(57)【要約】本発明の目的は、いわゆるキャッピング工程において、５’位水酸基を効率的にアシル化する方法を提供することにある。次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体の各リボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体の製造方法。2007097446.tif 000060
2007097446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体の製造方法。
【化１】
2007097446.tif 000037
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各Ｂｘは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。ｎは、１〜２００の範囲内にある整数を表す。各Ｑは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表す。各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３は、それぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル又はハロゲンを表す。Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄは、それぞれ同一又は異なって、アルキルを表す。Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄは、それぞれ同一又は異なって、Ｈ又はアルキルを表す。
各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
【化２】
2007097446.tif 000038
式（３）中、ＷＧ１は、電子吸引性基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
【化３】
2007097446.tif 000039
式（４）中、Ｅ１は、単結合又は次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化４】
2007097446.tif 000040
式（５）中、Ｑ、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
【請求項２】
ピリジン誘導体（１１ｂ）が２−ジメチルアミノピリジンである、請求項１に記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）がフェノキシ酢酸無水物である、請求項１に記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
ＷＧ１がシアノである、請求項１に記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
さらに、ピリジン又は２，６−ルチジンを用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴ核酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
下記工程を含む、次の一般式（Ａ）で表されるオリゴ核酸の製造方法。
【化５】
2007097446.tif 000041
式（Ａ）中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。ｎは、１〜２００の範囲内にある整数を表す。各Ｑは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表す。各Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ又はアルコキシアルキルオキシを表す。Ｚは、Ｈ、リン酸基又はチオリン酸基を表す。
工程：
次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
【化６】
2007097446.tif 000042
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各Ｑは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎは前記と同義である。各Ｂｘは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３は、それぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル又はハロゲンを表す。Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄは、それぞれ同一又は異なって、アルキルを表す。Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄは、それぞれ同一又は異なって、Ｈ又はアルキルを表す。
各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
【化７】
2007097446.tif 000043
式（３）中、ＷＧ１は、電子吸引性基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
【化８】
2007097446.tif 000044
式（４）中、Ｅ１は、単結合又は次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化９】
2007097446.tif 000045
式（５）中、Ｑ、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
【請求項７】
ピリジン誘導体（１１ｂ）が２−ジメチルアミノピリジンである、請求項６に記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項８】
フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）がフェノキシ酢酸無水物である、請求項６に記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項９】
ＷＧ１がシアノである、請求項６に記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項１０】
さらに、ピリジン又は２，６−ルチジンを用いることを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項１１】
下記工程Ａ〜Ｈを含む、次の一般式（Ａ）で表されるオリゴ核酸の製造方法。
【化１０】
2007097446.tif 000046
式（Ａ）中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。ｎは、１〜２００の範囲内にある整数を表す。各Ｑは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表す。各Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ又はアルコキシアルキルオキシを表す。Ｚは、Ｈ、リン酸基又はチオリン酸基を表す。
工程Ａ：
次の一般式（１）で表されるオリゴ核酸誘導体に酸を作用させることによって、５’位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
【化１１】
2007097446.tif 000047
式（１）及び（２）中、各Ｑは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎは前記と同義である。各Ｂｘは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。Ｒ１は、次の一般式（１０）で表される置換基を表す。
【化１２】
2007097446.tif 000048
式（１０）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
【化１３】
2007097446.tif 000049
式（３）中、ＷＧ１は、電子吸引性基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
【化１４】
2007097446.tif 000050
式（４）中、Ｅ１は、単結合又は次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化１５】
2007097446.tif 000051
式（５）中、Ｑ、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
工程Ｂ：
工程Ａにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２）に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を縮合させ、次の一般式（９）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
【化１６】
2007097446.tif 000052
式（２）及び（９）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ１、Ｔは、前記と同義である。
工程Ｃ：
工程Ｂにおいて未反応であるオリゴ核酸誘導体（２）のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
【化１７】
2007097446.tif 000053
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｔは、前記と同義である。Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３は、それぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル又はハロゲンを表す。Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄは、それぞれ同一又は異なって、アルキルを表す。Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄは、それぞれ同一又は異なって、Ｈ又はアルキルを表す。
工程Ｄ：
工程Ｂにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（９）に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程、
【化１８】
2007097446.tif 000054
式（９）及び（１３）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ１、Ｔは、前記と同義である。
工程Ｅ：
工程Ｄにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１３）を固相担体から切り出し、各核酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程、
【化１９】
2007097446.tif 000055
式（１３）及び（１４）中、各Ｂ、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２、Ｚは、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｔ、Ｚは、前記と同義である。
工程Ｆ：
工程Ｅにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１４）に、各リボースの２’位水酸基の保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（１５）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
【化２０】
2007097446.tif 000056
式（１４）及び（１５）中、各Ｂ、各Ｑ、各Ｒ、各Ｒ４は、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｒ１、Ｚは、前記と同義である。
工程Ｇ：
工程Ｆにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１５）の５’位の水酸基を脱離する工程、
【化２１】
2007097446.tif 000057
式（１５）及び（Ａ）中、各Ｂ、各Ｑ、各Ｒは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｒ１、Ｚは、前記と同義である。工程Ｈ：
工程Ｇにおいて製造されるオリゴ核酸（Ａ）を分離精製する工程。
【請求項１２】
工程Ｂにおいて、少なくとも１つは、核酸モノマー化合物として次の一般式（Ｂ）で表される化合物を用いることを特徴とする、請求項１１に記載のオリゴ核酸の製法。
【化２２】
2007097446.tif 000058
式（Ｂ）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。
Ｒ１は、次の一般式（１０）で表される置換基を表す。
【化２３】
2007097446.tif 000059
式（１０）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ１、ＷＧ２は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。
【請求項１３】
工程Ａ〜Ｄを繰り返すことにより所望の鎖長のオリゴ核酸を製造する、請求項１１又は１２のいずれかに記載のオリゴ核酸の製法。
【請求項１４】
ピリジン誘導体（１１ｂ）が２−ジメチルアミノピリジンである、請求項１１〜１３のいずれかに記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項１５】
フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）がフェノキシ酢酸無水物である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項１６】
ＷＧ１がシアノである、請求項１１〜１３のいずれかに記載のオリゴ核酸の製造方法。
【請求項１７】
さらに、ピリジン又は２，６−ルチジンを用いることを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれかに記載のオリゴ核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ核酸の固相合成法におけるキャッピング工程に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ核酸を製造する方法として、固相合成法が一般に知られている（非特許文献１）。
固相合成法は、固相担体に担持されたオリゴ核酸誘導体とホスホロアミダイト化合物とをカップリングさせることによって、所望の鎖長のオリゴ核酸を製造する方法であるが、全ての固相担体に担持されたオリゴ核酸誘導体に対してホスホロアミダイト化合物が完全に反応するとは限らない。そこで、高純度のオリゴ核酸を固相合成法で製造するため、固相担体に担持された未反応であるオリゴ核酸誘導体の５’位水酸基を保護し、上記カップリング反応に関与しないようにする工程、いわゆるキャッピング工程を経由する必要がある。
キャッピング工程では、オリゴ核酸誘導体の５’位水酸基を保護するためのアシル化剤として酸無水物（例えば、無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物）を、アシル化反応の活性化剤として、例えば、４−ジメチルアミノピリジン（以下、「４−ＤＭＡＰ」という。）やＮ−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）が一般に使用される。
しかし、アシル化反応の活性化剤として４−ＤＭＡＰを使用した場合には、核酸塩基であるグアニンと４−ＤＭＡＰとが反応し、グアニンが２，６−ジアミノプリン（以下、「２，６−ＤＡＰ」という。）へ変換されることが報告されている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ａｇｒａｗａｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ; Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，Ｖｏｌ．２０，６３（１９９３）
【非特許文献２】Ｊ．Ｓｃｏｔｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１７，ＮＯ．２０，８３３３（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一方、ＮＭＩは、現在最も一般的に使用されているアシル化反応の活性化剤であるが、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体につき、フェノキシ酢酸無水物と、ＮＭＩとを用いて、本発明者が、キャッピング工程を実施したところ、後述する試験例に示すように、満足できる効率で５’位水酸基にフェノキシアセチルが導入されず、その結果、高純度のオリゴ核酸を獲得するために、精製が煩雑になるという問題を見出した。
本発明の目的は、主として、いわゆるキャッピング工程において、リボースの５’位水酸基を効率的にアシル化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、鋭意検討した結果、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【化１】
2007097446.tif 000003
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各Ｂｘは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。ｎは、１〜２００の範囲内にある整数を表す。  ｎは、１０〜１００の範囲内にある整数が好ましく、また、より好ましくは、１５〜５０の範囲内にある整数である。各Ｑは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表す。Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３は、それぞれ同一又は異なって、Ｈ、アルキル又はハロゲンを表す。Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄは、それぞれ同一又は異なって、アルキルを表す。Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄは、それぞれ同一又は異なって、Ｈ又はアルキルを表す。
各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
【化２】
2007097446.tif 000004
式（３）中、ＷＧ１は、電子吸引性基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
【化３】
2007097446.tif 000005
式（４）中、Ｅ１は、単結合又は次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化４】
2007097446.tif 000006
式（５）中、Ｑ、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
Ｂｘに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂｘに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。  かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレン等を挙げることができる。とりわけ、グアニンのアミノ基の保護基としては、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルが好ましい。
ＢＸの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等を挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
ＢＸの修飾体における「アリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」の「アルキル」部分は、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜４のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等を挙げることができる。なかでも炭素数１〜３のものが好ましく、とりわけメトキシが好ましい。
ＢＸの修飾体に係る「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」部分としては、例えば、炭素数６〜１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル等を挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
ＢＸの修飾体に係る「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シアノ、ニトロ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シアノが好ましい。
ＷＧ１、ＷＧ２の「電子吸引性基」に係る「ハロゲン」としては、上記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「アルキルスルホニル」の「アルキル」部分は、上記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「アリールスルホニル」の「アリール」部分は、上記ＢＸの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」部分と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」又は「ジアルキルアミノ」は、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜６のアルケニルを挙げることができる。具体的には、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル等を挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜４のアルキニルを挙げることができる。具体的には、例えば、エチニル、２−プロピニル、１−ブチニル等を挙げることができる。
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄに係る「アルキル」は、上記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３に係る「ハロゲン」は、上記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
Ｅに係る「アシル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔの「アシルオキシ」に係る「アシル」部分は、前記ＢＸの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。
リボースの５’位水酸基をキャッピングするための「アシル化剤」としては、例えば、上記式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を挙げることができる。例えば、フェノキシ酢酸無水物、４−イソプロピルフェノキシ酢酸無水物、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ酢酸無水物、４−クロロフェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。
上記アシル化剤による「アシル化反応の活性化剤」としては、例えば、ピリジン誘導体（１１ｂ）及び（１１ｃ）を挙げることができる。例えば、２−ジメチルアミノピリジン（２−ＤＭＡＰ）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−4−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジメチル−4−ジメチルアミノピリジンを挙げることができる。
また、本発明として、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程を含む、次の一般式（Ａ）で表されるオリゴ核酸（以下、「オリゴ核酸（Ａ）」という。）の製造方法を挙げることができる。
【化５】
2007097446.tif 000007
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各Ｂｘ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄ、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｔは、前記と同義である。
【化６】
2007097446.tif 000008
式（Ａ）中、各Ｑ、各Ｒは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｚは、前記と同義である。各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。
Ｂで表される核酸塩基としては特に限定されるものではなく、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、Ｂの「修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アミノ」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、各々前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。
【０００７】
Ｉ．オリゴ核酸（Ａ）の製造方法
オリゴ核酸（Ａ）の製造方法について、以下に詳述する。
【化７】
2007097446.tif 000009
式（Ａ）中、各Ｂ、各Ｑ、各Ｒは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｚは、前記と同義である。
オリゴ核酸（Ａ）の製法は、公知の方法に従い行うことができるが、例えば、次に示す工程Ａ〜工程Ｈの操作を実施することにより、段階的に３’から５’の方向へ核酸モノマー化合物を縮合することにより行うことができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、オリゴ核酸の合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、すべての工程をマニュアル又は市販のＤＮＡ自動合成機を用いて製造することができる。自動合成機で行うことにより操作法の簡便化、また合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
【０００８】
（１）工程Ａ：
次の一般式（１）で表される（オリゴ）核酸誘導体に酸を作用させることによって、５’位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式（２）で表される（オリゴ）核酸誘導体を製造する工程。
【化８】
2007097446.tif 000010
式（１）及び（２）中、ｎ、Ｅ、Ｔは前記と同義である。各Ｂｘ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。  Ｒ１は、次の一般式（１０）で表される置換基を表す。
【化９】
2007097446.tif 000011
式（１０）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３に係る「アルコキシ」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
本工程は、固相担体に担持されている次の一般式（６ａ）、（６ｂ）で表される核酸誘導体（ｎ＝１である核酸誘導体（１））、又は、工程Ａ〜工程Ｄの操作を行うことにより製造される固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（ｎ＝２〜１００であるオリゴ核酸誘導体（１））（以下、「固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体」という。）に酸を作用させることにより実施することができる。
【化１０】
2007097446.tif 000012
式（６ａ）及び（６ｂ）中、ＢＸ、Ｒ１は、前記と同義である。Ｒ２Ｌ、Ｒ４Ｌは、前記置換基（４）を表す。Ｒ２は、アシルオキシを表す。Ｒ４ａは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は前記置換基（３）を表す。
Ｒ２、Ｒ４ａの「アシルオキシ」に係る「アシル」部分としては、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｘの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記Ｂｘの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記Ｂｘの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アミノ」、「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
核酸誘導体（６ａ）、核酸誘導体（６ｂ）は、公知の方法に従い製造される又は市販品として入手できる固相担体に担持されている核酸誘導体であり、好ましい態様としては、例えば、次の一般式（７）、（８）で表される核酸化合物を挙げることができる。
【化１１】
2007097446.tif 000013
式（７）及び（８）中、ＢＸ、Ｑ、Ｒ１、Ｒ４、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｒ４が置換基（３）である核酸化合物（７）、（８）は、後述するホスホロアミダイト化合物（Ｂ）から公知の方法に従い製造することができる。
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、１〜５％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、（オリゴ）核酸誘導体（１）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている（オリゴ）核酸誘導体に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
【０００９】
（２）工程Ｂ：
工程Ａにおいて製造される（オリゴ）核酸誘導体（２）に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を縮合させ、次の一般式（９）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
【化１２】
2007097446.tif 000014
式（２）及び（９）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ１、Ｔは、前記と同義である。
本工程は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に核酸モノマー化合物と活性化剤とを作用させることにより実施することができる。
「核酸モノマー化合物」としては、次の一般式（Ｂ）で表されるホスホロアミダイト化合物（以下、「ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）」という。）又は次の一般式（Ｃ）で表される核酸化合物を挙げることができる。
【化１３】
2007097446.tif 000015
式（Ｂ）及び（Ｃ）中、ＢＹ、Ｂｚは、それぞれ保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。Ｒ１、Ｒ４ａは、前記と同義である。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ１、ＷＧ２は、それぞれ、電子吸引性基を表す。【００１０】
Ｂｚに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
ＢＹに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂｚ、ＢＹに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。かかる「アミノ基の保護基」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アミノ基の保護基」と同じものを挙げることができる。
Ｂｚ、ＢＹの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂｚ、ＢＹの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、各々前記Ｂｘのそれらと同じものを挙げることができる。【００１１】
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「５〜６員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、モルホリン−１−イル、チオモルホリン−１−イルを挙げることができる。【００１２】
「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールを挙げることができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」という。）を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２）の種類、使用する活性化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
【００１３】
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、２’位の水酸基に中性条件下において脱離可能なエーテル型保護基を有するホスホロアミダイト化合物である。また、２’位の水酸基に導入された基が直鎖状の置換基であり、３’位の水酸基に結合するリン原子の周りにおける立体が混み合っていないため、従来から使用されているホスホロアミダイト化合物と比較して、オリゴＲＮＡを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進行し、縮合収率がよいという特徴を有する。
【００１４】
（３）工程Ｃ：
工程Ｂにおいて未反応である（オリゴ）核酸誘導体（２）のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表される（オリゴ）核酸誘導体を製造する工程。
【化１４】
2007097446.tif 000016
式（２）、（１１ａ）、（１１ｂ）、（１１ｃ）及び（１２）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄ、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｔは、前記と同義である。
本工程は、工程Ｂにおいて未反応である（オリゴ）核酸誘導体（２）の５’位水酸基を保護する反応であり、固相担体に担持されている未反応であるオリゴ核酸誘導体（２）にフェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）とアシル化反応の活性化剤（１１ｂ）又は（１１ｃ）と塩基とを作用させることにより実施することができる。
アシル化剤は、０．０５〜１Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。アシル化剤の使用量の使用量としては、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）の種類等によって異なるが、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）のモル量に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜３０倍モル量である。
アシル化反応の活性化剤の使用量としては、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）のモル量に対して、０．８〜５０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
また、必要であれば、本工程における副生成物であるフェノキシ酢酸誘導体を捕捉するために、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤として、例えば、ピリジン、２，６−ルチジン，２，４，６−コリジン又はこれら任意の混合物を添加することができる。とりわけ、２，６−ルチジンが好ましい。塩基の使用量としては、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）の種類、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）等によって異なるが、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）のモル量に対して、０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜２０倍モル量である。
反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。上記工程における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２）の種類、使用するアシル化剤の種類、使用するアシル化反応の活性化剤、塩基、反応温度等によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。
【００１５】
（４）工程Ｄ：
工程Ｂにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（９）に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程。
【化１５】
2007097446.tif 000017
式（９）及び（１３）中、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ１、Ｔは、前記と同義である。
本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
「リンを酸素で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用することができる。該酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン―ＴＨＦあるいはヨウ素／ピリジン―酢酸や過酸化剤（ｔ−ブチルヒドロパーオキシド／メチレンクロリドなど）を用いることができる。
また、リンを硫黄で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）を使用することができる。該酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（９）の種類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜５０倍モル量である。
【００１６】
（５）工程Ｅ：
工程Ｄにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１３）を固相担体から切り出し、各核酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程。
【化１６】
2007097446.tif 000018
式（１３）及び（１４）中、各Ｂ、各ＢＸ、各Ｑ、各Ｒ４、各ＷＧ２は、それぞれ独立して、前記と同義である。Ｅ、ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｔ、Ｚは、前記と同義である。
切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴＲＮＡを切り出し剤によって、固相担体及びリンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴ核酸誘導体が担持された固体担体に切り出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基部の保護基を脱離することができる。
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。
反応温度は、１５℃〜７５℃が適当であり、好ましくは１５℃〜３０℃であり、より好ましくは１８℃〜２５℃である。脱保護反応時間は、１０分〜３０時間が適当であり、好ましくは３０分〜２４時間であり、より好ましくは１〜４時間である。脱保護に使用される溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、２０〜３０重量％が適当であり、好ましくは２５〜３０重量％であり、より好ましくは２８〜３０重量％である。使用する試薬の量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（１３）に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜５０倍モル量である。
【００１７】
（６）工程Ｆ：
工程Ｅにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１４）に、各リボースの２’位水酸基の保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（１５）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
【化１７】
2007097446.tif 000019
式（１４）及び（１５）中、各Ｂ、各Ｑ、各Ｒ、各Ｒ４は、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｒ１、Ｚは、前記と同義である。
本工程は、オリゴ核酸誘導体（１４）に２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬を作用させることにより実施することができる。２’位の水酸基の保護基を脱離する工程は、「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」として、例えば、テトラブチルアンモニウムフロリド、トリエチルアミントリハイドロフロリドを作用させることにより行うことができる。使用する「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」の量は除去される保護基に対して１〜５００倍モル量が適当であり、好ましくは５〜１０倍モル量である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ＴＨＦ、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、ジメチルスルホキシド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応溶媒の使用量は、「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」に対して、０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、２０℃〜８０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１４）の種類、使用する２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、通常１時間〜１００時間が適当である。
また、必要であれば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを捕捉するために、アクリロニトリルの捕捉剤として、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれら任意の混合物を添加することができる。「ニトロアルカン」としては、直鎖状の炭素数１〜６のニトロアルカンを挙げることができる。具体的には、例えば、ニトロメタン等を挙げることができる。例えば、「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のアルキルアミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、ホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１−プロパンチオール、１−ブタンチオール、１−ペンタンチオール、１−ヘキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１〜６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、２−メルカプトエタノール、４−メルカプト−１−ブタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２−メルカプトエチルエーテル、３−メルカプトプロピルエーテル、４−メルカプトブチルエーテル、５−メルカプトペンチルエーテル、６−メルカプトヘキシルエーテルを挙げることができる。
「アクリロニトリルの捕捉剤」の使用量としては、オリゴ核酸誘導体（１４）の種類等によって異なるが、オリゴ核酸誘導体（１４）の各リボースの２’位水酸基を保護している２−シアノエトキシメチルに対して、０．８〜５００倍モル量が適当であり、好ましくは1〜１０倍モル量である。
【００１８】
（７）工程Ｇ：
オリゴ核酸誘導体（１５）の５’位の水酸基を脱離する工程。
【化１８】
2007097446.tif 000020
式（１５）及び（Ａ）中、各Ｂ、各Ｑ、各Ｒは、それぞれ独立して、前記と同義である。ｎ、Ｒ１、Ｚは、前記と同義である。
本工程は、最終的にオリゴ核酸誘導体（１５）の５’位水酸基の保護基を脱離する反応であり、固体担体から切り出されたオリゴＲＮＡに酸を作用させることにより実施することができる。
本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水、ｐＨが２〜５の緩衝液又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１５）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
【００１９】
（８）工程Ｈ：
工程Ｇにおいて製造されるオリゴ核酸（Ａ）を分離精製する工程。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８からＣ１８逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所望のオリゴＲＮＡを単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。この場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス塩酸、エチレンジアミン四酢酸を１ｍＭ〜２Ｍの濃度で添加し、溶液のｐＨを１〜９の範囲で調整することもできる。
【００２０】
工程Ａ〜工程Ｄの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。
また、上記オリゴ核酸の製造方法の工程Ｂにおいて、核酸モノマー化合物として少なくとも１回はホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を用いることによって、各Ｒのうち少なくとも１つが水酸基であるオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。さらに、上記オリゴ核酸の製造方法の工程Ｂにおいて、核酸モノマー化合物として、全てホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を用いることによって、各Ｒが全てＯＨであるオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。
ＩＩ．ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）の製法
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、次のようにして製造することができる。
以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行うことが一般的である。保護基は、反応後に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、例えば、次の工程ａ〜工程ｈの操作を実施することにより製造することができる。
以下、詳細に説明する。【００２１】
（１）工程ａ：
次の一般式（１６）で表されるリボ核酸誘導体にアルキル化試薬を作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入する、次の一般式（１７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化１９】
2007097446.tif 000021
式（１６）、（１７）及び（１７’）中、Ｂｚ、Ｒ１、ＷＧ１は、前記と同義である。
「アルキル化試薬」として、例えば、次の一般式（１８）で表されるエーテル化合物を挙げることができる。
【化２０】
2007097446.tif 000022
式（１８）中、Ｌは、ハロゲン、アリールチオ基、アルキルスルホキシド基又はアルキルチオ基を表す。ＷＧ１は、前記と同義である。
Ｌに係る「ハロゲン」、「アリールチオ基」の「アリール」、「アルキルスルホキシド基」及び「アルキルチオ基」の「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
エーテル化合物（１８）の具体例としては、次の１．〜２．の化合物を挙げることができる。
１．クロロメチル  ２−シアノエチルエーテル
２．２−シアノエチル  メチルチオメチルエーテル
エーテル化合物（１８）は、中性条件下において脱離可能なエーテル型置換基を、２’位の水酸基に塩基性条件下において導入することができる新規なアルキル化試薬であり、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を製造するための試薬として有用である。
【００２２】
エーテル化合物（１８）は、次に示す工程１〜工程４を実施することにより製造することができる。
工程１：
次の一般式（１９）で表されるアルコール化合物をアルキルチオメチル化し、次の一般式（２０）で表される化合物を製造する工程。
【化２１】
2007097446.tif 000023
式（１９）及び（２０）中、ＷＧ１は、前記と同義である。Ｒ３は、アルキル又はアリールを表す。
化合物（２０）は、Ｌがアルキルチオ基であるエーテル化合物（１８）である。
Ｒ３に係る「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ３がメチルである場合、アルキルチオメチル化試薬としては、例えば、ジメチルスルホキシド、無水酢酸及び酢酸の混合溶液を挙げることができる。「ジメチルスルホキシド」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜２００倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
工程２：
化合物（２０）をハロゲン化し、次の一般式（２１）で表される化合物を製造する工程。
【化２２】
2007097446.tif 000024
式（２０）及び（２１）中、ＷＧ１、Ｒ３は、前記と同義である。Ｘ２は、ハロゲンを表す。
化合物（２１）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがハロゲンである化合物である。
Ｘ２に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｔ．Ｂｅｎｎｅｃｈｅら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ７６２（１９８３））により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。ハロゲン化試薬としては、例えば、塩化スルフリル、オキシ塩化リンを挙げることができる。「ハロゲン化試薬」の使用量は、化合物（２０）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
工程３：
化合物（２１）をアリールチオ化し、次の一般式（２２）で表される化合物を製造する工程。
【化２３】
2007097446.tif 000025
式（２１）及び（２２）中、ＷＧ１、Ｘ２は、前記と同義である。Ｒ３ａは、アリールを表す。
化合物（２２）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがアリールチオ基である化合物である。
Ｒ３ａに係る「アリール」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アリール」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリルを挙げることができる。アリールチオ化試薬としては、例えば、チオフェノール、４−メチルベンゼンチオールを挙げることができる。「アリールチオ化試薬」の使用量は、化合物（２１）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
工程４：
化合物（２０）を酸化し、次の一般式（２３）で表される化合物を製造する工程。
【化２４】
2007097446.tif 000026
式（２０）及び（２３）中、ＷＧ１、Ｒ３は、前記と同義である。
化合物（２３）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがアルキルスルホキシド基である化合物である。
Ｒ３に係る「アルキル」としては、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）における「アルキル」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、メタノールを挙げることができる。酸化剤としては、例えば、メタクロロ過安息香酸、メタ過ヨウ素酸塩、過酸化水素を挙げることができる。「酸化剤」の使用量は、化合物（２０）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜２倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
【００２３】
「アルキル化試薬」として、化合物（２１）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。本工程において、必要に応じて、化合物（１６）に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。かかる「金属試薬」として、例えば、二塩化ジブチルスズを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
【００２４】
「アルキル化試薬」として、化合物（２０）又は化合物（２２）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３１，２３８５（１９９０））に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜５時間が適当である。
【００２５】
「アルキル化試薬」として、化合物（２３）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）に、アルキル化試薬と酸無水物と塩基とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。塩基としては、例えば、テトラメチルウレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜２４時間が適当である。
【００２６】
（２）工程ｂ：
工程ａにおいて製造されるリボ核酸誘導体（１７）を単離精製する工程。
本工程は、工程ａにおいて製造される混合物から通常の分離精製手段、例えば、薄層クロマトグラフィー、シリガゲルクロマトグラフィーなどの手段を用いることにより単離精製することができる。
【００２７】
（３）工程ｃ：
工程ｂとは別に、次の一般式（２４）で表されるリボ核酸誘導体にアルキル化試薬を作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入した、次の一般式（２５）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化２５】
2007097446.tif 000027
式（２４）及び（２５）中、Ｂｚ、ＷＧ１は、前記と同義である。
Ａは、次の一般式（２６ａ）又は（２６ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
【化２６】
2007097446.tif 000028
式（２６ａ）及び（２６ｂ）中、Ｒ６は、アルキルを表す。
Ｒ６に係る「アルキル」としては、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）における「アルキル」と同じものを挙げることができる。
「アルキル化試薬」としては、前記と同じものを挙げることができる。【００２８】
「アルキル化試薬」として、化合物（２１）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。本工程において、必要に応じて、化合物（２４）に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。かかる「金属試薬」として、例えば、二塩化ジブチルスズ、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリドを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
【００２９】
「アルキル化試薬」として、化合物（２０）又は化合物（２２）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３１，２３８５（１９９０））に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜５時間が適当である。
【００３０】
「アルキル化試薬」として、化合物（２３）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）に、アルキル化試薬と酸無水物と塩基とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。塩基としては、例えば、テトラメチルウレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜２４時間が適当である。
【００３１】
（４）工程ｄ：
工程ａ〜工程ｃとは別に、リボ核酸誘導体（２４）にジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを作用させることによって、次の一般式（２７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化２７】
2007097446.tif 000029
式（２４）及び（２７）中、Ａ、Ｂｚは、前記と同義である。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能であるリボ核酸誘導体（２４）に、ジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを作用させることにより実施することができる。
「ジメチルスルホキシド」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜２００倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。反応温度は、１０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
【００３２】
（５）工程ｅ：
工程ｄにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２７）に次の一般式（２８）で表されるアルコール化合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入した、次の一般式（２５）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化２８】
2007097446.tif 000030
式（２５）、（２７）及び（２８）中、Ａ、Ｂｚ、ＷＧ１は、前記と同義である。
本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（２７）に、アルコール化合物（２８）と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。
使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。「アルコール化合物（２８）」の使用量は、化合物（２７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」としては、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（２７）のモル量に対して、０．１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．２〜１０倍モル量である。反応温度は、−１００℃〜２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜１２時間が適当である。
【００３３】
（６）工程ｆ：
工程ｃ又は工程ｅにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２５）の３’位と５’位の水酸基の保護基を脱離する反応を行うことによって、次の一般式（２９）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化２９】
2007097446.tif 000031
式（２５）及び（２９）中、Ａ、Ｂｚ、ＷＧ１は、前記と同義である。
本工程は、化合物（２５）を有機溶媒に溶解し、フッ素化剤単独又はフッ素化剤と酸（例えば、酢酸、塩酸、硫酸）とを任意の混合比の混合試薬として反応させることにより実施することができる。本工程に使用しうる「フッ素化剤」としては、例えば、フッ化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムフロリド（以下、「ＴＢＡＦ」という。）、トリエチルアミントリヒドロフロリド、フッ化水素ピリジンを挙げることができる。「フッ素化剤」の使用量としては、化合物（２５）のモル量に対して、０．１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．２〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
混合試薬におけるフッ素化剤と酸との混合比は、１：０．１〜１：２が適当であり、好ましくは１：１〜１：１．２である。
【００３４】
（７）工程ｇ：
工程ｆにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２９）の５’位の水酸基に酸性条件下において脱離する保護基（Ｒ１）を導入する、リボ核酸誘導体（１７）を製造する工程。
【化３０】
2007097446.tif 000032
式（１７）、（２９）及び（３０）中、Ｂｚ、Ｒ１、ＷＧ１は、前記と同義である。Ｘ３は、ハロゲンを表す。
Ｘ３に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法に従い、化合物（２９）にＲ１Ｘ３（３０）を作用させることにより実施することができる。Ｒ１Ｘ３の使用量は、化合物（２９）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦを挙げることができる。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２９）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
【００３５】
（８）工程ｈ：
工程ｂ又は工程ｆにおいて製造されるリボ核酸誘導体（１７）にホスホロアミダイト化試薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、３’位の水酸基がホスホロアミダイト化されたホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を製造する工程。
【化３１】
2007097446.tif 000033
式（１７）及び（Ａ）中、Ｂｚ、Ｒ１、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、ＷＧ１、ＷＧ２は、前記と同義である。
「ホスホロアミダイト化試薬」としては、例えば、次の一般式（３１ａ）、（３１ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
【化３２】
2007097446.tif 000034
式（３１ａ）及び（３１ｂ）中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、ＷＧ２は、前記と同義である。Ｘ１は、ハロゲンを表す。
Ｘ１に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、化合物（１７）にホスホロアミダイト試薬を作用させて、３’位の水酸基をホスホロアミダイト化する反応であり、公知の方法に従い実施することができる。必要に応じて、活性化剤を使用することもできる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦを挙げることができる。
「ホスホロアミダイト化試薬」の使用量は、化合物（１７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールを挙げることができる。「活性化剤」の使用量は、化合物（１７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
このようにして、製造されるホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、それ自体公知の手段、例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィー等により分離精製することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に参考例及び試験例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されない。
【００３７】
参考例１  クロロメチル  ２−シアノエチルエーテル
工程１  メチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテルの製造
３−ヒドロキシプロピオニトリル３２ｇ（４５０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド４５０ｍｌに溶解し、無水酢酸３２４ｍＬ、酢酸２３１ｍＬを加え室温で２４時間攪拌した。炭酸水素ナトリウム９９０ｇを水４．５Ｌに溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下した。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸エチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色油状物のメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテルを４１ｇ得た（収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．１８（ｓ，３Ｈ）；２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．６９（ｓ，２Ｈ）
工程２  クロロメチル  ２−シアノエチルエーテルの製造
工程１で得られたメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル３．３ｇ（２５ｍｍｏｌ）を７０ｍＬの塩化メチレンに溶解させ、氷冷下２ｍＬ（２５ｍｍｏｌ）の塩化スルフリルを滴下し、さらに室温にて一時間反応させた。反応後、溶媒を留去し真空中にて蒸留し、目的化合物を無色油状物として２．５ｇ得た（収率８５％）。
沸点：８４−８５℃（０．３Ｔｏｒｒ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．９２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；５．５２（ｓ，２Ｈ）
【００３８】
参考例２  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン５４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル  ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま３０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（１９７ｍｇ；収率３４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；２．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．５５（ｄｄ，１Ｈ，１１．３，２．２Ｈｚ）；３．６２（ｄｄ，１Ｈ，１１．３，２．２Ｈｚ）；３．８３（ｓ，６Ｈ）；３．８７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．０７−４．０８（ｍ，１Ｈ）；４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３，１．９Ｈｚ）；４．５４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；４．９４，５．１１（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；５．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）；６．８５−６．８８（ｍ，４Ｈ）；７．２９−７．４１（ｍ，９Ｈ）；８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；８．５３（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６５２［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られた５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン２０９ｍｇ（０．３３２ｍｍｏｌ）、テトラゾール２３ｍｇ（０．３３２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２ｍＬに溶解し１５０ｍｇの（０．４９８ｍｍｏｌ）の２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを滴下し、４５℃で１．５時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２００ｍｇ；収率７３％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８５２［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００３９】
参考例３  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン
工程１  ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン１５０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下ＴＨＦ７ｍＬに溶解し、メチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル５４ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ１００ｍｇを加え、１０分攪拌した。０℃にしトリフルオロメタンスルホン酸１０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ２ｍＬ溶液を加え攪拌した後、Ｎ−ヨードスクシンイミド９２ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、塩化メチレンにて洗浄した後、有機相を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィーにて精製し、３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（１５０ｍｇ；収率８５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ０．９７−１．１２（ｍ，２８Ｈ）；２．６８−２．７３（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８６（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０５（ｍ，２Ｈ）；４．１２−４．３０（ｍ，４Ｈ）；５．０−５．０４（ｍ，２Ｈ）；５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；５．７５（ｓ，１Ｈ）；７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；９．６２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５７０［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
工程１で得られた３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン２００ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）をメタノール２ｍＬに溶解し、フッ化アンモニウム６５ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）を加え５０℃にて５時間加熱攪拌した。放冷後アセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１０８ｍｇ；収率９４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：  ２．７２−２．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；３．６８−３．９２（ｍ，４Ｈ）；４．００−４．０３（ｍ，１Ｈ）；４．２６−４．３２（ｍ，２Ｈ）；４．８１−４．９５（ｍ，２Ｈ）；５．７１（ｄ，１Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ）；６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４０】
参考例４  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン１４ｇ（４３ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン６８ｇ（８５６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ２０ｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド１９．６ｇ（５７．８ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール１０ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液を濃縮後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２６．５ｇ；収率９８％）。
【００４１】
参考例５  Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン５８８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル  ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンを得た（２１９ｍｇ；収率３５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．１９（ｓ，３Ｈ）；２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）；２．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；３．５５（ｄｄ，１Ｈ，１０．５，２．５Ｈｚ）；３．６３（ｄｄ，１Ｈ，１０．５，２．５Ｈｚ）；３．８２（ｓ，６Ｈ）；３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；４．０９−４．１４（ｍ，１Ｈ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；４．４４−４．４９（ｍ，１Ｈ）；４．９７，５．２４（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；５．９６（ｓ，１Ｈ）；６．８６−６．８８（ｍ，４Ｈ）；７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；７．２６−７．４２（ｍ，９Ｈ）；８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；８．５９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６９３［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）  シチジン２０５ｍｇ（０．３０６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１０５ｍｇ（０．８１２ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１１６ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２４２ｍｇ；収率９１％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８７１［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４２】
参考例６  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン
工程１  Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）シチジン１．００ｇ（１．８９ｍｍｏｌ）とメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル５００ｍｇ（３．７９ｍｍｏｌ）を混合し、トルエン１０ｍＬとＴＨＦ１０ｍＬの混合溶媒に溶解した。ついでトリフルオロメタンスルホン酸銀９７５ｍｇ（３．７９ｍｍｏｌ）を加え、モレキュラーシーブス４Ａを加え、乾燥した。氷冷下、Ｎ−ブロモスクシンイミド３７０ｍｇ（２．０８ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を遮光し、１０分間撹拌した。さらにＮ−ブロモスクシンイミド７０ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）を追加し、２５分間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンを得た。（９３６ｍｇ；収率８１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ０．９０−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２８（ｓ，３Ｈ）；２．６２−２．７９（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８９（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０４（ｍ，２Ｈ）；４．１９−４．２３（ｍ，３Ｈ）；４．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．７７（ｓ，１Ｈ）；７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；１０．１３（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６１１［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
工程１で得られたＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン５００ｍｇ（０．８１９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２．５ｍＬとメタノール２．５ｍＬの混合溶媒に溶解し、フッ化アンモニウム１５０ｍｇ（４．１０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で４時間反応させた。反応終了後、アセトニトリルにて希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２１０ｍｇ；収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：  ２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．６６−２．７１（ｍ，２Ｈ）；３．７２−３．７８（ｍ，３Ｈ）；３．９０（ｄｄ，１Ｈ，１３．０，２．６Ｈｚ）；４．０６−４．１１（ｍ，１Ｈ）；４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，５．２Ｈｚ）；４．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，２．９Ｈｚ）；４．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ）；７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）；８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３９１［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４３】
参考例７  Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン９．９ｇ（２６．８ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ１９０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン４３ｇ（５３８ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ２０ｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド１１．８ｇ（３４．９ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール２ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１５ｇ；収率８３％）。
【００４４】
参考例８  Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン６２７ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル  ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（４５０ｍｇ；収率６３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  １．９２（ｓ，３Ｈ）；２．４７−２．５１（ｍ，２Ｈ）；２．６８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；３．３０（ｄｄ，１Ｈ，１０．７，３．８Ｈｚ）；３．４７（ｄｄ，１Ｈ，１０．７，３．８Ｈｚ）；３．５５−３．６０（ｍ，１Ｈ）；３．６５−３．７０（ｍ，１Ｈ）；３．７４，３．７５（２ｓ，６Ｈ）；４．２２−４．２３（ｍ，１Ｈ）；４．５５−４．５８（ｍ，１Ｈ）；４．７８，４．８３（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；５．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；６．７６−６．７９（ｍ，４Ｈ）；７．１７−７．４４（ｍ，９Ｈ）；７．８８（ｓ，１Ｈ）；８．３６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１２．０６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
工程２  Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン４００ｍｇ（０．５６３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１８１ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１６１ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（４７１ｍｇ；収率９２％）。
【００４５】
参考例９  Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン２２．０ｇ（３６．０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン１７０ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１６．３ｇ（１２６ｍｍｏｌ）を加え、ついで１２．１ｇ（３９．７ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にし１５分間撹拌後、クロロメチル  ２−シアノエチルエーテル４．３０ｇ（３６．０ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま３０分間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た。（７．４７ｇ；収率３３％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；２．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）；２．６１（ｓ，３Ｈ）；３．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７，４．０Ｈｚ）；３．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７，３．２Ｈｚ）；３．６２−３．７９（ｍ，２Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；４．２５（ｂｒ．ｑ，１Ｈ，Ｊ〜４．６Ｈｚ）；４．５９（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；４．８７−４．９４（ｍ，３Ｈ）；６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）；６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ）；７．２２−７．３２（ｍ，７Ｈ）；７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；８．２０（ｓ，１Ｈ）；８．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；８．６２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６９５［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン１０．０ｇ（１４．４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン７５ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４．７ｇ（３６ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト４．８２ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を３０ｍＬ程度残して留去し得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１２．０ｇ；収率９３％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８９５［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４６】
参考例１０  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
工程１  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ−ヨードスクシンイミド２４５ｍｇ（１．０９ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸銀２８０ｍｇ（１．０９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８ｍＬに懸濁させ、モレキュラーシーブス４Ａを加え、乾燥した。ここに、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン４００ｍｇ（０．７３ｍｍｏｌ）とメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル１４５ｍｇ（１．１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン４ｍＬに溶解し、氷冷下で加えた。そのまま３時間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た。（２０１ｍｇ；収率４５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ０．９８−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．６２（ｓ，３Ｈ）；２．６９（ｔｄ，２Ｈ，６．５，Ｊ＝１．５Ｈｚ）；３．８１−３．８９（ｍ，１Ｈ）；４．０２−４．０９（ｍ，２Ｈ）；４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）；４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，４．５Ｈｚ）；５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；６．１０（ｓ，１Ｈ）；８．３４（ｓ，１Ｈ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３６［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン３００ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）を、酢酸０．１ｍＬと０．５ＭＴＢＡＦのＴＨＦ溶液２ｍＬの混合溶液に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（１６０ｍｇ；収率８６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．２５（ｓ，３Ｈ）；２．５３−２．６８（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．４６（ｍ，１Ｈ）；３．５６−３．６４（ｍ，２Ｈ）；３．６９−３．７３（ｍ，１Ｈ）；４．００−４．０１（ｍ，１Ｈ）；４．３６−４．３７（ｍ，１Ｈ）；４．７２−４．７８（ｍ，３Ｈ）；５．２０（ｂｔ，２Ｈ）；５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；６．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．７２（ｓ，１Ｈ）；１０．７２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：４１５［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４７】
参考例１１  Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン９．５０ｇ（２４．２ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン１００ｍＬに溶解し、濃縮して乾燥した後、アルゴン雰囲気下、脱水ピリジン１００ｍＬに溶解した。氷冷下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１０．７ｇ（３１．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間２０分反応した。反応終了後、塩化メチレンにて希釈し、水にて洗浄を行い無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（１３．８ｇ；収率８２％）
【００４８】
参考例１２  Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン７２０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル  ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（３８４ｍｇ；収率４８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ２．４７−２．５１（ｍ，２Ｈ）；２．５８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；３．４２（ｄｄ，１Ｈ，１０．１，３．８Ｈｚ）；３．４６（ｄｄ，１Ｈ，１０．１，３．８Ｈｚ）；３．５３−３．５７（ｍ，１Ｈ）；３．６９−３．７３（ｍ，１Ｈ）；３．７７（ｓ，６Ｈ）；４．２４−４．２６（ｍ，１Ｈ）；４．４８−４．５０（ｍ，１Ｈ）；４．６１−４．６５（ｍ，２Ｈ）；４．８３，４．８７（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；４．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；６．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ）；６．９２−６．９６（ｍ，３Ｈ）；７．０７−７．１１（ｍ，２Ｈ）；７．２０−７．４２（ｍ，９Ｈ）；７．８４（ｓ，１Ｈ）；８．９９（ｓ，１Ｈ）；１１．８１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８２５［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトの製造
工程１で得られたＮ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン３２０ｍｇ（０．３９９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１２８．８ｍｇ（０．９９６ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１４１．５ｍｇ（０．５９８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（３１６ｍｇ；収率７９％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：１００３［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４９】
参考例１３  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン
工程１  Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）グアノシン２．０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１６ｍＬに溶解し、メチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル０．９９ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ１．０ｇを加え、アルゴン雰囲気下−４５℃で１０分攪拌した。トリフルオロメタンスルホン酸０．６８ｇ（４．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ５ｍＬ溶液を加え攪拌した後、Ｎ−ヨードスクシンイミド１．０２ｇ（４．５ｍｍｏｌ）を加え、１５分攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ろ過後酢酸エチルにて抽出、有機相を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（２．０ｇ；収率８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ０．９９−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．５９−２．７７（ｍ，２Ｈ）；３．８２−４．０５（ｍ，３Ｈ）；４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；４．２５−４．３５（ｍ，２Ｈ）；４．５２−４．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，４．３Ｈｚ）；５．００，５．０７（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｓ，１Ｈ）６．９９−７．１２（ｍ，３Ｈ）；７．３５−７．４０（ｍ，２Ｈ）；８．０９（ｓ，１Ｈ）；９．３８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１１．８５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：７６６［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
１ＭＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液２．８３ｍＬ（２．８３ｍｍｏｌ）に酢酸０．１４ｍＬ（０．１４ｍｍｏｌ）を加えた溶液を調整する。工程１で得られたＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン１．０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２．８３ｍＬに溶解し、上で調整した溶液を加えアルゴン雰囲気下室温で１時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、塩化メチレンに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーにのせ精製し、目的化合物を得た。（０．６７ｇ；収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．５９−２．６６（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．６３（ｍ，４Ｈ）；３．９８（ｍ，１Ｈ）；４．３２（ｍ，１Ｈ）；４．５８−４．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；４．７１−４．７８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．１，６．８Ｈｚ）；４．８７（ｓ，２Ｈ）；５．１２（ｓ，１Ｈ）５．３７（ｓ，１Ｈ）；５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）６．９６−６．９９（ｍ，３Ｈ）；７．２８−７．３４（ｍ，２Ｈ）；８．３０（ｓ，１Ｈ）；１１．７８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５００［Ｍ−Ｈ］−
【００５０】
参考例１４  Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン６６０ｍｇ（１．３２ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ９ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン２．１ｇ（２６．４ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ６００ｍｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド５４０ｍｇ（１．５８ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール２ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（８００ｍｇ；収率７５％）。
【００５１】
参考例１５  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
工程１  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン２．００ｇ（３．６２ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド２５ｍＬに溶解し、無水酢酸１７．５ｍＬ、酢酸１２．５ｍＬを加え室温で１４時間撹拌した。反応終了後、水２００ｍＬに反応液を加え、酢酸エチルにて抽出を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンを得た。（１．３６ｇ；収率６１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ０．９６−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２０（ｓ，３Ｈ）；２．６１（ｓ，３Ｈ）；４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４，２．４Ｈｚ）；４．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）；４．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．６３−４．７１（ｍ，２Ｈ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；６．０９（ｓ，１Ｈ）；８．３１（ｓ，１Ｈ）；８．６５（ｓ，１Ｈ）；８．６９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３５［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン１．００ｇ（１．６３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ２５ｍＬに溶解した。３−ヒドロキシプロピオニトリル５．８８ｇ（８２．７ｍｍｏｌ）を加え、モレキュラーシーブス４Ａを加えて乾燥し、−４５℃に冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド４４０ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を加え、ついでトリフルオロメタンスルホン酸４９０ｍｇ（３．２６ｍｍｏｌ）を加えた後、−４５℃で１５分間撹拌した。反応終了後、冷却したままトリエチルアミンを加えて中和し、塩化メチレンにて希釈、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（７２２ｍｇ；収率７１％）。
試験例１  キャッピング工程において使用するアシル化反応の活性化剤及びフェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤の効果１
市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを担持したＣＰＧ固相担体（３３３ｍｇ，１５μｍｏｌ）をグラスフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ：アプライドバイオシステムズ社）を使用して、オリゴ核酸（アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−チミジン）の合成を行った。
核酸モノマー化合物として、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）を、縮合触媒としてベンジルメルカプトテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング工程に使用する試薬として次の表１に記載の４種類の試薬を使用し、核酸モノマー化合物を２０回縮合させた。
【表１】
2007097446.tif 000035
上記条件で製造した各オリゴ核酸に対し、切り出し剤としてアンモニア水：エタノール＝３：１を使用して、４０℃で４時間かけてＣＰＧ固相担体からの切り出し及び各リン酸部位、塩基部位の保護基の脱離反応を行った。各反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下、濃縮後、ニトロメタン１％を含む１ＭＴＢＡＦのＴＨＦ溶液を用いて室温下、３時間反応させ、２’位の水酸基の保護基の脱離反応を行った。上記各条件において製造したオリゴ核酸を未精製のまま一部取り出し、ＨＰＬＣ分析を行った。
図１は、上記１の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図２は、上記２の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図３は、上記３の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図４は、上記４の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、それぞれ下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った結果である。
測定条件：
ＨＰＬＣ装置  
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＴ  ＶＰ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶＰ  （島津製作所社製）
陰イオン交換ＨＰＬＣカラム
ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００＜４ｍｍφ  ｘ  ２５０  ｍｍ＞（ＤＩＯＮＥＸ社製）
カラム温度：５０℃
移動相
グラジエント：リニアグラジエント２０分（Ｂ液：５−２５％）
Ａ液：１０％アセトニトリルを含む２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液
Ｂ液：１０％アセトニトリル、７００ｍＭ  過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液
移動相の流量：１ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
次に、各反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を生成させた後、母液と沈殿を遠心分離した。デカンテーションによって母液を除去し、沈殿を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）にて不要ピークを除去後、溶出溶媒（１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を含む１０ｍＭリン酸緩衝液）を用いて精製した。溶液を透析処理後、目的化合物を得た。滅菌水でおよそ２０  ＯＤ／ｍｌ程度に希釈したサンプル２００μｌに対し、ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ１（０．５ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７°Ｃで４８時間反応させた後、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ）と緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，１ｍＭ  スペルミジンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ ９．３）を３７°Ｃで２４時間反応させて酵素分解を行った。それぞれについて酵素分解したものを下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った（図５，６，７参照）。
図５は、上記２の試薬を使用して製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、図６は、上記３の試薬を使用して製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、図７は、上記４の試薬を使用して製造した製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、それぞれ下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った結果である。
測定条件：
ＨＰＬＣ装置  
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
逆相ＨＰＬＣカラム
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＵＧ−５  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ＜４．６ｍｍφ  ｘ  ２５０  ｍｍ＞（野村化学社製）
カラム温度：４０℃
移動相
グラジエント：アイソクラティック２０分
５０ｍＭ  リン酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ３．０）：メタノール＝２０：１
移動相の流量：１ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
図１〜４の結果から、アシル化反応を促進するための活性化剤として２−ＤＭＡＰを使用した場合、ＮＭＩや４−ＤＭＡＰを使用した場合と比較してキャッピング効率が良好であることが明らかである。また、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤としてピリジンを使用するよりも２，６−ルチジンを使用したほうが、キャッピング効率が優れていることも確認された。
図５〜７の結果から、アシル化反応の活性化剤としてＮＭＩや４−ＤＭＡＰを使用した場合、少量ではあるが、保持時間が約８．５分のところに見られるグアノシン由来の２，６−ジアミノプリン体の生成が確認できた。一方、アシル化反応の活性化剤として２−ＤＭＡＰを使用した場合、顕著に２，６−ジアミノプリン体の生成が低減され、さらに、塩基をピリジンから２，６−ルチジンに変更することによって、２，６−ジアミノプリン体の生成が確認できなかった。
試験例２  キャッピング工程において使用するアシル化反応の活性化剤及びフェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤の効果２
市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを担持したＣＰＧ固相担体（３３３ｍｇ，１５μｍｏｌ）をグラスフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ：アプライドバイオシステムズ社）を使用して、オリゴ核酸（シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−チミジル−［３’→５’］−チミジン）の合成を行った。
核酸モノマー化合物として、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）を、縮合触媒としてベンジルメルカプトテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング工程に使用する試薬として下記表２に記載の３種類の試薬を使用し、核酸モノマー化合物を２０回縮合させた。
上記条件で製造した各オリゴＲＮＡに対し、切り出し剤としてアンモニア水：エタノール＝３：１を用いて、４０℃で４時間かけてＣＰＧ固相担体からの切り出し及び各リン酸部位、塩基部位の保護基の脱離反応を行った。各反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下、濃縮後、ニトロメタン１％を含む１ＭのＴＢＡＦ  ＴＨＦ溶液を用いて室温下、３時間反応させ、２’位水酸基の保護基の脱離反応を行った。次に、各反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を生成させた後、母液と沈殿を遠心分離した。デカンテーションによって母液を除去し、沈殿を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）にて不要ピークを除去後、溶出溶媒（１．０Ｍ  塩化ナトリウム水溶液を含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液）を用いて精製した。溶液を透析処理後、目的化合物を得た。上記各試薬を使用した場合におけるオリゴ核酸の収量及び収率を以下に示す。
【表２】
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得られた化合物が目的化合物であることは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、確認した。それぞれ、計算値：６６０７．０６  ［Ｍ＋Ｈ］＋に対して、各々実測値が、６６０７．６９  ［Ｍ＋Ｈ］＋、６６０９．９７  ［Ｍ＋Ｈ］＋、６６０７．９１  ［Ｍ＋Ｈ］＋であった。
以上から、キャッピング工程において、アシル化反応の活性化剤として２−ＤＭＡＰを、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤として２，６−ルチジンを使用することにより、オリゴ核酸の単離収率が格段に向上することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のキャッピング工程によれば、オリゴ核酸誘導体（２）に対して、十分満足できる効率でリボース５’位水酸基がアシル基で保護されたオリゴ核酸誘導体（１２）を製造することができる。
また、本発明のキャッピング工程によれば、アシル化反応の活性化剤として４−ＤＭＡＰを使用する場合のように、副生成物である２，６−ＤＡＰを生じない。
以上のとおり、本発明のキャッピング工程によれば、高純度でかつ簡便なオリゴ核酸の製造が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図２】図２は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図４】図４は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図５】図１は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図６】図２は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図７】図３は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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