(57)【要約】  本発明は、無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ粒子の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部位を有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも１つを含み、かつ該無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に位置することを特徴とする。本発明により、ハイブリッド形成法でのＤＮＡ、ＲＮＡの検出や、ＤＮＡの塩基配列の決定などの生体物質を対象とした分析、ＥＬＩＳＡ法での抗原の検出を行う分析などにおいて、より高感度で、より高精度の分析を行うことが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ粒子の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部位を有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも１つを含み、かつ該無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に位置することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質。
【請求項２】
前記無機蛍光ナノ粒子が、粒径が１〜１０ｎｍの球状の半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項３】
前記無機蛍光ナノ粒子が、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項４】
前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアがＳｉであり、シェルがＳｉＯ2であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項５】
前記無機蛍光ナノ粒子が、無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾基であるリンク形成修飾基を有することを特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項６】
無機蛍光ナノ粒子からなり、該無機蛍光ナノ粒子の表面に、生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基と、該無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾基であるリンク形成修飾基とを有することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質。
【請求項７】
前記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率が１０〜５０％であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項８】
前記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が１〜１０ｎｍの球状の無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第６または７項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項９】
前記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項１０】
前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアがＳｉであり、シェルがＳｉＯ2であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項１１】
前記リンク形成修飾基を介して水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力により前記無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結していることを特徴とする請求の範囲第６〜１０項のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項１２】
前記無機蛍光ナノ粒子が互いに連結することによって、粒子数が２〜２０の無機蛍光ナノ粒子クラスターを形成していることを特徴とする、請求の範囲第６〜１１のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
【請求項１３】
生体物質の蛍光標識方法であって、請求の範囲第１〜１２項のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質を用い、前記無機蛍光ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質に結合させることを特徴とする生体物質の蛍光標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を対象とした蛍光標識剤および生体物質の蛍光標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオインフォマティクス、プロテオミクスの観点から、ｍＲＮＡやタンパク質の生体内での作用、動態を解析するために、ゲノムの機能、遺伝子の発現調節または個々の生体分子の振る舞いを分子レベルで把握する、いわゆる「1分子イメージング」なる方法概念が提起されている。これに基づき病気の原因や医薬の作用を解明しようとする１分子イメージング技術の研究開発が進められている。このような１分子イメージング技術においては、標的とする生体物質（タンパク質、例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）の１分子に対して蛍光標識物質１分子を結合させ、これに所定の励起光を照射し、蛍光標識物質の発光を検出することにより、生体物質の動態などに関する情報を得ることが試みられる。蛍光標識物質の発光寿命が短く退色が早い場合や、発光強度が不足している場合には、1分子イメージングとして充分な観察が行えないことは明らかである。【０００３】
これまで生体物質を対象とした分析に一般的に用いられている有機蛍光色素、例えば蛍光タンパク質であるルシフェリンとルシフェラーゼとの反応を利用した生物発光、発光分子などを利用した有機蛍光色素は、上記のような発光寿命や発光強度の点で充分ではなかった。そこで１分子イメージング技術分野においては、これらの有機蛍光色素に替わるものとして、無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識物質が開発の途にある。無機蛍光ナノ粒子は、発光スペクトルがシャープな形状である（半値幅が狭い）こと、発光強度が強いこと、励起波長と発光波長が離れているため検出精度が高いこと、粒子サイズに応じて励起波長を制御できること、ならびに蛍光寿命が長いことなど、有機蛍光色素と比較して有利な点をもっている。【０００４】
このような、１分子イメージング技術分野における無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識剤については、上記のような事項だけでなく、標的とする生体物質との結合性、すなわち特異性、結合力も重要視される。ところが、従来の無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識剤（例えは特許文献１参照）においては、結合性に大きく関与する立体障害などの面から修飾基に関する結合性を改善することについて、何ら検討されてこなかった。また、無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識物質については、検出精度を改善するため、発光強度の向上が追求されている。従来は、個々の無機蛍光ナノ粒子の粒径や材質、またはコアシェル構造などの粒子の構造の面から、発光強度を向上させようとすることが試みられてきた（例えば特許文献１参照）が、さらなる改善の余地が残されていた。
【特許文献１】特開２００５−１７２４２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、無機蛍光ナノ粒子を用いた、生体物質への結合性を高め、より好適な標識を実現しうる蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、下記構成により達成される。
１．無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ粒子の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部位を有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも１つを含み、かつ該無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に位置することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質。
２．前記無機蛍光ナノ粒子が、粒径が１〜１０ｎｍの球状の半導体ナノ粒子であることを特徴とする１に記載の生体物質の蛍光標識物質。
３．前記無機蛍光ナノ粒子が、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする２に記載の生体物質の蛍光標識物質。
４．前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアがＳｉであり、シェルがＳｉＯ2であることを特徴とする３に記載の生体物質の蛍光標識物質。
５．前記無機蛍光ナノ粒子が、無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾基であるリンク形成修飾基を有することを特徴とする１〜４のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
６．無機蛍光ナノ粒子からなり、該無機蛍光ナノ粒子の表面に、生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基と、該無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾基であるリンク形成修飾基とを有することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質。
７．前記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率が１０〜５０％であることを特徴とする６に記載の生体物質の蛍光標識物質。
８．前記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が１〜１０ｎｍの球状の無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする６または７に記載の生体物質の蛍光標識物質。
９．前記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることを特徴とする６〜８のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
１０．前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアがＳｉであり、シェルがＳｉＯ2であることを特徴とする９に記載の生体物質の蛍光標識物質。
１１．前記リンク形成修飾基を介して水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力により前記無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結していることを特徴とする６〜１０項のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
１２．前記無機蛍光ナノ粒子が互いに連結することによって、粒子数が２〜２０の無機蛍光ナノ粒子クラスターを形成していることを特徴とする、６〜１１のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
１３．生体物質の蛍光標識方法であって、１〜１２のいずれか１項に記載の生体物質の蛍光標識物質を用い、前記無機蛍光ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質に結合させることを特徴とする生体物質の蛍光標識方法。【０００７】
本発明者らは、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する塩基、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、インターカレーターを含む生体物質に特異的に結合する部位を無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に有する修飾基を、該無機蛍光ナノ粒子の表面に導入することにより、立体障害などの問題が回避され、分析の対象とする生体物質への結合性が従来よりも向上した蛍光標識剤が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。以下、生体物資に結合する部位を有する修飾基を、単に生体物質結合修飾基ともいう。【０００８】
本発明において、上記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が１〜１０ｎｍの球状である無機蛍光ナノ粒子であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることがより好ましく、Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとする無機蛍光ナノ粒子が特に好ましい。【０００９】
上記のような修飾基を介することにより、蛍光標識剤を生体物質に好適に結合させることが可能となる。【００１０】
また、本発明者らは、蛍光標識物質として用いられる無機蛍光ナノ粒子の表面に、該蛍光標識物質同士を連結させるための修飾基を導入し、該蛍光標識物質同士が結合したクラスターを形成させることにより、分析対象を検出するための発光強度が従来よりも向上しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
本発明の上記構成６に係る無機蛍光ナノ粒子は、その表面に、生体物質に結合する部位を有する修飾基（生体物質結合修飾基）と、該無機蛍光ナノ粒子同士を互いに連結させるための修飾基（リンク形成修飾基）とを有する。無機蛍光ナノ粒子同士は、上記リンク形成修飾基を介した水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力により互いにリンクすることが好ましい。【００１２】
上記リンク形成修飾基を形成する分子による無機蛍光ナノ粒子の表面被覆率は、１０〜５０％であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、互いにリンクすることによって粒子数が２〜２０の無機蛍光ナノ粒子クラスターを形成することが好ましく、該粒子数は温度もしくはｐＨによって調整されるものであることが望ましい。【００１３】
本発明の上記構成６において、上記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が１〜１０ｎｍの球状である無機蛍光ナノ粒子であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることがより好ましく、Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとする無機蛍光ナノ粒子が特に好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ハイブリッド形成法でのＤＮＡ、ＲＮＡの検出や、ＤＮＡの塩基配列の決定などの生体物質を対象とした分析、ＥＬＩＳＡ法での抗原の検出を行う分析などにおいて、蛍光標識剤の結合性が改善され、1分子イメージング技術により、より高感度およびより高精度の分析を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（無機蛍光ナノ粒子）
本発明の蛍光標識物質に用いられる無機蛍光ナノ粒子は、ナノオーダーの粒子中に空間的に励起子を閉じ込め、いわゆる量子閉じ込め効果により、バルク以上の発光強度が得られる蛍光物質である。この無機蛍光ナノ粒子は、その粒径により発光強度や蛍光波長が変化することが知られており、所望の粒径のものを適宜調製することが可能である。本発明においては、１分子イメージングによる分析に好適な蛍光を発色するなどの点から、無機蛍光ナノ粒子は、粒径が０.５〜２０ｎｍ、好ましくは１〜１０ｎｍ、より好ましくは２〜５ｎｍの、球状またはほぼ球状の半導体ナノ粒子であることが好ましい。なお、このような粒径は、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）での観察により確認することが可能であり、少なくとも２００個の粒子像を観察した測定値の平均を用いるものとする。【００１６】
さらに、本発明において、上記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成からなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、いわゆるコアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることが望ましい。コアとなる物質よりも大きなバンドギャップを有する物質をシェルとすることにより、量子閉じ込め効果を安定化させ、コアシェル構造をもたない同サイズの無機蛍光ナノ粒子よりも発光強度を高めることが可能である。なお、このようなコアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子についての粒径は、シェル層を含めた部分の粒径をさす。【００１７】
上記無機蛍光ナノ粒子を構成する半導体ナノ粒子は特に制限されず、例えば、ＣｕＣｌ等のI-VII族化合物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のII-VI族化合物半導体、ＩｎＡｓ等のIII-V族化合物半導体またはＳｉ、Ｇｅ等のIV族半導体もしくはこれらの化合物半導体などの結晶を適宜選択して用いることができる。また、上記コアおよびシェルの構成については、例えば、ＣｄＳｅをコア／ＺｎＳをシェル、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとするなど、用いる半導体ナノ粒子に応じて好適な組み合わせを適宜選択することができる。本発明では、環境汚染や人体に対する毒性が懸念される物質を用いることなく、しかも発光が良好であることから、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとする、またはＧｅをコア／ＧｅＯ2をシェルとするコアシェル構造を有する半導体ナノ粒子を用いることが好適である。【００１８】
（上記構成１に係る修飾基）
本発明の蛍光標識物質は、上述したような無機蛍光ナノ粒子の表面に、特定の「修飾基」が導入されたものである。この修飾基は、生体物質と特異的に結合しうる部位（以下「生体物質結合部位」という。）を有し、例えば、生体物質結合部位、無機蛍光ナノ粒子の表面に直接結合している部位（以下「表面結合部位」という。）およびこれらの生体物質結合部位と表面結合部位を連結している中間部位（以下「スペーサー」という。）から構成される。このような修飾基を介して、上記無機蛍光ナノ粒子は、標識の対象とする生体物質に結合することが可能となる。【００１９】
上記生体物質結合部位としては、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルといったＤＮＡまたはＲＮＡを構成する塩基や、単独のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドが結合したポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）、インターカレーター、が挙げられる。これらの物質は、いずれも標的とする生体物質（遺伝子部位）に特異的に結合しうるものである。上記ＤＮＡまたはＲＮＡを構成する塩基はそれぞれに対応する相補的となる塩基に結合し、上記ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドはそれと相補的な塩基配列を有するヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと結合する。上記ポリヌクレオチドは複数の塩基を有するため、ＤＮＡまたはＲＮＡを構成する塩基が単独である場合と比較し、より安定した結合を形成することができる。【００２０】
また、上記インターカレーターは、ｄｓ（二本鎖）ＤＮＡの塩基対間に挿入結合する化合物である。本発明で用いられるインターカレーターとしては、例えば、蛍光剤としても用いられるエチジウムブロマイドやアクリジンなどの、ヘテロ環構造を有する化合物を用いることができる。このようなインターカレーターは、ｄｓＤＮＡが形成される際に塩基対間に挿入結合するため、例えばハイブリッド形成法においてｄｓＤＮＡを検出するための蛍光標識物質に用いることが可能である。【００２１】
このような生体物質結合部位は、修飾基の、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に存在する。これにより、無機蛍光ナノ粒子は立体障害を起こすことなく対象とする生体物質に結合し、これを標識することが可能となる。【００２２】
例えば、分子の構造が剛直で直線的な化合物に生体物質結合部位を導入して修飾基とする場合、その化合物の末端に生体物質結合部位を結合させることにより、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も遠ざけて位置させることが可能となる。また、後述するようなポリエチレングリコールなどによる構造を有する長鎖状の化合物に生体物質結合部位を導入する場合は、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた炭素原子に反応性官能基を位置させ、その官能基を介して生体物質結合部位を結合させればよい。【００２３】
生体物質結合部位が、修飾基の無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に存在することは、生体物質結合部位の導入位置と、生体物質との結合性との検量線を作成することで確認できる。例えば、長鎖状の分子構造におけるそれぞれの炭素原子に反応性官能基を位置させた化合物を用いて無機蛍光ナノ粒子に修飾基を導入し、それぞれの蛍光標識物質を生体物質に結合させて蛍光の強度を測定する。この際、最も強い蛍光が検出された蛍光標識物質に用いられている修飾基が、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に生体物質結合部位が存在している修飾基である。【００２４】
なお、本発明の蛍光標識物質は、本発明による効果を阻害しない範囲において、必要に応じて上述した以外のその他の修飾基、例えばリン酸基、アミノ基またはポリオキシエチレン基などを用いた親水性を向上させるための修飾基などを有することも可能である。【００２５】
（上記構成６に係る修飾基）
本発明の上記構成６の蛍光標識物質は、上述したような無機蛍光ナノ粒子に２種類の「修飾基」がそれぞれ少なくとも１個以上導入されたものである。本発明の修飾基の１つは、生体物質などに特異的に結合しうるものであり、以下これを「生体物質結合修飾基」とよぶ。もう１つの本発明の修飾基は、本発明の蛍光標識物質同士をリンク（連結）させるためのものであり、以下これを「リンク形成修飾基」とよぶ。なお、本発明の蛍光標識物質は、本発明による効果を阻害しない範囲において、必要に応じてその他の修飾基を有することも可能である。【００２６】
上記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率は、好ましいクラスターを形成できるようにするなどの点から、１０〜５０％であることが好ましく、１５〜４０％であることがより好ましい。なお、本発明における上述のような「表面被覆率」は、リンク形成修飾基を形成する分子が被覆している領域の面積の、無機蛍光ナノ粒子の表面積全体に対する割合であり、例えばＴＥＭを用いた観察により測定することが可能である。【００２７】
上記生体物質結合修飾基は、公知の手法により、対象とする分析における蛍光標識の用途に応じたものを導入すればよく、その態様は特に限定されない。例えば、ハイブリッド形成法によるＤＮＡの検出に用いられるような、ｓｓ（１本鎖）ＤＮＡを結合させた修飾基、ＥＬＩＳＡ法によるタンパク質の検出に用いられるような、ビオチンまたはアビジンを結合させた修飾基、あるいは、ガン細胞の検出に用いられるような、レクチンまたは特異的抗体を結合させた修飾基などを、本発明の生体物質結合修飾基とすることができる。【００２８】
上記リンク形成修飾基としては、水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力などにより相互に連結しうる化合物を用いることができる。例えば、上記共有結合としては、チオール基同士によるジスルフィド結合、アミノ基およびカルボキシル基によるペプチド結合などが挙げられ、これらの官能基を有する化合物を無機蛍光ナノ粒子の表面に導入すればよい。また、リンク形成修飾基としてヌクレオチド鎖を用いて、相補的なヌクレオチド鎖を有する無機蛍光ナノ粒子同士を連結させるようにすることも可能である。【００２９】
なお、リンク形成修飾基における、上記水素結合、イオン結合、共有結合などの反応部位の数は特に限定されず、適宜調節することが可能である。例えば、リンク形成修飾基は、結合力の比較的強い共有結合が１つ形成されるものでもよく、結合力の比較的弱い水素結合が複数形成されるものでもよい。【００３０】
本発明において、リンク形成修飾基は相互にリンクしあえるものであれば、単独の種類を用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明の一態様において、すべての蛍光標識物質には、リンク形成修飾基として、チオール基を有する同一の修飾基を導入することができる。また、アミノ基を有するリンク形成修飾基とカルボキシル基を有するリンク形成修飾基のような、２種類のリンク形成修飾基を１つの蛍光標識物質に導入したものも本発明の態様に含まれる。さらに、本発明の別の態様において、リンク形成修飾基として、アミノ基を有する同一または複数種の修飾基が導入された蛍光標識物質と、カルボキシル基を有する同一または複数種の修飾基が導入された蛍光標識物質とを組み合わせ、ペプチド結合によりリンクできるよう用いることができる。蛍光標識物質同士のリンク形成に影響を及ぼさないようにする観点からは、同一の蛍光標識物質に存在する官能基同士は互いに結合しないものであることがより好ましい。【００３１】
以上のような生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基は、通常、それぞれが異なる分子として無機蛍光ナノ粒子の表面に導入されるものであるが、本発明の一態様として、分岐構造を有する同一の分子に生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基の両方が備えられたものを導入することも可能である。【００３２】
また本発明においては、上記構成１の構成であり、かつ構成６の構成を有する態様即ち、上記構成５の態様が本発明の効果が大きく特に好ましい態様である。【００３３】
（蛍光標識物質の製造方法：無機蛍光ナノ粒子の調製）
本発明で用いられる無機蛍光ナノ粒子は、公知の方法に従って製造することができる。その製造方法は特に制限されないが、例えば、ＣＶＤ法、レーザーアブレーション法、シラン分解法、Ｓｉ電極蒸発法などの気相法や、電気分解法、逆ミセル法などの液相法が挙げられる。これらの方法により製造された無機蛍光ナノ粒子は、液体中に懸濁分散した状態、プレート上に固定化された状態などの態様で存在する場合があるが、後述するような修飾基の導入が行える態様であればとくに限定されるものではない。【００３４】
より具体的には、例えば、プラズマＣＶＤ法やスパッタ法を用いてＳｉ基板上にアモルファスのＳｉＯ2膜を堆積させ、これを高温でアニールし、ＳｉＯ2膜内にＳｉナノ粒子を形成させた後、ＨＦでＳｉＯ2膜を溶解することにより、液面に凝集したＳｉナノ粒子が得られる。さらに、その表面を酸素雰囲気下で自然酸化させれば、または加熱して熱酸化させれば、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとする無機蛍光ナノ粒子となる。【００３５】
（修飾基の導入）
本発明の修飾基は、無機蛍光ナノ粒子の表面に結合しうる化合物を用いて前記表面結合部位を形成し、この化合物に前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させることにより、導入することが可能である。また、表面結合部位を形成する化合物に、スペーサーを形成する化合物を結合させた後、前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させてもよい。【００３６】
表面結合部位を形成する化合物としては、例えば、無機物と有機物とを結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基またはメトキシ基を有し、他端にチオール基（メルカプト基）、アミノ基、エポキシ基（グリシジル基）、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物に結合する。従来用いられているシランカップリング剤としては、例えば、メルカプトプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。【００３７】
シランカップリング剤は、公知の手法を用いて反応させることにより、酸素原子を介して蛍光ナノ粒子と結合させることが可能である。例えば、以下に示すような手順の通りである。まず、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとする無機蛍光ナノ粒子を調整し、これを過酸化水素水中に分散させ、シェルの表面を水酸化させる。続いて、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランを添加して２時間程度かけて反応させることにより、シェルの表面にメルカプトプロピルトリエトキシシランが導入される。【００３８】
また、上記シランカップリング剤の代わりに、ジメルカプトコハク酸や１１−メルカプトウンデカン酸などを用いて表面結合部位を形成することもできる。例えば、後述するような逆ミセル法により半導体ナノ粒子を製造した場合、その表面はＴＯＰＯ（tri-n-octylphosphine oxide）などで被覆されているが、これとジメルカプトコハク酸または１１−メルカプトウンデカン酸とを置換反応させることが可能である。これにより、ジメルカプトコハク酸または１１−メルカプトウンデカン酸は硫黄原子を介して無機蛍光ナノ粒子の表面に結合するが、他端にはカルボキシル基を有するため、後述するような生体物質結合部位を形成するための化合物を結合させることができる。【００３９】
さらに、本発明において、無機蛍光ナノ粒子に直接結合する化合物と、生体物質結合修飾基および／またはリンク形成修飾基を形成するための化合物、上記シランカップリング剤などの表面結合部位を形成する化合物が、中間部位（「スペーサー」ともいう。）を介して結合するような態様であっても構わない。すなわち、該スペーサーは、無機蛍光ナノ粒子に直接結合する化合物と結合しうる部位と、生体物質結合修飾基および／またはリンク形成修飾基を形成するための化合物と結合しうる部位とを有する化合物であり、このような化合物としては、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（maleimidomethylcyclohexanecalboxylic acid sulfohydroxysuccinimide ester sodium salt）などのビファンクショナルクロスリンカーと呼ばれる有機分子を用いることが可能である。【００４０】
例えば、上記ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、アミノ基またはチオール基に対する指向性を有する反応部位を２つ有するので、その片方を例えばシランカップリング剤に結合させ、他方を生体物質結合部位を形成するための化合物との結合に用いることができる。また、ビファンクショナルクロスリンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのオキシアルキレンの両端に、表面結合部位を形成する物質に結合しうる機能性官能基と、生体物質結合部位を形成する物質とに結合しうる機能性官能基とが導入された構造のものを用いることもできる。【００４１】
一方、生体物質結合部位は、標的とする生体物質に結合しうる、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを構成する塩基やポリヌクレオチド、インターカレーターなどの一部に、表面結合部位またはスペーサーを形成する化合物が有する官能基と結合しうる官能基をあらかじめ公知の方法に従って導入することにより、それらの化合物に結合させることが可能である。例えば、チオール基を有するシランカップリング剤と、同じくチオール基を導入したヌクレオチドとを反応させた場合、ジスルフィド結合により、修飾基にヌクレオチドが導入される。【００４２】
また、リンク形成修飾基については、例えば、チオール基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性官能基を２つ以上有する化合物を用いることにより導入することができる。これらの官能基のうち、１つは、前述したような水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力などにより相互に連結するために用いられ、もう1つは、表面結合部位またはスペーサーを形成する化合物が有する官能基と結合するために用いられる。このようなリンク形成修飾基を形成するための化合物としては、例えば、ジカルボン酸類や、アミノ基およびカルボキシル基を少なくとも有する化合物であるアミノ酸などが挙げられる。【００４３】
本発明において、上記生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基がそれぞれ異なる分子として無機蛍光ナノ粒子の表面に導入される場合、例えば、２種類のシランカップリング剤を混合して用いるなどの手法により、それぞれの分子の表面被覆率を調整することが可能である。例えば、この手法においては、無機蛍光ナノ粒子および生体物質結合修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシランカップリング剤と、無機蛍光ナノ粒子およびリンク形成修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシランカップリング剤を、目的とする表面被覆率の割合と同じ割合で混合し、これら２種類のシランカップリング剤を含む混合溶液と無機蛍光ナノ粒子とを反応させ、その後に生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基を含む溶液と反応させるようにすればよい。無機蛍光粒子へ結合する、結合力の順位に従って官能基の結合部位を選択することにより平衡状態での表面修飾の割合をコントロールできる。【００４４】
（クラスター）
本発明の蛍光標識物質において、上述したようなリンク形成修飾基を介して無機蛍光ナノ粒子同士は互いに連結し、クラスターを形成する。このクラスターを構成する無機蛍光ナノ粒子の数は、温度またはｐＨにより調整することが可能であることが望ましい。リンク形成修飾基同志の結合力は、例えば温度、またはｐＨなどの環境を変更したり、リンク形成修飾基の結合を妨げる修飾基を導入しその数をコントロールすることによって調整することができる。また、リンク形成修飾基として例えばオリゴヌクレオチドを利用する場合、相補的な塩基配列と相補的でない塩基配列とを混在させることにより、リンク形成修飾基の結合力を調整することも可能である。【００４５】
また、上記クラスターを構成する無機蛍光ナノ粒子の数は適宜調整することができるが発光強度を充分に高めると共に、生体内の移動を妨げないようにするなどの点から、その数は２〜２０であることが好ましい。なお、クラスター中の無機蛍光ナノ粒子の数は、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）での観察により確認することが可能である。【００４６】
標的とする生体物質に結合した無機蛍光ナノ粒子に、生体物質には直接的に結合していない無機蛍光ナノ粒子が連結するような態様のクラスターが形成されることにより、1分子の生体物質を従来より多数の無機蛍光ナノ粒子で標識することが可能である。【００４７】
上述した本発明の蛍光標識物質は、従来の蛍光標識物質を用いて行われていた各種分析において好適に利用することが可能である。このような分析としては、例えば、固定細胞を用いた免疫染色、レセプター・リガンドのリアルタイムトラッキング、1分子イメージングなどが挙げられる。これらの分析において、本発明の蛍光標識物質により形成されたクラスターは、蛍光標識物質が単独である場合と比較して、より強力な蛍光を発するため、生体物質の検出精度を向上させることが可能となる。【００４８】
（蛍光標識物質を用いた分析方法）
本発明の蛍光標識剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝子情報を持つ、生体物質を対象とした各種分析に用いることができるが、とりわけ下記のような分析に好適に用いることができる。【００４９】
例えば、生体物質結合部位にアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはそれぞれの塩基を有するヌクレオチドを導入した、異なる波長の蛍光を発する４種類の蛍光標識剤は、それぞれの対応する塩基を有するｓｓＤＮＡまたはヌクレオチドに結合する。したがって、それらの４種類の結合標識剤を用いて、未知の塩基配列のｓｓＤＮＡの個々の塩基に蛍光標識剤を結合させた場合、これに励起光を照射し、蛍光の配列を読みとることにより、ｓｓＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。また、未知の塩基配列のｓｓＤＮＡを、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性または5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でヌクレオチドを１分子ずつ切断し、次々と切り離されるヌクレオチドのそれぞれに上記４種類の蛍光標識剤のいずれかを結合させるようにした場合、結合した蛍光標識剤が発する蛍光を高感度の蛍光検出器を用いて経時的に検出することにより、ｓｓＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
【実施例】
【００５０】
実施例1
（ＨＦエッチング法による無機蛍光ナノ粒子の調製）
プラズマＣＶＤによりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯｘ（ｘ＝１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１１００℃、１時間度アニールを行った。これにより、ＳｉＯ2膜中にＳｉ結晶が析出した。次に、このシリコンウエハーを室温で１％のフッ酸水溶液で処理することによりＳｉＯ2膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ結晶を回収した。なお、このフッ酸処理により、結晶表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉ結晶が安定化する。その後、回収したＳｉ結晶の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ2からなるシェル層を形成させた。【００５１】
(陽極酸化法による無機蛍光ナノ粒子の調製)
フッ酸（４６％）、メタノール（１００％）及び過酸化水素水（３０％）を１：２：２の割合で混合した溶液中で、ｐ型シリコンウエハー及び白金を対向電極として３２０ｍＡ／ｃｍ２で約１時間通電し、Ｓｉ結晶を析出させた。このようにして得られたＳｉ結晶の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ2からなるシェル層を形成させた。【００５２】
以上のように製造された、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとする無機蛍光ナノ粒子は、いずれも平均粒経３.５ｍｍであった。【００５３】
(オリゴヌクレオチド末端修飾基の導入：サンプルＡおよびＣ)
先ず、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を３０％Ｈ2Ｏ2中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。このようにして得られた蛍光標識物質をサンプルＡとした。【００５４】
また、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を製造し、これをサンプルＣとした。【００５５】
(オリゴヌクレオチドを中間位置させた修飾基の導入：サンプルＢおよびＤ)
先ず、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を３０％Ｈ2Ｏ2中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトエチルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端にメチルオキシカルボニル基を導入したオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、メルカプト基をスルフィド結合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。この無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとが結合している状態は、サンプルＡの修飾基の末端部にさらにメチルオキシカルボニル基が結合している状態に相当する。このようにして得られた蛍光標識物質をサンプルＢとした。【００５６】
また、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を製造し、これをサンプルＤとした。【００５７】
(ＤＮＡ塩基末端修飾基の導入：サンプルＥ)
まず、ＨＦエッチング法により得られた無機蛍光ナノ粒子を平均粒径１.５ｎｍ、２.０ｎｍ、２.５ｎｍ、３.０ｎｍの４つのサイズ別に分けた。それぞれについて、サンプルＡの調製の場合と同様に最表面のＳｉＯ2をシラン化するとともにメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換しバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたアデニン塩基を１００ｎＭになるように加えて１時間放置し、メルカプト基同志でスルフィドを形成することで、末端にアデニン塩基を結合させた。同様にしてグアニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基を末端にもつ修飾基を導入した無機蛍光ナノ粒子を調製した。これら４つの修飾基の異なりサイズの異なるＳｉ量子ドットを混合することでサンプルＥとした。【００５８】
(ＤＮＡ解析方法)
マイクロアレイスライドのウエルにあらかじめオリゴヌクレオチドが末端に結合された無機蛍光ナノ粒子を入れておき、検出対象ＤＮＡを滴下後、恒温層等に移し、ウェル内を数十度に加熱し、加湿化された条件で１日インキュベーションした。この際、互いの塩基配列が対応したオリゴヌクレオチドと検出対象ＤＮＡとが同一のウェルにある場合には、それらがハイブリダイゼーション反応を起こす。【００５９】
続いて、ウエルを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーション反応を起こしていないウェル内のオリゴヌクレオチドを結合した蛍光標識物質（サンプルＡ）を除去する。この結果、ウエル内にはハイブリダイゼーション反応を起こしたオリゴヌクレオチド結合無機蛍光ナノ粒子が残存することとなる。【００６０】
続いて、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、４３０ｎｍの励起光を所定のウェルに照射したときの、蛍光アドレス情報を検出し、目視で検出精度を判断した。検出精度は明らかに蛍光が明るくハイブリダイゼーションを起こしているマップが明確わかる場合は良好とし、蛍光強度が低く一見してわかりづらい場合には検出不良とした。また、別途、インキュベートしてハイブリダイゼーションを起こさせたサンプルを日本分光社製ＦＰ−６５００を用いて４００ｎｍ励起光を照射したときの蛍光強度を測定した。【００６１】
サンプルＢ、ＣおよびＤについても上記サンプルＡの場合と同様に測定を行った。これらの蛍光強度、目視検出精度に関する結果を表１に示す。なお、蛍光強度はサンプルＢを１００とした時の相対値で示している。【００６２】
表１に示されたように、本発明に従って末端部分に相補結合する部位を導入することによって蛍光強度が増大し、ＤＮＡに対する検出精度も大きく向上することがわかる。【００６３】
またサンプルＥについても検出対象ＤＮＡとウェル上で混合しマイクロアレイスライドのウエル上で検出することによりＤＮＡの塩基配列を異なる色の配列で表すことができ、ＤＮＡ配列情報を知ることができる。アデニン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は青色、グアニン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は青緑、シトシン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は緑、チミン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は赤色であった。【００６４】
【表１】
2007086501.tif 000002
【００６５】
実施例２
（オリゴヌクレオチド末端修飾基の導入：サンプルＡ２およびサンプルＣ２）
実施例１で作製したＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を２つに分けた。【００６６】
まず一方を用いて、３０％Ｈ2Ｏ2中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランとアミノプロピルトリエトキシシランとを４：１の割合で混合した混合物をトルエンの２％加えて、２時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共に、４：１の割合の表面積でメルカプト基およびアミノ基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、メルカプト基同士をスルフィド結合させ、無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。【００６７】
残る他方については、上記アミノプロピルトリエトキシシランの代わりにアルデヒド基が導入されたシランカップリング剤を用いた以外は上記と同様の方法にて、４：１の割合の表面積でメルカプト基およびアルデヒド基を導入し、さらに一端にメルカプト基の導入されたオリゴヌクレオチドを結合させた。【００６８】
この２種類の無機蛍光ナノ粒子を３０℃で２時間混合させ、得られた蛍光標識物質をサンプルＡ２とした。サンプルＡはＩＲ、分子量解析によりアミノ基とアルデヒド基が反応してリンクを形成し、無機蛍光ナノ粒子ナノ粒子が平均６つ集ったクラスターを形成していることが分かった。【００６９】
また、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を製造し、これをサンプルＣ２とした。【００７０】
（オリゴヌクレオチドを中間位置させた修飾基の導入：サンプルＢ２）
先ず、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を３０％Ｈ2Ｏ2中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトエチルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端にメチルオキシカルボニル基を導入したオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、メルカプト基をスルフィド結合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。このようにして得られた蛍光標識物質をサンプルＢ２とした。これは、本発明における生体物質結合修飾基のみが導入された状態のものである。【００７１】
また、ＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を製造し、これをサンプルＤ２とした。
(オリゴヌクレオチドを中間に位置させ、リンクされた修飾基の導入、：サンプルＥ２)
実施例１で作製したＨＦエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を２つに分けた。【００７２】
まず一方を用いて、３０％Ｈ2Ｏ2中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランとアミノプロピルトリエトキシシランとを４：１の割合で混合した混合物をトルエンの２％加えて、２時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共に、４：１の割合の表面積でメルカプト基およびアミノ基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端にメチルオキシカルボニル基を導入したオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、メルカプト基をスルフィド結合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。【００７３】
残る他方については、上記アミノプロピルトリエトキシシランの代わりにアルデヒド基が導入されたシランカップリング剤を用いた以外は上記と同様の方法にて、４：１の割合の表面積でメルカプト基およびアルデヒド基を導入し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端にメチルオキシカルボニル基を導入したオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、メルカプト基をスルフィド結合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。【００７４】
この２種類の無機蛍光ナノ粒子を３０℃で２時間混合させ、得られた蛍光標識物質をサンプルＥ２とした。サンプルＡはＩＲ、分子量解析によりアミノ基とアルデヒド基が反応してリンクを形成し、無機蛍光ナノ粒子が平均６つ集ったクラスターを形成していることが分かった。【００７５】
上記に記載の方法で作製したＡ２-Ｅ２を実施例１と同様の方法でＤＮＡ解析を行った。
これらの蛍光強度、目視検出精度に関する結果を表２に示す。なお、蛍光強度はサンプルＢ２を１００としたときの相対値で示している。【００７６】
表２に示されたように、本発明に従ってリンク形成修飾基を導入した蛍光標識物質を用いることにより蛍光強度が増大し、ＤＮＡに対する検出精度も大きく向上することがわかる。【００７７】
【表２】
2007086501.tif 000003
【国際調査報告】
2007086501.tif 000004
2007086501.tif 000005
2007086501.tif 000006
2007086501.tif 000007
2007086501.tif 000008