(57)【要約】  セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有する膵β細胞保護剤、糖尿病および／またはメタボリックシンドローム発症・進展抑制薬、飲食品及びインスリン分泌促進薬作用回復剤を提供する。これらを用いると、境界型糖尿病も含めた糖尿病患者、特に2型糖尿病患者に対して膵β細胞の機能を正常化させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有する膵β細胞保護剤。
【請求項２】
機能の低下した膵β細胞を正常化するための請求項１記載の膵β細胞保護剤。
【請求項３】
２型糖尿病患者用である請求項１記載の膵β細胞保護剤。
【請求項４】
インスリン分泌促進薬と併用してなる請求項１〜３のいずれか１項記載の膵β細胞保護剤。
【請求項５】
セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする糖尿病および／またはメタボリックシンドローム発症・進展抑制薬。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の膵β細胞保護剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項７】
セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有するインスリン分泌促進薬作用回復剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、境界型糖尿病も含めた糖尿病患者において、膵β細胞を保護するあるいは機能の低下した膵β細胞を正常化するための薬剤および飲食品ないし機能食品に関する。
（発明の背景）
生活習慣の欧米化にともなって日本国内でも糖尿病を呈する人口が年々増加している。平成14年に厚生労働省によって実施された糖尿病実態調査によれば、日本国内において糖尿病が強く疑われる人は現在治療中の人を含めて約740万人と推定されているが、そのほかに糖尿病の可能性を否定できないとされる人が約880万人おり、両者をあわせると約1620万人であることが報告されている（非特許文献1）。
糖尿病の診断基準としては最近、アメリカ糖尿病学会（ADA）、世界保健機構（WHO）、日本糖尿病学会（JDS）より臨床的、疫学的研究の成果を考慮したものが発表され、血糖値に関しては空腹時血糖≧126mg/dl、随時血糖値≧200mg/dl、75g経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）での2時間血糖値≧200mg/dlのいずれかが確認されれば糖尿病と診断される（非特許文献2、非特許文献3, 非特許文献4）。糖尿病の可能性を否定できない人とはHbA1cが5.6％以上6.1％未満であり、普段の健康診断などで疑わしいと言われつつも治療を受けていない人をさす。また、境界型の2型糖尿病と言われる糖尿病の前段階は耐糖能不全（impaired glucose tolerance(IGT)）と分類されるが、その基準は75ｇブドウ糖負荷試験における2時間後血糖値が140mg/dl以上200mg/dl未満でかつ空腹時血糖が110mg/dl以上126mg/dl未満とされる（非特許文献5）。【０００２】
近年、日本や欧米でおこなわれた大規模臨床研究によれば、食後2時間の血糖値の上昇が死亡リスクや心筋梗塞、脳卒中のリスクを増大させることが明らかにされている。（非特許文献6、非特許文献7）。さらに重要なこととしてこれらの調査では、空腹時血糖値が正常レベルでも食後血糖が高まることによって心血管イベント発生のリスクが上昇することが示され、糖尿病と診断されるよりも前の早い段階からの積極的な治療が重要であるとされている。
IGTも含めた糖尿病の早い段階において最も重要な特徴は、膵β細胞の機能低下にともなうインスリン分泌能の低下であることが知られている（非特許文献8）。健常人においては食後早期にインスリンの分泌が誘導され、これによって食後の血糖上昇が抑制されるが、糖尿病の発症・進展とともに食後早期インスリン分泌が減弱し、それを補完するように遅れたタイミングで過剰なインスリンが分泌されるいわゆる遅延過剰型のインスリン分泌パターンを示す。このようなパターンの変化が高インスリン血症からインスリン抵抗性を惹起してメタボリックシンドロームへの進展を促すと考えられている。このインスリン分泌の変化は糖尿病と診断されるよりも約10年前から始まっていることが明らかにされており（非特許文献9）、膵臓のβ細胞において正常なインスリン分泌能を維持または回復させることは境界領域も含めた早期段階からの糖尿病治療のアプローチのひとつとしては非常に重要である。正常なインスリン分泌とは、安静時または食間に不必要な分泌を起こすことなく、食後などの必要なときに必要量を分泌することを指す。
これまでに、インスリン分泌の低下を補うための治療剤として様々な経口インスリン分泌促進薬やインスリン製剤が開発され、用いられてきた。しかしながら、経口インスリン分泌促進薬は機能の低下した膵β細胞をさらに刺激してインスリンを無理に分泌させていることになり、長期的には薬剤の不応答が生じるなどβ細胞の機能をより低下させる場合が報告されている（非特許文献10）。また、インスリン製剤は膵β細胞からの分泌の低下を補うために注射や吸入などの方法によってインスリンを直接投与するもので、それによって膵β細胞の機能の保護を目的としたものではない。また、多くの2型糖尿病患者では肥満インスリン抵抗性であり、高インスリン血症の患者に対するインスリンの追加分泌促進や直接投与では効果が十分得られない。したがってより理想的には、正常な膵β細胞を維持する、または機能低下をおこしたβ細胞を正常化することによって正常なインスリン分泌を維持、回復させる治療法の確立が望まれている。【０００３】
ところで、これまでにアミノ酸によるインスリン分泌促進活性についての記載はいくつか知られている。特許文献1ではL-ロイシンL-アルギニン、L-アスパラギン酸には膵β細胞からの内因性のインスリン分泌を促進することが記載されており、また、特許文献2にはL-リジン、L-グリシン、L-シスチン、L-グルタミン酸から成る組成物には血糖降下作用があることも記載されている。さらに非特許文献11にはL-グリシン、L-セリン、L-グルタミンには3-phenylpyruvateによるアミノ酸代謝の促進を介したインスリン分泌促進作用を増強させる作用があることが記載されている。
その他非特許文献12にはグリシンに脂肪組織や骨格筋でのインスリン抵抗性を改善する作用があることが記載されている。
しかしながら、糖尿病状態においても正常な機能を維持する、あるいは糖尿病状態で機能低下をおこした膵β細胞を正常化し、先に定義した正常なインスリン分泌を回復させると言う作用についてはグリシン・セリンのみならずアミノ酸についても報告はまったくない。【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−２５５７２２号公報
【特許文献２】WO ０２/４９６３６号公報
【非特許文献１】厚生労働省健康局総務課生活習慣病対策室  平成14年糖尿病実態調査、2003
【非特許文献２】Diabetes Care 20: 1183 (1997)
【非特許文献３】Diabet Med 15: 539 (1998)
【非特許文献４】糖尿病 42: 385 (1999)
【非特許文献５】日本糖尿病学会編  糖尿病治療ガイド  分光堂（1999）
【非特許文献６】Lancet 354: 617 (1999)
【非特許文献７】Diabetes Care 22: 920 (1999)
【非特許文献８】N Engl J Med 326: 22 (1992)
【非特許文献９】日本臨床 63: 107 (2005)
【非特許文献１０】Diabetes Care 15: 737 (1992)
【非特許文献１１】Acta Diabet lat 20: 205 (1983)
【非特許文献１２】Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 287: R1387 (2004)
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、境界型糖尿病も含めた糖尿病患者、特に2型糖尿病患者に対して膵β細胞の機能を正常化させるための薬剤または飲食品の提供を目的とする。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討を行った結果、アミノ酸であるL-セリンとL-グリシンが糖尿病状態の膵β細胞の機能を正常化させることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有する膵β細胞保護剤を提供する。
本発明は、又、２型糖尿病患者用である膵β細胞保護剤を提供する。
本発明は、又、セリン、グリシン又はこれらの混合物、好ましくは上記膵β細胞保護剤を有効成分として含有することを特徴とする糖尿病および／またはメタボリックシンドローム発症・進展抑制薬を提供する。
本発明は、又、膵β細胞保護剤を含有することを特徴とする飲食品を提供する。
本発明は、又、セリン、グリシン又はこれらの混合物を有効成分として含有するインスリン分泌促進薬作用回復剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の膵β細胞保護剤は、高グルコース（食後血糖値が150ｍｇ/ｄL以上）によって誘導されるインスリンの過剰分泌を抑制して低グルコース濃度下でのインスリン分泌量を少量に抑制し、高グルコースの状態の時にのみインスリンが分泌されるようになり、正常なインスリン分泌を回復させる作用を有する。具体的にはβ細胞を主構成細胞とする膵臓のランゲルハンス島を高グルコース濃度下で培養して糖尿病状態を作り出し、それによって誘導されるインスリンの過剰分泌やグルコース濃度依存的なインスリン分泌の不全、さらにはインスリン分泌促進薬に対する不応答等に対する作用を以って本発明の膵β細胞保護剤の作用を確認することができる。
本発明の膵β細胞保護剤において、正常なインスリン分泌をおこすために必要な細胞内の分子機構の一つである分泌顆粒タンパク質の発現レベルの異常を正常化させる作用を有することが好ましい。また、高グルコースによってインスリン分泌促進薬、例えばナテグリニドに対するインスリン分泌応答が消失したランゲルハンス島に対して、インスリン分泌促進薬の作用を正常化させる作用を有することが好ましい。インスリン分泌促進薬の作用を正常化（回復）させる作用を有する場合には、インスリン分泌作用促進薬作用回復剤として有用である。さらにこの場合、インスリン分泌促進薬と併用（キット製品含む）もしくは合剤化することにより、より有用なインスリン分泌促進薬とすることが可能である。インスリン分泌促進薬とは、インスリンの分泌を促進する作用を有する薬剤であればいずれの薬剤でも良く、例えば、グリベンクラミド、グリクラジド、グリメピリド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリクロピラミド、グリブゾール等のスルホニルウレア剤、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド等の速効型インスリン分泌促進剤などがある。【０００８】
本発明で用いるグリシン、セリンには、遊離体のみならずその薬学的に許容される塩類を使用できる。Ｌ体、Ｄ体、Ｄ／Ｌ体のいずれでも良いが、Ｌ体が好ましい。また生体内で代謝されてこれらのアミノ酸を生成する化合物、例えば前駆体、プロドラッグ、ペプチドでも良い。
さらに本発明の薬剤には、上記成分に加えて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質を製剤学上許容される担体（補助剤）として含むこともできる。製剤用担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ-マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、セリン及び／又はグリシン酸と混合して使用される。【０００９】
本発明の薬剤は、例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮的投与、吸入投与等各種の投与形態に調製することができる。具体的には、適当な固形又は液状の製剤形態、例えば顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴下剤、輸液、注射用溶液、活性物質の放出を延長する製剤等を挙げることができる。
本発明に使用する薬剤の摂取量については、症状に応じて適当に選択されるが、経口投与の場合は成人患者で１日当たり、アミノ酸の正味重量で表して１日当たり通常１００ｍｇ以上、好ましくは０．５ｇ〜１００ｇ程度、更に好ましくは１〜２０ｇ程度摂取することができる。また、重篤な場合には更に増量することもできる。投与の回数、時期については、数日に１回でも、また１日１回でも可能であるが、通常は１日当たり数回、例えば２〜４回に分けて投与される。
一方、飲食品とする場合、例えばサプリメントとして顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセルとしても良く、また飲料、ゼリー、ビスケットなどの食品に本発明の薬剤を含有させたものがあげられる。【００１０】
本発明は、境界型糖尿病を含めた2型糖尿病患者に対して膵β細胞の機能を正常化することで糖尿病やメタボリックシンドロームの発症・進展を抑制するための根本治療となりうるための治療に有用である。
次に実施例に基づいて本発明を説明する。【００１１】
（実施例１）（インスリン分泌不全の予防効果の確認）
正常のWistar系雄性ラットから定法にしたがって膵臓よりランゲルハンス島を単離した。単離したランゲルハンス島は実体顕微鏡下で大きさが均一なものを採取し5個ずつにわけて24穴培養プレートに播き、これを8つのグループに分けてそれぞれ下記培地にて37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で一晩培養した。
第一群：正常グルコース濃度（5.6ｍM）を含むRPMI-1640培地
第二群：高グルコース濃度（16.7ｍM）を含むRPMI-1640培地
第三群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、0.3ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
第四群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
第五群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、3ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
第六群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、0.3ｍMグリシンを含むRPMI-1640培地
第七群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMグリシンを含むRPMI-1640培地
第八群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、3ｍMグリシンを含むRPMI-1640培地
一晩培養後のランゲルハンス島を、それぞれ一晩培養時と同様のグルコース濃度のKRBH緩衝液（129ｍM NaCl、4.7ｍM KCｌ、5ｍM NaHCO3、1.2ｍM MgSO4、1.2ｍM KH2PO4、2.5ｍM CaCl2、10ｍM HEPES、pH 7.4）に移し変えてそれまでの培養液を洗い流し、そのKRBH緩衝液中で再び37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で1時間培養した。1時間後に上記8つの培養条件のランゲルハンス島についてそれぞれ緩衝液を2.8ｍMグルコースを含むKRBHあるいは16.7ｍMグルコースを含むKRBH緩衝液500μlに交換して37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内でさらに1時間培養し、各穴より緩衝液を回収しその緩衝液中に分泌されたインスリン量を定法によりELISA法にて測定した。【００１２】
結果を表1に示す。正常グルコース濃度で培養した第一群のランゲルハンス島では2.8ｍMグルコースを含むKRBHによるインスリン分泌は0.37±0.08 ng/isletであったのに対し、16.7ｍMグルコースを含むKRBHの場合は1.90±0.3 ng/isletと約5倍の分泌上昇が認められた。これに対し、高グルコース濃度で培養した第二群のランゲルハンス島では2.8ｍMグルコースによる刺激ですでに1.06±0.49 ng/isletのインスリンが分泌されてインスリンの過剰分泌が認められたうえに、16.7ｍMグルコースによる刺激でのインスリン分泌は2.8ｍMグルコース刺激時に比べて約1.7倍程度と著しく減弱していた。このとき、培養液中にセリンまたはグリシンが含まれていた第三群から第八群については、セリンでは0.3ｍMから、グリシンでは1ｍMから2.8ｍMグルコース濃度下での過剰なインスリン分泌が有意に抑制され、高グルコース濃度で培養した場合に見られたような2.8ｍMグルコース刺激時に対する16.7ｍMグルコース刺激時のインスリン分泌の減弱は改善されていた。
以上の結果は、糖尿病の初期段階で見られるような高血糖によって誘導される高インスリン血症やグルコース濃度依存的なインスリン分泌不全の誘導がセリンやグリシンによって防止できることを示している。【００１３】
【表１】
2007060924.tif 000002
【００１４】
（実施例２）（インスリン分泌機構の悪化予防効果の確認）
実施例１と同様に正常のWistar系雄性ラットから定法にしたがって膵臓よりランゲルハンス島を単離した。単離したランゲルハンス島は実体顕微鏡下で大きさが均一なものを採取し10個ずつにわけて24穴培養プレートに播き、これを3つのグループに分けてそれぞれ下記培地にて37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で一晩培養した。
第一群：正常グルコース濃度（5.6ｍM）を含むRPMI-1640培地
第二群：高グルコース濃度（16.7ｍM）を含むRPMI-1640培地
第三群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
一晩培養後のランゲルハンス島をすべて回収し、定法に従ってmRNAを抽出してインスリン分泌制御に深く関わっていることが知られているタンパク質であるSNAP-25およびVAMP-2（Mol Endocrinol 17: 732 (2003)）の遺伝子発現量を定量的PCR法によって定量化した。【００１５】
結果を表2に示す。高グルコース濃度で培養したランゲルハンス島では正常グルコース濃度で培養した場合に比べてSNAP-25は65％程度低下しており、VAMP-2は2.8倍程度上昇していた。しかしセリンを共存させて培養することにより両遺伝子ともに正常グルコースで培養したときのレベルが維持されていた。グリシンは細胞内の代謝を経てセリンに変換されることから、グリシンでも同様の効果が期待できる。
以上の結果は、高血糖によって誘導されるインスリン分泌の調節機構の異常がセリンによって防止できることを示している。【００１６】
【表２】
2007060924.tif 000003
【００１７】
（実施例３）（インスリン分泌不全の改善効果の確認）
実施例1と同様に正常のWistar系雄性ラットから定法にしたがって膵臓よりランゲルハンス島を単離した。単離したランゲルハンス島を実体顕微鏡下で大きさが均一なものを採取し5個ずつにわけて24穴培養プレートに播き、これを高グルコース濃度（16.7ｍM）を含むRPMI-1640培地にて37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で一晩培養することによって実施例１に記したようなインスリン分泌不全を惹起した。
一晩培養後にランゲルハンス島を3つのグループに分けて下記培地にて37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内でさらに一晩培養した。
第一群：高グルコース濃度（16.7ｍM）を含むRPMI-1640培地
第二群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
第三群：正常グルコース濃度（5.6ｍM）を含むRPMI-1640培地
合計で二晩培養したランゲルハンス島を、それぞれ二晩目の培養時と同様のグルコース濃度のKRBH緩衝液に移し変えてそれまでの培養液を洗い流し、そのKRBH緩衝液中で再び37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で1時間培養した。1時間後に上記3つの培養条件のランゲルハンス島についてそれぞれ2.8ｍMグルコースを含むKRBHあるいは16.7ｍMグルコースを含むKRBH緩衝液500μlに交換して37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内でさらに1時間培養し、各穴より緩衝液を回収しその緩衝液中に分泌されたインスリン量を定法によりELISAにて測定した。【００１８】
結果を表3に示す。高グルコース濃度で二晩培養した第一群のランゲルハンス島では2.8ｍMグルコースによる刺激ですでに1.32±0.21 ng/isletのインスリン分泌がみられインスリンの過剰分泌が認められたうえに、16.7ｍMグルコース刺激によるさらなるインスリンの追加分泌は1.58±0.10 ng/isletと著しく減弱していた。一方、二晩目の培養時に培養液中のグルコース濃度を正常グルコース濃度に下げて糖尿病状態を解除した第三群のランゲルハンス島では2.8ｍMグルコースによる刺激時のインスリン分泌量が第一群に比べて有意に低下し、2.8ｍMグルコース刺激に対する16.7ｍMグルコース刺激によるインスリン分泌の減弱が改善されていた。第二群において高グルコース濃度の培養条件は変えずに、二晩目の培養時にセリンを添加した場合にも正常グルコース濃度に下げた場合と同様に2.8ｍMグルコースによるインスリン分泌量の有意な低下が見られ、2.8ｍMグルコース刺激時に対する16.7ｍMグルコースの刺激時のインスリン分泌も第三群と同様に回復が認められた。
グリシンは細胞内の代謝を経てセリンに変換されることから、グリシンでも同様の効果が期待できる。
以上の結果は、糖尿病発症後でも高血糖によって誘導された高インスリン血症やインスリン分泌不全がセリンによって正常なパターンに改善できることを示している。【００１９】
【表３】
2007060924.tif 000004
【００２０】
（実施例4）（インスリン分泌促進薬に対する応答性の回復の確認）
実施例1と同様に正常のWistar系雄性ラットから定法にしたがって膵臓よりランゲルハンス島を単離した。単離したランゲルハンス島は実体顕微鏡下で大きさが均一なものを採取し5個ずつにわけて24穴培養プレートに播き、これを4つのグループに分けてそれぞれ下記培地にて37℃、5%CO2濃度に保たれたインキュベーター内で一晩培養した。
第一群：高グルコース濃度（16.7ｍM）を含むRPMI-1640培地
第二群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMセリンを含むRPMI-1640培地
第三群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、1ｍMグリシンを含むRPMI-1640培地
第四群：高グルコース濃度（16.7ｍM）、１ｍMアラニンを含むRPMI-1640培地
一晩培養後のランゲルハンス島を、それぞれ一晩培養時と同様のグルコース濃度のKRBH緩衝液に移し変えてそれまでの培養液を洗い流し、そのKRBH緩衝液中で再び37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内で1時間培養した。1時間後に上記4つの培養条件のランゲルハンス島についてそれぞれ2.8ｍMグルコースを含むKRBHあるいは2.8ｍMグルコースと30μMのナテグリニドを含むKRBH緩衝液500μlに交換して37℃、5% CO2濃度に保たれたインキュベーター内でさらに1時間培養し、各穴より緩衝液を回収しその緩衝液中に分泌されたインスリン量を定法によりELISAにて測定した。【００２１】
結果を表4に示す。16.7ｍMグルコースで培養したランゲルハンス島（第一群）ではナテグリニドによるインスリンの分泌促進作用が消失していたのに対し、セリンおよびグリシンが添加された培地で一晩培養したランゲルハンス島（第二群および第三群）ではナテグリニドによるインスリン分泌はナテグリニドがない場合に比べて約3倍に上昇させた。一方、アラニンを入れた第四群ではそのような作用は認められなかった。
以上の結果は、高血糖によって誘導されたインスリン分泌促進剤に対する薬剤の感受性低下がセリンやグリシンによって防止でき、正常なインスリン分泌応答が保たれることを示している。【００２２】
【表４】
2007060924.tif 000005
【国際調査報告】
2007060924.tif 000006
2007060924.tif 000007
2007060924.tif 000008
2007060924.tif 000009