(57)【要約】  本発明の目的は、成体幹細胞を用いた治療法を確立するため、成体幹細胞の分離同定技術、幹細胞の機能を評価し易い動物モデルを提供することにある。  本発明は、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有するベクター、または該ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物もしくは形質転換細胞を提供する。
2007046398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号３で表される塩基配列からなるDNAを含み、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含むDNAが、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAである請求項１記載のDNA。
【請求項３】
配列番号１、２または３で表される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
【請求項４】
配列番号１、２または３で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
【請求項５】
配列番号１、２または３で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
【請求項６】
幹細胞が成体幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNA。
【請求項７】
外来遺伝子配列の上流側に、請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNAが連結されてなる、幹細胞特異的に外来遺伝子を発現させるベクター。
【請求項８】
外来遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
幹細胞が成体幹細胞である、請求項７または８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか1項に記載のベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれてなる、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、請求項１０または１１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
げっ歯類がマウスである、請求項１２記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
請求項７〜９のいずれか1項に記載のベクターを含有する形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離された、請求項１４記載の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有するベクター、ならびに該ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物および形質転換細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、造血不全、自己免疫疾患、心不全、肝不全、腎不全、皮膚傷害、神経変性疾患等に代表されるような組織変性に対する根治療法として臓器移植が実施されている。しかし、ドナー不足から患者に臓器が行き渡らないのが現状であり、臓器移植治療の先進国であるアメリカにおいても、ドナーからの臓器提供は移植ニーズに対して5％程度を満たすに過ぎない（非特許文献1）。また、臓器移植には、免疫抑制剤を生涯に渡り服用し続けなければならず、ドナー由来の感染症に罹る危険性がある等の問題点もある。【０００３】
こうした中、臓器移植による治療法の問題点を解決する手段として幹細胞を用いた治療法が期待を集めている。幹細胞とは自己と性質も遺伝形質も全く同一の娘細胞を複製する能力（自己複製能）を有し、かつ複数の分化した組織構成細胞を供給できる能力（多分化能）を有する細胞である。幹細胞は大別して胚性幹細胞（ES細胞）と成体幹細胞とに分類される。【０００４】
ES細胞は理論的には無限に増殖し、かつ成体組織を構成する全ての細胞に分化できる能力を有することから、ES細胞を大量に増やした後に分化誘導することにより、臓器移植に必要な組織または細胞を供給することができると期待されている。しかし、ES細胞はヒト受精卵から個体発生過程にある細胞より樹立するため倫理的な問題がある上、ES細胞を移植すると腫瘍を形成する危険性がある。【０００５】
一方、成体には造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞等、組織の機能性細胞を供給する幹細胞が存在する。
造血幹細胞は造血系の再構築能を有し、自己あるいは同種の骨髄および臍帯血に由来する造血幹細胞がすでに臨床応用されている（特許文献1〜7、非特許文献2）。神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア細胞等に分化する能力を有しており、パーキンソン病等の神経変性疾患に対する根治療法への利用が期待されている。間葉系幹細胞は骨細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞等に分化する能力を有し、骨、軟骨、腱、骨格筋、靭帯組織、脂肪組織における疾患の治療および皮膚の創傷治癒への利用が期待されている（特許文献8）。【０００６】
最近、成体の組織中に成体のほとんど全ての細胞に分化できる能力を持つ成体多能性幹細胞の存在が示された（特許文献9、10、非特許文献3）。成体多能性幹細胞はES細胞とは異なり腫瘍を形成するとの報告はない。また、成体多能性幹細胞はヒトを含む出生後の哺乳類の骨髄、骨格筋、皮膚、脳等から取得できることから倫理上の問題はなく、また、自己組織から取得した当該幹細胞を移植治療に用いれば、免疫拒絶に対する心配もない。このように、成体多能性幹細胞はその多能性、安全性に加え、倫理上の問題を解決できる、組織変性疾患に対する医療ツールとして現在注目を集めている。【０００７】
各種組織幹細胞の分離方法として、幹細胞に発現する表面抗原やその特性を利用する方法、組織幹細胞特異的な遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーを持つレポーターベクターを利用する方法が知られている。
例えば、造血幹細胞の場合、マウス骨髄においてはCD34-/c-kit+/Sca1+/Lineage（Lin）-（非特許文献4）、ヒト末梢血においてはCD34+/CD38-/Lin-（非特許文献5、6）またはCD34+/KDR+（非特許文献7）、ヒト骨髄においてはCD34-/Lin-（非特許文献8）、ヒト臍帯血においてはCD34-/Lin-/CD133+/CD7-（非特許文献9）をマーカーとして、造血幹細胞が濃縮された細胞画分を分離できることが知られている。また、Hoechst33342の細胞外排出能を指標にしたFACS分画法により、骨髄side population(SP)から造血幹細胞が濃縮された細胞画分を分離できることが知られている（非特許文献10）。また、β-catenin遺伝子をマーカーとした造血幹細胞の分離方法が知られている(特許文献11、12)。【０００８】
神経幹細胞（非特許文献11、12、13）の場合、分離方法としては、Sox（特許文献13）、NestinまたはMusashi(特許文献14)、AC133（特許文献15）をマーカーとして用いる方法が知られている。
間葉系幹細胞（特許文献8、16〜22、非特許文献14〜19）の場合、分離方法としては、SH2+, SH4+, CD29+, CD44+, CD71+, CD90+, CD106+, CD120a+, CD124+, CD14-, CD34-, CD45-をマーカーとして用いる方法が知られている。【０００９】
また、肝幹細胞および内胚葉系幹細胞（非特許文献20〜23）の場合、分離方法としては、c-Met+/c-kit-/CD49f+or low/CD29+/CD45-/Ter119-をマーカーとして用いる方法が知られている。
一方、ES細胞や胚性生殖細胞（EG細胞）が未分化状態で特異的に発現する遺伝子としてOct-3/4が知られている。Oct-3/4は原腸陥入前の胎児、発生初期の分裂時期、胚盤胞の内部細胞塊やembryonic carcinomaで発現し、分化すると発現が減少する。種々の解析からOct-3/4はES細胞等の未分化維持に必要であることが明らかにされている。Oct-3/4はRox-1と結合してESの未分化維持に必要なZn finger proteinであるRex-1の転写を活性化する（非特許文献24）。Oct-3/4遺伝子の発現を指標にして成体組織中の成体多能性幹細胞を同定する手法（特許文献9）が報告されている。【００１０】
成体多能性幹細胞の起源細胞については、骨格筋組織中のCD45-/Sca-1+/c-kit-/CD34+/Thy-1+の細胞表面マーカーを有する細胞であるとの報告もある（非特許文献25、26）。
また、β2-microglobulinを指標にした多能性幹細胞の分離手法も知られているが（特許文献23）、組織中のβ2-microglobulin陽性細胞集団から陰性の多能性幹細胞を同定することは容易ではない。【００１１】
さらに、神経幹細胞、造血幹細胞を含む細胞集団（c-kit+/Lin-）、ES細胞、数種のヒト癌細胞株において発現するヌクレオステミンという新しい核小体タンパク質が報告されている（特許文献24、非特許文献27）。
【特許文献１】US5,635,387
【特許文献２】US5,460,964
【特許文献３】US5,677,136
【特許文献４】US5,750,397
【特許文献５】US5,759,793
【特許文献６】US5,681,599
【特許文献７】US5,716,827
【特許文献８】US5,486,359
【特許文献９】WO2001/11011
【特許文献１０】WO2001/21767
【特許文献１１】US6,465,249
【特許文献１２】WO03/102215
【特許文献１３】US2002/0135539
【特許文献１４】特開2002-034580
【特許文献１５】US6,468,794
【特許文献１６】US5,827,735
【特許文献１７】US5,811,094
【特許文献１８】US5,736,396
【特許文献１９】US5,837,539
【特許文献２０】US5,837,670
【特許文献２１】US5,827,740
【特許文献２２】WO01/48149
【特許文献２３】US2002/0119564
【特許文献２４】WO2004/031731
【非特許文献１】J Am Med Assoc, 267, 239-246 (1992)
【非特許文献２】Exp Hematol, 24, 936-943 (1996)
【非特許文献３】Nature, 418, 41-49 (2002)
【非特許文献４】Science, 273, 242-245 (1996)
【非特許文献５】Blood, 89, 3919-24 (1997)
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci USA, 94, 5320-5 (1997)
【非特許文献７】Science, 285, 1553-8 (1999)
【非特許文献８】Nature Medicine, 4, 1038-45 (1998)
【非特許文献９】Blood, 95, 2813-20 (2000)
【非特許文献１０】J Exp Medicine, 183, 1797-806 (1996)
【非特許文献１１】Science, 287, 1433-1438 (2000)
【非特許文献１２】Brain Pathol, 9, 499-513 (1999)
【非特許文献１３】Mech Dev, 59, 89-102 (1996)
【非特許文献１４】J Cell Biochem, 64, 295-312 (1997)
【非特許文献１５】J Bone Miner Res, 11,1264-73 (1996)
【非特許文献１６】J Bone Joint Surg Am, 80, 1745-57 (1998)
【非特許文献１７】Exp Cell Res, 238, 265-72 (1998)
【非特許文献１８】Blood, 84, 4164-73 (1994)
【非特許文献１９】J Clin Invest, 103, 697-705 (1999)
【非特許文献２０】Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353, 821-30 (1998)
【非特許文献２１】Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353, 831-7 (1998)
【非特許文献２２】J Hepatol, 29, 676-82 (1998)
【非特許文献２３】Molecular Medicine, 40, 169-175 (2003)
【非特許文献２４】Molecular & Cellular Biology, 18, 1866-78 (1998)
【非特許文献２５】Blood, 98, 2615-1625 (2001)
【非特許文献２６】Nature, 418, 41-49 (2002)
【非特許文献２７】Genes & Development, 16, 2991-3003 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
成体幹細胞を用いた治療法を確立するためには、実用的な成体幹細胞の分離同定技術が不可欠である。また、そのためには、幹細胞の機能を評価し易い動物モデルの作製が必要である。
また、ヌクレオステミンは、その発現様式から、幹細胞の幹細胞性（Stemness）の維持に必要であると同時に、成体組織に存在する幹細胞や多能性幹細胞を分離同定するのに適したマーカーとなることが期待されている。しかしながら、前記のようにヌクレオステミンは核小体に局在しているため、細胞内で発現するヌクレオステミンを検出するためには細胞固定が必要となり、ヌクレオステミンを発現する細胞を生きた状態で分離することは出来ない。また、ヌクレオステミン遺伝子のプロモーターやエンハンサーなどの発現調節領域についてはこれまで報告が全くない。【００１３】
すなわち、本発明は、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有するベクター、または該ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物もしくは形質転換細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）配列番号１または配列番号３で表される塩基配列からなるDNAを含み、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
（２）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含むDNAが、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAである上記（１）のDNA。
（３）配列番号１、２または３で表される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
（４）配列番号１、２または３で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
（５）配列番号１、２または３で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA。
（６）幹細胞が成体幹細胞である、上記（１）〜（５）のいずれか１項のDNA。
（７）外来遺伝子配列の上流側に、上記（１）〜（６）のいずれか１項のDNAが連結されてなる、幹細胞特異的に外来遺伝子を発現させるベクター。
（８）外来遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる遺伝子である、上記（７）のベクター。
（９）幹細胞が成体幹細胞である、上記（７）または（８）のベクター。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれか1項のベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１１）ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれてなる、上記（１０）のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１２）非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、上記（１０）または（１１）のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１３）げっ歯類がマウスである、上記（１２）のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１４）上記（７）〜（９）のいずれか1項のベクターを含有する形質転換細胞。
（１５）上記（１０）〜（１３）のいずれか１項のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離された、上記（１４）記載の形質転換細胞。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有するベクター、または該ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物もしくは形質転換細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヌクレオステミン（NS）遺伝子のヒト組織における発現量を示した図である。縦軸は、NS遺伝子の発現量をGAPDH遺伝子に対する相対量（％）として表す。横軸は組織を表し、１．肝臓、２．肺、３．脳、４．心臓、５．胃、６．脾臓、７．脊髄、８．小腸、９．骨格筋、１０．子宮、１１．気管、１２．甲状腺、１３．胸腺、１４．精巣、１５．唾液腺、１６．前立腺、１７．胎盤、１８．リンパ節、１９．膵臓、２０．大腸、２１．末梢血、２２．腎臓を表す。
【図２】ヒトNS遺伝子の成人および胎児組織における発現量を示した図である。縦軸は、NS遺伝子の発現量をGAPDH遺伝子に対する相対量（％）として表す。横軸は組織を表し、□カラムは胎児由来組織、■カラムは成人由来組織を表し、１．脳、２．腎臓、３．肝臓、４．肺を表す。
【図３】pPLEmNSgKSB10の制限酵素地図を示した図である。
【図４】pPLEmNSgKSB10を安定導入したES細胞株を、レポーター活性を指標にしてFACSにより、EGFP高発現細胞集団(EGFP++)とEGFP低発現細胞集団(EGFP+)に分離し、それぞれにおける内在性NS遺伝子（□カラム）とEGFP遺伝子の発現量（■カラム）をRT-PCRで測定し、比較した結果を示した図である。縦軸は、遺伝子の相対的発現量を表す。
【図５】pNS Promoter7-EGFPの制限酵素地図を示した図である。
【図６】Aは、NS遺伝子上流約7kbのゲノム配列とEGFPを結合した配列を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの骨髄単核細胞におけるEGFPの発現を、FACSで解析した結果を示した図である。
【００１７】
Bは、該Tgマウスの骨髄単核細胞におけるEGFP、lineageマーカー、および幹細胞マーカーの発現をFACSで解析した結果を示した図である。
【図７】Aは、NS遺伝子上流約7kbのゲノム配列とEGFPを結合した配列を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの骨髄単核細胞のEGFP発現強度とコロニー形成能を比較した結果を示した図である。縦軸は、300細胞当りのコロニー数を表す。
【００１８】
Bは、該Tgマウスの骨髄単核細胞のEGFP発現強度と骨髄再構築能を比較した結果を示した図である。縦軸は、末梢血における1000細胞あたりのドナー由来細胞の割合（％）を表す。
【図８】NS遺伝子上流約7kbのゲノム配列とEGFPを結合した配列を導入したトランスジェニックマウスの精細管内のEpCAM陽性細胞におけるEGFPの発現を、FACSにより解析した結果を示した図である。縦軸は、カウント数を表す。横軸は、EGFPの蛍光強度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
１．幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA
幹細胞とは、多分化能を有すると同時に幹細胞が幹細胞を生み出すという自己複製能を有する細胞をいう。本発明において、幹細胞としては、前記の性質を有する細胞であればいずれも包含されるが、好ましくは胚性幹細胞（ES細胞）、成体幹細胞、より好ましくは成体幹細胞があげられる。【００２０】
成体幹細胞としては、各種組織幹細胞、成体多能性幹細胞等があげられる。
各種組織幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、消化管組織幹細胞、生殖組織幹細胞等があげられる。
プロモーターとは、細胞内でRNAポリメラーゼとの会合が可能な発現調節領域を含み、当該領域の下流（３’末端方向）に存在するコーディング配列の転写を開始させる機能を有する領域を含むDNA上の領域をいう。本発明においては、当該性質を有するプロモーターであればいずれのプロモーターも包含するが、転写の効率を調節するいわゆるエンハンサー領域をも含むプロモーターが好ましい。【００２１】
プロモーター活性とは、当該プロモーターの下流に存在するコーディング配列の転写を行う活性をいう。
幹細胞特異的なプロモーター活性とは、幹細胞におけるプロモーター活性が、他の細胞や組織と比較して高いことを意味する。
本発明のDNAとしては、配列番号１または３で表される塩基配列からなるDNAを含み、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNAがあげられる。配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含むDNAとしては、配列番号２で表される塩基配列からなるDNA等があげられる。【００２２】
配列番号１で表される塩基配列は、マウスヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始点（1st atg）の下流６番目のgから該翻訳開始点の上流7078番目のgまでの約７kb からなる領域の配列である。
配列番号２で表される塩基配列は、マウスヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始点（1st atg）の下流６番目のgから該翻訳開始点の上流10058番目のgまでの約10kb からなる領域の配列である。【００２３】
配列番号３で表される塩基配列は、ヒトヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始点（1st atg）の下流３番目のaから該翻訳開始点の上流9998番目のaまでの約10kb からなる領域の配列である。
なお、前記マウスヌクレオステミン遺伝子の配列は、Genbank Accession Number NW_000091により、前記ヒトヌクレオステミン遺伝子の配列は、Genbank Accession Number NT_00595986により参照することができる。【００２４】
本発明のDNAのプロモーター活性の測定方法は、当該DNAのプロモーター活性を測定できればいかなる測定方法でもよいが、例えばレポータージーンアッセイ系により測定することができる。具体的には、下記の（１）〜（３）の工程により行うことができる。
（１）被検対象のプロモーターの下流に、例えばルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、もしくはこれらの誘導体等のレポーター遺伝子を作動可能に連結した配列を含む活性測定用プラスミドを作製する工程、
（２）前記（１）の活性測定用プラスミドを用いて幹細胞および対照細胞を形質転換する工程、および
（３）前記（２）で得られた細胞におけるレポーター遺伝子の発現の有無を検出し、発現強度を測定する工程からなる方法により測定することができる。【００２５】
かかる測定方法により、幹細胞において対照細胞と比較して高い発現が検出された場合、被験対象であるプロモーターは幹細胞特異的なプロモーターであると同定することができ、レポーター遺伝子の発現強度がプロモーター活性の強度となる。
本発明のDNAは、配列番号１、２または３で表される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加（以下、単に「変異」と称する場合がある）された塩基配列からなり、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNAを包含する。【００２６】
かかるDNAは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、配列番号１、２または３で表される塩基配列からなるDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００２７】
変異の数および導入位置は、変異後のDNAが幹細胞特異的なプロモーター活性を有していればいずれでもよい。幹細胞特異的なプロモーター活性の測定方法としては、例えば前記のレポータージーンアッセイ系があげられる。
本発明のDNAにおいて１以上の塩基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１または複数の塩基配列中の位置において、１または複数の塩基の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよい。【００２８】
欠失、置換または付加される塩基の数は特に限定されないが、上記部位特異的変異法等の公知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１〜１０００個、好ましくは１〜５００個、より好ましくは１〜１００個、特に好ましくは１〜５０個である。
また、本発明のDNAが幹細胞特異的なプロモーター活性を有するためには、配列番号１、２または３で表される塩基配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。【００２９】
塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００３０】
本発明のDNAは、配列番号１、２または３で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNAを包含する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとは、配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するDNAをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０mol/lの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０mmol/l塩化ナトリウム、１５mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、上記したBLAST等を用いて計算したときに、配列番号１、２または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するDNA、好ましくは８０％以上の相同性を有するDNA、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
２．本発明のDNAを含有するベクター
本発明のベクターは、外来遺伝子配列の上流側に本発明のDNAが連結されており、幹細胞特異的に外来遺伝子を発現させることができる。【００３１】
上記外来遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子ならびにそれらの誘導体等のマーカー遺伝子があげられる。前記誘導体には、人工的に作製された変異体も含まれる。【００３２】
本発明のベクターは、本発明のDNAを適切なベクターに挿入することにより得ることができる。本発明に用いられるベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド等があげられ、具体的には、pNASS β、pGL3、pCAT3、 pβgal、pEGFP-1、pEGFP-N1、pEYFP-1、pSEAP2、pGeneBLAzer-TOPO等があげられる。
３．トランスジェニック非ヒト哺乳動物および形質転換細胞
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該発現ベクター中の外来遺伝子が幹細胞特異的に発現される。【００３３】
外来遺伝子として前記マーカー遺伝子を含有するベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた場合、幹細胞特異的な該遺伝子の発現の有無および強度を指標として、簡便に、幹細胞を分離同定することができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれていてもよい。【００３４】
非ヒト哺乳動物としては、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物があげられる。中でも、医薬研究用途に用いられていること、病態モデルが作製しやすいこと等の観点から、マウス、ラット等に代表されるげっ歯類が好ましく、特にマウスが好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製方法としては、例えば、マウス胚の操作マニュアル（近代出版、1989）、分子生物学プロトコール（南江堂、1994）、ジーンターゲティング（羊土社、1995）等により行うことができる。【００３５】
具体的には、まず、過排卵誘起した雌と種雄とを交配させる。交配後約１２時間を経た雌から卵管を取り出し、１細胞期（前核期）の受精卵を採取し、適切な培養液に入れる。ついで、本発明のベクターを受精卵の前核にマイクロインジェクションする。一方、性成熟に達した雌に精管切除した雄を交尾させて、偽妊娠雌を作製する。マイクロインジェクション後、生存した受精卵を前記偽妊娠雌の卵管内に移植する。その後、卵管内に移植された受精卵より発生した胎仔を自然分娩又は切開手術により取り出す。得られた仔の尾の一部からゲノムDNAを調製する。得られたDNAを分析して、得られた仔がトランスジェニック動物であるか否かを調べる。トランスジェニック動物を交配して系統を樹立する。樹立されたトランスジェニック動物中のベクターに存在する外来遺伝子について、発現解析を行ない、幹細胞特異的な発現を確認する。以上の操作により、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。【００３６】
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターを含有する形質転換細胞であって、該形質転換細胞が幹細胞である場合、該ベクター中の外来遺伝子を特異的に発現させることができる。
外来遺伝子として前記マーカー遺伝子を含有したベクターを保持した形質転換細胞を用いた場合、該マーカー遺伝子の発現の有無および強度を指標として、形質転換細胞の中から幹細胞を簡便に分離同定することができる。【００３７】
本発明の形質転換細胞は、前記マーカー遺伝子を含有したベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されたものであってもよく、公知の形質転換法により作製したものであってもよい。
公知の形質転換法としては、例えばリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法等があげられる。【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００３９】
ヒト組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現量
ヒト組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現量を定量RT-PCR法にて測定した。各組織のcDNAは、ヒト正常組織由来の1μgのpoly A RNA (BD Biosciences Clontech社)に対してSuperScript First-strand System for RT-PCR (Invitrogen社)を用いて合成した。
調製したcDNA、ヒトヌクレオステミン遺伝子特異的プライマー、SyberGreen I (Molecular Probe社)、dNTP mixおよびDNA Taq polymerase（TaKaRa Ex TaqTMR-PCR, TaKaRa社）を含む反応液を作製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社)を用いてPCR反応を行った。用いたcDNA量は2ngのpoly A RNA量に相当し、PCRプライマーは終濃度300nmol/L、dNTP mixは終濃度300nmol/Lになるように添加した。ヒトヌクレオステミン遺伝子特異的なプライマーの配列は配列番号4および5に、ヒトグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子特異的なプライマーの配列は配列番号6および7にそれぞれ示した。【００４０】
各PCR プライマーで増幅したPCR産物をpT7Blue (Novagen社)にクローニングしたプラスミドDNAをテンプレートとして予め作製しておき、これを段階希釈して検量線を作成し、各サンプルの増幅量を定量化した。
また、各組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現量は、GAPDH遺伝子の発現量に対する相対量で表した。【００４１】
結果を図１に示す。ヌクレオステミン遺伝子の発現量は、精巣、膵臓、肺等において他組織と比較して高く、特に精巣における発現量が顕著に高いことが明らかとなった。これらの組織においてはそれぞれ幹細胞の存在が報告あるいは示唆されており[Kanatsu-Shinohara, M., et al. Biol Reprod, 69, 612-616 (2003)、Zulewski, H., et al. Diabetes, 50, 521-533 (2001)、 Kotton, D.N., et al. Experimental Hematology, 32, 340-343 (2004)]、ヌクレオステミン遺伝子の発現の高い組織においては他組織に比べ幹細胞の存在比が高いことを示す結果であると考えられた。また、本結果のヒト正常組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現様式は、ラット正常組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現様式[Genes & Development, 16, 2991-3003 (2002)]と同様であることから、ヌクレオステミン遺伝子の発現様式は種間で保存されていることが示された。【００４２】
さらに、前記と同様の定量RT-PCR法で、胎児と成人の組織におけるヌクレオステミン遺伝子の発現を比較検討した。
結果を図２に示す。脳、腎臓および肝臓において、胎児でのヌクレオステミン遺伝子の発現が顕著に高いことが明らかとなった。胎児期の組織は幹細胞の存在比が高いことが知られており、胎児組織における幹細胞の存在比とヌクレオステミン遺伝子の発現量との相関が示された。
【実施例２】
【００４３】
マウス血球系細胞におけるヌクレオステミン遺伝子の発現様式
マウスの各種血球系細胞集団におけるヌクレオステミン遺伝子の発現量をRT-PCR法にて検討した。
まず、C57Bl/6マウス(日本クレア社)の骨髄から公知の方法により取得した血球系細胞について、細胞表面抗原およびHoechst33342 (Bis-Benzimide, Sigma社)の排出能を指標に、FACSソーター（BD FACSVantage SE System, BD Biosystems社）を用いて、造血幹細胞が存在しないと考えられているlineage陽性の細胞集団（Lin+）、造血幹細胞を僅かしか含まないと考えられているlineage陰性の細胞集団(Lin-)、造血幹細胞の存在が1000個に一個程度と考えられているc-kit陽性 Sca-1陽性 lineage陰性の細胞集団（KSL）におけるHoechst33342低排出性の亜群（MP/KSL）および高排出性の亜群（SP/KSL）を分取した。【００４４】
なお、細胞表面抗原に対する抗体としては、抗c-kit抗体（BD Parmingen社製、2B8）、抗Sca-1抗体（BD Parmingen社製、D7）、抗CD4抗体（BD Parmingen社製、L3T4)、 抗CD8抗体（BD Parmingen社製、53-6.72)、抗B220抗体（BD Parmingen社製、RA3-6B2）、 抗TER-119抗体（BD Parmingen社製）、抗Gr-1抗体（BD Parmingen社製、RB6-8C5）および抗Mac-1抗体（BD Parmingen社製、M1/70）を用いた。CD4およびCD8はT細胞のマーカー、B220はB細胞のマーカー、TER-119は赤血球のマーカー、Gr-1は顆粒球のマーカー、Mac-1はマクロファージのマーカーであり、これらのマーカーのいずれかが陽性の細胞をlineage陽性細胞、すべてが陰性の細胞をlineage陰性細胞とした。【００４５】
前記の各種血球系細胞集団からRNeasy kit (Qiagen社)を用いて精製した2.5μgのtotal RNAを0.5μgのoligo (dT)12-18プライマー（Invitrogen社）とアニーリングさせた後に、逆転写酵素（SuperscriptII, Invitrogen社）と反応させてcDNAを調製した。
調製したcDNA、遺伝子特異的プライマー、およびDNA Taq polymerase（TaKaRa Ex TaqTM, TaKaRa社）を含む反応液を調製し、PCR装置（GeneAmp PCR system9600, Perkin Elmer Cetus社, PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research社）を用いてPCR反応を行った。用いたcDNA量は20ngのtotal RNA量に相当し、PCR プライマーは終濃度500nmol/Lとなるように添加した。マウスヌクレオステミン遺伝子特異的なプライマー配列は配列番号8および9に、マウスGAPDH遺伝子特異的なプライマー配列は配列番号10および11にそれぞれ示した。PCR反応の増幅数は、ヌクレオステミン遺伝子、GAPDH遺伝子に対してそれぞれ、35サイクル、20サイクルとした。【００４６】
PCR産物は2％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド（EtBr, Nacalai社）で染色後、UVサンプル撮影装置（FASIII、TOYOBO社）で可視化して撮影した。
その結果、Lin+、Lin-、およびMP/KSLでは、ヌクレオステミン遺伝子の発現は検出限界以下であった。一方、SP/KSLではヌクレオステミン遺伝子の発現が検出されたことから、血球系細胞におけるヌクレオステミン遺伝子の発現はSP/KSLに限局していることが明らかとなった。【００４７】
SP/KSLには造血再構築能を有する細胞集団、すなわち造血幹細胞が最も濃縮されていると考えられていることから、ヌクレオステミン遺伝子は造血幹細胞に特異的に発現していることが示唆された。
【実施例３】
【００４８】
ヌクレオステミン遺伝子の転写調節配列のクローン化
１．マウスヌクレオステミン遺伝子の上流配列のクローン化
まず、マウスヌクレオステミン遺伝子を含むゲノム配列のクローニングを行った。
マウスゲノムが挿入されたBACクローン（BACPAC Resources Center）からマウスヌクレオステミン遺伝子（Genbank Accession# BC037996）を含むクローン（RP23-84O17、Invitrogen社）を選出し、以下のサザン解析に供した。【００４９】
サザン解析用のプローブは、6週齢オスのC57Bl/6マウス(日本クレア社)の尾部より精製したゲノムDNAを鋳型にして、配列番号12および13でそれぞれ表されるマウスヌクレオステミン遺伝子特異的プライマーを用いて増幅し、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche社)でDIG標識したものを用いた。
制限酵素（KpnI, BamHI, EcoRIまたはHindIII, TaKaRa社）で処理したBACクローンRP23-84O17を転写したナイロンメンブレン（Hybond N+, Amersham社）に対して、上記DIG標識したマウスヌクレオステミン遺伝子のプローブをDIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche社）を用いてハイブリダイズさせた。【００５０】
その結果、RP23-84O17には、マウスゲノム配列（Genbank Accession# NW_000091）から予想される長さのヌクレオステミン遺伝子配列が含まれていることを確認した。
次に、RP23-84O17をKpnIで酵素処理して得られた断片をpBlueScriptIISK(-)（Stratagene社）にクローニングしたライブラリーを作製し、上記プローブおよびDIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche社)を用いて、ヌクレオステミン遺伝子の上流配列を含むKpnI断片(12.2kb)のサブクローンを確認した。配列解析を行った結果、クローニングした断片にはヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始点（1st atg）より上流10kbを含む配列が含まれていた。
２．マウスヌクレオステミン遺伝子の上流配列を含むレポーターベクターの構築
増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子レポーターベクター（pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech社）をAseIおよびBglIIにて切断して平滑末端に変換した後、再結合することにより、プロモーターおよびエンハンサー領域を切除したレポーターベクター（pPLE）を構築した。上記のKpnI断片(12.2kb)の制限酵素部位KpnIから翻訳開始点(atg)の下流に存在するStuIまでの10kbの配列をpPLEの制限酵素部位KpnIからBamHI(平滑化処理)に挿入し、ヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始位置より上流10kbのゲノム配列を含むEGFPレポーターベクターpPLEmNSgKSB10（図３）を構築した。pPLEmNSgKSB10に含まれる、ヌクレオステミン遺伝子の翻訳開始位置より上流10kbのゲノム配列を、配列番号２に示す。
３．ヌクレオステミン遺伝子上流10kb配列の転写調節能
上記の、ヌクレオステミン遺伝子の上流10ｋbのゲノム配列の転写調節能を解析するため、構築したEGFPレポーターベクターpPLEmNSgKSB10のレポーター活性を検討した。【００５１】
ヌクレオステミン遺伝子の発現が報告されている胚性幹細胞（ES細胞）[Cell, 94, 339-352 (1998)]にpPLEmNSgKSB10をエレクトロポレーション（GenePulser, BioRad社）により導入し、300μg/mLのG418（Geneticin, Invitrogen社）存在下で培養することにより、pPLEmNSgKSB10安定導入ES細胞株を樹立した。
樹立した細胞株を蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE300, Nikon社）下で観察した結果、多くの細胞でEGFPが発現されており、ヌクレオステミン遺伝子上流10ｋbのゲノム配列がES細胞において転写活性を示すことが明らかとなった。【００５２】
さらに、前記細胞株を白血病阻害因子（LIF）非存在下で培養することにより分化誘導させた結果、レポーター活性が低下することが明らかとなった。
次に、前記細胞株について、FACSソーター（BD FACSVantage SE System, BD Biosystems社）でEGFPの発現量の高い細胞集団（EGFP++）および低い細胞集団(EGFP+)を分取し、それぞれの細胞集団のEGFPの発現レベルを調べた。【００５３】
すなわち、分取した細胞から前記と同様にcDNAを合成し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社)を用いて定量RT-PCRを行った。マウスヌクレオステミン遺伝子特異的プライマーの配列は配列番号8および9に、マウスGAPDH遺伝子特異的プライマーの配列は配列番号10および11に、EGFP遺伝子特異的プライマーの配列は配列番号14および15にそれぞれ示した。【００５４】
また、各PCR プライマーセットで増幅したPCR産物をpT7Blue (TaKaRa社)にクローニングしたものを調製し、これらを段階希釈したものから検量線を作成して各サンプルにおける遺伝子の発現量を定量した。
なお、各サンプルのヌクレオステミン遺伝子およびEGFP遺伝子の発現量をGAPDH遺伝子の発現量に対する相対量で表した。【００５５】
結果を図４に示す。前記細胞集団におけるEGFPレポーター遺伝子の発現量は、内在性のヌクレオステミン遺伝子の発現に相関していることが明らかとなった。この結果から、クローン化したヌクレオステミン遺伝子上流約10kbのゲノム配列には、ヌクレオステミン遺伝子の正および負の転写調節領域が含まれていることが示された。
【実施例４】
【００５６】
EGFPレポーター遺伝子トランスジェニックマウスの作製
pPLEmNSgKSB10に含まれるヌクレオステミン遺伝子の上流10kbのゲノム配列をKpnI、ついでNdeIで切断した後、Erase-a-Base System（Promega社）を用いて、5’側から段階的に欠失させた。
プラスミドを再環状化した後、大腸菌に導入し、pPLE-N1 mNSgKSB10 AU7078を得た。pPLE-N1 mNSgKSB10 AU7078に含まれる、約7kbのヌクレオステミン遺伝子上流の塩基配列を配列番号１に示す。【００５７】
pPLE-N1 mNSgKSB10 AU7078に含まれる約7kbのヌクレオステミン遺伝子上流配列およびEGFP遺伝子を含むSalI/NotI断片を、pCMV-SPORT6 (Invitrogen社)に結合させ、プラスミドNS promoter7-EGFP/pCMV-SPORT6を作製した。その後、pPLE-N1 mNSgKSB10 AU7078に含まれるSV40polyA部分をPCRにて増幅させた。その際、5’側のプライマー（配列番号16）にNotI切断部位を、3’側のプライマー（配列番号17）にNotI-SalI切断部位を挿入した。PCR産物をNotIにて消化した後、NS promoter7-EGFP/pCMV-SPORT6のNotI部位に挿入し、pNS Promoter7-EGFPを作製した（図５）。【００５８】
株式会社ワイエス研究所にて、制限酵素SalIを用いてヌクレオステミン遺伝子転写調節配列-EGFP-SV40 PolyA部分のみを切り出したフラグメントを精製し、C57BL/6由来の受精卵前核に注入した。遺伝子導入受精卵は常法に従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させた。得られた初代トランスジェニックマウス(F0)をC57BL/6マウスと交配させ系統を樹立した。
【実施例５】
【００５９】
EGFPレポーター遺伝子トランスジェニックマウスの解析
１．造血組織
実施例４で作製したトランスジェニックマウスの大腿骨より骨髄液を採取し、比重遠心法(Lymphoprep, 比重1.077, Fresenius Kabi Norge AS社)により単核球を分離した。FACS（FACS Vantage, Becton Dickinson社）により、EGFPの発現を確認した結果、約90％の細胞はEGFP陽性であった（図６のA）。【００６０】
EGFPの発現強度で分離した単核球の細胞集団をさらに、抗c-kit抗体（BD Parmingen社製、2B8）、抗Sca-1抗体（BD Parmingen社製、D7）、抗CD4抗体（BD Parmingen社製、L3T4)、 抗CD8抗体（BD Parmingen社製、53-6.72)、抗B220抗体（BD Parmingen社製、RA3-6B2）、 抗TER-119抗体（BD Parmingen社製）、抗Gr-1抗体（BD Parmingen社製、RB6-8C5）および抗Mac-1抗体（BD Parmingen社製、M1/70）を用いてFACSにより解析した。【００６１】
結果を図６のBに示す。EGFP強陽性細胞(EGFP+++)の半数は、c-kit陽性Sca-1陽性かつlineage陰性という、造血幹細胞が含まれると考えられている細胞集団に一致した。
次に、前記単核球を抗ヌクレオステミン抗体(R&D system社製)で免疫染色した結果、EGFP強陽性の細胞集団(EGFP+++)ではヌクレオステミン蛋白の発現は高く、一方、EGFP弱陽性の集団(EGFP+)では低いことが明らかとなり、EGFPの発現と内在性のヌクレオステミンの発現には相関があることが示された。【００６２】
さらに、FACSにより単離したEGFP強陽性細胞(EGFP+++)、中陽性細胞(EGFP++)、弱陽性細胞(EGFP+)のそれぞれ300個を、stem cell factor (SCF)、IL-6、IL-3、エリスロポエチンとともにメチルセルロース培地中で一週間培養し、コロニー形成能を調べた。
結果を図７のAに示す。EGFP強陽性細胞(EGFP+++)は、中〜弱陽性細胞(EGFP++ 〜 EGFP+)と比較し、コロニーを形成する能力が高かった。この結果から、EGFP強陽性細胞集団(EGFP+++)の中に、造血幹細胞が高い頻度で含まれていると考えられた。【００６３】
さらに、EGFP強陽性細胞(EGFP+++)、弱陽性細胞(EGFP+)の幹細胞活性を調べるため、骨髄移植による骨髄再構築実験を行った。
すなわち、C57BL/6マウス（Ly5.1）をレシピエントマウスとして用い、致死量のX線 (線原9.5Gy、0.5 Gy/min)を照射した後、尾静脈よりEGFP強陽性(EGFP+++)または弱陽性細胞(EGFP+)を注入し、４ヶ月飼育した。またその際、4×105個のLy5.1マウス由来骨髄単核球を同時に注入した。【００６４】
結果を図７のBに示す。EGFP強陽性細胞(EGFP+++)移植群では、末梢血に高率な生着を認める一方、弱陽性細胞(EGFP+)移植群ではほとんど全く生着は認められなかった。この結果から、EGFP強陽性細胞(EGFP+++)は、骨髄再構築能を有する造血幹細胞であり、一方、EGFP弱陽性細胞(EGFP+)は、幹細胞活性を有していないことが明らかとなった。
以上の結果から、本トランスジェニックマウスの造血組織において、EGFPが造血幹細胞特異的に発現していることが明らかとなり、本トランスジェニックマウスを用いることによって、造血幹細胞を分離同定できることが示された。
２．生殖組織
10週齢雄のトランスジェニックマウスから精巣組織凍結切片および精細管whole-mount標本を作製し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS FV1000, オリンパス社)でEGFPの発現を解析した。【００６５】
その結果、EGFPの発現は、未分化な生殖幹細胞と考えられているA型精原細胞で強く、やや分化したB型精原細胞や精母細胞では低下していた。一方、精子でも強い発現を示した。このEGFPの発現様式は、内在性のヌクレオステミンの発現様式と一致した。
次に、精細管内の細胞を1mg/mLコラゲナーゼTypeVI（Sigma社）および0.05% Trypsin-EDTA (Gibco社)処理により分離し、抗c-kit抗体、抗EpCAM抗体（BD Bioscience社製）を用いてFACS解析を行った。なおEpCAMは精原細胞の特異的マーカーである。【００６６】
結果を図８に示す。EpCAM陽性細胞において、EGFPの発現強度の異なる３つの細胞集団が認められた。EGFP強陽性の細胞集団(EGFP+++：Ｐ３)は、c-kit陰性の未分化なA型精原細胞であり、EFGP中陽性の細胞集団(EGFP++：Ｐ２)はやや分化したA型精原細胞、EFGP弱陽性の細胞集団(EGFP+：Ｐ１)はc-kit陽性のB型精原細胞であった。
さらに、それぞれの細胞集団を生殖細胞の分化障害のあるWBB6F1 W/Wvマウス（SLC社より購入）の精細管に移植し、3ヶ月後に生着能を調べた。その結果、EGFP+++細胞に生着能が認められ、該細胞が幹細胞活性を有することが示された。【００６７】
以上の結果から、本トランスジェニックマウスの生殖組織において、EGFPが生殖幹細胞特異的に発現していることが明らかとなり、本トランスジェニックマウスを用いることによって、生殖幹細胞を分離同定できることが示された。
３．消化管組織
10週齢雄のトランスジェニックマウスの小腸組織標本を作製し、蛍光顕微鏡でEGFPの発現を解析した。その結果、幹細胞が存在すると考えられているクリプト下部に位置する細胞にEGFPの発現が認められたことから、消化管組織幹細胞が標識されていると考えられた。すなわち、本トランスジェニックマウスの消化管組織において、EGFPが消化管組織幹細胞特異的に発現していることが明らかとなった。
４．中枢神経組織
10週齢雄のトランスジェニックマウスの中枢神経組織標本を作製し、蛍光顕微鏡でEGFPの発現を解析した。その結果、中枢神経系の幹細胞が存在することが知られている海馬歯状回および側脳室に面する脳室下帯で、EGFPは特に強く発現していた。また、神経幹細胞の特異的マーカーであるGlial fibrillary acidic protein（GFAP）に対する抗体を用いた組織免疫染色により、EGFP強陽性細胞とGlial fibrillary acidic protein（GFAP）陽性細胞とが一致したことから、神経幹細胞が標識されていると考えられた。すなわち、本トランスジェニックマウスの中枢神経組織において、EGFPが神経幹細胞特異的に発現していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、幹細胞特異的なプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有するベクター、または該ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物もしくは形質転換細胞を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１０−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１７−人工配列の説明：合成DNA
【図１】
2007046398.tif 000003
【図２】
2007046398.tif 000004
【図３】
2007046398.tif 000005
【図４】
2007046398.tif 000006
【図５】
2007046398.tif 000007
【図６】
2007046398.tif 000008
【図７】
2007046398.tif 000009
【図８】
2007046398.tif 000010
【配列表】
2007046398000001.app
【国際調査報告】
2007046398.tif 000011
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