(57)【要約】  ＡＭＡＣＲ由来の部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、当該ペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
alpha-methylacyl-CoA racemase（以下、ＡＭＡＣＲ）由来の部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：３〜配列番号：３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号：３〜配列番号：２３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
【請求項５】
配列番号：２４〜配列番号：３３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドを含有するエピトープペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
ＡＭＡＣＲと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ＡＭＡＣＲが配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１３】
ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）請求項８記載の核酸、
（ｃ）ＡＭＡＣＲ、および
（ｄ）ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）請求項８記載の核酸、
（ｃ）ＡＭＡＣＲ、および
（ｄ）ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、ＣＴＬの誘導方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の誘導方法により誘導されるＣＴＬ。
【請求項１９】
請求項１８記載のＣＴＬと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＴＬの誘導剤として使用される、請求項７、９、１０、１１、１２、１３または１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌ワクチンとして使用される、請求項７、９、１０、１１、１２、１３、１６または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
【請求項２４】
請求項２３記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、ＡＭＡＣＲ由来の腫瘍抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、alpha-methylacyl-CoA racemase（以下、AMACR）および当該AMACR由来ペプチドの、癌免疫分野における利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療法は、大きく「局所療法」と「全身療法」に分けることができる。局所療法には「手術療法」と「放射線療法」がある。また全身療法は抗癌剤、ホルモン剤などの薬剤を、内服や静脈内注射などで投与する薬物療法が主体になる。現状では、局所療法による治療で患者の40％前後が治癒し、７〜10％が何らかの形で抗癌剤の寄与により治癒している。すなわち、これら約50％の患者は手術療法、放射線療法あるいは化学療法により治癒されるが、残りの50％程度の患者は治らないというのが現状であり、今後これらの癌患者の治療を目的として、大きく2種の対策が必要であると考えられている。【０００３】
一つは早期発見により局所治療で治療できる割合を増加させることであり、もう一方は、新しい治療法を開発し、全身療法で治療できる割合を増加させることである。【０００４】
新しい治療法としては、従来の抗癌剤で認められた骨髄抑制に代表される重篤な副作用を持たない治療薬として、新しいコンセプトを有した分子標的治療薬が、近年多く開発、上市されている。例えば乳癌で高発現するHer2分子に対する抗体薬であるハーセプチン、また肺癌で高発現する上皮成長因子受容体(EGF-R)のチロシンキナーゼ阻害剤であるイレッサ等がある。その効果は顕著であり、強い抗腫瘍効果が報告されている。【０００５】
しかしながら、従来の抗癌剤で報告されていた骨髄抑制等の副作用は認められないものの、間質性肺炎など重篤な副作用が報告されていることから、分子標的治療薬とはいえ、未だ満足できる薬剤が無いのが現状であり、新たな癌特異的な分子を標的とした薬剤、あるいは新たな治療法の研究開発が望まれている。【０００６】
他方、新たな治療法として、近年生体の免疫力を利用した癌免疫療法の研究・開発が活発に進められている。生体による腫瘍の排除には、免疫系、特に自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が重要な役割を果たしている。ＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ヒトの場合はＨＬＡ抗原と呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが知られている。
この腫瘍抗原ペプチドあるいは当該ペプチドの由来である腫瘍抗原タンパク質、若しくはこれらをコードする核酸を、いわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的ＣＴＬを誘導・増強させる治療法が可能となった。【０００７】
腫瘍抗原タンパク質としては、1991年にT.Boonらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（非特許文献１を参照）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。【０００８】
腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の治療や診断に応用するために、メラノーマに比べて発生頻度が圧倒的に高い腺癌などに幅広く適応可能な、新たな腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの同定が望まれている。【０００９】
AMACR(alpha-methylacyl-CoA racemase)は、分岐鎖脂肪酸、胆汁酸中間体のβ酸化に寄与する酵素であり、前立腺癌の上皮組織で特異的に発現上昇する分子として知られている。
前立腺癌患者の血中でのAMACR特異的抗体価の上昇が観察されている（非特許文献２を参照）。また、AMACRを高発現する前立腺癌細胞株においてAMACR特異的siRNAを用いて遺伝子発現を減弱させた結果、細胞増殖能の低下が観察されたことから、AMACRが前立腺癌細胞株の増殖制御にも重要な働きをしていることが示されている（非特許文献３を参照）。さらにAMACR遺伝子の変異がadult-onset sensory motor neuropathyの原因であることが報告されている（非特許文献４を参照）。しかしながら、AMACRが癌ワクチンとして有用な腫瘍抗原タンパク質であることは知られていない。【００１０】
【非特許文献１】Science, 254, 1643-1647(1991)
【非特許文献２】J. Natl. Cancer Inst., 96(11), 834-843(2004)
【非特許文献３】Cancer Res., 63(21), 7365-7376(2003)
【非特許文献４】Nat. Genet., 24(2), 188-191(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、AMACRおよび当該AMACR由来ペプチドの、癌免疫分野における用途などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヒトAMACRのアミノ酸配列よりHLA-A24に結合する可能性を有するペプチドを合成し、結合親和性の高いペプチドを同定した。このAMACRペプチドを用いてHLA-A24陽性前立腺患者の末梢血リンパ球を刺激し、CTLの誘導を試みた結果、ペプチド特異的CTLを誘導することができた。以上の結果より、AMACRは前立腺癌において癌免疫療法の標的抗原（腫瘍抗原タンパク質）となることが示され、そのペプチドは前立腺癌患者のワクチン療法に有用な腫瘍抗原ペプチドとなることが明らかとなった。【００１３】
AMACRは前立腺癌のみならず、種々の癌組織で発現上昇していることが知られている（Am J Surg Pathol.,26,926-931(2002), Hum Pathol.,34,792-796(2003), Am J Surg Pathol.,29(3),381-389(2005), Appl Immunohistochem Mol Morphol 13,252-255(2005)）。前述のように本発明によりAMACRが腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなったため、前立腺癌と同様に発現上昇の認められる種々の癌（大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌）においても、本発明の腫瘍抗原タンパク質AMACRおよびその腫瘍抗原ペプチドは有用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。【００１４】
すなわち本発明は、
(1)  ＡＭＡＣＲ由来の部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(2)  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原である、前記(1)記載のペプチド、
(3)  配列番号：３〜配列番号：３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記(2)記載のペプチド、
(4)  配列番号：３〜配列番号：５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記(3)記載のペプチド、
(5)  配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる、前記(4)記載のペプチド、
(6)  配列番号：３〜配列番号：２３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(7)  配列番号：３〜配列番号：５のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(8)  配列番号：５に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(9)  配列番号：２４〜配列番号：３３のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(10)  前記(1)〜(9)のいずれかに記載のペプチドを含有するエピトープペプチド、
(11)  前記(1)〜(10)のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、【００１５】
(12)  前記(1)〜(10)のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
(13)  前記(12)記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(14)  ＡＭＡＣＲと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(15)  ＡＭＡＣＲが配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(14)記載の医薬組成物、
(16)  ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(17)  ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(16)記載の医薬組成物、【００１６】
(18)  以下の(a)〜(d)：
(a)前記(1)〜(10)のいずれかに記載のペプチド、
(b)前記(12)記載の核酸、
(c)ＡＭＡＣＲ、および
(d)ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法、
(19)  前記(18)記載の製造方法により製造される抗原提示細胞、
(20)  前記(19)記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(21)  以下の(a)〜(d)：
(a)前記(1)〜(10)のいずれかに記載のペプチド、
(b)前記(12)記載の核酸、
(c)ＡＭＡＣＲ、および
(d)ＡＭＡＣＲをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、ＣＴＬの誘導方法、
(22)  前記(21)記載の誘導方法により誘導されるＣＴＬ、
(23)  前記(22)記載のＣＴＬと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、【００１７】
(24)  ＣＴＬの誘導剤として使用される、前記(11)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)または(20)に記載の医薬組成物、
(25)  癌ワクチンとして使用される、前記(11)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(20)または(23)に記載の医薬組成物、
(26）  前記(1)〜(9)のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(27)  前記(1)〜(9)のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、ならびに
(28)  前記(27)記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、ＡＭＡＣＲ由来の腫瘍抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬、に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のAMACRおよびAMACR由来の腫瘍抗原ペプチド、またはこれらをコードする核酸等は、癌ワクチンとして有効に用いることができる。また前記AMACR由来の腫瘍抗原ペプチドは、CTLを検出するためのHLAテトラマー等の成分としても有効に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。【００２０】
1)本発明のタンパク質AMACR
本発明の腫瘍抗原タンパク質AMACRは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のAMACRは、天然物（例えば前立腺癌細胞株）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。
ここで配列番号：２に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_014324、Accession No. NP_055139として登録されたヒトAMACR(alpha-methylacyl-CoA racemase)のアミノ酸配列である。
前記において「配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有し、そのＮ末端側及び/又はＣ末端側に他のアミノ酸配列の付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「他のアミノ酸配列」とはAMACR以外の構造遺伝子のアミノ酸配列であっても良い。【００２１】
また前記において「配列番号：２に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具体的には以下の(a)〜(c)に挙げるタンパク質が挙げられる：
(a) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質。【００２２】
好ましくは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質としては、以下の(a')〜(c')に挙げるタンパク質が挙げられる：
(a') 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b') 配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c') 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質。【００２３】
前記(a)における「配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異体等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。【００２４】
前記(b)における「配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列と約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質などが挙げられる。
ここで「配列同一性」とは、２つのタンパク質間の、配列の同一性及び相同性をいう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。【００２５】
前記(c)における「配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号：1に記載の塩基配列と、約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、配列番号：1に記載の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。【００２６】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)や前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。【００２７】
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC(20×SSCは、333mM Sodium citrate、333mM NaClを示す)、0.5%SDSおよび50% ホルムアミドを含む溶液中で42℃にてハイブリダイズさせる条件、または6×SSCを含む(50%ホルムアミドは含まない)溶液中で65℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。【００２８】
以上に示したような配列番号：２に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質の具体例としては、例えばGenBank Accession No.NM203382, Accession No. NP976316 に記載の、ヒトAMACRのスプライシングバリアントが例示される。【００２９】
前記のように本発明のタンパク質AMACRは、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、AMACRを発現させた細胞がCTLにより認識される、すなわち当該細胞がCTLに反応性を示す、換言すれば本発明のタンパク質若しくは該タンパク質に由来する抗原ペプチドがCTLを活性化する若しくはCTLを誘導するという性質を示す。【００３０】
前記において細胞とは、HLA抗原を発現する細胞であることが好ましい。従って前記腫瘍抗原タンパク質としての活性とは、より具体的には、例えばHLA-A24やHLA-A2等のHLA抗原を発現する細胞において本発明のタンパク質を発現させることにより、本発明タンパク質由来の抗原ペプチドとHLA抗原との複合体が細胞表面に提示され、その結果、当該細胞がCTLに認識される、すなわちCTLが活性化される（CTLが誘導される）という性質を指す。【００３１】
このような本発明タンパク質の性質は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法（例えば51Crリリースアッセイ（J.Immunol.,159:4753,1997）、LDHリリースアッセイ（LDH Cytotoxicity Detection Kit（タカラバイオ）、サイトカイン量の測定等）により容易に測定することができる。以下に具体的なアッセイ法を例示する。【００３２】
まず、293-EBNA細胞（Invitrogen社）等の宿主細胞に対し、本発明タンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターと、HLA抗原をコードするDNAを含有する発現ベクターとをトランスフェクトする。ここで用いるHLA抗原をコードするDNAとしては、例えばHLA-A24抗原をコードするDNA若しくはHLA-A2抗原をコードするDNAが挙げられる。HLA-A24抗原をコードするDNAとしてはHLA-A2402のcDNA（Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）が挙げられる。またHLA-A2抗原をコードするDNAとしてはHLA-A0201のcDNA（GenBank Acc.No.M84379）が挙げられる。【００３３】
前記トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、用いたHLA抗原に拘束性のCTLを加えて作用させ、該CTLが反応（活性化）して産生する種々のサイトカイン、例えばIFN-γの量を、例えばＥＬＩＳＡ法などで測定することにより調べることができる。ここでCTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球を本発明のタンパク質AMACRで刺激することにより調製されたCTLや、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。【００３４】
また本発明のタンパク質は、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）に供することにより、in vivoでのCTL誘導活性を調べることができる。
本発明のタンパク質は、天然物（例えば前立腺癌細胞株など）から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また後述する本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。【００３５】
2)本発明のAMACR由来のペプチド
本発明のAMACR由来のペプチド（以下、本発明のペプチドと称する場合がある）とは、前記本発明のタンパク質AMACR由来の部分ペプチドを含有し、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識される腫瘍抗原ペプチドである。すなわち、前記した本発明のタンパク質AMACRのアミノ酸配列の一部を含有するペプチドであって、かつ、該ペプチドとＨＬＡ抗原との結合複合体がCTLにより認識されるようなペプチドであれば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の如何なる位置に存する如何なる長さのペプチドを含有するものであっても良い。【００３６】
このような本発明のペプチドは、例えば、AMACRの一部よりなる候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体がCTLにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。【００３７】
次に、本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき、以下に記述する。
HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している（例えばImmunogenetics,41:p178,1995などを参照のこと）。例えばHLA-A24のモチーフとしては、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンとなることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994、Immunogenetics,41:p178,1995、J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2のモチーフについては、以下の表１に示したモチーフが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995）。【００３８】
【表１】
2007066423.tif 000002
【００３９】
さらに近年、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、NIHのBIMASのソフトを使用することにより検索することができる（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ）。
ペプチドの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、通常8から1４アミノ酸程度であることが明らかにされている（ただしHLA‐DR、‐DP、‐DQについては、14アミノ酸以上の長さの抗原ペプチドも認められる）。【００４０】
これらのモチーフに関わるペプチド部分を本発明のAMACRのアミノ酸配列中から選び出すのは容易である。例えば、前記BIMASソフトでの検索により、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想される配列を容易に選び出すことができる。選び出された候補ペプチドを前述の方法にて合成し、該候補ペプチドがＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かを測定することにより、本発明のペプチドを同定することができる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドの具体的な同定法としては、例えば J.Immunol.,154,p2257,1995に記載の方法が挙げられる。すなわち、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで該候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたHLA抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLが誘導された場合は、該候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドに成り得ることが示される。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても調べることができる。【００４１】
さらに、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原をコードするｃＤＮＡを発現する発現プラスミドを、例えば 293-EBNA細胞（Invitrogen社）に導入した細胞に対して候補ペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原に拘束性のCTLを反応させ、該CTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を測定することによっても、調べることができる（J.Exp.Med.,187: 277,1998）。
ここでHLA抗原としては、HLA-A24抗原若しくはHLA-A2抗原が挙げられる。HLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、前記HLA抗原をコードするcDNAとしてはHLA-A2402のcDNA（Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）を用いることができる。またHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合は、前記HLA抗原をコードするcDNAとしてはHLA-A0201のcDNA（GenBank Acc.No.M84379）を用いることができる。【００４２】
また前記CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される場合の他、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）に供することにより、in vivoでの活性を調べることができる。【００４３】
前記のように腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している場合と異なり、例えばHLA-B55やHLA-A26のようにそのペプチドのモチーフが明らかでない場合は、これらのHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するCTL株が存在する場合には、例えばWO97/46676等に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原ペプチドを同定することができる。【００４４】
以上のような本発明のペプチドの具体例としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるAMACRの部分ペプチドであって、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドが結合するHLA抗原の観点からは、HLA-A24抗原またはHLA-A2抗原に結合する本発明のペプチドを挙げることができる。ペプチドの長さとして、好ましくは8〜14アミノ酸が、より好ましくは8〜11アミノ酸が挙げられる。
具体的には、配列番号：3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。ペプチドの長さとして、好ましくは9〜14アミノ酸が、より好ましくは9〜11アミノ酸が挙げられる。より具体的には、例えばHLA-A24結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号：3〜配列番号：23のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、HLA-A24抗原に結合してCTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表２）。好ましくは、配列番号：3、配列番号：4または配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
また、HLA-A2結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号：24〜配列番号：33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、HLA-A2抗原に結合してCTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表３）。【００４５】
本発明においては、前記の如き配列番号：２に記載のアミノ酸配列の一部を含有するペプチドのみならず、当該ペプチドの一部を改変した改変ペプチドであっても、HLA抗原と結合してCTLにより認識されるという性質を有する限り、本発明のペプチドの範疇に含まれる。具体的には、本発明のAMACRのアミノ酸配列、より具体的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列の一部からなる本発明のペプチドのアミノ酸配列に対して、１又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施したアミノ酸配列を含有する改変ペプチドであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものは、本発明のペプチドの範疇に含まれる。【００４６】
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り、任意であるが、前記したように通常、腫瘍抗原ペプチドの長さが８〜１４アミノ酸程度であることから、１個から数個の範囲が好ましい。【００４７】
本発明の改変ペプチドの長さとしては、８〜１４アミノ酸程度が好ましい（ただしHLA-DR、-DP、-DQについては、14アミノ酸以上の長さの場合もある。）
先に記載したように、HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している。また前記したように、HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列をインターネット上検索することができる（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ）。従って、該モチーフ等に基づき、前記改変ペプチドを作製することが可能である。【００４８】
例えばHLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、前記したように、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（J.Immunol., 152:p3913,1994、Immunogenetics,41:p178,1995、J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2の場合は、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンであり、Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンであることが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995）。またインターネット上でHLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列が示されており（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/）、例えば前記モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸が許容される。従って、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置（HLA-A24、HLA-A2においてはペプチドの第2位とＣ末端）にあるアミノ酸を他のアミノ酸（好ましくは前記インターネット等で結合可能と予想されているアミノ酸）に置換したアミノ酸配列を含むものであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという活性を持つ改変ペプチドを挙げることができる。【００４９】
より好ましくは、該位置において、前記モチーフ上知られたアミノ酸残基のいずれかに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつ前記活性を有する改変ペプチドが挙げられる。すなわち配列番号：3〜23に示されるようなHLA-A24結合性のペプチドの場合、その第2位のアミノ酸をチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつHLA-A24抗原と結合してＣＴＬにより認識される改変ペプチドが挙げられる。このうち第2位のアミノ酸をチロシンに置換したペプチドがより好ましい。【００５０】
さらに好ましくは、配列番号：3〜配列番号：5のいずれかに記載のアミノ酸配列の第2位のアミノ酸をチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したアミノ酸配列からなり、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。【００５１】
また配列番号：24〜33に示されるようなHLA-A2結合性のペプチドの場合、そのアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換したアミノ酸配列を含有し、かつHLA-A2抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが好ましい。【００５２】
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含有するエピトープペプチドも含まれる。
近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープを連結した約30merのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。【００５３】
またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にCTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Immunity., 1:751, 1994）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとCTLエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、CTLエピトープ（メラノーマ抗原gp100の第280位〜288位からなる腫瘍抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Tヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024）。
従って、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であって、CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。【００５４】
ここに、エピトープペプチドとは、(1)複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したペプチド、若しくは(2)CTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結したペプチドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。【００５５】
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープがCTLエピトープの場合、用いるCTLエピトープとしては、配列番号：2に代表されるAMACRのアミノ酸配列由来のHLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37,-B55, -Cw0401, -Cw0602などに拘束性のCTLエピトープが挙げられる。また、他の腫瘍抗原タンパク質由来のCTLエピトープも挙げられる。これらCTLエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのCTLエピトープの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明のペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。【００５６】
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、WO 02/47474 号公報および Int J. Cancer:100,565-570 (2002)に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりCTL誘導活性を測定することができる。【００５７】
さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能であり、このような修飾に係るペプチドも本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。【００５８】
3)本発明の核酸
本発明の核酸とは、具体的には、
(1)AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
を指す。【００５９】
(1)AMACRをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
AMACRをコードするポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えば前立腺癌等に由来する細胞や組織の cDNAやmRNA、cRNA、ゲノムDNA、または合成DNAのいずれであっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a) 配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
また前記（a）または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、が例示される。【００６０】
ここで配列番号：１に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_014324として登録されているヒトAMACR遺伝子のオープンリーディングフレームに該当する。また配列番号：２に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_014324、Accession No. NP_055139として登録されたヒトAMACRのアミノ酸配列である。【００６１】
前記において (a)配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、(b) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとは、より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。さらに、当該配列番号：１に記載の塩基配列、または配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'末端側及び/又は3'末端側に他の塩基配列の付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。ここで「他の塩基配列」とは、例えばAMACR以外の構造遺伝子をコードする塩基配列であっても良い。
これらAMACRをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有すものであれば良い。当該活性およびその測定法については、前記 「1)本発明のタンパク質」において記載したとおりである。【００６２】
配列番号：1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_014324において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：1に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば前立腺癌細胞株（例えば DU 145 (ATCC Number: HTB-81))由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。【００６３】
また、前記（a）または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチドとは、具体的には、
(c) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
が挙げられる。【００６４】
好ましくは、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。前記(a)または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列からなるポリヌクレオチドとしては、以下の(c')〜(e')に挙げるポリヌクレオチドが挙げられる：
(c') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド。【００６５】
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの塩基配列と約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。【００６６】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)や前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。【００６７】
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC(20×SSCは、333mM Sodium citrate、333mM NaClを示す)、0.5%SDSおよび50% ホルムアミドを含む溶液中で42℃にてハイブリダイズさせる条件、または6×SSCを含む(50%ホルムアミドは含まない)溶液中で65℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。【００６８】
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド」とは、例えば前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの塩基配列と約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。【００６９】
ここで「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド間の、配列の同一性及び相同性をいう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリヌクレオチドは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。【００７０】
このような配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述のハイブリダイゼーション反応や通常のＰＣＲ反応により、または後述するポリヌクレオチドの改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。【００７１】
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異体等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。【００７２】
この改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やPCR法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの公知の方法に従って製造することもできる。【００７３】
以上のような本発明のAMACRをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、AMACRをコードするポリヌクレオチドを発現させた細胞がCTLにより認識される、すなわち当該細胞がCTLに反応性を示す、換言すれば本発明のタンパク質AMACR若しくはそれに由来する抗原ペプチドがCTLを活性化する若しくはCTLを誘導するという性質を示す。当該活性およびその測定法については、前記 「1)本発明のタンパク質AMACR」において記載したとおりである。【００７４】
前記本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。またDNA、RNAのいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。【００７５】
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。【００７６】
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパクベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。【００７７】
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。【００７８】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質(AMACR)を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。【００７９】
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
前述のように本発明の核酸の範疇には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸も含まれる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。これら本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。【００８０】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。またDNA、RNAのいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチド（エピトープペプチド）を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、前述の(1)と同様である。【００８１】
4)本発明の抗原提示細胞
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりCTLの誘導が認められたが、これは、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞（樹状細胞）を用いることで、この抗原提示細胞を特異的に認識するCTLが誘導されたことを示すものである。従って、前記した本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることを特徴とする抗原提示細胞の製造方法、および当該製造方法により製造される抗原提示細胞を提供するものである。【００８２】
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＨＬＡ抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれであっても良い。【００８３】
本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のタンパク質またはペプチドをイン・ビトロでパルスして、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、Ｊ.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のタンパク質またはペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、DNAの形態であっても、RNAの形態であっても良い。具体的には、DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998などを参考にして行うことができ、またRNAの場合は J.Exp.Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。【００８４】
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良く、具体的には、例えば配列番号:3、配列番号：4または配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。当該抗原提示細胞は、例えばHLAの型がHLA-A24である前立腺癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に、配列番号：3、配列番号：4または配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをイン・ビトロでパルスし、HLA-A24抗原と前記ペプチドとの複合体を提示させることにより得られる。【００８５】
5)本発明のCTL
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激によりCTL誘導活性が認められた。これは、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞（樹状細胞）を用いることで、この抗原提示細胞を特異的に認識するCTLが誘導されたことを示すものである。従って、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることを特徴とするCTLの誘導方法、および当該方法により誘導されるCTLを提供するものである。【００８６】
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドTRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞上のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLを、イン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸を用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。【００８７】
養子免疫療法において用いられるCTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のタンパク質、ペプチド、あるいは核酸でイン・ビトロで刺激することにより作製される(Journal of Experimental Medicine 1999, 190:1669)。【００８８】
本発明のCTLは、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより誘導されたものであれば良く、単一のCTLクローンであっても、様々な種類のクローンからなるCTL混合物(集団)であっても良い。具体的には、例えば配列番号：3、4または5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するCTLを挙げることができる。【００８９】
6)本発明の医薬組成物
以上に記載した本発明のタンパク質、ペプチド、核酸、抗原提示細胞およびCTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明の医薬組成物は、CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分として使用することができる。以下具体的に説明する。【００９０】
(1)本発明のタンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明のタンパク質AMACRはCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬（癌ワクチン）の有効成分とすることができる。すなわち本発明のタンパク質を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、腫瘍を治療または予防し得るものである。当該タンパク質を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。【００９１】
本発明のタンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤は、AMACR陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
本発明のタンパク質を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。【００９２】
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。【００９３】
前記において菌体由来成分又はその誘導体とは、具体的には、例えば(1)細菌の死菌、(2)細菌由来の細胞壁骨格（Cell Wall Skeleton, CWSと略する）、(3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体等に分類される。ここで(1)細菌の死菌としては、例えば溶連菌粉末（例えばピシバニール；中外製薬株式会社）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げられる。
(2)細菌由来のCWSとしては、マイクバクテリア属由来のCWS（例えばマイコバクテリア属ウシ型結核菌であるBCG株のCWS）、ノカルディア属由来のCWS（例えばノカルディア・ノブラのCWS）、あるいはコリネバクテリア属由来のCWS等が挙げられる。【００９４】
(3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であるヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社）や担子菌由来多糖類（例えばレンチナン；味の素、クレスチン；三共株式会社、担子菌カワラタケ）、またムラミルジペプチド（MDP）関連化合物、リポ多糖（LPS）、リピドＡ関連化合物（MPL）、糖脂質トレハロースジマイコレート（TDM）、細菌由来のDNA（例えばCpGオリゴヌクレオチド）、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。
これら菌体由来成分及びその誘導体は、既に市販されているものであればそれを入手するか、又は公知文献（例えばCancer Res.,33,2187-2195(1973)、J.Natl.Cancer Inst.,48,831-835(1972)、J.Bacteriol.,94,1736-1745(1967)、Gann,69,619-626(1978)、J.Bacteriol.,92,869-879(1966)、J.Natl.Cancer Inst.,52,95-101(1974)）等に基き単離又は製造することが可能である。【００９５】
前記において「サイトカイン」とは、例えばIFN-α、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-γ、IL-18、あるいはIL-15などが挙げられる。これらのサイトカインは、天然品であっても遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイトカインは、既に市販されていればそれを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えばGenBank、EMBL、あるいはDDBJ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現・生産することができる。【００９６】
前記において「植物由来成分又はその誘導体」とは、例えばサポニン由来成分であるQuil A（Accurate Chemical&Scientific Corp）、 QS-21（Aquila Biopharmaceuticals inc.）、あるいはグリチルリチン（SIGMA-ALDRICHなど）などが挙げられる。
前記において「海洋生物由来成分又はその誘導体」とは、例えば海綿由来の糖脂質であるα-ガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
前記において油乳濁液（エマルション製剤）とは、例えば油中水型（w/o）エマルション製剤、水中油型（o/w）エマルション製剤、水中油中水型（w/o/w）エマルション製剤などが挙げられる。【００９７】
ここで油中水型（w/o）エマルション製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた形態をとる。水中油型（o/w）エマルション製剤は、有効成分を水の分散媒に分散させた形態をとる。また水中油中水型（w/o/w）エマルション製剤は、有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルション製剤の調製は、例えば、特開平８−９８５号公報、特開平９−１２２４７６号公報等を参考にして行うことができる。【００９８】
前記においてリポソーム製剤とは、有効成分を脂質二重膜構造のリポソームで水相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リポソームを作るための主要な脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等を加えてリポソームに荷電を与えて安定化させる。リポソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスエクストラクション法等が挙げられる。【００９９】
前記においてマイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックスから構成され、該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料としては、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法としては公知の方法（Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:129-146, 2000、Dev. Biol. Stand. 92:63-78, 1998、Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997）等に従えばよく特に限定されない。【０１００】
前記においてマイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆った形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コアセルベーション法、界面重合法等が挙げられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のタンパク質の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜100mg、より好ましくは0.01mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。【０１０１】
(2)本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤
本発明のペプチドはCTL誘導活性を有する。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明のペプチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA抗原に本発明のペプチドが提示され、提示されたHLA抗原とペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、AMACR陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。【０１０２】
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、単一のCTLエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約30merのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または予防が達成される。【０１０３】
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤として、より具体的には、例えば配列番号：3〜配列番号：33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤が挙げられる。好ましくは配列番号：3、配列番号：4または配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤が挙げられる。【０１０４】
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。これらアジュバントの具体例については、前記「6)-(1)本発明のタンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤」の項を参照されたい。【０１０５】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。【０１０６】
(3)本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明の核酸はCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させることで、腫瘍を治療または予防し得るものである。【０１０７】
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予防が達成される。
本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤は、AMACR陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。【０１０８】
本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。【０１０９】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。【０１１０】
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HJV)-リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。【０１１１】
また近年、複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。【０１１２】
(4)本発明の抗原提示細胞を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明の抗原提示細胞はCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、本発明の抗原提示細胞を腫瘍患者に投与することで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とするCTLの誘導剤は、AMACR陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。【０１１３】
抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、AMACR陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。【０１１４】
(5)本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明のCTLは腫瘍細胞傷害作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。
本発明のCTLを有効成分とする腫瘍の治療または予防薬は、AMACR陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、子宮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
CTLを有効成分として含有する腫瘍の治療または予防薬は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このようなCTLを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、AMACR陽性の患者の体内でCTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。【０１１５】
7)本発明のペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。好ましくは、配列番号：3、4または5に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。【０１１６】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。【０１１７】
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。【０１１８】
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（ELISA）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、本発明のAMACR遺伝子が発現している癌、例えば前立腺癌等の診断において有効である。【０１１９】
8)本発明のHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマー
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原とを含有するHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーまたはHLAペンタマーを提供する。
癌免疫療法において、治療前に腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）に対するCTL前駆細胞の頻度や量を予め調べることや、腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）による治療実施中の患者におけるCTLの頻度や量を調べることは、当該腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにおいて重要な指標となる。腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原とを含有するHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーは、抗原（抗原ペプチド）特異的CTLの検出、すなわち当該CTLの頻度や量を測定するための試薬として有用である。【０１２０】
ここでHLAテトラマーとは、HLA抗原のα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（HLAモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。
HLAモノマーとは前記HLAテトラマーの製造において用いられる、HLA抗原α鎖、β2ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をビオチン化したもの（単量体)を指す。【０１２１】
HLAダイマーとはHLA抗原α鎖とIg（イムノグロブリン、例えばIgG1)とを融合させ、これにβ2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6671-6675(1993))。HLAダイマーに結合した抗原ペプチド特異的CTLは、例えば標識抗IgG1抗体をIgG1に結合させることなどにより、検出することができる。
HLAペンタマーとは近年開発された技術であり、HLA抗原と抗原ペプチドとの複合体5分子がCoiled-Coilドメインを介して重合した５量体を指す。HLA抗原−抗原ペプチドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、HLAテトラマー法と同様にフローサイトメーター等で解析することができる（http://www.proimmune.co.uk/参照）。【０１２２】
以上に述べたHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーはいずれも受託合成可能であり、例えばProImmune社やBD Biosciences社などに委託することにより合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーなども市販されている（(株)医学生物学研究所等）。【０１２３】
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーとして具体的には、例えば配列番号：3、配列番号：4または配列番号：5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原とを含有するHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーが挙げられる。このうちCTLの検出においてはHLAテトラマーまたはHLAペンタマーを用いることが好ましい。【０１２４】
HLAモノマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP）、アロフィコシアニン(APC)などにより標識されたHLAモノマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーが挙げられる。【０１２５】
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるHLA抗原のうち、HLA-A24抗原（HLA-A24抗原のα鎖）は、Genbank Accession No.M64740 に開示されているHLA-A2402の公知の塩基配列の情報等に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。またHLA-A2抗原（HLA-A2抗原のα鎖）は、GenBank Acc.No.M84379に開示されているHLA-A0201遺伝子の公知の塩基配列の情報等に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。【０１２６】
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるβ2ミクログロブリンは、ヒト由来のβ2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒトβ２ミクログロブリンは GenBank Acc.No.AB021288 に開示されているヒトβ2ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。【０１２７】
HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマー作製法については、前記各文献により周知であるが、具体的にHLA-A24を用いたHLAテトラマーの作製法につき簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA-A24α鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばBL21）を用いることが好ましい。得られた単量体HLA-A24複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のHLA-ペプチド複合体を形成させる。次にHLA-ペプチド複合体におけるHLA-A24α鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4：1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。【０１２８】
前記で本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーは、AMACR由来の腫瘍抗原ペプチド特異的なCTLの検出用試薬として有効に用いられる。
本発明のCTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
1)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療開始前に、本発明の腫瘍抗原ペプチドに対するCTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該腫瘍抗原ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
2) 本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療実施中の患者におけるCTLの頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。【０１２９】
CTLの検出法としては、具体的には、被験患者よりCTLを含む生体試料（例えばPBMC)を単離し、本発明のHLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、HLAテトラマー等に結合した本発明ペプチド特異的なCTLの存在頻度または量を、フローサイトメーター等で測定する。【０１３０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１３１】
候補ペプチドの選択および合成
(1)候補ペプチドの選択
ヒトAMACRのアミノ酸配列(配列番号：2)中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：3〜23に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを選択した。また、HLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：24〜33に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。各ペプチドの配列とAMACR上の位置を以下の表に示す。【０１３２】
【表２】
2007066423.tif 000003
【０１３３】
【表３】
2007066423.tif 000004
【０１３４】
(2)ペプチド合成
前記のペプチドのうち、AMACR 125-133（配列番号：3）、AMACR 183-191（配列番号：4）、AMACR 240-248（配列番号：5）およびAMACR 364-373 (配列番号：6)のペプチドをFmoc法にて合成し、以下の実験に用いた。
【実施例２】
【０１３５】
AMACR抗原由来ペプチドのHLA-A*2402への結合親和性の検討
実施例１で合成したペプチドのHLA-*A2402への結合親和性の測定は、文献（J. Immunol. 164:2565, 2000）に記載の方法と同様に実施した。MHCクラスI分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株RMA-SにHLA-*A2402とH-2KbのキメラMHCの遺伝子を安定的に導入した細胞株RMA-S-A*2402細胞を、26℃で18時間培養した。RMA-S-A*2402細胞をPBS溶液で洗浄後、3μL/mLのヒトβ2-ミクログロブリンと100μL/ｍLの各種ペプチドを含有する培養液OPTI-MEM(Invitrogen社)に懸濁して26℃で3時間、37℃で3時間培養した。この細胞をPBS溶液で洗浄後、抗HLA-A24抗体、抗HLA-A2抗体により4℃で30分間処理した。さらに細胞をPBS溶液で洗浄後、PE標識した抗マウスIｇG抗体により4℃で30分間処理した。細胞を洗浄後、1％ホルマリンを含むPBS溶液1mLに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置FACScan（BDバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。検討した4種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図１に示した。【０１３６】
陽性対照として用いた、文献(J. Immunol. 158:3325, 1997)でHLA-A*2402に結合することが報告されているEBウイルス由来のペプチド(EBV)、及び文献(J. Immunol. 164:2565, 2000)で報告されているHIVウイルス由来のペプチド(HIV)は、強い結合能を示した。陰性対照として用いた文献(Eur J Immunol. 21:2891, 1991)でH2-Kbに結合することが報告されているOvalbumin由来のペプチド(SL8)は、低い活性を示した。検討に用いたぺプチドのうちAMACR抗原由来の3種類のペプチドAMACR 125-133（配列番号：3）、AMACR 183-191（配列番号：4）およびAMACR 240-248（配列番号：5）は、HLA-A*2402に非常に良好に結合することが示された。
【実施例３】
【０１３７】
AMACR抗原由来ペプチドによるヒト末梢血単核球からのCTL誘導(1)
実施例２でHLA-A*2402への強い結合能が認められたペプチドAMACR 240-248(配列番号：5）について、文献(J. Immunol. 169:1611, 2002)と同様の方法により、末梢血単核球からのCTL誘導を行った。HLA-A*2402陽性の前立腺癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、AIM-V培養液(Invitrogen社)を用いて培養した。24時間後、非接着性の細胞を回収して、100U/ｍLのIL-2を含んだAIM-Vを用いて培養した。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、1000U/mLのIL-4と1000U/mLのGM-CSFを含むAIM-V培養液で５日間培養した後、10μMの各種ペプチドを添加して１日間培養し、さらに10ng/ｍLのTNFと1000U/ｍLのIFN-αを加えて培養した。非接着性の細胞からCD8陽性Ｔ細胞を抗CD８抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のペプチドをパルスした抗原提示用細胞ととも培養した。CD8陽性Ｔ細胞を分離した残りの非接着性細胞は、１μｇ/ｍＬのPHAと100U/ｍLのIL-2を含むAIM-V培地で３日間培養した後、PHAを除いた培地で４日間培養し、２回目、３回目のペプチド刺激用の抗原提示細胞としてストックした。ペプチド刺激をしたCD8陽性Ｔ細胞に対しては、１回目のペプチド刺激から７日後と14日後に、ストックの抗原提示細胞に上記のペプチドを２時間パルスし、5000radでX線照射した細胞を添加して２回目、３回目のペプチド刺激を行った。３回目の刺激から１週間後のＴ細胞の細胞傷害活性を51Crリリースアッセイにより測定した。【０１３８】
標的細胞として、TAP分子を欠失したT2細胞にHLA-A*2402遺伝子を安定的に導入したT2A24細胞に対し、ペプチドAMACR 240-248(配列番号：5）を添加あるいは非添加の細胞、HLA-A24に結合するHIV由来ペプチドを添加した細胞、またNK細胞に対して感受性を示すHLA-A*2402陰性の慢性骨髄性白血病由来細胞株K562（ATCC株番号CCL-243）を用いた。標的細胞は、100μCiの51Crで1時間ラベルした。5×103個の標的細胞に対して、30倍のエフェクター細胞（ペプチド刺激したT細胞）を添加し、4時間培養して細胞傷害活性を測定した。前立腺癌患者検体7例の結果を図２に示す。検体1(Case 1)において、AMACR 240-248(配列番号：5）で刺激したT細胞は、ペプチドパルスしたHLA-A*2402陽性のT2A24細胞を傷害したが、ペプチド非添加、HIV由来ペプチドを添加した細胞およびHLA-A*2402陰性のK562は傷害しなかった。このようにAMACR由来のペプチドAMACR 240-248により誘導されたCTLは、HLA-A*2402拘束性にAMACR由来のペプチド提示細胞を特異的に傷害したことから、AMACR 240-248は腫瘍抗原ペプチドであることが示された。また、当該腫瘍抗原ペプチドの由来であるAMACRタンパクは腫瘍抗原タンパクであることが明らかとなった。
【実施例４】
【０１３９】
AMACR抗原由来ペプチドによるヒト末梢血単核球からのCTL誘導(2)
実施例２でHLA-A*2402への強い結合能が認められたペプチドAMACR 125-133(配列番号：3）および AMACR 183-191(配列番号：4）について、実施例３と同様の方法により、HLA-A*2402陽性の前立腺癌患者由来末梢血単核球からのCTL誘導を行った。前立腺癌患者検体7例の結果を図３に示す。２検体(Case8,Case9)において、AMACR 125-133、AMACR 183-191で刺激したT細胞は、ペプチドパルスしたHLA-A*2402陽性のT2A24細胞を強く傷害したが、ペプチド非添加その他標的細胞に対してはペプチドパルスしたものに比較して弱い傷害性が検出された。【０１４０】
更にペプチドAMACR 125-133(配列番号：3）、AMACR 183-191(配列番号：4）を用いて、Case9で得られたCTLを用いてE/T（Effector（CTL）とtarget（標的細胞））の比率を変化させた時の細胞傷害性を検討した結果を図４に示す。AMACR 125-133、AMACR 183-191で誘導されたCTLは、低いE/T比(1,3)ではペプチド非添加等陰性対照の標的細胞には傷害性を示さず、ペプチドパルスしたHLA-A*2402陽性のT2A24細胞のみを強く傷害した。また高いE/T比(10,30)では、図３の結果と同様、ペプチド非添加その他陰性対照の標的細胞に対して弱い傷害性を示したが、ペプチドパルスしたHLA-A*2402陽性のT2A24細胞にはより強い傷害性を示した。【０１４１】
以上の結果から、AMACR 240-248（配列番号：5)と同様に、AMACR 125-133(配列番号：3)およびAMACR 183-191(配列番号：4)も腫瘍抗原ペプチドであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明によりAMACRおよび当該AMACR由来ペプチド、またはこれらをコードする核酸等の、癌免疫分野における利用が提供される。本発明の腫瘍抗原タンパク質AMACRおよびそれに由来する腫瘍抗原ペプチドは、前立腺癌などの癌患者を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】AMACR由来の４種類のペプチドおよび陽性コントロールであるEBウイルス由来ペプチド(図中EBV)、HIVウイルス由来ペプチド(図中HIV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、縦軸は平均蛍光強度（結合親和性）を示す。横軸はペプチド名を示す。
【図２】AMACR 240-248ペプチドを用いて前立腺癌患者末梢血リンパ球より誘導したペプチド特異的な細胞傷害性T細胞（ＣＴＬ）誘導能を示した結果である。図中、縦軸はCTLによる細胞傷害活性を示す。横軸は前立腺癌7例の症例をCase1〜7で示す。またペプチド特異性を示すため、4種の標的細胞を用い、T2A24(-)はT2A24細胞のみ、T2A24 AMACRはT2A24細胞にAMACR 240-248ペプチドを添加、T2A24 HIVはT2A24細胞にHIVペプチドを添加、K562はK562細胞のみを示す。
【０１４４】
【図３】AMACR 125-133とAMACR 183-191ペプチドを用いて前立腺癌患者末梢血リンパ球より誘導したペプチド特異的な細胞傷害性T細胞（ＣＴＬ）誘導能を示した結果である。図中、縦軸はCTLによる細胞傷害活性を示す。横軸は前立腺癌7例の症例をCase8〜14で示す。またペプチド特異性を示すため、4種の標的細胞を用い、T2A24(-)はT2A24細胞のみ、T2A24 AMACRはT2A24細胞にAMACR 125-133とAMACR 183-191ペプチドを添加、T2A24 HIVはT2A24細胞にHIVペプチドを添加、K562はK562細胞のみを示す。
【図４】AMACR 125-133とAMACR 183-191ペプチドを用いて前立腺癌患者（Case9）末梢血リンパ球より誘導したペプチド特異的な細胞傷害性T細胞（ＣＴＬ）誘導能をE/T（Effector（CTL）とtarget（標的細胞））の比率を変化させた時の結果である。図中、縦軸はCTLによる細胞傷害活性を示す。横軸はE/T比を1,3,10,30に設定し、示す。またペプチド特異性を示すため、4種の標的細胞を用い、T2A24(-)はT2A24細胞のみ、T2A24  AMACRはT2A24細胞にAMACR 125-133とAMACR 183-191ペプチドを添加、T2A24 HIVはT2A24細胞にHIVペプチドを添加、K562はK562細胞のみを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号：３〜３３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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