(57)【要約】生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症する表現型を持つ白髪発症モデル動物。この白髪発症モデル動物は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、エンドセリンレセプターＢ（Ｅｄｎｒｂ）遺伝子がヘテロ型に欠損するが、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つ非ヒト哺乳動物、より好ましくは齧歯目動物、特に好ましくはマウス又はラットである。    この発明により、ヒトの白髪発症のメカニズムの研究、白髪発症を防止できる製剤又は処置等の研究に最適な白髪発症モデル動物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症する表現型を持つ非ヒト哺乳動物である白髪発症モデル動物。
【請求項２】
前記白髪発症モデル動物が、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、エンドセリンレセプターＢ（Ｅｄｎｒｂ）遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つ請求の範囲１項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項３】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子が、ＲＦＰ遺伝子と活性化型ＲＥＴ遺伝子がハイブリッドされたＲＦＰ−ＲＥＴである請求の範囲２項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項４】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子がメタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結したものである請求の範囲２項又は３項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項５】
前記非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である請求の範囲１項〜４項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物。
【請求項６】
前記齧歯目動物がマウス又はラットである請求の範囲５項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項７】
活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入された非ヒト哺乳動物であるＲＥＴ−トランスジェニック動物と、同種の非ヒト哺乳動物であって、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物とを交配することにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項８】
前記ＲＥＴ−トランスジェニック動物が、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物である請求の範囲７項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項９】
前記非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である請求の範囲７項又は８項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１０】
前記齧歯目動物がマウス又はラットである請求の範囲９項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１１】
前記ＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物が、３０４系、３０４／Ｂ６系、１９２系又は２４２系として樹立されたＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスである請求の範囲７項〜１０項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１２】
請求の範囲７項〜１１項のいずれかに規定されたＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物に対して、そのＥｄｎｒｂ遺伝子をヘテロ型に欠損させる遺伝子ターゲティング操作を行うか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に欠損させると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入する遺伝子改変操作を行うことにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１３】
請求の範囲７項〜１１項のいずれかに規定されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物に対し、活性化型ＲＥＴ遺伝子をヘテロ型に導入する遺伝子導入操作を行うことにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１４】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子の遺伝子導入操作に当たり、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子を用いる請求の範囲１３項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１５】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物の交配により、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を安定的に継代させる白髪発症モデル動物の継代方法。
【請求項１６】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を用いて白髪発症のメカニズムを研究し、又は、前記白髪発症モデル動物に対し一定の物質の投与又は一定の処置を行って白髪発症に対する影響を研究する白髪発症の研究方法。
【請求項１７】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物に対し、白髪発症の制御手段たる白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段としての一定の候補物質の投与又は一定の処置を行って、白髪発症に対するそれらの手段の抑制効果又は促進効果を検定することにより、ヒト及び／又は非ヒト哺乳動物における白髪発症の制御手段のスクリーニングを行う白髪発症制御手段のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求の範囲１７項に記載のスクリーニング方法によって選抜された以下の（１）又は（２）の物質を白髪発症制御成分として含む白髪発症制御用組成物。
（１）白髪発症防止／抑制物質及び／又は白髪発症促進物質に対する拮抗物質
（２）白髪発症促進物質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白髪発症モデル動物、白髪発症モデル動物の樹立方法、白髪発症モデル動物の継代方法、白髪発症の研究方法、白髪発症御手段のスクリーニング方法、及び白髪発症制御用組成物に関する。
更に詳しくは本発明は、
（ａ）生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症すると言う表現型を持つモデル動物と、
（ｂ）このモデル動物を特定の遺伝子操作や交配を組み合わせることにより得るモデル動物の樹立方法と、
（ｃ）得られたモデル動物の交配により、同じ表現型を持つモデル動物の子孫を得るモデル動物の継代方法と、
（ｄ）このようなモデル動物の利用により成立する白髪発症の研究方法と、
（ｅ）これらの研究の一部として行われる白髪発症制御手段（白髪発症を防止／抑制又は促進する手段）のスクリーニング方法と、
（ｆ）スクリーニングされた白髪発症を防止／抑制又は促進する物質を白髪発症制御成分として含む白髪発症制御用組成物と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、外来機能遺伝子を導入したトランスジェニック動物の作製技術やＥＳ細胞等における遺伝子の相同組換えを利用した遺伝子ターゲティング（遺伝子ノックアウト）技術により、ヒトの各種疾患等をシミュレートして実験・研究できるモデル動物を作製する提案が種々に行われている。一般的にこのような目的に用いるモデル動物としては生物分類上ヒトに近い哺乳類動物が好適であり、特にマウスやラット等の齧歯目動物を代表例とする小型哺乳動物は、入手や取扱いが比較的容易で成長や世代交代が速い点からも最適である。
文献１：特開平９−１３１１４６号公報
文献２：特開２００１−２３１４０２号公報
上記の文献１や文献２は、上記のようなモデル動物の例を開示する。即ち、文献１は、メタロチオネインＩＩＡプロモーター制御下のｃ−ｍｙｃ遺伝子が導入されて精子形成不全となったトランスジェニックラットを開示し、文献２は、ラットのプロバシン遺伝子プロモーターの下流にＳＶ４０ラージＴ抗原の遺伝子を結合してなるトランスジーンを導入した前立腺癌発生モデルラットを開示している。このように、従来提案されて来たモデル動物は、癌や糖尿病等の重篤なヒト疾患に関連するものが圧倒的に多い。
ところで、一方では、ヒトの健康や生死に関しない美容上又は外見上の問題であるが、その問題の根本的な原因や対策が解明されておらず、しかもその問題を解消又は回避するための関連商品が大きな市場を形成している分野がある。その典型的な一例が、黒色や褐色等の濃色の毛髪を持つヒトの加齢に伴う白髪発症の問題である。
即ち、加齢に伴う白髪の発症を美容上／外見上から気にする人は昔から多く、例えば白髪染め剤が大きな市場を形成している。しかし、白髪染めは外見上の修飾に過ぎないし、毛髪が少し伸長すれば見栄えが悪くなるため染毛を繰り返す必要があり、その都度染毛の手間が掛かることもあって、必ずしも利用者に十分な満足を与えていない。
世間には、白髪防止効果をうたった薬品や、俗に白髪防止効果があるとされる食品等も散見される。しかし、白髪発症のメカニズム自体が未解明であるため、これらの薬品や食品は科学的な根拠に欠けるし、これらの薬品や食品の継続的な摂取者も多様な遺伝的素質を有し、かつ極めて多様な環境下で極めて多様な食生活を送っているため、これらの薬品や食品の効果に統計的又は経験的な信頼性も認めにくい。
従って、ヒトの白髪発症メカニズムを研究するための有効な実験手段が提供されたなら、即ち、生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色で加齢に伴い白髪を発症する好適なモデル動物が存在すれば、白髪発症やその制御手段（防止／抑制手段又は促進手段）の研究・開発が顕著に進展することが予想される。しかしながら、このようなモデル動物は未だ提供されていないし、提案もされていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、白髪発症の好適なモデル動物（特に、小型哺乳類であるモデル動物）を提供し、そのことによって、白髪発症の研究やその制御手段の開発を促進することを目的とする。
（第１発明）
本願の第１発明は、生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症する表現型を持つ非ヒト哺乳動物である、白髪発症モデル動物である。
例えばマウスの場合、生後一週間ほどで、はじめて毛がはえる。
第１発明の白髪発症モデル動物たる非ヒト哺乳動物は、生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症すると言う表現型上の特徴を持つ。この特徴は、黒色、褐色、亜麻色等の濃色系の毛髪を持って生まれたヒトが加齢と共に白髪を自然発症すると言うヒトの白髪発症と同じ特徴である。そして、同じ哺乳動物であるヒトとモデル動物とにおいて、白髪発症のメカニズムは本質的に同様であろうと考えられる。
従って、この白髪発症モデル動物を用いた白髪発症のメカニズムの研究から、ヒトの白髪発症の制御手段（白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段）に関する知見、少なくとも有力な参考知見が得られることはほぼ確実である。その結果、実験に基づく科学的な根拠や信頼性を伴って、各種の白髪制御用組成物（白髪発症防止／抑制物質、白髪発症促進物質、又は白髪発症促進物質に対する拮抗物質を含む組成物）が開発され、あるいは白髪発症の制御に有効な処置又は環境条件等が解明されることを期待できる。そのため、第１発明の白髪発症モデル動物は、製薬企業、化粧品メーカー、食品メーカー、医療機器メーカー、各種健康／美容サービス企業等にとって魅力的な研究ツールであり得る。
（第２発明）
本願の第２発明においては、前記第１発明に係る白髪発症モデル動物が、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、エンドセリンレセプターＢ（Ｅｄｎｒｂ）遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つ。
白髪発症モデル動物は、より好ましくは、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つモデル動物である。
下記の文献３等により、活性化型ＲＥＴ遺伝子が遺伝子導入されたモデルマウスが、ヘテロ型に遺伝子導入されたものも含めて公知である。それらのモデルマウスには、３０４系、１９２系又は２４２系として樹立されているトランスジェニックマウスラインも含まれる。しかし、それらのトランスジェニックマウスはいずれも、生下時より全身の皮膚が黒色を呈する等の表現型が認められるものの、一生を通じて毛色は変化しない。
文献３：Ｔａｋａｓｈｉ  Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍａｓａｈｉｄｅ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍａｓａｆｕｍｉ  Ｉｔｏ，Ｋｉｙｏｈｉｒｏ  Ｈａｍａｔａｎｉ，Ｍａｓａｈａｒｕ  Ｏｈｂａｙａｓｈｉ，Ｗｏｒａｗｉｄｔｈ  Ｗａｊｊｗａｌｋｕ，Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｉｓｏｂｅ，Ｉｚｕｍｉ  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，″Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ｃａｒｒｙ  ａ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ／ｒｅｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ″Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ．１０，ｎｏ．１１，ｐｐ３１６７−３１７６（１９９１）
下記の文献４等により、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型又はホモ型に欠損した遺伝子ターゲティングマウスが公知である。しかし、それらの遺伝子ターゲティングマウスは、一生を通じて毛色が変化しない。
文献４：Ｋｉｍｉｎｏｒｉ  Ｈｏｓｏｄａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｊａｍｅｓ  ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａｍｙ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂａｙｎａｓｈ，Ｊａｓｏｎ  Ｃ．Ｃｈｅｕｎｇ，Ａｄｅｌ  Ｇｉａｉｄ，Ｍａｓａｓｈｉ  Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，″Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ（Ｐｉｅｂａｌｄ−Ｌｅｔｈａｌ）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｂ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｍｅｇａｃｏｌｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｃｏａｔ  Ｃｏｌｏｒ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ″Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．７９，１２６７−１２７６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３０（１９９４）
従って、第２発明の遺伝子型を持つモデル動物（例えばモデルマウス）が、生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪に変化すると言う表現型を持つことは、上記活性化型ＲＥＴ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスからも、上記Ｅｄｎｒｂ遺伝子が欠損した遺伝子ターゲティングマウスからも、全く予測できない。これらのトランスジェニックマウスと遺伝子ターゲティングマウスとを概念上組み合わせて見ても、全く予測できない。
（第３発明）
本願の第３発明においては、前記第２発明に係る活性化型ＲＥＴ遺伝子がＲＦＰ遺伝子と活性化型ＲＥＴ遺伝子のハイブリッド遺伝子たるＲＦＰ−ＲＥＴである。ＲＦＰ遺伝子は公知である。
活性化型ＲＥＴ遺伝子の種類は必ずしも限定されないが、例えば、第３発明に係るＲＦＰ−ＲＥＴが好ましい。
（第４発明）
本願の第４発明においては、前記第２発明又は第３発明に係る活性化型ＲＥＴ遺伝子が、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結したものである。
上記した第２発明又は第３発明に係る白髪発症モデル動物において、活性化型ＲＥＴ遺伝子はモデル動物の動物種等をある程度考慮して適宜に選択されたプロモーターと連結して遺伝子導入され得るが、本願発明者の実験によれば、例えばモデル動物がマウスやラット等の齧歯目動物である場合には、メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター領域と連結して遺伝子導入することが好ましい。
（第５発明）
本願の第５発明においては、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である。
白髪発症モデル動物たる非ヒト哺乳動物の種類は限定されないが、小型哺乳動物であって入手や取扱いが比較的容易であり、成長や世代交代が速い齧歯目動物が特に好ましい。
（第６発明）
本願の第６発明においては、前記第５発明に係る齧歯目動物がマウス又はラットである。
上記した第５発明に係る齧歯目動物の種類も特に限定されないが、この種のモデル動物としての取り扱いのノウハウが蓄積されているマウスやラットが、とりわけ好ましい。
（第７発明）
本願の第７発明は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入された非ヒト哺乳動物であるＲＥＴ−トランスジェニック動物と、同種の非ヒト哺乳動物であってＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物とを交配することにより、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法である。
本願発明者は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入された非ヒト哺乳動物であるＲＥＴ−トランスジェニック動物と、これと同種の非ヒト哺乳動物であって、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物との交配により、子（Ｆ１）の世代において前記の白髪発症モデル動物が得られることを発見した。
そして、遺伝子型の解析を行った結果、白髪発症モデル動物は活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つことを見出した。
従来、このような表現型を持つ非ヒト哺乳動物は知られていないので、この表現型は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたと言う遺伝子型によって規定されている、と考えられる。
この点を逆に述べれば、このような遺伝子型を持つモデル動物であれば、上記した両親の交配と言う手段以外の手段で作出したものであっても、白髪発症モデル動物としての表現型を示すと言うことである。従って、第１２発明又は第１３発明のような白髪発症モデル動物の樹立方法も成立する。
因みに、メンデルの遺伝の法則に基づけば、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＲＥＴ−トランスジェニック動物と、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損したＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティング動物との交配により、下記（１）〜（４）の４通りの遺伝子型を持つＦ１世代が各々４分の１の確率で得られる。
（１）  ＲＥＴ／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／−）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子型。
（２）  ＲＥＴ／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／＋）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子が欠損していない遺伝子型。
（３）  ＋／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／−）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子は導入されず、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子型。
（４）  ＋／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／＋）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子は導入されず、Ｅｄｎｒｂ遺伝子が欠損していない遺伝子型。
なお、活性化型ＲＥＴ遺伝子がホモ型に遺伝子導入されたＦ１世代は、発生上の障害によって出産には到らない。又、上記の（４）の遺伝子型を持つＦ１世代は、遺伝子の改変されていない野性型マウスである。
上記した（２）、（３）、（４）の遺伝子型を持つＦ１世代は、生後はじめてはえる黒色の毛が一生を通じてほとんど変化せず、白髪発症モデル動物としては利用できない。
又、Ｅｄｎｒｂ遺伝子改変動物の作製に関して、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がホモ型に欠損したものは生後数ケ月以内に巨大結腸症により死亡する。
但し、Ｅｄｎｒｂ遺伝子ホモ型欠損動物に対して、腸間神経節で組織特異的に発現する公知のＤｂＨ（ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）プロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入することにより、巨大結腸症を防ぐことができる。又、Ｅｄｎｒｂ遺伝子ヘテロ型欠損動物に対して上記のＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入した場合も巨大結腸症を発症しない。これらのＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入した動物は、ＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子を連結したＤＮＡを動物受精卵に導入することにより作製することができる。
このようなマウスを、交配親としてのＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物として用いることも可能である。この方法を用いたＥｄｎｒｂ遺伝子ホモ型ノックアウト動物の巨大結腸症の予防方法は、ラットを用いた例が下記の「文献５」によって既に公知である。
文献５：Ｇａｒｉｅｐｙ  ＣＥ，Ｏｈｕｃｈｉ  Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＣ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＡ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｍ．，″Ｓａｌｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｔｓ″Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００  Ａｐｒ；１０５（７）：９２５−３３．
（第８発明）
本願の第８発明においては、前記第７発明に係るＲＥＴ−トランスジェニック動物が、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物である。
上記した第７発明で用いる交配親の一方として用いるＲＥＴ−トランスジェニック動物としては、例えば、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物を用いることができる。
（第９発明）
本願の第９発明においては、前記第７発明又は第８発明に係る非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である。
白髪発症モデル動物たる非ヒト哺乳動物の種類は限定されないが、小型哺乳動物であって入手や取扱いが比較的容易であり、成長や世代交代が速い齧歯目動物が特に好ましい。
（第１０発明）
本願の第１０発明においては、前記第９発明に係る齧歯目動物がマウス又はラットである。
上記の第９発明に係る齧歯目動物の種類も特に限定されないが、この種のモデル動物としての取り扱いのノウハウが蓄積されているマウスやラットが、とりわけ好ましい。
（第１１発明）
本願の第１１発明においては、前記第７発明〜第１０発明のいずれかに係るＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物が、３０４系、３０４／Ｂ６系、１９２系又は２４２系として樹立された、ＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスである。
上記した第７発明〜第１０発明において、ＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物の種類又は系統は特段に限定されないが、後述の実施例で述べるように、３０４系、３０４／Ｂ６系、１９２系又は２４２系として樹立されたＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスを好ましく用いることができる。
（第１２発明）
本願の第１２発明は、第７発明〜第１１発明のいずれかに規定されたＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物に対して、その動物のＥｄｎｒｂ遺伝子をヘテロ型に欠損させる遺伝子ターゲティング操作を行うか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に欠損させると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入する遺伝子改変操作を行うことにより、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法である。
白髪発症モデル動物の特徴的な表現型は、「活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された」と言う遺伝子型により規定される。このような遺伝子型は、第７発明のような所定のＲＥＴ−トランスジェニック動物と所定のＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物との交配以外の手段によっても実現可能である。例えば第１２発明のように、ＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物に対して、そのＥｄｎｒｂ遺伝子をヘテロ型に欠損させる遺伝子ターゲティング操作を行うか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に欠損させると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入する遺伝子改変の操作を行い、このような遺伝子型を持つ白髪発症モデル動物を樹立することができる、
（第１３発明）
本願の第１３発明は、第７発明〜第１１発明のいずれかに規定されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物（即ち、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物）に対し、活性化型ＲＥＴ遺伝子をヘテロ型に導入する遺伝子導入操作を行うことにより、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物を得る、白髪発症モデル動物の樹立方法である。
前記第１２発明の場合と同じ理由から、第１３発明のように、Ｅｄｎｒｂ遺伝子改変動物に対して活性化型ＲＥＴ遺伝子をヘテロ型に導入する遺伝子導入操作を行うことによっても、「活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された」遺伝子型を持つ白髪発症モデル動物を樹立することができる。
（第１４発明）
本願の第１４発明においては、前記第１３発明に係る活性化型ＲＥＴ遺伝子の遺伝子導入操作に当たり、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子を用いる。
前記した第１３発明において活性化型ＲＥＴ遺伝子の遺伝子導入操作を行うに当たり、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結してＭＴ／ＲＥＴ−トランスジーンとし、このトランスジーンを遺伝子導入することが特に好ましい。
（第１５発明）
本願の第１５発明は、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物の交配により、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物を安定的に継代させる、白髪発症モデル動物の継代方法である。
第１発明〜第６発明に係る白髪発症モデル動物は、第７発明〜第１４発明に係る種々の方法で樹立することができる。そして、これらのモデル動物同士を交配することにより、安定的に継代して保存することが可能である。
メンデルの遺伝の法則によれば、白髪発症モデル動物同士を交配することにより、「活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された」遺伝子型を持つ白髪発症モデル動物を得る確率は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がホモ型に導入されると死に到る点を考慮にいれると、実質的に３分の１であると言える。
（第１６発明）
本願の第１６発明は、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物を用いて白髪発症のメカニズムを研究し、又は、この白髪発症モデル動物に対して一定の物質の投与又は−定の処置を行って白髪発症に対する影響を研究する、白髪発症の研究方法である。
第１６発明のように白髪発症モデル動物を用いて、白髪発症のメカニズムの研究や、白髪発症の制御因子（白髪発症の促進因子又は防止／抑制因子）の研究等を行うことができる。その研究成果は、生物分類上ヒトに近い非ヒト哺乳動物に関するものであるから、ヒトに対しても直接に適用できる可能性がある。少なくとも、ヒトの白髪発症に対して有力な参考知見となることは確実である。
（第１７発明）
本願の第１７発明は、第１発明〜第６発明のいずれかに係る白髪発症モデル動物に対し、白髪発症の制御手段たる白髪発症の抑制手段又は促進手段としての一定の候補物質の投与又は一定の処置を行って白髪発症に対するそれらの手段の抑制効果又は促進効果を検定することにより、ヒト及び／又は非ヒト哺乳動物における白髪発症の制御手段のスクリーニングを行う、白髪発症制御手段のスクリーニング方法である。
第１７発明のように、白髪発症モデル動物を利用してヒトや非ヒト哺乳動物における白髪発症の制御手段（白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段）のスクリーニングを有効に行うことができる。このような制御手段としては、白髪発症制御成分（白髪発症の防止／抑制効果又は促効果を示す化合物）を錠剤や内服液剤等の薬剤の形態で投与し、又は白髪発症制御成分含有食品の形態で投与する物質だけでなく、特定の処置、生理的又は心理的影響を与える特定の環境条件や生活条件、等の広範囲のカテゴリーにわたる各種の手段が含まれ得る。
第１７発明のスクリーニング方法は、白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段の探索のために単独に行うこともできる。又、より簡易な（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏのレベルの）スクリーニング方法、及び／又は、より本格的な（例えば、本人の承諾を得た上でヒトに対する試用によって行う）スクリーニング方法等と組み合わせて行うこともできる。
（第１８発明）
本願の第１８発明は、第１７発明に係るスクリーニング方法により選抜された以下（１）又は（２）の物質を白髪発症制御成分として含む、白髪発症制御用組成物である。
（１）白髪発症防止／抑制物質及び／又は白髪発症促進物質に対する拮抗物質
（２）白髪発症促進物質
少なくとも第１７発明に係るスクリーニング方法を含むスクリーニングにより選抜された白髪発症の防止／抑制手段や促進手段の内、生体に対する投与物質として使用可能なものについては、白髪発症制御用組成物の有効成分として利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
第１図は、実施例で構築したプラスミドｐＭＴ／ｒｅｔの構成を示す。第２図は、実施例で構築したターゲティングベクター等の構成を示す。第３図は、実施例に係る白髪発症モデルマウスの写真である。第４図は、実施例に係る白髪発症モデルマウスの白髪発症の状況を経時的に示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
次に、本願の第１発明〜第１８発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
〔白髪発症モデル動物〕
本発明の白髪発症モデル動物は、非ヒト哺乳動物であって、生後はじめて生える毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症する。なお、ここに言う「ほぼ黒色」とは、「色彩がほぼ黒色（黒っぽいグレー）」である場合、及び／又は、「ごく一部に黒色でない（例えば白色の）毛の部分があっても、大部分が黒色」である場合を言う。より具体的には、生後はじめて生える毛の色が黒色ないしほぼ黒色であるが、生後１〜３ケ月頃から（個体により多少のばらつきがある）それらの毛が白色への変化を見せ始める。
このような毛の色の変化は、ヒトの白髪発症のパターンと同様に、マウス体表の全領域においてほぼ均一に、かつ徐々に起こる。即ち、白髪発症開始時期には黒毛に対して白髪が数本見られる程度であるが、生後８〜１２ケ月ほど経つと、白髪発症モデル動物のほぼ全ての毛が白髪になる。この経過は、ヒトの白髪発症の経過と非常に類似している。
上記のような表現型を持つ白髪発症モデル動物は、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつエンドセリンレセプターＢ（Ｅｄｎｒｂ）遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持っている。
非ヒト哺乳動物たる白髪発症モデル動物の動物種、又は特定の動物種における系統は特段に限定されないが、齧歯目動物が好ましく、特にマウス又はラットが好ましく、とりわけマウスが好ましい。
活性化型ＲＥＴ遺伝子の種類は限定されないが、好ましい一例として、ＲＦＰ遺伝子と活性化型ＲＥＴ遺伝子のハイブリッドたるＲＦＰ−ＲＥＴを挙げることができる。活性化型ＲＥＴ遺伝子は、例えばメタロチオネインＩプロモーター等の適宜なプロモーターの下流に連結されて遺伝子導入されている。活性化型ＲＥＴ遺伝子は前記の文献１等により公知であるが、その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
Ｅｄｎｒｂ遺伝子は、マウスでは１４番目の染色体に位置し、巨大結腸症の発症や色素細胞の分化・増殖に関与している。Ｅｄｎｒｂ遺伝子は前記した文献２等により公知であるが、その塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
本発明に係る白髪発症モデル動物は、実験用の適宜な非ヒト哺乳動物に対して、上記の遺伝子型が得られるように、トランスジェニック動物の作製方法、遺伝子ターゲティング方法あるいは交配を適宜に組み合わせて実施すれば樹立することができる。これらの操作自体は専門的な知識と技術を有する当業者にとって特段に困難なものではない。
これらの白髪発症モデル動物は愛知県春日井市の学校法人中部大学にて飼育・管理されている。又、白髪発症モデル動物を１回の交配により作製することが可能な親動物の凍結受精卵及び凍結精子は、国立大学法人熊本大学の生命資源研究・支援センター（ＣＡＲＤ）に保存されている。親動物とは、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入された非ヒト哺乳動物であるＲＥＴ−トランスジェニック動物、及び、これと同種の非ヒト哺乳動物であって、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物である。
上記した本発明に係る白髪発症モデル動物や、親動物の凍結受精卵／凍結精子の利用を希望する第三者は、妥当な条件と利用上の制約のもとに、それらの分譲を受けることが可能である。
〔交配による白髪発症モデル動物の樹立〕
白髪発症モデル動物を交配によって樹立する場合には、まず、非ヒト哺乳動物に活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＲＥＴ−トランスジェニック動物と、同じ種の非ヒト哺乳動物であってＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物とを準備し、これらを交配させれば良い。
上記のＲＥＴ−トランスジェニック動物を準備する方法は限定されないが、遺伝子導入の際に活性化型ＲＥＴ遺伝子に連結させるプロモーターとしては、例えば、メタロチオネインＩプロモーター（ＭＴプロモーター）を使用することができる。ＭＴプロモーターと連結された活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＭＴ−ＲＥＴ−トランスジェニックマウスは、例えば後述の実施例１の方法で準備することができる。活性化型ＲＥＴ遺伝子がホモ型に遺伝子導入されたトランスジェニックマウスは、通常は出産に到らない。
白髪発症モデル動物がマウスである場合においては、ＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスとしては、前記の文献１記載され又は後述の実施例に記載した、３０４系、３０４／Ｂ６系、１９２系又は２４２系のＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスを好ましく用いることができる。但し、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＲＥＴ−トランスジェニックマウスである限りにおいて、他の系統のＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスも用いることができる。
上記のＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物を準備する方法も限定されないが、例えば後述の実施例２の方法で、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損したＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティング動物を準備することができる。
因みに、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がホモ型に欠損したＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティング動物は、生後数ケ月以内に、巨大結腸症により死亡する。しかしながら、ＤｂＨプロモーター（ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅプロモーター）下にＥｄｎｒｂ遺伝子を導入することにより、このような巨大結腸症を防止することができる。Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損したＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティング動物においても、ＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入することができ、これらも巨大結腸症を発症しない。このようにして得たＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物も、交配親とすることができる。
〔遺伝子ターゲティングによる白髪発症モデル動物の樹立〕
白髪発症モデル動物は、第２の樹立方法として、まず活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＲＥＴ−トランスジェニック動物あるいはＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物を準備し、これらのトランスジェニック動物に対して、そのＥｄｎｒｂ遺伝子をヘテロ型に欠損させる遺伝子ターゲティング操作を行うか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に欠損させると共にＤｂＨプロモーター下にＦｄｎｒｂ遺伝子を導入する遺伝子改変操作を行うことによっても樹立することができる。
〔遺伝子導入による白髪発症モデル動物の樹立〕
白髪発症モデル動物は、第３の樹立方法として、まずＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物を準備し、このＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物に対して活性化型ＲＥＴ遺伝子（あるいは活性化型ＭＴ／ＲＥＴ遺伝子）を導入する遺伝子導入操作によっても、樹立することができる。
なお、通常の非ヒト哺乳動物に対する活性化型ＲＥＴ遺伝子（あるいは活性化型ＭＴ／ＲＥＴ遺伝子）の遺伝子導入においては、トランスジーンの導入数（コピー数）は２以上であることが多い。しかし、Ｅｄｎｒｂ遺伝子改変動物に対する活性化型ＲＥＴ遺伝子（あるいは活性化型ＭＴ／ＲＥＴ遺伝子）のノックインの手法を用いた遺伝子導入においては、そのコピー数は１である。この場合は、活性化型ＲＥＴ遺伝子のコピー数が少ないことにより、白髪を自然発症するモデル動物とはならない可能性もある。
〔白髪発症モデル動物の継代〕
上記の各種の方法により樹立された白髪発症モデル動物同士を交配させることにより、白髪発症モデル動物を安定的に継代させることができる。この場合、交配により白髪発症モデル動物を得る確率は、３分の１である。
〔白髪発症の研究方法〕
白髪発症モデル動物を用いて、各種の非ヒト哺乳動物やヒト等の白髪発症に関する種々の研究を行うことができる。第１に、殆ど解明されていない白髪発症のメカニズム自体を研究できる。第２に、白髪発症のメカニズムの解明と関連して、白髪発症モデル動物に対する一定の物質の投与が、白髪発症に対して抑制的に働くか、促進的に働くか、あるいは白髪発症に関連しないか、等を具体的に確認できる。第３に、白髪発症モデル動物に対する一定の処置（各種の環境条件や生活条件の付与等）が、白髪発症に対して抑制的に働くか、促進的に働くか、あるいは白髪発症に関連しないか、等を具体的に確認できる。
〔白髪発症制御手段のスクリーニング方法〕
白髪発症の研究におけるより実用的な研究の形態として、白髪発症に対して抑制的又は促進的に働く各種の白髪発症制御手段をスクリーニングすることができる。
即ち、白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段としての一定の候補物質の投与又は一定の処置を行って、白髪発症に対するそれらの手段の抑制効果又は促進効果を検定することにより、ヒト及び／又は非ヒト哺乳動物における白髪発症の制御手段（抑制／防止手段又は促進手段）のスクリーニングを行うことができる。このようなスクリーニングが、本発明の白髪発症モデルマウスの提供により、初めて可能になった
〔白髪発症制御用組成物〕
上記のスクリーニング方法により、白髪発症に対して抑制的に働く物質が確認された場合、その物質を有効成分として含む薬剤、食品、化粧品等の白髪発症制御用（白髪防止用）組成物を提供することができる。
又、白髪発症に対して促進的に働く物質が確認された場合、この物質（アゴニスト）に対して拮抗的に働く物質（アンタゴニスト）を究明して、このような拮抗物質を有効成分として含む薬剤、食品、化粧品等の白髪発症制御用（白髪防止用）組成物を提供することができる。
更に、白髪発症に対して促進的に働く物質自体、白髪発症の重要な研究ツールとなるし、中途半端な白髪状態（いわゆる「ゴマシオ頭」）を嫌う人にとっては、完全な白髪状態への移行を促進する成分として有用である場合が想定されるから、このような白髪発症促進物質を有効成分として含む薬剤、食品、化粧品等の白髪発症制御用（白髪促進用）組成物を提供することができる。
【実施例】
【０００６】
次に本願発明の実施例を説明する。本願発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。
〔実施例１：ＭＴ／ＲＥＴトランスジェニックマウスの作製〕
以下に述べる実施例１のＭＴ−ＲＥＴ−トランスジェニックマウスの作製は、基本的に前記の文献１の方法に準拠したものである。但し、後述の３０４／Ｂ６系マウスに関しては、下記の文献６に記載されている。
文献６：Ｋａｔｏ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，Ａｋｈａｎｄ  ＡＡ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｄａｉ  Ｙ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｉ，″Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ″Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９８  Ｏｃｔ８；（１４）：１８８５−８．
（プラスミドの構築）
マウスのメタロチオネインＩ（ＭＴ−Ｉ）プロモーターを含んでいる１．７ｋｂのＥｃｏＲ１−Ｂｇ／ＩＩ断片をプラスミドｐＭＫ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）から切り出し、プラスミドｐＵＣ８のポリリンカーサイトにサブクローンした。次に、ｐＳＶ２ＲＥＴＴプラスミド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）におけるＳＶ−４０制御領域に相当する３４０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、上記のｐＵＣ８にサブクローニングされたＭＴ−Ｉプロモーターを含むＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片で置き換えて、プラスミドｐＭＴ／ＲＥＴを構築した。このプラスミドｐＭＴ／ＲＥＴは、ＭＴ−Ｉプロモーター領域と連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子であるトランスジーンＭＴ／ＲＥＴを含んでいる。
第１図に、ｐＭＴ／ＲＥＴの構成を示す。第１図において、ボックス１はマウスのメタロチオネインＩプロモーター（ＭＴ−Ｉ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を、ボックス２は活性化型ＲＥＴ遺伝子のｃＤＮＡを、ボックス３はＳＶ−４０のシークエンスを、ライン４はベクターのシークエンスをそれぞれ示す。図示された制限酵素（エンドヌクレアーゼ）の表記はＢ：ＢａｍＨＩ、ＢＧ：Ｂｇ／ＩＩ、Ｅ：ＥｃｏＲ１、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＰＳ：ＰｓｔＩ、ＰＶ：ＰｖｕＩ、Ｓ：ＳｍａＩ、Ｔ：Ｔｔｈ１１１Ｉである。図における右向き矢印はＨｉｎｄＩＩＩサイトの８４ｂｐ上流側に位置する転写開始点を示す。
（トランスジェニックマウスラインの樹立）
国立大学法人名古屋大学医学部の動物実験施設より提供を受けたＢＣＦ１マウス（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６）×ＢＡＬＢ／ｃ受精卵に対して、６．９ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＰｖｕＩ断片（ｐＭＴ／ＲＥＴ）のマイクロインジェクションを行い、これらの受精卵を偽妊娠させたＤＤＹの雌に移植することにより、ＭＴ／ＲＥＴトランスジーンを遺伝子導入された１７個体のファウンダー（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスを得た。マイクロインジェクションの方法、胚移植、及びＤＮＡ分析は、ホーガンらの方法（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に従った。
これらのファウンダーマウスの内、次の４系統であって、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたものをＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスとして樹立した。３０４系マウスが作製されてから数年後、３０４系とＣ５７ＢＬ／６系マウスの交配を繰り返すことにより３０４／Ｂ６系が作製された。これら４系統のＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスは、いずれも一生を通じて体毛の毛色が変化しない。但し、老齢期に１％程度の白髪が混じることはある。
１）  １９２系：雌、トランスジーンのコピー数が１４、皮膚黒色症（メラノーシス）及びメラノサイト系腫瘍を必ず発症する。
２）  ２４２系：雄、トランスジーンのコピー数が４、皮膚黒色症が見られるが腫瘍は発症しない。
３）  ３０４系：雄、トランスジーンのコピー数が５、皮膚黒色症及びメラノサイト系腫瘍を必ず発症する。
４）  ３０４／Ｂ６系：上記の３０４系のＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスに対してＣ５７ＢＬ／６マウスを交配して得たものである。生後３〜４ケ月位で良性メラノサイト系腫瘍を必ず発症する。
〔実施例２：Ｅｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングマウスの作製〕
本実施例に係るＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングマウスの作製は、前記した文献２の方法に従う。以下に、その概要を述べる。
（遺伝子ターゲティングベクターの構築）
第２図の「Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅ（野性型対立遺伝子座）」として、マウスのゲノムＤＮＡにおけるＥｄｎｒｂエクソン３を包含する部分のマップを示す。マップ中のＨ、Ｓ、Ｂ等のローマ文字は特定の制限酵素の認識部位を示し、Ｂ：ＢｇＩＩＩ、Ｅ：ＥｃｏＲ１、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ：Ｓａｌｌ、Ｐ：ＰｓｔＩである。
第２図の「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ターゲティングベクター）」として、マウスＥＳ細胞のＥｄｎｒｂ遺伝子をターゲティングするために構築した組み換え用ベクターを示す。この組み換え用ベクターは、クローニングしたマウスのゲノムＤＮＡにおけるＥｄｎｒｂエクソン３を包含している４．２ｋｂの部分をネオマイシン抵抗性カセット（「ｎｅｏ」と表記）で置き換え、かつポジティブ／ネガティブ選抜のために構築物の３’末端にｔｋカセット（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）を付加した（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）ものである。
所期のＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングが起こった場合のゲノムＤＮＡ部分を、第２図の「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ（ｅｄｎｒｂ）」として示す。第２図の下部には、サザンブロッティング用のプローブとＰＣＲプライマーのロケーションを併せ示した。
（遺伝子ターゲティングマウスの作製）
ＪＨ−１マウスＥＳ細胞ライン（Ｒｏｓａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）をｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ上で培養し、上記したＥｄｎｒｂ遺伝子をターゲティングベクターと共にエレクトロポレーションを施行した。次いで、「Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３」の記述に準じて、上記したｔｋカセットを利用したＧ４１８とＦＩＡＵに対する二重抵抗性検定によって、ＥＳ細胞の選抜を行った。
二重抵抗性のＥＳ細胞クローンは、所定の５’ｎｅｏプライマーと３’プライマーによってスクリーニングを行った。胚盤胞のマイクロインジェクションとキメラマウスの作成は、「Ｒｏｓａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３」の記述に従った。本実施例において、記載していない詳細な部分は、いずれも前記した文献２に準じて行った。
得られたＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングマウスの内、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がホモ型に欠損した遺伝子ターゲティングマウスは、メラノサイト増殖及びメラニン産生が阻害され、成長する前に、巨大結腸症を発症して死亡した。Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損したＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングマウスにおいては、メラノサイト増殖及びメラニン産生は外見上野性型と変わりなく、巨大結腸症を発症せずに成長したので、白髪発症モデルマウスの一方の親として下記の交配に供した。
なお、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がホモ型に欠損した遺伝子ターゲティングマウスでは、生後はじめて生える毛は大部分が白色で、一部黒色の斑点が混じる状態であった。Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子ターゲティングマウスでは、生後はじめて生える毛が全て黒い毛であった。
〔実施例３：交配〕
実施例１で得た３０４／Ｂ６系のＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウス（活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたもの）と、実施例２で得たＥｄｎｒｂ遺伝子ターゲティングマウス（Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損したもの）とを交配させた。
上記の交配により、理論的には下記（１）〜（４）の４通りの遺伝子型を持つＦ１世代が得られると考えられる。
（１）  ＲＥＴ／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／−）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子型。
（２）  ＲＥＴ／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／＋）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつＥｄｎｒｂ遺伝子が欠損していない遺伝子型。
（３）  ＋／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／−）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子は導入されておらず、かつＥｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子型。
（４）  ＋／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／＋）：即ち、活性化型ＲＥＴ遺伝子は導入されておらず、かつＥｄｎｒｂ遺伝子が欠損していない遺伝子型。
その結果、成長したＦ１世代として、上記（１）の遺伝子型を持つことが遺伝子型の解析によって確認されたモデルマウスを樹立することができた。このモデルマウスは、生後はじめて生えた毛の色が黒色であったが、生後１〜３ケ月を経過した頃から毛が白色への変化を見せ始め、幾分の個体差はあるものの、生後１２〜１８ケ月経過頃にはほとんどの毛が白色に変わった。
上記（１）の遺伝子型を持つ白髪発症モデルマウスであって、その毛が白色に変わった後の白髪発症モデルマウスの写真を第３図の（１）に示す。第３図の（２）には上記（２）の遺伝子型を持つマウスを、第３図の（３）には上記した（３）の遺伝子型を持つマウスを、第３図の（４）には上記（４）の遺伝子型を持つマウスを、それぞれ示す。第３図の（１）に示す白髪発症モデルマウスも、生後はじめて生えた毛は、第３図の（２）〜（４）に示すマウスと同様に、黒色ないしほぼ黒色であった。
次に、上記（１）の遺伝子型を持つ白髪発症モデルマウスにおける毛色の経時的変化を第４図に基づいて説明する。第４図に示す６匹のマウスは、それぞれ下記に述べる１）〜３）のマウスである。
１）第４図の「Ｃ」として示す右端のマウスは比較用に示したものであって、生後１５ケ月を経過した、上記（３）の遺伝子型「＋／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／−）」を持つマウスである。
２）第４図の「Ｂ」として示す右側から２番目のマウスも比較用に示したものであり、生後８ケ月を経過した、上記（２）の遺伝子型「ＲＥＴ／＋・Ｅｄｎｒｂ（＋／＋）」を持つマウスである。
３）第４図の右側から３番目〜６番目の４匹のマウスは、いずれも上記（１）の遺伝子型を持つ白髪発症モデルマウスであって、互いに月齢が異なるものである。即ち、第４図の「Ａ４」として示す右側から３番目のマウスが生後３ケ月を経過したもの、第４図の「Ａ３」として示す右側から４番目のマウスが生後６ケ月を経過したもの、第４図の「Ａ２」として示す右側から５番目のマウスが生後８ケ月を経過したもの、第４図の「Ａ１」として示す右側から６番目のマウスが生後１０ケ月を経過したものである。
第３図及び第４図から、本発明に係る白髪発症モデルマウスが、「生後はじめて生える毛の色が黒色ないしほぼ黒色であるが、加齢と共に白髪を自然発症する」と言う表現型を持つことが明瞭に認められる。
なお、第３図及び第４図は白黒写真であるため、黒毛のマウスの毛の一定の部分が、撮像用のフラッシュライトを反射して白っぽく写っているが、これらの白っぽく写った部分も、実際は黒色である。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によって、ヒトの白髪発症のメカニズムの研究や、白髪発症を有効に防止することができる製剤もしくは処置等の研究に最適な白髪発症モデル動物が提供される。
［配列表］
2007004337.tif 000002
2007004337.tif 000003
【図１】
2007004337.tif 000004
【図２】
2007004337.tif 000005
【図３】
2007004337.tif 000006
【図４】
2007004337.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月13日(2006.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生後はじめてはえる毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白髪を自然発症する表現型を持つ非ヒト哺乳動物であって、活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、エンドセリンレセプターＢ（Ｅｄｎｒｂ）遺伝子がヘテロ型に欠損した遺伝子型を持つか、あるいは活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入され、かつ、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入された遺伝子型を持つ白髪発症モデル動物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子が、ＲＦＰ遺伝子と活性化型ＲＥＴ遺伝子がハイブリッドされたＲＦＰ−ＲＥＴである請求の範囲２項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項４】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子がメタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結したものである請求の範囲２項又は３項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項５】
前記非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である請求の範囲１項〜４項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物。
【請求項６】
前記齧歯目動物がマウス又はラットである請求の範囲５項に記載の白髪発症モデル動物。
【請求項７】
活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入された非ヒト哺乳動物であるＲＥＴ−トランスジェニック動物と、同種の非ヒト哺乳動物であって、Ｅｄｎｒｂ遺伝子がヘテロ型に欠損するか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に欠損すると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子がホモ型又はヘテロ型に導入されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物とを交配することにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項８】
前記ＲＥＴ−トランスジェニック動物が、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子がヘテロ型に遺伝子導入されたＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物である請求の範囲７項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項９】
前記非ヒト哺乳動物が齧歯目動物である請求の範囲７項又は８項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１０】
前記齧歯目動物がマウス又はラットである請求の範囲９項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１１】
前記ＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物が、３０４系、３０４／Ｂ６系、１９２系又は２４２系として樹立されたＲＥＴ−トランスジェニックマウス又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニックマウスである請求の範囲７項〜１０項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１２】
請求の範囲７項〜１１項のいずれかに規定されたＲＥＴ−トランスジェニック動物又はＭＴ／ＲＥＴ−トランスジェニック動物に対して、そのＥｄｎｒｂ遺伝子をヘテロ型に欠損させる遺伝子ターゲティング操作を行うか、あるいはＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に欠損させると共にＤｂＨプロモーター下にＥｄｎｒｂ遺伝子をホモ型又はヘテロ型に導入する遺伝子改変操作を行うことにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１３】
請求の範囲７項〜１１項のいずれかに規定されたＥｄｎｒｂ遺伝子改変動物に対し、活性化型ＲＥＴ遺伝子をヘテロ型に導入する遺伝子導入操作を行うことにより、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を得る白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１４】
前記活性化型ＲＥＴ遺伝子の遺伝子導入操作に当たり、メタロチオネインＩ遺伝子をプロモーターとして連結した活性化型ＲＥＴ遺伝子を用いる請求の範囲１３項に記載の白髪発症モデル動物の樹立方法。
【請求項１５】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物の交配により、請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を安定的に継代させる白髪発症モデル動物の継代方法。
【請求項１６】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物を用いて白髪発症のメカニズムを研究し、又は、前記白髪発症モデル動物に対し一定の物質の投与又は一定の処置を行って白髪発症に対する影響を研究する白髪発症の研究方法。
【請求項１７】
請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の白髪発症モデル動物に対し、白髪発症の制御手段たる白髪発症の防止／抑制手段又は促進手段としての一定の候補物質の投与又は一定の処置を行って、白髪発症に対するそれらの手段の抑制効果又は促進効果を検定することにより、ヒト及び／又は非ヒト哺乳動物における白髪発症の制御手段のスクリーニングを行う白髪発症制御手段のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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