(57)【要約】  本発明は、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、新規なＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのインヒビター・タンパク質を提供し、本発明にかかるヒト血液凝固Ｘａ因子に対するＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのインヒビター・タンパク質は、アミノ酸配列  Ｉ：    SKKRP  DFCYL  PADDG  PCRAF  IPSFY  YNSTS  NECNT  FIYGG  CYGNA  NKFES  MDECR  KTCVA  SA      62を有するＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒に由来するＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのインヒビター・タンパク質ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ；あるいは、アミノ酸配列  II：C  RQNRP  DFCYL  PAVEG  PCRAY  IRSFF  YNSTS  NECEK  FFYGG  CYGNA  NKFET  RDECR  KTCVA  SA      63を有するＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒に由来するＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのインヒビター・タンパク質ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ；ならびに、その改変体タンパク質である。
2006131958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質であって、
下記のアミノ酸配列Ｉ（配列番号：１）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  F      20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質。
【請求項２】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質であって、
下記のアミノ酸配列II（配列番号：２）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  V  E  G  P  C  R  A      20
Y  I  R  S  F  F  Y  N  S  T  S  N  E  C  E  K  F  F  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  E  T  R  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質。
【請求項３】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄの変異体であって、
下記のアミノ酸配列III（配列番号：３）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  Y    20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G    40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A    60
S  A  T  R  R  P  T    67
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質変異体。
【請求項４】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄの改変体であって、
下記のアミノ酸配列IＶ（配列番号：７）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A  X3      20
I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質改変体。
【請求項５】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖの改変体であって、
下記のアミノ酸配列Ｖ（配列番号：８）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A      20
X3  I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質改変体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載されるｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体を、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有する活性成分として、ヒト血液凝固Ｘａ因子阻害剤の調製のために使用する
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒由来のトリプシン・インヒビター様たんぱく質  ｂｉｔｏｒａｎ、ならびに、その血液凝固因子Ｘａ阻害剤としての使用に関する。特には、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中から単離されたトリプシン・インヒビター様タンパク質  ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ、それらの改変体ならびに、その血液凝固因子Ｘａ阻害剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリン凝塊形成は、その直接的な起因は、トロンビンの作用により、フィブリノーゲンを構成しているα−鎖（フィブリノペプチドＡ）やβ−鎖（フィブリノフィブリノペプチドＡ）の切断に起因して、小さなペプチド断片（フィブリン単量体）が生成され、引き続き、ペプチド断片（フィブリン単量体）が重合される結果、不溶性のフィブリン（フィブリン多量体）が形成される現象である。同時に、トロンビンは、ＸIII因子の活性化を引き起こし、活性化された酵素：ＸIIIａ因子は、フィブリン分子の間の共有結合形成を触媒するため、フィブリン分子間は架橋され、分解され難い凝塊となる。【０００３】
実際には、前記のトロンビンの作用に因る不溶性のフィブリン（フィブリン多量体）形成に先立ち、血液中において、プロトロンビンアクチベータの形成過程と、このプロトロンビンアクチベータの有するセリンプロテアーゼ活性により、プロトロンビン（トロンビン前駆体）が二つの断片へと分割され、その一方の断片として、トロンビンが生成される過程が存在している。プロトロンビンアクチベータは、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素タンパク質；Ｘａ因子と、その補助因子である、Ｖａ因子と凝固促進性脂質とで構成されている。なお、そのプロ酵素であるＸ因子からＸａ因子へと変換される過程は、直接的には、ＶIIａ因子／組織因子複合体による活性化、さらに、間接的に、IＸａ因子／ＶIIIa因子リン脂質複合体による活性化を受ける機構と考えられている。また、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性は、ペプチド鎖中に含まれる塩基性アミノ酸残基リジン、アルギニンのＣ末側でペプチド鎖を切断するエンドペプチダーゼ活性である。すなわち、Ｘａ因子は、膵液中に含まれるセリンプロテアーゼの代表であるトリプシンと同様の機能を有している。【０００４】
一方、血漿中にＸａ因子が高い濃度で生成されると、血漿中に存在しているプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＥＰＩ）  あるいは  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＬＡＣＩ））に結合し始める。その結果、生成されるＥＰＩ／Ｘａ（ＬＣＡＩ／Ｘａ）複合体は、さらに、組織因子上に結合すると、四量体型のＶIIａ因子／組織因子／ＥＰＩ／Ｘａ（ＬＣＡＩ／Ｘａ）複合体となり、Ｘａ因子自体の酵素活性が阻害される。【０００５】
上述するＸａ因子に加えて、ＶIIａ因子もセリンプロテアーゼ活性を有する酵素タンパク質であり、これら活性型酵素タンパク質に選択的に結合し、そのプロテアーゼインヒビターとして機能する、内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩの存在が確認されている。ヒトのＸａ因子に特異的な内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩは、Ｋｕｎｉｔｚ  IIと称され、ヒトのＶIIａ因子に特異的な内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩは、Ｋｕｎｉｔｚ  Ｉと称され、いずれも、ウシ膵液由来のトリプシンに対しても、阻害活性を示すことが確認されている。さらに、ヒトの血漿中には、ウシ膵液由来のトリプシンに対して阻害活性を有する、Ｋｕｎｉｔｚ  IIIと称される、第三の内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩが存在している。【０００６】
その他、ウシ膵液由来のトリプシンを阻害する蛋白性インヒビター：ＢＰＴＩの構造解析もなされており、分子内にＣｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）が三箇所形成されることで三次元構造を構成し、トリプシンの活性部位に対して、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ（Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’）の部位において、結合していることが判明している。上記の内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩである、Ｋｕｎｉｔｚ  Ｉ、Ｋｕｎｉｔｚ  II、Ｋｕｎｉｔｚ  IIIと、前記トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）のアミノ酸配列を対比させると、これらの内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩも、対応する位置に分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）が可能なＣｙｓが存在しており、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）が三箇所形成されることで三次元構造を構成していると、推定されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述するフィブリン凝塊形成過程において、その直接的な起因は、トロンビンの作用により、フィブリノーゲンを構成しているα−鎖（フィブリノペプチドＡ）やβ−鎖（フィブリノフィブリノペプチドＡ）の切断であり、このトロンビンの酵素活性を阻害することにより、フィブリン凝塊形成を抑制することができる。トロンビンの酵素活性阻害に直接関与する血漿プロテアーゼインヒビターとして、アンチトロンビンIIIが知られている。このアンチトロンビンIIIのインヒビター活性は、血液中にヘパリンを投与すると、遅延型から速攻性の酵素インヒビターへと変移し、アンチトロンビンIIIの阻害活性を格段に高める。【０００８】
一方、トロンビンは、プロトロンビンアクチベータの有するセリンプロテアーゼ活性により、プロトロンビン（トロンビン前駆体）が二つの断片へと分割される結果、活性型酵素タンパク質として生成するので、プロトロンビンアクチベータの有するセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより、トロンビンの生成を抑制すると、結果的に、フィブリン凝塊形成の抑制が可能となる。この観点から、プロトロンビンアクチベータの有するセリンプロテアーゼ活性阻害、具体的には、プロトロンビンアクチベータのセリンプロテアーゼ活性の主体である、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性阻害剤も、フィブリン凝塊形成の抑制の医薬用途に適合するものとなる。【０００９】
Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性を阻害する機能を有する、内因性の血漿プロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚ  IIは、体表的なトリプシン・インヒビター：ＢＰＴＩと相同性を有するアミノ酸配列を有しており、その三次元構造も類似していると推定されている。すなわち、トリプシン・インヒビター：ＢＰＴＩの阻害活性部位；Ｃｙｓ１４−Ｌｙｓ１５−Ａｌａ１６−Ａｒｇ１７−Ｉｌｅ１８（Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’）の部位に相当する部分配列は、ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚ  II中では、Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ｇｌｙ１９−Ｔｙｒ２０−Ｉｌｅ２１であり、この部位を利用して、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性中心に結合することで阻害を達成していると推定される。【００１０】
Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性に対して特異的かつ高い阻害能を有する、血漿由来でない新規なプロテアーゼ・インヒビター・タンパク質は、フィブリン凝塊形成の抑制を目的とする医薬用途の観点から、新たな医薬用タンパク質の候補となる。【００１１】
本発明は、前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性に対して高い阻害能を有する、血漿由来でない新規なプロテアーゼ・インヒビター・タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性を阻害する機能を有する、内因性の血漿プロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚ  IIなどと、類似する三次元構造を有すると推定されるＫｕｎｉｔｚ型タンパク質が、様々なヘビが産生するヘビ毒中に存在している点に着目し、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性を阻害する機能を有する、ヘビ毒由来の新規なＫｕｎｉｔｚ型タンパク質の探索を試みた。その探索の結果、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を示す物質が含まれることを見出した。さらに、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を指標として、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含有されるＸａ因子阻害剤の分離を試みた結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、見掛けの分子量１１ｋＤａを示す水溶性タンパク質が、Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を示す成分として、分離された。このＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒由来のＸａ因子阻害活性を有する、見掛けの分子量１１ｋＤａを示すタンパク質に、「ｂｉｔｏｒａｎ」という名称を付した。さらに、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、Ｘａ因子阻害活性を有するｂｉｔｏｒａｎタンパク質評品を利用して、かかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質のアミノ酸配列の解析を進めたところ、実際は、極めて類似するアミノ酸配列を有する二種のタンパク質が前記評品サンプル中に混在していることは判明した。そのアミノ酸配列上の特徴的な相違を考慮し、一方に、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ」、他方に、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ」という名称を付した。【００１３】
加えて、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ」タンパク質、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ」タンパク質のアミノ酸配列と、体表的なトリプシン・インヒビター：ＢＰＴＩのアミノ酸配列とを対比させたところ、相当に高い相同性を示すことが確認され、少なくとも、その三次構造は、類似したものであると推定された。その知見に基づき、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質が示すＸａ因子阻害活性をもたらす阻害活性部位の推定を行った。さらに、推定される阻害活性部位の立体配置に影響を及ぼさず、また、全体の三次元構造形成にも影響を及ぼさない、すなわち、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質が示すＸａ因子阻害活性をもたらす阻害活性を保持しつつ、部分的に天然のアミノ酸配列を変更することも可能であることも見出した。すなわち、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の有するＸａ因子阻害活性と遜色のない阻害活性を発揮可能な、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の改変体の設計指針をも見出した。【００１４】
本発明者は、これらの一連の知見に基づき、本発明を完成するに到った。【００１５】
すなわち、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質は、
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質であって、
下記のアミノ酸配列Ｉ（配列番号：１）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  F      20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００１６】
また、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質であって、
下記のアミノ酸配列II（配列番号：２）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  V  E  G  P  C  R  A      20
Y  I  R  S  F  F  Y  N  S  T  S  N  E  C  E  K  F  F  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  E  T  R  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００１７】
さらに、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質変異体の一つの形態は、
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄの変異体であって、
下記のアミノ酸配列III（配列番号：３）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  Y    20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G    40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A    60
S  A  T  R  R  P  T    67
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００１８】
加えて、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質改変体は、一般的に表現すると、
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄの改変体であって、
下記のアミノ酸配列IＶ（配列番号：７）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A  X3      20
I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００１９】
同様に、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質改変体は、一般的に表現すると、
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質：ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖの改変体であって、
下記のアミノ酸配列Ｖ（配列番号：８）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A      20
X3  I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  F  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００２０】
一方、本発明は、上記の本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体の用途発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかる用途発明は、
上述する本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体を、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有する活性成分として、ヒト血液凝固Ｘａ因子阻害剤の調製のために使用する
ことを特徴とするｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体の使用である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明にかかるＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒に由来するｂｉｔｏｒａｎタンパク質、特には、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのトリプシン・インヒビター様タンパク質であり、なかでも、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示すため、フィブリン凝塊形成過程において、その起因となる、プロトロンビン（トロンビン前駆体）からトロンビンが生成される過程を抑制する目的で利用可能な、ヒト血液凝固Ｘａ因子に対する阻害剤として、好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害活性を有するｂｉｔｏｒａｎタンパク質の逆相ＨＰＬＣカラム精製段階における溶出画分（横バーで表示）と、精製済みｂｉｔｏｒａｎタンパク質のＳＤＳ・ＰＡＧＥ分析結果（Ｒ：還元状態、ＮＲ：非還元状態）を示す図である。
【図２】図２は、ヘビ研から入手したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害活性を有するｂｉｔｏｒａｎタンパク質の逆相ＨＰＬＣカラム精製段階における溶出画分（横バーで表示）と、精製済みｂｉｔｏｒａｎタンパク質のＳＤＳ・ＰＡＧＥ分析結果（Ｒ：還元状態、ＮＲ：非還元状態）を示す図である。
【図３】図３は、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、二種のｂｉｔｏｒａｎタンパク質；ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖのアミノ酸配列の対比と、その三次元構造中に存在する三箇所のＣｙｓ−Ｃｙｓ結合、ならびに、糖鎖修飾部位を示す図である。図中、−ＣＨＯは、糖鎖の修飾部位を示し、→は、阻害活性部位中、トリプシン型セリンプロテアーゼの切断部位に相当する部位を示す。
【図４】図４は、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質（ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖの混合物）が示す血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性と、ＳＢＴＩ（Ｋｕｎｉｔｚ型大豆由来トリプシン・インヒビター）が示す血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性の評価結果を対比する図である。
【図５】図５は、種々のヘビ由来のヘビ毒中に含まれる、トリプシン・インヒビター活性を有するＫｕｎｉｔｚ型成熟タンパク質、前駆体タンパク質と、本発明にかかるＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ由来のヘビ毒中に含まれる、血液凝固Ｘａ因子に対する阻害活性を有する、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質；ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ、ｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質と、そのアミノ酸配列の対比を示す図である。
【図６】図６は、ＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺から抽出されたｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから、クローニングされたｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列と、そのＯＲＦの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を示す図である。
【図７】図７は、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、二種のｂｉｔｏｒａｎタンパク質；ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖのアミノ酸配列と、ＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺からクローニングされたｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡ中、ＯＲＦの塩基配列にコードされているアミノ酸配列との対比を示す図である。
【図８】図８は、種々の生物由来のＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質の阻害活性部位の部分アミノ酸配列と、本発明にかかるＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ由来のヘビ毒中に含まれる、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質；ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖの阻害活性部位の部分アミノ酸配列との対比を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に、本発明をより詳しく説明する。【００２４】
本発明にかかるＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質；ｂｉｔｏｒａｎは、後述する実施例において説明するように、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ由来のヘビ毒中から単離されたものである。具体的には、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒中から分離、精製された、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質は、
下記のアミノ酸配列Ｉ（配列番号：１）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  F      20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
を有するｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質と、
下記のアミノ酸配列II（配列番号：２）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  V  E  G  P  C  R  A      20
Y  I  R  S  F  F  Y  N  S  T  S  N  E  C  E  K  F  F  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  E  T  R  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
を有するｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質である。また、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、ヘビ研から入手したヘビ毒中から分離、精製された。いずれも、そのＮ末は、翻訳後のプロセシングにより、切除を受けた上で、毒腺組織細胞から、成熟型タンパク質として分泌され、ヘビ毒中のタンパク質成分となっている。このＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、図４に示すように、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す。【００２５】
他に、南アフリカ共和国のＳＡＶ社から購入された、冷凍凍結されたＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺中から、この成熟型タンパク質を与える、ｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質の翻訳に使用されるｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製し、クローニングを行ったところ、図６に示す塩基配列（配列番号：４）を有する、下記のアミノ酸配列ＶI（配列番号：５）：
M  S  S  G  G  L  L  L  L  L  G  L  L  I  L  W  T  E  Q  T  P  V  S    23
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  Y                43
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G                63
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A                83
S  A  T  R  R  P  T                                                                    90
のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡがクローニングされた。このアミノ酸配列ＶI（配列番号：５）と、アミノ酸配列Ｉ（配列番号：１）、アミノ酸配列II（配列番号：２）とを比較すると、図７に示すように、アミノ酸配列ＶI（配列番号：５）とアミノ酸配列Ｉ（配列番号：１）との間に極めて高い相同性が見出され、アミノ酸配列ＶI（配列番号：５）は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質に相当するものの前駆体タンパク質のアミノ酸配列と判断される。このアミノ酸配列ＶI（配列番号：５）を有する前駆体タンパク質から得られる、成熟型ｂｉｔｏｒａｎタンパク質に、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’」という名称を付した。そのｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質と同様に、そのＮ末は、翻訳後のプロセシングにより、切除を受けた上で、下記のアミノ酸配列III（配列番号：３）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  D  D  G  P  C  R  A  Y    20
I  P  S  F  Y  Y  N  S  T  S  N  E  C  N  T  F  I  Y  G  G    40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  S  M  D  E  C  R  K  T  C  V  A    60
S  A  T  R  R  P  T    67
を有する成熟型タンパク質として、分泌されると判断される。【００２６】
ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質と、その生理的な機能は同等なものと考えられ、すなわち、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質であると判断される。【００２７】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含まれる、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質、ならびに、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質前駆体のアミノ酸配列と、既に報告されている、各種のヘビのヘビ毒中に含まれているＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質、あるいは、その前駆体のアミノ酸配列とを比較すると、図５に示すように、相同性が見出され、これらは、一つのファミリーを構成していると判断される。そして、上記のｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質前駆体のアミノ酸配列中、Ｎ末の下線を付した部分は、他のヘビ毒中に含まれているＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質の前駆体でも、対応するアミノ酸配列を示しており、成熟型タンパク質として分泌される際には、そのＮ末は、翻訳後のプロセシングにより、切除を受けると判断される。【００２８】
Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質である、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、分泌される際には、前駆体タンパク質のＮ末は、翻訳後のプロセシングにより、切除を受けるとともに、体表的なトリプシン・インヒビター：ＢＰＴＩと同様も、分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を形成して、三次元構造を有するものとなる。すなわち、図３に模式的に示すような、分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を有する構造を形成し、また、Ａｓｎ残基上に糖鎖修飾を有する形態となる。蛋白性インヒビター：ＢＰＴＩにおいて、トリプシンの活性部位との結合に関与する部分とされている、Ｃｙｓ１４−Ｌｙｓ１５−Ａｌａ１６−Ａｒｇ１７−Ｉｌｅ１８（Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’）の部位に相当するものとして、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を与える、阻害活性部位として、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９−Ｐｈｅ２０−Ｉｌｅ２１が、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質では、Ｃｙｓ１８−Ａｒｇ１９−Ａｌａ２０−Ｔｙｒ２１−Ｉｌｅ２２が特定される。【００２９】
なお、前述するｂｉｔｏｒａｎタンパク質の阻害活性部位は、全体の三次元構造によって、ヒト血液凝固Ｘａ因子に対して、適正な結合が可能な立体配置に保持されていると判断される。すなわち、トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）の三次元構造形成に不可欠な三箇所の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合；［Ｃｙｓ５：Ｃｙｓ５５］、［Ｃｙｓ１４：Ｃｙｓ３８］、［Ｃｙｓ３０：Ｃｙｓ５１］に対応して、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、［Ｃｙｓ８：Ｃｙｓ５８］、［Ｃｙｓ１７：Ｃｙｓ４１］、［Ｃｙｓ３３：Ｃｙｓ５４］の三組、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質では、［Ｃｙｓ９：Ｃｙｓ５６］、［Ｃｙｓ１８：Ｃｙｓ４２］、［Ｃｙｓ３４：Ｃｙｓ５５］の三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成が、全体の三次元構造を決定している。この三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成は、ベプチド鎖が、この三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合に適する配置を取った上で、その際、近接するＣｙｓ残基上の−ＳＨ間で、−Ｓ−Ｓ−結合が形成される。【００３０】
実際に、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質と、種々の生物由来のＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質と、その阻害活性部位の部分アミノ酸配列を比較すると、図８に示すように、三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合に利用されるＣｙｓの位置は共通している。一方、阻害活性部位が存在するペプチド鎖、すなわち、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質のＣｙｓ１７−Ｃｙｓ３０の間、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質のＣｙｓ１８−Ｃｙｓ３１の間の部分的アミノ酸配列を比較すると、必ずしも、相当性は高くない。全体的な三次元構造は、類似するもの、かかる部分的アミノ酸配列の相違が、各Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質における阻害活性部位の立体配置に影響を及ぼし、その阻害特性を決定する要因となっていると推定される。図５に示す、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質、ならびに、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質前駆体のアミノ酸配列と、既に報告されている、各種のヘビのヘビ毒中に含まれているＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質、あるいは、その前駆体のアミノ酸配列との比較においても、同様の推定がなされる。【００３１】
換言するならば、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質、ならびに、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質前駆体のアミノ酸配列中、極めて高い相同性を示す部分、すなわち、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質のＡｒｇ３−Ａｌａ６２の間、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質のＡｒｇ４−Ａｌａ６３の間のアミノ酸配列を本質的に保持すると、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の示す三次元構造を保持し、その結果、阻害活性部位の立体配置を、ヒト血液凝固Ｘａ因子に対して、適正な結合が可能な立体配置に保持することが可能であると結論できる。具体的には、かかる領域の部分アミノ酸配列として、下記のアミノ酸配列ＶII：
R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A  X3  
I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G  G  
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V  A  
S  A  
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有する改変体タンパク質は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質と同様に、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示す、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質となると結論できる。【００３２】
本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質改変体は、前記のアミノ酸配列ＶIIを保持するものであり、特に、
本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質改変体は
下記のアミノ酸配列IＶ（配列番号：７）：
S  K  K  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A  X3      20
I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G  G      40
C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V  A      60
S  A      62
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質であり、
同様に、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質改変体は、
下記のアミノ酸配列Ｖ（配列番号：８）：
C  R  Q  N  R  P  D  F  C  Y  L  P  A  X1  X2  G  P  C  R  A      20
X3  I  X4  S  F  X5  Y  N  S  T  S  N  E  C  X6  X7  F  X8  Y  G      40
G  C  Y  G  N  A  N  K  F  E  X9  X10  D  E  C  R  K  T  C  V      60
A  S  A      63
（但し、
X1=D  or  V;  X2=D  or  E;  X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X5=Y  or  F;  
X6=N  or  E;  X7=T  or  K;  X8=I  or  F;  X9=S  or  T;  X10=M  or  R  である）
を有するＫｕｎｉｔｚ型タンパク質である。【００３３】
なお、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質は、蛋白性インヒビター：ＢＰＴＩとトポロジー的には同じ立体構造を有すると推定され、従って、ｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質において、ヒト血液凝固Ｘａ因子との結合形成に関与すると推定される阻害活性部位は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質の−Ｇｌｙ１５−Ｐｒｏ１６−Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９−Ｐｈｅ２０−Ｉｌｅ２１−Ｐｒｏ２２−Ｓｅｒ２３−…−Ｃｙｓ３３の間、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の−Ｇｌｙ１６−Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１８−Ａｒｇ１９−Ａｌａ２０−Ｔｙｒ２１−Ｉｌｅ２２−Ａｒｇ２３−Ｓｅｒ２４−…−Ｃｙｓ３４の間の部分的アミノ酸配列が形成する部分構造により構成されている。一方、ｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質の全体の立体構造を支配する、三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合形成に関与する、前記の部分的アミノ酸配列のＮ末側の部分アミノ酸配列、ならびに、Ｃ末側の部分アミノ酸配列は、図５、図８に示すアミノ酸配列の対比に示すように、他の各Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質と相当に高い類似性を有している。従って、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質の−Ｇｌｙ１５−Ｐｒｏ１６−Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９−Ｐｈｅ２０−Ｉｌｅ２１−Ｐｒｏ２２−Ｓｅｒ２３−…−Ｃｙｓ３３の間、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の−Ｇｌｙ１６−Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１８−Ａｒｇ１９−Ａｌａ２０−Ｔｙｒ２１−Ｉｌｅ２２−Ａｒｇ２３−Ｓｅｒ２４−…−Ｃｙｓ３４の間の部分的アミノ酸配列と、他の各Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質由来の、前記の部分的アミノ酸配列のＮ末側の部分アミノ酸配列、ならびに、Ｃ末側の部分アミノ酸配列とを連結した、キメラ型タンパク質においても、ヒト血液凝固Ｘａ因子との結合形成に関与すると推定される阻害活性部位の立体構造を保持することも可能と考えられる。但し、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質中の、［Ｃｙｓ１７：Ｃｙｓ４１］、［Ｃｙｓ３３：Ｃｙｓ５４］の二組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質中の、［Ｃｙｓ１８：Ｃｙｓ４２］、［Ｃｙｓ３４：Ｃｙｓ５５］の二組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合に関して、その形成効率（ホールディング効率）は、キメラ型タンパク質においては、必ずしも、本来のｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質と同等とは結論できない。一方、前記アミノ酸配列ＶIIを選択する範囲では、全体の三次元構造を形成する効率（ホールディング効率）は、本来のｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質と同等と予想され、改変体タンパク質として、より好ましいものである。【００３４】
加えて、阻害活性部位に相当する部分的アミノ酸配列に関しては、
G  P  C  R  A  X3  I  X4 X11 X12 X13 X14  N  S  T  S  N  E  C
（但し、X3=F  or  Y;  X4=P  or  R;  X11=A  or  S;  X12=F  or  Y;  X13=F  or  Y;  X14=F  or  Y  である）を選択すると、本来のｂｉｔｏｒａｎ  タンパク質と同等の部分構造を保持でき、従って、ヒト血液凝固Ｘａ因子に対する阻害活性を保持できると推定される。【００３５】
なお、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質改変体は、上記のｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’タンパク質前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を基に、変異操作を施すことで、かかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質改変体をコードする遺伝子を作成した上で、組換え発現タンパク質として製造することが可能である。この組換え発現タンパク質を製造する際、その発現系としては、例えば、トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）などのＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質の組換え発現に利用された発現系が好適に利用可能である。なお、その際、成熟型タンパク質となる際、切除されるＮ末のリーダー配列、あるいは、シグナル配列部分は、利用される発現系に応じて、適宜、望ましいものを選択することが可能である。【００３６】
なお、本発明にかかるＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ由来のＫｕｎｉｔｚ型トリプシン・インヒビター様タンパク質；ｂｉｔｏｒａｎの前駆体タンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号：４）を、クローニング・ベクター：ｐＧＥＭ  Ｔ−eａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒのクローニング・サイト中に挿入したベクター：bitoran  D-pGEM  T-easyを、宿主大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株に導入して得られた形質転換株（bitoran  D/XL-1）は、ＫＭ１の名称を付し、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３５として、国際寄託（平成１７年５月１３日付け）がなされている。【００３７】
また、本発明にかかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体を、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有する活性成分として、ヒト血液凝固Ｘａ因子阻害剤の調製のために使用する際、かかるｂｉｔｏｒａｎタンパク質または、その改変体の含有比率は、その阻害活性能（ＩＣ５０）に基づき、適宜設定することが可能である。
【実施例】
【００３８】
以下に、本発明にかかるヘビ毒由来のトリプシン・インヒビター様ペプチド  ｂｉｔｏｒａｎならびに、その薬理的な機能に関して、より具体的に説明する。【００３９】
（ヘビ毒由来のトリプシン・インヒビター様ペプチド  ｂｉｔｏｒａｎの単離）
本発明者らは、ヘビ毒中に含まれる種々のタンパク質が有する生理学的な機能について、研究を進めたところ、トリプシン型のセリンプロテアーゼの活性を阻害するタンパク質が含まれることを見出した。具体的には、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒に含まれる種々のタンパク質中に、ヒトの血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性を阻害する機能を示すタンパク質が含まれていることを見出した。【００４０】
先ず、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒中に含有される種々のタンパク質成分から、ヒトのＸａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害能を有するタンパク質成分の分離を下記の手順で行った。分離には、カラム・クロマトグラフィーを利用し、カラム・クロマトグラフィー装置は、ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍと、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（Ａｍｅrｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎsｅ社）を使用し、液温は４℃とした。カラム溶出液中に含有されるタンパク質成分の検出は、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓにより、波長２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を観測し、含有されるタンパク質量の指標とした。【００４１】
ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）に溶解し、２ｍＬ（濃度２５０ｍｇ／ｍＬ）の粗ヘビ毒溶液とした。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ゲル濾過カラム（φ２．６ｃｍ×Ｌ６０ｃｍ）に、粗ヘビ毒溶液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。各２ｍＬの溶出画分を分取し、各溶出画分について、血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性の有無を確認する。その際、血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性アッセイでは、合成基質Ｂｏｃ−ロイシル−グルシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩を使用し、血液凝固Ｘａ因子のプロテアーゼ活性により、アルギニン残基のＣ末での切断による反応産物濃度（Ｃproduct：ｐ−ニトロアニリン濃度）を測定し、被験物質の添加の無い状態の生成濃度：Ｃproduct０と、被験物質を添加した状態の生成濃度：Ｃproductとから、阻害率を（Ｃproduct０−Ｃproduct）／Ｃproduct０として算出する。前記阻害活性アッセイにおいて、阻害活性を示した画分をプールした。【００４２】
次いで、同Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  カラム（φ１．６ｃｍ×Ｌ６０ｃｍ）に、プールされた阻害活性画分をアプライした。カラムからの溶出は、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、８カラム容量を、０．７Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配条件で行った。各２ｍＬの溶出画分を分取し、各溶出画分について、上記の阻害活性アッセイを利用して、阻害活性の有無を確認する。０．１Ｍ  ＮａＣｌ付近で溶出される画分のみに、阻害活性が見出された。この阻害活性を示した画分を、分取後、凍結乾燥し、タンパク質成分を回収した。【００４３】
さらに精製するため、前記凍結乾燥タンパク質成分を、逆相ＨＰＬＣ用のＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８  ＡＲ−３００カラム（φ４．６ｍｍ×Ｌ２５０ｍｍ）にアプライした。図１には、逆相ＨＰＬＣカラム精製における、かかるプロテアーゼ阻害活性を示すタンパク質成分の溶出画分を横バーによって表示している。この逆相ＨＰＬＣ精製済みサンプルについて、非還元状態（ＮＲ）と還元状態（Ｒ）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析を行った。図１中に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、単一のバンドを示すが、非還元状態（ＮＲ）と還元状態（Ｒ）とで見掛けの分子量に相違があり、分子内にＣｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）による架橋がなされていることは判明した。【００４４】
以上のカラム精製条件で単離された、ヒトの血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有するタンパク質に、「ｂｉｔｏｒａｎ」という呼称を付した。上記のカラム精製によって、粗ヘビ毒の凍結乾燥物２５０ｍｇから、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品０．６５ｍｇが得られた。【００４５】
加えて、蛇研から入手されたＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒からも、ヒトの血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有するタンパク質の単離を試みた。【００４６】
蛇研から入手したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒５００ｍｇを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）２５ｍＬに溶解し、濃度２０ｍｇ／ｍＬの粗ヘビ毒溶液２５ｍＬとした。次いで、同Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  カラム（φ１．６ｃｍ×Ｌ１０ｃｍ）に、プールされた阻害活性画分をアプライした。カラムからの溶出は、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、８カラム容量を、０．７Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配条件で行った。各２ｍＬの溶出画分を分取し、各溶出画分について、上記の阻害活性アッセイを利用して、阻害活性の有無を確認する。０．１Ｍ  ＮａＣｌ付近で溶出される画分のみに、阻害活性が見出された。【００４７】
この阻害活性を示した画分は、分取後、Ａｍｉｃｏｎ  ３０００  ＭＷ  ｃｕｔ−ｏｆｆ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を利用して、濃縮した。同Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ゲル濾過カラム（φ２．６ｃｍ×Ｌ６０ｃｍ）に、前記濃縮済み粗精製画分を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。各２ｍＬの溶出画分を分取し、各溶出画分について、血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害活性の有無を確認する。前記阻害活性アッセイにおいて、阻害活性を示した画分をプールした。【００４８】
プールされた阻害活性を示した画分は、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ、  ｐＨ６．０）で希釈した上で、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  カラム（φ１．６ｃｍ×Ｌ１１ｃｍ）にアプライした。その際、阻害活性を示すタンパク質成分は、素通り画分に回収されていた。この回収された素通り画分は、Ａｍｉｃｏｎ  ３０００  ＭＷ  ｃｕｔ−ｏｆｆを用いて、同様に濃縮する。【００４９】
最終的に、この濃縮済みの素通り画分を、逆相ＨＰＬＣ用のＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８  ＡＲ−３００カラム（φ４．６ｍｍ×Ｌ２５０ｍｍ）にアプライして、精製を図った。溶出には、０．１％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、ＣＨ３ＣＮ濃度０−６０％、２４０分間直線勾配の条件を選択した。【００５０】
その際、阻害活性を示すタンパク質成分は、図３に示す横バーの位置に溶出されている。この逆相ＨＰＬＣ精製済みサンプルについて、非還元状態（ＮＲ）と還元状態（Ｒ）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析を行った。図３中に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、単一のバンドを示すが、非還元状態（ＮＲ）と還元状態（Ｒ）とで見掛けの分子量に相違があり、分子内にＣｙｓ−Ｃｙｓ結合による架橋がなされていることが確認される。【００５１】
以上のカラム精製条件で、蛇研から入手したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒５００ｍｇから、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品０．７ｍｇが得られた。【００５２】
（ｂｉｔｏｒａｎのアミノ酸配列分析）
上記のように、単離されたプロテアーゼ阻害活性を示すタンパク質成分は、分子内にＣｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）による架橋がなされているので、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）を還元し、Ｃｙｓ残基の側鎖上のスルファニル基（−ＳＨ）にＳ−アルキル化処理を施した。次いで、Ｓ−アルキル化が完了したペプチドを、精製単離するため、再び、逆相ＨＰＬＣ用カラムにアプライした。その際、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒から取得されたｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品では、逆相ＨＰＬＣ用カラムから溶出されるＳ−アルキル化ペプチドのピークを観察したところ、二本のピークが見出された。この二本のピークを示すＳ−アルキル化ペプチドをそれぞれ分取し、凍結乾燥した。【００５３】
二種のＳ−アルキル化ペプチドに関して、それぞれ下記の手順でそのアミノ酸解析を行った。【００５４】
凍結乾燥済みＳ−アルキル化ペプチドの５ｎｍｏｌ相当量（５５μｇ）を、それぞれ、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃを用いて、２４時間３７℃で酵素消化し、断片化した。前記エンドペプチダーゼ酵素消化処理によって得られる、各ペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより、分取した後、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７３Ａ、４７７、  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＰＰＳＱ−２１Ａ）によって、各ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。また、別途、凍結乾燥済みＳ−アルキル化ペプチドを脱塩処理した後、そのＮ末アミノ酸配列を、プロテインシークエンサーによって分析した。【００５５】
Ｎ末アミノ酸配列、各エンドペプチダーゼ酵素消化処理で得られるペプチド断片のアミノ酸配列の分析結果に基づき、Ｓ−アルキル化ペプチドの全アミノ酸配列を決定した。図２に、二本のピークを示すＳ−アルキル化ペプチドに関して、決定された全アミノ酸配列を対比して示す。両者のアミノ酸配列は、極めて高い同一性を示すことが判明した。アミノ酸数６２のｂｉｔｏｒａｎタンパク質に、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ」の呼称を、アミノ酸数６３のｂｉｔｏｒａｎタンパク質に、「ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖ」の呼称を付した。すなわち、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎによる酵素消化により得られるペプチド断片が、両者の間で明確に相違しており、その相違は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質中、１３番目のアミノ酸Ｄ（Ａｓｐ）が、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質において、対応している１４番目のアミノ酸のＶ（Ｖａｌ）となっていることに由来している。この特徴的なアミノ酸の相違を考慮した呼称である。【００５６】
また、ヒトのＸａ因子に特異的な内因性のプロテアーゼインヒビター；ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚ  IIなど、前記トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対して、高い相同性を示す一群のプロテアーゼインヒビターにおいて見出されている、三箇所の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成に関与すると推定される、６箇所のＣｙｓが、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質においても保存されている。すなわち、前記トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）の三次元構造形成に不可欠な三箇所の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合；［Ｃｙｓ５：Ｃｙｓ５５］、［Ｃｙｓ１４：Ｃｙｓ３８］、［Ｃｙｓ３０：Ｃｙｓ５１］に対応して、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、［Ｃｙｓ８：Ｃｙｓ５８］、［Ｃｙｓ１７：Ｃｙｓ４１］、［Ｃｙｓ３３：Ｃｙｓ５４］の三組、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質では、［Ｃｙｓ９：Ｃｙｓ５６］、［Ｃｙｓ１８：Ｃｙｓ４２］、［Ｃｙｓ３４：Ｃｙｓ５５］の三組の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成が予想される。従って、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質も、図２に示すような、三箇所の分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成に伴って、トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）と同様な三次元構造を構成していると推定される。【００５７】
ウシ膵液由来のトリプシンを阻害する蛋白性インヒビター：ＢＰＴＩにおいて、トリプシンの活性部位との結合に関与する部分とされている、Ｃｙｓ１４−Ｌｙｓ１５−Ａｌａ１６−Ａｒｇ１７−Ｉｌｅ１８（Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’）の部位に相当するものとして、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９−Ｐｈｅ２０−Ｉｌｅ２１が、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質では、Ｃｙｓ１８−Ａｒｇ１９−Ａｌａ２０−Ｔｙｒ２１−Ｉｌｅ２２が特定される。【００５８】
加えて、天然のヘビ毒中に含有されているｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、Ａｓｎ２７残基の側鎖上の−ＣＯ−ＮＨ２が、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質では、Ａｓｎ２８残基の側鎖上の−ＣＯ−ＮＨ２が、それぞれ、Ｎ−グリコシル化を介する糖鎖の修飾部位と特定される。【００５９】
なお、蛇研から入手したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒から取得されるｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品では、逆相ＨＰＬＣ用カラムから溶出されるＳ−アルキル化ペプチドのピークを観察したところ、一本のピークが見出されるのみであった。この一本のピークを示すＳ−アルキル化ペプチドを分取し、凍結乾燥し、上述の手順でそのアミノ酸解析を行った。決定された全アミノ酸配列は、前記ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質のものとほぼ同一であった。【００６０】
（ｂｉｔｏｒａｎのヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害能）
ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒から取得されたｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品は、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の混合物であるが、この混合物を用いて、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する阻害能を評価した。【００６１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、  ｐＨ８．０）中に、濃度０．３μＭ  ヒトのＸａ因子、所定の濃度被験物質を添加溶解した酵素液９０μＬを、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに入れ、３７℃、１５分間インキュベートする。次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水中に、合成基質  ＬＧＲ−ｐＮＡを濃度４ｍＭで溶解した合成基質液１０μＬを添加する。各ウエル中において、合成基質  ＬＧＲ−ｐＮＡからＸａ因子のプロテアーゼ活性により、Ａｒｇ残基のＣ末側で切断がなされ、生成するｐ−ニトロアニリン量を、プレートリーダーを用いて、４０５ｎｍと４９２ｎｍにおける光吸収によりモニターする。その際、ｐ−ニトロアニリンの生成速度Ｖを算出し、被験物質を添加しない参照対照における生成速度Ｖ０を基準として、換算プロテアーゼ活性（Ｖ／Ｖ０）を算定する。【００６２】
陽性対照として、植物由来のトリプシン・インヒビター物質；ＳＢＴＩ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；  ＭＷ＝２０．１ｋＤａ）を用い、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒由来の「ｂｉｔｏｒａｎ」タンパク質凍結乾燥評品（ＭＷ＝１１ｋＤａ）と対比させて、阻害活性を評価した。図４に、被験物質を各種濃度添加した際の、換算プロテアーゼ活性（Ｖ／Ｖ０）を示す。図４に示す結果に基づき、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めると、ＳＢＴＩのＩＣ５０は、３×１０−７  Ｍであるのに対して、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質（ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質の混合物）のＩＣ５０は、２×１０−８  Ｍである。【００６３】
また、蛇研から入手したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒から取得されるｂｉｔｏｒａｎタンパク質凍結乾燥評品を用いて、同様の阻害能の評価を行ったところ、そのｂｉｔｏｒａｎタンパク質（ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質）のＩＣ５０は、２×１０−８  Ｍである。【００６４】
（ｂｉｔｏｒａｎのコード遺伝子のクローニング）
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓが産生するヘビ毒中から単離されたｂｉｔｏｒａｎタンパク質は、既に報告されている種々のトリプシン・インヒビター活性を示すＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅタンパク質と同一のファミリーを形成すると判断される。すなわち、Ｎ末にリーダー配列、あるいは、シグナル配列を有する前駆体タンパク質として翻訳され、細胞外に分泌される際、翻訳後プロセッシング過程を経ることで、Ｎ末部分が切除され、分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｓ−Ｓ結合）形成に伴い、本来の立体構造を有する成熟型タンパク質となると推定される。【００６５】
このｂｉｔｏｒａｎタンパク質の前駆体タンパク質をコード遺伝子のクローニングを試みた。【００６６】
南アフリカ共和国のＳＡＶ社から、冷凍凍結されたＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺を購入した。このＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺から、抽出によりｔｏｔａｌＲＮＡを調製し、逆転写により、ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡのｃＤＮＡを作製し、ｂｉｔｏｒａｎタンパク質の前駆体タンパク質をコード遺伝子のクローニングを試みた。【００６７】
（１）ｔｏｔａｌＲＮＡの調製
ＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺（一個体当たり２個）を、液体窒素中で凍結した状態で破砕する。この毒腺の破砕物から、ＩＳＯＧＥＮを利用して、ＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌＲＮＡの調製を行う。【００６８】
毒腺組織の破砕物に１５ｍＬのＩＳＯＧＥＮを加え、注射針を付けたシリンジを利用し、圧送して、前記組織細胞破砕物を該注射針内を通過させる処理を繰り返し施し、組織細胞破砕物の均一化を行う。その後、液体窒素中での凍結、室温での融解を行う、凍結融解処理を２回繰り返し、均一化された、該組織細胞破砕物の分散液中に存在する、組織細胞の破砕を完了させる。得られた均一な細胞破砕物分散液を５０ｍＬ容ファルコン・チューブに移し、クロロホルム３ｍＬを加えて、１５秒間よくシェイクする。その後、室温で、２〜３分間静置して、相分離を行う。更に、４℃において、１０分間、遠心（１２，０００ｒｐｍ）する。上清（水相）約２０ｍＬを、別の５０ｍＬ容ファルコン・チューブに回収する。【００６９】
回収される水相に対して、７．５ｍＬのイソプロパノールを添加し、よく混合する。室温で、５〜１０分間保持して、アルコール沈澱を行う。その後、４℃において、１０分間、遠心（１２，０００ｒｐｍ）する。上清を除去し、ペレット（アルコール沈澱画分）を回収する。【００７０】
ペレット（アルコール沈澱画分）に対して、エタノール２ｍＬを加え、ヴォルテックスにかけ、分散・混合する。分散・混合液を、４℃において、５分間、遠心（１２，０００ｒｐｍ）する。上清を除き、ペレット（アルコール沈澱画分）を回収する。【００７１】
洗浄後、残留する溶媒を蒸散させるため、該ＲＮＡ沈澱ペレットをアスピレーター乾燥する。乾燥済みＲＮＡ沈澱ペレットに、ＲＮａｓｅの混入のないＤＥＰＣ処理純水４０〜１００μＬを加えて、１０〜２０分間静置して、再溶解し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料液を調製する。【００７２】
調製されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料液中のＲＮＡ含有濃度は、波長２６０ｎｍにおける吸光度ＯＤ２６０から算定する。【００７３】
１０μｇのＲＮＡ量を含むｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料を、５×ＭＯＰＳ緩衝液２μＬ、ホルムアルデヒド３．５μＬ、ホルムアミド１０μＬの混合液に加えて、均一に混合し、さらに、ＤＥＰＣ処理純水を適量加えて、全体液量を２０μＬに調整する。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含む液を、６５℃、１５分間加熱処理し、熱変性させ、二本鎖構造を持たない一本鎖ＲＮＡへと変換する。さらに、この熱変性処理済みｔｏｔａｌ  ＲＮＡ液に、アガロース電気泳動用色素液２μＬを混合したものを、６．７％ホルムアルデヒド変性アガロースゲルに載せ、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で泳動させる。【００７４】
泳動後、エチジウムブロマイド染色を施し、指標とする２８Ｓ  ｒＲＮＡと１８Ｓ  ｒＲＮＡのバンド・デンシティをデンシティ・リーダーで測定し、この測定値を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの品質（ｒＲＮＡ／ｍＲＮＡの含有比率）を確認する。【００７５】
（２）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの作製
調製されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中に含まれるｍＲＮＡから、その塩基配列と相補的なｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製する。【００７６】
この過程では、ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法を適用し、ｃＤＮＡを作製する。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、市販のキット、例えば、Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  （宝酒造）、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、あるいは、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  ｓｅｔ  （宝酒造）を使用し、各キットに添付される標準的プロトコルに沿って実施することができる。具体的には、逆転写反応では、Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄｓでは、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇを用い、４２℃、４０分間；Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  では、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇを用い、６０℃、３０分間；ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  では、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇを用い、４２℃、９０分間；また、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  ｓｅｔ  では、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ６μｇを用い、５０℃、６０分間が、それぞれ標準的な反応条件となる。【００７７】
ここでは、ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法を適用し、ｃＤＮＡを作製する際、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を利用し、前記反応液温、反応時間の制御を行った。【００７８】
逆転写反応においては、ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡを鋳型として、その３’末端に存在するｐｏｌｙＡ配列部分に対して、各キットで用意されているプライマーをハイブリダイズさせた後、逆転写酵素により、相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の伸長がなされる。【００７９】
（３）ＰＣＲ反応によるｂｉｔｏｒａｎタンパク質の前駆体タンパク質をコードｃＤＮＡの増幅
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒由来のｂｉｔｏｒａｎタンパク質は、上記のアミノ酸配列から、Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのプロテアーゼ・インヒビター・タンパク質のファミリーに属すると判断される。一方、既に、ヘビ毒由来のＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅのプロテアーゼ・インヒビター・タンパク質は幾つか報告されており、そのコード遺伝子の塩基配列に基づき、前駆体タンパク質のアミノ酸配列も報告されている。【００８０】
図６に、それらＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅの成熟型タンパク質ならびに、前駆体タンパク質のアミノ酸配列を対比した結果を示す。その対比により、前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末のリーダー配列、あるいは、シグナル配列と推定される部分に、高い相同性を示す部分アミノ酸配列を有している。具体的には、そのＮ末端から、１５アミノ酸残基は、いずれも、「ＭＳＳＧＧＬＬＬＬＬＧＬＬＴＬ」の配列を示している。【００８１】
Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒由来のｂｉｔｏｒａｎタンパク質においても、その前駆体タンパク質において、Ｎ末のリーダー配列、あるいは、シグナル配列に相当する部分は、これと対応するものであると、推定した。その推定に従って、上流側プライマー（センスプライマー）として、前記「ＭＳＳＧＧＬＬＬＬＬＧＬＬＴＬ」の配列中、１−１０アミノ酸残基部分をコードする塩基配列に相当する下記の塩基配列：
５’−ATG  TCT  TCT  GGA  GGT  CTT  CTT  CTC  CTG  CTG−３’
Met  Ser  Ser  Gly  Gly  Leu  Leu  Leu  Leu  Leu
のプライマーを設計した。なお、このセンスプライマーは、日立計測器サービス社に、その合成、精製を依頼した。【００８２】
市販のキット：Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄｓを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中に含まれるｐｏｌｙＡ−ＲＮＡに対して調製されたｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、下記の手順で、前記センスプライマーの塩基配列を含むｃＤＮＡの増幅を行った。上流側プライマーとして、前記センスプライマーを、下流側プライマーとして、逆転写反応に使用したプライマーを利用し、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ溶液  １．２５μＬを用い、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１０μＭ  上流側プライマー、１０μＭ  下流側プライマー、１ｕｎｉｔ／μＬ  Ｅｘ−ｔａｑ  ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（最終濃度：１×）を含む、液量合計２５μＬのＰＣＲ反応溶液を調製し、下記の温度サイクルにより、ＰＣＲ反応を行う。温度サイクルは、ｄｅｎａｔｕｒｅ：９６℃、３０秒間；ａｎｎｅａｌｉｎｇ：５３℃、３０秒間；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：７２℃、６０秒間；計３５サイクルとし、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を利用し、前記反応液温、反応時間の制御を行った。【００８３】
ＰＣＲ反応後、反応液を採取し、１．５％アガロースゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。なお、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡは、０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液で染色を施し、紫外線照射下、バンド位置を前記蛍光染色により同定する。【００８４】
（４）アガロースゲル上のＰＣＲ増幅産物の回収
同定されたＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡのバンドを、ＵＶトランスイルミネーターによる紫外線照射下（波長  λ＝３０２ｎｍ）で観察しつつ、このバンド部分のゲルをカッターナイフで切り取る。切除されたゲル断片から、市販の抽出キット：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、該キットに添付される標準的プロトコルに従って、二本鎖ＤＮＡの抽出、精製を行う。【００８５】
（５）ｃＤＮＡ断片のクローニング・ベクターへの挿入
精製された二本鎖ＤＮＡは、市販のクローニング・キット：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用し、該クローニング・ベクター：ｐＧＥＭ  Ｔ−eａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒのクローニング・サイトに挿入する。該クローニング・キットに添付される標準的プロトコルに準じ、ベクター断片と、ｃＤＮＡ断片とのライゲーション反応は、総反応液量１０μＬを用い、１６℃、４時間以上反応を行った。【００８６】
（６）ｃＤＮＡ断片を挿入したクローニング・ベクターを保持する形質転換株の創製
ｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド・ベクターを構築した後、該プラスミド・ベクターを導入した形質転換株を下記の手順で作製した。【００８７】
６−１：コンピタント細胞の調製
宿主大腸菌  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株は、当該菌株が保持する薬剤耐性による選択用の抗生物質を含むプレート培地上でコロニーを形成させる。このコロニーから採取した種菌を、当該抗生物質を添加していないＳＯＢ培地に植菌し、１７．５℃で振とう培養する。波長６００ｎｍで測定される培地の濁度：Ａ６００が、Ａ６００＝０．４〜０．８に達するまで、３０〜４０時間程度培養する。その後、氷中で、培養物を１０分間冷却し、４℃、１２分間遠心（２，３００ｒｐｍ）して、集菌する。【００８８】
集菌された菌体は、氷冷した１７ｍＬのトランスフォーメーション・バッファー（ＴＢ）に懸濁し、さらに、１０分間氷上に、静置する。再び、この菌体懸濁液を、４℃、１２分間遠心（２，３００ｒｐｍ）して、集菌する。集菌された菌体は、氷冷した４．５ｍＬのＴＢ中に再懸濁し、さらに、３３０μＬのＤＭＳＯ（最終濃度７％）を添加した上で、穏やかに混和させ、引き続き、１０分間氷上に、静置する。【００８９】
以上の処理により調製されるコンピタント細胞の懸濁液は、１．５ｍＬ容チューブに各１２０〜１５０μＬ分注し、液体窒素中で凍結させる。このコンピタント細胞の懸濁液凍結物は、−８０℃のフリーザー中で保存する。【００９０】
６−２：形質転換
以下の手順で、前記ライゲーション反応後、反応液から回収されたプラスミド・ベクターを、コンピタント細胞に導入して、形質転換株を創製する。【００９１】
コンピタント細胞の懸濁液凍結物を手早く融解し、回収されたプラスミド・ベクター１００ｐｇ当たり、コンピタント細胞の懸濁液６０〜１００μＬを加え、３０分間氷上に静置する。その後、４２℃の温浴中で４０秒間熱ショックを加え、再び、２分間氷上に静置する。【００９２】
この熱ショック処理を施した液に、ＬＢ培地を５０〜１００μＬ加えて希釈する。この希釈された細胞懸濁液を、前記プラスミド・ベクター中に選択マーカーとして含まれる、アンピシリン耐性遺伝子に対応する抗生物質：アンピシリンを添加したＬＢプレート上に塗布する。３７℃、一晩培養し、前記ＬＢプレート上でコロニーを形成させる。【００９３】
（７）プラスミドの調製
ｃＤＮＡ断片が挿入されているｐＧＥＭ  Ｔ−eａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ、あるいは、ｐＧＥＭ  Ｔ−eａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒを保持する形質転換株は、アンピシリンを添加したＬＢプレート上でコロニーを形成している。このコロニーから、形質転換株を採取し、アンピシリン（５０−１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌する。３７℃、一晩振とう培養し、この培養物を、４℃、１５分間遠心（３，０００×ｇ）して、集菌する。集菌した形質転換株を破砕し、含まれるプラスミド・ベクターを、市販のプラスミド精製キット：ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、分離、精製する。【００９４】
なお、各コロニーの形質転換株から調製される精製済みプラスミドに関して、目的とするｃＤＮＡ断片を含んでいるか否かは、その分子量を測定することにより確認する。【００９５】
（８）挿入されているｃＤＮＡの塩基配列解析
目的とするｃＤＮＡ断片が挿入されている精製済みプラスミドを用いて、ｐＧＥＭ  Ｔ−eａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ中に挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を下記の手順で解析する。【００９６】
挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列は、その３’末端には、ｐｏｌｙＡ配列と、逆転写反応の際に利用した、ＲＴ−ＰＣＲキット中に添付されるプライマー由来の塩基配列を含んでいる。市販のキット：Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄｓを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中に含まれるｐｏｌｙＡ−ＲＮＡに対して調製されたｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡでは、該キットで利用される、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマー由来の塩基配列を含んでいる。配列決定プライマーとして、このＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマー由来の塩基配列を有するプライマーを利用し、ＰＣＲ増幅反応で利用した、上流側プライマー（センスプライマー）：５’−ATG  TCT  TCT  GGA  GGT  CTT  CTT  CTC  CTC  CTG  CTG−３’に由来する５’末端までの塩基配列を解析する。【００９７】
具体的には、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマー由来の塩基配列を有するプライマーを、配列決定プライマーとして利用し、挿入されているＤＮＡ断片部分を鋳型として、配列決定用の核酸鎖伸長反応を行う。この配列決定用の核酸鎖伸長反応で得られる、伸長鎖の３’末端には、蛍光ラベルが付された塩基が導入されている。配列決定用の核酸鎖伸長反応は、市販のキット：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を利用し、また、シークエンス操作は、島津製作所製シークエンサーのプロトコルに従って実施する。【００９８】
ＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺から抽出されたｍＲＮＡに基づき調製されるｃＤＮＡ中、上流側プライマー（センスプライマー）：５’−ATG  TCT  TCT  GGA  GGT  CTT  CTT  CTC  CTC  CTG  CTG−３’を利用する際、ＰＣＲ増幅産物として、図７に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片が得られていた。その塩基配列は、８９アミノ酸をコードしており、そのアミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ）は、図  に示すように、他のヘビ毒由来のＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅの成熟型タンパク質ならびに、前駆体タンパク質のアミノ酸配列と、高い相同性を示している。【００９９】
一方、ＬＡＴＯＸＡＮ社から購入した、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの粗ヘビ毒から取得されたｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質のアミノ酸配列と、このＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓの毒腺から採取された、ｍＲＮＡによりコードされる、ｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を対比すると、図  に示すように、このｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質のアミノ酸配列と、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質のアミノ酸配列は、ほぼ対応している。但し、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質では、Ｃｙｓ１７−Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９−Ｐｈｅ２０−Ｉｌｅ２１の部分が、このｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質（ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’）では、Ｃｙｓ４０−Ａｒｇ４１−Ａｌａ４２−Ｔｙｒ４３−Ｉｌｅ４４となっている。恐らく、このｂｉｔｏｒａｎ前駆体タンパク質（ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ’）は、ＳＡＶ社から購入したＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓに由来するｂｉｔｏｒａｎ  Ｄ型タンパク質の前駆体タンパク質であると、推断される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明にかかるＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｓのヘビ毒に由来するｂｉｔｏｒａｎタンパク質、特には、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｄタンパク質、ｂｉｔｏｒａｎ  Ｖタンパク質は、ヒト血液凝固Ｘａ因子が示すセリンプロテアーゼ活性に対する高い阻害能を示すため、プロトロンビン（トロンビン前駆体）からトロンビンが生成される過程を抑制する目的で利用可能な、ヒト血液凝固Ｘａ因子に対する阻害剤として利用可能である。
【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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