(57)【要約】血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有する血栓観測装置、および、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測方法。
2007046450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、
該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置。
【請求項２】
血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、
該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血栓生成室通過後の血液に血栓形成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、を有することを特徴とする血栓観測装置。
【請求項３】
前記血栓観測装置は、基板上に形成されたものである請求項１または２に記載の血栓観測装置。
【請求項４】
前記血栓観測装置は、さらに、流入管および／もしくは薬剤管を加圧するポンプ、または血栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管を吸引するポンプを有する請求項１ないし３のいずれかに記載の血栓観測装置。
【請求項５】
前記血栓観測装置は、さらに、圧力測定装置を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の血栓観測装置。
【請求項６】
前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものである請求項１ないし５のいずれかに記載の血栓観測装置。
【請求項７】
前記血栓誘発材が、さらに組織因子を含むものである請求項６に記載の血栓観測装置。
【請求項８】
前記血栓観測装置は、さらに、血栓形成室を撮影するためのカメラを有する請求項１ないし７のいずれかに記載の血栓観測装置。
【請求項９】
その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することを特徴とする血栓観測方法。
【請求項１０】
抗凝固処理がカルシウムキレート剤による処理であり、遊離カルシウム供与体によって抗凝固処理を解除する請求項９記載の血栓観測方法。
【請求項１１】
抗凝固処理がトロンビンアプタマーによる処理であり、トロンビンアプタマーのアンチセンスDNAによって抗凝固処理を解除する請求項９記載の血栓観測方法。
【請求項１２】
前記血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除する操作を行うことなく血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する請求項９記載の血栓観測方法。
【請求項１３】
組織トロンボプラスチンによって血液凝固を促進する請求項１２記載の血栓観測方法。
【請求項１４】
１種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固処理剤に対応する少なくとも１種の抗凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除する請求項９記載の血栓観測方法。
【請求項１５】
抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びカルシウムキレート剤であり、抗凝固処理解除剤が遊離カルシウム供与体である請求項１４記載の血栓観測方法。
【請求項１６】
抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びヘパリンであり、抗凝固処理解除剤がへパリナーゼである請求項１４記載の血栓観測方法。
【請求項１７】
抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びトロンビンアプタマーであり、抗凝固処理解除剤がトロンビンアプタマーのアンチセンスDNAである請求項１４記載の血栓観測方法。
【請求項１８】
前記接触相因子が血液凝固XII因子またはカリクレインである請求項１５ないし１７のいずれかに記載の血栓観測方法。
【請求項１９】
前記接触相因子が血液凝固XII因子であり、血液凝固XII因子阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビターである請求項１８記載の血栓観測方法。
【請求項２０】
前記血栓観測方法は、前記血栓生成室における血液の流入時および／または流出時の圧力を測定する請求項９ないし１９のいずれかに記載の血栓観測方法。
【請求項２１】
前記血栓誘発材がコラーゲンと組織因子を含むものである請求項９ないし２０のいずれかに記載の血栓観測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者等に投与した抗血栓薬の効能を観測する方法に関し、具体的には、全血または血小板を含む血漿を用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓形成を総合的に評価する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、心筋梗塞等のアテローム血栓症は、動脈硬化部位にてアテロームプラークが壊れ、血流に暴露された組織因子を含むコラーゲン上に、血小板が粘着し、さらに血小板凝集、血液凝固系の活性化が複合的に起こり、閉塞性の重篤な血栓を生じる。心筋梗塞等の心疾患による死亡は日本においても全死因の２位を占める重篤な疾患である。
しかしながら、心筋梗塞等においては動脈硬化領域においてのみ血栓形成が進み、全身における血栓傾向が極端に進む事はない。このような血栓症における血栓傾向の評価、抗血栓療法における抗血栓効果のモニタリングには試験管内の試験は不向きであり、血流の存在下、凝固および血小板（粘着、凝集）の総合的な評価が重要である。【０００３】
従来、血液凝固能の評価は、血漿を用いた部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボプラスチン時間（ＰＴ）、によって検査されている。ＡＰＴＴは主に内因系凝固、ＰＴは外因系凝固を反映する。血小板の検査としては多血小板血漿を用い、ＡＤＰ、コラーゲン等の血小板活性化物質を加え透過度の変化等によって血小板の凝集能を評価する事もできる。また、全血凝固時間、カルシウム再添加全血凝固時間等によって全血の凝固時間の測定もなされる。
さらに、全血を用いた検査系としてはトロンボエラストグラムが用いられ、凝固成分の活性化および血小板の凝集等がモニタリングされる。
しかしながら、生体内では血流下で血栓が成長するのに対し、上記の検査方法等は閉鎖された試験管内での測定であるため、血栓が生体内で成長する状態を観察することはできない。【０００４】
この問題点を解決する提案として、特許文献１、非特許文献２、３には、評価すべき抗血栓薬が投入された血液をコラーゲンセル上を通過させ、血小板を蛍光標識する事で血小板の粘着、凝集を共焦点顕微鏡装置によりモニタリングする方法が開示されている。
しかし、この文献に記載の発明は、抗凝固薬の存在下で観測を行うために、凝固系によって起こる血小板の粘着、凝集による血栓が形成されないこと、ないしは、血栓の生成能の低下を、血小板の形態変化を観測することで評価するものであり、凝固系と連動した血小板活性化が反映されない。したがって、抗血小板薬の薬効を評価するには好ましい発明ではあるが、血栓そのものや血栓形成過程全体をモニターする事はできない。また蛍光顕微鏡は高価であり一般の検査に使用するのは困難である。
又、特許文献２には抗凝固処理された血液の流動性を微細な櫛状のシリコンセルを通過させることで測定している。やはり特許文献２の手法も抗凝固処理された血液を用いるものであり凝固系の影響は測定できない。また本手法による血液粘度は個人差、日内差が大きく、薬剤治療を反映するのは困難な状況である。
血小板は凝固系によって活性化され、凝固系は活性化血小板によって促進される。すなわち抗凝固処理された血液は、血小板の活性化も抑制されてしまい抗血栓薬の効能を観測することはできない。さりとて、抗凝固処理を行わなければ血液は直ちに凝固してしまうので、試験に供することはできない。
【特許文献１】特開２００４−２５１６３０号公報
【特許文献２】特許公開２００６−１４５３４５号公報
【非特許文献１】Blood. 1990;75:390-398
【非特許文献２】Blood. 1999 Aug 1;94(3):968-75.
【発明の開示】
【０００５】
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、患者等に投与した抗血栓薬の効能を観測するに際し、全血または血小板を含む血漿（本明細書においては、これらをまとめて「血液」という場合がある。）を用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓形成を総合的に評価する装置および方法を提供することを課題とする。
【０００６】
［課題を解決するための手段］
前記課題を解決するため、本発明は、血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に血液凝固を促進（以下「凝固促進」という場合がある。）する薬剤または抗凝固処理を解除する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置を提供する。なお、本発明において「観測」とは、目視や撮像など血栓形成を視覚的に評価することのみならず、圧力測定などによって血栓形成の程度を数値化して評価することも含む。
また、本発明は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血栓生成室通過後の血液に血栓形成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、を有することを特徴とする血栓観測装置を提供する。
ここで、前記血栓観測装置は、基板上に形成されたものであることが好ましい。
本発明の血栓観測装置においては、さらに、流入管および／もしくは薬剤管を加圧するポンプ又は血栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管を吸引するポンプを有することが好ましい。
本発明の血栓観測装置においては、さらに、圧力測定装置や血栓形成室を撮影するためのカメラを有することが好ましい。
そして、前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものであることが好ましい。
前記血栓誘発材が、さらに組織因子（組織トロンボプラスチン）を含むものであるとより好ましい。
【０００７】
また、本発明は、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することを特徴とする血栓観測方法を提供する。本発明において、「血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流す」とは、流路内で抗凝固解除反応または凝固促進反応が起こっている状態であればよく、抗凝固解除剤または凝固促進剤を血液と流路内で混合しながら流す場合と、抗凝固解除剤または凝固促進剤を血液と混合した後に速やかに流すことを含む。
本発明の血栓観測方法においては、前記抗凝固処理がクエン酸などのカルシウムキレート剤による処理であり、遊離カルシウム供与体によって抗凝固処理を解除することが好ましい。
本発明の血栓観測方法においては、前記抗凝固処理がトロンビンアプタマーによる処理であり、トロンビンアプタマーのアンチセンスDNAによって抗凝固処理を解除することが好ましい。
ここで、本発明の血栓観測方法においては、血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除する操作を行うことなく血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することが好ましい。ここで血液凝固を促進する手段としては組織トロンボプラスチンの添加が好ましい。
また、本発明の血栓観測方法においては、１種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固処理剤に対応する少なくとも１種の抗凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除することが好ましい。ここで、抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びカルシウムキレート剤であり、抗凝固処理解除剤が遊離カルシウム供与体であることが好ましい。また、抗凝固処理剤が接触相因子阻害剤及びヘパリンであり、抗凝固処理解除剤がへパリナーゼであることが好ましい。さらに、抗凝固処理剤が血液凝固XII因子、カリクレインなどの接触相因子の阻害剤及びトロンビンアプタマーであり、抗凝固処理解除剤がトロンビンアプタマーのアンチセンスDNAであることが好ましく、血液凝固XII因子の阻害剤としてはコーン由来トリプシンインヒビターが好ましい。
また、本発明の血栓観測方法においては、前記血栓生成室における血液の流入時および／または流出時の圧力を測定することが好ましい。
さらに、本発明の血栓観測方法においては、血栓誘発材がコラーゲンと組織因子を含むものであることが好ましい。
【０００８】
［発明の効果］
請求項１にかかる本発明の血栓観測装置によれば、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有することにより、抗血栓薬を患者等に投与して採血した血液が血栓形成室にいたる流路において凝固しないように抗凝固処理された血液を、血栓生成室において意図的に血栓を形成させて観測することができるので、抗血栓薬の効能を人体内に近い環境で具体的に観測することができる。また、採血時に抗凝固処理剤を用いることができるため、採血後の検体を一定期間保存することができ、検査時期を任意に選択できる利点を有する。
請求項２にかかる本発明の血栓観測装置によれば、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該血栓生成室に接続されて血栓生成室通過後の血液に血栓形成防止剤を混和させる血栓形成防止剤流入管と、を有することにより、上記と同様に血栓観測が行えることに加え、血栓形成室の下流において血液凝固が進むことがないので、圧力測定に影響を与えることが防止でき、さらに微妙な圧力変化を観測することが出来る。
【０００９】
ここで、本発明の血栓観測装置が基板上に形成されたものであると少量の血液でも観測が可能となる。また、流入管および／もしくは薬剤管を加圧するポンプまたは血栓形成室に接続されて血栓形成室から血液を排出する排出管を吸引するポンプを有することで、所定圧力又は所定流速で、所定時間、血液や血液凝固を促進する薬剤を安定して流すことができる。
また、本発明の血栓観測装置が圧力測定装置を有することで血栓形成の程度を数値化でき、定量的な評価が可能である。
そして、前記血栓誘発材がコラーゲンを含むものであると設置が容易となる。前記血栓誘発材が、さらにコラーゲンと共に組織トロンボプラスチンなどの組織因子を含むものであると効果的に血栓生成を誘発することができる。
また、本発明の血栓観測装置が血栓形成室を撮影するためのカメラを有することで血栓生成の様子を映像として観察し、その映像を保存することも可能である。
【００１０】
また、請求項９にかかる本発明の血栓観測方法によれば、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することにより、抗血栓薬を患者等に投与して採血した血液が凝固しないように抗凝固処理された血液を、血液凝固を促進しつつ流して血栓誘発材上の血栓の生成を観測することができるので、抗血栓薬の効能を人体内に近い環境で具体的に観測することができる。また、採血時に抗凝固処理剤を用いることができるため、採血後の検体を一定期間保存することができ、検査時期を任意に選択できる利点を有する。ここで、抗凝固処理がクエン酸などのカルシウムキレート剤による処理であり、遊離カルシウム供与体によって抗凝固処理を解除すると、試薬の入手が容易であり好ましい。抗凝固処理がトロンビンアプタマーによる処理であり、トロンビンアプタマーのアンチセンスDNAによって抗凝固処理を解除すると、血液の生理的カルシウムイオン濃度を反映しつつ検査が可能である。
【００１１】
また、請求項１２にかかる本発明の血栓観測方法によれば、血栓生成室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除する操作を行うことなく血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測することもできるので、少量の血液で血栓生成の観察を行うことができ、被検者の負担を低減することができる。また、この場合、薬剤管は必ずしも必要としないため、血栓観測装置を簡略なものとすることができる。ここで、組織トロンボプラスチンを血液凝固促進剤として用いることで、ＸＩＩ因子活性化やカリクレイン活性化を迂回した径路で凝固系が活性化されて血液凝固が促進され、血栓生成室にて血栓を観測する事が可能である。
【００１２】
また、１種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固処理剤に対応する少なくとも１種の抗凝固処理解除剤で抗凝固処理を解除することで容易な操作で血栓形成を観測することもできる。この場合、接触相因子阻害剤及びカルシウムキレート剤による抗凝固処理を行い、遊離カルシウム供与体で抗凝固処理を解除するか、接触相因子阻害剤及びヘパリンによる抗凝固処理を行い、へパリナーゼで抗凝固処理を解除すると、血栓生成観測時に効果を発揮している抗凝固処理は、接触相因子阻害剤による抗凝固処理なので、より生理的な条件下、特にカルシウム、マグネシウム等の血栓症に関連する２価金属イオンの濃度を反映したまま血栓の観測を行うことが可能となる。この場合、血液凝固XII因子、カリクレインなどの接触相因子の阻害剤及びトロンビンアプタマーによる抗凝固処理を行い、トロンビン阻害アプタマーのアンチセンスDNAで抗凝固処理を解除すると、長期の血液保存が可能である。そして、血液凝固XII因子の阻害剤としてコーン由来トリプシンインヒビターを用いるとより効率よく抗凝固処理を行うことができる。
【００１３】
本発明の血栓観測方法においては、血栓生成室における血液の流入時および／または流出時の圧力を測定することで、極めて簡易な装置で容易に、血栓生成の程度を数値化でき、定量的な評価が可能である。
そして、血栓誘発材がコラーゲンと組織因子を含むものであると設置が容易となり、かつ、効果的に血栓生成を誘発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１の形態例に係る血栓観測装置を示す概念図である。
【図２】（ａ）は本発明の第１の形態例に係る実施例３、５、６の血栓誘発材１５の設置状態を示す概念図であり、（ｂ）は本発明の第１の形態例に係る実施例３、５、６の血栓生成結果を示す概念図である。
【図３】（ａ）は本発明の第１の形態例に係る実施例４の血栓誘発材１５の設置状態を示す概念図であり、（ｂ）は本発明の第１の形態例に係る実施例４の血栓生成結果を示す概念図である。
【図４】本発明の第２の形態例に係る血栓観測装置の要部（マイクロチップ本体）を示す概念図である。
【図５】本発明の第２の形態例に係る血栓観測装置の要部（マイクロチップ蓋）を示す概念図である。
【図６】本発明の第２の形態例に係る実施例７における血栓生成位置を示す概念図である。
【図７】本発明の第２の形態の他の例に係る血栓観測装置の要部（マイクロチップ本体）を示す概念図である。
【図８】本発明の第２の形態の他の例に係る血栓観測装置の要部（マイクロチップ蓋）を示す概念図である。
【図９】本発明の第３の形態例に係る血栓観測装置の要部を示す概念図である。（Ａ）は完成図、（Ｂ）はマイクロチップ本体、（Ｃ）はマイクロチップ蓋を示す。
【図１０】本発明の血栓観測装置を用いてシステム化した血栓観測システムを示す概念図である。
【図１１】（Ａ）は１０μＭのエクソサイトＩ及びＩＩに対するアプタマーを加えた血液を１５分間室温で保存した後に４０μＭの両アプタマーのアンチセンスＤＮＡを添加しトロンボエラストグラムで凝固の波形を解析した結果である。（Ｂ）は採血直後の血液のトロンボエラストグラムの波形である。
【図１２】本発明の第４の形態例に係る血栓観測装置の要部を示す概念図である。（Ａ）は完成図、（Ｂ）はマイクロチップの蓋、（Ｃ）はマイクロチップの基板を示す。
【図１３】実施例１７（control）、１８（Heparin）、１９（レオプロ）の圧力測定結果を示すグラフ。
【図１４】ヘパリンを０（control）、０．２、０．５、１単位／ｍｌ加えたときの圧力測定結果を示すグラフ。
【図１５】レオプロを０（control）、２、５、１０μｇ／ｍｌ加えたときの圧力測定結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００１５】
１…血栓観測装置、１０、１１０、３１１、４１１…血栓生成室、１１、１１１…流入管、１２、１１２、３１２…薬剤管、１３、３１３、４１３…排出管、１４、１１４…狭窄部位、１５、１１５、３１５…血栓誘発材、１６…生成された血栓、２０、２１、３２０、４２０…シリンジ、３０、３１、３３０、３３１、４１４、４２３…ポンプ、４０、４１、３４０…圧力センサー、１００…基板（マイクロチップ本体）、２００…基板（マイクロチップ蓋）、１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ…接続部、１００Ｄ…圧力計となる回路、１００Ｅ…調整弁、３００、４００…マイクロチップ（血栓観測装置）、３０６…ポンプ制御ユニット、３０７…コンピューター、３０８…ＣＣＤカメラ付蛍光実体顕微鏡、３１７…圧入管、３２２、４２２…血液凝固防止剤流入管、４１２…接続チューブ、４３０…ＣＣＤカメラ、４３１…レンズ、４３２…照明用光源、４３３…カメラ移動用レール、Ａ、Ｂ…血栓観測システム。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、最良の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。
図１は本発明の血栓観測装置の第１の形態例を示す概念図である。【００１７】
図１に示すように、本形態例に係る血栓観測装置１は、血栓生成室１０と、該血栓生成室１０に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管１１と、該流入管１１に接続されて前記流入管１１に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管１２とを備える。【００１８】
血栓生成室１０は、内部の一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた略円筒状であり、透明なガラスや熱可塑性樹脂などで製造することができる。血栓誘発材としては、コラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、予め作られた血栓、絹糸やコットン等の繊維基材などを挙げることができる。これらは一種単独で、または、複数を組み合わせて使用することができる。これらの内、入手が容易で、取り扱いやすく、実際の血管に近いモデルとなることからコラーゲンが特に好ましい。コラーゲンには組織因子が含まれていても良い。血栓誘発材が血流によって流出しないようコラーゲンやｖＷＦなどの血栓誘発材は、血栓生成室１０の内部にコーティングされた状態が望ましい。コーティングの方法は、例えば、コラーゲンのコーティングはガラスまたはポリスチレン表面に特開平０５−２６０９５０号公報やＢｌｏｏｄ．１９９５  Ａｐｒ  １；８５（７）：１８２６−３５．に記載されているように、酸性溶液に溶解し、親水性が付与された基材を浸漬、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便にコーティングが可能である。【００１９】
また、繊維基材や予め作られた血栓などの血栓誘発材は、血栓生成室１０の内部に固定された状態が望ましい。そして、薄い吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不織布や織布等にコラーゲンを含浸、乾燥させる事で、より血栓誘発能の高い血栓誘発材が得られる。また、組織トロンボプラスチンを含むコラーゲン溶液にそれらの基材を浸漬させ乾燥させると、さらに血栓誘発能が高まる。
血栓誘発材は、血栓生成室１０の内径や観測目的に応じて選択される。心筋梗塞等のアテローム血栓症をモデルにする場合においてはコラーゲン単独、又はコラーゲンと組織トロンボプラスチンを含むものであることが好ましく、さらに血栓生成室内の流路の狭窄を設けることにより、ずり応力が加わる形の血栓生成室であるとさらに好ましい。また、心原性脳梗塞等の別部位からの血栓が血流によって移動して付着し別部位の血管を閉塞させるような血栓の試験の場合には、予め少量の血栓を血栓生成室１０に固着させ、血栓誘発材とし、その上に生成する血栓の成長を観測する事が好ましい。毛細血管等の血栓症の試験の場合には血栓生成室における流路の内部が複数の流路に分割され、その幅または太さが１０μｍ〜３０μｍに狭められているものが望ましい。血栓生成室１０が幅または太さが１００μｍ以下の狭窄部を有する場合には、その狭窄部に生成した少量の血栓によって流路がより閉塞されるので、別途、血栓誘発材を用いることなく、凝固促進剤または抗凝固解除剤によって血栓生成を観測することができる。したがって、本発明においては、血栓誘発材としてこの狭窄部を含む。【００２０】
血栓誘発材は、コラーゲンやｖＷＦをコーティングするだけでも良いが、コーティング部位の血栓生成室１０を狭窄に構成し狭窄部位１４としておくと、高ずり応力惹起血小板凝集も観測することができ好ましい。血栓誘発材としてコラーゲンをコーティングする場合、少なくとも下地となる部位の基材は平滑なガラス又はプラスチックとすると密着性に優れ好ましい。なお、血栓生成室１０または血栓生成室１０の血栓誘発材が設けられる部位を着脱可能なカセットに構成しておくと、生成した血栓を洗浄したり、観察したり、血栓誘発材を交換したりする作業が容易となり好ましい。この場合、カセットは、シリコーンゴムのオーリング等で、液密に接続することが好ましい。血栓生成室１０の流入管１１が接続される端部と反対側の端部には、血液を排出する排出管１３が接続され、排出管１３をチーズで分岐しその先端にダイアフラム型等の圧力計４１を設けることが好ましい。一方、排出管１３の先端は図示しない貯留容器に接続されることが好ましい。【００２１】
血栓生成室１０に接続される流入管１１は、透明なガラスや熱可塑性樹脂などで製造することができる。流入管１１の血栓生成室１０に接続される端部と反対側の端部には、血液を供給するシリンジ２０が接続される。シリンジ２０にポンプ３０として、図示しない押圧手段にて、シリンジ２０のプランジャーを所定圧力で押圧するように構成する。ポンプとしては、市販の一般的なポンプを用いてもよいが、エアーの一定圧で押し出したり、シリンジをプランジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせたりしてシリンジポンプとしてもよい。
流入管１１の血栓生成室１０の近傍に、流入管１１をチーズで分岐しその先端にダイアフラム型等の圧力計４０を設けることが好ましい。【００２２】
シリンジ２０内の血液は抗凝固処理されている。抗凝固処理に用いる抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤の内、一般的な３．２％クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液９容に対してこの抗凝固処理剤１容とするのが好ましい。【００２３】
抗凝固処理剤を加えていない全血または血漿などは一般に数分以内で凝固する。凝固はクエン酸塩などのカルシウムキレート剤の添加によって軽減または消失させることができる。特にクエン酸塩は、プロトロンビナーゼならびに外因性および内因性テナーゼの集合および機能を妨げることが報告されている。
クエン酸処理した血液は一定期間（例えば、数時間から数日間）にわたって液体形態で保存することができ、操作を加えて血球分離物、多血小板および乏血小板血漿などの血液製剤を作製することもできる。クエン酸塩を含む血漿は、約−７０℃以下の温度で凍結することにより、長期間（数カ月から数年）保存可能である。本発明においては、この全血や血漿を用いることもでき、その場合もカルシウム等を再添加することが好ましい。
しかし、カルシウム等を再添加した全血や血漿は一般に、ほとんどの貯蔵容器内で接触活性化のために自然に凝固し、この場合には接触活性化は約２〜４分以内で生じうる。このため、本発明においては、採血してクエン酸処理した新しい血液や保存用に凍結した後に解凍したクエン酸処理した血液や血小板含有血漿に対して血栓観測直前にカルシウム等の抗凝固解除剤の添加を行ってもよい。【００２４】
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、ヒルログ（ヒルジンＣ末端領域ペプチド）、アプロチニン、抗トロンビン抗体、トロンビンアプタマー、コーン由来トリプシンインヒビター（１９７７．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５２．８１０５）等の利用が可能である。これらは、血液凝固因子を阻害することで凝固カスケードを阻害することで、血液凝固を阻害するものであり、本明細書では「凝固因子阻害剤」ということがある。
観測用サンプルを採血する方法としては、シリンジ又は真空採血管に予め上記の凝固因子阻害剤を入れて採血を行うか、又は、採血直後の血液に凝固因子阻害剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。
さらに、凝固因子阻害剤、例えば、ヘパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパリナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、ヘパリナーゼでへパリンを分解させ、観測目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。また、同様にクエン酸を含む真空採血管で採血し、塩化カルシウム及びコーン由来トリプシンインヒビターやトロンビンアプタマー等の観測目的に適した凝固因子阻害剤を加えることで、観測目的に合わせて抗凝固処理した血液を採血することが可能である。【００２５】
血栓生成室１０に接続される薬剤管１２は、透明なガラスや熱可塑性樹脂などで製造することができる。薬剤管１２の血栓生成室１０に接続される端部とは反対側の端部には、抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を供給するシリンジ２１が接続される。シリンジ２１にポンプ３１として、図示しない押圧手段にて、シリンジ２１のプランジャーを所定圧力で押圧するように構成する。ポンプとしては、市販の一般的なポンプを用いてもよいが、エアーの一定圧で押し出したり、シリンジをプランジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせたりしてシリンジポンプとしてもよい。薬剤管１２には後述するような抗凝固解除剤または凝固促進剤を充填する。【００２６】
本発明の血栓観測装置を用いて、血栓観測を行なうには、シリンジ２０内に抗凝固処理、例えば、クエン酸ナトリウムで処理した全血および血小板血漿（溶液Ａ）を充填する。シリンジ２１内には、抗凝固処理を解除する薬剤、例えば、塩化カルシウム溶液（溶液Ｂ）を充填する。溶液Ａの凝固カスケードが開始される溶液Ｂの濃度（５〜２０ミリモル）になるようにポンプ３０、３１によって流入管１１に溶液Ａと溶液Ｂとを供給し、流入管１１内で混合しつつ、溶液Ａと溶液Ｂの混合液を血栓生成室１０に流入させる。そして、血栓生成室１０の内部の一部には、予め血栓生成を誘発する、例えば、コラーゲン等が塗布されて血栓誘発材が設けられる。この血栓生成室１０は、例えば、透明なプラスチックチューブで形成することができる。この様な透視可能な血栓生成室１０を通過する血液を観測する装置によって簡便に血栓形成が観測される。【００２７】
血栓形成の観測は、一定時間血液を流した後、コラーゲンで処理されたセル（血栓生成室１０）内から血液を除去する事によって、目視によって評価する事が出来る。溶液Ａと溶液Ｂを送液するポンプがエアー駆動である場合は、一定圧で溶液Ａ、溶液Ｂを送液することで、排出管１３から排出される血流量の低下によって、コラーゲン上での血栓形成をモニターする事が出来る。または、流入管１１および排出管１３の血栓生成室１０近傍に圧力計が設けられている場合には、血栓生成室１０の内圧の変化を見ることでコラーゲン上での血栓形成をモニターする事が出来る。または、血栓生成室１０の厚みを５００μｍ以内にする事で顕微鏡による観察が可能である。特に多血小板血漿を用いた血栓は視認性が高いので観察が容易であり、肉眼による血栓形成の観察も可能である。さらには特許文献１に記載の方法で血小板を蛍光ラベルし蛍光顕微鏡でモニターする事も可能である。【００２８】
クエン酸のようなキレート剤による抗凝固処理を解除する薬剤としては、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム等のハロゲン化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、重炭酸カルシウム等の無機酸カルシウム塩、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アルギン酸、乳酸、グルコン酸、グリセリン酸、グリセロリン酸等の有機酸のカルシウム塩、などの遊離カルシウム供与体であるカルシウム化合物を挙げることができる。【００２９】
凝固因子阻害剤（抗凝固処理剤）により抗凝固処理した場合には、凝固因子阻害剤に応じた抗凝固解除剤を選択し使用することができる。例えば、ヘパリンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、プロタミン、へパリナーゼまたは抗へパリン抗体等が利用可能であり、ヒルジン、ヒルログおよびアプロチニンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、それぞれ抗ヒルジン抗体、抗ヒルログ抗体および抗アプロチニン抗体等の抗凝固解除剤が使用可能である。
抗トロンビン抗体を凝固因子阻害剤に用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、ＰＰＡＣＫトロンビン等の完全に不活性化されたトロンビン、トロンビンの分解断片およびトロンビン中における抗体認識エピトープを含有する合成ポリペプチド等の抗凝固解除剤の使用が可能である。
なお、抗凝固処理、または抗凝固解除に使用される抗体は補体系への影響を最小限にする為に、パパイン等でＦｃドメインを取り除いたものを使用するか鶏卵抗体等のヒト補体系活性化能を有さない抗体を使用することが望ましい。【００３０】
１本鎖オリゴＤＮＡであるトロンビンアプタマー（Ｂｌｏｏｄ．  １９９３  Ｊｕｎ  １５；８１（１２）：３２７１−６．又はJ Mol Biol. 1997 Oct 10;272(5):688-98.）を抗凝固処理剤として用いた場合にはトロンビンアプタマーに対するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等のトロンビンアプタマーに結合し機能を阻害する物質が抗凝固解除剤として使用可能である。トロンビンアプタマーはエクソサイトI及びIIを認識する２種を併用すると、単独の場合より飛躍的に高い抗凝固処理効果が得られる。この際用いられるアンチセンスＤＮＡは実質的にトロンビンアプタマーの抗トロンビン機能を無効化するものであれば、トロンビンアプタマーの一部に対するものであってもよい。
なお、トロンビンアプタマーとそのアンチセンスDNAがそれぞれ抗凝固処理剤と抗凝固解除剤として有効であることを後述の参考例に示す。【００３１】
ヘパリンによって抗凝固処理した場合には、数時間の間に凝固系が活性化されることはないので、血栓生成を観測するに際して長期間の血液保存が可能となるが、例えば、ヘパリン投与を受けた患者から採血した血液の検査には適さない場合がある。【００３２】
一方、ヒルジン、ヒルログ、抗トロンビン抗体は、凝固系に最終段階ではたらくトロンビンを阻害することでフィブリノゲンのフィブリンへの変換を阻害する阻害剤であるが、トロンビンを完全に阻害した場合でも、凝固カスケードの接触相因子（プレカリクレイン、ＸＩＩ因子等）がゆっくりと活性化を受けるので、徐々に凝固カスケード上流における活性化が起こり長期間の血液保存には適さない場合がある。【００３３】
また、アプロチニンは接触相のカリクレインの活性を阻害することで、内因系血液凝固カスケードを遅延するが、カリクレイン活性の阻害下においても、ゆっくりと凝固カスケードが活性化を受け、アプロチニン存在下においても数時間後には血液が凝固する。
したがって、採血後数十分程度後の血液の血栓生成の観測においては、トロンビンの阻害剤および／またはアプロチニンで抗凝固処理して血栓生成の観測が可能である。しかし、観測着手に長時間要する場合や、観測に長時間を要する場合は、好ましくない場合がある。
採血後１時間以上経過した後に血栓生成を観測する場合は、トロンビンアプタマーとコーン由来トリプシンインヒビターやヒルジンとアプロチニンを併用して抗凝固処理するか、凝固時間に多大な影響を与えないレベル、例えば、１単位／ｍｌ未満の少量のへパリンを接触相因子の阻害剤またはトロンビンの阻害剤と併用することが望ましい。
トロンビンアプタマーはエクソサイトI及びIIに対する2種類のアプタマーを併用することで抗凝固処理効果を飛躍的に高めることが可能で、さらに両アプタマーのアンチセンスDNAで抗凝固処理を即時に解除することが可能である。【００３４】
また、コーン由来トリプシンインヒビター（ＸＩＩ因子阻害剤）、アプロチニン（カリクレイン阻害剤）等の接触相因子に対する阻害剤とトロンビンアプタマー等のトロンビンに対する阻害剤の両方を検体（血液）に添加しておき、これにトロンビンアプタマーのアンチセンスＤＮＡ（トロンビンアプタマーの阻害剤）等を加え、トロンビン阻害剤の機能のみを阻害してトロンビンの機能阻害を解除した後、速やかに検体を血栓生成室に流せば、例えば、組織因子（組織トロンボプラスチン）等で外因系凝固カスケードが活性化され、血液凝固が促進されて生理的な血栓生成の観測が可能となる。
あるいは、クエン酸等のキレート剤又はヘパリン等の抗凝固処理解除が可能な抗凝固処理剤とコーン由来トリプシンインヒビターの両方で抗凝固処理を行い、これに塩化カルシウム等の遊離カルシウム供与体又はへパリナーゼでそれぞれが対応する抗凝固処理を解除した後、速やかに血栓生成形成室に流して、外因系凝固カスケードの活性化により血液凝固を促進することも可能である。
この場合、血栓誘発材に組織因子（組織トロンボプラスチン）を適宜量含ませることが望ましい。血栓誘発材をコラーゲン及び組織トロンボプラスチンを混和し乾燥させることでコーティングしたものを用いると血栓生成室においてのみ血栓生成が進み特に望ましい。アテローム血栓のモデルとして組織因子（組織トロンボプラスチン）を含むコラーゲン溶液をコートした血栓誘発材を用いると、病理機序を反映した観測を行うことが可能である。
なお、クエン酸などのカルシウムキレート剤によって抗凝固処理を行った血液に、遊離カルシウム供与体およびトリプシンインヒビターを加えた後、速やかに血栓形成室に流して血栓形成を測定することや、ヘパリンによって抗凝固処理を行った血液に、ヘパリナーゼおよびトリプシンインヒビターを加えた後、速やかに血栓形成室に流して血栓形成を測定することも可能である。上記のような、１種または複数種の抗凝固処理剤を用いて抗凝固処理された血液を、用いた抗凝固剤に対応する少なくとも１種の抗凝固処理解除剤を混合した後、速やかに血栓形成室に流して血栓を観測するという方法には、例えば、後述の図９に示されるような血栓観測装置が使用できる。【００３５】
上記のヒルジンやトロンビンアプタマー等のトロンビンの阻害剤、接触相因子に対する合成低分子阻害剤および蛋白質の抗凝固処理剤は、クエン酸やＥＤＴＡ等のカルシウム等をキレートする抗凝固処理剤と比較すると高価ではあるものの、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等の２価金属イオンの濃度を変化させることがないので、患者の血液の本来の濃度における血栓生成をモニタリングに反映することが可能となり、より患者の病態を反映した観測が可能となる。【００３６】
血液凝固は、活性化ＸＩＩ因子やカリクレイン等の接触相因子の阻害により抑制する事が可能であるが、実際の生理的血栓、止血においてはＸＩＩａおよびカリクレインの活性はあまり関与していないことが報告されている。実際にＸＩＩ因子、プレカリクレインの先天性欠乏症患者においても出血等の所見は全くみられない。特に心筋梗塞等のアテローム血栓症においては、動脈硬化によるプラークに起因する組織因子によって凝固系が活性化されることが広く知られており、ＸＩＩ因子は主に活性化血小板上でトロンビンによって活性化を受ける。よって、ＸＩＩ因子やプレカリクレインの活性化阻害剤または活性化ＸＩＩ因子やカリクレイン阻害剤を抗凝固処理剤として用いて抗凝固処理する場合は、抗凝固解除剤を加えなくともよい。抗凝固処理剤の代わりに組織因子（組織トロンボプラスチンなど）等の外因系凝固を活性化する物質を血液に添加する、または血栓誘発材に加える事によって、ＸＩＩ因子活性化やカリクレイン活性化を迂回した径路で凝固系が活性化されて血液凝固が促進され、血栓生成室にて血栓を観測する事が可能である。【００３７】
抗凝固解除剤を加えずに、組織因子等の外因系凝固を活性化する物質の添加により血液凝固を促進して血栓形成を観測する場合に使用可能な抗凝固処理剤としては、カリクレイン阻害剤であるＰＫＳＩ−５２７（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ５７：８８９，１９９０）、や活性化ＸＩＩ因子阻害剤であるＤ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＣＫ（Ｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社）等の合成低分子阻害剤があげられる。また、蛋白質阻害剤として抗カリクレイン抗体、抗プレカリクレイン抗体、抗凝固ＸＩＩ因子抗体、抗活性化凝固ＸＩＩ因子抗体、コーン由来トリプシンインヒビター等の凝固カスケードの接触相プロテアーゼに対する抗体等が挙げられる。
抗凝固解除剤を加えずに、外因系凝固を活性化する物質により血液凝固を促進して血栓形成を観測する場合、特に入手及び抗凝固能の観点から、クエン酸とコーン由来トリプシンインヒビター又はトロンビンアプタマーとコーン由来トリプシンインヒビターによって、一旦、抗凝固処理を行って血液を保存すると観測操作の自由度を高めることができ好ましい。そして、血栓観測直前に遊離カルシウム供与体又はトロンビンアプタマーのアンチセンスDNAでコーン由来トリプシンインヒビターによる抗凝固処理を残して部分的に他の抗凝固処理を解除する。この場合、コラーゲン又は組織トロンボプラスチンを含むコラーゲンをコーティングした血栓誘発材を用いて外因系凝固を活性化して血液凝固を促進することがアテローム血栓のモデルとして望ましい。【００３８】
上記の血栓観測に用いる血液を供給するシリンジや真空採血管などの容器は、ヘパリンコーティングされた容器やポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）、ポリ２メトキシエチルアクリレート（PMEA）等の抗血栓性や血液適合性を有する素材でコートされた容器を用いる事が望ましい。【００３９】
本発明の血栓観測装置の別の形態例では、チューブや血栓生成室はマイクロチップ等の微細な流路によって基板上に一体化させることもできる。
図４は、本発明の血栓観測装置の第２の形態例の要部の平面図である。図４の基板１００には溝が彫られ、回路が形成される。本形態例は、小さな基板上に血栓観測装置の要部である血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固解除剤又は血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管とが基板上に一体化した回路としてマイクロチップ化された形態である。本形態例は、基板に一体化した要部以外は第１の形態例と同様である。
図４の基板１００はマイクロチップの本体となるものであり、その材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等である。血栓等を観察する観点からは透明な材質が好ましく、回路を形成する観点からはプラスチックが好ましい。したがって、透明なプラスチックが特に好ましい。PDMS（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン樹脂製とした場合には、密着性に優れるため、蓋部材と接着剤などで接着しなくても圧着することで回路を形成することが出来る。ポリスチレン製の基盤を用いた場合には流路をＰＶＬＡで簡便にコーティングし抗血栓処理をすることが可能である。またＰＭＥＡによっても簡便かつ効果的に抗血栓処理する事が可能である（参考実験４参照）。【００４０】
図５は、図４の基板１００に重ね合わせて密着してマイクロチップの蓋となる基板の平面図である。図５の基板２００は、透明なスライドガラスまたはプラスチック等からなる板やシートである。基板２００を蓋として重ね合わせて密着することで、基板１００の回路が血栓生成室１１０、流入管１１１および薬剤管１１２となる。【００４１】
血栓生成室１１０内面に血栓誘発材１１５を設けるには、基板２００の設置予定位置に例えば、コラーゲン等を塗布しておけばよい。基板２００のコラーゲン塗布面を内向きにした状態で、基板１００と基板２００とを接合や嵌合により密着させると血栓形成室を有する血栓観測装置が得られる。塗布が容易なので溝のない平坦な基板２００にコラーゲンを塗布する事が望ましい。また、組織トロンボプラスチンをコラーゲンと混合して塗布することで、さらに高い血栓誘発能を有する血栓誘発材を得る事が出来好ましい。そして、塗布したコラーゲンで血栓が形成されやすくするためには、コラーゲン塗布部位のガラスをすりガラスにするなど、表面積を上げる処理を加えることが可能である。【００４２】
基板１００における接続部１００Ａ、接続部１００Ｂおよび接続部１００Ｃにはそれぞれ、流入管、薬剤官および排出管の一部である図示しないチューブが接続され、接続部１００Ａおよび接続部１００Ｂにはチューブを介して図示しないポンプがそれぞれ接続されている。接続部１００Ａからは抗凝固処理された血液が注入され、接続部１００Ｂからは抗凝固処理剤に対応する抗凝固解除剤が注入される。
本形態例によれば、極少量の血液で血栓形成の観察ができるので、被検者の負担が小さくて済む。また、メパクリン等の蛍光試薬で血小板をラベルする事で、基板２００側より基板２００に付着した血小板をモニターする事が可能である。【００４３】
なお、回路１００Ｄは空気が閉塞されて終端が封止可能な回路で、圧力計となる。回路１００Ｄは、終端に回路１００Ｄを圧力計としたときの圧力抜きや感度を上げるための調整弁１００Ｅを設けることが好ましい。調整弁１００Ｅは、キャップや粘着テープで閉鎖したり、必要な感度に応じて樹脂等の詰め物で容積を変更したりすることができる。この回路１００Ｄは血液の侵入により空気と混ざったり、空気が逃散しない程度に狭く形成される。その太さは基板１００の材質にもよるが、およそ０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度である。血栓形成によって血栓観測装置の流入管１１１の内圧が高まると、回路１００Ｄ内の空気が血液により圧縮されて、その分抗凝固処理された血液が回路１００Ｄ内に侵入する。回路１００Ｄ内の血液の移動によって内圧を随時モニターする事が可能である。【００４４】
上述した本発明の血栓観測装置および／または血栓観測方法によってコラーゲンへの血小板の粘着、活性化血小板上での凝固系の活性化、血小板凝集による活性化血小板の堆積をモニターする事が可能である。
さらにアテローム血栓症の血栓形成を再現する為に血栓生成室１０、１１０に狭窄部位１４、１１４を作ることで高ずり応力惹起血小板凝集も反映した観測が可能である。【００４５】
図９は本発明の血栓観測装置の第３の形態例の要部を示す概念図であり、血液凝固防止剤を血栓生成室より下流の血液に混和する血液凝固防止剤流入管３２２および圧入管３１７を説明するもので、本形態例においては血栓生成室より上流の薬剤管は設けていない。
第３の形態例では、抗凝固処理剤（例えば、クエン酸とコーン由来トリプシンインヒビター）を加えて採血した血液に、測定直前に抗凝固解除剤（例えば、遊離カルシウム供与体）を加えたものをシリンジ３２０に入れ、該シリンジに接続された圧入管３１７からミネラルオイルなどの血液圧送用の液体を圧入して血液をマイクロチップ３００へ押し出す。
サンプルシリンジ３２０にかかる圧力の上昇は、血栓の生成による流路の閉塞状況を示すため、圧力変化をモニターすることで血栓形成を検知することができる。圧力変化による血栓形成のモニターは、特に閉塞性血栓が形成される強固なアテローム血栓のモデルの観測に適しており、血栓誘発材としては、特に制限されないが、例えば、外因系凝固を活性化して血液凝固を促進する場合は、コラーゲンと組織因子を用いたものが血栓の観測に有効である。
圧力測定に際しては、血栓形成による流路内の圧力をより正確に測定する為に、図９に示すように、血液凝固防止剤流入管３２２よりマイクロチップ３００に形成された流路を経由して血液凝固防止剤を血栓生成室より下流の血液に混和することによって、血液が、血栓生成室以降の流路での血栓形成が防止される。これにより、血栓生成室における血栓の生成にともなう流路の狭窄又は閉鎖による流路内の圧力変化を特異的にかつ正確に測定することができるので望ましい。
この様な、血液凝固防止剤としては特に制限されず、本発明で用いる抗凝固処理剤を用いても良いが、コストや取扱性を考慮して、アルカリ又は酸性溶液、アルコール、尿素、ＳＤＳ類、等の蛋白変性によって血液凝固を防止するものから適宜選択することが好ましい。
ここで、本発明の血栓観測装置は、図９の形態例において、圧入管３１７を設ける代わりに、排出管３１３に吸引ポンプを設け、吸引圧力（陰圧）の変化により血栓形成の程度を測定する装置とすることもできる。この様に構成することにより、後述する層状に分離する液体によって間接的に血液を押し出すポンプを用いる場合に、血液の量が少ないと血液とミネラルオイルなどの圧送用液体の接触領域で混合された液体が送られるおそれがあるが、その様な事態を防ぐことが可能でより効率のよい測定が可能である。
また、本発明の血栓観測装置に血液を供給する容器（サンプルタンク）をシリンジなどの密閉容器とする必要がなく、蓋がなく大気に開放された容器とすることができるので、血栓観測装置を簡素化できる。さらに、本発明の血栓観測装置の流路内部が陰圧となるので、本発明の血栓観測装置をマイクロチップで形成するに際して、例えば、マイクロチップ本体とマイクロチップ蓋が完全に接着していなくても血液が漏れることがない。場合によっては、マイクロチップ本体とマイクロチップ蓋を嵌合させただけであっても、嵌合の精度がよければ、そのままで血栓観測装置として使用することができる。【００４６】
図１０は、さらにシステム化された血栓観測システムＡを示す。
図１０の血栓観測システムＡは、微量送液ポンプ３３０に血液より比重が小さい液体を充填し、これを圧入管３１７より血液が収容されたサンプルシリンジ３２０に圧入して血液の上に重層し、血液をマイクロチップ３００に押し出すものである。押出された血液は、マイクロチップ内で薬剤管３１２から注入された抗凝固解除剤と混合され、血栓形成室３１１に到達する。微量送液ポンプ３３０の血液圧送用の液体としては流動パラフィン、ミネラルオイルやシリコーンオイルなどの各種油脂、生理食塩水等が挙げられる。この様に、間接的に血液を押し出すことにより微量送液ポンプ３３０及び圧力センサー３４０が血液で汚染されることを防ぐことが可能となる。
なお、この様な血液に対して層状に分離する液体によって間接的に血液を押し出すポンプは、上記いずれの形態例の本発明の血栓観測装置に適用することもできる。
そして、微量送液ポンプ３３０により、サンプルシリンジ３２０にかかる圧力は、圧力センサー３４０によって測定される。
さらに、この血栓観測システムＡにおいては、画像解析により血栓形成状況をより詳細に把握することが出来る。特にキナクリン等によって血小板、白血球を蛍光標識しコラーゲンへの粘着及び凝集を観測する場合は、蛍光発色による単位面積あたりの輝度を画像解析で観測することで観測結果を数値化し、データとして保存することが可能である。画像解析はＣＣＤカメラ付蛍光実体顕微鏡３０８によって捕らえられた像をコンピューター３０７で処理してディスプレイに表示させることによって行うことができる。
したがって、この血栓観測システムＡにおいては、画像解析及びサンプルシリンジ３２０にかかる圧力の変化により総合的な血栓形成状況を判定することができる。
なお、この様な血栓観測システムは、いずれの形態例の本発明の血栓観測装置を用いてシステム化することができる。【００４７】
図１２は、本発明の血栓観測装置の第４の形態例を示す概念図であり、血栓生成を観察するためのカメラを有する血栓観測装置を示す。
この血栓観測装置においては、例えば、クエン酸とコーン由来トリプシンインヒビターで抗凝固処理された血液を、抗凝固処理解除剤（例えば、遊離カルシウム供与体）を加えて速やかにシリンジ４２０に充填する。排出管４１３に接続されたポンプ４１４によって吸引することにより血液を血栓生成室４１１に流して血栓を生成させる。吸引圧力（陰圧）の変化により血栓形成の程度を測定することができる。
また、血栓生成室通過後の血液が凝固して排出管４１３が詰まったり、圧力測定に影響を与えることを防ぐため、血栓形成防止剤流入管４２２により血栓形成防止剤を血栓生成室通過後の血液に混和する。
さらに、マイクロチップ４００の下に、例えば、CCDカメラからなるカメラ４３０を設置することで血栓形成を撮像することができ、マイクロチップ上の空間を有効に利用することが可能である。カメラ４３０は、レール４３３により血栓形成室の下を前後左右に移動することができる。カメラ４３０がその位置をＸ軸およびＹ軸として数値化して記憶する機能を有するものを用いることで複数の特定箇所を定期的に巡回して撮像することができる。この様に構成することにより、カメラ４３０の倍率を高く設定しても、血栓生成室４１１の広い範囲にわたって血栓形成過程を経時的に観測する事が可能である。さらにカメラ４３０の周囲に、例えば、LEDからなる光源４３２を備えているとカメラ４３０との位置関係を一定に保持したまま光源４３２も同時に移動でき、好ましい。光源４３２は白色光と共に特定の蛍光物質を励起可能な波長光を撮像対象となる蛍光物質に応じて照射可能とする事で多種の蛍光物質の励起を行うことが可能であり好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
図１に示す血栓観測装置を用いて、採血直後の血液９容量部に対し３．２％クエン酸ナトリウムを１容量部混合したクエン酸処理血液（溶液Ａ）５０ｍｌをシリンジ２０に、０．２ＭＣａＣｌ2（溶液Ｂ）１０ｍｌをシリンジ２１に充填し、シリンジ２０、２１を内径３ｍｍの透明なナイロンチューブチューブ（流入管１１、薬剤管１２）にそれぞれ接続する。両チューブをＴ字状のジョイント（チーズ）にて合流させ１本の内径３ｍｍ、長さ３ｃｍのナイロンチューブ（流入管１１）を介して内径３ｍｍ長さ１ｃｍのポリカーボネート製の血栓生成室１０に接続する。血栓生成室１０自体を着脱可能なカセットとし、ナイロンチューブ（流入管１１）とのつなぎ目にはシリコーンゴムのオーリングを介在させて液密とし、内部にはガラス製部材をエポキシ系接着剤で固定し、狭窄部位１４を作る。狭窄部位１４の最も絞られた部位の内径（狭窄部位１４と内壁との最大間隙）が１．５ｍｍになるように設計する。また、血栓生成室１０に同径、同材質のチューブを排出管１３としてシリコーンゴムのオーリングを介在させて液密に接続し、図１に示す血栓観測装置１を作製する。なお、流入管１１および排出管１３の血栓生成室１０近傍には、ジョイント（チーズ）を介してフランジ型の圧力計４０、４１をそれぞれ設ける。また、血栓生成室１０の内面のガラス製狭窄部材は１％不溶性コラーゲンタイプＩ（和光純薬株式会社製）の０．１Ｎ酢酸溶液に浸漬後乾燥する事で内面のガラス製狭窄部に血栓誘発材１５としてコラーゲンをコーティングする。そして、シリンジ２０、２１をプランジャーが上になるよう倒立させ、溶液Ａを５ｍｌ／分、溶液Ｂを０．５ｍｌ／分で流れる様に、それぞれのプランジャーに重りをのせてシリンジポンプとする。【００４９】
溶液Ａおよび溶液Ｂを１０分間流すと、数分経過したところで流入管１１および排出管１３の圧力計４０、４１に差が現れ、時の経過と共にその差が大きくなり、同時に排出管１３から排出される血液も徐々に減少することが確認される。全ての溶液を流し終わった後、血栓観測装置１に生理食塩水を流して血栓生成室１０を洗浄すると、血栓生成室１０に血栓が形成されていることが目視で確認される。【００５０】
実施例２
実施例１において、溶液Ａを、さらに未分画ヘパリン（ブタ粘膜製）を溶液Ａに対して１ｍｇ／ｍｌになるように加えたものに代えること以外は、実施例１と同様に血栓観測装置１を作製し、血栓生成観測を行う。
この場合、実施例１で見られた圧力差の発生や血流量の低下は起こらず、生理食塩水にて洗浄後の血栓生成室１０に目視では血栓を確認できない。【００５１】
実施例３
内径３ｍｍ  長さ５ｃｍのガラス管をカセット式の血栓生成室１０としたこと、シリンジ２０、２１をそれぞれ電動モーター駆動のシリンジポンプに接続したこと、および、狭窄部位１４と狭窄部位１４上に血栓誘発材１５としてコーティングされたコラーゲンに代えて、図２（ａ）に示すようにガラス管の流入管１１との接続部から５ｍｍ内側に入った血栓生成室１０の内面に長さ１．５ｃｍの実施例１のコラーゲンに浸漬して４℃で風乾した絹糸を血栓誘発材１５として接着剤で接着させたこと以外は、実施例１と同様に血栓観測装置１を作製した。【００５２】
シリンジ２０の溶液Ａを３ｍｌ／分、シリンジ２１の溶液Ｂを０．３ｍｌ／分で１５分間流した後、血栓生成室１０を取り外して生理食塩水にて内部を洗浄したところ、絹糸の下流端を始点として生成されたと見られる下流に向けて広がる図２（ｂ）に示す彗星状の長さ１ｃｍ、厚さ約１ｍｍの血栓１６がガラス管内面に付着している事が目視にて確認された。ここで、生成された血栓が彗星状となるのは、血流の影響によるものと考えられる。
なお、血栓の最も広い部分の幅は約３ｍｍであった。【００５３】
実施例４
絹糸に代えて、図３（ａ）に示すように抗凝固処理されていない血液５０μｌをガラス管の内面にパスツールピペットを用いて滴下した後、１５分間室温にて放置する事で直径が約２ｍｍ程度の円盤状の血栓を血栓誘発材１５として作ったこと以外は、実施例３と同様に血栓観測装置１を作製した。【００５４】
実施例３と同様に、溶液Ａおよび溶液Ｂを流した後、血栓生成室１０を取り外して生理食塩水にて内部を洗浄したところ、血栓誘発材１５としての血栓を包み込んで下流に向けて広がる図３（ｂ）に示す彗星状の長さ１ｃｍ、厚さ約１ｍｍの血栓１６がガラス管内面に付着している事が目視にて確認された。ここで、生成された血栓が彗星状となるのは、血流の影響によるものと考えられる。
なお、血栓の最も広い部分の幅は約３ｍｍであった。【００５５】
実施例５
実施例３において、溶液Ａを、さらに抗凝固処理剤としてアルガトロバン（登録商標、第一製薬株式会社製）を実施例３の溶液Ａに対して０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えたものに代えたこと以外は、実施例３と同様に血栓観測装置１を作製し、血栓生成観測を行った。
その結果、生理食塩水にて洗浄後のガラス管内に目視では血栓を確認できなかった。【００５６】
実施例６
実施例３において、溶液Ａとして、全血に対し１μｇ／ｍｌになるようにヒルジンを添加することによって抗凝固処理した血液を用いることおよび溶液Ｂとして、全血に対し１ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した抗ヒルジンポリクローナル抗体（株式会社コスモバイオ社製）を用いること以外は、実施例３と同様に血栓観測装置１を作製し、血栓生成観測を行う。
この場合、実施例３とほぼ同様の血栓形成が確認される。【００５７】
実施例７
採血直後の血液に１０μｇ／ｍｌのアプロチニンと１μｇ／ｍｌの濃度で組換えヒルジン（和光純薬社製）を加えて抗凝固処理を行った全血（溶液Ａ）１０ｍｌおよび血液凝固を促進する薬剤としてトロンボプラスチン試薬（シスメックス社製）１バイアル/mlを生理食塩水１０００倍希釈した溶液にパパイン固定樹脂を用いてＦｃドメインを分離した抗ヒルジンポリクローナル抗体（株式会社コスモバイオ社製）５ｍｇ／ｍｌになるように添加した溶液（溶液Ｂ）１ｍｌを用意する。
血栓観測装置の作製にあたり、ポリジメチルシロキサン製の図４に示す幅４０ｍｍ、長さ７０ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの基板１００および厚さが１ｍｍで同寸のガラス製の図５に示す基板２００を用いる。【００５８】
図４に示したパターンで基板１００の表面を深さ０．５ｍｍの溝で彫って血栓生成室１１０を含む回路を形成する。溝の幅は流入管１１１となる部分が１ｍｍである。回路１００Ｄの長さは３０ｍｍで、終端に直径１ｍｍの貫通孔を設け調整弁１００Ｅとし、開閉可能なキャップで閉鎖する。血栓生成室１１０は長さ３０ｍｍ、幅は広い部分で２．５ｍｍであり、幅０．５ｍｍの狭窄部１１４を有するものである。そして、接続部１００Ａ、１００Ｂ、として直径１ｍｍの貫通孔を、接続部１００Ｃとして直径２．５ｍｍの貫通孔を設ける。【００５９】
基板２００には、図５に示すように基板１００の狭窄部１１４を覆う位置に血栓誘発材１１５としてコラーゲンを幅１０ｍｍの帯状に塗布する。コラーゲン塗布に際しては、基板２００の狭窄部１１４に対応する矩形形状にマスキングテープを貼り、その上からシリコーン系剥離剤ＳＲＸ−２１１（東レ・ダウコーニング社）をコーティングする。その後マスキングテープを剥がし、剥離剤未塗布のガラス領域に１％になるようにコラーゲンタイプI（和光純薬社）を０．１Ｎ酢酸に溶解した溶液を滴下し、２５℃１時間放置した後に剥離剤層上のコラーゲンを精製水で洗い流して狭窄部１１４に対応する矩形形状の剥離剤未塗布のガラス領域のみにコラーゲンを塗布する。
その後、基板２００のコラーゲン塗布面と基板１００の回路形成面を対向させて密着させる。【００６０】
基板１００の裏面（回路が形成されていない面）から接続部１００Ａ、１００Ｂに内径１ｍｍのシリコーンチューブを接続しおよびそれぞれ溶液Ａが充填された１０ｍｌ用シリンジおよび溶液Ｂが充填された１ｍｌ用のシリンジに接続し、それぞれのシリンジをシリンジポンプに装着する。なお、接続部１００Ｃには内径２．５ｍｍのシリコーンチューブを接続し排出管とする。【００６１】
接続部１００Ａより溶液Ａを０．３ｍｌ／分の流速で注入する。接続部１００Ｂからは溶液Ｂを０．０３ｍｌ／分の流速で注入する。
５分間それぞれの溶液を接続部１００Ａ、接続部１００Ｂより流し、接続部１００Ａより生理食塩水を注入し血液を洗い流した後、確認すると主に基板２００のコラーゲン処理面の中でも主に図６の領域ａおよび領域ｂに血栓形成が確認される。【００６２】
実施例８
採血直後の血液に０．３ｍｇ／ｍｌになるようにパパインによってＦｃドメインを切断した抗ＸＩＩ因子ポリクローナル抗体（コスモバイオ社製）および０．３単位になるように未分画へパリン（ブタ由来  和光純薬社製）を添加して溶液Ａとすること、トロンボプラスチン試薬（第一化学社製）を５０倍希釈して溶液Ｂとすること、図８に示す厚さ１ｍｍの透明なポリスチレン製の基板２００のコラーゲン塗布領域に前処理として２ｇ／リットルになるように過マンガン酸カリウムを濃硫酸に溶解した溶液を滴下し２５℃１０分間反応させ、その後すばやく精製水で洗浄し、前処理した領域に１％になるようにコラーゲンタイプI(和光純薬)を０．１Ｎ酢酸に溶解した溶液を滴下し、２５℃１時間放置した後に精製水で洗い流し、コラーゲンを塗布すること、図７に示す血栓生成室１１０に狭窄部を有しない基板１００を用いること、以外は実施例７と同様に血栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行う。なお、基板１００の接続部１００Ｃは直径１ｍｍの貫通孔とし、内径１ｍｍのシリコーンチューブを排出管として接続する。【００６３】
１０分間溶液Ａおよび溶液Ｂを流した後、接続部１００Ａより生理食塩水を注入して血液を洗い流すと、基板２００のコラーゲン塗布領域の流路部分に赤色血栓の付着が確認される。【００６４】
実施例９
採血直後の血液に０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度にアプロチニン、および１μｇ／ｍｌの濃度に組換えヒルジン（和光純薬社製）を加えて抗凝固処理を行い、さらに１０μＭになるようにキナクリン（シグマ社）を添加し溶液Ａとしたこと、
接続部１００Ｂをキャップで閉鎖し、接続部１００Ａより１ｍｌ／分の流速で溶液Ａのみを注入したこと以外は、実施例７と同様に血栓観測装置を作製し、血栓生成観測を行った。【００６５】
基板２００側からコラーゲン塗布面に焦点を合わせ、蛍光実体顕微鏡で観察したところ、コラーゲン塗布面の一部に緑色のキナクリンの蛍光発色が確認され、経時的にその領域が斑状に広がり、１０分後にはコラーゲン塗布面の大部分で血小板の粘着によると思われる緑色蛍光発色が確認された。【００６６】
実施例１０
キナリンを添加せずに溶液Ａとしたこと以外は、実施例９と同様に血栓観測装置を作製し、血栓生成観測を行った。
接続部１００Ａより１ｍｌ／分の流速で血液を注入した。注入中、接続部１００Ｃのチューブを摘み２秒間閉鎖したところ、内圧上昇に伴い即座に回路１００Ｄ内の血液が分岐点より２０ｍｍまで進み、接続部１００Ｃを開通させたが、血液は、分岐点より２０ｍｍ地点からの移動は見られず、圧力上昇が起こった痕跡が確認できた。【００６７】
実施例１１
実施例８の溶液Ａのへパリンに代えてパパインによってＦｃドメインを切断した抗トロンビンポリクローナル抗体（コスモバイオ社）を３０μｇ／ｍｌになるように添加すること、実施例８の溶液ＢにさらにＰＰＡＣＫトロンビンを５ｍｇ／ｍｌになるように添加すること以外は、実施例８と同様に血栓観測装置を作製し、血栓生成観測を行う。
１５分間溶液Ａおよび溶液Ｂを流した後、接続部１００Ａより生理食塩水を注入して血液を洗い流すと、基板２００のコラーゲン処理領域の流路部分に赤色血栓の付着が確認される。【００６８】
実施例１２
へパリン０．５単位／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのアプロチニンを加えた採血直後の血液５０ｍｌを８００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みより多血小板血漿（ＰＲＰ）を作成し溶液Ａとしたこと、
溶液Ｂにはトロンボプラスチン試薬（シスメックス社）1バイアル/1mlを生理食塩水によって３０倍に希釈した溶液を用いたこと、以外は実施例７と同様に血栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行った。
実体顕微鏡を用いて狭窄部位１１４の血栓生成観測を１５分間行った。狭窄部位１１４近辺には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰り返しながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。【００６９】
実施例１３
実施例１２の溶液ＡのＰＲＰ２０ｍｌに対し、遠心分離した沈殿より採取した赤血球を５００μｌ加え溶液Ａとしたこと、
溶液Ｂにはトロンボプラスチン試薬（シスメックス社）1バイアル/1mlを生理食塩水にて３０倍に希釈した溶液を用いたこと、
基板２００を全面シリコーン系剥離剤ＳＲＸ−２１１（東レ・ダウコーニング社）をコートしたスライドガラスとしたこと、
基板１００の血栓生成室１１０の狭窄部１１４の上流側に隣接する漸次２．５ｍｍ幅に広がる広幅部分の拡幅終点付近に約１μｌの全血を付着させ１０分間室温で放置し血液を凝固させて予備的な血栓を設け血栓誘発材としたこと、以外は、実施例７と同様にＡ溶液およびＢ溶液を流し、血栓生成観測を行った。【００７０】
１５分間実体顕微鏡で血栓付着領域をモニターした。５分後あたりより予備的な血栓を基点として下流に向かって新たに生成した赤色血栓が確認され、１５分後までに徐々に下流に向かって広がり、幅も２．５ｍｍ幅まで広がった。血流は形成された血栓の上や合間を縫うように流れているのが確認された。【００７１】
実施例１４
終濃度５μＭのエクソサイトIトロンビンアプタマー（ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ：配列番号１）および終濃度３０μｇ／ｍｌのコーン由来トリプシンインヒビター（コスモバイオ社）を加えた採血直後の血液５０ｍｌを８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みより多血小板血漿（ＰＲＰ）を作成し溶液Ａとしたこと、
１５０μＭになるようにアンチセンスＤＮＡ（ＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣ：配列番号２）を生理食塩水に溶解して溶液Ｂとしたこと、
血栓誘発材１１５の設置に際して、実施例７のコラーゲン溶液に対しトロンボプラスチン試薬（シスメックス社）１バイアルを１ml精製水に溶解し精製水で透析した溶液を５：１の割合で混合した溶液をシリコーン未塗布領域に滴下し４℃で送風し乾燥したこと、以外は実施例７と同様に血栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行った。
実体顕微鏡を用いて狭窄部位１１４の血栓生成観測を５分間行った。狭窄部位１１４近辺には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰り返しながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。【００７２】
実施例１５
実施例１４と同手順でＰＲＰ作成後、測定直前に１５μＭになるようにアンチセンスＤＮＡ（ＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣ：配列番号２）を添加し抗トロンビン処理を解除し溶液Ａとしたこと、
実施例９と同様に、接続部１００Ｂの注入口を閉塞したこと、
実施例１４のコラーゲン溶液に代えてコラーゲンタイプＩ（細胞培養のディッシュをコラーゲンコートするコラーゲン試薬、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ社  ＴｙｐｅＩ−Ａ原液）を用いたこと、
溶液Ａのみを０．２ｍｌ／分の流速で５分間流したこと、以外は実施例１４と同様に血栓観測装置を作成し、血栓生成観測を行った。
実体顕微鏡を用いて狭窄部位１１４の血栓生成観測を行った。狭窄部位１１４近辺には血小板塊の付着が複数確認され、血小板塊が付着したりはがれたりを繰り返しながら、塊の数が増加するとともに、大きさも成長するのが観測された。【００７３】
実施例１６
図７に示すパターンで基板の表面を深さ０．１ｍｍの溝で彫るとともに、血栓生成室１１０の中央付近に長さ１ｍｍ、幅４０μｍの凸条を、間隔４０μｍで溝の底部全面に直立させて仕切壁を残したこと、
実施例９と同様に、接続部１００Ｂの注入口を閉塞したこと、
基盤２００を表面無処理の単なるスライドガラスとしたこと、以外は実施例７と同様に血栓観測装置を作成した。仕切壁間の隙間（流路）は毛細血管を模したものである。
採血直後の全血に終濃度３０μｇ／ｍｌのコーン由来トリプシンインヒビターと終濃度１０μＭのエクソサイトIトロンビンアプタマーを加えて抗凝固処理を行った。観測直前に３０μＭになるようにエクソサイトIトロンビンアプタマーのアンチセンスＤＮＡを加え、１００Ａより０．０５ｍｌ／分の流速で５分間注入した。
実体顕微鏡を用いて仕切壁間の隙間の血栓生成観測を行ったところ、５分間の観測中に順次血栓形成により流路が閉塞し、約半分の流路が血栓形成により閉塞するのが観測された。【００７４】
実施例１７
図９に示すシリンジ送液系および実施例７と同材質の図９の（Ｂ）と（Ｃ）に示すマイクロチップの基板と蓋とを圧着させたマイクロチップ３００を用いた。このマイクロチップ３００は、血液凝固防止剤流入管３２２と排出管３１３を実施例７の排出管と同様に基板１００に接続したものである。但し、図９のマイクロチップ３００の溝は全て深さ２００μｍとし、サンプルシリンジ３２０から血液が流入する流路を幅１ｍｍで長さ４０ｍｍとし、その先に２００μｍ幅で長さ１０ｍｍの狭窄な流路からなる血栓生成室３１１および血液凝固防止剤流入管３２２に接続される流路を形成した。シスメックス社ＰＴ試薬（組織トロンボプラスチン）１バイアルを１ｍｌの精製水に溶解し、精製水に透析したものをコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン社製）に対し１対１で混合した溶液を図９に示す血栓誘発材３１５の位置に塗布した。その後４℃で、塗布部を風乾させ、血栓生成室３１１を覆い血栓誘発材３１５として用いた。シリンジに終濃度がコーン由来トリプシンインヒビター：２５μｇ／ｍｌ、エクソサイトＩトロンビンアプタマー：１０μＭ、エクソサイトＩＩトロンビンアプタマー：１０μＭ（５’−ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ−３’：配列番号３）になるように抗凝固処理剤を加え採血した。採血した血液に対し測定直前に、それぞれ４０μＭになるようにエクソサイトＩ及びエクソサイトＩＩのトロンビンアプタマーに対するアンチセンスＤＮＡを加え、シリンジ（テルモ社製  １ｍｌシリンジ）を血液で満たし図９のサンプルシリンジ３２０とした。送液ポンプ内の圧力をモニタリング可能な微量送液ポンプであるマイフロー（アービオテック社製）を図９の圧入管３１７に接続しサンプルシリンジ３２０にかかる圧力をモニタリングしながら図９の（Ａ）に示す様にサンプルシリンジ３２０の上部よりミネラルオイルを圧入し、血液をマイクロチップ３００に５０μｌ／ｍｉｎの速度で押し出した。
血液凝固防止剤として１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０を血液凝固防止剤流入管３２２より５０μｌ／ｍｉｎで流した。圧力測定開始から６分後に圧力が上昇しはじめた。
血栓の飛泳による圧力の上下を繰り返しながら８０ｋＰａまで圧力が上昇した（図１３のcontrol）。【００７５】
実施例１８
実施例１７と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さらに１単位／ｍｌになるように未分画ヘパリンを加えたこと以外は、実施例１７と同様の操作を行い、圧力の測定を行った。圧力は１３分後に上昇しはじめた。圧力は約１０ｋＰａまで上昇した（図１３のHeparin）。【００７６】
実施例１９
実施例１７と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さらに５０μｇ／ｍｌになるようにレオプロ（リリー社）を加えたこと以外は、実施例１７と同様の操作を行い、圧力の測定を行った。１８分間の観測において圧力の上昇は確認されなかった（図１３のレオプロ）。【００７７】
実施例２０
３．２％クエン酸と血液との比が１：９の割合になるようにクエン酸を加えて採血し、さらにその血液に２５μｇ／ｍｌになるようにコーン由来トリプシンインヒビターを添加し抗凝固処理を行った。血栓生成観測に際して、抗凝固処理した血液に対し１５ｍＭになるように塩化カルシウムを加えた直後に、血液をシリンジ（テルモ社製１ｍｌシリンジ）に加えた後、実施例１７と同様のマイクロチップに４０μｌ／ｍｉｎの流速で血液を流入させ実施例１７と同様のシステムで圧力変化を測定した。圧力は１５分後に上昇を開始し６０ｋＰａ程度まで上昇した。【００７８】
実施例２１
実施例２０と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さらにそれぞれ、０．２単位／ｍｌ、０．５単位／ｍｌ、１単位／ｍｌのへパリンを加えたこと以外は、実施例２０と同様の操作を行い、圧力の測定を行った。結果を図１４に示す。【００７９】
実施例２２
実施例２０と同様に抗凝固処理剤を加え採血を行った。その後、さらに２μｇ／ｍｌのＲｅｏＰｒｏ（リリー社）を加えたこと以外は、実施例２０と同様の処理を行い、圧力の測定を行った。圧力は２０分後に上昇を開始し、２５分後に１５ｋＰａにまで上昇した（図１５）。【００８０】
実施例２３
図１２に示すシリンジ送液系および図１２の（Ｂ）と（Ｃ）に示すマイクロチップの蓋の基板２００とマイクロチップの本体の基板１００とを圧着させたマイクロチップ４００を用いた。テフロン（登録商標）チューブ製の排出管４１３にはミネラルオイルを満たし、その一端をシリコーンゴム製の接続チューブ４１２を介してマイクロチップ４００と接続し、他端を圧力センサーが内蔵された吸引ポンプ４１４に接続した。マイクロチップ４００の流路からなる流入管にはシリコンゴム製の接続チューブ４１２を介してシリンジ４２０を接続した。テフロン（登録商標）チューブ製の血液凝固防止剤流入管４２２の一端には送液ポンプ４２３を接続し、他端にはシリコンゴム製の接続チューブ４１２を介して血栓生成室の終端に接続した。この様に、マイクロチップ４００に排出管４１３、シリンジ４２０および血液凝固防止剤流入管４２２を接続して血栓観測装置Ｂとした。血栓生成室の下には、レール４３３に載せられて駆動可能とされ、ＬＥＤからなる照明光源４３２を備えるCCDカメラ４３０を設置した。
マイクロチップの溝は全て深さ１２０μｍとした。
血液が流入する流路を幅８００μｍで長さ７ｍｍ、狭窄流路を幅２００μｍで長さ１０ｍｍの流路とした。
マイクロチップの基板２００の、マイクロチップの基板１００に圧着される面の狭窄部の流路に面する領域に、ＰＴ試薬（シスメックス社：組織トロンボプラスチン）１バイアルを１ｍｌの精製水に溶解し、精製水に透析したものをコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン社製）に対し１対１で混合した溶液を塗布した。その後４℃で真空乾燥させ、基板１００を基板２００と圧着させ、血栓生成室４１１を有するマイクロチップ４００とした。
抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムが封入されている真空採血管で採血を行い、シリンジ４２０に入れる直前に終濃度１２．５ｍMの塩化カルシウムと２５μｇ／ｍｌになるようにコーン由来トリプシンインヒビターを添加した。
送液ポンプ内の圧力をモニタリング可能な微量送液ポンプであるマイフロー（アービオテック社製）をポンプ４１４として排出管４１３に接続し、流路の内圧をモニタリングしながら１５μｌ／ｍｉｎの速度で吸引した。
血液凝固防止剤として１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０を血液凝固防止剤流入管４２２より８μｌ／ｍｉｎで流した。圧力測定開始から４分後に主に白色の血栓形成が確認されると共に内圧の低下が確認され10分後には開始時より３０kＰａ内圧の低下が確認された。
また、流路内の血栓形成部位をカメラ４３０を移動させながら撮像して血栓の生成を確認した。血栓の生成が確認された位置を記憶して定期的に巡回して撮像することにより、複数の大きな血栓について経時的な血栓の成長及び崩壊を記録する事が出来た。【００８１】
なお、以下に参考実験を行い、トロンビンアプタマーとそのアンチセンスＤＮＡがそれぞれ抗凝固処理剤と抗凝固解除剤として有効であることを示す。［参考実験１］
採血直後の血液、これに対し３００μｇ／ｍｌのコーン由来トリプシンインヒビターを１０分の１容量添加した血液、これに対し、さらに、５μＭになるようにエクソサイトＩを認識するトロンビンアプタマーを加えた血液、の３種類の血液の凝固時間をエッペンドルフチューブ（ポリプロピレン製）中にて測定した。サンプルは１分ごとに上下反転させ流動性を確認した。無添加の血液の凝固時間は９分であった。これに対し、トリプシンインヒビターを添加した血液の凝固時間は２２分、さらにトロンビンアプタマーを添加した血液の凝固時間は６２分であった。
又、５μＭのエクソサイトＩを認識するトロンビンアプタマー及び５μＭのエクソサイトＩＩを認識するトロンビンアプタマーを併用した場合には、トリプシンインヒビター無しの場合においても３時間後にも血液凝固は確認されなかった。エクソサイトＩ認識トロンビンアプタマー：５’−  ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ  −３’  配列番号１エクソサイトＩＩ認識トロンビンアプタマー：５’−ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ−３’配列番号３【００８２】
［参考実験２］
また、血漿２００μＭに対し、生理食塩水１０μｌを添加したサンプルＡ、５００μＭエクソサイトＩ認識トロンビンアプタマーを１０μｌ添加したサンプルＢ、５００μＭエクソサイトＩ認識トロンビンアプタマーと１５００μＭエクソサイトＩ認識トロンビンアプタマーアンチセンスＤＮＡの溶液を１０μｌ添加したサンプルＣのＡＰＴＴをそれぞれ測定したところ、サンプルＡは４４秒、サンプルＢは２分以上、サンプルＣは４５秒であった。【００８３】
［参考実験３］
図１１（Ａ）は１０μＭのエクソサイトＩ及びＩＩに対するアプタマーを加えた血液を１５分間室温で保存した後に４０μＭの両アプタマーのアンチセンスＤＮＡを添加しトロンボエラストグラムで凝固の波形を解析したものである。図１１（Ｂ）は採血直後の血液のトロンボエラストグラムの波形である。
図１１（Ａ）および（Ｂ）の結果より、２種のトロンビンアプタマーの添加で血液の保存が可能で、アンチセンスＤＮＡによってその抗凝固処理が解除されていることが分かる。
以上、参考実験１〜３の結果よりコーン由来トリプシンインヒビターとトロンビンアプタマーの組み合わせが全血の凝固を効果的に抑制すること、トロンビンアプタマーの抗凝固作用はトロンビンアプタマーに対するアンチセンスＤＮＡによって無効化されることが明らかである。【００８４】
[参考実験４]
以下、血液の保存及び基板上での血小板粘着に関するＰＭＥＡコーティングの有効性を示す。
１）特開平4-152952に従い合成した１％PMEA含有メタノール溶液を2.5ｍｌアクリル樹脂容器（内寸  1ｃｍ×１ｃｍ×4.5ｃｍ）に塗布し、９０℃で１０分乾燥した。次に、３．２％クエン酸によって抗凝固処理した血液760μｌを非コート容器及びＰＭＥＡコート済容器に加え5分ごとにピペットで吸引し血液凝固を確認した。
その結果、非コート容器においては30分で明らかな粘性の上昇がみられ60分で凝固したのに対し、PMEAコート容器では35分で明らかな粘性の上昇が見られたが、凝固時間は90分にまで延長された。【００８５】
２）上記PMEAを透明アクリル板に平滑にコーティングした。これを実施例９のコラーゲンコート板（図８）の代わりに用い、実施例９と同様に、血液中のキナクリンラベル血小板及び白血球の粘着実験を行った。
その結果、非コートアクリル板には血液を流し始めて10分後には血小板、白血球の明らかな粘着凝集が確認されたが、PMEAコートアクリル板には30分後にも血小板、白血球の粘着及び凝集は確認されなかった。
上記結果より、本血栓観測装置において血液保存シリンジ、チューブ、基板などをPMEAでコートすることにより、血栓観測室以外の血栓形成が抑制され、血栓観測室特異的血栓観測が可能である事が示唆された。【００８６】
以上、本発明を好適な実施の形態に基づいて説明してきたが、本発明は上述の実施例や形態例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の改変が可能である。例えば、ポンプの圧力を高めに設定し、排出管の内径を小さく取ることにより流入管内および排出管内に背圧を発生させ、血圧に相当する内圧の負荷のもとで血流量を調整しつつ、血栓生成をモニタリングする事も可能である。そして、この時の血流の速度もポンプの圧力と排出管の絞り量で自由に調節する事が可能である。
【産業上の利用の可能性】
【００８７】
本発明の血栓観測装置および血栓観測方法は、患者等に投与した抗血栓薬の効能を観測するに際し、全血または血小板を含む血漿を用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓形成を総合的に評価するために好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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