(57)【要約】本発明のＰＡＩ−１阻害剤および医薬組成物は、下式（１）：［化１］2007083689.tif 000112〔式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２は置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３は水素原子を示す。またはＲ2およびＲ３が互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン、またはシングルボンド；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基、または、下式（２）；［化２］2007083689.tif 000113（式中、Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’はそれぞれＲ１、Ｒ２およびＲ３と同意義である。）で示される基を示す。〕で示される化合物またはその塩を有効成分とするものである。
2007083689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）：
【化１】
2007083689.tif 000095
〔式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２およびＲ３は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン、炭素数３〜８のシクロアルキレン、またはシングルボンド；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基、または、下式（２）；
【化２】
2007083689.tif 000096
（式中、Ｒ１’は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２’およびＲ３’は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい。）を示す。〕
で示される化合物若しくはその塩、またはこれらの溶媒和物を有効成分とする、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項２】
一般式（１）中、Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレン；Ｒ４は、下式（２）；
【化３】
2007083689.tif 000097
（式中、Ｒ１’は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２’およびＲ３’は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい。）
で示される化合物若しくはその塩、またはこれらの溶媒和物を有効成分とする、請求項１記載のプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ２’が、同一または異なって、置換基を有していてもよいフェニル基、２−チエニル基、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であるか、または同一または異なって、Ｒ２とＲ３もしくはＲ２’とＲ３’がそれぞれ結合して、縮合６員環を形成している、請求項１に記載するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項４】
Ｒ３およびＲ３’が、同一または異なって、水素原子、炭素数１〜３の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、またはハロゲン原子である、請求項１に記載するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項５】
Ａが、炭素数３〜５の直鎖状のアルキレン、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−、またはシクロヘキシレンである、請求項１に記載するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項６】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ２’がフェニル基または２−チエニル基であり、Ａがブチレンである、請求項１に記載するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１阻害剤、および薬学的に許容される担体または添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項８】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１活性が発症に関わっている疾患の予防または治療薬である請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
線溶系促進薬である請求項８に記載する医薬組成物。
【請求項１０】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１活性が発症に関わっている疾患が、狭心症、心筋梗塞もしくは心房細動における心房内血栓、虚血性心疾患、虚血性脳血管障害、動脈硬化症、肺塞栓症、外科手術時の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、糖尿病合併症としての血管障害、神経障害、網膜症もしくは腎症、または経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄である、請求項８に記載する医薬組成物。
【請求項１１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１活性が発症に関わっている疾患が組織線維化を伴う疾患である、請求項８に記載する医薬組成物。
【請求項１２】
組織線維化を伴う疾患が肺線維症である、請求項１１に記載する医薬組成物。
【請求項１３】
経口投与形態を有する請求項７に記載する医薬組成物。
【請求項１４】
下式（３）：
【化４】
2007083689.tif 000098
〔式中、Ｒ１とＲ１’は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２とＲ２’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３とＲ３’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレンを示す。但し、Ｒ２およびＲ２’が置換基を有さないフェニル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンおよび−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−のいずれでもなく、またＲ２およびＲ２’がイソブチル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンではない。〕
で示される化合物またはその塩。
【請求項１５】
下式（４）〜（１５）に示される化合物またはその塩：
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸
【化５】
2007083689.tif 000099
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸
【化６】
2007083689.tif 000100
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸
【化７】
2007083689.tif 000101
2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸
【化８】
2007083689.tif 000102
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸
【化９】
2007083689.tif 000103
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸
【化１０】
2007083689.tif 000104
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸
【化１１】
2007083689.tif 000105
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸
【化１２】
2007083689.tif 000106
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸
【化１３】
2007083689.tif 000107
2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸
【化１４】
2007083689.tif 000108
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸
【化１５】
2007083689.tif 000109
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸
【化１６】
2007083689.tif 000110
2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸 
【化１７】
2007083689.tif 000111
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載する化合物若しくはその薬学的に許容される塩、またはこれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（以下、「ＰＡＩ−１」ともいう）阻害剤に関する。また本発明は、ＰＡＩ−１活性を阻害する作用を有し、ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている各種疾患の予防または治療に有効な医薬組成物に関する。さらに本発明は、ＰＡＩ−１阻害活性を有する新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、脳塞栓症、脳梗塞、一過性脳虚血発作等の虚血性脳血管障害、狭心症、心筋梗塞、心房細動における心房内血栓、心不全等の虚血性心疾患の病因となり得る。血液循環には、体内組織に酸素や栄養を運搬し、不要物を回収するための流動性が求められる一方で、外傷時等に止血して血液の損失を防ぐ凝固性も必要である。この流動性と凝固性という相反する機能がアンバランスとなり凝固側に傾いたとき、血管内に血栓が生じ、虚血性の脳血管障害や心疾患が生じると考えられている。【０００３】
線維素溶解系（以下、「線容系」と称する）は、血栓溶解、組織の破壊や修復、細胞移動などに重要な役割を果たしている。線溶系は、プラスミノーゲンアクチベーター（以下、「ＰＡ」と称する）がプラスミノーゲンをプラスミンに変換することにより活性化される。一方、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）は、ＰＡを阻害する。【０００４】
組織プラスミノーゲンアクチベーター（以下、「ｔ−ＰＡ」と称する）は、プラスミンの前駆体であるプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。プラスミンはフィブリンを分解してフィブリン分解産物に変える。【０００５】
ＰＡＩ−１は、ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（以下、「ｕ−ＰＡ」と称する）を特異的に阻害するセリンプロテアーゼインヒビターであり、プラスミンの生成を抑制し、ひいてはフィブリンの分解を阻害する。【０００６】
ＰＡＩ−１には、立体構造の違いにより、ＰＡ阻害活性を示す活性型（active form）と、ＰＡ阻害活性を示さない潜在型（latent form）とがある。通常、血漿中には２０ｎｇ／ｍＬのＰＡＩ−１が存在し、主要な産生細胞である血管内皮細胞の他、肝細胞、巨核球（megakaryocyte）、および脂肪細胞で産生されることも知られている。【０００７】
ＰＡＩ−１は、急性期タンパク質であり、種々のサイトカインや増殖因子により産生が亢進して、敗血症や播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）における虚血性臓器障害を引き起こす原因の一つとして考えられている。また、ＰＡＩ−１遺伝子プロモーターの一塩基置換による遺伝子多型が知られており、当該遺伝子多型に起因して血漿ＰＡＩ−１濃度が増加することが明らかにされている。【０００８】
また、糖尿病に関しては、動脈硬化の促進および細小血管合併症が、糖尿病の重要な合併症である虚血性心疾患、糖尿病性網膜症および腎障害の原因になると考えられている。たとえば糖尿病性腎症では、糸球体内の細胞外基質の増加と間質の線維化が特徴的に認められ、糸球体と尿細管におけるＰＡＩ−１の発現が増強される。近位尿細管培養では、高血糖条件下でＰＡＩ−１の産生増加が認められる。また、腎間質線維化モデルマウスを用いた実験では、ＰＡＩ−１の腎組織内発現とマクロファージ浸潤との相関性が確認されている（非特許文献１参照）。【０００９】
またネフローゼ症候群患者の一日蓄尿を濃縮して尿中ＰＡＩ−１量を測定した結果から、ネフローゼ症候群患者の尿中ＰＡＩ−１濃度は高値であることが報告されている（非特許文献２参照）。【００１０】
Ｔｈｙ−１腎炎モデルに、ＰＡＩ−１拮抗剤として不活性ＰＡＩ−１ミュータント（非特許文献３）やｔ−ＰＡ（非特許文献４）を投与した結果、炎症（細胞浸潤）の軽減、ＴＧＦ−βの低下、およびメサンギウム基質の減少が確認され、Ｔｈｙ−１腎炎の改善が認められたとの報告もある。【００１１】
ＰＡＩ−１の血漿濃度の増加による線溶活性の低下は、深部静脈血栓症、虚血性心疾患および糖尿病性血管障害と関係している。線溶活性の低下に加え、過凝血性および血小板過凝集性を含むいくつかの他の血栓形成性の異常もまた、糖尿病患者において示されており、これらは微小血栓形成に寄与し、糖尿病性細小血管障害や糖尿病性大血管障害の進行に重要な役割を果たしている。【００１２】
このように、ＰＡＩ−１は、種々の血栓症、癌、糖尿病、および動脈硬化症等の各種の病態の形成や進展に関与していると考えられている。このため、ＰＡＩ−１の活性を阻害する化合物は、血栓症を始め、癌、糖尿病合併症、および動脈硬化症等の、線溶活性の低下に関係する疾患の予防および治療剤として有用である（非特許文献５）。【００１３】
また、組織の線維化は、肺を始め、心臓、血管、肝臓および腎臓など多くの組織や器官で生じるが、それを根本的に治療する薬剤は未だなく、経験的にプレドニゾロンやコルチコステロイドなどの副腎皮質ホルモン、ならびにシクロホスファミド（アルキル化剤）やアザチオプリン（代謝拮抗剤、免疫抑制剤）などの細胞障害性薬剤が、対症療法的に使用されているのが現状である。
【非特許文献１】Aya N，et al.（アヤ・エヌら），J. Pathol.（ザ・ジャーナル・オブ・パソロジー）, 166, 289-295, 1992
【非特許文献２】Yoshida Y，et al.（ヨシダ・ワイら），Nephron （ネフロン）,88, 24-29, 2001
【非特許文献３】W. A. Border, et al.（ダブリュー・エー・ボーダーら），J. Clin. Invest．（ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インべスティゲーション），112, 379, 2003
【非特許文献４】W. A. Border, et al.（ダブリュー・エー・ボーダーら）， Kidney Int．（キドニー・インターナショナル），59，246，2001
【非特許文献５】Egelund R，et al.（イゲルンドら），J. Biol. Chem.（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー），276, 13077-13086, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これまで、線溶系促進薬としてはｕ−ＰＡであるウロキナーゼが知られているが、これはヒト尿から精製して得られており、生産効率や安全性は決して高いとはいえない。さらに、ウロキナーゼは、分子量約５４,０００の高分子化合物である。そのほかの線溶系促進薬としては、チソキナーゼ、アルテプラーゼ（遺伝子組換え）、ナサルプラーゼ（細胞培養）、ナテプラーゼ（遺伝子組換え）、モンテプラーゼ（遺伝子組換え）、パミテプラーゼ（遺伝子組換え）およびバトロキソビンが知られているが、いずれも高分子化合物である。従って、線溶系促進薬として、大量合成が可能であり安全性の高い低分子化合物由来の薬物が求められている。また、組織の線維化を根本的に治療し改善する有効な薬物の開発も求められている。【００１５】
本発明は、かかる従来の問題に鑑み、大量合成が可能な低分子化合物を有効成分とする安全性の高い医薬組成物、特に線溶系促進薬または抗線維症剤として有用な医薬組成物を提供することを目的とする。また、線溶系促進薬または抗線維症剤などの医薬組成物の有効成分として有用な新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、下式（１）で示される化合物若しくはその塩、またはこれらの溶媒和物（以下、これらを総称して「本発明の化合物（１）」または「化合物（１）」という。）が、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）に対して高い阻害活性を有することを見出し、さらにこれがＰＡＩ−１阻害剤として線溶系促進薬の有効成分として有用であることを確認した。また本発明者らは、ＰＡＩ−１が組織線維化、特に肺線維症の主原因であることを見出し、本発明の化合物（１）によってこの組織線維化が有意に改善することを確認した。また、本発明者らは、かかる化合物（１）の中でも後述する式（３）で示される化合物（以下、これらを総称して「本発明の化合物（３）」または「化合物（３）」という。）、特に化合物（４）〜（１６）は、文献未収載の新規化合物であること確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。【００１７】
すなわち、本発明には下記の態様が含まれる：
（Ｉ）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）阻害剤
項１．下式（１）：【００１８】
【化１】
2007083689.tif 000003
【００１９】
〔式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２およびＲ３は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン、炭素数３〜８のシクロアルキレン、またはシングルボンド；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基、または、下式（２）；【００２０】
【化２】
2007083689.tif 000004
【００２１】
（式中、Ｒ１’は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２’およびＲ３’は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい。）を示す。〕
で示される化合物若しくはその塩、またはこれらの溶媒和物を有効成分とする、ＰＡＩ−１阻害剤。【００２２】
項２．一般式（１）中、Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレン；Ｒ４は、下式（２）；【００２３】
【化３】
2007083689.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ１’は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子を示す。またＲ２’およびＲ３’は互いに結合して５〜６員の環を形成していてもよい。）
で示される化合物若しくはその塩、またはこれらの溶媒和物を有効成分とする、項１記載のＰＡＩ−１阻害剤。【００２５】
項３．Ｒ２およびＲ２’が、同一または異なって、置換基を有していてもよいフェニル基、２−チエニル基、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２であるか、または同一または異なって、Ｒ２とＲ３もしくはＲ２’とＲ３’がそれぞれ結合して縮合６員環を形成している、項１または２に記載のＰＡＩ−１阻害剤。【００２６】
項４．Ｒ３およびＲ３’が、同一または異なって、水素原子、炭素数１〜３の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、またはハロゲン原子である、項１乃至３のいずれかに記載のＰＡＩ−１阻害剤。【００２７】
項５．Ａが、炭素数３〜５の直鎖状のアルキレン、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−、またはシクロヘキシレンである、項１乃至４のいずれかに記載のＰＡＩ−１阻害剤。【００２８】
項６．Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ２’がフェニル基または２−チエニル基であり、Ａがブチレンである、項１乃至５のいずれかに記載のＰＡＩ−１阻害剤。【００２９】
（II）医薬組成物
項７．項１乃至６のいずれかに記載するＰＡＩ−１阻害剤、および薬学的に許容される担体または添加剤を含む医薬組成物。言い換えれば、上記一般式（１）に記載する化合物若しくはその塩またはこれらの溶媒和物、および薬学的に許容される担体または添加剤を含む医薬組成物。【００３０】
項８．ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている疾患の予防または治療薬である項７記載の医薬組成物。【００３１】
項９．線溶系促進薬である項７または８記載の医薬組成物
項１０．ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている疾患が、狭心症、心筋梗塞もしくは心房細動における心房内血栓、虚血性心疾患、虚血性脳血管障害、動脈硬化症、肺塞栓症、外科手術時の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、糖尿病合併症としての血管障害、神経障害、網膜症もしくは腎症、または経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄である、項９に記載する医薬組成物。【００３２】
項１１．ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている疾患が、組織線維化を伴う疾患である項８に記載する医薬組成物。【００３３】
項１２．組織線維化を伴う疾患が肺線維症である項１１に記載する医薬組成物。【００３４】
項１３．経口投与形態を有する項７乃至１２のいずれかに記載する医薬組成物。【００３５】
項１４．下式（３）：【００３６】
【化４】
2007083689.tif 000006
【００３７】
〔式中、Ｒ１とＲ１’は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２とＲ２’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３とＲ３’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレンを示す。但し、Ｒ２およびＲ２’が置換基を有さないフェニル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンおよび−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−のいずれでもなく、またＲ２およびＲ２’がイソブチル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンではない。〕
で示される化合物またはその塩。【００３８】
項１５．下式（４）〜（１６）のいずれかに示される化合物またはその塩：【００３９】
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸【００４０】
【化５】
2007083689.tif 000007
【００４１】
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【００４２】
【化６】
2007083689.tif 000008
【００４３】
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【００４４】
【化７】
2007083689.tif 000009
【００４５】
2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【００４６】
【化８】
2007083689.tif 000010
【００４７】
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【００４８】
【化９】
2007083689.tif 000011
【００４９】
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【００５０】
【化１０】
2007083689.tif 000012
【００５１】
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸【００５２】
【化１１】
2007083689.tif 000013
【００５３】
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【００５４】
【化１２】
2007083689.tif 000014
【００５５】
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【００５６】
【化１３】
2007083689.tif 000015
【００５７】
2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【００５８】
【化１４】
2007083689.tif 000016
【００５９】
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸【００６０】
【化１５】
2007083689.tif 000017
【００６１】
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸【００６２】
【化１６】
2007083689.tif 000018
【００６３】
2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸 【００６４】
【化１７】
2007083689.tif 000019
【００６５】
項１６．項１４または１５に記載する化合物若しくはその薬学的に許容される塩、またはこれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分とする医薬組成物。【００６６】
なお、当該医薬組成物の用途は特に限定されず、ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている疾患の予防または治療用途などのＰＡＩ−１阻害作用に基づくものに限定されるわけではない。
【発明の効果】
【００６７】
本発明により、大量合成が可能であり安全性の高い低分子化合物を有効成分とする医薬組成物を提供することができる。当該医薬組成物は、ＰＡＩ−１に対して高い阻害作用を有する化合物（ＰＡＩ−１阻害剤）を有効成分とするものであり、ＰＡＩ−１活性に起因して生じる各種の疾患の予防または治療剤として有効に用いることができる。特に、本発明の医薬組成物は、線溶系促進薬として、狭心症、心筋梗塞もしくは心房細動における心房内血栓、虚血性心疾患、虚血性脳血管障害、動脈硬化症、肺塞栓症、外科手術時の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、糖尿病合併症としての血管障害、神経障害、網膜症もしくは腎症、または経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄の予防または治療に有用である。また本発明の医薬組成物は、抗線維症薬として、組織線維化に関連する各種の疾患、特に肺線維症の予防または治療に有用である。【００６８】
また本発明によれば、ＰＡＩ−１に対して高い阻害作用を有する新規化合物を提供することができる。かかる化合物は、ＰＡＩ−１活性に起因して生じる各種の疾患の予防または治療剤など、医薬組成物の有効成分として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
（Ｉ）ＰＡＩ−１阻害剤
本発明が提供するＰＡＩ−１阻害剤は、下式（１）：【００７０】
【化１８】
2007083689.tif 000020
【００７１】
で示される化合物またはその塩を有効成分とするものである。【００７２】
式（１）中、Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基で示される。ここで、炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、およびter-ブチル基などの直鎖または分枝鎖状のアルキル基を挙げることができるが、Ｒ1として好ましくは水素原子およびt-ブチル基である。【００７３】
式（１）中、Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基である。好ましくは置換基を有していてもよいフェニル基、チエニル基、メチル基、イソブチル基、イソプロピル基、または水素原子であり、より好ましくはチエニル基、フェニル基、およびイソブチル基である。【００７４】
チエニル基としては好適には２−チエニル基を挙げることができる。これらフェニル基またはチエニル基の置換基としてはカルボキシル基、アミノ基、ハロゲン原子、ヘテロ環基を挙げることができる。好ましくはハロゲン原子（例えば、塩素原子、フッ素原子、ヨウ素原子など）である。
炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ネオヘキシル基、ｔｅｒ−ヘキシル基を挙げることができる。好ましくは炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基であり、より好ましくはメチル基、イソプロピル基、イソブチル基である。【００７５】
式（１）中、Ｒ２とＲ３は、これらが結合する炭素原子とともに互いに結合して５〜６員の環を形成したものであってもよい。かかる５〜６員環としては、シクロヘキサン、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、シクロペンタン、シクロペンテンおよびベンゼンを挙げることができる。好ましくはシクロヘキサンである。【００７６】
また、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子であることもできる。フェニル基の置換基としては前述するようにカルボキシル基、アミノ基、ハロゲン原子、ヘテロ環基を挙げることができる。また炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基としても、前述するものを同様に挙げることができる。Ｒ３として、好ましくは水素原子、フェニル基、メチル基、イソプロピル基、およびハロゲン原子である。【００７７】
Ａは、シングルボンド；炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン；炭素数３〜８のシクロアルキレンである。好ましくは、炭素数２〜５の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、炭素数６のシクロアルキレン（シクロヘキサンジイル）、およびビニレンである。炭素数２〜５の直鎖または分枝鎖状のアルキレンとして具体的には、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−を挙げることができる。好ましくはブチレン基、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、シクロヘキサンジイルである。【００７８】
式（１）中、Ｒ４としては、水素原子、または置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基を挙げることができる。【００７９】
ここで、フリル基としては２−フリル基が好ましい。フェニル基またはフリル基が置換基を有する場合、当該置換基としては、塩素原子、ヨウ素原子、臭素原子またはフッ素原子のハロゲン原子；炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を挙げることができる。ハロゲン原子として好ましくはフッ素原子または塩素原子である。炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基としては、具体的には前述するものを挙げることができるが、好ましくはｔｅｒ−ブチル基、ｎ−ブチル基である。【００８０】
また、Ｒ４は、下式（２）で示される基であることができる：【００８１】
【化１９】
2007083689.tif 000021
【００８２】
ここで、Ｒ１’としては、前述するＲ１と同様に、水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を挙げることができる。化合物（１）がＲ４として上記の基（２）を有する場合、Ｒ１’とＲ１とは異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。  【００８３】
また、Ｒ２’としては、前述するＲ２と同様に、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基若しくはチエニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を挙げることができる。化合物（１）がＲ４として上記の基（２）を有する場合、Ｒ２’とＲ２とは異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。【００８４】
Ｒ３’も、前述するＲ３と同様に、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子であってもよいし、またＲ２’とともに、これらが結合する炭素原子とともに互いに結合して５〜６員の環を形成してなるものであってもよい。化合物（１）がＲ４として上記の基（２）を有する場合、Ｒ３とＲ３’とは異なっていてもよいが、同一であることが好ましく、また、互いに同時にＲ２とＲ２’ととも５〜６員の環を形成していてもよい。【００８５】
好適な化合物としては、式（１）において、Ａが炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレンであり、またＲ４として上記基（２）を有するものである。かかる好適な化合物として、下式（１７）に示す化合物を挙げることができる：【００８６】
【化２０】
2007083689.tif 000022
【００８７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は前記と同意義である。）
本発明が対象とする化合物（１）（特に化合物（17））として、好ましくはＲ１およびＲ１’が水素原子であるもの、およびＲ１およびＲ１’が同一または異なってter-ブチル基であるものを挙げることができる。より好ましくは、Ｒ２およびＲ２’が、水素原子、置換基を有するかまたは置換を有しないフェニル基、２−チエニル基、イソプロピル基、イソブチル基〔−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２〕であるか、またはＲ２とＲ３およびＲ２’とＲ３’がそれぞれ互いに結合して６員環を形成しているものである。また更に好ましくは、Ａがエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−、またはシクロヘキサンジイルであるものである。より好ましい本発明の化合物（１）（特に化合物（17））としては、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ３およびＲ３’がいずれも水素原子であり、Ｒ２およびＲ２’がフェニル基または２−チエニル基であり、Ａがブチレンまたは−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−である化合物を挙げることができる。【００８８】
なお、本発明が対象とするこれらの化合物（１）は、前述するように遊離の形態を有するものであってもよいが、塩の形態を有するもののであってもよい。ここで塩としては、通常、医薬上許容される塩、たとえば無機塩基または有機塩基との塩、または塩基性アミノ酸との塩などを挙げることができる。無機塩基としては、たとえば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウムやアンモニウム等を挙げることができる。有機塩基としては、たとえば、エタノールアミン等の第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン等を挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、たとえば、アルギニン、リジン、オルニチン等を挙げることができる。【００８９】
本発明が対象とする好適な化合物（１）として、具体的には下記の化合物ａ〜ｎおよびｏ〜zzを挙げることができる。【００９０】
化合物ａ
2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【００９１】
【化２１】
2007083689.tif 000023
【００９２】
化合物ｂおよびその塩
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(2-チエニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸【００９３】
【化２２】
2007083689.tif 000024
【００９４】
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(2-チエニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸  ジナトリウム塩【００９５】
【化２３】
2007083689.tif 000025
【００９６】
化合物ｃ
2-[3-(3'-カルボキシ-4',5',6',7'-テトラヒドロ‐ベンゾ[b]チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4,5,6,7-テトラヒドロ-ベンゾ[b]チオフェン-3-カルボン酸【００９７】
【化２４】
2007083689.tif 000026
【００９８】
化合物ｄおよびその塩
2-[5-(3’カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【００９９】
【化２５】
2007083689.tif 000027
【０１００】
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸  ジナトリウム塩【０１０１】
【化２６】
2007083689.tif 000028
【０１０２】
化合物ｅ
2-[3-(3'-カルボキシ-4',5',6',7'-テトラヒドロ[b]チオフェン-2'-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4,5,6,7-テトラヒドロ-ベンゾ[b]チオフェン-3-カルボン酸【０１０３】
【化２７】
2007083689.tif 000029
【０１０４】
化合物ｆ
2-ヘキサノイルアミノ-4-p-トリルチオフェン-3-カルボン酸【０１０５】
【化２８】
2007083689.tif 000030
【０１０６】
化合物ｇ
2-(3-フラン-2-イル-アクリロイルアミノ)-4−（２−チエニル）−3−-カルボン酸【０１０７】
【化２９】
2007083689.tif 000031
【０１０８】
化合物ｈおよびその塩
2-[4-(3'-カルボキシ-4'-(2-チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- 3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸【０１０９】
【化３０】
2007083689.tif 000032
【０１１０】
2-[4-(3'-カルボキシ-4'-(2-チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- 3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸  ジナトリウム塩【０１１１】
【化３１】
2007083689.tif 000033
【０１１２】
化合物ｉ
4-イソブチル-2-シンナモイルチオフェン-3-カルボン酸【０１１３】
【化３２】
2007083689.tif 000034
【０１１４】
化合物ｊ
2-[4-(3'-カルボキシ-4',5',  6', 7'-テトラヒドロ-ベンゾ[b]チオフェン-2-イルカルバモイル)-3,3-ジメチル]-ブチリルアミノ)-4,5,6,7- テトラヒドロ-ベンゾ[b]チオフェン-3-カルボン酸【０１１５】
【化３３】
2007083689.tif 000035
【０１１６】
化合物ｋ
2-[5-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)-(3,3-ジメチル))ブチルアミノ]-4-フェニル-チオフェン-3-カルボン酸【０１１７】
【化３４】
2007083689.tif 000036
【０１１８】
化合物ｌ
2-(4-tert-ブチルベンゾイルアミノ)-4−（2−チエニル）−３−カルボン酸【０１１９】
【化３５】
2007083689.tif 000037
【０１２０】
化合物ｍ
2-(3-フェニルプロピオニルアミノ)- 4−（2−チエニル）−３−カルボン酸【０１２１】
【化３６】
2007083689.tif 000038
【０１２２】
化合物ｎ
2-(4-フルオロベンゾイルアミノ)- 4−（2−チエニル）−３− カルボン酸【０１２３】
【化３７】
2007083689.tif 000039
【０１２４】
化合物ｏ
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸【０１２５】
【化３８】
2007083689.tif 000040
【０１２６】
化合物ｐ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０１２７】
【化３９】
2007083689.tif 000041
【０１２８】
化合物ｑ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０１２９】
【化４０】
2007083689.tif 000042
【０１３０】
化合物ｒ
2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０１３１】
【化４１】
2007083689.tif 000043
【０１３２】
化合物ｓ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０１３３】
【化４２】
2007083689.tif 000044
【０１３４】
化合物ｔ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０１３５】
【化４３】
2007083689.tif 000045
【０１３６】
化合物ｕ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸【０１３７】
【化４４】
2007083689.tif 000046
【０１３８】
化合物ｖ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０１３９】
【化４５】
2007083689.tif 000047
【０１４０】
化合物ｗ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０１４１】
【化４６】
2007083689.tif 000048
【０１４２】
化合物ｘ
2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０１４３】
【化４７】
2007083689.tif 000049
【０１４４】
化合物ｙ
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸【０１４５】
【化４８】
2007083689.tif 000050
【０１４６】
化合物ｚ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸【０１４７】
【化４９】
2007083689.tif 000051
【０１４８】
化合物zz
2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸【０１４９】
【化５０】
2007083689.tif 000052
【０１５０】
これらの化合物ａ〜ｎおよびｏ〜zzはいずれも一般式（１）で示される化合物（１）に包含されるものであるが、なかでも化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｊ、ｋ、ｏ〜zzは、一般式（17）で示される化合物に包含される化合物である。化合物（１）のうち好ましくは、化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｓ、ｔ、ｖおよびｒであり、より好ましくは化合物ａ、ｂ、ｄ、ｅ、ｈ、ｓおよびｔであり、特に好ましくは化合物ａ、ｂ、ｄ、およびｈである。【０１５１】
また、本発明が対象とする化合物（１）は、遊離物またはその塩が溶媒和してなるものであってもよい。かかる溶媒和物には水和物が含まれる。【０１５２】
化合物（１）、特に化合物ａ〜ｎは商業的に入手可能であり、また自体公知の方法により製造することができる。例えば、化合物（１）のうち、Ｒ４として、式（２）で示される基を有する化合物は、下記（Ａ）の製法１、またはこれに準じた方法で製造することができる。なお、化合物（１）中、化合物ｏ〜zzは、文献未収載の新規化合物であり、その製造方法は製造例５〜１７にて詳細に説明する。【０１５３】
（Ａ）製法１
式（18）：【０１５４】
【化５１】
2007083689.tif 000053
【０１５５】
（式中、Ｒ１” は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義した通りである。）  
で示される化合物を、式（19）【０１５６】
【化５２】
2007083689.tif 000054
【０１５７】
（式中、Ａは上記で定義した通りであり、Ｘは脱離基である。）
で示される化合物と反応させ、次いで得られた化合物を必要により加水分解し、Ｒ1が水素原子で示される化合物(１)(特に化合物（17）)を製造する。【０１５８】
またＲ４として水素原子、または置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基を有する化合物は下記（Ｂ）の製法２またはこれに準じた方法で製造することができる。【０１５９】
（Ｂ）製法２
式（20）：【０１６０】
【化５３】
2007083689.tif 000055
【０１６１】
（式中、Ａは上記で定義した通りであり、Ｘは脱離基、Ｒ４’は水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基を示す。）
で示される化合物を、式（18）【０１６２】
【化５４】
2007083689.tif 000056
【０１６３】
（式中、Ｒ１”、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義した通りである。）  
で示される化合物と反応させ、次いで得られた化合物を必要により加水分解し、Ｒ１が水素原子、Ｒ４が水素原子、または置換基を有していてもよいフェニル基またはフリル基で示される化合物（１）を製造する。【０１６４】
ここで、式（19）および式（20）中、Ｘで示される脱離基としては、例えばハロゲン原子を挙げることができる。ハロゲン原子として、具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を挙げることができる。好ましくは塩素である。【０１６５】
化合物（18）と化合物（19）または化合物（18）と化合物（20）との反応は当業者には公知の、通常のアシル化反応に準じて行われ、適宜な溶媒中、適宜な塩基の存在下で行うことができる。塩基としてはトリエチルアミン、ピリジンなどの有機塩基を好適に用いることができる。このようにして得られるアミド−エステル体を、必要によりアルカリ加水分解反応に供することにより、Ｒ１が水素である目的化合物（１）（アミド−カルボン酸体）を製造することができる。本アルカリ加水分解反応は当業者には公知の、通常の方法で行うことができ、使用するアルカリとしては水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化バリウムなどが用いられる。【０１６６】
化合物（１）のＰＡＩ−１阻害活性は、インビトロアッセイ系で評価することができる。かかるインビトロアッセイ系としては、たとえば、化合物（１）の存在下で、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）に対するＰＡＩ−１の活性変動を測定する方法を挙げることができる。なお、かかるＰＡＩ−１の活性変動は、基質に対するｔ−ＰＡの作用によって生じる反応生成物を指標とすることによって測定することができる。例えば、後述する実験例１では、発色性基質（S-2288）に対するｔ−ＰＡの作用によって生じるｐ−ニトロアニリド（反応生成物）の量を指標として、ＰＡＩ−１の活性変動を測定するインビトロアッセイ系を例示している。反応生成物の生成量が少ないほど、ＰＡＩ−１阻害活性が高いと判断できる。【０１６７】
また化合物（１）のＰＡＩ−１阻害活性は、化合物（１）の存在下で、ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体（PAI-1/t-PA複合体）の形成変動を、例えばウエスタンブロッティング法などで測定することによっても評価することができる（例えば、実験例２参照）。ここでPAI-1/t-PA複合体の形成量が少ないほど（PAI-1/t-PA複合体形成阻害）、ＰＡＩ−１阻害活性が高いと判断できる。【０１６８】
化合物（１）は、ＰＡＩ−１の活性を阻害する作用を有する。中でも化合物ａ〜ｌ、好ましくは化合物ａ、ｂ、ｄ、ｅおよびｈ、特に好ましくは化合物ａ、ｂ、ｄおよびｈは、後述する実験例で示すように優れたＰＡＩ−１活性阻害作用を有している。当該作用により、プラスミンによるフィブリンの分解およびフィブリノーゲンの分解を高めることができ、生体の線溶系を促進すること、また生体の線溶系低下を改善することが可能である。【０１６９】
また、今回、組織線維化の原因の一つがＰＡＩ−１であることが判明した。従って、化合物（１）によれば、そのＰＡＩ−１の活性を阻害する作用に基づいて、組織線維化ならびに組織線維化に関係する疾患を予防または改善することが可能である。【０１７０】
本発明のＰＡＩ−１阻害剤は、かかる化合物（１）を有効成分とするものである。本発明のＰＡＩ−１阻害剤は、化合物（１）１００％からなるものであってもよいし、またそうでなくてもＰＡＩ−１阻害作用を発揮する有効量の化合物（１）を含有するものであればよい。制限されないが、ＰＡＩ−１阻害剤には、通常、化合物（１）が０．１〜９９重量％、好ましくは１〜８０重量％の範囲で含まれる。【０１７１】
（II）医薬組成物
本発明は、前述するＰＡＩ−１阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。言い換えれば、本発明の医薬組成物は、前述する化合物（１）を有効成分として含有するものである。本発明の医薬組成物は、化合物（１）を有効量含むことによって、ＰＡＩ−１阻害作用を有しており、その結果、プラスミンによるフィブリンの分解およびフィブリノーゲンの分解を高めて、生体の線溶系を促進する作用、または生体の低下した線溶系を改善する作用を有する。【０１７２】
このため、本発明の医薬組成物は線溶系の促進薬として用いることができる。具体的には、本発明の医薬組成物は、ＰＡＩ−１活性が発症に関わっている血栓性の疾患や病態、または線溶系低下を原因とする疾患や病態の予防または治療剤として有用である。かかる疾患または病態として、例えば、狭心症、心筋梗塞、心房細動における心房内血栓、心不全等の虚血性心疾患、脳塞栓症、脳梗塞、一過性脳虚血発作等の虚血性脳血管障害、動脈硬化症、肺塞栓症、外科手術時の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、糖尿病合併症（血管障害、神経障害、網膜症、腎症など）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄等の血栓形成が関与する種々の疾患または病態を挙げることができる。【０１７３】
また本発明の医薬組成物は、化合物（１）を有効量含むことによってＰＡＩ−１阻害作用を有しており、その結果、組織や器官の線維化を予防または改善する作用を有する。このため、本発明の医薬組成物は、ＰＡＩ−１活性に関連して生じる組織または器官の線維化に関係する疾患や病態の予防または治療剤として有用である。かかる疾患または病態として、例えば、肺線維症、心筋梗塞に伴う組織の線維化、腎症に伴う組織の線維化等を挙げることができる。【０１７４】
本発明の医薬組成物は、通常、線溶系の促進（若しくは改善）または抗線維化に有効量の化合物（１）に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。医薬組成物中の化合物（１）の配合量は、対象とする疾患や病態の種類や投与形態に応じて適宜選択されるが、通常、全身投与製剤の場合には、医薬組成物の全体重量（１００重量％）の０.００１〜５０重量％、特に０.０１〜１０重量％とすることができる。【０１７５】
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与および静脈内投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。【０１７６】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【０１７７】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。【０１７８】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択するここができる。また、それらの製剤についても徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【０１７９】
本発明の医薬組成物にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【０１８０】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。【０１８１】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。【０１８２】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。【０１８３】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。【０１８４】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。【０１８５】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。【０１８６】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。【０１８７】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。【０１８８】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。【０１８９】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。【０１９０】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。【０１９１】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。【０１９２】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。【０１９３】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。【０１９４】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。【０１９５】
本発明の医薬組成物を、線溶系の低下（血栓形成）に関連する病態に対する予防薬または治療薬として用いる場合、その経口投与量として、化合物（１）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、より好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。静脈内投与をする場合、化合物（１）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。【０１９６】
また本発明の医薬組成物を、組織線維化に関連する病態に対する予防薬または治療薬として用いる場合、その経口投与量として、化合物（１）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、より好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。静脈内投与をする場合、化合物（１）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。【０１９７】
（III）新規化合物およびその用途
前述するように、一般式（１）で示される化合物の中で、下式（３）で示される化合物およびその塩は、文献未収載の新規化合物である。【０１９８】
【化５５】
2007083689.tif 000057
【０１９９】
〔式中、Ｒ１とＲ１’は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ２とＲ２’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、または炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基；Ｒ３とＲ３’は、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基、またはハロゲン原子；Ａは炭素数１〜７の直鎖または分枝鎖状のアルキレン、または炭素数３〜８のシクロアルキレンを示す。但し、Ｒ２およびＲ２’が置換基を有さないフェニル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンおよび−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−のいずれでもなく、またＲ２およびＲ２’がイソブチル基であり且つＲ３およびＲ３’が水素原子であるとき、Ａはブチレンではない。〕
で示される化合物またはその塩。【０２００】
本発明は、かかる新規化合物を提供するものである。【０２０１】
ここで上記式（３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＡのおのおのの具体的な定義は、前述する化合物（１）に関して説明した通りである。【０２０２】
本発明が対象とする新規化合物（３）として、Ｒ１およびＲ１’が、同一または異なって、水素原子、またはter-ブチル基であるものを挙げることができる。好ましくはＲ１およびＲ１’が水素原子であるものである。また、新規化合物（３）として、Ｒ２およびＲ２’が、同一または異なって、水素原子、置換基としてハロゲン原子を有するかまたは置換を有しないフェニル基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基〔−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２〕であるものを挙げることができる。さらに、新規化合物（３）として、Ｒ３およびＲ３’が、同一または異なって、水素原子、メチル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロゲン原子であるものを挙げることができる。また、Ａとしては、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−、またはシクロヘキシレンを挙げることができる。【０２０３】
新規化合物（３）として、具体的には下記の化合物ｏ〜zzを挙げることができる。かかる化合物の製造方法は、製造例５〜１７にて詳述する。【０２０４】
化合物ｏ
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸【０２０５】
【化５６】
2007083689.tif 000058
【０２０６】
化合物ｐ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０２０７】
【化５７】
2007083689.tif 000059
【０２０８】
化合物ｑ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０２０９】
【化５８】
2007083689.tif 000060
【０２１０】
化合物ｒ
2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０２１１】
【化５９】
2007083689.tif 000061
【０２１２】
化合物ｓ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０２１３】
【化６０】
2007083689.tif 000062
【０２１４】
化合物ｔ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０２１５】
【化６１】
2007083689.tif 000063
【０２１６】
化合物ｕ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸【０２１７】
【化６２】
2007083689.tif 000064
【０２１８】
化合物ｖ
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸【０２１９】
【化６３】
2007083689.tif 000065
【０２２０】
化合物ｗ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０２２１】
【化６４】
2007083689.tif 000066
【０２２２】
化合物ｘ
2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸【０２２３】
【化６５】
2007083689.tif 000067
【０２２４】
化合物ｙ
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸【０２２５】
【化６６】
2007083689.tif 000068
【０２２６】
化合物ｚ
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸【０２２７】
【化６７】
2007083689.tif 000069
【０２２８】
化合物zz
2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸【０２２９】
【化６８】
2007083689.tif 000070
【０２３０】
これらの化合物は、前述するようにＰＡＩ−１阻害作用を有しており、ＰＡＩ−１が発症に関係している疾患や病態、例えば線溶系の低下（血栓形成）に関連する病態または組織線維化に関連する病態に対する予防薬または治療薬（医薬組成物）の有効成分として有用である。これらの化合物（化合物ｏ〜zz）の中でも好ましくは化合物ｏ〜ｘであり、より好ましくは化合物ｓ、ｔ、ｒ、ｑおよびｗであり、さらに好ましくは化合物ｓ、ｔおよびｒである。【０２３１】
ゆえに、本発明は、上記化合物（３）、特に化合物ｏ〜zz（好ましくは化合物ｏ〜ｘ）若しくはその薬学的に許容される塩、またはその溶媒和物を有効成分とする医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、（II）の記載に従って、定法により投与形態に応じて適切な製剤形態に調製することができる。
【実験例】
【０２３２】
以下、本発明を製造例および実験例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に制限されるものではない。
【０２３３】
製造例１
図１に示すスキーム（Step１、Step２、Step３）に従って、下式（21）：
【０２３４】
【化６９】
2007083689.tif 000071
【０２３５】
（式中、Ｒはフェニル基または２−チエニル基である。）
に示される化合物を合成した。
【０２３６】
式中、Ｒがフェニル基である化合物は、2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸であり、以下「化合物ａ」ともいう。一方、Ｒ２およびＲ２’が２−チエニル基である化合物は、2-[3-(3'-カルボキシ-4'-チエニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-チエニルチオフェン-3-カルボン酸であり、以下「化合物ｂ」ともいう。
【０２３７】
（１）Ｓｔｅｐ１：アミド−エステル(3)の合成
10g（54.6mmol）のアジピン酸クロリド無水物（1）114mmolのアミノエステル化合物(2)（Ｒ＝フェニル基、または２−チエニル基）、および11ml（114mmol）のピリジンの混合物を、乾燥ジオキサン70ml中で2.5時間加熱した。反応混合液を暖かいうちに冷水の中に注入し、次いで炭酸カリウム15gを添加してアルカリ化した。沈殿物を濾別し、水で洗浄した。沈殿物を乾燥させた後、ＭｅＯＨ／ＴＨＦ（50:50、400ml）の混合液を用いて再結晶し、16〜21ｇのアミド−エステル(3)〔Ｒ＝フェニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸ジエチルエステル、Ｒ＝２−チエニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-（2−チエニル）チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-（2−チエニル）チオフェン-3-カルボン酸ジエチルエステル〕を得た（収率７０％）。
【０２３８】
（２）Ｓｔｅｐ２：アミド−エステル(3)の加水分解
42.3mmolのアミド−エステル（3）を870mLのＴＨＦに溶解し、これに115mlの水に溶解した0.91mmol水酸化ナトリウム水溶液（4）を添加した。攪拌しながら３.５時間加熱し、次いで終夜室温に放置した。非溶解性の不純物を濾別除去し、次いで混合物を、容量が約250mlになるまでエバポレートした（Ｔbath＝40℃）。残渣の塩(5) 〔Ｒ＝フェニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸ジナトリウム塩、Ｒ＝２−チエニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-（2−チエニル）チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-（2−チエニル）チオフェン-3-カルボン酸ジナトリウム塩〕を濾取し、塩化メチレンとメタノールで洗浄した（収率３０％）。
【０２３９】
（３）Ｓｔｅｐ３：アミド−カルボン酸（6）（化合物a、ｂ)の合成
上記で得られた塩(5)を、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（150ml／200ml）の混合液に溶解し、20％酢酸水溶液により酸性化した。沈殿物を濾取し、水で洗浄した。次いで、得られた酸（6）〔Ｒ＝フェニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（分子量：552.67）（化合物ａ）、Ｒ＝２−チエニル基：2-[3-(3'-カルボキシ-4'-（2−チエニル）チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-（2−チエニル）チオフェン-3-カルボン酸（分子量：560.69）（化合物ｂ）〕を室温下、真空して乾燥した。全収率は、約１５％であった。化合物ａおよびｂのＮＭＲのデータをそれぞれ図２および３に示す。
【０２４０】
製造例２
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(2-チエニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｂ）のジナトリウム塩の製造
【０２４１】
【化７０】
2007083689.tif 000072
【０２４２】
製造例１で合成した化合物ｂを、THF中NaOH水溶液を用いてジナトリウム塩に変換して掲題の化合物を調製した。
m.p. :   258-260℃
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.60-1.80(4H, m), 2.35-2.60(4H, m), 6.76(2H, s), 6.95(1H, dd, J=3.4,3.4Hz), 7.30(1H, dd, J=1.2, 3.4Hz), 7.35(1H, dd, J=1.2, 3.4Hz), 14.1(2H, s)。
【０２４３】
製造例３
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｄ）のジナトリウム塩の製造
【０２４４】
【化７１】
2007083689.tif 000073
【０２４５】
化合物ｄ（Specs社、オランダ）を、THF中NaOH水溶液を用いてジナトリウム塩に変換して掲題の化合物を調製した。
m.p. :  248-251℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.81(12H, d, J=6.8Hz), 1.55-1.70(4H, m), 1.90(2H, septet, J=6.8Hz), 2.24-2.43(4H, m), 2.72(2H, d, J=6.8Hz), 6.26(2H, s)。
【０２４６】
製造例４
2-[4-(3'-カルボキシ-4'-(2-チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- 3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-(2-チエニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｈ）のジナトリウム塩の製造
【０２４７】
【化７２】
2007083689.tif 000074
【０２４８】
化合物ｈ（Specs社、オランダ）を、THF中NaOH水溶液を用いてジナトリウム塩に変換して掲題の化合物を調製した。
m.p. :  245-248℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.14(6H, s), 2.48(4H, s), 6.76(2H, s), 6.95(1H, dd, J=3.4, 5.2Hz), 7.29(1H, dd, J=1.2, 3.4Hz), 7.35(1H, dd, J=1.2, 5.2Hz), 14.1(2H, s)。
【０２４９】
製造例５
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｏ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２５０】
【化７３】
2007083689.tif 000075
【０２５１】
(1)Step 1
7.73g (50mmol) のp-クロロアセトフェノン、4.96g (50mmol) のシアノ酢酸メチル、0.45g (7.5mmol) の酢酸及び 0.19g (2.5mmol) の酢酸アンモニウムを 30ml のトルエン中で3時間脱水加熱還流した。冷却した後、反応混合液を酢酸エチルで希釈して水で洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に60mlのメタノール、1.6 g (50mmol) の硫黄及び4.4g (50mmol)のモルホリンを加えて4時間加熱還流した。その後反応液を冷却後、濾過し濾過液を濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで希釈して水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製して1.1gの2-アミノ-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸メチルエステルを得た（収率7%）。
【０２５２】
(2)Step 2   
0.16ml (1.1mmol)のアジピン酸クロリドおよび0.64g (2.3mmol)の2-アミノ-4-(4’-クロロフェニル)-3-チオフェンカルボン酸メチルエステルの混合物を5mlのDMF中室温で一晩攪拌した。反応混合液を氷水に注入した。沈殿物を濾別し、水およびジエチルエーテルで洗浄し、乾燥することにより0.66gの2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを得た（収率92%）。
【０２５３】
(3)Step 3  
0.61g (0.9mmol)の2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを10mlのTHF溶液に溶解し、次いで2.2mlの1N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて50〜60℃で2.5時間攪拌し、更に室温で15時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣を濾取し水で洗浄した。得られた残渣にTHF-酢酸エチル-水を加えた後、1N 塩酸を加えて酸性化した有機層を分離した後濃縮し得られた残渣を水、酢酸エチルで洗浄し、次いで乾燥することにより、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-4’-(p-クロロフェニル)チオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-(p-クロロフェニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｏ）を得た（収率45%）。
m.p. :   271-273℃ (dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.60-1.80(4H, m), 2.50-2.65(4H, m), 6.89(2H, s), 7.29-7.41(8H, m), 11.2(2H, s)。
【０２５４】
製造例６
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｐ）の製造
後述するStep 1〜2に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２５５】
【化７４】
2007083689.tif 000076
【０２５６】
(1)Step 1   
0.2ml(1.5mmol)のグルタル酸クロリドおよび0.64g (3mol)の2-アミノ-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸メチルエステルの混合物を6mlのDMA中室温で一晩攪拌した。反応混合液に酢酸エチルを加えて抽出後硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮して 0.73gの2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを得た（収率93%）。
【０２５７】
(2)Step 2   
730mg (1.4mmol)の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルをTHFに溶解し、次いで、1N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて50〜60℃で16時間攪拌した。冷却後THFを減圧留去した。残渣を濾取して水及び酢酸エチルで洗浄した。得られた残渣を水に懸濁して1N 塩酸を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた残渣を濾取しジエチルエーテルで洗浄した後乾燥することにより、掲題の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｐ）を得た（収率17%）。
m.p. :  217-218℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.84(12H, d, J=7.4Hz), 1.60-2.10(4H, m), 2.40-2.74(4H, m), 2.60(4H, d, J=7.4Hz), 6.60(2H, s), 11.3(2H, s)。
【０２５８】
製造例７
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｑ）の製造
後述するStep 1〜2に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２５９】
【化７５】
2007083689.tif 000077
【０２６０】
(1)Step 1   
0.46g (2.34mmol)の3,3-ジメチルペンタンジオイル ジクロリド1.0g (4.69mol)および2-アミノ-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸メチルエステルの混合物をDMA溶液中室温で一晩攪拌した。反応混合液を氷水に注入し、炭酸水素ナトリウムを添加してアルカリ化した。次いで酢酸エチルで抽出し硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより1.29g の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを得た（収率92%）。
【０２６１】
(2)Step 2   
1.19g (2.17mmol)の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルをTHFに溶解して、次いで1N 水酸化ナトリウムを添加し50〜60℃で4時間攪拌した。次いで室温で一晩攪拌し、反応混合液を減圧留去して得られた残渣に1N 塩酸を加えて酸性化し攪拌した。これを濾過し、母液を濃縮した。析出した結晶を濾過し乾燥することにより、掲題の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-3,3-ジメチルブチリルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｑ）を得た（収率22%）。
m.p. :  198-201℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.84(12H, d, J=6.6Hz), 1.12(6H, s), 1.70-1.95(2H, m), 2.53-2.64(8H, m), 6.60(1H, s), 11.4(1H, s)。
【０２６２】
製造例８
2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｒ）の合成
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２６３】
【化７６】
2007083689.tif 000078
【０２６４】
(1)Step 1   
10.6g (88.2mmol) のベンゾフェノン、20g (141.6mmol) のシアノ酢酸tert-ブチルエステル、5.3g (88.2mmol) の酢酸及び6.2g (70.8mmol)のモルホリンを50mlのトルエン中で12.5時間脱水加熱還流した。冷却した後、反応液を水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に100mlのDMF、2.8g (88.2mmol) の硫黄及び7.7g (88.2mmol)のモルホリンを加えて一晩攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを加えた後、水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、次いでヘキサンで再結晶して、14.7gの2-アミノ-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルを得た（収率60.5%）。
【０２６５】
(2)Step 2   
0.36g,（1.82mmol）のピメロイルクロリドおよび1.0g (3.63mmol)の2-アミノ-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルの混合物をDMF溶液中室温で一晩攪拌した。反応液を氷水中に注入し、炭酸水素ナトリウムを添加してアルカリ化した。沈殿物を濾別し、水、酢酸エチル-IPE混合液で洗浄し、乾燥して、0.68gの2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た（収率55%）。
【０２６６】
(3)Step 3  
0.66g (0.98mmol)の2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルおよびTFAを塩化メチレン溶媒中室温で一晩攪拌した。反応溶液を濃縮した後、残渣を濾取し、酢酸エチル-IPEで洗浄、乾燥することにより、掲題の2-[6-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ヘキサノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｒ）を得た（収率85%）。
m.p. :  204-206℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.24-1.46(2H, m), 1.68(4H, q, J=7.6Hz), 2.75(4H, t, J=7.6Hz), 6.84(1H, s), 7.23-7.40(10H, m), 11.3(2H,s), 12.9(2H, br)。
【０２６７】
製造例９
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｓ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２６８】
【化７７】
2007083689.tif 000079
【０２６９】
(1)Step 1   
10g (74.5mmol) のプロピオフェノン、14.9g (105.5mmol) のシアノ酢酸tert-ブチルエステル、4.51g (74.5mmol) の酢酸及び5.19g (59.5mmol)のモルホリンを100mlのトルエン中で3.5時間脱水加熱還流した。冷却した後、反応液を水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に100mlのDMF、2.4g (74.5mmol) の硫黄及び6.5g (74.5mmol)のモルホリンを加えて一晩攪拌した後、反応液に酢酸エチルを加えて水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより8.38gの2-アミノ-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルを得た（収率39%）。
【０２７０】
(2)Step 2   
0.32g (1.7mmol) のアジピン酸クロリドおよび1.0g (3.6mmol)の2-アミノ-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルの混合物を5mlのDMA中室温で2時間攪拌した。反応混合液を氷水中に注入し、次いで炭酸水素ナトリウムを添加してアルカリ化した。沈殿物を濾別し、水及びIPEで洗浄し乾燥して1.2gの2-[5-(3’-カルボキシ-5’メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た（収率87%）
(3)Step 3   
0.97g (1.4mmol) の2-[5-(3’-カルボキシ-5’メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルおよび2mlのTFAを3mlの塩化メチレン中室温で一晩攪拌した。反応混合液を濃縮した後、残渣を濾取し、酢酸エチル-IPEで洗浄し乾燥することにより、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-5’メチル-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチル-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｓ）を得た（収率98%）。
m.p. :  250-252℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.59-1.80(4H, m), 2.07(3H, s), 2.55-2.63(4H, m), 7.14-7.40(10H, m), 11.3(2H, s), 12.6(2H, br)。
【０２７１】
製造例１０
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｔ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２７２】
【化７８】
2007083689.tif 000080
【０２７３】
(1)Step 1
10.6.g (88.2mmol) のフェニルアルデヒド、20g (141.1mmol) のシアノ酢酸tert-ブチルエステル、5.3g (88.2mmol) の酢酸及び6.2g (70.6mmol)のモルホリンを50mlのトルエン中で6.5時間脱水加熱還流した。冷却した後、反応液を水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を100mlのDMF、2.83g (88.2mmol)の硫黄及び7.68g (88.2mmol)のモルホリンを加えて一晩攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを加えた後、水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより2.69gの2-アミノ-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルを得た（収率11.1%）。
【０２７４】
(2)Step 2   
0.42g (2.3mmol) のアジピン酸クロリドおよび1.0g (3.6mmol)の2-アミノ-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 tert-ブチルエステルの混合物を10mlのDMA中室温で一晩攪拌した。反応混合液を酢酸エチルで希釈して炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水および水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより0.37g の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た（収率31%）。
【０２７５】
(3)Step 3
0.37g (0.56mmol) の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルおよび2mlのTFAを3mlの塩化メチレン中氷冷下で2時間、次いで室温で1時間攪拌した。反応混合液を濃縮した後、残渣を濾取し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥した。次いでTHF/ヘキサンの混合液を用いて再結晶することにより、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｔ）を得た（収率52%）。
m.p. :  289-291℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.61-1.80(4H, m), 2.57-2.71(4H, m), 7.20-7.69(10H, m), 7.51(2H, s), 11.1(2H, s), 13.3(2H, br)。
【０２７６】
製造例１１
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｕ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２７７】
【化７９】
2007083689.tif 000081
【０２７８】
(1)Step 1   
2.2ml (15.4mmol)のアジピン酸クロリドおよび5.3g (33.9mmol)の2-アミノチオフェン-3-カルボン酸メチルエステルの混合物を30mlのDMA中室温で1.5時間攪拌し、次いで50〜60℃で1時間攪拌した。反応混合液を氷水中に加えた後、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてアルカリ性とした。析出した沈殿物を濾取して水及び酢酸エチルで洗浄、乾燥することにより6.5gの2-[5-(3’-カルボキシチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-チオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを得た(収率99%)。
【０２７９】
(2)Step 2  
0.85g (2mmol)の2-[5-(3’-カルボキシチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-チオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルのエタノール溶液に1N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて室温で0.5時間攪拌の後、50〜60℃で3時間攪拌した。冷却後エタノールを減圧留去した。得られた残渣に水を加えて酢酸エチルで洗浄後、水層に1N 塩酸水溶液を加えると沈殿物を得た。得られた沈殿物を濾取して水で洗浄後乾燥し0.73gの2-[5-(3’-カルボキシチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-チオフェン-3-カルボン酸を得た（収率91%）。 
【０２８０】
(3)Step 3   
0.5g (1.26mmol)の2-[5-(3’-カルボキシチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-チオフェン-3-カルボン酸及び0.34g (2.52mmol)のNCSをTHF/DMFの混合液中室温で一晩攪拌した。反応混合液を氷水に注入した後沈殿物を濾取し、メタノール及び酢酸エチルで洗浄、乾燥した後THF/ヘキサンの混合液で再結晶し、2-[5-(3’-カルボキシ-5’-クロロチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-クロロチオフェン-3-カルボン酸を得た（収率53%）。
m.p. :  282-284℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.46-1.78(4H, m), 2.50-2.72(4H, m), 7.12(2H, s), 11.0(2H, s), 11.3(2H, br)。
【０２８１】
製造例１２
2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｖ）の製造
後述するStep 1〜2に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２８２】
【化８０】
2007083689.tif 000082
【０２８３】
(1)Step 1  
0.52g(3.0mmol)の1,4-シクロヘキサンジカルボン酸（cis, trans混合物）および2.2ml(30mmol)の塩化チオニルの混合液を室温で一晩攪拌した後、濃縮した。得られた残渣と1.49g(5.4mmol)の2-アミノ-5-フェニルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルをDMA中室温で4時間攪拌した。反応混合液を氷水中に注入し、炭酸水素ナトリウムを添加してアルカリ化した。沈殿物を濾取し、水、ジエチルエーテルで洗浄、乾燥し、0.97gの2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た（収率52%）。
【０２８４】
(2)Step 2  
0.41g (0.6mmol)の2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルおよび1mlのTFAを3mlの塩化メチレン中室温で5時間攪拌した。反応混合液を濃縮し、得られた残渣を濾取し、IPEで洗浄し、乾燥した。次いでTHF/ヘキサンの混合液を用いて再結晶し、2-[4-(3’-カルボキシ-4’-フェニルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸を得た（収率73%）。
m.p. :  >290℃
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.34-2.10(8H, m), 2.51-2.68(2H, m), 6.69(2H, s), 7.22-7.40(10H, m), 13.3(2H, br)。
【０２８５】
製造例１３
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｗ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２８６】
【化８１】
2007083689.tif 000083
【０２８７】
(1)Step 1   
54ml (430mmol)  の4-メチル-2-ペンタノン、25ml (285mol) のシアノ酢酸メチルエステル、3.5ml (61mmol)の酢酸及び1.5g (19mmol) の酢酸アンモニウムを90mlのトルエン中で2.5時間脱水加熱還流した。冷却後、反応混合液を酢酸エチルで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液、NaCl水溶液で洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に、80mlのメタノール、8.8g (276mmol)の硫黄及び7.4ml（85mmol）モルホリンを加えて6時間加熱還流した。反応液を冷却後、濾過し濾液を濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで希釈して水及びNaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、2-アミノ-5-イソプロピル-4-メチルチオフェン-3-カルボン酸メチルエステル及び2-アミノ-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸メチルエステルの混合物を得た。
【０２８８】
(2)Step 2 
4.27gの上記混合物と0.7ml (5mmol) のアジピン酸クロリドを20mlのDMA中室温で15時間攪拌した。反応混合液を氷水に注入し、次いで炭酸水素ナトリウムを添加して中和した。得られた混合液に酢酸エチルを加えて抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、ジエチルエーテル / ヘキサンで結晶を析出させ濾別した。得られた濾液を濃縮し、ジエチルエーテルで結晶化することで0.81gの2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルを得た。
【０２８９】
(3)Step 3
0.3g (0.56mmol)の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸ジメチルエステルをエタノールに溶解し、次いで2mlの1N 水酸化ナトリウムを加えて60〜65℃で3時間加熱した。反応混合物を濃縮した後、残渣に氷水を加えて酢酸エチルで洗浄した。次いで、水層に氷冷下で1N 塩酸を加えて減圧濃縮後，残渣にEt2Oを加えて析出した結晶を濾取し、Et2Oおよび水で洗浄することにより、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-イソプロピル-4’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｗ）を得た（収率 47%）。
m.p. :  190-192℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.84(6H, d, J=6.6Hz), 1.20(6H, d, J=6.8Hz), 1.15-1.70(1H, m), 1.70-1.90(1H, m), 2.22(3H, s), 2.40-2.60(6H, m), 3.25(1H, septet, J=6.6Hz), 6.59(1H, s), 11.2(1H,s), 11.3(1H, s)。
【０２９０】
製造例１４
2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｘ）の製造
後述するStep 1〜2に従って、下式に示す、掲題の化合物ｘを合成した。
【０２９１】
【化８２】
2007083689.tif 000084
【０２９２】
(1)Step 1
0.17ml(1.5mmol)のこはく酸クロリドおよび640mg (3mol)の2-アミノ-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸メチルエステルの混合物を6mlのDMA中室温で18時間攪拌した。反応混合液を氷水に注入し、炭酸水素ナトリウムを添加してアルカリ化した。沈殿物を濾別し、水、IPEで洗浄した後乾燥して、646mgの2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸 ジメチルエステルを得た（収率84%）。
【０２９３】
(2)Step 2
610mg (1.2mmol)の2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸 ジメチルエステルをTHFに溶解し、次いで、1N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて50〜60℃で6時間攪拌した。冷却後THFを減圧留去した。残渣を濾取して水及び酢酸エチルで洗浄した。得られた残渣を水に懸濁して1N 塩酸を加えて酢酸エチル-THFで抽出し、有機層をNaCl水溶液で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた残渣を濾取しエタノールで再結晶することにより、掲題の2-[3-(3’-カルボキシ-4’-イソブチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-プロパノイルアミノ]-4-イソブチルチオフェン-3-カルボン酸を得た（収率26%）。
m.p. : 278-280 ℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.84(12H, d, J=6.6Hz), 1.81(2H, septet, J=6.8Hz), 2.61(4H, d, J=6.8Hz), 2.86(4H, s), 6.60(2H, s), 11.3(2H,br)。
【０２９４】
製造例１５
2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸（化合物ｙ）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物を合成した。
【０２９５】
【化８３】
2007083689.tif 000085
【０２９６】
(1)Step 1   
15.2g (176mmol)  の3-メチル-2-ブタノン、24.9g (176mmol) のシアノ酢酸tert-ブチルエステル、5.7g (176mmol)の硫黄及び15.4g（176mmol）モルホリンの混合物を75mlのDMFに加えてアルゴン雰囲気下室温で15時間攪拌した。その後反応液を70〜80℃で8時間攪拌した．反応混合液をNaCl水溶液中に注入し，酢酸エチルで抽出した．次いで有機層を水で洗浄し，溶媒を減圧留去した．得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し18.3g の2-アミノ-4-イソプロピルチオフェン-3-カルボン酸 tert-ブチルエステルを得た（収率43%）。
【０２９７】
(2)Step 2 
1.1ml (7.5mmol) のアジピン酸クロリドおよび3.63g (15mmol)の2-アミノ-4-イソプロピルチオフェン-3-カルボン酸 tert-ブチルエステルの混合物を20mlのDMA中室温で15時間攪拌した。反応混合液を氷水に注入した。得られた沈殿物を濾取し、水、ヘキサンで洗浄して4.19gの2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た(収率93%)。
【０２９８】
(3)Step 3
1.2g (2mmol)の2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルをクロロホルムに溶解し、次いで2mlのTFAを加えて室温で16時間攪拌した。反応混合物を濃縮した後、残渣に水を加えて沈殿物を濾取し、水およびEt2Oで洗浄することにより、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-4’-イソプロピルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-4-イソプロピルオフェン-3-カルボン酸（化合物ｘ）を得た（収率 75%）。
m.p. : 247-249℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.17(12H, d, J=6.8Hz), 1.66(4H, m), 2.50-2.60(4H, m), 3.50(2H, septet, J=6.8Hz), 6.68(2H, s), 11.4(2H, s)。
【０２９９】
製造例１６および１７
2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｚ）、および2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物zz）の製造
後述するStep 1〜3に従って、下式に示す、掲題の化合物ｚを合成し、次いでStep 4により、掲題の化合物zzを合成した。
【０３００】
【化８４】
2007083689.tif 000086
【０３０１】
(1)Step 1
5.8g (99.9mmol)  のプロピオンアルデヒド、14.1g (176mmol) のシアノ酢酸tert-ブチルエステル、59mg(0.68mmol) のモルホリン、41mg (0.68mmol) の酢酸およびモレキュラシーブ4Aの混合溶液をトルエン中で3日間攪拌した。その後、反応溶液をろ過し、水で洗浄後に硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣と3.2g (99.9mmol)の硫黄及び8.7g（99.9mmol）モルホリンの混合物を100mlのDMFに加えて一晩攪拌した。反応混合液を水に注入し，酢酸エチルで抽出した．次いで有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し，溶媒を減圧留去した．得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製して4.93g の2-アミノ-4-メチルチオフェン-3-カルボン酸tert-ブチルエステルを得た（収率23%）。
【０３０２】
(2)Step 2 
0.47g (2.58mmol) のアジピン酸クロリドおよび1.0g (4.69mmol)の2-アミノ-4-メチルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルの混合物を10mlのDMA中室温で3時間攪拌した。反応混合液を氷水に注入し、次いで炭酸水素ナトリウムを加えてアルカリ化した。得られた沈殿物を濾取し、酢酸エチル/THF/ヘキサンで再結晶して0.96gの2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルを得た(収率77%)。
【０３０３】
(3)Step 3
0.96g (1.8mmol)の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸 ジ-tert-ブチルエステルの塩化メチレンに溶解し、次いで2mlのTFAを加えて室温で3時間攪拌した。反応混合物を濃縮した後、残渣にヘキサンを加えて濾過し、IPE、酢酸エチルで洗浄した。次いでTHF/ヘキサンで再結晶し、掲題の2-[5-(3’-カルボキシ-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物ｚ）を得た（収率 75%）。
m.p. : 260-262℃(dec.)
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.59-1.75(4H, m), 2.32(6H, d, J=1.2Hz), 2.50-2.61(4H, m), 6.82(2H, d, J=1.2Hz), 10.9(2H, s), 13.0(2H, br)。
【０３０４】
(4)Step 4
次いで、上記濾液および洗浄液を全て合わせて減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製することにより、掲題の2-[5-(3’-tert-ブトキシカルボニル-5’-メチルチオフェン-2’-イルカルバモイル)-ペンタノイルアミノ]-5-メチルチオフェン-3-カルボン酸（化合物zz）を得た（収率16%）。
m.p. : 175-177 ℃
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.54(9H, s), 1.60-1.71(4H, m), 2.30-2.33(6H, m), 2.49-2.63(4H, m), 6.78(1H, d, J=1.3Hz), 6.82(1H, d, J=1.3Hz), 10.7(1H, s), 11.4(1H, br)。
【０３０５】
実験例１    化合物ａおよびｂのＰＡＩ−１阻害活性の測定
ヒトＰＡＩ−１（Molecular Innovations Inc.製 (米国)、以下同じ）に対する化合物ａおよびｂ（被験化合物）の阻害作用を評価した。具体的には、上記各被験化合物を各種の濃度（20、35、50および100μＭ）で含む、0.1％  Tween80含有100mM  Tris-HCl（pH8）溶液にヒト由来のＰＡＩ−１を入れて、37℃で15分間インキュベートした。次いでこれに0.53 pmol/μLに調整したヒト由来組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）（American Diagnostica, Inc. 製(米国)、以下同じ）を入れて、引き続き37℃で15分間インキュベートした。続いて、これに発色性基質である1.25mMのS-2288合成基質（Chromogenix社製（イタリア）、以下同じ）を添加した。最終混合液は、100mM Tris-HCl（pH8）、30mM NaCl、１％ DMSO、0.1％ Tween80、67nM PAI-1、9.8nM t-PA、1mM S-2288および各被験化合物ａまたはｂ（20、35、50または100μＭ）を含んでいる。
【０３０６】
ｔ−ＰＡの作用によって発色性基質（S-2288）から切断されて遊離したＰ−ニトロアニリドを、分光光度計を用いて吸光度405nmで5分毎、30分間測定した。被験化合物を配合しない系についても同様に試験し、この系（コントロール系）の30分後のＰＡＩ−１活性を100％として、各被験化合物を添加した場合のＰＡＩ−１活性を評価した。
【０３０７】
比較試験として、上記被験化合物に代えて抗血栓薬として米国で臨床試験に導入されている下式の化合物（tiplaxtinin）（但し、濃度20、35、50μＭ）についても同様に試験を行った。
【０３０８】
【化８５】
2007083689.tif 000087
【０３０９】
結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図４（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ化合物ａ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸〕（濃度20、35、50、100μＭ）、化合物ｂ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-チエニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-チエニルチオフェン-3-カルボン酸〕（濃度20、35、50、100μＭ）、およびtiplaxtinin（比較化合物）（濃度20、35、50μＭ）を添加した場合のＰＡＩ−１活性（％）を示す。この結果、35μＭおよび50μＭの濃度において、化合物ａおよびｂのほうが、tiplaxtinin（比較化合物）よりも強く、ＰＡＩ−１活性を抑制することがわかった（ＰＡＩ−１阻害活性）。
【０３１０】
実験例２    ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体形成阻害作用
各被験化合物（化合物ａおよびｂ）について、ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体（PAI-1/t-PA複合体）形成阻害活性をウエスタンブロッティング法により試験した。
【０３１１】
具体的には、6.7pmol／μLに調整したＰＡＩ−１溶液と、各被験化合物をモル比で1500倍となるように、0.1％  Tween80を含む20mM Tris-HCl（pH7.8）中で混合して37℃で15分間インキュベーションした。反応液を10000カットフィルター（ミリポア）を用いて被験化合物を除去した後、1.4pmol／μLに調整したｔ−ＰＡを添加して37℃で15分間反応させた。
【０３１２】
これをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、ウエスタンブロッティングを行った。具体的には、反応溶液をＰＢＳでタンパク量が0.3μｇ／レーンとなるように調製し、loading buffer（第一化学薬品製）と混合し、100℃で5分間加熱したものをサンプル溶液とした。当該サンプル溶液を電気泳動装置（第一化学薬品製）およびトリス−グリシン緩衝液（第一化学薬品製）を用いて4〜20％ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製）で電気泳動を行った。電気泳動終了後、ウエスタンブロッティングを行った。具体的には、電気泳動したタンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜（PVDF膜、Biorad製）に転写（100Vで１時間）し、その後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（雪印乳業）で室温２時間振とうしてブロッキングした。その後、1000倍希釈したｔ−ＰＡ抗体（Cedarlane Laboratories Ltd.製 (カナダ)）と４℃で一晩反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識ヒツジＩｇＧ抗体を加え、室温で１時間反応後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液で発色させた。
【０３１３】
結果を図５に示す。図５中、レーン１はｔ−ＰＡの電気泳動像、レーン２および３は被験化合物としてそれぞれ化合物ａおよびｂを用いた場合のサンプル溶液の電気泳動像、レーン４は被験化合物（化合物ａ、ｂ）を使用しないでＰＡＩ−１とｔ−ＰＡを反応させたサンプル溶液の電気泳動像をそれぞれ示す。
【０３１４】
この結果からわかるように、化合物ａ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸〕および化合物ｂ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2-チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸〕は、ともにＰＡＩ−１とｔ−ＰＡとの複合体の形成を阻害した。
【０３１５】
実験例３    線維素溶解作用の評価
各被験化合物（化合物ａおよびｂ）の線維素溶解作用を、松尾らの文献（Matsuo, O. et al., Haemostasis 16, 43-50 (1986)）に従って評価した。
【０３１６】
具体的には、0.2mlの生理食塩水に溶解したトロンビン（10NIH U/ml：持田製薬製）を、9cmプレート上で、1.5 mg／mlの割合でフィブリノーゲン（Organon Teknica社製）を含む水溶液（25mM  バルビタールナトリウム、50 mM  NaCl、および25 mM  CaCl２含有）を加え、室温で２時間放置した。これを用いて、線維素溶解アッセイを行った。
【０３１７】
すなわち、上記プレートの上に、ＰＡＩ−１、ｔ−ＰＡおよび各被験化合物の混合物を滴下し、室温で18時間インキュベートし、プラスミノーゲン活性化による線維素溶解を、プレート上の溶解面積で測定した。なお、ＰＡＩ−１、ｔ−ＰＡおよび各被験化合物の混合物として、実施例２と同様に反応させた後、ｔＰＡが50 NIH／mLになるように調整したものを用いた。結果を図６に示す。
【０３１８】
その結果、化合物ａ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸〕および化合物ｂ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2−チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸〕は、ともに、ＰＡＩ−１による線維素溶解の抑制を阻害することがわかった。
【０３１９】
実験例４    アンチプラスミン（ＡＰ）活性に対する被験化合物の阻害作用の検討
アンチプラスミン（ＡＰ）活性に対する各被験化合物の阻害作用を評価した。
【０３２０】
具体的には、0.2 pmol／μLに調整したＡＰ（Sigma-Aldrich Co.製）に各被験化合物をモル比で6000〜60000倍に相当する過剰量添加し、0.1％ Tween80を含む20 mM Tris-HCl（pH7.8）中で37℃、15分間インキュベーションした。その後、0.2 pmol／μLに調整したプラスミンと37℃で15分間反応させた。つづいて、1.25 mM プラスミン合成基質（ペプチド研究所、日本）を添加し、プラスミンの切断作用によって上記基質から遊離するＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を蛍光波長380nm、励起波長460nmで5分毎、30分間測定した。対照試験として、上記被験化合物を配合しない系についても同様に試験を行い、この反応30分後のＡＰ活性を100％として、各被験化合物のＡＰ阻害作用を評価した。
【０３２１】
化合物ａ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸〕に関する結果を図７（Ａ）に、化合物ｂ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2−チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸〕に関する結果を図７（Ｂ）に示す。この結果、化合物ａおよびｂは、いずれもＡＰ活性を阻害しなかった。この結果から、化合物ａおよびｂは、ＰＡＩ−１活性とは異なるセリンプロテーゼには作用せず、ＰＡＩ−１活性に対して特異的に作用することが確認できた。
【０３２２】
実験例５    プラスミンとアンチプラスミンの複合体形成阻害の検討
アンチプラスミン（ＡＰ）活性に対する化合物ｂの阻害作用を評価した。
【０３２３】
具体的には、7.5 pmol／μLに調整したＡＰ溶液と1 mMの〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2−チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｂ）をモル比で3,000倍または15,000倍となるように添加し、0.1％ Tween80を含む20 mM Tris−HCl（pH7.8）中で37℃、15分間インキュベーションした。同様に6.7 pmol／μLに調整したＰＡＩ−１溶液と１mMの化合物ｂをモル比で3,000倍または15,000倍になるように混合した。反応液から10,000カットフィルター（ミリポア）を用いて化合物ｂを除去した後、12.6pmol／μLに調整したプラスミンを添加して37℃で15分間反応させた。
【０３２４】
反応溶液をloading buffer（第一化学薬品製）と混合し、100℃で５分間加熱したものをサンプル溶液とした。当該サンプル溶液を電気泳動装置（第一化学薬品製）およびトリス−グリシン緩衝液（第一化学薬品製）を用いて4〜20％ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製）で電気泳動した。電気泳動終了後、通常の染色法（クーマシー・ブリリアント・ブルー）でバンドを検出した。結果を図８に示す。図８中、レーン１〜３はそれぞれプラスミン（Plasmin）、アンチプラスミン（AP）、およびＰＡＩ−１の電気泳動像、レーン４は化合物ｂを使用しないでプラスミンとアンチプラスミンを反応させたサンプル溶液の電気泳動像、レーン５および６は化合物ｂをそれぞれ3,000倍および15,000倍のモル比で使用してプラスミンとアンチプラスミンを反応させたサンプル溶液の電気泳動像、レーン７は化合物ｂを使用しないでプラスミンとＰＡＩ−１を反応させたサンプル溶液の電気泳動像、レーン８および９は化合物ｂをそれぞれ3,000倍および15,000倍のモル比で使用してプラスミンとＰＡＩ−１を反応させたサンプル溶液の電気泳動像を、それぞれ示す。
【０３２５】
図８に示すように、2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2−チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸（化合物ｂ）は、モル比3,000倍でプラスミンとＰＡＩ−１との複合体形成を阻害した。一方、プラスミンとＡＰとの複合体形成に対してはモル比3,000倍および15,000倍では阻害しなかった。
【０３２６】
実験例６
（１）上記化合物ａ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-フェニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-フェニルチオフェン-3-カルボン酸〕および化合物ｂ〔2-[3-(3'-カルボキシ-4'-(2−チエニル)チオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-(2−チエニル)チオフェン-3-カルボン酸〕、ならび表１に示す化合物ｃ〜ｌについて、実験例１に記載する方法に従って、ヒトＰＡＩ−１に対する阻害活性を調べた。被験化合物を配合しない系についても同様に試験し、この系の30分後のＰＡＩ−１活性を100％として、各被験化合物（化合物ｃ〜l、濃度20、35、および50μＭ）を添加した場合のＰＡＩ−１活性を評価した。
【０３２７】
なお、これらの化合物ａ〜ｌは、Ambinter社(46 quai Louis Bleriot  Paris，F-75016  France：httP://www.ambinter.com.）やInterchim社（213 Avenue Kennedy BP 1140 Montlucon, Cedex, 03103 France: http://WWW.interchim.com.）、Enamine社（I.Kudri str.41 Apt. 29 Kiev 042, 01042 Ukraine: http://www.enamie.relc.com)、SPEC and  BioSPECS社（Fleminglaan l6 CP Rijswijk，2289 Netherlands: http://www.specs.net）の化合物ライブラリーから入手した。
【０３２８】
結果を表１に合わせて示す。
【０３２９】
【表１】
2007083689.tif 000088
【０３３０】
2007083689.tif 000089
【０３３１】
この結果から、化合物ａ〜ｌはいずれもＰＡＩ−１活性に対して阻害作用を有していることがわかる。中でも化合物ａ、ｂ、ｄおよびｅ、特に化合物ｄは優れた阻害活性を有している。
（２）調製例５〜１４で調製した化合物ｏ〜ｘについても、実験例１に記載する方法に従って、ヒトＰＡＩ−１に対する阻害活性を調べた。上記と同様に、被験化合物を配合しない系の30分後のＰＡＩ−１活性を100％として、各化合物ｏ〜ｘ（濃度40、50および100μＭ）を添加した場合のＰＡＩ−１活性を評価した。
【０３３２】
結果を表２に示す。
【０３３３】
【表２】
2007083689.tif 000090
【０３３４】
2007083689.tif 000091
【０３３５】
この結果から、化合物ｏ〜ｘはいずれもＰＡＩ−１活性に対して阻害作用を有していることがわかる。中でも化合物ｓ、ｔ、ｖ、ｒ、ｑおよびｗ、特に化合物ｓ、ｔ、ｖおよびｒは高い阻害活性を有している。
【０３３６】
実験例７    ブレオマイシン誘導肺線維症に対する効果の評価
本発明の化合物（１）の、生体内での抗線維作用を評価するため、ブレオマイシンで人為的に肺線維症を誘導したモデル動物（マウス）を用いて以下の実験を行った。
【０３３７】
まず、C57BL/6マウス（雄、体重19-21ｇ）にペントバルビタールを腹腔内投与して麻酔をかけ、頸部の器官を切開した。コントロールに10匹のマウスを使用した。コントロール用のマウス（n=10）には、14日間に亘って、１日に２回、生理食塩水に溶解したブレオマイシン（日本化薬製）（1.5U/kg）を気管内投与した。一方、被験対象マウスには、14日間に亘って、１日に２回、上記の気管内投与に加えて、0.5％のカルボキシメチルセルロース水溶液に懸濁させた化合物ｂ（2-[3-(3'-カルボキシ-4'-チエニルチオフェン-2'-イルカルバモイル)- ペンタノイルアミノ]-4-チエニルチオフェン-3-カルボン酸）（200 mg/kg）を強制経口投与した。次いで、これらのコントロールマウスおよび被験マウスの肺組織を組織分析にかけ、またヒドロキシプロリン量を測定した。なお、肺組織のヒドロキシプロリン量は、Kivirikkoらの方法（Anal. Biochem.19,249-255 (1967)）に従って、肺組織の加水分解物中の量として測定した。肺線維症のレベル（重篤度）は、Ashcortらの方法（J.Clin.Pathol.41,467-470、(1988)）を用いて０〜８にスコアした。また、これらのコントロールマウスと被験対象マウスについて、血漿のＰＡＩ−１活性（ng/ml）を測定した。肺組織の組織分析の結果を図９（ａは線維症スコア、ｂは組織染色画像）に、肺組織中のヒドロキシプロリン量および血漿ＰＡＩ−１活性を表３に示す。
【０３３８】
【表３】
2007083689.tif 000092
【０３３９】
この結果から、ブレオマイシン投与によって著しく増加した肺組織中のヒドロキシプロリンの量が、化合物ｂの投与によって有意に減少することがわかる。また、ブレオマイシン投与によって血漿ＰＡＩ−１活性が顕著に増加すること、そしてこの血漿ＰＡＩ−１活性の増加も化合物ｂの投与によって有意に減少することがわかった。
【０３４０】
また図９からわかるように、ブレオマイシン投与によって誘導された肺線維症（線維症スコア：4.7±0.17、コントロール群：0.5±0.17、P<0.001）は、化合物ｂの投与によって有意に改善され（線維症スコア：2.9±0.42、P<0.01）、上記ＰＡＩ−１活性の結果と一致した。
【０３４１】
これらの結果は、化合物ｂを始めとするＰＡＩ−１阻害作用を有する本発明の化合物（１）が、線溶系促進作用に加えて、肺線維化のプロセスを防止する作用を有することを示している。既に、Eitzmanらによって、ＰＡＩ−１遺伝子を過剰発現するか、または欠損させたマウスの肺組織では、ＰＡＩ−１発現とコラーゲン蓄積との間に強い関係が認められることが報告されている（J.Chin.Invest.97,232-237（1996））。強いＰＡＩ−１阻害活性を有する化合物ｂが、肺線維症を改善することを示す上記の結果は、ＰＡＩ−１が肺線維症の単なる指標ではなく、その主な要因であることを示唆している。線維化は、肺だけでなく、心臓、血管、肝臓、および腎臓を含む多くの組織や器官で生じるため、この知見は極めて重要である。すなわち、ＰＡＩ−１活性を阻害することによって、繊維症に関連した各種の疾患（心疾患、肝硬変、腎臓病または放射線障害）を予防または治療することが可能と考えられる。
【０３４２】
実験例８
血栓モデル動物に対する2‐[3‐(3’‐カルボキシ‐4’‐チエニルチオフェン‐2’‐イルカルバモイル)‐ペンタノイルアミノ]‐4‐チエニルチオフェン‐3‐カルボン酸（化合物ａ）の抗血栓作用
本発明の化合物の抗血栓に対する有効性を確認するため、血栓モデル動物であるラットＡＶシャントモデルを用いて、2‐[3‐(3’‐カルボキシ‐4’‐チエニルチオフェン‐2’‐イルカルバモイル)‐ペンタノイルアミノ]‐4‐チエニルチオフェン‐3‐カルボン酸（化合物ａ）の抗血栓作用を調べた。また、これに加えて血液凝固検査も並行して行った。
【０３４３】
なお、ここでＡＶシャントモデル試験は、公知文献（R.F.Peters,et al.,Thromb Haemost 1991;65, 268-274：Yoshiyuki Morishima, et al., Thromb Haemost 1997;78, 1366-1371：Atsuhiro Sugidachi, et al., British Journal of Phermacology 2000;129, 1349-1446)に従って行った。
【０３４４】
（１）試験化合物および投与液の調製
試験化合物として、本発明の化合物ａに加えて、比較化合物（陽性対照化合物）として、ワーファリン（和光純薬工業（株）製）とチクロピジン塩酸塩（Sigma-Aldrich Co.製）を用いた。
【０３４５】
これらの試験化合物は、カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク株式会社製）（以下、「CMC-Na」という）0.5ｇを注射用水（大塚製薬（株）製）100mLに溶解した溶媒（0.5％ CMC-Na溶液）に懸濁して、投与液とした。具体的には、化合物ａは、0.5％ CMC-Na溶液に75mg/mL濃度となるように懸濁させ、チクロピジン塩酸塩は0.5％ CMC-Na溶液に142.3mg/mL濃度となるように懸濁させ、また、ワーファリンは0.5％ CMC-Na溶液に0.3mg/mL濃度となるように懸濁させて、投与液を調製した。
【０３４６】
（２）試験動物
ＡＶシャントモデル試験に使用する動物としては、馴化飼育において体重増加量が平均値±３ＳＤの正常範囲内にある８週令の体重270〜300ｇのＣＤ(ＳＤ)系ラット（日本チャールス・リバー株式会社製）を用いた。これらのラット（合計28匹）は、溶媒投与群（１群：ｎ＝７）、化合物ａ投与群の（２群：ｎ＝７）、チクロピジン塩酸塩投与群（３群：ｎ＝７）、及びワーファリン投与群（４群：ｎ＝７）の４つの群に群分けした。
【０３４７】
（３）試験方法
(3-1) ＡＶシャントモデル試験
各試験化合物は、試験動物における各化合物の体内動態を考慮し、ＡＶシャント手術を実施する時間に最大血中濃度に達するように、試験動物に投与した。具体的には、試験化合物ａは麻酔・シャント手術の17.5時間前に300mg/kg、ワーファリンは23.5時間前に1.2mg/kg、チクロピジン塩酸塩は1.5時間前に500mg/kgの割合でそれぞれ投与した。ＡＶシャントモデルの施術は、各試験化合物の体内動態を考慮し、最大血中濃度に達する時点で行った。
【０３４８】
ＡＶシャントモデルの作成手術は下記の方法に従って行った。
【０３４９】
まず、8cmの7号ポリエチレン製チューブ（ヒビキ社製）内に6.5cm絹糸（松田医科1-0号）を通し、その両端に5号チューブ（1.5cm）を介して3号チューブ（12.5cm）を接続し、シャント用カテーテルを作成した。絹糸を通した接続部には、血液が漏れないようパラフィルムを巻いた。
【０３５０】
ラットを、ペントバルビタール（大日本住友製薬（株）製）を50mg/kgの割合で腹腔内に投与して麻酔し、上記カテーテル内に生理食塩液を満たし、カテーテルの両端を各々右頸動脈及び左頸静脈に挿入して、血液を灌流した。灌流開始から30分後にカテーテルを鉗子ではさんで血流を止め、絹糸を通したチューブ部分を切り出した。次いで、血液灌流により形成された血栓の重量を測定した。具体的には、切り出したチューブから絹糸を慎重に取り出し、液相を濾紙で除いて残った湿重量を測定し、さらにこれから6.5cmの絹糸の重量を引いて、これを血栓重量とした。
【０３５１】
(3-2) 血液凝固検査
上記血栓重量を測定する際にチューブを切り出すと同時に、腹部大動脈から凝固検査用に血液を採取した。全血1.8mLを3.13％クエン酸入り真空採血管に添加して、遠心して血漿を得た。また、全血0.5mLを血清分離剤と凝固促進剤が入った微量採血管に添加し、血清を得た。全自動血液凝固測定装置を用い、血漿について活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time：APTT）及びプロトロンビン時間（prothrombin time：PT）を測定した。
【０３５２】
（４）結果
媒体投与群および各試験化合物投与群（１〜４群）について得られた血栓重量を表４に示す。
【０３５３】
【表４】
2007083689.tif 000093
【０３５４】
この結果からわかるように、上記ラットＡＶシャントモデルにおいて、本発明の化合物ａ投与群の血栓重量は、陽性対照化合物（ワーファリン、チクロピジン塩酸塩）投与群と同様に、媒体投与群と比較して有意に減少した。なお、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）について、媒体投与群と比較して、本発明の化合物ａ投与群に有意な変化は認められなかった。
【０３５５】
一方、ワーファリン投与群は、血栓重量を減少させ、ＰＴ及びＡＰＴＴを延長した。チクロピジン塩酸塩投与群は、血栓重量を減少させたが、本発明の化合物ａと同様にＰＴ及びＡＰＴＴに対して影響を示さなかった。なお、ここでＰＴとＡＰＴＴはいずれも凝固系を判断する指標である。すなわち、この試験で、本発明の化合物ａはＰＴとＡＰＴＴのいずれにも影響を与えなかったという結果は、当該化合物ａが抗凝固剤と異なる性質の化合物であることを意味している。
【０３５６】
以上のラットＡＶシャントモデルを用いた試験結果から、2‐[3‐(3’‐カルボキシ‐4’‐チエニルチオフェン‐2’‐イルカルバモイル)‐ペンタノイルアミノ]‐4‐チエニルチオフェン‐3‐カルボン酸（化合物ａ）は抗凝固剤とは異なる作用機序で抗血栓作用を示すことが明らかになった。
【０３５７】
実験例９    細胞障害試験
一般に、細胞質局在酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、障害により溶解した細胞から放出されることが知られている。該ＬＤＨは比較的安定であるため、ＬＤＨを定量することにより、間接的に薬物の細胞障害を調べることができる。
【０３５８】
本発明の化合物ａ及びｂを、250μＭ、125μＭ、または50μＭの割合で、HeLa細胞（子宮頚がん由来上皮様細胞株）に添加し、細胞から溶出したＬＤＨを、ＩＮＴ（テトラゾリウム塩）と30分間酵素反応を行い、ＩＮＴから変換された赤色ホルマザンを490nmで定量することにより、化合物ａおよびｂの細胞障害性を試験した。また、対照試験として、化合物ａおよびｂに代えて、0.5％のDMSOを用いて同様に試験を行った。本発明の化合物ａおよびｂは、いずれも250μMまで細胞障害性が認められなかった。
【０３５９】
実験例１０    急性毒性試験
ＩＣＲマウス（日本クレア株式会社から入手、雄、19〜21ｇ）（ｎ＝5）に化合物ａ及びｂを、それぞれ単回経口投与で１ｇ／ｋｇ投与し、２週間経過観察を行った。両化合物とも死亡個体は認められなかった。
【０３６０】
実験例１１    吸収性試験
Wisterラット（日本クレア株式会社から入手、雄、160〜180ｇ）（ｎ＝5）に化合物ａ及びｂを、それぞれ50 mg/kgで経口投与し、1、2，6、18、24時間後および7日後に静脈から採血して、血液中の化合物量を測定し、最高血中濃度（Cmax）、および半減期（T1/2）を調べた。比較対照試験として、化合物ａ及びｂに代えてtiplaxtininを用いて同様にして試験を行った。化合物ａとｂおよびtiplaxtininの半減期（T1/2）を表５に示す。
【０３６１】
【表５】
2007083689.tif 000094
【０３６２】
この結果からわかるように、化合物ａ及びｂは、tiplaxtininよりも顕著に長い血中持続性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０３６３】
【図１】本発明の化合物（１）（特に化合物ａとｂ）の合成スキームを示す図である。
【図２】本発明の化合物ａ（N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−フェニル−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド）のＮＭＲデータを示す。
【図３】本発明の化合物ｂ（N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−（2,2’-チエニル）−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド）のＮＭＲデータを示す。
【図４】（Ａ）N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−フェニル−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ａ）、（Ｂ）N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−（2,2’-チエニル）−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ｂ）および（Ｃ）tiplaxtininのＰＡＩ−１阻害活性を示す図である。縦軸は、ＰＡＩ−１活性（％）を示す（実験例１）。
【図５】ウエスタンブロッティング法による、各化合物の組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）とＰＡＩ−１の複合体形成阻害効果を示す電気泳動像である（実験例２）。
【図６】フィブリンプレート法（天然基質法）による、各化合物のＰＡＩ−１阻害効果を示す図である（実験例３）。
【図７】N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−フェニル−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ａ）（図（Ａ））、およびN,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−（2,2’-チエニル）−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ｂ）（図（Ｂ））のアンチプラスミン（ＡＰ）活性に対する効果を示す図である（実験例４）。
【図８】ウエスタンブロッティング法による、N,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−（2,2’-チエニル）−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ｂ）のプラスミンとアンチプラスミンの複合体形成阻害効果を示す電気泳動像である。
【図９】ブレオマイシン誘導肺線維症に対するN,N’-ビス［3,3’−カルボキシ−4,4’−（2,2’-チエニル）−2,2’−チエニル］ヘキサンジカルボキシアミド（化合物ｂ）の抗線維効果を示す、ａは線維症スコア、ｂは組織染色画像である（実験例７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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