(57)【要約】  本発明は、ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、及び抗酸化剤に関する。さらに、ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有する皮膚外用剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤。
【請求項２】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする細胞賦活剤。
【請求項３】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項４】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項６】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分とする保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、抗酸化剤、及び皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物抽出物を含有する保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、抗酸化剤、及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤への応用が検討されてきた。【０００３】
例えば、保湿剤としてラン科植物（特開２００２−２０５９３３号公報参照）、アガベ抽出物（特開２００２−１９３８２０号公報参照）、落花生種皮の抽出物（特開２００２−１４５７５７号公報参照）、サイリウム抽出物（特開２００２−１４５７５６号公報参照）、竜眼種子の抽出物（特開２００２−１４５７３２号公報参照）、オオバコ抽出物（特開２００２−１４５７３１号公報参照）が知られている。細胞賦活剤としてポンカンのエッセンス（特開２００１−１３１０４５号公報参照）、美白剤として白鶴霊芝の水及び／又は有機溶媒抽出物（特開２００３−８９６３０号公報参照）、中性脂肪蓄積抑制剤としてシッポゴケ属植物の抽出物（特開２００４−３３１５８０号公報参照）、抗酸化剤としてサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特開平１０−１８２４１３号公報参照）が知られている。【０００４】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、細胞賦活作用、美白作用、中性脂肪蓄積抑制作用、抗酸化作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来その効果が知られていなかったゼンマイ科植物抽出物に優れた保湿作用、細胞賦活作用、美白作用、中性脂肪蓄積抑制作用、抗酸化作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ゼンマイ科植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、または抗酸化剤に関する。
別の本発明は、ゼンマイ科植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤に関する。
【０００７】
本発明によれば、ゼンマイ科植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、および抗酸化剤を提供することができる。
これらの保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、抗酸化剤を化粧料、外用医薬品等の皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、皮膚の弾力低下、シミ、くすみといった種々の皮膚症状の発現防止や改善に優れた効果を発揮する、様々な組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ゼンマイ科（Ｏｓｍｕｎｄａｃｅａｅ）植物は、原始的なシダ植物であり、ゼンマイ属（Ｏｓｍｕｎｄａ）、トデア属（Ｔｏｄｅａ）、レプトプテリス属（Ｌｅｐｔｏｐｔｅｒｉｓ）などが知られている。ゼンマイ属（Ｏｓｍｕｎｄａ）植物としては、ゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、レガリスゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｒｅｇａｌｉｓ）、ヤシャゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｌａｎｃｅａ）、オオバヤシャゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ヤマドリゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）、オニゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｃｌａｙｔｏｎｉａｎａ）、シロヤマゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｂａｎｋｓｉｉｆｏｌｉａ）が知られている。
これらの植物は、単独で用いられるほか、２種以上を組み合わせて使用することもできる。【０００９】
本発明では、ゼンマイ科の植物であれば特に限定されないが、入手が比較的容易などの理由から適切なものとして、ゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ）が挙げられる。【００１０】
これらゼンマイ科植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、胞子体または配偶体の根、茎、幹、葉、若芽などの任意の部位を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
それらはそのまま粉砕して使用することもできるが、それらの部位からの抽出物を用いることが好ましい。【００１１】
抽出には、ゼンマイ科植物の胞子体、配偶体のいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、胞子体の全草、根、葉身、葉柄などを用いるとよい。その際、複数の部位を用いて抽出物を得るようにしてもよい。また、異なる溶媒を用いて抽出された抽出物を２種以上混合して用いてもよい。
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加温してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。【００１２】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。【００１３】
ゼンマイ科植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま放置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。或いは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ゼンマイ科植物の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。【００１４】
ゼンマイ科植物またはその抽出物は、優れた保湿作用、細胞賦活作用、美白作用、中性脂肪蓄積抑制作用、抗酸化作用を有し、保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、抗酸化剤として利用することができる。
これらの各剤は、ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他の成分の配合の有無等については、何ら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤、分散剤等）を任意に含むことができる。【００１５】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤は、皮膚や毛髪等に優れた保湿効果を与えるとともに、肌荒れ、小じわ、くすみといった皮膚症状の改善に優れた効果を発揮し、肌のキメを整え、肌の透明感を高めることができる。【００１６】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分とする細胞賦活剤は、優れた真皮線維芽細胞賦活効果及び表皮細胞賦活効果を有し、優れた細胞賦活作用を発揮する。【００１７】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたメラニン産生抑制効果及びチロシナーゼ活性阻害効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。【００１８】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤は、優れた中性脂肪蓄積抑制効果を有し、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を発揮する。【００１９】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたラジカルの消去効果、及びスーパーオキサイドアニオンの消去効果を有し、優れた抗酸化作用を発揮する。【００２０】
ゼンマイ科植物またはその抽出物を、化粧品、外用医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、シミ、くすみ、乾燥、小じわ等の様々な皮膚症状の防止・改善に優れた効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができる。したがって、たとえば、保湿用皮膚外用剤または美白用皮膚外用剤として好ましく使用することができる。【００２１】
ゼンマイ科植物またはその抽出物の皮膚外用剤中の配合量は、皮膚外用剤の種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、皮膚外用剤全量に対して、固形分換算で、０．０００１〜１０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。【００２２】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒、パック剤、貼布剤、パップ剤、エアゾール剤等、種々の剤型で提供することができる。【００２３】
皮膚外用剤には、ゼンマイ科植物またはその抽出物の他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料及び洗浄料等に通常配合される任意の成分、たとえば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、アルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、美白剤、中性脂肪蓄積抑制剤、抗酸化剤、あるいはゼンマイ科植物以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。
【実施例】
【００２４】
以下にゼンマイ科植物抽出物の調製例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤としての処方例、使用試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。【００２５】
＜調製方法１＞
ゼンマイ（Ｏｓｍｕｎｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の胞子体全草の乾燥粉砕物１ｋｇに５０質量％エタノール水溶液を２０リットル加え、室温で７日間浸漬した。抽出液をろ過して回収し、溶媒を除去した後、ゼンマイ科植物抽出物３０ｇを得た。【００２６】
＜調製方法２＞
ゼンマイの胞子体全草の乾燥粉砕物１ｋｇに水を２０リットル加え、９０℃にて６時間還流して抽出した。抽出液をろ過して回収し、溶媒を除去した後、ゼンマイ科植物抽出物２０ｇを得た。【００２７】
＜調製方法３＞
ゼンマイの胞子体全草の乾燥粉砕物１ｋｇにメタノール２０リットル加え、室温で７日間浸漬した。抽出液をろ過して回収し、溶媒を除去した後、ゼンマイ科植物抽出物５０ｇを得た。【００２８】
＜調製方法４＞
超臨界抽出装置にゼンマイの胞子体全草の乾燥粉砕物１００ｇを投入し、４０℃において１５Ｍｐａの大気圧下で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、ゼンマイ科植物抽出物１０ｇを得た。【００２９】
＜細胞賦活作用の評価１（真皮線維芽細胞賦活作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物の真皮線維芽細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表１に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価では、試料を含む培地の他に、ネガティブコントロールとして１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価結果を、ネガティブコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値として、表１に示す。【００３０】
【表１】
2008018133.tif 000002
【００３１】
表１より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物を添加した培地では、有意な真皮線維芽細胞賦活効果が認められた。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた真皮線維芽細胞賦活作用を有することが明らかとなった。【００３２】
＜細胞賦活作用の評価２（表皮細胞賦活作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物の表皮細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
ヒト表皮未全角化細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、市販のクラボウ社製Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２を用いた。２４時間培養後、表２に示す濃度で試料を添加した試験培地に交換し、さらに２４時間培養した。次いで、３−(４，５−ジメチル−２−チアゾリル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して２時間培養した後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
評価結果を、試料無添加の培地を用いたコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした場合の相対値として、表２に示す。【００３３】
【表２】
2008018133.tif 000003
【００３４】
表２より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物を添加した培地では、有意な表皮細胞賦活効果が認められた。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた表皮細胞賦活作用を有することがわかった。
以上のことから、ゼンマイ科植物抽出物は，優れた細胞賦活作用を有することが明らかとなった。【００３５】
＜美白作用の評価１（メラニン産生抑制作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物のメラニン産生抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法３により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を、１ディッシュ当り１．８×１０４個となるように播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表４に示す各濃度に調整した試料添加培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシンにより細胞を剥離し、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物の色を、表３に示す判定表に基づいて目視判定した。評価は５段階評価とし、ネガティブコントロール（判定５）に試料無添加の５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロール（判定１）に乳酸ナトリウムを５０ｍＭ含有する５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
また、メラニン産生量を評価するために、沈殿物にＳｏｌｕｅｎ−３５０（株式会社パーキンエルマージャパン）を加えて煮沸し、分光光度計（（株）日立ハイテクノロジーズ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
得られた結果を表４に示す。【００３６】
【表３】
2008018133.tif 000004
【００３７】
【表４】
2008018133.tif 000005
【００３８】
表４より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物を添加した培地では、有意なメラニン産生抑制効果が認められた。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用を有することがわかった。【００３９】
＜美白作用の評価２（チロシナーゼ活性阻害作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物のチロシナーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェル当たり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、クラボウ社製Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓによって表５に示す各濃度に調整した試料添加培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に、１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有リン酸緩衝液７５μＬに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μＬを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量を、式（１）に各測定値を導入して求めた。
式（１）：  生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）｝−２．１６６／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにより各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当たりのドーパメラニン生成量を求めた。測定結果を、試料無添加の培地を用いたコントロールの値を基準として、阻害率により表５に示す。【００４０】
【表５】
2008018133.tif 000006
【００４１】
表５より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物を添加した培地を用いた場合には、メラニン産生量の低下が認められた。このことより、ゼンマイ科植物抽出物は、優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有することがわかった。
以上のことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた美白作用を有することが明らかとなった。【００４２】
＜中性脂肪蓄積抑制作用の評価＞
ゼンマイ科植物抽出物の脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ・ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社）を、１ウェル当り１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ＰＧＭ培地（１０質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞が飽和状態になる直前に表６に示す濃度の試料を添加したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬ  インシュリン，１μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，２００μＭ  Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０日〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳにて洗浄の後、０．５ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳにて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。抽出後、マイクロプレートリーダーにより、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を測定した。
測定結果を、試料無添加の培地を用いたコントロールにおける、中性脂肪蓄積量を１００とした相対値により、表６に示す。【００４３】
【表６】
2008018133.tif 000007
【００４４】
表６より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物を添加した培地では、有意な中性脂肪蓄積抑制効果が認められた。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。【００４５】
＜抗酸化作用の評価１（ラジカル消去作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物の抗酸化作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
各試料を、５０質量％エタノールを用いて濃度調整して試料溶液とし、表７に示す濃度となるように９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、良く混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。その後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料を添加しなかった場合のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を式（２）に導入して求めた。結果を表７に示す。
式（２）：  ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）【００４６】
【表７】
2008018133.tif 000008
【００４７】
表７より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物には優れたＤＰＰＨラジカルの消去効果が認められた。このことより、ゼンマイ科植物抽出物は、優れたラジカルの消去作用を有することがわかった。【００４８】
＜抗酸化作用の評価２（スーパーオキサイドアニオン消去作用）＞
ゼンマイ科植物抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したゼンマイ科植物抽出物を用いた。
９６穴マイクロプレートに、表８に示す濃度となるように任意の濃度に希釈したゼンマイ抽出物のＨａｎｋｓ（＋）溶液２５μＬと、反応溶液７５μＬ（０．２５ｍＭ  ＮＢＴ，１ｍＭ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＨａｎｋｓ（＋）液(ｐＨ７．４)）を添加し、キサンチンオキシダーゼ溶液２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（３）の値をラジカル消去率とした。評価結果を表８に示した。
式（３）：  ｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）【００４９】
【表８】
2008018133.tif 000009
【００５０】
表８より明らかなように、ゼンマイ科植物抽出物には優れたスーパーオキサイドアニオンの消去効果が認められた。このことより、ゼンマイ科植物抽出物は、優れたスーパーオキサイドアニオンの消去作用を有することがわかった。
以上のことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。【００５１】
続いて、上記各調製方法で得られたゼンマイ科植物抽出物を配合した皮膚外用剤の処方例を示す。
［実施例１］乳液
配合：
【表Ａ】
2008018133.tif 000010
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。【００５２】
［実施例２］化粧水
配合：
【表Ｂ】
2008018133.tif 000011
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。【００５３】
［実施例３］クリーム
配合：
【表Ｃ】
2008018133.tif 000012
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。【００５４】
［実施例４］美容液
配合：
【表Ｄ】
2008018133.tif 000013
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。【００５５】
［実施例５］水性ジェル
配合：
【表Ｅ】
2008018133.tif 000014
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解させた（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。【００５６】
［実施例６］クレンジング料
配合：
【表Ｆ】
2008018133.tif 000015
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。【００５７】
［実施例７］洗顔フォーム
配合：
【表Ｇ】
2008018133.tif 000016
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。【００５８】
［実施例８］メイクアップベースクリーム
配合：
【表Ｈ】
2008018133.tif 000017
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。【００５９】
［実施例９］乳液状ファンデーション
配合：
【表Ｉ】
2008018133.tif 000018
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。【００６０】
［実施例１０］油中水型エモリエントクリーム
配合：
【表Ｊ】
2008018133.tif 000019
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに、（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。【００６１】
［実施例１１］パック
配合：
【表Ｋ】
2008018133.tif 000020
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。【００６２】
［実施例１２］入浴剤
配合：
【表Ｌ】
2008018133.tif 000021
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。【００６３】
［実施例１３］ヘアーワックス
配合：
【表Ｍ】
2008018133.tif 000022
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。【００６４】
［実施例１４］ヘアートニック
配合：
【表Ｎ】
2008018133.tif 000023
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。【００６５】
＜保湿作用の評価１（保湿性）＞
実施例１、３の皮膚外用剤を用いた使用試験を行い、ゼンマイ科植物抽出物の保湿性について評価した。その際、実施例１において配合したゼンマイ科植物抽出物を、５０％質量エタノール水溶液に代えたものを比較例１、実施例３において配合したゼンマイ科植物抽出物を、５０％質量エタノール水溶液に代えたものを比較例２として、同様に使用試験を行った。【００６６】
男女パネラー１５名を一群として、４群のパネラーに各試料をブラインドにてそれぞれ１か月間使用させ、「感じる」、「どちらともいえない」、「感じない」の三段階で評価した。表９に、各評価を得たパネラー数を示す。【００６７】
【表９】
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【００６８】
表９より、ゼンマイ科植物抽出物を配合した実施例使用群においては、８０％以上のパネラーに明確な保湿性が感じられることがわかった。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、優れた保湿作用を有することが明らかとなった。【００６９】
＜保湿作用の評価２（肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感）＞
実施例１、３及び比較例１、２の皮膚外用剤を用いた使用試験を行い、肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感について、それらの症状の改善効果を評価した。【００７０】
各試料について、肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感について悩みを持つ２０〜５０才代の男女パネラー２０名を一群とし、４群のパネラーに各試料をブラインドにてそれぞれ１か月間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。皮膚状態の指標として、肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感について、「改善」、「やや改善」、「変化なし」の三段階で評価した。肌荒れと肌の透明感は目視にて評価し、肌のキメはマイクロスコープを用いて観察した。表１０に各評価を得たパネラー数を示す。【００７１】
【表１０】
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【００７２】
表１０より、肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感について、ゼンマイ科植物抽出物を含有しない比較例１、２使用群においては、半数以上のパネラーに改善が認められなかったが、ゼンマイ科植物抽出物を配合した実施例使用群おいては、７０％以上のパネラーに明確な改善が認められた。このことから、ゼンマイ科植物抽出物は、肌荒れ、肌のキメ、肌の透明感において、皮膚症状の改善に優れた効果を有することがわかった。
以上のことから、ゼンマイ科植物抽出物は優れた保湿作用を有することが明らかとなった。
【国際調査報告】
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