(57)【要約】  本発明によれば、有機溶媒を含まず、かつ比容積が4.0ml/g以下であるヒアルロン酸またはその塩の粉末、およびヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することを特徴とする、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒を含まず、かつ比容積が4.0ml/g以下であるヒアルロン酸またはその塩の粉末。
【請求項２】
ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１記載の粉末。
【請求項３】
ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することを特徴とする、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法。
【請求項４】
有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末が比容積4.0ml/g以下であることを特徴とする、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、請求項３または４記載の製造方法。
【請求項６】
ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にヒアルロン酸またはその塩を生成、蓄積させた後、培養物から不溶物および分子量６０００以下の物質を除去して得られるヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することを特徴とする、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法。
【請求項７】
有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末が比容積4.0ml/g以下である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、請求項６または７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩の粉末およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法としては、鶏冠から抽出する方法またはヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培養液から分離、精製する方法が知られている（特許文献１〜７）。
ヒアルロン酸は水溶液中では不安定性なため、工業的に生産する際は最終的に固体、特に粉末として得ることが好ましい。ヒアルロン酸を粉末として取得する場合、ヒアルロン酸を含有する水溶液に塩および親水性有機溶媒を添加して、ヒアルロン酸塩を沈殿として析出させ、それを分離して乾燥する手法がよく用いられる。このため、ヒアルロン酸を沈殿させる際に用いる親水性有機溶媒がヒアルロン酸の粉末中に残留することが避けられないが、該粉末を食品などの用途に用いる場合には有機溶媒の残留は好ましいことではない。【０００３】
また、有機溶媒の環境への排出を皆無にすることは不可能であり、昨今の環境問題においても好ましいことではない。
一方、有機溶媒を使用しないヒアルロン酸の製造法として、凍結乾燥法も考えられるが、凍結乾燥品は綿のような繊維状物質となり、移送や小分けが難しく、取り扱いが不便である。このため、有機溶媒を含まない、粉末状のヒアルロン酸またはその塩が求められている。
【特許文献１】特公平5-56957号公報
【特許文献２】特許第2938880号公報
【特許文献３】特許第2731545号公報
【特許文献４】特開平9-324001号公報
【特許文献５】特開平11-60608号公報
【特許文献６】特開昭58-84801号公報
【特許文献７】特開昭61-171703号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（８）に関する。
（１）有機溶媒を含まず、かつ比容積が4.0ml/g以下であるヒアルロン酸またはその塩の粉末。
（２）ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、上記（１）の粉末。
（３）ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することを特徴とする、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法。
（４）有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末が比容積4.0ml/g以下であることを特徴とする、上記（３）の製造方法。
（５）ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、上記（３）または（４）の製造方法。
（６）ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にヒアルロン酸またはその塩を生成、蓄積させた後、培養物から不溶物および分子量６０００以下の物質を除去して得られるヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することを特徴とする、有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法。
（７）有機溶媒を含まないヒアルロン酸またはその塩の粉末が比容積4.0ml/g以下である、上記（６）の製造方法。
（８）ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、上記（６）または（７）の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、有機溶媒を含まず、かつ比容積4.0ml/g以下であるヒアルロン酸またはその塩の粉末を供給することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．本発明のヒアルロン酸またはその塩
本発明のヒアルロン酸またはその塩は、有機溶媒を含まず、かつ比容積が4.0ml/g以下のヒアルロン酸またはその塩であれば、その分子量、塩の種類は特に限定されないが、好ましくは平均分子量が６０００より大きく１５０万以下、より好ましくは７０００より大きく１２０万以下、さらに好ましくは８０００より大きく１００万以下、特に好ましくは１万より大きく８０万以下のヒアルロン酸またはその塩をあげることができ、ヒアルロン酸塩としては、好ましくはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、より好ましくはナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩等をあげることができ、さらに好ましくはナトリウム塩をあげることができる。【０００８】
本発明において、ヒアルロン酸またはその塩の分子量は、日本薬局方記載の粘度測定法により測定した際の分子量が用いられる。
本発明のヒアルロン酸またはその塩の粉末は、有機溶媒、特にヒアルロン酸またはその塩を精製する際に通常用いられているメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類を含んでいない粉末である。有機溶媒を含まないとは、日本薬局記載の残留溶媒試験法に従い、ガスクロマトグラフィーによりヒアルロン酸またはその塩の粉末中の有機溶媒量を測定した場合、検出限界以下であることをいう。【０００９】
また、本発明のヒアルロン酸またはその塩の粉末の比容積は、4.0ml/g以下であれば特に限定されないが、好ましくは3.7ml/g以下で1.0ml/g以上、より好ましくは3.5ml/g以下で2.0ml/g以上の比容積をあげることができる。
本発明における比容積とは、日本薬局方第一追補記載の「かさ密度及びタップ密度測定法」によりヒアルロン酸またはその塩の粉末の比容積値を測定したときの比容積である。【００１０】
２．本発明のヒアルロン酸またはその塩の粉末の製造方法
本発明のヒアルロン酸またはその塩の粉末は、ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥することにより製造することができる。【００１１】
ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液は、公知の方法により鶏冠等の結合組織からヒアルロン酸またはその塩を抽出して得られる水溶液、ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物の培養物から得られる水溶液などをあげることができる。
鶏冠等の結合組織からヒアルロン酸またはその塩を抽出する方法としては、該組織をミンチ状にした後、生理食塩水などの水性溶媒でヒアルロン酸を抽出する方法をあげることができる。【００１２】
ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物としては、当該能力を有する微生物であれば特に限定されないが、好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物、より好ましくはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptcoccus pyogenes)、ストレプトコッカス・エキ(Streptcoccus equi)、ストレプトコッカス・エキシミリス(Streptcoccus equismilis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ(Streptcoccus dysgalactiae)、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptcoccus zooepidemicus)等の微生物をあげることができる。【００１３】
微生物の培養物としては、該微生物を培地に培養して得られる培養物をあげることができる。
微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００１４】
炭素源としては、微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００１５】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3〜9に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。【００１６】
鶏冠からの抽出物、または微生物を培養して得られた培養物を遠心分離、濾過または静置することにより組織や菌体などの不溶物を除去する。必要に応じて活性炭などを用いて脱色処理を行ってもよい。抽出物や培養物を活性炭で処理した後、濾過により活性炭を除去するのと同時に不溶物を除去することもできる。
また、不溶物を除去する前後に、該培養物に水酸化ナトリウム等の塩基類、または塩酸などの酸類を添加することにより、該培養物中に含まれるヒアルロン酸またはその塩を加水分解し、ヒアルロン酸またはその塩の低分子化を行ってもよい。塩基類および酸類の濃度、ならびに加水分解の処理時間を調節することにより、目的とする平均分子量が６０００より大きく１５０万以下、より好ましくは７０００より大きく１２０万以下、さらに好ましくは８０００より大きく１００万以下、特に好ましくは１万より大きく８０万以下のヒアルロン酸またはその塩を有するヒアルロン酸またはその塩を調製することができる。【００１７】
上記方法により本発明の方法で用いられるヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液を得ることができ、該水溶液を直接スプレー乾燥することにより本発明のヒアルロン酸またはその塩の粉末を取得することもできるが、スプレー乾燥する前に該水溶液から分子量６０００以下、好ましくは７０００以下、より好ましくは８０００以下、さらに好ましくは１００００以下の不純物を除去することにより、純度が高いヒアルロン酸またはその塩の粉末を得ることができる。【００１８】
上記した分子量１００００以下の不純物の除去は、ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液から該不純物を除去できる方法であれば、いかなる方法で行ってもよく、例えば限外濾過膜で処理する方法、および透析法などをあげることができ、好ましくは限外濾過膜で処理する方法をあげることができる。
限外濾過膜で処理する際の限外濾過膜の選択、ならびに処理温度および添加速度などの条件は、当業者であれば、取得したいヒアルロン酸またはその塩の分子量、ヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液中のヒアルロン酸またはその塩の濃度および平均分子量、ならびに該水溶液中に含有される不純物の種類と分子量分布から決定することができる。【００１９】
上記した限外濾過膜としては、旭化成社製のＳＩＰ３０１３（分子量６０００カット）およびＳＬＰ−３０５３（分子量１００００カット）などをあげることができる。
本発明の製造法で行われるスプレー乾燥は、上記したヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液をスプレー乾燥させることができるものであれば、市販のスプレー乾燥機など、いずれのスプレー乾燥機を用いても行うことができ、例えばAPV Ahydro社製、Niro Japan社製および株式会社大川原製作所製のスプレードライヤーなどをあげることができる。【００２０】
スプレー乾燥に供するヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液としては、ヒアルロン酸およびその塩の濃度が、好ましくは0.1〜20％(w/v)、より好ましくは2〜10％(w/v)、特に好ましくは3〜8％(w/v)の水溶液をあげることができる。
スプレー乾燥の条件、すなわちノズル形式などの機器仕様、ならびに送風温度およびフィード流量などの運転条件は、当業者であれば目的とするヒアルロン酸またはその塩の分子量、スプレー乾燥に供する水溶液中のヒアルロン酸またはその塩の濃度に応じて決定することができる。【００２１】
例えばストレプトコッカス・ズーエピデミカスを培地に培養して得られる培養物を酸性、例えばpH3.0にして培養物中のヒアルロン酸塩を平均分子量１５万になるように低分子化した後、培養物に活性炭を加えて脱色、濾過して得られたヒアルロン酸またはその塩を含有する水溶液を旭化成社製の限外濾過膜SIP3013で処理し、不純物を透過液として取り除くことにより、純度の高いヒアルロン酸またはその塩を取得するための水溶液を得ることができる。【００２２】
該水溶液中のヒアルロン酸またはその塩の濃度を4％(w/v)前後に調整した後、噴霧ノズルは二流体ノズル、送風温度は入り口温度を130〜180℃、出口温度を70〜100℃、フィード流量は0.8〜1.2kg/hの条件でスプレー乾燥することで、本発明のヒアルロン酸またはその塩を取得することができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
スプレー乾燥によるヒアルロン酸塩粉末の製造（１）
ストレプトコッカス・ズーエピデミクス(Streptcoccus zooepidemicus) NCTC7023 [J. Gen. Microbial.，15，485-491(1956)]をブレイン・ハート・インヒュージョン寒天培地(日本製薬社製)を用いて37℃で16時間培養して得られた菌体を、グルコース1 %(w/v)、ペプトン1.5 %(w/v)、酵母エキス0.5 %(w/v)、コーンスチープリカー1 %(w/v)、グルタミン酸ナトリウム0.3 %(w/v)、リン酸二カリウム0.2 %(w/v)、硫酸マグネシウム0.05 %(w/v)、チオ硫酸ナトリウム0.1 %(w/v)、炭酸カルシウム2 %(w/v)からなる種培地(pH 7.0) 300mLに播種し、37 ℃、16時間振盪培養した。この種培養液150 mLを、グルコース2.5 %(w/v)、ペプトン1.5 %(w/v)、酵母エキス0.5 %(w/v)、コーンスチープリカー0.5 %(w/v)、リン酸二カリウム0.2 %(w/v)、硫酸マグネシウム0.005 %(w/v)、チオ硫酸ナトリウム0.1 %(w/v)からなる発酵培地(pH 7.2) 3 Lが入っている5 L容ジャーファーメンターに播種し、37 ℃、通気量0.3 vvm、pH 7.0で26時間培養し、ヒアルロン酸ナトリウムを含有する培養物を取得した。【００２４】
該培養物3Ｌに硫酸を加えてpH3.0に調整し、70℃で5時間保温することによりヒアルロン酸ナトリウムを低分子化した後、培養物に活性炭を加えて１時間撹拌した。活性炭が入った培養物を濾過して菌体を含む固形分を取り除いた。
得られた濾液を限外濾過膜（UF膜）である旭化成社製のSIP0013を用いて50℃で膜処理し、透過液として不純物を取り除くことにより高純度のヒアルロン酸ナトリウムを含有する水溶液を取得した。【００２５】
該水溶液に水酸化ナトリウムを加えてpH5.5〜7.0に調整するとともに、ヒアルロン酸ナトリウム濃度を4％(w/v)に調整した後、スプレー乾燥または凍結乾燥することによりヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
スプレー乾燥は、APV Ahydro社製 52型 パイロット機を用い、噴霧ノズルは二流体ノズル、送風温度は入り口温度が150℃、出口温度が90℃、フィード流量は1.0kg/hで行った。スプレー乾燥で得られた乾燥物は粉末状であり、凍結乾燥により得られた乾燥物は綿のような繊維状であった。【００２６】
得られたヒアルロン酸ナトリウム乾燥物の比容積は、日本薬局方第一追補記載の「かさ密度及びタップ密度測定法」、残留溶媒種および残留溶媒量は日本薬局方記載の「残留溶媒測定法」に従い、ガスクロマトグラフィー分析した。表１に結果を示す。【００２７】
【表１】
2008004530.tif 000002
【００２８】
表１のとおり、残留溶媒は検出されなかったので、残留溶媒種を決定する必要はなかった。
また、上記のスプレー乾燥で得られたヒアルロン酸ナトリウムの純度は98％であり、平均分子量は約15万であった。なお、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量は、日本薬局方記載の粘度測定法により測定した。
【実施例２】
【００２９】
スプレー乾燥によるヒアルロン酸塩粉末の製造（２）
実施例１と同様の方法で取得したヒアルロン酸ナトリウムを含有する培養物に水酸化ナトリウムを0.33mol/lとなるように添加し、30℃で4〜5時間保温することによりヒアルロン酸ナトリウムを低分子化した後、塩酸を加えてpH6.0〜7.0に調整した培養物に活性炭を加えて１時間撹拌する。活性炭が入った培養物を濾過して菌体を含む固形分を取り除く。【００３０】
得られた濾液をpH3.0に調整した後、限外濾過膜である旭化成社製のSIP0013を用いて50℃で膜処理し、透過液として不純物を取り除くことにより高純度のヒアルロン酸を含有する水溶液を取得する。
該水溶液に水酸化ナトリウムを加えてpH5.5〜7.0調整した後、スプレー乾燥することにより比容積が4.0ml/g以下のヒアルロン酸ナトリウムの粉末を取得することができる。
［比較例］
市販されている各種ヒアルロン酸ナトリウムの粉末の比容積、残留溶媒種および残留溶媒量を実施例１と同様の方法で分析した。結果を表２に示す。【００３１】
【表２】
2008004530.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、有機溶媒を含まず、かつ比容積4.0ml/g以下であるヒアルロン酸またはその塩の粉末を供給することができる。
【国際調査報告】
2008004530.tif 000004
2008004530.tif 000005
2008004530.tif 000006
2008004530.tif 000007