(57)【要約】  被検試料の種別を問わず、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができ、且つ、その後の分析への影響を更に低減し、微量試料の検出にも好適な核酸抽出方法を提供する。特には、核酸抽出に続く核酸増幅、並びに分析へと続く一連の反応系の手順の便宜を図るべく改良を行なう。そのため、本発明の核酸抽出方法では、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させて核酸を遊離させる工程を設けた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させて核酸を遊離させる工程を有する核酸抽出方法。
【請求項２】
前記デオキシコール酸の濃度が、0.01〜10mMである請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記グリコール酸の濃度が、0.1〜100mＭである請求項１又は２に記載の核酸抽出法。
【請求項４】
タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させて核酸を遊離させる工程を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
25〜95℃にて５〜120分間、熱処理を行なう請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記核酸の遊離工程に続いて、マグネシウム塩、及び緩衝液を添加する工程を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記被検試料が、微生物を含む試料である請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を含む核酸抽出キット。
【請求項９】
使用時において終濃度が0.01〜10mMとなるようにデオキシコール酸を含む請求項８記載の核酸抽出キット。
【請求項１０】
使用時において終濃度が0.1〜100mMとなるようにグリコール酸を含む請求項８又は９に記載の核酸抽出キット。
【請求項１１】
タンパク質分解酵素を含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
【請求項１２】
マグネシウム塩、及び緩衝液を含む請求項８〜１１のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の核酸抽出方法においては、細胞壁や細胞膜を破壊した後にこれらを取り除き、タンパク質を変性させ、核酸を分離する等の多くの工程を必要としていた。この際使用される試薬には、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液や腐食性の高いフェノール液等の慎重な取り扱いを要するものが含まれていた。【０００３】
そこで、かかる問題を解決すべく、微生物菌体とファージの混合物からDNAを精製する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。具体的には、本法は、フェノールとエタノールとを用いたDNA濃縮工程に代えて、限外濾過膜に試料を通過させる工程を設けることによって、不純物を除去しDNAを濃縮するものである。【０００４】
上述した従来の核酸抽出方法によれば、フェノール液の使用を回避することはできても、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液は精製が必要であった。このように、慎重な取り扱いを要する試薬の種類を減らすことはできても、すべての試薬を取り扱いが容易なもので代替するのは困難であるという問題点があった。更には、微生物菌体、具体的には大腸菌、とファージとの混合物からDNAを精製するのは、夾雑物が少なく、細胞壁等の障害が少ないので、比較的容易であるが、他の試料に応用する場合には、その生物特有の構造物や試料に含まれる夾雑物が障害となって、広く生物の種別を問わず効率的に核酸を抽出する方法を提供することは困難であった。【０００５】
更には、従来の抽出方法を用いて抽出した核酸試料に残存する試薬が、後の分析を阻害することがあり、更なる精製工程を必要としたり、分析精度が落ちたりするという問題点があった。特に、現在、バイオテクノロジーの分野では生物の遺伝子検査について細胞から遺伝子DNAを効率よく無傷で抽出する方法が必須であると認識されている。又、研究の迅速化のため、遺伝子抽出等の操作の自動化が図られているが、工程が増えると、遠心分離、吸引ろ過などの精製にかけるステップが煩雑なものとなり、自動遺伝子検査機器の省力化、小型化の障害となっていた。更に、昨今の当該技術情勢は、被検対象物から抽出した核酸を直接分析に供するよりも、核酸抽出物を、核酸増幅技術を利用して増幅した後に分析を行なうことが一般的となっている。また、核酸増幅技術を利用した分析方法も汎用技術となっている。【０００６】
そこで、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRと略する）法において、核酸抽出工程を経ず、糞便、血液等の試料中の核酸を効率よく増幅する方法が提案されている（例えば、特許文献２、３、４、５、６、７、８参照。）。具体的には、ポリアミン、ポリアニオン、界面活性剤、DDT等の電荷物質を添加することにより、試料中に含まれる色素、タンパク質、糖類、若しくは未知の夾雑物等のPCR反応を阻害する正、負の電荷物質を中和して、これらPCR反応阻害物質の影響を抑制するものである。しかし、これらの方法は、細胞を迅速に破壊して核酸を抽出することを目的とするものではない。【０００７】
また、慎重な取り扱いを必要とする試薬の使用を回避すべく、界面活性剤およびキレート剤の利用により生体試料から核酸を抽出する技術が知られている。具体的には、不織布に捕捉することにより生体試料から核酸を抽出する方法、硫酸デキストラン等の多糖担体に捕捉することにより生体試料から核酸を抽出する方法において、これら核酸抽出の前処理として界面活性剤、キレート剤、還元剤、タンパク質分解酵素等で細胞及び細菌等を破壊することが報告され、界面活性剤としてコール酸の利用が例示されている（例えば、特許文献９、１０参照。）。しかしながら、これらの方法は、不織布やカラム等の特別の用具を必要とするものであり、界面活性剤およびキレート剤等は細胞破壊の前処理段階で利用されるに過ぎず、更に、捕捉後に担体の洗浄等の工程が必要であると想定される。また、プロテイナーゼＫを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物の存在下で反応させて、硬組織由来の生体試料から核酸を抽出する方法が報告され、陰イオン界面活性剤としてコール酸の利用が例示されている（例えば、特許文献１１参照）。【０００８】
ここで、上述のコール酸等の界面活性剤、及びキレート剤は核酸の抽出に利用されることが知られるが、一方で、核酸増幅反応等の種々の酵素反応を阻害することも知られていた。そのため、これらの物質を利用して核酸を抽出した場合、核酸試料の精製、希釈等の工程を経ずして、核酸増幅、並びにその後の分析へと続く一連の反応系に抽出後の核酸を供することはできないとの問題点を有していた。しかしながら、上述した方法は、いずれもかかる問題点の解決に対して何らの知見を与えるものではなかった。【０００９】
そこで、本発明者らは、上記問題点に鑑み、特定の試薬構成のコール酸類を利用した核酸抽出方法を開発した（非特許文献１を参照）。具体的は、被検試料に、デオキシコール酸、及びグリココール酸からなる反応液を、それぞれ1mM、10mMとなるように添加し、続いてプロテイナーゼＫ、及びEDTAからなる反応液を添加した後、70℃で10分間、それに続いて94℃で10分間、加熱処理することにより被検試料から核酸を抽出するものである。
【特許文献１】特開平５−２３６９６３号公報
【特許文献２】特開平６−２７７０６１号公報
【特許文献３】特開平８−１７３１９８号公報
【特許文献４】特開平９−９９６７号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８７号公報
【特許文献６】特開２０００−９３１７５号公報
【特許文献７】特開２００１−２５８５５６号公報
【特許文献８】特開２００１−２５８５６２号公報
【特許文献９】特開２００６−５５０７９号公報
【特許文献１０】特開２００３−２３５５５５号公報
【特許文献１１】特開２００４−２０１５５８号公報
【非特許文献１】大泉由紀他、DNAマイクロアレイによるクリプトスポリジウムの検出と種同定、用水と廃水、2004年８月１日、第46巻、第８号、第685〜692頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した本発明者らの従前法は、被検試料の種別を問わず、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができる有用な方法であることが確認されている。そして、上述の本発明者らの従前法は、上述の昨今の当該技術情勢を鑑みて、核酸増幅反応を含めた核酸抽出後の分析等の反応系への影響を抑制するべく構成されたものではあるが、反応系によっては核酸増幅反応が効果的に進行しない場合があることが判明した。そのため、核酸抽出後の核酸増幅に際して核酸抽出物の希釈を要する場合があり、特に微量試料の分析精度が十分でない場合があった。更に、94℃という高温下での加熱処理を行うことで、長鎖DNAの分解が生じ分析精度が低下する場合があることも判明した。また、個々の分析対象に合致させて最適化したPCR条件を変更することなく、核酸抽出物を容易に反応系に組み込みたいとの市場の要求があった。【００１１】
従って、本発明の目的は、被検試料の種別を問わず、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができ、且つ、その後の分析への影響を更に低減し、微量試料の検出にも好適な核酸抽出方法を提供することにある。特には、核酸抽出に続く核酸増幅、並びにその後の分析へと続く一連の反応系の手順の便宜を図るべく本発明者の従前核酸抽出方法の改良を行なった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的を達成するための本発明の核酸抽出方法の特徴手段は、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させて核酸を遊離させる工程を有する点にある。【００１３】
上記特徴手段において、前記デオキシコール酸の濃度が、0.01〜10mMであることが好ましく、また、前記グリコール酸の濃度が、0.1〜100mＭであることが好ましく、或いは、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させて核酸を遊離させる工程を有することが好ましく、或いは、25〜95℃にて５〜120分間、熱処理を行なう工程を有することが好ましく、或いは、前記核酸の遊離工程に続いて、マグネシウム塩、及び緩衝液を添加する工程を有することが好ましい。
そして、前記被検試料が、微生物を含む試料であることが好ましい。【００１４】
この目的を達成するための本発明の核酸抽出キットの特徴構成は、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を含む点にある。【００１５】
上記特徴構成において、使用時において終濃度が0.01〜10mMとなるようにデオキシコール酸を含むことが好ましく、また、使用時において終濃度が0.1〜100mＭとなるようにグリコール酸を含むことが好ましく、或いは、タンパク質分解酵素を含むことが好ましく、或いは、マグネシウム塩、及び緩衝液を含むことが好ましい。【００１６】
本発明の核酸抽出方法は、哺乳類が持つ消化液の一つである胆汁酸に着目したものである。胆汁酸の主成分はタウロコール酸、デオキシコール酸、グリココール酸などコール酸類である。コール酸類は界面活性剤としての性質も持っており、膜タンパク質の抽出のための細胞膜破壊試薬としても用いられている利用価値の高い物質である。ところが、コール酸類は、酵素反応を阻害するため、酵素反応に供する際には、細胞破壊反応後に取り除くか、若しくは希釈を必要とした。発明者らは、これに対して、コール酸類であるデオキシコール酸をグリコール酸と併用することにより、一種類のコール酸で、しかも、後の酵素反応に与えず、かつ、安定性を保持した状態で効率的に核酸を抽出できることを見出した。更に、核酸抽出反応時におけるキレート剤の併存によって、細胞内から遊離した核酸を核酸分解酵素から保護することができ効率的な核酸抽出が達成されることも見出した。本発明の核酸抽出方法は、核酸抽出試薬類、並びに施用濃度の最適化により構築されたものであり、これにより効率的な核酸抽出が達成される。【００１７】
デオキシコール酸、及びグリコール酸の細胞破壊の分子化学的なメカニズムは、次のように推測される。細胞膜はリン脂質とタンパク質から構成されており、デオキシコール酸、及びグリコール酸がこの細胞膜のリン脂質の脂質二重層の中に入り込んで膜を壊れやすくすると共に界面活性作用によりリン脂質及びタンパク質成分を溶解する。このメカニズムは  動物、植物、微生物の別を問わず、すべての生物に共通であろう。従って、本法は、幅広い生物由来の被検試料に対してその効果を発揮すると考えられる。【００１８】
ここで、デオキシコール酸、及びグリコール酸は、フェノール液や強アルカリ溶液等と比べて取り扱いが容易である。同時に、グリコール酸との併用によりコール酸類をデオキシコール酸１種類に限定することで核酸抽出後の酵素反応を妨げないよう構成したことから、核酸増幅反応等の後の反応系に供する試料は精製工程を必要としない。【００１９】
即ち、本発明の核酸抽出方法に係るデオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させる工程を有する核酸抽出方法は、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができる。且つ、核酸抽出物を、核酸増幅反応等の後の反応系に容易に組み込むことができる。したがって、本発明の核酸抽出方法は、核酸抽出反応、並びにその後に続く分析を含めた一連の反応系の自動化、省力化に大きく役立つものと考えられる。引いては、自動遺伝子検査機器の省力化、小型化が実現される。【００２０】
更に、被検試料に接触させる際の前記デオキシコール酸の濃度が0.01〜10mＭであると、或いは、前記グリコール酸の濃度が、0.1〜100mＭであると、核酸抽出後の酵素反応を含めた反応系を阻害せずに、確実に、核酸の抽出を行うことができ、最も効率がよい。【００２１】
加えて、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を有すると、試料中に混在するタンパク質を分解するので、膜の分子構造が完全に破壊され、更に確実に細胞を破壊できる。【００２２】
加えて、核酸の遊離に続いて、マグネシウム塩、及び緩衝液を添加する工程を有すると、核酸増幅反応等の後の反応系に更に容易に組み込むことができる。【００２３】
更に、核酸を細胞内から遊離させる際に加温することが多く、その際の加温条件が30〜70℃であると、遊離した核酸を分解することなく、タンパク質の分解と同時に熱による揺らぎで細胞膜の破壊が促進され、最も効率がよい。【００２４】
微生物細胞を含む試料は、その生物に特有の堅牢な構造物や、幾重にも重なる膜構造等が障害となって迅速且つ効率のよい核酸抽出が難しい場合があるが、本法は、これら微生物に場合であっても本法は適用可能である。よって、本法を採用することによって、病気の診断等の医療分野や、環境汚染等の検査においても、迅速且つ高精度化を達成することができる。【００２５】
上記核酸抽出方法を実施するに当たって、本法を実施可能なデオキシコール酸、グリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤を含む核酸抽出キットを用いると、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができる。且つ、核酸抽出物を、核酸増幅反応等の後の反応系に容易に組み込むことができる。したがって、核酸抽出反応、並びにその後に続く分析を含めた自動化、省力化に大きく役立つものと考えられ、必要な試薬をキットとして揃えることで、省力化に大きく貢献することができる。【００２６】
更に、前記核酸抽出キットにおいて、使用時において終濃度が0.01〜10ｍＭとなるようにデオキシコール酸を含むことで、また、使用時において終濃度が0.1〜100ｍＭとなるようにグリコール酸を含むことで、確実に、核酸抽出後の酵素反応を含めた反応系を阻害せずに、核酸の抽出を行うことができる。【００２７】
更に、前記核酸抽出キットがタンパク質分解酵素を含むと、試料に混在するタンパク質を分解するので、更に確実に細胞を破壊できる。【００２８】
更に、前記核酸抽出キットがマグネシウム塩、及び緩衝液を含むと、核酸増幅反応等の後の反応系に容易に組み込むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に本発明の実施の形態を説明する。まず、本発明の核酸抽出方法は、上述の本発明者らの従前の核酸抽出方法（「用水と廃水」、第46巻、第８号、第685〜692頁）を改良したものである。【００３０】
尚、本願において、「核酸」とは、DNA、RNA、及びこれらの誘導体を含む概念として用いられる。【００３１】
本発明に係る核酸抽出方法は、デオキシコール酸、グリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させる工程を有する。二価陽イオンのキレート剤としては、試料中の金属イオン、特にはマグネシウムイオンと配位して安定な錯塩を形成できる限り制限はないが、エチレンジアミン四酢酸（以下、「EDTA」と略する）が好ましく例示される。そして、好ましくは、デオキシコール酸濃度が0.01〜10mM、グリコール酸が0.1〜100mM、EDTAが0.01〜200mM、更に好ましくは10〜100mMとなる状態で、前記被検試料に前記デオキシコール酸、グリコール酸及びEDTAを接触させる。【００３２】
これにより、核酸を効率的に抽出できると共に、抽出された核酸の保護が可能となる。デオキシコール酸とグリコール酸、特にはデオキシコール酸のもつ界面活性作用を利用して細胞膜等を溶解し、それにより細胞内部の核酸が溶液中に遊離する。それと同時に、グリコール酸及びEDTAの作用により、遊離された核酸はDNA分解酵素等の核酸分解酵素から保護される。具体的には、グリコール酸はヒドロキシ酢酸としても称される電解質の低分子化合物であり、核酸の周囲でDNA分解酵素から核酸を保護する。そして、キレート剤により溶液中のマグネシウムイオンをキレートすることで、マグネシウム要求性のDNA分解酵素が不活化される。被検試料の細胞膜が充分に破壊されるまで、この工程は続けられ、PCR試料の調製等の少量の試料の調製にあたっては、例えば、５〜６０分程度の接触時間があれば足りる。【００３３】
上述した本発明者らが提案した従前法ではコール酸類としてデオキシコール酸及びグルココール酸の２種類を使用していたが、本発明の核酸抽出方法においては、デオキシコール酸、一種類のみに限定し、グリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤と並存させて構成している。つまり、本発明の方法は、DNAポリメラーゼ等酵素反応の阻害物質となるコール酸類の使用を制限して構成したものであり、後に続く分析への影響を最小限に抑制することが可能となる。したがって、本発明の核酸の抽出方法により得られた核酸抽出物は、希釈等の酵素反応阻害物質除去のための手段を経ることなく、直接的に核酸増幅反応等の後の分析に適用することができ、抽出対象が微量である場合にも好適に使用可能である。【００３４】
被検試料の細胞膜の破壊を確実なものとするため、更に、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を設けることができる。これにより、被検試料中の細胞の細胞膜等のタンパク質成分を分解し、細胞内部の核酸の溶液中への遊離が更に促される。この工程は、上記デオキシコール酸、グリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させる工程と同時に行うこともできる。タンパク質分解酵素としては、例えば、プロテイナーゼＫが好適であり、例えば、これを0.01〜10mAUを添加する。【００３５】
上記工程の後、タンパク質成分の分解のため加熱処理を行なう。加熱処理は、25〜95℃にて５〜120分間行なわれる。これにより、試料中のタンパク質成分は分解する。上述した本発明者らが提案した従前法では加熱処理を70℃にて10分間、それに続いて94℃にて10分間行なっているが、本発明の方法においては、加熱温度を下げると共に、加熱時間を短縮して構成されている。これにより、従前法よりも緩和な条件での加熱により長鎖DNAの分解を抑制でき、核酸の抽出効率、並びにその後に続く分析の検出感度を更に向上することが可能となる。【００３６】
核酸増幅反応等の後の分析への直接的な適用を容易にするため、更に、マグネシウム塩、及びpH緩衝液を被検試料に接触させる工程を設けることができる。マグネシウム塩としては、核酸の安定性並びにその後の分析を阻害しない限り制限はないが、好ましくは塩化マグネシウムである。そして、マグネシウム塩は先に添加したキレート剤の結合量に相当する量添加することが好ましい。また、緩衝液としても核酸の安定性並びにその後の分析を阻害しない限り制限はないが、好ましくは、pH６〜10の範囲での緩衝能を有し、特に好ましくはTAPS緩衝液等である。そして、好ましくは、塩化マグネシウムを0.1〜50mM、TAPS緩衝液を0.01〜200mM、pH７〜９に調製して添加する。ここで、マグネシウム塩と緩衝液は、各々を単独で添加してもよく、また、マグネシウム塩を緩衝液に溶解させた形態で添加することもできる。【００３７】
これにより、本発明の核酸抽出方法で得られた核酸抽出物を、核酸増幅反応等の後の分析への直接適用可能となり、個々の検出対象に併せた最適化した核酸増幅反応条件を変えることなく、容易に反応系に組み込むことができる。つまり、核酸増幅反応に使用されるTaq DNAポリメラーゼをはじめとするDNAポリメラーゼはマグネシウム要求性酵素であることから、先に添加したキレート剤の影響を消去することができ、PCR等の後の反応系に供する際に、個々の反応系において好適化された反応条件、特にはマグネシウムイオン濃度等を変更することなくそのまま核酸抽出物を適用できる。これにより、DNAポリメラーゼ等の酵素の活性の発現に好適な反応環境を形成することができ、分析精度が向上する。ここで、マグネシウム塩の使用が好適であるが、鉄、マンガン塩等、後の反応系に応じて、酵素の反応環境の形成に好適な、若しくは、影響を与えない金属塩を、マグネシウム塩に代えて、若しくは併用して添加するように構成することもできる。そして、pH緩衝液の添加により、その後の分析におけるpH調整を容易にし、特にPCR法においては、用いるDNAポリメラーゼの至適pHへの調整が容易になると共に、先に添加した試薬群の後の反応系への影響を消失させることができる。したがって、個々の検出対象に合わせて最適化された反応条件、特にはPCRにおけるマグネシウムイオン濃度、DNAポリメラーゼの種類等を変更することなく、容易に核酸抽出物を反応系に組み込むことができる。【００３８】
以上の通り構成することで、本発明の核酸抽出方法によって得られた核酸抽出物は、直接、その後の反応系に組み込むことができる。つまり、本発明の核酸抽出方法によって得られた核酸抽出物中には、後の分析を阻害する反応阻害物質の混入を最小限に低減させたものである。そのため、従前法において必要であった核酸抽出液の希釈等を含めた該反応阻害物質を除去する工程を設ける必要がない。これにより、操作の省力化、並びに核酸試料の損失を最小限に低減できる共に、全液量の増加による検出感度の低下を低減できる。したがって、手間を掛けずに微量の各種検出対象を確実に検出したいとの市場の要求に応えることができる。本発明の核酸抽出方法によって得られた核酸抽出物を組み込むのに好適な分析反応系としては特に制限はないが、核酸増幅法による核酸の増幅並びに検出が好ましく例示される。そして、核酸増幅法としてはPCR、LCR（リガーゼ連鎖反応）等が例示され、汎用技術であるTaq DNAポリメラーゼによるPCRに特に好ましく利用でき、その応用範囲は広範に亘る。【００３９】
本法は、被検試料として微生物、動物、植物の別を問わず、すべての生物を含む試料に適用可能である。したがって、被検試料とは、生物、即ち核酸を含有すると推定される環境もしくは生体試料等の何れをも含む概念である。【００４０】
具体的には、微生物を含む被検試料としては、グラム陽性、グラム陰性を問わず、全ての細菌、酵母、原虫、原生動物等を含有する試料が例示される。微生物試料は、その生物に特有の堅牢な構造物や、幾重にも重なる膜構造等が障害となって迅速且つ効率のよい核酸抽出が難しい場合があるが、本発明の核酸抽出方法は、このような微生物の場合であっても適用可能である。よって、本発明の核酸抽出方法を採用することによって、病気の診断等の医療分野や、環境汚染等の検査においても、迅速且つ高精度化を達成することができる。特には、微生物を含む被検試料は、微生物による環境汚染を検査するために利用可能であり、或いは、バイオレメディエーションの分野において、浄化対象である土壌、水等の環境中の汚染物質資化菌の存在を確認する等のために利用可能であろう。【００４１】
また、前記被検試料に含まれる微生物がクリプトスポリジウムであると、水道水の安全性検査等に利用できるので、疫学的見地から非常に有用である。前記クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)は、胞子虫類のコクシジウム（Coccidium)目に属する、ヒト、ウシやブタ等の家畜、イヌ、ネズミ等の哺乳動物の消化管に寄生する寄生性原虫であり、本原虫にヒトが感染すると、腹痛を伴う水様性もしくは粘液性便を主徴とする症状が３日〜１週間程度持続し、時として、嘔吐や発熱を伴うこともある。本原虫に感染した患者、感染動物から糞便とともに排出される莫大な数のオーシストは、新たな個体への感染源となるため、クリプトスポリジウムの伝播経路は多岐にわたる。水中に存在するクリプトスポリジウムのオーシストは、塩素抵抗性を示し、浄水処理における塩素消毒は無効であるため、通常の浄水処理で完全に除去することは困難であり、水道水を介した大規模集団感染が生じることがある。【００４２】
クリプトスポリジウムの種類や量を判定するために種々の方法が提案されており、オーシストから核酸を抽出しPCRによって同定、定量する方法もあった。この方法では、凍結融解、超音波処理などを繰り返すことでオーシストからスポロゾイトを脱嚢させた後、プロテアーゼでスポロゾイトを溶解させることにより、もしくは、フェノール抽出/エタノール沈殿等の公知の核酸精製処理により、行うのが一般的あった。そのため、各種処理が煩雑で時間がかかり、且つ、核酸精製処理過程においては、必ず、核酸の損失を生じるがため、検出感度の低下を招くという問題点もあった。【００４３】
ところが、本法による脱嚢過程を顕微鏡で観察すると、オーシストの破壊だけでなく、そこから出てきたスポロゾイトも破壊していることが確認された。従って、本法において、前記被検試料がクリプトスポリジウムであると、検査において、その操作が簡便になり迅速な分析が可能となると共に、分析精度が向上するという顕著な効果を奏するものである。【００４４】
また、動物由来の試料としては、毛根、血球細胞を含む血液、糞便等が例示され、何らかの動物細胞を含む生検サンプル等の動物由来の被検試料から核酸を抽出すれば、例えば、病気の診断等の医療分野における検査等に利用でき、迅速、高精度の診断方法を提供することができる。【００４５】
植物由来の試料としては、種子、果実、種皮、茎、葉、根等が例示される。従来法では細胞壁等の堅牢な構造物が障害となって植物細胞からの迅速且つ効率のよい核酸抽出が難しい場合があるが、このような場合であっても本法は適用可能であり、品種、銘柄の特定等に利用できる。尚、これらの用途は、例示であって、前掲のものに限定されるものではない。【００４６】
ここで、植物細胞や酵母などのカビの仲間、グラム陽性菌など細胞壁を有する生物から核酸を抽出する場合、被検試料とデオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤と接触させる前に、細胞壁を分解する前処理工程を設けることが好ましい。細胞壁は生物種によってその組成が異なるので、それぞれの組成に応じた細胞壁分解酵素(例えば、セルラーゼ、ザイモリアーゼ、リゾチウム等)を被検試料に接触させ、細胞壁を溶解させる。但し、これらの生物に対して細胞壁分解酵素を作用させなくとも、本法を適用することはできる。【００４７】
本発明の核酸抽出方法を実施するにあたって、それぞれの工程（その後の分析工程をも含めて）を機械装置に実行させ、自動化することも可能である。このような場合、又は、人が操作を行う場合にあってはその人の便宜のため、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を含む試薬を核酸抽出キットとして供給することができる。このキットにおいて、使用時における終濃度が、0.01〜10mMとなるようにデオキシコール酸を、0.1〜100mMとなるようにグリコール酸を、0.01〜200mMとなるように二価陽イオンのキレート剤を配合することが好ましい。特には、0.01〜0.5mMとなるようにデオキシコール酸を、0.1〜10mMとなるようにグリコール酸を配合することが好ましい。更には、この核酸抽出キットに、細胞壁分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素を含ませることもでき、更には、マグネシウム塩、緩衝液を含ませることもできる。例えば、それらは、工程ごとに必要とされる緩衝液等の試薬と共に溶解し密封した液状物（溶液）の原液又は濃縮液として供給することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明の核酸抽出方法を具体的に説明する。【００４９】
［実施例１］レジオネラからの核酸抽出
レジオネラ属のLegionella pneumophila（L. pneumophila）SG3株、及び、これとは異なる種のレジオネラ属の細菌（Legionella sp.）の細胞から、以下の手順でDNAを抽出し、その存在を確認した。【００５０】
染色体DNAの調製
レジオネラ細胞を緩衝液に懸濁して５μLの被検試料を作製した。この被検試料に、２μLのIB液（10mM デオキシコール酸、0.35mM グリコール酸、100mM EDTA・2Na）を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、２μLのIIB液（0.1mAU プロテイナーゼＫ(QIAGEN社製)）を添加し、50℃で10分間インキュベートし、この後、更に、80℃で５分間インキュベートした。次に、２μLのIIIB液（25mM MgCl2、0.5mM TAPS Buffer（pH9.5））を添加し、レジオネラ細胞から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を調製した。尚、上記反応液IB〜IIIB液の代わりに、滅菌水を同容量添加した以外は上記と同様に処理した核酸試料（コントロール）を調製した。【００５１】
DNAの増幅
上記で調製した核酸試料を室温まで冷却し、それぞれを鋳型としてPCRを行い、レジオネラの遺伝子を含む増幅断片を得た。PCR反応は、フォワードプライマー Leg113F（5'- GCACGTGTGTAGCCCTACCC -3'；配列識別番号１）、リバースプライマー Lrg1115R（5'-ACTGGAACTGAGACACGGTC-3'；配列識別番号２）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer（+Mg2+）、タカラバイオ社製）を５μL、2.5mMのdNTPsを５μL、10pM/μLのプライマー各１μL、5U/μLのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5μL、上記で調製した核酸試料を12.5μL、滅菌水を25μL加えて、全量50μLとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。次に、PCR反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。【００５２】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図１に示す。L. pneumophila SG3株及びLegionella sp.のそれぞれについて、３．０×１００、３．０×１０１、３．０×１０２、３．０×１０３、３．０×１０４個の細胞に相当する核酸試料を各レーンにロードした。コントロールの核酸試料についても同様にロードした。図中、ゲル１及び２は本発明の核酸抽出方法であるIB液〜IIIB液によって処理をした実施例の結果を示し、ゲル１はL. pneumophila SG3株、ゲル２はLegionellasp.の結果を示す。また、ゲル３及び４はコントロールの結果を示し、ゲル３はL. pneumophilaSG3株、ゲル４はLegionella sp.の結果を示す。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本発明の核酸抽出方法により核酸抽出を行なった実施例の場合、L. pneumophila SG3株とLegionellasp.のそれぞれについて、少ない細胞からでも遺伝子の増幅が起こり、細胞数が増えるにつれて増幅されたDNAのバンドが太くなっており、細胞数に応じた定量的な増幅が起こった（ゲル１、２）。このことから、本発明の核酸抽出方法により安定した核酸の抽出及び増幅が可能となることが判明した。更に、本発明の核酸抽出方法は定量的PCR法として、レジオネラの検出・定量に応用可能であることがわかる。他方、コントロールにおいてもPCR産物は生じたが、細胞数と増幅されたDNAのバンドの太さの間に相関性がなく、DNAの抽出又はPCR反応が阻害されているおそれがある（ゲル３、４）。【００５３】
レジオネラ菌は、細胞内増殖性のグラム陰性桿菌である。原虫や藻類、ヒト体内では好中球やマクロファージ内で増殖し、肺炎（レジオネラ症）の原因となる。湿った環境に生息し、河川などの自然の水系のほか、クーリングタワーや循環式浴槽等で増殖し、ヒトでの肺炎の集団発生が起こることもある。かかる事情により、レジオネラ菌の迅速且つ正確な検出を行うため、本発明の核酸抽出方法を用いて核酸を抽出し分析に供することは疫学的見地からみて非常に有用である。特に、レジオネラ症はL. pneumophilaが原因となることが多く、かかる種の核酸抽出に本法を適用することで、ヒトへのレジオネラ感染、これに伴う肺炎の発生を効果的に抑制することができる。【００５４】
［実施例２］ヒト培養細胞からの核酸抽出
ヒト培養細胞（Hela S3）から、以下の手順でDNAを抽出し、その存在を確認した。【００５５】
染色体DNAの調製
Hela S3細胞を緩衝液に懸濁して５μLの被検試料を作製した。この被検試料に、２μLのIB液（10mMデオキシコール酸、0.35mMグリコール酸、100mM EDTA・2Na）を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、２μLのIIB液（0.1mAU プロテイナーゼＫ(QIAGEN社製)）を添加し、50℃で10分間インキュベートし、この後、更に、80℃で５分間インキュベートした。次に、２μLのIIIB液（25mM MgCl2、0.5mM TAPS Buffer（pH9.5））を添加し、HelaS3細胞から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を調製した。尚、上記反応液IB〜IIIBの代わりに、滅菌水を同容量添加した以外は上記と同様に処理した核酸試料（コントロール）を調製した。【００５６】
DNAの増幅
上記で調製した核酸試料を室温まで冷却し、それぞれを鋳型としてヒトグロビン遺伝子に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行い、Hela S3細胞の遺伝子を含む増幅断片を得た。PCR反応は、フォワードプライマー  KM29（5'- GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG -3'；配列識別番号３）、リバースプライマー  PC04（5'- CAACTTCATCCACGTTCACC -3'；配列識別番号４）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer（+Mg2+）、タカラバイオ社製）を５μL、2.5mMのdNTPsを５μL、10pmol/μLのプライマーを各１μL、5U/μLのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5μL、上記で調製した核酸試料を12.5μL、滅菌水を25μL加えて、全量50μLとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。次に、PCR反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。【００５７】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図２に示す。１×100、１×101、１×102、１×103個の細胞に相当する核酸試料を各レーンにロードした。コントロールについても同様にロードした。図中、ゲルＡは本発明の核酸抽出方法であるIB液〜IIIB液によって処理をした実施例の結果を示し、ゲルＢはコントロールの結果を示す。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本発明の核酸抽出方法により核酸抽出を行った実施例の場合、少ない細胞からでも遺伝子の増幅が起こったことがわかる（ゲルＡ）。このことから、本発明の核酸抽出方法により安定した核酸の抽出及び増幅が可能となることが判明した。他方、コントロールにおいて、PCR産物は生じたが、そのシグナルは実施例に比べると非常に弱く、DNAの抽出効率が悪いことがわかる（ゲルＢ）。【００５８】
［実施例３］イネ種子からの核酸抽出
染色体DNAの調製
イネ種子として、市販のコシヒカリ精米  １粒を、ＴＥ Buffer 50μLに溶解した後、0.2mLチューブ内で95℃にて５分間加熱して被検試料を作製した。そのうち５μLを分取し、２μLのIB液（10mMデオキシコール酸、0.35mMグリコール酸、100mM EDTA・2Na）を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、２μLのIIB液（0.1mAU  プロテイナーゼＫ(QIAGEN社製)）を添加し、50℃で10分間インキュベートし、この後、更に、80℃で５分間インキュベートした。次に、２μLのIIIB液（25mM MgCl2、0.5mM TAPS Buffer（pH9.5））を添加し、イネ種子から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を調製した。尚、上記反応液IB〜IIIBの代わりに、滅菌水を同容量添加した以外は上記と同様に処理した核酸試料（コントロール）を調製した。【００５９】
DNAの増幅
上記で調製した核酸試料を室温まで冷却し、それぞれを鋳型としてPCRを行い、イネ種子由来の遺伝子を含む増幅断片を得た。PCR反応は、フォワードプライマー  IRF170（5'- GTAAATGCCCTTTTTTCCCC -3'；配列識別番号５）、リバースプライマー  IRF170（5'- CGAACCCTCGGTAAACAAAA -3'；配列識別番号６）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer（+Mg2+）、タカラバイオ社製）を５μL、2.5mMの dNTPsを５μL、10pmol/μLのプライマーを各１μL、5U/μLのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5μL、上記で調製した核酸試料を12.5μL、滅菌水を25μL加えて、全量50μLとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。次に、PCR反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。【００６０】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図３に示す。上記操作によって得られた核酸試料を、希釈なし、又は、夫々、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3に希釈したものを各レーンにロードした。コントロールについても同様にロードした。図中、レーン１〜５は、本発明の核酸抽出方法であるIB液〜IIIB液によって処理をした実施例の結果を示し、レーン６〜９はコントロールの結果を示す。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本発明の核酸抽出法に基づいて核酸抽出を行った実施例の場合、低濃度の試料からでも遺伝子の増幅が起こり、濃度が上昇するにつれて増幅されたDNAのバンドが太くなっており、試料濃度に応じた定量的な増幅が起こった。このことから、本発明の核酸抽出方法は定量的PCR法として、コシヒカリ精米のような植物種子由来の試料に含まれる核酸の検出・定量に応用可能であることがわかる（レーン２〜５）。他方、コントロールにおいてもPCR産物は生じたが、試料濃度と増幅されたDNAのバンドの太さの間に相関性がなく、核酸の抽出又はPCR反応が阻害されているおそれがある（レーン６〜９）。【００６１】
［実施例４、比較例１、２］
クリプトスポリジウムのオーシストからのDNA抽出における本発明の核酸抽出法及び従前法の比較
以下に、クリプトスポリジウムのオーシストからのDNA抽出、及び、抽出したDNAを用いた一連の分析を例に挙げ、本発明の核酸抽出方法の有効性を更に説明する。同時に、上記した本発明者らの従前法との比較を行なった。なお、従前の核酸抽出方法とは、上述の「用水と廃水」に開示された核酸抽出方法である。【００６２】
［実施例４］本発明の核酸抽出方法による抽出
本発明の核酸抽出方法を用いて、クリプトスポリジウムのオーシストからDNAを抽出し、抽出したDNAにつきPCR増幅を行なった。【００６３】
染色体DNAの抽出
クリプトスポリジウムのオーシスト５×103個を緩衝液に懸濁して５μLの被検試料を作製した。この被検試料に、２μLのIB液（10mMデオキシコール酸、0.35mMグリコール酸、100mM EDTA・2Na）を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、２μLのIIB液（0.1mAUプロテイナーゼＫ(QIAGEN社製)）を添加し、50℃で10分間インキュベートした。この後、更に、80℃で５分間インキュベートすることでプロテイナーゼＫを失活させた。次に、２μlのIIIB液（25mM MgCl2、0.5mM TAPS Buffer（pH9.5））を添加し核酸試料を調製した。【００６４】
DNAの増幅
上記で調製した核酸試料を室温まで冷却し、これを鋳型としてPCRを行い、クリプトスポリジウム由来の遺伝子を含む増幅断片を得た。PCR反応は、フォワードプライマー18SF（5'-GGAACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'；配列識別番号７）、リバースプライマー18SR（5'-GGTCGATCCCCTAACTTTCGTT-3'；配列識別番号８）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer（buffer for Blend Taq（+Mg2+）、東洋紡績社製）を５μL、2mMのdNTPsを５μL、10pmol/μL のプライマーを各１μL、2.5U/μLのBlend Taq(東洋紡績社製）を0.5μL、上記で調製した核酸試料を12.5μL、滅菌水を25μL加えて、全量50μLとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
次に、PCR反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。【００６５】
［比較例１］従前法による抽出−１
本発明の核酸抽出方法の改良の基礎となった、本発明者らの従前法を用いて、クリプトスポリジウムのオーシストからDNAを抽出し、抽出したDNAにつきPCR増幅を行なった。まず、上記実施例４と同様にしてクリプトスポリジウムのオーシストの被検試料を作製した。この被検試料に、２μLの反応溶液IA（3.5mMデオキシコール酸（終濃度1mM）、35mMグリココール酸（終濃度10mM））を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、４μLの反応溶液IIA（17mAUプロテイナーゼＫ(600mAU/mL, QIAGEN社製)、9.7mM EDTA・2Na）を添加し、70℃で10分間インキュベートした。この後、更に、94℃で10分間インキュベートすることでプロテイナーゼＫを失活させた。このようにして調整した核酸試料を、上記実施例４と同様にしてPCR、並びに電気泳動に供した。【００６６】
［比較例２］従前法による抽出−２
上記比較例１で取得した核酸試料を10分の１に緩衝液で希釈した以外は、同様にして電気泳動に供した。【００６７】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図４に示す。図中、レーン１は比較例１の結果を、レーン２は比較例２の結果を、レーン３は実施例４の結果を示す。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本発明の核酸抽出方法に基づいて核酸抽出を行った場合、低濃度の試料からでも遺伝子の増幅が起こり、感度よく増幅産物を検出することができた（レーン３）。一方、本発明者らの従前法によって抽出された核酸試料を直接に増幅反応に供した場合には、増幅産物をほとんど確認することができなかった（レーン１）。してみると、従前法では、核酸抽出又はPCR反応の段階いずれかで、核酸抽出の際に添加した試薬群のいずれかにより反応が阻害されている恐れがある。したがって、かかる反応阻害を回避するため従前法ではPCRに際して核酸抽出物の希釈を要するが、抽出された核酸試料を10分の１濃度に希釈して増幅反応に供した場合にも、増幅産物をほとんど確認することができなかった（レーン２）。つまり、希釈により分析感度の低下したことがわかる。【００６８】
このことから、本発明の核酸抽出方法は希釈等の手段を必要とせず、直接的に核酸抽出物を核酸増幅法に適用可能であり、高感度に被検試料中に含まれる核酸を検出、定量できることがわかる。高精度な検出感度から微量試料の分析に特に有用である。一方、従前法も核酸抽出法としてその利用価値は高いことは認められているが、核酸増幅法等への適用、特には微量試料への適用には若干の問題点があることが判明した。そして、かかる問題点を改良した本発明の核酸抽出方法は、更に広範な利用価値がある。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、広く生物の種別を問わず効率的に核酸を抽出することができるので、病気の診断等の医療分野や、環境汚染等の検査、及び植物品種、銘柄の特定等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】レジオネラ細胞を被検試料として、本発明の核酸抽出方法により核酸を抽出した結果を示す電気泳動図
【図２】ヒト培養細胞を被検試料として、本発明の核酸抽出方法により核酸を抽出した結果を示す電気泳動図
【図３】コシヒカリ精米を被検試料として、本発明の核酸抽出方法により核酸を抽出した結果を示す電気泳動図
【図４】クリプトスポリジウムのオーシストを被検試料として、本発明の核酸抽出方法と従前の核酸抽出方法を比較した結果を示す電気泳動図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007116450.tif 000007