(57)【要約】核酸増幅反応において、プライマーが意図しない場所への結合することによって不所望な核酸の断片を生じることがない、適切なプライマーを設計することができるプライマー設計装置、プライマー設計プログラム、及びプライマー設計サーバ装置を提供する。核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理をコンピュータに行わせるための、プライマー設計プログラムであって、複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、２つの部位のうち他方の部位において得られる増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを実行することによって、核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する、プライマー設計プログラム。
2008004691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するための装置であって、
（Ｉ）プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを含む処理命令を入力するための入力部と；
（ＩＩ）前記計算命令Ａを受けて、
複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを含む処理を行うことによって、
前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを決定するための処理部と；
（ＩＩＩ）複数の前記プライマー候補からなるプライマー候補群であって、前記複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の前記増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
前記処理部によって計算された前記相補性の結果と、
前記処理部によって決定された前記一連のプライマーと、
を少なくとも格納するための記憶部と；
（ＩＶ）前記処理部によって決定された前記一連のプライマーを出力するための出力部と；
を備える、プライマー設計装置。
【請求項２】
前記入力部（Ｉ）で入力される前記処理命令は、前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記選出命令Ｂを受けて、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて、前記プライマー候補群を選出することをさらに含み、
前記記憶部（ＩＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及び前記プライマー設計パラメータがさらに格納される、請求の範囲第１項に記載のプライマー設計装置。
【請求項３】
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位についてのプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第２項に記載のプライマー設計装置。
【請求項４】
前記入力部（Ｉ）において入力される前記処理命令は、前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｃを受けて、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含み、
前記記憶部（ＩＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象の核酸配列がさらに格納される、請求の範囲第１項に記載のプライマー設計装置。
【請求項５】
前記入力部（Ｉ）において入力される前記処理命令は、前記プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｄを受けて、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することをさらに含む、請求の範囲第１項に記載のプライマー設計装置。
【請求項６】
核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理を、コンピュータに行わせるための、プライマー設計プログラムであって、
複数のプライマー候補からなるプライマー候補群であって、複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
が少なくとも与えられることにより、
前記プライマー候補と前記増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを受けて、
前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを実行することを含む工程を行うことによって、前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを、前記複数のプライマー候補群から決定するための処理をコンピュータに行わせるための、プライマー設計プログラム。
【請求項７】
前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂを受けることにより、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて前記プライマー候補群を選出することを実行することを含む工程がさらに行われる、請求の範囲第６項に記載のプライマー設計プログラム。
【請求項８】
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位についてのプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第７項に記載のプライマー設計プログラム。
【請求項９】
前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃを受けることにより、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することを実行することを含む工程がさらに行われる、請求の範囲第６項に記載のプライマー設計プログラム。
【請求項１０】
前記プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄを受けることにより、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することを実行することを含む工程がさらに行われる、請求の範囲第６項に記載のプライマー設計プログラム。
【請求項１１】
ネットワークを介して他のコンピュータと通信可能な、核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するためのサーバ装置であって、
（Ｖ）他のコンピュータから送信されてくる、
プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを含む処理命令を受信するための受信部と；
（ＶＩ）前記計算命令Ａを受けて、
複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを含む処理を行うことによって、
前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを、前記複数のプライマー候補群から決定するための処理部と；
（ＶＩＩ）複数の前記プライマー候補からなるプライマー候補群であって、前記複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の前記増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
前記処理部によって計算された前記相補性の結果と、
前記処理部によって決定された前記一連のプライマーと、
を格納するための記憶部と；
（ＶＩＩＩ）前記処理部によって決定された前記一連のプライマーを、他のコンピュータに送信するための送信部と；
を備える、プライマー設計サーバ装置。
【請求項１２】
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記選出命令Ｂを受けて、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて、前記プライマー候補群を選出することをさらに含み、
前記記憶部（ＶＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及び前記プライマー設計パラメータがさらに格納される、請求の範囲第１１項に記載のプライマー設計サーバ装置。
【請求項１３】
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位についてのプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第１２項に記載のプライマー設計サーバ装置。
【請求項１４】
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｃを受けて、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含み、
前記記憶部（ＶＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象の核酸配列がさらに格納される、請求の範囲第１１項に記載のプライマー設計サーバ装置。
【請求項１５】
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｄを受けて、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することをさらに含む、請求の範囲第１１項に記載のプライマー設計サーバ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅用プライマー設計装置、プライマー設計プログラム、及びプライマー設計サーバ装置（Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）に関する。本発明は、解析対象核酸の中から必要な塩基配列を増幅する反応に使用するプライマーを設計するための計算装置、プログラム、及びサーバ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
２つ以上の核酸を同時に増幅する反応として，マルチプレックスＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ポリメラーゼ連鎖反応）が知られている。マルチプレックスＰＣＲを利用して一塩基多型（ＳＮＰ）のタイピングをおこなう技術として、特許文献：特開２００２−３００８９４号公報「一塩基多型タイピング方法」などがある。同技術で示されるように，マルチプレックスＰＣＲは微量の血液から抽出される少量のＤＮＡを効率よく増幅し，多数のＳＮＰをタイピングするのに有用な技術である。
マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーの設計は、例えば以下のようにして行われる。
はじめに、増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から増幅部位（ターゲット）に対応するプライマー候補を選び出す。増幅対象ＤＮＡの塩基配列からプライマー候補を選び出す手法としては、例えば、特許文献：特開２００３−９９４３８号公報「コンピュータを利用して解析対象核酸塩基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計するためのコンピュータソフトウェアプログラム及びその方法」などがある。以下に、増幅対象ＤＮＡの塩基配列からプライマー候補を選び出す手法の例を、図１を参照して説明する。
増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から１つめの増幅部位（ターゲット）Ｘ１に対応するプライマー候補を選び出す。
このとき、プライマー候補は、プライマーの融解温度Ｔｍ、ＧＣ含量、塩基配列の長さ、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマーダイマーの形成のしにくさをあらわすスコアから選び出されるものとする。
Ｔｍ、ＧＣ含量、及び塩基配列の長さが、あらかじめ定めた範囲内に収まっている、ターゲットＸ１に対応するｎ個のプライマー候補のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマーダイマーの形成のしにくさから算出した、プライマー候補の優位性を示すスコアが最も高いものをＰ１１、２番目に高い候補をＰ１２、そしてｎ番目の候補をＰ１ｎと呼ぶことにする。
２つめのターゲットＸ２に対応するｎ’個のプライマー候補Ｐ２１，Ｐ２２，・・・，Ｐ２ｎ’も、上記と同様に選び出す。
すべてのターゲットについて同様の操作を繰り返し、ｍ番目のターゲットＸｍに対応するｋ個のプライマー候補Ｐｍ１，Ｐｍ２，・・・，Ｐｍｋを選び出す。
次に、選び出されたプライマー候補の中から反応に最適なプライマーの組み合わせを選び出すために、異なるターゲットのプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。プライマー同士の相補性を調べることについて記載した文献として、非特許文献：Ｒａｃｈｌｉｎ  Ｊ，Ｄｉｎｇ  Ｃ，Ｃａｎｔｏｒ  Ｃ，Ｋａｓｉｆ  Ｓ．；Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｄｅｏｆｆｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ；ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；２００５  Ｊｕｌ  ２５；６：１０２が挙げられる。
一方、第２０回国際生化学・分子生物学会議バイオインダストリーセミナー（２００６年６月２３日）における、非特許文献：プロメガ株式会社、演者：ダグラス・Ｒ・ストーツ，Ｐｈ．Ｄ．（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｒ．Ｓｔｏｒｔｓ，Ｐｈ．Ｄ．）、「ＰｌｅｘｏｒＴＭ  ｑＰＣＲ  ａｎｄ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍによる定量的マルチプレックス増幅」においては、プライマー設計の際、他のアンプリコンへのミスプライミングを予め排除することが開示されたが、その具体的なアルゴリズムは開示されていない。
【特許文献１】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献２】特開２００３−９９４３８号公報
【非特許文献１】ラクリン・Ｊ（Ｒａｃｈｌｉｎ  Ｊ）、ディング・Ｃ（Ｄｉｎｇ  Ｃ）、カンター・Ｃ（Ｃａｎｔｏｒ  Ｃ）、及びカシフ・Ｓ（Ｋａｓｉｆ  Ｓ）著、ＳＮＰゲノタイピングのためのマルチプレックスＰＣＲアッセイ設計におけるコンピュテーショナルトレードオフ（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｄｅｏｆｆｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、「ビー・エム・シー・ゲノミクス（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、２００５年７月２５日、第６巻、ｐ．１０２
【非特許文献２】プロメガ株式会社、演者：ダグラス・Ｒ・ストーツ，Ｐｈ．Ｄ．（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｒ．Ｓｔｏｒｔｓ，Ｐｈ．Ｄ．）、第２０回国際生化学・分子生物学会議バイオインダストリーセミナー、ＰｌｅｘｏｒＴＭ  ｑＰＣＲ  ａｎｄ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍによる定量的マルチプレックス増幅、２００６年６月２３日
【発明の開示】
【０００３】
発明の目的
プライマー同士の相補性は、以下のようにして調べることができる。
プライマーは通常塩基配列の異なる２つの核酸の組であり、例えば、プライマーＰｘは、２つの核酸ｐｘＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）及びｐｘＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）であらわされる。そして、関数ｐａ（ｉ，ｊ）を塩基配列ｉとｊの相補性を求める関数として表現した場合、ターゲットＸに対するプライマーＰｘと、ターゲットＹに対するプライマーＰｙとの相補性を確かめるためには、プライマーのすべての組み合わせ、すなわちｐａ（ｐｘＦ，ｐｙＦ）、ｐａ（ｐｘＦ，ｐｙＲ）、ｐａ（ｐｘＲ，ｐｙＦ）、及びｐａ（ｐｘＲ，ｐｘＲ）を調べる必要がある。
具体的には、プライマーＰ１１（すなわち核酸ｐ１１Ｆ及びｐ１１Ｒ）と、プライマーＰ２１（すなわち核酸ｐ２１Ｆ及びｐ２１Ｒ）との相補性を調べるために、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｆ），ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｒ），ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｆ），及びｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｒ）を求める。一方で、あらかじめ、相補性のスコア（すなわち上記関数による計算値）の上限値ｐａｍａｘを定めておく。プライマーＰ１１とプライマーＰ２１とについて求めた上記関数による計算値（相補性のスコア）のうち、いずれかがｐａｍａｘを超えていた場合は、Ｐ１１かＰ２１を２番目の候補に置き換える必要があるということになる。どちらを置き換えるかは，他のプライマーとの組み合わせによって計算された相補性のスコアをもとに決めればよい。
まずは、選び出した各ターゲットのプライマー候補のうち優先順位が１番目の候補（Ｐ１１，Ｐ２１，・・・，Ｐｍ１）を、相補性を検証するための対象とし、当該１番目の候補の中から２つを選び出すすべての組み合わせについて、相補性スコアを計算する。計算の結果、ｐａｍａｘを超える相補性スコアを生じたプライマーを、候補からはずす。優先順位が１番目のプライマーが候補からはずされた後は、当該ターゲットにおける２番目のプライマー候補が相補性を検証するための対象となる。このように、プライマー候補は、優先順位の高いものから順に候補をはずされていく。
上記の操作を繰り返し，すべてのターゲットについて，プライマー候補の組み合わせのスコアがｐａｍａｘ以下になるようにする。このようにして求められたプライマーの組み合わせは，異なるターゲットのプライマー同士がプライマーダイマーを形成する可能性が低く、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとなる。
既に述べたように、マルチプレックスＰＣＲは、多数のＳＮＰをタイピングするのに有用な技術である。しかし、その成否の多くは、増幅で用いるプライマーの設計に因っている。上述の従来技術で設計されたプライマーは、実際に増幅反応を行っても増幅されない場合が数多くあった。その理由は次の通りである。
上述した従来技術は、プライマー設計の際に他のプライマーの配列を検査して、相補的な配列を持つプライマーが同時に選出されるのを防ぎ、このことによって、目的の核酸の増幅反応を効率よく行うものである。ところが、増幅反応においては、反応が進むにつれてプライマーの数は減少し、逆に核酸の数が増加していく。その速度は、増幅反応のサイクル数をｎとしたとき、理想的な条件下では２のｎ乗に比例する。すると、反応の初期段階では数が少ないために問題にならなかった増幅核酸が、その数の増加とともに問題になってくる。すなわち、増幅された核酸の塩基配列の中に、意図せずして他のプライマーと同じ塩基配列があった場合、当該プライマーと当該増幅された核酸とで結合してしまい、増幅反応を阻害することになる。
このことを、具体的な例で説明する。０．１６ｎｇ／ｕＬのＤＮＡ８ｕＬについて、２０箇所の増幅部位をマルチプレックスＰＣＲで増幅するとする。ＤＮＡの大きさが３Ｇｂｐであるとき、分子量は約９．９０×１０１１であるから、増幅前のＤＮＡの量は次式で求められる。
（０．１６×１０−９）×８．０÷（９．９０×１０１１）＝１．２９×１０−２１［ｍｏｌ］
一方、プライマー２０組（合計４０種類）が１．２５ｕＭの濃度で０．８３ｕＬ使用されるとすると、プライマーの合計量は、
（１．２５×１０−６）×（０．８３×１０−６）＝１．０４×１０−１２［ｍｏｌ］
となる。この時点では、ＤＮＡ量はプライマー量に比べて圧倒的に少ないため、プライマーが意図しない場所でＤＮＡに結合するリスクは考慮する必要はなく、プライマー同士が意図しない場所で結合するリスクのほうが圧倒的に高い。
次に、マルチプレックスＰＣＲ反応によって増幅された結果、２００ｂｐの核酸２０種類が合計で５０ｎｇ生成されるとすると、その合計の数は、
（５０×１０−９）÷（６．６０×１０４）＝７．５８×１０−１３［ｍｏｌ］
となる。ここでは、２００ｂｐの分子量を６．６０×１０４として計算している。
このように、マルチプレックスＰＣＲの結果、増幅された核酸は反応前のプライマー量とほぼ同程度まで増え、その一方でプライマーは核酸が増えた分だけ数が減ることになる。その結果、プライマー同士が意図しない場所で結合するリスクは低くなり、逆にプライマーと増幅された核酸が意図しない場所で結合するリスクが高くなる。
図２に、プライマーと増幅された核酸が意図しない場所で結合した例を示す。本来プライマーｐ１１Ｆとｐ２１Ｆから、増幅産物としてｘ１１及び［ｘ１１］（ここで、［ｘ１１］はｘ１１に相補的な配列）が生成されるはずである。しかしながら、別の部位を増幅するためのプライマーｐ２１Ｆの一部に、意図せずｘ１１に相補的な配列があるため、ｐ２１Ｆがｘ１１途中に結合してしまう。その結果、本来の増幅産物ｘ１１及び［ｘ１１］よりも短い別の増幅産物ｘ１１’及び［ｘ１１’］（同様に、［ｘ１１’］はｘ１１’に相補的な配列）を多く作ってしまうことになる。すると、目的の増幅産物を十分得ることができない。
また、２つのプライマーが意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率と、プライマーと増幅産物である核酸とが意図せずに相補的な配列を持つ確率との違いにも注目しなければならない。
例えば核酸Ａの３’末端側からａ個の配列と相補的な配列が、大きさｋ［ｍｅｒ］の核酸Ｂの配列の中に含まれている確率は、次式であらわされる。
（１／４）ａ×（ｋ−ａ＋１）
２つのプライマーが意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率、すなわち、プライマーＡの３’末端側配列（ａ＝５とする。）と相補的な配列がプライマーＢ（ｋ＝２０とする。）の中に含まれている確率は、以下のように求められる。
（１／４）５×（２０−５＋１）＝１．６［％］
一方、プライマーと増幅産物である核酸とが意図せずに相補的な配列を持つ確率、すなわち、プライマーＡの３’末端側配列（ａ＝５とする。）と相補的な配列が、増幅された核酸Ｂ（ｋ＝２６０とする。）の中に含まれている確率は、以下のように求められる、
（１／４）５×（２６０−５＋１）＝２５．０［％］
この結果は、２つのプライマーが意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率よりも１６倍高いことを示している。それだけでなく、この確率は、増幅産物が大きくなればなるほど高くなる。
つまり、プライマーの設計の際に、ＰＣＲ反応によって増幅される核酸の配列とプライマーとの配列の相補性を確認していなければ、反応の後半になるに従って増幅反応を阻害する核酸が増加することになる。その結果、目的の核酸が十分得られないだけでなく、プライマーの意図しない場所への結合によって不所望な核酸の断片が多数増幅されることになる。
そこで本発明の目的は、核酸増幅反応において、プライマーが意図しない場所へ結合することによって不所望な核酸の断片を生じることがない、適切なプライマーを設計することができるプライマー設計装置、プライマー設計プログラム、及びプライマー設計サーバ装置を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、ある特定の部位を増幅するためのプライマーと、前記特定の部位以外の部位において生成する増幅産物との相補性を調べることによって、上記本発明の目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。すなわち、本発明は、プライマー設計装置（下記［１］〜［５］）、プライマー設計プログラム（下記［６］〜［１０］）、プライマー設計サーバ装置（下記［１１］〜［１５］）を含む。下記［１］〜［１５］における、「プライマー候補」、「プライマー候補群」、「増幅産物」、及び「増幅産物群」について、以下に概説する。
本発明において、複数の増幅すべき部位を、Ｘ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍとする場合に、プライマー設計のために考慮される核酸種を図６に示している。
プライマー候補は、例えば１番目の増幅部位Ｘ１については、Ｐ１１，Ｐ１２，・・・，Ｐ１ｎのそれぞれをいう。同様に、ｍ番目の増幅部位Ｘｍについては、Ｐｍ１，Ｐｍ２，・・・，Ｐｍｋのそれぞれをいう。
なお、本発明において、プライマーと記載する場合、特に断りの無いかぎり、フォワードプライマーとリバースプライマーの対であることを意味する。従って、例えばプライマー候補Ｐ１１は、フォワードプライマーｐ１１Ｆとリバースプライマーｐ１１Ｒとのプライマー対を意味する。
プライマー候補群は、例えば１番目の増幅部位Ｘ１については、複数のプライマー候補Ｐ１１，Ｐ１２，・・・及びＰ１ｎからなる群をいう。同様に、ｍ番目の増幅部位Ｘｍについては、複数のプライマー候補Ｐｍ１，Ｐｍ２，・・・，及びＰｍｋからなる群をいう。
増幅産物は、例えば１番目の増幅部位Ｘ１については、ｘ１１，［ｘ１１］，ｘ１２，［ｘ１２］，・・・，ｘ１ｎ，［ｘ１ｎ］のそれぞれをいう。同様に、ｍ番目の増幅部位Ｘｍについては、ｘｍ１，［ｘｍ１］，ｘｍ２，［ｘｍ２］，・・・，ｘｍｋ，［ｘｍｋ］のそれぞれをいう。ここで、例えば［ｘ１１］は、ｘ１１に相補的な核酸、［ｘｍ２］はｘｍ２に相補的な核酸、［ｘｍｋ］はｘｍｋに相補的な核酸であることを示す。以下、他の核酸についても同様である。
なお、本明細書において、特に断りの無い限り、プライマー候補から得られる増幅産物とは、プライマー候補を用いた増幅反応を行った場合に理論上生成する増幅産物をいう。従って、例えばｘ１１及び［ｘ１１］は、プライマーＰ１１（すなわちプライマー対ｐ１１Ｆ及びｐ１１Ｒ）を用いて増幅反応を行った場合に、理論上生成する増幅産物である。
増幅産物群は、例えば１番目の増幅部位Ｘ１については、複数の増幅産物ｘ１１，［ｘ１１］，ｘ１２，［ｘ１２］，・・・，ｘ１ｎ，及び［ｘ１ｎ］からなる群をいう。同様に、ｍ番目の増幅部位Ｘｍについては、複数の増幅産物ｘｍ１，［ｘｍ１］，ｘｍ２，［ｘｍ２］，・・・，ｘｍｋ，及び［ｘｍｋ］からなる群をいう。
下記［１］〜［５］は、プライマー設計装置に関する。
［１］
核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するための装置であって、
（Ｉ）プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを含む処理命令を入力するための入力部と；
（ＩＩ）前記計算命令Ａを受けて、
複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを含む処理を行うことによって、
前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを決定するための処理部と；
（ＩＩＩ）複数の前記プライマー候補からなるプライマー候補群であって、前記複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の前記増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
前記処理部によって計算された前記相補性の結果と、
前記処理部によって決定された前記一連のプライマーと、
を少なくとも格納するための記憶部と；
（ＩＶ）前記処理部によって決定された前記一連のプライマーを出力するための出力部と；
を備える、プライマー設計装置。
すなわち、上記［１］は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマー設計において、プライマー候補と増幅産物との相補性を検証することを特徴とする、プライマー設計装置である。
［２］
前記入力部（Ｉ）で入力される前記処理命令は、前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記選出命令Ｂを受けて、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて、前記プライマー候補群を選出することをさらに含み、
前記記憶部（ＩＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及び前記プライマー設計パラメータがさらに格納される、［１］に記載のプライマー設計装置。
［３］
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位に対するプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、［２］に記載のプライマー設計装置。
すなわち、上記［２］及び［３］は、特に、本発明のプライマー設計装置が、プライマー候補の選出も行う形態に向けられる。
［４］
前記入力部（Ｉ）において入力される前記処理命令は、前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｃを受けて、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含み、
前記記憶部（ＩＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象の核酸配列がさらに格納される、［１］〜［３］のいずれかに記載のプライマー設計装置。
すなわち、上記［４］は、特に、本発明のプライマー設計装置が、プライマー候補から増幅産物を計算することも行う形態に向けられる。
［５］
前記入力部（Ｉ）において入力される前記処理命令は、前記プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄをさらに含み、
前記処理部（ＩＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｄを受けて、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することをさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のプライマー設計装置。
すなわち、上記［５］は、特に、本発明のプライマー設計装置が、プライマー候補同士の相補性を検証することも行う形態に向けられる。
下記［６］〜［１０］は、プライマー設計プログラムに関する。
［６］
核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理を、コンピュータに行わせるための、プライマー設計プログラムであって、
複数のプライマー候補からなるプライマー候補群であって、複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
が少なくとも与えられることにより、
前記プライマー候補と前記増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを受けて、
前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを実行することを含む工程を行うことによって、前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを、前記複数のプライマー候補群から決定するための処理をコンピュータに行わせるための、プライマー設計プログラム。
すなわち、上記［６］は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマーをコンピュータによって設計する際に、プライマー候補と増幅産物との相補性を検証する処理を実行させることを特徴とする、プライマー設計プログラムである。本明細書において、プログラムとは、コンピュータによって直接実行可能なものと、ハードディスクなどにインストールすることによって実行可能となるものとを含む。
［７］
前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂを受けることにより、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて前記プライマー候補群を選出することを実行することを含む工程がさらに行われる、［６］に記載のプライマー設計プログラム。
［８］
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位に対するプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、［７］に記載のプライマー設計プログラム。
すなわち、上記［７］及び［８］は、特に、本発明のプライマー設計プログラムが、プライマー候補の選出を行う処理も実行する形態に向けられる。
［９］
前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃを受けることにより、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することを実行することを含む工程がさらに行われる、［６］〜［８］のいずれかに記載のプライマー設計プログラム。
すなわち、上記［９］は、特に、本発明のプライマー設計プログラムが、プライマー候補から増幅産物を計算する処理も実行する形態に向けられる。
［１０］
前記プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄを受けることにより、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することを実行することを含む工程がさらに行われる、［６］〜［９］のいずれかに記載のプライマー設計プログラム。
すなわち、上記［１０］は、特に、本発明のプライマー設計プログラムが、プライマー候補同士の相補性を検証する処理も実行する形態に向けられる。
下記［１１］〜［１５］は、プライマー設計サーバ装置に関する。
［１１］
ネットワークを介して他のコンピュータと通信可能な、核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するためのサーバ装置であって、
（Ｖ）他のコンピュータから送信されてくる、
プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令Ａを含む処理命令を受信するための受信部と；
（ＶＩ）前記計算命令Ａを受けて、
複数の増幅すべき部位から２つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、前記２つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記２つのうち他方の部位において得られる前記増幅産物の配列との相補性を計算しスコア化することを含む処理を行うことによって、
前記複数の部位を増幅するための一連のプライマーを、前記複数のプライマー候補群から決定するための処理部と；
（ＶＩＩ）複数の前記プライマー候補からなるプライマー候補群であって、前記複数の増幅すべき部位のそれぞれに対応するプライマー候補群のデータと、
複数の前記増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞれは、前記増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
前記処理部によって計算された前記相補性の結果と、
前記処理部によって決定された前記一連のプライマーと、
を格納するための記憶部と；
（ＶＩＩＩ）前記処理部によって決定された前記一連のプライマーを、他のコンピュータに送信するための送信部と；
を備える、プライマー設計サーバ装置。
すなわち、上記［１１］は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマーを、上記本発明のプライマー設計プログラムが導入されていないコンピュータによって設計する際にネットワークを介してアクセスするサーバ装置であって、プライマー候補と増幅産物との相補性を検証する処理を行うことを特徴とする、プライマー設計サーバ装置である。本明細書において、ネットワークを介した他のコンピュータとは、端末装置及び他のサーバ装置を含む。
［１２］
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、前記プライマー候補群を選出させるための選出命令Ｂをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記選出命令Ｂを受けて、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて、前記プライマー候補群を選出することをさらに含み、
前記記憶部（ＶＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及び前記プライマー設計パラメータがさらに格納される、［１１］に記載のプライマー設計サーバ装置。
［１３］
前記プライマー設計パラメータが、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位に対するプライマー対のプライマー分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、［１２］に記載のプライマー設計サーバ装置。
すなわち、上記［１２］及び［１３］は、特に、本発明のプライマー設計サーバ装置が、プライマー候補の選出を行う処理も行う形態に向けられる。
［１４］
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、前記増幅産物を計算させるための計算命令Ｃをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｃを受けて、前記複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含み、
前記記憶部（ＶＩＩ）には、少なくとも前記増幅対象の核酸配列がさらに格納される、［１１］〜［１３］のいずれかに記載のプライマー設計サーバ装置。
すなわち、上記［１４］は、特に、本発明のプライマー設計サーバ装置が、プライマー候補から増幅産物を計算する処理を行う形態に向けられる。
［１５］
前記受信部（Ｖ）において受信される前記処理命令は、プライマー候補同士の相補性を計算させるための計算命令Ｄをさらに含み、
前記処理部（ＶＩ）において実行される前記処理は、前記計算命令Ｄを受けて、前記複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、前記２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性を計算することをさらに含む、［１１］〜［１４］のいずれかに記載のプライマー設計サーバ装置。
すなわち、上記［１５］は、特に、本発明のプライマー設計サーバ装置が、プライマー候補同士の相補性を検証する処理も行う形態に向けられる。
上記［１］〜［１５］において、最も適したプライマーをプライマー候補群から決定するための相補性のスコア化においては、｛（ローカルアライメントのスコア）／（アライメントの対象となった配列の長さ）｝を相補性指数として用い、当該相補性指数の小さい核酸同士ほど、相補性が低いと判断することが好ましい。
本発明によると、核酸増幅反応において、プライマーが意図しない場所へ結合することによって不所望な核酸の断片を生じることがない、適切なプライマーを設計することができるプライマー設計装置、プライマー設計プログラム、及びプライマー設計サーバ装置を提供することができる。本発明によって設計されたプライマーは、プライマー同士の配列の相補性だけでなく、増幅反応によって得られる核酸の配列とプライマーの配列の相補性を加味し、反応液中に相補性の高い組み合わせがないように考慮されている。このため、所望の増幅産物を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、従来のプライマー設計法において考慮される核酸種を示した図である。
図２は、従来のプライマー設計法において起こる問題点について説明した図である。
図３は、本発明のプライマー設計装置の全体構成の一例を示す図である。
図４は、図３の装置を、ＣＰＵを用いて実現した場合のハードウェア構成の一例を示す図である。
図５は、本発明のプライマー設計プログラムを用いたプライマー設計装置の記憶部におけるデータ配置図の一例である。
図６は、本発明を用いたプライマー設計法において考慮される核酸種を示した図である。
図７は、本発明のプライマー設計プログラムを用いたプライマー設計方法の一例における処理フローチャートである。
図８は、本発明のプライマー設計プログラムを用いたプライマー設計方法の他の一例における処理フローチャートである。
図９は、本発明のサーバ装置を用いたシステムの全体構成を示す図である。
図１０は、本発明のサーバ装置を用いたプライマー設計方法の一例における処理フローチャートである。
図１１は、実施例におけるプライマー設計法において考慮された核酸種を示した図である。
図１２は、プライマー間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含まれる情報の一部を示す。
図１３は、プライマー及び増幅産物間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含まれる情報の一部を示す。
図１４は、実施例において設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、得られたＰＣＲ産物量を測定した結果を示す。
図１５は、実施例において設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、得られたＰＣＲ産物量を測定した結果を示す。
Ｉ：入力部
ＩＩ：処理部
ＩＩＩ：記憶部
ＩＶ：出力部
１：ＣＰＵ
２：ＲＡＭ
３：キーボード
４：ディスプレイ
５：ハードディスク
６：プログラム記憶部
７：データ記憶部
８：ＯＳ記憶部
１１：増幅部位情報格納領域
１２：組み合わせ情報格納領域
１３：ターゲット配列情報格納領域
１４：プライマー候補情報格納領域
１５：プライマ候補番号情報格納領域
１６：変更フラグ情報格納領域
１７：相補性計算結果情報格納領域
１８：フォワードプライマー情報及びリバースプライマー情報格納領域
１９：増幅産物情報格納領域
２０：プライマー同士間の相補性結果格納領域
２１：プライマー及び増幅産物間の相補性結果格納領域
３０：サーバ装置
３１、３２、及び３３：端末装置
４１：アライメント計算すべき２つのプライマー配列
４２：３’末端のローカルアライメントスコアであることを示す情報
４３：ローカルアライメントスコア
４４：アライメントの対象となった配列の長さ
４５：マッチする塩基の場所を示す情報
５１：アライメント計算すべきプライマー配列
５２：アライメント計算すべき増幅産物配列
５３：３’末端のローカルアライメントスコアであることを示す情報
５４：ローカルアライメントスコア
５５：アライメントの対象となった配列の長さ
５６：マッチする塩基の場所を示す情報
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のプライマー設計装置、プライマー設計プログラム、及びプライマー設計サーバ装置は、プライマー候補と増幅産物との相補性を計算することに特徴を有するものである。
＜１．プライマー設計装置の全体構成＞
本発明のプライマー設計装置は、核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するための装置であって、入力部（Ｉ）、処理部（ＩＩ）、記憶部（ＩＩＩ）、及び出力部（ＩＶ）を含む。図３は、本発明のプライマー設計装置の全体構成を示すブロック図である。
＜１−１．入力部＞
入力部（Ｉ）は、処理命令などを入力するためのものである。また、場合によりプライマー設計に必要な情報、プライマー候補群の情報、増幅産物群の情報などを入力しても良い。
より具体的には、入力部（Ｉ）は、少なくとも処理命令を処理部に与えるためのインターフェイスをいう。入力部（Ｉ）としては、キーボード、マウスなどの、人間とのインターフェイスとなるデバイスと、インターフェイス回路、インターフェイスプログラムなど、他のプログラムや他のコンピュータなどとのインターフェイスとなる手段とが含まれる。
処理命令は、少なくとも、プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させる処理を行うための計算命令Ａを含み、後述の処理部（ＩＩ）に当該処理を実行させるものである。また、処理命令は、プライマー候補群を選出させる処理を行うための選出命令Ｂ、増幅産物を計算させる処理を行うための計算命令Ｃ、及びプライマー候補同士の相補性を計算させる処理を行うための計算命令Ｄをさらに含むことができ、後述の処理部（ＩＩ）に当該処理を実行させるものである。
＜１−２．処理部＞
処理部（ＩＩ）において処理命令を実行する工程の詳細については、後の１−４．プライマー設計プログラムにおいて述べる。
処理部（ＩＩ）は、処理命令すなわち少なくとも計算命令Ａを実行するものをいい、ＣＰＵなどが含まれる。処理部（ＩＩ）は、計算命令Ａを受けることにより、増幅産物とプライマー候補との相補性計算を行う。
増幅産物とプライマー候補との相補性計算を行う際は、増幅すべき複数の部位から２つの部位を任意に選択した場合の、２つの部位のうち一方の部位に対するプライマー候補の配列と、他方の部位における増幅産物の配列との相補性を計算する。
プライマー候補を選出する処理も本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、処理部（ＩＩ）は、処理命令として選出命令Ｂも受け、増幅すべき複数の部位それぞれについて別々に、複数のプライマー候補を選出する処理を行うことができる。
増幅産物の配列を求める処理も本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、処理部（ＩＩ）は、処理命令として計算命令Ｃも受け、増幅すべき部位すべてについて、プライマー候補群に含まれるすべてのプライマー候補によって生成される増幅産物の配列を求める処理を行うことができる。
プライマー候補同士の相補性を計算する処理も本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、処理部（ＩＩ）は、処理命令として計算命令Ｄも受け、増幅すべき複数の部位から２つの部位を任意に選択した場合の、２つの部位のプライマー候補同士の相補性を計算する処理を行うことができる。
このことによって、複数の部位を増幅するための最適な一連のプライマーを、プライマー候補群から決定することができる。
＜１−３．記憶部＞
記憶部（ＩＩＩ）は、プライマー候補群のデータ、増幅産物群のデータ、処理部（ＩＩ）によって計算された相補性の計算結果、及び処理部（ＩＩ）によって決定された最適な一連のプライマーのデータなどを格納するためのものをいい、ＲＡＭなどの主記憶装置及びハードディスクなどの補助記憶装置が含まれる。
記憶すべきデータ・情報は、外部データベースなどから読み込まれるものであっても良いし、本発明のプライマー設計装置によって得られるものであっても良い。外部データベースなどから読み込まれる場合は、記憶すべきデータ・情報は、例えば、ＣＤ−ＲＯＭなどのリムーバブルメディアから、ドライブを介して読み込まれるものであってもよいし、ネットワークを通じて、サーバコンピュータからダウンロードされるものであっても良い。
（プライマー候補群のデータ）
本発明においては、複数の増幅すべき部位のうち、特定の一の増幅すべき部位に対して複数のプライマー候補のデータを用いる。特定の一の増幅すべき部位を増幅することができる異なる複数のプライマー候補を、本明細書ではプライマー候補群と記載する。
従って、プライマー候補群のデータとは、増幅すべき部位１箇所につき複数のプライマー候補に関するデータをいう。プライマー候補は、上述のプライマー設計パラメータを含むプライマー設計情報に基づいて、増幅すべき部位ごとに別個に選出することができるものである。
プライマー候補群のデータとしては、増幅すべき部位１箇所につき複数のプライマー候補の情報を少なくとも含み、さらに、各々のプライマー候補の優先順位の情報を含むことができる。プライマー候補の情報としては、具体的には、少なくともプライマー候補の配列情報を含み、さらに、プライマー候補の位置情報や大きさの情報を含むことができる。プライマー候補の優先順位においては、前記プライマー設計パラメータをより好ましく満たすものをより優先順位が高いものとすることができる。
（増幅産物群のデータ）
増幅産物群のデータは、増幅すべき部位１箇所につき複数の増幅産物の情報を少なくとも含み、さらに、当該増幅産物に対応するプライマー候補の優先順位の情報を含むことができる。増幅産物の情報としては、具体的には、少なくとも増幅産物の配列情報を含み、さらに、増幅産物の配列の大きさを含むことができる。
なお、増幅産物とは、プライマー候補を増幅反応に用いた場合に理論上生成する増幅産物のことをいう。
（相補性の結果）
相補性の結果としては、相補性を評価することができるスコアを含むものであればどのようなものでも良い。スコアの取り方は、当業者によって適宜決定することができるため、特に限定されないが、例えば、比較対象となる核酸間における配列においてマッチする塩基の長さ、或いは、比較対象となる核酸間における配列においてマッチする塩基の割合に相当する量などをスコアとしてとることができる。
本発明では、相補性に基づくローカルアライメントによるスコア（以下、ｓｃｏｒｅと記載する場合がある）と、アライメントの対象となった配列の長さ（以下、ｌｅｎｇｔｈと記載する場合がある）との比（以下、ｒａｔｉｏと記載する場合がある）、言い換えれば、ｓｃｏｒｅをｌｅｎｇｔｈで割った値を、相補性評価のための指数（相補性指数）として用いることが特に好ましい。ここで、ｌｅｎｇｔｈがより大きく且つｓｃｏｒｅがより小さいことは、相補性が低いことを表す。従って、ｌｅｎｇｔｈに対するｓｃｏｒｅの割合として示されるｒａｔｉｏは、その値が小さいほど、対象となる２つの配列の相補性が低いことを表す。本発明の好ましい相補性スコアであるｒａｔｉｏ値は、特に、プライマー候補と増幅産物間の相補性計算によって算出される値である場合、当該プライマー候補を用いた複数部位の増幅を実際に行ったときに生成する増幅産物の量と良い相関を示すことが本発明者らによって見出されており、大変信頼性の高い値である。
（最適な一連のプライマーのデータ）
処理部（ＩＩ）において、増幅すべき部位それぞれについて、少なくともプライマー候補と増幅産物との組み合わせ全てについて相補性が評価された結果、プライマー候補群中最も相補性の評価が良いプライマー候補が最適なプライマー候補として決定される。
従って、最適な一連のプライマーのデータは、全ての増幅すべき部位からそれぞれ決定された、上記のようなプライマー候補のセットについてのデータであり、少なくとも配列情報を含むものである。
（その他の情報）
記憶部（ＩＩＩ）には、上記のデータ以外に、以下の情報が含まれていてよい。
例えば、増幅対象となる核酸の配列、及び複数の増幅すべき部位の情報が含まれてよい。増幅すべき部位の情報としては、少なくとも増幅すべき部位の位置情報を含み、さらに、増幅すべき部位の配列や当該配列の大きさなどを含むことができる。
また、プライマーが最低限満たすべきパラメータである、プライマー設計パラメータが含まれてよい。プライマー設計パラメータとしては、融解温度、ＧＣ含量、塩基長、増幅産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、１つの部位に対するプライマー対のプライマー分子間における相補性（すなわちプライマーダイマーの形成しやすさ）又はプライマー分子内における相補性（すなわちヘアピン構造の形成のしやすさ）などを表すパラメータが含まれる。また、これらパラメータの優先順位も含まれていて良い。
さらに、増幅すべき部位から２つを選ぶ全ての組み合わせの情報が含まれていてよい。それぞれの組み合わせにおいて組み合わせられた２つの部位について、一方の部位を増幅するためのプライマー候補と、他方の部位で生成しうる増幅産物との相補性の計算が、処理部（ＩＩ）で行われうる。さらに、当該２つの部位について、一方の部位に対するプライマー候補と、他方の部位に対するプライマー候補との相補性の計算が、処理部（ＩＩ）で行われても良い。
さらに記憶部（ＩＩＩ）には、上記のデータ・情報以外に、処理部（ＩＩ）における計算が行われている間にプライマー候補を識別するためのフラグの情報が含まれていても良い。
上述した各データ・情報は、例えば後述の図５に示すような配置で記憶部（ＩＩＩ）に格納されてよい。
＜１−４．出力部＞
出力部（ＩＶ）は、少なくとも決定された最適な一連のプライマーを出力するためのものをいい、ディスプレイなどが含まれる。最適なプライマーの出力の形態としては、プライマー配列そのものの出力、及びプライマー配列を含むデータファイルの出力が含まれる。出力とは、表示、印刷だけでなく、データとして他のプログラムや装置に与える場合も含む概念である。
＜２．プライマー設計装置の動作概要＞
本発明のプライマー設計装置の動作概要の一例を以下に記載する。なお、処理部（ＩＩ）において処理命令を実行する工程の詳細については、後の１−４．プライマー設計プログラムにおいて述べる。
記憶部（ＩＩＩ）に、プライマー候補群データ、及び増幅産物群データが格納されている。プライマー候補群データには、複数のプライマー候補の配列情報とともに、各々のプライマー候補の優先順位の情報を含むことができる。増幅産物群のデータには、増幅産物の配列情報とともに、当該増幅産物に対応するプライマー候補の優先順位の情報を含むことができる。
入力部（Ｉ）に処理命令として計算命令Ａが入力されると、記憶部（ＩＩＩ）に格納されたプライマー候補群データ、及び増幅産物群データが、処理部（ＩＩ）に送られ、プライマー候補と増幅産物との相補性の計算が行われる。相補性の計算結果は、記憶部（ＩＩＩ）に格納される。
本発明のプライマー設計装置においては、上記のプライマー候補と増幅産物との相補性の計算以外に、プライマー候補を選出する工程、増幅産物の配列を求める工程、及び／又は、プライマー候補同士の相補性を計算する工程を行うことができる。
プライマー候補を選出する工程を本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、入力部（Ｉ）から処理命令として選出命令Ｂも受けることにより、処理部（ＩＩ）は、記憶部（ＩＩＩ）から、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータを呼び出し、増幅すべき複数の部位それぞれについて別々に、複数のプライマー候補を選出する処理を行うことができる。選出されたプライマー候補のデータは、記憶部（ＩＩＩ）に格納される。
増幅産物の配列を求める工程を本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、入力部（Ｉ）から処理命令として計算命令Ｃも受けることにより、処理部（ＩＩ）は、記憶部（ＩＩＩ）から、少なくとも増幅対象となる核酸の配列とプライマー候補配列とを呼び出し、増幅産物を計算する処理を行うことができる。求められた増幅産物のデータは、記憶部（ＩＩＩ）に格納される。
プライマー候補同士の相補性を計算する工程を本発明のプライマー設計装置にて行う場合は、入力部（Ｉ）から処理命令として計算命令Ｄも受けることにより、処理部（ＩＩ）は、記憶部（ＩＩＩ）から、少なくともプライマー候補の情報を呼び出し、プライマー候補同士の相補性を計算することができる。相補性の計算結果は、記憶部（ＩＩＩ）に格納される。
処理部（ＩＩ）は、プライマー候補と増幅産物との相補性の計算を含む、プライマー設計のための全ての処理が終了した際、各増幅部位において優先順位がもっとも高いプライマー同士を、最適な一連のプライマーとして決定することができる。計算された相補性の結果及び決定された一連のプライマーのデータは、記憶部（ＩＩＩ）に格納される。記憶部（ＩＩＩ）に格納された最適な一連のプライマーのデータは、出力部（ＩＶ）に出力される。
＜３．ハードウェア構成＞
図３の処理部を、中央演算処理装置ＣＰＵを用いて実現した場合、本発明のプライマー設計装置は、パーソナルコンピュータとして実現される。この場合、他の構成要素としては、キーボードが入力部として、ディスプレイが出力部として、ＲＡＭなどの主記憶装置及びハードディスクなどの補助記憶装置が記憶部として実現される。
本発明のプライマー設計装置のハードウェア構成を図４に示す。図４において、ＣＰＵ１には、ＲＡＭ２、キーボード３、ディスプレイ４、及びハードディスク５が接続されている。ハードディスクには、プライマー設計プログラム記憶部６、データ記憶部７、及びオペレーティングシステム（ＯＳ）記憶部８などの領域があり、それぞれ、プライマー設計プログラム、データ、ＯＳが記憶されている。プライマー設計プログラムが起動されると、当該プログラムがハードディスク５からＲＡＭ２にロードされた後、ＣＰＵ１に送られて計算などの処理が行われ、その結果がＲＡＭ２に書き戻される。この一連の動作により、本発明の機能が奏されるようになっている。
前述の１−３．記憶部で挙げたそれぞれのデータ・情報は、図４におけるデータ記憶部７に格納されている。より詳しくは、例えば図５に示すように、データ記憶部は、複数の増幅部位それぞれについての情報が格納される領域１１、及び、それら増幅部位から２つの部位を選び出す組み合わせの情報が格納される領域１２を有することができる。
増幅部位についての情報の領域１１のそれぞれは、増幅ターゲットとなる配列情報の領域１３、及び、当該増幅ターゲットを増幅することができるプライマー候補情報の領域１４を有することができる。当該領域１３は、増幅ターゲットとなる塩基配列情報の領域、及び当該増幅ターゲットとなる配列の大きさ情報の領域を有することができる。当該領域１４のそれぞれは、フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）側のプライマー候補（以下、フォワードプライマーと記載する）及びリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）側のプライマー候補（以下、リバースプライマーと記載する）の情報の領域１８、及び、当該当該プライマー候補によって生成しうる増幅産物の情報の領域１９を有することができる。
当該領域１８は、フォワードプライマーの配列情報の領域、リバースプライマーの配列情報の領域、フォワードプライマーの位置情報の領域、リバースプライマーの位置情報の領域、フォワードプライマーの配列の大きさ情報の領域、及びリバースプライマーの配列の大きさ情報の領域を有することができる。当該領域１９は、プライマー候補によって生成しうる増幅産物の配列情報の領域、及び、当該増幅産物の配列の大きさ情報の領域を有することができる。
増幅部位から２つの部位を選び出す組み合わせの情報の領域１２は、組み合わせられた部位の番号情報の領域１５、当該部位における優先順位の変更フラグの情報の領域１６、及び、当該組み合わせにおける相補性の計算結果の領域１７を有することができる。
当該領域１７は、当該組み合わせられた部位におけるプライマー候補と増幅産物との相補性の計算結果の領域２１、及び、当該組み合わせられた部位におけるプライマー候補同士の相補性の計算結果の領域２０を有することができる。
＜４．プライマー設計プログラム＞
本発明の一実施形態であるプライマー設計プログラムは、核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理を、コンピュータに行わせるためのプログラムである。本発明のプライマー設計プログラムは、本発明のプライマー設計装置及びプライマー設計サーバ装置に導入されて好ましく用いられる。
本発明のプライマー設計プログラムにより、プライマー候補と増幅産物との相補性を計算する処理が少なくとも行われる。プライマー候補と増幅産物との相補性計算に際し、プライマー候補群のデータ、及び増幅産物群のデータが与えられる。これら情報・データの詳細、及び、その他与えられうる情報・データについては、上記１．プライマー設計装置の全体構成の１−３．記憶部において述べたとおりである。
プライマー候補と増幅産物との相補性の計算は、計算命令Ａを受けることによって行われる。具体的には、計算命令Ａを受けることにより、複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択した場合の、２つの部位のうち一方の部位に対するプライマー候補の配列と、２つの部位のうち他方の部位において得られる増幅産物の配列との相補性を計算する処理とが行われる。プライマー候補と増幅産物との相補性の計算の際には、計算結果（すなわち算出された相補性スコア）が、あらかじめ定めた相補性スコアの条件を満たさない場合、プライマー候補の優先順位が書き換えられる。プライマー候補と増幅産物との組み合わせ全てにおいて、相補性スコアの条件を満たすように、プライマー候補の優先順位を書き換えながら相補性計算を繰り返すことができる。
プライマー候補と増幅産物との相補性を計算する処理の前には、プライマー候補を選出する処理と、増幅産物を求める処理とを行うことができる。また、プライマー候補と増幅産物との相補性を計算する処理は、適宜、増幅反応液中に存在する核酸種同士の相補性を検証するための他の処理とともに行われてよい。例えば、プライマー候補を選出する処理工程が行われた後、プライマー候補と増幅産物との相補性の計算処理と、プライマー候補同士の相補性の計算処理とが行われて良い。この場合、プライマー候補と増幅産物との相補性の計算処理と、プライマー候補同士の相補性の計算処理とは、どちらが先に行われてもよい。
プライマー候補を選出する処理は、選出命令Ｂを受けることによって行われる。具体的には、選出命令Ｂを受けることにより、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー設計パラメータに基づいて、プライマー候補群が選出される。
増幅産物を求める処理は、計算命令Ｃを受けることによって行われる。具体的には、記計算命令Ｃを受けることにより、複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記プライマー候補の配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物が計算される。
プライマー候補同士の相補性の計算を行う処理は、計算命令Ｄを受けることによって行われる。具体的には、計算命令Ｄを受けることにより、複数の増幅すべき部位から２つの部位を任意に選択する場合の、２つの部位のうち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、２つの部位のうち他方の部位についてのプライマー候補の配列との相補性が計算される。
プライマー設計のための全ての処理が終了した際、各増幅部位において優先順位がもっとも高いプライマー同士を、最適な一連のプライマーとして決定することができる。
以下、図６を参照し、本発明のプログラムを用いたプライマー設計方法の例を示すフローチャートを挙げて、本発明のプログラムについて説明する。
＜４−１．処理フローチャート１＞
図７は、本発明のプログラムを用いたプライマー設計方法の一例を示すフローチャートである。当該フローチャート１は、入力工程Ｓ１１、プライマー候補選出工程Ｓ１２、プライマー間の相補性計算工程Ｓ１３、プライマー及び増幅産物間の相補性計算工程Ｓ１５、及び、出力工程Ｓ１７を含む。
Ｓ１１においては、増幅対象となる核酸の配列、増幅すべき部位の情報、及び、プライマー設計パラメータが入力される。ここでは、図６に示すように、ｍ箇所の増幅部位（ターゲットＸ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍ）を増幅するものとする。さらにＳ１１においては、計算命令Ａ、選出命令Ｂ、計算命令Ｃ、及び計算命令Ｄが入力される。
Ｓ１２においては、選出命令Ｂを受け、増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から、ｍ箇所の増幅部位（ターゲットＸ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍ）それぞれについて、別々にプライマー候補を選び出す。ここでは、ｍ番目のターゲットＸｍに対するｋ個のプライマー候補をＰｍ１，Ｐｍ２，・・・，Ｐｍｋとする。
Ｓ１３−Ｓ１４においては、計算命令Ｄを受け、異なるターゲットにおけるプライマー候補同士が、意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。
Ｓ１５−Ｓ１６においては、計算命令Ｃ及びＡを受け、プライマー候補を用いた増幅反応によって生成しうる増幅産物とプライマー候補とが、意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。
まずＳ１３において、ｍ個の増幅部位Ｘ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍから２つの部位を選び出すすべての組み合わせにおいて、１番目のプライマー候補同士の配列の相補性を示すスコアをそれぞれ計算する。言い換えれば、各ターゲットのプライマー候補のうち、１番目のプライマー候補Ｐ１１，Ｐ２１，・・・，Ｐｍ１の中から２つを選び出すすべての組み合わせについて、配列の相補性を示すスコアをそれぞれ計算する。具体的には、上記背景技術において述べたとおりである。すなわち、例えば、ｍ個の増幅部位Ｘ１，Ｘ２，・・・，ＸｍからＸ１とＸ２とを選び出す組み合わせにおいて、プライマー候補間の相補性を調べる場合は、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｆ），ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｒ），ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｆ），及びｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｒ）を求めることによって、相補性スコアを算出する。ここでは、関数ｐａ（ｉ，ｊ）を、塩基配列ｉとｊの相補性を求める関数として表現している。一方で、あらかじめ、相補性スコア上限値ｐａｍａｘを定めておく。そして、相補性スコアの計算値がｐａｍａｘを超えているかを検証する。当該計算値が、当該上限を超える場合は、プライマー候補を２番目の候補に置き換えることによって優先順位の書き換えを行う。そして、置き換えられた候補について、上記と同様に相補性スコアの計算、検証、及び必要に応じプライマー候補の優先順位の書き換えを行う。このように、相補性スコアの算出とプライマー候補の優先順位の書き換えとを繰り返す。
Ｓ１４において、すべての増幅部位の組み合わせにおいて、相補性スコアの計算値がｐａｍａｘ以下となる条件を満たしているかどうか、判断する。当該条件を満たしていれば（Ｙｅｓ）、Ｓ１５の工程に進む。当該条件を満たしていなければ（Ｎｏ）、Ｓ１２に戻る。この場合、Ｓ１２のプライマー候補選出において、より優先順位の低いプライマー候補を選出するか、プライマー設計パラメータの条件を変えてプライマー候補を選出するか、或いは、プライマー候補選出方法自体を変更してプライマー候補を選出するか、などの方法を行い、Ｓ１４における条件が満たされるまで、Ｓ１２〜Ｓ１４の工程を行う。
Ｓ１５においては、ｍ個の増幅部位Ｘ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍから２つの部位を選び出すすべての組み合わせにおいて、一方の増幅部位における１番目のプライマー候補と、他方の増幅部位における１番目のプライマー候補によって生成する増幅産物との相補性を示すスコアをそれぞれ計算する。
Ｓ１５においては、まず、選出されたプライマー候補を核酸増幅反応に用いた場合に生成しうる増幅産物を計算する。増幅産物の計算の方法としては特に限定されず、当業者によって適宜行われる。例えば、増幅対象となる核酸の配列と増幅すべき部位の位置情報とから増幅産物を求めることができる。
次に、相補性スコアの計算を行う。例えば、ｍ個の増幅部位Ｘ１，Ｘ２，・・・，ＸｍからＸ１とＸ２とを選び出す組み合わせにおいて、プライマー候補と増幅産物の相補性を調べる場合は、次の核酸種の組み合わせについて相補性を示すスコアを計算する。
ここで、ターゲットＸ１の１番目のプライマー候補Ｐ１１（フォワードプライマーｐ１１Ｆ及びリバースプライマーｐ１１Ｒ）から核酸増幅反応によって生成する増幅産物の配列をｘ１１及び［ｘ１１］とし、ターゲットＸ２の１番目のプライマー候補Ｐ２１（フォワードプライマーｐ２１Ｆ及びリバースプライマーｐ２１Ｒ）から核酸増幅反応によって生成する増幅産物の配列をｘ２１及び［ｘ２１］とする。
プライマー候補Ｐ２１による増幅産物と、プライマー候補Ｐ１１との相補性については、相補性を示すスコアの算出は、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｘ２１）、ｐａ（ｐ１１Ｆ，［ｘ２１］）、ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｘ２１）、及びｐａ（ｐ１１Ｒ，［ｘ２１］）の計算によって行うことができる。
また、プライマー候補Ｐ１１による増幅産物と、プライマーＰ２１との相補性については、相補性を示すスコアの計算は、ｐａ（ｐ２１Ｆ，ｘ１１）、ｐａ（ｐ２１Ｆ，［ｘ１１］）、ｐａ（ｐ２１Ｒ，ｘ１１）、及びｐａ（ｐ２１Ｒ，［ｘ１１］）の算出によって行うことができる。
一方で、あらかじめ、増幅産物とプライマー候補との間の相補性スコア（すなわち上記関数による計算値）の上限値ｐａｍａｘ−ｐｒｏｄｕｃｔを定めておく。そして、増幅産物とプライマー候補との間の相補性を示す上記関数による計算値が、上限値ｐａｍａｘ−ｐｒｏｄｕｃｔを超えているか否かを検証する。当該計算値が、当該上限値を超える場合は、プライマー候補又は増幅産物を２番目の候補に置き換えることによって優先順位の書き換えを行う。そして、置き換えられた候補について、上記と同様に相補性スコアの計算、検証、及び必要に応じ優先順位の書き換えを行う。このように、相補性スコアの算出と優先順位の書き換えとを繰り返す。
Ｓ１６において、すべての増幅部位の組み合わせについて、相補性スコアの計算値がｐａｍａｘ−ｐｒｏｄｕｃｔ以下となる条件を満たしているかどうか、判断する。当該条件を満たしていれば（Ｙｅｓ）、Ｓ１７の工程に進む。当該条件を満たしていなければ（Ｎｏ）、Ｓ１２に戻る。この場合、Ｓ１２におけるプライマー候補選出方法を変え、Ｓ１６における条件が満たされるまで、Ｓ１２〜Ｓ１６の工程を行う。
上述の工程によって、すべての増幅部位について、プライマー候補どうしの組み合わせのスコアがｐａｍａｘ以下であり、プライマー候補と生成される核酸の組み合わせのスコアがｐａｍａｘ−ｐｒｏｄｕｃｔ以下であるプライマー候補が得られる。このようなプライマー候補が、最適なプライマーとして決定され、Ｓ１７において、当該最適なプライマーが出力される。
＜４−２．処理フローチャート２＞
図８は、本発明のプログラムを用いたプライマー設計方法の他の一例を示すフローチャートである。フローチャートの他の一例を示す。当該フローチャート２は、入力工程Ｓ２０１、増幅産物計算工程Ｓ２０２、プライマー間の相補性計算工程Ｓ２０７、プライマー及び増幅産物間の相補性計算工程Ｓ２０８、及び、出力工程Ｓ２１３を含む。当該フローチャート２についての下記説明においては、相補性計算後、相補性スコアの条件を満たすかどうかの判断、及びプライマーの優先順位を書き換えるプロセスについて、より詳しく述べる。その他、相補性計算を行うプロセスなどについては、上記フローチャート１における例と同様である。
Ｓ２０１においては、増幅対象となる核酸の配列、増幅すべき部位の情報、及びプライマー候補データが入力される。このとき、例えば、これら情報・データが書き込まれたファイル形式で入力を行うことができる。ｍ箇所の増幅部位（ターゲットＸ１，Ｘ２，・・・，Ｘｍ）を増幅するものとすると、増幅すべき部位の情報は、前述の図５に示す、増幅部位Ｘ１情報〜増幅部位Ｘｍ情報の領域１１に格納される。プライマー候補データは、これら増幅部位情報の領域１４に格納される。さらにＳ２０１においては、計算命令Ａ、計算命令Ｃ、及び計算命令Ｄが入力される。
Ｓ２０２においては、計算命令Ｃを受け、増幅対象となる核酸の配列及び増幅すべき部位の情報から、増幅産物が計算される。計算された増幅産物のデータは、図５に示す、プライマー候補情報の領域１４における増幅産物の情報の領域１９に格納される。
Ｓ２０３においては、プライマー候補同士間の相補性スコアの上限値、及び、プライマー候補及び増幅産物間の相補性スコアの上限値の設定を行う。ユーザが当該上限値を入力してもよいが、この例においては、あらかじめ値が書き込まれていてよい。
Ｓ２０４においては、各プライマー候補におけるプライマー候補変更フラグを、すべてＴＲＵＥにする。このフラグがＴＲＵＥであるプライマー候補は、後述のＳ２０６の分岐後、プライマー候補同士間の相補性スコア、及びプライマー候補及び増幅産物間の相補性スコアの計算を実行することになる。一番初めの状態では、全てのプライマー候補について計算をするため、初期状態として、全てのフラグをＴＲＵＥにする。
Ｓ２０５においては、その後の工程において、増幅部位から２箇所を選び出す全ての組み合わせについて、プライマー候補同士間の相補性スコアの計算と、プライマー候補及び増幅産物間の計算とを実行することを命令する。例えば、図５に示す、組み合わせ情報の領域１２に格納された組み合わせ１について、Ｓ２０６〜Ｓ２０９の処理が行われ、組み合わせ２について、Ｓ２０６〜Ｓ２０９の処理が行われる、というように、全ての組み合わせについて、Ｓ２０６〜Ｓ２０９の処理が繰り返し行われる。なお当該計算は、ＴＲＵＥのフラグが付されているプライマー候補及びそれによって生成しうる増幅産物のうち、もっとも優先順位が高いものについて行われる。
Ｓ２０６においては、プライマー候補変更フラグがＴＲＵＥかどうかを判断する。ここで、プライマー候補変更フラグとしては、計算がまだ行われていない増幅部位の組み合わせにおけるプライマー候補に対してはＴＲＵＥが付され、すでに計算済みの増幅部位の組み合わせにおけるプライマー候補に対してはＦＡＬＳＥが付されるものとする。フラグ情報は、図５に示す、組み合わせ情報の領域１２における候補変更フラグの領域１６に格納されている。プライマー候補変更フラグがＴＲＵＥであれば、その部位の組み合わせについて相補性の計算を行う。プライマー候補変更フラグがＦＡＬＳＥであれば、その部位の組み合わせについては同じ計算を繰り返さずに、計算対象部位を次の部位の組み合わせに移す。
Ｓ２０７においては、プライマー候補同士間の相補性スコアを計算する。計算結果は、図５に示す、相補性計算結果の領域１７における、プライマー候補同士の相補性の計算結果の領域２０に格納される。例えば、増幅部位Ｘ１とＸ２とを選ぶ組み合わせにおいては、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｆ）の計算結果は１−Ｆｏｒｗａｒｄ  ｘ  ２−Ｆｏｒｗａｒｄ、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｐ２１Ｒ）の計算結果は１−Ｆｏｒｗａｒｄ  ｘ  ２−Ｒｅｖｅｒｓｅ、ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｆ）の計算結果は１−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｘ  ２−Ｆｏｒｗａｒｄ、ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｐ２１Ｒ）の計算結果は１−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｘ  ２−Ｒｅｖｅｒｓｅの各領域に格納される。
Ｓ２０８においては、プライマー候補及び増幅産物間の相補性スコアを計算する。計算結果は、図５に示す、相補性計算結果の領域１７における、プライマー候補と増幅産物との相補性の計算結果の領域２１に格納される。例えば、増幅部位Ｘ１とＸ２とを選ぶ組み合わせにおいては、ｐａ（ｐ１１Ｆ，ｘ２１）及びｐａ（ｐ１１Ｆ，［ｘ２１］）の計算結果は１−Ｆｏｒｗａｒｄ  ｘ  ２−Ｐｒｏｄｕｃｔ、ｐａ（ｐ１１Ｒ，ｘ２１）及びｐａ（ｐ１１Ｒ，［ｘ２１］）の計算結果は１−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｘ  ２−Ｐｒｏｄｕｃｔ、ｐａ（ｐ２１Ｆ，ｘ１１）及びｐａ（ｐ２１Ｆ，［ｘ１１］）の計算結果は２−Ｆｏｒｗａｒｄ  ｘ  １−Ｐｒｏｄｕｃｔ、ｐａ（ｐ２１Ｒ，ｘ１１）及びｐａ（ｐ２１Ｒ，［ｘ１１］）の計算結果は２−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｘ  １−Ｐｒｏｄｕｃｔの各領域に格納される。
Ｓ２０９においては、上記Ｓ２０７及びＳ２０８で計算済みとなった組み合わせにおけるプライマー候補変更フラグをＦＡＬＳＥに変える。
Ｓ２１０においては、上記Ｓ２０７又はＳ２０８で得られた相補性スコアの計算値が、上記Ｓ２０３において設定した上限値を超えているものと、上記Ｓ２０７及びＳ２０８で得られた相補性スコアの計算値が、上記Ｓ２０３において設定した上限値を超えていないものとで分岐する。当該計算値が当該上限値を超えている場合は、Ｓ２１１へ、そうでない場合は、Ｓ２１３へ進む。
Ｓ２１１においては、上記Ｓ２０７又はＳ２０８で得られた相補性スコアの計算値が、上記Ｓ２０３において設定した上限値を超えたプライマー候補を、相補性の計算の対象からはずすために、計算すべきプライマー候補を、次の優先順位のプライマー候補へ書き換える。
Ｓ２１２においては、上記Ｓ２１１で優先順位が繰上げられたプライマー候補を含む組み合わせについて、再び上記Ｓ２０７及びＳ２０８の計算を行う必要があるため、当該計算を行うべき当該組み合わせのプライマー候補のフラグを、全てＴＲＵＥに書き換える。その後、再びＳ２０５へ戻る。
Ｓ２１３においては、増幅部位から２箇所を選ぶ全ての組み合わせにおいて、上記Ｓ２０７及びＳ２０８の計算結果が、Ｓ２０３で設定された相補性スコアの上限値以下の条件を満たし、且つ優先順位の最も高いプライマー候補を、増幅反応に用いるプライマーとして決定し、出力することができる。このとき、例えば、決定されたプライマーの配列が書き込まれたファイル形式で出力を行うことができる。
＜５．プライマー設計サーバ装置＞
本発明のプライマー設計サーバ装置は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマーを、他のコンピュータによって設計する際に、ネットワークを介して通信することができるサーバ装置であって、プライマー候補と増幅産物との相補性を検証する処理を行うことを特徴とするサーバ装置である。ネットワークを介した他のコンピュータには、端末装置及び他のサーバ装置が含まれる。ネットワークとしては、インターネットやＬＡＮなどが挙げられる。本発明のサーバ装置は、通信のための受信部（Ｖ）、送信部（ＶＩＩＩ）、及び、上記本発明のプライマー設計装置と同様に処理部（ＶＩ）及び記憶部（ＶＩＩ）を有するものであり、受信部（Ｖ）、送信部（ＶＩＩＩ）を備える以外は上記本発明のプライマー設計装置と同様のハードウェア構成を有する（図示せず）。
本発明の一実施形態であるプライマー設計サーバによるシステムの例を図９に示す。この例においては、サーバ装置３０と端末装置３１、３２、３３・・・が、インターネットを介して接続されている。サーバ装置は、３０は、本発明のプライマー設計プログラムが記録されており、ウェブサーバとして機能するものである。端末装置３１、３２、３３・・・には、ウェブサイトを閲覧するための閲覧プログラムが記録されている。端末装置３１、３２、３３・・・は、サーバ装置３０にアクセスすることにより、プライマー設計を行うことができる。端末装置３１、３２、３３・・・も、通信のための受信部及び送信部を有することを除いては、本発明のプライマー設計装置と同様のハードウェア構成を有する。
本発明のプライマー設計サーバ装置の記憶部は、ユーザ或いはユーザの属するグループごとに、前記図５に示したような一連のデータ領域を設けている。これら領域は、それぞれユーザ識別子やグループ識別子などによって識別されている。
＜５−１．処理フローチャート＞
図１０に、本発明のプライマーサーバ設計装置を用いたプライマー設計方法の一例を示すフローチャートである。当該フローチャートにおいては、Ｓ３０５でプライマー設計処理が行われる。Ｓ３０５で行われる処理は、図７及び図８で示したとおりである。
本発明のサーバ装置は、Ｓ３０１において、クライアントからサーバに接続の要求があるまで待つ。Ｓ３０２において、クライアントに入力画面を送信する。ここでは、例として、本発明のサーバにＷＷＷサーバの機能を持たせて、ＴＣＰ／ＩＰによってＨＴＭＬ形式で送信することを想定する。一方、クライアント側はウェブブラウザによって入力画面を表示し、以下の入力等を行う。
Ｓ３０３においては、クライアントからのプライマーの設計に必要な情報が入力されるのを待つ。一方、クライアント側は、例えば塩基配列を入力する場合は、最も一般的なＦＡＳＴＡ形式で入力する。
Ｓ３０４においては、入力された情報が正しいかどうかを判定する。入力された情報が正しければ（ＹＥＳ）、Ｓ３０５に進み、間違っていれば（Ｎｏ）、Ｓ３０９に進む。Ｓ３０９においては、入力が間違っていることを示す画面をクライアントに送信する。
Ｓ３０５においては、入力された情報をもとに，プライマーの設計を行う。このアルゴリズムは、図７及び図８と同様である。
Ｓ３０６においては、プライマー設計が成功であるかどうかを判定する。プライアー設計が成功であれば（ＹＥＳ）、Ｓ３０７に進み、失敗であれば（Ｎｏ）、Ｓ３１０に進む。Ｓ３１０においては、設計に失敗したことを示す画面をクライアントに送信する。
Ｓ３０７においては、設計した結果及びそれを表示する画面をクライアントに送信する。
Ｓ３０８においては、クライアントからの接続が切断されればＹＥＳに進み、終了する。なお、このタイミングに限らず、いつでもクライアントから接続が切断されれば同様に終了処理をおこなって終了することができる。
【実施例】
【０００６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、以下において、プライマー候補を単にプライマーと記載することがある。
以下の実施例では、本発明のプライマー設計プログラムを用いて、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーを設計した。本発明のプログラムによって最も好ましい判断されたプライマーと、それより優先順位の低いプライマーとをそれぞれ用いて、実際にマルチプレックスＰＣＲを行った。そして、プライマー同士が誤って結合しない条件下で、ＰＣＲ産物と他のプライマーとの結合がＰＣＲの効率に及ぼす影響を検証した。検証は、２箇所の一塩基多型（ＳＮＰ）部位を増幅するマルチプレックスＰＣＲの系で行った。プライマー設計から検証までの概略は、以下のとおりである。
＜１＞２箇所目のＳＮＰ部位について、シングルＰＣＲ用のプライマー設計ソフトウェアで、プライマー候補を独立に選び出した。
＜２＞各プライマー間の相補性を計算し、誤って結合する可能性の低いプライマーの組み合わせを選び出した。
＜３＞上記＜２＞で選んだプライマーの組み合わせについて、ＰＣＲ産物とプライマーの相補性を計算した。
＜４＞上記＜２＞で選んだプライマーの組み合わせで、マルチプレックスＰＣＲを行った。
＜５＞上記＜４＞のＰＣＲ産物の増幅量を測定した。
＜６＞上記＜３＞の相補性計算結果と＜５＞の測定結果とを比較し、ＰＣＲ産物・プライマー間の相補性とＰＣＲ産物の増幅量の間に相関があるか調べた。
以下、＜１＞〜＜６＞の手順について、図１１を参照して詳しく述べる。なお、本実施例では、マイクロソフト社ウインドウズのコマンドプロンプトを使用した。
＜１＞２箇所のＳＮＰ部位それぞれについてのプライマー候補の選出
ＳＮＰのデータベースの中から、塩基配列″ＮＴ＿０２２１８４″を取得した。この塩基配列に含まれる２つのＳＮＰを増幅ターゲットにした。これらＳＮＰの″ｒｅｆＳＮＰ  ＩＤ″はそれぞれ″ｒｓ３７７０７９９″及び″ｒｓ３７７０７９７″である。本実施例においては、塩基配列″ＮＴ＿０２２１８４″の中から２０ｋｂｐの塩基配列だけを取り出し、プライマー設計ソフトに入力した。プライマー設計ソフトウェアとしては、シングルＰＣＲのプライマー設計ソフトウェア″ｐｒｉｍｅｒ  ３″（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｃｏｄｅ．ｈｔｍｌ）を用いた。
（なお、″ＮＴ＿０２２１８４″のすべての塩基配列をプライマー設計ソフトに入力することもできる。ただしその場合は、塩基配列の大きさが膨大であることから、プライマー候補選択に多くの時間を費やすことになる。）
このようにして、それぞれのＳＮＰ部位のプライマー候補を独立に選び出した。
＜２＞プライマー間の相補性の計算
上記＜１＞におけるプライマー選出で用いた″ｐｒｉｍｅｒ  ３″に付属のソフトウェア″ＤＰＡＬ″を使用し、増幅ターゲットであるＳＮＰ  Ｘ１：″ｒｓ３７７０７９９″及びＸ２：″ｒｓ２７７０７９７″に対するプライマー候補群の中から１つずつ候補を選び出し、プライマー間の３’末端での相補性を示すスコア（３’末端のローカルアライメントスコア）を計算した。なお、″ＤＰＡＬ″は、ローカルアライメントならびにグローバルアライメントのスコアを計算するソフトウェアで、実行時に、３’末端固定かそうでないかを選ぶことができる。
プライマー間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含まれる情報の一部を図１２に示す。図１２には、当該出力ファイル中の、Ｘ１に対するプライマーＰ１Ａ（フォワードプライマー″ｐ１ＡＦ″＆リバースプライマー″ｐ１ＡＲ″）と、Ｘ２に対するプライマーＰ２Ａ（フォワードプライマー″ｐ２ＡＦ″＆リバースプライマー″ｐ２ＡＲ″）との相補性の計算結果について書かれた部分の文字列を示す。当該情報は、アライメントスコアを計算する２つのプライマー配列４１、３’末端のローカルアライメントスコアであることを示す情報４２、ローカルアライメントスコア４３、アライメントの対象となった配列の長さ４４、及び、２つの配列でマッチする塩基の場所を示す情報４５を含む。
結果として、次の４組のプライマーの組み合わせを選び出した。これらの組み合わせにおいて、それぞれのプライマーは、Ｘ１に対するプライマーＰ１Ａ（″ｐ１ＡＦ″＆″ｐ１ＡＲ″）及びＰ１Ｂ（″ｐ１ＢＦ″＆″ｐ１ＢＲ″）と、Ｘ２に対するプライマーＰ２Ａ（″ｐ２ＡＦ″＆″ｐ２ＡＲ″）及びＰ２Ｂ（″ｐ２ＢＦ″＆″ｐ２ＢＲ″）とからなる群から選ばれる。
2008004691.tif 000003
2008004691.tif 000004
＜３＞増幅産物とプライマーとの相補性の計算
上記＜２＞で挙げたプライマーの組み合わせのそれぞれについて、増幅産物とプライマーとの相補性の計算を行った。当該プライマーを用いて核酸増幅を行ったときに得られる増幅産物の配列を求めた。増幅産物の配列を求める方法としては、テンプレートの配列とプライマーの位置から求めることができる。或いは、ｅ−ＰＣＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｅ−ｐｃｒ／）のようなソフトウェアを使用して求めることも可能である。当該ソフトウェアを使用して求めた増幅産物の配列を以下に示す。
2008004691.tif 000005
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次に、＜２＞と同様の手順で、プライマー及び増幅産物それぞれの中から１つずつ配列を選び出し、プライマーと増幅産物との３’末端固定のローカルアライメントスコアを求めた。ここでは、プライマーの３’末端を固定した場合のスコアのみが分かればよく、増幅産物の３’末端固定のスコアまで求める必要はない。
相補性の計算を行ったプライマーと増幅産物との組み合わせは以下のとおりである。
2008004691.tif 000008
プライマーと増幅産物との間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含まれる情報の一部を図１３に示す。図１３には、当該出力ファイル中の、組み合わせ［５］（Ｐ１Ａ−Ｐ２Ａ＿ｐｒｏｄｕｃｔ）による相補性の計算結果について書かれた部分の文字列を示す。当該情報は、アライメントスコアを計算するプライマー配列５１及び増幅産物配列５２、３’末端のローカルアライメントスコアであることを示す情報５３、ローカルアライメントスコア５４、アライメントの対象となった配列の長さ５５、及び、２つの配列でマッチする塩基の場所を示す情報５６を含む。
さらに、＜２＞で得られたプライマー間（組み合わせ［１］〜［４］）の相補性、及び、＜３＞で得られたプライマーと増幅産物との間（組み合わせ［５］〜［１２］）の相補性についての計算結果から、必要なデータを抜き出してまとめたものを下記表１、２及び３に示す。
下記表１は、＜２＞で得られたプライマー間（組み合わせ［１］〜［４］）の相補性の計算結果における、ローカルアライメントスコアの合計（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）、アライメントの対象となった配列の長さの合計（ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）、及びそれらの比（ｒａｔｉｏ：ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ／ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｘ  １００）を示す。
【表１】
2008004691.tif 000009
下記表２は、＜３＞で得られたプライマーと増幅産物との間（組み合わせ［５］〜［８］）の相補性の計算結果における、ローカルアライメントスコアの合計（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）、アライメントの対象となった配列の長さの合計（ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）、及びそれらの比（ｒａｔｉｏ：ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ／ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｘ  １００）を示す。なお、組み合わせ［５］〜［８］は、増幅産物としてＸ２を含む増幅産物を得る反応系中に存在するプライマー及び増幅産物の組み合わせである。
【表２】
2008004691.tif 000010
下記表３は、＜３＞で得られたプライマーと増幅産物との間（組み合わせ［９］〜［１２］）の相補性の計算結果における、ローカルアライメントスコアの合計（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）、アライメントの対象となった配列の長さの合計（ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）、及びそれらの比（ｒａｔｉｏ：ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ／ｔｏｔａｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｘ  １００）を示す。なお、組み合わせ［９］〜［１２］は、増幅産物としてＸ１を含む増幅産物を得る反応系中に存在するプライマー及び増幅産物の組み合わせである。
【表３】
2008004691.tif 000011
ここで、既に述べたように、″ｓｃｏｒｅ″はローカルアライメントのスコアであり、″ｌｅｎｇｔｈ″はアライメントの対象となった配列の長さであることから、より大きいｌｅｎｇｔｈ、及びより小さいｓｃｏｒｅは、相補性の低さを表す。従って、ｌｅｎｇｔｈに対するｓｃｏｒｅの割合として示されるｒａｔｉｏは、その値が小さいほど、対象となる２つの配列の相補性が低いことを表す。これは、すなわちプライマーの条件として好ましいことを示すといえる。このことを、次の＜４＞で実証した。
＜４＞  選出したプライマーを用いることによる増幅量の検証
前記＜２＞で選び出した組み合わせ［１］〜［４］の４通りの組み合わせによるプライマーをそれぞれ用いることにより、４通りのマルチプレックスＰＣＲをおこなった。マルチプレックスＰＣＲは、３０サイクル行った。
ＰＣＲ産物の増幅量は、インベーダ反応を利用して測定した。マルチプレックスＰＣＲによって、Ｘ１：″ｒｓ３７７０７９９″を含む増幅産物と、Ｘ２：″ｒｓ２７７０７９７″含む増幅産物とが得られる。これらＳＮＰ（Ｘ１及びＸ２）がそれぞれインベーダ反応によって検出されるため、それぞれの増幅産物の量を調べることができる。
インベーダ反応においては、測定すべき２つのＰＣＲ産物に対応し、かつ波長の異なる蛍光物質が付された２つのプローブを使用することによって、２つのＰＣＲ産物量が同時に測定できるようにした。インベーダ反応が進むにつれて、それぞれのＰＣＲ産物において蛍光強度が上昇するが、その上昇速度はＰＣＲ産物の増幅量に応じて変化する。すなわち、増幅量が多い場合は蛍光強度の上昇速度が速く、逆に増幅量が少ない場合は傾向強度の上昇が遅くなる。このようにしてＰＣＲ産物量を測定した結果を図１４及び図１５のグラフに示す。それぞれの曲線から、図に記載のプライマー−増幅産物の組み合わせが含まれる反応系によって得られた増幅産物の量を知ることができる。
さらに、これらグラフにおける増幅曲線の傾きを最小二乗法で計算した。この計算結果を、以下の表４（ａ）及び（ｂ）に示す。
表４（ａ）においては、ＳＮＰ  Ｘ２を含む増幅産物を得るための反応系に関して、増幅曲線の傾きを、使用したプライマーの組み合わせ、当該プライマー間の相補性指数（すなわち上記表１で得られたｒａｔｉｏ値）、反応系中に存在するプライマー−増幅産物間の組み合わせ、当該プライマー−増幅産物間の相補性指数（すなわち上記表２で得られたｒａｔｉｏ値）などとともに示す。
表４（ｂ）においては、ＳＮＰ  Ｘ１を含む増幅産物を得るための反応系に関して、増幅曲線の傾きを、使用したプライマーの組み合わせ、当該プライマー間の相補性指数（すなわち上記表１で得られたｒａｔｉｏ値）、反応系中に存在するプライマー−増幅産物間の組み合わせ、当該プライマー−増幅産物間の相補性指数（すなわち上記表３で得られたｒａｔｉｏ値）などとともに示す。
【表４（ａ）】
2008004691.tif 000012
【表４（ｂ）】
2008004691.tif 000013
上記表４（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ示すように、増幅曲線の傾きは、プライマー間の相補性指数とは相関を示しているとはいえないが、プライマー−増幅産物間の相補性指数とは良い相関を示していることがわかる。すなわち、プライマー−増幅産物間の相補性指数（ｒａｔｉｏ値）を求めることによって、増幅量を評価することができることがわかる。
以上より、プライマー間の相補性指数と、プライマー−増幅産物間の相補性指数とが総合的に良好である、［２］の組み合わせ（すなわちＰ１Ａ−Ｐ２Ｂ）のプライマーが、ＳＮＰ  Ｘ１を含む増幅産物及びＳＮＰ  Ｘ２を含む増幅産物の両方を効率よく合成しており、従って、最適なプライマーであると評価することができる。
このように、複数の増幅ターゲットを効率よく合成することは、従来のようにプライマー間の相補性の判定のみを行うよりも、プライマー−増幅産物間の相補性の判定をさらに行うことが大きく影響していることが証明された。
上記実施例においては、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。このため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
［配列表］
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2008004691.tif 000015
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2008004691.tif 000017
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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