(57)【要約】本発明は、内部に空洞を有するタンパク質を利用して、酸化亜鉛のナノ粒子の元となる酸化亜鉛−タンパク質複合体を得ることを目的とする。本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法は、フェリチンに代表されるような内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、請求項２に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記過酸化水素を添加した後の前記アンモニアの濃度が８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記緩衝液のｐＨが６．９以上１０．４以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記アンモニアが前記亜鉛イオンに配位している、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項９】
さらに水が前記亜鉛イオンに配位している、請求項８に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンである、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  特許文献１にも例示されるように、フェリチンに代表される内部に空洞を有するタンパク質の当該空洞に金属、金属塩、または金属化合物を充填させ、さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、量子ドットに代表されるドット体を有する半導体装置の製造方法が知られている。【０００３】  タンパク質の空洞にコバルト酸化物を充填させる方法が特許文献２に、ＣｄＳｅなどの二族・六族化合物を充填させる方法が特許文献３に例示されている。
【特許文献１】特開２００３−８６７１５号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３１９８号公報
【特許文献３】国際公開第０３／０９９７０８号パンフレット
【非特許文献１】Ｄ．Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．Ｊｏｓｈｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７９，３１１６−３１１９
【非特許文献２】Ｍａｕｒｉｃｉａ  Ｏｒｔｅｇａ−Ｌｏｐｅｚ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａｖｉｌａ−Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｌ．Ａｌｂｏｒ−Ａｇｕｉｌｅｒａ  ａｎｄ  Ｖ．Ｍ．Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｒｅｓｅｎｄｉｚ，２００３，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３８、ｐ１２４１−ｐ１２４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明者は、タンパク質の空洞に酸化亜鉛を充填させること、すなわち、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造を試みた。【０００５】  しかし、特許文献２の表２に例示されているように、濃度が１ｍＭ〜５ｍＭの過酸化水素（これは代表的な酸化剤である）を用いて、内部に空洞を有するタンパク質としてのフェリチン、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、当該過酸化水素を添加しても、酸化亜鉛−タンパク質複合体は得られなかった。【０００６】  タンパク質は酸化剤の影響を受けて変性しやすい。【０００７】  従って、５ｍＭを超える濃度の過酸化水素を添加するとタンパク質が変性して酸化亜鉛−タンパク質複合体はますます得られにくいと考えられる。【０００８】  実際に、敢えて４０ｍＭの濃度の過酸化水素を用いても、酸化亜鉛−タンパク質複合体は製造されなかった。【０００９】  本発明者はこの課題を鋭意検討した結果、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下の過酸化水素を用いれば、酸化亜鉛−タンパク質複合体が得られると言う知見を見出し、本発明を完成させた。【００１０】  本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  上記目的を達成する本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法は、内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する。【００１２】  過酸化水素添加工程の前に、緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有することが好ましい。【００１３】  過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度は１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であることが好ましい。【００１４】  過酸化水素添加工程の前に、緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有することが好ましい。【００１５】  過酸化水素を添加した後のアンモニアの濃度は８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下であることが好ましい。【００１６】  緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液であることが好ましい。【００１７】  緩衝液のｐＨは６．９以上１０．４以下であることが好ましい。【００１８】  アンモニアは亜鉛イオンに配位していることが好ましい。【００１９】  さらに水が亜鉛イオンに配位していることが好ましい。【００２０】  内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンであることが好ましい。【００２１】  本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２２】  本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造過程で起こっているものと考えられる反応を説明する模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００２４】  １０  たんぱく質（アポフェリチン）
２０  モノマーサブユニット
３０  チャンネル
４０  保持部
５０  酸化亜鉛
６０  酸化亜鉛−たんぱく質複合体
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】  以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に限定されない。【００２６】  本明細書においては、「酸化亜鉛−たんぱく質複合体」を単に「複合体」と呼ぶことがある。【００２７】  また、濃度についてはｍＭ（ミリモーラ、すなわち、ｍｍｏｌ／Ｌ、ミリモル／リットル）を用いるが、これは得られた緩衝液、とりわけ過酸化水素を供給した後の緩衝液における試薬の濃度を意味する。【００２８】  すなわち、「アンモニアの濃度が８ｍＭである」と記載した場合、これは過酸化水素を供給した後の緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が８ｍＭという意味である。【００２９】  緩衝液に供給されるアンモニア水におけるアンモニア濃度が８ｍＭという意味ではない。また、別途、記載しない限り、過酸化水素を供給する前における緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が８ｍＭという意味でもない。【００３０】  ｐＨについても同様であり、別途、記載しない限り、過酸化水素を供給した後の緩衝液のｐＨを意味する。【００３１】  （内部に空洞を有するタンパク質について）
内部に空洞を有するタンパク質としては、フェリチンを挙げることができる。【００３２】  天然のフェリチンはウマの脾臓から公知の方法で得ることができる。【００３３】  本明細書で用いられる用語「フェリチン」とは、天然の（すなわち、野生の）フェリチンの他、遺伝子組み替え技術により一部の塩基が他の塩基に置換された遺伝子組み替えフェリチンを含む。このような遺伝子組み替えフェリチンは、特開２００３−３３１９１号公報に例示される。【００３４】  効率性の観点から、天然のフェリチンからＮ末端の１塩基目から８塩基目までの塩基を除去した欠失フェリチンを用いることが多いが、このような欠失フェリチンもまた、用語「フェリチン」に含まれる。【００３５】  さらに、内部の空洞に金属、金属塩、または金属化合物が充填されていないフェリチンを、充填されたフェリチンと区別するために「アポフェリチン」と呼ぶことがあるが、明瞭にこれらを区別しない限り、用語「フェリチン」にはアポフェリチンを含む。【００３６】  以下、図１を用いて、アポフェリチンについて説明する。【００３７】  図１（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。【００３８】  図１（ａ）に示すように、アポフェリチン１０は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニット２０が非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状たんぱく質である。【００３９】  そして、その直径は約１２ｎｍであり、通常のたんぱく質に比べて、高い熱安定性と高いｐＨ安定性を有している。【００４０】  さらに、アポフェリチン１０の中心には、図１（ｂ）に示すように直径約７ｎｍの空洞状の保持部４０を有し、外部とチャンネル３０を介してつながっている。【００４１】  以下では、アポフェリチン１０の保持部４０に、ナノ粒子が形成されるメカニズムについて、生体内で行われている鉄原子を例に説明する。【００４２】  アポフェリチン１０の外部と内部とを結ぶチャンネル３０の表面には、ｐＨ７〜ｐＨ８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出している。【００４３】  そして、プラス電荷を持っている２価の鉄イオンは、マイナス電荷を持つアミノ酸との静電相互作用によりチャンネル３０に取り込まれる。【００４４】  さらに、アポフェリチン１０の保持部４０の内表面には、チャンネル３０の内表面と同じく、ｐＨ７〜ｐＨ８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出している。【００４５】  そのため、チャンネル３０から取り込まれた２価の鉄イオンは、一部のサブユニット内にあるｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｅｎｔｅｒ（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化され、内部の保持部４０へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）結晶の核形成が起こる。【００４６】  その後、順次取り込まれる鉄イオンは、フェリハイドライト結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径７ｎｍの酸化鉄からなるナノ粒子が保持部４０内に形成される。【００４７】  現在までに、このアポフェリチンを用いて、人工的に以下に示すような鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフ��リチン複合体が作製されている。【００４８】  例えば、マンガン、ウラン、ベリリウム、アルミニウムおよび亜鉛などである。【００４９】  なお、上記では、鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについても、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。【００５０】  そして、これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部４０の直径とほぼ等しく、約７ｎｍである。【００５１】  空洞を有するたんぱく質であれば、単一のサブユニットから構成されているたんぱく質であっても、複数のサブユニットから構成されているたんぱく質であってもアポフェリチンの代わりに用いることができる。【００５２】  それらの中でも、同一のアミノ酸配列を有するサブユニットで構成されるたんぱく質、もしくは単一のモノマーから構成されるリコンビナントであるたんぱく質、例えばリコンビナントフェリチンなどは、構造が安定で、高濃度の酸化剤に対する耐性が高いため、変性を生じにくく好ましい。【００５３】  たんぱく質は、その空洞の形状が球状に限定されることはなく、ロッド状、リング状などの保持部を有するものであってもよい。一例として、Ｄｐｓたんぱく質およびウイルスたんぱく質を挙げることができる。【００５４】  例えば、Ｄｐｓたんぱく質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状たんぱく質）を用いた場合、直径が４ｎｍの酸化亜鉛のナノ粒子を作製することができる。【００５５】  ウイルスたんぱく質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＬＡ−１、Ｐｏｌｙｏｍａ、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Ｐｏｌｉｏなどが挙げられる。【００５６】  その中でも、取り扱いの容易性や形状を考慮すれば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスたんぱく質を用いることが好ましい。【００５７】  以上述べたように、本実施の形態によれば、用いるたんぱく質の空洞状の保持部の形状、大きさに応じた酸化亜鉛のナノ粒子を形成することができる。【００５８】  ここでいう「ナノ粒子」とは、５０ｎｍ以下で、かつ粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げれば、直径１ｎｍ〜５０ｎｍの粒子がナノ粒子に相当する。【００５９】  （亜鉛イオンについて）
緩衝液は亜鉛イオンを含有する。【００６０】  亜鉛イオンの由来は特に限定されず、一般に金属塩として緩衝液に供給される。【００６１】  収率の観点からは、後述する実験例４および表４からも明らかなように、酢酸亜鉛を緩衝液に供給しておくことが好ましい。【００６２】  亜鉛イオンの濃度は１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であることが好ましい。【００６３】  亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ未満ではあまりにも亜鉛イオン濃度が薄すぎるために複合体の形成が困難となる傾向がある。【００６４】  後述する実験例３および表３からも明らかなように、亜鉛イオンの濃度が２ｍＭであることが最も好ましく、これよりも濃度が高くなると収率が低下し得る。【００６５】  亜鉛イオンの濃度が２０ｍＭを超えることは、非効率的である。【００６６】  特に、酢酸亜鉛を用いる場合、この傾向および効率性が顕著に現れる。【００６７】  酢酸亜鉛ほどではないが、硝酸亜鉛を緩衝液に供給しても良い。【００６８】  後述する実験例４および表４からも明らかなように、硝酸亜鉛を用いた場合、硫酸亜鉛を用いた場合よりかは収率が良いからである。【００６９】  （アンモニアについて）
緩衝液はアンモニアを含有する。【００７０】  本発明においては、アンモニアは亜鉛イオンに配位子として配位していると考えられる。【００７１】  このことは、特許文献３にも開示されている。【００７２】  亜鉛イオンは４つの配位子を有するが、その全てがアンモニアであってもよく、一部のみがアンモニアであって、他の配位子は水であっても良い。【００７３】  アンモニアは、アンモニア水として緩衝液に供給される。【００７４】  後述する実験例２および表２からも明らかなように、アンモニアの濃度は８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下であることが好ましい。【００７５】  アンモニアの濃度が８ｍＭ未満では複合体の形成が困難となる傾向がある。【００７６】  アンモニアの濃度が３６０ｍＭを超えることは非効率的である。【００７７】  （緩衝液について）
緩衝液としては特に限定されないが、ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることが好ましい。【００７８】  後述する実験例２および表２からも明らかなように、緩衝液のｐＨは６．９以上１０．４以下であることが好ましい。【００７９】  ｐＨが６．９未満であることや１０．４を超えることは、弱アルカリ性を好むフェリチンにとっては、望ましい環境ではないからである。【００８０】  （過酸化水素の添加について）
本発明においては、上記のような内部に空洞を有するタンパク質（代表的にはフェリチン）、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加することを特徴とする。【００８１】  後述する実験例１および表１からも明らかなように、過酸化水素の濃度は１００ｍＭであることが最も望ましい。【００８２】  緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が６０ｍＭ未満であると、複合体は形成されない。同様に、緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が１５０ｍＭを超えても、複合体は形成されない。【００８３】  複合体の形成が可能な過酸化水素の緩衝液中の濃度は６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下であるが、好ましい緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度は８０ｍＭ以上１２０ｍＭ以下である。【００８４】  なお、過酸化水素は過酸化水素水として緩衝液に供給される。【００８５】  緩衝液に過酸化水素を供給した後、１日以上放置する。【００８６】  その後、遠心分離などにより、緩衝液から複合体を得ることができる。【００８７】  （その他）
複合体を得るにあたっては、室温もしくはアポフェリチンなどのたんぱく質１０が変性しない温度範囲、例えば７０℃以下で、かつスターラーなどで攪拌しながら混合して行うことが好ましい。【００８８】  （理論的説明）
本発明者らは本発明が以下の理論に拘束されることを決して好まないが、複合体が形成されるメカニズムは以下の通りであると考えている。【００８９】  まず、たんぱく質の表面は、マイナス電荷が広く分布している。そして、そのマイナス電荷に、溶液中に導入された亜鉛化合物やアンモニアから生じるプラス電荷のＺｎ２＋やアンモニウムイオンが結合する。【００９０】  そのため、酸化剤である過酸化水素がたんぱく質と反応しようとしても、たんぱく質はその表面に結合したＺｎ２＋やアンモニウムイオンにより保護されているため、たんぱく質と直接反応できない。【００９１】  そこで、過酸化水素は、たんぱく質の表面に結合したＺｎ２＋を酸化し、３価のプラス電荷のＺｎ３＋（もしくはＺｎの中間体）にする。【００９２】  しかし、Ｚｎ３＋は不安定であるため、すぐにＺｎ２＋に戻る。【００９３】  そして、Ｚｎ２＋に戻るときに、Ｚｎ３＋は酸化剤として作用し、溶液中のＺｎ２＋や過酸化水素を酸化する。【００９４】  このような過程を繰り返すことにより、高濃度の過酸化水素が添加された溶液中においても、たんぱく質と過酸化水素との反応を防ぐことができるためたんぱく質の変性が起こりにくいものと考えられる。【００９５】  一方、特許文献２に開示されているコバルト−たんぱく質複合体の場合、上記と同様にたんぱく質の表面にプラス電荷のＣｏ２＋やアンモニウムイオンが結合する。【００９６】  そして、過酸化水素はＣｏ２＋を同様に酸化し、３価のプラス電荷のＣｏ３＋にする。【００９７】  ところが、Ｃｏ３＋は安定であるため、Ｃｏ２＋に戻ることがない。【００９８】  したがって、Ｃｏ３＋が酸化剤として作用しない。【００９９】  そのため、高濃度に過酸化水素が添加された溶液中では、たんぱく質への過酸化水素の反応を防止することができず、たんぱく質は容易に変性してしまう。【０１００】  その結果、コバルト−たんぱく質複合体を形成する場合には、過酸化水素は必須ではあるが、高濃度に導入することができない。この限界の濃度が５ｍＭ程度であると考えられる。【０１０１】  以上のように、本発明においては、コバルトをたんぱく質の保持部に内包させる場合のプロセスとは異なり、Ｚｎのイオンとしての特性をアンモニアおよび酸化剤である過酸化水素により有効に利用することにより、酸化亜鉛−たんぱく質複合体を効率よく得られる。【０１０２】  この結果、６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下である高濃度の過酸化水素を溶液中に導入可能とし、高い収率で再現性よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成することができる。【０１０３】  さらにこのメカニズムについて図面を用いて説明する。【０１０４】  図３は、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成されるメカニズムを説明する模式図である。【０１０５】  図３に示すたんぱく質１０は、図１に示されるタンパク質を単純化して示したものであり、同じ構成要素には同じ符号を用いている。【０１０６】  まず、調整された溶液の条件において、多数存在するアンモニウムイオンと亜鉛化合物から生ずる亜鉛イオンは、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンを形成し、例えばその一部が水で置換された状態で安定化している。【０１０７】  そして、たんぱく質１０の保持部４０の表面���、マイナス電荷に帯電しているため、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンは、静電相互作用によりチャンネル３０を通って保持部４０に取り込まれる。【０１０８】  その結果、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンが、たんぱく質１０の保持部４０で高濃度に濃縮される。【０１０９】  また、たんぱく質１０が高濃度の過酸化水素中で変性しないメカニズムでも述べたように、溶液中には、３価のプラス電荷を有する亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンも同様に形成され、溶液中に存在する。【０１１０】  そのため、３価のプラス電荷を有する錯イオンは、２価のプラス電荷を有する錯イオンと比べて、マイナス電荷に帯電しているたんぱく質１０の保持部４０に入りやすい。【０１１１】  そして、たんぱく質１０の保持部４０に取り込まれた３価のプラス電荷を有する錯イオンの亜鉛イオンは、過酸化水素により２価のプラス電荷の亜鉛イオンに還元される。【０１１２】  さらに、たんぱく質１０の保持部４０で高濃度に濃縮された２価の亜鉛イオンは、過酸化水素により、水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）２）を形成する。【０１１３】  そして、形成された水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）２）は、たんぱく質１０の保持部４０内の亜鉛の濃度の上昇と最適に調整されたｐＨの値により、平衡状態である酸化亜鉛（ＺｎＯ）に変化する。【０１１４】  その結果、水に不溶な酸化亜鉛（ＺｎＯ）は、たんぱく質１０の保持部４０内に蓄積され、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成されると考えてられる。【０１１５】  以上説明したように、本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、たんぱく質を変性させる過酸化水素を高濃度に導入しても、たんぱく質を変性させることなく、効率よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成することができる。【０１１６】  また、得られた酸化亜鉛−たんぱく質複合体から、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を再現性よく作製することができる。
【実施例】
【０１１７】  以下、本発明を実施例（実験データ）と共にさらにより詳細に説明する。【０１１８】  （実施例１）
この実施例１では、過酸化水素の濃度について実験したデータを示す。【０１１９】  以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、酢酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）をＨＥＰＥＳ緩衝液に添加した。【０１２０】  ５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  酢酸亜鉛  ４０μＬ
１００ｍＭ  アンモニア水  ３２０μＬ
５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８００μＬ
ミリＱ水  １０１６μＬ
ｐＨは、その値が７．８になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。【０１２１】  このように調製されたＨＥＰＥＳ緩衝液に、添加後に表１に示される濃度になるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。【０１２２】  緩衝液中での過酸化水素の濃度が１００ｍＭの場合には、攪拌後のｐＨは６．９であった。【０１２３】  過酸化水素を添加した後のＨＥＰＥＳの濃度は２００ｍＭであり、過酸化水素を添加した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬであり、過酸化水素を添加した後の酢酸亜鉛の濃度は２ｍＭであり、過酸化水素を添加した後のアンモニアの濃度は１６ｍＭであった。過酸化水素を添加した後のｐＨは６．９であった。緩衝液の総量は２ｍＬであった。なお、後述する実施例２〜４においても、緩衝液の総量は２ｍＬであった。【０１２４】  その後、ＨＥＰＥＳ緩衝液を２４時間放置した。【０１２５】  次いで、遠心分離機を用いて、３０００ｒｐｍで２０分、遠心分離して沈殿物を除去した。【０１２６】
【表１】
2006132050.tif 000002
表１は、過酸化水素の濃度に対して酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を求めた結果である。【０１２７】  表中の記号は、たんぱく質の全量に対する酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成比率を示し、「◎」は８０％以上、「○」は１０％以上８０％未満、「△」は１０％未満、「×」は０％またはほとんど形成されていないことを表している。このことは、他の表でも同じである。【０１２８】  表１に示されるように、緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下の範囲において、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成できることが理解される。【０１２９】  すなわち、特許文献２を初めとする従来例からは考えられないような高濃度の過酸化水素を用いることにより、たんぱく質の変性を抑制することができ、かつ効率よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが確認された。【０１３０】  特に酸化剤である過酸化水素の濃度を１００ｍＭとしたときには、９０％以上の高い収率で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが見出された。【０１３１】  図４は、過酸化水素の濃度が６０ｍＭである場合の透過型電子顕微鏡写真である。【０１３２】  矢印に示されるフェリチンに酸化亜鉛が含まれている。【０１３３】  なお、この写真の取り方はすでに知られているが、ここでは念のため、以下、説明する。【０１３４】  タンパク質だけのアポフェリチンを、直接電子顕微鏡で観察すると、何も見えない。そこで、金グルコースと呼ばれる染色剤でアポフェリチンを染色する。すると、アポフェリチンの周りが金グルコースで占められることにより、アポフェリチン部分は白い丸、アポフェリチンのまわりは黒くなり、アポフェリチンを確認することができる。なお、金グルコースはアポフェリチンの中には入らない。【０１３５】  酸化亜鉛のコアが入っているフェリチンでは、白い丸の真ん中に黒い酸化亜鉛のコアが見える。すなわち、ドーナツ状に見えているのが、フェリチンであり、白いドーナツ部がフェリチンのタンパク質部分、ドーナツの内側が酸化亜鉛のコアである。【０１３６】  このようにして、コアの入ったドーナツ状のフェリチンの数とコアの入っていない白丸のアポフェリチンの数を数えて、写真に写っているアポフェリチン＋フェリチンの数の内、何パーセントがフェリチンであるか、各濃度について確認した（その結果が表１である）。【０１３７】  （実施例２）
この実施例２では、ｐＨおよびアンモニアの濃度について実験したデータを示す。【０１３８】  本実施例では、以下に示すように、溶液のｐＨの値とアンモニアの濃度の調整が可能な３つの領域に分けて実施した。【０１３９】  第１の領域は、溶液のｐＨの値が８．２未満で、アンモニアの濃度が６０ｍＭ以下の範囲である。【０１４０】  この領域では、実施例１と同様にして溶液を作製した。【０１４１】  溶液中の濃度が１００ｍＭとなるように過酸化水素を反応溶液に混合した。【０１４２】  なお、過酸化水素を混合した後のＨＥＰＥＳの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。【０１４３】  第２の領域は、溶液のｐＨの値が８．２以上、１０．５以下で、アンモニアの濃度が６０ｍＭ以下の範囲である。【０１４４】  以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、酢酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）、およびＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。【０１４５】  ５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  酢酸亜鉛  ４０μＬ
１００ｍＭ  アンモニア水  １２０μＬ
５００ｍＭ  ＣＡＰＳＯ  ８００μＬ
ミリＱ水  １２１６μＬ
ｐＨは、いったんその値が９．４になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。【０１４６】  このように調製されたＣＡＰＳＯ緩衝液に、添加後の過酸化水素の濃度が１００ｍＭとなるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。【０１４７】  緩衝液中での過酸化水素の濃度が１００ｍＭの場合（添加量２２６ｍＬ）には、攪拌後のｐＨは９．１であった。【０１４８】  なお、過酸化水素を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後のアンモニア水の濃度は１６ｍＭ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。【０１４９】  その後のｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。【０１５０】  第３の領域は、溶液のｐＨの値が６．５以上、１０．５以下で、アンモニアの濃度が６０ｍＭを超える範囲である。【０１５１】  以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、硝酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）、および塩化アンモニウムをミリＱ水に混合した。【０１５２】  ５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  硝酸亜鉛  ４０μＬ
１Ｍ  アンモニア水  １２０μＬ
２Ｍ  塩化アンモニウム  ２４０μＬ
ミリＱ水  １３６６μＬ
ｐＨは、いったんその値が９．４になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。【０１５３】  このように調製されたＣＡＰＳＯ緩衝液に、添加後の過酸化水素の濃度が１００ｍＭとなるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。【０１５４】  なお、過酸化水素を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後のアンモニア水の濃度は１６ｍＭ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。【０１５５】  その後のｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを添加することによって行った。【０１５６】  そして、得られた溶液を、室温中に２４時間放置し、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を検討した。【０１５７】  このとき、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態の評価は、実験例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の観察により行った。【０１５８】  以下に、上記３つの領域で得られた溶液を室温中で２４時間放置した後の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態をまとめて表２に示す。なお、表２は、溶液のｐＨの値とアンモニアの濃度に対する酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を相対的に示している。【０１５９】
【表２】
2006132050.tif 000003
表２に示すように、アンモニアの濃度が８ｍＭ以上、３６０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が、６．９以上、１０．４以下の範囲で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが理解される。【０１６０】  また、アンモニアの濃度が１４ｍＭ以上、６０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が６．９以上、７．４以下の範囲、およびアンモニアの濃度が５０ｍＭ以上、２５０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が８．２以上、９．４以下の範囲において、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が、高い収率で再現性よく形成され、特に好ましいことが理解される。【０１６１】  その中でも、溶液のｐＨの値が６．９近傍において、アンモニアの濃度が１６ｍＭ、酢酸亜鉛の濃度が２ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭにおいて、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が、９０％以上の収率で得られた。【０１６２】  図２は、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。【０１６３】  同図から、ほとんどのたんぱく質の保持部に酸化亜鉛が形成されていることわかる。【０１６４】  なお、図中の白抜き矢印は、代表的な酸化亜鉛−たんぱく質複合体を示す。【０１６５】  また、たんぱく質の保持部に形成された物質が、酸化亜鉛であることは、高分解能透過型電子顕微鏡を用いた結晶構造の面間隔の測定により確認した。【０１６６】  （実施例３）
この実施例３では、好ましい亜鉛イオンの濃度のデータを示す。【０１６７】  実施例１とほぼ同様に、過酸化水素を添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１６ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ溶液の濃度が２００ｍＭで、ｐＨの値を６．９近傍に調整して行った。【０１６８】  その際、亜鉛イオンの濃度を変更して検討した。なお、亜鉛イオンは、酢酸亜鉛として供給した。【０１６９】  結果を、表３に示す。【０１７０】
【表３】
2006132050.tif 000004
表３に示すように、亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上、２０ｍＭ以下の範囲で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが理解される。特に、亜鉛イオン濃度が、１ｍＭ以上、４ｍＭ以下の範囲は、再現性や収率の点から好ましいことが理解される。【０１７１】  （実施例４）
この実施例４では、好ましい亜鉛化合物（亜鉛塩）に関するデータを示す。【０１７２】  実施例３とほぼ同様に、過酸化水素を添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１６ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、亜鉛イオンが２ｍＭ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ溶液の濃度が２００ｍＭで、ｐＨの値を６．９近傍に調整して行った。【０１７３】  その際、亜鉛イオンの供給源として、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛を用いた。【０１７４】  その結果を、表４に示す。【０１７５】
【表４】
2006132050.tif 000005
表４に示すように、いずれの亜鉛化合物においても複合体を形成できるが、これら３つの亜鉛化合物（亜鉛塩）の中でも、酢酸亜鉛および硝酸亜鉛が好ましく、酢酸亜鉛がより好ましいことが理解できる。【０１７６】  上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】  本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得ることができる。【０１７８】  さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、酸化亜鉛からなるドット体を有する半導体装置を得ることができる。
【図１】
2006132050.tif 000006
【図２】
2006132050.tif 000007
【図３】
2006132050.tif 000008
【図４】
2006132050.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月9日(2007.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、請求項２に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記過酸化水素を添加した後の前記アンモニアの濃度が８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記緩衝液のｐＨが６．９以上１０．４以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記アンモニアが前記亜鉛イオンに配位している、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項９】
さらに水が前記亜鉛イオンに配位している、請求項８に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンである、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１にも例示されるように、フェリチンに代表される内部に空洞を有するタンパク質の当該空洞に金属、金属塩、または金属化合物を充填させ、さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、量子ドットに代表されるドット体を有する半導体装置の製造方法が知られている。
【０００３】
タンパク質の空洞にコバルト酸化物を充填させる方法が特許文献２に、ＣｄＳｅなどの二族・六族化合物を充填させる方法が特許文献３に例示されている。
【特許文献１】特開２００３−８６７１５号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３１９８号公報
【特許文献３】国際公開第０３／０９９７０８号パンフレット
【非特許文献１】D.Price and J.G.Joshi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79, 3116-3119
【非特許文献２】Mauricia Ortega-Lopez, Alejandro Avila-Garcia, M.L.Albor-Aguilera and V.M. Sanchez Resendiz, 2003, Materials Research Bulletin 38、p1241-p1248
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、タンパク質の空洞に酸化亜鉛を充填させること、すなわち、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造を試みた。
【０００５】
しかし、特許文献２の表２に例示されているように、濃度が１ｍＭ〜５ｍＭの過酸化水素（これは代表的な酸化剤である）を用いて、内部に空洞を有するタンパク質としてのフェリチン、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、当該過酸化水素を添加しても、酸化亜鉛−タンパク質複合体は得られなかった。
【０００６】
タンパク質は酸化剤の影響を受けて変性しやすい。
【０００７】
従って、５ｍＭを超える濃度の過酸化水素を添加するとタンパク質が変性して酸化亜鉛−タンパク質複合体はますます得られにくいと考えられる。
【０００８】
実際に、敢えて４０ｍＭの濃度の過酸化水素を用いても、酸化亜鉛−タンパク質複合体は製造されなかった。
【０００９】
本発明者はこの課題を鋭意検討した結果、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下の過酸化水素を用いれば、酸化亜鉛−タンパク質複合体が得られると言う知見を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法は、内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する。
【００１２】
過酸化水素添加工程の前に、緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有することが好ましい。
【００１３】
過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度は１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００１４】
過酸化水素添加工程の前に、緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有することが好ましい。
【００１５】
過酸化水素を添加した後のアンモニアの濃度は８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００１６】
緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液であることが好ましい。
【００１７】
緩衝液のｐＨは６．９以上１０．４以下であることが好ましい。
【００１８】
アンモニアは亜鉛イオンに配位していることが好ましい。
【００１９】
さらに水が亜鉛イオンに配位していることが好ましい。
【００２０】
内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンであることが好ましい。
【００２１】
本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に限定されない。
【００２４】
本明細書においては、「酸化亜鉛−たんぱく質複合体」を単に「複合体」と呼ぶことがある。
【００２５】
また、濃度についてはｍＭ（ミリモーラ、すなわち、ｍｍｏｌ／Ｌ、ミリモル／リットル）を用いるが、これは得られた緩衝液、とりわけ過酸化水素を供給した後の緩衝液における試薬の濃度を意味する。
【００２６】
すなわち、「アンモニアの濃度が８ｍＭである」と記載した場合、これは過酸化水素を供給した後の緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が８ｍＭという意味である。
【００２７】
緩衝液に供給されるアンモニア水におけるアンモニア濃度が８ｍＭという意味ではない。また、別途、記載しない限り、過酸化水素を供給する前における緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が８ｍＭという意味でもない。
【００２８】
ｐＨについても同様であり、別途、記載しない限り、過酸化水素を供給した後の緩衝液のｐＨを意味する。
【００２９】
（内部に空洞を有するタンパク質について）
内部に空洞を有するタンパク質としては、フェリチンを挙げることができる。
【００３０】
天然のフェリチンはウマの脾臓から公知の方法で得ることができる。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「フェリチン」とは、天然の（すなわち、野生の）フェリチンの他、遺伝子組み替え技術により一部の塩基が他の塩基に置換された遺伝子組み替えフェリチンを含む。このような遺伝子組み替えフェリチンは、特開２００３−３３１９１号公報に例示される。
【００３２】
効率性の観点から、天然のフェリチンからＮ末端の１塩基目から８塩基目までの塩基を除去した欠失フェリチンを用いることが多いが、このような欠失フェリチンもまた、用語「フェリチン」に含まれる。
【００３３】
さらに、内部の空洞に金属、金属塩、または金属化合物が充填されていないフェリチンを、充填されたフェリチンと区別するために「アポフェリチン」と呼ぶことがあるが、明瞭にこれらを区別しない限り、用語「フェリチン」にはアポフェリチンを含む。
【００３４】
以下、図１を用いて、アポフェリチンについて説明する。
【００３５】
図１（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
【００３６】
図１（ａ）に示すように、アポフェリチン１０は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニット２０が非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状たんぱく質である。
【００３７】
そして、その直径は約１２ｎｍであり、通常のたんぱく質に比べて、高い熱安定性と高いｐＨ安定性を有している。
【００３８】
さらに、アポフェリチン１０の中心には、図１（ｂ）に示すように直径約７ｎｍの空洞状の保持部４０を有し、外部とチャンネル３０を介してつながっている。
【００３９】
以下では、アポフェリチン１０の保持部４０に、ナノ粒子が形成されるメカニズムについて、生体内で行われている鉄原子を例に説明する。
【００４０】
アポフェリチン１０の外部と内部とを結ぶチャンネル３０の表面には、ｐＨ７〜ｐＨ８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出している。
【００４１】
そして、プラス電荷を持っている２価の鉄イオンは、マイナス電荷を持つアミノ酸との静電相互作用によりチャンネル３０に取り込まれる。
【００４２】
さらに、アポフェリチン１０の保持部４０の内表面には、チャンネル３０の内表面と同じく、ｐＨ７〜ｐＨ８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出している。
【００４３】
そのため、チャンネル３０から取り込まれた２価の鉄イオンは、一部のサブユニット内にあるferroxidase center（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化され、内部の保持部４０へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ）結晶の核形成が起こる。
【００４４】
その後、順次取り込まれる鉄イオンは、フェリハイドライト結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径７ｎｍの酸化鉄からなるナノ粒子が保持部４０内に形成される。
【００４５】
現在までに、このアポフェリチンを用いて、人工的に以下に示すような鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体が作製されている。
【００４６】
例えば、マンガン、ウラン、ベリリウム、アルミニウムおよび亜鉛などである。
【００４７】
なお、上記では、鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについても、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。
【００４８】
そして、これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部４０の直径とほぼ等しく、約７ｎｍである。
【００４９】
空洞を有するたんぱく質であれば、単一のサブユニットから構成されているたんぱく質であっても、複数のサブユニットから構成されているたんぱく質であってもアポフェリチンの代わりに用いることができる。
【００５０】
それらの中でも、同一のアミノ酸配列を有するサブユニットで構成されるたんぱく質、もしくは単一のモノマーから構成されるリコンビナントであるたんぱく質、例えばリコンビナントフェリチンなどは、構造が安定で、高濃度の酸化剤に対する耐性が高いため、変性を生じにくく好ましい。
【００５１】
たんぱく質は、その空洞の形状が球状に限定されることはなく、ロッド状、リング状などの保持部を有するものであってもよい。一例として、Ｄｐｓたんぱく質およびウイルスたんぱく質を挙げることができる。
【００５２】
例えば、Ｄｐｓたんぱく質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状たんぱく質）を用いた場合、直径が４ｎｍの酸化亜鉛のナノ粒子を作製することができる。
【００５３】
ウイルスたんぱく質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Rotavirus、Reovirus、ＬＡ−１、Polyoma、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、Ross River、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Polioなどが挙げられる。
【００５４】
その中でも、取り扱いの容易性や形状を考慮すれば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスたんぱく質を用いることが好ましい。
【００５５】
以上述べたように、本実施の形態によれば、用いるたんぱく質の空洞状の保持部の形状、大きさに応じた酸化亜鉛のナノ粒子を形成することができる。
【００５６】
ここでいう「ナノ粒子」とは、５０ｎｍ以下で、かつ粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げれば、直径１ｎｍ〜５０ｎｍの粒子がナノ粒子に相当する。
【００５７】
（亜鉛イオンについて）
緩衝液は亜鉛イオンを含有する。
【００５８】
亜鉛イオンの由来は特に限定されず、一般に金属塩として緩衝液に供給される。
【００５９】
収率の観点からは、後述する実験例４および表４からも明らかなように、酢酸亜鉛を緩衝液に供給しておくことが好ましい。
【００６０】
亜鉛イオンの濃度は１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００６１】
亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ未満ではあまりにも亜鉛イオン濃度が薄すぎるために複合体の形成が困難となる傾向がある。
【００６２】
後述する実験例３および表３からも明らかなように、亜鉛イオンの濃度が２ｍＭであることが最も好ましく、これよりも濃度が高くなると収率が低下し得る。
【００６３】
亜鉛イオンの濃度が２０ｍＭを超えることは、非効率的である。
【００６４】
特に、酢酸亜鉛を用いる場合、この傾向および効率性が顕著に現れる。
【００６５】
酢酸亜鉛ほどではないが、硝酸亜鉛を緩衝液に供給しても良い。
【００６６】
後述する実験例４および表４からも明らかなように、硝酸亜鉛を用いた場合、硫酸亜鉛を用いた場合よりかは収率が良いからである。
【００６７】
（アンモニアについて）
緩衝液はアンモニアを含有する。
【００６８】
本発明においては、アンモニアは亜鉛イオンに配位子として配位していると考えられる。
【００６９】
このことは、特許文献３にも開示されている。
【００７０】
亜鉛イオンは４つの配位子を有するが、その全てがアンモニアであってもよく、一部のみがアンモニアであって、他の配位子は水であっても良い。
【００７１】
アンモニアは、アンモニア水として緩衝液に供給される。
【００７２】
後述する実験例２および表２からも明らかなように、アンモニアの濃度は８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００７３】
アンモニアの濃度が８ｍＭ未満では複合体の形成が困難となる傾向がある。
【００７４】
アンモニアの濃度が３６０ｍＭを超えることは非効率的である。
【００７５】
（緩衝液について）
緩衝液としては特に限定されないが、ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることが好ましい。
【００７６】
後述する実験例２および表２からも明らかなように、緩衝液のｐＨは６．９以上１０．４以下であることが好ましい。
【００７７】
ｐＨが６．９未満であることや１０．４を超えることは、弱アルカリ性を好むフェリチンにとっては、望ましい環境ではないからである。
【００７８】
（過酸化水素の添加について）
本発明においては、上記のような内部に空洞を有するタンパク質（代表的にはフェリチン）、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加することを特徴とする。
【００７９】
後述する実験例１および表１からも明らかなように、過酸化水素の濃度は１００ｍＭであることが最も望ましい。
【００８０】
緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が６０ｍＭ未満であると、複合体は形成されない。同様に、緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が１５０ｍＭを超えても、複合体は形成されない。
【００８１】
複合体の形成が可能な過酸化水素の緩衝液中の濃度は６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下であるが、好ましい緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度は８０ｍＭ以上１２０ｍＭ以下である。
【００８２】
なお、過酸化水素は過酸化水素水として緩衝液に供給される。
【００８３】
緩衝液に過酸化水素を供給した後、１日以上放置する。
【００８４】
その後、遠心分離などにより、緩衝液から複合体を得ることができる。
【００８５】
（その他）
複合体を得るにあたっては、室温もしくはアポフェリチンなどのたんぱく質１０が変性しない温度範囲、例えば７０℃以下で、かつスターラーなどで攪拌しながら混合して行うことが好ましい。
【００８６】
（理論的説明）
本発明者らは本発明が以下の理論に拘束されることを決して好まないが、複合体が形成されるメカニズムは以下の通りであると考えている。
【００８７】
まず、たんぱく質の表面は、マイナス電荷が広く分布している。そして、そのマイナス電荷に、溶液中に導入された亜鉛化合物やアンモニアから生じるプラス電荷のＺｎ2+やアンモニウムイオンが結合する。
【００８８】
そのため、酸化剤である過酸化水素がたんぱく質と反応しようとしても、たんぱく質はその表面に結合したＺｎ2+やアンモニウムイオンにより保護されているため、たんぱく質と直接反応できない。
【００８９】
そこで、過酸化水素は、たんぱく質の表面に結合したＺｎ2+を酸化し、３価のプラス電荷のＺｎ3+（もしくはＺｎの中間体）にする。
【００９０】
しかし、Ｚｎ3+は不安定であるため、すぐにＺｎ2+に戻る。
【００９１】
そして、Ｚｎ2+に戻るときに、Ｚｎ3+は酸化剤として作用し、溶液中のＺｎ2+や過酸化水素を酸化する。
【００９２】
このような過程を繰り返すことにより、高濃度の過酸化水素が添加された溶液中においても、たんぱく質と過酸化水素との反応を防ぐことができるためたんぱく質の変性が起こりにくいものと考えられる。
【００９３】
一方、特許文献２に開示されているコバルト−たんぱく質複合体の場合、上記と同様にたんぱく質の表面にプラス電荷のＣｏ2+やアンモニウムイオンが結合する。
【００９４】
そして、過酸化水素はＣｏ2+を同様に酸化し、３価のプラス電荷のＣｏ3+にする。
【００９５】
ところが、Ｃｏ3+は安定であるため、Ｃｏ2+に戻ることがない。
【００９６】
したがって、Ｃｏ3+が酸化剤として作用しない。
【００９７】
そのため、高濃度に過酸化水素が添加された溶液中では、たんぱく質への過酸化水素の反応を防止することができず、たんぱく質は容易に変性してしまう。
【００９８】
その結果、コバルト−たんぱく質複合体を形成する場合には、過酸化水素は必須ではあるが、高濃度に導入することができない。この限界の濃度が５ｍＭ程度であると考えられる。
【００９９】
以上のように、本発明においては、コバルトをたんぱく質の保持部に内包させる場合のプロセスとは異なり、Ｚｎのイオンとしての特性をアンモニアおよび酸化剤である過酸化水素により有効に利用することにより、酸化亜鉛−たんぱく質複合体を効率よく得られる。
【０１００】
この結果、６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下である高濃度の過酸化水素を溶液中に導入可能とし、高い収率で再現性よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成することができる。
【０１０１】
さらにこのメカニズムについて図面を用いて説明する。
【０１０２】
図３は、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成されるメカニズムを説明する模式図である。
【０１０３】
図３に示すたんぱく質１０は、図１に示されるタンパク質を単純化して示したものであり、同じ構成要素には同じ符号を用いている。
【０１０４】
まず、調整された溶液の条件において、多数存在するアンモニウムイオンと亜鉛化合物から生ずる亜鉛イオンは、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンを形成し、例えばその一部が水で置換された状態で安定化している。
【０１０５】
そして、たんぱく質１０の保持部４０の表面は、マイナス電荷に帯電しているため、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンは、静電相互作用によりチャンネル３０を通って保持部４０に取り込まれる。
【０１０６】
その結果、亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンが、たんぱく質１０の保持部４０で高濃度に濃縮される。
【０１０７】
また、たんぱく質１０が高濃度の過酸化水素中で変性しないメカニズムでも述べたように、溶液中には、３価のプラス電荷を有する亜鉛イオンとアンモニアの錯イオンも同様に形成され、溶液中に存在する。
【０１０８】
そのため、３価のプラス電荷を有する錯イオンは、２価のプラス電荷を有する錯イオンと比べて、マイナス電荷に帯電しているたんぱく質１０の保持部４０に入りやすい。
【０１０９】
そして、たんぱく質１０の保持部４０に取り込まれた３価のプラス電荷を有する錯イオンの亜鉛イオンは、過酸化水素により２価のプラス電荷の亜鉛イオンに還元される。
【０１１０】
さらに、たんぱく質１０の保持部４０で高濃度に濃縮された２価の亜鉛イオンは、過酸化水素により、水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）2）を形成する。
【０１１１】
そして、形成された水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）2）は、たんぱく質１０の保持部４０内
の亜鉛の濃度の上昇と最適に調整されたｐＨの値により、平衡状態である酸化亜鉛（ＺｎＯ）に変化する。
【０１１２】
その結果、水に不溶な酸化亜鉛（ＺｎＯ）は、たんぱく質１０の保持部４０内に蓄積され、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成されると考えてられる。
【０１１３】
以上説明したように、本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、たんぱく質を変性させる過酸化水素を高濃度に導入しても、たんぱく質を変性させることなく、効率よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成することができる。
【０１１４】
また、得られた酸化亜鉛−たんぱく質複合体から、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を再現性よく作製することができる。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施例（実験データ）と共にさらにより詳細に説明する。
【０１１６】
（実施例１）
この実施例１では、過酸化水素の濃度について実験したデータを示す。
【０１１７】
以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、酢酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）をＨＥＰＥＳ緩衝液に添加した。
【０１１８】
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  酢酸亜鉛  ４０μＬ
１００ｍＭ  アンモニア水  ３２０μＬ
５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８００μＬ
ミリＱ水  １０１６μＬ
ｐＨは、その値が７．８になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。
【０１１９】
このように調製されたＨＥＰＥＳ緩衝液に、添加後に表１に示される濃度になるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。
【０１２０】
緩衝液中での過酸化水素の濃度が１００ｍＭの場合には、攪拌後のｐＨは６．９であった。
【０１２１】
過酸化水素を添加した後のＨＥＰＥＳの濃度は２００ｍＭであり、過酸化水素を添加した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬであり、過酸化水素を添加した後の酢酸亜鉛の濃度は２ｍＭであり、過酸化水素を添加した後のアンモニアの濃度は１６ｍＭであった。過酸化水素を添加した後のｐＨは６．９であった。緩衝液の総量は２ｍＬであった。なお、後述する実施例２〜４においても、緩衝液の総量は２ｍＬであった。
【０１２２】
その後、ＨＥＰＥＳ緩衝液を２４時間放置した。
【０１２３】
次いで、遠心分離機を用いて、３０００ｒｐｍで２０分、遠心分離して沈殿物を除去した。
【０１２４】
【表１】
2006132050.tif 000010
【０１２５】
表１は、過酸化水素の濃度に対して酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を求めた結果である。
【０１２６】
表中の記号は、たんぱく質の全量に対する酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成比率を示し、「◎」は８０％以上、「○」は１０％以上８０％未満、「△」は１０％未満、「×」は０％またはほとんど形成されていないことを表している。このことは、他の表でも同じである。
【０１２７】
表１に示されるように、緩衝液に含まれる過酸化水素の濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下の範囲において、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が形成できることが理解される。
【０１２８】
すなわち、特許文献２を初めとする従来例からは考えられないような高濃度の過酸化水素を用いることにより、たんぱく質の変性を抑制することができ、かつ効率よく酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが確認された。
【０１２９】
特に酸化剤である過酸化水素の濃度を１００ｍＭとしたときには、９０％以上の高い収率で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが見出された。
【０１３０】
図４は、過酸化水素の濃度が６０ｍＭである場合の透過型電子顕微鏡写真である。
【０１３１】
矢印に示されるフェリチンに酸化亜鉛が含まれている。
【０１３２】
なお、この写真の取り方はすでに知られているが、ここでは念のため、以下、説明する。
【０１３３】
タンパク質だけのアポフェリチンを、直接電子顕微鏡で観察すると、何も見えない。そこで、金グルコースと呼ばれる染色剤でアポフェリチンを染色する。すると、アポフェリチンの周りが金グルコースで占められることにより、アポフェリチン部分は白い丸、アポフェリチンのまわりは黒くなり、アポフェリチンを確認することができる。なお、金グルコースはアポフェリチンの中には入らない。
【０１３４】
酸化亜鉛のコアが入っているフェリチンでは、白い丸の真ん中に黒い酸化亜鉛のコアが見える。すなわち、ドーナツ状に見えているのが、フェリチンであり、白いドーナツ部がフェリチンのタンパク質部分、ドーナツの内側が酸化亜鉛のコアである。
【０１３５】
このようにして、コアの入ったドーナツ状のフェリチンの数とコアの入っていない白丸のアポフェリチンの数を数えて、写真に写っているアポフェリチン＋フェリチンの数の内、何パーセントがフェリチンであるか、各濃度について確認した（その結果が表１である）。
【０１３６】
（実施例２）
この実施例２では、ｐＨおよびアンモニアの濃度について実験したデータを示す。
【０１３７】
本実施例では、以下に示すように、溶液のｐＨの値とアンモニアの濃度の調整が可能な３つの領域に分けて実施した。
【０１３８】
第１の領域は、溶液のｐＨの値が８．２未満で、アンモニアの濃度が６０ｍＭ以下の範囲である。
【０１３９】
この領域では、実施例１と同様にして溶液を作製した。
【０１４０】
溶液中の濃度が１００ｍＭとなるように過酸化水素を反応溶液に混合した。
【０１４１】
なお、過酸化水素を混合した後のＨＥＰＥＳの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。
【０１４２】
第２の領域は、溶液のｐＨの値が８．２以上、１０．５以下で、アンモニアの濃度が６０ｍＭ以下の範囲である。
【０１４３】
以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、酢酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）、およびＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。
【０１４４】
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  酢酸亜鉛  ４０μＬ
１００ｍＭ  アンモニア水  １２０μＬ
５００ｍＭ  ＣＡＰＳＯ  ８００μＬ
ミリＱ水  １２１６μＬ
ｐＨは、いったんその値が９．４になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。
【０１４５】
このように調製されたＣＡＰＳＯ緩衝液に、添加後の過酸化水素の濃度が１００ｍＭとなるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。
【０１４６】
緩衝液中での過酸化水素の濃度が１００ｍＭの場合（添加量２２６ｍＬ）には、攪拌後のｐＨは９．１であった。
【０１４７】
なお、過酸化水素を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後のアンモニア水の濃度は１６ｍＭ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。
【０１４８】
その後のｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。
【０１４９】
第３の領域は、溶液のｐＨの値が６．５以上、１０．５以下で、アンモニアの濃度が６０ｍＭを超える範囲である。
【０１５０】
以下に示されるＬ鎖アポフェリチン、硝酸亜鉛、および水酸化アンモニウム（アンモニア水）、および塩化アンモニウムをミリＱ水に混合した。
【０１５１】
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ鎖アポフェリチン  ８μＬ
１００ｍＭ  硝酸亜鉛  ４０μＬ
１Ｍ  アンモニア水  １２０μＬ
２Ｍ  塩化アンモニウム  ２４０μＬ
ミリＱ水  １３６６μＬ
ｐＨは、いったんその値が９．４になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。
【０１５２】
このように調製されたＣＡＰＳＯ緩衝液に、添加後の過酸化水素の濃度が１００ｍＭとなるように８８２ｍＭの過酸化水素を添加し、攪拌した。
【０１５３】
なお、過酸化水素を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は２００ｍＭ、過酸化水素を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を混合した後のアンモニア水の濃度は１６ｍＭ、過酸化水素を混合した後の酢酸亜鉛は２ｍＭであった。
【０１５４】
その後のｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを添加することによって行った。
【０１５５】
そして、得られた溶液を、室温中に２４時間放置し、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を検討した。
【０１５６】
このとき、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態の評価は、実験例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Transmission Electron Microscope）の観察により行った。
【０１５７】
以下に、上記３つの領域で得られた溶液を室温中で２４時間放置した後の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態をまとめて表２に示す。なお、表２は、溶液のｐＨの値とアンモニアの濃度に対する酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を相対的に示している。
【０１５８】
【表２】
2006132050.tif 000011
【０１５９】
表２に示すように、アンモニアの濃度が８ｍＭ以上、３６０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が、６．９以上、１０．４以下の範囲で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが理解される。
【０１６０】
また、アンモニアの濃度が１４ｍＭ以上、６０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が６．９以上、７．４以下の範囲、およびアンモニアの濃度が５０ｍＭ以上、２５０ｍＭ以下の範囲で、かつ溶液のｐＨの値が８．２以上、９．４以下の範囲において、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が、高い収率で再現性よく形成され、特に好ましいことが理解される。
【０１６１】
その中でも、溶液のｐＨの値が６．９近傍において、アンモニアの濃度が１６ｍＭ、酢酸亜鉛の濃度が２ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭにおいて、酸化亜鉛−たんぱく質複合体が、９０％以上の収率で得られた。
【０１６２】
図２は、酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。
【０１６３】
同図から、ほとんどのたんぱく質の保持部に酸化亜鉛が形成されていることわかる。
【０１６４】
なお、図中の白抜き矢印は、代表的な酸化亜鉛−たんぱく質複合体を示す。
【０１６５】
また、たんぱく質の保持部に形成された物質が、酸化亜鉛であることは、高分解能透過型電子顕微鏡を用いた結晶構造の面間隔の測定により確認した。
【０１６６】
（実施例３）
この実施例３では、好ましい亜鉛イオンの濃度のデータを示す。
【０１６７】
実施例１とほぼ同様に、過酸化水素を添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１６ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ溶液の濃度が２００ｍＭで、ｐＨの値を６．９近傍に調整して行った。
【０１６８】
その際、亜鉛イオンの濃度を変更して検討した。なお、亜鉛イオンは、酢酸亜鉛として供給した。
【０１６９】
結果を、表３に示す。
【０１７０】
【表３】
2006132050.tif 000012
【０１７１】
表３に示すように、亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上、２０ｍＭ以下の範囲で酸化亜鉛−たんぱく質複合体を形成できることが理解される。特に、亜鉛イオン濃度が、１ｍＭ以上、４ｍＭ以下の範囲は、再現性や収率の点から好ましいことが理解される。
【０１７２】
（実施例４）
この実施例４では、好ましい亜鉛化合物（亜鉛塩）に関するデータを示す。
【０１７３】
実施例３とほぼ同様に、過酸化水素を添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１６ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／ｍＬ、亜鉛イオンが２ｍＭ、過酸化水素の濃度が１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ溶液の濃度が２００ｍＭで、ｐＨの値を６．９近傍に調整して行った。
【０１７４】
その際、亜鉛イオンの供給源として、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛を用いた。
【０１７５】
その結果を、表４に示す。
【０１７６】
【表４】
2006132050.tif 000013
【０１７７】
表４に示すように、いずれの亜鉛化合物においても複合体を形成できるが、これら３つの亜鉛化合物（亜鉛塩）の中でも、酢酸亜鉛および硝酸亜鉛が好ましく、酢酸亜鉛がより好ましいことが理解できる。
【０１７８】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明の酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得ることができる。
【０１８０】
さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、酸化亜鉛からなるドット体を有する半導体装置を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の製造過程で起こっているものと考えられる反応を説明する模式図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−たんぱく質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０１８２】
１０    たんぱく質（アポフェリチン）
２０    モノマーサブユニット
３０    チャンネル
４０    保持部
５０    酸化亜鉛
６０    酸化亜鉛−たんぱく質複合体
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006132050.tif 000014
【図３】
2006132050.tif 000015
【図２】
2006132050.tif 000016
【図４】
2006132050.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月10日(2007.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が６０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有し、前記内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンである、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、請求項２に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記過酸化水素を添加した後の前記アンモニアの濃度が８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記緩衝液のｐＨが６．９以上１０．４以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記アンモニアが前記亜鉛イオンに配位している、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項９】
さらに水が前記亜鉛イオンに配位している、請求項８に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月12日(2007.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液に、濃度が８０ｍＭ以上１２０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有し、
前記内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンであり、
前記緩衝液のｐＨが６．９以上１０．４以下である
酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に酢酸亜鉛を添加する酢酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記過酸化水素を添加した後の亜鉛イオンの濃度が１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、請求項２に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記過酸化水素添加工程の前に、前記緩衝液に硝酸亜鉛を添加する硝酸亜鉛添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記過酸化水素を添加した後の前記アンモニアの濃度が８ｍＭ以上３６０ｍＭ以下である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記アンモニアが前記亜鉛イオンに配位している、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
さらに水が前記亜鉛イオンに配位している、請求項７に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
上記目的を達成する本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法は、内部に空洞を有するタンパク質であるフェリチン、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有し、ｐＨが６．９以上１０．４以下である緩衝液に、濃度が８０ｍＭ以上１２０ｍＭ以下となるように過酸化水素を添加する過酸化水素添加工程を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2006132050.tif 000018
2006132050.tif 000019
2006132050.tif 000020
2006132050.tif 000021
2006132050.tif 000022