【事件の表示】
　上記当事者間の特許第５３４３３０３号発明「Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸の製造方法」の特許無効審判事件について、次のとおり審決する。
【結　論】
　特許第５３４３３０３号の明細書、特許請求の範囲を、訂正請求書に添付された訂正明細書、特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項［１〜１１］、１２について訂正することを認める。
　特許第５３４３３０３号の請求項１〜２及び４〜１２に係る発明についての審判請求は成り立たない。
　特許第５３４３３０３号の請求項３に係る発明についての審判請求を却下する。
　審判費用は参加によって生じた費用を含めて、請求人及びその参加人の負担とする。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本件特許第５３４３３０３号に係る出願は、平成１７年１２月２８日（優先権主張　平成１６年１２月２８日、平成１７年９月９日）の出願であって、平成２５年８月２３日に特許権の設定登録がなされたものである。
　本件特許についての無効審判の手続の経緯の概要は以下のとおりである。
平成２９年２月２４日　　審判請求書
平成２９年４月２０日　　手続補正書及び上申書
平成２９年７月７日　　　答弁書及び訂正請求書
平成２９年１０月２日　　弁駁書
平成２９年１１月２日　　参加申請書
平成２９年１２月２５日　参加許否の決定
平成３０年４月１２日　　審理事項通知書
平成３０年５月２２日　　口頭審理陳述要領書（請求人及び被請求人）
平成３０年６月５日　　　口頭審理
平成３０年６月２６日　　上申書（被請求人）
平成３０年９月２７日　　補正許否の決定
　
第２　訂正請求について
１．平成２９年７月７日付け訂正請求（以下、「本件訂正」という。）の内容
　本件訂正における訂正事項は、以下のとおりである。
　
（１）訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１の（ｉｉ）に「１若しくは数個」とあるのを、「１〜５個」に訂正する。
　
（２）訂正事項２
　特許請求の範囲の請求項２に「４２４位及び／または４３７位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である」とあるのを、「４２４位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換し、及び／または４３７位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換する変異である」に訂正する。
　
（３）訂正事項３
　特許請求の範囲の請求項３を削除する。
　
（４）訂正事項４
　特許請求の範囲の請求項４に「前記（ｉｉ）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニン及び／または１１１位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異である、請求項１に記載のコリネ型細菌」とあるのを、「Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニンをスレオニンに、及び／または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌」に訂正する。
　
（５）訂正事項５
　特許請求の範囲の請求項５に「前記（ｉｉ）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１又は数アミノ酸を挿入する変異である、請求項１に記載のコリネ型細菌」とあるのを、「Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１〜５アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌」に訂正する。
　
（６）訂正事項６
　特許請求の範囲の請求項６に「請求項１〜５」とあるのを、「請求項１、２、４及び５」に訂正する。
　
（７）訂正事項７
　特許請求の範囲の請求項７に「請求項１〜６」とあるのを、「請求項１、２及び４〜６」に訂正する。
　
（８）訂正事項８
　特許請求の範囲の請求項８に「請求項１〜７」とあるのを、「請求項１、２及び４〜７」に訂正する。
　
（９）訂正事項９
　特許請求の範囲の請求項９に「請求項１〜８」とあるのを、「請求項１、２及び４〜８」に訂正する。
　
（１０）訂正事項１０
　特許請求の範囲の請求項１０に「請求項１〜９」とあるのを、「請求項１、２及び４〜９」に訂正する。
　
（１１）訂正事項１１
　特許請求の範囲の請求項１１に「請求項１〜１０」とあるのを、「請求項１、２及び４〜１０」に訂正し、「該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−グルタミン酸を回収する」とあるのを、「該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を回収する」に訂正する。
　
（１２）訂正事項１２
　明細書の段落【００３３】の「配列番号５の塩基配列１４３７−３０３５番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のｙｇｇＢ遺伝子であり、」のうち、「ＡＴＣＣ１３０３２株」を「ＡＴＣＣ１３８６９株」に訂正する。
　
２．訂正請求の適否
（１）一群の請求項について
　訂正事項１〜１１に係る訂正前の請求項１〜１１について、請求項２〜５は請求項１を引用し、請求項６〜１１はそれぞれ請求項１〜５、請求項１〜６、請求項１〜７、請求項１〜８、請求項１〜９及び請求項１〜１０を引用するものであって、訂正事項１により訂正される請求項１に連動して訂正されるものであるから、訂正前の請求項１〜１１に対応する訂正後の請求項１〜１１は、特許法第１３４条の２第３項に規定する一群の請求項である。
　
（２）訂正事項１
　訂正前の請求項１では、（ｉｉ）の置換、欠失、又は挿入されるアミノ酸の個数として「１若しくは数個」と特定していたのを「１〜５個」と限定するものであるから、訂正事項１は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、願書に添付した明細書の段落【００７３】には、訂正前の請求項１に記載の「配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域における１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入」について、「数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個を意味する」と記載されているから、訂正事項１は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項１は、ｙｇｇＢ遺伝子における変異の際に置換されるアミノ酸の個数を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項１に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項１に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項１に関して、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。
　
（３）訂正事項２
　訂正前の請求項２では、４２４位及び４３７位のプロリンを置換するアミノ酸として「他のアミノ酸」とあるのを、それぞれ「アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸」及び「スレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項２は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、願書に添付した明細書の段落【００７２】には、４２４位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異について「４２４番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換されることが望ましく」と記載されており、４３７位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異について「４３７番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）に置換することが望ましく」と記載されているから、訂正事項２は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　訂正事項２は、ｙｇｇＢ遺伝子における変異後のアミノ酸を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項２に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項２に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項２に関して、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。
　
（４）訂正事項３
　訂正事項３は、訂正前の請求項３を削除するものであるから、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項３は、請求項の削除であるから、明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項３は、請求項の削除を目的とするものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　
（５）訂正事項４
　訂正事項４は、訂正前の請求項４が訂正前の請求項１を引用する記載であったものを、請求項間の引用関係を解消し、請求項１の記載を引用しないものとし、独立請求項へ改めるための訂正であって、特許法第１３４条の２第１項ただし書第４号に規定する「他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること」を目的とするものである。
　また、訂正前の請求項４では、１００位及び１１１位のアラニンを置換するアミノ酸として「他のアミノ酸」とあるのを、それぞれ「スレオニン」及び「スレオニンもしくはバリン」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項４は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項４は、他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとするものであり、また、願書に添付した明細書の段落【００７５】には、１００位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異については「スレオニン残基に置換されていることが望ましい」と記載されており、願書に添付した明細書の段落【００７６】には、１１１位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異について「中でも分岐鎖アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン）、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン、セリン、チロシン）、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい」と記載されているから、訂正事項４は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項４は、ｙｇｇＢ遺伝子における変異後のアミノ酸を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項４に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項４に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項４に関して、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。
　
（６）訂正事項５
　訂正事項５は、訂正前の請求項５が訂正前の請求項１を引用する記載であったものを、請求項間の引用関係を解消し、請求項１の記載を引用しないものとし、独立請求項へ改めるための訂正であって、特許法第１３４条の２第１項ただし書第４号に規定する「他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること」を目的とするものである。
　また、訂正前の請求項５では、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に挿入されるアミノ酸の数が「１又は数アミノ酸」であるのを、「１〜５アミノ酸」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項５は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項５は、他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとするものであり、また、願書に添付した明細書の段落【００７３】には、訂正前の請求項５が引用する訂正前の請求項１における（ｉｉ）に記載の変異について、「数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個を意味する」と記載されているから、訂正事項５は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項５は、ｙｇｇＢ遺伝子における変異するアミノ酸の個数を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項５に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項５に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項５に関して、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。
　
（７）訂正事項６〜１０
　訂正事項６〜１０は、訂正前の請求項６〜１０が、請求項３を含む他の請求項を引用する記載であったところ、請求項３を削除したことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項６〜１０は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、訂正事項６〜１０は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項６〜１０は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項６〜１０に関して、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。
　
（８）訂正事項１１
　訂正事項１１は、訂正前の請求項１１が、請求項３を含む他の請求項を引用する記載であったところ、請求項３を削除したことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　訂正前の請求項１１では、「該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−グルタミン酸を回収する」とあり、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」と択一的に記載されていたものから、「該培地中に」、「該培地から」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項１１は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項１１は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、また、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」との択一的記載から、「該培地中に」、「該培地から」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項１１は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項１１は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、また、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」と択一的に記載されていたものから、「該培地中に」、「該培地から」に限定するものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項について無効審判の請求の対象とされているので、特許法特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は課されない。
　
（９）訂正事項１２
　願書に最初に添付した明細書の段落【００３３】には、「配列番号５の塩基配列１４３７−３０３５番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のｙｇｇＢ遺伝子」と記載され、また、「配列番号８３の塩基配列５０１−２０９９番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＣ＿００３４５０として登録されているゲノム配列中の塩基番号１３３６０９２−１３３７６９３にコードされており、ＮＣｇｌ　１２２１として登録されている（ＮＰ＿６００４９２．　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｓｍａｌｌ−ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ．．．［ｇｉ：１９５５２４９０］）。」と記載され、配列番号５と配列番号８３の塩基配列が何れもＡＴＣＣ１３０３２株の配列とされているが、両配列が重なる１４３７〜２０９９番目を比較すると配列番号５と配列番号８３とで一致しないので、何れかが誤記であることがわかる。
　両配列とＮＣｇｌ　１２２１の配列を比較すると、配列番号８３が、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の配列であることは明らかであるから、配列番号５がＡＴＣＣ１３０３２株である旨の記載が誤記であることは明らかであり、さらに、願書に最初に添付した明細書の段落【０１０３】には、配列番号５のｙｇｇＢ遺伝子を保有するコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株名の説明として「ＡＴＣＣ１３８６９株」との記載があることから、段落【００３３】に記載された配列番号５が「ＡＴＣＣ１３０３２株」である旨の記載が誤記であり、正しくは、「ＡＴＣＣ１３８６９株」であることは明らかである。
　したがって、訂正事項１２は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第２号に規定する誤記又は誤訳の訂正を目的とするものである。
　また、訂正事項１２は、願書に最初に添付した明細書の段落【０１０３】に記載されている配列番号５の遺伝子を有する正しいコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株名の記載に基づいて誤記を訂正するものであるから、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第５項に適合するものである。
　さらに、訂正事項１２は、明細書中の誤記を訂正するためのものであるから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１３４条の２第９項で準用する同法第１２６条第６項に適合するものである。
　本件特許無効審判事件においては、すべての請求項について無効審判の請求の対象とされているので、特許法第１３４条の２第９項で読み替えて準用する同法第１２６条第７項の独立特許要件は課されない。
　
３．訂正請求に対する結論
　以上のとおり、本件訂正は、特許法第１３４条の２第１項ただし書第１号、第２号及び第４号に掲げる事項を目的とするものであり、同法同条第９項で準用する同法第１２６条第５項及び第６項に適合するものである。
　よって、本件訂正を認める。
　
第３　本件訂正発明
　本件訂正により訂正された請求項１〜２及び４〜１２は、訂正明細書、訂正特許請求の範囲の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項１〜２及び４〜１２に記載された次のとおりのものである（以下、それぞれ「本件訂正発明１」〜「本件訂正発明２」及び「本件訂正発明４」〜「本件訂正発明１２」という。）。なお、請求項３は削除された。
　
　「【請求項１】Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
　　前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は、（ｉ）、（ｉ’）、（ｉ’’）または（ｉｉ）の変異が導入された、コリネ型細菌：
　　（ｉ）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域の欠失、
　　（ｉ’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、
　　（ｉ’’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、
または
　　（ｉｉ）配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域における１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入。
【請求項２】前記（ｉ’’）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、４２４位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換し、及び／または４３７位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換する変異である、請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項３】（削除）
【請求項４】Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニンをスレオニンに、及び／または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌。
【請求項５】Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１〜５アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌。
【請求項６】前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が、下記（ａ）〜（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子である請求項１、２、４及び５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：
　　（ａ）　配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｂ）　配列番号８のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｃ）　配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｄ）　配列番号２０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｅ）　配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｆ）　配列番号２２のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｇ）　配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｈ）　配列番号２４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｉ）　配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｊ）　配列番号６４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｋ）　配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｌ）　配列番号７０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｍ）　配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｎ）　配列番号７４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
【請求項７】前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により、Ｌ−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項１、２及び４〜６のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項８】さらに（ｉ）のｓｙｍＡ遺伝子が不活化するように改変された、請求項１、２及び４〜７のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
（ｉ）　配列番号８６の塩基番号５８５〜１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項９】さらにα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項１、２及び４〜８のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１０】コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項１、２及び４〜９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】請求項１、２及び４〜１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項１２】下記（ａ）〜（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子：
　　（ａ）　配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｂ）　配列番号８のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｃ）　配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｄ）　配列番号２０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｅ）　配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｆ）　配列番号２２のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｇ）　配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｈ）　配列番号２４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｉ）　配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｊ）　配列番号６４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｋ）　配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｌ）　配列番号７０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｍ）　配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｎ）　配列番号７４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。」
　
第４　当事者の主張の概要
１．請求人の主張
　請求人は、本件特許第５３４３３０３号を無効とする、審判費用は被請求人の負担とする、との審決を求め、以下のように主張したが、平成３０年５月２２日付け口頭審理陳述要領書において無効理由１及び２を取り下げたので、審理の対象となるのは無効理由３、４、５及び６である。
　
（無効理由１）本件特許の請求項１、３、７、１０〜１１に係る発明は、甲第２６号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができないものである。
　
（無効理由２）本件特許の請求項７、９に係る発明は、甲第２６号証または甲第２６号証及び甲第２号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。
　
（無効理由３）本件訂正発明１、４、６〜７、９〜１２は、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証等に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。
　
（無効理由４）本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１〜２、４〜７、１０〜１２の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているとはいえないから、本件発明の詳細な説明の記載は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていないものである。
　
（無効理由５）本件訂正発明１〜２、４〜７、１０〜１２は、発明の詳細な説明に記載されたものとはいえないから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていないものである。
　
（無効理由６）本件訂正発明６〜１２は、明確に記載されているとはいえないから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たしていないものである。
　
　そして、請求人が提出した証拠方法は、以下のとおりである。
　甲第１号証：特許第５３４３３０３号公報
　甲第２号証：国際公開第９５／３４６７２号
　甲第３号証：特開昭６１−２６８１８５号公報
　甲第４号証：特開昭６２−２０１５８５号公報
　甲第５号証：化学大辞典（縮刷版第３２刷）（１９８９）ｐ．２６８−２７１
　甲第６号証：生化学辞典（第３版）（１９９８）ｐ．８５８
　甲第７号証：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（２００２）１５（１），ｐ．２９−３３
　甲第８号証：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７，ｐ．５７２−５８０
　甲第９号証：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７（３１），ｐ．２７６８２−２７６８８
　甲第１０号証：ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００３），２１８，ｐ．３０５−３０９
　甲第１１号証：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／１０１９２５１？ｒｅｐｏｒｔ＝ｆｕｌｌ＿ｒｅｐｏｒｔ＆ｆｏｒｍａｔ＝ｔｅｘｔ）
　甲第１２号証：Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇ．（１９９９）１，ｐ．２５５−２６１
　甲第１３号証：Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８（２２），ｐ．１５８２−１５８７
　甲第１４号証：ＥＭＢＯ　Ｊ．（２００３）２２（１），ｐ．３６−４６
　甲第１５号証：Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊ．（２００４．Ｎｏｖ．）８７，ｐ．３０５０−３０６５
　甲第１６号証：Ｃｌｕｓｔａｌｗ　Ｒｅｓｕｌｔ　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）Ｃｇｌ１２７０と，本件特許の配列番号８４及び８５とのアミノ酸配列のアラインメント
　甲第１７号証：特表２００２−５０８９２１号公報
　甲第１８号証：特開昭６２−１６６８９０号公報
　甲第１９号証：特開昭６３−２１４１８９号公報
　甲第２０号証：特開２００４−３１３２０２号公報
　甲第２１号証：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８６）２５，ｐ．２２０−２２３
　甲第２２号証：Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９６）５１，ｐ．４０−５０
　甲第２３号証：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６），６２（１２），ｐ．４３４５−４３５１
　甲第２４号証：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０（１），ｐ．１２６−１３２
　甲第２５号証の１：国際公開第２００３／０４６１２３号
　甲第２５号証の２：米国特許出願公開第２００５／０００３４９４号明細書
　甲第２６号証：欧州特許出願公開第１１０８７９０号明細書
　甲第２７号証：Ｃｌｕｓｔａｌｗ　Ｒｅｓｕｌｔ　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）甲第２６号証の配列番号４９０１と本件特許の配列番号８４及び８５とのアミノ酸配列のアラインメント
　甲第２８号証：実験報告書
　甲第２９号証：生化学辞典（第３版）（１９９８）ｐ．１２１７
　甲第３０号証：特開昭６３−２１４１８９号公報
　甲第３１号証：Ｃｌｕｓｔａｌｗ　Ｒｅｓｕｌｔ　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）Ｃｇ１１２７０によりコードされるアミノ酸配列と配列番号２２及び配列番号２４のアミノ酸配列のアライメント
　甲第３２号証：Ｃｌｕｓｔａｌｗ　Ｒｅｓｕｌｔ　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）大腸菌由来ｙｇｇＢ及びコリネ型細菌由来ｙｇｇＢのＴＭ３領域のアミノ酸配列のアライメント
　甲第３３号証：Ｃｌｕｓｔａｌｗ　Ｒｅｓｕｌｔ　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）本件特許の配列番号８４及び配列番号６とのアミノ酸配列のアライメント
　甲第３４号証：実験報告書
　甲第３５号証：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（２００２）２（３），ｐ．１５１−１５６
　
２．被請求人の主張
　被請求人は、本件無効審判請求は成り立たない、審判費用は請求人の負担とする、との審決を求め、請求人の主張する無効理由及び証拠によっては、本件訂正発明を無効にすることはできないと主張した。
　
　そして、被請求人の提出した証拠方法は以下のとおりである。
　乙第１号証：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１３）７７（５），ｐ．１００８−１０１３
　乙第２号証：化学と生物（２０１２）５０（６），ｐ．４４１−４４９
　乙第３号証：中森茂著「アミノ酸発酵技術の系統化調査」『技術の系統化調査報告　第１１集』（独立行政法人国立科学博物館産業技術史資料情報センター編集）（２００８）ｐ．５８、６６、７４
　乙第４号証：Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７）７３（１４），ｐ．４４９１−４４９８
　乙第５号証：Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２８（６），ｐ．３３３−３３７
　乙第６号証：実験成績証明書「Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９−１９のグルタミン酸生産能の評価、および１９型ＹｇｇＢ変異の評価」
　乙第７号証：真野佳博＝川向誠編著『ポイントがわかる分子生物学第２版』（２０１０年）ｐ．２−３、１８−１９
　乙第８号証：社団法人日本化学会編『標準化学用語辞典』（１９９８）ｐ．５７１
　乙第９号証：日本光合成学会のウェブサイトの光合成事典の「グリシンベタイン」の項のプリントアウト（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｏｔｏｓｙｎ．ｊｐ／ｐｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？％Ｅ３％８２％Ｂ０％Ｅ３％８３％ＡＡ％Ｅ３％８２％Ｂ７％Ｅ３％８３％Ｂ３％Ｅ３％８３％９９％Ｅ３％８２％ＢＦ％Ｅ３％８２％Ａ４％Ｅ３％８３％Ｂ３）
　乙第１０号証：相川直樹ら編集『医学大辞典１９版』（２００６）ｐ．６４１
　乙第１１号証：『１４９０６の化学商品』（２００６）ｐ．１６１４、１６４５
　乙第１２号証：「第III部第２章第４節　特定の表現を有する請求項等についての取扱い」『特許・実用新案審査基準』ｐ．１−２
　乙第１３号証：日本農芸化学会誌（１９４９）２３（１０），ｐ．４２６−４２９
　乙第１４号証：Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著『発酵工学の基礎』（１９９２）ｐ．１６９−１７２、１８９−１９０
　乙第１５号証：相田浩ら編『アミノ酸発酵』、明石邦彦ら著「１．酸素及び炭酸ガスの効果」（１９８６）ｐ．１２７−１４４
　乙第１６号証：東京大学農学部農芸化学教室編『実験農芸化学下第３版』（１９８０）ｐ．２０１−２０３
　乙第１７号証：「坂口フラスコと振盪培養機」と題した有限会社いわしやバイオサイエンスのウェブサイトのプリントアウト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｗａｓｈｉｙａｂｉｏ．ｃｏｍ／ｎｅｗｐａｇｅ０３．ｈｔｍｌ）
　乙第１８号証：「容器形状や振とうの速度・振幅と培養効率について」と題したタイテック株式会社のウェブサイトのプリントアウト（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｉｔｅｃ．　ｎｅｔ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１７／０５／ＡＤＳ０２５＿ＢＲｓ＿０４＿Ｋ０１．ｐｄｆ）
　乙第１９号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３（４），ｐ．９１７−９２１
　乙第２０号証：『南山堂　医学大辞典』（２００８）ｐ．１８５１、２２８０
　乙第２１号証：Ｇ．Ｅ．Ｓｃｈｕｌｚ，Ｒ．Ｈ．Ｓｃｉｒｍｅｒ共著『タンパク質　構造・機能・進化』（１９８７）ｐ．１９−２９
　乙第２２号証の１：「第２章生命の化学的基礎」と題した東京医科歯科大学のウェブサイトのプリントアウト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍｄ．ａｃ．ｊｐ／ａｒｔｓｃｉ／ｂｉｏｌ／ｔｅｘｔｉｎｔｒｏ／Ｃｈａｐｔ２．ｈｔｍ＃ｔｏｐ）
　乙第２２号証の２：「生物学基礎」と題した東京医科歯科大学のウェブサイトのプリントアウト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍｄ．ａｃ．ｊｐ／ａｒｔｓｃｉ／ｂｉｏｌ／ｔｅｘｔｉｎｔｒｏ／ｉｎｔｒｏｔｏｐ．ｈｔｍ）
　乙第２３号証：宮田隆著「分子進化学の基礎」物性研究（２００３）８１（１），ｐ．５３−５９
　乙第２４号証：「アミノ酸の製法について」と題した被請求人ウェブサイトのプリントアウト（ｈｔｔｐｓ／／ｗｗｗ．ａｊｉｎｏｍｏｔｏ．ｃｏ．ｊｐ／ａｍｉｎｏ／ｍａｎａｂｏｕ／ｓｅｉｈｏｕ．ｈｔｍｌ）
　乙第２５号証：岡田弘著『グルタミン酸製造技術の変遷』化学工業（１９８４）ｐ．７６−８１
　乙第２６号証：特許第６１９６０３４号公報
　
第５　甲号証の記載事項
　甲第８、２〜４、７、９〜１０、１２〜１５、１７〜２４号証、甲第２５号証の１、甲第３０、３５号証には、以下の事項が記載されている（英語で記載されている証拠は、日本語訳で摘記する。）。
　
１．甲第８号証
（甲８−１）「細菌は、低浸透圧ストレスに対して、低分子量の溶質を遊離し、一定の膨脹圧を維持することによって応答する。我々は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、浸透圧の突然の低下による様々な溶質の排出に関わる、浸透圧調節チャネルの機能を研究している。当該チャネルは、グリシンベタイン及びプロリンのような相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子、例えば、グルタミン酸又はリジンの遊離は、制限され、ＡＴＰは、厳しい浸透圧ショックの後であっても、完全に維持された。」（第５７２頁、要約第１行〜第６行）
　
（甲８−２）「これらの結果は、大腸菌のメカノセンシティブチャネルに類似の浸透圧調節チャネルが、Ｃ．グルタミカムに存在することを示唆する。」（第５７２頁、要約第１３行〜第１４行）
　
（甲８−３）「表１．Ｃ．グルタミカムでの低浸透圧ショック後の溶質排出の特異性。標識又は非標識の相溶性の溶質（グリシンベタイン、プロリン、エクトイン）の蓄積により、あるいはジペプチド（リジン、アラニン）の添加により、高浸透圧条件下（それぞれ１８６０ｍＯｓｍ及び２１００ｍＯｓｍ）で細胞を溶質に負荷した。細胞は、表に示したように希釈した。シリコンオイルの上清及びペレットにおける低浸透圧ショックの１分後、シンチレーションカウンティング（ｓｃ．ｃｏｕｎｔ．）、ＨＰＬＣ、酵素アッセイ、ＮＭＲ、ルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ、又はフレームフォトメトリー（ｆｌａｍｅ　ｐｈ．）を用いて排出を測定した。値はμｍｏｌ・ｍｇｄｍ−１で示す、なぜなら、変化した細胞質体積に基づく真の内部濃度への補正は、総変化の結果のミスリーディングを起こすためである。すべての値は、少なくとも３回の実験の平均である。等モル希釈及び５４０ｍＯｓｍに対する低浸透圧ショックのそれぞれに関し、残存した溶質の相対値を示す。
ａグリシンベタイン（３ｍＭ）及びエクトイン（３ｍＭ）を同時に負荷。
ｂＡＴＰの排出は、細胞質のＡＴＰ総量の２％を超えなかった。
ｃＮａ＋及びＫ＋の場合、浸透圧のステップは２１００、１１４０、８２０、４２０ｍＯｓｍとした。
ｄ２ｍＭグリシンペタインの存在下で負荷し、競合状態を作出（本文を参照）。」（第５７５頁、表１）
　
（甲８−４）「土壌細菌として、Ｃ．グルタミカムは、頻繁に起こる緊急事態、即ち、低浸透圧ショックに対して応答する効率的なメカニズムを装備している。浸透圧変化に由来する膜に作用する機械的ストレスは、細胞サイズの有意な変化を定量することにより明らかにされた。我々が研究してきた排出システムは、大腸菌及びＬ．プランタルムにおいて以前記載したメカノセンシティブチャネル（Ｂｅｒｒｉｅｒら、１９９２；Ｓｃｈｌｅｖｅｒら、１９９３；Ｇｌａａｓｋｅｒら、１９９６）と定性的に類似する方法で低浸透圧ショックに応答する。しかしながら、Ｃ．グルタミカムのチャネルは、運搬の特異性と排出活性の制御に関して、いくつかの特異的性質を示す。」（第５７８頁左欄第３７行〜第４９行）
　
（甲８−５）「非特異的チャネル阻害剤Ｇｄ３＋に対するこのチャネルの感受性の欠如は（Ｂｅｒｒｉｅｒら、１９９２；Ｓｃｈｌｅｖｅｒら、１９９３；Ｈａｓｅら、１９９５）、大腸菌において記載されクローン化されたＧｄ３＋感受性ＭｓｃＬチャネルとは異なるものとして、それをさらに定義する（Ｓｕｋｈａｒｅｖら、１９９４）。しかしながら、この非特異的遮蔽剤が作用しないその他の例も存在する（Ｂｅｒｒｉｅｒら、１９９６）。したがって、Ｃ．グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、ＭｓｃＳと類似するかもしれない（Ｍａｒｔｉｎａｃら、１９８７、１９９０；ＺｏｒａｔｔｉとＰｅｔｒｏｎｉｌｌｉ、１９８８；Ｂｅｒｒｉｅｒら、、１９９６）。」（第５７８頁右欄第４６行〜第５５行）
　
２．甲第２号証
（甲２−１）「α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌、この細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法、及びコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来するα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子、この遺伝子を含む組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌、及び前記組換えＤＮＡを保持し、Ｌ−リジン生産能を有する細菌を用いたＬ−リジンの製造法を開示する。」（要約）
　
（甲２−２）「従来よりＬ−グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生産されている。」（第１頁第１３行〜第１４行）
　
（甲２−３）「コリネ型Ｌ一グルタミン酸生産菌のα―ＫＧＤΗ活性のレベルがＬ−グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、薬剤遺伝子の挿入等によるα―ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取得、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型Ｌ一グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ―グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。」（第３３頁下から第６行〜最終行）
　
（甲２−４）「２．請求項１記載のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。」（請求項２）
　
３．甲第３号証
（甲３−１）「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られている。」（第２頁右上欄第８行〜第１０行）
　
（甲３−２）「工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌に所望の物質を大量に効率よく生産させるために、その細菌のＤＮＡ組換え技術による育種改良が試みられている。」（第２頁右上欄第１４行〜第１７行）
　
４．甲第４号証
（甲４−１）「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られている。」（第２頁右上欄第８行〜第９行）
　
（甲４−２）「工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌について、ＤＮＡ組換技術による育種改良が試みられている。」（第２頁右上欄第１４行〜第１６行）
　
５．甲第７号証
（甲７−１）「エタノールの産業的生産（例えば、醸造、燃料エタノール生産）において、澱粉の発酵可能な糖への変換は、典型的に６５−７３℃で起こるため、α―グルコシダーゼの熱安定性は重要である。本件研究では、我々は、４つの植物種由来のα―グルコシダーゼの熱安定性を調査し、それらの推定アミノ酸配列を比較し、そして、野生型酵素に存在する残基のプロリンへの置換による、α−グルコシダーゼの熱安定性への影響を試験した。大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）由来のα−グルコシダーゼは、その他３つのα−グルコシダーゼよりも顕著に熱に不安定であった。これら４つのα−グルコシダーゼの公開された推定アミノ酸配列の比較により、大麦の酵素には見られない、最も熱に安定な３つのα−グルコシダーゼにおいて保存されたプロリン残基を明らかにした。部位特異的変異を組換え大麦α−グルコシダーゼに行い、これらの保存された位置でプロリンを有するタンパク質を作成した。これらの変異タンパク質の一つ、Ｔ３４０Ｐの熱安定性（Ｔ５０）は、非変異酵素より１０℃高かった。」（第２９頁、要約）
　
（甲７−２）「
図３．ｐＨ６．０での、組換え大麦α−グルコシダーゼ（ｒＡＧＬ，四角）、Ｔ３４０Ｐ変異酵素（三角）、及びＡ７４２Ｐ変異酵素（円）の活性における温度の影響。０〜６０℃の範囲の温度、ｐＨ６で、ｒＡＧＬ、Ｔ３４０Ｐ、及びＡ７４２Ｐを１０分インキュベートした。マルトース加水分解の残存速度を、１８時間、３０℃、ｐＨ４．５でアッセイした。残存活性は、非加熱のコントロールのパーセントに基づく（ｒＡＧＬ＝０．７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、Ｔ３４０Ｐ酵素＝０．９ｎｍｏ１／ｍｉｎ／ｍｌ、Ａ７４２Ｐ酵素＝１．６５ｎｍｏ１／ｍｉｎ／ｍｌ。」（第３１頁、図３）
　
（甲７−３）「プロリン残基は熱安定性に重要なため（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８７；Ｓｕｚｕｋｉら、１９８９）、組換え大麦α−グルコシダーゼにおいて変異を行い、より熱に安定なα−グルコシダーゼに存在する位置にプロリン残基を挿入した。変異を行い、３３６、３４０、及び７４２の位置ヘプロリンを追加した。Ｔ３４０Ｐ及びＡ７４２Ｐはα−グルコシダーゼ活性を有する一方、３３６の位置での変異（Ｒ３３６Ｐ）は、不活性なタンパク質をもたらした（データは示さず）。
　Ｇａｒｎｉｅｒらの理論（Ｇａｒｎｉｅｒら、１９７８）に基づくペプチド構造プログラム（ウィスコンシンＧＣＧパッケージ、ウィスコンシン、マディソン郡）を用いて行った二次構造の推定は、この残基をβ−シートの中に置いたため（表１）、５４７の位置では変異を行わなかった。Ｗａｔａｎａｂｅらによれば、β−シートの中にプロリン残基を挿入すると、酵素の熱安定性は増強されない（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９１）。
　野生型組換え大麦α−グルコシダーゼ（ｒＡＧＬ）、並びにＴ３４０Ｐ及びＡ７４２Ｐ変異酵素の熱安定性プロフィル（ｐＨ６）は、図３に示される。図３に示される、粗抽出物に由来するｒＡＧＬの熱安定性プロフィルは、Ｍｕｓｌｉｎらにより以前に公開された精製ｒＡＧＬの熱安定性プロフィル（Ｍｕｓｌｉｎら、２０００）とほぼ同一であった。実際に、Ｔ５０は、粗酵素で４７．８℃、精製酵素で４７．６℃であった。従って、我々は、本研究で使用するいずれの酵素抽出物は精製を要しないと結論した。Ａ７４２Ｐ酵素は、２０℃のＴ５０を有し、そして４０℃への曝露後は完全に不活性であった。これに対し、Ｔ３４０Ｐ酵素は、最も高い熱安定性を示し、５０℃より高い温度に加熱されるまで活性を低下させなかった。」（第３１頁左欄第６行〜右欄第４行）
　
６．甲第９号証
（甲９−１）「本質的に、すべての生物は機械的な力を検知する。バランス感覚、触覚、及び聴覚は、この能力に依存するヒトでのいくつかのシステムである。微生物も、細胞性エンベロープを介する浸透グラジエントに由来する力を検出しているはずである。これらのシステムの本質的にすべての電気生理学的研究は、これらの力を感知する最も主要なメカニズムの一つとして、メカノセンシティブ（ＭＳ）チャネルを示唆している（ＭＳチャネルのレビューに関し、Ｒｅｆ．１を参照）。」（第２７６８２頁左欄第２６行〜第３４行）
　
７．甲第１０号証
（甲１０−１）「コリネバクテリウム・グルタミカム遺伝子配列におけるデータベースサーチは、大腸菌のメカノセンシティブチャネル、ＭｓｃＬ及びｙｇｇＢのホモログを明らかにした。これら推定チャネルの生理的役割を解明するために、欠損変異体を構築した。ｍｓｃＬ欠失変異体の浸透圧ダウンショックにより誘導されたベタイン排出は、野生型のそれとほとんど同じであったー方、ｙｇｇＢ欠失変異体は排出速度を低下させた。興味深いことに、ベタイン排出能がより一層の低下することが期待された二重欠損株は、野生型と比較してわずかに減少した排出速度を有するのみであり、浸透圧ダウンシフト後の死滅率を増加させなかった。これらの結果は、Ｃ．グルタミカムは、ＭｓｃＬやＹｇｇＢ／ＫｅｆＡファミリーと関係しない、第３のタイプのメカノセンシティブチャネルを有するかもしれないという仮説を導く。更に、二重欠損変異体において検出された高い運搬能のため、ＭｓｃＭ様の活性はベタイン排出に関わりがありそうにない。」（第３０５頁、要約）
　
（甲１０−２）「細胞が外部浸透圧の急激な低下に曝されると、水の流入が膨脹圧の増加を引き起こし、細胞が破壊され得る。応答として、細胞質の溶質がメカノセンシティブチャネルを介して放出され、膨脹圧の急激な低下が達成される。異なる大きさ及び伝導度のメカノセンシティブチャネルの活性は、グラム陰性及びグラム陽性細菌において示された。少なくとも三つのサブファミリー、ＭｓｃＬ、ＭｓｃＳ、及びＭｓｃＭが大腸菌で同定された。」（第３０５頁左欄第１２行〜右欄第２行）
　
（甲１０−３）「２．６．アクセション番号
　Ｃ．グルタミカムのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）におけるのｍｓｃＬ及びｙｇｇＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の番号は、それぞれ、Ｃｇ１０８７９及びＣｇ１１２７０である。」（第３０７頁左欄第８行〜第１１行）
　
（甲１０−４）「これらは、それぞれ大腸菌のｍｓｃＬ及びｙｇｇＢに類似する２つのオープンリーディングフレームを明らかにした。ＭｓｃＬホモログ（１３５アミノ酸残基）は、結核菌のＭｓｃＬと５７％同じアミノ酸を共有し、そして大腸菌のＭｓｃＬと３８％同じアミノ酸を共有し、更にＭｓｃＬファミリーの典型的な構造的特徴を有する。ＹｇｇＢホモログは、５３３アミノ酸を有し、大腸菌のｙｇｇＢ、２つのタンパク質の内部のみで２９％同一アミノ酸が見いだされた、よりも、様々なミコール酸含有放線菌の対応するホモログに対してより高い相同性を示す（〜３６％同一）。」（第３０７頁左欄第１９行〜第３０行）
　
（甲１０−５）「
図１．１５秒（閉じたシンボル、実線）及び６０秒（オープンシンボル、ドット線）後のダウンショックの程度に対する、排出されたベクイン量の依存性。示された浸透圧のバッファーに懸濁する前に、放射標識したベタインに細胞を前もって負荷した。Ａ：野生型；Ｂ：Ｃｇ△ｍｓｃＬ；Ｃ：Ｃｇ△ｙｇｇＢ；及びＤ：Ｃｇ△ｍｓｃＬＡｙｇｇＢ。破線は１５秒（Ａのグラフのリニアフィット）後の野生型の排出速度を表す。」（第３０８頁、図１）
　
８．甲第１２号証
（甲１２−１）「今回の結果によると、グルタミン酸の排出は、Ｃ．グルタミカム２２６２におけるグルタミン酸の過剰生産のための主要な動力学的ボトルネックと考えることができる。遺伝の報告では、アミノ酸の排出は、Ｃ．グルタミカムでのリジン（Ｋｅ１１ｅら、１９９６）、イソロイシン（Ｍｏｒｂａｃｈら、１９９６）、及びスレオニン（Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄら、１９９４）生産のための可能性のある律速ステップとしても推測された。結論として、株又はプロセスの改善に向けられた将来の研究は、細胞のアミノ酸排出能をさらなる増強、ひいてはグルタミン酸の内部蓄積の低減を特に目的とすべきである。」（第２６０頁右欄第２４行〜第３４行）
　
９．甲第１３号証
（甲１３−１）「ＭｓｃＳチャネル、ｙｇｇＢをコードする遺伝子は、Ｂｏｏｔｈとその共同研究者により同定された；」（１５８２頁第１欄第２５行〜第２７行）
　
（甲１３−２）「ＭｓｃＳにおけるＡｌａ１０６に相当する、ホモログタンパク質ＫｅｆＡにおける９２２番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調している。」（第１５８３頁第３欄第１５行〜第１５８４頁第１欄第２行）
　
（甲１３−３）「メカノセンシティビティー。メカノセンシティブチャンネルを同定することにおけるチャレンジの一部に、メカノセンシティビティーに関わる明確な配列モチーフがないことがある；これらチャネルの多様性は、ＭｓｃＳとＭｓｃＬの構造的相同性の欠如によりさらに強調される。しかしながら、ｙｇｇＢ（８）の分析で指摘されるように、両タンパク質での特定の膜貫通ヘリックスは、第４の残基ごとに存在する傾向にある、小さな（Ｇｌｙ及びＡ１ａ）保存された残基のパターンを示す。これらの残基、特にＧ１ｙは、ヘリックスーヘリックスパッキング相互作用（（３６）を参照）に関与し、そして、ＭｓｃＳ及びＭｓｃＬの構造において、それらはポア形成ヘリックスのインターフェース部位で発見された。これらのチャネルは、高いコンダクタンス特性を示し、そして、これは、それらの両方とも、ＭｓｃＬで提案されたように（１５、１８）、クローズ状態とオープン状態の間で、ポア領域において相当なコンフォメーションの再配列を受けることが示唆される。結果として、ポアのヘリックス間のインターフェースでの残基は、クローズ状態及びオープン状態のいずれにおいても、ヘリックスーパッキング相互作用に互換性があるはずである。小さいアミノ酸、特にＧ１ｙ及びＡ１ａは、これらの位置で、コンダクタンス状態間の相互変換を促進し、よって、これら高コンダクタンス、メカノセンシティブチャネルの特徴かもしれない（３７）。」（第１５８６頁第２欄第２２行〜第３欄第１０行）
　
１０．甲第１４号証
（甲１４−１）「大腸菌ＭｓｃＳメカノセンシティブチャネルタンパク質の主な構造的特徴を、アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）融合、正確な欠損及び部位特異的変異を用いて調査した。ＰｈｏＡタンパク質融合データは、ポジティブ−インサイド則と組み合わせて、ＭｓｃＳが膜を３回横断し、Ｎｏｕｔ−Ｃｉｎ構造をとっているというモデルを強く支持する。欠損データは、タンパク質のＣ末端ドメインは、ＭｓｃＳチャネルの安定性に必須であり、一方、タンパク質はＮ末端での小さな欠失を寛容するであろうことを示唆する。ゲイン・オブ・ファンクション（ＧＯＦ）又はロス・オブ・ファンクションのいずれかを示す４つの変異体が同定された：二重変異体Ｉ４８Ｄ／Ｓ４９ＰはＭｓｃＳを不活性化し、一方、ＭｓｃＳ変異体Ｔ９３Ｒ、Ａ１０２Ｐ、及びＬ１０９Ｓは強力なＧＯＦ表現型を引き起こした。ダウンショック生存アッセイにおいて欠失されたＭｓｃＫタンパク質の発現がＭｓｃＬ及びＭｓｃＳに置換できるという証拠により、ＭｓｃＫ（以前はＫｅｆＡ）の少なくとも２つのドメインに対するＭｓｃＳの類似は強化される。機構、保存、及び変異体の影響に関する研究に由来するデータは、ＭｓｃＳチャネルの構造における有意な洞察を提供する。」（第３６頁、要約）
　
（甲１４−２）「大腸菌では、ＭＳチャネル活性の３つの認識されたグループが存在し、それらは、電気的伝導度及び活性化のための圧力闇値に基づいて定義される：ＭｓｃＭ、低圧力により開かれる低（小）チャネル；ＭｓｃＳ、中程度の圧力により開かれる〜１ｎＳチャネル；ＭｓｃＬ、高い伝導度を示し、非常に高い膜張力でのみ開く（Ｂ１ｏｕｎｔら、１９９９；Ｓｕｋｈａｒｅｖ、１９９９）。」（第３６頁右欄第５行〜第１２行）
　
（甲１４−３）「電気生理学的分析により検出された大腸菌のＭｓｃＳ活性は、ＫｅｆＡとＹｇｇＢの合計である（Ｌｅｖｉｎａら、１９９９）。ＹｇｇＢタンパク質は、脂質ベシクルにおいて単独で再構成され、ＭｓｃＳと同じ伝導度で機能的チャネルを形成することが示された（Ｏｋａｄａら、２００２；Ｓｕｋｈａｒｅｖ、２００２）。これに基づいて、ＹｇｇＢはＭｓｃＳに改名すべきであること、そして、類似の伝導度を有するがＫ＋と特異的な相互作用を有するＫｅｆＡはＭｓｃＫと呼ぶべきであることが提案された（Ｌｉら、２００２）。」（第３６頁右欄第３７行〜第４５行）
　
（甲１４−４）「
ＭｓｃＳタンパク質の機構。（Ａ）ＤＮＡＳＴＡＲに適合されたプログラムを用いて作成された大腸菌ＭｓｃＳタンパク質の疎水性プロット（ｗ＝１９残基）。
（Ｄ）ＰｈｏＡデータに基づくＭｓｃＳタンパク質の提案されたトポロジー。シンボル：十、プラスにチャージしたアミノ酸；影を付けた円、提案されたペリプラスムに位置する残基９４。」（第３７頁、図１Ａ、図１Ｄ）
　
（甲１４−５）「これらのデータは、ｐＭｓｃＳＨ６からの非誘導発現に関わる低い濃度で発現させた場合であっても、Ａ１０２Ｐ変異が強いＧＯＦ表現型を引き起こすことを示唆する。」（第４１頁左欄第２５行〜第２８行）
　
（甲１４−６）「最近、Ｂ１ｏｕｎｔとその同僚は、類似の形質を示した残基４０でのＭｓｃＳのＧＯＦ変異体を単離し、この残基はＭｓｃＳにおいて類似の「ロッキング」の役割を果たすことを提案した（Ｏｋａｄａら、２００２）。Ｖ４０Ｋ及びＶ４ＯＤの置換のみが、有意なＧＯＦ表現型を引き起こした。その他の変化、中程度に親水性の残基への変化並びにグリシンへの変化でさえも、寛容された。この研究では、我々は、三つの新たなＭｓｃＳＧＯＦアレル、Ｔ９３Ｒ、Ｌ１０９Ｓ、及びＡ１０２Ｐを同定し、これらはペリプラスミックループ及びＴＭＳ３に存在する。」（第４３頁左欄第１９行〜第２８行）
　
１１．甲第１５号証
（甲１５−１）「周囲環境の様々な刺激に対して保護及び反応する能力は、すべての生物にとり必須である。音、重力、又は浸透圧により発生する機械的な力は、その他の刺激の中で、メカノセンシティブイオンチャネルを含む様々なメカニズムを介して生物により感知される（ＨａｍｉｌｌとＭａｒｔｉｎａｃ、２００１；ＳｕｋｈａｒｅｖとＣｏｒｅｙ、２００４）。これらの膜タンパク質は、機械的刺激の適用により開閉し、したがって、実質的に電気的シグナル（メカノトランスダクション）になる、或いは、単純に、例えば、浸透圧に対する細胞体積の制御又は適合に役立つイオン電流を形成する。」（第３０５０頁左欄第２行〜第１３行）
　
（甲１５−２）「
図１．ＭｓｃＳのホモヘプタマー構造。（Ａ）ＭｓｃＳ結晶構造のカートゥーン表示。各サブユニットは、異なる色で示される。示唆される膜の位置（Ｂａｓｓら、２００２）は影付きのバーとして示される。（Ｂ）７量体構造のサブユニットＢ。このサブユニットは、カートゥーンとリボン表記で示される。膜貫通ドメインは３つのヘリックス（ＴＭ１、ＴＭ２、及びＴＭ３Ａ−ＴＭ３Ｂ）及びより大きな細胞質ドメインにより形成される。ＴＭ３Ａ−ＴＭ３Ｂヘリックスは、残基Ｇｌｙ１１３で顕著にねじれ、膜の細胞質側でポアの最も狭い部分に近づく。（Ｃ）サーフェス及びチューブ表示において示される２つのモノマーの膜貫通ヘリックス。チャージした残基は、空間充填表記で示され、青（＋）及び赤（−）で示される。Ｌｅｕ１０５及びＬｅｕ１０９の位置（空間充填表記により描かれる）は、矢印で示される。（Ｄ）膜貫通ドメインのトップビュー（残基２７−１２８）。ポア残基（９６−１１３）は、サーフェス表記において示される。各サブユニットは、色と文字でラベルされる。１つのサブユニットのＴＭ３Ｂヘリックスは、隣のサブユニットのＴＭ１及びＴＭ２の間のループのちょうど下に位置する。（Ｅ）ＭｓｃＳのサーフェス表記。側面に位置し、底で一つになる７つの細胞質のオープニング。」（第３０５１頁、図１）
　
（甲１５−３）「ランダム変異実験は、いくつかの機能的に関連する残基を同定した。二重変異Ｉ４８Ｄ／Ｓ４９Ｐ（両残基とも、ＴＭ１の細胞質側に位置する、図１Ｂ）はチャネルを不活性化し、一方、Ｔ９３Ｒ、Ｌ１０９Ｓ、Ａ１０２Ｐ、Ｖ４０Ｋ、及びＶ４０Ｄは、ゲイン・オブ・ファンクション表現型として同定された（Ｍｉｌｌｅｒら、２００３ａ；Ｏｋａｄａら、２００２）。９３、１０２、及び１０９の残基がチャネルの伝導特性に影響を与えることは驚くことではないなぜなら、それらはポアを内張りするヘリックス（図１のＴＭ３Ａ）に位置するからである。」（第３０５１頁右欄第３行〜第３０５２頁左欄第１行）
　
（甲１５−４）「
図６．（Ａ）ポアの閉鎖によるＴＭ３Ａ変形の詳細。サブユニットＣヘリックス（残基９６−１１３）のバックボーンは、チューブ表記で示される。残基Ｇｌｙ１０１、Ａｌａ１０２、Ｌｅｕ１０５、及びＡ１ａ１０６は、リコリス表記で示される。水素結合は、青で示される。（左）シミュレーションｓｉｍ１の終わり（４．４５ｎｓ）でのスナップショット。（右）シミュレーションｓｉｍ２ａのｔ＝６．０４ｎｓでのスナップショット。（Ｂ）ポア残基（９６−１１３、ＴＭ３Ａ）及び周囲の脂質（ファンデルワールス表記、水素原子を白、炭素原子をシアン、そして酸素原子を赤とする）。サブユニットを図１Ｄのように着色した。各サブユニットの残基Ｌｅｕ１０５は、空間充填表記で示される。サブユニットＡ（明るい青）、Ｃ（赤）、及びＥ（オレンジ）は、顕著なねじれを示し、それらのＬｅｕ１０５側鎖はポアを遮蔽する。サブユニットＡは脂質と密接する一方で、その他のサブユニットは密接しない。」（第３０５５頁、図６）
　
１２．甲第１７号証
（甲１７−１）「【０００２】
　アミノ酸は、産業上極めて重要であり、アミノ酸の使用は多様である：すなわちたとえばＬ−リジン、たとえばＬ−スレオニン、Ｌ−メチオニン及びＬ−トリプトファンは飼料添加物として、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔ）は調味料として、Ｌ−イソロイシン及びＬ−チロシンは医薬業界で、Ｌ−アルギニン及びＬ−イソロイシンは薬剤として、あるいはＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓｐａｒａｔ）及びＬ−フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化合物として必要とされる。
【０００３】
　この種々のアミノ酸製造の好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な未精製物質を使用することができるからである。微生物としてたとえばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びその同属菌ｓｓｐ．フラブム（ｆｌａｖｕｍ）及びｓｓｐ．ラクトフェルメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（Ｌｉｅｂｅｌ　等、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９１）４１：２５５−２６０）　及びエシェリキア・コリ（大腸菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）及びその同属菌が使用される。
【０００４】
　しかしこの菌は、一般にアミノ酸を増殖に必要な量でしか産生しないので、過剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸の生合成が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコントロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である。この方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、生合成の有効な調節を遮断するために使用する。したがってたとえばＬ−チロシン−　及びＬ−フエニルアラニン相似体に耐性であるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている（特開昭５１−１９０３７号及び同５３−３９５１７号公報）。同様にＬ−リジン−　又はＬ−スレオニン相似体に耐性の細菌がコントロールメカニズムを阻害するために使用されることが記載されている（ヨーロッパ特許第０２０５８４９号明細書、英国特許第２１５２５０９号明細書）。」（段落【０００２】〜【０００４】）
　
１３．甲第１８号証
（甲１８−１）「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られている。」（第２頁左上欄第１４行〜第１６行）
　
１４．甲第１９号証
（甲１９−１）「Ｌ−グルタミン酸は調味料として幅広い用途があり、グルタミン酸生産性コリネ型細菌を培養して該細菌にＬ−グルタミン酸を生産せしめ、生成するＬ−グルタミン酸を該細菌の培養物から分離する発酵法により工業的に生産されている。」（第２頁左下欄第１０行〜第１４行）
　
（甲１９−２）「これらの細菌を用いてグルタミン酸を製造する際には、発酵終了時のＬ−グルタミン酸の培地中への蓄積濃度を高めること、および使用原料（Ｗ）当りのグルタミン酸の生成量（対糖収率）を向上させることが工業的に重要である。上記目的を達成するために、生産菌の育種改良が種々検討されている．たとえば、グルタミン酸のアナログ（構造類似体）またはグルタミン酸生合成経路の各種中間体のアナログ等に耐性を示す菌株を作製することにより、各種酵素活性のフィードバック阻害や抑制の解除された菌株を育種する方法．またグルタミン酸生合成経路の途中より分岐して副生産物の合成に向かう経路の酵素活性の低下した菌株を育種する方法等が試みられている。一方、グルタミン酸生合成に関与する酵素の活性を強化することによりＬ−グルタミン酸の生産速度を高めるとともに効率良くＬ−グルタミン酸を生成させる試みも近年行われるようになり、この目的省達成するためにグルタミン酸の生合成経路に関与する各種酵素遺伝子のクローニングが行われつつある．」（第２頁左下欄第１９行〜右下欄第１９行）
　
（甲１９−３）「しかしながら、Ｌ−グルタミン酸発酵においてその生産性を十分向上することのできる菌株については、これまでに報告された例がなかった。」（第３頁右上欄第５行〜第７行）
　
１５．甲第２０号証
（甲２０−１）「【０００６】
　本発明は、プラスミドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な強化および調節を行うことができ、アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供することを目的とする。
　本発明は、副生アスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こすことなく、コリネバクテリア菌株にグルタミン酸を高収率で生産する能力を付与することができるＧＤＨ用プロモーターを提供することを目的とする。
　本発明は、又、上記ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を提供することを目的とする。
　本発明は、又、上記遺伝子を有するＬ−グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株を提供することを目的とする。
　本発明は、構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法を提供することを目的とする。
　本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる、グルタミン酸の収率を向上させ、より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法を提供することを目的とする。」（段落【０００６】）
　
１６．甲第２１号証
（甲２１−１）「本研究では、我々は、フェドバッチ発酵でのコリネバクテリウム・グルタミカムによるグルタミン酸の生産を試験した。対数増殖期に、２種の界面活性剤を非常に正確なステップで添加することによって、アミノ酸の排出を誘導した。界面活性剤のいくつかの効果を報告し、そして排出の誘発におけるそれらの役割を議論する。高濃度又は低濃度の排出されたグルタミン酸のいずれかをもたらす様々な条件での発酵における、細胞内と細胞培地間のグルタミン酸の再分配を我々は観察した。グルタミン酸の細胞内濃度を測定し、生理的状態の変化を反映する細胞容積の変化を考慮した。」（第２２０頁左欄第３１行〜右欄第１１行）
　
１７．甲第２２号証
（甲２２−１）「生合成経路と反応エンジニアリングの最適化における進んだ状態との比較において、アミノ酸の過剰生産における重要なステップ：生産物の発酵培地への排出、に向けられた研究は比較的少数である。」（第４０頁左欄第４１行〜右欄第２行）
　
１８．甲第２３号証
（甲２３−１）「したがって、高濃度のＬ−イソロイシン生産菌ＳＭ１３において、このアミノ酸の外部への輸送は、主要な律速反応ステップであり、ゆえに、生物工学の目的のための菌株設計の新しいターゲットである。」（第４３４５頁、要約第１３行〜第１５行）
　
１９．甲第２４号証
（甲２４−１）「これらの結果は、Ｃ．グルタミカムを用いるスレオニン生産は、このアミノ酸の排出システムにより制限されることが示唆される。」（第１２６頁、要約第１４行〜第１５行）
　
２０．甲第２５号証の１
（甲２５の１−１）「
」（第５５頁、表１）
　
２１．甲第３０号証
（甲３０−１）「これらの細菌を用いてグルタミン酸を製造する際には、発酵終了時のＬ−グルタミン酸の培地中への蓄積濃度を高めること、および使用原料（Ｗ）当りのグルタミン酸の生成量（対糖収率）を向上させることが工業的に重要である。上記目的を達成するために、生産菌の育種改良が種々検討されている．たとえば、グルタミン酸のアナログ（構造類似体）またはグルタミン酸生合成経路の各種中間体のアナログ等に耐性を示す菌株を作製することにより、各種酵素活性のフィードバック阻害や抑制の解除された菌株を育種する方法．またグルタミン酸生合成経路の途中より分岐して副生産物の合成に向かう経路の酵素活性の低下した菌株を育種する方法等が試みられている。」（第２頁左下欄第１９行〜右下欄第１２行）
　
２２．甲第３５号証
（甲３５−１）「基本培地（５０ｍｌ）を、５ｍｌシード培地と共に、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに２度接種し、ロータリー振とうインキュベーター中、３０℃で６日間培養した。」（第１５１頁右欄第５行〜第７行）
　
（甲３５−２）「振とうフラスコ中、撹拌数が５０ｒｐｍから２００ｒｐｍに増えると、Ｌ−リジン生産は急速に増加し、その後横ばいになった。糖の利用は５０ｒｐｍから３００ｒｐｍで増加したが、最大収率は２００ｒｐｍで観察された（図２）。」（第１５１頁右欄下から第５行〜最終行）
　
第６　乙号証の記載事項
　乙第１９号証には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。）。
　
１．乙第１９号証
（乙１９−１）「相対的に強固な主鎖角を有するプロリン残基（６８）とプロリン残基が水素結合形成の際に供与するアミド基の水素原子を欠如していることが、プロリンをよく知られたＣＫ−ヘリックス構造の破壊者としている（６９）。その代りに、相対的に親水性のプロリンの残基は（７０）、β−ターン構造にプロリンが頻繁に存在する（すべてトランス型のペプチド結合と共に）ことからも明らかなように、タンパク質鎖の折り畳みを促進する主たる構造上の役割を果たしている（総説として、参考文献７１参照）。」（第９１９頁左欄第８行〜第１５行）
　
第７　当審の判断
１．無効理由３（甲第８号証を主引用例とする進歩性）について
（１）甲第８号証に記載された発明
　上記記載事項（甲８−１）、（甲８−２）及び（甲８−５）によると、甲第８号証には、「大腸菌のＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明（以下、「甲８発明」という。）が記載されていると認められる。
　なお、請求人は、審判請求書第６１頁において、「甲第８号証には、以下の発明（「甲８発明」）が開示されている。　Ｌ−グルタミン酸の排出に関わる、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネルを有する、コリネバクテリウム・グルタミカム。」と主張し、上記記載事項（甲８−１）及び（甲８−３）を、甲第８号証に「Ｌ−グルタミン酸の排出に関わる、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネル」が開示されている根拠としているが、甲第８号証には、上記記載事項（甲８−３）の表１の結果に基づいて、「当該チャネルは、グリシンベタイン及びプロリンのような相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子、例えば、グルタミン酸又はリジンの遊離は、制限され、」と記載され（上記記載事項（甲８−１））、また、上記記載事項（甲８−３）の表１の結果は、甲第８号証に記載の「Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネル」が、Ｌ−グルタミン酸の排出に関与することを示すものではないから、上記記載事項（甲８−１）及び（甲８−３）をみても、コリネバクテリウム・グルタミカムの「Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネル」が、Ｌ−グルタミン酸の排出に関わることが甲第８号証に記載されているとは認められないので、請求人の上記主張は採用できない。
　
（２）本件訂正発明１について
ア　本件訂正発明１と甲８発明との対比
　本件明細書の段落【０００６】には、「コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのｙｇｇＢ遺伝子のホモログであり（非特許文献２，３）、メカノセンシティブチャンネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｈａｎｎｅｌ）の一種として解析されているが、（非特許文献４）」と記載されており、また、メカノセンシティブチャンネルが浸透圧調節チャネルとしての機能を有することは技術常識である。
　よって、本件訂正発明１に記載のｙｇｇＢ遺伝子は、浸透圧調節チャネルの一種の遺伝子であり、また、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌が、浸透圧調節チャネルを有していれば、その遺伝子を有することは明らかであるから、本件訂正発明１と甲８発明とを対比すると、両者は、浸透圧調節チャネル遺伝子を有するコリネ型細菌である点で一致し、以下の点で相違する。
（相違点）本件訂正発明１は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は、（ｉ）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域の欠失、（ｉ’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、（ｉ’’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、または（ｉｉ）配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域における１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の変異が導入された、コリネ型細菌であるのに対し、甲８発明は、そのような特定がされていない点。
　
イ　相違点についての検討
　上記相違点について検討する。
　上記記載事項（甲８−５）には、「Ｃ．グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、ＭｓｃＳと類似するかもしれない」との示唆があるものの、上記記載事項（甲８−１）〜（甲８−５）は、甲第８号証に記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が、ｙｇｇＢ遺伝子であることを示す記載とはいえず、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを開示も示唆もしていない。
　甲第２号証には、コリネ型細菌において、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損させることが記載されている（上記記載事項（甲２−１）〜（甲２−４））が、上記記載事項（甲２−１）〜（甲２−４）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを開示も示唆もしていない。
　甲第１０号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムに、大腸菌のｙｇｇＢ遺伝子及びＭｓｃＬ遺伝子のホモログが存在すること、ｙｇｇＢ遺伝子ホモログのオープンリーディングフレームはＣｇｌ１２７０であること、ｙｇｇＢ欠失変異体はベタインの排出速度を低下させたことが記載されている（上記記載事項（甲１０−１）〜（甲１０−５））が、ｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することは記載されておらず、上記記載事項（甲１０−１）〜（甲１０−５）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
　甲第１３号証には、大腸菌において、ｙｇｇＢの１０６番目のアラニンに相当する、ホモログタンパク質ＫｅｆＡにおける９２２番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調することが記載されている（（甲１３−１）〜（甲１３−２））が、甲第１３号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１３−１）〜（甲１３−３）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
　甲第１４号証には、大腸菌のメカノセンシティブチャンネルには、ＭｓｃＭ、ＭｓｃＳ及びＭｓｃＬがあること、ＹｇｇＢはＭｓｃＳに改名すべきであること、大腸菌のｙｇｇＢは、２８６個のアミノ酸より構成される３回膜貫通タンパク質であること、ＭｓｃＳにはゲイン・オブ・ファンクション（ＧＯＦ）変異体があり、Ｔ９３Ｒ、Ｌ１０９Ｓ及びＡ１０２Ｐのアミノ酸置換を有するＧＯＦ変異体を得ることが記載されている（上記記載事項（甲１４−１）〜（甲１４−６））が、甲第１４号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１４−１）〜（甲１４−６）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
　甲第１５号証には、大腸菌のｙｇｇＢの膜貫通ドメインＴＭ３は、ＴＭ３Ａ及びＴＭ３Ｂで構成され、ＴＭ３Ａ（９６−１１３番目のアミノ酸）がチャネルのポアを形成すること、ＴＭ３Ａの１０１番目のグリシン、１０２番目のアラニン、１０５番目のロイシン及び１０６番目のアラニンが、チャネルのポアの遮蔽に関与していることが記載されている（上記記載事項（甲１５−１）〜（甲１５−４））が、甲第１５号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１５−１）〜（甲１５−４）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
　よって、甲第２、１０、１３〜１５号証の記載は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。また、周知技術ないし技術常識を示す証拠として提出された甲第３〜４、７、９、１２、１７〜２４号証、甲第２５号証の１、甲第３０、３５号証にも、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はなく、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することの動機付けとなるような記載はないから、甲第２、１０、１３〜１５号証の記載及び本願優先日前の周知技術に基づいても、甲８発明において、浸透圧調節チャネルの遺伝子として、ｙｇｇＢ遺伝子を選択し、さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
　
ウ　本件訂正発明１の効果について
　本件明細書の実施例２〜１３の記載から、本件訂正発明１は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという、甲８発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。
　
エ　まとめ
　したがって、本件訂正発明１は、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
（３）請求人の主張について
　請求人は、平成２９年１０月２日付け弁駁書において、「グルタミン酸生産能を有することが周知であったコリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸の生産性を高めるという周知の課題を解決するために、重要な問題として認識されていた菌体内のＬ−グルタミン酸の菌体外への排出に着目し（技術常識）、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸の排出能を増強することは、当業者が容易に試みる事項である。その際、Ｌ−グルタミン酸の排出能を有する浸透圧制御チャネルを標的として選択し、それによるＬ−グルタミン酸の排出効率を高めることは当然である。　Ｌ−グルタミン酸の排出効率を高める手段として、浸透圧制御チャネルかつ機械受容チャネルであるｙｇｇＢ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３に変異を導入することが知られていた（甲１４発明及び甲１５発明）。ＴＭ３（およそ９６−１２７番目のアミノ酸）は、ｙｇｇＢタンパク質のチャネルのポア形成に重要であり、ＴＭ３の変異により、チャネルがオープンになった状態が実現する。　そこで、Ｌ−グルタミン酸の排出効率を高めることを目的として、甲８発明のコリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ（Ｃｇｌ１２７０に特定される（甲１０号証）。）に対し、甲１４発明又は甲１５発明を適用してＴＭ３のアミノ酸を変異させ、相違点１の構成を採用することは、当業者が容易に想到し得た事項である。」と主張している。
　しかしながら、上記（２）イで述べたように、甲第１４号証、甲第１５号証は、ｙｇｇＢ（ＭｓｃＳ）がＬ−グルタミン酸の排出に関与するチャネルであることを示す文献ではないから、「Ｌ−グルタミン酸の排出効率を高める手段として、浸透圧制御チャネルかつ機械受容チャネルであるｙｇｇＢ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３に変異を導入することが知られていた（甲１４発明及び甲１５発明）。」との請求人の上記主張は失当であり、また、上記（１）及び（２）イで述べたように、「甲８発明」は、「大腸菌のＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明であり、当該浸透圧調節チャネルがｙｇｇＢであることを示す記載は甲第８号証にはないから、「甲８発明のコリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ」との請求人の上記主張は失当である。
　また、上記（１）及び（２）イで述べたように、甲第８号証、甲第１０号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢが、Ｌ−グルタミン酸の排出に関与することが記載されているとはいえないから、甲８発明の「大腸菌のＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネル」に対して、甲第１０号証の記載を参照して、甲第１４号証、甲第１５号証の記載事項を適用しても、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し、その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえないから、請求人の上記主張は採用できない。
　
（４）本件訂正発明６〜７、９〜１１について
　本件訂正発明６〜７、９〜１０は、本件訂正発明１に更なる限定を加えた発明であり、また、本件訂正発明１１は、本件訂正発明１のコリネ型細菌を使用する方法の発明であるから、上記（２）で述べたように、本件訂正発明１が、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上、本件訂正発明６〜７、９〜１１も、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
（５）本件訂正発明４について
　本件訂正発明４は、訂正前の請求項１を引用する記載であったものを、請求項１の記載を引用しないものとし、独立請求項とした発明であり、実質的に本件訂正発明１の（ｉｉ）の「配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域における１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入」の変異の下位概念に該当する「配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニンをスレオニンに、及び／または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異」を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌に係る発明であるから、上記（２）で述べたように、本件訂正発明１が、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上、本件訂正発明４も、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
（６）本件訂正発明１２について
ア　本件訂正発明１２と甲８発明との対比
　本件明細書の段落【０００６】には、「コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのｙｇｇＢ遺伝子のホモログであり（非特許文献２，３）、メカノセンシティブチャンネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｈａｎｎｅｌ）の一種として解析されているが、（非特許文献４）」と記載されており、また、メカノセンシティブチャンネルが浸透圧調節チャネルとしての機能を有することは技術常識である。
　よって、本件訂正発明１２に記載のｙｇｇＢ遺伝子は、浸透圧調節チャネルの一種の遺伝子であり、また、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌が、浸透圧調節チャネルを有していれば、その遺伝子を有することは明らかであるから、本件訂正発明１２と甲８発明とを対比すると、両者は、浸透圧調節チャネル遺伝子である点で一致し、以下の点で相違する。
（相違点）本件訂正発明１２は、「下記（ａ）〜（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子：
　　（ａ）　配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｂ）　配列番号８のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｃ）　配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｄ）　配列番号２０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｅ）　配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｆ）　配列番号２２のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｇ）　配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｈ）　配列番号２４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｉ）　配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｊ）　配列番号６４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｋ）　配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｌ）　配列番号７０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
　　（ｍ）　配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
　　（ｎ）　配列番号７４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。」であるのに対し、甲８発明は、そのような特定がされていない点。
　
イ　相違点についての検討
　上記相違点について検討する。
　上記記載事項（甲８−５）には、「Ｃ．グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、ＭｓｃＳと類似するかもしれない」との示唆があるものの、上記記載事項（甲８−１）〜（甲８−５）は、甲第８号証に記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が、ｙｇｇＢ遺伝子であることを示す記載とはいえず、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを開示も示唆もしていない。
　甲第２号証には、コリネ型細菌において、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損させることが記載されている（上記記載事項（甲２−１）〜（甲２−４））が、上記記載事項（甲２−１）〜（甲２−４）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを開示も示唆もしていない。
　甲第１０号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムに、大腸菌のｙｇｇＢ遺伝子及びＭｓｃＬ遺伝子のホモログが存在すること、ｙｇｇＢ遺伝子ホモログのオープンリーディングフレームはＣｇｌ１２７０であること、ｙｇｇＢ欠失変異体はベタインの排出速度を低下させたことが記載されている（上記記載事項（甲１０−１）〜（甲１０−５））が、ｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することは記載されておらず、上記記載事項（甲１０−１）〜（甲１０−５）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
　甲第１３号証には、大腸菌において、ｙｇｇＢの１０６番目のアラニンに相当する、ホモログタンパク質ＫｅｆＡにおける９２２番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調することが記載されている（（甲１３−１）〜（甲１３−２））が、甲第１３号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１３−１）〜（甲１３−３）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載とはいえない。
　甲第１４号証には、大腸菌のメカノセンシティブチャンネルには、ＭｓｃＭ、ＭｓｃＳ及びＭｓｃＬがあること、ＹｇｇＢはＭｓｃＳに改名すべきであること、大腸菌のｙｇｇＢは、２８６個のアミノ酸より構成される３回膜貫通タンパク質であること、ＭｓｃＳにはゲイン・オブ・ファンクション（ＧＯＦ）変異体があり、Ｔ９３Ｒ、Ｌ１０９Ｓ及びＡ１０２Ｐのアミノ酸置換を有するＧＯＦ変異体を得ることが記載されている（上記記載事項（甲１４−１）〜（甲１４−６））が、甲第１４号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１４−１）〜（甲１４−６）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
　甲第１５号証には、大腸菌のｙｇｇＢの膜貫通ドメインＴＭ３は、ＴＭ３Ａ及びＴＭ３Ｂで構成され、ＴＭ３Ａ（９６−１１３番目のアミノ酸）がチャネルのポアを形成すること、ＴＭ３Ａの１０１番目のグリシン、１０２番目のアラニン、１０５番目のロイシン及び１０６番目のアラニンが、チャネルのポアの遮蔽に関与していることが記載されている（上記記載事項（甲１５−１）〜（甲１５−４））が、甲第１５号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子に関する文献ではなく、また、Ｌ−グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項（甲１５−１）〜（甲１５−４）は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
　よって、甲第２、１０、１３〜１５号証の記載は、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。また、周知技術ないし技術常識を示す証拠として提出された甲第３〜４、７、９、１２、１７〜２４号証、甲第２５号証の１、甲第３０、３５号証にも、コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ−グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はなく、また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することの動機付けとなるような記載はないから、甲第２、１０、１３〜１５号証の記載及び本願優先日前の周知技術に基づいても、甲８発明において、浸透圧調節チャネルの遺伝子として、ｙｇｇＢ遺伝子を選択し、さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
　
ウ　本件訂正発明１２の効果について
　本件明細書の実施例２〜１３の記載から、本件訂正発明１２は、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという、甲８発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。
　
エ　まとめ
　したがって、本件訂正発明１２は、甲第８号証、甲第２号証、甲第１０号証、甲第１３号証、甲第１４号証及び甲第１５号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
２．無効理由４（実施可能要件）及び無効理由５（サポート要件）について
（１）本件発明の詳細な説明の記載内容
　本件発明の詳細な説明には、以下の内容が記載されている。
　
ア．「【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造において、Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本研究者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ｙｇｇＢ遺伝子がコリネ型細菌のＬ−グルタミン生産に関与していることを明らかにし、ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。」（段落【０００７】〜【０００８】）
　
イ．「【００６９】
＜ＩＩＩ＞　本発明の変異型ｙｇｇＢ遺伝子
　以下、変異型ｙｇｇＢ遺伝子の具体例を挙げる。ただし、変異型ｙｇｇＢ遺伝子は、コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
【００７０】
（ＩＩＩ−１）Ｃ末端側変異
　この変異は、配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９−５３３の配列、または配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば、この領域は、配列番号５の塩基配列においては、塩基番号２６９２−３０３５番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス（以下ＩＳという）や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や、上記ＩＳの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
【００７１】
（ＩＩＩ−１−１）転移因子の挿入による変異（２Ａ−１型変異）
　Ｃ末端側変異の一例として、配列番号５の２６９１番目のＧの次にＩＳが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号７に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。配列番号８においては、配列番号６の４１９位のバリンから下流の領域が短いＩＳに由来する配列に置換されている。なお、配列番号７にて挿入されたＩＳは、ＩＳ１２０７（Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ９６９６２）　、ＩＳ７１９：　（Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ　Ｅ１２７５９）と相同性の高い配列である。
　上記変異型ｙｇｇＢ遺伝子を２Ａ−１型変異と呼ぶ。２Ａ−１型変異には、配列番号６、６２、６８、８４および８５のＣ末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
　また、上記領域に他のＩＳが挿入されたもの、例えば上述したようなｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅをコードするＩＳが挿入されたものも、本発明の範囲に含まれる。ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが、それぞれのｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅが認識しやすい箇所やＩＳが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
【００７２】
（ＩＩＩ−１−２）プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異（６６型変異、２２型変異）
　またＣ末端側変異の一例として、配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９−５３３の配列、または配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは、配列番号６の以下の位置に存在する。
４２４番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４２４番目）
４３７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４３７番目）
４５３番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４５３番目）
４５７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４５７番目）
４６２番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４６２番目）
４６９番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４６９番目）
４８４番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４８４番目）
４８９番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４８９番目）
４９７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４９７番目）
５１５番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の５１５番目）
５２９番目のプロリン残基（配列番号６８、８４、８５の５２９番目、配列番号６２番目の５２５番目）
５３３番目のプロリン残基（配列番号６８、８４、８５の５３３番目、配列番号６２番目の５２９番目）
　ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側のプロリン残基は、ＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　２００２　Ｊａｎ；１５（１）：２９−３３、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．１９９１　Ｄｅｃ　２５；２６６（３６）：２４２８７−９４．）中でも４２４番目と４３７番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。ここで他のアミノ酸とは、プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｈｉｓから選択される残基に置換すればよい。特に、４２４番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換されることが望ましく、中でも分岐鎖アミノ酸であるＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅが望ましい。（６６型変異）４２４番目のプロリンをロイシンに置換する変異として、例えば、配列番号６７の１６７３位の“Ｃ”を“Ｔ”に置換する変異が挙げられる。この変異型ｙｇｇＢ遺伝子を配列番号６９に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
　また、４３７番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ）に置換することが望ましく、中でもＳｅｒへの置換が望ましい。（２２型変異）４３７番目のプロリンをセリンに置換する変異としては、例えば配列番号５の２７４５位のＣをＴに置換する変異が挙げられる。また、本変異は、３０６０位のＣをＴに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型ｙｇｇＢ遺伝子を配列番号７３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
【００７３】
（ＩＩＩ−２）膜貫通領域の変異
　ｙｇｇＢ遺伝子がコードするＹｇｇＢタンパク質は、５個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号６、６２、６８、８４、８５の野生型のＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３（第１膜貫通領域）、２５〜４７（第２膜貫通領域）、６２〜８４（第３膜貫通領域）、８６〜１０８（第４膜貫通領域）、１１０〜１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。これらをコードするＤＮＡは配列番号５の１４３７−１５０５、１５０９−１５７７、１６２０−１６８８、１６９２−１７６０、１７６４−１８３２番目の塩基に該当する。本発明の変異は、この膜貫通領域をコードするＤＮＡ内に変異を有していることが望ましく、変異導入は１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って、ここでアミノ酸配列の置換の場合は、アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく、上記数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個を意味する。またアミノ酸の挿入、欠失変異は、１〜数塩基のポイントミューテーションの導入や、フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入、例えば、３，６，９，１２，１５，１８、または２１塩基の挿入または欠失、好ましくは、３，６、または９塩基の欠失または挿入、より好ましくは３塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
【００７４】
　例えば、以下のような変異が例として挙げられる。
（ＩＩＩ−２−１）第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異）
　この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、１４番目のロイシン残基、１５番目のトリプトファン残基間に１又は数アミノ酸挿入された変異である。具体例としては、１４番目のロイシン残基、１５番目のトリプトファン残基間に、３アミノ酸導入されたもの、例えばＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕが挿入されたものが挙げられ、この変異の例として、配列番号５の１４８０番目のＧの次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【００７５】
（ＩＩＩ−２−２）第４膜貫通領域の変異（１９型変異）
　この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、１００番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン、セリン、チロシン）に置換されていることが望ましく、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
【００７６】
（ＩＩＩ−２−３）第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異、８型変異）
　この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、１１１番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であれば、いずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも分岐鎖アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン）、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン、セリン、チロシン）、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として、配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異（Ｌ３０型変異）や、配列番号６１の８３７番目のＧがＡに置換された変異（８型変異）が挙げられる。Ｌ３０型変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。８型変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
【００７７】
　上記の「変異型ｙｇｇＢ遺伝子」は、ビオチンが過剰量存在する条件におけるＬ−グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、上述の変異を含む機能的に均等な遺伝子、例えば、配列番号７の塩基番号１４３７〜２７０５の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１９の塩基番号１４３７〜３０４４の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号２１の塩基番号１４３７〜３０３５の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号２３の塩基番号１４３７−３０３５の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号６３の塩基番号５０７−２０９３の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号６９の塩基番号４０３−２００１の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号７３の塩基番号５４８−２１４６の塩基配列を含むＤＮＡのような変異型遺伝子と実質的に相同な遺伝子で、これらと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件のことをいう。例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件が挙げられ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７８】
　変異型ｙｇｇＢ遺伝子がコードするタンパク質としては、同タンパク質の活性がビオチンが過剰量存在する条件においてＬ−グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、機能的に均等なタンパク質例えば、配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４から選択されるアミノ酸配列において、上記変異点のアミノ酸以外にさらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記置換は保存的置換（中性変異）が好ましく、保存的置換としては、ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。また、上述したように、配列番号８５のＸａａのアミノ酸が置換されてもよい。さらに、本発明のｙｇｇＢ遺伝子は、配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌で変異型ｙｇｇＢがコードするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
【００７９】
　特に、以下のアミノ酸は配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４のアミノ酸配列において置換されていてもよい。
４８位のＧｌｕ（好ましくはＡｒｇによる置換）
２７５位のＡｓｐ（好ましくはＳｅｒによる置換）
２９８位のＧｌｕ（好ましくはＡｌａによる置換）
３４３位のＡｌａ（好ましくはＶａｌによる置換）
３９６位のＰｈｅ（好ましくはＩｌｅによる置換）
４３８位のＳｅｒ（好ましくはＧｌｙによる置換）
４４５位のＶａｌ（好ましくはＡｌａによる置換）
４５４位のＡｌａ（好ましくはＶａｌによる置換）
４５７位のＰｒｏ（好ましくはＳｅｒによる置換）
４７４位のＳｅｒ（好ましくはＡｓｐによる置換）
５１７位のＶａｌ（好ましくは欠失）
５１８位のＧｌｕ（好ましくは欠失）
５１９位のＡｌａ（好ましくは欠失）
５２０位のＰｒｏ（好ましくは欠失）」（段落【００６９】〜【００７９】）
　
ウ．「【００８１】
　本発明のコリネ型細菌は、変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入することにより、Ｌ−グルタミン酸アナログに対する耐性が向上したものであってもよい。本発明でＬ−グルタミン酸アナログとは、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、α−メチルグルタミン酸、β−ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸−γ−モノヒドロキサメ−ト、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−モノエチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−ジ−ｔ−ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ジエチルエステル、Ｄ−グルタミン酸、４−フルオログルタミン酸が挙げられる。Ｌ−グルタミン酸アナログに対する耐性の向上とは、最少培地に４−フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数（コロニー形成能を有する菌数）を１／１００まで抑制できるような濃度においても１／１０以上の増殖を示すことをいう。具体的には、１．２５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭ、より好ましくは、５ｍＭ以上の４−フルオログルタミン酸に耐性を有することを意味する。
」（段落【００８１】）
　
エ．「【実施例２】
【００９５】
＜Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９由来ｏｄｈＡ変異株の構築＞
　コリネ型細菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしているｏｄｈＡ遺伝子の配列は既に明らかにされている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４２，３３４７−３３５４，（１９９６）、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｄ８４１０２）。公開されているｏｄｈＡ遺伝子の配列を基に、配列番号１、２に記載のプライマーを設計しＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｏｄｈＡ遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅したＰＣＲ断片をＢａｍＨＩで完全分解し、実施例１で構築したｐＢＳ４ＳのＢａｍＨＩ部位に挿入したプラスミドｐＢＳ４ＳΔｓｕｃＡｉｎｔを構築した（構築図は図３に記載）。
【００９６】
　電気パルス法（特開平２−２０７７９１）にてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９へｐＢＳ４ＳΔｓｕｃＡｉｎｔを導入し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−Ｄｅｘ寒天培地（グルコース　５ｇ／ｌ、ポリペプトン　１０ｇ／ｌ、酵母エキス　１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ、尿素　３ｇ／ｌ、大豆蛋白加水分解液１．２ｇ／ｌ、寒天　２０ｇ／ｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整：オートクレーブ１２０℃２０分）上に塗布した。３１．５℃にて培養後、生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にｐＢＳ４ＳΔｓｕｃＡｉｎｔが組み込まれた１回組換え株であることをＰＣＲにて確認した。なお１回組換え株であることの確認は、候補株の染色体を鋳型にし、ｐＢＳ４Ｓ上の特異的配列（配列番号３）と染色体上の配列（配列番号４）をプライマーにしたＰＣＲを行うことによって、容易に確認することが出来る（非組み換え株の染色体上にはｐＢＳ４Ｓの配列が存在していないため、ＰＣＲによって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる）。
【００９７】
　こうして取得した１回組換え株を２Ａ−１株と名付けた。野生株ＡＴＣＣ１３８６９および２Ａ−１株を２０ｍｌのフラスコ培地（グルコース３０ｇ／ｌ，　硫酸アンモニウム　１５ｇ／ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＶＢ１　２００μｇ／ｌ，　Ｂｉｏｔｉｎ３００μｇ／ｌ，　大豆加水分解物（Ｔ−Ｎ）０．４８ｇ／ｌ，　ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整：オートクレーブ１１５℃１０分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを１ｇ加え、３１．５℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培地中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表１に示す（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の濁度で菌体量の指標であり、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。親株のＡＴＣＣ１３８６９ではＬ−グルタミン酸を全く生成しない条件においても２Ａ−１株ではＬ−グルタミン酸生産能を有することが確認された。
【００９８】
【表１】
」（段落【００９５】〜【００９８】）
　
オ．「【実施例３】
【００９９】
　＜２Ａ−１由来ｏｄｈＡ復帰株の構築＞
　取得した２Ａ−１株は、染色体上のｏｄｈＡ遺伝子がｐＢＳ４ＳΔＴ￥ｓｕｃＡｉｎｔによって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させればｏｄｈＡは野生型に復帰する。一方、ｏｄｈＡが欠損した株では、糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、ｏｄｈＡが野生型に復帰すれば糖を含まないＣＭ２Ｂ（ポリペプトン　１０ｇ／ｌ、酵母エキス　１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ　１０μｇ／Ｌ、寒天　２０ｇ／ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで、２Ａ−１株をＣＭ２Ｂプレートに塗布し、生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株２Ａ−１Ｒ株をＣＭ２Ｂプレートで純化し、そのカナマイシン感受性を調べたところ、すべてカナマイシン感受性であり、スクロース耐性であることが明らかとなった。
【０１００】
　ｐＢＳ４ＳΔｓｕｃＡｉｎｔにはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子が含まれているため、ｐＢＳ４ＳΔｓｕｃＡｉｎｔを有する株ではカナマイシン耐性とスクロース感受性を示し、脱落した株ではカナマイシン感受性を示し、またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から２Ａ−１Ｒ株ではｏｄｈＡが野生型に復帰していることが示唆された。さらにｏｄｈＡ遺伝子の配列を確認した結果、ｏｄｈＡ遺伝子には変異がないことが確認されたことから、２Ａ−１Ｒ株ではｏｄｈＡは野生型に復帰していると結論した。２Ａ−１Ｒ株のグルタミン酸生産能を実施例２と同様の方法で確認した。結果を表２に示す。（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の菌体量、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）２Ａ−１Ｒ株のグルタミン酸蓄積は２Ａ−１株には劣るものの野生株ＡＴＣＣ１３８６９よりも遥かに高いことが示された（表２）。また、糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ、２Ａ−１Ｒではグルタミン酸の分解が認められ、ｏｄｈＡが野生型に復帰していることが裏付けられた（図４）。
【０１０１】
【表２】
【実施例４】
【０１０２】
＜２Ａ−１Ｒ株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離＞
　２Ａ−１Ｒ株は、ＣＭ２Ｂプレート培地上においては、野生株ＡＴＣＣ１３８６９とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし、最少培地（グルコース２０ｇ／ｌ，硫酸アンモニウム　２．６４ｇ／Ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　０．５ｇ／Ｌ，　Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／Ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２５ｇ／Ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／Ｌ，　ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２　０．０１ｇ／Ｌ，　ＣｕＳＯ４　０．０２ｍｇ／Ｌ，　ＭＯＰＳ　４０ｇ／Ｌ，　プロトカテク酸　３０ｍｇ／Ｌ，　ＶＢ１・ＨＣｌ２００μｇ／Ｌ，　Ｂｉｏｔｉｎ　３００μｇ／Ｌ，　寒天　２０ｇ／Ｌ，　ＮａＯＨを用いてｐＨ６．７に調整）プレート上では野生株ＡＴＣＣ１３８６９に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで、最少培地で２Ａ−１Ｒ株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
【０１０３】
　ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分分解し、シャトルベクターｐＶＫ９をＢａｍＨＩで処理したものとライゲーションし、ライゲーション反応液をエタノール沈殿した後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（タカラバイオ）のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。ｐＶＫ９は、ｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）のＡｖａＩＩ部位を平滑末端化し、ｐＨＫ４（特開平０５−００７４９１）に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形質転換後の菌体はカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート培地（ポリペプトン　１０ｇ／ｌ、酵母エキス　５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／ｌ、寒天　２０ｇ／ｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）に塗布し、３７℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかきとり、プラスミドを抽出しＡＴＣＣ１３８６９のライブラリーとした。このライブラリーを実施例３で得られた２Ａ−１Ｒ株に電気パルス法にて形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む最少培地プレートに塗布し、コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果、配列番号５に記す断片がｐＶＫ９のＢａｍＨＩ部位に挿入されていたことが明らかとなった。このプラスミドをｐＬ５ｋと命名した。
【０１０４】
　ｐＬ５ｋの挿入配列と、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３４５０）を比較した結果、ｐＬ５ｋには完全長のＯＲＦとして、配列番号６に示すアミノ酸配列をもつＯＲＦのみが含まれていることが明らかとなった。ＯＲＦが膜タンパク質か否かは、インターネット上で利用可能なプログラム「ＳＯＳＵＩ」によって予測可能である（２００４／１０／０７　現在ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０Ｅ．ｈｔｍｌにリンクされている）。「ＳＯＳＵＩ」でこのＯＲＦを解析した結果、５回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号６のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３、２５〜４７、６２〜８４、８６〜１０８、１１０〜１３２の領域に相当する。これらをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５の１４３７−１５０５、１５０９−１５７７、１６２０−１６８８、１６９２−１７６０、１７６４−１８３２番目の塩基配列に、膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号２５−２９、表３に示した
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
　さらに公知の文献を調べた結果、このＯＲＦはＹｇｇＢ（ＮＣｇｌ　１２２１）として解析されているＯＲＦであることが明らかとなった（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｌｅｔｔｅｒｓ　２１８（２００３）３０５−３０９）。
【実施例５】
【０１０７】
＜２Ａ−１Ｒ株のＹｇｇＢ遺伝子の変異点同定＞
　２Ａ−１Ｒ株の最少培地における生育をｐＬ５Ｋが相補したことから、２Ａ−１Ｒ株のｙｇｇＢ遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで、２Ａ−１Ｒ株のｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果２Ａ−１Ｒ株ではＹｇｇＢ遺伝子のＣ末端側の領域にＩＳが挿入されていることが明らかとなった（図５）。２Ａ−１Ｒ株の変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に記した。このことから、２Ａ−１Ｒ株のグルタミン酸生産能は、ｙｇｇＢ遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお、この変異は２Ａ−１Ｒ株のみならず２Ａ−１株にも存在していた。ｏｄｈＡ遺伝子に変異を導入した際に、安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで、ＩＳが挿入されたこの変異を、２Ａ−１型変異とした。」（段落【００９９】〜【０１０７】）
　
カ．「【実施例６】
【０１０８】
＜２Ａ−１型ｙｇｇＢ変異株構築とＬ−グルタミン酸生産能評価＞
（６−１）２Ａ−１型変異の野生株への導入と評価（１回組換え株）
　２Ａ−１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９と配列番号１０に示す合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、２Ａ−１型変異を有するｙｇｇＢ遺伝子断片を増幅した。増幅産物はＳａｃＩで処理し、実施例１のｐＢＳ３のＳａｃＩ部位に挿入した。２Ａ−１型変異を有するｙｇｇＢ断片がクローニングされたプラスミドをｐＢＳ３ｙｇｇＢ２Ａと名付けた。電気パルス法にてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９にｐＢＳ３ｙｇｇＢ２Ａを導入し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−Ｄｅｘ寒天培地上に塗布した。３１．５℃にて培養後生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にｐＢＳ３ｙｇｇＢ２Ａが組み込まれた１回組換え株であることをＰＣＲで確認した。得られた一回組換え株を１３８６９−２Ａとした。この株では、野生型のｙｇｇＢ遺伝子と変異型のｙｇｇＢ遺伝子の両方が発現していることとなる。
【０１０９】
　取得したｙｇｇＢ変異導入株１３８６９−２Ａのグルタミン酸生産能を、実施例２記載の方法にて確認した。その結果を表４に示す（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の菌体量、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。１３８６９−２Ａ株では、ＡＴＣＣ１３８６９株がＬ−グルタミン酸を生成しない条件でも、明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから、ＹｇｇＢ遺伝子の変異により、グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
（６−２）２Ａ−１型変異の野生株への導入と評価（２回組換え株）
　変異型遺伝子のみを有する株を構築する為、１３８６９−２Ａ株をＣＭ−Ｄｅｘ液体培地で一夜培養した懸濁液をＳ１０寒天培地（スクロース　１００ｇ／ｌ、ポリペプトン　１０ｇ／ｌ、酵母エキス　１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ、尿素　３ｇ／ｌ、大豆蛋白加水分解液１．２ｇ／ｌ、寒天　２０ｇ／ｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整：オートクレーブ１２０℃２０分）上に塗布し３１．５℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をｓ２Ｂ寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調整し、配列番号９と配列番号１０に示す合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い変異を確認し、ｙｇｇＢ遺伝子にＩＳ様配列が挿入されていた株を１３８６９−２Ａ−７とした。
【０１１２】
　取得した１３８６９−２Ａ−７株のグルタミン酸生産能を、実施例２記載の方法にて確認した。その結果を表５に示す。（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の菌体量、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。１３８６９−２Ａ−７株では、２Ａ−１Ｒ株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから、ビオチン過剰量存在下でのＬ−グルタミン酸生産は、ｙｇｇＢ遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【０１１３】
【表５】
」（段落【０１０８】〜【０１１３】）
　
キ．「【実施例７】
【０１１４】
＜Ａ１型ＹｇｇＢ変異株の構築と評価＞
　上述のＬ−グルタミン酸生産性のｏｄｈＡ変異株を解析した結果、上述の２Ａ−１変異の他にｙｇｇＢ遺伝子上に５種類の変異を見出した。以下、それぞれＡ１型変異、１９型変異、Ｌ３０型変異、８型変異、６６型変異とし、前者３つについてはＡＴＣＣ１３８６９の染色体に変異を導入して効果を確認した。８型変異についてはＡＴＣＣ１４０６７の染色体に変異を導入して効果を確認した。６６型変異に関しては、Ｃ．ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　ＡＴＣＣ１７９６５の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【０１１５】
　Ａ１型変異は、配列番号５の１４８０番目のＧの次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異であり、配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のロイシン残基、１５番目のトリプトファン残基間にシステイン、セリン、ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【０１１６】
　Ａ１型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号３０に示す合成ＤＮＡと配列番号３１に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製する。同様に配列番号３２と配列番号３３の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製する。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号３４の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行えばＡ１型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られたＹｇｇＢ断片はＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたｐＢＳ４　ＹｇｇＢＡ１を実施例６記載の方法と同様にＡＴＣＣ１３８６９株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し、Ａ１型に置換されていた株を選択すれば、Ａ１型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つＡ１型変異株をＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株とした。
【０１１７】
　ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株と親株のＡＴＣＣ１３８６９株を実施例２と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
　Ａ１変異を染色体上に導入した、ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株は親株のＡＴＣＣ１３８６９株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１１８】
【表６】
」（段落【０１１４】〜【０１１８】）
　
ク．「【実施例８】
【０１１９】
＜１９型ＹｇｇＢ変異株の構築と評価＞
　１９型変異は、配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異であり、配列番号６のアミノ酸配列の１００番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。実施例７と同様の方法にて、１９型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築した。具体的には、配列番号３０に示す合成ＤＮＡと配列番号３５に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製する。同様に配列番号３３と配列番号３６の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製する。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号３４の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行えば１９型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られたＹｇｇＢ断片はＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたｐＢＳ４　ＹｇｇＢ１９を実施例６記載の方法と同様にＡＴＣＣ１３８６９株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し、１９型に置換されていた株を選択すれば、１９型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ１９型変異株をＡＴＣＣ１３８６９−１９株とした。
　【０１２０】
　ＡＴＣＣ１３８６９−１９株と親株のＡＴＣＣ１３８６９株を実施例２と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。１９変異を染色体上に導入した、ＡＴＣＣ１３８６９−１９株は親株のＡＴＣＣ１３８６９株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
　【０１２１】
【表７】
」（段落【０１１９】〜【０１２１】）
　
　
ケ．「【実施例９】
【０１２２】
＜Ｌ３０型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
　Ｌ３０型変異は、配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異であり、配列番号６の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
　実施例７と同様の方法にて、Ｌ３０型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築した。具体的には、配列番号３０に示す合成ＤＮＡと配列番号３７に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製する。同様に配列番号３４と配列番号３８の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製する。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号３４の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行ないＬ３０型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型ＹｇｇＢ断片はＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたｐＢＳ４　ＹｇｇＢ−Ｌを実施例６記載の方法と同様にＡＴＣＣ１３８６９株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し、Ｌ３０型に置換されていた株を選択し、Ｌ３０型変異を有する株を構築した。このような変異を持つＬ３０型変異株をＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ株とした。
【０１２３】
　ＡＴＣＣ１３８６９株と、ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ株を実施例２と同様の方法で培養を行い、培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表８に示す。（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の菌体量、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。Ｌ−３０変異を導入したＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０株は親株のＡＴＣＣ１３８６９株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
　【０１２４】
【表８】
」（段落【０１２２】〜【０１２４】）
　
　
コ．「【実施例１０】
【０１２５】
＜変異型ｙｇｇＢ遺伝子導入株のＬ−グルタミン酸生成条件における培養評価＞
　コリネ型細菌はＴｗｅｅｎ４０等の脂肪酸系界面活性剤の添加や、ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで、ＡＴＣＣ１３８６９株とＡＴＣＣ１３８６９−１９株について、Ｔｗｅｅｎ４０添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は、２０ｍｌのフラスコ培地（グルコース８０ｇ／ｌ，　硫酸アンモニウム　３０ｇ／ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＶＢ１　２００μｇ／ｌ，　Ｂｉｏｔｉｎ　６０μｇ／ｌ，　大豆加水分解物（Ｔ−Ｎ）０．４８ｇ／ｌ，　ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整：オートクレーブ１１５℃１０分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを１ｇ加え、３１．５℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Ｔｗｅｅｎ４０添加培養においては、種培養液２ｍｌを２０ｍｌのフラスコ培地（グルコース８０ｇ／ｌ，　硫酸アンモニウム　３０ｇ／ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＶＢ１　２００μｇ／ｌ，　Ｂｉｏｔｉｎ　６０μｇ／ｌ，　大豆加水分解物（Ｔ−Ｎ）０．４８ｇ／ｌ，　ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整：オートクレーブ１１５℃１０分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを１ｇ加え、３１．５℃で振とう培養した。培養開始後、ＯＤ６２０（ｘ１０１）＝０．２に到達した時点で、最終濃度５ｇ／ＬとなるようにＴｗｅｅｎ４０を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては、種培養液１ｍｌを２０ｍｌのフラスコ培地（グルコース８０ｇ／ｌ，　硫酸アンモニウム　３０ｇ／ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４ｇ／ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＶＢ１　２００μｇ／ｌ，　大豆加水分解物（Ｔ−Ｎ）０．４８ｇ／ｌ，　ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整：オートクレーブ１１５℃１０分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを１ｇ加え、３１．５℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約２．９μｇ／Ｌとなる。
　Ｔｗｅｅｎ４０添加培養およびビオチン制限培養ともに、培養開始後４０時間後の培地中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表９に示す（ＯＤ６２０は１０１倍希釈の菌体量、Ｇｌｕ（ｇ／Ｌ）はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。ＡＴＣＣ１３８６９−１９株では、Ｌ−グルタミン酸生産条件でもＬ−グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
　ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０、ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株、ＡＴＣＣ１３８６９−１９株、プラスミドによるｙｇｇＢ増幅株についても、Ｔｗｅｅｎ４０添加培養を行なった。ＣＭ−Ｄｅｘプレートに一夜培養した菌体を１／６プレート分かきとり、２０ｍｌのフラスコ培地（グルコース８０ｇ／ｌ，　硫酸アンモニウム３０ｇ／ｌ，　ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｇ／ｌ，　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／ｌ，　ＶＢ１　２００μｇ／ｌ，　Ｂｉｏｔｉｎ　６０μｇ／ｌ，　大豆加水分解物（Ｔ−Ｎ）０．４８ｇ／ｌ，　ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整：オートクレーブ１１５℃１０分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを１ｇ加え、３１．５℃で振とう培養した。培養開始５時間後にＴｗｅｅｎ４０を終濃度１ｇ／Ｌとなるように添加し、培養開始から２４時間後の菌体量とＬ−グルタミン酸の収量を分析した。その結果、表１０に示すように、ＡＴＣＣ１３８６９−１９，　ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０，　ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株、野生型のｙｇｇＢ遺伝子増幅株（ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＬ５ｋ−１）ともにＬ−グルタミン酸生産条件でのＬ−グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
【０１２８】
【表１０】
」（段落【０１２２】〜【０１２８】）
　
サ．「【実施例１１】
【０１２９】
＜８型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
　８型変異は、配列番号６１の８３７位のＧがＡに置換された変異であり、配列番号６２の１１１位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
　実施例７と同様の方法にて、８型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築する。具体的には、配列番号３０に示す合成ＤＮＡと配列番号６５に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍＡＴＣＣ１４０６７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製する。同様に配列番号３４と配列番号６６の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製する。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号３４の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、８型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型ＹｇｇＢ断片はＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたｐＢＳ４　ＹｇｇＢ８を実施例６記載の方法と同様にＡＴＣＣ１４０６７株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し、８型に置換されていた株を選択し、８型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ８型変異株をＡＴＣＣ１４０６７ｙｇｇＢ８株とする。」（段落【０１２９】）
　
シ．「【実施例１２】
【０１３０】
＜６６型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
　６６型変異は、配列番号６７の１６７３番目のＣがＴに置換された変異であり、配列番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６９に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
　実施例７と同様の方法にて、６６型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築する。具体的には、配列番号３０に示す合成ＤＮＡと配列番号７１に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ．ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａＡＴＣＣ１７９６５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製した。同様に配列番号３４と配列番号７２の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製する。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号１０の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行えば６６型ｙｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型ＹｇｇＢ断片をＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたｐＢＳ４　ＹｇｇＢ６６を実施例６記載の方法と同様にＡＴＣＣ１７９６５株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し、６６型に置換されていた株を選択することで、６６型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ６６型変異株をｙｇｇＢ６６株とする。」（段落【０１３０】）
　
ス．「【実施例１３】
【０１３１】
＜ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異による変異型ｙｇｇＢ遺伝子のスクリーニング＞
（１３−１）ｙｇｇＢ欠損株の構築
　変異型のｙｇｇＢ遺伝子をｉｎ　ｖｉｔｒｏでｙｇｇＢに変異をランダムに導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずｙｇｇＢ欠損株を構築した。配列番号３９に示す合成ＤＮＡと配列番号４０に示す合成ＤＮＡをプライマーとして、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ末端側断片を調製した。同様に配列番号４１と配列番号４２の合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｃ末端側断片を調製した。配列番号４０と４１は互いに相補的である。続いてＮ末端側断片とＣ末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号３９と配列番号４２の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行ないｙｇｇＢ遺伝子のＯＲＦを欠失した断片を取得した。
【０１３２】
　得られたＰＣＲ断片はＳａｃＩで処理してｐＢＳ４ＳのＳａｃＩ部位に挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたｐＢＳ４ΔＹｇｇＢを実施例６記載の方法でＡＴＣＣ１３８６９株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３９と配列番号４２の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｙｇｇＢ遺伝子が欠損していることを確認した。得られたｙｇｇＢ遺伝子欠損株をＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ株とした。
【０１３３】
（１３−２）変異型ｙｇｇＢ遺伝子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　スクリーニング
　一方、ｙｇｇＢ遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず、プラスミドｐＬ５ｋはｙｇｇＢ遺伝子以外の領域を若干含んでいるため、ｐＬ５ｋをＸｈｏＩとＳａｌＩで処理し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドｐＬ５ｋＸＳを得た。なおＳａｌＩ認識部位は、配列番号５の塩基配列上には存在しないが、ｐＢＳ３のマルチクローニングサイトに存在している。得られたｐＬ５ｋＸＳ約１０μｇを５００ｍＭリン酸緩衝液、４００ｍＭヒドロキシルアミン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６．０）に溶解し、７５℃で３０分から９０分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは、ＳＵＰＲＥＣ−０２（タカラバイオ）で脱塩した後、実施例６記載の方法でＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ株に導入し、Ｋｍ２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ２Ｂ培地で形質転換体を選択した。また、対照として変異処理前のｐＬ５ｋＸＳについてもＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ株に導入した。出現した形質転換体を、ＣＭ２ＢＧＵ２培地（実施例３記載のＣＭ２Ｂ培地にグルコース１０ｇ／Ｌと１５ｇ／ＬのＵｒｅａを含む）２ｍｌの液体培地に接種し、３１．５℃で５時間しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量した。
　表１１に、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢを変異処理したｐＬ５ｋＸＳで形質転換した株をＣＭ２ＢＧＵ２培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間６０分と９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中には、１ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン酸を蓄積するクローンが３クローンが存在していた。なお、培地中にもともと含まれていたグルタミン酸は０．１６ｇ／Ｌであり、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳ（変異処理なし）のグルタミン酸蓄積量は０．３１ｇ／Ｌであった。
　表１２に、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢを変異処理したｐＬ５ｋＸＳで形質転換した株をＣＭ２ＢＧＵ培地（Ｕｒｅａが１．５ｇ／Ｌである以外はＣＭ２ＢＧＵ２培地と同組成）にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に、１ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン酸を蓄積するクローンが１クローン存在していた。
・・・・・・・・・・・・
【０１３６】
　表１１において、６０分の変異処理時間を行うことで１ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドをｐＬ５ｋＸＳｍ−２２，表１２において、９０分の変異処理時間を行うことで０．９ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン酸生産能を獲得したプラスミドをｐＬ５ｋＸＳｍ−２７とした。ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳ株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳｍ−２７株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳｍ−２２株を、実施例２記載の条件で培養し、４時間後の菌体量とＬ−グルタミン酸蓄積を分析した。表１３に、独立した３回の実験による平均値を示した。ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳｍ−２７株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ／ｐＬ５ｋＸＳｍ−２２株では有意にＬ−グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのランダムな変異導入によってもＬ−グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお、ｐＬ５ｋＸＳｍ−２２が含むｙｇｇＢ遺伝子の配列は、配列番号７３に示した。（２２型変異）
２２型変異は、４３７番目のプロリンをセリンに置換する変異であり、例えば配列番号５の２７４５位のＣをＴに置換する変異である。また、本変異は、３０６０位のＣをＴに置換する変異を伴っている。この変異型ｙｇｇＢ遺伝子を配列番号７３に、該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】
（１３−３）変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とＬ−グルタミン酸生産確認
　（１３−２）で得られた新規変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入方法は、実施例６に記載された方法でｐＢＳ４Ｓに変異型遺伝子を導入し、ＡＴＣＣ１３８６９の染色体上の野生型のｙｇｇＢ遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株のＡＴＣＣ１３８６９株を実施例２と同様の方法で培養を行う。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定し、変異導入株がＬ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したｙｇｇＢ変異株を取得することが出来る。」（段落【０１３１】〜【０１３８】）
　
セ．「【実施例１４】
【０１３９】
＜変異型ｙｇｇＢ遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性＞
（１４−１）固体培地における４−フルオログルタミン酸感受性
　ｙｇｇＢ変異によってＬ−グルタミン酸の生産能が向上している株では、Ｌ−グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで、ｙｇｇＢ変異によるＬ−グルタミン酸のアナログとして、４−フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例４記載の最少培地に、ＮａＯＨでｐＨ６．７に調整しフィルター滅菌した４−フルオログルタミン酸を終濃度７．５ｍＭとなるように添加した。ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０株、ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株をＣＭ−Ｄｅｘ培地に塗布して一夜培養した後集菌し、滅菌した０．８５％のＮａＣｌ溶液で洗浄し、図６上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは３１．５℃で培養し、その経時変化を図６に示した。４−フルオログルタミン酸を無添加の条件では、ＡＴＣＣ１３８６９株が最も生育が速いのに対し、４−フルオログルタミン酸添加条件ではＡＴＣＣ１３８６９株の生育が抑えられ、ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ株およびＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株の方が生育が良好であることが示された。
　【０１４０】
（１４−２）液体培地における４−フルオログルタミン酸感受性
　実施例４記載の最少培地（ただし寒天を含まない）に、ＮａＯＨでｐＨ６．７に調整しフィルター滅菌した４−フルオログルタミン酸を終濃度１．２５ｍＭ，　２．５ｍＭ，　５ｍＭ，　１０ｍＭ，　２０ｍＭとなるように添加した。ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｙｇｇＢ株、ＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０株、ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株をＣＭ−Ｄｅｘ培地に塗布して３１．５℃で一夜培養した後集菌し、滅菌した０．８５％のＮａＣｌ溶液で洗浄し、液体培地に接種し３１．５℃にて振とう培養した。各菌株において、４−フルオログルタミン酸を無添加の培地でのＯＤ６６０の値が１に到達した時点で培養を終了し、培養液を適当に希釈してＣＭ−Ｄｅｘプレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し、液体培養終了時の生菌数とした。４−フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を１として、４−フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図７に示した。ＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株およびＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０株では、４−フルオログルタミン酸に対する感受性が低下（４フルオログルタミン酸耐性が向上）していることが明らかとなった。
　これらの結果から、４−フルオログルタミン酸等、グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のｙｇｇＢ変異株が取得できることが示された。」（段落【０１３９】〜【０１４０】）
　
（２）本件訂正発明の課題
　本件訂正発明の課題は、コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造において、Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することである（上記記載内容ア．）。
　
（３）本件明細書の実施例８の実験結果について
　請求人は、本件訂正発明１１について、本件明細書の実施例８において、野生株であるＡＴＣＣ１３８６９と１９型ｙｇｇＢ変異株であるＡＴＣＣ１３８６９−１９とのグルタミン酸生産量が比較されているが、グルタミン酸の生産量は、ＡＴＣＣ１３８６９では０．５ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ１３８６９−１９では０．７ｇ／Ｌであり（表７）、両者の差（０．２ｇ／Ｌ）は、実施例２及び３の測定結果の数値からすると、誤差の範囲内にすぎず、ＡＴＣＣ１３８６９−１９によってＬ−グルタミン酸の生産能力が向上したとはいえない、また、甲２８号証、甲第３４号証を提示して、本件明細書の実施例８の条件（Ｔｗｅｅｎ４０添加またはビオチン制限を課さない条件）では、野生株ＡＴＣＣ１３８６９も１９型変異株であるＡＴＣＣ１３８６９−１９も、Ｌ−グルタミン酸を生産しなかったのに対し、Ｔｗｅｅｎ４０添加またはビオチン制限の条件で初めてＡＴＣＣ１３８６９−１９はＬ−グルタミン酸を生産したことから、本件訂正発明１１は、「Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶ、また、発明の詳細な説明は、当業者がＬ−グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の実施例８の実験結果については、各菌株培養後のグルタミン酸濃度は、野生株が０．５ｇ／Ｌであるのに対し、１９型ｙｇｇＢ変異株は０．７ｇ／Ｌを示しており（上記記載内容のク．の表７）、１９型ＹｇｇＢ変異の導入によりグルタミン酸生産能が野生型の１．４倍になったことが明確に記載されており、また、実施例８には、「ＡＴＣＣ１３８６９−１９株と親株のＡＴＣＣ１３８６９株を実施例２と同様の方法で培養を行った。」と記載されている（上記記載内容ク．の【０１２０】）ものの、実施例２と実施例８とは別々に行われた実験であり、実施例８の実験では、実施例８の「ＡＴＣＣ１３８６９株」と実施例８の「ＡＴＣＣ１３８６９−１９株」とは、用いた菌株が異なるという点以外はすべて同一条件下で実験が行われたものと認められ、その測定結果の数値を比較することができるが、実施例２の「ＡＴＣＣ１３８６９株」と実施例８の「ＡＴＣＣ１３８６９株」とは、必ずしもそうとはいえないから、実施例２及び３の測定結果の数値は、実施例８とは別に行われた実験において測定された数値であり、その数値を根拠に実施例８の実験結果を誤差の範囲内にすぎないということはできず、それ以外に「両者の差（０．２ｇ／Ｌ）は、誤差の範囲内にすぎ」ないことを裏付ける証拠は何ら提出されていないので、本件明細書の実施例８の実験結果は、１９型ＹｇｇＢ変異体によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものであるといえるから、発明の詳細な説明は、当業者がＬ−グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。また、この実施例８の結果は、非誘導条件下での再現実験により複数回再現されており（乙第６号証の実験１及び２の結果参照）、このことからも、実施例８の実験結果は、１９型ＹｇｇＢ変異体の導入によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものであるといえる。
　また、甲第２８号証、甲第３４号証の実験結果は、「三角フラスコ」を用いた低速での撹拌培養による実験結果であって、そもそも本件明細書には、「三角フラスコ」を用いて培養を行うことは全く記載されておらず、本件明細書に記載されている「坂口フラスコ」を用いて、本件明細書の実施例８の実験条件に沿った実験を行っても、本件明細書の実施例８の実験結果が再現できなかった証拠は提出されていないので、甲第２８号証、甲第３４号証の記載事項が、本件訂正発明１１は、「Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶことの根拠になるとはいえない。
　よって、本件訂正発明１１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（４）コリネ型細菌の培養条件について
　請求人は、本件訂正発明１１について、本件明細書の実施例１０によると、Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件またはビオチン制限条件という特定の条件下に限り、ＡＴＣＣ１３８６９−１９のＬ−グルタミン酸生産量がＡＴＣＣ−１３８６９と比較して向上したことから、「Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題は、Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件又はビオチン制限条件下でのみ解決できるといえるが、本件訂正発明１１には、これらの条件が加えられておらず、通常の培養による製造法が記載されているにすぎないから、本件訂正発明１１は、上記課題が解決できない範囲に及ぶ、また、発明の詳細な説明は、当業者がＴｗｅｅｎ４０添加又はビオチン制限なしでもＬ−グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件訂正発明は、上記課題を解決するための手段として、「ｙｇｇＢ遺伝子がコリネ型細菌のＬ−グルタミン生産に関与していることを明らかにし、ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し」たものであり（上記記載内容ア．）、コリネ型細菌の培養条件といった好適条件は発明特定事項として課題解決に必ずしも必要な事項ではなく、また、本件明細書の実施例１０は、Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件またはビオチン制限条件というＬ−グルタミン酸生成を誘導できる条件を試験した実験であり（上記記載内容コ．）、その条件下でしかＬ−グルタミン酸生産量の向上が見られないことを示すものではなく、上記（３）で述べたように、実施例８の実験結果は、非誘導条件下で１９型ＹｇｇＢ変異体によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものといえる（上記記載内容エ．及びク．）から、本件訂正発明１１は、「Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶとはいえず、また、発明の詳細な説明は、当業者がＴｗｅｅｎ４０添加又はビオチン制限なしでもＬ−グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていないともいえない。
　よって、本件訂正発明１１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（５）２Ａ−１型変異（本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異）について
　請求人は、本件訂正発明１について、本件訂正発明１の（ｉ）の変異が導入されたコリネ型細菌及びそのＬ−グルタミン酸の生産性は発明の詳細な説明には記載されておらず、また、発明の詳細な説明において、本件訂正発明１の（ｉ’）の変異が導入され、Ｌ−グルタミン酸の生産性向上が実際に確認されたコリネ型細菌は、配列番号６の４１９番目から下流のアミノ酸が欠失され、そのＣ末端側に５つのアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）よりなるＩＳが挿入された変異ｙｇｇＢ（配列番号８のアミノ酸配列）が導入されたコリネ型細菌のみであり（実施例５及び６、表４及び表５）、４１９−５２９番目の領域の任意の位置に任意の長さ及び配列のＩＳ又はトランスポゾンが挿入された変異ｙｇｇＢを有するコリネ型細菌を取得したこと、及びそのＬ−グルタミン酸の生産能を確認したことは具体的に示されていないので、このような変異ｙｇｇＢを有するコリネ型細菌が、上記実施例に示された変異ｙｇｇＢ（配列番号８）を有するコリネ型細菌と同等のＬ−グルタミン酸の生産性を有すると理解することはできないから、当業者は、本件明細書の記載から、本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識できず、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の実施例５及び６には、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９から下流部分のＣ末端側にトランスポゾンにより挿入されたＩＳ（インサーションシークエンス）である５個のアミノ酸が挿入された２Ａ−１型変異が開示され、当該変異を導入したコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を確認したことが記載されており（上記記載内容オ．及びカ．）、この２Ａ−１型変異は、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９―５３３のＹｇｇＢタンパク質のＣ末端側領域が欠失し、５個のアミノ酸に置換されたものであり、その変異の態様からすれば、実質的にはＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠失した変異であるといえるから、当業者であれば、実施例５及び６の記載から、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠失した変異について同様の効果が得られることを認識できるものであり、また、当業者であれば、実施例５及び６の結果は、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構造が改変されることで生じたものと理解することができるから、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域にＩＳ又はトランスポゾンの挿入を導入したコリネ型細菌について、アミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構造が改変された場合には、本件明細書の上記実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識できるので、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載（上記記載内容オ．及びカ．）及び本件明細書の記載（上記記載内容イ．）から、本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識でき、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、本件訂正発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異について、本件訂正発明１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（６）６６型変異、２２型変異（本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異）について
　請求人は、本件訂正発明１について、発明の詳細な説明において、本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異が導入され、Ｌ−グルタミン酸の生産性が実際に確認されているコリネ型細菌は、４３７番目のプロリンがセリンに置換された変異ｙｇｇＢ（配列番号７４のアミノ酸配列）が導入されたコリネ型細菌のみであり（実施例１３）、配列番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換された変異ｙｇｇＢ（配列番号７０のアミノ酸）が導入されたコリネ型細菌（実施例１２）については、Ｌ−グルタミン酸の生産性は確認されておらず、配列番号６等の４１９−５３３又は４１９−５２９の領域に存在する任意のプロリンの１つ以上をその他の任意のアミノ酸に置換した場合に、実施例１３に示された具体例（４３７番目のプロリンをセリンに置換、配列番号７４）と同様にＬ−グルタミン酸の生産性が向上することを認識できず、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の実施例１２及び１３には、アミノ酸番号４２４のプロリンがロイシンに置換された６６型変異を導入したコリネ型細菌を構築したことが記載され（上記記載内容シ．）、アミノ酸番号４３７のプロリンがセリンに置換された２２型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのＬ−グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており（上記記載内容ス．）、また、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域に存在するプロリンの位置については、本件明細書の段落【００７２】に具体的に記載されている（上記記載内容イ．）から、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載（上記記載内容シ．及びス．）及び本件明細書の記載（上記記載内容イ．）に従って、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌を構築し、その中からＬ−グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められないから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明について、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　また、本件明細書には、上述の如く、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌がＬ−グルタミン酸の生産能を向上させることができた実施例が少なくとも１つ存在し、また、本件明細書の段落【００７２】には、ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側のプロリン残基は、ＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられることが記載されている（上記記載内容イ．）から、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載（上記記載内容シ．及びス．）及び本件明細書の記載（上記記載内容イ．）、並びにタンパク質の構造におけるプロリンの役割についての乙第１９号証等の記載から、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌について、アミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構造が改変された場合には、本件明細書の上記実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識でき、Ｌ−グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえるから、本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではない。
　よって、本件訂正発明１の（ｉ’’）の変異について、本件訂正発明１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（７）膜貫通領域の変異（本件訂正発明１の（ｉｉ）の変異）について
　請求人は、本件訂正発明１について、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸１−２３番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、Ｌ−グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、１４番目のロイシンと１５番目のトリプトファンの間に３アミノ酸からなるＩＳ（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）が挿入された１例に過ぎず（実施例７）、当該１−２３番目でのアミノ酸の置換や欠失については具体的に示されておらず、配列番号６等のアミノ酸配列の１−２３番目において、１〜５個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に１〜５個の任意のアミノ酸を挿入した場合に実施例７に示された具体例と同様に、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、また、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸８６−１０８番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、Ｌ−グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、１００番目のアラニンをスレオニンに置換した１例に過ぎず（実施例８）、当該８６−１０８番目でのアミノ酸の挿入や欠失については具体的に示されておらず、配列番号６等のアミノ酸配列の８６−１０８番目において、１〜５個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に１〜５個の任意のアミノ酸を挿入した場合に、実施例８に示された具体例と同様にＬ−グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、さらに、配列番号６等のアミノ酸配列の１１１−１３２番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、Ｌ−グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、１１１番目のアラニンをバリンに置換した１例に過ぎず（実施例９及び１１）、当該１１１−１３２番目でのアミノ酸の挿入や欠失については具体的に示されておらず、配列番号６等のアミノ酸配列の１１１−１３２番目において、１〜５個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に１〜５個の任意のアミノ酸を挿入した場合に、実施例９及び１１に示された具体例と同様にＬ−グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉｉ）の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の実施例７〜９及び１１には、１４番目のロイシンと１５番目のトリプトファンの間に３アミノ酸からなるＩＳ（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）が挿入されたＡ１型変異を導入したコリネ型細菌を構築し、そのＬ−グルタミン酸生産能が向上したことが記載され（上記記載内容キ．）、１００番目のアラニンがスレオニンに置換された１９型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのＬ−グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており（上記記載内容ク．）、１１１番目のアラニンがバリンに置換されたＬ３０型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのＬ−グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており（上記記載内容ケ．）、１１１番目のアラニンがスレオニンに置換された８型変異を導入したコリネ型細菌を構築したことが記載されており（上記記載内容サ．）、また、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、１１０−１３２の領域は、２３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域であり、さらに、訂正請求により、アミノ酸番号１−２３、８６−１０８、１１０−１３２の領域に導入されるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の個数は１〜５個に限定されているから、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載（上記記載内容キ．〜ケ．及びサ．）及び本件明細書の記載（上記記載内容イ．）に従って、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌を構築し、その中からＬ−グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められないから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明１の（ｉｉ）の変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明について、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　また、本件明細書には、上述の如く、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、１１０−１３２の領域における１〜５個のアミノ酸の変異を導入したコリネ型細菌がＬ−グルタミン酸の生産能を向上させることができた実施例がそれぞれ少なくとも１つ存在し、また、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、１１０−１３２の領域は、２３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域で、かつ、上記実施例の変異の位置の近傍の領域であり、さらに、訂正請求により、アミノ酸番号１−２３、８６−１０８、１１０−１３２の領域に導入されるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の個数は１〜５個に限定されているから、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載（上記記載内容キ．〜ケ．及びサ．）及び本件明細書の記載（上記記載内容イ．）から、配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえるから、本件訂正発明１の（ｉｉ）の変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではない。
　よって、本件訂正発明１の（ｉｉ）の変異について、本件訂正発明１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（８）配列番号８５のアミノ酸配列について
　請求人は、本件訂正発明１について、発明の詳細な説明において、野生型ｙｇｇＢタンパク質として具体的に示されているのは、配列番号６、６８、８４及び６２のみであり、配列番号６の複数箇所（４８番目、２７５番目、２９８番目、３４３番目、３９６番目、４３８番目、４４５番目、４５４番目、４５７番目、４７４番目及び５１７−５２０番目）のアミノ酸に対して、任意のアミノ酸への置換又は欠失を行ったことは具体的に示されていないので、配列番号６の上記複数箇所において、任意のアミノ酸で置換した場合や欠失させた場合に、ｙｇｇＢタンパク質として機能するのか当業者は認識することができないし、そのような置換や欠失が導入されたアミノ酸配列に対して、本件訂正発明１の（ｉ）、（ｉ’）、（ｉ’’）又は（ｉｉ）の変異をさらに導入した場合に、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができず、また、発明の詳細な説明は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して、本件訂正発明１の（ｉ）、（ｉ’）、（ｉ’’）又は（ｉｉ）の変異を導入することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、配列番号８５のアミノ酸配列は、コリネ型細菌に保存されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を示したものであり、配列番号６等で示すＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち、アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をＸａａで示したものである（本明細書の段落【００３５】〜【００３６】、上記記載内容イ．の【００７８】〜【００７９】、等）から、配列番号８５のアミノ酸配列についても、他の配列番号のアミノ酸配列と同様にＹｇｇＢタンパク質としての機能を有すると当業者は認識することができるし、また、本件訂正発明１の（ｉ）、（ｉ’）、（ｉ’’）又は（ｉｉ）の変異を導入した場合についても、上記（５）〜（７）で述べたように、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、発明の詳細な説明は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、配列番号８５のアミノ酸配列について、本件訂正発明１は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（９）本件訂正発明２について
　請求人は、本件訂正発明２について、発明の詳細な説明において、本件訂正発明２の変異が導入され、Ｌ−グルタミン酸の生産性が実際に確認されているコリネ型細菌は、４３７番目のプロリンがセリンに置換された変異ｙｇｇＢ（配列番号７４のアミノ酸配列）が導入されたコリネ型細菌のみであり（実施例１３）、配列番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換された変異ｙｇｇＢ（配列番号７０のアミノ酸）が導入されたコリネ型細菌（実施例１２）については、Ｌ−グルタミン酸の生産性は確認されておらず、配列番号６等の４２４番目及び／又は４３７番目のプロリンをその他のアミノ酸に置換（４２４番目のプロリンについて、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンに置換；４３７番目のプロリンについて、スレオニン、セリン、又はチロシンに置換）した場合に、実施例１３に示された具体例（４３７番目のプロリンをセリンに置換、配列番号７４）と同様に、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することを認識できず、本件訂正発明２は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明２の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、上記（６）で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項２は、「前記（ｉ’’）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、４２４位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換し、及び／または４３７位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換する変異である」のように、４２４位または４３７位のプロリンから置換されるアミノ酸が限定されているから、本件訂正発明２の変異について、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、本件訂正発明２は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明２の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１０）本件訂正発明４について
　請求人は、本件訂正発明４について、本件明細書には、配列番号６等のアミノ酸における１１１位のアラニンをスレオニンに置換した変異が導入されたコリネ型細菌及びそのＬ−グルタミン酸の生産性、配列番号６等のアミノ酸における１００位のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されたコリネ型細菌及びそのＬ−グルタミン酸生産性、１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異が導入されたコリネ型細菌及びそのＬ−グルタミン酸生産性についての実施例は記載されていないので、本件訂正発明４の全範囲において、実施例８、９または１１に示された具体例と同様のＬ−グルタミン酸生産性が達成されることを当業者は認識できず、本件訂正発明４は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明４の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、上記（７）で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項４は、「前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニンをスレオニンに、及び／または１１１位のアラニンをスレオニン又はバリンに置換する変異である」のように、１００位または１１１位のアラニンから置換されるアミノ酸が限定されているから、本件訂正発明４の変異について、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、本件訂正発明４は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明４の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１１）本件訂正発明５について
　請求人は、本件訂正発明５について、配列番号６等の１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に挿入される１〜５個の任意のアミノ酸の組み合わせは膨大であり、タンパク質を構成する各アミノ酸は、タンパク質の２次構造の形成や３次元構造の安定化に関わり、タンパク質の機能発現に大きく影響することが知られているから、本件訂正発明５の全範囲において、実施例７に示された僅か１つの具体例と同様に、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することはできず、本件訂正発明５は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明５の変異により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、上記（７）で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項５は、「前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１〜５アミノ酸を挿入する変異である」のように、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に挿入されるアミノ酸の個数は１〜５個に限定されているから、本件訂正発明５の変異について、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、本件訂正発明５は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明５の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１２）本件訂正発明６について
　請求人は、本件訂正発明６について、配列番号８、２０、２２、２４、６４、７０、７４のアミノ酸配列に１〜５個の更なる変異が導入されたアミノ酸配列、それをコードする遺伝子、及び当該変異によるＬ−グルタミン酸の生産性に関して、本件明細書は実質的に記載していないが、タンパク質を構成する各アミノ酸は、タンパク質の２次構造の形成や３次元構造の安定化に関わり、タンパク質の機能発現に大きく影響することが知られているから、配列番号８、２０、２２、２４、６４、７０、７４のアミノ酸配列において、１〜５個の任意のアミノ酸について置換または欠失を行った場合、あるいは任意の部位に１〜５個の任意のアミノ酸を挿入または付加した場合に、どのような変異タンパク質が、過剰量のビオチンを含む培地中でＬ−グルタミン酸の生産性向上をもたらすのか理解することはできないので、本件訂正発明６は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明６により、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、配列番号８、２０、２２、２４、６４、７０、７４のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ４２３個、５３６個、５３３個、５３３個、５２９個、５３３個、５３３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するタンパク質であるから、４２３個、５３６個、５３３個、５３３個、５２９個、５３３個、５３３個のアミノ酸のうちの、１〜５個程度の任意のアミノ酸を置換または欠失させた場合や任意の部位に１〜５個程度の任意のアミノ酸を挿入または付加させた場合に、元のタンパク質の活性を失わない蓋然性が高いことは本件出願時の技術常識であり、また、当業者であれば、本件明細書の記載から、変異を導入するとＹｇｇＢタンパク質の活性が失われてしまうようなアミノ酸の位置等については理解することが可能であるから、本件訂正発明６について、Ｌ−グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　よって、本件訂正発明６は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明６の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１３）本件訂正発明７について
　請求人は、本件訂正発明７について、本件明細書には、配列番号２０の変異型ｙｇｇＢが導入されたＡＴＣＣ１３８６９−Ａ１株及び配列番号２２の変異型ｙｇｇＢが導入されたＡＴＣＣ１３８６９−Ｌ３０株が、４−フルオログルタミン酸の感受性を低下させたことが確認されている（実施例１４）に過ぎず、４−フルオログルタミン酸に対する耐性に関する結果から、Ｌ−グルタミン酸アナログに包含される全ての化合物に対してコリネ型細菌がどのような耐性を有するのか理解することできないから、本件訂正発明７に包含される極めて広範なコリネ型細菌のいずれもが、様々な化合物が広く包含されるＬ−グルタミン酸アナログ一般に対して耐性を向上させることは認識できず、本件訂正発明７は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明７のコリネ型細菌がＬ−グルタミン酸アナログ耐性を向上させることが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の実施例１４には、変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログである４−フルオログルタミン酸耐性が向上した菌株を取得した（上記記載内容セ．）ことが記載され、この実施例１４では、Ａ１型変異、Ｌ３０型変異の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入された２種の菌株がグルタミン酸アナログ耐性を有していたことが開示されており、当業者であれば、複数の変異型ｙｇｇＢ遺伝子導入菌株の結果が開示された本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の記載（上記記載内容ウ．）を踏まえ、変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログに耐性を有する菌株を取得できることを認識できるから、本件訂正発明７は、発明の詳細な説明に記載されたものではないとはいえず、また、複数の変異型ｙｇｇＢ遺伝子導入菌株の結果が開示された本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の記載（上記記載内容ウ．）から、変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログに耐性を有する菌株を取得できることは当業者であれば理解することができるから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明７のコリネ型細菌がＬ−グルタミン酸アナログ耐性を向上させることが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていないとはいえない。
　よって、本件訂正発明７は、発明の詳細な説明に記載されたものといえ、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明７の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１４）本件訂正発明１０について
　本件訂正発明１０は、本件訂正発明１〜２、４〜７に更なる限定を加えた発明であるから、上記（５）〜（１３）で述べたように、本件訂正発明１〜２、４〜７は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１〜２、４〜７の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる以上、本件訂正発明１０は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１０の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１５）本件訂正発明１１について
　請求人は、本件特許の請求項１１に係る発明について、コリネ型細菌を培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を該培地中に生成させること、及び菌体からＬ−グルタミン酸を回収することについては、本件明細書には記載されておらず、また、発明の詳細な説明は、本件特許の請求項１１に記載の方法により、Ｌ−グルタミン酸を製造ができる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
　しかしながら、訂正請求により、請求項１１は、「コリネ型細菌を培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を回収する」に訂正され、Ｌ−グルタミン酸の生成蓄積及び回収は、培地からのみとしているので、本件訂正発明１１は、発明の詳細な説明に記載されたものといえ、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１６）本件訂正発明１２について
　本件訂正発明１２は、本件訂正発明６に記載の変異型ｙｇｇＢ遺伝子と実質的に同一の変異型ｙｇｇＢ遺伝子に係る発明であるから、上記（１２）で述べたように、本件訂正発明６は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明６の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる以上、本件訂正発明１２は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１２の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　
（１７）まとめ
　したがって、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明１〜２、４〜７、１０〜１２の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえるから、本件発明の詳細な説明の記載は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできず、また、本件訂正発明１〜２、４〜７、１０〜１２は、発明の詳細な説明に記載されたものといえるから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
　
３．無効理由６（明確性要件）について
（１）本件訂正発明６、１２の記載について
　請求人は、本件訂正発明６、１２の記載について、「過剰量のビオチン」という記載において、「過剰量」とはいかなる量をいうのか不明であるから、本件訂正発明６、１２は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の段落【００３２】には、「過剰量のビオチン」について、「「過剰量のビオチンを含む条件」とは、例えば、培地中にビオチンを３０μｇ／Ｌ以上、好ましくは４０μｇ／Ｌ、さらに好ましくは５０μｇ／Ｌ含む条件をいう。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「過剰量のビオチン」という記載の意味内容を理解することができるから、本件訂正発明６、１２は、明確に記載されているといえる。
　
（２）本件訂正発明７の記載について
　請求人は、本件訂正発明７の記載について、コリネ型細菌が「Ｌ−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする」と記載されているが、「Ｌ−グルタミン酸アナログ」にはどのような物質が具体的に包含されるのか、その範囲が明らかでないから、本件訂正発明７は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の段落【００６８】には、「Ｌ−グルタミン酸アナログ」について、「Ｌ−グルタミン酸アナログとしては、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、α−メチルグルタミン酸、β−ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸−γ−モノヒドロキサメ−ト、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−モノエチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−ジ−ｔ−ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ジエチルエステル、Ｄ−グルタミン酸、４−フルオログルタミン酸が挙げられ、特に４−フルオログルタミン酸アナログが使用できる。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「Ｌ−グルタミン酸アナログ」に包含される具体的な物質を理解することができるから、本件訂正発明７は、明確に記載されているといえる。
　
（３）本件訂正発明８の記載について
　請求人は、本件訂正発明８の記載について、「コリネ型細菌」に関する発明と「ＤＮＡ」に関する発明という異なる２つの発明が併記されており、また、「さらに（ｉ）のｓｙｍ遺伝子が不活性化するように改変された」と記載されているが、訂正後の請求項１の（ｉ）の変異型ｙｇｇＢタンパク質との関係が不明であるから、本件訂正発明８は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
　しかしながら、本件訂正発明８は、「コリネ型細菌」に係る発明であることは明らかであり、また、本件訂正発明８の「（ｉ）のｓｙｍＡ遺伝子」は、訂正後の請求項１の（ｉ）ではなく、訂正後の請求項８の「（ｉ）配列番号８６の塩基番号５８５〜１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ。」を示すものであることは明らかであるから、本件訂正発明８は、明確に記載されているといえる。
　
（４）本件訂正発明９の記載について
　請求人は、本件訂正発明９の記載について、「α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」と記載されているが、比較の対象が特定されておらず、何に比べてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が「低下」するのか不明であるから、本件訂正発明９は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
　しかしながら、本件明細書の段落【００８３】には、「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性」について、「「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」とは、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」という記載の意味内容を理解することができるから、本件訂正発明９は、明確に記載されているといえる。
　
（５）本件訂正発明１０、１１の記載について
　本件訂正発明１０、１１は、訂正後の請求項６〜９を引用するものであるが、上記（１）〜（４）で述べたように、本件訂正発明６〜９は、明確に記載されているといえる以上、本件訂正発明１０、１１も、明確に記載されているといえる。
　
（６）本件訂正発明６の訂正後の請求項４、５を引用する部分の記載について
　請求人は、本件訂正発明６の訂正後の請求項４、５を引用する部分の記載について、本件訂正発明４は、「前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１００位のアラニンをスレオニンに、及び／または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌」に係る発明であるが、本件訂正発明６の（ｅ）〜（ｊ）以外の変異型ｙｇｇＢ遺伝子との関係が不明であり、また、本件訂正発明５は、「前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１〜５アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌」に係る発明であるが、本件訂正発明６の（ｃ）〜（ｄ）以外の変異型ｙｇｇＢ遺伝子との関係が不明であるから、本件訂正発明６及び訂正後の請求項６を引用する本件訂正発明７〜１１は、明確に記載されているとはいえないと、平成３０年５月２２日付け口頭審理陳述要領書（第８頁下から第４行〜第９頁最終行）で新たに主張している。
　しかしながら、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、本件訂正発明６の訂正後の請求項４を引用する部分については、（ｅ）〜（ｊ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応し、また、本件訂正発明６の訂正後の請求項５を引用する部分については、（ｃ）〜（ｄ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応することは明らかであるから、本件訂正発明６及び訂正後の請求項６を引用する本件訂正発明７〜１１は、明確に記載されているといえる。
　
（７）まとめ
　したがって、本件訂正発明６〜１２は、明確に記載されているといえるから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
　
４．本件特許の請求項３に係る発明についての審判請求
　本件特許の請求項３は、上記第２のとおり、本件訂正により削除された。その結果、本件特許の請求項３に係る発明についての審判請求は、その対象を欠くこととなったので、不適法な請求であり、その補正をすることができないものであるから、特許法第１３５条の規定により却下すべきものである。
　
第８　むすび　
　以上のとおりであるから、請求人の主張する理由及び提出した証拠方法によっては、本件訂正発明１〜２及び４〜１２の特許を無効とすることはできない。
　また、本件特許の請求項３に係る発明は、本件訂正により削除されたため、それらに対して請求人がした審判の請求については却下する。
　審判に関する費用については、特許法第１６９条第２項の規定で準用する民事訴訟法第６１条の規定により、参加によって生じた費用を含めて請求人及びその参加人が負担すべきものとする。
　よって、結論のとおり審決する。