(57)【要約】  本発明の課題は、目的タンパク質に修飾される新規なタグを提供することである。また、このようなタグを使い、目的タンパク質を捕捉する手段を提供する。  詳しくは、DNA結合タンパク質がDNAと結合を有すという分子機構の知識をもとに新規なタンパク質のタグの検討を行った。その結果、DNA結合型タンパク質特にDNA結合型転写因子又はDNA結合型核内受容体のDNA結合能を有するアミノ酸配列を目的タンパク質のタグとして使えば、合成された融合タンパク質を容易に捕捉することにより精製又は検出、並びに標識化することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質と供に発現するアミノ酸配列（以後、タグ部位と称す）による目的タンパク質のタグとしての用途。
【請求項２】
タグ部位が、DNA結合能を有するアミノ酸配列を含むDNA結合型タンパク質である請求項１に記載の用途。
【請求項３】
DNA結合型タンパク質が、DNA結合型転写因子又はDNA結合型核内受容体である請求項２に記載の用途。
【請求項４】
DNA結合型タンパク質が、以下のいずれか１から選ばれる請求項２又は３に記載の用途。
（１）配列番号２、４又は６の配列、
（２）配列番号２、４又は６の配列と少なくとも約８０％以上のアミノ酸配列上の相同性を有する配列、
（３）上記（１）の配列と１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつDNA結合能を有する配列
【請求項５】
タグ部位とタグ親和性物質の関係が以下のいずれか１以上から選ばれる請求項１に記載の用途。
１）アビジン又はストレプトアビジンのビオチン結合タンパク質／ビオチン、２）マルトース結合タンパク質／マルトース、３）Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、４）DNA結合タンパク質／DNA、５）抗原分子（エピトープ）／抗体、６）カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、７）ATP結合タンパク質／ATP、８）エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール
【請求項６】
エンドペプチターゼ認識アミノ酸配列が前記タグに付加されている請求項１〜５の何れか一に記載の用途。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一に記載のタグを使い融合タンパク質を捕捉するタンパク質の捕捉方法。
【請求項８】
捕捉が、固定化されたDNAによる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
捕捉が、融合タンパク質の精製又は検出のためである請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか一に記載のタグを使い融合タンパク質に標識物質を固定するタンパク質の標識方法。
【請求項１１】
融合タンパク質が、無細胞タンパク質合成手段で調製される請求項７〜１０の何れか一に記載の方法。
【請求項１２】
無細胞タンパク質合成手段が、コムギ胚芽抽出液を利用する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質精製用タグとして含むタンパク質精製用キット。
【請求項１４】
請求項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質検出用タグとして含むタンパク質検出キット。
【請求項１５】
請求項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質標識用タグとして含むタンパク質標識用キット。
【請求項１６】
以下の要素を含む、タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a: 融合タンパク質が、１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で発現している、
b. 該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に、融合タンパク質のタグ部位と親和性を有する物質（タグ親和性物質）が固定化されている、
c. 融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の親和性を介して、融合タンパク質が該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に捕捉されている。
【請求項１７】
１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で２種以上の融合タンパク質が発現している請求項１６に記載のタンパク質チップ試薬。
【請求項１８】
融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の関係が以下のいずれか１以上から選ばれる請求項１６又は１７に記載のタンパク質チップ試薬。
１）アビジン又はストレプトアビジンのビオチン結合タンパク質／ビオチン、２）マルトース結合タンパク質／マルトース、３）Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、４）ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、５）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６）DNA結合タンパク質／DNA、７）抗原分子（エピトープ）／抗体、８）カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、９）ATP結合タンパク質／ATP、１０）エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール
【請求項１９】
融合タンパク質が、無細胞タンパク質合成系で発現することを特徴とする請求項１６〜１８に何れか一に記載のタンパク質チップ試薬。
【請求項２０】
無細胞タンパク質合成系が、コムギ胚芽抽出液由来の無細胞タンパク質合成系である請求項１９に記載のタンパク質チップ試薬。  
【請求項２１】
請求項１６〜２０の何れか一に記載のタンパク質チップ試薬を含むタンパク質合成用キット。
【請求項２２】
請求項１６〜２０の何れか一に記載のタンパク質チップ試薬を用いた、以下の要素を含む融合タンパク質との相互作用物質の検査方法。
（１）検出対象物質を、融合タンパク質が捕捉化されたウェルに添加し、融合タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（２）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タグとしての新規用途、特にDNA結合型タンパク質（DNA結合型転写因子、DNA結合型核内受容体）のDNA結合能を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の新規なタグに関する。このようなタグを用いることで、タンパク質の精製、固定、捕捉、検出、標識を可能とし、合わせて、タンパク質チップ試薬のための新規な系を提供した。
また、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2005-187468、2005-286956からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子について
細胞を構成するタンパク質は遺伝子（DNA）→mRNA→タンパク質の過程を経て合成される。特にDNAからmRNAを合成する段階は転写反応または遺伝子発現と呼ばれ、遺伝子産物であるタンパク質の合成量を調節する重要な反応であり、ひいては細胞の機能、構造にかかわるタンパク質の合成量を制御していることになる。この転写反応は転写因子と呼ばれる一群のDNAに親和性を有するタンパク質によって引き起こされ、例えば、基本転写因子として知られるRNAポリメラーゼは，TATAボックスや転写開始部位から構成されるプロモーターと呼ばれる転写制御領域の特定の塩基配列を有するDNAに結合し、RNAポリメラーゼを組込んで種々の転写因子が集合した転写複合体を形成してmRNAの合成を開始する。プロモーターに依存する転写反応は遺伝子特異性がなく基本転写と呼ばれている。
このような基本転写の調節をつかさどる転写調節領域の特定の塩基配列を有するDNAは転写制御領域と呼ばれ（エンハンサーまたはサイレンサーと混同して呼ばれる場合もある）、通常はプロモーターの上流に存在し、この領域に結合する転写調節因子（もしくは遺伝子特異的転写因子とも呼ぶ）が直接または別の転写調節補因子（メディエーター，コファクターまたは介在因子とも呼ぶ）を介して基本転写因子と相互作用することにより基本転写の調節を行っている。【０００３】
核内受容体
脂溶性ビタミン（ビタミンA,ビタミンD）、甲状腺ホルモン、ステロイドホルモンなどの脂溶性物質は細胞膜を自由に通過し、核内受容体に結合する。受容体はN末端により転写を制御する超可変領域、DNA結合領域およびホルモン結合領域に分かれ、構造も類似し、スーパーファミリーを形成している。DNA結合領域はジンクフィンガー構造をもち、AGGTCAを基本モチーフとするエレメントに結合し、遺伝子の転写を促進する。【０００４】
一方、生体内で発現する全てのタンパク質を対象にして解析を行うプロテオーム解析は、発現プロテオミクスと機能（相互作用）プロテオミクスに大別される。
発現プロテオミクスは、生体内である特定のタンパク質がどこでどの程度発現しているかを網羅的に解析する手法であり、また機能プロテオミクスは、ある特定のタンパク質が如何なる分子と相互作用しているかを網羅的に解析する手法である。従来これらの解析は、二次元電気泳動、酵母による２−ハイブリッド法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法等により行われていたが、分析時間、感度、擬陽性、解析に必要な資料の量等の問題があり、タンパク質を高密度に集積したタンパク質チップの開発が進められている。【０００５】
また、タンパク質チップとしては、抗体チップに血清等を接触させ、該チップ上で生じる抗原抗体反応を固相酵素免疫検定法（以下、これを「ELISA法」と称することがある）により検出するものや、タンパク質を固相化したチップとMALDI−TOF  MS（マトリクス支援イオン化−飛行時間型質量分析計：（非特許文献１、非特許文献２）を組み合わせたSELDI（SurfaceEnhanced Laser Desorption/Ionization）プロテインチップシステム等が開発されている。【０００６】
加えて、タンパク質チップの実現に現在大きな努力がされているが、（１）非特異的結合に由来するバックグランドノイズの影響、（２）タンパク質の固体化操作による該タンパク質の立体構造への影響、により実現にいたっていない。【０００７】
一方、研究又は医療において必要とされるいろいろなタンパク質を効率良く得るために、今日注目されているのが、無細胞タンパク質合成手段である。この方法には、ウサギ網状赤血球抽出液（Reticulocyte  Lysate）が良く用いられていた。しかし、最近、コムギ胚芽無細胞系（Wheat  Germ  Extract）の不安定化機構の解明をもとに、安定且つ高翻訳活性能を有するコムギ胚芽抽出液調製法と、該コムギ胚芽抽出液を用いた高効率無細胞タンパク質合成システムが提供されるようになり、様々なタンパク質合成に利用されている（非特許文献３）（特許文献１〜３）。【０００８】
上記コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系では、タンパク質合成に関与する親水性タンパク質が抽出液中に多く存在する。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系にて合成されたタンパク質は、これらと混ざり合った環境で発現タンパク質の合成過程が進む。よって、ある発現させたタンパク質を精製しようとする場合において、従来方法では、既知タグ(His×6、GST等)を融合させた状態で合成し、そのタグに特異的に吸着するカラムやビーズで精製を行うことが有効であると考えられていた。しかし、いくつかの既知のタグを用いた精製法には、コムギ胚芽の抽出液中に存在するいくつかのタンパク質が精製後に残ってしまうという問題点がある。これは、それぞれのタグと同様な吸着性のある胚芽由来のタンパク質、担体であるカラムの樹脂やビーズそのものに吸着性のある胚芽由来のタンパク質、精製の際に使われるバッファーの条件下で不溶化を起こす胚芽由来のタンパク質などが原因となると考えられている。また、従来の様な高濃度の類似様基質を用いてタンパク質を溶出する場合、反応条件によっては、溶出後溶液からそれらの類似様基質を除去する必要があった。しかし、これらを除去するのは容易ではなく非常に煩雑な操作を必要とした。【０００９】
また、従来のタンパク質標識は、タンパク質の立体構造に不可逆的な影響を与えるアミノ基を利用した化学的修飾、放射性同位体や蛍光タンパク質、ストレプトアビジンなどの高親和性タンパク質などが用いられてきた。しかし、化学的修飾はそのタンパク質の立体構造への不可逆的な影響により多くの場合、本来の構造・活性をとりえないため、機能解析への利用はほぼ不可能であった。放射性同位体は特別な施設を必要とし、蛍光タンパク質は一分子あたりの蛍光強度が低く、特別な装置を用いた実験系にのみに利用が限定され、低分子リガンドに結合する高親和性タンパク質の利用は、他の化合物による修飾による親和性の低下がおこり、自由な標識が困難であった。【００１０】
以上により、上記問題点を解決できるような、１）容易に目的タンパク質を捕捉又は標識可能なタグ、２）タンパク質の立体構造に不可逆的な影響を与えないようにチップのウェルに捕捉可能なタグ、の開発の要望があった。【００１１】
【特許文献１】特開2000-236896公報
【特許文献２】特開2002-125693公報
【特許文献３】特開2002-204689公報
【非特許文献１】Koster, H., et al., Nature Biotechnol., 14, 1123-1128(1996)
【非特許文献２】Griffin, T. J. ,et al., Nature Biotechnol., 15, 1368-1372(1997)
【非特許文献３】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
多くの非特異的吸着性タンパク質は、イオン力を介した結合であるため、一般的に至適塩を含むバッファー洗浄により除去もしく軽減できる。高塩濃度でも特定の物質に結合力を有しているタグが開発できれば、簡便な塩を用いた洗浄によって、目的のタンパク質を優先的に補捉・固定できる。これらの方法は、プロテオミクス解析おいて実用的なタンパク質チップ開発など、精製プロセスを伴った目的タンパク質の固定・捕捉化へと発展させることができるため、非常に重要な基盤技術となり得る。よって、本発明の課題は、目的タンパク質に修飾される（共に発現する）新規なタグを提供することである。また、このようなタグを使い、目的タンパク質を精製、捕捉、固定、検出又は標識する手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、DNA結合型タンパク質特に転写因子又は核内受容体がDNAと結合を有すという分子機構の知識をもとに新規なタンパク質のタグの検討を行った。その結果、DNA結合型転写因子又はDNA結合型核内受容体のDNA結合能を有するアミノ酸配列を目的タンパク質のタグとして使えば、合成された融合タンパク質を容易に精製、固定、捕捉、検出又は標識、さらには実用化可能なタンパク質チップの作製が可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
つまり、本発明は、
「１．目的タンパク質と供に発現するアミノ酸配列（以後、タグ部位と称す）による目的
タンパク質のタグとしての用途。
２．タグ部位が、DNA結合能を有するアミノ酸配列を含むDNA結合型タンパク質である前項１に記載の用途。
３．DNA結合型タンパク質が、DNA結合型転写因子又はDNA結合型核内受容体である前項２に記載の用途。
４．DNA結合型タンパク質が、以下のいずれか１から選ばれる前項２又は３に記載の用途。
（１）配列番号２、４又は６の配列、
（２）配列番号２、４又は６の配列と少なくとも約８０％以上のアミノ酸配列上の相同性を有する配列、
（３）上記（１）の配列と１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつDNA結合能を有する配列
５．タグ部位とタグ親和性物質の関係が以下のいずれか１以上から選ばれる前項１に記載の用途。
１）アビジン又はストレプトアビジンのビオチン結合タンパク質／ビオチン、２）マルトース結合タンパク質／マルトース、３）Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、、４）DNA結合タンパク質／DNA、５）抗原分子（エピトープ）／抗体、６）カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、７）ATP結合タンパク質／ATP、８）エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール
６．エンドペプチターゼ認識アミノ酸配列が前記タグに付加されている前項１〜５の何れか一に記載の用途。
７．前項１〜６の何れか一に記載のタグを使い融合タンパク質を捕捉するタンパク質の捕捉方法。
８．捕捉が、固定化されたDNAによる前項７に記載の方法。
９．捕捉が、融合タンパク質の精製又は検出のためである前項７又は８に記載の方法。
１０．前項１〜６の何れか一に記載のタグを使い融合タンパク質に標識物質を固定するタンパク質の標識方法。
１１．融合タンパク質が、無細胞タンパク質合成手段で調製される前項７〜１０の何れか一に記載の方法。
１２．無細胞タンパク質合成手段が、コムギ胚芽抽出液を利用する前項１１に記載の方法。
１３．前項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質精製用タグとして含むタンパク質精製用キット。
１４．前項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質検出用タグとして含むタンパク質検出キット。
１５．前項１〜６に何れか一に記載のタグを融合タンパク質標識用タグとして含むタンパク質標識用キット。
１６．以下の要素を含む、タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a: 融合タンパク質が、１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で発現している、
b. 該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に、融合タンパク質のタグ部位と親和性を有する物質（タグ親和性物質）が固定化されている、
c. 融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の親和性を介して、融合タンパク質が該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に捕捉されている。
１７．１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で２種以上の融合タンパク質が発現している前項１６に記載のタンパク質チップ試薬。
１８．融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の関係が以下のいずれか１以上から選ばれる前項１６又は１７に記載のタンパク質チップ試薬。
１）アビジン又はストレプトアビジンのビオチン結合タンパク質／ビオチン、２）マルトース結合タンパク質／マルトース、３）Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、４）ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、５）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６）DNA結合タンパク質／DNA、７）抗原分子（エピトープ）／抗体、８）カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、９）ATP結合タンパク質／ATP、１０）エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール
１９．融合タンパク質が、無細胞タンパク質合成系で発現することを特徴とする前項１６〜１８に何れか一に記載のタンパク質チップ試薬。
２０．無細胞タンパク質合成系が、コムギ胚芽抽出液由来の無細胞タンパク質合成系である前項１９に記載のタンパク質チップ試薬。  
２１．前項１６〜２０の何れか一に記載のタンパク質チップ試薬を含むタンパク質合成用キット。
２２．前項１６〜２０の何れか一に記載のタンパク質チップ試薬を用いた、以下の要素を含む融合タンパク質との相互作用物質の検査方法。
（１）検出対象物質を、融合タンパク質が捕捉化されたウェルに添加し、融合タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（２）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。」
からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、新規なタグとしてDNA結合型タンパク質特にDNA結合型転写因子又はDNA結合型核内受容体を用いることで、融合タンパク質を捕捉し、目的タンパク質の精製、固定、検出又は標識に利用できることを見出し、タンパク質のタグとして新たな展開を可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のタグは、目的タンパク質と供に発現するアミノ酸配列（以後、タグ部位と称することがある）である。該アミノ酸配列は、下記に示すタンパク質又は特定のアミノ配列（詳しくはあるアミノ酸の繰り返し配列）である。また、該アミノ酸配列であるタグ部位は、以下に示すタグ親和性物質と親和性を有する必要がある。
また、本発明の融合タンパク質中には、タグ、目的タンパク質に加え、リンカー、エンドペプチターゼ認識アミノ酸配列等を有することができる。【００１７】
本発明のタグに用いるDNA結合型タンパク質
本発明のタグに用いるDNA結合型タンパク質は、DNA結合能を有するアミノ酸配列を含んでおり、非特異的にDNAに結合可能なものであればいずれも使用可能であるが、転写因子又は核内受容体が好適に例示される。以下に好適な具体例を挙げて説明する。【００１８】
HY5
核酸配列（配列番号１）
ATGCAGGAACAAGCGACTAGCTCTTTAGCTGCAAGCTCTTTACCATCAAGCAGCGAGAGGTCATCAAGCTCTGCTCCACATTTGGAGATCAAAGAAGGAATTGAAAGCGATGAGGAGATACGGCGAGTGCCGGAGTTTGGAGGAGAAGCTGTCGGAAAAGAAACTTCCGGTAGAGAATCTGGATCGGCGACCGGTCAGGAGCGGACACAGGCGACTGTCGGAGAAAGTCAAAGGAAGCGAGGGAGGACACCGGCGGAGAAAGAGAACAAGCGGCTGAAGAGGTTGTTGAGGAACAGAGTTTCAGCTCAGCAAGCAAGAGAGAGGAAAAAGGCTTACTTGAGCGAGTTGGAAAACAGAGTGAAAGACTTGGAGAACAAAAACTCTGAACTTGAAGAGCGACTCTCTACTCTTCAGAACGAGAACCAGATGCTTAGACATATTCTGAAGAACACAACAGGAAACAAGAGAGGAGGTGGTGGTGGTTCTAATGCTGATGCAAGCCTTTGA
アミノ酸配列（配列番号２）
MQEQATSSLAASSLPSSSERSSSSAPHLEIKEGIESDEEIRRVPEFGGEAVGKETSGRESGSATGQERTQATVGESQRKRGRTPAEKENKRLKRLLRNRVSAQQARERKKAYLSELENRVKDLENKNSELEERLSTLQNENQMLRHILKNTTGNKRGGGGGSNADASL【００１９】
FTZ-F1  (SF-1, NR5A1)
核酸配列（配列番号３）
ATGGACTATTCGTACGACGAGGACCTGGACGAGCTGTGCCCCGTGTGCGGGGACAAGGTGTCCGGCTACCACTACGGACTGCTCACGTGTGAGAGCTGCAAGGGCTTCTTCAAGCGCACGGTGCAGAACAACAAGCACTACACGTGCACCGAGAGCCAGAGCTGCAAGATCGACAAGACGCAGCGCAAGCGCTGTCCCTTCTGCCGCTTCCAGAAATGCCTGACGGTGGGGATGCGCCTGGAAGCCGTGCGCGCTGACCGTATGAGGGGTGGCCGGAACAAGTTTGGGCCGATGTACAAGCGGGACCGGGCCCTGAAACAGCAGAAGAAGGCACAGATTCGGGCCAATGGCTTCAAGCTGGAGACAGGGCCCCCGATGGGGGTGCCCCCGCCGCCCCCTCCCGCACCGGACTACGTGCTGCCTCCCAGCCTGCATGGGCCTGAGCCCAAGGGCCTGGCCGCCGGTCCACCTGCTGGGCCACTGGGCGACTTTGGGGCCCCAGCACTGCCCATGGCCGTGCCCGGTGCCCACGGGCCACTGGCTGGCTACCTCTACCCTGCCTTTCCTGGCCGTGCCATCAAGTCTGAGTACCCGGAGCCTTATGCCAGCCCCCCACAGCCTGGGCTGCCGTACGGCTACCCAGAGCCCTTCTCTGGAGGGCCCAACGTGCCTGAGCTCATCCTGCAGCTGCTGCAGCTGGAGCCGGATGAGGACCAGGTGCGGGCCCGCATCTTGGGCTGCCTGCAGGAGCCCACCAAAAGCCGCCCCGACCAGCCGGCGGCCTTCGGCCTCCTGTGCAGAATGGCCGACCAGACCTTCATCTCCATCGTGGACTGGGCACGCAGGTGCATGGTCTTCAAGGAGCTGGAGGTGGCCGACCAGATGACGCTGCTGCAGAACTGCTGGAGCGAGCTGCTGGTGTTCGACCACATCTACCGCCAGGTCCAGCACGGCAAGGAGGGCAGCATCCTGCTGGTCACCGGGCAGGAGGTGGAGCTGACCACAGTGGCCACCCAGGCGGGCTCGCTGCTGCACAGCCTGGTGTTGCGGGCGCAGGAGCTGGTGCTGCAGCTGCTTGCGCTGCAGCTGGACCGGCAGGAGTTTGTCTGCCTCAAGTTCATCATCCTCTTCAGCCTGGATTTGAAGTTCCTGAATAACCACATCCTGGTGAAAGACGCTCAGGAGAAGGCCAACGCCGCCCTGCTTGACTACACCCTGTGCCACTACCCGCACTGCGGGGACAAATTCCAGCAGCTGCTGCTGTGCCTGGTGGAGGTGCGGGCCCTGAGCATGCAGGCCAAGGAGTACCTGTACCACAAGCACCTGGGCAACGGGATGCCCCGCAACAACCTGCTCATCGAAATGCTGCAAGCCAAGCAGACTTGA
アミノ酸配列（配列番号４）
MDYSYDEDLDELCPVCGDKVSGYHYGLLTCESCKGFFKRTVQNNKHYTCTESQSCKIDKTQRKRCPFCRFQKCLTVGMRLEAVRADRMRGGRNKFGPMYKRDRALKQQKKAQIRANGFKLETGPPMGVPPPPPPAPDYVLPPSLHGPEPKGLAAGPPAGPLGDFGAPALPMAVPGAHGPLAGYLYPAFPGRAIKSEYPEPYASPPQPGLPYGYPEPFSGGPNVPELILQLLQLEPDEDQVRARILGCLQEPTKSRPDQPAAFGLLCRMADQTFISIVDWARRCMVFKELEVADQMTLLQNCWSELLVFDHIYRQVQHGKEGSILLVTGQEVELTTVATQAGSLLHSLVLRAQELVLQLLALQLDRQEFVCLKFIILFSLDLKFLNNHILVKDAQEKANAALLDYTLCHYPHCGDKFQQLLLCLVEVRALSMQAKEYLYHKHLGNGMPRNNLLIEMLQAKQT【００２０】
FTZ-F1β (NR5A2)
核酸配列（配列番号５）
ATGCTGCCCAAAGTGGAGACGGAAGCCCTGGGACTGGCTCGATCGCATGGGGAACAGGGCCAGATGCCGGAAAACATGCAAGTGTCTCAATTTAAAATGGTGAATTACTCCTATGATGAAGATCTGGAAGAGCTTTGTCCCGTGTGTGGAGATAAAGTGTCTGGGTACCATTATGGGCTCCTCACCTGTGAAAGCTGCAAGGGATTTTTTAAGCGAACAGTCCAAAATAATAAAAGGTACACATGTATAGAAAACCAGAACTGCCAAATTGACAAAACACAGAGAAAGCGTTGTCCTTACTGTCGTTTTCAAAAATGTCTAAGTGTTGGAATGAAGCTAGAAGCTGTAAGGGCCGACCGAATGCGTGGAGGAAGGAATAAGTTTGGGCCAATGTACAAGAGAGACAGGGCCCTGAAGCAACAGAAAAAAGCCCTCATCCGAGCCAATGGACTTAAGCTAGAAGCCATGTCTCAGGTGATCCAAGCTATGCCCTCTGACCTGACCATTTCCTCTGCAATTCAAAACATCCACTCTGCCTCCAAAGGCCTACCTCTGAACCATGCTGCCTTGCCTCCTACAGACTATGACAGAAGTCCCTTTGTAACATCCCCCATTAGCATGACAATGCTGCACGGCAGCCTGCAAGGTTACCAAACATATGGCCACTTTCCTAGCCGGGCCATCAAGTCTGAGTACCCAGACCCCTATACCAGCTCACCCGAGTCCATAATGGGCTATTCATATATGGATAGTTACCAGACGAGCTCTCCAGCAAGCATCCCACATCTGATACTGGAACTTTTGAAGTGTGAGCCAGATGAGCCTCAAGTCCAGGCTAAAATCATGGCCTATTTGCAGCAAGAGCAGGCTAACCGAAGCAAGCACGAAAAGCTGAGCACCTTTGGGCTTATGTGCAAAATGGCAGATCAAACTGTCTTCTCCATTGTCGAGTGGGCCAGGAGTAGTATCTTCTTCAGAGAACTTAAGGTTGATGACCAAATGAAGCTGCTTCAGAACTGCTGGAGTGAGCTCTTAATCCTCGACCACATTTACCGACAAGTGGTACATGGAAAGGAAGGATCCATCTTCCTGGTTACTGGGCAACAAGTGGACTATTCCATAATAGCATCACAAGCCGGAGCCACCCTCAACAACCTCATGAGTCATGCACAGGAGTTAGTGGCAAAACTTCGTTCTCTCCAGTTTGATCAACGAGAGTTCGTATGTCTGAAATTCTTGGTGCTCTTTAGTTTAGATGTCAAAAACCTTGAAAACTTCCAGCTGGTAGAAGGTGTCCAGGAACAAGTCAATGCCGCCCTGCTGGACTACACAATGTGTAACTACCCGCAGCAGACAGAGAAATTTGGACAGCTACTTCTTCGACTACCCGAAATCCGGGCCATCAGTATGCAGGCTGAAGAATACCTCTACTACAAGCACCTGAATGGGGATGTGCCCTATAATAACCTTCTCATTGAAATGTTGCATGCCAAAAGAGCATAA
アミノ酸配列（配列番号６）
MLPKVETEALGLARSHGEQGQMPENMQVSQFKMVNYSYDEDLEELCPVCGDKVSGYHYGLLTCESCKGFFKRTVQNNKRYTCIENQNCQIDKTQRKRCPYCRFQKCLSVGMKLEAVRADRMRGGRNKFGPMYKRDRALKQQKKALIRANGLKLEAMSQVIQAMPSDLTISSAIQNIHSASKGLPLNHAALPPTDYDRSPFVTSPISMTMPPHGSLQGYQTYGHFPSRAIKSEYPDPYTSSPESIMGYSYMDSYQTSSPAGIPHLILELLKCEPDEPQVQAKIMAYLQQEQANRSKHEKLSTFGLMCKMADQTLFSIVEWARSSIFFRELKVDDQMKLLQNCWSELLILDHIYRQVVHGKEGSIFLVTGQQVDYSIIASQAGATLNNLMSHAQELVAKLRSLQFDQREFVCLKFLVLFSLDVKNLENFQLVEGVQEQVNAALLDYTMCNYPQQTEKFGQLLLRLPEIRAISMQAEEYLYYKHLNGDVPYNNLLIEMLHAKRA【００２１】
PPAR（peroxisome proliferator-activated receptor）
ステロイドホルモン受容体ファミリーに属する核内受容体であり、生活習慣病発症、例えば糖尿病と関連する内分泌・糖・脂質代謝、さらには血管機能や炎症などの循環器系や発ガン機構に関与する種々の標的遺伝子の発現を調節している転写因子として知られている。【００２２】
p53
RB遺伝子に引き続いて、1989年に２番目に同定された癌抑制遺伝子である。p53遺伝子は染色体の17p13.1に存在し、その遺伝子産物は分子量53kDの核内蛋白質である。最初、p53遺伝子はmycに似た癌遺伝子であると考えられていたが、その後、p53蛋白には野性型と変異型があり、野性型は細胞の増殖機能を制御する機能をもち、RB遺伝子と良く似た働きをもつ癌抑制遺伝子であることが明らかになった。【００２３】
ＮＦκＢ
サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦなど）やケモカイン、インターフェロン、ＭＨＣ分子、増殖因子、細胞接着分子などの遺伝子発現を制御し、特に免疫系に重要な働きを持つ疾患関連転写調節因子として知られており、例えば、慢性関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患や炎症性疾患および癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。【００２４】
ＡＰ−１
転写調節因子のＦｏｓとＪｕｎファミリーからなる複合体で、細胞増殖，分化，特に細胞ガン化や炎症性疾患に関与していることが知られており、例えば、炎症性疾患や癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。【００２５】
HIF-1
低酸素によって活性化される遺伝子転写因子であり、血管内皮増殖因子などの遺伝子発現制御を通じて血管新生の制御に密接に関わることが示されている。NFκBはサイトカイン（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF）などやケモカイン、インターフェロン、MHC分子、増殖因子、細胞接着分子などの遺伝子発現を制御することが知られており、特に免疫系に重要な働きを持つ転写因子として知られている。【００２６】
ＣＲＥＢ（Cyclic AMP Respones Element Binding protein）
細胞増殖，分化，学習や記憶プロセス，薬物常用に対する神経系順応、インスリンとグルカゴンなどによるグルコネオジェネシスなどの代謝経路制御などに重要な働きを持つ疾患関連転写調節因子として知られており、例えば、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等の治療薬のターゲット分子として注目されている。【００２７】
Smad
TGFβスーパーファミリーの細胞内シグナル伝達において中心的役割を担う転写因子であり、細胞の増殖、分化、細胞外マトリックス形成、細胞死に関与し、特に細胞ガン化や組織繊維化などの疾患との関わりが注目されている。Smadは３種類に分類され、それぞれR-Smad（Receptor-regulated Smad）、Co-Smad（Common-mediator Smad）およびI-Smad（Inhibitory Smad）と呼ばれる。【００２８】
その他、本発明のタグに利用可能なDNA結合型タンパク質特に転写因子又は核内受容体の例を下記に挙げるが、本発明で使用可能な転写因子又は核内受容体はこれらに限定されるものではない。
selectivity factor 1(SL1:TAFI110, TAFI63, TAFI48)，upstream binding factor(UBF)，TATA-binding protein(TBP)，TFIID/TAF250，TFIID/TAF150，TFIID/TAF130(135)，TFIID/TAF105，TFIID/TAF100，TFIID/TAF80(70)，TFIID/TAF68，TFIID/TAF55，TFIID/TAF31(32)，TFIID/TAF30，TFIID/TAF28，TFIID/TAF20(15)，TFIID/TAF18，TFIIAα/β，TFIIAγ，TFIIB，TFIIEα，TFIIEβ，TFIIF/RAP30，TFIIF/RAP74，ERCC3，ERCC2，p62，p52，p44，MO15，MAT1，p34，TFIIIB 90/BRF，GCN5,Srb，C/EBP， 1-Oct，ACF，Gcn5，PCAF(p300/CBP-associated factor)，SRC-1(steroid receptor coactivator 1)，TAFII250，CBP，p300，MBF1α/EDF-1，MBF1β，Sp1，BTEB1，BTEB2，EKLF，E2F-1，E2F-2，E2F-3，E2F-4，E2F-5，E2F-6，DP-1，DP-2，NFI/CTF-1，E1A(E1AF)， CREB-H，ATF-1，ATF-2，ATF-3，ATF-4，ATF-5，ATF-6，ATF-7，C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPγ，C/EBPδ，C/EBPε，CHOP，HSF1，HSF2，HSF4，IRF-1，IRF-2，IRF-3，IRF-4，IRF-5，IRF-6，IRF-7，ICSBP/IRF-8，p48/IRF-9，GRα，GRβ,ERα，ERβ，VDR，Ah receptor，Arnt，Nrf2，SREBP-1c，SREBP-2，STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6，GATA-1，GATA-2，GATA-3，GATA-4，GATA-5，Ikaros，MyoD1，HES1，p45(NF-E2)，MAFK，TCF-1，TCF-4，LEF-1，NeuroD，Ad4BP/SF-1，MITF，TFE3，TFEB，TFEC，RARα，RARβ，RARγ，RＸRα，RＸRβ，Hoxb-1，EGR1，EGR2，EGR3，NGFI-C，Gli，Gli3，gsc，gscl，Pax-6，Brachyury，SRY，c-maf，mafB，NRL，mafK，mafF，mafG，Pit-1/GHF-1，PROP1，c-myc，N-myc，L-myc，Fos，fra-1，fra-2，c-Jun，JunB，JunD，c-myb，PEBP2α，PEBP2B/AML-1，PEBP2αC，Rb，p53，NF-κB2，NF-κB1，WT1，Smad1，Smad2，Smad3，Smad4，Smad5，Smad6，Smad7，Smad8，Smad9，Nurr1，Nor1。【００２９】
また、本発明に用いる転写因子又は核内受容体のアミノ酸配列は、配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列と約３０％、好ましくは約５０％、さらに好ましくは約７０％、最も好ましくは約８０％、より最も好ましくは約９５％の相同性配列からなるアミノ酸配列であってもよい。さらには、配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつDNA結合能を有する配列も好適である。
欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することができる。
上記のような変異の導入において、DNA結合能を担持する観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。【００３０】
本発明で使用できる転写因子又は核内受容体は、DNA結合部位を有しておれば、特に限定されるものではないが、その塩基配列の長さは、遺伝子操作上より短いと有利である。好適には、アミノ酸配列の長さが３〜３００個、より好ましくは３〜２００個、さらに好ましくは  ３〜１５０個である。
加えて、所望により、目的達成後に目的タンパク質とタグを分離するために、例えばエンドペプチターゼ認識アミノ酸配列を目的タンパク質配列とタグ配列間に付加することができる。【００３１】
加えて、本発明のタグは、上記のDNA結合能を有するアミノ酸配列を含む転写因子又は核内受容体由来に限定されない。本発明のタグは、融合タンパク質のタグ部位が、タグ部位と親和性を有する物質と親和性を有すればよい。ここで、タグ部位と親和性を有する物質（タグ親和性物質と称する）とは、タグとの親和性の関係から以下のいずれか１以上から選ばれる。
アビジン又はストレプトアビジンのビオチン結合タンパク質（タグ、以下同じ）／ビオチン（タグ親和性物質、以下同じ）、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、DNA結合タンパク質／DNA、抗原分子（エピトープ）／抗体、カルモジュリン結合ペプチド／カルモジュリン、ATP結合タンパク質／ATP、エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール。
また、ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオンは、融合タンパク質の精製には好適ではないが、融合タンパク質の検出、標識には好適に利用できる。
また、タグ親和性物質のウェル内表面及び／又はウェル中の担体の固定化方法であるが、タグ親和性物質がウェル内表面及び／又はウェル中の担体と配置されておれば良く、特に固定化方法は限定されないが、コーティングなどが挙げられる。【００３２】
上記のようなタグは、目的タンパク質と共に発現し、このタグは、当該目的タンパク質の捕捉又は標識をするために使用できる。この捕捉により、当該融合タンパク質の精製、検出又は固定手段として利用可能である。融合タンパク質の合成系は、特に限定されるものではないが、DNAが夾雑物として存在しない系が好適である。好適な例として、無細胞タンパク質合成手段で調製されるタンパク質が例示される。さらにより好ましくは無細胞タンパク質合成手段が、コムギ胚芽を利用する系である。【００３３】
担体へのDNAの固定
本発明の一態様は、タグを使った捕捉が、タンパク質の精製又は固定に使われる場合である。この場合、一つの態様として、担体に固定されたDNAを使い、目的タンパク質をタグにより捕捉する。このような固定化DNAのDNA配列は、上記転写因子又は核内受容体と結合可能な任意の配列であってよい。本発明で用いたDNA固定化担体は、担体の例としてセルロース樹脂（Amersham Pharmacia Biotech社製）を使い、これに子ウシゲノムDNA配列が固定化させている市販のものであるが、これに限定されない。また、従来既知の担体に上記転写因子又は核内受容体と結合可能な配列を固定化し、適宜未固定のDNAを緩衝液で洗浄等することによりDNA固定化担体を作製できるが、これに限定されない。さらに、該担体をカラムに充填することにより、容易にDNA固定化カラムが作製可能である。具体的には、（DNA-Cellulose  Column (native)、Amersham Pharmacia Biotech社製：子ウシゲノムDNAが固定されている）等が挙げられる。
DNA固定化担体によるタンパク質の捕捉前処理としての担体の平衡化は、特に限定されるものではなく、自体公知のDNA固定化担体の洗浄法に準じて調製できる。例えば、エッペンドルフチューブ中に充填されたDNA固定化カラム用樹脂に、MilliQ  waterで洗浄し、続いて遠心分離操作により上澄液を除去し、さらに適当な緩衝液で洗浄し、続いて遠心分離操作により上澄液を除去することにより達成することができるが、これに限定されない。【００３４】
高分子ポリマー内へのDNAの固定
本発明では、機能を保持したタンパク質の固定化には、１）目的タンパク質が直接大気と触れない、２）目的タンパク質周辺に空間的ゆとりを与える、３）簡易洗浄により不必要な物質を軽減・除去する、という技術が必要であるので、これらの条件を満たすことができる高分子ポリマーを固定化に用いた。一般的な高分子ポリマーと、DNAを混合することにより、直接的な大気との接触が遮断された網目状にDNAが張り巡らされた空間を形成することが出来る。この空間に、DNAに結合可能なタグが融合された目的タンパク質を補捉させた後、簡易洗浄により目的タンパク質を特異的に固定させることが可能となる。本発明では、高分子ポリマーとして、アガロース（タカラバイオ, SeaKem Gold Agarose）を用い、このアガロース内にサケ精子DNAを加え、熱による流体化後、混合し、サケ精子DNAを含むアガロースをガラスプレート上に広げることにより、平面プレート上にDNAが固定された空間を形成させた。しかし、この方法に限定されない。高分子ポリマー以外にもセラミックス、カーボン、活性炭等で固定化することもできる。平面な担体の上にタンパク質を捕捉する場合、一過的に流動性を有する高分子ポリマーにDNAを混合し、続いて、アガロース、ポリアクリルアミド、種々のヒドロゲル、吸水性高分子、疎水性高分子等に固定化することは好適である。【００３５】
タグ修飾タンパク質の調製
本発明において、タグ修飾タンパク質は、タグと目的タンパク質が融合したタンパク質（融合タンパク質と呼ぶことがある）を意味する。
DNA結合型タンパク質のタグを用いた融合タンパク質の例とすると、DNA結合型転写因子融合タンパク質、DNA結合型核内受容体融合タンパク質が挙げられる。この調製における転写-翻訳は、好適な方法として以下のような無細胞合成手段による方法で調製されることが例示される。転写鋳型は、インビトロ転写反応の鋳型分子として使用し得るDNAをいい、適当なプロモーター配列の下流に融合タンパク質（タグ＋目的タンパク質）をコードする塩基配列を少なくとも有する。適当なプロモーター配列とは、転写反応において使用されるＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター配列をいい、例えば、SP6プロモーター、T7プロモーター等が挙げられる。融合タンパク質をコードするDNAは、タグタンパク質をコードするDNA及び目的タンパク質をコードするDNAを含むDNAを意味し、所望により、エンドペプチターゼ認識配列をコードするDNAも含むことができる。さらには、タグ配列と目的タンパク質配列の間には、２つの間の適切な距離を保つためにリンカー配列を導入することもできる。また、タグ配列のN末端又はＣ末端のいずれも目的タンパク質に連結してもよい。目的タンパク質をコードするDNAは、無細胞タンパク質合成系で発現させたいタンパク質をコードするDNAを意味する。
転写鋳型は、プロモーター配列と融合タンパク質をコードする塩基配列との間に翻訳効率を制御する活性を有する塩基配列を有することが好ましく、例えば、タバコモザイクウイルス由来のΩ配列などのＲＮＡウイルス由来の５'非翻訳領域、及び/又はコザック配列等を用いることができる。さらに、転写鋳型は、融合タンパク質をコードする塩基配列の下流に転写ターミネーション領域等を含む３'非翻訳領域を含むことが好ましい。３'非翻訳領域としては、終止コドンより下流の約１．０〜約３．０キロベース程度が好ましく用いられる。これらの３'非翻訳領域は必ずしも融合タンパク質をコードする遺伝子本来のものである必要はない。本発明の方法の好ましい実施態様においては、融合タンパク質をコードするDNAをPCR法によって増幅・合成した反応産物を精製することなくそのまま転写鋳型とすることも可能である。尚、非特異的増幅により生じる短鎖DNA（結果として目的産物の収量低下及び低分子翻訳産物ノイズを生じる）の生成を防ぐために、国際公開ＷＯ０２／１８５８６号に記載のプロモーター分断型プライマーを用いることもできる。
このようにして得られる転写鋳型DNAはクロロホルム抽出やアルコール沈殿により精製した後に転写反応に供してもよいが、PCR反応後の反応液をそのまま転写鋳型溶液として使用することが可能である。
転写反応は、自体公知の方法を用いて調製された融合タンパク質をコードする転写鋳型DNA又はPCR法によって増幅・合成したDNAを精製することなく調製された融合タンパク質をコードする転写鋳型DNAから、インビトロ転写反応により翻訳鋳型であるmRNAを生成させる工程を含む。当該工程は、反応系（例えば、96穴タイタープレートなどの市販の容器）に提供された転写鋳型を含む溶液、好ましくはPCR反応液と、転写鋳型中のプロモーターに適合するRNAポリメラーゼ（例えば、SP6  RNAポリメラーゼなど）やRNA合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液（「転写反応用溶液」ともいう）とを混合した後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約３０℃〜約４２℃で約３０分間〜約１６時間、好ましくは約２時間〜約５時間該混合液をインキュベートすることにより行われる。
なお、好ましい翻訳鋳型となるmRNAは、融合タンパク質をコードする遺伝子DNA（Chiu, W. &#8211;L.,et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)）が挿入されたpEU-ベクター（Sawasaki, T. et al.,PNAS, 99 (23), 14652-7（2002））を基に、Ω配列部分をＷＯ０３／０５６００９号公報に記載の配列番号136の塩基配列に置き換えたプラスミドDNAを鋳型として、SP6 RNApolymerase（Promega社製）を用いて転写を行うこともできる。
ついで、転写溶液は、タンパク質合成用細胞抽出液に直接添加する。ここで用いられるタンパク質合成用細胞抽出液としては、翻訳鋳型を翻訳して該鋳型にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等が用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds), IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、E.coli S30 extract system（Promega社製）やRTS 500 Rapid Translation System（Roche社製）に添付のもの等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではRabbit Reticulocyte Lysate Sytem（Promega社製）に添付のもの等、更にコムギ胚芽由来ではPROTEIOSTM（TOYOBO社製）に添付のもの等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液の系を用いることが好ましく、植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウ等の種子が好ましく、特にコムギ種子胚芽抽出液を用いたものが好適である。さらに、抽出液の調製工程において混入した胚乳成分および低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去されたコムギ種子胚芽抽出液がより好適である。翻訳反応は、調製して得られた転写溶液をタンパク質合成用細胞抽出液に直接添加し、これに基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、３'，５'−cAMP、葉酸塩、抗菌剤等の、翻訳反応に必要もしくは好適な成分を含有する溶液を添加して、翻訳反応に適した温度で適当な時間インキュベートすることにより行うことができる。【００３６】
タグ修飾タンパク質のDNA固定化担体での捕捉及び回収
翻訳反応によって調製された融合タンパク質であるタグ修飾タンパク質は、翻訳反応溶液の状態で、DNA固定化担体と接触させて、タグ修飾タンパク質をDNA固定化担体に捕捉され回収される。詳しくは、タンパク質合成反応が完了した後、精製用カラム例えばエッペンドルフチューブ中に、DNA固定化担体を充填・平衡化し、これに融合タンパク質を含有する例えば翻訳反応液（細胞抽出液）を展開し、さらに捕捉用緩衝液を導入し、接触反応を行う。接触により、DNA固定化担体のDNAとタグ修飾タンパク質が、タグのDNA結合部位を介して結合する。その後、洗浄用緩衝液で洗浄した後、溶出用緩衝液で、DNAとタグとの親和性を減弱させ、タグ修飾タンパク質をDNA固定化担体から遊離させ溶出する。溶出は、例えば溶出液中の塩濃度の変化により達成できる。また、別の方法として、溶出液中にDNaseを含有することにより、DNA固定化担体のDNAを分解し、タグ修飾タンパク質を溶出することができる。
また次の方法も有用である。親和性物質を結合させた捕捉用担体を調製すれば、この系を利用して目的タンパク質の捕捉・検出が可能となる。好適な例としては、ビオチン化DNAを試薬とし、捕捉用担体として固定化ストレプトアビジンを用いる系である。捕捉用担体として固定化ストレプトアビジンにビオチン化DNA試薬を作用させ、タグ修飾目的タンパク質を接触・反応させ、ストレプトアビジン−ビオチン化DNA−タグ修飾目的タンパク質を形成させることができ、これにより、タグ修飾目的タンパク質を捕捉できる。この捕捉により、選択的に目的タンパク質が捕捉され、その存在をストレプトアビジンとビオチンの結合反応によって確認、検出できる。このような系は、タンパク質チップ等のタンパク質の固定化技術としての応用が可能である。【００３７】
目的タンパク質の分取
本発明は、上記のようにタグ修飾タンパク質を回収することから、目的タンパク質の分取のためにはタグと目的タンパク質の間にエンドペプチダーゼのような酵素で分断可能な配列を予め導入しておけば目的タンパク質の分取は容易である。このような配列は自体公知であり、それらを広く応用可能である。導入は、例えばDNA結合型タンパク質をコードするDNAの塩基配列中に、エンドペプチターゼで切断処理されるアミノ酸配列（エンドペプチターゼ認識配列）をコードする塩基配列を連結させることによって可能である。これにより、既知のさまざまなエンドペプチターゼを作用させることで目的タンパク質とタグであるDNA結合型タンパク質を分離・分取することが可能である。エンドペプチターゼは、目的タンパク質とDNA結合型タンパク質を切断できるペプチターゼであればいかなるものでも良い。例えば、プレシジョンプロテアーゼ｛プレシジョンサイト（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro）の配列を矢印の位置で選択的に切断するエンドペプチターゼ：アマシャムバイオサイエンス社製｝、Thrombin 、Factor Xa 等が利用できる。【００３８】
本発明の別の態様は、上記のタグを使い、多検体タンパク質の反応検出に利用することができる。例えば、DNAを含む高分子ポリマー内（これらをDNAが封入された高分子ポリマーと呼ぶことがある）に目的タンパク質の捕捉を行い、目的タンパク質あるいは他のタンパク質を含む化学物質の反応検出にも利用できる。好適な例としては、スライドグラスのような平面上プレートにDNA封入アガロースによる外気と遮断されたタンパク質反応空間を作り、そこにタグが修飾された蛍光ラベルタンパク質を捕捉させ、蛍光強度を調べることにより、目的タンパク質を定量することができる。また、タグ修飾リン酸化タンパク質を捕捉させ、洗浄用緩衝液で余分なタンパク質（補捉されていないタンパク質）等を取り除き、リン酸化タンパク質の活性を検出することができる。さらに、同様なDNA封入アガロースを用いた他の好適な例としては、タグを病原性生物のタンパク質に融合し、上記平面プレートに並べ、疾病患者から採取した血清を用いて反応させることにより、ワクチン候補もしくはマーカータンパク質をスクリーニングすることができる。このような系は、タンパク質チップ等のタンパク質の固定化技術として応用が可能である。【００３９】
タグを用いた融合タンパク質への標識物質の固定化方法
本発明の別の態様は、上記のタグを使い、DNAを介して目的タンパク質を低分子親和性物質や蛍光色素などの標識物質で標識することができる。ここで、標識物質の例示として、ビオチン、自体公知の蛍光色素であるFITC、ローダミン、テキサスレッド、低分子親和性物質であるがある。例えば、低分子親和性化合物による標識の好適な例としては、ビオチン化DNAを試薬とし、目的タンパク質をビオチン化標識することが例示される。タグ修飾目的タンパク質を含む溶液をビオチン化DNAと接触させて反応させ、ビオチン化DNA結合タグ修飾目的タンパク質を得ることができる。さらに、この結合体をストレプトアビジン固定化スライドグラスにより、プレート上に捕捉することができる。この捕捉により、選択的に目的タンパク質が捕捉され、その存在をストレプトアビジンとビオチンの結合反応によって確認できる。このような系は、タンパク質チップ等のタンパク質の固定化技術や、タンパク質標識技術として応用が可能である。【００４０】
転写・翻訳一体型無細胞タンパク質合成用チップ
本発明の別の態様は、少なくとも、１）上記のタグ及び目的タンパク質をコードする塩基配列のPCR産物又はコードする塩基配列を導入したベクター、２）RNAポリメラーゼ、SP6、RNA合成用基質（4種類のリボヌクレオチド4リン酸）等の転写に必要な成分、３）アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、cAMP、葉酸塩、抗菌剤等の翻訳に必要な成分、４）タンパク質合成用細胞抽出液、好ましくはコムギ胚芽抽出液、を自体公知の容器に添加されている転写・翻訳一体型無細胞タンパク質合成用チップである。該チップでは、好適には、自体公知の乾燥化方法特に凍結乾燥方法により、乾燥化して転写・翻訳一体型無細胞タンパク質合成用乾燥化チップとすることができる。好適な方法として、国際公開番号WO 2005/015212 A1に記載のチップ作成方法を利用できる。また、チップである容器をいくつもの領域に区分すること、又該区分された領域に異なる目的タンパク質をコードする塩基配列のPCR産物又はコードする塩基配列を導入したベクターを添加することにより、一度に多種類のタグ融合タンパク質をチップ上に発現することができる。
本発明の転写・翻訳一体型無細胞タンパク質合成用乾燥製化チップのタンパク質合成方法は、転写・翻訳非共役型、転写・翻訳共役型があるが、いずれの方法によっても行うことができる。例えば、転写・翻訳非共役型では、まず、転写反応に適したマグネシウム濃度溶液をチップに添加し、最初に転写反応を行う。続いて、翻訳反応に適した温度及びマグネシウム濃度にするために、ヒーター等でチップの温度調整及びマグネシウム濃度を希釈するための溶液をチップに添加する。これにより、チップ内は、翻訳反応に適した条件になり、実質的に翻訳反応のみが進む。また、転写・翻訳共役型では、転写及び翻訳の両方に適した条件に設定し、転写及び翻訳を同時に行う。
また、チップの底に、あらかじめDNAを固定化しておけば、翻訳されたタグ融合タンパク質が、該DNAと結合する。これにより、チップ内を適当な洗浄液で洗浄すれば、該DNAと結合したタグ融合タンパク質以外の成分を除去することができる。その後、１）チップ内の塩濃度を変化させることにより、タグ融合タンパク質を精製することができる、また２）チップの底に固定化されたDNAと結合したタグ融合タンパク質は、翻訳反応終了後まもないので、融合タンパク質が活性な状態であるので、このような状態の融合タンパク質に対して反応性を示す物質のスクリーニングに好適に利用することができる。【００４１】
精製用キット
本発明では、上記述べたようなタンパク質の精製方法に使用する試薬の少なくとも１をタンパク質合成手段用試薬キットとして提供することができる。該キットは、DNA結合型タンパク質をタグとして利用する目的タンパク質の精製・分離が可能な新規方法を提供するものである。【００４２】
検出用キット
また、本発明では、タンパク質の検出に使用する試薬の少なくとも１をタンパク質検査用試薬キットとして提供することができる。該キットは、DNA結合型タンパク質をタグとして利用する目的タンパク質の検査が可能な新規方法を提供するものである。【００４３】
標識用キット
また、本発明では、タンパク質の標識に使用する試薬の少なくとも１をタンパク質標識用試薬キットとして提供することができる。該キットは、DNA結合型タンパク質をタグとして利用する目的タンパク質の標識が可能な新規方法を提供するものである。【００４４】
本発明のタンパク質チップとは、１種又は２種以上の融合タンパク質が適当な基盤（ウェルの表面）に一緒に又は別々に捕捉若しくは固定化されているチップ或はウェル中に存在するチップを意味する。そして、融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の親和性を介して、融合タンパク質が該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に捕捉されている。また、タンパク質チップは、タンパク質と、タンパク質、核酸、低分子化合物、あるいは糖鎖等との結合性、相互反応性を解析する（以下これを「プロテオーム解析」と称することがある）のに用いられる。また、融合タンパク質の発現方法は、好適には、無細胞タンパク質合成系、特にコムギ胚芽抽出物由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球抽出液由来の合成系を用いることができるが、その他の系である昆虫細胞由来合成系、化学合成系（固相合成）等も利用することができる。【００４５】
無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬の作製方法
試薬は少なくとも以下の要素を含む。
a. 融合タンパク質が、１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で発現している、
b. 該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に、融合タンパク質のタグ部位と親和性を有する物質（タグ親和性物質）が固定化されている、
c. 融合タンパク質のタグ部位とタグ親和性物質の親和性を介して、融合タンパク質が該ウェル内表面及び／又はウェル中の担体に捕捉されている。
なお、融合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系、特にコムギ胚芽抽出物由来を利用して発現することが好ましい。【００４６】
タンパク質ライブラリーの作製
本発明の試薬及び/又はキットは、異なる融合タンパク１種又は２種以上を、１又は複数の領域に区画された容器のウェル内で発現・捕捉・固定化することによりタンパク質ライブラリー作製用キットとして調製することができる。【００４７】
相互作用物質の検査方法
相互作用物質の検査方法は少なくとも以下の工程を含むことによって実施できる。
（１）検出対象物質を、融合タンパク質が捕捉されたウェルに添加し、融合タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（２）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。【００４８】
用いられるウェルとしては、上記記載のものを用いることができるが、プロテオーム解析に用いる検出方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、プラスチック、ポリカーボネート、複合糖質、アクリル樹脂、ニトロセルロース、ガラス、あるいはシリコン等の材質よりなるものが挙げられる。また、プロテオーム解析に表面プラズモン法（Cullen,D.C., at al., Biosensors, 3(4), 211-225(1987-88)）を用いる場合には、ガラス等の透明の基盤上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。【００４９】
翻訳反応溶液に含まれる翻訳鋳型としては、本発明のタンパク質チップ合成キットにより作製したタンパク質チップを用いたプロテオーム解析の目的により適宜選択される。具体的には、例えば、タンパク質の機能解析に用いる場合には、機能性タンパク質をコードする配列を有するｍＲＮＡが選択される。例えば、イオンチャンネル、トランスポーター、成長因子、加水分解酵素、合成酵素、酸化・還元酵素、タンパク質性阻害剤、生理活性ペプチド、ペプチド性毒素、Ｇタンパク質共役型受容体等の受容体、リガンド、抗体等が挙げられる。また、測定対象検体としては、特定タンパク質及び／又は該特定タンパク質の翻訳鋳型と相互反応する物質であれば特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸、低分子化合物、あるいは糖鎖等が挙げられる。【００５０】
ウェルにどの融合タンパク質を発現させるかについては、特に制限はないが、ウェルの位置（座標）と融合タンパク質の種類が対応することが好ましい。【００５１】
融合タンパク質と相互作用する物質を質的又は量的に判定する方法としては、融合タンパク質と検体の相互反応を検出できる方法であれば特に限定されないが、具体的には、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｊｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２，（１９９５））により解析する場合、通常ＥＬＩＳＡ法により用いられるプラスチック製のマイクロタイタープレートが好ましい。表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））を用いる場合には、ガラス等の透明基盤上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが好ましい。また、エバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５））を用いる場合には、ガラス等の透明体が好ましく、さらに好ましくは石英ガラス製のものが用いられる。蛍光イメージングアナライズ法を用いる場合には、通常タンパク質等を捕捉・固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロタイタープレート等も用いることができる。【００５２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
DNA結合型タンパク質融合タンパク質（HY5、NR5A1、NR5A2、HY5-GFP、HY5-eIF4B、HY5-CaMk2δ、HY5-GS、HY5-NEK2）の転写鋳型の作製
翻訳鋳型となるmRNAは、HY5遺伝子DNA（配列番号１）のみが挿入されたpEU-HY5ベクター、NR5A1遺伝子DNA（配列番号３）のみが挿入されたpEU- NR5A1ベクター、NR5A2遺伝子DNA（配列番号5）のみが挿入されたpEU- NR5A2ベクター、HY5遺伝子DNA（配列番号１）及びGFP遺伝子DNA（Chiu, W. &#8211;L.,et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)）が挿入されたpEU-HY5-GFPベクター、HY5遺伝子DNA（配列番号１）及びelF4B遺伝子DNA（GenBank Accession No.AB076839）が挿入されたpEU-HY5-elF4Bベクター、HY5遺伝子DNA（配列番号１）及びCaMK2δ遺伝子DNA（GenBank Accession No.AF071569）が挿入されたpEU-HY5-CaMk2δベクター、HY5遺伝子DNA（配列番号１）及びGS遺伝子DNA（GenBank Accession No.S70004）が挿入されたpEU-HY5-GSベクター、HY5遺伝子DNA（配列番号１）及びNEK2遺伝子DNA（GenBank Accession No.NM＿002497）が挿入されたpEU-HY5-NEK2ベクターを鋳型として、転写反応溶液〔最終濃度、80ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ7.8、16ｍＭ  酢酸マグネシウム、10ｍＭ  ジチオスレイトール、2ｍＭ  スペルミジン、2.5ｍＭ  4ＮＴＰｓ（4種類のヌクレオチド三リン酸）、0.8Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤、1.6Ｕ／μｌ  SP6  ＲＮＡポリメラーゼ〕を調製し、37℃で3時間反応させた。得られたRNAをエタノール沈殿により精製して用いた。
なお、コントロールとしてのDHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、GST-GS（GST：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、GST-NEK2, GST-CaMK2δの転写鋳型も上記同様に作製した。
【実施例２】
【００５４】
DNA結合型タンパク質融合タンパク質（HY5、NR5A1、NR5A2、HY5-GFP、HY5-eIF4B、HY5-CaMk2δ、HY5-GS、HY5-NEK2）の翻訳
調製したコムギ胚芽抽出物含有液5.8μlを含むタンパク質合成用反応液（それぞれ最終濃度で、29ｍＭ HEPES−KOH（pH7.8）、95ｍＭ酢酸カリウム、2.7ｍＭ酢酸マグネシウム、0.4ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各0.23ｍＭＬ型アミノ酸20種類、2.9ｍＭジチオスレイトール、1.2ｍＭ ＡＴＰ（和光純薬社製）、0.25ｍＭ ＧＴＰ（和光純薬社製）、15ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、0.9Ｕ／μl RNase inhibiter（TAKARA社製）、50ｎｇ／μl  tRNA（Moniter,  R.,et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1-(1960)）、0.46μｇ／l  クレアチンキナーゼ（Roche社製））25μlを作製した。この反応液に実施例１で作製した翻訳鋳型mRNA（HY5、NR5A1、NR5A2、HY5-GFP、HY5-eIF4B、HY5-CaMk2δ、HY5-GS、HY5-NEK2、DHFR（コントロール用）、GST-GS（コントロール用）、GST-NEK2（コントロール用）、 GST-CaMK2δ（コントロール用））を8μｇ／μl加え、26℃で48時間インキュベートした。
【実施例３】
【００５５】
カラム用樹脂の平衡化
DNA-Cellulose  Column (native)（Amersham Pharmacia Biotech社製：子ウシゲノムDNAが固定されている）であるカラム用樹脂を5倍量のMilliQ  waterで洗浄し、10000rpm,1分間で遠心分離した。続いて、該カラム用樹脂を5倍量のwash  buffer（表１）で洗浄し、10000rpm,1分間で遠心分離した。上記操作をもう一度繰り返した。
【表１】
2007000972.tif 000002
【実施例４】
【００５６】
DNA結合型タンパク質のアッセイ
エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂、実施例２で調製した各DNA結合型タンパク質をそれぞれ（HY5、ヒト核内レセプター11種類）20μlずつ（計240 μl）とその2倍量のbinding  buffer（表１）を導入し、フタをした後に、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,1分間で遠心分離し、遠心分離で得られた上澄液720μlを試料とした（図１のレーン１）。続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表１）1mlで3回洗浄し、elution  buffer(1)（表１）50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液20μlを試料とした（図１のレーン２）。続いて、elution  buffer(2)50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液20μlを試料とした（図１のレーン３）。各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図１）。【００５７】
DNA結合型タンパク質のアッセイの結果
図１のレーン２の結果からHY5のバンドを確認できた。さらに、図１のレーン３の塩濃度500 mMの溶出ではほぼ単一のバンドとしてHY5を確認できた。よって、以下の実施例でHY5転写因子を用いた。
【実施例５】
【００５８】
HY5転写因子の精製
実施例４で特に配列特異性が低くてもDNAに結合すると思われるHY5をDNA結合型タンパク質として選択した。エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂、実施例２で調製したHY5  80μlとその2倍量のbinding  buffer（表１）を導入し、フタをした後に、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,１分間で遠心分離し、遠心分離で得られた上澄液240μlを試料とした（図２のレーンのtotal）。続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表１）1mlで3回洗浄し、elution  buffer(1)（表１）50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液20μlを試料とした（図２のレーン１）。続いて、elution  buffer(2)（表１）50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液20μlを試料とした（図２のレーン２）。各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図２）。
なお、コントロールとしてのDHFRでも上記同様に行った（図２）。【００５９】
HY5転写因子の精製の結果
実施例４の結果と同様に、塩を含む溶出液（elution  buffer）で、HY5を精製することができた。特に、塩濃度が高いelution  buffer(2)で濃いバンドが検出できた（レーン２）。また、DNA結合型タンパク質（DNA結合型転写因子）ではないDHFRでは、DHFRの分子量を表すバンドの存在がなかった。よって、DNA結合型転写因子であるHY5が、配列非特異的にDNA固定化カラムに結合していた。
【実施例６】
【００６０】
DNase含有elution  bufferを用いてのHY5転写因子及びHY5転写因子融合タンパク質の精製方法
エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂、実施例２で調製した各HY5、HY5-GFP、HY5-elF4B  100μlとその2倍量のbinding  buffer（表１）を導入し、フタをした後に、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,1分間で遠心分離し、続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表１）1mlで3回洗浄した。上記カラム用樹脂を4つ用意して、以下のelution  bufferでそれぞれ溶出し、溶出で得られた溶出液20μlを試料とした（図３）。
１．elution  buffer (1)（表１）50μl（図３のレーン１）
２．wash  buffer（表１）49ml＋DNase  1μl（図３のレーン２）
３．wash  buffer（表１）40ml＋DNase  10μl（図３のレーン３）
４．wash  buffer（表１）46.5ml＋DNase  1μl＋25mM  EDTA（図３のレーン４）
各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図３）。
なお、コントロールとしてのDHFRでも上記同様に行った（図３）。【００６１】
DNase含有elution  bufferを用いてのHY5転写因子及びHY5転写因子融合タンパク質の精製方法の結果
HY5転写因子とHY5転写因子融合タンパク質すべてにおいて精製ができた。さらに、DNaseを含有する溶出液で溶出することでも、精製ができた。これはカラムに固定されているDNAがDNaseより分解されるためであった。また、EDTAを含む溶出液ではDNaseの活性が阻害されるため、精製ができなかった。
【実施例７】
【００６２】
高塩濃度条件による洗浄
エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂50μl、実施例２で調製したHY5-GFP  150μlとその2倍量のbinding  buffer  300μl（表２）を導入し、フタをした後に、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,1分間で遠心分離し、遠心分離で得られた上澄液3μlを試料とした（図４のレーン１）。続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表２）1mlで2回洗浄し、洗浄溶液10μlを試料とした（図４のレーン２）。続いて、elution  buffer（表２）50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液10μlを試料とした（図４のレーン３）。続いて、elution  buffer（表２）50μlで溶出し、溶出で得られた溶出液10μlを試料とした（図４のレーン４）。各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図４）。
【表２】
2007000972.tif 000003
【００６３】
高塩濃度条件による洗浄の結果
HY5-GFPが高塩濃度条件下で洗浄すると、他のバンドの検出がなかった。すなわち、高塩濃度条件による洗浄により、高純度でタンパク質を精製することができた。
【実施例８】
【００６４】
未希釈翻訳溶液での精製とHY5転写因子精製タグの汎用性
以下の結合条件１、２によりHY5転写因子精製タグの汎用性を確認した。詳しくは、以下の通りである。
結合条件１
エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂25μl、実施例２で調製した各HY5-GFP、HY5-CaMK2δ、HY5-GS  240μlを導入し、フタをした（約100mM  KOAc）。なお、binding  bufferにより希釈しなかった。
結合条件２
エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂25μl、実施例２で調製した各HY5-GFP、HY5-CaMK2δ、HY5-GS  120μlとその2倍量のbinding  buffer  240μl（表３）を導入し、フタをした（約33mM  KOAc）。
結合条件１及び２を、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,1分間で遠心分離し、遠心分離で得られた上澄液4.5μlを試料とした（図５：結合条件１、２のレーン１）。続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表３）500μlで2回洗浄し、洗浄溶液12μlを試料とした（図５：結合条件１、２のレーン２）。続いて、elution  buffer  1（表３）25μlで溶出し、溶出で得られた溶出液12μlを試料とした（図５：結合条件１、２のレーン３）。続いて、elution  buffer  2（表３）25μlで溶出し、溶出で得られた溶出液12μlを試料とした（図５：結合条件１、２のレーン４）。各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図５）。
【表３】
2007000972.tif 000004
【００６５】
未希釈翻訳溶液での精製とHY5転写因子精製タグの汎用性の結果
翻訳溶液を希釈しなかった条件１及び翻訳溶液を希釈した条件２のいずれにおいても、各HY5転写因子融合タンパク質の単一バンドを検出することができた。すなわち、HY5は、汎用性の高い精製タグであることがわかった。
これにより、DNA結合転写因子融合タンパク質含有翻訳溶液を希釈せずにそのまま精製することができる。
【実施例９】
【００６６】
ビオチン化DNAの調製
表４に示すPCR手段で、配列番号７の塩基配列を合成増幅した。合成した塩基配列は、5'末端がビオチン化されており、DNA転写因子のHY5と結合しうる塩基配列（A, C, G-Box）を担持する。PCR産物に1μｌのエクソヌクレアーゼIを添加し、1時間37℃でインキュベートした。さらに15分間80℃でインキュベートし、Buffer  1（表５）を使いG-2マイクロスピンカラムで調製し、ビオチン化DNAとした。
【表４】
2007000972.tif 000005
【００６７】
【表５】
2007000972.tif 000006
【実施例１０】
【００６８】
ストレプトアビジン・ビオチン結合を利用したHY5特異的結合DNA担体の調製と、HY5修飾タンパク質の捕捉
ビオチン化DNAを固定する担体として、ストレプトアビジン固定マグネットビーズ（MagneSphere:Promega）25μｌを用意し、50μｌのBuffer  1（表５）を使いビーズの3倍量で洗浄した。これに実施例９で調製したビオチン化DNA  20μｌを加えた。続いて、30分間4℃でインキュベートした（5〜10分毎に混合）。続いて、25μｌのBuffer  1で洗浄し、実施例２で作成した翻訳後の溶液（HY5-GS、GST-GS）45μｌを加え、1時間4℃でインキュベートした。なお、加える前の溶液1 μlを試料とした（図６：各レーン１）。次に、MagneSphere Magnetic Separation Stand（Promega社）を用い、得られた上澄液4.5 μlを試料とした（図６：各レーン２）。次いで50μｌのBuffer  2（表５）で5回洗浄し、次いで20μｌのBuffer  3（表５）を加え10分間r.t.でインキュベートして、タンパク質を溶出した。なお、この溶出液17μｌを試料とした（図６：各レーン３）。続いて、SDS添加PAGE用試料調製溶液をカラムに加えて煮沸した。なお、この煮沸した溶液17μｌを試料とした（図６：各レーン４）。
なお、コントロールとしての非ビオチン化DNA（HY5-GS）でも上記同様に行った（図６のdsDNA）。【００６９】
HY5特異的結合DNA担体での捕捉の結果
DNA固定化担体は、HY5-GSを補捉することができた。一方、DNA結合型タンパク質（DNA結合型転写因子）ではないGSTを融合したタンパク質GST-GSは、補捉することができなかった。加えて、ビオチン化されていないDNA固定化担体(dsDNA)では、HY5-GSは検出することはできなかった。これは、ビオチン化されていないDNAは、ストレプトアビジンと結合できなかったことによる。
以上により、DNA結合型転写因子及びビオチン化DNAを用いれば、目的タンパク質を補捉、検出することができる。
【実施例１１】
【００７０】
DNA封入アガロースゲルスライドの作製
20 mM Hepes-KOH(pH 7.6), 2 mM 塩化マグネシウムバッファーに、SeaKem Gold Agarose（タカラバイオ社）を終濃度0.2 %加え、溶かした後、Salmon testes DNA (native)（シグマアルドリッチ社）を終濃度0.1 μg/ml加え、非蛍光スライドガラス状に薄くのばし、DNAの封入されたアガロースゲルスライドを作製した。【００７１】
HY5修飾タンパク質のDNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉
実施例２に従って作成した0.5μｌ翻訳後の溶液（HY5-GFP）を実施例１１のDNA封入アガロースゲルスライド上にスポットし、50 mlのBuffer  1（表５）中で静置した。そして、蛍光イメージアナライザー（Tyhoon）で各時間のGFPの蛍光を検出した（図７：スライド中の左）。
なお、コントロールとしてGST-GFPでも上記同様に行った（図７：スライド中の右）。【００７２】
HY5修飾タンパク質のDNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉の結果
図７の結果により、DNA結合型転写因子融合GFPのみがゲルスライドに固定化されていた。
以上により、DNA結合型転写因子及びDNA封入アガロースゲルスライドを用いれば、目的タンパク質を捕捉、検出さらには定量検出をすることができる。
【実施例１２】
【００７３】
DNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉HY5修飾タンパク質の自己リン酸化活性の検出
実施例２に従って作成した5μｌ翻訳後の溶液（HY5-NEK2, HY5-CaMK2δ, HY5-GS）をDNA封入アガロースゲルスライド上に0.25 μlスポットし、50 mlのBuffer  1（表５）中で2時間静置した。スライドガラスの水分を充分に拭き取ったのち、[γ-32P] ATPを含むリン酸化反応溶液｛50ｍＭ  Tris-HCl pH 7.8、100 mM  塩化ナトリウム、10 mM  塩化マグネシウム、0.1 mM  ジチオスレイトール｝25 μlをアガロースゲル状にマウントし、37℃で30分反応させた。次に、50ｍｌの[γ-32P] ATPを含まないリン酸化反応バッファー中で2時間静置し、未反応の[γ-32P] ATPを洗い流した。そして、イメージアナライザー（Tyhoon）を用いてオートラジオグラムを検出した（図８:スライド左）。
なお、コントロールとしてGST-NEK2, GST-CaMK2δ, GST-GSでも上記同様に行った（図８：スライド右）。【００７４】
DNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉HY5修飾タンパク質の自己リン酸化活性の検出の結果
図８の結果により、DNA結合型転写因子融合タンパク質のみがゲルスライドに固定化されており、自己リン酸化活性を持つことが知られているNEK2, CaMK2δのみスポットが検出され、自己リン酸化活性の検出が可能であることがわかった。
以上により、DNA封入アガロースゲルスライドを用いれば、機能を保持したタンパク質固定化チップを作製することができる。
【実施例１３】
【００７５】
ストレプトアビジンコートスライドでのビオチン標識HY5修飾タンパク質の捕捉
実施例９で調製した1μｌビオチン化DNAと実施例２で作成した5μｌ翻訳後の溶液（HY5-GFP）を１０分間室温でインキュベートし、HY5がビオチン化DNAを結合することによるビオチン標識HY5融合GFPを調製した。一方、標識タンパク質捕捉チップとしてストレプトアビジンをコートしたスライド（グライナー社）を用意した。次に、ビオチン化DNAと翻訳後の溶液（HY5-GFP）の混合液1μｌを該スライド上にスポットし、50μｌのBuffer  1（表５）を使い３回洗浄した。そして、蛍光イメージアナライザー（Tyhoon）でGFPの蛍光を検出した（図９の左のスライド）。
なお、コントロールとして非ビオチン化dsDNAとHY5-GFPの混合液（図９の中央のスライド）、HY5-GFPのみ（図9の右のスライド）でも上記同様に行った（図９）。【００７６】
ストレプトアビジンコートスライドでのビオチン標識HY5修飾タンパク質の捕捉の結果
図９の結果により、DNA結合型転写因子融合タンパク質のみがチップに固定化されている。
以上により、DNA結合型転写因子及びビオチン化DNA、ストレプトアビジンコートチップを用いれば、タンパク質固定化スライドを作製することができる。
【実施例１４】
【００７７】
ヒト核内受容体NR5A1, NR5A2の精製
これまでの実施例ではHY5転写因子を用いたが、HY5のみではなく、核内受容体であるNR5A1, NR5A2も配列特異性が低くDNAに結合するかを調べるために、NR5A1, NR5A2を検討した。詳しくは、エッペンドルフチューブ中に、実施例３で平衡化したカラム用樹脂、実施例２で調製したNR5A1, NR5A2  145μl（図１０のレーン１）を導入し、フタをした後に、4℃で2時間攪拌（10 rpm）した。その後、10000rpm,1分間で遠心分離し、遠心分離で得られた上澄液145μlを試料とした（図１０のレーン２）。続いて、カラム用樹脂をwash  buffer（表１）1mlで3回洗浄し、elution  buffer  2（表３）15μlで溶出し、溶出で得られた溶出液15μlを試料とした（図１０のレーン３）。各試料を12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて還元条件下でSDS-PAGEを行い、CBB染色した（図１０）。【００７８】
核内受容体であるNR5A1, NR5A2の精製の結果
実施例４の結果と同様に、塩を含む溶出液（elution  buffer）で、NR5A1, NR5A2を精製することができた。よって、本発明のDNA結合型核内レセプターであるNR5A1, NR5A2も、配列非特異的にゲノムDNA固定化カラムに結合するので、本発明のタグとして利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の産業上の利用可能性は、タンパク質の新規なタグとしてDNA結合型タンパク質を用いることで、新規目的タンパク質を捕捉し、目的タンパク質の精製或いは検出並びに標識方法を提供できることにある。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】DNA結合型タンパク質のアッセイの結果を示す。Ｍは、分子量マーカー、totalは、未精製画分、星印（★）は、HY5のバンドを示す。（実施例４）
【図２】HY5転写因子の精製結果を示す。markerは、分子量マーカー、totalは、未精製画分、星印（★）は、HY5のバンドを示す。（実施例５）
【図３】HY5転写因子融合タンパク質の結果を示す。markerは、分子量マーカー、totalは、未精製画分、星印（★）は、HY5転写因子融合タンパク質のバンドを示す。（実施例６）
【図４】高塩濃度条件下洗浄によるHY5-GFPタンパク質の結果を示す。Ｍは、分子量マーカー、totalは、未精製画分を示す。（実施例７）
【図５】未希釈翻訳溶液での溶出によるHY5転写因子融合タンパク質の結果を示す。Ｍは、分子量マーカー、星印（★）は、HY5転写因子融合タンパク質のバンドを示す。（実施例８）
【図６】タグ修飾タンパク質のDNA担体での捕捉の結果を示す。Ｍは、分子量マーカーを示す。（実施例１０）
【図７】タグ修飾タンパク質のDNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉の結果を示す。左のスライドは、HY5-GFP、右のスライドは、GST-GFPを示す。（実施例１１）
【図８】タグ修飾タンパク質のDNA封入アガロースゲルスライドでの捕捉と、自己リン酸化活性の検出の結果を示す。スライドの左側は、HY5融合タンパク質、スライドの右側は、GST融合タンパク質であり、スライドの上から、NEK2, CaMK2δ, GSのスポットを示す。（実施例１２）
【図９】タグ修飾タンパク質のビオチン標識とストレプトアビジンスライドでの捕捉の結果を示す。左のスライドは、ビオチン化DNAとHY5-GFP、中央のスライドは、非ビオチン化DNAとHY5-GFP、右のスライドは、HY5-GFPのみ。（実施例１３）
【図１０】NR5A1, NR5A2の精製結果を示す。Mは、分子量マーカー、星印（★）は、NR5A1又はNR5A2のバンドを示す。（実施例１４）
【図６】
2007000972.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2007000972000001.app
【国際調査報告】
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