(57)【要約】ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（又は細胞）との特定遺伝子の発現レベルの差を指標とした、新規な乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法を提供することを目的とする。このため、（１）ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）における特定の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを測定し、（２）ヒトの非転移性乳癌組織（または細胞）における上記遺伝子の発現レベルを測定し、（３）上記（１）及び（２）の測定値を比較し、その差異に基づいて乳癌のリンパ節転移可能性を判定することを特徴とする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（または細胞）における、マーカー遺伝子の発現レベルの差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法。
【請求項２】
マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子のmRNA量で表されることを特徴とする、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
マーカー遺伝子が、GenBank登録番号NM000903、NM006804、NM033547、CR611676、NM177967、NM152558、NM178167、NM003752、AK131568、CR592336、NM178507、NM002862、NM006913、NM005794、NM014164、NM000853および3番染色体178882962bpから178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログからなる群のうちの、１または２以上より選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（または細胞）におけるマーカー遺伝子の発現レベルの差が、２倍以上または１／２以下である、請求項１から３のいずれかに記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法に関する。より詳細には、特定の塩基配列を有するマーカー遺伝子の発現レベルを転移性乳癌細胞と非転移性乳癌細胞とで比較することに基づく、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では乳癌が急激に増加しており、特に女性罹患者の第１位となっている。乳癌は、女性ホルモン（エストロゲン）が関与している癌で、初潮が早い、閉経が遅い、初産年齢が遅いまたは高齢で未産、など、エストロゲンにさらされる期間が長いことが乳癌にかかりやすい条件として考えられている。また、食生活の欧米化による高脂肪食、肥満なども関与していると考えられ、これは特に閉経後の女性で、脂肪組織でエストロゲンが作られているためであると考えられる。また、女性の社会進出などのライフスタイルも日本における乳癌罹患率の上昇に関係していると考えられる。【０００３】
乳癌は、非浸潤癌、浸潤癌、パジェット病の大きく３つに分けられるが、しこりを生じるような乳癌のほとんどが浸潤癌であり、硬癌、乳頭腺管癌、充実腺管癌などの一般的な癌と、粘液癌などの特殊型とがある。【０００４】
早期乳癌の検診としては乳癌特異的な血液検査法がなく、触診およびＸ線像診断が行われている。しかし併用した場合でも見落し率は20％と高く、Ｘ線像診断には専門医の判定が必要となる等の問題がある。また、術前、術中の乳癌細胞診断では病理医による鑑別が必須であるが、病理医不足や鑑別基準のばらつき等の問題があり、検診から鑑別の間を埋めるべき客観的かつ簡便な検出/診断法が存在しない。近年、直径1mm以下の癌組織を検出できるPET診断が行われつつあるが、大規模な設備が必要であり、簡便に検診に利用することは極めて難しい。【０００５】
近年の研究から、癌が遺伝子の異常を原因とする疾病であることが明らかになりつつあり、例えば癌組織と正常組織での、特定の遺伝子の発現レベルが異なるという現象を利用し、癌細胞を検出する方法が提案されている（特許文献１、２）。【０００６】
【特許文献１】特開2003-284594号公報
【特許文献２】特開2003-284596号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リンパ節転移性乳癌の場合、乳癌術後において、腫瘍サイズ、切除癌細胞の核異型度、ホルモン受容体量等の指標を用いて経過を予測し、必要に応じてリンパ節等への転移や再発の抑制を目的とする術後補助療法（アジュバント療法）を行う。しかしながら、現在のところ、これら指標の予測精度は十分ではなく、再発リスク低減、適切な投薬による患者QOL向上の観点から精度の高い予後指標が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者らが鋭意研究を実施し、転移性乳癌細胞又は組織において、特定のマーカー遺伝子の発現レベルが非転移性乳癌細胞又は組織とは異なり、それが乳癌のリンパ節転移可能性の判定に応用しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、課題を解決するための手段は以下のとおりである。【０００９】
（１）ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（または細胞）における、マーカー遺伝子の発現レベルの差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法。
（２）マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子のmRNA量で表されることを特徴とする、前記（１）に記載の判定方法。
（３）マーカー遺伝子が、GenBank登録番号NM000903、NM006804、NM033547、CR611676、NM177967、NM152558、NM178167、NM003752、AK131568、CR592336、NM178507、NM002862、NM006913、NM005794、NM014164、NM000853および3番染色体178882962bpから178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログからなる群のうちの、１または２以上より選択されることを特徴とする、前記（１）または（２）に記載の判定方法。
（４）ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（または細胞）におけるマーカー遺伝子の発現レベルの差が、２倍以上または１／２以下である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の判定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の判定方法により、遺伝子レベルにて乳癌のリンパ節転移可能性の判定を迅速かつ簡便に行うことが可能となり、乳癌の転移防止につなげることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１）の発現量の比較を示す図。
【図２】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃２）の発現量の比較を示す図。
【図３】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃３）の発現量の比較を示す図。
【図４】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃４）の発現量の比較を示す図。
【図５】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃５）の発現量の比較を示す図。
【図６】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃６）の発現量の比較を示す図。
【図７】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃７）の発現量の比較を示す図。
【図８】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃８）の発現量の比較を示す図。
【図９】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃９）の発現量の比較を示す図。
【図１０】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１０）の発現量の比較を示す図。
【図１１】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１１）の発現量の比較を示す図。
【図１２】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１２）の発現量の比較を示す図。
【図１３】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１３）の発現量の比較を示す図。
【図１４】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１４）の発現量の比較を示す図。
【図１５】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１５）の発現量の比較を示す図。
【図１６】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１６）の発現量の比較を示す図。
【図１７】HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号＃１７）の発現量の比較を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織における、特定のマーカー遺伝子の発現レベル差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法である。本発明におけるマーカー遺伝子とは、その発現レベルを転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織とで比較することにより、該乳癌細胞の転移性の可能性を判定することを可能にする遺伝子のことである。【００１３】
本発明は、先記マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子のmRNA量で表されることを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法である。より詳細には、転移性乳癌組織由来の細胞と非転移性乳癌組織由来の細胞からトータルRNAを抽出し、その中に含まれる先記マーカー遺伝子から転写されるmRNA量を比較することを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法である。遺伝子のmRNA量を測定する遺伝子発現解析法としては、包括的転写産物プロファイル解析法（HiCEP法）、DNAマイクロアレイ法、定量的逆転写PCR法（定量RT-PCR法）、ノザンハイブリダイゼーション法などが適用可能である。また、in  situハイブリダイゼーション法のように、細胞からトータルRNAを抽出せずにmRNA量を測定する遺伝子発現解析法も、本発明に適用可能である。また、検出精度を向上させるため、上記方法を２つ以上組み合わせることも可能である。さらに本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、一例として、本遺伝子にコードされる蛋白質の量を測定する方法がある。特定蛋白質の量の測定は、具体的には例えば、該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーなどにより実施することができる。本遺伝子にコードされる蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子にコードされる蛋白質を免疫抗原として調製することができる。【００１４】
なお、HiCEP法とは、包括的かつ高検出な感度を特徴とする転写物プロファイル解析手法の一つである。以下、その方法について簡単に記載する（詳細はNucleic  Acids  Res.,  2003,  Vol.31,  No.16  e94を参考のこと）。組織・細胞サンプルから、常法によりToTal  RNAを抽出・精製する。5'ビオチンオリゴdTを用いて二本鎖cDNAを合成する。制限酵素MspIを用いcDNAを切断する。アビジンビーズでポリA側断片を回収した後、MspI切断サイトへ3'-アダプターを連結する。制限酵素MseIにより断片を切断する。MseI切断サイトへ3'-アダプターを連結する。5'および3'末端に連結されたアダプター配列に選択的２塩基を追加したPCRプライマー（5'側16本、3'側16本、5'側プライマーには蛍光標識を施す）を作成し、これらの組み合わせである256通りの定量的PCRを行う。PCR産物をプライマー組み合わせごとにFragment  Analyzerに掛け、複数の蛍光ピークからなる電気泳動像（遺伝子発現プロファイル）を、サンプルに付き256個取得する。こうして得た蛍光ピークを異なるサンプル間で比較することにより、転写物の発現量比較が可能となる。【００１５】
本発明におけるマーカー遺伝子としては、転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織においてその発現量に顕著な差が見られるものであれば特に限定されず、例えばGenBank登録番号NM000903、NM006804、NM033547、CR611676、NM177967、NM152558、NM178167、NM003752、AK131568、CR592336、NM178507、NM002862、NM006913、NM005794、NM014164、NM000853および3番染色体178882962bpから178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログからなる群のうちの、１または２以上より選択されるものが適用可能である。【００１６】
なお、GenBank登録データにおいては、同一遺伝子を異なる研究者が異なる時期、分野、名称で登録している場合や、遺伝子多型やスプライシングバリアントがあるものを新規なものとして登録している場合があるため、本来同一遺伝子とみなしてよい塩基配列データが異なる登録番号として重複して存在する。通常それらを総称してホモログと称し、本発明においても同様の意味に用いる。【００１７】
本発明の乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法は、転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織との、遺伝子の発現レベルの差が顕著なものをマーカー遺伝子とすることを特徴とする。ここで、前記「発現レベル」とは、マーカー遺伝子から転写されるmRNAの発現量であってもよく、前記mRNAから翻訳されるタンパク質の発現量であってもよい。遺伝子発現レベルの差としては、転移性乳癌細胞又は組織の発現レベルを１とした場合、非転移性乳癌細胞又は組織のそれが望ましくは１．５以上または２／３以下、より望ましくは２以上または１／２以下である。一方、転移性乳癌細胞又は組織と比較した非転移性乳癌細胞又は組織の上記マーカー遺伝子の発現レベルが上記範囲外では、乳癌のリンパ節転移可能性の判定をすることが困難であるため、望ましくない。【００１８】
対象となる乳癌は、乳管癌（乳頭腺管癌、充実腺管癌、硬癌など）、小葉癌、特殊型（粘液癌・髄様癌・管状癌）、パジェット病等、いずれの種類の乳癌でも適用可能であるが、望ましくは硬癌、小葉癌または充実腺管癌である。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例においては、ヒト転移性乳癌組織と非転移性組織の遺伝子発現レベル（RNA転写レベル）を、遺伝子発現解析法の一技術として公知の包括的高感度転写産物プロファイル解析技術（HiCEP技術）（Nucleic  Acids  Res.,  2003,  vol.31(16),  e94）を用い測定し、各遺伝子に関しその発現レベルをヒト転移性乳癌組織と非転移性組織で比較した。【００２０】
本実施例では、表１に示すステージIIの乳癌患者（Caucasian）５名（原発性ガン。リンパ節転移有り2名、無し3名。全てTNM分類ステージII。）より採材された乳癌組織（市販品）を使用した。
【表１】
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【００２１】
上記検体から、RNeasyキット（キアゲン社製）を用いてキット常法によりトータルRNAを抽出した。各試料由来の0.1μgのトータルRNAを鋳型としてSuper  Script  First  Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR（インビトロゲン社製）で逆転写反応を行い、得られた逆転写反応産物を80ユニットのDNAポリメラーゼＩ（インビトロゲン社製）、4ユニットのRNaseＨ（インビトロゲン社製）および40ユニットの大腸菌DNAリガーゼ（インビトロゲン社製）で16℃、2時間反応した。得られた二本鎖cDNAを40ユニットの制限酵素MseＩ（ニューイングランド・バイオラボ社製）および50ユニットの制限酵素MspＩ（タカラバイオ社製）で37℃、4時間反応し、得られたDNA断片の両端にアダプター配列を接続した。こうして得られたアダプター配列付きDNA断片を鋳型に用いて選択的PCRを行い、その反応産物についてキャピラリー電気泳動による分析を行った。得られた波形データを用い、遺伝子発現レベルの測定と試料間の遺伝子発現レベル比較、発現遺伝子のパターン分類を行い、クラスタリングデータ（発現変動ピーク）を得た。【００２２】
解析の結果、表２及び図１から図１７に示すように、サンプルに供した患者のリンパ節転移有無に応じて、マーカー遺伝子転写物17種の蛍光ピーク強度が明瞭な差を示すことが分かる。なお、この解析においては１検体につき2回の測定をおこない、その結果得られる蛍光ピークを重ねた。マーカー遺伝子転写物に対応するピークを矢印で示す。【００２３】
転写物番号1から11（転写物番号は表１のもの）については転移“有り”サンプルにおいて蛍光ピークが認められるのに対し、転移“無し”サンプルではピークがゼロもしくは転移“有り”サンプルの半分以下の発現強度となっている。逆に、転写物12から17については転移“無し”サンプルに明瞭な蛍光ピークが認められるのに対し、転移“有り”サンプルではピークがゼロもしくは転移“無し”サンプルの半分以下の発現強度となっている。このことから、この17遺伝子は、その発現強度に応じて乳癌転移性を区別する指標となっていることが分かる。【００２４】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明を構成する遺伝子群を利用することにより、従来の課題であった高感度で客観的、簡便、迅速な乳癌のリンパ節転移可能性の判定が可能となり、乳癌の予後予測用マーカーとして利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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