(57)【要約】  本発明は、前立腺関連蛋白由来のペプチドであって、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫および／または液性免疫に認識されるペプチドを提供する。本発明のペプチドは、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法を可能とし、これまでに癌ワクチン候補ペプチドが同定されているHLA-A2またはHLA-A24分子が陰性の前立腺癌患者の治療に貢献しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺関連蛋白由来のペプチドであって、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫および／または液性免疫に認識されるペプチド。
【請求項２】
細胞性免疫および液性免疫に認識される請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸残基数が８〜１１個である、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなる、請求項１から３までのいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
機能的に同等の性質を有する、請求項４に記載のペプチドの誘導体。
【請求項６】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列のC末端アミノ酸をリシンまたはアルギニンで置換したアミノ酸配列からなる、請求項５記載の誘導体。
【請求項７】
請求項１から４までのいずれに記載のペプチドまたは請求項５または６記載の誘導体をコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項１から４までのいずれかに記載のペプチド、請求項５または６記載の誘導体、または請求項８記載のベクターを含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項１０】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む、癌ワクチンである請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から４までのいずれかに記載のペプチド、請求項５または６記載の誘導体、または請求項８記載のベクターを被験者に投与することを含む、前立腺癌を処置または予防するための方法。
【請求項１２】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを癌ワクチンとして投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前立腺癌を処置または予防するための医薬の製造における、請求項１から４までのいずれかに記載のペプチド、請求項５または６記載の誘導体、または請求項８記載のベクターの使用。
【請求項１４】
医薬が配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む癌ワクチンである、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を請求項１から４までのいずれかに記載のペプチドまたは請求項５または６記載の誘導体と接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを用いる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の方法により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１８】
請求項１から４までのいずれかに記載のペプチドまたは請求項５または６記載の誘導体を含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのキット。
【請求項１９】
HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者に由来する抗原提示能を有する細胞に、請求項１から４までのいずれかに記載のペプチドまたは請求項５または６記載の誘導体を取り込ませるか、または請求項８記載のベクターを導入することを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドまたはその誘導体とHLA-A3スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項２０】
配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを用いる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０記載の方法により調製された抗原提示細胞。
【請求項２２】
請求項１から４までのいずれかに記載のペプチド、請求項５または６記載の誘導体、または請求項８記載のベクターを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドまたはその誘導体とHLA-A3スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性の前立腺癌患者の治療に有用な前立腺癌関連蛋白由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は老年期男性に多い癌である（非特許文献１）。前立腺癌にはアンドロゲン除去療法が一過性に奏功するが、ホルモン抵抗性または骨転移性前立腺癌として再発した場合に有効な治療法はない。このような患者にとって特異的免疫療法は有望な選択肢となりうる。なぜなら前立腺癌反応性細胞傷害性T細胞は特異的に転移を探し出すことができるからである。現在までに様々な癌抗原タンパク質およびCTLに認識されるそれら由来のペプチドが同定されている（非特許文献２）。前立腺に関連するものでは、前立腺特異的抗原（PSA）(非特許文献３−５）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）(非特許文献６、７）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）（非特許文献８、９）または前立腺幹細胞抗原（PSCA)（非特許文献１０−１２）に由来するペプチドが幾つか同定されている。これら前立腺関連抗原は、メラノーマに対するメラノサイト分化抗原のように、前立腺癌に対する特異的免疫療法における標的として期待されている（非特許文献１３）。しかしながら、HLA-A2および-A24アレルの頻度が世界的に高いことから、これまでに同定されたペプチドワクチン候補はこれらのアレルに集中していた。【０００３】
HLAクラスIアレルには、構造的相同性およびペプチド結合モチーフ解析に基づき、HLA-A2、-A3、-B7および-B44スーパータイプアレルと提唱されているものがある(非特許文献１４)。それらのうちA3スーパータイプアレルは、コーカサス人の38%、中国人の53%、日本人の46%および北米アフリカ系アメリカ人およびヒスパニックの43%に見られる（非特許文献１４）。
【非特許文献１】Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA.. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 2000;50:7-33.
【非特許文献２】Renkvist N. Castelli C, Robbins PF, Parmiani G. A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 2001;50:3-15.
【非特許文献３】Correale P, Walmsley K, NIeroda C, et al. In vitro generation of human cytotoxic T lymphocytes specific for peptides derived from prostate-specific antigen. J Natl Cancer Inst 1997;89:293-300.
【非特許文献４】Xue BH, Zhang Y, Sosman J, Peace DJ. Induction of human cytotoxic T lymphocytes specific for prostate-specific antigen. Prostate 1997;30:73-78.
【非特許文献５】Correale P, Walmsley K, Zaremba S, Zhu MZ, Schlom J, Tsang KY. Generation of human cytotoxic T lymphocyte lines directed against prostate-specific (PSA) employing a PSA oligoepitope peptide. J Immunol 1998;161:3186-94.
【非特許文献６】Horiguchi Y, Nukaya I, Okazawa K, et al. Screening of HLA-A24-restricted epitope peptides from prostate-specific membrane antigen that induce specific antitumor cytotoxic T lymphosytes. Clin Cancer Res 2002;8:3885-92.
【非特許文献７】Tjoa B, Kenny G, Ragde H, Misrock SL, Murphy G. Presentation of prostate tumor antigens by dendritic cells stimulates T-cell proliferation and cytotoxicity. Prostate 1996;28:65-9.
【非特許文献８】Inoue Y, Takaue Y, Takei M, et al. Induction of tumor specific cytotoxic T lymphocytes in prostate cancer using prostatic acid phosphatase derived HLA-A2402 bindin peptide. J Urol 2001;166:1508-13.
【非特許文献９】Peshwa MV, Shi JD, Ruegg C, Laus R, van Schooten WC. Induction of prostate tumor-specific CD8+ cytotoxic T-pymphocytes in vitro usin antigen-presenting cells pulsed with prostatic acid phosphatase peptide. Prostate 1998;36:129-38.
【非特許文献１０】Dannull J, Diener PA, Prikler L, et al. Prostate stem cell antigen is a promising candidate for immunotherapy of advanced prostate cancer Cancer Res 2001;60:5522-8.
【非特許文献１１】Matsueda S, Kobayashi K, Nonaka Y, Noguchi M, Itoh K, Harada M. Identification of new prostate stem cell antigen-derived peptides immunogenic in HLA-A2(+) patients with hormone-refractory prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2004;53:479-89.
【非特許文献１２】Matsueda S, Yao A, Ishihara Y, et al. A prostate stem cell antigen-derived peptide immunogenic in HLA-A24+ prostate cancer patients. Prostate 2004;60:205-13.
【非特許文献１３】Harada M, Noguchi M, Itoh K. Target molecules in specific immunotherapy against prostate cancer. Int J Clin Oncol 2003; 8:193-9.
【非特許文献１４】Sette, A., and Sidney, J. Ninemajor HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and B polymorphism. Immunogenetics, 50:201-212, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前立腺癌患者の治療の可能性を広げうる前立腺関連蛋白由来ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、前立腺関連蛋白由来のペプチドであって、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫および／または液性免疫に認識されるペプチドを提供する。具体的には、本発明は、配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと機能的に同等の性質を有するペプチド誘導体を提供する。また本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクターを提供する。【０００６】
本発明はまた、本発明のペプチドもしくは誘導体またはベクターを含む前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物、特に癌ワクチンである該医薬組成物、を提供する。【０００７】
本発明はまた、本発明のペプチドもしくは誘導体またはベクターを被験者に投与することを含む前立腺癌を処置または予防するための方法、特に該ペプチドもしくは誘導体またはベクターを癌ワクチンとして投与する該方法、を提供する。【０００８】
本発明はまた、前立腺癌を処置または予防するための医薬の製造における本発明のペプチドもしくは誘導体またはベクターの使用、特に医薬が癌ワクチンである該使用、を提供する。【０００９】
さらに、本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたは誘導体と接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。【００１０】
また、本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者に由来する抗原提示能を有する細胞に、本発明のペプチドまたは誘導体を取り込ませること、または本発明のベクターを導入することを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドまたはその誘導体とHLA-A3スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者に対するペプチド基盤免疫療法、特に癌ワクチン療法が可能となった。本発明は、これまでに癌ワクチン候補ペプチドが同定されているHLA-A2またはHLA-A24分子が陰性である前立腺癌患者の治療に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、LNCaP亜細胞株のHLA-A3スーパータイプアレルの発現を示す図である。白抜き部分は一次抗体なしで染色した結果を示す。
【図２】図２は、ペプチド反応性IgGの特異性を示すグラフである。患者血漿中のペプチド反応性IgGのレベルは、対応ペプチドを固相化したウェルで血漿試料をインキュベートすることにより有意に低下した。
【図３】図３は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者および健常人由来のペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性を示すグラフである。図中に示す各ペプチドで刺激した前立腺癌患者および健常人由来PBMCは、対応するHLA分子を発現する前立腺癌細胞株に対して高い細胞傷害活性を示した。
【図４】図４は、前立腺癌細胞に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性が、HLAクラスI拘束性かつCD8陽性T細胞依存的であることを示すグラフである。ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、抗HLAクラスI抗体によって有意に抑制された。
【図５】図５は、前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性がペプチド特異的CTLに依存することを示すグラフである。ペプチド刺激PBMCの前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性は、対応ペプチドをパルスしたコールド標的細胞により有意に抑制された。
【図６】図６は、各種のHLA-A3スーパータイプアレルを有する前立腺癌細胞に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性を示すグラフである。図中に示すペプチドで刺激したHLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者由来のPBMCは、各種HLA-A3スーパータイプアレル分子を発現する前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のペプチドは前立腺関連蛋白の一部より成るペプチド断片である。本発明において前立腺関連蛋白とは、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）または前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）を意味する。これらのアミノ酸配列は、以下のGenebankアクセション番号にて開示されている：M26663（PSA）；AF007544（PSMA）；M24902（PAP）。【００１４】
「HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合できる」とは、ペプチドがHLA-A3スーパータイプアレル分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。一般にHLA分子に結合するペプチドはHLAの型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有する。その規則性あるアミノ酸配列を結合モチーフと呼ぶ。HLA-A3スーパータイプアレル分子には、HLA-A11、-A31、-A33、-A0301および−A6801分子が含まれ、これらは結合モチーフを共有する（Sette, A., and Sidney, J. Ninemajor HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and B polymorphism. Immunogenetics, 50:201-212, 1999.）。HLA-A3スーパータイプアレル分子に対する結合モチーフを有するペプチドは、Bioinformatics and Molecular Analysis Section（NIH, Bethesda, MD）等のコンピューター解析により決定することができる。【００１５】
ペプチドが「細胞性免疫に認識される」とは、そのペプチドが特異的なCTLに認識される、言い換えればペプチド特異的CTLを誘導する能力を備えていることを意味する。ペプチドがCTLに認識されるか否かは、例えばCTLがそのペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイトカイン（例えばIFN-γ）を産生するか否かをELISA法等により測定して判断することができる。また、51Cr放出測定法等により誘導されたCTLの細胞傷害活性を確認することができる。CTLによる認識性を考慮すると、本発明のペプチドのアミノ酸残基数は８〜１４個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは８〜１１個、特に好ましくは９または１０個である。【００１６】
ペプチドが「液性免疫に認識される」とは、そのペプチドに特異的なIgGが生体内に存在すること、つまりはペプチド特異的IgGが血漿から検出されることを意味する。本発明者らは以前、ある種の癌患者の血漿中にCTLエピトープペプチドに反応するIgGが高頻度に検出されること（Nakatsura T, Senju S, Ito M, Nishimura Y, Itoh K., Eur J Immunol 2002;32:826-36; Ohkouchi S, Yamada A, Imai N, et al., Tissue Antigens 2002;59:259-72）、およびPSAまたはPSMA由来のCTL指向性ペプチドに反応するIgGが前立腺癌患者および健常人の血漿において検出できること（Harada M, Kobayashi K, Matsueda S, Nakagawa M, Noguchi M, Itoh K., Prostate 2003;57:152-9.; Kobayashi K, Noguchi M, Itoh K, Harada M., Cancer Science 2003;94:622-7）を観察している。血漿中のIgGに認識され易いペプチドは、ペプチド特異的CTLの誘導能を有することが期待される。血漿中の特異的IgGは、常套的ELISA法等によって測定することができる。【００１７】
細胞性免疫および液性免疫の両方に認識されるペプチドは生体内において免疫原性が高いことが期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドが本発明において特に好適に用いられる。【００１８】
本発明におけるペプチドの誘導体は、配列番号４、１５、２２、３２、または４２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸を置換し、および／またはそのアミノ酸残基数が８〜１１個となる範囲で１または２個のアミノ酸を欠失および／または付加したペプチドである。「機能的に同等の性質を有する」とは、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫および／または液性免疫に認識される性質を備えることを意味する。「機能的に同等の性質を有する」か否かは、前記の方法に従い判断することができる。【００１９】
アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させない観点から、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノおよび芳香族アミノ酸等）の間で行うことが好ましい。また、アミノ酸の置換、欠失および／または付加は、HLA分子結合モチーフ上許容されるものが好ましい。すなわち、ペプチドの誘導体は、そのC末端アミノ酸がリシンまたはアルギニンであることが好ましい。配列番号４、１５、２２、３２、または４２に示すアミノ酸配列のC末端アミノ酸をリシンまたはアルギニンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体が、本発明に特に好適である。【００２０】
本発明のペプチドおよび誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、アミノ酸のN-アシル化物、O-アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドおよび誘導体は、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、N末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基等を結合するものや、C末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、t-ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。【００２１】
本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）などに記載されている方法が挙げられる。【００２２】
本発明のペプチドまたは誘導体は、本発明のペプチドまたは誘導体のアミノ酸配列を含むペプチドが細胞内で断片化されて生じ、HLA分子との複合体として提供される場合もある。本発明には、そのような態様で本発明のペプチドまたは誘導体を利用することも含まれる。本発明のペプチドまたは誘導体を提供できる限り、ペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。【００２３】
本発明のペプチドおよび誘導体は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを効率的に誘導し増殖させることができる。即ち本発明のペプチドおよび誘導体は、前立腺癌反応性CTLを誘導するためや、前立腺癌に対する医薬組成物を製造するためなどに使用することができ、前立腺癌の治療において有用である。【００２４】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含有し、その含有ペプチドまたは誘導体に特異的な前立腺癌反応性CTLを誘導することにより治療効果を発揮する。本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用することができる。癌患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合体なので、複数種類のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良い。本発明の医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状製剤、リピッドを結合させた製剤などにしてもよい。【００２５】
投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中の本発明のペプチドまたは誘導体の量として０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇである。これを数日、数週または数ヶ月に１回、１〜３年間継続して投与することが好ましい。【００２６】
本発明の核酸分子は、本発明のペプチドまたは誘導体を提供できるものである。本発明の核酸分子が組み込まれたベクターを抗原提示細胞に導入し発現させると、本発明のペプチドまたは誘導体がHLA分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。この抗原提示細胞はペプチド特異的前立腺癌反応性CTLを効率的に増殖させることができる。本発明の核酸分子を前立腺癌の治療に用いる場合、その核酸分子を含むベクターを患者に投与して患者体内で発現させてもよく、あるいはそのベクターを体外で適当な細胞、例えば患者由来の樹状細胞に導入した後にその細胞を患者体内に戻しても良い。これらの方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。【００２７】
本発明の核酸分子を組み込むベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P.  Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。【００２８】
本発明のベクターは、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物とすることができる。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、DNA含量として0.1μg〜100mg、好ましくは1μg〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。【００２９】
以上の記載から明らかなように、本発明のペプチドおよび誘導体、並びに本発明のベクターは、前立腺癌を処置または予防するための方法、および前立腺癌を処置または予防するための医薬の製造に使用することができる。【００３０】
本発明のCTL誘導方法は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを提供するものである。本発明において「前立腺癌反応性」とは、前立腺癌細胞上の癌抗原ペプチドとHLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害しうる性質を有することを意味する。本発明のCTL誘導方法は、例えば、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者から採取された末梢血単核細胞（PBMC）を、in vitroで本発明のペプチドまたは誘導体の存在下培養することにより行う。本方法により誘導されるCTLは、養子免疫療法、すなわちPBMCを採取した患者体内に誘導したCTLを戻して癌細胞を傷害する癌治療法に有用である。つまり本CTLは、前立腺癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。【００３１】
本発明のCTL誘導キットは、前記CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。【００３２】
本発明の抗原提示細胞調製方法は、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを誘導するための抗原提示細胞を提供するものである。本発明の抗原提示細胞調製方法は、例えばHLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドまたは誘導体をパルスして取り込ませるか、あるいはそのような細胞に本発明のベクターを周知の方法により導入し発現させることにより行う。抗原提示能を有する細胞は例えば樹状細胞であり、患者より採取したPBMCから培養プレート接着細胞を分離し、IL-4およびGM-CSFの存在下で約１週間培養することにより調製することができる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘導体とHLA分子との複合体を特異的に認識するCTLを誘導することができ、患者に投与されると患者体内で前立腺癌反応性CTLの誘導を促進することができる。つまり本抗原提示細胞は、前立腺癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。【００３３】
本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。
１．  方法
１．１  患者
HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者（HLA-A11陽性（n = 5）、-A31陽性（n = 5）および-A33陽性（n = 5））より事前の文書による承諾を得てPBMCを得た。HLA-A3陽性または-A68.1陽性患者は日本人においては極めて頻度が低いため（1.6％および0.5％）（Aizawa M. The Proceedings of the 3rd Asia-Oceania Histocompaatibility Workshop Conference, pp. 1090-1103. Oxford: Oxford University Press, 1986.）、それら由来のPBMCは入手できなかった。PBMCを採取した患者はいずれもHIV非感染であった。末梢血20mlを採取し、フィコール・コンレイ比重遠心法によりPBMCを調製した。試料は全て実験で使用するまで低温にて保存した。癌患者PBMC上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した：抗HLA-A11モノクローナル抗体（ｍAb）(Cat＃ 0284HA; One Lambda Inc., Canoga, CA, USA)；抗HLA-A31 mAb (Cat＃ 0273HA; One Lambda)；抗HLA-A33 mAb (Cat＃ 0612HA; One Lambda)。なお、本試験開始に当たっては、久留米大学の医療に関する倫理委員会の承認を得て行った。【００３５】
１．２  細胞株
CIRは、HLAクラスI分子の遺伝子導入に適したBリンパ芽球様細胞株である（CRL-1993）。C1R-A11、-A31および-A33は、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現する亜細胞株であり、これら亜細胞株上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は以前に報告している（Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K., Clinical Cancer Reseach 2004;10:1112-20.）。LNCaPはHLA-A*0201陽性前立腺癌細胞株である（CRL-1740）。HLA-A11、-A31および-A33分子をそれぞれ発現するLNCaP亜細胞株を製造するため、既報の方法により、HLA-A1101、-A3101または-A3303プラスミドｃDNAを真核細胞発現ベクターであるpCR3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に挿入した（Yang D, Nakao M, Shichijo S, et al., Cancer Res 1999;59:4056-63.）。ジーン・パルサー（Bio RAD, Richmond, CA, USA）を用いてエレクトロポレーションを行った。LNCaP-A11、-A31および-A33が、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現する亜細胞株である（図１）。これら細胞株は全て10％FCS含有RPMI 1640（Invitrogen）で培養した。【００３６】
１．３  PBMCからのペプチド反応性CTLの誘導
ペプチド反応性CTLは既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28.）。PBMCをin vitroにてPSA、PAPおよびPSMA由来ペプチドまたは対照ペプチドで刺激して、対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、C1R-A31またはC1RA33細胞に応答して産生されるIFN-γを測定した。詳細には、U底96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において培養液200μl中で、PBMC（1 x 105 細胞／ウェル）を各ペプチド（10μl／ml）とquadruplicate（４ウェル一組）にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Gibco-BRL）より構成された。3日毎に培養液の半分を除去して対応ペプチド（10μg/ml）を含む新しい培養液と交換した。培養15日目に、対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞で培養細胞の半分を刺激し、残りの半分は対照ペプチドであるHIVペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞と培養した。18時間インキュベートした後上清を回収し、インターフェロン（IFN）-γのレベルを酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、P値が0.05未満であり、かつHIVペプチドをパルスした細胞と比較して対応ペプチドをパルスした細胞に応答して50 pg/mlを超えるIFN-γが産生された場合に陽性と判断した。【００３７】
１．４  ペプチド
HLA-A3、-A11、-A31、-A33および-A68.1分子に対する結合モチーフに基づき、42種類の前立腺関連蛋白由来ペプチド（PSA由来ペプチド10種類、PAP由来ペプチド12種類およびPSMA由来ペプチド20種類）を調製した（Parker KC, Bednarek MA, Cokigan JE., J Immunol 1994;152:163-75.）。これら５種類のHLA-Aアレルは結合モチーフを共有するがHLA-A3またはHLA-A68.1陽性の日本人は非常に稀なことから、本研究ではHLA-A11、-A31および-A33分子に対する結合能を検討した。各ペプチドのアミノ酸配列は表１に示す。
【表１】
2007000935.tif 000002
ペプチドは全て純度＞９０％であり、Biologica Co.（Nagoya, Japan）より購入した。HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合する対照ペプチドとして、インフルエンザ（Flu）ウィルス由来ペプチド（NVKNLYEKVK）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）由来ペプチド（AVFDRKSDAK）、チロシナーゼ関連タンパク質２（TRP2）由来ペプチド（LLGPGRPYR）、およびHIV由来ペプチド（RLRDLLLIVTR）を使用した。ペプチドは全てジメチルスルホキシドを用いて10μg/mlの用量で溶解した。【００３８】
１．５  細胞傷害活性の測定
LNCaP、LNCaP-A11、LNCaP-A31またはLNCaP-A33に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出測定法により測定した。フィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞を陰性対照細胞として使用した。丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、示したエフェクター細胞／標的細胞の比率でエフェクター細胞とともに培養した。細胞傷害活性測定実験の直前にCD8陽性T細胞を CD8 Positive Isolation Kit （Dynal, Oslo, Norway）により単離した。特異的51Cr放出は、試験におけるc.p.m.から自然放出によるc.p.m.を差し引いて計算した。エフェクター細胞なしでインキュベートした試料の上清より自然放出を決定し、その後試料を1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートして全放出を決定した。抗体による阻害実験では、培養開始時にウェルに10μg/mlの抗HLAクラスI mAb（W6/32：マウスIgG2a）、抗クラスII(HLA-DR) mAb（L243：マウスIgG2a）または抗CD14 mAb（H14：マウスIgG2a）を添加した。【００３９】
１．６  コールド標的細胞阻害実験
ペプチド反応性CTLの特異性は、コールド標的細胞による阻害実験により確認した。詳細には、丸底96ウェルプレートにおいて51Cr標識標的細胞（2 x 103 細胞／ウェル）をコールド標的細胞（2 x 104 細胞）の存在下エフェクター細胞（2 x 104 細胞／ウェル）とともに培養した。対応ペプチドまたHIVペプチドのいずれかでパルスしたC1R-A11、-A31および-A33をコールド標的細胞として使用した。【００４０】
１．７  ペプチド特異的IgGの検出
血漿中のペプチド特異的IgGのレベルは、既報のようにしてELISAにより測定した（Nakatsura T, Senju S, Ito M, Nishimura Y, Itoh K., Eur J Immunol 2002;32:826-36.）。詳細には、20μg／ウェルの濃度でペプチドを固相化したプレートをBlock Ace （Yukijirushi, Tokyo, Japan）でブロッキングし、0.05％ Tween-20- Block Aceで希釈した血漿試料（100μl／ウェル）をプレートに添加した。4℃で24時間インキュベートした後プレートを洗浄し、1:1000希釈のウサギ抗ヒトIgG（γ鎖特異的）（Dako, Glostrup, Denmark）とともにさらに2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1:100希釈のヤギ抗ウサギIgG結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（En Vision; Dako）（100μl）を各ウェルに添加し、プレートを室温で40分間インキュベートした。プレートを再び洗浄した後テトラメチルベンジジン基質溶液（KPL, Guildford, UK）（100μl／ウェル）を添加し、その後１M リン酸を添加して反応を停止させた。段階希釈した各試料の吸光度（OD値）を比較してペプチド反応性IgGレベルを評価した。値はOD U/mlで示す。1:100希釈の血漿のOD値がコントロールであるHIV ペプチドに対するIgGについてのOD値の平均+3SDを超える場合に、対応ペプチドに反応するIgGが陽性であると判断した。ペプチド反応性IgGの特異性を確認するため、ペプチドを固相化したプレートで試料を培養し、上清中のペプチド特異的IgGのレベルをELISAにより測定した。【００４１】
１．８  統計
データの統計学的有意差は、両側スチューデントt検定により決定した。0.05未満のP値を統計学的に有意であると判断した。【００４２】
２．  結果
２．１  PSA、PAPおよびPSMA由来ペプチドに反応するIgGの検出
はじめに、42種類の前立腺関連蛋白由来ペプチドが前立腺癌患者のIgGによって認識されるかについて検討した。CTL誘導能を調べるin vitro感作実験を多数のペプチドを用いて行うことは困難であり、また、CTL誘導ペプチドに反応するIgGは幾つかのタイプの癌患者の血漿中に高頻度に検出されることから、我々ははじめにこのスクリーニングを行った。結果は表２に示す。
【表２】
2007000935.tif 000003
PSA由来ペプチドではPSA 104-112、PSA 60-68、PSA 16-24またはPSA 100-109ペプチド、PAP由来ペプチドではPAP 39-47、PAP 155-163、PAP 171-180またはPAP 248-257ペプチド、そしてPSMA由来ペプチドではPSMA 403-411、PSMA 641-649、PSMA 207-215およびPSMA 431-440ペプチドに反応するIgGが、前立腺癌患者の血漿中に検出される頻度が高かった。ペプチド反応性IgGは、健常人よりも癌患者において検出される頻度が高いようであった。【００４３】
次に、ペプチド反応性IgGの試験の妥当性について確認した。代表的結果を図２に示す。患者血漿中のPSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215およびPSMA 431-440ペプチドに反応するIgGのレベルは、各対応ペプチドを固相化したウェルで試料をインキュベートすることにより有意に減少した。これは、本試験がペプチド特異的IgGを検出する試験として信頼できることを意味する。【００４４】
２．２  前立腺癌患者PBMCからのペプチド反応性CTLの誘導
癌患者のIgGに高頻度に認識される候補ペプチドが、HLA-A11陽性、-A31陽性および−A33陽性前立腺癌患者のPBMCからペプチド反応性CTLを誘導できるかについて検討した。IgGに認識される頻度が低い陰性対照として、PSA 36-45、PAP 19-28およびPSMA 199-207ペプチドを使用した。陽性であった結果を表３に示す。
【表３】
2007000935.tif 000004
PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215およびPSM A431-440ペプチドが、HLA-A11陽性癌患者5人のうちそれぞれ3、1、1、0および0人、HLA-A31陽性癌患者5人のうちそれぞれ3、3、1、2および1人、HLA-A33陽性癌患者5人のうちそれぞれ2、3、4、3および2人のPBMCから対応ペプチド反応性のCTLを誘導した。これらペプチドはまた、健常人のPBMCからペプチド反応性CTLを効率的に誘導した。これらの結果は、PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215およびPSMA 431-440ペプチドが、HLA-A3スーパータイプアレルを有する前立腺癌患者のPBMCからペプチド特異的CTLを誘導するためのペプチドとして有用であることを示唆している。【００４５】
２．３  HLA-A3スーパータイプアレルを有する前立腺癌患者のPBMCからの前立腺癌反応性CTLの誘導
PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215およびPSMA 431-440ペプチドによるin vitro刺激によって誘導されたCTLが前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示しうるか否かについて検討した。HLA-A11陽性患者2人（#9および#13）、HLA-A11陽性健常人1人(#14)、HLA-A31陽性患者1人(#22)およびHLA-A33陽性患者3人(#14、#15および#19)に由来するPBMCを上記ペプチドで刺激し、これらの患者由来のペプチド反応性CTLがHLA-A11、HLA-A31およびHLA-A33分子を発現する前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示しうるかについて検討した。結果は図３に示す。PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215およびPSMA 431-440ペプチドのそれぞれによりin vitroにおいて刺激したHLA-A11陽性患者および健常人由来のPBMCは、LNCaP-A11細胞に対してLNCaP細胞およびHLA-A11陽性T芽球化細胞に対してよりも高レベルな細胞傷害活性を示した。同様に、これらペプチドはHLA-A31陽性患者およびHLA-A33陽性患者のPBMCから前立腺癌反応性CTLを誘導する能力を有していた。以上の結果は、PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215またはPSMA 431-440ペプチドによりin vitroにおいて刺激したPBMCは、HLA-A11、-A31あるいは-A33拘束性に前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示しうることを示唆する。【００４６】
２．４  前立腺癌細胞に対するペプチド特異的かつCD8陽性T細胞依存性細胞傷害活性
ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に関与する細胞の同定を試みた。図４に示すように、PSA 16-24、PAP 155-163、PAP 248-257、PSMA 207-215またはPSMA 431-440 ペプチドで刺激したHLA-A11陽性患者(#9および#13)、HLA-A11陽性健常人(#10および#14)、HLA-A31陽性患者(#22)およびHLA-A33陽性患者(#19および#14)由来のCD8陽性T細胞の細胞傷害活性は、抗HLAクラスI mAbの添加により有意に阻害されたが、抗HLAクラスII mAb (HLA-DR)またはアイソタイプ適合対照抗体として用いた抗CD14 mAbの添加によっては阻害されなかった。この結果は、前立腺癌細胞に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性が、HLAクラスI拘束性CD8陽性T細胞に依存することを示唆する。【００４７】
さらに、LNCaP-A11、-A31、および-A33細胞に対するそれらの細胞傷害活性は、対応ペプチドをパルスした非標識C1R-A11、-A31および-A33細胞を添加すると有意に抑制されたが、HIVペプチドをパルスした細胞によっては抑制されなかった（図５）。一部の例外はあるものの（PSMA 207-215で刺激した健常人（#14）由来のPBMC；PSMA 431-440ペプチドで刺激した患者（#14）由来のPBMC）、本結果は全体として、ペプチド刺激PBMCの前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性が対応ペプチド特異的なCD8陽性T細胞によることを示唆している。【００４８】
２．５  HLA-A3スーパータイプアレルを有する前立腺癌細胞に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性
あるHLA-A3スーパータイプアレル分子陽性のペプチド刺激PBMCが、他のHLA-A3スーパータイプアレルを発現する前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示すかについて検討した。図６に示すように、in vitroにおいてPSA 16-24ペプチドで刺激した患者#9（HLA-A11陽性）由来のPBMC、PAP 155-163ペプチドで刺激した患者#2（HLA-A31陽性）由来のPBMC、およびPAP 248-257ペプチドで刺激した患者#22（HLA-A33陽性）由来のPBMCは、LNCaP-A11、LNCaP-A31およびLNCaP-A33細胞のいずれに対してもLNCaP細胞と比較して高レベルな細胞傷害活性を示した。PHA刺激T芽球化細胞に対する細胞傷害活性は観察されなかった。これらの結果は、本発明のペプチドで刺激したPBMCがHLA-A3スーパータイプに属するHLA分子を有する前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を発揮することを示している。即ち本発明のペプチドは、HLA-A3スーパータイプの種類によらず、HLA-A3スーパータイプアレル分子陽性の患者に広く使用できると言える。
【図１】
2007000935.tif 000005
【図２】
2007000935.tif 000006
【図３】
2007000935.tif 000007
【図４】
2007000935.tif 000008
【図５】
2007000935.tif 000009
【図６】
2007000935.tif 000010
【配列表】
2007000935000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
配列番号４、１５または２２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
請求項４記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項４記載のペプチドまたは請求項８記載のベクターを含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項１０】
癌ワクチンである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を請求項４記載のペプチドと接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
請求項１５記載の方法により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１８】
請求項４記載のペプチドを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのキット。
【請求項１９】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、請求項４記載のペプチドを取り込ませるか、または請求項８記載のベクターを導入することを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
請求項１９記載の方法により調製された抗原提示細胞。
【請求項２２】
請求項４記載のペプチドまたは請求項８記載のベクターを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのキット。
【請求項２３】
配列番号４２に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２４】
請求項２３記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２３記載のペプチドまたは請求項２５記載のベクターを含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項２７】
配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドまたは該アミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項２８】
癌ワクチンである、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を請求項２３記載のペプチドと接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項３０】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項３２】
請求項２３記載のペプチドを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのキット。
【請求項３３】
配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのキット。
【請求項３４】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、請求項２３記載のペプチドを取り込ませるか、または請求項２５記載のベクターを導入することを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項３５】
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子陽性前立腺癌患者から採取された抗原提示能を有する細胞に、配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを取り込ませるか、または該アミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを導入することを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の方法により調製された抗原提示細胞。
【請求項３７】
請求項２３記載のペプチドまたは請求項２５記載のベクターを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのキット。
【請求項３８】
配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドまたは該アミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む、前立腺関連蛋白由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ３スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのキット。
【国際調査報告】
2007000935.tif 000011
2007000935.tif 000012
2007000935.tif 000013
2007000935.tif 000014
2007000935.tif 000015
2007000935.tif 000016
2007000935.tif 000017