(57)【要約】本発明は同一の蛋白質をコードするＤＮＡを連結した場合に、宿主内で連結した遺伝子間での相同組換えを抑える方法及び該遺伝子を提供する。本発明により相同組換えを抑えたヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターを用いた組換えペプチドの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、異なるオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド。
【請求項４】
連結する遺伝子群が配列表の配列番号１乃至１３からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子群であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
連結する遺伝子群が配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子群であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
連結する遺伝子群が配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至２９８、配列番号４１及び配列番号５３からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
連結する遺伝子群の数が２乃至５から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
連結する遺伝子群の数が、２又は３であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号６５のヌクレオチド番号１１乃至５９８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号６７のヌクレオチド番号１１乃至８９８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの上流にプロモーター領域及びリボソーム結合部位、下流に転写終結因子があることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことからなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項１３】
ｃｅｒ領域を含むことからなる、請求項１２に記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
ｒｅｃＡプラス株であることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞が大腸菌ＹＡ２１株又はＷ３１１０株であることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）請求項１４乃至１７からなる群から選択される宿主細胞を培養する工程。
ｉｉ）該宿主細胞により発現されたペプチドを回収する工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である２乃至５から選択されるいずれかの数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞より発現されたペプチドを回収する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である２乃至５から選択されるいずれかの数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現されたペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法
ｉ）配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の異なる２乃至５から選択されるいずれかの数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現されたペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程。
【請求項２２】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至２９５、配列番号４１及び配列番号５３から選択されるヌクレオチド配列からなる遺伝子を２又は３個、該遺伝子がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列を介して連結し、同一のオープンリーディングを構成するポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）配列表の配列番号６５のヌクレオチド番号１１乃至５９８又は配列番号６７のヌクレオチド番号１１乃至８９８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程。
【請求項２４】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）プラスミドｐＭＫ７．３により形質転換された宿主細胞を培養する工程：
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程。
【請求項２５】
以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）プラスミドｐＭＫ７．５により形質転換された宿主細胞を培養する工程：
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに対して、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程。
【請求項２６】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１８乃至２５のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、多重連結遺伝子を用いた遺伝子組換によって組換ペプチドを製造するに際し、多重連結遺伝子を構成する各遺伝子間の相同組換えを防ぐ方法に関するものであり、また、該方法によって作製された遺伝子に関するものであり、更に、該遺伝子を用いたペプチドの製造方法に関する。本発明の方法によって、組換えペプチドの効率的な生産が可能となる。
【背景技術】
【０００２】  多くのペプチドが遺伝子組換え技術を用いて微生物や動物細胞などを宿主として生産されている。【０００３】  一方、低分子量のペプチドを発現させる場合には、宿主が有するプロテアーゼによる目的ペプチドの分解（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８８），２６３，ｐ．１３０７−１３１３）を防ぐために、目的ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に別のペプチドを付加した融合蛋白質として発現させる方法が採用されている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９８７），２１０，ｐ．５６−６０）しかし、この方法では、目的ペプチドの分子量が小さいほど、融合蛋白質に占める目的ペプチドの割合が小さくなり、目的のペプチドを十分量生産することは困難になる。【０００４】  融合蛋白質内での目的ペプチドの占める割合を増大させるために、目的ペプチドをコードする遺伝子を複数個連結させたものを挿入した発現ベクターを構築し、これを用いて形質転換させた宿主を培養することにより、多量の目的ペプチドを発現採取する方法が報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８４），８１，ｐ．４６２７−４６３１）。そして、この方法を応用した大腸菌を用いたヒトカルシトニンの生産も報告されている（特開平５−３２０１９６号公報及びＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（１９９６），８２，ｐ．１４０−１４４）。【０００５】  しかし、同一配列を多重化したＤＮＡは、宿主内で同一の配列同士の相同組換えによって失われることがあり、ペプチドの安定生産のためには、相同組換えを防ぐ必要があった。【０００６】  相同組換えは、主にＲｅｃＡ蛋白質によって起こることが知られており（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｇ．Ｍら著、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ」、１９８４年、ｐ．１０３４−１０４３）、ＲｅｃＡ遺伝子を持たない、ＲｅｃＡ−の大腸菌を使用することによってある程度相同組換えを防ぐことができるが、なお相同組換えが起こり得ることが報告されており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９３），２８，ｐ．３０１−３１２）、相同組換えを更に抑え、目的とするペプチドの安定生産が達成される方法が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の課題は、同一の蛋白質をコードする遺伝子を連結した場合に、宿主内で連結した遺伝子間での相同組換えを抑える方法を提供することである。【０００８】  さらに本発明の一つの課題は、ＲｅｃＡのような相同組換えに関与する遺伝子を宿主が有するか有さないかに関わらず、同一のタンパク質をコードする遺伝子を連結した場合に相同組換えを抑える方法を提供することである。
さらに本発明の一つの課題は、ＲｅｃＡを有する宿主を用いて同一の蛋白質をコードする遺伝子を連結した場合に宿主内で相同組換えを抑える方法を提供することである。【０００９】  さらに本発明の一つの課題は、相同組換えを抑えたベクターを提供することである。【００１０】  さらに本発明の一つの課題は、該ベクターを使用したペプチドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行ったところ、目的ペプチドをコードする遺伝子を複数個連結する場合に、コードするアミノ酸が変わらない範囲でヌクレオチド配列を改変し、連結する複数の遺伝子のヌクレオチド配列が相同にならないようにすることで、連結した遺伝子同士の相同組換えを防ぐことができることを発見し本発明を完成した。
本発明は、ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群を連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド及び、該ポリヌクレオチドを用いたペプチドの製造方法等に関する。【００１２】  本発明によって、多重連結遺伝子を構成する遺伝子群同士の相同組換による遺伝子の欠失を防ぐことができ、遺伝子組換え法による物質の生産性の低下を防ぐことができる。【００１３】  すなわち、本発明は、
（１）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド、
（２）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド、
（３）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、異なるオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチド、
（４）連結する遺伝子群が配列表の配列番号１乃至１３からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子群であることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
（５）連結する遺伝子群が配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子群であることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
（６）連結する遺伝子群が配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至２９８、配列番号４１及び配列番号５３からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（７）連結する遺伝子群の数が２乃至５から選択されるいずれかであることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
（８）連結する遺伝子群の数が、２又は３であることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
（９）配列表の配列番号６５のヌクレオチド番号１１乃至５９８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
（１０）配列表の配列番号６７のヌクレオチド番号１１乃至８９８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
（１１）（１）乃至（１０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの上流にプロモーター領域及びリボソーム結合部位、下流に転写終結因子があることを特徴とするポリヌクレオチド、
（１２）（１）乃至（１１）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、
（１３）ｃｅｒ領域を含むことからなる、（１２）に記載の組換えＤＮＡベクター、
（１４）（１２）又は（１３）に記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞、
（１５）ｒｅｃＡプラス株であることを特徴とする、（１４）に記載の宿主細胞、
（１６）宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載の宿主細胞。
（１７）宿主細胞が大腸菌ＹＡ２１株又はＷ３１１０株であることを特徴とする、（１４）に記載の宿主細胞。
（１８）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）（１４）乃至（１７）からなる群から選択される宿主細胞を培養する工程。
ｉｉ）該宿主細胞により発現されたペプチドを回収する工程。
（１９）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である２乃至５から選択されるいずれかの数からなる遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞より発現されたペプチドを回収する工程、
（２０）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である２乃至５から選択されるいずれかの数からなる遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現されたペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程、
（２１）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法
ｉ）配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の異なる２乃至５から選択されるいずれかの数の遺伝子群が、該遺伝子群がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列をコードする遺伝子を介して連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現されたペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程、
（２２）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至２９５、配列番号４１及び配列番号５３から選択されるヌクレオチド配列からなる遺伝子を２又は３個、該遺伝子がコードするペプチドを分解しないプロテアーゼで切断される配列を介して連結し、同一のオープンリーディングを構成するポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、ペプチドの連結部分にのみ作用するプロテアーゼを作用させ、反応液より連結部分が切断されたペプチドを回収する工程、
（２３）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）配列表の配列番号６５のヌクレオチド番号１１乃至５９８又は配列番号６７のヌクレオチド番号１１乃至８９８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターにより形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程。
（２４）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）プラスミドｐＭＫ７．３により形質転換された宿主細胞を培養する工程：
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程、
（２５）以下の工程を含む、ペプチドの製造方法：
ｉ）プラスミドｐＭＫ７．５により形質転換された宿主細胞を培養する工程：
ｉｉ）該宿主細胞で発現された組換えペプチドに対して、トリプシンを作用させ、反応液より配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを回収する工程。
（２６）宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする、（１８）乃至（２５）のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
からなる。
【発明の効果】
【００１４】  本発明により、多重連結遺伝子を用いた組換ペプチドの生産に際し、遺伝子間の相同組換えを防ぐことが可能になり、安定した組換ペプチドの生産が可能になった。【００１５】  また、本発明により、相同組換えの起きにくい多重連結遺伝子が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  １．用語の説明
本明細書中において、多重連結遺伝子とは、同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする複数の遺伝子群が同一のオープンリーディングフレームを構成している遺伝子をいう。多重連結遺伝子を構成する遺伝子群は、同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドの連結部分には開始コドン及び終止コドンが含まれないようにしてある。本明細書中において遺伝子の多重化とは、遺伝子を複数連結することをいい、具体的には、同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする複数の遺伝子群が同一のオープンリーディングフレームを構成するようにすることをいう。また、同一のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする複数の遺伝子群が異なるオープンリーディングフレームを構成ようにすることも遺伝子の多重化という。本明細書中において遺伝子を多重化する場合の遺伝子の数は特に制限はないが、ペプチドの種類やペプチドのアミノ酸残基数によって異なる。なお、本明細書中においては、「蛋白質」と「ペプチド」の用語については同じ意味に用いており、特に区別していない。【００１７】  ２．遺伝子の多重化
（１）目的ペプチド
本発明により生産することができる目的ペプチドは特に限定されるものではないが、例えば、以下のペプチドを挙げることができる。【００１８】  生物由来のペプチドの例としては、副腎皮質刺激ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ），アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ），アミリン（Ａｍｙｌｉｎ），アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）Ｉ，アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩ，アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩＩ，Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（Ａ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｂ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ），ビッグガストリン（Ｂｉｇ  Ｇａｓｔｒｉｎ），カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ），カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ），コレシストキニン（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ），コルチコトロピン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ），コルチスタチン（Ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ），Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｃ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），デフェシン（Ｄｅｆｅｓｉｎ）１，デルタ・スリープ、インデューシングペプチド（Ｄｅｌｔａ  Ｓｌｅｅｐ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），ダイノルフィン（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ），エラフィン（Ｅｌａｆｉｎ），α−エンドルフィン（α−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ），β−エンドルフィン（β−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ），γ−エンドルフィン（γ−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ），エンドセリン−１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１），エンドセリン−２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２），エンドセリン−３（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３），ビッグエンドセリン−１（Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１），ビッグエンドセリン−２（Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２），ビッグエンドセリン−３（Ｂｉｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３），エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ），ガラニン（Ｇａｌａｎｉｎ），ビッグカストリン（Ｂｉｇ  Ｇａｓｔｒｉｎ），ガストリン（Ｇａｓｔｒｉｎ），ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ），ガストリン放出ペプチド（Ｇａｓｔｒｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ），グルカゴン様ペプチド−２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｉｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２），成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ），成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ），グアニリン（Ｇｕａｎｙｌｉｎ），ウログアニリン（Ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ），ヒスタチ５（Ｈｌｓｔａｔｉｎ  ５），インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ），ジョイニングペプチド（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），黄体ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ），黒色細胞刺激ホルモン（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ），ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ），モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）��ニューロキニンＡ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ａ），ニューロキニンＢ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ｂ），ニューロメジンＢ（Ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ  Ｂ），ニューロメジンＣ（Ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ  Ｃ），ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ），ニューロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ），オキシトシン（Ｏｘｙｔｃｉｎ），プロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  Ｐｅｐｔｉｄｅ），クロモグラニンＡ（Ｃｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ），副甲状腺ホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ），ＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ），ペプチドヒスチジン−メチオニン−２７（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎ−２７），脳下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ポリペプチド３８（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ３８），血小板因子−４（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４），ペプチドＴ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ），セクレチン（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ），血清胸腺因子（Ｓｅｒｕｍ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ），ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ），サブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ），チロトロピン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ），ウロコルチン（Ｕｒｏｃｏｒｔｌｎ），管活性腸ペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）及びこれらの誘導体、塩等が挙げられる。これらのペプチドのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから入手することが出来る。【００１９】  人工的に合成されたペプチドの例としては、特開平２００３−７９３８９号特許公開公報に記載されている、ポリペプチドＡ（配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ポリペプチドＢ（配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、特開２０００−３２７６９９号特許公開公報に記載されたペプチド１（配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド２（配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド３（配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド４（配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド５（配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド６（配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド９（配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド１０（配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド１１（配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチド１２（配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、ペプチドＨ７−３（配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、及び、これらの誘導体、塩等を挙げることができる。【００２０】  なお、本発明においてはこれ���のペプチドに加えて、これらのペプチドのアミノ酸配列の一部が置換、欠失、付加されているペプチドも用いることができる。【００２１】  （２）ヌクレオチド配列の改変
本発明においては、遺伝子の多重化を行うに際し、連結する複数の遺伝子群間で、ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一であるようにヌクレオチド配列を改変し、遺伝子間の相同組換えを防いでいる。【００２２】  目的とするペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の改変は、ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸を変更しない範囲で行うことができる。アミノ酸をコードするヌクレオチド配列（コドン）は表１に記載したとおりである。例えば、セリンをコードするヌクレオチド配列は、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃの６種類あるので、これらの６種類のヌクレオチド配列の間ではヌクレオチド配列を改変してもこれらのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸は変わらないことになる。【００２３】
【表１】
2007004538.tif 000002
なお、生物種ごとにコドンの使用頻度が異なるので、ヌクレオチド配列の改変に際しては、コドン使用頻度を考慮した上で使用頻度の高いコドン同士を改変することがより好ましい。例えば、大腸菌を宿主としてペプチドを発現させる場合には、大腸菌のコドン使用頻度をデータベース等（例えば、ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４５．０）を使用して調べた上で、使用頻度の高いコドン間で改変を行うことがより好ましい。【００２４】  また、メチオニンやトリプトファンのように、１種類のコドンしかないアミノ酸もあり、全てのコドンを別のヌクレオチド配列からなるコドンに変更することはできないが、遺伝子同士の相同組換えを防ぐことができる限りにおいて、変更するコドンの数は特に制限されない。【００２５】  本発明で用いることができるヌクレオチド配列の改変方法としてはヌクレオチド配列を改変できる限りにおいて特に制限されないが例えば、以下のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかの方法を用いることができる。【００２６】  ｉ）目的とするペプチドの遺伝子のヌクレオチド配列にもとづいて、各アミノ酸残基のコドンごとに同じアミノ酸をコードする他のヌクレオチド配列からなるコドンに塩基配列を改変した、合成オリゴヌクレオチドを作製する。
例えば、目的とするペプチドのアミノ酸配列が、
Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ（配列表の配列番号３３のアミノ酸番号４乃至１６）、ヌクレオチド配列が、
ｇｇｔ  ａｔｃ  ａｔｃ  ｇｃａ  ｇｃａ  ｔａｃ  ｃａｇ  ａａｃ  ｃｃｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ｔｇｇ  ａａａ（配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至４９）
である場合には、下記のようなヌクレオチド配列：
ｇｇｃ  ａｔｔ  ａｔｔ  ｇｃｇ  ｇｃｇ  ｔａｔ  ｃａａ  ａａｔ  ｃｃｇ  ｇｃｇ  ａｇｃ  ｔｇｇ  ａａｇ（配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至３９）
からなるオリゴヌクレオチドを合成すれば、該オリゴヌクレオチドがコードするペプチドのアミノ酸配列は配列表の配列番号３３のアミノ酸番号４乃至１６となり、コードするアミノ酸配列は同じであるが、ヌクレオチド配列の異なる遺伝子を取得することができる。そして、両遺伝子を連結した二重遺伝子を含む発現ベクターにおいて相同組換えを抑制することができる。【００２７】  ｉｉ）目的とするペプチドのアミノ酸残基数が多く、ＤＮＡ合成機で一度に合成することが難しい場合には、例えばヌクレオチド配列の５’側及び／又は３’側がオーバーラップするようにして該ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を分割したコドンを変更した複数の合成オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングしてＤＮＡリガーゼで連結するという方法を用いることができる。【００２８】  ｉｉｉ）部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法を用いることができる。【００２９】  （３）遺伝子の多重化
本発明における遺伝子の多重化は、上記（２）に記載の方法によって作製された、ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群を同一のオープンリーディングフレームを構成するように連結することによって達成される。本発明における遺伝子の多重化は、また、上記（２）に記載の方法によって作製された、ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が、異なるオープンリーディングフレームを構成するように連結することによっても達成される。【００３０】  ｉ）本発明における多重化遺伝子の例としては、ヌクレオチド配列は異なるがコードするアミノ酸配列が同一である複数の遺伝子群が連結し、同一のオープンリーディングフレームを構成するポリヌクレオチドを挙げることができる。複数の遺伝子群が連結して同一のオープンリーディングフレームを構成するようにするためには、遺伝子の連結部分に終止コドンが含まれないようにする点に留意する。【００３１】  目的とするペプチドをコードする遺伝子を二重化した場合には発現したペプチドは目的とするペプチドが２つ結合したペプチドになり、目的とするペプチドをコードする遺伝子を三重化した場合には発現したペプチドは目的とするペプチドが３つ結合したペプチドになり、この様に発現するペプチドは多重化する遺伝子の数に応じて分子量が大きくなる。【００３２】  多重連結遺伝子によって、発現する複数のペプチドが連結したペプチド（「多重連結ペプチド」という。）は酵素処理や化学処理を行って、目的とするペプチドの間の連結部分を切断し、目的とするペプチドにすることができる。そのような方法としては例えば目的とするペプチドの連結部分に特定の酵素で切り取られるようなアミノ酸配列をあらかじめリンカーとして付しておく方法を用いることができる。【００３３】  例えば、目的とするペプチドにトリプシン切断部位がない場合には、目的とするペプチドの連結部分にトリプシンで切断除去されるアミノ酸（例えばアルギニン）をコードするヌクレオチド配列をあらかじめ付加しておけば、発現した多重連結ペプチドをトリプシンで処理することによって、該アミノ酸のカルボニル側のペプチド結合を切断し、目的とするペプチドを取得することができる。【００３４】  連結ペプチドを切断する別の方法としては、目的とする遺伝子の連結部分に特定のプロテアーゼで切断する配列を付加しておき、該配列を認識するプロテアーゼを多重連結遺伝子と同じ読み枠で接続する方法を用いることができる（特開平８−８０１９４参照）。この方法を用いれば、発現したペプチドに対して別途酵素処理を行う必要がない。【００３５】  コードするアミノ酸配列は同じであるがヌクレオチド配列が異なる遺伝子の連結は、例えば次のようにして行うことができる。【００３６】  まず、目的遺伝子の５’端及び３’端に制限酵素の切断部位を導入する。この場合、導入する制限酵素切断部位はどのようなものでもよいが、好ましくは目的遺伝子内にその制限酵素切断部位を持たないものである。また、発現ベクターを用いる場合にはマルチクローニングサイトに存在する制限酵素認識部位を選択すれば容易に目的の遺伝子を発現ベクターに組み込むことが���きる。この際に、多重連結ペプチドの連結部分が切断するようなプロテアーゼ認識配列を付加することもできる。【００３７】  これらの制限酵素切断部位を目的遺伝子に導入する場合には、あらかじめ制限酵素切断部位を導入した合成オリゴヌクレオチドを使用する他、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変等の方法が使用できる。【００３８】  制限酵素切断部位は５’側では目的遺伝子のアミノ酸をコードしている領域の上流であり、３’側では目的遺伝子のアミノ酸をコードしている領域の下流であればいずれの場所でもよいが、好ましくはコード領域の直前及び直後である。【００３９】  ２連結遺伝子を含む発現ベクターは例えば以下の方法で作成することができる。まず制限酵素認識部位の導入された第１の遺伝子を該制限酵素で切断し、切断断片を分離精製する。次いで、あらかじめ制限酵素処理をした発現ベクターにＤＮＡリガーゼでつなぎ合わせる。この際必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて制限酵素切断面を平滑化してからつなぐこともできる。次に該遺伝子が導入されたベクターを精製し、該ベクターの外側に該遺伝子の３’側のアミノ酸をコードする領域の外側を切断する制限酵素で処理し、目的とする第１の遺伝子の下流に制限酵素コドンを改変した第２の遺伝子を同じ転写方向で結合する。【００４０】  ３連結遺伝子の場合には更に同様の方法で第３の遺伝子を同じ転写方向で結合する。【００４１】  ｉｉ）本発明の他の１つの例としては、リボゾーム結合領域、翻訳開始コドン及び構造遺伝子を含む発現単位を複数連結したＤＮＡ断片間において相同組換えが起きないように一方の遺伝子のヌクレオチド配列を、構造遺伝子部分のアミノ酸配列を改変しない範囲で改変する方法を挙げることができる。【００４２】  発現単位を複数連結したＤＮＡ断片は、例えば、特開平１−９５７９８に記載の方法で作製することができる。また、ヌクレオチド配列の改変は、上記ｉ）に記載の方法で行うことができる。
（４）多重連結遺伝子の発現
発現ベクターとしては宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターを用いることが出来る。プラスミドベクターにはプロモーター領域、オペレーター領域、転写終結因子を含む。また、当該発現ベクターにはリプレッサー領域、プラスミドの多量体化を防ぐ領域、及び／又は薬剤耐性領域を含むことができる。このようなベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合には一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種ベクターがいずれも使用できる。【００４３】  該ベクターの有するプロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、これらのプロモーターを目的のポリペプチドの産生に使用することができる。【００４４】  オペレーター領域としては例えば、大腸菌のｌａｃ  ＵＶ５、ｔｒｐ、ｒｅｃ  Ａ等のオペレーター領域相当の塩基配列が挙げられる。【００４５】  転写終結因子としては例えば、ｔｒｐＡターミネーター、ｌａｃオペロンのターミネーター及びｐＢＲ３２２のターミネーター等を挙げることができる。【００４６】  プラスミドの多量体化を防ぐ領域としては例えば、大腸菌のＣｏｌＥ１プラスミド由来のｃｅｒ領域（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（１９８９），８，ｐ．３０９−３１５）等を挙げることが出来る。【００４７】  薬剤耐性遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を挙げることが出来る。【００４８】  上記ベクターに、上記（３）で作製した多重連結遺伝子を導入することによって、多重連結遺伝子を発現するベクターを構築することが出来る。【００４９】  本発明の方法で作製したベクターではベクター内の多重連結遺伝子間の相同組換えを抑えることができるので、相同組換に関与する遺伝子であるｒｅｃＡ等を有さない株はもちろん、ｒｅｃＡ等を有する株でも宿主として用いることができる。ＲｅｃＡを有する（ＲｅｃＡ＋）大腸菌としては例えば、大腸菌ＹＡ２１株（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３６，１９７８，ｐ．６９３−６９９参照：Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）及び大腸菌Ｋ１２株由来のＷ３１１０株、大腸菌ＢＬ２１株を挙げることが出来る。また、ＲｅｃＡを有さない（ＲｅｃＡ−）大腸菌としては、例えば大腸菌ＢＬＲ株を挙げることが出来る。【００５０】  このようにして得られた発現ベクターは常法に従って、宿主、例えば大腸菌等に導入して形質転換体を得ることができ、該形質転換体を培養して発現したペプチドを酵素処理や化学処理することによって取得することができる。また、上述のようにプロテアーゼを同時に発現するようにすれば、酵素処理の工程を経ることなく目的とするペプチドを取得することができる。
【実施例】
【００５１】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、当業者が通常行う方法、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。【００５２】  以下、スギ花粉症に対する治療効果を有するＴ細胞エピトープポリペプチド（特開２０００−３２７６９９号公報にペプチド１１として記載）をコードする遺伝子を例として、多重連結遺伝子を作製した。【００５３】  実施例１．Ｔ細胞エピトープペプチド遺伝子の構築と組換えタンパク質の生産
（１）Ｔ細胞エピトープポリペプチド遺伝子の構築
Ｔ細胞エピトープポリペプチドＨ７−３（以下、「Ｈ７−３」とする。アミノ酸配列：配列表の配列番号１３）をコードする遺伝子（配列表の配列番号３２のヌクレオチド番号１１乃至２９８に示されるヌクレオチド配列からなる。）の多重連結遺伝子を以下のように構築した。【００５４】  Ｈ７−３のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３）に基づいて大腸菌のコドン使用頻度（Ｇｒａｎｔｈａｍ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，４３−７４，１９８１）を考慮して塩基配列を設計した。１６の部分に分割した合成オリゴヌクレオチド（Ｆ１、Ｆ８乃至Ｆ１２、Ｆ１５乃至Ｆ２４）をＤＮＡ合成器（ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３９４，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で合成した。各合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
2007004538.tif 000003
これらの合成オリゴヌクレオチドのｈ７−３−１との対応を示す（図１）。【００５５】  各合成オリゴヌクレオチドのうち、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３及びＦ２４の１４種の合成オリゴヌクレオチドの５’末端側をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ：Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．２０２１ｓ）でリン酸化した。各１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドをＦ１とＦ２０、Ｆ１９とＦ２２、Ｆ２１とＦ２４、Ｆ２３とＦ８、Ｆ９とＦ１０、Ｆ１１とＦ１２、Ｆ１５とＦ１６、Ｆ１７とＦ１８との組み合わせで混合し、１００℃で５分間加熱処理した後、室温にて徐冷し、アニーリングした。【００５６】  形成した二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．６０２２）を使用して連結し、
ＰＲｖプライマー：ｇｇａｔｃｃｇｃｇｔ  ｇｇｔａｔｃａｔｃｇ  ｃａ（配列表の配列番号３０）、
とＰＦｗプライマー：ａｇｇｔｃｇａｃｔｔ  ａｃａｇａｔｃｔｇｃ  ａｃ（配列表の配列番号３１）
を使用して、ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ７７４Ａ）によるＰＣＲ反応（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって増幅を行った。【００５７】  ＰＣＲ反応によって増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＵＣ１８ベクター（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．３２１８）にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を使用して連結した。次にこのベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．９０５２）に導入し、形質転換体を得た。形質転換体より調製した目的の遺伝子が挿入されたプラスミドをｐＵＣ（ｈ７−３）と命名した。【００５８】  （２）Ｔ細胞エピトープペプチド遺伝子発現ベクターの構築
Ｔ細胞エピトープペプチドを発現するために、以下のように発現ベクターを構築した。【００５９】  （２）−１  プラスミドｐＭＫＹ０１の構築
（１）で得られたプラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．６０２５）で末端の平滑化を行った。得られた直鎖状ＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化することによって、Ｈ７−３ペプチドをコードする遺伝子ｈ−７−３−１を含むポリヌクレオチド（配列表の配列番号３２）を回収した。このポリヌクレオチドと、制限酵素ＳａｃＩで消化し次いでＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔで末端の平滑化を行った後、制限酵素ＳａｌＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。この形質転換体を培養して調製されたプラスミドをｐＭＫＹ０１と命名した。【００６０】  プラスミドｐＭＫＹ０１内では、Ｈ７−３ペプチドをコードするポリヌクレオチドｈ７−３−１がプラスミドｐＵＣ１８由来のｌａｃＺ遺伝子と同じ読み枠（インフレーム：ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で連結されており、ペプチドＨ７−３を含むペプチド（配列表の配列番号３３）がｌａｃプロモーター制御下でβ−ガラクトシダーゼのＮ末端７アミノ酸残基：
Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ（配列表の配列番号３４）
との融合蛋白質として発現される。【００６１】  （２）−２  プラスミドｐＭＫＹ０２の構築
次に、融合蛋白質遺伝子の終止コドンの下流にｔｒｐＡターミネーター遺伝子を導入した。ｔｒｐＡターミネーター遺伝子をコードする合成オリゴヌクレオチドＳｔｒｐＮ：
ｔｃｇａｃａｇｃｃｃ  ｇｃｃｔａａｔｇａｇ  ｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｃａ（配列表の配列番号３５）、
とＮｔｒｐＳ：ｔａｔｇａａａａａａ  ａａｇｃｃｃｇｃｔｃ  ａｔｔａｇｇｃｇｇｇ  ｃｔｇ（配列表の配列番号３６）
を１００℃で５分間煮沸し、室温で徐冷することによって二本鎖ＤＮＡ断片を調製し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．２０２１Ｓ）で５’末端のリン酸化を行った。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｌＩとＮｄｅＩで消化したプラスミドｐＭＫＹ０１とＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。形質転換体から得られたプラスミドをｐＭＫＹ０２と命名した。ｐＭＫＹ０１及びｐＭＫＹ０２の構築方法を示した（図２）。【００６２】  （２）−３  プラスミドｐＭＫＹ０３の構築
次に、プラスミドｐＭＫＹ０２を制限酵素ＰｖｕＩＩとＳｓｐＩで消化することによって得られる０．９ｋｂのｌａｃＺプロモーターからｔｒｐＡターミネーターまでの領域を含む断片をプラスミドｐＢＲ３２２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．３０５０）の制限酵素ＰｖｕＩＩ−ＳｓｐＩの二重消化によって得られる複製オリジン領域を含む２．１ｋｂ断片にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。形質転換体から得られたプラスミドをｐＭＫＹ０３と命名した。【００６３】  （２）−４  プラスミドｐＭＫＹ０４の構築
プラスミドｐＭＫＹ０３のプラスミドｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子へ置換した。まず、プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア，２７−４８９７−０１）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して得られるカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニングサイトに存在するＥｃｏＲＩサイトにＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。形質転換体から得られたプラスミドをｐＵＧ４１８と命名した。【００６４】  プラスミドｐＵＧ４１８をＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔで末端の平滑化を行った後、プラスミドｐＭＫＹ０３を制限酵素ＳｓｐＩ及びＤｒａＩで消化して得られた２．１ｋｂの断片に、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。形質転換体から得られたプラスミドをｐＭＫＹ０４と命名した。ペプチドＨ７−３をコードする遺伝子ｈ７−３−１発現ベクター、ｐＭＫＹ０３及びｐＭＫＹ０４の構築方法を示す（図３）。【００６５】  （３）ｐＭＫＹ０４を用いた組換えタンパク質の生産
ｐＭＫＹ０４を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３６，１９７８，ｐ．６９３−６９９参照：Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）に塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。【００６６】  形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１０ｇトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇイーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ塩化ナトリウムをそれぞれ１Ｌの溶液に含む）にて、３７℃で８時間、振とう培養した。【００６７】  次に培養液を２％接種量になるように、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む生産培地（５０ｇグリセロール、１０ｇイーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ）、７ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、４ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ  Ｌ−ロイシン、２ｇ  Ｌ−メチオニン、１．２ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０４ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ  ＣａＣｌ２、０．０１ｇ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００４ｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ  ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０００５ｇ  Ｈ３ＢＯ３をそれぞれ１Ｌの溶液に含む）に添加して、３７℃で２０から２２時間、三角フラスコを使用して振とう培養を行った。【００６８】  培養後の菌体より抽出した総蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、目的とする組換え蛋白質の発現量は図に示す程度であった（図４）。【００６９】  実施例２．多重（２連結）遺伝子の構築と組換えタンパク質の生産
多重連結遺伝子の例として、同一の遺伝子を二重化した。
（１）ニ重化遺伝子及びペプチド発現ベクターの構築
（１）−１  プラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）２の構築
実施例１で構築したプラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）に導入されたペプチドＨ７−３をコードする遺伝子ｈ７−３−１のヌクレオチド配列（配列表の配列番号３２）には、ＰＲｖプライマーとＰＦｗプライマーによって導入された制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩがある（図５）。ｐＵＣ（ｈ７−３）をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化してＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を得た。また、別にｐＵＣ（ｈ７−３）をＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化した。ｐＵＣ（ｈ７−３）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位にｈ７−３−１のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体より調製したプラスミドをｐＵＣ（ｈ７−３）２と命名した。ｐＵＣ（ｈ７−３）２の構築方法を図６に示す。【００７０】  （１）−２  プラスミドｐＫＢＲ７．１の構築
プラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）２を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、Ｈ７−３をコードする遺伝子が二重化したペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、Ｈ７−３を含むペプチドをコードする遺伝子が二重化したペプチドの遺伝子を「ｈ７−３−１−ｈ７−３−１」とする。）（配列表の配列番号３７）を回収した。次に、ｈ７−３−１−ｈ７−３−１を発現させるために、実施例１で構築したプラスミドｐＭＫＹ０４を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化し、回収したｈ７−３−１−ｈ７−３−１をコードするポリヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いてＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐＭＫＹ０４に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。形質転換体より調製したプラスミドをｐＫＢＲ７．１と命名した。プラスミドｐＫＢＲ７．１では、ｈ７−３−１−ｈ７−３−１が、β−ガラクトシダーゼの開始アミノ酸より７アミノ酸：Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ（配列表の配列番号３４）
の下流に同じ読み枠で連結されており、ｌａｃプロモーターによってその発現が制御されている。ｐＫＢＲ７．１の作製方法を図７に示す。【００７１】  （２）二重化遺伝子を用いた組換えタンパク質の生産
ｐＫＢＲ７．１を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株（Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）に塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。形質転換体を実施例１の（３）と同様の方法で培養した。【００７２】  菌体より抽出した総蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端アミノ酸配列解析によって分析し、β−ガラクトシダーゼ由来の７アミノ酸残基：
Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ（配列表の配列番号３４）のうち、Ｎ末端のメチオニンが除去された６残基からなるペプチドとペプチドＨ７−３との融合タンパク質が発現していることを確認した。大腸菌では、しばしば、メチオニンアミノペプチダーゼによって、Ｎ末端のメチオニンが除去されることが報告されている（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，７５１−７５７，１９８７）ことから、Ｎ末端のメチオニンは、上記メチオニンアミノペプチダーゼで除去されていることが推察された。【００７３】  （３）二重化遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−１の検出
プラスミドＤＮＡ自動抽出装置（ＫＵＲＡＢＯ  ＰＩ−５０α）を用いて、上記（２）で得られた大腸菌の培養液からプラスミドｐＫＢＲ７．１を抽出した。次いでｐＫＢＲ７．１を鋳型とし、ＹＡＳ１プライマー：
ｔｔａｔｇｃｔｔｃｃ  ｇｇｃｔｃｇｔａｔｇ（配列表の配列番号３９）とＹＡＡ１プライマー：
ａａａａａｇｃｃｃｇ  ｃｔｃａｔｔａｇｇｃ（配列表の配列番号４０）をプライマーとして、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｎｏ．ＲＲ０２ＡＧ）によるＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用。）によってｈ７−３−１−ｈ７−３−１遺伝子の増幅を試みた。【００７４】  その結果、形質転換体には、遺伝子が二重化したｈ７−３−１−ｈ７−３−１遺伝子を保持するプラスミド以外に、二重化していないｈ７−３−１遺伝子を保持するプラスミドも存在することが明らかになった。これは、培養中に、２重化したＨ７−３をコードする遺伝子を標的とした相同組換えが生じ、二重に存在したＨ７−３をコードする遺伝子の１つの遺伝子に相当する領域が消失したためと考えられた。【００７５】  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、増幅断片の塩基配列の解析によっても１つの遺伝子が消失していることが確認できた。また、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に三角フラスコ培養終了時点での培養液を塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ法を上述したＰＣＲ反応と同様に行った結果、二重に存在したＨ７−３をコードする遺伝子（ｈ７−３−１−ｈ７−３−１）の１つの遺伝子に相当する領域が消失した形質転換体が含まれていた。【００７６】  結果を図８及び図９に示す。【００７７】  実施例３．コドン改変遺伝子を用いた多重（２連結）遺伝子の構築と組換えタンパク質の生産
（１）コドン改変遺伝子の構築
実施例２により、同一配列の遺伝子を多重化した遺伝子同士の相同組換えにより、多重化した遺伝子が欠落することが明らかとなった。相同組換えの推定模式図を示す（図１０）。
そこで、実施例２で使用した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株の起源株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４５．０）を考慮して、実施例１に記載したＨ７−３をコードする遺伝子のコドンを改変した遺伝子を設計し、その遺伝子をｈ７−３−２と命名した。ｈ７−３−２のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１に記載されている。【００７８】  ｈ７−３−２のヌクレオチド配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて下記のオリゴヌクレオチドを合成した。
2007004538.tif 000004
これらのプライマーとｈ７−３−２との対応を図１１に示した。【００７９】  ｍｏｄ１及びｍｏｄ２ｃ、ｍｏｄ３及びｍｏｄ４ｃ、ｍｏｄ５及びｍｏｄ６ｃ、ｍｏｄ７及びｍｏｄ８ｃ、並びに、ｍｏｄ９及びｍｏｄ１０ｃは、それぞれ、３’−末端側が１０ｂｐオーバーラップするように設計した。ｍｏｄ１及びｍｏｄ２ｃ、ｍｏｄ３及びｍｏｄ４ｃ、ｍｏｄ５及びｍｏｄ６ｃ、ｍｏｄ７及びｍｏｄ８ｃ、並びに、ｍｏｄ９及びｍｏｄ１０ｃの各組み合わせをＰＣＲプライマーとしてＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．１２３４４−０２４）を使用して、ＰＣＲを行った。それぞれのプライマーの組み合わせで、約７０ｂｐの増幅断片を取得した。【００８０】  次に、ｍｏｄ１及びｍｏｄ２ｃ、ｍｏｄ３及びｍｏｄ４ｃ、並びに、ｍｏｄ５及びｍｏｄ６ｃの各プライマーの組み合わせで増幅した断片を混合し、ｍｏｄ１及びｍｏｄ６ｃをプライマーとして、同様にＰＣＲを行った。また、ｍｏｄ７及びｍｏｄ８ｃ、並びに、ｍｏｄ９及びｍｏｄ１０ｃの各プライマーの組み合わせで増幅した断片を混合し、ｍｏｄ７及びｍｏｄ１０ｃをプライマーとして、同様にＰＣＲを行った。最後に、ｍｏｄ１及びｍｏｄ６ｃをプライマーとして増幅した断片並びにｍｏｄ７及びｍｏｄ１０ｃをプライマーとして増幅した断片を混合し、ｍｏｄ１及びｍｏｄ１０ｃをプライマーとして、同様にＰＣＲを行い、目的の大きさの増幅した断片を取得した。得られた増幅断片は、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  クローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．４５−００３１）にクローニングした。改変されたペプチドＨ７−３のアミノ酸配列とｈ７−３−２のヌクレオチド配列を示す（図１２）。【００８１】  （２）コドン改変遺伝子と未改変遺伝子による多重連結遺伝子発現ベクターの構築
（１）でクローニングされたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することによってｈ７−３−２遺伝子をコードするポリヌクレオチドを回収し、回収したポリヌクレオチドを実施例２と同様の方法で、ｐＵＣ（ｈ７−３）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、得られたベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセルに塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。【００８２】  形質転換体より調製されたプラスミドをｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２とした。ｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２の構築方法を示す（図１３）。【００８３】  ｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２を、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩで消化してｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子を含むポリヌクレオチドを回収した。回収したポリヌクレオチドをｐＭＫＹ０４の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ切断部位にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、連結したベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセルに塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。形質転換体より調製されたプラスミドをｐＭＫ７．１と命名した。ｐＭＫ７．１の構築方法を示す（図１４）。【００８４】  ｐＭＫ７．１に導入された、Ｈ７−３をコードするコドンを改変した遺伝子とコドンを改変していない遺伝子からなるニ重化した遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片は、β−ガラクトシダーゼの開始アミノ酸より７アミノ酸（Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ：配列表の配列番号３４）の下流に同じ読み枠で連結されており、ｌａｃプロモーターによってその発現が制御されている。発現ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列表の配列番号７１に、またアミノ酸配列を配列表の配列番号７２に示す。【００８５】  （３）コドン改変遺伝子の多重化による組換えタンパク質の生産
プラスミドｐＭＫ７．１を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株（Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）に塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。形質転換体を実施例１と同様の方法で培養し、菌体より抽出した全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端アミノ酸配列解析によって分析し、β−ガラクトシダーゼの７アミノ酸からメチオニンが除去された６アミノ酸残基（Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ：配列表の配列番号３４のアミノ酸番号２乃至７）からなるペプチドとペプチドＨ７−３の融合タンパク質が発現していることを確認した（図１５）。【００８６】  （４）ｈ７−３−１−ｈ７−３−２の検出
プラスミドＤＮＡ自動抽出装置（ＫＵＲＡＢＯ  ＰＩ−５０α）を用いて、上記（３）で得られた大腸菌の培養液からプラスミドＤＮＡを抽出した。次いで得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＹＡＳ１プライマー（配列表の配列番号３９）とＹＡＡ１プライマー（配列表の配列番号４０）をプライマーとして、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒによるＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子（配列表の配列番号６５）の増幅を試みた。【００８７】  その結果、実施例２で観察された相同組換えによる遺伝子の欠失は観察されなかった。また、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に三角フラスコ培養終了時の培養液を塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ法を上述したＰＣＲと同様に行った結果、相同組換えが生じたと考えられる形質転換体は認められなかった（図１６Ａ）。【００８８】  次に、３０Ｌ容通気撹拌培養槽を使用して多重化したｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の安定性を評価した。培養終了時点での培養液を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ法を上述したＰＣＲ反応と同様に行った。その結果、全く遺伝子を保持していないクローンが存在していることが明らかとなった（図１６Ｂ）。【００８９】  実施例４．プラスミドｐＭＫ７．１に存在する相同性組換え標的領域の除去によるペプチドＨ７−３発現プラスミドｐＭＫ７．３の構築
実施例３で構築したプラスミドｐＭＫ７．１にはｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子のプロモーターの上流とターミネーターの下流に５２ｂｐと１３８ｂｐの相同な領域が存在する。相同組換えによって多重化した遺伝子の一部が欠失することを防ぐために相同領域の一箇所を除去した発現ベクターを構築した。【００９０】  （１）プラスミドｐＭＫ７．１に存在する相同領域の除去
プラスミドｐＭＫ７．１を制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＮｄｅＩで消化し、ｌａｃプロモーター−β−ガラクトシダーゼ融合部分−ｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子−ｔｒｐＡプロモーター部分を含む０．８３ｋｂのＰｖｕＩＩ−ＮｄｅＩ断片を調製した。次に、プラスミドｐＭＫ７．１を制限酵素ＮｄｅＩによって消化し、ｐＢＲ３２２由来の複製オリジン領域、カナマイシン耐性遺伝子を含む２．６ｋｂのＮｄｅＩ断片を調製した。それぞれ調製された断片は、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔで末端の平滑化を行った後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、得られたプラスミドをｐＭＫ７．３と命名した。ｐＭＫ７．３の構築方法を示す（図１７）。【００９１】  （２）プラスミドｐＭＫ７．３を用いた組換えタンパク質の生産
プラスミドｐＭＫ７．３を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株（Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）に塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。形質転換体を実施例２と同様の方法で培養した。菌体より抽出した全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端アミノ酸配列解析によって分析したところ、β−ガラクトシダーゼの７アミノ酸からメチオニンが除去された（ＴＭＩＴＮＳ）とペプチドＨ７−３の融合タンパク質が発現していることが確認された（図１８）。【００９２】  （３）ＰＣＲによるｈ７−３−１−ｈ７−３−２の検出
プラスミドＤＮＡ自動抽出装置（ＫＵＲＡＢＯ  ＰＩ−５０α）を用いて、上記（２）で得られた大腸菌の培養液からプラスミドＤＮＡを抽出した。次いで得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＯｕｔｓｉｄｅＦプライマー：
ｔｃｃｔｔａｃｇｃａ  ｔｃｔｇｔｇｃｇｇ（配列表の配列番号６９）及び
ＯｕｔｓｉｄｅＲプライマー：
ｇｔａｔｃａｃｇａｇ  ｇｃｃｃｔｔｔｃｇ（配列表の配列番号７０）をプライマーとして使用して、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒによるＰＣＲによってｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の増幅を行った。その結果、相同組換えによる遺伝子の欠失は観察されなかった（図１９）。【００９３】  （４）コロニー・ダイレクトＰＣＲによるｈ７−３−１−ｈ７−３−２の検出
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に上記（２）で得られた培養終了時の組換体の培養液を塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、上記（３）と同じプライマーを用いてコロニー・ダイレクト（ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ）ＰＣＲ）法を行った結果、相同組換えが生じたと考えられる形質転換体は認められなかった。【００９４】  （５）通気撹拌培養によるｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の安定性の確認
３０Ｌ容通気撹拌培養槽を使用して多重化したｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の安定性を評価した。上記（２）と同様の方法で培養した形質転換体の培養液を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、上記（３）と同じプライマーを用いてコロニー・ダイレクトＰＣＲ法を行った結果、相同組換えが生じたと考えられる形質転換体は認められなかった（図２０）。【００９５】  実施例５．組換え蛋白質の生産
ペプチドＨ７−３は、９６アミノ酸残基より構成されるペプチドであり、そのアミノ末端はグリシンである。したがって、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として大腸菌菌体内で発現したペプチドＨ７−３は、トリプシン消化によって回収することができる。
（１）組換え蛋白質の精製
（１）−１  シトラコニル化
実施例４で得たｐＭＫ７．３を保持する形質転換大腸菌ＹＡ２１株の培養液１．２Ｌから、遠心分離によって湿菌体を得た。この湿菌体を３倍量の破砕用ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６−２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波破砕機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＵＳ−６００）で菌体を分散させて、フレンチプレス（Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー）で菌体を破砕した。蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ、尿素（Ｕｒｅａ）濃度が６．６６Ｍになるように菌体破砕液を調製し、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．６−８．８の間に調整した。【００９６】  融合蛋白質１ｇ当たり１５０μｌの無水シトラコン酸を添加して、直ちに５Ｎ  ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．６−８．８の間に調整した。１５分毎に、この反応を実施し、合計８回繰り返すことによって、シトラコニル化を行った。【００９７】  （１）−２  Ｈ７−３の精製
反応終了後の溶液に等量の２０ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２溶液を添加した。溶液の温度を１７−１９℃に保持し、酢酸でｐＨを７．６−７．８に調製した後、トリプシンを添加して３０分間酵素反応を行った。反応終了後の溶液に、終濃度１％になるようにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し、次いで１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心分離操作を行い、ペプチドＨ７−３を含む沈殿を回収した。【００９８】  ペプチドＨ７−３を含む沈殿に再懸濁ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）を沈殿の重量の３倍量加えた。この溶液に、１０Ｍ  Ｕｒｅａ溶液を添加し、Ｎａ２ＨＰＯ４の終濃度２０ｍＭ、Ｕｒｅａの終濃度が８Ｍになるように純水を添加して調製した。次に、この溶液のｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨ溶液で７．６に調整した。さらに、終濃度１０ｍＭになるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加し、室温で、３０分間撹拌して可溶化を行った。反応終了後の溶液にリン酸を加えてｐＨを２に調整した後、アセトニトリル、ＴＦＡをそれぞれ終濃度３０％、０．１％になるように添加して、室温で３０分間撹拌した。【００９９】  撹拌後の溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、上清をＭＦろ過膜（０．２μｍ）でろ過した。ろ液に終濃度が２０％になるようにアセトニトリルを、終濃度が０．２％になるようにＴＦＡそれぞれ添加した。【０１００】  この溶液を２０ｍｌのＣＨＰ２０Ｐレジン（三菱化学）に吸着させ、０．１％のＴＦＡを含む３０％アセトニトリルで分離精製した。ペプチドＨ７−３を含む画分を、８Ｍ  Ｕｒｅａ−１０ｍＭ  ＤＴＴ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４で平衡化した５ｍｌのＣＭセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  ＦＦ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｋ．Ｋ．，Ｎｏ．１７−５１５５−０１）に吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配（１０ｍＭから１００ｍＭ）によって分画した。【０１０１】  ペプチドＨ７−３を含む溶出画分にリン酸を加えてｐＨを２に調整し、終濃度が２０％になるようにアセトニトリルを、終濃度が０．１％になるようにＴＦＡをそれぞれ添加した。次に、この溶液を２０ｍｌのＣＨＰ２０Ｐレジンに吸着させ、０．１％のＴＦＡを含む３０％アセトニトリルと０．１％のＴＦＡを含む４０％アセトニトリルで溶出し、Ｈ７−３を含む画分を回収した。ペプチドＨ７−３を含む画分のアセトニトリル濃度を１５％に調製した。【０１０２】  次いでこの溶液から、逆相カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（３μｍ、６ｍｍ−ｉ．ｄ．ｘ２５ｃｍ，ＹＭＣ，Ｎｏ．ＡＭ−３１３−３）を用いて、移動相Ａ（ＲＯ水：ＴＦＡ＝１，０００：１）と移動相Ｂ（アセトニトリル：ＴＦＡ＝１，０００：１）のグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出によってペプチドＨ７−３がＨＰＬＣ純度９０％以上含まれる画分を回収した。得られた画分を凍結乾燥したところ、ペプチドＨ７−３が約６．７ｍｇ得られた。【０１０３】  精製したＨ７−３のＮ末端１０残基のアミノ酸配列解析をしたところ、ＧＩＩＡＡＹＱＮＰＡ（配列表の配列番号１３のアミノ酸番号１乃至１０）であることを確認した。また、液相消化ペプチドマッピング、ＬＣ／ＭＳによる分子量測定によって目的のＨ７−３であることを確認した。
（２）組換え蛋白質生産量の比較
実施例３に記載した、ｈ７−３−１−ｈ７−３−１遺伝子を有するプラスミドｐＫＢＲ７．１を保持する形質転換大腸菌（ＹＡ２１／ｐＫＢＲ７．１）及びｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子を有するプラスミドｐＭＫ７．３を保持する形質転換大腸菌（ＹＡ２１／ｐＭＫ７．３）を３０Ｌ容通気撹拌培養槽で培養し、両菌株の生産量を比較した。上記（１）で示した方法に準じて可溶化したペプチドＨ７−３は、大腸菌ＹＡ２１／ｐＫＢＲ７．１では、最終培養液１Ｌ当たり６７４ｍｇであり、大腸菌ＹＡ２１／ｐＭＫ７．３では、最終培養液１Ｌ当たり８８９ｍｇであった。ペプチドＨ７−３をコードする多重連結遺伝子の安定性を高め、さらに、ベクター配列での相同組換えを抑制した結果、約３０％生産量が向上したことが確認できた。【０１０４】  実施例６．コドン改変遺伝子の多重（３連結）遺伝子の構築と組換えタンパク質の生産
（１）コドン改変遺伝子の３重化
コドン改変遺伝子を３連結する多重化（三重化）を行った。ｈ７−３のコドンを改変した遺伝子を設計し、その遺伝子をｈ７−３−３と命名した。ｈ７−３−３のヌクレオチド配列は配列表の配列番号５３に記載されている。【０１０５】  Ｈ７−３−３のヌクレオチド配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて下記のオリゴヌクレオチドを合成した。
2007004538.tif 000005
各合成オリゴヌクレオチドとｈ７−３−３のヌクレオチド配列との対応を示す（図２１）。また、ペプチドＨ７−３のアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子ｈ７−３−３の配列を示す（図２２）。【０１０６】  実施例３で示したように、４ｍ−１と４ｍ−２ｃ、４ｍ−３と４ｍ−４ｃ、４ｍ−５と４ｍ−６ｃ、４ｍ−７と４ｍ−８ｃ、及び、４ｍ−９と４ｍ−１０ｃは、それぞれ、３’−末端側が１０ｂｐオーバーラップするように設計されている。４ｍ−１及び４ｍ−２ｃ、４ｍ−３及び４ｍ−４ｃ、４ｍ−５及び４ｍ−６ｃ、４ｍ−７及び４ｍ−８ｃ、並びに、４ｍ−９及び４ｍ−１０ｃの組み合わせをＰＣＲプライマーとしてＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．１２３４４−０２４）を使用して、ＰＣＲを行った。それぞれのプライマーの組み合わせで、それぞれ約７０ｂｐの増幅断片を取得した。【０１０７】  次に、４ｍ−１及び４ｍ−２ｃ、４ｍ−３及び４ｍ−４ｃ、並びに、４ｍ−５及び４ｍ−６ｃの各プライマーの組み合わせで増幅したＤＮＡ断片を混合し、４ｍ−１及び４ｍ−６ｃをプライマーとして使用して、同様にＰＣＲを行った。【０１０８】  また、４ｍ−７及び４ｍ−８ｃ、並びに、４ｍ−９及び４ｍ−１０ｃの各プライマーの組み合わせで増幅したＤＮＡ断片を混合し、４ｍ−７及び４ｍ−１０ｃをプライマーとして使用して、同様にＰＣＲを行った。【０１０９】  最後に、４ｍ−１及び４ｍ−６ｃのプライマーの組み合わせで増幅したＤＮＡ断片、並びに、４ｍ−７及び４ｍ−１０ｃのプライマーの組み合わせで増幅したＤＮＡ断片を混合し、４ｍ−１及び４ｍ−１０ｃをプライマーとして、同様にＰＣＲを実施し、目的の大きさの増幅断片を取得した。【０１１０】  増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  クローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．４５−００３１）にクローニングした。ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ消化によって回収し、実施例４と同様に、ｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、得られたベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセルに塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。【０１１１】  形質転換体より調製したプラスミドをｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３と命名した。ｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３の構築方法を示す（図２３）。【０１１２】  プラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、Ｈ７−３をコードする遺伝子が３連結したポリヌクレオチドを回収した。【０１１３】  回収したプラスミドをｐＭＫ７．１の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ切断部位にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、連結したベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセルに塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、プラスミドｐＭＫ７．４と命名した。ｐＭＫ７．４の構築方法を示す（図２４）。【０１１４】  プラス��ドｐＭＫ７．１には、相同組換えの標的となる相同領域が存在する。そこで、プラスミドｐＭＫ７．４より、実施例４と同様の方法で相同領域の除去を行った。【０１１５】  プラスミドｐＭＫ７．４より、制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＮｄｅＩの二重消化によってｌａｃプロモーター−β−ガラクトシダーゼ融合部分−ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３遺伝子−ｔｒｐＡプロモーター部分を含む１．１ｋｂのＰｖｕＩＩ−ＮｄｅＩ断片を調製した。次に、プラスミドｐＭＫ７．１を制限酵素ＮｄｅＩで消化し、ｐＢＲ３２２由来の複製オリジン領域、カナマイシン耐性遺伝子を含む２．６ｋｂのＮｄｅＩ断片を調製した。それぞれ調製された断片は、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔで末端の平滑化を行った後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体から得られたプラスミドをｐＭＫ７．５と命名した。ｐＭＫ７．５の構築方法を示す（図２５）。発現ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列表の配列番号７３に、またアミノ酸配列を配列表の配列番号７４に示す。
（２）コドン改変遺伝子の多重化（３重化）による組換えタンパク質の生産
プラスミドｐＭＫ７．５を、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＡ２１株（Ｆ−λ−ｌｅｕ  ｍｅｔ）に塩化カルシウム法によって導入し、形質転換体を得た。形質転換体を実施例２の（３）と同様の方法で培養した。【０１１６】  菌体より抽出した総蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端アミノ酸配列解析によって分析し、β−ガラクトシダーゼの７アミノ酸（Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ：配列表の配列番号３４）とペプチドＨ７−３の融合タンパク質が発現していることを確認した。【０１１７】  （３）ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３の検出
プラスミドＤＮＡ自動抽出装置（ＫＵＲＡＢＯ  ＰＩ−５０α）を用いて、上記（２）で得られた大腸菌の培養液からプラスミドｐＭＫ７．５を抽出した。次いでｐＭＫ７．５を鋳型とし、ＯｕｔｓｉｄｅＦプライマーとＯｕｔｓｉｄｅＲプライマーを用いて、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒによるＰＣＲ反応（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３遺伝子（配列表の配列番号６７）の増幅を試みた。【０１１８】  その結果、相同組換えによる遺伝子の欠失は観察されなかった（図２６）。また、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗沫して増殖したコロニーより、９６クローンを選抜して、ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ法を上述したＰＣＲ反応と同様に行った結果、相同組換えが生じたと考えられる形質転換体は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】  本発明により、複数の遺伝子を連結した場合に相同組換えを抑えることが可能になり、該方法によって作製された遺伝子を含む発現ベクターを用いることによってペプチドの生産性を向上させることが可能になった。本発明は組換えペプチドの生産に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】合成オリゴヌクレオチドのｈ７−３−１との対応を示す図。合成オリゴヌクレオチドはイタリック文字またはアンダーラインで示した。
【図２】ペプチドＨ７−３をコードする遺伝子ｈ７−３−１発現ベクター、ｐＭＫＹ０１及びｐＭＫＹ０２の構築方法を示す図。
【図３】ペプチドＨ７−３をコードする遺伝子ｈ７−３−１発現ベクター、ｐＭＫＹ０３及びｐＭＫＹ０４の構築方法を示す図。
【図４】β−ガラクトシダーゼに融合させたペプチドＨ７−３の発現を示す図。矢印は、発現したβ−ガラクトシダーゼ融合ペプチドＨ７−３を示す。Ｍのカラムは分子量マーカー、ＣはＹＡ２１、１−１１のカラムはｐＭＫＹ０４で形質転換された大腸菌ＹＡ２１株の独立したクローンを示す。
【図５】ペプチドＨ７−３のアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子ｈ７−３−１の配列を示す図。制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩの切断部位を下線で示した。
【図６】ペプチドＨ７−３の２連結ペプチドをコードする遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−１を保持するベクターｐＵＣ（ｈ７−３）２の構築方法を示す図。
【図７】ペプチドＨ７−３の２連結ペプチド発現ベクターｐＫＢＲ７．１の構築方法を示す図。
【図８】目的生産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析とＰＣＲ法による二重化連結遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−１の検出結果を示す図。Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるβ−ガラクトシダーゼに融合させた７エピトープ連結ペプチドの解析結果を示す。ＢはＰＣＲ法によるｈ７−３−１−ｈ７−３−１の検出結果を示す。＃１と＃２は、培養液より分離された独立したコロニーを示す。＃１は、目的融合蛋白質非生産株を示す。＃２は、β−ガラクトシダーゼ融合二重化連結ペプチド生産株を示す。
【図９】コロニーダイレクトＰＣＲによるｈ７−３−１−ｈ７−３−１遺伝子の検出を示す図。
【図１０】多重化した遺伝子間での相同組換え推定模式図。
【図１１】ｈ７−３−２遺伝子合成用オリゴヌクレオチドとｈ７−３−２との対応を示す図。合成オリゴヌクレオチドはイタリック文字とアンダーラインで示した。
【図１２】ペプチドＨ７−３のアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子ｈ７−３−２の配列を示す図。制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩの切断部位を下線で示した。
【図１３】ペプチドＨ７−３を２連結したペプチドを発現する遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−２を含むベクターｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２の構築方法を示す図。
【図１４】ペプチドＨ７−３を２連結したペプチドを発現する遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−２を含む発現ベクターｐＭＫ７．１の構築方法を示す図。
【図１５】Ｈ７−３の２連結ペプチドの発現を示す図。矢印はβ−ガラクトシダーゼ融合二重化７エピトープ連結ペプチドの移動度を示す。Ｍは分子量マーカー、ＣはＹＡ２１、１−１１は，ｐＭＫ７．１で形質転換された大腸菌ＹＡ２１株の独立したクローンを示す。
【図１６】コロニーダイレクトＰＣＲによるｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の検出結果を示す図。Ａ：フラスコ培養終了液をプレートに塗沫して得られたコロニーＢ：通気撹拌培養終了液をプレートに塗沫して得られたコロニー
【図１７】プラスミドｐＭＫ７．３の構築方法を示す図。
【図１８】β−ガラクトシダーゼに融合させたＨ７−３の２連結ペプチドの発現を示す図。矢印はβ−ガラクトシダーゼ融合二重化７エピトープ連結ペプチドの移動度を示す。Ｍは分子量マーカー、ＣはＹＡ２１株、１−１１はｐＭＫ７．３によって形質転換されたＹＡ２１株の独立したクローンを示す。
【図１９】ＰＣＲ法によるｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の検出結果を示す図。１−７はｐＭＫ７．３によって形質転換されたＹＡ２１株の独立したクローンを示す。
【図２０】通気撹拌培養終了液をプレートに塗沫して得られたコロニーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲによるｈ７−３−１−ｈ７−３−２遺伝子の検出結果を示す図。
【図２１】ｈ７−３−３遺伝子合成用オリゴヌクレオチドとｈ７−３−３との対応を示す図。合成オリゴヌクレオチドはイタリック文字とアンダーラインで示す。
【図２２】ペプチドＨ７−３のアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子ｈ７−３−３のヌクレオチド配列を示す図。各エピトープは矢印の範囲で示した。制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩの切断部位を下線で示した。
【図２３】ペプチドＨ７−３を３連結したペプチドを発現するプラスミドｐＵＣ（ｈ７−３）−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３の構築方法を示す図。
【図２４】ペプチドＨ７−３を３連結したペプチドの発現ベクターｐＭＫ７．４の構築方法を示す図。
【図２５】発現プラスミドｐＭＫ７．５の構築方法を示す図。
【図２６】目的ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析とＰＣＲ法による三重化遺伝子ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３の検出結果を示す図。Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるβ−ガラクトシダーゼに融合させた連結ペプチドの解析結果を示す。ＢはＰＣＲ法によるｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３の検出結果を示す。ＣはＹＡ２１株のみ、１−５は、ｐＭＫ７．５によって形質転換されたＹＡ２１株の独立したクローンを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】配列番号１：ペプチドＡ
配列番号２：ポリペプチドＢ
配列番号３：ペプチド１
配列番号４：ペプチド２
配列番号５：ペプチド３
配列番号６：ペプチド４
配列番号７：ペプチド５
配列番号８：ペプチド６
配列番号９：ペプチド９
配列番号１０：ペプチド１０
配列番号１１：ペプチド１１
配列番号１２：ペプチド１２
配列番号１３：合成ペプチドＨ７−３
配列番号１４：Ｆ１
配列番号１５：Ｆ８
配列番号１６：Ｆ９
配列番号１７：Ｆ１０
配列番号１８：Ｆ１１
配列番号１９：Ｆ１２
配列番号２０：Ｆ１５
配列番号２１：Ｆ１６
配列番号２２：Ｆ１７
配列番号２３：Ｆ１８
配列番号２４：Ｆ１９
配列番号２５：Ｆ２０
配列番号２６：Ｆ２１
配列番号２７：Ｆ２２
配列番号２８：Ｆ２３
配列番号２９：Ｆ２４
配列番号３０：ＰＲｖプライマー
配列番号３１：ＰＦｗ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号３２：ｈ７−３−１
配列番号３３：ｈ７−３−１
配列番号３４：β−ガラクトシダーゼの部分ペプチド
配列番号３５：ＳｔｒｐＮ
配列番号３６：ＮｔｒｐＳ
配列番号３７：ｈ７−３−１−ｈ７−３−１
配列番号３８：ｈ７−３−１−ｈ７−３−１
配列番号３９：ＹＡＳ１プライマー
配列番号４０：ＹＡＡ１プライマー
配列番号４１：ｈ７−３−２
配列番号４２：ｈ７−３−２
配列番号４３：ｍｏｄ１
配列番号４４：ｍｏｄ２ｃ
配列番号４５：ｍｏｄ３
配列番号４６：ｍｏｄ４ｃ
配列番号４７：ｍｏｄ５
配列番号４８：ｍｏｄ６ｃ
配列番号４９：ｍｏｄ７
配列番号５０：ｍｏｄ８ｃ
配列番号５１：ｍｏｄ９
配列番号５２：ｍｏｄ１０ｃ
配列番号５３：ｈ７−３−３
配列番号５４：ｈ７−３−３
配列番号５５：４ｍ−１
配列番号５６：４ｍ−２ｃ
配列番号５７：４ｍ−３
配列番号５８：４ｍ−４ｃ
配列番号５９：４ｍ−５
配列番号６０：４ｍ−６ｃ
配列番号６１：４ｍ−７
配列番号６２：４ｍ−８ｃ
配列番号６３：４ｍ−９
配列番号６４：４ｍ−１０ｃ
配列番号６５：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２
配列番号６６：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２
配列番号６７：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３
配列番号６８：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３
配列番号６９：ＯｕｔｓｉｄｅＦプライマー
配列番号７０：ＯｕｔｓｉｄｅＲプライマー
配列番号７１：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２とｌａｃＺの部分ペプチドの融合ペプチド
配列番号７２：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２とｌａｃＺの部分ペプチドの融合ペプチド
配列番号７３：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３とｌａｃＺの部分ペプチドの融合ペプチド
配列番号７４：ｈ７−３−１−ｈ７−３−２−ｈ７−３−３とｌａｃＺの部分ペプチドの融合ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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