(57)【要約】本発明は遺伝子工学に関し、具体的には、ファージディスプレイ法とインテインを介したタンパク質開裂反応とを組み合わせて用いた、組み換えペプチドの設計、製造および修飾に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を包含することを特徴とする、少なくとも１つのジスルフィド結合を有するペプチドの製造方法。
−  目的ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、
−  インテインとの融合体を形成するように該核酸分子を発現ベクターに組み込む工程、
−  ペプチド−インテイン融合体を発現させてペプチド−インテイン融合タンパク質を得る工程、および
−  温度およびｐＨの変化により、得られたペプチド−インテイン融合タンパク質からペプチドの開裂を誘導する工程。
【請求項２】
開裂させたペプチドをアフィニティーカラムで精製する工程をさらに包含することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該融合体の発現を、宿主系を用いてin vivoで行うことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
該宿主系がEscherichia coli細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
融合体の発現をin vitroで行うことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
該提供する核酸分子が合成核酸分子であり、該合成核酸分子は、目的ペプチドをコードするヌクレオチド配列および該核酸分子の発現ベクターへの組み込みを可能とする配列成分を包含することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
該提供する核酸分子が、ファージディスプレイベクターから得た核酸分子をＰＣＲで増幅したものであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
ファージディスプレイベクターから得た核酸分子にコードされているペプチドに、アミノ酸類似体が含まれることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
製造するペプチドがファージディスプレイ法を用いてスクリーニングしたペプチドであり、該提供する核酸分子が、目的ペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接し、該ヌクレオチド配列の発現ベクターへの組み込みを可能とする配列成分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いて得たＰＣＲ複製産物であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
該オリゴヌクレオチドプライマーのペアが、CCT TTC TGC TCT TCC AAC GCC GAC GGG GCT 配列であるフォワードプライマー配列およびACT TTC AAC CTG CAG TTA CCC AGC GGC CCC 配列であるリバースプライマー配列からなることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
製造するペプチドが親水性ペプチドライブラリーを構築しており、該目的ペプチドに少なくとも１種の親水性アミノ酸を導入するために、該提供する核酸分子に親水性アミノ酸をコードするコドンが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１２】
該製造するペプチドのアミノ酸配列が、ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣであることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
製造するペプチドが親水性ペプチドライブラリーを構築しており、該目的ペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸残基を少なくとも１種の親水性アミノ酸で置換するために、該提供する核酸分子に親水性アミノ酸をコードするコドンが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
製造するペプチドによってペプチドのプールを構成するために、該提供する核酸分子が、それぞれ異なった目的ペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含有することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１５】
該ペプチドのプールから高い溶解性を示すペプチドをスクリーニングする工程をさらに包含することを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
該ペプチド−インテイン融合体の発現を下記の工程を包含する方法で行い、アミノ酸類似体を含むペプチド−インテイン融合タンパク質を得ることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
−  非天然アミノ酸で置換することが可能な天然アミノ酸に対する栄養要求性を有する宿主細胞を提供する工程、および
−  該宿主細胞内において、非天然アミノ酸であるアミノ酸類似体の存在下、該ペプチド−インテイン融合体を発現させる工程。
【請求項１７】
該製造するペプチドのアミノ酸配列が、ＣＴＴＨ（５−フルオロ−Ｗ）ＧＦＴＬＣであることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
該製造するペプチドのアミノ酸配列が、ＣＴＴＨ（６−フルオロ−Ｗ）ＧＦＴＬＣであることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１９】
ＣＴＴＨ（５−フルオロ−Ｗ）ＧＦＴＬＣで表されるアミノ酸配列からなる、高い血清安定性を示すペプチド。
【請求項２０】
ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣで表されるアミノ酸配列からなる、高い水溶性を示すペプチド。
【請求項２１】
ＣＴＴＨ（５−フルオロ−Ｗ）ＧＦＴＬＣで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１６の方法で得られるペプチド。
【請求項２２】
ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１１の方法で得られるペプチド。
【請求項２３】
下記の工程を包含することを特徴とする、非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法。
−  栄養要求性宿主を用いて、アミノ酸類似体含有ペプチドのライブラリーをファージに発現させる工程、
−  栄養要求性宿主内のファージに提示されているアミノ酸類似体含有ペプチドから目的ペプチドを選択する工程、
−  該目的ペプチドをコードする核酸分子をインテインベクターに導入する工程、および
−  請求項１６に記載の工程に従って、該目的ペプチドをコードする核酸分子を発現させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学に関し、具体的には、ファージディスプレイ法とインテインを介したタンパク質開裂反応とを組み合わせて用いた、組み換えペプチドの設計、製造および修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファージディスプレイ法および他のハイスループットスクリーニング法は、選択したレセプターや他の標的に結合する低分子量ペプチドを得るために用いられている。標的に結合するペプチドは、バイオパニングによってかなり迅速に同定することができものの、このような配列から有用な高親和性ペプチドを開発するには相当の時間がかかる場合がある。さらに、ファージディスプレイ法などのコンビナトリアルな方法は、通常、結合相互作用のみに基づいてペプチドを同定するため、十分な水溶性を示す生物学的に活性なペプチドを見出すためには、複数の候補を試験する必要がある。残念ながら、異なる種類のペプチドの系列を化学合成によって調製することは、特に、特定のジスルフィド結合の配置を用いてペプチドを環化しなければならない場合、困難且つ費用のかさむ作業となる。
【０００３】
所望の活性を有するペプチドの同定を促進するために、ペプチドをグルタチオン−Ｓ−転移酵素やアルカリフォスファターゼとの融合タンパク質として製造する方法が実施されている。しかし、担体タンパク質と融合すると、ペプチドはその活性を失う場合がある。さらに、ペプチドが酵素阻害物質である場合、融合タンパク質はこのような活性を示すのにあまり適切ではないことがある。これらの問題は、プロテアーゼまたはペプチド結合を加水分解する化学物質（例えば、臭化シアンやヒドロキシルアミン）を用いてペプチドを担体から切り離すことによって回避することができるが、ペプチドの収率は非常に低いことが多い。このような試薬の使用はまた、ペプチド自身の分解をもたらすこともある。
【０００４】
ファージディスプレイシステムによって見出されるペプチドもまた、水に不溶性である場合が多く、その不溶性によって研究や生体系での使用が困難になっている。
【０００５】
組み換えタンパク質を調製するための、インテインを介したタンパク質スプライシングシステムが報告されている（Chong et al., 1997）。インテインは、タンパク質スプライシング活性を有するタンパク質であり、細菌に組み換えタンパク質を発現させるための融合パートナーとして広く用いられている。インテインの自己開裂能により、標的タンパク質をインテインから切り離すことが可能になるので、プロティナーゼやペプチド結合を加水分解する化学物質による処理は不要となる（Chong et al., 1997; Mathys et al., 1999）。
【０００６】
インテインのスプライシング活性は、例えばチオール試薬によって誘導することができ、また一方では、温度とｐＨの変化によっても誘導することができる（Evans et al., 1999）。
【０００７】
インテインシステムは、小さな環状ペプチドの製造に用いられてきた（WO 00/36093）。この特許出願で開示されている方法では、ペプチドの環化を触媒するために、分離インテイン（split intein）のトランススプライシング能を利用している。この特許公報で製造したペプチドは主鎖環状ペプチド、即ちＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸との間にペプチド結合を有するペプチドである。この方法においては、標的ペプチドが分離インテインの２つの部分の間に挿入されており、このような構造は主鎖環状ペプチドを得るために不可欠である。
【０００８】
ファージディスプレイ法が新規なペプチドリガンドを選択するための有力な手段である一方で、現在のファージディスプレイライブラリーは、２０種の天然アミノ酸の使用に依存しなければならないため、その化学的多様性に限界がある。ファージに提示されているペプチドやタンパク質に、さらなるアミノ酸を加えるためのアプローチが、わずかながらin vitroおよびin vivoで行われている。また、非天然アミノ酸を含む合成ペプチドを、ファージディスプレイ変異誘発法によって修飾した、ファージが提示するタンパク質に結合する試みも行われている（Dwyer et al., 2000）。
【０００９】
ファージに提示されたペプチドの化学的多様性を増加させるためのアミノ酸類似体の組み込みは、より高活性で安定したペプチドの同定につながり、このようなペプチドは創薬プロセスの手がかりとなる化合物としての役割を果たし得るので、アミノ酸類似体の組み込みは非常に重要である。
【００１０】
発明の概要 
本発明者らは、溶解性の型でファージに提示されているペプチドを迅速に製造するための方法として、インテインを介したタンパク質スプライシングの開発によって改善された、ペプチドの製造および修飾のための方法を考案した。本発明の方法は、ジスルフィド架橋を有するペプチドの製造において特に有用であり、この方法では、ペプチドの開裂を温度／ｐＨ誘導可能な（temperature/pH-inducible）インテインスプライシングを用いて行う。一例として、ゼラチナーゼ阻害物質であるドデカペプチドＣＴＴ（アミノ酸配列：ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ）の製造について記載する。ＣＴＴは、繊維状ファージに提示されたランダムペプチドライブラリーのスクリーニングによって発見された、ジスルフィド結合含有低分子量ペプチドである。
【００１１】
インテインシステムはまた、非天然アミノ酸を含む異型ＣＴＴペプチドを調製することも可能にした。５−フルオロトリプトファンを含有するＣＴＴペプチドは、野生型ＣＴＴペプチドに比べ、ヒト血清においてより安定であり、腫瘍細胞浸潤のより有力な阻害物質であることが明らかになった。
【００１２】
ＣＴＴペプチドは水に溶解する。しかし、標識を目的とする場合には、ペプチドに追加のチロシン残基を挿入する必要がある。このような追加のチロシンを含む、化学的に合成、修飾されたＣＴＴペプチドは、しかしながら、水に不溶性であり、そのためこのペプチドは研究に用いるのに非実用的である。そこで、ランダムな疎水性アミノ酸が隣接している追加のチロシンを含むＣＴＴペプチドのコンビナトリアル ライブラリーをインテイン融合体として発現させ、得られたペプチドの溶解性と活性を試験した。その結果、本発明者らは、このシステムを用いると、改善された高い溶解特性を示すペプチドのスクリーニングが簡便に行われることを見出した。
【００１３】
従って、本発明者らは、インテインを介したタンパク質の開裂反応を、E. coliでの組み換えペプチドの生成に用いた。この方法により、１０アミノ酸残基からなるゼラチナーゼ阻害ペプチド（アミノ酸配列：ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ）の迅速な製造および精製をミリグラム単位の量で行うことが可能となる。ペプチドのアラニンスキャニング変異誘導法によって、トリプトファン残基がゼラチナーゼ阻害活性の中心であることが分かった。生合成によってヒドロキシル化トリプトファン類似体やフッ素化トリプトファン類似体をインテイン融合タンパク質に組み込んだ後でもインテインの開裂は生じた。アミノ酸類似体は、in vitroで構築したバクテリオファージＭｕ ＤＮＡ転位複合体（in vitro assembled bacteriophage Mu DNA transposition complexes）を用いた挿入変異誘発によって、トリプトファン栄養要求性に変換したタンパク質発現株を用いて効果的に組み込んだ。全てのトリプトファン類似体含有ペプチドがゼラチナーゼ阻害活性を保持していた。野生型のＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドと比べて、５−フルオロトリプトファン含有ペプチドは高い血清安定性を示し、腫瘍細胞の浸潤に対するより強力な阻害物質であった。これらの研究は、非天然アミノ酸の生合成による組み込みによってペプチドを修飾し、その活性を改善するための新たな可能性を開いた。総合的には、これらの研究は、インテインを介したペプチドの発現がペプチドの設計において用途の広い手段であり、そして潜在的な治療的用途を有する高活性ペプチドの開発を可能にすることを示している。
【００１４】
さらに、ｐｒｏＭＭＰ−９を標的としてファージの選択を行った。選択のための操作を３回行った後、その結果として残ったペプチドをインテインベクターでクローニングした。クローニングには、ペプチドの配列がわからなくとも、いかなるファージ挿入ペプチドをも増幅することができるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いた。このようにして得られたペプチドのアミノ酸配列はＡＤＧＡ−(Ｘ)n−ＧＡＡＧであり、アミノ酸配列ＡＤＧＡとＧＡＡＧはファージに由来し、(Ｘ)nは挿入ペプチドである。具体例としては、２種のこのようなペプチドの発現に成功し、それらの特異性をファージ結合の阻害によって示すことができた。
【００１５】
さらに、栄養要求性E. coliを用いてファージ粒子にアミノ酸類似体を組み込むためのペプチドディスプレイシステムを開示する。このシステムは、改善された活性または安定性を有するペプチドの選択を促進すると考えられる。栄養要求性の細菌株では、アミノ酸要求性は、天然アミノ酸の非存在下における転移ＲＮＡの誤ったアミノアシル化を強制し、続いてアミノ酸類似体のポリペプチドへの組み込みが生じる。このような方法を、本発明ではファージ粒子の製造に用いる。
【００１６】
従って、本発明は、概して、次の工程を包含する、ペプチドの製造方法に関する。目的ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、インテインとの融合体を形成するように該核酸分子を発現ベクターに組み込む工程、およびペプチド−インテイン融合体を発現させてペプチド−インテイン融合タンパク質を得る工程。
【００１７】
好ましい態様においては、上記方法のために提供する核酸分子は、ファージディスプレイベクター、あるいはリボソームディスプレイシステム、プラスミド−ペプチドディスプレイシステムまたは他の遺伝学的ディスプレイシステムから得たＰＣＲ増幅核酸分子である。
【００１８】
上記の方法は、得られたペプチドの開裂を誘導する工程、および開裂させたペプチドをアフィニティカラムで精製する工程をさらに包含してもよい。好ましい態様においては、ペプチドの開裂は、温度およびｐＨの変化により誘導する。
【００１９】
本発明の方法においては、通常、融合体の発現を、適切な宿主系を用いてin vivoで行う。このような宿主系においては、ペプチド−インテイン融合体を、例えば、Escherichia coli細胞で発現させる。他の微生物宿主や真核生物宿主、例えば酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞なども用いることができる。
【００２０】
一方、本発明の方法における融合体の発現は、in vitroで行うこともできる。その場合、翻訳は生きている細胞を用いずに行うことになるので、翻訳機構は通常、細胞溶解物や細胞抽出物から得る。
【００２１】
上記で概説したように、本発明の方法はペプチドの設計における様々な目的、例えば、水溶性を高めたペプチドを得るための、任意の親水性アミノ酸を含むペプチドのライブラリーの構築、非天然アミノ酸を含むペプチドの製造、または改善された特性についてスクリーニングするためのペプチドのプールの製造、に適用することができる。
【００２２】
本発明の方法の具体的な用途は、ファージディスプレイ法によって得たペプチドの製造であり、この場合、普遍的なインテイン・オリゴヌクレオチドプライマーのペアを設計する。このようなプライマーの構造は、ペプチドの配列がわからなくとも、挿入ペプチドの増幅を可能にする。
【００２３】
従って、以下の普遍的なプライマーを設計した。
（１）CCT TTC TGC TCT TCC AAC GCC GAC GGG GCT からなる、インテイン・フォワードSapIプライマー配列。このプライマーは、アミノ酸ＡＤＧＡをファージからペプチドに加える。
（２）ACT TTC AAC CTG CAG TTA CCC AGC GGC CCC からなる、インテイン・リバースPstIプライマー配列。このプライマーは、アミノ酸ＧＡＡＧをファージからペプチドに加える。
【００２４】
これらのプライマー配列は、ファージに提示されるいかなるペプチドをもインテイン融合体として増幅およびクローニングするのに用いることができる。つまり、ファージペプチドをＰＣＲを用いて増幅し、挿入物を制限酵素であるSapIおよびPstIで消化する。得られた挿入ペプチドを、同様に消化したインテインベクターに結合する。そして、結合したベクターで宿主細胞を形質転換し、発現させる。さらなる工程として、本発明の方法は宿主細胞から得たペプチドを精製する工程を包含してもよい。
【００２５】
本発明者らの研究により、インテインシステムの有用性は、低分子量ペプチドの製造および非天然アミノ酸による低分子量ペプチドの修飾に及んだ。非天然アミノ酸（例えばフッ素化トリプトファン）を組み込み得ることは、創薬プロセスで用いるための、より高い活性および／または安定性を示すペプチドの開発を促進するはずである。さらに、複数のアミノ酸栄養要求性を有する変異（modified）株を用いることにより、複数のアミノ酸を非天然アミノ酸で置換することが可能である。
【００２６】
非天然アミノ酸を含むペプチドの調製方法の好ましい態様においては、非天然アミノ酸を含むペプチドを栄養要求性宿主内でファージに提示させることによって直接選択し、続いて選択したペプチドをインテイン融合体としてファージに発現させる。
【００２７】
この非天然アミノ酸ディスプレイシステムは、アミノ酸類似体の組み込みが特定のコドンとは無関係であるため、fUSE5ベクターを用いた既存のファージライブラリーと完全に適合する。従って、アミノ酸類似体を含む新規なライブラリーは、既存のライブラリーで感染させることで簡単に作製することができる。これによってライブラリー構築に必要な、時間のかかるクローニングおよび形質転換のための工程を回避することができる。さらに、インテイン支援ペプチド発現（intein-assisted peptide expression）は、効率的にファージディスプレイを補完し、例えば、フルオロプトファン含有ペプチドを、活性分析のために可溶性ペプチドとして直接発現させることができる。
【００２８】
本発明のシステムは、トリプトファンなどの存在量の低いアミノ酸に対して用いると最も効果を表す。ファージディスプレイ法によって選択されたペプチドは、非常に多くの場合トリプトファンの存在量が増えているので、トリプトファン類似体をファージライブラリーに組み込むことができるということは重要である。
【００２９】
発明の詳細の説明 
略語：
ＣＴＴ：          ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド（Koivunen et al., 1999a））；
ｉＣＴＴ：        組み換えＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド； 
ＳＴＴ：          ＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳペプチド; 
ＭＭＰ：          マトリックスメタロプロティナーゼ；
５ＯＨ−Ｔｒｐ：  ５−ヒドロキシトリプトファン；
５Ｆ−Ｔｒｐ：    ５−フルオロトリプトファン；
６Ｆ−Ｔｒｐ：    ６−フルオロトリプトファン；そして
７Ａ−Ｔｒｐ：    ７−アザトリプトファン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
方法  
ペプチドの化学合成
ペプチドの合成は、Applied Biosystems model 433A（カルフォルニア州、フォスターシティ）を用い、ジスルフィド結合の形成に過酸化水素を用いる以外は、公知のFmoc化学手法（Fmoc-chemistry）（Koivunen et al., 1999a）に従って合成した。端的に記すと、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）にペプチドをその濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、そこにペプチド１００ｍｇあたり０．５ｍｌの３％過酸化水素を加えた。３０分間インキュベートしたのち、ｐＨを３．０に調整し、得られた環状ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製は、０．１％トリフルオロ酢酸を用いたアセトニトリルの直線濃度勾配（３０分で０％から７０％に上昇）で行った。
【００３１】
インテイン−ペプチド融合体のクローニング
ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチド： 5'-GGTGGTGCTCTTCCAACTGTACGACCCATTGGGGATTTACTTTATGTTAACTGCAGGCG-3'を、ＤＮＡポリメラーゼ（Dynazyme II；フィンランド国、エスポー、Finnzymes製）および塩基配列が5'-CGCCTGCAGTTAACA-3'であるプライマーを用いて２本鎖に変換し、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドをSapI および PstIで消化して挿入物を得た。挿入物を精製し、読み枠を構成するようにSapI−PstI消化pTwinベクター骨格（New England Biolabs製）に結合した（Evans et al., 1999）。正しく挿入されていることを配列の解析で裏付けた。コドンGCGをアラニンのコドンとして用いてアラニン変異ペプチドを調製するために、同様のクローニング法を使用した。全てのファージ挿入ペプチドのクローニングを行えるように、以下の普遍的オリゴヌクレオチド配列を用いた： 5'-CCT TTC TGC TCT TCC AAC GCC GAC GGG GCT-3'（インテイン・フォワードSapIプライマー配列）および5'-ACT TTC AAC CTG CAG TTA CCC AGC GGC CCC-3'（インテイン・リバースPstIプライマー配列）。親水性ＣＴＴペプチドライブラリーを構築するためには、合成縮重オリゴヌクレオチド配列： 5'-GGTGGTTGCTCTTCCAACGGCCGCCVAVVAVTATVAVGGCTGTACCACCCATTTACTTTATGTTAACTGCAGGCG-3'（式中、VはA, CまたはGである）を調製し、正常ＣＴＴペプチドに用いたのと同じプライマーを用いて２本鎖ＤＮＡに変換した。
【００３２】
細菌で行うペプチド製造
インテイン融合ペプチドをコードしているプラスミドをE. coli ER2566株（New England Biolabsより購入）に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを、ＯＤ600が０．７に達するまで１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。タンパク質の発現は０．３ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、さらに３７℃で４時間インキュベートした。細菌のペレットを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる緩衝液Ｂ１に懸濁した。超音波処理および遠心分離を行った後、可溶性画分をキチンアフィニティーカラム（chitin affinity column）（New England Biolabs製）にアプライした。インテイン融合タンパク質の大部分を含む不溶性画分は、８Ｍ 尿素／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で可溶化し、超音波処理に付した。続いて、可溶化した材料を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない緩衝液Ｂ１で少なくとも１６倍に希釈し、遠心分離で透明にした。得られた透明な上清もキチンアフィニティーカラムにアプライした。このカラムをＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない緩衝液Ｂ１で完全に洗浄した。５０ｍＭ 酢酸アンモニウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）からなる溶液中、２２℃で一晩インキュベートすることにより、インテイン開裂反応をカラム上で行った。遊離したペプチドを溶出し、凍結乾燥またはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Waters製）により濃縮し、濃縮物を逆相ＨＰＬＣで精製した。個々のペプチドがどのようなペプチドであるかをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で検証した。ペプチドの定量は、ｏ−フタルアルデヒドまたはＨＰＬＣ分析を用いて行った。既知濃度のＣＴＴペプチドを標準として用いた。
【００３３】
トリプトファン要求性E. coli ER2566変異株の作製
In vitroで構築したバクテリオファージＭｕ ＤＮＡ転位複合体（In vitro assembled bacteriophage Mu DNA transposition complexes）の調製を、公知の方法（Lamberg et al., 2002）と実質的に同様に行った。端的に記すと、カナマイシン耐性遺伝子を保持する１．１ｐｍｏｌのトランスポゾンＤＮＡおよび４．９ｐｍｏｌのＭｕＡタンパク質を、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）／５０％ グリセロール／０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２０μｌ中で混合した。転位複合体構築反応を３０℃で２時間行い、複合体を得た。得られた複合体を１：８または１：１６の希釈率で、エレクトロコンピテントE. coli ER2566株に対してエレクトロポレーションを行い、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢプレートで培養した。得られたクローンを、Ｍ９最小培地プレートおよび１ｍＭ ＤＬ−トリプトファン（Sigma製）含有Ｍ９培地プレートにそれぞれレプリカ法で移した。成長にトリプトファンを要求する、ER2566/Trp82株と命名したクローンをさらなる研究のために選択した。トランスポゾン挿入部位を決定するために、染色体ＤＮＡをゲノムＤＮＡ単離キット（Qiagen製）で単離し、単離したゲノムＤＮＡをPstIで消化した。得られたゲノム断片をPstI消化pUC19プラスミドに結合して形質転換を行い、カナマイシン存在下で形質転換体を選択した。トランスポゾンの境界のＤＮＡ配列をトランスポゾン特異的プライマーである5'-ATCAGCGGCCGCGATCC-3'および5'-TTATTCGGTCGAAAAGGATCC-3'でシークエンシングした。ゲノム上の挿入位置はＢＬＡＳＴサーチを用いて特定した。
【００３４】
アミノ酸類似体をファージ粒子に組み込むための、栄養要求性E. coliの作製
カナマイシン耐性遺伝子を保持するin vitro構築バクテリオファージＭｕ ＤＮＡ転位複合体を調製し、MC1061株に対し、公知の方法（Lamberg et al., 2002）でエレクトロポレーションを行った。転位が成功したことをカナマイシン耐性の獲得で確認し、得られたコロニーを０．５ｍＭのメチオニンまたはトリプトファンの存在下または非存在下で、０．５ｍＭ Ｌ−ロイシンおよび１ｍＭ チアミンを含有するＭ９最小寒天プレートにレプリカ法で移すことにより、栄養要求性についてスクリーニングした。組み込みについて調べるために、メチオニンまたはトリプトファンを成長に要求するクローンを選択した。ファージの感染を可能にするために、E. coli NK5468株（コネティカット州、ニューヘブン、エール大学、E. coli 遺伝センター（E. coli Genetic Center）より入手）のＦ’線毛［lacIq L8 pro with Tn9 in lacYZ］を交配により転移した。交配が成功したことをクロラムフェニコール耐性の獲得で確認した。
【００３５】
ペプチドへのトリプトファン類似体の組み込み
インテイン−ＣＴＴ融合体をコードしているプラスミドを、栄養要求性ER2566/Trp82株に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを、０．６％ グリセロール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ4、１００μｇ／ｍｌ アンピシリン、２５μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび０．５ｍＭ ＤＬ−トリプトファンを添加したＭ９培地で、ＯＤ600が０．８〜１．０に達するまで培養した。トリプトファン類似体である５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５ＯＨ−Ｔｒｐ；Sigma製）、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（５Ｆ−Ｔｒｐ）、６−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（６Ｆ−Ｔｒｐ）またはＤＬ−７−アザトリプトファン（７Ａ−Ｔｒｐ；ICN Biomedicals製）の組み込みを、培地変更法（medium shift procedure）（Minks et al., 1999; Mohammadi et al., 2001; Ross et al., 1997; Tang et al., 2001）により行った。培養した細菌を遠心分離し、トリプトファンまたはトリプトファン類似体を含有しない新鮮なＭ９培地に懸濁した。残存トリプトファンの大部分を使い切るために懸濁した細菌を３７℃で１５分間培養し、その後トリプトファン類似体を最終濃度が０．５ｍＭになるように０．５ｍＭ ＩＰＴＧと共に添加した。３７℃で４時間培養したのち、細菌をペレット化し、融合タンパク質の精製を上述のように行った。
【００３６】
ゼラチナーゼ阻害アッセイ
ゼラチナーゼであるｐｒｏＭＭＰ−２およびｐｒｏＭＭＰ−９（Roche製）を、酢酸ｐ−アミノフェニル第二水銀とトリプシンでそれぞれ活性化し、続いて、各試験ペプチドの存在下または非存在下で３０分間インキュベートした。ゼラチナーゼ阻害活性を次の３種のアッセイ法により求めた：（i）ゼラチナーゼ活性キット（Roche製）を製造者の説明書に従って用いた、ビオチン化ゼラチンの分解；（ii）ＭＯＳ−２５０分光蛍光計（仏国、クレ、Bio-Logic SA製）を用いて励起波長３３０ｎｍおよび発光波長３９０ｎｍで追跡する、ＭＭＰ−２特異的蛍光ペプチド基質（MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2）（Calbiochem製）（最終濃度２．５μＭ）の分解；（iii）活性化ＭＭＰ−２を０．１ｍｇ／ｍｌ β−カゼインと共に３７℃で２時間インキュベートし、得られた試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析することによる、β−カゼインの分解。
【００３７】
細胞浸潤
HT-1080ヒト フィブロサルコーマ細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを添加した１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地で培養した。細胞浸潤アッセイを、マトリゲル（Matrigel）で被覆したインベージョンチャンバー（invasion chamber）で上記の血清含有培地を用いて公知の方法（Koivunen et al., 1999a）で行った。端的に記すと、細胞をペプチドと共に１時間プレインキュベートし、その後マトリゲルで被覆したインベージョンチャンバー（Becton Dickinson製）内を１６時間移動させた。移動した細胞をクリスタルバイオレットで染色し、染色細胞を計数した。
【００３８】
分光分析法および蛍光分析法
各ペプチドの２００〜３７５ｎｍの範囲にある吸光スペクトルを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液中で、ジェネシス５（Genesys 5）分光光度計（ニューヨーク州、ロチェスター、Thermo Spectronic製）で測定した。トリプトファン、５ＦＷまたは６ＦＷの存在下で培養したＣＴＴファージの蛍光スペクトルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１％ ＳＤＳからなる溶液に懸濁した熱変性ファージ（２×１０9／ｍｌ）の蛍光強度を測定することで得た。３００〜５００ｎｍの範囲の蛍光発光スペクトル（３回のスキャンの平均値）をＭＯＳ−２５０分光蛍光計で記録した。ペプチドを２９５ｎｍの波長（バンド幅：５ｎｍ）で励起させ、３００〜５００ｎｍの範囲の発光スペクトルを記録した。
【００３９】
ヒト血清中でのペプチド安定性
本研究所職員から血液サンプルを採集し、そこから得た血清を一定量づつ−７０℃で保存した。未希釈のヒト血清に、最終濃度が１５０μＭになるようにペプチドを添加した。ペプチドを添加した血清を３７℃でインキュベートし、種々のインキュベーション時間で血清の一部を採取した。採取した血清をＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液で希釈し、即座に液体窒素で凍結しサンプルとした。凍結サンプルを解凍し、９６穴のドットブロッターを用いてニトロセルロース膜にロードした。５％ＢＳＡ含有ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液でブロッキングした。その後、ＣＴＴ−ペプチドをカップリングしたスカシガイヘモシアニン（Sigma製）で免疫することで調製した抗ＣＴＴウサギ血清を１／５００に希釈し、上記ニトロセルロース膜と共にインキュベートした。結合した抗ＣＴＴ抗体を、１／２０００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（デンマーク国、DAKO製）を用いた化学ルミネセンスの増加により検出した。
【００４０】
アミノ酸類似体
ＤＬ−エチオニン（Ｅｔｈ）、ＤＬ−ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アザ−ＤＬ−ロイシン（Ａｌｅ）、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５ＯＨ）、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（５ＦＷ）、６−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（６ＦＷ）およびＤＬ−７−アザトリプトファン（７ＡＷ）をSigma-AldrichまたはICN Biomedicalsより購入した。
【００４１】
ファージ粒子へのアミノ酸類似体の組み込み
ＣＴＴペプチドを提示している繊維状バクテリオファージfUSE5を、MB5F株またはMB64F株を宿主とし、化学合成培地であるＭ９培地に次の物質を添加して培養した：０．２％ グルコース、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ4、２０μｇ／ｍｌ テトラサイクリン、２５μｇ／ｍｌ カナマイシン、１０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール、１ｍＭ チアミン、各０．２ｍＭのグアノシン、ウラシル、アデニンおよびチミジン、ならびに０．１〜０．８ｍＭの２０種全てのアミノ酸（Neidhardt et al., 1974）。アミノ酸類似体の組み込みを培地変更法により行った。端的に記すと、細菌（ＯＤ600＝０．７〜１．０）を遠心分離し、置換するアミノ酸を含有していない新鮮なＭ９培地に懸濁した。最終濃度が（Ｌ−異性体として）０．５〜２ｍＭになるようにアミノ酸類似体を添加し、細菌を一晩培養した。
【００４２】
ファージの定量
ファージ上清の希釈系列を調製し、各系列を、標準的な手法（Koivunen et al., 1999b）で E. coli K91/kan株に感染させるのに用いた。各１０μｌの感染大腸菌含有液を、４０μｇ／ｍｌ テトラサイクリンおよび１０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート３枚に植えた。一晩インキュベートしたのち、細菌のコロニーの数を数えた。
【００４３】
フルオロファージライブラリーの調製
各１５μｌのＣＸ7Ｃ、ＣＸ8ＣおよびＸ9Ｃのライブラリー（Koivunen et al., 1999a, Koivunen et al., 2001）を、テリフィックブロス（Terrific Broth）で培養したMB5F株に感染させた。ファージの感染により０．５×１０9個の独立したクローンが生じた。一晩インキュベートしたのち、細菌を１リットルのＭ９培地で継代してから一晩培養した。培地変更法を上述のように行い、アミノ酸類似体である５ＦＷおよび６ＦＷを同時に、最終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。翌日、得られたファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌで２回沈殿させた（Koivunen et al., 1999b）。
【００４４】
フルオロファージライブラリーのバイオパニング
合計２．５×１０5個のEahy926細胞（Koivunen et al., 1999a, Koivunen et al., 2001）を１５０μｌの１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、フルオロファージライブラリー（形質導入単位（transducing unit）：１×１０9）の一定分量と共に＋４℃で４時間インキュベートした。インキュベートした細胞をウシ血清濃度勾配を用いた遠心分離に付し（Williams et al., 2002）、得られたファージ含有上清を２．５×１０5個のKS1767細胞にアプライし、＋４℃で４時間インキュベートした。ここからサンプルを得、血清濃度勾配を用いて再び遠心分離に付し、得られた細胞のペレットをMB5F細菌を感染させるのに用いた。MB5F細菌を一晩培養し、その後、フルオロトリプトファンの存在下で一日培養した。ファージを回収し、２順目のEahy926細胞でのサブトラクションおよびKS1767細胞での選択に用いた。
【００４５】
結果
インテインベクターを用いたペプチドの生合成
Ssp DnaBミニ−インテインは１５４個のアミノ酸のみからなり、そのＣ−末端に融合したタンパク質は一般的に効率よく発現されることから、ペプチド産生を行うためにＣ−末端開裂活性を有するこのSsp DnaBミニ−インテインを選択した。さらに、このインテインの開裂活性は、ｐＨおよび温度条件の変化、即ち、ｐＨ８．５で４℃からｐＨ７．０で２２℃への変更によって誘導される。従って、ジスルフィド結合およびペプチドの活性に干渉すると考えられるチオールを用いて行うインテイン開裂の誘導を回避することができた。末端にシステインを有するペプチドの産生にインテインを用いることの利点の一つは、システインは触媒作用に好ましいアミノ酸であり、高開裂効率をもたらすからである（Paulus, 2000）。
【００４６】
本発明者らは、１０個のアミノ酸残基からなるゼラチナーゼ阻害物質であり、ジスルフィド結合による環状型のみで活性であるＣＴＴペプチドのインテインを介した産生を調べることから研究を開始した。実質的に全てのインテイン−ＣＴＴ融合タンパク質は封入体で見られ、尿素で可溶化することにより回収した。このようなペプチドは、カラム上で行う開裂反応後に７０〜９０％の純度で得ることができた。ＨＰＬＣによる最終精製後の収量は、１リットルの培養細菌あたりのペプチドが最大２ｍｇであった。インテイン融合誘導体ＣＴＴ（即ち、ｉＣＴＴ）は自発的に環化し、質量分析法において、ジスルフィド結合含有ＣＴＴペプチドの予想された分子量を有していた（表１）。次に、ゼラチナーゼ阻害活性に必要なアミノ酸残基を特定するために、ＣＴＴのアラニンスキャニング変異誘導法（alanine-scanning mutagenesis）を実施した。Ａｌａ−置換ペプチドがｉＣＴＴと同等の収率で得られた。質量分析法により、各環状ペプチドがどのようなペプチドであるか確認した（表１）。
【００４７】
【表１】
2006514543.tif 000002
【００４８】
ゼラチナーゼ阻害ペプチドの機能解析
ｉＣＴＴのゼラチナーゼ阻害活性は、複数のアッセイにおいて化学的に合成したＣＴＴのゼラチナーゼ阻害活性と同等であった。ゼラチン分解アッセイにおいては、ｉＣＴＴおよびＣＴＴは類似の濃度依存性を示し（図１のＡを参照）、ＩＣ50値はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の阻害のいずれについても２０μＭであった（データは示さない）。非環状の合成対照ペプチドＳＴＴ（アミノ酸配列：ＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳ）は、ｉＣＴＴよりも数倍活性が低かった。
【００４９】
ゼラチン分解アッセイにおけるＡｌａ−置換ペプチドの分析により、トリプトファン、グリシンおよびフェニルアラニンの置換はゼラチナーゼ阻害活性を著しく低下させることがわかった（図１のＢ）。野生型ペプチドに比べて、Ｗ→Ａ、Ｇ→ＡおよびＦ→Ａの置換を含む変異ペプチドのゼラチン分解阻害率はそれぞれ、１７±１２％、５３±７％および３６±７％であった。他の位置で生じている全てのＡｌａによる置換は、ゼラチナーゼ阻害活性に明確には影響を与えなかった。例えば、Ｈ→Ａ置換を有するペプチドは野生型の活性の約８０％を保持していた。同様の結果が、蛍光原性ＭＭＰ−２基質アッセイで行ったペプチドの比較によって得られた（データは示さない）。
【００５０】
トリプトファン類似体を含むペプチドの生合成
インテイン発現系によってペプチド合成が可能であることを実証したので、本発明者らは、インテイン誘導ペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みの可能性について調べた。ペプチドの活性およびおそらく安定性を高める可能性が最も高いと考えられたため、本発明者らは、ＣＴＴのただ１つのトリプトファン残基の修飾に本研究の焦点を定めた。非天然トリプトファン類似体の有効な組み込みに必要なトリプトファン要求性E. coliは、in vitroで構築したバクテリオファージＭｕ ＤＮＡ転位複合体を用いた変異誘導により調製した。ER2566/Trp82と命名したクローンを単離したところ、トリプトファンに対する栄養要求性であることがわかった。トランスポゾン挿入部位は、１，３１５，３４０〜１，３１５，３４４ヌクレオチドを重複しているゲノム上の位置に見られ、この番号は、完全にシークエンシングされたE. coliK12株に従った番号付けである。従って、Ｍｕ転位に特徴的な、正しい５塩基対からなる標的部位の重複を特定した（Lamberg et al., 2002）。挿入は、トリプトファン合成酵素のβサブユニットをコードしているtrpB遺伝子内にあり、観察された表現系と一致した。
【００５１】
Er2566/Trp82クローンは、培養細菌に添加した５−ヒドロキシトリプトファン、５−フルオロトリプトファン、６−フルオロトリプトファンまたは７−アザトリプトファンを含むＣＴＴインテイン融合タンパク質を発現するのに用いた（図２のＡ）。これらのトリプトファン類似体は、これまでに、トリプトファン要求性E. coliにより合成された複数のタンパク質に組み込まれている（Minks et al., 1999; Mohammadi et al., 2001; Ross et al., 1997）。発現したインテイン融合タンパク質には７個のトリプトファン残基が存在し、そのうちの３個はキチン結合ドメインに、３個はインテインに、１個はＣＴＴペプチドに存在する。本発明者らは４種全てのトリプトファン類似体のインテイン融合タンパク質への組み込みを観察した（図２のＢ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、フッ素化Ｔｒｐ類似体を含むインテイン融合タンパク質は、正常のトリプトファンを含むタンパク質よりも早く移動した。一方、より極性の高い５ＯＨ−Ｔｒｐ残基および７Ａ−Ｔｒｐ残基は、それを含む融合タンパク質の移動度を遅くした。野生型のタンパク質と比較すると、融合タンパク質の収率は、５ＯＨ−Ｔｒｐ、５Ｆ−Ｔｒｐおよび６Ｆ−Ｔｒｐについてはわずかに減少し、７Ａ−Ｔｒｐについては有意に減少した。注目すべきことは、５Ｆ−Ｔｒｐおよび６Ｆ−Ｔｒｐは、インテイン開裂活性を有意に損なうことはなく、フッ素化Ｔｒｐを含むＣＴＴペプチドは最小培地１リットルに対して約０．３ｍｇの収量で得られた。５ＯＨ−Ｔｒｐ残基はインテイン開裂に影響を与え、ペプチドの収率は低下した。７Ａ−Ｔｒｐ含有ペプチドは活性を測定するのに十分な量を得ることができなかった。各ペプチドが予想された非天然トリプトファン類似体を含むことを、質量分析法により確認した（表１）。野生型のＣＴＴペプチドは、フッ素化ペプチド調製物にはごく少量しか存在せず、５ＯＨ−ＣＴＴ調製物には全く検出されなかった（データは示さない）。修飾ペプチドがどのようなペプチドであるかを、紫外線吸収および蛍光分析法によりさらに確認した。５ＯＨ−Ｔｒｐ含有ＣＴＴペプチドは、第二吸光最大が赤色方向にずれた特徴的な吸光プロファイルを示した（図２のＣ）。全ての修飾ペプチドが、野生型ペプチドとは異なる蛍光発光スペクトルを示した（図２のＤ）。
【００５２】
修飾ＣＴＴペプチドのゼラチナーゼ阻害活性を、β−カゼイン分解アッセイ（図３のＡ）およびゼラチン分解アッセイ（データは示さない）で試験した。ゼラチナーゼ阻害活性における有意な差はこれらのアッセイでは見られなかった。１００μＭの濃度では、５ＯＨ−Ｔｒｐ、５Ｆ−Ｔｒｐまたは６Ｆ−Ｔｒｐを含有するペプチドは、ｉＣＴＴがカゼイン分解をほぼ完全に阻害するのと同等の効率でＭＭＰ−２を阻害した。アミノ酸類似体は、ペプチドのプロテアーゼ感受性に影響するので、本発明者らは次に、正常ヒト血清中でペプチドをインキュベートすることでペプチドの安定性を調べた。ペプチドの存在量を決定するために、５Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドも認識する抗ＣＴＴ抗体を用いた。野生型ＣＴＴペプチドの半減期が０．５時間であるのに比べて、５Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドの半減期は３時間であり、血清中でより安定であった（図３のＢ）。抗ＣＴＴ−抗体は、血清の存在下では５ＯＨ−Ｔｒｐ含有ペプチドおよび６Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドを弱くしか認識しなかったので、これらのペプチドの半減期を決定することはできなかった。抗ＣＴＴ抗体は対照用の環状ペプチド（アミノ酸配列がＣＥＲＧＧＬＥＴＳＣのものとＣＰＣＦＬＬＧＣＣのもの）と反応しなかったので、抗ＣＴＴ抗体は非常に特異的であった。熱不活化ウシ胎児血清を１０％添加した細胞培養培地では、ＣＴＴの安定性と５Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドの安定性に有意な差は見られなかった（データは示さない）。
【００５３】
細胞浸潤アッセイにおいては、細胞を１０％の熱不活化ウシ胎児血清の存在下で培養した場合、５Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドおよび６Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドはｉＣＴＴが示した活性と同程度の活性を示した（図４のＡ）。しかしながら、HT-1080細胞を、１０％の非加熱（即ち、不活性化処理なしの）ヒト血清で培養したところ、５Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドは、ｉＣＴＴよりも有意により優れた細胞浸潤阻害剤であり（図４のＢ）、この結果は、血清安定性を示すデータと相関していた。６Ｆ−Ｔｒｐ含有ペプチドの活性は野生型ペプチドの活性と変わらなかったことから、このような効果はＴｒｐの５位で生じたフッ素置換に特異的であった。
【００５４】
親水性インテインペプチドライブラリーの調製
ＣＴＴペプチドを放射性ヨードで標識するために、付加的なチロシンを含むペプチドを化学合成により調製した。ＣＴＴペプチドそのものは水溶性であるものの、付加的なチロシンを含むペプチドは水に不溶性であることが判明した。従って、水溶性のチロシン含有ＣＴＴペプチドをスクリーニングするために、インテインシステムを用いてペプチドライブラリーを調製した。ランダムなアミノ酸を含むよう設計された、極性アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドを、チロシン含有ＣＴＴペプチドの溶解性を高める可能性があるものとして用いた。得られたライブラリーは、アミノ酸配列がＧＲＸＸＹＸＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（式中、Ｘはいかなる親水性アミノ酸でもよい）で表されるペプチドをコードしていた。始めに、オリゴヌクレオチド： 5'-GGTGGTTGCTCTTCCAACGGCCGCCVAVVAVTATVAVGGCTGTACCACCCATTTACTTTATGTTAACTGCAGGCG-3'を設計し、そしてオリゴヌクレオチド合成装置を用いたコンビナトリアルな合成によって調製した。調製したオリゴヌクレオチドは、親水性アミノ酸をコードしている３個のＶＡＶ（式中、ＶはＧ、ＡまたはＣを表す）コドンを含んでいた。
【００５５】
オリゴヌクレオチドをＰＣＲで二本鎖にした。ＰＣＲ産物をPstIおよびSapIで消化し、消化産物を、PstIおよびSapIで消化したTWIN2インテインベクター（New England Biolabs製）でクローニングした。このようにして得られたＤＮＡ構築物を、MC1061コンピテント細胞に対してエレクトロポレーションを行い、ライブラリーを得た。得られたライブラリーは２１６種のＣＴＴペプチドを含んでいた。少なくとも２１６種の独立したMC1061のクローンのプールからプラスミドベクターを抽出した。インテインの産生が可能なER2566細胞に対して抽出したプラスミドのエレクトロポレーションを行った。プラスミドを有している細胞を、アンピシリンを含むＬＢ培地のプレートで培養した。１０種の独立したクローンを、１つのプールに集めた。１つのプールに集められた１０種のクローンを培養し、ペプチドを発現させ、キチンアフィニティーカラムおよび逆相Ｃ１８カラムで精製した。ペプチドの各プールの活性を試験した。ＰＢＳへの溶解性も試験した。明確な活性および十分高い溶解性を示す２つのプールに対応するクローンを培養し、ペプチドを上述のように精製した。このようなペプチドのうちの１種（アミノ酸配列：ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ）は、もとのペプチドに比べて水またはＰＢＳに対して溶解性が高く、活性であった（図５）。このペプチドをコードするプラスミドをシークエンシングして、ペプチドを化学合成により合成した。
【００５６】
いかなるファージディスプレイペプチドもインテイン融合タンパク質として発現させうるという一般的な方法の有用性を証明するために、ｐｒｏＭＭＰ９に対する結合性について選択したファージ由来のペプチドを、普遍的なプライマーを用いて増幅した。ファージ選択を３順行った後にｐｒｏＭＭＰ９に特異的に結合するファージクローンの挿入ペプチドを増幅し、インテインベクターにクローニングした。ペプチドを発現させ、ＨＰＬＣで精製した。ｐｒｏＭＭＰ９に結合するファージの特異性およびそれがどのようなペプチドであるかを、ファージＥＬＩＳＡ法で確認した。インテインシステムによるペプチド発現物は、同じ挿入ペプチドを有するファージの結合しか遮断せず、他の挿入ペプチドを保持しているファージの結合と競合しなかった（図６）。
【００５７】
ファージ粒子へのアミノ酸類似体の組み込み
アミノ酸類似体の効率的な組み込みと共に高レベルのファージ産生を達成するために、ファージディスプレイライブラリーの調製に一般的に用いられるE. coli MC1061株に突然変異を誘導した。トリプトファンおよびメチオニンに対する栄養要求性の誘導体を、in vitroで構築したバクテリオファージＭｕ ＤＮＡ転位複合体を用いたランダム挿入変異誘導（random insertional mutagenesis）により、Lambert et al. (2002)の記載と実質的に同様の方法で単離した。親株であるMC1061株は、ファージ感染に必要なＦ線毛を持たないことから、E. coli NK5468株由来のＦ’線毛を、新たに単離した栄養要求性株に転移した。この結果、MB5Fと命名されたトリプトファン要求性株およびMB64Fと命名されたメチオニン要求性株が得られた。図７は、ペプチドディスプレイファージシステムに必要な細菌株を得るための方法を示すものである。新規な株の感染力は、K91/kan宿主に比べて約１０％であるが、繊維状ファージに感染することができるので実用的である。
【００５８】
市販のトリプトファン類似体である５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５ＯＨ）、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（５ＦＷ）、６−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン（６ＦＷ）およびＤＬ−７−アザトリプトファン（７ＡＷ）を、ファージ粒子への組み込み効率について初めに試験した（図８）。トリプトファン要求性のMB5F株を、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドを保持しているfUSE5ファージに感染させた。感染した細菌を規定の培地で培養した後に、培地を、試験するアミノ酸類似体を含有する培地に変えた。対照としては、トリプトファンまたはその類似体を欠いている培地に細菌を移した。一晩培養したのち、培養上清のＣＴＴ−fUSE5ファージの力価を、E. coliK91/kanに感染させることにより測定した。５ＦＷおよび６ＦＷではトリプトファンとほぼ同数の感染性粒子を得た。５ＦＷと６ＦＷとを組み合わせたものもファージ粒子を効率的に生じた。対照的に、５ＯＨおよび７ＡＷはファージの製造を充分に促進しなかった（図９のＡ）。
【００５９】
メチオニン類似体であるエチオニンおよびノルロイシンの組み込み効率についても、MB64F株を用いて上記と同様に調べた。この実験では、ノルロイシン（Ｎｌｅ）は十分に高い効率で組み込むことができたが、エチオニン（Ｅｔｈ）は高い効率で組み込むことはできなかった（図９のＢ）。MC1061株は天然にロイシン要求性なので、ロイシン類似体であるノルバリン（Ｎｖａ）および４−アザロイシン（Ａｌｅ）についても調べた。しかしながら、これらの類似体を組み込むための試みは失敗に終わった（データは示さない）。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるトリプトファン類似体の移動度の違いを利用して類似体の組み込み効率を測定する方法については、わずか５０個のアミノ酸からなる、分子量が約５２００の主要なコートタンパク質であるpVIIIの解像度が不十分であることから、組み込み効率を求めることはできなかった。フッ素化トリプトファン類似体が実際にファージ粒子に組み込まれていることを示すために、フッ素置換物はタンパク質中のトリプトファンに固有の蛍光特性を変化させるという事実を利用した。組み込まれていないフルオロトリプトファンを全て除去するために、５ＦＷおよび６ＦＷの存在下で培養したファージを、ＰＥＧ／ＮａＣｌで４回沈殿させた。このような処理により得られたファージ（２×１０9ファージ／ｍｌ）をＳＤＳで変性し、その蛍光スペクトルを記録した。観察された蛍光発光は、主として主要なコートタンパク質であるpVIIIに含まれる単一のトリプトファンに由来するものであり、このコートタンパク質は、ビリオン当たり約２８００コピー存在するのに対し、他のコートタンパク質は２〜５コピーしか存在しない。サンプルを２９５ｎｍの波長で励起した場合には、５ＦＷ含有ファージおよび６ＦＷ含有ファージの蛍光量子収率は、これらの類似体を用いた前出のデータと一致して高度に上昇する（Minks et al., 1999）。さらに、６ＦＷ含有ファージ調製物の発光最大波長は、野生型ファージの発光最大波長が３３９ｎｍであるのと比較して、６ｎｍ増加して３４５ｎｍになった（図１０）。これらの結果は類似体の組み込みが顕著であることを示すが、組み込みレベルの定量分析は不可能である。
【００６１】
非天然アミノ酸含有ファージのライブラリーを調製し、バイオパニングで使用可能であることを示すために、５ＦＷおよび６ＦＷを含有する、ＣＸ7Ｃ、ＣＸ8ＣおよびＸ9Ｃのライブラリーを調製した。これらのライブラリーは、MB5F株に野生型のＣＸ7Ｃ、ＣＸ8ＣおよびＸ9Ｃのライブラリーを感染させ（Koivunen et al., 1999a; Koivunen et al., 2001）、次いでこのようなファージ感染細菌を５ＦＷおよび６ＦＷの存在下で培養することにより得た。KS1767ヒトカポジ肉腫細胞を認識するが内皮細胞系であるEahy926細胞を認識しないペプチドを単離するために、増幅したファージをKS1767ヒトカポジ肉腫細胞によるバイオパニングに付した。KS1767−特異的ペプチドは、Eahy926細胞に結合するペプチドのライブラリーを除いたあとに得た（図１１）。バイオパニングを２順した後には、ファージは２．２倍に濃縮されており、このような結果は、化学合成培地におけるファージ粒子の形成が比較的ゆっくりとしていることを考慮すると、有意な結果である。
【００６２】
参考文献 
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】合成ペプチドまたはインテイン製造ペプチドによるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の阻害。（Ａ）図中に記載のペプチド濃度のＣＴＴ、ｉＣＴＴまたはＳＴＴで、ＭＭＰ−９を処理した。ＭＭＰ−９活性はビオチン化ゼラチンを用いて求めた。（Ｂ）アラニン変異ペプチド（表１を参照）の活性を、ゼラチン分解アッセイでＭＭＰ−２を１００％阻害したＣＴＴの活性と比較した。全てのアッセイにおいては、基質を添加する前に、ペプチドを酵素と３０分間プレインキュベートした。結果は３回の測定により得た値の平均値±標準偏差で示し、少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
【図２】トリプトファン類似体のインテイン−ＣＴＴペプチド融合タンパク質への組み込み。（Ａ）本実験で使用したトリプトファン類似体。（Ｂ）尿素で可溶化して得た細菌溶解物中のインテイン−ＣＴＴ融合タンパク質を示す１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。全てのサンプルをＩＰＴＧで誘導した。インテイン−ＣＴＴ融合タンパク質の見かけの分子量は約３０ｋＤａである。（Ｃ）正常トリプトファン含有ＣＴＴペプチドおよび５ＯＨ−Ｔｒｐ含有ＣＴＴペプチドの紫外線吸収スペクトル。５Ｆ−Ｔｒｐ含有ＣＴＴペプチドおよび６Ｆ−Ｔｒｐ含有ＣＴＴペプチドの紫外線吸収スペクトルは野生型ペプチドの紫外線吸収スペクトルと類似しているので示さない。（Ｄ）トリプトファン類似体含有ＣＴＴペプチドの蛍光発光スペクトル。ペプチドの蛍光発光最大値が同じ値になるように正規化した。
【図３】トリプトファン類似体含有ＣＴＴペプチドの活性および安定性。（Ａ）基質としてβ−カゼイン（２１ｋＤａ）を用いたＭＭＰ−２の阻害。ペプチド（１００μＭ）をＭＭＰ−２およびβ−カゼイン（０．１ｍｇ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートし、このような処理により得られたサンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。（Ｂ）濃度が１５０μＭのｉＣＴＴ、５Ｆ−ＣＴＴまたは負の対照ペプチド（アミノ酸配列：ＣＥＲＧＧＬＥＴＳＣ）を、未希釈のヒト血清中で、３７℃で図中に示した時間インキュベートした。サンプルを取り出し、凍結保存し、ニトロセルロース膜にブロットした。ＣＴＴレベルを抗−ＣＴＴポリクローナル抗体を用いて定量した。ブロットをスキャンし、３回の測定により得た値の平均値±標準偏差として結果を示した。同様の結果が、他の２回の実験で得られた。
【図４】ペプチドによる、HT-1080腫瘍細胞浸潤の阻害を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（Ａ）または１０％の非加熱正常ヒト血清（Ｂ）で行った結果である。細胞を、１５０μＭの組換えペプチドの存在下または非存在下で、マトリゲルで被覆したトランスウェルを１６時間移動させた。結果は、３個のウェルから得た値の平均値±標準偏差である。この結果は、３回の独立した実験結果を代表するものである。アスタリスク（＊）はスチューデントのｔ検定で統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図５】ＣＴＴ−ペプチド、ならびに１０種のＣＴＴペプチド誘導体を含むプール１およびプール２を用いた、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）の阻害。ライブラリーは、ＣＴＴペプチド誘導体の２１６種の異なる組み合わせを含む。プール１から得たクローン４およびプール２から得たクローン７を精製し、ゼラチナーゼＡに対する阻害活性についても試験した。
【図６】ｐｒｏＭＭＰ−９に特異的に結合するファージクローン＃４３から得た挿入ペプチドを普遍的なインテインオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングし、インテイン−ペプチド融合体を発現させ、発現したペプチドをＨＰＬＣで精製した。マイクロタイターウェルを２０ｎｇ／ウェルのｐｒｏＭＭＰ−９で被覆し、ウシ血清アルブミンでブロッキングし、そして１５μＭ ペプチドの存在下または非存在下でファージを結合させた。結合しなかったファージをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗い流し、結合したファージをＨＲＰ結合抗ファージ抗体で検出した。発現および精製されたペプチド＃４３は、同じペプチド＃４３を保持しているファージのｐｒｏＭＭＰ−９への結合を阻害したが、異なるペプチド（ペプチド＃６３）を保持している他のｐｒｏＭＭＰ−９結合ファージの結合は阻害しなかった。同様に、挿入ペプチド＃６３は、ペプチド＃６３を保持しているファージの結合しか阻害せず、ペプチド＃４３を保持しているファージの結合は阻害しなかった。ペプチドＣＴＴは、ペプチド＃４３とペプチド＃６３を保持しているファージの結合に影響を与えなかったことから、ファージ結合の特異性が確認された。
【図７】栄養要求性ファージ宿主株を調製するための方法の概略図。
【図８】ファージへの組み込みについて試験したアミノ酸類似体の構造。
【図９】アミノ酸類似体の存在下におけるファージの製造。ファージを、本明細書の「方法」の欄に記載したように調製した。培養上清の希釈系列を３組調製し、得られた希釈系列をE. coliK91/kanに感染させるのに用いた。元のアミノ酸の存在下の培養ファージと比較した、感染性ファージの割合を示す。トリプトファン類似体（Ａ）およびメチオニン類似体（Ｂ）の存在下でのファージ製造をまとめたデータを示す。
【図１０】フルオロトリプトファンの組み込みは、ファージに固有の蛍光発光特性を変える。ファージサンプルを１％ＳＤＳ含有緩衝液中で加熱することにより変性し、蛍光スペクトルを励起波長２９５ｎｍで記録した。３００〜５００ｎｍの範囲の蛍光発光を測定した。
【図１１】ヒト細胞系であるEahy926細胞およびKS1767細胞を用いたバイオパニングを２順行った後のフルオロファージライブラリーの濃縮。ファージは、Eahy926細胞でサブトラクションを行い、KS1767細胞に対する結合で選択した。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１〜４：
人工的な配列の説明： オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５：
人工的な配列の説明： オリゴヌクレオチドプライマーであり、２６、２８、２９、３１、３５および３７番目のｖは、ａ、ｃまたはｇである。
配列番号６〜７：
人工的な配列の説明： オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８〜１１：
生物の種名が未知なものの説明： 未知
配列番号１２〜１９：
人工的な配列の説明： ＣＴＴ−ペプチドのＡｌａ−置換体
配列番号２０：
人工的な配列の説明： 第５残基にトリプトファン類似体を有するＣＴＴ−ペプチドであり、第５残基のXaaは、５−ＯＨ−Ｔｒｐ、５−Ｆ−Ｔｒｐまたは６−Ｆ−Ｔｒｐである。
配列番号２１〜２２：
人工的な配列の説明： 対照配列
配列番号２３：
人工的な配列の説明： 付加的な親水性アミノ酸を有するＣＴＴ−ペプチドであり、第３、４および６残基のXaaはいかなる親水性アミノ酸でもよい。
配列番号２４：
人工的な配列の説明： 付加的な親水性アミノ酸を有するＣＴＴ−ペプチド
【図１】
2006514543.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2006514543000001.app
【国際調査報告】
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