(57)【要約】  本発明者らは、HCVタンパク質およびスフィンゴ脂質の結合部位の特定および、結合能について検討を行った。その結果、ラフトの構成成分であるスフィンゴミエリンと、HCVタンパク質であるHCV-NS5Bが特定の部位において強く結合すること、およびこれらの結合によりHCVウイルスの複製が行われていることが明らかとなった。また、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害することにより、HCVウイルスの複製を抑制出来ることが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
【請求項２】
スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドである、請求項１に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項３】
スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項４】
スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを認識する抗体である、請求項１に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項５】
HCVタンパク質がHCV-NS5Bである請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（A）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）（A）に記載のペプチドと被検化合物の結合を検出する工程
（C）（A）に記載のペプチドと結合する被検化合物を選択する工程
【請求項８】
以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（A）被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定する工程
（C）被検化合物を添加しない場合に比べて、上記結合能を低下させた被検化合物を選択する工程
【請求項９】
HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【請求項１１】
以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤の効力の評価方法。
（A）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）（A）に記載のペプチドと被検化合物の結合を検出する工程
（C）（A）に記載のペプチドと結合する被検化合物の、HCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する工程
【請求項１２】
以下の（A）および（B）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤の効力の評価方法。
（A）被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定することによる、HCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する工程
【請求項１３】
請求項１１または１２のいずれかに記載の評価方法に用いるためのキット。
【請求項１４】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行し、そのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年３万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。【０００３】
ＨＣＶは１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Hepacivirus）属に分類される。【０００４】
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。【０００５】
よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。【０００６】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。【０００７】
近年、リバビリン（Ribavirin：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。【０００８】
ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていなかった。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。【０００９】
しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。【００１０】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】国際公開公報WO98/56755号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報WO04/71503号パンフレット
【特許文献３】国際公開公報WO05/05372号パンフレット
【非特許文献１】ブイ・ローマンなど著、サイエンス（Science）、1999年、第285巻、第110-113頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者らは、国際公開公報WO98/56755号（特許文献１）に開示されており、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する一連の化合物が、上記レプリコンアッセイ法で高いＨＣＶの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献２）。また本願発明者らは、該化合物がインビトロの細胞毒性については軽微であり、ＨＣＶ感染症の予防剤または治療剤として極めて有用であることを見出し、さらに該化合物および誘導体の合成方法を構築した（特許文献３）。また本願発明者らは、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与すること、およびスフィンゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となることを明らかにした（WO2006/16657）。【００１２】
スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、HIV等のウイルスがラフトを介して複製される（Takeda M. et al. (2003) PNAS, 100, 25、Lucero H. A., et al. (2004) Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208、Simons K. (1997) Nature, 387, 569、G.−Z. Leu et al. (2004)）。
これらのことから本発明者らは、HCVがラフトを介して複製されると予想し、スフィンゴ脂質を含むラフトを介したHCVウイルス複製について、詳細な機構の解明を試みた。【００１３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を提供することにある。また、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットの提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、本願発明者らはHCVタンパク質およびスフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン）の結合部位の特定および、結合能について検討を行った。
まず、HCVタンパク質の中に、スフィンゴ脂質結合領域があるか探索するために、類似する構造をCEプログラムにより検索した。その結果、NS5Bの配列E230-G263において、へリックス・ターン・へリックスのモチーフを持った類似構造が認められた（図1）。【００１５】
次に、Biacore S51を用いて、NS5Bスフィンゴ結合領域（NS5B-SBD）とスフィンゴミエリン（SM）との結合能を確認したところ、NS5B-SBDペプチドは、濃度依存的にスフィンゴミエリンと結合することが明らかとなった（図2A）。また、プリオンタンパク質（PrP）においても同様な結合が認められた（図2B）。
さらに、NS5Bスフィンゴ結合領域ペプチドおよびその誘導体のHCVレプリコン阻害活性を測定したところ、これらのペプチドは有意な抗HCV複製阻害活性を示すことが明らかとなった（図３）。
上記の結果よりラフトの構成成分であるスフィンゴミエリンと、HCVタンパク質であるHCV-NS5Bが特定の部位において強く結合すること、およびこれらの結合によりHCVウイルスの複製が行われていることが明らかとなった。また、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害することにより、HCVウイルスの複製を抑制出来ることが明らかとなった。【００１６】
即ち、本発明者らは、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。【００１７】
本発明は、より具体的には、以下の〔１〕〜〔１４〕を提供する。
〔１〕スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
〔２〕スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドである、〔１〕に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
〔３〕スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドである、〔１〕に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
〔４〕スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを認識する抗体である、〔１〕に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
〔５〕HCVタンパク質がHCV-NS5Bである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の薬剤。
〔６〕HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤。
〔７〕以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（A）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）（A）に記載のペプチドと被検化合物の結合を検出する工程
（C）（A）に記載のペプチドと結合する被検化合物を選択する工程
〔８〕以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（A）被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定する工程
（C）被検化合物を添加しない場合に比べて、上記結合能を低下させた被検化合物を選択する工程
〔９〕HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔７〕または〔８〕に記載のスクリーニング方法。
〔１０〕〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
〔１１〕以下の（A）〜（C）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤の効力の評価方法。
（A）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）（A）に記載のペプチドと被検化合物の結合を検出する工程
（C）（A）に記載のペプチドと結合する被検化合物の、HCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する工程
〔１２ 〕以下の（A）および（B）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤の効力の評価方法。
（A）被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する工程
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
（B）上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定することによる、HCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する工程
〔１３〕〔１１〕または〔１２〕のいずれかに記載の評価方法に用いるためのキット。
〔１４〕以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａは、HCV-NS5Bの配列E230-G263およびV3ループのアミノ酸配列を示す図である。Ｂは、HCV-NS5Bの構造を示す図である。縦線はHCV-NS5Bの同定した推定のスフィンゴ脂質結合領域。斜線はHIV-1 V３ループのスフィンゴ脂質結合領域を示す。Ｃは、HCV-NS5Bにおけるへリックス・ターン・へリックスのモチーフを示す図である。
【図２】Biacoreを用いたHCV-NS5Bスフィンゴ結合領域ペプチド（NS5B-SBD、配列番号：１）とスフィンゴミエリン（SM)との結合検討の結果を示す図である。Ａは、NS5B-SBDペプチドのセンサグラムを示す図であり、NS5B-SBDペプチドは濃度依存的にスフィンゴミエリンとの結合を認めた。Ｂは、NS5B-SBDペプチドとプリオンタンパク質（PrP、配列番号：２）の、スフィンゴミエリンへの結合能を比較したものである。センサグラム80s時のRU値を示す。
【図３】NS5Bスフィンゴ結合領域ペプチドおよびその誘導体のHCVレプリコン阻害活性測定の結果を示す図である。
【図４】スフィンゴ脂質合成経路（パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンまでの合成経路）を示す図である。
【図５】ノザンブロット解析によるミリオシンのHCV  RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。
【図６】ノザンブロット解析による式（II）で表される化合物のHCV  RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸は式（II）で表される化合物の濃度を表す。
【図７】ウェスタンブロット解析によるミリオシンのHCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。
【図８】ウェスタンブロット解析による式（II）で表される化合物のHCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸は式（II）で表される化合物の濃度を表す。
【図９】フモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性を示す図である。
【図１０】siRNAによるセリンパルミトイル転移酵素（LCB1)のタンパク質発現阻害を示す写真である。
【図１１】siRNAによるHCVレプリコン阻害活性および細胞毒性の影響を示す図である。
【図１２】式（II）で表される化合物によるHCVレプリコンの阻害及び宿主細胞への毒性を示す図である。
【図１３】式（II）で表される化合物によるHCV-NS3タンパク質の発現阻害を示す写真である。免疫染色の後、蛍光顕微鏡にて観察した。白色はNS3タンパク質、灰色はヘキスト３３342で染色された核を示す。
【図１４】式（II）で表される化合物によるNS3、NS5A、およびNS-5Bタンパク質の発現阻害を示す写真である。各タンパク質の発現は、ウェスタンブロット解析により行った。
【図１５】式（II）で表される化合物によるSPT阻害活性を示す図である。
【図１６】式（II）で表される化合物によるセラミド、スフィンゴミエリンのde novo合成阻害を示す写真である。
【図１７】Ｃ２−セラミドによる式（II）で表される化合物のHCV複製阻害の抑制を示す写真である。
【図１８】ラフト生合成関連低分子化合物によるHCV複製阻害を示す図である。
【図１９】式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す写真である。
【図２０】式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。【００２０】
本発明において、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物とは、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合反応を、直接的もしくは間接的に阻害するものであれば如何なる化合物であってもよい。また、これらの阻害剤を生成または増加させる化合物であって、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合反応を間接的に阻害する化合物であってもよい。【００２１】
本発明において、HCVタンパク質としては、HCV-NS2、HCV-NS３、HCV-NS4A、HCV-NS4B、HCV-NS5A、HCV-NS5Bを挙げることが出来るが、より好ましくは、HCV-NS5Bを挙げることができる。【００２２】
本発明のスフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物の好ましい例としては、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを挙げることができる。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド【００２３】
配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において例えば１〜10個、好ましくは１〜5個のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドもこれらのペプチドに含まれる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００２４】
配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドとしては、配列番号：５〜７のいずれかに記載のアミノ酸からなるペプチドを挙げることが出来る。
これらのペプチドは、スフィンゴミエリンにおけるHCVタンパク質結合部位に特異的に結合し、そのためスフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合活性を低下させることが考えられる。その結果として、ラフトを介したHCVウイルスの複製が抑制されるものと考えられる。【００２５】
本発明のスフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物の好ましい例としては、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、該ペプチドを発現しうる形で適当なベクターに組み込んで用いることもできる。【００２６】
本明細書中、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを「発現しうる形で含む」とは、該ポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入されており、動物の細胞内に侵入した場合に、該細胞内で所定のペプチドを発現させうる形態で含むことをいう。すなわち、例えば、投与される動物種および投与部位に適したプロモータの制御下に該コードDNAが配置されていることを指す。【００２７】
本発明のスフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害する化合物の好ましい例としては、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを認識する抗体を挙げることが出来る。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。【００２８】
本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はHCVタンパク質と結合することにより、HCVタンパク質とスフィンゴミエリンの結合を阻害する。その結果として、ラフトを介したHCVウイルスの複製が抑制されるものと考えられる。【００２９】
該ペプチドを認識する抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、該ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００３０】
具体的には、該ペプチドを認識する抗体を作製するには次のようにすればよい。
該ペプチドをコードする塩基配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の該ペプチドを公知の方法で精製し、この精製ペプチドを感作抗原として用いればよい。また、該ペプチドと他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。【００３１】
本明細書において「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによって、ＨＣＶを消滅あるいは軽減させること、さらなるＨＣＶの広がりを抑制すること、ＨＣＶの感染による症状を軽減することを意味する。また「予防」という記載は、HCVが感染する前に、被験者に投与され、HCVの感染を防いだり、増殖を抑制させることを意味する。ＨＣＶの感染による症状としては、好ましくはＣ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。【００３２】
本発明の化合物は、医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。
上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％である。【００３３】
本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。【００３４】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有することもできる。【００３５】
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。【００３６】
本発明の化合物を医薬として投与する場合、抗ウイルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、0.1〜2000mgの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。【００３７】
上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行うことができる。【００３８】
上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。【００３９】
上記局所投与（経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。【００４０】
上記経直腸的投与は、本発明の化合物の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物などからなる低融点固体に混入した座剤などを用いて行うことができる。【００４１】
上記投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。
本発明のペプチド或いは抗体などのタンパク質を細胞内で作用させるために細胞内に当該タンパク質を輸送する手法として、例えば、細胞膜透過機能を有するペプチド（例えばPegelin やPenetratinなど）を付加すること（Martine Mazel etal., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-Cancer Drugs 2001, 12、Dcrossi D. et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450.）により本発明のタンパク質を細胞内に輸送させることが可能である。【００４２】
また、本発明のペプチドを細胞内に導入する方法としては、（１）ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス）にペプチド配列をコードする遺伝子を１コピー又は複数コピー連結し、このウイルスを感染させることによって導入する方法、（２）目的のペプチドを静脈注射によって直接導入する方法、（３）目的のペプチド又はそれをコードするDNAを物理的に細胞や組織に導入する方法（たとえば、パーティクルガン）等を挙げることが出来る。パーティクルガンは、極めて強力な遺伝子導入法で、金またはタングステンの微粒子（マイクロキャリア）に付着させた核酸をヘリウムガスの圧力によって標的細胞に導入する方法である。この方法は、マイクロインジェクション法に比べ、操作が非常に簡単であり、細胞種に関わらず広範囲な応用が期待できる。このことを利用して、ペプチドの導入にも応用することが期待される。【００４３】
本発明は、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド【００４４】
第一の態様に用いられるペプチドの状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。該ペプチドが発現している細胞としては、外来性のペプチドを発現している細胞が挙げられる。上記外来性のペプチドを発現している細胞は、例えば、該ペプチドをコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。このような外来性のペプチドが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。【００４５】
ペプチドが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ペプチドをコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。【００４６】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。【００４７】
本発明において「接触」は、ペプチドの状態に応じて行う。例えば、ペプチドが精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒトを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、該ペプチドが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをペプチドが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を利用することも可能である。【００４８】
第一の態様では、次いで、上記ペプチドと被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記ペプチドと結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、HCV感染症を治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもよい。【００４９】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド【００５０】
第二の態様では、次いで、上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定する。結合能の測定は上記に記載の方法で行うことが出来る。
本方法においては、ついで、被検化合物を添加しない場合と比較して、上記結合能を低下させた場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【００５１】
また、本発明は、HCV感染症を治療または予防するための薬剤の効力の評価方法に関する。
本発明の薬剤の評価方法の第一の態様としては、まず、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドに被検化合物を接触させる。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
第一の態様では、ついで、上記ペプチドと被検化合物の結合を検出する。ペプチドと被検化合物の結合の検出は、上記に記載の方法により行うことが出来る。ついで、上記ペプチドと結合した被検化合物の、HCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する。上記ペプチドに対する被検化合物の結合能（例えば、平衡結合定数、結合速度定数、解離速度定数、等）を検出することで、該被検化合物のHCV感染症の治療または予防効果の効力を評価することが出来る。例えば、被検化合物が上記ペプチドに対し有意な結合能を示す場合には、該被検化合物はHCV感染症の有意な治療または予防効果を示すと評価することが出来る。【００５２】
本発明の薬剤の評価方法の第二の態様としては、まず、被検化合物を以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと同時に、スフィンゴミエリンに添加する。
（ａ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：１から４、１０または１１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド【００５３】
第二の態様では、次いで、上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能を測定し、該被検化合物のHCV感染症の治療または予防効果の効力を評価する。結合能の測定は上記に記載の方法で行うことが出来る。上記ペプチドとスフィンゴミエリンの結合能（例えば、平衡結合定数、結合速度定数、解離速度定数、等）を検出することで、該被検化合物の、上記ペプチドとスフィンゴミエリンの結合阻害能を検出することができる。さらに、これらの値を基にして、該被検化合物のHCV感染症の治療または予防効果の効力を評価することが出来る。例えば、被検化合物を添加することにより、被検化合物を添加しない場合に比べて、上記ペプチドとスフィンゴミエリンの結合能を有意に低下させた場合には、該被検化合物はHCV感染症の有意な治療または予防効果を示すと評価することができる。【００５４】
本発明の上記記載の評価方法は、HCV感染症を治療又は予防するための新規薬剤を見出すためのスクリーニング方法のみに限らず、医薬候補化合物の開発のための薬効の効力の評価や医薬品の製造供給の際に必要な品質管理のための効力の評価を行う場合の評価方法としても有用である。
本発明は、上記に記載のスクリーニング方法または評価方法に用いるためのキットに関する。このようなキットには、上記に記載のスクリーニング方法または評価方法の検出工程や測定工程に使用されるものを含みうる。例えば、該ペプチドと、スフィンゴミエリンの結合能測定に必要とされる試薬、機器等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００５６】
〔実施例１〕HCV-NS5Bのスフィンゴ脂質結合モチーフの探索
HIV-1gp120 由来のV3ループ（図１Ａ、配列番号：４）やプリオン由来のPrPタンパク質は、スフィンゴ脂質結合ドメインをもっている。HCVタンパク質の中に、スフィンゴ脂質結合領域があるかどうか探索するために、これらと類似する構造をCEプログラム(cl.sdsc.edu/ce.html)を用いて検索した。その結果、図１に示すようにHCV-NS5Bの配列E230-G263（図１Ａ、配列番号：３）において、へリックス・ターン・へリックスのモチーフ（図１）をもった類似構造が認められた。HCV-NS5B全長の塩基配列を配列番号：８に、アミノ酸配列を配列番号：９に示す。この構造ドメインのサイズはV3ループとほぼ一致した（図１Ｂは、HCV-NS5Bの構造。縦線はHCV-NS5Bの同定した推定のスフィンゴ脂質結合領域。斜線はHIV-1 V3ループのスフィンゴ脂質結合領域）。【００５７】
〔実施例２〕推定のNS5Bスフィンゴ結合領域ペプチド（NS5B-SBD) とスフィンゴミエリン(SM) との結合
Biacore S51を使用して、NS5B-SBDペプチドとSMとの結合能を検討した。 SMをクロロホルムに溶解し、真空乾固したあと、PBS緩衝液を加え、１０ｍMとなるよう懸濁した。懸濁液は凍結融解を繰り返し、ポアサイズ50 nmのメンブレンに通し、リポソームを調製し、センサチップL1に固定化した。合成ペプチドは、NS5B(DIRVEESIYQCCDLAPEARQAIKSLTERLY（配列番号：１）, Sigma genosysにより合成)、及びPrP（KQHTVTTTTKGENFTETDVKMMER（配列番号：２）, Sigma genosysにより合成)を使用した。特異的結合量は、ペプチドを加えていないセンサグラムをブランクとし、各濃度のセンサグラムから差し引いたものを結合量の測定に用いた。その結果、NS5B-SBDペプチドは、濃度依存的にスフィンゴミエリンとの結合を認めた（図２Ａ、NS5B-SBDペプチドのセンサグラム）。プリオンタンパク質（PrP)においても同様な結合が認められた（図２Ｂ、図２Ａのセンサグラム80s時のRU値）。【００５８】
上記の結果よりラフトの構成成分であるスフィンゴミエリンと、HCVタンパク質であるHCV-NS5Bが特定の部位において強く結合すること、およびこれらの結合によりHCVウイルスの複製が行われていることが明らかとなった。これらの知見により、スフィンゴミエリンとHCVタンパク質の結合を阻害することにより、HCVウイルスの複製を抑制することが出来るものと示唆された。【００５９】
〔実施例３〕NS5Bスフィンゴ結合領域ペプチドおよびその誘導体のHCVレプリコン阻害活性測定
次に、HCVレプリコン細胞を用いて、NS5bスフィンゴ結合領域ペプチド（配列番号：１）およびその誘導体ペプチド（配列番号：１０、１１）のHCVレプリコン阻害活性を測定した。
【表１】
2007043640.tif 000002
HCVレプリコン細胞を96穴プレートの１穴当たり10,000細胞（0.1mL）入れ、５％Fetal Bovine Serum（以下FBS）(HyClone, Cat. No. SH30071)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium(以下DMEM) (Invitrogen, Cat. No. 10569-010)中で37℃、５％CO２存在下20時間培養した。96穴プレートの培地を捨て、FBSを含まないDMEMを0.1ｍL加えた。BioPORTER (Gene Therapy System, Cat. No.BP502401)をクロロホルムで溶解し、風乾にてフィルム化した。これをPhosphate Buffered Saline（Sigma, Cat. No. D8537）に溶解したペプチド（2mg/mL）で再溶解した。5分後、96穴プレートに0.01mLの上記各ペプチドを添加し、37℃、５％CO２存在下で3〜4時間培養した。10%FBSを含むDMEMを0.1ｍL加え、更に培養を行なった。ペプチド添加から20時間および40時間後に、Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Cat. No. E2520)でレプリコン活性を測定した。ネガティブペプチドとして配列番号：１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用した。
その結果、NS5Bスフィンゴ結合領域ペプチドおよびその誘導体は終濃度0.1mg/ｍLにおいて、20〜30％の抗HCV複製阻害を示すことが明らかとなった（図３）。一方、ネガティブペプチドでは阻害が観測されなかった。【００６０】
以下に参考例として、WO2006/16657に記載された実施例を例示する。
〔参考例１〕ノザンブロット解析によるミリオシンまたはオーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する式（II）で表される化合物のHCV  RNA複製阻害活性の測定
ミリオシン又は以下の式（II）で表される化合物を１ｐMから100μMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、５％CO2存在下、37度にて培養した。
式（II）：【００６１】
2007043640.tif 000003
【００６２】
72時間後に細胞を回収し、全RNAを抽出した後で、Ambion社のノザンマックスキットの方法に従いネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。
ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、NorthernMax transfer buffer (Ambion #8672), 転写膜 BrightStar-Plus (Ambion #10100), ろ紙（Sigma P-6664）, ULTRAhyb (Ambion #8670)。プローブの標識はBiotinStar Psoralen-Biotin kit (Ambion #9860G3)でビオチン化標識した。High Stringency buffer (Amibion #8674); BrightStar BioDetect kit (Wash buffer, Ambion #8650G; Blocking buffer, Ambion #8651G; Streptavidin-Alkaline Phosphatase, Ambion #2374G; Assay buffer, Ambion #8652G;CDP-Star, Ambion #8653G)【００６３】
１％アガロースゲルで1μgのトータルRNAを泳動し、泳動後エチジウムブロミドでRNAを染色して写真をとり、脱色後NorthernMax transfer bufferを用いて転写膜に2時間転写した。湿ったままの状態でUVクロスリンカーにてRNAを転写膜に固定化した。ハイブリローターを用いて、ULTRAhybにて42度、30分間の回転前処理の後、前処理液を捨て、ビオチン化したネオマイシン耐性遺伝子と10mlのULTRAhyb液を加えて42度一夜振とう処理した。【００６４】
ULTRAhyb液を捨て、42度に保温したHigh Stringency bufferを15ml加え42度で30分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。浸る程度のWash bufferで転写膜を洗浄した。転写膜をBlocking bufferで30分間振とうした。液を捨て、10mlのBlocking bufferに2μlのStreptavidin-Alkaline Phosphataseを加えたもので室温30分間振とうした。転写膜を浸る程度のBlocking bufferで10分間振とうした。Wash bufferで5分間洗浄し、Wash bufferで転写膜を洗浄した後、CDP-Starで転写膜を覆い、5分後に余分な液を除き、1時間後にX線フィルムに感光させ、バンドの濃さからRNA量を比較した。その結果、ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でレプリコンRNAを50%減少させる効果が認められた（図５、６）。【００６５】
〔参考例２〕ウェスタンブロット解析によるミリオシンまたは式（II）で表される化合物のHCVタンパク合成阻害の測定
ウェスタン解析は以下の方法でおこなった。ミリオシン又は式（II）で表される化合物を１ｐMから100μMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、５％CO2存在下、37度にて培養した。72時間後に培地を捨て、PBS(Phosphate buffered saline)を加え、ピペッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。Phosphate用溶解液（50 mM Tris-HCl(pH7.5),0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin）を加えてピペッティングにより細胞を破壊し、高速遠心により上清を回収した。Dye Reagent (Nacalai tesque #074-27)にてタンパク定量をおこなった（ウシγグロブリン標準液、BIO-RAD#500-0005）。得られたタンパク質5μgを9−11%グラジエントゲル（第一化学薬品、＃317552）でトリス‐グリシン‐SDS緩衝液（BIO-RAD＃161-0772）で電気泳動した。分子量サイズマーカーはRainbow molecular weight markers（AmershamBioscience#RPN756）を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO-RAD#170-3930）にてメンブレン（PROTRAN BA85, Nitrocellulose transfer membrane(Shleicher&Schuell #10401196)に転写した。HCVタンパク由来の抗NS3ウサギ抗体を用いてウエスタン解析を行った。内部標準として抗アクチンウサギ抗体を用いた。その結果、 ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でHCVタンパク質の発現を50%減少させる効果が認められた（図７、８）。【００６６】
〔参考例３〕フモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性の測定
スフィンゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフィンゴシンからジヒドロセラミドを生成するジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素を特異的に阻害するフモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性を測定した。
ホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞(Huh-3-1)を5%ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコMEM（Gibco cat. no. 10569）に懸濁し96穴プレートに5000細胞／Wellで蒔き、5%CO2、37度で一夜培養した。約20時間後、フモニシンB1を順次３倍希釈し、終濃度1.37μMから1000μMになるように加え、さらに3日間培養した。アッセイプレートは２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアプレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、Wellあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0%として薬剤のIC50（50%阻害濃度）を算出した。一方、細胞毒性試験はセル・カウントキット−８（DOJIN Laboratories, cat. No.341-07761）をWellあたり10μl入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、約30分間放置後にOD450nmが1.0程度になった時点で測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0%として薬剤のIC50（50%阻害濃度）を算出した。
その結果、フモニシンB1は10-1000μMの濃度で、HCVレプリコン阻害活性を示すことがわかった（図９）。【００６７】
〔参考例４〕セリンパルミトイル転移酵素のsiRNA合成
SPTの阻害がHCVレプリコン活性を阻害しているかを確認する目的で、LCB1（SPTのヘテロダイマーのうち１サブユニット）を標的としたsiRNAを合成した。２種の特異的なsiRNA (si246、si633)は、LCB1ｃDNAの配列（GenBank Accession No. Y08685）をもとにデザインし、Qiagen社により合成された。コントロールsiRNA（配列番号：１５）は、LCB１の発現に影響しない配列を使用した。合成したsiRNA配列を配列番号：１３（si246）および配列番号：１４に示した。
〔参考例５〕ウエスタンブロット解析を用いたsiRNAによるLCB1のタンパク質発現阻害
6穴プレートに1.2×105個のHuh-3-1細胞をまき、３７℃、５％で一晩培養した。2.3μLの20μM siRNAを100μL のECR buffer(RNAiFect Kit中に含まれるBuffer) に加え、激しく攪拌し、さらに4μLのRNAiFectトランスフェクション試薬 (Qiagen cat. No. 301605) を加え、緩やかに攪拌して室温にて10分間放置した。siRNAは、最終濃度が35 nMになるように加え、4日間培養した。【００６８】
細胞を細胞溶解用緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin）に懸濁し、氷上で10分間放置した。15,000×gで10分間遠心し、上清を回収した。タンパク質の定量後、各サンプルの蛋白量を10μgに調製し、1/4量の５×SDSサンプル緩衝液（125 mM Tris-HCl (pH 6.5), 25 % Glycerol, 5% SDS, 0.25 % BPB, 5% 2-Mercaptoethanol）に加え、98℃5分処理する。ポリアクリルアミドゲルPAGミニ9/11（第一化学、cat. No. 317552）で電気泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブレンPROTRAN BA85 (Schleicher&Schuell cat. No. 10404496) にブロッティング (70V、3時間) する。メンブレンをBlocking Buffer(10% skim milk, 0.1% Tween 20/PBS)でBlockingを行う。1000倍希釈した抗LCB1抗体（Transduction cat. No. L89820）及び250倍希釈した抗アクチン(20-33) 抗体 (Sigma cat. No. A5060) で２時間室温にて反応させる。メンブレンを0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、二次抗体として、1000倍希釈した抗マウスIgG-HRP（Cell Signaling cat. No. A7076）及び抗ウサギIgG-HRP (Cell Signaling cat. No. A7074)を1時間室温にてそれぞれ反応させる。メンブレンを0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、ECLで1分間反応させ、オートラジオグラフィーにてシグナルを検出した。
その結果、図１０に示すように、コントロールsiRNAと比較して、si246、si633はともにLCB1のタンパク質発現量の減少が認められた。特に、si246では強く発現阻害が認められた。【００６９】
〔参考例６〕LCB1のノックダウンによるHCVレプリコン阻害活性効果
参考例５の結果にもとづいて、Huh-3-1細胞がLCB1発現を低下する条件下での細胞毒性及びHCVレプリコン活性の影響を以下の方法にて測定した。すなわち、96穴プレートに1ウエルあたり3500個の細胞をまき、３７℃、５％で一晩培養した。1.75 μLの2 μM siRNAを23.3μL のECR 緩衝液(RNAiFect Kit中に含まれる緩衝液) に加え、激しく攪拌し、さらに0.31μLのRNAiFectトランスフェクション試薬を加え、緩やかに攪拌して室温にて10分間放置した。siRNAは、最終濃度が35 nMになるように加え、4日間培養した。細胞毒性による影響は、培地に10μLのCell counting kit-8 (DOJIN Laboratories cat. No. 341-07761) を加えて３−４回ピペットで混和し、３７℃、１時間放置後、マイクロプレートリーダーEmax (Molecular devices) を用いて450 nmの吸光度で測定した。HCVレプリコン活性は、培養終了後、新しい培地に交換し、Steady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）を用い、Wellあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0％として薬剤のIC50（50％阻害濃度）を算出した。
その結果、図１１に示すように、LCB1の発現を抑制したsi246、si633処理した細胞では、コントロールsiRNA処理した細胞に対し、有意にHCVレプリコン活性を阻害した。この阻害効果は、LCB１の発現を強く抑制したsi246で強く認められた。また、同条件下においてsiRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められなかった。【００７０】
〔参考例７〕HCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験
式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体について、HCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験を行った。
まず、HCV−RNAのコピー数を定量するためにHCV−RNAの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Kriegerら（J. Virol.75:4614）の方法に従い、HCV遺伝子のIRES（Internal Ribosome Entry Site）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でHuh7細胞に導入し、G418耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞（Huh-3-1）を5％ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコＭＥＭ（Gibco cat. no. 10569-010）に懸濁し、96穴プレートに5000細胞／ウェルで播種し、5％ＣＯ2  37℃で一夜培養した。約20時間後、希釈した試験化合物をウェルあたり10μl加え、さらに3日間培養した。アッセイプレートを2系統用意し、1つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、ウェルあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、試験化合物未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ50（50％阻害濃度）を算出した。【００７１】
また、細胞毒性の測定にはCell counting kit-8（同人堂カタログNo. CK04）を用いた。すなわち、10μlのCell counting kit-8をクリアープレートに添加し、37度で30〜60分間保温した。96穴プレートリーダーにて波長450nm、対照波長630nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0％として薬剤のＣＣ50（50%細胞阻害濃度）を算出した。
上記のHCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験の結果を表２および３に示す。【００７２】
【表２】
2007043640.tif 000004
【００７３】
【表３】
2007043640.tif 000005
【００７４】
〔参考例８〕式（II）で表される化合物によるHCV レプリコンの阻害及び宿主細胞への毒性
HCVレプリコン細胞に、図１２に示された濃度の式（II）で表される化合物で処理を行い、レプリコン複製阻害活性及び細胞生存阻害活性を測定した。 レプリコンによるルシフェラーゼ活性はSteady-GLO luciferase assay system (Promega, cat. no. E2510)、細胞生存阻害活性は、Cell counting counting kit-8 (Dojin Laboratories, cat. no. 341-07761)を用いて測定したその結果図１２に示すように、式（II）で表される化合物による処理により濃度依存的にHCVレプリコン阻害活性を認めた（IC50＝2 nM)。また、式（II）で表される化合物の細胞毒性は、認められなかった（IC50>50nM)。【００７５】
〔参考例９〕免疫染色法による式（II）で表される化合物のHCV-NS3タンパク質発現阻害の確認
HCVレプリコン細胞を100 nMの式（II）で表される化合物で96時間処理した後、細胞を3.7％ホルムアルデヒドで固定した。３％ BSAでブロッキング後、NS3抗体（Fホフマン・ラロシュより供与）でインキュベートした後、洗浄した細胞をTexas-RedラベルしたウサギIgG（Molecular probe )でインキュベートし、蛍光顕微鏡で解析した(図１３)。その結果、図１３に示すように、HCV-NS3タンパク質は核周辺に存在したが、式（II）で表される化合物の添加によりそれが消失した(白色で示された部分はNS3タンパク質、灰色で示された部分はヘキスト３３342（Sigma, cat. no. B2261) で染色された核を示す）。【００７６】
〔参考例１０〕ウエスタンブロット解析による式（II）で表される化合物のNS3、NS5A及びNS5Bタンパク質の発現阻害
レプリコン細胞を100 ｎMの式（II）で表される化合物で図１４に示された時間（48時間および96時間）処理した。ウエスタンブロット解析は、参考例５と同様の方法にておこなった。その結果、時間依存的にHCVの非構造タンパク質NS3、NS5A及びNS5Bを各抗体で検出した結果、ウイルスタンパク質の発現レベルの低下が認められた（図１４）。【００７７】
〔参考例１１〕 式（II）で表される化合物によるSPT阻害活性
in vitroにおけるSPT阻害活性を測定するために、ヒト組み換え型SPT（ヘテロダイマーLCB1及びLCB2）タンパク質を調製した。ヒト肝臓のｃDNAライブラリー（Clontech, cat. no. 639307) から、LCB1及びLCB2のcDNAをRT-PCRによって取得し、Hisタグ付きのpBudCE4.1ベクター(Invitogen, cat. no. V532-20)に組み込んだ。HEK293細胞(ATCC, cat. no. CRL-1573)に遺伝子導入し、72時間後、細胞を溶解し、Ni-NTAアガロース（Qiagen, cat. no. 1018244)にてタンパク質を精製した。SPT活性は反応緩衝液[200 mM HEPES buffer (pH 8.0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.05 mM pyridoxal 5-phosphate, 0.2 mM palmitoyl-CoA, 0.1 mM L-serine, and 1 mCi [3H]serine (Amersham, cat. no. TRK308)]に精製したSPTを加え、15分37℃にて反応した。クロロホルム：メタノール（1：2, v/v)で抽出後有機層を水で2回再抽出した後、有機層の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、図１５に示すように、式（II）で表される化合物はIC50約10ｎM でSPT阻害活性を有していることが明らかとなった。   【００７８】
〔参考例１２〕式（II）で表される化合物によるセラミド、スフィンゴミエリンのde novo合成阻害
HCVレプリコン細胞を、図１６に示された濃度の式（II）で表される化合物で48時間処理した後、 [14C]セリンで３時間標識した。クロロホルム：メタノール（1：2, v/v)で抽出後、de novo合成されたセラミド（図１６Ａ)、スフィンゴミエリン（図１６Ｂ）を薄層クロマトグラフィーにより分離した。その結果、図１６に示すように、式（II）で表される化合物は濃度依存的に細胞内のセラミド及びスフィンゴミエリンのde novo合成を阻害した。【００７９】
〔参考例１３〕C２−セラミドによる式（II）で表される化合物の複製阻害の回復
式（II）で表される化合物によるHCVレプリコン阻害活性が、スフィンゴ脂質生合成経路に依存するか否かを明らかにするために、細胞性浸透性セラミド：C2−セラミド(Sigma, cat. no. A7191)を式（II）で表される化合物と同時にHCVレプリコン細胞に添加し、96時間培養した。細胞抽出物を用いて、実施例５と同様の方法にてウエスタンブロット解析を行った。その結果(図１７)、式（II）で表される化合物によるHCV複製阻害はC2セラミドの濃度に依存して抑制されることが明らかとなった。【００８０】
〔参考例１４〕ラフト生合成関連低分子化合物によるHCV複製阻害
HCVレプリコン細胞を、既知のSPT阻害剤ミリオシン (Sigma, cat. no. M1177）、セラミド合成阻害剤フモニシン B1(Sigma,  cat. no. F1147)、およびセラミド輸送阻害剤HPA-12 [KobayashiらOrg.lett.(2002)の合成方法に準じて合成）で処理した後、72時間後レプリコン活性及び生細胞数を測定した。その結果、いずれの化合物も細胞毒性を認めない濃度でHCVの複製を抑制する効果が認められた(図１８）。【００８１】
〔参考例１５〕式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（１）
HCVレプリコン細胞に1mMの式（II）で表される化合物を72時間添加した後、細胞抽出液を可溶化剤1% Nonidet P-40 (Nacalai tesque, cat. no. 252-23)にて1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、フラクション１−９まで分離し、ウエスタンブロット解析は、参考例５と同様な方法にて行った。その結果、図１９に示すように式（II）で表される化合物は可溶化剤耐性画分のNS5Bの発現レベルを低下させた。しかしながら、NS5Aや宿主のラフト結合タンパク質カベオリン-2において式（II）で表される化合物による影響は認められなかった。カベオリン-2の発現はカベオリン-2抗体（BD Transduction, cat. no. 610684)により確認した。【００８２】
〔参考例１６〕式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（２）
HCVレプリコン細胞に1mMの式（II）で表される化合物を72時間添加した後、細胞抽出液を1% NP-40で1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質（可溶化剤耐性）、非ラフトタンパク質を分離し、PBSで希釈し濃縮後ELISA解析により定量した。その結果、式（II）で表される化合物は、NS5Bにおいて有意にラフト上から解離が認められた(図２０）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
これまで、HCV遺伝子の機構と機能の解明が行われ、HCVの非構造タンパク質を標的としたHCV治療剤の開発が進められていたが、非構造タンパク質自体が複製の過程で変異を起こす可能性があるため、効果的な治療剤の開発が困難であった。【００８４】
本発明により、スフィンゴ脂質がHCVタンパク質の特定の部位において強く結合することがわかり、ホスト細胞内でのウイルスの複製のメカニズムが明らかとなった。これらの結合を阻害する化合物が、HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となるものと考えられる。
本発明の知見は、スフィンゴ脂質およびHCVタンパク質の結合を新規なターゲットとした抗HCV剤の開発に大きく貢献するものである。【００８５】
これまでの抗HCV剤は、標的となるカスケードが不明確であり副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的がスフィンゴ脂質およびHCVタンパク質の結合作用であり、結合部位もより明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。
【図１】
2007043640.tif 000006
【図２】
2007043640.tif 000007
【図３】
2007043640.tif 000008
【図４】
2007043640.tif 000009
【図５】
2007043640.tif 000010
【図６】
2007043640.tif 000011
【図７】
2007043640.tif 000012
【図８】
2007043640.tif 000013
【図９】
2007043640.tif 000014
【図１０】
2007043640.tif 000015
【図１１】
2007043640.tif 000016
【図１２】
2007043640.tif 000017
【図１３】
2007043640.tif 000018
【図１４】
2007043640.tif 000019
【図１５】
2007043640.tif 000020
【図１６】
2007043640.tif 000021
【図１７】
2007043640.tif 000022
【図１８】
2007043640.tif 000023
【図１９】
2007043640.tif 000024
【図２０】
2007043640.tif 000025
【配列表】
2007043640000001.app
【国際調査報告】
2007043640.tif 000026
2007043640.tif 000027
2007043640.tif 000028
2007043640.tif 000029
2007043640.tif 000030
2007043640.tif 000031
2007043640.tif 000032
2007043640.tif 000033