(57)【要約】本発明は、ＡＧＥｓに対して優れた吸着能を有する吸着剤を提供することを目的とする。本発明のＡＧＥｓ吸着剤は、親水性メタクリレート含有共重合体樹脂でなる、終末糖化産物吸着剤を提供し、該共重合体の構成単位は、特定のメタクリレート系化合物およびビニル化合物でなる。好ましくは、上記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂は、塩基性のイオン交換基を有する。
2007037554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性メタクリレート含有共重合体樹脂でなる、終末糖化産物吸着剤であって、
該共重合体の構成単位が、以下の式［Ｉ］：
2007037554.tif 000014
で表され、
式［Ｉ］において、Ｚは、
2007037554.tif 000015
2007037554.tif 000016
および
2007037554.tif 000017
のうちのいずれかで表される置換エチレン基であり、ｍおよびｎはモル数を示し、ｍとｎとの比は０．１：９９．９〜１５：８５であり、そして
上記式（Ｚ１）において、Ｙは、ピリジル基または以下の式（Ｙ１）で表される含窒素基：
2007037554.tif 000018
（式（Ｙ１）中、Ａはカルボニル基、炭素数１〜８のアルキレン基、アリレーン基、またはアラルキレン基であり、ｐは０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくは置換アルキル基であるが、同時に水素原子ではなく、そしてＮが４級アンモニウムである場合には対イオンが存在してもよい）であり、
上記式（Ｚ２）において、Ｙ１は、上記式（Ｙ１）で表される含窒素基であり、および
上記式（Ｚ３）において、Ｒ４は、炭素数１〜４のアルキル基である、吸着剤。
【請求項２】
前記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂が、塩基性のイオン交換基を有する、請求項１に記載の終末糖化産物吸着剤。
【請求項３】
前記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂が、ポリマーで被膜されている、請求項１または２に記載の終末糖化産物吸着剤。
【請求項４】
前記ポリマーが、２−ヒドロキシエチルメタクリレートポリマーまたはグリコシドエチルメタクリレートポリマーである、請求項３に記載の終末糖化産物吸着剤。
【請求項５】
前記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂が、エチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；２−ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；グリコシドエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；エチレングリコールジメタクリレート架橋３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート塩酸塩共重合体；またはエチレングリコールジメタクリレート架橋トリエチレンテトラミン置換グリシジルメタクリレート共重合体の樹脂である、請求項１に記載の吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）を特異的に吸着する吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＡＧＥｓ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応から始まる一連の反応（メイラード反応）により生じる不可逆的な高分子架橋物質である。これらの反応は、生体内で長期間にわたりゆっくり進行する。例えば、糖尿病の臨床検査項目の１つとして挙げられているヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、赤血球のタンパク質であるヘモグロビンの糖化物であり、ＡＧＥｓの１種である。
ＡＧＥｓは、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病による合併症の原因物質である。また、ＡＧＥｓは、血管内皮細胞に存在する特異的な受容体（ＲＡＧＥ）に結合して糖尿病性血管症の発症に関連することも知られている。現在、わが国において、糖尿病の潜在患者数が１６３０万人にのぼり特に中高年の４．５人に１人が糖尿病予備軍であるとの報告を考慮すると、体内のＡＧＥｓを除去することは、今後の糖尿病合併症の発症・進行を予防する点で非常に重要である。さらに、ＡＧＥｓは、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどの種々の衰弱性疾患の発症にも関与している。
このような背景の下、体内のＡＧＥｓを除去するために、種々の薬剤が提案されている。例えば、ＡＧＥｓ生成抑制剤として、従来からアミノグアニジン、ピリドキサミン誘導体などが知られている。さらに特開２００４−３００１５３号公報には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが開示されている。しかし、これらの生成抑制剤は、将来的なＡＧＥｓの蓄積を予防する点では有効であるものの、既に蓄積されたＡＧＥｓを除去するという課題を解決するものではない。
他方、確立されたＡＧＥ架橋を破壊する物質も検討されており、例えば、Ｎ−臭化フェナシルチアゾリウム（ＰＴＢ）などが知られている。最近では、１，４−ベンゼン−ｂｉｓ［４−メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］などの７種の化合物が報告されている（例えば、特表２００４−５２９１２６号公報）。しかし、これらのＡＧＥ分解効果は、必ずしも十分とはいえない。
このように、蓄積されたＡＧＥｓを除去する点において、効果的な薬剤が開発されていないのが、現状である。
ところで、本発明者は、親水性メタクリレート含有共重合体樹脂を開発し、この樹脂が、リン酸またはシュウ酸に対して優れた吸着能を有することを見出している（特開２００５−１３９４１４号公報）。しかし、この樹脂については、上記吸着能以外の用途は知られていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、糖尿病合併症の原因物質であるＡＧＥｓに対して優れた吸着能を有する吸着剤を提供することにある。
本発明の終末糖化産物吸着剤は、親水性メタクリレート含有共重合体樹脂でなり、該共重合体の構成単位が、以下の式［Ｉ］：
2007037554.tif 000003
で表され、式［Ｉ］において、Ｚは、
2007037554.tif 000004
および
2007037554.tif 000005
のうちのいずれかで表される置換エチレン基であり、ｍおよびｎはモル数を示し、ｍとｎとの比は０．１：９９．９〜１５：８５であり、そして上記式（Ｚ１）において、Ｙは、ピリジル基または以下の式（Ｙ１）で表される含窒素基：
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（式（Ｙ１）中、Ａはカルボニル基、炭素数１〜８のアルキレン基、アリレーン基、またはアラルキレン基であり、ｐは０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくは置換アルキル基であるが、同時に水素原子ではなく、そしてＮが４級アンモニウムである場合には対イオンが存在してもよい）であり、上記式（Ｚ２）において、Ｙ１は、上記式（Ｙ１）で表される含窒素基であり、および上記式（Ｚ３）において、Ｒ４は、炭素数１〜４のアルキル基である。
１つの実施態様においては、上記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂は、塩基性のイオン交換基を有する。
別の実施態様においては、上記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂は、ポリマーで被膜されている。
さらなる実施態様においては、上記ポリマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレートポリマーまたはグリコシドエチルメタクリレートポリマーである。
さらに別の実施態様においては、上記親水性メタクリレート含有共重合体樹脂は、エチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；２−ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；グリコシドエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；エチレングリコールジメタクリレート架橋３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート塩酸塩共重合体；またはエチレングリコールジメタクリレート架橋トリエチレンテトラミン置換グリシジルメタクリレート共重合体の樹脂である。
本発明の終末糖化産物（ＡＧＥｓ）吸着剤は、優れたＡＧＥｓ吸着能を有する。この吸着能は、他の樹脂、特に陰イオン交換樹脂には見られない優れた作用である。この吸着剤は、糖尿病合併症、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどのＡＧＥｓが関与する疾患の治療薬、あるいは血液透析カラム、ＡＧＥｓ単離精製用カラム、食品脱ＡＧＥｓカラム、食品脱色カラム、化粧品などとして利用される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の吸着剤および他の樹脂のＡＧＥ−１に対する吸着能を示すグラフである。
図２は、本発明の吸着剤および他の樹脂のＡＧＥ−２に対する吸着能を示すグラフである。
図３は、本発明の吸着剤または他の樹脂を充填したカラムによる濾過前および濾過後の全血中のＡＧＥ−２濃度を示すグラフである。
図４は、本発明の吸着剤または他の樹脂を充填したカラムによる濾過前および濾過後の全血中の血中総タンパク質濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の終末糖化産物（ＡＧＥｓ）吸着剤は、親水性メタクリレート含有共重合体樹脂（以下、単に共重合体樹脂という）でなる。あるいはポリマーで被膜された共重合体樹脂でなる。以下、共重合体樹脂、共重合体樹脂のポリマーによる被膜化、および該共重合体でなるＡＧＥｓ吸着剤について順次説明する。
（共重合体樹脂）
本発明で用いる共重合体樹脂の構成単位は、以下の一般式［Ｉ］：
2007037554.tif 000007
で表される。この共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、およびグラフト共重合体のいずれであってもよい。
上記一般式［Ｉ］において、Ｚの置換エチレン基は、以下の式（Ｚ１）〜（Ｚ３）：
2007037554.tif 000008
および
2007037554.tif 000009
のうちのいずれかで表される。
上記式（Ｚ１）において、Ｙは、ピリジル基または含窒素基である。ピリジル基は、さらに置換基を有していてもよく、例えば、メチル基などの炭素数が１〜４のアルキル基または水酸基が置換され得る。
上記Ｙの含窒素基は、さらに以下の式（Ｙ１）：
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（式中、Ａはカルボニル基、炭素数１〜８のアルキレン基、アリレーン基、またはアラルキレン基であり、ｐは０または１であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子、または炭素数１〜４のアルキル基もしくは置換アルキル基であるが、同時に水素原子ではなく、そしてＮが４級アンモニウムである場合には対イオンが存在してもよい）で表される。
上記式（Ｙ１）において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の炭素数１〜４のアルキル基もしくは置換アルキル基は、直鎖であってもよく、分岐鎖を有していてもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基などが挙げられる。
上記式（Ｙ１）において、窒素原子は、３級アミンであっても、４級アンモニウムであってもよい。本発明においては、４級アンモニウムが好ましい。このように、共重合体中に塩基性のイオン交換基を有することによって、ＡＧＥｓの吸着量が増加する。
上記式（Ｙ１）は、具体的には、以下の含窒素基である：
−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２（式中、ｎは１〜５の整数である）、
および
−ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＨ（式中、ｎは１〜５の整数である）。
上記式（Ｚ２）において、Ｙ１は上記式（Ｙ１）で表される含窒素基である。
上記式（Ｚ３）において、Ｒ４は、炭素数１〜４のアルキル基である。直鎖のアルキル基であってもよく、分岐鎖を有するアルキル基であってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基などが挙げられる。
上記式［Ｉ］において、ｍおよびｎは、共重合体樹脂の各構成単位のモル数を示す。ｍとｎとの比は、０．１：９９．９〜１５：８５、好ましくは２：９８〜１２：８８、より好ましくは５：９５〜１０：９０、さらに好ましくは７：９３〜９：９１、特に好ましくは８：９２程度である。上記のモル比０．１：９９．９〜１５：８５の範囲を外れる場合、例えば、ｍのモル比が０．１未満の場合は、置換エチレン基が導入されにくく、ＡＧＥｓの吸着量の点で劣る。１５を超える場合は、分子間の架橋が進まず、樹脂マトリクスの少ない非常に硬い樹脂となる。その結果、樹脂内部を吸着に利用できないので、ＡＧＥｓを吸着することが困難となる。
上記共重合体樹脂の中でも、特に、エチレングリコールジメタクリレートとＮ−メチルピリジルエチレンとの共重合体（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ）が、ＡＧＥｓに対する吸着能が高いことから好ましく用いられる。
本発明に用いられる共重合体樹脂は、塩基性のイオン交換基を有することが、ＡＧＥｓに対する吸着能を高める点で好ましい。共重合体樹脂は、上記のとおり、いずれの置換エチレン基中においても窒素原子を有している。したがって、この窒素原子を４級アンモニウム化することによって、強塩基性のイオン交換基を導入できる。上記ＥＧＤＭＡ−４ＶＰを４級アンモニウム化し、かつ塩酸塩化したエチレングリコールジメタクリレートとＮ−メチルピリジルエチレン塩酸塩との共重合体（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩）が特に好ましく用いられる。
本発明に用いられる共重合体樹脂は、例えば、上記の共重合体を構成する単量体となり得る親水性メタクリレート系化合物とビニル化合物とを重合分散媒中で反応させることによって得られる。さらに必要に応じて、アミン付加、４級アンモニウム化などが行われ得る。本発明に用いられる共重合体樹脂の合成方法を以下に説明する。
上記親水性メタクリレート系化合物としては、具体的には、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート類；アルコキシアルキル（メタ）アクリレート類；アミノ（メタ）アクリレート類；アルキルアミノ（メタ）アクリレート類；ポリ（アルキレングリコール）（メタ）アクリレート類などが挙げられる。好ましくは、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）である。
上記ビニル化合物としては、例えば、塩化ビニル、酢酸ビニル、マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、スチレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、４−ビニルピリジン（４−ＶＰ）などが挙げられる。好ましくは４−ビニルピリジン（４−ＶＰ）である。なお、ＧＭＡなどの窒素原子を含まないビニル化合物を用いる場合は、予め、あるいは重合後アミン化が行われる。
上記重合分散媒は、特に制限されない。例えば、ヒドロキシエチルセルロース水溶液などが用いられる。重合分散媒は、必要に応じて、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを添加してもよい。
上記重合反応において、親水性メタクリレート系化合物とビニル化合物との割合は、上記一般式［Ｉ］中のｍおよびｎを満たす範囲で適宜設定される。好ましくは質量比で１：９９〜９９：１、より好ましくは３：９７〜４０：６０、さらに好ましくは５：９５〜２０：８０である。反応温度および反応時間についても用いる化合物の種類、目的とする共重合体の組成などに応じて適宜設定すればよい。
重合終了後、必要に応じて、具体的には、窒素原子を含まないビニル化合物を用いた場合に、アミン付加を行う。アミン付加は、例えば、アンモニア、トリエチレンテトラミンなどを用いて当業者が通常用いる方法により行われる。このようにして、本発明に用いられる親水性メタクリレート含有共重合体樹脂が得られる。
得られた共重合体樹脂は、必要に応じて、共重合体中に存在する窒素原子を４級アンモニウム化する。これによって、強塩基性のイオン交換基が導入される。４級アンモニウム化は、例えば、上記共重合体樹脂にブロモメタンなどを反応させることによって行われる。上記共重合体樹脂とブロモメタンとの割合は、強塩基性のイオン交換基の導入率に応じて適宜設定すればよく、特に制限されない。好ましくは上記共重合体樹脂とブロモメタンとが質量比で１００：１〜１：１、より好ましくは５０：１〜５：１、さらに好ましくは１０：１程度である。得られた共重合体樹脂は、さらに必要に応じて、塩酸などで塩にされる。
（共重合体樹脂のポリマーによる被膜化）
上記の共重合体樹脂は、さらにポリマーにより被膜することが好ましい。特に共重合体樹脂よりも親水性が高いポリマーで被膜することによって、体内投与する場合に胃や腸などへの負担をより軽減することができる。さらに胃内で食物と混和しやすくなる（Ｈ．ＩｎｏｕｅおよびＳ．Ｙａｍａｇｉｓｈｉ、Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００５年、第２巻、第３号、第２５０−２５４頁参照）。親水性が高いポリマーとしては、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、グリコシドエチルメタクリレート（ＧＥＭＡ）、メタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）などが挙げられる。これらのポリマーは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよく、さらに、これらのポリマーの共重合体であってもよい。共重合体としては、例えば、ＧＭＡ−ＨＥＭＡ共重合体、ＧＭＡ−ＧＥＭＡ共重合体などが挙げられる。
被膜化は、当業者が通常用いる方法により行われる。例えば、上記ポリマーを含む溶液（例えば、ＤＭＳＯ溶液、水溶液など）中に、共重合体樹脂を浸漬させ、乾燥することによって行われる。
（ＡＧＥｓ吸着剤）
本発明のＡＧＥｓ吸着剤は、上記共重合体樹脂でなる。特に好ましくは、エチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；２−ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；グリコシドエチルメタクリレートとメタクリル酸グリシジルとの共重合体ポリマーで被膜されたエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体；エチレングリコールジメタクリレート架橋３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート塩酸塩共重合体；またはエチレングリコールジメタクリレート架橋トリエチレンテトラミン置換グリシジルメタクリレート共重合体の樹脂でなる。このＡＧＥｓ吸着剤は、他の樹脂、特に陰イオン交換樹脂にはみられない優れたＡＧＥｓ吸着能を有する。特に共重合体樹脂に塩基性のイオン交換基を導入することによって、より優れたＡＧＥｓ吸着能が得られる。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤は、例えば、糖尿病合併症、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどのＡＧＥｓが関与する疾患の治療薬、あるいは血液透析カラム、ＡＧＥｓ単離精製用カラム、食品脱ＡＧＥｓカラム、食品脱色カラム、化粧品などとして利用される。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤に吸着されるＡＧＥｓは、当業者において通常知られるＡＧＥｓであり、特に制限されない。ＡＧＥとしては、例えば、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７，７８３（２００１）に定義されるＡＧＥ−１およびＡＧＥ−２、ペントシジン、クロストリン、Ｘ１（フルオロリンク）、ピロピリジン、ピラリン、カルボキシメチルリジン、イミダゾロン化合物、カルボキシエチルリジン、メチルグリオキサールダイマー、グリオキサールダイマー、イミダゾリジン、アルグピリミジンなどが挙げられる。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤を治療薬として用いる場合、この吸着剤は、通常経口投与、ゾンデ投与、または注腸投与（直腸投与）される。経口投与する場合、カプセル剤、錠剤、粉末（散剤）、顆粒剤、懸濁剤などの形態で投与され得る。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤を治療薬として用いる場合、投与量は、成人１日当たり１０ｍｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重となるように設定することが好ましい。１０ｍｇ／ｋｇ体重未満の場合、十分な効果が得られない場合がある。２００ｍｇ／ｋｇ体重を超える場合は、腸に負担をかける場合がある。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤をカラムとして用いる場合、使用量および使用態様は特に制限されない。例えば、慢性および急性の透析患者に対して行う血液透析（Ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ）の流路に、上記吸着剤を充填したカラムを直列に設置することによって使用する。あるいは食品脱ＡＧＥｓカラムまたは食品脱色カラムとして、液状食品あるいは液状成分を、上記吸着剤を充填したカラムに通液することによって使用する。
本発明のＡＧＥｓ吸着剤を化粧品として用いる場合、例えば、ＡＧＥｓ吸着剤を粉砕し、化粧クリームなどに混合することによって使用する。
【実施例】
【０００６】
（実施例１：エチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ）塩酸塩共重合体（１）の製造およびＡＧＥｓ吸着能の評価）
（１）試薬
エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ；１級試薬、和光純薬工業株式会社）は、１０％水酸化ナトリウム水溶液で洗浄して重合禁止剤を除去した後、重合反応に供した。なお、反応に供するまで、窒素置換した保存容器内で保存した。４−ビニルピリジン（４ＶＰ、和光純薬工業株式会社）は、予め減圧蒸留して用いた。重合開始剤のアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ；特級試薬、和光純薬工業株式会社）はそのまま用いた。
（２）重合分散媒の調製
０．５ｗ／ｖ％ヒドロキシエチルセルロース水溶液に、塩化ナトリウムが１０ｗ／ｖ％となるように添加して重合分散媒を調製した。
（３）合成
温度計、テフロン（登録商標）製の二枚攪拌羽根（羽根径８０ｍｍ）を備えた攪拌装置、ジムロート、およびアルゴン導入管を装着した１０００ｍＬ容量のセパラブル三頚丸底フラスコに、重合分散媒５００ｍＬを入れた。窒素気流下、４００ｒｐｍで約１０分間攪拌した後、攪拌速度を３００ｒｐｍに調節した。次いで、ＥＧＤＭＡと４−ＶＰとを８０：２０の質量比で混合した混合物１００ｍＬに、１００ｍｇのＡＩＢＮを溶解させてモノマー混合溶液を調製し、この混合溶液を重合分散媒中に注入した。
光学顕微鏡下で、球状のモノマー相が良好に重合分散媒中に分散したことを確認した後、３０分〜４０分かけて７０℃まで昇温させ、７０℃に保持して４時間重合した。さらに８０℃に昇温した後、１時間反応させ、その後、５時間以上かけてゆっくり冷却して反応生成物を得た。反応生成物を吸引濾過し、熱脱イオン水で３回洗浄し、さらに、脱イオン水とメタノールとの等容量混合液で洗浄した後、６０℃にて１２時間乾燥させた。その後、減圧下にて１昼夜乾燥させてエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン共重合体を得た。
得られた共重合体について、さらにブロモメタンを反応させた。次いで、反応生成物をイオン水とメタノールとの等容量混合液で洗浄し、乾燥させることによって４級アンモニウム化された遊離塩基形ポリマーを得た。
次いで、遊離塩基形ポリマーの元素分析を行い、窒素含量を測定した。遊離塩基形ポリマー約５ｇを１００ｍＬ容量のビーカーに入れ、脱イオン水を加えて十分に膨潤させた後、ガラス棒で攪拌しながら、測定した窒素含量の４０ｍｏｌ％に相当する１Ｎ塩酸を加えた。１晩以上室温で放置した後、懸濁液上清のｐＨが５〜６であること、および上清に０．１Ｍ硝酸銀を滴下しても白濁しないことにより塩酸塩化を確認した。さらにイオン水とメタノールとの等容量混合液で洗浄した後、十分に乾燥させて、以下の式に示すエチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）とする）を得た。
2007037554.tif 000011
得られたＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）について、元素分析装置（ＭＴ−７００ＨＣＮ、ヤナコ分析工業）を用いて分析したところ、炭素元素５７．８１％、水素元素６．７０％、および窒素元素１．９８％であった。窒素含量が低く、４−ＶＰに相当する置換基はあまり導入されていなかった。
（４）ＡＧＥｓ吸着能の評価
チューブに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＡＧＥ−１（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７，７８３（２００１）に定義される）をそれぞれ約２００μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入れ、樹脂添加前のＡＧＥ−１量を抗ＡＧＥ−１ポリクローナル抗体（北陸大学薬学部  竹内正義教授より供与）を用いるＥＬＩＳＡ法により、総タンパク質量（ＡＧＥ−１とＢＳＡとの合計量）をローリー法（Ｌｏｗｒｙ法）により実測した。次いで、さらに上記（３）で得られたＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）５０ｍｇを添加し、３７℃にて３時間チューブを回転させて攪拌した。攪拌後、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、上清を得た。この上清のＡＧＥ−１量および総タンパク質量を測定した。上清の測定値と、樹脂添加前の測定値の差を、それぞれＡＧＥ−１の吸着量およびタンパク質の総吸着量とした。さらに、得られた総タンパク質の吸着量と、ＡＧＥ−１の吸着量との差から、ＢＳＡの吸着量を求めた。以下の式から樹脂のＡＧＥ−１に対する吸着能を評価した。結果を図１に示す：
ＡＧＥ吸着能＝ＡＧＥの吸着量／ＢＳＡの吸着量
次いで、ＡＧＥ−１の代わりに、ＡＧＥ−２（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７，７８３（２００１）に定義される）を用い、かつ抗ＡＧＥ−１ポリクローナル抗体の代わりに、抗ＡＧＥ−２ポリクローナル抗体（北陸大学薬学部  竹内正義教授より供与）を用いたこと以外は、上記と同様にして、ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）のＡＧＥ−２に対する吸着能を評価した。結果を図２に示す。
（実施例２：ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩共重合体（２）の製造およびＡＧＥｓ吸着能の評価）
ＥＧＤＭＡと４−ＶＰとの割合を１０：９０の質量比としたこと以外は、実施例１と同様にして、エチレングリコールジメタクリレート架橋Ｎ−メチルピリジルエチレン塩酸塩共重合体（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（２）とする）を得た。得られたＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（２）について、元素分析装置（ＭＴ−７００ＨＣＮ、ヤナコ分析工業）を用いて分析したところ、炭素元素５３．１０％、水素元素６．８３％、および窒素元素８．９４％であった。ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）に比べて窒素含量が高く（４倍以上）、４−ＶＰに相当する置換基が多く導入されていることを確認した。このＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（２）を用いて、実施例１と同様にして、ＡＧＥ−１およびＡＧＥ−２に対する吸着能を評価した。結果を図１および図２にそれぞれ示す。
（比較例１および２）
ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）の代わりに、Ｓｅｖｅｌａｍｅｒ  ＨＣｌ（陰イオン交換樹脂；キリンビール株式会社）およびクレメジン（活性型表面を有する炭（非選択性吸着）；三共株式会社）をそれぞれ用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ＡＧＥ−１およびＡＧＥ−２に対する吸着能を評価した（それぞれ比較例１および２とする）。結果を図１および図２にそれぞれ示す。
図１および２に示すように、実施例１および２のＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）および（２）が、比較例１および２の樹脂に比べて、ＡＧＥ−１およびＡＧＥ−２のいずれに対しても優れた吸着能を有していた。このことは、本発明の吸着剤が、ＡＧＥｓを選択的に吸着し、高いＡＧＥ吸着能を有することを示す。さらに、実施例１の４−ＶＰに相当する置換基の導入率が低いＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）においても、優れたＡＧＥｓ吸着能を示したことから、この吸着能は、形成された樹脂マトリックスにＡＧＥが選択的に捕捉されることによるものと考えられる。実施例２のＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩共重合体樹脂（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（２））は、特に高いＡＧＥｓ吸着能を有していた。
（実施例３：ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩共重合体の被膜化１）
被膜用ポリマーとして、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ；１級試薬、和光純薬工業株式会社）と、メタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ、ナカライテスク株式会社）との共重合体ポリマーを以下のようにして調製した。まず、これらの試薬に含まれる重合禁止剤（ヒドロキシモノメチルエーテル）を除去するために減圧蒸留を行った。次いで、５０ｍＬのエタノールに、１２ｍＬのＨＥＭＡおよび６０μＬのＧＭＡを、４００ｍｇのα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（重合開始剤；ナカライテスク株式会社）の存在下、６０℃にて１０時間重合させた。得られたＧＭＡ−ＨＥＭＡ共重合体ポリマーをアセトン中に滴下してビーズ状に成形し、濾過により回収した。さらに真空乾燥し、さらに粉砕機で粉砕してＧＭＡ−ＨＥＭＡ共重合体ポリマーの粉末を得た。
上記で得られたＧＭＡ−ＨＥＭＡ共重合体ポリマーの粉末１０ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５０ｍＬに溶解した。この溶液中に、上記実施例１で得たＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩共重合体（ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１））２０ｇを入れ、十分浸漬させた後、濾過し、風乾し、さらに真空乾燥器中で１２０℃にて乾燥させて、被膜されたＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）を得た。このＧＭＡ−ＨＥＭＡ被膜ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）は、被膜していないものと同等のＡＧＥｓ吸着能を有していた。
（実施例４：ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ塩酸塩共重合体の被膜化２）
ＨＥＭＡの代わりに、グリコシドエチルメタクリレート（ＧＥＭＡ；日本精化株式会社）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、ＧＭＡ−ＧＥＭＡ共重合体ポリマーの粉末を得た。その後、実施例３と同様にして操作して、ＧＭＡ−ＧＥＭＡ共重合体ポリマーで被膜されたＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）を得た。このＧＭＡ−ＧＥＭＡ被膜ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）は、被膜していないものと同等のＡＧＥｓ吸着能を有していた。
（実施例５：ＥＧＤＭＡ架橋３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＡＨＰＭＡ）塩酸塩共重合体ポリマーの製造）
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（１）試薬
ＥＧＤＭＡ（１級試薬、和光純薬工業株式会社）は、１０％水酸化ナトリウム水溶液で洗浄して重合禁止剤を除去した後、重合反応に供した。なお、反応に供するまで、窒素置換した保存容器内で保存した。グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ；１級試薬、和光純薬工業株式会社）は、予め減圧蒸留して用いた。重合開始剤のアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ；特級試薬、和光純薬）はそのまま用いた。
（２）重合分散媒の調製
ヒドロキシエチルセルロース（東京化成工業株式会社）を１ｗ／ｖ％の割合で含む水溶液（４５００〜６０００ｃｐｓ）５０ｍＬに、硫酸ナトリウム（特級試薬、ナカライテスク株式会社）６ｇを混合し、脱イオン水で全量を５００ｍＬとして重合分散媒を調製した。
（３）合成
温度計、テフロン（登録商標）製の二枚攪拌羽根（羽根径８０ｍｍ）を備えた攪拌装置、ジムロート、および窒素導入管を装着した１０００ｍＬ容量のセパラブル三頚丸底フラスコに、重合分散媒５００ｍＬを入れた。窒素気流下、４００ｒｐｍで約１０分間攪拌した後、攪拌速度を２５０ｒｐｍに調節した。
次いで、ＧＭＡを２８．５ｇ、ＥＧＤＭＡを１．５ｇ、およびＡＩＢＮを１００ｍｇ混合し、この混合物を重合分散媒中に注入した。
光学顕微鏡下で、球状のモノマー相が良好に重合分散媒中に分散したことを確認した後、約１時間かけて５０℃まで昇温させ、５０℃に保持して２時間重合した。さらに約３０分かけて８０℃に昇温した後、１時間反応させた。生成物を吸引濾過して回収し、熱脱イオン水で３回洗浄し、さらに、メタノールで洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥し、さらにデシケーター内で減圧下、一晩乾燥させた。
次いで、ドライアイス−アセトン浴で十分に冷却した２００ｍＬ容量の耐圧反応容器に、エタノール３０ｍＬを入れ、アンモニアガスを約２０分間注入した。上記の乾燥させた生成物１０ｇを耐圧反応容器に入れ、よく振り混ぜた後、６０℃の水浴中で１０時間反応させた。ドライアイスーアセトン浴上で冷却しながら開封した後、反応生成物を脱イオン水中に移し、未反応のアンモニアが蒸発するまで、ドラフト内に放置した。反応生成物をガラス製カラム管に入れ、流出液のｐＨが６〜７になるまで脱イオン水とメタノールとの等容量混合液で洗浄し、メタノールで再度洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥させ、さらにデシケーター内で減圧下、約１２時間乾燥させた。得られたポリマーの赤外吸収スペクトルをＤＲ−８０００（島津製作所、３ＦＴ０１）を用いて測定したところ、ＥＧＤＭＡ−ＡＨＰＭＡ共重合体ポリマーであることを確認した。
さらに、以下のようにして共重合体ポリマーの塩酸塩化を行った。まず、上記で得られたＥＧＤＭＡ−ＡＨＰＭＡ共重合体ポリマーの元素分析を行い、窒素含量を測定した。該共重合体ポリマー４．８ｇを１００ｍＬ容量のビーカーに入れ、脱イオン水を加えて十分に膨潤させた後、ガラス棒で攪拌しながら、測定した窒素含量の４０ｍｏｌ％に相当する１Ｎ塩酸を滴下した。滴下量は、７．０２ｍＬであった。約１２時間室温で放置した後、懸濁液上清のｐＨが５〜６であること、および上清に０．１Ｍ硝酸銀を滴下しても白濁しないことにより塩酸塩化を確認した。さらにガラス製カラム管に入れ、メタノールで洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥し、さらにデシケーター内で減圧下、約２４時間乾燥させてＥＧＤＭＡ−ＡＨＰＭＡ塩酸塩共重合体ポリマーを得た。次いで、ＪＩＳ規格２４メッシュ篩を用いて粒子径７１０μｍ以下の共重合ポリマーを回収した。
（実施例６：ＥＧＤＭＡ架橋３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＡＨＰＭＡ）塩酸塩共重合体ポリマーの製造）
ＧＭＡを２７．０ｇ、ＥＧＤＭＡを３．０ｇとしたこと以外は、実施例５と同様に操作して、ＥＧＤＭＡ−ＡＨＰＭＡ塩酸塩共重合体ポリマーを得た。なお、１Ｎ塩酸の滴下量は、共重合体ポリマー４．９９ｇに対して、７．３０ｍＬであった。
（実施例７：ＥＧＤＭＡ架橋トリエチレンテトラミン置換グリシジルメタクリレート（ＴＴＡ置換ＧＭＡ）共重合体ポリマーの製造）
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（１）試薬
ＥＧＤＭＡは、１０％水酸化ナトリウム水溶液で洗浄して重合禁止剤を除去した後、重合反応に供した。ＧＭＡは、予め減圧蒸留（６ｍｍＨｇ、７６℃）して用いた。トリエチレンテトラミン（ＴＴＡ；１級試薬、和光純薬工業株式会社）は、減圧蒸留して用いた。重合開始剤のＡＩＢＮはそのまま用いた。なお、ＥＧＤＭＡおよびＧＭＡは反応に供するまで、窒素置換した保存容器内で保存した。
（２）重合分散媒の調製
ヒドロキシエチルセルロース（東京化成工業株式会社）を１ｗ／ｖ％の割合で含む水溶液（４５００〜６０００ｃｐｓ）５０ｍＬに、硫酸ナトリウム（特級試薬、ナカライテスク株式会社）６ｇを混合し、脱イオン水で全量を５００ｍＬとして重合分散媒を調製した。
（３）合成
温度計、テフロン（登録商標）製の二枚攪拌羽根（羽根径８０ｍｍ）を備えた攪拌装置、ジムロート、および窒素導入管を装着した１０００ｍＬ容量のセパラブル三頚丸底フラスコに、重合分散媒５００ｍＬを入れた。窒素気流下、４００ｒｐｍで約１０分間攪拌した後、攪拌速度を２５０ｒｐｍに調節した。
次いで、ＧＭＡを２９．４ｇ、ＥＧＤＭＡを０．６ｇ、およびＡＩＢＮを１００ｍｇ混合し、この混合物を重合分散媒中に注入した。
光学顕微鏡下で、球状のモノマー相が良好に重合分散媒中に分散したことを確認した後、約１時間かけて５０℃まで昇温させ、５０℃に保持して２時間重合した。さらに約３０分かけて８０℃に昇温した後、１時間反応させた。生成物を吸引濾過して回収し、熱脱イオン水で３回洗浄し、さらに、メタノールで洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥し、さらにデシケーター内で減圧下、一晩乾燥させた。
約３０ｇの乾燥させた生成物をＪＩＳ規格２２、３０、４２、６０、８３、１００、１４０、および２００メッシュ篩を順次重ねた篩機に投入し、３０分間振盪分級を行った。１００〜４２メッシュ（１４９〜３５５μｍ）および４２〜３０メッシュ（３５５〜５００μｍ）画分を回収し、以下の合成に供した。
２００ｍＬ容量の耐圧反応容器に、上記の画分を５ｇ、ＴＴＡを１２．５ｍＬ、および１，４−ジオキサンを３７．５ｍＬ入れ、よく振り混ぜた後、８０℃の水浴中で５時間反応させた。耐圧反応容器を開封した後、反応生成物を脱イオン水中に移し、反応生成物を吸引濾過して回収した。反応生成物をガラス製カラム管に入れ、０．１Ｎの塩酸水溶液および０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、流出液のｐＨが６〜７になるまで脱イオン水で洗浄した。さらに、得られた反応生成物を、５Ｂ濾紙を用いたブフナーロートにより吸引しながらメタノールで洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥し、さらにデシケーター内で減圧下、約１２時間乾燥させた。得られたポリマーの赤外吸収スペクトルをＤＲ−８０００（島津製作所、３ＦＴ０１）を用いて測定したところ、ＥＧＤＭＡ−ＴＴＡ置換ＧＭＡ共重合体ポリマーであることを確認した。
さらに、以下のようにして共重合体ポリマーの塩酸塩化を行った。まず、上記で得られたＥＧＤＭＡ−ＴＴＡ置換ＧＭＡ共重合体ポリマーの元素分析を行い、窒素含量を測定した。該共重合体ポリマー約２ｇを５０ｍＬ容量の三角フラスコに入れ、脱イオン水を加えて十分に膨潤させた後、ガラス棒で攪拌しながら、測定した窒素含量に相当する量の１Ｎ塩酸を滴下した。約１２時間室温で放置した後、反応液を５Ｂ濾紙を用いたブフナーロートにより吸引濾過し、さらに濾物をメタノールで洗浄した。その後、６０℃にて１２時間乾燥し、さらにデシケーター内で減圧下、約２４時間乾燥させてＥＧＤＭＡ−ＴＴＡ置換ＧＭＡ塩酸塩共重合体ポリマーを得た。
（実施例８：ＥＧＤＭＡ架橋トリエチレンテトラミン置換グリシジルメタクリレート（ＴＴＡ置換ＧＭＡ）共重合体ポリマーの製造）
ＧＭＡを２８．５ｇ、ＥＧＤＭＡを１．５ｇとしたこと以外は、実施例７と同様に操作して、ＥＧＤＭＡ−ＴＴＡ置換ＧＭＡ塩酸塩共重合体ポリマーを得た。
（実施例９：カラムにおけるＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）樹脂の使用）
（１）ＡＧＥ−２の生成
１８０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（和光純薬株式会社）および３９ｍｇのジエチレントリアミン五酢酸（キレート剤；和光純薬株式会社）を、５０ｍＬのファルコンチューブに入れた。当該ファルコンチューブに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２０ｍＬ添加して、ボルテックスミキサーにて溶解した。用いたリン酸緩衝液は、２４ｇ／Ｌの０．２Ｍリン酸二水素ナトリウムをビーカーに入れ、ｐＨが７．４になるようにｐＨメーターで確認しながら２８．３９ｇ／Ｌの０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムを９５ｍＬ加えて調製した。次いで、当該ファルコンチューブにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；脂肪酸非含有、ナカライテスク株式会社）を５００ｍｇ添加し、ボルテックスミキサーにて溶解した。溶解後、この溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）に通し、無菌溶液を得た。この無菌溶液を入れた５０ｍＬファルコンチューブの蓋をパラフィルムにて密封し、３７℃で１週間インキュベートした。次いで、未反応のＤＬ−グリセルアルデヒドを除くために、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）にかけ、溶出液をＨＰＬＣ（ギルソン社製）で確認した。ＡＧＥ−２を検出した画分を集め、必要に応じて、溶出液は透析で濃縮してＡＧＥ−２を得た。
（２）抗ＡＧＥ−２モノクローナル抗体の作製
マウスを用いて、上記（１）で得たＡＧＥ−２を抗原としたモノクローナル抗体を作製した（東洋紡株式会社に委託）。
（４）ＡＧＥｓ吸着能の評価
実施例１にて製造したＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）樹脂５ｍＬを５ｍＬカラムに充填した。同様に、陰イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗ（ダウケミカル株式会社）５ｍＬを別の５ｍＬカラムに充填し、対照として用いた。
ＳＤラット（雄１０週齢）より採血したナトリウムヘパリン（清水製薬株式会社）混入全血を準備した。これらの全血に、上記（１）で得たＡＧＥ−２を１００μｇ／ｍＬとなるように混合した。
上記で準備したカラムにチューブを連結し、ペリスタポンプ（アズワン株式会社）にて１ｍＬ／分となるように、２０ｍＬの全血を流した。実験は室温（２０℃）で行った。カラムを通過した全血を、３０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離し、上清のみを取り出した。
上記（２）で得たモノクローナル抗体およびＥＬＩＳＡ作製キット（ナカライテスク株式会社）を用いてＡＧＥ−２用ＥＬＩＳＡを作製し、全血のカラム通過前および後の各試料中のＡＧＥ−２濃度を測定した。また、これらの試料中に含まれる全てのタンパク質の濃度をローリー法により測定した。
上記ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）樹脂を充填したカラムまたは陰イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗを充填したカラムに全血を通過させた場合のＡＧＥ−２濃度および血中総タンパク質濃度をそれぞれ図３および図４に示す。図３および図４に示されるように、陰イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗを充填したカラムでは、濾過前に比べてＡＧＥ−２濃度および血中の総タンパク質濃度ともが減少していた。これに対して、ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）樹脂を充填したカラムでは、ＡＧＥ−２濃度が大きく減少したが、血中の総タンパク質濃度はあまり減少していなかった。このように、ＥＧＤＭＡ−４ＶＰ（１）樹脂を充填したカラムは、ＡＧＥ−２に対して選択的な吸着能を有することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の終末糖化産物（ＡＧＥｓ）吸着剤は、優れたＡＧＥｓ吸着能を有する。この吸着能は、他の樹脂、特に陰イオン交換樹脂には見られない優れた作用である。この吸着剤は、糖尿病合併症、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどのＡＧＥｓが関与する疾患の治療薬、あるいは血液透析カラム、ＡＧＥｓ単離精製用カラム、食品脱ＡＧＥｓカラム、食品脱色カラム、化粧品などとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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