(57)【要約】  本発明は、ユウロピウムとテルビウムなどの２つ以上の希土類金属と蛍光性の錯体を形成し、３４０ｎｍ以上の波長で効果的に励起できる希土類蛍光錯体と、該希土類蛍光錯体を含んでなる蛍光標識剤および該希土類蛍光錯体を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等を提供する。  本発明は、４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格と、２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジン骨格とが結合してなる環状配位子を有することを特徴とする希土類蛍光錯体、それを用いた蛍光標識剤等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）
【化１５】
2007026808.tif 000016
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示す。）
で表される化合物、又はその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）のＲ２及びＲ３が、カルボキシメチル基である請求項１に記載の化合物、又はその塩。
【請求項３】
一般式（Ｉ）のＲ１のアミノ基の置換基が、標識される物質との結合のための基である請求項１又は２に記載の化合物、又はその塩。
【請求項４】
少なくとも２種類の希土類金属と錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することでき、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる希土類蛍光錯体を形成するための配位子を有する希土類蛍光錯体。
【請求項５】
配位子が、４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格と、２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジン骨格とが結合してなる環状配位子である請求項４に記載の希土類蛍光錯体。
【請求項６】
希土類蛍光錯体が、次の一般式（II）
【化１６】
2007026808.tif 000017
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される化合物である請求項４又は５に記載の希土類蛍光錯体。
【請求項７】
希土類蛍光錯体が、次の一般式（III）
【化１７】
2007026808.tif 000018
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される化合物である請求項４〜６のいずれかに記載の希土類蛍光錯体。
【請求項８】
一般式（Ｉ）のＲ１のアミノ基の置換基が、標識される物質との結合のための基である請求項６又は７に記載の希土類蛍光錯体。
【請求項９】
希土類蛍光錯体における希土類金属が、ユーロピウム若しくはテルビウムである請求項４〜８のいずれかに記載の希土類蛍光錯体。
【請求項１０】
テルビウムと錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することができ、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる蛍光錯体を形成するための配位子を有するテルビウム錯体。
【請求項１１】
テルビウム錯体の配位子が、次の一般式（IV）
【化１８】
2007026808.tif 000019
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示す。）
で表される化合物である請求項１０に記載のテルビウム錯体。
【請求項１２】
テルビウム錯体の配位子が、次の一般式（Ｉ）
【化１９】
2007026808.tif 000020
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示す。）
で表される化合物である請求項１０又は１１に記載のテルビウム錯体。
【請求項１３】
請求項４〜１２のいずれかに記載の希土類蛍光錯体を含んでなる標識される物質を蛍光標識するための蛍光標識剤。
【請求項１４】
標識される物質が、生体由来物質又は生理活性物質である請求項１３に記載の蛍光標識剤。
【請求項１５】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求項１４に記載の蛍光標識剤。
【請求項１６】
請求項４〜１２のいずれかに記載の希土類蛍光錯体を、標識される物質との結合のための基を介して結合させることを特徴とする標識される物質を蛍光標識する方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の蛍光標識剤で標識された生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１８】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求項１７に記載の標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１９】
請求項１３に記載の蛍光標識剤を、標識される物質との結合のための基を介して標識される物質に結合させて、当該標識される物質を標識化して、蛍光標識剤の蛍光を測定することからなる蛍光測定法。
【請求項２０】
蛍光測定法が、時間分解蛍光測定法である請求項１９に記載の蛍光測定法。
【請求項２１】
時間分解蛍光測定法が、時間分解蛍光イムノアッセイ、時間分解蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、時間分解蛍光顕微鏡イメジング、又は時間分解蛍光クロマトグラフイーである請求項２０に記載の蛍光測定法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の蛍光標識剤を含有してなることを特徴とする蛍光測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユウロピウムとテルビウムなどの２つ以上の希土類金属と蛍光性の錯体を形成し、３４０ｎｍ以上の波長で効果的に励起できる希土類蛍光錯体、より詳細には、４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格と、２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジン骨格とが結合してなる環状配位子を有することを特徴とする希土類蛍光錯体、当該希土類金属錯体を含んでなる蛍光標識剤、及び当該希土類金属錯体を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、当該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法及び蛍光測定法用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体試料中の微量分析の分析法として、抗原−抗体反応を利用したイムノアッセイや、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどがよく利用されている。これらの分析方法においては、抗体、ＤＮＡなどを標識する標識剤を使う必要があり、高感度検出を可能にする標識剤として、蛍光による標識、放射性同位体による標識、酵素による標識等がよく用いられている。
放射性同位体による標識は高感度ではあるが、貯蔵、使用、処理に際して危険を伴う欠点がある。また、酵素による標識は、酵素の分子量が大きく、温度などの外的要因による影響を受けやすく不安定であり、再現性に劣るという問題点や、酵素標識剤を被標識物に結合させることにより、酵素および被標識物の活性が低下してしまうという欠点がある。
また、蛍光による標識法としては、有機蛍光色素による標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロライドなど）が知られているが、励起光の散乱によるバックグラウンドノイズやサンプル中に存在する他の共存物質の蛍光に由来するバックグラウンドノイズにより標識剤からの蛍光検出が大きく阻害され、高感度の測定が困難になるという欠点がある。【０００３】
蛍光による標識方法としては、この他に、希土類蛍光錯体による標識が知られている。希土類蛍光錯体は、長い蛍光寿命（通常の有機の蛍光物質が持つ数ナノ秒の蛍光寿命に比べ、希土類蛍光錯体は数十から数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ）、大きなストークスシフト、シャープな蛍光発光ピークという特性を有している。この特性を生かし時間分解測定を用いて、励起光や共存物質に由来する短寿命のバックグラウンドノイズを除去することで高感度測定が可能になる。かかる特性により、希土類蛍光錯体を標識剤とした時間分解測定法が既に開発されている。
このような希土類蛍光錯体として２，２’：６’，２”−テルピリジン誘導体が報告されている（特許文献１参照）。また、このような２，２’：６’，２”−テルピリジン誘導体を放射性金属種と錯体化させて、放射性試薬として使用されることも報告されている（特許文献２参照）。
一方、本発明者らはすでに、アミノ基を持つタンパク質を直接標識できるクロロスルホニル化４座β-ジケトン型の標識剤を開発し、それらを用いた時間分解蛍光測定法への応用を検討してきた（特許文献３及び４参照。）。しかし、上記クロロスルホニル化４座β-ジケトン型の標識剤は一般的に水溶性が乏しいため、小さい生体物質（例えば、アミノ基を持つ分子量の小さい核酸塩基やそのほかの有機化合物）を標識すると、標識された生体物質体の水溶性が低下し、溶液中から沈殿してしまうという欠点があった。また、キレート力が十分でないため、使用できるバッファーの種類に制限があるという欠点もあった。  本発明者らは、さらに多くの希土類蛍光錯体標識剤を開発し、それらを用いた時間分解測定法への応用を検討してきた。これまで、開発した  Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−｛２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−フェニルピリジン｝四酢酸（以下、ＢＰＴＡと略す。）は、テルビウムおよびユウロピウムと錯体を形成し強い蛍光を発するが、励起極大波長が３２０ｎｍと短かった。また、｛２，２’，２’’，２’’’−｛４’−｛［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］ビフェニル−４−イル｝−  ２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝四酢酸｝（以下、ＤＴＢＴＡと略す。）は、３４０ｎｍ以上で励起可能だが、ユウロピウムとのみ蛍光性の錯体を形成するだけであった（特許文献５参照）。【０００４】
蛍光励起波長は、光源、レンズ等の光学材料などの装置構成上の制約、また、サンプル等への影響が少ないなどの理由からより長波長で励起できることが重要であり、３４０ｎｍ以上の波長での励起が可能な希土類蛍光錯体の開発が望まれている。
また、ＤＮＡの分析においては、ＤＮＡプローブ法がよく用いられている。この方法は２種あるいはそれ以上の標識剤を用いて標準試料と検体とを標識し、これらを同一プローブＤＮＡに与え、競合的ハイブリダイゼーションの結果によって検体中のＤＮＡ量を定量している。このような方法においては、複数の希土類イオンと蛍光を発する錯体を形成することができることが求められている。【０００５】
【特許文献１】特開平３−５００２９７号公報
【特許文献２】特開平７−５０６６６７号公報
【特許文献３】特開平９−２４１２３３号公報
【特許文献４】特開２０００−１１１４８０号公報
【特許文献５】ＷＯ  ２００３／０７６９３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、ユウロピウムとテルビウムなどの２つ以上の希土類金属と蛍光性の錯体を形成し、３４０ｎｍ以上の波長で効果的に励起できる希土類蛍光錯体と、該希土類蛍光錯体を含んでなる蛍光標識剤および該希土類蛍光錯体を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を有し、複数の希土類イオンと容易に錯体を形成し、更に該錯体が水溶液中で充分に安定であり、バッファーの種類によらず、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有するという特徴を有する新規な標識試薬と、該標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、該錯体を含んでなる蛍光標識剤、及び該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、４−ビフェニル−  ２，２’：６’，２’’−テルピリジンとＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−｛２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジンを骨格に有する環状配位子が、ユウロピウム及びテルビウムのいずれとも蛍光性の錯体を形成すること、さらにこれらの錯体が３４０ｎｍ以上の波長で効果的に励起できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は、少なくとも２種類の希土類金属と錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することでき、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる希土類蛍光錯体を形成するための配位子を有する希土類蛍光錯体に関する。より詳細には、本発明は、４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格と２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジン骨格とからなる環状配位子を有する希土類蛍光錯体に関する。さらに詳細には、本発明は、希土類蛍光錯体が、次の一般式（II）【０００９】
【化１】
2007026808.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される化合物である希土類蛍光錯体に関する。さらに詳細には、本発明は、希土類蛍光錯体が、次の一般式（III）【００１１】
【化２】
2007026808.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される化合物である希土類蛍光錯体に関する。
また、本発明は、前記した本発明の希土類蛍光錯体を含んでなる標識される物質を蛍光標識するための蛍光標識剤、当該蛍光標識剤を用いた蛍光標識をする方法、当該蛍光標識剤で標識された生体由来物質又は生理活性物質、当該蛍光標識剤で蛍光標識された物質の蛍光を測定することからなる蛍光測定法、及び当該蛍光標識剤を含有してなることを特徴とする蛍光測定用キットに関する。
さらに、本発明は、次の一般式（Ｉ）【００１３】
【化３】
2007026808.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示す。）
で表される化合物、又はその塩に関する。
また、本発明は、テルビウムと錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することができ、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる蛍光錯体を形成するための配位子を有するテルビウム錯体に関する。
本発明をより詳細に説明すれば、本発明は以下のとおり説明される。
（１）次の一般式（Ｉ）【００１５】
【化４】
2007026808.tif 000005
【００１６】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示す。）
で表される化合物、又はその塩。
（２）一般式（Ｉ）のＲ２及びＲ３が、カルボキシメチル基である前記（１）に記載の化合物、又はその塩。
（３）一般式（Ｉ）のＲ１のアミノ基の置換基が、標識される物質との結合のための基である前記（１）又は（２）に記載の化合物、又はその塩。
（４）少なくとも２種類の希土類金属と錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することでき、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる希土類蛍光錯体を形成するための配位子を有する希土類蛍光錯体。
（５）４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格と、２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジン骨格とが結合してなる環状配位子を有する希土類蛍光錯体。
（６）希土類蛍光錯体が、次の一般式（II）【００１７】
【化５】
2007026808.tif 000006
【００１８】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される化合物である希土類蛍光錯体。
（７）希土類蛍光錯体が、次の一般式（III）【００１９】
【化６】
2007026808.tif 000007
【００２０】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示し、Ｌｎは希土類金属を示す。）
で表される希土類蛍光錯体。
（８）一般式（Ｉ）のＲ１のアミノ基の置換基が、標識される物質との結合のための基である前記（６）又は（７）のいずれかに記載の希土類蛍光錯体。
（９）希土類蛍光錯体における希土類金属が、ユーロピウム若しくはテルビウムである前記（４）〜（８）のいずれかに記載の希土類蛍光錯体。
（１０）テルビウムと錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することができ、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる蛍光錯体を形成するための配位子を有するテルビウム錯体。
（１１）テルビウム錯体の配位子が、次の一般式（IV）【００２１】
【化７】
2007026808.tif 000008
【００２２】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示す。）
で表される化合物である前記（１０）に記載のテルビウム錯体。
（１２）テルビウム錯体の配位子が、次の一般式（Ｉ）【００２３】
【化８】
2007026808.tif 000009
【００２４】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してカルボキシアルキル基を示す。）
で表される化合物である前記（１０）又は（１１）に記載のテルビウム錯体。
（１３）前記（４）〜（１２）のいずれかに記載の希土類蛍光錯体を含んでなる標識される物質を蛍光標識するための蛍光標識剤。
（１４）標識される物質が、生体由来物質又は生理活性物質である前記（１３）に記載の蛍光標識剤。
（１５）生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である前記（１４）に記載の蛍光標識剤。
（１６）前記（４）〜（１２）のいずれかに記載の希土類蛍光錯体を、標識される物質との結合のための基を介して結合させることを特徴とする標識される物質を蛍光標識する方法。
（１７）前記（１３）に記載の蛍光標識剤で標識された生体由来物質又は生理活性物質。
（１８）生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である前記（１７）に記載の標識した生体由来物質又は生理活性物質。
（１９）前記（１３）に記載の蛍光標識剤を、標識される物質との結合のための基を介して標識される物質に結合させて、当該標識される物質を標識化して、蛍光標識剤の蛍光を測定することからなる蛍光測定法。
（２０）蛍光測定法が、時間分解蛍光測定法である前記（１９）に記載の蛍光測定法。
（２１）時間分解蛍光測定法が、時間分解蛍光イムノアッセイ、時間分解蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、時間分解蛍光顕微鏡イメジング、又は時間分解蛍光クロマトグラフイーである前記（２０）に記載の蛍光測定法。
（２２）前記（１３）に記載の蛍光標識剤を含有してなることを特徴とする蛍光測定用キット。【００２５】
本発明の錯体は、少なくとも２種類の希土類金属と錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することでき、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる希土類蛍光錯体を形成するための配位子を有することを特徴とする希土類蛍光錯体であり、より詳細には、本発明は、４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジンと２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）ピラジンを骨格とする環状配位子を有することを特徴とする希土類蛍光錯体である。
本発明の希土類蛍光錯体における配位子は、次の一般式（Ｖ）、【００２６】
【化９】
2007026808.tif 000010
【００２７】
（式中、Ｒ１は、水素原子、又はビフェニル環上に置換した置換基を示す。）
で表される４−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン骨格における左右のピリジン環と、次の一般式（VI）、【００２８】
【化１０】
2007026808.tif 000011
【００２９】
で表される２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−ピラジン骨格とが適当な基で結合して、環状の化合物となっていることを特徴とするものである。
一般式（III）で表されるテルピリジン骨格における左右のピリジン環と、一般式（IV）で表されるピラジン骨格とを結合させる基としては、希土類金属が配位することができるための適当な距離を確保することができ、かつ両方の骨格を化学的に結合することができ、そして化学物質としての安定性を維持できる基であれば特に制限はない。好ましい環状の化合物としては、次の一般式（IV）、【００３０】
【化１１】
2007026808.tif 000012
【００３１】
（式中、Ｒ１はニトロ基又は置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基からなる両者の環を結合する基を示し、これらの基は希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有していてもよい基を示す。）
で表される大環状の化合物が例示される。
Ｌ１及びＬ２における、少なくとも１個の炭素原子が窒素原子に置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜６、好ましくは２〜４の直鎖状又は分岐状のアルキレン基、又はこれらのアルキレン基の中の炭素原子の少なくとも１個が窒素原子で置換された基が挙げられる。窒素原子で置換された基としては、一般式、
−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−Ｒ６−
（式中、Ｒ４、Ｒ６はそれぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｒ５は、希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基を有してもよい炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
で表される基が例示される。当該一般式における、炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基などの炭素数１〜５、好ましくは１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。特に好ましい基としてはメチレン基、エチレン基などが挙げられる。
また、一般式（Ｖ）又は（IV）におけるＲ１としては、水素原子であってもよいが、本発明の希土類蛍光錯体を蛍光標識剤として使用する場合に標識される物質に結合させるための官能基となることができる基が好ましい。好ましい官能基としては、ニトロ基やアミノ基のような窒素原子を含有する基が挙げられるがこれに限定されるものではない。【００３２】
また、前記一般式（IV）で表される大環状の化合物のＬ１、Ｌ２における希土類イオンの陽電荷を中和するための陰性の基としては、イオン状態になっている希土類金属イオンの陽電荷を中和するための陰性になることができる官能基を有する基が、さらに置換したものが好ましい。このような陰性になることができる官能基としては、カルボキシル基、スルホン酸基などの酸性や、水酸基のような中性であってもよいが、製造の容易さや化合物の安定性の点からカルボキシル基が好ましい。好ましい陰性になることができる官能基を有する基としては、カルボキシアルキル基が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明の好ましい希土類蛍光錯体における配位子としては、前記した一般式（IV）又は一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が挙げられる。
前記した一般式（Ｉ）又は一般式（IV）における置換基Ｒ１は、ビフェニル環上の置換基であることを示しており、ビフェニル環のどちらの環に置換した置換基であってもよい。また、置換する位置が特定されていてもよいし、種々の置換位置に置換した置換基の混合物であってもよい。さらに、置換基Ｒ１は、１つであってもよいし、必要によっては２つ以上存在してもよい。このような置換基が２つ以上存在する場合には、それらは同一のものであってもよいし、それぞれ異なる種類の置換基であってもよい。【００３３】
前記した一般式（Ｉ）又は一般式（IV）のＲ１における置換されていてもよいアミノ基としては、無置換のアミノ基や、標識される物質（被標識物質）と結合できる基で置換されたアミノ基が挙げられる。標識される物質（被標識物質）と結合できる基としては、これらの被標識物質が有する反応性の官能基と反応して、共有結合を形成し得る基であって、アミノ基と安定な結合が可能なものであれば特に制限はない。一般式（Ｉ）のＲ１における置換されたアミノ基としては、例えば、イソチオシアナト基、ハロゲノアセチルアミノ基、ヒドラジノ基、(４,６−ジハロゲノ−１,３,５−トリアゼン−２−イル)アミノ基、カルボキシル基等が好ましいものとして挙げられる。
ここで、ハロゲノアセチルアミノ基、(４,６−ジハロゲノ−１,３,５−トリアゼン−２−イル)アミノ基におけるハロゲノ基としては、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ等が挙げられる。
前記した一般式（Ｉ）のＲ２及びＲ３におけるカルボキシアルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキル基にカルボキシル基が置換した基であり、例えば、カルボキシメチル基、１−カルボキシエチル基、２−カルボキシエチル基などが挙げられる。好ましいカルボキシアルキル基としては、カルボキシメチル基が挙げられる。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、カルボキシル基などの酸性の基についてはナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩などが例示され、アミノ基などの塩基性の基については塩酸、硫酸などの酸の塩が例示される。【００３４】
本発明の一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物は、希土類金属イオンと安定な錯体を形成することができ、前記した一般式（II）又は一般式（III）で表される希土類金属錯体を形成することができる。ここに、一般式（II）におけるＲ１、Ｌ１、及びＬ２、一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記してきた一般式（Ｉ）又は一般式（IV）におけるそれらと同じものである。希土類イオンの種類としては、形成される錯体の蛍光強度、蛍光波長、蛍光寿命等を考慮して選択することができ、特に三価のランタノイドイオンとの錯体が好ましく、より好ましくは三価のユウロピウムイオン、三価のテルビウムイオン、三価のサマリウムイオン、三価のジスプロシウムイオンなどが挙げられる。
本発明の希土類金属錯体は、少なくとも２種類の希土類金属と錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することでき、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる希土類蛍光錯体を形成するための配位子を有することを特徴とするものであるが、テルビウム錯体については、テルビウムと錯体を形成することができ、当該錯体は蛍光を発することができ、かつ当該錯体が３４０ｎｍ以上の波長の光で励起可能となる蛍光錯体を形成するための配位子を有するものであればよい。このようなテルビウム錯体における配位子としては前記してきた一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物などを挙げることができる。【００３５】
希土類金属イオンと本発明の一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物とが錯形成し生成する錯体は、蛍光錯体であり、従って、本発明に係る希土類金属錯体は蛍光標識剤として使用することができる。
本発明の蛍光標識剤は、本発明の希土類金属錯体を含んでなるものであるが、本発明の蛍光標識剤は、希土類金属錯体として単離されたもの、当該希土類金属錯体を含む溶液、及び希土類金属イオンと本発明の一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物とを含んでなる溶液の何れをも包含する。
本発明における蛍光標識方法は、本発明の前記した蛍光標識剤を用いることを特徴とするものであり、前記した本発明の蛍光標識剤を用いて、種々の被標識物質を蛍光標識することにより行うことができる。例えば、（１）先ず被標識物質と本発明の一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物とを反応させ、その後に適当な希土類金属イオンを作用させて、錯体を形成させることにより蛍光標識する方法、(２)本発明の一般式（Ｉ）又は一般式（IV）で表される化合物と希土類金属イオンと被標識物質とを同時に反応させて、錯体形成と蛍光標識とを併行して行う方法とがあるが何れの方法で行うかは任意である。
本発明の一般式（Ｉ）〜一般式（IV）で表されるいずれかの化合物と被標識物質とを結合させる方法としては、一般式（Ｉ）〜（IV）のＲ１における置換されていてもよいアミノ基と、被標識物質が有する反応性の官能基、例えば、アミノ基や水酸基などとを、公知の方法により反応させて行うことができる。二価性の試薬（架橋剤）を用いて、本発明の蛍光標識剤又はその配位子のアミノ基と被標識物質とを架橋して標識するか、あるいは当該アミノ基をもう一段階誘導体化させて、標識することができる。このような架橋剤としては、例えば、次のような化合物、【００３６】
【化１２】
2007026808.tif 000013
【００３７】
などが挙げられる。これらの架橋剤はアミノ基を対象とした場合に有用であり、また、次に挙げる化合物、【００３８】
【化１３】
2007026808.tif 000014
【００３９】
などはチオール基を対象とする場合に有用なものとして挙げることができる。
本発明における被標識物質に特に制約はなく、生体由来物質、生理活性物質、その他の化学物質等に広く適用され得る。また、被標識物質の分子サイズ、存在形態（溶液又は固相）、単一か組成物か等には制限されない。本発明の蛍光標識剤により標識される被標識物質の条件としては、該被標識物質の一部に、本発明に係る蛍光標識剤と共有結合し得る反応性の基が少なくとも１つあればよい。或いは、斯かる基を導入することが可能な基を有するものであればよい。
このような、本発明の蛍光標識剤により標識可能な生体由来物質、生理活性物質としては、例えば、酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、糖、糖タンパク質、ホルモン、リピッド、核酸、核酸誘導体、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、細胞、脂肪類化合物、アミノ酸、薬物（抗生物質を含む）等が挙げられる。
また、タンパク質の具体例としては、抗体及びその誘導体、抗原およびその誘導体、アビジン（ストレプトアビジンを含む）、血清アルブミン、種々のハプテン、ホルモン、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられる。
その他の化学物質としては、例えば、農薬、日常化学品、化学試薬、工業化学品等が挙げられる。
本発明における蛍光測定法は、前記した本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとからなる希土類金属錯体を蛍光標識剤として用いて測定を行うか、或いは、前記した本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとを用いて、種々の被標識物質を蛍光標識して測定を行うことを特徴とするものである。
蛍光測定法の代表的なものとしては、例えば時間分解蛍光測定法が挙げられる。
時間分解蛍光測定法の応用例としては、例えば、時間分解蛍光免疫測定法やＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ法、クロマトグラフイー法、蛍光顕微鏡法等を挙げることができる。【００４０】
本発明における蛍光測定法用試薬は、前記した本発明の蛍光測定法に用いられる試薬であり、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとからなる希土類金属錯体を蛍光標識剤として含んでなるか、或いは、前記した本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとを含んでなることを特徴とするものである。
本発明の蛍光測定法用試薬は、生体由来物質、生理活性物質、その他の化学物質等の測定に使用し得るが、特に、生体由来物質、生理活性物質の測定により効果的である。
生体由来物質、生理活性物質の具体例は、先に記載した通りである。
また、本発明における試薬のキットは、前記した本発明の蛍光測定法に用いられる試薬のキットであり、前記した本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとからなる希土類金属錯体を蛍光標識剤として含んでなるか、或いは、前記した本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と希土類金属イオンとを含んでなるものである。【００４１】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法、そのための出発原料等については特に制約はなく、何れの化合物も通常の有機合成法を適宜組合わせることにより製造することができる。生成物の構造同定は、通常の有機化合物構造分析法、例えば、１Ｈ ＮＭＲ、有機元素分析法などを用いて行うことができる。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法を、Ｒ１がアミノ基で、Ｒ２及びＲ３が同時にカルボキシメチル基である場合を例にして反応スキームで示すと以下のようになる。【００４２】
【化１４】
2007026808.tif 000015
【００４３】
まず、３−メチルピラゾールと２，６−ジクロロピラジンとを反応させて化合物１を製造し、次いでメチル基をハロゲン化してハロゲノメチル体２とした後、アミノ酢酸エチルを用いてアルコキシカルボニルアルキル基をしてＮ−アルコキシカルボニルアルキル体３を製造することにより、前記一般式（IV）で表されるピラジン骨格を有する化合物を製造する。ついで、このＮ−アルコキシカルボニルアルキル体３と、前記一般式（III）で表されるテルピリジン骨格を有するハロゲノメチル体４とを反応させて、本発明の環状配位子化合物５を製造することができる。この反応で使用する一般式（III）で表されるテルピリジン骨格を有するハロゲノメチル体４は、例えば、特許文献５（ＷＯ  ２００３／０７６９３８号公報）に記載された方法により製造することができる。
得られた、環状配位子化合物５のエステル基を加水分解することにより、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物であるニトロ体６を製造することができる。また、この化合物５又は６のニトロ基を接触還元などの方法により還元することにより、対応するアミノ体を製造することができる。得られたアミノ体におけるアミノ基を適当な置換基で置換することにより、対応する置換基で置換されたアミノ体を製造することができる。
この方法又はこれに準じた方法により本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物を製造することができる。この化合物は、必要により、適宜塩にすることもできる。
このようにして製造された本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物のエタノールなどの溶媒に溶解し、この溶液に希土類金属イオンを有する化合物、例えば、塩化希土類金属化合物などを添加して混合することにより、本発明の一般式（II）で表される希土類金属錯体７を製造することができる。さらに、必要により、希土類金属錯体７のニトロ基を接触還元などの方法により還元することにより、対応するアミノ体８を製造することができる。得られたアミノ体におけるアミノ基を適当な置換基で置換することにより、対応する置換基で置換されたアミノ体を製造することができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明は、被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を有し、希土類金属イオンと容易に錯体を形成し得る新規な化合物、及びそれを含有してなる希土類金属錯体を提供するものである。当該希土類金属錯体該錯体は水溶液中で安定であり、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有するだけでなく、２種以上の希土類金属と錯体を形成することができ、さらに通常のレーザー光源が有する３４０ｎｍ以上の波長の光においても十分な蛍光発光を得ることができる。それ故、本発明の希土類金属錯体を用いることにより、アミノ基やメルカプト基等の官能基を有する酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、ホルモン、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、薬物（抗生物質を含む）及びその他の有機化合物等を水溶液中で直接標識することが可能となる。特に、２種以上の蛍光波長の異なる蛍光標識剤を必要とする蛍光測定法において、本発明の蛍光標識剤は極めて有用なものである。
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、共有結合形成により被標識物質（具体的には、アミノ基やメルカプト基等を有する酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、ホルモン、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、薬物（抗生物質を含む）及びその他の有機化合物等）と非常に安定な標識複合体を形成し、それを希土類イオンと反応させることにより非常に安定な希土類蛍光錯体標識複合体が得られる。その標識複合体も同様に非常に長い蛍光寿命と強い蛍光を有し、時間分解蛍光イムノアッセイやＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ等に直接応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明の希土類金属錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕの吸光スペクトルを示すチャートである。図１の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．５×１０−５Ｍである。
【図２】図２は、本発明の希土類蛍光錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂの吸収スペクトルを示すチャートである。図２の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．２×１０−５Ｍである。
【図３】図３は、本発明の希土類蛍光錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕの励起スペクトルを示すチャートである。図３の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．５×１０−６Ｍであり、６１３ｎｍの蛍光を検出した。
【図４】図４は、本発明の希土類蛍光錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂの励起スペクトルを示すチャートである。図４の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．２×１０−６Ｍであり、５４５ｎｍの蛍光を検出した。
【図５】図５は、本発明の希土類蛍光錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕの時間分解蛍光スペクトルを示すチャートである。図５の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．５×１０−６Ｍであり、３３０ｎｍの光で励起した。遅延時間は０．２ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算３０回で測定した。
【図６】図６は、本発明の希土類蛍光錯体であるニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂの時間分解蛍光スペクトルを示すチャートである。図６の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１．２×１０−６Ｍであり、３３０ｎｍの光で励起した。遅延時間は０．２ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算１００回で測定した
【図７】図７は、本発明の希土類蛍光錯体であるアミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕの時間分解モードで測定した励起スペクトルを示すチャートである。図７の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１×１０−５Ｍであり、６１４ｎｍの蛍光を検出した。遅延時間は０．１ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算100回で測定した。
【図８】図８は、本発明の希土類蛍光錯体であるアミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕの時間分解モードで測定した発光スペクトルを示すチャートである。図８の横軸は波長(ｎｍ)を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１×１０−５Ｍであり、３６１ｎｍ  の光で励起した。遅延時間は０．１ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算１００回で測定した。
【図９】図９は、本発明の希土類蛍光錯体であるアミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂの時間分解モードで測定した励起スペクトルを示すチャートである。図９の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１×１０−５Ｍであり、５４５ｎｍの蛍光を検出した。遅延時間は０．１ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算１００回で測定した。
【図１０】図１０は、本発明の希土類蛍光錯体であるアミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂの時間分解モードで測定した発光スペクトルを示すチャートである。図１０の横軸は波長(ｎｍ)を示し、縦軸は蛍光強度を示す。溶媒はメタノールで、錯体の濃度は１×１０−５Ｍであり、３６１ｎｍの光で励起した。遅延時間は０．１ｍｓ、測定時間は０．５ｍｓ、積算１００回で測定した。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。【００４７】
参考例１
前記した製造チャートにおける化合物４で示される化合物（［４'−（ニトロ−ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジイル］ビス（ブロモメチル））の製造
特許文献５（ＷＯ  ２００３／０７６９３８号公報）に記載された方法により以下のようにして製造した。【００４８】
（１）４'−（ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジンの製造
Ｎ−［２−（ピリド−２'−イル）−２−オキソエチル］ピリジニウムアイオダイド（１６．３ｇ，５０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−３−（ビフェニル−４''−イル）−１−（ピリド−２'−イル）−２−プロペノン（１４．２６ｇ，５０ｍｍｏｌ）、及び酢酸アモニウム（２３．１ｇ）を５００ｍｌの乾燥メタノールに加え、撹拌下、２４時間還流した。反応液を冷却して、沈澱を濾取し、冷メタノールで十分洗浄した後、アセトニトリルから再結晶し、目的の化合物を得た。真空乾燥後の収率は４９．３％であった。
元素分析結果(Ｃ２７Ｈ１９Ｎ３):
計算値（％）, C = 84.13, H = 4.97, N = 10.90。
実測値（％）, C = 84.01, H = 4.82, N = 10.88。
更に、１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３): δ
8.80 (s, 2H), 8.75 (d, J=4.6Hz, 2H), 8.69 (d, J= 7.8Hz, 2H),
8.01 (d, J=8.6Hz, 2H), 7.89 (t, J=7.6Hz, 2H),
7.75 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.68 (d, J=6.9Hz, 2H),
7.48 (t, J=6.9Hz, 2H), 7.41-7.33 (m, 3H)。【００４９】
（２）４'−（ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−１，１''−ジオキシドの製造
前記（１）で得られた化合物（１９．２７ｇ，５０ｍｍｏｌ）を７００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶かした。これに、５０ｇの３−クロロペルオキシ安息香酸を加え、室温で２０時間を撹拌した。反応液を３００ｍｌの１０％  Ｎａ２ＣＯ３水溶液で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥した後、溶媒を減圧蒸去した。生成物を３００ｍｌのメタノールに溶かし、濾過により微量の不溶物を除いた後、減圧蒸留で溶媒を除去した。生成物をアセトニトリルでよく洗い、真空乾燥して目的の化合物を得た。収率は９１．４％であった。１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)：  δ
9.29 (s, 2H), 8.38 (d, J=6.6Hz, 2H), 8.25 (d, J=8.2Hz, 2H),
7.94 (d, J=8.6Hz, 2H), 7.72 (d, J=8.6Hz, 2H),
7.66 (d, J=6.9Hz, 2H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.41-7.29 (m, 5H)。【００５０】
（３）４'−（ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジカーボニトリルの製造
４５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に、前記（２）で得られた化合物（１５．６５ｇ，３７．５ｍｍｏｌ）と（ＣＨ３）３ＳｉＣＮ（３７．２ｇ，３７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分撹拌した後、塩化ベンゾイル１５０ｍｍｏｌを約２０分を要して徐々に滴下した。反応液を室温で２４時間撹拌した後、溶媒を減圧下半分まで留去した。残りの溶液に１０％  Ｋ２ＣＯ３ 水溶液６００  ｍｌを加え、室温で１時間攪拌後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄し、更に冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した後、真空乾燥して目的の化合物を得た。収率は８０．８％であった。１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６)：  δ
8.99 (d, J=7.6Hz, 2H), 8.75 (s, 2H), 8.31 (t, J=7.9Hz, 2H),
8.20 (d, J=7.6Hz, 2H), 8.10 (d, J=7.6Hz, 2H),
7.92 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.78 (d, J=7.6Hz, 2H),
7.54-7.42 (m, 3H)。【００５１】
(４) ４'−（ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジカルボン酸ジメチルの製造
Ｈ２ＳＯ４  ９０ｍｌ／ＣＨ３ＣＯＯＨ  ９０ｍｌ／Ｈ２Ｏ  ２０ｍｌの混合溶媒に、前記（３）で得られたニトリル体８．７１ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、９０−１００℃で２４時間撹拌した。反応溶液を８００ｇの氷に加え、撹拌後、沈澱を濾取し、水とエタノールで充分洗浄した後、真空乾燥して、９．１３ｇの加水分解物を得た。
氷−水で冷却した６００ｍｌの乾燥メタノールにチオニルクロライドＳＯＣｌ２  ２４ｇを加え、１５分間撹拌した後、上で得た加水分解物９．１３ｇを加え、撹拌下２４時間還流した。溶媒を減圧留去し、生成物を１０００ｍｌのクロロホルムＣＨＣｌ３  に溶解し、１５％のＮａＨＣＯ３水溶液で有機層を充分洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ  ＝９９：１ｗ／ｗ）で精製した。これをトルエンから再結晶し、目的の化合物を得た。収率は４８．５％であった。
元素分析結果(Ｃ３１Ｈ２３Ｎ３Ｏ４)：
計算値（％）, C = 74.24, H = 4.62, N = 8.38。
実測値（％）, C = 74.15, H = 4.55, N = 8.38。
更に、１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３）：  δ
8.88 (s, 2H), 8.86 (d, J=7.9Hz, 2H), 8.20 (d, J=7.6Hz, 2H),
8.06 (d, J=7.9Hz, 2H), 8.00 (d, J=7.2Hz, 2H),
7.78 (d, J=6.6Hz, 2H), 7.70 (d, J=6.9, 2H), 7.52-7.30 (m, 3H),
4.07 (s, 6H)。【００５２】
（５）４'−（ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジヒドロキシメチルの製造
４００ｍｌの乾燥エタノールに、前記（４）で得られたメトキシカルボニル体（７．０２ｇ，１４ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４ ３．０２ｇを加え、室温で３時間撹拌した後、１時間環流した。溶媒を減圧留去し、生成物を２００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３  水溶液に加え、撹拌下、沸騰まで加熱した。冷却後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄した後、真空乾燥して目的の化合物を得た。収率は９２．０％であった。１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ
8.75 (s, 2H), 8.55 (d, J=7.9Hz, 2H), 8.07-8.00 (m, 4H),
7.92 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.78 (d, J=7.2Hz, 2H),
7.61 (d, J=7.9Hz, 2H), 7.57-7.50 (m, 2H), 7.46-7.40 (m, 1H),
5.57 (t, J=5.9Hz, 2H), 4.74 (d, J=4.6Hz, 4H)。【００５３】
（６）４'−（４''''−ニトロ−ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジヒドロキシメチルの合成
前記（５）で得られた化合物（１．７８ｇ，４ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの無水酢酸に加え、６０℃で１５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、生成物に２０ｍｌの無水酢酸を加え、氷−水で外部冷却下、２０ｍｌの酢酸―３ｍｌの発煙硝酸溶液を滴下した。氷−水で外部冷却下、２時間撹拌した後、更に室温で２４時間撹拌した。反応液を２５０ｍｌの水に加え、１時間撹拌した後、ＣＨＣｌ３ １００ｍｌで３回抽出した。ＣＨＣｌ３溶液を５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を減圧留去した。生成物に１５０ｍｌのエタノール、１０ｇのＫＯＨと１５ｍｌの水を加え、室温で３６時間撹拌した。反応液に３００ｍｌの水を加え、沈澱を遠心分離で収集し、５時間真空乾燥した後、水で充分洗浄した。真空乾燥して目的のニトロ体化合物を得た。収率は９０．７％であった。１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物と４'−（２''''−ニトロ−ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジヒドロキシメチルの混合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ
8.81-8.79 (m, 2H), 8.61 (d, J=7.9Hz, 2H),
8.37 (d, J=7.2Hz, 1H), 8.17-8.03 (m, 6H), 7.88-7.80 (m, 1H),
7.75-7.58 (m, 4H), 4.78 (s, 4H)。【００５４】
（７）４'−（４''''−ニトロ−ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジブロモメチルの製造
前記（６）で得られた化合物（１．７８ｇ，３．６３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２００ｍｌ−ＤＭＦ８０ｍｌ混合溶媒に溶解し、ＰＢｒ３  ３．５２ｇを加え、撹拌下６時間環流した。溶媒を減圧留去した後、生成物にＣＨＣｌ３  ３００ｍｌを加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４  水溶液４ｘ２００ｍｌで有機層を洗浄した後、更に、１０％のＮａＨＣＯ３  水溶液２００ｍｌで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥し、溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９９．５：０．５ｖ／ｖ）で精製した。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して目的のブロモメチル体化合物を得た。収率は５６．３％であった。
元素分析結果(Ｃ２９Ｈ２０Ｂｒ２Ｎ４Ｏ２)：
計算値（％）, C = 56.52, H = 3.27, N = 9.09。
実測値（％）, C = 56.64, H = 3.32, N = 9.10。
質量分析結果  （ＦＡＢ−ＭＳ）：
ｍ／ｅ，  ６１７．３（Ｍ＋Ｈ＋），  ５７１．３（Ｍ−ＮＯ２）
更に、１Ｈ ＮＭＲで生成物は目的化合物と４'−（２''''−ニトロ−ビフェニル−４'''−イル）−２，２'：６'，２''−ターピリジン−６，６''−ジブロモメチルの混合物であることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ
8.70 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.57 (d, J=7.9Hz, 2H),
8.33 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.10-8.00 (m, 6H),
7.95 (d, J=8.2Hz, 1H), 7.70-7.55 (m, 4H), 4.84 (s, 4H)。
【実施例１】
【００５５】
（１）２，６−ビス（３−メチル−ピラゾール−１−イル）ピラジン［前記した製造チャートにおける化合物１（以下、化合物の番号は前記した製造チャートの番号である。）］の製造
３−メチルピラゾール(9.85g, 120 mmol)を乾燥ＴＨＦ１５０ｍｌに溶解し、その後カリウム(4.7g, 120 mmol)を加え６０℃で反応させた。カリウムが確認出来なくなった後、室温まで放冷した。次いで、２，６−ジクロロピラジン(4.46g, 30 mmol)を加えて４日間還流した後、放冷した後、水(75 ml)を加えた。減圧蒸留を行い、ＴＨＦを留去した後、沈殿物を吸引濾取した。水で洗浄し、目的化合物を得た。収率は８５．５％だった。１Ｈ ＮＭＲにより生成を確認した。
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３, 400 MHz)：  δ
2.41 (s, 6H), 6.33 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 8.38 (d, J = 2.4 Hz, 2H),
9.08 (s, 2H)
【実施例２】
【００５６】
（２）２，６−ビス（３−ブロモメチル−ピラゾール−１−イル）ピラジン［化合物２］の製造
実施例１で製造した化合物１(2.16g, 9mmol)、及びＮ−ブロモコハク酸イミド(3.2g, 18 mmol)を四塩化炭素(200 ml)に加えた。この混合溶液に過酸化ベンゾイル(50 mg)を加え２０時間還流した。反応溶液を室温まで放冷した後、水でさらに冷却した。固体を吸引濾別し、濾液を溶媒が１０〜２０ｍＬになるまで減圧濃縮した。冷凍庫で冷却(１時間)し、生じた沈殿を吸引ろ過により濾取し、ヘキサンで洗浄した。真空乾燥を１時間行った後、四塩化炭素より再結晶を行い、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥して目的化合物を得た。収率は３０．１％だった。１Ｈ ＮＭＲにより生成を確認した。
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３, 300 MHz)：  δ
4.57 (s, 4H), 6.62 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 8.44 (d, J = 2.7 Hz, 2H),
9.16 (s, 2H)
【実施例３】
【００５７】
（３）２，６−ビス｛３−［（Ｎ−エトキシカルボニルメチル）アミノメチル］ピラゾール−１−イル｝ピラジン［化合物３］の製造
実施例２で製造した化合物２(0.76g, 2.0 mmol)、及びグリシンエチルエステル塩酸塩(1.4g, 10 mmol)を乾燥アセトニトリル(150 ml)に加えた。その後に炭酸カリウム(2.1g, 15 mmol)を加え、２４時間還流攪拌した。生じた沈殿を吸引濾別し、少量のクロロホルムで洗浄し、濾液より溶媒を減圧留去した。クロロホルム２００ｍＬに再び溶解し、１０％塩化ナトリウム水溶液（200 ml×3）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。薄層クロマトグラフ法（クロロホルム：メタノール＝９５：５）で精製し目的化合物を得た  。収率は１６．２％だった。１Ｈ ＮＭＲにより生成の確認を行った。
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３, 400 MHz)：  δ
1.29 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 2.17 (s, 2H), 3.51 (s, 4H), 3.96 (s, 4H),
4.21 (q, J = 7.2 Hz, 4H) 6.51 (d, J = 2.4 Hz, 2H),
8.43 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 9.14 (s, 2H)
【実施例４】
【００５８】
（４）ニトロ−ＢＴＰＤＡジエチルエステル［化合物５］の製造
前記した参考例１の方法により製造された６，６”−ジブロモメチル−４’−（ニトロビフェニル−４−イル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン［化合物４］(186 mg, 0.3 mmol)と、実施例３で製造した化合物３(133 mg, 0.3 mmol)とを乾燥アセトニトリル(150 ml)に加えた。炭酸ナトリウム(315mg，3mmol)を加え、２４時間還流攪拌した。沈殿を吸引濾別し、少量のクロロホルムで洗浄し、濾液より溶媒を減圧留去したクロロホルム２００ｍＬに再び溶解し、１０％塩化ナトリウム水溶液（200 ml×3）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフ法（シリカゲル、クロロホルム‐メタノール＝９５：５  ｖ／ｖ）で精製して目的化合物を得た。収率は５０．２％だった。
【実施例５】
【００５９】
（５）ニトロ−ＢＴＰＤＡ［化合物６］の製造
実施例４で製造した化合物５(150 mg, 0.15 mmol)、及び水酸化カリウム(400 mg, 6.0 mmol)を少量のエタノールと２ｍＬの水に加え、２４時間還流攪拌した。溶媒を減圧留去した後、少量の水に再び溶解させた。この溶液に３Ｍ塩酸を少しずつ滴下し、ｐＨ１以下に調整した。室温で３時間攪拌した後、遠心分離により沈殿物を得た。１％塩酸で洗浄した後乾燥して目的化合物を得た。収率は７９．２％だった。ＥＳＩ−ＭＳにより生成の確認を行った。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：  ｍ／ｅ  ８４１．５  （Ｍ＋Ｈ＋）＋
【実施例６】
【００６０】
（６）ニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕ［化合物７−Ｅｕ］の製造
実施例５で製造した化合物６(84 mg 0.1 mmol)と塩化ユーロピウム六水和物(75.4mg 0.5mmol)をメタノール３０ｍＬに加え、２４時間還流攪拌した。その後に、溶媒を減圧留去した。少量のメタノールに溶解させ、ジエチルエーテルを用いて再沈殿を行い、一晩冷蔵庫で静置させた。沈殿物を遠心分離により収集し、乾燥して目的化合物を得た。収率は５０．７％だった。ＥＳＩ−ＭＳにより生成の確認を行った。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：  ｍ／ｅ  ９９１．３  （Ｍ−Ｃｌ−）＋
【実施例７】
【００６１】
（７）アミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕ［化合物８−Ｅｕ］の製造
実施例６で製造した化合物７−Ｅｕ(45 mg 0.05 mmol)、及び１０％Ｐｄ／Ｃを乾燥メタノール（20ml）に加えた。この溶液を凍結−脱気−融解を繰り返し、溶存酸素を除去した。水素雰囲気下、室温で6時間攪拌し、触媒を濾別し、溶液を減圧乾固し、目的化合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳにより生成の確認を行った。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：  ｍ／ｅ  ９６１．３  （Ｍ−Ｃｌ−）＋
【実施例８】
【００６２】
（８）ニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂ［化合物７−Ｔｂ］の製造
実施例５で製造した化合物６（１６８  ｍｇ  ０．２  ｍｍｏｌ）と塩化テルビウム六水和物（１５０  ｍｇ  ０．５ｍｍｏｌ）をメタノール８０  ｍｌに加え、２４時間還流攪拌した。その後に、溶媒を減圧留去した。少量のメタノールに溶解させ、ジエチルエーテルを用いて再沈殿を行い、一晩冷蔵庫で静置させた。沈殿物を遠心分離により収集し、乾燥して目的化合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳにより生成の確認を行った。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：  ｍ／ｅ  ９９７．３  （Ｍ−Ｃｌ−）＋
【実施例９】
【００６３】
（９）アミノ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂ［化合物８−Ｔｂ］の製造
実施例８で製造した化合物７−Ｔｂ（４５  ｍｇ  ０．０５  ｍｍｏｌ），１０％  Ｐｄ／Ｃを乾燥メタノール（２０ｍｌ）に加えた。この溶液を凍結?脱気?融解を繰り返し、溶存酸素を除去した。水素雰囲気下、室温で６時間攪拌し、触媒を濾別し、溶液を減圧乾固し、目的化合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳにより生成の確認を行った。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：  ｍ／ｅ  ９６７．３  （Ｍ−Ｃｌ−）＋
【実施例１０】
【００６４】
実施例６で製造したニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕ［化合物７−Ｅｕ］、及び実施例８で製造したニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂ［化合物７−Ｔｂ］について、それぞれをメタノールに溶解し、それぞれの吸光度を測定した。［化合物７−Ｅｕ］の吸光スペクトルを図１に示し、［化合物７−Ｔｂ］の吸光スペクトルを図２に示す。これらの希土類金属錯体は、それぞれ３２８ｎｍ、３３３ｎｍに極大吸収波長を有していた。
【実施例１１】
【００６５】
実施例６で製造したニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｅｕ［化合物７−Ｅｕ］、及び実施例８で製造したニトロ−ＢＴＰＤＡ−Ｔｂ［化合物７−Ｔｂ］について、メタノール溶液中におけるそれぞれの蛍光特性を測定した。［化合物７−Ｅｕ］の励起スペクトルを図３に示し、その時間分解スペクトルを図５に示す。また、［化合物７−Ｔｂ］の励起スペクトルを図４に示し、その時間分解スペクトルを図６に示す。これらの希土類金属錯体の極大励起波長は、それぞれ３３６ｎｍ、３４０ｎｍであった。また、時間分解スペクトルを測定した結果、それぞれユウロピウム、テルビウム錯体に特有の蛍光を観測した。
【実施例１２】
【００６６】
実施例７で製造したアミノーＢＴＰＤＡ−Ｅｕ［化合物８−Ｅｕ］、及び実施例９で製造したアミノーＢＴＰＤＡ−Ｔｂ［化合物８−Ｔｂ］について、メタノール溶液中におけるそれぞれの蛍光特性を測定した。［化合物８−Ｅｕ］の励起スペクトルを図７に示し、発光スペクトルを図８に示す。また、［化合物８−Ｔｂ］の励起スペクトルを図９に示し、発光スペクトルを図１０に示す。これらの希土類蛍光錯体の極大励起波長はいずれも３６１ｎｍであり、それぞれの中心金属に特徴的な発光（Ｅｕ : ６１４ｎｍ、Ｔｂ: ５４５ｎｍ）を観測した。
この結果、本発明の希土類金属錯体は極めて優れた吸光特性、蛍光特性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、蛍光標識剤として有用な新規な希土類金属錯体、及びその配位子として有用な新規な化合物を提供するものである。本発明の希土類金属錯体は、被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）と結合基を介して結合可能であり、水溶液中で安定であり、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有するだけでなく、２種以上の希土類金属と錯体を形成することができ、さらに通常のレーザー光源が有する３４０ｎｍ以上の波長の光においても十分な蛍光発光を得ることができる。
したがって、本発明は、蛍光イムノアッセイやＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ等の蛍光イムノアッセイ、特に時間分解蛍光イムノアッセイにおいて有用な蛍光標識剤、その材料を提供するものであり、産業上の利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007026808.tif 000029
【図１０】
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【国際調査報告】
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2007026808.tif 000032
2007026808.tif 000033
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