【事件の表示】
　特願２０１７−２３８４４２「細胞において多能性を誘導する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年　４月２６日出願公開、特開２０１８−　６４５７８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、２００９年１０月９日（パリ条約による優先権主張、２００８年１０月９日、米国（ＵＳ））を国際出願日とする特願２０１１−５３１２３５の一部を平成２６年１２月１９日に新たな特許出願（特願２０１４−２５７３５３）とし、その一部を平成２８年７月１５日に新たな特許出願（特願２０１６−１４０３２６）とし、さらにその一部を平成２９年１２月１３日に新たな特許出願としたものであって、平成３０年１０月３１日付けの拒絶理由通知に対して、平成３１年１月２４日に意見書が提出され、令和１年６月１１日付けで拒絶査定がなされ、同年１０月１８日に拒絶査定不服審判の請求がなされたものである。
第２　本願発明
　本願の請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、出願時の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される以下のとおりのものと認める。
「【請求項１】
　体細胞において多能性を誘導する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３と接触させることを含むものであり、ＭＵＣ１＊は細胞外ドメインがＰＳＭＧＦＲ（配列番号５）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質である、方法。」
第３　原査定の理由
　令和１年６月１１日付けでなされた拒絶査定の理由は、本願の発明の詳細な説明の記載は、本願発明の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されていないから、本願は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件（実施可能要件）を満たしておらず、また、出願時の技術常識に照らしても、発明の詳細な説明に開示された内容を本願発明の範囲まで拡張ないし一般化できるとはいえないので、本願は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件（サポート要件）を満たしていない、というものである。
第４　当審の判断
１　本願の発明の詳細な説明及び図面の記載事項
　本願の発明の詳細な説明及び図面には、次のとおりの事項が記載されている。
（１）背景技術
「【０００３】
　転写因子の異所性発現によって体細胞をリプログラムし、多能性にすることができることがマウス及びヒトにおいて実証されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。疾患又は老化によって引き起こされる損傷を修復するために、患者自身の皮膚細胞に由来する幹細胞を使用して細胞及び組織を生成することができるため、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の生成は、完全に個人化された再生医療の実現に大いに有望である（非特許文献１０、非特許文献１１）。転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせの強制発現が成熟細胞を多能性状態へと戻すことが示されている。
　【０００４】
　以前の研究では、これらの転写因子は複数のウイルスベクターを用いて発現させていた（非特許文献７、非特許文献４、非特許文献２、非特許文献８、非特許文献６、非特許文献９、非特許文献５）。この複数のベクターの使用は、複数の組込みイベントのために問題を生じ、これは発癌性リスクの増大につながるおそれがある（非特許文献７、非特許文献１２）。研究者らは、単一のベクター系（非特許文献１３）、摘出可能なベクター（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）、非組込み型（non-integrating）ベクター（非特許文献１７、非特許文献１８）及び一時的トランスフェクション（非特許文献１９）を用いることによってこの問題を克服しようと試みてきた。しかしながら、これらの方法はエピジェネティックリプログラミングを達成する上で極めて非効率的である。
　【０００５】
　多能性を誘導する方法には、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃのトランスフェクションが含まれるが、これは癌を引き起こす可能性があるため望ましくない。ｉＰＳ細胞は、ｃ−Ｍｙｃをトランスフェクトすることなく生成することができる（非特許文献３、非特許文献２０）。しかしながら、そのリプログラミングの効率は大幅に低下している。同様に、Ｋｌｆ４は異形成を誘導するおそれがある（非特許文献２１）。
　【０００６】
　複数のウイルスベクターの組込み、及び多能性を誘導する遺伝子の一部の望ましくない副作用に関連する問題から、多能性誘導遺伝子の一部又は全ての使用を、その発現を調節するか、若しくは多能性誘導遺伝子によって発現が調節されるタンパク質遺伝子産物及びタンパク質、又は多能性を誘導する遺伝子若しくはタンパク質の発現を調節する小分子の使用に置き換える必要がある。この目的で、遺伝子ではなく、遺伝子産物の導入によっても多能性が誘導されたことが報告されている（非特許文献２２）。細胞への侵入を容易にするためにポリアルギニンでタグ付けされた組み換えＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃによって、マウス体細胞がリプログラムされた。小分子を用いて中核となる（core set）遺伝子のうち１つの必要性をなくした例もある。Ｎａｎｏｇを上方調節する小分子によって、同様にＮａｎｏｇを上方調節するＫｌｆ４遺伝子が不要となっている（非特許文献２３）。別の研究では、小分子ＨＤＡＣ阻害剤によってＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの両方が不要とされている（非特許文献２４）。これらの研究から以下のことが示される：１）タンパク質遺伝子産物によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；２）遺伝子を上方調節する小分子によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；及び３）同じ調節経路の遺伝子（又は遺伝子産物）は相互に代用することができる。」
（２）発明が解決しようとする課題
「【０００８】
　これらの成果にもかかわらず、これらの方法にはリプログラミングの効率が低いとの欠点があるという大きな問題が残っている。現在の体細胞における多能性の誘導率は低過ぎるため、ｉＰＳ細胞の治療的使用は非実用的である。したがって、単独で、又は既に同定されたものに加えて、細胞において多能性を誘導するか、又は多能性誘導の効率を向上させるタンパク質及び小分子を同定する必要がある。」
（３）発明を実施するための形態
「【００１６】
　本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」とは、ＭＵＣ１＊シグナル伝達を直接的又は間接的に増大させることを指し、ＭＵＣ１＊受容体の二量化、さらにＭＵＣ１受容体の切断によるＭＵＣ１＊の産生の増大を含むが、これらに限定されない。ＭＵＣ１＊活性は、ＭＵＣ１受容体（さらに切断され、二量化される）の転写発現の増加によっても増大し得る。したがって、一態様では、ＭＵＣ１＊活性はＭＵＣ１＊を二量化するエフェクター分子の活性の増大、又はＭＵＣ１を切断してＭＵＣ１＊を形成する切断分子の活性の増大、又はＭＵＣ１の発現の増加によって増大し得る。したがって、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの活性を増大させることが可能な任意の化学種又は生物種、ＭＵＣ１＊を形成するＭＵＣ１切断酵素、又はＭＵＣ１の発現を増進する任意の転写活性化因子が、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」種として包含される。」
「【００１９】
　本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊」とは、細胞外ドメインが本質的にＰＳＭＧＦＲ（配列番号５）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質を指す。」
「【００２７】
多能性の誘導
　体細胞をリプログラムして、多能性状態へと戻すことができることが最近発見された。転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子、又はタンパク質自体を体細胞に導入し、多能性状態へと戻すことができる。これらの多能性因子の多くは、以前は癌遺伝子であると考えられていた。ｃ−Ｍｙｃはよく知られた癌遺伝子であり、同様にＫｌｆ４は異形成を誘導することが示されている（非特許文献２１）。ＯＣＴ４は多能性幹細胞を同定する上で最も基準となるものとして同定されている。核内のＯＣＴ４の存在は細胞が多能性であることを示唆し、その欠如は細胞が分化過程に入っており、もはや任意の細胞型に分化可能でないことを示唆する。最近では、ＯＣＴ４も同様に多くの癌細胞の核内に存在するが、正常な成熟細胞には存在しないことが知られるようになっている。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質（配列番号１）の切断形態であるＭＵＣ１＊が、固形腫瘍癌のおよそ７５％で発現される強力な成長因子受容体であり（Raina et al., 2009）、多能性幹細胞上でもこの「腫瘍形成」形態で発現される（Hikita et al., 2008）ことを最近発見した。本発明は、ＭＵＣ１＊及びＭＵＣ１＊関連因子、並びにそれらを多能性の誘導若しくは維持のため、又は多能性誘導の効率を増進するために利用する方法に関する。
　【００２８】
　本発明は、ｉＰＳ細胞の生成を誘導するか、又はその効率を向上させるために、タンパク質因子、それらをコードする遺伝子、又はそれらの発現に影響を及ぼす小分子を含むＭＵＣ１＊関連因子を使用することを包含する。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断形態であるＭＵＣ１＊が、癌細胞及び多能性幹細胞の両方の成長を媒介する主要な成長因子受容体であることを示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインと、その活性化リガンドＮＭ２３との間の相互作用が中断されることは、多能性幹細胞にとって致死的であり（Hikita et al., 2008）、この経路が多能性にとって重要であることを示唆している。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドである（Mahanta et al., 2008）（配列番号１２〜配列番号１７及び配列番号２２〜配列番号２３）。ＮＭ２３は、分化を阻害する一方で多能性幹細胞の成長を刺激するその能力に加えて、ｃ−Ｍｙｃの転写を誘導することが示されている（Dexheimer atal., 2009）。したがって、ＮＭ２３を多能性状態への変換が起きている細胞に添加することによって、ｃ−Ｍｙｃ癌遺伝子をトランスフェクトし、関連する健康上のリスクを緩和するという利益がもたらされる。加えて、ＮＭ２３又は二価抗ＭＵＣ１＊抗体によってＭＵＣ１＊を刺激することで、ＭＡＰキナーゼ増殖経路が活性化され、それにより細胞生存が増大する（Mahanta et al., 2008）。ＮＡＮＯＧ発現は多能性を誘導し、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３はＮａｎｏｇ発現を抑制する（Lin et al., 2007）。したがって、ｐ５３を抑制することによって、多能性の誘導に対するＮＡＮＯＧの必要性が低減又は排除される。ＭＵＣ１細胞質尾部（ＭＵＣ１０−ＣＴ）の異所的に発現される７２アミノ酸の断片は、癌細胞の核内に存在し、そこでｐ５３プロモーターに結合することが示されている（Wei et al., 2007）。配列番号１１に示されるようなＭＵＣ１−ＣＤのおよそ７２アミノ酸の断片は、ｉＰＳ細胞生成を誘導又は増進するために他の多能性誘導因子と組み合わせて使用することができる。しかしながら、このペプチドは天然のＭＵＣ１種とは一致せず、したがって望ましくない影響をもたらすおそれがある。本発明者らは、ＭＵＣ１＊が核に移行し（実施例１及び実施例９、並びに図６）、したがってｉＰＳ細胞生成を誘導若しくは増進するために、単独で、又は他の多能性誘導因子と組み合わせて使用されることを開示する。このアプローチの裏付けとして、中核となる多能性遺伝子からの幾つかの遺伝子が、ＭＵＣ１、その切断酵素及び／又はその活性化リガンドＮＭ２３の転写を調節することが報告されている（Boyer et al., 2005）。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はＭＵＣ１プロモーターに結合し、その切断酵素ＭＭＰ−１４のプロモーターにも結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭ２３プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊がｈＥＳＣの維持にとって重要であり、重要な多能性遺伝子の標的であると仮定して、本発明者らはＭＵＣ１＊、又はＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増大させる作用物質を、その活性化リガンドＮＭ２３と共に導入することを用いて、ｉＰＳ細胞の生成を誘導又は増進するために以前に同定された多能性誘導因子の一部又は全てを置き換えることができることを開示する。」
「【００３０】
　本発明は、成熟細胞、又は幾らか分化した細胞に、ＭＵＣ１＊及びその関連因子の発現に影響を及ぼす遺伝子又は遺伝子産物を導入することによって、分化を元に戻すか、又は幹様特性を維持することを含む。ＭＵＣ１＊は膜貫通タンパク質ＭＵＣ１の切断形態である。ＭＵＣ１＊関連因子としては、完全長ＭＵＣ１、ＭＵＣ１を切断する酵素、ＭＵＣ１＊活性化リガンド、さらにはＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊の発現に影響を及ぼす転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の遺伝子又は遺伝子産物の成熟細胞又は幾らか分化した細胞への導入が、これらの細胞又はそれらの子孫において多能性又は幹細胞性を誘導することにも関する（drawn to）。本願は、幹細胞において多能性を維持するためのそれらの使用を説明する。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の発現に影響を及ぼす作用物質は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ｍｙｃ及びＬＩＮ２８等の多能性を誘導することが既に知られている１つ又は複数の遺伝子若しくは遺伝子産物と組み合わせて、又は置き換えて添加することができる。」
「【００３２】
　胚性幹細胞（ＭＵＣ１の切断形態であるＭＵＣ１＊のみを発現する）を用いた本発明者らの以前の研究では、その細胞外ドメインの二量化によって、成長が刺激され、分化が阻害されることが示された（Hikita et al., 2008）。これらの効果は、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを、二価抗ＭＵＣ１＊抗体、組み換えＮＭ２３、又は優先的に二量体を形成する突然変異体ＮＭ２３（Ｓ１２０Ｇ）のいずれかを用いて二量化することによって達成された（Kim et al., 2003）。一価抗ＭＵＣ１＊　Ｆａｂを用いたＭＵＣ１＊細胞外ドメインの阻害は、数時間以内に死をもたらした。これらの発見から、ＭＵＣ１＊が重要な「幹細胞性」因子であることが示唆される。また、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＭＵＣ１遺伝子プロモーター、さらにはその切断酵素のプロモーターに結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断することはｈＥＳＣにとって致死的であるため、多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＭＵＣ１、その切断酵素及びその活性化リガンドの発現を誘導するということになる。既に多能性を誘導することが示されている遺伝子又は遺伝子産物の１つ又は複数は、単独で、又はその切断酵素及び／又は活性化リガンドＮＭＥ７、ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲエピトープを二量化する抗体に加えて、ＭＵＣ１＊の遺伝子をトランスフェクトするか、又はその遺伝子産物を導入することによって置き換えることができる。」
「【００３４】
　ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は上記で挙げたものを含む関連因子によって、多能性を誘導し、多能性を誘導するため又は多能性を維持するために使用される１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を置き換えることができる。
　【００３５】
　線維芽細胞及び皮膚線維芽細胞等の体細胞に、幹細胞様特徴の誘導（場合によっては子孫が多能性幹細胞になるよう誘導する）を助けるＭＵＣ１タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトする場合がある。本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の遺伝子を細胞にトランスフェクトして、幹細胞様状態への復帰を誘導する（場合によっては実際の多能性幹細胞を誘導する）。ＭＵＣ１遺伝子又はＭＵＣ１＊遺伝子の各々を、細胞に単独で、又は多能性若しくは幹細胞様特性の誘導を助ける他の遺伝子と組み合わせて導入してもよい。例えば、ＭＵＣ１、又は優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを、細胞にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする１つ又は複数の遺伝子と共に導入する。ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを線維芽細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Yu et al., 2007）。別の実施形態では、ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを体細胞、線維芽細胞又は他の細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Takahashi et al., 2007）。同様に、ＭＵＣ１＊及び／又はその活性化リガンドであるＮＭ２３、又はＮＭ２３のＳ１２０Ｇ突然変異体をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトして多能性を誘導する。ＭＵＣ１＊及び／又はＮＭ２３は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃ等の他の遺伝子と共にトランスフェクトして、多能性又は幹細胞様特性を誘導してもよい。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１を認識する抗体をコードするＤＮＡを細胞に単独で、又は他の遺伝子と共にトランスフェクトして、細胞又はその子孫において幹細胞特性を誘導することもできる。抗ＭＵＣ１＊抗体は分泌されると二量化し、それによりＭＵＣ１＊受容体、及び幹様特性を促進又は維持するその機能を活性化する。」
「【００３８】
　別の例では、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊と相互作用するリガンドを体細胞、皮膚線維芽細胞、線維芽細胞又は幾らか分化した細胞に、単独で、又は多能性を誘導若しくは維持する他の遺伝子と組み合わせて添加して多能性を誘導する。例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子の１つ又は複数を、線維芽細胞又は他の細胞にトランスフェクトした後、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドの存在下で培養する。ＭＵＣ１＊の二量体タンパク質リガンドが好ましい。好ましい実施形態では、二価抗ＭＵＣ１＊抗体を、細胞又はその子孫が多能性幹細胞となるようにする遺伝子をトランスフェクトした細胞に添加する。」
（４）実施例
「【００４７】
実施例１．ＭＵＣ１＊は成長及び細胞死抵抗性を促進する。
　ＭＵＣ１＊は、線維芽細胞のクローン性成長（コロニー拡大）を促進する。完全長ＭＵＣ１（配列番号１）、ＭＵＣ１＊１１１０（配列番号５）又は空ベクターをトランスフェクトした３Ｙ１細胞の単一細胞クローンを、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地中に、６０ｍｍ皿当たり１０００個の細胞でプレーティングした。細胞を９日間増殖させた後、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。皿を水で洗浄した後、７０％メタノール中１％クリスタルバイオレットで室温で２０分間染色した。皿を水で３回洗浄し、室温で一晩乾燥させて、写真に撮った。図１Ａから、吸収されるクリスタルバイオレットの量（細胞数の指標）は、ＭＵＣ１＊単一細胞クローン＃３及び＃４４を増殖させる場合にはるかに高いことが示される。対照的に、完全長ＭＵＣ１をトランスフェクトした細胞（単一細胞クローン＃８及び＃１７）は、空ベクターをトランスフェクトした細胞に対して成長速度の増大を示さなかった。このことから、切断形態のＭＵＣ１＊は成長及び／又は生存の利点を有するが、完全長タンパク質は有しないことが示される。」
「【００４８】
実施例２．抗ＭＵＣ１＊　Ｆａｂは、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））抵抗性細胞（１ｕｇ／ｍｌのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）中での培養によって抵抗性にされた）において、ＴＡＸＯＬ（登録商標）による細胞死に対する抵抗性を遮断する。
　Fessler et al., 2009は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抵抗性細胞がＴＡＸＯＬ（登録商標）、ドキソルビシン及びシクロホスファミドに対しても抵抗性であることを報告している。報告されているように、これらの薬物抵抗性癌細胞はＭＵＣ１＊を過剰発現することによって抵抗性を得る。以下の実験から、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのＰＳＭＧＦＲ部分を遮断することによって、癌細胞において獲得された薬物抵抗性が取り消されることが示された。親細胞（ＢＴ４７４）又は抵抗性細胞（ＢＴＲｅｓ１）を、９６ウェルプレート（４ウェル／条件）において、１００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル、Sigma、Ｔ７１９１）の存在下又は非存在下で、細胞に抗ＭＵＣ１＊　Ｆａｂ、対照Ｆａｂを添加したか、又はＦａｂを添加しなかった。２日後、細胞を５０μｌのトリプシン中に再懸濁し、トリパンブルーの存在下で計数した。細胞死率をトリパンブルー取り込み率として算出した。ＢＴ４７４細胞は、各々の条件下でＴＡＸＯＬ（登録商標）に応答して細胞死を起こし、ＢＴＲｅｓ１細胞はＭＵＣ１＊抗体の存在下でのみ細胞死を起こした（図１Ｂ）。」
「【００４９】
実施例３．ＭＵＣ１＊は成長因子受容体として働き、人工抗体（抗ＭＵＣ１＊抗体）又はその天然リガンドであるＮＭ２３（ＮＭＥ）を用いたその細胞外ドメインの二量化によって活性化される。
　ＭＵＣ１＊陽性ＺＲ−７５−３０細胞（６０００個／ウェル）、又は対照（ＭＵＣ１陰性）ＨＥＫ２９３細胞（４０００個／ウェル）を、９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、０時間の細胞数を数え、２４時間又は４８時間毎に種々の濃度の抗ＭＵＣ１＊抗体又はＦａｂを低（０．１％）血清培地に添加した。数日間のインキュベーションの後、細胞をトリプシン中に再懸濁し、計数して、正規化成長率を算出した。ＺＲ−７５−３０細胞の刺激は、リガンド誘導性成長刺激について実証されているように、釣鐘型曲線を示したが、ＨＥＫ２９３細胞は示さなかった（図１Ｃ）。ＭＵＣ１を標的とするｓｉＲＮＡ、又は対照ｓｉＲＮＡを安定にトランスフェクトしたＭＵＣ１＊陽性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を用いた同様の実験では、成長の刺激は対照をトランスフェクトした細胞でしか起こらず、抗体の特異性がさらに実証される（図１Ｄ）。同一の結果が、ＭＵＣ１＊の天然リガンドであるＮＭ２３についても実証されている（図１Ｅ）。」
「【００５０】
実施例４．ＮＭ２３は、基本的にＭＵＣ１＊の細胞外ドメインから構成されるＰＳＭＧＦＲペプチドに特異的に結合する。
　結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置及びＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定した。ヒスチジンタグ付きＭＵＣ１＊１１１０−ｅｃｄ（配列番号５）又は無関係のペプチド（HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS（配列番号３４））を、Mahantaet al. 2008に記載されるように、本発明者らの研究室で作製した５．７％ＮＴＡ−Ｎｉ＋＋　ＳＡＭでコートしたＳＰＲチップの別個のフローチャネルに固定化した。精製したウシ又は組み換えヒトＮＭ２３の３５μＬのプラグを５ｕＬ／分という一定流量（flow stream）で注入し、センサーグラム（sensograms）を記録した。ウシ肝臓から精製したＮＭ２３（Sigma、Ｎ−２６３５）を、ＰＢＳ単独で希釈した。親和性を、１：１ラングミュアモデルを用いて広範囲の濃度にわたって測定した。一次速度式ではこの系を適切に表すことができないため、実際の親和性は変わることがある（図１Ｆ）。」
「【００５１】
実施例５．ＭＵＣ１＊成長因子受容体及びそのリガンドＮＭ２３は、未分化ｈＥＳＣ上に存在するが、分化ｈＥＳＣ上には存在しない。
　未分化（多能性）状態又は分化したばかりの状態のヒト胚性幹細胞を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって分析した。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ（dissected）、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライド（Nunc）にプレーティングした。未分化細胞については、細胞をプレーティングの５日後〜７日後に固定した。分化細胞については、プレーティングの５日後〜７日後にｂＦＧＦを培養培地から除去して、細胞を１４日間分化させた後、固定した。細胞はＰＢＳで洗浄してから、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで、４℃で１５分間固定した。細胞を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び１％ロバ又はヤギ血清で１時間ブロッキングした。０．１％ＮＰ−４０を細胞内抗原に対する抗体として使用した。一次抗体をブロッキングバッファー（block）で希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した：ＯＣＴ４（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ　Ｃｌｏｎｅｓ　Ｈ−１３４及びＣ−１０、１００倍希釈）、完全長ＭＵＣ１（ＶＵ４Ｈ５、Santa Cruz Biotechnology、５０倍希釈）、ＭＵＣ１＊（Minerva、２５０倍希釈）又はＮＭ２３（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ　ＮＭ３０１、１００倍希釈））。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、以下の二次抗体と共に３０分間インキュベートした：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　５５５ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　３５０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、２００倍）；ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＴＲ（Santa Cruz、１００倍）。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、退色防止封入剤（anti-fade mounting medium）（Biomeda）を用いてカバースリップを載せた。５分間のＤＡＰＩ染色（１μｇ／ｍｌ）によって核を可視化した。免疫染色した細胞を、OlympusのＢＸ−５１落射蛍光顕微鏡上で可視化した。これらの実験の結果から、ＭＵＣ１＊は未分化細胞（多能性幹細胞）の表面上に存在するが（図２Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）、分化ｈＥＳＣ上には存在しない（図２Ｄ）ことが示される。図３から、ＭＵＣ１＊のリガンドであるＮＭ２３はＭＵＣ１＊と共局在化することが示される（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＭＵＣ１＊及びそのリガンドであるＮＭ２３は、多能性幹細胞（ＯＣＴ４陽性細胞）上でしか発現されず、分化した細胞上では発現されない（図３Ｃ及び図３Ｆ）（ＤＡＰＩによってＯＣＴ４陰性細胞の核が染色される）。」
「【００５２】
実施例６．ＭＵＣ１＊は多能性幹細胞の成長を媒介する。
　二価抗ＭＵＣ１＊を用いたＭＵＣ１＊の刺激の多能性幹細胞に対する効果を決定するために、以下の実験を行った。結果から、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの添加によって、多能性（ＯＣＴ４陽性）幹細胞の成長が刺激され、フィーダー細胞、その抽出物又はｂＦＧＦの非存在下でのその成長も可能となることが示される。
　【００５３】
　多能性（ＯＣＴ４陽性）ｈＥＳＣの長期的成長は、ＭＵＣ１＊の刺激によって媒介される。ｈＥＳＣをトリプシン解離して、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに４×１０４細胞／ウェルで播種した。培地を交換し、個々のコロニーが見えるようになるまで、抗体を二価抗ＭＵＣ１＊に対する最終濃度１μｇ／ｍｌで一日おきに添加した。培養条件には、ｂＦＧＦを添加した及びｂＦＧＦを添加していない、「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）及びＨｓ２７馴化培地が含まれる。各々の条件について細胞を４連で（in quadruplicate）増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定して、上記のようにＯＣＴ４免疫染色を行った。図４のパネルＡ〜パネルＤは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加したマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。パネルＥ〜パネルＨは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加しなかったマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。抗ＭＵＣ１＊抗体の細胞培養物への添加（図４Ｃ、図４Ｄ）は、ｂＦＧＦを添加したものの成長（図４Ａ、図４Ｂ）と比べて、より多くの多能性幹細胞を生じた。線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地の非存在下で培養した細胞への抗ＭＵＣ１＊抗体の添加（図４Ｇ、図４Ｈ）は、多能性細胞を生じなかった（ＯＣＴ４の非存在）ｂＦＧＦを添加して増殖させた細胞（図４Ｅ、図４Ｆ）とは全く対照的に、豊富な多能性幹細胞を生じた。」
「【００５４】
実施例７．ＭＵＣ１＊刺激の多能性幹細胞の成長を増進する効果を、定量的カルセインアッセイにおいて直接測定した。
　ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ、９６ウェルプレートのマトリゲルコートウェル上で１．９×１０４細胞／ウェルの密度で増殖させた。培養培地は、３０％Ｈｓ２７馴化培地を添加したｈＥＳＣ培地及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有していた。抗体を、二価抗ＭＵＣ１＊については１μｇ／ｍｌ、一価抗ＭＵＣ１＊については１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。実験は３連で（in triplicate）行った。抗体処理の４１時間後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Molecular Probes）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、生細胞及び死細胞を定量化した。Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて蛍光を測定した。図５の棒グラフから、二量化リガンド（抗ＭＵＣ１＊）を用いたＭＵＣ１＊の刺激は、幹細胞成長を増進し、一方で抗ＭＵＣ１＊　ＦａｂによりＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断し、全幹細胞死をもたらすことが示される。」
「【００５５】
実施例８．二価抗ＭＵＣ１＊抗体、ＮＭ２３、ＮＭ２３突然変異体又はｂＦＧＦを用いた幹細胞成長の刺激の効果を比較するために、長期的幹細胞成長実験を行った。
　ｈＥＳＣをトリプシンで解離させ、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに、８．２×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種した。培地を交換し、抗体又は野生型若しくは突然変異体ＮＭ２３タンパク質を、抗ＭＵＣ１＊抗体については８０ｎｇ／ｍｌ、野生型組み換えＮＭ２３若しくは突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）ＮＭ２３については１ｎＭの最終濃度で、又は組み換えｂＦＧＦを「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）中４ｎｇ／ｍｌの最終濃度で一日おきに添加した。対照として、Ｈｓ２７線維芽細胞からの３０％馴化培地及び４ｎｇ／ｍｌの組み換えｂＦＧＦ（Peprotech、＃１００−１８Ｂ）を含む最小幹細胞培地において、細胞を同様に増殖させた。この実験の結果から、ＭＵＣ１＊リガンドが、マトリゲル上のこれらの細胞の「正常」増殖培地である馴化培地＋ｂＦＧＦと比べて、最小培地における多能性コロニーの成長をより良く刺激することが示される。表１に結果を詳述する。
　【００５６】
説明Ａ：２つのウェルの一方において２つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｂ：２つのウェルの一方において７つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである　　　　
説明Ｃ：２つのウェルの一方において５つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである　　　　
説明Ｄ：コロニーなし　　　　
説明Ｅ：２つの非常に小さな分化したコロニー　　　　
説明Ｆ：５つのほとんど分化したコロニー」
「【００５７】
実施例９．ＭＵＣ１＊は細胞の核に移行する。
　抗ＭＵＣ１＊モノクローナルＡｂを、Ａｌｅｘａ　５５５色素によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで標識し、ＭＵＣ１＊をトランスフェクトしたＨＣＴ−１１６細胞（ＭＵＣ１陰性）（冷ＰＢＳで４℃で洗浄した）に４℃で結合させた。２０分後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定するか、又は予熱した（pre-warmed）増殖培地を用いてインキュベートした。４０分後、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した後、ブロッキングし、ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ、２．５％ＦＢＳ及び０．１％ＮＰ−４０で透過化処理した。抗ＥＥＡ１抗体（Cell Signaling Technologies、２４１１Ｓ）及びＡｌｅｘａ　４８８（Invitrogen、２００倍）を用いてエンドソームを染色した（図６）。」
「【００５８】
実施例１０．ＭＵＣ１＊は核に移行し、そこで転写因子又は補因子として機能する。
　ＭＵＣ１の細胞質ドメイン（ＭＵＣ１−ＣＤ）に相当する、人工的に発現させたペプチドが核に移行することが科学文献において以前に報告されている（Huang, et al. 2005）。別の研究では、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３のプロモーター部位に結合することが報告されている（Wei, et al. 2007）。しかしながら、Wei, et al., 2007の報告では、この能力に関して、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３の転写を上方調節するか、又は下方制御するかは決定されていない。幹細胞性又は多能性を誘導又は維持するためには、ｐ５３を抑制するのが望ましい（Maimets, et al., 2008）。さらに、ＭＵＣ１の細胞質ドメイン単独の強制発現は、ＭＵＣ１のいかなる天然状態又は切断状態にも一致しない。したがって、本発明者らは、これが実際に核に移行する多能性のマーカーであるＭＵＣ１＊であるか否かを決定しようとした。
　【００５９】
　ＭＵＣ１＊上のＰＳＭＧＦＲエピトープを認識するが、ＭＵＣ１が完全長である場合には同じエピトープを認識しない（Mahanta et al 2008）ポリクローナル抗体である抗ＭＵＣ１＊を使用して、ヒト胚性幹細胞をHikita et al (2008)の方法に従って染色した。胚性幹細胞は、ＭＵＣ１＊を排他的に発現し、完全長ＭＵＣ１を発現しない。免疫細胞化学によって、ＭＵＣ１＊が胚性幹細胞の核内で検出されることが多いことが示された。蛍光標識した（tagged）抗ＭＵＣ１＊　Ｆａｂフラグメントを、ＭＵＣ１＊又は空ベクターをトランスフェクトした細胞と共にインキュベートした。過剰のＦａｂを除去し、細胞をＰＢＳで４℃で洗浄してパラホルムアルデヒドで固定するか、又は受容体内在化を促すために予熱した培地を用いて３７℃で１０分間、２５分間若しくは４０分間インキュベートした後、パラホルムアルデヒド固定した。様々な時点で細胞を４℃にし、受容体内在化を停止させた。ＦａｂはＭＵＣ１＊をトランスフェクトした細胞に特異的に結合したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（データは示さない）。図６では、４０分後にＭＵＣ１＊が細胞の核に移行したことが示される。」
「【００６０】
実施例１１．ＭＵＣ１関連因子を用いて、ｐ５３並びにそのアポトーシス促進効果及び成長阻害効果を阻害し、ｉＰＳ（人工多能性幹）細胞を生成する効率を増大させる。
　小分子Ｎｕｔｌｉｎは、ｐ５３とその天然阻害剤ｈＤＭ２との間の相互作用を妨げることによってｐ５３の活性を増大させる（Vassilev et al., 2004）。Ｎｕｔｌｉｎによるｐ５３活性の誘導は、ヒト胚性幹細胞の分化を推進する（Maimets, et al., 2008）。同様に、胚性幹細胞におけるｐ５３の過剰発現は、おそらくはアポトーシスの誘導によってｈＥＳＣの成長を阻害する（Maimets, et al., 2008）。ｐ５３欠損マウスでは、原発腫瘍の形成（establishment）が増進された（Zhou et al., 2000）。このため、ｐ５３活性を妨げることによって、ｉＰＳ細胞株を樹立する効率が増大する。
　【００６１】
　「中核となる」多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４を用いた新規のｉＰＳ株の樹立において、多能性の誘導は、初めにｐ５３を小分子Ｎｕｔｌｉｎによって阻害し、次いでＭＵＣ１＊を導入することで増進される。ＭＵＣ１＊は、１）ＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡをトランスフェクトすること、及びｂ）効率的に細胞に侵入するようポリアルギニントラクトによって修飾された組み換えＭＵＣ１＊タンパク質を添加することによって、多能性の誘導が起きている細胞に導入する。
　【００６２】
　中核となる多能性遺伝子を皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした。しかしながら、皮膚線維芽細胞又は他の成熟細胞への直接的又は間接的な遺伝子産物の外因性発現も予想される。本発明では、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は関連因子の添加によって、中核となる多能性因子の一部又は全部が除外され得ることも予想される。
　【００６３】
　多能性の誘導は、ＭＵＣ１の細胞質尾部に相当するペプチドを、多能性への変換が起きている細胞に外部から添加した場合にも増進される。任意で、ＭＵＣ１−ＣＤを、ペプチドが細胞に侵入することを可能にするポリアルギニントラクト等のリーダー配列で修飾する。」
「【００６４】
実施例１２．ＭＵＣ１関連タンパク質の導入は、ｃ−ｍｙｃの転写を誘導すること及びＭＵＣ１＊を活性化することによって多能性を増進する。
　ｃ−Ｍｙｃは多能性の誘導を増進することが示されている。ＮＭ２３はｃ−ｍｙｃの転写を誘導し（Dexheimer et al., 2009）、ｃ−ｍｙｃの必要性をなくす。ＮＭ２３を、それをコードする核酸のトランスフェクションによって、又はタンパク質自体（細胞侵入を助けるポリアルギニントラクト等の配列で修飾してもよい）を外部から添加することによって、ｉＰＳへの変換が起きている細胞に導入する。ＮＭ２３の野生型又は突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）（二量体形態が好ましい）を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加する。ｉＰＳ細胞生成の効率が増進される。
　【００６５】
　ＮＭ２３（ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２又はＮＭＥ−７）は、多能性の誘導又は維持を増進する。ＮＭ２３は、以前に同定された多能性因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４を含むが、これらに限定されない）、及び本明細書中で開示される他の因子と共に導入される。」
「【００６６】
実施例１３．ＭＵＣ１＊関連因子を含む、新たな中核となる多能性因子の同定
　多能性を誘導若しくは維持するか、又はｉＰＳｃ形成の効率を向上させるか、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４から構成される多能性遺伝子セットの１つ又は複数を置き換えるために、ＭＵＣ１＊を細胞に導入する。ＭＵＣ１＊をコードする核酸を含有するＤＮＡ構築物を、上述の多能性遺伝子セット（又はそれらの遺伝子産物）の組み合わせと共に皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。ｉＰＳコロニー形成の効率を、生成された幹細胞の数を計数することによって決定する。さらに、細胞をＯＣＴ４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ　１−６０、ＴＲＡ　１−８１、ＴＲＡ　２−４９／６Ｅ（アルカリホスファターゼ）及びＮＡＮＯＧ等の多能性マーカーの免疫蛍光検出によって分析する。得られた細胞を核型安定性、及び３つの異なる生殖細胞系列（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に沿って分化する能力について評価する。これは、中胚葉検出についてはＣＤ３４又は平滑筋アクチン、内胚葉検出についてはＧＡＴＡ−４又はサイトケラチン１９、外胚葉検出についてはネスチン又はβＩＩＩチューブリン等といった生殖細胞系列特異的マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光検出によって決定する。ＭＵＣ１＊活性化リガンド、好ましくは抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３（ＮＭＥ）を任意で添加して、多能性の誘導又は維持をさらに増進する。」
２　判断
　上記（２）のとおり、発明の詳細な説明の記載によれば、本願発明が解決しようとする課題は、単独で、又は既に同定されたものに加えて、細胞において多能性を誘導するか、又は多能性誘導の効率を向上させるタンパク質及び小分子を同定することにあると認められ（段落【０００８】）、そして、請求項１には、「体細胞において多能性を誘導する方法」として、体細胞を、「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」と接触させることを「含む」ことが記載されており、請求項１には、上記「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」を、単独で用いる場合と既に同定されたものに加えて用いる場合との２つの場合が含まれているといえる。
　したがって、本願がサポート要件を満たすには、発明の詳細な説明において、請求項１に記載の上記「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」が、既に同定されたものに加えて用いる場合のみならず、単独で体細胞に接触させた場合にも、体細胞において多能性を誘導するものとして同定されたこと、すなわち、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」が、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させるというそれらが有する機能によって、単独で用いる場合に、体細胞において多能性を誘導するものであることが、当業者が認識できるように記載されている必要がある。
　ここで、「多能性」について、本願明細書中で明確な定義はされていないが、上記（３）のとおり、「多能性の誘導」の見出しが付された本願明細書の段落【００２７】には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８といった、それらを組み合わせて導入することで体細胞を多能性状態へと戻すことができる多能性因子が挙げられ、ＯＣＴ４の欠如は細胞が分化過程に入っており、もはや任意の細胞型に分化可能でないことを示唆することが記載されており、段落【００２８】には、ｉＰＳ細胞の生成誘導について記載されていることをふまえるに、本願発明の「多能性を誘導する」は、ｉＰＳ細胞のように任意の細胞型に分化可能な細胞、すなわち、外胚葉、中胚葉、内胚葉の三胚葉の複数系統へと分化する能力を有する細胞へと誘導されることを意味すると解釈される。そして、本願明細書の実施例１３において、多能性因子の同定の際、得られた細胞を３つの異なる生殖細胞系列（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に沿って分化する能力について評価すると記載されていることは、上記事項と整合するものである。
　そして、発明の詳細な説明をみると、上記（１）、（３）のとおり、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」が、腫瘍や多能性幹細胞でその発現が認められているＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断形態であるＭＵＣ１＊を活性化するリガンドであること、ＮＭ２３は多能性幹細胞の成長を刺激する能力に加え、体細胞をリプログラムして多能性状態へと戻すのに用いられる遺伝子の１つであるｃ−Mｙｃの転写を誘導する機能を有するといったことは記載されているが、既に同定されたものを加えることなく、上記二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３のようなＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に接触させることのみで、体細胞において多能性を誘導できることの根拠（作用機序等）についての記載はない。また、上記（１）のとおり発明の詳細な説明にも記載されているように、本願出願時、体細胞において多能性を誘導する多能性因子として、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８といったいくつかのものが既に知られているが、それらにしても単独では多能性を誘導することはできないため、複数のものを適切に組み合わせて体細胞に導入する必要があると当業者は認識していたと認められるところ（必要ならば、「日本内科学会雑誌」（２００８年）Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．６，ｐｐ．１３４１−１３４７における「２．体細胞の初期化」、「３．ｉＰＳ細胞株の樹立」の項、「ファルマシア」（２００８年）Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１０４７−１０５１における「４　ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）の開発」の項を参照。）、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に作用させるだけで、多能性を有するように体細胞の性質を変化させることが可能であることが技術常識であったとはいえない。そして、明細書のその他の箇所にも、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に作用させることのみで、体細胞において多能性を誘導できることが合理的に推認できるような技術常識の説明もされていない。
　以上に鑑みると、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」のようなＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが単独で、体細胞において多能性を誘導できるか否か、すなわち、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といったごく限られた種類の細胞のみが有する極めて特異な性質である三胚葉性の分化能を有する状態へと戻すことができるか否かは、実験的に確認をしてみなくてはわからないというべきである。すなわち、発明の詳細な説明において、実験的な確認がなされていなければ、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが単独で体細胞において多能性を誘導できることを、当業者が認識することはできないというべきである。
　そこで、明細書の実施例の記載をみると、上記（４）で摘記したとおり、ＭＵＣ＊は繊維芽細胞のクローン成長を促進すること（実施例１）、抗ＭＵＣ１＊　Ｆａｂはトラスツマブ抵抗性細胞においてＴＡＸＯＬによる細胞死に対する抵抗性を遮断すること（実施例２）、ＭＵＣ１＊は成長因子受容体として働き、抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３を用いたその細胞外ドメインの二量化によって活性化されること（実施例３）、ＮＭ２３はＭＵＣ１＊の細胞外ドメインから構成されるＰＳＭＧＦＲペプチドに特異的に結合すること（実施例４）、ＭＵＣ１＊成長因子受容体及びＮＭ２３は未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）上に存在するが、分化ｈＥＳＣ上には存在しないこと（実施例５）、ＭＵＣ１＊は多能性（ＯＣＴ４陽性）幹細胞の成長を媒介すること（実施例６）、二量化リガンド（抗ＭＵＣ１＊）を用いたＭＵＣ１＊の刺激は幹細胞成長を増進する一方、抗ＭＵＣ１＊　ＦａｂによるＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの遮断は全幹細胞死をもたらすこと（実施例７）、ＭＵＣ１＊リガンド（二価抗ＭＵＣ１＊抗体、ＮＭ２３、ＮＭ２３変異体）は、正常増殖培地（馴化培地＋ｂＦＧＦ）と比べて、最少培地における多能性コロニーの成長をより良く刺激すること（実施例８）、ＭＵＣ１＊をトランスフェクトしたＨＣＴ−１１６細胞においてＭＵＣ１＊は細胞の核に移行すること（実施例９）、及び、ヒト胚性幹細胞においてＭＵＣ１＊は核に移行すること（実施例１０）について、実際に実験を行ったことやそれらの具体的な実験結果（図１〜６、段落【００５６】の表１）が示されているが、そのいずれも、既に同定されたものを加えることなく、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」のようなＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に対して作用させることのみで、多能性を誘導できることを示すものではない。
　また、実施例１１には、「中核となる」多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４を用いた新規のｉＰＳ株の樹立において、多能性の誘導は、初めにｐ５３を小分子Ｎｕｔｌｉｎによって阻害し、次いでＭＵＣ１＊を導入することで増進されること（段落【００６１】）、中核となる多能性遺伝子を皮膚線維芽細胞にトランスフェクトしたこと（段落【００６２】）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は関連因子の添加によって、中核となる多能性因子の一部又は全部が除外され得ることも予想されること（段落【００６２】）が記載されているが、皮膚線維芽細胞のような体細胞において多能性を誘導する際に、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」の添加によって、中核となる多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４の全部が除外されること、すなわち、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」のようなＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが、中核となる多能性遺伝子を要することなく単独で、体細胞において多能性を誘導することを具体的に裏付ける実験結果は何ら示されていない。
　さらに、実施例１２には、ｃ−Ｍｙｃは多能性の誘導を増進すること、ＮＭ２３はｃ−Ｍｙｃの転写を誘導することが既に報告されていることをふまえて、ＮＭ２３の野生型又は突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加すること、ｉＰＳ細胞生成の効率が増進されること（段落【００６５】）が記載されているが、そもそも、ＮＭ２３の野生型又は突然変異体が単独で、すなわち、既に同定された多能性因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４のトランスフェクトを要することなく、体細胞において多能性を誘導することを記載するものではないし、また、その具体的な実験結果も何ら示されていない。
　そして、実施例１３は、単に、皮膚繊維芽細胞を用いた、ＭＵＣ１＊関連因子を含む、新たな中核となる多能性因子を同定する手法について記載するものにすぎない。
　以上のとおり、発明の詳細な説明には、上記「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」を単独で体細胞に接触させることのみで、体細胞において多能性を誘導することを実験的に確認したことついて、何ら具体的に記載されていない。したがって、本願明細書に上記本願発明の課題が解決できたことが具体的に記載されているとは認められない。
　したがって、発明の詳細な説明には、請求項１に記載の上記「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」が、上記課題が解決できることを当業者が認識できるように記載されているとは認めることができないから、本願は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。
　また、多能性、すなわち、三胚葉性の分化能は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といったごく限られた種類の細胞のみが有する極めて特異な性質であるから、具体的なデータによる実証がなくては当業者が発明を理解できる程度に開示されているということはできないため、発明の詳細な説明は、請求項１に記載の上記「ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」を単独で用いる場合について、本願発明に係る方法を実施することができる程度に明確かつ十分に記載したものとは認められないから、本願は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。
３　請求人の主張に対して
　令和１年１０月１８日付け審判請求書において、請求人は、概略、以下の点を主張する。
　「以下の（ａ）〜（ｄ）の事項をふまえれば、本願発明の詳細な説明には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃの、量、発現若しくは活性における増加を起こす核酸でトランスフェクトされていない線維芽細胞等の出発細胞から、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種によって多能性幹細胞を誘導することが記載されているといえる。
（ａ）本願発明の詳細な説明には、実際の実験結果を伴う実施例の記載として、胚性幹細胞の培養に二価抗ＭＵＣ１＊抗体を添加して無添加のＯｃｔ４染色細胞と二価抗ＭＵＣ１＊抗体添加での抗ＭＵＣ１＊抗体染色細胞を比較したこと、胚性幹細胞の培養にＮＭ２３を添加したコロニーの結果があり、上記実験結果により、二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３を胚性幹細胞と接触させることにより、胚性幹細胞において多能性を維持することが本願発明の詳細な説明において開示されている。
（ｂ）本願発明の詳細な説明の実施例１１および１２には、ＭＵＣ１＊、ＮＭ２３がｉＰＳ細胞を生成する効率を増大させることが記載されており、特に、実施例１２には、ＮＭ２３の野生型又は突然変異体を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加すると、ｉＰＳ細胞生成の効率が増進されたことが記載されている。
（ｃ）本願発明の詳細な説明には、ＮＭ２３等ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種が、ｉＰＳ細胞生成を誘導するために、単独で使用されること、及び、以前に同定された多能性誘導因子、すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃを置き換えることができることが明記されている（［０００８］、［００２８］、［００３０］、［００３２］、［００３４］、［００３５］、［００３８］）。
（ｄ）「本願発明の詳細な説明には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃの、量、発現若しくは活性における増加を起こす核酸でトランスフェクトされていない線維芽細胞等の出発細胞から、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種によって多能性幹細胞を誘導することが記載されている」ことを支持するデータとしては、ヒト線維芽細胞に二量体形態のNM23-S120Gを接触させることにより、ヒト線維芽細胞から幹様形態のコロニーを生産・誘導されることについて記載されている特表特表２０１６−５０２３９９（特に、明細書段落０１７８）が挙げられる。当該実験データは本願出願後に開示されたものであるものの、当該実験データを導き出す実験手法自体は本願明細書に記載の方法および／または本願出願時の技術常識により当業者が容易に採用することが可能なものであり、出願時に行われた実験結果自体が変わるものではない。」
　まず、発明の詳細な説明における上記（ａ）〜（ｃ）の事項はいずれも、上記「二価抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３」のようなＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが単独で、体細胞において多能性を誘導できることの根拠（作用機序等）について記載するものではなく、また、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に作用させて、多能性を有するように体細胞の性質を変化させることが可能であることが技術常識であることを記載するものではなく、さらに、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものを単独で体細胞に作用させることのみで、体細胞において多能性を誘導できることが合理的に推認できるような技術常識を説明するものでもない。そして、上記２に記載したとおり、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが単独で体細胞において多能性を誘導できることを当業者が認識することができるためには、発明の詳細な説明において実験的な確認がなされていることについての記載を要するが、上記（ａ）〜（ｃ）の事項はいずれも、ＭＵＣ１＊の二量体化を増加させることによりＭＵＣ１＊活性を増大させる機能を有するものが単独で体細胞において多能性を誘導することについての実験的な確認には当たらない。
　また、上記（ｄ）の事項について、特許法第３６条第６項第１号は、特許請求の範囲の記載が適合するものでなければならない要件として、「特許を受けようとする発明が発明の詳細な説明に記載したものであること。」（サポート要件）を規定しており、そして、特許請求の範囲の記載が、同要件に適合するか否かは、
特許請求の範囲と明細書の発明の詳細な説明とを対比し、特許請求の範囲に記載された発明が、発明の詳細な説明に記載された発明で、発明の詳細な説明の記載により当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か
その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か
　よって、「本願発明の詳細な説明には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃの、量、発現若しくは活性における増加を起こす核酸でトランスフェクトされていない線維芽細胞等の出発細胞から、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種によって多能性幹細胞を誘導することが記載されている」という、請求人の上記主張は採用できない。
第５　むすび
　以上のとおり、本願は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項第１項に規定する要件を満たしていないから、拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。