(57)【要約】    本発明は、貯蔵物質の蓄積プログラムが改変された植物体及びその用途等を提供することを目的とする。このため、本発明では、植物体を、Ｂ３DNA結合ドメインとＥＡＲモチーフとを備え、糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有する２以上のタンパク質をコードする２以上の遺伝子の発現が抑制可能に構築する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体であって、
Ｂ３DNA結合ドメインとＥＡＲモチーフとを備え、糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有する２以上のタンパク質をコードする２以上の遺伝子の発現が抑制可能に構築された、植物体。
【請求項２】
前記糖誘導性プロモーターは、糖誘導的サツマイモスポラミン最小プロモーターである、請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
前記２以上のタンパク質は、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質並びに以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質である、請求項１又は２に記載の植物体。
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
【請求項４】
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質をそれぞれコードする遺伝子の発現を抑制可能な外来性因子を保持する、請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
糖誘導的に胚発生後期型の遺伝子発現を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の植物体。
【請求項６】
糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現量が増大し、光合成関連遺伝子から選択される1種又は２種以上の遺伝子の発現量が減少する遺伝子発現を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の植物体。
【請求項７】
糖誘導的に貯蔵物質を産生する、請求項１〜６のいずれかに記載の植物体。
【請求項８】
前記貯蔵物質は種子における貯蔵物質である、請求項７に記載の植物体。
【請求項９】
前記貯蔵物質は油脂を含む、請求項７又は８に記載の植物体。
【請求項１０】
植物個体の全体又は一部である、請求項１〜９のいずれかに記載の植物体。
【請求項１１】
前記植物個体は、糖誘導的に本来の貯蔵器官以外の部位で貯蔵物質を蓄積する、請求項１０に記載の植物体。
【請求項１２】
前記植物個体は胚軸に前記貯蔵物質を集積する幼植物個体である、請求項１０又は１１に記載の植物体。
【請求項１３】
前記植物体は種子である、請求項１〜９のいずれかに記載の植物体。
【請求項１４】
前記種子は、糖誘導的に発芽後の幼植物個体の胚軸に前記貯蔵物質を蓄積する、請求項１３に記載の植物体。
【請求項１５】
前記植物体は培養組織である、請求項１〜９のいずれかに記載の植物体。
【請求項１６】
前記培養組織はカルスである、請求項１５に記載の植物体。
【請求項１７】
前記植物体は植物細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の植物体。
【請求項１８】
前記植物体は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）又は該植物種由来である、請求項１〜１７のいずれかに記載の植物体。
【請求項１９】
以下の表１に示す、糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現量が増大し、以下の表に示す光合成関連遺伝子から選択される1種又は２種以上の遺伝子の発現量が減少するよう発現調節可能である、請求項１８に記載の植物体。
【請求項２０】
植物体の生産方法であって、
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能な植物体を作製する作製工程を備える、生産方法。
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
【請求項２１】
前記作製工程は、前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制された植物個体の交配による種子の作出を含む、請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２２】
前記作製工程は、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する遺伝子操作を含む、請求項２０又は２１に記載の生産方法。
【請求項２３】
植物体の貯蔵物質集積プログラムの改変方法であって、
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能に植物体を改変する工程を備える、改変方法。
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
【請求項２４】
植物貯蔵物質の生産方法であって、
糖の存在下、請求項１〜１９のいずれかに記載の植物体において前記貯蔵物質を生産させる工程を備える、生産方法。
【請求項２５】
以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する、１種又は２種以上の核酸コンストラクトを含む、植物貯蔵物質の生産促進剤。
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における貯蔵物質の蓄積や胚発生に関連するプログラムの作動性を改変する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物はその種子や塊根、根茎に貯蔵物質を蓄積する。貯蔵物質としては、貯蔵タンパク質、貯蔵デンプン及び貯蔵油脂などがよく知られている。これらの貯蔵物質は、幼若植物が光合成によって自立栄養可能な状態になるまでの栄養源であるとともに、ヒトを含む動物において重要な栄養源であり、さらには工業原料でもある。こうした貯蔵物質は、通常、植物の成熟等に伴う特定の時期及び特定の組織においてのみ蓄積されるが、植物による貯蔵物質の蓄積機能を制御することができれば、貯蔵物質の集積を時期的、場所的、あるいは量的および質的に所望に改変して貯蔵物質を取得することも可能となる。このため、植物における貯蔵物質の蓄積については種々の検討がなされている。【０００３】
例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の種子において貯蔵タンパク質や油脂の集積を含む成熟プログラムを制御する転写制御因子として、ＡＢＩ３、ＦＵＳ３、及びＬＥＣ２の３種の植物固有のＢ３ＤＮＡ結合ドメインを持つタンパク質が知られている。これらは、転写因子ＬＥＣ１及び（植物ホルモンの）アブシジン酸とともに種子成熟プログラムを調節していると報告されている（Int JDevBiol56; 645-651(2005)）。一方、本発明者らは、同様にＢ３ＤＮＡドメイン結合タンパク質であって糖応答性遺伝子発現制御に関わる転写制御因子として、ＨＳＩ２、ＨＳＩ２−Ｌ１(以下、HSL1 ともいう。)及びＨＳＩ２−Ｌ２(以下、HSL2 ともいう。)を同定し、これらの解析を行っている（Plant Physiol. 138;675-685（2005）、Plant Biotech 22; 371-377（2005））。これらの転写制御因子は、いずれもＢ３ＤＮＡ結合ドメインを有しているとともに、転写抑制モチーフＥＡＲに類似した配列をそのC末端側に有していることがわかっている。【０００４】
また、遺伝子操作によって種子の油脂含有量を増加させる試み（特開平９−３１３０５９号公報）や突然変異によって根の先端部に油脂を蓄積することも開示されている（Sience, vol.277, 91-94（1997））。
【発明の開示】
【０００５】
HSI2、HSI2-L1及びHSI2-L2は、上記したＡＢＩ３、ＦＵＳ３、及びＬＥＣ２とは異なるサブファミリーを構成しているが、これらＨＳＩ２サブファミリーに属する転写制御因子の機能は現在までのところ明らかになってはいない。また、植物における貯蔵油脂などの貯蔵物質の集積の遺伝的制御機構も明らかにはなっていない。
【０００６】
本発明は、貯蔵物質の蓄積プログラムが改変された植物体及びその用途等を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、本来の貯蔵器官以外の器官あるいは本来の貯蔵物質の蓄積時期以外の時期において貯蔵物質を蓄積可能な植物体及びその用途等を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、植物の貯蔵物質の生産方法を提供することを他の一つの目的とする。
【０００７】
本発明者らは、糖誘導性の遺伝子発現制御に関わる２種類の転写因子のそれぞれについてのホモ欠損体を交配させて得た２種類の転写因子のホモ欠損体の種子を糖の存在下で発芽させると、通常の幼若植物体の成長を呈することなく胚発生状態を再現し、その胚軸において油脂などの貯蔵物質が蓄積するという知見を得た。さらに、このホモ欠損体の種子の発芽後において、各種の貯蔵関連遺伝子の発現量が増大する一方、光合成関連遺伝子の発現量が減少し、発芽後の胚軸は種子に似た胚発生状態を発現しているという知見を得た。これらの知見によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、植物体であって、Ｂ３DNA結合ドメインとＥＡＲモチーフとを備え、糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有する２以上のタンパク質をコードする２以上の遺伝子の発現が抑制可能に構築された、植物体が提供される。本発明の植物体において前記糖誘導性プロモーターは、糖誘導的サツマイモスポラミン最小プロモーターであることが好ましい。
【０００９】
本発明の植物体において、前記２以上のタンパク質は、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質並びに以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質であるとすることができる。また、本発明の植物体は、前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質をそれぞれコードする遺伝子の発現を抑制可能な外来性因子を保持することができる。
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
【００１０】
本発明の植物体は、糖誘導的に胚発生後期型の遺伝子発現を示してもよいし、また、糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現量が増大し、光合成関連遺伝子から選択される1種又は２種以上の遺伝子の発現量が減少する遺伝子発現を示すものであってもよい。また、本発明の植物体は、糖誘導的に貯蔵物質を産生するものとすることができ、前記貯蔵物質は種子における貯蔵物質とすることができ、好ましくは前記貯蔵物質は油脂を含むことができる。
【００１１】
本発明の植物体は、植物個体の全体又は一部であってもよいし、この場合、糖誘導的に本来の貯蔵器官以外の部位で貯蔵物質を蓄積するものであってもよいし、前記植物個体は胚軸に前記貯蔵物質を集積する幼植物個体であってもよい。また、本発明の植物体は、種子であってもよく、この場合、糖誘導的に発芽後の幼植物個体の胚軸に前記貯蔵物質を蓄積するものであってもよい。さらに、本発明の植物体は、培養組織であってもよく、この場合、培養組織はカルスであってもよい。さらにまた、本発明の植物体は、植物細胞であってもよい。
【００１２】
本発明の植物体は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）または該植物種由来であるとすることができる。この植物体は、表１に記載される、糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現量が増大し、以下の表に示す光合成関連遺伝子から選択される1種又は２種以上の遺伝子の発現量が減少するように、発現調節するものであってもよい。
【００１３】
本発明によれば、植物体の生産方法であって、
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、上記（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び上記（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能な植物体を作製する作製工程を備える、生産方法が提供される。
【００１４】
本発明の生産方法においては、前記作製工程は、前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制された植物個体の交配による種子の作出を含んでいてもよいし、また、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する遺伝子操作を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明によれば、植物体の貯蔵物質集積プログラムの改変方法であって、
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、上記（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び上記（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能に植物体を改変する工程を備える、改変方法が提供される。
【００１６】
本発明によれば、植物貯蔵物質の生産方法であって、
糖の存在下、上記いずれかに記載の植物体において前記貯蔵物質を生産させる工程を備える、生産方法が提供される。
【００１７】
本発明によれば、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される１種又は２種以上の第１のタンパク質及び以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される１種又は２種以上の第２のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する、１種又は２種以上の核酸コンストラクトを含む、植物貯蔵物質の生産促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】RAV1、RAV2、ARF1、ARF3、ABI3及びHSI2を含むシロイヌナズナにおけるB3ドメインタンパク質ファミリーの配列解析結果（Clustal Wプログラムによる）を示す。
【図２】ΔHSI2 (hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1) におけるHSI2遺伝子及びHSI2-L1(HSL1)遺伝子上のT-DNA挿入位置とプライマーの位置を示す。
【図３】野生型（Col）、KK株、Δhsi2-/-／Δhsi2-l1+/-株、Δhsi2＋/-／Δhsi2-l1−/-について、リアルタイムRT-PCR  を実施してｍRNAの量を調べた結果を示す。
【図４】KK株における表現型の解析結果（写真）を示す図。左列はKK株であり、右列は野生型である。左列写真の左の数字は、吸水処理後の経過日数を示す。
【図５】KK株と野生型についてAgilent Arabidopsis3 oligo Microarrayを用いてマイクロアレイ解析を行い、KK株において発現量が野生型の３０倍以上増加した遺伝子群の表を示す。
【図６】KK株と野生型についてAgilent Arabidopsis3 oligo Microarrayを用いてマイクロアレイ解析を行い、KK株において発現量が野生型の１／５以下に低下した遺伝子群の表を示す。
【図７】Ａは野生型及びKK株幼植物体における吸水処理後４日以降の種子登熟・胚発生において機能する転写因子群についての定量的RT-PCRによる発現解析結果、Ｂは野生型及びKK株幼植物体における吸水処理後５日に発現する転写遺伝子群と培地スクロース濃度との関係を示す。
【図８】Ａは吸水処理後４〜９日目の野生型及びKK株の幼植物体における種子貯蔵タンパク質の蓄積状況のウェスタンブロッティングによる解析結果、Ｂは吸水処理後５日目及び１２日目の野生型及びKK株の幼植物体におけるFAT RED 7Bによる染色結果、Ｃは吸水処理後４日目及び９日目の野生型及びKK株の幼植物体から抽出した脂質サンプルの分析結果を示す。
【図９】野生型及びKK株から採取した胚軸をSIM培地で培養して観察した結果（写真）を示す図。左列は野生型で、右列はKK株である。左列写真の左側の数字は、培養開始からの経過日数を示す。
【図１０】野性型とKK株の吸水処理後７日目の幼植物体の胚軸を切り取り、ホルモンフリー培地に移植して１４日間培養した結果（写真）を示す。
【図１１】吸水後７日目の野生型およびKK株の芽生えから切り取った胚軸を更にホルモンフリー培地で１４日間培養した組織、および野生株のCIMカルスからのタンパク質抽出物についてのSDS-PAGEとoleosin S4抗体及び12S globulin抗体を用いたウェスタンブロッティング解析結果を示す。
【図１２】KK株及び野生型の幼植物体及び野生型の乾燥種子から抽出した脂質の脂肪酸組成を示すグラフ図。KK seedlingは、KK株幼植物体、Col-0 seedlingは野生型幼植物体、Col-0 seedは、野生型乾燥種子をそれぞれ表し、Cに付記された数字は、脂肪酸の炭素数と二重結合数を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、Ｂ３DNA結合ドメインとＥＡＲモチーフとを備え、糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有する２以上のタンパク質をコードする２以上の遺伝子の発現が抑制可能に構築された植物体に関している。本発明者らが既に見出しているこれらの特徴を有する２つのタンパク質（具体的には、サツマイモスポラミン最小プロモーターの作動抑制活性を有しており、より具体的には、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードする遺伝子のそれぞれがホモ欠損している植物体を創出したところ、各一方の遺伝子のホモ欠損体においてはなんら表現型に変化が認められないにもかかわらず、胚発生及び貯蔵物質の蓄積に関連する遺伝子が脱抑制された表現型が見出された。すなわち、これらのタンパク質が協働して胚発生及び貯蔵物質の蓄積に関連する遺伝子の発現の抑制に関連していることがわかった。したがって、これら２つの遺伝子の発現を制御することにより、胚発生や貯蔵物質の蓄積プログラムの作動性（作動時期、作動強度など）を制御できることが期待できる。例えば、これらの２つの遺伝子の発現を抑制することで、これらのプログラムの作動を本来の作動時期でなくとも開始させることができ、あるいは、本来の種子や根茎などの本来の貯蔵器官でなくとも貯蔵物質を蓄積させることが考えられる。さらに、これらの２つの遺伝子の発現を抑制することにより、胚発生状態が継続されることになる。このため、カルスなど組織培養においては、植物ホルモンなどの刺激がなくても未分化状態を維持することができる。したがって、本発明の植物体によれば、貯蔵物質の蓄積と分化能とを兼ね備える組織培養を容易に実現できる。【００２０】
以下、本発明の実施の実施形態である植物体、植物体の生産方法、植物体における貯蔵物質の蓄積プログラムの改変方法、植物貯蔵物質の生産方法及び植物貯蔵物質の生産促進剤について説明する。【００２１】
（植物体）
本発明を適用する植物体としては、高等植物であれば特に限定しないで、単子葉植物及び双子葉植物に適用することができる。本発明の実施例で用いるシロイヌナズナのほか、ダイズ、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワー（油脂貯蔵植物）、バレイショ、サツマイモ（デンプン貯蔵植物）などの双子葉植物やイネ、ムギ、キビなどの単子葉植物が挙げられるが、双子葉植物が好ましい。また、植物体としては、デンプン貯蔵植物、油脂貯蔵植物及びタンパク質貯蔵植物などに分類できるが、油脂貯蔵植物に好ましく適用できる。以上のことから、本発明を適用するのに好ましい植物としては、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの双子葉植物である油脂貯蔵植物が挙げられる。また、サツマイモ、バレイショなどの双子葉植物であるデンプン貯蔵植物も好ましい。なお、本発明において貯蔵物質としては、特に限定されないで、油脂、タンパク質、デンプンなどのいずれであってもよい。好ましくは油脂である。さらに、適用する植物体における貯蔵物質のみならず、外来遺伝子によりコードされ当該植物において産生可能な他の植物体又は他の生物由来のタンパク質等であってもよい。【００２２】
また、植物体とは、植物個体、その植物個体を構成しうる全ての種類、形態の細胞、植物固体の一部である組織や器官ならびに生殖細胞を含む。さらに、また植物個体の一部としては、その繁殖媒体（種子、根茎、果実、切穂等）も包含する。【００２３】
本発明において発現を制御しようとする遺伝子は、植物固有のＢ３ＤＮＡ結合ドメインとＥＡＲモチーフとを備え、糖誘導性プロモーターの作動活抑制活性を有するタンパク質をコードしている。ここで、糖誘導性プロモーターの作動抑制活性とは、あるタンパク質が、植物体内において糖誘導性プロモーターの作動をすることを抑制する活性を意味している。また、当該作動抑制活性とは、あるタンパク質が、糖誘導性プロモーターにより作動可能に結合された構造遺伝子の発現を抑制する活性を備えることを意味することができる。こうしたタンパク質としては、例えば、能動的リプセッサーとして機能するような転写抑制因子が挙げられる。【００２４】
糖誘導性プロモーターとは、グルコース、スクロースなど通常植物が利用可能な糖類であればよく、単糖類、二糖類及び多糖類から選択されるいずれかの糖によって誘導されるプロモーターであればよい。糖としては、典型的には、スクロースである。糖誘導性プロモーターとしては、At-βAmy （シロイヌナズナ）(Plant Physiol 107: 895-904), ApL3（シロイヌナズナ） (Plant Physiol 134: 81-91), patatin（ジャガイモ） (Plant J 11: 53-62)などが知られているが、本発明のタンパク質ないし遺伝子を取得するための指標となる糖誘導性プロモーターとしては、サツマイモスポラミンプロモーター（Plant Mol Biol 14：595-604、Plant Pysiol 138：675-685）（NCBIアクセッション番号：X13509）及び２１０ｂｐからなるサツマイモスポラミン最小プロモーター（Mol Genet Genom 272:690-699）（配列番号：５）が挙げられる。サツマイモスポラミン遺伝子は、根茎において最も豊富な液胞タンパク質をコードしており、このタンパク質の発現は、スクロースやグルコースなどの糖によって他の植物組織においても誘導されることがわかっている。したがって、こうした貯蔵物質関連の糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有している場合には、胚発生や貯蔵物質の蓄積プログラムを効果的に制御できると考えられる。【００２５】
本発明において発現を制御する遺伝子がコードするタンパク質は、植物固有のＢ３ＤＮＡ結合ドメイン（Pfam：UK(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/),USA (http://pfam.wustl.edu/),アクセッション番号: PF02362）を有していることが好ましい。あるタンパク質がＢ３ＤＮＡ結合ドメインを有しているかどうかは、たとえば、Pfamのウエブサイトのアクセッション番号PF02362において得られる配列番号：６に記載のアミノ酸配列やPlant Cell (1997)Vol.9 799-807に参照されているZea Maize のVIVIP AROUS1(Vp1)のB3DNA結合ドメイン（配列番号：３０）などの既知のB3DNA結合ドメイン配列とアラインメントして決定することができる。より具体的には、既知のB3DNA結合ドメイン配列とＢ３DNA結合ドメインを有している可能性のあるタンパク質のアミノ酸配列とを公知のペアワイズアラインメントの手法（ドットマトリックス： http://www.cgr.ki.se/cgr/groups/sonnhammer/Dotter.html, http://www.isrec.isb-sib.ch/dotlet/Dotlet.html, ダイナミックプログラミングアルゴリズム(ペイズブロックアライナー：http://www.wadsworth.org.resnres/bioinfo/,  BCM Search Launcher：http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/,等、FASTAやBLASTなどのワード又はk-ダブル法（BLAST２配列アラインメント:http://www.ncbi.nlm.gov/gorf/bl2.html, FASTAプログラムパッケージ：http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta/fasta_list/html ）などを用いたり、既知のB3DNA結合ドメイン配列と複数の可能性あるタンパク質のアミノ酸配列及び/又は既知のB3DNA結合ドメインタンパク質のアミノ酸配列とを公知のマルチプルアラインメントの手法（ClustalW: http://align.genome.jp/, HAMMER(隠れマルコフモデル)： http://hmmer.wustl.edu/ , MultiAlin: http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html, mkdom/xdom: http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/xdom/ ）を用いるなどして、決定することができる。なお、制御対象となるタンパク質は、互いに34％以上の相同性（同一性）を有していることが好ましく、より好ましくは76％以上の相同性（同一性）を有している。【００２６】
また、HSI2と他のこの種のファミリーとの関係から、本発明において発現が制御されるタンパク質は以下の特徴を有するB3DNA結合ドメインを有していてもよい。RAV1、RAV2、ARF1、ARF3、ABI3及びHSI2を含むシロイヌナズナにおけるB3ドメインタンパク質ファミリーの配列解析結果（Clustalプログラムによる）を図１に示す。このマルチプルアラインメントから、HSI2は、以下の３つの特徴を有しているといえる。すなわち、（１）アミノ酸配列の下の丸印で示されるアミノ酸残基を備えている。このアミノ酸残基は、６つのタンパク質において同一である、（２）白抜き三角印で示される部位に、それぞれ特定の性質のアミノ酸（非極性又は極性（塩基性又は酸性）を有している、（３）図において四角で囲まれた部位であるファミリー間において保存されたアミノ酸残基を有している。本発明において発現制御されるタンパク質は、好ましくは、これらの特徴のいずれかを有しており、好ましくは、上記（１）の特徴を有している。また、好ましくは２種以上の特徴を有しており、さらに好ましくは全ての特徴を有する。【００２７】
また、本発明に関するタンパク質は、EARモチーフ（ERF-associated amphiphilic repression motif）(Plant Cell 13:1959-1968))を備えていることが好ましい。EARモチーフは、転写因子タンパク質のＣ末端側に備えられる。こうしたEARモチーフとしては、各種見出されており、例えば、以下の表に示すものが挙げられる(Biochem Biophys Res Commun 321: 172-178; Trends Plant Sci 11: 109-112, Trends Plant Sci. 2006 Mar;11(3):109-12.)。また、こうしたＥＡＲモチーフと同等の機能を発現する配列も本発明において用いることができる。
【表１】
2007135755.tif 000002
【００２８】
こうした本発明に関するタンパク質としては、以下の２種類のタンパク質が挙げられる。第１のタンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（HSI2）であり、第２のタンパク質は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（HSI2-L１; HSL1）である。これらのタンパク質は、いずれも、シロイヌナズナにおいてサツマイモスポラミン最小プロモーターの能動的レプレッサとして見出された転写因子タンパク質であるHSI2及びHSI2-L2(HSL1)である。【００２９】
また、他の第１のタンパク質としては、HSI2のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなりHSI2と同質の活性を有するタンパク質が挙げられる。また、他の第２のタンパク質としては、HSI2-L１(HSL1)のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなりHSI2-L１(HSL1)のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、同質の活性とは、活性が質的に同一であることを意味しており、活性がそれぞれ配列番号：２及び配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも活性が低いものであっても高いものであってもよい。こうした活性は、例えば、サツマイモスポラミン最小プロモーターに適当なレポーター遺伝子を結合させた発現カセットを保持する植物体にこうしたタンパク質を発現させて、糖の存在下においてこうしたレポーター遺伝子の発現を抑制するかどうかによって検出することができる。【００３０】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法(Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350, 1987)が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、天然型タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても、配列番号：２又は４と同質の活性を有していればよい。【００３１】
また、他の第１のタンパク質としては、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、HSI2と同質の活性を有するタンパク質が挙げられる。また、他の第２のタンパク質としては、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、HSI2-L１(HSL1)と同質の活性を有するタンパク質が挙げられる。配列番号：１に記載の塩基配列は、HSI2をコードする塩基配列であり、配列番号：３に記載の塩基配列は、HSI2-L１(HSL1)をコードする塩基配列である。【００３２】
こうした他のタンパク質は、ハイブリダイゼーション技術（Southern EM: J Mol Biol 98: 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術(Saiki RK, et al: Science 230: 1350, 1985、Saiki RK,et al: Science 239: 487, 1988)を利用する方法が挙げられる。すなわち、HSI2のアミノ酸配列からなるタンパク質やHSI2-L１(HSL1)のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ若しくはその一部又はその相補鎖をプローブとして、あるいは、こうしたタンパク質のゲノムDNAの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シロイヌナズナや他の植物から、HSI2又はHSI2-L1(HSL1)と同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAを単離し、該タンパク質を取得することは当業者において通常行い得る範囲のことである。【００３３】
なお、こうしたタンパク質をコードするDNAは、好ましくは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行うことによって得ることができる。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を意味するものとする。【００３４】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。【００３５】
本発明の植物体においては、HSI2若しくはHSI2と実質的に同一なタンパク質及びHSI2-L１(HSL1)若しくはHSI2-L１(HSL1)と実質的に同一なタンパク質とをコードする遺伝子の発現が抑制可能に構築されている。ここで、HSI2若しくはHSI2と実質的に同一なタンパク質及びHSI2-L１(HSL1)若しくはHSI2-L１(HSL1)と実質的に同一なタンパク質とをコードする遺伝子としては、植物体内において本来的に内在する遺伝子のほか、遺伝子操作、交配及び突然変異等によって染色体上に保持されることになった遺伝子を含んでいる。本発明の植物体においては、第１のタンパク質をコードする遺伝子と第２のタンパク質をコードする遺伝子との双方の発現が抑制されていればよく、それぞれのタンパク質は１種のみでもよく２種類以上が組み合わされていてもよい。【００３６】
植物体においてこうした２以上の遺伝子の発現を抑制可能に構築するには、種々の手法を採用することができる。本発明において「遺伝子の発現の抑制」とは、遺伝子の転写の抑制、タンパク質への翻訳への抑制及び不完全なタンパク質の発現を包含しており、これらのいずれの形態において、完全な抑制や変異のほか、結果として、胚発生や貯蔵物質の蓄積プログラムの作動を改変できる範囲で部分的な抑制や変異であってもよい。また、遺伝子の発現が抑制される植物体は、その全体であってもよいし一部であってもよい。【００３７】
植物において２以上の特定の遺伝子の発現を抑制する方法としては、たとえば、交配または遺伝子操作によることができる。交配によって得られる植物体は、１又は２以上の遺伝子を欠損した植物体同士による自然または人為的な受精並びに種子形成を経て得られる植物体であり、遺伝子操作によって得られる植物体は、特定遺伝子のノックアウトした植物細胞のほか、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡ干渉法及びリボザイム法等を用いて、ｍＲＮＡを対象にした発現抑制可能な核酸コンストラクトを導入し保持させた植物細胞から再生された植物体である。なお、本発明において、交配やノックアウト等による標的遺伝子の欠損や変異等、標的遺伝子に内在する要因による発現抑制を内在性因子による発現抑制とし、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡ干渉法、リボザイム法等による標的遺伝子に内在する要因以外による発現抑制を外来性因子による発現抑制とするものとする。なお、本発明において前記２以上の遺伝子の発現を抑制するのに用いられる手法はこれらに限定されるものではない。【００３８】
アンチセンス法は、三重鎖形成による転写開始阻害、転写阻害、スプライシング阻害等の作用のいずれの作用によって、遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。たとえば、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的なアンチセンスな配列、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列などが挙げられる。こうしたアンチセンス配列をコードするＤＮＡは適当なプロモーター下に接続され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結された形態で、公知の手法により植物体内に導入することができる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス配列の長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。【００３９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法は、例えば、植物体における本発明のＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載のＤＮＡ）またはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いることができる（Ｃｈｕａｎｇ ＣＦ ＆ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ＥＭ： Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： ４９８５， ２０００）。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。【００４０】
コサプレッション法は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる標的遺伝子の発現抑制である。コサプレッションは植物においても観察される（Ｓｍｙｔｈ ＤＲ： Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７： Ｒ７９３， １９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ Ｒ： Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６： ８１０， １９９６）。例えば、本発明のＤＮＡの発現がコサプレッションにより抑制された植物体を得るためには、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載のＤＮＡ）またはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して根の伸長が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。【００４１】
また、リボザイム法は、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものを利用することができる（小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素， ３５： ２１９１， １９９０）。ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムとして機能する配列を利用することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２２８： ２２８， １９８８、ＫｏｉｚｕｍｉＭ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２３９： ２８５， １９８８、小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素 ３５： ２１９１， １９９０、 Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７： ７０５９， １９８９、Ｂｕｚａｙａｎ ＪＭ： Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９， １９８６、Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ ＆Ｓａｓａｋｉ Ｎ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ６７５１， １９９１、菊池洋： 化学と生物 ３０： １１２， １９９２）。リボザイムをコードするＤＮＡは、たとえば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結されるようにして植物体に導入することができる（Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３： ７３３， １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＡＭ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ ＪＪ： Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６： ４８２３， １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ ＣＡ ＆ Ｃｅｃｈ ＴＲ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ３８７５， １９９１、Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ５１２５， １９９１）。【００４２】
本発明の植物体は、以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制されてあるいは抑制可能に構築されている。こうした本発明の植物体は、糖誘導的に胚発生後期型の遺伝子の発現量を増大させることができる。シロイヌナズナにおいては、こうした遺伝子の発現量増大が観察されており、こうした発現形態によれば、胚発生状態が形成されるため、種子などにおける貯蔵物質の合成及び蓄積が促進されるものと考えられる。また、本発明の植物体は、糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子の発現量を増大させる一方、光合成関連遺伝子の発現量を減少させることもできる。こうした発現傾向がシロイヌナズナにおいて観察されている。このような発現形態によれば、糖の存在下で貯蔵物質の合成及び蓄積が促進されると考えられる。【００４３】
本発明の植物体が植物個体の全体又は一部であるときには、糖誘導的に本来の貯蔵器官以外の部位で油脂などの貯蔵物質を蓄積するものである態様をとることができる。たとえば、幼植物個体であって、その胚軸に前記貯蔵物質を集積するものであってもよい。さらに、繁殖材料である種子の場合には、発芽後に糖誘導的に幼植物個体の胚軸に油脂などの貯蔵物質を蓄積するものであってもよい。本発明の植物体がカルスなどの培養組織の場合には、胚発生状態を維持して増殖可能であるため、貯蔵物質を産生する組織培養や細胞培養に用いることができる。【００４４】
本発明の植物体は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）または該植物種由来であるときには、表１に示す、糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子の発現量が増大し、以下の表に示す光合成関連遺伝子の発現量が減少するように、発現調節が可能である。したがって、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質やこれらのタンパク質によって合成される生産物の生産を促進することができる。さらに、これらの遺伝子のプロモーターの下流に外来タンパク質をコードする遺伝子を結合した核酸コンストラクトの利用により、植物体において他の植物体あるいは他の生物由来のタンパク質等を発現させることも可能となる。【００４５】
（植物体の生産方法・植物体における貯蔵物質の蓄積プログラムの改変方法）
本発明の植物体の生産方法は、上記したように植物体に対して交配のほか遺伝子操作を実施して前記２以上の遺伝子の発現を抑制可能な植物体を作製する作製工程を備えている。また、植物体における貯蔵物質の蓄積プログラムの改変する方法は、本発明の植物体を生産する方法において実施する上記作製工程の一部である、前記２以上の遺伝子の発現を抑制可能に植物体を改変する改変工程を含んでいる。なお、植物体の改変工程は、交配または遺伝子操作により最終的に種子や植物個体を再生するまでに至らない範囲の交配操作または遺伝子操作のみを行う工程を含んでいる。【００４６】
本発明の植物体を交配により作製する工程は、１または２以上の遺伝子において欠損や変異を有する植物体を交配してその種子を得る工程であり、遺伝子操作により本発明の植物体を作製する工程は、２以上の遺伝子の遺伝子発現を抑制可能な核酸コンストラクト(ノックアウト、アンチセンス、ＲＮＡｉ、リボザイム、コサプレッション等による)を構築し、これを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程である。植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。【００４７】
核酸コンストラクトが導入される細胞としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞を含めることができる。例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス、葉など特定器官の切片等が挙げられる。植物の形質転体は、所定の再生工程を実施することで細胞を植物体に変換することができる。再生の方法は、植物の種類によって異なるが、各種公知の方法を使用できる。【００４８】
植物細胞への核酸コンストラクトの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。また、再生した植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。【００４９】
例えば、シロイヌナズナにおいて形質転換植物体を作出する手法については、バキューム法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ， Ｎ． ＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ， Ｇ． （１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８２，２５９−２６６）・Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法（Ｃｌｏｕｇｈ， Ｓ． Ｊ． ＆ Ｂｅｎｔ， Ａ． Ｆ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６， ７３５−７４３）が、ポプラにおいて形質転換植物体を作出する手法については、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｌｅｐｌｅ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１１， １３７−１４１）などがあげられる。また、例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ ＳＫ： Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ， Ｅｄｓ） ｐｐ．６６−７４， １９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ： Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １００： １５０３， １９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ， ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７， １９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ： Ｐｌａｎｔ Ｊ ６： ２７１， １９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。【００５０】
（植物貯蔵物質の生産方法）
本発明の植物体において、前記２以上の遺伝子の発現を抑制することで、糖誘導的に胚形成プログラム又は貯蔵物質の蓄積プログラムが開始される。これらのプログラムの開始により、少なくとも胚形成が開始され維持されるかあるいは貯蔵物質の合成・蓄積が開始され維持される。後述する実施例において示すように、シロイヌナズナにおいては、発芽時に胚形成及び油脂の合成及び蓄積が開始され、カルス培養では、油脂を合成蓄積するとともに植物ホルモン刺激なくても胚形成状態を維持することができる。したがって、本発明の植物体を成長または増殖させることで植物の貯蔵物質を生産することができる。【００５１】
（植物貯蔵物質の生産促進剤）
本発明の植物貯蔵物質の生産促進剤は、前記２以上の遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトである。こうした各種核酸コンストラクトについては、すでに述べたとおりであり、遺伝子操作により植物体に導入し、形質転換植物体を得ることにより、植物貯蔵物質の蓄積・生産を促進できる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の限定されるものではない。【００５３】
まず、以下の実施例において用いる材料及び方法について説明する。
（材料及び方法）
１．植物材料
植物材料としてはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, Col-0 ecotype、以下単に野生型という。)を用いた。また、野生型をバックグラウンドとする突然変異株ΔHSI2(hsi2-2)はABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)、SALK institute (La Jolla, CA)から入手した。さらに、ΔHSI２-L1(hsl1-1)は、HSI2-L1(HSL1)遺伝子の１２番目のエクソンにT-DNAが挿入された変異株系統（SALK_059568）をSALK Instituteから入手した。【００５４】
２．植物の生育
0.025% TritonX-100、5% NaClOからなる滅菌溶液で種子の表面を殺菌し、滅菌水で３〜５回洗浄後、特に断らない限りGamborg B-5ビタミン( 100mg/l ミオイノシトール、10mg/l チアミン塩酸塩、1mg/l ニコチン酸、1mg/l ピリドキシン塩酸塩; Gamborg et al., 1968)、2.5mM Mes-KOH (pH 5.7-5.8)、1%ショ糖を含むMS無機塩 (Murashige and Skoog, 1962)の培地に0.3%のジェライトを加えて固化させたプレート上に播種した。種子の休眠を打破する為に4℃、暗下で２〜５日間のインキュベート後、22℃、40-50 E/m2sの強さの連続光下のグロースキャビネット(SANYO社製)に移して生育させた。【００５５】
後代種子を獲得する場合はプレートで約２週間生育させた植物体を、バーミキュライトを入れた鉢に移し、22℃、連続光下の植物育成室(SANYO社製)で生育させた。液肥としてハイポネックス(ハイポネックス ジャパン)を水道水で2,000〜5,000倍に希釈したものを適宜与えた。【００５６】
シュート誘導培地（Shoot inducing medium（SIM））は、基本培地に0.86μMインドール酢酸（IAA）と2.5μM N６-（Δ２-イソペンテニル）-アデニン（２iP）を加えた培地を使用した。Callus inducing medium（CIM）は、基本培地に、2.3μM 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4D）と0.46μMカイネチンを加えた培地を使用した。【００５７】
３．植物体切片の観察
吸水処理後５日目の幼植物体全体を、水・エタノール・酢酸・ホルマリン混液（20:18:1:1,v/v）のFAAで１６時間４℃で固定し、エタノール濃度を段階的に上げて脱水した。その後、Technobit 7100（Kulzur Wehrheim, Germany）を用いてそのプロトコールに従って包理した。タングステンナイフを装備したRM2125RTロータリーミクトローム（Leica, Wein, Austria）を用いて包理したサンプルを0.5μmの厚さに切断し、カバーグラス上で乾燥させた。その後、0.05％のトルイジンブルー（Merck, Darmstadt, Germany）で１分間、室温で染色した後、速やかに水で５分間洗浄し、顕微鏡（BX60, Olympus, Tokyo）で観察した。【００５８】
４．T-DNA挿入変異株のジェノタイピング
ジェノタイピングのためのゲノムDNAの抽出Δhsi２(hsi2-2)及びΔhsi2-L1(hsl1-1)のT-DNAの挿入位置の決定は、以下のとおり行った。【００５９】
４−１．ゲノムDNA抽出
ゲノムDNAの抽出は40 μlの0.4N NaOHを入れたマイクロチューブ(安井機械)に植物体から切り取った本葉を1枚いれ、磁性体メタルコーンを加えてマルチビーズショッカー(安井機械)で5秒間の破砕を2回行った。破砕液に200 μlの100mM Tris-HCl (pH 8.0)を加えて中和し、4℃、2,000rpmで遠心分離した後の上清をゲノムDNA溶液としてPCR反応に用いた。DNAシーケンシング用のゲノムDNAはCTAB法で抽出し、PCR反応における鋳型DNAの純度をあげた。すなわち、2gの植物体を凍結破砕した後、5 mlのCTAB buffer (1.42 M NaCl,20 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM Tris-HCl(pH8), 0.25mMポリビニルピロリドン, 52.9mM臭化セチルトリメチルアンモニウム)を加え55℃で30分間インキュベートした後、5 mlのクロロホルムを加え室温で30分間浸透し、3,000 rpmで10分間遠心分離しその上清を精製DNA溶液としPCR反応に使用した。【００６０】
４−２．T-DNA挿入変異株ΔHSI2(hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1)のT-DNA挿入位置の決定
T-DNA挿入変異株ΔHSI2(hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1)のT-DNA挿入位置の決定は、上記のビーズショッカーを使用した方法でゲノムDNAを抽出した後、HSI2遺伝子特異的プライマー、HSI-L1(HSL1)遺伝子特異的プライマー及びT-DNA特異的プライマーを用いて行った。図２にHSI2遺伝子及びHSI2-L1(HSL1)遺伝子上のT-DNA挿入位置とプライマーの位置を示す。【００６１】
プライマーセットa〜dは以下の構成であった。HSI２及びHSI２-L1(HSL1)遺伝子におけるT-DNA挿入位置の決定は、それぞれプライマーセットb及びプライマーセットｄを用いて得たPCR産物について、別途説明するDNAシークエンスを実施することにより行った。【００６２】
プライマーセットａ：
S08-f; 5’-GTATCACCAGCCTGTAGCATCATGGAC-3’（配列番号：７）
S08-r; 5’-AGGCAGCTAATGCTGGAGACATGCAG-3’（配列番号：８）【００６３】
プライマーセットb：
S08-f；5’-GTATCACCAGCCTGTAGCATCATGGAC-3’（配列番号：７）
PL11; 5’-TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3’（配列番号：９）【００６４】
プライマーセットｃ：
S05-f；5'-AAGCATCACACTGCACCCATTGCT-3'（配列番号：１０）
S05-r；5'-TCGGAACATTGGGACTAAGAGCAAG-3'（配列番号：１１）【００６５】
プライマーセットｄ：
S05-f；5'-AAGCATCACACTGCACCCATTGCT-3'（配列番号：１０）
PL11; 5’-TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3’（配列番号：９）【００６６】
５．DNAシークエンス
T-DNA挿入位置決定等を明らかにするために行ったDNAシークエンスにはApplied Biosystems社製Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1を用いてシークエンス反応を行い、同社製キャピラリー・シーケンサーABI Prism 3100を用いてシークエンス反応産物を電気泳動する事でDNA配列を明らかにした。【００６７】
６．マイクロアレイ解析
野生型とKK株の吸水処理後４日目の幼植物体から全RNAを抽出し、Agilent's Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（Agilent Technology, Palo Alto, CA）を用い、そのプロトコールに従いCy3、Cy5でラベルしたcRNAプローブを作成し、Agilent Arabidopsis３oligo Microarrayに対してハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイ解析は、２回の独立したRNA抽出物につきそれぞれハイブリダイゼーションを行った。計２回のハイブリダイゼーション後のシグナル検出と解析及び標準化は、Feature Extractor（Version A.7.5.1.; Agilent Technology）を用いた。マイクロアレイの生データとｃRNAのラベリング、ハイブリダイゼーション実験の詳細は公開マイクロアレイデータベースArrayexpress（http://www.ebi.ac.uk/rayexpress ）にアクセッション番号E-MEXP-542として登録した（ただし、本件特許出願時において未公開である）。【００６８】
７．定量的RT-PCRによる発現解析
定量的RT-PCR (Real-time RT-PCR)のための一本鎖cDNAは5 μgの全RNAからオリゴ(dT)20プライマーを用いSUPERSCRIPT III (Invitrogen)によって作製し、Rnase-free水によって10倍に希釈した。Real-time RT-PCRは25 μl 反応溶液中5 μlの希釈したcDNA鋳型溶液、12.5 μlのCybergreen dye set 混合溶液 (Bio-Rad)、0.5 μlずつの遺伝子特異的プライマー(最終濃度 200nM)で行った。反応条件は95℃ 5分(95℃ 15秒、60℃ 15秒、72℃ 30秒) X 40サイクルで行った。相対的mRNAレベルはCt法にもとづいて算出した。ACT2を内部標準遺伝子として用いた。各反応に用いたプライマーセットを以下に示す。なお、oleosin S3、At2S3、LEC1、LEC2は、Mendoza et al.,（2005）に記載の配列を用いた。
【００６９】
ACT2
Forward; 5’- CTGTTGACTACGAGCAGGAGATGGA -3’ （配列番号：１２）
Reverse ; 5’- GACTTCTGGGCATCTGAATCTCTCA -3’ （配列番号：１３）
HSI2
Forward; 5’- CTTCCATATCAGCTTGAAACTCTC -3’ （配列番号：１４）
Reverse; 5’- TGGCTCAAGACGCCAGTGATGTTT -3’ （配列番号：１５）
HSI2-L1(HSL1)
Forward; 5’- ATGAGGCTTCTCCAAGCTGCAGCGT -3’ （配列番号：１６）
Reverse ; 5’- GAACCGTGTTCTGTGCTGACCATAT -3’ （配列番号：１７）
LHCB2:4
・5'-GTAA AGGT CCGA TCGA AAAT CTGT-3'（配列番号：１８）
・5'-TTAT CCGA TCAA ACTC TATT TTCCG-3'（配列番号：１９）
Oleosin S3
・Forward; 5’ - AGGCAGATTGCTAAAGCTGCAAC - 3’（配列番号：２０）
・Reverse; 5’ - ACTGTGATGAGAGCCGGG -3’（配列番号：２１）
At2S3 
・Forward; 5’ - AGCAAAACATGGCTAACAAGCTCT - 3’（配列番号：２２）
・Reverse; 5’ - CTGGCATCTCTGTCTTGGACCT - 3’（配列番号：２３）
LEC1
・Forward; 5’ - ACCAGCTCAGTCGTAGTAGCC -3’（配列番号：２４）
・Reverse; 5’ - GTGAGACGGTAAGGTTTTACGCATGAT - 3’（配列番号：２５）
LEC2
・Forward; 5’ - CTCTCTCTCTCTCCGGGAAA - 3’（配列番号：２６）
・Reverse; 5’ - CCATCTGCTCCACCGGGTAT - 3’（配列番号：２７）
WRI1
Forward; 5’ - TCTTTGGGACAAAAGCTCTTGGAATTCGAT - 3’（配列番号：２８）
Reverse; 5’ - TACGTATGTGCTGCTGCTTCTTCACT -3’（配列番号：２９）【００７０】
８．SDS-PAGEとウェスタンブロッティング
SDS-Polyacrylamide Gel Erectrophoresis（SDS-PAGE）とolesosin S4と12S
Globulin抗体を用いたウェスタンブロッティングはShimada et al.,( J. Biol. Chem. 278: 32292-32299, 2003)に従って行った。野生型乾燥種子、幼植物体及び切り取った胚軸を50ｍM Tris-HCl（pH8.0）、0.05％SDS、５％メルカプトエタノール、１０％グリセロールを含む抽出用緩衝液中で破砕した。この破砕液を95℃、５分間インキュベート後、15000rpmで10分間遠心した。その上清を、SDS-PAGE並びに引き続き、ポリジフルオロビニリデンのメンブレン(0.45mm; Nihon Millipore,Tokyo)にセミドライ式転写装置（Bio-Rad）を用いて転写した。転写後のメンブレンを、５％（w/v）スキムミルクを含む２０mM Tris-HCl（pH7.5）、0.14M NaCl,０．０５％（w/v）Toriton-X100からなる緩衝液中でインキュベートし、抗12S globulin抗体（20000倍希釈）若しくは抗oleosin S4抗体（10000倍希釈）で１時間インキュベートした。その後、西洋ワサビ過酸化水素標識抗ウサギIgG抗体（5000倍希釈;GE Healthcare Bio-science、 Piscataway, NJ）を二次抗体として用いた。シグナルはECL Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare Bio-science）を用いて検出した。【００７１】
９．Fat Red 7B染色
Fat Red 7Bを用いた組織染色は、Brundrett et al.,(1991)の方法に従って行った。ポリエチレングリコール（平均分子量400D、Sigma, St.Louis, MO）に、0.1％（w/v）Fat Red 7B（Sigma）を１時間90℃で溶解させ、等量の90％(v/v)グリセロールと混合させたものを染色液とした。この染色液中に組織標品を１時間、室温でインキュベートした。その後、水で数回洗浄した後、グリセロールでスライドグラス上にマウントし顕微鏡（SZX12、OLYMPUS）下で観察した。【００７２】
１０．脂質分析
トリアシルグリセロール（TAG）を分析するために、20mgの組織をクロロホルム・メタノール混液（２：１(v/v)）１ml中で破砕し、15000rpmで５分間遠心した。その上清を乾固させ、20μlのクロロホルムに再溶解した。この脂質標品をシリカゲル60F254 HPTLCシート（Merck）にスポットし、ヘキサン・ジエチルエーテル・酢酸混液（4:1:0.05、v/v）の展開溶液を用いて展開した。精製グリセロールトリリノレン酸（Sigma）をTAGの標準標品として同時に展開した。展開後のHPTLCシートに硫酸を塗布して120℃、5分間加熱して脂質を視覚化した。【００７３】
（実施例１：HSI２及びHSI２-L1(HSL1)の二重破壊変異株の単離）
HSI2-L1(HSL1)遺伝子の１２番目のエクソンにT-DNAが挿入された変異株系統（SALK_059568）から、T-DNAホモ挿入系統をゲノミックPCRにより選抜した。ホモ挿入系統は、野生型と比較してHSI2-L1 (HSL1) ｍRNA量が顕著に低下していた。この結果に基づいて、このT-DNA挿入変異株系統をΔHSI2-L1(hsl1-1)とした。ΔHSI2-L1(hsl1-1)植物体は、目立った異常はなく野生型株同様の生育を示した。【００７４】
次に、ΔHSI2(hsi2-2)ホモ系統植物とΔHSI2-L1(hsl1-1)ホモ系統植物とを交配させて得られたF1種子を自家受粉させ、そのF2植物を経てF3植物体を得た。得られたF3植物体の１４４個体中８個体が異常な幼植物体であり、９日で生育が停止した。このことは、ΔHSI2(hsi2-2)とΔHSI2-L1(hsl1-1)についての二重変異体が異常な幼植物体であることを示唆していた。このため、Δhsi2-/-／Δhsi2-l1+/-及びΔhsi2＋/-／Δhsi2-l1−/-の遺伝型の植物体をゲノミックＰＣＲで選抜し、それぞれ自家受精させて後代の植物体を得たところ、前者については２５２個体中６２個体（3:1の比率のX２値＝0.085、ｐ≧0.05）が、後者については134個体中３５個体（3:1の比率のX２値＝0.09、ｐ≧0.05）が、それぞれ異常な表現型を示した。異常な幼植物体の遺伝型はΔhsi2−/-／Δhsi2-l1−/-であり、少なくともひとつの野生型のHSI2又はHSI2-L1(HSL1)を有している場合には、野生型と同様に正常に成長した。【００７５】
また、これらの変異株について、リアルタイムRT-PCRを実施してｍRNAの量を調べた結果を図３に示す。図３に示すように、Δhsi2-/-：Δhsi2-l1―/-である二重変異株（KK株）においてはHSI2 mRNAもHSI2-L１(HSL1)mRNAも極めて少なく、これらの遺伝子の転写量が顕著に低下していることがわかった。なお、異常な幼植物体の発生頻度がΔhsi2-/-／Δhsi2-l1+/-及びΔhsi2＋/-／Δhsi2-l1−/-の後代において同程度であるため、異常な幼植物体の表現型は、HSI2及びHSI2-L1(HSL1)以外の遺伝子の変異であるとは考えにくかった。以上のことから、KK株において異常な幼植物体の表現型となるのは、HSI2及びHSI2-L1(HSL1)の発現量の低下のためであると考えられ、HSI2及びHSI2-L1(HSL1)は、幼植物体の成長に必要な機能を互いに相補していると考えられた。【００７６】
（実施例２：二重変異株の表現型の詳細な解析）
二重変異株の幼植物体の成長を観察するため、Δhsi2-/-／Δhsi2-l1+/-及びΔhsi2＋/-／Δhsi2-l1−/-の後代植物体の種子を１％スクロース含有寒天培地で発芽させた。シロイヌナズナの野生型では吸水処理後３日目には根毛が発達し（図４右列最上段）、緑化した子葉が５日目には展開し（図４右列２段目）、さらに7日目には根が相当程度伸張する(図４右列３段目)。また、野生型の胚軸は凹凸は観察されない（図４右列最下段）。これに対して、KK株は、根毛の発達と子葉の展開について顕著な遅延が観察されるため（図４左列最上段、2段目）、吸水処理後３〜５日で他の遺伝子型の幼植物体を区別することができた。さらに、KK株は吸水処理後５日目に胚軸が肥大し（図４左列２段目）、吸水処理後７日目には胚軸は淡黄色となり凸凹した表面を有するようになった（図４左列３段目）。さらに、9日目には、肥大化し凸凹のある胚軸は黄色に色づいたカルス様となるとともに、この段階でほとんどのKK株は成長を停止した（図４左列４段目及び最下段）。加えて8〜１５％のKK変異株において子葉が３枚になる個体が現れた。このことは、KK株は、発生においてなんらかの欠損を持っていることを示唆した。【００７７】
また、吸水処理後５日目の野生型とKK株の胚軸の切片をトルイジンブルーで染色して観察したところ、KK株では、表皮細胞が小さくなり不規則に分裂していた。同様の傾向が根の断面においても観察された。【００７８】
これに対して、スクロースを含まない培地で発芽させたKK株のほとんどは、野生型と同様に吸水処理後５日目前後には緑の子葉を展開したものの根がほとんど成長しなかった。さらに、ほとんどのKK株は、この段階で成長が停止した。なお、胚軸の肥大化は観察されなかった。また、土壌で発芽させたKK株は、スクロースフリー培地で発芽させたのと同様の態様を取った。以上のことから、KK株幼植物体の胚軸が肥大する表現型は、外部からのスクロースの供給に大きく依存することがわかった。すなわち、HSI2及びHSI2-L1(HSL1)は糖誘導的に起こる胚軸肥大を抑止する役割を持つことがわかった。【００７９】
（実施例３：マイクロアレイ解析）
ΔHSI2(hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1)についての二重欠損により発現レベルの影響を受ける遺伝子を調べるため、野生型とKK株についてマイクロアレイ解析を行った。KK変異株の胚軸の肥大化が生じない吸水処理後４日目の幼植物体から全RNAを抽出し、材料及び方法の６．マイクロアレイ解析の記載に従って操作した。シロイヌナズナの37685の遺伝子に対応するプローブが固定化された２枚のアレイ（Agilent Arabidopsis3 oligo Microarray）において、野生型よりもKK株が２倍以上の発現量であった遺伝子が８５６個存在し、発現量が３０倍以上であった遺伝子も４０個存在した。一方、KK株において発現量が低下した遺伝子も存在した。KK株において発現量が３０倍上昇した遺伝子群を図５に示し、発現量が１／５以下に低下した遺伝子群を図６に示す。【００８０】
図５においては、油脂貯蔵タンパク質に関する遺伝子に下線を付し、種子貯蔵タンパク質に関する遺伝子をイタリックで示し、転写因子には星印を付した。図５において明らかなように、貯蔵タンパク質や胚発生後期において発現量が増大する遺伝子群がKK株において顕著に発現量が増大していた。すなわち、種子特異的発現を示す５種のオレオシン(oleosin)、種子貯蔵タンパク質である４種の2Sアルブミン（at2S1、at2S2、at2S4、at2S5）のほか、LEC1-likeやｂZIP67（DPBF2）といった胚発生期の重要な転写因子であり種子貯蔵タンパク質を正に制御する転写因子の発現量も顕著に増大していた。さらに、FUS3、ABI3、ｂZIP12、WRI1といった胚発生の中〜後期の発生プログラムの鍵となる転写調節因子の発現量も５倍〜８倍程度に上昇していた。【００８１】
一方、図６に示すように、発現量がKK株において発現量が１／３０にまで低下している遺伝子は存在しなかったが、発現量が顕著に減少した遺伝子群には、光合成に関する遺伝子が含まれていた（図６中下線を付した）。【００８２】
これらの結果から、KK株は幼植物体においても胚発生後期型の遺伝子発現パターンを呈し、光形態形成の進行が低下していることがわかった。このことから、HSI2及びHSI2-L1(HSL1)リプレッサーは、芽生えでの胚発生プログラムの作動を抑制するのに必要であることがわかった。【００８３】
（実施例４：定量的RT-PCRによる発現解析）
KK株幼植物体において種子登熟・胚発生期に重要な役割を果たす転写因子群の発現が吸水処理後４日目以降においてどのように変化しているかを調べた。すなわち、野生型とKK株の吸水処理後４，５，７，９日目の幼植物体から全RNAを抽出して、材料と方法の７．定量的リアルタイムRT-PCRによる発現解析に従い操作した。図７Ａには、１％スクロース含有培地における結果を示す。また、培地のスクロース濃度を変えて５日目の幼植物体からRNAを分離して定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。結果を図７Ｂに示す。【００８４】
図７Ａに示すように、１％スクロース含有培地における野生型の幼植物体では、HSI2及びHSI2-L1 (HSL1)のmRNAはいずれも発現しており、光合成に利用されるLHCB2:4のmRNA量は、子葉が緑化する５日から７日の間に急激に増加した。一方、KK株では野生型と比較してHSI2及びHSI2-L1(HSL1)の発現レベルはいずれのRNAサンプルにおいても顕著に減少していたが、胚発生〜種子成熟期に特異的な遺伝子であるOleosinS3、At2S3、LEC1、LEC2、FUS3及びWRI1が発現していた。KK株では、種子成熟遺伝子は、異なるパターンで発現されていた。Ole3及び At2S3のmRNAsは、野生型に比較して４日令KK株幼植物体においてすでに３０倍以上であったが、これらのmRNAは、７日まではさらに増加した。また、４〜５日令にかけてLEC1, LEC2及び FUS3のmRNA量の劇的な増加を観察した。発芽のマスター調節因子の発現タイミングは、胚軸におけるカルス様構造の成長の開始時期と類似していた。LEC1及び LECの異常な発現は、胚発生プログラムを引き起こすため、これらの調節遺伝子の活性化は、種子成熟遺伝子の発現をもたらす。一方、WRI1/ASML1のmRNAは、吸水処理から少なくとも４日後にはKK株においてすでに高くなっている。今回調べたほかの遺伝子と異なり、WRI1/ASML1は、野生型において栄養組織において長角果よりも顕著に低いレベルではあるが発現していた。HSI2と HSI2-L1 (HSL1)は、WRI1の発現調節に関して他の遺伝子よりも直接的に役割を担っていると考えられた。【００８５】
また、図７Ｂに示すように、30 mM (1.0%, w/v) から90 mM (3.1%, w/v)のスクロースの存在は、スクロース不存在時に比較して２倍近くHSI2及びHSL1の発現を促進する一方、10mMスクロースは、LHCB2;4の発現を抑制するのに十分量であった。１％スクロース含有培地上で成長したKK株の幼植物体は、野生型に比較してLHCB2;4の発現が顕著に減少されていた。KK株の幼植物体における種子成熟遺伝子の発現は、スクロース濃度に応じて異なる応答性を示した。OleS3, LEC1及び FUS3の発現が１０mMのスクロースで十分に誘導されたのに対し、At2S3及び LEC2は、スクロース濃度が９０mMがまでは、スクロース濃度依存的に発現が増大した。WRI1/ASML1の発現量は３０mMのスクロースで最大となった。これらの結果は、種子成熟遺伝子発現におけるスクロースの影響は一様ではなく、スクロースは複数の糖シグナリング経路を介して直接又は間接的にこれらの遺伝子の発現に関与している可能性があることを示唆している。【００８６】
（実施例５：KK株における種子貯蔵物質の蓄積）
マイクロアレイ解析によりKK株では幼植物体においても後期胚発生型の遺伝子発現プロファイルを示していた（実施例３）。そこで、KK株幼植物体で種子貯蔵タンパク質が蓄積しているかどうかをSDS-PAGEによって調べた。スクロースを含まない培地及びスクロース１％を含有する培地でそれぞれ吸水処理後、４、７及び９日目の野生型とKK株の幼植物体からタンパク質を抽出し、前述の材料と方法の８．SDS-PAGEとウェスタンブロッティングに従い操作した。また、野生型とKK株の幼植物体に種子特異的な貯蔵物質である脂質が蓄積されているかどうかについて同９．FAT RED 7B染色に従い操作して調べた。さらに、この染色がトリアシルグリセロール（TAG）によるものであるかどうかを、前記材料及び方法の１０．脂質分析に従い操作して調べた。SDS-PAGE等におけるコントロールとしては、野生型の乾燥種子から抽出したタンパク質サンプルを用いた。これらの結果を図８Ａ〜図８Ｃに示す。【００８７】
図８Ａには、SDS-PAGE後のウェスタンブロッティングの結果を示す。SDS-PAGEでは、野生型及びKK株において、どの段階のタンパク質抽出サンプルにおいても大きな差異は認められなかった。これに対して、図８Ａに示すように、種子特異的タンパク質であるoleosin S4に対する抗体及び同じく種子特異的タンパク質である12S globulinに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによれば、両者間にタンパク質発現の有無が検出された。すなわち、スクロースを含まない培地で生育させた野生型の幼植物体は、いずれも段階でもこれらのタンパク質のシグナルを検出しなかったが、KK株の吸水処理後４日目の幼植物体においてoleosin S4のシグナルを検出した。なお、KK株でも12S globulinのシグナルは検出しなかった。一方、スクロースを含有する培地で生育させた場合、野生型の幼植物体では吸水処理後４日目にoleosin S4が検出されたのみで、それ以外はいずれのタンパク質も検出しなかった。これに対して、KK株の幼植物体では、全ての生育段階で両タンパク質が検出された。以上のことから、KK株においてはスクロースに依存して種子貯蔵タンパク質が幼植物体において蓄積されることがわかった。【００８８】
図８Ｂには、FAT RED 7Bによる染色結果を示す。図８Ｂに示すように、吸水処理後５日目では、野生型の幼植物体では根のみが弱く染色されたが、KK株では、胚軸においても強く染色された。吸水処理後１２日目においては、野生型ではほとんど染色されないのに対して、KK株では、依然胚軸において強い染色が観察されるとともに、子葉においても染色されていた。これらの結果によれば、KK株の幼植物体において種子貯蔵油脂が蓄積されることが示唆された。【００８９】
図８Ｃには、脂質分析結果を示す。スクロースを含まない培地で生育させた野性型の幼植物体では、非常に少量のTAGが検出されたに過ぎなかった。これに対してKK株の４日目の幼植物体において、多量のTAGの蓄積が検出された。しかし、KK株でも９日目には、TAGが消失していた。この結果は、図８Ａに示すoleosin S4の蓄積パターンに一致していた。一方、スクロースを含有する培地で生育させた野生型の幼植物体では、吸水処理後４日目でKK株と同レベルのTAGが蓄積されていたが、９日目においては、TAGはほとんど消失していた。これに対して、KK株では９日目においても４日目と同レベルでのTAGが蓄積されていた。以上のことから、KK株の幼植物体においては、スクロース誘導的に種子貯蔵油脂が蓄積されることがわかった。【００９０】
(実施例６：胚状態カルスの形成)
KK株では胚発生後期の細胞状態が幼植物体にも現れ、胚軸がカルス様になることから、植物成長を制御している植物ホルモンであるサイトカイニンやオーキシンによってシュートの再分化能を獲得すると考えられた。このため、野生型とKK株の種子を０．８６μMのインドール酢酸と２.５μMのN６-（Δ２-イソペンテニル）―アデニンを含むSIM培地（shoot inducing medium）に播種し植物体を観察した。結果を図９に示す。【００９１】
図９に示すように、播種後２１日目において野性型はホルモンを含まない培地で生育させ場合と大差ない形態を示したが、KK株は、カルス様の胚軸から再分化シュートや本葉のような器官の再生を示した。このようなシュートの再生は、野生型ではCIM培地（callus inducing medium）上で前処理を行ったカルスでのみ観察されるものである。【００９２】
次に、こうしたKK株のカルスが脱分化カルスか胚状態カルスであるかを検証するために、野性型とKK株の吸水処理後７日目の幼植物体の胚軸を切り取り、ホルモンを含まない培地に移植して１４日間培養した。KK株については合計４８個の胚軸について培養した。結果を図１０に示す。【００９３】
図１０に示すように、野生型の胚軸はカルス化しないのに対して、KK株の４８個の胚軸はカルスの発達に類似した異常な細胞分裂を示した。また、野生型の胚軸はFAT RED 7Bによってはほとんど染色されなかったのに対して、KK株の胚軸は、FAT REDA 7Bにより強く全体が染色され、胚発生後期の細胞のように脂質が蓄積されていることが示唆された。以上のことから、KK株は幼植物体においても、種子貯蔵タンパク質や胚発生に関する転写因子のｍRNAの発現が持続し、胚発生中の細胞に類似した分裂活性の高い胚軸を備えていることがわかった。【００９４】
さらに、上記のように吸水処理後７日目の幼植物から切り取った野生型及びKK株の胚軸のほか、2.3μMオーキシンと0.46μMカイネチンを含むCIM培地（Koncz et al.,）上でカルス誘導を行った野生型の胚軸（CIMカルス）とからそれぞれタンパク質を抽出し、SDS-PAGEとoleosin S4抗体及び12S globulin抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。結果を図１１に示す。【００９５】
図１１のSDS-PAGE結果に示すように、KK株においては、コントロールとして用いた種子のタンパク質抽出サンプルと同様に12S globulinAサブユニット（31 kDa）、12S globulin Bサブユニット（23 kDa）及び2S albumin（5 kDa）と考えられる種子貯蔵タンパク質のバンドが検出された。また、KK株のバンドパターンは、種子タンパク質抽出サンプルのバンドパターンのみならず、野生型胚軸抽出サンプルのバンドパターンとも類似していた。このことから、KK株の胚軸由来カルスは、種子と栄養組織双方の特徴を備えていると考えられた。また、図１１にあわせて示すウェスタンブロッティングの結果からは、コントロールである種子とKK株由来胚軸カルスのタンパク質抽出サンプルでoleosin S4及び12S globulinの強いシグナルが観察された。以上のことから、KK株の胚軸は、植物ホルモンに依存しないで胚状態のカルスを形成していると考えられた。【００９６】
(実施例７：脂質分析)
春化処理後の7日目の幼植物体（野生型（Col-0株）及びKK変異株）及び乾燥種子（野生型）、各20 mgの組織からクロロホルム:メタノール混液(2:1, v/v) 1 mlで脂質を抽出後、15,000 rpmで5分間遠心分離した。上清を乾固させ、250μlのメタノール、2% C15=0Me を15μL加え再溶解させた。再溶解させた試料100μlに900μlのメタノール、1ml 10% HCl(in メタノール）を添加し80℃、1時間でメタノリシス化を行った。メタノリシス化後、1.5mlのn-Hexaneを加え撹拌し、n-Hexane層を回収しN2条件下で乾固させた。乾固させた試料を500μlのn-Hexaneに再溶解させ、GC2010(島津製作所)を用いたガスクロマトグラフィーにより脂肪酸メチルエステルの脂肪酸含有量を定量した。結果を、図１２に示す。【００９７】
図１２に示すように、KK変異株の幼植物体から抽出した脂肪酸組成はCol-0野生型株と異なっており、種子特異的な脂肪酸(C18=1、C20=1)が多く含まれていた。以上の結果から、KK幼植物体は種子油脂を貯蔵していると考えられた。【００９８】
本出願は、２００６年５月２３日に出願された日本国特許出願第２００６−１４２４５５号を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、形質転換植物体の創出に利用することができる。特に、糖類や脂質など有用な貯蔵物質の蓄積をコントロールした形質転換植物体の創出に利することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号７〜２９：合成プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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