(57)【要約】  本発明はRETに対する抗体等のRETの機能を阻害する物質を含有してなる医薬を提供する。また、本発明はGDNFに対する抗体等のGDNFの機能を阻害する物質を含有してなる医薬を提供する。更に、本発明はGFRα1に対する抗体等のGFRα1の機能を阻害する物質を含有してなる医薬を提供する。本発明の医薬は乳癌などの予防・治療剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
【請求項２】
物質が
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項１記載の医薬。
【請求項３】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２または３記載の医薬。
【請求項５】
癌の予防・治療剤である請求項１〜４記載の医薬。
【請求項６】
乳癌の予防・治療剤である請求項１〜４記載の医薬。
【請求項７】
癌細胞の増殖阻害剤である請求項１〜４記載の医薬。
【請求項８】
乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項１〜４記載の医薬。
【請求項９】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項１０】
哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項１１】
哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項１２】
哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項１３】
哺乳動物に対して、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項１４】
物質が
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項１０〜１３記載の方法。
【請求項１５】
物質が配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項１０〜１３記載の方法。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項１８】
乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項１９】
癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項２０】
乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項２１】
物質が配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項１７〜２０記載の使用。
【請求項２２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
【請求項２４】
物質が
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項２３記載の医薬。
【請求項２５】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
【請求項２６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２４または２５記載の医薬。
【請求項２７】
癌の予防・治療剤である請求項２３〜２６記載の医薬。
【請求項２８】
乳癌の予防・治療剤である請求項２３〜２６記載の医薬。
【請求項２９】
癌細胞の増殖阻害剤である請求項２３〜２６記載の医薬。
【請求項３０】
乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項２３〜２６記載の医薬。
【請求項３１】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項３２】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項３３】
哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項３４】
哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項３５】
哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項３６】
哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項３７】
物質が
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項３３〜３６記載の方法。
【請求項３８】
物質が配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項３３〜３６記載の方法。
【請求項３９】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項４１】
乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項４２】
癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項４３】
乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項４４】
物質が配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項４０〜４３記載の使用。
【請求項４５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
【請求項４７】
物質が
（１）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項４６記載の医薬。
【請求項４８】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
【請求項４９】
抗体がモノクローナル抗体である請求項４７または４８記載の医薬。
【請求項５０】
癌の予防・治療剤である請求項４６〜４９記載の医薬。
【請求項５１】
乳癌の予防・治療剤である請求項４６〜４９記載の医薬。
【請求項５２】
癌細胞の増殖阻害剤である請求項４６〜４９記載の医薬。
【請求項５３】
乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項４６〜４９記載の医薬。
【請求項５４】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項５５】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項５６】
哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項５７】
哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項５８】
哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項５９】
哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項６０】
物質が
（１）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である請求項５６〜５９記載の方法。
【請求項６１】
物質が配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項５６〜５９記載の方法。
【請求項６２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項６４】
乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項６５】
癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項６６】
乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
【請求項６７】
物質が配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項６３〜６６記載の使用。
【請求項６８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６７記載の使用。
【請求項６９】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
【請求項７０】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を含有してなる乳癌の予防・治療剤。
【請求項７１】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能がＧＤＮＦによるＲＥＴの活性化またはＧＤＮＦによる乳癌細胞増殖促進である、請求項７０記載の予防・治療剤。
【請求項７２】
物質が、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（２）ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
であって、ＧＤＮＦによるシグナル伝達阻害活性またはＧＤＮＦによる乳癌細胞増殖阻害活性を有しているものである、請求項７０記載の予防・治療剤。
【請求項７３】
物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項７０記載の予防・治療剤。
【請求項７４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項７２または７３記載の予防・治療剤。
【請求項７５】
ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の治療に用いられる、請求項７０記載の予防・治療剤。
【請求項７６】
ＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の治療に用いられる、請求項７０記載の予防・治療剤。
【請求項７７】
哺乳動物に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項７８】
ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項７９】
ＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
【請求項８０】
物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の予防・治療方法。
【請求項８１】
乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
【請求項８２】
ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
【請求項８３】
ＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
【請求項８４】
物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項８１乃至８３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RETに対する抗体等のRETの機能を阻害する物質およびその用途、具体的には、癌（特に、乳癌）の予防・治療剤または診断剤、癌細胞の増殖阻害剤などに関する。
また、本発明は、GDNF(Glial cell derived neurotropic factor)に対する抗体等のGDNFの機能を阻害する物質およびその用途、具体的には、癌（特に、乳癌）の予防・治療剤または診断剤、癌細胞の増殖阻害剤などに関する。
更に、本発明は、GFRα1(GDNF family receptor alpha 1)に対する抗体等のGFRα1の機能を阻害する物質およびその用途、具体的には、癌（特に、乳癌）の予防・治療剤または診断剤、癌細胞の増殖阻害剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
RET遺伝子は1985年、NIH3T3細胞を形質転換する遺伝子としてヒトリンパ腫由来DNAライブラリーより見出された遺伝子である。以後、RET mRNAとしては2つのバリアント（Refseq Accession No. NM_020630, 020975）、タンパク質としては1114アミノ酸よりなるアイソフォームa（Refseq Accession No. NP_066124）、1072アミノ酸よりなるアイソフォームc（Refseq Accession No. NP_065681）の2つアイソフォームが報告されている。RETタンパク質は、アイソフォームによって細胞内にあると考えられるC末端からの51及び9アミノ酸がそれぞれに特異的であるものの、共通して1つの細胞膜貫通部位と細胞外にカドヘリン様構造、及び細胞内にプロテインキナーゼ活性部位を持つ受容体型チロシンキナーゼと予想されている。RETタンパク質のリガンドとしてはGDNF(Glial cell line-derived neurotropic factor)、コレセプターとしてはGFRα1（GDNF family receptor α 1）が報告されている。RETタンパク質は生理的には種々の神経、腎臓の発生に働いていると考えられている。
また、RET遺伝子は、活性化型変異と多発性内分泌腫瘍2型、失活型変異とヒルシュスプルング病、逆位又は転座による活性化と甲状腺乳頭癌の関連が報告されている（非特許文献１）。Expression sequence tag DNAデータベースLIFESEQ（登録商標）の解析により、RET遺伝子は副腎癌、前立腺癌、乳癌、結合組織癌で遺伝子発現が正常組織に比べて増加していることが報告されている（特許文献１）。【０００３】
GDNF遺伝子は1993年、ラット中脳細胞のドーパミン取り込みを指標にグリア由来B49細胞培養上清から精製されたタンパク質をコードするラット遺伝子のヒトオルソログとしてヒトゲノムライブラリーより見出された遺伝子である。以後、ヒトGDNF mRNAとしては3つのバリアント（Refseq Accession No. NM_000514, 199231, 199234）、タンパク質としては211アミノ酸よりなるアイソフォーム1（Refseq Accession No. NP_000505）、185アミノ酸よりなるアイソフォーム2（Refseq Accession No. NP_954701）、133アミノ酸よりなるアイソフォーム3（Refseq Accession No. NP_954704）の3つアイソフォームが報告されている。GDNFタンパク質は、アイソフォームによってN末端側のアミノ酸配列がそれぞれに特異的であるものの、共通してTGF-beta(Transforming growth factor-beta)様構造を持つTGF-betaファミリーの一つと考えられている。GDNFタンパク質のレセプターとしてはGFRα1 (GDNF family receptor alpha 1)、コレセプターとしてはRETチロシンキナーゼが報告されている。GDNFタンパク質は生理的には中脳ドーパミン作動性神経細胞、運動神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞などの神経栄養因子として働いていると考えられている。
また、GDNF遺伝子は、変異と先天性中枢性肺胞低換気症候群及びヒルシュスプルング病の関連が報告されている（非特許文献２、３）。【０００４】
GFRα1遺伝子は1996年、ヒトGDNF(Glial cell line-derived neurotropic factor)と結合するタンパク質をコードするラット遺伝子のヒトオルソログとしてヒト脳黒質由来DNAライブラリーより見出された遺伝子である。以後、ヒトGFRα1 mRNAとしては2つのバリアント（Refseq Accession No. NM_005264, 145793）、タンパク質としては465アミノ酸よりなるアイソフォームa（Refseq Accession No. NP_005255）、460アミノ酸よりなるアイソフォームb（Refseq Accession No. NP_665736）の2つアイソフォームが報告されている。GFRα1タンパク質は、アイソフォームaに比してbは5アミノ酸残基の欠失が見られるものの、共にシステイン残基に富むGPI(Glycosylphosphatidylinositol)アンカー型タンパク質と予想されている。GFRα1タンパク質のリガンドとしてはGDNF 、NeurturinおよびArtemin、コレセプターとしてはRETチロシンキナーゼが報告されている（非特許文献４）。
また、GFRα1遺伝子は、その変異と甲状腺髄様癌の関連が報告されている（非特許文献５）。
Expression sequence tag DNAデータベースLIFESEQ（登録商標）の解析により、GFRα1遺伝子は乳癌、脳腫瘍で遺伝子発現が正常組織に比べて増加していることが報告されている（特許文献１）。また、乳癌で遺伝子発現が増加している遺伝子群の1つであることが報告されている（特許文献２）。
【特許文献１】国際公開第03/024392号パンフレット
【特許文献２】国際公開第02/059377号パンフレット
【非特許文献１】Endocrinology, 145巻: 5448-5451 2004年
【非特許文献２】Journal of Cell Science, 116巻: 3855-3862 2005年
【非特許文献３】Am. J. Hum. Genet, 62巻: 715-717 1998年
【非特許文献４】Anatomical Science International, 80巻: 42-52 2005年
【非特許文献５】Oncogene, 20巻: 2161-70 2001年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、GDNF(Glial cell line-derived neurotropic factor)をヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７に投与したところ、予想外にも細胞増殖が増加すること、そしてRET遺伝子またはGFRα1遺伝子に対するsiRNAをヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７に投与したところ、予想外にもGDNF依存的な細胞増殖の増加が抑制されることを見出し、GDNF、GDNFにより活性化されたRETタンパク質、およびGDNFにより活性化されたGFRα1タンパク質が細胞増殖を誘発すると考えた。
本発明者らは、この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
［２］物質が
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［１］記載の医薬。
［３］配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
［４］抗体がモノクローナル抗体である［２］または［３］記載の医薬。
［５］癌の予防・治療剤である［１］〜［４］記載の医薬。
［６］乳癌の予防・治療剤である［１］〜［４］記載の医薬。
［７］癌細胞の増殖阻害剤である［１］〜［４］記載の医薬。
［８］乳癌細胞の増殖阻害剤である［１］〜［４］記載の医薬。
［９］配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
［１０］哺乳動物に対して、配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
［１１］哺乳動物に対して、配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［１２］哺乳動物に対して、配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
［１３］哺乳動物に対して、配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
［１４］物質が
（１）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［１０］〜［１３］記載の方法。
［１５］物質が配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項１０〜１３記載の方法。
［１６］抗体がモノクローナル抗体である上記［１５］記載の方法。
［１７］癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［１８］乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［１９］癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［２０］乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［２１］物質が配列番号：１（ＲＥＴタンパク質アイソフォームａ）または配列番号：３（ＲＥＴタンパク質アイソフォームｃ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である［１７］〜［２０］記載の使用。
［２２］抗体がモノクローナル抗体である上記［２１］記載の使用。【０００８】
［２３］配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
［２４］物質が
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［２３］記載の医薬。
［２５］配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
［２６］抗体がモノクローナル抗体である［２４］または［２５］記載の医薬。
［２７］癌の予防・治療剤である［２３］〜［２６］記載の医薬。
［２８］乳癌の予防・治療剤である［２３］〜［２６］記載の医薬。
［２９］癌細胞の増殖阻害剤である［２３］〜［２６］記載の医薬。
［３０］乳癌細胞の増殖阻害剤である［２３］〜［２６］記載の医薬。
［３１］配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
［３２］配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
［３３］哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
［３４］哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［３５］哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
［３６］哺乳動物に対して、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
［３７］物質が
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［３３］〜［３６］記載の方法。
［３８］物質が配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である［３３］〜［３６］記載の方法。
［３９］抗体がモノクローナル抗体である［３８］記載の方法。
［４０］癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［４１］乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［４２］癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［４３］乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［４４］物質が配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である［４０］〜［４３］記載の使用。
［４５］抗体がモノクローナル抗体である［４４］記載の使用。【０００９】
［４６］配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
［４７］物質が
（１）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［４６］記載の医薬。
［４８］配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
［４９］抗体がモノクローナル抗体である［４７］または［４８］記載の医薬。
［５０］癌の予防・治療剤である［４６］〜［４９］記載の医薬。
［５１］乳癌の予防・治療剤である［４６］〜［４９］記載の医薬。
［５２］癌細胞の増殖阻害剤である［４６］〜［４９］記載の医薬。
［５３］乳癌細胞の増殖阻害剤である［４６］〜［４９］記載の医薬。
［５４］配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
［５５］配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
［５６］哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
［５７］哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［５８］哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
［５９］哺乳動物に対して、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
［６０］物質が
（１）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
である［５６］〜［５９］記載の方法。
［６１］物質が配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である［５６］〜［５９］記載の方法。
［６２］抗体がモノクローナル抗体である［６１］記載の方法。
［６３］癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［６４］乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［６５］癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［６６］乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
［６７］物質が配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である［６３］〜［６６］記載の使用。
［６８］抗体がモノクローナル抗体である［６７］記載の使用。
［６９］配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
［７０］ＧＤＮＦ（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）、ＧＦＲα１（配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）及びＲＥＴ（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）の機能を阻害する物質を含有してなる乳癌の予防・治療剤。
［７１］ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能がＧＤＮＦ（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）によるＲＥＴ（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）の活性化またはＧＤＮＦ（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）による乳癌細胞増殖促進である、［７０］記載の予防・治療剤。
［７２］物質が、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（２）ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
であって、ＧＤＮＦ（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）によるシグナル伝達阻害活性またはＧＤＮＦ（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）による乳癌細胞増殖阻害活性を有しているものである、［７０］記載の予防・治療剤。
［７３］物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、［７０］記載の予防・治療剤。
［７４］抗体がモノクローナル抗体である、［７２］または［７３］記載の予防・治療剤。
［７５］ＧＦＲα１タンパク質（配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）及びＲＥＴタンパク質（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）を発現する乳癌の治療に用いられる、［７０］記載の予防・治療剤。
［７６］ＧＤＮＦタンパク質（配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）、ＧＦＲα１タンパク質（配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）及びＲＥＴタンパク質（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）を発現する乳癌の治療に用いられる、［７０］記載の予防・治療剤。
［７７］哺乳動物に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［７８］ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［７９］ＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
［８０］物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、［７７］乃至［７９］のいずれかに記載の予防・治療方法。
［８１］乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
［８２］ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
［８３］ＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質の使用。
［８４］物質が、
（１）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、［８１］乃至［８３］のいずれかに記載の使用。
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
RETに対する抗体等のRETの機能を阻害する物質、GDNFに対する抗体等のGDNFの機能を阻害する物質、GFRα1に対する抗体等のGFRα1の機能を阻害する物質は、例えば、乳癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GDNFの濃度（ng/mL）とヒト乳癌細胞株における細胞増殖促進活性の関係をCell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を用いて測定したものである。横軸は投与したGDNFの濃度（ng/mL）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【図２】RET遺伝子に対するsiRNA存在下でのGDNFの濃度（ng/mL）とヒト乳癌細胞株における細胞増殖促進活性の関係をCell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を用いて測定したものである。横軸は投与したGDNFの濃度（ng/mL）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【図３】GFRα1遺伝子に対するsiRNA存在下でのGDNFの濃度（ng/mL）とヒト乳癌細胞株における細胞増殖促進活性の関係をCell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を用いて測定したものである。横軸は投与したGDNFの濃度（ng/mL）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【図４】a)ヒト乳癌細胞株におけるRETタンパク質の発現をウェスタンブロット法を用いて解析したものである。ｂ）ヒト乳癌細胞株におけるRETタンパク質の発現をフローサイトメトリー法を用いて解析したものである。
【図５】a)ヒト乳癌細胞株におけるGFRα1タンパク質の発現をウェスタンブロット法を用いて解析したものである。ｂ）ヒト乳癌細胞株におけるGFRα1タンパク質の発現をフローサイトメトリー法を用いて解析したものである。
【図６ａ】GDNFとの反応時間とヒト乳癌細胞株におけるシグナル伝達系タンパク質のリン酸化の関係を測定したものである。ELISA法を用いて測定したものである。横軸は投与したGDNFとの反応時間（min）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【図６ｂ】GDNFとの反応時間とヒト乳癌細胞株におけるシグナル伝達系タンパク質のリン酸化の関係を測定したものである。ウェスタンブロット法を用いて解析したものである。レーン1、２、３、４にはそれぞれGDNFを０、１０、２０、３０分間反応させた細胞のライゼートを電気泳動した。
【図７】ラットGDNFの濃度（ng/mL）とヒト乳癌細胞株における細胞増殖促進活性の関係をCell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を用いて測定したものである。横軸は投与したラットGDNFの濃度（ng/mL）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【図８】ヒト乳癌組織におけるRETタンパク質の発現を免疫染色法を用いて測定したものである。
【図９】ヒト乳癌組織におけるGFRα1タンパク質の発現を免疫染色法を用いて測定したものである。
【図１０】抗GDNF抗体の濃度（μg/mL）とヒト乳癌細胞株における細胞増殖阻害活性の関係をCell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を用いて測定したものである。横軸は投与した抗GDNF抗体の濃度（μg/mL）を示し、縦軸は450 nmの吸光度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（Ｉ．抗ＲＥＴ抗体等）
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「RETタンパク質・アイソフォームａ」と略記する場合がある）または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「RETタンパク質・アイソフォームｃ」と略記する場合がある）（以下、両者を併せて「RET」または「本発明のタンパク質Ｉ」と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。【００１３】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。【００１４】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。【００１５】
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science,247：1306-1310 (1990)を参照）。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。【００１６】
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＤＮＦの刺激を細胞内へ伝達することにより、癌細胞（例、乳癌細胞）の増殖を促進させる活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質Ｉの活性の程度が配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
RETの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、RETとGFRα1を共発現した癌細胞（例、乳癌細胞）をＧＤＮＦで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。【００１７】
また、RETとしては、例えば、（i）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。該タンパク質は、好ましくは、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。【００１８】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。【００１９】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。【００２０】
RETがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるRETに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【００２１】
さらに、RETには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。【００２２】
RETの具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトRETタンパク質・アイソフォームａ）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトRETタンパク質・アイソフォームｃ）などがあげられる。【００２３】
RETの部分ペプチドとしては、前記したRETの部分ペプチドであって、好ましくは、前記したRETと実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。RETの部分ペプチドは免疫原性を有していることが好ましい。【００２４】
例えば、RETの構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。【００２５】
また、本発明で用いられるRETの部分ペプチドは、(1)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、(2)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、(3)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、(4)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、さらにより好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは(5)それらが組み合わされていてもよい。【００２６】
また、RETの部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、RETの部分ペプチドには、前記したRETと同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【００２７】
かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【００２８】
RETまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００２９】
RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質としては、例えば、
（１）RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）RETまたはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）RETまたはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）RETまたはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
などが用いられる。【００３０】
RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、「本発明の抗体Ｉ」と略記することがある）は、RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgAが挙げられる。また、本発明の抗体Ｉは、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらのキメラ抗体などの何れであってもよい。あるいは非ヒト温血動物 (例: ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)やヒトの抗体遺伝子ライブラリーを用いたファージディスプレー法等の抗体ディスプレー法により得られる抗体なども、本発明の抗体Ｉに包含され得る。本発明の抗体Ｉは、好ましくはヒトモノクローナル抗体である。【００３１】
本発明の抗体Ｉは、RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域 (CDR) を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール (PEG) 等のタンパク質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。【００３２】
本発明の抗体Ｉとしては、RETの細胞外領域を認識する抗体が好ましい。RETの細胞外領域としては、例えば以下のものを挙げることができる：
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質におけるアミノ酸番号１〜６３５からなる領域；
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質におけるアミノ酸番号１〜６３５からなる領域。【００３３】
RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを包括的に「RET類」と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【００３４】
以下に、本発明の抗体Ｉの抗原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体Ｉを調製するために使用される抗原としては、上記RET類（例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（RET）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩）、RETの細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩、もしくはRETと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原Ｉと称することもある）。【００３５】
本発明の抗原Ｉの具体例としては、RET類を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、RETの細胞外領域タンパク質またはその塩、RETの細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質、またはRETと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドなどが挙げられる。【００３６】
その他のタンパク質またはペプチドとしては、例えば、FLAG-tag、His-tag、Myc-tag、V5-tag、GST-tag、S-tag、T7-tag、抗体（ヒト抗体、マウス抗体など）のFc領域などが挙げられる。【００３７】
かかる(合成)ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【００３８】
RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。またRETの細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質はその融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。【００３９】
(a)本発明の抗原Ｉをヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の組織または細胞から調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることができる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた抗原をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。【００４０】
(b)本発明の抗原Ｉをコードする核酸を含有する形質転換体を用いてRET類、もしくはRETの細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩を製造する場合、該核酸は、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning（2nd ed.；J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。【００４１】
RETまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるRETのアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。【００４２】
RETまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。RETまたはその部分ペプチドをコードするＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）又は初期転写産物などが挙げられる。【００４３】
RETまたはその部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの方法としては、RETまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する方法、RETの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡをプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法によって目的とするＤＮＡを選別する方法等を挙げることができる。PCRに用いる鋳型ポリヌクレオチドとしては、RETまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等を用いることができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【００４４】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００４５】
より具体的には、RETをコードする核酸（ＤＮＡ等）としては、（i）配列番号：２で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトRETタンパク質・アイソフォームａ）をコードする）、あるいは配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸などや、（ii）配列番号：４で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトRETタンパク質・アイソフォームｃ）をコードする）、あるいは配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸などが用いられる。
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。【００４６】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。【００４７】
クローン化されたRETまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。RETの細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを得る場合には、上記と同様の方法によりクローニングするか合成したRET細胞外領域をコードするＤＮＡとその他のタンパク質(ペプチド)をコードするＤＮＡとを自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って連結する事ができる。【００４８】
以上のようにして獲得される本発明の抗原ＩをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、本発明の抗原Ｉを製造することができる。
本発明の抗原Ｉの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の抗原ＩをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【００４９】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。【００５０】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。なかでも、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。【００５１】
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【００５２】
発現ベクターとしては、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。【００５３】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の抗原ＩをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。【００５４】
このようにして構築された本発明の抗原ＩをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。【００５５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。【００５６】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。【００５７】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。【００５８】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。【００５９】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。【００６０】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。【００６１】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、マウスＮＳ０細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児細胞２９３Ｆ細胞、などが用いられる。【００６２】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。【００６３】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。【００６４】
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。【００６５】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。【００６６】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。【００６７】
このようにして、本発明の抗原ＩをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。【００６８】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。【００６９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。【００７０】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。【００７１】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。【００７２】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００７３】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００７４】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００７５】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明の抗原Ｉを生成せしめることができる。【００７６】
上記培養物からRETを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。【００７７】
本発明の抗原Ｉを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明の抗原Ｉが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。【００７８】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明の抗原Ｉの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【００７９】
かくして得られる本発明の抗原Ｉが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。【００８０】
なお、組換え体が産生する本発明の抗原Ｉを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。【００８１】
かくして生成する本発明の抗原Ｉの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。【００８２】
(c)RETを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原Ｉとして直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（b）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293細胞、COS7細胞、CHO-K1細胞、NIH3T3細胞、Balb3T3細胞、FM3A細胞、L929細胞、SP2/0細胞、P3U1細胞、NS0細胞、B16細胞、またはP388細胞などが好ましく用いられる。
(d)RETと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはRETを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【００８３】
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【００８４】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原Ｉは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質Ｉを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。【００８５】
不溶化した本発明の抗原Ｉを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原Ｉを適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原Ｉ（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原Ｉに対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。【００８６】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。【００８７】
投与に際して抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体Ｉの作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Nature、356巻、152項-154項参照）。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。【００８８】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。【００８９】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、ＳＰ２／０やＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【００９０】
また、モノクローナル抗体産生細胞の作製の為の細胞融合操作として電気融合法を用いても良い。【００９１】
ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。【００９２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原やタンパク質発現細胞を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。【００９３】
（ｂ）その他の方法によるモノクローナル抗体作製
本発明の抗体Ｉの作製方法は（a）に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原Ｉを高発現した癌の患者や本発明の抗原Ｉを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。【００９４】
本発明の抗原Ｉに特異的に結合するモノクローナル抗体(フラグメント)の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライブラリーを担いだ抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを本発明の抗原Ｉに対し一定時間反応させ、非特異的に結合するものを洗浄除去した後、本発明の抗原Ｉに特異的に結合するものを溶出回収し、その抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、数回同様の方法を繰り返し、最終的にクローン化した抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりIgG抗体遺伝子の該領域と組換えることにより、モノクローナルIgG抗体遺伝子を得ることができる。【００９５】
また、本発明の抗体Ｉは、ヒトや上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試験管内において本発明の抗原Ｉにより自体公知の方法により免疫した後、(a)に記載と同様の方法によりハイブリドーマを作製する事により得ることもできる。【００９６】
（ｃ）モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体Ｉは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。【００９７】
本発明のモノクローナル抗体Ｉは、上記のモノクローナル抗体含有原料から自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）や疎水カラムによる吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原あるいはプロテインＡやプロテインＧなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するアフィニティー精製法〕に従って行なうことができる。【００９８】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体Ｉは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原Ｉとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【００９９】
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。【０１００】
RETをコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「アンチセンスRET」又は「本発明のアンチセンス核酸Ｉ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたRETをコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、RETをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスRETは、RETをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。【０１０１】
アンチセンスRETの標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてRETタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、RETをコードする核酸の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、RETをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスRETは、RETをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるRETをコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。【０１０２】
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいても良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてもよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてもよい。【０１０３】
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。アンチセンスRETは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press,1993 などに開示されている。【０１０４】
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【０１０５】
RETをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスRETに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。RET ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。【０１０６】
RETをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（RETをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスRETに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature,411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。【０１０７】
本発明のアンチセンス核酸Ｉは、RETをコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。【０１０８】
アンチセンスRETの遺伝子発現阻害活性は、RETをコードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外のRETをコードする遺伝子発現系またはRETの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。【０１０９】
上記した本発明の抗体Ｉ及び本発明のアンチセンス核酸Ｉ等のRETの機能（例えば、RET活性や発現）を阻害する物質は、例えば以下の用途を有する。【０１１０】
後記実施例において示されるように、ＧＤＮＦを癌細胞（例えば乳癌細胞）に作用させることにより、細胞増殖が促進し、この細胞増殖はRETに対するsiRNAにより抑制される。この事実は、ＧＤＮＦ／ＲＥＴシグナルの活性化により癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖が促進し、ＲＥＴの活性または発現を阻害し得る物質が、癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖を阻害し、癌（例えば乳癌）の予防・治療に有効であることを示すものである。【０１１１】
本発明の抗体Ｉは、ＲＥＴに特異的に結合することによりＲＥＴの活性を阻害し、また本発明のアンチセンス核酸ＩはＲＥＴの発現を阻害し得るので、癌（例えば乳癌）患者に対して本発明の抗体Ｉを投与したり、本発明のアンチセンス核酸Ｉを患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、癌細胞中のＲＥＴの活性や発現を阻害し、該癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防・治療することができる。【０１１２】
また、後記実施例において示されるように、ＲＥＴは癌細胞（例えば乳癌細胞）の表面上に発現している。従って、本発明の抗体Ｉは、癌細胞表面のＲＥＴに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することによっても、該癌細胞を殺傷し、癌を予防・治療し得る。【０１１３】
従って、上記したa)本発明の抗体Ｉ又はb)本発明のアンチセンス核酸Ｉ等のRETの機能（例えば、RET活性や発現）を阻害する物質を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌の予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞（好ましくは、乳癌細胞）の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤などとして使用することができる。【０１１４】
本発明の抗体Ｉを上記予防・治療剤等として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
また、本発明のアンチセンス核酸Ｉを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。【０１１５】
本発明の抗体Ｉ又は本発明のアンチセンス核酸Ｉ等のRETの機能（例えば、RET活性や発現）を阻害する物質を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【０１１６】
本発明の抗体Ｉ又は本発明のアンチセンス核酸Ｉ等のRETの機能（例えば、RET活性や発現）を阻害する物質は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体Ｉ又は本発明のアンチセンス核酸Ｉと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。【０１１７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体Ｉまたは本発明のアンチセンス核酸Ｉを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはアンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。【０１１８】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【０１１９】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。アンチセンス核酸の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記アンチセンス核酸が含有されていることが好ましい。【０１２０】
本発明の抗体Ｉを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体Ｉを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０１２１】
本発明のアンチセンス核酸Ｉを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明のアンチセンス核酸Ｉを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０１２２】
なお前記した各組成物は、上記抗体やアンチセンス核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。【０１２３】
さらに、本発明の抗体Ｉ又は本発明のアンチセンス核酸Ｉ等のRETの機能（例えば、RET活性や発現）を阻害する物質は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体Ｉ又は本発明のアンチセンス核酸Ｉ、および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。【０１２４】
本発明の抗体Ｉは、RETを特異的に認識し、被検液中のRETの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができるので、例えば、該タンパク質の発現低下または発現上昇などの診断剤として有用である。後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）はRETを発現し、ＧＤＮＦの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、RETに対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、本発明の抗体Ｉを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のRETを検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にＧＤＮＦに感受性の高い癌（例えば乳癌）を検出し得る。すなわち、本発明の抗体Ｉは、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、本発明の抗体Ｉを用いて検体中のRETを定量することによって、RETの発現の増加が検出された場合、対象が例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるRETの発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することができる。癌細胞におけるRETの発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。【０１２５】
本発明の抗体Ｉを用いたRETの定量法としては、例えば、
（ｉ）本発明の抗体Ｉと、被検液および標識化されたRETとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたRETの割合を測定することを特徴とする被検液中のRETの定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体Ｉおよび標識化された本発明の別の抗体Ｉとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のRETの定量法等を挙げることができる。【０１２６】
上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はRETの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がRETのＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてRETのＣ端部に反応する抗体を用いることができる。【０１２７】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。【０１２８】
被検液としては、RETが細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、RETが細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清や、体液（血液、血清、血漿、尿、汗、母乳等）がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液、培養上清、体液等からRETを分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。【０１２９】
本発明の抗体Ｉを用いるRETの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。【０１３０】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。【０１３１】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体Ｉに被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体Ｉを反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質Ｉ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。【０１３２】
サンドイッチ法によるRETの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体Ｉとしては、RETの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、例えば、２次反応で用いられる抗体が、RETのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。【０１３３】
本発明の抗体Ｉをサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。【０１３４】
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、または、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。【０１３５】
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。【０１３６】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０１３７】
また、本発明の抗体Ｉを用いてRETの定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。【０１３８】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法Ｉに適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてRETの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。【０１３９】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。【０１４０】
以上のようにして、本発明の抗体Ｉを用いることによって、RETを感度良く定量することができる。【０１４１】
また、本発明の抗体Ｉは、RETを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のRETの検出、被検細胞内におけるRETの挙動分析などのために使用することができる。【０１４２】
RETをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸 (以下、「センスRET」ともいう)、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (アンチセンスRET)は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) におけるRETをコードするDNAまたはmRNAの異常 (遺伝子異常) を検出することができるので、例えば、該DNAの損傷もしくは突然変異やmRNAのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該DNAの増幅やmRNAの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。RETをコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ (例えば、約15塩基以上) を有する限り特に制限されず、また、RETの部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスRETを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）はRETを発現し、ＧＤＮＦの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、RETに対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、センスもしくはアンチセンスRETを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のRETを検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にGDNFに感受性の高い癌（例えば乳癌）を検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスRETは、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスRETを用いて検体中のRETの発現を定量することによって、RETの発現の増加が検出された場合、対象は、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるRETの発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することが出来る。癌細胞におけるRETの発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。【０１４３】
（ＩＩ．抗ＧＤＮＦ抗体等）
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム1」と略記する場合がある）、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム2」と略記する場合がある）または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム3」と略記する場合がある）（以下、三者を併せて「GDNF」または「本発明のタンパク質ＩＩ」と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。【０１４４】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。【０１４５】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。【０１４６】
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側
鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science,247：1306-1310 (1990)を参照）。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。【０１４７】
実質的に同質の活性としては、例えば、癌細胞（例、乳癌細胞）の増殖を促進させる活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質ＩＩの活性の程度が配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
GDNFの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、癌細胞（例、乳癌細胞）をＧＤＮＦで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。【０１４８】
また、GDNFとしては、例えば、（i）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。該タンパク質は、好ましくは、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。【０１４９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。【０１５０】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。【０１５１】
GDNFがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるGDNFに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【０１５２】
さらに、GDNFには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。【０１５３】
GDNFの具体例としては、例えば、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム1）、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム2）、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム3）などがあげられる。【０１５４】
GDNFの部分ペプチドとしては、前記したGDNFの部分ペプチドであって、好ましくは、前記したGDNFと実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。GDNFの部分ペプチドは免疫原性を有していることが好ましい。【０１５５】
例えば、GDNFの構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。【０１５６】
また、本発明で用いられるGDNFの部分ペプチドは、(1)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、(2)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、(3)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、(4)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、さらにより好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは(5)それらが組み合わされていてもよい。【０１５７】
また、GDNFの部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、GDNFの部分ペプチドには、前記したGDNFと同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【０１５８】
かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【０１５９】
GDNFまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【０１６０】
GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質としては、例えば、
（１）GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）GDNFまたはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）GDNFまたはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）GDNFまたはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
などが用いられる。【０１６１】
GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、「本発明の抗体ＩＩ」と略記することがある）は、GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgAが挙げられる。また、本発明の抗体ＩＩは、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらのキメラ抗体などの何れであってもよい。あるいは非ヒト温血動物 (例: ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)やヒトの抗体遺伝子ライブラリーを用いたファージディスプレー法等の抗体ディスプレー法により得られる抗体なども、本発明の抗体ＩＩに包含され得る。本発明の抗体ＩＩは、好ましくはヒトモノクローナル抗体である。【０１６２】
本発明の抗体ＩＩは、GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域 (CDR) を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール (PEG) 等のタンパク質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。【０１６３】
GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを包括的に「GDNF類」と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【０１６４】
以下に、本発明の抗体ＩＩの抗原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体ＩＩを調製するために使用される抗原としては、上記GDNF類（例えば、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（GDNF）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩）、もしくはGDNF類と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原ＩＩと称することもある）。【０１６５】
本発明の抗原ＩＩの具体例としては、GDNF類を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、またはGDNF類と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドなどが挙げられる。【０１６６】
かかる(合成)ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【０１６７】
GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。【０１６８】
(a)本発明の抗原ＩＩをヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の組織または細胞から調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることができる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた抗原をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。【０１６９】
(b)本発明の抗原ＩＩをコードする核酸を含有する形質転換体を用いてGDNF類を製造する場合、該核酸は、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。【０１７０】
GDNFまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるGDNFのアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。【０１７１】
GDNFまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。GDNFまたはその部分ペプチドをコードするＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）又は初期転写産物などが挙げられる。【０１７２】
GDNFまたはその部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの方法としては、GDNFまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する方法、GDNFの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡをプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法によって目的とするＤＮＡを選別する方法等を挙げることができる。PCRに用いる鋳型ポリヌクレオチドとしては、GDNFまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等を用いることができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【０１７３】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【０１７４】
より具体的には、GDNFをコードする核酸（ＤＮＡ等）としては、（i）配列番号：６で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム1）をコードする）、あるいは配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：５に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸などや、（ii）配列番号：８で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム2）をコードする）、あるいは配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：７に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸、iii）配列番号：１０で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGDNFタンパク質・アイソフォーム3）をコードする）、あるいは配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：９に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸、などが用いられる。
配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：６で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：１０で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（NationalCenter for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。【０１７５】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。【０１７６】
クローン化されたGDNFまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。【０１７７】
以上のようにして獲得される本発明の抗原ＩＩをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、本発明の抗原ＩＩを製造することができる。
本発明の抗原ＩＩの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の抗原ＩＩをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【０１７８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。【０１７９】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。なかでも、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。【０１８０】
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【０１８１】
発現ベクターとしては、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。【０１８２】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の抗原ＩＩをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。【０１８３】
このようにして構築された本発明の抗原ＩＩをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。【０１８４】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。【０１８５】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。【０１８６】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。【０１８７】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。【０１８８】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。【０１８９】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。【０１９０】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、マウスＮＳ０細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児細胞２９３Ｆ細胞、などが用いられる。【０１９１】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０１９２】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０１９３】
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。【０１９４】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０１９５】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。【０１９６】
このようにして、本発明の抗原ＩＩをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。【０１９７】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。【０１９８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。【０１９９】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。【０２００】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。【０２０１】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０２０２】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０２０３】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０２０４】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明の抗原ＩＩを生成せしめることができる。【０２０５】
上記培養物からGDNFを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。【０２０６】
本発明の抗原ＩＩを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明の抗原ＩＩが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。【０２０７】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明の抗原ＩＩの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【０２０８】
かくして得られる本発明の抗原ＩＩが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。【０２０９】
なお、組換え体が産生する本発明の抗原ＩＩを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。【０２１０】
かくして生成する本発明の抗原ＩＩの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。【０２１１】
(c)GDNFを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原ＩＩとして直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（b）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293細胞、COS7細胞、CHO-K1細胞、NIH3T3細胞、Balb3T3細胞、FM3A細胞、L929細胞、SP2/0細胞、P3U1細胞、NS0細胞、B16細胞、またはP388細胞などが好ましく用いられる。
(d)GDNFと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはGDNFを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York(1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【０２１２】
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【０２１３】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原ＩＩは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質ＩＩを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。【０２１４】
不溶化した本発明の抗原ＩＩを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原ＩＩを適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原ＩＩ（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原ＩＩに対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。【０２１５】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。【０２１６】
投与に際して抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体ＩＩの作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Nature、356巻、152項-154項参照）。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。【０２１７】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。【０２１８】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、ＳＰ２／０やＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【０２１９】
また、モノクローナル抗体産生細胞の作製の為の細胞融合操作として電気融合法を用いても良い。【０２２０】
ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。【０２２１】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原やタンパク質発現細胞を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。【０２２２】
（ｂ）その他の方法によるモノクローナル抗体作製
本発明の抗体ＩＩの作製方法は（a）に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原ＩＩを高発現した癌の患者や本発明の抗原ＩＩを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。【０２２３】
本発明の抗原ＩＩに特異的に結合するモノクローナル抗体(フラグメント)の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライブラリーを担いだ抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを本発明の抗原ＩＩに対し一定時間反応させ、非特異的に結合するものを洗浄除去した後、本発明の抗原ＩＩに特異的に結合するものを溶出回収し、その抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、数回同様の方法を繰り返し、最終的にクローン化した抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりIgG抗体遺伝子の該領域と組換えることにより、モノクローナルIgG抗体遺伝子を得ることができる。【０２２４】
また、本発明の抗体ＩＩは、ヒトや上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試験管内において本発明の抗原ＩＩにより自体公知の方法により免疫した後、(a)に記載と同様の方法によりハイブリドーマを作製する事により得ることもできる。【０２２５】
（ｃ）モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体ＩＩは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。【０２２６】
本発明のモノクローナル抗体ＩＩは、上記のモノクローナル抗体含有原料から自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）や疎水カラムによる吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原あるいはプロテインＡやプロテインＧなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するアフィニティー精製法〕に従って行なうことができる。【０２２７】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体ＩＩは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原ＩＩとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【０２２８】
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。【０２２９】
GDNFをコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「アンチセンスGDNF」又は「本発明のアンチセンス核酸ＩＩ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたGDNFをコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、GDNFをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスGDNFは、GDNFをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。【０２３０】
アンチセンスGDNFの標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてGDNFタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、GDNFをコードする核酸の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、GDNFをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスGDNFは、GDNFをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるGDNFをコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。【０２３１】
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいても良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてもよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてもよい。【０２３２】
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。アンチセンスGDNFは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press,1993 などに開示されている。【０２３３】
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【０２３４】
GDNFをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスGDNFに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。GDNF ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。【０２３５】
GDNFをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（GDNFをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスGDNFに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature,411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。【０２３６】
本発明のアンチセンス核酸ＩＩは、GDNFをコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。【０２３７】
アンチセンスGDNFの遺伝子発現阻害活性は、GDNFをコードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外のGDNFをコードする遺伝子発現系またはGDNFの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。【０２３８】
上記した本発明の抗体ＩＩ及び本発明のアンチセンス核酸ＩＩ等のGDNFの機能（例えば、GDNF活性や発現）を阻害する物質は、例えば以下の用途を有する。【０２３９】
後記実施例において示されるように、ＧＤＮＦを癌細胞（例えば乳癌細胞）に作用させることにより、細胞増殖が促進する。この事実は、ＧＤＮＦにより癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖が促進し、ＧＤＮＦの活性または発現を阻害し得る物質が、癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖を阻害し、癌（例えば乳癌）の予防・治療に有効であることを示すものである。【０２４０】
本発明の抗体ＩＩは、ＧＤＮＦに特異的に結合することによりＧＤＮＦの活性を阻害し、また本発明のアンチセンス核酸ＩＩはＧＤＮＦの発現を阻害し得るので、癌（例えば乳癌）患者に対して本発明の抗体ＩＩを投与したり、本発明のアンチセンス核酸ＩＩを患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、組織中のＧＤＮＦの活性や発現を阻害し、ＧＤＮＦの癌細胞に対する作用を減弱させることにより癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防・治療することができる。【０２４１】
従って、上記したa)本発明の抗体ＩＩ又はb)本発明のアンチセンス核酸ＩＩ等のGDNFの機能を阻害する物質を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌の予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞（好ましくは、乳癌細胞）の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤などとして使用することができる。【０２４２】
本発明の抗体ＩＩを上記予防・治療剤等として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
また、本発明のアンチセンス核酸ＩＩを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。【０２４３】
本発明の抗体ＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩ等のGDNFの機能を阻害する物質を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【０２４４】
本発明の抗体ＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩ等のGDNFの機能を阻害する物質は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体ＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。【０２４５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体ＩＩまたは本発明のアンチセンス核酸ＩＩを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはアンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。【０２４６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【０２４７】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。アンチセンス核酸の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記アンチセンス核酸が含有されていることが好ましい。【０２４８】
本発明の抗体ＩＩを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体ＩＩを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０２４９】
本発明のアンチセンス核酸ＩＩを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明のアンチセンス核酸ＩＩを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０２５０】
なお前記した各組成物は、上記抗体やアンチセンス核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。【０２５１】
さらに、本発明の抗体ＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩ等のGDNFの機能を阻害する物質は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体ＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩ、および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。【０２５２】
本発明の抗体ＩＩは、GDNFを特異的に認識し、被検液中のGDNFの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができるので、例えば、該タンパク質の発現低下または発現上昇などの診断剤として有用である。後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）がＧＤＮＦの作用を受けることによりその細胞増殖が促進される。従って、本発明の抗体ＩＩを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGDNFを検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にＧＤＮＦに感受性の高い癌（例えば乳癌）が増殖し易い状態に被検体があるか否かを検出し得る。すなわち、本発明の抗体ＩＩは、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、本発明の抗体ＩＩを用いて検体中のGDNFを定量することによって、GDNFの発現の増加が検出された場合、対象は、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）が増殖し易い状態にあると診断し得る。【０２５３】
本発明の抗体ＩＩを用いたGDNFの定量法としては、例えば、
（ｉ）本発明の抗体ＩＩと、被検液および標識化されたGDNFとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたGDNFの割合を測定することを特徴とする被検液中のGDNFの定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体ＩＩおよび標識化された本発明の別の抗体ＩＩとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のGDNFの定量法等を挙げることができる。【０２５４】
上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はGDNFの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がGDNFのＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてGDNFのＣ端部に反応する抗体を用いることができる。【０２５５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。【０２５６】
被検液としては、GDNFが細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、GDNFが細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清や、体液（血液、血清、血漿、尿、汗、母乳等）がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液、培養上清、体液等からGDNFを分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。【０２５７】
本発明の抗体ＩＩを用いるGDNFの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。【０２５８】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。【０２５９】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体ＩＩに被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体ＩＩを反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質ＩＩ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。【０２６０】
サンドイッチ法によるGDNFの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体ＩＩは、GDNFの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、GDNFのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。【０２６１】
本発明の抗体ＩＩをサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。【０２６２】
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、または、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。【０２６３】
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。【０２６４】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０２６５】
また、本発明の抗体ＩＩを用いてGDNFの定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。【０２６６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法ＩＩに適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてGDNFの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。【０２６７】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。【０２６８】
以上のようにして、本発明の抗体ＩＩを用いることによって、GDNFを感度良く定量することができる。【０２６９】
また、本発明の抗体ＩＩは、GDNFを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のGDNFの検出、被検細胞内におけるGDNFの挙動分析などのために使用することができる。【０２７０】
GDNFをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸 (以下、「センスGDNF」ともいう)、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (アンチセンスGDNF) は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) におけるGDNFをコードするDNAまたはmRNAの異常 (遺伝子異常) を検出することができるので、例えば、該DNAの損傷もしくは突然変異やmRNAのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該DNAの増幅やmRNAの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。GDNFをコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ (例えば、約15塩基以上) を有する限り特に制限されず、また、GDNFの部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスGDNFを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）がＧＤＮＦの作用を受けることによりその細胞増殖が促進される。従って、センスもしくはアンチセンスGDNFを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGDNFを検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にＧＤＮＦに感受性の高い癌（例えば乳癌）が増殖し易い状態に被検体があるか否かを検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスGDNFは、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスGDNFを用いて検体中のGDNFの発現を定量することによって、GDNFの発現の増加が検出された場合、対象は、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）が増殖し易い状態にあると診断し得る。【０２７１】
（ＩＩＩ．抗GFRα1抗体等）
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「GFRα1タンパク質・アイソフォームａ」と略記する場合がある）または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、「GFRα1タンパク質・アイソフォームｂ」と略記する場合がある）（以下、両者を併せて「GFRα1」または「本発明のタンパク質ＩＩＩ」と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。【０２７２】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。【０２７３】
配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。【０２７４】
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science,247：1306-1310 (1990)を参照）。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。【０２７５】
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＤＮＦの刺激を細胞内へ伝達することにより、癌細胞（例、乳癌細胞）の増殖を促進させる活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質ＩＩＩの活性の程度が配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
GFRα1の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、RETとGFRα1を共発現した癌細胞（例、乳癌細胞）をＧＤＮＦで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。【０２７６】
また、GFRα1としては、例えば、（i）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。該タンパク質は、好ましくは、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。【０２７７】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。【０２７８】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。【０２７９】
GFRα1がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるGFRα1に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【０２８０】
さらに、GFRα1には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。【０２８１】
GFRα1の具体例としては、例えば、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGFRα1タンパク質・アイソフォームａ）、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGFRα1タンパク質・アイソフォームｂ）などがあげられる。【０２８２】
GFRα1の部分ペプチドとしては、前記したGFRα1の部分ペプチドであって、好ましくは、前記したGFRα1と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。GFRα1の部分ペプチドは免疫原性を有していることが好ましい。【０２８３】
例えば、GFRα1の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。【０２８４】
また、本発明で用いられるGFRα1の部分ペプチドは、(1)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、(2)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、(3)そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、(4)そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、さらにより好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは(5)それらが組み合わされていてもよい。【０２８５】
また、GFRα1の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、GFRα1の部分ペプチドには、前記したGFRα1と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【０２８６】
かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【０２８７】
GFRα1またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【０２８８】
GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質としては、例えば、
（１）GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）GFRα1またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
（３）GFRα1またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）GFRα1またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
などが用いられる。【０２８９】
GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、「本発明の抗体ＩＩＩ」と略記することがある）は、GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgAが挙げられる。また、本発明の抗体ＩＩＩは、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらのキメラ抗体などの何れであってもよい。あるいは非ヒト温血動物 (例: ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)やヒトの抗体遺伝子ライブラリーを用いたファージディスプレー法等の抗体ディスプレー法により得られる抗体なども、本発明の抗体ＩＩＩに包含され得る。本発明の抗体ＩＩＩは、好ましくはヒトモノクローナル抗体である。【０２９０】
本発明の抗体ＩＩＩは、GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域(CDR) を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール (PEG) 等のタンパク質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。【０２９１】
本発明の抗体ＩＩＩとしては、GFRα1の細胞外領域を認識する抗体が好ましい。GFRα1は、通常、GPIアンカーを介して細胞表面に発現している。従って、通常、GFRα1のペプチド部分の全長は細胞外領域に該当する。【０２９２】
GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを包括的に「GFRα1類」と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【０２９３】
以下に、本発明の抗体ＩＩＩの抗原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体ＩＩＩを調製するために使用される抗原としては、上記GFRα1類（例えば、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（GFRα1）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩）、GFRα1の細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩、もしくはGFRα1と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原ＩＩＩと称することもある）。【０２９４】
本発明の抗原ＩＩＩの具体例としては、GFRα1類を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、GFRα1の細胞外領域タンパク質またはその塩、GFRα1の細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質、またはGFRα1と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドなどが挙げられる。【０２９５】
その他のタンパク質またはペプチドとしては、例えば、FLAG-tag、His-tag、Myc-tag、V5-tag、GST-tag、S-tag、T7-tag、抗体（ヒト抗体、マウス抗体など）のFc領域などが挙げられる。【０２９６】
かかる(合成)ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。【０２９７】
GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。またGFRα1の細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質はその融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。【０２９８】
(a)本発明の抗原ＩＩＩをヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の組織または細胞から調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることができる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた抗原をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。【０２９９】
(b)本発明の抗原ＩＩＩをコードする核酸を含有する形質転換体を用いてGFRα1類、もしくはGFRα1の細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩を製造する場合、該核酸は、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。【０３００】
GFRα1またはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるGFRα1のアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。【０３０１】
GFRα1またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞）など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。GFRα1またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）又は初期転写産物などが挙げられる。【０３０２】
GFRα1またはその部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの方法としては、GFRα1またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する方法、GFRα1の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡをプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法によって目的とするＤＮＡを選別する方法等を挙げることができる。PCRに用いる鋳型ポリヌクレオチドとしては、GFRα1またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等を用いることができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【０３０３】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【０３０４】
より具体的には、GFRα1をコードする核酸（ＤＮＡ等）としては、（i）配列番号：１２で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGFRα1タンパク質・アイソフォームａ）をコードする）、あるいは配列番号：１２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１１に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸などや、（ii）配列番号：１４で表される塩基配列を含有する核酸（該核酸は、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトGFRα1タンパク質・アイソフォームｂ）をコードする）、あるいは配列番号：１４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸などが用いられる。
配列番号：１２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：１２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号：１４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号：１４で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。【０３０５】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。【０３０６】
クローン化されたGFRα1またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。GFRα1の細胞外領域とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを得る場合には、上記と同様の方法によりクローニングするか合成したGFRα1細胞外領域をコードするＤＮＡとその他のタンパク質(ペプチド)をコードするＤＮＡとを自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って連結する事ができる。【０３０７】
以上のようにして獲得される本発明の抗原ＩＩＩをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、本発明の抗原ＩＩＩを製造することができる。
本発明の抗原ＩＩＩの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の抗原ＩＩＩをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【０３０８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。【０３０９】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。なかでも、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。【０３１０】
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【０３１１】
発現ベクターとしては、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。【０３１２】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の抗原ＩＩＩをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。【０３１３】
このようにして構築された本発明の抗原ＩＩＩをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。【０３１４】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。【０３１５】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。【０３１６】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。【０３１７】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。【０３１８】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。【０３１９】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。【０３２０】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、マウスＮＳ０細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児細胞２９３Ｆ細胞、などが用いられる。【０３２１】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０３２２】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０３２３】
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０３２４】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。【０３２５】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。【０３２６】
このようにして、本発明の抗原ＩＩＩをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。【０３２７】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。【０３２８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。【０３２９】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。【０３３０】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。【０３３１】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０３３２】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０３３３】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【０３３４】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明の抗原ＩＩＩを生成せしめることができる。【０３３５】
上記培養物からGFRα1を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。【０３３６】
本発明の抗原ＩＩＩを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明の抗原ＩＩＩが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。【０３３７】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明の抗原ＩＩＩの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【０３３８】
かくして得られる本発明の抗原ＩＩＩが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。【０３３９】
なお、組換え体が産生する本発明の抗原ＩＩＩを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。【０３４０】
かくして生成する本発明の抗原ＩＩＩの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。【０３４１】
(c) GFRα1を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原ＩＩＩとして直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（b）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293細胞、COS7細胞、CHO-K1細胞、NIH3T3細胞、Balb3T3細胞、FM3A細胞、L929細胞、SP2/0細胞、P3U1細胞、NS0細胞、B16細胞、またはP388細胞などが好ましく用いられる。
(d) GFRα1と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはGFRα1を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York(1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【０３４２】
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【０３４３】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原ＩＩＩは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質ＩＩＩを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。【０３４４】
不溶化した本発明の抗原ＩＩＩを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原ＩＩＩを適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原ＩＩＩ（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原ＩＩＩに対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。【０３４５】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。【０３４６】
投与に際して抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体ＩＩＩの作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Nature、356巻、152項-154項参照）。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。【０３４７】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。【０３４８】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、ＳＰ２／０やＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【０３４９】
また、モノクローナル抗体産生細胞の作製の為の細胞融合操作として電気融合法を用いても良い。【０３５０】
ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。【０３５１】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原やタンパク質発現細胞を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。【０３５２】
（ｂ）その他の方法によるモノクローナル抗体作製
本発明の抗体ＩＩＩの作製方法は（a）に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原ＩＩＩを高発現した癌の患者や本発明の抗原ＩＩＩを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。【０３５３】
本発明の抗原ＩＩＩに特異的に結合するモノクローナル抗体(フラグメント)の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライブラリーを担いだ抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを本発明の抗原ＩＩＩに対し一定時間反応させ、非特異的に結合するものを洗浄除去した後、本発明の抗原ＩＩＩに特異的に結合するものを溶出回収し、その抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、数回同様の方法を繰り返し、最終的にクローン化した抗体(フラグメント)提示細胞もしくは抗体(フラグメント)提示リボソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりIgG抗体遺伝子の該領域と組換えることにより、モノクローナルIgG抗体遺伝子を得ることができる。【０３５４】
また、本発明の抗体ＩＩＩは、ヒトや上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試験管内において本発明の抗原ＩＩＩにより自体公知の方法により免疫した後、(a)に記載と同様の方法によりハイブリドーマを作製する事により得ることもできる。【０３５５】
（ｃ）モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体ＩＩＩは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。【０３５６】
本発明のモノクローナル抗体ＩＩＩは、上記のモノクローナル抗体含有原料から自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）や疎水カラムによる吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原あるいはプロテインＡやプロテインＧなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するアフィニティー精製法〕に従って行なうことができる。【０３５７】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体ＩＩＩは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原ＩＩＩとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【０３５８】
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。【０３５９】
GFRα1をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「アンチセンスGFRα1」又は「本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたGFRα1をコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、GFRα1をコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスGFRα1は、GFRα1をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。【０３６０】
アンチセンスGFRα1の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてGFRα1タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、GFRα1をコードする核酸の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、GFRα1をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスGFRα1は、GFRα1をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるGFRα1をコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。【０３６１】
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいても良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてもよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてもよい。【０３６２】
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスGFRα1は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press,1993 などに開示されている。【０３６３】
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【０３６４】
GFRα1をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスGFRα1に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。GFRα1 ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。【０３６５】
GFRα1をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（GFRα1をコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスGFRα1に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature,411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。【０３６６】
本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩは、GFRα1をコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。【０３６７】
アンチセンスGFRα1の遺伝子発現阻害活性は、GFRα1をコードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外のGFRα1をコードする遺伝子発現系またはGFRα1の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。【０３６８】
上記した本発明の抗体ＩＩＩ及び本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ等のGFRα1の機能（例えば、GFRα1活性や発現）を阻害する物質は、例えば以下の用途を有する。【０３６９】
後記実施例において示されるように、ＧＤＮＦを癌細胞（例えば乳癌細胞）に作用させることにより、細胞増殖が促進し、この細胞増殖はGFRα1に対するsiRNAにより抑制される。この事実は、ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１／ＲＥＴシグナルの活性化により癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖が促進し、ＧＦＲα１の活性または発現を阻害し得る物質が、癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖を阻害し、癌（例えば乳癌）の予防・治療に有効であることを示すものである。【０３７０】
本発明の抗体ＩＩＩは、GFRα1に特異的に結合することによりGFRα1の活性を阻害し、また本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩはGFRα1の発現を阻害し得るので、癌（例えば乳癌）患者に対して本発明の抗体ＩＩＩを投与したり、本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩを患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、癌細胞中のGFRα1の活性や発現を阻害し、該癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防・治療することができる。【０３７１】
また、後記実施例において示されるように、GFRα1は癌細胞（例えば乳癌細胞）の表面上に高発現している。従って、本発明の抗体Ｉは、癌細胞表面のＲＥＴに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することによっても、該癌細胞を殺傷し、癌を予防・治療し得る。【０３７２】
従って、上記したa)本発明の抗体ＩＩＩ又はb)本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ等のGFRα1の機能を阻害する物質を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌の予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞（好ましくは、乳癌細胞）の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤などとして使用することができる。【０３７３】
本発明の抗体ＩＩＩを上記予防・治療剤等として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
また、本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。【０３７４】
本発明の抗体ＩＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ等のGFRα1の機能を阻害する物質を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【０３７５】
本発明の抗体ＩＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ等のGFRα1の機能を阻害する物質は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体ＩＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。【０３７６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体ＩＩＩまたは本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはアンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。【０３７７】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【０３７８】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。アンチセンス核酸の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記アンチセンス核酸が含有されていることが好ましい。【０３７９】
本発明の抗体ＩＩＩを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体ＩＩＩを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０３８０】
本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩを含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩを１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０３８１】
なお前記した各組成物は、上記抗体やアンチセンス核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。【０３８２】
さらに、本発明の抗体ＩＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ等のGFRα1の機能を阻害する物質は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体ＩＩＩ又は本発明のアンチセンス核酸ＩＩＩ、および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。【０３８３】
本発明の抗体ＩＩＩは、GFRα1を特異的に認識し、被検液中のGFRα1の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができるので、例えば、該タンパク質の発現低下または発現上昇などの診断剤として有用である。後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）はGFRα1を発現し、ＧＤＮＦの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、GFRα1に対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、本発明の抗体ＩＩＩを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGFRα1を検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にＧＤＮＦに感受性の高い癌（例えば乳癌）を検出し得る。すなわち、本発明の抗体ＩＩＩは、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、本発明の抗体ＩＩＩを用いて検体中のGFRα1を定量することによって、GFRα1の発現の増加が検出された場合、対象が例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるGFRα1の発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することが出来る。癌細胞におけるGFRα1の発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。【０３８４】
本発明の抗体ＩＩＩを用いたGFRα1の定量法としては、例えば、
（ｉ）本発明の抗体ＩＩＩと、被検液および標識化されたGFRα1とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたGFRα1の割合を測定することを特徴とする被検液中のGFRα1の定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体ＩＩＩおよび標識化された本発明の別の抗体ＩＩＩとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のGFRα1の定量法等を挙げることができる。【０３８５】
上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はGFRα1の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がGFRα1のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてGFRα1のＣ端部に反応する抗体を用いることができる。【０３８６】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。【０３８７】
被検液としては、GFRα1が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、GFRα1が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清や、体液（血液、血清、血漿、尿、汗、母乳等）がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液、培養上清、体液等からGFRα1を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。【０３８８】
本発明の抗体ＩＩＩを用いるGFRα1の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。【０３８９】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。【０３９０】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体ＩＩＩに被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体ＩＩＩを反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質ＩＩＩ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。【０３９１】
サンドイッチ法によるGFRα1の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体ＩＩＩとしては、GFRα1の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、例えば、２次反応で用いられる抗体が、GFRα1のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。【０３９２】
本発明の抗体ＩＩＩをサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。【０３９３】
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、または、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。【０３９４】
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。【０３９５】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０３９６】
また、本発明の抗体ＩＩＩを用いてGFRα1の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。【０３９７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法ＩＩＩに適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてGFRα1の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。【０３９８】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。【０３９９】
以上のようにして、本発明の抗体ＩＩＩを用いることによって、GFRα1を感度良く定量することができる。【０４００】
また、本発明の抗体ＩＩＩは、GFRα1を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のGFRα1の検出、被検細胞内におけるGFRα1の挙動分析などのために使用することができる。【０４０１】
GFRα1をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸 (以下、「センスGFRα1」ともいう)、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (アンチセンスGFRα1) は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) におけるGFRα1をコードするDNAまたはmRNAの異常 (遺伝子異常) を検出することができるので、例えば、該DNAの損傷もしくは突然変異やmRNAのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該DNAの増幅やmRNAの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。GFRα1をコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ (例えば、約15塩基以上) を有する限り特に制限されず、また、GFRα1の部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスGFRα1を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）はGFRα1を発現し、ＧＤＮＦの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、GFRα1に対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、本発明の抗体ＩＩＩを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGFRα1を検出・定量することにより、癌（例えば乳癌）、特にＧＤＮＦに感受性の高い癌（例えば乳癌）を検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスGFRα1は、癌（例えば乳癌）の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスGFRα1を用いて検体中のGFRα1の発現を定量することによって、GFRα1の発現の増加が検出された場合、対象が例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌）である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるGFRα1の発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することが出来る。癌細胞におけるGFRα1の発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。【０４０２】
（ＩＶ．ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴ（本明細書において、ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１／ＲＥＴともいう。）の機能を阻害する物質）
本発明は、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を含有してなる癌（例えば乳癌）の予防・治療剤を提供するものである。【０４０３】
「ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能」とは、ＧＤＮＦにより、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＧＦＲα１の相互作用を介して、ＲＥＴを活性化させる機能をいう。「ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能」としては、ＧＤＮＦによるＲＥＴシグナルの活性化、ＧＤＮＦによる癌（例えば乳癌）細胞等の細胞増殖促進などが挙げられる。ここで、一部の甲状腺癌等において、ＲＥＴやＧＦＲα１の活性化型変異により、ＧＤＮＦ非依存的にその下流のシグナルが活性化し、細胞増殖が亢進していることが報告されているが（非特許文献１、非特許文献５）、これは「ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能」には含まれない。【０４０４】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質としては、
（１）ＲＥＴもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、ＧＤＮＦもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、ＧＦＲα１もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体）、
（２）低分子化合物またはその塩、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
であって、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する活性（ＧＤＮＦによるシグナル伝達阻害活性、ＧＤＮＦによる癌（例えば乳癌）細胞等の細胞増殖阻害活性）を有しているものを挙げることができる。【０４０５】
（１）の抗体としては、上述の本発明の抗体Ｉ、抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩ等を用いることができる。（３）のアンチセンス核酸としては、上述の本発明のアンチセンス核酸Ｉ、アンチセンス核酸ＩＩ、アンチセンス核酸ＩＩＩ等を用いることができる。（４）のｓｉＲＮＡとしては、上述のＧＤＮＦ、ＧＦＲα１又はＲＥＴをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡもしくは初期転写産物等）のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡを挙げることができる。【０４０６】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質は、好ましくは（１）の抗体である。（１）の抗体は、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１又はＲＥＴに特異的に結合し、例えば、ＧＤＮＦとＲＥＴの相互作用、ＧＤＮＦとＧＦＲα１の相互作用や、ＧＦＲα１とＲＥＴの相互作用を阻害すること等により、ＲＥＴの下流のシグナル活性化を阻害し得る。【０４０７】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質は、例えば以下の用途を有する。【０４０８】
後記実施例において示されるように、癌細胞（例えば乳癌細胞）の細胞表面にＲＥＴやＧＤＦα１が発現しており、ＧＤＮＦを癌細胞（例えば乳癌細胞）に適用すると、ＲＥＴの下流のシグナルが活性化され、細胞増殖が促進し、この細胞増殖はＲＥＴやＧＤＦα１に対するｓｉＲＮＡにより抑制される。この事実は、癌細胞（例えば乳癌細胞）において機能的なＧＤＦα１やＲＥＴが発現しており、ＧＤＮＦ／ＧＤＦα１／ＲＥＴシグナルの活性化により癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖が促進していること、そして、このＧＤＮＦ／ＧＤＦα１／ＲＥＴシグナル活性化を阻害し得る物質が、癌細胞（例えば乳癌細胞）の増殖を阻害し、癌（例えば乳癌）の予防・治療に有効であることを示すものである。【０４０９】
従って、癌（例えば乳癌）患者に対してＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を投与することによって、癌細胞中のＧＤＮＦ／ＧＤＦα１／ＲＥＴシグナル活性化を阻害し、該癌細胞の増殖を阻害し、癌を予防・治療することができる。【０４１０】
従って、上記したＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌の予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞（好ましくは、乳癌細胞）の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤などとして使用することができる。【０４１１】
特に、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質は、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する癌（例えば乳癌）や、ＧＤＦＮタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質を発現する癌（例えば乳癌）の治療に有用である。このような癌細胞はＧＤＮＦに依存的に活性化し、増殖し得るからである。癌細胞におけるＧＤＮＦタンパク質、ＧＦＲα１タンパク質及びＲＥＴタンパク質の発現は、これらのタンパク質に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーや免疫組織学的解析により確認することができる。【０４１２】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を上記予防・治療剤等として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
また、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質として、（３）のアンチセンス核酸を上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。【０４１３】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【０４１４】
ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。【０４１５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはアンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。【０４１６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤（口腔内フィルム剤を含む）等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【０４１７】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記（１）の抗体が含有されていることが好ましい。アンチセンス核酸の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記（３）のアンチセンス核酸が含有されていることが好ましい。【０４１８】
上記（１）の抗体を含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０４１９】
上記（３）のアンチセンス核酸を含有する上記予防・治療剤等の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、アンチセンス核酸を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【０４２０】
なお前記した各組成物は、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。【０４２１】
さらに、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１及びＲＥＴの機能を阻害する物質、並びに上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。【０４２２】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）【０４２３】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：p-トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2-Bzl         ：2,6-ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：2-クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：2-ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：t-ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：t-ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：N-9-フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：1-ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾ
トリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド【０４２４】
配列表の各配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
RETタンパク質・アイソフォームａのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するRETタンパク質・アイソフォームａをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
RETタンパク質・アイソフォームｃのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するRETタンパク質・アイソフォームｃをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム3をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
GFRα1タンパク質・アイソフォームａのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するGFRα1タンパク質・アイソフォームａをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
GFRα1タンパク質・アイソフォームbのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するGFRα1タンパク質・アイソフォームbをコードするDNAの塩基配列を示す【０４２５】
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０４２６】
GDNF投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖促進
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 ％ウシ胎児血清（Hyclone社）、１× MEM用非必須アミノ酸（大日本製薬）、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、100 units/mLペニシリンG（和光純薬）、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン（和光純薬）を含むMEM（Invitrogen社）で懸濁し、1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ヒト組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を1ウェルあたり10 μL添加し、5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、GDNFを投与した細胞は非投与細胞に比べて約40 ％吸光度が増加した（図１）。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7においてGDNFが細胞増殖を誘発することが示唆された。
【実施例２】
【０４２７】
RET遺伝子のsiRNA投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 ％ウシ胎児血清（Hyclone社）、１× MEM用非必須アミノ酸（大日本製薬）、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、100 units/mLペニシリンG（和光純薬）、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン（和光純薬）を含むMEM（Invitrogen社）で懸濁し、5％炭酸ガス気流中、37℃で培養した後、siRNAをトランスフェクションした。
具体的には、RET遺伝子のmRNAを切断する活性を持つ下記の3種のsiRNA(B-Bridge社)を混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なRNAi効果を示さないことが保証されている下記の3種のsiRNA（B-Bridge社、以下non-silencing dsＲＮＡと略する）の混合物を用いた。
＜RETに対するsiRNA＞
（SHF27A-0609-1）
Sense鎖    ：gaccauagcuccugggagaTT（配列番号：１５）
Antisense鎖：ucucccaggagcuauggucTT（配列番号：１６）
（SHF27A-0609-2）
Sense鎖    ：gaacuugguucuuggaaaaTT（配列番号：１７）
Antisense鎖：uuuuccaagaaccaaguucTT（配列番号：１８）
（SHF27A-0609-3）
Sense鎖    ：ccacauggauugaaaacaaTT（配列番号：１９）
Antisense鎖：uuguuuucaauccauguggTT（配列番号：２０）
＜non-silencing dsRNA＞
（C6A-0126-1）
Sense鎖    ：auccgcgcgauaguacguaTT（配列番号：２１）
Antisense鎖：uacguacuaucgcgcggauTT（配列番号：２２）
（C6A-0126-2）
Sense鎖    ：uuacgcguagcguaauacgTT（配列番号：２３）
Antisense鎖：cguauuacgcuacgcguaaTT（配列番号：２４）
（C6A-0126-3）
Sense鎖    ：uauucgcgcguauagcgguTT（配列番号：２５）
Antisense鎖：accgcuauacgcgcgaauaTT（配列番号：２６）
300pmolのRET遺伝子に対するsiRNA、または300pmolのnon-silensing dsＲＮＡを含む3μLの溶液 を、MCF 7細胞100万個を懸濁したNucleofector Solution V（Amaxa biosystems社）100μLと混合した後、Nucleofector program P-020によりトランスフェクションした。この混合液をMCF 7細胞培養液4mLに全量添加し、24時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を1ウェル当たり3500個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した後、ヒト組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を1ウェルあたり10μL添加し、5％炭酸ガス気流中、37℃で、さらに3時間放置した後、450nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。
その結果、RET遺伝子に対するsiRNAを投与した細胞はnon-silensing dsRNA投与細胞に比べて、GDNF投与による吸光度の増加が抑制された（図２）。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該siRNA非存在下ではGDNFにより活性化されたRETタンパク質が細胞増殖を誘発し、siRNA等によりRETの機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
【実施例３】
【０４２８】
GFRα1遺伝子のsiRNA投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 ％ウシ胎児血清（Hyclone社）、１× MEM用非必須アミノ酸（大日本製薬）、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、100 units/mLペニシリンG（和光純薬）、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン（和光純薬）を含むMEM（Invitrogen社）で懸濁し、5％炭酸ガス気流中、37℃で培養した後、siRNAをトランスフェクションした。
具体的には、GFRα1遺伝子のmRNAを切断する活性を持つ下記の3種のsiRNA(B-Bridge社)を混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なRNAi効果を示さないことが保証されている下記の3種のsiRNA（B-Bridge社、以下non-silencing dsＲＮＡと略する）の混合物を用いた。
＜GFRα1に対するsiRNA＞
（SHF27A-0610-1）
Sense鎖    ：gagcagagcugcagcaccaTT（配列番号：２７）
Antisense鎖：uggugcugcagcucugcucTT（配列番号：２８）
（SHF27A-0610-2）
Sense鎖    ：gcagcugucuaaaggaaaaTT（配列番号：２９）
Antisense鎖：uuuuccuuuagacagcugcTT（配列番号：３０）
（SHF27A-0610-3）
Sense鎖    ：cucagaaggcuuugggauaTT（配列番号：３１）
Antisense鎖：uaucccaaagccuucugagTT（配列番号：３２）
＜non-silencing dsRNA＞
（C6A-0126-1）
Sense鎖    ：auccgcgcgauaguacguaTT（配列番号：２１）
Antisense鎖：uacguacuaucgcgcggauTT（配列番号：２２）
（C6A-0126-2）
Sense鎖    ：uuacgcguagcguaauacgTT（配列番号：２３）
Antisense鎖：cguauuacgcuacgcguaaTT（配列番号：２４）
（C6A-0126-3）
Sense鎖    ：uauucgcgcguauagcgguTT（配列番号：２５）
Antisense鎖：accgcuauacgcgcgaauaTT（配列番号：２６）
25pmolのGFRα1遺伝子に対するsiRNA、または25pmolのnon-silensing dsＲＮＡを含む4μLの溶液 を、MCF 7細胞100万個を懸濁したNucleofector Solution V（Amaxa biosystems社）100μLと混合した後、Nucleofector program P-020によりトランスフェクションした。この混合液をMCF 7細胞培養液4mLに全量添加し、24時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を1ウェル当たり3500個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した後、ヒト組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を1ウェルあたり10μL添加し、5％炭酸ガス気流中、37℃で、さらに3時間放置した後、450nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。
その結果、GFRα1遺伝子に対するsiRNAを投与した細胞はnon-silensing dsRNA投与細胞に比べて、GDNF投与による吸光度の増加が抑制された（図３）。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該siRNA非存在下ではGDNFにより活性化されたGFRα1タンパク質が細胞増殖を誘発し、siRNA等によりGFRα1の機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
【実施例４】
【０４２９】
ヒト乳癌細胞株におけるRETタンパク質の発現
実施例１の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7のライゼートを調製し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗RETヤギポリクローナル抗体（R&Dシステムズ社）を一次抗体、HRP（Horse Radish Peroxidase）付加抗ヤギIgG抗体（SIGMA社）を二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、分子量170ｋDa付近にバンドが検出された（図４a）。分子量の大きさより、このバンドはRETタンパク質に由来すると考えられ、MCF 7においてRETタンパク質が発現していることが示唆された。またMCF 7の生細胞を用いて、同じ抗体を一次抗体、AlexaFluor488付加抗ヤギIgG抗体（Invitrogen社）を二次抗体としてフローサイトメトリー解析を行った。その結果、抗RET抗体を用いた際にピークシフトが観察された（図４b）。先のウェスタンブロット解析の結果を含め、RETタンパク質はMCF7の細胞膜表面上に発現していることが示唆された。
【実施例５】
【０４３０】
ヒト乳癌細胞株におけるGFRα1タンパク質の発現
実施例１の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7のライゼートを調製し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗GFRα1ヤギポリクローナル抗体（R&Dシステムズ社）を一次抗体、HRP付加抗ヤギIgG抗体（SIGMA社）を二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、分子量55ｋDa付近にバンドが検出された（図５a）。分子量の大きさより、このバンドはGFRα1タンパク質に由来すると考えられ、MCF 7においてGFRα1タンパク質が発現していることが示唆された。またMCF 7の生細胞を用いて、同じ抗体を一次抗体、AlexaFluor488付加抗ヤギIgG抗体（Invitrogen社）を二次抗体としてMCF 7のフローサイトメトリー解析を行った。その結果、抗GFRα1抗体を用いた際にピークシフトが観察された（図５b）。先のウェスタンブロット解析の結果を含め、GFRα1タンパク質はMCF7の細胞膜表面上に発現していることが示唆された。
【実施例６】
【０４３１】
GDNF投与によるヒト乳癌細胞株の細胞内シグナル伝達タンパク質のリン酸化
実施例１の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり150万個の細胞密度で6穴平底組織培養プレートに播種した。5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ヒト組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して終濃度 10 ug/mLで投与し、0、10、20、30分間培養後にライゼートを調製した。そのライゼートの一部を、PathScan Sandwich ELISAキット（セルシグナリング社）により解析した。その結果GDNF添加によりERK1/2、Akt、MEK1/2のリン酸化が誘導されることが検出された（図６a）。またライゼートの一部をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗リン酸化ERK1/2抗体、抗リン酸化JNK抗体、抗リン酸化p38-MAPK抗体、抗リン酸化Akt抗体、抗Akt抗体（セルシグナリング社）を一次抗体、HRP付加抗ウサギIgG抗体（セルシグナリング社）二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果GDNF添加によりERK1/2、Aktのリン酸化が誘導されることが観察された（図６b）。これらの実験より、MCF 7はGDNF添加に反応し、細胞内シグナル伝達経路にあるタンパク質を活性化させることが確認された。
【実施例７】
【０４３２】
ラットGDNF投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖促進
実施例１の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ラット組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を1ウェルあたり10 μL添加し、5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、GDNFを投与した細胞は非投与細胞に比べて約40 ％吸光度が増加した（図７）。この結果より、ラットなどのげっ歯類のGDNFがヒト乳癌由来細胞株MCF 7の細胞増殖を誘発し、げっ歯類を用いた担癌実験を行える可能性があることが示された。
【実施例８】
【０４３３】
ヒト乳癌組織におけるRETタンパク質の発現
ヒト乳癌組織切片（SuperBioChip社）を10 mM クエン酸緩衝液（ph6.0）中で15分間煮沸処理することにより、抗原を賦活化し、実施例４で用いた抗RET抗体（R&Dシステムズ社）を一次抗体、抗ヤギIg・ビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を二次抗体（DAKO社）、HRP標識ストレプトアビジン（DAKO社）を三次反応物として用いてDABで発色させて免疫組織染色解析を行った。その結果、乳癌組織で染色像が検出された。乳癌組織においてRETタンパク質が発現していることが示唆された（図８）。また、連続切片を用いて行った実施例９の結果より、RETタンパク質とGFRα1タンパク質は同じ細胞でも発現している可能性が示された。
【実施例９】
【０４３４】
ヒト乳癌組織におけるGFRα1タンパク質の発現
ヒト乳癌組織切片（SuperBioChip社）を10 mM クエン酸緩衝液（ph6.0）中で15分間煮沸処理することにより、抗原を賦活化し、実施例５で用いた抗GFRα1抗体（R&Dシステムズ社）を一次抗体、抗ヤギIg・ビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を二次抗体（DAKO社）、HRP標識ストレプトアビジン（DAKO社）を三次反応物として用いてDABで発色させて免疫組織染色解析を行った。その結果、乳癌組織で染色像が検出された。乳癌組織においてGFRα1タンパク質が発現していることが示唆された（図９）。また、連続切片を用いて行った実施例８の結果より、RETタンパク質とGFRα1タンパク質は同じ細胞でも発現している可能性が示された。
【実施例１０】
【０４３５】
抗GDNF抗体投与によるヒト乳癌細胞株の細胞増殖阻害
実施例１の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、抗GDNFポリクローナル抗体（R&Dシステムズ社）もしくは、抗GDNFモノクローナル抗体（R&Dシステムズ社）をＰＢＳに懸濁して投与し、更に、ヒト組換え型GDNF（R&Dシステムズ社）を終濃度１ ng/mLとなるように投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液（和光純薬）を1ウェルあたり10 μL添加し、5 ％炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、抗GDNF抗体を投与した細胞は非投与細胞に比べて約30 ％吸光度が減少した（図１０）。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該抗体非存在下ではGDNFが細胞増殖を誘発し、抗体等によりGDNFの機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０４３６】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、例えば、乳癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。【０４３７】
本出願は、日本で出願された特願２００５−３０８５８９（出願日：２００５年１０月２４日）及び特願２００６−０４５９９４（出願日：２００６年２月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2007049624.tif 000002
【図２】
2007049624.tif 000003
【図３】
2007049624.tif 000004
【図７】
2007049624.tif 000005
【図１０】
2007049624.tif 000006
【図４】
2007049624.tif 000007
【図５】
2007049624.tif 000008
【図６ａ】
2007049624.tif 000009
【図６ｂ】
2007049624.tif 000010
【図８】
2007049624.tif 000011
【図９】
2007049624.tif 000012
【配列表】
2007049624000001.app
【国際調査報告】
2007049624.tif 000013
2007049624.tif 000014
2007049624.tif 000015
2007049624.tif 000016
2007049624.tif 000017
2007049624.tif 000018
2007049624.tif 000019
2007049624.tif 000020
2007049624.tif 000021