【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−インテインポリペプチドを含む第２の融合タンパク質との結合により、活性インテイン複合体を形成することができるＮ−インテインポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質であって、Ｎ−インテインポリペプチドは、固体支持体に共有結合され得る、可溶性融合タンパク質。
【請求項２】
前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項３】
前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項１又は２に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項４】
固体支持体に任意に共有結合により結合されるＮ−インテインポリペプチドを含むマトリックス。
【請求項５】
前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項４に記載のマトリックス。
【請求項６】
前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、請求項５に記載のマトリックス。
【請求項７】
前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項４〜６いずれかに記載のマトリックス。
【請求項８】
前記固体支持体が、磁気ビーズである、請求項７に記載のマトリックス。
【請求項９】
前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、請求項４〜８いずれかに記載のマトリックス。
【請求項１０】
ａ）ペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質；及び
ｂ）固体支持体に任意に共有結合により結合されるＮ−インテインポリペプチドを含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス
を含む、分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１１】
前記Ｎ−インテインポリペプチドは、ペプチド結合により結合したＮ−インテインとＮ−インテイン可溶化パートナーを含む第２の融合タンパク質として存在する、請求項１０に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１２】
前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項１０又は１１に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、請求項１２に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１４】
前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項１０〜１３いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１５】
前記固体支持体が、磁気ビーズである、請求項１４に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１６】
前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、請求項１０〜１５いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１７】
前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスが、前記融合タンパク質と固体支持体の間にスペーサ分子をさらに含む、請求項１１〜１６いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーの単一部位で前記固体支持体に結合される、請求項１１〜１７いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーの２つ以上の部位で前記固体支持体に結合される、請求項１１〜１７いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
【請求項２０】
サンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法であって、
ａ）ペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を含有するサンプルを提供するステップ；
ｂ）前記第１の融合タンパク質中の前記Ｃ−インテインポリペプチドが、Ｎ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、請求項１に規定されるＮ−インテインを含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップ；
ｃ）不活性インテイン複合体を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ；
ｄ）前記インテイン複合体が活性となり、前記Ｃ−インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ；及び
ｅ）切断された標的分子を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステムを使用して標的分子を精製する方法であって、
ａ）ペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を含有するサンプルを提供するステップ；
ｂ）前記第１の融合タンパク質中の前記Ｃ−インテインポリペプチドが、Ｎ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、Ｎ−インテインを含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップ；
ｃ）不活性インテイン複合体を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ；
ｄ）前記インテイン複合体が活性となり、前記Ｃ−インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ；及び
ｅ）切断された標的分子を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２２】
前記第１の融合タンパク質中の前記Ｃ−インテインポリペプチドが、前記第２の融合タンパク質中の前記Ｎ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、触媒として不活性のインテイン複合体を形成する条件が、
ａ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝９を含むバッファー；
ｂ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び５０ｍＭ  ＮａＡｃ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝５を含むバッファー；又は
ｃ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８を含むバッファー
を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記インテイン複合体の触媒活性を促進する条件が、
ａ）５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファー；
ｂ）０．３Ｍ  Ｌ−アルギニン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ＝６．５を含むバッファー；又は
ｃ）０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ＝８．０を含むバッファー
を含む、請求項２０〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、１５ｋＤａ未満の分子量、６０未満の脂肪族指数（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）値、及び−１未満の疎水度大規模平均値を有する、請求項２０〜２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、Ｎ−インテイン可溶化パートナー１３８（配列番号１５）又はその変異体である、請求項２０〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｎ−インテインポリペプチドが、ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン（配列番号１）又はその変異体であり、前記Ｃ−インテインポリペプチドが、ＧＰ４１−１Ｃ−インテイン（配列番号９）である、請求項２０〜２５いずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記標的分子が、治療標的に対するモノクローナル抗体であるか、又は前記標的分子が、治療標的である、請求項２０〜２６いずれかに記載の方法。
【請求項２８】
後の使用のために、前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスをクリーニング、再生又は保存するステップをさらに含む、請求項２０〜２７いずれかに記載の方法。
【請求項２９】
アフィニティ精製での使用に好適なインテイン複合体のスクリーニング方法であって、
ａ）第１の融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドがＮ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、ペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質と、請求項１に規定されるＮ−インテインを接触させるステップ；及び
ｂ）インテイン活性を支持する条件下で、前記標的分子が、前記Ｃ−インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップ、ここで、切断された標的分子の存在が、触媒活性インテイン複合体を示す、
を含む、方法。
【請求項３０】
ペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項３１】
前記標的分子が、治療標的に対するモノクローナル抗体であるか、又は前記標的分子が、治療標的である、請求項３０に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞により産生される、Ｃ−インテインポリペプチド及び標的分子を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、相補的なＮ−インテインポリペプチドと結合し得る、融合タンパク質。