(57)【要約】  本発明は外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株、及びその製造方法を提供する。本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株。
【請求項２】
外因性不死化遺伝子がＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードするものである、請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
ブタ由来である、請求項１記載の細胞株。
【請求項４】
下記（１）〜（３）の性質を有する、請求項１記載の細胞株：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）ＧＦＡＰ及びＳ１００の産生能を有する；及び
（３）ＴＧＦ−β１及びＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりヒアルロン酸産生が促進される。
【請求項５】
更に、以下の性質を有する、請求項４記載の細胞株：
（４）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＨＡＳ２の発現が上昇する。
【請求項６】
更に、以下の性質を有する、請求項４記載の細胞株：
（５）ＩＬ−１αの刺激によりＶＥＧＦの発現が上昇する。
【請求項７】
上記の性質が２０継代以上維持される、請求項４〜６のいずれかに記載の細胞株： 
【請求項８】
生ウイルスの感染を介さずに樹立される、請求項１記載の細胞株。
【請求項９】
硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される、請求項１記載の細胞株。
【請求項１０】
硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、硝子体細胞株の製造方法。
【請求項１１】
外因性不死化遺伝子がＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードするものである、請求項１０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝子体細胞株およびその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
硝子体は、網膜、毛様体、水晶体に囲まれた硝子体腔（vitreous cavity）を満たすゲル様組織で、中間透光体を形成するとともに、眼球内圧の維持にも関与している。硝子体は、眼球容積の約４／５を占め、その９９％は水である。硝子体のゲル構造は、コラーゲン繊維とボール状になったヒアルロン酸（ＨＡ）との二重の網目構造を呈し、これが強力な含水能力の原因である。硝子体の異常は、種々の網膜硝子体疾患（例えば、増殖性網膜硝子体疾患等）の原因となり、視力の低下を引き起こす。硝子体の機能や構造を詳細に解析することは、網膜硝子体疾患の治療薬を開発していく上で重要である。本発明者らは、増殖性網膜硝子体疾患の増殖組織を解析することにより、該疾患の病態にヒアルロン酸産生が関与していることを報告している（Japanese Journal of Ophthalmology, vol.7, p.557-564, 2003：非特許文献１）。【０００３】
硝子体細胞は、硝子体内に含まれる細胞であり、ＨＡ等の多様な硝子体構成成分を産生する。そこで、硝子体細胞をインビトロで培養し、その機能を解析することが、網膜硝子体疾患の病態を解明し、該疾患の治療薬の開発を進める上で重要である。【０００４】
しかしながら、硝子体細胞は、その増殖能が非常に低く、実質的に長期的な培養が不可能であるか、培養できたとしてもその増殖は極めて困難である。また、新生仔から得られる硝子体細胞は、比較的培養が容易ではあるが、その増殖能には制限があり、また、長期継代では、細胞の巨大化や変性が起こる可能性もある。そこで、硝子体細胞としての本来の機能を維持したまま、長期の継代が可能な硝子体細胞株の開発が望まれる。【０００５】
一方、不死化遺伝子として知られるシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）の大型Ｔ抗原遺伝子をヒト水晶体上皮細胞に導入することにより、ヒト水晶体上皮細胞株が作製された［特開平１０−５２２７２：特許文献１、Andley U.P. ら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994)：非特許文献２］。しかし、これまでに、硝子体細胞を株化したという報告はない。
【特許文献１】特開平１０−５２２７２号公報
【非特許文献１】Japanese Journal of Ophthalmology, 7: 557-564 (2003)
【非特許文献２】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、硝子体の生理学的・生化学的研究や増殖性網膜硝子体疾患などの網膜硝子体疾患の予防および治療薬の開発のための研究手段として有用であり、また、硝子体再生のため、生体中への移植が可能な硝子体細胞株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、不死化遺伝子を機能的に組み込んだプラスミド発現ベクターでブタ硝子体細胞をトランスフェクトすることによって、硝子体細胞にインビトロでの無限増殖能を付与し、半永久的に継代培養可能なクローナルなブタ硝子体細胞株を樹立することに成功して本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株。
［２］外因性不死化遺伝子がＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードするものである、［１］記載の細胞株。
［３］ブタ由来である、［１］記載の細胞株。
［４］下記（１）〜（３）の性質を有する、［１］記載の細胞株：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）ＧＦＡＰ及びＳ１００の産生能を有する；及び
（３）ＴＧＦ−β１及びＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりヒアルロン酸産生が促進される。
［５］更に、以下の性質を有する、［４］記載の細胞株：
（４）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＨＡＳ２の発現が上昇する。
［６］更に、以下の性質を有する、［４］記載の細胞株：
（５）ＩＬ−１αの刺激によりＶＥＧＦの発現が上昇する。
［７］上記の性質が２０継代以上維持される、［４］〜［６］のいずれかに記載の細胞株。
［８］生ウイルスの感染を介さずに樹立される、［１］記載の細胞株。
［９］硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される、［１］記載の細胞株。
［１０］硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、硝子体細胞株の製造方法。
［１１］外因性不死化遺伝子がＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードするものである、［１０］記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】硝子体細胞株の形態を示す写真である。
【図２】試験プロトコールを模式的に示す図である。
【図３】硝子体細胞株のＨＡＳ２の発現に対するＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＴＧＦ−β１刺激の効果を示す図である。
【図４】硝子体細胞株のヒアルロン酸産生に対するＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＴＧＦ−β１刺激の効果を示す図である。
【図５】ＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＴＧＦ−β１刺激によるＨＡＳ２発現に対する、Ｓｍａｄ２、３又は４の強制発現の効果を示す図である。
【図６】試験プロトコールを模式的に示す図である。
【図７】硝子体細胞株のＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現に対するＩＬ−１α刺激の効果を示す図である。
【図８】硝子体細胞株のＶＥＧＦタンパク質発現に対するＩＬ−１α刺激の効果を示す図である。縦軸は、ヒトＶＥＧＦ標準品から導き出される、ブタＶＥＧＦ濃度の相対値である。
【図９】硝子体細胞株のＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現に対するＩＬ−１β、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＴＮＦα刺激の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の硝子体細胞株は、外因性不死化遺伝子を含有し、該不死化遺伝子の発現の結果として、インビトロでの無限増殖能を獲得した細胞群である。【００１２】
本発明の硝子体細胞株は、哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の偶蹄類、ウマ等の奇蹄類、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。本発明の硝子体細胞株は、好ましくは、ブタ由来である。【００１３】
ここで「不死化遺伝子」とは、細胞を不死化し、無限増殖能を獲得させる遺伝子をいい、例えばｃ−ｍｙｃ，ｒａｓ等の癌遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ、ＳＶ４０由来の大型Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子）、ポリオーマウイルスの大型Ｔ抗原遺伝子、パピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子などが挙げられる。また、本発明において「外因性不死化遺伝子」とは、本発明の硝子体細胞株の起源となる硝子体細胞が生来有していない、細胞外から新たに導入される不死化遺伝子を意味する。したがって、本発明の細胞株が由来する哺乳動物以外に由来する不死化遺伝子のほか、たとえば、本発明の細胞株が由来する哺乳動物の癌遺伝子であっても、標的細胞内で発現可能な（すなわち、正常の内因性癌遺伝子が受けている発現抑制を受けない）形態に改変されたものも外因性不死化遺伝子に属するものとする。本発明の外因性不死化遺伝子として、好ましくは、ウイルス由来の不死化遺伝子、より好ましくはＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子が用いられる。【００１４】
本発明の硝子体細胞株は、好ましくは、組織より分離された硝子体細胞に、上記の外因性不死化遺伝子を機能的に担持する、すなわち標的細胞内で発現可能な形態で担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を適当な培地中で継代培養することによって樹立することができる。【００１５】
硝子体細胞は、例えば、摘出された眼組織から硝子体組織を離断し、はさみ等で細かく（約２ｍｍ角）に切断し、得られた硝子体断片を、ウシ胎児血清や仔ウシ血清１０〜２０％を含む適当な液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等に懸濁し、ＣＯ2 インキュベーター中で２日間程度培養することにより、培養容器上に接着した線維芽細胞様の細胞として単離することが出来る。単離された硝子体細胞がトランスフェクションに供される。【００１６】
本発明で使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが例示される。不死化遺伝子の導入過程において生ウイルスの感染を介さずに細胞株を樹立することが可能であり、細胞内でウイルス粒子の産生の可能性がないので、発現ベクターは好ましくは、プラスミドベクターである。ウイルスゲノムをベクターとして使用する場合は、該ベクターが導入された細胞内で、少なくとも完全なウイルス粒子が産生されないように遺伝子の一部を欠失または変異させておくことがより好ましい。【００１７】
外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターの構築方法として、例えば、外因性不死化遺伝子にＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を使用する場合には、以下の方法が例示される。ＳＶ４０ゲノミックＤＮＡの初期領域に存在する不死化遺伝子（すなわち、大型Ｔ抗原遺伝子）を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、硝子体細胞中で該遺伝子を発現可能なプロモーターを含有するプラスミドベクターに挿入する。プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭｕＭＬＶ ＬＴＲ等が挙げられる。ＳＶ４０初期プロモーターを用いる場合、ＳＶ４０ゲノミックＤＮＡから該プロモーターと大型Ｔ抗原コード領域の両方を含むＤＮＡ断片を切り出してもよい。【００１８】
プラスミドベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ等が挙げられる。また、さらに転写終結シグナル、外因性不死化遺伝子の発現をエンハンスする特異的な配列などを当該ベクターの適当な位置に配することもできる。このようにして構築された外因性不死化遺伝子発現ベクターは、適当な宿主中、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等で大量に合成させ、常法により回収精製した後、常用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等により硝子体細胞に導入される。【００１９】
ウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、レンチウイルス等のレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルス等が挙げられる。レトロウイルスによる遺伝子導入は、遺伝子が染色体へ組み込まれるように導入されるので、好ましい。また、レンチウイルスは分裂及び非分裂細胞の両方に感染し、遺伝子を導入することができる。ウイルス粒子を含む培養液中で硝子体細胞を培養することにより、外因性不死化遺伝子が硝子体細胞内へ導入される。この際、遺伝子導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることにより、導入効率を高めることが出来る。【００２０】
トランスフェクション後の細胞は、液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等で培養される。培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ2 濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。２〜３日ごとに新鮮な培地に交換し、細胞増殖が飽和点に達した時に継代する。一旦、細胞増殖が止まってからも培養を続け、再増殖を始めた細胞群を単クローンの細胞群として分別する。クローンの分離は以下のようにして行うことができる。トリプシンとＥＤＴＡ溶液を浸染させた小径の濾紙を目的のクローン細胞群上に静置し、培養容器より細胞を剥離して濾紙に付着させる。濾紙小片に付着したクローン細胞群を、濾紙ごと別の培養容器に移す。また、コロニーをピックアップする方法、限界希釈法や、セルソーターを用いる方法によってもクローンを分離することが出来る。クローナルな細胞株は、個々の細胞の性質が均一であるため、従来不均一な硝子体細胞を用いて行われていた硝子体の生理学的・生化学的研究、網膜硝子体疾患の病因解明および予防・治療薬の開発等のための有用なモデル細胞となり得る。【００２１】
上記のようにして得られた硝子体細胞株は一般的な動物細胞培養技術により継代培養することができる。細胞の増殖能の指標として、下式により算出される細胞集団倍加数（cell population doubling level；ＰＤＬ）が用いられる。
ＰＤＬ＝ｌｏｇ10（Ｎi ／Ｎ0 ）／ｌｏｇ10２
Ｎi ＝第ｉ継代培養終了時の細胞数
Ｎ0 ＝第１継代培養開始時の細胞数
本発明の細胞株のＰＤＬは、通常１継代ごとに、通常約１．１〜２．０、好ましくは１．４〜１．５ずつ増加する。【００２２】
本発明の細胞株は、下記（１）〜（３）の性質を有し得る：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）ＧＦＡＰ及びＳ１００の産生能を有する；及び
（３）ＴＧＦ−β１及び／又はＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりヒアルロン酸産生が促進される。【００２３】
ここで、ＧＦＡＰ及びＳ１００を産生することは、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。ＧＦＡＰ（Glial Fibrillary Acidic Protein／グリア線維性酸性タンパク質）は、分子量約５０ｋＤａの中間径フィラメントである。Ｓ１００は、ＥＦハンドと呼ばれるloop-helix-loop構造のカルシウム結合モチーフを２つ有する、分子量約１０ｋＤａの酸性タンパク質である。ＴＧＦ−β１及び／又はＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりヒアルロン酸産生が促進されることも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。増殖性網膜硝子体疾患等の病態にヒアルロン酸産生が関与することが報告されていることから（Japanese Journal of Ophthalmology, vol.7, p.557-564, 2003）、本発明の細胞株は、特に、サイトカイン刺激による硝子体細胞からのヒアルロン酸産生のこれらの疾患への関与について研究するための強力なツールとなる。【００２４】
本発明の細胞株は、上記の性質に加えて、更に下記（４）の性質を有していてもよい。
（４）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＨＡＳ２の発現が上昇する。【００２５】
「遺伝子の発現」とは、該遺伝子をコードするｍＲＮＡ又は該遺伝子産物（タンパク質）の発現を意味する。ＨＡＳ２（Hyaluronan synthase 2）はヒアルロン酸の合成酵素である。ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＨＡＳ２の発現が上昇することも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。【００２６】
本発明の細胞株は、上記の性質に加えて、更に下記（５）の性質を有していてもよい。
（５）ＩＬ−１αの刺激によりＶＥＧＦの発現が上昇する。【００２７】
たとえば、本発明の細胞株をＩＬ−１αで刺激すると、ＲＴ−ＰＣＲ解析等によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルは、非刺激コントロールのｍＲＮＡレベルと比較して、１２時間後で２倍以上、４８時間後では２．５倍以上となる。ＩＬ−１αの刺激によりＶＥＧＦの発現が上昇することも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。【００２８】
また、本発明の細胞株のＶＥＧＦ発現は、ＩＬ−１β、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＴＮＦα刺激によっては有意な変化を示さない。たとえば、本発明の細胞株をこれらのサイトカインで刺激しても、ＲＴ−ＰＣＲ解析等による４８時間後のＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルは、非刺激コントロールのｍＲＮＡレベルの０．５〜１．５倍の範囲内である。したがって、本発明の細胞株は、特に、ＩＬ−１α刺激によるＶＥＧＦ発現のメカニズムの解析に有用である。【００２９】
本発明の細胞株は、通常、細胞の巨大化・変性が実質的にみられない。「細胞の巨大化・変性が実質的にみられない」とは、細胞の顕微鏡観察により、一部に伸張した細胞がみられることはあっても、その大多数（例えば約９５％以上）は本来の硝子体細胞の形態的特徴を示すことを意味する。本発明の細胞株を長期（例えば約４０継代以上）に亘り継代すると、細胞形態が伸張する傾向を示す場合があるが、この伸張した細胞株も本発明の範囲内である。【００３０】
本発明の硝子体細胞株は、２０継代以上、好ましくは３５継代以上にわたり上記性質が安定に維持されている。【００３１】
本発明の細胞株は硝子体の生理学的・生化学的研究、網膜硝子体疾患の病因解明及び予防・治療薬の開発、並びに眼疾患用医薬品の安全性試験等のための有用なモデル細胞となり得る。且つ当該細胞は安定な供給が可能であるから、硝子体再生を目的とした移植や人工硝子体の有用な材料となり得る。また、本発明の細胞株は硝子体特異的蛋白質であるＧＦＡＰ及びＳ１００の産生能を有し、ヒアルロン酸産生能を有することから、該細胞株の大量培養により該物質を大量に製造することもできる。また、本発明の細胞株をIL-1αにより刺激することによりVEGF発現が促進することから、この発現誘導を抑制する化合物を選択することにより、硝子体細胞から放出されるVEGFが関与する、血管内皮の増殖、血管透過性の亢進、新生血管の増殖等の症状を予防・治療し得る化合物をスクリーニングすることができる。【００３２】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（ブタ硝子体組織の単離及びブタ硝子体細胞の調製）
２歳齢のブタの眼組織より硝子体を摘出し、はさみで２ｍｍ角に切断した。得られた硝子体断片をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）（１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン含有）中に懸濁し、１０ｃｍ培養ディッシュ上で、３７℃、５％  ＣＯ２にて培養した。２日後、ディッシュ上に接着した線維芽細胞様の細胞として、硝子体細胞が得られた。【００３４】
（不死化遺伝子ＳＶ４０大型Ｔ抗原の導入及び細胞株の単離）
上記で得られた硝子体細胞に、ＳＶ４０大型Ｔ抗原の配列が組み込まれたベクター（RIKEN Tag-LTR-pUC18 sense #4）をリン酸カルシウム法（BD Calphos Mammalian Transfection Kit）を用いて導入した。
８０％コンフルエントのときに、培養ディッシュに０．２５％  トリプシン／ＥＤＴＡを４ｍｌ加え、３７℃、５％  ＣＯ２にて５分間処理することにより、細胞を剥がし、その後上記ＤＭＥＭを同量加えることによりトリプシンを失活させた。その後、３８０×ｇにて２分間、遠心分離することにより細胞を回収した。細胞を１：１０希釈となるように培養ディッシュに播き、３７℃、５％ＣＯ２にて更に培養した。
４日間培養後、コロニーを形成している細胞を選択し、該細胞をトリプシンで剥がし、コロニー毎に１２穴プレート中で培養した。８０％コンフルエント程度になったところで、細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに継代し、更に８０％コンフルエント程度になったところで、細胞を凍結保存した（５％  ＤＭＳＯ／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）。【００３５】
（細胞の継代）
単離されたコロニーを同様の条件で、第４０継代まで引続き培養した。培養を通じて、細胞は一定の比率で継代し続けることが可能であったことから、細胞の増殖速度の低下は認められなかった。５継代ごとにＰＤＬを算出した。得られた細胞株のＰＤＬは、１継代ごとに、約１．４〜１．５ずつ増加した。
顕微鏡下で細胞の形態を観察した。ＤＭＩＲＢＥ顕微鏡（Leica社製）に接続された冷
却ＣＣＤカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）で細胞の様相を撮影した。撮影条件は以下の通り：対物レンズ  ５倍／接眼レンズ  １０倍／光量  ９．０Ｖ。細胞は単層からなり、線維芽細胞様の形態を呈した（図１）。４０代継代後の細胞の一部に、伸張した細胞形態を呈する傾向が認められたものの、細胞の巨大化や変性はほとんど認められなかった。【００３６】
（ＳＶ４０大型Ｔ抗原の発現確認）
細胞から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により不死化遺伝子ＳＶ４０大型Ｔ抗原のｍＲＮＡ発現を確認した。【００３７】
（硝子体細胞株の表現型の解析）
硝子体細胞株は、ＧＦＡＰ及びＳ１００タンパク質を発現していた。このことから、得られた硝子体細胞株は硝子体細胞としての生理学的特徴を保持していることが示された。
次に、樹立された硝子体細胞株における、ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）２の発現及びヒアルロン酸産生に対するＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＴＧＦ−β１の影響を調べた。該発現はＲＴ−ＰＣＲにて観察した。
即ち、硝子体細胞株が５０〜６０％コンフルエントのときに、該細胞の培地をウシ血清を１％を含んだＤＭＥＭに交換し、２４時間培養後、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）により細胞を刺激した。一部の試験においては、培地交換から６時間後に、Ｓｍａｄ２、３又は４を細胞株にトランスフェクションした。サイトカイン刺激の３、６、２４及び４８時間後に、細胞及び培養上清を回収した（図２）。細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行い、ＨＡＳ２に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Roche FastStart High Fidelity PCR Systemを用い、Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems)上で行った。ＰＣＲの条件は以下の通り：
９５℃  ２分間  →  （９５℃  ３０秒  →  Ｘ℃  ３０秒  →  ７２℃  ３０℃）×Ｙサイクル  →  ７２℃  ７分
Ｘ＝５０、Ｙ＝３５・・・ＨＡＳ２
Ｘ＝６０、Ｙ＝２５・・・ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ
また、培養上清中のヒアルロン酸濃度をヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社）を用いて測定した。【００３８】
その結果、硝子体細胞株をＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）により刺激すると、刺激から６時間後にＨＡＳ２のｍＲＮＡ発現量が上昇した（図３）。該刺激により、培養上清中のＨＡ濃度が経時的に上昇したことから、ＴＧＦ−β１及びＰＤＧＦ−ＢＢの刺激により硝子体細胞株におけるヒアルロン酸合成が亢進したことが示唆された（図４）。このことから、得られた硝子体細胞株は硝子体細胞としての生理学的特徴を保持していることが示された。
Ｓｍａｄ２、３又は４の強制発現により、ＴＧＦ−β１刺激によるＨＡＳ２の発現が認められた（図５）。このことから、ＴＧＦ−β１の作用はＳｍａｄ２、３及び４の経路を介するものであることが示唆された。ＴＧＦ−β１とＰＤＧＦ−ＢＢとの相乗効果は認められなかった。
【実施例２】
【００３９】
実施例１において樹立した硝子体細胞株における、サイトカイン刺激に対するVEGF発現の変化を調べた。VEGFのｍRNAレベルでの発現はRT-PCRにより、またタンパク質レベルでの発現はELISAにより調べた。
即ち、硝子体細胞株が50〜60％コンフルエントのときに、該細胞の培地をウシ血清1％を含んだDMEMに交換し、２４時間培養後、サイトカイン（IL-1α、IL-1β、TNFα、PDGF-AA、ＰＤＧＦ-BB又はTGFβ）（10ng/ml）で48時間刺激した（図６）。刺激した細胞から全RNAを抽出し、cDNA合成を行い、VEGFのプライマーを用いてPCRを施行した。刺激した細胞の培地をELISAに用いた。ブタVEGFに対する適切な抗体が無いため、ヒトVEGFに対する抗体を用いたELISAによりVEGFタンパク質濃度の測定を行い、結果をヒトVEGF標準品から導き出される参考値として算出した。PCRはTOYOBO KOD plusのキットを用い、Gene PCR System 9700(Applied Biosystem)にて行った。PCRの条件は以下の通りである：
95℃  120秒；
（95℃  15秒、62℃  30秒、68℃  30秒）×30 cycle；
68℃  90秒。
ELISAは三菱ビーシーエルに依頼した。【００４０】
その結果、硝子体細胞株をIL-1αにより刺激すると、VEGFのｍＲＮＡ発現量が経時的に上昇した（図７）。該刺激により、培養上清中のVEGFタンパク質濃度も経時的に上昇したことから、IL-1αの刺激により硝子体細胞株におけるＶＥＧＦタンパク質の産生が亢進したことが示唆された（図８）。
一方、硝子体細胞株を他のサイトカイン（IL-1β、IL-6、TNFα、PDGF-AA、PDGF-BB又はTGFβ）により刺激しても、VEGFのｍＲＮＡ発現量の有意な変化は認められなかった（図９）。
このことから、実施例１で得られた硝子体細胞株は、特に、IL-1α刺激によるVEGF発現のメカニズムの解析に有用であることが示唆された。IL-1α刺激によるVEGFの発現を抑制することができれば、血管内皮の増殖抑制、血管透過性の亢進抑制、新生血管の増殖抑制につながると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。
本出願は日本で出願された特願２００６−０３６９５３（出願日：２００６年２月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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