(57)【要約】sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、sucE1遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記sucE1遺伝子が（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法：
（ａ）配列番号15の塩基番号571〜2187の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号15の塩基番号571〜2187の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内でその発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させるＤＮＡ。
【請求項５】
前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いたコハク酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び特許文献２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び特許文献４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産なども報告されていた（例えば、特許文献５）。
コリネ型細菌の全ゲノム配列が明らかにされ、その中に含まれる推定タンパク質コード配列についての機能予測がなされている（非特許文献２）。本発明においてsucE1と呼ぶ遺伝子もその中の一つであるが、パーミアーゼをコードすると予想されているものの、その実際の機能は明らかにされておらず、コハク酸合成経路への関わりも全く知られていなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４２，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−１９６８８７号公報
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 (2-3), 99-109 (2003)
【発明の開示】
【０００４】
本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸の製造方法を提供することにある。
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸の生成速度、あるいは、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２）前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）の方法。
（３）前記細菌が、sucE1遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である（１）又は（２）の製造方法。
（４）前記sucE1遺伝子が（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）〜（３）のいずれかの製造方法：
（ａ）配列番号15の塩基番号571〜2187の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号15の塩基番号571〜2187の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内でその発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（５）前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】遺伝子破壊用プラスミドpBS3の構築を示す図。○で囲まれた数字はその配列番号のプライマーを示す。
【図２】遺伝子破壊用プラスミドpBS4の構築を示す図。○で囲まれた数字はその配列番号のプライマーを示す。
【図３】sucE1欠損用プラスミドの構築を示す図。○で囲まれた数字はその配列番号のプライマーを示す。
【図４】sucE1増幅用プラスミドの構築を示す図。○で囲まれた数字はその配列番号のプライマーを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法に用いられる細菌は、コハク酸生産能を有し、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である。このような細菌はコハク酸生産能を有する親株において、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変することにより得ることができる。また、親株がコハク酸生産能を有していない場合、コハク酸の生産能を付与し、さらに、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。
本発明に使用できる細菌の親株は、特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌、エシェリヒア属細菌が好ましく、中でも、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。【０００９】
上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１、ＡＴＣＣ１３０３２及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERMP-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。【００１０】
本発明の方法に用いる細菌を得るための親株として用いられる細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。【００１１】
親株がコハク酸生産能を有していない場合、変異処理や遺伝子組換えによりコハク酸生産能を付与する。ただし、sucE1遺伝子の発現を増強するための改変によりコハク酸生産能を有するようになる場合は、必ずしもコハク酸生産能を付与する必要はない。
なお、ここでいう「コハク酸生産能」とは、該細菌を培地で培養したときに、培地中に回収可能な程度にコハク酸を蓄積する能力をいう。
育種によってコハク酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、コハク酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。コハク酸に関与する酵素としては、例えば、後述するようなピルビン酸カルボキシラーゼや、特開2005-095169号公報に開示されたフマル酸レダクターゼなどが挙げられる。ピルビン酸カルボキシラーゼ、フマル酸レダクターゼ遺伝子を増幅した細菌は、特表2002-511250号公報、特開平１１−１９６８８８号公報、特開２００５−９５１６９号公報などに記載されている。【００１２】
コハク酸生産能を付与するための改変は、後述するように嫌気条件で発現する酵素であるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することによっても達成できる。また、細菌を紫外線、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、コハク酸を生産する株を選抜する方法によってコハク酸生産能を付与してもよい。コハク酸生産能を有する変異株としては、特開2005-065641号公報に開示されているグルタミン酸要求性株などが挙げられる。【００１３】
本発明の方法に用いる細菌は、上記のようなコハク酸生産能を有する細菌を、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。なお、コハク酸生産能を付与するための改変とsucE1遺伝子の発現を増強するための改変はどちらを先に行ってもよい。【００１４】
sucE1遺伝子がコードするタンパク質（sucE;succinate exporter）は、Permeaseの一種と推測されており、細菌内でその発現を増強させた場合に細菌の「コハク酸生産能」を向上させるタンパク質である。【００１５】
本発明の方法に用いる細菌を得るために使用するsucE1遺伝子としては、Brevibacterium flavum MJ233由来のsucE1遺伝子（配列番号15の塩基番号571〜2187）、あるいはC.glutamicum ATCC13032由来のsucE1遺伝子（配列番号17の塩基配列）、C.efficiens YS314由来のsucE1遺伝子（配列番号19の塩基配列）、C.diphtheriaegravis NCTC13129由来のsucE1遺伝子（配列番号23の塩基配列）などを挙げることができる。C.glutamicum ATCC13032のsucE1遺伝子は、GenBank Accession No. NC#003450として登録されているゲノム配列中のNCgl2130として登録されている。(アミノ酸配列はGenBank Accession No. NP#601414)。C.efficiens YS314のsucE1遺伝子はGenBank Accession No. NC#004369として登録されているゲノム配列中のCE2102として登録されている。C.diphtheriae gravis NCTC13129由来のsucE1遺伝子は、GenBank Accession No.NC#002935のDIP0830として登録されている。
また、本発明の方法に用いる細菌を得るために使用するsucE1遺伝子は、細菌においてその発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させることが出来る限り、他の微生物由来のsucE1のホモログ遺伝子を用いてもよい。sucE1遺伝子のホモログは、BLAST等によって配列番号15の塩基番号571〜2187の配列などを参照して、検索出来る（//blast.genome.jp/）。【００１６】
sucE1遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号13及び14に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、C.glutamicumのsucE1とsucE1の制御領域を含む、その隣接領域を取得することができる。他の微生物のsucE1のホモログも同様にして取得され得る。【００１７】
コリネ型細菌の種や菌株によってsucE1遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明の方法に用いる細菌を得るために使用するsucE1遺伝子は、配列番号15の塩基番号571-2187の配列、配列番号17、または19の配列を有する遺伝子に限られず、細菌内でその発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させることができる限り、配列番号16、18、20のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１から２０個、好ましくは、１から１０個、より好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、sucE1遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe,trp,tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu,ile,val間で、極性アミノ酸である場合には、gln,asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys,arg,his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp,glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser,thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。【００１８】
さらに、sucE1遺伝子は、配列番号１６、１８、２０のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させることが出来るタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれsucE1が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にsucE1遺伝子は、発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号１６,１８または２０のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はＣ末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。【００１９】
このようなsucE1遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号15の塩基番号571〜2187の塩基配列、配列番号17、19の塩基配列、を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得される。変異処理としては、配列番号15の塩基番号571〜2187の塩基配列、配列番号17、または19に示す塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プロ−ンPCR 、DNA shuffling, StEP−PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にsucE1に変異を導入して活性の高いsucE1遺伝子を取得することが出来る。（Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction.）
なお、これらのsucE1相同遺伝子が発現を増強することによりコハク酸生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し、コハク酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。【００２０】
また、sucE1遺伝子は、配列番号15の塩基番号571〜2187の配列,配列番号17もしくは19の配列の相補配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ発現を増強することにより、細菌のコハク酸生産能を向上させるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80％以上,好ましくは90％以上,より好ましくは95％以上,特に好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号15の塩基番号571〜2187の配列、配列番号17又は19の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。【００２１】
上記のようなsucE1遺伝子について、その発現量が増強するように細菌を改変する。
ここで、「sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのSucE1産物分子の数が増加した場合や、SucE1産物分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。なお、比較対象となる野生型のコリネ型細菌とは、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869やATCC13032などが挙げられる。
sucE1遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、sucE1のm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。【００２２】
sucE1遺伝子の発現量の増強は、sucE1遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、sucE1遺伝子を含む断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のようなコハク酸生産能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にコハク酸生産能を付与してもよい。また、コピー数の上昇は、sucE1をコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にsucE1遺伝子が転移したことの確認は、sucE1遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。【００２３】
また、sucE1遺伝子の発現の増強は、sucE1遺伝子の発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、sucE1のプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る。（国際公開第ＷＯ００／１８９３５号パンフレット）【００２４】
以下、コハク酸生産能を有し、sucE1遺伝子の発現量が上昇するように改変した微生物の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001）等のマニュアルに従って実施出来る。【００２５】
同遺伝子の発現量の増強は、sucE1遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでsucE1遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずsucE1遺伝子を、コリネ型細菌などの染色体からクローニングする。
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号１３、１４に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いsucE1遺伝子を増幅することが出来る。【００２６】
PCR法により増幅されたsucE1遺伝子を含む遺伝子断片は、増幅する微生物で自律複製可能な複製起点を有するベクターに組み込み、該ベクターで細菌を形質転換することによって増幅することが好ましい。特にコリネ型細菌に導入する場合は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。【００２７】
コリネ型細菌を宿主として用いる場合、上記DNAをコリネ型細菌で機能するベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。【００２８】
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。【００２９】
sucE1遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、sucE1の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめsucE1の増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。【００３０】
上記のように調製した組換えプラスミドを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929(1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）.によっても、細菌の形質転換を行うことができる。【００３１】
sucE1のコピー数を高めることは、sucE1を細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上にsucE1を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、sucE1をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。【００３２】
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにsucE1遺伝子を導入して、染色体上で増幅させる方法が考えられる。例えば用いることが出来るベクターは、ｐＳＵＰ３０１（Simo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Schaefer等, Gene 145, 69〜73 (1994) ）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison, WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; US-A 5487993）、ｐＣＲ(R)Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993)）、ｐＥＭ１（Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516）またはｐＢＧＳ８（spratt等, 1986, Gene, 41：337〜342）等が挙げられる。sucE1遺伝子を含むプラスミドベクターを細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988)）、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994)）に記載されている。【００３３】
また、sucE1の活性を上昇させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のsucE1のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、sucE1の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される。(Hamilton et al,; Journal of Bacterology171:4617-4622) 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PS2プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。【００３４】
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。sucE1遺伝子上流のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりsucE1遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。なお、pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
なお、発現調節配列の改変は、sucE1遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。【００３５】
本方法においては、sucEの発現上昇に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）活性が低減化するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここで、「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されsucE1遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例えば後述の実施例２のようにして、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をsucE1遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作とsucE1の発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。【００３６】
LDHの活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上のLDH遺伝子に、細胞中のLDH活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上のLDHをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上のLDHをコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異型LDHをコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、染色体上の正常型LDH遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによってもLDH活性を低下または欠損させることができる。【００３７】
例えば、LDH活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。LDH遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型LDH遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のLDH遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。なお、コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、上記、p48K及びpSFKT2（以上、米国特許第6303383号参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。
また、上記のような遺伝子破壊操作においては、遺伝子組み換えのマーカーとしてレバンシュークラーゼを用いることもできる（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69−73）。【００３８】
また、本反応においては、sucE1の発現増強加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌を用いてもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強される」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述するようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。sucE1及びピルビン酸カルボキシラーゼの発現が増強されたコリネ型細菌は、特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、sucE1遺伝子及びピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより作製することができる。【００３９】
本発明の方法に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。【００４０】
ＰＣ遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム由来のPC遺伝子を用いることができる（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）（配列番号２１）。また、ＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号２１の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。配列番号２１の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号２１の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。【００４１】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
なお、PC遺伝子発現の増強は、上述したsucE1遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。【００４２】
本発明では、上記のような、コハク酸生産能を有し、sucE1遺伝子の発現が増強するように改変された細菌を用いてコハク酸の製造を行う。
コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってもコハク酸を製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによってもコハク酸を製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。【００４３】
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。【００４４】
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。【００４５】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。【００４６】
上記炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。【００４７】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜10、好ましくはｐＨ６〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。【００４８】
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。【００４９】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。【００５０】
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。【００５１】
反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーによりコハク酸を分離・精製することができる。【００５２】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【実施例１】
【００５３】
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（A）pBS3の構築
バチルス・ズブチリスの染色体DNAを鋳型として配列表配列番号１と2をプライマーとして用いて、PCRにより取得した。PCR反応は、LA taq(TaKaRa)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合49℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後BglIIとBamHIで消化し、平滑化した。
この断片をpHSG299のAvaIIで消化後、平滑化した部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、カナマイシン（以下、Kmと略す）25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS3と命名した。pBS3の構築過程を図1に示す。【００５４】
（B）pBS4Sの構築
pBS3上に存在するKm耐性遺伝子配列中のSmaI部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換によりKm耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCRで取得した。まず、pBS3を鋳型として配列表配列番号3，4の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、Km耐性遺伝子のN末端側の増幅産物を得る。一方Km耐性遺伝子のC末端側の増幅産物を得るためにpBS3を鋳型として配列表配列番号5，6の合成DNAを鋳型としてPCRを行う。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(TaKaRa)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。
配列表配列番号4と5は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在するSmaI部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次にSmaI部位が破壊された変異型Km耐性遺伝子断片を得るために、上記Km耐性遺伝子N末端側及びC末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表配列番号3，6の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたKm耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(TaKaRa)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1.5分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。生成したPCR産物を常法により精製後BanIIで消化し、上記のpBS3のBanII部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、Km 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4Sと命名した。pBS4Sの構築過程を図2に示す。
【実施例２】
【００５５】
＜sucE1遺伝子破壊株の構築＞
(A) sucE1遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株由来のsucE1遺伝子のorfを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （Genbank Database Accession No. NC#003450）のNCgl2130周辺の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的にはブレビバクテリウム・フラバムMJ233株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号7、8の合成DNAをプライマーとしてPCRを行いsucE1遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、sucE1遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株のゲノムDNAを鋳型とし、配列表配列番号9、10の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。PCR反応は、Pyrobest DNAPolymerase(TaKaRa)を用い、94 ℃で3分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合60℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを30回繰り返すことにより、目的のPCR産物を得ることができる。配列表配列番号8と9は互いに相補的であり、sucE1のorfの全配列を欠損させた構造となっている。次に内部配列を欠失したsucE1遺伝子断片を得るために、上記sucE1N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表配列番号11と12の合成DNAをプライマーとしてPCRを行いsucE1のorfを欠失した増幅産物を得た。PCR反応は、Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa)を用い、94℃で3分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合58℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを30回繰り返すことにより、目的のPCR産物を得ることができる。生成したPCR産物を常法により精製後BamHIで消化した後、上記実施例１（B）で構築したpBS4SのBamHI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔsucE1と命名した。該プラスミドの構築図を図3に示す。【００５６】
（B）sucE1破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS4SΔsucE1はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。ブレビバクテリウム・フラバムMJ233ΔLDH株（特開2005-95169記載のMJ233/ΔLDH株）を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS4SΔsucE1を用いて形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)に寒天1.5%を含む）に塗布し、31.5℃で約24時間培養した。プラスミドは、エシェリヒア・コリSCS110（stratagene）をpBS4SΔsucE1で形質転換し、この株から抽出したものを用いた。出現したコロニーは該プラスミドのsucE1遺伝子断片とブレビバクテリウム・フラバムMJ233株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。
次にこれらの一回目の組換え体を、カナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10寒天培地（ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、pH7.5(KOH)に寒天1.5%を含む）に塗布にし、31.5℃にて約24時間培養し、ショ糖に耐性を示すクローンを取得した。これらの株は、正常なsacB遺伝子を発現しなくなった株であり、その中には2回目の相同組換えによりpBS4SΔsucE1が脱落した株が含まれる。さらに、2回目の相同組換えを起こした株は、sucE1遺伝子がpBS4SΔsucE1に由来する欠失型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。sucE1遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体より染色体DNAを抽出し、PCRにてsucE1遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。得られた２回組換え株のうち、sucE1遺伝子をPCRで増幅するためのプライマー（配列表配列番号7および配列表配列番号10）を用いて増幅した際、MJ233株の染色体DNAを鋳型にしたものよりもPCR産物の大きさが小さいものをsucE1欠損株として以降の実験に使用した。取得したsucE1欠損株をMJ233ΔldhΔsucE1と命名した。
【実施例３】
【００５７】
＜sucE1増幅株の構築＞
（A）sucE1遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株由来のsucE1遺伝子増幅プラスミドは以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （Genbank Database Accession No.NC003450）のNCgl2130周辺の塩基配列を参考に設計した配列表配列番号１３、１４の合成DNAをプライマーとして、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行う。PCR反応は、Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa)を用い、94 ℃で3分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合60℃ 30秒、伸長72℃ 2.5分からなるサイクルを30回繰り返すことにより、目的のPCR産物を得ることができる。生成したPCR産物を常法により精製後Sse8387Iで消化した後、pVK9のSse8387I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、図４の構成のプラスミドをpVKsucE1と命名した。なお、pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。【００５８】
（B）sucE1増幅株の作成
上記（A）で得られたpVKsucE1およびpVK9を用いて、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233ΔLDH株およびMJ233ΔLDHΔsucE1株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)に寒天1.5%を含む）に塗布し、31.5℃で約24時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。
【実施例４】
【００５９】
＜sucE1改変株によるコハク酸生産＞
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh株(WO2005/021770)にpVK9またはpVK9sucE1を導入した株、およびMJ233ΔldhΔsucE1株にpVK9またはpVK9sucE1を導入した株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地にて培養して得た菌体をシード培地 20ml（グルコース 20g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、尿素 4g/L、FeSO4・7H2O 0.02g/L、MnSO4・7H2O 0.02g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、イーストエキストラクト  1g/L、カザミノ酸  1g/L）に接種し、好気条件にて31.5℃にて坂口フラスコで約8時間振とう培養を行った。
その後、シード培養液700μlを分取し、直ちにエッペンチューブ中のメイン培地 700μl（グルコース200g/L、亜硫酸Na 30g/Lをフィルターろ過したものに、乾熱滅菌した炭酸マグネシウムを終濃度143g/Lとなるように混合）と混合し、31.5℃で振とう培養をおこなった。４８時間後に培養を停止し、生成したコハク酸量を、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simadzu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simadzu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。各菌株について、複数検体の評価を行った結果を表１に示した。
MJ233Δldh/pVK9sucE1は、MJ233Δldh/pVK9に比べ、約１．５倍のコハク酸の蓄積を示した。このことから、sucE1の発現量の増加がコハク酸の発酵生産に有効であることが示された。
一方、MJ233ΔldhΔsucE1/pVK9株では、全くコハク酸の蓄積が認められなくなった。これは、sucE1遺伝子がコハク酸生産菌から失われると、著しくコハク酸生産能を損なうことを意味する。sucE1を欠失した株にsucE1をプラスミドで相補した株MJ233ΔldhΔsucE1/pVKsucE1では、MJ233ΔldhΔsucE1/pVK9よりも高いコハク酸蓄積が認められた。pVK9は細胞内のコピー数が約１０コピーであることから、MJ233ΔldhΔsucE1にpVK9sucE1を導入すると、sucE1の発現量としては野生型よりも上回ることとなる。この結果からも、sucE1の発現増強がコハク酸生産に有効であることが示された。【００６０】
【表１】
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【産業上の利用の可能性】
【００６１】
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸を製造することができる。得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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