(57)【要約】【課題】  自動化が促進され、収率が上昇し、安定性が増したピロールイミダゾールポリアミドの合成法の提供。【解決手段】  固相合成法において、ＨＣＴＵを縮合活性化剤とすることでポリアミドの自動合成を促進できる。さらに、モノマーを固体で投入することで収率が上昇でき、酸塩化物による手合成を組み合わせることで、どのような配列のピロールイミダゾールポリアミドをも合成できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相合成法によるピロールイミダゾールポリアミドの合成法であって、ＨＣＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート）を縮合活性化剤として用いる合成法。
【請求項２】
原料モノマーを固体のまま導入する請求項１に記載の合成法。
【請求項３】
Ｎ末端へのピロール結合又はイミダゾール結合を酸塩化物法によって行う請求項１又は２に記載の合成法。
【請求項４】
原料モノマーがピロール酸塩化物又はイミダゾール酸塩化物である請求項３に記載の合成法。
【請求項５】
ピロール原料及びイミダゾール原料をピロールイミダゾールダイマーで導入するダイマー法による請求項１に記載の合成法。
【請求項６】
自動合成による請求項５に記載の合成法。
【請求項７】
化学式１で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化１］
2007060860.tif 000017
【請求項８】
化学式２で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化２］
2007060860.tif 000018
【請求項９】
化学式３で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化３］
2007060860.tif 000019
【請求項１０】
化学式４で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化４］
2007060860.tif 000020
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
従来、ピロール・イミダゾール合成にあたり、液相法や、ＨＡＴＵ（０−［７−アゾベンゾトリアゾールー１−イル］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（２−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート）等を縮合活性剤として用いるペプチド合成機における固相Ｆｍｏｃ法による自動合成法等が行われている（例えば、特許文献１参照）。また、改良型固相ペプチド合成に関し、固相に付加されているＣ末端部が、カップリング工程の間適切に保護され、特異的なアミノ酸から成るプレ配列を含むこと等を特徴とする開発がなされている（例えば、特許文献２参照）。【０００２】
しかし、これらの方法には高い技術と煩雑な操作、及び多くの時間が必要であるという問題があった。また、手作業が必要な部分が多く、合成の完全な自動化には至っておらず、イミダゾール‐ピロール配列の合成も困難であった。従って、従来の方法と比べて自動化が促進され、収率が上昇し、安定性が増した、どのような配列のピロールイミダゾールポリアミドをも簡便に合成できるピロールイミダゾールポリアミドの合成法の提供が望まれている。
【特許文献１】ＷＯ２００３／０００６８３号公報
【特許文献２】特表２００１−５００１３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は自動化が促進され、収率が上昇し、安定性が増したピロールイミダゾールポリアミドの合成法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、固相合成法において、ＨＣＴＵを縮合活性化剤として用いることでポリアミドの自動合成を促進できることを見出した。これに加え、原料モノマーを固体で投入することにより、ピロールイミダゾールポリアミドの収率が上昇できることを見出した。
さらに酸塩化物による手合成を組み合わせることで、どのような配列のピロールイミダゾールポリアミドをも合成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。さらにまた、ピロールイミダゾールダイマーを原料の一部として用いることで、ピロールイミダゾールポリアミドの完全自動合成が可能になることも見出した。【０００５】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１０）に関する。
（１）  固相合成法によるピロールイミダゾールポリアミドの合成法であって、ＨＣＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート）を縮合活性化剤として用いる合成法。
（２）  原料モノマーを固体のまま導入する上記（１）に記載の合成法。
（３）  Ｎ末端へのピロール結合又はイミダゾール結合を酸塩化物法によって行う上記（１）又は（２）に記載の合成法。
（４）  原料モノマーがピロール酸塩化物又はイミダゾール酸塩化物である上記（３）に記載の合成法。
（５）  ピロール原料及びイミダゾール原料をピロールイミダゾールダイマーで導入するダイマー法による上記（１）に記載の合成法。
（６）  自動合成による上記（５）に記載の合成法。
（７）  化学式１で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化１］
2007060860.tif 000002
（８）  化学式２で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化２］
2007060860.tif 000003
（９）  化学式３で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化３］
2007060860.tif 000004
（１０）  化学式４で示されるピロールイミダゾールポリアミド。
［化４］
2007060860.tif 000005
【発明の効果】
【０００６】
本発明の合成法により、迅速かつ定量的にピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。合成されたピロールイミダゾールポリアミドは、ＤＮＡ配列を認識して特異的に結合できるので医療用等に有用である。また、この合成法をシステムに含むことで、自動性・収率・安定性が増した合成機の提供等も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＡｃＰｙＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの分取精製後のＨＰＬＣを示した図である（実施例１）。
【図２】ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの分取精製後のＨＰＬＣを示した図である（実施例１２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の合成法は、縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用いれば、Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法などの従来知られている固相合成法のいずれの方法も用いることができる。このうちＦｍｏｃ法を用いることが好ましい。
本発明の合成法は、不溶性固相単体上で、保護アミノ酸の縮合反応、Ｎα−アミノ保護基の脱保護反応等を繰り返すことで行うことができる。【０００９】
本発明の合成法には、自動合成と手動合成を組み合わせる場合と自動合成のみで行う場合が含まれる。自動合成と手動合成を組み合わせる場合は、手動合成が酸塩化物法により行われることが好ましい。酸塩化物法により、ピロールとイミダゾールのカップリング収率が９０％以上になるため、いずれのピロールイミダゾールポリアミドも合成できるからである。
なお、酸塩化物法では、ピロール酸塩化物又はイミダゾール酸塩化物を用いるが、これらはいずれの方法で合成したものも用いることができる。本発明の実施例の方法により独自に合成したものを用いることが特に好ましい。【００１０】
また、自動合成のみで行う場合は、ダイマー法により行われることが好ましい。ダイマー法を行うことにより、合成の目的とするピロールイミダゾールポリアミドを完全に自動の工程で合成することができる。【００１１】
本発明の合成法において自動合成を行う場合には、自動合成機を用いることが好ましい。自動合成機としては、半自動合成機、全自動合成機及びマルチペプチド合成機等の従来知られているいずれの装置も用いることができるが、ペプチドシンセサイザを用いることが特に好ましい。【００１２】
本発明の合成に用いるモノマーとしてはＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ社製）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ社製）等の市販のものを用いることができる。また、合成する化合物によっては、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）なども用いることができる。合成するピロールイミダゾールポリアミドの構造にＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨを組み込むことで、得られる化合物の歪みの解消を行い、ＤＮＡに対しての親和性を向上させることができる。
また、ダイマーとしてはＦｍｏｃＰｙＩｍＣＯＯＨダイマー（Ｗａｋｏ社製）等を用いることができる。これらの合成のためのモノマー、ダイマー等は、合成に用いることができるものであればいずれのものも問わない。【００１３】
本発明の合成法においてモノマーを用いる場合には、固体のまま導入することが好ましい。モノマーの導入とは、モノマーを合成過程に導入することをいい、合成機内ラックに試験管に入ったモノマーをセットすることも含まれる。
従来の方法では、モノマーはＤＭＦ等の溶媒に溶かした後、液体として合成過程に導入されてきた。しかし、この方法では、モノマーを溶液状態で保持するために、分解されやすく、合成するピロールイミダゾールポリアミドの収率が低いという問題があった。
一方、モノマーを固体のまま導入することは、モノマーが分解されにくく、合成するピロールイミダゾールポリアミドの収率が高くなるため好ましい。ここで、本発明のモノマーを固体のまま導入するとは、モノマーを試験管に入れ、そのまま合成過程に導入することをいう。
なお、モノマーを固体のまま導入するにあたり、モノマーをあらかじめ乳鉢・乳棒で細かくすりつぶすことが好ましい。また、モノマーを合成直前に減圧下でよく乾燥させておくことが好ましい。これらの処理を経ることによって、合成するピロールイミダゾールポリアミドの収率を上げることができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
［実施例１］【００１４】
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成（酸塩化物法）＞
自動合成及び酸塩化物法による手動合成を組み合わせ、ＨＣＴＵを縮合活性化剤として、ＡｃＰｙＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐ（化１）を合成した。以下、化学式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）。【００１５】
［化１］
2007060860.tif 000006
【００１６】
１．試薬の調製
１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，１４５ｍｇ）を７カップリング分、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，１４５ｍｇ）を１カップリング分、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３０ｍｇ）を１カップリング分及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２５ｍｇ）を３カップリング分用意し、レジンに対して各４当量ずつ秤量し、試験管に移した。秤取したモノマーは乳鉢・乳棒で細かくすりつぶし、減圧下でよく乾燥させておいた。
２）合成用試薬
合成機による合成のために、表１に記載の試薬を調製して用いた。【００１７】
【表１】
2007060860.tif 000007
【００１８】
２．カラムの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＣＬＥＡＲ−Ａｃｉｄ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を２００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）取り、ＤＭＦ２ｍＬで３０分間膨潤させた。膨潤後レジンをＤＭＦごとカラム内に移し、そのまま合成機にセットできるように調製した。【００１９】
３．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製した０．５Ｍ  ＨＣＴＵ／ＤＭＦと１Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦを縮合活性化剤として合成機（ペプチドシンセサイザＰＩＯＮＥＥＲ；アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）にインストールし、また先に準備しておいた各モノマーの入った試験管をＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。
合成機内ラックにセットした各試験管内のモノマーをＤＭＦで溶解した後、合成機をスタートさせ、Ｈ２ＮＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎまで次の（１）〜（３）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。得られたＨ２ＮＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−ＲｅｓｉｎはＤＭＦ２ｍＬで３０分間膨潤させておき、その間、続く手合成で用いるＦｍｏｃＰｙ酸塩化物を調製した。
（１）  カップリング処理が、上記活性化剤を用いてＤＭＦ中１時間行われた。
（２）  アセチルキャッピング処理（Ａｃ２Ｏ：Ｐｙｒｉｄｉｎｅ：ＤＭＦ＝１：１：１８）が行われ、ミスカップリング体の伸長を停止した。
（３）  Ｆｍｏｃ脱保護（２０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ）の後、（１）に戻り、次のカップリング反応に進んだ。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。【００２０】
４．ペプチド合成（手動：酸塩化物法）
窒素雰囲気下、１カップリング分のＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（１４５ｍｇ）を脱水塩化メチレン（Ｎａｋａｌａｉ社製，２ｍＬ）で懸濁させた。ここにオキサリルクロライド（Ｎａｃａｌａｉ社製，５２μＬ）を滴下し、続いてＤＭＦ（２μＬ）を加えて３０分間室温で撹拌した。反応後、減圧下溶媒を留去させることで、ＦｍｏｃＰｙ酸塩化物が泡状固体として得られた。
膨潤しておいたＨ２ＮＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎに対してピリジン（１３０μＬ）を加え、ここに塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解させたＦｍｏｃＰｙ酸塩化物を加えた。室温で１５分間振盪させた後、レジンをＤＭＦ、メタノール、塩化メチレンでよく洗った。得られたレジンはＤＭＦ膨潤させて再び合成機に戻し、アセチルキャッピング処理を行った。【００２１】
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ社製，２ｍＬ）を加えて５５℃で１０時間よく撹拌してレジンからポリアミドの切り出しを行った。セライト濾過によりレジンを取り除き、メタノール：塩化メチレン＝１：１溶液でポリアミドを回収した。
溶媒を留去後、再度ＤＭＦに溶解させ、ＨＰＬＣで分取精製した。分取精製後のＨＰＬＣを図１に示した（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ３ＣＮ＝１００：０〜３３．３：６６．７，２０ｍｉｎ）。分取精製の後、凍結乾燥をして、標的ポリアミドＡｃＰｙＩｍβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐを得た（５３．５ｍｇ，３７．６％，ＥＳＩ  ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；１４２３．０，ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋Ｈ］＋；１４２２．７）。
［実施例２〜７］【００２２】
実施例１と同様の方法で表２に記載のピロールイミダゾールポリアミドを合成し、それぞれの収率を調べた。実施例４で合成したピロールイミダゾールポリアミドの構造式を化学式２に、実施例６で合成したピロールイミダゾールポリアミドの構造式を化学式３に示した。【００２３】
【表２】
2007060860.tif 000008
【００２４】
［化２］
2007060860.tif 000009
【００２５】
［化３］
2007060860.tif 000010
【００２６】
［比較例１］
＜ＨＢＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
縮合活性化剤としてＨＢＴＵを用い、実施例１と同様の方法で、上記実施例２で合成した化合物（ＡｃＩｍＰｙβＰｙγＩｍβＰｙＰｙβＤｐ）を合成した。
実施例１と同じモノマー、合成用試薬を用い、調製したカラムを用い、酸塩化物法による手動合成を加えた合成機によるポリアミドの合成を行った。実施例１の方法では、縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用いているが、ここではＨＢＴＵを用い、Ａｃｔｉｖａｔｏｒ１縮合試薬とをＨＢＴＵ／ＤＭＦ（０．５Ｍ）とした。
得られたピロールイミダゾールポリアミドは微量であり、収率が十分に測定できなかった。その結果、縮合活性剤としてＨＢＴＵを用い、酸塩化物法を行った場合では、十分なピロールイミダゾールポリアミドの合成ができないことが示された。【００２７】
［比較例２］
＜ＨＡＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
自動合成及び酸塩化物法による手動合成を組み合わせ、ＨＡＴＵを縮合活性化剤として、表３に記載のピロールイミダゾールポリアミドを合成し、それぞれの収率を調べた。
実施例１と同じモノマー、合成用試薬を用い、調製したカラムを用い、酸塩化物法による手動合成を加えた合成機によるポリアミドの合成を行った。なお、実施例１の方法では、モノマーを固体で導入しているが、ここではモノマーの導入にあたり、モノマーをＤＭＦで溶解し、一般的な方法である液体の状態で導入した。モノマーを液体で導入した場合におけるピロールイミダゾールポリアミドの回収重量を実施例１と同様に測定し、収率を求めた。それぞれの重量及び収率を表３に示した。
この結果、ＨＡＴＵを縮合活性化剤として用い、モノマーを液体で導入した場合は収率が１０％未満と低いが、ＨＣＴＵを縮合活性化剤として用い、モノマー固体で導入した場合では、収率が２０〜４０％に上昇することが確認された。【００２８】
【表３】
2007060860.tif 000011
［実施例８］【００２９】
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、実施例１と同様の方法で、ＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐを合成し、収率を調べた。得られた回収重量及び収率は表４に示した。【００３０】
［比較例３］
＜ＨＡＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
縮合活性化剤としてＨＡＴＵを用い、実施例８と同様の方法で、ＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐを合成し、収率を調べた。得られた回収重量及び収率は表４に示した。【００３１】
【表４】
2007060860.tif 000012
【００３２】
実施例８及び比較例３の結果より、縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用いた場合はＨＡＴＵを用いた場合と比べて化合物の収率が高いことが示された。
［実施例９］【００３３】
＜モノマーを固体で導入するピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、実施例１と同様の方法でＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐを合成し、収率を調べた。この合成において、モノマーは固体で導入した。得られた回収重量及び収率は表５に示した。【００３４】
［比較例４］
＜モノマーを液体で導入するピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、実施例９と同様の方法でＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐを合成し、収率を調べた。この合成において、モノマーはＤＭＦで溶解し、一般的な方法である液体の状態で導入した。得られた回収重量及び収率は表５に示した。【００３５】
【表５】
2007060860.tif 000013
【００３６】
実施例９及び比較例４の結果より、モノマーを固体で導入した場合は液体で導入した場合と比べて化合物の収率が高いことが示された。
［実施例１０］【００３７】
＜カップリング収率の検討＞
酸塩化物法におけるカップリングを行った。実施例１と同様に、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＣＬＥＡＲ−Ａｃｉｄ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いてカラムの調製を行った。そして、表１と同様に調製した０．５Ｍ  ＨＣＴＵ／ＤＭＦと１Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦを用い、合成機（ペプチドシンセサイザＰＩＯＮＥＥＲ；アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）によってＨ２ＮＩｍ末端を有するレジン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）Ｈ２ＮＩｍＰｙ−Ｒｅｓｉｎを自動合成した。得られたＨ２ＮＩｍＰｙ−ＲｅｓｉｎはＤＭＦ２ｍＬで３０分間膨潤させておき、その間に、続く手合成で用いるＦｍｏｃＰｙ酸塩化物を調製した。
窒素雰囲気下、ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（９０．６ｍｇ）を脱水塩化メチレン（Ｎａｋａｌａｉ社製，２ｍＬ）で懸濁させた。ここにオキサリルクロライド（Ｎａｃａｌａｉ社製，３４μＬ）を滴下し、続いてＤＭＦ（２μＬ）を加えて３０分間室温で撹拌した。反応後、減圧下溶媒を留去させることで、ＦｍｏｃＰｙ酸塩化物が泡状固体として得られた。
上記で調製したＨ２ＮＩｍＰｙＲｅｓｉｎを塩化メチレン（６００μＬ）に膨潤させた後に、ピリジン（１３０μＬ）を加え、これに上記で得たＦｍｏｃＰｙ酸塩化物を加えた。室温で１時間振盪させた後、レジンをＤＭＦ、メタノール、塩化メチレンでよく洗った。
実施例１と同様に、分取精製及び凍結乾燥をして、ピロールイミダゾールポリアミドを得た。得られたピロールイミダゾールポリアミドは、ＨＰＬＣ測定、重量測定を行い、カップリング収率を求めた。
カップリング収率は式１に示すように、ＨＰＬＣよりカップリングしたものとしていないもののピークエリア比より算出した。【００３８】
［式１］
（カップリングしたピークエリア／モル吸光係数）／（カップリングしていないピークエリア／モル吸光係数＋カップリングしたピークエリア／モル吸光係数）＊１００【００３９】
［比較例５］
＜カップリング収率の検討＞
酸無水物法におけるカップリングを行った。Ｈ２ＮＩｍ末端を有するレジンをＤＭＦ２ｍＬで３０分間膨潤させた。
窒素雰囲気下、ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（３６２．４ｍｇ）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＴＣＩ，２０６．３ｍｇ）を脱水塩化メチレン（Ｎａｋａｌａｉ社製，１．５ｍＬ）で懸濁させ、室温で１時間撹拌した。ここにＤＭＡＰ（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（４−ジメチルアミノピリジン）；Ｗａｋｏ）（６１ｍｇ）を加えて３分間さらに撹拌した。
膨潤しておいたレジンに対して上記懸濁液を加え、室温で１時間振盪させた後、レジンをＤＭＦ、メタノール、塩化メチレンでよく洗った。
実施例１と同様に、分取精製及び凍結乾燥をして、ピロールイミダゾールポリアミドを得た。得られピロールイミダゾールポリアミドは、ＨＰＬＣ測定、重量測定を行い、実施例９と同様にカップリング収率を求めた。
実施例９及び比較例５において得られたカップリング収率を表６に示した。その結果、酸塩化物法の方が、高いカップリング率であることが示された。【００４０】
【表６】
2007060860.tif 000014
【００４１】
［比較例６］
＜酸無水物法を用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
自動合成及び酸無水物法による手動合成を組み合わせ、ＨＣＴＵを縮合活性化剤として、ピロールイミダゾールポリアミドＡｃＩｍＩｍβＩｍＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐ及びＡｃＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙγＰｙＩｍβＩｍＰｙＩｍβＤｐの合成を試みた。
比較例５と同じモノマー、合成用試薬を用い、調製したカラムを用い、酸無水物法による手動合成を加えた合成機によるポリアミドの合成を行った。ＡｃＩｍＩｍβＩｍＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙβの合成では、生成物が合成できず、ＩｍＰｙカップリングを定量的に行うことが困難であった。また、ＡｃＰｙＰｙＰｙ−ＩｍＰｙγＰｙ−ＩｍＰｙＩｍβＤｐの合成ではレジン直後のＩｍ→Ｐｙが全く入らないため、合成できなかった。従って、酸無水物法による合成では、ピロールイミダゾールポリアミドの合成が十分にできないことが確認された。
［実施例１１］【００４２】
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成（ダイマー法）＞
ダイマー法（マニュアル法）による自動合成により、ＡｃＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙγＩｍＰｙβＰｙＰｙＩｍβＤｐを合成した。【００４３】
１．試薬の調製
１）ダイマー
ＦｍｏｃＰｙＩｍＣＯＯＨダイマー（Ｗａｋｏ社製、１９４ｍｇ）を１カップリング分用いた。また、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３０ｍｇ）を１カップリング分及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２５ｍｇ）を２カップリング分、ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，１４５ｍｇ）を６カップリング分、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，１４５ｍｇ）をカップリング分用いた。
これらをレジンに対して各４当量ずつ秤量し、試験管に移した。秤取したダイマーは減圧下で乾燥後、２ｍＬのＤＭＦに溶解させた。
２）合成用試薬
表１に記載の試薬を調製して用いた。【００４４】
２．カラムの調製
実施例１と同様に、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＣＬＥＡＲ−Ａｃｉｄ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いてカラムの調製を行った。【００４５】
３．ペプチド合成
表１と同様に調製した０．５Ｍ  ＨＣＴＵ／ＤＭＦと１Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦを用い、合成機（ペプチドシンセサイザＰＩＯＮＥＥＲ；アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）によってＨ２ＮＩｍ末端を有するレジン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）Ｈ２ＮβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎを自動合成した。得られたＨ２ＮβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−ＲｅｓｉｎはＤＭＦ２ｍＬで３０分間膨潤させておき、その間、続く自動合成−２で用いるＦｍｏｃＰｙＩｍＣＯＯＨダイマーの活性化エステルを調製した。【００４６】
５．ペプチド合成
遠心管にＦｍｏｃＰｙＩｍＣＯＯＨ（３２５ｍｇ）、ＨＯＢｔ（ＨＯＢｔ：Ｂｕｔａｎｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅ製，１４７ｍｇ）を量り取り、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。ここにＤＣＣ（ＴＣＩ社製）（２４６ｍｇ）を加えて１０ｍｉｎほど室温で放置してＦｍｏｃＰｙＩｍＣＯＯＨダイマーの活性化ステルを調製した。
膨潤しておいたＨ２ＮβＰｙＰｙγＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−ＲｅｓｉｎをＤＭＦごと流し込み、ここにＤＩＥＡ（Ｎａｃａｌａｉ社製、６５０μＬ）を加えて室温で１２時間振盪した。反応後レジンをＤＭＦ、メタノール、塩化メチレンでよく洗浄した。【００４７】
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ＤＣＣ（Ｎａｃａｌａｉ社製、２ｍＬ）を加えて５５℃で１０時間よく撹拌してレジンからポリアミドの切り出しを行った。セライト濾過によりレジンを取り除き、メタノール：塩化メチレン＝１：１溶液でポリアミドを回収した。
溶媒を留去後、再度ＤＭＦに溶解させ、ＨＰＬＣで分取精製した。分取精製の後、凍結乾燥をして、ＡｃＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙγＩｍＰｙβＰｙＰｙＩｍβＤｐを得た（７２．１ｍｇ、４３．２％、ＥＳＩ  ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；１６６７．０，ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋；１６６６．８）。
［実施例１２］【００４８】
＜酸塩化物法によるＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの合成＞
実施例１と同様の方法により、ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐ（化４）を合成した。
［化４］
2007060860.tif 000015
【００４９】
実施例１と同様に準備したモノマー、合成用試薬及び調製したカラムを用い、合成機による自動合成及び酸塩化物法による手動合成によってポリアミドの合成を行った。酸塩化物法は下記の条件で行った以外は、実施例１と同様に合成を行い、得られたポリペプチドを精製、回収した。
分取精製後のＨＰＬＣは図２に示した（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ３ＣＮ＝１００：０〜３３．３：６６．７，２０ｍｉｎ）。分取精製の後、凍結乾燥をして、標的ポリアミドＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐを得た（５３．５ｍｇ，３７．６％，ＥＳＩ  ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；１４２３．０，ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋Ｈ］＋；１４２２．７）。【００５０】
ペプチド合成（手動：酸塩化物法）
窒素雰囲気下、１カップリング分のＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（１４５ｍｇ）をＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ；Ｗａｋｏ社製，２ｍＬ）で懸濁させた。ここにオキサリルクロライド（Ｎａｃａｌａｉ社製，５１．５μＬ）を滴下し、続いてＤＭＦ（２μＬ）を加えて３０分間室温で撹拌した。反応後、減圧下溶媒を留去させることで、ＦｍｏｃＰｙ酸塩化物が泡状固体として得られた。
膨潤しておいたＨ２ＮＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙ−Ｒｅｓｉｎに対してピリジン（１３０μＬ）を加え、ここにＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させたＦｍｏｃＰｙ酸塩化物を加えた。室温で２０分間振盪させた後、レジンをＤＭＦ、メタノール、塩化メチレンでよく洗った。
実施例１と同様に、分取精製及び凍結乾燥をして、標的ポリアミドＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐを得た。ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの回収重量及び収率は表７に示した。
［実施例１３］【００５１】
＜ダイマー法によるＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの合成＞
縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、実施例１１と同様のダイマー法を用いて、ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐ（化４）を合成し、収率を調べた。回収重量及び収率は表７に示した。【００５２】
［比較例７］
＜酸無水物法によるＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐの合成＞
縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、比較例５と同様の酸無水物法を用いて、ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐ（化４）を合成し、収率を調べた。回収重量及び収率は表７に示した。【００５３】
【表７】
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【００５４】
実施例１２、実施例１３及び比較例７の結果より、縮合活性化剤としてＨＣＴＵを用い、酸塩化物法及びダイマー法で合成した場合は、酸無水物法で合成した場合と比べて４０．０％前後の高い収率が得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の合成法により、迅速かつ定量的にピロールイミダゾールポリアミドを合成し、医療用等に利用することができる。また、この合成法をシステムに含む、自動性・収率・安定性が増した合成機の提供等も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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