(57)【要約】本発明は、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するＲＮＡ結合ペプチド、例えば、次式Ｉ：    Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ                （Ｉ）    （Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）  で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するＲＮＡ結合ペプチド。
【請求項２】
ＧＮＲＡ配列がターミナルループ構造を有するものである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
細胞又はウイルスの増殖を抑制することができる請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）で示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
【請求項６】
Ｒが少なくとも９〜１１残基含まれることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド、誘導体又はこれらの塩。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
（ａ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の６５％以上を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【請求項９】
アミノ酸配列の一部に化学修飾が施された、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれるペプチド又はその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
（ｃ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列を含むペプチド
（ｄ）上記式で示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
（ｅ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｆ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有するペプチド
【請求項１１】
ＤＮＡである請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５】
抗生物質、抗菌剤、抗癌剤又は抗ウイルス剤として使用するための請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列に接触させ、シグナルを検出することを特徴とする、ＧＮＲＡへの結合活性を有するペプチドの検出方法。
【請求項１７】
（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列に接触させ、シグナルを検出することを特徴とする、ＧＮＲＡへの結合活性を有するペプチドのスクリーニング方法。
【請求項１８】
ターミナルループ配列、第一のステム配列、バルジアウト配列及び第二のステム配列を有する核酸。
【請求項１９】
請求項１８記載の核酸をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載の組換えベクターを発現させて、ターミナルループ配列、第一のステム配列、バルジアウト配列及び第二のステム配列を有するＲＮＡを得、得られたＲＮＡと被験物質とを接触させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ結合ペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボソームのＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有するＲＮＡ結合ペプチド、その検出方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボソームにはＧ−Ｎ−Ｒ−Ａの４つの塩基配列が含まれていることが多く、この塩基配列はテトラループを形成することが知られている（Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８，６８３−６９３，２００４）。このＧＮＲＡの塩基配列を「ＧＮＲＡモチーフ」と呼ぶ。ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵであり、ＲはＡ又はＧを表す。リボソームでは、このＧＮＲＡモチーフがループを形成する。このモチーフは、リボソームが機能するために重要な役割を果たすと考えられている（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，ｐｐ．８４６７−８４７１，１９９０）。
また、大腸菌リボソームにおいてもＧＮＲＡモチーフを有することが知られており（Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８，６８３−６９３，２００４）、大腸菌では、ＧＣＡＡループ−ヘリックスの相互作用が大腸菌の機能発揮に影響を与えると考えられる。
したがって、ＧＮＲＡモチーフに結合するペプチドは、競合的にＧＮＲＡループ−ヘリックスの相互作用を阻害することができるといえる。
しかしながら、このようなペプチドは未だ知られていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＮＡ結合ペプチドとその検出方法又はスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、リボソームのＧＮＲＡモチーフを有する塩基配列に結合することができるペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するＲＮＡ結合ペプチド。
本発明のペプチドにおいて、結合領域であるＧＮＲＡ配列はターミナルループ構造を有するものであることが好ましい。また、本発明のペプチドは、細胞又はウイルスの増殖を抑制することができる。さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
本発明においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩であることが好ましい。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
本発明のペプチドは、好ましくはＲを少なくとも９〜１１残基含むものである。
さらに、本発明においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。
（ａ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
さらに、本発明は、上記ペプチド又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の６５％以上を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。
好ましい態様においては、本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものが挙げられる。
（２）以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれるペプチド又はその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
（Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｂ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
（ｃ）上記式Ｉで示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列を含むペプチド
（ｄ）上記式で示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチド
（ｅ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（ｆ）配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有するペプチド
上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであることが好ましい。
（３）上記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（４）上記組換えベクターを含む形質転換体。
（５）上記ペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含有してなる医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤又は抗ウイルス剤として使用することができる。
（６）（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列に接触させ、シグナルを検出することを特徴とする、ＧＮＲＡへの結合活性を有するペプチドの検出方法。
（７）（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列に接触させ、シグナルを検出することを特徴とする、ＧＮＲＡへの結合活性を有するペプチドのスクリーニング方法。
（８）ターミナルループ配列、第一のステム配列、バルジアウト配列及び第二のステム配列を有する核酸。
（９）上記（８）記載の核酸をコードするＤＮＡ。
（１０）上記（９）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（１１）上記（１０）記載の組換えベクターを発現させて、ターミナルループ配列、第一のステム配列、バルジアウト配列及び第二のステム配列を有するＲＮＡを得、得られたＲＮＡと被験物質とを接触させることを特徴とする、上記ＲＮＡ結合ペプチドのスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＧＮＲＡモチーフを含むループ−ヘリックス構造を有するリボソームの図である。
図２は、ＲＮＡ結合ペプチドのセレクションの概要を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち、当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するＲＮＡ結合ペプチドに関する。本発明のペプチドは、アルギニンに富む１３個のアミノ酸配列を骨格とするペプチドであり、当該ペプチドによって、例えばＧＮＲＡ配列を含むＲＮＡ（例えばリボソーム）の機能を阻害するというものである。
１．ＧＮＲＡモチーフを含む核酸
本発明において、ＧＮＲＡで示される塩基配列を「ＧＮＲＡモチーフ」という。ＧＮＲＡモチーフにおいて、Ｎは、ＤＮＡにおいてはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、ＲＮＡにおいてはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。また、ＲはＡ又はＧを表す。本発明は、上記ＧＮＲＡモチーフに結合することができるペプチドが抗生物質、抗菌剤、抗癌剤として利用できるものと考え、本発明を完成するに至った。
一般に、ワトソン−クリックの塩基対からなる核酸の二重らせん構造は、塩基間の水素結合と、塩基対間のスタッキング相互作用によって安定化される。さらに、核酸は、この二重鎖以外にも非塩基対部位や多重鎖構造を形成する。非塩基対部位は、塩基対を形成していない部位と、塩基対を形成している部位に分類され、塩基対を形成していない部位として、バルジアウト、インターナルループ、ターミナルミスマッチ、ヘアピンループ、ダングリングエンドなどが例示され、塩基対を形成する部位として、ミスマッチ塩基対などが例示される。
本発明において、ＧＮＲＡモチーフを含む核酸は、このような非塩基対部位を含むものである。具体的には、ＧＮＲＡモチーフ、２つのステム配列及びバルジアウト配列により構成される。図１において、丸で囲った「ＧＣＭ」部分の配列がＧＮＲＡモチーフであり、ターミナルループ（ターミナルミスマッチ）を形成する。ターミナルループの配列に連結するステム配列を第一のステム配列とすると、第一のステム配列は、図１において５’方向から３’方向に向かって「ＣＵＧＧＣＣ」で示される塩基配列とその相補鎖により形成されるステム配列である。第二のステム配列は、図１において、５’方向から３’方向に向かって「ＣＧＡＧＡＵ」で示される塩基配列とその相補鎖により形成されるステム配列である。ステム配列には、「Ｇ−Ｕ」のようにミスマッチの塩基対を形成されたものも含まれる（例えば図１の第二のステム配列）。第一ステム配列と第二ステム配列との間には、ステムからはみ出た構造を有する核酸が存在する。このはみ出た核酸配列を「バルジアウト配列」という。図１において、５’から３’方向に向かって「ＧＧＡ」で示される配列（丸で囲った部分）がバルジアウト配列である。バルジアウト配列は、第一のステムと第二のステムを連結した構造となっており、バルジアウト配列の相補鎖側には、塩基配列は含まれていない（図１）。この点で、バルジアウト配列は、相補鎖側に塩基配列を含む「インターナルループ」と異なる。
図１は、具体的にＲＮＡの塩基配列（配列番号１２）を例示してあるが、ＤＮＡ配列であってもよい。また、図１は本発明を説明するための例示であって、図１に示す塩基配列に限定されるものではない。
第一及び第二のステム配列の長さは、ステムを形成する限り互いにワトソン−クリックの相補塩基対（例えばＡに対してＵ又はＴ、Ｇに対してＣ）を形成する関係にある必要はなく、力学的エネルギーの関係により非ワトソン−クリック塩基対による相補鎖を形成すればよい。ステム配列の長さは、特に限定されるものではないが、例えば４〜２０塩基、好ましくは４〜１０塩基、より好ましくは４〜８塩基、さらに好ましくは６塩基である。
本発明においては、発現させたときに上記ターミナルループ、第一のステム、バルジアウト及び第二のステムを形成するように塩基配列を設計し、これをベクターに組み込んでペプチドのスクリーニングに供することができる。
本発明は、極めて多数の組合せをもつペプチドライブラリーから、例えばカナマイシン・アンチターミネーション・システム（「ＫＡＮシステム」という）と呼ばれる手法により、本発明のペプチドをスクリーニングすることができる。
ＫＡＮシステムとは、細胞内でカナマイシン耐性遺伝子の機能を用いて、ＲＮＡとペプチドとの相互作用を検出するアッセイシステムを意味する（Ｈａｄａｓ  Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ９，２５２−２６１，２００３）。
具体的には、ＧＮＲＡモチーフの塩基配列を有するオリゴＤＮＡと、レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子とを組み込んだＮレポータープラスミド、及びペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを組み込んだＮ発現プラスミドを細胞に導入する。細胞内でＧＮＲＡモチーフとペプチドが相互作用するとカナマイシン耐性遺伝子が転写翻訳され、ＧＮＲＡモチーフとペプチドとが接触したシグナルとして、細胞はカナマイシン耐性を獲得する。
細胞には、酵母や大腸菌などを用いることができる。大腸菌を用いた場合、カナマイシンを含んだ培地で生存した大腸菌には、ＧＮＲＡモチーフと相互作用するペプチドが発現していることになる。但し、レポーター遺伝子はカナマイシンに限定されるものではなく、ＬａｃＺレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などを連結することができる。ＬａｃＺ遺伝子を使用すると、培地にＸｇａｌを添加することで青又は白色に発色する。陽性クローンは青色に発色するので、これを指標として目的のクローンを選択することができる。ルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を使用すると、陽性クローンは蛍光を発するので、これを指標として目的のクローンを選択することができる。
２．ＧＮＲＡモチーフに結合することができるペプチド又はその塩
本発明のペプチドは、少なくとも次式Ｉ：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｘ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ａｘｇ−Ａｒｇ              （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。上記ペプチドはＲＮＡ結合ペプチドの一つであり、ＧＮＲＡモチーフに結合することができる。なお、本明細書において、アミノ酸表記は「Ｒ」（アルギニン）、「Ｑ」（グルタミン）などの１文字表記をする場合もある。Ｘ１はＡｒｇ又はＬｙｓを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ４はＡｌａ又はＡｒｇを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基を表す。任意のアミノ酸残基は、天然に存在する任意のアミノ酸残基であり、例えば２０種類のアミノ酸残基から選ばれる。
本発明のペプチドは、上記式のアミノ酸配列を含み、好ましくは１３〜２３個のアミノ酸配列を有する。そして、その中のいくつかのアミノ酸はアルギニンに富むドメイン（「アルギニンリッチドメイン」という）を形成する。例えば、２３アミノ酸残基を有するペプチドは、その中の５番目から１９番目がアルギニンリッチドメインを形成する。本発明のペプチドにおいて、アルギニンの数は、少なくとも９〜１１個である。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質のアルギニンリッチドメインは、それらの類似のＲＮＡと高親和性及び特異性をもって結合することが示されている。そして、配列がシンプルであること、及び構造が多様であることから、アルギニンリッチドメインはＲＮＡ結合ペプチドを同定するために有効なツールとして利用することができる。
上記ＫＡＮシステムにより得られた本発明のペプチドのアミノ酸配列を以下の配列番号２〜６に例示する。本発明のペプチドがＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有する限り、当該アミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい（これらを本発明において「変異体」という）。例えば、式Ｉで示されるアミノ酸配列（配列番号１）又は配列番号２〜６で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、式Ｉで示されるアミノ酸配列又は配列番号２〜６で表わされるアミノ酸配列に１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、式Ｉで示されるアミノ酸配列又は配列番号２〜６で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、式Ｉで示されるアミノ酸配列又は配列番号２〜６に示されるアミノ酸配列を含む１３〜２３残基の長さのアミノ酸配列において、上記欠失、置換、付加等の変異を含むペプチドも、ＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有する限り、本発明のペプチドに含まれる。
１：ＭＡ  ＴＰ  ＫＲＧＧＲＡＡＲＲＲＲＲＱＲＲ  ＡＡＴＡ（配列番号２）
２：ＭＡ  ＮＩ  ＲＳＧＧＲＧＡＲＲＲＲＲＥＲＲ  ＡＡＡＡ（配列番号３）
３：ＭＡ  ＹＨ  ＲＲＧＧＲＲＡＲＡＲＲＲＱＲＲ  ＡＡＡＡ（配列番号４）
４：ＭＡ  ＲＮ  ＫＲＧＧＫＰＡＲＲＲＲＡＲＲＲ  ＡＡＡＡ（配列番号５）
５：ＭＡ  ＴＰ  ＫＲＧＧＲＡＡＲＲＲＲＲＱＲＲ  ＡＡＡＡ（配列番号６）
本発明のペプチドとＧＮＲＡモチーフとの結合活性は、ＫＡＮシステムにおけるレポーター遺伝子の発現量を基に、既知のペプチド（例えばＡＲＰＬ２、配列番号７）との相対的定量化を行い評価することにより測定することができる。このときの解離定数は１００ｐＭ〜１０ｐＭである。
ＡＲＰＬ２：ＭＡ  ＸＸ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＡＡＡＡ（配列番号７）
本発明は、上記ペプチドのほかにその誘導体も含まれる。「誘導体」とは、本発明のペプチドを起源とし、３以上のアミノ酸にまでアミノ酸の数を減らしたり、一部のアミノ酸を非天然の物を含んだ他のアミノ酸に置換したものをいう。また、上記誘導体は、天然物の一部を修飾したものであっても、化学合成により合成された修飾残基を含むペプチドであってもよい。
本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものも含む。「化学修飾」とは、化学試薬をタンパク質に反応させ、主にアミノ酸残基側鎖の化学構造を変えることをいう。例えば、本発明のペプチドの活性部位又は活性部位近傍に存在すると予想されるアミノ酸を特異的に修飾する試薬（例えばポリエチレングリコール）を反応させる方法などが採用される。アフィニティラベルを行ってもよい。また、化学修飾にはアミノ酸のα炭素をメチル化したものも含む。化学修飾法は、当分野において周知である（大野素徳・金岡祐一・崎山文夫・前田浩  著、生物化学実験法１２、蛋白質の化学修飾（上）、学会出版センター）。
なお、化学修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドの修飾部分は、ペプチド本来の活性には影響せず、他の効果として作用する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（１０），２２６９−２２７２，２００３）。
置換、欠失等の変異が導入されているかどうかは、アミノ酸配列の配列決定、分子進化的工学やＸ線やＮＭＲなどによる構造解析を用いて確認することができる。
また、本発明のペプチドの誘導体には、そのレトロエナンチオマーも含む。「レトロエナンチオマー」とは、上記ペプチドのアミノ酸配列の向きが左右逆になること（鏡像体を形成すること）を意味する。すなわち、ペプチドのＮ末端がＣ末端となり、Ｃ末端がＮ末端となり、かつ各アミノ酸がＤアミノ酸によって構成されている配列となることを意味する。このようなレトロエナンチオマーも、ＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有する限り本発明に含まれる。
さらに、本発明は、上記ペプチド（例えば式Ｉや配列番号１〜５に示すアミノ酸配列を含むペプチド）、その変異体、又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。上記６５％の領域としては、例えば配列番号１〜３に示す配列のうち、５番目〜１９番目（アルギニンリッチドメイン）の領域などが挙げられる。また、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列のうち、７０％以上、８０％以上、９０％以上の領域としてそれぞれ３番目〜１９番目、１番目〜１９番目、３番目〜２３番目の領域を例示することができ、９５％以上の領域として連続する２２個のアミノ酸の領域を例示することができる。
上記のとおり本発明のペプチドのアミノ酸配列が決定されると、その後は、当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、これを発現させることにより、あるいは上記ペプチドを化学合成することにより、得ることができる。
本発明のペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製し得る。
３．コンビナトリアルオリゴヌクレオチドライブラリー
本発明は、（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドが多数集合したライブラリーを提供する。また、本発明は、上記（ＶＶＫ）ｎ（ｎは１１〜３５の整数を表す）で示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドに、ＧＮＲＡで示されるモチーフを接触させ、シグナルを検出することを特徴とする、ＧＮＲＡへの結合活性を有するペプチドの検出方法を提供する。
ＶＶＫの連続数（ｎ）は限定するものではないが、例えば１１〜３５（３３〜１０５ヌクレオチド）、好ましくは１１〜３０（３３〜９０ヌクレオチド）、より好ましくは１１〜２０（３３〜６０ヌクレオチド）、さらに好ましくは１５〜２０（４５〜６０ヌクレオチド）である。そして、（ＶＶＫ）ｎを含むヌクレオチドの長さ（全長）は、特に限定されるものではなく、任意の長さを設計することが可能である。（ＶＶＫ）ｎに他の配列が付加されていてもよい。ヌクレオチドの合成効率を考慮すると、（ＶＶＫ）ｎと他の配列で構成されるオリゴヌクレオチドは、全長で３００塩基以内、好ましくは２００塩基以内、更に好ましくは１００塩基以内に収まるようにＶＶＫ及び他の配列を調節することが好ましい。
オリゴヌクレオチドは、化学合成によって得ることができる。ヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、ＤＮＡであることが好ましい。オリゴヌクレオチドの化学合成法は、当業者にとって周知であり、市販の合成機を使用することもできる。
ここで、ＶＶＫのコドンにおいて、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表わす。従って、ＶＶＫにより規定されるコドンは全部で１８通り（３×３×２）存在する。ＶＶＫコドンは、荷電性及び極性アミノ酸であって大きな疎水性側鎖ではなく小さい側鎖を持つアミノ酸を主にコードする。アルギニンのコドンはＣＧＮ又はＡＧＲ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、ＲはＡ又はＧを表す）であるから、上記ＶＶＫにより規定されるコドンのうち、アルギニンのコドンはＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧである。従って、ＶＶＫにより規定される１コドンにおいてアルギニンがコードされる確率（コドン頻度は考慮しない）は、３／１８＝約１６．７％である。コドン全体の組合せは６４通りであるから、ランダムにコドンを作製した場合は、アルギニンをコードする確率は６／６４＝約９．４％となる。従って、（ＶＶＫ）ｎの領域はアルギニンが選択される確率が高くなり、ライブラリー（通常、１０７個以上であるが、この数に限定されない）にはアルギニン含有率の高いペプチドをコードするヌクレオチドが含まれる。但し、アルギニンをコードする確率を高くするために、アルギニンのコドン（プロトタイプ）とＶＶＫコドン（ランダムタイプ）との比が例えば１：１（但し、この比に限定されない）となるように両コドン配列を混合して合成してもよい。
本発明においては、ＧＮＲＡモチーフを用いたＮレポータープラスミドと、（ＶＶＫ）ｎで示されるヌクレオチド配列を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドとを組み込んだＮ発現プラスミドを作製することもできる。作製したＮレポータープラスミドと、オリゴヌクレオチドライブラリーとして機能するＮ発現プラスミドとを用いてＫＡＮシステムを行うと、ＧＮＲＡモチーフへの結合活性を有するペプチドであって、（ＶＶＫ）ｎに対応するｎ残基のアミノ酸配列を含むペプチドを得ることができる。
従って、ＫＡＮシステムによってシグナルを検出することにより、ＲＮＡ結合活性を有する目的のペプチドを検出し、あるいは目的のペプチドをスクリーニングすることができる。シグナルの検出は前記と同様である。本発明において、「シグナル」とは、前記レポーター遺伝子の発現により、カナマイシンを使用したときはコロニーの生存、ＬａｃＺ遺伝子を使用したときは青色の発色、蛍光遺伝子を使用したときは蛍光発色を意味する。
また、合成したオリゴヌクレオチドを上記ＫＡＮシステムに用いるＮ発現プラスミドに組み込むことで、コンビナトリアルオリゴヌクレオチドライブラリーを得ることができる。ヌクレオチドをプラスミドに組み込む方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
４．ペプチドの化学合成
本発明のペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成できる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（島津製作所製ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
反応後は、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの通常の精製法を組み合わせて本発明のペプチドを精製することができる。
５．ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のペプチドを遺伝子工学的に設計し、得ることができる。例えば、本発明のペプチドのアミノ酸配列をもとに塩基配列を設計し、合成すればよい。ポリヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、ＤＮＡであることが好ましい。
変異体のペプチドを遺伝子工学的に得るには、配列番号１〜６のアミノ酸配列をコードするポリペプチドを、当分野において周知の部位特異的突然変異誘発法によって変異体を作製することができる。市販の部位特異的突然変異誘発用キットを用いてもよい（例えばＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製））。
さらに、本発明においては、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＮＲＡで示される塩基配列を含むＲＮＡのうち当該ＧＮＲＡ配列への結合活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００〜１０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を参照することができる。
６．組換えベクター、形質転換体及びペプチド
タンパク質発現用組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。
本発明において、本発明のペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることもできる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養法は、当分野において周知である（前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によるペプチド合成を採用することができる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型ＲＮＡとしては、前記５に記載のポリヌクレオチドが挙げられ、鋳型ＤＮＡとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターとリボゾーム結合部位を有している上記ポリヌクレオチド、あるいは翻訳開始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを用いることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムによるペプチド合成後は、上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
７．ＧＮＲＡモチーフ結合ペプチド又はその塩を含む医薬組成物
さらに、本発明のペプチドは、細胞又はウイルスの増殖を抑制することができる。従って、本発明のペプチドを抗生物質、抗菌剤、抗癌剤又は抗ウイルス剤などの医薬組成物として使用することができる。
本発明のペプチドを例えばウイルスの増殖抑制剤又は感染予防剤として使用する場合は、患者又はウイルス陽性の健常者に対して治療又は予防を特異目的として用いることができる。また、健常者に対して、感染予防の目的で使用することができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明のペプチドを使用する対象とすることができる。
また、本発明の医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。本発明のペプチドの有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり１０〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜材料と方法＞
（１）プラスミドの作製
レポータープラスミド（図１）は、ｐＡＣとｐＡＣＫプラスミド（１）を親プラスミドとして、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩサイトを利用し、Ｔ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いて作製した。ライブラリーは以下の通り作製した。すなわち、Ｐｅｌｅｄらの方法（Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，Ｈ．，Ｈｏｒｉｙａ，Ｓ．，Ｄａｓ，Ｃ．，Ｈａｒａｄａ，Ｋ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．（２００３）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＲＥ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＲＮＡ９，２５２−６１．）を基に、コドン単位の変異導入法を用いて化学合成により一本鎖ＤＮＡを作製し、この一本鎖ＤＮＡの相補鎖合成を行った。得られたＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩ及びＢｓｍＩ処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製して、インサートＤＮＡを作製した。ｐＢＲベクターは、ｐＢＲ  Ｎ−をＮｃｏＩ処理、ＢｓｍＩ処理を行った後、フェノール抽出とエタノール沈殿後、ＳＡＰ処理して作製した。ＡＲＰＬ２インサートＤＮＡとＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーション反応を行い、ライブラリープラスミドを得た。これらのライブラリープラスミド混合物を用いて形質転換した後、ライブラリーの導入されていない親プラスミドにより形質転換される細胞は約１０％であり、残り９０％がライブラリープラスミドにより形質転換された細胞となる。
（２）アンチターミネーション・システムを用いたＲＮＡ結合ペプチドのセレクションとコロニーカラーアッセイ
以下のセレクションは文献１を基に行った。
まず、１次セレクションは次のように行った。カナマイシンレポーターを含むＮ５６７細胞（８０μｌ）を３つ用意し、それぞれにＡＲＰＬ２を導入したｐＢＲ（１００ｎｇ／μｌ）を２μｌずつ加え、２．０ｋＶのパルスでエレクトロポレ−ションを行い形質転換させ、ＳＯＣ（５ｍｌ）を加え、室温で４時間培養した。その後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．２ｍＭとなるように加え、続けて同様に２時間培養した。その後、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、ＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）、カナマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を含むプレートに捲いた。３日後、形成されたコロニーを掻き採り、プラスミドＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡはＥｃｏＲ  Ｖ処理によりｐＡＣを切断した後、フェノール抽出とエタノール沈澱を行い、Ｈ２Ｏに溶解した。
カナマイシン耐性レポーターを用いた２次セレクション以降は、ｐＢＲプラスミド（３００−５００ｎｇ／μｌ）を１μｌずつ用い、カナマイシンレポータープラスミドを含むＮ５６７細胞（８０μｌ）を上述のようにエレクトロポレーションにより形質転換させ、カナマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を含むプレート上において培養を行った後、プラスミドを単離した。
ＬａｃＺレポータープラスミドを用いたスクリーニングは、レポータープラスミドを含むＮ５６７細胞（３００μｌ）をｐＢＲ（２５０ｎｇ／μｌ）を５μｌ用いてヒートショック法により形質転換し、ｔｒｙｐｔｏｎｅを各３ｍＬを加えた。３７℃において一時間培養を行った後、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、ＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、８０ｍｇ／Ｌ）を含むプレートに捲き、３７℃において２８時間培養した。その後、２４℃で１１９時間培養し形成されたコロニーの色を調べた。
セレクションされたプラスミドのプール（図２、ｐｏｏｌ＃３）から、末端にアルギニンを含む配列を選別するためのＰＣＲは次のように行った。
フォワードプライマー：
（１ｍＭ，５’−ＡＡＧＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’）（配列番号８）
リバースプライマー：
（１ｍＭ，５’−ＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧ−３’）（配列番号９）
以下の反応組成を含む反応溶液（７２０μｌ）を、９４℃で５分間熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０サイクル行い、続いて７２℃で１０分間反応させた。
2007004341.tif 000002
ｔａｑポリメラーゼ増幅した二本鎖ＤＮＡは、ＰＡＧＥにより精製し、続いてＮｃｏ  ＩとＢｓｍ  Ｉ処理後、再びＰＡＧＥにより精製し、これをライゲーション反応に用い、ｐＢＲに導入した。これらのプラスミド混合物を用いて形質転換した後、ライブラリーの導入されていない親プラスミドにより形質転換される細胞は約８％であり、残り９２％がライブラリープラスミドにより形質転換された細胞となる。このようにして、作製したｐＢＲ（１ｎｇ／ｕｌ）の１μｌを、ＬａｃＺレポータープラスミドを含むＮ５６７細胞（８０μｌ）に加え、２．０ｋＶのパルスでエレクトロポレ−ションを行い形質転換させ、上述のＸ−ｇａｌを含プレートに捲いた。３７℃において４２時間培養した後、２４℃で３３時間培養し形成されたコロニーの色を調べた。
単離されたｐＢＲプラスミドのレポーターに対する特異性及びＲＮＡ結合活性は、コロニーカラーアッセイにより、評価した。
文献：
１）Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，Ｈ．，Ｈｏｒｉｙａ，Ｓ．，Ｄａｓ，Ｃ．，Ｈａｒａｄａ，Ｋ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．（２００３）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＲＥ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．ＲＮＡ９，２５２−６１．
＜結果＞
（１）ＲＮＡ結合ポリペプチドのＡＲＰＬ２からの細胞内選択
野生型（ＷＴ）レポータープラスミドを標的とし、ＡＲＰＬ２からのＲＮＡ結合ペプチドのセレクションを行った。検索したクローンの数、カナマイシンを含むプレートにおける生存率、Ｘ−ｇａｌを含むプレート上において青色を呈したコロニーの割合を図２に示す。１．２ｘ１０８の配列の中から検索を行い、レポータープラスミド由来の擬似陽性を排除するため、ライブラリープラスミドを単離し、新しいカナマイシンレポータープラスミド（Ｋレポータープラスミド）を持つ細胞に導入した。陽性クローンを２−３回のセレクションにより濃縮した後、ＬａｃＺレポータープラスミド（Ｌレポータープラスミド）を用い、スクリーニングを行い、青色を呈したコロニーからそれぞれライブラリープラスミドを単離し、標的レポーターに対する特異性を調べた。その結果、ＷＴ及びＭＴ２レポーターのみにおいて特異性を示すクローンが単離された（表１）。しかしながら、６６クローン中６１クローンが、非特異的にβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンであり、そのうち５８配列がドープ領域末端の１５番目のコドンがアルギニン以外のアミノ酸であったため、末端にアルギニンを含む配列を選択的に増幅するようなプライマーを用いてＰＣＲを行った。そのようにして、選択したライブラリーを再びｐＢＲに導入し、Ｌレポータープラスミドを用いたスクリーニングを行ったところ、新たに３つの特異的なクローンが同定された（表１）。
【表１】
2007004341.tif 000003
ドープ領域の中でアルギニン以外に置換されたアミノ酸および、非ランダム領域で変異があったアミノ酸を太字で示す。３７℃において２５時間培養後のコロニーの青さを＋の数で評価した。＋の半分の青みの強さを（＋）と表記する。
【実施例２】
【０００７】
コンビナトリアルライブラリーのデザイン
コンビナトリアルペプチドライブラリーを、Ｎタンパク質（１−１９残基）のＲＮＡ結合ドメインを置換しているλＮタンパク質との融合タンパク質として発現した。オリゴヌクレオチドライブラリーをコドンに基づく突然変異誘発法を用いて以下の配列で合成した（Ｈａｒａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，１１８８７−１１８９２）。
１５残基のアルギニンをコードするプロトタイプ配列：
５’−ＧＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’（配列番号１０）
ランダム配列：
５’−ＧＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＶＶＫ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’（配列番号１１）
上記ＶはＡ、Ｃ、及びＧを等モル含む混合物であり、ＫはＧ及びＴを等モル含む混合物である。ライブラリーは、アルギニンコドン：ＶＶＫコドンを１：１の割合で混合して合成した。従って、ライブラリーには、ペプチドあたり平均５個以下の非アルギニン残基を含むことが予想される。ポアソン分布に従うと仮定すると、１０７クローンをスクリーニングすることによって、３つの非アルギニンコドンを有する配列のほぼ全て、４つの非アルギニンコドンを持つ配列の１０％以下、及び５つの非アルギニンコドンを持つ配列の１％以下をサンプリングすることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１：合成ペプチド
配列番号１：ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓを表す（存在位置：３）。
配列番号１：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：４）。
配列番号１；ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓを表す（存在位置：７）。
配列番号１：ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓを表す（存在位置：１０）。
配列番号１：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：１１）。
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号７：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：３〜４）。
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＲＮＡ
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、ＲＮＡ結合ペプチドが提供される。本発明のＲＮＡ結合ペプチドは、ＧＮＲＡモチーフに結合してＲＮＡの機能を阻害することができるため、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤に利用することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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