(57)【要約】  本発明者らは、MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系のシステムを考案し、本発現系の標的細胞への目的遺伝子の導入能、目的遺伝子の標的細胞における発現能について検討を行った。その結果、本発明の発現系が、標的細胞への目的遺伝子の高い導入能、目的遺伝子の標的細胞における高い発現能を保持していることが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
（ａ）ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
（ｂ）該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程
【請求項２】
工程（a）において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子（VLP）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼＩプロモーターであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および／またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記（ａ）または（ｂ）に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、請求項１１に記載の方法。
（ａ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
（ｂ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
【請求項１３】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
in vitroにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標的細胞が、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
in vivoにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター。
【請求項２０】
外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
【請求項２１】
請求項１９に記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、および請求項２０に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
【請求項２２】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ウイルス粒子の製造方法。
（ａ）ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
（ｂ）該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法に関する。また本発明は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムに関する。さらに本発明は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子の製造方法、および当該ウイルス粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでのタンパク質発現（タンパク質生産、機能解析など）系は非ウイルスタンパク質発現系とウイルスタンパク質発現系の２種類に大別できる。非ウイルスタンパク質発現系は作製簡便、低コスト、短期間での大量調製が可能、生物安全性が高いなどの長所があるが、in vitroでの遺伝子導入効率が導入試薬や細胞種類などに大きく依存し、in vivoにおいて遺伝子導入効率が非常に低い。一方、ウイルスタンパク質発現系はin vitroとin vivoの両方において高い遺伝子導入効率が得られることが多いが、非ウイルスベクターに比べてコストが高く、調製に時間がかかり、生物安全性への配慮が必要などの短所もある。これら２種類のタンパク質発現系にはそれぞれ長所と短所があるため、より高性能な新規タンパク質発現系の開発が望まれていた。【０００３】
センダイウイルスベクター（以下SeVと標記することもある）は細胞質型のウイルスベクターであり、in vitroとin vivoの両方において遺伝子導入効率、発現効率が高いことや、in vitroでは長期持続発現が可能など優れた性能が有している。しかしながら、作製コストが高く、短期間での大量調製が困難などウイルスベクターに共通な弱点も保持している。【０００４】
一方、SeVゲノムの一部が欠失しており、増殖するためには正常ウイルスをヘルパーとして必要とし、かつ正常ウイルスの増殖を抑制（干渉）する性質を持っている干渉性欠損粒子（DI）の存在が知られている。このDI粒子の性質を利用して、外来遺伝子を搭載した人工DI（SeVミニゲノム）のcDNAプラスミドを構築し、NP,P,Lを発現するヘルパーSeV或いはヘルパープラスミドと一緒に標的細胞へ導入することにより、目的外来蛋白の発現を試みた例が報告されている（非特許文献１）。このことにより、組換えSeVベクターと比べ、よりベクターcDNAの作製が容易なミニゲノム系によるタンパク発現が可能となったが、in vivoやin vitroにおける遺伝子導入および発現効率が低く、これらの改善が求められている。
上記のことから、ウイルスベクターおよびミニゲノムを用いた発現系の双方の利点を保持した新しい発現系の開発が求められている。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Vullienoz et al, Journal of General Virology, 86:171-180, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法を提供することにある。また本発明は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムの提供を課題とする。さらに本発明は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子の製造方法、および当該ウイルス粒子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、SeVベクターの優れた性能を活かしながら、作製が簡便で、低コスト、短期間での大量調製が可能な新しいタンパク質発現系を開発するため、SeVミニゲノム（MiniSeV）系の利用を試みた。SeVミニゲノム系は、作製が簡便で、転写複製効率が高いなどの有利な特徴を有しているが、細胞内での自律的な複製に正常ウイルスあるいはNP,P,L発現プラスミドをヘルパーとして必要とするため、高発現能のベクターとして仕上げるには困難であった。【０００７】
そこで、本発明者らはMiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系（図６）のシステムを考案し、本発現系の標的細胞への目的遺伝子の導入能、目的遺伝子の標的細胞における発現能について検討を行った。まず、SeV融合タンパク質（Fタンパク質）を欠損させたSeV/ΔF、および目的遺伝子(GOI：gene of interest)を搭載したSeV ミニゲノム cDNA プラスミドを、T7RNAポリメラーゼとSeV融合タンパク質（Fタンパク質）が発現している生産細胞に導入した。その後、MiniSeV/GOI粒子とSeV/ΔF粒子が共存した培養上清を回収した。このMiniSeV/GOIとSeV/ΔF共存粒子を用いることにより、in vitroとin vivoの両方において、目的遺伝子（GOI）の標的細胞への高い導入効率、および該細胞内での高い発現効率を実現した。本発明においては、目的遺伝子（GOI）の一例としてGFPを用いた。
さらに、上記共存粒子系のSeVミニゲノムにおいてRNAポリメラーゼIプロモーターを用いた場合、又は目的遺伝子にTag配列（HA-Tag）を付加した場合にも、目的遺伝子の標的細胞への高い導入効率、および該細胞内での高い発現効率が実現されることが明らかとなった。【０００８】
即ち、本発明者らは、目的遺伝子の標的細胞への高い導入能、および目的遺伝子の標的細胞における高い発現能を保持する、MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系の構築に成功し、これにより本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔５１〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
（ａ）ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
（ｂ）該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程
〔２〕工程（a）において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子（VLP）である〔１〕に記載の方法。
〔４〕マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔５〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼＩプロモーターであることを特徴とする、〔４〕に記載の方法。
〔６〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、〔６〕に記載の方法。
〔８〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、〔６〕に記載の方法。
〔９〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および／またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記（ａ）または（ｂ）に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、〔１１〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
（ｂ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔１３〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔６〕に記載の方法。
〔１４〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである〔６〕に記載の方法。
〔１５〕生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕in vitroにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕標的細胞が、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかである、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕in vivoにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕外来遺伝子にTag配列が付加されていることを特徴とする、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕Tag配列が、HA-Tagである〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター。
〔２２〕改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔２１〕に記載のベクター。
〔２３〕P遺伝子および／またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔２１〕または〔２２〕に記載のベクター。
〔２４〕マイナス鎖一本鎖RNAが下記（ａ）または（ｂ）に記載のマイナス鎖一本鎖RNAである、〔２３〕に記載のベクター。
（ａ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
（ｂ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔２５〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子（VLP）である〔２１〕〜〔２４〕のいずれかに記載のベクター。
〔２６〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔２１〕〜〔２５〕のいずれかに記載のベクター。
〔２７〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔２６〕に記載のベクター。
〔２８〕
外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔２９〕一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔２８〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３０〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼＩプロモーターであることを特徴とする、〔２９〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３１〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔２８〕〜〔３０〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３２〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔３１〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３３〕外来遺伝子にTag配列が付加されていることを特徴とする、請求項２８〜３２のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３４〕Tag配列が、HA-Tagである請求項３３に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔３５〕〔２１〕〜〔２７〕のいずれかに記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、および〔２８〕〜〔３４〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
〔３６〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ウイルス粒子の製造方法。
（ａ）ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
（ｂ）該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
〔３７〕工程（a）において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子（VLP）である〔３６〕に記載の方法。
〔３９〕マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔３６〕に記載の方法。
〔４０〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼＩプロモーターであることを特徴とする、〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔３６〕〜〔４０〕のいずれかに記載の方法。
〔４２〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、〔４１〕に記載の方法。
〔４４〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔４３〕に記載の方法。
〔４５〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔４３〕または〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および／またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔４３〕〜〔４５〕のいずれかに記載の方法。
〔４７〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記（ａ）または（ｂ）に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、〔４６〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
（ｂ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔４８〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔４１〕に記載の方法。
〔４９〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである〔４１〕に記載の方法。
〔５０〕生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である〔３６〕〜〔４９〕のいずれかに記載の方法。
〔５１〕〔３６〕〜〔５０〕のいずれかに記載の方法において回収される、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】pSeVagp55/ΔFの構築図である。
【図２】pSeVagp55/(P/C)m/ΔFの構築図である。
【図３】SeV minigenomeのデザイン図である。（A）Single-promoter SeV minigenome; MiniSeVSP/GOI（B）Double-promoter SeV minigenome; MiniSeVDP/GOI（１）GPの第58番目の塩基CがAに変異、この変異によってSの機能が大きく下がる。（２）GPの最初12塩基の欠失によって3’-promoter機能が大きく下がる。
【図４】SeV single-promoter minigenome cDNAの構築図である。
【図５】SeV double-promoter minigenome cDNAの構築図である。
【図６】MiniSeV-SeV/ΔF粒子共存蛋白発現系の仕組みを示す図である。
【図７】Helper SeVデザインによる共存粒子生産性への影響を示す写真である。(A) Packaging Cellでの共存粒子の生産  (B) Target Cellへの共存粒子による感染
【図８】MiniSeV cDNAデザインによる共存粒子生産性への影響を示す写真および図である。(A) Packaging Cellでの共存粒子の生産  (B) 生産された共存粒子のタイター
【図９】SeVagp55/ΔFとSeVagp55/(P/C)m/ΔFを用いた共存粒子生産性の比較を示す写真および図である。(A) Packaging Cellでの共存粒子の生産  (B) Target Cellへの共存粒子による感染  (C) 生産された共存粒子のタイター
【図１０】共存粒子中MiniSeVとHelper SeVの量比改善を示す写真および図である。(A) Packaging Cellでの共存粒子の生産  (B) 生産された共存粒子のタイターとHelper SeV/MiniSeV量比
【図１１】MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子によるin vitro発現を示す写真である。
【図１２】共存粒子によるin vivo発現（鼻腔内GFP発現）を示す写真である。
【図１３】MiniSeVDP/GFP cDNAプラスミドおよびSeVagp55/ΔF感染性粒子によるタンパク質発現を示す写真である。
【図１４】RNA polymerase I promoterを用いたminigenome cDNAの構築図である。
【図１５】HA-Tag付き遺伝子（GFP）搭載minigenome cDNAの構築図である。
【図１６】RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系によるin vitro発現を示す写真である。
【図１７】HA-Tag付き遺伝子を搭載した共存粒子系によるin vitro発現を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者らは、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入し、生産細胞内でそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を標的細胞に導入することで、高い目的遺伝子の導入効率および発現効率を実現することが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。【００１２】
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法に関する。
（ａ）ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
（ｂ）該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程【００１３】
本発明において、マイナス鎖RNAウイルスとは、マイナス鎖（ウイルスタンパク質をセンスにコードする鎖と相補的なアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスのことである。マイナス鎖RNAウイルスはネガティブ鎖RNAウイルスとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型 (non-segmented) マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が好ましい。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）、ブニヤウイルス（Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）、アレナウイルス（Arenaviridae）などの科に属するウイルスが含まれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。欠損型ベクターとしては、例えばエンベロープを構成するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一つを欠損するベクターが挙げられる。具体的には、ウイルスの種類によっても異なるが、F、H、HN、G、M、M1などのエンベロープ構成タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一つを欠損するベクターが例示できる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。【００１４】
本発明において特に好適に用いられるマイナス鎖RNAウイルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(mumps virus)、麻疹ウイルス(measles virus)、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、ラブドウイルス科(rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が例示できる。本発明においてパラミクソウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。【００１５】
例えば、センダイウイルス（Sendai virus; SeV）の場合、天然のウイルスのゲノムサイズは約15,000塩基で、ネガティブ鎖は 3'の短いリーダー領域に続き、NP（ヌクレオキャプシド）、P（ホスホ）、M（マトリックス）、F（フュージョン）、HN（ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ）、およびL（ラージ）タンパク質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い5'トレイラー領域を5’端に有する。【００１６】
パラミクソウイルスの「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、およびラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ホスホ（P）タンパク質は、RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化タンパク質である。マトリックス（M）タンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から維持する機能を果たす。フュージョン（F）タンパク質は、宿主細胞への侵入にかかわる膜融合タンパク質であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパク質である。ラージタンパク質は、RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独のmRNAが転写され、タンパク質が転写される。P遺伝子からは、Pタンパク質以外に、異なるORFを利用して翻訳される非構造タンパク質（C）と、Pタンパク質mRNAを読み取り途中のRNA編集により作られるタンパク質（V）が翻訳される。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に、3'から順に、次のように表記される。また、一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L【００１７】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; およびSV-5, D13868が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。【００１８】
本発明において、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムとは、ゲノムの一部を欠失しているため、増殖するには欠失した遺伝子を相補する働きを持つヘルパーウイルスを必要とし、かつヘルパーウイルスの増殖を抑制する干渉性欠損粒子のうち、マイナス鎖RNAウイルスに由来するものをいう。【００１９】
マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムは、ゲノムRNA中に所望の外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子は特に制限はなく、天然のタンパク質全長、その部分断片（7アミノ酸以上、好ましくは8、10、または15アミノ酸以上）、またはそれらと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド等をコードするものであってよい。外来遺伝子が導入された組換えウイルスベクターは、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムのゲノムに該遺伝子をアンチセンスにコードする遺伝子を挿入することによって得られる。
ミニゲノムに搭載する遺伝子数が少ない（ゲノムサイズが短い）方が転写複製効率がよい。本発明のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム中のマイナス鎖一本鎖RNAウイルスを構成するタンパク質を全部欠失するのが最も好ましいが、複数を欠失していてもよい。【００２０】
遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムのタンパク質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムRNAの3'リーダー領域と3'端に最も近いウイルスタンパク質ORFとの間、各ウイルスタンパク質ORFの間、および/または5'端に最も近いウイルスタンパク質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、複数の遺伝子を欠失するマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムでは、その欠失領域に挿入してもよい。なお、パラミクソウイルス科ウイルスミニゲノムに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Kolakofski, D. et al., J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Roux, L. J. Virol. 1993: 67; 4822-4830）。挿入した外来遺伝子とマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。E-I-S配列を介して2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することもできる。【００２１】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムは、一つまたは複数のゲノムプロモーターを保持していてもよい。本発明において、ゲノムプロモーターは特に制限されるものではないが、一例としてRNAポリメラーゼＩプロモーターを挙げることができる。RNAポリメラーゼＩを細胞内で発現する細胞を生産細胞として用いる場合には、RNAポリメラーゼＩを外来ベクター（ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター）により供給する必要がなく、その供給分のコストが省かれる。その上で、T7系と同様に遺伝子の高い発現効率が実現できる。【００２２】
外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖（ネガティブ鎖）の3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の3'の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。外来遺伝子を高発現させるためには、外来ポリペプチドをコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3'リーダー領域と3'に最も近いウイルスタンパク質ORFとの間に挿入される。あるいは、3'に一番近いウイルスタンパク質遺伝子と2番目のウイルスタンパク質遺伝子のORFの間、または3'から２番目と３番目のウイルスタンパク質遺伝子の間に挿入してもよい。【００２３】
外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するS配列としては、例えばマイナス鎖RNAウイルスの所望のS配列を用いることができるが、センダイウイルスであれば、3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはC; V= A, C, またはG）（配列番号：２２）のコンセンサス配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：２３）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：２４）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：２５）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：２６）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：２７）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：２８）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（配列番号：２９）（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3' (配列番号：３０)）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
また、本発明の外来遺伝子には、Tag配列をコードする塩基配列を付加していてもよい。Tag配列を付加することによって、外来遺伝子の機能が不明な場合であっても、外来遺伝子の発現を確認することが可能となる。Tag配列が付加される位置は特に限定されるものではなく、外来遺伝子のアミノ末端側に付加されていてもよいし、カルボキシル末端側に付加されていてもよい。Tag配列の種類は特に限定されるものではないが、一例として、HA-Tag配列を用いることが可能である。【００２４】
本発明において、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが増殖するために、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが欠失した遺伝子を相補する働きをする、マイナス鎖RNAウイルスベクターのことを示す。
本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子（VLP）であってもよい。【００２５】
パラミクソウイルスは、一般に、エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに含まれるRNAはパラミクソウイルスのゲノムである（−）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖RNAであり、この一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質が結合し、RNPを形成している。このRNPに含まれるRNAがウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae : The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.）。【００２６】
本発明のヘルパーマイナス鎖ウイルスベクター中のマイナス鎖一本鎖RNA（ゲノムRNA）は、典型的には、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現していることが好ましいが、これに限定されない。本発明においては、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質が発現されていればよい。【００２７】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖ウイルスベクター中のマイナス鎖一本鎖RNA（ゲノムRNA）は、Fタンパク質、Mタンパク質およびまたはHNタンパク質の全部または一部を発現しないように改変されていてもよい。パラミクソウイルスのFタンパク質は宿主細胞膜への膜融合に、HNタンパク質は膜接着に関わるタンパク質である。Mタンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から維持するタンパク質である。本発明のウイルスベクターは、ゲノムRNA からF、MおよびHNタンパク質を発現しないため、粒子形成能および伝播性を有しない。すなわち本発明のウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該宿主細胞内において感染性ウイルス粒子を産生して自らが感染した細胞の隣接細胞へ娘ウイルスを侵入させることはできない。一方、本発明のウイルスベクターは感染性粒子を産生してもよい。後述するように、本発明のウイルスベクターを再構築する際にFタンパク質、Mタンパク質および/またはHNタンパク質を共発現させれば、再構築されたウイルスベクターは宿主への感染性を有する。【００２８】
本発明においては、このうち F、HN、および M 遺伝子を欠損するゲノムを設計することにより、エンベロープタンパク質を発現しないように改変することができるが、F遺伝子が欠損していることが特に好ましい。またベクターのゲノムにコードされる NP、P、およびL遺伝子は、ウイルス由来の遺伝子配列そのままでもよいが、これらの遺伝子がコードするタンパク質がゲノムRNAと結合し、細胞内でRNPの複製を行う活性を持つ限り、変異が導入されていてもよい。さらに、これらのゲノムRNAの塩基配列を含むマイナス鎖RNAがコードするポリペプチドの１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加したポリペプチドをコードするマイナス鎖一本鎖RNA、当該ゲノムRNAの塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNAも、該RNA中の遺伝子によってコードされるNP、P、およびLタンパク質がゲノムRNAと結合し、RNP複製活性を有する限り、本発明のベクターのゲノムRNAとなり得る。このような変異は、当業者によって周知の技術によって行うことができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入することや、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入することが可能である。上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、「1×SSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2×SSC、0.1% SDS、65℃」程度の洗浄液および温度条件で実施することができる。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記(-)鎖RNAがコードするポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて開発されたBLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。【００２９】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターであってもよい。5’端のトレイラー領域に存在するアンチゲノムプロモーターのゲノム転写複製効率が3’端のリーダー領域に存在するゲノムプロモーターより高いため、5’端のトレイラー領域が3’端のリーダー領域に置換されると、ヘルパーウイルスのゲノム転写複製効率が低下し、ミニゲノムとの競合が抑えられ、より高いミニゲノム蛋白発現が得られる(Le Mercier P. et al.J Virol. 2002 76(11): 5492-5502)。【００３０】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、P遺伝子および／またはC遺伝子に変異を保持していてもよい。本変異は、マイナス鎖RNAウイルスの細胞障害性を低下させる変異であってもよい。このような変異が起こる部位は特に限定されないが、SeV Pタンパク質の9番目のLys（K9）、13番目のGlu（E13）、17番目のGlu（E17）、29番目のIle（I29）、38番目のSer（S38）、39番目のGlu（E39）、41番目のThr（T41）、47番目のArg（R47）、48番目のSer（S48）、52番目のAsn（N52）、55番目のAsn（N55）、56番目のThr（T56）、58番目のGln（Q58）、SeV Cタンパク質の16番目のLeu（L16）、17番目のLys（K17）、18番目のLys（K18）、21番目のLys（K21）、22番目のLeu（L22）、25番目のArg（R25）、27番目のGln（Q27）、28番目のGlu（E28）、30番目のGlu（E30）、35番目のMet（M35）、36番目のLeu（L36）、38番目のAsp（D38）、41番目のMet（M41）、47番目のAsn（N47）、48番目のGln（Q48）、52番目のGlu（E52）、55番目のGlu（E55）、63番目のThr（T63）、66番目のLys（K66）、または68番目のGln（Q68）の他のアミノ酸への置換を、好ましい例として挙げることができる。一つの部位において変異が導入されてもよく、また複数の部位において変異が導入されていてもよい。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれば、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。具体的には、SeV Pタンパク質のK9のGlyへの置換（K9G）、E13のGlyへの置換（E13G）、E17のGlyへの置換（E17G）、I29のValへの置換（I29V）、S38のGlyへの置換（S38G）、E39のGlyへの置換（E39G）、T41のAlaへの置換（T41A）、R47のGlyへの置換（R47G）、S48のGlyへの置換（S48G）、N52のSerへの置換（N52S）、N55のGlyへの置換（N55G）、T56のAlaへの置換（T56A）、Q58のArgへの置換（Q58R）、SeV Cタンパク質のL16のTrpへの変異（L16W）、K17のGlyへの変異（K17G）、K18のArgへの変異（K18R）、K21のGlyへの変異（K21G）、L22のTrpへの変異（L22W）、R25のGlyへの変異（R25G）、Q27のArgへの変異（Q27R）、E28のGlyへの変異（E28G）、E30のGlyへの変異（E30G）、M35のThrへの変異（M35T）、L36のTrpへの変異（L36W）、D38のGlyへの変異（D38G）、M41のThrへの変異（M41T）、N47のGlyへの��異（N47G）、Q48のArgへの変異（Q48R）、E52のGlyへの変異（E53G）、E55のGlyへの変異（E55G）、T63のAlaへの変異（T63A）、K66のGlyへの変異（K66G）、またはQ68のArgへの変異（Q68R）などが例示できる。【００３１】
本発明ではLタンパク質においても変異が導入されていてもよい。Lタンパク質の変異部位としては、1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスLタンパク質の相同部位の置換が挙げられる。Lタンパク質のこれら２つの変異の両方を有するLタンパク質遺伝子が特に好ましい。アミノ酸変異は、やはり所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、N1197のSerへの置換（N1197S）、K1795のGluへの置換（K1795E）などが例示できる。【００３２】
P遺伝子とC遺伝子の変異は、両方持っていることで、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。上記のFタンパク質、HNタンパク質およびMタンパク質を発現しないように改変された組み換えマイナス鎖RNAウイルスに上記変異を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。特にP、およびC遺伝子の両方に変異を有するウイルスがより好ましい。P遺伝子に上記箇所の変異を、さらにC遺伝子に上記の変異を持つウイルスは最も好ましい。【００３３】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、下記（ａ）または（ｂ）に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含んでいてもよい。
（ａ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
（ｂ）配列番号：１０に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA【００３４】
本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1×SSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００３５】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、野生型センダイウイルスベクターであってもよい。
以下において、本発明の発現系の各工程について説明する。
本発明の発現系においては、第一の工程として、上記に記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する。
本発明においては、上記工程において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入してもよい。
本発明において、「生産細胞」として好ましくは、所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）およびCV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK-21細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。本発明において、より好ましい例としては、BHK-21細胞を挙げることができるが、特に限定されるものではない。【００３６】
マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムcDNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、(i)目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、(ii)目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、(iii)目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。【００３７】
(ii)としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、Lipofectamine 2000 (Invitrogen  Cat. No.11668-019)、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）などが挙げられる。(i)としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3) 沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。(ii)の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105 ）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。(iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で(i)や(ii)の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。【００３８】
以上、３つのカテゴリーの中で(ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、本発明においては、トランスフェクション試薬が適している。好適には Lipofectamine 2000 (Invitrogen  Cat. No.11668-019)、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169）が用いられる。
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの再構成は公知の方法により行うことができる。【００３９】
回収されたウイルスの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性(HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）。また、GFP（緑色蛍光タンパク質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。【００４０】
本発明の発現系においてT7 RNAポリメラーゼとFタンパク質（変異型F5Rであってもよい）の発現方法は特に制限されず、例えば、プラスミドなどで一時発現させる方法や、生産細胞にT7 RNAポリメラーゼとFタンパク質（F5R）持続発現する細胞を用いる方法などが挙げられる。本発明において、生産細胞は、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していてもよい。ウイルスゲノム以外から供給されるこれらのタンパク質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。他のウイルスとしては、例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質（VSV-G）を挙げることができる。一般に、エンベロープタンパク質は細胞毒性を示すものが多いため、誘導性プロモーターの制御下にベクターの再構成時にのみ発現させることもできる。【００４１】
細胞内でベクターを再構成させる時にエンベロープタンパク質を生産細胞において発現させれば、このエンベロープタンパク質がミニゲノムウイルス粒子に取り込まれ、エンベロープタンパク質による感染性を保持するウイルスベクターを生産することができる。
このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内でRNPを増殖させることはできても、それ自身はエンベロープ遺伝子を持たないため、初めと同じようなエンベロープタンパク質を持つウイルスを再度生産することはできない。このようなベクターは、特に遺伝子治療など高い安全性が要求される分野に極めて有用である。【００４２】
上記の第一の工程を行うことで、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、ウイルス再構成され、生産細胞から放出される。
具体的には、実施例（図６）に示すように、T7 RNAポリメラーゼとSeVの融合タンパク質であるFタンパク質（変異型F5Rでも可）が発現している生産細胞にヘルパーSeV/ΔF（SeVagp55/ΔFが好ましい）と目的外来遺伝子(GOI)を搭載したSeVミニゲノムcDNAプラスミド (pSeVmini/GOI)が導入されると、T7 RNAポリメラーゼの働きでMiniSeV/GOIのRNAゲノムがpSeVmini/GOIから転写され、Helperの役割を担っているSeV/ΔFから発現しているNP,P,Lタンパク質を利用してMiniSeV/GOIのRNPが形成、複製される。このMiniSeV/GOIのRNPはHelper SeV/ΔFから発現したM,HNと生産細胞から発現したF/F5Rを利用して、感染性MiniSeV/GOI粒子としてパッケージングされ、感染性Helper SeV/ΔF粒子と共に培養上清に放出される。【００４３】
本発明の発現系においては、第二の工程として、該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する。
回収したウイルス粒子（ウイルスベクター）は実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全タンパク質（但しキャリアーや安定剤として加えたタンパク質は除く）のうち、ウイルスベクターの成分として含まれるタンパク質の割合が10% (重量/重量) 以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができるが、これらに制限されない。【００４４】
本発明は、これら第一および第二の工程を含む、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子の製造方法に関する。マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムの高い導入能、目的遺伝子の高い発現能を実現するためには、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがパッケージングされたウイルス粒子の放出量を増加させる必要がある。本発明のように、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターとしてSeVagp55ΔF等の改変体を用いることによって、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがパッケージングされたウイルス粒子の放出量を向上させることができる。【００４５】
またヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターがパッケージングされたウイルス粒子の毒性（細胞障害性）を下げるためには、生産細胞から放出されるウイルス粒子の比率（ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター：マイナス鎖RNAウイルスミニゲノム）を同等にさせることが必要である（ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターに対するマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムの数が多くなることが好ましい）。本発明のように、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターとしてSeVagp55/(P/C)m/ΔF等の改変体を用いることによって、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがパッケージングされたウイルス粒子の放出割合を増加させることができる。
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターを使い分けることによって、様々な目的（導入・発現の向上、毒性の低下）を達成することができる。【００４６】
本発明の発現系においては、第三の工程として、上記の第二の工程で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する。
本発明において「標的細胞」とは、本発明のウイルス粒子を導入することにより外来遺伝子を発現させたい所望の細胞を示す。
本発明において、ウイルス粒子を導入する標的細胞は、in vitroにおける標的細胞でもよいし、in vivoにおける標的細胞（すなわち動物において直接外来遺伝子を発現させる）でもよい。in vitroにおける標的細胞としては、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかを挙げることができるが、特に限定されるものではない。【００４７】
in vitroにおいてウイルス粒子を標的細胞に導入する場合は、例えば培養液または生理食塩水など所望の生理的水溶液中で標的細胞にウイルス粒子を感染させる。この際、MOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜1000の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜500、さらに好ましくは3〜300、さらに好ましくは5〜100である。ウイルス粒子と細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば1分以上、好ましくは3分以上、5分以上、10分以上、または20分以上接触させればよく、例えば1〜60分程度、より特定すれば5分〜30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。【００４８】
ウイルスゲノムRNAを含むRNPや非感染性ウイルス粒子（ウイルス様粒子 (VLP)）を細胞に導入するには、周知のトランスフェクション方法を利用することができる。具体的には、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、DEAE-デキストラン (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリポソームベースのトランスフェクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレーション (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 および 9) など、当業者に知られる様々な技術で細胞にトランスフェクトすることが可能である。エンドソームでの分解を抑制するため、トランスフェクションにおいてクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。トランスフェクション試薬を幾つか例示すれば、DOTMA（Roche）、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300)、CalPhosTM Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051-1)、CLONfectinTM (Clontech #8020-1) などが挙げられる。エンベロープウイルスはウイルス粒子形成の際に宿主細胞由来のタンパク質を取り込むことが知られており、このようなタンパク質は、細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584）。従って、エンベロープが除去されたRNPを用いることには利点がある（WO00/70055）。【００４９】
また、本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、およびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを標的細胞に導入して、細胞内でウイルスRNPを直接形成させ、標的細胞において外来遺伝子を発現させることもできる。
本発明のウイルス粒子（またはウイルスベクター）が導入された細胞を12時間〜5日間（好ましくは1〜3日間）程度培養し、外来遺伝子を発現させる。
in vivoにおいてウイルス粒子を標的細胞に導入する場合は、本発明のウイルス粒子を直接動物に投与し、外来遺伝子を発現させる。【００５０】
上記に記載の本発明のウイルス粒子が感染した（導入された）細胞を、動物に投与（ex vivo投与）してもよい。細胞は、そのまま、あるいは溶解してライセート（溶解物）として動物に接種する。ベクター感染細胞のライセートは界面活性剤で細胞膜を溶解する方法、凍結・融解をくり返す方法などで作製することができる。界面活性剤としては非イオン性のTriton X-100、Nonidet P-40などが0.1〜1%の濃度で用いられる。例えばPBSで洗浄したあと遠心によって回収した細胞塊をTNE buffer [25mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40]に再懸濁し氷上で１０から３０分間放置することで得られる。抗原として使用するタンパクが細胞質に可溶性である場合は得られたライセートを遠心（10,000 x g, 10分）して不要な不溶性画分を沈澱として除去した後の上清を免疫に用いることができる。界面活性剤を用いることが望ましくない投与部位に使用するライセートは洗浄後PBSに再懸濁した細胞を５-６回にわたってくり返し凍結・融解して破壊することで得られる。【００５１】
接種ルートに特に制限はないが、例えば筋注（例えば腓腹筋）、皮下投与、鼻腔内投与（点鼻）、手掌または足蹠皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好適である。接種部位は、一箇所または複数箇所（例えば2〜15箇所）であってよい。また、接種量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与の際には、接種対象動物、接種部位、接種回数などを適宜調整してよい。例えば、一箇所当たりの接種量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜 5×1011 CIU (cell infectious unit)、好ましくは1×106 CIU 〜 1×1010 CIU とするとよい。細胞を介して接種（ex vivo投与）する場合は、例えば同種の培養細胞株（例えばサルコーマ細胞株）に本発明のウイルスを感染させ、104〜109細胞、好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。【００５２】
例えば、ヒトにおいては１回当たりの投与量は 2×105 CIU〜 2×1010 CIUが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造されたタンパク質製剤であれば、タンパク質の投与量は例えば、10ng/kgから100μg/kg、好ましくは100ng/kgから50μg/kg、より好ましくは1μg/kgから5μg/kgの範囲であるとよい。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。【００５３】
本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、マイナス鎖RNAウイルスミニゲノム、これらがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子、該ウイルス粒子が導入された細胞、またはそのライセートは、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わされて使用されてもよい。
薬理学的に許容される所望の担体または媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。【００５４】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。【００５５】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。【００５６】
本発明おいては、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート20，40，60又は80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート20及び80が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート２０又はポリソルベート80の場合では、一般には0.001〜100 mg／mLであり、好ましくは0.003〜50 mg／mLであり、さらに好ましくは0.005〜2 mg／mLである。【００５７】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等  他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。【００５８】
また、本発明においては、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等のタンパク質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。【００５９】
本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のN-アセチルトリプトファンを使用することもできる。【００６０】
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。【００６１】
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。【００６２】
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される薬理学的に許容される所望の担体または媒体は、使用方法に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。【００６３】
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルス粒子を調製すれば、このウイルス粒子を投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。本発明のウイルス粒子の遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、タンパク質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。【００６４】
外来遺伝子として、感染症に関する細菌またはウイルスの抗原をコードする遺伝子を用いれば、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導することができる。即ち、ワクチンとして利用することができる。
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対し本発明のウイルス粒子を適用することが考えられる。例えば腫瘍治療としては、腫瘍細胞、またはDC細胞などの抗原提示細胞（APC）に本発明のベクターを用いて治療効果を有する遺伝子を発現させることができる。このような遺伝子としては、癌抗原 Muc-1 または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、メラノーマ gp100抗原などが挙げられる。このような遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i）IL-2と一本鎖IL-12 との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、ii）IL-2とインターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、iii）単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF）、iv）脳腫瘍を治療対象とした GM-CSF と IL-4 の組み合わせ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）などが挙げられる。【００６５】
感染症の治療としては、インフルエンザにおいては、例えば強毒株 H5N1 型エンベロープ、日本脳炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)）、エイズにおいては、例えばHIV gagまたは SIV gag タンパク質（J. Immunology (2000) vol. 164, 4968-4978）、HIVエンベロープタンパク質の経口投与によるワクチン治療、ポリ乳酸-グリコール共重合体に包んでの投与（Kaneko, H. et al., Virology 267: 8-16 (2000)）、コレラにおいては、例えばコレラ毒素のBサブユニット（CTB）（Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292-7）、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイルスの糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949-52）、子宮頚癌においては、ヒトパピローマウイルス6型のカプシドタンパクL1（J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)）などが挙げられる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ヘルパーSeVのcDNA構築
1.1  pSeVagp55/ΔFの構築
図１に示したように、先ず、pSeV(TDK)を制限酵素Kas IとFse Iで処理、精製したSeV トレイラー配列(genome 5’ promoter)を含む断片をTemplateとして、Primer agp55-1F (5’-caggtttgaggatattatacatag, 24 mer（配列番号：１）)とagp55-1R (5’-caggattttagtttttcttactattgtc, 28 mer（配列番号：２）)を用いたPCRでFragment 1が得られ、Primer agp55-3F (5’- ctcttgtttggtgggtcggcatggcatctc, 30 mer（配列番号：３）)とagp55-3R (5’- ttagctcactcattaggcaccccag, 25 mer（配列番号：４）)を用いたPCRでFragment 3が得られた。また、pSeV(TDK)を制限酵素Kas IとNot Iで処理、精製したSeV Leader配列(genome 3’ promoter)を含む断片をTemplateとして、Primer agp55-2F (5’-gtaagaaaaactaaaatcctgtataacttc, 30 mer（配列番号：５）)とagp55-2R (5’-gccgacccaccaaacaagagaaaaaacatg, 30 mer（配列番号：６）)を用いたPCRでFragment 2が得られた。次に、Fragment 1, 2, 3をTemplateとして、Primer agp55-1Fとagp55-3Rを用いたPCRでSac IIとMlu I制限酵素サイトを含む断片が得られた。最後に、この断片をSac IIとMlu Iで処理、精製した後、同様にSac IIとMlu Iで処理して、SeV トレイラー配列を含む断片を取り除いたpSeV/ΔFベクターにインサートとして挿入し、pSeVagp55/ΔF（配列番号：７）が得られた。上記において、agp55とはLeader-Leaderタイプ（TrailerをLeaderに入れ替えたもの）であることを、ΔFはF遺伝子が欠損していることを示す。【００６７】
1.2  pSeVagp55/(P/C)m/ΔFの構築
図２に示したように、SeV/4C(-)/wを限外希釈法でウイルスクローニングを行い、各クローンからRNA genomeを抽出し、RT-PCRを行い、ゲノム配列を調べたところ、P/C遺伝子に多数の変異があるクローン4が得られた。このクローン4のRNA genomeをTemplateとして、Primer SeVF619 (5’-atgggtatcctgcatgcctaggag, 24 mer（配列番号：８）)とSeVR2111 (5’-atcgattatcttgggtcgacg, 21 mer（配列番号：９）)を用いたPCRで両端にSph I とSal I制限酵素サイトを持つ断片（配列番号：１０）が得られた。この断片をSph I とSal Iで処理、精製し、インサートとして、pSeVagp55/ΔFベクターに対応する両端にSph I とSal I制限酵素サイトを含む配列と入れ替え、pSeVagp55/(P/C)m/ΔFが得られた。上記において、(P/C)m とはP遺伝子および／またはC遺伝子に変異が導入されていることを示す。pSeVagp55/(P/C)m/ΔFの全長配列を配列番号：１１に示す。【００６８】
〔実施例２〕  Helper SeV の調製（SeV/ΔF, SeVagp55/ΔF, SeVagp55/(P/C)m/ΔF）
2.1  準備
1) 細胞：前日〜8e5 BHK-21 cells/well (6-well plate)
2) 20％FBS/opti-MEM [Cat No. 31985-070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S無添加)
3) opti-MEM （原液）【００６９】
2.2  Transfection溶液準備
1) DNA溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液)                                     250 μL
pCAGGS-NP (Z) , 1 μg/ μL                              0.5 μL
pCAGGS-P (Z)/4C(-) , 1 μg/ μL                       0.5 μL
pCAGGS-L (TDK), 1 μg/ μL                            2.0 μL
pCAGGS-F5R, 1 μg/ μL                                  0.5 μL
pCAGGS-T7, 1 μg/ μL                                    0.5 μL
SeV cDNA, 1 μg/ μL                                          5 μL
2) LipofectAMINE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen社] 溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液)                               250 μL
LipofectAMINE2000                                      18 μL
3) 2)の溶液を準備した5分後に、1)の溶液と混合、RTで20-30分置く。【００７０】
2.3  opti-MEM ( 原液)で1回洗浄、0.5 mL/wellの20％FBS/opti-MEMを添加した後、上記Transfection溶液を0.5 mL/well細胞へ添加する。【００７１】
2.4  37℃で6h後、1 mL/well 10%FBS/G-MEMを添加する。翌日、VP-SFMで１回洗浄した後、5 μg/mL Trypsin/VP-SFMを加えて培養する。３日目の上清（P0ウイルス溶液）を回収し、新鮮のLLC-MK2/F/Ad細胞へ感染する（P0からP1へウイルス継代）。以後、LLC-MK2/F/Ad細胞を用いてウイルスを生産する。P1以後の上清をCIU Assayでウイルスのタイターを調べる。【００７２】
〔実施例３〕  SeV minigenomeのデザインとcDNA構築
3.1  SeV minigenomeのデザイン
図３に示したように、通常のSingle-promoter (GP)を有するSeVminiSP/GOIとDouble-promoter (GP58A-GPd12)を有するSeVminiDP/GOI、２種類のMinigenomeをデザインした。（参考文献：Nature of a paramyxovirus replication promoter influences a nearby transcription signal, Diane Vullienoz et al, Journal of General Virology, p171-180, v86, 2005）【００７３】
3.2  SeV single-promoter (SP) minigenome cDNAの構築
図４Aに示したように、市販GFPプラスミドをTemplateとして、Primer Not I-GFP-N (5’- agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer（配列番号：１２）)とGFP-Sac II-C (5’- caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg, 65 mer（配列番号：１３）)を用いたPCRで得られたNot I-GFP-Sac II断片をNot IとSac IIで処理、精製し、GFPインサートとして、同様にNot IとSac IIで処理、NP,P,L,M,F,HN配列を含む断片を除いたpSeV(TDK)ベクター（Not IとSac IIサイトを含む。437〜670位はMiniSeVゲノム配列を示す。配列番号：１４、特開2002-272465）に挿入し、pMiniSeVSP/GFPが得られた。
MiniSeVSP/GFPゲノム配列を配列番号：１５に示す。なお、1〜137位および858〜996位はMiniSeVゲノム配列、138〜857位は搭載したGFPのORF配列を示す。
図４Bに示したように、GFP以外の他の目的遺伝子（GOI）を搭載したSeV minigenome cDNAを構築する場合、Primer Not I-GOI-NとGOI-Sac II-Cを用いたPCRでGOIの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付け、pMiniSeVSP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることで簡単に作製できる。
Primer Not I-GOI-Nの配列は「5’-agttcacgcggccgcagatcttcacg（配列番号：１６）+GOI ORFのStart コドンを含む最初の18〜24 sense配列」になるよう、またPrimer GOI-Sac II-Cは「5’-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa（配列番号：１７）+リンカー+GOI-ORFのStopコドンを含む最後の18〜24 antisense配列、リンカーが0〜2塩基でゲノム総塩基数が6の倍数になるよう調整する」になるよう設計する。【００７４】
3.3  SeV Double-promoter (DP) minigenome cDNAの構築
図５Aに示したように、pMiniSeVSP/GFPをTemplateとしてPrimer 224N (5’- ataccgcatcaggcgccattcg, 22 mer（配列番号：１８）)と(GP58A-GPd12)R (5’- gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, 57 mer（配列番号：１９）)を用いたPCRで得られた断片と、Primer (GP58A-GPd12)F (5’- ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer（配列番号：２０）)とGFP-Sac II-C (配列上記参照)を用いたPCRで得られた断片を精製した後、Templateとして、Primer 224N とGFP-Sac II-C を用いたPCRで得られた断片をKas IとSal Iで処理、精製し、インサートとして、同様にKas IとSal Iで処理してSingle-promoterを含む配列を除いたpMiniSeVSP/GFPベクターに挿入し、pMiniSeVDP/GFPが得られた。pMiniSeVDP/GFPの配列を、配列番号：２１に示す。なお、437〜1516位はMiniSeVゲノム配列、そのうち658〜1377位は搭載したGFPのORF配列を示す。
図５Bに示したように、GFP以外の他の目的遺伝子（GOI）を搭載したSeV minigenome cDNAを構築する場合、Primer Not I-GOI-NとGOI-Sac II-C（設計方法は上記参照）を用いたPCRでGOIの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付け、pMiniSeVDP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることで簡単に作製できる。【００７５】
〔実施例４〕  MiniSeV-SeV/ΔF粒子共存タンパク質発現系の仕組み
図６に示したように、T7 RNAポリメラーゼとSeVの融合タンパク質であるFタンパク質（変異型F5Rでも可）が発現している生産細胞にHelper SeV/ΔF（SeVagp55/ΔFが好ましい）と目的遺伝子(GOI)を搭載したSeV ミニゲノムcDNAプラスミド (pSeVmini/GOI)が導入されると、T7 RNAポリメラーゼの働きでMiniSeV/GOIのRNA geonomeがpSeVmini/GOIから転写され、ヘルパーの役割を担っているSeV/ΔFから発現しているNP,P,Lタンパク質を利用してMiniSeV/GOIのRNPが形成、複製される。生産細胞はBHK-21細胞が好ましいが、それに限らない。T7 RNAポリメラーゼとF/F5Rの発現方法は特に制限されず、例えば、プラスミドなどで一時発現させる方法やT7 RNAポリメラーゼとF/F5R持続発現細胞を用いる方法などが挙げられる。T7 RNAポリメラーゼとF/F5R両蛋白持続発現細胞が好ましいが、どちらかを単独発現する細胞でもよい。このMiniSeV/GOIのRNPはHelper SeV/ΔFから発現したM,HNと生産細胞から発現したF/F5Rを利用して、感染性MiniSeV/GOI粒子として包装され、感染性Helper SeV/ΔF粒子と共に培養上清に放出される。この感染性MiniSeV/GOIとHelper SeV/ΔF粒子が共存した培養上清を回収し、目的細胞へ感染すると、Helper SeV/ΔFの転写複製システム（NP,P,Lタンパク質）を利用してMiniSeV/GOIに搭載した目的遺伝子GOIが発現される。
Helper SeVはここでSeV/ΔFを例として示したが、それに限らず、SeVの構成タンパク質NP,P,L,M,F,HNの任意一つ或いは複数を欠損したタイプでもよいが、それら欠損したタンパク質が生産細胞から別途発現する必要がある。【００７６】
〔実施例５〕  Helper SeV/ΔFデザインによるMiniSeV-SeV/ΔF共存粒子生産性への影響
前日、3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad（T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へSeV/ΔFとSeVagp55/ΔF（SeVゲノムの5'側55塩基配列を3'側55塩基のanitisense配列に換えたLeader/Leaderタイプ）をmoi 10で感染1h後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とpMiniSeVSP/GFP (2μg/well)を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg）。培養(10%FBS/G-MEM培地)２日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、４日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図７A)。上記回収した培養上清を100μL/wellでLLC-MK2細胞（6-well plate）へ感染し、２日目GFP写真を撮影した(図７B)。
図７Aに示したように、SeVagp55/ΔFをHelper SeVとした場合の方が、通常のSeV/ΔFと比べて、ミニゲノムによるタンパク質の発現効率（GFP発現細胞の割合）が高かった。また、図７Bに示したGFP発現細胞数は生産された共存粒子中のMiniSeVの量を表しているが、SeVagp55/ΔFを用いた共存粒子の生産性がSeV/ΔFよりはるかに高かった。【００７７】
〔実施例６〕  MiniSeV cDNAデザインによるMiniSeV-SeV/ΔF共存粒子生産性への影響
前日、3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad（T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へSeVagp55/ΔFをmoi 10で感染1h後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とMinigenome cDNA (2μg/well)を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg）。ここでMiniSeV cDNAとしては、pMiniSeVSP/GFP、pMiniSeVDP/GFPの２種類を用いた。培養(10%FBS/G-MEM培地)２日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、5μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、４日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図８A)。上記回収した培養上清を用いて、CIU Assayを行った(図８B)。具体的には、サンプルを10倍ずつ希釈し、100μL/wellで6-well plateのLLC-MK2細胞へ1ｈ感染させた後、無血清培地で培養して２日目に、GFP発現細胞数をカウントし、MiniSeVタイターとして計測した。また、Anti-SeV抗体DN2を用いて抗体染色を行い、DN2-positive細胞数をカウントし、ヘルパーSeVタイターとして計測した。
図８に示したようにSPとDPデザイン両方において高いGFP発現効率が得られたが、DPデザインにおいて、より高いMiniSeV生産性（GFP-CIU）および低いヘルパー SeV/MiniSeV量比が得られた。【００７８】
〔実施例７〕  SeVagp55/ΔFとSeVagp55/(P/C)m/ΔFを用いた共存粒子生産性の比較
前日3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad（T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へSeVagp55/ΔFとSeVagp55/(P/C)m/ΔFをmoi 1, 3, 10で1h感染させた後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とpMiniSeVDP/GFP (2μg/well)を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg）。培養(10%FBS/G-MEM培地)２日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、４日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図９A)。上記回収した培養上清を100μL/wellでLLC-MK2細胞（6-well plate）へ感染し、２日目にGFP写真を撮影した(図９B)。また、上記回収した培養上清を用いて、CIU Assayを行った(図９C)。
図９に示したように、SeVagp55/ΔFをHelper SeVとして共存粒子を生産した場合、より高いMiniSeV生産性が得られたが、Helper SeV/MiniSeVの量比（〜10倍）も高かった。一方、SeVagp55/(P/C)m/ΔFを用いて共存粒子を生産した場合は、比較的低いMiniSeV生産性であったが、Helper SeV/MiniSeVの量比（約１：１）が非常に低かった。目的によってこの２種類Helper SeVを使い分けることが可能である。【００７９】
〔実施例８〕Helper SeV/MiniSeV量比の改善
前日8e5 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 0.5, 1, 2で1h感染させた後、「pCAGGS/T7 (1μg/well)、pCAGGS/F5R (４μg/well)およびpMiniSeVDP/GFP (５μg/well)」或いは「pCAGGS/NP,P,L (0.5,0.5,2μg/well)、pCAGGS/T7 (1μg/well)、pCAGGS/F5R (４μg/well)およびpMiniSeVDP/GFP (５μg/well)」を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μl/μg）。また、上記２条件プラスミドを導入した６時間後のBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 0.5, 1, 2で感染を行った。培養(10%FBS/G-MEM培地)１日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、３日目GFP写真を撮影し(図１０A)、培養上清を回収した。上記回収した培養上清を用いてCIU Assayを行った(図１０B)。
図１０に示したように、MiniSeV cDNAを導入する時にNP,P,L発現するプラスミドを一緒に導入すると、生産された共存粒子中のMiniSeVの量に大きな変化はなかったが、Helper SeV/MiniSeVの量比が低下する傾向が見られた。【００８０】
〔実施例９〕共存粒子によるin vitro発現
24-well collagen-coated plateで〜90％コンフルエントになるよう培養した293T, A549, BHK-21, C2C12, HeLa, LLC-MK2, MDCK, NIH3T3細胞へMiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子（2e6 GFP-CIU/mL, 7.7e6 DN2-CIU/mL）をMOI3で感染させた後、32℃で培養した。２日目にGFP写真を撮影した(図１１)。
図１１に示したように、MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子によって、検討した８種類細胞のすべてにおいて高いGFP導入、発現効率が得られた。【００８１】
〔実施例１０〕共存粒子によるin vivo発現
MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子を用いて（5e6 GFP-CIU/head）マウス(n=3)への鼻腔内投与を行った。コントロールとして同量SeV18+GFP/ΔFを投与した。２日目解剖、鼻腔を摘出し、GFP写真を撮影した（図１２）。
図１２に示したように、MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子を用いて高いin vivo発現（鼻腔内GFP発現）が得られた。【００８２】
〔実施例１１〕
12-well collagen-coated plateで〜90％コンフルエントになるよう培養したBHK-21, HeLa細胞へHelper-SeVとしてのSeVagp55/T7/ΔF感染性粒子をmoi20で1h感染させた後、MiniSeVDP/GFP cDNA plasmidをLipofectamine 2000試薬 [Lipofectamine 2000/DNA=2.0 (μL/μg), 2 μg DNA/well]で導入し、２日目でGFP写真を撮影した(図１３)。
図１３に示すように、MiniSeVDP/GFPのcDNA プラスミドとSeVagp55/T7/ΔF感染性粒子を標的細胞へ導入することによって、高いミニゲノム蛋白発現効率が得られた。【００８３】
〔実施例１2〕RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系
SeVベクターはT7 promoterを用いているため、ウイルスを再構築する時にT7 polymeraseを供給する必要がある。上記実施例における共存粒子生産の際にも、minigenome cDNAを生産細胞へ導入すると同時にT7 polymerase発現プラスミドも一緒に導入する方法、又はT7 polymerase遺伝子を搭載したHelper-SeVを使用する方法によって、T7 polymeraseを供給しなければならない。前者の方法の場合、導入するプラスミドの種類が多く、生産コストと生産効率においてマイナス影響を与える恐れがある。また、後者の方法の場合、Helper-SeVがT7 polymeraseを、MiniSeVに搭載した目的遺伝子（GOI）と常に同時に発現するため、蛋白機能の解析にマイナス影響を与える可能性がある。これら問題を回避するため、T7 promoterの代わりにRNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系を検討した。【００８４】
12.1  RNA polymerase I promoterを用いたminigenome cDNA plasmidの構築
図14に示したように、pMpolBDV plasmidをTemplateとして、Primer Apa I/polmPr-F (5’-gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag, 33mer (配列番号：３１))とpolmPr/GP-R (5’- ctcttgtttggtacctatctccaggtccaatagg, 34mer（配列番号：３２）)を用いたPCRでApa I-polmPr Fragmentが得られた。また、pMiniSeVDP/GFPをTemplateとして、Primer polmPr/GP-F (5’- gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac, 34mer (配列番号：３３))とMiniDP/Not I-R (5’- gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27mer (配列番号：３４))を用いたPCRでDP-Not I Fragmentが得られた。次に、Apa I-polmPr FragmentとDP-Not I FragmentをTemplateとして、Primer Apa I/polmPr-FとMiniDP/Not I-Rを用いたPCRで得られたApa I-polmDP-Not I Fragmentを、Apa I/Not Iによって処理し、精製した。精製後の断片を、同様にApa I/Not I処理し、Apa IからNot Iまでの断片を取り除いたpMiniSeVDP/GFPに挿入し、pMiniSeVDPpolm/GFPを得た。【００８５】
GFP遺伝子のサイズは0.7kbで比較的に短く、より長いサイズの遺伝子の共存粒子生産性を検討するため、GFPとLuciferaseの融合蛋白（GFP-Luci, 2.3kb）をモデルとして構築した。図14に示したように、pMiniSeVDP/GFPをTemplateとして、Primer GFP-Not I-F (5’- atatgcggccgcaatggtgagcaagggcgaggag, 34mer (配列番号：３５))とGFP-Luci3m-R (5’- tggcgtcttccttgtacagctcgtccatgccg, 32mer (配列番号：３６))を用いたPCRでNot I-GFP Fragmentが得られた。また、pSeV18+Luci3m/ΔFをTemplateとして、Primer GFP-Luci3m-F (5’- acgagctgtacaaggaagacgccaaaaacataaag, 35mer (配列番号：３７))とLuci3m-Not I-R (5’- atatgcggccgcttacacggcgatctttccgc, 32mer (配列番号：３８))を用いたPCRでLuci3m-Not I Fragmentが得られた。次に、Not I-GFP FragmentとLuci3m-Not I FragmentをTemplateとして、Primer GFP-Not I/Luci3m-Not Iを用いたoverlap PCRで得られたNot I-GFP-Luci-Not I FragmentをNot I処理し、インサートとして調製した。pMiniSeVDPpolm/GFPをTemplateとして、Primer MiniDP/Not I-F (5’- tcacgcggccgctagtccctatcgtgcagaacg, 33mer (配列番号：３９))とMiniDP/Not I-R (5’- gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27mer (配列番号：４０))を用いたPCRで得られたNot I-MiniSeVDPpolm-Not I FragmentをNot I処理し、ベクターとして調製した。さらに、GFP-Luciインサート(2384nt (配列番号：４１))をMiniSeVDPベクターに挿入し、pMiniSeVDPpolm/GFP-Luciを得た。【００８６】
12.2  RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子の生産
前日1e6 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 10で1h感染させた後、「pCAGGS/F5R (５μg/well)およびpMiniSeVDPpolm/GFP (５μg/well)」を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μl/μg）。また、「pCAGGS/NP,P,L (0.5,0.5,2μg/well)、pCAGGS/F5R (４μg/well)およびpMiniSeVDPpolm/GFP-Luci (５μg/well)」を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5μl/μg）翌日にSeVagp55/ΔFをmoi 10で感染を行った。培養(10%FBS/G-MEM培地)１日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、3μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、以後毎日培地交換及びGFP写真を撮影し、Day 4培養上清を用いてCIU Assayを行った(図１6)。
図１６に示したように、サイズが短い遺伝子（GFP, 0.7kb）と長い遺伝子（GFP-Luci, 2.3kb）の両方において、1e7 GFP-CIU/ml以上のMiniSeVを含む共存粒子が生産され、RNA polymerase I promoterを用いても共存粒子の高い生産性が得られることを確認した。【００８７】
〔実施例１3〕HA-Tag付き遺伝子を搭載した共存粒子系
GFPなどマーカー遺伝子や免疫染色可能な抗体をコードする遺伝子を、本発明の共存粒子系に搭載した場合には、共存粒子中のMiniSeVのタイターを容易に測定することができる。しかしながら、性能不明な遺伝子を搭載した場合又は免疫染色可能な抗体をコードする遺伝子を搭載しない場合には、共存粒子中のMiniSeVのタイターを測定するのは困難である。この問題を解決するため、HA-Tag付きの遺伝子（GFP）を搭載した共存粒子系を検討した。【００８８】
13.1  HA-Tag付き遺伝子(GFP)搭載minigenome cDNAの構築
図15に示したように、GFPのN末端にHA-Tagを付けるため、minigenome cDNAの構築を行った。まず、GFP搭載プラスミドをTemplateとして、Primer HA-GFP-Not I-F (5’- atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg, 63mer (配列番号：４２))とGFP-Not I-R2 (5’- tatgcggccgcttacttgtacagctcgtccatg, 33mer (配列番号：４３))を用いたPCRでNot I-HA-GFP-Not I Fragmentが得られた。また、同じTemplateで、Primer GFP-Not I-F (上記実施例12参照)とGFP-HA-Not I-R (5’- tatgcggccgcttaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacttgtacagctcgtccatgccg, 63mer (配列番号：４４))を用いたPCRでNot I-GFP-HA-Not I Fragmentが得られた。この２種類Fragment (Not I-HA-GFP-Not IとNot I-GFP-HA-Not I)をNot I処理し、インサートとして同じNot I処理した上記実施例１２で得られたNot I-MiniSeVDPpolm-Not I Fragmentへ挿入し、pMiniSeVDPpolm/HA-GFPとpMiniSeVDPpolm/GFP-HAを得た。【００８９】
13.2  HA-Tag付き遺伝子(GFP)を搭載した共存粒子の生産
前日1e6 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 10で1h感染させた後、「pCAGGS/F5R (５μg/well) + pMiniSeVDPpolm/GFP (５μg/well) or pMiniSeVDPpolm/HA-GFP (５μg/well) or pMiniSeVDPpolm/GFP-HA (５μg/well)」を導入した（導入試薬：Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5μl/μg）。培養(10%FBS/G-MEM培地)１日目、無血清培地VP-SFMで１回洗浄した後、3μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、以後毎日培地交換及びGFP写真を撮影し、Day 4培養上清を用いてCIU Assayを行った（図17）。また、Rabbit Anti-HA-Tag抗体を一次抗体、Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG抗体を二次抗体として、共存粒子で感染したLLC-MK2細胞を免疫染色した（図17）。
図１７-Aに示したように、N末端或はC末端にHA-Tag付きGFPを搭載した場合、コントロール（HA-TagなしGFP搭載）と同レベルの共存粒子が生産された。また、図１７-Bに示したように、HA-Tag抗体を用いた蛍光抗体染色で、HA-Tag付き遺伝子(GFP)を搭載した共存粒子に感染された細胞を特異的に染色できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明者らが開発したMiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系は、従来のウイルスベクターの「遺伝子導入効率・発現効率が高い」という利点、および非ウイルスベクターの「作製簡便、短期大量調製容易、低コスト」という利点を併せて保持している。すなわち、本発明の発現系は、従来の非ウイルスベクターおよびウイルスベクター双方の利点を持ち合わせているため、有用なタンパク質の生産、抗体作製、タンパク質機能解析、遺伝子治療、遺伝子ワクチンなど幅広い分野への応用が期待される。【００９１】
また、ヘルパーウイルスベクターにタンパク質欠損タイプを用いた場合には、共存粒子を標的細胞に感染させた後、再び感染性粒子が放出する恐れがなく、生物安全性の面で優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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