(57)【要約】  大豆たん白質を原料に、分岐鎖アミノ酸を効率的に吸収させる組成物を得る事を課題とする。大豆たん白質を、「金属プロテアーゼ」「酸性プロテアーゼ」「チオールプロテアーゼ」「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から、２種以上の異なった分類に属する酵素を作用させることによって、ジ，トリペプチド含量が高いペプチド組成物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長220nmの紫外吸収積算総量に対して、分子量700以上のペプチド画分の紫外吸収積算量が40%以下であり、分子量100〜350であるペプチド画分の紫外吸収積算量が、分子量350以上であるペプチド画分の紫外吸収積算量に対して1.0倍以上であり、且つ遊離アミノ酸含量が全粗たん白質成分中の15重量%以下となるような分子量組成を有する、大豆に由来するたん白質をプロテアーゼで分解することによって得られるペプチド組成物。
【請求項２】
大豆に由来するたん白質が分離大豆たん白質である請求項１のペプチド組成物。
【請求項３】
大豆に由来するたん白質が大豆グリシニンである請求項１のペプチド組成物。
【請求項４】
分岐鎖アミノ酸の60重量％以上が、分子量100〜500のペプチド画分に含まれる、請求項１のペプチド組成物。
【請求項５】
「金属プロテアーゼ」，「酸性プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から、２種以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させることによって得られる請求項１のペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
起源の異なる２種以上の酵素を作用させる、請求項１または請求項５のペプチド組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１の組成物を有効成分とする、分岐鎖アミノ酸迅速摂取用ペプチド組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はたん白質栄養、特に近年その有効性が示唆されている分岐鎖アミノ酸の吸収速度に優れたペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
スポーツ時や労働時など筋肉を激しく使用した際は、アミノ酸、特に分岐鎖アミノ酸が消費される。その為、これら行為の後に分岐鎖アミノ酸を中心としたアミノ酸を摂取する事で、疲労感や筋損傷等を有効に抑制できるとされている。しかし、最も一般的なアミノ酸の供給源であるたん白質は、水への溶解に時間がかかったり、水溶液の粘度が高く、摂取後も消化管内でプロテアーゼが作用するまでに時間がかかるため、その吸収速度は早くはなく、摂取の効果は強くは反映されにくい。【０００３】
他方たん白質の加水分解物である遊離アミノ酸は、たん白質や高分子ペプチドより優れた吸収速度を示す。しかし、目的のアミノ酸、特に分岐鎖に富んだアミノ酸を多量に摂取しようとしても、分岐鎖アミノ酸自体の溶解度が低い事や、口中での特有の味、浸透圧に由来する腹腔内での膨満感などがあり、ヒトの摂取が困難な場合が多い。【０００４】
一方、たん白質を部分加水分解したペプチドは、基質となるたん白質と比較して、溶解性、粘度、pH、浸透圧、高次構造、抗酸化能、吸収性、呈味性が大きく異なる場合が多い。また、特定のジ，トリペプチドはその吸収速度の比較において優位であると指摘される事がある（非特許文献１）（非特許文献２）。【０００５】
大豆たん白質は栄養価が高く、入手，加工し易い食品たん白質素材として広く使われており、これを用いた大豆ペプチド製品も知られている。ところが、大豆たん白質をプロテアーゼで加水分解しても、ジ，トリペプチドを収率良く分解する事は容易ではない。例えば、（特許文献１）にはペプチド鎖長２〜１０の低分子ペプチドの製造方法が開示されているが、この方法で調製したペプチド組成物の純粋なジ，トリペプチド含量を測定したところ、40重量%程度であった。また（特許文献２）には、トリ，デイ（ジ）ペプチドから成る低分子ペプチドが開示されている。分子量700以上の画分及び遊離アミノ酸の量は測定されているものの、分子量700以下のペプチドの分子量分布の測定はされておらず、平均分子量という概念でしか分子量分布を捉えていない。【０００６】
特許文献３には、肝疾患患者用の分岐鎖アミノ酸高含有ペプチドの製法が開示されている。しかし、その分析値によれば、主成分となるオリゴペプチドは分子量1,000前後であり、ジ，トリペプチドの存在量はやはり数十%に留まっている。【０００７】
この様に、市販のペプチド、特に大豆ペプチドは、個々の分子量のペプチド分子に着目して調製されている訳ではなく、その結果分子量の分布幅が広く、ジ，トリペプチド含量は低いレベルに留まっている。また、これらオリゴペプチド画分のアミノ酸組成について、これまでに特に言及された報告も無く、その分子量と個々のアミノ酸吸収の関係についての考察は行なわれてこなかった。【０００８】
【非特許文献１】中坊幸弘「大豆タンパク質の加工特性と生理機能」建帛社,133−154, 1999
【非特許文献２】薩秀夫，清水誠「アミノ酸トランスポーター」臨床栄養 Vol.10, No.2, 155−160, 2002
【特許文献１】特開昭６３−２８７４６２
【特許文献２】特開昭５９−０７６０２２
【特許文献３】特許２９４５９９５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この発明は、大豆たん白質を原料に、容易な方法でジ，トリペプチド含量が高いペプチド組成物を得、またこのペプチド組成物を用いて分岐鎖アミノ酸を効率的に吸収させる組成物を得る事を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、大豆たん白質を素材に、活性中心により4種類に分類されるプロテアーゼの中から、２種以上の異なった種類のプロテアーゼを作用させる事で、分子量100〜350で表される分子量組成を有し、且つこれらオリゴペプチド画分に分岐鎖アミノ酸が多く含まれるペプチド素材を開発した。更に、このペプチドを用いる事で、特に分岐鎖アミノ酸の吸収性に優れる事を見い出し、本ペプチド素材の発明に至った。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
即ち本発明は、波長220nmの紫外吸収積算総量に対して、分子量700以上のペプチド画分の紫外吸収積算量が40%以下であり、分子量100〜350であるペプチド画分の紫外吸収積算量が、分子量700以上であるペプチド画分の紫外吸収積算量に対して1.0倍以上であり、且つ遊離アミノ酸含量が全粗たん白質成分中の15重量%以下となるような分子量組成を有する、好ましくは分岐鎖アミノ酸の60重量％以上が、分子量100〜500のペプチド画分に含まれる、大豆に由来するたん白質をプロテアーゼで分解することによって得られるペプチド組成物で、好ましくは大豆たん白質が分離大豆たん白質であり、更に好ましくは、大豆たん白質が大豆グリシニンである。
また、プロテアーゼが、「金属プロテアーゼ」，「酸性プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」の中から、２種以上の異なった分類に属する酵素を、或いは２種以上の起源の異なった酵素を、順次もしくは同時に作用させることによって得られる、上記ペプチド組成物の製造方法であり、上記ペプチド組成物を有効成分とする、分岐鎖アミノ酸迅速摂取用ペプチド組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、大豆たん白質を原料に、特に分岐鎖アミノ酸の吸収性に優れたペプチド素材を得る事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本発明の大豆たん白質は、丸大豆，脱皮脱胚軸大豆，脱脂大豆，脱脂大豆を更に酸性水や極性有機溶媒で洗浄した濃縮大豆たん白質を原料とし、これを水または温水で分散させた大豆抽出スラリー、或いは更に不溶画分を分離した大豆抽出液である。好ましくは、抽出液を等電点沈澱して得た分離大豆たん白質であり、更に好ましくは、大豆β-コングリシニン（7Sグロブリン）と大豆グリシニン（11Sグロブリン）以外のたん白質成分（脂質親和性大豆たん白質）を除去した分離大豆たん白質であり、最も好ましくは、分離大豆たん白質を分画して得た大豆グリシニン（11Sグロブリン）である。大豆グリシニンの分画方法は、例えば、Thanh & Okubo & Shibasaki, Isolation and Characterization of the Multiple 7S Globulins of Soybean Proteins. Plant Physiol. 56, 19-22（1975）、Thanh, V. H. and Shibasaki, K., Major proteins of soybean seeds. A straightforward fractionation and their characterization. J. Agric. Food Chem., 24, 1117- 1121 (1976)、及び、Nagano, T., Hirotsuka, M., Mori, H., Kohyama, K. and Nishinari, K., Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans. J. Agric. Food Chem., 40, 941-944(1982)、或いは、特願２００５−１５７８７１に開示された方法等、公知の方法に従って行なう事ができる。これら大豆たん白質は抽出液のまま、或いは乾燥物とした上で再度水溶液として、以下の分解を行なう事ができる。【００１４】
分解は、上記大豆たん白質スラリーまたは水溶液を基質とし、プロテアーゼ処理を行なう。 ここで用いるプロテアーゼは、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」，「酸性プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」，「チオールプロテアーゼ」，「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から、２種以上、好ましくは３種以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させる事ができる。【００１５】
このプロテアーゼの分類は、酵素化学の分野に於て通常行なわれている、活性中心のアミノ酸の種類による分類方法であり、各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテイナーゼ，Streptomyces中性プロテイナーゼ，Aspergillus中性プロテイナーゼ，サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン，Aspergillus酸性プロテイナーゼ，スミチームAP等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン，パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，Streptomycesアルカリプロテイナーゼ，Aspergillusアルカリプロテイナーゼ，アルカラーゼ，ビオプラーゼ等が挙げられるが、これ以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認する事ができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なる為に、「切れ残り」を減らし、効率よくオリゴペプチドを得る事ができる様になる。【００１６】
或いは異なった起源（起源生物）の酵素を併用する事で、更に効率良くオリゴペプチドを製造する事ができる。同分類でも起源が異なれば、基質であるたん白質への作用部位も異なり、結果としてジ，トリペプチドの収率を増やすことが出来る。２種以上、好ましくは３種以上の異なった起源の酵素を、順次もしくは同時に作用させる事ができる。また、２種以上の分類の異なる酵素に、同分類で起源の異なる酵素を１種以上併用する事も好ましい。【００１７】
これらプロテアーゼはエキソ活性が少ない物が好ましい。また、粗酵素や酵素製剤は複数種のプロテアーゼを含んでいる場合があるが、この際は実質的な活性を示すプロテアーゼが、それぞれ別々に存在するものとして扱う事ができる。またそれぞれのプロテアーゼは活性中心や起源により分類する事ができる。【００１８】
反応ｐＨや反応温度は、それぞれのプロテアーゼの至適条件、或いは活性の得られる条件であり、特に２種以上のプロテアーゼを同時に用いる際は、共に活性が得られる条件を選択する。通常反応ｐＨは各々の酵素の至適ｐＨ付近であり、温度は0〜100℃，好ましくは20〜80℃，更に好ましくは40〜60℃で反応を行なう。反応時間もｐＨや温度により変化するので特には限定しないが、概ね5分〜24時間、好ましくは10分〜12時間、更に好ましくは30分〜6時間が適当である。反応後、反応液は60℃〜100℃で加熱する事で残存酵素活性を失活させる。【００１９】
反応液はそのまま乾燥を行なう事もできるし、任意のｐＨに調整する事もでき、またｐＨ調整時に発生する沈澱物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去する事もできる。この際、前述した脂質親和性大豆たん白質を除去した分離大豆たん白質を原料として用いる事で、沈澱の発生を抑制し、生成物の収率を高められる。また、この後に活性炭や吸着樹脂により、精製を行なう事もできる。【００２０】
得られたペプチド組成物は、以下の方法により分子量分布および遊離アミノ酸含量を測定する。
○分解率測定
1 重量%濃度の試料に、30重量%のトリクロロ酢酸（TCA）を等量添加し、3,000rpm 10分間遠心し、得られた上澄をケルダール法にて測定し、別途ケルダール法にて測定した全粗たん白質に対する割合として算出した。【００２１】
○分子量測定方法
２種のカラム直列接続によってペプチド用ゲルろ過システムを組み、分子量マーカーとなる既知ペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた（表１，図１）。酵素分解した分解物（１％）を10,000×g、10分で遠心した上清を、ゲルろ過用溶媒で２倍希釈し、その5μlをアプライした。各分子量画分の含有量比率％については、全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた。（１stカラム：Superdex 75 10/300GL、  2ndカラム：Superdex Peptide 7.5/300GL，溶媒：1%SDS/10mMリン酸緩衝液,pH8.0，２５℃，流速：0.25ml/min，検出：OD220nm）【００２２】
表１  分子量標準物質
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【００２３】
○遊離アミノ酸含量測定
試料（4 mg/ml）を等量の3%スルホサリチル酸に加え、室温で15分間振とうした。10,000rpm 10分間遠心し、得られた上澄を0.45 μmフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製 JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定した。アミノ酸量はケルダール法にて得られた全粗たん白質に対する量として算出した。【００２４】
○オリゴペプチド画分のアミノ酸組成分析
3重量%試料溶液を10,000×g，10分遠心して、上清を凍結乾燥した。乾燥試料を10mMリン酸緩衝液,pH8.0の13%溶液とし、さらにエタノールを30重量％になるまで加え、その2mlを遠心分離（10,000×g，10分）した。沈澱は水で溶解し、2mlにフィルアップした。一方、上清はゲルろ過（LH-20）にチャージした。条件は以下に示す。
ゲル濾過：セファデックスLH20, カラム：φ2.2×80cm  全容量300ml
展開液：10mMリン酸緩衝液,ｐH8.0＋30％EtOH、流速2ml/分
検出：OD280nm
沈澱画分及び、チャージからの溶出量が84ml〜120mlの区分までを分子量500以上画分とし、チャージからの溶出量が120ml〜312mlの区分を分子量100〜500画分として分画した。それぞれ80〜100℃で蒸発乾固し、2mlの水で溶解し所定容量の液をとり、酸分解し、アミノ酸分析装置にかけ、各画分のアミノ酸濃度とアミノ酸組成を測定した。各画分のアミノ酸濃度から、全体に対する各画分のアミノ酸分配率を算出した。さらにアミノ酸組成と分配率を掛け合わせて親水，分岐鎖，芳香族の各種アミノ酸の各画分への分配率を算出した。【００２５】
この様に得られたペプチド組成物は、波長220nmの紫外吸収積算総量に対して、分子量700以上のペプチド画分の紫外吸収積算量が40%以下、好ましくは30%以下であり、分子量100〜350であるペプチド画分の紫外吸収積算量が、分子量350以上であるペプチド画分の紫外吸収積算量に対して1.0倍以上、好ましくは1.2倍以上であり、且つ遊離アミノ酸含量が全粗たん白質成分中の15重量%以下、好ましくは10重量%以下となるような分子量組成を有する。また、好ましくは分岐鎖アミノ酸の60重量％以上、更に好ましくは80重量％以上が、分子量100〜500のペプチド画分に含まれる特徴を有する。【００２６】
本発明品は分子量100〜350で表される、腸管からの吸収が非常に早いと指摘されるジ，トリペプチドが多く含まれる。更に、上記工程で得られたペプチド組成物は、分岐鎖アミノ酸が分子量100〜500の画分に多く含まれ、また親水性アミノ酸が高分子画分に多く含まれる特徴があるため、このペプチド組成物を摂取すると、アミノ酸をオリゴペプチドとして迅速に吸収出来る上に、特に分岐鎖アミノ酸を非常に迅速に吸収する事が可能になる。分岐鎖アミノ酸の吸収が早い事で、筋肉損傷時に迅速に対応でき、結果として疲労回復，筋肉痛低減等の効果を得る事ができる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例示によって制限されるものではない。尚、例中の％，部は何れも重量基準を、収率は乾燥物重量としての回収率を意味する。【００２８】
Ａ．各試料の調製
脱脂大豆１部を水10部に溶解し、pH7.0で１時間、撹拌下で抽出を行ない、オカラを遠心分離で除いて脱脂豆乳を得た。脱脂豆乳に塩酸を加え、pH4.5とした。沈澱を遠心分離で回収し、10重量％まで水で希釈し、水酸化ナトリウムでpH7.0に中和した後に、高温殺菌及び噴霧乾燥を行ない、分離大豆たん白質を得た。また、脱脂大豆１部を水10部に溶解し、pH7.0で１時間、撹拌下で抽出を行ない、オカラを遠心分離で除いて脱脂豆乳を得た。得られた脱脂豆乳に0.01％の亜硫酸水素Naを加え、塩酸でpH6.4とした。脱脂豆乳を2〜５℃で６時間静置し、遠心分離で沈降物を回収し、水酸化Naで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行なって大豆グリシニンを得た。これらたん白質を基質として、加水分解酵素を用いてペプチドを調製した。比較を行うことを目的として、同一のアミノ酸の組成からなる遊離アミノ酸混合物を調製した。【００２９】
（実施例１）
３％分離大豆たん白質溶液に対して、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus，金属プロテアーゼ，大和化成）を対たん白質あたり２％加え、pH9.0，58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp.セリンプロテアーゼ，ナガセケムテック）を対たん白質あたり１％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。スミチームFP（起源；Aspergillus sp.，金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を対たん白質あたり１％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。以上の処理の後、90℃，20分で反応を停止した後、吸収試験や性質を調べる試料とした。原料の分離大豆たん白質に対する固形分収率は、87重量%であった。【００３０】
（実施例2）
３％大豆グリシニン溶液に対して、実施例１と同条件で３種類のプロテアーゼで反応を行なった。原料の大豆グリシニンに対する固形分収率は、96重量%であった。【００３１】
（比較例１）
３％大豆グリシニン溶液に対して、ビオプラーゼを対たん白質あたり４％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。【００３２】
（比較例２）
３％大豆グリシニン溶液に対して、サモアーゼを対たん白質あたり２％加え、pH9.0，58℃で120分間作用させた。【００３３】
（比較例３）
３％大豆グリシニン溶液に対して、ビオプラーゼを対たん白質あたり４％加え、pH9.0，58℃で120分間作用させた。【００３４】
B．分解度と分子量分布
上述のような方々で得られた試料について、前述した方法により、酵素分解度及び分子量分布を求めた。また、比較例４として市販大豆ペプチド（不二製油製 ハイニュートDC6）を同様に分析した。【００３５】
表２．分解率及び各分子量画分収率
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【００３６】
各反応物の分析結果を表２に、また分子量スタンダートを図１に、典型的なゲル濾過パターンを図２に示した。今回の反応条件では、どれも遊離アミノ酸含量が10重量%以下と小さかった。また、実施例１〜２のように、異なった分類や異なった起源のプロテアーゼを複数組み合わせて用いることにより、分子量350以上のペプチド画分の存在量に対する、分子量100〜350のペプチド画分の存在量の比が、どれも1.0を超えており、また分子量700以上の画分はどちらも40重量%を下回り、比較例１〜４に比べてジ，トリペプチドのオリゴペプチドを高度に含有したペプチド素材を得られることが示された。【００３７】
すなわち、同分類のプロテアーゼを使用した場合、TCA可溶化率を指標にした分解率は、ほぼ同等のレベルまで分解は進むものの、その分子量分布には大差がなく、それは酵素量、時間を変えても改善できないことが示唆された。【００３８】
C．オリゴペプチド画分のアミノ酸組成
実施例１，実施例２の試料及び、比較例４のアミノ酸組成を比較し、親水性アミノ酸（Arg，Asp，Glu，Lys，Ser，Gly，Pro，Thr，Ala，His，Cys，Met）、分岐鎖アミノ酸（Val，Ile，Leu）、芳香族アミノ酸（Tyr，Phe，Trp）含量をそれぞれ求め、高分子側（分子量500以上）及び低分子側（分子量100〜500）への分配率を測定した。【００３９】
表３  オリゴペプチド画分への、各アミノ酸の分配率
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【００４０】
表３に示す様に本発明品は、実施例１では分岐鎖アミノ酸の60%以上が、実施例２では80%以上が、分子量100〜500のオリゴペプチド画分に存在した。これにより本発明品が、分岐鎖アミノ酸が吸収し易いペプチド組成物である事が判る。【００４１】
D．ペプチドの吸収速度
上記の実施例２の試料に対して、分解前の大豆グリシニン、両者と同等なアミノ酸組成を有するアミノ酸の混合物を調製し、各試料のヒトに対する吸収速度を比較した。測定法は下記に、結果は（表４；初期吸収速度）、（表５；６０分間の吸収速度）、に示した。【００４２】
測定法
各試料12.5ｇを水200mlに溶解または均一に分散させ、12人の被験者に対し30秒以内に摂取させた。更に容器内を50mlの水で洗浄し、それも摂取させた(計250ml)。摂取終了5分後から採血を開始し、静脈にカニューレを挿入したまま、30分までは５分間隔で、それ以降60分までは10分間隔で採血し、血清中の遊離アミノ酸量の変化を調べた。5〜30分間はほぼ直線的に上昇したため、この間の上昇率をアミノ酸初期吸収速度（n mol/ml/min）と定めた。また、60分間に上昇した値の総和を積分し、血中アミノ酸上昇濃度（m mol/ml）として算出した。結果は、表４，５に示した。【００４３】
（表４）初期吸収速度（n mol/ml/min）
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【００４４】
（表５）血中アミノ酸上昇濃度（m mol/ml）
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【００４５】
これらの結果より、実施例２で調製した大豆グリシニン由来のペプチドは、吸収速度や吸収効率において遊離のアミノ酸より優れていることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
大豆たん白質を原料に、容易な方法でジ，トリペプチド含量が高いペプチド組成物を得た。このペプチド組成物は分岐鎖アミノ酸を効率的に吸収させる事に優れる物である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】分子量測定用ゲル濾過における、マーカーペプチドの保持時間と分子量の関係を示すグラフである。
【図２】実施例２で調製したペプチドを、分子量測定用ゲル濾過に供した際の分離クロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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