(57)【要約】本発明は、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬、ＨＥＲ２シグナル阻害薬などとして有用であるエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬。
【請求項２】
エネルギー代謝阻害剤が、ＡＴＰ産生阻害剤である請求項１記載の予防・治療薬。
【請求項３】
ＡＴＰ産生阻害剤が、糖代謝阻害剤である請求項２記載の予防・治療薬。
【請求項４】
糖代謝阻害剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である請求項３記載の予防・治療薬。
【請求項５】
ミトコンドリア活性阻害剤が、電子伝達系阻害剤である請求項４記載の予防・治療薬。
【請求項６】
電子伝達系阻害剤が、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である請求項５記載の予防・治療薬。
【請求項７】
ミトコンドリア活性阻害剤が、ＴＣＡ回路阻害剤である請求項４記載の予防・治療薬。
【請求項８】
ミトコンドリア活性阻害剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項４記載の予防・治療薬。
【請求項９】
糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である請求項３記載の予防・治療薬。
【請求項１０】
エネルギー代謝阻害模倣剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項１記載の予防・治療薬。
【請求項１１】
エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬。
【請求項１２】
エネルギー代謝阻害模倣剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項１１記載の予防・治療薬。
【請求項１３】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である請求項１２記載の予防・治療薬。
【請求項１４】
ＨＥＲ２が、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１または１１記載の予防・治療薬。
【請求項１５】
ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬および（または）ＨＥＲ２シグナル阻害薬である請求項１または１１記載の予防・治療薬。
【請求項１６】
シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である請求項１５記載の予防・治療薬。
【請求項１７】
ＨＥＲ２の脱リン酸化剤である請求項１または１１記載の予防・治療薬。
【請求項１８】
癌の転移・再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である請求項１または１１記載の予防・治療薬。
【請求項１９】
ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用およびＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬。
【請求項２０】
試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２１】
エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法。
【請求項２２】
哺乳動物に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法。
【請求項２３】
ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬を製造するためのエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用。
【請求項２４】
ＨＥＲ２が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを特徴とする、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬などに関する。さらに詳しくは、ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬、ＨＥＲ２シグナル阻害薬、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２と呼ばれることもある）は、ＥＧＦ受容体ファミリーに属するチロシンリン酸化酵素活性を有する受容体であり、癌の増殖・悪性化に関与する因子である。ＨＥＲ２は、乳癌、肺癌、大腸癌、膵癌、卵巣癌などの種々の腫瘍に高発現しており、ＨＥＲ２発現患者の予後は不良である（Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２７巻、５号、２０００年、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ  ９、１３−１９頁）。これより、ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗ＨＥＲ２療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、事実、ＨＥＲ２に対するヒト化モノクローナル抗体（トラスツズマブ、ハーセプチン）はＨＥＲ２高発現の化学療法剤抵抗性、転移性乳癌に対し臨床で効果を示している（Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２９巻、３号、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ  １１、２００２年、３８−４３頁）。トラスツズマブ自身は、ＨＥＲ２シグナルの中和活性を持たず、腫瘍細胞のＨＥＲ２受容体への結合により、受容体の細胞内取り込みを促進し、細胞表面の受容体数を減らし、その結果、抗腫瘍効果を示すといわれており（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３７巻、２５５−２６３頁、１９９３年）、その効果は、ＨＥＲ２高発現腫瘍に限定されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２１巻、１５号、２８８９−２８９５頁、２００３年）。この欠点を補うべく、受容体チロシンリン酸化酵素阻害など、現在、ＨＥＲ２シグナルを中和、阻害し、腫瘍の増殖を抑制する試みが行われている。
一方、癌細胞は、無限増殖能、転移能などの性質を保持するため、多量のエネルギーを必要としている。細胞のエネルギーはＡＴＰであるが、それを賄うため癌細胞は糖代謝、脂質代謝、アミノ酸代謝等エネルギー産生に関与する代謝経路を亢進させている。例えば、癌細胞への糖取り込み亢進は、一般的であり（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８４巻、１０１４−１０２０頁、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４巻、８９１−８９９頁、２００４年）、臨床においてＰＥＴ診断の技術的基本となっている。増殖因子受容体は、細胞増殖シグナルを伝達する作用に加え、下流ｍＴＯＲなどの情報伝達分子を介して、直接、間接的にミトコンドリアを含めた代謝活性を亢進させ、受容体発現細胞のエネルギー代謝を促進する（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｃａｒｅ、８巻、１号、６７−７２頁、２００５年）。
【発明の開示】
【０００３】
安全で治療効果の優れたＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、糖代謝の抑制、呼吸の抑制、およびミトコンドリアの活性の抑制によるエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、ＨＥＲ２のリン酸化が低下すること、ＨＥＲ２発現細胞の増殖が阻害されることを見出し、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、
〔２〕エネルギー代謝阻害剤が、ＡＴＰ産生阻害剤である上記〔１〕記載の予防・治療薬、
〔３〕ＡＴＰ産生阻害剤が、糖代謝阻害剤である上記〔２〕記載の予防・治療薬、
〔４〕糖代謝阻害剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔３〕記載の予防・治療薬、
〔５〕ミトコンドリア活性阻害剤が、電子伝達系阻害剤である上記〔４〕記載の予防・治療薬、
〔６〕電子伝達系阻害剤が、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である上記〔５〕記載の予防・治療薬、
〔７〕ミトコンドリア活性阻害剤が、ＴＣＡ回路阻害剤である上記〔４〕記載の予防・治療薬、
〔８〕ミトコンドリア活性阻害剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔４〕記載の予防・治療薬、
〔９〕糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である上記〔３〕記載の予防・治療薬、
〔１０〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔１〕記載の予防・治療薬、
〔１１〕エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、
〔１２〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔１１〕記載の予防・治療薬、
〔１３〕ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔１２〕記載の予防・治療薬、
〔１４〕ＨＥＲ２が、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔１〕または〔１１〕記載の予防・治療薬、
〔１５〕ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬および（または）ＨＥＲ２シグナル阻害薬である上記〔１〕または〔１１〕記載の予防・治療薬、
〔１６〕シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である上記〔１５〕記載の予防・治療薬、
〔１７〕ＨＥＲ２の脱リン酸化剤である上記〔１〕または〔１１〕記載の予防・治療薬、
〔１８〕癌の転移・再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である上記〔１〕または〔１１〕記載の予防・治療薬、
〔１９〕ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用およびＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、
〔２０〕試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法、
〔２０ａ〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、細胞内ＡＴＰ量である上記〔２０〕記載のスクリーニング方法、
〔２０ｂ〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、ミトコンドリア酸化還元活性である上記〔２０〕記載のスクリーニング方法、
〔２０ｃ〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）タンパク質のリン酸化または（および）ＡＭＰＫの基質タンパク質のリン酸化である上記〔２０〕記載のスクリーニング方法、
〔２１〕エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法、
〔２１ａ〕エネルギー代謝が、ＡＴＰ産生である上記〔２１〕記載の方法、
〔２１ｂ〕ＡＴＰ産生が、糖代謝である上記〔２１ａ〕記載の方法、
〔２１ｃ〕糖代謝が、ミトコンドリア活性である上記〔２１ｂ〕記載の方法、
〔２１ｄ〕ミトコンドリア活性が、電子伝達系である上記〔２１ｃ〕記載の方法、
〔２１ｅ〕電子伝達系が、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも一種である上記〔２１ｄ〕記載の方法、
〔２１ｆ〕ミトコンドリア活性が、ＴＣＡ回路である上記〔２１ｄ〕記載の方法、
〔２１ｇ〕糖代謝が、解糖系である上記〔２１ｂ〕記載の方法、
〔２１ｈ〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔２１〕記載の方法、
〔２１ｉ〕エネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法、
〔２１ｊ〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔２１ｉ〕記載の方法、
〔２１ｋ〕ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化することが、ミトコンドリア活性を阻害することである上記〔２１ｊ〕記載の方法、
〔２２〕哺乳動物に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法、
〔２３〕ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬を製造するためのエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用、
〔２４〕ＨＥＲ２が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを特徴とする、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法などを提供する。
また、本発明は、
〔ｉ〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２に関連する疾患の予防・治療薬、
〔ｉｉ〕ＨＥＲ２に関連する疾患が癌または関節リウマチである上記〔ｉ〕記載の予防・治療薬も提供する。
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、ＨＥＲ２のリン酸化を抑制し、ＨＥＲ２のシグナルを阻害、ＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害するため、例えば、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬、ＨＥＲ２シグナル阻害薬、ＨＥＲ２の脱リン酸化剤、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬、関節リウマチの予防・治療薬などとして安全な医薬として使用することができる。さらには、ＨＥＲ２発現癌患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することにより、ＨＥＲ２発現癌を予防・治療することができる。試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、細胞培養時の酸素濃度を２０％から７％へと低下させた場合に、ＨＥＲ２のリン酸化量の変化を経時的に測定した結果を表す図である。図中、縦軸は酸素濃度２０％で培養した場合のＨＥＲ２タンパク質リン酸化量を１００％として、各時間でのＨＥＲ２タンパク質リン酸化量を相対比で示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（１）エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬
本発明は、細胞のエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、ＨＥＲ２発現細胞の増殖が顕著に阻害されることを見出したことに基づいている。したがって、本発明は、一つの局面において、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬を提供する。
「エネルギー代謝阻害剤」としては、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。細胞のエネルギー代謝には、ＡＴＰ産生、トランスポーター、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝阻害剤」としては、典型的には、例えば、ＡＴＰ産生阻害剤、トランスポーター活性阻害剤などが挙げられる。
「細胞」としては、例えば、動物細胞（例、哺乳動物の細胞）、昆虫細胞などが含まれる。好ましくは、動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは、ヒト癌細胞、特にＨＥＲ２発現細胞である。
「ＡＴＰ産生阻害剤」としては、ＡＴＰ産生を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、糖代謝阻害剤、アミノ酸代謝阻害剤、脂質代謝阻害剤などが挙げられる。
「糖代謝阻害剤」としては、糖代謝を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ミトコンドリア活性阻害剤、解糖系阻害剤などが挙げられる。
「ミトコンドリア活性阻害剤」としては、ミトコンドリアの活性・機能を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、電子伝達系阻害剤、ＴＣＡ回路阻害剤などが挙げられる。また、例えば、低酸素状態の誘導、糖、脂質、アミノ酸等の栄養供給を制限するなどして、好気的代謝を抑制することは、ミトコンドリア活性阻害剤を使用することと等価なものと考えることができる。
「電子伝達系阻害剤」としては、電子伝達系を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤などが挙げられる。
「呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤」としては、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選ばれる少なくとも−種を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、複合体Ｉに対するロテノン、ピエリシヂン、ミクソチアゾール、カプサイシン、アセトゲニン、アラキドン酸など；複合体ＩＩに対するマロン酸、ジメチルコハク酸、ＴＴＦＡ（２−Ｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）など；複合体ＩＩＩに対するアンチマイシン、スティグマテリン、アラキドン酸；複合体ＶＩに対するアジ化ナトリウム、シアニド、硫化水素、ハイドロコルチゾン、デクサメサゾンなど；複合体Ｖに対する２，４−ジニトロフェノール、バリノマイシン、オリゴマイシン；ＦＣＣＰ〔カルボニル  シアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン〕などが挙げられる。
「ＴＣＡ回路阻害剤」としては、ＴＣＡ回路を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、トリフルオロ酢酸、サリチル酸などが挙げられる。
「解糖系阻害剤」としては、解糖系を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、２−デオキシグルコース、フッ化ナトリウム、リチウムヨード酢酸などが挙げられる。
「アミノ酸代謝阻害剤」としては、アミノ酸代謝を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、アミノ基転移阻害剤（例、アミノオキシアセチル酸など）、脱アミノ基阻害剤、脱カルボン酸阻害剤などが挙げられる。
「脂質代謝阻害剤」としては、脂質代謝を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ベータ−酸化阻害剤（例、テトラデシルグリシル酸（Ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌｇｌｙｃｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）など）などが挙げられる。
「トランスポーター活性阻害剤」としては、細胞のトランスポーター活性を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、グルコーストランスポーター阻害剤（例、フロリジンなど）、ピルビン酸・乳酸トランスポーター阻害剤（例、シアノ−４−ヒドロキシシンナメート（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍａｔｅ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）、アミノ酸トランスポーター阻害剤（例、２−アミノビシクロヘプタンカルボン酸（２−ａｍｉｎｏｂｉｃｙｃｌｏ−（２，２，１）−ｈｅｐｔａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＨ））など）などが、「トランスポーター活性阻害剤」の例として挙げられるが、これらに限定されず、トランスポーターの活性を阻害し細胞のエネルギー代謝に必要な基質の供給を抑えることによって、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を奏することができる任意の物質が含まれる。
「エネルギー代謝阻害模倣剤」としては、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応（例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、ｍＲＮＡ転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など）を誘導する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤などが挙げられる。
「ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤」としては、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、メトフォルミン、フェンフォルミン、ブフォルミン、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオシド）、インスリン抵抗性改善剤〔例、トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）またはその塩（好ましくは塩酸塩）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）またはその塩（好ましくはマレイン酸塩）、レグリキサン（Ｒｅｇｌｉｘａｎｅ）、ネトグリタゾン（Ｎｅｔｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、リボグリタゾン（Ｒｉｖｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、エダグリタゾン（Ｅｄａｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、テサグリタザール（Ｔｅｓａｇｌｉｔａｚａｒ）、ラガグリタザール（Ｒａｇａｇｌｉｔａｚａｒ）、ムラグリタザール（Ｍｕｒａｇｌｉｔａｚａｒ）、メタグリダセン（Ｍｅｔａｇｌｉｄａｓｅｎ）、ナベグリタザール（Ｎａｖｅｇｌｉｔａｚａｒ）、バラグリタゾン（Ｂａｌａｇｌｉｔａｚｏｎｅ）など〕などが挙げられるが、これらに限定されず、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化し、ＨＥＲ２のリン酸化を抑制する任意の物質が含まれる。なお、「ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤」が、上記「ミトコンドリア活性阻害剤」としての作用を有していてもよい。
ＨＥＲ２（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、血小板など）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
ＨＥＲ２としては、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が挙げられる。
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えばＨＥＲ２作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＨＥＲ２作用などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、本発明のタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以ド、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、公知の方法、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｉｉ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
「ＨＥＲ２発現癌」とは、ＨＥＲ２（好ましくは、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド）が発現している癌細胞であれば、いずれの癌細胞でもよい。例えば、公知の方法、遺伝子検出方法〔例、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、ＣＩＳＨ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、サザンブロット法など〕、メッセンジャーＲＮＡ検出方法〔例、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ）、ＩＳＨ（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロット法など〕、タンパク質検出方法〔例、ＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏ−ｈｉｓｔｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｅｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）など〕などの方法で、ＨＥＲ２遺伝子、ＨＥＲ２のメッセンジャーＲＮＡ、ＨＥＲ２タンパク質が検出される癌細胞などが挙げられる。
エネルギー代謝（好ましくは、糖代謝など）を阻害する、またはエネルギー代謝阻害を模倣することにより、ＨＥＲ２発現細胞の増殖が阻害され、ＨＥＲ２の脱リン酸化が起こり、またはＨＥＲ２のシグナルが阻害される。「ＨＥＲ２のシグナル」としては、例えば、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナル、転移シグナルなどが挙げられる。
従って、エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬として有用であり、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など、好ましくは乳癌など）、アテローム性動脈硬化症、血管新生（例、固形癌および肉腫の成長にともなう血管新生、腫瘍の転移にともなう血管新生、および糖尿病性網膜症にともなう血管新生など）、ウイルス性疾患（例、ＨＩＶ感染など）、関節リウマチなどの予防・治療薬などとして、さらには、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬などとして安全な医薬として使用することができる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、必要に応じ、常套手段に従って製剤化すればよい。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、ＨＥＲ２発現癌に対し、より強い増殖阻害作用を示すことより、例えば、ＨＥＲ２が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療のために投与されることにより、優れた臨床効果を示す。この結果、不必要な投薬を減らし、副作用の危険を減弱するとともに、該患者に対する治療効果を上げることができる。
ＨＥＲ２が発現しており、糖代謝が亢進している患者としては、例えば、ＨＥＲ２（好ましくは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド）が発現しており、公知の方法で糖代謝が亢進していると判断される患者、例えばＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）により癌の存在が認識される患者、血管造影、ＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｅｉｎｇ）などの方法で癌への血流が認識される患者などが挙げられる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、ホルモン療法剤、抗癌剤（例、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤）など（以下、併用薬物と略記する）と併用して使用することができる。
「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストロール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レポルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等）、ＥＲダウンレギュレーター（例、フルベストラント等）、ヒト閉経ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン等）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等）、５α−レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、デュタステリド、エプリステリド等）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン等）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾール等）などが挙げられる。ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）が好ましい。
「化学療法剤」としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール等）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」としては、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンなどが挙げられる。
「免疫療法剤（ＢＲＭ）」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾールなどが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」における「細胞増殖因子」としては、細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく、通常、分子量が２０，０００以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子が用いられ、具体的には、（１）ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、ＥＧＦ、ハレグリン（ＨＥＲ２リガンド）等〕、（２）インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、インシュリン、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−１、ＩＧＦ−２等〕、（３）ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−１０等〕、（４）その他の細胞増殖因子〔例、ＣＳＦ（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等〕などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」としては、前記の細胞増殖因子と結合能を有する受容体であればいかなるものであってもよく、具体的には、ＥＧＦ受容体、ハレグリン受容体（ＨＥＲ２）、インシュリン受容体、ＩＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体−１またはＦＧＦ受容体−２などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」としては、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）；ＨＥＲ２抗体）、メシル酸イマチニブ、ＺＤ１８３９またはセツキシマブ、ＶＥＧＦに対する抗体（例、ベバシツマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロトポルフィリン・コバルト錯塩、水銀ヘマトポルフィリン・ナトリウム、トポイソメラーゼＩ阻害薬（例、イリノテカン、トポテカン等）、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬（例えば、ソブゾキサン等）、分化誘導剤（例、レチノイド、ビタミンＤ類等）、血管新生阻害薬（例、サリドマイド、ＳＵ１１２４８等）、α−ブロッカー（例、塩酸タムスロシン、ナフトピジル、ウラピジル、アルフゾシン、テラゾシン、プラゾシン、シロドシン等）、セリン・スレオニンキナーゼ阻害薬、エンドセリン受容体拮抗薬（例、アトラセンタン等）、プロテアゾーム阻害薬（例、ボルテゾミブ等）、Ｈｓｐ９０阻害薬（例、１７−ＡＡＧ等）、スピロノラクトン、ミノキシジル、１１α−ヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害・転移抑制薬（例、ゾレドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、クロドロン酸）なども用いることができる。
前記した中でも、併用薬物としては、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２抗体）などが好ましい。
エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
（２）試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定する、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法
本発明はまた、別の局面において、試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。
試験化合物を接触させる「細胞」としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞などが用いられる。好ましくは、動物細胞、好ましくはヒト培養癌細胞などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ヒト培養癌細胞〔例、ヒト乳癌細胞（例、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３など）、ヒト肺癌細胞（例、Ａ５４９など）、ヒト大腸癌細胞（例、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６など）、ヒト膵癌細胞（例、ＡｓＰＣ−１、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２など）、ヒト卵巣癌細胞（例、ＯＶ−ＣＡＲ−３、ＣａＯＶ−３など）、ヒト腎臓癌（例、ＡＣＨＮなど）など〕などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
上記動物細胞を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
上記昆虫細胞を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ′ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４が好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
試験化合物としては、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられる。
スクリーニングの例として、以下の方法などが挙げられる。
（ｉ）（ａ）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｂ）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合のエネルギー代謝阻害活性をそれぞれ測定し、比較することにより、エネルギー代謝阻害活性を有する化合物を選択する。
（ｉ−１）具体例として、（ａ−１）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｂ−１）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合の細胞内ＡＴＰ量をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
細胞内ＡＴＰ量の測定は、公知の方法、例えば、蛍光ＡＴＰ測定法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｍｅｔｈｄｓ．１６０巻、８１−８８頁、１９９３年）またはそれに準ずる方法などを用いる。
（ｉ−２）具体例として、（ａ−２）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｂ−２）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合のミトコンドリア酸化還元活性をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
ミトコンドリア酸化還元活性の測定は、公知の方法、例えば、ＭＴＴ測定法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｍｅｔｈｄｓ．６５巻、５５−６３頁、１９８３年）またはそれに準ずる方法などを用いる。
ＨＥＲ２発現細胞およびＨＥＲ２非発現細胞は、約１，０００〜１００，０００個／ウェルで播種し、約２４〜１２０時間培養する。
ＨＥＲ２発現細胞としては、例えば、上記「ＨＥＲ２発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記（ｂ）の場合におけるエネルギー代謝阻害活性が、上記（ａ）の場合におけるエネルギー代謝阻害活性に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる化合物を、エネルギー代謝阻害活性を阻害する化合物として選択する。
上記培養の際、培養液のグルコース濃度を減じて行ってもよく、酸素濃度を減じて行ってもよい。
さらに、上記（ｉ）で得られた化合物については、（ｃ）ＨＥＲ２非発現細胞を培養した場合と（ｄ）該化合物存在下、ＨＥＲ２非発現細胞を培養した場合の細胞増殖活性をそれぞれ測定し、比較することにより、非特異的な増殖阻害作用を有する化合物を除いてもよい。例えば、上記（ｄ）の場合における細胞増殖活性が、上記（ｃ）の場合における細胞増殖活性に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を、ＨＥＲ２発現細胞に選択的に増殖阻害作用を有する化合物として選択する。
細胞増殖は、公知の方法、例えば、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ（ＳＲＢ）色素染色法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．８２巻，１１０７−１１１２頁，１９９０年）、ＢｒｄＵ  取込みＥＬＩＳＡ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．８５巻、１６９−１７９頁、１９８５年）などを用いて測定する。
ＨＥＲ２発現細胞およびＨＥＲ２非発現細胞は、約１，０００〜１００，０００個／ウェルで播種し、約２４〜１２０時間培養する。
ＨＥＲ２発現細胞としては、例えば、上記「ＨＥＲ２発現癌」細胞などが用いられる。
（ｉｉ）（ｅ）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｆ）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合の、ＡＭＰＫタンパク質の活性をそれぞれ測定し、比較することにより、ＡＭＰＫタンパク質を活性化する化合物（エネルギー代謝阻害の模倣剤）を選択する。
（ｉｉ−１）具体例として、（ｅ−１）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｆ−１）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合の、ＡＭＰＫタンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
（ｉｉ−２）具体例として、（ｅ−２）ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合と（ｆ−２）試験化合物存在下、ＨＥＲ２発現細胞を培養した場合の、ＡＭＰＫの基質タンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
ＡＭＰＫの基質タンパク質としては、ｐ７０  Ｓ６Ｋタンパク質、ＡＣＣタンパク質などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７巻、５４７９−５４８７頁、２００４年）。
ＡＭＰＫタンパク質のリン酸化、およびＡＭＰＫの基質タンパク質のリン酸化の検出は、公知の方法に従って行う。例えば、培養後、ＳＤＳサンプルバッファーを直接、または抽出操作（例、ＲＩＰＡ緩衝液などを用いた抽出など）後に添加し、細胞を溶解する。得られた細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分離し、リン酸化ＡＭＰＫタンパク質に特異的な抗体、またはＡＭＰＫの基質タンパク質のリン酸化に特異的な抗体などを用いてウェスタンブロッティング法を行う。
ＨＥＲ２発現細胞は、約１，０００〜１００，０００個／ウェルで播種し、約２〜２４時間培養する。
ＨＥＲ２発現細胞としては、例えば、上記「ＨＥＲ２発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記（ｆ）の場合におけるＡＭＰＫタンパク質の活性が、上記（ｅ）の場合におけるＡＭＰＫタンパク質の活性に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上亢進させる化合物を、ＡＭＰＫタンパク質を活性化する化合物（エネルギー代謝阻害の模倣剤）として選択する。
上記（ｉ）および（ｉｉ）で得られる化合物は、エネルギー代謝阻害活性、またはエネルギー代謝阻害を模倣する活性（例、ＡＭＰＫ活性化作用）を有し、ＨＥＲ２発現細胞に選択的な増殖阻害作用を有するため、ＨＥＲ２発現癌に特異的で安全な低毒性の化合物である。従って、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的にＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬として、投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法
本発明はまた、別の局面において、細胞のエネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法を提供する。
細胞のエネルギー代謝には、ＡＴＰ産生、トランスポーター、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝を阻害すること」としては、典型的には、例えば、ＡＴＰ産生を阻害すること、トランスポーター活性を阻害することなどが含まれる。
好ましい態様では、エネルギー代謝は、ＡＴＰ産生に直接関与するものであり、これは例えば、糖代謝に関するものである。糖代謝としては、ミトコンドリア活性に関するもの、および解糖系に関するものが含まれる。ミトコンドリア活性には、電子伝達系が関与するもの、およびＴＣＡ回路が関与するものが含まれる。また、電子伝達系が関与するものとしては、呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶから選ばれる少なくとも一種が関与するものが挙げられる。
また、エネルギー代謝の阻害を模倣することには、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応（例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、ｍＲＮＡ転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など）を、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などの作用により誘導することが含まれる。好ましい例としては、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質を細胞または被験体に投与することによって、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化することが挙げられる。
上記本発明のＨＥＲ２発現癌の予防・治療方法は、例えば、上記（１）に記載したエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を被験体（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）に対して投与することを含む。あるいは、例えば、上記（２）に記載したスクリーニング方法によって得られた化合物の有効量を被験体（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）に投与することを含む。しかしながら、本発明の範囲は、これらの特定の態様に限定されず、細胞内のエネルギー代謝を直接または間接的に阻害する作用を奏する任意の化合物または条件を目的の細胞に提供することによって、該細胞のエネルギー代謝を阻害することもまた、本発明の範囲内である。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスＨＥＲ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
マウスＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ラットＨＥＲ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラットＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【実施例】
【０００６】
本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
エネルギー代謝阻害によるＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害
ヒトＨＥＲ２発現細胞としてＢＴ−４７４乳癌細胞（ＡＴＣＣより購入）を、ＨＥＲ２非発現細胞としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣより購入）を用いた。これら細胞を９６穴マルチウェルプレートに播種（ＢＴ−４７４：３．０ｘ１０４細胞／ウェル、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：１．５ｘ１０４細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物（複合体Ｉ：ロテノン）を終濃度１０μｍｏｌ／Ｌから４倍の希釈列で１０段階を添加し、さらに５日間培養した。培養後、ロテノンを含む培養液を除き、リン酸緩衝液で細胞を洗浄、５％トリクロロ酢酸溶液で固定後、０．４％（Ｗ／Ｖ）Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ（ＳＲＢ）色素溶液（１％  酢酸に溶解）を加え、細胞タンパク質を染色した。その後、プレートからＳＲＢ色素溶液を除き、１％  酢酸溶液にて洗浄した後、１００μＬの１０ｍＭ  トリス緩衝溶液を加えて色素を抽出溶解し、吸収波長５５０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質量として細胞量を測定した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．８２巻，１１０７−１１１２頁，１９９０年）。ロテノンを加えないウェル（対照）の吸光度を１００％とした時に、ロテノンを添加したウェルの吸光度の割合を求め、残存細胞量を対照の５０％に抑制するのに必要な化合物濃度（ＩＣ５０）値を算出した。
その結果、ＢＴ−４７４細胞でのＩＣ５０値は０．００４μｍｏｌ／Ｌ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＩＣ５０値は０．５μｍｏｌ／Ｌであった。
これより、ロテノンが、ＨＥＲ２非発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に比べ、ＨＥＲ２発現ＢＴ−４７４細胞の増殖をより強く抑制することがわかる。よって、ミトコンドリアの活性阻害による細胞のエネルギー代謝阻害が、ＨＥＲ２発現細胞に選択的な細胞増殖阻害を示すことが明らかとなった。
［実施例２］
エネルギー代謝阻害によるＨＥＲ２シグナル抑制
ヒトＨＥＲ２発現ヒト乳癌細胞株であるＢＴ−４７４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（ＢＴ−４７４：１．２ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物（複合体Ｉ：ロテノン、複合体ＩＩＩ：アンチマイシン、複合体Ｖ：オリゴマイシン：和光純薬）を終濃度１μｍｏｌ／Ｌから４倍の希釈列で５段階を添加し培養を続けた。２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にトランスファー後、リン酸化ＨＥＲ２に特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４４）、下流抗アポトーシスシグナル伝達分子Ａｋｔに特異的な抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２７１）および下流増殖シグナル伝達分子ＭＡＰＫに特異的な抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９１０１）を用いて、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
ＨＥＲ２のリン酸化は、溶媒対照群のＢＴ−４７４細胞で顕著に検出された。このときロテノン、アンチマイシンおよびオリゴマイシンによって、ＨＥＲ２のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化抑制も認められた。
これより、ミトコンドリアの活性阻害による細胞内エネルギー代謝の阻害は、ＨＥＲ２のリン酸化を抑制し、ＨＥＲ２の下流シグナルを抑制することが明らかとなった。実施例１の結果と併せ、エネルギー阻害によるＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害に、ＨＥＲ２が関与することが明らかである。
［実施例３］
好気的代謝の抑制（酸素供給抑制）によるＨＥＲ２リン酸化抑制
ヒトＨＥＲ２発現ヒト癌細胞株ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣより購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（１．２ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。プレートは炭酸ガスインキュベーター（７％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、３７℃）へ移し、ウェルにＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）を経時的に加え、細胞を溶解した。この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離した（Ｓｈａｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）。次に、実施例１と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化ＨＥＲ２、リン酸化Ａｋｔおよびリン酸化ＭＡＰＫを検出した。
図１に示すように、通常の培養条件（２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、３７℃）ではＢＴ−４７４細胞のＨＥＲ２リン酸化は顕著であったが、低酸素処理（７％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、３７℃）により、時間依存的なＨＥＲ２のリン酸化抑制が認められた。
これより、低酸素によるエネルギー代謝の阻害により、ＨＥＲ２のリン酸化が抑制されることが明らかになった。
［実施例４］
グルコースの利用阻害によるＨＥＲ２リン酸化抑制
ＨＥＲ２発現ヒト癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣより購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（４．０ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した後、含有するグルコース量を０．１ｍｇ／ｍＬとした培地に置換し、さらに２時間培養した。グルコース代謝拮抗剤である２−デオキシグルコースを終濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した。この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離した（Ｓｈａｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）。次に、実施例１と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化ＨＥＲ２、リン酸化Ａｋｔおよびリン酸化ＭＡＰＫを検出した。
２−デオキシグルコース未添加のＳＫ−ＢＲ−３細胞（対照）でのＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化は顕著であり、２−デオキシグルコースの添加によって、各タンパク質のリン酸化が抑制された。
これより、解糖系の阻害によるエネルギー代謝の阻害により、ＨＥＲ２のリン酸化、およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
［実施例５］
ＡＭＰＫ活性化によるＨＥＲ２リン酸化抑制
ＡＭＰＫは、細胞内のエネルギー代謝のセンサーとして働き、エネルギー代謝が阻害される（ＡＤＰ／ＡＴＰ比が増加する）ことにより活性化されることが知られている。ＡＭＰＫの活性化（エネルギー代謝の阻害を模倣する）によるＨＥＲ２のリン酸化およびそのシグナルが抑制されるか否かを、以下のように調べた。
ヒトＨＥＲ２発現ヒト癌細胞株ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣより購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（１．２ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ＡＭＰＫを活性化するメトフォルミン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７９巻、４２号、４３９４０−４３９５１頁、２００４年）を終濃度１５ｍｍｏｌ／Ｌから３倍の希釈列で５段階を添加し、培養を続けた。２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した。この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離した（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）。次に、実施例１と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化ＨＥＲ２、リン酸化Ａｋｔおよびリン酸化ＭＡＰＫを定量した。
ＨＥＲ２のリン酸化は、溶媒対照群のＢＴ−４７４細胞では顕著に検出され、メトフォルミンの添加によって、濃度依存的なＨＥＲ２のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化抑制も認められた。
このように、エネルギー代謝が阻害されている状態を模倣する、ＡＭＰＫの活性化により、ＨＥＲ２のリン酸化およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
［実施例６］
エネルギー代謝阻害とＡＭＰＫ活性化−ＨＥＲ２リン酸化抑制との相関−
ヒトＨＥＲ２発現ヒト乳癌細胞株であるＢＴ−４７４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（ＢＴ−４７４：１．２ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ阻害化合物ロテノン（和光純薬）を終濃度１、０．３３３、０．１１１、０．０３３および０．０１１μｍｏｌ／Ｌの５段階で添加し、培養を続けた。２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にトランスファー後、リン酸化ＨＥＲ２に特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４４）、ＡＭＰＫに特異的なＡＭＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２５３５）およびリン酸化ＡＭＰＫに特異的な抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２５３２）を用い、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて、抗体を化学発光検出し、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ画像解析装置（富士写真フィルム）によりリン酸化タンパク質量として定量した。
ＨＥＲ２のリン酸化は、溶媒対照群のＢＴ−４７４細胞で顕著に検出され、ロテノンの添加により用量依存的に減少した。このとき、ＡＭＰＫが活性化していることを示すＡＭＰＫリン酸化量が、ＨＥＲ２のリン酸化量とは逆に、用量依存的に増加した。またこのとき、ＡＭＰＫのタンパク質量自身に量的な変化は観察されなかった。
実施例２の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害によりＡＭＰＫがリン酸化されるとき、このリン酸化と増殖シグナルであるＨＥＲ２のリン酸化およびその下流シグナルの抑制とは逆相関することが明らかである。
［実施例７］
エネルギー代謝阻害とＡＭＰＫ活性化−ＨＥＲ２リン酸化抑制との相関−
ヒトＨＥＲ２発現ヒト乳癌細胞株であるＢＴ−４７４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（ＢＴ−４７４：１．２ｘ１０５細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ロテノンとは異なる機序のエネルギー代謝阻害剤として、ミトコンドリア呼吸鎖複合体ＩＩＩ阻害化合物アンチマイシン（和光純薬）を終濃度１、０．３、０．１、０．０３および０．０１ｎｍｏｌ／Ｌで添加し、培養を続けた。また別のプレートを用い、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｖ阻害化合物オリゴマイシン（和光純薬）を終濃度１００、３０、１０、３および１ｎｇ／ｍＬで添加し、培養を続けた。また２，４−ジニトロフェノールを３００、１００、３０、１０および３μｍｏｌ／Ｌで添加し、培養を続けた。各々のプレートは、薬物添加２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にトランスファー後、リン酸化ＨＥＲ２に特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４４）、リン酸化アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）に特異的なｐＡＣＣ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号３６６１）およびリン酸化Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）に特異的な抗リン酸化Ｓ６Ｋ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２０９）を用い、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて、抗体を化学発光検出し、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ画像解析装置（富士写真フィルム）によりリン酸化タンパク質量として定量した。
ＨＥＲ２のリン酸化は、溶媒対照群のＢＴ−４７４細胞で顕著に検出され、アンチマイシン、オリゴマイシン、および２，４−ジニトロフェノールの添加により用量依存的に減少した。このとき、ＡＭＰＫの基質であり活性の指標となっているＡＣＣは、何れの化合物においても、用量依存的にリン酸化が増加した。また下流分子として知られているＳ６Ｋのリン酸化が抑制されており、ＡＭＰＫからのシグナルが、細胞内を伝達されていることも明らかとなった。
実施例２、６の結果と併せ、これよりエネルギー代謝阻害は、ＨＥＲ２のリン酸化とＨＥＲ２下流シグナルを抑制し、ＨＥＲ２のリン酸化とＡＭＰＫのリン酸化、すなわちＡＭＰＫ活性とは逆相関することが明らかである。
［実施例８］
エネルギー代謝阻害によるＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害
ヒトＨＥＲ２発現細胞としてＢＴ−４７４乳癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞、Ａ５４９非小細胞肺癌細胞、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を用い、ＨＥＲ２非発現細胞としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ａ４９８腎癌細胞（いずれもＡＴＣＣより購入）を用いた。各細胞を５００ｃｅｌｌｓ／１５０μＬ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。アンチマイシン（最終濃度：１，０．１，０．０１，０．００１μｍｏｌ／Ｌ）、２，４−ジニトロフェノール（最終濃度：０．６，０．２，０．０６，０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ）、メトフォルミン（最終濃度：２５，５，１，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＡＩＣＡＲ（最終濃度：２５，５，１，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）の各化合物を培地で希釈し上記最終濃度となるよう５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。５日間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆ（同仁化学研究所）を用い細胞数を測定した。
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。５日間の培養を行った９６穴プレートから上清を除き、ＲＰＭＩ培地（フェノールレッド不含、血清不含）で１０００倍に希釈したＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。室温で３０分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光（励起波長；４８０ｎｍ、蛍光波長；５３０ｎｍ）を測定した。
測定結果から、化合物を加えないウェル（対照）の蛍光を１００％とした時に、化合物を添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する％として求めた。
結果、細胞増殖を５０％以上阻害する最小の濃度は以下の通りとなった。
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これより、何れの化合物も、ＨＥＲ２非発現癌に比べ、ＨＥＲ２発現癌に１０〜１００倍以上強く作用することが明らかである。実施例１の結果と併せ、エネルギー代謝阻害またＡＭＰＫの活性化により、ＨＥＲ２リン酸化および細胞内シグナル伝達が抑制され、ＨＥＲ２発現癌に特異的に細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
［実施例９］
エネルギー代謝阻害によるＨＥＲ２シグナル抑制の特異性
ヒトＥＧＦＲ発現ヒト類表皮癌細胞株であるＡ４３１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入）を２４穴マルチウェルプレートに播種（Ａ４３１：６ｘ１０４細胞／ウェル）し、炭酸ガスインキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）中で一夜培養した。ミトコンドリア複合体阻害化合物（複合体Ｉ：ロテノン、和光純薬）を終濃度１μｍｏｌ／Ｌから４倍の希釈列で５段階を添加し培養を続けた。２時間後に培養液を除き、ＳＤＳサンプルバッファー（２００μＬ）で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液（８μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にトランスファー後、リン酸化ＥＧＦＲに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２３２）を用いて、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
ＥＧＦＲのリン酸化は、溶媒対照群のＡ４３１細胞で顕著に検出された。このときロテノンによるＥＧＦＲのリン酸化抑制は認められなかった。
ＥＧＦＲはＨＥＲ１とも呼ばれ、ＨＥＲ２と高い相同性を持ち同じファミリーに分類される受容体チロシンリン酸化酵素である。実施例２の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害による受容体チロシンリン酸化抑制は、ＨＥＲ２特異的である事が明らかとなった。
［実施例１０］
ＡＭＰＫ活性化によるＨＥＲ２発現癌細胞増殖阻害
ヒトＨＥＲ２発現細胞としてＢＴ−４７４乳癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を用い、ＨＥＲ２非発現細胞としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ａ４９８腎癌細胞（いずれもＡＴＣＣより購入）を用いた。各細胞を５００ｃｅｌｌｓ／１５０μＬ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。トログリタゾン（最終濃度：２５，６．２５，１．５６μｍｏｌ／Ｌ）を培地で希釈し、上記最終濃度となるよう５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。５日間、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆ（同仁化学研究所）を用い細胞数を測定した。
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。５日間の培養を行った９６穴プレートから上清を除き、ＲＰＭＩ培地（フェノールレッド不含、血清不含）で１０００倍に希釈したＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｆを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。室温で３０分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光（励起波長；４８０ｎｍ、蛍光波長；５３０ｎｍ）を測定した。
測定結果から、トログリタゾンを加えないウェル（対照）の蛍光を１００％とした時に、トログリタゾンを添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する％として求めた。
この結果、トログリタゾンはＨＥＲ２発現癌細胞に対し、２５μｍｏｌ／Ｌの濃度で、ＢＴ４７４細胞を５０％、ＭＢ４５３細胞を２５％、ＬＮＣａＰ細胞を４８％にまで増殖阻害した。この増殖阻害は濃度依存的であった。一方、ＨＥＲ２非発現癌細胞では、２５μｍｏｌ／Ｌの濃度でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は１００％、Ａ４９８細胞が１０５％と、まったく増殖阻害活性を示さなかった。
トログリタゾンはＡＭＰＫを活性化する事が報告されている。実施例７、８の結果と併せ、ＡＭＰＫの活性化はＨＥＲ２リン酸化を抑制し、ＨＥＲ２発現癌特異的な、細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、ＨＥＲ２のリン酸化を抑制し、ＨＥＲ２のシグナルを阻害、ＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害するため、例えば、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬、ＨＥＲ２シグナル阻害薬、ＨＥＲ２の脱リン酸化剤、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬、関節リウマチの予防・治療薬などとして安全な医薬として使用することができる。さらには、ＨＥＲ２発現癌患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することにより、ＨＥＲ２発現癌を予防・治療することができる。試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。
［配列表］
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【図１】
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【国際調査報告】
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