(57)【要約】本発明は、新規タンパク質キナーゼNRHK1を利用する組成物、有機体および方法を提供する。この新規タンパク質キナーゼは、21エキソンを含む、ヒト遺伝子によってコードされている。ヒトゲノムは、ヒトクロモソーム9の9q34座内またはその近くに局在する。新規ヒトタンパク質とNIMA−関連キナーゼのコンセンサス配列間の配列類似性により、本新規ヒトタンパク質が、NIMA−関連キナーゼとして機能しうることが示唆される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
核酸配列が、
（ａ）配列番号：１に示される核酸配列、
（ｂ）（ａ）の相補物、および
（ｃ）遺伝コードの縮重のために、（ａ）または（ｂ）とは異なる核酸配列
からなる群から選択される、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
核酸配列が、
（ａ）配列番号：３に示される核酸配列、
（ｂ）（ａ）の相補物、および
（ｃ）遺伝コードの縮重のために、（ａ）または（ｂ）とは異なる核酸配列
とからなる群から選択される、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
核酸配列のバリアントを含む単離ポリヌクレオチドであって、核酸配列が配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードしており、バリアントおよび該核酸配列が少なくとも９１％の配列同一性を有するところの、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
バリアントおよび該核酸配列が少なくとも９５％の配列同一性を有するところの、請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補物からなるポリヌクレオチドにハイブリッド形成する単離ポリヌクレオチドであって、少なくとも１０００の核酸からなり、配列番号：４〜５のヌクレオチド配列もその相補物も含まないところの、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
高ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補物からなるポリヌクレオチドにハイブリッド形成する単離ポリヌクレオチドであって、少なくとも２０００の核酸からなり、タンパク質キナーゼをコードしているところの、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：２の断片を含む単離ポリペプチドであって、該断片が少なくとも５００の配列番号：２の保存アミノ酸残基を含むところの、単離ポリペプチド。
【請求項９】
断片が配列番号：２からなるところの、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号：２の断片のバリアントを含む単離ポリペプチドであって、該断片が少なくとも５００の配列番号：２の保存アミノ酸残基を含むところの、ポリペプチド。
【請求項１１】
バリアントおよび該断片が少なくとも９５％の配列同一性を有するところの、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
１０５Ｍ−１以下の結合親和性で配列番号：２に示されるアミノ酸配列に結合可能な抗体。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２の抗体、または
（ｂ）配列番号：１またはその相補物のヌクレオチド配列にハイブリッド形成するプローブ、
を含むＮＲＨＫ１検出キット。
【請求項１４】
請求項１のポリヌクレオチドまたはそのバリアントを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはそのバリアントを含むヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
動物のゲノム中の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が機能的に崩壊し、該遺伝子が配列番号：２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている、ヒト以外の動物。
【請求項１７】
ＮＲＨＫ１キナーゼに結合可能な薬剤を同定するための方法であって、
候補薬剤を
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２の断片、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のバリアント、
を含むポリペプチドと接触させること、および
該候補薬剤と該ポリペプチド間の結合を検出すること、
を含む方法。
【請求項１８】
ＮＲＨＫ１キナーゼの活性のレベルの調整能を有する薬剤を同定する方法であって、
候補薬剤を
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号：２の生物学的に活性な部分、
を含むポリペプチドと接触させること、および
該ポリペプチドの活性のレベルの変化を検出すること、
を含む方法。
【請求項１９】
医薬上許容される担体およびＮＲＨＫ１活性またはＮＲＨＫ１遺伝子発現を調整する薬剤を含む、ＮＲＨＫ１−関連疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２０】
対象における、ＮＲＨＫ１−関連疾患を予防または処置するための方法であって、
有効量の請求項１９の医薬組成物を対象内に導入する工程を含む、方法。
【請求項２１】
ＲＮＡ干渉によってヒトＮＲＨＫ１遺伝子発現の阻害能を有するポリヌクレオチド。
【請求項２２】
表４から選択した、ｓｉＲＮＡセンス鎖またはｓｉＲＮＡアンチセンス鎖を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ヒトＮＲＨＫ１遺伝子を発現している細胞内に、請求項２１のポリヌクレオチドを導入し、それによってＲＮＡ干渉によって、該細胞中の該遺伝子の発現を阻害することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、2002年10月10日付け出願の米国仮出願明細書番号第60/417,155号、発明の名称「新規ヒトキナーゼを使用する組成物、有機体および方法」の内容を本明細書の一部とする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、新規ヒトタンパク質キナーゼ、NIMA−関連ヒトキナーゼ1（NRHK1）を使用する組成物、有機体および方法論に関し、このキナーゼは、チロシンタンパク質キナーゼおよびセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの触媒ドメインに相同的な配列を持ち、NIMA−関連タンパク質キナーゼに遠縁で関連する。本発明は、キナーゼ関連疾患、とりわけ、NRHK1の異常な発現に関連した疾患を診断、予防および治療するために使用可能である。
【技術背景】
【０００３】
タンパク質キナーゼは、リン酸基をタンパク質に加えることによって、多くの異なる細胞増殖、分化、およびシグナル伝達工程を調整する。制御されていないシグナル伝達が、炎症、がん、動脈硬化および乾癬を含む、種々の疾患状態に関連してきた。可逆的タンパク質リン酸化が、真核細胞の制御活性のための、主要な戦略である。典型的な哺乳動物細胞に活性のある10,000のタンパク質の1,000を越えるものがリン酸化されると推定されている。活性化を駆動する、タンパク質キナーゼによって、高エネルギーリン酸が、一般的に、アデノシン三リン酸分子（ATP）から、特定のタンパク質へ伝達され、およびタンパク質ホスファターゼによって、タンパク質から除去される。リン酸化は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、増殖および分化因子など）、細胞周期チェックポイント、および環境または栄養ストレスに対する応答で起こる。リン酸化工程は、分子スイッチにおける分岐点に、おおよそ似ている。スイッチが入ると、適切なタンパク質キナーゼが、代謝酵素、調整タンパク質、レセプター、細胞骨格タンパク質、イオンチャネルまたはポンプ、または転写因子を活性化する。
【０００４】
キナーゼは、最も広く知られているタンパク質群、非常に多様な機能および特異性を持つ酵素のスーパーファミリーを含む。これらは通常、基質、それらの調整分子、またはいくつかの変異表現系の観点の後に命名される。基質に関しては、タンパク質キナーゼが、大まかに2つの群に分類出来る。リン酸化チロシン残基（タンパク質チロシンキナーゼ、PTK）およびリン酸化セリンまたはスレオニン残基（セリン／スレオニンキナーゼ、STK）である。2、3のタンパク質キナーゼは、二重特異性を持ち、スレオニンおよびチロシン残基をリン酸化する。ほとんど全てのキナーゼが、類似の250〜300アミノ酸触媒ドメインを含む。キナーゼドメインの第一次構造は保存されており、さらに、11サブドメインに分類出来る。I〜IVのサブドメインを含む、キナーゼドメインのN−末端が、一般的に、ATP（またはGTP）ドナー分子に結合し、指向するローブ様構造に折りたたまれる。キナーゼドメインのC末端が、サブドメインVI〜XIを含む、大きなローブを形成し、タンパク質基質に結合し、ATPから、セリン、スレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基への、ガンマリン酸の伝達を実施する。サブドメインVが、2つのローブを広げる。11サブドメインそれぞれが、そのようなサブドメインの特徴であり、非常に保存されている、特異的残基およびアミノ酸のモチーフまたはパターンを含む。
【０００５】
キナーゼは、キナーゼドメインのいずれかの側上に局在するか、またはそのループ内に挿入された、異なるアミノ酸配列（一般的に5〜100残基）によって、ファミリーに分類しうる。認識し、その標的タンパク質と相互作用するので、これらの添加アミノ酸配列によって、それぞれのキナーゼの調整が可能になる。
【０００６】
リン酸部位の存在により、多重の経路で、タンパク質機能が調整される。共通の機構が、酵素の触媒的特性（VmaxおよびKm）の変化に関わり、その活性化または不活性化を導く。
【０００７】
第二の広く認識された機構が、タンパク質−タンパク質相互作用を促進することに関わる。この例は、リガンド活性化EGFレセプターチロシンキナーゼのチロシン自己リン酸化である。この事象により、レセプターのC−末端細胞内ドメイン上のリン酸チロシン残基の、アダプター分子Grb2のSHモチーフへの高親和性結合が引き起こされる。ついでGrb2が、そのSH3モチーフを介して、SHCのような、第二アダプター分子へ結合する。この複合体の形成によって、EGFの生物学的効果の原因である、シグナル伝達事象が活性化される。セリンおよびスレオニンリン酸化事象がまた、リン酸セリンおよびリン酸スレオニンの、多様なタンパク質に存在するWWモチーフへの高親和性結合によって仲介される、タンパク質−タンパク質相互作用事象を介して、その生物学的機能を発揮すると認識されきている。
【０００８】
タンパク質リン酸化の第三の重要な結果は、基質の細胞内局在化における変化である。例として、非常に多様なタンパク質の核持ち込みおよび持ち出し事象が、タンパク質リン酸化によって調整される。
【０００９】
多くのキナーゼが、調整カスケードに関わり、そこでそれらの基質が、その活性が、そのリン酸化状態によって調整される、他のキナーゼを含みうる。結局のところ、下流のエフェクターの活性は、そのような経路の活性化の結果である、リン酸化によって調整される。
【発明の要約】
【００１０】
本発明は、新規ヒトタンパク質キナーゼを用いる組成物、有機体および方法論を開示している。新規ヒトタンパク質キナーゼは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ、pキナーゼおよびチロシンキナーゼの触媒部位のコンセンサス配列と相同的な配列を共有する。新規タンパク質はまた、NIMA−関連キナーゼのキナーゼドメインに対して相同性を示す。本タンパク質をコードしている遺伝子は、ヒトクロモソーム9の座9q34の近くに局在している。この新規遺伝子は、本明細書以下では、NIMA−関連ヒトキナーゼ（NRHK1）遺伝子と呼び、そのコードされているタンパク質（類）を、NRHK1またはNRHK1キナーゼと呼ぶ。
【００１１】
NRHK1中のキナーゼドメインは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの触媒ドメインのコンセンサス配列と100％配列アライメントを示し、pキナーゼドメインのコンセンサス配列と100％配列アライアンス、チロシンキナーゼの触媒ドメインのコンセンサス配列と87.5％配列アライメント、およびNIMA−関連タンパク質キナーゼのキナーゼドメインと28％配列アライメントを示す。種々のキナーゼドメインの有用性が、本技術分野で知られている。固有のペプチド配列、およびそのペプチドをコードしている核酸配列が、ヒト治療薬剤の開発、治療タンパク質の同定の助けのためのモデルとして使用可能であり、キナーゼを発現している細胞および組織中のキナーゼ活性を調整する、ヒト治療薬剤の開発のための標的として働く。
【００１２】
1つの態様において、本発明は、NRHK1またはNRHK1のバリアントをコードしているヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、NRHK1またはNRHK1のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを提供する。
【００１４】
また他の態様において、本発明は、NRHK1遺伝子またはNRHK1の活性の発現レベルを調整する、薬剤を提供する。
【００１５】
本発明はまた、（a）NRHK1またはNRHK1のバリアントをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを検出すること、および（b）生物学的試料中のNRHK1またはNRHK1のバリアントのアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出すること、を含む方法も提供する。
【００１６】
本発明はさらに、HRHK1遺伝子またはNRHK1活性の発現レベルを調整する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、NRHK1遺伝子を含む細胞株、NRHK1遺伝子に関するトランスジェニック動物、NRHK1遺伝子が破壊された動物（NRHK1ノックアウト動物）を提供する。これらの細胞株および動物は、NRHK1の機能を研究するために使用可能である。
【００１８】
また他の態様において、本発明は、RNA干渉による、NRHK1遺伝子発現を阻害することが可能であるポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
本発明はさらに、siRNAまたは他のRNAi配列を、標的細胞内に導入することによって、NRHK1遺伝子発現を阻害する方法を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態を、発明の詳細な記述にて、以下に記述している、特に言及しない限り、本明細書および請求項内での言葉および語句は、当業者に対する、通常で、一般的な意味をもつ。他の意味が意図される場合は、明細書において、特定の意味が言葉または語句に適用されることが、特別に言及される。
【００２１】
本発明は、好ましい実施形態にて記述されている特定の構造、物質または方法に限定はされず、請求された機能を実施するために、任意の、および全ての、公知の、または以後開発される等価の構造、物資または方法とともに、請求された機能を実施する、任意および全ての構造、物質または方法を含むことが意図される。
【００２２】
さらなる例が、本開示物にわたって存在し、請求した機能を実施可能であるでれども、本明細書で同定されない、構造、物質または方法の使用が、本発明の目的から排除されることは、本発明者らの意図するところではない。
【００２３】
（図面の簡単な記載）
本発明は、以下の図面と組み合わせて、より理解されるであろう。
【００２４】
図１は、NRHK1のアミノ酸残基28〜297を、Ser/Thrタンパク質キナーゼのファミリーの触媒ドメインと比較している。
【００２５】
図２は、NRHK1のアミノ酸残基28〜296と、pキナーゼのタンパク質キナーゼドメイン間の配列アライメントを示している。
【００２６】
図３は、NRHK1のアミノ酸残基59〜294と、チロシンキナーゼのファミリーの、触媒ドメイン間の配列アライメントを示している。
【００２７】
図４は、NRHK1のアミノ酸残基25〜285と、NIMA−関連タンパク質キナーゼのアミノ酸残基1〜246間の配列アライメントを例示している。
【００２８】
図５は、NRHK1の疎水性プロファイルを示している。
【００２９】
以下の詳細な記述は、当業者が、本発明を作製し、使用することが可能であるように提示される。説明の目的のために、特定の用語を、本発明の理解を得るために、列記する。しかしながら、これらの特定の詳細は、本発明を実施するために必要ではないことが、当業者によって理解されるであろう。特定のアプリケーションの記述は、代表的な例としてのみ提供される。好ましい実施形態に対する、種々の改変が、当業者にとって簡単に理解されえ、本明細書で定義された一般的な原理が、本発明の精神および目的を逸脱せずに、他の実施形態および適用に適用可能でありうる。本発明は、示した実施形態に制限されるような意図はなく、本明細書で開示された原理および特徴に一致した、もっとも広い可能性ある目的にしたがうべきである。
【００３０】
本発明は、新規に開発されたゲノム予測原理から得られた配列情報に依存している。簡単に記すと、タンパク質キナーゼの触媒ドメインのX−線結晶構造を集め、その構造同一性／類似性にしたがって、互いに並べた。アライメントを、キナーゼ触媒ドメインの構造プロファイルをもつ、「スコアリングマトリックス（scoring matrix）」に変換した。このスコアリングマトリックスを、ついでセレーラヒトゲノム（Celera Human Genome）データベースを検索するために使用し、キナーゼ触媒ドメインを持つ配列を引き出した。
【００３１】
この解析に基づいて、本発明により、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの触媒ドメインのコンセンサス配列、そのキナーゼペプチドをコードしているcDNA配列およびゲノム配列に高い相同性である、キナーゼドメインを含むヒトキナーゼペプチドのアミノ酸配列、および本発明のキナーゼに対する構造または配列相同性を持つ、最も近い本技術分野で公知のタンパク質／ペプチド／ドメインに関する情報が提供される。
【００３２】
本発明のペプチドは、商業的に重要な産物およびサービスの発展のために使用しうる。本発明の種々の態様が、以下の小区分にて詳細に記述されている。小区分を使用することは、本発明を制限する意図はない。それぞれの小区分は、本発明の任意の態様に適用される。
【００３３】
定義および用語
本発明の理解を促進させるために、多数の用語および語句を以下に定義する。
【００３４】
本明細書で使用するように、その天然の環境から除去する場合に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「単離（isolated）」される。たとえば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、本質的に細胞性物質から遊離し、または化学的前駆体から遊離しているように、精製工程を介して単離される。本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドが、同質性または他の精製の程度まで、精製可能である。精製のレベルは、意図する使用に依存しうる。当業者に理解されるように、ポリヌクレオチド／ポリペプチドは、考えられうる量の他の成分または分子が存在している場合でも、その望む機能を実施可能である。
【００３５】
いくつかの使用で、「本質的に、細胞性物質から遊離（substantially free of cellular material）」しているポリヌクレオチド／ポリペプチドに、汚染ポリヌクレオチド／ポリペプチドを含む、約30（重量）％以下の他のポリヌクレオチド／ポリペプチドを持つ、調製物が含まれる。たとえば、前記調製物は、約20％以下、約10％以下、または約5％以下の他のポリヌクレオチド／ポリペプチドを含みうる。ポリヌクレオチド／ポリペプチド調製物が、組換え体的に産出される場合、本質的に培養培地を含まないことが可能であり、すなわち、培養培地成分がポリヌクレオチド／ポリペプチド調製物の約20重量％以下を示す。
【００３６】
語句「本質的に化学的前駆体から遊離している（substantially free of chemical precursors）」には、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが、化学的前駆体、または、ポリヌクレオチド／ポリペプチドの合成に関与する他の化学物質から分離されている、調製物が含まれる。1つの実施形態において、語句「本質的に化学的前駆体から遊離している」には、約30（重量）％未満、約20（重量）％未満、約10（重量）％未満、または約5（重量）％未満の、合成に使用される化学的前駆体または他の化学物質を含む、キナーゼ調製物が含まれる。
【００３７】
本発明で使用するように、細胞内に導入したポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドである。同様に、細胞内に導入されたベクターから発現されるポリペプチドもまた、単離ポリペプチドである。
【００３８】
「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」には、任意の数のヌクレオチドが含まれうる。たとえば、ポリヌクレオチドは、少なくとも10、20、25、30、40、50、100またはそれ以上のヌクレオチドを持ちうる。ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNA、二本鎖または一本鎖でありうる。そのポリペプチドが、ポリヌクレオチドから転写および／または翻訳可能である場合に、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードしている。プロモーターおよび／またはエンハンサー（類）のような翻訳および／または転写調整配列を、前記転写および／または翻訳が起こる前に、ポリヌクレオチドに加えることが可能である。さらに、ポリヌクレオチドが一本鎖である場合に、本来のポリヌクレオチドおよびその相補的配列を含む、相当する二本鎖DNAが、前記翻訳および／または転写の前に調製可能である。
【００３９】
本明細書で使用するように、「ポリヌクレオチドのバリアント（a variant of a polynucleotide）」は、1つまたはそれ以上の置換、添加、および／または欠失によって、本来のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドを言う。たとえば、ポリヌクレオチドのバリアントは、1、2、5、10、15、20、25またはそれ以上のヌクレオチド置換、添加または欠失を持ちうる。好ましくは、改変は、インフレームであり、すなわち、改変されたポリヌクレオチドは、本来または意図した終止コドンまで、転写または翻訳されうる。本来のポリヌクレオチドが、生物学的活性を持つポリペプチドをコードしている場合、本来のポリヌクレオチドのバリアントによってコードされたポリペプチドは、本質的にそのような活性を維持している。
【００４０】
好ましくは、生物学的活性は、本来の活性に対して、50％未満、より好ましくは、20％未満まで、減少／増加する。
【００４１】
ポリヌクレオチドのバリアントは、低ストリンジェントな条件、好ましくはストリンジェントな条件、またはより好ましくは高いストリンジェントな条件下で、本来のポリヌクレオチドまたはその相補的配列にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドでありうる。異なる厳格さの条件の例を、表1にて列記している。高いストリンジェントな条件は、少なくとも、条件A〜Fと同様の厳格さであるものであり、ストリンジェントな条件は、少なくとも、条件G〜Lと同様の厳格さであるものであり、低ストリンジェントな条件は、少なくとも、条件M〜Rと同様の厳格さであるものである。表1で使用するように、ハイブリッド形成は、約2時間の該ハイブリッド条件下で実施され、続いて、相当する洗浄条件下での、2回の15分洗浄で実施される。
【表１】
2006514544.tif 000002
1：ハイブリッド長は、ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドのハイブリッド形成領域に関して予測されたものである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成の場合、ハイブリッド長は、ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドの物として仮定する。公知の配列のポリヌクレオチドがハイブリッドする場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を並べ、最適な配列相補性の領域または領域類を同定することによって決定可能である。
H：ハイブリッド形成および洗浄緩衝液中で、SSPE（1×SSPEは、0.15M  NaCl、10mM  NaH2PO4および1.25mM  EDTA、pH7.4である）は、SSC（1×SSCは、0.15M  NaClおよび15mM  クエン酸ナトリウムである）と置換可能である。
TB＊−TR＊：長さにして50未満の塩基対であると予測されたハイブリッドに関するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの溶解温度（Tm）より5〜10℃低いべきであり、ここで、Tmは、以下の式にしたがって決定される。長さが18塩基対よりも小さなハイブリッドに関して、Tm（℃）＝2（A＋T塩基の＃）＋4（G＋C塩基の＃）。長さが18〜49塩基対のハイブリッドに関して、Tm（℃）＝81.5＋16.6（log10Na＋）＋0.41（％G＋C）−（600/N）で、式中Nはハイブリッド中の塩基の数であり、Na＋は、ハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（1×SSCに関して、Na＋＝0.165M）
【００４２】
遺伝子コードの縮重の結果として、同一のポリペプチドをコードしている多くのポリヌクレオチドバリアントが存在することが、当業者より理解されうる。これらのポリヌクレオチドバリアントのいくつかが、本来のポリヌクレオチドへの、最小の配列相同性を持つ。それにもかかわらず、コドン利用の違いによって変化する、ポリヌクレオチドが、本発明にて特に考慮される。
【００４３】
本明細書で使用するように、「ポリペプチド（polypeptide）」は、任意の数のアミノ酸残基を含むことが可能である。たとえば、ポリペプチドは、少なくとも5、10、15、20、30、40、50またはそれ以上のアミノ酸残基をもって良い。
【００４４】
本明細書で使用するように、「ポリペプチドのバリアント（variant of a polypeptide）」は、1つまたはそれ以上の置換、欠失および／または挿入によって、本来のポリペプチドからは異なるポリペプチドである。好ましくは、これらの改変は、ポリペプチドの本来の生物学的機能を、本質的に変化（たとえば、減少または増強）されない。たとえば、バリアントは、本来のポリペプチドの生物学的活性を、減少または増強または維持可能である。好ましくは、バリアントの生物学的活性は、本来のポリペプチドに対して、50％未満、またはより好ましくは20％未満まで、減少または増強する。
【００４５】
同様に、抗原特異的抗血清と反応するバリアントの能力が、本来のポリペプチドに対して、50％未満、好ましくは20％未満まで、増強または減少可能である。これらのバリアントは、本来のポリペプチド配列を改変すること、ついで、抗原特異的抗体または抗血清との、前記改変したポリペプチドの反応性を測定することによって、調製および評価可能である。
【００４６】
好ましくは、バリアントポリペプチドは、1つまたはそれ以上の保存置換を含む。「保存置換（conservative substitution）」は、アミノ酸が、同様の特性を持つ他のアミノ酸に置換されたものであり、当業者が、置換されたポリペプチドの二次構造および水性特性が、本質的に変化しないことを予想する保存アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または芳香性特性に基づいて実施される。陰性電荷アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれ、陽性電荷アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれる。非電荷極性ヘッド基を持ち、同様の親水性値を持つアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、またはグリシンおよびアラニン、またはアスパラギンおよびグルタミン、またはセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。保存変化を産出可能な他のアミノ酸の群には、（1）ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr、（2）cys、ser、tyr、thr、（3）val、ile、leu、met、ala、phe、（4）lys、arg、his、および（5）phe、tyr、trp、hisが含まれる。ポリペプチドバリアントはまた、非保存変化も含みうる。
【００４７】
ポリペプチドバリアントは、ポリペプチドの生物学的活性、免疫原性、二次構造および／または水性性質において、最小の影響を持つ、アミノ酸の欠失および／または添加によって調製可能である。バリアントは、たとえば、本来の配列中の1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、置換すること、改変すること、欠失すること、または添加することによって調製可能である。ポリペプチドバリアントは好ましくは、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約90％、もっとも好ましくは少なくとも約95％の、本来のポリペプチドに対する配列相同性を示す。
【００４８】
ポリペプチドバリアントは、翻訳後修飾のような天然の工程によって、または化学的改変によってのいずれかで、本来のポリペプチドから改変されたポリペプチドを含む。これらの改変は、本技術分野でよく知られている。改変は、骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいずれの場所でも起こる。同一の型の改変が、該ポリペプチド中のいくつかの部位で、同一の、または異なる程度で存在可能であることが理解されるであろう。また、該ポリペプチドは多くの型の改変を含みうる。ポリペプチドは、たとえば、ユビキチン化の結果として、分岐して良く、分岐あり、またはなしで、環状であってよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドが、天然の翻訳後修飾工程によって得られ、また、合成方法を介して作成されうる。本発明のために好適な改変には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘメ部位の共有結合ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解工程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質への転移RNA仲介アミノ酸添加、およびユビキチン化が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用するように、語句「調整（modulation）」には、アップ−レギュレーション、誘導、刺激、増強作用、阻害、ダウン−レギュレーションまたは抑制、または阻害の緩和が含まれる。
【００５０】
ヌクレオチド配列は、2つの配列が、機能的関連内に配置される場合に、他のヌクレオチド配列に対して、「動作可能に連結する（operably linked）」。たとえば、5’調整配列が、in vitro転写／翻訳系中、または宿主細胞中で、コード配列の転写を開始可能である場合に、コード配列は、5’調整配列に動作可能に連結する。「動作可能に連結する」は、連結しているDNA配列が、互いに隣接していることを要求はしない。介在している配列が、2つの動作可能に連結した配列間に存在して良い。
【００５１】
本明細書で使用するように、「無病（disease−free）」ヒトは、NRHK1−関連疾患を持たないヒトを言う。無病細胞、組織または試料は、そのような無病ヒトから得た、細胞、組織または試料を言う。
【００５２】
ポリヌクレオチドが、以下の配列、（1）遺伝子のRNA転写物の配列、（2）遺伝子のRNA転写物の相補配列、（3）遺伝子のRNA転写物のcDNA配列、（4）RNA転写物の配列のcDNA配列の相補配列、（5）遺伝子のゲノム配列、および（6）遺伝子のゲノム配列の相補配列、の少なくとも1つにハイブリッド形成可能である場合に、ポリヌクレオチドは、遺伝子に「ハイブリッド形成可能（capable of hybridizing）」である。
【００５３】
本明細書で使用するように、アライメント中での配列「同一性（dentity）」は、標準のタンパク質−タンパク質BLASTプログラム（blastp）、標準のヌクレオチド−ヌクレオチドBLASTプログラム（blastn）、またはBLAST2配列（Sequence）プログラムによって決定可能である。好適なBLASTプログラムは、National Center of Biotechnology Information（NCBI）、National Librart of Medicine, Washigton, DC, USAによって維持されているウェブサイトにて見ることが可能である。
【００５４】
ヒトNRHK1遺伝子およびNRHK1キナーゼ
本発明は、セリン／スレオニンキナーゼ、pキナーゼおよびチロシンキナーゼの触媒ドメインのコンセンサス配列に相同性の配列を含む、タンパク質をコードしている、新規ヒト遺伝子（NRHK1遺伝子）を同定している。新規タンパク質はまた、NIMA−関連タンパク質キナーゼに遠縁に関連する。NRHK1をコードしているヌクレオチドおよびNRHK1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：1および2にて描写している。NRHK1遺伝子は、ヒトクロモソーム9の9q34座に局在する。とりわけ、NRHK1遺伝子は、遺伝子LOC157890とLOC57109の間に局在し、遺伝子LOC169436と重なり合う。
【００５５】
ヒトクロモソーム座9q34および近隣領域は、限定はしないが、大腸がん、前立腺がん、頭部頸部サルコーマ細胞リンホーマ、肺アデノカルシノーマ、膀胱がん、腎臓細胞カルシノーマ、T細胞非ホーキンスリンホーマ、インスリノーマ、小児副腎皮質腫瘍、慢性骨髄性白血病、結節硬化症、爪・膝蓋骨症候群、II型格子状異栄養、原発性捻転性筋緊張異常症、先天性全身性リポジストロフィ、および若年性筋委縮性側索硬化症を含む、多数の疾患に関連してきた。
【００５６】
ヒトNRHK1遺伝子は21個のエキソンを含む。エキソンは、セレーラゲノムデータベース（配列番号：3）中、ヒトクロモソーム9のヌクレオチド配列にマップされる。エキソン1〜29、31および32もまた、NCBIによって維持されている、エントレズ  ヒューマン  ゲノム  シークエンス  データベース（Entrez Human Genome Sequence Database）のヒトクロモソーム中のヌクレオチド110001〜137201にマップされる。表2は、ゲノム配列配列番号：3中のこれらの21個のエキソンそれぞれの局在を列記している。表2はまた、NRHK1コード配列配列番号：1中のそれぞれのエキソンの相当する局在を示している。
【表２】
2006514544.tif 000003
【００５７】
PPS−BLASTプログラム（NCBIによって維持されているBLASTウェブサイトによって利用可能な、PPS−BLAST 2.2.3［April 24, 2002］）を用いた、保存ドメイン検索によって、NRHK1が、いくつかのタンパク質キナーゼドメインのコンセンサス配列に相同の配列を含んだことが示された。
【００５８】
とりわけ、NRHK1のアミノ酸残基28〜297は、Ser/Thrタンパク質キナーゼのファミリーの触媒ドメイン（Entrez登録番号：smart00220）に非常に相同性である。このキナーゼファミリーには、C−Jun N−末端キナーゼ（JNK3）、アベルソンチロシンキナーゼ、カルモジュリン−結合、小胞−関連、タンパク質キナーゼ−様タンパク質（1G5）、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼprp4、C.エレガンス（C.elegans）中のSer/Thrタンパク質キナーゼのCdc2/Cdc28サブファミリー、およびC.エレガンスのリボソームS6キナーゼが含まれる。図1は、二つの配列が、130ビットのスコア、および2×10−31のE値で、100.0％アライメントを共有することを示している。本発明の他の図にて使用する様に、「クエリー（query）」は、NRHK1の配列を示し、「対象（Sbject）」は、NRHK1配列と比較した配列を意味している。
【００５９】
図2は、NRHK1のアミノ酸残基28〜296がまた、pキナーゼのタンパク質キナーゼドメイン（Entrez登録番号：pfam00069）と100.0％アラインしたことを示している。アライメントは、119ビットのスコア、および3×10−28のE値を持つ。このpキナーゼファミリーには、タンパク質キナーゼCk2、wee1様タンパク質キナーゼ（WEE1hu）、およびチロシン−タンパク質キナーゼRYKが含まれる。
【００６０】
図3は、NRHK1のアミノ酸残基59〜294と、チロシンキナーゼのファミリーのN−末端間の配列アライメントを示している（Entrez登録番号：smart00219）。このファミリーには、繊維芽細胞増殖因子レセプター1、チロシン−タンパク質キナーゼ（KIN15/KIN16サブファミリー）、およびドロソフィラ（Drosophila）レセプタータンパク質−チロシンキナーゼファミリーメンバー（drl−P1）が含まれる。NRHK1のキナーゼドメイン中のアミノ酸残基59〜294が、smart00219に対して、76.4ビットのスコア、および4×10−15のE値で、87.5％配列同一異性を持つ。
【００６１】
図4は、NRHK1のアミノ酸残基25〜285と、ポピュラス  x  カネセンス（Populus x canescens）NIMA−関連タンパク質キナーゼ（Entrez登録番号：AF469649＿1）のN−末端の間の配列アライメントを示している。2つの配列は、87.8バイトのスコアおよび5×10−16のE値での、28％配列同一性を共有している。NIMA−関連キナーゼは、アスペルギルス  ニジュランス（Aspergillus nidulans）中の有糸分裂を制御する、（有糸分裂遺伝子A中ではない）NIMAと、高いアミノ酸ン配列同一性を共有しているタンパク質キナーゼの群である。とりわけ、NIMAは、セリン10におけるヒストンH3のリン酸化を介して、有糸分裂クロマチン濃縮を調整する。NIMA−関連キナーゼはまた、NIMAの発現が、大腸菌、カエルまたはヒト細胞中の有糸分裂事象を促進可能であるので、他の真核生物中の細胞周期を調整しうる。さらに、NIMAのドミナント−ネガティブ種が、ヒト細胞の有糸分裂への進行に逆行して影響を与えうる。ヒトNek6（hNek6）、哺乳動物NIMA−関連キナーゼのメンバーは、ヒトクロモソーム9q33−34に局在し、これは、NRHK1が局在しているクロモソーム9中の同一の領域である。
【００６２】
図5は、NRHK1の疎水性プロファイルを示している。疎水性解析により、NRHK1キナーゼが、膜または膜貫通タンパク質である可能性が少ないことが示唆された。
【００６３】
NRHK1は、PCT第WO00/73469号にて開示された、ヒトタンパク質キナーゼ−様タンパク質SGK071（Entrez登録番号：AX056458、SGK071のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：5および6で描写されている）に対して、明らかな配列相同性を示している。対合BLASTアルゴリズムを用いる解析によって、NRHK1およびSGK071が、アミノ酸レベルで84％の配列同一性（blastp、マトリックス：BLOSUM62、ギャップオープン：11、Gap伸長：1、x＿dropdff50、予想：10.0、ワードサイズ：3、フィルター：未チェック）、ヌクレオチドレベルで、90％の配列同一性（blastn、マッチ：1、ミスマッチ：−2、ギャップオープン：5、ギャップ伸長：0、x＿dropoff：50、予想：10.0、ワードサイズ：11、フィルター：未チェック）を共有することが明らかになった。
【００６４】
ヒトにおけるNRHK1遺伝子の存在および発現は、種々のEST配列によって支持されている。たとえば配列番号：1のヌクレオチド1〜583は、GenBank登録番号BI458908、AL044935、BM015576、AI799141、Incyte登録番号6854652H1にて開示されているEST配列によって支持されており、配列番号：1のヌクレオチド584〜866は、GenBank登録番号AV763896、AI936591、AW183662、およびAI554166によって開示されたEST配列によって支持されており、配列番号：1のヌクレオチド867〜949は、GenBank登録番号AW629230、およびIncyte登録番号6854652H1および6883792H1によって開示されたEST配列によって支持され、配列番号：1のヌクレオチド1565〜1707は、Incyte登録番号6140228F8によって開示されたETSによって支持され、配列番号：1のヌクレオチド2426〜2493は、GenBank登録番号BQ184985によって開示されたESTによって支持される。
【００６５】
タンパク質キナーゼの利用
タンパク質キナーゼは、シグナル伝達経路のような、多くの重要な生物学的工程の調整に関与する。細胞シグナル伝達の異常が、多くの疾患に関与してきた。サイトカインによるシグナル伝達の調整、およびプロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子との、シグナル分子の関連が、きわめて強い調査の目的であった。多くの治療的戦略が、現在、タンパク質キナーゼを活性化する、または不活性化する化合物の合成を介して、発展している。
【００６６】
疾患の原因論におけるキナーゼの重要性が、良く確立されてきている。キナーゼタンパク質は、薬物活性および開発の主要な標的である。米国での実施中の臨床試験の2002年1月のサーベイによって、100以上の臨床試験が、キナーゼの調整を含んでいることが明らかになった。試験は、喘息、パーキンソン病、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎、せき髄損傷、筋肉状態、骨粗鬆症、移植片対宿主触感、心臓血管疾病、自己免疫疾病、網膜剥離、脳梗塞、てんかん、虚血／再潅流、乳癌、子宮がん、膠芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、非小細胞肺癌、脳腫瘍、カポジサルコーマ、膵臓がん、肝臓がんおよび他の腫瘍を含む、非常に多様な治療適応症で実施中である。アンチセンス分子、抗体、小分子および遺伝子治療さえ含む、多数の種類の、キナーゼ活性の調整物が現在臨床試験中である。したがって、先には知られていなかったキナーゼファミリータンパク質のメンバーを同定し、特性化することが、薬理学的開発の領域で価値がある。本発明は、構造的に、NIMA−関連タンパク質キナーゼに関連する、先に同定はされていないヒトキナーゼタンパク質を提供することによって、本技術分野の状況を進展させる。
【００６７】
多くの治療的戦略が、シグナル伝達経路中の重要な成分を標的とする。キナーゼ遺伝子発現を調整するためのアプローチには、メッセンジャーRNAの翻訳後処理を阻害するための特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド、キナーゼ活性を阻害するための、天然に存在する産物およびその化学的誘導体、およびレセプター結合キナーゼを阻害するための、モノクローナル抗体が含まれる。キナーゼ阻害剤によってまた、他の薬剤が、さらなる時間、効果的になり、現在の治療と相乗的に働くようになる場合もある。
【００６８】
現在、大きく注目を浴びている、薬理学的調査の領域は、転写制御、アポトーシス、タンパク質分解、核インポートおよびエキスポート、細胞骨格調整およびチェックポイントシグナル伝達での、リン酸化の役割である。シグナルネットワークおよび関与するタンパク質に関する知識を集めることで、リン酸化依存シグナル伝達の、強力で特定の薬理学的調整物の開発における、実施使用がされうる。高い特異性のキナーゼ調製物の論理的構造に基づく設計および開発が、日常的になってきており、シグナル伝達にて仲裁する薬剤が、薬剤の主要な種類になってきている。いくつかのキナーゼの機能を以下に記述している。
【００６９】
第二メッセンジャー依存タンパク質キナーゼは、環状AMP（cAMP）、環状GMP、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、3,4,5−三リン酸、環状−ADPリボース、アラキドン酸、ジアシルグリセロールおよびカルシウム−カルモジュリンのような、第二メッセンジャーの効果を仲介する。環状AMP依存タンパク質キナーゼ（PKA）は、STKファミリーの重要なメンバーである。環状−AMPは、研究されてきている、全ての原核生物および動物細胞中の、ホルモン活性の細胞内メディエーターである。そのようなホルモン誘導細胞応答には、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨再吸収、および心拍数および心筋収縮力の調整が含まれる。PKAは、全ての動物細胞でみられ、これらの細胞のほとんどで、環状−AMPの効果にの説明となると考えられる。PKA発現の変化が、がん、甲状腺疾病、糖尿病、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患を含む、種々の疾病および疾患に関与する。
【００７０】
カルシウム−カルモジュリン（CaM）依存タンパク質キナーゼもまた、STKファミリーのメンバーである。カルモジュリンは、カルシウムの結合に対する応答における、標的タンパク質への結合による、多くのカルシウム調整工程を仲介する、カルシウムレセプターである。これらの工程での主要な標的タンパク質は、CaM依存タンパク質キナーゼである。CaM−キナーゼは、平滑筋収縮（MLCキナーゼ）、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、および神経伝達物質（CaMキナーゼIおよびCaMキナーゼII）の調整に関与する。CaMキナーゼIは、神経伝達物質関連タンパク質シナプシスIおよびII、遺伝子転写調節物、CREB、および嚢胞性線維症伝導力調整タンパク質、CFTRを含む、種々の基質をリン酸化する。CaMIIキナーゼもまた、異なる部分でシナプシンをリン酸化し、チロシンヒドロキシラーゼのリン酸化および活性化を介して、脳内のカテコールアミンの合成を制御する。多くのCaMキナーゼが、CaMへの結合に加えて、リン酸化によって活性化される。キナーゼは、それ自身を自己リン酸化可能であり、または、「キナーゼカスケード（kinase cascade）」の部分として、他のキナーゼによってリン酸化されてよい。
【００７１】
他のリガンド−活性化タンパク質キナーゼは、5’−AMP−活性化タンパク質キナーゼ（AMPK）である。哺乳動物AMPKは、酵素アセチル−CoAカルボキシラーゼおよびヒドロキシメチルグルタリル−CoAリダクターゼのリン酸化を介する、脂肪酸およびステロール合成の調整物であり、ヒートショック、およびグルコースおよびATPの枯渇のような、細胞ストレスに対するこれらの経路の応答を仲介する。AMPKは、触媒アルファサブユニットと、アルファサブユニットの活性を調整すると信じられている、2つの非触媒ベータおよびガンマサブユニットからなる、ヘテロ三量体複合体である。AMPKのサブユニットは、脳、心臓、脾臓および肺のような、非脂質性組織で、予想よりも広く分布している。この分布によって、AMPKの機能が、脂質膜のみの調整以上のものであることが示唆される。
【００７２】
有糸分裂活性化タンパク質キナーゼ（MAP）はまた、STKファミリーのメンバーである。MAPキナーゼはまた、細胞内シグナル伝達経路を調整する。これらは、リン酸化カスケードを介して、細胞表面から核までの、シグナル伝達を仲介する。いくつかの亜群が同定されてきており、それぞれ、異なる基質特異性を示し、異なる細胞外刺激に対して応答する。MAPキナーゼシグナル伝達経路は、哺乳動物、ならびに酵母で存在する。哺乳動物経路を活性化する細胞外刺激には、表皮増殖因子（EGF）、紫外線光、高浸透圧培地、ヒートショック、エンドトキシンリポポリサッカライド（LPS）、および、腫瘍壊死因子（TNF）およびインターロイキン−1（IL−1）のような、プロ−炎症サイトカインが含まれる。
【００７３】
EGFレセプターは、ホルモンに不応答性の乳癌の半分以上で見られる。EGFは、多くの腫瘍で見られ、EGFは、腫瘍細胞増殖に必要であり得る。EGFに対する抗体が、マウスにおける腫瘍移植片の増殖を抑制する。アンフィレグリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、膵臓癌細胞株の増殖を阻害した。
【００７４】
抗−エストロゲン活性を持つタンパク質キナーゼC阻害剤である、タモキシフェンが、ホルモン−依存乳癌のための、現在の標準の治療である。この化合物の使用によって、子宮内膜のような他の組織におけるがんの進展のリスクが増強しうる。関連化合物である、ラロキシフェンは、骨粗鬆症に対して保護を示してきた。治療標的を同定する時に、阻害剤の組織特異性を考慮しなければならない。
【００７５】
増殖因子の細胞外刺激に対する応答での、核へのシグナル伝達に、有糸分裂活性化タンパク質（MAP）キナーゼが関与する。MAPキナーゼは、細胞外レセプターからのシグナル伝達、またはヒートショックまたはUV放射を仲介する、タンパク質セリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。正常細胞での細胞増殖および分化は、多数のMAPキナーゼカスケードの調整および制御下である。MAPキナーゼの機能の異常および調整緩和によって、癌化が開始され、支持されうる。インスリンおよびIGF−1がまた、二型糖尿病で発生する、獲得性インシュリン抵抗性で重要であり得る、有糸分裂MAPキナーゼ経路を活性化する。
【００７６】
多くのがんが、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ−タンパク質−キナーゼB／Aktシグナルカスケードの構造的活性化を含む、生存戦略を発達させることによって、化学治療に対して耐性になる。本生存シグナル経路はしたがって、その機能を静止しうる特定の阻害剤の開発のための、重要な標的になる。PI−3キナーゼ／Aktシグナル伝達カスケードは、糖尿病において、等しく重要である。RTKsによって活性化される経路は、続いて、グリコーゲンシンセターゼ3（GSK3）およびグルコース取り込みを調整する。AKTが、2型糖尿病における活性を減少させたので、治療標的を提供する。
【００７７】
タンパク質キナーゼ阻害剤は、外来ペプチド阻害剤の生理学的機能のin vivo制御および調整に関して多数の知識を提供する。PKC内の疑似基質配列が、その脂質活性物がない状態で、キナーゼを阻害するように働く。キレリスリンのようなPKC阻害剤は、基質相互作用を抑制するために、触媒ドメイン上で働き、一方で、カルホスチンは、疑似基質配列をまね、ATPase活性を抑制するため、または共因子結合を阻害するために、制御ドメイン上で働く。
【００７８】
いくつかのタンパク質キナーゼが、現在までに、知られていない生理学的調節の系を持つけれども、多くが、上流タンパク質キナーゼによる、自己リン酸化、またはリン酸化によって活性化、または不活性化される。タンパク質キナーゼの調整はまた、転写、転写後、および翻訳後処理の間にも起こる。転写後調整の機構は、前駆体mRNAの選択的スプライシングである。たとえば、タンパク質キナーゼCβIおよびβIIは、C−末端50〜52アミノ酸をコードしているエキソンのスプライシングの差によって由来する、一本鎖PKCβ遺伝子の2つのアイソフォームである。スプライシングは、インシュリンおよびIGF−1のような、ペプチドホルモンに対する応答にて、キナーゼカスケードによって調整可能である。PKC βIおよびβIIは、有糸分裂活性タンパク質（MAP）キナーゼファミリーのリン酸化メンバーに関して、グリコーゲンシンセターゼ3βに関して、TLS/Fusのような核転写因子に対して、および他の核キナーゼに対して、異なる特異性を持つ。PKCβII mRNAの転写後選択的スプライシングを阻害することによって、PKCβII−依存工程が阻害される。
【００７９】
種々のタンパク質キナーゼの発現を阻害するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発が、成功してきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質のmRNA転写物と特異的に結合するように設計された、短い長さの合成製造された、化学的に改変されたDNAまたはRNAである。mRNAとのアンチセンス部位の相互作用が、タンパク質翻訳を阻害し、mRNAの転写後処理（たとえば選択的スプライシングおよび安定性）を阻害するする場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PKCαの翻訳を阻害するための、mRNA形態の選択的スプライシングを変えるために開発されてきた。
【００８０】
タンパク質キナーゼCアイソフォームが、糖尿病の血管合併症にて観察される細胞変化に関連してきた。高血糖が、糖尿病ラットの腎糸球体中での、PKCαおよびβアイソフォームのレベルの増加に関連する。PKCβ阻害剤の経口投与によって、TGF−β1および細胞外マトリックス成分遺伝子のmRNA発現の増加を防止した。特定のPKCβ阻害剤（LY333531）の投与によってまた、サイトカイン、カルデスモン、および網膜および腎臓血流の血行動態のレベルを正常化する。心筋でのPKCβアイソフォームの過剰発現が、結果として、心臓肥大および心不全となった。糖尿病対象におけるPKCβ過剰発現の副作用を防止するためのLY333531の使用が、調査されている。本化合物はまた、薬力学的活性でありうることを示唆している、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫に対して、第I／II相臨床試験中である。
【００８１】
PPK（増殖−関連キナーゼ）は、ヒトメガカロイティック細胞中での、細胞周期および細胞増殖の調整に関与する、血清／サイトカイン誘導可能STKである。PPKは、細胞分化に関連するSTKsのポロ（ヒトポロ遺伝子より由来する）ファミリーに関連する。PPKは、肺癌組織内でダウンレギュレートされ、その正常組織でのダウンレギュレート発現が、がん原性形質転換を導く、プロト−発がん遺伝子でありうる。MAPキナーゼ発現の変化が、がん、炎症、免疫疾病、増殖および発達に影響を与える疾病を含む、種々の疾患状態に関与する。
【００８２】
DNA−依存タンパク質キナーゼ（DNA−PK）は、哺乳動物細胞における二本鎖切断の修復に関連する。本酵素は、セリン／スレオニンキナーゼとして働くために、二本鎖DNAの末端、または一本鎖から二本鎖DNAへの転移を必要とする。問題があるか、不完全であるDNA−PK活性を持つ細胞は、放射線誘導DNA二本鎖切断を回復させることが不可能であり、結果として、イオン化放射の致死効果に対して、非常に感受性である。DNA−PKの阻害は、放射線または化学治療薬剤での抗腫瘍処置の効果を増加する可能性を持つ。
【００８３】
サイクリン−依存タンパク質キナーゼ（CDKs）は、細胞周期を介して、細胞の発達を制御するSTKsの他の群である。サイクリンは、有糸分裂工程に関与する選択的タンパク質をリン酸化し、活性化することによって、細胞周期の種々の期を誘因する、CDKsに結合し、活性化することによって働く、小調整タンパク質である。CDKsは、活性化するために、多数の入力を必要とするので、特有である。サイクリンの結合に加えて、CDK活性化が、特定のスレオニン残基のリン酸化、および特定のチロシン残基の脱リン酸化を必要とする。
【００８４】
CDKsの細胞性阻害剤はまた、細胞周期進行において、主要な役割を果たす。サイクリンおよびCDKの発現、機能および構造の変化が、がん表現系にて遭遇する。したがって、CDKsは、新規のがん治療薬剤のための、重要な標的であり得る。
【００８５】
化学治療抵抗性細胞は、アポトーシスを避ける傾向にある。特定の環境下で、好ましくはCDKの活性化が、望ましくない条件下で、細胞周期の進展を促進すること、すなわち、DNA傷害がひろく回復されていない中で、有糸分裂をはかることによって、アポトーシスを促進させうる。
【００８６】
プリンおよびプリン類似体は、CDK阻害剤として働く。フラボピリドールは、60nMにて、腫瘍細胞の50％増殖阻害を引き起こすフラボノイドである。また、EGFRおよびタンパク質キナーゼAを阻害する。フラボニリデルは、アポトーシスを誘導し、ヌードマウスにおける腫瘍移植片としての、in vivoでの、リンパ、せき髄、大腸および前立腺がん細胞増殖を阻害する。
【００８７】
スタウロスポリンおよびその誘導体、UCN−01は、タンパク質キナーゼCの阻害に加えて、サイクリンB/CDKを阻害する（IC50＝3〜6nM）。スタウロスポリンは毒性であるが、その誘導体である7−ヒドロキシスタウロスポリン（UCN−01）は、抗腫瘍特性を持ち、臨床試験中である。UCN−01は、CDKsのリン酸化に影響を与え、細胞周期チェックポイント機能を変化させる。これらの化合物は、多重の細胞内標的が、阻害剤の濃度が、細胞内で増加するために、影響を受けうることを例示している。
【００８８】
タンパク質キナーゼ、PTKsは、その標的タンパク質上のチロシン残基を特にリン酸化し、膜貫通、レセプターPTKsおよび非膜貫通、非−レセプターPTKsに分けられる。膜貫通タンパク質チロシンキナーゼは、ほとんどの増殖因子に対するレセプターである。増殖因子の、レセプターへの結合が、ATPから、レセプターおよび他の特定のタンパク質の選択されたチロシン側鎖へのリン酸基の伝達を活性化する。レセプターPTKsに結合した増殖因子（GF）には、表皮GF、血小板由来GF、繊維芽細胞GF、肝細胞GF、インシュリンおよびインシュリン様GF、神経GF、血管内皮GF、およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【００８９】
RTKsが、腫瘍細胞増殖を刺激するので、RTKsの阻害剤が、そのようながんの成長および増幅を阻害しうる。RTKsの阻害剤はまた、腫瘍血管新生を予防するのに有用であり、血管内皮細胞および間質性繊維芽細胞のような、血管細胞上に局在するRTKsを標的とすることによって、宿主組織からのを支持を排除可能である。たとえば、VEGFは、血管新生の間、内皮細胞増殖を刺激し、タンパク質および他の増殖因子が、腫瘍にアクセス可能になるように、腫瘍血管の浸透性を増加させる。VEGFシグナル伝達の阻害剤の経口投与形態の、広いスペクトルの抗腫瘍効果が報告されてきている。したがって、VEGFレセプターシグナル伝達の阻害が、主要な治療標的を提示する。細胞外レセプターもまた、阻害の標的である。たとえば、EGFレセプターファミリーおよびそのリガンドが、多くの腫瘍型にて、過剰発現しており、オートクラインループとして存在する。
【００９０】
RTKsの構造および活性化機構、およびチロシンキナーゼによって制御されるシグナル伝達経路の知識が増えることによって、標的特異的薬物および新規がん治療の開発の可能性が提供された。ダウンレギュレートされたRTKシグナル伝達の防止または妨害に対するアプローチには、細胞外リガンド結合ドメインまたは細胞内基質結合領域いずれかを標的とする、選択的成分の開発が含まれる。
【００９１】
腫瘍細胞を選択的に殺すための、もっとも成功した戦略は、がんに非常に関連し、腫瘍細胞の表面に発現する、RTKsの細胞外ドメインに対して指向する、モノクローナル抗体（mAbs）の使用である。過去数年、組換え体抗体技術が、新規の遺伝子工学的に作成した抗体のデザイン、選択および産出において、多数の進歩があった。標的がん治療のためのヒト化抗体、ヒト−マウスキメラまたは二重特異的抗体を作製することも可能である。力学的に、抗RTK mAbsは、リガンド−レセプター相互作用を防止することによって、したがって、リガンド誘導RTKシグナル伝達を阻害すること、およびRTKダウン−レギュレーションおよび内在化を増加させることによって働きうる。さらに、mAbsを、癌細胞上の特定のエピトープに結合させることによって、オプソニン化および補体仲介溶解のような、免疫仲介応答を誘導しえ、マクロファージまたはナチュラルキラー細胞による抗体依存細胞性細胞傷害を誘因しうる。近年、mAbsが、標的腫瘍細胞の内部で、細胞内シグナル伝達パターンを変化させること、増殖阻害および／またはアポトーシスを導くことによって、腫瘍増殖を制御することが明らかになった。さらに、二重特異性抗体が、エフェクター細胞上のレセプターで、標的細胞上の選択した表面分子を架橋し、したがって、標的細胞に対して、細胞毒性応答を誘因する。二重特異性抗体の臨床試験でみられた毒性にもかかわらず、抗体エンジニアリング、腫瘍抗原の特性化および免疫学の発展が、抗癌治療のための、論理的に設計された二重特異性抗体の産出を補助しうる。
【００９２】
異常なRTKシグナル伝達を阻害する他の見込みあるアプローチは、固有のチロシンキナーゼ活性を選択的に干渉し、それによって、レセプター自己リン酸化、および下流シグナル伝達物の活性化を阻害する、小分子薬物を開発することである。キナゾリン類に属する、チロホスチンが、レセプターチロシンキナーゼドメインにおけるATP結合部位に関して、ATPと競合する、そのような阻害剤の1つの重要な群であり、この群のいくつかのメンバーが、EGFRを特異的に阻害することが示されてきている。新血管形成に関与するレセプターの強力かつ選択的な阻害剤が、開発されてきており、現在臨床評価が行われている。増強された強度および選択性、より高い、in vitroおよびin vivo効果および毒性の減少を備える、新規のクラスのチロシンキナーゼ阻害剤（TKIs）が、構造に基づく薬物設計、結晶学構造情報、コンビナトリアル化学およびハイスループットスクリーニングの利点を用いて、開発されてきている。
【００９３】
組換え体免疫毒素が、標的選択的薬物設計の他の可能性を提供する。組換え体免疫毒素は、mAbsの重および軽鎖の可変ドメインのような特定のリガンド、または増殖因子へ、融合したかまたは化学的に共役した、いずれかの、バクテリアまたは植物毒素からなる。免疫毒素は、シュードモナス  エキソトキシンAまたはジフテリア毒素のようなバクテリア毒素、またはリシンAまたはクラビンのような、植物毒素を含みうる。これらの組換え体分子は、標的細胞の細胞表面レセプターへの結合の後に、内在化されたときに、その標的細胞を選択的に殺すことができる。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用が、レセプタータンパク質キナーゼ（RTKs）の活性化を阻害するための、他の戦略を表している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写を阻害し、したがって、標的タンパク質の発現を阻害するために、mRNAと相互作用するように設計される、合成DNAまたはRNAの短い部分である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリックの塩基対によって、mRNAと相互作用し、したがって、標的タンパク質に対して非常に特異的である。いくつかの前臨床および臨床試験によって、アンチセンス治療が、固体腫瘍の治療に、理論的に有用であり得ることが示唆される。
【００９５】
治療的仲介のための、選択的抗がん標的としての、RTKsおよびそれらの関連シグナル伝達の可能性が認識されてきた。結果として、mAbsおよびRTKのような、種々の成功した標的特異的薬物が開発されてきており、現在、臨床試験で評価されている。表3には、現在臨床相で評価されているか、すでにFDAによって許可された、レセプターチロシンキナーゼシグナル伝達に対するもっとも成功した薬物を要約している。
【表３】
2006514544.tif 000004
【００９６】
非レセプターRTKsは、膜貫通領域を欠き、かわりに、細胞表面レセプターの細胞内領域との複合体を形成する。非レセプターPTKsを介して機能するレセプターには、サイトカイン、ホルモン（増殖ホルモンおよびプロラクチン）およびTおよびBリンパ球上の抗原特異的レセプターが含まれる。
【００９７】
多くのPTKsが、その活性が、もはや正常細胞対象に左右されない、癌細胞における変異発がん遺伝子の産物としてまず同定された。事実、公知の発がん遺伝子の三分の一が、PTKsをコードしており、細胞形質転換（発がん）が、しばしばチロシンリン酸化活性の増加を伴うことがよく知られている。
【００９８】
フラボピリドール、ジェニステム、エルブスタチン、レベンダスチンA、スタウロスポリンおよびUCN−01のような、多くのチロシンキナーゼ阻害剤が、天然の産物より由来する。ATP結合部位を指向する阻害剤もまた入手可能である。RTKsからのシグナルがまた、核チロシンキナーゼ、膜アンカー（ファルネシル化の阻害剤）および転写因子のような、他の標的部位にて阻害可能である。
【００９９】
EGFR、HER2、PDGFR、srcおよびablのような増殖促進チロシンキナーゼのシグナル伝達可能性を標的にすることにより、腫瘍増殖が阻害され、一方で、IGF−1およびTRKが、腫瘍細胞生存を干渉しうる。これらのキナーゼの阻害は、腫瘍シュリンケージおよびアポオーシスを導きうる。FklI/KDRおよびsrcは、腫瘍の新血管形成（血管新生）に必要なキナーゼである。これらのキナーゼの阻害によって、腫瘍増殖が遅くなり、転移が減少する。
【０１００】
RTKsの阻害剤は、細胞遊走、浸潤および転移を防止することによって腫瘍発展を抑制する。これらの薬物は、おそらく腫瘍進行のために必要な時間を増加させ、疾患の攻撃性を阻害または減弱しうるが、しかし、当初は測定可能な腫瘍退化にはならない可能性がある。
【０１０１】
不完全なチロシンキナーゼから発生するがんの例は、ニューロン特異的チロシンキナーゼ、未分化リンホーマキナーゼ（ALK）の好ましくない発現を示す、「ALKomas」と呼ばれる、ALK陽性リンホーマのクラスである。
【０１０２】
イレッサ（ZD1839）は、経口活性選択的EGF−R阻害剤である。この化合物は、癌細胞増殖に関連するシグナル伝達を乱す。本剤の臨床効果は、第I／II相臨床試験中の患者によって、良く耐性であることを示している。本化合物は、いくつかの癌細胞株に対して、有望な細胞傷害性を示している。
【０１０３】
主要なタンパク質キナーゼが、脳にて、しばしばニューロン特異的様式で発現しているので、タンパク質リン酸化は、脊椎動物中枢神経系の発達および機能で、鍵となる役割を果たしているに違いない。したがって、ニューロン特異的キナーゼは、薬理学的に活性な調整物の開発の標的として、よく確立されている。
【０１０４】
NIMA−関連キナーゼは、p34Cdc2タンパク質キナーゼとの組み合わせで、アスペルギルス  ニジュランス（Aspergillus nidulans）中の有糸分裂を調整する、タンパク質キナーゼである、NIMA（never in mitosis gene A）と高いアミノ酸ン配列同一性を共有しているタンパク質キナーゼの一群である。有糸分裂が、この種にて開始可能である前に、p34cdc2／サイクリンBおよびNIMA両方が、正しく活性化されるべきであり、p34cdc／サイクリンBは、NIMAの有糸分裂特異的活性化にて、役割を果たす。さらに、両方のキナーゼは、有糸分裂が完了できる前に、タンパク質分解的に破壊されなければならない。NIMAは、セリン10の位置で、ヒストンH3のリン酸化を介して、有糸分裂クロマチン濃縮を調整する。NIMA−関連キナーゼはまた、NIMAの発現が、酵母、カエルまたはヒト細胞内の有糸分裂事象を促進可能であるので、他の真核細胞における細胞周期も調整しうる。アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞にて、NIMAは、Mos、CDC2またはMAPキナーゼを活性化せずに、卵割胞崩壊を誘導する。HeLa細胞にて、NIMAのドミナント−ネガティブバージョンが、特異的G2拘束を引き起こすことによって、有糸分裂への進行に悪影響を及ぼす。
【０１０５】
（すべてのNIMA−関連キナーゼにて保存された）スレオニン199の変異が、NIMAβ−カセインキナーゼ活性を阻害し、そのin vivo機能を廃した。この部位は、NIMA（FXXT）に関して、最小コンセンサスリン酸化部位に一致し、環状−AMP−依存タンパク質キナーゼの自己リン酸化部位に類似する。NIMA−関連キナーゼ遺伝子、Nek1の変異によって、マウスでの進行性多嚢性腎臓疾患を含む、多面的な効果を引き起こす。
【０１０６】
ヒトNIMA−関連キナーゼ（NeK）ファミリー内で、Nek2タンパク質キナーゼが、アスペルギルス  ニジュランスのNIMAの、もっとも近い公知の哺乳動物関連物である。2つのキナーゼは、その触媒ドメイン上で、47％の配列同一性を共有し、G2からM期への移動時にピークとなる、小細胞周期依存発現を示す。組換え体NeK2が、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼとして活性であり、自己リン酸化が起こりうることが明らかになった。ヒトNek2と真菌NIMA両方が、同一ではなくても、同様の、タンパク質および合成ペプチドの組をリン酸化し、ベータ−カセインが、in vitroにて、Nek2をアッセイするために、好適な基質であることがわかった。HeLa細胞において、Nek2活性は、その数と平行し、MおよびG1期で少なく、SおよびG2期の間で高い。ヒトNek2は、セントロゾームに局在している。活性Nek2の過剰発現により、セントロゾームの著しいスプリッティングが誘導され、一方で活性または不活性Nek2いずれかの発現の延長により、セントロゾーム物質の分散および集中的微小管−核活性の欠損が導かれる。これらの結果は、ヒトNek2の1つの機能が、セントロゾーム周期に関連することを示唆している。
【０１０７】
ヒトNek3が、RT−PCRによってクローン化された。高レベルのNek3発現が、睾丸、卵巣、および脳で検出され、低レベルの発現が、他のほとんどの組織で検出された。Nek3  mRNAは、研究された増殖細胞株全てで観察され、細胞周期の間、量は変化しなかった。ヒトNek3遺伝子は、体細胞ハイブリッドによってヒトクロモソーム13に、放射線ハイブリッドマッピングによって13q14.2にアサインされた。
【０１０８】
ヒトNek6は、ヒトクロモソーム9q33〜34に局在し、これはNRHK1が局在するのと同様の領域である。Nek6転写物は、ほとんどの組織中で発現しているようにみられる。
【０１０９】
ヒトNek7は、ヒトNek6と77％同一である。系統発生解析により、Nek6、Nek7およびC.エレガンス F19H6.1が、タンパク質キナーゼのNIMAファミリー内で、サブファミリーを構築することが示唆されている。Nek7発現は、肺、筋肉、睾丸、脳、心臓、肝臓、白血球および脾臓を含む組織のサブセットに制限された。ヒトNEK7遺伝子は、体細胞ハイブリッドによって、ヒトクロモソーム1に、照射ハイブリッドマッピングによって1q31.3にアサインされた。
【０１１０】
最近、新規のヒトNIMA−関連キナーゼである、ヒトNek8と、その候補基質であるBicd2が、単離され、クローン化された。Nek8は、タンパク質キナーゼのNekファミリーと相同の、N−末端触媒ドメイン、RC1と相同の中央ドメイン、GTPase Ramに関するグアニンヌクレオチド交換因子、およびC−末端コイルド−コイルドメインを含む。Nek2と同様、Nek8は、他の外来基質上、ベータ−カセインが、好ましくキナーゼ活性に関する生化学的な要求を共有し、自己リン酸化およびオリゴ重合化可能である。Nek8活性は、細胞周期調整ではなく、Nek3と同様に、レベルは、G（0）−拘束細胞にて、一定に高い。Bicd2は、Nek8活性を持つ、共クロマトグラフされたタンパク質である。本タンパク質は、コイルド−コイルタンパク質である、ドロソフィラ（Drosophila）タンパク質Bicaudal Dのヒト相同物である。Bicd2は、in vitroにて、Nek8によってリン酸化され、外来タンパク質がin vivoで結合する。Bicd2は、細胞骨格構造に局在し、その細胞内局在は、微小管形態学に依存する。ノコダゾールでの細胞の処理によって、Bicd2の劇的な再編成が引き起こり、Nek8リン酸化と相関する。したがって、Nek8とBicd2両方が、細胞周期非依存微小管ダイナミクスと関連したことが明らかである。
【０１１１】
要約すると、キナーゼタンパク質は、薬物活性および開発のための、主要な標的である。したがって、キナーゼタンパク質の未だ未知のメンバーを同定すること、および特性化することが、薬理学的開発の領域で価値がある。本発明は、タンパク質キナーゼの触媒ドメインに配列および構造類似性を持つ、未だ同定されていないヒトキナーゼタンパク質を提供することによって、本技術分野の水準を進展させる。とりわけ、NRHK1内のキナーゼドメインは、セリン／スレオニンキナーゼ、pキナーゼおよびチロシンキナーゼのファミリー内の相当するドメインと、高い配列同一性を共有する。NRHK1内のキナーゼドメインはまた、NIMA−関連キナーゼの配列に遠縁で関連する。いろいろな種での機能的研究が、G（2）／M進展、クロマチン濃縮およびセントロゾーム調整における、NIMA−関連キナーゼに関連してきた。その本来の形態、または変異形態で、NRHK1内のキナーゼドメインを、他のキナーゼ内の相当するドメインの機能に影響を与えるために使用可能である。このドメインはまた、好適な基質をリン酸化するために使用可能である。基質ペプチドを、抗体に共役可能であり、基質ペプチドに加えたリン酸基を、放射活性、または蛍光的に標識可能である。そのようにして標識した抗体を、当業者によって理解されるように、種々の検出アッセイで使用可能である。
【０１１２】
NRHK1遺伝子および遺伝子産物を、NRHK1の異常な発現に関連する疾病を診断すること、予知すること、およびモニタリングすることのための、分子マーカーとして使用可能である。さらに、NRHK1遺伝子は、ヒト細胞におけるNRHK1遺伝子発現を増強する、または阻害することが可能な、見込みのある薬剤または薬物に関してスクリーンするために使用可能である。NRHK1遺伝子産物（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）を、NRHK1活性を増強する、または阻害することが可能な、見込みのある薬剤または薬物に関してスクリーンするために使用可能である。さらに、NRHK1の異常な発現に関連した疾病を処置するための種々の治療的方法を、NRHK1遺伝子、その変異体、またはNRHK1遺伝子の発現、またはNRHK1遺伝子産物の活性に影響を与える、薬剤／薬物に基づいて設計可能である。
【０１１３】
以下の小項目は、ヒトNRHK1遺伝子およびNRHK1キナーゼの利用の例を示している。本発明の精神および範囲内での、種々の変更および改変が、本記述より、当業者に明らかになるであろう。
【０１１４】
ポリヌクレオチドおよびその変異体
本発明の1つの態様は、NRHK1 mRNAsのような、NRHK1遺伝子またはその転写物にハイブリッド形成可能な、単離ポリヌクレオチドプローブに関連する。これらのプローブは、ヒト組織または細胞内の、NRHK1遺伝子の発現レベルを検出するために使用可能である。本発明はまた、NRHK1遺伝子またはNRHK1キナーゼ−コード配列の増幅または変異のための、RCRプライマーとしての使用のための、ポリヌクレオチド断片を意図している。本発明の他の態様は、NRHK1、またはその断片または変異体をコードしている、単離ポリヌクレオチドに関連する。これらのポリヌクレオチドは、NRHK1、またはその断片または変異体を発現するために使用可能である。したがって、タンパク質産物を、NRHK1の活性を調節する薬剤／薬物に関してスクリーンするために使用可能である。さらに、これらのポリヌクレオチドは、ヒトでのNRHK1遺伝子の発現またはNRHK1の活性を標的とする、遺伝子治療ベクターを設計するために使用可能である。
【０１１５】
配列番号：1または配列番号：3を含むポリヌクレオチドは、当業者によって理解されるような、標準の分子生物学的技術を用いて調製可能である。たとえば、配列番号：1の5’および3’末端から由来するプライマーを使用して、ヒト組織から単離したmRNAsを増幅可能である。そのようにして産出されたcDNAは、配列番号：1を含む。同様に、配列番号：3を含む、ヒトゲノム配列を増幅するためのプライマーを、NRHK1遺伝子のゲノム配列を調製するために、設計し、使用可能である。配列番号：1または配列番号：3の（類似物のような）変異体または断片を、同様に調製可能である。あるいは、プローブを、配列番号：1または配列番号：3の全長または断片を含む、ポリヌクレオチド分子を同定するために、cDNAまたはゲノム配列ライブラリーに関してスクリーンするために設計可能である。このようにして同定された分子を、全長配列番号：1または配列番号：3を含む好適なベクターを作製するために使用可能である。
【０１１６】
NRHK1遺伝子にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドを、たとえば自動化DNA合成機を用いてのような、標準の合成技術によって調製可能である。好ましくは、ポリヌクレオチドプローブは、低ストリンジェントな条件、ストリンジェントな条件、または高ストリンジェントな条件下で、NRHK1遺伝子にハイブリッド形成可能である。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：1の、少なくとも15、20、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む。配列番号：1および配列番号：3の任意の断片を、NRHK1遺伝子またはその転写物に対する、ハイブリッド形成プローブまたはPCRプライマーとして使用しうる。プローブ／プライマーを、本質的に精製可能である。
【０１１７】
好ましい実施形態において、NRHK1遺伝子に対するハイブリッド形成プローブには、標識基が含まれる。標識基は、放射同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共因子でありうる。このようにして標識されたプローブは、ヒト組織におけるNRHK1遺伝子の発現レベルを決定するための、診断キットの一部として使用可能である。
【０１１８】
本発明は、他の種でのヒトNRHK1遺伝子類似体を包含する。これらの類似体は、NCBIによって維持されるEntrez/GenBank配列データベースのような、他の異なる配列データベースの検索によって決定可能である。本発明はまた、以上で記述した分子とは、構造的に異なるが、しかし、以上で記述した分子と、本質的に同様の特性を持つ、ポリペプチド分子を包含する。そのような分子には、対立遺伝子変異体が含まれ、これは、より詳細に以下で記述する。
【０１１９】
ヒトNRHK1遺伝子中のDNA配列多型が、天然の対立遺伝子変化によって、異なる個体間で存在する。対立遺伝子は、該遺伝的座にて、二者択一的におこる、遺伝子の一群の1つである。NRHK1遺伝子のRNA発現レベルに影響を与えるDNA多型もまた存在可能であり、たとえば、遺伝子の発現の調製または分解に影響を与えることを介して存在可能である。本発明は、ヒトNRHK1遺伝子の全ての対立遺伝子変異体を意図している。NRHK1遺伝子の対立遺伝子変異体および他の類似体は、配列番号：1または配列番号：3から由来したプローブ／プライマーを用いて単離可能である。
【０１２０】
もちろん、配列番号：1および配列番号：3が改変可能であることが理解されるべきである。改変ポリヌクレオチドは、1つまたはそれ以上の変異を含んで良い。これらの変異は、配列番号：1または配列番号：3中の1、2、3、5、10、15、20またはそれ以上のヌクレオチド残基の置換、添加、または欠失であり得る。部位特異的変異導入またはPCR−仲介変異導入のような、標準の技術を使用可能である。好ましくは、これらの変異により、保存アミノ酸置換が作製される。あるいは、変異は、飽和変異導入によって、NRHK1遺伝子またはそのcDNAの全て、または部分にわたり、無作為に導入可能である。変異導入に続いて、コードされたタンパク質が、組換え発現可能であり、その活性を決定可能である。
【０１２１】
1つの実施形態において、「非必須（non-essential）」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を引き起こすヌクレオチド置換を誘導可能である。「非必須」アミノ酸残基は、タンパク質の生物学的活性を変化させることになしに、変更可能な残基である。一方、「必須（essential）」アミノ酸残基は、タンパク質の生物学的活性に必要である。異なる種からのNRHK1遺伝子の対立遺伝子変異体または類似体間で保存されているアミノ酸残基は、本発明では変更されない。
【０１２２】
したがって、本発明の他の態様は、NRHK1の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む、NRHK1タンパク質に関連する。これらのタンパク質は、本来のヒトNRHK1キナーゼからのアミノ酸配列とは異なるが、その生物学的活性を保つ。1つの実施形態において、改変されたタンパク質は、配列番号：2に対して、少なくとも約85％、90％、95％、98％またはそれ以上の類似性を持つ。
【０１２３】
他の実施形態において、NRHK1タンパク質は、NRHK1活性の阻害となる、アミノ酸残基中の変異を含む。これらの変異導入されたNRHK1タンパク質は、NRHK1の異常な発現に関連した疾病を患う患者における、NRHK1活性を阻害するために使用可能である。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドはさらに、in vivoで、その安定性を増加させるために改変可能である。可能性のある改変には、限定はしないが、5’および／または3’末端での隣接配列の添加、骨格での、ホスホジエステル結合ではなく、ホスホロチオエートまたは2−メチルの使用、および／またはイノシン、クエオシンおよびウイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および他の改変形態のような、非伝統的塩基の挿入、が含まれる。
【０１２５】
NRHK1遺伝子に対するアンチセンスである、ポリヌクレオチド分子を調製可能である。「アンチセンス（antisense）」ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしている「センス（sense）」ポリヌクレオチドに相補的である、ヌクレオチド配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに、水素結合を介して結合可能である。
【０１２６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ワトソンとクリックの塩基対のルールにしたがって設計可能である。アンチセンスポリヌクレオチド分子は、NRHK1遺伝子の全コード領域およびコード領域の一部に相補的であり得る。アンチセンスポリヌクレオチド分子はまた、NRHK1遺伝子のコード鎖中の「非コード領域（noncoding region）」に相補的でもありうる。好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチドは、NRHK1遺伝子の一部分のみに対するアンチセンスである、オリゴヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドは、たとえば、長さにして、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドである。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、当業者に理解されるような、化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築可能である。たとえば、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然に局在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるため、またはアンチセンスとセンスポリヌクレオチド間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるために設計された、種々に改変したヌクレオチドを用いて、化学的に合成可能である。アンチセンスポリヌクレオチドを作製するために使用可能である改変ヌクレオチドには、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンチルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル  アデノシン、ウラシル−5−オキソ酢酸、ウイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、3−（3−アミノ−2−N−2−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、および2,6−ジアミノプリンが含まれる。ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドもまた使用可能である。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが、アンチセンス方向でサブクローン化された（すなわち、挿入ヌクレオチドから転写されたRNAが、対象の標的ポリヌクレオチドに対して、アンチセンス方向のものであり得る）発現ベクターを用いて、生物学的に産出可能である。
【０１２７】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを、NRHK1キナーゼをコードする、細胞mRNAsおよび／またはゲノムDNAsにハイブリッド形成する、または結合するように、対象に投与するか、またはin situにて適用可能であり、これによって、NRHK1キナーゼの発現を阻害する。ハイブリッド形成は、結果として、従来のヌクレオチド相補性を介して、安定な二本鎖となりうる。アンチセンスポリヌクレオチドの投与経路の例には、組織部位での直接注入が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドをまた、まず改変し、ついで全身に投与可能である。たとえば、全身投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現したレセプターまたは抗体に特異的に結合するように改変可能である。好適な改変には、アンチセンスポリヌクレオチドを、細胞表面レセプターまたは抗体に結合する、ペプチドまたは抗体に連結することが含まれる。さらに、アンチセンスポリヌクレオチドは、ベクターを用いて伝達可能である。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、強力なpol IIおよびpol IIプロモーターをベクター内で使用しうる。
【０１２８】
1つの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは、α−芳香族ポリヌクレオチドである。α−芳香族ポリヌクレオチド分子は、通常のβ−ユニットと比較して、鎖が、互いに平行して走る、相補RNAと、特定の二本鎖ハイブリッドを形成する。アンチセンスポリヌクレオチド分子はまた、2−o−メチルリボヌクレオチドまたはキメラRNA−DNA類似体も含みうる。
【０１２９】
他の実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドはリボザイムである。リボザイムは、mRNAのような、一本鎖ポリヌクレオチドを開裂可能な、リボヌクレアーゼ活性を持つ、触媒的RNA転写物の配列分子であり、相補領域を持つ。したがって、リボザイム（たとえば、Haselhoif and Gerlach Nature 334：585−591, 1988にて記述された、ハマーヘッドリボザイム）を、その発現を阻害するために、NRHK1のmRNA転写物を触媒的に開裂するために使用可能である。NRHK1遺伝子またはその転写物に対して特異性を持つリボザイムは、配列番号：1または3に基づいて消化可能である。NRHK1遺伝子から転写されたmRNAsを、特異的リボヌクレアーゼ活性を持つ、触媒的RNAを、RNA分子のプールから選択するために使用可能である。
【０１３０】
あるいは、NRHK1遺伝子の発現を、調節領域（たとえばプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を用いることによって阻害可能である。これらのヌクレオチド配列は、標的細胞内の遺伝子の転写を防止する、三重らせん状構造を形成可能である。
【０１３１】
NRHK1遺伝子の発現はまた、RNA干渉（「RNAi」）を用いて阻害可能である。RNAiは、二本鎖RNA（dsRNA）を特定の有機体または細胞型へ導入することによって、相同性mRNAの分解が引き起こる現象である。まず、線虫（Caenorhabditis elegans）にて発見され、それより、RNAiは、広範囲の有機体で動作することがわかってきた。たとえば、哺乳動物細胞内で、長いdsRNA（＞30nt）の導入によって、強力な抗ウイルス応答を開始可能であり、タンパク質合成およびRNA分解の非特異的分解によって例示される。RNA干渉によって、mRNAレベルでの、遺伝子スライシングの機構が提供される。近年、RNAiは、in vivoでの分解のために特定の転写を作り出すための、二本鎖RNAs（dsRNA）を用いる、外因性かつ強力な遺伝子特異的スライシング技術となってきている。また、遺伝子ノックアウトのための、効果的で、広く適用可能なアプローチでもある。たとえば、RNAi標的化Fas−仲介アポトーシスが、マウスを、劇症性肝炎から保護することが示されている。RNAi技術は、米国特許第5,919,619号、第6,506,559号およびPCT第WO99/14346号、第WO01/70949号、第WO01/36646号、第WO00/63364号、第WO00/44895号、第WO01/75164号、第WO01/92513号、第WO01/68836号、および第WO01/29058号のような、多数の明細書にて開示されてきている。
【０１３２】
好ましい実施形態において、短い干渉RNAs（siRNA）が使用される。siRNAは、19〜25ヌクレオチドを持つdsRNAsである。siRNAsは、Dicerと呼ばれるRNaseIII−関連ヌクレアーゼによる、長いdsRNA分子の分解によって、内生的に産出可能である。siRNAsはまた、細胞内へ外来的に導入可能であり、または発現構造物の転写によって可能である。一旦形成されると、siRNAsは、RNA誘導スライシング複合体（RISCs）として知られる、エンドリボヌクレアーゼ−含有複合体内に、タンパク質成分とともにアセンブルする。siRNAのATP産出巻き戻しによりRISCsが活性化され、順に、ワトソン−クリック塩基対によって、相補mRNA転写物を標的部とし、それによって、mRNAを開裂し、破壊する。mRNAの開裂は、siRNA鎖によって結合した領域の中央近くで起こる。この配列特異的mRNA分解は、結果として遺伝子スライシングとなる。
【０１３３】
少なくとも2つの方法を使用して、siRNA−仲介遺伝子スライシングを達成可能である。第一に、siRNAsは、in vitroで合成し、遺伝子発現を一過性に抑制するために、細胞内に導入可能である。合成siRNAによって、RNAiを達成する、簡単で、十分な方法が提供される。siRNAは、たとえば対称2ジヌクレオチド3’オーバーハングを持つ、19ヌクレオチドを含みうる、短い混合オリゴヌクレオチドの二本鎖である。合成21bp siRNA二本鎖（19RNA塩基と、続くUUまたはdTdT3’オーバーハング）を用いて、配列特異的遺伝子スライシングを、哺乳動物細胞内で達成可能である。これらのsiRNAsは、長いdsRNAによるDNA−依存タンパク質キナーゼ（OKR）を活性化せずに、哺乳動物内で、標的とした遺伝子翻訳を特異的に抑制し、結果として、多くのタンパク質の転写の非特異的抑制となる。
【０１３４】
第二に、siRNAsは、ベクターより、in vivoにて発現可能である。このアプローチは、細胞またはトランスジェニック動物内で、安定にsiRNAsを発現するために使用可能である。1つの実施形態において、siRNA発現ベクターを、ポリメラーゼIII（polIII）転写ユニットからのsiRNA転写物を駆動するために、遺伝子操作する。siRNA機能に対して有益である特徴、ヘパリンsiRNAsへの2bpオーバーハング（UU）の添加を導く、短いATリッチな転写末端部位を配置するので、polIII転写物ユニットが、ヘアピンsiRNA発現に好適である。polIII発現ベクターもまた、siRNAを発現するトランスジェニックマウスを作製するために使用可能である。
【０１３５】
他の実施形態において、siRNAsは、組織特異的様式で発現可能である。本アプローチでは、長い二本鎖RNAs（dsRNAs）がまず、選択した細胞株またはトランスジェニックマウスの核内で、（CMV（polII）のような）プロモーターから発現する。長いdsRNAsは、核内で（たとえばDicerによって）siRNAsに処理される。siRNAsは、核より出て、遺伝子特異的スライシングを仲介する。同様のアプローチを、組織特異的ノックダウンマウスを作製するために、組織特異的（polII）プロモーターとの組み合わせで使用可能である。
【０１３６】
UUのような、任意の3’ジヌクレオチドオーバーハングを、siRNAsのために使用可能である。siRNAに関して、一本鎖G残基でRNaseによって開裂される可能性があるため、オーバーハング内のG残基が避けられる場合もある。
【０１３７】
siRNA配列それ自身に関して、30〜50％のGC含率でのsiRNAsが、ある場合に、それより高いG／C含率を持つものよりも、より活性でありうることが発見された。さらに、4〜6ヌクレオチドポリ（T）区域が、RNA pol IIIに対する末端シグナルとして働きえるので、標的配列内の＞4TsまたはAsのストレッチが、RNA pol IIIプロモーターから発現すべき、配列を設計する、特定の場合に、避けられてよい。さらに、mRNAのいくつかの領域が、高く構造化されるか、または制御タンパク質によって結合されるかいずれかであってよい。したがって、遺伝子配列の長さに沿って、異なる位置で、siRNA標的部位を選択することが有益であり得る。最終的に、見込みのある標的部位を、適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較可能である。他のコード配列に対して、16〜17を超えるの連続塩基対を持つ任意の標的配列が、特定の場合で、考慮によって排除されうる。
【０１３８】
1つの実施形態において、siRNAが、短いスペーサー配列、および転写終止部位としてはたらく、Tsの列を持つ末端によって分離される、2つの反転繰り返しを持つように設計可能である。この設計によって、短いヘアピンsiRNAに折りたたまれることが予想されるRNA転写物が産出される。siRNA標的配列の選別、推定ヘパリンの幹をコードしている、反転繰り返しの長さ、反転繰り返しの順番、ヘパリンのループをコードしているスペーサー配列の長さおよび組成、および5’−オーバーハングの有無は、所望の結果を達成するために、変更可能である。
【０１３９】
siRNA標的は、AAジヌクレオチドに関して、mRNA配列をスキャンすること、およびAAの直下流の19ヌクレオチドを再コードすることによって、選別可能である。他の方法もまた、siRNA標的を選択するために使用可能である。1つの例では、siRNA標的配列の選択は、標的配列が、GGで始まり、BLAST検索によって解析されたような他の遺伝子と、明らかな配列相同性を共有しない限り、純粋に実験的に決定される（たとえば、Sui et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515−5520, 2002参照）。他の例では、より複雑な方法を、siRNA標的配列を選択するために使用する。本手順は、外来mRNA中の任意の利用可能部位を、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／RNase H法（Lee et al.,Nature Biotechnology 20：500-505,2002）による分解に関して標的化可能であるという観察を利用する。
【０１４０】
他の実施形態において、ヘアピンsiRNA発現カセットが、標的のセンス鎖、続いて短いスペーサー、標的のアンチセンス鎖、および転写終止として5〜6Tsを含むように構築される。siRNA発現構造内のセンスおよびアンチセンス鎖の順番は、ヘアピンsiRNAの遺伝子スライシング活性に影響を与えずに変更可能である。いくつかの例で、順番の逆転が、遺伝子スライシング活性における部分的減少を引き起こしうる。
【０１４１】
siRNA発現カセットの幹として使用されるヌクレオチド配列の長さは、たとえば、19〜29の範囲であり得る。ループサイズは、3〜23ヌクレオチドの範囲であり得る。他の長さおよび／またはループサイズもまた使用可能である。
【０１４２】
また他の実施形態において、ヘアピンsiRNAが、遺伝子スライシングで機能的であるという条件で、ヘアピンsiRNA構造物内の5’オーバーハングを使用可能である。1つの特定の実施例にて、5’オーバーハングには、約6ヌクレオチド残基が含まれる。
【０１４３】
好ましい実施形態において、RNAiの標的配列は、配列番号：1から選択された、21マー配列断片である。標的配列の5’末端は、ジヌクレオチド「NA」を持ち、ここで「N」は、任意の塩基でありえ、「A」はアデニンを表す。残りの19マー配列は、45％と55％との間にあるGC含率である。さらに、残りの19マー配列は、（1）任意の3つの連続同一塩基（すなわち、GGG、CCC、TTTまたはAAA）、（2）ロール中の7つの「GC」、および（3）5またはそれ以上の塩基を持つ、任意のパリンドローム配列を含まない。さらに、標的配列は、他のヒト遺伝子に対して、低い配列相同性を持つ。1つの特定の実施例において、可能性ある標的配列は、NCBIのヒトUniGeneクラスター配列データベースに対して、BLASTNによって検索される。ヒトUniGeneデータベースは、遺伝子指向性クラスターの非齧歯類組を含む。各UniGeneクラスターには、固有の遺伝子をあらわす配列が含まれる。BLASTN検索にて、他のヒト遺伝子に対してヒットを生まない、配列番号：1の断片を、RNAiに関する好ましい候補配列として選択する。検索の間、e−値が、（「1」のような）厳格値として設定されうる。表4は、以上で記述した設定を用いて調製したRNAiに関する、例示NRHK1遺伝子標的配列を列記している。各標的配列に関するsiRNA配列（センス鎖およびアンチセンス鎖）もまた開示されている。さらに、配列番号：1中の各標的配列の5’末端局在が同定される（「5末端」）。
【表４】
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【０１４４】
また他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを、分子の安定性、ハイブリッド形成または溶解性を改善するために、塩基部位、糖部位またはリン酸骨格を改変可能である。たとえば、ポリヌクレオチド分子のデオキシリボースリン酸骨格を、ペプチドポリヌクレオチドを産出するために、改変可能である（Hyrup B.et al.Bioorganbic & Medicinal Chemistry 4：523, 199を参照のこと）。本明細書で使用する語句「ペプチドポリヌクレオチド（peptide polynucleotides）」または「PNAs」は、デオキシリボースリン酸骨格が、シュードペプチド骨格で置換され、4つの天然のヌクレオ塩基が保持される、ポリヌクレオチドミミック、たとえばDNAミミックを言う。PNAsの中性骨格が、低イオン強度の条件下で、DNAおよびRNAへの特異的なハイブリッド形成を許容することが示されてきた。PNAオリゴマーは、標準の固体相ペプチド合成プロトコールを用いて合成可能である。
【０１４５】
PNAsは、治療および診断適用で使用可能である。たとえば、PNAsは、NRHK1遺伝子発現の配列特異的調製のための、アンチセンス薬剤として使用可能である。PNAsはまた、遺伝子内の単一塩基対変異の解析（たとえばPNA−特異的PCRクランピング）、他の酵素（たとえばS1ヌクレアーゼ）との組み合わせで使用する場合、人工制限酵素として、またはDNAシークエンシングまたはハイブリッド形成のためのプローブまたはプライマーとして、使用可能である。
【０１４６】
1つの実施形態において、PNAsを、PNAに疎水性または他のヘルパー基を接続することによって、RNA−DNAキメラの形成によって、または本技術分野で公知のリポソームまたは他の薬物伝達技術の使用によって、その安定性または細胞取り込みを促進するために改変可能である。たとえば、本発明のポリヌクレオチドのPNA−DNAキメラを産出可能である。これらの技術によって、PNA部位が、高い結合親和性および特異性を提供する一方で、RNaseHおよびDNAポリメラーゼのような、DNA認識酵素が、DNA部位と相互作用することを可能にする。PNA−DNAキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数、および方向に基づいて選択される、適切な長さのリンカーを用いて連結可能である。PNA−DNAキメラは、以下のように合成可能である。DNA鎖を、標準のホスホラミダイトカップリング化学反応および改変ヌクレオシド類似体を用いて、固体支持体上で合成する。ついで、PNAモノマーを段階的に連結して、5’PNA区画と3’DNA区画を持つ、キメラ分子を産出する。あるいは、キメラ分子を、5’DNA区画と3’PNA区画で、合成可能である。
【０１４７】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチド（たとえばin vivoでの宿主細胞レセプターの標的化のため）、または細胞膜または血液−腎臓バリアを介した輸送を促進する薬剤（たとえばPCT第WO89/10134号を参照のこと）のような、他の添付基を含みうる。さらに、ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成誘因開裂薬剤、または挿入剤を用いて、改変可能である。このために、ポリヌクレオチドを、他の分子（たとえばペプチド、ハイブリッド形成誘因架橋薬剤、輸送薬剤、またはハイブリッド形成誘因開裂薬剤）へ結合可能である。さらに、ポリヌクレオチドを、検出可能に標識化可能である。
【０１４８】
ポリペプチドおよびその変異体
本発明のいくつかの態様は、正常のNRHK1活性を阻害可能である、NRHK1ポリペプチドおよび改変NRHK1ポリペプチドを単離することに関連する。本発明はまた、抗−NRHK1抗体を作製するために好適な、免役原性ポリペプチド断片も意図する。
【０１４９】
1つの実施形態において、天然NRHK1ポリペプチドを、標準のタンパク質精製技術を用いることによって、細胞または組織供給源より単離可能である。標準の精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的およびクロマトグラフィー技術が含まれる。特定の例には、イオン交換、親水性、アフィニティまたは逆相HPLCクロマトグラフィー、およびクロマトフォーカシングが含まれる。1つの実施形態において、NRHK1ポリペプチドを、抗−NRHK1抗体と共役した標準のアフィニティーカラムを用いて精製する。超濾過およびディアフィルトレーション技術もまた使用可能である。精製の度合いは、NRHK1ポリペプチドの使用の目的に依存する。いくつかの例で、精製が必要ではない。
【０１５０】
他の実施形態において、正常のNRHK1活性を阻害可能な、NRHK1ポリペプチドまたは変異NRHK1ポリペプチドを、組換え体DNA技術によって産出する。組換え体発現の代わりに、NRHK1ポリペプチドまたは変位NRHK1ポリペプチドを、標準のペプチド合成技術を用いて、化学的に合成可能である。
【０１５１】
本発明は、ヒトNRHK1遺伝子によってコードされたNRHK1ポリペプチドまたはその類似体を提供する。本発明のポリペプチドは、本質的に、ヒトNRHK1キナーゼ（配列番号：2）に相同的であり得る。好ましくは、これらのポリペプチドは、天然のNRHK1キナーゼの生物学的活性を維持する。1つの実施形態において、ポリペプチドには、配列番号：2に対する少なくとも約85％、90％、95％、98％、またはそれ以上相同である、アミノ酸配列が含まれる。
【０１５２】
2つの配列間の、配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Needlleman and Wunsch（J.Mol.Biol.48：444-453, 1970）アルゴリズム、Blossom 62マトリックスまたはOAM250マトリックスいずれか、16、14、12、10、8、6または4のギャップウェイト、1、2、3、4、5または6の長さウェイトを用いてGCGソフトウェアパッケージ内のGAPプログラムを用いて決定可能である。2つのヌクレオチド配列のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE.Meyers and W.Miller（CABIOS, 4：11-17, 1989）のアルゴリズム、またはNCBIのBLASTウェブサイトで入手可能な対合BLASTプログラムを用いて決定可能である。
【０１５３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を、同様の配列を同定するために、好適なデータベースを検索するための、クエリー配列として使用可能である。検索は、NCBIによって維持されているBLASTウェブサイトで入手可能である、タンパク質BLAST、ヌクレオチドBLAST、対合BLAST、およびゲノムBLASTのような、BLASTプログラムを用いて実施可能である。BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータも使用可能である。
【０１５４】
本発明はさらに、キメラまたは融合NRHK1ポリペプチドを提供する。融合NRHK1ポリペプチドは、NRHK1−関連ポリペプチドおよび非−NRHK1ポリペプチドを含む。NRHK1−関連ポリペプチドには、全てまたは一部の配列番号：2またはそのバリアントが含まれる。その天然の二次および四次構造へ各ペプチドが折りたたまれることを保証するのに十分な距離まで、非NRHK1ポリペプチド成分から、NRHK1−関連ポリペプチドを分離するために、ペプチドリンカー配列を、使用可能である。そのようなペプチドリンカー配列は、本技術分野でよく知られている標準の技術を用いて、融合タンパク質内に組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子、（1）柔軟性の伸長配座を採用するその能力、（2）NRHK1−関連ポリペプチドおよび非NRHK1ポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用可能な、二次構造を採用するその無能性、および（3）ポリペプチド機能性ポリペプチドと反応しうる、親水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択可能である。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含む。ThrおよびAlaのような、他の近い中性アミノ酸もまた、リンカー配列で使用可能である。リンカーとして好適なアミノ酸配列には、Maratea et al.,Gene 40：39-46, 1985、Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262, 1986、米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号で開示されたものが含まれる。リンカー配列は、長さにして、1〜約50アミノ酸でありうる。リンカー配列は、NRHK1−関連ポリペプチドまたは非−NRHK1ポリペプチドが、それぞれの機能的ドメインを分離し、それによって立体的干渉を防止する、非必須N−末端アミノ酸領域を持つ場合には、必要ない。
【０１５５】
1つの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号：2のようなNRHK1−関連配列が、GST配列のC−末端に融合する、GST−NRHK1融合タンパク質である。この融合タンパク質は、組換え体NRHK1の精製を促進可能である。
【０１５６】
本発明のNRHK−1融合タンパク質を、医薬組成物内に組み込み、対象に投与可能である。NRHK1融合タンパク質を、NRHK1基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために利用可能である。NRHK1−融合タンパク質はまた、（i）NRHK1の異常な改変または変異、または（ii）NRHK1の異常な翻訳後修飾によって引き起こされる障害の処置または防止のために使用可能である。正常または変異NRHK1ポリペプチドまたはその断片を含む融合タンパク質が、ヒト対象中のNRHK1活性を阻害するために使用可能であることも、ありうる。
【０１５７】
さらに、NRHK1−融合タンパク質を、抗NRHK1抗体を産出するための、免疫原として使用可能である。これらはまた、NRHK1リガンドを精製するため、またはNRHK1とその基質間の相互作用を阻害可能な分子に対してスクリーンするために使用可能である。
【０１５８】
好ましくは、本発明のNRHK1−キメラまたは融合タンパク質を、標準の組換え体DNA技術を用いて産出する。融合部位（たとえばGSTポリペプチド）をコードしている市販されている発現ベクターを使用可能である。
【０１５９】
シグナル配列を、分泌したタンパク質または他の対象のタンパク質の分泌および単離を促進するために使用可能である。シグナル配列は、典型的には、一般的に、成熟タンパク質から単離される、疎水性アミノ酸のコアによって特性化される。そのようなシグナルペプチドは、分泌経路を通るので、成熟タンパク質からのシグナル配列の開裂を可能にする、処理部位を含む。本発明は、シグナル配列、または同じ物をコードしているポリヌクレオチド配列を持つ、NRHK1ポリペプチドを包含する。
【０１６０】
本発明はまた、NRHK1に対するアンタゴニストとして機能する、NRHK1変異体にも関連する。1つの実施形態において、NRHK1のアンタゴニストを、治療薬剤として使用する。たとえば、野生型NRHK1と非機能的ダイマーを形成するNRHK1の変異体（ドミナントネガティブ変異体と呼ぶ）は、NRHK1の活性を減少可能であり、NRHK1がレベルまたは活性において、異常に上昇した対象内の疾患を改善しうる。ドミナントネガティブNRHK1変異体は、当業者によって理解されるような、変異導入によって作製可能である。
【０１６１】
NRHK1アゴニストまたはアンタゴニストいずれかとして機能するNRHK1変異体を、変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定可能である。NRHK1変異体の種々のライブラリーは、たとえば、可能性のあるNRHK1配列の変性組が、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にNRHK1配列の組を含むより大きな融合タンパク質の一組として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列内に酵素的にライゲーションすることによって産出可能である。変質オリゴヌクレオチド配列から、可能性のあるNRHK1変異体のライブラリーを産出するために使用可能である、種々の方法が存在する。変質遺伝子配列は、自動化DNA合成機を用いて、化学的に合成可能である。ついで、合成遺伝子を、適切な発現ベクター内にライゲーション可能である。
【０１６２】
1つの実施形態において、コード配列のライブラリーを、ヌクレアーゼを用いて産出可能である。たとえば、NRHK1コード配列の二本鎖PCR断片を、1分子あたり約1つのニックを産出する、ヌクレアーゼによって処理可能である。ついで二本鎖DNAsを、変性および復元のサイクルにかける。異なるニック化産物からのセンス／アンチセンス対を含みうる、新規に再形成されたDNAsを、S1ヌクレアーゼによって処理し、一本鎖部分を除去する。本方法を用いて、NRHK1のN−末端、C−末端または内部断片をコードしている発現ライブラリーを誘導可能である。
【０１６３】
さらに、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増強する技術である、再帰的アンサンブル変異導入（REM）を使用して、NRHK1変異体を調製可能である（Delgrae et al.,Protein Engineering 6：327-331, 1993）。
【０１６４】
NRHK1断片またはその変異体をまた、固相合成法のような、合成方法を用いて産出可能である。好ましくは、合成した断片は、約100未満のアミノ酸、好ましくは約50未満のアミノ酸を持つ。
【０１６５】
抗体
本発明の他の態様にしたがって、NRHK1またはその変異体に特異的な抗体を調製する。抗体は、その抗体と抗原間の結合親和性が、105M−1と等しいか、それより大きい場合に、抗原に「特異的に（specifically）」結合すると考えられる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。好ましくは、抗体はモノクローナルである。より好ましくは、抗体はヒト化抗体である。
【０１６６】
ポリクローナル抗NRHK1抗体は、好適な対象を、NRHK1またはその断片で免疫化することによって調製可能である。免疫化対象における抗NRHK1抗体タイターを、ELISAのような、標準の技術を用いて、時間を追ってモニタ可能である。抗NRHK1抗体を、公知の技術を用いて、免疫化した対象から単離可能である。
【０１６７】
1つの実施形態において、抗NRHK1抗体を産出可能なハイブリドーマを調製する。精製したNRHK1またはその誘導体、またはその断片を、哺乳動物のような脊椎動物を免疫するために使用する。好適な哺乳動物には、マウス、ウサギおよびヒツジが含まれる。好ましくは、免疫化のために使用した断片には、少なくとも8アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも12アミノ酸残基、非常に好ましくは、少なくとも16アミノ酸残基、もっとも好ましくは、少なくとも20アミノ酸残基が含まれる。
【０１６８】
NRHK1の免疫原断片（エピトープ）は、公知の技術を用いて同定可能である。一般的に、配列番号：2のいかなる断片をも、NRHK1に特異的な抗体を作製するために使用可能である。好ましいエピトープは、NRHK1の表面上の局在する領域である。これらの領域は、通常疎水性である。
【０１６９】
脾臓細胞を、免疫化した脊椎動物より単離し、（ミエローマのような）不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成する。好ましくは、不死化細胞株は、リンパ球と同様の哺乳動物種より由来する。たとえば、齧歯類ハイブリドーマを、不死化マウス細胞株を、本発明の免疫原調製物で免疫化したマウスから単離したリンパ球と誘導させることで作成可能である。好ましい不死化細胞株には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「HAT培地」）に感受性の、マウスミエローマ細胞株が含まれる。好適なミエローマ細胞株には、限定はしないが、P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653、またはSp210-Ag14ミエローマ株が含まれ、これらの全てが、ATCCより入手可能である。1つの実施形態において、HAT感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いて、マウス脾臓細胞に融合させる。そのようにして産出されたハイブリドーマ細胞を、融合していないか、非生産的に融合したミエローマ細胞を殺す、HAT培地に対して選別する。モノクローナル抗−NRHK1抗体を産出する、ハイブリドーマ細胞を、ついで、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。
【０１７０】
モノクローナル抗−NRHK1抗体はまた、組換え体コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（たとえば、抗体ファージ提示ライブラリー）をスクリーニングすることによっても調製可能である。ファージ提示ライブラリーを産出し、スクリーニングするためのキットが、市販されている（たとえば、ファルマシア  リコンビナント  ファージ  アンチボディー  システム（Pharmacia Recombinant Pharge Antibody System）、カタログ番号第27-9400-01、ストラタジーン（Stratagene）SurfZAP（商標）ファージ  ディスプレイ  キット（Pharge Display Kit）、カタログ番号第240612号）。
【０１７１】
本発明の抗NRHK1抗体にはまた、「一本鎖Fv（singel-chain Fv）」、または「scFv」が含まれる。scFv断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含む。一般的に、scFvポリペプチドはさらに、VHおよびVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ポリペプチドリンカーは、scFvを、抗体結合に対して望む構造を形成するようにする。さらに、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え体抗NRHK1抗体を、当業者に理解されるように、調製可能である。
【０１７２】
ヒト化抗体は、とりわけ、ヒト対象の治療的処置のために望ましい。非ヒト（たとえば齧歯類）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または（Fv、Fab、Fab'、 F(ab')2、または抗体の他の抗体結合亜配列のような）その断片である。ヒト化抗体は、相補決定領域（CDRs）を形成する残基が、望む特異性、親和性および能力を持つ、マウス、ラットまたはウサギ抗体のような、非ヒト抗体のCDRsからの残基によって置換された、ヒト免疫グロブリンから由来する。いくつかの例で、ヒト免疫グロブリンのFv断片残基が、相当する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中、または挿入されたCDRまたはフレームワーク配列ない、いずれでも発見されない残基を含みうる。ヒト化抗体は、少なくとも1つまたは2つの可変ドメインを含みえ、そのなかで、全てまたは本質的に全てのCDR領域が、ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、全てまたは本質的にすべての定常領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、好ましくは、少なくとも、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Fc）の一部を含む。
【０１７３】
ヒト化抗体は、外来性免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現不可能であるが、ヒト重鎖および軽鎖を発現できる、トランスジェニックマウスを用いて産出可能である。トランスジェニックマウスを、通常の様式で、選択した抗体で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウス内に含まれるヒト免疫グロブリントランスジーンは、B細胞分化の間に再編成され、つづいて、クラススイッチおよび体細胞変異導入を受ける。本技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を調製可能である。
【０１７４】
さらに、選択したエピトープを認識するヒト化抗体を、「ガイド選別（guided selection）」と呼ばれる技術を用いて産出可能である。本アプローチにおいて、選別した非ヒトモノクローナル抗体、たとえば齧歯類抗体を、同様のエピトープを認識しているヒト化抗体の選別を補助するために使用する。
【０１７５】
好ましい実施形態において、NRHK1に対する抗体は、NRHK1の生物学的機能を減少、または削除可能である。好ましくは、抗体は、少なくとも25％のNRHK1活性を減少させる。より好ましくは、抗体は、少なくとも約50％の活性を減少させる。非常に好ましくは、抗体は、約95〜100％のNRHK1活性を減少させる。
【０１７６】
抗NRHK1抗体を、NRHK1を単離するために使用可能である。好適な方法には、アフィニティクロマトグラフィーと免疫沈降が含まれる。さらに、抗NRHK1抗体を、NRHK1の発現レベルを評価するために使用可能である。抗NRHK1抗体はまた、臨床試験手順の一部として、NRHK1レベルをモニタするため、または該治療方法の効果を決定するためにも使用可能である。検出は、抗体を、検出可能基質に結合させることによって促進可能である。検出可能な基質の例には、種々の酵素、人工基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質が含まれる。好適な酵素の例には、ホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な人工基の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン  イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアエクオリンが含まれ、好適な放射活性物質の例には、125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【０１７７】
抗NRHK1抗体はまた、特定の細胞または組織に対して、治療的薬剤／薬物を標的化するためにも有用である。治療的薬剤／薬物を、共有結合または非共有結合いずれかで、抗体に結合させうる。たとえば、治療的薬剤を、リンカー基を介して抗体に結合可能である。リンカー基は、抗体の結合能力の干渉を避けるように、薬剤から、抗体を分離するためのスペーサーとして機能しうる。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的活性を増強するようにも、したがって、結合効率を増加させるためにも働きうる。（ピアス  ケミカル社（Pierce Chemical Co., Rockford, III）のカタログで記載されているもののような）同種または異種機能性のような、種々の二重機能または多重機能薬剤を、リンカー基として使用可能である。結合は、たとえば、アミノ基、カルボキシル基、スルホヒジル基または酸化炭水化物残基を介して、効果を発揮しうる。この方法を記述している多数の参考文献が存在する。たとえば米国特許第4,671,958号を参照のこと。
【０１７８】
治療薬剤が、抗体から遊離している時がより強力である場合、標的細胞内への内在化の間、または内在化において、開裂される、リンカー基を使用することが望ましい可能性がある。多数の異なる開裂可能なリンカー基が記述されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出に関する機構には、ジスルフィド結合の還元（たとえば、米国特許第4,489,710号）による、感光色素結合の照射（たとえば米国特許第4,625,014号）による、誘導化アミノ酸側鎖の加水分解（米国特許第4,638,045号）による、血清補体仲介加水分解（たとえば米国特許第4,671,958号）、または酸触媒加水分解（たとえば米国特許第4,569,789号）による開裂が含まれる。
【０１７９】
1つ以上の薬剤を抗体に結合することも望ましい可能性がある。1つの実施形態において、多数の薬剤を、1つの抗体分子に結合する。他の実施形態において、少なくとも2つの異なる型の薬剤を1つの抗体に結合させる。特定の実施形態にかかわらず、1つ以上の薬剤の免疫共役物を、当業者に理解されるような、種々の方法にて調製可能である。
【０１８０】
ベクター、発現ベクターおよび遺伝子伝達ベクター
本発明の他の態様は、NRHK1またはその一部をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ベクターの1つの型は、「プラスミド」であり、これには、さらなるDNA区画を導入可能な、環状二本鎖DNAである。ベクターにはまた、発現ベクターおよび遺伝子伝達ベクターが含まれる。
【０１８１】
本発明の発現ベクターは、NRHK1またはその一部をコードしているポリヌクレオチドを含む。発現ベクターはまた、1つまたはそれ以上の、発現している前記ポリヌクレオチドに動作可能に連結した、調節配列をも含む。これらの調節配列は、宿主細胞の種類に依存して選択される。発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、望む発現レベルのような因子に依存することが、当業者によって理解されるであろう。NRHK1は、大腸菌（E.coli）のようなバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現可能である。発現ベクターはまた、in vitroにて、たとえば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳することも可能である。
【０１８２】
原核生物中のタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する、構成性または誘導可能プロモーターを含むベクターにて実施される。融合ベクターは、そこでコードされているタンパク質へ、通常、組換え体タンパク質のアミノ酸末端へ、多数のアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは、一般的に、3つの目的、1）組換え体タンパク質の発現を増加させること、2）組換え体タンパク質の可溶性を増加させること、および3）親和性精製にて、リガンドとして働くことによって、組換え体タンパク質の精製を助けること、にかなう。しばしば、融合タンパク質の精製に続いて、融合部位からの組換え体タンパク質の分離を可能にするように、融合発現ベクターにて、タンパク質分解開裂部位が、および組換え体タンパク質の結合部にて導入される。好適な開裂酵素には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例には、pGEX（ファルマシア  ピスカタウェイ（Pharmacia Piscataway）、NJ）、pMAL（ニュー  イングランド  バイオラボズ（New England Biolads）、Berverly、MA）、およびpRITS（ファルマシア）が含まれる。精製した融合タンパク質を、NHRK1活性アッセイで使用可能であり、またはNRHK1の特異的な抗体を産出するために使用可能である。
【０１８３】
好適な誘導可能非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrcとpET 11dが含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存している。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gnl）によって仲介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存している。本ウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下、T7 gnl遺伝子を持つ内在プロファージからの宿主株、BL21（DE3）またはHSLE174（DE3）によって提供される。
【０１８４】
大腸菌中の組換え体タンパク質発現を最大化する1つの戦略は、組換え体タンパク質を、タンパク質分解開裂する能力が改善されている宿主バクテリア中で、タンパク質を発現させることである。他の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが、大腸菌で好ましく使用されるものであるように、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を変化させることである。
【０１８５】
他の実施形態において、NRHK1発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母発現ベクターの例には、pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2（インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）, San Diego, CA）およびpixZ（インビトロジェン社）が含まれる。
【０１８６】
あるいは、NRHK1またはそのバリアントを、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内に発現させることが可能である。好適なバキュロウイルスには、pAcシリーズおよびpVLシリーズが含まれる。
【０１８７】
また他の実施形態において、NRHK1またはそのバリアントを、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞内に発現させることができる。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8およびpMT2PCが含まれる。哺乳動物細胞内で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調整要素によって提供される。たとえば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびSimian Virus40から由来する。
【０１８８】
他の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、組織特異的調整要素を含む。好適な組織特異的調整プロモーターの例には、肝臓特異的アルブミンプロモーター、甲状腺特異的プロモーター、T細胞レセプターおよび免疫グロブリンのプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（たとえば、ニューロフィラメントプロモーター）、膵臓特異的プロモーター、および乳腺特異的プロモーター（たとえば、乳漿プロモーター）が含まれる。成長調整プロモーターもまた意図され、たとえばα−フェトタンパク質プロモーターが含まれる。
【０１８９】
本発明はまた、NRHK1をコードするが、アンチセンス方向で、発現ベクター内にクローン化される、ポリヌクレオチドを含む、組換え体発現ベクターを提供する。アンチセンス方向ポリヌクレオチドに動作可能に連結する調整配列は、種々の細胞型での、アンチセンスRNA分子の連続発現を指向するように選択可能である。好適な調節配列には、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。調整配列はまた、アンチセンスRNAの構造性、組織特異的、または細胞型特異的発現を指向するように選択可能である。アンチセンス発現ベクターは、組換え体プラスミド、ファージミド、またはアンチセンスポリヌクレオチドが、非常に効果的な調整領域の制御下で産出される、弱毒化ウイルスの形態でありうる。
【０１９０】
本発明はさらに、ポリヌクレオチドを哺乳動物に伝達するための、遺伝子伝達賦形剤を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子伝達賦形剤を介して、局所または全身いずれかに投与可能である。ポリヌクレオチドの発現は、外来哺乳動物または異種プロモーターを用いて誘導可能である。in vivoにおけるポリヌクレオチドの発現は、構造性であるか、または調整されるか、いずれかであり得る。遺伝子伝達賦形剤は好ましくは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、またはアルファウイルスベクターを含む、ウイルスベクターである。ウイルスベクターはまた、アストロウイルス、コルコナウイルス、オルトミキソウイルス、パポバウイルス、パラミキソウイルス、パルボウイルス、ピコナウイルス、ポックスウイルス、またはトガウイルスベクターである。
【０１９１】
遺伝子治療構造物の伝達は、以上で言及したウイルスベクターに制限されない。他の伝達方法も使用可能である。これらの方法には、核酸発現ベクター、殺アデノウイルスに連結するか、またはしないポリカチオン凝集、リガンド結合DNAまたはRNAの消化、リポソーム−DNA共役物、遺伝子ガン、イオン化放射、核電荷中和、または細胞膜との融合が含まれる。裸DNAもまた使用可能である。裸DNAの取り込み効率は、生物分解可能ラテックスビーズを用いて改善しうる。本方法はさらに、その疎水性を増加させるために、ビーズを処置することによって改善可能である。
【０１９２】
調整可能発現系
本発明の他の態様は、望ましいポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞内で発現させるための、調整可能発現系の使用に関連する。本発明に好適な系を、簡単に以下に記述する。
【０１９３】
tet-on/off系
tet−系は、大腸菌Tn10トランスポゾンのテトラサイクリン抵抗性オペロンから由来する2つの調整要素、tetレプレッサータンパク質（tetR）およびTetRが結合するTetオペレーターDNA配列（tertO）に基づいている（Gossen et al.,Science 268：］1766-1769, 2995）。本系は、2つの成分、「レギュレーター（regulator）」と「レポーター（reporter）」プラスミドからなる。「レギュレーター」プラスミドは、単純ヘルペスウイルスのBP16活性化ドメインに融合した変異Tetレセプター（rtetR）を含む、ハイブリッドタンパク質をコードしている。「レポーター」プラスミドは、tet−応答性要素（TRE）を含み、これは、選択した「レポーター」遺伝子を制御する。rtetR-VP16融合タンパク質が、唯一TREに結合し、したがって、テトラサイクリンの存在下で、「レポーター」遺伝子の転写を活性化する。本系は、レトロウイルス、アデノウイルスおよびAAVを含む、多数のウイルスベクター内に組み込まれてきた。
【０１９４】
エクジソン系
エクジソン系は、ドロソフィラ（Drosophila）中に見られる脱皮誘導系に基づいているが、哺乳動物細胞内での誘導可能な発現用に改変されている。本系は、ドロソフィラステロイドホルモンエクジソン、ムリステロンAの類似体を用いる、ヘテロ二量体核レセプターを介して、対象の遺伝子の発現を活性化する。発現レベルは、哺乳動物の生理学に影響を与えずに、基底レベルよりも200倍超過であると報告されてきている（No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3346-3351, 1996）。
【０１９５】
プロゲステロン−系
プロゲステロンレセプターは通常、特定のDNA配列に結合し、そのホルモンリガンドとの相互作用を介して、転写を活性化することを刺激する。反対に、プロゲステロンアンタゴニストである、ミフェプリストン（RUAA486）は、ホルモン誘導核トランスポートおよび続くDNA結合をブロック可能である。RU486との相互作用を介する結合を刺激可能な、プロゲステロンの変異体形態が産出されてきた。特異的な、調整可能な転写因子である、プロゲステロンレセプターのRU486−結合ドメインが、酵母転写因子GAL4のDNA−結合ドメイン、およびHSVタンパク質VP16の転写促進ドメインに融合する。キメラ因子は、RU486の存在しない状態では不活性である。しかしながら、ホルモンの添加によって、キメラタンパク質における配座変化が誘導され、この変化によって、GAL−4結合への結合およびGAL4−結合部位を含むプロモーターからの転写の活性化が可能になる（Wang et al.,Nat.Biotech 15：239-243, 1997）。
【０１９６】
ラパマイシン−系
FK506およびラパマイシンのような免疫抑制剤は、特定の細胞性タンパク質に結合し、その重合化を促進することによって働く。たとえば、ラパマイシンのFK506−結合タンパク質（FKBP）への結合によって、結果として、他のラパマイシン結合タンパク質FRAPとのヘテロ重合化となり、これが、薬剤の除去によって逆転可能である。薬剤の添加による、2つのタンパク質の互いの結合の能力が、転写を含む、多数の生物学的工程の調整を可能にする。キメラDNA−結合ドメインは、FKBPに融合し、これによって、特異的DNA−結合配列への融合タンパク質の結合が可能になる。転写活性化ドメインもまた、FRAPに融合する。これらの2つの融合タンパク質が同一の細胞内に共発現する場合、完全に機能的な転写因子が、ラパマイシンの添加によって仲介されるヘテロ重合化によって形成可能である。重合化キメラ転写因子がついで、合成DNA−結合配列のコピーを含む、合成プロモーター配列に結合可能である。この系は、アデノウイルスおよびAAVベクター内に、首尾良く統合された。長期調整可能遺伝子発現が、マウスおよびヒヒの両方で達成された（Ye et al.,Science 283：88-91, 1999）。
【０１９７】
検出方法
NRHK1の異常な発現に関連した疾病の患者において、NRHK1の発現レベルが、ヒトにおけるNRHK1関連疾患の存在を検出するための指示として使用可能である。NRHK1遺伝子産物の相対量の検出および測定は、本技術分野で公知の種々の方法を用いて実施可能である。
【０１９８】
遺伝子の転写レベルを検出するための典型的な方法論には、細胞または組織試料からRNAを抽出すること、標識化プローブを、抽出したRNAまたは（cDNAまたはcRNAのような）その誘導体へハイブリッド形成させること、およびプローブを検出することが含まれる。好適な方法には、ノザンブロットおよび定量的PCRまたはRT−PCRが含まれる。in situハイブリッド形成もまた、ヒト組織内のNRHK1遺伝子の転写レベルを検出するために使用可能である。
【０１９９】
ポリペプチドを検出するための典型的な方法論には、タンパク質を細胞または組織試料から抽出すること、抗体を、標的ポリペプチドに結合させること、および抗体を検出することが含まれる。好適な方法には、酵素免疫測定法（ELISA）、ウエスタンブロット、免疫沈殿および免疫蛍光が含まれる。抗体は、ポリクローナル、または好ましくはモノクローナルである。抗体は、本来の抗体またはその断片（たとえばFabまたはF（ab'）2）である。抗体は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、酵素共因子、または検出可能リガンドによって標識可能である。プローブまたは抗体に関連した、語句「標識された（labeled）」は、共有結合を介してのような、直接標識、ならびに、直接標識された他の薬剤によって仲介されるような間接標識が含まれることが意図されている。間接標識化の例には、蛍光標識化第二抗体を用いた第一抗体の標識化、またはたとえば蛍光標識化ストレプトアビジンによって検出可能な、ビオチンの、DNAプローブの結合が含まれる。
【０２００】
好ましくは、抗体のNRHK1への結合親和性は、少なくとも105M-1である。より好ましくは、結合親和性は、少なくとも106M-1である。電気泳動、クロマトグラフィーまたは直接配列決定のような他の方法もまた、生物学的試料中のポリペプチドの検出のために使用可能である。抗NRHK1抗体もまた、対象に直接導入可能である。抗体は、対象におけるその存在および局在が、標準のイメージング技術を用いて検出可能である、放射活性マーカーによって標識可能である。
【０２０１】
1つの実施形態において、ヒト対象のゲノム内の、NRHK1遺伝子のゲノムコピーが、疾患の存在または傾向を示す。ゲノム内のNRHK1遺伝子のコピーの存在および数の検出は、本技術分野で公知の方法によって実施可能である。たとえば、サザンブロットを用いて査定可能である。サザンブロットのためのプローブは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共因子で標識可能である。
【０２０２】
診断アッセイの領域において、上記検出方法を、NRHK1−関連疾患の重症度を決定するために使用可能である。生物学的試料を、試験標的より単離し、疾患を持たない、または対象試料と比較して、試料中のNRHK1の存在、量および／または活性を評価する。生物学的試料中のNRHK1の発現レベルは、試験対象中のNRHK1関連疾患の存在または重症度を示唆可能である。語句「生物学的試料（biological sample）」は、対象より単離した、組織、細胞または生物学的流体を含むことを意図する。好ましい生物学的試料は、従来の方法を用いて対象より単離した、血清試料である。
【０２０３】
スクリーニング方法
本発明はまた、NRHK1モジュレーターを同定するための方法を提供する。好適なモジュレーターには、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、ポリヌクレオチド、小分子または他の薬物のような、治療的部位を含む、化合物または薬剤が含まれる。これらの部位は、NRHK1に結合するか、NRHK1の活性において、調整（たとえば、刺激または阻害）効果を持つか、いずれかでありうる。1つの実施形態において、部位が、1つまたはそれ以上のその天然基質との、NRHK1の相互作用において、調整効果を持つ。これらの部位はまた、NRHK1の発現において、調整効果をもちうる。本発明のスクリーニングアッセイは、NRHK1と試験成分間の相互作用を検出することを含む。
【０２０４】
本発明の試験化合物は、小分子もしくは生物活性薬剤のいずれかでありうる。好ましい実施形態において、試験化合物は、小有機または無機分子である。他の好ましい実施形態において、試験化合物は、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリサッカライド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。
【０２０５】
本発明の1つの態様にしたがって、NRHK1の生物学的活性を阻害する化合物に関してスクリーニングするための方法が提供される。これらの化合物を含む医薬組成物を、ついで調製可能である。スクリーニング方法には、（1）試料を化合物に接触させること、および（2）試料中のNRHK1の発現プロファイルまたは生物学的活性を比較して、化合物が、本質的に、NRHK1の発現レベルまたは活性を減少させるかどうかを決定する。スクリーニング方法は、in vivoまたはin vitroいずれかで実施可能である。
【０２０６】
本発明はさらに、NRHK1と結合パートナー間の結合を調整可能である化合物に関してスクリーニングするための方法を含む。本明細書で使用する語句「結合パートナー（binding partner）」は、NRHK1に対する基質、またはNRHK1への結合親和性を持つリガンドいずれかとして働く、生物活性薬剤を言う。生物活性薬剤は、多数の天然に存在するか、または人工的な化合物、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドより選択可能である。
【０２０７】
NRHK1の発現、活性または結合能力の阻害剤を、治療的組成物として使用しうる。これらの阻害剤は、本明細書以下で記述したような、好適な医薬組成物中で処方可能である。
【０２０８】
本発明はまた、NRHK1の活性または発現を阻害可能な化合物に関する、ハイスループットスクリーニングを実施するための方法も提供する。1つの実施形態において、ハイスループットスクリーニング法には、試験化合物をNRHK1に接触させること、ついで、NRHK1における試験化合物の効果を検出すること、が含まれる。サイトセンサー  ミクロフィジオメーターに基づくアッセイ、カルシウム流束アッセイ（たとえばFLIPR（登録商標）、モレキュラー  デバイシス社（Molecular Devices Corp.）, Sunnyvale, CA））またはTUNELアッセイのような、機能的アッセイを使用して、NRHK1細胞活性を測定可能である。蛍光に基づく技術を、ハイスループットおよびウルトラハイスループットスクリーニングのために使用可能である。これらには、制限はしないが、BRET（登録商標）およびFRET（登録商標）が含まれる（両方ともパッカード  インストゥルメント社（Packard Instrument Co.）, Meriden, CT）より）。
【０２０９】
好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニングアッセイは、BIACORE（登録商標）系（ビアコア  インターナショナル  AB（Biacore International AB）、Uppsala, Sweden）によって提供されるような、標識を含まないプラズマ共鳴技術を用いる。プラズマフリー共鳴は、表面プラズマ波が、金属／液体境界線にて励起される時に発生する。試料との接触の結果として、表面からの指向光を反射することによって、表面プラズモン共鳴が、表面層における、反射指標の変化を引き起こす。表面層における重量濃度の該変化に関する反射指標変化は、（タンパク質、ペプチド、脂質およびポリヌクレオチドを含む）多くの生物活性薬剤に関して同様であり、BIACORE（登録商標）センサー表面が、様々なこれらの生物活性薬剤に結合するように、官能化可能であるので、したがって、試験化合物の広い選択の検出が達成されうる。
【０２１０】
臨床試験中の薬物の効果のモニタリング
本発明のHRNK1検出方法を用いて、NRHK1−関連疾患に関する治療薬剤の効果を、臨床試験中にモニタ可能である。治療薬剤は、薬物、小分子、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチドまたはポリヌクレオチドでありうる。薬剤の治療に対する応答での、NRHK1遺伝子の発現または活性における変化を使用して、NRHK1−関連疾患を患う患者における、薬剤の治療的効果を評価することが可能である。さらに、薬剤に対する応答での、NRHK1の発現または活性を、臨床試験中、種々の点で測定可能である。
【０２１１】
好ましい実施形態において、治療薬剤の効果をモニタするための方法には、（i）対象から、投与前試料を得ること、（ii）投与前試料中のNRHK1の発現または活性のレベルを検出すること、（iii）対象から、1つまたはそれ以上の投与後試料を得ること、（iv）投与後試料中のNRHK1の発現または活性のレベルを検出すること、（v）投与前試料中のNRHK1の発現または活性のレベルを、投与後試料中のNRHK1の発現または活性のレベルと比較すること、の段階が含まれる。薬剤の投与の用量または頻度は、特定の患者における、薬剤の効果に基づいて適合しうる。したがって、NRHK1発現または活性は、薬剤が、観察可能な表現系応答を示さなくても、NRHK1−関連疾患に対する、治療薬剤の効果の指標として使用可能である。
【０２１２】
予後アッセイ
本明細書で記述された検出方法は、NRHK1−関連疾患を持つ対象、または発達するリスクのある患者を同定するために使用可能である。さらに、本検出方法は、薬剤（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、小分子または他の薬物候補）を、NRHK1−関連疾患を効果的に処置する、または予防するために、対象に投与可能であるかどうかを決定するために使用可能である。
【０２１３】
NRHK1−関連疾患の異なる進展ステージにおけるNRHK1発現プロファイルが確立可能である。さらに、薬物治療に対して異なる応答を持つ、異なる患者におけるNRHK1発現プロファイルが決定される。特定の発現プロファイルが、よくない予後の兆候の増加と比例しうるように、パターンが現れる。したがって、本発明の予後アッセイを使用して、NRHK1−関連疾患に関する処置を受けている対象が、長期生存または疾患進展に関する、よくない見通しを持つかどうかを決定しうる。好ましくは、予後は、診断の後短期間に、たとえば、診断の後数日内に、実施される。ついで予後の結果を、個々の治療プログラムを考案し、それによって、処置の効果、および長期生存およびよく生存している見込みを増強することが可能である。
【０２１４】
本発明の方法はまた、NRHK1遺伝子の遺伝的変化を検出し、それによって、変化した遺伝子を持つ対象が、NRHK1活性または発現における異常な制御によって特徴づけられるダメージに対してリスクを持つかどうかを決定するために使用可能である。好ましい実施形態において、本方法には、NRHK1遺伝子の健全さに影響を与える遺伝的変化が存在するか、またはしないかを検出すること、またはNRHK1遺伝子の異常発現を検出すること、が含まれる。遺伝的変化は、少なくとも1つの以下の存在を確かめることによって検出可能である。1）NRHK1遺伝子からの1つまたはそれ以上のヌクレオチドの検出、2）NRHK1遺伝子に対する、1つまたはそれ以上のヌクレオチドの添加、3）NRHK1遺伝子の1つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、4）NRHK1遺伝子中のクロモソーム再構成、5）NRHK1遺伝子のメッセンジャーRNA転写のレベルの変化、6）NRHK1遺伝子の異常改変、7）NRHK1遺伝子のメッセンジャーRNA転写の、非野生型スプライシングパターンの存在、8）非野生型レベルNRHK1、9）NRHK1遺伝子の対立遺伝子欠失、および10）NRHK1の不適当な翻訳後修飾。
【０２１５】
1つの実施形態において、変化の検出には、（アンカーPCTまたはRACE  PCRのような）ポリメラーゼ連鎖反応、あるいは、ライゲーション連鎖反応（LCR）での、プローブ／プライマーの使用が含まれる。LCRが、NRHK1遺伝子の点変異を検出するためにとりわけ有用であり得る。本方法には、対象から試料を収集すること、試料からポリヌクレオチド（ゲノムDNA結合、mRNA、または両方）を単離すること、NRHK1遺伝子または遺伝子産物に、特異的にハイブリッド形成する1つまたはそれ以上のプライマーと、前記ポリヌクレオチドを接触させること、および増幅産物が存在するか、またはしないかを検出すること、または増幅産物の大きさを検出すること、およびその長さを対象と比較すること、の段階が含まれる。PCRおよび／またはLCRが、本明細書で記述した他の任意の技術との組み合わせで、初期増幅段階として使用可能であることが理解される。
【０２１６】
他の増幅方法には、自己持続配列複製（Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878, 1990）、転写増幅系（Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177, 1989）、およびQ−ベータ  レプリカーゼ（Q-Beta Replicase）（Lizardi et al.Bio-Technology 6：1197, 1988）が含まれる。
【０２１７】
他の実施形態において、NRHK1遺伝子内の変異を、制限酵素を用いて同定可能である。制限酵素消化パターンの違いによって、NRHK1遺伝子またはその転写物における変異（類）が示される。さらに、配列特異的リボゾームを使用して、特異的変異の存在を検出可能である。たとえば、米国特許第5,498,531号を参照のこと。
【０２１８】
また他の実施形態において、NRHK1遺伝子内の遺伝的変異を、非常に多数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、高密度アレイを用いて同定可能である。たとえば、NRHK1遺伝子中の遺伝的変異は、二次元アレイにて同定可能である。この例において、プローブの第一ハイブリッド形成アレイを使用して、試料および対象中のDNA結合の長いストレッチをスキャンして、2つの配列間の塩基の変化を同定する。この段階によって点変異が同定される。この段階に続き、検出した全てのバリアントまたは変異に相補的である、より小さく、特異的なプローブアレイを用いることで、特異的な変異の特性化が可能になる、第二ハイブリッド形成アレイが実施される。各変異アレイは、平行プローブ組からなり、1つが、野生型遺伝子に相補的であり、他が、変異遺伝子に相補的である。
【０２１９】
また他の実施形態において、本技術分野で公知の配列反応を使用して、変異を検出するために、NRHK1遺伝子を直接配列決定する。質量分析によるシークエンシングを含む、任意の自動化シークエンシング手順を使用可能であることが意図される。
【０２２０】
1つの実施形態において、開裂薬剤からの保護を使用して、RNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する。一般的に、「ミスマッチ開裂（mismatch cleavage）」技術には、野生型NRHK1遺伝子配列を含む、（標識化）RNAまたはDNAを、組織試料から得た、見込みのある変異RNAまたはDNAとハイブリッド形成させることが含まれる。二本鎖デュプレックスを、デュプレックスの一本鎖領域を開裂する薬剤で処置する。薬剤は、RNase（RNA/DNA二本鎖のため）、またはS1ヌクレアーゼ（DNA/DNAハイブリッドのため）でありうる。1つの場合、DNA/DNAまたはRNA/DNA二本鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ピペリジンおよびヒドロキシルアミン、またはピペリジンおよび四酸化オスミウムで処理する。消化の後、得られた物質を、大きさにて、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、これより、変異の部位（類）を決定する。
【０２２１】
好ましい実施形態において、ミスマッチ開裂反応は、二本鎖DNA中の、ミスマッチ塩基対を認識する1つまたはそれ以上のタンパク質を使用する。たとえば、大腸菌のmutY酵素は、G/AミスマッチにてAを開裂し、HeLa細胞からのチミジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチにてTを開裂する。1つの場合において、cDNAを、試験細胞から単離したmRNAより調製する。ついで、cDNAが、NRHK1遺伝子から由来したプローブにハイブリッド形成する。このようにして形成された二本鎖を、DNAグリコシラーゼミスマッチ回復酵素で処理し、もし存在した場合、ミスマッチ産物を、電気泳動プロトコールまたは類似の物より検出可能である。たとえば、米国特許第5,459,039号を参照のこと。
【０２２２】
他の実施形態において、電気泳動移動度の変化を、NRHK1遺伝子中の変異を同定するために使用する。変異体と野生型ポリヌクレオチド間の電気泳動移動度の差を、一本鎖配座多型（SSCP）を用いて検出可能である。電気泳動移動度における得られた変化により、一本鎖変化の検出が可能である。DNAグリコシラーゼ断片を、プローブで標識または検出可能である。1つの場合、アッセイの感度は、RNAを用いることによって増強し、この場合、二次構造が、配列の変化に対してより感受性である。好ましい実施形態において、アッセイは、電気泳動移動度の変化に基づき、二本鎖ヘテロ二本鎖分子を分離するために、ヘテロ二本鎖解析を利用する（Keen et al.,Trends Genet 7：5, 1991）。
【０２２３】
また他の実施形態において、変異または野生型断片の移動を、編成勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いて評価する。この目的のために、DNA断片を改変して、これらが完全に編成されないように保証することが可能である。たとえば、およそ40のGCリッチ塩基対のGCクランプを、PCRを用いてDNAグリコシラーゼ断片に加えることが可能である。さらなる実施形態において、温度勾配を、編成勾配の代わりに使用する（Rosenbaum and Reissner,Biophys Chem 265：12753, 1987）。
【０２２４】
点変異を検出するための他の技術の例には、限定はしないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が含まれる。1つの実施形態において、特定の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、（増幅が、異なるハイブリッド形成に基づくように）分子の真ん中で、または適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防止するか、減少させうる、1つのプライマーの3’末端にて、対象の変異を持つ。たとえば、Saiki et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230, 1989を参照のこと。さらに、開裂に基づく検出を行うために、変異の領域内に、新規制限部位を導入することが望ましい可能性がある。
【０２２５】
本明細書で記述する方法は、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブまたは1つの抗体を含む、パッケージングされた診断キットを用いて実施可能である。これらのキットは、NRHK1−関連疾患の症状または家族歴を示している患者を診断するために、臨床設定で使用可能である。NRHK1が発現している、全ての細胞型または組織を、予後または診断目的のために使用可能である。
【０２２６】
予防方法
本発明はまた、異常なNRHK1発現または活性に関連した疾患を予防するための方法も提供する。本方法には、標的対象へ、NRHK1発現または活性を調整する薬剤を投与することが含まれる。
【０２２７】
異常なNRHK1発現または活性によって引き起こされるか、または帰する疾患のリスクをおう対象を、本明細書で記述した診断または予後アッセイを用いて同定可能である。NRHK1−関連疾患を防止するか、または遅延させるために、NRHK-1関連ン疾患症状の発現より前に、予防薬剤を投与可能である。好適な予防薬剤には、変異NRHK1タンパク質、NRHK1アンタゴニスト薬剤、またはNRHK1アンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。
【０２２８】
本発明の予防方法は、ファーマコジェノミクスの研究から得られた知識に基づいて、とりわけ仕立てるか、または改変可能である。ファーマコジェノミクスには、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、遺伝子解析のような、ゲノム技術の、臨床開発中か、または市販されているか、いずれかである、薬剤への適用が含まれる。ファーマコジェノミクスは、薬部に対する患者の応答（たとえば、患者の「薬物応答表現型（drug response phenotype）」、または「薬物応答遺伝子型（drug response genotype）」）を決定するために使用可能である。したがって、本発明の他の態様は、個々の薬物応答遺伝子型にしたがって、NRHK1モジュレーターを用いる個々の予防または治療処置を仕立てるための方法を提供することである。ファーマコジェノミクスにより、臨床家または医者が、処置によってもっとも利益を得る患者に対して、予防または治療処置を対象とする、および毒性薬物関連副作用を経験しうる対象の処置を避けることが可能である。
【０２２９】
「ゲノム−ワイド  アソシエーション（genome-wide association）」として知られる、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、1つのファーマコジェノミクスアプローチは、第一に、すでに公知の遺伝子関連部位からなるヒトゲノムの、高分解マップに基づいている（たとえば、ヒトゲノム上の60,000〜100,000多型または変異部位からなる、「二−対立（bi-allelic）」遺伝子マーカーマップであり、それぞれが2つのバリアントを含む）。そのような高分解遺伝子マップを、特定の観察された薬物応答または副作用と関連した遺伝子を同定するために、第II／III相薬物試験を受けている対象の、統計学的に実質的な数のそれぞれのゲノムのマップと比較可能である。あるいは、そのような高分解マップを、ヒトゲノム内の、数1000万の単一ヌクレオチド多型の組み合わせからつくることが可能である。「SNP」は、DNAのストレッチ中、単一ヌクレオチド塩基にて起こる、共通の変化である。たとえば、SNPは、DNAのそれぞれ1000塩基あたり1回起こりうる。SNPは、疾患工程に関連しうる。しかしながら、大多数のSNPsは、疾患に関連しない可能性がある。SNPの発生の基づいた遺伝子マップを考慮すると、個々が、それらの個々のゲノム内のSNPsの特定のパターンに基づいて、ゲノムカテゴリーにグループ分け可能である。そのような様式にて、そのような遺伝的に同類の固体の間で共通である性質を考えて、処置レジメを、遺伝的に同様の固体の群に対して仕立てることが可能である。したがって、NRHK1遺伝子の、NRHK1−関連疾患を持つ患者のSNPマップへのマッピングが、薬物応答−予測遺伝子の同定を促進しうる。
【０２３０】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ（candidate gene approach）」を使用して、薬物応答を予測する遺伝子を同定可能である。本方法にしたがって、薬物標的をコードしている遺伝子が公知の場合、その遺伝子の、すべての共通のバリアントを、集団内で、容易に同定可能である。ついで、特定の薬物応答が、1つの遺伝子の型対他の型に関連するか、決定可能である。
【０２３１】
薬物代謝酵素の活性が、薬物活性の程度および期間両方の主要な決定物である。薬物代謝酵素（例えば、N−アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）およびシトクロームP450酵素CYP2D6およびCYPZC19）の遺伝的多型の発見によって、どうしてある対象が、予想される薬物効果をもつ、または、薬物の標準かつ安全な用量をとった後に、大きな薬物応答および重大な毒性をしめすか、のような説明が提供された。これらの多型は、集団中2つの表現型、多量代謝者および貧代謝者にて発現する。貧代謝者表現型の発生は、異なる集団で異なる。例えば、CRYP2D6に関してコードしている遺伝子は、非常に多型であり、いくつかの変異が、貧代謝者にて同定されており、全てが、機能的CYP2D6の欠失を導く。CYP2D6とCYP2C19の貧代謝者は、標準の用量を服用した時に、非常に頻繁に、過剰な薬物応答と、副作用を経験する。代謝物が活性治療部位である場合、貧代謝者は治療応答を示さない。他方の多量代謝者、標準の薬物に応答しない、超急速代謝者と呼ばれる。最近、超急速代謝の分子基礎が、CYP2D6遺伝子増幅によるものであると、同定された。
【０２３２】
1つの実施形態において、「遺伝子発現プロファイリング（gene expression profiling）」法を、薬物応答を予測する、遺伝子を同定するために使用可能である。これに関して、薬物を投薬した動物の遺伝子発現プロファイリングが、毒性に関連した遺伝子経路が、現れるかどうかの指標を与えうる。
【０２３３】
以上のファーマコジェノミクスアプローチから発生した情報を、特定の個体に好適な、適切な投与量または治療レジメを決定するために使用可能である。この知識は、副作用または治療の失敗をさけ、したがって、NRHK1モジュレーターで対象を処置したときの治療的または予防的効果を増強可能である。
【０２３４】
治療的方法
以上で記述したように、本発明は、HRHK1関連疾患のリスクを持つ、影響を受けやすい、または診断された対象を治療するための、治療方法を含む。治療方法は、対象の薬物応答遺伝子型に基づいて、個々に仕立てることが可能である。典型的には、治療方法には、対象内でのNRHK1の発現または活性を調整することが含まれる。1つの実施形態において、本方法には、対象内の多数の細胞を、NRHK1の発現または活性を阻害する薬剤と接触させることが含まれる。好適な薬剤には、ポリヌクレオチド（たとえば、NRHK1のアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ポリペプチド（たとえば、NRHK1のドミナントネガティブ変異体）、または他の小有機および無機物質が含まれる。これらにはまた、NRHK1阻害剤またはアンチセンス配列をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターが含まれる。さらに、薬剤は、治療的部位と共役した、抗NRHK1抗体であり得る。好適な薬剤は、本発明のスクリーニングアッセイを用いて同定可能である。
【０２３５】
医薬組成物
本発明はさらに、NRHK1モジュレーターと医薬上許容される担体を含む、医薬組成物を指向する。本明細書で使用する「医薬上許容される担体（phamaceutically aceptable carrier）」は、薬理学的投与に適合可能な、任意およびすべての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定剤、結合剤、吸着剤、塩基、緩衝薬剤、潤滑油、放出制御基剤、希釈剤、乳化薬剤、湿潤剤、潤滑油、分散培地、コーティング、抗バクテリアまたは抗真菌剤、等張および吸着遅延剤などを含むことが意図される。薬理学的活性基質に対する、そのような培地および薬剤の使用が、本技術分野でよく知られている。任意の従来の培地または薬剤が、活性化合物と適合可能ではない範囲を除いて、組成物内でのそれらの使用が意図される。補充試薬もまた、組成物内に組み込むことが可能である。
【０２３６】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合可能なように処方される。投与経路の例には、非経口、たとえば、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の成分、注射のための水、食塩水、固定油、ポリエチレングルコール、グリセリンのような無菌希釈液、ポリエチレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸、クエン酸またはリン酸のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性のための薬剤が含まれる。pHを、塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基で調節可能である。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスまたはプラスチックでできた多重投与バイアル中に封入可能である。
【０２３７】
注射可能な使用に好適な医薬組成物には、無菌水溶液または分散液、無菌注射可能な溶液、または分散液の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、クレモフォア（Cremophor）EL（商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合で、注射可能組成物は無菌であるべきであり、シリンジ注入が容易である範囲まで、流体であるべきである。製造および保存の条件下で、安定でなければならず、バクテリアおよび真菌のような微生物の混入活性に対して保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散溶媒でありうる。適切な流体性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合、要求される粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、維持可能である。細菌の活性の防止は、種々の抗バクテリアおよび抗真菌剤、たとえば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、等張薬剤、たとえば、糖類、マンニトール、スルビトールのようなポリアルコール類、塩化ナトリウムが、組成物内に含まれることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長が、吸収を遅延させる薬剤、たとえば一ステアリン酸アルミウムおよびゼラチンを、組成物内に含めることによって達成可能である。
【０２３８】
無菌注射可能溶液は、適切な溶媒内に、要求された量で、活性モジュレーター（たとえば、抗NRHK1抗体、NRHK1活性阻害剤、またはNRHK1に対するアンチセンスヌクレオチドを発現している遺伝子治療ベクター）を組み込むこと、続いて滅菌濾過によって調製可能である。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎分散培地と、以上で数え上げたものからの要求された他の成分を含む、無菌賦形剤内に組み込むことによって調製可能である。無菌注射可能溶液の調製のための、無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性、成分＋先に滅菌濾過した溶液からの任意のさらなる望ましい成分を産出する、吸引乾燥および凍結乾燥である。
【０２３９】
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル内に組み込むか、錠剤に圧縮可能である。経口治療投与の目的のために、活性化合物をまた、口洗浄としての使用のために、流体担体を用いて調製可能であり、そこで、流体担体中の化合物は、経口で適用され、スウィッシュされ、喀出されるか、飲み込まれる。薬理学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどが、任意の以下の成分または同様の性質の化合物を含むことが可能である。すなわち、微晶質性セルロース、テガカントガムまたはゼラチンのような結合剤、デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギニン酸、ピリモゲル（Primogel）またはトウモロコシデンプンのような分解剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステルテス（Stertes）のような潤滑剤、二酸化コロイドシリコーンのような滑走剤、シュクロースまたはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ芳香のような芳香剤である。
【０２４０】
吸入による投与のために、化合物を、圧縮容器からのエアゾルスプレー、または好適な推進剤、たとえば二酸化炭素のようなガス、またはネブライザーを含む、ディスペンサーの形態で伝達する。
【０２４１】
全身性投与はまた、経粘膜または経皮方法によっても可能である。経粘膜または経皮投与のために、浸潤すべきバリアに適切な浸潤剤を、処方中で使用する。そのような浸潤剤は、一般的に本技術分野で公知であり、たとえば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸およびフシジック酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の使用を介して達成可能である。経皮投与のために、生物学的化合物を、本技術分野で一般的に公知な軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム内に処方する。
【０２４２】
化合物はまた、座薬（たとえば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の座薬基体で）、または直腸伝達のための保持浣腸剤の形態で調製可能である。
【０２４３】
1つの実施形態において、生物活性化合物を含みうる、治療部位を、埋め込みおよびマイクロカプセル伝達経を含む、放出制御処方のような、体からの急速な消滅に対して化合物を保護する担体と調製する。酢酸エチレンンビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーを使用可能である。そのような処方の調製のための方法は、当業者によって理解される。物質はまた、アルザ社（Alza Corporation）およびノバ  ファーマシューティカル社（Nova Pharmaceuticals, Inc.）から商業的に入手可能である。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液もまた、医薬上許容される担体として使用可能である。これらは、当業者に公知の方法、たとえば、米国特許第4,522,811号に記述されているように、調製可能である。
【０２４４】
投与が簡単で、用量が一定であるような、用量ユニット形態で、経口または非経口組成物を処方することが、特に利点がある。本明細書で使用する用量ユニット形態には、処置されるべき対象に対して一体の用量として適した物理的に分離したユニットが含まれ、それぞれのユニットは、必要な薬理学的担体と関連して、望む治療効果を産出すると計算された、先に決められた量の活性化合物を含む。本発明の用量ユニット形態に関する詳述は、活性化合物の固有の特性、および達成されるべき特定の治療効果、および個体の治療のための、そのような活性化合物を配合する領域での、固有の制限によって規定され、直接依存する。
【０２４５】
そのような化合物の毒性および治療効果は、たとえば、LD50（集団の50％までの致死量）およびED50（集団の50％で治療的に効果的な用量）を決定するために、細胞培養中または実験動物中での、標準の薬理学的手順によって決定可能である。毒性と治療効果の用量比が、治療指数であり、比LD50／ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用しても良い一方で、感染していない細胞の可能性のある障害を最小化し、それによって副作用を減少させるために、影響を受ける組織の部位に、そのような化合物を標的化する伝達経を設計することを考慮すべきである。
【０２４６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトでの使用に関する用量の範囲を処方する時に使用可能である。そのような用量は、好ましくは、毒性がほとんど、または全くないED50を含む、循環濃度の範囲内である。用量は、使用する用量形態および使用する投与経路に依存して、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で使用する任意の化合物に関して、治療的に効果的な用量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。用量は、細胞培養にて決定したように、IC50（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、環状血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて処方してよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量を、より実際に決定するために使用可能である。血漿中のレベルを、たとえば、高性能液体クロマトグラフィーによって、測定して良い。
【０２４７】
医薬組成物を、投与の説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサー内に含めることができる。
【０２４８】
キット
本発明はまた、生物学的試料中のNRHK1遺伝子産物の存在を検出するためのキットも含む。例示キットには、mRANまたはタンパク質レベルでの、NRHK1の発現を査定するための試薬が含まれる。好ましくは、試薬には、抗体またはその断片が含まれ、そこで、抗体または断片は、NRHK1に特異的に結合する。任意に、キットには、NRHK1遺伝子の転写物に特異的に結合可能な、ポリヌクレオチドプローブを含みうる。キットはまた、試験試料中のNRHK1タンパク質またはmRNAの量を決定するための方法、および／または対照または標準に対して、試験試料中のNRHK1タンパク質またはmRNAの量を比較するための方法が含まれる。化合物または薬剤を、好適な容器内にパッケージ可能である。
【０２４９】
本発明はさらに、細胞またはヒト対照中の、NRHK1−関連疾患を阻害するための、多数の化合物の、それぞれの好適性を査定するためのキットを提供する。そのようなキットには、NRHK1の発現を査定するための、試験すべき多数の化合物、および（NRHK1タンパク質に特異的に結合する抗体、またはNRHK1遺伝子にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドプローブまたはプライマーのような）試薬が含まれる。
【０２５０】
以上で記述した実施形態は、例示のために提供したものであり、制限ではないことが理解されるべきである。本発明の意図の範囲内での種々の変化および改変が、本記述より、当業者に明らかになるであろう。
【０２５１】
宿主細胞
本発明の他の態様は、本発明のポリヌクレオチド分子、すなわち発現ベクター、遺伝子伝達ベクター内のNRHK1遺伝子またはその類似体、または、宿主細胞のゲノムの、特定の位置に、相同的に組み入れることを可能にする配列を含む、本発明のポリヌクレオチド分子、を導入した宿主細胞に関連する。語句「宿主細胞（host cell）」および
「組換え体宿主細胞（recombinant host cell）」は、本明細書で同義的に使用される。そのような語句は、特定の対象細胞のみでなく、そのような細胞の子孫または可能性のある子孫も言及することが理解される。特定の改変が、変異または環境の影響いずれかによって、続く世代で発生しうるので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一ではないが、本明細書で使用されるような語句の範囲内に含まれる。
【０２５２】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞でありうる。たとえば、NRHK1遺伝子は、大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（チャイニーズ  ハムスター卵巣細胞（CHO）、COS細胞、フィッシャー344ラット細胞、ＨＬＡ−Ｂ27ラット細胞、HeLa細胞、A549細胞または293細胞）内に発現可能である。
【０２５３】
ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、真核または原核細胞内に導入可能である。本明細書で使用する語句「形質転換（transformation）」および「トランスフェクション（transfection）」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DAKD−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞への外来ポリヌクレオチド（たとえばDNA）の導入のための、本技術分野で認識された種々の技術を言う。
【０２５４】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクションに依存して、細胞の小さな画分のみが、外来DNAグリコシラーゼをそのゲノムに統合しうる。これらの統合物を同定し、選別するために、選別可能なフラッグ（たとえば、抗生物質に対する抵抗性）をコードしている、遺伝子を、一般的には、対照のゲノムに加えて、宿主細胞に導入する。好ましい選別可能フラッグには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような、薬物に対する抵抗性を供与するものが含まれる。選別可能フラッグをコードしているポリヌクレオチドを、NRHK1をコードしているのと同様のベクターによって宿主細胞内に導入可能であり、または分離ベクターによって導入可能である。導入されたポリヌクレオチドを安定にトランスフェクトされた細胞を、薬物選別によって同定可能である（すなわち、選別可能フラッグ遺伝子が組み込まれた細胞は生存し、一方で、他の細胞は死亡する）。
【０２５５】
培地中の真核または原核宿主細胞のような、本発明の宿主細胞を、NRHK1を産出（すなわち発現）させるために使用可能である。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて、NRHK1を産出するための方法を提供する。1つの実施形態の方法には、（NRHK1遺伝子を含む組換え体発現ベクターを導入した）本発明の宿主細胞を、NRHK1が産出されるような、好適な培地中で培養すること、が含まれる。他の実施形態の方法には、培地または宿主細胞からNRHK1を単離すること、が含まれる。
【０２５６】
トランスジェニックおよびノックアウト動物
本発明の宿主細胞をまた、非ヒトトランスジェニック動物を産出するために使用可能である。たとえば、1つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、NRHK1−コード配列を導入した、受精卵母細胞または胚幹細胞である。ついでそのような宿主細胞を、NRHK1をコードしている外来配列を、それらのゲノムに導入した、非ヒトトランスジェニック動物、または、NRHK1をコードしている外来配列が変化した、類似組換え体動物を作製するために使用可能である。そのような動物は、NRHK1の機能および／または活性を研究するため、およびNRHK1活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書で使用する「トランスジェニック動物（transgenic animal）」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、動物の1つまたはそれ以上の細胞がトランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発達し、成熟動物のゲノム内に残る、細胞のゲノム内にくみこまれる外来DNAであり、それによって、トランスジェニック動物の1つまたはそれ以上の細胞型または組織内でのコードされた遺伝子産物の発現が指向される。本明細書で使用する語句「相同組換え体動物（homologous recombinant animal）」または「ノックアウト動物（knockout animal）」は、そこで外来NRHK1遺伝子が、動物の発育の前に、外来性遺伝子と、動物の細胞内に導入されたDNA分子、たとえば動物の胚細胞間の相同組換えによって変化する、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０２５７】
本発明のトランスジェニック動物は、NRHK1−コードポリヌクレオチドを、たとえば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の配偶前核に導入すること、および卵母細胞を、偽妊娠メス里親動物内で発育させることによって作製可能である。イントロニック配列およびポリアデニル化シグナルもまた、トランスジーンの発現の効率を増加させるために、トランスジーン内に誘導可能である。組織特異的調節配列（類）を、特定の細胞にNRHK1の発現を指向するために、トランスジーンに動作可能に結合可能である。胚操作およびマイクロインジェクションを介したトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物を産出するための方法が、本技術分野で一般的になってきた。同様の方法を、他のトランスジェニック動物の産出のために使用する。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム内での、本発明のトランスジーンの存在、および／または動物の組織または細胞内での、本発明の遺伝子に相当するmRNAの発現に基づいて同定可能である。トランスジェニック創始動物をついで、トランスジーンを含むさらなる動物を繁殖させるために使用可能である。さらに、NRHK1をコードしているトランスジーンを含むトランスジェニック動物をさらに、他のトランスジーンを含む、他のトランスジェニック動物に繁殖させることができる。
【０２５８】
相同組換え動物（ノックアウト動物）を作製するために、欠失、添加、または置換を導入して、それによって、遺伝子を変化させる、たとえば機能的に崩壊させる、本発明の遺伝子の少なくとも一部分を含むように、ベクターを調製する。遺伝子は、ヒト遺伝子であって良く、しかしより好ましくは、本発明のヒト遺伝子の非ヒト相同物（たとえばNRHK1遺伝子のホモログ）である。例えば、マウス遺伝子を、マウスゲノム内の本発明の外来遺伝子を変化させるのに好適な、相同組換えポリヌクレオチド分子、たとえばベクターを構築するために使用可能である。好ましい実施形態において、相同組換えポリヌクレオチド分子を、相同組換えに際して、本発明の外来遺伝子が機能的に崩壊する（すなわち、もはや、機能的タンパク質をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように、設計する。あるいは、相同組換えポリヌクレオチド分子を、相同組換えに際して、内生遺伝子が、変異を受けるか、変化するが、ただし機能的タンパク質はコードしている（たとえば、上流調製領域が変化し、それによって、内生NRHK1遺伝子の発現が変化する）ように、設計可能である。相同組換えポリヌクレオチド分子において、本発明の遺伝子の変化した部分は、本発明の遺伝子の追加ポリヌクレオチオド配列によって、その5’および3’末端で隣接し、相同組換えポリヌクレオチド分子に含まれる外来性遺伝子と、細胞、たとえば胚幹細胞内の内生遺伝子間で相同組換えが起こる。追加隣接ポリヌクレオチド配列は、内生遺伝子との成功相同組換えに対して十分な長さのものである。
【０２５９】
典型的には、隣接DNA（5’および3’末端両方）の数キロ塩基が、相同組換えポリヌクレオチド分子内に含まれる。相同組換えポリヌクレオチド分子は、エレクトロポレーションによって、胚幹細胞内に導入される。導入された遺伝子が、内生遺伝子と、相同組換えした細胞を選別する。選別された細胞を、ついで、動物の胚盤胞内に注入し、凝集キメラを作製可能である。ついでキメラ胚を、好適な偽妊娠メス里親動物内に埋め込み、胚を出産まで持って行く。その生殖細胞系列細胞内に相同組換えDNAを持つ子孫を使用して、動物のすべての細胞が、相同組換えDNAの生殖細胞系列伝達によって、相同組換えDNAを含む、動物を妊娠させることが可能である。相同組換えポリヌクレオチド分子、たとえばベクター、または相同組換え動物を構築するための方法が、本技術分野でよく知られている。
【０２６０】
他の実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物を、トランスジーンの調製発現を可能にする、選別系を含んで、産出可能である。そのような系の1つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。リコンビナーゼ系の他の例は、サッカロマイセス  セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のFLPリコンビナーゼ系である（たとえば、O'Gorman et al.,Science 251：1351-1355, 1991）。cre/loxPリコンビナーゼ系を使用して、トランスジーンの発現を調整する場合、Creリコンビナーゼおよび選択タンパク質両方をコードしているトランスジーンを含む動物が必要である。そのような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築を介して、たとえば、2つのトランスジェニックマウス、1つは選別タンパク質をコードしているトランスジーンを含み、他はリコンビナーゼをコードしているトランスジーンを含む、を交配することによって提供可能である。
【０２６１】
本明細書で記述した非ヒトトランスジェニック動物のクローンをまた、Wilmut,I.et al.,Nature 385：810-813, 1997、およびPCT第WO97/07668号および第WO97/07669号にて記述された方法にしたがって産出可能である。簡単に記すと、トランスジェニック動物からの細胞、たとえば体細胞を単離し、成長周期を出て、Go0期に入るように誘導する。ついで静止細胞を、たとえば電気的パルスを用いて、静止細胞を単離したのと同様の種の動物からの徐核卵母細胞に融合可能である。再構築した卵母細胞を、培養して、ついで桑実胚または未分化胚芽細胞まで発育させ、疑妊娠メス里親動物へ移す。このメス里親動物から生まれた子孫が、細胞、たとえば体細胞を単離する動物のクローンでありうる。
【実施例１】
【０２６２】
ヒトゲノムデータベース中のNRHK1の同定
NRHK1の核酸配列を、新規に開発されたゲノム予測パイプラインより得た。つまり、タンパク質キナーゼの触媒ドメインのX線結晶構造を集め、その配列同一性／類似性にしたがって、互いにアラインした。アライメントを、キナーゼ触媒ドメインの構造プロファイルをもつ、「スコアリングマトリックス（scoring matrix）」に変換した。ついで、このスコアリングマトリックスを使用して、キナーゼ触媒ドメインを持つ配列に関する、セレーラ  ヒト  ゲノム（Celera Human Genome）データベースを検索した。
【実施例２】
【０２６３】
BLAST解析
NRHK1とGenBankデータベース中の他の配列間の配列アライメントを、NCBIのBLASTウェブサイトで入手可能な、標準のタンパク質−タンパク質B LAST（blastp）、標準のヌクレオチド−ヌクレオチドBLAST（blastn）、BLAST2配列、およびヒトゲノムBLASTプログラムを用いて、実施した。
【０２６４】
「Filter」設定、未チェック、「Expect」設定10.0、「Word Size」設定3、「Matrix」設定BLOSUM62、「Gapコスト」設定、伸張：11および伸張：1での、「nr」データベース（NCBIのBLASTウェブサイトで入手可能）における標準のタンパク質−タンパク質BLAST検索により、NRHK1と多数のタンパク質間の部分的アミノ酸配列が同定された。これらのタンパク質には、限定はしないが、Populus c canescen NIMA−関連タンパク質キナーゼ（Entrez登録番号：AF469649、NHK1のアミノ酸残基25〜285に対して28％アライメント）、L.esculentum LSTK−1−様キナーゼ（Entrez登録番号：AF079103、NRHK1アミノ酸残基25〜321に対して27％アライメント）、C.elegans仮定タンパク質T07A9.3（Entrez登録番号：AF036706、NRHK1のアミノ酸残基27〜307に対して25％アライメント）、およびヒトNIMA−関連キナーゼ1（Entrez登録番号：XM＿048605、NRHK1のアミノ酸残基25〜297に対して24％アライメント）が含まれる。
【０２６５】
保存ドメイン検索を、RPS-BLAST 2.3.3［Apr-24-2002］にて、標準のタンパク質−タンパク質BLAST検索内で実施した。NRHK1のアミノ酸残基28〜297が、ser/thrタンパク質キナーゼ（Entrez登録番号：smart00220、100.0％アライメント）の触媒ドメイン、pキナーゼ（Entrez登録番号：pfam00069、100.0％アライメント）のキナーゼドメイン、およびチロシンキナーゼ（Entrez登録番号：smart00219、87.5％アライメント）のコンセンサス配列に対して、高い類似性を共有する。
【０２６６】
「Filter」設定、未チェック、「Expect」設定10.0、「Word Size」設定3、での、nrデータベース（NCBIのBLASTウェブサイトで入手可能）における標準のヌクレオチド−ヌクレオチドBLAST検索により、ただ1つのヌクレオチド配列、予想ヒトcDNA LOC169436（XM＿095696、配列番号：4）が同定され、この配列は、ヌクレオチド88〜174（100％同一性）、174〜583（100％同一性）、および575〜2403（99％同一性）に対して有意な相同性を示した。
【０２６７】
「Filter」設定、未チェック、「Expect」設定10.0、「Word Size」設定3での、「pat」データベース（NCBIのBLASTウェブサイトで入手可能）における標準のヌクレオチド−ヌクレオチドBLAST検索により、NRHK1とヒトタンパク質キナーゼ様タンパク質SGK071（Entrez登録番号：AX056458、配列番号：5および6）との間の有意なヌクレオチド配列類似性が同定され、これは、PCT第WO00/73469号で開示されている。対合BLASTアルゴリズムを用いるさらなる解析によって、NRHK1とSGK071が、アミノ酸レベルにて、84％配列同一性（blastp、マトリックス：BLOSUM62、ギャップオープン：11、Gap伸張：1、x＿ドロップオフ：50、予想：10.0、ワードサイズ：3、フィルター：未チェック）、およびヌクレオチドレベルにて、90％配列同一性（blastn、マッチ：1、ミスマッチ：−2、ギャップオープン：5、ギャップ伸張：0、x＿ドロップオフ：50、予想：10.0、ワードサイズ：11、フィルター：未チェック）を共有することが明らかになった。
【０２６８】
ヒトゲノム検索を、Expect設定0.01、Filter設定デフォルト、Descriptions設定100、およびAlignment設定100で、blastnプログラムを用いて実施した。NRHK1遺伝子が、ヒトクロモソーム9の座9q34にマップされた。とりわけ、NRHK1遺伝子は、LOC157890とLOC57109の間に局在し、クロモソーム9上で、遺伝子LPC169436と重なる。NRHK1遺伝子の全ての21エキソンが、NBCIによって維持されたEntrez Human Genome Sequence Databaseの、ヒトクロモソーム9のヌクレオチド110001〜137201にマップされた。エキソンはまた、Celeraゲノムデータベース（配列番号：3）にマップされた。NRHK1遺伝子中のエキソン／イントロンは、「ゲノムDNA配列とcDNA配列をアライメントするためのコンピュータプログラム（A computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence.）」Genome Res.8：967-974, 1998にて、Flora et al.によって記述された、プログラム「sim4」を用いて決定した。
【実施例３】
【０２６９】
疎水性解析
NRHK1配列（配列番号：5）の疎水性プロファイルを、GES（ゴールドマン（Goldman）、Engelman and Steitz）疎水性スケール（Engelman,D.M.,Steiz,T.A.and Goldman,A.1986.膜タンパク質のアミノ酸配列における、非極性膜貫通へリックスの同定（Identifying nonpolar transmembrane helices in amino acid sequences of membrane proteins.）Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.15：321-353、1986）を用いて作製した。つまり、GESスケールを用いて、非極性二重膜貫通へリックスを同定した。曲線は、20残基のウインドウ上の、残基特異的疎水性スケールの平均である。線がフレームの上半分（ポジティブ）である場合、疎水性領域を示し、下半分（ネガティブ）にある場合、親水性領域である。
【０２７０】
図5にて、X軸は、アミノ残基（aa）中のタンパク質の長さをあらわし、Y軸は、GESスコアを表す。曲線は、前タンパク質のGESパターンを示し、一方で、直線は、可能性のある膜スパンイングドメインに関する特定のカットオフを示している。疎水性プロファイルは、NRHK1が、おそらく膜タンパク質であることを示している。
【０２７１】
新規ヒト遺伝子NRHK1を用いる、組成物、有機体および方法論の好ましい実施形態を記述したが（これらは、例示であり、限定の意図はない）、改変および変化を、上記技術の観点から、当業者によって実施されることが留意される。したがって、付随する請求項によって定義されたように、記述された目的の範囲内で、開示された特定の実施形態で、変化が実施されうる。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
（原文に記載なし）
【配列表】
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【図１】
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【図２】
2006514544.tif 000036
【図３】
2006514544.tif 000037
【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月7日(2005.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006514544000001.app
【国際調査報告】
2006514544.tif 000040
2006514544.tif 000041
2006514544.tif 000042