と試薬は電圧を印加する前に予め混合しておくことが望ましい。攪拌子を使って物理的に両者を混合することができる。あるいは電気的な方法によって、両者を混合することもできる。電気的な手法としては、異なる方向の電圧パルスの断続的な印加によって、担体粒子の位置を物理的に動かす方法を例示することができる。【００６４】
本発明においては、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液は、予めインキュベートすることができる。本発明者は電圧パルス印加前の反応液のインキュベートによって、電圧パルス印加後の凝集塊の形成が促進されることを明らかにした。すなわち、電圧パルス印加前のインキュベートによって反応が促進される。【００６５】
反応液のインキュベートは、たとえば室温以上の温度で実施される。インキュベートの温度は、反応液に含まれる各種の反応成分の活性を維持できる限り、できるだけ高温であることが望ましい。インキュベートのための時間は限定されない。すなわちインキュベートの温度において、反応成分の変性をもたらさない範囲でインキュベートすることができる。インキュベートの時間は長いほど促進効果も増強される。したがって、必要なレベルの促進効果を期待できる温度と時間の条件を予め設定することが望ましい。【００６６】
具体的には、たとえばインキュベートのための温度条件として、通常３７〜９０℃、好ましくは４０〜９０℃、あるいは４５〜８０℃を示すことができる。たとえば親和性物質である蛋白質抗原を、結合パートナーである抗体を用いて、本発明に基づいて測定することができる。抗体や抗原を構成する蛋白質は高温では変性することが知られている。しかし、たとえば血清の非動化のための一般的な条件である５６℃３０分というインキュベート条件は、多くの蛋白質は変性しない。更に本発明者らは、イムノアッセイのような低い蛋白質濃度条件で、短時間の処理であれば、９０℃程度の温度であっても蛋白質の変性は無視しうることを確認した。たとえば４５〜８０℃の範囲において、５〜１８０秒のインキュベートは、ほぼ同じレベルの反応促進効果を得られることが確認された。したがって、本発明における好ましいインキュベートの条件として、好ましくは４５〜８０℃、より好ましくは５０〜６５℃で、５秒以上、たとえば５〜３０秒を示すことができる。
本発明においては、血球成分を含む試料が高温でインキュベートされる。本発明者の知見によれば、たとえば６０℃９０秒、あるいは８０℃で３０秒などの条件においては、電場による血球成分の破壊等の影響は確認できなかった。【００６７】
本発明においては、より長いインキュベート時間をも含まれることは言うまでもない。しかし、反応時間の短縮が望まれる場合には、５秒以上の短い時間を採用することによって、反応時間を犠牲にすることなく目的とする反応促進効果を期待することができる。また、たとえば８０℃を越える高温条件においては、インキュベート時間を５〜３０秒とすることで、血球の崩壊や蛋白質の変性を避けることができる。
通常、血球の大きさは一定の範囲にある。したがって、粒子の計数に当たり、血球に由来するシグナルを特異的に検出することができる。しかし血球が崩壊すると、さまざまな大きさの構成成分が生成される。崩壊した構成成分は大きさが不ぞろいなため、どのシグナルが血球に由来するものなのかを特異的に検出することが難しい。つまり血球の崩壊はノイズの原因となる可能性がある。そこで、血球の崩壊を避けることにより、崩壊した血球の構成成分に起因するノイズの影響を防ぐことができる。特に高感度な測定が求められる場合などには、ノイズレベルの低い条件を与えることの意義は大きい。【００６８】
あるいは、本発明の方法を耐熱性の物質の反応に応用する場合には、高温条件は問題とならない。たとえばDNAは、高温条件下でもきわめて安定である。したがってDNA間の結合を担体粒子の凝集によって測定しようとする場合には、インキュベートのための温度としてより高い温度を選択することもできる。【００６９】
本発明において、インキュベートによって反応が促進されるメカニズムは、次のように説明することができる。電圧パルスの印加によって整列した担体粒子は、その上に固定された結合パートナーが、親和性物質を介して別の担体粒子上の結合パートナーと架橋されることによって凝集塊を構成する。一連の反応は、担体粒子が整列したときに起きると考えられていた。しかし本発明者が得た知見によると、電圧パルス印加前のインキュベートが反応の効率化に貢献することが確認された。またこのインキュベートの間に、担体粒子上の結合パートナーに親和性物質が結合した状態が形成されることも明らかにした。つまり、電圧パルス印加によって担体粒子を整列させる前に、結合パートナーが親和性物質を捕捉した状態にしておくことが反応を効率化すると考えられる。【００７０】
電圧パルスを印加されていない条件下では、電圧パルス印加時と比べて、担体粒子の自由度ははるかに大きいと考えられる。したがって、担体粒子上の結合パートナーと親和性物質は接触することができ、結合パートナーは親和性物質を捕捉することができる。ここに電圧パルスを印加すると、親和性物質を捕捉した結合パートナーを有する担体粒子は他の担体粒子とともに電場に整列する。このとき結合パートナーは既に親和性物質を捕捉しているので、接近した他の担体粒子の結合パートナーとの結合によって速やかに凝集塊が形成される。電場が断続的に印加され、担体粒子の整列と分散が繰り返されることにより接触の機会が増え、凝集塊の形成が促進される。【００７１】
つまり電圧パルスの印加の後に担体粒子の凝集を検出し、その凝集を指標として親和性物質を測定する方法においては、担体粒子の凝集塊は、以下の一次反応と二次反応を経て形成されると言ってよい。
一次反応：担体粒子上の結合パートナーが親和性物質を捕捉する反応。このとき、必ずしも親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造は形成されなくても良い。
二次反応：複数の担体粒子上の結合パートナーが親和性物質に結合する反応。その結果、親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造（すなわち凝集塊）が形成される。
二次反応は電圧パルスの印加によって促進される。しかし、これまで一次反応を促進するための具体的な条件は明らかにされていなかった。したがって本発明は、一次反応の促進のための条件を提供したと捉えることもできる。すなわち本発明における電圧パルスの印加前のインキュベート工程は、一次反応の促進のための工程であると言うこともできる。【００７２】
本発明においては、電圧パルスを印加する前の反応液中に水溶性高分子化合物を添加することができる。水溶性高分子化合物の存在下で、親和性物質と結合パートナーの結合を粒子凝集反応によって検出することによって、凝集反応の強化、あるいは安定化を達成することができる。反応液中の水溶性高分子化合物の濃度は、たとえば０．０５〜５％から適宜選択することができる。より好ましくは０．１〜３％、更に好ましくは０．３〜１％である。凝集反応の強化作用が強い化合物は、５％を超える濃度において、非特異的凝集反応の可能性を大きくする傾向がある。また、０．０５％以下の低い濃度では、その効果が十分に期待できない場合がある。【００７３】
水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース等を用いることができる。ポリエチレングリコールの分子量は、６０００〜２００００００が好ましい。これらの水溶性高分子化合物は１種類でも良いし、２種類以上を組み合わせてもよい。水溶性高分子化合物を反応液に添加するためには、粒子担体を含む試薬中に予め必要量を添加しておくことができる。あるいは水溶性高分子化合物を粒子担体とは異なる試薬として混合することもできる。たとえば、サンプルの希釈液中に水溶性高分子化合物を添加しておくことができる。更に、混合される複数の試薬、並びに希釈液中に添加しておくこともできる。【００７４】
好ましくは、２試薬系とし、緩衝液などの第一試薬に含有させておき、担体を含む第二試薬と混合して測定に使用する。このとき、第一試薬中には異好性抗体(heterophile antibody)などの非特異物質を吸収する非特異吸収剤やリウマチ因子を吸収するための物質を添加することができる。【００７５】
本発明に基づく、電圧パルスの印加前のインキュベートによる反応効率の向上は、凝集阻止反応に応用することもできる。すなわち、前記工程(1')〜(3')を含む本発明の方法においても同様に、測定対象親和性物質とを含む反応液を、凝集試薬成分と混合する前または後にインキュベートすることができる。インキュベートの条件は、前記の条件と同様である。また凝集阻止反応系においても、反応液に水溶性高分子化合物を添加することができる。【００７６】
上記のように、電圧パルスの印加前の反応液のインキュベートは、担体粒子の凝集反応の促進に有効である。このとき、インキュベートの温度は、高いほうがより効果が大きいことは既に述べた。一方、電圧パルスを印加された反応液の温度は、ジュール熱のために上昇する。導体を電流が流れるときに、導体において発生する熱がジュール熱である。本発明者は、インキュベートにおける高温条件が凝集反応に促進的に作用するのに対して、電圧パルス印加時の温度上昇が凝集反応に対して阻害的に作用することを見出した。したがって、電圧印加時には、反応液の温度を低く維持することが有利である。【００７７】
本発明は、次の工程(1)〜(3)を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)がこの媒体の存在下で行われ、かつ工程(１)における担体粒子が血球成分と識別可能な体積の凝集塊を与える大きさであることを特徴とする測定方法を提供する。
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程【００７８】
本発明の測定方法を構成する各工程を以下に具体的に説明する。
混合された反応液は次に電極を介した槽に移動して、電圧パルスを印加する。電場をかけると担体粒子は誘電分極を起こして静電的に引き合い直鎖状に並ぶ。この現象は、パールチェイン化と呼ばれている。その後電場を停止すると直鎖に並んでいた担体粒子は瞬時に再分散する。一方パールチェイン化の際に生物的特異的反応物質が存在すると、生物的特異的反応に関与した担体粒子は電場を停止後も分散せずに凝集塊を形成したままの状態で存在する。これらの生物的特異的凝集反応に関与している凝集粒子及び／又は関与しなかった分散した担体粒子を測定することにより生物的特異的反応物質の存在を検出又は測定することができる。
【００７９】
本発明の測定方法においては、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方が、その三次元情報を指標として計数される。本発明において、粒子は電場を停止後に測定することができる。あるいは電場に置かれた粒子を、電場を停止することなく測定することもできる。たとえば、電場に置かれた粒子は、電場の中から取り出すことによって計数することができる。更に、粒子の計数前に、粒子を分散させる工程を実施することができる。計数前の分散工程によって、非特異的な要因によって凝集した粒子を分散させることができる。その結果、測定精度の向上が期待できる。粒子は、攪拌や反応液の希釈によって分散させられる。【００８０】
本発明において、反応液の希釈にあたり、前記工程(3)または(3')の前に、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化することができる。結合の強化によって、希釈に伴う凝集塊の崩壊を防止することができる。たとえば、反応液を電圧パルスの印加条件下で希釈する方法は、本発明における好ましい希釈方法である。より具体的には、電圧パルスを印加した希釈液に、反応液を添加することにより、希釈が行われる。希釈液は電極の間に配置され、電圧パルスが印加される。言い換えれば、対向する電極間に希釈液が配置される。【００８１】
反応液は、電圧パルスが印加された条件下で希釈することができる。このとき、電極の大きさや電極の間隔は特に限定されない。すなわちパールチェイン化後の反応液と希釈液との初期の接触が対向電極を挟む電界の中で行われる。【００８２】
希釈工程においては、電圧パルスは、交流電圧が好ましい。電圧パルスの印加条件は、反応液および希釈液の電気分解を誘発しない任意の条件とすることができる。電圧パルスの電圧は、例えば０．１Vから１．２V、より好ましくは０．３から０．９Vである。電圧パルスの周波数はたとえば１００KHｚから１０MHｚ、より好ましくは４００KHzから１MHｚである。電圧パルスには、任意の波形を用いることができる。具体的には、方形波、正弦波、三角波などがを示すことができる。より好ましい電圧パルスは、方形波である。本発明においては、少なくとも反応液と希釈液が接触する瞬間を含む時間帯において、電圧パルスが印加されていることが望ましい。印加時間はごく短時間であっても希釈における結合の強化作用を期待することができる。より具体的には、０．５−３０秒、通常１−１０秒、たとえば１−５秒である。【００８３】
希釈液には、塩を含む溶液を用いることができる。具体的には、５０mMから６００mMの塩が添加された、生理食塩水、グリシン緩衝液、りん酸緩衝液などを用いることができる。塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを示すことができる。希釈液には、アジ化ナトリウムなどの防腐剤やTriton X-100などの界面活性剤、グリセリン、ショ糖などが含まれていてもよい。【００８４】
電圧パルスを印加した状態で希釈することにより、凝集塊を構成する親和性物質（または凝集試薬）と結合パートナーの結合反応は強化される。電圧パルスによってもたらされた電界によるダイポールモーメント効果が、両者の結合を強化するためと考えられた。いずれにせよ、電圧パルス印加条件下での希釈により、凝集塊の崩壊は抑制され、凝集塊を維持したまま反応液の希釈を実現できることが確認された。【００８５】
あるいは、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化することができる希釈手段として、両者の結合を強化しうる結合強化剤を利用することができる。結合強化剤とは、反応液への添加によって、両者の結合を強化することができる成分を言う。たとえば、蛋白質間の結合は、グルタルアルデヒドあるいはカルボジイミドなどの化合物の添加によって強化される。したがって、蛋白質抗原と抗体との免疫学的な結合は、グルタルアルデヒドあるいはカルボジイミドなどによって強化することができる。これらの化合物は、結合強化剤として好ましい。【００８６】
結合強化剤は、親和性物質と結合パートナーの官能基に作用して両者を化学的に結合する。あるいは凝集阻止反応系においては、凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する。その結果、両者の結合によって形成された凝集塊が、物理的に高度な安定性を獲得する。例えば、親和性物質あるいは凝集試薬、および結合パートナーが蛋白質であれば、分子内にはアミノ基やカルボシキル基がある。これらの官能基は、グルタルアルデヒドやカルボジイミドなどの化学物質で架橋される。【００８７】
反応液中における結合強化剤の濃度は、結合強化剤の種類に応じて適宜設定することができる。より具体的には、例えばグルタルアルデヒドの場合、反応液における終濃度は、通常０．１〜２５％、好ましくは０．２〜１８％である。結合強化剤は、親和性物質と結合パートナーとの結合体を含む反応液の希釈前に、反応液に添加すればよい。結合強化剤の添加後の反応液は、好ましくは37℃で数秒〜20秒程度、好ましくは２〜１０秒、あるいは２〜５秒のインキュベート後、希釈することができる。結合強化剤にグルタルアルデヒドあるいはカルボジイミドを用いた場合には、反応液に添加後、直ちに希釈することもできる。【００８８】
結合強化剤の添加は、本発明における希釈工程として有効である。本発明においては、更に、先に述べた電圧パルス印加条件下での希釈工程に、結合強化剤を組み合わせることもできる。すなわち、反応液に結合強化剤を添加した後に、先に述べた条件に従って、電圧パルス印加条件下で、反応液を希釈することができる。あるいは、結合強化剤を添加された希釈液を利用して、先に述べた条件に従って、電圧パルス印加条件下で、反応液を希釈することもできる。両者を組み合わせることによって、結合の強化作用が強められる。【００８９】
本発明において、反応液の希釈とは、反応液と希釈液との混合によって、反応液中における担体粒子の濃度を低下させることを言う。反応液における担体粒子の濃度は、試料の量と試薬として供給される担体粒子の量によって決定される。更に本発明においては、反応液における担体粒子の濃度は、通常、パールチェイン化によって担体粒子の凝集を促進することができる範囲に設定される。具体的には、反応液における担体粒子の濃度は、先に述べたように、通常０．１〜１重量％、より好ましくは０．２〜０．５重量％である。これに対して、たとえば１００倍以上、通常１０００倍以上、具体的には１０００〜１０００００倍、好ましくは２０００〜４００００倍に希釈することができる。希釈後の担体粒子の濃度は０．１×１０−５〜０．００１重量％、好ましくは０．２５×１０−５〜５×１０−５重量％である。【００９０】
本発明においては、粒子は、三次元情報を指標として計数される。本発明において、三次元情報を指標とする計数とは、粒子および／または凝集塊の三次元情報を測定し、その結果に基づいて粒子および／または凝集塊を計数することを言う。顕微鏡画像を解析する公知の方法は、二次元情報に基づいて凝集のレベルを決定している。したがって、三次元情報を指標とする本発明と公知の方法とは、明確に区別される。【００９１】
三次元情報を測定するための方法は限定されない。また、本発明における計数とは、粒子および／または凝集塊の数を求めることを言う。粒子および／または凝集塊の数は、単に数のみを測定することもできる。あるいは凝集した粒子を、凝集していない粒子と区別して測定することもできる。更に、凝集した粒子については、凝集した粒子の数ごとに、その凝集塊の数を測定することもできる。三次元情報を指標として粒子を計数するためのいくつかの方法が公知である。【００９２】
本発明に利用することができる粒子の計数方法は、物理的な原理に基づく測定方法が有利である。本発明において物理的な測定方法とは、粒子または凝集塊に固有の物理的な情報を評価することができる測定方法を言う。粒子または凝集塊に固有の物理的な情報は、真の測定結果と言い換えることもできる。これに対して画像情報から取得される二次元情報を解析する方法は、実際には凝集していない粒子の重なりを凝集塊として検出してしまう。このような検出結果は、粒子に固有の物理的な情報とは言えない。【００９３】
粒子または凝集塊を物理的に測定するには、フローシステムの利用が有利である。フローシステムは、微細なフローセル中を通過する粒子の物理的な情報を解析することができるシステムである。フローシステムを利用することにより、容易に物理的な測定を実施することができる。すなわち本発明における物理的な測定とは、フローシステムによって粒子および凝集塊のいずれかまたは両方の三次元情報を測定し計数する工程を含む。三次元情報を指標として粒子を物理的に計数するための方法として、たとえば、コールター原理またはレーザー回析散乱法を示すことができる。【００９４】
コールター原理（USPA2656508，1953年）とは、アパーチャー（細孔）の両側に電極を置き、アパーチャー内を通過する粒子による電気抵抗の変化に基づいて粒子の体積を検出する解析方法である。電解液を通して両電極間に微小電流を流したとき、電解液中に懸濁した粒子が吸引されてアパーチャーを通過すると、粒子体積に相当する電解液が粒子によって置換される。その結果、両電極間の電気抵抗に変化を生じるので、この変化を測定することにより、粒子の計数とサイズ（体積）を測定することができる。体積を検出する方法として静電容量法があるが、実用化されているものは電気抵抗法がほとんどである。【００９５】
アパーチャーサイズは、解析対象となる粒子に合わせて適宜調節することができる。一般に、アパーチャーサイズは、担体粒子の平均粒径に対して数倍〜数１００倍、たとえば数倍〜１００倍、好ましくは５倍〜５０倍とするのが有利である。この場合、体積に比例したシグナルが検出でき、精度のよい高感度な測定が実現できる。粒子径に対してアパーチャーサイズの倍率は小さい方が感度はよくなるが、小さすぎると粒子が詰まりやすくなり、大きすぎると粒子の検出感度が低下するので好ましくない。【００９６】
より具体的には、たとえば粒子径が１〜２．４μm、特に１〜１．８μmの担体粒子を計数する場合、アパーチャーサイズは３０〜１００μm、好ましくは４０〜８０μm、たとえば５０〜７５μmの範囲から選択することができる。２〜３μmの担体粒子は、本発明による親和性物質の測定方法において、特に好ましい粒子サイズとして挙げることができる。すなわち本発明は、次の工程(1)〜(3)、あるいは(1')〜(3')を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)または(1')がこの媒体の存在下で行われることを特徴とする測定方法を提供する。【００９７】
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均粒径１〜１．８μmを有する担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を、５０〜７５μmのアパーチャーサイズを有するコールター原理によって、その三次元情報を指標として計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程、または
(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均粒径１〜１．８μmを有する担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、
(2')工程(1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、５０〜７５μmのアパーチャーサイズを有するコールター原理によって、その三次元情報を指標として計数する工程、および、
(3')工程(2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程。【００９８】
一般にアパーチャーサイズが小さい方が、非凝集粒子をより正確に計数することができる。反対にアパーチャーサイズを大きくすることによって、凝集粒子がアパーチャーに詰まりにくくなる。アパーチャーの詰まりは解析効率の低下の原因となる。詰まる頻度を低くすることが、解析効率の向上につながる。たとえば、凝集粒子が多量に生成することが予測される場合には、アパーチャーサイズを大きめに設定することによって、アパーチャーの詰まりを防止することができる。あるいは、粒子径の小さい担体粒子を用いることで同様の効果を期待することができる。更に、試料の希釈によって凝集粒子の割合を低下させ、アパーチャーの詰まりを防止することもできる。通常は、期待される検出感度、予想される検出対象物質の濃度、そして機器構成（特にアパーチャーサイズ）に応じて、それぞれ適切な条件を選択すればよい。【００９９】
このようにして凝集粒子を計数することによって、凝集粒子の割合を知ることができる。凝集粒子の割合とは、計数した全粒子に占める凝集した粒子の割合を言う。また凝集粒子の割合を、凝集率(agglutination ratio)と言う。更に、予め濃度がわかっている標準試料について、凝集率を求め、両者の関係をグラフにプロットすることによって、標準曲線を得ることができる。これに対して、検体の凝集率を照合すれば、検体に含まれる測定対象親和性物質の濃度を明らかにすることができる。
あるいは前記標準曲線を回帰式として表すこともできる。回帰式が得られれば、凝集率を回帰式に代入することによって、測定対象親和性物質の濃度を算出することもできる。【０１００】
一方レーザー回析散乱法とは、粒子にレーザーを照射した際に生じる揺らぎを検出することにより粒子の計数と平均径を測定するものである。いずれの場合も、測定精度を高めるために、粒子の誤測定を抑制する目的として、反応粒子を希釈、超音波の印加又は／及びシースフォロー方式などを用いることが好ましい。【０１０１】
その他にも以下のような方法を、粒子体積の測定方法として示すことができる。
遠心沈降法：液中における粒子の沈降速度と粒径の関係を示すストークスの式により粒径分布を測定する方法（光透過式遠心沈降法では、ストークスの法則を適用し、同じ比重の粒子ならば大粒のものの方が小粒のものよりも早く沈降することを利用する。その時の粒子濃度を光透過による濁度変化として解析し、粒度分布を求めることができる）。【０１０２】
キャピラリー方式：キャピラリー中を流れる粘性流体のレイノルズ数が小さい場合、そこにはポアズイユ（Hagen−Poiseuille）の流体が発生する。この流れはキャピラリー中央ほど速く、管壁ほど遅いため、大きな粒子は平均的に速い流束中を、小さい粒子は平均的に遅い流束中を流れて行くことになる。つまり粒子は一定長のキャピラリー中を流れる際、この移動速度の違いにより、サイズ別に分離され検出される。【０１０３】
三次元的画像解析：異なる方向から撮影した複数の画像情報を解析し、粒子の三次元情報を求めることができる。あるいはｘｙ平面の画像情報をｚ軸方向へスキャンすることにより、粒子の三次元情報を求めることができる。【０１０４】
本発明の測定方法は、三次元情報を指標として凝集した（またはしなかった）担体粒子が計数される。計数の結果によって、測定対象である親和性物質が定性的に、または定量的に測定される。定性的な測定においては、凝集粒子の存在は、測定対象である親和性物質の存在を意味する。あるいは凝集阻止反応の場合には、凝集の阻止が検出されたときに、測定対象の存在が証明される。【０１０５】
また定量的な測定においては、凝集のレベルを測定対象である親和性物質の量と関連付けることができる。より具体的には、予め親和性物質の量が明らかな試料について本発明の測定方法を行い、三次元情報に基づく凝集粒子の検出結果と親和性物質の量の関係を明らかにしておく。次に、試料について同様の測定を行い、堆積に基づく凝集粒子の検出結果から、親和性物質の量を明らかにすることができる。凝集阻止反応の場合であっても、同様にして定量的な測定は可能である。【０１０６】
粒子および／または凝集塊の計数方法としては、一定の粒子数をカウントする手段においては、２個以上に凝集した粒子数／総粒子数や単粒子／総粒子数など目的に合わせて演算式を選ぶことができる。総粒子数とは、ある計測時間内に計測された全ての粒子の数であっても良いし、反応液の全量を解析の対象とする場合には、文字通り、反応液に含まれる粒子の総数とすることもできる。反応液に含まれる粒子の総数は、反応液の全容量が明らかな場合には、その一部を計数することによって、近似的に算出することもできる。【０１０７】
更に、本発明においては、サンプルである血球成分含む媒体に占める血球成分の体積を求めることができる。本発明においては、担体粒子の凝集塊および凝集していない担体粒子のいずれもが、血球成分と識別される。その結果、血球成分をこれらの担体粒子とは別に計数することもできる。三次元情報を指標に血球成分を計数することによって、その体積も知ることができる。血球成分の体積がわかれば、サンプルとした媒体に占める血球成分の割合を決定することもできる。こうして決定された全血成分に占める血球成分の割合は、ヘマトクリット値とほぼ同じ意味を持つ。
したがって、たとえば全血をサンプルとして利用したとき、全血の体積から血球成分の体積を除いた体積は、血清（または血漿）の体積に相当する。両者の体積比に基づいて、本発明によって測定された全血中に含まれる測定対象物質の濃度を、血清濃度に補正することができる。【０１０８】
たとえばコールター原理（USPA2656508、1953年）を用いた検出法は、粒子の計数とサイズ（体積）を測定できることから、未凝集と凝集塊の粒度分布、及び血球成分の容積と個数を同時に計測できる。つまり、反応溶液中の血球成分の容積と個数が測定できるため、血球成分の総容量が算出できる。したがって、測定に使用した全血の試料中の血球成分の容量の割合を求めることができる。血漿（または血清）試料は、全血から血球成分を除いたものであることから、血球成分の割合により補正することで、血漿（または血清）の測定値に換算できる。
AR（血漿）＝AR（全血）×１００／（１００−血球成分の割合％）
本発明において、血球成分の体積を求めるために、コールター原理を利用することができる。たとえば、赤血球を計数するために、２００μm以下のアパーチャーサイズを有するコールター計数装置によって、血球の数と体積を明らかにすることができる。血球の体積を決定するための好ましいアパーチャーサイズは、３０〜２００μmである。【０１０９】
あるいは、電気抵抗法やレーザー回析散乱法などによって、一定時間あたりに検出された粒子および／または凝集塊の数に基づいて、親和性物質を検出または測定することができる。つまり、凝集反応により単粒子は凝集して凝集塊を形成することから、時間当たりに計数される粒子数が少なくなる。または、所定数の粒子および／または凝集塊を計数するに要する時間を指標とすることもできる。このような計数方法を本発明に適用する場合には、それぞれ粒子および／または凝集塊の数と、親和性物質の量との間の関係を、回帰式として表すことができる。【０１１０】
抗体が感作された粒子は、抗原の濃度に応じて、２個以上の粒子からなる凝集塊の割合が多くなる。そして２個以上に凝集した粒子数／総粒子数で表される凝集率は、１．００（１００％）に収束する。【０１１１】
コールター原理にしろレーザー回析散乱法にしろ、粒子の三次元情報を計測する方法は、二次元的な画像データを解析する方法と比較して、簡単な機器構成によって、高精度な解析が期待できる。既に述べたように、二次元的な画像データの解析においては、反応液の容積が制限される。これに対して三次元情報を計測する方法は、フロー式の解析手法を応用できるため、反応液の容積は制限されない。また反応空間の物理的な形状も制限されない。これらの理由により、機器構成はシンプルとなる。加えて、反応液量を自由に設定できることが、再現性や検出感度の向上に貢献する。【０１１２】
あるいは本発明は、次の工程(1')〜(3')を含む、親和性物質の測定方法であって、測定対象親和性物質が血球成分を含む媒体に含まれており、工程(１)または(1')がこの媒体の存在下で行われ、かつ工程(１)または(1')における担体粒子が血球成分と識別可能な体積の凝集塊を与える大きさであることを特徴とする測定方法を提供する。
(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、
(2')工程(1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する工程、および、
(3')工程(2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程。【０１１３】
凝集試薬を利用する、凝集阻止反応に基づく免疫学的粒子凝集反応法の原理は既に述べた。上記工程によって、免疫学的粒子凝集反応に本発明を応用することができる。上記工程を構成する電圧パルスの印加や凝集塊の形成レベル、あるいは凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルの解析は、先に具体的に述べたような方法によって実施することができる。【０１１４】
なお凝集阻止反応の原理に基づいて本発明を実施する場合には、２個以上の粒子が凝集した凝集塊がより多く生成される条件を選択することが望ましい。あるいは、単粒子／総粒子数を指標として凝集レベルを評価する方法が好ましい。凝集阻止反応の原理に基づく場合には、このような演算式を利用したほうが、２個以上に凝集した粒子数／総粒子数の演算式に基づく解析よりも、高い感度を期待できる。【０１１５】
本発明の方法は、反応液を保持し電圧パルスを印加する機構と、担体粒子を計数する機構を備えた装置によって実施することができる。たとえば、本発明の方法を実施するための装置として、次の手段を含む、親和性物質の測定装置を用いることができる。
(a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを保持する空間、
(b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加するための電極、および
(c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、および凝集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する手段。【０１１６】
本発明において、(a) 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを保持する空間には、反応液を保持するための任意の空間を利用することができる。微量の試料を反応させるためには、小容量の空間であることが有利である。たとえば１μL〜１０mL、好ましくは１０〜５００μL程度の空間を利用することができる。この空間は、必要に応じて、試料や試薬の供給手段、あるいは後に述べる担体粒子の計測手段を装備することもできる。
次に本発明における(b) 前記空間に保持された担体粒子に電圧パルスを印加するための電極について説明する。担体粒子を電場に整列されるための電極は、たとえば先に記載した先行技術文献においても利用されている。これら公知の電極を、本発明に利用することができる。本発明の装置には、電極に電圧を供給するための電源を装備することができる。【０１１７】
本発明を実施するための装置における電圧パルスを印加するための電極は、少なくとも１組（２つ）の電極で構成される。複数の異なる方向の電圧パルスを与えるために、３以上の電極を備えることもできる。たとえば、３つの電極Ａ、Ｂ、Ｃを配置し、Ａ−Ｂ間、Ｂ−Ｃ間、およびＡ−Ｃ間の３つの方向の電圧パルスを印加することができる。この他、２組（４つ）の電極を配置し、直交する電圧パルスを印加することもできる。
更に、異なる方向の電圧パルスを印加するために、電極を駆動する機構を備えることができる。たとえば、反応液の中で電極を回転させることにより、複数の異なる方向から電圧パルスを印加することができる。異なる方向から電圧パルスを印加するとき、印加の方向は任意の角度とすることができる。【０１１８】
更に本発明を実施するための装置は、(c) 前記空間に保持された担体粒子の凝集によって生じた凝集塊、および凝集しなかった前記担体粒子のいずれかまたは両方を、その三次元情報を指標として計数する手段を含む。該計数手段は、前記空間に装備することができる。あるいは前記空間に保持された反応液を前記空間から取り出して計数手段に導入した後に、計数することもできる。
三次元情報を指標として凝集した、またはしなかった担体粒子を計数する手段としては、コールター原理、あるいはレーザー回析散乱法を利用した計測手段を利用することができる。コールター原理のためには、たとえば前記空間内の反応液を、コールター原理のための電極を備えたアパーチャーに導入して、必要な解析が行われる。アパーチャーのサイズは、先に述べたような基準に基づいて、適宜調節することができる。【０１１９】
試薬に用いる粒子径、あるいは予測される凝集粒子の割合に応じて、異なるサイズを有する複数のアパーチャーを切り替えて利用する機構を採用することもできる。更に、担体粒子とは別に、血球成分を計数するためのアパーチャーを備えることもできる。たとえば、本発明の装置は、複数のアパーチャーに反応液を導くための流路切り替え機構を備えることができる。更に、試薬の種類や、予測される凝集粒子の割合などに基づいて、流路を自動的に選択する機構を組み合わせることもできる。あるいは、本発明を実施するための装置は、アパーチャーサイズの切り替えによって、自動的に検出感度を調節する機構を備えることができる。検出感度の調節機構として、たとえば、まず大き目のアパーチャーサイズで解析し、凝集粒子の割合が小さいと予測された場合に、より小さいアパーチャーに切り替える機構を示すことができる。レーザー回析散乱法を利用する場合も同様に、解析のための光学セルに反応液を導入して解析すればよい。
本発明において、電場においてパールチェイン化された担体粒子は、必要に応じて再分散させた後に、三次元情報を取得することができる。本発明を実施するための装置には、担体粒子の再分散のための機構を装備することができる。担体粒子は、希釈や超音波処理によって再分散することができる。
本発明を実施するための装置を構成する上記(a)-(c)の要素は、１つの連続する流路内に配置することができる。あるいは、各要素を不連続な空間として構成し、各要素の間を反応液を移動させることによって、本発明の測定方法を実施することもできる。【０１２０】
本発明を実施するための装置には、上記測定方法を実施するための付加的な機構を組み合わせることができる。本発明の装置に組み合わせることができる付加的な機構を、以下に例示する。
試料の分取機構
試料の希釈機構
測定結果の記録機構
測定結果の表示機構
測定結果の印刷機構
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔参考実験〕
（１）全血に含まれる血球成分の体積測定
全血検体を生理食塩水で希釈して、マルチサイザーIII（ベックマン・コールター社製）で測定した。
（２）結果
結果を図１に示した。全血成分は、概ね３２〜８５μm３の体積で、平均粒子径は４〜５．５μmあった。表１に不溶性担体粒子の粒子径とこれが凝集した場合の体積との関係を示す。これらのことから、全血を検体として測定した場合、全血成分の影響を受けにくい粒子の大きさは、３０μm３以下の体積であることがわかる。概ね、粒子径が２．４μm以下の粒子を使用できる。好ましくは、１．０〜２．０μm以下であり、最も好ましくは１．４〜１．８μmである。【０１２２】
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【０１２３】
〔実施例１〕
（１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬の調製
0.15mg/mL抗ＣＲＰ抗体（シバヤギ社製）を含むグリシン緩衝液（50mMグリシン、50mM塩化ナトリウム、0.09％アジ化ナトリウム含有、以下GBSと略す）を抗体溶液としてラテックス試薬の調製に用いた。ラテックス粒子は、1.0μmのラテックス（積水化学社製、固形分１０％懸濁液）0.1mLにGBS0.9mLを加えてラテックス懸濁液とした。
１mLの抗体溶液とラテックス懸濁液を混合し、37℃で2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を0.5％牛血清アルブミンのグリシン緩衝液（0.5%BSA-GBS）2mLに懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬を調製した。【０１２４】
（２）測定装置
図２（A）の装置を使用して、生物学的特異的凝集反応（抗原抗体反応）を測定した。検体と試薬１（緩衝液：2試薬系の場合に適用。1試薬系／ラテックス試薬のみの場合は不要）を分注して混合し、更に試薬2（ラテックス試薬）を分注して混合するための分注・攪拌槽温度コントロール機構１を備え、次に反応槽（パルス印加槽）3に反応液を移動させ、電極4を介してパルス電圧を数秒から数十秒間印加して、パールチェイン化させる。反応液はパールチェイン化された後、希釈（希釈槽5）され、粒度分布計6を用いて担体の凝集状態を測定する（温度コントロール機構1及び2はOFF設定とした）。
図２（B）は、パルス印加槽の断面を示す図であり、電極間の距離は0.8mm、電極の厚さは0.03mm、電極の長さは20mmである。【０１２５】
（３）測定方法
健常者の全血試料を検体として測定した。検体2.0μLとGBS18μLを混和し、この2.0μLと前述した抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬2.0μLをマイクロチューブにとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数400KHzの交流電圧（矩形波）37Vp-p（±18.5V）の電解強度で60秒間印加しパールチェインを形成させた。この60秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈して、マルチサイザーIIIを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集度（AR）を、以下の式により求めた。
ＡＲ＝（２個以上に凝集した粒子数）／（総粒子数）×１００ （％）【０１２６】
（４）結果
結果を図３に示した。【０１２７】
〔比較例１〕
実施例１の検体と抗ＣＲＰ感作ラテックス試薬を使用して、交流電圧（矩形波）の設定を０Ｖとした以外は、実施例１と同様に行った。結果を図４に示した。
図３及び図４から、全血成分の影響をなしにラテックス凝集塊の粒度分布を測定できることがわかる。抗原抗体反応をパールチェイン化により促進させた本発明は、図３に示すように、未凝集、２個および３個に凝集した凝集塊が検出され、凝集度を算出すると、ＡＲ＝１２．６％、ＣＲＰ値＝０．１０ｍｇ／ｄＬであった。パールチェイン化を行わなかった比較例では、ＡＲ＝１．５％、ブランク値との相違がないためＣＲＰは検出できなかった。本発明は従来法に比べ、全血試料においても迅速且つ高感度に測定することができることがわかる。【０１２８】
〔比較例２〕
血球成分の崩壊の影響を比較した。全血試料20μLとGBS180μLをマイクロチューブに採取して、混合した後、６０℃および８０℃で所定時間インキュベートした。直ちに、ポリスチレンラテックスビーズで構成した血球カウンター（マルチサイザーIII、ベックマンコールター社製）を使用して、試料の粒度を解析した。結果を図５および図６に示した。
図に示すように80℃の温度で30秒を超えてインキュベーションした場合は、血球の崩壊が始まった。崩壊によって生じた血球の構成成分のピークは、約３μm３付近に存在した。そのシグナルは、インキュベーション時間を45秒にすると更に増加した。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明の測定方法、あるいは測定装置は、血球成分を含む媒体中の親和性を有するあらゆる物質の測定に有用である。具体的には、たとえば全血試料の解析によって、様々な疾患の診断に有用な情報を得ることができる。より具体的には、ホルモン、腫瘍マーカー、酵素、薬剤、感染性病原体、あるいはそれらに対する抗体は、医療機関において、日常的に測定されている。これらの測定対象成分は、いずれも本発明における親和性物質に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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