(57)【要約】  不純物を含むグリコール酸またはグリコール酸塩溶液に、二室式電気透析処理と、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮処理および冷却晶析処理から選ばれるいずれか一つ以上の処理を組み合わせることにより、高純度なグリコール酸を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコール酸塩を含む溶液に対して、以下の工程（ａ１）、（ａ２）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択された３〜５種類の工程（ただし、工程（ａ２）は必須）を１回または２回以上任意の順で行うことを特徴とするグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【請求項２】
グリコール酸塩を含む溶液に対する以下の工程の種類と順番が、（ａ１）（ａ２）（ｂ）、（ｃ）（ａ２）（ｂ）、（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｃ）、または（ｃ）（ａ２）（ｃ）（ｄ）の何れかであることを特徴とする請求項１に記載のグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【請求項３】
グリコール酸塩を含む溶液に対して、以下の工程（ａ１）、（ａ２）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択された３〜５種類の工程（ただし、工程（ａ２）は必須）を１回または２回以上任意の順で行い、それに続いて工程（ｂ）を１回または２回以上行うことを特徴とするグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【請求項４】
グリコール酸塩を含む溶液に対する以下の工程の種類と順番が、（ａ１）（ｃ）（ａ２）（ｂ）、（ａ１）（ａ２）（ｄ）（ｂ）、（ａ１）（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｂ）、または（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｂ）の何れかであることを特徴とする請求項３に記載のグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【請求項５】
工程（ａ１）が、電極間に陰イオン交換膜と陽イオン交換膜を交互に配列して形成された脱塩室と濃縮室とを有する電気透析装置の脱塩室に、グリコール酸塩溶液を供給して電気透析を行い、グリコール酸アニオンと１価カチオンを前記イオン交換膜から透過させ、グリコール酸塩溶液を得る工程であり、
工程（ａ２）が、バイポーラ膜と陽イオン交換膜を交互に配列して形成された酸室と塩基室とを有する水分解電気透析装置の酸室に、工程（ａ１）処理後、または工程（ｃ）処理後のグリコール酸塩溶液をそのまま或いは任意の工程を介して供給し、グリコール酸アニオンをバイポーラ膜による水の電気分解により酸性化してグリコール酸溶液を得る工程である
ことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の直前に、（ｅ）濃縮工程を行うことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項７】
エチレングリコールを酸化してグリコール酸塩を含有する溶液を得る工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項８】
グリコール酸塩を含む溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物を、酸素存在下でエチレングリコールと接触させて得られるものであることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項９】
前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、請求項８に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項１０】
精製後のグリコール酸に対するエチレングリコールのモル比が０．１％未満であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項１１】
グリコール酸塩を含む溶液中のエチレングリコール濃度が、グリコール酸塩に対するモル比で５％未満であることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項１２】
グリコール酸に対する水素イオン以外のカウンターカチオンの総濃度が０〜５ｐｐｍのグリコール酸が得られることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項１３】
工程（ａ１）が二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程であり、工程（ａ２）が二室式水分解電気透析工程であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製造方法で得られるグリコール酸。
【請求項１５】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製造方法で得られるグリコール酸を原料とする、ポリグリコール酸。
【請求項１６】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製造方法で得られるグリコール酸を原料として、環状エステルを経由させた開環重合、または重縮合させることにより得られるポリグリコール酸。
【請求項１７】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法で得られるグリコール酸と、１つの分子中に官能基として水酸基およびカルボン酸基を各々１つずつ若しくはどちらかを２つ有する化合物を原料として、これらを重縮合させることによって得られるグリコール酸系共重合体。
【請求項１８】
グリコール酸アンモニウム塩水溶液を出発物質とし、グリコール酸アンモニウム塩を酸性化して得られるグリコール酸水溶液であって、該水溶液中のアンモニウムイオン濃度がグリコール酸に対して５ｐｐｍ以下であることを特徴とするグリコール酸水溶液。
【請求項１９】
グリコール酸アンモニウム塩水溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物によって得られることを特徴とする請求項１８に記載のグリコール酸水溶液。
【請求項２０】
前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、請求項１９に記載のグリコール酸水溶液。
【請求項２１】
グリコール酸アンモニウム塩の酸性化が、グリコール酸アンモニウム塩水溶液に対する水分解電気透析処理によって行われることを特徴とする請求項１８に記載のグリコール酸水溶液。
【請求項２２】
グリコール酸アンモニウム塩水溶液を出発物質とし、グリコール酸アンモニウム塩を酸性化して得られるグリコール酸水溶液から得られるグリコール酸であって、該グリコール酸中のアンモニウムイオン濃度がグリコール酸に対して５ｐｐｍ以下であることを特徴とするグリコール酸。
【請求項２３】
グリコール酸アンモニウム塩水溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物によって得られることを特徴とする請求項２２に記載のグリコール酸。
【請求項２４】
前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、請求項２３に記載のグリコール酸。
【請求項２５】
グリコール酸アンモニウム塩の酸性化が、グリコール酸アンモニウム塩水溶液に対する水分解電気透析処理によって行われることを特徴とする請求項２２に記載のグリコール酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度なグリコール酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（α―ヒドロキシ酢酸）は、従来、ボイラーのスケール洗浄剤等の汎用化学品として利用されてきたが、近年、化粧品材料や生分解性ポリマー、医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料としても注目されている。このため、高純度なグリコール酸を、安価に供給する要求が高まってきている。【０００３】
現行市販されている、工業的に用いられる等級のグリコール酸は、グリコール酸および硫酸の存在下においてホルムアルデヒドおよび水のカルボニル化反応により製造される。得られた粗グリコール酸は、活性炭処理による脱色、陰イオン交換樹脂による硫酸の除去、生蒸気ストリッピングによる低沸点不純物の除去、陽イオン交換樹脂による金属不純物の除去という多段の工程を経て精製されている(特許文献１)。【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法によって得られるグリコール酸は少なからず夾雑物を含んでおり、化粧品原料やポリマー原料としては純度的に問題がある。例えば、グリコール酸中には、シュウ酸、ギ酸などの有機酸が夾雑していることがある。グリコール酸をポリマー原料として用いる場合、これらの夾雑物は微量含まれているだけでもグリコール酸の脱水縮合反応を阻害し、相対的に高分子量化が抑制される。また、夾雑物の中にはポリグリコール酸を黒色に着色させる成分も含まれている。さらには、夾雑物の一つであるメトキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、化粧品や食品や飲料の包材中に含まれることは望ましくない。【０００５】
グリコール酸純度を向上させるため、上記の精製法において得られた工業的等級のグリコール酸に、種結晶として相対的に純度の高いグリコール酸を少量添加し、５℃〜−１８℃にて冷却晶析を行い、より夾雑物の少ないグリコール酸を得る方法が開示されている（特許文献２）。特許文献２に記載の方法によれば純度９９％以上のグリコール酸を得ることが可能であると記載されているが、収率が著しく低い(５℃において収率６．６％)点が問題である。【０００６】
また、微生物による発酵法によって有機酸を製造する際に、イオン交換膜による電気透析処理をし、該電気透析処理後にキレート樹脂処理を行い、更にキレート樹脂処理後にイオン交換膜による水分解電気透析を行って有機酸とアルカリとをそれぞれ回収する技術が開示されている（特許文献３）。【０００７】
しかしながら、本特許文献中には、化粧品材料や生分解性ポリマー、医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸、そのポリグリコール酸を得るための原料グリコール酸に関する記載は一切なされていない。また、特許文献３に記載の方法によって得たグリコール酸を原料とした場合も、夾雑物の除去は十分ではなく、その結果得られるポリグリコール酸は高分子量化が抑制される。【０００８】
【特許文献１】米国特許第３，８５９，３４９号
【特許文献２】特表平６-５０１２６８公報
【特許文献３】特開平９−１３５６９８公報
【発明の開示】
【０００９】
このように、従来のグリコール酸製造方法の欠点は、精製工程が極めて煩雑で非効率的であるにも関わらずその純度が低いこと、高純度化した場合にはグリコール酸収率が著しく低下しコスト高になることであった。また、従来法のグリコール酸を原料とした場合、得られるポリグリコール酸の物性も満足できるものではなかった。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、電気透析処理と、さらに活性炭処理、イオン交換樹脂処理および冷却晶析処理からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の処理と、を組み合わせるグリコール酸の製造方法が、化粧品材料、生分解性ポリマー、医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料として、より高純度なグリコール酸を安価に且つ大量に製造することができることを見出した。
【００１１】
また、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、グリコール酸からポリグリコール酸等を製造する際、ポリグリコール酸の物性に多大な悪影響を及ぼすグリコール酸中の夾雑物の特定とその濃度とを見出すに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下のとおりである。
[１]グリコール酸塩を含む溶液に対して、以下の工程（ａ１）、（ａ２）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択された３〜５種類の工程（ただし、工程（ａ２）は必須）を１回または２回以上任意の順で行うことを特徴とするグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【００１３】
[２]グリコール酸塩を含む溶液に対する以下の工程の種類と順番が、（ａ１）（ａ２）（ｂ）、（ｃ）（ａ２）（ｂ）、（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｃ）、または（ｃ）（ａ２）（ｃ）（ｄ）の何れかであることを特徴とする請求項１に記載のグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【００１４】
[３]グリコール酸塩を含む溶液に対して、以下の工程（ａ１）、（ａ２）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択された３〜５種類の工程（ただし、工程（ａ２）は必須）を１回または２回以上任意の順で行い、それに続いて工程（ｂ）を１回または２回以上行うことを特徴とするグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【００１５】
[４]グリコール酸塩を含む溶液に対する以下の工程の種類と順番が、（ａ１）（ｃ）（ａ２）（ｂ）、（ａ１）（ａ２）（ｄ）（ｂ）、（ａ１）（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｂ）、または（ｃ）（ａ２）（ｄ）（ｂ）の何れかであることを特徴とする[３]に記載のグリコール酸の製造方法。
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
（ａ２）水分解電気透析工程
（ｂ）冷却晶析工程
（ｃ）活性炭処理工程
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
【００１６】
[５]工程（ａ１）が、電極間に陰イオン交換膜と陽イオン交換膜を交互に配列して形成された脱塩室と濃縮室とを有する電気透析装置の脱塩室に、グリコール酸塩溶液を供給して電気透析を行い、グリコール酸アニオンと１価カチオンを前記イオン交換膜から透過させ、グリコール酸塩溶液を得る工程であり、工程（ａ２）が、バイポーラ膜と陽イオン交換膜を交互に配列して形成された酸室と塩基室とを有する水分解電気透析装置の酸室に、工程（ａ１）処理後、または工程（ｃ）処理後のグリコール酸塩溶液をそのまま或いは任意の工程を介して供給し、グリコール酸アニオンをバイポーラ膜による水の電気分解により酸性化してグリコール酸溶液を得る工程であることを特徴とする、[１]乃至[４]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００１７】
[６]工程（ｂ）の直前に、（ｅ）濃縮工程を行うことを特徴とする、[１]乃至[５]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００１８】
[７]エチレングリコールを酸化してグリコール酸塩を含有する溶液を得る工程を含むことを特徴とする、[１]乃至[６]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００１９】
[８]グリコール酸塩を含む溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物を、酸素存在下でエチレングリコールと接触させて得られるものであることを特徴とする、[１]乃至[７]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００２０】
[９]前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、請求項８に記載のグリコール酸の製造方法。
【００２１】
[１０]精製後のグリコール酸に対するエチレングリコールのモル比が０．１％未満である[１]乃至[９]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００２２】
[１１]グリコール酸塩を含む溶液中のエチレングリコール濃度が、グリコール酸塩に対するモル比で５％未満であることを特徴とする、[１]乃至[１０]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００２３】
[１２]グリコール酸に対する、水素イオン以外のカウンターカチオンの総濃度が０〜５ｐｐｍのグリコール酸が得られる[１]乃至[１１]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００２４】
[１３]工程（ａ１）が二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程であり、工程（ａ２）が二室式水分解電気透析工程であるところの[１]乃至[１２]のいずれかに記載のグリコール酸の製造方法。
【００２５】
[１４] [１]乃至[１３]のいずれかの方法で得られるグリコール酸
【００２６】
[１５] [１]乃至[１３]のいずれかの方法で得られるグリコール酸を原料とする、ポリグリコール酸。
【００２７】
[１６] [１]乃至[１３]のいずれかの方法で得られるグリコール酸を原料として、環状エステルを経由させた開環重合、または重縮合させることにより得られるポリグリコール酸。
【００２８】
[１７] [１]乃至[１３]のいずれかの方法で得られるグリコール酸と、１つの分子中に官能基として水酸基およびカルボン酸基を各々１つずつ若しくはどちらかを２つ有する化合物を原料として、これらを重縮合させることによって得られるグリコール酸系共重合体。
【００２９】
[１８]グリコール酸アンモニウム塩水溶液を出発物質とし、グリコール酸アンモニウム塩を酸性化して得られるグリコール酸水溶液であって、該水溶液中のアンモニウムイオン濃度がグリコール酸に対して５ｐｐｍ以下であることを特徴とするグリコール酸水溶液。
【００３０】
[１９]グリコール酸アンモニウム塩水溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物によって得られる[１８]に記載のグリコール酸水溶液。
【００３１】
[２０]前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、[１９]に記載のグリコール酸水溶液。
【００３２】
[２１] グリコール酸アンモニウム塩の酸性化が、グリコール酸アンモニウム塩水溶液に対する水分解電気透析処理によって行われる[１８]に記載のグリコール酸水溶液。
【００３３】
[２２]グリコール酸アンモニウム塩水溶液を出発物質とし、グリコール酸アンモニウム塩を酸性化して得られるグリコール酸水溶液から得られるグリコール酸であって、該グリコール酸中のアンモニウムイオン濃度がグリコール酸に対して５ｐｐｍ以下であることを特徴とするグリコール酸。
【００３４】
[２３]グリコール酸アンモニウム塩水溶液が、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する能力を有する微生物によって得られる[２２]に記載のグリコール酸。
【００３５】
[２４] 前記微生物がエシェリヒア属に属することを特徴とする、[２３]に記載のグリコール酸。
【００３６】
[２５] グリコール酸アンモニウム塩の酸性化が、グリコール酸アンモニウム塩水溶液に対する水分解電気透析処理によって行われる[２２]に記載のグリコール酸。
【００３７】
本発明のグリコール酸の製造方法によれば、夾雑物の少ないグリコール酸を少ない工程で製造することができ、ポリマー原料用途として使用可能な高純度なグリコール酸を安価に工業生産することが可能となる。当該方法により得られるグリコール酸を原料として用いることにより、高分子量、着色度等の物性に優れたポリグリコール酸等の（共）重合体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００３９】
【図１】本発明に使用する二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置の概略図である。
【図２】本発明に使用する二室式水分解電気透析装置の概略図である。
【図３】実施例２における反応液中のグリコール酸アンモニウム蓄積量の経時変化を示したグラフである。
【図４】実施例１５において、グリコール酸中にエチレングリコールが０．１６ｍｏｌ％残存している場合の、グリコール酸・エチレングリコール縮合物の増加およびエチレングリコールの減少を経時的に示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下に本発明を詳しく説明する。
（グリコール酸塩を含む溶液の製造）
本発明における「グリコール酸塩を含む溶液」とは、グリコール酸塩、または、グリコール酸およびグリコール酸塩の混合物が任意の溶媒と混和している状態を指している。尚、ここでいう任意の溶媒とは、より具体的には水であるが、水にアルコール類などの有機物やリン酸や塩化ナトリウムなどの無機塩、タンパク質、菌体などの第三成分がその存在比の大小に係わらず存在していてもよい。また、グリコール酸塩の対イオンとして、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなど任意のカチオンがその濃度に係わらず存在していてもよい。【００４１】
本発明において、供給される精製前のグリコール酸塩を含む溶液の製造方法は、公知の方法を用いることができる。【００４２】
また、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を触媒として、グリコロニトリルを水和して得られるグリコール酸塩を含む溶液も好適に使用できる。例えば、グリコロニトリルを含むリン酸カリウム緩衝液中に、ニトリラーゼ活性を有する微生物を添加し、グリコロニトリルを水和することでグリコール酸アンモニウム塩を得る方法（国際公開公報ＷＯ０２／０６８６５８号）、グリコロニトリルを含む水溶液にニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を添加し、グリコロニトリルを水和することでグリコール酸アミドを得、さらに該溶液を加熱することでグリコール酸アミドからグリコール酸アンモニウム塩を得る方法などが挙げられる。尚、ここでいうニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物とは、本来グリコロニトリルからグリコール酸を生産する能力を有しているか、何らかの手段を用いることによりグリコロニトリルからグリコール酸を生産する能力を獲得または強化した微生物の総称を意味する。【００４３】
さらに、エチレングリコールの酸化によって得られるグリコール酸塩を含む溶液に対しても本発明を適用させることができる。特に、中性からアルカリ性条件下において、グリコール酸塩を含む溶液を生成させる方法が好ましい。例えば、エチレングリコールを含む蒸留水にパラジウム活性炭粉末触媒を添加し、水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを８〜１０に保ちながら、空気を吹き込んでエチレングリコールを酸化させグリコール酸ナトリウム塩溶液を得る方法（特開昭５４−１３２５１９号公報）、エチレングリコールとメタノールとを、Au／TiO2−SiO2触媒の存在下、酸素と反応させることにより得られたグリコール酸メチルを、加水分解することによってグリコール酸溶液を得る方法（特開２００４−４３３８６号公報）などが挙げられる。【００４４】
なかでも、エチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する微生物を酸素存在下でエチレングリコールと接触させて得られるグリコール酸および／またはグリコール酸塩を含む溶液が、最も好適に使用される。【００４５】
本発明におけるエチレングリコールを酸化しグリコール酸を生成する微生物とは、本来エチレングリコールからグリコール酸を生産する能力を有しているか、何らかの手段を用いることによりエチレングリコールからグリコール酸を生産する能力を獲得または強化した微生物の総称を意味する。【００４６】
ここで、エチレングリコールからグリコール酸を生産する能力を獲得または強化した微生物の例として、エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素、およびグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素を有する微生物、またはこのような酵素の活性を何らかの方法によって付与または強化された微生物が挙げられる。そのような酵素として、ラクトアルデヒドレダクターゼ、およびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが例示され、該酵素活性を全く有しない野生型の該微生物に遺伝子組換え等の方法によって該酵素活性を与えることで、野生型の該微生物と比較して有意に該酵素の活性を向上させ、もって、エチレングリコールからグリコール酸を生産する能力が獲得または強化される。そのような微生物の具体例として、実施例に示すような遺伝子組換え大腸菌が挙げられるが、それに限られるものではない。【００４７】
これらの微生物は、例えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物に導入する等の方法を用いて作出することができる。ゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ(Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et.al.,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。【００４８】
本発明において、微生物の培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地を用いることができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。【００４９】
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。【００５０】
本発明において、微生物の培養条件は、例えば、好気条件下でｐＨ５〜８、温度２５℃〜４０℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は５０時間以内とすることができる。【００５１】
本発明における「微生物を酸素存在下でエチレングリコールと接触させる」とは、エチレングリコールを添加しうる液体、例えばリン酸カリウム緩衝液などの緩衝液や、微生物の培養に用いた培地および純水等に、エチレングリコールおよび培養した微生物を添加し、スパージャや単管等を用いて空気または酸素を吹き込み、ディスクタービン等の攪拌翼を用いて攪拌することで、エチレングリコール、微生物、酸素を十分に接触させ得る状態のこと、またはその状態が成り立つ操作のことをいう。【００５２】
ここで、本発明において、上記のような状態もしくは操作により、エチレングリコールからグリコール酸塩を含む溶液が得られる作用のことを以下「反応」と定義し、また、「反応」によって得られたグリコール酸塩を含む溶液のことを「反応液」と定義する。【００５３】
本発明に係るグリコール酸生産反応に使用される反応液としてはエチレングリコールを含む液体を用いることができ、リン酸カリウム緩衝液などの緩衝液や、微生物の培養に用いた培地、及び純水を例示することができる。【００５４】
本発明のグリコール酸生産反応に際して、反応条件は、例えば、ｐＨ６〜９、温度２０℃〜４０℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら反応することが好ましい。【００５５】
ｐＨを適切に制御する方法としては、生成するグリコール酸を中和しうるに十分なアルカリ水溶液を適時流加する方法が挙げられる。【００５６】
使用するアルカリ水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液などが挙げられる。また、このように適時中和して反応させた場合、グリコール酸はグリコール酸塩として得られる。【００５７】
反応液中の菌体を除去する方法としては、例えば反応液から菌体を遠心分離などで除去する方法を採用することができる。【００５８】
特に、本発明を実施する場合、グリコール酸塩を含む溶液中にエチレングリコールが含まれることがあり、その濃度によっては、後述する精製処理を実施しても完全に除去されないことがある。ここで、エチレングリコールは、官能基として水酸基を２つ有しているため、グリコール酸を重合させポリグリコール酸を得ようとする際には、重合開始前のカルボキシル基と水酸基のモルバランスを変化させ、結果として重合阻害剤として働く。よって、グリコール酸塩を含む溶液中のエチレングリコール濃度を可能な限り低減させ、これを用いて後述する各種精製操作を行い、精製後に得られるグリコール酸に含まれるエチレングリコール濃度を可能な限り低減させることが、より分子量の高いポリグリコール酸を製造する際には重要である。さらに、本発明者らは、エチレングリコールが含まれるグリコール酸塩を含む溶液においては、低温下においても、エチレングリコールとグリコール酸の縮合物が自発的に生成し、経時的に増加してゆく現象を見出した。このエチレングリコールとグリコール酸の縮合物も官能基として水酸基のみを２つ有しており、グリコール酸を重合させポリグリコール酸を得ようとする際、エチレングリコールと同様に重合阻害剤として働く。【００５９】
以上のことから、本発明においては、後述する各種精製処理を実施する前段階であるグリコール酸塩を含む溶液中、および、後述する各種精製処理を実施した後のグリコール酸に含まれるエチレングリコール濃度は、可能な限り低減されていることが望ましい。より具体的には、後述する各種精製処理を実施する前段階であるグリコール酸塩を含む溶液中においては、グリコール酸塩に対するモル比で５％未満まで、より好ましくは、１％未満まで低減させればよく、後述する各種精製処理を実施した後のグリコール酸においては、グリコール酸に対するモル比で０．１％未満まで、より好ましくは、０．０２％未満まで低減させればよい。【００６０】
（ａ１）陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程
本発明における「電気透析装置」とは、陽イオン交換膜、陰イオン交換膜、バイポーラ膜のうち、いずれか２種類の膜を交互に配列して形成される電気透析装置のことを指す。本発明においては、この装置を用いて行う電気透析操作のことを「電気透析工程」と定義される。また、本発明において使用される電気透析装置として、陽イオン交換膜と陰イオン交換膜とを交互に配列し、濃縮室と脱塩室を形成させた「陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置」があり、そのようなものとして代表的には「二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置」が例示される。そして、本発明においては「陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置」を用いた電気透析操作のことが「陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程」と定義される。そして、更に具体的な処理として代表的には「二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程」が例示される。【００６１】
本発明における陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置の電極は、公知のものを使用することができる。即ち、陽極としては、白金、チタン/白金、カーボン、ニッケル、ルテニウム/チタン、イリジウム/チタンなどを使用することができる。また、陰極としては、鉄、ニッケル、白金、チタン/白金、カーボン、ステンレス鋼などを使用することができる。更に、電極の構造も公知の構造が採用される。一般的な構造としては、メッシュ状、格子状等が挙げられる。【００６２】
また、本発明において、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置の陽イオン交換膜、陰イオン交換膜は、従来公知の膜を使用することができる。【００６３】
更に、本発明において、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置は、陽電極、陰電極の間に陰イオン交換膜と陽イオン交換膜とを交互に配列して濃縮室と脱塩室とを形成することによって構成される。【００６４】
図１は、本発明において使用される陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置の代表的な態様の概略図を示すものである。【００６５】
即ち、図１において、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置は、陽電極４と陰電極５との間に、膜として陽イオン交換膜Ｃ、陰イオン交換膜Ａの２種類が交互に配列され、濃縮室８および脱塩室９の二室が形成されている。陽イオン交換膜Ｃと陽電極４との空隙６、および陽イオン交換膜Ｃと陰電極５との空隙７には電極液が満たされている。【００６６】
上記陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置の構造は、公知の構造が採用される。【００６７】
本発明において、上記、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置を使用した電気透析方法は、濃縮室８、脱塩室９のそれぞれの室に供給する液の外部タンク（不図示）を設けて、それぞれの室と外部タンクとの間で液を循環しながら電気透析を行う方法が好適に採用される。【００６８】
グリコール酸塩溶液を脱塩室９に供給して、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理を行うと、濃縮室８に精製されたグリコール酸塩が濃縮される。このときグリコール酸塩溶液中には、タンパク質、アミノ酸、色素類やシュウ酸、グリオキシル酸、ギ酸、酢酸などの有機酸類、または無機塩類等の不純物が存在するが、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理によって濃縮室８に移動し濃縮されるのは、主にグリコール酸塩と無機塩類である。【００６９】
本発明において、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程時の各種液の温度は、通常５〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲であることが好適である。【００７０】
（ｃ）活性炭処理工程
本発明における、グリコール酸塩を含む溶液に対する活性炭処理を行う際に用いられる活性炭は、公知のものを用いることができる。またその形態も粉状、粒状などの形状であってもよく特に制限されない。使用量としては、経済的には可能な限り低減されていることが望ましいが、具体的には、活性炭が添加されるグリコール酸塩を含む溶液に対して２０重量％以下が望ましい。さらに、より好適には、１〜１２．５重量％である。接触温度および時間は、１０〜３０℃において１５〜６０分処理する方法が好適に採用される。接触方式としては、例えばバッチ方式、カラム充填方式などが採用される。【００７１】
（ａ２）水分解電気透析工程
本発明においてグリコール酸塩からグリコール酸への変換のために、「水分解電気透析装置」を用いる。該装置はバイポーラ膜と陽イオン交換膜とを交互に配列し、酸室と塩基室を形成させた電気透析装置のことである。その代表的なものとしては「二室式水分解電気透析装置」を挙げることができる。本発明においては、「水分解電気透析装置」を用いた電気透析操作のことを「水分解電気透析工程」と定義される。そして、更に具体的な処理として代表的には「二室式水分解電気透析工程」が例示される。【００７２】
水分解電気透析工程においては、得られたグリコール酸塩溶液に対して、水分解電気透析装置を用いて、水分解電気透析工程を行い、グリコール酸とアルカリをそれぞれ回収する。【００７３】
すなわち、バイポーラ膜と陽イオン交換膜を使用した水分解電気透析装置に、グリコール酸塩溶液を供給して水分解電気透析工程を行い、酸室よりグリコール酸を、塩基室よりアルカリをそれぞれ得る。【００７４】
本発明におけるバイポーラ膜としては、従来公知のバイポーラ膜、すなわち陽イオン交換膜と陰イオン交換膜とを貼合わせた構造を有する公知のバイポーラ膜を使用することができる。【００７５】
更に、本発明において、水分解電気透析装置の陽イオン交換膜としては、公知の陽イオン交換膜を用いることができる。【００７６】
本発明において、水分解電気透析装置は、陽電極および陰電極の間にバイポーラ膜と陽イオン交換膜とを交互に配列して酸室と塩基室とを形成することによって構成される。【００７７】
図２は、本発明において使用される水分解電気透析装置の代表的な態様の概略図を示すものである。
即ち、図２において、水分解電気透析装置は、陽電極４および陰電極５の間に、膜としてバイポーラ膜Ｂ、陽イオン交換膜Ｃの２種類が交互に配列され、酸室１１、および塩基室１０の二室が形成されている。陽イオン交換膜Ｃと陽電極４との空隙６、および陽イオン交換膜Ｃと陰電極５との空隙７には電極液が満たされている。ここで、バイポーラ膜Ｂの陰イオン交換体側と陽イオン交換膜Ｃの間の室が塩基室１０、バイポーラ膜Ｂの陽イオン交換体側と陽イオン交換膜Ｃの間の室が酸室１１となる。【００７８】
上記、水分解電気透析装置の構造は、公知の構造が採用される。
本発明において、上記水分解電気透析装置を使用した水分解電気透析工程は、酸室１１、塩基室１０のそれぞれの室に供給する液の外部タンク（不図示）を設けて、それぞれの室と外部タンクとの間で液を循環しながら電気透析を行う方法が好適に採用される。【００７９】
上記、グリコール酸塩溶液を酸室１１に供給して電気透析を行うと、酸室１１のグリコール酸塩は通電と共にグリコール酸に変換していく。【００８０】
即ち、酸室１１中に導入されたグリコール酸塩の陽イオンは、陽イオン交換膜Ｃを透過して塩基室１０へ移動し、このとき、バイポーラ膜Ｂから生成したＯＨイオンと結合して塩基となる。また、酸室１１ではバイポーラ膜Ｂから生成したプロトンとグリコール酸アニオンとが結合して非解離性のグリコール酸となり、そのまま酸室１１にとどまる。【００８１】
本発明において、水分解電気透析工程時の各種液の温度は、通常５〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲であることが好適である。【００８２】
以上のように、水分解電気透析工程により、グリコール酸塩を分解しグリコール酸とアルカリを分離し、グリコール酸を回収することができる。
なお、分離したアルカリは、グリコール酸等有機酸発酵での中和剤として再利用することができる。
上記陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程および水分解電気透析工程によって、すでに市販工業的等級よりも純度の高いグリコール酸を得ることができる。【００８３】
即ち、市販工業的等級のグリコール酸純度が約８２％であるのに対し、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析工程および水分解電気透析工程によって得られたグリコール酸純度は約９８％である。【００８４】
（ｄ）イオン交換樹脂処理工程
本発明におけるイオン交換樹脂処理は、公知の陽イオン交換樹脂を用いることができるが、特に強酸性のイオン交換基が存在する陽イオン交換樹脂が好適に使用される。そのような強酸性イオン交換基として、スルホン酸基が例示される。使用量としては、陽イオン交換樹脂が添加されるグリコール酸溶液に対して１〜１０重量％、より好適には３〜５重量％使用される。接触温度および時間は、１０〜３０℃において１５〜６０分処理する方法が好適に採用される。接触方式としては、例えば、バッチ方式、カラム充填方式などが採用される。本操作により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどカチオンを吸着除去でき、処理後の溶液に残存するカチオン濃度は、グリコール酸に対して５ｐｐｍ以下となる。【００８５】
（ｅ）濃縮工程
本発明における濃縮工程は、公知の濃縮方法により行われる。例えば、減圧下において２０〜８０℃、より好適には３０〜４０℃で加熱すればよいが、この方法に限定されるものではない。この濃縮処理によって、グリコール酸溶液は、任意の濃度に濃縮すればよいが、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは７０〜８５重量％に濃縮すればよい。【００８６】
（ｂ）冷却晶析工程
本発明における冷却晶析処理の方法は、公知の方法を用いることができるが、先に述べた濃縮処理を実施し、７０〜８５重量％に濃縮されたグリコール酸溶液を、５〜−２５℃の温度に、より好適には４〜−２０℃に冷却することにより、グリコール酸結晶を３２〜７５％という高収率で得ることができる。特に種結晶として純粋なグリコール酸を添加する必要は無いが、添加することもできる。また、冷却中は攪拌することなく静置することで、より結晶粒径の大きく高純度で、ろ過回収が容易な結晶を得ることができる。冷却晶析処理を実施する際に使用する容器の材質は、ガラスやＳＵＳなど公知のものを用いることができる。【００８７】
得られた結晶の回収方法は、結晶を母液から分離するための公知の方法を用いることができる。例えば、フィルタープレス、減圧式のベルトフィルター、また、リーフフィルタに代表されるような回分加圧ろ過機やスクリュウデカンタに代表されるような遠心分離機等を使用して結晶とろ液とを分離すればよいが、これらの方法に限定されるものではない。また、分離された結晶ケーキを乾燥する前に、水、グリコール酸水溶液、アルコールなどの各種溶媒で洗浄しても良い。【００８８】
回収された結晶の乾燥方法は、公知の方法を用いることができるが、例えば、真空乾燥機内において、１０〜２５℃で１６〜２４時間真空乾燥することが好適に採用される。【００８９】
本発明においては、グリコール酸塩を含む溶液に対して、上述の工程（ａ１）、工程（ａ２）、工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）よりなる群から選択された、少なくとも工程（ａ２）を含む３〜５種類の工程を１回または２回以上任意の順で行う。【００９０】
このような本発明のグリコール酸の製造方法によれば、夾雑物の少ないグリコール酸を少ない工程で製造することができ、ポリマー原料用途として使用可能な高純度なグリコール酸を安価に工業生産することができる。なお、本発明において「３〜５種類の工程を１回または２回以上任意の順で行う」とは、
（Ａ）例えば、工程ａ１，工程ａ２，工程ｂを選択し、工程ｂ→工程ａ１→工程ａ２のように選択された全工程を任意の順で行うのを１回とし、これを１回または２回以上繰り返す態様、
（Ｂ）例えば、工程ａ１，工程ａ２，工程ｂを選択し、工程ｂ→工程ｂ→工程ａ１→工程ａ２→工程ａ１のように選択された各工程を任意に複数回繰り返す態様、
のいずれをも含むものである。【００９１】
また、本発明のグリコール酸の製造方法は、グリコール酸塩を含む溶液に対して以下の工程順の何れかで実施することが好ましい。
（１）工程（ａ１）、工程（ａ２）、工程（ｂ）
（２）工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｂ）
（３）工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｄ）、工程（ｃ）
（４）工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｃ）、工程（ｄ）【００９２】
このような順でグリコール酸の製造方法を実施することにより、より高純度なグリコール酸を生産することができる。【００９３】
さらに、高純度なグリコール酸を製造する観点から、上述の順に工程を行った後に、それに続いて（ｂ）冷却晶析工程を１回または２回以上行うことも好ましい。【００９４】
本発明において、（ｂ）冷却晶析工程を最後に行う態様としては、さらに高純度なグリコール酸を製造する観点から、グリコール酸塩を含む溶液に対して以下の工程順の何れかで実施することが好ましい。
（５）工程（ａ１）、工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｂ）
（６）工程（ａ１）、工程（ａ２）、工程（ｄ）、工程（ｂ）
（７）工程（ａ１）、工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｄ）、工程（ｂ）
（８）工程（ｃ）、工程（ａ２）、工程（ｄ）、工程（ｂ）【００９５】
また、（ｂ）冷却晶析工程の直前に、（ｅ）グリコール酸溶液の濃縮工程を行うことが好ましい。これにより、（ｂ）冷却晶析工程を効率的に行うことができる。【００９６】
このような工程を含む本発明のグリコール酸の製造方法によれば、グリコール酸に含まれるエチレングリコールがグリコール酸に対してモル比で０．１％未満、好ましくは０．０２％未満にまで低減された高純度なグリコール酸を得ることができる。このようなグリコール酸を用いることにより、従来に比べ分子量が高く、着色が低減されたポリグリコール酸等の（共）重合体を製造することができる。【００９７】
さらに、本発明のグリコール酸の製造方法によって得られるグリコール酸は、グリコール酸に対する、アンモニウムイオン等の水素イオン以外のカウンターカチオンの総濃度が５ｐｐｍ以下、好ましくは０〜１ｐｐｍにまで低減されている。したがって、グリコール酸を原料として得られるポリグリコール酸の着色が低減され、透過率が向上する。【００９８】
このような本発明の製造方法において得られたグリコール酸を原料として用い、後述する処方によって重合することにより、着色が少なく、高分子量のポリグリコール酸やグリコール酸系共重合体を得ることができる。【００９９】
ポリグリコール酸の製造方法の一例を挙げると、グリコール酸からポリグリコール酸の重合反応において、
[第一工程]グリコール酸水溶液を１００℃以上１６０℃以下で、常圧若しくは減圧下で脱水し、重量平均分子量が１０００以上１万以下とするオリゴマー工程、
[第二工程]第一工程で得られたオリゴマーを気中乾燥後、不活性ガス気流下、１８０℃以上２３０℃以下で、重量平均分子量３万以上に固相重合する工程、
の２段階の工程を含んでなる、グリコール酸の重合方法が挙げられるが、これに限られるものではない。【０１００】
また、グリコール酸系共重合体は、公知の方法によって製造することができ、グリコール酸と、１つの分子中に官能基として水酸基およびカルボン酸基を各々１つずつ若しくはどちらかを２つ有する化合物を原料として、これらを重縮合させることによって得ることができる。前記化合物としては、イソフタル酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール等を挙げることができる。
［実施例］【０１０１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、実施例１〜８は、グリコール酸アンモニウムからグリコール酸を得る一連の工程を説明する例である。【０１０２】
本発明における各成分の濃度の測定方法については、下記の方法がその代表例として挙げられるが、これらに限られる訳ではなく、公知の方法を採用することができる。【０１０３】
[グリコール酸濃度およびエチレングリコール濃度]
日立製作所製高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、以下の設定にて定量した。カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（信和化工社製）、溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ＝２．１）、流速：１．０ｍＬ／分。グリコール酸はＵＶを検出器として波長２１０ｎｍにて検出した。また、エチレングリコールは同様のＨＰＬＣを同様の設定で用い、示差熱屈折計（ＲＩ）を検出器として検出した。【０１０４】
[陽イオン濃度]
日本分光社製イオンクロマトグラフィーを用い、以下の設定にて定量した。カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＣ  ＹＫ−４２１（昭和電工社製）、溶離液：３ｍＭリン酸水溶液、流速：１．０ｍＬ／分。また、検出器としては電気伝導度計を用いた。【０１０５】
［実施例１］
ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築【０１０６】
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６４５４１）。ｆｕｃＯを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号１）、及びＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。さらに、ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣ（配列番号３）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化することで約１．５ｋｂｐのａｌｄＡフラグメントを得た。さらにグリセルアルデヒド  ３−リン酸脱水素酵素(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するため大腸菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号５）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４００に記載）をコードするフラグメントを得た。上記の３つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡを回収した。このプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することによりＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を得た。【０１０７】
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、エシェリヒア・コリＤＨ５α株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１０８】
［実施例２］
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸アンモニウムの生産【０１０９】
前培養として三角フラスコに入れたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬに実施例１で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を植菌し、一晩、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、（表１）に示す組成の培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量１ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（アンモニア水溶液で調整）で行った。培養開始後２４時間以降は、エチレングリコールを５ｇ／時間の速度で２２時間添加した。得られた培養液中のグリコール酸アンモニウム蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を図３に示す。【０１１０】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株において２２時間で１２９ｇ／Ｌのグリコール酸アンモニウムの蓄積が確認された。また、残存するエチレングリコール濃度はグリコール酸アンモニウムに対して０．００２ｍｏｌ％未満であった。【０１１１】
（表１）
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【０１１２】
［実施例３］
二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理によるグリコール酸塩溶液の調製【０１１３】
二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析装置は、陰イオン交換膜(アストム社製、商品名：ネオセプタＡＣＳ)と陽イオン交換膜(同、ネオセプタＣＭＸ)とが順番にそれぞれ１０枚ずつ（総有効膜面積は５５０ｃｍ2）配置され、脱塩室、濃縮室が形成されたフィルタープレス型電気透析装置を用いた。脱塩室には実施例２で得られたグリコール酸アンモニウム溶液３ｋｇを、濃縮室には純水１．２ｋｇをそれぞれ対応するタンクを設け、供給、循環した。なお、電極液としては２％硫酸水溶液１．５ｋｇを使用した。これらの装置を用いて、室温（約２５℃）、一定電圧１５Ｖにて１１時間電気透析を行った。その結果、濃縮室から、グリコール酸アンモニウム濃度１６．２重量％のグリコール酸アンモニウム溶液２．３ｋｇが得られた。【０１１４】
［実施例４］
グリコール酸塩溶液の活性炭処理
水洗の後、軽く水分をふき取った活性炭レバチットＡＦ５（ＬＡＮＸＥＳＳ社製）１１９ｇを１Ｌビーカーにとった。このビーカーに実施例３で得たグリコール酸アンモニウム溶液５ｋｇを加え、２５℃で１５分攪拌した後、デカンテーションで処理済上清を別の受器に移した。回収した上清を減圧濾過して活性炭微紛を除去した。本操作により、グリコール酸塩以外の有機酸および有機酸塩、夾雑タンパク質、着色成分が除去された。また、本操作によるグリコール酸アンモニウム塩の回収率は９８．８％であった。【０１１５】
［実施例５］
二室式水分解電気透析処理によるグリコール酸塩溶液からグリコール酸溶液の調製
二室式水分解電気透析装置は、陽イオン交換膜(アストム社製、商品名：ネオセプタＣＭＸ)とバイポーラ膜(同、ネオセプタＢＰ−１)とが順番にそれぞれ１０枚ずつ（総有効膜面積は５５０ｃｍ2）配置され、酸室、塩基室が形成されたフィルタープレス型電気透析装置を用いた。酸室には実施例４で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２．５ｋｇを、塩基室には純水２．５ｋｇをそれぞれ対応するタンクを設け、供給、循環した。なお、電極液としては２％硫酸水溶液２ｋｇを使用した。これらの装置を用いて、室温（約２５℃）、一定電圧２０Ｖにて１０．５時間電気透析を行った。その結果、酸室からグリコール酸濃度１２．３重量％、アンモニウムイオン濃度８００ｐｐｍのグリコール酸溶液２．３ｋｇが得られ、塩基室からはアンモニア水２．７ｋｇが得られた。【０１１６】
［実施例６］
グリコール酸溶液の陽イオン交換樹脂処理
陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８−２００）８０ｍＬを純水で懸濁させ、直径２．５ｃｍのカラムに充填し、１０倍量以上の純水で洗浄した。洗浄後、本カラムに実施例５で得られたグリコール酸溶液を定速流量ポンプを使用して７ｍＬ／ｍｉｎの流速で流通せしめた。回収したグリコール酸溶液をイオンクロマトグラフにより分析したところ、アンモニウムイオン濃度が８００ｐｐｍから検出限界（１ｐｐｍ）未満に低下していた。また、本操作によるグリコール酸の回収率は１００％であった。【０１１７】
［実施例７］
グリコール酸溶液の濃縮
実施例６で得られたグリコール酸溶液４．５ｋｇを、ロータリーバキュームエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社製）を使用し、１００ｍｂａｒ、３０℃にて１２時間減圧濃縮を行ったところ、グリコール酸濃度７８．９重量％、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満のグリコール酸溶液６６３ｇを得た。【０１１８】
［実施例８］
冷却晶析によるグリコール酸の調製
実施例７で得られたグリコール酸溶液４４６ｇを、−２０℃で１６時間維持した。この間に多数の六方結晶が生成した。５Ａ濾紙（アドバンテック東洋社製）を装着したヌッチェロートを吸引ろ過ビンに取り付け、バキュームポンプで吸引しながら該結晶を吸引ろ過にて回収した。回収した結晶を直径１０ｃｍのプラスチック製シャーレに移し、減圧下、２６℃にて２４時間乾燥させた。この結晶を分析したところ、グリコール酸濃度９９．９９重量％、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満のグリコール酸結晶２５４ｇ（収率７２．４％）を得た。【０１１９】
［実施例９］
二室式電気透析処理と活性炭処理、濃縮処理および冷却晶析処理とを組合わせて得られたグリコール酸の重合評価
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）を、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をしてグリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．８重量％）を得た。引き続き、実施例４に記載の活性炭処理を行い、グリコール酸アンモニウム溶液１．６ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１５．８重量％）を得た後、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．２重量％）。さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２２６ｇを得、引き続き、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３１ｇを得た。得られたグリコール酸にはアンモニウムイオンが２８０ｐｐｍ残存していた。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作は以下のように行った。【０１２０】
[第一工程]
攪拌装置、温度計、脱水管および底抜きコックを装着した４つ口フラスコに蒸留水で７０重量％に調整した上記グリコール酸水溶液１００．０ｇを装入した。【０１２１】
攪拌しながら、脱気・窒素置換を３回繰り返した後、常圧下で室温から１４０℃まで２時間かけて昇温してグリコール酸水溶液に含有される水分を粗脱水した。その後１４０℃、常圧下で１時間熟成し、続けて、１４０℃で常圧から７０ｋＰａまで徐々に減圧することで残りの水分と縮合水を除去した。この段階で系内の溶液粘度がやや上昇してきた。更に、１４０℃、７０ｋＰａで３０分間熟成した後、常圧に戻し、反応フラスコの底抜きコックより内容物を抜出した。抜出し、急冷することにより、内容物は白色の結晶固体のオリゴマーとなった。得られた白色結晶固体オリゴマーの収量は５０．９ｇであった。この段階で、ポリグリコール酸オリゴマーの分子量は重量平均分子量（Ｍｗ）で６０００であった。【０１２２】
[第二工程]
上記で得られたポリグリコール酸オリゴマー固体を粉砕・分級して、粒径２．３６〜１．００ｍｍのペレットとした。このペレット２０ｇを、窒素流通可能な内容量１００ｃｃのＳＵＳ製カラムに充填した。このカラムをイナートオーブン内に固定して、窒素流量、すなわち比速度（以下Ｓｖ）にして２００ｍｌ/ｈｒ/ｇの条件下で、１２０℃、１８０℃、２００℃、２１０℃、２２０℃の各温度にて各２０時間ずつ段階的に固相重合した。最終の２２０℃固相重合後、ポリグリコール酸のペレットを回収した。得られたポリグリコール酸の品質評価は、着色度評価および分子量評価にて行った。着色度は、得られたポリグリコール酸０．１ｇに１Ｎ水酸化ナトリウム１．９ｇを加え、５０℃恒温槽内で２０ｈｒインキュベートし加水分解した後、３．０ｇ蒸留水でメスアップした試料を、ＵＶ／Ｖｉｓ吸光光度計を用いて３００ｎｍにおける透過率を測定した。分子量は得られたポリグリコール酸３ｍｇを２５０℃オーブンを用いて２分間加熱し、非晶ポリマーを得た後、ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解させ、ＧＰＣを用いて分子量を測定した。結果を（表２）に示した。【０１２３】
（表２）
2007049707.tif 000003
【０１２４】
［実施例１０］
活性炭処理と二室式電気透析処理、濃縮処理および冷却晶析処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１２５】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）を、実施例４に記載の活性炭処理を行い、グリコール酸アンモニウム塩２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム塩濃度１２．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１３．０重量％）を得た後、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２３０ｇを得、次にこのグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３３ｇを得た。得られたグリコール酸においては、アンモニウムイオン濃度は３００ｐｐｍであった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表３）に示した。【０１２６】
（表３）
2007049707.tif 000004
【０１２７】
［実施例１１］
二室式電気透析処理と陽イオン交換樹脂処理、濃縮処理および冷却晶析処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１２８】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）を、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をしてグリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１３．０重量％）を得た後、実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．３重量％）。さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２３０ｇを得、次にこのグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３３ｇを得た。得られたグリコール酸においては、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表４）に示した。【０１２９】
（表４）
2007049707.tif 000005
【０１３０】
［実施例１２］
二室式電気透析処理と濃縮処理および冷却晶析処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１３１】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理を行ってグリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．８重量％）を得た。次に実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１３．０重量％）を得た後、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２３０ｇを得た。引き続き、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、得られた結晶を別途準備した８０重量％のグリコール酸溶液１３０ｇで５回洗浄して、グリコール酸１１０ｇを得た。得られたグリコール酸にはアンモニウムイオンが１ｐｐｍ残存していた。また、８０重量％のグリコール酸で３回洗浄を行った場合、グリコール酸１２０ｇが得られた。得られたグリコール酸にはアンモニウムイオンが５ｐｐｍ残存していた。さらに、８０重量％のグリコール酸で洗浄を行わなかった場合、グリコール酸は１３０ｇ回収され、アンモニウムイオンが３８０ｐｐｍ残存していた。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表５）に示した。【０１３２】
（表５）
2007049707.tif 000006
【０１３３】
［実施例１３］
二室式電気透析処理と活性炭処理、陽イオン交換樹脂処理、濃縮処理および冷却晶析処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１３４】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．８重量％）を得た。引き続き、実施例４に記載の活性炭処理を行い、グリコール酸アンモニウム溶液１．６ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１５．８重量％）を得た後、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．２重量％）。これに実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．６ｋｇを得（グリコール酸濃度１１．４重量％）、さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２２６ｇを得た。次に、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３１ｇを得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表６）に示した。【０１３５】
（表６）
2007049707.tif 000007
【０１３６】
［実施例１４］
活性炭処理と二室式電気透析処理、陽イオン交換樹脂処理、濃縮処理および冷却晶析処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１３７】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例４に記載の活性炭処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．２重量％）。これに実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．６ｋｇを得（グリコール酸濃度１１．４重量％）、さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２２６ｇを得た。次に、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３１ｇを得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表７）に示した。【０１３８】
（表７）
2007049707.tif 000008
【０１３９】
[実施例１５]
エチレングリコールがグリコール酸塩に対して１０ｍｏｌ％残存しているグリコール酸塩溶液を精製して得られたグリコール酸の重合評価【０１４０】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法において、通気量を０．２ｖｖｍ、撹拌速度を５００ｒｐｍに変更して、グリコール酸アンモニウム溶液を得た（グリコール酸アンモニウム濃度１１．６重量％）。この溶液にはエチレングリコールがグリコール酸アンモニウムに対して１０ｍｏｌ％残存していた。このグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇに実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１５．０重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸アンモニウムに対して１．０ｍｏｌ％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１１．６重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して１．１５ｍｏｌ％）を得た後、実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１１．０重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して１．１５ｍｏｌ％）。さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２０７ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して１．１５ｍｏｌ％）を得、引き続き、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１２０ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．１６ｍｏｌ％）を得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表８）に示した。【０１４１】
（表８）
2007049707.tif 000009
【０１４２】
このように、実施例１５では、ポリグリコール酸を調製した場合、着色度には問題が無いが、エチレングリコールの残濃度が高いため、分子量が低くなることが明らかとなった。よって、望ましくは精製後のグリコール酸に対するエチレングリコールの濃度はモル比で０．１％未満であることが示された。
また、このグリコール酸を２５℃にて１０日間保存した場合の組成変化を経時的に観察し、結果を図４に示した。図４に示すように、グリコール酸中にエチレングリコールがグリコール酸に対して０．１６ｍｏｌ％残存している場合、グリコール酸とエチレングリコールが自発的に反応し、その縮合物が経時的に増加していくことが示された。また、これを原料として重合評価を行った場合、（表８）に示めした結果と同様に、分子量の小さいポリグリコール酸の得られることが明らかとなった。なお、図４中、黒い四角印はエチレングリコール濃度（ｍｏｌ％）を示し、丸印はグリコール酸・エチレングリコール縮合物濃度（ｍｏｌ％）を示す。【０１４３】
[実施例１６]
エチレングリコールがグリコール酸塩に対して４．９ｍｏｌ％残存しているグリコール酸塩溶液を精製して得られたグリコール酸の重合評価【０１４４】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法において、通気量を０．５ｖｖｍ、撹拌速度を６００ｒｐｍに変更して、グリコール酸アンモニウム溶液を得た（グリコール酸アンモニウム濃度１２．３重量％）。この溶液にはエチレングリコールがグリコール酸アンモニウムに対して４．９ｍｏｌ％残存していた。このグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇに、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１５．９重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸アンモニウムに対して０．４９ｍｏｌ％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１２．３重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．５５ｍｏｌ％）を得た後、実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１１．６重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．５５ｍｏｌ％）。さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２１９ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．５５ｍｏｌ％）を得、引き続き、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１２７ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．０７６ｍｏｌ％）を得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表９）に示した。【０１４５】
（表９）
2007049707.tif 000010
【０１４６】
［実施例１７］
エチレングリコールがグリコール酸塩に対して１．０ｍｏｌ％残存しているグリコール酸塩溶液を精製して得られたグリコール酸の重合評価【０１４７】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法において、通気量を０．８ｖｖｍ、撹拌速度を７００ｒｐｍに変更して、グリコール酸アンモニウム溶液を得た（グリコール酸アンモニウム濃度１２．７重量％）。この溶液にはエチレングリコールがグリコール酸アンモニウムに対して１．０ｍｏｌ％残存していた。このグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇに、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．５重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸アンモニウムに対して０．１ｍｏｌ％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１２．７重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．１１ｍｏｌ％）を得た後、実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．０重量％、エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．５５ｍｏｌ％）。さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２２６ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．１１ｍｏｌ％）を得、引き続き、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１３１ｇ（エチレングリコール濃度はグリコール酸に対して０．０１５ｍｏｌ％）を得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表７）に示した。【０１４８】
（表１０）
2007049707.tif 000011
【０１４９】
[実施例１８]
活性炭処理と二室式電気透析処理、陽イオン交換樹脂処理、活性炭処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１５０】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例４に記載の活性炭処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．２重量％）。これに実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．６ｋｇを得（グリコール酸濃度１１．４重量％）、さらに、実施例４に記載の活性炭処理を実施することでグリコール酸溶液１．６ｋｇ（グリコール酸濃度１１．３重量％）を得た。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１１）に示した。【０１５１】
（表１１）
2007049707.tif 000012
【０１５２】
[実施例１９]
活性炭処理と二室式電気透析処理、活性炭処理、陽イオン交換樹脂処理とを組み合わせて調製されたグリコール酸の重合評価【０１５３】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例４に記載の活性炭処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度１２．２重量％）。さらに、実施例４に記載の活性炭処理を実施することでグリコール酸溶液１．５ｋｇ（グリコール酸濃度１２．１重量％）を得た。これに実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液１．５ｋｇを得（グリコール酸濃度１２．１重量％）、このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１２）に示した。【０１５４】
（表１２）
2007049707.tif 000013
【０１５５】
[比較例１]
市販工業的等級グリコール酸を原料として用いた重合評価
米国特許第３，８５９，３４９号に従って製造された市販工業的等級グリコール酸（和光純薬工業社製）を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１３）に示した。【０１５６】
（表１３）
2007049707.tif 000014
【０１５７】
（表１３）に示すように、市販工業的等級グリコール酸を用いた場合、本発明に示された製法で得られたグリコール酸を用いた場合と比較して、透過率が低い、つまり着色度の高いポリグリコール酸の得られることが示された。【０１５８】
[比較例２]
市販高純度グリコール酸を原料として用いた重合評価
特表平６-５０１２６８号公報に従って製造された市販高純度グリコール酸（東京化成工業社製）を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１４）に示した。【０１５９】
（表１４）
2007049707.tif 000015
【０１６０】
（表１４）に示すように、市販高純度グリコール酸を用いた場合でも、本発明に示された製法で得られたグリコール酸を用いた場合と比較して、透過率が低い、つまり着色の多いポリグリコール酸の得られることが示された。【０１６１】
[比較例３]
電気透析処理および濃縮処理によって得られたグリコール酸の重合評価【０１６２】
実施例１に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を用い、実施例２に記載の方法で得られたグリコール酸アンモニウム溶液２ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１２．９重量％）に、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液１．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１６．８重量％）を得た。引き続き、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を行い、グリコール酸溶液１．４ｋｇ（グリコール酸濃度１３．０重量％）を得た後、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２３１ｇを得た。得られたグリコール酸にはアンモニウムイオンが４９００ｐｐｍ残存していた。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１５）に示した。【０１６３】
（表１５）
2007049707.tif 000016
【０１６４】
（表１５）に示すように、電気透析処理と濃縮処理のみでグリコール酸を精製した場合、アンモニウムイオンが高濃度で残存し、実施例９〜１９において示したような、活性炭処理と陽イオン交換樹脂処理、冷却晶析処理とを組合わせて精製した場合と比較して、透過率が低い、つまり着色度の高いポリグリコール酸の得られることが示された。【０１６５】
［実施例２０］
グリコロニトリルを原料として製造されたグリコール酸塩溶液を用いたグリコール酸の調製と、これを原料とした重合評価【０１６６】
国際公開公報ＷＯ０２／０６８６５８号の実施例１に記載の方法を用い、グリコール酸アンモニウム溶液を調製した。具体的には、以下のように調製した。Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）を湿菌体で６２ｇ懸濁させた９３８ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウム溶液(ｐＨ７．０)を５０℃で1時間加熱し、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させ、その後２５℃水槽にて冷却した。これを遠心分離にかけ、上清を除去した後、９４８ｍＬの０．０２Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．０）に再分散させ、さらに遠心分離にかけ、上清を除去した。得られた菌体を９３８ｍＬの０．０２Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．０）に再分散し、５５重量％のグリコロニトリル水溶液を１０６ｍＬ添加し、２５℃で２時間撹拌した。撹拌した後、該溶液を遠心分離にかけ、上清を回収した。本操作により、添加したグリコロニトリルは完全にグリコール酸アンモニウムに転化した。上記操作を数回繰り返し、得られたグリコール酸アンモニウム溶液３．３ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度８．４重量％）に、実施例３に記載の二室式陰イオン／陽イオン交換膜電気透析処理をして、グリコール酸アンモニウム溶液２．５ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１０．８重量％）を得た。引き続き、実施例４に記載の活性炭処理を行い、グリコール酸アンモニウム溶液２．６ｋｇ（グリコール酸アンモニウム濃度１０．２重量％）を得た後、実施例５に記載の二室式水分解電気透析処理を施し、グリコール酸溶液２．５ｋｇを得た（グリコール酸濃度７．９重量％）。これに実施例６に記載の陽イオン交換樹脂処理を施し、グリコール酸溶液２．６ｋｇを得（グリコール酸濃度７．５重量％）、さらに、実施例７に記載の濃縮処理を実施することで８０重量％のグリコール酸溶液２４３ｇを得た。次に、このグリコール酸溶液に実施例８に記載の冷却晶析処理を施し、グリコール酸１４１ｇを得た。得られたグリコール酸において、アンモニウムイオン濃度は検出限界（１ｐｐｍ）未満であった。このグリコール酸を原料として重縮合反応を行い、ポリグリコール酸を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価、分子量評価は実施例９と同様にして行った。結果を（表１６）に示した。なお、上記のＡＴＣＣ番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにおける寄託番号を示していて、上記菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに請求することにより、有償で何人でも入手することができる。【０１６７】
（表１６）
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【０１６８】
（表１６）に示すように、グリコロニトリルを原料として得られたグリコール酸アンモニウム溶液に対しても、本発明による精製方法は好適で、得られたグリコール酸を重合して得たポリグリコール酸は、着色が少なく、分子量の大きいことが示された。【０１６９】
[実施例２１]
グリコール酸系共重合体を調製することによる、グリコール酸の重合評価【０１７０】
実施例１７で得られたグリコール酸を用いて、グリコール酸系共重合体を調製した。具体的には、グリコール酸１００重量部、イソフタル酸２９．７重量部、エチレングリコール３８．９重量部、トリメチロールエタン０．０８重量部を反応槽に仕込み、窒素雰囲気の常圧下、攪拌下に１３０〜２００℃で、生成する水を留去しながら約２４時間、透明化するまでエステル化反応を行った。得られたポリエステルオリゴマーを攪拌装置、留出管を装備したガラス製反応器に仕込んだ。留出管は真空ポンプと減圧調整器からなる真空装置に接続されており、蒸発物を留去可能な構造となっている。ここにゲルマニウム系触媒（二酸化ゲルマニウム ６．７重量％含有）を０．６重量部添加した。まず窒素気流下２００℃で攪拌下約３０分反応し、その後その系を２００℃に保ったまま、約１時間で約０．８ｔｏｒｒまで減圧にし、その後約１０時間で約０．８〜０．５ｔｏｒｒの条件で、２２５℃まで攪拌しながら昇温して反応を行い、生成するエチレングリコールを系外に留去した。この重縮合物中のグリコール酸、イソフタル酸、エチレングリコール、およびジエチレングリコールの各成分単位の組成はそれぞれ７１．０モル％、１４．５モル％、１０．１モル％、および４．４モル％であった。このポリエステル樹脂を約４０℃で約２０時間減圧下に乾燥後、２枚の真鍮板、アルミ板および離型フィルムの間に所定量をはさみ、２００℃で溶融させ、１０ＭＰａで１分間圧縮したのち、２０℃の温度に設定した圧縮成形機で再び１０ＭＰａで圧縮冷却し、約７０μｍの厚みをもつプレスフィルムを作製した。得られたフィルムは透明でΔｂ値は６．７％であった。【０１７１】
[比較例４]
市販高純度グリコール酸を原料としたグリコール酸系共重合体を調製することによる、グリコール酸の重合評価【０１７２】
米国特許第３，８５９，３４９号に従って製造された市販工業的等級グリコール酸（和光純薬工業社製）を原料として重縮合反応を行い、グリコール酸系共重合体を調製した。重合操作および重合によって得られたポリグリコール酸の着色度評価は実施例２１と同様にして行った。その結果、得られたフィルムはやや着色しており、Δｂ値は１２．８％であった。このように、グリコール酸系共重合体を調製した場合においても、本発明記載の製造方法で製造されたグリコール酸を用いた場合、市販高純度グリコール酸を用いた場合と比較して、着色度の低いグリコール酸系共重合体の得られることが示された。【０１７３】
以下に、実施例３〜２０および比較例１〜３により得られたグリコール酸およびポリグリコール酸の物性値を表１７に、実施例２１および比較例４により得られたグリコール酸およびグリコール酸系共重合体の物性値を表１８にまとめて示す。なお、各グリコール酸のグリコール酸濃度、エチレングリコールのモル比、アンモニウムイオン濃度は水分を除いた場合の値である。【０１７４】
（表１７）
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【０１７５】
（表１８）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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