(57)【要約】血管内皮依存性の血管拡張作用を有する血管拡張剤、動脈硬化予防剤及び日常的に連用可能で、安全性に優れ、血管内皮依存性の血管拡張作用を有する機能性食品を提供すること。本発明の血管拡張剤及び機能性食品は、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのトリペプチド又は、Val Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物を有効成分として含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチドを有効成分として含む血管拡張剤。
【請求項２】
Val Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物を有効成分として含む血管拡張剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮依存性の血管拡張作用を示す血管拡張剤及びこのような作用を示す機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化性疾患の終末像である心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患は、ガンと並んで我が国における死因の最も大きな割合を示している。動脈硬化の危険因子としては、高脂血症、高血圧、糖尿病、喫煙、肥満、高尿酸血症、加齢、ストレス等が挙げられ、それらが相互に絡み合って血管障害を引き起こす。このため、個々の危険因子の程度が軽度であっても、それらの重複により危険度が相加的、相乗的に増加し、虚血性疾患のリスクも高まる。
一方、上述の１つの危険因子作用を低下させることだけでは、動脈硬化の発症予防には至らないと考えられている。例えば、非特許文献１又は２には、血中コレステロール濃度と動脈硬化発症が相関しないことが、非特許文献３には、高血圧状態を抑制しても動脈硬化の程度に変化が見られないことが、また、非特許文献４には、エナラプリルを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤を投与しても動脈硬化抑制作用は見られないことが記載されている。更に、これらの結果として、梗塞性の虚血性疾患、例えば、急性心不全が発症した場合、非特許文献５によれば、血行動態の安定化を図るために、ニトロプルシッド、ニトログリセリン等の血管拡張剤や、利尿薬、強心薬等の薬剤が必要となる。
従って、例えば、特許文献１及び２において、トリペプチドのVal Pro Pro及びIle Pro Proが、血圧降下作用を示すアンジオテンシンＩ変換酵素の阻害活性を有すること、また、抗ストレス作用を有することが記載されているが、このことにより、該トリペプチドが、抗動脈硬化作用を有するとは言えず、また、血管拡張作用があるとは言えない。【０００３】
ところで、動脈硬化は、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態であり、近年、このような症状の要因の一つとして、血管内皮の損傷や機能低下が挙げられている。
従って、血管内皮に依存する血管拡張剤には、動脈硬化抑制作用が期待できる。
【特許文献１】特開平６−１９７７８６号公報
【特許文献２】特開平１１−１００３２８号公報
【非特許文献１】食の科学 257 (1999) p20−25
【非特許文献２】Atherosclerosis 151 (2000) p501−508
【非特許文献３】Circulation 104 (2001) p2391−2394
【非特許文献４】International Journal of Cardiology 81 (2001) p107−115
【非特許文献５】別冊・医学のあゆみ  循環器疾患-state of arts ver.2(2001) p332- 334
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、血管内皮依存性の血管拡張作用を有する血管拡張剤を提供することにある。
本発明の別の課題は、日常的に連用可能で、安全性に優れ、血管内皮依存性の血管拡張作用を有する機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチドを有効成分として含む血管拡張剤が提供される。
また本発明によれば、Val Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物を有効成分として含む血管拡張剤が提供される。
更に本発明によれば、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチドを有効成分として含み、血管拡張作用を有する機能性食品が提供される。
更にまた本発明によれば、Val Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物を有効成分として含む血管拡張作用を有する機能性食品が提供される。
また本発明によれば、血管拡張剤又は、血管拡張作用を有する機能性食品を製造するための、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチド、若しくはVal Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物の使用が提供される。
更に本発明によれば、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチド、若しくはVal Pro Pro及び／又はIle Pro Proを含有する蛋白質分解物を動物に有効量投与する血管の拡張方法が提供される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の血管拡張剤及び機能性食品は、獣乳カゼイン等に由来するVal Pro Pro及び／又はIle Pro Pro、更にはこれらの少なくとも一方を含む蛋白質分解物を有効成分として含むので、安全性に優れ、血管内皮依存性の血管拡張作用を示し、特に、機能性食品の場合は、常用的に摂取可能である。
従って、本発明の血管拡張剤は、心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患における血行の確保のために有用であり、また、そればかりではなく、加齢、生活習慣病等により収縮に偏った血管に弛緩をもたらし、動脈硬化予防や、血流障害に係る、肩こり、冷え性、血栓症等の予防が期待できる。また、本発明の機能性食品は、血管拡張、更には血流障害等に係る、肩こり、冷え性、血栓等の各種症状や疾病のための効能を表示した健康食品や特定保健用食品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１及び比較例１で行った、血管拡張試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１で行った、血管拡張反応の内皮依存性確認試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の血管拡張剤及び機能性食品は、Val Pro Pro及び／又はIle Pro Pro(以下これらトリペプチドをそれぞれVPP、IPPと略す)又はこれらの少なくとも一方を含む蛋白質分解物を有効成分として含む。
前記トリペプチドは、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、ナトリウム塩、リン酸塩等の無機酸塩、及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等の塩を付加したものであっても良い。
前記トリペプチドの調製法としては、例えば、VPP及び／又はIPPのアミノ酸配列を有するペプチド又は蛋白質を、微生物による発酵により分解精製する方法、酵素加水分解する方法が挙げられる他、合成法によっても得ることができる。詳細は前述の特許文献１及び２を参照することができる。従って、本発明に用いる有効成分としては、VPP及び／又はIPPのアミノ酸配列を有するペプチド又は蛋白質を、微生物により発酵した、VPP及びIPPの少なくとも１つのペプチドを含む発酵物又はその精製物、若しくはVPP及び／又はIPPのアミノ酸配列を有するペプチド又は蛋白質を、酵素により分解した、VPP及びIPPの少なくとも１つのペプチドを含む加水分解物又はその精製物等を用いることもできる。【０００９】
本発明の血管拡張剤の有効投与量は、その作用を単回投与により得るためには、ヒトの場合、１日あたり、トリペプチド量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、特に１ｍｇ〜１ｇ程度が好ましい。
血管拡張剤の投与は、その疾病の症状等により調整することができる。急性症状に対しては、単回及び持続的な非経口投与が適当である。また、慢性症状及び予防的な使用に対しては、３０日間以上常用的に経口摂取することが好ましい。【００１０】
本発明の血管拡張剤の投与方法は、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内等への投与が挙げられ、患部への直接投与も可能である。【００１１】
本発明の血管拡張剤の形態は、前記投与方法に応じて決定することができ、製剤の形態とすることができる。例えば、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、乳剤等が挙げられる。
前記製剤化は、例えば、適宜必要に応じて、薬剤として許容される担体、アジュバント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で製造する。【００１２】
本発明の機能性食品は、血管拡張、更には血流障害に係る各種疾病のための効能を表示又は宣伝しうる健康食品や特定保健用食品等とすることができる。
このような効能、特に血管拡張作用やそれに伴う疾病の改善作用を得るための摂取量は、機能性食品が、連用が可能であり、常用的に長期間摂取しうることを鑑みると、１日あたり、前記トリペプチド量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、特に１ｍｇ〜１ｇ程度が好ましい。また、１日あたりの摂取回数に応じて、機能性食品における１回あたりの摂取量を前記トリペプチド量換算で更に低くすることも可能である。【００１３】
本発明の機能性食品の摂取期間は、特に限定されず、慢性症状の改善や予防的な使用に関しては長期間摂取することが好ましい。上記効能を得るために、通常３０日間以上、特に３〜１２か月程度、常用的に摂取することが好ましい。
本発明の機能性食品は、有効成分としての前記トリペプチド、若しくは該トリペプチドを含む食品素材等を各種飲食品に配合する方法等により製造できるので、あらゆる飲食品の形態とすることができる。例えば、錠菓、ヨーグルト、乳飲料、乳製品、酒類、清涼飲料水、粉末又は顆粒状食品、カプセル食品、各種栄養強化又は補助食品などの形態にすることが可能である。また本発明の機能性食品には、通常、食品に添加可能な各種添加剤を配合することもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
合成例
IPP及びVPPを以下に示す有機化学合成法により合成した。合成は島津製作所製のペプチド自動合成装置(PSSM-8型)を用いた固相法によって行った。
固相担体として２−クロロトリチル(2-Chlorotrityl)タイプのポリスチレン樹脂であって、アミノ基をフルオレニルメチルオキシカルボニル基(以下Fmocと略す)で保護されたプロリンが結合した樹脂５０ｍｇを使用した(島津製作所社製 登録商標SynProPep Resin）。前記アミノ酸配列に従って、アミノ基がFmoc基で保護されたFmoc−Ile、Fmoc−Pro及びFmoc−Valを１００μｍｏｌづつ、常法に従い、ペプチド配列通り順次反応させてペプチド結合樹脂を得た。
次にこのペプチド結合樹脂を１ｍｌの反応液A(１０容量％酢酸、１０容量％トリフルオロエタノール、８０容量％ジクロロメタン)に懸濁し、室温で３０〜６０分間反応させてペプチドを樹脂から切離した後、反応液Aをガラスフィルターで濾過した。濾液の溶媒を減圧除去後、直ちに１ｍｌの反応液B(８２．５％容量トリフルオロ酢酸、３％容量エチルメチルスルフィド、５％容量純水、５％容量チオアニソール、２．５％容量エタンジチオール、２％容量チオフェノール)を加え、室温で６時間反応させて側鎖保護基を外した。これに無水エーテル１０ｍｌを加えてペプチドを沈殿させ、３０００回転、５分間遠心して分離した。その沈殿を無水エーテルにて数回洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチド全量を、０．１Ｎ塩酸水溶液２ｍｌに溶解した後に、Ｃ18の逆層カラムを用いたＨＰＬＣで、以下の条件に従って精製した。【００１５】
ポンプ：形式Ｌ６２００インテリジェントポンプ（日立製作所）、検出機：形式Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所）にて２１５ｎｍの紫外部吸収を検出カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ18（ウォーターズ社製）、溶出液：Ａ液；０．１重量％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液；０．１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル（Ｂ／Ａ＋Ｂ）×１００（％）：０→４０％（６０分）、流速：１ｍｌ／分。最大吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することにより目的とする合成ペプチドIPP及びVPPをそれぞれ５．７ｍｇ、６．５ｍｇ得た。精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（形式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、さらにアミノ酸分析装置（形式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。【００１６】
実施例１
（血管拡張試験）
ウィスター(Wistar)系ラットより胸部大動脈を摘出し、２mm幅で切断し、大動脈リングを作製した。該リングをマグヌス装置(ラボサポート社製、製品名マイクロティッシュオーガンバスMTB-1Z)に取付け、一定の張力をかけ平衡化させた。次いで、50mM KClにより大動脈リングの収縮反応を確認した。続いて、１μMフェニレフリン(Phenylephrine)にて大動脈リングを収縮させ、安定した収縮が得られた標本を、１μMアセチルコリンで、血管内皮依存性の拡張反応を観察し、内皮機能が保持されていることを確認した。
次に、１μMフェニレフリンにて大動脈リングを前収縮させた後、合成例で調製したVPP及びIPPを１０-9Mから１０倍ずつ濃度をあげて添加し、拡張反応を大動脈リングの張力の変化から観察した。また、拡張反応の用量依存性についても検討した。
その結果、VPP及びIPPによる血管拡張反応は、１ｍMから観察されはじめ、１０ｍMでは明確な一過性の血管拡張反応が確認された。結果を図１に示す。【００１７】
（VPP、IPPの血管拡張反応の内皮依存性確認試験）
VPP及びIPPの血管拡張性について血管内皮の関与を確認するために、血管内皮を常法により、物理的に除去した血管を比較対照として、VPPについて上記と同様な血管拡張試験を行った。その結果、血管拡張反応が内皮の除去により減弱したため、VPP及びIPPの血管拡張は、血管内皮依存性が高いことがわかった。結果を図２に示す。【００１８】
比較例１
トリペプチドVPP及びIPPの代わりに、アミノ酸のバリン(Val)又はプロリン(Pro)を、同濃度で用い、実施例１と同様に血管拡張試験を行った。
その結果、１０ｍMの拡張反応は、Val及びProの何れにおいても観察されなかった。結果を図１に示す。
以上のことより、VPP又はIPPの血管拡張作用は、ペプチドの状態で活性を有することがわかる。【００１９】
参考例
特開２００４−２４４３５９号公報によれば、各種ミルクタンパク質由来のタンパク質を加水分解して得られるペプチドを有効成分とする血管拡張性医薬組成物及び血管拡張性健康食品組成物が報告されている。VPP、IPPを含むアミノ酸配列は、β-カゼイン、κ-カゼインに存在することが知られているので、該公報に記載された製造例にて得られるペプチドにVPP、IPPが含まれるかどうかを確認した。
製造例のうち、β-カゼイン、κ-カゼインを含むタンパク質原料である市販の脱脂粉乳について試験した。即ち、脱脂粉乳１ｋｇを温水２リットルに懸濁させ、ｐH７．５に調整後、サモアーゼ(大和化成社製)４０ｇを加え、５０℃で１６時間反応させた。反応後、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、加水分解ペプチドを製造した。高速クロマトグラフ質量分析計(LC／MS)を用いて分析した結果、この中にVPP、IPPは検出されなかった。
以上の結果より、特開２００４−２４４３５９号公報において報告された血管拡張は、VPP、IPP以外の成分によるものであることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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