(57)【要約】  本発明によれば、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製造法、および該蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
微生物がエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項７記載の蛋白質の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物または請求項１記載の蛋白質と、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸およびジペプチドとを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取するペプチドの製造法。
【請求項１０】
アミノ酸がL-アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸である請求項９記載のペプチドの製造法。
【請求項１１】
L-アミノ酸がL-アラニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-メチオニン、L-セリン、L-スレオニン、L-システイン、L-アスパラギン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-アスパラギン酸、L-α-アミノブチル酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン、N-アセチル-L-システインおよびN-アセチル-L-αアミノブチル酸からなる群から選ばれるL-アミノ酸である請求項１０記載のペプチドの製造法。
【請求項１２】
ジペプチドがγ-L-グルタミルアミノ酸、γ-L-Dグルタミルアミノ酸、γ-L-（α-メチル
）グルタミルアミノ酸、β-アミノグルタリルアミノ酸、γ-L-（N-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-DL-（β-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-DL-（γ-メチル）グルタミルアミノ酸からなる群から選ばれるジペプチドである請求項９記載のペプチドの製造法。
【請求項１３】
γ-L-グルタミルアミノ酸がγ-L-グルタミル-L-システイン、γ-L-グルタミル-L-α-アミノブチル酸、γ-L-グルタミル-L-S-メチルシステイン、γ-L-グルタミル-L-セリン、γ-L-グルタミル-L-アラニン、γ-L-グルタミル-L-ノルバリン、γ-L-グルタミル-L-ハイポグリシン、γ-L-グルタミル-β-シアノアラニン、γ-L-グルタミル-Se-メチルセレノシステイン、N-（γ-L-グルタミル）アミノ-D-プロリンからなる群から選ばれるγ-L-グルタミルアミノ酸である請求項１２記載のペプチドの製造法。
【請求項１４】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のペプチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製造法、該蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、数十残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が主に用いられ、２〜数残基の短鎖のペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法による短鎖ペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も副生されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。【０００３】
酵素法による短鎖ペプチドの合成に関しては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、エステル交換酵素（特許文献１〜３、非特許文献２）を利用する方法、耐熱性アミノアシルt-RNA合成酵素を利用する方法（特許文献４〜７）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、NRPSと称す）を利用する方法（非特許文献３、４および特許文献８、９参照）が知られている。【０００４】
しかし、蛋白質分解酵素の逆反応を利用する方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。エステル交換酵素を利用する方法では、基質となるアミノ酸のエステル化が必要であり、効率化および基質となるアミノ酸エステルと生成したペプチドの分解による収率低下といった問題点がある。耐熱性アミノアシルt-RNA合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。NRPS を利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である4'−ホスフォパンテテイン（4'-phosphopantetheine）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。【０００５】
一方、酵素分子量がNRPSより小さく、補酵素である4'-phosphopantetheineを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ-glutamylcysteine synthetase）、D-アラニル−D-アラニン（D-Ala−D-Ala）リガーゼ（D-Ala−D-Ala ligase）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（poly-γ-glutamate synthetase）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはD-アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、L-アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合する短鎖ペプチドの合成に用いることはできない。【０００６】
L-アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性が知られているのはバシリシン合成酵素とグルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase）のみである。バチルス属に属する微生物由来のバシリシン合成酵素は、ジペプチド抗生物質であるバシリシン［L-アラニル−L-アンチカプシン（L-Ala−L-anticapsin）］及びL-アラニル−L-アラニン（L-Ala−L-Ala）を合成する活性を有する（非特許文献５および６参照）のみでなく、多様な組合せの同一または異なる遊離のアミノ酸から種々のジペプチドを生成する活性を有することが報告されている（特許文献１０、非特許文献７）。グルタチオンシンセターゼは、γ-L-グルタミル-L-システイン（γ-L-Glu-L-Cys）のシステイン残基とグリシン（Gly）をα位で連結してグルタチオン（γ-L-Glu-L-Cys-Gly）を生成するだけでなく、数種類のγ-L-グルタミルアミノ酸（ジペプチド）のＣ末端のアミノ酸残基とグリシンを連結してγ-L-グルタミルジペプチド（トリペプチド）を生成する（非特許文献８）が、γ-L-グルタミルアミノ酸とグリシン以外のL-アミノ酸とを連結する活性は報告されていない。【０００７】
これらの酵素を用いて、種々のジペプチドやトリペプチドを生産することが可能であるが、これらの酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でない短鎖ペプチドもあるため、これらの酵素とは基質特異性が異なる新たな短鎖ペプチド合成酵素が求められている。
クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824の染色体ＤＮＡの塩基配列、および遺伝子の推定塩基配列とも公知である（非特許文献９参照）。しかしながら、該遺伝子中のCAC1540遺伝子にコードされる蛋白質の機能はもちろん、CAC1540遺伝子が実際に機能を有する蛋白質をコードする遺伝子であるか否かも知られていない。
【特許文献１】国際公開第2003/010187号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2003/010307号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2003/010189号パンフレット
【特許文献４】特開昭58-146539号公報
【特許文献５】特開昭58-209991号公報
【特許文献６】特開昭58-209992号公報
【特許文献７】特開昭59-106298号公報
【特許文献８】米国特許第5795738号
【特許文献９】米国特許第5652116号
【特許文献１０】国際公開第2004/058960号パンフレット
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
【非特許文献２】J. Biotechnol., 115, 211-220 (2005)
【非特許文献３】Chem. Biol., 7, 373-384 (2000)
【非特許文献４】FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
【非特許文献５】J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987)
【非特許文献６】Enzyme Microb. Technol., 29, 400-406 (2001)
【非特許文献７】J. Bacteriol., 187, 5195-5202 (2005)
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 254, 5184-5190 (1979)
【非特許文献９】http://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Cace_ATCC824
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いた該蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製造法、および該蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）上記（２）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（４）上記（３）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（５）形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、上記（４）の形質転換体。
（６）微生物がエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、上記（５）の形質転換体。
（７）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（８）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（７）の蛋白質の製造法。
（９）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物または上記（１）の蛋白質と、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸およびジペプチドとを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取するペプチドの製造法。
（１０）アミノ酸がL-アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸である上記（９）のペプチドの製造法。
（１１）L-アミノ酸がL-アラニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-メチオニン、L-セリン、L-スレオニン、L-システイン、L-アスパラギン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-アスパラギン酸、L-α-アミノブチル酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン、N-アセチル-L-システインおよびN-アセ
チル-L-αアミノブチル酸からなる群から選ばれるL-アミノ酸である上記（１０）のペプ
チドの製造法。
（１２）ジペプチドがγ-L-グルタミルアミノ酸、γ-D-グルタミルアミノ酸、γ-L-（α-メチル）グルタミルアミノ酸、β-アミノグルタリルアミノ酸、γ-L-（N-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-DL-（β-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-L-（γ-メチル）グルタミルアミノ酸からなる群から選ばれるジペプチドである上記(９)のペプチドの製造法。
（１３）γ-L-グルタミルアミノ酸がγ-L-グルタミル-L-システイン、γ-L-グルタミル-L-α-アミノブチル酸、γ-L-グルタミル-L-S-メチルシステイン、γ-L-グルタミル-L-セリン、γ-L-グルタミル-L-アラニン、γ-L-グルタミル-L-ノルバリン、γ-L-グルタミル-L-ハイポグリシン、γ-L-グルタミル-β-シアノアラニン、γ-L-グルタミル-Se-メチルセレノシステイン、N-（γ-L-グルタミル）アミノ-D-プロリンからなる群から選ばれるγ-L-グルタミルアミノ酸である上記(１２)のペプチドの製造法。
（１４）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記(４)〜（６）のいずれか１つに記載の形質転換体である、上記(９)〜（１３）のいずれか１つに記載の記載のペプチドの製造法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によりペプチド合成活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いて種々のペプチドを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プラスミドpCAC1540の構築過程を示す図である。
【符号の説明】
【００１２】
図中のCAC1540は、クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824株由来のCAC1540遺伝子、PT7はＴ７プロモーター遺伝子、His・tagはHis・tag配列を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
をあげることができる。【００１４】
本明細書におけるペプチド合成活性とはペプチド結合を形成する活性であり、アミノ酸のα位のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との間のペプチド結合を形成する活性、およびジペプチドのＣ末端のアミノ酸残基のα位のカルボキシル基とアミノ酸のアミノ基との間のペプチド結合を形成する活性をいう。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質は、Molecular cloning, a laboratory manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００１５】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００１６】
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００１７】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピ
オン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がペプチド合成活性を有するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列との比較において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００１８】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) ］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００１９】
本発明の蛋白質が、ペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質と１種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸、好ましくはγ-グルタミルアミノ酸とL-アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析し、確認する方法をあげることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、
［１］上記１の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００２０】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるが、ハイブリダイゼーションに用いるプローブはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは２００塩基以上、特に好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができる。【００２１】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。【００２２】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。ストリンジェントな条件は、プローブＤＮＡの鎖長の長さやＧＣ含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の方法により設定することができる。また、より低いストリンジェント条件を用いることもできるが、ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/Lの塩化ナトリウム、0.2mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件においてハイブリダイゼーションを行った後、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。【００２３】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記した[１]または[２]のＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２４】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源と１種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸、好ましくはγ-グルタミルアミノ酸とL-アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
３．本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、該微生物としては、好ましくはクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に属する微生物、さらに好ましくはClostridium acetobutylicum ATCC824をあげることができ、該形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体をあげることができる。【００２５】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌、より好ましくはEscherichia属に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物、好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に属する微生物、より好ましくはClostridium acetobutylicum ATCC824の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号２で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはClostridium属に属する微生物、より好ましくはClostridium acetobutylicumに属する微生物、さらに好ましくClostridium acetobutylicum ATCC824の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。【００２６】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡを取得することもできる。【００２７】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]あるいはApplied Biosystems 3700 DNA Analyzer（アプライド・バイオシステム社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００２８】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。【００２９】
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pPCR-Script Amp （ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００３０】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。【００３１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394号）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号２で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリ BL21/pCAC1540をあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することもできる。【００３２】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。【００３３】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３４】
発現ベクターとしては、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3、pET-21d(+)（いずれもノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600号）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescript II SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (国際公開第98/12343号パンフレット)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798号）等を例示することができる。【００３５】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００３６】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００３７】
本発明のＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばpCAC1540をあげることができる。
宿主細胞として用いる原核生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア
（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Batillus megaterium）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14297、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ATCC6872、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス���Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。【００３８】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394号）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。【００３９】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等をあげることができる。【００４０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979号）、pAS3-3（特開平2-227075号）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。【００４１】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４２】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞
、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299号）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。【００４３】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075号）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。【００４４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００４５】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００４６】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細
胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等
を用いることができる。【００４７】
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori） N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075号）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等をあげることができる。【００４８】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００４９】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885号、特開昭60-70080号、国際公開第94/00977号パンフレット）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887号）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856号、特許第2517813号）等をあげることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００５０】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００５１】
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５２】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００５３】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００５４】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００５５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle）のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００５６】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。【００５７】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００５８】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。【００５９】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平5-336963号、国際公開第94/23021号パンフレット等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００６０】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075号に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００６１】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００６２】
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nutr., 63, 639 (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627 (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192号）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００６３】
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。【００６４】
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【００６５】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Q-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組合せて用い、精製標品を得ることができる。【００６６】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００６７】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００６８】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963号、国際公開第94/23021号パンフレットに記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００６９】
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【００７０】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物または上記１の本発明の蛋白質と、１種以上のアミノ酸またはジペプチドとアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、上記６の方法により製造された本発明の蛋白質を用いることができる。また、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物、好ましくはクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）に属する微生物、さらに好ましくはClostridium acetobutylicum ATCC824を後述の方法で培養し、得られた培養物から上記６の単離精製法にて取得できる本発明の蛋白質も用いることができる。【００７１】
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質としては、１種以上、好ましくは１〜３種、さらに好ましくは１種もしくは２種のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸の組合せをあげることができる。基質が１種以上のアミノ酸である場合、アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンからなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸を用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-メチオニン、L-セリン、L-スレオニン、L-システイン、L-アスパラギン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-アスパラギン酸、L-α-アミノブチル酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン、N-アセチル-L-システインおよびN-アセチル-L-αアミノブチル酸などをあげることができる。【００７２】
基質がジペプチドとアミノ酸の組合せである場合、ジペプチドとしては、γ-L-グルタミルアミノ酸、γ-D-グルタミルアミノ酸、γ-L-（α-メチル）グルタミルアミノ酸、β-アミノグルタリルアミノ酸、γ-L-（N-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-DL-（β-メチル）グルタミルアミノ酸、γ-DL-（γ-メチル）グルタミルアミノ酸からなる群から選ばれるジペプチドをあげることができる。γ-L-グルタミルアミノ酸としては、γ-L-グルタミル-L-システイン、γ-L-グルタミル-L-α-アミノブチル酸、γ-L-グルタミル-L-S-メチルシステイン、γ-L-グルタミル-L-セリン、γ-L-グルタミル-L-アラニン、γ-L-グルタミル-L-ノルバリン、γ-L-グルタミル-L-ハイポグリシン、γ-L-グルタミル-β-シアノアラニン、γ-L-グルタミル-Se-メチルセレノシステイン、N-（γ-L-グルタミル）アミノ-D-プロリンからなる群から選ばれるγ-L-グルタミルアミノ酸をあげることができる。また、基質がジペプチドとアミノ酸の組合せである場合、アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンからなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸を用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-メチオニン、L-セリン、L-スレオニン、L-システイン、L-アスパラギン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-アスパラギン酸、L-α-アミノブチル酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン、N-アセチル-L-システインおよびN-アセチル-L-αアミノブチル酸などをあげることができる。【００７３】
上記製造法に用いられる、より好ましい基質としては、γ-L-グルタミル-L-システインとL-アラニン、グリシン、L-メチオニン、L-セリン、およびL-システインからなる群から選ばれるアミノ酸との組合せをあげることができる。
基質である１種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸は、ペプチドを生成、蓄積させる水性媒体に粉末のまま、あるいは溶液として供給することができるが、該水性媒体中で化学合成法、酵素的合成法、または生物学的合成法等により基質を合成することにより供給することもできる。例えば、ペプチドを生成、蓄積させる水性媒体中に、エシェリヒア・コリ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素[EC6.3.2.2]、L-グルタミン酸、L-システイン、およびＡＴＰを共存させることにより、γ-L-グルタミル-L-システインを供給することができる。基質の供給はペプチドを生成、蓄積させる前に行ってもよく、ペプチドの生成と同時でも構わない。【００７４】
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるジペプチドまたは1種のアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。
上記製造法において、基質として用いるジペプチドとアミノ酸は、それぞれ0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。【００７５】
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。ＡＴＰはペプチドを生成、蓄積させる水性媒体に粉末のまま、あるいは溶液として供給することができるが、例えば解糖系やポリリン酸キナーゼなどを利用したＡＴＰ再生活性（ペプチド生成の際に生じるＡＤＰをＡＴＰに変換する活性）を該水性媒体に加えることでＡＴＰを供給することもできる。具体的には、Corynebacterium ammoniagenesの培養菌体と炭素源を添加する方法［Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644(2001)］、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸を添加する方法［J. Biosci. Bioeng., 91, 557(2001) ］等をあげることができる。【００７６】
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【００７７】
ペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるペプチドとしては、アミノ酸同士がペプチド結合で連結したペプチド、またはジペプチドのＣ末端のアミノ酸残基とアミノ酸、好ましくはγ-L-グルタミルアミノ酸とL-アミノ酸、グリシンおよびβ-アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸、より好ましくはγ-L-グルタミル-L-システインのシステイン残基とL-アラニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-メチオニン、L-セリン、L-スレオニン、L-システイン、L-アスパラギン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-アスパラギン酸、L-α-アミノブチル酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン、N-アセチル-L-システイン、N-アセチル-L-αアミノブチル酸、グリシンおよびβ-Alaからなる群から選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したペプチド、さらに好ましくは、γ-L-グルタミル-L-システインのシステイン残基とL-アラニン、グリシン、L-メチオニン、L-セリンおよびL-システインからなる群から選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したトリペプチドをあげることができる。
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造において酵素源として用いられる微生物の培養物としては、本発明の蛋白質を生産する微生物を該微生物の生育に適した培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。例えば、該微生物としてClostridium acetobutylicum ATCC824を用いる場合、NBRC medium No.807培地（ポリペプトン 15g/L、イースト・エキストラクト 5g/L、グルコース 5g/L、塩化ナトリウム 2.5g/L、L-システイン 0.5g/L、チオグリコール酸ナトリウム 0.5g/L、レザズリン 1mg/L、pH 7.0-7.2）やATCC medium 1017培地（グランド・ビーフ 500g/L、1N 水酸化ナトリウム 25mL/L、ペプトン 30g/L、イースト・エキストラクト 5.0g/L、リン酸水素２カリウム 5.0g/L、0.025% レザズリン溶液 4.0mL/L、L-システイン 0.5g/L、pH7.0）などの培地を用い、２５〜４０℃、１〜１０日間、ガスパック（日本ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いて嫌気的に培養して得られる培養物をあげることができる。また、本発明の製造法において酵素源として用いられる形質転換体の培養物としては、該形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。【００７８】
微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物の界面活性剤処理物、該培養物の溶媒処理物、該培養物の酵素処理物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該微生物の培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。【００７９】
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸との組合せとしては、上記（１）と同様の化合物をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるジペプチドまたは1種のアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。【００８０】
基質として用いる１種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に供給することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。【００８１】
ペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、上記（１）と同様のペプチドをあげることができる。
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。【００８２】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
CAC1540遺伝子発現株の造成
クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号２
で表される塩基配列を有する、機能未知蛋白質をコードするCAC1540遺伝子の塩基配列情報（http://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Cace_ATCC824、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=15024486&itemID=4&view=gbwithparts）に基づき、クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824の染色体ＤＮＡからCAC1540遺伝子の相同遺伝子を以下のようにして取得した。【００８４】
まず、クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824株をNBRC medium No.807培地(ポリペプトン 15g/L、イースト・エキストラクト 5g/L、グルコース 5g/L、塩化ナトリウム 2.5g/L、L-システイン 0.5g/L、チオグリコール酸ナトリウム 0.5g/L、レザズリン 1mg/L
、pH 7.0-7.2) 10mLに植菌して37℃で嫌気的に24時間静置培養した。培養液1mLを250mLのNBRC medium No.807培地に植菌し、37℃で嫌気的に48時間静置培養した。遠心分離により集菌した菌体からDNeasy Kit（キアゲン社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。【００８５】
パーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosystems）社製8905型ＤＮＡ合成
機を用いて、配列番号３および４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、クロストリジウム・アセトブチリカムATCC824株の染色体ＤＮＡのCAC1540遺伝子の開始コドンを含む領域の5'末端にNcoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、CAC1450遺伝子のＣ末端アミノ酸配列を含むＤＮＡ配列と相補的な塩基配列の5'末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【００８６】
CAC1450遺伝子の相同遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてクロストリジウム・アセトブチリカムATCC824株の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2 unitsのKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、5μLのKOD plus DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（東洋紡社製）、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μLを調製し、95℃で135秒間加温した後、95℃で30秒間、52℃で45秒間、68℃で90秒間の工程を25回繰り返し、さらに68℃で3分間加温することにより行った。【００８７】
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、該ＰＣＲによりCAC1540遺伝子の相同遺伝子断片に相当する約1.0kbのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からGFX PCR DNA and Gel Band purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、20μLのTEに溶解した。
該ＤＮＡの塩基配列を公知の方法で決定したところ、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号２で表される塩基配列であることを確認した。【００８８】
次に、上記で得られたＤＮＡ溶液5μLを用い、該ＤＮＡを制限酵素NcoIおよびXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、GFX PCR DNA and Gel Band purification kitを用いて、CAC1540遺伝子を含む約1.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
0.2μgの発現ベクターpET-21d(+)（ノバジェン社製）を制限酵素NcoIおよびXhoIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により約5.4kbのＤＮＡ断片を回収した。【００８９】
上記で得られたCAC1540遺伝子を含む約1.0kbのＤＮＡ断片および上記で取得した発現ベクターpET-21d(+)の約5.4kbのＤＮＡ断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、16℃で1時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株（タカラバイオ社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)］によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。【００９０】
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、３’末端にHisタグ配列をコードする配列が付加されたCAC1540遺伝子がT7プロモーター下流に連結された発現ベクターであるpCAC1540が取得されていることを確認した（図１）。
pCAC1540を用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。【００９１】
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pCAC1540が保持されていることを確認した。
【実施例２】
【００９２】
ペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例１で得られたpCAC1540を保有するエシェリヒア・コリ BL21(DE3)（エシェリヒア・コリ BL21(DE3)/pCAC1540）を50μg/mLのアンピシリンを含む3mLのLB培地が入った試験管に接種し、30℃で16時間振盪培養した。得られた培養液のうち100μLを100mLのLB培地が入った500mL三角フラスコに接種した。37℃で2時間振盪培養した後、終濃度が1mmol/Lになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに37℃で5時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【００９３】
該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、HisTrap（Hisタグ付加蛋白質精製キット、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてHisタグが付加した蛋白質を精製した。
【実施例３】
【００９４】
Hisタグ付加蛋白質を用いたトリペプチドの生産
実施例２で得られた精製Hisタグ付加蛋白質を65μg/L、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、12.5mmol/Lのγ-L-Glu-L-Cysと12.5mmol/Lの各種L-アミノ酸からなる反応液を調製し、37℃で19時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸量をデタミナーL IP（協和メデックス社製）を用いて定量することにより、トリペプチド生成反応の進行を確認し、反応生成物をMALDI-TOFMSを用いて分析することにより、表１に示すトリペプチドの生成を確認した。【００９５】
【表１】
2007066430.tif 000002
【００９６】
表１にあるとおり、本発明の蛋白質はアミノ酸のα位のカルボキシル基、またはジペプチドのＣ末端のカルボキシル基とアミノ酸のアミノ基とをペプチド結合で連結させ、種々のペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により、種々のペプチドを製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2007066430.tif 000003
【配列表】
2007066430000001.app
【国際調査報告】
2007066430.tif 000004
2007066430.tif 000005
2007066430.tif 000006