(57)【要約】  血中マーカーを用いて膵臓癌を診断および治療する新規方法を提供すること。  抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含有する膵臓癌の診断薬および治療薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含有する膵臓癌診断薬。
【請求項２】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＭＩＧＯ２タンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１記載の膵臓癌診断薬。
【請求項３】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＡＭＩＧＯ２抗体を反応させてＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１又は２記載の膵臓癌診断薬。
【請求項４】
標識した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与後画像診断によりＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１又は２記載の膵臓癌診断薬。
【請求項５】
膵臓癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である請求項１〜４のいずれか１項記載の膵臓癌診断薬。
【請求項６】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体の、膵臓癌診断薬の製造のための使用。
【請求項７】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＭＩＧＯ２タンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項６記載の使用。
【請求項８】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＡＭＩＧＯ２抗体を反応させてＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することにより診断されるものである請求項６又は７記載の使用。
【請求項９】
標識した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与後画像診断によりＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することにより診断されるものである請求項６又は７記載の使用。
【請求項１０】
被験者から採取された試料に抗ＡＭＩＧＯ２抗体を反応させ、当該試料中のＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することを特徴とする膵臓癌の診断方法。
【請求項１１】
被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である請求項１０記載の膵臓癌の診断方法。
【請求項１２】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体を有効成分とする膵臓癌治療薬。
【請求項１３】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＭＩＧＯ２タンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１２記載の膵臓癌治療薬。
【請求項１４】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項１２記載の膵臓癌治療薬。
【請求項１５】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である請求項１２記載の膵臓癌治療薬。
【請求項１６】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体の、膵臓癌治療薬の製造のための使用。
【請求項１７】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＭＩＧＯ２タンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１６記載の膵臓癌治療薬の使用。
【請求項１８】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である請求項１６記載の使用。
【請求項２０】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与することを特徴とする、膵臓癌治療方法。
【請求項２１】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＭＩＧＯ２タンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を利用した膵臓癌の診断薬及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌患者は、毎年増加する傾向にあり、２００１年の日本国内の年間死亡者数は、約２万人である。また、男性の癌死の第５位、女性の癌死の第６位をそれぞれ占めている。膵臓癌は予後が悪く、切除例の５年生存率は５〜２０％である。膵臓癌の予後が悪い原因は、癌病巣が２ｃｍ程度のときに、既に膵臓の外に浸潤をきたし、肝臓に転移するケースが多いためである。従って、膵臓癌は早期診断が非常に重要であるが、現在のところ膵臓癌が周囲臓器に浸潤する前に診断する方法は、存在していない。【０００３】
日本国内の全国調査では、最初に膵臓癌を発見した方法として、ＣＴが４４％と最も多く、超音波が４１％である。従って、現在この２つの検査方法が膵臓癌の診断に重要である。しかし、現在一般的に使用されているＣＴの場合、癌組織と非癌組織の区別がつきにくく、診断に熟練した技術を要する。膵臓癌の腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＥＡなどがある。これらのマーカーは、いずれも進行癌で陽性となるが、早期の診断率は低く、早期診断に有用と言えるマーカーはない。さらに、ＣＡ１９−９は肝炎、肝硬変、膵炎のような非悪性腫瘍でも血中濃度が上昇するため、膵臓癌の診断への使用は、適切ではないことが知られている。【０００４】
ＦＤＧ−ＰＥＴによる膵臓癌診断も実施されているが、検査コストが高いことや、画像の分解能が悪い、などといった問題がある。従って、ＰＥＴ検査の費用対効果や効率を考慮した場合、膵臓癌組織を特異的に認識するプローブを開発し、高精度な診断方法を開発することが望まれている。【０００５】
一方、膵臓癌の治療は、手術、化学療法、放射線療法により行われる。全症例のうち切除が可能なものは、４０％以下である。術後の５年生存率は５〜２０％と、極めて低い。手術による合併症の併発も多く、問題となっている。局所進展や遠隔転移によって見つかった膵臓癌の多くは、手術適応にはならず、化学療法や放射線療法を適応する。放射線療法は、消化管への負担が少ないため、外来でも施行可能であるため、近年では症例が増加する傾向にある。【０００６】
従って、膵臓癌診断においては、簡便かつ的確な検査が可能な新たな膵臓癌診断マーカーが求められている。また、膵臓癌の治療においては、非侵襲的で、かつ効果的な治療方法、すなわち、膵臓癌細胞に対して特異的に傷害を与える治療薬の開発が望まれている。【０００７】
近年、癌細胞に特異的に発現されているタンパク質を標的にした癌の診断および治療方法の開発が盛んである。すなわち、癌細胞に高発現であるが、正常組織では発現が少ないかあるいは発現していない細胞表面タンパク質をターゲットとして、血液および組織等を用いた診断および治療を行う方法である。既に、ハーセプチン等の診断および治療薬が臨床の場に提供され、多くの患者の治療に貢献しているが、さらに、他の癌についても特異的な治療薬の開発が望まれている。【０００８】
ＡＭＩＧＯ２は、同じファミリーであるＡＭＩＧＯ１及びＡＭＩＧＯ３と、アミノ酸数、ドメイン、及び遺伝子配列のホモロジーが極めて類似している。これらは全て、１回膜貫通型タンパク質で、シグナルペプチドを持つ。このことは、ＡＭＩＧＯ２タンパク質が膜タンパク質であると同時に、血液中にも分泌される可能性を示唆している。ＡＭＩＧＯファミリーのタンパク質の構造は、全て類似し細胞外に６つのｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を持ち、これらのドメインを挟むようにしてＬＲＲアミノ末端ドメインとＬＲＲカルボキシル末端ドメインが存在する。また、細胞外の膜貫通ドメインの近くには、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインが存在する。ＡＭＩＧＯファミリーは、神経組織に発現し、細胞接着分子として機能することが示唆されている（非特許文献１）。【０００９】
特許文献１および特許文献２には胃癌、甲状腺癌、乳癌、子宮癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌および脳腫瘍についてＡＭＩＧＯ２遺伝子発現亢進の記載があるものの、膵臓癌ではＡＭＩＧＯ２遺伝子発現が正常組織と差がないことを示している。さらに、これら文献における抗体を用いた実施例においては、ラット胎児脳における分化進展に伴うＡＭＩＧＯのタンパク質発現を免疫染色、免疫沈降、ウェスタンブロットにて確認しているにすぎず、具体的に抗ＡＭＩＧＯ２抗体が癌の診断や治療に使用できるとの記載はない。
【非特許文献１】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３  Ｍａｒ  １７；１６０（６９）：９６３−７３．
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／００３１６５パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０５５０５５パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
膵臓癌は他の癌と同様に、早期の治療が予後を決定付けるため、初期の癌を診断する必要がある。しかし、現在の技術では、膵臓癌を早期診断する技術は存在しない。一方、膵臓癌の手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが多い。また、放射線治療については、健常組織への被爆が問題である。【００１１】
本発明の目的は、精度良く、早期膵臓癌を診断する方法と、効果的な治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従来の研究では、膵臓癌組織にはＡＭＩＧＯ２遺伝子の発現が認められないと報告されていたが、意外にも、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果より、膵臓癌組織において、ＡＭＩＧＯ２遺伝子の発現量が正常な膵臓組織よりも多いことを見出した。さらに、ＡＭＩＧＯ２タンパク質に対する抗体を作製し、以下の目的に合致した抗体を選択した。
１）ＥＬＩＳＡ測定系用に選択した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ３１２２およびＰＰＺ３１３３により膵臓癌細胞株抽出液および培養液中に放出されたＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することに成功した。
２）また、免疫染色用に選択した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ２９１３、ＰＰＺ２９５２およびＰＰＺ３１３０では、膵臓癌患者摘出組織において、約８３％の患者で陽性であることが確認できた。
３）さらに、良好に細胞増殖に影響を及ぼす抗体として抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ２９１９、ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３１２４，ＰＰＺ３１３５およびＰＰＺ３１４８を選択した。
４）それら抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローンあるいは膵臓癌細胞株であるＰＫ−４５Ｐへの抗ＡＭＩＧＯ２抗体の投与において細胞傷害活性の指標とされるＣＤＣおよび／あるいはＡＤＣＣ活性を示した。
５）さらに、ｓｃｉｄマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、膵臓癌細胞株ＰＫ−４５ＰおよびＡＭＩＧＯ２強制発現膵臓癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ２のマウスへの生着および増殖を抗ＡＭＩＧＯ２抗体が抑制した。
６）また、膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを担癌させたｓｃｉｄマウスに蛍光物質で標識した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングによって腫瘍塊への抗ＡＭＩＧＯ２抗体の集積を確認できた。
７）細胞表面上に存在するＡＭＩＧＯ２に結合した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を介し、細胞傷害性を持つ物質がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることで細胞増殖抑制効果が認められた。
以上１）〜７）のことから、本発明を完成させるに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含有する膵臓癌の診断薬及び治療薬を提供するものである。【００１４】
また、本発明は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体の、膵臓癌診断薬の製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体の、膵臓癌治療薬の製造のための使用を提供するものである。【００１５】
また、本発明は、被験者から採取された試料に抗ＡＭＩＧＯ２抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与して、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することを特徴とする膵臓癌の診断方法を提供するものである。
さらに、本発明は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与することを特徴とする膵臓癌の治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
従来の代表的な癌の画像診断である、グルコース類似物質を用いた陽電子放出核種で標識した物質をプローブとするＰｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＤＧ−ＰＥＴ）は、膵臓癌の初期診断において偽陽性や偽陰性が多い。
本発明によれば、特異的に検出できる分子イメージング（ＰＥＴ）で行う方法および血液診断ならびにバイオプシーにより採取した組織を用いた診断（生検）が可能となり、早急に新たな治療計画の策定が可能となる。また、手術を伴わず、患者に負担をかけない膵臓癌の非侵襲的な治療の実施が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−ａ】ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３を用いたＡＭＩＧＯ２の遺伝子発現解析の結果を示す。：正常組織、非癌部におけるＡＭＩＧＯ２遺伝子の発現解析
【図１−ｂ】ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３を用いたＡＭＩＧＯ２の遺伝子発現解析の結果を示す。：臨床検体におけるＡＭＩＧＯ２遺伝子の発現解析
【図１−ｃ】ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３を用いたＡＭＩＧＯ２の遺伝子発現解析の結果を示す。：癌細胞株におけるＡＭＩＧＯ２遺伝子の発現解析
【図２】ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３ｐｌｕｓ２を用いた膵癌臨床検体におけるＡＭＩＧＯ２の遺伝子発現解析の結果を示す。
【図３】精製ｓＡＭＩＧＯ２の非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す。
【図４】市販の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を用いたＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）ライゼートおよび膵癌細胞株ライゼートのウェスタンブロットによる解析結果を示す。
【図５】ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図６】膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐのフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図７】ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を標的細胞としたＣＤＣ活性の定量的解析結果を示す。
【図８】膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを標的細胞としたＣＤＣ活性の定量的解析結果を示す。
【図９】抗ＡＭＩＧＯ２抗体による膵癌組織の免疫組織染色の結果を示す。
【図１０】膵癌細胞株をｓｃｉｄマウスに移植し形成された腫瘍塊の免疫染色の結果を示す。
【図１１】膵癌細胞株を移植したｓｃｉｄマウスにおける抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（サブクラスがＩｇＧ１の抗体群）の腫瘍生着・増殖抑制試験の評価結果を示す。
【図１２】膵癌細胞株を移植したｓｃｉｄマウスにおける抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（サブクラスがＩｇＧ２ａの抗体群）の腫瘍生着・増殖抑制試験の評価結果を示す。
【図１３】ＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ２および、野生株ＭＩＡ  ＰａＣａ２でのＡＭＩＧＯ２の免疫染色結果を示す。
【図１４】ＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株を移植したｓｃｉｄマウスにおける抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の腫瘍生着抑制に関する評価結果を示す。
【図１５】ＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株を移植したｓｃｉｄマウスにおける抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ３１２４の腫瘍増殖抑制に関する評価結果を示す。
【図１６】ＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株を移植したｓｃｉｄマウスにおける抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ３１４８の腫瘍増殖抑制に関する評価結果を示す。
【図１７】ｓｃｉｄマウスに膵癌細胞株を移植して形成させた腫瘍への抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の集積をｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングにより確認した結果を示す。
【図１８】抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体が細胞膜表面上のＡＭＩＧＯ２に結合することでエンドサイトーシスされることを確認した結果を示す。
【図１９】細胞傷害活性を持つ物質のコンジュゲート抗体によるＡＭＩＧＯ２発現細胞の増殖抑制効果を調べた結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明により、診断及び治療される疾患は、膵臓癌である。診断及び治療の対象となる動物は、ヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳類でも良い。【００１９】
本発明において膵臓癌診断を行う場合、被験者の血液中および臓器組織にＡＭＩＧＯ２タンパク質が検出された場合に、被験者が膵臓癌である可能性が高いと判定される。また、膵臓癌と診断された患者の血液あるいは組織中ＡＭＩＧＯ２タンパク質濃度を測定することにより、その患者が治療対象患者か否かを判定すること（治療対象患者の選択）ができる。さらに、膵臓癌の治療後、ＡＭＩＧＯ２タンパク質測定において、ＡＭＩＧＯ２タンパク質の量が術前より減少した場合、治療の経過が良好であると判定される。一方、治療後のＡＭＩＧＯ２タンパク質の量が低下しないあるいは増加する場合には、再発および転移があると判定される。膵臓癌診断は、画像診断、生検および血液診断により行うことができる。【００２０】
画像診断においては、標識した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を投与後画像診断によりＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することにより行うことができる。より具体的には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体に、標識物質として放射性同位元素で標識したプローブを被験者に投与し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで癌組織を検出することができる。使用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは陽電子放出放射性同位元素であり、さらに好ましくは１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ、１５Ｏ、９４ｍＴｃ、１２４Ｉである。抗ＡＭＩＧＯ２抗体への放射性同位元素の標識は、当業者公知の方法により行うことができる。【００２１】
生検により膵臓癌診断を行う方法としては、被験者から得られた臓器組織を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくは免疫染色である。免疫染色などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００２２】
生検により膵臓癌診断を行う他の様態として、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を一次抗体として使用した免疫組織学的染色法を行うことができる。具体的には、被験者から得られた検体を公知の方法によりパラフィンや凍結等により固定し、切片を作製する。次いで、切片を一次抗体として抗ＡＭＩＧＯ２抗体、二次抗体としてＩｇＧを認識するビオチン標識抗体をそれぞれ用いて処理する。二次抗体は、ＩｇＧを認識する公知の抗体を用いることができ、例えばウサギ抗ＩｇＧ抗体などを挙げることができる。二次抗体に標識物質を結合させ、それぞれの標識物質に適した公知の方法により、切片中のＡＭＩＧＯ２タンパク質の有無を検出する。また、二次抗体を使用せず、抗ＡＭＩＧＯ２抗体に標識物質を結合させ、免疫組織学的染色法を行うこともできる。標識物質は当業者公知の物質を用いることができるが、例えばペルオキシターゼ、ＦＩＴＣなどを挙げることができる。抗体と標識物質の結合は、当業者に公知の方法で行うことができ、具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した結合方法を挙げることができる。【００２３】
膵臓癌診断を行う他の様態としては、被験者から得られた血液、血清、または血漿を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００２４】
血液、血清、または血漿を検体とした膵臓癌診断方法としては、例えば、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＡＭＩＧＯ２抗体とタンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を介して支持体に結合したＡＭＩＧＯ２タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。【００２５】
本発明において抗ＡＭＩＧＯ２抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＡＭＩＧＯ２抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。【００２６】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体と試料中のＡＭＩＧＯ２タンパク質の結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用され、通常用いるｐＨの範囲であればよい。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体とＡＭＩＧＯ２タンパク質の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。【００２７】
本発明によるＡＭＩＧＯ２タンパク質の検出方法においては、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＡＭＩＧＯ２タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＡＭＩＧＯ２タンパク質を定量的に検出することも可能である。【００２８】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体を介して支持体に結合したＡＭＩＧＯ２タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＡＭＩＧＯ２抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＡＭＩＧＯ２抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。【００２９】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＡＭＩＧＯ２抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。【００３０】
具体的には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含む溶液をプレートまたはビーズなどの支持体に加え、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を支持体に固定する。プレート、またはビーズを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートまたはビーズに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＡＭＩＧＯ２抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートまたはビーズを洗浄し、支持体に残った標識抗ＡＭＩＧＯ２抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。【００３１】
本発明のＡＭＩＧＯ２タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＡＭＩＧＯ２抗体と、ストレプトアビジンを用いる方法を挙げることができる。【００３２】
具体的には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＡＭＩＧＯ２抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出する。【００３３】
本発明のＡＭＩＧＯ２タンパク質検出方法の他の態様として、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。【００３４】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＡＭＩＧＯ２抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＡＭＩＧＯ２タンパク質を、一次抗ＡＭＩＧＯ２抗体、および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。【００３５】
本発明のＡＭＩＧＯ２タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を感作した担体を用いてＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中にＡＭＩＧＯ２タンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。【００３６】
本発明のタンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ社製）等のバイオセンサーを用いることにより抗ＡＭＩＧＯ２抗体とＡＭＩＧＯ２タンパク質との結合をそれぞれ検出することが可能である。具体的には抗ＡＭＩＧＯ２抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ抗ＡＭＩＧＯ２抗体に結合するＡＭＩＧＯ２タンパク質を共鳴シグナルの変化としてそれぞれ検出することができる。【００３７】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。【００３８】
本発明の膵臓癌診断薬は、キットの形態であってもよい。本発明の膵臓癌診断薬は少なくとも抗ＡＭＩＧＯ２抗体を含む。該診断薬がＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。【００３９】
本発明の生検組織および血液などの試料を用いた診断用抗ＡＭＩＧＯ２抗体は、ＡＭＩＧＯ２タンパク質にそれぞれ特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、高感度で特異的な測定が可能であれば、市販されている抗体を使用してもよい。【００４０】
又、支持体に固定される抗ＡＭＩＧＯ２抗体と標識物質で標識される抗ＡＭＩＧＯ２抗体は、ＡＭＩＧＯ２タンパク質の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。【００４１】
本発明において膵臓癌の治療を行う場合、抗ＡＭＩＧＯ２抗体と膵臓癌細胞に発現したＡＭＩＧＯ２タンパク質を特異的に結合させ、膵臓癌細胞に傷害を与えることにより行うことができる。細胞傷害は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体の細胞傷害活性、例えばＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を利用することができる。【００４２】
本発明の膵臓癌治療および画像診断に用いられる抗体は、ＡＭＩＧＯ２タンパク質と特異的に結合する限り、モノクローナル抗体であればキメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体、ヒト抗体のいずれであっても良い。また、それら抗体は、膵臓癌に対する治療効果があれば、市販されている抗体を使用してもよい。好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。さらに、本発明で使用される抗体は、糖鎖を改変された抗体であっても良い。抗体の糖鎖を改変することにより、抗体の細胞傷害活性を増強できる。また、膵臓癌治療に用いられる抗体は、抗癌作用を有する抗体であれば良く、抗腫瘍効果のある物質を結合させた抗体でも良い。モノクローナル抗体に抗腫瘍効果を持つ薬物や放射性同位元素を結合させたモノクローナル抗体により、癌の治療が可能である。【００４３】
本発明における細胞傷害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明においてＣＤＣ活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。【００４４】
抗ＡＭＩＧＯ２抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる。例えば、予め標的細胞に取り込ませた放射性物質５１Ｃｒの放出を指標にした方法［Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＨＬＡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１４５，５４０．等］、予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標にした方法［Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ（ｃａｌｃｅｉｎ−ｒｅｌｅａｓｅ−ａｓｓａｙ），ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄｔｅｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７２，２２７．等］、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法［Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．ａｎｄ  Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  ＤＭ．（１９８３）Ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４，３１３．等］が報告されている。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で脾臓細胞を分離する。５−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍＬに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を５−１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて適宜希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
ＡＭＩＧＯ２を発現する細胞（ＡＭＩＧＯ２をコードする遺伝子で形質転換された細胞、膵癌細胞）を用意する。予め標的細胞に取り込ませた放射性物質５１Ｃｒの放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射体標識する。放射体標識後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。
予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は２５μＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ［３’，６’−Ｄｉ（Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−４’，５’−ｂｉｓ［Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ］ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ｔｅｔｒａａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ］とともに、細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で３７℃にて３０分間培養することにより蛍光標識する。蛍光標識後、細胞を５％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合には、細胞を濃度２×１０５／ｍＬに調製してそのまま用いる。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を５０μＬずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、１００μＬの上清を回収し、５１Ｃｒの放出を指標とする場合にはガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬＤ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの界面活性剤を加えて細胞を全溶解した試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標とする場合には蛍光プレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５２０ｎｍ）で蛍光強度を測定する。標的細胞に内在するＬＤＨの放出を指標とする場合には、ＬＤＨとＤｉａｐｈｏｒａｓｅの共役反応によってテトラゾリウム塩から生成される赤色のホルマザンをマイクロプレートリーダー（波長４９０ｎｍ）で測定する。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞５０μＬと、抗ＡＭＩＧＯ２抗体２０μＬを加え、氷上にて３０分間反応させる。その後、補体溶液１０μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、５０μＬの上清を回収し、放射活性などを測定する。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。【００４５】
さらに、抗ＡＭＩＧＯ２抗体は、膵臓癌治療薬として癌組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、癌細胞に傷害をもたらす薬物を結合させた抗体を投与することにより、癌部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。
薬物と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １；１０（１３）：４５３８−４９．）。抗体に結合させる薬物は、癌細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができるが、好ましくは抗癌剤と毒素であり、さらに好ましくはＣａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ、ＤＭ１、ＤＭ４、リシン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡである。【００４６】
膵臓癌治療に用いられる抗体は、ＡＭＩＧＯ２タンパク質と特異的に結合する抗体に、癌細胞に傷害をもたらす放射性同位元素を結合することにより、細胞傷害活性を付加あるいは増強させたものでもよい。抗体と放射性同位元素の結合は、当業者公知の方法により、行うことができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｍａｒ−Ａｐｒ；５（２）：１０１−４．）。利用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくはβ線やα線を放出する核種であり、さらに好ましくは１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙである。【００４７】
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いた膵臓癌治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；９（６）：７７３−８２．）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。【００４８】
本発明で使用される抗ＡＭＩＧＯ２抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＡＭＩＧＯ２抗体として、哺乳動物由来あるいはトリ由来モノクローナル抗体が好ましい。特に、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。【００４９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＡＭＩＧＯ２タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。【００５０】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＡＭＩＧＯ２タンパク質はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ  １８１８４７）に開示された遺伝子／アミノ酸配列（配列番号１及び２）を発現することによって得る。すなわち、ＡＭＩＧＯ２タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＡＭＩＧＯ２タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＡＭＩＧＯ２タンパク質を精製して用いることもできる。【００５１】
次に、この精製ＡＭＩＧＯ２タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＡＭＩＧＯ２タンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＡＭＩＧＯ２タンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ヒトＡＭＩＧＯ２遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のヒトＡＭＩＧＯ２タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるヒトＡＭＩＧＯ２タンパク質の部分および大きさは限られない。【００５２】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。【００５３】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００５４】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００５５】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。【００５６】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。【００５７】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【００５８】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００５９】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００６０】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。【００６１】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。【００６２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＭＩＧＯ２タンパク質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＡＭＩＧＯ２タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＡＭＩＧＯ２タンパク質を投与して抗ＡＭＩＧＯ２抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＡＭＩＧＯ２タンパク質に対するヒト抗体をそれぞれ取得してもよい（ＷＯ  ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ  ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ  ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ  ９４／０２６０２号パンフレット参照）。【００６３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００６４】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００６５】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＡＭＩＧＯ２抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＰＧＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。【００６６】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。【００６７】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。【００６８】
目的とする抗ＡＭＩＧＯ２抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。【００６９】
本発明で使用される抗ＡＭＩＧＯ２抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。【００７０】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。【００７１】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００７２】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＡＭＩＧＯ２タンパク質に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。【００７３】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００７４】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。【００７５】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。【００７６】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。【００７７】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＡＭＩＧＯ２抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【００７８】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＡＭＩＧＯ２タンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。【００７９】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。【００８０】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。【００８１】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。【００８２】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢＪ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。【００８３】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。【００８４】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００８５】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。【００８６】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。【００８７】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００８８】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。【００８９】
本発明の膵臓癌治療薬は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。【００９０】
経口投与用には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。【００９１】
非経口投与用には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、抗ＡＭＩＧＯ２抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。【００９２】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、抗ＡＭＩＧＯ２抗体は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。【００９３】
本発明の膵臓癌治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与するのが好ましい。
【実施例】
【００９４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００９５】
実施例１  ＤＮＡマイクロアレイによる各種癌細胞におけるＡＭＩＧＯ２遺伝子発現解析
膵癌において発現が亢進する遺伝子を探索するために、表１に示す各種ヒト組織および株化癌細胞におけるＲＮＡならびに分化度の異なる２４例の膵臓癌、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例の各摘出組織、および対照としての正常組織（摘出された膵臓癌組織の非癌部）４例よりレーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。【００９６】
上記全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ−１３３（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）に供しＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）に準じて遺伝子発現解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＡＭＩＧＯ２ｍＲＮＡ（プローブＩＤ：２２２１０８  ａｔ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）が正常膵臓（５２．９）と比較して、膵臓癌４例の内３例で発現スコア（３０４．０，１４８．７，４４８．９）がそれぞれ５．７倍、２．８倍、８．５倍と発現亢進していることが明らかとなった。（図１ａ，ｂ）。【００９７】
膵臓癌細胞株における解析において、ＡＭＩＧＯ２の発現は、Ｃａｐａｎ１，Ｐａｎｃ１，ＰＫ−４５Ｈ，ＰＫ−４５Ｐ，ＰＫ−５９およびＱＧＰ−１で発現スコア１００以上を示した（図１ｃ）。
摘出した膵臓癌組織に関して高分化型４例、中分化型１７例、低分化型３例ならびに正常膵４例、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例から調製した全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）で遺伝子発現解析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０での全遺伝子の発現スコアの平均値を１００としたときの各組織での発現スコアを示す。その結果、ＡＭＩＧＯ２ｍＲＮＡ（プローブＩＤ：２２２１０８  ａｔ  ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｌｕｓ２）は、正常膵、前癌病変、膵管内乳頭粘液性腫瘍、高分化型膵臓癌では発現スコアが低いのに対し、中分化型膵臓癌および低分化型膵臓癌で発現が亢進していることが明らかとなった（図２）。【００９８】
【表１】
2007122820.tif 000002
【００９９】
実施例２  ＡＭＩＧＯ２ｃＤＮＡのクローニング
ＡＭＩＧＯ２のｃＤＮＡは、膵臓癌細胞株ＰＫ−５９細胞由来のｃＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲ法によって増幅した。この時、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ  １８１８４７）の配列情報を元にＯＲＦ領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）を含む断片を増幅するように設計されたプライマーセットＡＭＩＧＯ２ＦＷ（配列番号３）とＡＭＩＧＯ２ＲＶ（配列番号４）を用いた。このＰＣＲ反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃−１５秒、６０℃−１５秒、６８℃−１２０秒、４０サイクルで行った。
その後、アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近い約１．６ｋｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、このゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて精製を行うことによって目的のＡＭＩＧＯ２の全長ｃＤＮＡ（以下、ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌｃＤＮＡ）を得た。【０１００】
実施例３  ＡＭＩＧＯ２の抗原の調製
（１）ＡＭＩＧＯ２の全長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
前述のＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＥｃｏＲＶ（ＴａＫａＲａ社製）で処理した後、同じくＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで処理したｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢにラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＦ４／ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌを得た。【０１０１】
（２）ＡＭＩＧＯ２の細胞外領域に相当する部分長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
ＡＭＩＧＯ２の全長ｃＤＮＡ（ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌｃＤＮＡ）をテンプレートにし、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ  １８１８４７）の配列情報を元にＡＭＩＧＯ２の細胞外領域に相当する部分のｃＤＮＡ断片（ｓＡＭＩＧＯ２ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたプライマーセットＡＭＩＧＯ２ＦＷ（配列番号３）とｓＡＭＩＧＯ２−Ｒｖ−ＫＹ（配列番号５）を用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃−１５秒、６０℃−１５秒、６８℃−９０秒、４０サイクルで行った。
アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近い約９００ｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて精製を行うことによって目的のｓＡＭＩＧＯ２ｃＤＮＡを得た。
このｓＡＭＩＧＯ２ｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ社製）で処理した後、同じくＫｐｎＩ／ＸｂａＩで処理したＭｙｃ−ＨｉｓＢにラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＦ４／ｓＡＭＩＧＯ２を得た。【０１０２】
（３）ＡＭＩＧＯ２全長タンパク質およびｓＡＭＩＧＯ２タンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０５  ｃｅｌｌのＣＨＯ細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４／ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌまたはｐＥＦ４／ｓＡＭＩＧＯ２と１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混合し、１５〜４５分間の室温におけるインキュベーションを行った後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌日に限界希釈法および選択試薬であるＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングを開始した。
ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯは、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロットおよびフローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用）を用いることにより、シグナルが強く、しかも増殖が良好なクローンを選択した。その結果、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）が得られ、ＥＸＺ１００５をモノクローナル抗体作製時のスクリーニングに使用した。
ｓＡＭＩＧＯ２発現ＣＨＯ細胞のスクリーニングは、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＭＡＢ２０８０）を用いたウェスタンブロットで培養上清中に分泌されるｓＡＭＩＧＯ２の濃度を解析することで行った。培養上清中への分泌量が多く、しかも増殖が良好なクローンを選択した結果、ｓＡＭＩＧＯ２発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ０９０２）が得られた。この選択されたｓＡＭＩＧＯ２発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ０９０２）を培養面積１，５００ｃｍ２のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム  （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてｓＡＭＩＧＯ２  Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  ｔａｇ融合タンパク質（以下、ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質として示す）の精製を行った。非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、９５％以上の純度であることが確認された（図３）。この精製された融合タンパク質をＰＢＳに対し透析を行い、免疫用抗原およびエピトープ同定などの解析用タンパク質として用いた。ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質の濃度は、既知濃度の純品のウシ血清アルブミンを検量線としたＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製キットを使用）で算出した。【０１０３】
（４）ＡＭＩＧＯ２のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインを発現する組み換えバキュロウイルスの作製
実施例２で調製したＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌｃＤＮＡをテンプレートにし、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ  １８１８４７）の配列情報を基にＡＭＩＧＯ２のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインに相当する部分のｃＤＮＡ断片（ＡＭＩＧＯ２／ＩｇｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたプライマーセットＢＳ／ＡＭＩＧＯ２／Ｉｇ−ＦＷ（配列番号６）とＢＳ／ＡＭＩＧＯ２／Ｉｇ−ＲＶ（配列番号７）を用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃−１５秒、６０℃−１５秒、６８℃−５０秒、４０サイクルの条件で反応させた。アガロースゲル電気泳動を行うことによって目的のサイズのｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて目的のＡＭＩＧＯ２ＩｇｃＤＮＡを得た。このＡＭＩＧＯ２ＩｇｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）によって３７℃で１時間処理した後、フェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿により回収した。このようにして調製したＡＭＩＧＯ２ＩｇｃＤＮＡを、ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて切断したｐＢａｃＳｕｒｆ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、トランスファーベクターｐＢＳ／ＡＭＩＧＯ２／Ｉｇを構築した。次いで、４μｇのｐＢＳ／ＡＭＩＧＯ２／Ｉｇを制限酵素ＢｐＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にて切断直鎖化した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示書に準じてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に導入し、ＡＭＩＧＯ２のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインとｇｐ６４の融合タンパク質発現組み換えバキュロウイルスを調製した。
上記により調製した組み換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞（２ｘ１０６個細胞／ｍＬ）にＭＯＩが５となるように加え感染させた後、２７℃で３日間培養した。ＡＭＩＧＯ２のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインとｇｐ６４の融合タンパク質を発現する発芽型バキュロウイルス（ＢＶ）は３日間培養後の培養上清より回収した。すなわち、培養液を８００ｘｇで１５分間遠心し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、回収した培養上清を４５，０００ｇで３０分間遠心した。沈殿物をＰＢＳで懸濁した標品をＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ−ＢＶ画分とし、後述する抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体のエピトープ同定に使用した。【０１０４】
実施例４  膵臓癌細胞株のウェスタンブロットによるＡＭＩＧＯ２の検出
市販の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＭＡＢ２０８０）を用いて、膵臓癌細胞株１２種（Ｃａｐａｎ１，ＫＬＭ１，ＭＩＡ  ＰａＣａ２，ＮＯＲ−Ｐ１，Ｐａｎｃ１，ＰＫ−１，ＰＫ−８，ＰＫ−９，ＰＫ−４５Ｈ，ＰＫ−４５Ｐ，ＰＫ−５９、ＱＧＰ−１）および陽性コントロールとしてのＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）の細胞ライゼート中のＡＭＩＧＯ２をウェスタンブロットにより検出した。すなわち、各細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ、２μｇ／ｍＬ  アプロチニン、２μｇ／ｍＬ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、２μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．８７ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．４））にて可溶化することで調製した細胞ライゼートを非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンに、膵臓癌細胞の場合は１０μＬ、陽性コントロールのＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）の場合は０．５μＬアプライした。
泳動終了後のゲルからタンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に転写し、一次抗体として抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を反応させ、次いで二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を反応させてＡＭＩＧＯ２を検出した。【０１０５】
その結果、分子量約７５〜６５ｋＤａの位置にＰＫ−４５Ｈ，ＰＫ−４５Ｐ，ＰＫ−５９およびＱＧＰ−１の細胞ライゼートにおいて強いバンドが検出され、Ｃａｐａｎ１，Ｐａｎｃ１，ＰＫ−１の細胞ライゼートにおいて弱いバンドが検出された。その他の細胞ライゼートにおいては、バンドはほとんど検出されなかった。この結果は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と相関し、ｍＲＮＡの発現スコアが高い細胞株においてのみＡＭＩＧＯ２タンパク質が検出された（図４）。陽性コントロールのＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）のライゼートで検出されたＡＭＩＧＯ２の分子量は約８５ｋＤａであり、膵臓癌細胞のそれと比較するとやや高分子量であるが、これは陽性コントロールのＡＭＩＧＯ２タンパク質のＣ末端側に付加されているＭｙｃ−Ｈｉｓ  ｔａｇ（分子量約３ｋＤａ）と、糖鎖構造の違いに基づくものと推察された。【０１０６】
実施例５  抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体によるＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株のフローサイトメトリー
上述の細胞ライゼートのウェスタンブロットでＡＭＩＧＯ２が検出されたＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いて、細胞膜表面にＡＭＩＧＯ２が発現しているか否かをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーで解析した。すなわち、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０６個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液（１％ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％  ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社製）に播種し市販の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（０．６μｇ／ｗｅｌｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を加えて、４℃で３０分間反応させた。
そしてＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、使用説明書に準じてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリーを実施した。抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の陰性コントロールには正常マウスＩｇＧを用いた。また、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を細胞に反応させる前に、ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質（５．１μｇ／ｗｅｌｌ）と抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を反応させることで、フローサイトメトリーでのピークシフトが消失するか否か調べた。【０１０７】
ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）での結果を図５に示した。抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を反応させることでピークシフトが観察され、このピークシフトは抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を事前にｓＡＭＩＧＯ２タンパク質と反応させることで消失した。膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐでの結果を図６に示した。ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）の結果と同様に、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を反応させることでピークシフトが観察され、このピークシフトは抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を事前にｓＡＭＩＧＯ２タンパク質と反応させることでほぼ消失した。【０１０８】
これらの結果より、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐの細胞膜表面上にＡＭＩＧＯ２タンパク質が発現していることが明らかとなり、抗ＡＭＩＧＯ２抗体作製においてスクリーニング用細胞として使用することとした。【０１０９】
実施例６  抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の作製
ＰＢＳに溶解した５０μｇのｓＡＭＩＧＯ２タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を等量混合してＭＲＬ／ｌｐｒマウス（三共ラボサービス）に腹腔内注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当のｓＡＭＩＧＯ２タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸを混合して腹腔内注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ１との細胞融合を行った。
ハイブリドーマ培養上清中の抗ＡＭＩＧＯ２抗体のスクリーニングは、実施例５の方法に従いＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いたフローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用）で行った。その結果、表２に示すように陽性ハイブリドーマ２８種が得られた。表中、ＩＭＳ（Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ）は陽性コントロールとして用いたｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を免疫したマウス抗血清（０．３μＬ／ｗｅｌｌ使用）を示し、ＮＭＳ（Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ）は陰性コントロールとして用いた免疫前のマウス抗血清（０．３μＬ／ｗｅｌｌ使用）を示す。【０１１０】
【表２】
2007122820.tif 000003
【０１１１】
次いで、これら２８種の陽性ハイブリドーマの培養上清について、実施例５の方法に従い膵臓癌細胞ＰＫ−４５Ｐを用いたフローサイトメトリーでの反応性を調べた。また、この実験においては、培養上清中に含まれる抗ＡＭＩＧＯ２抗体が、膵臓癌細胞ＰＫ−４５Ｐの細胞膜上に発現するＡＭＩＧＯ２に特異的に反応することを確認する目的で、各ハイブリドーマの培養上清を細胞に反応させる前にｓＡＭＩＧＯ２タンパク質（５．１μｇ／ｗｅｌｌ）を培養上清に添加し、培養上清に含まれる抗体が中和されてフローサイトメトリーでのピークシフトが減弱するか否か調べた。その結果、１種（ＰＰＺ２９２７）を除く２７種のハイブリドーマ培養上清において、ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質の添加によってピークシフトが減弱し、この２７種のハイブリドーマ培養上清中に含まれる抗体は膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐの細胞膜上に発現しているＡＭＩＧＯ２に特異的に結合することが確認された。【０１１２】
【表３】
2007122820.tif 000004
【０１１３】
続いて、表３に示したハイブリドーマのうち、ＰＰＺ２９２７を除く２７種のハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングし、最終的に２０種のクローンを確立した。次いでクローニング後のハイブリドーマをプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃ  ＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）の腹腔内に移植（１ｘ１０７個／匹）し、腹水を作製した。【０１１４】
実施例７  各種抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の精製とサブクラスの同定
実施例６で作製した腹水から、硫酸アンモニウムによる塩析およびＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によるアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製した。各精製抗体のサブクラスは、マウス・モノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて調べた（表４）。【０１１５】
【表４】
2007122820.tif 000005
【０１１６】
実施例８  ウェスタンブロットによる抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体のエピトープ同定
抗原としてｓＡＭＩＧＯ２タンパク質あるいはＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ−ＢＶ画分を還元及び非還元条件のサンプルバッファーで処理し、１レーン当たり１５０ｎｇ（ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質）あるいは５９０ｎｇ（ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ−ＢＶ画分）をアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動終了後、ゲル内のタンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に３８Ｖで１６時間転写した。転写膜を４０％ブロックエース（雪印）／ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、４０％ブロックエース（雪印）／ＴＢＳ液で３μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を室温で１時間反応させた後、膜をＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間ｘ３回洗浄した。
その後、１０％ブロックエース（雪印）／ＴＢＳで５，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を室温で１時間反応させた後、ＴＢＳＴで５分間ｘ３回洗浄を行った。最後にＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を作用させ、化学発光シグナルをＸ線フィルムに５分間感光させた。各抗原に対する抗体の反応性はバンドの濃淡で判定し、その結果を表５にまとめた。【０１１７】
【表５】
2007122820.tif 000006
【０１１８】
この結果から、ＰＰＺ２９０４，ＰＰＺ２９１２，ＰＰＺ２９１３，ＰＰＺ２９３６，ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３０１６，ＰＰＺ３１２２の７種の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体は、ＡＭＩＧＯ２のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメインに存在するエピトープを認識することが分かった。また、この７種のモノクローナル抗体は、還元下の抗原にも反応したことから、ジスルフィド結合によって形成されるＡＭＩＧＯ２の立体構造に依存しないエピトープを認識することも分かった。
ＰＰＺ３１３０は、ｓＡＭＩＧＯ２には反応するがＡＭＩＧＯ２−Ｉｇに反応しないことより、ＬＲＲアミノ末端ドメインからＬＲＲカルボキシル末端ドメインで構成される領域に存在するエピトープを認識することが分かった。ＰＰＺ３１３０も還元下の抗原に反応するので、ジスルフィド結合によって形成されるＡＭＩＧＯ２の立体構造に依存しないエピトープを認識することが分かった。【０１１９】
他の１２種の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（ＰＰＺ２９１９，ＰＰＺ２９２０，ＰＰＺ２９３７，ＰＰＺ２９５６，ＰＰＺ３００３，ＰＰＺ３１２４，ＰＰＺ３１２５，ＰＰＺ３１３３，ＰＰＺ３１３５，ＰＰＺ３１４５，ＰＰＺ３１４８，ＰＰＺ３１６０）は、いずれの抗原にも反応しなかった。この１２種のモノクローナル抗体はＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）に強く反応するが（表２参照）、ウェスタンブロットで反応しなかった。その理由として、これらモノクローナル抗体の認識するエピトープがＡＭＩＧＯ２の高次構造によって形成されておりＳＤＳに暴露されることでエピトープの構造が消失したことが考えられる。【０１２０】
実施例９  抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の解離定数の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用いてモノクローナル抗体の解離定数を測定した。まず、センサーチップＣＭ５に、抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＡｃｏｒｅ社）に対しアミンカップリング法を用いて固相化した。次に、各種抗ＡＭＩＧＯ２抗体を数百ＲＵ程度の固相化量となる様にＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）に０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたｂｕｆｆｅｒで調製した上でインジェクションし、抗ＡＭＩＧＯ２抗体を固定化した。次いで、ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を上記ｂｕｆｆｅｒに２５ｎＭから５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭの各濃度で調製したものをインジェクションし、結合・解離を測定した後、解析プログラム（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて解離定数を求めた。その測定結果を表６に示した。【０１２１】
【表６】
2007122820.tif 000007
【０１２２】
表６より、解離定数が１０−９オーダーの低い数値を示すＰＰＺ３１３３，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３０１６，ＰＰＺ２９５６，ＰＰＺ２９２０の５種のモノクローナル抗体は、ｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を捕捉する能力が高いので、ＥＬＩＳＡ法による血液あるいは組織中ＡＭＩＧＯ２測定系の構築に応用できる。【０１２３】
実施例１０  ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株に対する抗ＡＭＩＧＯ２抗体の細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）
ＣＤＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。【０１２４】
標的細胞として、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）および膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いた。これらの細胞をプレートから剥離後、２×１０５個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注して炭酸ガスインキュベーター中で一夜培養した。翌日、プレート底面に接着した細胞を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄した後、各ウェルに５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）を３０μＬずつ分注し、さらに実施例７の表４に示した精製抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体２０種それぞれを３０μＬ／ｗｅｌｌ（抗体濃度：１０．７μｇ／ｍＬ、反応時の抗体終濃度は４μｇ／ｍＬとなる）分注した後、氷上で３０分間インキュベーションした。
次いで、Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で１６倍に希釈した補体標品（標的細胞がＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）の場合）あるいは同培地で８倍に希釈した補体標品（標的細胞が膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐの場合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。反応停止後、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。なお、陽性コントロール（ＩＭＳ）としてｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を免疫したマウス抗血清（１００倍希釈）を、陰性コントロール（ＮＭＳ）として免疫前のマウス抗血清（１００倍希釈）を用いた。【０１２５】
細胞傷害活性は、以下の通り求めることができる。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：［各試料における吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｂ：［補体に由来するＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｃ：［標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｄ：［０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］【０１２６】
結果を表７に示した。ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いたＣＤＣ活性の測定値において、高いＣＤＣ活性（７０％以上）を示すものは１３クローン、低いＣＤＣ活性（７０％以下）を示すものは７クローンであった。膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いたＣＤＣ活性測定値において、高いＣＤＣ活性（１０％以上）を示すものは７クローン、低いＣＤＣ活性（１０％未満）を示すものは１３クローンであった。
ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いた場合と膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いた場合で各クローンのＣＤＣ活性値が必ずしも相関しないのは、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）と膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐの細胞膜上に発現しているＡＭＩＧＯ２タンパク質の量の差などによると想定される。実際、図５および図６の結果から、両者でのＡＭＩＧＯ２タンパク質の発現量の違いは明らかである。【０１２７】
【表７】
2007122820.tif 000008
【０１２８】
表７において、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いた場合と膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いた場合のいずれにおいても高いＣＤＣ活性を示した７種の抗体（ＰＰＺ２９１９，ＰＰＺ２９３７，ＰＰＺ３００３，ＰＰＺ３１２４，ＰＰＺ３１２５，ＰＰＺ３１３５，ＰＰＺ３１４８）について、定量的にＣＤＣ活性を求めるべく反応時の抗体濃度を２００〜０ｎｇ／ｍＬ［標的細胞としてＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いた場合］、２００〜０μｇ／ｍＬ［標的細胞として膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを用いた場合］となるように調製し、上述の方法でＣＤＣ活性を測定した。
ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を標的細胞に用いたときの結果を図７に示した。また、膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを標的細胞に用いた時の結果を図８に示した。図７および図８より、ＣＤＣ活性５０％を示すときの抗体濃度（ＥＣ５０、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を標的細胞に用いた場合）あるいはＣＤＣ活性２５％を示すときの抗体濃度（ＥＣ２５、膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを標的細胞に用いた場合）を求めたところ、表８のようになり、上位４種の抗体はＰＰＺ２９１９，ＰＰＺ３１２４，ＰＰＺ３１３５，ＰＰＺ３１４８であった。【０１２９】
【表８】
2007122820.tif 000009
【０１３０】
このように高いＣＤＣ活性を示した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体は、細胞傷害活性に基づく膵臓癌の治療薬として有用と考えられる。この４種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＰＰＺ２９１９（識別番号：ＰＰＭＸ０５０１，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０１７）、ＰＰＺ３１２４（識別番号：ＰＰＭＸ０５０２，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０１８）、ＰＰＺ３１３５（識別番号：ＰＰＭＸ０５０３，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０１９）、ＰＰＺ３１４８（識別番号：ＰＰＭＸ０５０４，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０２０）として（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した（受領日：平成１８（２００６）年９月８日）。
なお、ＣＤＣ活性を示さないモノクローナル抗体であっても、フローサイトメトリーで膵臓癌細胞の膜表面上に発現するＡＭＩＧＯ２への結合が確認されれば、抗体をアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させることで膵臓癌の治療薬として有用と考えられる。【０１３１】
実施例１１  ＥＬＩＳＡによるＡＭＩＧＯ２検出試薬の構築
実施例９の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体の解離定数の測定で、解離定数が１０−９オーダーの低い数値を示す、すなわちＡＭＩＧＯ２の捕捉能力が高いＰＰＺ３１３３，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３０１６，ＰＰＺ２９５６，ＰＰＺ２９２０の５種のモノクローナル抗体の組合せでＥＬＩＳＡによるＡＭＩＧＯ２検出試薬の構築を行った。
５種のモノクローナル抗体のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ（同仁化学）を用い、キット付属のマニュアルの用法容量に従い実施した。
Ｍａｘｉ  ｓｏｒｐ  ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に精製抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃一夜放置することで固相化した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）でウェルを洗浄し、４０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０（４０％  ＢＡ−ＴＢＳ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間放置することでプレート上の未吸着部分をブロッキングした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、４０％  ＢＡ−ＴＢＳで０．７３ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を１００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。
Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、１０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０（１０％ＢＡ−ＴＢＳ）で０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈したペルオキダーゼ標識抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＳＣＹＴＥＫ社）で暗所にて室温、３０分間反応させたのち、ＳＴＯＰ液（ＳＣＹＴＥＫ社）にて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度１．１以上を○、吸光度１．１未満０．６以上を△、吸光度０．６未満を×として評価した（表９）。【０１３２】
【表９】
2007122820.tif 000010
【０１３３】
表９において「○」を示した組合せについて、後述の実施例１２に記した膵臓癌細胞株の培養上清中に存在する可溶型ＡＭＩＧＯ２に対する反応性を検討した結果、ＰＰＺ３１２２とＰＰＺ３１３３の組合せが最も良好な反応性を示すことが分かった。【０１３４】
従って、ＥＬＩＳＡの組合せ検討で最も有用であった２種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＰＰＺ３１２２およびＰＰＺ３１３３をそれぞれ識別番号：ＰＰＭＸ０５０７，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０２３および識別番号：ＰＰＭＸ０５０８，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０２４として（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した（受領日：平成１８（２００６）年９月８日）。【０１３５】
実施例１２  ＥＬＩＳＡによる膵臓癌細胞ライゼートおよび培養上清中のＡＭＩＧＯ２の検出
実施例１１の結果より、ＰＰＺ３１３３を固相抗体、ＰＰＺ３１２２をペルオキシダーゼ標識抗体とした組合せで膵臓癌細胞ライゼートおよび培養上清中のＡＭＩＧＯ２の検出を試みた。
細胞がほぼコンフルエントに増殖してから４日目の細胞を用いて、細胞ライゼートおよび培養上清を以下のようにして調製した。
膵臓癌細胞ライゼートは、抽出用緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２μｇ／ｍＬアプロチニン、２μｇ／ｍＬ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、２μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．８７ｍｇ／ｍＬ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．４））で細胞を可溶化させることで調製し、４０％  ＢＡ−ＴＢＳで１０倍に希釈した標品をサンプルとした。膵臓癌細胞培養上清は、遠心分離（３，０００回転、１０分）で細胞を除去した上清を４０％ＢＡ−ＴＢＳで３倍に希釈した標品をサンプルとした。【０１３６】
Ｍａｘｉ  ｓｏｒｐ  ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）にＰＰＺ３１３３（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃一夜放置することで固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）でウェルを洗浄し、４０％  ＢＡ−ＴＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間放置することでプレート上の未吸着部分をブロッキングした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、上記のようにして調製した希釈後の膵臓癌細胞ライゼートおよび細胞培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、１０％  ＢＡ−ＴＢＳで０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈したペルオキシダーゼ標識ＰＰＺ３１２２を１００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ試薬で暗所にて室温、３０分間反応させたのち、ＳＴＯＰ液にて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
膵臓癌細胞ライゼートおよび培養上清中のＡＭＩＧＯ２の濃度は、既知濃度のｓＡＭＩＧＯ２タンパク質を検量線として算出した。膵臓癌細胞ライゼート中のＡＭＩＧＯ２は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット使用）で求めた全タンパク質濃度あたりのＡＭＩＧＯ２濃度として算出した。【０１３７】
その結果、表１０の通り細胞ライゼート中のＡＭＩＧＯ２は、ＭＩＡ  ＰａＣａ２において検出限界以下であったが、ＰＫ−１，ＰＫ−４５ＰおよびＰＫ−５９では、１．９ｎｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，４．４ｎｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，６．７ｎｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの濃度で検出された。この濃度は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３でのｍＲＮＡの発現スコアの程度にほぼ比例した。また、ＰＫ−１，ＰＫ−４５ＰおよびＰＫ−５９では、それぞれ１．９ｎｇ／ｍＬ、２．９ｎｇ／ｍＬ、２．４ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞培養液中にもＡＭＩＧＯ２が検出されたが、ＭＩＡ  ＰａＣａ２では検出限界以下であった。この事実は、細胞膜上に発現したＡＭＩＧＯ２が何らかの原因により切断され、可溶型ＡＭＩＧＯ２として細胞培養液中に遊離することを示している。さらには、被験者の血液あるいは体液を検体として、この可溶型ＡＭＩＧＯ２を検出することで、膵臓癌の診断の可能性が示唆された。【０１３８】
【表１０】
2007122820.tif 000011
【０１３９】
実施例１３  膵臓癌の免疫組織染色
予備実験として膵癌細胞株ＰＫ−４５ＰおよびＣａｐａｎ−１に対する免疫染色を試み、両者の細胞株あるいはいずれかの細胞株に対して反応性が認められた抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を用い、膵臓癌の臨床検体について免疫組織染色を実施した。
膵臓癌組織および正常膵臓組織の検体として、Ｆｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＰａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＆  Ｎｏｒｍａｌ  ＴＭＡ（ホルマリン固定後パラフィン包埋標本を厚さ５μｍの組織切片としてマウントされている）を用いた。具体的には以下のように実施した。
組織スライドを１００％キシレンに５分間ずつ３回浸漬することで脱パラフィンし、続いて１００％エタノールに１分間ずつ２回浸漬、９０％エタノールに１分間、１回、さらに７０％エタノールに１分間、１回浸漬することで親水化を行った。その後、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で５分間ずつ３回洗浄した後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬しオートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）によって抗原を賦活化した。抗原の賦活化後、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、内在性のペルオキシダーゼを失活させるために０．３％過酸化水素加メタノール中で室温１５分間反応させた。
次いで、蒸留水で１回洗浄後、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄し、４０％ブロックエース（雪印乳業）含むＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）でブロッキングした（室温、３０分間）。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、１０％ブロックエースを含むＴＢＳで２０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を４℃で一夜反応させた。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、ＰＢＳで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を二次抗体として室温で１時間反応させた。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、ＤＡＢ（３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩）を用いて発色させた。また、核の対比染色にはヘマトキシリンを用いた。【０１４０】
図９に示したようにＰＰＺ２９１３，ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１３０の３種の抗体によって、膵臓癌組織に発現亢進するＡＭＩＧＯ２を特異的に免疫染色できることが分かった。また、組織アレイ上にスポットされている膵臓癌組織６６検体について、ＡＭＩＧＯ２発現のランク付けをヒストファインＨＥＲ２キットの染色の度合いによる基準に従い行った。４段階の判定スコアは以下の通りとした。
判定スコア０は、検体組織中の腫瘍細胞の中でＡＭＩＧＯ２陽性を呈している細胞がないか、あるいはＡＭＩＧＯ２陽性細胞数が１０％に満たないもの。判定スコア１＋は、検体組織中の腫瘍細胞の中でＡＭＩＧＯ２陽性を呈している細胞が１０％以上あるが、腫瘍細胞の一部の膜に限局した弱い染色強度を有するもの。判定スコア２＋は、検体組織中の腫瘍細胞の中でＡＭＩＧＯ２陽性を呈している細胞が１０％以上あり、腫瘍細胞の膜に限局した中程度の染色強度を有するもの。判定スコア３＋は、検体組織中の腫瘍細胞の中でＡＭＩＧＯ２陽性を呈している細胞が１０％以上あり、腫瘍細胞の膜に限局した強度の染色強度を有するもの。
このスコア付けに従って、膵臓癌組織６６検体を分類したところ、スコア０は２４検体（３６％）、スコア１＋は２８検体（４２％）、スコア２＋は９検体（１４％）、スコア３＋は５検体（８％）であった。
スコア１＋以上を染色陽性とすると計４２検体となり、陽性率は６４％であった。さらに厳しく、スコア２＋〜スコア３＋に分類される検体をＡＭＩＧＯ２過剰発現と判断すると、計１４検体であり、陽性率は２１％であった。【０１４１】
ＰＰＺ２９１３、ＰＰＺ２９５２およびＰＰＺ３１３０のそれぞれを識別番号：ＰＰＭＸ０５０９，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０３７、識別番号：ＰＰＭＸ０５１０，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０３８および識別番号：ＰＰＭＸ０５１１，受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０３９として（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した（受領日：平成１８（２００６）年９月２７日）。【０１４２】
実施例１４  ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）に対する抗ＡＭＩＧＯ２抗体の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
ＡＤＣＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。【０１４３】
エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈマウス（８週齢、オス、埼玉実験動物）から脾臓を摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾細胞を分離した。同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調製し、５００Ｕ／ｍＬ  ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ  マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）存在下で５日間培養した。測定当日、脾細胞を回収し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で洗浄後、同培地で１．２５×１０７個／ｍＬに調製し、エフェクター細胞とした。【０１４４】
標的細胞の調製
標的細胞として、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を用いた。細胞をプレートから剥離後、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）に懸濁し、２×１０４個／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に３０μＬ／ｗｅｌｌ分注した。【０１４５】
ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞に濃度２．４μｇ／ｍＬの抗体液を１０μＬ／ｗｅｌｌ分注した後、３０分間インキュベーションした。次いで、エフェクター細胞を４０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。
細胞傷害活性は、以下の通り求めることができる。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：［各試料における吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｂ：［エフェクター細胞に由来するＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｃ：［標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］
Ｄ：［０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度］−［培養液のバックグラウンドの吸光度］【０１４６】
結果を表１１に示した。表中、陰性対照とはＡＭＩＧＯ２に反応性を示さないことが事前に判明している抗体である。この陰性対照の抗体が示したＡＤＣＣ活性値３．２％に対し、２０％以上の高いＡＤＣＣ活性を示す４種抗体（ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３１３３およびＰＰＺ３１４５）が得られた。
これら４種の抗体を産生するハイブリドーマは、ＰＰＺ２９５２（識別番号：ＰＰＭＸ０５１０、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０３８）、ＰＰＺ３１２２（識別番号：ＰＰＭＸ０５０７、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０２３）、ＰＰＺ３１３３（識別番号：ＰＰＭＸ０５０８、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１０２４）、ＰＰＺ３１４５（識別番号：ＰＰＭＸ０５１９、ＦＥＲＭ
ＡＰ−２１０４２）として（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した（ＰＰＺ２９５２およびＰＰＺ３１４５に関しては、受領日：平成１８（２００６）年９月２７日、ＰＰＺ３１２２およびＰＰＺ３１３３に関しては、受領日：平成１８（２００６）年９月８日）。【０１４７】
【表１１】
2007122820.tif 000012
【０１４８】
各種使用目的に対応できる抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を作製した。ＡＭＩＧＯ２タンパク質の全長のみならず、各種部分ペプチドを哺乳類細胞のＣＨＯ細胞および発芽型バキュロウィルスに発現させて免疫用ならびにスクリーニング用抗原として使用した。その結果、表１２に示すように使用目的に対応できる抗体を選択することができた。この結果が示すように、使用目的全てに合致した抗体の取得は困難であり、使用目的に対応できる抗体を取得するためには、目的に応じたスクリーニング方法を取り入れることが必須であることが明らかとなった。【０１４９】
【表１２】
2007122820.tif 000013
【０１５０】
実施例１５  膵臓癌細胞株のｓｃｉｄマウスへの移植と形成された腫瘍塊の免疫染色
膵臓癌細胞株ＰＫ−４５ＰをＣＢ１７−ｓｃｉｄマウス（メス、７週齢）に右側腹部皮下に移植し（１ｘ１０７個細胞／マウス）、移植３４日後に腫瘍塊を摘出した後、ＯＴＣコンパウンド包埋し凍結切片を作製した。このようにして作製した凍結切片をＰＢＳ（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で５分間ずつ３回洗浄した後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬しオートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）によって抗原を賦活化した。
抗原の賦活化後、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、内在性のペルオキシダーゼを失活させるために０．３％過酸化水素加メタノール中で室温１５分間反応させた。次いで、蒸留水で１回洗浄後、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄し、４０％ブロックエース（雪印乳業）を含むＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）でブロッキングした（室温、３０分間）。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、１０％ブロックエースを含むＴＢＳで２０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体を４℃で一夜反応させた。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、ＰＢＳで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を二次抗体として室温で１時間反応させた。ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）を用いて発色させた。また、核の対比染色にはヘマトキシリンを用いた。【０１５１】
結果を図１０に示した。ｓｃｉｄマウスに移植した膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐは、マウス皮下で腫瘍塊を形成した後もＡＭＩＧＯ２の発現を維持していることが分かった。また、その免疫染色の度合いを実施例１３に記載した判定基準によって判断すると、スコア１＋と判定された。【０１５２】
実施例１６  膵臓癌細胞株のｓｃｉｄマウスへの生着・増殖抑制試験
実施例１５に示した、ｓｃｉｄマウスの皮下に移植後もＡＭＩＧＯ２の発現が維持（判定：スコア１＋）されていることが判明した膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを新たにｓｃｉｄマウス（メス、７週齢）の右側腹部皮下に２ｘ１０６細胞個／マウスとなるように移植し、移植日をｄａｙ０として、このｄａｙ０を含みｄａｙ１５まで３日間隔でマウス尾静脈から抗体を投与し（合計６回投与）、膵臓癌細胞株の生着性確認（触診による）ならびに生着後腫瘍塊の体積測定（皮膚を介して腫瘍塊の長径Ｌと短径Ｗをノギスで測定し、腫瘍体積Ｖを計算式Ｖ＝ＬＷ２／２で算出した。単位ｍｍ３）を２〜３日間隔でｄａｙ３８まで実施した。
投与抗体として、ＣＤＣ活性あるいは／およびＡＤＣＣ活性を示した３種の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３１４８）を選択した。
このとき、ＰＰＺ２９５２はサブクラスＩｇＧ１、ＰＰＺ３１２２およびＰＰＺ３１４８はサブクラスＩｇＧ２ａであるので、移植したＰＫ−４５Ｐに反応しない陰性コントロール抗体として、それぞれのサブクラスに対応する３４２３（サブクラスＩｇＧ１）およびＫ７１２４（サブクラスＩｇＧ２ａ）も投与した。一群１０匹として、一回の抗体投与量はマウス体重から換算して２５ｍｇ／ｋｇとした。
サブクラスがＩｇＧ１の抗体群に関する結果を図１１に、サブクラスがＩｇＧ２ａの抗体群に関する結果を図１２に示した。抗体投与期間、すなわちｄａｙ０からｄａｙ１５までの期間は各試験群とも腫瘍の生着が確認された。しかし、抗体投与終了後の腫瘍体積の増加をみると、ＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３１４８のいずれの抗体とも、陰性コントロールの３４２３あるいはＫ７１２４に比較し、腫瘍増殖抑制効果が認められた。実施例１３および実施例１５に記載したように、ｓｃｉｄマウスに移植して形成させたＰＫ−４５Ｐ腫瘍塊の免疫染色スコアが１＋であるのに比較し、臨床検体である膵臓癌組織の免疫染色スコアは１＋以上を示すものが６４％以上であった。このことから、ＡＭＩＧＯ２を高発現している癌患者においてＰＰＺ２９５２，ＰＰＺ３１２２，ＰＰＺ３１４８による膵臓癌治療効果が期待できる。【０１５３】
実施例１７  ＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株のｓｃｉｄマウスへの生着・増殖抑制試験
（１）ＡＭＩＧＯ２強制発現膵臓癌細胞株の作製
ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のプロトコールに準じて、実施例３（１）で調製したＡＭＩＧＯ２全長発現ベクターｐＥＦ４／ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌを膵臓癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ２にトランスフェクションした。すなわち、トランスフェクション前日に直径３５ｍｍディッシュに８×１０５ｃｅｌｌのＭＩＡ  ＰａＣａ２を播種し一晩培養を行い、翌日に、３μｇの発現ベクターｐＥＦ４／ＡＭＩＧＯ２ｆｕｌｌと６μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ試薬を１５０μＬの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混合し、１５〜４５分間の室温におけるインキュベーションを行った後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌日に限界希釈法および選択試薬であるＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングを開始した。
ＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２は、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロット、フローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用）および抗ＡＭＩＧＯ２抗体による免疫染色により、シグナルが強く、しかも増殖が良好なクローンを選択し、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローンＥＸＺ３９０１を得た。ＡＭＩＧＯ２タンパク質の発現量を免疫染色によって調べると、図１３に示すようにＭＩＡ  ＰａＣａ２野生株に比べＥＸＺ３９０１でのＡＭＩＧＯ２タンパク質の発現は十分に高いことが確認できた。【０１５４】
（２）ＡＭＩＧＯ２強制発現膵臓癌細胞株のｓｃｉｄマウスへの移植
上記で作製したＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローン（ＥＸＺ３９０１）あるいは野生株のＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞株をｓｃｉｄマウス（メス、７週齢）の右側腹部皮下に１ｘ１０７細胞個／マウスとなるように移植した。【０１５５】
（３）腫瘍塊サイズおよびｓｃｉｄマウス血清中ＡＭＩＧＯ２タンパク質の測定
膵臓癌細胞株移植後の腫瘍塊およびｓｃｉｄマウス血清中ＡＭＩＧＯ２タンパク質濃度を知るために、ＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローン（ＥＸＺ３９０１）あるいは野生株のＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞株を移植したｓｃｉｄマウス各２匹のｄａｙ１０に腫瘍塊の摘出とマウス血清の採取を行った。摘出した腫瘍塊の長径を定規で測定し、長径３ｍｍ未満を小、長径３ｍｍ以上６ｍｍ未満を中、長径６ｍｍ以上を大としてサイズ分類した。マウス血清中ＡＭＩＧＯ２タンパク質の検出は、実施例１１に示したＥＬＩＳＡによって実施した。表１３に結果をまとめた。ＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローン（ＥＸＺ３９０１）を移植したマウス個体では、腫瘍サイズに比例した濃度で血清中ＡＭＩＧＯ２タンパク質を検出できた。ＭＩＡ  ＰａＣａ２野生株を移植したマウス個体では、腫瘍塊のサイズは十分にもかかわらず血清中ＡＭＩＧＯ２タンパク質が全く検出できなかったことから、ＥＸＺ３９０１移植マウスの血清中に検出し得たＡＭＩＧＯ２タンパク質は、ＥＸＺ３９０１腫瘍塊から何らかの原因で血液中に遊離したものと考えられた。【０１５６】
【表１３】
2007122820.tif 000014
【０１５７】
（４）ｓｃｉｄマウスにおけるＡＭＩＧＯ２強制発現膵癌細胞株の生着・増殖抑制試験
前記実施例１７（２）と同様に作製した担癌マウスモデルに対して、移植日をｄａｙ０として、このｄａｙ０を含みｄａｙ２７まで３日間隔でマウス尾静脈から抗体を投与し（合計１０回投与）、膵臓癌細胞株の生着性確認（触診による）ならびに生着後腫瘍塊の体積測定（皮膚を介して腫瘍塊の長径Ｌと短径Ｗをノギスで測定し、腫瘍体積Ｖを計算式Ｖ＝ＬＷ２／２で算出した。単位ｍｍ３）を３〜４日間隔でｄａｙ４２まで実施した。
投与抗体として、ＣＤＣ活性あるいは／およびＡＤＣＣ活性を示した２種の抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（ＰＰＺ３１２４およびＰＰＺ３１４８）を選択した。
ＰＰＺ３１２４およびＰＰＺ３１４８はサブクラスＩｇＧ２ａであるので、移植したＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローン（ＥＸＺ３９０１）に反応しない陰性コントロール抗体として、Ｋ７１２４（サブクラスＩｇＧ２ａ）も投与した。一群１０匹として、一回の抗体投与量はマウス体重から換算して７５ｍｇ／ｋｇとした。
各抗体投与群での腫瘍生着率を図１４に示した。いずれの抗体投与群においてもＡＭＩＧＯ２全長発現ＭＩＡ  ＰａＣａ２クローン（ＥＸＺ３９０１）は移植後１２日までは８０〜９０％の生着率を示した。しかし、ＰＰＺ３１２４およびＰＰ３１４８投与群では、その後、生着率は暫時低下し抗体投与が終了した３１日以降でも２０〜３０％の生着率に止まった。一方、陰性コントロールであるＫ７１２４投与群では抗体投与期間の２１日に１００％の生着率を示した。
また、生着後の腫瘍体積の平均値±ＳＤの推移について、ＰＰＺ３１２４に関する結果を図１５に、ＰＰＺ３１４８に関する結果を図１６に示した。被験抗体（ＰＰＺ３１２４あるいはＰＰＺ３１４８）投与群と陰性コントロール抗体（Ｋ７１２４）投与群との間で、各測定日での腫瘍体積の平均値の差をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で検定すると、ＰＰＺ３１２４投与群は１２日以降、ＰＰＺ３１４８投与群は１５日以降、ｐ値＜０．０１となり有意と結論づけることができた。【０１５８】
実施例１８  近赤外領域でのｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングによる担癌マウスの腫瘍への抗体の集積確認
（１）蛍光物質による抗体の標識
０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）で濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（ＰＰＺ３１２４）１ｍＬに撹拌下でＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解した２５ｍＭ  ＤＹ−６７６−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）２．５μＬを添加し、暗所にて室温で１時間反応させた（ＰＰＺ３１２４とＤＹ−６７６のモル比＝１：２）。反応液の全量を予め１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、抗体溶出画分をプール後、抗体濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように限外濾過により濃縮した。波長２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数（２２０，０００Ｍ−１ｃｍ−１）および波長６７４ｎｍでのＤＹ−６７６のモル吸光係数（１４５，０００Ｍ−１ｃｍ−１）より算出したＰＰＺ３１２４抗体１分子あたりの蛍光物質ＤＹ−６７６の結合数は、０．８分子であった。
同様の方法で陰性コントロール抗体Ｋ７１２４もＤＹ−６７６で標識した。Ｋ７１２４抗体１分子あたりのＤＹ−６７６の結合数は０．９分子であった。【０１５９】
（２）ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
ｓｃｉｄマウス（メス、７週齢）の右側腹部皮下に膵臓癌細胞株ＰＫ−４５Ｐを２ｘ１０６細胞個／マウスとなるように移植することで作製した担癌マウスを用意し、上記で調製したＤＹ−６７６標識ＰＰＺ３１２４あるいはＤＹ−６７６標識Ｋ７１２４（いずれも濃度：５ｍｇ／ｍＬ）の０．１ｍＬをマウス尾静脈から投与した。蛍光標識抗体の投与４８時間後にペントバルビタールをマウス腹腔に注射し麻酔下で近赤外励起蛍光検出ユニット搭載のＬＡＳ−３０００（富士フイルム）で蛍光イメージングデータを取得した。
ＤＹ−６７６標識ＰＰＺ３１２４投与マウスの結果を図１７（ａ）に、ＤＹ−６７６標識Ｋ７１２４投与マウスの結果を図１７（ｂ）に示した。図中、腫瘍の存在部位を白色の破線円で示した。ＤＹ−６７６標識ＰＰＺ３１２４は担癌マウスの腫瘍に集積が認められた。また、陰性コントロールのＤＹ−６７６標識Ｋ７１２４投与マウスの腫瘍には蛍光が検出されていないことから、ＤＹ−６７６標識ＰＰＺ３１２４の集積は、腫瘍細胞上に発現するＡＭＩＧＯ２蛋白質にＰＰＺ３１２４が結合することによる特異的な反応に基づくことが分かった。すなわち、蛍光標識した抗ＡＭＩＧＯ２抗体ＰＰＺ３１２４を担癌マウスの静脈内に投与することでＡＭＩＧＯ２を発現する腫瘍を特異的にイメージングできることが分かった。【０１６０】
実施例１９  抗体結合によるＡＭＩＧＯ２蛋白質の細胞内移行
（１）蛍光物質による抗体の標識
０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）で濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体（ＰＰＺ３１２４）３６５μＬに撹拌下でジメチルフォルムアミドに溶解した５ｍｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）１．７μＬを添加し、暗所にて室温で１時間反応させた（ＰＰＺ３１２４とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８のモル比＝１：２）。反応液の全量を予め１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、抗体溶出画分をプールした後、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように限外濾過により濃縮した。波長２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数（２２０，０００Ｍ−１ｃｍ−１）および波長４９５ｎｍでのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８のモル吸光係数（７１，０００Ｍ−１ｃｍ−１）より算出したＰＰＺ３１２４抗体１分子あたりの蛍光物質Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の結合数は、０．８分子であった。【０１６１】
（２）共焦点レーザー顕微鏡を用いた抗体結合ＡＭＩＧＯ２蛋白質の細胞内移行の確認
直径３５ｍｍのガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）に実施例３（３）で作製したＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１００５）を５×１０５ｃｅｌｌで播種し２日間培養した後、培地を捨て、上記で調製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＰＰＺ３１２４を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地２００μＬを細胞に加え室温で５分間インキュベートした。次いで、１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地で細胞を洗浄し、同培地２００μＬを添加後、共焦点レーザー顕微鏡（倒立型ＩＸ８１、オリンパス製）で経時的（０，０．５，１，２時間）にデータを取得した（励起波長４８８ｎｍ／蛍光波長５１９ｎｍ）。反応直後では細胞膜表面に局在した蛍光シグナルが、時間経過と共に細胞内に移行する様子が観察された（図１８）。すなわち、細胞膜表面上に存在するＡＭＩＧＯ２に抗体（ＰＰＺ３１２４）が結合すると、エンドサイトーシスによってＡＭＩＧＯ２−抗体複合体が細胞内に取り込まれることが分かった。【０１６２】
実施例２０  細胞傷害活性を持つ物質をコンジュゲートした抗体によるＡＭＩＧＯ２発現細胞の増殖抑制
実施例３（３）で作製したＡＭＩＧＯ２全長発現ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地で懸濁し、平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０３個となるように捲き込み１夜培養した（７０μＬ／ウェル）。次いで、１次抗体として抗ＡＭＩＧＯ２抗体ＰＰＺ３１２４あるいは陰性コントロール抗体Ｋ７１２４を種々濃度含む１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）を３０μＬ／ウェルで添加し（ＰＰＺ３１２４あるいはＫ７１２４のウェル内での終濃度：０．１，１，１０，１００ｎｇ／ｍＬ、各濃度３重測定）、５％ＣＯ２インキュベーター内（３７℃）に１時間静置した。Ｆ−１２ＨＡＭ培地（ＦＢＳ不含）で２回細胞を洗浄し、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で０．２１μｇ／ｍＬとなるように希釈した植物由来毒素Ｓａｐｏｒｉｎ結合抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧ（商品名：Ｍａｂ−ＺＡＰ，フナコシ）を２次抗体として１５０μＬ／ウェルで添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内（３７℃）に４８時間静置した。次いで、各ウェルにＸＴＴ試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製細胞増殖キットＩＩ）を７５μＬ／ウェルで添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内（３７℃）に６時間静置した。マイクロプレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度（各ウェルの生細胞数に比例する）を測定し、２次抗体のみ反応させたウェルの吸光度の平均値を１００％とし、１次抗体を種々濃度で反応させたウェル吸光度の相対％を求めた。この相対％を生細胞数（％）として１次抗体濃度に対してプロットした結果を図１９に示した。
１次抗体としてＰＰＺ３１２４を反応させた場合、生細胞数（％）は抗体の濃度依存的に大きく低下した。この結果は、細胞膜上に存在するＡＭＩＧＯ２タンパク質にＰＰＺ３１２４が濃度依存的に結合し、それに応じて植物由来毒素Ｓａｐｏｒｉｎ結合抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧが結合した後、実施例１９に示したエンドサイトーシスによって植物由来毒素Ｓａｐｏｒｉｎが細胞内に取り込まれ細胞毒性を示したことを示している。すなわち、抗ＡＭＩＧＯ２モノクローナル抗体ＰＰＺ３１２４を間接的あるいは直接的に植物由来毒素Ｓａｐｏｒｉｎで標識し、ＡＭＩＧＯ２発現細胞に作用させることで細胞増殖抑制作用を持たせることができる。
【図１−ａ】
2007122820.tif 000015
【図１−ｂ】
2007122820.tif 000016
【図１−ｃ】
2007122820.tif 000017
【図２】
2007122820.tif 000018
【図４】
2007122820.tif 000019
【図５】
2007122820.tif 000020
【図６】
2007122820.tif 000021
【図７】
2007122820.tif 000022
【図８】
2007122820.tif 000023
【図１１】
2007122820.tif 000024
【図１２】
2007122820.tif 000025
【図１４】
2007122820.tif 000026
【図１５】
2007122820.tif 000027
【図１６】
2007122820.tif 000028
【図１７】
2007122820.tif 000029
【図１９】
2007122820.tif 000030
【図３】
2007122820.tif 000031
【図９】
2007122820.tif 000032
【図１０】
2007122820.tif 000033
【図１３】
2007122820.tif 000034
【図１８】
2007122820.tif 000035
【配列表】
2007122820000001.app
【国際調査報告】
2007122820.tif 000036
2007122820.tif 000037
2007122820.tif 000038
2007122820.tif 000039
2007122820.tif 000040
2007122820.tif 000041