(57)【要約】【課題】本発明の目的は、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有し、細胞内の酸化還元制御因子として重要な役割を果たすチオレドキシンの産生を促進する物質を提供することにある。さらには、該物質を有効成分として含有し、慢性閉塞肺疾患の予防又は治療において有効で且つ安全性が高い医薬を提供することにある。【解決手段】本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、該抽出物を有効成分として含有するチオレドキシン産生促進剤に関する。該抽出物は、喫煙抽出物質、過酸化水素等の刺激による酸化ストレスに対して、優れたチオレドキシン産生促進作用を有し、顕著な肺細胞保護効果を示した。従って、該抽出物を有効成分とする本発明医薬は、慢性喫煙等の持続的な酸化ストレスが主原因とされる慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤として、副作用の少ない安全性の高い医薬として有用性の高いものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有するチオレドキシン産生促進剤。
【請求項２】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する肺細胞保護剤。
【請求項３】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
炎症組織がウサギの皮膚組織である請求項１乃至３のいずれか一項記載の剤。
【請求項５】
注射剤である請求項１乃至４のいずれか一項記載の剤。
【請求項６】
経口剤である請求項１乃至４のいずれか一項記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、具体的にはワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有するチオレドキシン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は紫外線や微粒子などの環境有害物質への曝露、ウイルスや細菌感染により引き起こされる炎症など様々なストレスに曝されることにより、細胞内では活性酸素種が産生され、蛋白質や遺伝子が酸化され障害を受ける。そこで、生体は活性酸素種に対する防御機構として、酸化還元（レドックス）応答を基本とするシステムを備えており、その代表的なものの一つとしてチオレドキシンシステムが挙げられる。【０００３】
チオレドキシンは、大腸菌のDNA合成に必須な酵素であるリボヌクレオチド還元酵素に水素イオンを供与する補酵素として発見された。チオレドキシンは-Cys-Gly-Pro-Cys-という活性部位を有しており、2つのシステイン残基の間でジスルフィド（S-S）結合を作る酸化型とジチオール（-SH-SH）を作る還元型が存在する細胞内の酸化還元制御因子である。【０００４】
チオレドキシンは紫外線、放射線、酸化剤、ウイルス感染、虚血再灌流傷害、及び抗ガン剤投与などにより誘導されることが明らかになっている。様々なストレスにより誘導されたチオレドキシンは、単独で一重項酸素やヒドロキシルラジカルを消去する他、ペルオキシレドキシンとの協調作用により、活性酸素種を消去する抗酸化物質として生体内で働くことが報告されており、種々の遺伝子発現を調節する転写因子や細胞内のシグナル伝達分子の活性を制御している。従って、チオレドキシンを誘導すれば細胞内で引き起こされる各種の酸化還元現象に基づく病的状態又はその前段階の状態から、細胞、組織、器官等を保護し得ることが期待されることから、チオレドキシン誘導物質の研究が進められ、例えば、そのような誘導物質としてイソプレノイド系化合物が開示されている。（特許文献１参照）【０００５】
上述したような酸化／抗酸化すなわちレドックス状態の不均衡がもたらす疾患・病態の一つとして、慢性閉塞性肺疾患（COPD）等を含む肺疾患が挙げられる。COPDは、有害微粒子の吸入により気道や末梢肺組織に慢性的な炎症が起き、痰のからみや気管支のむくみ（慢性気管支炎）、肺胞の破壊（肺気腫）によって起こる持続的な気道の閉塞状態を病態とする疾患で、その最大の原因は喫煙である。たばこ煙中にはオキシダント（oxidant）が多量に含まれており、肺は酸化ストレスに晒された状態に陥っている。従って、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有することが知られているチオレドキシンは、喫煙による組織障害及び炎症を抑制することが示唆される。実際、健常喫煙者では非喫煙者に比し血中チオレドキシン濃度が有意に高値であることが報告されており、チオレドキシンの産生増加が、慢性喫煙という持続的な酸化ストレス対する防御機構として働いていることが考えられる。このような観点から、これを治療戦略として用いることは妥当であり、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤としてチオレドキシンが有効であることが開示されている。（特許文献２参照）【０００６】
本発明医薬の有効成分であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物については、鎮痛作用、鎮静作用、抗ストレス作用、抗アレルギー作用（特許文献３参照）、免疫促進作用、抗癌作用、肝硬変抑制作用（特許文献４参照）、特発性血小板減少性紫斑病に対する治療効果（特許文献５参照）、帯状疱疹後神経痛、脳浮腫、痴呆、脊髄小脳変性症等への治療効果（特許文献６参照）、レイノー症候群、糖尿病性神経障害、スモン後遺症等への治療効果（特許文献７参照）、カリクレイン産生阻害作用、末梢循環障害改善作用（特許文献８参照）、骨萎縮改善作用（特許文献９参照）、敗血症やエンドトキシンショックの治療に有効な一酸化窒素産生抑制作用（特許文献１０参照）、骨粗鬆症に対する治療効果（特許文献１１参照）、Ｎｅｆ作用抑制作用やケモカイン産生抑制作用に基づくエイズ治療効果（特許文献１２、１３）、脳梗塞等の虚血性疾患に対する治療効果（特許文献１４）、線維筋痛症に対する治療効果（特許文献１５）、感染症に対する治療効果（特許文献１６）などが開示されている。しかしながら、該抽出物がチオレドキシンの産生を促進させることや、肺細胞を保護し、慢性閉塞肺疾患の予防又は治療に有効であるとの医薬用途に関する発表や報告はまだ無い。【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３２２９２９号公報
【特許文献２】特開２００５−６０４０８号公報
【特許文献３】特開昭５３−１０１５１５号公報
【特許文献４】特開昭５５−８７７２４号公報（第３、５、６頁）
【特許文献５】特開平１−２６５０２８号公報（第１、２頁）
【特許文献６】特開平１−３１９４２２号公報（第３、４頁）
【特許文献７】特開平２−２８１１９号公報（第３頁）
【特許文献８】特開平７−９７３３６号公報（第４頁）
【特許文献９】特開平８−２９１０７７号公報
【特許文献１０】特開平１０−１９４９７８号公報
【特許文献１１】特開平１１−８０００５号公報（第２、３頁）
【特許文献１２】特開平１１−１３９９７７号公報
【特許文献１３】特開２０００−３３６０３４号公報（第２、３頁）
【特許文献１４】特開２０００−１６９４２号公報
【特許文献１５】国際公開ＷＯ２００４／０３９３８３号公報
【特許文献１６】特開２００４−３００１４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有し、細胞内の酸化還元制御因子として重要な役割を果たすチオレドキシンの産生を促進する物質を提供することにある。さらには、該物質を有効成分として含有し、慢性閉塞肺疾患の予防又は治療において有効で且つ安全性が高い医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が、チオレドキシン産生において優れた促進作用を有し、肺細胞の保護作用を示し、慢性閉塞肺疾患の予防又は治療剤として有用であることを見出し発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、慢性喫煙等による酸化ストレス等に対してチオレドキシン産生を促進させ、肺細胞保護効果を示すという優れた薬理作用を有するため、これを有効成分として含有する本発明薬剤は、副作用等の問題点のない安全な医薬として有用性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、過酸化水素刺激及び無血清刺激に対する本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の細胞保護作用を調べた結果である。
【図２】図２は、喫煙抽出物質刺激に対する本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の細胞保護作用を調べた結果である。
【図３】図３は、過酸化水素刺激及び無血清刺激に対する本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の抗アポトーシス作用を調べた顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物のチオレドキシン産生促進作用（遺伝子レベル）を調べた結果である。
【図５】図５は、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物のチオレドキシン産生促進作用（蛋白レベル）を調べた結果である。
【図６】図６は、喫煙曝露したマウスの肺組織において、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物による組織保護作用を調べた顕微鏡写真である。
【図７】図７は、喫煙曝露したマウスの気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数を計測し、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物による炎症細胞浸潤抑制作用を調べた結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明医薬に用いるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物に関して、ワクシニアウイルスを接種した炎症組織において産生される生理活性物質、該物質を病態組織から抽出する方法並びにそれらの薬理活性などについては上述のように種々報告されている（上記特許文献３乃至１６等）。【００１３】
また市販されている医薬品としてはワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤がある。この製剤は、医療薬日本医薬品集〔2006年版、財団法人日本医薬情報センター編集・発行〕の2585-2587頁に記載されているように、ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有する薬剤であり、腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感・異常知覚・痛み、帯状疱疹後神経痛等に対する適応が認められており、皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として製造承認を受けて市販されている。【００１４】
本発明医薬に用いるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は上述したようなワクシニアウイルス接種炎症組織から抽出した非蛋白性の生体機能調整物質であり、前記の医療薬日本医薬品集にも掲載されているワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は医薬品の製造承認を受け市販されており入手可能である。また上述した特許文献に記載されている種々のワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を本発明物質として利用でき、それらの製造方法や好ましい投与量なども文献中に説明されている。【００１５】
本発明医薬に用いるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。【００１６】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
（a）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液（濾液または上清）を得る。
（b）前記抽出液を酸性のｐＨに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
（c）得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（d）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のｐＨに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。【００１７】
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。【００１８】
これら炎症組織を採取して破砕し、その１乃至５倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。【００１９】
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去する。【００２０】
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはｐＨ３．５乃至５．５に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。【００２１】
吸着剤より有効成分を溶出（脱離）させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のｐＨに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはｐＨ９乃至１２に調整した水を使用することができる。【００２２】
このようにして得られた抽出物（溶出液）は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい形態に適宜調製することができる。例えば、溶液のｐＨを中性付近に調整して製剤用原体とすることもでき、また濃縮・希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さらに注射用製剤として塩化ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することもできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。【００２３】
患者への投与方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられ、投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販製剤で認められている投与量は、前記の医療薬日本医薬品集（2585頁）によれば、基本的には内服では１日１６ＮＵ、注射剤では１日３．６乃至７．２ＮＵを投与するよう医療用医薬品としては示されているが、疾患の種類、重傷度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である（ＮＵ：ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるＳＡＲＴストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のＥＤ50値をもって規定する。１ＮＵはＥＤ50値が100 mg／kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分１mgを示す活性である。）【００２４】
以下に、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造方法の例、並びに本発明抽出物の新規な薬理作用、すなわちチオレドキシン産生促進作用及びCOPD予防・治療作用に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でｐＨ５に調整した後、９０〜１００℃で３０分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９とし、さらに９０〜１００℃で１５分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約ｐＨ４．５に調整し、２％の活性炭を加えて２時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでｐＨ１０とし、６０℃で１．５時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでｐＨ１１とし、６０℃で１．５時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。以下の薬理試験では実験に適した濃度に適宜調整して使用した。【００２６】
実施例２
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性（ｐＨ４．５乃至５．５）に調整した後、１００℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性（ｐＨ８．５乃至１０．０）とし、さらに１００℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約ｐＨ４．５とし、約１．５％の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでｐＨ９．４乃至１０に調整し、３乃至５時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。【００２７】
実施例３
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でｐＨ５．０に調整した後、流通蒸気下１００℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９．１とし、さらに１００℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でｐＨ４．１に調整し、活性炭２％を加えて２時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭５．５％を加えて２時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでｐＨ９．９とし、６０℃で１．５時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでｐＨ１０．９とし、６０℃で１．５時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量１００の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。【００２８】
次に、上記実施例１で得られた本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を被験物質として用いたチオレドキシン産生促進作用に関する薬理試験の結果の一例を示す。【００２９】
薬理試験１：過酸化水素（H2O2）障害に対する細胞保護作用
ヒト肺胞上皮由来の細胞株A549細胞をチオール除去DMEM培地（以下、特に明記しない場合は、該培地は無血清培地である）下で、被験物質を添加し16時間、前培養した。さらに0.3 mM H2O2（最終濃度）を添加し6時間培養した後、LDH assay（Roche Diagnostics社）にて培養上清中のLDH（乳酸脱水素酵素）を測定し、細胞のviabilityの指標とした。過酸化水素障害に対する本発明抽出物の細胞保護効果を調べた結果の一例を図１に示す。
A549細胞に無血清培地下でH2O2刺激を加えると、細胞傷害を引き起こすが、本発明抽出物を添加し、前培養することにより、細胞傷害が濃度依存性に有意に抑制された。また、同時に無血清刺激による細胞傷害に対しても抑制効果が認められた。【００３０】
薬理試験２：喫煙抽出物質刺激に対する細胞保護作用
A549細胞をチオール除去DMEM培地下で、被験物質（0.01 U/mL）を添加し16時間、前培養した。さらに喫煙抽出物質を添加し6時間培養した後、LDH assayにて培養上清中のLDHを測定し、細胞のviabilityの指標とした。なお、喫煙抽出物質（cigarette smoke extract, CSE）は、たばこ煙発生装置SG-200（柴田科学）を用いて作製した。すなわち、タバコ（ケンタッキー・リサーチシガレット2R4F）10本分の煙を10mLのチオール除去DMEM （10% HEPES添加）に通過させたものを100% CSEとし、実験に適した濃度に適宜希釈して使用した。喫煙抽出物質刺激に対する本発明抽出物の細胞保護効果を調べた結果の一例を図２に示す。
本発明抽出物を添加し、前培養することにより、CSEによる細胞傷害が有意に抑制され、その効果はNAC（N−アセチルシステイン、0.1 mM）と同等であった。【００３１】
薬理試験３：抗アポトーシス作用
Chamber slide上に培養したA549細胞に対し、チオール除去DMEM培地下で被験物質を添加し10時間、前培養した後、さらにH2O2添加し24時間培養した。また、比較のため、ウシ胎児血清（FCS）添加培地下でも同様にA549細胞を培養した。Hoechst 33342及びヨウ化プロピジウムにて染色し、蛍光顕微鏡で細胞死を評価した。本発明抽出物の抗アポトーシス作用を調べた結果の一例を図３に示す。
本発明抽出物は無血清刺激及びH2O2刺激によるアポトーシスを抑制した。（図３の蛍光顕微鏡写真中、高輝度の小型の核を有する細胞がアポトーシスである。）【００３２】
薬理試験４：抗酸化作用
A549細胞をチオール除去DMEM培地下で、被験物質（0.01 U/mL）を添加し16時間、前培養し、さらに0.3 mM H2O2（最終濃度）を添加し3時間培養した。次に、トリプシン処理後、oxidant反応性蛍光基質CM-H2DCFDA（Molecular Probe社）を添加し20分間培養した。フローサイトメトリー（FACSCalibur、BD bioscience社）にて緑色蛍光を測定した。酸化ストレスにより蛍光輝度が上昇した細胞を陽性細胞として、結果を陽性細胞率で判定した。本発明抽出物の抗酸化作用を調べた結果の一例を表１に示す。
無血清及びH2O2刺激等の酸化ストレスによる細胞の陽性細胞率上昇が、本発明抽出物により有意に抑制された。【００３３】
【表１】
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【００３４】
薬理試験５：チオレドキシン産生促進作用（遺伝子レベル）
A549細胞をチオール除去DMEM培地下で、被験物質を添加し9時間培養した。RNAを抽出し、RT-PCR法により、チオレドキシンのmRNA発現を測定した（ABI社7300 リアルタイムPCRシステム）。本発明抽出物の遺伝子レベルでのチオレドキシン産生促進作用を調べた結果の一例を図４に示す。
本発明抽出物のチオレドキシン産生促進効果は、遺伝子レベルにおいて濃度依存的に認められた。【００３５】
薬理試験６：チオレドキシン産生促進作用（蛋白レベル）
A549細胞をチオール除去DMEM培地下で、被験物質を添加し培養した。細胞溶解物中のチオレドキシン発現量を、ウエスタンブロット法により測定した。本発明抽出物の蛋白レベルでのチオレドキシン産生促進作用を示す結果の一例を図５に示す。
本発明抽出物のチオレドキシン産生促進効果は、蛋白レベルにおいて濃度依存性に認められた。
なお、ヒト肺線維芽細胞株のWI38を用いた場合にも、A549細胞と同様の細胞保護作用、チオレドキシン産生促進作用等が本発明抽出物に認められた。【００３６】
薬理試験７：組織保護作用（in vivo）
C57BL/6J雄性マウス（8週齢）を3日間喫煙曝露し（day1-3）、被験物質投与（day0-3、100NU/kg/day、i.p.）の効果を検討した。喫煙曝露は、たばこ煙発生装置SG-200（柴田科学）を用いて行い、1日1時間全身曝露した。最終喫煙24時間後に、マウスを瀉血致死させ、10%中性緩衝ホルマリンにて伸展固定肺標本を作製した。肺標本は、HE染色及びssDNA免疫染色し、炎症・傷害を評価した。本発明抽出物の組織保護作用（in vivo）を調べた結果の一例を図６に示す。
喫煙曝露により、(1) 細気管支の細胞死、血管周囲間質の浮腫・炎症細胞浸潤（HE染色）、(2) 細気管支、肺胞、小血管のアポトーシス（ssDNA免疫染色）が引き起こされるが、本発明抽出物の投与により、これらの肺炎症・傷害が抑制される傾向が認められた（図６のssDNA免疫染色の顕微鏡写真中、黒色に濃染する核を持つ細胞がアポトーシスである）。【００３７】
薬理試験８：炎症細胞浸潤抑制作用（in vivo）
上記薬理試験７と同様に、8週齢のC57BL6マウスに対し、たばこ煙を1日1時間計3日間、たばこ煙発生装置SG-200（柴田科学）を用いて曝露させた。マウスは被験物質投与群（n=3、喫煙30分前に1NU/kg腹腔内投与）と生理食塩水投与群（n=3）に分け、最終喫煙曝露24時間後に気管支肺胞洗浄（BAL）を施行し、BAL液の中の好中球数を比較検討した。BALは生理食塩水1mLで計5回行い、得られた細胞からサイトスピン標本を作製し、DiffQuik染色の後、細胞数をカウントした。本発明抽出物の炎症細胞浸潤抑制作用（in vivo）を調べた結果の一例を図７に示す。本発明抽出物の投与により、喫煙曝露による炎症細胞（好中球）の浸潤が有意に（p<0.05）抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
上記の薬理試験結果より明らかなように、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、喫煙抽出物質、過酸化水素、無血清等の刺激による酸化ストレスに対して、優れたチオレドキシン産生促進作用を有するとともに、抗酸化作用、アポトーシス抑制作用等の顕著な肺細胞保護効果を示した。従って、本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物はレドックス状態の不均衡がもたらす疾患・病態に有効であり、例えば、慢性喫煙等の持続的な酸化ストレスが主原因とされる慢性閉塞性肺疾患（COPD）の予防又は治療剤としても有用である。市販のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は長年に亘って使用され、非常に安全性の高い薬剤として認められている。このように、本発明抽出物はチオレドキシン産生促進剤、肺細胞保護剤或いは肺気腫や慢性気管支炎等の慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤として新規な薬剤であり、副作用もほとんど発現しない安全性の高い医薬として有用性の高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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