(57)【要約】  認識対象物質を高感度に検知でき、且つ構造が安定なバイオセンサを低コストで提供する。認識対象物質を捕捉し検知するバイオセンサであって、２以上の特定官能基を有する炭化水素系化合物からなるリンカーと、リンカーの１つの特定官能基と直接結合した分子認識物質であるペプチドと、リンカーの他の１つの特定官能基と直接結合した担持体と、を有することを特徴とする。好ましくは、特定官能基をエポキシ基とアミノ基との反応生成官能基とする。また、ペプチドとしては、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列のうち、その超可変領域に該当する部分に存在する連続する３つ以上のアミノ酸配列を含む人工合成ペプチドを用いる。
2008018355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認識対象物質を捕捉し検知するバイオセンサであって、
分子認識物質であるペプチドと、
２以上の特定官能基を有する炭化水素系化合物からなるリンカーと、
担持体と、
を有し、
前記ペプチドは前記リンカーの１つの特定官能基と直接結合し、前記担持体は前記ペプチドと結合した当該リンカーの他の１つの特定官能基と直接結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記特定官能基がエポキシ基とアミノ基との反応生成官能基である、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記特定官能基が２つであり、且つ各々の特定官能基が前記リンカーの両末端にそれぞれ配置されている、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記リンカーの特定官能基部分以外の構造が、親水性、疎水性、又は両親媒性を持つ炭化水素系の構造であることを特徴とする、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記リンカーが、「−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＲ−；Ｒは水素原子又はアルキル基を示す」で
示されるアルキレンオキサイド構造を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記ペプチドが、人工合成ペプチドである、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記人工合成ペプチドが、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列と同一、アミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端に他のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものである、
ことを特徴とする請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記人工合成ペプチドのＣ末端側及び／又はＮ末端側のアミノ酸がシステインである、
ことを特徴とする請求項６又は７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基が修飾されており、
当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
当該Ｃ末端のアミノ酸のアミノ基と前記特定官能基とが結合している、
ことを特徴とする請求項６又は７に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記Ｃ末端のアミノ酸がリジンである、
ことを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記リンカーの長さが、０．５〜１０ｎｍである、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記リンカーの長さが、０．８〜７．０ｎｍである、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記担持体上に固定された前記ペプチドが、１種類である、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記担持体上に固定された前記ペプチドが、ランダムに混在する２種類以上のペプチドである、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記担持体上に１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ａと、
上記とは異なる１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ｂと、
が形成されている、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記担持体が、基板、固体粒子、膜、繊維、ゲルのいずれかである、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記担持体が、基板、固体粒子、繊維、ゲルのいずれかの表面に形成された薄膜である、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記薄膜が、キトサンであり、その膜厚が５０〜４００ｎｍである、
ことを特徴とする請求項１７に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
分子認識物質であるペプチドと、両末端にエポキシ基を有する炭化水素系化合物からなるリンカー分子と、を混合した液を、表面にエポキシ基と結合する官能基を有する担持体と接触させて、前記ペプチドと前記リンカー分子とを直接結合させ、前記リンカー分子と前記担持体とを直接結合させるステップを備える、
ことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項２０】
前記混合液に含まれるペプチドの濃度が、０．００１〜２．０モル／Ｌである、
ことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２１】
前記混合液に含まれるリンカー分子の濃度が、０．００１〜４．０モル／Ｌである、
ことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２２】
前記リンカー分子が、「Ｇ−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＲ−）n−Ｏ−Ｇ；Ｒは水素原子又はアルキル基を示し、Ｇはグリシジル基を示す。ｎは１以上の整数」で示されるポリアルキレンオキサイドジグリシジルエーテル又はモノアルキレンオキサイドジグリシジルエーテルである、
ことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２３】
エポキシ基と結合する前記担持体表面の官能基が、アミノ基である、
ことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２４】
前記担持体は、キトサンを酸溶液に溶かしたキトサン溶液を基板、固体粒子、繊維、又はゲルの表面に塗布し形成した薄膜である、
ことを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２５】
前記キトサン溶液の２５℃での粘度が、１００〜１０００Ｐａ・Ｓである、
ことを特徴とする請求項２４に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２６】
前記キトサン薄膜の膜厚が、５０〜４００ｎｍである、
ことを特徴とする請求項２５に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項２７】
請求項７に記載のバイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法であって、
前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体を形成する第１ステップと、
前記ペプチド−認識対象物質複合体と、蛍光物質付き抗体材料とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体−蛍光物質付き抗体材料を形成する第２ステップと、
余剰な蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第３ステップと、
前記蛍光物質の量を検出する第４ステップと、
金コロイドを添加し、前記システインと金コロイドとを反応させる第５ステップと、
余剰な金コロイドと前記蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第６ステップと、
前記第６ステップの後、再度前記蛍光物質の量を検出する第７ステップと、
を備え、
前記第４ステップでの蛍光物質の量と前記第７ステップでの蛍光物質の量との差より前記認識対象物質の量を測定する、
ことを特徴とする検出方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のバイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法であって、
前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体を形成する第１ステップと、
前記ペプチド−認識対象物質複合体と、システインが末端に付加されたペプチドとを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体−システイン付加ペプチドを形成する第２ステップと、
余剰なシステインが末端に付加されたペプチドを洗浄する第３ステップと、
金コロイドを添加し、前記システインと金コロイドとを反応させる第４ステップと、
余剰な金コロイドを洗浄する第５ステップと、
前記第６ステップの後、金コロイドの発色量を検出する第６ステップと、
を備える、
ことを特徴とする検出方法。
【請求項２９】
特定分子を捕捉する分子捕捉物質としてのペプチドと、
前記ペプチドを担持する担持体と、
前記ペプチドと前記担持体とを繋ぐリンカーと、
を有し、
前記ペプチドが生体の免疫グロブリンとは構造の異なる人工合成ペプチドであり、
前記リンカーが少なくとも２つの反応性官能基を有する炭化水素系化合物であり、
前記リンカーの１つの反応性官能基に前記人工合成ペプチドが直接結合し、当該反応性官能基以外の他の反応性官能基に前記担持体が結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３０】
請求項２９に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列のうち、その超可変領域に該当する部分に存在する連続する３つ以上のアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３１】
請求項３０に記載のバイオセンサにおいて、
前記３つ以上のアミノ酸配列を構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３２】
請求項２９に記載のバイオセンサにおいて、
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の３つがイソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、グリシン、システイン、チロシンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、他の一つが前記疎水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を疎水性型アミノ酸配列とするとき、
前記人工合成ペプチドは、前記疎水性型アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が疎水性アミノ酸で置換されてなる合成疎水性アミノ酸配列ユニットを含んでなるものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３３】
請求項３２に記載のバイオセンサにおいて、
前記合成疎水性アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３４】
請求項２９に記載のバイオセンサにおいて、
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の３つがヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群より選択される親水性アミノ酸であり、他の一つが前記親水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を親水性型アミノ酸配列とするとき、
前記人工合成ペプチドは、前記親水性型アミノ酸配列に含まれる親水性アミノ酸以外のアミノ酸が親水性アミノ酸で置換されてなる合成親水性アミノ酸配列ユニットを含んでなるものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３５】
請求項３４に記載のバイオセンサにおいて、
前記合成親水性アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３６】
請求項２９ないし３５のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３７】
請求項２９ないし３５のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基が修飾されており、
当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３８】
請求項３７に記載のバイオセンサにおいて、
前記Ｃ末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３９】
請求項２９ないし３５のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
前記Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されており、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４０】
請求項３９に記載のバイオセンサにおいて、
前記Ｎ末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４１】
請求項２９ないし３５のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されておらず、
当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が一つのリンカーと結合し、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と他の一つのリンカーとが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４２】
請求項４１に記載のバイオセンサにおいて、
前記Ｎ末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４３】
請求項２９ないし３５のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、
前記Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されており、
前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が一つのリンカーと結合し、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と他の一つのリンカーとが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４４】
請求項４３に記載のバイオセンサにおいて、
前記Ｎ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ
【請求項４５】
請求項３７又は３８に記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーの長さが、０．５〜１．５ｎｍである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４６】
請求項３６、３９又は４０に記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーの長さが、２．０〜６．０ｎｍである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４７】
請求項４１ないし４４いずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーの長さが、０．５〜１０ｎｍである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４８】
請求項２９ないし４２のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーの反応性官能基と前記人工合成ペプチドとの結合が、エポキシ基とアミノ基との反応により生じたものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項４９】
請求項２９ないし４８のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーの反応性官能基と前記担持体との結合が、エポキシ基とアミノ基との反応により生じたものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項５０】
請求項２９ないし４９のいずれかに記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカーが、「−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＲ−；Ｒは水素原子又はアルキル基を示す」で示されるアルキレンオキサイド構造を有する、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項５１】
請求項２９に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する４つのアミノ酸配列であって、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、グリシン、システイン、チロシンからなる群から選択される疎水性アミノ酸が４つ連続して配列された天然疎水性アミノ酸配列ユニットを含む、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項５２】
請求項２９に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する４つのアミノ酸配列であり、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群から選択される親水性アミノ酸が４つ連続して配列された天然親水性アミノ酸配列ユニットを含む、
ことを特徴とするバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の検出を行うバイオセンサに関し、より詳しくは、分子認識物質であるペプチドがリンカーを介して担持体上に固定されたバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析時間の短縮化や操作の簡略化のために、認識対象物質と特異的に反応する分子認識物質（例えば、タンパク質やペプチド）を、マイクロチップの反応領域に高密度に固定配置する技術が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００３】
【非特許文献１】軽部征夫著  「バイオセンサ」シーエムシー出版  ２００２年
【０００４】
タンパク質は、さまざまな物質群と共存した生体内においては安定であるが、単離された場合には、温度・湿度・ｐＨ・酸素・光・夾雑物質・汚れ・腐敗等の影響によって構造が変化したり、失活したりするおそれがある。また、タンパク質は、固体（チップ）表面との接触の際に変性するおそれもある。さらに、認識対象物質を含むサンプルにプロテアーゼ等の酵素が存在すると、タンパク質が加水分解されてしまうおそれもある。よって、これらの要因を全て排した装置を構成しようとすると、装置全体が複雑化するので機器トラブルの増大やコスト高を招く。さらに、単離されたタンパク質はそれ自体が高価であるので、単離されたタンパク質を用いる上記技術は、バイオセンサ装置のコスト上昇を招く。【０００５】
他方、ペプチドは、タンパク質のような複雑な３次元構造をもたない。よって、上記のようにタンパク質が被る構造変化や失活がないので、分子認識物質として有用であると考えられている。しかしながら、ペプチドを直接チップ（基板等）に固定すると、ペプチドの自由運動が阻害され、分子認識能力を失ってしまう。このため、チップとペプチドとの距離をある程度離した状態で両者をつなぐリンカーが不可欠となる。【０００６】
リンカーを用いてペプチドをチップに固定する技術としては、特許文献１の技術がある。【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５３６０７３号公報
【０００８】
特許文献１は、基板表面に安定に結合したアンカーセグメントと、ペプチド模倣タンパク質結合剤と、該アンカーセグメントおよび該ペプチド模倣セグメントを接続し、そして分離するリンカーセグメントと、を含むタンパク質結合剤に関する。この技術によると、失活のおそれの無いタンパク質結合剤を提供できるとされる。【０００９】
しかしながら、特許文献１にかかる技術は、
（１）ペプチド模倣タンパク質結合剤とリンカーセグメントの結合、
（２）リンカーセグメントとアンカーセグメントの結合、
（３）アンカーセグメントと基板との結合、
という３つの複雑な工程を必要とするため、コスト高になるという問題がある。【００１０】
他方、特許文献２には、リンカーとしてグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いる方法が提案されている。【００１１】
【特許文献２】特公昭６１−８９４２号公報
【００１２】
特許文献２にかかる技術は、キトサンなどのアミノ基を有する固体に、グルタルアルデヒドを介して抗体や酵素等のタンパク質を固定化する技術である。グルタルアルデヒドはリンカーとして優れた反応性を有するが、一方で消毒薬としても広く用いられている化合物でもあり、タンパク質等を失活させる。また、グルタルアルデヒドは柔軟性を欠く物質であり、固定化に際して、タンパク質等を硬質化して、分子認識機能を損なわせるおそれもある。【００１３】
ところで、ペプチドを得るためには、天然のタンパク質を分解する方法や人工合成する方法があるが、天然のタンパク質を分解するためには、先ず特定のタンパク質を単離し、しかる後に分解する必要があり、天然ペプチドの入手には多大なコストが掛かる。他方、人工合成する方法は、任意のペプチドをより安価に得ることができるが、検出対象であるタンパク質の分子認識部位以外のペプチドを用いても、目的とする分子を検出することができない。また、分子認識に不必要な部分を含むペプチドの合成は、コスト上昇を招くのみで有益ではない。【００１４】
それゆえ、目的とする分子を検出するのに必要不可欠な最小単位のアミノ酸配列（ペプチド）を先ず特定し、これを天然タンパク質の分解によって得るか、または人工合成し、これを分子認識物質として用いるのが合理的である。特に上記必要不可欠な最小単位のアミノ酸配列を含むペプチドを人工合成して用いるのが合理的である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は以上のような考えの下になされた発明である。本発明は分子認識性、保存安定性、経済性に優れた使い勝手のよいバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するための第1の発明に係るバイオセンサは、認識対象物質を捕捉し検知するバイオセンサであって、分子認識物質であるペプチドと、２以上の特定官能基を有する炭化水素系化合物からなるリンカーと、担持体と、を有し、前記ペプチドは前記リンカーの１つの特定官能基と直接結合し、前記担持体は前記ペプチドと結合した当該リンカーの他の１つの特定官能基と直接結合していることを特徴とする。【００１７】
この構成によれば、分子認識物質としてペプチドを用いているため、構造安定性が向上する。【００１８】
また、前記ペプチドは前記リンカーの１つの特定官能基と直接結合し、前記担持体は前記ペプチドと結合した当該リンカーの他の１つの特定官能基と直接結合している。よって４、上記特許文献１のように複雑な反応工程を必要としない。【００１９】
ここで、上記「ペプチド」には、２以上のアミノ酸がペプチド結合したものは勿論、ペプチドを構成するアミノ酸の官能基が修飾されたものも含まれる。また、「特定官能基」とは、エポキシ基と、エポキシ基と反応する官能基との反応により形成されたエポキシ基由来の官能基を意味する。例えば、エポキシ基とペプチドのアミノ基とが反応してアミノアルコール（Ｒ1−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨＲ2；Ｒ1はリンカーのエポキシ以外の構造を示し、Ｒ2はペプチドのアミノ基以外の構造を示す）が生じた場合、［−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−］が特定官能基となる。なお、ペプチドとリンカーとの結合部位に存在する特定官能基と、担持体とリンカーとの結合部位に存在する特定官能基が異なっていてもよい。【００２０】
上記構成において、前記特定官能基がエポキシ基とアミノ基との反応生成官能基である、とすることができる。【００２１】
この構成によると、エポキシ基とアミノ基とが速やかに結合反応するので、バイオセンサの作製が容易である。この構成を実現するため、リンカー分子（リンカーの元となる分子）としてエポキシ基を２以上有するものを用い、ペプチドとしてＮ末端のアミノ基が修飾されていないものや、アミノ基を２つ有するリジン、アルギニンを含むものを用い、担持体としてアミノ基を有する化合物を用いることが好ましい。【００２２】
上記構成においては、前記特定官能基が２つであり、且つ各々の特定官能基が前記リンカーの両末端にそれぞれ配置されている、構成を採用することができる。【００２３】
この構成によると、リンカーがペプチドの分子認識性に悪影響を及ぼすことが無い。【００２４】
このようなリンカーの特定官能基部分以外の構造としては、親水性や疎水性、両親媒性を持つものであればよく、好ましくは炭化水素系の構造を用いる。この構造内には分枝構造を有していてもよく、不飽和結合、環状構造や芳香族構造が含まれてもよい。また、エーテル基、カルボキシル基、カルボニル基等の酸素を含む構造が含まれていてもよい。中でも、「−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＲ−；Ｒは水素原子又はアルキル基を示す。」で示されるポリアルキレンオキサイド構造を有するものを用いると、適度な両親媒性が得られるため、好ましい。【００２５】
また、前記ペプチドとして、人工合成ペプチドを用いる、ことができる。人工合成ペプチドは、コストの低減および再現性の向上を図れる点で好ましい。【００２６】
また、前記人工合成ペプチドは、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列と同一、アミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端に他のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものである、とすることができる。【００２７】
抗体タンパク質の超可変領域内のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる部分であるので、この部分のアミノ酸配列を用いると、抗原特異性の高いペプチドが得られる。よって、超可変領域のアミノ酸配列を用いると、目的とする分子を検出するのに不可欠なアミノ酸数を必要最小限にまで少なくすることができ、これにより分子認識物質であるペプチドの人工合成にかかるコストを低減させることができる。【００２８】
この人工合成ペプチドは、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端に他のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものや、これらを組み合わせたものであってもよい。【００２９】
また、上記構成において、人工合成ペプチドのＣ末端側及び／又はＮ末端側のアミノ酸をシステインとすることができる。【００３０】
また、ペプチドとリンカーとの結合位置をＣ末端側に限定するために、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基が修飾されており、且つ当該ペプチドのＣ末端のアミノ酸が側鎖に第1級アミンを有するアミノ酸であり、当該Ｃ末端のアミノ酸のアミノ基と前記特定官能基とが結合している、構成とすることができる。また、ペプチド末端以外のペプチドに側鎖に第1級アミンを有するアミノ酸が含まれる場合、このアミノ酸のα−アミノ基以外のアミノ基を修飾してもよい。【００３１】
上記側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。【００３２】
また、リンカーの長さは、好ましくは０．５〜１０ｎｍとし、より好ましくは０．８〜７．０ｎｍとする。前記リンカーの長さが過小であると、十分に担持体とペプチドを離間できず、過大であるとリンカーが折れ曲がってしまい、ペプチドの分子認識機能を損なうおそれがあるからである。【００３３】
また、前記担持体上に固定された前記ペプチドが、１種類である、とすることができる。【００３４】
この構成によると、１種類の認識対象物質を確実に検出できる。【００３５】
また、前記担持体上に固定された前記ペプチドが、ランダムに混在する２種類以上のペプチドである、とすることができる。【００３６】
この構成によると、以下のような効果を奏する。例えば、認識対象物質に複数の認識部位がある場合には、それぞれの認識部位に相当する複数種のペプチドを固定することにより、複数種のペプチドが１つの認識対象物質を捕捉でき、分子認識作用をより強めることができる。また、サンプル中に、複数種の認識対象物質が含まれている可能性がある場合には、複数種の認識対象物質のいずれか１つ以上が含まれているか、全く含まれていないかを、一回の分析操作で判別できる。【００３７】
上記構成において、前記担持体上に１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ａと、上記とは異なる１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ｂと、が形成されている、構成とすることができる。【００３８】
この構成によると、２種の認識対象物質に対する分析を同時に行うことができる。この構成においては、３以上の分子認識領域が形成されていてもよく、さらに、分子認識領域Ａに２種類以上のペプチドが固定され、分子認識領域Ｂに分子認識領域Ａとは異なる２種類以上のペプチドが固定されていてもよい。【００３９】
担持体としては、如何なる形状のものであってもよいが、基板、固体粒子、膜、繊維、ゲル等を用いることが使い勝手性がよい。しかし、通常、基板等自体の表面にエポキシ基と結合する官能基を配することが難しい場合があり、この場合には、これらの表面に、エポキシ基と結合する官能基を有する化合物の薄膜（この薄膜が担持体となる）を形成することが好ましい。【００４０】
また、前記薄膜が、キトサンであり、その膜厚が５０〜４００ｎｍである、とすることができる。【００４１】
上記課題を解決するための第２の発明にかかるバイオセンサの製造方法は、分子認識物質であるペプチドと、両末端にエポキシ基を有する炭化水素系化合物からなるリンカー分子と、を混合した液を、表面にエポキシ基と結合する官能基を有する担持体と接触させて、前記ペプチドと前記リンカー分子とを直接結合させ、前記リンカー分子と前記担持体とを直接結合させるステップを備えることを特徴とする。【００４２】
この構成によると、上記１つのステップで、ペプチドのアミノ基とリンカー分子の一方のエポキシ基とが結合反応し、担持体の官能基と当該リンカー分子の他方のエポキシ基とが結合反応するので、ペプチドとリンカー分子とを直接固定でき、当該リンカー分子と担持体とを直接固定できる。よって、製造工程を簡略化できる。【００４３】
ここで、エポキシ基と結合する官能基としては、求核性を持った化合物を用いることができ、このような官能基としてアミノ基、水酸基等を用いることができる。【００４４】
上記構成において、前記混合液に含まれるペプチドの濃度が、０．００１〜２．０モル／Ｌである、とすることができる。【００４５】
また、前記混合液に含まれるリンカー分子の濃度が、０．００１〜４．０モル／Ｌであるとすることができる。【００４６】
また、前記リンカー分子が、「Ｇ−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＲ−）n−Ｏ−Ｇ；Ｒは水素原子又はアルキル基を示し、Ｇはグリシジル基を示す。ｎは１以上の整数」で示されるポリ（モノ）アルキレンオキサイドジグリシジルエーテルであるとすることができる。【００４７】
また、エポキシ基と結合する前記担持体表面の官能基が、アミノ基であるとすることができる。【００４８】
また、前記担持体は、キトサンを酸溶液に溶かしたキトサン溶液を基板、固体粒子、繊維、又はゲルの表面に塗布し形成した薄膜であるとすることができる。【００４９】
また、前記キトサン溶液の２５℃での粘度が、１００〜１０００Ｐａ・Ｓであるとすることができる。【００５０】
また、前記キトサン薄膜の膜厚が、５０〜４００ｎｍであるとすることができる。【００５１】
上記課題を解決するための第３の発明にかかる検出方法は、上記ペプチドを構成するアミノ酸にシステインが含まれるバイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法であって、前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体を形成する第１ステップと、前記ペプチド−認識対象物質複合体と、蛍光物質付き抗体材料とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体−蛍光物質付き抗体材料を形成する第２ステップと、余剰な蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第３ステップと、前記蛍光物質の量を検出する第４ステップと、金コロイドを添加し、前記ペプチドと金コロイドとを反応させる第５ステップと、余剰な金コロイドと前記蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第６ステップと、前記第６ステップの後、再度前記蛍光物質の量を検出する第７ステップと、を備え、前記第４ステップでの蛍光物質の量と前記第７ステップでの蛍光物質の量との差より前記認識対象物質の量を測定することを特徴とする。【００５２】
タンパク質を検出する場合、バイオセンサを構成する基板等の表面に認識対象物質であるタンパク質が非特異的吸着により吸着し、これによる検出信号も検出されてしまうため、正確なタンパク質量を測定できない。しかし、上記方法を用いると、第４ステップでの発光量を計測した後、金コロイドを導入することにより、ペプチド−認識対象物質複合体から認識対象物質が脱離し、代わりに金コロイドとシステインとが反応する。このため、ペプチド−認識対象物質複合体の量の分だけ発光が減少する。よって、この発光の減少量を正確なタンパク質の量として検出できる。【００５３】
上記課題を解決するための第４の発明にかかる検出方法は、上記バイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法であって、前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体を形成する第１ステップと、前記ペプチド−認識対象物質複合体と、システインが末端に付加されたペプチドとを反応させて、ペプチド−認識対象物質複合体−システイン付加ペプチドを形成する第２ステップと、余剰なシステイン含有抗体材料を洗浄する第３ステップと、金コロイドを添加し、前記システインと金コロイドとを反応させる第４ステップと、余剰な金コロイドを洗浄する第５ステップと、前記第６ステップの後、金コロイドの発色量を検出する第６ステップと、を備えることを特徴とする。【００５４】
この方法によっても、認識対象物質の量を精度よく検出できる。【００５５】
上記課題を解決するための第５の本発明にかかるバイオセンサは、特定分子を捕捉する分子捕捉物質としてのペプチドと、前記ペプチドを担持する担持体と、前記ペプチドと前記担持体とを繋ぐリンカーと、を有し、前記ペプチドが生体の免疫グロブリンとは構造の異なる人工合成ペプチドであり、前記リンカーが少なくとも２つの反応性官能基を有する炭化水素系化合物であり、前記リンカーの１つの反応性官能基に前記人工合成ペプチドが直接結合し、当該反応性官能基以外の他の反応性官能基に前記担持体が結合していることを特徴とする。【００５６】
この構成によれば、分子捕捉物質として天然の免疫グロブリンとは構造が異なる人工合成ペプチドを用いているため、天然の免疫グロブリンまたは天然の免疫グロブリン由来のペプチドをそのまま用いるよりも物理的・化学的安定性を向上させることができるとともに、センサの作製コストを低減させることができる。【００５７】
また、前記ペプチドは前記リンカーの１つの反応性官能基と直接結合し、前記担持体は前記ペプチドと結合した当該リンカーの他の１つの反応性官能基と直接結合した構造であるので、構造安定性に優れるとともに、この構造ではリンカーを介してペプチドが外方に突き出た状態になるので、特定分子に対する捕捉効率が高い。【００５８】
ここで、「生体の免疫グロブリンとは構造の異なる人工合成ペプチド」とは、生体の免疫タンパク質の全部または一部と完全同一でないことを意味する。すなわち、生体の免疫タンパク質の全部または一部のアミノ酸配列に異なるアミノ酸が付加されていたり、免疫タンパク質の全部または一部のアミノ酸配列が変更されたりするものを意味する。【００５９】
上記構成において、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列のうち、その超可変領域に該当する部分に存在する連続する３つ以上のアミノ酸配列を含む、構成とすることができる。【００６０】
免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる部分であり、この部分のアミノ酸配列を用いると、抗原特異性の高い（特定分子の捕捉能力の高い）ペプチドが得られる。この高い抗原特異性を得るためには、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列のうち、少なくともその超可変領域に該当する部分に存在する連続する３つのアミノ酸配列を含ませることが好ましい。より好ましくは、連続する５つ以上のアミノ酸配列を含ませ、さらに好ましくは連続する８つ以上のアミノ酸配列を含ませる。【００６１】
免疫グロブリンの超可変領域の決定方法について説明する。【００６２】
（１）先ずアミノ酸シークエンス（エドマン法）を行う抗体サンプルを決定する。このアミノ酸シークエンスはＮ末端から解析していくものだが、タンパク質の中にはＮ末端アミノ酸がブロックされているものがあり、アミノ酸シークエンスが行えない場合がある。そのため、複数の抗体サンプルの中からブロックされていないものを選択する。【００６３】
（２）数残基のアミノ酸シークエンスを行うと、Ｈ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸に加え不純物として混入するアミノ酸が同時に検出される。このため、検出されたアミノ酸を、Ｈ鎖の構成要素、Ｌ鎖の構成要素、不純物の３種類に分ける。【００６４】
（３）同一種由来の抗体の基本構造は同じであることが知られており、既知の抗体のＨ鎖アミノ酸配列を遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.genome.jp/dbget-bin/www#bfind?genbank-today））やＥＭＢＬ（http://www.genome.jp/dbget-bin/www#bfind?embl-today））から全てピックアップし、対象とする抗体種類（サブタイプ）に関するアミノ酸配列について相同比較する。上記（２）で分析したアミノ酸と合致するアミノ酸配列があれば、その抗体はブロックされていないＨ鎖をもつことになる。Ｌ鎖も同様に行い、ブロックの有無を判断する。これにより、アミノ酸シークエンスを行う抗体サンプルを決定する。【００６５】
（４）上記（３）で決定された抗体サンプルを用いて、既知の抗体の超可変領域を含むよう再度アミノ酸シークエンスを行う。【００６６】
（５）ＥＭＢＬやＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子データベースに収録されている抗体のＨ鎖遺伝子配列情報に基づくアミノ酸配列を少なくとも５以上、好ましくは全てを拾い出し、それらに対して相同性比較を行う。既知の抗体の超可変領域に当たる配列箇所（一般的には、免疫グロブリン分子のH鎖およびL鎖のN末端から数えて、およそ２０〜４０番目、５０〜７０番目、８０〜１２０番目のアミノ酸）であって、かつ以下の式で示される変化率が２０以上の領域を超可変領域と決定する。【００６７】
【数１】
2008018355.tif 000003
【００６８】
上記構成において、前記３つ以上のアミノ酸配列を構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されている、構成とすることができる。【００６９】
ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ペプチドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、このような官能基を他の官能基で修飾しておくことが好ましい。【００７０】
上記構成において、天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の３つがイソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、グリシン、システイン、チロシンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、他の一つが前記疎水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を疎水性型アミノ酸配列とするとき、前記人工合成ペプチドは、前記疎水性型アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が疎水性アミノ酸で置換されてなる合成疎水性アミノ酸配列ユニットを含んでなるものである構成とすることができる。【００７１】
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなり、かつ当該アミノ酸のうち３つが疎水性であり、他の一つが非疎水性であるアミノ酸配列である場合、非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に変更することにより、特定分子の捕捉能力を高めることができる。なお、超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸の選定の仕方は任意である。【００７２】
上記構成において、前記合成疎水アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されていることを構成とすることができる。【００７３】
ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ペプチドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、このような官能基を他の官能基で修飾しておくことが好ましい。【００７４】
上記構成において、天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の３つがヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群より選択される親水性アミノ酸であり、他の一つが前記親水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を親水性型アミノ酸配列とするとき、前記人工合成ペプチドは、前記親水性型アミノ酸配列に含まれる親水性アミノ酸以外のアミノ酸が親水性アミノ酸で置換されてなる合成親水性アミノ酸配列ユニットを含んでなるものである、構成とすることができる。【００７５】
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する４つのアミノ酸からなり、かつ当該アミノ酸のうち３つが親水性であり、他の一つが非親水性であるアミノ酸配列である場合、非親水性アミノ酸を親水性アミノ酸に変更することにより、特定分子の捕捉能力が高まる。上記構成における「連続する４つのアミノ酸」は、超可変領域内にあることが要件であるが、予め特定されるものではない。超可変領域内から任意に選定された「連続する４つのアミノ酸」を意味する。【００７６】
上記構成においては、前記合成親水アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で修飾されている、構成とすることができる。【００７７】
ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ペプチドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、好ましくはこのような官能基を他の官能基で修飾しておくのがよい。【００７８】
上記構成において、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、構成とすることができる。【００７９】
ペプチドのＮ末端のアミノ酸には、他の官能基と反応していないα−アミノ基があり、このα−アミノ基とリンカー分子とを結合させることにより、リンカーとペプチドを直接結合させることができる。【００８０】
上記構成において、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、前記Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されており、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、構成とすることができる。【００８１】
この構成を採用すると、人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されて反応性をなくしているが、Ｎ末端のアミノ酸が第１級アミンを有するため、このアミノ酸の側鎖の第１級アミンとリンカー分子とを結合させることにより、リンカーとペプチドを直接結合させることができる。【００８２】
上記側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。【００８３】
また、アミノ基の修飾には、アセチル基を用いることが好ましい。【００８４】
これらの構成において、前記リンカーの長さが、２．０〜６．０ｎｍである構成とすることができる。【００８５】
リンカーをペプチドのＮ末端のアミノ酸と結合させた場合、リンカーの長さか短すぎたり、長すぎたりすると、特定分子の捕捉能力が低下するので、上記長さとするのが好ましい。この原因としては、リンカーの長さが短すぎると、ペプチドの立ち上がりが悪く、またリンカーの長さが長すぎたりすると、ペプチドの先端側が担持体に対して寝るように配置されるため、目的分子と会合しにくくなるためであると推察される。【００８６】
上記構成において、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基が修飾されており、当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と前記リンカーとが結合している、構成とすることができる。【００８７】
この構成を採用すると、人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基が修飾されて反応性をなくしているが、Ｃ末端のアミノ酸が側鎖に第１級アミンを有するため、このアミノ酸の側鎖の第１級アミンとリンカー分子とを結合させることにより、リンカーとペプチドを直接結合させることができる。【００８８】
側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。【００８９】
この構成において、前記リンカーの長さが、０．５〜１．５ｎｍである構成とすることができる。【００９０】
リンカーをペプチドのＣ末端のアミノ酸と結合させた場合、理由は定かではないが、リンカーの長さが長くなると特定分子の捕捉能力が低下する。これは、リンカーをペプチドのＣ末端のアミノ酸と結合させた場合には、リンカーの長さが長くなると、ペプチドが担持体に対して寝るように配置し、特定分子と会合しにくくなるためであると推察される。【００９１】
上記構成において、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されておらず、当該人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が一つのリンカーと結合し、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と他の一つのリンカーとが結合している構成とすることができる。【００９２】
この構成では、ペプチドのＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸が、それぞれ異なるリンカーと結合されているが、このように２つのリンカーとＮ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸とを結合させると、ペプチドが特定分子と会合しやすい状態に配置されるようになるため、特定分子の捕捉能力が増大する。【００９３】
上記構成において、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸であり、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、前記Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基が修飾されており、前記人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸が一つのリンカーと結合し、前記人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸と他の一つのリンカーとが結合している構成とすることができる。【００９４】
この構成によっても、ペプチドが特定分子と会合しやすい状態に配置されるようになるため、特定分子の捕捉能力が増大する。【００９５】
側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。【００９６】
これらの構成において、前記リンカーの長さが、０．５〜１０ｎｍである構成とすることができる。【００９７】
ペプチドのＮ末端のアミノ酸と一つのリンカーとを結合させ、ペプチドのＣ末端のアミノ酸と他の一つのリンカーとを結合させた場合、理由は定かではないが、特定分子の捕捉能力は、リンカーの長さによる影響を受けない。これは、このようにリンカーとペプチドとを結合させた場合には、ペプチドが担持体に対して寝るように配置しないため、特定分子と会合しやすいためであると推察される。ただし、リンカーの長さを０．５ｎｍ未満とすることは、技術上困難であり、リンカーの長さを１０ｎｍよりも大きくすると、コスト高となる。よって、上記範囲内に規制することが好ましい。【００９８】
上記構成において、前記リンカーの反応性官能基と前記人工合成ペプチドとの結合が、エポキシ基とアミノ基との反応により生じたものである構成とすることができる。【００９９】
上記構成において、前記リンカーの反応性官能基と前記担持体との結合が、エポキシ基とアミノ基との反応により生じたものである構成とすることができる。【０１００】
この構成によると、エポキシ基とアミノ基とが速やかに結合反応するので、バイオセンサの作製が容易となる。この構成を実現するため、リンカー分子（リンカーの元となる分子）としてエポキシ基を２以上有するものを用い、Ｎ末端のα−アミノ基が修飾されていないペプチドや、側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸を含むペプチドを用い、担持体として表面にアミノ基を有する化合物を用いることが好ましい。【０１０１】
上記構成において、前記リンカーが、「−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＲ−；Ｒは水素原子又はアルキル基を示す」で示されるアルキレンオキサイド構造を有する構成とすることが、適度な両親媒性が得られるため好ましい。【０１０２】
上記構成において、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する４つのアミノ酸配列であって、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、グリシン、システイン、チロシンからなる群から選択される疎水性アミノ酸が４つ連続して配列された天然疎水性アミノ酸配列ユニットを含む構成とすることができる。【０１０３】
この構成によると、天然疎水性アミノ酸ユニットが特定分子に対して高い認識力を有するため、特定分子を捕捉する能力が向上する。【０１０４】
上記構成において、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する４つのアミノ酸配列であり、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群から選択される親水性アミノ酸が４つ連続して配列された天然親水性アミノ酸配列ユニットを含む構成とすることができる。【０１０５】
この構成によると、天然親水性アミノ酸ユニットが特定分子に対して高い認識力を有するため、特定分子を捕捉する能力が向上する。
【発明の効果】
【０１０６】
以上説明したように、本発明によると、構造安定性が高く分子認識性に優れたバイオセンサを低コストで実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。【０１０８】
本実施の形態にかかるバイオセンサは、図１に示すように、分子認識物質であるペプチド１と、ペプチドを担持する担持体２と、ペプチド１と担持体２とを繋ぐリンカー３と、を有する。【０１０９】
本実施の形態で用いるペプチドは、複数のアミノ酸がペプチド結合してなるペプチドであり、天然物由来のものであってもよく、人工合成されたものでもよいが、コストや再現性の観点から、人工合成ペプチドを用いることが好ましい。人工合成ペプチドの場合、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列を解析した後に、その超可変領域に含まれる連続した３つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドを用いることが好ましい。【０１１０】
ここで、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる部位である。よって、この免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列に含まれる連続した３つ以上のアミノ酸配列含むペプチドを用いることにより、分子認識力の高いペプチドを必要最小限のアミノ酸数で実現することができ、これによりペプチド人工合成のコストを低減できる。分子認識力をより高めるためには、好ましくは、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列に含まれる連続した５つ以上のアミノ酸配列含むペプチドを用い、さらに好ましくは、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列に含まれる連続した８つ以上のアミノ酸配列含むペプチドを用いる。【０１１１】
超過変領域に含まれる連続した３つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドは、分子認識力の向上やリンカーとの固定化を容易にするために、その本来の配列が一部変更されてもよく、Ｃ末端及び／又はＮ末端に他のアミノ酸が付加されてもよいし、ペプチドを構成するアミノ酸の有する一部の官能基が修飾されていてもよい。【０１１２】
なお、超可変領域のアミノ酸の配列数は、一般に１０個程度と言われているが、分子認識を行うペプチドとして機能させるために、人工合成ペプチドのアミノ酸配列数は、超可変領域のアミノ酸の配列の連続した３個以上のアミノ酸を含ませることが好ましく、より好ましくは５個以上含ませ、さらに好ましくは８個以上含ませる。【０１１３】
また、人工合成ペプチドのアミノ酸配列数は、好ましくは３〜３０個程度とし、より好ましくは４〜１６個程度とする。アミノ酸配列数が多くなると、それだけ合成コストが上昇するので、アミノ酸配列数は、分子補足機能を発揮できる必要最小が好ましい。【０１１４】
次に超可変領域のアミノ酸配列の変更例について説明する。例えば、アミノ酸配列中にイソロイシン（Ｉ）−ヒスチジン（Ｈ）−トリプトファン（Ｗ）−トリプトファン（Ｗ）の配列があった場合、ヒスチジン（Ｈ）をトリプトファン（Ｗ）に変更すると、疎水性のアミノ酸が４個連続するため、ペプチドの疎水性が向上するが、疎水性を向上させると、特定分子の捕捉能力が高まることが期待できる。すなわち、天然免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列と完全同一の人工合成ペプチドよりも、その一部のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換した合成ペプチドの方が、特定分子に対する捕捉能力が高い場合が多い。【０１１５】
また、例えばスレオニン（Ｔ）−グルタミン酸（Ｅ）−チロシン（Ｙ）−スレオニン（Ｔ）の配列があった場合、チロシン（Ｙ）をグルタミン酸（Ｅ）に変更すれば、親水性のアミノ酸が４個連続するため、ペプチドの親水性が向上し、特定分子の捕捉能力が良くなると予想される。【０１１６】
また、例えばスレオニン（Ｔ）−イソロイシン（Ｉ）−グルタミン酸（Ｅ）−チロシン（Ｙ）の配列があった場合、イソロイシン（Ｉ）をグルタミン酸（Ｅ）に変更すれば、水素結合を形成するアミノ酸が４個連続するため、ペプチドの水素結合性が向上し、特定分子の捕捉能力が更に良くなると予想される。ここで、水素結合性のアミノ酸とは、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸である。【０１１７】
また、超可変領域のアミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端にシステインを付加して、他の素材への結合性を付与することもできる。また、超可変領域のアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸のアミノ基を修飾し、且つＣ末端に側鎖に第１級アミンを有するアミノ酸（例えば、リジン）を付加することにより、ペプチドのリンカーとの結合部位をこのＣ末端のアミノ酸と限定できるので、ペプチドとリンカーとの結合により、分子認識を行うアミノ酸配列部分の構造を変化させることを防止できる。【０１１８】
ここで、免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＤ等がある。例えばＩｇＧ抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖により構成され、Ｈ鎖とＬ鎖それぞれに超可変領域が存在する。解析される超可変領域はＨ鎖のみでも良いし、Ｌ鎖だけでも良く、またＨ,Ｌ鎖両方が解析されてもよい。【０１１９】
解析に用いられる免疫グロブリンは、ＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＹなどであっても良いし、遺伝子組み換え抗体（単鎖抗体など）やファージディスプレーであっても良い。【０１２０】
免疫グロブリンの超可変領域の決定方法は、前述と同様に行う。【０１２１】
抗体製造方法としては、従来より用いられている方法を用いることができる。例えばマウス等の試験動物内にアレルゲンを投与し、生体内において抗体タンパク質を製造させ、これを単離、精製する方法が用いる。【０１２２】
抗体を産生させるアレルゲンは、花粉（ブタクサ、スギ、カモガヤ、イタリアンライグラス、カナムグラ、ヨモギ、イネ、コナラ、シラカンバ、テンサイ、ハンノキ、キョウチクトウ、スズメノテッポウ、ケンタッキー３１フェスク、ヒメガマ、ハルジオン、イチゴ、バラ、リンゴ、アカシア、イエローサルタン、ヤナギ、ウメ、ヤマモモ、ナシ、コスモス、ピーマン、ブドウ、クリ、コウヤマキ、スズメノカタビラ、サクランボ、サクラ、ナデシコ、アフリカキンセンカ、ヒメスイバ、キク、除虫菊、クロマツ、アカマツ、カラムシ、ケヤキ、クルミ、タンポポ、モモ、セイタカアキノキリンソウ、イチョウ、オオバヤシャブシ、ツバキ、スターチス、アブラナ、グロリオサ、ミカン、ネズ、ウイキョウ、オリーブ、イチイ、オオバコ、マキ  以上報告順）や、ハウスダスト（ネコ由来物、ゴキブリ由来物、イヌ由来物、カビ由来物、ダニ由来物、マウス由来物）、または食物（小麦、そば、卵、乳、落花生、あわび、いか、いくら、えび、オレンジ、かに、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏肉、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン  以上厚生労働省特定原材料等）の全部もしくは一部を構成する物質であることが望ましいが、これに限るものではない。【０１２３】
また、ｍＲＮＡを用いて超可変領域を決定する方法も採用できる。この方法の手順の一例は以下のとおりである。【０１２４】
（１）抗体産生細胞（ハイブリドーマ）の培養調製する。【０１２５】
（２）細胞からｍＲＮＡの回収・精製。【０１２６】
（３）ｃＤＮＡ合成。【０１２７】
（４）ライブラリ作製（ファージライブラリ）。【０１２８】
（５）目的遺伝子のスクリーニング。【０１２９】
（６）目的遺伝子（抗体）のＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション等。【０１３０】
（７）分離した遺伝子のクローニング。【０１３１】
（８）大腸菌ベクターへの組換え。【０１３２】
（９）遺伝子配列分析操作。【０１３３】
（１０）クローニングできたベクター調製（配列分析のための鋳型ＤＮＡ）。【０１３４】
（１１）遺伝子配列操作のためのＰＣＲ操作。【０１３５】
（１２）ＤＮＡシーケンサー装置での分析。【０１３６】
（１３）ＤＮＡシーケンサーでの分析結果の解析。【０１３７】
（１４）確認のための抗体のＮ末端のアミノ酸配列分析。【０１３８】
（１５）解析したＤＮＡ配列に基づくアミノ酸配列と、実際の抗体のＮ末端が一致するか確認。【０１３９】
リンカーは、両末端に特定官能基（反応性官能基）を有し、この特定官能基によりペプチドとリンカー、及び当該リンカーと担持体とが直接結合されている。このリンカーとして、両末端にエポキシ基とアミノ基との反応生成物からなる特定官能基を有する炭化水素系化合物を用いることが好ましい。例えば、親水性または疎水性もしくは両親媒性の炭化水素系化合物の両末端に、エポキシ基を有するジグリシジルエーテルを持ったものをアミノ基と反応させてなるものを用いることができる。ジグリシジル構造中のエポキシ基の一方が分子認識を行うペプチドのアミノ基と共有結合し、もう一方のジグリシジル構造中のエポキシ基が担持体の官能基と共有結合して、ペプチドとリンカー、当該リンカーと担持体とがそれぞれ直接結合される。【０１４０】
保水性の観点から、リンカー分子は、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＥ）が好ましい。ＰＥＧ−ＤＥの構造を以下に表す。
【化１】
2008018355.tif 000004
【０１４１】
ここで、ｎ＝１のときＰＥＧ−ＤＥの全鎖長は８．３Å、ｎ＝２のときは１１．０Å、ｎ＝４のときは１６．６Å、ｎ＝９のときは３０．４Å、ｎ＝１３のときは４１．４Å、ｎ＝２２のときは６６．２Åとなる。【０１４２】
ＰＥＧ−ＤＥをリンカー分子として用いれば、ＰＥＧの鎖長に関わり無く、担持体やペプチドを硬化させず、且つ有害な作用も無いため、ペプチドを失活させる可能性をきわめて低くすることができる。【０１４３】
また、生体膜の厚さ、リポソームの脂質二分子膜の厚さ、ＬＢ膜（単分子累積膜）などの厚さが５０Å以下であれば、立体配置は直線状となり、１００Å程度の長さになると、折れ曲がり状態になることが知られている。【０１４４】
この知見を当てはめると、例えば、人工合成ペプチドが３４．０Å（アミノ酸配列数が１０個）に１１．０Å（ｎ＝２）のリンカーが結合すると、長さの和は４５．０Åとなるので、人工合成ペプチドとリンカーが直線状に配置すると予想される。また、人工合成ペプチドが７．４Å（アミノ酸配列数が２個）に６６．２Å（ｎ＝２２）のリンカーが結合すると、長さの和は７３．６Åとなるので、人工合成ペプチドとリンカーが少し折れ曲がった状態に配置すると予想される。さらに、人工合成ペプチドが３４．０Å（アミノ酸配列数が１０個）に６６．２Å（ｎ＝２２）のリンカーが結合すると、長さの和は１００．２Åとなるので、人工合成ペプチドとリンカーが折れ曲がった状態で配置されると予想される。【０１４５】
ここで、前記リンカーの長さが過小であると、十分に担持体とペプチドを離間できず、過大であるとリンカーが折れ曲がりすぎて、ペプチドの分子認識機能を損なうおそれがある。よって、リンカーの長さは、好ましくは０．５〜１０ｎｍ（５〜１００Å）とし、より好ましくは０．８〜７．０ｎｍ（８〜７０Å）とする。【０１４６】
本発明で述べているペプチドを固定化する担持体は、エポキシ基と反応する官能基を有するものであればよく、担持体自体の形状や担持体を支持する支持体の形状としては、基板、固体粒子、膜、繊維、ゲル等が好ましい。エポキシ基と反応する官能基を有する担持体としては、エポキシ基との反応性が高い点で、アミノ基を有するものがよく、使い勝手がよいことから、キトサンが特に好適である。キトサンは、粒子としても、膜としても、ゲルとしても、溶液としても、リンカー分子と結合させることが可能である。またリンカーを介してペプチドと反応したキトサン溶液を、他の粒子、基板、繊維などの表面に膜状に付着させて固定化してもよい。【０１４７】
キトサンを担持体として用い、基板等の表面にキトサン薄膜を形成するには、キトサンを酢酸や塩酸に溶解させ、この溶液に基板等を浸漬する方法を採用することができる。この際、キトサン溶液の濃度を２．５％程度とし、酸濃度を調整してその粘度を、室温で、１００〜１０００ｍＰａ・ｓとし、好ましくは２００〜５００ｍＰａ・ｓとする。【０１４８】
また、石英板、ガラス板、シリコン板などの基板や、繊維・パイプなどのような曲面体をキトサンの酸水溶液に浸漬し、その表面に薄膜を形成する場合、その膜厚は５０〜４００ｎｍとする。ただし、酸は上記に限定されず、キトサン溶液の濃度も２．５％に限定されない。また、キトサン薄膜を形成するための基体も上記に限られず、膜厚も上記範囲に限定されない。【０１４９】
リンカーを介して人工合成ペプチドを担持体に固定化する方法としては、浸漬法が最も簡便である。ただし、固定化方法は浸漬法に限定されるものではない。【０１５０】
浸漬法により固定化を行う場合、浸漬液に含まれる人工合成ペプチドの濃度は、好ましくは０．００１〜２．０モル／Ｌとし、より好ましくは０．００５〜１．０モル／Ｌとする。また、浸漬液に含まれるリンカー分子の濃度としては、好ましくは０．００１〜４．０モル／Ｌとし、より好ましくは０．００８〜２．０モル／Ｌとする。【０１５１】
人工合成ペプチドがリンカーを介して担持体に固定化された態様は、担持体上に固定された人工ペプチドが１種類であってもよく、ランダムに混在する２種類以上であってもよい。また、担持体上に１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ａと、上記とは異なる１種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域Ｂと、が形成されていてもよい。３以上の分子認識領域が形成されていてもよく、一つの分子認識領域に複数のペプチドが固定されていてもよい。【０１５２】
このバイオセンサには、光学的検出法、電気化学的検出法、機械的検出方法等の公知の検出方法の全てが適用可能である。以下に酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）を適用し光学的検出方法を用いた例について説明する。【０１５３】
［検出方法１］
（バイオセンサの作製）
キトサン薄膜が表面に形成されたＥＬＩＳＡ法用プレートのウェルに、両末端にエポキシ基を有するリンカー分子と人工合成ペプチドの混合溶液を滴下し、４〜４０℃の任意の温度で、数時間から数日の間放置して、バイオセンサを作製する。【０１５４】
（ブロッキング処理）
この後、当該リンカー分子と当該ペプチドの混合溶液を緩衝液等を用いて洗浄し、ブロッキング液（例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）液）を添加し、４〜４０℃の任意の温度で、数時間から数日の間放置してブロッキング処理を行う。ブロッキング処理後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ウェルの洗浄を行う。【０１５５】
（ペプチド−アレルゲン複合体形成反応）
次に、アレルゲンタンパク質とＢＳＡとを含有するリン酸緩衝液を、０、１、５、１０ｎｇ／ｍＬの濃度でウェルに滴下し、２時間室温で反応を行う。その後、上記と同じ方法でウェルの洗浄を行う。【０１５６】
（ペプチド−アレルゲン−酵素標識抗体複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化されたＥＬＩＳＡ法用プレートのウェルに、ペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体とＢＳＡとを含有するリン酸緩衝液を添加し、３７℃で１時間放置する。この後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ウェルの洗浄を行う。【０１５７】
（酵素反応）
ついで、ウェルに酵素と反応して発色する基質を添加し、室温で１０分間、基質とペルオキシダーゼとの反応を行う。この後、酵素反応停止液を添加する。【０１５８】
（検出）
４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで計測する。【０１５９】
他の光学的検知としては、以下の方法が例示できる。なお、バイオセンサの作製〜ペプチド−アレルゲン複合体形成反応までの各工程は、人工合成ペプチドにシステインが含まれること以外は、上記検出方法１と同様であるのでその説明を省略する。【０１６０】
［検出方法２］
（ペプチド−アレルゲン−蛍光標識抗体複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化されたＥＬＩＳＡ法用プレートのウェルに、蛍光色素標識付きモノクローナル抗体とＢＳＡとを含有するリン酸緩衝液を添加して、３７℃で１時間放置する。この後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ウェルの洗浄を行う。【０１６１】
（一次検出）
先ず４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで計測する。【０１６２】
（二次検出）
金コロイドを添加し、放置・洗浄後に再びプレートリーダーで４５０ｎｍ吸光度を計測する。【０１６３】
通常、アレルゲンタンパク質は、非特異的吸着によって、ペプチド以外のプレート部分に吸着し、これによる発色がノイズとなって検出される。しかし、この方法を用いると、金コロイドがアレルゲンタンパク質よりも優先的にペプチドのシステインに結合し、ペプチド−アレルゲンタンパク質複合体からアレルゲンタンパク質が脱離する。このため、二次検出で検出される吸光度は、非特異的吸着由来の吸光度となる。よって、一次検出と二次検出との差を求めることにより、真に認識反応が行われた量を測定することができる。【０１６４】
もう１つ別の光学的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ずしも以下の方法に限定されるものではない。なお、バイオセンサの作製〜ペプチド−アレルゲン複合体形成反応までの各工程は、上記検出方法１と同様であるのでその説明を省略する。【０１６５】
［検出方法３］
（ペプチド−アレルゲン−システイン含有ペプチド複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化されたＥＬＩＳＡ法用プレートのウェルに、システイン含有ペプチドを含有するリン酸緩衝液を添加し、３７℃で１時間放置する。この後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ウェルの洗浄を行う。【０１６６】
（酵素反応）
ついで、ウェルに金コロイドを添加し、室温で１０分間、金コロイドとシステインとの反応を行う。【０１６７】
（検出）
金コロイドによる赤色発色を計測する。【０１６８】
機械的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ずしも以下の方法に限定されるものではない。【０１６９】
［検出方法４］
既成のシリコンウエハーが短冊状に加工する。幅１ｍｍ長さが３ｍｍの先端部分に幅５ｍｍ長さ１０ｍｍの基部の二段構造になった短冊を作製する。先端部分と基部との境界部分にピエゾ素子を接合し、基部の反対側をＳＵＳ３０４の冶具に固定する。【０１７０】
先端部分にはキトサン薄膜を形成し、上記検出方法１と同様にして人工合成ペプチドをキトサンに固定化する。【０１７１】
ピエゾ素子に４２０ＫＨｚの共振周波数を与える。人工合成ペプチドがアレルゲンタンパク質と結合したときには、共振周波数が変化する。この周波数変化を基質特異反応重量に変換することで、アレルゲンタンパクの量を検知することができる。【０１７２】
電気化学的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ずしも以下の方法に限定されるものではない。【０１７３】
［検出方法５］
５ｍｍ×３ｍｍのプラスチック基板の両端に５ｍｍ×１ｍｍの金電極もしくは白金電極を施す。これら両端の電極からはそれぞれリードを付け、さらにプラスチック基板全体にキトサン薄膜を形成する。上記検出方法１と同様にして人工合成ペプチドをキトサンに固定化する。【０１７４】
プラスチック基板両端の電極には１Ｈｚから１ＭＨｚの交流が任意にかけられ、人工合成ペプチドがアレルゲンタンパク質と結合したときには交流インピーダンスが変化する。この交流インピーダンス変化量より、アレルゲンタンパクの量を検知することができる。【０１７５】
（実施例１）
［花粉アレルゲンＣｒｙ−Ｊ１の超可変領域の解析］
日本スギ（Cryptomeria japonica）由来のＣｒｙ−Ｊ１を認識する抗体はＩｇＧ抗体であり、そのＨ鎖の超可変領域の解析を行った。当該ＩｇＧ抗体はマウスモノクローナル抗体（Anti Cryj1 Mouse #013、生化学工業）を用いた。【０１７６】
（１）まず、上記材料から、アミノ酸シークエンス（エドマン法）を行う抗体サンプルを決定するために、以下の実験を行った。【０１７７】
通常、アミノ酸シークエンスは、Ｎ末端から解析していくものであるが、タンパク質の中にはＮ末端アミノ酸がブロック（修飾）されているものがあり、Ｎ末端アミノ酸がブロックされているとアミノ酸シークエンスが行えない場合がある。そのため、複数の抗体サンプルの中からブロックされていないものを選択するため、以下の試験を行った。【０１７８】
（２）当該ＩｇＧ抗体の超可変領域のアミノ酸配列をＨＰＬＣで分析を行った。数残基（本実施例は６残基）のアミノ酸シークエンスを行うと、Ｈ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸に加え不純物として混入するアミノ酸が同時に検出された。このため、検出されたアミノ酸を、Ｈ鎖の構成要素、Ｌ鎖の構成要素、不純物の３種類に分けた。【０１７９】
（３）ここで、同一種（同一生物）由来の抗体の基本構造は同じであることから、既知のマウスモノクローム抗体のＨ鎖アミノ酸配列の全てを遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ；http://www.genome.jp/dbget
-bin/www#bfind?genbank-today）の遺伝子情報から翻訳した配列）からピックアップし、対象とする抗体種類（サブタイプ）に関するアミノ酸配列について相同比較した。ここで、（２）で分析したアミノ酸と合致するアミノ酸配列があれば、その抗体はブロックされていないＨ鎖をもつことになる。Ｌ鎖も同様に行い、ブロックの有無を判断した。これにより、ブロックされていないアミノ酸配列を選定し、これをアミノ酸シークエンスを行う抗体サンプルとした。【０１８０】
（４）この抗体サンプルを用いて、アミノ酸シークエンスを行った。【０１８１】
（５）既知の抗体のＨ鎖アミノ酸配列を全てピックアップし、対象とする抗体種類（サブタイプ）に関するアミノ酸配列について相同比較した。既知の抗体の超可変領域に当たる配列箇所（一般的には、免疫グロブリン分子のH鎖およびL鎖のＮ端から数えて、およそ２０〜４０番目、５０〜７０番目、８０〜１２０番目のアミノ酸）で、かつ（４）で分析したアミノ酸配列に特異的な配列を＃０１３の超可変領域と決定した。この分析結果を図２に示す。この図において、「〜」は、相同性比較の対象のアミノ酸配列に対して、相同なアミノ酸の配列位置を合わせる（アライメント）ために各配列に入れるギャップ（挿入・欠失）を示す。【０１８２】
その結果、日本スギ（Cryptomeria japonica）由来のＣｒｙ−Ｊ１マウスモノクローナル抗体ＩｇＧ（AntiＣｒｙ−Ｊ1 Mouse #013生化学工業）のＨ鎖超可変領域のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かってＴＥＹＴＩＨＷＷと決定した。【０１８３】
［Ｃｒｙ−Ｊ１認識ペプチドの人工合成］
次の２種類のペプチドを通常のペプチド合成装置にて人工合成した。
（１）フルオレセイン結合ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ（フルオレセインはＴと結合した）
（２）アセチル化−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ（アセチル化はＮ末端のＴのα−アミノ基のみ）
なお、上記アミノ酸配列において、ペプチドとリンカーとの結合を、ペプチドのＣ末端のアミノ酸とするために、超可変領域のアミノ酸配列のＣ末端にリジン（Ｋ）を加え、Ｎ末端のアミノ酸のアミノ基を修飾し、反応性を消失させた。【０１８４】
［キトサン薄膜への合成ペプチドの固定化と構造推定］
フルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫを用いてキトサン薄膜上への合成ペプチドの固定化を行った。
片倉チッカリン製ＣＴＦの２．５％キトサン酢酸水溶液を１０ｍＬ調製した。その２ｍＬをシリンジで分取し、２５ｍｍ×２５ｍｍの石英板上に滴下した。その石英板を３０００ｒｐｍで３０秒間回転させた後、８０℃で１時間乾燥させた。このようなスピンキャスト法で作製したキトサン膜は、厚みが２００ｎｍの均質な膜であった。【０１８５】
次に、フルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫが０．３４ｍｍｏｌとポリエチレンジグリシジルエーテル（デナコールＥＸ-８５０  ナガセケムテックス）が０．３４ｍｍｏｌと
が溶かされた水溶液１０ｍＬを用意し、そこに上記のキトサン膜が塗膜された石英板を浸漬した。浸漬時間は１８時間である。キトサン膜が塗膜された石英板の乾燥はクリーンベンチ中で２４時間行った。その後、蒸留水にキトサン膜が塗膜された石英板を２４時間浸漬し洗浄した。洗浄後の乾燥はクリーンベンチ中で２４時間行った。【０１８６】
この石英板に励起波長４９５ｎｍの光を照射し、蛍光を検出した。この結果を図３に示す。図３からわかるように、５４０ｎｍの発光が確認できた。よって、上記の操作でフルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫがリンカーを介してキトサン膜に固定化されたことがわかった。【０１８７】
ここに、フルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫとリンカー分子であるデナコールＥＸ-
８５０が結合した鎖状の構造体は、鎖の長さから考察してキトサン膜平面から立ち上がった状態で固定化されていると予想される。その予想図を図４に示す。【０１８８】
［バイオセンサの作製と検出］
抗Ｃｒｙ−Ｊ１抗体Ｈ鎖超可変領域ペプチド（アセチル化ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ）と花粉アレルゲンタンパク質（Ｃｒｙ−Ｊ１）との反応性をＥＬＩＳＡ法にて調べた。実験方法は以下のようにまとめることができる。【０１８９】
（１）ペプチドの固定
アミノ基結合プレート（ＭＳ−３６０８Ｆ、住友ベークライト社製）のウェルに、アセチル化‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ０．０９５ｍｇ／ｍＬ、ポリエチレンジグリシジルエーテル０．０１８ｍｇ／ｍＬの液を２００μＬ添加し、４℃で一晩静置した。【０１９０】
（２）ブロッキング処理
ペプチド液を取り出し、ブロッキングワン（ナカライテスク社製）を２００μＬ添加し４℃でブロッキング処理を実施した。【０１９１】
（３）ウェルの洗浄
ブロッキング処理後、ブロッキング液を取り出し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐ
ＢＳを用いてウェルの洗浄を行った。洗浄は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７．４  ０．１５ＭＮａＣｌ）を２００μＬウェルに添加、取り出しの操作を３回実施した。【０１９２】
（４）花粉アレルゲンＣｒｙ−Ｊ１の添加
花粉アレルゲンＣｒｙ−Ｊ１(生化学工業社製)を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて０、１、５、１０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに１００μＬずつ添加した。添加後室温で２時間静置した。【０１９３】
（５）ウェルの洗浄
Ｃｒｙ−Ｊ1溶液を取り出し（３）と同様にしてウェルの洗浄を行った。【０１９４】
（６）ペルオキシダーゼ結合抗Ｃｒｙ−Ｊ１モノクローナル抗体の添加
ペルオキシダーゼ結合抗Ｃｒｙ−Ｊ１モノクローナル抗体（生化学工業社製）を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を１００μＬずつウェルに添加し、３７℃、１時間静置した。【０１９５】
（７）ウェルの洗浄
ペルオキシダーゼ結合抗Ｃｒｙ−Ｊ１モノクローナル抗体を取り出し、（３）と同じようにウェルの洗浄を行った。【０１９６】
（８）発色
ウェルに発色液（ナカライテスク社製）を１００μＬ添加し、室温で１０分間反応を実施した。１０分後停止液を１００μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（バイオラッド社製）にて測定した。【０１９７】
この結果を図５に示す。すなわち、花粉アレルゲンタンパク質（Ｃｒｙ−Ｊ１）は濃度に依存して当該ペプチドに捕捉され、検出できることがわかった。【０１９８】
（実施例２）
リンカーの長さがバイオセンサの検出感度に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。人工合成ＣＲＹ−Ｊ1認識ペプチドであるアセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＳＨ１）の５μｇ／ｍＬ水溶液と、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）が４５μＭの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝９）を混合し固相反応を行った。【０１９９】
リンカー分子としてのＰＥＧ−ＤＧ（ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル）は鎖長の異なる６種類を選んだ。すなわちサンプル１：鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１、サンプル２：鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２、サンプル３：鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４、サンプル４：鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９、サンプル５：鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３、サンプル６：鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２である。ＰＥＧ−ＤＧはナガセケムテックス株式会社製デナコールＥＸシリーズより選んだ。【０２００】
固相反応は、アミノ化９６穴ＥＬＩＳＡ法用プレート（住友ベークライト製、スミロンＭＳ−３６０８Ｆ）を固相に用い、室温で２４時間にて完了した。【０２０１】
次に、ＥＬＩＳＡ法用プレートの９６穴の各々に１００μＬの蒸留水を充填し、洗浄を３回行った。【０２０２】
ブロッキングはナカライテスク社製ブロッキングワンを用い、反応は室温で行い時間は２４時間で終了した。【０２０３】
界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）用いて、余剰ブロッキング剤の洗浄を３回行った。【０２０４】
アセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨは蒸留水で希釈し、濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬのものを用意した。【０２０５】
長さの異なるリンカー分子それぞれに、アセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ希釈液０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬを５０μＬずつ滴下して、リンカーとペプチドとの結合を行った。【０２０６】
リンカーと反応しなかったアセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨは、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で３回洗浄を行った。【０２０７】
二次抗体である抗スギ花粉抗原Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ（ＨｏｒｓｅＲａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（生化学工業）を０．１%Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈して調製し、その調製液を１００μＬ添加し、室温1時間反応した。【０２０８】
反応しなかった二次抗体（抗-スギ花粉抗原Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ）は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いて、３回洗浄を行った。【０２０９】
発色液はＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社）を用いて発色反応を室温で実施した。基質液を１００μＬ添加してから３０分後に反応後停止液を１００μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０２１０】
横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）リンカー長さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにしたものを図６に示す。【０２１１】
ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）の鎖長が異なる６種類；（１）鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１（２）鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２（３）鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４（４）鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９（５）鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３（６）鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２のそれぞれについて、抗原Ｃｒｙｊ１の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬにおける４５０ｎｍの吸光度の傾きは、いずれも直線となった。【０２１２】
図６から明らかなように、リンカー長さが１５Å以下のもの（重合度ｎが１又は２のもの）に人工合成ペプチドであるアセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨを結合させたもののＣｒｙ−Ｊ１に対する検出効率は、リンカー長さが１６．６Å以上のもの（重合度ｎが４以上のもの）に人工合成ペプチドを結合させたものよりも高くなることが分かった。この理由は、リンカーが短ければ、ペプチドのアミノ酸配列が基板に対して比較的直立した形で存在し、Ｃｒｙ−Ｊ１と会合しやすい状態にあるのに対し、リンカーが長くなるにつれて、ペプチドが基板に対して寝るように配置し、Ｃｒｙ−Ｊ１と会合しにくくなるためと考えられる。【０２１３】
このことから、人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸にリンカーを結合した場合には、リンカー長さが１．５ｎｍ（１５Å）以下であることが好ましいことがわかる。【０２１４】
（実施例３）
上記実施例２とは逆に、ペプチドのＮ末端にリンカーを結合させた場合に、リンカーの長さが検出感度に与える影響を調べた。このために、アセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨ（ＳＨ２）を合成した。アセチル化は、リジン（Ｋ）のα−アミノ基のみであり、リジンの側鎖のアミノ基とリンカーとが結合している。【０２１５】
固相化反応は、抗Ｃｒｙ−Ｊ１抗体Ｈ鎖超可変領域ペプチドであるアセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨの５μｇ／ｍＬ水溶液と、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）が４５μＭの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝９）を混合して行った。【０２１６】
ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）は鎖長の異なる６種類を選んだ。すなわち、（１）鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１（２）鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２（３）鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４（４）鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９（５）鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３（６）鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２である。ＰＥＧ−ＤＧはナガセケムテックス株式会社製デナコールＥＸシリーズより選んだ。【０２１７】
固相反応は、アミノ化９６穴ＥＬＩＳＡ法用プレート（住友ベークライト製、スミロンＭＳ−３６０８Ｆ）を固相に用い、室温で２４時間にて完了した。【０２１８】
次に、ＥＬＩＳＡ法用プレートの９６穴の各々に１００μＬの蒸留水を充填し、洗浄を３回行った。【０２１９】
ブロッキングはナカライテスク社製ブロッキングワンを用い、反応は室温（２５℃）で行い、時間は２４時間で終了した。【０２２０】
余剰ブロッキング剤は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いて３回洗浄を行った。【０２２１】
アセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨは蒸留水で希釈し、濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬのものを用意した。【０２２２】
長さの異なるリンカー分子それぞれに、アセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨ希釈液０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬを５０μＬずつ滴下して行った。【０２２３】
反応しなかったアセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨの洗浄は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いて３回行った。【０２２４】
二次抗体である抗−スギ花粉抗原 Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ（生化学工業）を０．１%Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈して調製し、その調製液を１００μＬ添加し、室温1時間反応した。【０２２５】
反応しなかった二次抗体（抗−スギ花粉抗原Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ）の洗浄は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で３回行った。【０２２６】
発色液はＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット(ナカライテスク社)を用いて発色反応を室温で実施した。基質液を１００μＬ添加してから３０分後に反応後停止液を１００μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０２２７】
横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）リンカー長さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにしたものを図７に示す。【０２２８】
ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）の鎖長が異なる６種類；（１）鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１（２）鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２（３）鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４（４）鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９（５）鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３（６）鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２のそれぞれについて、抗原Ｃｒｙｊ１の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬにおける４５０ｎｍの吸光度の傾きは、いずれも直線となった。【０２２９】
また、図７から明らかなように、リンカー長さが２０〜６０Å（２．０〜６．０ｎｍ、重合度ｎが４〜９）である場合に、人工合成ペプチドであるアセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨのＣｒｙ−Ｊ１に対する検出効率は高くなることが分かった。この理由は、定かではないが、リンカーの長さが一定の範囲内にある場合に、ペプチドのアミノ酸配列が基板に対して比較的直立した形で存在し、Ｃｒｙ−Ｊ１を捕捉しやすい状態になるためと考えられる。【０２３０】
（実施例４）
本実施例では、人工合成ペプチドのＮ末端に一つのリンカーを、人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸に他の一つのリンカーを結合させた場合に、リンカーの長さが検出感度に与える影響を調べた。【０２３１】
アセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＳＨ３）を合成した。すなわちＣｒｙ−Ｊ１認識ペプチドのアミノ酸配列両端にリジン残基を配置し、Ｃ末端のリジンの側鎖のアミノ基が一つのリンカーと、Ｎ末端のリジンのα−アミノ基がアセチル化され、側鎖のアミノ基が他の一つのリンカーと結合するようにした。この概略図を図９に示す。【０２３２】
固相化反応は、アセチル化−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨの５μｇ／ｍＬ水溶液と、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）が４５μＭの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝９）を混合して行った。【０２３３】
ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）は鎖長の異なる６種類を選んだ。すなわち（１）鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１（２）鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２（３）鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４（４）鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９（５）鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３（６）鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２である。ＰＥＧ−ＤＧはナガセケムテックス株式会社製デナコールＥＸシリーズより選んだ。【０２３４】
固相反応は、アミノ化９６穴ＥＬＩＳＡ法用プレート（住友ベークライト製、スミロンＭＳ−３６０８Ｆ）を固相に用い、室温で２４時間にて完了した。【０２３５】
次に、ＥＬＩＳＡ法用プレートの９６穴の各々に１００μＬの蒸留水を充填し、洗浄を３回行った。【０２３６】
ブロッキングはナカライテスク社製ブロッキングワンを用い、反応は室温（２５℃）でおこない時間は２４時間で終了した。【０２３７】
余剰ブロッキング剤は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液  （ｐＨ＝７）を用いて洗浄を３回行った。【０２３８】
アセチル化−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨは蒸留水で希釈し、濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬのものを用意した。【０２３９】
長さの異なるリンカー分子それぞれに、アセチル化−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ希釈液０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬを５０μＬずつ滴下して行った。【０２４０】
反応しなかった抗原Ｃｒｙ−Ｊ１の洗浄は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で３回行った。【０２４１】
二次抗体である抗−スギ花粉抗原Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ（生化学工業）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈して調製し、その調製液を１００μＬ添加し、室温1時間反応した。【０２４２】
反応しなかった二次抗体（抗−スギ花粉抗原Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ）は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いて洗浄を３回行った。【０２４３】
発色液はＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット(ナカライテスク社)を用いて発色反応を室温で実施した。基質液を１００μＬ添加してから３０分後に反応後停止液を１００μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０２４４】
ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）の鎖長が異なる６種類；（１）鎖長８．３Å、重合度ｎ＝１（２）鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２（３）鎖長１６．６Å、重合度ｎ＝４（４）鎖長３０．４Å、重合度ｎ＝９（５）鎖長４１．４Å、重合度ｎ＝１３（６）鎖長６６．２Å、重合度ｎ＝２２のそれぞれについて、抗原Ｃｒｙｊ１の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬにおける４５０ｎｍの吸光度の傾きは、いずれも直線となった。【０２４５】
横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）リンカー長さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにしたものを図８に示す。【０２４６】
図８から明らかなように、アセチル−ＮＨ−ＫＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨのＣｒｙｊ１に対する検出効率は、リンカー長さに関わり無くほぼ同等の検出効率を示すことが分かった。この理由は、人工合成ペプチドのＣ末端のアミノ酸に一つのリンカーを、人工合成ペプチドのＮ末端のアミノ酸に他の一つのリンカーを結合させた場合、リンカー長さに影響を受けることなく、基板に対して人工合成ペプチドが平行に配置するため、Ｃｒｙｊ−１が人工合成ペプチド（ＳＨ３）にほぼ同等に捕捉されるためと考えられる。【０２４７】
（実施例５）
抗Ｃｒｙｊ−１免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列であるＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷ−ＣＯＯＨのアミノ酸配列は、Ｎ末端側からの配列ＴＥＹＴは、Ｔ，Ｅ，Ｔが親水性であり、親水性が高い。またＩＨＷＷは、Ｉ，Ｗが疎水性であり、疎水性が高い。また、トリプトファン（Ｗ）は、ペプチドやタンパクの認識サイトとして機能することが多いと考えられている。このため、Ｎ末端に近い配列ＴＥＹＴの親水性を上げ、Ｃ末端に近い配列ＩＨＷＷの疎水性を上げるために、チロシン（Ｙ）を親水性のグルタミン酸（Ｅ）に変更し、ヒスチジン（Ｈ）を疎水性のトリプトファン（Ｗ）に変更し、アセチル−ＮＨ−ＴＥＥＴＩＷＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＡＬ１）を人工合成した。【０２４８】
固相化反応は、アセチル−ＮＨ−ＴＥＥＴＩＷＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＡＬ１）の５μｇ／ｍＬ水溶液と、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）が４５μＭの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝９）を混合して行った。【０２４９】
ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）は、鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２を用いた。【０２５０】
固相反応は、アミノ化９６穴ＥＬＩＳＡ法用プレート（住友ベークライト製、スミロンＭＳ−３６０８Ｆ）を固相に用い、室温で２４時間にて完了した。【０２５１】
次に、ＥＬＩＳＡ法用プレートの９６穴の各々に１００μＬの蒸留水を充填し、洗浄を３回行った。【０２５２】
ブロッキングはナカライテスク社製ブロッキングワンを用い、反応は室温でおこない時間は２４時間で終了した。【０２５３】
余剰ブロッキング剤の洗浄は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で３回行った。【０２５４】
人工合成ペプチドＡＬ１は蒸留水で希釈し、濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬのものを用意した。【０２５５】
人工合成ペプチドＡＬ１の反応は、抗原Ｃｒｙｊ１希釈液０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬを５０μＬずつ滴下して行った。【０２５６】
反応しなかった人工合成ペプチドＡＬ１は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いて洗浄を３回行った。【０２５７】
二次抗体である抗−スギ花粉抗原 Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ（生化学工業）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈して調製し、その調製液を１００μＬ添加し、室温1時間反応した。【０２５８】
反応しなかった二次抗体（抗-スギ花粉抗原 Ｃｒｙ−Ｊ１−ＨＲＰ）の洗浄は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２５含有リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で３回行った。【０２５９】
発色液はＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット(ナカライテスク社)を用いて発色反応を室温で実施した。基質液を１００μＬ添加してから３０分後に反応後停止液を１００μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０２６０】
ＰＥＧ−ＤＧ鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２によって固相化されたにアセチル−ＮＨ−ＴＥＥＴＩＷＷＷＫ−ＣＯＯＨついて、抗原Ｃｒｙ−Ｊ１の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬにおける４５０ｎｍの吸光度の傾きは、直線となった。【０２６１】
人工合成Ｃｒｙ−Ｊ１認識ペプチドであるアセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＳＨ１）については、実施例２に準じて固相化反応を行った。用いたポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）は、鎖長１１．０Å、重合度ｎ＝２である。【０２６２】
固相化されたにアセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨついて、抗原Ｃｒｙ−Ｊ１の濃度が０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬにおける４５０ｎｍの吸光度の傾きは、直線となった。【０２６３】
横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧ）リンカー長さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにしたものを図１０に示す。【０２６４】
図１０から明らかなように、アセチル−ＮＨ−ＴＥＹＴＩＨＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＳＨ１）とアセチル−ＮＨ−ＴＥＥＴＩＷＷＷＫ−ＣＯＯＨ（ＡＬ１）は、Ｃｒｙ−Ｊ１に対してほぼ同等の反応性を示すことが分かった。この理由は、アミノ酸配列ＴＥＹＴＩＨＷＷＫが、親水性、疎水性共に、Ｃｒｙ−Ｊ１の認識に対して十分な能力を持っていたからと考察できる。それゆえ、一部の領域の親水性と、一部の領域の疎水性を向上させた人工合成ペプチドＴＥＥＴＩＷＷＷＫは、超可変領域のＣ末端にリジンを付加した人工合成ペプチドＴＥＹＴＩＨＷＷＫと同様の認識能力を示すに止まると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０２６５】
以上説明したように本発明によると、低コストで且つ失活等のおそれのないバイオセンサを低コストで実現できる。このバイオセンサは、環境計測器、医療検査機器等に利用可能であり、産業上の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】実施の形態にかかるバイオセンサの概略図である。
【図２】実施例１で測定したアミノ酸配列（Ｃｒｙ−Ｊ1マウスモノクローナル抗体ＩｇＧ（AntiＣｒｙ−Ｊ1 Mouse #013生化学工業））と、データベースに記載のアミノ酸配列との相同比較を示す図である。
【図３】人工合成ペプチドであるフルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫが、デナコールＥＸ-８５０を介してキトサン膜に固定化された状態の吸光度を示すグラフである。
【図４】人工合成ペプチドであるフルオレセイン‐ＴＥＹＴＩＨＷＷＫがリンカーを介してキトサンに固定化された構造の予想図である。
【図５】実施例１における実験結果を示すグラフである。
【図６】実施例２にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
【図７】実施例３にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
【図８】実施例４にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
【図９】実施例４にかかるバイオセンサの概略図である。
【図１０】実施例５にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
【符号の説明】
【０２６７】
１  ペプチド
２  担持体
３  リンカー
【図１】
2008018355.tif 000005
【図２】
2008018355.tif 000006
【図３】
2008018355.tif 000007
【図４】
2008018355.tif 000008
【図５】
2008018355.tif 000009
【図６】
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【図７】
2008018355.tif 000011
【図８】
2008018355.tif 000012
【図９】
2008018355.tif 000013
【図１０】
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【国際調査報告】
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2008018355.tif 000016
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