【手続補正書】
【提出日】平成31年4月18日(2019.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞由来の細胞内含有物を抽出する装置であって：
（ａ）ｘｙｚコントローラに搭載され、ナノピペットの内部の第１疎水性電解液と共に用いるために適応させた第１電極に取り付けられたナノピペットと；
（ｂ）ナノピペットの外側にあり、細胞の外側に接触する第２の異なる電解液と接触するように配置し、適応させた第２電極と；
（ｃ）電流検出回路および電圧制御回路と；を備え、前記電流検出回路は電極間のイオン電流を検出し、前記電圧制御回路は、所定の時間で第１電極と第２電極との間の電圧を逆転することにより、液体のナノピペットへの流入及び流出を制御する、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記ｘｙｚコントローラは、サブミクロンのｘステップ及びｙステップでナノピペットを機械的に移動させ、かつ、細胞に向かう、または離れるｚ方向に前記ナノピペットを移動させるためにナノピペットに取り付けられ、前記ｘｙｚコントローラはユーザが定義した制御に従って前記機械的な移動を制御する電子制御を有し、前記電圧制御は、前記ｘｙｚコントローラが細胞内にナノピペットの先端を位置させた際に電圧を逆にする、装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であって、前記ナノピペットのｚ方向は第１電極および第２電極の間を流れるイオン電流により生成される信号によって制御される、装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、前記第１電極は、例えば銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）等の銀製である、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、前記第１電解液は、例えば１−２ジクロロエタン等の疎水性液体、および、例えばテトラヘキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）等のボレートを含むイオン性物質を有する、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、該ナノピペットは石英製である、装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の装置であって、
（ａ）第１バイアス電圧を提供してナノピペット内で第１電解液を保持するステップと；
（ｂ）第２の異なるバイアス電圧を提供して細胞内から物質の流入を引き起こすステップと；
（ｃ）第３の異なるバイアス電圧を提供してナノピペットから流体の流出を引き起こすステップと；
に従って該装置を操作する、プログラムされた一連の命令を備える、装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であって、前記電流検出装置が感知したイオン電流の変化に応じて装置を操作する、一連のプログラムされた命令を備える、装置。
【請求項９】
個別の細胞から標的細胞内含有物を抽出する方法であって、
（ａ）標的細胞内含有物を有する少なくとも１個の細胞を含む溶液を抽出用に用意するステップと；
（ｂ）バイアス電圧を生成するために、ｘｙｚコントローラ、内部電極および外部電極に連結され、さらに、疎水性溶液を含み先端を有するナノピペットを有するナノピペットSICM（走査型イオンコンダクタンス顕微鏡）装置を提供するステップと；
（ｃ）ナノピペットSICM装置を操作して、ナノピペットの先端を流れるイオン電流の降下または他の変化を感知することで、前記１個の細胞に接近するステップと；
（ｄ）内側電極と外側電極との間に正の電圧を生成し、細胞内への挿入の間、液体がナノピペット内の疎水性溶液に入るのを防止するステップと；
（ｅ）ナノピペットを位置づけ細胞の所定場所に貫通させ、細胞内に挿入するステップと；
（ｆ）標的細胞内含有物をナノピペットに流入させ抽出するために、内部電極と外部電極との間の電圧を調整するステップと；
（ｇ）標的細胞内含有物がナノピペットから出るのを防止するため、電圧をさらに調節するステップと；
（ｈ）電圧をさらに調節して、抽出した標的細胞内含有物をサンプル容器に流出させるステップと；を備える方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、抽出した該標的細胞内含有物が核酸またはタンパク質を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記核酸はDNAまたはRNAを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記DNAはミトコンドリアDNAである方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、前記電圧は
（ａ）標的細胞内含有物をナノピペット内に流入させる−１００ｍＶ〜−１０００ｍＶ；
（ｂ）流入を停止させ、かつ、ナノピペットからの流出を防止する１００ｍＶ〜５００ｍＶ；
（ｃ）抽出した標的細胞内含有物を流出させる＋０．５Ｖ〜２Ｖ；
の一以上である、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ステップ（ａ）での流入が１秒〜５秒間続く方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法であって、核酸保存緩衝液を含むサンプル容器内に流出させる、方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法であって、抽出した標的細胞内含有物が単一ミトコンドリアに由来するDNAであり、ミトコンドリアDNAのシーケンスの一部を決定するステップをさらに含む、方法。
【請求項１７】
個別の細胞から細胞内含有物を抽出する方法であって、
（ａ）バイアス電圧を生成するために、ｘｙｚコントローラ、内部電極および外部電極を有し、かつ、単一細胞を貫通するための先端を含むナノピペットをさらに有するナノピペット装置を提供するステップと；
（ｂ）該ナノピペット装置を操作して、細胞の標的細胞内含有物をナノピペットに流入させ抽出するステップと；
（ｃ）抽出した標的細胞内含有物がナノピペットから出ることを防止するため、電圧をさらに調節するステップと；
（ｄ）電圧をさらに調節して、抽出した標的細胞内含有物をサンプル容器に流出させるステップと；
（ｅ）抽出した標的細胞内含有物を、（ｉ）抽出した標的細胞内含有物由来のmRNAの分析、（ｉｉ）抽出した標的細胞内含有物由来の一つ以上の選択したタンパク質の分析、のうち一つまたは両方により分析するステップと；
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記mRNAの分析には、細胞由来の少なくとも５００ｐｇのmRNAを分析することが含まれる、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、該mRNAの分析には、細胞内のmRNAシーケンスの少なくとも９０％を分析することが含まれる、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記タンパク質の分析には、特定のタンパク質を検出する超高感度アッセイが含まれる、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記アッセイには近接ライゲーションが含まれる、方法。
【請求項２２】
請求項１７、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記タンパク質種を分析するステップが、EGFR、MKK1、ERK1/2、JAK、AP1/JunおよびSTATのうち少なくとも一つを分析するステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１７、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法であって、リン酸化タンパク質を、リン酸化されていない同一のタンパク質から差別化するステップをさらに含む、方法。
【請求項２４】
請求項１７、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法であって、分析を、同じ細胞について、時間をずらして複数回実行する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、さらに、リン酸化タンパク質を、リン酸化されていない同一のタンパク質から差別化するステップを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１７、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法であって、細胞由来のタンパク質種を分析するステップが、翻訳後修飾を有するタンパク質を、そのように修飾されていない同一のタンパク質から差別化するステップを含む、方法。