(57)【要約】  本発明は、緑膿菌に関連する疾患の診断、予防、または治療に用いられるタンパク質抗原またはペプチド抗原およびこれらに対する抗体を提供することを目的とする。本発明によれば、緑膿菌に関連する疾患の診断、予防、または治療に用いられる、緑膿菌の外膜タンパク質ＰＡ５１５８由来のタンパク質またはペプチドおよびこれらに対する抗体が提供される。
2007049770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物。
【請求項２】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
【請求項４】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載のタンパク質または請求項３もしくは４に記載のペプチドを含んでなる、抗原組成物。
【請求項６】
請求項１または５に記載の抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物。
【請求項７】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質またはその一部に対する抗体またはその機能的断片。
【請求項８】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の一部が、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分である、請求項７に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質である、請求項８に記載の抗体またはその機能的断片：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項１０】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分が、配列番号：５で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである、請求項８に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される、請求項１０に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分が、配列番号：６で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである、請求項８に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１４】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と同じ抗原と交差反応するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１６】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物。
【請求項１７】
緑膿菌に関連する疾患が、緑膿菌感染に起因する全身感染疾患である請求項６に記載のワクチン組成物または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
緑膿菌感染が、多剤耐性緑膿菌感染である、請求項６に記載のワクチン組成物または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項７〜１３、および１５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌感染症診断剤。
【請求項２０】
請求項７〜１３、および１５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌の検出キット。
【請求項２１】
請求項７〜１３、および１５のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑膿菌の外膜タンパク質ＰＡ５１５８由来のタンパク質抗原またはペプチド抗原、および該抗原に対する抗体に関する。本発明はまた、該抗原を含んでなるワクチン組成物に関する。本発明はさらに、該抗体を含んでなる医薬組成物、緑膿菌感染症診断剤、緑膿菌の検出キット、アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、土壌、水中など自然環境中に広く一般的に分布しているグラム陰性桿菌であるが、治療抵抗性の重篤な致死性の感染症を引き起こす。その主な標的は、熱傷、臓器移植または癌患者を含む、一般にｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｈｏｓｔと呼ばれる生体防御機能が衰弱した易感染性の患者であり、緑膿菌は院内感染の主要な原因菌である。さらに本菌による肺感染症は嚢胞性繊維症患者において致死性である。これらの患者に対して、主に抗緑膿菌活性を有する抗菌剤が投与されるが、緑膿菌の薬剤耐性により十分に治療効果が得られない症例が多い。また、緑膿菌に対するワクチンや抗体についても古くから検討されているが、直接、不活化した菌を用いる方法では、緑膿菌の血清型別に種々のワクチンや抗体を調製しなければならない等の欠点があった。【０００３】
このような状況下、緑膿菌間で共通なアミノ酸配列を有する緑膿菌由来のタンパク質を用いた能動免疫または受動免疫による緑膿菌感染症の予防あるいは治療が期待されている。緑膿菌由来のタンパク質をワクチンに応用する例としては、外膜タンパク質ＯｐｒＦおよびＯｐｒＩの一部分を融合させた組換えタンパク質（特開平８−２４５６９９号公報）、ｔｙｐｅＩＶ  ｐｉｌｉｎタンパク質（ＷＯ２００４／０９９２５０号公報）等が知られている。【０００４】
また、緑膿菌由来のタンパク質を標的とする抗体医薬に関しては抗ｔｙｐｅＩＶ  ｐｉｌｉｎ  抗体（ＷＯ２００４／０９９２５０号公報）、抗ＰＡ１７０６（またはＰｃｒＶ）抗体（米国特許公報第６３０９５６１号、６８２７９３５号）等が報告されている。【０００５】
しかし、多様な血清型を示す緑膿菌の臨床分離株が共通に保有する菌体由来のタンパク質は、「共通抗原」として緑膿菌感染症の予防、診断あるいは治療に応用可能であるため、常に求められている。【０００６】
ところで、ＰＡ５１５８（またはｏｐｍＧ）遺伝子にコードされるＰＡ５１５８（別名ＯｐｍＧ）タンパク質は、アミノグリコシド系抗生物質の耐性化に直接関与する排出ポンプを構成する外膜タンパク質であることが報告されている（Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47, 1101-1111）。しかしながら、該タンパク質をワクチンの成分として、また該タンパク質に対する抗体を緑膿菌感染症治療剤あるいは診断薬として用いることは全く知られていなかった。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、緑膿菌の外膜タンパク質から新規で有用な「共通抗原」を探索することを試み、種々検討の結果、緑膿菌の外膜にあるＰＡ５１５８（別名ＯｐｍＧ）タンパク質をコードする遺伝子が、ヒト血清の存在いかんに関わらず、定常的に発現していることをＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により見出した（実施例１）。また、８８株の緑膿菌臨床分離株について遺伝子解析を実施したところ、ＰＡ５１５８タンパク質の２箇所にわたる推定細胞外領域にアミノ酸変異が認められず、完全に保存されていることを見出した（実施例２）。さらに、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫して得られた抗血清または抗体が、緑膿菌感染モデルマウスにおいて高い感染防御効果を示すこと（実施例９〜１２）、該抗体がＰＡ５１５８タンパク質に結合すること（実施例７、８、および１３）、該抗体がアミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強効果を示すこと（実施例１４）を確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、緑膿菌感染を実質的に予防あるいは治療する能力を有し、緑膿菌感染患者由来の臨床分離株の多様性に対応できるワクチン組成物として使用可能なタンパク質抗原またはペプチド抗原、また、該抗原に対する抗体を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物が提供される。
【００１０】
本発明によれば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質（以下、「本発明によるタンパク質」という）が提供される：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【００１１】
本発明によれば、配列番号：５で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド（以下、「本発明による第一の態様のペプチド」という）が提供される。
【００１２】
本発明によれば、配列番号：６で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド（以下、「本発明による第二の態様のペプチド」という）が提供される（以下、本発明による第一の態様のペプチドと、本発明による第二の態様のペプチドとを併せて「本発明によるペプチド」ということがある）。
【００１３】
本発明によれば、本発明によるタンパク質または本発明によるペプチドを含んでなる、抗原組成物が提供される（以下、この抗原組成物と、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物とを併せて「本発明による抗原組成物」という）。
【００１４】
本発明によれば、本発明による抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントとを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物が提供される。
【００１５】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質またはその一部に対する抗体またはその機能的断片（以下、「本発明による抗体」という）が提供される。
【００１６】
本発明によれば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマが提供される。
【００１７】
本発明によれば、本発明による第一の態様の抗体と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明によれば、本発明による第一ないし第三の態様のいずれかの抗体を含んでなる、緑膿菌感染症診断剤が提供される。
【００１９】
本発明によれば、本発明による第一ないし第三の態様のいずれかの抗体を含んでなる、緑膿菌の検出キットが提供される。
【００２０】
本発明によれば、本発明による第一ないし第三の態様のいずれかの抗体を含んでなる、アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強剤が提供される。
【００２１】
本発明は、緑膿菌感染症を実質的に予防または治療する能力を有し、さらには緑膿菌感染症患者由来の臨床分離株の多様性に対応するワクチン組成物およびポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供するものであり、これらは緑膿菌感染症の予防若しくは治療剤、または緑膿菌感染症診断薬への応用を可能にするものである。
【００２２】
さらに本発明による抗体は、緑膿菌の外膜ないしは細胞外に存在するＰＡ５１５８タンパク質の細胞外領域と結合し、しかもこれらの領域は、血清型等によらず株間での保存性が極めて高く多様な臨床分離株と反応すると推測されるので、緑膿菌感染症に対し高い治療効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｐＥＴ１５ｂプラスミド（ｐＥＴ−ＰＡ５１５８−１）を示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００２４】
［ＰＡ５１５８タンパク質］
ＰＡ５１５８タンパク質は緑膿菌由来の外膜ＰＡ５１５８タンパク質である。該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３に、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号：１に記載される。
【００２５】
ここで、シグナル配列およびＰＡ５１５８タンパク質と相同性の高い緑膿菌ＰＡ０４２７（ＯｐｒＭ）タンパク質の立体構造情報（J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819）と、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質の立体構造情報（Nature, 2000, 405, 914-919）と、ＰＡ５１５８タンパク質の２次構造とから得られる情報より、配列番号：１で表される塩基配列のうち、アミノ酸コード領域１４７９塩基中の３３７番目から１４７９番目の塩基配列は、ＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分をコードすると推測された（配列番号：２）。
【００２６】
ＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質である：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【００２７】
本願明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。
【００２８】
改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１または複数個（好ましくは、１ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２９】
本願明細書において、「保存的置換」とは、１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３０】
本願明細書において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．５×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、６０℃、１５分間の洗浄条件、好ましくは０．５×ＳＳＣ濃度、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、を意味する。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３２】
本願明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列についての「同一性」とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基またはアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３３】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００３４】
本発明において、配列番号：４で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
【００３５】
従って、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：２で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３６】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：２で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３７】
本願明細書において、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができ、例えば、そのタンパク質を遺伝子組み換え技術により発現させ、ＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を作製できるかどうかを評価することにより決定することができる。
【００３８】
本発明によるタンパク質は、緑膿菌の細胞表面に表出しているため、該タンパク質は、緑膿菌に対する抗体を作製するための抗原（タンパク質抗原）として用いることができる。
【００３９】
ＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分のうち、アミノ酸変異が認められない部分として以下の２カ所（以下、推定細胞外領域という）が特定された：
配列番号：５で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド；および
配列番号：６で表されるアミノ酸配列、または１若しくは数個の保存的置換を有する配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
【００４０】
本発明によるペプチドは、緑膿菌の細胞表面に表出し、また緑膿菌において保存されているため、該ペプチドは緑膿菌に対する抗体を作製するための抗原（ペプチド抗原）として用いることができる。
【００４１】
該ペプチドは、多数の緑膿菌臨床分離株においてアミノ酸変異が認められなかったことから、共通抗原として有用である点で有利である。
【００４２】
本発明によるペプチドは、電荷による凝集等を防ぐために、Ｎ末端やＣ末端にブロック基を付加することが可能である。Ｎ末端には、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、Ｃ末端にはアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）がよく用いられるがこれらに限定されない。  本発明によるペプチドは、システイン残基を付加し、スペーサーとの結合を強化する修飾などを用いることができる。
【００４３】
スペーサーとしては、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などを用いることが一般的であるが、これに限るものでなくスペーサーとして機能する化合物であれば足りる。
【００４４】
本発明によるペプチドは、担体として、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）あるいはラパスガイ由来のヘモシアニン（ＫＬＨ  Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアータンパク質を用いることが可能であるがこれらに限定されない。
【００４５】
［抗原組成物］
本発明によるタンパク質または本発明によるペプチドは、タンパク質抗原またはペプチド抗原として用いることができる。従って、本発明によれば、緑膿菌由来の外膜ＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができる該タンパク質抗原または該ペプチド抗原を含んでなる抗原組成物が提供される。
【００４６】
ここで、タンパク質抗原またはペプチド抗原は、好ましくは、本発明によるタンパク質または本発明によるペプチドを当業者に周知の方法に従って精製して用いることができる。
【００４７】
本願明細書において、「抗原組成物」とは、タンパク質抗原またはペプチド抗原を唯一の構成要素とする組成物でもよく、また他の成分を含んでなる組成物であってもよい。
【００４８】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物が提供される。
【００４９】
［ワクチン組成物］
本発明による抗原組成物は、ワクチンとして用いることができる。従って、本発明によれば、緑膿菌由来の外膜ＰＡ５１５８タンパク質に対する抗体を産生することができる抗原組成物を含んでなるワクチン組成物が提供される。
【００５０】
本発明によれば、本発明による抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとを含んでなる緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物を製造することができる。
【００５１】
本発明によるワクチン組成物に用いられる担体は、投与の様式および経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、キャリアータンパク質（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ラパスガイ由来のヘモシアニン（ＫＬＨ：Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等）、溶解剤（例えば、エタノール、ポリソルベート、Cremophor EL（登録商標）等）、等張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤（例えば、ラクトース、スターチ、結晶性セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽無水珪酸、炭酸カルシウム等）、結合剤（例えば、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等）、安定化剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゴル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油等）等がある。必要であれば、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤、または塩基性物質（例えば、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、重炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、トリスアミノメタン等）等を加えてもよい。
【００５２】
キャリアータンパク質の具体例としては、本発明によるワクチン組成物の抗原性を高めるため、本発明によるペプチドに公知のＫＬＨ溶液（Calbiotec社製  ５０％グリセロール溶液に１ｍｌ当たり１２５ｍｇを溶解させる）をカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させることができる。
【００５３】
本発明によるワクチン組成物に用いられる希釈剤は、投与の様式及び経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、例えば、水または生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、重炭酸塩溶液等が挙げられる。
【００５４】
本発明によるワクチン組成物に用いられるアジュバントは、投与の様式及び経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、例えば、コレラ毒素、大腸菌の熱不安定腸毒素（ＬＴ）、リポソーム、又は免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ：ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）等が挙げられる。
【００５５】
投与は、緑膿菌による感染のおそれがある投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。
【００５６】
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗原組成物を、薬学的に許容される上記の坦体などと混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００５７】
経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には溶剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等が挙げられる。
【００５８】
非経口投与のための剤型は、溶剤、懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、坐剤、眼剤、点鼻剤、点耳剤等が挙げられる。
【００５９】
本製剤の徐放を希望する場合、生物分解性のポリマー（例えば、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ポリグリコリド等）を、増量母材として加えることができる（例えば、米国特許５，４１７，９８６号公報、米国特許４，６７５，３８１号公報、米国特許４，４５０，１５０号公報を参照することができる）。
【００６０】
経口投与の場合、香味料及び着色料を加えることもできる。
【００６１】
適当な医薬用の担体および希釈剤等、並びにこれらの使用のために医薬上必要な物は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【００６２】
本発明によるワクチン組成物の投与量は、例えば、ワクチン抗原の種類、本抗原と共にアジュバントを投与するか否か、共投与されるアジュバントの種類、投与の様式と頻度、及び希望する効果（例えば、予防か、それとも治療か）により、本発明者によって決定されるが、一般的には、本発明のワクチン組成物を、１成人１投与あたり１μｇ〜１００ｍｇの量で投与する。本ワクチンと共にアジュバントを投与する場合、一般的には、１成人１投与あたり１ｎｇ〜１ｍｇの量を投与する。本発明者の決定に従って、必要がある場合には、投与を繰り返す。例えば、初期化のための投与に引き続いて、１週間毎に３回の増強のための投与を行うことができる。あるいは増強のための注射を、最初の免疫接種後８〜１２週目に、そして２回目の増強を１６〜２０週目に、同一の調合剤を用いて行うことができる。
【００６３】
［抗体］
本発明による抗体は、緑膿菌の外膜ＰＡ５１５８タンパク質またはその一部を認識しかつ、緑膿菌に結合することができる。
【００６４】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の一部が、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の細胞表面表出部分である、本発明による抗体またはその機能的断片が提供される。
【００６５】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の一部が、本発明によるタンパク質である、本発明による抗体（以下、「本発明による第一の態様の抗体」という）が提供される。
【００６６】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の一部が、本発明による第一の態様のペプチドである、本発明による抗体（以下、「本発明による第二の態様の抗体」という）が提供される。
【００６７】
本発明によれば、緑膿菌由来のＰＡ５１５８タンパク質の一部が、本発明による第二の態様のペプチドである、本発明による抗体（以下、「本発明による第三の態様の抗体」という）が提供される。
【００６８】
このような抗体には、本発明によるタンパク質を認識し、かつ緑膿菌に結合する抗体が含まれる。また、本発明によるペプチドを認識する抗体が含まれる。
【００６９】
本発明による抗体は、好ましくは精製された本発明によるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物を免疫して抗体が誘発できる量で実験動物へ投与することによって得られる。心臓あるいは動脈から採血し、分離して得た抗血清を精製した後、純粋抗体として使用することができる。
【００７０】
本発明による抗体には、ＰＡ５１５８タンパク質またはペプチドを抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体も含む）、遺伝子組換え技術を用いて製造されキメラ抗体およびヒト化抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体が含まれる。
【００７１】
本発明による抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、ヒト抗体が望ましい。
【００７２】
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。本発明によるヒト抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Intern. Rev. Immunol, 1995, 13, 65-93、J. Mol. Biol, 1991, 222, 581-597、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報等を参照することができる）。
【００７３】
「ヒト化抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域）の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体である。本発明によるヒト化抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、ＥＰ２３９４００、ＷＯ９０／０７８６１号公報等を参照することができる）。
【００７４】
「キメラ抗体」は、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。具体的には、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合して作製することができる。本発明によるキメラ抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報等を参照することができる）。
【００７５】
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Antibodies A LABORATORY MANUAL Ed Harlow, David Lane Cold Spring Harbor Laboratory 1988、単クローン抗体実験マニュアル（1987）講談社、富山朔二ら編、単クローン抗体  ハイブリドーマとELISA（1987）講談社、岩崎辰夫ら編等を参照することができる）。
【００７６】
本発明によるポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。
【００７７】
本発明による「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、本発明によるタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられる。
【００７８】
本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
【００７９】
本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−ＢＰ−１０６７２のもと受託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
【００８０】
従って、本発明によれば、２００５年１０月７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７５より移管）のハイブリドーマ（５１５８−Ｌ１−１）が提供される。
【００８１】
本発明による抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００８２】
本発明によれば、本発明によるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と同じ抗原と交差反応するモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体が提供される。
【００８３】
本発明によれば、本発明による抗原組成物に応答して、動物自身の免疫系によって産生されることを特徴とする緑膿菌に結合することができる抗体が提供される。
【００８４】
［抗体の用途および医薬組成物］
緑膿菌に関連する疾患
緑膿菌は宿主の抵抗力の低下につれて致命的な結果となる日和見感染の病原菌であり、また、抗生物質に抵抗性であるため、院内感染の主要な原因菌でもある。後記実施例により示されるように、ムチン投与によりマクロファージの機能を低下させたマウス緑膿菌易感染性モデルおよびＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ投与により好中球を減少させたマウス緑膿菌易感染性モデルにおいて、本発明による第一の態様の抗体が実際に感染防御効果を有することが確認された（実施例９および１０）。また、マウス多剤耐性緑膿菌易感染性モデルにおいて、本発明による第一の態様の抗体が実際に感染防御効果を有することが確認された（実施例１１および１２）。従って、本発明による第一の態様の抗体は、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に有用である。
【００８５】
緑膿菌に関連する疾患としては、多剤耐性緑膿菌を含む緑膿菌感染に起因する全身感染疾患、例えば、敗血症、髄膜炎、心内膜炎等が挙げられる。耳鼻科領域では、中耳炎、副鼻腔炎、呼吸器科領域では、肺炎、慢性気道感染症、カテーテル感染症、外科領域では、術後腹膜炎、術後胆道などの炎術後感染症、眼科領域では、眼瞼膿瘍、涙膿炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿瘍、全眼球炎、眼窩感染、泌尿器科領域では、複雑性尿路感染症を含む尿路感染症、カテーテル感染症、肛門周辺膿瘍等が挙げられる。この他にも、重症熱傷、気道熱傷を含む熱傷や褥瘡感染症、嚢胞性繊維症等が挙げられる。
【００８６】
本発明による第一の態様の抗体は、治療に難渋する多剤耐性緑膿菌感染症の予防または治療に対し有効性が期待できる点で有利である。
【００８７】
本発明によれば、緑膿菌に関連する疾患の予防剤または治療剤の製造のための、本発明による第一の態様の抗体の使用が提供される。
【００８８】
本発明によれば、予防上または治療上の有効量の本発明による第一の態様の抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防方法または治療方法が提供される。
【００８９】
緑膿菌感染症診断剤
後記の実施例において示されるように、本発明による第一の態様の抗体は、本発明によるタンパク質、本発明による第一の態様のペプチド、および本発明による第二の態様のペプチドとそれぞれ結合すること、また緑膿菌とのみ反応し、他の菌種とは全く反応しないことが確認された（実施例７および実施例８）。また、本発明による第二の態様の抗体は、本発明による第一の態様のペプチドと結合することが確認された（実施例１３）。さらに、本発明による第三の態様の抗体は、本発明による第二の態様のペプチドと結合すること、また緑膿菌とのみ反応し、他の菌種とは全く反応しないことが確認された（実施例７）。従って、本発明による抗体は、緑膿菌感染の診断に有用である。
【００９０】
本発明による抗体は、精製品のほかにハイブリドーマ培養上清、腹水の形態においても他の菌種による感染と緑膿菌感染を明確に区別することができる。
【００９１】
本発明によれば、本発明による抗体を用いる緑膿菌感染の診断方法が提供される。
【００９２】
本発明による診断方法は、緑膿菌感染のおそれのあるヒトを含む哺乳動物から喀痰、肺洗浄液、膿、涙、血液、尿等の生体試料を採取し、次いで、採取した試料と本発明による抗体とを接触させ、抗原抗体反応が生じたか否かを判断することにより実施することができる。
【００９３】
緑膿菌感染症診断薬キット
本発明によれば、緑膿菌の存在を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが提供される。
【００９４】
本発明による抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することにより緑膿菌の存在を検出する。
【００９５】
従って本発明による検出キットは、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【００９６】
アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強剤
後記の実施例において示されるように、本発明による抗体の添加により、アミノグリコシド抗生物質であるゲンタマイシンの抗菌力を増強することが確認された（実施例１４）。従って、本発明による抗体は、抗緑膿菌活性増強剤として用いることができる。
【００９７】
本発明によれば、アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強剤の製造のための、本発明による抗体の使用が提供される。
【００９８】
本発明によれば、治療上の有効量の本発明による抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性を増強する方法が提供される。
【００９９】
医薬組成物
本発明による医薬組成物または用剤は、本発明による抗体を有効成分として用い、好ましくは、精製した抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液などを含有する組成物の形態で使用しても良い。
【０１００】
本発明による医薬組成物は必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）などを含有させることもできる。
【０１０１】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミンなどを例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、燐酸塩緩衝液、水酸化アルミニウムなどを例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
投与は、投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。
【０１０３】
医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、一般的な健康状態、緑膿菌感染症の程度及び投与する抗体組成物の成分により多様である。本発明による抗体組成物は、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１ないし１０００ｍｇ、好ましくは１ないし１００ｍｇを投与する。  
本発明による医薬組成物は、緑膿菌による感染のおそれがある患者に対してあらかじめ投与しておくことが好ましい。
【０１０４】
診断剤として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることが出来る。たとえば腹水、目的抗体を含む培養液、または精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ（生理食塩を含むリン酸緩衝液）等で希釈した後、０．１％ナトリウムアジド等を防腐剤として加える。またはラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものも抗体価を求め適当に希釈し、防腐剤を添加して用いる。前記のように本発明の抗体をラテックス粒子に結合させたものは、診断薬として好ましい剤型の一つである。この場合のラテックスとしては適当な樹脂材料たとえばポリスチレン、ポリビニールトルエン、ポリプタジエン等のラテックスが適当である。
【実施例】
【０１０５】
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１０６】
実施例１：ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ヒト血清添加培地で発現している遺伝子を探索する手法として、ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現解析システム（Affymetrix社製GeneChip P. aeruginosaゲノムアレイ）を用いた。緑膿菌ＰＡＯ１菌株（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７）を用いて、３通りの培養条件、すなわち０％、２０％、５０％ヒト血清添加Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（ナカライテスク社製）（最終のＬＢ培地組成は均一）で３７℃にて５９５ｎｍの吸光度が１．０になるまで振とう培養し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｎｉキット（QIAGEN GmbH社製）を用い、添付文書の方法に従って、全ＲＮＡを抽出し、２１００バイオアナライザー（Agilent Technologies社製）により定量を行った。その後、ＧｅｎｅＣｈｉｐの添付文書の方法に従って実験を行った。遺伝子発現データの解析はＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（Affymetrix社製）により行い、シグナルならびにディテクションを計算した。このとき、全プローブセットのシグナルの平均値が１０００となるように補正を行った。実験は独立に２回実施した。【０１０７】
その結果、ハウスキーピングタンパク質であるＰＡ４７６１タンパク質（ＤｎａＫあるいはＨＳＰ７０）は、いずれの培養条件でも血清添加の有無に関わらず、転写産物が検出されたことを示す「Ｐｒｅｓｅｎｔ」と判定され、該遺伝子が発現していることが示された。また、ＰＡ５１５８タンパク質ならびにＰＡ２０１９タンパク質（ＭｅｘＸ）と会合し薬剤排出ポンプを構成する内膜貫通タンパク質でテトラサイクリンやアミノグシコシド系抗生物質などリボソーム阻害剤によって誘導されるＰＡ２０１８タンパク質（ＭｅｘＹ）（J. Bacteriology, 2005, 187, 5341-5346）は、それらの薬剤が存在しない今回の条件下では「Ａｂｓｅｎｔ」と判定され、該遺伝子が発現していないことが示された。一方、ＰＡ５１５８タンパク質に関しては、いずれの条件下においても血清添加の有無に関わらず「Ｐｒｅｓｅｎｔ」と判定された。【０１０８】
以上のことから、間違いなくＰＡ５１５８遺伝子が発現し、その遺伝子産物であるＰＡ５１５８タンパク質が菌体表面に定常的に存在している可能性が示唆された。このことから、緑膿菌のＰＡ５１５８タンパク質がワクチンの成分として有用であることが示唆された。【０１０９】
実施例２：臨床分離株におけるＰＡ５１５８遺伝子の解析
使用菌株は、全国の臨床施設において各種臨床材料より分離された緑膿菌８８株（明治製菓株式会社  横浜研究所に保管）を試験に供した。これらの株は血液、尿、喀痰、膿、咽頭粘液などに由来しており、血清型は緑膿菌研究会主催の型別検討委員会の決定（１９７５年）による血清学的分類に基づくＡ群、Ｂ群、Ｅ群、Ｇ群、Ｉ群などが含まれている。【０１１０】
（１）ゲノムＤＮＡの調製
臨床分離の緑膿菌８８株についてそれぞれ、ミューラーヒントン培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で３７℃にて一晩培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN GmbH社製）を用い、添付文書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１１１】
（２）ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、ＰＡ５１５８遺伝子を含む領域をＰＣＲにより増幅した。具体的には、緑膿菌ＰＡＯ１菌株のゲノム配列（ＮＣＢＩのデータベースにおけるアクセッション番号：  ＮＣ＿００２５１６）をもとに、各遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット（配列番号：７、配列番号：８）を設計し、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）で添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied BioSystems社製）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動により、目的のサイズ（１６４５塩基対）であることを確認した。【０１１２】
（３）ＤＮＡシーケンサーによるポリヌクレオチド配列の解析
ＰＣＲ産物は、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＰＣＲプレート（Millipore Corporation社製）にて精製後、シーケンス反応に供した。ＰＡＯ１菌株のゲノム配列（ＮＣ＿００２５１６）をもとに、各ＰＣＲ産物をシーケンシングできるプライマー（配列番号：９〜配列番号：１２）を設計し、シーケンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Applied BioSystems社製）を用いた。シーケンス反応は添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied BioSystems社製）で実施した。シーケンス反応産物は、あらかじめ水で膨張させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（Amersham Biosciences AB社製）をつめたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＶプレート（Millipore Corporation社製）で精製後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied BioSystems社製）を用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。【０１１３】
上記の解析により判明した臨床分離株のポリヌクレオチド配列をポリペプチド配列に置換し、ＰＡＯ１菌株のものと比較検討した結果、ＰＡ５１５８タンパク質の全長配列において、２１ヶ所に変異が認められた（表１）。【０１１４】
しかしながら、ＰＡ５１５８タンパク質と相同性の高い緑膿菌ＰＡ０４２７（ＯｐｒＭ）タンパク質の立体構造情報（J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819）と、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質の立体構造情報（Nature, 2000, 405, 914-919）とＰＡ５１５８タンパク質の２次構造から得られる情報を基に、独自に推測した２カ所の推定細胞外領域（配列番号：５、配列番号：６）にアミノ酸変異は認められなかった。このことから、緑膿菌のＰＡ５１５８タンパク質が「共通抗原」として有用であることが示唆された。
【表１】
2007049770.tif 000003
【０１１５】
実施例３：ＰＡ５１５８遺伝子ＤＮＡ断片のクローニング 
緑膿菌ＰＡ５１５８遺伝子（配列番号：１）のアミノ酸コード領域１４７９塩基中の３３７番目から１４７９番目のＤＮＡ断片（配列番号：２）を、以下の方法により、無細胞系タンパク質発現ベクターｐＩＶＥＸ２．４ｄ（Roche Diagnostics社）および大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Novagen社）に組み込んだ。【０１１６】
アミノ酸コード領域の１番目から３３６番目の塩基配列は、シグナル配列およびＰＡ５１５８タンパク質と相同性の高い緑膿菌ＰＡ０４２７（ＯｐｒＭ）タンパク質の立体構造情報（J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819）と、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質の立体構造情報（Nature, 2000, 405, 914-919）と、ＰＡ５１５８タンパク質の２次構造から得られる情報を基に細胞表面に表出しない部分をコードすると推測し、クローニング対象から除外した。【０１１７】
クローニングするＤＮＡ断片を緑膿菌ＰＡＯ１菌株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００；Perkin-Elmer社製）により増幅した。ＤＮＡポリメラーゼはＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社製）を使用し、反応液にジメチルスルホキシドを１０％添加し、ＰＣＲプライマーは制限酵素部位ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）を付加するための塩基を含むプライマー（配列番号：１３、配列番号：１４）を用いた。【０１１８】
温度条件は、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５４℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクルとし、最後に７２℃で５分間の延長時間を加えた。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いて精製し、ＸｈｏＩ（New England Biolabs社製）およびＢａｍＨＩ  （東洋紡社製）で切断した。ｐＩＶＥＸ２．４ｄをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、これらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いて抽出精製した。ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで切断した  ＰＣＲ産物およびｐＩＶＥＸ２．４ｄをＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）で連結し、大腸菌ＤＨ５α株（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  ＤＨ５α、東洋紡社製）を形質転換した。ＰＡ５１５８遺伝子断片が組み込まれたｐＩＶＥＸ２．４ｄプラスミド（ｐＩＶＥＸ−ＰＡ５１５８−１０）を、  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いて精製し、挿入部分の塩基配列を確認した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ、Applied Biosystems社製）。【０１１９】
次に、ｐＥＴ１５ｂをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＩＶＥＸ−ＰＡ５１５８−１０のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片と連結して大腸菌を形質転換し、ＰＡ５１５８遺伝子断片が組み込まれたｐＥＴ１５ｂプラスミド（ｐＥＴ−ＰＡ５１５８−１）を得た（図１）。【０１２０】
実施例４：ＰＡ５１５８組換えタンパク質の発現ならびに精製 
組換えタンパク質の発現には無細胞および大腸菌の発現系を用いた。【０１２１】
無細胞系は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと大腸菌ライセートにより転写と翻訳を行うＲＴＳ  ５００  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ（Roche Diagnostic社製）を使用した。無細胞系タンパク質発現ベクターｐＩＶＥＸ−ＰＡ５１５８−１０は、Ｔ７プロモーターの下流にＨｉｓ−タグ（６個の連続したヒスチジン）が融合したＰＡ５１５８タンパク質をコードするプラスミドである（実施例３参照）。取扱説明書に従って無細胞系反応液を調製し、１０μｇのｐＩＶＥＸ−ＰＡ５１５８−１０を添加して３０℃で２０時間反応した後、生成した不溶性タンパク質を遠心で回収した。【０１２２】
大腸菌発現系は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株とＴ７プロモーターを有するｐＥＴベクターの発現系（Novagen社製）を使用した。この発現系においては、ＢＬ２１（ＤＥ３）株の染色体に組み込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の転写はｌａｃＩリプレッサーにより抑制されており、誘導剤であるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すると転写抑制が解除され、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現が誘導される。また、ｐＥＴベクターのＴ７プロモーター下流に組み込まれた遺伝子の転写もｌａｃＩリプレッサーにより抑制されており、ＩＰＴＧを添加すると転写抑制が解除され、宿主から供給されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって転写が起こり、組み込まれた遺伝子が発現する。大腸菌発現ベクターｐＥＴ−ＰＡ５１５８−１は、Ｔ７プロモーターの下流にヒスチジンタグが融合したＰＡ５１５８タンパク質をコードするプラスミドである（実施例３参照）。ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウムで処理（Molecular Cloning第２版、Sambrook他（1989）参照）し、ｐＥＴ−ＰＡ５１５８−１により形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、新しい培地に２００倍希釈で懸濁して３７℃で４時間培養後、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加し、さらに３時間培養した。細胞を遠心で回収し、−２０℃で凍結した。細胞をタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Novagen社製）で溶解し、添付説明書に準じて封入体を回収した。この際、超音波処理を加え、リゾチーム（卵白リゾチーム、生化学工業社製）は最終濃度２００μｇ／ｍｌとした。【０１２３】
タンパク質の精製には、Ｈｉｓ−タグを利用したＮｉキレートクロマトグラフィを用いた。無細胞または大腸菌の発現系で発現した不溶性タンパク質を、溶解バッファー（８Ｍ尿素、５ｍＭイミダゾール、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％ＮＰ−４０を添加したダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ））で可溶化した。溶解したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Qiagen社製）に結合し、４０容量の溶解バッファーで洗浄した。さらに、４０容量の洗浄バッファー（ＮＰ−４０を除いた溶解バッファー）で洗浄した後、溶出バッファー（８Ｍ尿素、３００ｍＭイミダゾール、２００ｍＭ  ＮａＣｌを添加したＰＢＳ）により、Ｈｉｓ−タグ付タンパク質を溶出し回収した。【０１２４】
その結果、無細胞系では１ｍｌの反応液から１．５ｍｇのタンパク質、大腸菌発現系では１００ｍｌの培養から９．０ｍｇのタンパク質が最終的に得られた。【０１２５】
実施例５：抗原の免疫ならびに血清の調製 
緑膿菌はＰＡ１０３菌株（ＡＴＣＣ２９２６０）をミューラーヒントン寒天培地上にて一晩３７℃で培養し、数個のコロニーをＬＢ培地に懸濁後、一晩３７℃で振とう培養し、ＰＢＳで洗浄、再懸濁した後、１％となるようにホルマリンを加え、２４時間以上不活化処理した不活化菌を使用した。【０１２６】
ＰＡ５１５８組換えタンパク質による免疫は１００μｇ／ｍｌとなるよう８Ｍ尿素溶液に溶解して用いた。【０１２７】
ＰＡ５１５８タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列は、ＰＡ５１５８タンパク質と相同性の高い緑膿菌ＰＡ０４２７（ＯｐｒＭ）タンパク質の立体構造情報（J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819）と、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質の立体構造情報（Nature, 2000, 405, 914-919）とＰＡ５１５８タンパク質の２次構造から得られる情報を基に独自に推測した。推測したアミノ酸配列（配列番号：５、配列番号：６）を含むペプチドの合成はＦｍｏｃを用いる固相合成法を用いた。配列番号：５および配列番号：６の、各アミノ酸配列のアミノ末端にシステイン残基を付加し、アミノ末端をアセチル化、カルボキシル末端をアミド化したペプチドを合成した。配列番号：５のアミノ酸配列を含む合成ペプチド（配列番号：１５）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ１６６４．２（計算値ｍ／ｚ  １６６３．９）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間１５．４６９分にエリア面積比８８．２５％のピークを与えた。また、配列番号：６のアミノ酸配列を含む合成ペプチド（配列番号：１６）は質量分析にて［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ１５４０．６（計算値ｍ／ｚ  １５３８．７）を与え、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間１２．５２４分にエリア面積比７６．４７％のピークを観測した。上記した合成ペプチドにスペーサーを介してＫｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ  （ＫＬＨ）とカップリングさせたコンジュゲートペプチドを調製した。スペーサーとしてはＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Pierce社製）を用いた。なお、ペプチド合成および、そのＫＬＨコンジュゲートペプチドの調製はThermo ELECTRON社に委託した。【０１２８】
ＫＬＨコンジュゲートペプチドよる免疫は１００μｇ／ｍｌとなるよう８Ｍ尿素溶液に溶解して用いた。免疫方法としては雄性ＢＮラット（日本チャールスリバー社より購入）あるいは雌性ニュージーランドホワイトウサギ（日本チャールスリバー社より購入）の皮下あるいは筋肉内に初回のみフロインドの完全アジュバントとともに、２回目以降は不完全アジュバントとともに２週間間隔で、計６回免疫した。ホルマリン不活化菌、ＰＡ５１５８組換えタンパク質、実施例５に記載のＫＬＨコンジュゲートペプチドをそれぞれ２０μｇ／ａｎｉｍａｌで免疫した。最終免疫の１週間後、腹部大動脈あるいは頚動脈からの全採血を行い、室温１時間放置後、遠心分離（１５００Ｇ、２０分間）を行い、上清を血清としてラット１匹あたり約５ｍｌ、ウサギ１羽あたり約５０ｍｌを得た。【０１２９】
実施例６：抗血清からのＩｇＧ画分の精製 
ラット及びウサギ抗血清からのＩｇＧ画分の精製は、McCauley R & Racker, E ; Molecular and Cellular Biochemistry 1, 73-81 (1973)らの方法に従った。氷冷飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ８）を４３（ｖ／ｖ）％になるように添加し、得られた懸濁液を室温で１５分間攪拌した。１０，０００ｘｇで２０分間遠心することにより沈殿を回収し、１０％グリセロールを添加した１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）に溶解後、氷冷飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ８）を５０（ｖ／ｖ）％になるように添加し再度沈殿を析出させることにより２回洗浄を行った。沈殿を、１０％グリセロール添加した１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、次いで該緩衝液に対して一夜透析した。遠心後、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ  （東ソー社製））に添加し、２８０ｎｍの紫外吸収を測定することにより素通り容積をＩｇＧ画分として回収した。最終標品は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  （Millipore社製）を用い濃縮し、最終的にＰＢＳ（−）溶液に交換した。ラット抗血清は３ｍｌ、ウサギ抗血清は１５ｍｌより精製を行い、ＩｇＧ画分としてそれぞれ３．０〜８．０ｍｇおよび３０〜５０ｍｇタンパクを得た。タンパク定量はＬｏｗｒｙ法に基づくＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Bio-Rad社製）、ＩｇＧの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。【０１３０】
また、別法としてウサギ抗血清からのＩｇＧ画分の精製には、ＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティカラムクロマトグラフィーを使用した。方法は、ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ  （Amersham社製）に添付されている取扱説明書に従った。ウサギ抗血清を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラムに添加し、同緩衝液で洗浄した。溶出は、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で行い、分画チューブに１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）を１／２０容量入れておくことにより直ちに中和した。２８０ｎｍの紫外吸収を測定することにより回収容量を決定し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  （Millipore社製）を用い濃縮後、最終的にＰＢＳ（−）溶液に交換し最終標品とした。ウサギ抗血清１０ｍｌより精製を行い、ＩｇＧ画分として約６０ｍｇタンパクを得た。タンパク定量はＬｏｗｒｙ法に基づくＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Bio-Rad社製）、ＩｇＧの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。【０１３１】
実施例７：Ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ試験
Ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡは、ＬＢ培地で培養したＰＡ１０３菌株の菌液をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｔｙｐｅ，NUNC社製）に分注し４℃で固相化後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳで洗浄し、２％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳによるブロッキング後、１次抗体サンプルとして、生理食塩水で希釈した実施例５で得られた血清または精製ＩｇＧ画分を加え、３７℃で１時間反応させて行った。洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（５０００倍希釈、Sigma社製）あるいはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（５０００倍希釈、Sigma社製）を用い、発色基質（ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、KPL社製）を添加して反応後、０．１８Ｍ硫酸で酵素反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１３２】
その結果、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清については、陰性対照である免疫前ラット血清（１００倍希釈）の吸光度が０．０３１であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫したラット血清（１００倍希釈）では０．３９９であった。これはＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清中に、菌体表面に露出するＰＡ５１５８タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（ＩｇＧ）が含まれていることを示している。【０１３３】
また、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ウサギ血清から得られた精製ＩｇＧ画分については、陰性対照であるウサギｓｈａｍ血清から精製したＩｇＧ画分（５μｇ／ｍｌ）の吸光度が０．１５であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫したウサギ血清から精製したＩｇＧ画分（５μｇ／ｍｌ）では、０．９９０であった。これは該ＩｇＧ画分中に、細胞表面に露出するＰＡ５１５８タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（ＩｇＧ）が含まれていることを示している。【０１３４】
さらに、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清から得られた精製ＩｇＧ画分については、陰性対照であるラットｓｈａｍ血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）の吸光度が０．１３２であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫したラット血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）では、０．３７０であった。また、配列番号：１６のＫＬＨコンジュゲートペプチドを免疫したラット血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）については、０．３２２であった。これは該ＩｇＧ画分中に、細胞表面に露出するＰＡ５１５８タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（ＩｇＧ）が含まれていることを示している。【０１３５】
なお、同じ条件の下で、緑膿菌と同じグラム陰性菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，  ＡＴＣＣ２５９２２）を用いてｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを実施した結果、陰性対照であるラットｓｈａｍ血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）の吸光度が０．１１８であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫したラット血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）では０．０９０、配列番号：１６のＫＬＨコンジュゲートペプチドを免疫したラット血清から精製したＩｇＧ画分（５０μｇ／ｍｌ）では０．０７２であった。これは該ＩｇＧ画分中には、大腸菌の細胞表面に露出する抗原を認識する抗体（ＩｇＧ）が含まれていないことを示している。したがってこの結果は、該ＩｇＧ画分を緑膿菌の検出に用いることができることを示している。【０１３６】
実施例８：  ＥＬＩＳＡ試験
（１）ＰＡ５１５８組換えタンパク質に結合する抗体の検出
ＰＡ５１５８組換えタンパク質に結合する抗体をＥＬＩＳＡ法で検出するため、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を、８Ｍ尿素を添加したＰＢＳに溶解し、９６穴ニッケルプレート（ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  （ＨＳ）  Ｎｉｃｋｅｌ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ、Sigma社製）にウェルあたり０．５μｇのタンパク質を入れ、室温で１時間置いてプレートに結合させた。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭイミダゾールおよび５００ｍＭ  ＮａＣｌを添加したＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキングバッファー（０．５％ゼラチンを添加した洗浄バッファー）でブロッキング後、実施例５で得られた抗体を含む試料をウェルに入れ、３０分間反応後に洗浄し、２次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、１００００倍希釈、Sigma社製）を入れ、３０分間反応後に洗浄した。発色基質（ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、KPL社製）を入れて反応後、１Ｍリン酸で酵素反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１３７】
その結果、陰性対照である免疫前血清（１０，０００倍希釈）では０．０５８であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清（１０，０００倍希釈）では０．４１０であった。これはＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清中に、免疫原としたＰＡ５１５８組換えタンパク質に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１３８】
また、陰性対照であるアジュバントのみを投与したラットから得られた血清より精製したラットｓｈａｍ  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）では吸光度は０．１９０であったが、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）では吸光度は２．９１８であった。これはラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ中に、免疫原としたＰＡ５１５８組換えタンパク質に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１３９】
（２）ＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域ペプチドに結合する抗体の検出
ＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域ペプチド（配列番号：５、配列番号：６）に結合する抗体をＥＬＩＳＡ法で検出するため、実施例５で合成したペプチドを炭酸バッファー（０．１５％Ｎａ２ＣＯ３、０．３％ＮａＨＣＯ３）に溶解し、９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）にウェルあたり１μｇあるいは２μｇのペプチドを入れ、４℃で一晩置いてプレートに吸着させた。ＰＢＳで洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳでブロッキング後、実施例５で得られた抗体を含む試料を希釈してウェルに入れ、１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した。２次抗体をウェルに入れて３０分間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した。上記と同様に発色し、吸光度を測定した。【０１４０】
その結果、陰性対照である免疫前血清（１００倍希釈）では、ＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域ペプチド（配列番号：５）１μｇをコートしたウェルの吸光度が０．０５３であったのに対し、ＰＡ５１５８組換えタンパク質を免疫したラット血清（１００倍希釈）では、吸光度が０．４４５であった。これは該血清中に、ＰＡ５１５８タンパク質の細胞外ペプチド（配列番号：５）に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１４１】
また、陰性対照であるアジュバントのみを投与したラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラットｓｈａｍ  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）では、ＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域ペプチド（配列番号：５）２μｇをコートしたウェルの吸光度が０．１３５であったが、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）では吸光度は０．３６８であった。これはラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ中に、ＰＡ５１５８タンパク質の細胞外ペプチド（配列番号：５）に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１４２】
さらに、ＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域ペプチド（配列番号：６）に結合する抗体の検出には、該タンパク質の水溶性を向上させるためにＮ末端に６個のアミノ酸を付加したペプチド（配列番号：１７）を、１ウェルあたり２μｇコートして用いた。【０１４３】
その結果、陰性対照であるアジュバントのみを投与したラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラットｓｈａｍ  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）では、吸光度が０．１６０であったが、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）では吸光度は０．５８９であった。これはラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ中に、ＰＡ５１５８タンパク質の細胞外ペプチド（配列番号：６）に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１４４】
実施例９：ＰＡ１０３菌株感染に対するＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清の感染防御能
４週齡のＣＤ−１マウス（日本チャールズリバー社より購入）に５％ムチン含有生理食塩水１００μｌに懸濁したＰＡ１０３菌株の生菌１．０ｘ１０５ｃｆｕ／マウス（２０ＬＤ５０）を腹腔内に投与し、直後にＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清（血清サンプルは全て生理食塩水で２．５倍希釈した）を１０ｍｌ／ｋｇで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１４５】
その結果、陰性対照のラットｓｈａｍ血清では７匹中５匹のマウスが死亡したが、ホルマリン不活化ＰＡ１０３菌株を免疫したウサギ血清投与群では全例生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清投与群は７匹中６匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１４６】
実施例１０：好中球減少マウスにおけるＰＡ１０３菌株感染に対するＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清の感染防御能
Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（以下、ＣＹとする。Sigma-Aldrich社製）の１２．５ｍｇ／ｍｌ（生理食塩水）を調製し、４週齡のＣＤ−１マウスに１２５ｍｇ／ｋｇの割合でｄａｙ  −５、−２、０に腹腔内投与して末梢血中の好中球を減少させた。その後、ＰＡ１０３菌株の生菌１．８３  ｘ  １０５  ｃｆｕ／マウス（１３６ＬＤ５０）を腹腔内に投与し、直後にＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清（血清サンプルは全て生理食塩水で２．５倍希釈した）を１０ｍｌ／ｋｇで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１４７】
その結果、陰性対照のラットｓｈａｍ血清では７匹中全例死亡したが、ホルマリン不活化ＰＡ１０３菌株を免疫したラット血清投与群では７匹中４匹生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清投与群は７匹中３匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１４８】
実施例１１：好中球減少マウスにおける多剤耐性緑膿菌感染に対するＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清の感染防御能
各種抗菌剤の多剤耐性緑膿菌ＭＳＣ０６１２０菌株に対する最小発育阻止濃度は、イミペネム：３２μｇ／ｍｌ、アミカシン：６４μｇ／ｍｌ、シプロフロキサシン：＞２５６μｇ／ｍｌであった。ＣＹの１２．５ｍｇ／ｍｌ（生理食塩水）を調製し、４週齡のＣＤ−１マウスに１２５ｍｇ／ｋｇの割合でｄａｙ  −５、−２、０に腹腔内投与して末梢血中の好中球を減少させた。その後、ＭＳＣ０６１２０菌株の生菌１．２３ｘ１０５  ｃｆｕ／マウス（１１ＬＤ５０）を腹腔内に投与し、直後にＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清（血清サンプルは全て生理食塩水で２．５倍希釈した）を１０ｍｌ／ｋｇで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１４９】
その結果、陰性対照のラットｓｈａｍ血清では７匹中５匹死亡したが、ホルマリン不活化ＰＡ１０３菌株を免疫したラット血清投与群では７匹中６匹生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清投与群は７匹中６匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１５０】
実施例１２：好中球減少マウスにおける多剤耐性緑膿菌感染に対するラット抗ＰＡ５１５８抗体の感染防御能
ＭＳＣ０６１２０菌株の生菌１．１８ｘ１０５  ｃｆｕ／マウス（１０ＬＤ５０）を腹腔内に投与し、直後にＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧを尾静脈より１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１５１】
その結果、陰性対照のラットｓｈａｍ  ＩｇＧ  １ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与群では７匹中４匹死亡したが、ホルマリン不活化ＰＡ１０３菌株を免疫したラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ１０３菌株  ＩｇＧ投与群では７匹中全例生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ投与群は７匹中６匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１５２】
実施例１３：モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製
調製したＰＡ５１５８組換えタンパク質の実施例５における最終免疫１週間後，麻酔下、無菌的に脾臓を摘出した。得られた脾臓をＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco社製）で洗浄した後、スライドグラスに脾臓を挟み、すり潰し微小片として供試脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で１２００ｒｐｍ５分間遠心し洗浄した。一方１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で５％ＣＯ２、相対湿度１００％、３７℃で予め培養して対数増殖期にあるミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１細胞）をＲＰＭＩ−１６４０培地で遠心洗浄し、先に述べた脾細胞とミエローマ細胞の比が４：１程度になるように混合した。混合した細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て細胞を充分にほぐした。この細胞を含む遠心管にポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．  １０００  和光純薬社製）２ｇ、ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬおよびＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）０．２ｍＬからなる溶液１ｍＬを静かに加え、遠心管をゆっくり回転させ細胞を混合させた。一分後、遠心管をゆっくり回転させながらＲＰＭＩ−１６４０培地１５ｍＬを３分かけ加えた。１０００ｒｐｍで７分間遠心後、上清を捨て充分に細胞をほぐした後、脾細胞として１．６×１０６／ｍＬとなるようＨＡＴ培地（Gibco社製）にて調整し、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に０．２ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２、相対湿度１００％、３７℃で約１〜２週間培養後、ウェル中に生育しているハイブリドーマが顕微鏡下で観察された。【０１５３】
（１）目的抗体のスクリーニング
緑膿菌の細胞表面に結合する抗体を実施例７に記載したｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法で検出した。また、ＰＡ５１５８組換えタンパク質またはＰＡ５１５８タンパク質の推定細胞外領域（配列番号：５、配列番号：６）に結合する抗体を実施例８に記載したＥＬＩＳＡ法で検出した。【０１５４】
（２）目的抗体産生細胞のクローニング
ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を２×１０７／ｍＬになるよう１０％ＦＣＳ／ＨＴ培地にて調整し、０．１ｍＬ／ウェルになるよう９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に分注し５％ＣＯ２、相対湿度１００％、３７℃で一晩培養した。翌日スクリーニングの結果、目的抗体を産生していると判定されたハイブリドーマを５個／０．１ｍＬとなるよう１０％ＦＣＳ／ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地にて調整し、その前日に胸腺細胞を分注したウェルに０．１ｍＬずつ分注した。１〜２週間後にクローンの生育が顕微鏡下で観察できた。スクリーニングの項で述べた方法で分析し、目的抗体を産生しているクローンを選択した。再度上記の方法でハイブリドーマとして１個／０．１ｍＬとなるよう１０％ＦＣＳ／ＨＴ（Gibco社製）培地にて調整したハイブリドーマを、その前日に胸腺細胞を分注したウェルに０．１ｍＬずつ分注した。１〜２週間後にスクリーニングの項で述べた方法で分析し目的の抗体を産生する単クローン
を選択した。【０１５５】
（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏによる細胞の培養およびＭＡｂの産生
９６穴マイクロプレートで充分増殖させた目的クローンは２４穴プレート、５０ｍＬ、２５０ｍＬフラスコに徐々にスケールアップして１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で培養した。このようにして得られた細胞の培養上清に産生されているＭＡｂを実施例８に記載したＥＬＩＳＡ法で検出した。【０１５６】
その結果、緑膿菌ＰＡ０４２７（ＯｐｒＭ）タンパク質の立体構造情報（J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819）と、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質の立体構造情報（Nature, 2000, 405, 914-919）とＰＡ５１５８タンパク質の２次構造から得られる情報より推定した細胞外領域である配列番号：５を含む実施例５の合成ペプチド（配列番号：１５）を吸着したウェルへの結合を検出するＥＬＩＳＡでの吸光度が、陰性対照である１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地では０．０５３であったのに対し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２であるハイブリドーマの培養上清は、吸光度が０．９０３であったことから、該ペプチドに結合するＭＡｂが産生されていることが明らかとなった。【０１５７】
実施例１４：アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強
ＰＡ５１５８タンパク質は、アミノグリコシド系抗生物質の耐性化に直接関与する排出ポンプを構成する外膜タンパク質であることが報告されており（Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47, 1101-1111）、本タンパク質を欠損させた変異株においては、アミノグリコシド系抗生物質に対する感受性が増加する。そこで我々が得た本タンパク質を認識する種々の抗体に、アミノグリコシド系抗生物質排出ポンプに対する阻害作用があるかどうか試験した。【０１５８】
緑膿菌ＰＡ１０３菌株（ＡＴＣＣ２９２６０）をミューラーヒントン液体培地にて一晩３７℃で振とう培養し、１ｘ１０５  ｃｆｕ／ｍｌとなるよう同培地で希釈した後、再び３７℃で振とう培養を開始し、２時間後にゲンタマイシンを０．１２５μｇ／ｍｌとなるよう加えた。同時に陰性対照群はＰＢＳを、抗体添加群は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７２のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であるラット抗ＰＡ５１５８Ｌ１  ＩｇＧ、配列番号：６のＫＬＨコンジュゲートペプチド免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８Ｌ２  ＩｇＧ、ＰＡ５１５８組換えタンパク質免疫ラット血清より精製したＩｇＧ画分であるラット抗ＰＡ５１５８  ＩｇＧ、をそれぞれ３００μｇ／ｍｌとなるよう加えた。その後４時間３７℃で振とう培養し、それぞれの生菌数を測定した。【０１５９】
その結果、コントロール群では１．０５ｘ１０８  ｃｆｕ／ｍｌまで増殖していたのに対し、陰性対照群では５．４ｘ１０６  ｃｆｕ／ｍｌであった。さらに、抗体添加群では、それぞれ６．４ｘ１０５  ｃｆｕ／ｍｌ、７．５ｘ１０５  ｃｆｕ／ｍｌ、６．３ｘ１０５  ｃｆｕ／ｍｌと、いずれも陰性対照群より生菌数が減少しており、各抗体に、アミノグリコシド抗生物質であるゲンタマイシンの抗菌力を増強する効果が認められた。【０１６０】
いずれの抗体もアミノグリコシド系抗生物質排出ポンプを構成するＰＡ５１５８タンパク質およびその配列の一部に結合できる性質を持つことから、本アミノグリコシド抗生物質の抗緑膿菌活性増強効果は、本排出ポンプを阻害することに起因する効果であることが推測された。
【図１】
2007049770.tif 000004
【配列表】
2007049770000001.app
【国際調査報告】
2007049770.tif 000005
2007049770.tif 000006
2007049770.tif 000007
2007049770.tif 000008
2007049770.tif 000009
2007049770.tif 000010
2007049770.tif 000011