(57)【要約】  本発明は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項２】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項３】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項４】
ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第２項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項５】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項６】
ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項７】
ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等よりなる群から選択される少なくとも１の疾患であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項８】
ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項９】
治療剤又は発病抑制剤が、ポリグルタミン病の病変部位への局所投与用であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１０】
局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする請求の範囲第９項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１１】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とする脳室の拡大抑制剤。
【請求項１２】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤。
【請求項１３】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とする神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制剤。
【請求項１４】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤。
【請求項１５】
治療又は発病抑制が、脳室の拡大抑制によるものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１６】
脳室の拡大が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物による線条体神経細胞変性又は細胞死によるものであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１７】
線条体神経細胞変性又は細胞死がカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化によるものであることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１８】
治療又は発病抑制が、神経新生によるものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項１９】
治療又は発病抑制が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制によるものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の治療剤又は発病抑制剤。
【請求項２０】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用。
【請求項２１】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与するポリグルタミン病の治療又は発病抑制方法。
【請求項２２】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの脳室の拡大抑制剤の製造の為の使用。
【請求項２３】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与する脳室の拡大抑制方法。
【請求項２４】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤の製造の為の使用。
【請求項２５】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与するポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制方法。
【請求項２６】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制剤の製造の為の使用。
【請求項２７】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与する神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制方法。
【請求項２８】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤の製造の為の使用。
【請求項２９】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与するポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）又はそれをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリグルタミン病は常染色体優性進行性神経変性疾患である。ポリグルタミン病は、ポリグルタミン病の該当遺伝子に異常に伸長したポリグルタミンをコードするシトシン・アデニン・グアニン（ＣＡＧ）の繰り返し配列を有し、その異常に伸長したＣＡＧの繰り返し配列を有する原因遺伝子が翻訳されポリグルタミン病原因遺伝子産物を発現することにより発症する。ポリグルタミン病、例えばハンチントン舞踏病において、原因遺伝子としてハンチンチン遺伝子が第４染色体短腕上に同定されている（非特許文献１）。ハンチンチン遺伝子は３１４５アミノ酸残基のハンチンチン蛋白質をコードする。この蛋白質自体は様々な組織で発現し全長蛋白質は主に細胞質に存在し非病原性である。ハンチンチン遺伝子の第1エクソンにはＣＡＧの繰り返し配列が存在する。このＣＡＧの繰り返し配列は非病原性の場合では約３０未満の反復であるが、ＣＡＧの繰り返しが約３０以上にもなるとハンチントン舞踏病を惹起する病原性遺伝子となる。ＣＡＧの繰り返しが約３０以上に増加したハンチンチン遺伝子からはハンチンチン蛋白質のＮ末端側グルタミンの連続（ポリグルタミン）が長くなった蛋白質（変異ハンチンチン）が作られる。このようなポリグルタミンが長くなった変異ハンチンチンは凝集を起こしやすくなっている。また長いポリグルタミンは他の蛋白質との相互作用に影響すること、ハンチンチン蛋白質自身の切断（プロセシング）を促進することなどが報告されている。切断されたハンチンチン蛋白質は核に多く存在し、このことが細胞に対する毒性を発揮し、ハンチントン舞踏病を惹起すると考えられている。ハンチントン舞踏病は、一般に中年で発病し、発病から１５−２０年で死に至る。その症状は特徴的な筋肉運動の変調、認識力の低下及び精神科の症状等によって特徴づけられる。筋肉運動の変調は、舞踏病や筋失調症を含む自発的随意運動と異常不随意運動の調整喪失によると考えられている。【０００３】
一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献２、３参照）。ＨＧＦの投与は、抗アポトーシス活性によって劇症肝炎を伴うマウスにおけるエンドトキシン誘発致死的肝障害を予防し、ＨＧＦ遺伝子治療は致命的な肝硬変を持つラットの生存率を改善し得ることが知られている（非特許文献４、５参照）。また、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献６、７参照）。とりわけＨＧＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に匹敵する運動ニューロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている（非特許文献８参照）。前記ＧＤＮＦの産生促進剤は、神経変性疾患の一つである筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療剤として知られ（特許文献１参照）、ＨＧＦ（遺伝子も含む）もＡＬＳ形質転換モデルマウス（ヒトＡＬＳの原因遺伝子であるＳＯＤ１Ｇ９３Ａを発現させた形質転換マウス）の病気の進行を遅らせ、生存率を延長することが知られている（特許文献２、非特許文献９参照)。
一方、ハンチントン舞踏病遺伝子で形質転換したＲ６／２マウスにレンチウイルスベクターを用いてＧＤＮＦ遺伝子が導入されたが、ＧＤＮＦ遺伝子の導入は該マウスに対して有用な効果を示さなかったことが知られている（非特許文献１０参照）。
これらのことは、神経変性疾患であっても、ＡＬＳを含めアルツハイマー病やパーキンソン病等とハンチントン舞踏病等のポリグルタミン病とは、その病因や、病態、発病方法等が全く異なり、これら疾患を同列に扱うことは出来ないことを示している。【０００４】
また、特許文献３には、パーキンソン病で変性する中脳黒質ドーパミンニューロンを薬剤投与により特異的に死滅させる中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子の中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットへの作用効果を行動学的に及び組織学的に検討した実施例が示されており、ＨＧＦ遺伝子の前投与により中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ＯＨＤＡから保護し、中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットの症状を抑えたとの実験結果が示されている。そして、この特許文献３では、このような実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がパーキンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）などの神経疾患の治療にも適用できるとし、かかる神経疾患の１つとしてハンチントン舞踏病も挙げられている。
しかしながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性ニューロンという特定種のニューロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、ポリグルタミン病は上記したように長鎖のグルタミン鎖（ポリグルタミン）を含む原因遺伝子産物を発現することにより発症する神経変性疾患である。６−ＯＨＤＡによる神経細胞変性又は細胞死惹起メカニズムとポリグルタミン病原因遺伝子産物による神経細胞変性又は細胞死メカニズムは全く異なるものであり、６−ＯＨＤＡに対して神経保護作用を示したからといってＨＧＦがポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞死を保護するとは到底予測できない。臨床的には、共に神経変性疾患であってもパーキンソン病とポリグルタミン病とは、全く異なる病態を示すだけでなく、両疾患に因果関係は認められない。また、障害神経細胞も完全に異なっている。このため、パーキンソン病モデルラットの上記実験結果のみから、ＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡがポリグルタミン病の治療に有効であるとは到底いえず、また有効であったとする報告もない。【０００５】
上記のように、ハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対する治療方法は確立されておらず、困難を極めているのが現状である。
【特許文献１】特開２００２−４７２０６号公報
【特許文献２】特開２００２−８７９８３号公報
【特許文献３】国際公開第２００３／０４５４３９号パンフレット
【非特許文献１】ザ・ハンチントンズ・ディジーズ・コラボレイティブ・リサーチ・グループ（The  Huntington's  Disease  Collaborative  Research  Group），セル（Cell），１９９３年，第７２巻，ｐ．９７１−９８３
【非特許文献２】中村（Nakamura）ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アンド・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem．Biophys．Res．Commun．），１９８４年，第１２２巻，ｐ．１４５０−１４５９
【非特許文献３】中村（Nakamura）ら，ネイチャー（Nature），１９８９年，第３４２巻，ｐ．４４０−４４３
【非特許文献４】コウサイ（Kosai）ら，ヘパトロジー（Hepatology），１９９９年，第３０巻，ｐ．１５１−１５９
【非特許文献５】ウエキ（Ueki）ら，ネイチャー・メディシン（Nat．Med．），１９９９年，第５巻，ｐ．２２６−２３０．
【非特許文献６】松本（Matsumoto）ら，チバ・ファウンデイション・シンポジウム（Ciba Found．Symp．），１９９７年，第２１２巻，ｐ．１９８−２１１；ディスカッション２１１−１９４
【非特許文献７】船越（Funakoshi）ら，クリニカ・チミカ・アクタ(Clin．Chim．Acta．)，２００３年，第３２７巻，ｐ．１−２３
【非特許文献８】ニューロン（Neuron），１９９６年，第１７巻，ｐ．１１５７−１１７２
【非特許文献９】サン（Sun）ら，ブレイン・リサーチ・モレキュラ・ブレインリサーチ（Brain．Res．Mol．Brain．Res．），２００２年，第１０３巻，ｐ．３６−４８
【非特許文献１０】ポポビック・エヌ（Popovic N）ら, エクスペリメンタル・ニューロジー（Exp．Neurol．），２００５年，第１９３巻，ｐ．６５−７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ポリグルタミン病を治療又は発病抑制するのに有効な薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質もしくはＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下において、ＨＧＦ蛋白質等ということもある。）、あるいはそれらをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（以下において、ＨＧＦ遺伝子ということもある。）がポリグルタミン病に対して優れた治療効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明者らは、まずハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病のモデルマウスである変異（ＣＡＧリピートの長い病因変異）ハンチンチンエキソン1（変異ＨＤエキソン１）を導入した形質転換マウス（Ｒ６／２マウス）を用いて、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子のポリグルタミン病への関与を検討した。
本発明者らは、神経向性を有し複製能を欠如したベクター（Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター）を用いて上記形質転換マウス（Ｒ６／２）の線条体にラットＨＧＦ遺伝子を導入し、線条体においてラットＨＧＦ蛋白質を発現するＲ６／２形質転換マウスを作製し、当該マウスを用いて、実際にＨＧＦ遺伝子がポリグルタミン病に対して効果を示すか否かを検討した。その結果、ラットＨＧＦ遺伝子の導入されたマウスでは、驚くべきことにクラスピングという手足を広げられない現象の開始が遅延され、寿命が延び、また運動機能障害が改善されることが明らかとなった。これらの知見により、ＨＧＦ蛋白質の発現はハンチントン舞踏病を含むポリグルタミン病に対して治療効果、発病抑制効果をもたらすことが、初めて明らかとされた。【０００９】
次に本発明者らは、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子によるポリグルタミン病の治療効果又は発病抑制効果のメカニズムを検討した結果、少なくとも線条体におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制作用と共に、神経細胞の新生作用という２つの新たなメカニズムにより、ＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子がポリグルタミン病に有用な効果をもたらすことを見出した。ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化を抑制することにより線条体における神経細胞変性又は細胞死を抑制し、線条体の萎縮を抑制すると共に脳室拡大を抑制することができる。すなわちＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子は、神経細胞変性又は細胞死を抑制すると共に神経細胞を新生するという２つの作用を通して、ポリグルタミン病における運動機能の改善効果と寿命の延長効果を奏する。【００１０】
また、本発明者らは、変異ハンチンチンが有する長いポリグルタミンが断片化（プロセシング）により神経毒性を獲得することに注目し、前記プロセシングに及ぼすＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子の効果を検討した。本発明者らは、変異ＨＤエキソン１を導入した形質転換マウス（Ｒ６／２マウス）では、ハンチンチン蛋白質は断片化されるが、これにＨＧＦ遺伝子を導入したＲ６／２形質転換マウスでは、ハンチンチン蛋白質の断片化が抑制されることを知見した。
このような、ＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子の効果は本発明において初めて見出されたものであり、発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤、
［２］  有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする前記［１］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［３］  ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［２］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［４］  ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記［２］又は［３］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［５］  有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする前記［１］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［６］  ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする前記［５］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［７］  ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等よりなる群から選択される少なくとも１の疾患であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［８］  ポリグルタミン病がハンチントン舞踏病であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［９］  治療剤又は発病抑制剤が、ポリグルタミン病の病変部位への局所投与用であることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［１０］  局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする前記［９］記載の治療剤又は発病抑制剤、【００１２】
［１１］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とする脳室の拡大抑制剤、
［１２］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤、
［１３］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とする神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制剤、
［１４］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とすることを特徴とするポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤、
［１５］  治療又は発病抑制が、脳室の拡大抑制によるものであることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［１６］  脳室の拡大が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物による線条体神経細胞変性又は細胞死によるものであることを特徴とする前記［１５］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［１７］  線条体神経細胞変性又は細胞死がカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化によるものであることを特徴とする前記［１６］記載の治療剤又は発病抑制剤、
［１８］  治療又は発病抑制が、神経新生によるものであることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［１９］  治療又は発病抑制が、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制によるものであることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の治療剤又は発病抑制剤、
［２０］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用、
［２１］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与するポリグルタミン病の治療又は発病抑制方法、及び、
［２２］  （１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤としての使用、
に関する。【００１３】
また、本発明は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与することを特徴とする脳室の拡大抑制方法、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する方法、カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化を抑制する方法、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングを抑制する方法に関する。【００１４】
さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングを抑制する医薬を製造するための（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの使用に関する。【００１５】
さらに、本発明は、脳室の拡大を抑制する医薬、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制する医薬、カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化を抑制する医薬、又はポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングを抑制する医薬としての（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの使用に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病、例えばハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等に対して極めて優れた治療効果又は発病抑制効果を発揮するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＨＳＶ−ＨＧＦ形質導入後のＲ６／２マウス線条体におけるＨＧＦの発現を示す図である。図中ａは野生型同腹子マウス線条体を、ｂはＲ６／２マウス線条体を、ｃはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス線条体を、ｄはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス線条体の組織像を示す。ｅはＥＬＩＳＡにより測定した各マウス線条体のＨＧＦ量を示す。
【図２】図２は、Ｒ６／２マウスの線条体にＨＳＶ−ＨＧＦ又はＨＳＶ−ＬａｃＺ形質導入後の体重の経時変化を示す図である。
【図３】図３は、Ｒ６／２マウスの線条体にＨＳＶ−ＨＧＦ又はＨＳＶ−ＬａｃＺ形質導入後の生存曲線を示す図である。
【図４】図４は、クラスピングテストにおけるマウスの姿勢を示す図である。
【図５】図５は、クラスピングテストにおけるスコアの経時変化を示す図である。
【図６】図６は、ロタロッドテストにおける運動機能の経時変化を示す図である。
【図７】図７は、フットプリントテストにおける歩幅の平均間隔の経時変化を示す図である。
【図８】図８は、フットプリントテストにおける前肢／後肢の重なりの分離の経時変化を示す図である。
【図９】図９は、マウス脳の冠状断面を示す図である。図中、Ｃｔｘは大脳皮質を、ＣＣは脳梁を、Ｓｔｒは線条体を、Ｌｖは側脳室（Lateral  ventricle）を示す。
【図１０】図１０は、９週令マウスの脳重量を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図１１】図１１は、線条体におけるＮｅｕＮ陽性細胞を示す図である。
【図１２】図１２は、線条体におけるＮｅｕＮ陽性細胞数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図１３】図１３は、線条体におけるリン酸化ｃ−Ｍｅｔの発現を示す図である。
【図１４】図１４は、線条体における活性化カスパーゼ−３の免疫染色像を示す図である。
【図１５】図１５は、カスパーゼ−３のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。図中、１，２は野生型同腹子を、３，４はＲ６／２マウスを、５，６はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、７，８はＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図１６】図１６は、ウエスタンブロット分析における活性化カスパーゼ−３のバンド強度を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図１７】図１７は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼ−３の活性化に対するＲ６／２マウスにおけるカスパーゼ−３の活性化率を示す図である。
【図１８】図１８は、カスパーゼ−１のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。図中、１，２は野生型同腹子を、３，４はＲ６／２マウスを、５，６はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、７，８はＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図１９】図１９は、ウエスタンブロット分析における活性化カスパーゼ−１のバンド強度を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。
【図２０】図２０は、野生型同腹子マウスにおけるカスパーゼ−１の活性化に対するＲ６／２マウスにおけるカスパーゼ−３の活性化率を示す図である。
【図２１】図２１は、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス及び野生型同腹子の線条体におけるＫｉ−６７陽性細胞の免疫染色像を示す図である。図中、Ｓｔｒは線条体を、ＬＶは脳室を、ＳＶＺは脳室下帯を示す。
【図２２】図２２は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２３】図２３は、マウス脳室下帯及び線条体におけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２４】図２４は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２５】図２５は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２６】図２６は、マウス脳室下帯及び線条体におけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２７】図２７は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２８】図２８は、マウス線条体におけるネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図２９】図２９は、マウス線条体におけるＤＣＸとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図３０】図３０は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄実質に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図３１】図３１は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄腔に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図３２】図３２は、ハンチンチン蛋白質のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図３３】図３３は、ハンチンチン蛋白質のウエスタンブロット分析におけるＣ末端フラグメントを定量解析した結果を示す図である。図中＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において「ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＨＧＦ蛋白質を発現し得るＤＮＡをいう。ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、例えば、Nature，342，440（1989）；特許第２７７７６７８号公報；Biochem．Biophys，Res．Commun．，1989年，第163巻，p．967-973；Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，1991年，第88巻（16号），p．7001-7005等に記載され、例えば、GeneBank/EMBL/DDBJにAccession No．Ｍ６０７１８、Ｍ７３２４０、ＡＣ００４９６０、ＡＹ２４６５６０、Ｍ２９１４５又はＭ７３２４０等として登録されているヒト由来のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。また、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡには、前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。【００１９】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、若しくは配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。ここで、配列番号１で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ６０７１８の塩基配列第７３乃至２２５９に相当し、該ＤＮＡは配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。配列番号２で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ７３２４０の塩基配列第６６乃至２２３７に相当し、該ＤＮＡは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。【００２０】
配列番号１又は２で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ストリンジェントな条件は、以下において同様である。【００２１】
上記の配列番号１又は２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号１又は２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular  Cloning，A  laboratory  Manual，Third  Edition（J．Sambrook  et  al．，Cold  Spring  Harbor  Lab．Press，2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００２２】
さらに、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えばＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ等も好ましく使用できる。【００２３】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有しかつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。このようなＤＮＡとしては、より具体的には、例えば、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第６３０番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡや、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第８６４番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡ等が好ましく挙げられる。【００２４】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版等の基本書等を参考にして行うことができる。【００２５】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリー又は合成ＤＮＡ等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＲＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＲＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞又は組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。【００２６】
本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦ蛋白質は、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を分離すること等により得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Biochem．Biophys．Res．Commun．1989年、第163巻，p．967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個（複数個とは例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２のヒトＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ［Fukuta  K  et  al．，Biochemical  Journal，388，555-562（2005）］等を挙げることができる。
さらに、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用されるＨＧＦ蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。【００２７】
上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えばAccession  No．Ｐ１４２１０（配列番号３）又はAccession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２（配列番号４）で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げられる。配列番号４で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の第１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession  No．ＢＡＡ１４３４８又はＡＡＣ７１６５５等のヒト由来ＨＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。【００２８】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡであってもよい。このようなＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＡＡＢ３１８５５，ＮＰ＿０３４５５７，ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ［例えばAccession  No．ＮＰ＿５８７１３（配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）等］、ウシ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６，ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）又はチンパンジー由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＸＰ５１９１７４等）などが挙げられるが、これらに限定されない。【００２９】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは金属を示す）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、アセチルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル等のＣ２−６アルカノイルメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基又はカルボキシラートを有している場合、カルボキシル基又はカルボキシラートがアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。【００３０】
本発明で用いるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下、ＨＧＦ部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、ＨＧＦ部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチドや、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２８８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。
本発明のＨＧＦ部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは上記と同意義）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ；Ｒは上記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、ＨＧＦ部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。【００３１】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。【００３２】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る保護基を有していてもよい部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有していてもよい残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、M．Bodanszky及びM．A．Ondetti、ペプチド・シンセシス（Peptide  Synthesis），Interscience  Publishers，New  York（1966年）、Schroeder及びLuebke、ザ・ペプチド（The  Peptide），Academic  Press，New  York（1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。【００３３】
本発明における、「ポリグルタミン病」としては、原因遺伝子の塩基配列に含まれるシトシン・アデニン・グアニン（ＣＡＧ；グルタミンのコドン）配列の繰り返し配列を約３０以上含む原因遺伝子が転写、翻訳されてできる異常に伸長したグルタミン鎖（ポリグルタミン）を含む原因遺伝子産物が神経細胞に異常蓄積又は凝集して神経細胞変性又は細胞死や機能異常、例えば筋肉運動の変調（例えば舞踏病や筋失調症等）、認識力の低下又は精神化症状等を引き起こす遺伝性神経変性疾患が典型例として挙げられる。
ポリグルタミン病としては、具体的には、例えばハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等が挙げられる。【００３４】
本発明において、「治療」とは、ポリグルタミン病の症状を緩解、又は完治させることをいい、より具体的には、例えば、ポリグルタミン病における神経細胞変性又は細胞死を抑制又は遅延させることによって、前記機能異常を抑制又は防止し、正常化させることを含む。また、該治療には、神経細胞変性又は細胞死が誘発される部位において、神経細胞を新生させること等も包含される。【００３５】
本発明において、「発病抑制」とは、ポリグルタミン病のＣＡＧの繰り返しを約３０以上有する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成されて誘発される神経変性又はその進行を抑えることをいい、ポリグルタミン病のＣＡＧの繰り返しを約３０以上有する原因遺伝子が発現し、該原因遺伝子産物が生成され蓄積されるのを抑制又は防止することを包含する。
原因遺伝子としては、例えばハンチンチン遺伝子等が挙げられる。該ハンチンチン遺伝子はその第1エクソンにＣＡＧの繰り返し配列を有する。なお、ハンチンチン遺伝子は非病原性の場合では前記第1エクソンに存在するＣＡＧの繰り返し配列が約３０未満であるが、病原性遺伝子としては前記ＣＡＧの繰り返し配列が約３０以上になるものが挙げられる。【００３６】
ポリグルタミン病の発病抑制の方法としては、例えば（１）ＣＡＧの繰り返しを３０以上有する原因遺伝子の発現抑制又は防止、（２）ＣＡＧの繰り返しを３０以上有する原因遺伝子産物の生成抑制又は防止、（３）生成されたＣＡＧの繰り返しを３０以上有する原因遺伝子産物の蓄積抑制又は防止、（４）ポリグルタミン病原因遺伝子産物に起因しておこる神経変性の進行抑制、あるいは（５）ＣＡＧの繰り返しを３０以上有する原因遺伝子産物のプロセシングの抑制等が挙げられる。前記（１）乃至（５）いずれかあるいは２つ以上を抑制又は防止することが好ましい。【００３７】
本発明のポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。【００３８】
本発明の治療剤又は発病抑制剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分がＨＧＦ蛋白質の場合と、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの場合と若干異なってもよい。
例えば、有効成分がＨＧＦ蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみを又はそれを慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等に製剤されるのが好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。【００３９】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。【００４０】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類；コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体；ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％が好ましい。【００４１】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接ポリグルタミン病の病変部位に直接注射（髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）をポリグルタミン病の病変部位のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１〜２５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。【００４２】
一方、ＨＧＦ遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、ＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクター等をポリグルタミン病の病変部位の組織（例えば脊髄神経、脳等）へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄等から細胞を体外に取り出して、該細胞にＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の病変部位又は脊髄に移植する方法等が挙げられる。【００４３】
発現ベクターとしては、ｎａｋｅｄプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０又は免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを導入することが可能である。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
前記ＨＳＶ−１ベクターは神経向性を有するベクターである。ＨＳＶ−１ベクターとしては、多重遺伝子（３０ｋｂまで）が組み込まれている大きな（１５２ｋｂ）ゲノムを有し、かつ生涯にわたり潜在的に神経細胞に対して感染を樹立する能力を有するものが好ましい。具体的なＨＳＶ−１ベクターとしては、ウイルス複製のためのＩＣＲ４，ＩＣＰ３４．５及びＶＰ１６（ｖｍｗ６５）をエンコードする３つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態にある複製能力のないＨＳＶ−１（ＨＳＶ１７６４／４−／ｐＲ１９）ベクター（Coffin  RS，et  al.，J．Gen．Virol．1998年，第79巻，ｐ．3019-3026；Palmer  JA，et  al.，J．Virol.，2000年，第74巻，ｐ．5604-5618；Lilley  CE，et  al.，J．Virol.，2001年，第75巻，ｐ．4343-4356）等が挙げられる。また、ＡＡＶベクターは、非病原性ウイルスに属し、安全性が高く、また神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターである。ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５等が挙げられる。これらＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクターは目的遺伝子を神経細胞等において長期間発現させ得る。ポリグルタミン病は長期間を経て病態を完成するので、本発明に使用されるベクターとしては、長期発現を可能とするＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクターがとりわけ好ましい。
ＨＧＦのポリグルタミン病に対する効果の評価のためには、例えば、ＨＳＶ−１ベクター、ＡＡＶベクターを使用してＨＧＦ遺伝子をポリグルタミン病の病変部位、例えば線条体や髄腔内等へ形質導入するのが好ましい。【００４４】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態［例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤等］をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）はＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤を製造する場合、例えばＨＧＦ遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターに換算して、通常１×１０6ｐｆｕ〜１×１０12ｐｆｕ、好ましくは１×１０7ｐｆｕ〜２×１０11ｐｆｕ、さらに好ましくは１．５×１０7ｐｆｕ〜１．５×１０11ｐｆｕを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。【００４５】
本発明の剤は、ポリグルタミン病、例えばハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の治療又は発病の抑制に用いることができる。
ポリグルタミン病の治療又は発病の抑制効果は、公知の方法［例えば、クラスピングテスト（Nat．Med，第10巻，p．148-154，Epub．2004年，Jan．2018）；ロタロッドテスト（J．Neurosci，2000年，第20巻，p．4389-4397）；フットプリントテスト（J．Neurosci，1999年，第19巻，p．3248-3257）等］やそれに準じる方法、例えば、後述する試験例等に記載されている方法等を用いて測定することができる。【００４６】
また、本発明によれば、ＨＧＦ蛋白質もしくはＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（ＨＧＦ蛋白質等）、あるいはＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（ＨＧＦ遺伝子）を、脳室の拡大抑制、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制、神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制又は神経細胞新生に使用し得る。【００４７】
脳室拡大は、脳の萎縮、特に線条体萎縮（例えば、線条体細胞死に基づく線条体萎縮）によるものが含まれる。本発明に係るＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、脳室拡大により生じる症状、例えば歩行困難等の四肢障害等の運動機能障害、言語障害、記憶障害又は神経科症状等を抑制し得る。【００４８】
ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死は、神経組織、例えば線条体等においてポリグルタミン病原因遺伝子産物が発現して蓄積するために生じるものが含まれる。本発明に係るＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、ポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死、特に線条体におけるポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死を抑制し得る。なお、細胞死は、アポトーシス及びネクローシスを包含する。このため細胞死抑制というときは、細胞自体の死が抑制されればよく、アポトーシスを抑制してもよく、またネクローシスを抑制してもよく、あるいはその両方を抑制してもよい。【００４９】
また、本発明に係るＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、前記細胞死の誘導に関与する、プロテアーゼ、例えばカスパーゼ、とりわけカスパーゼ−１又はカスパーゼ−３の活性化を抑制し得る。ヒトには、カスパーゼは約１０〜２０種類存在し、ある種のカスパーゼが活性化されるとそのカスパーゼによって他のカスパーゼが活性化されるというカスケード反応を生じ、細胞死を誘導する。これらカスパーゼ中でカスパーゼ−３はカスパーゼ活性化の最後の段階で細胞死を実行する酵素として知られている。また、カスパーゼ−３は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている(Zhang  Yら，J，Neurochem，2003年，第87巻，ｐ．1184-1192)。カスパーゼ−３は種々の細胞内蛋白質を分解することによって細胞死を実行するプロテア―ゼであって、神経細胞において神経細胞変性又は細胞死が誘導される際に活性化され得る。カスパーゼ−３又はカスパーゼ−１の活性化抑制とは、前記カスパーゼ−３又はカスパーゼ−１の活性化を抑制することをいう。カスパーゼ−３又はカスパーゼ−１の活性化抑制作用は、公知の方法あるいはそれに準じる方法（例えば、Trends  Biochem．Sci．，1997年，第22巻，ｐ．388-393 ；Biochem．J．，1997年，第326巻，ｐ．1-16；Anal．Biochem．，1997年，第251巻，ｐ．98-102等に記載の方法）や例えば、後述する試験例等に記載されている方法等を用いて測定することができる。【００５０】
また、本発明に係るＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、神経細胞新生に関与する。神経細胞新生は、神経細胞に分化する神経芽細胞や神経幹細胞等の増殖を含む。新しい神経細胞が生まれるには、細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂時には、遺伝情報をコピーするためにＤＮＡが合成さる。ＤＮＡが合成されたかどうかを知る手がかりとなる物質としては、例えばＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）等が挙げられる。例えば、ＢｒｄＵを体内に注入すると新しく生まれる細胞には、このＢｒｄＵが取り込まれるのでこのＢｒｄＵを指標に神経細胞の新生を判定できる。従って、神経細胞新生作用は、例えば脳神経細胞に取り込まれるＢｒｄＵを指標に測定する方法や後述する試験例等に記載されている方法等を用いて測定することができる。【００５１】
また、本発明に係るＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子は、ポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシングに関与する。プロセシングは、ポリグルタミン病原因遺伝子発現過程において、該遺伝子の転写産物が細胞内の蛋白分解酵素等により部分分解等を受け固有の局在性や機能をもつ蛋白質に成熟していく過程をいうが、本発明においては該原因遺伝子産物が断片化されることをも含む。ポリグルタミン病では、いずれの原因遺伝子も原因遺伝子中に存在するポリグルタミンの伸張（３０以上）を認めることを共通の特徴とする。ポリグルタミン病における神経毒性発現には、ＣＡＧの繰り返しを３０以上有する原因遺伝子産物が断片化されることが含まれる。例えばハンチントン舞踏病においては、原因遺伝子（ハンチンチン遺伝子）に含まれるＣＡＧの繰り返しが３０以上に増加したハンチンチン遺伝子が発現される過程においてプロセシングにより、該原因遺伝子産物（変異ハンチンチン）が断片化される。断片化された変異ハンチンチンは、病原性を有し、神経毒性を発現すると考えられている。これらのことを背景にして、ハンチンチン蛋白質がプロセシングを受けて断片化されたハンチンチンになる効率がＨＧＦ遺伝子により抑制されるかどうかを評価することで、プロセシングを抑制するか否かを評価することができる。前記プロセシングの抑制作用は例えば後述する試験例に記載されている方法等を用いて測定することができる。【００５２】
本発明の使用は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡのポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤としての使用である。また、上記の（１）あるいは（２）の成分のポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤の製造の為の使用である。【００５３】
本発明のポリグルタミン病の治療又は発病抑制方法は哺乳動物に上記の（１）あるいは（２）の成分を投与する方法である。【００５４】
さらに、本発明の使用は上記の（１）あるいは（２）の成分の脳室の拡大抑制剤としての使用である。また、上記の（１）あるいは（２）の成分の脳室の拡大抑制剤の製造の為の使用である。【００５５】
本発明の脳室の拡大抑制方法は哺乳動物に上記の（１）あるいは（２）の成分を投与する方法である。【００５６】
さらに、本発明の使用は上記の（１）あるいは（２）の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤としての使用である。また、上記の（１）あるいは（２）の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制剤の製造の為の使用である。【００５７】
本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物依存神経細胞変性又は細胞死抑制方法は哺乳動物に上記の（１）あるいは（２）の成分を投与する方法である。【００５８】
さらに、本発明の使用は上記の（１）あるいは（２）の成分の神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制剤としての使用である。また、上記の（１）あるいは（２）の成分の神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制剤の製造の為の使用である。【００５９】
本発明の神経細胞におけるカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−１の活性化抑制方法は哺乳動物に上記の（１）あるいは（２）の成分を投与する方法である。【００６０】
さらに、本発明の使用は上記の（１）あるいは（２）の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤としての使用である。また、上記の（１）あるいは（２）の成分のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制剤の製造の為の使用である。【００６１】
本発明のポリグルタミン病原因遺伝子産物のプロセシング抑制方法は哺乳動物に上記の（１）あるいは（２）の成分を投与する方法である。【００６２】
本発明の医薬及び方法はポリグルタミン病、例えばハンチントン舞踏病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症等、好ましくはハンチントン舞踏病の患者への使用が好適である。
【実施例】
【００６３】
以下に試験例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６４】
〔試験例１〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおけるＨＧＦの作用
１．実験動物
Ｂ６ＣＢＡ−ＴｇＮ（変異ＨＤエキソン１）６２Ｇｐｂ／Ｊ雌性マウス（Mangiarini  Ｌら，Cell，1996年，第87巻，p．493-506）から摘出した卵巣が移植されたＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雌性マウスは、Jackson  Laboratory（Bar  Harbor，ME）から入手し、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雄性マウスと共に飼育し、交配した。
交配した子は、その尾組織から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析により遺伝子系を決定し、ＴｇＮ６２Ｇｐｂ遺伝子を有するマウスをハンチントン舞踏病モデルマウスＲ６／２マウス（以下、Ｒ６／２マウスと略記する。）とした。また、前記Ｒ６／２マウスと同腹でＴｇＮ（変異ＨＤエキソン１）６２Ｇｐｂ遺伝子を持たないマウスを野生型同腹子マウスとして使用した。
全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべての取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少ない数の動物を使用した。【００６５】
２．ベクターの構築、製造及び精製
ｐＲ１９ＧＦＰＷＰＲＥ（Lilley  CEら，J．Virol，2001年，第75巻，p．4343-4356）のＧＦＰ（green  fluorescent  protein；緑色蛍光タンパク)遺伝子を、ラットＨＧＦをコードするＤＮＡの全長（ｒａｔＨＧＦ；配列番号５）にＫＴ３タグ（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’ ；配列番号７）を付加したｃＤＮＡ（Sun  Ｗら，J．Neurosci，2002年，第22巻，p．6537-6548）で置換し、ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥを構築した。このベクター（ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥ）のシークエンスは、ＡＢＩ  ３１０キャピラリーシークエンサーを使用する分析により確認した。次いで、Ｍ４９細胞を用いて、プラスミドｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＤＮＡと、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスＤＮＡとのコトランスフェクションにより相同組換えを行なった。白色プラークを選択し、３回精製し、Palmer JAらの方法（J．Virol，2000年，第74巻，p．5604-5618）に従い、複製能力のないウイルスを増殖させた。ラットＨＧＦの発現を、免疫染色によって確認した。該発現を更にウエスタンブロット法及びラットＨＧＦの酵素抗体免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により確認した。本試験に使用するために、タイター（titer）が１〜２×１０9 ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニット）／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクター（ＨＧＦ発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する）と、タイターが１〜１．５×１０9ｐｆｕ／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスベクター（ＨＧＦ非発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺと略記する）を調製した。【００６６】
３．脳内へのＨＳＶ挿入（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）
４週令のＲ６／２マウスに、ペントバルビタールを５０ｍｇ／ｋｇ静脈注射して深く麻酔した。線条体（−０．４ｍｍ前後，±１．８ｍｍ内外側方向、及び−３．５ｍｍ背腹方向）へ注射するために、該マウスをＫｏｐｆ脳定位固定装置に入れ固定した。５μＬのＨＳＶ−ＬａｃＺ（５×１０6ｐｆｕ）又はＨＳＶ−ＨＧＦ（３×１０5ｐｆｕ）を該マウスに注射した。注射は、マウスの前記線条体に１０μＬのハミルトンシリンジを用いて速度０．３μＬ／ｍｉｎで実施された。以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス、ＨＳＶ−ＨＧＦを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスという。【００６７】
４．組織学的及び免疫組織化学的分析
マウスに深く麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を心臓から流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。得られた凍結切片は、ニッスル物質を染色するためクレシル・バイオレットで染色した。
免疫組織化学的染色は、凍結切片を、ＰＢＳで洗浄し、１０％ヤギ又はロバ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬し、次いで抗体と共に４℃で一晩インキュベートすることによって行なわれた。【００６８】
抗体は、以下を使用した。
（１）ＮｅｕＮ抗体
マウスモノクロナール抗体（Chemicon  International社製；カタログ番号ＭＡＢ３７７）を５００倍希釈して使用した。
（２）ｃ−Ｍｅｔ抗体
ＳＰ２６０、ウサギポリクロナール抗体（Santa  Cruz  Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−１６２）を５０倍希釈して使用した。
（３）リン酸化ｃ−Ｍｅｔ抗体
ウサギポリクロナール抗体，（Biosource社製；カタログ番号４４−８８８Ｇ）を１００倍希釈して使用した。
（４）活性化カスパーゼ−３抗体
ウサギポリクロナール抗体（プロメガ社製；カタログ番号Ｇ７４８）を１２５倍希釈して使用した。【００６９】
５．酵素抗体免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法
組織のＨＧＦは、Sun  Wら、Brain  Res  Mol  Brain  Res，2002年，第103巻，ｐ．36-48に記載のように抗ＨＧＦポリクロナール抗体（Tokushu  Meneki製）を用いて測定した．【００７０】
６．ウエスタンブロッティング
マウスの脳線条体のホモゲナイズは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド；和光純薬工業株式会社製）、２μｇ／ｍＬアンチパイン（ペプチド研究所製）、２μｇ／ｍＬロイペプチン（ペプチド研究所製）、２μｇ／ｍＬペプスタチン（ペプチド研究所製）を用いて調製された。同量の蛋白質（１２０μｇ／レーン）を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。分離後、蛋白質をポリビニリデンジフルオリド（polyvinylidene difluoride；ＰＶＤＦ）膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ電気的に転写した。転写したＰＶＤＦ膜は、室温で２時間、１０質量％スキムミルクでブロッキング後、抗カスパーゼ−３抗体(ウサギポリクロナール抗体；カタログ番号Ｃ９５９８，Sigma社製)又は抗カスパーゼ−１（ｐ２０）抗体（ウサギポリクロナール抗体；カタログｓｃ−１２１８−Ｒ，Santa  Cruz  Biotechnology社製）でブロットした。次いで、抗カスパーゼ−３抗体又は抗カスパーゼ−１抗体は、２次抗体（DakoCytomation社製）をコンジュゲートしたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共にインキュベーションし、製品説明書に従ってＥＣＬ  reagents（製品番号ＲＰＮ２１０６，アマシャム・バイオサイエンス社製）で発色させた。
バンドの強度は、Wayre  Rasband氏によって開発されたＮＩＨ（National Institutes  of  Health）イメージソフトウエアを使用して解析された。【００７１】
７．統計的分析
データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で示し、統計学的有意差の検定は、フィッシャーの最小有意差法（ＰＬＳＤ）を用いる分散分析で評価した。
各グループのデータは、解析ソフトＳｔａｔｖｉｅｗ  ５．０（SAS  Institute，Inc.製）で分析した。ｐ＜０．０５の確率値の違いを統計的有意差ありとした。【００７２】
８．ＨＳＶ導入に伴うＨＧＦ発現
ＨＧＦのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を、免疫組織化学的に分析した。９週令（ＨＳＶ−ＨＧＦ又はＨＳＶ−ＬａｃＺ注射５週後）において、ＨＧＦの免疫反応性が、Ｒ６／２マウス又はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスの線条体で増加した（図１ａ−ｄ）。
ＥＬＩＳＡを用いた線条体におけるＨＧＦ蛋白質濃度は以下の通りであった。線条体におけるＨＧＦ蛋白質濃度は、ＨＳＶ−ＨＧＦを投与した野生型同腹子マウスでは、ＨＳＶ−ＨＧＦ注射３日後に４７．０７±５．８１ｎｇ／ｇとなり、Ｒ６／２マウスのＨＧＦの約３倍に増加した。９週令において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス線条体におけるＨＧＦ蛋白質濃度はＲ６／２マウス又はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して有意に増加した。また、１３週令においても、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス線条体におけるＨＧＦ蛋白質濃度はＲ６／２マウス又はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して増加をみたが、９週令と比較するとその程度は低下していた（図１ｅ）。【００７３】
９．体重変化
ウイルス挿入後、経時的にマウス体重を測定した。
Ｒ６／２マウス又はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスの体重は、９週令の野生型同腹子マウスと比較して有意に減少した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスの体重は、Ｒ６／２マウスの体重と比較して差は認められなかった（図２）。【００７４】
１０．生存曲線
Ｒ６／２マウス、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスの生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により分析し、Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ５．０（SAS  Institute，Inc．製）を用いてログランク検定（log−rank  test）を行なった。
その結果を図３に示した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスの寿命は平均１００．４±２．６日であり、Ｒ６／２マウスへのＨＳＶ−ＨＧＦの注射は、Ｒ６／２マウスの平均寿命（９１．３±３．８日）及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスの平均寿命（８８．６±３．８日）を延長させた。（図３）。【００７５】
１１．クラスピングテストに対するＨＧＦの作用
クラスピングテストのため、マウスは３０秒間尻尾を持って釣り上げ、フット・クラスピング（手足を広げられない姿勢）度をスコア化した。
フット・クラスピング度はTanaka  Mらの方法（Nat．Med，第10巻，p．148-154，Epub．2004年，Jan  2018）に従い、フット・クラスピング時間から表１のようにスコア化した。【００７６】
【表１】
2007122976.tif 000002
【００７７】
図４のＲ６／２マウスの姿勢がフット・クラスピングの特徴的な表現型である。野生型同腹子マウスは、フット・クラスピングの表現型を示さなかった（図４；野生型同腹子）。クラスピングスコアの経時変化を図５に示す。Ｒ６／２マウス又はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスは６週令からずっとクラスピングの表現型を示した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスではフット・クラスピングの表現型を８週令まで示さず、その後も１２週令まで、フット・クラスピング時間（スコア）の抑制が認められた。【００７８】
１２．ロタロッドテストに対するＨＧＦの作用
前肢及び後肢運動機能とバランスの測定のためにロタロッド装置を使用した。ロタロッドテストは、Ferrante  RJらの方法（J．Neurosci，2000年，第20巻，p．4389-4397）に従って行なった。すなわち、試験は、ロタロッド装置を用い、１０ｒｐｍで回転する棒の上に１８０秒マウスをのせ、棒から落ちる時間を記録し、分析した。
図６にロタロッドテストの経時変化を示した。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスでは野生型同腹子マウスと比較してロタロッドテストにおいてその機能が経時的に低下した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較してロタロッドテストの成績が有意に改善された。【００７９】
１３．フットプリントテストに対するＨＧＦの作用
フットプリントテストは、Carter  RJらの方法（J．Neurosci，1999年，第19巻，p．3248-3257）に従って行なった。フットプリントパターンを分析するために、前肢と後肢の足の運びは、Carter  RJらの方法に従い、歩行の間、赤(前肢)インクと黒（後肢)インクで記録した。動物を、長さ５０ｃｍ、幅１０ｃｍの通路にそって歩かせた。歩幅の長さは、各歩幅間における前肢の動きの平均間隔として測定した。左又は右前肢フットプリント、又は後肢のフットプリントの重なりは、歩幅の変化の均一性を測定するために使用した。
図７、８にフットプリントテストの経時変化を示した。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスでは野生型同腹子マウスと比較してフットプリントテストにおいてその歩幅の間隔が経時的に小さくなり、前肢／後肢の重なりが経時的に低下し、前肢と後肢が分離した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、Ｒ６／２マウスと比較して歩幅の間隔が大きくなり（図７）、前肢／後肢の重なりの分離が減少した（図８）。【００８０】
１４．組織学的及び免疫組織化学的分析結果
組織学的及び免疫組織化学的分析結果を以下に示した。
（１）脳萎縮と脳重量
発明者らは、脳部分のニッスル染色法を使用してＲ６／２マウスにおける脳萎縮に対するＨＧＦの作用を評価した(図９)。９週令において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスでは、線条体の萎縮による脳室の拡大が認められた。一方、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、この脳室の拡大が抑制された。９週令のマウスの脳重量を図１０に示す。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスの脳重量は、野生型同腹子マウスの脳重量と比較して減少した。しかし、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、この脳重量の減少が抑制された。【００８１】
（２）ＮｅｕＮ陽性細胞数に対するＨＧＦの作用
９週令におけるマウス線条体中の神経細胞の総数を、神経細胞のマーカー（ＮｅｕＮ）を指標に算出した。ＮｅｕＮは、ＮｅｕＮ抗体を用いて免疫組織化学的染色を行い検出し（図１１）、検出された細胞数（ＮｅｕＮ陽性細胞数）をカウントした（図１２）。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスにおけるＮｅｕＮ陽性細胞数は、野生型同腹子マウスと比較して有意に減少した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較してＮｅｕＮ陽性細胞数の有意な増加が認められた。【００８２】
（３）リン酸化ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの作用
Ｒ６／２マウスを用いて、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体が該マウスに発現するかどうか解明した。免疫組織化学的分析は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体が、野生型同腹子マウスと同様にＲ６／２マウスにおいてもＮｅｕＮ陽性細胞に局在することを示した（図１３のリン酸化ｃ−Ｍｅｔ／ＮｅｕＮ）。ＨＧＦで誘発されるｃ−Ｍｅｔチロシンリン酸化反応を調べるために、発明者らは線条体におけるリン酸化ｃ−Ｍｅｔの免疫染色を施行した（図１３）。ｃ−Ｍｅｔの活性化を反映しているリン酸化ｃ−Ｍｅｔ免疫反応性のレベルがＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおいて、他のグループのマウスのそれと比較して増加した。【００８３】
（４）カスパーゼに対するＨＧＦの作用
カスパーゼ−３は、ハンチントン舞踏病で活性化されることが知られている(Zhang  Yら，J，Neurochem，2003年，第87巻，ｐ．1184-1192)。発明者らは、ＨＧＦの神経保護作用を分析するために、ＨＧＦが活性化カスパーゼ−３の誘導に変化をもたらすかどうかを調べた。発明者らは活性化カスパーゼ−３の免疫染色を用いて、線条体におけるカスパーゼの活性化に対するＨＳＶ−ＨＧＦの作用を評価した。
９週令マウスにおける免疫組織化学的分析の結果は、以下のとおりであった。すなわち活性化カスパーゼ−３は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスの線条体（主としてＮｅｕＮ陽性細胞；図１４の活性化カスパーゼ−３／ＮｅｕＮ）に認められたが、野生型同腹子マウスの線条体には認められなかった。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、該活性化カスパーゼ−３の免疫反応性が減少した(図１４)。【００８４】
活性化カスパーゼ−３の定量分析のために、カスパーゼ−３のウエスタンブロット解析を施行した(図１５)。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスにおいて、カスパーゼ−３の顕著な活性化を認めた。一方、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、カスパーゼ−３の活性化がＲ６／２マウスやＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに比べ抑制された。ウエスタンブロット分析における活性化カスパーゼ−３のバンド強度を定量的に測定すると、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、カスパーゼ−３の活性化がＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを１０％とすると、その２３％にまで抑制されていた（図１６）。カスパーゼ−３の活性の測定結果も同様であった（図１７）。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスでは、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ−３の活性は高値を示したが、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは野生型同腹子マウスと同レベルまでカスパーゼ−３の活性が抑制された。【００８５】
また、カスパーゼ−１は、ハンチントン舞踏病患者及びＲ６／２マウスの脳で活性化されることが知られている（Zhang Yら、J Neurochem、2003年、第87巻、p．1184-1192）。そこで、Ｒ６／２マウス線条体におけるカスパーゼ−１のウエスタンブロットを検討した（図１８）。カスパーゼ−１のウエスタンブロット分析は、プロフォームとアクティブフォームを認識する抗体を用いて行なった。ウエスタンブロット分析における活性化カスパーゼ−１のバンド強度（Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する％）は、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス線条体で４０％にまで抑制された(図１９)。カスパーゼ−１の活性の測定結果も同様であった（図２０）。Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスでは、野生型同腹子マウスに比べカスパーゼ−１の活性は高値を示したが、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは野生型同腹子マウスと同レベル近くまでカスパーゼ−１の活性が抑制された。【００８６】
〔試験例２〕
ハンチントン舞踏病遺伝子導入形質転換マウスにおける脳神経細胞の新生に対するＨＧＦの作用
試験例１と同様に作成したＲ６／２マウス、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス及び野生型同腹子マウスを用いた。
１．Ｋｉ−６７細胞に対するＨＧＦの作用
脳室下帯（subventricular zone；ＳＶＺ）及び線条体での神経細胞増殖を検討した。増殖細胞のマーカーとしてＫｉ−６７を選択し、Ｋｉ−６７の免疫染色を行い、脳室下帯及び線条体でのＫｉ−６７陽性細胞数を測定した。線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでのＫｉ−６７陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスにおけるそれと比較して有意に増加した。（図２１）．【００８７】
２．ＢｒｄＵ取り込みに対するＨＧＦの作用
５週令マウスにＢｒｄＵ（４×７５ｍｇ／ｋｇ  腹腔内投与，生理食塩液に溶解、２時間毎に合計４回）を投与し、ＢｒｄＵ注射２８日後（９週令）に屠殺した。マウスに麻酔し、心臓からＰＢＳを流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。
ＢｒｄＵ免疫組織化学的染色のために、凍結切片は、１Ｎ塩酸で６０℃、３０分インキュベートし、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬した。その後、凍結切片は、抗ＢｒｄＵ（ラットモノクロナール抗体；Oxford  Biotechnology社製；カタログ番号ＯＢＴ００３０）と共に４℃で３６時間インキュベートした。二重染色は蛍光色素アレクサ４８８と蛍光色素アレクサ５４６をコンジュゲートした２次抗体（Molecular  Probes社製）で視覚化し、かつ切片はＴＯ  ＰＲＯ−３（Molecular  Probes社製）で核を対比染色した。蛍光画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０共焦点蛍光顕微鏡で検出した。
結果：
脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を測定した結果、脳室下帯において、各群間にＢｒｄＵ陽性細胞数の有意な差は認められなかった。しかし、線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスのＢｒｄＵ陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して有意に増加した（図２２）。これらのデータは、ＨＳＶ−ＨＧＦ処置により神経細胞増殖が増強されることを示す。【００８８】
３．ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）は、神経幹細胞のマーカーである。ネスチンは、試験例１における免疫組織化学的染色に従って染色した。抗体としては、ネスチン抗体［マウスポリクロナール抗体（BD  Biosciences社製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用］を用いた。
ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図２３）。【００８９】
４．ダブルコルチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ダブルコルチン（doublecortin；ＤＣＸ）は遊走神経芽細胞のマーカーである。ＤＣＸは、試験例１における免疫組織化学的染色に従って染色した。抗体としては、ＤＣＸ抗体［ヤギポリクロナール抗体（Santa  Cruz  Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−８０６６）を１００倍希釈して使用］を用いた。
ＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＤＣＸとＢｒｄＵにおける両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図２４）。【００９０】
５．ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、遊走神経芽細胞のマーカーである。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、試験例１における免疫組織化学的染色に従って染色した。抗体としては、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体［マウスモノクロナール抗体（AbCys  S．A．社製；カタログ番号ＡｂＣ００１９）を８００倍希釈して使用］を用いた。
ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体においてＲ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図２５）。【００９１】
６．βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
βIIIチューブリンは、神経細胞の初期〜分化型マーカーである。βIIIチューブリンは、試験例１に記載の免疫組織化学的染色に従って染色した。抗体としては、βIIIチューブリン抗体［ＴｕＪ１、マウスモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；カタログ番号ＭＡＢ１１９５）を２００倍希釈して使用］を用いた。
βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図２６）。【００９２】
７．ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＮｅｕＮは分化した神経細胞のマーカーである。ＮｅｕＮは、試験例１に記載の抗体を用い、試験例１と同様に免疫組織化学的染色を行なった。
ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＮｅｕＮｎとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図２７）。【００９３】
８．リン酸化ｃ−Ｍｅｔとネスチンの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ネスチン陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びネスチンは、試験例１に記載の抗体を用い、試験例１と同様に免疫組織化学的染色を行なった。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、ネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図２８）。【００９４】
９．リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ＤＣＸ陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びＤＣＸは、上記と同様に免疫組織化学的染色を行なった。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図２９）。【００９５】
〔試験例３〕
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ含有ベクターの脊髄投与による脊髄におけるＨＧＦの発現
１．ベクターの構築、製造及び精製
（１）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＨＳＶ−１ベクター
ＨＧＦ遺伝子を挿入したＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクターとしては、試験例１で作成したＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクターを用いた。該ベクターを以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する。
（２）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＡＡＶ−２ベクター及びＡＡＶ−４ベクター
ＡＡＶ  Helper−Free  System（Stratagene，USA；カタログ番号＃２４００７１）キット中に含まれるｐＣＭＶ−ＭＣＳのマルチクローニングサイトにラットＨＧＦ−ＫＴ３［ラットＨＧＦをコードするＤＮＡ（配列番号５）のＣ末端にＫＴ３タグ配列（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’；配列番号７）を付加したもの；Sun，Funakoshiら，J．Neurosci．，2002年，第22巻，p．6537-6548］を挿入した。挿入が正しいことをシークエンスにより確認した。ＮｏｔＩサイトでベクターを２つのフラグメントに開裂し、ラットＨＧＦ−ＫＴ３含む断片をｐＡＡＶ−ＭＣＳを同様にして開列したものと入れ替えることで、ＡＡＶ２−ＨＧＦ作成のためのｐＡＡＶ−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した。ＡＡＶ４−ＨＧＦ作成のためにはｐＡＡＶ−ＭＣＳをＡＡＶ４用に改変したものを用いることで同様に処理し、ｐＡＡＶ4−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，2000年，第97巻，p．3428-3432）。次いで上記キットに含まれるＨＥＫ１９３細胞に、ラットＨＧＦ−ＫＴ３が挿入されたｐＡＡＶ−ＭＣＳをキットの使用説明書に従い導入した。該細胞におけるラットＨＧＦ−ＫＴ３の発現とその活性は、ＥＬＩＳＡ法及びＭＤＣＫ細胞に対する散乱分析法により確認した。得られたベクターをＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦと略記する。【００９６】
２．脊髄実質への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄実質に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、動物をペントバルビター深麻酔下に屠殺した。速やかに脊髄を取り出し、脊髄の上部（upper  spinal；吻側；Ｕ）、中部（middle  spinal；中央部；Ｍ）及び下部（lower  spinal；尾側；Ｌ）の３つの領域に分け、それぞれの脊髄断片を、前記の方法でホモゲナイズした。ＥＬＩＳＡ法にてＨＧＦ蛋白質量を測定した。
その結果を図３０に示す。ベクターを腰髄部の脊髄実質に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、尾側（腰髄を含む）＞＝中央部＞吻側であった。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。【００９７】
３．脊髄腔への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄腔に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、上記脊髄実質への投与における方法と同様に、脊髄を取り出し、脊髄の吻側、中部及び尾側のＨＧＦ蛋白質量を測定した。
その結果を図３１に示す。ベクターを腰髄部の脊髄腔に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、脊髄実質への注射よりＨＧＦの発現量は低かったが、脊髄のいずれの部位［尾側（腰髄を含む）、中央部、吻側］において、ほぼ同じ程度であった。即ち、脊髄腔への投与では、広範囲な神経細胞へのＨＧＦの供給が可能であった。これは、脊髄実質にベクターを投与した場合に比べ、脊髄液により、ベクターが脊髄全体に拡散されたためであると考えられた。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。【００９８】
〔試験例４〕
変異ＨＤエキソン１遺伝子産物のプロセシングに対するＨＧＦの作用
試験例１と同様に作成したＲ６／２マウス、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス及び野生型同腹子マウスを用いた。各マウスを９週齢で屠殺し、試験例１のウエスタンブロッティングの項に記載の方法と同様に線条体ホモゲナイズを調製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離し、分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜は、室温で２時間、１０質量％スキムミルクでブロッキング後、抗ハンチンチン抗体でブロットした。抗ハンチンチン抗体は、ハンチンチン蛋白質のＣ末端部位を認識するヤギポリクロナール抗体（Santa  Cruz社製；カタログ番号ｓｃ−８６７８）を１００倍希釈したものを使用した。次いで、２次抗体（DakoCytomation社製）をコンジュゲートしたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共にインキュベーションし、製品説明書に従ってＥＣＬ  reagents（製品番号ＲＰＮ２１０６，アマシャム・バイオサイエンス社製）で発色させた。
バンドの強度は、Wayre  Rasband氏によって開発されたＮＩＨ（National Institutes  of  Health）イメージソフトウエアを使用して解析された。【００９９】
ウエスタンブロット分析の結果を図３２に示す。野生型同腹子では、ハンチンチン蛋白質が発現されたが、ハンチンチン蛋白質が断片化されたＣ末端フラグメントは殆ど検出されなかった。Ｒ６／２では野生型同腹子に対して、ハンチンチン蛋白質に相当する部位にバンドは殆ど認められず、該蛋白質が断片化されたＣ末端フラグメントが強く検出された。このことは、Ｒ６／２では変異ＨＤエキソン１遺伝子産物のプロセシングによりハンチンチン蛋白質が断片化されることを示している。ＨＳＶ−ＬａｃＺ投与群もＲ６／２と同様であった。一方、ＨＳＶ−ＨＧＦ投与群では、野生型同腹子におけるハンチンチン蛋白質と同位置にバンドが検出されたが、ハンチンチン蛋白質のＣ末端フラグメントの発現は強く抑制された。【０１００】
ウエスタンブロット分析におけるＣ末端フラグメントのバンド強度を、Wayre  Rasband氏によって開発されたＮＩＨ（National Institutes  of  Health）イメージソフトウエアを使用して定量解析した。その結果を図３３に示す。定量解析の結果、ＨＳＶ−ＨＧＦを投与したＲ６／２群では、ＨＳＶ−ＬａｃＺ（コントロールベクター）を投与したＲ６／２群を１００％とした時の３０％未満にＣ末端フラグメントへの断片化が抑制された。この結果は、ＨＧＦが変異ＨＤエキソン１遺伝子産物のプロセシングを抑制させることを示すものである。本結果からも、ＨＧＦはハンチントン舞踏病の発病を抑制させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の治療剤又は発病抑制剤は、ポリグルタミン病の治療又は発病抑制のための薬剤として有用である。
【図２】
2007122976.tif 000003
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図１】
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【図４】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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