(57)【要約】本発明によれば、真核微生物に有機溶媒耐性を付与する遺伝子が提供される。本発明の有機溶媒耐性遺伝子は、配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む。本発明の遺伝子は、有機溶媒に対してほとんど耐性のない酵母に、有機溶媒に対する耐性を付与し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む、有機溶媒耐性遺伝子。
【請求項２】
前記他のアミノ酸がセリンである、請求項１に記載の有機溶媒耐性遺伝子。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号４の１位から１０７３位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の有機溶媒耐性遺伝子。
【請求項４】
前記塩基配列が配列番号３の１位から３２２２位の塩基配列である、請求項３に記載の有機溶媒耐性遺伝子。
【請求項５】
前記有機溶媒がイソオクタン、ノナン、オクタン、およびｎ−ヘキシルエーテルからなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の有機溶媒耐性遺伝子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の有機溶媒耐性遺伝子が導入された形質転換酵母。
【請求項７】
前記酵母がサッカロマイセス属に属する酵母である、請求項６に記載の形質転換酵母。
【請求項８】
有機溶媒に対してほとんど耐性のない酵母に、有機溶媒に対する耐性を付与する方法であって、
配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子を得る工程；
該遺伝子を該有機溶媒に対してほとんど耐性のない酵母に導入して形質転換酵母を得る工程；および
該形質転換酵母を有機溶媒の存在下で培養して生育の有無を確認する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機溶媒に対する耐性を付与する遺伝子および該遺伝子が導入された酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体触媒を利用した物質生産（バイオプロダクション）が広く行われている。この方法は、合成化学反応による方法と比べて、複雑な反応を容易に、常温・常圧などの穏和な条件下で、かつ小さなエネルギー消費で行うことができる。さらに、位置選択・立体選択的特異性も有するという利点がある。これを利用して、これまでにアミノ酸、核酸、抗生物質、エタノールなどの多くの物質が工業的レベルで生産されている。しかしながら、その多くは親水性物質である。疎水性物質は、通常の微生物が生育する培地中には溶解しにくく、またその多くが微生物に対して毒性を有するため、この方法による生産は困難であると考えられてきた（Ｆａｉｚａｌ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５年，３２巻１１−１２号，５４２−５４７頁；Ｒｏｊａｓ，Ａ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００４年，７０巻６号，３６３７−３６４３頁；Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ｉ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３年，６９巻９号，５１２０−５１２７頁；Ｓａｒｄｅｓｓａｉ，Ｙ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２００４年，２０巻３号，６５５−６６０頁；Ｌｅｏｎ，Ｒ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，２３巻，４８３−５００頁；加藤純一ら、化学工業，２００５年１１月号，５６−６０頁；および小田忍、塗料の研究，２０００年，１３５号，２４−３５頁）。
微生物による疎水性物質生産における問題を解決するために、種々の方法が試みられている。その１つは、微生物を種々の担体に固定化することにより、有機溶媒の毒性から細胞を保護する固定化法である。具体的には、３−オキソブタン酸エチルのエチル−（Ｓ）−ヒドロキシブタノエートへの還元反応を、固定化したパン酵母を用いてイソオクタン中で行ったことが報告されている（Ｋａｎｄａ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，４９巻４号，３７７−３８１頁）。しかし、この方法は、固定化の手間がかかり、さらに一定時間ごとに菌体の再活性化が必要であることなどの問題がある。
これらの問題を解決するために、水−有機溶媒二層系を用いた疎水性物質生産法が提案された（Ｆａｉｚａｌ，Ｉ．ら、前出；Ｒｏｊａｓ，Ａ．ら、前出；Ｓａｒｄｅｓｓａｉ，Ｙ．Ｎ．ら、前出；Ｌｅｏｎ，Ｒ．ら、前出；および加藤純一ら、前出）。この方法では、微生物が生育する水層に、基質または生産物、あるいはその両者を溶解し得る有機溶媒層を重ね、その境界面で微生物による物質変換反応を行う。疎水性物質はほとんどが有機溶媒層に溶解するため、水層に存在する微生物に対する毒性は最小限に抑えられる。また、有機溶媒層からの生成物の抽出は比較的容易であり、生成物によるフィードバック阻害も抑えられる。しかし、この方法においても、有機溶媒による毒性を防ぐことはできない。そのため使用する有機溶媒に対しては、微生物が耐性を有する必要がある。現状では、この制限のために、使用できる溶媒が限られている。
近年、高い毒性のトルエンなどに耐性を有するグラム陰性細菌（大腸菌（清水一憲ら、酵素工学ニュース，２００５年，５３号；Ａｏｎｏ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８年，１８０巻４号，９３８−９４４頁；Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７年，１７９巻１９号，６１２２−６１２６頁；Ａｏｎｏ，Ｒ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９７年，６３巻９号，３６３７−３６４２頁；およびＳｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，７１巻２号，１０９３−１０９６頁）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｓｅｇｕｒａ，Ａ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００４年，６巻４号，４１６−４２３頁；Ｓｅｇｕｒａ，Ａ．ら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．，２００３年，７巻５号，３７１−３７６頁；Ｒｏｊａｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００１年，１８３巻１３号，３９６７−３９７３頁；Ｊｕｎｋｅｒ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９９年，１８１巻１８号，５６９３−５７００頁；Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８年，１８０巻１３号，３３２３−３３２９頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９９年，１８１巻１５号，４４９３−４４９８頁；Ｈｉｒａｙａｍａ，Ｈ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９８年，１６９巻２号，２１９−２２５頁；Ｌｉ，Ｘ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６年，５０巻１号，５３−５６頁；およびＬｉ，Ｘ．Ｚ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００３年，４７巻１号，２７−３３頁））が見出された。古細菌（Ｕｓａｍｉ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３年，６７巻８号，１８０９−１８１２頁およびＴｏｋｕｎａｇａ，Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３年，７０巻８号，４４２４−４４３１頁）またはグラム陽性細菌（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００２年，９４巻１号，４５−５１頁およびＦｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｐ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ．，２００３年，２２巻３号，２１１−２１６頁）でも、有機溶媒耐性菌が発見されている。これらは、有機溶媒中、あるいは水−有機溶媒の二層系において、有用物質の生産に応用され始めている。さらに、これらの細菌における個々の耐性メカニズムについても解明が進んでいる。これまでに報告されているのは、細胞内の有機溶媒を排出するトランスポーターの存在、細胞膜脂質組成または透過性の変化、小分子の輸送を行っている細胞膜孔（ポーリン）の減少などである。しかし、細胞全体の耐性機構としては、未だほとんど解明されていない。
有機溶媒耐性を有する真核微生物については、これまでのところ、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、イソオクタンに対して耐性を有する１つの株が報告されているのみである（Ｋａｎｄａ，Ｔ．ら、前出およびＫａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１年，５５巻４号，４７６−４７９頁）。この株は、その親株でも生育できないイソオクタン存在下において生育することができる。有機溶媒耐性に関しては、通常のサッカロマイセス・セレビシエは、生育できたとしても、せいぜい毒性の低いドデカンで生育できる程度である（Ｍｉｕｒａ，Ｓ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００年，６６巻，４８８３−４８８９頁）。上記の株の遺伝子発現の解析がｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法（ＤＤ−ＰＣＲ）（Ｍｉｕｒａ，Ｓ．ら、前出）およびＤＮＡチップを用いる方法で行われているが、有機溶媒に対する耐性の機構は未だ明らかではない。
ところで、ＰＤＲ１遺伝子が酵母の多剤耐性に関与する遺伝子であることが知られている（ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００年，４７０巻２号，１５６−１６０頁；Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，２７８巻２号，１２７３−１２８０頁；およびＣａｒｖａｊａｌ，Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９７年，２５６巻４号，４０６−４１５頁）。この遺伝子は、薬剤耐性に関連する多くの遺伝子の発現を制御し、このタンパク質の特定のアミノ酸を変異させると、薬剤耐性が向上することが報告されている（Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら（前出）ではＲ８２１Ｈ、Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｅ．ら（前出）ではＦ８１５Ｓ）。しかし、有機溶媒耐性との関連については、これまで報告はない。
【発明の開示】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、有機溶媒に対する耐性がほとんどない真核微生物に有機溶媒に対する耐性を付与し得る遺伝子を提供することである。
本発明は、有機溶媒耐性遺伝子を提供し、この遺伝子は、配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む。
１つの実施態様では、上記他のアミノ酸はセリンである。
別の実施態様では、上記ポリペプチドは、配列番号４の１位から１０７３位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
さらなる実施態様では、上記塩基配列は、配列番号３の１位から３２２２位の塩基配列である。
さらに別の実施態様では、上記有機溶媒は、イソオクタン、ノナン、オクタン、およびｎ−ヘキシルエーテルからなる群から選択される。
さらに、本発明は、上記有機溶媒耐性遺伝子が導入された形質転換酵母も提供する。
１つの実施態様では、上記酵母は、サッカロマイセス属に属する酵母である。
さらに、本発明は、有機溶媒に対してほとんど耐性のない酵母に、有機溶媒に対する耐性を付与する方法を提供する。この方法は、
配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子を得る工程；
該遺伝子を該有機溶媒に対してほとんど耐性のない酵母に導入して形質転換酵母を得る工程；および
該形質転換酵母を有機溶媒の存在下で培養して生育の有無を確認する工程を含む。
本発明によれば、有機溶媒に対する耐性を付与する遺伝子が提供される。この遺伝子により、有機溶媒耐性についての報告がほとんどなかった真核微生物（特に酵母）に対しても、有機溶媒に対する耐性が付与され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、イソオクタンを添加したＳＤＣ培地におけるＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）株、ＫＫ−２１１株、ＤＹ−１株、およびＭＴ８−１株の培養におけるＯＤ６００濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、有機溶媒に対する耐性を付与する遺伝子に関する。この遺伝子は、有機溶媒に対してほとんど耐性のない真核微生物（特に酵母）に、有機溶媒に対する耐性を付与し得る。本明細書中では、この遺伝子を「有機溶媒耐性遺伝子」と称する。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子は、その遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、８２１位のアルギニンの他のアミノ酸での置換変異を伴っている。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、酵母のゲノムデータベース上にあるサッカロマイセス・セレビシエ野生型のＰＤＲ１のアミノ酸配列に相当し得るが、この配列がこの微生物に由来する必要はない。８２１位のアルギニンの他のアミノ酸での置換変異により、有機溶媒耐性だけでなく、例えば、以下で説明するような薬剤耐性もまた付与され得るが、薬剤耐性が付与されることは必ずしも必要ではない。置換変異されたアミノ酸は、アルギニンを除く任意のアミノ酸であり得る。８２１位のアルギニンの他のアミノ酸での置換変異とは、本来のアルギニンが何らかの様式で変異を受けていることをいい、有機溶媒耐性が付与されるようにアルギニンが修飾されることを除外しない。好ましくは、８２１位のアミノ酸はセリンであるが、これに限定されない。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、上記の８２１位のアミノ酸の置換に加えて、有機溶媒耐性を喪失しない限り、さらなるアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加のような変異を有し得る。さらなる置換、欠失、挿入、および／または付加のような変異のアミノ酸残基の数は、所望の性質を有する限り、任意の数である。例えば、以下で説明する配列同一性を有する配列となるような任意の数であり得る。通常２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは１０以下、さらにより好ましくは７アミノ酸残基以下である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入し得る。変異導入は、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入方法、具体的には、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、ＰＣＲによる変異導入法などにより行われ得る。なお、アミノ酸残基の置換に用いられる核酸は、発現させる宿主のコドン使用頻度に合わせて設計され得る。
したがって、本発明の有機溶媒耐性遺伝子は、配列番号２の１位から１０６８位のアミノ酸配列において、少なくとも、８２１位のアルギニンが他のアミノ酸で置換されている変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし得る。
１つの実施態様では、本発明の有機溶媒耐性遺伝子は、配列番号４の１位から１０７３位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む。上記アミノ酸配列は、サッカロマイセス・セレビシエＫＫ−２１１株のＰＤＲ１のアミノ酸配列であり得る。ＫＫ−２１１株のＰＤＲ１のアミノ酸配列は、酵母のゲノムデータベース上にあるサッカロマイセス・セレビシエ野生型のＰＤＲ１のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される）とは、以下の表１にも示すように、次の４箇所で異なる：Ｔ１８Ｒ、Ｔ９４Ａ、Ｒ８２１Ｓ、および１０２０〜１０２４位のＮＮＫＮＮの挿入。配列番号４の１位から１０７３位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子は、有機溶媒耐性に加えて、従来のＰＤＲ１変異株と同様の薬剤耐性も付与し得る。この実施態様の遺伝子においても、上述したように、該遺伝子によりコードされるポリペプチドは、所望の性質を有する限り、さらなるアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加のような変異を有し得る。
配列番号４の１位から１０７３位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号３の１位から３２２２位の塩基配列であり得るが、当該アミノ酸配列をコードし得るものであれば、配列番号３の塩基配列に１つ以上の塩基の変更を伴うものであってもよい。
上述したようなアミノ酸および／または核酸塩基の変異を含む配列とは、配列番号２または配列番号１に示される配列からの差異を有する任意の配列を表し得る。そのような配列には、人工的にアミノ酸および／または核酸塩基を変異したもののみならず、自然界においてアミノ酸および／または核酸塩基が変異したものも、所望の性質を有する限り含まれる。もちろん、自然界において、上述したような配列番号２または配列番号１に示される配列との差異を有する配列を本来有するものも含まれる。
得られた遺伝子が有機溶媒耐性遺伝子か否かは、該遺伝子が導入された生物の有機溶媒の存在下における生育の有無によって確認できる。有機溶媒の毒性は、その極性に依存し、極性が大きいほど毒性は強いといわれている。分子の極性を表す指標としては、有機溶媒のｎ−オクタノール相と水相との間の分配係数（Ｐｏｗ）の常用対数をとった値ｌｏｇＰｏｗが最も一般的である。この指標は、厳密には極性ではなく疎水性の指標であるが、極性と疎水性との間にはある程度の相関が見られる。ｌｏｇＰｏｗ値が低いほど毒性が強い。ある微生物が生育可能な有機溶媒の中でｌｏｇＰｏｗ値が最も低い有機溶媒を、その微生物の指標有機溶媒と呼ぶ。本発明の有機溶媒耐性遺伝子によれば、微生物の指標有機溶媒よりも高い毒性（または低いｌｏｇＰｏｗ値）を有する有機溶媒に対する耐性が付与され得る。例えば、通常のサッカロマイセス・セレビシエの指標有機溶媒はドデカンであり、このｌｏｇＰｏｗ値は７．０である。本発明の有機溶媒耐性遺伝子によれば、ｌｏｇＰｏｗ値がより低い有機溶媒、例えば、イソオクタン、ノナン、オクタン、ｎ−ヘキシルエーテルなどに対する耐性が付与され得る。以下の実施例ではイソオクタンに対する耐性を確認する手法を説明しているが、他の有機溶媒についても、当業者が通常行い得る改変を伴って耐性の確認を行い得る。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子は、当業者が通常用いる方法によって、宿主細胞に導入され得る。「遺伝子の導入」とは、細胞の中に遺伝子を導入し、発現させることを意味する。遺伝子の導入には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法がある。導入される遺伝子は、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に組み込まれてもよい。遺伝子の導入は、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＴＲＰ、ＬＥＵ２など）で選択され得る。
有機溶媒耐性を有する形質転換酵母は、本発明の有機溶媒耐性遺伝子を酵母細胞に導入することにより得られる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。サッカロマイセス属に属する酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエが好ましい。遺伝子を酵母細胞に導入するには、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。有機溶媒耐性遺伝子は、宿主のゲノム上の遺伝子への挿入または遺伝子との相同組換えによる染色体への直接組み込みによっても導入され得る。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子が導入された形質転換酵母は、例えば、ＰＤＲ１によって付与される薬剤耐性によって選抜し得る。このような薬剤耐性選抜については、例えば、ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．ら（前出）；Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら（前出）；およびＣａｒｖａｊａｌ，Ｅ．ら（前出）に記載される。選抜に用いられる薬剤としては、シクロヘキシミド、オリゴマイシン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、ケトコナゾールなどが挙げられ得る。シクロヘキシミドは、最も代表的な抗真菌剤であることから好ましい。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子が導入された形質転換酵母は、上記のように、有機溶媒に対する耐性が付与され得る。
本発明の有機溶媒耐性遺伝子が導入された形質転換酵母の培養は、当業者が通常用いる方法に従って、適切な培地および培養条件を適宜選択することにより行うことができる。本発明の形質転換酵母は、上記の有機溶媒を水相に重ねた二層系においても好適に培養できる。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【実施例】
【０００６】
（実施例１：サッカロマイセス・セレビシエＫＫ−２１１株の分析）
非特許文献２７に記載の手順に従って、イソオクタンに対して耐性を有する酵母サッカロマイセス・セレビシエＫＫ−２１１株を作成した。ＫＫ−２１１株の親株のＤＹ−１株（オリエンタル酵母工業株式会社）および実験室株であるＭＴ８−１株（Ｔａｊｉｍａ，Ｍ．，Ｎｏｇｉ，Ｙ．，およびＦｕｋａｓａｗａ，Ｔ．，Ｙｅａｓｔ，１９８５年，１巻１号，６７−７７）もまた、以下の実施例にて用いた。
（１．遺伝子転写パターンの分析）
ＫＫ−２１１株のイソオクタンに対する耐性の機構を調べるために、ＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、ＫＫ−２１１株の遺伝子転写パターンを分析した。その結果、ＫＫ−２１１株の遺伝子転写パターンは、転写因子ＰＤＲ１の変異株であるＭＳ３５（Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら、前出）またはｐｄｒ１−３（ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．ら、前出）における遺伝子転写パターンと高い類似性を示した（データは示さず）。
（２．薬剤耐性に関する分析）
さらに、ＰＤＲ１変異株が種々の薬剤に対して耐性を有するので、ＫＫ−２１１株についても薬剤耐性を調べた。薬剤としては、最も代表的な抗真菌剤であるシクロヘキシミド（０．５μｇ／ｍｌ）を用いた。その結果、ＫＫ−２１１株は、その親株であるＤＹ−１株よりもはるかに高い耐性を示した（データは示さず）。
（３．ＰＤＲ１配列決定および分析）
上記１および２の結果を踏まえ、ＫＫ−２１１株の有機溶媒耐性の原因がＰＤＲ１にあるのではないかと考えた。そこで、この配列を精査した。
サッカロマイセス・セレビシエＫＫ−２１１株、ＤＹ−１株、およびＭＴ８−１株からゲノムＤＮＡを抽出した。各ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＰＤＲ１−ｐｒｏ―Ｆ−３（配列番号５）およびＰＤＲ１−ｔｅｒｍ−Ｒ（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、各株のＰＤＲ１のＯＲＦを含む断片（約３．８ｋｂ）を増幅した。その後、増幅断片を精製し、分光光度計で濃度を測定した。
次いで、以下のプライマーを用いて、上記の精製後の反応液を鋳型としてシークエンスＰＣＲを行い、シークエンサーでそれぞれのＤＮＡ塩基配列を確認した。配列確認用プライマーは、以下の通りである：
ＰＤＲ１−ｐｒｏ―Ｆ−３（配列番号５）
ＰＤＲ１−Ｆ（配列番号７）
ＰＤＲ１−３６１―Ｆ（配列番号８）
ＰＤＲ１−７２１―Ｆ（配列番号９）
ＰＤＲ１−１０８１―Ｆ（配列番号１０）
ＰＤＲ１−１４４１―Ｆ（配列番号１１）
ＰＤＲ１−１８０１―Ｆ（配列番号１２）
ＰＤＲ１−２１６１―Ｆ（配列番号１３）
ＰＤＲ１−２５２１―Ｆ（配列番号１４）
ＰＤＲ１−２８８１―Ｆ（配列番号１５）。
得られたＤＮＡ塩基配列から推定される各アミノ酸配列の差異を分析した。ＫＫ−２１１株のＤＮＡ塩基配列を配列番号３に、そして推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。アミノ酸配列の差異の結果を以下の表１に示す。代表的な変異型ＰＤＲ１配列であるｐｄｒ１−３（Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｅ．ら、前出）との比較も合わせて示す。
【表１】
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表１に示すように、ＫＫ−２１１株は、親株ＤＹ−１株または実験室株ＭＴ８−１株とアミノ酸レベルで数箇所の差異が見られた。さらに、データベース上の野生型ＰＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）と比較して、４箇所のアミノ酸に違いが見られた。このうち１つの変異（Ｒ８２１Ｓ）は、これらとは別の薬剤耐性を有する株における変異箇所（Ｒ８２１Ｈ：Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら、前出）と同一の箇所であった。
（４．有機溶媒耐性の確認）
ＫＫ−２１１株について、以下に示す手順に基づいて、イソオクタンに対する耐性を確認した。
まず、平板培地からＫＫ−２１１株をＹＰＤ（酵母エキスペプトンデキストロース）培地１０ｍｌに接種し、２４時間培養した。培養液を、５００ｍｌ容三角フラスコに入ったＹＰＤ１００ｍｌに最終濃度がＯＤ６００＝０．１となるように接種した。このフラスコ中の培養液にイソオクタン２０ｍｌを重層し、３０℃で振盪培養した。増殖を始めるのに２日（４８時間）以上要し、さらに３日かけて定常期まで培養した。得られた菌体をＹＰＤプレートに接種し、生育してきたコロニーを新たに同条件下で培養した。その結果、増殖が見られ、イソオクタン耐性が確認された（データは示さず）。
さらに、ＳＤＣ−Ｗ培地（０．５％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（ＤＩＦＣＯ）を含むＳＤ液体培地）５０ｍｌ＋イソオクタン５０ｍｌの組成に代えたこと以外は、上記と同様の手順でＫＫ−２１１株を培養した。この場合もＫＫ−２１１株の増殖が見られた（データは示さず）。
（実施例２：有機溶媒耐性酵母の調製）
実施例１と同様に、ＫＫ−２１１ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰＤＲ１−ｐｒｏ―Ｆ−３（配列番号５）およびＰＤＲ１−ｔｅｒｍ−Ｒ（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、ＰＤＲ１のＯＲＦを含む断片（約３．８ｋｂ）を増幅し、この断片を精製した。
得られた断片をＭＴ８−１に導入して、ＭＴ８−１を形質転換した。形質転換は、得られた断片とＭＴ８−１ゲノム上のＰＤＲ１との相同組換えにより行った。形質転換した菌体を、０．２５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤ培地に接種し、生存コロニーを選抜した。選抜したコロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にして組換え体のＰＤＲ１全配列を読み取ることにより、組換えを確認した。得られた変異株をＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）と命名した。
実施例１と同様の手順に従って、得られた変異株ＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）の有機溶媒耐性について試験した。未変異のＭＴ８−１株、イソオクタン耐性株であるＫＫ−２１１株、および親株であるＤＹ−１株についても同様に試験した。図１は、イソオクタンを添加したＳＤＣ培地におけるＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）株、ＫＫ−２１１株、ＤＹ−１株、およびＭＴ８−１株の培養におけるＯＤ６００濃度の経時変化を示すグラフである。図１中の記号は以下の通りである。黒菱形：ＫＫ−２１１；四角：ＤＹ−１；黒三角：ＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）；×：ＭＴ８−１。
図１に示すように、変異体ＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）株の増殖が観察された。有機溶媒なしで培養した場合もＫＫ−２１１株とは同様の増殖差を示すので、最終ＯＤ６００の濃度の差は、ＫＫ−２１１とＭＴ８−１との間の倍数性の違いによるものであると考えられる。したがって、変異体ＭＴ８−１（ｐｄｒ１−ｋ）株においても、ＫＫ−２１１株と同様に、イソオクタン耐性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の遺伝子を用いれば、有機溶媒耐性のほとんどない真核微生物（特に酵母）にも有機溶媒耐性を付与することができる。本発明の遺伝子が導入された形質転換酵母は、化学合成よりも生物変換による合成が適している疎水性化合物の合成に広範に使用できる。例えば、バイオプラスチック、バイオ燃料などの生物資源を利用した化成品合成に有用である。
［配列表］
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【図１】
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【国際調査報告】
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