(57)【要約】高いＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製阻害活性を有し、ＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防および治療に有用である化合物の簡便で安価な製造方法を提供する。  式（１）：2007000994.tif 000064〔式中、Ａは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基などの基を表す。〕で示される化合物または製薬上許容されうるそれらの塩を生物学的に製造する方法であって、式（２）：2007000994.tif 000065で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株の菌体または培地／培養液中に式（３）：2007000994.tif 000066〔式中、Ａは上記式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基などの基を表す〕で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を添加して、該菌株に直接、上記式（１）の化合物を産生させることを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
2007000994.tif 000058
〔式中、Ａは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、−ＯＲ１、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；
ここでＲ１は、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を表す。〕
で示される化合物または製薬上許容されうるそれらの塩を生物学的に製造する方法であって、
式（２）：
2007000994.tif 000059
で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株の菌体または培地／培養液中に式（３）：
2007000994.tif 000060
〔式中、Ａは、上記式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を添加して、該菌株に直接、上記式（１）の化合物を産生させることを特徴とする方法。
【請求項２】
式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩のＲが、メチル基である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩が、式（３）の化合物の塩酸塩である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
Ａが、置換されていてもよいフェニル基または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニルオキシ基である、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
式（２）の化合物を産生する菌株が、Ｆ１４７６株または当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、またはそれらの変異株である、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
式（２）の化合物を産生する菌株が、以下のａ）およびｂ）から選択される、１以上の特徴を有している菌株、またはそれらの変異株である、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
ａ）菌株が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍに属するか、もしくはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと同等の形状を示す；
ｂ）菌株の遺伝子のＩＴＳ領域の配列が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株のそれと、９９％以上相同する。
【請求項７】
式（２）の化合物を産生する菌株が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株、またはその変異株である、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
式（３）：
2007000994.tif 000061
〔式中、Ａは、請求項１の式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩の培地添加物としての使用。
【請求項９】
式（３′）：
2007000994.tif 000062
〔式中、Ａは、請求項１の式（１）の化合物と同じ定義を意味する。〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩。
【請求項１０】
式（３）：
2007000994.tif 000063
〔式中、Ａは、請求項１の式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を含む培地添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する高い複製阻害活性を有する、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防および治療に有用な化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行しそのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。【０００３】  ＨＣＶは１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属に分類される。【０００４】  ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。【０００５】  よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対症療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。【０００６】  現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン療法が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。【０００７】  近年、リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。【０００８】  ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、現在の所、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていない。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。【０００９】  しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。【００１０】  本願発明者らは、糸状菌類に属する、フザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）から下記化合物を単離し、該化合物並びにその誘導体が高いＨＣＶの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献１）。なお、該化合物は、国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号（特許文献２）にも開示されており、抗真菌活性および免疫反応阻害作用を有することが知られている。【００１１】
2007000994.tif 000002
【００１２】  更に本願発明者らは、該化合物およびその誘導体を全合成する方法を開発し、その方法により得られた各種誘導体が同様に優れたＨＣＶ複製阻害活性を有することを見出した（特許文献３）。
【特許文献１】国際公開第２００４／０７１５０３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／５６７５５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／００５３７２号パンフレット
【非特許文献１】ブイ・ローマンなど著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９９年、第２８５巻、第１１０−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  本発明者は、鋭意研究を行った結果、上記化合物を産生する菌株（「Ｆ１４７６株」並びにその変異株など）を用いて、培養液中に特定のアミノ酸誘導体の塩を添加することにより、上記化合物の誘導体を直接該菌株に産生させる方法を見出した。さらに本発明者らは、上記化合物の誘導体を直接該菌株に産生させるための最適な培養条件、並びに添加するアミノ酸誘導体の最適な塩を見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】  本発明は、高いＨＣＶの複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶ感染による肝臓疾患の予防および治療に有用な化合物の簡便で有用な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  本発明は、
式（１）：
2007000994.tif 000003
〔式中、Ａは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、−ＯＲ１、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；【００１６】  ここでＲ１は、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を表す。〕
で示される化合物または製薬上許容されうるそれらの塩を生物学的に製造する方法であって、【００１７】  式（２）：
2007000994.tif 000004
で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株の菌体または培地／培養液中に式（３）：【００１８】
2007000994.tif 000005
〔式中、Ａは、上記式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を添加して、該菌株に直接、上記式（１）の化合物を産生させることを特徴とする方法に関する。【００１９】  さらに本発明は、式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩のＲが、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、特にメチル基であることを特徴とする上記の製造方法に関する。【００２０】  さらに本発明は、式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩が、式（３）の化合物の塩酸塩であることを特徴とする上記の製造方法に関する。【００２１】  さらに本発明は、Ａが、置換されていてもよいフェニル基または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニルオキシ基である、上記の製造方法に関する。【００２２】  さらに本発明は、式（２）の化合物を産生する菌株が、Ｆ１４７６株または当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、特にＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株またはそれらの変異株である、上記の製造方法に関する。
さらに本発明は、式（２）の化合物を産生する菌株が、以下のａ）およびｂ）から選択される、１以上の特徴を有している菌株、またはそれらの変異株である、上記の製造方法に関する。
ａ）菌株が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍに属するか、もしくはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと同等の形状を示す；
ｂ）菌株の遺伝子のＩＴＳ領域の配列が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株のそれと、９９％以上相同する。【００２３】  また本発明は、式（３）：
2007000994.tif 000006
〔式中、Ａは、上記式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩の培地添加物としての使用に関する。【００２４】  また本発明は、式（３′）：
2007000994.tif 000007
〔式中、Ａは、上記式（１）の化合物と同じ定義を意味する。〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩に関する。【００２５】  さらに本発明は、式（３）：
2007000994.tif 000008
〔式中、Ａは、上記式（１）の化合物と同じ定義を意味し；Ｒは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す〕
で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を含む培地添加物に関する。
【発明の効果】
【００２６】  本発明は、Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染症の治療および予防に有効である式（１）の化合物もしく製薬上許容されうるそれらの塩を、簡便でかつ安価に製造することができる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】化合物１のＵＶスペクトラムを示した図である。
【図２】化合物１の標品のＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図３】Ｆ１４７６株の、ＳＮＡ上でのｗｅｔ部分の形態的性状の例を示した図である。
【図４】Ｆ１４７６株の、ＳＮＡ上でのｆａｓｔ部分の形態的性状の例を示した図である。
【図５】Ｆ１４７６株の、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ領域／４６６ｂｐ）の近隣結合系統樹を示した図である。
【図６】Ｆ１４７６株の、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ領域／４６６ｂｐ）の最大節約系統樹を示した図である。
【図７】Ｆ１４７６株の、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＴＥＦ  １−α／６７７ｂｐ）領域の近隣結合系統樹を示した図である。
【図８】Ｆ１４７６株の、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＴＥＦ  １−α／６７７ｂｐ）領域の最大節約系統樹を示した図である。
【図９】Ｆ１４７６株の、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＧＳ／２３５８ｂｐ）領域の近隣結合系統樹を示した図である。
【図１０】Ｆ１４７６株の、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＧＳ／２３５８ｂｐ）領域の最大節約系統樹を示した図である。
【図１１】Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７を培養して得られた試料液のＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】  本明細書においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、所定の炭素数を有する飽和炭化水素基を意味する。炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル、３−メチルペンチル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、３−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、１，１−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、３−エチルペンチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、３−メチルヘプチル、２，２−ジメチルヘキシルなどを挙げることができる。【００２９】  また直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基とは、所定の炭素数を有し、すくなくとも１つの二重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、ビニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、プレニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、５−ヘキセニル、４−メチルー３−ペンテニル、１−ヘプテニル、６−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、７−オクテニルなどを挙げることができる。【００３０】  また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、所定の炭素数を有し、少なくとも１つの三重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜８のアルキニル基としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、３−ヘプチニル、４−ヘプチニル、５−ヘプチニル、６−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニル、４−オクチニルなどを挙げることができる。【００３１】  またシクロアルキル基とは、所定の炭素数を有する環状飽和炭化水素基を意味する。たとえば、炭素数３〜８のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。
本明細書において記載されるアリール基は、芳香族性を有する単環または多環の炭化水素基を意味する。具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレンなどから誘導される基を挙げることができる。【００３２】  本明細書において記載されるヘテロアリール基は、芳香族性を有し、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子から独立して選択されるヘテロ原子１〜４個（好ましくは１または２個）を環員として含む４〜６員の単環または７〜１０員の二環の環状基（好ましくは単環基）を意味する。具体的には、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、ピリジン、チアゾール、イミダゾール、ピリミジン、インドール、キノリン、オキサゾール、イソオキサゾール、ピラジン、トリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピラゾールなどから誘導される基を挙げることができる。【００３３】  本明細書において記載されるアラルキル基は、上記のアリール基で置換されている上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体的にはベンジル基、フェネチル基などを挙げることができる。【００３４】  本明細書において記載されるヘテロアリールアルキル基は、上記のヘテロアリール基で置換されている上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。【００３５】  本明細書においてハロゲン原子とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。【００３６】  本明細書において記載される製薬上許容されうるそれらの塩とは、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。【００３７】  本明細書において記載される、式（３）のアミノ酸誘導体の塩とは、培地中の、菌株の生育、もしくは菌株による式（１）の化合物の産生に実質的に悪影響を与えないものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属などとの塩；アンモニウム塩などを挙げることができ、好ましくは塩酸、トリフルオロ酢酸、ナトリウム塩が挙げられる。【００３８】  本発明の式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌類とは、式（２）で表される化合物を培地中でわずかでも産生できる菌類であればいかなるものでもよく、例えば、フザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）（ＷＯ０４／０７１５０３）もしくは当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、およびそれらの変異株、オーレオバシディウム・エスピー・ＴＫＲ２４４９株��ＷＯ９８／０５６７５５）もしくは当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、およびそれらの変異株などが挙げられる。該菌類としては、好ましくは、Ｆ１４７６株または当該菌株と分類学的もしくは遺伝学的に同等な菌株、およびそれらの変異株である。【００３９】  本発明において「分類学的に同等な菌株」とは、分類学的に同一の特徴を有する菌株をいう。具体的には以下に示すようなＦ１４７６株と同等の生理学的性質を有し、かつ本発明の式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。【００４０】  本発明において「遺伝学的に同等な菌株」とは、遺伝学的に同等な性質の特徴を有する菌株をいい、具体的には菌株が有する５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ  ２８Ｓ  ｒＤＮＡなどのリポゾーマルＤＮＡの配列が同一もしくは相同性が９８％以上、好ましくは９９％以上で、かつ本発明の式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。【００４１】  菌株が、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有するか否かは、菌株を培養し、化合物を培養物中から分離し、分離した化合物を必要に応じて更に精製し、化合物あるいは精製物を分析することにより確認することができる。【００４２】  培養方法、分離方法および精製方法としては、後述する、本発明の式（１）の化合物を製造する方法において述べられている、各種栄養源および許容される添加物を含有する培地を用いる各種培養方法および培養条件；各種分離方法；ならびに各種精製方法を採用することができる。【００４３】  なお、菌株の培養時には、式（１）の化合物を製造する際に添加する式（３）で表されるアミノ酸誘導体は、原則として添加しないが、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有するか否かを判定する目的においては、必要に応じて、アミノ酸誘導体として、式（４）：
2007000994.tif 000009
（式中、ＲＡは、水素原子または炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、好ましくはメチル基を示す）で表されるプレニルチロシン誘導体を添加してもよい。式（４）で表されるプレニルチロシン誘導体は、フリー体のままでも、あるいは、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ナトリウム塩として添加してもよいが、塩酸塩として添加するのが好ましい。式（４）で表されるプレニルチロシン誘導体としては、ＲＡがメチル基である化合物の塩酸塩が好ましい。添加時の形態（粉末、有機溶媒に溶解）、添加量および添加後の培養条件は、式（１）の化合物を製造する際に添加する式（３）で表されるアミノ酸誘導体についてのそれらと同じである。【００４４】  式（２）で表される化合物を産生できる能力を確認するための分析方法としては、菌株を培養／分離／精製して得られる化合物から得られる、例えば、融点、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、ＵＶスペクトル、ＭＳスペクトル、ＨＰＬＣにおけるｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ、旋光度、Ｘ線構造解析などの周知の測定方法によるデータを、標品である式（２）の化合物と比較し、一致するか否か判定する方法が挙げられる。【００４５】  なお、これらの測定方法は、適宜組み合わせて判定に用いてもよく、例えばＬＣ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび高分解能ＭＳ分析（以下、ＴＯＦ−ＭＳとも称する）などのように、もともと組み合わされている測定方法を採用してもよい。【００４６】  ここで、分析に用いる化合物は、単品であっても、２以上の化合物の混合物であってもよく、どちらを用いるかは、分析方法に応じて、適宜選択できる。【００４７】  菌株を培養／分離／精製して得られる化合物を、標品である式（２）の化合物と比較し、一致するか否か判定するための具体的な基準としては、例えば以下のものを挙げることができる：
１）ＭＳスペクトルにおいて、分子イオンピーク：６６０（Ｍ＋Ｈ）と、脱プレニル化に基づくフラグメントピーク：５９２とが観察されるか否か。
２）元素分析またはＴＯＦ−ＭＳにおいて、分子式：Ｃ３６Ｈ５４ＮＯ１０が導き出されるか否か。
３）ＵＶスペクトルが、図１で示される形を示すか否か（化合物１：１００ｍｇ／Ｌ；溶媒：ＭｅＯＨ）。
すなわち、２７７および２２８ｎｍで極大吸収：λｍａｘを示すか否か。【００４８】４）ＨＰＬＣにおいて、以下のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかのピークが検出されるか否か：
ｉ）後述する本願明細書実施例２の分析条件１で分析した場合の、６．１±０．１分のリテンションタイム（ＲＴ）を有するピーク；
ｉｉ）本願明細書実施例４の分析条件３で分析した場合の、２．０±０．１分のリテンションタイム（ＲＴ）を有するピーク；
ｉｉｉ）本願明細書試験例１の分析条件５で分析した場合の、２２．３±０．１分のリテンションタイム（ＲＴ）を有するピーク。【００４９】  その他、文献公知となっている各種データを挙げることもできる。【００５０】  上述したように、本発明の製造方法においては、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株としては、上述のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株を挙げることができるが、Ｆ１４７６株は、後述する試験例１に詳述するように、フザリウム  インカナータム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ）に属する菌株である。【００５１】  本発明において「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと同等の形状を有する」とは、菌株が、以下のａ）〜ｃ）のすべての特徴を有することをいう：
ａ）ポリフィアライドを有する。ポリフィアライドとは分生子形成細胞の先端で、分生子が生じた後、その一部が肥大もしくは成長して、その先端で次の分生子を生じる形状をいう。
ｂ）分生子が、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合して形成され、典型的には三日月形（ｌｕｎａｔｅ）でときに長楕円形ないし円筒形となり、その先端は顕著に細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。截断痕とは、円錐体の上部を水平方向の割面で切り取ったときに残された下部の形状のことをいう。
これらの分生子の形態の判定に当たっては、例えばＡｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｇ．Ｃ．，Ｋｉｒｋ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｉｓｂｙ，Ｇｕｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＣＡＢ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２００１や、本願明細書の試験例１において図示されている分生子の形態的性状（図３および図４）を参照することができる。
ｃ）分生子が、０〜５個、好ましくは２〜４個の隔壁を有する。分生子の大きさは、２隔壁分生子では、長さ１５．５〜１９．５μｍ、幅２．５〜３．５μｍ、３隔壁分生子では、長さ１５．５〜３７．５μｍ、幅２．５〜６．５μｍ、４隔壁分生子では、長さ２４．０〜３７．０５μｍ、幅３．０〜６．０μｍ、５隔壁分生子では、長さ２７．５〜４１．５μｍ、幅３．０〜６．０μｍである。【００５２】  本発明において、「ＩＴＳ領域」とは、菌株が有するリボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のうち、ＩＴＳ１、５．８ＳおよびＩＴＳ２の３つの部分を合わせた領域をいう。そして２つの菌株のＩＴＳ領域の配列が９９％以上相同すれば、それらの菌株は同種であると判断できることが、例えば以下の文献１〜３により裏づけられている。
文献１：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３７，１９８５−１９９３（１９９９）
文献２：Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４０，４９１−５０１（１９９９）
文献３：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８，１５１０−１５１５（２０００）【００５３】  特に、文献３は、Ｆ１４７６株（Ｆｕｓａｒｉｕｍ属）と同じ糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）についての裏づけ事例として位置づけられる。【００５４】  上記より、本発明の製造方法において式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する糸状菌株として用いることができる菌株としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍに属するか、またはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと同等の形状を示す；および／またはその遺伝子のＩＴＳ領域の配列がＦ１４７６株のそれと９９％以上相同する菌株を挙げることができる。【００５５】  本発明に使用することができるＦ１４７６株は、２０００年１月２４日に鎌倉市鎌倉山南斜面にて採集された落葉より２０００年２月２９日に洗浄濾過法により分離した糸状菌である。【００５６】  上記Ｆ１４７６株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
生育温度範囲は、１０〜３０℃であり、好ましくは、２０〜３０℃である。
生育可能ｐＨ範囲は、３〜１１であり、好ましくは、５〜７である。
Ｆ１４７６株は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６と表示した上で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、２００３年２月４日付で、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９０として寄託されている。【００５７】  Ｆ１４７６株の分類学的な特徴は以下の通りである。本発明のＦ１４７６株と分類学的に同等な菌株とは、以下の分類学的な特徴を有し、かつ、本発明の式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌株をいう。【００５８】培養諸性状
バレイショ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）上での生育は遅く、２５℃、近紫外光照射下１０日で直径１２ｍｍに達し、生育率は１．５〜１．６ｍｍ／日である。密集した菌糸叢を形成し、表面は皺状で盛り上がり、中央部分に湿った分生子座が集まり、周辺部はときに顕著に綿毛状の菌糸塊をつくり、色調は明るい橙色（杏色、Ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｇｈｔ  ＡｐｒｉｃｏｔないしＡｐｒｉｃｏｔ、マンセル５ＹＲ７／６から７／１０、メトゥエン６Ａ６から６Ｂ８）、裏面は淡橙色から橙色（ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、ｂｒｉｇｈｔ  ｒｅｄｄｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ、Ｔｉｇｅｒ  Ｌｉｌｙ、マンセル５−１０ＹＲ７／１０、メトゥエン６Ｂ８から８Ａ６）を呈する。【００５９】  暗所では生育率は少し悪く、０．９〜１．１ｍｍ／日で、色調はより薄く、ベージュ色（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン４Ａ３）で、裏面は明るい赤味黄色（ｌｉｇｈｔ  ｒｅｄｄｉｓｈ  ｙｅｌｌｏｗ、Ｎａｐｌｅｓ  Ｙｅｌｌｏｗ）であり、しかし菌糸の色調が濃くなることもあり、黄土色から灰褐色（ｇｏｌｄ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｏｃｈｅｒ、ｌｉｇｈｔ  ｇｒａｙｉｓｈ  ｂｒｏｗｎ、Ｂｌｏｎｄ、マンセル１０ＹＲ５／４−８、メトゥエン５Ｅ５−８）となり、その場合の裏面は暗黄褐色（栗皮色、ｄａｒｋ  ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｂｒｏｗｎ、Ｂｕｒｎｔ  Ｕｍｂｅｒ、マンセル１０ＹＲ３／６）を呈する。【００６０】  麦芽エキス寒天培地（ＭＡ）上での生育は遅く、近紫外光照射下１１日で直径１１ｍｍに達し、生育率は１．０ｍｍ／日である。密集した菌糸叢を形成し、盛り上がり、羊毛状ないしフェルト状、色調は明るい橙色（ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ａｐｒｉｃｏｔ、マンセル５ＹＲ８／６、メトゥエン６Ａ６）、裏面は輝橙色（ｂｒｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｎａｓｔｕｒｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、マンセル５ＹＲ７／１２、メトゥエン６Ａ７）を呈する。暗所では色調は淡色となる。【００６１】  オートミール寒天培地（ＯＡ）上での生育は早く、近紫外光照射下１０日で直径２１ｍｍに達し、生育率は３．７ｍｍ／日である。平坦だが中央部分に多数の分生子座が密集した、粒状のコロニーを呈する。色調は明るい黄橙色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ、Ｍａｉｚｅ、マンセル５ＹＲ７／８、メトゥエン６Ｂ６）であり、裏面も同色である。暗所での色調は淡色となる。【００６２】  合成栄養寒天培地（ＳＮＡ）上での生育は遅く、近紫外光照射下７日で直径１３ｍｍに達し、生育率は１．６ｍｍ／日である。平坦でうすいコロニーを形成し、該コロニーは、フェルト状ないし羊毛状であり、中央部分には湿った分生子座が点在し、色調はベージュ色（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン４Ａ３）であり、裏面も同色である。暗所でも同様の生育を示す。【００６３】  三浦培地（ＬＣＡ）上での生育は早く、近紫外光照射下１０日で直径２５ｍｍに達し、生育率は３．４ｍｍ／日である。平坦でうすいコロニーを形成し、該コロニーは、粒状ないし綿毛状であり、中央部分には湿った分生子座が点在し、色調はベージュ色（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン��Ａ３）であり、裏面も同色である。暗所でも同様の生育を示す。【００６４】  生育温度範囲は、１０〜３０℃であり、至適生育温度は２０〜３０℃である。
生育ｐＨ範囲は、ｐＨ３〜１１であり、至適ｐＨは、ｐＨ５〜７である。【００６５】形態的性状
ＳＮＡ上では、分生子柄は、主に気中菌糸から垂直に立ち上がり、分岐し、その分枝あるいは分生子柄に直接フィアライドを輪生し、複雑な分生子形成構造を形成する。ときに気中菌糸に直接フィアライドを単生することもある。寒天表面上を這う菌糸から分生子構造が形成することもある。分生子柄は、１０〜３０μｍの長さとなる。フィアライドは、円筒形で、先端には通常顕著なカップ構造を有し、４．０〜２０．０×２．５〜３．０μｍの大きさである。分生子は、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合して形成され、典型的には三日月形でときに長楕円形ないし円筒形となり、先端は顕著に細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。通常、分生子は２−４隔壁を有するが、隔壁がないあるいは１または５隔壁を有することがあり、大きさは平均、１９．３×３．８μｍ、Ｌ／Ｗ  ５．２である。厚膜胞子は認められない。【００６６】同定
明色の菌糸から形成される複雑な房状の分生子構造は、ときに分生子座となり、分生子は円筒形のフィアライド先端から内生的に生ずるフィアロ型で、明色、特徴的な舟形ないし三日月形の２〜５細胞となる。以上の形態的特徴から、本菌Ｆ１４７６株は不完全菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属することがわかる。そこで本菌をＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株と同定した。
以下に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌株の属と種に関する同定法について述べた参考文献を記す。【００６７】参考文献
Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｗ．ａｎｄ  Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．１９８２  Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ−ａ  ｐｉｃｔｏｒｉａｌ  ａｔｌａｓ．Ｍｉｔｔ．Ｂｉｏｌ．Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔ．Ｌａｎｄ−ｕ．Ｆｏｒｓｔｗｉｒｔｓｃｈ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｄａｈｌｅｍ  ２０９：１−４０６．
Ｂｏｏｔｈ，Ｃ．１９７１．Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ．ＣＭＩ，Ｋｅｗ，Ｓｕｒｒｅｙ，２３７ｐｐ．
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ｗ．，Ｋｅｎｄｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｃｏｎｎｅｒｓ，Ｉ．Ｌ．ａｎｄ  Ｓｉｇｌｅｒ，Ｌ．１９８０．Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ．
Ｇａｍｓ，Ｗ．１９７１．Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ−ａｒｔｉｇｅ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｉｌｚｅ（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．２６２ｐｐ．【００６８】  なお、本発明においては、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌株から、必要に応じて、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ６７８．７７株を除外することが許される。【００６９】  本発明において「変異株」とは、上記Ｆ１４７６株、ＴＫＲ２４４９株などの、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌類の自然または人工的な突然変異株で、かつ、式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌株を言う。【００７０】  一般に当業者であれば、公知の方法を用いて、上記Ｆ１４７６株、ＴＫＲ２４４９株などの式（２）で表される化合物を産生できる能力を有する菌類から、当該菌類よりも優れた能力（例えば、本発明の式（１）または式（２）で表される化合物の産生能など）を有する変異株など種々の変異株を作製することは容易である。【００７１】  例えば、当該菌類の胞子もしくは菌糸を、γ線、Ｘ線、紫外線照射などの物理的な手段で、または亜硝酸、メタンスルホン酸エチル、メタンスルホン酸メチル、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンのような化学物質で処理したのち、洗浄、希釈し、ポテトデキストロース寒天プレートなどの寒天培地に塗布して培養、単離することにより、変異株が得られる。その後、得られた各菌株を固体培養もしくは液体培養し、培養物を適切な溶媒などで抽出後、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳなどの分析機器を用いて分析し、各菌株の化合物の生産性を評価することにより、高生産変異株など種々の変異株を得ることができる。【００７２】  本発明の化合物の製造方法について以下に詳細に記載する。
本発明の式（１）の化合物は、上記に示す式で示されるものであり、この式（１）におけるＡは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、−ＯＲ１、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；【００７３】  ここでＲ１は、水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を表す。【００７４】  Ｒ１としては、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基が好ましく、特に２−ブチン−１−イルなどのブチニル基が好ましい。【００７５】  上記の「置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基」の置換基としては、ハロゲン原子、−ＯＲ２、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノもしくはジ置換されていてもよいアミノ基、アシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホニル基、カルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボニル基、ホルミル基、アミノスルホニル基などが挙げられ、それらによってモノ、ジもしくはトリ置換されていてもよい。ここでＲ２は、水素原子、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、またはトリフルオロメチル基を表す。当該置換基としては、フッ素、メトキシ基、メチル基およびジメチルアミノ基が好ましい。
置換されていてもよいアリール基の好ましいものとしては、例えば、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基が挙げられ、更に好ましくはメトキシフェニル基およびフルオロフェニル基が挙げられる。
置換されていてもよいヘテロアリール基の好ましいものとしては、例えば、ピリジル基が挙げられる。【００７６】  本発明の式（１）の化合物におけるＡとしては、−ＯＲ１；ハロゲン原子またはメトキシ基で置換されているフェニル基；およびピリジル基が好ましく、特に、２−ブチン−１−イルオキシなどのブチニルオキシ基が好ましい。【００７７】  本発明の式（３）のアミノ酸誘導体は、上記に示す式で示されるものであり、この式（３）におけるＡは、上記の式（１）の化合物のＡと同様の定義を表す。
なお、このような式（３）のアミノ酸誘導体としては、Ｒが水素原子である遊離カルボン酸、およびＲがメチルまたはｔ−ブチルであるカルボン酸メチルまたはｔ−ブチルエステルを挙げることができ、なかでもＲがメチルである上記式（３´）で表されるアミノ酸誘導体を挙げることができる。【００７８】  なお、本発明の式（３）のアミノ酸誘導体は、例えば以下のようにして製造することができる。【００７９】製法−１
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上記式中、Ｐは、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、またはカルボキシル基の保護基を示し、Ｐ′は、アミノ基の保護基を示し、Ｒ１′は、所望の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を示す。【００８０】工程１−１
化合物１−１は市販されている化合物（Ｌ−チロシン−ｔ−ブチルエステル、Ｌ−チロシンメチルエステルなど）または市販されている化合物（Ｌ−チロシンなど）から容易に合成することができる化合物であり、これをアセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルカルボニルなどのようなアミノ基の保護基によって保護することにより化合物１−２を得ることができる。この時の反応条件は、″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ（著），１９９９，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ″に記載されているようなアミノ基の保護基の条件が用いられる。【００８１】工程１−２
化合物１−２を、ジエチルエーテル、トルエン、シクロヘキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウムなどの塩基の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは室温で、ハロゲン原子またはメシラートもしくはトシラートなどの脱離基と結合させた上記定義のＲ１′と反応させることにより、所望の基Ｒ１′の導入された化合物１−３を得ることができる。あるいは化合物１−２を光延反応条件下、水酸基で置換された上記定義のＲ１′と反応させることによっても化合物１−３を得ることができる。【００８２】工程１−３
化合物１−３のアミノ基の保護基Ｐ′を脱保護することにより化合物１−４を得ることができる。この時の反応条件は、″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ（著），１９９９，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ″に記載されている様なアミノ基の保護基の脱保護の条件が用いられる。
工程１−４
化合物１−４のカルボキシル基の保護基Ｐを脱保護することにより化合物１−５を得ることができる。この時の反応条件は、″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ（著），１９９９，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ″に記載されている様なカルボキシル基の保護基の脱保護の条件が用いられる。【００８３】製法−２
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上記式中、Ｐは、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、またはカルボキシル基の保護基を示し、Ｐ′は、アミノ基の保護基を示し、Ｔは、メシラート、トルエンスルホナート、トリフルオロメタンスルホナートなどの脱離基を示し、Ａ′は、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示す。【００８４】工程２−１
工程１−１で得た化合物１−２を、ジエチルエーテル、トルエン、シクロヘキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、メタンスルホン酸クロリド、トルエンスルホン酸クロリド、無水トリフルオロメタンスルホン酸などの脱離基となりえる化合物と反応させることにより、脱離基Ｔを導入した化合物２−１を得ることができる。【００８５】工程２−２
化合物２−１を、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、水などの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、パラジウムジアセテート、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムなどのパラジウム触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、所望のアリール基またはヘテロアリール基であるＡ′を有する、アリールまたはヘテロアリールボロン酸誘導体あるいはアリールまたはヘテロアリールボロン酸エステル誘導体、あるいは所望のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であるＡ′を有するテトラアルキルすず誘導体、アルケニルまたはアルキニルトリ−ｎ−ブチルすず誘導体などと反応させることにより化合物２−２を得ることができる。【００８６】工程２−３
化合物２−２のアミノ基の保護基Ｐ′を脱保護することにより化合物２−３を得ることができる。この時の反応条件は、″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ（著），１９９９，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ″に記載されているようなアミノ基の保護基の脱保護の条件が用いられる。【００８７】工程２−４
化合物２−３のカルボキシル基の保護基Ｐを脱保護することにより化合物２−４を得ることができる。この時の反応条件は、″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ（著），１９９９，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ″に記載されている様なカルボキシル基の保護基の脱保護の条件が用いられる。【００８８】  Ａが上記以外の基である式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩も、上記の方法に準じて合成することができる。また、Ｒが水素原子、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基である式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩は、上記製法１および２で得られた化合物を、必要に応じてカルボキシル基の脱保護反応およびエステル化などの反応に付すことにより合成することができる。【００８９】  本発明の好ましい式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。【００９０】  化合物１
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化合物２
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化合物３
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化合物４
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化合物５
2007000994.tif 000016
【００９１】  本発明の式（１）の化合物を製造する方法は、前記の式（２）の化合物を産生できる能力を有する菌株を、式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩を該菌株の生育に好適な培地（好ましくは培養液）中に添加した培地中で培養して、所望の式（１）の化合物を当該菌株に産生させるものである。【００９２】  本発明の、式（１）の化合物を製造するための培養に用いられる培地としては、式（２）の化合物を産生できる能力を有する菌株（例えばＦ１４７６株あるいはその変異株など）が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。【００９３】  上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、サッカロース、マルトース、キシロース、シュークロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸などを挙げることができる。式（１）の化合物を製造する効率性の観点では、グルコース、フルクトース、ラクトースおよびデキストリンが好ましく、なかでもラクトースが更に好ましい。【００９４】  上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、ファーマメディア、尿素、アミノ酸などの有機窒素化合物、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩などの無機窒素化合物などを挙げることができる。【００９５】  上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類などを挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。【００９６】  上記栄養源は、単独かまたは適宜組み合わせて使用することができる。【００９７】  上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩などの重金属塩；ビオチン、ビタミンＢ１などのビタミン類；その他、菌の生育を助け、本発明化合物の産生を促進する有機物、無機物などを適宜添加することができる。【００９８】  上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤、界面活性剤などを添加することができる。【００９９】  培養条件は、該菌株が良好に生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ３〜１１、温度１０〜３０℃で５〜１０日程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用する菌類の種類や特性、外部条件などに応じて適宜選択でき、最適条件を選択できる。【０１００】  このように調整した菌株を含有する培養液に式（３）のアミノ酸誘導体を添加し、所望の式（１）の化合物を生産させる。すなわち培養中の微生物菌体を含む培養液にそのまま、あるいは培養終了後、遠心分離または濾過により培養液から分離した菌体を別の培養液に懸濁させたものに、式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩を添加し、更に培養する。菌体の懸濁に使用できる培養液は、前記した培地、またはその組み合わせであることが好ましい。【０１０１】  培地に添加する式（３）のアミノ酸誘導体またはその塩は、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ナトリウム塩などの塩で��ることが好ましい。当該アミノ酸誘導体は、粉末のままか、あるいは水またはエタノールなどの水溶性有機溶媒などに溶解して培地に添加すればよく、その添加量は、培地１ｍｌ当たり５０〜２０００ｍｇが好ましい。【０１０２】  当該アミノ酸誘導体添加後は、２５〜３０℃で３〜１４日間、好ましくは５〜１０日程度、振とうあるいは通気攪拌条件下で培養を行うことにより、所望の式（１）の化合物を生産させることができる。【０１０３】  本発明化合物を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養法、液体培養法などの培養方法を採用することができるが、好ましくは液体培養法を用いることができる。液体培養法を採用する際、上記栄養源の１つである上記炭素源としては、グルコース、フルクトース、ラクトースおよびデキストリンを用いることが好ましく、なかでもラクトースを用いることが更に好ましい。
また、液体培養法における好ましい液体培地としては、例えば、本願明細書の実施例５に示した液体培地２、実施例７に示した液体培地３、および実施例８に示した液体培地５などが挙げられる。【０１０４】  上述の培養方法によって、本発明化合物は、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積された化合物を、公知の方法により、培養物中から分離した後、必要に応じて更に精製することができる。【０１０５】  上記分離は、培養物全体を、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトンなどの非親水性有機溶媒、あるいはメタノール、アセトンなどの親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過または遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。【０１０６】  上記分離した培養液から本発明化合物を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の上記化合物を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。【０１０７】  上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂などを挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質などによって適宜１種または２種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類などの水溶性有機溶媒の含水溶液などを適宜組み合わせたものなどを挙げることができる。上記含水溶液における含水率は、担体や水溶性有機溶媒の種類などに応じて適宜選択することができるが、例えば１０〜９０％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは、４０〜６０％（Ｖ／Ｖ）である。【０１０８】  上記分離した菌体から本発明化合物出発を分離するには、アセトン、メタノールなどの親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。【０１０９】  本発明においては、このようにして培養物中から分離された本発明化合物の粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。【０１１０】  上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などを挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、水などを挙げることができ、これらは２種以上を併用することができる。また溶出溶媒にはトリフルオロ酢酸および酢酸を添加することができる。【０１１１】  上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などが結合した化学結合型シリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲルなどを挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒の含水溶液などを使用することができる。また移動相にはトリフルオロ酢酸および酢酸を添加することができる。【０１１２】  以上述べたとおり、本発明の式（１）の化合物の製造方法は、従来知られている製法に比べ、煩雑な化学合成の工程を用いずに、菌体から直接所望の式（１）の化合物を産生させるものであり、従来よりも簡便に大量の所望の化合物を製造できるものである。【０１１３】  なお、Ａが、プレニルオキシ基以外の基である本発明の式（１）の化合物を製造する際には、菌株が元来その産生能力を有している式（２）で表される化合物が、目的外化合物として得られることがある。その場合は、前述した脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法により精製を行い、式（２）で表される化合物から式（１）の化合物を分離して得ることができる。また、式（２）で表される化合物を産生できる菌株の変異株を作製し、式（４）で表されるプレニルチロシンを添加しなければ、式（２）の化合物を産生しないか、式（１）の化合物に対する式（２）の化合物の産生割合が、変異前よりも低い菌株を選抜して製造に用いることで、より効率的に式（１）の化合物を得ることもできる。【０１１４】  さらに、本発明の式（１）の化合物の製造方法においては、式（１）の化合物から、式（２）の化合物を、必要に応じて除くことが許される。【０１１５】  このようにして得られる本発明の式（１）の化合物は、そのまま、もしくはそのプロドラッグとして、または製薬的に許容されうる塩として、医薬組成物、特にＨＣＶに起因する肝臓疾患の治療剤の有効成分として使用することができる。
【実施例】
【０１１６】  以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の各実施例で使用されるアミノ酸１〜６および産生される化合物１〜５は、以降に記載する。【０１１７】実施例１
化合物２の固体培養法での生産
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株の斜面培養から一白金耳を、１００ｍｌの液体培地１（グルコース２．０％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１．０％、ポリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．００５％、硫酸銅５水和物０．０００５％、塩化マンガン４水和物０．０００５％、トーストソーヤ１．０％）を入れた５００ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、３日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液２ｍｌを、玄米固体培地（発芽玄米５ｇ、脱塩水２ｍｌ）を入れた５０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに接種した。１０ｍｇ／ｍｌに調製後、ろ過滅菌したアミノ酸１の水溶液を培養開始時に１ｍｌ、培養開始後４８および９６時間後に、０．５ｍｌずつ添加し、２７℃、１６８時間静置培養を行った。このように培養した培養物にメタノール１０ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで２０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液５００μｌを濃縮乾固後、１０μｌジメチルスルホキシドおよび９０μｌメタノールで溶解し、下記分析条件に示す分析条件Ａで分析した結果、化合物２の生産が認められた。添加したアミノ酸の種類と生産された化合物の物理化学的性質を表１に示す。生産された化合物２は、標品を分析条件２に示したＬＣ／ＭＳの条件で分析し、得られたマススペクトルのＭ＋Ｈ値とＲＴが一致することを基に同定した。【０１１８】分析条件Ａ
装置：ＬＣ−ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ＬＣＱ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃｏｍｂｉ  ＲＰ−５（５μｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ）（ＮＯＭＵＲＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）【０１１９】
2007000994.tif 000017
流速：３ｍｌ／分、温度：室温【０１２０】
【表１】
2007000994.tif 000018
【０１２１】実施例２
Ｆ１４７６−Ｃ１９３株の取得
ＭＡ斜面培地（マルトエクストラクト１．０％、イーストエクストラクト０．１％、バクトソイトン０．１％、グルコース１．０％、寒天２．０％）に生育したＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９０）より４ｍｌの滅菌生理食塩水を用いて胞子懸濁液を作成した（胞子数：約５×１０６／ｍｌ）。得られた胞子液０．３ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌに調製した１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン０．３ｍｌ、生理食塩水２．４ｍｌをまぜて２７℃、１２７ｒｐｍで１時間振とうし、変異処理をした。処理液２ｍｌを１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、２ｍｌの滅菌生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して０．１ｍｌずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で５−６日間培養し、得られたコロニーをポテトデキストロース寒天斜面培地に広げ、１４０株の変異候補株を得た。得られた菌体を滅菌水にて懸濁し、玄米固体培地（発芽玄米５ｇ、脱塩水２ｍｌ）を入れた５０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに接種し２７℃、１９２時間静置培養を行った。このようにして培養した培養物にメタノール１０ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで２０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液５００μｌを濃縮乾固後、１０μｌのジメチルスルホキシドおよび９０μｌのメタノールで溶解し、下記に示す分析条件１で分析することで、化合物１の高生産株をスクリーニングした。その結果、化合物１の高生産株Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−Ｃ１９３株を得ることができた。（表２）【０１２２】
【表２】
2007000994.tif 000019
化合物１の物理化学的性状
分子量６５９
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）ｍ／ｚ＝６６０（Ｍ＋Ｈ）
分析条件１におけるリテンションタイム（ＲＴ）６．１±０．１分【０１２３】分析条件１
装置：ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ）
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃｏｍｂｉ  ＲＰ−５（５μｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ）（ＮＯＭＵＲＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）
2007000994.tif 000020
流速：３ｍｌ／分、温度：室温【０１２４】実施例３
化合物２、化合物３および化合物４の固体培養法での生産
Ｆ１４７６−Ｃ１９３株の斜面培養から一白金耳を、１００ｍｌの液体培地１（グルコース２．０％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１．０％、ポリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．００５％、硫酸銅５水和物０．０００５％、塩化マンガン４水和物０．０００５％、トーストソーヤ１．０％）を入れた５００ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、３日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液２ｍｌを、玄米固体培地（発芽玄米５ｇ、脱塩水２ｍｌ）を入れた５０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに接種し、培養４８、７２、９６、１４４時間後に、１０ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸１の水溶液を０．５ｍｌ添加し、２７℃、１９２時間静置培養を行った。このように培養した培養物にメタノール１０ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで２０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、メタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液５００μｌを濃縮乾固後、１０μｌジメチルスルホキシドおよび９０μｌメタノールで溶解し、下記分析条件２に示す分析条件で分析した結果、化合物２の生産が認められた。同様の方法で、アミノ酸２の添加により化合物２を、アミノ酸３の添加で化合物３を、アミノ酸４の添加で化合物４を得た。添加したアミノ酸の種類と生産された化合物の物理化学的性質を表３に示す。生産された化合物は、化合物２、化合物３および化合物４の標品を分析条件２に示したＬＣ／ＭＳの条件で分析し、得られたマススペクトルのＭ＋Ｈ値とＲＴが一致することを基に同定した。【０１２５】分析条件２
装置：ＬＣ−ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ＬＣＱ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃｏｍｂｉ  ＲＰ−５（５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ）（ＮＯＭＵＲＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）
2007000994.tif 000021
流速：３ｍｌ／分、温度：室温【０１２６】
【表３】
2007000994.tif 000022
【０１２７】実施例４
Ｆ１４７６−Ｇ８１株の取得
実施例２と同様にＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−Ｃ１９３株の胞子懸濁液を作成し（胞子数約２×１０６／ｍｌ、得られた胞子液０．３ｍｌを用いて変異処理をした。処理液２ｍｌを１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、２ｍｌの生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して０．１ｍｌずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で５〜６日間培養し、得られたコロニーをポテトデキストロース寒天斜面培地に広げ、３６０株の変異候補株を得た。得られた菌株を、１０ｍｌの液体培地１を入れた３０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに接種し、２７℃、７日間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。このようにして培養した培養物にｎ−ブタノール１０ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで２０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ｎ−ブタノール抽出液を得た。得られたｎ−ブタノール抽出液１ｍｌを濃縮乾固後、１０μｌのジメチルスルホキシドおよび９０μｌのメタノールで溶解し、下記に示す分析条件３で分析し、化合物１の高生産株をスクリーニングした。その結果、化合物１の高生産株Ｆ１４７６−Ｇ８１株を得ることができた。Ｆ１４７６−Ｇ８１株の化合物１の生産性をｎ−ブタノール抽出液の濃度で示す。生産量は、化合物１の標品を分析条件３で分析し２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表４）【０１２８】
【表４】
2007000994.tif 000023
【０１２９】分析条件３
装置：Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ｓｙｓｔｅｍ  ９９６
カラム：Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８（５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）
2007000994.tif 000024
流速：１．５ｍｌ／分、温度：室温【０１３０】実施例５
Ｆ１４７６−Ｇ８１株による化合物４の液体培養法での生産
実施例２と同様に液体培地１を用いてＦ１４７６−Ｇ８１株の種培養液を調製した。この種培養液４ｍｌを、液体培地２（ポテトスターチ８．０％、フラクトース０．１４％、バクトソイトン０．８％、米ぬか２．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％）３６ｍｌを入れた３００ｍｌ容フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養７２、９６、１４４時間後に、４ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸５の水溶液を０．５ｍｌずつ添加し、２７℃、２２０ｒｐｍで１６８時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を下記に示す分析条件４で分析した結果、化合物４の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物４の標品を分析条件４で分析し、２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表５）【０１３１】
【表５】
2007000994.tif 000025
化合物４の物理化学的性状
分子量６４３
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）ｍ／ｚ＝６４４（Ｍ＋Ｈ）
分析条件４におけるＲＴ１．３±０．１分【０１３２】分析条件４
装置：ＬＣ−ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８（５μｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：以下に示す溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）
2007000994.tif 000026
【０１３３】実施例６
Ｆ１４７６−Ｈ３６株の取得
実施例２と同様にＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−Ｇ８１株の胞子懸濁液を作成した（胞子数約６×１０７／ｍｌ）。得られた胞子液０．３ｍｌを用い実施例２同様に変異処理をした。処理液２ｍｌを１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、２ｍｌの生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して０．１ｍｌずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で５〜６日間培養し、得られたコロニーをポテトデキストロース寒天斜面培地に広げ、７７株の変異候補株を得た。得られた菌株を、１０ｍｌの液体培地１を入れた３０ｍｌ容ポリプロピレン製チューブに接種し２７℃、３日間、１６０ｒｐｍで振とう培養し種培養液を調製した。この種培養液４ｍｌを、３６ｍｌの液体培地２を入れた３００ｍｌ容フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍ７日間振とう培養した。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件３で分析し化合物１の高生産株をスクリーニングした。その結果、化合物１の高生産株Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−Ｈ３６株を得ることができた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物１の標品を分析条件３で分析し２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表６）【０１３４】
【表６】
2007000994.tif 000027
【０１３５】実施例７
Ｆ１４７６−Ｈ３６株による化合物５の液体培養法での生産
実施例２と同様に液体培地１を用いてＦ１４７６−Ｈ３６株の種培養液を調製した。この種培養液４ｍｌを、液体培地３（ラクトース１４．０％、グルコース０．１％、イーストエクストラクト１．０％、ファーマメディア（Ｔｒａｄｅｒｓ社製）２．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％）３６ｍｌを入れた３００ｍｌ容フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養７２、９６、１４４時間後に、４ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸６の水溶液を０．５ｍｌずつ添加し、２７℃、２２０ｒｐｍで１６８時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件４で分析した結果、化合物５の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物５の標品を分析条件４で分析し２５５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表７）【０１３６】
【表７】
2007000994.tif 000028
化合物５の物理化学的性状
分子量６８１
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）ｍ／ｚ＝６８２（Ｍ＋Ｈ）
分析条件４におけるＲＴ：１．８±０．１分【０１３７】実施例８
Ｆ１４７６−Ｈ３６株による化合物４の液体培養法での生産
Ｆ１４７６−Ｈ３６株の斜面培養から一白金耳を、１００ｍｌの液体培地４（グルコース２．０％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１．０％、ポリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．０５％、トーストソーヤ１．０％）を入れた５００ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、２日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液４ｍｌを液体培地５（ラクトース８．０％、グルコース０．１％、イーストエクストラクト１．０％、ファーマメディア（Ｔｒａｄｅｒｓ社製）１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％）３６ｍｌを入れた３００ｍｌ容フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養７２、９６、１４４時間後に、６ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸５の水溶液を１ｍｌずつ添加し、２７℃、２２０ｒｐｍで１６８時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件４で分析した結果、化合物４の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物４の標品を分析条件４で分析し２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表８）【０１３８】
【表８】
2007000994.tif 000029
【０１３９】実施例９
Ｆ１４７６−ＣＨ４４．９株の取得
Ｆ１４７６−Ｇ８１株の斜面培養から一白金耳を、３０ｍｌの液体培地６（フラクトース４．０％、カジトン０．１％、硝酸ナトリウム０．３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、塩化カリウム０．０５％、硫酸鉄７水和物０．００１％）を入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し、２７℃、５日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、培養液を得た。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清より胞子液を作成後、得られた胞子液を用いて、実施例２同様に変異処理をした。処理液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して０．１ｍｌずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で５〜６日間培養し、変異候補株を得た。得られた菌株を、３０ｍｌの液体培地４を入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し、２７℃、２日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液４ｍｌを３０ｍｌの液体培地５を入れた２５０ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで７日間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件３で分析し、化合物１の非生産株をスクリーニングした。その結果、化合物１の非生産株Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−ＣＨ４４．９株を得ることができた。【０１４０】実施例１０
Ｆ１４７６−ＣＨ４４．９株による化合物４の液体培養法での生産
Ｆ１４７６−ＣＨ４４．９株の斜面培養から一白金耳を、１００ｍｌの液体培地４（グルコース２．０％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１．０％、ポロースリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．０５％、トーストソーヤ１．０％）を入れた５００ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、２日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液４ｍｌを液体培地５（ラクトース８．０％、グルコース０．１％、イーストエクストラクト１．０％、ファーマメディア（Ｔｒａｄｅｒｓ社製）１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％）３６ｍｌを入れた３００ｍｌ容フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養７２、９６、１４４時間後に、６ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸５の水溶液を１ｍｌずつ添加し、２７℃、２２０ｒｐｍで１６８時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件４で分析した結果、化合物４の生産が認められた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物４の標品を分析条件４で分析し２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表９）
【表９】
2007000994.tif 000030
【０１４１】実施例１１
Ｆ１４７６−ＣＨ４４．２８株の取得
Ｆ１４７６−ＣＨ４４．９株の斜面培養から一白金耳を、３０ｍｌの液体培地６を入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し、２７℃、５日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、培養液を得た。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清より胞子液を作成後、得られた胞子液を用いて実施例２同様に変異処理をした。処理液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、生理食塩水で胞子を洗浄後、希釈して０．１ｍｌずつポテトデキストロース寒天プレート（日本製薬社製）に塗布した。室温で５〜６日間培養し、変異候補株を得た。得られた菌株を、３０ｍｌの液体培地４を入れた２５０ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、２日間、２２０ｒｐｍで振とう培養し、種培養液を得た。この種培養液４ｍｌを３０ｍｌの液体培地５を入れた２５０ｍｌ容臍つき三角フラスコに接種し、２７℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養７２、９６、１４４時間後に、６ｍｇ／ｍｌに調製後ろ過滅菌したアミノ酸５の水溶液を１ｍｌずつ添加し、２７℃、２２０ｒｐｍで１６８時間振とう培養を行った。このようにして培養した培養物１ｍｌに１００％エタノール４ｍｌを加え、１８０ｒｐｍで３０分間振とう攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、エタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出液を上記に示した分析条件３で分析し化合物４の高生産株をスクリーニングした。同様の変異処理を繰り返すことにより、化合物４の高生産株Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６−ＣＨ４４．２８株を得ることができた。生産量を液体培養物中の濃度で示す。生産量は、化合物４の標品を分析条件４で分析し、２２５ｎｍの吸収から得られるピークの面積値をもとに定量した。（表１０）
【表１０】
2007000994.tif 000031
【０１４２】アミノ酸と化合物の構造式
アミノ酸１
2007000994.tif 000032
アミノ酸２
2007000994.tif 000033
アミノ酸３
2007000994.tif 000034
アミノ酸４
2007000994.tif 000035
アミノ酸５
2007000994.tif 000036
アミノ酸６
2007000994.tif 000037
化合物１
2007000994.tif 000038
化合物２
2007000994.tif 000039
化合物３
2007000994.tif 000040
化合物４
2007000994.tif 000041
化合物５
2007000994.tif 000042
【０１４３】  以下に、上記実施例で使用したアミノ酸誘導体またはその塩の製造方法の例を記載する。以下に記載されていないアミノ酸誘導体またはその塩も、市販されているか、または以下の製造例の記載および当業者の技術常識に基づいて容易に合成することができる。【０１４４】製造例１
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ピリジン−３−イルフェニル）−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩（アミノ酸１）の合成
2007000994.tif 000043
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ピリジン−３−イルフェニル）−プロピオン酸ｔ−ブチルエステル（２１０ｍｇ、０．７０４ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１ｍｌ）に溶解し、室温にて３時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、得られた残渣にヘキサンージクロロメタンーメタノール（１０：３：１）混合液（２０ｍｌ）を加え析出した粉末を濾取した。真空ポンプで減圧乾燥後、無色粉末の（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ピリジン−３−イルフェニル）−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩（２４５ｍｇ、９８％）を得た。
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ピリジン−３−イルフェニル）−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩の物理化学的性状
分子量  ３５６
ＥＩ−ＭＳ（ポジティブモード）２４２（Ｍ＋−Ｃ２ＨＦ３Ｏ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（重水中）の化学シフト値δ：
３．１６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、３．２６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、４．１８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、７．３８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．６３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．９９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、８．６０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、８．７１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、８．９１（１Ｈ、ｓ）【０１４５】製造例２
（Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−（２−ブチニルオキシ）フェニル｝−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩（アミノ酸５）の合成
2007000994.tif 000044
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシンメチルエステル（東京化成：１５０ｇ、０．５０８ｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７００ｍｌ）に、炭酸カリウム（８７．７ｇ、０．６３５ｍｏｌ）、１−ブロモ−２−ブチン（７４．３ｇ、０．５５９ｍｏｌ）を加え、室温で１９時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２Ｌ）を加え、飽和塩化アンモニウム水溶液（１．５Ｌ）、飽和重曹水（１．５Ｌ）、飽和食塩水（１．０Ｌ）で順次洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し、溶媒を減圧留去後、淡黄色油状物を得た。得られた油状物を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解し０℃〜５℃に冷却した。次に４Ｎ塩酸／酢酸エチル（１．０Ｌ、４．０ｍｏｌ）を滴下し、同温度にて２時間撹拌しその後室温にて１５時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（５００ｍｌ）で希釈後、析出した粉末を濾取し、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）混合液（１．０Ｌ）で洗浄した。真空ポンプで減圧乾燥後、無色粉末の（Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−（２−ブチニルオキシ）フェニル｝−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩（１４３ｇ、９９％）を得た。
（Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−（２−ブチニルオキシ）フェニル｝−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の物理化学的性状
分子量  ２８３
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）２４８（Ｍ−ＨＣｌ＋Ｈ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（メタノールｄ−４中）の化学シフト値δ：
１．８１（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、３．１１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ、７．０Ｈｚ）、３．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ、６．０Ｈｚ）、３．８１（３Ｈ、ｓ）、４．２７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、６．０Ｈｚ）、４．６６（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、６．９６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．１７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）【０１４６】製造例３
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩（アミノ酸６）の合成
2007000994.tif 000045
【０１４７】ａ）（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（４−トリフルオロメタンスルホニルオキシフェニル）−プロピオン酸メチルエステルの合成
2007000994.tif 000046
【０１４８】  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシンメチルエステル（１５０ｇ、０．５０８ｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（４００ｍｌ）に無水ピリジン（２５７ｍｌ、２．５４ｍｏｌ）を加え、０℃〜５℃に冷却した。次にトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１４３ｇ、０．５０８ｍｏｌ）を滴下し、同温度にて２時間３０分間撹拌した。反応液に水（１．５Ｌ）、ジクロロメタン（５００ｍｌ）を加え分液し、有機層を０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１．５Ｌ）、水（１Ｌ）、１Ｎ塩酸（２×１．５Ｌ）、水（２×１．５Ｌ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥し、濃縮して乳白色固体の（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（４−トリフルオロメタンスルホニルオキシフェニル）−プロピオン酸メチルエステル（２１７ｇ、１００％）を得た。
（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（４−トリフルオロメタンスルホニルオキシフェニル）−プロピオン酸メチルエステルの物理化学的性状
分子量  ４２７
ＦＡＢ−ＭＳ（ポジティブモード、マトリックスｍ−ＮＢＡ）４２８（Ｍ＋Ｈ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロフォルム中）の化学シフト値δ：
１．４１（９Ｈ、ｓ）、３．０４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、３．１８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、６．０Ｈｚ）、３．７２（３Ｈ、ｓ）、４．５７−４．６４（１Ｈ、ｍ）、５．０４（１Ｈ、ｂｒｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．１６−７．２６（４Ｈ、ｍ）【０１４９】ｂ）（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステルの合成
2007000994.tif 000047
（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（４−トリフルオロメタンスルホニルオキシフェニル）−プロピオン酸メチルエステル（３１．０ｇ、０．０７２５ｍｏｌ）、３−メトキシフェニルボロン酸（１９．８４ｇ、０．１３１ｍｏｌ）、炭酸カリウム（１４．０３ｇ、０．１０２ｍｏｌ）を無水トルエン（４００ｍｌ）に懸濁し、窒素雰囲気下にて、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金（２．５１ｇ、０．００２２ｍｏｌ）を加えた。窒素気流下９０℃で２時間撹拌したのち、反応混合物をセライトにて濾過し、残渣を酢酸エチル（５００ｍｌ）で洗浄した。濾液を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２×５００ｍｌ）、水（５００ｍｌ）、１Ｎ塩酸（５００ｍＬ）、水（５００ｍｌ）、飽和食塩水（３００ｍｌ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し濃縮後、粗化合物（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステルを黄色油状物質として得た。
（Ｓ）−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステルの物理化学的性状
分子量  ３８５
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）３８６（Ｍ＋Ｈ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロフォルム中）の化学シフト値δ：
１．４２（９Ｈ、ｓ）、３．００−３．２０（２Ｈ、ｍ）、３．７４（３Ｈ、ｓ）、３．８６（３Ｈ、ｓ）、４．５９−４．６７（１Ｈ、ｍ）、５．０２（１Ｈ、ｂｒｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、６．８７−６．９２（１Ｈ、ｍ）、７．１０−７．３２（４Ｈ、ｍ）、７．３８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．５２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）。【０１５０】ｃ）（Ｓ）−２−アミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩（アミノ酸６）の合成
2007000994.tif 000048
ｂ）で得られた油状物を酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し０℃〜５℃に冷却した。次に４Ｎ塩酸／酢酸エチル（８３ｍｌ、０．３３２ｍｏｌ）を滴下し、同温度にて２時間撹拌しその後室温にて１５時間撹拌した。反応液をヘキサン（１００ｍｌ）で希釈後、析出した粉末を濾取し、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）混合液（５０ｍｌ）で洗浄した。真空ポンプで減圧乾燥後、無色粉末の（Ｓ）−２−アミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステル塩酸塩（２０．６３ｇ、８８％）を得た。
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３′−メトキシビフェニル−４−イル）−プロピオン酸メチルエステル  塩酸塩の物理化学的性状
分子量  ３２１
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）２８６（Ｍ−ＨＣｌ＋Ｈ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（メタノールｄ−４中）の化学シフト値δ：
３．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、７．５Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、３．８４（６Ｈ、ｓ）、４．３７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、６．５Ｈｚ）、６．９２（１Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２．５Ｈｚ、１．０Ｈｚ）、７．１３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、２．０Ｈｚ）、７．１８（１Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２．０Ｈｚ、１．０Ｈｚ）、７．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．３５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、７．５Ｈｚ）、７．６３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）【０１５１】試験例１
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株の同定
概要
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株のコロニーの生育は、きわめて遅く、バレイショ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）上では明るい橙色で湿潤な分生子座を形成したり、堅く皺状で盛り上がり表面が綿毛状の菌叢を形成するなど多形であるが、表裏とも決して赤紫にはならない。このことからは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｅｒｉｓｍｏｉｄｅｓまたはＦ．ａｑｕａｅｄｕｃｔｕｕｍなどであることが示唆された。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、合成栄養寒天培地（ＳＮＡ）上では平坦でほぼ無色のコロニーを形成した。分生子は、分生子座上または菌糸から直接立ち上がるフィアライド、あるいは培養後期に気中菌糸から立ち上がるポリフィアライドの先端で形成され、その形状は、０〜５隔壁、長さ４０μｍ以下、典型的には三日月形で、先端が細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。これらの顕微鏡下の形態的特徴から、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株がＳｅｃｔｉｏｎ  Ｅｕｐｉｏｎｎｏｔｅｓに属する可能性は否定され、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍが候補となった。【０１５２】  分子系統解析を行うためにｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）（図５、６）、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＴＥＦ  １−α）（図７、８）、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＧＳ）（図９、１０）の３領域の塩基配列を調べたところ、Ｆ１４７６株はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと分子系統学的に近縁であり、特に、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍクレードに含まれ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７と最も近縁であることが分かった。一方、Ｆ．ｅｑｕｉｓｅｔｉは分生子先端が細長く伸びる特徴を有することなどから、Ｆ１４７６株がＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉに属する可能性は否定された。【０１５３】  以上の結果を総合して、Ｆ１４７６株をＦｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（Ｒｏｂｅｒｇｅ）Ｓａｃｃａｒｄｏと同定した。なお、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７が、Ｆ１４７６株と同じく化合物１を産生したことによっても、この同定の妥当性が裏付けられた。【０１５４】材料および方法
使用した菌株
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は２０００年１月２４日に鎌倉市鎌倉山南斜面にて採集された落葉より２０００年２月２９日に洗浄濾過法により分離した糸状菌である。後述するように自然変異しやすく、培養性状の異なるクローンが容易に出現する。ヘテロなコロニーを形成するクローンをｏｒｇ、橙色の分生子座をコロニー表面全体に作るクローンをｗｅｔ、主として菌糸叢のみのクローンをｆａｓｔと、場合によって称することとした。【０１５５】  比較に用いた菌株は以下の通りで、いずれもオランダ中央菌類研究所（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ（以下、「ＣＢＳ」とも称する））より分譲された菌株である。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ（Ｃｏｒｄａ）Ｓａｃｃ．ＣＢＳ  １０７．０７、ＣＢＳ  １９３．６０、ＣＢＳ  ３０７．９４、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（Ｒｏｂ．）Ｓａｃｃ．ＣＢＳ  １６１．２５、ＣＢＳ  １４５．４４、ＣＢＳ  ６７８．７７。ＣＢＳから分譲された菌株の培養実験は、すべて、玉川大学において、奥田徹教授によってとり行われた。【０１５６】形態的性状の観察
形態観察の方法と使用した培地は、主としてＧｅｒｌａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ（１９８２）およびＡｏｋｉ（１９９８、２００３）に従った。すなわちよく生育したスラントから分生子もしくは菌糸断片をバレイショ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）および合成栄養寒天培地（ＳＮＡ）上に３点植菌し、暗黒下もしくは近紫外光照射下で２０℃もしくは２５℃で１週間から３週間（主として１０日）培養し、培養性状を肉眼、実態顕微鏡下で観察し、色調はマンセルおよびメトゥエン記号で記載した。なお麦芽エキス寒天培地（ＭＡ）、オートミール寒天培地（ＯＡ）、三浦培地（ＬＣＡ）などの培地も用いた。形態観察には主としてＰＤＡとＳＮＡを用いたが、ときにカーネーション葉寒天培地（ＣＬＡ）も用いた。フィアライドや分生子の計測にはＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（ｖｅｒ  ７．０、Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，）と汎用画像解析ソフトＯｐｔｉｍａｓ（ｖｅｒ  ６．５、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，）を用いて、半自動測定を行った。【０１５７】ＤＮＡの抽出
Ｆ１４７６株およびＣＢＳより分譲されたＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍはＰＤＡ上で培養し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン、東京）を用いてＤＮＡを抽出した。【０１５８】  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）領域の増幅には、ＩＴＳ４（ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）プライマー、ＩＴＳ５（ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）プライマー（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）を、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＴＥＦ  １−α）領域の増幅にはＴＥＦ１（ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡＣＡＡＧＡＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）プライマー、ＴＥＦ２（ＧＧＡ（Ｇ／Ａ）ＧＴＡＣＣＡＧＴ（Ｇ／Ｃ）ＡＴＣＡＴＧＴＴ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）プライマー（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）を、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＧＳ）領域の増幅にはＣＮＬ１２（ＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＡＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）プライマー、ＳＣＮ１（ＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）プライマー（Ｋｏｓｉａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００５）を用いた。増幅したＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン、東京）を用いて精製した。精製サンプルは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ、東京）と、上記各６種のプライマーと、ＩＧＳ領域については新たに設計したＩＧＳ１（ＴＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）プライマー、ＩＧＳ２（ＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）プライマーの合計８種のプライマーを用いてサイクルシークエンスを行い、精製した後、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ３１０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ、東京）でＤＮＡ配列のシークエンスを行った。得られたＦ１４７６株のＩＴＳ領域、ＴＥＦ  １−α領域、およびＩＧＳ領域の配列を、それぞれ以下に示した。【０１５９】Ｆ１４７６株のＩＧＳ領域の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）
2007000994.tif 000049
2007000994.tif 000050
【０１６０】Ｆ１４７６株のＴＥＦ  １−α領域の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）
2007000994.tif 000051
【０１６１】Ｆ１４７６株のＩＴＳ領域の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）
2007000994.tif 000052
2007000994.tif 000053
【０１６２】系統解析
得られたシークエンスデータはＣｌｕｓｔａｌＷでアライメントし、ＰＡＵＰ（ｖｅｒ  ４．０  ｂｅｔａ１０；Ｓｗｏｆｆｏｒｄ  ２０００）を用いて、Ｔｉ／Ｔｖ比を求め、重み付けを行った。その後、近隣結合法および最大節約法で解析し、系統樹を作成して、ブートストラップ検定を行った。【０１６３】Ｆ１４７６株およびＣＢＳ標準株の化合物１の生産確認
Ｆ１４７６株とＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍの標準株合計７株を、そば培地（２５０ｍｌ三角フラスコ１本につき、そば１０ｇ、ＳＢ溶液１０ｍｌを含む。ＳＢ溶液はＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（オリエンタル酵母）１００ｍｇ、酒石酸ナトリウム５０ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４５０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５０ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５．０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５．０ｍｇ、脱塩水１，０００ｍｌからなる）中、各２本ずつ２５℃で１２日間静置培養した。【０１６４】  培養物をｎ−ブタノール２０ｍｌで抽出し、３００μｌを濃縮乾固し、等量のメタノールに溶解して試料液とした後、下記分析条件５に示したＬＣ／ＭＳの分析条件で用いて分析した。【０１６５】  検出された化合物１は、標品を下記分析条件５に示したＬＣ／ＭＳの条件で分析して得られたマスクロマトグラフィー（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ（Ｍ＋Ｈ）：６６０）のピーク面積値を用いた絶対検量線法にて定量した。【０１６６】分析条件５
装置：島津高速液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−２０１０Ａ
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃ１８  ＭＧＩＩ，２ｍｍ×７５ｍｍ，３μｍ（資生堂社製）
移動相：以下に示した溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．１％蟻酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．１％蟻酸）
2007000994.tif 000054
流速：０．２ｍｌ／分、温度：４０℃
検出：Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ（ＥＳＩ）
Ｓｃａｎ  ｍｏｄｅ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（ＳＩＭ）（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｍ／ｚ＝６６０．３，５９２．１）【０１６７】  次にＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７を培養して得られた試料液を、下記分析条件６に示したＴＯＦ−ＭＳの分析条件で用いて分析した。【０１６８】分析条件６
装置：ＬＣ−ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ
ＬＣＱ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃｏｍｂｉ−ＲＰ，３．０ｘ５０ｍｍ，５μｍ（野村化学社製）
移動相：以下に示した溶媒勾配溶出
Ａ液：水（０．０１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ液：アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸）
2007000994.tif 000055
流速：１．２７６ｍｌ／分、温度６０℃【０１６９】  さらに同じくＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７を培養して得られた試料液を、下記分析条件７に示す分析条件で用いてＭＳ／ＭＳ分析し、化合物１の標品から得られるスペクトル（図２）と比較した。【０１７０】分析条件７
装置、カラム、移動相、流速、温度：分析条件６に同じ
ＭＳ／ＭＳ条件
イオンモード：ＥＳＩ  ポジティブ
イオンスプレイ電圧：５５００Ｖ
温度：４５０℃
コリジョンエネルギー：２５Ｖ【０１７１】結果
培養諸性状
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株のバレイショ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）上での生育は遅く、２５℃、近紫外光照射下１０日で直径１０〜１５ｍｍに達し、生育率は１．５〜１．６ｍｍ／日であった。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、部分的に密集した堅い菌糸叢を形成し、その表面は皺状で盛り上がり、白色ないし薄いピンク色（マンセル５ＹＲ−１０ＹＲ９／２）を呈し、周辺部はときに顕著に綿毛状の菌糸塊を形成した（ｆａｓｔ部分と呼ぶ）。また一部に湿った分生子座が集まり、色調は明るい橙色（杏色、ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｇｈｔ  ＡｐｒｉｃｏｔないしＡｐｒｉｃｏｔ、マンセル５ＹＲ７／６から７／１０、メトゥエン６Ａ６から６Ｂ８）（ｗｅｔ部分と呼ぶ）であった。裏面は、淡橙色から橙色（ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、ｂｒｉｇｈｔ  ｒｅｄｄｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ、Ｔｉｇｅｒ  Ｌｉｌｙ、マンセル５−１０ＹＲ７／１０、メトゥエン６Ｂ８から８Ａ６）を呈したが、表裏とも赤紫色にはならなかった。暗所では、生育率は少し悪く、０．９〜１．１ｍｍ／日であった。色調はより薄く、ベージュ（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン４Ａ３）色で、裏面は明るい赤味黄色（ｌｉｇｈｔ  ｒｅｄｄｉｓｈ  ｙｅｌｌｏｗ、Ｎａｐｌｅｓ  Ｙｅｌｌｏｗ）であった。しかし、菌糸の色調が濃くなることもあり、黄土色から灰褐色（ｇｏｌｄ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｏｃｈｅｒ、ｌｉｇｈｔ  ｇｒａｙｉｓｈ  ｂｒｏｗｎ、Ｂｌｏｎｄ、マンセル１０ＹＲ５／４−８、メトゥエン５Ｅ５−８）となり、その場合の裏面は暗黄褐色（栗皮色、ｄａｒｋ  ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｂｒｏｗｎ、Ｂｕｒｎｔ  Ｕｍｂｅｒ、マンセル１０ＹＲ３／６）であった。いずれの場合も裏面も赤紫色にはならなかった。【０１７２】  上記の湿った分生子座を豊富に形成する部分（ＷＥＴ部分）を継代すると、生育が早くなり、１０日で直径２２〜２７ｍｍに達し、均質で平坦、ビロード状、粘液質の橙色のコロニーを形成するようになり、ときに黄色色素を培地中に作ることもあった。またＦＡＳＴ部分を継代すると肉眼的に分生子座の橙色が認められなくなり、主として菌糸叢からなる綿毛状あるいは粒状、粉状コロニーが形成され、コロニーは、１０日で１０〜１６ｍｍに達した。
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株の合成栄養寒天培地（ＳＮＡ）上での生育は遅く、近紫外光照射下７日で直径１３ｍｍに達し、生育率は１．６ｍｍ／日であった。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、平坦で薄いコロニーを形成した。該コロニーは、フェルト状ないし羊毛状であり、中央部分は湿った分生子座が点在しており、色調はベージュ色を呈した（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン４Ａ３）。裏面も同色であった。暗所でも同様の生育を示した。【０１７３】  ＷＥＴ部分を継代してＳＮＡ上で生育させたところ、コロニーは１０日で１４〜１９ｍｍに達したが、ほかの培養性状にあまり変化はなかった。ＦＡＳＴ部分は、１０日で１９〜２０ｍｍと早い生育を示した。【０１７４】  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株の麦芽エキス寒天培地（ＭＡ）上での生育は遅く、近紫外光照射下１１日で直径１１ｍｍに達し、生育率は１．０ｍｍ／日であった。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、密集した菌糸叢を形成し、菌糸叢は、盛り上がり、羊毛状ないしフェルト状であった。色調は明るい橙色（ｌｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ａｐｒｉｃｏｔ、マンセル５ＹＲ８／６、メトゥエン６Ａ６）であり、裏面は輝橙色（ｂｒｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、マンセル５ＹＲ７／１２、メトゥエン６Ａ７）であった。暗所では色調は淡色となった。【０１７５】  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株のオートミール寒天培地（ＯＡ）上での生育は早く、近紫外光照射下１０日で直径２１ｍｍに達し、生育率は３．７ｍｍ／日であった。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、平坦だが中央部分に多数の分生子座が密集した、粒状コロニーを呈した。色調は明るい黄橙色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ、Ｍａｉｚｅ、マンセル５ＹＲ７／８、メトゥエン６Ｂ６）であり、裏面も同色であった。暗所での色調は淡色となった。【０１７６】  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株の三浦培地（ＬＣＡ）上での生育は早く、近紫外光照射下１０日で直径２５ｍｍに達し、生育率は３．４ｍｍ／日であった。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｆ１４７６株は、平坦でうすいコロニーを形成し、コロニーは、粒状ないし綿毛状であり、中央部分は湿った分生子座が点在しており、色調はベージュ色（ｐａｌｅ  ｂｅｉｇｅ、Ｉｖｏｒｙ、マンセル１０ＹＲ９／２、メトゥエン４Ａ３）であり、裏面も同色であった。暗所でも同様の生育を示した。【０１７７】形態的性状
ＳＮＡ上では、分生子柄は主に気中菌糸から垂直に立ち上がり、分岐することがある。その分枝あるいは分生子柄に直接フィアライドが２から８個輪生した。分生子柄やフィアライドからなる分生子形成構造は、ときに分生子座を形成する複雑な構造を示した。またコロニーの周辺部分では、分生子柄を形成することなく、気菌糸上に直接フィアライドが単生もしくは輪生した。寒天表面上を這う菌糸から分生子が形成されることもあった。とくに２週間以上培養すると、分生子形成細胞は、分生子の形成過程で伸長あるいは膨張し、１細胞で複数個の分生子傾性部分を生ずるポリフィアライド（もしくはメソ分生子形成細胞）となった。分生子柄は、１０〜３０μｍの長さとなった。フィアライドは、円筒形、ペン軸形、とっくり形などであり、その先端には通常顕著なカップ構造を有していた。ポリフィアライド（もしくはメソ分生子形成細胞）は上部に２〜５個の開口部を生じていたが、カップ構造は顕著ではなかった。分生子形成細胞（フィアライド、ポリフィアライド）では、そのサイズは、単生のものではｗｅｔ部分が（８．５）１０．５−２４．５（３６．５）ｘ２．５−３．０（３．５）μｍ（平均１７．５ｘ３．０μｍ）、Ｌ／Ｗ（２．７５）３．１０−９．７０（１６．２５）（平均６．４）、ｆａｓｔ部分は（７．０）９．５−２５．０（２８．０）ｘ２．５−３．０（３．５）μｍ（平均１７．０ｘ３．０μｍ）、Ｌ／Ｗ（２．７８）３．３１−８．７７（１０．０）（平均６．０４）であった。特に分生子座を形成する密に輪生した分生子形成細胞では、そのサイズは、ｗｅｔ部分が（６．０）８．０−１４．０（１９．０）ｘ２．５−３．５μｍ（平均１１．０ｘ３．０μｍ）、Ｌ／Ｗ（２．００）２．３８−５．０６（７．５６）（平均３．７２）、ｆａｓｔ部分は（８．５）９．０−１２．５（１４．０）ｘ（２．５）３．０−３．５μｍ（平均１１．０ｘ３．０μｍ）、Ｌ／Ｗ（２．５）２．８５−４．３３（５．０）（平均３．５９）であった。分生子は、フィアライドの先端に粘液質で塊状に集合して形成され、典型的には三日月形でときに長楕円形ないし円筒形となり、先端は顕著に細長く延びることはない。分生子の基部は明瞭な足細胞を有するか、截断痕状または鈍頭である。また、通常分生子は２−４隔壁を有するが、隔壁がないあるいは１または５隔壁を有することがあった。分生子のサイズは、ｗｅｔ部分の３隔壁分生子では（１８．５）２３．５−２９．０（３２．５）ｘ（３．０）４．０−５．５（６．５）μｍ（平均２６．５ｘ５．０μｍ）、Ｌ／Ｗ  ４．１９−８．３９（平均５．５２）、４隔壁分生子では２７．０−３０．０（３２．５）ｘ（３．０）３．５−５．５（６．０）μｍ（平均２８．５ｘ４．５μｍ）、Ｌ／Ｗ  ４．６５−８．８８（平均６．４８）、ｆａｓｔ部分の２隔壁分生子では１６．０−１９．０ｘ２．５−３．０μｍ（平均１７．５ｘ２．５μｍ）、Ｌ／Ｗ  ６．４５−６．８４（平均６．６４）、３隔壁分生子では（１５．５）２２．０−２８．０（３３．５）ｘ（２．５）３．０−５．０（５．５）μｍ（平均２５．０ｘ４．０μｍ）、Ｌ／Ｗ  ４．４２−１０．３０（平均６．５５）、４隔壁分生子では（２５．０）２６．０−３１．５（３７．０）ｘ（３．０）４．０−５．５（７．０）μｍ（平均２９．０ｘ４．５μｍ）、Ｌ／Ｗ  ４．４５−９．４１（平均６．４）、５隔壁分生子では２７．５−３３．０（３５．５）ｘ（３．０）４．０−５．５（６．０）μｍ（平均３０．５ｘ５．０μｍ）、Ｌ／Ｗ  ４．８７−８．８１（平均６．５４）であった。菌糸上には典型的な粗面の厚膜胞子の形成は認められなかったが、空洞化肥厚したほとんど平滑で亜球形の細胞が、菌糸の先端もしくは中間に１細胞または数細胞が連鎖した形状で形成され、そのサイズは、（５．５）８．５−１５．０（１５．５）ｘ（５．０）６．０−１３．５（１４．０）μｍ（平均１１．５ｘ９．５μｍ）、Ｌ／Ｗ  １．０４−１．４５（１．６１）（平均１．２４）であった（図３および図４参照）。なお、例えば、「（５．５）８．５−１５．０（１５．５）」は、「通常は８．５−１５．０の範囲であるが、５．５−１５．５まで拡大されることもある」を意味する。【０１７８】ＤＮＡ塩基配列による系統解析
得られたＩＴＳ領域の塩基配列（４６６ｂｐ）をＢＬＡＳＴ検索した結果、Ｆ１４７６株はＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍと相同性が高いことが分かった。そこで系統解析には、Ｆ１４７６株とＣＢＳの標準株、Ｆ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ  ３株とＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ３株の他、ＢＬＡＳＴ検索で相同性が高かった１４株の登録データを用いた。近隣結合法・最大節約法で系統解析した結果（図５、６）、Ｆ１４７６株はＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍとクレードを形成した（ブートストラップ値：１００）。【０１７９】  ＴＥＦ  １−α領域（６７７ｂｐ）の系統解析は、ＣＢＳの標準株の他、ＢＬＡＳＴ検索で相同性が高かった１５株の登録データを用いた。近隣結合法での解析の結果（図７）、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍとともにＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉクレードの外に位置することが分かった。最大節約法での解析の結果でも（図８）、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍクレードに含まれた。【０１８０】  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＧＳ）領域（２３５８ｂｐ）の系統解析は、ＣＢＳの標準株の他、ＢＬＡＳＴ検索で相同性が高かった６株の登録データを用いた。近隣結合法での解析の結果（図９）、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍとともにＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉクレードの外に位置することが分かった。最大節約法での解析の結果でも（図１０）、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍクレードに含まれた。
Ｆ１４７６株およびＣＢＳ標準株の化合物１の生産確認【０１８１】  ＬＣ／ＭＳでの分析の結果、Ｆ１４７６株とＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７を培養して得られた試料液中には、化合物１の標品と比較して、Ｍ＋Ｈ値とＲＴが一致するマスクロマトグラフィーのピークが観察された。しかしＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７を除くＣＢＳ標準株５株の培養抽出物中には化合物１は検出されなかった（ＮＤ）。なお、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７の化合物１の生産量は定量限界以下（ｔｒ）であった。結果を表１１としてまとめた。
【表１１】
2007000994.tif 000056
化合物１の物理化学的性状
分子量６５９
ＥＳＩ（ＬＣ／ＭＳポジティブモード）ｍ／ｚ＝６６０（Ｍ＋Ｈ）
分析条件５における化合物１のＲＴ  ２２．３±０．１分【０１８２】  ＴＯＦ−ＭＳでの分析の結果、表１２に示した分子式を得た。この分子式は、化合物１のものと一致した。
【表１２】
2007000994.tif 000057
【０１８３】  ＭＳ／ＭＳでの分析結果を図１１に示した。化合物１の標品から得られたスペクトルと比較し一致することを確認した。【０１８４】  以上より、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７は、化合物１を生産することが示された。【０１８５】考察と同定
Ｆ１４７６株は生育がきわめて遅く、ＰＤＡ上で粘液質ビロード状の鮮やかな橙色のコロニーを形成したり（ｗｅｔ部分）、堅く不規則な外形の主として菌糸叢からなるコロニーを形成した（ｆａｓｔ部分）。継代を続けると次第に両者の性質が分離し、生育が早まる傾向があった。これらの肉眼的に差異のあるクローンを単離してＩＴＳ領域とＴＥＦ  １−α領域の塩基配列の相同性を調べたところ、完全に一致していたことから、これらのクローンは分子系統分類学上は同一と考えた。【０１８６】  Ｆ１４７６株の生育が遅く橙色の平坦なコロニーを形成することからは、Ｆ．ｍｅｒｉｓｍｏｉｄｅｓやＦｕｓａｒｉｕｍ  ａｑｕａｅｄｕｃｔｕｕｍ（Ｒａｂｅｎｈ．＆  Ｒａｄｌｋ．）Ｓａｃｃ．などのＳｅｃｔｉｏｎ  Ｅｕｐｉｏｎｎｏｔｅｓが候補にあげられた。しかし顕微鏡下ではポリフィアライドを形成する点、ＩＴＳ領域の塩基配列の相同性からＢＬＡＳＴ検索し、近隣結合法・最大節約法で系統解析して得られた結果（図５、６）、そしてＦ１４７６株が、Ｆ．ｍｅｒｉｓｍｏｉｄｅｓなどからは遠く、Ｆ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍとクレードを形成（ブートストラップ値：１００）することから、Ｆ１４７６株が、少なくともＳｅｃｔｉｏｎ  Ｅｕｐｉｏｎｎｏｔｅｓであることは否定された。次にＴＥＦ  １−α領域（６７７ｂｐ）を用いて系統解析を行い、近隣結合法での解析の結果（図７）、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍとともにＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉクレードの外に位置することが分かった。特に、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ６７８．７７と最も近縁であることが分かった（ブートストラップ値：６６）。さらに、ＩＧＳ領域（２３５８ｂｐ）の塩基配列を用いた最大節約法での解析の結果（図１０）においても、Ｆ１４７６株はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍクレードに含まれており、かつ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ６７８．７７と最も近縁であることが分かった。【０１８７】  一方、Ｆ１４７６株のように分生子形成細胞の一部が伸張し分生子形成部位を複数つくるポリフィアライドもしくはメソ分生子形成細胞を形成するＦｕｓａｒｉｕｍには、Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ（Ｆｒ．）Ｓａｃｃ．、Ｆ．ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｎｕｍ（Ｔｈｕｍ．）Ｓａｃｃ、Ｆ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ  Ｗｏｌｌｅｎｗ．＆  Ｒｅｉｎｋｉｎｇ、Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（＝Ｆ．ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ（Ｃｋｅ）Ｓａｃｃ．、Ｆ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ  Ｂｅｒｋ．＆  Ｒａｖｅｎｅｌ）、Ｆ．ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ  Ｓｈｅｒｂ、Ｆ．ｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ（Ｗｏｌｌｅｎｗ．＆  Ｒｅｉｎｋｉｎｇ）Ｐ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｔｏｕｓｓｏｕｎ  ＆  Ｍａｒａｓａｓなどがあるが（Ｐａｓｃｏｅ  １９９０）、分生子が著しく小さいか、分生子先端が細長く延びるか、菌糸または裏面色素が赤紫となることを特徴とすることなどから、Ｆ１４７６株がＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ以外であることは否定され、これは、分子系統学的データとは矛盾しなかった。またＴＥＦ  １−α領域とＩＧＳ領域の塩基配列から近縁とされるＦ．ｅｑｕｉｓｅｔｉは、ポリフィアライドを形成せず、分生子先端が特徴的に伸張し、４隔壁以上の分生子の長さが��０μｍを超える点で明らかにＦ１４７６株とは異なる。以上の培養性状、形態的特徴、分子系統分類学的結果、さらに化合物１の生産性から、生育が著しく遅い点が異なるが、本菌Ｆ１４７６株を、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ（Ｒｏｂｅｒｇｅ）Ｓａｃｃａｒｄｏと同定した。【０１８８】  Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍは、Ｇｅｒｌａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ（１９８２）によればＦ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍとされ、２つの変種、ｖａｒ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍとＦ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ  Ｗｏｌｌｅｎｗ．が知られている。後者は分生子の隔壁が多く（０〜９隔壁）、大きさもそれにつれて大きくなる特徴がある。この点ではＦ１４７６株は、Ｆ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ  ｖａｒ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍの方がより近い。Ｂｏｏｔｈ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｏｎ（１９８４）はＦ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍの２変種を同一としてＦ．ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍの名称を用いたが、Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ（１９９０）はＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍがＦ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓに対応するとした。また先に述べたとおり歴史的にはＦ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍには２変種があったが、Ｐａｓｃｏｅ（１９９０）は２変種を一つに統合してＦ．ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍとした。続いてＮｉｒｅｎｂｅｒｇ（１９９０）は統合は認めたが、命名法上Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍがより早く優先権があるのでＦ．ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍを異名とした。２つの変種を認めるか認めないかにより命名法上の問題からＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍをとるかＦ．ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍをとるかはまだ議論の余地がある（Ｋｈｏａ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）。今回比較に用いたＣＢＳの標準菌株の中でもっとも系統的に近縁だったものはＣＢＳ  ６７８．７７である。この菌株はＭａｔｓｕｓｈｉｍａ（１９７５）によりＰｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ（Ｂｅｒｋ．＆  Ｒａｖｅｎｅｌ）Ｍａｔｓｕｓｈ．として三重県津市の土壌から分離記載された株である。その他のＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍの標準株は、ＣＢＳ  １６１．２５がオーストラリア、ＣＢＳ  １４５．４４は出所不明だが日本とは考えられないので、Ｆ１４７６株が同じくわが国由来のＦ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ  ＣＢＳ  ６７８．７７と系統的に非常に近縁であるのはもっともである。このことは、Ｆ１４７６株が、ＣＢＳ６７８．７７株と同じく化合物１を産生したことによってもサポートされる。【０１８９】  なお、本同定に当たっては、以下の文献を引用した：
Ａｏｋｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｋ．１９９８．Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｅ  ｓｐ．ｎｏｖ．ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎ．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１−６．
Ａｏｋｉ  Ｔ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｋ，Ｈｏｍｍａ  Ｙ，ａｎｄ  Ｌａｔｔａｎｚｉ  ＡＲ．２００３．Ｓｕｄｄｅｎ−ｄｅａｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−Ｆ．ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｆ．ｔｕｃｕｍａｎａｅ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ  ９５：６６０−６８４．
Ｂｏｏｔｈ  Ｃ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｏｎ  ＢＣ．１９８４．Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ，ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｎａｍｅ  ｆｏｒ  Ｆ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ  ａｕｃｔ．Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８３：７０２−７０４．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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