(57)【要約】  次の工程を少なくとも含む、コンドロイチン糖鎖の製造方法：「グルクロン酸供与体」、「Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体」、「糖受容体」及び「コンドロイチンを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる工程。ここで界面活性剤はｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸、スクロースモノラウリル酸から選ばれることが好ましい。次の１）〜３）の全ての性質を有するコンドロイチン糖鎖：１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である、２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される、３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがコンドロイチン不飽和二糖に一致する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン糖鎖の製造方法。
工程：「グルクロン酸供与体」、「Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体」、「糖受容体」及び「コンドロイチンを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。
【請求項２】
「コンドロイチンを合成する菌体酵素」が、大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼを発現させた菌体酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼが、Ｋ４ＣＰである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
菌体酵素として用いる宿主が、大腸菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
大腸菌が、大腸菌ＴＯＰ１０株である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
界面活性剤が、ナイミーン、ＭＥＧＡ−１０、コール酸ナトリウム、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノコール酸、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
界面活性剤が、ナイミーン、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
界面活性剤が、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
「共存」が、１０〜５０℃の条件下で１時間〜１０日間行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
「共存」が、２０〜４０℃の条件下で１０〜３０時間行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
「共存」が、２０〜４０℃の条件下で１５〜２４時間行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１２】
「共存」が、２５〜３７℃の条件下で１５〜２４時間行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
「グルクロン酸供与体」がＵＤＰ−グルクロン酸であり、かつ、「Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体」がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、並びにＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ及びＵＤＰ−グルコースを反応系中に共存させ、「Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体」としてのＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、及び「グルクロン酸供与体」としてのＵＤＰ−グルクロン酸を供給する、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
さらに、キシレン、クロロホルム、パラフィン及びホルムアルデヒドからなる群から選ばれる１又は２以上の有機溶媒を共存させることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
共存させる有機溶媒が、クロロホルム又は「クロロホルム及びキシレン」であることを特徴とする、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
共存状態における有機溶媒の濃度が、０％超５％未満であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
製造されるコンドロイチン糖鎖が、下記１）〜３）の全ての性質を有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがコンドロイチン不飽和二糖に一致する。
【請求項１９】
重量平均分子量が７万５千以上である請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
重量平均分子量が２０万以上である請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
「コンドロイチンを合成する菌体酵素」による酵素反応時に、界面活性剤を共存させることを特徴とする、コンドロイチン合成の促進方法。
【請求項２２】
下記１）〜３）の全ての性質を有するコンドロイチン糖鎖。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがコンドロイチン不飽和二糖に一致する。
【請求項２３】
重量平均分子量が５万〜５０万である請求項２２に記載のコンドロイチン糖鎖。
【請求項２４】
重量平均分子量が７万５千〜２０万である請求項２３に記載のコンドロイチン糖鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖コンドロイチン糖鎖及びその製造方法並びにコンドロイチン合成の促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
Ｇｌｃ：グルコース
ＧｌｃＵＡ：グルクロン酸
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｋ４ＣＰ：大腸菌Ｋ４株由来コンドロイチンポリメラーゼ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ: Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization−飛行時間型−質量分析
ＵＤＰ：ウリジン５’−ジリン酸【０００３】
ＣＨは、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃがそれぞれβ１−３結合及びβ１−４結合で交互に直線上に結合したグリコサミノグリカンの一種である。ＣＨは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織にＣＳプロテオグリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分化、神経細胞伸展、軟骨・骨形成、組織再生などに重要な役割を担っている。【０００４】
またＣＳは、組織癒着防止、関節炎治療薬、腰痛関節痛治療薬、神経痛改善薬、肩関節炎治療薬、点眼薬、慢性腎炎治療薬、滋養強壮、などの医薬品や健康食品、化粧品（保湿剤）等の形で有用な物質として市販されている。ＣＳは天然では通常、重量平均分子量２００００から５００００の糖鎖として存在しており、重量平均分子量１０万以上のＣＳも存在していることが知られている。これらのＣＳは、長鎖構造であることから、保湿性やイオン保持特性などの構造特性をもち、また、細胞外マトリックス成分として細胞接着や発生分化のシグナル伝達などの特異的な生理機能を持つことも知られている。【０００５】
動物由来のＣＨ合成酵素が複数クローニングされているが、それらの発現酵素のみではＣＨポリメラーゼ活性を持たず、また有していたとしてもその酵素活性が弱いため、工業的にＣＨ糖鎖を効率よく製造するには十分とはいえない。一方、Ｋ４ＣＰもクローニングされており、この酵素は単独でＣＨポリメラーゼ活性を有しており、効率よくＣＨが製造できることも知られている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、その組換え精製酵素を使用してＣＨ合成反応を長時間行っても、約２万程度のＣＨ糖鎖ができるにとどまる。【０００６】
また、ＣＨはＣＳを脱硫酸化することでも製造することができるが、原料のＣＳの鎖長がたとえ長かったとしても副反応により糖鎖が切断されてしまい、市販されているものの重量平均分子量は１万以下であるというのが現状である。
長鎖ＣＨ糖鎖を合成する技術は今まで知られていないが、産業上の有用性からも長鎖高分子ＣＨ糖鎖やその製造方法の開発が望まれている。【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１９９５８３号公報
【非特許文献１】ニノミヤ、Ｔ（Ninomiya, T.）ら、２００２年、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７７巻、第２４号、ｐ．２１５６７−２１５７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、長鎖高分子ＣＨ糖鎖及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＣＨ合成酵素によりＧｌｃＵＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、及び糖受容体からＣＨを合成する方法において、ＣＨ合成酵素としてＣＨ合成酵素を強制発現させた大腸菌の発現菌株を使用し、界面活性剤の存在下に合成反応を行うことにより、精製遊離酵素よりも極めて鎖長の長いＣＨ多糖体を製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明は下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、ＣＨ糖鎖の製造方法（以下、「本発明方法１」という）を提供する。
工程：「ＧｌｃＵＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」及び「ＣＨを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。【００１１】
また本発明方法１においては、「ＣＨを合成する菌体酵素」が大腸菌由来のＣＨポリメラーゼを発現させた菌体酵素であることが好ましく、この大腸菌由来のＣＨポリメラーゼはＫ４ＣＰであることが極めて好ましい。【００１２】
また本発明方法１においては、菌体酵素に用いる宿主が大腸菌であることが好ましく、中でも大腸菌ＴＯＰ１０株であることが極めて好ましい。【００１３】
また本発明方法１においては、用いる界面活性剤が、ナイミーン、ＭＥＧＡ−１０、コール酸ナトリウム、n−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノコール酸、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが好ましく、中でもナイミーン、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが好ましく、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが極めて好ましい。【００１４】
また、本発明方法１は「共存」が、１０〜５０℃の条件下で１時間〜１０日間行われることが好ましく、２０〜４０℃の条件下で１０〜３０時間行われることがより好ましく、２０〜４０℃の条件下で１５〜２４時間行われることがさらに好ましく、２５〜３７℃の条件下で１５〜２４時間行われることが特に好ましい。【００１５】
また、本発明方法１はＧｌｃＵＡ供与体がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡであり、かつ、ＧａｌＮＡｃ供与体がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであることが好ましい。【００１６】
この場合、ＵＤＰ-Ｇｌｃ４−エピメラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、並びにＵＤＰ-Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ及びＵＤＰ-Ｇｌｃを反応系中に共存させ、「ＧａｌＮＡｃ供与体」としてのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、及び「ＧｌｃＵＡ供与体」としてのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを供給することができる。【００１７】
また本発明方法１は、さらに、キシレン、クロロホルム、パラフィン及びホルムアルデヒドからなる群から選ばれる１又は２以上の有機溶媒を共存させることが好ましく、特にクロロホルム又は「クロロホルム及びキシレン」を共存させることが好ましい。また共存状態における有機溶媒の濃度は０％超５％未満であることが好ましく、０．５％超３％未満であることがさらに好ましく、１％であることが極めて好ましい。【００１８】
また、本発明方法１は、製造されるＣＨ糖鎖が下記１）〜３）の全ての性質を有するものであることが好ましい。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがＣＨ不飽和二糖に一致する。
本発明方法１により製造されるＣＨ糖鎖の分子量は、重量平均分子量で、好ましくは７万５千以上、より好ましくは２０万以上であり、好ましい分子量の範囲として具体的には、５万〜２０万、５万〜５０万、５万〜１００万、７万５千〜２０万、７万５千〜５０万、７万５千〜１００万、２０万〜５０万、２０万〜１００万、５０万〜１００万等の範囲を例示することができる。【００１９】
また、本発明は「ＣＨを合成する菌体酵素」による酵素反応時に、界面活性剤を共存させることを特徴とする、ＣＨ合成の促進方法（以下、「本発明方法２」という）を提供する。【００２０】
また本発明は、下記１）〜３）の全ての性質を有するＣＨ糖鎖（以下、「本発明糖鎖」という）を提供する。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがＣＨ不飽和二糖に一致する。
本発明糖鎖の分子量は、重量平均分子量で、好ましくは７万５千以上、より好ましくは２０万以上であり、好ましい分子量の範囲として具体的には、５万〜２０万、５万〜５０万、５万〜１００万、７万５千〜２０万、７万５千〜５０万、７万５千〜１００万、２０万〜５０万、２０万〜１００万、５０万〜１００万等の範囲を例示することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明方法１は、天然に存在し特異な生理活性があることが知られている高分子ＣＳと同程度あるいはそれ以上の重量平均分子量をもつ高分子ＣＨ糖鎖を製造できることから極めて有用である。本発明方法２は、極めて効率的にＣＨ糖鎖を製造できることから極めて有用である。また本発明糖鎖は、通常動物組織から抽出したＣＨではみられない高分子のＣＨであり、特異な物性及び生理活性も期待され、医薬品、健康食品、化粧品等の素材となりうることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を本発明方法１、本発明方法２及び本発明糖鎖の順に、実施するための最良の形態により詳説する。【００２３】
＜１＞  本発明方法１
本発明方法１は下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、ＣＨ糖鎖の製造方法である。
工程：「ＧｌｃＵＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」及び「ＣＨを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。すなわち、ＣＨを合成する菌体酵素を反応触媒として、ＧｌｃＵＡ供与体からのＧｌｃＵＡ残基と、ＧａｌＮＡｃ供与体からのＧａｌＮＡｃ残基と交互に糖受容体に転移させ、ＣＨ糖鎖を生成させる工程である。【００２４】
ここにいう「ＧｌｃＵＡ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧｌｃＵＡ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧｌｃＵＡヌクレオチドが好ましい。ＧｌｃＵＡヌクレオチドとしては、ＵＤＰ-ＧｌｃＵＡや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５’−ジリン酸）−ＧｌｃＵＡ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが好ましい。【００２５】
また、ここにいう「ＧａｌＮＡｃ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧａｌＮＡｃ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドが好ましい。ＧａｌＮＡｃヌクレオチドとしては、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃやｄＴＤＰ（デオキシチミジン５’−リジン酸）−ＧａｌＮＡｃ糖が例示されるが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが好ましい。
これらの糖ヌクレオチドは、公知の方法で製造しても良く、市販のものを用いても良い。【００２６】
また、本発明方法１において用いる「糖受容体」は、例えば下記一般式（１）及び（２）で示される糖鎖を例示することができる。
GlcUA−R1    ・・・・（１）
GalNAc−R2    ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、Ｒ１及びＲ２は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。）【００２７】
「Ｒ１」や「Ｒ２」としては、例えば、ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基や、ＨＡ骨格を有する糖鎖の残基等が例示される。例えばここにいう「ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基」としてはＣＨ残基やＣＳ残基等が例示される。このような糖鎖残基には、さらに他の化学物質などが結合していても良い。【００２８】
また、糖受容体の糖鎖のサイズも特に限定されないが、例えば１〜５０糖程度、好ましくは１〜４０糖程度、より好ましくは１〜３０糖程度、さらに好ましくは１〜２０糖程度のオリゴ糖を例示することができる。より具体的にはＣＨの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などが例示される。また、一般式（１）及び（２）の「Ｒ１」や「Ｒ２」としては、このようなサイズのＣＳオリゴ糖、ＨＡオリゴ糖なども用いることができる。
また、一般式（１）の非還元末端糖残基ＧｌｃＵＡはβ構造であることが好ましく、そのＧｌｃＵＡ残基がＲ１基のＧｌｃＮＡｃやＧａｌＮＡｃと結合している場合には、そのグリコシド結合はβ１−３構造であることが好ましい。一般式（２）の非還元末端糖残基ＧａｌＮＡｃもβ構造であることが好ましく、そのＧａｌＮＡｃ残基がＲ２基のＧｌｃＵＡと結合している場合には、そのグリコシド結合はβ１−４構造であることが好ましい。【００２９】
このような糖受容体は、公知の方法で製造することもでき、また市販のものなどを用いることもできる。
また、本発明方法１において用いられる「ＣＨを合成する菌体酵素」は、ＣＨを合成する活性を有する菌体酵素である限りにおいて特に限定されない。【００３０】
なお、本出願書類において「菌体酵素」とは、菌の形態を保ったままで特定の酵素活性を発揮することができる菌体自体を意味する。すなわち「ＣＨを合成する菌体酵素」とは、菌の形態を保ったままでＣＨを合成する酵素活性を発揮することができる菌体を意味するものである。【００３１】
この「ＣＨを合成する菌体酵素」は、大腸菌由来のＣＨポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ菌体酵素（大腸菌由来のＣＨポリメラーゼを発現させた菌体酵素）であることが好ましい。特に莢膜多糖体の生産に関与する遺伝子を持つ大腸菌から得られる遺伝子を組み込んだものが好ましく、特にＫ４ＣＰを発現させたものを用いることが極めて好ましい。宿主としては、大腸菌を用いることが好ましく、その中でも大腸菌ＴＯＰ１０株が極めて好ましい。【００３２】
ここにいう「Ｋ４ＣＰ」とは、ＣＨを受容体基質とし、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ等）及びＧｌｃＵＡヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ等）を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端がＧｌｃＵＡ残基の場合には当該末端にＧａｌＮＡｃを、非還元末端がＧａｌＮＡｃ残基の場合には当該末端にＧｌｃＵＡを結合させることによりＧａｌＮＡｃとＧｌｃＵＡを交互に結合させて、ＣＨを伸長させるポリメラーゼである（非特許文献１、特許文献１）。【００３３】
本発明方法１において大腸菌にＣＨポリメラーゼ活性を発現させるため導入されるＤＮＡの製造方法や由来も特に制限されない。例えばＫ４ＣＰは元々Ｋ４抗原を有する大腸菌から取得されたものであるが、形質転換された他の生物種から取得されたものや、化学合成等によって製造されたＤＮＡでもよい。【００３４】
また、大腸菌Ｋ４株のＫ４抗原特異的合成関連遺伝子クラスターRegion 2 (R-II)にはＫ４ＣＰ以外にもＣＨ合成に関与する有用な遺伝子があり、１番目のＯＲＦであるKfoAは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するＵＤＰ−Ｇｌｃ４−エピメラーゼの遺伝子と同定され、７番目のＯＲＦであるKfoFは、ＵＤＰ−ＧｌｃをＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに変換する活性を有する、ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼの遺伝子と同定された。【００３５】
したがって、KfoAのコードするエピメラーゼ活性とKfoFのコードするデヒドロゲナーゼ活性を利用することにより、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃやＵＤＰ−ＧｌｃＵＡより安価な材料であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとＵＤＰ−Ｇｌｃを基質としてＣＨポリマーを合成することができる。すなわち、本発明方法１において、ＵＤＰ−Ｇｌｃ４−エピメラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、並びにＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ及びＵＤＰ−Ｇｌｃを反応系中に共存させ、「ＧａｌＮＡｃ供与体」としてのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、及び「ＧｌｃＵＡ供与体」としてのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを供給することにより、ＣＨ糖鎖を製造することができる（後記実施例７〜９参照）。【００３６】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ−Ｇｌｃは既知の酵素や菌体反応によりＧｌｃなどの単糖から合成できることが知られており、より安価な材料からＣＨ糖鎖を工業的に生産できることが期待される。【００３７】
また、上記ＵＤＰ−Ｇｌｃ４−エピメラーゼ及びＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼの形態は特に限定されないが、Ｋ4ＣＰと同様に菌体酵素とすることが好ましく、したがって、Ｋ４ＣＰ発現系に加えてKfoAやKfoF大腸菌発現系により作製した組換え酵素の菌体リアクターを用いて、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ−Ｇｌｃから長鎖ＣＨを合成することが可能となり、安価な材料から長鎖ＣＨを合成でき、酵素の精製に必要な手間とコストを省くことができる、工業的に非常に有利な長鎖ＣＨの大量合成手法が提供される。【００３８】
これらのＤＮＡを導入するためのベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現することができる適当なベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組み込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系として、COS細胞、3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、pGIR201(Kitagawa, H., and Paulson, J.C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401) 、pEF-BOS (mizushima, S., and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 5322) 、pCXN2 (Niwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200) pCMV-2 (イーストマン  コダック (Eastman Kodak) 製) 、pCEV18、pME18S (丸山ら, Med. Immunol., 20, 27(1990)) 又はｐSVL（ファルマシア バイオテク社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせ、大腸菌（E. coli）と、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX、pTrc99、pKK233-3、pEZZZ18、pCH110、（ファルマシア  バイオテック社製）、pET（ストラタジー社製）、pBAD、pRSET、及びpSE420（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターの他、宿主細胞として、昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に大腸菌とpTrcHisとの組み合わせが好ましい。【００３９】
また、これらのＤＮＡ及び発現ベクターは分泌型や細胞内滞留型などが存在するが、細胞内に発現した酵素分子がとどまる細胞内滞留型が好ましい。【００４０】
また、発現ベクターのプロモーターは、適宜選択できるが、β−イソプロピルチオガラクトシドで発現誘導できるlacプロモーターが好ましい。また、細胞内で酵素活性構造を維持するため、変性沈殿形態のインクルージョンボディーを作りにくく、比較的発現効率が低いtrcプロモーターも好ましい。
本発明方法１に用いられる菌体酵素は、公知の方法を当業者が適宜選択し調製できる。具体的方法については後述の実施例１を参照されたい。【００４１】
また、本発明方法１は、用いられる界面活性剤が、ナイミーン、ＭＥＧＡ−１０、コール酸ナトリウム、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノコール酸、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが好ましく、中でもナイミーン、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが好ましく、さらにｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることが極めて好ましい。【００４２】
また、本発明方法１で用いられる「共存」とは、これらの供与体分子、糖受容体分子及び菌体酵素が相互に接触し、菌体酵素による酵素反応が惹起される状態である反応系が形成される限りにおいて特に限定されない。例えば、これらを溶液中で共存させてもよく、菌体酵素を適当な固相（ビーズ、限外濾過膜、透析膜等）に固着させこれに前記の供与体及び受容体を含有する溶液を連続的に接触させることにより共存させてもよい。したがって、例えばカラム型のリアクターや、膜型リアクター等を採用することもできる。また、ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ００／２７４３７号に記載された方法と同様に、受容体を固相に固着させて酵素反応させることもできる。さらに、供与体を再生（合成）するバイオリアクター等を組み合わせてもよい。【００４３】
また、本発明方法１における「共存」は、１０〜５０℃の条件下で１時間〜１０日間行われることが好ましく、２０〜４０℃の条件下で１０〜３０時間行われることがより好ましく、２０〜４０℃の条件下で１５〜２４時間行われることがさらに好ましく、２５〜３７℃の条件下で１５〜２４時間行われることが特に好ましい。【００４４】
この共存は、温度及びｐＨを一定に保持して行うことが好ましい。ｐＨを一定に保持するために、この反応は当該ｐＨ領域において緩衝作用を有する緩衝溶液中で行うことが好ましい。本発明方法１における「共存」に適するｐＨの範囲は５〜９であり、好ましくはｐＨ６〜８であり、中性付近が極めて好ましい。【００４５】
なお本発明方法１における「ＧｌｃＵＡ」及び「ＧａｌＮＡｃ」は、それぞれＤ−ＧｌｃＵＡ及びＤ−ＧａｌＮＡｃであることが好ましい。また、本発明方法１の一般式において示されるＧｌｃＵＡとＧａｌＮＡｃとの間のグリコシド結合（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）はβ１−３結合であることが好ましく、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＵＡとの間のグリコシド結合（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ）はβ１−４結合であることが好ましい。【００４６】
また、共存させる時にさらに有機溶媒を共存させることができ、キシレン、クロロホルム、パラフィン及びホルムアルデヒドからなる群から選ばれる１又は２以上の有機溶媒を共存させることが好ましく、特にクロロホルム又は「クロロホルム及びキシレン」を共存させることが好ましい。また共存状態における有機溶媒の濃度は０％超５％未満であることが好ましく、０．５％超３％未満であることがさらに好ましく、１％であることが極めて好ましい。【００４７】
また、糖受容体として、非還元末端にＧｌｃＵＡβ１−３構造又はＧａｌＮＡｃβ１−４構造を有する糖鎖誘導体を用いることにより、本発明方法１によって高分子鎖長のＣＨ誘導体を製造することもできる。ここにいう糖鎖誘導体とは、例えば、式（１）及び（２）の糖受容体であってＲ１およびＲ２としてＣＨ以外の糖鎖、糖鎖ではない任意の有機基などを有するものを意味し、高分子鎖長のＣＨ誘導体とは、高分子鎖長のＣＨにＣＨ以外の糖鎖、糖鎖ではない任意の有機基などが結合したＣＨ誘導体を意味するものである。【００４８】
また、本発明方法１は、製造されるＣＨ糖鎖が下記１）〜３）の全ての性質を有することが好ましい。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの諸条件は、実施例を参照されたい。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがＣＨ不飽和二糖に一致する。【００４９】
この場合には、用いる糖受容体は、下記一般式（１）又は（２）において「Ｒ１」及び「Ｒ２」がＣＨ骨格のみをもつ糖鎖である必要がある。
GlcUA−R1    ・・・・（１）
GalNAc−R2    ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、Ｒ１及びＲ２は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。）【００５０】
ここにいう「コンドロイチナーゼＡＢＣ」とは、グリコサミノグリカン分解酵素の一種で、ＣＨ、ＨＡに作用し、ヘキソサミンを還元末端に持つ不飽和二糖にまで完全に分解する酵素である。
また、本発明で用いる「実質的に全て」とは、上記分解産物を二糖分析したときに、ＣＨ不飽和二糖以外のピークが通常のＨＰＬＣにおいて検出できないことを意味する。【００５１】
本発明方法１により製造されるＣＨ糖鎖の分子量は特に限定されないが、本発明方法１は重量平均分子量が５万以上であるＣＨ糖鎖の製造に用いることができ、重量平均分子量が７万５千以上であるＣＨ糖鎖を製造するときに用いられることが好ましく、重量平均分子量２０万以上のＣＨ糖鎖を製造するときに用いられることが特に好ましい。分子量の上限としては特に限定されるものではなく、例えば、重量平均分子量で５０万や１００万程度のＣＨ糖鎖も製造可能である。従って好ましい分子量の範囲として具体的には、５万〜２０万、５万〜５０万、５万〜１００万、７万５千〜２０万、７万５千〜５０万、７万５千〜１００万、２０万〜５０万、２０万〜１００万、５０万〜１００万等の範囲が挙げられる。【００５２】
＜２＞  本発明方法２
本発明方法２は、「ＣＨを合成する菌体酵素」による酵素反応時に、界面活性剤を共存させることを特徴とする、ＣＨ合成の促進方法である。
本発明方法２は、例えば、本発明方法１のような「ＣＨ糖鎖の製造方法」において、「ＣＨを合成する菌体酵素」による酵素反応を界面活性剤の存在下に行うことによりＣＨ合成が促進されるという知見に基づくものであり、本発明方法２にいう「ＣＨを合成する菌体酵素」、「界面活性剤」、「共存」の語の意味は、いずれも本発明方法１について説明したものと同じである。【００５３】
また、本発明方法２を本発明方法１と同様の工程で行う場合、用いられる「ＧｌｃＵＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」についての説明や、合成されるべきＣＨ糖鎖の説明、その他諸条件等についての説明は、いずれも本発明方法１と同じである。【００５４】
＜３＞  本発明糖鎖
本発明糖鎖は、下記１）〜３）の全ての性質を有するＣＨ糖鎖である。
１）重量平均分子量：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、５万以上である。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの諸条件については、実施例を参照されたい。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣで完全に二糖に分解される。
３）当該糖鎖をコンドロイチナーゼＡＢＣで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがＣＨ不飽和二糖に一致する。【００５５】
また、本発明糖鎖の分子量は特に限定されないが、通常重量平均分子量で５万以上であり、７万５千以上であることが好ましく、２０万以上であることがより好ましい。本発明糖鎖における分子量の上限は特に限定されるものではなく、重量平均分子量で５０万や１００万程度分子量を有し得る。従って本発明糖鎖の分子量の範囲を具体的に例示すると、５万〜２０万、５万〜５０万、５万〜１００万、７万５千〜２０万、７万５千〜５０万、７万５千〜１００万、２０万〜５０万、２０万〜１００万、５０万〜１００万等の範囲が挙げられる。【００５６】
本発明糖鎖は、その状態も特に限定されず、溶液状態であっても、固体の状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）等であってもよい。
また、本発明糖鎖で用いられる「コンドロイチナーゼＡＢＣ」の用語の意義は本発明方法１で述べたものと同じである。
なお、本発明糖鎖は例えば本発明方法１を用いることにより製造することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。【００５８】
実施例１  菌体酵素の調製
特願2003-199583に示された方法に従い、大腸菌由来のＣＨポリメラーゼ（Ｋ４ＣＰ）酵素の遺伝子及び発現ベクターを製造した。発現ベクターとしてはpTrcHisプラスミド（インビトロゲン社製）を用いた。この方法で得られた発現ベクターを導入した大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地にて波長６００ｎｍにおける培養液の吸光度が約０．６となるまで３７℃で培養し、発現誘導分子であるβ−イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに３７℃で３時間培養し、酵素発現を誘導した。その培養液１ｍｌをとり、遠心チューブに移して 10,000 rpm で１分間遠心した。上清を捨て、残った細胞沈殿物を菌体酵素とした。また、この細胞沈殿物は−８０℃で保存することにより少なくとも１年間酵素活性を維持できる。【００５９】
実施例２  ＣＨ６糖（ＣＨ６）の調製
ＣＳを化学的に脱硫酸化したＣＨ（生化学工業株式会社製）に、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）を添加し、ＮａＣｌを含有する酢酸ナトリウム緩衝液中で限定分解することによって、非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である偶数糖のＣＨオリゴ糖を得た。得られたオリゴ糖をゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、ＣＨ６に相当する画分を集めて、凍結乾燥した。この得られた画分についてウロン酸含有量分析（カルバゾール法）、ＨＰＬＣ（ＧＰＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、コンドロイチナーゼ処理後の二糖分析等を行った結果、還元末端がＧａｌＮＡｃ残基で非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である６糖であることを確認した。【００６０】
実施例３  界面活性剤の濃度の検討
実施例１で得られた菌体酵素に、終濃度０、０．１、０．２、０．４、１．０又は２．０％の界面活性剤ナイミーンＳ−２１５（Nymeen S-215；日本油脂株式会社製）を含有する５０ ｍＭ Tris-HCl(pH7.2)緩衝液（２０ ｍＭ ＭｎＣｌ2、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ nmole ＣＨ６、３ nmol ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、０．２ μＣｉ ＵＤＰ−[3Ｈ]ＧａｌＮＡｃ及び３nmol ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを含有するもの）を添加して懸濁し、３０℃で１５時間振盪した。反応後、沸騰水中で１０分間加熱処理した後、15,000 rpmで５分間遠心して沈殿を除去し、上清をSuperdex peptide HR10/30 カラム（アマシャム社製）を用いたゲル濾過に付した。溶出液中の糖鎖は２２５ｎｍの吸収により検出した。【００６１】
高分子領域に存在する吸収ピークに相当する溶出画分を採取し、[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの取り込みを検出した。取り込みは、使用した[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃのトータルの放射活性を１００％とした場合における取り込まれた放射活性の比（％）で示した。結果を図１に示す。【００６２】
その結果、酵素反応時における界面活性剤の濃度を０．４％以上にすることによって、[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの約３７％が高分子画分に取り込まれることが示された。一方、界面活性剤ナイミーンＳ−２１５を添加せずに菌体酵素を使用すると、[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの取り込みはほとんど観察されなかった（図１）。【００６３】
実施例４  菌体酵素を用いた長鎖のＣＨ糖鎖の合成と分子量の分析
界面活性剤ナイミーンＳ−２１５の終濃度を０．４％として実施例３と同様にＣＨ糖鎖の合成を行った結果、使用した[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの約３７％が高分子画分に取り込まれることが再確認された。この高分子画分を実施例３と同様に処理した後、上清をSuperdex peptide HR10/30 カラム（アマシャム社製）を用いたゲル濾過に付し、実施例３と同様に検出した。さらに、この画分をコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）で処理した結果、完全に低分子化された。またこれにより生じた分解産物を二糖分析した結果、全ての分解産物がＣＨ不飽和二糖と一致することを確認した。したがって、前記の高分子画分はＣＨであることが確認され、酵素反応時における界面活性剤の濃度を０．４％以上とすることによって非常に効率よく高分子のＣＨを製造することが示された。【００６４】
また得られた高分子画分のSuperdex peptide HR10/30 カラムにおける溶出の様子を図２に示す。得られた高分子画分のピークは、Superdex Peptide HR10/30カラムのボイド容積位置に溶出された（図２中の黒丸）。このカラムの排除限界は、ＨＡ標準品を用いて測定すると重量平均分子量20,000であることから、得られた高分子画分（ＣＨポリマー）は重量平均分子量20,000以上であると推定された。【００６５】
一方、精製された遊離の組換えＫ４ＣＰ（特許文献１及び非特許文献１に記載の方法で製造したもの）を用いて同様に反応させると、重量平均分子量5,000のＣＨが合成された（図２中の白丸）。【００６６】
実施例５  菌体酵素を用いた長鎖のＣＨ糖鎖の合成と分子量の分析
本発明方法により合成されるＣＨポリマーの分子量をさらに詳細に検討するため、以下のように合成と分子量の分析を行った。
すなわち、実施例４と同様に菌体酵素を用いて得られたＣＨポリマー、及び実施例４と同様の条件においてＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ濃度を３０nmolに変更して合成したＣＨポリマーのそれぞれを直列につないだ Sephacryl S500 HR 10/30カラムとSuperose 6 HR 10/30 カラムに付したところ、ＨＡ標準品を指針として前者は重量平均分子量７万５千の位置に（図３中の黒丸）、後者は重量平均分子量２０万の位置に溶出した（図３中の黒四角）。【００６７】
実施例６  酵素反応時における界面活性剤の種類の検討
終濃度０．４％の各種界面活性剤を用い、実施例３と同様に試験することによって、界面活性剤の種類による[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの取り込みに対する影響を調べた。酵素としては、実施例１で製造した菌体酵素を用いた。また用いた界面活性剤は以下の通りである。【００６８】
Nymeen S-215（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン、日本油脂株式会社製）
Triton X-100  （ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ナカライテスク株式会社製）
Tween 20  （ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ナカライテスク株式会社製）
Tween 80  （ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ナカライテスク株式会社製）
Brij 35  （ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ナカライテスク株式会社製）
Brij 58  （ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル、ナカライテスク株式会社製）
Nonidet P-40  （ノニデット  Ｐ−４０、ナカライテスク株式会社製）
Tergitol NP-40  （タージトール  ＮＰ−４０、ナカライテスク株式会社製）
CHAPS  （３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート、Ｄｏｊｉｎｄｏ製）
Octyl-thioglucoside  （ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、キシダ化学製）
Dodecyl-maltoside  （ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、キシダ化学製）
MEGA-9  （ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、キシダ化学製）
MEGA-10  （ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、キシダ化学製）
CHAPSO  （３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、キシダ化学製）【００６９】
Sodium cholate  （コール酸ナトリウム、キシダ化学製）
LDS  （ラウリル硫酸リチウム、キシダ化学製）
SDS  （ドデシル硫酸ナトリウム、キシダ化学製）
Octyl-glucoside  （ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、キシダ化学製）
Heptyl-thioglucoside  （ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、キシダ化学製）
Nonyl-thiomaltoside  （ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、キシダ化学製）
Sucrose monocholate  （ショ糖コール酸モノエステル、キシダ化学製）
Sucrose monocaprate  （ショ糖カプリン酸モノエステル、キシダ化学製）
Sucrose monolaurate  （ショ糖ラウリン酸モノエステル、キシダ化学製）【００７０】
取り込みは、使用した[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃのトータルの放射活性を１００％とした場合における取り込まれた放射活性の比（％）で示した。結果を図４に示す。なお図４中の「精製酵素」は、菌体酵素に代えて実施例４で用いた「精製された遊離の組換えＫ４ＣＰ」を界面活性剤の非存在下で反応させたものを、「界面活性剤なし」は、菌体酵素を界面活性剤の非存在下で反応させたものをそれぞれ意味する。【００７１】
図４に示すように、菌体酵素を用いた場合、スクロースモノカプロン酸、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド又はスクロースモノラウリル酸を用いると、特に効率よく［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃが取り込まれることが示された。【００７２】
実施例７  酵素反応時における有機溶媒の影響の検討
終濃度１％の種々の有機溶媒を用い、実施例３と同様に試験することによって、有機溶媒の種類による[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃの取り込みに対する影響を調べた。酵素としては、実施例１で製造した菌体酵素を用いた。また用いた有機溶媒は以下の通りである。【００７３】
キシレン
パラホルムアルデヒド
ホルマリン
グルタールアルデヒド
クロロホルム
パラフィン
クロロホルム・エタノール混液
クロロホルム・キシレン混液
パラフィン・キシレン混液【００７４】
取り込みは、使用した[３Ｈ]ＧａｌＮＡｃのトータルの放射活性を１００％とした場合における取り込まれた放射活性の比（％）で示した。結果を図５に示す。なお図５中の「有機溶媒なし」は、菌体酵素を有機溶媒の非存在下で反応させたものを意味する。【００７５】
図５に示すように、菌体酵素を用いた場合、クロロホルム又は「クロロホルムとキシレンとの混合物」を用いると、［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃの取り込みが促進されることが示された。
また、有機溶媒としてクロロホルムを用いる場合の濃度の依存性を調べるために、酵素反応液中のクロロホルム濃度を０、０．５、１．０、２．０、５．０又は１０．０％として実施例３と同様に試験することによって、高分子画分中の［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃの取り込み量を調べた。結果を図６に示す。【００７６】
図６に示す通り、菌体酵素を用いた場合、酵素反応液中のクロロホルムの濃度が０％超５％未満とすると、［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃの取り込みが促進されることが示された。【００７７】
実施例８  kfoA及びkfoFのサブクローニングと発現ベクターの構築
特開2003-199583で示された大腸菌Ｋ４株の遺伝子クラスターRegion 2(R-II)のDNA配列をテンプレートとして、PCR法により大腸菌由来ＵＤＰ−Ｇｌｃ4−エピメラーゼ遺伝子（kfoA）及び大腸菌由来ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ遺伝子（kfoF）のcDNAを得た。得られたＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りＰＣＲを行った。【００７８】
kfoA-SP：CGGGATCCCGATGAATATATTAGTTACAGG（下線部はBamHIサイト、配列番号５）
kfoA-AS：CCCAAGCTTGGGTAGAAGTTATCGTAAAAT（下線部はHindIIIサイト、配列番号６）
kfoF-SP：CGGGATCCCGATGAAAATTGCAGTTGCTGG（下線部はBamHIサイト、配列番号７）
kfoF-AS：CCCAAGCTTGGGTCTTTAATAGCCATAAAA（下線部はHindIIIサイト、配列番号８）【００７９】
テンプレート100 ngに対し、TakaRa Ex Taq 2.5 Unit（タカラバイオ社製）、10×Ex Taq Buffer 10 μl、2.5 mM dNTP Mixture 8 μl、センスプライマーとアンチセンスプライマーをそれぞれ100 pmolずつ加え、milli-Q水で全量100 μlとなるよう調節した。ＰＣＲの条件は、９４℃、５分で反応を行った後、「９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で９０分間」のサイクルを３０サイクル繰り返し、その後７２℃で７分間反応させて行った。【００８０】
反応液から目的のフラグメントをQIA quick（キアゲン社製）によりゲル抽出し、BamHIとHindIIIで終夜限定分解を行った。その後、再度ゲル抽出して目的のフラグメントを精製した。同じ制限酵素で限定分化したpTric-HisCベクター（インビトロゲン社製）約100 ngに対し、精製したcDNA断片を約300 ng、T4 ligase（NEB社製）0.5 μl、10×T4 ligase Buffer 1 μlを加え、milli-Q水で全量10 μlとなるよう調節し、16℃の水浴中で1時間ライゲーションを行った。その後、反応液5 μlを用いてTOP10のコンピテントセル100 μlを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地（LB/Ampプレート）に塗布した状態で37℃で終夜静置した。【００８１】
プレート上のコロニーからそれぞれ任意の5つを選択し、アルカリプレップ法でプラスミドを抽出して、BamHIとHindIIIによりインサートチェックを行った。正しくインサートが組み込まれていたプラスミドについてシークエンスを確認し、データベースの遺伝子配列（GeneBank accession No. AB079602）と相違がないことを確認した。確認された大腸菌Ｋ４株由来ＵＤＰ−Ｇｌｃ4−エピメラーゼ遺伝子（kfoA）及びＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ遺伝子（kfoF）のＤＮＡ配列をコードアミノ酸とともに配列表の配列番号１及び３に、これらの遺伝子によりコードされるＵＤＰ−Ｇｌｃ4−エピメラーゼ及びＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号２及び４に、それぞれ示す。【００８２】
実施例９  KfoA及びKfoFの組換え体作製と活性確認
KfoA及びKfoFの発現ベクターをそれぞれ大腸菌TOP10に形質転換し、アンピシリン含有LB液体培地 100 ml中でO.D.600 = 0.5となるまで37℃で培養し、終濃度1mMとなるようIPTGを添加して3時間発現誘導を行った。その後、超音波処理して得られた可溶性画分をNi-NTA Agarose（キアゲン社製）カラムに通し、KfoA及びKfoFの精製酵素を得た。得られた酵素画分を1 Lの20 % Glycerol 含有PBS溶液中で終夜透析した後、溶液を入れ替えて6時間の透析を2回繰り返した。【００８３】
KfoAの酵素反応は酵素2.5 μl、1 mM ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ5 μl、1 M Tris-HCl 5 μl、水 37.5 μlを混合した溶液を30℃の浴槽中で1時間加温して行った。その後、Hydrosphere C18カラム（YMC社製）でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを分離し、その面積比から酵素活性（単位時間当たりにＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを産生する量）を見積もった。【００８４】
KfoFの反応は酵素5 μl、1 mM ＵＤＰ−Ｇｌｃ 5 μl、1 M Tris-HCl or Glycine-NaOH 5 μl、5 mM β-NAD+ 10 μl、水25 μlを混合した溶液を30℃の浴槽中で1時間加温して行った。その後、Hydrosphere C18カラムでＵＤＰ−ＧｌｃとＵＤＰ−ＧｌｃＵを分離し、その面積比から酵素活性（単位時間当たりにＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを産生する量）を見積もった。【００８５】
大腸菌発現系により作製したKfoA及びKfoFの組換え酵素をNi-NTA Agaroseカラムで精製し、回収した画分をSDS PAGEで分離した。マウスTetra His tag抗体（キアゲン社製）を一次抗体に、Goat Anti Mouse HRP抗体（ギブコ社製）を二次抗体に用いたWestern Blottingで組換え酵素の発現を確認した。その結果、KfoAはHis tagの分子量を含めた42 kDaの位置に、KfoFは48 kDaの位置に特異的な染色が主バンドとして検出された。また、SDS PAGE後のゲルをCBB染色したところ、これらのバンド以外に強く染まったバンドは見られなかった。回収した酵素は20 % Glycerol 含有 PBS溶液で3回透析し、-80℃で保存した。【００８６】
作製したKfoA及びKfoFの組換え酵素を用いて、至適反応条件の検討を行った。KfoA 2.5 μl、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ5 nmol、終濃度1 M Tris-HCl（pH 7.0 − 10.0）となるように調製した反応液（50 μl）を30℃の水浴中で1時間加温した。その後、Hydrosphere C18逆相カラムを用いて、作製されたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと未反応のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを分離し、2つのピークの面積比からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが全糖ヌクレオチド量に対して占める割合を定量した。この結果、pH 8.5で最もＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが多く作製されていた為、Tris-HCl pH8.5をKfoAの至適緩衝液と決定した。【００８７】
また、KfoFについては、KfoF 5 μl、ＵＤＰ−Ｇｌｃ 5 nmol、β-NAD+ 50 nmol、0.1 M Tris-HCl（pH 7.0 − 10.0）もしくは0.1 M Glycine-NaOH（pH 9.0 − 10.0）となるように調製した反応液（50 μl）を30℃の水浴中で1時間加温した。その後、吸光光度計で340 nmの吸光度を測定し、各pHでの酵素活性を相対的に比較した。この340 nmの吸光度はＵＤＰ−Ｇｌｃ 1分子が酸化された際に生じるβ-NADH 2分子に由来するものであり、KfoFの酵素活性に比例した値となる。この結果、Glycine-NaOH pH 9.4で反応した時の吸光度が最大であった為、これをKfoFの至適緩衝液と決定した。【００８８】
実施例１０  ３種の菌体酵素リアクターによるＣＨポリマー合成
実施例１と同様にして、KfoA及びKfoFの発現ベクターをそれぞれ大腸菌TOP10に形質転換し、アンピシリン含有LB液体培地 100 ml中でO.D.600 = 0.5となるまで37℃で培養し、終濃度1 mMとなるようIPTGを添加した後、発現誘導を3時間行なった。培養液をそれぞれ1 mlずつに分注して、15,000×gで1分間遠心して上清を取り除き、-80℃で保存して、KfoAとKfoFの菌体酵素とした。この２種の菌体リアクターと実施例１で得たＫ４ＣＰ菌体を混ぜ、ＣＨ６ 0.1 nmol, UDP-[3H]GlcNAc 3 nmol (0.1 μCi), UDP-Glc 3 nmol, β-NAD+ 30 nmolを加え、150 mM NaCl, 0.2 mM MnCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 0.4 % Nymeen S-215（界面活性剤）となるよう全量100 μlに調製し、30℃で激しく攪拌しながら終夜合成反応を行った。反応液は10分間煮沸した後に15,000×gで1分間遠心し、上清を0.45 μm孔径のフィルター（ミリポア社製）を通して濾過した。各サンプルをSuperdex Peptide 10/300 GL（アマシャム社製）でサイズ分画した後に、各画分の3H含量をシンチレーションカウンターで計測し、ＣＨポリマーの合成を確認した。生成物のSuperdex Peptideカラムにおける溶出曲線を図７に示す（C-ABC(-)）。さらにその生成物をコンドロイチナーゼABC処理した後、上記と同様にして各画分の3H含量をシンチレーションカウンターで計測した。コンドロイチナーゼABC処理した生成物のSuperdex Peptideカラムにおける溶出曲線を図７に示す（C-ABC(+)）。生成物のコンドロイチナーゼABC処理により高分子ピークが消失したことから、得られた高分子はＣＨ多糖鎖であることが明確となった（図７）。【００８９】
また、CH6を添加しないで上記と同様のＣＨ合成を行った。ＣＨ６を添加した場合としなかった場合の生成物のSuperose 6 10/300 GLカラムにおける溶出曲線を図８に示す（CH6(+)及びCH6(-)）。ＣＨ６を添加しないと同様な操作をしてもコンドロイチナーゼ分解性の高分子は得られないことからＣＨ６が、ＣＨ糖鎖伸長に必須であることが明らかとなった（図８）。
以上より、これら3つの酵素リアクターを用いた合成系により、ＵＤＰ−ＧｌｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを供与体基質として、受容体基質のＣＨ６が伸長されて超高分子のＣＨポリマーが合成されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明方法は、高分子ＣＨ糖鎖の製造に利用することができ、製造された高分子ＣＨは医薬品、食品、化粧品などの機能性分子として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＣＨ合成の界面活性剤濃度依存性を示す図である。
【図２】実施例４で得られた反応上清のSuperdexPeptideカラム溶出曲線を示す図である。
【図３】反応上清のSephacrylS500 とSuperose 6の直列カラムによる溶出曲線を示す図である。
【図４】終濃度０．４％の種々の界面活性剤のＣＨ合成に対する影響を示す図である。
【図５】ＣＨ合成に対する有機溶媒の影響を示す図である。
【図６】ＣＨ合成に対する有機溶媒濃度依存性を示す図である。
【図７】実施例１０で得られた生成物の及びコンドロイチナーゼABC処理した同生成物のSuperdex Peptideカラムにおける溶出曲線を示す図である。
【図８】実施例１０のＣＨ合成においてＣＨ６を添加して得られた生成物および添加せずに得られた生成物のSuperoseカラムにおける溶出曲線を示す図である。
【図１】
2007069693.tif 000002
【図２】
2007069693.tif 000003
【図３】
2007069693.tif 000004
【図４】
2007069693.tif 000005
【図５】
2007069693.tif 000006
【図６】
2007069693.tif 000007
【図７】
2007069693.tif 000008
【図８】
2007069693.tif 000009
【配列表】
2007069693000001.app
【国際調査報告】
2007069693.tif 000010
2007069693.tif 000011
2007069693.tif 000012
2007069693.tif 000013