(57)【要約】  微生物内にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入することによりＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの機能を強化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を向上させた微生物を用いてヒドロキシカルボン酸を生産する。
2007129466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産方法。
【請求項２】
微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
【請求項３】
微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
【請求項４】
微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする請求項２記載の生産方法。
【請求項５】
末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールであり、ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項６】
ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化し、かつ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化した微生物。
【請求項７】
グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする請求項６記載の微生物。
【請求項８】
微生物がエシェリヒア・コリである請求項１〜５のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項９】
微生物がエシェリヒア・コリである請求項６または７に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸を生産する微生物と、微生物を用いたグリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシカルボン酸類の中にはポリマー原料や医薬中間体として有用で、その効率的な生産方法が求められているものがある。その一例としてグリコール酸（α―ヒドロキシ酢酸）が挙げられる。グリコール酸は、洗浄剤や化粧品原料として利用されてきたが、近年、ガスバリア性ポリマーや医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料として注目されている。ガスバリア性材料として注目されている理由はポリグリコール酸層が高い酸素ガスバリア性を有しており、酸素の存在下で変質しやすい食品や炭酸飲料を包装するための材料としての性能を備えているからである。
現行市販されている化学合成品のグリコール酸は少なからず夾雑物を含んでおり、ポリマー原料としては純度的に問題がある。なぜならこれらの夾雑物はグリコール酸の脱水縮合反応を阻害するのみならず、夾雑物の一つであるメトキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、食品や飲料の包材中に含まれることが望ましくないからである。精製によって夾雑物を除くことは技術的には可能であるが、そのような精製品は価格が高くなり、安価な包材原料としては現実的でない。【０００３】
化学合成品のグリコール酸に見られる上記の問題点を回避するため、エチレングリコールを原料としたバイオ法によるグリコール酸製造の試みが行われている。特許文献１及び特許文献２において、エチレングリコール含有培地上で、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属に属する酵母、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する菌株、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌株、またはエシェリヒア・コリＢ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ）株を培養し、培養液中からグリコール酸を分離・採取することを特徴とする微生物によるグリコール酸の生産方法が開示されている。特許文献１及び特許文献２の実施例に記載されているグリコール酸生産方法の中でグリコール酸蓄積濃度が最も高いものは、ピシア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を用いた方法であり、３０時間の反応で３５．３ｇ／Ｌのグリコール酸が得られている。ピシア・ナガニシイを用いたグリコール酸生産については更に、反応条件の改善がなされ、１２０時間の反応で１０５ｇ／Ｌのグリコール酸が得られることが非特許文献１で報告されている。【０００４】
特許文献３においてはラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子とラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで該酵素活性が付与又は強化された微生物を用いることによりエチレングリコールをはじめとする末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールを原料として、グリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸を生産することが可能であること、さらには微生物が有しているグリコール酸オキシダーゼをコードする遺伝子を破壊し、該酵素活性を不活性化することによりグリコール酸の生産性が向上することが開示されている。
上記した従来の方法によるグリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸の生産反応においては反応に供する菌体量が多いがために、それに伴う製造コストの上昇や菌体に由来する不純物の夾雑、さらにはヒドロキシカルボン酸類の製造後に菌体を廃棄するのに多大な労力とコストがかかるという問題点があげられる。【０００５】
酸化酵素を用いてアルコールからケトンを製造する方法においては反応に必要な酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤと略することがある）を反応に伴って生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと略することがある）から再生させる以下のような技術が利用されている。つまり目的とするケトンを生産するための酸化反応とＮＡＤ再生のためのケトンの還元反応の２つの反応を組み合わせる方法や、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるオキソグルタル酸の還元反応を組み合わせる技術などである。
上記のＮＡＤを再生する技術においてはＮＡＤ再生のための反応基質を反応系に添加する必要があり、さらにはＮＡＤ再生反応により副生物が反応系内に蓄積するという欠点があげられる。
アルコールからのケトン製造において、上記の欠点を補うＮＡＤ再生方法として微生物が有する呼吸鎖を介して分子状酸素を還元し水を生成することでＮＡＤを再生するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを利用する方法が例示されるが（特許文献４）、この酵素活性を強化した微生物による実例は報告されていない。    
【特許文献１】特開平１０−１７４５９３号公報
【特許文献２】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／１０６００５号パンフレット
【特許文献４】特開２００５−２１８３４９号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．６５（１０），ｐｐ．２２６５−２２７０，（２００１）
【発明の開示】
【０００６】
化学合成法では、得られるヒドロキシカルボン酸の純度の点で十分ではなく、また、従来のバイオ法では、生産反応に供する菌体量が多く菌体の廃棄等の問題がある。本発明が解決しようとする課題は、少ない菌体量で効率よく生産することができる、工業的に有利なヒドロキシカルボン酸類の生産方法、および該生産方法に適した微生物を提供することである。
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生能を強化した微生物を用いることにより、ヒドロキシカルボン酸を少ない菌体量で効率よく生産することができることを見出した。
即ち、本発明は以下の〔１〕から〔９〕に記載のとおりである。
【０００８】
〔１〕微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化した微生物を用いることを特徴とするヒドロキシカルボン酸の生産方法。
〔２〕微生物が、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化した微生物であることを特徴とする〔１〕記載の生産方法。
〔３〕微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする〔１〕記載の生産方法。
〔４〕微生物が、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減した微生物であることを特徴とする〔２〕記載の生産方法。
〔５〕末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールがエチレングリコールであり、ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の生産方法。
【０００９】
〔６〕ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化し、かつ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化した微生物。
〔７〕グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減したことを特徴とする〔６〕記載の微生物。
〔８〕微生物がエシェリヒア・コリである〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の生産方法。
〔９〕微生物がエシェリヒア・コリである〔６〕または〔７〕に記載の微生物。
【００１０】
本発明によりグリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸類を少ない菌体量で効率よく生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１２】
【図１】参考例１における細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）の経時変化を示したグラフである。  図中の□は、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を示す。  図中の○は、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明を詳しく説明する。【００１４】
本実施形態は、ヒドロキシカルボン酸の生産方法である。この方法は、微生物を用いて末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する方法において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化した微生物を用いるものである。【００１５】
微生物とは、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を本来有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を有し得る微生物であればいずれの微生物であってよい。好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されている細菌、放線菌、酵母、カビが例示され、より好ましくはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が例示される。【００１６】
また、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとは、炭素鎖の末端に水酸基を有し、かつ分子内に２つ以上の水酸基を有する脂肪族化合物であればその構造に特に制限はないが、そのような化合物としてエチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２，４−ブタントリオールなどが例示できる。
また、ヒドロキシカルボン酸とは、上記した末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類について水酸基を有する末端炭素の一つが酸化されカルボン酸になっているものである。そのような化合物としてグリコール酸、ヒドロキシエトキシ酢酸、グリセリン酸、３−ヒドロキシプロパン酸、２−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシブタン酸、４−ヒドロキシブタン酸、２，４−ジヒドロキシブタン酸などが例示できる。
本実施形態においてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとは、酸化型および還元型の明記がない限りそのどちらをも指す。
本実施形態では、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとして、エチレングリコールを用いることができる。また、ヒドロキシカルボン酸としては、グリコール酸を好適に用いることができる。【００１７】
また、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．６．５．３または１．６．９９．３または１．６．９９．５に分類され、ユビキノン、ジメチルメナキノン、メナキノン等のキノン類を電子受容体としてＮＡＤＨからＮＡＤを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。好ましくはＩ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．６．９９．３に分類されるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼである。エシェリヒア・コリを例とするとＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｖ００３０６によって報告されている遺伝子ｎｄｈにコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが例示される。【００１８】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を強化するとは、その活性が強化前に比べ２倍以上向上していることが好ましい。酵素活性が向上した微生物は、例えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に導入する方法やゲノム内において該酵素をコードする遺伝子のプロモーターに変異を導入するなどの方法を用いて作出することができる。野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に該遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子をプラスミドの形態で微生物に導入することが例示できる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載されている。【００１９】
本実施形態に係る微生物は、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化する。【００２０】
ここで、ラクトアルデヒドレダクターゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．７７に分類され、１．２−プロパンジオールから、補酵素であるＮＡＤの存在下でラクトアルデヒドを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。【００２１】
また、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２２に分類され、ラクトアルデヒドから、補酵素であるＮＡＤの存在下で乳酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指し、且つＩ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２１に分類され、グリコールアルデヒドから、補酵素であるＮＡＤの存在下でグリコール酸を生成する反応を触媒する酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの総称も併せて指すものである。なぜならばエシェリヒア・コリを用いた先行文献で、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは同一の酵素であることが報告されているからである（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．７７８８−７７９２，（１９８３））。【００２２】
また、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの少なくとも１つの酵素活性を強化したとは、エシェリヒア・コリを例にすると、これらの酵素の少なくとも１つの酵素活性が、野生株（又は組換え前の微生物）の２０倍以上であることが好ましく、より好ましくは１００倍以上である。【００２３】
酵素活性が向上した微生物は、例えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に導入する方法やゲノム内において該酵素をコードする遺伝子のプロモーターに変異を導入するなどの方法を用いて作出することができる。野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に該遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子をプラスミドの形態で微生物に導入することが例示できる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの文献等に記載されている。【００２４】
たとえば、ラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が向上したエシェリヒア・コリは、以下のように作製することができる。【００２５】
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６４５４１）。【００２６】
ｆｕｃＯを取得するためにエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでｆｕｃＯフラグメントを得る。【００２７】
また、ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでａｌｄＡフラグメントを得る。【００２８】
さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとなるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することでＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得る。【００２９】
上記の３つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを結合した後、エシェリヒア・コリに形質転換し、ＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得る。得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた菌体からプラスミドを回収する。本プラスミドを任意の宿主エシェリヒア・コリに導入することでラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が向上したエシェリヒア・コリを作製できる。【００３０】
本実施形態に係る微生物は、グリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または微生物本来の活性よりも低減される。【００３１】
ここで、グリコール酸オキシダーゼとは、Ｉ．Ｕ．Ｂ．酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．３．１５に分類され、グリコール酸からグリオキシル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。【００３２】
また、グリコール酸オキシダーゼ活性の不活性化とは、その酵素活性が完全に消失することを意味する。また、グリコール酸オキシダーゼ活性の低減とは、その酵素活性の一部が消失することを意味し、野生株（又は組換え前の微生物）が有するグリコール酸オキシダーゼ活性に対して、２分の１以下であることが好ましく、より好ましくは１０分の１以下である。酵素機能を不活性化、或いは低減するには、そのタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入するか、欠失させる、置換させる、あるいはそのタンパク質を特異的に不活性化する薬剤を添加する、紫外線を照射する、などの方法がある。標的とする遺伝子についてそれを欠失させる方法や、変異させる方法、および、置換する方法については、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。具体的にはエシェリヒア・コリＭＴ−１１０２３株が、グリコール酸オキシダーゼをコードする遺伝子であるｇｌｃＤＥＦの破壊によりグリコール酸オキシダーゼ活性が不活性化した微生物として例示できる。【００３３】
エシェリヒア・コリＭＴ−１１０２３株は遺伝子破壊によりグリコール酸オキシダーゼが不活性化しているため、これを用いて本発明を実施することが可能である。本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ―１０２９３の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、特許手続き上の微生物の寄託等の国際承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１７年３月１０日より寄託されている。【００３４】
ある標的酵素をコードする遺伝子を微生物に導入するにあたっての「プラスミドの形態で」とは、該遺伝子をベクターに連結し組換えプラスミドを作成し、これを形質転換等の方法で該微生物に導入する事を意味する。また、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターと目的遺伝子を機能的に連結した際には、プラスミドが有するレプリコンの性質により、微生物細胞当たりのコピー数が一般的に少ないといわれるプラスミドを利用することでも本発明の目的を達し得る。そのようなレプリコンを有するプラスミドとしてｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０３）などが例示できる。【００３５】
本実施形態の生産方法を実施するに際しては、通常、培地を用いて微生物を培養して増殖させて必要量の微生物菌体を得る。
本発明において、培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオン、その他が必要に応じて適宜使用される。有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。【００３６】
培養に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
また、培地組成は、ポリペプトン０．５ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下、Ｆｅ２ＳＯ４０．０２ｇ／Ｌ以上０．３ｇ／Ｌ以下、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．３ｇ／Ｌ以上１５ｇ／Ｌ以下、ニコチン酸０．０２ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（溶媒は水）とすると好ましい。【００３７】
本実施形態に係る微生物の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、ｐＨと温度を適切に制御しながら培養する。好気条件であっても、嫌気条件であってもよいが、好ましくは、好気条件とする。通気量は、培地１Ｌあたり０．２Ｌ／ｍｉｎ以上３Ｌ／ｍｉｎ以下とすると好ましく、０．５Ｌ／ｍｉｎ以上２Ｌ／ｍｉｎ以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、２００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下とすると好ましく、５００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍとするとより好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも培養が可能である。
ｐＨは５以上８以下とすることが好ましく、ｐＨ７．０以上７．４以下とするとより好ましく、ｐＨ７．２とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
また、温度は、２５℃以上４０℃以下とすることが好ましく、３３℃以上３７℃以下とするとより好ましく、３５℃とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
培養に必要な時間は１２時間以上５０時間以下とする。これにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。【００３８】
ヒドロキシカルボン酸の生産に使用される溶媒としては、リン酸カリウム緩衝液などの緩衝液や、前述の微生物の培養に用いた培地、及び純水を例示することができる。また、原料の脂肪族多価アルコールと溶媒との混合液に、先に培養により得られた微生物菌体を接触させて反応を行うことができる。微生物菌体は、培養が終わった培養液そのものを使用する方法や、培養液から菌体のみを回収して使用する方法が例示できる。【００３９】
本発明の生産方法における反応に際して、反応条件は特別の制限はなく、ｐＨと温度を適切に制御しながら反応する。
例えば、ｐＨは６以上９以下とすると好ましく、ｐＨ７．０以上８．０以下とするとより好ましく、ｐＨ７．２とすると最も好ましい。こうすることにより反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、温度は、２０℃以上４５℃以下の範囲内が好ましく、３０℃以上４０℃以下とすると特に好ましく、３５℃が最も好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、反応は、好ましくは、好気条件とする。通気量は、反応液１Ｌあたり０．１Ｌ／ｍｉｎ以上２．０Ｌ／ｍｉｎ以下とすると好ましく、０．２Ｌ／ｍｉｎ以上１．０Ｌ／ｍｉｎ以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、２００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下とすると好ましく、４００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下とするとより好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも反応が可能である。
また、反応時間は１２時間以上９６時間以下とすることにより、収率８０％以上でヒドロキシカルボン酸を得ることができる。【００４０】
以上のようにして得られた反応液中に蓄積した生産物であるヒドロキシカルボン酸を回収する方法としては、特に制限はないが、例えば反応液から菌体を遠心分離などで除去した後、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法で分離する方法が採用できる。
【実施例】
【００４１】
（製造例１）エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ欠失株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼの遺伝子（以下、ｇｌｃＤＥＦと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ４３４９０）。【００４２】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡのｇｌｃＤＥＦ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、配列番号１（ＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧ）及び配列番号２（ＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＴＧＧ）並びに配列番号３（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ）及び配列番号４（ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣ）のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化することにより、それぞれ約６７０ｂｐ、７９０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを、温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５−１９１（２０００））をＫｐｎＩ、ＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株（東洋紡績社製）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。【００４３】
このプラスミドをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを、薬剤を含まないＬＢ液体培地で、３０℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００４４】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、薬剤を含まないＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｇｌｃＤＥＦを含む約３．８ｋｂｐ断片を増幅させ、ｇｌｃＤＥＦ領域が欠失している株を選抜し、得られた株をＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ欠失株（以下△ｇｌｃＤＥＦと略することがある）と命名した。なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００４５】
（製造例２）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６４５４１）。【００４６】
ｆｕｃＯを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号５（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧ）及び配列番号６（ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。さらに、ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号７（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣ）及び配列番号８（ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化することで約１．５ｋｂｐのａｌｄＡフラグメントを得た。
さらに、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号９（ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ）及び配列番号１０（ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。【００４７】
上記の３つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、このプラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡと命名した。【００４８】
（製造例３）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターによる△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
製造例２で得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡを製造例１で得られた△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を得た。【００４９】
（実施例１）ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターの構築と該ベクターによる△ｇｌｃＤＥＦ株形質転換体の構築
エシェリヒア・コリのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの遺伝子（以下、ｎｄｈと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｖ００３０６）。ｎｄｈを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号１１（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧ）及び配列番号１２（ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧ）に示すオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法で増幅することで約１．３ｋｂｐのｎｄｈフラグメントを得た。得られたｎｄｈフラグメントをＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ処理した。【００５０】
このＤＮＡフラグメントと、製造例２で作成したｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平滑末端処理、脱リン酸化処理を行ったフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、このプラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈと命名した。得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈを製造例１で得られた△ｇｌｃＤＥＦ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株を得た。【００５１】
（実施例２）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株によるグリコール酸生産
実施例１で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株を前培養として三角フラスコに入れたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬに植菌し、一晩、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、以下に示す組成の培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの時間を培地中のグルコース濃度０．１ｇ／L未満となるような可変速度でグルコースを全量で４０ｇ供給した。【００５２】
＜培地組成＞
ポリペプトン：７ｇ／Ｌ
グルコース：３０ｇ／Ｌ
ニコチン酸：０．１ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４：０．０９ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：５ｇ／Ｌ
溶媒：水【００５３】
培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌した。集菌後の湿菌体を４．５ｇ秤量し、エチレングリコール６５ｇと共に蒸留水に懸濁し最終液量を５００ｍｌとした。懸濁液をＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に移し７０時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、反応温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。得られた反応液中のグリコール酸蓄積量を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーを用い、以下の設定にて定量した。【００５４】
カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（信和化工社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．１）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器測定波長：２８０ｎｍ【００５５】
また、湿菌体の一部を５０℃で乾燥させた後の乾燥重量から、反応に使用した菌体の乾燥菌体重量を求めた。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株において乾燥菌体１ｇあたり３９．８ｇのグリコール酸を生産していた。【００５６】
また、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株の生育速度は、比較例１における△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株と同様のものであり、ｎｄｈの強化による生育の遅延が起きていないことが確認された。【００５７】
（比較例１）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸生産
製造例３で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２０．２ｇであった。【００５８】
（参考例１）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株における細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量の測定
△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株、および△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。【００５９】
グリコール酸生産時の△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株および△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について、一定時間においてサンプリングを行い、それぞれの菌株について２本の微量遠沈管に１ｍＬずつサンプリングし、４℃で遠心、集菌した。２本の遠沈管のうち１本をＮＡＤ測定、１本をＮＡＤＨ測定に使用し、それぞれ以下の処理を行った。【００６０】
ＮＡＤ測定用のサンプルには、集菌した湿菌体１．５ｍｇあたり４００μＬの０．０４ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を加え懸濁した。懸濁液を９０℃で３分加熱の後、氷上で急冷した。この処理液の上清を用い、以下に示す組成の反応液を作成した。なお、１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌとしてｐＨ９．０のものを用いた。またアルコールデヒドロゲナーゼとしてＳＩＧＭＡ社製アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ３２６３）を１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で溶解し、４００ユニット／ｍＬ（ただし１ユニットはｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間に１μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換するのに必要な酵素量）としたものを使用した。反応液の４５０ｎｍにおける吸光度をテトラカラーワン（生化学工業社製）のプロトコールに従って測定した。なおＳＩＧＭＡ社製ＮＡＤの溶液について同様の処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、サンプルのＮＡＤ濃度を求めた。【００６１】
ＮＡＤＨ測定用のサンプルには、集菌した湿菌体１．５ｍｇあたり４００μＬの０．０４ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を加え懸濁した。懸濁液を９０℃で３分加熱の後、氷上で急冷した。この処理液の上清を用い、以下に示す組成の反応液を作成した。なお１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌとしてｐＨ８．８のものを用いた。またアルコールデヒドロゲナーゼとしてＳＩＧＭＡ社製アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ３２６３）を１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で溶解し、４００ユニット／ｍＬ（ただし１ユニットはｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間に１μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換するのに必要な酵素量）としたものを使用した。【００６２】
反応液の４５０ｎｍにおける吸光度をテトラカラーワン（生化学工業社製）のプロトコールに従って測定した。なお、ＳＩＧＭＡ社製ＮＡＤＨの溶液について、同様の処理を施したものを測定することにより検量線を作成し、サンプルのＮＡＤＨ濃度を求めた。図１は、この時のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示す。横軸は反応時間（ｈｒ）、縦軸はＮＡＤＨ／ＮＡＤ比（ＮＡＤＨ含量／ＮＡＤ含量）を示している。
△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ−ｎｄｈ株において常にＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の値が小さく、ＮＡＤＨからＮＡＤを再生していることが示された。【００６３】
＜反応液組成＞
サンプル上清：２５μＬ
１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：２５μＬ
２５％エタノール：１０μＬ
純水：２０μＬテトラカラーワン（生化学工業社製）：１０μＬ
アルコールデヒドロゲナーゼ：１０μＬ
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のヒドロキシカルボン酸の生産方法および微生物は、ポリマー原料や医薬中間体として有用なグリコール酸等のヒドロキシカルボン酸類の製造に用いることができる。
【図１】
2007129466.tif 000003
【配列表】
2007129466000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月29日(2008.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本実施形態に係る微生物の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、ｐＨと温度を適切に制御しながら培養する。好気条件であっても、嫌気条件であってもよいが、好ましくは、好気条件とする。通気量は、培地１Ｌあたり０．２Ｌ／ｍｉｎ以上３Ｌ／ｍｉｎ以下とすると好ましく、０．５Ｌ／ｍｉｎ以上２Ｌ／ｍｉｎ以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、２００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下とすると好ましく、５００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下とするとより好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも培養が可能である。
ｐＨは５以上８以下とすることが好ましく、ｐＨ７．０以上７．４以下とするとより好ましく、ｐＨ７．２とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
また、温度は、２５℃以上４０℃以下とすることが好ましく、３３℃以上３７℃以下とするとより好ましく、３５℃とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
培養に必要な時間は１２時間以上５０時間以下とする。これにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
（比較例１）△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株によるグリコール酸生産
製造例３で得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株について実施例２と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の乾燥菌体１ｇあたりのグリコール酸生産量は２０．２ｇであった。
【国際調査報告】
2007129466.tif 000004
2007129466.tif 000005
2007129466.tif 000006
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2007129466.tif 000009
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