(57)【要約】  本発明は、アレルギーを特異的に検出する検査系、並びにアレルギーの増悪を鋭敏に反映する検査系などを提供する。  より詳細には、本発明は、プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ばれる１以上のＣＨＤ２測定用手段を含む、診断用、特にアレルギーの診断用試薬、あるいは肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出用試薬；動物から採取された生体サンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定し、該動物のアレルギーを評価することを含む、アレルギーの検査方法、あるいは肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ばれる１以上のＣＨＤ２測定用手段を含む、診断用試薬。
【請求項２】
アレルギーの診断用試薬である、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
アレルギーの有無または程度の診断用試薬である、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
ヒトまたはイヌにおける診断用試薬である、請求項１記載の試薬。
【請求項５】
プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ばれる１以上のＣＨＤ２測定用手段を含む、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出用試薬。
【請求項６】
動物から採取された生体サンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定し、該動物のアレルギーを評価することを含む、アレルギーの検査方法。
【請求項７】
肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞を含むサンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定することを含む、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出方法。
【請求項８】
ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、医薬、試薬または食品。
【請求項９】
ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、アレルギー疾患、免疫疾患または寄生虫性疾患の予防・治療薬。
【請求項１０】
ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、肥満細胞および／またはＴ細胞の機能の調節剤。
【請求項１１】
被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、医薬、試薬または食品として有効な候補物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、アレルギー疾患、免疫疾患または寄生虫性疾患を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、肥満細胞および／またはＴ細胞の機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
以下からなる群より選ばれるいずれかの物質、細胞または動物：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその部分ペプチド；
（ｂ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはその部分ヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）の発現ベクター；
（ｄ）（ｃ）の発現ベクターが組み込まれた形質転換体；
（ｅ）ＣＨＤ２タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体；
（ｆ）ＣＨＤ２タンパク質またはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；
（ｇ）ＣＨＤ２に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、２以上のプライマーのセットまたは核酸プローブ；
（ｈ）ＣＨＤ２の発現が調節された細胞または動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー等の検査方法、診断用試薬等の試薬、医薬、食品、スクリーニング方法などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは近年、その患者数が増加していることから社会的に大きな問題となっている。その診断とそれに基づく適確な治療法の開発は社会的ニーズが大きい。アレルギーの診断はこれまでに主に感作抗原の同定（どんなアレルゲンにアレルギー反応を示すかを調べること）を目的に行われてきた。このような検査には、皮内反応あるいはプリックテスト、さらに血清中の抗原特異的ＩｇＥを測定する血清ＩｇＥ検査がある。皮内反応やプリックテストはスギ花粉抗原液などを患者皮膚に皮内注射あるいは傷に塗布して膨疹（注射部位の皮膚の腫れ）ができるかどうか調べることによって、アレルギー反応を起こす物質を見つける検査方法である。また、血清中ＩｇＥ検査は、血液中のＩｇＥがどんな物質に対して作られているかを調べる検査であり、ＩｇＥが作られた物質は体内でアレルギー反応を起こす物質と想定されるため、ＩｇＥが反応する物質はすなわちアレルゲンであると判定される。【０００３】
このように従来のアレルギーの検査はアレルゲンとなる物質を見つけるためには有用である。しかし、陽性と判定された物質はアレルギー反応を起こす可能性があると考えられるものの、実際にアレルギー症状を起こすかどうかは不明であり、さらに、これら検査結果は、過去にアレルギーを獲得したことを示すだけであって現在はその物質にアレルギー反応を起こしているかどうかは不明であることが問題であった。このようなことから、症状が類似するアレルギーと感染症（感冒、インフルエンザなど）の鑑別、さらにアレルギー反応が実際に起こっているかどうかの判断には、従来のアレルギー検査は無効であり、これらの判断は現場の臨床医の経験に任されているのが現状で客観的判断はされていない。従って、実際に起こっているアレルギーだけを感知する検査系（アレルギーを特異的に検出する検査）、さらにはアレルギーの増悪を鋭敏に反映する検査系の開発が求められている。【０００４】
ところで、クロマチンヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質２（chromodomain helicaseDNA binding protein 2：ＣＨＤ２）は、例えば、ヒト由来のものがGenBankアクセッション番号：NM_001271により登録されている。しかしながら、ＣＨＤ２について科学的に意義ある報告は何らなされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アレルギーを特異的に検出する検査系、さらにはアレルギーの増悪を鋭敏に反映する検査系などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＣＨＤ２がアレルギーを起こす主たる細胞である肥満細胞および幼若化（blastogenic）Ｔ細胞（本明細書中、活性化（activated）Ｔ細胞と同義である）に特異的に発現していることを見出した。肥満細胞および幼若化Ｔ細胞はアレルギーの病変部に顕著に認められることから、ＣＨＤ２の発現を観察することにより、肥満細胞および幼若化Ｔ細胞が関わるアレルギー反応の検出が可能になると考えられる。従って、ＣＨＤ２の発現検査系はアレルギーの診断およびモニター指標として有用であり得る。
本発明者らはまた、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質が、医薬、試薬または食品として有用であり得ること、特にアレルギー疾患または免疫疾患等の疾患の予防・治療、あるいは肥満細胞およびＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能、分化または増殖の調節に有用であり得ること、ならびにＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質のスクリーニングは、医薬、試薬または食品の開発、例えば、アレルギー疾患または免疫疾患等の疾患の予防・治療薬、あるいは肥満細胞およびＴ細胞の機能、分化または増殖を調節し得る物質の開発に有用であり得ることなどを見出した。【０００７】
以上の知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供する。
〔１〕プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ばれる１以上のＣＨＤ２測定用手段を含む、診断用試薬。
〔２〕アレルギーの診断用試薬である、上記〔１〕の試薬。
〔３〕アレルギーの有無または程度の診断用試薬である、上記〔１〕の試薬。
〔４〕ヒトまたはイヌにおける診断用試薬である、上記〔１〕の試薬。
〔５〕プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ばれる１以上のＣＨＤ２測定用手段を含む、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出用試薬。
〔６〕動物から採取された生体サンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定し、該動物のアレルギーを評価することを含む、アレルギーの検査方法。
〔７〕肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞を含むサンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定することを含む、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出方法。
〔８〕ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、医薬、試薬または食品。
〔９〕ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、アレルギー疾患、免疫疾患または寄生虫性疾患の予防・治療薬。
〔１０〕ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む、肥満細胞および／またはＴ細胞の機能の調節剤。
〔１１〕被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、医薬、試薬または食品として有効な候補物のスクリーニング方法。
〔１２〕被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、アレルギー疾患、免疫疾患または寄生虫性疾患を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法。
〔１３〕被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節するか否かを評価することを含む、肥満細胞および／またはＴ細胞の機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
〔１４〕以下からなる群より選ばれるいずれかの物質、細胞または動物：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその部分ペプチド；
（ｂ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはその部分ヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）の発現ベクター；
（ｄ）（ｃ）の発現ベクターが組み込まれた形質転換体；
（ｅ）ＣＨＤ２タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体；
（ｆ）ＣＨＤ２タンパク質またはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；
（ｇ）ＣＨＤ２に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、２以上のプライマーのセットまたは核酸プローブ；
（ｈ）ＣＨＤ２の発現が調節された細胞または動物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マウスの各種臓器におけるCHD2の発現を示す図である。
【図２】マウス肥満細胞におけるCHD2の発現を示す図である。
【図３】マウスT細胞、B細胞におけるCHD2の発現を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、アレルギー等の病態または疾患の検査（または診断）方法を提供する。【００１０】
一実施形態では、本発明の検査方法は、例えば、（ａ）動物から採取された生体サンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定し、（ｂ）該動物のアレルギーを評価することを含み得る。【００１１】
ＣＨＤ２（chromodomain helicase DNA binding protein 2）は、chromatin organization modifierドメインとSNF2 related helicase/ATPaseドメインにより特徴付けられるタンパク質ファミリーに属し、クロマチン構造を調節してＤＮＡの転写に影響を与えると考えられるタンパク質である。ＣＨＤ２の配列情報としては、各種動物由来のものがGenBankに登録されている。例えば、ヒトＣＨＤ２についてはGenBankアクセッション番号：NM_001271、マウスＣＨＤ２についてはGenBankアクセッション番号：XM_145698、イヌＣＨＤ２についてはGenBankアクセッション番号：XM_854029及びXM_536179、ラットＣＨＤ２についてはGenBankアクセッション番号：XM_218790、チンパンジーＣＨＤ２についてはGenBankアクセッション番号：XM_510607がGenBankに登録されている。【００１２】
上記（ａ）において、生体サンプルが採取され得る動物は、アレルギーを生じ得る任意の動物であり得る。本発明が適用され得る動物としては、例えば、霊長類、齧歯動物等の哺乳動物、あるいはペット、家畜、使役動物が挙げられる。より詳細には、本発明が適用され得る動物としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ラマが挙げられる。【００１３】
本発明において用いられ得る生体サンプルは、上述の動物、即ち、アレルギーが疑われる、および／またはアレルギーを有し得る動物から採取された生体サンプルであり得る。ＣＨＤ２の発現は、皮膚、肺、消化管等の外部環境に接する組織または臓器では認められないことから、このような組織または臓器においてＣＨＤ２の発現が認められた場合には、肥満細胞または幼若化Ｔ細胞が浸潤してアレルギー反応が生じていると考えられる。従って、生体サンプルは、ＣＨＤ２の発現が通常認められないこのような組織または臓器由来のサンプルであり得、例えば、鼻粘膜、口腔粘膜、皮膚、眼（例、結膜、角膜）、皮膚、気管、肺、消化管、膀胱、膣粘膜、尿道、耳垢（耳道）、喀痰等の粘液等の組織または臓器由来のサンプルが挙げられる。なお、侵襲性が低いという観点からは、上記のうち、鼻粘膜、口腔粘膜、皮膚、眼、膣粘膜、耳垢、喀痰等の粘液などの組織由来のサンプルが好ましい。【００１４】
本発明の検査方法の対象となり得るアレルギーは、生体が曝され得る、生体が摂取し得る、または生体に適用され得る物質または組成物により生じるものである限り特に限定されない。このような物質または組成物としては、例えば、花粉（例、スギ、ヒノキ、ブタクサ、シラカバ、牧草）、食品（例、牛乳、そば、卵、ピーナッツ、カニ、エビ、果物、ごま、そば、小麦、米、とうもろこし、肉類またはそれらの加工品）、ヒト以外の生物またはその由来物（例、ダニ、ゴキブリ、またはイヌ、ネコ、ウサギ等の動物またはオウム、インコ等の鳥類の体毛、糞便、尿、フケ）、薬物（例、ペニシリン等の抗生物質、アスピリン等の抗炎症薬、セボフルレン等の吸入麻酔薬、皮膚外用薬）、医療用品（例、喘息患者に対する気管支洗浄液、歯科用品）、生活用品（例、化粧品、整髪料、クリーム、洗剤、塗料、殺虫剤、アクセサリー）、その他の物質または組成物など（例、ラテックス、ホルムアルデヒド、ニッケル等の金属、樹脂、日光）が挙げられる。以下、このような物質または組成物を、必要に応じてアレルゲンと省略する。【００１５】
なお、本発明の検査方法の対象となり得るアレルギーは、肥満細胞およびＴ細胞が関与するアレルギーであるＩ型およびＩＶ型アレルギーであり得る。従って、これらのアレルギーを、ＩＩ型およびＩＩＩ型アレルギーと鑑別することが可能である。【００１６】
ＣＨＤ２の発現の測定は、ＣＨＤ２遺伝子の転写産物またはＣＨＤ２タンパク質を対象として自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＣＨＤ２遺伝子の転写産物の発現量は、生体サンプルからのtotal ＲＮＡの調製後、ＰＣＲ（例、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例えば、WO00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例えば、WO00/56877参照）等の遺伝子増幅法、あるいはノザンブロッティング、マイクロアレイなどにより測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、生体サンプルからの抽出液の調製後、免疫学的手法により測定され得る。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。ＣＨＤ２の発現の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、質量分析法が挙げられる。【００１７】
上記（ｂ）において、ＣＨＤ２の発現の測定結果に基づき、動物におけるアレルギーが評価され得る。動物におけるアレルギーの評価は、種々の観点より行うことができる。【００１８】
例えば、動物におけるアレルギーの評価は、アレルギー反応の有無の観点より行われ得る。ＣＨＤ２の発現が通常認められない組織または臓器由来のサンプルにおいてＣＨＤ２の発現が認められた場合、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞が当該組織または臓器に浸潤していると考えられる。従って、このような組織または臓器においてＣＨＤ２の発現が確認された場合には、アレルギー反応が現に生じていると考えられる。これらの理由により、本発明の検査方法は、現に生じているアレルギーを検知できる、診断特異度が高い、高感度である等の利点を有する。【００１９】
アレルギー反応の有無の評価はまた、アレルギー様症状を有する動物を対象として行うことも有益である。このような態様では、アレルギー様症状を有する動物において、該症状が本当にアレルギーに起因するものであるか否かが評価され得る。換言すれば、アレルギー様症状を示す疾患とアレルギーとの鑑別が可能である。これは、アレルギー様症状を示す疾患の多くは、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞が組織または臓器に浸潤し得ないことに起因する。本発明の検査方法によりアレルギーとの鑑別が可能である、アレルギー様症状を示す疾患は、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞が組織または臓器に浸潤し得ない疾患である限り特に限定されないが、例えば、感染症（例、感冒、インフルエンザ、真菌症、ブドウ球菌感染症、風疹等の皮膚ウイルス感染症）、自己免疫疾患（例、膠原病）、異物、腫瘍、乾癬、シックハウス症候群、寄生虫性疾患が挙げられる。【００２０】
動物におけるアレルギーの評価はまた、アレルギー反応の程度の観点より行われ得る。アレルギー反応の程度は、組織または臓器に浸潤する肥満細胞数および／または幼若化Ｔ細胞数、ひいては当該組織または臓器由来の生体サンプルにおけるＣＨＤ２の発現量に相関し得ると考えられるため、ＣＨＤ２の発現量に基づきアレルギー反応の程度を評価することが可能である。従って、本発明の検査方法は、例えば、抗アレルギー療法（例、減感作療法）における治療効果のモニタリングに有用である。【００２１】
別の実施形態では、本発明の検査方法は、例えば、Ｔ細胞および肥満細胞の発生、分化、成熟に関連する検査（例、免疫疾患の検査、免疫療法等のモニタリング）に有用である。【００２２】
本発明はまた、診断用試薬を提供する。【００２３】
本発明の試薬は、例えば、ＣＨＤ２測定用手段を含み得る。ＣＨＤ２測定用手段は、ＣＨＤ２の発現の測定が可能である限り特に限定されないが、例えば、プライマー、核酸プローブ、抗体が挙げられる。本発明はまた、このようなＣＨＤ２測定用手段自体をも提供する。本発明の試薬は、例えば、本発明の検査方法を簡便に行うことを可能にする。【００２４】
本発明の試薬に含まれ得るプライマーは、ＣＨＤ２遺伝子の増幅および検出を可能とする限り特に限定されない。例えば、プライマーのサイズは、少なくとも約１２ｂｐ以上、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１６〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約１８〜３５ｂｐであり得る。また、遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の試薬に含まれ得るプライマー数は特に限定されないが、例えば、本発明の試薬は、２以上のプライマーを含み得る。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。このようなプライマーは、自体公知の方法により作製できる。【００２５】
本発明の試薬に含まれ得る核酸プローブは、ＣＨＤ２遺伝子の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、ＣＨＤ２遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば約１５ｂｐ以上、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。核酸プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは、自体公知の方法により作製できる。【００２６】
本発明の試薬に含まれ得る抗体は、ＣＨＤ２タンパク質に特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ＣＨＤ２タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。抗体は、自体公知の方法により作製できる。【００２７】
例えば、ポリクローナル抗体は、ＣＨＤ２タンパク質あるいはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。【００２８】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作製できる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1、P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。【００２９】
ＣＨＤ２測定用手段は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供され得る。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。【００３０】
本発明の試薬は、ＣＨＤ２測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。例えば、ＣＨＤ２測定用手段が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含み得る。このようなキットはまた、ポジティブコントロール（例、ＣＨＤ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその部分ヌクレオチド、ＣＨＤ２タンパク質またはその部分ペプチド）を含み得る。【００３１】
より詳細には、本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、ＣＨＤ２測定用手段の種類に応じたさらなる構成要素を含み得る。例えば、ＣＨＤ２測定用手段がプライマーである場合、キットは、逆転写酵素、核酸抽出液をさらに含み得る。ＣＨＤ２測定用手段が核酸プローブである場合、キットは、核酸抽出液をさらに含んでいてもよい。ＣＨＤ２測定用手段が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出用試薬をさらに含んでいてもよい。【００３２】
また、本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、動物から生体サンプルを採取し得る手段をさらに含み得る。動物から生体サンプルを採取し得る手段は、動物から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、非生検器具（例、綿棒、メス、テープ等の細胞採取用具、あるいは水疱、膿疱からの内溶液採取用具（例、注射針））、生検器具（例、生検針）などが挙げられる。【００３３】
本発明は、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出方法を提供する。【００３４】
本発明の検出方法は、例えば、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞を含むサンプルにおいてＣＨＤ２の発現を測定することを含み得る。本発明の検出方法は、例えば、上述した検査方法に準じてインビトロで行うことができる。本発明の検出方法は、例えば、上述した検査方法に有用である。【００３５】
本発明の検出方法はまた、アレルギーを誘発し得ない、またはアレルギーを誘発し得る物質または組成物（例、食品、飲料水）のスクリーニングに有用であり、アレルギーを誘発し得ない物質または組成物の開発、あるいはアレルギーを誘発し得る物質または組成物の同定を可能とする。この場合、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞を含むサンプルとして、被験物に曝された、被験物を摂取した、または被験物が適用された上述の動物由来の生体サンプル（生体サンプルａ）が使用され得る。この場合、被験物は、生体が曝され得る、生体が摂取し得る、または生体に適用（例、投与）され得る物質または組成物である限り特に限定されない。このような態様では、本発明の検出方法は、生体サンプルａにおけるＣＨＤ２の発現の測定後、被験物がアレルギーを誘発し得るか否かを評価することを含み得る。被験物としては、例えば、後述するものが使用できる。【００３６】
本発明の検出方法はさらに、アレルギーを抑制し得る物質または組成物（例、食品、飲料水）のスクリーニングに有用であり、アレルギーを抑制し得る物質または組成物の開発を可能とする。この場合、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞を含むサンプルとして、アレルゲンに曝された、アレルゲンを摂取した、またはアレルゲンが適用され、かつ被験物に曝された、被験物を摂取した、または被験物が適用された上述の動物由来の生体サンプル（生体サンプルｂ）が使用され得る。この場合、被験物は、生体が曝され得る、生体が摂取し得る、または生体に適用され得る物質または組成物である限り特に限定されない。このような態様では、本発明の検出方法は、生体サンプルｂにおけるＣＨＤ２の発現の測定後、被験物が、アレルゲンにより誘発され得るアレルギーを抑制し得るか否かを評価することを含み得る。被験物としては、例えば、後述するものが使用できる。【００３７】
本発明はまた、肥満細胞および／または幼若化Ｔ細胞の検出用試薬を提供する。本発明の検出用試薬は、上述した１以上のＣＨＤ２測定用手段を含み得る。本発明の検出用試薬は、例えば、上述した診断用試薬に準じて作製、使用できる。本発明の検出用試薬はまた、本発明の検出方法を簡便に行うことを可能とする。【００３８】
本発明は、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質を含む剤（または組成物）を提供する。本発明はまた、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質自体をも提供する。ＣＨＤ２の生物学的役割についてはこれまで何ら報告がないが、本発明者らは、ＣＨＤ２が肥満細胞および幼若化Ｔ細胞において特異的に発現していることから、肥満細胞およびＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）において重要な役割を果たし得ることを見出した。【００３９】
一実施形態では、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質は、ＣＨＤ２の発現を促進する物質であり得る。なお、本明細書で使用される場合、ＣＨＤ２の発現の促進としては、ＣＨＤ２（タンパク質）自体の補充をも含むものとする。ＣＨＤ２の発現を促進する物質としては、例えば、ＣＨＤ２（タンパク質）、ＣＨＤ２をコードする核酸を含む発現ベクター（ＣＨＤ２発現ベクター）、低分子化合物が挙げられる。【００４０】
本発明の剤に含まれ得るＣＨＤ２は、上述の動物由来の天然ＣＨＤ２またはその変異体であり得るが、好ましくはヒト由来の天然ＣＨＤ２またはその変異体であり得る。ＣＨＤ２は、肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能、あるいはその分化または増殖を調節（例、促進または抑制）し得る限り、あるいはchromatin organization modifierドメインまたはSNF2 related helicase/ATPaseドメインの機能（例、ＤＮＡ結合能）を保持し得る限り、そのコードするアミノ酸配列（例、配列番号１で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列）において１以上のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。【００４１】
より詳細には、本発明の剤に含まれ得るＣＨＤ２は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するものであり得る。同一性（％）は自体公知の方法により決定できる。例えば、同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。同一性（％）は、上記の任意の方法で決定されたものであれば構わないが、好ましくは計算に際して、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法が採用され得る。ＣＨＤ２の部分ペプチドは、所定の有用性（例、免疫原性）を示し得る長さである限り特に限定されず、例えば、少なくとも約８個以上、好ましくは約１０個以上、より好ましくは約１２個以上の連続するアミノ酸からなり得る。【００４２】
本発明の剤に含まれ得るＣＨＤ２はまた、天然のＣＨＤ２発現細胞から回収され得るタンパク質、または組換えタンパク質であり得る。ＣＨＤ２は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）天然のＣＨＤ２発現細胞からＣＨＤ２を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＣＨＤ２発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＣＨＤ２を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＣＨＤ２を合成してもよい。ＣＨＤ２は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＣＨＤ２抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。【００４３】
本発明の剤に含まれ得るＣＨＤ２発現ベクターに挿入される、ＣＨＤ２をコードするポリヌクレオチドは、上記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するものであり得る。ＣＨＤ２発現ベクターに挿入される上記ポリヌクレオチドはまた、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1% SDS／50〜65℃での１回または２回以上の洗浄が挙げられる。ＣＨＤ２をコードするポリヌクレオチドの部分ヌクレオチドは、例えば、少なくとも約１５または１６個以上、好ましくは約１８個以上、より好ましくは約２０個以上の長さであり得る。【００４４】
別の実施形態では、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質は、ＣＨＤ２の発現を抑制する物質であり得る。ＣＨＤ２の発現を抑制する物質としては、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ＣＨＤ２に対する転写活性化因子が結合する領域を模倣するデコイ核酸、ターゲティングベクター（例、ＣＨＤ２遺伝子の相同組換えを誘導し得るＣＨＤ２遺伝子に相同な第一および第二のポリヌクレオチド、ならびに必要に応じて選択マーカーを含むベクター）、低分子化合物が挙げられる。【００４５】
別の実施形態では、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質は、ＣＨＤ２の機能を抑制する物質であり得る。ＣＨＤ２の機能を抑制する物質としては、例えば、ＣＨＤ２の作用を妨げ得る物質である限り特に限定されないが、ＣＨＤ２阻害タンパク質（例、ＣＨＤ２ドミナントネガティブ変異体、上述したＣＨＤ２抗体、あるいはキメラ抗体、ヒト化またはヒト型抗体）、これらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。【００４６】
ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質が、核酸分子またはタンパク質分子である場合、本発明の剤は、核酸分子またはタンパク質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、ＣＨＤ２発現細胞（例、肥満細胞、幼若化Ｔ細胞等のＴ細胞）に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、ＣＨＤ２発現細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得るが、例えば、肥満細胞特異的プロモーターとしては、ｃ−ｋｉｔ、ＦｃεＲＩａ、ＦｃεＲＩｂを、幼若化Ｔ細胞等のＴ細胞特異的プロモーターとしては、ＩＬ−２、ＯＸ−４０、Ｓｐｒｏｕｔｙを使用できる。本発明はまた、このようなプロモーターを有する発現ベクターを提供する。【００４７】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。【００４８】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。【００４９】
本発明の剤は、ＣＨＤ２の発現または機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００５０】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。【００５１】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００５２】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。【００５３】
本発明の剤は、例えば、医薬、試薬または食品として有用である。例えば、本発明の剤は、免疫疾患（例、自己免疫疾患、免疫不全症）、アレルギー疾患（例、スギ花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎）、寄生虫性疾患（例、アニサキス症、疥癬）の予防・治療のために、あるいは肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能の調節、あるいはそれらの分化または増殖の調節のために使用することができる。【００５４】
本発明は、被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、医薬、試薬または食品として有効な候補物、あるいは肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能、またはその分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含む剤（または組成物）を提供する。【００５５】
スクリーニング方法に供される被験物は、いかなる化合物または組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。【００５６】
本発明のスクリーニング方法は、被験物がＣＨＤ２の発現または機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法は、１）ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞を用いたＣＨＤ２の発現の測定、２）ＣＨＤ２の機能を測定可能な再構成系を用いたＣＨＤ２の機能の測定、３）ＣＨＤ２発現細胞を用いたＣＨＤ２の機能の測定、４）動物を用いたＣＨＤ２の発現または機能の測定などに基づき行われ得る。【００５７】
上記１）において、ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物とＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の発現量を測定し、該発現量を被験物を接触させない対照細胞におけるＣＨＤ２の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＨＤ２の発現量を調節する被験物を選択する工程。【００５８】
上記方法の工程（ａ）では、被験物がＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。【００５９】
ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞とは、ＣＨＤ２の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的または間接的に評価可能な細胞をいう。ＣＨＤ２の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＣＨＤ２発現細胞であり得、一方、ＣＨＤ２の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞は、上述した動物の細胞であり得る。【００６０】
ＣＨＤ２発現細胞は、ＣＨＤ２を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。また、ＣＨＤ２発現細胞としては、肥満細胞、幼若化Ｔ細胞を使用することもまた好ましい。また、アレルギー疾患、免疫疾患、寄生虫性疾患等の疾患モデル動物由来の細胞を用いてもよい。【００６１】
ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域は、ＣＨＤ２の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、ＣＨＤ２遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＣＨＤ２の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質または検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。【００６２】
ＣＨＤ２遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＣＨＤ２遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＣＨＤ２に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＣＨＤ２の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＣＨＤ２発現細胞が好ましい。【００６３】
被験物とＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。【００６４】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、上述した自体公知の方法により行われ得る。また、ＣＨＤ２の発現を測定可能な細胞として、ＣＨＤ２転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。【００６５】
次いで、被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の発現量が、被験物を接触させない対照細胞におけるＣＨＤ２の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない対照細胞におけるＣＨＤ２の発現量は、被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。【００６６】
上記方法の工程（ｃ）では、ＣＨＤ２の発現量を調節する被験物が選択される。例えば、ＣＨＤ２の発現量を増加させる（発現を促進する）、またはＣＨＤ２の発現量を減少させる（発現を抑制する）被験物は、例えば、上述した疾患の予防・治療に、あるいは肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能、あるいは分化または増殖の調節に有用である。【００６７】
上記２）において、ＣＨＤ２の機能を測定可能な再構成系とは、ＣＨＤ２（タンパク質）およびその他の因子（例、核酸分子、タンパク質）を含む、被験物によるＣＨＤ２の機能調節能を評価可能な非培養細胞系をいう。再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物、ならびにＣＨＤ２（タンパク質）およびその結合因子を接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた場合におけるＣＨＤ２およびその結合因子を含む複合体量を測定し、該量を被験物を接触させない場合の該複合体量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＨＤ２の機能を調節する被験物を選択する工程。【００６８】
上記方法の工程（ａ）では、ＣＨＤ２およびその結合因子を含む複合体の形成が可能であるアッセイ系において、被験物、ＣＨＤ２およびその結合因子が接触される。結合因子としては、例えば、ＤＮＡが挙げられる。なお、ＣＨＤ２およびその結合因子の一方または双方は、それらの複合体の検出を容易にするため標識されていてもよい。標識としては、例えば、上述した標識用物質による標識の他、レポーター遺伝子によりコードされ得るタンパク質との融合が挙げられる。また、本アッセイ系では、ＣＨＤ２および／またはその他の因子（例、結合因子）等を含む細胞ホモジネート（例、ＣＨＤ２発現ベクターおよび／またはＣＨＤ２の結合因子の発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。【００６９】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物を接触させた場合における複合体量が測定される。複合体量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法（例、BiacoreＴＭの使用）が挙げられる。【００７０】
次いで、被験物を接触させた場合の複合体量が、被験物を接触させない場合の複合体量と比較される。複合体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない場合の複合体量は、被験物を接触させた場合の複合体量の測定に対し、事前に測定した複合体量であっても、同時に測定した複合体量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。【００７１】
上記方法の工程（ｃ）では、複合体量を調節する被験物が選択される。例えば、ＣＨＤ２の複合体量を増加させる（複合体の形成を促進する）、またはＣＨＤ２の複合体量を減少させる（複合体の形成を抑制する）被験物は、例えば、上述した疾患の予防・治療に、あるいは肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）の機能、あるいは分化または増殖の調節に有用である。【００７２】
上記３）において、ＣＨＤ２発現細胞を用いるＣＨＤ２の機能レベルを測定するスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物とＣＨＤ２発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の機能レベルを測定し、該機能レベルを被験物を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＨＤ２の機能レベルを調節する被験物を選択する工程。【００７３】
上記方法の工程（ａ）では、被験物がＣＨＤ２発現細胞と接触条件下におかれる。ＣＨＤ２発現細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。ここで用いられるＣＨＤ２発現細胞は、タンパク質レベルでのＣＨＤ２のアッセイが可能な程度にＣＨＤ２を発現し得る細胞であり得る。このようなＣＨＤ２発現細胞の好ましい例としては、ＣＨＤ２発現ベクターおよび／またはＣＨＤ２の結合因子の発現ベクターがトランスフェクトされた細胞（例、肥満細胞、Ｔ細胞）が挙げられる。ＣＨＤ２発現細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。【００７４】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物を接触させた細胞におけるＣＨＤ２の機能レベルが測定される。ＣＨＤ２の機能レベルは、例えば、上記２）の方法の他、ツーハイブリッドシステムにより測定できる。なお、本工程（ｂ）における機能レベルの比較、および上記方法の工程（ｃ）は、上記方法２）と同様に行われ得る。【００７５】
上記４）において、動物を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物を投与した動物におけるＣＨＤ２の発現量または機能レベルを測定し、該発現量を被験物を投与しない対照動物におけるＣＨＤ２の発現量または機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＨＤ２の発現量または機能レベルを調節する被験物を選択する工程。
なお、本方法論は、（ｂ）および（ｃ）の工程のみを必須とすることもできる。【００７６】
上記方法の工程（ａ）では、動物として、例えば、上述の動物が使用される。動物としてはまた、上述した疾患モデル動物が使用され得る。被験物の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。【００７７】
上記方法の工程（ｂ）では、ＣＨＤ２の発現量または機能レベルの測定は自体公知の方法により測定され得る。例えば、動物から単離または採取された肥満細胞またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）あるいは上述した生体サンプルにおけるＣＨＤ２の発現量または機能レベルが、上記１）〜３）の方法の工程（ｂ）と同様の方法論により測定され得る。本工程（ｂ）における発現量の比較および上記方法の工程（ｃ）もまた、上記１）〜３）の方法論と同様に行われ得る。【００７８】
本発明は、ＣＨＤ２の発現が調節された細胞および動物を提供する。発現の調節は、発現の抑制（例、ノックアウト）、または発現の促進（過剰または安定発現）であり得る。本発明の細胞および動物は、ＣＨＤ２の発現が一過的または構成的に調節されたものであり得るが、構成的に調節されたものが好ましい。本発明の細胞としては、肥満細胞およびＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）もまた好ましく、本発明の動物としては、このような細胞特異的に発現が調節されたものもまた好ましい。本発明の細胞は、本発明の動物由来の細胞であり得、また、初代培養細胞または細胞株であり得る。このような細胞および動物は、本明細書中に記載されるベクター（例、肥満細胞および／またはＴ細胞（例、幼若化Ｔ細胞）特異的発現ベクター等の発現ベクター、あるいはターゲティングベクター）等を用いることで、自体公知の方法により作製できる。【００７９】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【００８０】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００８１】
材料および方法
１）マウス骨髄由来肥満細胞の作製
BALB/cマウス、メス、8週齢およびscidマウス、メス、8週齢の大腿骨骨髄を採取し、マウスインターロイキン-3 (5 ng/ml) 添加α-MEM培地で4から8週間培養してマウス骨髄由来肥満細胞を作製した。これらを回収してRNAを抽出し、RT-PCRのテンプレートとした。また、レチノイン酸 (ATRA)(1μM)、マウスIL-4 (50 ng/mL)、リポポリサッカライド (10μg/mL) で4または14時間刺激培養した細胞を回収した。【００８２】
２）マウスB細胞、T細胞の分離
BALB/cマウス、メス、8週齢の脾臓からMACS (magnetic cell sorting: 磁石を付けた抗体によって細胞を分離する方法) によりB細胞とT細胞を分離し、その一部はそのまま凍結してRNAを抽出した。残りはマウスインターロイキン-4 (50 ng/ml) およびリポポリサッカライド (10μg/ml) で4 時間、14時間刺激した後、細胞を回収してRNAを抽出した。【００８３】
３）マウス由来サンプルからのRNA抽出とcDNAの作製
BALB/cマウス、メス、8週齢およびscidマウス、メス、8週齢より各種臓器を採取し、上述のとおり分離培養した肥満細胞、T細胞、B細胞からTotal RNAを抽出した。Total RNAの抽出にはFast RNA extraction kitを用いた。抽出したＲＮＡは20-100μg/mlの濃度に調製し、reverse transcriptase によりcDNAを作製した。cDNA作製RT反応はGeneAmp RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems)を用い、25℃10分、42℃15分、72℃10分で行った。【００８４】
４）マウスCHD2についてのプライマー設計
マウスCHD2をRT-PCRで検出するために、コンピューターソフトウェア、Genetyx (Genetyx Corporation) を用いてプライマーを設定した。プライマーは報告されているマウスCHD2の予想cDNA配列539-557 (forward primer) と738-719 (reverse primer) で作製し、その塩基配列はそれぞれ5’-acgacgacgatgatgatgaa-3’ (配列番号３)、5’-ggctcctttctttcccagtc-3’ (配列番号４) とした。【００８５】
５）マウスCHD2についてのPCR反応
RT反応によって得たcDNAをテンプレートとして上記プライマーペアを用いて95℃5分でdenature後、95℃1分、55℃1分、72℃1分30秒で40サイクルの反応を遺伝子増幅器で行い、3％アガロースゲルに電気泳動後エチジウムブロマイドで染色し、UV発光下にて増幅されたPCR産物の有無を観察した。【００８６】
６）ヒト末梢血の分離とヒトT細胞、B細胞の純化
ボランティア1名より末梢血10ccを採取し、PBSで2倍希釈後にフィコールに重層して1500rpm、40分間遠心して単核球分画（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）を採取した。
PBMCからMACS（magnetic cell sorting）システム（pan T cell Isolation KitおよびBcell Isolation Kit, MiltenYi Biotec）を用いて定法に従ってヒトT細胞、B細胞をそれぞれ純化した。
また、末梢血由来培養肥満細胞を、IL-3（1 ng/ml）、幹細胞因子（200 ng/ml）、IL-6（50 ng/ml）でメチルセルロースにおいて6週間培養し、次いでSCF（100 ng/ml）、IL-6（50 ng/ml）で液体培地において培養、維持して、当該培養肥満細胞を純化した。【００８７】
７）ヒト由来サンプルからのRNA抽出及びPCR
ヒトT細胞、非T細胞、B細胞、PBMC、肥満細胞からRNA抽出キット、RNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAを20-100μg/mlの濃度に調製し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製した。
cDNA作製のためのRT反応は、GeneAmp RNA PCR Core Kit（Applied Biosystems）を用いて、25℃10分、42℃15分、72℃10分で行った。
ヒトCHD2 mRNAをRT-PCRで検出するために、コンピューターソフトウェア、Genetyx (GenetyxCorporation) を用いてプライマーを設計した。プライマーは既報のヒトCHD2 cDNA配列（AF006514）を元に648-668（forward primer）と853-835（reverse primer）の位置で作製した。それらの塩基配列はそれぞれ、5’-GCACAGGACTTCAAAGCAAAC-3’（配列番号５）、5’-TGTCCACTTCCTGGATCAC-3’（配列番号６）であり、ヒトCHD2 PCR産物の大きさは206bpである。また、内部標準分子としてヒトGAPDHを利用した。ヒトGAPDH mRNA発現解析は、既報のプライマーペア（Stefan Bauer, et al., PNAS, 2001;98 9237-9242）を用いて、157bpのPCR産物を検出するように行った。
RT反応によって得たcDNAをテンプレートとして上記プライマーペアを用いてヒトCHD2 mRNA検出には、95℃5分で変性後、95℃30秒、62℃1分、72℃1分30秒で29サイクルの反応を遺伝子増幅器で行い、ヒトGAPDH検出には95℃5分でdenature後、95℃30秒、58℃1分、72℃1分30秒で29サイクルの反応を遺伝子増幅器で行い、3％アガロースゲルに電気泳動後エチジウムブロマイドで染色し、UV発光下にて増幅されたPCR産物の有無を観察した。また、このPCR産物の配列を解析して、ヒトCHD2 mRNA由来の断片であることを確認した。【００８８】
８）イヌ由来サンプルからのRNA抽出とリアルタイム定量PCR
イヌから採取した皮膚サンプルをTissue Lyser (キアゲン) を用いて5分間破砕した後、RNA抽出キットRNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いてRNA抽出を行った。採取したRNAを50 ng/mlの濃度に調製し、Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズジャパン）を用いたTaqManリアルタイムPCR法により、イヌCHD2およびアレルギー性皮膚炎で発現している他の分子（c-kit、幹細胞因子）、並びに内部標準用分子（GAPDH）のmRNA発現を定量的に測定した。
実験に用いたプライマーとプローブは、下記表１の通りである。【００８９】
【表１】
2007069423.tif 000002
【００９０】
実施例１：マウスの各種臓器におけるCHD2の発現
マウスの各種臓器におけるCHD2の発現を、上記３）〜５）に従い測定した。結果を図１に示す。
その結果、肝臓、腎臓、大脳、胸腺にのみ発現が認められた。【００９１】
実施例２：マウス肥満細胞におけるCHD2の発現
次いで、マウス肥満細胞におけるCHD2の発現を、上記１）、３）〜５）に従い測定した。結果を図２に示す。
その結果、マウス骨髄由来培養肥満細胞 (BMMC) にCHD2は高発現していた。また、T細胞とB細胞を持たないscidマウスでは、骨髄由来培養肥満細胞に弱く発現が認められると同時に、肝臓、腎臓には発現が認められず、心臓においてのみ弱い発現が認められた。なお、他の動物由来の肥満細胞でもCHD2の発現が認められるか確認したところ、イヌ由来肥満細胞株でも同様にCHD2が高発現していた（データ示さず）。
以上より、CHD2は肥満細胞に強く発現している分子であることがわかった。また、BALB/cマウスで認められた肝臓、腎臓に発現していたCHD2は、scidマウス (B細胞、T細胞欠損) において肝臓、腎臓に発現が認められなかったことから、肥満細胞由来の発現であると推察された。【００９２】
実施例３：マウスT細胞、B細胞におけるCHD2の発現パターン
マウスT細胞、B細胞におけるCHD2の発現パターンを、上記２）〜５）に従い測定した。結果を図３に示す。
その結果、マウス脾臓由来B細胞およびT細胞にはCHD2の発現は認められなかったが、脾臓T細胞をinterleukin-4 (IL-4) とlipopolysaccaride(LPS) で刺激すると4時間後に一過性にCHD2の発現が認められた。また、胸腺T細胞 (幼若) にはCHD2は恒常的に発現していることがわかった。
以上より、CHD2は脾臓の幼若化T細胞および胸腺T細胞に発現することがわかった。【００９３】
実施例４：ヒト肥満細胞、T細胞、B細胞におけるCHD2の発現
次いで、ヒト肥満細胞、T細胞、B細胞におけるCHD2の発現を、上記６）、７）に従い測定した。
その結果、ヒトCHD2 mRNAは、肥満細胞に強発現していたが、T細胞、B細胞では、非常に弱い発現が認められた。
以上より、CHD2はヒトにおいても肥満細胞の検出に有用であることがわかった。【００９４】
実施例５：ヒト鼻拭い液中のCHD2の発現
スギ花粉症アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜を滅菌綿棒で数回こすった後、綿棒をRNeasyMini Kit（キアゲン）のキットの細胞溶解液に浸した。その溶解液から定法どおりにRNAを抽出し、上記７）と同様の条件でRT-PCR法によってヒトCHD2、及び内部標準分子ヒトGAPDH mRNAの発現を測定した。陽性コントロールとしてヒト末梢血由来培養肥満細胞のRNAを利用した。
その結果、スギ花粉症アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜拭い液においてもヒトCHD2の発現が認められた。
以上より、ヒト由来サンプルにおけるCHD2発現を測定することで、ヒトにおけるアレルギーを診断し得ることがわかった。【００９５】
実施例６：イヌのアレルギー性皮膚炎病変部におけるCHD2の発現
イヌアレルギー性皮膚炎と臨床的に診断された症例の皮膚バイオプシーサンプルを5 mm径のパンチバイオプシーにより採取した。このバイオプシーサンプルを用いて、イヌのアレルギー性皮膚炎病変部におけるCHD2 mRNAの発現を測定した。RNA抽出とリアルタイム定量PCRは、上記８）の方法に従って行った。
その結果、CHD2 mRNAの発現は、アレルギー病変部で発現が上昇する分子で肥満細胞の浸潤の指標となるSCF及びc-kitと同様に、肥満細胞の浸潤が高い症例では高かったものの、肥満細胞の浸潤が低い症例では低かったことから、SCF及びc-kitのmRNA発現との相関性が認められた。
以上より、イヌのアレルギー性皮膚炎においても肥満細胞が関連するアレルギーのマーカーとしてCHD2が利用できることがわかった。また、ヒトだけでなく、動物の医療分野においてもCHD2の検出によってアレルギー診断が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の検査方法は、アレルギーの有無または程度の検査、あるいはＴ細胞および肥満細胞の発生、分化、成熟に関連する検査（例、免疫疾患の検査、免疫療法等のモニタリング）などに有用である。
本発明の検出方法は、上述した検査方法、アレルギーを誘発し得ない物質または組成物の開発、アレルギーを誘発し得る物質または組成物の同定、アレルギーを抑制し得る物質または組成物の開発などに有用である。
本発明の診断用試薬および検出用試薬は、本発明の検査方法および検出方法を簡便に行うことを可能にするため有用である。
本発明の医薬、試薬または食品は、アレルギー疾患、免疫疾患または寄生虫性疾患の予防・治療薬として、ＣＨＤ２の発現または機能の調節剤として、あるいはそれらに関連する機能性食品として有用である。
本発明のスクリーニング方法は、上記の医薬、試薬または食品の開発に有用である。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたはその部分ヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の発現ベクターが組み込まれた形質転換体、本発明の抗体、本発明のハイブリドーマ、本発明のアンチセンス核酸、本発明のリボザイム、本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸、本発明のターゲティングベクター、本発明のプライマーセットまたは本発明の核酸プローブ、本発明の細胞、本発明の動物は、本発明の検査方法および検出方法を行うために、並びに本発明の診断用試薬および検出用試薬の開発などに有用である。
本出願は、２００５年１２月１２日に日本で出願された特願２００５−３５８３２７、及び２００６年６月６日に日本で出願された特願２００６−１５７６９０を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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