(57)【要約】  プライマー伸長反応を利用したＳＮＰタイピングにおけるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサを提供する。  絶縁性の基板１と、その上に形成された測定極２と対極３からなる電極系と、前記基板１上に設けられたピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、前記酵素を含む反応試薬層３６と前記緩衝液成分を含む反応試薬層３５が分離されているピロリン酸センサであって、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層３７が、緩衝液成分を含む反応試薬層３５から分離されていることを特徴とする。
2007083693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系とを備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が前記緩衝液成分から分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、
ピロリン酸センサ。
【請求項２】
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記ピロホスファターゼから分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼから分離されている、請求項１記載のピロリン酸センサ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項２に記載のピロリン酸センサ。
【請求項４】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項５】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項６】
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されている、請求項５記載のピロリン酸センサ。
【請求項７】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が前記緩衝液成分から分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、
ＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項８】
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記ピロホスファターゼから分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼから分離されている、請求項７記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項９】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項８に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項１０】
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、請求項７に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１０記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリン酸は、細胞内における酵素反応に深く関与していることが知られている。例えば、蛋白質の合成過程において、アミノ酸がアミノアシルアデニル酸を経由してアミノアシルｔＲＮＡを形成する反応においてピロリン酸が生成される。また、例えば、植物などに見られるデンプン合成の過程では、グルコース−１−リン酸とＡＴＰとの反応によってＡＤＰ−グルコースが生成される際に、ピロリン酸が生成される。これら以外にも、種々の酵素反応においてピロリン酸が関与していることが知られている。従って、ピロリン酸を定量的に検出する技術は、細胞状態、あるいは上記の酵素反応等を解析する上で重要な技術である。【０００３】
従来のピロリン酸測定方法として、Ｇｒｉｎｄｌｅｙらの化学的方法（非特許文献１参照が知られている。しかし、この方法では濃硫酸を用いるので、好ましくない。【０００４】
特許文献１では、濃硫酸などの薬品を用いずに、酵素を利用した三種類のピロリン酸測定方法が開示されている。それらに関して以下に説明する。【０００５】
第１の方法は、ピロリン酸をホスホエノ−ルピルビン酸およびアデノシン一リン酸の存在下で、ピルベートオルソホスフェートジキナーゼを作用させる方法である。この反応によってピルビン酸が生成されるので、ピルビン酸の量を測定することによってピロリン酸の量を算出することができる。なお、ピルビン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、ラクテートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してピルビン酸をＮＡＤＨで還元する際に、ＮＡＤＨの減少を比色定量する方法である。もう１つは、生成したピルビン酸にピルベートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導くことによって比色定量する方法である。【０００６】
第２の方法は、ピロリン酸をシチジン二リングリセロールの存在下でグリセロール−３−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼに作用させる方法である。この反応によってグリセロール三リン酸が生成される。従って、グリセロール三リン酸の生成量を測定することでピロリン酸の量を算出することができる。グリセロール三リン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してグリセロール三リン酸をＮＡＤ（Ｐ）+で酸化する際に、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を比色定量する方法である。もう１つは、生成したグリセロール三リン酸にグリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導きこれを比色定量する方法である。【０００７】
第３の方法は、ピロリン酸をシチジン二リン酸リビトールの存在下でリビトール−５−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼを作用させる方法である。この反応によってＤ−リビトール−５−リン酸が生成されるため、その生成量を測定することでピロリン酸量を測定することができる。Ｄ−リビトール−５−リン酸を測定する方法は、ＮＡＤ+（ま
たはＮＡＤＰ+）の存在下でリビトール−５−ホスフェートデヒドロゲナーゼを作用させ
てＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の増加を比色定量する方法が提案されている。【０００８】
その他にも特許文献２には、ピロホスファターゼによりピロリン酸をリン酸に加水分解した後、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによりリン酸をイノシンまたはキサントシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化してキサンチンとし、さらに酸化して尿酸を生成させ、このキサンチンオキシダーゼによる酸化過程で生じる過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて発色剤を発色させる方法が示されている。【０００９】
しかしながら、これらのピロリン酸の測定方法ではサンプルの吸光度もしくは発色を測定するため、光学系を含む比較的大きな装置を用いる必要がある。【００１０】
一方、核酸の伸長反応もピロリン酸が関与する重要な生体反応の一種である。【００１１】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。【００１２】
これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなく、様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。【００１３】
この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されているのがＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。ＳＮＰは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。ＳＮＰはヒトゲノムＤＮＡ内に２〜３百万あると言われており、遺伝子多型のマーカーとして利用しやすく、臨床への応用が期待されている。現在では、ＳＮＰ関連技術として、ゲノム中のＳＮＰの位置同定およびＳＮＰと疾患との関連性等の研究とともに、ＳＮＰ部位の塩基を判別するＳＮＰタイピング技術の開発が行われている。【００１４】
ＳＮＰタイピングの技術は、ハイブリダイズを利用したもの、制限酵素を利用したもの、リガーゼ等の酵素を利用したもの等様々な種類のものがある。それらの技術のうち、最も簡便な技術としてプライマー伸長反応を利用するものがある。この技術では、プライマー伸長反応が起こるか否かを判定することによって、ＳＮＰタイピングを行なう。【００１５】
プライマー伸長反応を利用したＳＮＰタイピング技術の検出には、実際のＤＮＡの増幅産物を蛍光色素を用いて検出する方法や、固定化プローブを用いる方法の他に、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成の副産物であるピロリン酸を検出する方法も考案されている。この方法では、伸長反応の進行の差を検出するために、プライマー伸長反応の進行に伴って生成されるピロリン酸をＡＴＰに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用してピロリン酸の量を測定する方法を用いている（非特許文献２を参照）。【００１６】
さらに特許文献３には、ピロリン酸を測定することによって、試料液中の目的核酸を高感度で測定する方法や、ＳＮＰを簡便にタイピングする方法が開示されている。特許文献３によると、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供して、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応によって、ＤＮＡプローブを伸長させ、ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸をピロホスファターゼによって無機リン酸へと変換し、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよび電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む測定系を用いて、最終的には電極で電流値を測定することによって、ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法が示されている。この方法によれば、ピロリン酸を含む試料を測定系に加えてから、１００秒以内にＳＮＰ配列が判別可能であることが述べられている。【００１７】
この方法では、ピロリン酸の測定およびＳＮＰのタイピングは、電子メディエータの酸化還元反応を電気化学的に測定することによって可能であり、光学系を必要としない簡便かつ高感度な方法として開示されている。【００１８】
このようなピロリン酸の測定およびＳＮＰのタイピングでは、センサ基板上に必要な試薬を乾燥担持しておくことによって、センサチップを小型化することができ、さらには非常に簡便な操作で測定が可能となる。【００１９】
特許文献４には、試薬乾燥担持型のバイオセンサにおいて、緩衝剤成分と酵素を同時に担持する場合、それぞれを分離して配置することによって、酵素活性の低下を防ぐことが可能であることが開示されている。
【特許文献１】特開昭６１−１２３００号公報
【特許文献２】特開２００２−３６９６９８号公報
【特許文献３】国際公開第０３／０７８６５５号パンフレット
【特許文献４】特開平７−８３８７２号公報
【非特許文献１】Ｇ．Ｂ．Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃ.Ａ．Ｎｉｃｈｅｌ, Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ,.vol３３.ｐ１１４（１９７０）
【非特許文献２】Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかしながら、上述したピロリン酸の測定およびそれを用いたＳＮＰタイピングでは、さらに多くの試薬を用いるため、緩衝液成分と酵素を分離して配置し乾燥担持するだけでは、安定した特性がでないという課題を有していた。【００２１】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で検出するセンサおよびそれを用いたＳＮＰタイピングセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、本発明は絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記基板上に設けられたピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されているピロリン酸センサであって、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とするピロリン酸センサを提供する。【００２３】
本発明はさらに、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、さらに酵素を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。  本発明はさらに、前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層が、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。【００２４】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の分離された部分にそれぞれ形成されていることを特徴とする。【００２５】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の同一の部分に積層されて形成されていることを特徴とする。【００２６】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されていることを特徴とする。【００２７】
絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、前記基板上に設置された反応キャビティと、前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、前記測定キャビティ内にピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、かつ前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されているＳＮＰタイピングセンサセンサであって、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とするＳＮＰタイピングセンサを提供する。【００２８】
本発明はまた、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、さらに酵素を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。【００２９】
本発明はまた、前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層が、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。【００３０】
本発明はさらに、前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする。【００３１】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のピロリン酸センサによれば、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図
【図２】本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図
【図３】本発明の一実施の形態に係るハウジング基板の構造を示す斜視図
【図４】本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す斜視図
【図５】本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す断面図
【図６】本発明の一実施の形態に係るＳＮＰタイピングセンサの構造を示す斜視図
【図７】本発明の一実施の形態の結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００３４】
１  絶縁基板
２  測定電極
３  対極
４  参照電極
５  導電性パターン
６  端子部
７  電極基板
２１  絶縁膜
３１  ハウジング基板
３２  キャビティ
３３  注入孔
３４  空気孔
３５  第１の反応試薬層
３６  第２の反応試薬層
３７  第３の反応試薬層
３８  第４の反応試薬層
４１  測定キャビティ
４２  ＰＣＲキャビティ
４３  流路
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。【００３６】
（実施の形態１）
図１は、本発明の一実施の形態を示す電極基板の斜視図である。絶縁基板１上には、測定極２、対極３、参照極４が形成されている。それぞれの電極は、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどから選択することが可能であるが、表面状態の安定性などの観点から金を選択することが望ましい。【００３７】
参照極４は、溶液中における電位の安定性から、不分極性を示す照合電極を用いることがさらに望ましく、取り扱いの簡便性等から、銀・塩化銀電極を選択することが好ましい。銀・塩化銀電極の形成方法は、金や白金などで形成された電極パターンの参照極４部位上に、銀メッキを施し、塩化ナトリウム水溶液中で電圧を印加して表面を塩化銀化する方法、銀・塩化銀ペースト材料で電極本体を構成する方法、銀ペーストの表面を次亜塩素酸ナトリウム等の水溶液と接触させる方法、等を挙げることができる。【００３８】
各電極は、導電性パターン５によって、外部回路との接続部分である端子部６と電気的に結合されている。導電性パターン５および端子部６もまた、電極部分と同様の材料で形成されることが、製造工程から見ても望ましい。絶縁基板１上への電極および導電性パターンの形成方法としては、例えば絶縁基板１上への導電性材料の印刷、導電性材料のスパッタリングもしくは蒸着後のフォトリソグラフィを用いたエッチングもしくはレーザーによる除去加工、マスクを用いた電極パターンの直接スパッタリング、等が考えられる。【００３９】
絶縁基板１としては、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、樹脂等を選択することができるが、ディスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工の容易さやコスト面から考えて、樹脂材料を選択することが望ましい。【００４０】
樹脂材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン−２，６−ナフタレート（ＰＥＮ）などを選択することができる。中でも、スパッタリングによる金電極形成の場合は、金との密着性の観点等から、ＰＥＴを選択することが好ましい。また絶縁基板１の厚みとしては、取り扱いの容易さ等から、好ましくは０．１ｍｍ〜２．０ｍｍ、さらに好ましくは０．１８８ｍｍ〜１．０ｍｍがよい。【００４１】
電極基板７は、このままでも使用可能であるが、図２に示すように、電極部分の面積の規定および導電性パターン５の絶縁・保護の観点から、絶縁膜２１でコーティングされていてもよい。絶縁膜２１としては、例えばポリイミド等の樹脂材料をスピンコートで成膜した後、フォトリソグラフィを用いて電極部分のみを露出させる方法や、あらかじめ電極部分に打ち抜かれた粘着シートを貼付する方法、絶縁性ペースト材料を印刷する方法等を用いることが可能である。【００４２】
電極基板７は、絶縁膜２１の有無に関わらず、試薬の担持を行うことにより、このままでもピロリン酸センサとして使用可能であるが、測定溶液の乾燥やコンタミネーションを防ぐことを目的として、次に示すようにハウジングを行っても良い。【００４３】
図３は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの斜視図であり、図１に示す電極基板と図４に示すハウジング基板とからなる。本発明によるバイオセンサに用いられるハウジング基板３１は、試料液と反応しない材料を選択する必要があり、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、樹脂等を選択することができるが、ディスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工のしやすさやコスト面から考えて、絶縁基板１と同様に樹脂材料を選択することが望ましい。【００４４】
樹脂材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン−２，６−ナフタレート（ＰＥＮ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリジメチルシルオキサン（ＰＤＭＳ）などを選択することができる。ＰＭＭＡおよびＰＣは、透明性がよく内部試料の状態を確認することが可能であり、微細な切削加工等が容易なため、特に好ましい。また、耐熱性が要求される場合は、特にＰＣが好ましい。【００４５】
ハウジング基板３１上に形成されるキャビティ３３の形成方法は、ハウジング基板３１が樹脂材料の場合、切削加工の他、金型による成型、熱転写によるエンボス加工などを用いることができる。また、貫通孔を持つシートを張り合わせることでもキャビティ３３を形成することが可能である。【００４６】
こうして形成したキャビティ３３を含むハウジング基板３１は、電極基板７と接着されるが、ハウジング基板３１と電極基板７は、完全に接着もしくは密着し、キャビティ３３内部の試料を封止することが好ましい。接着には、例えば、アクリル系やエポキシ系、シリコーンなどの接着剤、両面テープなどの粘着シート等を用いることができる。また、ポリカーボネートのように有機系溶剤に対する耐性が低い材料を用いた場合、クロロホルム等の有機系溶剤をハウジング基板３１と電極基板７の界面に流し込み、加圧することによって接着することができる。また、ＰＳやＰＭＭＡ等の熱可塑性樹脂を用いた場合には、熱融着による方法も用いることが可能である。【００４７】
ハウジング基板３１にはキャビティ３２内部に試料を注入するための試料注入孔３３が設けられている。試料注入孔３３は少なくとも１つあれば良いが、空気の抜ける穴として空気孔３４を設けておくと、試料の注入時に使用した以外の空気孔３４がキャビティ３２内部の空気の逃げ道として機能し、試料を速やかに注入することができるので好ましい。【００４８】
注入孔３３および空気孔３４は、キャビティ３２に接続されていれば、位置は特に限定されない。キャビティ３２内部は、既知の親水性処理が施されていると、試料がより速やかに導入され得る。注入孔３３および空気孔３４は、試料を注入した後は、粘着テープ等の方法で封止してもよいが、短時間の測定であれば開口状態でも使用され得る。【００４９】
キャビティ３２の内部には、緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩を含む第１の反応試薬層３５、ピロホスファターゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを含む第２の反応試薬層３６、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む第３の反応試薬層３７、および酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを含む第４の反応試薬層３８が担持される。【００５０】
後述する実施例からも理解されるように、ピロリン酸濃度と電流値との比例関係を発現させると共に、当該比例関係の傾きをより大きくするという点からは、上記のように４つの反応試薬層３５〜３８に分割することが最も好ましい（実施例のサンプルＤを参照）。【００５１】
上記傾きは小さくなるが、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（第４の反応試薬層３８）と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩（第１の反応試薬層３５）とを同一の反応試薬層に含ませても良い（実施例のサンプルＣを参照）。【００５２】
少なくとも、本発明においては、ピロホスファターゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼと緩衝液成分とが分離されているだけでなく、グリセルアルデヒド−３−リン酸と緩衝液成分とが分離されていればよい。【００５３】
従って、実施例のサンプルＢのように、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（第４の反応試薬層３８）と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩（第１の反応試薬層３５）とを同一の反応試薬層に含ませるだけでなく、グリセルアルデヒド−３−リン酸（第３の反応試薬層３７）と、ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼ（第２の反応試薬層３６）とを同一の反応試薬層に含ませても良い。ただし、上記比例関係の明瞭性や上記傾きはより小さくなる傾向がある。【００５４】
電子メディエータとしては、水溶性であって酸化体で安定しているものが望ましく、例えばフェリシアン化カリウムを用いることができる。【００５５】
マグネシウム塩としては、マグネシウムイオンを含み、水溶性であってｐＨが中性〜弱アルカリ性のものであれば良く、例えば塩化マグネシウムを用いることができる。【００５６】
酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に代えて、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）を用いても良い。また、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ+）とともに、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を用いてもよい。本明細書においては、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸、これらの組み合わせをそれぞれヌクレオチド類ともいう。【００５７】
第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８が担持される位置は、キャビティ３２内部の任意の場所でよいが、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８は、図３で示すように、電極基板７上の分離された位置に担持される。【００５８】
各反応試薬層３５〜３８の担時は、所定の位置に一定量の各試薬を含む試薬溶液をそれぞれ滴下し、常温真空乾燥、温風乾燥、凍結乾燥などによって、溶媒である水分を蒸発させることによって行うことができる。【００５９】
（実施の形態２）
図５は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの断面図である。図５に示したように、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８は、電極基板７上に積層されて担持される。このとき、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８が混合されないようにするために、公知の技術を用いることができる。例えば、第１の反応試薬層を形成する際に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のような高分子材料との混合層を形成することによって、第２の反応試薬層３６は水溶性の薄膜状とすることができる。次にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような親水性高分子膜を第２の反応試薬層３６の上に形成する。次に、第４の反応試薬層３８を形成する際には、試薬をＰＶＰが難溶性を示すトルエンのような溶媒に溶解させて滴下することにより、第１の反応試薬層の成分と交じり合うことなく、第４の反応試薬層３８が形成される。第３の反応試薬層３７と第４の反応試薬層３８においても、同様のことを繰り返すことにより各反応試薬層の成分が交じり合うことなく形成できる。ＰＶＰ膜は水溶性のため、試料溶液の供給により、各反応試薬層３５〜３８は速やかに混合される。【００６０】
なお、図３および図５において、各反応試薬層３５〜３８はそれぞれ電極基板７上に担持したが、キャビティ３２内部であればどのような位置に担持されてもよく、ハウジング基板３１のキャビティ３２側に担持されてもよい。【００６１】
（実施の形態３）
図６は、本発明の一実施の形態を示すＳＮＰタイピングセンサの斜視図である。図３と同様、電極基板７と、ハウジング基板３１とから構成されているが、ハウジング基板３１には、測定キャビティ４１の他に、ＰＣＲキャビティ４２、および測定キャビティ４１とＰＣＲキャビティ４２とを接続する流路４３が設けられている。注入孔３３から、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡ試料液と共に、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系を注入し、ヒーター等を用いてＰＣＲキャビティ４２で温度サイクルを実行することによってＰＣＲ反応を行うと、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡのＳＮＰ部位と、ＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブが相補的であった場合、ＤＮＡプローブを伸長させるとともにピロリン酸を生成させることができる。一方、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡのＳＮＰ部位と、ＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブが非相補的な場合、ＤＮＡプローブの伸長は行われず、ピロリン酸は生成しない。その後、ＰＣＲ反応の終了した試料液を流路４３を介して測定キャビティ４１に移動させると、ＳＮＰタイプに応じたピロリン酸の定量を行うことができ、測定対象のＤＮＡのＳＮＰタイピングが可能となる。また、反応キャビティ４２中に、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系を担持しておけば、注入孔３４からＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡ試料液のみを注入することによって、測定対象のＤＮＡのＳＮＰタイピングが可能となる。【００６２】
なお、反応キャビティ４２から流路４３を介して測定キャビティ４１へと試料液を移動させる手段としては、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、ペリスタポンプ等の外部ポンプ、バイオセンサ上に一体型で組み込むマイクロポンプ、バイオセンサ自体を回転させることによって得られる遠心力等を用いることができる。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
以下、本発明のバイオセンサについてさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【００６４】
以下、一実施の形態に係る電極基板を用いて、試料溶液中のピロリン酸の測定を行った実施例について説明する。【００６５】
まず、絶縁基板１として厚さ１８８μｍのポリエチレンテレフタレートのシートに、スパッタリングによって７００オングストロームの金薄膜を形成した。次に、エッチングによって図１に示すごとき測定極２、対極３、参照極４、導電性パターン５、端子６を同時に形成し、所定の大きさに切り出して、電極基板７を作製した。測定極２の電極面積は、２．０ｍｍ2であった。【００６６】
また、上記に従って作製した電極基板７の参照極４表面に、塩化銀ペースト（ＤＢ２２７５  日本アチソン株式会社製）を塗布し、８０℃×３０分の条件で乾燥し、参照極４表面に銀塩化銀電極を形成した。【００６７】
次に、測定用試薬の乾燥担持を行った。各試薬は、電極基板７上に２〜４箇所のスポットに分けて滴下した。各スポットに滴下した試薬とスポット位置との関係を表１に示す。【００６８】
【表１】
2007083693.tif 000003
【００６９】
このように、試薬スポットを形成した電極基板７を真空チャンバー内に静置して、室温で３０分間真空乾燥を行った。このようにしてピロリン酸センサＡ〜Ｄを作製した。【００７０】
ここで試料溶液として、０μＭ、５０μＭおよび１００μＭ  ピロリン酸水溶液をそれぞれの電極基板上に２０μｌ滴下し、ピペッティングを行った後、３０℃５分間の条件でインキュベートを行い、参照電極４に対して６００ｍＶの電位を測定電極２に印加し、そのとき測定電極２に流れた電流値を測定した。【００７１】
各ピロリン酸濃度における電位印加６０秒後の電流値をグラフにしたものを図７に示す。【００７２】
センサとして利用するためには、それぞれのグラフの傾きが大きく、直線性が良いほうが好ましいことは言うまでもない。【００７３】
酵素と、その他の試薬を分離しただけのピロリン酸センサＡ（２スポット）では、バックグランドが高く、定量性が得られなかった。【００７４】
ＧＡＰを酵素と同じスポットに滴下したピロリン酸センサＢ（２スポット）では、ピロリン酸の濃度に応じた電流値が観察された。【００７５】
ＧＡＰを単独スポットとしたピロリン酸センサＣ（３スポット）では、グラフの傾きが大きくなった。【００７６】
さらにＮＡＤ+を単独スポットとしたピロリン酸センサＤ（４スポット）では、いっそ
う傾きが大きくなり、直線性も増した。【００７７】
（実施例２）
以下、一実施の形態に係るＳＮＰタイピングセンサを用いて、試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行った実施例について説明する。【００７８】
まず、実施例１と同様に、ピロリン酸センサＧを作製した。【００７９】
ただし、ハウジング基板３１として、図６に示すごとく、測定キャビティ４１の他に、ＰＣＲキャビティ４２、および測定キャビティ４１とＰＣＲキャビティ４２とを接続する流路４２が設けられているものを使用した。反応試薬層の配置は、実施例１のサンプルＣ（３スポットタイプ）と同一である。【００８０】
ＳＮＰタイピングのモデルとして、テンプレートとしてＣｏｎｔｒｏｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（寶酒造製）を用い、完全マッチプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１（５'−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３'：配列番号１）およびＰｒｉｍｅｒ３（５'−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３'：配列番号２）、一塩基ミスマッチプライマーとして、改変Ｐｒｉｍｅｒ１'（５'−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＡ−３'：配列番号３）およびＰｒｉｍｅｒ３を用いて測定を行った（５００ｂｐ増幅用）。【００８１】
注入孔３３から、蒸留水  １２．４μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑTMＢｕｆｆｅｒ  ２．０μｌ、２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μｌ、２５μｇ／μｌ  ＢＳＡ  ０．８μｌ、２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｚ−ＴａｑTM  ０．２μｌ、および２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各１．０μｌ、１μｇ／ｍｌ  λＤＮＡ  １．０μｌおよびを加えた（総量２０μｌ）センサをＳＮＰタイピングセンサＸ、Ｐｒｉｍｅｒ１の代わりにＰｒｉｍｅｒ１'を加えたセンサをＳＮＰタイピング
センサＹとして、ＰＣＲ反応を、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒の条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液を、ＰＣＲキャビティ４２から流路４２を通して測定キャビティ４１へと送液し、実施例２と同様に測定した結果を表２に示す。【００８２】
【表２】
2007083693.tif 000004
【００８３】
表２から明らかなように、プライマーとして鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と完全に相補的なＰｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３を用いたＳＮＰタイピングセンサＸでは、ＰＣＲキャビティ４２において行われたＰＣＲ反応の進行によって生成されたピロリン酸が測定キャビティ４１における電気化学測定によって検出された。一方、ＳＮＰタイピングセンサＹにおいては、Ｐｒｉｍｅｒ１'の３'末端側が、鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と相補的でないため、テンプレートλＤＮＡを鋳型としたＰｒｉｍｅｒ３による伸長反応が行われただけで、ＰＣＲによる増幅反応は進行せず、よって電流はほとんど観察されなかった。よって、ＳＮＰタイピングセンサＸおよびＹを用いることによって、ＳＮＰ部位のモデルである一塩基ミスマッチのタイピングを行うことができた。【００８４】
［配列表のフリーテキスト］
配列番号１の<223>：プライマー
配列番号２の<223>：プライマー
配列番号３の<223>：プライマー
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、プライマー伸長反応を利用した方法によるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサ、およびＳＮＰタイピングセンサを提供することができる。
【図１】
2007083693.tif 000005
【図２】
2007083693.tif 000006
【図３】
2007083693.tif 000007
【図４】
2007083693.tif 000008
【図５】
2007083693.tif 000009
【図６】
2007083693.tif 000010
【図７】
2007083693.tif 000011
【配列表】
2007083693000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月29日(2008.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系とを備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからも分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、
ピロリン酸センサ。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項４】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項５】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項６】
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されている、請求項５記載のピロリン酸センサ。
【請求項７】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからもから分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、
ＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項７に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項１０】
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、請求項７に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１０記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月12日(2008.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系とを          備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからも分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、ピロリン酸センサ。
【請求項２】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項３】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項４】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項５】
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて
形成されている、請求項４記載のピロリン酸センサ。
【請求項６】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからもから分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、ＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項７】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項６に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項８】
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、請求項６に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項９】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項８記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリン酸は、細胞内における酵素反応に深く関与していることが知られている。例えば、蛋白質の合成過程において、アミノ酸がアミノアシルアデニル酸を経由してアミノアシルｔＲＮＡを形成する反応においてピロリン酸が生成される。また、例えば、植物などに見られるデンプン合成の過程では、グルコース−１−リン酸とＡＴＰとの反応によってＡＤＰ−グルコースが生成される際に、ピロリン酸が生成される。これら以外にも、種々の酵素反応においてピロリン酸が関与していることが知られている。従って、ピロリン酸を定量的に検出する技術は、細胞状態、あるいは上記の酵素反応等を解析する上で重要な技術である。
【０００３】
従来のピロリン酸測定方法として、Ｇｒｉｎｄｌｅｙらの化学的方法（非特許文献１参照が知られている。しかし、この方法では濃硫酸を用いるので、好ましくない。
【０００４】
特許文献１では、濃硫酸などの薬品を用いずに、酵素を利用した三種類のピロリン酸測定方法が開示されている。それらに関して以下に説明する。
【０００５】
第１の方法は、ピロリン酸をホスホエノ−ルピルビン酸およびアデノシン一リン酸の存在下で、ピルベートオルソホスフェートジキナーゼを作用させる方法である。この反応によってピルビン酸が生成されるので、ピルビン酸の量を測定することによってピロリン酸の量を算出することができる。なお、ピルビン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、ラクテートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してピルビン酸をＮＡＤＨで還元する際に、ＮＡＤＨの減少を比色定量する方法である。もう１つは、生成したピルビン酸にピルベートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導くことによって比色定量する方法である。
【０００６】
第２の方法は、ピロリン酸をシチジン二リングリセロールの存在下でグリセロール−３−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼに作用させる方法である。この反応によってグリセロール三リン酸が生成される。従って、グリセロール三リン酸の生成量を測定することでピロリン酸の量を算出することができる。グリセロール三リン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してグリセロール三リン酸をＮＡＤ（Ｐ）+で酸化する際に、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を比色定量する方法である。もう１つは、生成したグリセロール三リン酸にグリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導きこれを比色定量する方法である。
【０００７】
第３の方法は、ピロリン酸をシチジン二リン酸リビトールの存在下でリビトール−５−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼを作用させる方法である。この反応によってＤ−リビトール−５−リン酸が生成されるため、その生成量を測定することでピロリン酸量を測定することができる。Ｄ−リビトール−５−リン酸を測定する方法は、ＮＡＤ+（ま
たはＮＡＤＰ+）の存在下でリビトール−５−ホスフェートデヒドロゲナーゼを作用させ
てＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の増加を比色定量する方法が提案されている。
【０００８】
その他にも特許文献２には、ピロホスファターゼによりピロリン酸をリン酸に加水分解した後、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによりリン酸をイノシンまたはキサントシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより酸化してキサンチンとし、さらに酸化して尿酸を生成させ、このキサンチンオキシダーゼによる酸化過程で生じる過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて発色剤を発色させる方法が示されている。
【０００９】
しかしながら、これらのピロリン酸の測定方法ではサンプルの吸光度もしくは発色を測定するため、光学系を含む比較的大きな装置を用いる必要がある。
【００１０】
一方、核酸の伸長反応もピロリン酸が関与する重要な生体反応の一種である。
【００１１】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
【００１２】
これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなく、様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。
【００１３】
この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されているのがＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。ＳＮＰは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。ＳＮＰはヒトゲノムＤＮＡ内に２〜３百万あると言われており、遺伝子多型のマーカーとして利用しやすく、臨床への応用が期待されている。現在では、ＳＮＰ関連技術として、ゲノム中のＳＮＰの位置同定およびＳＮＰと疾患との関連性等の研究とともに、ＳＮＰ部位の塩基を判別するＳＮＰタイピング技術の開発が行われている。
【００１４】
ＳＮＰタイピングの技術は、ハイブリダイズを利用したもの、制限酵素を利用したもの、リガーゼ等の酵素を利用したもの等様々な種類のものがある。それらの技術のうち、最も簡便な技術としてプライマー伸長反応を利用するものがある。この技術では、プライマー伸長反応が起こるか否かを判定することによって、ＳＮＰタイピングを行なう。
【００１５】
プライマー伸長反応を利用したＳＮＰタイピング技術の検出には、実際のＤＮＡの増幅産物を蛍光色素を用いて検出する方法や、固定化プローブを用いる方法の他に、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成の副産物であるピロリン酸を検出する方法も考案されている。この方法では、伸長反応の進行の差を検出するために、プライマー伸長反応の進行に伴って生成されるピロリン酸をＡＴＰに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用してピロリン酸の量を測定する方法を用いている（非特許文献２を参照）。
【００１６】
さらに特許文献３には、ピロリン酸を測定することによって、試料液中の目的核酸を高感度で測定する方法や、ＳＮＰを簡便にタイピングする方法が開示されている。特許文献３によると、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供して、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応によって、ＤＮＡプローブを伸長させ、ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸をピロホスファターゼによって無機リン酸へと変換し、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよび電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む測定系を用いて、最終的には電極で電流値を測定することによって、ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法が示されている。この方法によれば、ピロリン酸を含む試料を測定系に加えてから、１００秒以内にＳＮＰ配列が判別可能であることが述べられている。
【００１７】
この方法では、ピロリン酸の測定およびＳＮＰのタイピングは、電子メディエータの酸化還元反応を電気化学的に測定することによって可能であり、光学系を必要としない簡便かつ高感度な方法として開示されている。
【００１８】
このようなピロリン酸の測定およびＳＮＰのタイピングでは、センサ基板上に必要な試薬を乾燥担持しておくことによって、センサチップを小型化することができ、さらには非常に簡便な操作で測定が可能となる。
【００１９】
特許文献４には、試薬乾燥担持型のバイオセンサにおいて、緩衝剤成分と酵素を同時に担持する場合、それぞれを分離して配置することによって、酵素活性の低下を防ぐことが可能であることが開示されている。
【特許文献１】特開昭６１−１２３００号公報
【特許文献２】特開２００２−３６９６９８号公報
【特許文献３】国際公開第０３／０７８６５５号パンフレット
【特許文献４】特開平７−８３８７２号公報
【非特許文献１】Ｇ．Ｂ．Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃ.Ａ．Ｎｉｃｈｅｌ, Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ,.vol３３.ｐ１１４（１９７０）
【非特許文献２】Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかしながら、上述したピロリン酸の測定およびそれを用いたＳＮＰタイピングでは、さらに多くの試薬を用いるため、緩衝液成分と酵素を分離して配置し乾燥担持するだけでは、安定した特性がでないという課題を有していた。
【００２１】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で検出するセンサおよびそれを用いたＳＮＰタイピングセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、本発明は絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記基板上に設けられたピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されているピロリン酸センサであって、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とするピロリン酸センサを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、さらに酵素を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。本発明はさらに、前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層が、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。
【００２４】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の分離された部分にそれぞれ形成されていることを特徴とする。
【００２５】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の同一の部分に積層されて形成されていることを特徴とする。
【００２６】
本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されていることを特徴とする。
【００２７】
絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、前記基板上に設置された反応キャビティと、前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、前記測定キャビティ内にピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、かつ前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されているＳＮＰタイピングセンサセンサであって、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とするＳＮＰタイピングセンサを提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層が、さらに酵素を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。
【００２９】
本発明はまた、前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層が、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。
【００３０】
本発明はさらに、前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする。
【００３１】
本発明はさらに、前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のピロリン酸センサによれば、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００３４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の一実施の形態を示す電極基板の斜視図である。絶縁基板１上には、測定極２、対極３、参照極４が形成されている。それぞれの電極は、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどから選択することが可能であるが、表面状態の安定性などの観点から金を選択することが望ましい。
【００３５】
参照極４は、溶液中における電位の安定性から、不分極性を示す照合電極を用いることがさらに望ましく、取り扱いの簡便性等から、銀・塩化銀電極を選択することが好ましい。銀・塩化銀電極の形成方法は、金や白金などで形成された電極パターンの参照極４部位上に、銀メッキを施し、塩化ナトリウム水溶液中で電圧を印加して表面を塩化銀化する方法、銀・塩化銀ペースト材料で電極本体を構成する方法、銀ペーストの表面を次亜塩素酸ナトリウム等の水溶液と接触させる方法、等を挙げることができる。
【００３６】
各電極は、導電性パターン５によって、外部回路との接続部分である端子部６と電気的に結合されている。導電性パターン５および端子部６もまた、電極部分と同様の材料で形成されることが、製造工程から見ても望ましい。絶縁基板１上への電極および導電性パターンの形成方法としては、例えば絶縁基板１上への導電性材料の印刷、導電性材料のスパッタリングもしくは蒸着後のフォトリソグラフィを用いたエッチングもしくはレーザーによる除去加工、マスクを用いた電極パターンの直接スパッタリング、等が考えられる。
【００３７】
絶縁基板１としては、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、樹脂等を選択することができるが、ディスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工の容易さやコスト面から考えて、樹脂材料を選択することが望ましい。
【００３８】
樹脂材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン−２，６−ナフタレート（ＰＥＮ）などを選択することができる。中でも、スパッタリングによる金電極形成の場合は、金との密着性の観点等から、ＰＥＴを選択することが好ましい。また絶縁基板１の厚みとしては、取り扱いの容易さ等から、好ましくは０．１ｍｍ〜２．０ｍｍ、さらに好ましくは０．１８８ｍｍ〜１．０ｍｍがよい。
【００３９】
電極基板７は、このままでも使用可能であるが、図２に示すように、電極部分の面積の規定および導電性パターン５の絶縁・保護の観点から、絶縁膜２１でコーティングされていてもよい。絶縁膜２１としては、例えばポリイミド等の樹脂材料をスピンコートで成膜した後、フォトリソグラフィを用いて電極部分のみを露出させる方法や、あらかじめ電極部分に打ち抜かれた粘着シートを貼付する方法、絶縁性ペースト材料を印刷する方法等を用いることが可能である。
【００４０】
電極基板７は、絶縁膜２１の有無に関わらず、試薬の担持を行うことにより、このままでもピロリン酸センサとして使用可能であるが、測定溶液の乾燥やコンタミネーションを防ぐことを目的として、次に示すようにハウジングを行っても良い。
【００４１】
図３は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの斜視図であり、図１に示す電極基板と図４に示すハウジング基板とからなる。本発明によるバイオセンサに用いられるハウジング基板３１は、試料液と反応しない材料を選択する必要があり、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、樹脂等を選択することができるが、ディスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工のしやすさやコスト面から考えて、絶縁基板１と同様に樹脂材料を選択することが望ましい。
【００４２】
樹脂材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン−２，６−ナフタレート（ＰＥＮ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリジメチルシルオキサン（ＰＤＭＳ）などを選択することができる。ＰＭＭＡおよびＰＣは、透明性がよく内部試料の状態を確認することが可能であり、微細な切削加工等が容易なため、特に好ましい。また、耐熱性が要求される場合は、特にＰＣが好ましい。
【００４３】
ハウジング基板３１上に形成されるキャビティ３３の形成方法は、ハウジング基板３１が樹脂材料の場合、切削加工の他、金型による成型、熱転写によるエンボス加工などを用いることができる。また、貫通孔を持つシートを張り合わせることでもキャビティ３３を形成することが可能である。
【００４４】
こうして形成したキャビティ３３を含むハウジング基板３１は、電極基板７と接着されるが、ハウジング基板３１と電極基板７は、完全に接着もしくは密着し、キャビティ３３内部の試料を封止することが好ましい。接着には、例えば、アクリル系やエポキシ系、シリコーンなどの接着剤、両面テープなどの粘着シート等を用いることができる。また、ポリカーボネートのように有機系溶剤に対する耐性が低い材料を用いた場合、クロロホルム等の有機系溶剤をハウジング基板３１と電極基板７の界面に流し込み、加圧することによって接着することができる。また、ＰＳやＰＭＭＡ等の熱可塑性樹脂を用いた場合には、熱融着による方法も用いることが可能である。
【００４５】
ハウジング基板３１にはキャビティ３２内部に試料を注入するための試料注入孔３３が設けられている。試料注入孔３３は少なくとも１つあれば良いが、空気の抜ける穴として空気孔３４を設けておくと、試料の注入時に使用した以外の空気孔３４がキャビティ３２内部の空気の逃げ道として機能し、試料を速やかに注入することができるので好ましい。
【００４６】
注入孔３３および空気孔３４は、キャビティ３２に接続されていれば、位置は特に限定されない。キャビティ３２内部は、既知の親水性処理が施されていると、試料がより速やかに導入され得る。注入孔３３および空気孔３４は、試料を注入した後は、粘着テープ等の方法で封止してもよいが、短時間の測定であれば開口状態でも使用され得る。
【００４７】
キャビティ３２の内部には、緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩を含む第１の反応試薬層３５、ピロホスファターゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを含む第２の反応試薬層３６、グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む第３の反応試薬層３７、および酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを含む第４の反応試薬層３８が担持される。
【００４８】
後述する実施例からも理解されるように、ピロリン酸濃度と電流値との比例関係を発現させると共に、当該比例関係の傾きをより大きくするという点からは、上記のように４つの反応試薬層３５〜３８に分割することが最も好ましい（実施例のサンプルＤを参照）。
【００４９】
上記傾きは小さくなるが、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（第４の反応試薬層３８）と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩（第１の反応試薬層３５）とを同一の反応試薬層に含ませても良い（実施例のサンプルＣを参照）。
【００５０】
少なくとも、本発明においては、ピロホスファターゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼと緩衝液成分とが分離されているだけでなく、グリセルアルデヒド−３−リン酸と緩衝液成分とが分離されていればよい。
【００５１】
従って、実施例のサンプルＢのように、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（第４の反応試薬層３８）と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩（第１の反応試薬層３５）とを同一の反応試薬層に含ませるだけでなく、グリセルアルデヒド−３−リン酸（第３の反応試薬層３７）と、ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼ（第２の反応試薬層３６）とを同一の反応試薬層に含ませても良い。ただし、上記比例関係の明瞭性や上記傾きはより小さくなる傾向がある。
【００５２】
電子メディエータとしては、水溶性であって酸化体で安定しているものが望ましく、例えばフェリシアン化カリウムを用いることができる。
【００５３】
マグネシウム塩としては、マグネシウムイオンを含み、水溶性であってｐＨが中性〜弱アルカリ性のものであれば良く、例えば塩化マグネシウムを用いることができる。
【００５４】
酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に代えて、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）を用いても良い。また、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ+）とともに、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）を用いてもよい。本明細書においては、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸、これらの組み合わせをそれぞれヌクレオチド類ともいう。
【００５５】
第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８が担持される位置は、キャビティ３２内部の任意の場所でよいが、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８は、図３で示すように、電極基板７上の分離された位置に担持される。
【００５６】
各反応試薬層３５〜３８の担時は、所定の位置に一定量の各試薬を含む試薬溶液をそれぞれ滴下し、常温真空乾燥、温風乾燥、凍結乾燥などによって、溶媒である水分を蒸発させることによって行うことができる。
【００５７】
（実施の形態２）
図５は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの断面図である。図５に示したように、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８は、電極基板７上に積層されて担持される。このとき、第１の反応試薬層３５、第２の反応試薬層３６、第３の反応試薬層３７、および第４の反応試薬層３８が混合されないようにするために、公知の技術を用いることができる。例えば、第１の反応試薬層を形成する際に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のような高分子材料との混合層を形成することによって、第２の反応試薬層３６は水溶性の薄膜状とすることができる。次にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような親水性高分子膜を第２の反応試薬層３６の上に形成する。次に、第４の反応試薬層３８を形成する際には、試薬をＰＶＰが難溶性を示すトルエンのような溶媒に溶解させて滴下することにより、第１の反応試薬層の成分と交じり合うことなく、第４の反応試薬層３８が形成される。第３の反応試薬層３７と第４の反応試薬層３８においても、同様のことを繰り返すことにより各反応試薬層の成分が交じり合うことなく形成できる。ＰＶＰ膜は水溶性のため、試料溶液の供給により、各反応試薬層３５〜３８は速やかに混合される。
【００５８】
なお、図３および図５において、各反応試薬層３５〜３８はそれぞれ電極基板７上に担持したが、キャビティ３２内部であればどのような位置に担持されてもよく、ハウジング基板３１のキャビティ３２側に担持されてもよい。
【００５９】
（実施の形態３）
図６は、本発明の一実施の形態を示すＳＮＰタイピングセンサの斜視図である。図３と同様、電極基板７と、ハウジング基板３１とから構成されているが、ハウジング基板３１には、測定キャビティ４１の他に、ＰＣＲキャビティ４２、および測定キャビティ４１とＰＣＲキャビティ４２とを接続する流路４３が設けられている。注入孔３３から、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡ試料液と共に、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系を注入し、ヒーター等を用いてＰＣＲキャビティ４２で温度サイクルを実行することによってＰＣＲ反応を行うと、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡのＳＮＰ部位と、ＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブが相補的であった場合、ＤＮＡプローブを伸長させるとともにピロリン酸を生成させることができる。一方、ＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡのＳＮＰ部位と、ＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブが非相補的な場合、ＤＮＡプローブの伸長は行われず、ピロリン酸は生成しない。その後、ＰＣＲ反応の終了した試料液を流路４３を介して測定キャビティ４１に移動させると、ＳＮＰタイプに応じたピロリン酸の定量を行うことができ、測定対象のＤＮＡのＳＮＰタイピングが可能となる。また、反応キャビティ４２中に、ＤＮＡのＳＮＰ配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系を担持しておけば、注入孔３４からＳＮＰタイピング測定対象のＤＮＡ試料液のみを注入することによって、測定対象のＤＮＡのＳＮＰタイピングが可能となる。
【００６０】
なお、反応キャビティ４２から流路４３を介して測定キャビティ４１へと試料液を移動させる手段としては、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、ペリスタポンプ等の外部ポンプ、バイオセンサ上に一体型で組み込むマイクロポンプ、バイオセンサ自体を回転させることによって得られる遠心力等を用いることができる。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
以下、本発明のバイオセンサについてさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６２】
以下、一実施の形態に係る電極基板を用いて、試料溶液中のピロリン酸の測定を行った実施例について説明する。
【００６３】
まず、絶縁基板１として厚さ１８８μｍのポリエチレンテレフタレートのシートに、スパッタリングによって７００オングストロームの金薄膜を形成した。次に、エッチングによって図１に示すごとき測定極２、対極３、参照極４、導電性パターン５、端子６を同時に形成し、所定の大きさに切り出して、電極基板７を作製した。測定極２の電極面積は、２．０ｍｍ2であった。
【００６４】
また、上記に従って作製した電極基板７の参照極４表面に、塩化銀ペースト（ＤＢ２２７５  日本アチソン株式会社製）を塗布し、８０℃×３０分の条件で乾燥し、参照極４表面に銀塩化銀電極を形成した。
【００６５】
次に、測定用試薬の乾燥担持を行った。各試薬は、電極基板７上に２〜４箇所のスポットに分けて滴下した。各スポットに滴下した試薬とスポット位置との関係を表１に示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
このように、試薬スポットを形成した電極基板７を真空チャンバー内に静置して、室温で３０分間真空乾燥を行った。このようにしてピロリン酸センサＡ〜Ｄを作製した。
【００６８】
ここで試料溶液として、０μＭ、５０μＭおよび１００μＭ  ピロリン酸水溶液をそれぞれの電極基板上に２０μｌ滴下し、ピペッティングを行った後、３０℃５分間の条件でインキュベートを行い、参照電極４に対して６００ｍＶの電位を測定電極２に印加し、そのとき測定電極２に流れた電流値を測定した。
【００６９】
各ピロリン酸濃度における電位印加６０秒後の電流値をグラフにしたものを図７に示す。
【００７０】
センサとして利用するためには、それぞれのグラフの傾きが大きく、直線性が良いほうが好ましいことは言うまでもない。
【００７１】
酵素と、その他の試薬を分離しただけのピロリン酸センサＡ（２スポット）では、バックグランドが高く、定量性が得られなかった。
【００７２】
ＧＡＰを酵素と同じスポットに滴下したピロリン酸センサＢ（２スポット）では、ピロリン酸の濃度に応じた電流値が観察された。
【００７３】
ＧＡＰを単独スポットとしたピロリン酸センサＣ（３スポット）では、グラフの傾きが大きくなった。
【００７４】
さらにＮＡＤ+を単独スポットとしたピロリン酸センサＤ（４スポット）では、いっそ
う傾きが大きくなり、直線性も増した。
【００７５】
（実施例２）
以下、一実施の形態に係るＳＮＰタイピングセンサを用いて、試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行った実施例について説明する。
【００７６】
まず、実施例１と同様に、ピロリン酸センサＧを作製した。
【００７７】
ただし、ハウジング基板３１として、図６に示すごとく、測定キャビティ４１の他に、ＰＣＲキャビティ４２、および測定キャビティ４１とＰＣＲキャビティ４２とを接続する流路４２が設けられているものを使用した。反応試薬層の配置は、実施例１のサンプルＣ（３スポットタイプ）と同一である。
【００７８】
ＳＮＰタイピングのモデルとして、テンプレートとしてＣｏｎｔｒｏｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（寶酒造製）を用い、完全マッチプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１（５'−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３'：配列番号１）およびＰｒｉｍｅｒ３（５'−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３'：配列番号２）、一塩基ミスマッチプライマーとして、改変Ｐｒｉｍｅｒ１'（５'−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＡ−３'：配列番号３）およびＰｒｉｍｅｒ３を用いて測定を行った（５００ｂｐ増幅用）。
【００７９】
注入孔３３から、蒸留水  １２．４μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑTMＢｕｆｆｅｒ  ２．０μｌ、２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μｌ、２５μｇ／μｌ  ＢＳＡ  ０．８μｌ、２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｚ−ＴａｑTM  ０．２μｌ、および２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各１．０μｌ、１μｇ／ｍｌ  λＤＮＡ  １．０μｌおよびを加えた（総量２０μｌ）センサをＳＮＰタイピングセンサＸ、Ｐｒｉｍｅｒ１の代わりにＰｒｉｍｅｒ１'を加えたセンサをＳＮＰタイピング
センサＹとして、ＰＣＲ反応を、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒の条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液を、ＰＣＲキャビティ４２から流路４２を通して測定キャビティ４１へと送液し、実施例２と同様に測定した結果を表２に示す。
【００８０】
【表２】
2007083693.tif 000013
【００８１】
表２から明らかなように、プライマーとして鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と完全に相補的なＰｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３を用いたＳＮＰタイピングセンサＸでは、ＰＣＲキャビティ４２において行われたＰＣＲ反応の進行によって生成されたピロリン酸が測定キャビティ４１における電気化学測定によって検出された。一方、ＳＮＰタイピングセンサＹにおいては、Ｐｒｉｍｅｒ１'の３'末端側が、鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と相補的でないため、テンプレートλＤＮＡを鋳型としたＰｒｉｍｅｒ３による伸長反応が行われただけで、ＰＣＲによる増幅反応は進行せず、よって電流はほとんど観察されなかった。よって、ＳＮＰタイピングセンサＸおよびＹを用いることによって、ＳＮＰ部位のモデルである一塩基ミスマッチのタイピングを行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、プライマー伸長反応を利用した方法によるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサ、およびＳＮＰタイピングセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図
【図２】本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図
【図３】本発明の一実施の形態に係るハウジング基板の構造を示す斜視図
【図４】本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す斜視図
【図５】本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す断面図
【図６】本発明の一実施の形態に係るＳＮＰタイピングセンサの構造を示す斜視図
【図７】本発明の一実施の形態の結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００８４】
１  絶縁基板
２  測定電極
３  対極
４  参照電極
５  導電性パターン
６  端子部
７  電極基板
２１  絶縁膜
３１  ハウジング基板
３２  キャビティ
３３  注入孔
３４  空気孔
３５  第１の反応試薬層
３６  第２の反応試薬層
３７  第３の反応試薬層
３８  第４の反応試薬層
４１  測定キャビティ
４２  ＰＣＲキャビティ
４３  流路
【配列表のフリーテキスト】
【００８５】
配列番号１の<223>：プライマー
配列番号２の<223>：プライマー
配列番号３の<223>：プライマー
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007083693.tif 000014
【図２】
2007083693.tif 000015
【図３】
2007083693.tif 000016
【図４】
2007083693.tif 000017
【図５】
2007083693.tif 000018
【図６】
2007083693.tif 000019
【図７】
2007083693.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月17日(2008.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と
を備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからも分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、ピロリン酸センサ。
【請求項２】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項３】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項４】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されている、請求項１に記載のピロリン酸センサ。
【請求項５】
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて
形成されている、請求項４記載のピロリン酸センサ。
【請求項６】
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからもから分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、ＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項７】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項６に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項８】
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、請求項６に記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項９】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項８記載のＳＮＰタイピングセンサ。
【請求項１０】
ピロリン酸センサによって、試料溶液中のピロリン酸の濃度を測定する方法であって、
前記ピロリン酸センサは、
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と
を備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからも分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせであり、
前記方法は、以下の工程を包含する：
前記試料溶液を前記基板上に滴下する工程、
前記電極系に流れる電流値を測定する工程、および
前記電流値から前記試料溶液中のピロリン酸の濃度を定量する工程。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて
形成されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＮＰタイピングセンサによって、試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行う方法であって、
前記ＳＮＰタイピングセンサは、
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからもから分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせであり、
前記方法は、以下の工程を包含する：
前記試料溶液を前記反応キャビティに注入する工程、
前記試料溶液を前記反応キャビティから前記流路を介して前記測定キャビティに移動させる工程、
前記電極系に流れる電流値を測定する工程、および
前記電流値から前記試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行う工程。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサおよび方法、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサおよびＳＮＰタイピング方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で検出するセンサおよび方法、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサおよびＳＮＰタイピング方法を提供することを目的とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
上記目的を達成する本発明に係るピロリン酸センサは、
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と
を備え、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからも分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである。
このピロリン酸センサによって試料溶液中のピロリン酸の濃度を測定する本発明に係る方法は、以下の工程を包含する：
前記試料溶液を前記基板上に滴下する工程、
前記電極系に流れる電流値を測定する工程、および
前記電流値から前記試料溶液中のピロリン酸の濃度を定量する工程。
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されていることが好ましい。
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが分離されていることが好ましい。
第１の反応試薬層および第２の反応試薬層をさらに備え、
前記第１の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、
前記第２の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、
前記基板の法線方向から見た場合に前記第１の反応試薬層と前記第２の反応試薬層とが積層されていることが好ましい。
前記第１の反応試薬層および第２の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されていることが好ましい。
上記目的を達成する本発明に係るＳＮＰタイピングセンサは、
絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、
前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キャビティと、
前記基板上に設置された反応キャビティと、
前記測定キャビティと前記反応キャビティを繋ぐ流路を含み、
ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キャビティ内に担持されており、
前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、
前記グリセルアルデヒド−３−リン酸が、前記緩衝液成分、前記ピロホスファターゼ、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれからもから分離されており、
前記ヌクレオチド類は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである。
このＳＮＰタイピングセンサによって試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行う本発明に係る方法は、以下の工程を包含する：
前記試料溶液を前記反応キャビティに注入する工程、
前記試料溶液を前記反応キャビティから前記流路を介して前記測定キャビティに移動させる工程、
前記電極系に流れる電流値を測定する工程、および
前記電流値から前記試料溶液中のＤＮＡのＳＮＰタイピングを行う工程。
前記ヌクレオチド類が、前記ピロホスファターゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、前記グリセルアルデヒド−３−リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されていることが好ましい。
前記反応キャビティにおいて、ＤＮＡ増幅反応を行うことが好ましい。
前記ＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲ反応であることが好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明によれば、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサおよび方法、ならびにそれを用いたＳＮＰタイピングセンサおよびＳＮＰタイピング方法を提供することができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
本発明によれば、プライマー伸長反応を利用した方法によるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサおよび方法、ならびにＳＮＰタイピングセンサおよびＳＮＰタイピング方法を提供することができる。
【国際調査報告】
2007083693.tif 000021
2007083693.tif 000022