【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５種の細菌属のうちいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法であって、該方法は、
反応混合物において３００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、該血小板試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、該反応混合物が、第１のプライマーおよび第２のプライマーを有するプライマー対と検出可能プローブとを含み、該プライマー対が、該アンプリコンを挟み、該アンプリコンが、該検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々は、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの別個の保存領域にハイブリダイズし、該別個の保存領域が、該少なくとも５種の細菌属間で同一であり、該第１のプライマーが、配列番号４に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号５または６に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号７に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号８に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号９に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号１０に記載の配列またはその相補体を含む、ステップと、
該検出可能プローブによる該アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、該検出可能プローブによる該ハイブリダイゼーションが、該少なくとも５種の細菌属のいずれかによる該血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じる、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記血小板試料が、アフェレーシスにより単離された血小板濃縮物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５ｍＬ未満の血小板濃縮物から単離された核酸が、前記核酸増幅反応に供される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌汚染の検出が、レシピエントへの輸注に先立ち、かつ／または前記血小板試料を得てから２４時間以内に完了される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも５種の細菌属が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも５種の細菌属の細菌種が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能シグナルが、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出シグナルに基づき前記細菌汚染の量を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸増幅反応が、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板試料または前記その部分が、増幅に先立ち３５℃を上回るインキュベーション温度で培養されたことがない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能プローブが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、またはそれらの相補体からなる群から選択される配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸増幅反応が、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記５種の細菌属が、少なくとも８種の細菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分の増幅および検出のための組成物であって、該部分が３００ヌクレオチド未満の長さであり、該組成物は、
配列番号９に記載の配列またはその相補体を含む第１のプライマーと、
配列番号１０に記載の配列またはその相補体を含む第２のプライマーと、
配列番号１６に記載の配列またはその相補体を含む検出可能プローブと
を含む、組成物。
【請求項１６】
前記組成物が容器内に存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分の増幅および検出のための組成物であって、該部分が、３００ヌクレオチド未満の長さであり、該組成物は、
第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対であって、該プライマー対は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドとの増幅反応において、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅し、該アンプリコンの配列は、配列番号１〜３のいずれかの配列またはその相補体と最適にアライメントされた場合、少なくとも９０％の配列同一性を示し、該プライマー対が、該アンプリコンを挟み、該アンプリコンが、検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの別個の保存領域にハイブリダイズし、該別個の保存領域が、少なくとも５種の細菌属間で同一であり、該第１のプライマーが、配列番号４に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号５または６に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号７に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号８に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号９に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号１０に記載の配列またはその相補体を含む、プライマー対と、
該アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズする検出可能プローブと
を含む、組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、容器内に存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分の増幅および検出のための反応混合物であって、該部分が、３００ヌクレオチド未満の長さであり、該反応混合物が、
試料核酸と、
第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対であって、該プライマー対は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドとの増幅反応において、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅し、該アンプリコンの配列は、配列番号１〜３のいずれかの配列またはその相補体と最適にアライメントされた場合、少なくとも９０％の配列同一性を示し、該プライマー対が、該アンプリコンを挟み、該アンプリコンが、検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの別個の保存領域にハイブリダイズし、該別個の保存領域が、少なくとも５種の細菌属間で同一であり、該第１のプライマーが、配列番号４に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号５または６に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号７に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号８に記載の配列またはその相補体を含むか、あるいは、該第１のプライマーが、配列番号９に記載の配列またはその相補体を含み、該第２のプライマーが、配列番号１０に記載の配列またはその相補体を含む、プライマー対と、
該アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズする検出可能プローブと、
ポリメラーゼと
を含み、該反応混合物が反応サイトに存在する、反応混合物。
【請求項２０】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドとの増幅反応において、複数の標的細菌属のいずれか１種由来の１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、前記プライマー対および前記検出可能プローブにより行われた場合、サイクル閾値（ＣＴ）が、３０未満であり、該閾値が、ベースライン値を上回る陽性蛍光シグナルを生じさせる、請求項１９に記載の反応混合物。
【請求項２１】
請求項１５に記載の組成物を含む、血小板試料の細菌汚染の検出のためのキット。
【請求項２２】
請求項１７に記載の組成物を含む、血小板試料の細菌汚染の検出のためのキット。
【請求項２３】
請求項２１に記載のキットを使用して、前記血小板試料の前記細菌を検出する方法であって、該方法は、
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを有するプライマー対を用いて、該血小板試料またはその部分に対して核酸増幅反応を実施して、３００ヌクレオチド以下の１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドのアンプリコンの検出可能量を生じさせるステップであって、複数の細菌属のいずれか１種由来の１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が行われた場合、サイクル閾値（ＣＴ）が、３０未満であり、該閾値が、ベースラインを上回る陽性蛍光シグナルを生じさせる、ステップと、
前記検出可能プローブにより該アンプリコンを検出するステップであって、該検出可能プローブが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、該保存配列が、該複数の異なる細菌属間で同一である、ステップと
を含み、該プライマー対が、該検出可能プローブがハイブリダイズする該保存配列を含むアンプリコンを挟み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの別個の保存領域にハイブリダイズし、該別個の保存領域が、該複数の異なる細菌属間で同一である、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載のキットを使用して、前記血小板試料の前記細菌を検出する方法であって、該方法は、
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを有するプライマー対を用いて、該血小板試料またはその部分に対して増幅反応を実施して、３００ヌクレオチド以下の１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドのアンプリコンの検出可能量を生じさせるステップであって、前記少なくとも５種の細菌属のいずれか１種由来の１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が行われた場合、サイクル閾値（ＣＴ）が、３０未満であり、該閾値が、ベースライン値を上回る陽性蛍光シグナルを生じさせる、ステップと、
前記検出可能プローブにより該アンプリコンを検出するステップであって、該検出可能プローブが、前記保存配列に特異的にハイブリダイズし、該保存配列が、該少なくとも５種の細菌属間で同一である、ステップと
を含み、該プライマー対が、該検出可能プローブがハイブリダイズする該保存配列を含むアンプリコンを挟み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々は、該１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの別個の保存領域にハイブリダイズし、該別個の保存領域が、該少なくとも５種の細菌属間で同一である、方法。