(57)【要約】    抗炎症薬を得るための簡便なスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法に用いるポリペプチドは、細胞接着分子の発現に関与しており、血管内皮細胞の白血球への接着において重要な役割を果たしていることから、該ポリペプチドの発現量及びその機能を評価することにより、血管内皮細胞接着抑制物質をスクリーニングすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。
【請求項２】
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチド。
【請求項３】
被験物質非存在下よりも前記遺伝子又はポリペプチドの発現量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
（１）請求項１に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（２）白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
（３）白血球と上記細胞との接着量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
被験物質非存在下よりも白血球と上記細胞との接着量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、請求項４記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
（１）請求項１に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
被験物質非存在下よりも細胞接着分子の発現量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、請求項６記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
（１）請求項２に記載のポリペプチドと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの特異結合体の存在下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質非存在下よりも特異結合体の結合量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、請求項８記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
炎症性サイトカインを接触させる工程をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎからなる群から選択されるいずれかである、請求項１から１０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
血管内皮細胞接着抑制物質を抗炎症薬として選択するものである請求項１から１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞接着抑制物質、及び抗炎症剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の炎症性疾患は、白血球の炎症巣への集積・浸潤が原因となって引き起こされる。白血球がリンパ節あるいは炎症巣へ集積・浸潤するためには、それが、まず、血管内皮細胞に接着する必要がある。この接着の過程は、以下の３つの段階：１）血管内皮細胞上での白血球のローリング、２） 白血球の活性化、及び３）血管内皮細胞への白血球の強い接着、を含む。最初に起こるローリング（段階１））は、炎症性サイトカインにより血管内皮細胞上に誘導・発現される細胞接着分子の1 つであるＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎと、白血球上に発現しているシアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）糖鎖抗原との結合により、引き起こされることが明らかとなっている。その後に起こる活性化（段階２））、及び強い接着（段階３)）は、白血球上に発現しているインテグリン、及び炎症性サイトカインにより血管内皮細胞上に誘導・発現される細胞接着分子ＶＣＡＭ−１ （Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｎｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１)又は細胞接着分子ＩＣＡＭ−１ (Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｎｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１)といわれる免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する細胞接着分子により引き起こされることが明らかとなっている（非特許文献１）。【０００３】
また、このような様々な細胞接着分子の発現が種々の炎症性病変局所において亢進していることも報告されており、そしてそれらが慢性炎症の病態形成に関与していることが明らかとなっている。【０００４】
これらの現象は、その病変部位において白血球の浸潤を伴う炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎等で起こっていると考えられる。また、これらの現象は、白血球の浸潤を伴うアレルギー性疾患の原因となることが知られている。【０００５】
以上のことから、炎症部位において炎症性サイトカインにより誘導される種々の細胞接着分子の発現を抑制すれば、白血球の炎症巣への集積・浸潤を阻止でき、これにより炎症性疾患の治療が可能になると考えられる。
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 １９９５年、第３２巻、p. ９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞接着分子の発現抑制及び血管内皮細胞の白血球細胞への接着抑制、という新規な作用機構を有する、従来の抗炎症剤によっては治療困難であった種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患に対して高い治療効果をもつ有用な物質を得るための簡便なスクリーニング系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、鋭意研究の結果、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ−αの添加によって発現が誘導された遺伝子として見出された遺伝子のうち６つの遺伝子が、ＩＣＡＭ−１やＶＣＡＭ−１等の細胞接着分子の発現、または血管内皮細胞が白血球細胞との接着に関与していることを見出すことより、本発明を完成させた。これらの遺伝子がコードするポリペプチドの発現量を減少させる、もしくは該ポリペプチドの有する機能を阻害するような物質は、血管内皮細胞と白血球の接着を抑制する物質であり、これらの物質は新規のメカニズムに基づく抗炎症薬になると考えられる。
即ち、本発明によれば、
［１］ 
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、
［２］ 
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチド、
［３］
被験物質非存在下よりも前記遺伝子又はポリペプチドの発現量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、上記［１］または［２］に記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［４］
（１）上記［１］に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（２）白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
（３）白血球と上記細胞との接着量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［５］
被験物質非存在下よりも白血球と上記細胞との接着量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、上記［４］記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［６］
（１）上記［１］に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［７］
被験物質非存在下よりも細胞接着分子の発現量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、上記［６］記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［８］
（１）上記［２］に記載のポリペプチドと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの特異結合体の存在下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［９］
被験物質非存在下よりも特異結合体の結合量を減少させる被験物質を、選択する工程をさらに含む、上記［８］記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
［１０］
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎからなる群から選択されるいずれかである、上記［１］から［９］いずれかに記載のスクリーニング方法、
［１１］
炎症性サイトカインを接触させる工程をさらに含む、上記［１］から［１０］いずれかに記載のスクリーニング方法、
［１２］
血管内皮細胞接着抑制物質を抗炎症薬として選択するものである上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のスクリーニング方法、が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、血管内皮細胞と白血球細胞との接着を抑制することにより抗炎症作用を示す、従来にない抗炎症剤の探索が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについて、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにて実験数を４系列に増やし、ＩＣＡＭ−１の発現抑制効果を再評価した(実施例３ａ) ：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例３ａ)-ｃ)の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラムは４系列の解析により得られた４９０ｎｍの吸光度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングでＩＣＡＭ−１の発現抑制で陽性反応を示したｓｉＲＮＡ、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示したｓｉＲＮＡであることを表す。
【図２】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについて、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにて実験数を４系列に増やし、ＶＣＡＭ−１の発現抑制効果を再評価した(実施例３ａ) ：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラムは４系列の解析により得られた４９０ｎｍの吸光度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングでＶＣＡＭ−１の発現抑制で陽性反応を示したｓｉＲＮＡ、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示したｓｉＲＮＡであることを表す。
【図３】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについて、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにて実験数を４系列に増やし、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現抑制効果を再評価した(実施例３ａ) ：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラムは４系列の解析により得られた４９０ｎｍの吸光度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングでＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現抑制で陽性反応を示したｓｉＲＮＡ、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示したｓｉＲＮＡであることを表す。
【図４】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについてその抑制効果を定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルで評価した。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子のｓｉＲＮＡのうちＩＣＡＭ−１の発現抑制を示した７つのｓｉＲＮＡ（斜線カラム）、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較してΔＣｔの差で１以上の減少(５０％以上の発現減少)を示したことを表す。 ａ．ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）を評価した。  ｂ．ａの各ｓｉＲＮＡがそのターゲットとなる遺伝子をノックダウンするかをｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）で評価した。
【図５】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＶＣＡＭ−１発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについてその抑制効果を定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルで評価した。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子のｓｉＲＮＡのうちＶＣＡＭ−１の発現抑制を示した５つのｓｉＲＮＡ（斜線カラム）、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較してΔＣｔの差で１以上の減少(５０％以上の発現減少)を示したことを表す。 ａ． ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）を評価した。  ｂ．ａの各ｓｉＲＮＡがそのターゲットとなる遺伝子をノックダウンするかをｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）で評価した。
【図６】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡについてその抑制効果を定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現レベルで評価した。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子のｓｉＲＮＡのうちＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現抑制を示した８つのｓｉＲＮＡ（斜線カラム）、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較してΔＣｔの差で１以上の減少(５０％以上の発現減少)を示したことを表す。 ａ．ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）を評価した。尚、サンプル数の関係上、解析が２プレートに分かれたため、それぞれのプレートにおけるデータを分けて表記した。  ｂ．ａの各ｓｉＲＮＡがそのターゲットとなる遺伝子をノックダウンするかをｍＲＮＡ発現レベル（ΔＣｔ値）で評価した。
【図７】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣにトランスフェクションし、ＴＮＦ−αにより誘導されるＴＨＰ−１細胞との接着を抑制できるかどうかを検討した（各実験数４系列）。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは４系列の解析により得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強度が高いほど多くのＴＨＰ−１細胞がＨＵＶＥＣに接着していることを表している。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較して５０％以上の接着抑制を示したことを表す。 今回調べたｓｉＲＮＡの中で顕著なＴＨＰ−１細胞の接着抑制効果を示すものは認められなかった。
【図８】実施例２ｄ） の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣにトランスフェクションし、ＴＮＦ−αにより誘導されるＵ９３７細胞との接着を抑制できるかどうかを検討した（各実験数４系列）。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは４系列の解析により得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強度が高いほど多くの Ｕ９３７細胞がＨＵＶＥＣに接着していることを表している。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較して５０％以上の接着抑制を示したことを表す。
【図９】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣにトランスフェクションし、ＴＮＦ−αにより誘導されるＭＯＬＴ−４細胞との接着を抑制できるかどうかを検討した（各実験数４系列）。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは４系列の解析により得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強度が高いほど多くのＭＯＬＴ−４細胞がＨＵＶＥＣに接着していることを表している。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較して５０％以上の接着抑制を示したことを表す。
【図１０】実施例２ｄ）の一次スクリーニング(Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ)において、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示したｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣにトランスフェクションし、ＴＮＦ−αにより誘導されるＪｕｒｋａｔ細胞との接着を抑制できるかどうかを検討した（各実験数４系列）。本グラフは、実施例３ａ）−ｃ）の実験結果により炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであると判断された６遺伝子をターゲットとした９つのｓｉＲＮＡ (斜線のカラム)、陰性コントロールｓｉＲＮＡ(白色カラム)、そして陽性コントロールｓｉＲＮＡ(黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは４系列の解析により得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強度が高いほど多くのＪｕｒｋａｔ細胞がＨＵＶＥＣに接着していることを表している。尚、アスタリスク（＊）は陰性コントロールｓｉＲＮＡと比較して５０％以上の接着抑制を示したことを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．炎症性サイトカインによって発現が上昇するポリヌクレオチド
本発明のスクリーニング方法において使用することができる「炎症性サイトカインによって発現が上昇するポリヌクレオチド」とは、ヒトおよび／またはヒト以外の哺乳動物の、炎症性サイトカインの添加（炎症性サイトカイン処理）によって発現が上昇するポリヌクレオチドを意味する。【００１１】
炎症性サイトカインとは、細菌やウィルス感染、腫瘍、組織損傷などに伴う炎症反応に深く関与するサイトカインをさす。例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）などが知られているが、好ましくはＴＮＦ−αである。【００１２】
炎症性サイトカイン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドは具体的には、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが含まれる。【００１３】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、遺伝子工学的手法により、上述した天然型のポリヌクレオチドの配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などで改変したポリヌクレオチドを調製することができ、それらは後述する検定方法によって、天然型のポリペプチドと同様の機能有するか否かが確認できる。このような天然型のヌクレオチド配列に一部のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加されたヌクレオチド配列を有し、天然型の、ポリヌクレオチドと同等の活性を示すポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。炎症性サイトカイン処理によって発現量が変動するポリヌクレオチドの具体例としては、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列のいずれかを含むことからなるポリヌクレオチドをその例としてあげることができるが、これらに限定されない。なお、本発明における「ポリヌクレオチド」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子やＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）も含むものとする。【００１４】
なお、遺伝子工学的手法については、特に断りのない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することが可能である。【００１５】
１．１ 炎症性サイトカイン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドの特定方法
本発明の、炎症性サイトカイン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドは、炎症性サイトカイン処理によって発現量が変動するポリヌクレオチドであり、血管内皮細胞に炎症性サイトカイン処理することによって、発現の上昇を確認することができる。具体的には、例えば後述する実施例１に示す方法により、血管内皮細胞より全ＲＮＡを調製した後、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行うことによって、特定することができる。【００１６】
解析の結果、炎症性サイトカイン処理したヒト臍帯静脈血管内皮細胞と炎症性サイトカイン処理しないヒト臍帯静脈血管内皮細胞で、発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドとして特定することができる。そしてこの特定されたポリヌクレオチドを以下、「炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド」とする。
ここで「著しく異なる」とは、例えば、アフィメトリックス社やアジレント社などから市販されているＤＮＡマイクロアレイによる解析により、炎症性サイトカイン処理した場合の遺伝子のｍＲＮＡ量が炎症性サイトカイン未処理の場合と比べ、２倍以上増加していると判断される場合やアプライドシステム社などから市販されているリアルタイムＰＣＲシステム（定量的ＰＣＲシステム）において炎症性サイトカイン処理した場合の遺伝子のｍＲＮＡ量が炎症性サイトカイン未処理の場合に比べΔＣＴ値の差で１以上の場合、すなわち、ｍＲＮＡ量が２倍以上増加している場合等をいう。【００１７】
こうして特定された炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドとしては具体的には配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。【００１８】
１．２ 炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド
上記１．１において特定されたポリヌクレオチドの他に、それぞれのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、炎症性サイトカインによって発現が上昇するポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含めることができる。このようにして特定されたポリヌクレオチドも「炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド」という。すなわち、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドは、以下の１）又は２）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドである。
１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。【００１９】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、市販のハイブリダイゼーション溶液Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。【００２０】
１．３ 炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの検定
炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドは、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞において炎症性サイトカイン処理によって、処理しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、炎症性サイトカインによって引き起こされる細胞接着分子の発現、及び／又は血管内皮細胞と白血球細胞の接着の変化に影響を与えるポリヌクレオチドであり、細胞接着分子の発現や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響を及ぼす物質のスクリーニング等に用いることができる。【００２１】
具体的な検定方法の例としては、まず特定された炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド断片をプローブとして、ヒトｃＤＮＡライブラリー等から、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを適当な細胞に導入して高発現させ、血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響が生じるか否かを調べることにより検定することができる。【００２２】
また、試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能にどの様な影響が出るかを調べることもできる。また、遺伝子の発現を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いる方法を挙げることもできる（「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００）。例えば、ｓｉＲＮＡを文献記載の方法に従って導入し、ｓｉＲＮＡの対象となる遺伝子の発現量及び細胞接着分子の発現量を調べることができる。逆に、後述の「５．形質転換細胞の作製方法」に従って形質転換細胞を作製し、細胞の有する機能、具体的には、細胞接着分子の発現量や白血球との接着にどの様な影響が現れるかを検討することができる。【００２３】
１．４ 炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの細胞接着分子の発現誘導機能
炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの発現を抑制した血管内皮細胞では細胞接着分子の発現量の低下が観察される。例えば、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに対するｓｉＲＮＡを作製し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞にトランスフェクションした場合に、陰性コントロールに比べて、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＥ−セレクチンなどの細胞接着分子のいずれか、もしくは複数の発現量を有意に低下させる。すなわち、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの発現産物である、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは細胞接着分子の誘導に重要な役割（細胞接着分子の発現誘導機能）を果たしている。【００２４】
１．５ 炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドによる血管内皮細胞の白血球との接着誘導機能
炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの発現を抑制させた血管内皮細胞では白血球との接着量の低下が観察される【００２５】
例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに対するｓｉＲＮＡを作製し、標的細胞にトランスフェクションした場合に、陰性コントロールに比べて、白血球細胞との接着量が有意に低下する。すなわち、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの発現産物である、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは血管内皮細胞の白血球細胞との接着誘導に重要な役割（血管内皮細胞の白血球との接着誘導機能）を果たしている。【００２６】
２．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド
本発明の「炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド」は、血管内皮細胞において細胞接着分子の発現誘導や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響する、本発明のスクリーニングに用いることができるポリペプチドを意味する。本発明における炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞において、炎症性サイトカイン処理すると、処理しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、血管内皮細胞において細胞接着分子の発現誘導や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響を与える被験物質を検出するためのスクリーニング等に利用することができ、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。【００２７】
本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、上記１．４及び１．５に示したような、細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は血管内皮細胞の白血球細胞との接着誘導に重要な役割を果たしている。本発明のスクリーニングに用いることができる炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドとは具体的には、以下の１）または２）のいずれかに記載のポリペプチドである。
１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチド。【００２８】
２）のポリペプチドには、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドが含まれ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有する限り、含まれる。前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。【００２９】
なお、本明細書中において「ポリペプチド」という言葉には、タンパク質、これに糖鎖が付加されたもの、塩も含むものとする。【００３０】
３．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの生産方法
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。【００３１】
３．１  ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法
より具体的には、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する方法である。例えばロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎ ｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、１、２０−２３（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、２、２８−２９（２００１）。【００３２】
３．２  公知の遺伝子工学的手法により調製する方法
形質転換細胞（すなわち、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換させることによって、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。具体的には、「５．形質転換細胞の作製方法」の項において詳述する。【００３３】
４．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに対する抗体
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに対する抗体は、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドのいずれかに結合するが、他のいかなるタンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。このような抗体は、後述する「６．スクリーニング方法」の項で記載するポリペプチドの発現を測定するスクリーニング方法に使用できるほか、抗体を含む医薬組成物としても利用することができる。【００３４】
前記抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７，１９９２）、抗原となるタンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５−４９７、１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ、Ｒ．ｅｄ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐ．３６５−３６７、１９８０、Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）に従って、目的のポリペプチドに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。【００３５】
抗体を作製するための抗原としては、目的のポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。【００３６】
前記抗原ポリペプチドは目的のポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによって該ポリヌクレオチドを発現させることにより、該ポリヌクレオチドを得ることが出来る。【００３７】
抗原となるポリペプチドは上記、「３．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの生産」の項に記載した方法によって製造することができる。【００３８】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。【００３９】
目的のポリペプチドと特異的に結合する抗体の例として、目的ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。【００４０】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。【００４１】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。【００４２】
（ａ）  抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製した本発明の蛋白質またはその一部を使用することができる。さらに、本発明により本発明の蛋白質の一次構造が明らかにされたので、当業者に周知の方法を用いて、本発明の蛋白質の部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。【００４３】
（ｂ）  抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、マウスが最も好適に用いられるが、これに限定されない。【００４４】
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。【００４５】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。【００４６】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。【００４７】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。【００４８】
（ｃ）  ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ， Ｄ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８１， １−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１） ［Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６， ５１１−５１９ （１９７６） ］、Ｓｐ２ ／Ｏ−Ａｇ１４ （ＳＰ−２） ［Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２７６， ２６９−２７０ （１９７８）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］ 、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３から４日前に正常培地［例えば、１０％ ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。【００４９】
（ｄ）  細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。【００５０】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。【００５１】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液およびマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％ 炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。【００５２】
（ｅ）  ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。【００５３】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する。【００５４】
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。【００５５】
（ｅ）  クローニング
工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。【００５６】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。【００５７】
（ｆ）  ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。かくして得られるモノクローナル抗体は、目的のポリペプチドに対して高い抗原特異性を有する。【００５８】
（ｇ）  モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。【００５９】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。【００６０】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、その特異性を利用した目的のポリペプチドの検出や分離精製に用いることができる。【００６１】
５．形質転換細胞の作製方法
本発明のスクリーニングに用いるため、もしくは目的のポリペプチドを産生するために有用である形質転換細胞は、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに組込んだ後、宿主細胞（原核細胞、真核細胞）を形質転換させて作製することができる。【００６２】
目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（Ｉ）ＰＣＲを用いた方法、（ＩＩ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（ＩＩＩ）化学合成法などを挙げることができるが、好ましくはＰＣＲを用いた方法である。以下、各製造方法について、順次、説明する。【００６３】
（Ｉ）ＰＣＲを用いた方法
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。すなわち、目的のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、目的のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、目的のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。【００６４】
より詳細には、まず、目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織（例えば、膵臓）から、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、目的のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。【００６５】
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２つのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。また、ゲノムＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。【００６６】
（ＩＩ）常法の遺伝子工学的手法を用いる方法
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。【００６７】
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。【００６８】
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（Ａ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、（Ｂ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法、（Ｃ）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法、（Ｄ）目的のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法、又は（Ｅ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法を採用することができる。【００６９】
（Ａ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、目的ポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。【００７０】
（Ｂ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、目的ポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、目的ポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。【００７１】
（Ｃ）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞表面に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いることもできる。目的のポリペプチドに対する抗体を用いて、目的のポリペプチドを検出することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。【００７２】
（Ｄ）目的のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面でポリペプチドを産生させ、目的のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。【００７３】
（Ｅ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。目的のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。【００７４】
得られた目的の形質転換株より目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。【００７５】
（ＩＩＩ）化学合成法を用いた方法
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。また、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，４３−７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。【００７６】
このようにして得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。【００７７】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。【００７８】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。【００７９】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。【００８０】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５、８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。【００８１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３、１７５−１８２、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７、４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。【００８２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１、８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。【００８３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２、４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１、８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ、Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。【００８４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ、Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ、（１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ． Ｉ： ３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ、Ｉ．Ｍ．ａｎｄ Ｖ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２、１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ Ｗａｎｇ、ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９、１６７−１７４）。【００８５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｂ．ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０、１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ、Ｌ．Ｎｉｌｅｓ、ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８、１２５−１３１）。【００８６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。【００８７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え体は、目的とするポリペプチドの物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で目的のポリペプチドを大量に製造できる。また、精製したポリペプチドの分子量は質量分析器、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等通常の方法で決定することができる。なお、スプライシングバリアントが存在する可能性もあるが、目的のポリペプチドと同一の機能（生物活性）を有する限りにおいてこれらのポリペプチドも目的のポリペプチドに含まれる。【００８８】
前記形質転換細胞を培養することにより、前記細胞の内外に生産される目的のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、例えば、目的のポリペプチドを発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、目的のポリペプチドを含む画分を得ることができる。得られた画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、目的のポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。【００８９】
目的のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と目的のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。【００９０】
６．本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法に使用するポリペプチドは、血管内皮細胞に炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ−αの添加によって発現量が上昇した遺伝子がコードするポリペプチドとして見出されたものである。実施例にも示すようにＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン等の細胞接着分子の発現誘導や血管内皮細胞の白血球細胞との接着に関っていることがわかる。【００９１】
したがって、該ポリペプチドの機能を抑制する物質は、細胞接着分子の発現を抑制し、ひいては血管内皮細胞が白血球細胞と接着することを阻害する物質（以下、「血管内皮細胞接着抑制物質」という）となる。このような物質は、血管内皮細胞と白血球細胞の接着を阻害するので、これらが原因とされる炎症性疾患、自己免疫疾患、喘息、乾癬、移植における拒絶反応、関節リウマチなどにも適応できるが、炎症性疾患への適応が最も好ましい。【００９２】
また、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも一つの発現量を測定することによって抗炎症薬のスクリーニングをすることができる。【００９３】
本スクリーニング方法に用いられる「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法で本発明の該ポリペプチドの機能を促進又は抑制する効果を調べる対象となる物質をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、本発明の該ポリヌクレオチドの発現量を増加するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、個体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分から４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。【００９４】
本スクリーニング方法に用いられる細胞としては炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを発現し、血管内皮細胞または血管内皮細胞に由来する細胞、もしくはＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインによる刺激により血管内皮細胞に生じる同様の炎症性反応が発現する細胞であれば、特に制限されず用いることができる。またヒトと同じ反応を示せば細胞の動物種に制限されず使用できる。具体的には、本発明である炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを安定発現するヒト血管内皮細胞株、もしくはレトロウイスルベクターなどで炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを強制発現させたヒト臍帯静脈血管内細胞（ＨＵＶＥＣ）やヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）などを血管内皮細胞用培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）あるいは１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＣＤＢ１３１培地（インビトロジェン社製を）で培養したものが使用できる。【００９５】
本スクリーニング方法を実施するにあたって血管内皮細胞を使用する場合においては、生体内の炎症状態を再現するため、培養細胞に刺激を加えることが望ましい。具体的には、炎症性サイトカイン、ＬＰＳ、百日咳毒素などを培地中に添加する方法が挙げられる。炎症性サイトカインとしては、細菌やウィルス感染、腫瘍、組織損傷などに伴う炎症反応に深く関与するサイトカインをさす。例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などが挙げられるが、好ましくは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である。【００９６】
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液または核抽出画分が用いられ得るが、全細胞抽出液が好適である。全細胞抽出液は、必要により高速遠心することにより不溶性の物質を除去した後、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調製工程に供される。【００９７】
６．１  発現量の測定を利用したスクリーニング方法
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、血管接着分子の発現を誘導させることにより血管内皮細胞に白血球細胞との細胞接着を誘導する。したがって、該ポリペプチドの発現量を減少させる物質は血管内皮細胞接着抑制能を有する物質である。これらの物質は具体的には以下の工程を含むスクリーニング方法によって取得することができる。【００９８】
Ａ−１．遺伝子の発現量を測定する場合
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。
Ａ−２．ポリペプチドの発現量を測定する場合
（１）血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するもの。
Ｂ．形質転換細胞を用いる場合
（１）１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記遺伝子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。【００９９】
６．１．１  ポリヌクレオチドの測定方法
本発明のスクリーニング方法の実施態様としては、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドを指標にして検出する方法がある。このようなポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に示す配列の全部もしくは一部の配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。下記の方法に従って、該ポリヌクレオチドを測定することができる。【０１００】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合には目的とするポリヌクレオチドのいずれか一つを発現可能な条件であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培養条件が知られており、該条件下において該細胞が目的とするポリヌクレオチドを発現する場合は、該条件で培養してよい。【０１０１】
ポリヌクレオチドを測定するにあたっては、まず全ＲＮＡの抽出が必要となる。ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．、（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。【０１０２】
得られた全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に用いることもできる。【０１０３】
スクリーニング方法に含まれる工程において、炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの発現量の測定方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ランオン・アッセイ、遺伝子チップ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーションに従って実施することができるが、特にＲＴ−ＰＣＲを用いて実施することが望ましい。【０１０４】
まず本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドのｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する。この方法において、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。ＲＴ−ＰＣＲは市販のキット（例えば、ＲＮＡ ＰＣＲキット ＡＭＶ ｖｅｒ２．１：タカラバイオ社製）を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行なうことができるが、以下の方法でもできる。【０１０５】
逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的に本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドから３０ヌクレオチド、更に好ましくは２３ヌクレオチドから３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。【０１０６】
一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した１５から４０ヌクレオチド、好ましくは１８から３５ヌクレオチド、更に好ましくは２１から３０ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。【０１０７】
これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌクレオチド配列の５’末端に、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。ＲＴ−ＰＣＲの反応は常法により行なうことができる。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにまで精製されている必要はない。【０１０８】
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。ポリヌクレオチド定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲ法を改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｏｕａｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１、２８０−２８５）や、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法（Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｇｅｎｏｍ．Ｒｅｓ．６、９８６−９９４）なども利用可能である。【０１０９】
被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果、目的のポリヌクレオチドの発現量を低下させた被験物質は、本発明の該ポリペプチドの機能を抑制する物質であり、該ポリペプチドの発現に起因する血管内皮細胞の接着を抑制することから抗炎症剤の治療または予防剤となり得る。【０１１０】
６．１．２  ポリペプチドの測定方法
また、本発明のスクリーニング方法の別の実施態様としては、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド（タンパク質）を検出する方法がある。具体的には下記の態様によって、該ポリペプチドの発現量を測定することができる。【０１１１】
ポリペプチド発現量の測定方法の好適な態様として、抗体を利用した方法について説明する。なお、このとき使用する抗体は、上述の「４．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに対する抗体」の記載に従って作製することができる。まず、試料中のポリペプチドを９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートのウエル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。【０１１２】
（１）試料の調製
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液または核抽出画分が用いられ得るが、全細胞抽出液が好適である。全細胞抽出液は、必要により高速遠心することにより不溶性の物質を除去した後、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調製工程に供される。【０１１３】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。【０１１４】
（２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガントの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。ポリペプチドを固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製））、またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製）等が挙げられる。【０１１５】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ ｅｄ ｂｙ Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ． Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ． Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ 参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド））。【０１１６】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％ アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃から室温で一晩、または３７℃で１から３時間静置することにより、ウェル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。【０１１７】
（３）検出
抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。【０１１８】
標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。【０１１９】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。【０１２０】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記（３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。【０１２１】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製）を用いて酵素活性を測定する。【０１２２】
（４）測定操作
ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％ スキムミルク、０．０５から０．１％ ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１から１０％のウシ血清アルブミン、０．５から３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６から２４時間、または室温で１から３時間である。【０１２３】
次に、メンブレンを０．０５から０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００から２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分から１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。【０１２４】
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記（２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。【０１２５】
次に、ウェル内を０．０５から０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記（３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００から２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１から３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。【０１２６】
また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記（４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記（２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。【０１２７】
（５）判定
被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果該ポリペプチドの産生量を低下させた被験物質は、対象とするポリペプチドの機能を抑制する物質であり、該ポリペプチドの発現に起因する血管内皮細胞の接着を抑制することから抗炎症剤の治療または予防剤となり得る。【０１２８】
６．２  機能の測定によるスクリーニング
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、炎症性サイトカイン刺激による細胞接着分子の発現誘導活性、及び／又は血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導活性を有する。したがって、該ポリペプチドの機能を抑制する物質は血管内皮細胞接着抑制能を有する物質である。これらの物質は具体的には以下の工程を含むスクリーニング方法によって取得することができる。【０１２９】
Ａ．白血球への接着を利用したスクリーニング方法
（１）１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、
を含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（２）白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
（３）白血球と上記細胞との接着量を測定する工程。【０１３０】
Ｂ．細胞接着分子の発現誘導活性を利用したスクリーニング方法
（１）１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または
２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＮＦ−αの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、を含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
（２）細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。【０１３１】
具体的には、培養上清に被験物質を加え適当な時間培養し、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌｅｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ mｏｌｅｃｕｌｅ（ＩＣＡＭ）−１、ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＶＣＡＭ）−１そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎなど炎症時に血管内皮細胞に惹起される接着分子の発現を指標に評価する。細胞表面の各接着分子の発現は、内皮細胞を培養器から剥がした後、各接着分子に対する蛍光標識したモノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）で染色し、フローサイトメーターを用いた手法で検出することができる。また別法して、各接着分子を認識するモノクローナル抗体を用いたｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を模した方法にてマイクロプレートウェル上で直接定量することもできる。具体的には９６穴マイクロプレート上で被験物質を添加した状態で適当な時間培養した内皮細胞の培養上清を取り除き、内皮細胞をメタノール：エタノール（３：１混合比）の固定液で固定し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）含ＰＢＳにてブロッキングした後に内皮細胞を抗ヒトＩＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を０．１％ＢＳＡ含ＰＢＳの希釈液で反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含ＰＢＳで洗浄した後再び１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）含ＰＢＳにてブロッキングした後に、０．１％ＢＳＡ含ＰＢＳで希釈したｈｏｒｓｅ ｌａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を反応させた後０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰをペルオキシダーゼ用発色キットＯ（住友ベークライト社製）を用いて使用説明書のプロトコールにしたがって、各マイクロプレートウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定することにより内皮細胞表面の各接着分子の発現を定量することができる。また培養上清中に分泌された遊離性の接着分子もＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で添付の使用説明書にしたがって測定することもできる。以上の方法においてコントロール（被験物質未添加）細胞と比較して、何れかの接着分子の発現が減少した被験物質が本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの機能を抑制する物質であると判定することができる。【０１３２】
一方、白血球細胞と血管内皮細胞の接着を測定する方法は、９６穴マイクロプレート上で被験物質を添加した状態で適当な時間培養した細胞にＶｙｂｒａｎｔ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて使用説明書に従い蛍光標識したＴリンパ球系培養細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔなど）、単球系培養細胞（ＴＨＰ−１、Ｕ９３７など）あるいはヒト末梢静脈血から分離した白血球細胞を添加し、洗浄後内皮細胞に接着した白血球細胞の蛍光を蛍光マイクロプレートリーダーで測定することにより定量できる。以上の方法において、コントロール（被験物質未添加）細胞と比較して、何れかの白血球細胞の接着を減少させた被験物質が本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの機能を抑制する物質であると判定することができる。【０１３３】
６．３  特異結合体を利用したスクリーニング方法
ここで、特異結合体とは炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと特異的に結合できるようなタンパク質（抗体を含む）、アプタマ―、低分子化合物等が含まれる。  炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、細胞の内外において、直接的もしくは間接的に他のタンパク質と結合することにより、その活性を調節していると考えられる。したがって、該ポリペプチドとかかるタンパク質の結合を阻害する物質は血管内皮細胞接着を調節する物質の可能性が高い。これらの物質は具体的には以下の工程を含むスクリーニング方法によって取得することができる。
（１）１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、炎症性サイトカインの存在下において（ａ）細胞接着分子の発現誘導機能、及び／又は（ｂ）血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を示すポリペプチド、のいずれかと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの特異結合体の存在下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。【０１３４】
特異的に結合できるタンパク質を得る方法としては、例えば、精製した炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを用いて、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドにヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと特異的に結合する細胞抽出液中のタンパク質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと直接結合するタンパク質、および炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドとの結合活性は持たないが、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに直接結合するタンパク質と複合体を形成することにより間接的に炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに結合するタンパク質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。【０１３５】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。【０１３６】
これらの方法により、本発明の炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと直接もしくは間接的に相互作用するタンパク質のｃＤＮＡが得られれば、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと該タンパク質との相互作用を阻害する物質のスクリーニングに利用することができる。具体的には、まず、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドを発現させた形質転換細胞等の細胞等を破砕して調整したライセート（好ましくは炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの精製標品）を調製する。緩衝液、イオン、及び／又はｐＨのようなスクリーニング条件を最適化し、最適化したバッファー中で、ライセートと、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと相互作用するタンパク質の標識体とを、試験化合物と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ニトロセルロースフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。得られた標識体の結合阻害を指標に、炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと、これと相互作用するタンパク質の結合を阻害する化合物を選択することができる。なお、この化合物が、アゴニスト又はアンタゴニストであるかについては、この項に記載の他のスクリーニング方法などにより確認することができる。【０１３７】
なお、特異的に結合できるタンパク質が抗体である場合は「４．炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドに対する抗体」の記載に従えば、取得することができる。【０１３８】
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドと該タンパク質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記スクリーニングを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。【０１３９】
特異結合体については、通常はその挙動を検出可能とするため種々の物質で標識されうる。タンパク質を標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら1994年）等に記載されている常法を用いることにより行うことができる。種々の物質としては化学発光物質、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、元素、金属類、ビオチンが挙げられる。以下に具体例を示すがこれらに限定されるものではない。化学発光物質とは例えばルミノールやアクリジニウムエステルなどをさす。酵素とは例えばβ-ガラクトシダーゼやアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えばユウロピウムクリプテートやＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）やＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などをさす。着色ビーズとは例えばプロテイン Aビーズ、ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなどをさす。放射性同位元素とは例えば14Ｃや125Ｉや3Ｈなどをさす。元素とは例えばユウロピウムなどのランタニド元素をさす。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。【０１４０】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４１】
ＤＮＡマイクロアレイ解析による炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド候補の探索
血管内皮細胞は白血球の浸潤、サイトカインの分泌などの炎症反応の誘導に重要な機能を有している。そこで血管内皮細胞に発現しかつ炎症反応に重要な役割を果たす遺伝子を見出すため、まず代表的な炎症性サイトカインであるｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）−αの刺激により血管内皮細胞で発現上昇する遺伝子を以下の手順でＤＮＡマイクロアレイ解析により探索した。【０１４２】
ａ）ＴＮＦ−α刺激血管内皮細胞の全RNAの調製
購入した冷凍保存ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を添付の使用説明書に従い、血管内皮細胞用基礎培地（ＥＧＭ−２：Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）にＥＧＭ−２添加因子セット（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を添加した１５ｍｌの培養液（以下ＥＧＭ−２）にて７５ｃｍ２培養フラスコ中で３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下でコンフルエントな状態まで培養し、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（以下ＨＥＰＥＳ液：Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）、０．０２５％トリプシン／０．０１％ ＥＤＴＡ液（以下トリプシン液：Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）、トリプシン中和液（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を用いて細胞を回収した。これを２３０×ｇ、室温で５分間遠心分離し、４．５×１０５細胞／ｍｌの細胞濃度になるようにセルバンカー（十慈フィールド株式会社製）に懸濁し、１ｍｌずつセラムチューブに分注した後−８０℃で冷凍保存したものをストックとして以下の実験に用いた。そのストックした細胞４本を各１５ｍｌのＥＧＭ−２に再懸濁し、７５ｃｍ２底面積の培養フラスコに播種し、１日毎に培養上清を新鮮な１５ｍｌのＥＧＭ−２と交換し、コンフルエントな状態に達するまで培養を続けた。次に細胞をＨＥＰＥＳ液、トリプシン液、トリプシン中和液により細胞を剥がし、細胞を２３０×ｇ、室温で５分間遠心分離し、１０ｍｌのＥＧＭ−２を加え２．５ｍｌずつ１７．５ｍｌのＥＧＭ−２の入った１５ｃｍシャーレ４枚に分注し、細胞がコンフルエントな状態になるまで１日ごとに培養上清を２０ｍｌの新鮮なＥＧＭ−２と交換しながら３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養を続けた。細胞がコンフルエントになったシャーレ３枚の培養上清をｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ hｕｍａｎＴＮＦ−α（ＧＴ社製）を２０μｇ／ｍｌの濃度になるように０．１％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ：シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した液１０μｌを２０ｍｌのＥＧＭ−２に加えたもの（ＴＮＦ−α最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）に交換し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で１時間、４時間、２４時間培養した後、培養上清を取り除き１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１２ｍｌ加え、直ちにセルスクレーパーを使って細胞を溶解し、その細胞溶解液を１５ｍｌ遠心チューブに移し−８０℃で凍結保存した。尚、残りのシャーレ１枚分の細胞はコントロール用のＴＮＦ−α未処理の細胞（０時間処理）として、ＴＮＦ−αを含むＥＧＭ−２の代わりに２０ｍｌの新鮮なＥＧＭ−２を加え、直ちに上記の方法にて細胞溶解液を調製し、−８０℃保存した。その後室温で細胞溶解液を融解させた後、ＴＲＩｚｏｌ試薬添付の使用説明書に従い全ＲＮＡ精製を行った。尚、ＲＮＡは５００μｌのｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＥＰＣ）処理水で溶解した。【０１４３】
ｂ）ＤＮＡマイクロアレイ解析
以下のＤＮＡマイクロアレイ解析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂａｒ Ｃｏｒｄｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｔｙｐｅ ７ Ｓｔａｒ（以下 Ｔｙｐｅ ７ Ｓｔａｒ：アマシャムバイオサイエンス社製)に１２種類のヒト臓器由来のｃＤＮＡをテンプレートに調製したｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）を含む約５０００配列のＰＣＲ断片（長さ約５００塩基対）をＡｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いてスポッティングした自家作製のＤＮＡマイクロアレイ及びかずさヒトｃＤＮＡナイロンマイクロアレイ（以下ＫＤＲアレイ：カケンジェネクス社製）を用いて実施した。尚、Ｔｙｐｅ ７ Ｓｔａｒには、各ＰＣＲ断片を２スポットずつ搭載した。
Ｔｙｐｅ ７ Ｓｔａｒにおける解析は以下の手順にて実施した。上記ａ）の全ＲＮＡ２．５μgをテンプレートにしてＭｅｓｓａｇｅ Ａｍｐ ａＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて添付の使用説明書に従いｍＲＮＡを増幅（ａＲＮＡ化）した。次にマイクロアレイ１枚につきＴＮＦ−α処理０、１、４、２４時間それぞれのａＲＮＡを１μｇ使用し、Ａｔｌａｓ Ｇｌａｓｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により添付の使用説明書に従いｃＤＮＡ化及びＣｙ３標識またはＣｙ５標識した後、ＴＮＦ−α処理０時間（コントロール）のＣｙ３標識ｃＤＮＡとＴＮＦ−α処理１、４、２４時間のＣｙ５標識ｃＤＮＡの組み合わせとまた逆にＴＮＦ−α処理０時間（コントロール）のＣｙ５標識ｃＤＮＡとＴＮＦ−α処理１、４、２４時間のＣｙ３標識ｃＤＮＡの組み合わせ（計６種類の組み合わせ）でｃＤＮＡをミックスし、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。そして精製した標識ｃＤＮＡの各混合液５０μｌ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２（アマシャムバイオサイエンス社製）５０μｌ、そしてホルムアミド１００μｌを混合し、マイクロアレイ自動ハイブリダイゼーション・洗浄装置Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｌｉｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＡＳＰ）（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて使用説明書に従い各組み合わせの混合液１種類につき１枚のマイクロアレイ（計６枚）に対してハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。これらマイクロアレイをＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ（モレキュラーダイナミクス社製）でスキャニングしマイクロアレイのＣｙ３、Ｃｙ５の蛍光シグナルをそれぞれ画像データとして取得した。さらに取得した画像データについて、画像解析ソフトウェアＡｒｒａｙＶｉｓｏｎ（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて各スポットをグリッディングし、Ｃｙ３、Ｃｙ５の両蛍光シグナルの強度を数値化し、この数値化データをテキストファイルに保存した。【０１４４】
また、ＫＤＲアレイによる解析は以下の手順で解析した。上記ａ）のＴＮＦ−α処理０、１、４、２４時間の全ＲＮＡそれぞれ１７μｇとｄＴ２５オリゴマー８μｇを混合し、全量１８．８μｌになるようにＤＥＰＣ処理蒸留水でメスアップし、７０℃１０分間加熱後氷上で急冷した。これにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）添付の５×１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、０．１Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）５μｌ、キットに添付外のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各々Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をそれぞれ１０ｍＭを含む混合液４μｌ、０．１ｍＭｄＣＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製１０ｍＭを１００倍希釈して調製）０．２μｌ、１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，３７０Ｍｂｑ／ｍｌ［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）１０μｌを添加し、４２℃で２分間インキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を２μｌ加えた後４２℃で１時間インキュベートした。次にＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により添付の使用説明書に従い精製し、これに１０ｍｇ／ｍｌ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５μｌ、１μｇ／μｌポリアデニル酸（シグマアルドリッチ社製）１μｌを加え、１００℃、５分間の熱変性後にあらかじめ６８℃に暖めておいたＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡社製）４２０μｌに加え６８℃、３０分間インキュベートした。同時に８枚のＫＤＲアレイを一枚ごとに容量５ｍｌ、胴径１６．５ｍｍφ、全高４５ｍｍのガラス製バイアル瓶（マイティバイアル：テックジャム社製）１本に丸めて入れ、これに３ｃｍの長さのガラス棒を入れ、各バイアル瓶に２００μｌのＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、このバイアル瓶をハイブリダイゼーションボトル（Ｒｏｂｂｉｎｓ社製）に直列に入れ、Ｍｉｃｒｏ Ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ｒｏｂｂｉｎｓ社製）でローテーションしながら６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、バイアル瓶のＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを捨て、これにインキュベートを完了した３３Ｐ標識ｃＤＮＡを混合したＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｏｌｕｔｉｏｎをＫＤＲアレイ１枚につき２００μｌ加え、プレハイブリダイゼーションと同様の方法でローテーションを行いながら６８℃で一晩インキュベートしハイブリダイズした。尚、ＴＮＦ−α処理０、１、４、２４時間の各サンプルにつき２枚のＫＤＲアレイにハイブリダイゼーションを行った。その後バイアル瓶からＫＤＲアレイを取り出し、２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，６８℃，１５分間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，６８℃，１５分間の洗浄を２回実施し、ＫＤＲアレイをイメージングプレート（ＩＰ：富士フイルム社製）に１、４、７日間露光し、ＩＰに転写されたＫＤＲアレイの放射活性をフルオロ・イメージアナライザーＦＬＡ３０００Ｇ（富士フイルム社製）にて画像データとして取得���た。そしてその画像データを用いて画像解析ソフトウェアＡｒｒａｙＧａｕｇｅ（富士フィルム社製）により各スポットをグリッディングしてその放射活性を数値化し、テキストファイルに保存した。
次に両マイクロアレイの解析により得られた各スポットの数値データのテキストファイルをマイクロアレイデータ解析ソフトウェアであるＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてデータを統合し、各スポットについてＴＮＦ−α１、４、２４時間処理のシグナル強度をＴＮＦ−α０時間処理（ＴＮＦ−α未処理）のシグナル強度で割り込んだシグナル比すなわちＴＮＦ−α処理により処理時間１，４，２４時間後に何倍発現変動するかを算出し、Ｔｙｐｅ ７ Ｓｔａｒにおいてマイクロアレイ上の２スポット×サンプルの蛍光標識（Ｃｙ３、Ｃｙ５）を入れ換えたデータ計４スポットのうち３スポット以上のデータで、またかずさアレイの場合は併行して解析したアレイ２枚分の両方のデータで１、４、２４時間後に何れかの点でシグナル強度比が２以上すなわち２倍以上発現上昇しているスポットを抽出した。さらに抽出されたスポットのＰＣＲ断片の配列をクエリーとして、ＢｉｏＳＣＯＵＴ（Ｌｉｏｎ社製）そしてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）とＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの公共データベースであるＥｎｓｅｍｂｌを対象に解析した結果、２倍以上発現上昇していると判定されたスポットは、重複を除くと最終的に計１４２の遺伝子に集約された。そしてデータベース上から全長ｍＲＮＡ配列などの情報を取得し、これらに“ＴＮＦＵＰ＿通し番号”という形でＩＤを付けた。尚、これらの１４２遺伝子のうち後述の実施例２、３の解析にて新規の機能が見出されたことにより本発明の対象とした炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードする遺伝子は、ＴＮＦＵＰ＿００１３（配列番号１）、ＴＮＦＵＰ＿００６４（配列番号３）、ＴＮＦＵＰ＿００７２（配列番号５）、ＴＮＦＵＰ＿０１１３（配列番号７）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４（配列番号９）、ＴＮＦＵＰ＿０１４２（配列番号１１）の６遺伝子である。このとき、ＴＮＦＵＰ＿００７２については２つ（ＴＮＦＵＰ＿００７２；配列番号５、ＴＮＦＵＰ＿００７２Ｂ；配列番号１３）の、またＴＮＦＵＰ＿０１４２については６つ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２；配列番号１１、ＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｂ；配列番号１５、ＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｃ；配列番号１７、ＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｄ；配列番号１９、ＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｅ；配列番号２１、ＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｆ；配列番号２３）のスプライシングバリアントが存在していた。そしてデータベース検索の結果、これら６遺伝子の遺伝子名は公共データベースであるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ上では、ＴＮＦＵＰ＿００１３はｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３Ｂ（ＦＮＤＣ３Ｂ）、ＴＮＦＵＰ＿００６４はｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４４−ｌｉｋｅ（ＩＦＩ４４Ｌ）、ＴＮＦＵＰ＿００７２はＴＮＦＡＩＰ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＴＮＩＰ１）、ＴＮＦＵＰ＿０１１３は、ＴＢＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ 4（ＴＢＣ１Ｄ４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４はｎｉｃａｓｔｒｉｎ（ＮＣＳＴＮ）、そしてＴＮＦＵＰ＿��１４２はＳＯＮ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＯＮ）であった。
【実施例２】
【０１４５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの機能的スクリーニング（一次スクリーニング）
実施例１のＤＮＡマイクロアレイ解析から抽出された１４２の発現上昇遺伝子が内皮細胞において炎症に重要な機能を有するかを、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で各遺伝子をノックダウンすることにより、ＴＮＦ−αの刺激でＨＵＶＥＣに生じる接着分子の発現誘導を抑制できるかどうかを指標に以下の手順にて検証した。すなわちｓｉＲＮＡにより接着分子の発現が抑制された場合そのｓｉＲＮＡのターゲットとなる遺伝子が炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド候補となる。【０１４６】
ａ）ｓｉＲＮＡの調製
ＲＮＡｉを利用した炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドの機能的スクリーニングのために、ＣＵＧＡ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成を実施した。尚、今回合成したｓｉＲＮＡのうち後述の実施例２ｄ）で顕著な接着分子発現抑制効果を認めかつ後述の実施例３の解析により新規の機能を持つことが確証された炎症性サイトカイン誘導ポリペプチド６遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、また陰性コントロールｓｉＲＮＡ及び陽性コントロールのｓｉＲＮＡのターゲット配列、合成用オリゴＤＮＡ配列および合成されるｓｉＲＮＡの配列を表１に例として示す。具体的なｓｉＲＮＡの合成・調製は以下の通りに行った。実施例１ｂ）で見出された発現上昇遺伝子（１４２遺伝子）について、全長のｍＲＮＡ配列からｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）を抜き出し、またスプライシング・バリアントがある場合はその共通部分の塩基配列のみを抜き出した。次に下記の表１及び表２の例に示されるように抜き出した塩基配列からｓｉＲＮＡセンス鎖３'オーバーハング２塩基部分とｓｉＲＮＡの２本鎖部分（表中のｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｒｅｇｉｏｎ）１９塩基部分そしてｓｉＲＮＡアンチセンス鎖３'オーバーハング部分の２塩基部分からなる２３塩基の領域（表中のＴａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ターゲット配列）を各遺伝子につき４領域選び出し、ＣＵＧＡ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの使用説明書に従いターゲット配列の３'にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の相補配列（５'−ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３'）を付加した表１、または配列２５−５２を例とするセンス鎖鋳型オリゴＤＮＡとアンチセンス鎖鋳型オリゴＤＮＡをデザインし化学合成（シグマジェノシス社製）した。尚、配列番号２５−３０はＴＮＦＵＰ＿００１３、配列番号３１−３２はＴＮＦＵＰ＿００６４、配列番号３３−３４はＴＮＦＵＰ＿００７２、配列番号３５−３６はＴＮＦＵＰ＿０１１３、配列番号３７−３８はＴＮＦＵＰ＿０１１４、そして配列番号３９−４２はＴＮＦＵＰ＿０１４２に対するｓｉＲＮＡ合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。また、配列番号４５，４６はｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌｅｒ aｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＩＣＡＭ）−１、配列番号４７，４８はｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＶＣＡＭ）−１、配列番号４９，５０はＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、配列番号５１，５２はｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（ＴＮＦＲ１）に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ合成用オリゴＤＮＡ（その産物のｓｉＲＮＡが高いノックダウン効果を持つことをあらかじめ確認済）そして配列番号４３，４４はＧｅｎＢａｎｋに対するＢｌａｓｔ検索でいずれの遺伝子にもヒットしないようにデザインした１９塩基の配列をターゲット領域に持つ陰性コントロールｓｉＲＮＡ用オリゴＤＮＡの塩基配列である。これらを含む前述の実施例1で検出された１４２遺伝子とコントロール遺伝子に対してデザインした全てのオリゴＤＮＡを鋳型として用いてＣＵＧＡ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔキットにより使用説明書に一部の改変を加えた方法でｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成および精製を実施した。改変とはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写合成したｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞に誘発されるインターフェロン応答を５'端のリン酸基を取り除くことにより抑えるもので、Ｋｉｍら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２，ｐ３２１−３２５）が報告した手法に改良を加えた方法である。具体的には同キットの標準プロトコールの半量にてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応及びヌクレアーゼ反応を実施した後、その５０μｌの反応液に７μｌのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を加えボルテックスミキサーにて攪拌後１分間室温で静置し、１２０００ｒｐｍで室温１分間遠心し、上清をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製後、これに２０ｕｎｉｔｓ（２μｌ）のｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ, ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と６μｌの１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＣＩＰに添付）及び２μｌのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ蒸留水を加え（全量６０μｌ）、タッピングにより攪拌後３７℃１時間インキュベートし、４０μｌのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ蒸留水を加え、最後にＣＵＧＡ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコールに従いｓｉＲＮＡのフェノール・クロロホルム精製を行った。その後分光光度計を用いてｓｉＲＮＡの濃度測定を行いＲＮＡ Ｆｒｅｅ蒸留水で１００ｎｇ／μｌに調製した。尚、これらの配列番号２５から５２の配列のオリゴＤＮＡを使用し上記の方法でｓｉＲＮＡを合成した場合、表１及び表２のｓｉＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅに示す配列のものが合成される。
【表１】
2006134960.tif 000002
【表２】
2006134960.tif 000003
【０１４７】
ｂ）機能的スクリーニング用ＨＵＶＥＣの培養・調製
購入した冷凍保存ＨＵＶＥＣ（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を使用説明書に従い、ウシコラーゲンＩ型がコーティングされた底面積７５ｃｍ２の培養フラスコ（住友ベークライト社製）中で内皮細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）によりＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下で培養し、コンフルエントになった状態の細胞をサブカルチャーセットＡ（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を用いて細胞を剥がして継代培養を開始し、培養フラスコ１本分の細胞を２本に継代した場合を１代として、７代から８代継代した後コンフルエントになった１本分の培養フラスコの細胞をサブカルチャーセットＡを用いて剥がし、２００×ｇで５分間遠心後２ｍｌのセルバンカー（十慈フィールド社製）に浮遊させ、これを１ｍｌずつ２本のセラムチューブに冷凍保存した細胞をストックとして以下の実験に用いた。冷凍保存したストック１本分の細胞を１５ｍｌの培地が入ったウシコラーゲンＩ型コーティング底面積７５ｃｍ２培養フラスコに加え６時間から１８時間後２５ｍｌの新鮮な培地と交換して３日間培養し、コンフルエントになった細胞をサブカルチャーセットＡを用いて回収し、２００×ｇで５分間遠心後１×１０５細胞／ｍｌの細胞濃度になるように内皮細胞増殖培地で浮遊液を調製した。これをウシコラーゲンＩ型がコーティングされた９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに１００μｌ（１×１０４細胞）ずつ分注した。これを１８時間から２４時間培養した後、各ウェルの細胞は９５−１００％コンフルエントな状態に達した。尚、一次スクリーニング1回の解析つき上記９６穴マイクロプレートをＩＣＡＭ−１解析用、ＶＣＡＭ−１解析用そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ解析用の計３枚調製した。【０１４８】
ｃ）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
上記ｂ）の各ウェルの細胞に上記ａ）で合成したｓｉＲＮＡをＴａｒｇｅｆｅｃｔ−ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて以下の操作によりトランスフェクションした。尚、スクリーニング１回の解析につき９２のｓｉＲＮＡ、３つの陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ用）、そして陰性コントロールｓｉＲＮＡ計９６のｓｉＲＮＡについて３枚（ＩＣＡＭ−１測定用、ＶＣＡＭ−１測定用、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ測定用）の９６穴プレートに対してトランスフェクションを実施した。
１００ｎｇ／μｌのｓｉＲＮＡ１つにつき９６穴ＰＣＲプレートの１ウェルに３．１μｌ（０．３１μｇ）ずつ分注し、これに同キットに含まれているＳｏｌｎＡ １２０μｌ、ＳｏｌｎＢ ７５μｌと４５００ｍｇ／ｌグルコース含Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）１４．８ｍｌの混合液をｓｉＲＮＡが入ったＰＣＲプレートの各ウェルにつき１５５μｌずつ加え、ＡＢｓｏｌｕｔｅ ＱＰＣＲ Ｓｅａｌ（ＡＢｇｅｎｅ社製）にてＰＣＲプレートをシールしたのち転倒混和し、マイクロプレート用遠心機により混合液をスピンダウンした後２５分間３７℃でインキュベートした。そして上記ｂ）の細胞を培養した９６穴マイクロプレートの培養上清を８連タイプのアスピレータにより抜きとり、直ちに８連マイクロピペットを用いて９６穴ＰＣＲプレートの各ウェルのｓｉＲＮＡの混合液を５１μｌずつ（各ウェルにつき０．１μｇのｓｉＲＮＡに相当）を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。その後直ちに新鮮な内皮細胞増殖培地を１００μｌずつ８連マイクロピペットで加え、１６時間ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下でインキュベートした。その後各ウェルの上清を１２６μｌ取り除き、７５μｌの新鮮な内皮細胞増殖培地を加え上清の全量を１００μｌとし、ＩＣＡＭ−１測定用プレート及びＶＣＡＭ−１測定用プレートは８時間、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ測定用プレートは１６時間同条件でインキュベーションを継続した。その後ＩＣＡＭ−１用のマイクロプレートの各ウェルに０．７５ｎｇ／ｍｌの濃度に内皮細胞増殖培地で希釈したヒトＴＮＦ−α（ＧＴ社製）を５０μｌ（最終濃度０．２５ｎｇ／ｍｌ）を加えて１８．５時間、ＶＣＡＭ−１測定用プレートの各ウェルには３０ｎｇ／μｌのＴＮＦ−α希釈液を５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）加え１８．５時間、そしてＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ測定用プレート各ウェルには３０ｎｇ／μｌのＴＮＦ−α希釈液を５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）加え２．５時間、ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下でインキュベートした。【０１４９】
ｄ）Ｃｅｌｌ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ）
次に接着分子を認識するモノクローナル抗体を用いたｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を模した方法にてマイクロプレート上でＨＵＶＥＣ表面に発現する各接着分子の検出を行った。具体的には上記ｃ）でｓｉＲＮＡをトランスフェクション後インキュベートした９６穴マイクロプレートの上清を取り除き、直ちにメタノール：エタノール（３：１混合比）の固定液を１００μｌ加え１時間室温で静置することにより固定し、プレートウオッシャーを使用して０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含ＰＢＳで３回洗浄した後１％ＢＳＡ含ＰＢＳを１００μｌ加え３０分間室温でブロッキングした後に上清を取り除き、抗ヒトＩＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を０．１％ＢＳＡ含ＰＢＳで５００倍希釈（最終濃度１μｇ／ｍｌ）した液を対応したマイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ加え３０分間室温で抗体を反応させ、マイクロプレートウオッシャーを使用して０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含ＰＢＳで４回洗浄した。その後再び１％ＢＳＡ含ＰＢＳ１００μｌで３０分間室温にてブロッキングし上清を取り除いた後に、０．１％ＢＳＡ含ＰＢＳで１０００倍希釈（最終濃度１μｇ／ｍｌ）したｈｏｒｓｅ ｌａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ & Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μｌ加えて反応させた後、マイクロプレートウオッシャーを使用して０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含ＰＢＳで５回洗浄し、上清を完全に取り除いた後ＨＲＰをペルオキシダーゼ用発色キットＯ（住友ベークライト社製）を用いて使用説明書のプロトコールに従って発色反応を行い、各マイクロプレートウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定し内皮細胞表面の各接着分子の発現を評価した。すなわち、吸光度が低ければ接着分子の発現がより強く抑制されていることを示す。さらにＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ解析用プレートそれぞれで９２のｓｉＲＮＡにおける４９０nmの吸光度の平均値（ｍｅａｎ）と標準偏差（ＳＤ）を算出し“ｍｅａｎ−２×ＳＤ”以下の吸光度を示すｓｉＲＮＡを陽性と判定した。その結果１８遺伝子に対応する２１のｓｉＲＮＡがＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの何れかの発現抑制効果を示し、陽性と判定され、その対応遺伝子である１８遺伝子を炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドの候補として選択した。
【実施例３】
【０１５０】
炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド候補の検証
上記実施例２ｄ）にて陽性と判定された２１のｓｉＲＮＡの効果を以下の手順にて再検証した。この再検証により結果として炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドとしてＴＮＦＵＰ＿００１３（配列番号１）、ＴＮＦＵＰ＿００６４（配列番号３）、ＴＮＦＵＰ＿００７２（配列番号５）、ＴＮＦＵＰ＿０１１３（配列番号７）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４（配列番号９）、ＴＮＦＵＰ＿０１４２（配列番号１１）の６遺伝子が絞り込まれた。【０１５１】
ａ）Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡによる接着分子発現抑制の再現性（二次スクリーニング）
実施例２ｄ）に記載の一次スクリーニングの結果の再現性を確認するため、陽性反応を示した２１のｓｉＲＮＡについて４系列（４ウェル）ずつに解析数を増やし、実施例２と同一の方法で再解析を行った。その結果、一次スクリーニングで検出されたｓｉＲＮＡの接着分子発現抑制効果の殆どが再現された。
図１から３は２１のｓｉＲＮＡのうちこの二次スクリーニングで接着分子の発現抑制効果が再現され、さらに後述のｂ）、ｃ）で炎症に高い関連性を持つと判断された６遺伝子に対する計９つのｓｉＲＮＡと陰性および陽性コントロールｓｉＲＮＡにおける結果を示す。尚、図の縦軸は各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の４９０ｎｍの吸光度を示し、斜線のカラムはｄ）の一次スクリーニングにおいて該当する接着分子の発現抑制効果が陽性であったｓｉＲＮＡであることを示す。また灰色のカラムは該当の接着分子で陽性ではないが、他の接着分子で陽性であったものを示し、白色、黒色のカラムはそれぞれ陰性コントロール、陽性コントロールのｓｉＲＮＡにおけるデータを示す。また各データは４ウェルのデータの平均値を示し、エラーバーは４ウェルのデータの標準偏差を示す。
ＩＣＡＭ−１の発現（図１）については陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＩＣＡＭ１−ｓｉ）のデータから推測すると本バッチのアッセイではＩＣＡＭ−１が通常よりも高く検出されたと考えられるため、ｓｉＲＮＡによる抑制効果が若干わかりにくいが、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対する３つのｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−１，３，４）、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）で陰性コントロールｓｉＲＮＡよりも４９０ｎｍ吸光度で約４０％減少の発現抑制効果を示した。また、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）では約３０％の発現抑制が認められた。さらにＴＮＦＵＰ＿０１４２については一次スクリーニングで抑制効果を検出した２つのｓｉＲＮＡのうち一方のｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−３）で３０％程度の抑制効果しか現れなかったが、一方のｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）で約４０％の抑制効果が認められた。
ＶＣＡＭ−１の発現（図２）については、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対する２つのｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２，３）で陰性コントロールｓｉＲＮＡよりも４９０ｎｍ吸光度で５０％以上減少の発現抑制効果を示した。ＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）についてはこれらに比べ効果が若干弱いものの約５０％の抑制効果が認められた。
さらにＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現（図３）については、一次スクリーニングで抑制効果を検出したＴＮＦＵＰ＿００１３に対する３つのｓｉＲＮＡのうち２つ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−３，４）において陰性コントロールｓｉＲＮＡよりも４９０ｎｍ吸光度で約５０％減少の発現抑制効果を示した。またＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）、ＴＮＦＵＰ＿０１１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１３−４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）で５０％以上の抑制効果が認められた。そしてＴＮＦＵＰ＿０１４２については一次スクリーニングで抑制効果を検出した２つのｓｉＲＮＡのうち一方のｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）で５０％以上の抑制効果が認められた。
これらの結果から図１から３に示されるｓｉＲＮＡの対応遺伝子であるＴＮＦＵＰ＿００１３はＩＣＡＭ−１とＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＴＮＦＵＰ＿００６４はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１、ＴＮＦＵＰ＿００７２はＶＣＡＭ−１とＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＴＮＦＵＰ＿０１１３はＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＴＮＦＵＰ＿０１１４はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎそしてＴＮＦＵＰ＿０１４２はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現誘導に関わる可能性が高いと判断され、いわゆる炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドであることが明らかとなった。【０１５２】
ｂ）定量的ＰＣＲによる遺伝子変動の評価
実施例２ｄ）にて陽性であった２１のｓｉＲＮＡにより各接着分子の発現がｍＲＮＡレベルで変動しているかどうか、さらにそのｓｉＲＮＡがターゲットとしている遺伝子が実際にノックダウンされているかを以下の手順で定量的ＰＣＲにより評価した。上記ａ）にて８代継代培養した後に凍結保存したＨＵＶＥＣのストック１本分の細胞を１５ｍｌの内皮細胞増殖培地が入ったウシコラーゲンＩ型でコーティングされた７５ｃｍ２底面積の培養フラスコに加え６時間から１８時間ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件で培養した後、２５ｍｌの新鮮な培地と交換し、３日間の培養後コンフルエントになった細胞をサブカルチャーセットＡを用いて回収し、２００×ｇで５分間遠心後１×１０５細胞／ｍｌの細胞濃度になるように内皮細胞増殖培地で浮遊液を調製した。これをウシコラーゲンＩ型でコーティングされた６穴培養プレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに２ｍｌ（２×１０５細胞）ずつ分注し、ＣＯ２ ５％、３７℃の条件下で一晩インキュベートし９５−１００％コンフルエントな状態まで培養した。次にＴａｒｇｅｆｅｃｔ−ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔキットに含まれているＳｏｌｎＡ ８μｌ、ＳｏｌｎＢ ５μｌと４５００ｍｇ／ｌグルコース含ＤＭＥＭ ９８７μｌを混合した液を実施例２ｄ）で陽性であった２１のｓｉＲＮＡまたは陰性コントロール、陽性コントロールｓｉＲＮＡ（各１００ｎｇ／μｌ）２０μｌに加えた後、２５分間 ３７℃でインキュベートし、これをＨＵＶＥＣの培養上清２ｍｌと置換し直ちにＣＯ２濃度５％、３７℃の条件で３０分間インキュベートした後、新鮮な内皮細胞増殖培地２ｍｌを加えＣＯ２濃度５％、３７℃の条件で１４−１５時間インキュベートした。そして培養上清を新鮮な内皮細胞増殖培地１．９ｍｌと置換しＩＣＡＭ−１測定用には培地置換より１０時間後に５ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αを１００μｌ（最終濃度０．２５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＣＡＭ−１測定用には培地置換より１０時間後に２００ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αを１００μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ用には培地置換より１５．５時間後に２００ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αを１００μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）添加した。その後、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１測定の場合は１４時間、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ測定の場合は２．５時間ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下でインキュベートした後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて添付の使用説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。次に各サンプルにつき全ＲＮＡを０．５μｇ使用してオリゴｄＴプライマーを用いてスーパースクリプトファーストストランドシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりその使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、これをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し（３０μｌの溶出ｂｕｆｆｅｒでｃＤＮＡを溶出）、そのうち１反応につき１μｌのｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲプライマーを０．２μＭの濃度でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）の標準プロトコールに準じて反応液（各反応はすべて２系列ずつ）を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００（アプライ���バイオシステムズ社製）にて９５℃１０分間加熱後、９５℃１５秒間、６０℃１分間の反応を４０回繰り返し増幅曲線を作成した。尚、今回使用した２１のｓｉＲＮＡに対応する１８遺伝子のＰＣＲプライマーうち、実施例３ａ）−ｃ）の解析により見出された炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードする６遺伝子に対するＰＣＲプライマーはＴＮＦＵＰ＿００１３：配列番号５３−５４、ＴＮＦＵＰ＿００６４：配列番号５５−５６、ＴＮＦＵＰ＿００７２：配列番号５７−５８、ＴＮＦＵＰ＿０１１３：配列番号５９−６０、ＴＮＦＵＰ＿０１１４：配列番号６１−６２、ＴＮＦＵＰ＿０１４２：配列番号６３−６４である。接着分子に対するＰＣＲプライマーはＩＣＡＭ−１：配列番号６５−６６、ＶＣＡＭ−１：配列番号６７−６８、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ：配列番号６９−７０、そして内在性コントロール遺伝子に対するＰＣＲプライマーはβ―ａｃｔｉｎ：配列番号７１−７２、ｇｌｙｄｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）：配列番号７３−７４である（表３参照）。そして得られた増幅曲線からＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＳＤＳ ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて各ウェルのＣｔ値を求め、各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたサンプルについてＧＡＰＤＨとβ―ａｃｔｉｎのＣｔの平均値から各遺伝子におけるＣｔ値を差し引いたΔＣｔ値を求め、これと陰性コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合のΔＣｔ値と比較することにより各遺伝子の発現の変動を評価した。実施例２ｄ）で陽性であった２１のｓｉＲＮＡのデータのうち実施例３ａ）−ｃ）の結果から炎症への関連性が高いと判断された６遺伝子（炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドをコードする遺伝子）に対する９つのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の各接着分子および各ｓｉＲＮＡのターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を図４のａ−ｂ、図５のａ−ｂ、そして図６のａ−ｂに示す。図４ａ、図５ａ、そして図６ａに示す一部のｓｉＲＮＡにおいて接着分子ｍＲＮＡの発現変動の幅が小さいものが存在するものの、図４から６に示す殆どのｓｉＲＮＡにおいて陰性コントロールとΔＣｔ値の差が１以上すなわち５０％の発現減少が認められ、実施例２ｄ）、そして実施例３ａ）の結果がｍＲＮＡレベルでも再現された。
具体的にＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現（図４ａ）については、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対する３つのｓｉＲＮＡのうち２つ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−１，３）、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対する２つのｓｉＲＮＡのうち１つ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）において５０％以上の発現減少が認められた。
またＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現（図５ａ）については、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）、ＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対する２つのｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２，３）において５０％以上の発現減少が認められた。
さらにＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現（図６ａ）については、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対する３つのｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−１，３，４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１３−４）、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）において５０％以上の発現減少が認められた。また、ＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）及びＴＮＦＵＰ＿０１４２に対する２つのｓｉＲＮＡのうち１つ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）においては５０％近い発現減少が認められた。
また図４ｂ、図５ｂ、そして図６ｂに示されるように、これらの６遺伝子に対するｓｉＲＮＡはそのターゲット遺伝子のｍＲＮＡの発現を陰性コントロールとΔＣｔ値の差が１以上すなわち５０％以上ノックダウンしていることも確認された。
よってこれらの６遺伝子をそのｓｉＲＮＡでノックダウンすることによりＴＮＦ−αで誘導される接着分子の発現誘導がｍＲＮＡでも抑制されることが明らかとなり、これらの６遺伝子は血管内皮細胞の炎症反応に関連性が高い遺伝子（炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド）であることが再確認された。
【表３】
2006134960.tif 000004
【０１５３】
ｃ）白血球細胞−ＨＵＶＥＣ接着解析
実施例２ｄ）の一次スクリーニングにて陽性であった２１のｓｉＲＮＡにより実際にＴＮＦ−αにより誘発される白血球細胞とＨＵＶＥＣとの接着が抑えられるかどうかを検証した。具体的には実施例２ａ）の手順に従いウシコラーゲンＩ型がコーティングされたブラッククリアボトム９６穴マイクロプレート４枚（ＢＤバイオサイエンス社製）に培養・調製した。次に９６穴フォーマットの滅菌済みマイクロチューブへ分注した２１の各ｓｉＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）に１６．４μｌ（１．６４μｇ）にＴａｒｇｅｆｅｃｔ−ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれているＳｏｌｎＡ １６４μｌ、ＳｏｌｎＢ １０２．５μｌと４５００ｍｇ／ｌグルコース含Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）２０．２ｍｌの混合液を８２０μｌずつ加え転倒混和し、スピンダウンした後２５分間３７℃でインキュベートした。そしてＨＵＶＥＣを培養した９６穴マイクロプレートの培養上清を８連タイプのアスピレータにより抜きとり、直ちに８連マイクロピペットを用いて上記のｓｉＲＮＡの混合液を５１μｌずつ（各ウェルにつき１μｇのｓｉＲＮＡに相当する。また１つのｓｉＲＮＡにつき４ウェル×４プレート計１６ウェルに対し添加した）を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。その後直ちに新鮮な内皮細胞増殖培地を１００μｌずつ８連マイクロピペットで加え、１５時間ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下でインキュベートした。その後各ウェルの上清を１２６μｌ取り除き、７５μｌの新鮮な内皮細胞増殖培地を加え上清の全量を１００μｌとし、９時間同条件でインキュベーションを継続した。その後３０ｎｇ／μｌのＴＮＦ−α希釈液を５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）加え１８時間、ＣＯ２濃度５％、３７℃の条件下でインキュベートした。一方、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で継代培養したＴリンパ球系培養細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）、単球系培養細胞（ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）それぞれ７×１０７細胞をＶｙｂｒａｎｔ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて使用説明書に従い蛍光標識し、ＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地により５×１０６細胞／ｍｌの濃度の浮遊液を調製した。そして上記のＴＮＦ−α処理後のマイクロプレート各ウェルの上清を８連タイプのアスピレータにより抜きとり、直ちに１ウェルにつき１００μｌ（５×１０５細胞）の蛍光標識した各白血球細胞を各々のマイクロプレートに８連マイクロピペットを用いて添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に各ウェルにＦＢＳ不含のＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを加え直ぐに８連アスピレータ−と８連マルチマイクロピペットを用いて各ウェルにつき２００μｌのＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、最後に２００μｌのＰＢＳを加え、蛍光マイクロプレートリーダーにより蛍光測定（励起／蛍光：４８５ｎｍ／５３５ｎｍ）し、各ｓｉＲＮＡにおける４系列（４ウェル）のデータの平均値を求めた。尚、この蛍光強度はマイクロプレートに残っている（ＨＵＶＥＣに接着している）白血球細胞の数と比例する。そして、その蛍光強度が陰性コントロールｓ���ＲＮＡにおける蛍光強度の５０％以下（５０％以下の接着阻害）の場合を陽性と判定した。図７から１０は、解析した２１のｓｉＲＮＡのうち実施例３ａ）−ｃ）の結果から炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチドと判断された６遺伝子に対応する９つのｓｉＲＮＡまた陰性および陽性コントロールｓｉＲＮＡにおけるデータを示す。図７から１０で示されるように、今回解析したｓｉＲＮＡのうちＴＮＦＵＰ＿００６４−４がＭＯＬＴ−４とＪｕｒｋａｔ、ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３がＵ９３７とＭＯＬＴ−４とＪｕｒｋａｔ、ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２がＭＯＬＴ−４とＪｕｒｋａｔ、ＴＮＦＵＰ＿０１４２−３がＭＯＬＴ−４の接着を５０％以上阻害することが示され、ＴＮＦＵＰ＿００６４、ＴＮＦＵＰ＿０１１４、そしてＴＮＦＵＰ＿０１４２の３遺伝子が少なくとも今回調べた白血球細胞との接着に関わっていることが明らかとなり、炎症領域の血管内皮細胞で特に白血球の接着・浸潤の誘導に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、今回検討した細胞ではＴＮＦＵＰ＿００１３、ＴＮＦＵＰ＿００７２、そしてＴＮＦＵＰ＿０１１３については、そのｓｉＲＮＡで接着抑制効果は認められなかったが、上記ａ）ｂ）にて接着分子の発現を抑制する事が証明されたことや今回の解析にてｓｉＲＮＡと白血球細胞種の組み合わせにより接着抑制の様式が異なっていたことから、今回用いなかった他の白血球細胞もしくは末梢血の何れかの白血球の接着に関連している可能性は十分考えられる。【０１５４】
ｄ）炎症性サイトカイン誘導ポリヌクレオチド候補の検証の総括
今回の検証実験を総括すると少なくともＨＵＶＥＣにおいて、ＴＮＦＵＰ＿００１３はＩＣＡＭ−１とＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現に関連する遺伝子、ＴＮＦＵＰ＿００６４はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１の発現に関連しかつＴリンパ球系の細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）の接着に関連する遺伝子、ＴＮＦＵＰ＿００７２はＶＣＡＭ−１とＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現に関連する遺伝子、ＴＮＦＵＰ＿０１１３はＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現に関連する遺伝子、ＴＮＦＵＰ＿０１１４はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現に関連しかつ単球系の細胞（Ｕ９３７）及びＴリンパ球系の細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）の接着に関連する遺伝子、ＴＮＦＵＰ＿０１４２はＩＣＡＭ−１とＶＣＡＭ−１及びＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎの発現に関連しかつ及びＴリンパ球系の細胞（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）の接着に関連する遺伝子であることが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０１５５】
配列番号：１は、ＴＮＦＵＰ＿００１３の遺伝子配列である。
配列番号：２は、ＴＮＦＵＰ＿００１３の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：３はＴＮＦＵＰ＿００６４の遺伝子配列である。
配列番号：４は、ＴＮＦＵＰ＿００６４の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ＴＮＦＵＰ＿００７２の遺伝子配列である。
配列番号：６は、ＴＮＦＵＰ＿００７２の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３の遺伝子配列である。
配列番号：８は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４の遺伝子配列である。
配列番号：１０は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２の遺伝子配列である。
配列番号：１２は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、ＴＮＦＵＰ＿００７２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿００７２Ｂの遺伝子配列である。
配列番号：１４は、ＴＮＦＵＰ＿００７２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿００７２Ｂの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１５は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｂの遺伝子配列である。
配列番号：１６は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｂの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１７は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｃの遺伝子配列である。
配列番号：１８は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｃの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１９は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｄの遺伝子配列である。
配列番号：２０は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｄの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：２１は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｅの遺伝子配列である。
配列番号：２２は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｅの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：２３は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｆの遺伝子配列である。
配列番号：２４は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２のスプライシングバリアントであるＴＮＦＵＰ＿０１４２Ｆの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：２５は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−１）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：２６は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−１）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：２７は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−３）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：２８は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−３）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：２９は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−４）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３０は、ＴＮＦＵＰ＿００１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００１３−４）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３１は、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３２は、ＴＮＦＵＰ＿００６４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００６４−４）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３３は、ＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３４は、ＴＮＦＵＰ＿００７２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿００７２−２）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３５は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１３−４）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３６は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１３−４）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３７は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３８は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１１４−３）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３９は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４０は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−２）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４１は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−３）のセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４２は、ＴＮＦＵＰ＿００４２に対するｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＵＰ＿０１４２−３）のアンチセンス鎖合成用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４３は、陰性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｎ．Ｃｔｒｌ−ｓｉ）のセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４４は、陰性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｎ．Ｃｔｒｌ−ｓｉ）のアンチセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４５は、ＩＣＡＭ−１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＩＣＡＭ１−ｓｉ）のセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４６は、ＩＣＡＭ−１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＩＣＡＭ１−ｓｉ）のアンチセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４７は、ＶＣＡＭ−１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＶＣＡＭ１−ｓｉ）のセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４８は、ＶＣＡＭ−１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＶＣＡＭ１−ｓｉ）のアンチセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：４９は、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎに対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｓｉ）のセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：５０は、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎに対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｓｉ）のアンチセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：５１は、ＴＮＦＲ１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＲ１−ｓｉ）のセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：５２は、ＴＮＦＲ１に対する陽性コントロールｓｉＲＮＡ（ＴＮＦＲ１−ｓｉ）のアンチセンス鎖用オリゴＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：５３は、ＴＮＦＵＰ＿００１３定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５４は、ＴＮＦＵＰ＿００１３定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５５は、ＴＮＦＵＰ＿００６４定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５６は、ＴＮＦＵＰ＿００６４定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５７は、ＴＮＦＵＰ＿００７２定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５８は、ＴＮＦＵＰ＿００７２定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：５９は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６０は、ＴＮＦＵＰ＿０１１３定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６１は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６２は、ＴＮＦＵＰ＿０１１４定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６３は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６４は、ＴＮＦＵＰ＿０１４２定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６５は、ＩＣＡＭ−１定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６６は、ＩＣＡＭ−１定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６７は、ＶＣＡＭ−１定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６８は、ＶＣＡＭ−１定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：６９は、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：７０は、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：７１は、β―ａｃｔｉｎ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：７２は、β―ａｃｔｉｎ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：７３は、ＧＡＰＤＨ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
配列番号：７４は、ＧＡＰＤＨ定量用のＰＣＲプライマーの塩基配列である。
【図１】
2006134960.tif 000005
【図２】
2006134960.tif 000006
【図３】
2006134960.tif 000007
【図４】
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【図５】
2006134960.tif 000009
【図６】
2006134960.tif 000010
【図７】
2006134960.tif 000011
【図８】
2006134960.tif 000012
【図９】
2006134960.tif 000013
【図１０】
2006134960.tif 000014
【配列表】
2006134960000001.app
【国際調査報告】
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2006134960.tif 000019
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