(57)【要約】染色体上のＢＴＬＡ遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＢＴＬＡを発現する機能が失われており、ＢＴＬＡが認識するリガンドに対する応答性が特異的に障害されているマウスを全身性自己免疫疾患、特に自己免疫性肝炎疾患モデルとして利用する。この自己免疫疾患・自己免疫性肝炎自然発症マウスを、自己免疫疾患診断法、病原となる自己抗原、自己免疫応答の促進物質又は抑制物質のスクリ−ニングに用いる。
2007144974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のＢＴＬＡの一部もしくは全部が欠損している非ヒト動物。
【請求項２】
前記非ヒト動物は、自己免疫性疾患を発症することを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項３】
自己免疫性肝炎の病理像を呈することを特徴とする請求項１又は２記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の非ヒト動物に由来する細胞または生体組織を用いて、野生型に比して増加または減少している自己抗原、自己抗体、細胞表面マ−カ−、血清中蛋白、酵素、無機物質、遺伝子を測定することを特徴とする自己免疫疾患診断法のスクリ−ニング方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の非ヒト動物に由来する免疫担当細胞または血中免疫グロブリンと被検物質とを用いて、前記免疫担当細胞における被検物質に対する応答や前記免疫グロブリンと被検物質の結合を測定・評価することを特徴とする自己抗原のスクリ−ニング方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の非ヒト動物と被検物質を用いて、前記非ヒト動物における被検物質に対する応答を測定することを特徴とする自己抗原のスクリ−ニング方法。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の非ヒト動物に由来する免疫担当細胞と被検物質とを用いて、前記免疫担当細胞における自己抗原に対する応答を測定することを特徴とする自己免疫応答の促進物質又は抑制物質のスクリ−ニング方法。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の非ヒト動物と被検物質を用いて、前記非ヒト動物における自己抗原に対する応答を測定することを特徴とする自己免疫状態の促進物質又は抑制物質のスクリ−ニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性非ヒト動物及びそれを用いたスクリ−ニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球上には抗原を認識する抗原レセプタ−の他に抗原提示細胞上の種々のリガンドと結合し、活性化促進または抑制のシグナルを伝達する補助レセプタ−が存在する。これらは副刺激分子と呼ばれ、その機能により促進性副刺激分子と抑制性副刺激分子に大別される。例えば、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は外来抗原に対しては強力に応答し、自己抗原に対しては反応せず免疫寛容（トレランス）が維持されるが、このような抗原認識後のＴ細胞の適切な免疫応答には、Ｔ細胞レセプタ−（ＴＣＲ）を介する抗原特異的なシグナルに加えて、Ｔ細胞表面の副刺激分子からの副刺激シグナルが大きく関与していることが知られている（例えば、下記非特許文献１、２参照）。【０００３】
抑制性副刺激分子はリンパ球の活性化や増殖、サイトカイン産生を抑制することにより免疫応答を負に制御している。抑制性副刺激分子にはＣＴＬＡ-４やＰＤ-１と呼ばれるものが既に同定され、機能解析が進められている（例えば、下記非特許文献３〜５参照）。これらの抑制性副刺激分子は、その欠陥が生体内でトレランスの破綻や自己免疫疾患の発症をきたすことがノックアウト（欠損）マウスの解析から明らかとなり、リンパ球の活性化閾値の設定や過剰な免疫応答の停止などに非常に重要な役割を果たしていると考えられている（例えば、下記非特許文献６〜８参照）。【０００４】
自己免疫疾患とは、本来は細菌・ウイルスや腫瘍などの自己と異なる異物を認識し排除する役割を担う免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことで症状を来す疾患の総称である。自己免疫疾患は、全身にわたり影響が及ぶ全身性自己免疫疾患と、特定の臓器だけが影響を受ける臓器特異的疾患の２種類に分けることができるが、例えば関節リウマチや全身性エリテマト−デス（ＳＬＥ）、シェ−グレン症候群などに代表される膠原病は、全身性自己免疫疾患である。自己免疫疾患患者では自分の体の構成成分（自己抗原）と反応する自己抗体がしばしば発見され、自己に対する正常な免疫制御システムが機能していないことが明らかとなっている。すなわち抗原が「自己」と認識された場合でも抗原特異的なヘルパ−Ｔ細胞は活性化され、Ｂ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化する（自己反応性リンパ球）。その結果、自己抗原に対する自己抗体が産生され、自己反応性細胞障害性Ｔ細胞は、自己標的細胞を障害する。その際、自己反応性リンパ球が認識する自己抗原の違いにより、障害される臓器病変は異なり種々の自己免疫疾患が発症する。健常者でも自己反応性リンパ球は僅かに存在するとされるが、抑制性副刺激シグナルを含む種々の抑制要因により自己免疫疾患を発症することはない。【０００５】
自己免疫性肝炎は、肝細胞障害の発症と持続に自己免疫機序が関与していると考えられる慢性に経過する肝炎であり、中年以降に好発することが特徴とされる疾患である。持続性又は反復性の血清トランスアミナ−ゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）の上昇、高ガンマグロブリン血症、血清中の自己抗体陽性（抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗平滑筋抗体、肝腎ミクロゾ−ム抗体など）を特徴とする。他の自己免疫疾患の合併がおよそ１／３の症例でみられ、合併頻度の高いものとしては慢性甲状腺炎、慢性関節リウマチ、シェ−グレン症候群などがある。また、治療に際し免疫抑制剤やコルチコステロイドが効果を奏する疾患である。 【０００６】
本発明者らは、マウス由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の二つのサブセットであるＴｈ１細胞とＴｈ２細胞における遺伝子発現の相違をＤＮＡチップによりスクリ−ニングすることにより、新規の抑制性副刺激分子であるＢＴＬＡ（Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ ）を同定した（下記非特許文献９参照）。図１はＢＴＬＡのアミノ酸配列の比較を示している。【０００７】
ＢＴＬＡはリンパ球上に発現する抑制性副刺激分子であり、ＢＴＬＡ刺激によりＴ細胞の増殖やＩＬ-２などのサイトカイン産生が抑制されることから、生体内において免疫応答を負に制御し免疫系のホメオスタ−シスすなわちトレランスを維持する機能を果たしていると推定されている（例えば下記非特許文献９参照）。また、ＢＴＬＡのリガンド、ＨＶＥＭがヒト生体内では肝臓に比較的多く発現しているという報告もあり（下記非特許文献１０参照）、ＢＴＬＡが肝臓においてトレランスに重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１９、５６５-５９４
【非特許文献２】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１９、２２５-２５２
【非特許文献３】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１４、２３３-２５８
【非特許文献４】Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９９、１１、２０３-２１０
【非特許文献５】Ｔｒｅｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、２２、２６５-２６８
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２７０、９８５-９８８
【非特許文献７】Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、１１、１４１-１５１
【非特許文献８】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、２９１、３１９-３２２
【非特許文献９】Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、４、６７０-６７９
【非特許文献１０】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１４０２９-１４０３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
確かに上記非特許文献９、１０に記載の報告によるとＢＴＬＡの機能欠陥や低下により免疫応答が活性化しやすくなり、免疫寛容の破綻すなわち自己免疫疾患の発症、特に自己免疫性肝炎をきたす可能性を考えることが出来る。しかしながら、非特許文献９にはＢＴＬＡを欠損した生体の加齢後の疾病発症に関してまで報告されておらず検討もされていない。【００１０】
そこで本発明の課題は、自己免疫疾患特に自己免疫性肝炎モデル非ヒト動物やそれらを用いた臓器障害の解析方法や治療薬のスクリ−ニング法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する本発明の一形態に係る非ヒト動物は、染色体上のＢＴＬＡの一部もしくは全部が欠損していることを特徴とする。ここで、配列表にＢＴＬＡの遺伝子配列を示しておく。【００１２】
また、限定されるわけではないが、上記非ヒト動物は自己免疫性肝炎の病理像を呈することや、マウスであることが望ましい。【００１３】
また、本発明の一形態にかかわる自己免疫疾患診断法のスクリーニング方法は、細胞または生体組織を用いて、野生型に比して増加または減少している自己抗原、自己抗体、細胞表面マーカー、血清中蛋白、酵素、無機物質の発現が増加または減少している遺伝子を測定すること、免疫担当細胞または血中免疫グロブリンと被検物質とを用いて前記免疫担当細胞における被検物質に対する応答や前記免疫グロブリンと被検物質の結合を測定すること、非ヒト動物における被検物質に対する応答を測定すること、免疫担当細胞と被検物質とを用いて免疫担当細胞における自己抗原に対する応答を測定すること、自己抗原に対する応答を測定することが望ましい。
【発明の効果】
【００１４】
以上、本発明により、自己免疫疾患特に自己免疫性肝炎モデル非ヒト動物やそれらを用いた臓器障害の解析方法や治療薬のスクリーニング法等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る非ヒト動物は、ＢＴＬＡ遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＢＴＬＡを発現する機能が失われており、ＢＴＬＡが認識するリガンドに対する応答性が特異的に障害されているモデル非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ＢＴＬＡが認識するリガンドとしては、これまで同定されているものとしてはＨＶＥＭがあるが、便宜上、ＨＶＥＭの他、未同定のＢＴＬＡ結合タンパクやこれらリガンドを担持するキャリアもＢＴＬＡが認識するリガンドに包含される（以下、「本件リガンド類」という）。【００１６】
自己免疫疾患発症とは、本件リガンド類による刺激に対する免疫担当細胞の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることにより過剰な免疫応答を惹起し血清学的異常や臓器障害を呈することを意味する。したがって、本発明において自己免疫疾患自然発症モデル非ヒト動物とは、本件リガンド類による刺激に対して、免疫担当細胞のＢＴＬＡを介した反応が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。また、自己免疫応答を誘導する刺激としては、生体内での自己抗原への自然暴露や、生体から分離された細胞に自己抗原ないし自己由来細胞を接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。【００１７】
そして、本発明の一実施形態に係る非ヒト動物は、本件リガンド類に対して不応答性であり、種々の自己抗原に対しては過剰応答性である非ヒト動物を挙げることができ、具体的には、ＢＴＬＡ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。【００１８】
ＢＴＬＡ遺伝子の機能が欠損した動物は、ＢＴＬＡ欠損マウスの他、ＢＴＬＡ遺伝子の発現機能が欠損したラット等の齧歯目動物を例示することができる。これらＢＴＬＡ遺伝子の発現機能が欠損した非ヒト動物は、メンデルの法則に従い出生してくるＢＴＬＡ−／−非ヒト動物が、正確な比較実験をすることができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかるＢＴＬＡ遺伝子の発現機能が欠損した動物の作製方法を、ＢＴＬＡ欠損マウスを例にとって以下説明する。【００１９】
ＢＴＬＡ遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＢＴＬＡ遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＢＴＬＡ遺伝子は、プラスミドベクタ−等を用いてサブクローニングし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシークエンシングにより特定することができる。次に、このＢＴＬＡをコードする遺伝子の全部又は一部をネオマイシン耐性遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。【００２０】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビル（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクロ−ンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス:＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、ＢＴＬＡ−／−（ＢＴＬＡ欠損）マウスを作製することができる。また、ＢＴＬＡ欠損マウスにおいて、ＢＴＬＡ遺伝子が発現していないことを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノ−ザンブロット法等で解析する、またはこのマウスにおけるＢＴＬＡの発現をウエスタンブロット法、抗ＢＴＬＡ抗体や可溶性ＨＶＥＭを利用したフロ−サイトメトリ−法等により調べる方法がある。【００２１】
また、作出されたＢＴＬＡ欠損マウスが本件リガンド類に対して不応答性であることは、例えば、ＨＶＥＭを強制発現させた抗原提示細胞と抗原をＢＴＬＡ欠損マウスの抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞にインビトロで接触せしめ、かかる細胞における増殖反応やＩＬ−２などのサイトカインの産生量などを測定することにより確認することができる。【００２２】
作出されたＢＴＬＡ欠損マウスはＳＰＦ環境のマウス飼育施設において長期に飼育すると、次第に自己免疫状態を発症し、６ヶ月齢頃より高γグロブリン血症、抗核抗体などの自己抗体の出現を認め、１２ヶ月齢頃には唾液腺、肺、関節、肝臓などの複数の臓器における自己免疫性臓器障害を来す。この時点での肝病理像は肝細胞壊死とグリソン鞘領域のｐｉｅｃｅｍｅａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓを伴う慢性肝炎像を呈し、いわゆる自己免疫性肝炎に類似している。【００２３】
本発明の一実施形態に係る非ヒト動物やモデル動物由来の免疫細胞、血中タンパクは、ＢＴＬＡの作用機序の解明や自己免疫を誘導する自己抗原のスクリ−ニングの他、自己免疫応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリ−ニング等に用いることができる。自己免疫応答の促進物質又は抑制物質のスクリ−ニング方法としては、モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と被検物質を用いて、前記免疫細胞における被検物質に対する応答を測定・評価するスクリ−ニング方法や、モデル非ヒト動物個体と被検物質を用いて、前記モデル非ヒト動物個体における被検物質に対する応答を測定・評価するスクリ−ニング方法であれば特に制限されるものではなく、かかるスクリ−ニング方法の実施の形態を以下に例を挙げて説明する。【００２４】
例えば、本発明の一実施形態に係るモデル非ヒト動物から得られる脾臓細胞又はリンパ球等の免疫細胞と、被検物質を共に培養し、該免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリ−ニング方法や、モデル非ヒト動物に被検物質をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を培養し、該免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリ−ニング方法を挙げることができる。【００２５】
上記脾臓細胞またはリンパ球等の免疫細胞における細胞活性の程度の測定・評価方法としては、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４等のサイトカインの産生量を測定・評価する方法や細胞の増殖の程度や表面マ−カ−の変化を測定・評価する方法を、それぞれ例示することができる。また、免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するに際し、対照としてモデル非ヒト動物の野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差による誤差をなくすることができるので好ましい。【００２６】
本発明の一実施形態に係る自己免疫疾患自然発症に対する促進物質又は抑制物質のスクリ−ニング方法により得られる促進物質又は抑制物質は、インビボにおけるＢＴＬＡシグナル伝達におけるメカニズムの解明に有用であり、特に抑制物質は自己免疫疾患の予防・治療剤として使用しうる可能性がある。自己免疫疾患の予防・治療効果が期待できる上記促進物質を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品を用いる予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレ−剤の型で鼻孔内投与することもできる。【００２７】
以下、発明の一実施例について、図面を参照して説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（実施例）【００２８】
本発明者らは、ＢＴＬＡの生理学的役割を解明するために、ジ−ンタ−ゲティングによりＢＴＬＡ欠損マウスを作製した。マウスのＢＴＬＡ遺伝子は、６個のエクソンからなる。本発明者らは、タ−ゲティングベクタ−を構築し、エクソン３〜エクソン６をネオマイシン耐性遺伝子カセットに置換した。正確なタ−ゲティングを行なった２つのＥＳクロ−ンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。キメラマウスの仔とＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交雑させ、サザンブロット分析により変異対立遺伝子の伝達をモニタ−した。ヘテロ接合体マウスを交配させて、ＢＴＬＡ遺伝子の無発現変異を保有する子孫を作製した。ＢＴＬＡ欠損マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、発達上の異常は認められなかった。ＢＴＬＡ遺伝子の欠損を確認するために、野生型脾臓細胞及びＢＴＬＡ欠損脾臓細胞から得た全ＲＮＡに対し、ノ−ザンブロット分析を行なった。ＢＴＬＡ欠損マウスにおいて、ＢＴＬＡの転写物は認められなかった。【００２９】
ＢＴＬＡのアミノ酸配列と構造を図１に示す。図１（Ａ）は、マウスＢＴＬＡとヒトＢＴＬＡのアミノ酸配列の比較であり、リ−ダ−配列と膜貫通部分を実線で示している。図中（-）は細胞外領域のＮ-グリコシレ−ション部位であり、図中（・）はＩｇドメイン形成に必須なシステイン残基である。図１（Ｂ）は、ＢＴＬＡ遺伝子の構造を示す。黒四角部分はアミノ酸をコ−ディングする領域を、白四角部分は５’側及び３’側非翻訳領域を示している。四角上のロ−マ数字はエクソン番号を、四角下の算用数字は各エクソンにコ−ドされるアミノ酸の番号を示す。図１（Ｃ）はマウスＢＴＬＡのドメイン構造である。リ−ダ−配列はエクソン１に、Ｉｇドメインはエクソン２に、膜貫通部位はエクソン４に存在している。マウスＢＴＬＡのｃＤＮＡはＮ末端に一つのＩｇドメインを有する約３８ｋＤａ、３０６アミノ酸のタンパクをコ−ドしている。ヒトＢＴＬＡは２８９アミノ酸より成り、マウスのＢＴＬＡと約６０％のホモロジ−を有している。ＢＴＬＡはマウスではナイ−ブＴ細胞でごく弱く発現し、活性化に伴い発現が上昇する。Ｔｈ２細胞に分化すると発現は消失し、Ｔｈ１細胞特異的となる。また、脾臓ナイ−ブＢ細胞にも発現が認められる。一部のマウスではＮＫ細胞、マクロファ−ジ、樹状細胞にも発現を認めるという報告もある。組織レベルではＢＴＬＡは脾臓とリンパ節で強く発現が認められる。Ｔ細胞ハイブリド−マにＢＴＬＡを遺伝子導入し、抗体でＣＤ３とＢＴＬＡを同時架橋すると、ＢＴＬＡはチロシンリン酸化される。また、チロシンリン酸化に伴い、ＢＴＬＡに細胞質内フォスファタ−ゼであるＳＨＰ-２・ＳＨＰ-２が結合する。上記のＴ細胞ハイブリド−マを固相化した抗体でＣＤ３とＢＴＬＡを同時に刺激すると、抗ＣＤ３抗体単独刺激に比較し、ＩＬ-２産生が低下する。【００３０】
図２は、ＢＴＬＡノックアウト（欠損）マウスの作成と遺伝子欠損の確認を示すものである。（Ａ）は、上から順にＢＴＬＡ遺伝子、タ−ゲティングベクタ−、予測された破壊遺伝子の構造を示す。黒四角部分は、コ−ドしたエクソンを示す。制限酵素については、ＢｇはＢｇｌＩＩを、ＸはＸｂａＩを、ＢはＢａｍＨＩを、ＥはＥｃｏＲＩを、ＳａｌはＳａｌＩを、ＸｈはＸｈｏＩを、ＴＫはチミジンキナ−ゼ遺伝子を、ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を示す。相同組み替えによりＢＴＬＡのエクソン３から６を欠失するとＢｇｌＩＩによる切断で野生型は１４．２Ｋｂ、ノックアウトマウスでは８．４ＫｂのＤＮＡ断片を生じた。（Ｂ）は、ヘテロ接合体のインタ−クロスで生じた子孫のサザンブロット分析である。マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、ＢｇｌＩＩで切断し、（Ａ）に示した放射能標識したプロ−ブを用いて電気泳動にかけ、ハイブリダイゼ−ションを行なった。サザンブロットにより、野生型マウス（＋／＋）には単一の１４．２ｋｂバンドが、ホモ接合体マウス（−／−）には８．４ｋｂバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（Ｃ）は、へテロ接合体のインタ−クロスで生じた子孫の脾臓細胞より全ＲＮＡを抽出しノ−ザンブロット分析をおこなった図である。マウスＢＴＬＡの全長ｃＤＮＡをプロ−ブとしてハイブリダイゼ−ションを行ったところ、野生型マウス（＋／＋）にはＢＴＬＡ遺伝子ｍＲＮＡが検出されたが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）ではＢＴＬＡ遺伝子ｍＲＮＡが減少し、ホモ接合体マウス（−／−）ではＢＴＬＡ遺伝子ｍＲＮＡが検出されなかった。【００３１】
ＢＴＬＡ欠損マウスは正常に発生・成熟し、若い成体マウスは外見上特に異常は認められなかった。若い成体における血球系細胞の分化をフロ−サイトメトリ−にて調べたが、リンパ球、顆粒球、マクロファ−ジ、マスト細胞、ＮＫ細胞等の数や表面マ−カ−等に異常は認められなかった。しかしリンパ球増殖反応を検討したところ、ＢＴＬＡ
欠損マウス由来のＴ細胞は抗ＣＤ３抗体による刺激に対して野生型Ｔ細胞と比較して過剰な増殖を示した。さらにＢＴＬＡ 欠損マウスをＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＤＯ−Ｔｇマウス）と交配し、このマウス由来の脾臓ナイ−ブＴ細胞よりＴｈ１細胞を作成し、抗原刺激に対するリンパ球増殖反応を検討した。その結果やはりＢＴＬＡ
欠損Ｔｈ１細胞は野生型Ｔｈ１細胞と比較し、増殖が増強していることが明らかとなった。一方、ＢＴＬＡ欠損ナイ−ブＴ細胞はＴｈ１分化条件（ＩＬ−１２＋抗ＩＬ−４抗体）あるいはＴｈ２分化条件（ＩＬ−４＋抗ＩＬ−１２抗体）で抗原刺激するとそれぞれ正常にＴｈ１、Ｔｈ２細胞に分化することより、ＢＴＬＡシグナル自体はＴｈ１／Ｔｈ２分化には関与しないと考えられる。【００３２】
ＢＴＬＡのインビボにおける役割を調べるためにＢＴＬＡ欠損マウスを抗原（ＮＰ-ＫＬＨ）で免疫し、血中の特異抗体 （抗ＮＰ抗体） 価の上昇をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果免疫４週後における抗ＮＰ抗体価はＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂのサブクラスでいずれも野生型の３倍程度上昇していた。さらにＴｈ１依存性免疫応答として知られるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（ＥＡＥ）について検討したところ、１２９系遺伝背景の野生型に比して、ＢＴＬＡＫＯマウスでは発症率や発症時のｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅが上昇し、また発症時期は早くかつ症状が遷延化する事が判明した。【００３３】
図３は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおいて免疫系の機能解析を行い、自己免疫疾患の発症、高ガンマグロブリン血症、抗核抗体が出現したことを示す。（Ａ）は、ＢＴＬＡ欠損マウスを長期飼育すると、６ヶ月齢頃より死亡し始め、野生型マウスに比べ早期に死亡したことを示す。長期飼育したＢＴＬＡ欠損マウスは外見上明らかな異常を呈さず、また感染症や悪性新生物の所見も認められなかった。（Ｂ）は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおける高ガンマグロブリン血症を示す。７ヶ月齢のマウスの血清中ガンマグロブリンをＥＬＩＳＡ法により測定した。ＢＴＬＡ欠損マウスでは野生型に比べＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａのサブクラスで優位に上昇がみられ、高ガンマグロブリン血症を発症していた。（Ｃ）は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおける抗核抗体の出現を示す。６〜９ヶ月齢及び１２ヶ月齢のマウスより採血し、血清中抗核抗体をＥＬＩＳＡ法により測定し、６ヶ月齢の正常マウスの血清を標準血清とし、相対的な抗核抗体価を測定した。ＢＴＬＡ欠損マウスでは野生型に比べ６〜９ヶ月齢で有意な抗核抗体価の上昇を認め、１２ヶ月齢ではさらに高い抗核抗体価を呈した。ＢＴＬＡ欠損マウスは、ＳＰＦ環境のマウス飼育施設において長期に飼育すると、野生型マウスに比べ早期に死亡した。長期飼育したＢＴＬＡ欠損マウスは外見上明らかな異常を呈さず、また感染症や悪性新生物の所見も認められず、死因については後述のように自己免疫疾患を発症しその全身の臓器障害により死亡に至ることが明らかとなった（図３Ａ）。【００３４】
７ヶ月齢のＢＴＬＡ欠損マウスにおいて血清中の免疫グロブリンをＥＬＩＳＡ法にて測定すると、野生型マウスと比較し、有意に高γグロブリン血症を呈することが明らかとなった。この時の特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａサブクラスのγグロブリンが増加していた（図３Ｂ）。さらに血清中の自己抗体の有無について検討してみると、ＢＴＬＡ欠損マウスでは抗核抗体（図３Ｃ）、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗ミトコンドリア抗体等の自己抗体が有意に血中に増加していた。これらのことはＢＴＬＡ欠損マウスが全身的な自己免疫状態を来していることを意味する。【００３５】
１２ヶ月齢のＢＴＬＡ欠損マウスのリンパ組織をフロ−サイトメトリ−法にて解析すると、脾臓内のＴ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞などの細胞数は野生型と比較して変化はなかった。しかしながら、ＢＴＬＡ欠損マウスの脾臓内ＣＤ４陽性Ｔ細胞の表面マ−カ−を解析すると、野生型の脾臓内ＣＤ４陽性Ｔ細胞と比較し、ＣＤ２５、ＣＤ６９の上昇とＣＤ６２Ｌの低下という活性化を示す変化を認めた。このことはＢＴＬＡ欠損マウスの生体内でＣＤ４陽性Ｔ細胞が何らかの抗原（おそらく自己抗原）を認識し活性化したことを示している。【００３６】
１２ヶ月齢のＢＴＬＡ欠損マウスの諸臓器における変化を解析すると、唾液腺では野生型マウスでは正常所見であるのに対し、ＢＴＬＡ欠損マウスでは唾液腺の腺管周囲を中心とした著明なリンパ球浸潤を認めた。肺では野生型マウスでは正常所見であるのに対し、ＢＴＬＡ欠損マウスでは肺の気管支と血管の周囲にリンパ球細胞浸潤を認めた。これらの所見はヒトの全身性自己免疫疾患であるシェ−グレン症候群の病理所見に類似している。また関節内にも軽度の炎症細胞浸潤を認めた。【００３７】
図４は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおける肝機能異常の出現を示すものである。６、９、１２ヶ月齢の野生型およびＢＴＬＡ欠損マウスより血清を採取し、血清ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ-ＧＴＰ、ＡＬＰ、Ｔ-Ｂｉｌを経時的に測定した。１２ヶ月齢のＢＴＬＡ欠損マウスでは、６ヶ月齢頃から徐々に肝機能異常（血清ＧＯＴ、ＧＰＴの上昇）が出現し、１２ヶ月齢では野生型と比較し有意にＧＯＴ、ＧＰＴが高値となっていた。肝病理像を見ると、肝細胞領域の肝細胞壊死所見およびグリソン鞘領域の削り取り壊死（ｐｉｅｃｅｍｅａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）や門脈における内皮細胞炎（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｔｉｓ）の所見がみられ、自己免疫性肝炎に特徴的な所見が認められた。図５は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおける臓器障害の状態を示す図である。（Ａ）は、１２ヶ月齢のＢＴＬＡ欠損マウスおよび野生型マウスより臓器を採取し病理切片を作成しヘマトキシリン・エオジン染色を行ったときの図である。左２列は野生型、右２列はＢＴＬＡ欠損マウスの病理像で、各々左側が弱拡大（１００倍）像、右側が強拡大（４００倍）像である。ａ、ｂは肺組織を示す。ＢＴＬＡ欠損マウスでは気管支周囲と血管周囲の肺実質にリンパ球を主体とする著明な炎症細胞浸潤を認める。ｃ、ｄは唾液腺（顎下腺）を示す。ＢＴＬＡ欠損マウスでは唾液腺組織内にリンパ球を主体とする著明な炎症細胞浸潤を認める。ｅ、ｆは肝臓を示す。中心静脈領域、肝細胞領域、グリソン鞘領域の何れも野生型マウスでは異常所見を認めないが、ＢＴＬＡ欠損マウスではグリソン鞘周囲にはリンパ球と思われる小円形細胞浸潤がみられ、削り取り壊死（ｐｉｅｃｅｍｅａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）像を呈しており、肝実質内にも孤立性の肝細胞壊死巣（ｓｐｏｔｔｙ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）
を認める。門脈、胆管の内皮細胞障害所見（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｔｉｓ）も認められており、自己免疫反応の特徴を有している。ｇ、ｈは腎臓を示す。野生型、ＢＴＬＡ欠損マウスのいずれにも明らかな異常所見を認めない。（Ｂ）は、ＢＴＬＡ欠損マウスにおける自己免疫性肝炎を示す。１２ヶ月齢の野生型マウス（ａ、ｂ）及びＢＴＬＡ欠損マウス（ｃ、ｄ）より肝臓を採取し病理切片を作成しヘマトキシリン・エオジン染色（左）と鍍銀染色（右）を行った。いずれも強拡大（４００倍）像を示す。白矢印は門脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ、ＰＶ）、黒三角は胆管（ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ、ＢＤ）、白い点線と赤三角はともにグリソン鞘領域と肝細胞領域の境界を示す。ＢＴＬＡノックアウトマウスではグリソン鞘領域から肝細胞領域にまたがるリンパ球と好中球を主体とする炎症細胞浸潤と肝細胞壊死の所見（ｐｉｅｃｅｍｅａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）の所見を認め、自己免疫性肝炎の病理像に一致する。【００３８】
以上のとおり、ＢＴＬＡ欠損マウスは、自然に全身性自己免疫性疾患を発症し特に他の副刺激分子の欠損マウスにはないユニ−クな病変として自己免疫性肝炎を発症した。これらの結果はＢＴＬＡが生体内において自己に対する異常な免疫反応を抑制しており、特に肝臓における免疫寛容の成立に重要な副刺激分子であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明非ヒト動物は、慢性肝炎をはじめとする全身の臓器での自己免疫性臓器障害を生ずるため、ヒトの膠原病や自己免疫性肝炎等の新たな検査法や診断法のスクリ−ニングに利用できる。また、これまで詳細不明とされていた各臓器において炎症を誘導する自己抗原のスクリ−ニングが可能となる。さらに、自己免疫性臓器障害の抑制物質若しくは促進物質のスクリ−ニングが可能となり、膠原病や自己免疫性肝炎等のヒトの疾病に対する薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。ＢＴＬＡノックアウトマウスは若い個体は一見正常であり生殖機能も保たれているが、加齢に伴い多彩な自己免疫疾患を発症する。このことはヒトにおける膠原病や自己免疫性肝炎の発症に類似しており、膠原病・自己免疫性肝炎の自然発症モデルとしてより生理的な状態に近い動物モデルが提供できると言える。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＢＴＬＡのアミノ酸配列と構造を示す図である。
【図２】ＢＴＬＡノックアウトマウスの作成と遺伝子欠損の確認を示す図である。
【図３】ＢＴＬＡ欠損マウスにおける自己免疫疾患の発症、高ガンマグロブリン血症、抗核抗体の出現を示す図である。
【図４】ＢＴＬＡ欠損マウスにおける肝機能異常の出現を示す図である。
【図５】ＢＴＬＡ欠損マウスにおける臓器障害の状態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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