(57)【要約】本発明は、耳垢型又は腋下臭症の評価方法に関し、ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型と個体の耳垢の乾型又は湿型とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型と個体の耳垢の乾型又は湿型とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
【請求項２】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列において、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子多型と個体の耳垢の乾型又は湿型とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
（ａ）第５３８番目の塩基の遺伝子多型及び第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（ｂ）第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
【請求項３】
第５３８番目の塩基の遺伝子多型が一塩基多型である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
第５３８番目の塩基の遺伝子多型が連鎖不平衡ブロックを形成するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
耳垢の評価は、第５３８番目の塩基の遺伝子多型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは湿型であると診断し、ＡＡのホモ接合のときは乾型であると診断するものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
耳垢の評価は、遺伝子多型が、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失したアリルのホモ接合のとき、又は第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＡである接合のときは乾型であると診断し、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＧである接合のときは湿型であると診断するものである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型と個体の腋下臭とを関連づけることを特徴とする、腋下臭症の評価方法。
【請求項８】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列において、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子多型と個体の腋下臭とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
（ａ）第５３８番目の塩基の遺伝子多型及び第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（ｂ）第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
【請求項９】
第５３８番目の塩基の遺伝子多型が一塩基多型である請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
第５３８番目の塩基の遺伝子多型が連鎖不平衡ブロックを形成するものである請求項７又は８記載の方法。
【請求項１１】
腋下臭症の評価は、第５３８番目の塩基の遺伝子多型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは腋下臭症であると推定し、ＡＡのホモ接合のときは腋下臭症ではないと推定するものである、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
腋下臭の評価は、遺伝子多型が、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失したアリルのホモ接合のとき、又は第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＡである接合のときは腋下臭ではないと推定し、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＧである接合のときは腋下臭であると推定するものである、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法により評価された結果を指標として、個体に使用する腋下臭症治療用薬物又は化粧品の種類及び／又は量を決定する方法。
【請求項１４】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第５３８番目の塩基を含む少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失部位を挟みこむ少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
１０〜５０塩基の長さを有する請求項１４又は１５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドを含む、耳垢又は腋下臭の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の特定の一塩基多型を指標として、個体の耳垢型又は腋下臭症を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耳垢は、外耳道アポクリン腺の分泌物であり、湿型及び乾型の２型からなるメンデル遺伝形質である。湿型耳垢は、ヒトにおける原型であり、明るい黄褐色から濃い茶色で樹脂様の粘り気のある耳垢として特徴づけられている。一方、乾型は耳垢を欠く形質である。湿型は乾型に対して完全優性である。
乾型耳垢は、モンゴル人、北中国人、韓国人、チベット人及び日本人（本土）を含む、東アジア人でかなり見られ（８０−９５％）、多数を占める（文献１〜８）。しかし、乾型は、北西ヨーロッパ人およびアフリカを起源とする人々ではほとんど存在しない（〜１％）。これに対し、南アジア（〜３０％）、太平洋諸島（〜４０％）、中央アジア（〜４０％）、アジアの少数民族（〜３０％）及び東ヨーロッパ（〜３％）の人種における乾型の頻度は、アジア系のアメリカ原住民（３０−５０％）及びイヌイット（〜５０％）と同様、中間値を示す（文献１、９、１０）。従って、これらの数字は、地理的勾配分布を示している。
本発明者は以前、日本人家系の連鎖解析により、耳垢遺伝子座を第１６染色体（１６ｑ１１．２−ｑ１２．１）の動原体付近に存在するＤ１６Ｓ３０９３マーカーとＤ１６Ｓ３１１７マーカーとの間の約５．９ｃＭ（センチモルガン）のゲノム領域に位置づけた（文献１１）。しかし、耳垢型を決定している遺伝子やその多型は知られていなかった。
文献：
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８．Ｎｏｒａｋｍａｌ  Ｉ，Ｔａｎ  ＳＧ：Ｃｅｒｕｍｅｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｔｈｎｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｍａｌａｙｓｉａ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：１１９−１２１，１９７９
９．Ｓｐｉｔｓｙｎ  ＶＡ，Ａｆａｎａｓ▲ｅ▼ｖａ  Ｉ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｅａｒ  ｗａｘ  ｂｙ  ｉｔｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ．Ｇｅｎｅｔｉｋａ  ２５：１８５４−１８６０，１９８９
１０．Ｐｅｔｒａｋｉｓ  ＮＬ，Ｐｉｎｇｋｅ  Ｕ，Ｐｅｔｒａｋｉｓ  ＳＪ，Ｐｅｔｒａｋｉｓ  ＳＬ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｅａｒｗａｘ  ｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ  ３５：１４１−１４４，１９７１
１１．Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ−Ａ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｇｈａｄａｍｉ  Ｍ，Ｏｇｕｒａ  Ｔ，Ｙａｎａｉ  Ｙ，Ｎａｋａｔｏｍｉ  Ｋ，Ｓａｄａｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｍａｓｕｉ  Ａ，Ｎａｎｋｏ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｎ，Ｎｉｉｋａｗａ  Ｎ：Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｅｔ／ｄｒｙ  ｅａｒｗａｘ  ｌｏｃｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６．Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：２０００−２００２，２００２
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の遺伝子変異（多型）を利用した個体の耳垢型（乾型又は湿型）を評価する方法、および腋下臭症の評価方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意にゲノム医学的研究を行った。そして、ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子において、第５３８番目の塩基配列の塩基置換変異（一塩基多型）及び第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失を見出した。前者の一塩基多型を「ｃ．５３８Ｇ＞Ａ」という。この変異はＡＢＣＣ１１のアミノ酸配列の第１８０番目のグリシンからアルギニンへの置換を生ずる多型であった。さらに、本発明者は、当該一塩基多型及び２７塩基欠失は、ヒトの二型性の遺伝形質を直接的に決定するＤＮＡ多型であることを初めて明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第５３８番目の塩基の遺伝子多型と個体の耳垢の乾型又は湿型とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
（２）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子多型と個体の耳垢の乾型又は湿型とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
（ａ）第５３８番目の塩基の遺伝子多型及び第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（ｂ）第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（３）上記（１）又は（２）において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型は一塩基多型であることが好ましい。また、第５３８番目の塩基の遺伝子多型は連鎖不平衡ブロックを形成するものであってもよい。
上記（１）の方法において、耳垢の評価は、第５３８番目の塩基の遺伝子多型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは湿型であると診断し、ＡＡのホモ接合のときは乾型であると診断することができ、また、上記（２）の方法において、耳垢の評価は、遺伝子多型が、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失したアリルのホモ接合のとき、又は第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＡである接合のときは乾型であると診断し、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＧである接合のときは湿型であると診断することができる。
（４）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第５３８番目の塩基の遺伝子多型と個体の腋下臭とを関連づけることを特徴とする、腋下臭症の評価方法。
（５）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子多型と個体の腋下臭とを関連づけることを特徴とする、耳垢の評価方法。
（ａ）第５３８番目の塩基の遺伝子多型及び第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（ｂ）第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失した遺伝子多型
（６）上記（４）又は（５）において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型は一塩基多型であることが好ましい。また、第５３８番目の塩基の遺伝子多型は連鎖不平衡ブロックを形成するものであってもよい。
（７）腋下臭症の評価は、上記（４）の方法において、第５３８番目の塩基の遺伝子多型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは腋下臭症であると推定することができ、ＡＡのホモ接合のときは腋下臭症ではないと推定することができる。また、上記（５）の方法において、腋下臭の評価は、遺伝子多型が、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失したアリルのホモ接合のとき、又は第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＡである接合のときは腋下臭ではないと推定し、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＧである接合のときは腋下臭であると推定することができる。
（８）上記（４）〜（７）のいずれかの方法により評価された結果を指標として、個体に使用する腋下臭症治療用薬物又は化粧品の種類及び／又は量を決定する方法。
（９）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第５３８番目の塩基を含む少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１０）ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子の塩基配列のうち、第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失部位を挟みこむ少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば１０〜５０塩基の長さを有するが、これに限定されるものではない。
（１１）上記（９）又は（１０）のオリゴヌクレオチドを含む、耳垢又は腋下臭の評価用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、各種アレルと表現型との関係を示す図である。
図２は、各種遺伝子におけるＳＮＰマーカーとｐ値との関係を示す図である。
図３は、アレルＡの様々な頻度をプロットした世界等高線地図における地理的勾配分布を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００５−１７８５６３号明細書の全体を包含する。
本発明は、ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子（「ＡＢＣＣ１１遺伝子」ともいう）の塩基配列（例えば配列番号１）のうち、５３８番目の塩基置換（「ｃ．５３８Ｇ＞Ａ（Ｇｌｙ１８０Ａｒｇ）」又は「ｃ．５３８Ｇ＞Ａ」という）、及び第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失を指標として、個体の耳垢型を評価する方法に関する。「評価」とは、ある遺伝子変異（本発明で明らかになった変異は遺伝子多型）と表現型とを結びつけて、ある遺伝子変異（多型）を有する場合は特定の表現型を有するものと、推定、決定、判定又は診断することを意味する。ここで遺伝子多型とは、遺伝子変異が一般集団中で１％以上の頻度でみられるものをいう。
本発明者は、上記５３８番目の塩基において、遺伝子型がＡＡのホモ接合のとき乾性耳垢型、ＧＡヘテロ接合又はＧＧホモ接合のとき湿性耳垢型であることを見出した。また、本発明者は、アジア系のいくつかの個体にｃ．５３８Ｇ＞Ａとは独立した、ＡＢＣＣ１１遺伝子のエクソン２８中の第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失（Δ２７）をも見いだした。さらに、ＡＢＣＣ１１遺伝子の５３８番目の塩基がＧ［アリルＧ（湿型耳垢型）］またはＡ［アリルＡ（乾型耳垢型）］であるｃＤＮＡをＬＬＣ−ＰＫ１細胞に導入した機能解析アッセイにおいて、アリルＡ由来のアルギニン残基を有するＬＬＣ−ＰＫ１細胞が、アリルＧ由来のグリシンのものと比較して、細胞内から細胞外へのｃＧＭＰ輸送能が低いことも見いだした。本発明は、これらの知見により完成されたものである。
ＡＢＣＣ１１遺伝子
ＡＢＣＣ１１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔ，ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １１）遺伝子は、ヒト第１６染色体の１６ｑ１２．１領域に位置する耳垢決定遺伝子である。ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする遺伝子は、例えば配列番号１に示されるものであり、ＡＢＣＣ１１は１，３８２アミノ酸残基のアミノ酸配列（配列番号２）からなる。ＡＢＣＣ１１は多剤薬剤耐性−関連タンパク質８（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８（ＭＲＰ８））ともいい、２つのＡＴＰ−結合ドメイン及び１２の膜貫通ドメインを含む（Ｙａｂｕｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｔａｍｍｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。「ＡＢＣＣ１１をコードする」とは、ゲノム配列のうちＡＢＣＣ１１タンパク質への翻訳が行われるという意味である。
なお、ＡＢＣＣ１１遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡのほか、上記配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（分子雑種形成）し、かつＡＢＣＣ１１として機能するタンパク質をコードするＤＮＡであって、５３８番目の塩基はＧ又はＡであるものを含む。ストリンジェントな条件としては、たとえば、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜９００ｍＭ、好ましくは１５０〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件が挙げられる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
ＡＢＣＣ１１遺伝子は、当業者に公知の方法（例えばコロニーハイブリダイゼーション等の公知のハイブリダイゼーション法）により、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。また、ＡＢＣＣ１１遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されており、その配列情報は容易に入手することができる（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ３６７２０２）。なお、配列番号１で示される塩基配列は、上記Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ３６７２０２に登録されている塩基配列のコード領域（第７９番目〜４２２７番目）の塩基に対応する。
遺伝子多型解析
本発明において、遺伝子多型は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のうち第５３８番目の塩基において主に一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）、及び挿入／欠失多型を含む。
ＳＮＰとは、遺伝子の特定の１塩基が他の塩基に置換することによる多型を意味する。但し、本発明においては、第５３８番目の塩基の置換による多型のほか、第５３８番目の塩基が欠失するか、あるいは第５３８番目に他の塩基が挿入する多型（挿入／欠失多型）も含まれる。なお、「第５３８番目」、「第３９３９番目から第３９６５番目」という位置は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のコード領域における位置を意味するものである。
また、本発明の遺伝子多型ｃＳＮＰ（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）は、連鎖不平衡の領域に存在する。ここで、連鎖不平衡とは、多型と多型が緊密に連鎖しているためにメンデルの独立の法則による平衡状態から逸脱していることをいう。ｃＳＮＰとはＳＮＰのうち機能タンパク質への翻訳が行われるコード領域に存在するＳＮＰという意味である。
本発明者は、上記ＳＮＰがハプロタイプ別に分類できることを見出した。ハプロタイプとは、同一染色体上で相互に近隣する遺伝子やＳＮＰなどの対立遺伝子（アリル）の１組（遺伝的構成）を意味する。ゲノム上近接するＳＮＰは、連鎖不平衡の強いブロック（連鎖不平衡ブロック）で遺伝する。いくつかのＳＮＰが、ある表現型（例えば腋下臭症の発症）に関連して出現する場合には、個々のＳＮＰを全てタイピングしなくても、連鎖不平衡ブロックを構成する代表的なＳＮＰを解析することによって、患者の遺伝子型と表現型との関連を明らかにすることができる。本発明者は、ハプロタイプ解析の結果から、ＡＢＣＣ１１遺伝子領域に強い連鎖不平衡ブロックを推定することができた。
そこで、本発明は、薬物の感受性を評価するのに用いる遺伝子多型として、上記のＳＮＰだけでなく、ハプロタイプを利用した方法も提供する。
従って、本発明で明らかとなったｃＳＮＰ（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）又はハプロタイプを解析することによって、個々人耳垢型、腋下臭症であるか否かを評価することができる。また、ＡＢＣＣ１１遺伝子はＤＮＡアナログなどの抗がん剤に対する感受性・耐性に関与する遺伝子であるため、本発明のｃＳＮＰ（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）又はハプロタイプを用いて、抗がん剤に対する感受性を推定することもできる。この薬物感受性は、薬物の種類や量を決定する上で重要な情報となる。特に、抗がん剤は、使用方法によっては重篤な副作用を引き起こすなど、社会的な大きな問題を生じる可能性があるため、各個人に適切な投薬量を投薬前にあらかじめ知ることは極めて有用である。
本発明において、遺伝子多型情報を得る方法は、一般的な多型検出法を利用して得ることができる。例えば、ＡＢＣＣ１１遺伝子中の塩基配列の５３８番目の塩基の一塩基多型であるｃＳＮＰ（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）は、塩基配列決定法、ＰＣＲによる方法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＤＮＡチップ法、プライマー伸長反応を利用する方法等が採用される。
ＳＮＰを代表とする多型情報解析には市販のキットを使用することができ、自動化も可能である。
表現型解析
ｃ．５３８Ｇ＞Ａは耳垢型の決定因子であり、耳垢表現型において、ＧＧホモ接合及びＧＡヘテロ接合の遺伝子型は共に湿性耳垢型であり、ＡＡホモ接合の遺伝子型は乾性耳垢型であるものと関連づけることができる。なお、ｃ．５３８Ｇ＞Ａを含む３つの多型部位からなるハプロタイプは、日本人では、強固な連鎖不平衡ブロックを形成する。
ｃ．５３８Ｇ＞Ａは、ＡＢＣＣ１１（ＭＲＰ８）タンパク質のアミノ酸１８０位でグリシン→アルギニン置換（Ｇｌｙ１８０Ａｒｇ）が起こる。アミノ酸１８０位がアルギニン残基となったＭＲＰ８（細胞膜タンパク質）を有する細胞は、グリシン残基である細胞よりも、ｃＧＭＰの分泌機能が低い。このアミノ酸置換部位は、ＭＲＰ８の最初の膜貫通ドメインに位置し、グリシン→アルギニン置換は薬剤排出ポンプタンパク質としての機能障害の起因となることが推定される。
生体内におけるＭＲＰ８の生理学的基質は未だに不明であるが、最近の研究では、ＭＲＰ８は両親媒性アニオン輸送タンパク質（トランスポーター）であり、かつ、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ等のプリン／ピリミジンヌクレオチド類縁物質の薬剤排出ポンプとして機能することが知られている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本発明研究で見出されたＭＲＰ８の機能に関する知見は、以前報告された耳垢に関する研究結果、すなわち、湿型耳垢腺は明るい色調の分泌顆粒を含有すること（Ｓｈｕｇｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、耳垢は両親媒性及び芳香性の化合物を含有すること（Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、およびＭＲＰ８は多様な親油性物質を輸送することができること（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）とは矛盾がなく、ＡＢＣＣ１１は耳垢を分泌する機能を有する耳垢型の決定因子であるといえる。
本発明の方法において、例えばＡＢＣＣ１１遺伝子（配列番号１）のうち第５３８番目の塩基置換は、Ｇ（グアニン）／Ａ（アデニン）の一塩基多型である。また、耳垢の評価は、第５３８番目の塩基の遺伝子型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは湿型であると診断し、ＡＡのホモ接合のときは乾型であると診断することができる。
さらに、本発明においては、ＡＢＣＣ１１遺伝子（配列番号１）のうち、第５３８番目の塩基及び第３９３９番目から第３９６５番目までの塩基の２箇所の多型（二重接合）を利用して、乾型であるか湿型であるかの診断をすることも可能である。
第５３８番目の塩基が「Ａ」のアリルを「アリルＡ」、「Ｇ」のアリルを「アリルＧ」とし、第３９３９番目から第３９６５番目の２７個の塩基が欠失していないアリルを「正常アリル」、欠失しているアリルを「Δ２７アリル」とすると、乾型であるか湿型であるかの診断は、以下の通り行うことができる（図１）。
一方のアリルがアリルＡ又はアリルＧとΔ２７アリルとの組み合わせを有し、かつ、他方のアリルがアリルＡと正常アリルとの組み合わせを有する二重ヘテロ接合の場合（図１の（ａ））：乾型
アリルＡ又はアリルＧとΔ２７アリルとの二重ホモ接合の場合（図１の（ｂ））：乾型
一方のアリルがアリルＡ又はアリルＧとΔ２７アリルとの組み合わせであり、かつ、他方のアリルがアリルＧと正常アリルとの組み合わせの場合（図１の（ｃ））：湿型
すなわち、遺伝子多型が、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基が欠失したアリルのホモ接合のとき（図１（ｂ））、又は第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＡである接合の遺伝子多型を有するとき（図１（ａ））は乾型であると診断する。
また、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基の欠失アリルと正常アリルとのヘテロ接合であって当該正常アリルの第５３８番目の塩基がＧである接合の遺伝子多型を有するとき（図１（ｃ））は湿型であると診断することができる。
なお、Δ２７アリルがホモ接合のときは、第５３８番目の塩基はＡ及びＧのどちらでも乾型になるため、前述の耳垢の評価において、第５３８番目の塩基の遺伝子型がＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合のときは湿型であると診断する点と矛盾を生じる。しかしながら、欠失アリルの頻度は非常に低いため、ＧＡのヘテロ接合又はＧＧのホモ接合の場合でも乾型の表現型が現われたときに、Δ２７アリルのホモ接合であるかどうかを調べれば足りるため、本発明の評価に支障を生ずることはない。
耳垢型と腋下臭症の評価
腋窩腺、乳房腺及び耳道腺は全てアポクリン腺である。腋下臭症（臭汗症ともいう）は、湿型耳垢と関連しており、発汗により促進されることはよく知られている。臭汗症患者の腋窩皮膚の組織学的研究により、多数、かつ、大型のアポクリン腺が見出されている（Ｂａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
湿型の個々のアポクリン汗腺により産生される脂肪族及び芳香族化合物等の様々な親油性物質は、その数及び大きさが増大すると、臭汗症の原因となりうる。これは、ＡＢＣＣ１１遺伝子のアリルＧを導入されたブタ由来のＬＣＣ−ＰＫ１細胞は、アリルＡを導入された細胞と比較すると分泌機能が増大しているという本発明者の機能的研究により支持される。
従って、耳垢型決定方法により決定された耳垢型を指標として、腋下臭症を推定又は診断することができる。哺乳動物では、体臭等のアポクリン汗腺の分泌物はある種のフェロモンのような性的魅力の一因となりうる。本発明者のゲノム配列データベース及びＰＣＲサーチによれば、チンパンジー、オランウータン、シロテテナガザル（ｗｈｉｔｅ−ｈａｎｄｅｄ  ｇｉｂｂｏｎ）、ニホンザル及びイヌにはＡＢＣＣ１１遺伝子があるが、マウス及びラットには存在しない。古代北方モンゴロイドは寒冷環境で生活していたと推測されており、寒冷気候への適応としてある選択的な優位性を獲得しえたのかもしれない。しかし、乾型人種は生殖適応度がより優れているという証拠は得られていない。
本発明においては、耳垢表現型でＡＢＣＣ１１遺伝子の第５３８番目塩基がＧＡヘテロ接合又はＧＧホモ接合の遺伝子型を示すときは湿型の耳垢型であると関連づけ、このＧＡヘテロ接合又はＧＧホモ接合型の個体は腋下臭症の可能性があると推定することができる。また、ＡＡホモ接合の遺伝子型を示すときは乾性耳垢型であると関連づけ、腋下臭症の可能性は少ないと推定することができる。
また、本発明においては、ＡＢＣＣ１１遺伝子（配列番号１）の第５３８番目の塩基、及び第３９３９番目から第３９６５番目までの２７個の塩基の欠失の２箇所の多型（二重接合）を利用して、乾型であるか湿型であるかの診断をすることも可能である。
図１（ａ）及び（ｂ）に示す態様は乾型であり、これらのタイプでは腋下臭症の可能性は少ないと推定することができる。また、図１（ｃ）に示す態様は湿型であり、腋下臭症の可能性があると推定することができる。
このように、耳垢型決定方法により決定された耳垢型を指標として、腋下臭症か否かを推定することにより、腋下臭症の程度が明らかになる。さらに、その結果を指標として、個体に投与する腋下臭症の治療のための薬物、あるいは化粧品の種類及び量を決定することが可能となる。
腋下臭症の集団において検出される臭いの原因となる化合物として、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状の飽和又は不飽和脂肪酸、アルデヒド及びアルコールが考えられ、特にｎ−ヘキサノイックアシッド、ｎ−ヘプタノイックアシッド、ｎ−オクタノイックアシッド、ｎ−ノナノイックアシッド、ｎ−デカノイックアシッド、ｎ−ウンデカノイックアシッド、ｎ−ドデカノイックアシッド、２−メチルペンタノイックアシッド、２−メチルヘキサノイックアシッド、２−メチルヘプタノイックアシッド、２−メチルオクタノイックアシッド、２−メチルノナノイックアシッド、２−メチルデカノイックアシッド、３−メチルペンタノイックアシッド、３−メチルヘキサノイックアシッド、３−メチルヘプタノイックアシッド、３−メチルオクタノイックアシッド、３−メチルノナノイックアシッド、３−メチルデカノイックアシッド、（Ｚ）−３−メチル−２−ペンテノイックアシッド、（Ｅ）−３−メチル−２−ペンテノイックアシッド、（Ｚ）−３−メチル−２−ヘキセノイックアシッド、（Ｚ）−３−メチル−２−ヘプテノイックアシッド、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘプテノイックアシッド、（Ｚ）−３−メチル−２−オクテノイックアシッド、（Ｅ）−３−メチル−２−オクテノイックアシッド、３−ハイドロキシ−３−メチル−２−ペンテノイックアシッド、３−ハイドロキシ−３−メチル−２−ヘキセノイックアシッド、３−ハイドロキシ−３−メチル−２−ヘプテノイックアシッド、３−ハイドロキシ−３−メチル−２−オクテノイックアシッド、２−エチルヘキサノイックアシッド、４−エチルペタノイックアシッド、４−エチルヘキサノイックアシッド、４−エチルオクタノイックアシッド、４−エチルノナノイックアシッド、４−エチルデカノイックアシッド、５−ヘキセノイックアシッド、６−ヘプテノイックアシッド、７−オクテノイックアシッド、８−ノネノイックアシッド、９−デセノイックアシッド、１０−ウンデセノイックアシッド、１１−ドデセノイックアシッド等が推定される。これらの化合物は、汗腺から分泌され、又はその前駆体等が皮膚常在菌や光、空気等の作用により酸化、還元、分解若しくは反応することにより生成される。従って、これら化合物等の臭いを軽減若しくはマスキングする薬物、化粧品又は香料を使用するか、又はその前駆体等が皮膚常在菌や光、空気等の作用により酸化、還元、分解若しくは反応することを抑える薬物、化粧品又は香料を使用することにより、腋下臭症を回避することができる。本発明においては、ＡＢＣＣ１１遺伝子の第５３８番目の塩基を調べることで、どのような薬物又は化粧品を使用すればよいかを判断することができる。
ところで、耳垢型と乳がん感受性との関連を示す研究が以前報告された（Ｐｅｔｒａｋｉｓ，１９７１）。例えば、アジア人種（乾型耳垢型優位）は、白人や黒人（湿型耳垢型優位）よりも乳がんの発生率が低いことが知られている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このことは、耳垢が湿型であるときは乳癌の発生率が高く、乾型であるときは、乳がんの発生率が低いと推定することができる。さらにＡＢＣＣ１１遺伝子は、乳がん細胞において強く発現している（Ｂｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｉｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、ｃ．５３８Ｇ＞Ａ部位の遺伝子型、つまり耳垢表現型の違いにより、乳がん感受性を予測することが可能である。
プローブまたはプライマーとしての使用
本発明は、上記した耳垢型を決定する方法等に用いる、耳垢型決定用ヌクレオチド、腋下臭症評価用オリゴヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドは、耳垢型又は腋下臭症評価用Ｔａｑｍａｎプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することができる。
腋下臭症の評価は、耳垢型を指標として行われる。従って、腋下臭症評価用オリゴヌクレオチドは、耳垢型評価用のオリゴヌクレオチドに準じるものであるので、耳垢型決定用Ｔａｑｍａｎプローブ又はＰＣＲプライマーについて以下に説明する。
腋下臭症評価のために使用される材料である被験対象者からのゲノムＤＮＡサンプルは、血液、唾液、皮膚等から抽出することができるが、ＤＮＡサンプルを採取できるものであれば、これに限定されるものではない。ゲノムＤＮＡの抽出及び精製法は周知の通りである。例えば、ヒトから採取した血液、唾液、皮膚等の検体から、フェノール・クロロフォルム法等を用いてゲノムＤＮＡを精製する。その際、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ等の市販のゲノムＤＮＡ抽出キットや装置を用いてもよい。
本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１）のうち、第５３８番目の塩基を含むオリゴヌクレオチド、又は第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失（Δ２７）部位を含むように設計された少なくとも１０塩基の配列、又は当該欠失部位を挟み込むように設計された少なくとも１０塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも１０塩基であれば特に限定されるものではなく、好ましくは１０〜１００塩基である。本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１記載の塩基配列に基づいて通常の化学合成により得ることができる。
本発明においてプライマー及び／又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば第５３８番目の多型を検出するときは第５３８番目の塩基を含むように設計し合成する。また、本発明においてはこれらの配列の相補鎖（相補配列）も含まれる。
オリゴヌクレオチドは、多型部位が塩基配列の５’末端又は３’末端に存在するように設計する。但し、オリゴヌクレオチドは、多型部位が塩基配列の５’末端又は３’末端に存在するように設計したものに限定されず、５’又は３’末端よりも内側に存在するように設計してもよい。
作製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、当該プローブが被験ＤＮＡにハイブリダイズしたかどうかを利用して多型を決定又は検出することができる。
Δ２７の多型を検出するときは、オリゴヌクレオチドをプローブ又はＰＣＲ用プライマーとして使用することができる。
プローブは、配列番号１に示す塩基配列のうち、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基配列の一部からのみ構成されるように（つまり当該２７塩基内の塩基から構成されるように）設計することができる（「プローブ２７」とする）。また、配列番号１に示す塩基配列のうち、第３９３９番目から第３９６５番目の２７塩基配列を含み、かつ、第３９３９番目の塩基よりも上流側の塩基及び第３９６５番目の塩基よりも下流側の塩基を含むように設計することもできる（「プローブ２７α」とする）。あるいは、２７塩基分の欠失を考慮して欠失部位の下流側の塩基と欠失部位の上流側の塩基で欠失部位を挟むように設計することもできる。この場合は、３９３８番目の塩基（配列番号１の３９３８番の「ａ」）と、２７塩基が欠失したことにより新たに３９３９番目の塩基となった塩基（配列番号１の３９６６番の「ａ」）が連結される。このように２７塩基の欠失を考慮して作製したオリゴヌクレオチドを「プローブΔ２７」とする。そうすると、プローブ２７及びプローブ２７αは、正常の塩基配列（２７塩基の欠失がない塩基配列）を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドの有無によってアリルΔ２７であるか否かを判断（検出）することができる。また、プローブΔ２７は正常の塩基配列（２７塩基の欠失がない塩基配列）とはハイブリダイズせず、欠失が生じた塩基配列とハイブリダイズすることができるため、これによりアリルΔ２７であるか否かを判断（検出）することができる。
また、ＡＢＣＣ１１遺伝子のエクソン２８中の第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失（Δ２７）の検出にはＰＣＲ法を用いることができ、欠失部位の両端に近接する塩基配列からＰＣＲプライマーセットを設計して、作製する。
アリルΔ２７を検出するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを設計するときは、第３９３８番目の塩基よりも上流側から設計すると共に、３９６６番目の塩基（正常の遺伝子のときの塩基配列）よりも下流側から設計する。これにより、ＰＣＲで増幅された断片は、欠失の有無により検出される断片の大きさが２７塩基分異なるため、断片の大きさの相違により欠失を検出することができる。プライマーの長さは、少なくとも１５塩基、好ましくは１５〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２４塩基の長さとなるように設計する。このときのプライマー配列は、増幅断片が１０００ｂｐ以下、好ましくは５００ｂｐ以内、さらに好ましくは２００ｂｐ以内（１００〜２００）ｂｐとなるように鋳型ＤＮＡの領域から適宜選択する。
以上のように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。
なお、プローブには、予め蛍光標識（例えばＦＡＭ、ＶＩＣ等）を付加して作業の自動化を図ることも可能である。
ＡＢＣＣ１１遺伝子の第５３８番目の塩基置換、及び第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失に関するゲノム塩基配列解析については、ＰＣＲ産物のシーケシング法を適用することができる。湿性及び乾型のＤＮＡサンプルのうちの１つを適当なアニーリング温度にセットしてＰＣＲの鋳型として用いることができる。ＰＣＲはＥｘＴａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて、製造者の説明書に従って行えばよい。
ＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色で可視化すると、野生型アリルと欠失型アリルは、欠失断片に由来して異なるサイズの断片のバンドとして得られる。同様に、Δ２７の検出は塩基配列決定でも可能である。
シーケンシングはＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ処理後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１を用いて、Ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行うことができる。得られた配列をＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でアラインメントし、ＳＮＰｓ又は変異を可視化できる。
ＡＡ、ＧＧ及びＧＡ遺伝子型を有する細胞の機能的アッセイは、以下のように行うことができる。すなわち、ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のアリルＡ又はＧを、適当な発現ベクターに組み込む。本発明に用いることができる発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のｐＧＥＸ等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター等が挙げられる。哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏ（−）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）等が挙げられる。
アリルＡ−又はＧ−を含んだｃＤＮＡを、適当な方法を用いて宿主に発現させる。発現方法は、リポフェクタミン試薬を用いる方法、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられるが、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が好ましい。
また、トランスフェクションに用いることのできる宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。
本機能アッセイは、宿主細胞に特に限定されるものではないが、動物細胞、例えばブタ近位尿細管由来上皮細胞であるＬＬＣ−ＰＫ１細胞（ＪＣＲＢ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）が好ましい。この宿主細胞を適当な時間培養した後、細胞をヒグロマイシンＢ含有培養液に移し、さらに適当な時間培養した後に、ヒグロマイシンＢ耐性細胞のコロニーを単離し、アレルＡ又はアレルＧの発現をＲＴ−ＰＣＲで検出して確認する。その後、細胞を培養し大量の細胞から膜分画を抽出することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験としてｃＧＭＰなどの膜輸送の基質となる分子を加えることで輸送能を測定することができる。
耳垢型評価法又は腋下臭症評価用キット
本発明において、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のうち、コード領域の第５３８番目の塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び第３９３９番目〜第３９６５番目にわたる２７塩基欠失部位の両側に近接する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは、耳垢型決定のためのキットに含めることができる。
本発明のキットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含むものである。そのような成分としては、限定されるものではないが、例えば本発明のオリゴヌクレオチド、緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップなどを含む。
本発明のキットは、本発明において見出された遺伝子多型である、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のうち、第５３８番目の塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び第３９３９番目〜第３９６５番目にわたる２７塩基欠失の両端に近接する塩基配列に対するオリゴヌクレオチドを含む。従って、例えば、腋下臭症の治療のための薬物を患者等に使用する前（例えば手術前等）に採血してＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをキット中のオリゴヌクレオチドと反応させて遺伝子型を判定する。判定された遺伝子型から薬物の種類又は用量などの投与計画が作成される。その結果、個人に合った薬物効果を得ることができ、オーダーメイド医療に有用となる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
実施例１：耳垢決定遺伝子の決定
本発明者らが以前の研究で耳垢遺伝子座をマップした〜５．９−ｃＭ領域周辺には公知の多型マーカーが希少であったため、最初に、ＮＣＢＩ遺伝子バンク（Ｇｅｎｂａｎｋ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ）において、ＣＡ−反復マーカーを検索した。また同時に、ＪＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ）において、当該耳垢遺伝子座が特定されているはずの２つのゲノム配列間（ＡＣ００３０３４及びＡＣ００７７２８）に関する一塩基変異多型（ＳＮＰ）を検索した。
Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されたゲノム配列に対応する１３４個の蛍光染色標識プライマーセットを設計し、ＡＣ００３０３４及びＡＣ００７７２８の配列の間の区間のＣＡ−反復マーカーを増幅した。この区間には、以前マッピングされたＤ１６Ｓ３０９３、Ｄ１６Ｓ３１１７及び耳垢遺伝子座位が含まれる（Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
次いでこれらのマーカーを用いて、１１８名のボランティア（６４乾型個体及び５４の湿型対照個体）の遺伝子型を決定し、症例（乾型個体）・対照（湿型個体）試験を行った。ボランティアのＤＮＡサンプルは匿名の態様で収集し、その耳垢型は自己申告とした。サンプル中のＰＣＲ産物をＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で分離し、得られたアリルを、Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析し、カイ２乗検定を用いて統計学的に解析した。ＳＮＰの遺伝型決定は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で処理した後に、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ  ３．１を用いた、Ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるダイレクトシークエンスにより行った。ＳＮＰデータはまた、カイ２乗検定により解析した。
その結果、１２個のＣＡ−反復マーカーがｌｏｇ１０＜−２．３という有意なｐ−値を示した。ここでｐ値とは統計学的な有意水準を現す値である。第１６染色体の長腕のＣＡ−反復マーカーにおけるｐ−値は、短腕でのｐ−値よりも低かったが、当該マーカーでは、これ以上耳垢遺伝子座を特定できなかったので、本発明者は、ＡＢＣＣ１２遺伝子を包含するＣＡ−反復（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００７６００（図２、「ＡＣ００７６００−Ｍ１」））周辺のシーケンシングを行うことにより、新たに、ｐ−値がｌｏｇ１０＜−２．３を示すＳＮＰｓを検索した。
この結果、同定した６２個のＳＮＰ（１６個が新規同定のＳＮＰｓであり、４６個が登録されたＳＮＰｓであった）のうち、Ｂ−８１５４０及びＩＭＳ−ＪＳＴ１４１６７６の２個は、各々４．０ｘ１０−９及び７．６ｘ１０−５という有意なｐ−値を示した（図２）。
さらに、この２つのＳＮＰアリルに関して、試験された６４名の乾型個体全てがホモ接合体であった。これらの知見は、乾型の劣性形質及び創始者効果と一致し、耳垢遺伝子座がこの領域内にあることを強く示唆した。Ｇｅｎｂａｎｋのゲノム情報によれば、２つのＳＮＰ部位は互いに６００ｋｂ離れており、この間にはＡＢＣＣ１２（ＡＢＣＣ  ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１２）、ＡＢＣＣ１１、ＬＯＮＰ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ＬＯＮ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）及びＳＩＡＨ１（ｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １）の４つの遺伝子が含まれていることが分かる（図２）。
ここで、本発明者は、当該４つの遺伝子領域に焦点を当て、湿型耳垢を有することが確実な８人について完全シークエンスを行った。ある遺伝子内の与えられたＳＮＰが耳垢遺伝子座と密接に連鎖する場合、以前報告された日本人集団における耳垢の表現型のデータ（Ｍａｔｓｕｎａｇａ，１９６２；Ｏｍｏｔｏ，１９７３）に照らせば、その８人は、８０−９０％ヘテロ接合性を示すことが予測される。本発明者は、そのようなＳＮＰを当該領域に見出し、同様の上記と同一の１１８サンプルについて、再度症例（乾型個体）・対照（湿型個体）試験を行った。
３種のＳＮＰ、すなわち、ＡＢＣＣ１１のエキソン４中のＢ３５７７６０（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）、ＬＯＮＰのイントロン１２中のＢ４７５３４０（ＩＶＳ１２＋７５０８Ａ＞Ｇ）、及びＬＯＮＰのイントロン１４中のＡｌｕ−反復配列内のＢ４８２５００（ＩＶＳ１４＋３２０Ａ＞Ｇ）が最も低いｐ−値（＜２．０ｘ１０−１４）（図２）を示し、それらのＳＮＰは日本人集団において強い連鎖不平衡（ＬＤ）（ｒ２＞０．９７）にあった。
遺伝子型解析の結果、乾型と自己申告した６４サンプルのうち、Ｂ３５７７６０遺伝子座では６３サンプルはＡＡホモ接合体で、１サンプルはＧＡヘテロ接合体であった。Ｂ４７５３４０座では、６２サンプルがＡＡであり、２サンプルがＧＡであり、Ｂ４８２５００座では、６３サンプルがＡＡであり、１サンプルがＧＡであった。残りの５４人の湿型サンプルでは、３つの各遺伝子座で、６サンプルがそれぞれＧＧ、ＧＧ及びＧＧホモ接合体であり、３３サンプルが、それぞれＧＡ、ＧＡ及びＧＡヘテロ接合体であり、１５サンプルがＡＡ、ＡＡ及びＡＡホモ接合体であった。
２つの主な３−遺伝子座ハプロタイプである、Ｇ−Ｇ−Ｇ及びＡ−Ａ−Ａが１１７サンプル中に見出され、１つの稀なハプロタイプであるＡ−Ｇ−Ａが、乾型のサンプル中に見出された。これらのデータは、当該３つのＳＮＰｓのうちの１つが耳垢型を決定付ける変異であることを強く示唆したが、何人かのサンプルは耳垢型表現型と遺伝子型間に矛盾がみられた。
上記解析と並行して、３つのＳＮＰをカバーするＢＡＣ（細菌人工染色体）及びコスミドライブラリーを、家系から判断して明らかにヘテロ接合体である１個体から構築し、各々湿性及び乾型のアレルに対応する２つのコンティグセットをシークエンスした。その結果、これらのクローンは、構造的にも異常はなく、他にいかなる新たな塩基の変化も見られなかった。
その後本発明者は、医師によって耳垢型が新たに同定された１２６人の日本人ボランティア（８８乾型及び３８湿型の個体）において、上記３種のＳＮＰ座に関する遺伝子型を決定した。最初の耳鼻科検査では、８個体の耳垢型は分類不能であったが、０．０６（８／１２６）という数値は以前報告された０．０５（Ｍａｔｓｕｎａｇａ，１９６２）に匹敵し、自己申告及び耳鼻科診断による耳垢型は真の表現型と一致するとは限らないという事実が導き出された。しかしながら、８人中６人は、綿棒で採取した耳垢を再度評価することにより湿性又は乾型かに明白に決定できた。他の２人は依然として分類できなかったが、家族構成員内の耳垢型の伝達パターンに基づき、最終的には乾型に分類された。結果をまとめると、Ｂ３５７７６０（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）座の遺伝子型は、乾型の８８個体のうち８７がＡＡホモ接合体であり、湿型の３８個体は全てＧＡヘテロ接合体又はＧＧホモ接合体であった（表１）。
【表１】
2006135115.tif 000002
2006135115.tif 000003
例外は１人で、表現型（乾型）及び遺伝子型（ＧＡヘテロ接合体）の間の不一致が見られた。しかし、この個体は、ＡＢＣＣ１１中のＧアリルにおけるＧ／Ａ部位の下流にあるエクソン２８内に第３９３９番目〜第３９６５番目の２７塩基が欠失（３９３９−３９６５ｄｅ１２７）していた。この欠失（△２７）によりアリルＧの機能障害がおこり、結果として乾性表現型となった。従って、日本の長崎在住者の間のアリルＡ頻度は、８８人／１２６人、すなわち０．８２９と算出できる。
本発明者は、ＣＥＰＨ（西・北ヨーロッパ出身の先祖をもつ白人）家系由来のＤＮＡにおけるＢ３５７７６０及びＢ４７５３４０の間に、いくつかの組換えアリルを見出したが、耳垢表現型が決定された１２６人の日本人中にはそのような組換え体は同定されなかった。当該データを他の１１８の一連の日本人由来のサンプルと組み合わせた場合、１つの組換え事象が明らかとなった。２つのマーカー間の間隔はほとんど完全な連鎖不平衡（ｒ２▲＝▼１．００、Ｄ’▲＝▼１．００；及びｒ２＞０．６４、Ｄ’＞０．８４、各々、１２６名の日本人及び９６名のＣＥＰＨ家系構成員）を示したため、おそらく、Ａ−Ａハプロタイプ（乾型ハプロタイプ）は、創始者由来であると考えられる。２つの他のＳＮＰｓであるＢ３３４０００及びＢ４０４９４０は各々、Ｂ３５７７６０に対して約２４ｋｂほど動原体寄り、及び約４７ｋｂほど末端寄りであり（図２）、各々のマイナーアリル頻度が０．３及び０．５である８７の乾型サンプルの関連研究で、高いｐ−値（１．３ｘ１０−３及び１．５ｘ１０−３）を示した。この結果は、この２つのＳＮＰは耳垢型決定に関与していないことを示す。
これらの解析結果を総合すると、Ｂ３５７７６０は耳垢型の決定因子であり、さらに、ＡＢＣＣ１１中の他の部位の稀な変異もまた、個体の一部の乾型形成に寄与すると推定できる。
【実施例２】
【０００７】
実施例２：アレルＡ及び２７塩基欠失をもつアリルの種々の集団における頻度分布
様々な集団間の乾性−耳垢表現型頻度における研究は多数行われている（Ｍａｔｓｕｎａｇａ，１９６２；Ｐｅｔｒａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７；Ｐｅｔｒａｋｉｓ，１９６９；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，１９６９；Ｐｅｔｒａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１；Ａｌｆｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０；Ｏｍｏｔｏ，１９７３；Ｐａｔｅｌ，１９７３；Ｎｏｒａｋｍａｌ  ａｎｄ  Ｔａｎ，１９７９；Ｓｐｉｔｓｙｎ  ａｎｄ  Ａｆａｎａｓ▲ｅ▼ｖａ，１９８９）（ｔａｂｌｅ及びＯｎｌｉｎｅ  ｔａｂｌｅ）。本発明者は、世界中の合計３３集団（１つの国籍又は１つの国における１つの民族を１集団と数えた）の遺伝子型を直接シークエンスし、アリル“Ａ”特異的Ｔａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ又は一本鎖多形性分析（ＳＳＣＰ）を用いて決定した。
以前の研究で示された乾性耳垢の表現型分布から予想されたように、東アジア人種はアリルＡ頻度が極めて高い。最高値（１００％）は大邸（テグ）地方（韓国南東部）の韓国人、および北部中国人でみられ、ここの人々ではアリルＧは皆無であり、ＧＡもＧＧ遺伝子型も存在しなかった（表１）。
次にアリルＡが高い集団は、モンゴル人、北部中国人以外の中国人及び本土日本人（長崎在住者）であった。一方、アリルＡ頻度が最も低いのは、サハラ以南のアフリカの様々な国出身のアフリカ人及びアフリカ出身のアメリカ市民である。中間頻度は、アイヌ−及び沖縄−日本人、南アジア人、オセアニア人、南北アメリカ原住民、及びそれほど頻度は高くないがヨーロッパ出身のアメリカ人、及びヨーロッパ人、および他の人種で観察された。耳垢表現型において以前示されたように（Ｏｍｏｔｏ，１９７３）、アリルＡの様々な頻度をプロットした世界等高線地図では、韓国および北中国がピークであり、ユーラシア大陸における北−南及び東−西の下方の地理的勾配分布を示すことが明らかとなった（図３）。
一方、本発明者はまた、ＰＣＲ及びその後のゲル電気泳動解析による２７塩基欠失について様々な集団の個体の遺伝子型を決定した。
本発明者は、２７塩基欠失の検出のためのＰＣＲプライマーセットを設計した。ＰＣＲのプライマー配列、ＰＣＲ反応組成液、サイクル条件は以下の通りである。
プライマー（Ｆ）：ＣＡＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧ  （配列番号３）
プライマー（Ｒ）：ＣＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＧＡ  （配列番号４）
反応液組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２５℃）
５０ｍＭ  ＫＣｌ
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２００μＭ  ｄＮＴＰ
０．５μＭ  プライマー
サイクル条件：（９５℃×２０秒、６０℃×２０秒、７２℃×２０秒）×３５サイクル
ＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色で可視化した。野生型アレルは１４３ｂｐの大きさであったが、欠失型アレルは１１６ｂｐであった。
意外にも、２７塩基欠失は、日本人５００人中１人（０．００１）に加えてアメリカ原住民２０人中２人（欠失アリル頻度が０．０５０）、アンデス山岳の人々１０人中１人（０．０５０）、及びボリビア人３０人中９人（０．１５０）、タイ人５０人中１人（０．０２０）で見られた。２７塩基欠失は、韓国人、中国人、モンゴル人、与那国島及びアイヌ系日本人、太平洋諸島の人々、ＣＥＰＨ家系、ウクライナ人、ロシア人、イベリア人、ユダヤ人、ハンガリー人、コロンビア人、ベネズエラ人、又はアフリカ系アメリカ人では全くみられなかった（表１）。２７塩基欠失はＢ３５７７６０（ｃ．５３８Ｇ＞Ａ）遺伝子座（１人のＡＡ及び６人のＧＧホモ接合体、並びに４人のＧＡヘテロ接合体）での遺伝子型には依存せず、南北アメリカ原住民の一部において比較的頻出する欠失多型である。このように、２７塩基欠失は稀であるが、アリルＡと同様に、そのホモ接合体では、腋下臭がないものと考えられる。
【実施例３】
【０００８】
実施例３：ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のアリルＡ又はアリルＧを導入したＬＬＣ−ＰＫ１細胞における遺伝子発現およびｃＧＭＰ輸送に関するアッセイ
ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のアレルＡ又はＧをもつ完全長ｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏに組込み、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、製造者の指示書に従い、ブタ由来のＬＬＣ−ＰＫ１細胞（ＪＣＲＢ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）へトランスフェクトした。４８時間後、細胞を２００μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ含有培養液に移した。１４日後にヒグロマイシンＢ耐性の細胞のコロニーを単離した。アリルＡ又はアリルＧを発現する細胞から全ｍＲＮＡを抽出し、７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法で発現量を定量した。ＡＢＣＣ１１−ｍＲＮＡとＧＡＰＤＨ（対照）の比を算出し、統計学的に比較した。その結果、導入された各アリルのコピー数は不明であるが、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中のアリルＡ発現量はアリルＧよりも３倍ほど高かった。
ヒグロマイシンＢ耐性細胞を５×１０８個になるまで培養し、細胞膜分画を回収して、以前報告された手法（Ｍｉｔｏｍｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍａｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に従い、ｃＧＭＰの膜輸送能を測定した。その結果、ＡＢＣＣ１１がコードするＭＲＰ８タンパク質の輸送はＡＴＰ依存性であることを確認し、さらに、グリシン−１８０残基（アリルＧ）をもつ細胞膜のｃＧＭＰに対する輸送能は、アリルＡをもつ細胞膜および何も組み込んでいないベクターだけを導入した細胞膜に比べて高いことが示された。ｃＧＭＰに対して算出したＫｍ値は生体内の生理的な濃度に比べて高すぎたが、グリシン−１８０残基をもつＭＲＰ８は他の内因性基質を輸送しているのではないかと推定される。
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【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のうち第５３８番目の塩基置換又は第３９３９番目から第３９６５番目にわたる２７塩基の欠失を利用して耳垢型の評価を行うことができ、また腋下臭症の評価を行うことができる。すなわち、本発明は、耳垢型を決定している、ＡＢＣＣ１１遺伝子の塩基配列のうち、５３８番目の塩基の１ヶ所の多型部位の遺伝子型を調べるのみで、耳垢型（乾型又は湿型）を評価することができる。また、耳垢型は腋下臭症と密接に関連するため、本発明により腋下臭症の評価をすることができる。したがって、本発明の方法は、腋下臭に使用するための化粧品等の開発に有用である。
さらに、この５３８番目の塩基の多型部位の遺伝子型から、人種の起源が古代の北方モンゴロイド人種起源である可能性が非常に高いことが分かる。したがって、ＡＢＣＣ１１遺伝子の５３８番目の塩基の多型部位は、従来の方法よりも極めて簡便な方法で人種の祖先を分類することを可能とする新しいマーカーとなり、考古学又は人類学の発展に寄与するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
［配列表］
2006135115.tif 000004
2006135115.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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