【手続補正書】
【提出日】令和1年8月20日(2019.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中でステビオールグリコシドを生産することができる組み換え微生物であって、
微生物が、配列番号１０７、１０８、１１１、１１３、１１５、または１２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内在性の輸送体遺伝子、および、少なくとも１つの前記内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する、配列番号１０４または１０５で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内在性の転写因子遺伝子の改変された発現を有し、ここで、前記内在性の輸送体遺伝子は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体またはMajor Facilitatorスーパーファミリー（ＭＦＳ）輸送体をコードする、
改変された発現が、相当する未改変の微生物について観察される発現のレベルと比較して、少なくとも１つの前記内在性の輸送体遺伝子、少なくとも１つの前記内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの前記内在性の転写因子遺伝子、または両方の増加または減少した発現を含む、
微生物が、少なくとも１つの異種輸送体遺伝子を発現する、
改変された発現が、相当する未改変の微生物について観察される発現のレベルと比較して、配列番号１０４、１１５、または１２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の過剰発現、または、各遺伝子座を破壊することまたは欠失させることによる、配列番号１０５、１０７、１０８、１１１または１１３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の減少した発現を含み、
および、微生物が、
（ａ）  スクロース輸送体（ＳＵＣ１）ポリペプチドおよびスクロースシンターゼ（ＳＵＳ１）ポリペプチドをコードする１つまたは２つ以上の遺伝子、ここで、ＳＵＳ１ポリペプチドが、配列番号７８または８０で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）  ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号４３〜５０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）  ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号３３〜３９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｄ）  ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号１〜６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｅ）  ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号７〜１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）  ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号１１〜１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；および
（ｇ）  シトクロムＰ４５０複合体を還元できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号２０、２２、２７または２８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
をさらに含み、および、
（ｈ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３のヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号３０または９１で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｉ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコースまたは１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号８５または８９で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｊ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号２９または８８で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；および
（ｋ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコースまたは１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、遺伝子が、２つまたは３つ以上のコピー数を有し、およびここで、ポリペプチドが、配列番号５１、５４、５５、８６または９０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
をさらに含み、
少なくとも１つの前記遺伝子が組み換え遺伝子であり、および
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＭまたはそれらの組み合わせである、
前記組み換え微生物。
【請求項２】
部分（ａ）〜（ｋ）の少なくとも１つの遺伝子が、微生物における発現のためにコドン最適化されている、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項２に記載の組み換え微生物。 
【請求項４】
Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種の酵母細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。 
【請求項５】
Yarrowia lipolytica種の酵母細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
細胞培養物からステビオールグリコシドの排出を変化させる方法であって、遺伝子が発現される条件下で、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を増殖させることを含み、ここで、ステビオールグリコシドが微生物によって生産される、前記方法。
【請求項７】
細胞培養物中でステビオールグリコシドを生産する方法であって、遺伝子が発現される条件下で、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を増殖させることを含み、ここで、増殖させることが、１つまたは２つ以上の遺伝子の発現を誘導すること、または、１つまたは２つ以上の遺伝子を構成的に発現することを含み、およびここで、ステビオールグリコシドが微生物によって生産される、前記方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、 
（ａ）  レバウジオシドＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され；
（ｂ）  レバウジオシドＢが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され；
（ｃ）  レバウジオシドＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され；
（ｄ）  レバウジオシドＥが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され；および／または
（ｅ）  レバウジオシドＭが、ステビオールの１３−ＯＨをグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、
前記方法。
【請求項９】
レバウジオシドＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
レバウジオシドＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
レバウジオシドＭが、ステビオールの１３−ＯＨをグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、配列番号１０４、１１５、または１２２で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステビオールグリコシドが、細胞培養物中に、少なくとも５００ｍｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え微生物の細胞培養物中で、植物由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドの全細胞のバイオコンバージョンを含む、レバウジオシドＭを生産する方法であって、
ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを使用し、ここで、ポリペプチドが、配列番号５１、５４、５５、８６または９０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、および、
（ａ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３のヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号３０または９１で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号８５または８９で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号２９または８８で示されるアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
の１つまたは２つ以上を使用し、
ここで、植物由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、１，２−ビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤもしくはレバウジオシドＥまたはこれらの混合物を含む、
前記方法。
【請求項１５】
細胞培養物からレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離することをさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、単離するステップが、細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を得ること、および
（ａ）  上清を、１つまたは２つ以上の吸着樹脂に接触させて、少なくとも一部のレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に得ること、または
（ｂ）  上清を、１つまたは２つ以上のイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムに接触させて、少なくとも一部のレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に得ること、または
（ｃ）  レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に結晶化または抽出すること、
それによって、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含むステビオールグリコシド組成物を、細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
回収されたステビオールグリコシド組成物が、ステビア草のステビオールグリコシド組成物と比較してレバウジオシドＭについて濃縮され、および、植物由来ステビア抽出物から得られたステビオールグリコシド組成物と比較して、ステビア草由来成分の減少したレベルを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、細胞培養物が、
（ａ）  組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド；
（ｂ）  グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素；
を含む、前記方法。
【請求項２０】
組み換え微生物が、発酵槽内においてある温度である期間増殖させられ、ここで温度および期間が、ステビオールグリコシド組成物の生産を容易にする、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
（ａ）  微生物によって生産されたステビオールグリコシド；
（ｂ）  グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素；
をさらに含み、
ここで、ステビオールグリコシドが、細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、
前記細胞培養物。
【請求項２２】
細胞培養物中で増殖させた請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え微生物の細胞溶解物であって、
（ａ）  微生物によって生産されたステビオールグリコシド；
（ｂ）  グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素；
を含み、
ここで、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシドが、細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、
前記細胞溶解物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
スクロースシンターゼはあらゆる好適な生物に由来し得る。例えば限定なしに、Arabidopsis thaliana（例えば配列番号７８）またはCoffea arabica（例えば配列番号８０）由来のスクロースシンターゼのコード配列（例えばPCT/US2012/050021の配列番号１７８、１７９および１８０参照）が、好適なプロモーターの制御下にある発現プラスミドにクローニングされて、宿主（例えば微生物または植物）によって発現され得る。ＳＵＳコード配列はＳＵＣ２（スクロース加水分解酵素）欠損S.cerevisiae株によって発現されて、酵母による細胞外のスクロースの分解を回避し得る。スクロースシンターゼは、かかる株によって、スクロース輸送体（例えば、A.thaliana  ＳＵＣ１輸送体またはその機能的なホモログ）および１つまたは２つ以上のＵＧＴ（例えばＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅまたはそれらの機能的なホモログの１つまたは２つ以上）と組み合わせて発現され得る。スクロースを含有する培地によって宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースおよび１つまたは２つ以上のグルコシド（例えばステビオールグルコシド）の生産を促進し得る。尚、場合によっては、スクロースシンターゼおよびスクロース輸送体が、特定の化合物（例えばステビオール）の生産用の組み換え体である宿主細胞によってＵＧＴと一緒に発現され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019162110000001.app