(57)【要約】  本発明は、全身的な骨質の改善を細胞移植により実現可能な移植材料を提供することを目的とする。この目的のため、本発明では、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用する移植材料を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植材料であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用する移植材料。
【請求項２】
ヒト又は非ヒトの骨部における骨密度増加を促進する、請求項１に記載の移植材料。
【請求項３】
前記細胞は、間葉系幹細胞又は骨形成能を有する細胞である、請求項１又は２に記載の移植材料。
【請求項４】
前記細胞は自家細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の移植材料。
【請求項５】
脈管内投与用又は静脈内投与用である、請求項１〜４のいずれかに記載の移植材料。
【請求項６】
骨髄腔内投与用である、請求項１〜４のいずれかに記載の移植材料。
【請求項７】
骨疾患の予防用又は治療用である、請求項１〜６のいずれかに記載の移植材料。
【請求項８】
前記骨疾患は全身性又は局所性である、請求項７に記載の移植材料。
【請求項９】
前記骨疾患は、骨欠損、骨ページェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び骨軟化症から選択されるいずれかである、請求項７又は８に記載の移植材料。
【請求項１０】
前記骨疾患は、変形性関節症、腰背痛及び慢性関節リウマチから選択されるいずれかである、請求項９に記載の移植材料。
【請求項１１】
前記骨疾患は、骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び骨軟化症から選択されるいずれかである、請求項９に記載の移植材料。
【請求項１２】
前記骨粗しょう症は、閉経性骨粗しょう症である、請求項９又は１１に記載の移植材料。
【請求項１３】
整形外科用、美容形成用、形成外科用、歯科用及び口腔外科用のいずれかである、請求項１〜８のいずれかに記載の移植材料。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の移植材料を含み、投与形態が全身投与及び／又は局所投与である、骨質改善剤。
【請求項１５】
前記投与形態は、脈管内投与用又は骨髄腔内投与である、請求項１４記載の骨質改善剤。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の移植材料の製造方法であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を準備する工程を備える、製造方法。
【請求項１７】
前記細胞は自家細胞である、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を培養する工程を備える、請求項１６又は１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を保存する工程を備える、請求項１６〜１８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植材料及び骨質改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本においては、団塊世代というエルダー世代が50％以上を占める高齢化社会になっている。その中で、高齢化とともに骨粗しょう症に罹患する患者層も増加してきている。例えば、骨粗しょう症による骨質低下に伴う大腿骨頚部骨折の患者は年間約１０万人に及んでいる。【０００３】
こうした骨粗しょう症などによる骨欠損部位の修復や再生のための治療方法としては、自己の組織、例えば、脂肪、筋膜、軟骨、骨片等を用いる自家移植が挙げられる。しかしながら、自家移植の場合、骨欠損部位に対して十分な移植材料を確保できないという問題や健全部位を侵襲するという問題がある。また、同種移植や異種移植にあっては、自家移植と同様供給量に問題があるほか、免疫、ウイルス感染の問題も指摘されている。【０００４】
一方、こうした問題を解決するために、チタンなどでできた人工関節を２種類のセメントなどにより固定する移植材料（セメント型とポーラス型）がある。また、特再表ＷＯ２００２／０４００７１号公報には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む移植材料が開示されている。また、骨粗しょう症は大腿骨などの局所にのみ生じるものではなく、全身的に生じうるものである。全身的な骨粗しょう症に対応する治療法としては、特開２００３−５５２２６号公報や特開２００４−４３４７６号公報などに薬剤による治療法が開示されるほか、食事や運動による方法などが一般的に知られている。
【発明の開示】
【０００５】
しかしながら、現在までのところ、全身的な骨密度低下や骨粗しょう症に有効な予防方法や治療方法も局所的な骨疾患に有効な予防方法や治療方法も見出されていない。また、非局所的な手法によって局所の骨密度の低下を改善するのに有効な方法も見出されていない。特に、全身的な骨粗しょう症に有効な予防・治療方法は少なく、上記した局所補充的あるいは局所再生用の移植材料によれば、局所的な骨質改善がある程度は可能であっても全身的な骨粗しょう症には有効ではない。また、薬剤を用いる治療法では、疾患の性質上長期投与が要請されることから副作用等の問題が生じかねない。さらに、食事や運動による方法では、重度の骨粗しょう症患者にはもはや有効ではない。
【０００６】
そこで、本発明は、全身的又は局所的な骨質の改善を細胞移植により実現可能な移植材料を提供することを１つの目的とする。また、本発明は、局所投与によらなくても局所の骨質の改善を細胞移植により実現可能な移植材料を提供することを他の一つの目的とする。
【０００７】
本発明者らは、骨質改善を目的として間葉系幹細胞等の全身投与又は局所投与について検討したところ、全身投与形態であっても、全身的な骨密度の低下傾向を効果的に改善することができるとともに局所の骨密度の低下も確実に抑制できるという知見を得た。また、局所投与であっても有効に局所の骨密度の低下を抑制できることを見出した。すなわち、本発明者らの知見によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、移植材料であって、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用する移植材料が提供される。なお、本発明において、「骨質改善」とは、骨形成、骨形成の促進、骨密度の増加、及び骨疾患の予防又は治療のいずれかを意味している。
【０００９】
本発明の移植材料は、ヒト又は非ヒトの骨部における骨密度増加を促進可能であることが好ましく、前記細胞は、間葉系幹細胞又は骨形成能を有する細胞であることが好ましい。また、前記細胞は自家細胞であることが好ましい。さらに、本発明の移植材料は、脈管内投与用又は静脈内注入用であることが好ましく、また、本発明の移植材料は、骨髄腔内投与用であることが好ましい。さらにまた、本発明の移植材料は、骨疾患の予防用又は治療用とすることができ、全身性骨疾患にも局所性骨疾患にも有用であるが、特に、全身投与形態の場合には、全身性骨疾患に有用である。また、本発明の移植材料は、整形外科用、美容形成用、形成外科用、歯科用及び口腔外科用のいずれかとして使用できる。また、本発明の移植材料は、成形外科などにおける脊髄損傷に対する治療用であってもよいし、口腔外科における顎骨延長の治療用であってもよい。
【００１０】
本発明によれば、上記いずれかに記載の移植材料を含み、投与形態が全身投与又は局所投与である、骨質改善剤が提供される。全身投与形態は、脈管内投与であることが好ましい。また、局所投与形態は、骨髄腔内投与であることが好ましい。
【００１１】
本発明によれば、上記いずれかに記載の移植材料の製造方法であって、、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を準備する工程を備える、製造方法が提供される。本発明の移植材料の製造方法においては、前記細胞は、自家細胞であることが好ましく、さらに、、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を培養する工程を備えることが好ましい。また、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を保存する工程を備えることが好ましい。さらに、本発明によれば、上記いずれかの移植材料を準備する工程を備える、骨質改善剤の製造方法も提供される。
【００１２】
本発明によれば、骨質改善方法であって、上記いずれかの移植材料を全身投与又は局所投与する工程を備える、方法が提供される。前記投与工程は、全身投与の場合、好ましくは、静脈投与などの脈管投与である。また、局所投与の場合、骨髄腔内投与である。さらに、全身投与と局所投与とを組み合わせて使用してしてもよい。すなわち、前記全身投与又は局所投与工程に先立って、又は前記全身投与工程又は局所投与工程と同時に、あるいは前記全身投与工程又は局所投与工程の後に骨質改善を要する局所に本発明の移植材料を局所投与し又は本発明の移植材料を全身投与するようにしてもよい。なお、局所には、スキャホールド、ＰＲＰ、ＰＲＰゲル、各種成長因子、ＥＣＭタンパク質、ゲル化材料、増粘剤などの細胞以外の成分のみを投与してもよいし、これらと細胞とを局所投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例における間葉系幹細胞の投与形態を示す図である。
【図２】図２は、実施例の全身投与群の骨密度測定結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例におけるμＣＴ撮影の結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例の局所投与群の骨密度測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用すること移植材料に関し、さらに、当該移植材料を含む骨質改善剤、当該移植材料又は骨質改善剤の製造並びに当該移植材料又は骨質改善剤を用いる骨質改善方法、特には、骨疾患の予防若しくは治療方法に関する。【００１５】
本発明の移植材料は、脈管系投与等に全身投与又は骨髄腔内等に局所投与することで骨密度が低下した部位において骨密度の上昇、すなわち、骨組織の再生が可能である。したがって、本発明の移植材料によれば、局所投与によらないで、全身的あるいは局所的な骨密度等の改善が可能である。また、局所投与によらないでも骨質改善が可能であることから、局所投与される他の骨質改善を目的とする移植材料や薬剤などと併用することも可能である。さらに、骨質の改善を要する部位に別途スキャホールドを局所投与するなどすることで効果的に骨質改善することが可能である。また、本発明の移植材料は、局所投与によっても骨密度の上昇及び骨組織の再生が可能である。したがって、本発明の移植材料によれば、全身投与と局所投与とを組み合わせて行うことができる。さらに、こうした骨質改善用の移植材料を用いた再生医療によれば、低侵襲でしかも適時に補充的若しくは追加的な骨質低下予防や骨質改善が可能となる。以下、本発明を詳細に説明する。【００１６】
（移植材料）
（移植材料として使用する細胞）
本発明の移植材料は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含んでいる。本発明の移植材料に用いる細胞は、これらのうち１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。【００１７】
全身投与用には、好ましくは、胚性幹細胞及び／又は間葉系幹細胞を用いる。より好ましくは間葉系幹細胞である。こうした細胞は、これらの細胞源であるヒトあるいは非ヒト動物から採取されたものであってもよいし、さらに培養されたものであってもよい。あるいは人工的な手法により確立されたものであってもよい。細胞は、拒絶反応を有効に回避できる限りにおいて異種細胞であってもよいが、好ましくは同種細胞であり、さらに好ましくは自家細胞を用いる。また、細胞は、必要に応じて遺伝的に修飾がなされていてもよい。さらに、凍結保存されたものであってもよい。【００１８】
例えば、間葉系幹細胞は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は臍帯血などを供給源として採取することができる。これらの供給源から間葉系幹細胞を採取する方法は当業者において周知である。採取した間葉系幹細胞は、そのまま用いることもできるし、培養して必要量を取得するようにしてもよい。また、間葉系幹細胞の培養の方法はBoo, J.S., Yamada, Y., Hibino, Y., Okazaki, Y.,  Okada K., Hata, K., Yoshikawa, T., Sugiura Y., and Ueda, M.  Tissue-Engineered Bone Using Mesenchymal Stem Cells and a Biodegradable scaffold.  J. Craniofac. surg. 13, 231-239, 2002、Yamada, Y., Boo, J.S., Ozawa, R., Nagasaka、T., Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda, M.  Bone regeneration following injection of ｍesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold.  J. Cranio-maxillofac. surg.  31, 27-33, 2003などに記載されるほか、当業者においては周知である。【００１９】
また、局所投与用には、骨形成能を有する細胞が好ましい。骨形成能を有する細胞とは、骨芽細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨系細胞に分化した間葉系幹細胞やＥＳ細胞等を含む骨組織を形成しうる細胞をいう。好ましくは、骨系細胞に分化した間葉系幹細胞を用いる。なお、「骨系細胞に分化した」とは、未分化状態の間葉系幹細胞や胚性幹細胞が骨系細胞へ方向付けされた状態をいう。骨系へ分化した間葉系幹細胞はＥＳ細胞は、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく、また、ヒト由来の細胞を利用できる。骨芽細胞、前骨芽細胞及び軟骨細胞は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は臍帯血から採取することができる。また、骨系細胞に分化した間葉系幹細胞は、例えば、採取した間葉系幹細胞をインビトロで骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで調製できる。前記骨系細胞への分化を誘導するには、たとえば、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、及びＬ−アスコルビン酸を含む培地が挙げられる。なお、培養条件はこれに限定するものではなく、従来公知の骨系細胞についての分化誘導条件を利用してもよい。骨系細胞へ分化した間葉系幹細胞は凍結処理をしたものであってもよい。また、未分化間葉系幹細胞の供給源としては、腸骨骨髄、顎骨骨髄などの骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は臍帯血から採取することができる。これらから従来公知の方法で採取した後、間葉系幹細胞をその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞のうち、接着性を有するものを選択することで未分化間葉系幹細胞を得ることができる。【００２０】
（細胞以外の成分）
本発明の移植材料は、全身投与用であっても局所投与用であっても、適当な媒体に細胞を懸濁させた懸濁液の形態を採ることが好ましい。こうした媒体としては特に限定しないが、生理食塩液や適当な緩衝液などを選択できる。本発明の移植材料は、媒体としては、血液あるいはその一部を含んでいてもよい。たとえば、血液の一部（成分）としては、血漿、多血小板血漿（ＰＲＰ）などを用いることができる。ＰＲＰは、例えば、商品名：濃厚血小板「日赤」（日本赤十字社製）に準じるものである。ＰＲＰは、採取した血液を遠心分離処理するなどして調製できる。なお、ＰＲＰは自己由来のＰＲＰであることが好ましい。なお、ＰＲＰは、本発明の移植材料に含まれずに、本発明の移植材料とは別個に投与されてもよい。【００２１】
また、本発明の移植材料は、成長因子を含むことができる。例えば、多血小板血漿に含まれる成長因子である、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧＦ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉや塩基性線維芽細胞絵師長因子（ｂ−FGF）、骨誘導因子（ＢＭＰ）などを含むことができる。特に、ＰＲＰ又は１種又は２種以上の成長因子との併用によれば、骨形成又は骨形成を促進すべき部位において効果的に骨密度を増進させることができる。なお、成長因子は、本発明の移植材料に含まれずに、本発明の移植材料とは別個に投与されてもよい。【００２２】
本発明の移植材料を局所投与用として用いる場合、単独で局所投与（生理食塩水などを媒体として）されてもよいし、上記したＰＲＰや各種成長因子のほか、スキャホールド、ＥＣＭタンパク質、ゲル化材料、増粘剤から選択される１種又は２種以上を含んでいてもよい。例えば、細胞を生理食塩水などを用いて局所に単独投与した場合には、細胞を骨髄全体に到達させることが可能であり、一方スキャホールドを用いた場合には、細胞を骨の一定領域に留めておいて必要な部分のみを骨質改善することができる。【００２３】
こうしたスキャホールドとしては、各種の人工骨や生体骨（自家骨などを含む）のほか、生体内で分解吸収される高分子材料が挙げられる。かかる高分子材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグルコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸あるいはグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニンなどの合成高分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸およびその誘導体などの多糖、あるいはゼラチン、コラーゲン（コラーゲンのタイプおよびその抽出法はいずれでもよい）などが挙げられる。【００２４】
また、スキャホールドとして、ＰＲＰに含まれる血小板及びフィブリノーゲンをトロンビン等を用いてゲル化させたＰＲＰゲルを用いることもできる。ＰＲＰゲルは、上記の高分子材料と共役して骨形成の有効なスキャホールドとして機能できる。ＰＲＰゲルは、また、上記のように各種成長因子を含む点においても良好なスキャホールドを構築する。【００２５】
さらに、骨質改善部位に対して、供給可能な他の成分としては、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が挙げられる。ＥＣＭは自家であることが好ましいが、同種他家であってもよい。【００２６】
ゲル化材料は、例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含むことができる。このようなゲル化材料を局所投与することで、トロンビンがＰＲＰ中のフィブリノーゲンに作用してフィブリンが生成し、そしてフィブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化材料としては、このようにＰＲＰ中の成分に作用して粘性を増加させるものであってもよいし、それ自身により増粘効果を奏するものを使用してもよい。また、ゲル化材料に加えて、移植後に作用して本発明の移植材料の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を用いてもよい。使用時には適度な流動性を有しかつ移植後には粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。前記ゲル化材料としては、コラーゲンやフィブリン糊が挙げられる。また、増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等の増粘剤が挙げられる。【００２７】
（移植材料の投与形態）
本発明の移植材料は、全身投与又は局所投与の形態を採ることができる。全身投与の形態は、特に限定されないが、骨組織をターゲットとした細胞移植を意図する全身投与の観点から、好ましくは、血管やリンパ管を経由する脈管内投与である。なかでも、静脈など血管内投与とすることが好ましい。投与手法としては、注射、点滴、カテーテルなどを用いることができる。【００２８】
また、局所投与についても特に限定されないが、骨髄腔内等に投与することができる。投与手法としては、注射、点滴、カテーテルなどを用いることができる。【００２９】
本発明の移植材料の投与にあたっては、上記した細胞以外の成分であるＰＲＰや成長因子などを組み合わせて投与することができる。なお、こうした細胞以外の成分は、移植材料に細胞とともに含まれていてもよいし、移植材料とは別個に投与されるものであってもよい。全身投与にあたり、本発明の移植材料を静脈内投与等するのにあたっては、カテーテルあるいは注射器で血管等に注入可能な程度の液性（粘性、液性等）に適宜調製される。また、局所投与にあたっては、骨髄腔内に注射器やカテーテルで注入可能な程度の液性に適宜調製される。なお、移植材料を注射剤あるいは注入剤などとして製剤化するには、薬理学的に許容される各種の担体や添加剤などを用いることができる。【００３０】
全身投与する細胞懸濁液の細胞数は、1×１０5細胞／ｍｌ以上とすることができるが、好ましくは１×１０6細胞／ｍｌ以上１×１０8細胞／ｍｌ以下である。また、局所投与にあたっても、同様の細胞数とすることができる。【００３１】
（全身投与とスキャホールド等の他の成分の単独局所投与との併用）
本発明の移植材料を全身投与するのにあたっては、移植材料の投与（移植）に先立ってあるいは移植とともに骨形成又は骨形成を促進しようとする部位（骨疾患部位、整形外科における治療又は予防部位、美容形成における治療又は予防部位、形成外科における治療又は予防部位、歯科における治療又は予防部位、口腔外科における治療又は予防部位等）などの骨質改善部位（骨質の改善を要する部位、以下同じ。）にスキャホールド、PRP、各種成長因子、ＥＣＭタンパク質、ゲル化材料、増粘剤等を供給しておくことができる。こうすることで、移植した細胞の骨疾患部位等における生着や骨疾患部位での細胞増殖等を促進して、骨疾患部位での骨形成（再生）を促進することが可能となる。こうしたスキャホールド、ゲル化材料、増粘剤としては、すでに局所投与時に用いるものとして例示したものを使用できる。【００３２】
（全身投与と本発明の移植材料の局所投与との併用）
本発明の移植材料は、全身投与するものであるため、本発明の移植材料を全身投与するとともに、骨質改善部位へ本発明の移植材料の局所投与を併用してもよい。例えば、間葉系幹細胞を静脈内に投与するとともに、骨形成能を有する細胞を骨髄腔注入などにより局所投与してもよい。局所投与と全身投与とを併用することにより、相乗的効果が期待できるとともに、局所における重点的な骨質改善が期待できる。【００３３】
本発明の移植材料は、従来の埋め込み型人工骨や関節などの人工構築物による治療と併用して全身投与してもよい。こうすることで、人工構築物の生着を促進することが可能である。【００３４】
（移植材料の用途）
本発明の上記した各種態様の移植材料は、骨質改善用に用いることができる。すなわち、典型的には骨形成又は骨形成促進による骨密度の低下抑制、維持、増加や、各種骨疾患の治療、予防、改善に利用できる。また、本発明の移植材料は、整形外科、美容形成、形成外科、歯科及び口腔外科の領域にも適用することができる。例えば、整形外科領域では、股関節や骨頭，膝関節などの骨・関節軟骨の再生や骨延長等、美容形成領域では、軟骨再生による隆鼻術、しわとり、歯科及び口腔外科領域では、インプラント（人工歯根）の植立のための顎骨の骨質強化や再建、歯槽骨の増強・再生、外科手術後の顎骨再建、唇顎口蓋裂の顎裂部の再建等に用いることができる。整形外科領域においては、さらに、脊髄損傷に対する治療にも用いることができ、口腔外科領域においては、顎骨延長にも用いることができる。【００３５】
本発明の移植材料は、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒト）の骨疾患における骨質改善ないし予防・治療に用いることが好ましい。前記骨疾患としては、骨密度の低下や骨組織の劣化等の症状を伴うなどして骨量の低下を伴う疾患である。こうした骨疾患としては、（１）原発性骨粗しょう症（加齢に伴う原発性骨粗しょう症、閉経に伴う骨粗しょう症、卵巣摘出に伴う骨粗しょう症等）、（２）二次性骨粗しょう症（例えば、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、甲状腺機能亢進性骨粗しょう症、腎不全による骨粗しょう症、炎症性骨粗しょう症、クッシング症候群に伴う骨粗しょう症リューマチ性骨粗しょう症等）、（３）癌骨転移、高カルシウム血症、ページェット病、骨欠損（歯槽骨欠損、下顎骨欠損、小児期突発性骨欠損等）、骨壊死等が挙げられる。【００３６】
（移植材料の製造方法）
本発明の移植材料の製造方法は、本発明の移植材料に用いる細胞を準備する工程を供えることができる。すなわち、上記した細胞のいずれかを採取ないし確立する工程を備えることができ、また、加えて当該細胞を培養する工程を備えることができる。さらに、分化誘導する工程を実施してもよい。分化誘導についてはすでに説明したとおりである。さらに、本発明の移植材料の製造方法においては、上記した細胞のいずれかを保存する工程を含むことができる。一旦取得した細胞を使用時期まで保存することで適時に移植を行うことができる。保存工程は、保存に先立って細胞は凍結することが好ましく、また、凍結に際しては適宜細胞保存剤を添加することができる。【００３７】
（骨質改善剤及び骨疾患の予防・治療剤）
本発明の骨質改善剤及び骨疾患の予防・治療剤（以下、単に骨改善剤等）は、本発明の移植材料を含んでいる。本発明の骨質改善剤等は、骨質改善用途や骨疾患の予防・治療用用途に全身投与及び／又は局所投与して使用するものである。本発明の骨質改善剤等は、本発明の移植材料と同様の用途に同様の方法で用いることができる。特に、本発明の骨質改善剤等としては、脈管内投与用など全身投与用として製剤化された形態や骨髄腔内投与用など局所投与用として製剤化された形態が挙げられる。こうした骨質改善剤等としては、公知の骨質改善であるエストロゲン、ビタミンＫ、ビスフォスフォネート等が含まれていてもよいし、また、これらと併用投与するものであってもよい。なお、本発明の骨質改善剤は、本発明の移植材料により、周知の医薬品担体等を用いることにより取得することができる。【００３８】
（骨質改善方法及び骨疾患の予防・治療方法）
本発明の骨質改善方法及び骨疾患の予防・治療方法は、本発明の移植材料又は骨質改善剤等を全身投与及び／又は局所投与する工程を含んでいる。本発明の移植材料等を用いることで、既に説明したように骨質改善並びに骨疾患の予防又は治療が可能となる。なお、移植材料の投与形態で既に説明したように、本発明の移植材料等を全身投与するのに先立ってあるいは全身投与とともに、スキャホールド、成長因子、ＰＲＰ、ＥＣＭタンパク質、ゲル化材料及び増粘剤や本発明の移植材料（細胞を単独であるいはスキャホールド等を同時にあるいは別個に投与する態様を含む。）やその他の移植材料の局所投与や人工構築物の導入などを行うこともできる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、本実施例は本発明を限定するものではない。【００４０】
本実施例では、骨粗しょう症モデルラットを作製し、本発明の移植材料が骨密度低下を改善できることを確認した。【００４１】
（骨粗しょう症モデルラットの作製）
骨粗しょう症モデルラットは、卵巣を摘出することにより確立した。この方法は、J Bone Miner Res 1997;12:1844-1850,Hitoshi Sainoらに準じて行った。処置後のラットについて、後述する細胞移植の前に骨密度（ＤＸＡ（２重エネルギーＸ線吸収計）というＣＴ機を用いて）を計測し、骨粗鬆症モデルが成立していることを確認した。【００４２】
（間葉系幹細胞の採取及び培養）
GFPラットの大腿骨骨髄液より採取した間葉系幹細胞（以下ＭＳＣsと略す）を分離、培養し、目的の細胞数まで培養を行った。培養の方法はBoo, J.S., Yamada, Y., Hibino, Y., Okazaki, Y.,  Okada K., Hata, K., Yoshikawa, T., Sugiura Y., and Ueda, M.  Tissue-Engineered Bone Using Mesenchymal Stem Cells and a Biodegradable scaffold.  J. Craniofac. surg. 13, 231-239, 2002、Yamada, Y., Boo, J.S., Ozawa, R., Nagasaka、T., Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda, M.  Bone regeneration following injection of ｍesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold.  J. Cranio-maxillofac. surg.  31, 27-33, 2003）に準じて行った。ＧＦＰラットは大阪大学の岡部先生らが開発したものを、日本SLC社を介して購入した。このラットはＧＦＰ遺伝子が全ての組織において組み込まれており、移植細胞の動向を追うことができるものである。このラットは、J. Am Soc Nephrol 12:2625-2635,2001, Takahito Ito et al.,に記載されている。【００４３】
（間葉系幹細胞の経静脈的全身投与）
培養したＭＳＣｓを生理食塩水で懸濁して細胞数が５×１０６個／ｍｌ、１×１０７個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、骨粗しょう症モデルの成立を確認したモデルラット（ヌードラット）の尾静脈よりそれぞれ注入した（図１参照）。なお、骨粗しょう症モデル成立のための骨密度測定は、卵巣摘出後、2週、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月程度とした。【００４４】
（骨系細胞に分化した間葉系幹細胞の調整）
上記ＧＦＰラットの大腿骨から未分化間葉系幹細胞を採取し、分化誘導して骨系細胞に分化した間葉系幹細胞を調製した。【００４５】
間葉系幹細胞の分化誘導の方法は、Boo, J.S., Yamada, Y., Hibino, Y., Okazaki, Y.,  Okada K., Hata, K., Yoshikawa, T., Sugiura Y., and Ueda, M.  Tissue-Engineered Bone Using Mesenchymal Stem Cells and a Biodegradable scaffold.  J. Craniofac. surg. 13, 231-239, 2002、Yamada, Y., Boo, J.S., Ozawa, R., Nagasaka、T., Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda, M.  Bone regeneration following injection of ｍesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold.  J. Cranio-maxillofac. surg.  31, 27-33, 2003、Yamada, Y., Ueda, M., Naiki, T., Takahashi, M., Hata, K., and Nagasaka, T.  Autogenous injectable Bone for Regeneration with Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Platelet-Rich Plasma (PRP) - Tissue-engineered bone regeneration -.  Tissue Eng. 10 (5/6), 955-964, 2004.に準じた。すなわち、前記ＧＦＰラットの大腿骨の骨髄穿刺により未分化間葉系幹細胞を含む骨髄を採取し、骨髄細胞を、基本培地、低グルコースＤＭＥＭ、増殖サプリメント（Cambrex社製）で培養し、３つのサプリメント（デキサメタゾン、β−グリセロリン酸ナトリウム、及びＬ−アスコルビン酸２リン酸）によって間葉系幹細胞の骨系細胞への分化を誘導した。骨系細胞に分化した間葉系幹細胞は、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを基質として使用したアルカリホスファターゼ活性を検出することで確認した。間葉系幹細胞は、移植に使用する前にトリプシン処理を施した。【００４６】
（局所投与）
前述のとおりに調製した間葉系幹細胞を、生理食塩水又はＰＲＰとともに、図１に示すとおり、ラット（ヌードラット）の大腿骨に骨髄穿刺針を用いて注入した。移植した細胞数は、５×１０６個／ｍｌ、１×１０７個／ｍｌとした。【００４７】
（ＰＲＰの調製）
ＰＲＰは、ラット末梢血から全血を採取し、５分間１１００ｒｐｍの遠心分離後、イエロープラズマ（血小板及び白血球とともにバフィーコートを含む）を、長いカニューレで中性のモノベットに回収し、１０分間、２５００ｒｐｍの遠心分離で血小板を単一ペレットとして調製した。前記ＰＲＰは、残存血漿にリサスベンドし、ＰＲＰのゲル化に使用した。ＰＲＰのゲル化は、前記ＰＲＰにトロンビン／塩化カルシウム溶液を添加し、気泡を含ませながら混合することにより行った。前記トロンビン／塩化カルシウム溶液は１０ｍｌの１０％塩化カルシウム溶液に、１０，０００Ｕのウシトロンビンを溶解して調製した。【００４８】
（評価）
骨粗しょう症モデルラットに所定の方法で細胞を移植直後、移植後1ケ月、２ケ月及び３ケ月経過後に同様にして骨粗しょう症モデルラット成立確認のための骨密度測定と同様の方法で骨密度を測定し、骨密度に基づいて細胞移植の状態を確認した。図２に、全身投与群における移植前、移植時、移植後１ヶ月の骨密度の測定結果を示す。また、骨密度の改善が得られた状態でと殺し、μCTを撮影した。全身投与群では、脊椎を撮影し、局所投与群では大腿骨を撮影した。μＣＴ結果を図３に示す。また、図４には、局所投与群における移植前、移植時、移植後１ヶ月の骨密度の測定結果を示す。【００４９】
全身投与群について、図２及び図３に示すように、コントロール群では骨密度値の変化は見られなかったが、卵巣摘出（骨粗しょう症コントロール）群では骨密度値の低下が観察され、骨粗しょう症モデルが成立していた。また、細胞移植群では細胞移植時までは骨密度値の低下傾向が見られたが、細胞移植を行うことにより、骨密度値の上昇が確認された。特に、１×１０７個／ｍｌの投与群では、移植１ヶ月後には移植直後にコントロールと比較して１０％程度の骨密度の増加が観察された。さらに、μCTにおいても骨密度の改善が確認された。細胞数は１×10７個の方が効果的であった。従来の薬物治療による骨密度の増加が３〜４％程度であることを考慮すると、本発明の移植材料による骨密度改善効果が優れていることがわかった。【００５０】
また、局所投与群について、図３及び図４に示すように、細胞移植群で骨密度値の上昇が確認されるとともに、μＣＴにおいても骨密度の改善が確認された。細胞移植による骨密度はコントロールに比較して１０％程度の増加が観察された。したがって、全身投与時と同様、本発明の移植材料は、局所投与した場合であっても骨密度改善効果が優れていることがわかった。【００５１】
以上のことから、骨粗しょう症に対して間葉系幹細胞を全身投与することにより、骨密度の改善が確認された。このことにより、本発明の移植材料によれば、全身的に起こっている骨粗しょう症に対しても、また今まで局所的にしか対応できなかった症例に対しても有効な治療又は予防が行えることがわかった。全身的な投与によって、脊髄などの局所においても明らかな骨密度低下抑制又は骨密度増加の効果が得られることがわかった。【００５２】
また、骨粗しょう症に対して骨系細胞に分化した間葉系幹細胞を局所投与することにより、骨密度の改善が確認された。このことにより、全身的に起こっている骨粗しょう症の局所治療に本発明の移植材料が有効であることがわかった。また、局所的な骨疾患や骨質改善部位に対しても本発明の移植材料が有効であることがわかった。【００５３】
なお、本明細書において引用された文献は、引用によりその内容の全てが本明細書に編入される。また、本出願は２００５年６月１３日に出願された米国仮出願第６０／６８９，５５３号を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の移植材料は、例えば、整形外科、美容整形、歯科、口腔外科及び耳鼻咽喉科等における骨再生医療分野及び骨密度の低下抑制、維持、増加など骨質改善のほか、骨粗しょう症などの骨疾患の予防・治療に有用である。
【図１】
2006134921.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
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【請求項３】
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【請求項４】
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【請求項５】
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【請求項６】
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【請求項７】
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【請求項８】
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【請求項９】
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【請求項１０】
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【請求項１１】
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【請求項１２】
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【請求項１３】
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【請求項１４】
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【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
移植材料であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の自家細胞を含有し全身投与用である、骨質改善用移植材料。
【請求項２１】
ヒト又は非ヒトの骨部における骨密度増加を促進する、請求項２０に記載の移植材料。
【請求項２２】
前記細胞は、間葉系幹細胞又は骨形成能を有する細胞である、請求項２０又は２１に記載の移植材料。
【請求項２３】
前記自家細胞は培養自家細胞である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の移植材料。
【請求項２４】
脈管内投与用である又は静脈内投与用である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の移植材料。
【請求項２５】
骨疾患の予防用又は治療用である、請求項２０〜２４のいずれかに記載の移植材料。
【請求項２６】
前記骨疾患は全身性又は局所性である、請求項２５の記載の移植材料。
【請求項２７】
前記骨疾患は、変形性関節症、腰背痛及び慢性関節リウマチから選択されるいずれかである、請求項２５又は２６に記載の移植材料。
【請求項２８】
前記骨疾患は、骨欠損、骨粗しょう症、骨折及び歯周疾患から選択される請求項２５又は２６に記載の移植材料。
【請求項２９】
前記骨疾患は、骨ページェット病及びパーキンソン病のいずれかである、請求項２５又は２６に記載の移植材料。
【請求項３０】
前記骨疾患は、骨減少症及び骨軟化症のいずれかである、請求項２５又は２６に記載の移植材料。
【請求項３１】
前記骨疾患は、閉経性骨粗しょう症である、請求項２５又は２６に記載の移植材料。
【請求項３２】
整形外科用、美容整形用、形成外科用、歯科用及び口腔外科用のいずれかである、請求項２０〜３１のいずれかに記載の移植材料。
【請求項３３】
請求項２０〜３２のいずれかに記載の移植材料を含有する、全身投与用骨質改善剤。
【請求項３４】
全身投与用である骨質改善用移植材料の製造方法であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の自家細胞を準備する工程を備える、製造方法。
【請求項３５】
前記自家細胞は培養細胞である、請求項３４に記載の製造方法。
【請求項３６】
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を保存する工程を備える、請求項３４又は３５に記載の製造方法。
【国際調査報告】
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