(57)【要約】   脳での過剰発現が統合失調症の原因となるＳＲＥＢ２をコードするポリヌクレオチドとプロモーターを含むポリヌクレオチドが導入され、統合失調症状を呈する非ヒトトランスジェニック動物；並びに、前記動物に被検物質を投与する工程、投与された動物の統合失調症関連障害を測定する工程、及び統合失調症治療効果を有する物質を選択する工程を含む、統合失調症治療剤のスクリーニング法を開示する。本発明によれば、統合失調症の発症原因となる遺伝背景を反映した統合失調症モデル動物及び統合失調症治療剤のインビボスクリーニング法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、（２）プロモーターを含むポリヌクレオチドとが導入され、統合失調症状を呈する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記プロモーターが外来性プロモーターである、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１又は２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記プロモーターが、前記ポリペプチドを脳に限定して発現させるプロモーターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記プロモーターがα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIプロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
動物がマウスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
前脳での配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのｍＲＮＡ発現量が野生型と比較して１．５倍以上３倍未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物からなる統合失調症モデル動物。
【請求項９】
陰性症状及び／又は認知障害モデル動物である、請求項８に記載の統合失調症モデル動物。
【請求項１０】
統合失調症治療効果検出のための請求項１〜７のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項１１】
統合失調症治療効果が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害治療効果である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、及び、被検物質を投与された動物の統合失調症関連障害を分析する工程を含む、被検物質の統合失調症治療効果を検出する方法。
【請求項１３】
分析する工程が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を分析する工程であり、統合失調症治療効果が陰性症状及び／又は認知障害の改善効果である、請求項１２に記載の検出する方法。
【請求項１４】
統合失調症治療剤のスクリーニングのための請求項１〜７のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項１５】
統合失調症治療剤が陰性症状及び／又は認知障害治療剤である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、被検物質を投与された動物の統合失調症関連障害を分析する工程、及び統合失調症治療効果を有する物質を選択する工程を含む、統合失調症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
分析する工程が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を分析する工程であり、選択する工程が統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を有する物質を選択する工程であり、統合失調症治療剤が陰性症状及び／又は認知障害治療剤である、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の方法によりスクリーニングする工程、及び、前記スクリーニングにより得られた物質を製剤化する工程を含む、統合失調症治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、統合失調症治療剤をスクリーニングするのに有効なツールとなるモデル動物、そして、前記モデル動物を用いた新規な統合失調症治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症（Schizophrenia）は、幻覚及び妄想といった陽性症状、社会性の欠如及び感情の平板化などの陰性症状、並びに認知障害を呈する慢性かつ重篤な脳機能障害である。統合失調症の生涯罹患率は人種、性別に関わらず１％であるのに対して、一卵性双子の一方が罹患している場合、他方の罹患率が４０〜５０％、親が罹患している場合、子供の罹患率が６〜１７％ということから、遺伝要因がその発症に関わることが知られている。一方、一卵性双子の罹患率が一致しないということから、統合失調症の発症には遺伝要因の他に環境要因、発達要因などが関係していると考えられている（非特許文献１）。【０００３】
これまでの研究から、統合失調症の発症に関して複数の仮説が提唱されている。統合失調症治療効果を有する薬剤の作用メカニズム解明の過程で、ドーパミンと統合失調症との関連性が発見された（ドーパミン仮説）。一方、神経伝達物質グルタミン酸の遮断効果を有するＰＣＰ（Phencyclidine；フェンサイクリジン）等の薬剤の投与により幻覚、妄想といった症状が惹起されることから、グルタミン酸神経伝達が統合失調症の発症に関わっている可能性が示唆された（グルタミン酸仮説）。また、統合失調症の発症には発達期の神経ネットワーク形成の障害が関与するという仮説も提唱されている（発達障害仮説）。【０００４】
統合失調症治療薬は１９５０年代から導入された。これまでの治療薬はドーパミンの神経伝達遮断作用に基づくもので、一般に幻覚及び妄想といった陽性症状の治療効果を有するが、陰性症状並びに認知障害に対する効果に欠け、またドーパミン神経伝達の遮断による副作用、特に運動機能障害が引き起こされることが知られている（Lieberman et al., N Engl J Med., 353, 1209-1223, 2005）。現在使用されている薬剤は全てドーパミン神経伝達の遮断活性を有し、前述の懸念点を払拭できていない。そのため、より効果的で副作用の少ない新しい作用機序に基づいた薬剤が求められている（非特許文献２）。【０００５】
有効な治療効果を示す薬剤を見いだすためには、標的分子に対する効力だけではなく、薬剤自体のインビボ（in vivo）での生体内利用率や脳内移行性を考慮に入れる必要がある。従って、発症メカニズムの解明、発症の予防もしくは病態の改善、治療のための医療技術及び薬剤の開発等のためには、個体レベルで解析可能なモデル動物の存在が不可欠である。【０００６】
統合失調症のモデル動物としては、ドーパミン仮説、グルタミン酸仮説に則りドーパミン作動薬投与動物、グルタミン酸神経伝達遮断薬投与動物、また、発達障害仮説に基づいた海馬破壊動物などが挙げられる。しかし、これらのモデル動物は統合失調症の発症原因となる遺伝背景を反映したものではなく、統合失調症で障害されている表現型の一部、特に陽性症状を反映するに過ぎないとの見方が強い（非特許文献３）。【０００７】
トランスジェニック動物は、遺伝子の機能を生体内で検証する方法として、また疾患治療剤を開発するためのモデル動物として期待されるものであるが、統合失調症のように発症メカニズムが明らかになっていないヒトの病態を反映したモデルを作成することは困難である。【０００８】
一方、ＳＲＥＢ２については、中枢神経系、泌尿器生殖器系を中心に発現している新規なＧタンパク質共役型受容体ファミリータンパク質の１つとして開示されており（特許文献１、非特許文献４）、また、ＳＲＥＢ２のＳＮＰで規定される特定のハプロタイプの割合が統合失調症患者で統合失調症でないコントロールに比べて多いことが報告されている（特許文献２）。しかし、ＳＲＥＢ２トランスジェニック動物は作製されておらず、ＳＲＥＢ２が統合失調症の原因となることも知られていなかった。【０００９】
【特許文献１】国際公開第９９／４６３７８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０８６１４７号パンフレット
【非特許文献１】メリッサ・ケー・スピーキング（Melissa K. Speaking），“統合失調症（Schizophrenia）”，[online]，２００２年８月，米国国立精神衛生研究所（NationalInstitute of Mental Health），［２００５年７月１４日検索］，インターネット＜URL:http://www.nimh.nih.gov/publicat/NIMHschizoph.pdf＞
【非特許文献２】「ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（The New England Journal of medicine）」，（米国），２００５年，第３５３巻，ｐ．１２０９−１２２３
【非特許文献３】「ビヘイビアラル・ファーマコロジー（Behavioural pharmacology）」，（英国），２０００年，第１１巻，ｐ．２２３−２３３
【非特許文献４】「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）」，（米国），２０００年，第２７２巻，ｐ．５７６−５８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、統合失調症の発症原因となる遺伝背景を反映した統合失調症、特に陰性症状及び認知障害を示すモデル動物、並びに統合失調症治療剤のインビボスクリーニング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、脳、特に前脳（大脳皮質、海馬）に選択的に目的遺伝子を発現させることができるα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIプロモーター領域を用いてＧタンパク質共役型受容体ファミリーに属するＳＲＥＢ２を過剰発現したトランスジェニックマウスを製造したところ、意外にも統合失調症状を呈するトランスジェニックマウスが得られ、ＳＲＥＢ２の脳での過剰発現が統合失調症の原因であることが判明した。前記トランスジェニックマウスが統合失調症治療剤のスクリーニングツールである統合失調症モデル動物になることを見出し、更に、前記トランスジェニックマウスの統合失調症関連障害の改善を指標とすることによる統合失調症治療剤のインビボスクリーニング系を構築した。また、前記トランスジェニックマウスは、統合失調症の陰性症状及び認知機能障害を呈することを見出した。統合失調症治療剤、特に陰性症状及び認知機能障害治療剤をスクリーニングするのに有効なツールとなるモデル動物であるＳＲＥＢ２トランスジェニック動物及び前記トランスジェニック動物を用いた統合失調症治療剤のスクリーニング方法を提供し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、（２）プロモーターを含むポリヌクレオチドとが導入され、統合失調症状を呈する非ヒトトランスジェニック動物、
［２］前記プロモーターが外来性（exogenous）プロモーターである、［１］に記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［４］前記プロモーターが、前記ポリペプチドを脳に限定して発現させるプロモーターである、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［５］前記プロモーターがα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIプロモーターである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［６］動物がマウスである、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［７］前脳での配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのｍＲＮＡ発現量が野生型と比較して１．５倍以上３倍未満である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物、
［８］［１］〜［７］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物からなる統合失調症モデル動物、
［９］陰性症状及び／又は認知障害モデル動物である、［８］に記載の統合失調症モデル動物、
［１０］統合失調症治療効果検出のための［１］〜［７］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用、
［１１］統合失調症治療効果が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害治療効果である、［１０］に記載の使用、
［１２］［１］〜［７］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、及び、被検物質を投与された動物の統合失調症関連障害を分析する工程を含む、被検物質の統合失調症治療効果を検出する方法、
［１３］分析する工程が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を分析する工程であり、統合失調症治療効果が陰性症状及び／又は認知障害の改善効果である、［１２］に記載の検出する方法、
［１４］統合失調症治療剤のスクリーニングのための［１］〜［７］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用、
［１５］統合失調症治療剤が陰性症状及び／又は認知障害治療剤である、［１４］に記載の使用、
［１６］［１］〜［７］のいずれか１つに記載の非ヒトトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、被検物質を投与された動物の統合失調症関連障害を分析する工程、及び統合失調症治療効果を有する物質を選択する工程を含む、統合失調症治療剤のスクリーニング方法、並びに
［１７］分析する工程が、統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を分析する工程であり、選択する工程が統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害の改善効果を有する物質を選択する工程であり、統合失調症治療剤が陰性症状及び／又は認知障害治療剤である、［１６］に記載のスクリーニング方法、
［１８］［１６］又は［１７］に記載の方法によりスクリーニングする工程、及び、前記スクリーニングにより得られた物質を製剤化する工程を含む、統合失調症治療用医薬組成物の製造方法
に関する。【００１３】
本明細書においては、「外来性（exogenous）プロモーター」とは、ＳＲＥＢ２遺伝子プロモーター以外のプロモーターを意味する。「統合失調症状を呈する」とは、これに限定されるものではないが、特には、後述の驚愕反応解析においてプレパルスインヒビション低下を示すことを意味する。「統合失調症モデル動物」とは、被検物質の統合失調症治療効果を検出するために、あるいは、統合失調症治療剤のスクリーニングのために用いるための動物である。「陰性症状」とは、これに限定されるものではないが、特には、後述の社会性行動試験において社会性行動障害を示すこと、あるいは、後述のモーリスの水迷路学習課題において無動化増強を示すことを意味する。「認知機能障害」とは、これに限定されるものではないが、特には、後述のモーリスの水迷路学習課題及び／又は恐怖条件付け試験において記憶学習障害を示すことを意味する。
【発明の効果】
【００１４】
これまでの統合失調症様行動様式を示すことが報告されているモデル動物は、統合失調症患者の発症原因となる遺伝背景を反映したものではない。本発明のＳＲＥＢ２非ヒトトランスジェニック動物により、はじめて、ヒトの発症原因となる遺伝的変異を反映した統合失調症モデルでの真の統合失調症治療効果を有する薬剤のスクリーニングが可能となる。ＳＲＥＢ２のＳＮＰで規定される特定のハプロタイプの割合が統合失調症患者で多いことが確認されているが、具体的にＳＲＥＢ２の発現の亢進、低下などの機能的側面は記載されておらず（WO02/086147）、ＳＲＥＢ２の過剰発現によりどのような症状を呈するかは不明であった。本発明のＳＲＥＢ２非ヒトトランスジェニック動物で、その発現亢進が統合失調症の原因となることが初めて明らかとなった。本発明のＳＲＥＢ２非ヒトトランスジェニック動物は、これまで薬剤誘発統合失調症モデルでは表現できなかった統合失調症の陰性症状及び認知機能障害を呈することから、これまで困難だった陰性症状及び認知機能障害の評価を可能とする有用なモデルとなる。また、本発明のＳＲＥＢ２非ヒトトランスジェニック動物の好適態様の１つである、導入遺伝子をヘテロで持つＳＲＥＢ２非ヒトトランスジェニック動物は、導入遺伝子をヘテロで持つことで統合失調症に関連した表現型を呈することから、他の遺伝子改変動物（特に遺伝子ノックアウト動物）と比較して繁殖が容易であり、統合失調症改善効果を有する薬剤のスクリーニングに有用なモデル動物である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プレパルスインヒビション試験の実施方法を示す説明図である。
【図２】プレパルスインヒビション試験の結果を示すグラフである。
【図３】モーリス水迷路学習課題（習得試行におけるプラットホーム到達時間）の結果を示すグラフである。
【図４】モーリス水迷路学習課題（習得試行における無動時間）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「受容体」は「受容体タンパク質」を、「ＳＲＥＢ２」は「ＳＲＥＢ２タンパク質」を表す。
「導入ポリヌクレオチド」は、トランスジェニック動物作製用であって、プロモーター領域と受容体をコードするポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドを表す。
以下、本発明を詳細に説明する。【００１７】
［１］導入ポリヌクレオチドに含まれるポリヌクレオチドによりコードされる受容体及びそのポリヌクレオチド
１）統合失調症関連受容体
本発明のトランスジェニック動物作製用の導入ポリヌクレオチドに含まれるポリヌクレオチドによりコードされる受容体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが特に好ましい。【００１８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、以下、「統合失調症関連受容体」と称する。
「配列番号２で表されるアミノ酸配列」は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属するマウスＳＲＥＢ２のアミノ酸配列（WO99/46378）である。なお、マウスＳＲＥＢ２、ヒトＳＲＥＢ２、及びラットＳＲＥＢ２は、アミノ酸配列が完全に一致する。【００１９】
２）導入ポリヌクレオチドに含まれるポリヌクレオチド
導入ポリヌクレオチドに含まれる受容体をコードするポリヌクレオチドは、統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号１で表される塩基配列における７９８５番目〜９０９４番目の塩基からなる配列のポリヌクレオチドである。【００２０】
［２］トランスジェニック動物の作製方法
１）導入ポリヌクレオチドに含まれるプロモーターの製造
導入ポリヌクレオチドは、統合失調症関連受容体の発現を制御するためのプロモーター配列を含み、所望によりエンハンサー配列を含むことができる。このプロモーター、エンハンサー配列の選択によって、前記受容体を全身性に発現させることもでき、また、特定の組織で選択的に発現させることもできる。本発明の統合失調症モデル動物作成のためのプロモーターとしては、特に限定されるものではないが、外来性プロモーターが好ましく、例えば、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII（α-calcium-calmodulin-dependent kinase II、α-CaM-kinase II）遺伝子のプロモーター領域［Mayford,
M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250-13255］、神経細胞特異的エノラーゼのプロモーター領域［Quon，D.ら（1991）Nature
352，239−241］、又はＴｈｙ−１遺伝子のプロモーター領域［Vidal, M. et al. (1990) EMBO J 9:833-840］などを利用することができ、統合失調症関連受容体を脳選択的に発現させることができるプロモーターが好ましく、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII遺伝子のプロモーター領域の利用が最も好ましい。α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII遺伝子が脳選択的であり、特に前脳に発現選択性が高い神経細胞遺伝子であることから、前記プロモーター領域を用いることにより脳、特に前脳（大脳皮質、海馬）に選択的に目的遺伝子を発現させることができ、その結果、意外にも統合失調症状を呈するトランスジェニックマウスが得られ、ＳＲＥＢ２の脳での過剰発現が統合失調症の原因であることが判明した。【００２１】
α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII遺伝子のプロモーター領域の調製のためには、遺伝子データベースGenBankに登録されている配列（Accession No.
AJ222796）で表される塩基配列の情報に基づいて、プライマーセットを設計することができる。設計した前記プライマーセットと、鋳型であるゲノムＤＮＡとを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Saiki,
R. K.ら、(1988) Science 239、487-491］を実施することにより、前記導入ポリヌクレオチドの一部を得ることができる。ゲノムＤＮＡは市販品（クロンテック社）を用いることができ、また、動物血液を用いて市販のゲノムＤＮＡ抽出キット（キアゲン社）により得ることもできる。更に、得られたＤＮＡを適当なベクターに組み込むことにより、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIプロモーター領域を得ることができる。【００２２】
２）統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドの製造
導入ポリヌクレオチドに含まれる統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドは、WO99/46378記載の方法に従って得ることができる。例えば、配列番号１で表される塩基配列における７９８５番目〜９０９４番目の塩基配列からなるＳＲＥＢ２遺伝子は、公知の配列（WO99/46378）の任意部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて細胞から単離したｍＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）により調製することもできる。【００２３】
３）導入ポリヌクレオチドの製造
本発明のトランスジェニック動物作製用の導入ポリヌクレオチドは、任意のプロモーター領域（好ましくは外来性プロモーター領域）と統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも含み、前記プロモーター活性の調節下にあるように、統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドを配置する限り、プロモーター及び統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチドの配置順序は特に限定されるものではない。例えば、実施例１に記載のように、適当なベクターのマルチクローニングサイトに、順次、前記プロモーター領域と統合失調症関連受容体遺伝子を導入することにより、導入ポリヌクレオチドを調製することができる。前記ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡績社）を挙げることができる。より具体的には実施例１に記載の方法で導入ポリヌクレオチドを得ることができる。導入ポリヌクレオチドとしては、例えば、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII遺伝子のプロモーター領域の下流にＳＲＥＢ２  ＤＮＡ（配列番号１の７９８５番目〜９０９４番目）とＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナルをつないだ遺伝子が挙げられる。特に好ましい導入ポリヌクレオチドの例としては、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。ＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナルは、例えばｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）から得ることができる。導入ポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＰＣＲを用いた方法を挙げることができる。また、本発明の遺伝子操作技術は公知の方法（例えば、Maniatis，T.ら，”Molecular
Cloning−A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982）に従って実施することができる。【００２４】
４）トランスジェニック動物の製造
本発明のトランスジェニック動物は、統合失調症関連受容体をコードするポリヌクレオチド及びプロモーター（好ましくは外来性プロモーター）を含むポリヌクレオチドが導入され、統合失調症状を呈する非ヒトトランスジェニック動物である限り、特に限定されるものではない。導入ポリヌクレオチドとして、前述の導入ポリヌクレオチドを使用すること以外は、従来公知の方法（例えば、Animal Biotechnology,1,175-84、1990）に基づいて作製することができる。具体的には、例えば、後述の実施例１に記載の手順に基づいて作製することができる。すなわち、前記導入ポリヌクレオチドを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入ポリヌクレオチドが組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。本明細書において「トランスジェニック動物」とは、ヒトを除くトランスジェニック動物（すなわち、非ヒトトランスジェニック動物）を意味し、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、ショウジョウバエ）などを挙げることができる。非ヒト動物としては、技術的にはすべての動物種を対象とすることが可能であるが、げっ歯類が好ましく、マウス又はラットがより好ましく、特には近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が最も整っているマウスが好ましい。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また、培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡの物理的注入（マイクロインジェクション）法が好ましい。【００２５】
例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶かしたベクターをマイクロピペットで受精卵に注入し、この卵をホルモン処理［例えば、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ２α、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、エストラジオール、黄体形成ホルモン（ＬＨ）等］又は小動物では物理的刺激により擬妊娠状態にした宿主動物の子宮内に移植する。この宿主動物を飼育して分娩させることによって遺伝子導入非ヒト動物が得られる。遺伝子導入非ヒト動物が得られたか否かは、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入ポリヌクレオチドの存在を確認することにより知ることができる。導入ポリヌクレオチドの存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入ポリヌクレオチドはその子孫の５０％に伝達され、野生型又は変異型の動物を効率よく作出することが可能である。統合失調症モデル動物、特に統合失調症の陰性症状及び／又は認知障害モデル動物としては、前脳（大脳皮質、海馬）での統合失調症関連受容体（特にはＳＲＥＢ２）のｍＲＮＡ発現量が野生型と比較して１．５倍以上３倍未満であるモデル動物（特にはマウス）がより好ましく、７週齢での統合失調症関連受容体（特にはＳＲＥＢ２）のｍＲＮＡ発現量が野生型と比較して１．５倍以上２．５倍未満であるモデル動物（特にはマウス）が最も好ましい。ＳＲＥＢ２  ｍＲＮＡ発現量は、実施例３記載の方法で検出することができる。【００２６】
このようにして作製したトランスジェニック動物及び統合失調症状を呈するその子孫であるトランスジェニック動物は、統合失調症治療効果、特に陰性症状及び／又は認知障害治療効果の検出、統合失調症治療剤、特に陰性症状及び／又は認知障害治療剤のスクリーニングに有用である。【００２７】
［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法
常法である統合失調症関連障害測定方法、例えば、以下の１）〜４）に記載の方法により、統合失調症関連障害の改善［例えば、驚愕反応解析におけるプレパルスインヒビション（Prepulse inhibition）低下の抑制効果、社会性行動試験における社会性行動障害の改善効果、モーリスの水迷路学習課題及び／又は恐怖条件付け試験における記憶学習障害の改善効果］を指標に、被検物質がトランスジェニック動物の統合失調症関連障害を治療（治癒又は改善）する効果があるかどうかを検出し、被検物質の統合失調症治療効果の検出が可能である。
また、例えば、以下の２）及び３）に記載の方法により、統合失調症の陰性症状の改善（例えば、社会性行動試験における社会性行動障害の改善効果、モーリスの水迷路学習課題における無動化増強の改善）を指標に、被検物質がトランスジェニック動物の統合失調症陰性症状を治療（治癒又は改善）する効果があるかどうかを検出し、被検物質の統合失調症陰性症状治療効果の検出が可能である。
また、例えば、以下の３）及び４）に記載の方法により、統合失調症の認知障害の改善（例えば、モーリスの水迷路学習課題及び／又は恐怖条件付け試験における記憶学習障害の改善効果）を指標に、被検物質がトランスジェニック動物の統合失調症認知障害を治療（治癒又は改善）する効果があるかどうかを検出し、被検物質の統合失調症認知障害治療効果の検出が可能である。【００２８】
１）驚愕反応解析（プレパルスインヒビション試験）
測定装置として、防音箱内に振動センサーの付いた保定シリンダー及び音刺激を負荷するためのスピーカー部分と制御用コンピュータ部分からなる小動物用驚愕反応測定装置（SR-LAB、米国サンディエゴ社）を用いる。
パルスに対する動物の驚愕反応を、振動センサーを介して「振動の大きさ」（amplitude）として測定する。なお、測定中は外界から音を遮断する目的で７０ｄＢの背景ノイズ（background white
noise）を常時負荷する。系統別に野生型（ＷＴ）マウスとトランスジェニック（ＴＧ）マウスを測定装置に入れ、３分間馴化させた後、下記ａ）〜ｆ）の６刺激を無作為に各６回（合計３６回）、試行間隔平均約１５秒にて動物に負荷し、音刺激６５ｍｓ後に認められる保定シリンダーの振動を測定して下記評価を行う。下記ｄ）〜ｆ）におけるプレパルス負荷開始とパルス負荷開始との間隔は、１００ｍｓである。記号「Ｐ」及び「ＰＰ」は、それぞれ、パルス及びプレパルスを意味し、縦軸は「振動の大きさ」である。【００２９】
a) 無刺激（background white noise）：BG
b) 80dB（40ms）（プレパルスのみ）：PP
c) 120dB（40ms）（パルスのみ）：P
d) 73dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルス：3D
e) 76dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルス：6D
f) 82dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルス：12D【００３０】
具体的な測定項目を以下に示す：
i）１２０ｄＢ単独刺激時［前記ｃ）］の驚愕反応（振動係数：図１に示すＡの６回平均値）。
ii）プレパルス３条件［すなわち、前記ｄ）〜ｆ）］について、それぞれ６回平均値を用いて、下記式で規定されるＰＰＩ（プレパルスインヒビション）を算出する。
ＰＰＩ（％）＝｛１−（Ｂ／Ａ）｝×１００
［式中、Ａ及びＢは、それぞれ、図１に示すＡ及びＢの値である］
iii）無刺激時［前記ａ）］又はプレパルス刺激のみ負荷時［前記ｂ）］の振動係数（６回平均値）。
プレパルスインヒビションが低下した場合、統合失調症状を表しているとみなされる。【００３１】
２）社会性行動試験
２匹の社会性行動として、マウス２匹を新規プラスチックケージ（ＰＣ）内で６０分間遭遇させ、社会的探索動作（social investigation）、追従動作（following）、休息姿勢（resting）の発現頻度及び累積時間を測定する。また、２匹の行動をビデオカメラで撮影しＤＶＤレコーダーを用いてＤＶＤ−Ｒに録画する。行動観察は、例えば、午後９時から１２時に、室内灯下で行う。社会的探索動作及び／又は追従動作の回数低下及び／又は時間短縮があった場合、社会性行動障害があると判断され、統合失調症の陰性症状を表しているとみなされる。【００３２】
群の社会性行動として、飼育ケージ中の行動をビデオカメラで撮影し、ＤＶＤレコーダーを用いてＤＶＤ−Ｒに録画する。撮影は、例えば、午後９時から１２時の間に開始し、４８時間撮影する。【００３３】
３）モーリスの水迷路学習課題
ａ）装置の設置
実験装置は、視覚では識別不可能な透明なアクリル製のプラットホーム（直径：約１０ｃｍ、高さ：約２６．５ｃｍ）と、プラットホームが水に隠れるように約２７．５ｃｍの高さまで水（水温１７〜１８℃）を張った灰色塩化ビニール製の円形プール（直径：約６８ｃｍ、高さ：約３２ｃｍ）を使用する。プラットホームには場所がわかるように黒色の四角柱をたてる。また、プールを４つの象限に分割し、そのうちの第四象限中央（プール中央より約１７ｃｍ）にプラットホームを設置し、プールの周囲には空間的手がかりとして赤い三角錐を設置する。
マウスの遊泳行動はビデオ画像行動解析装置（SMART、Panlab社）を用いて解析し、更に、ＤＶＤビデオレコーダを用いてＤＶＤ−Ｒに記録する。ＤＶＤ−Ｒは参考データとし、ビデオ画像行動解析装置から打ち出した結果を、１次データとする。【００３４】
ｂ）測定方法
（１）習得試行
４日間、午前と午後（計８回）に１匹１日２回、習得試行を行う。第１日目及び第２日目はプラットホーム上に黒色の四角柱を立て、第３日目及び第４日目は四角柱は立てないで行う。
マウスの頭が円形プールの壁に向くように投入し、プラットホーム上に到達するまでの時間（goal latency：秒）をストップウォッチで測定（測定時間は最大９０秒間）する。９０秒以内にプラットホームに辿り着き、プラットホーム上に３０秒間滞在した場合は、プラットホームの位置を認識していると判断し、測定を終了する。９０秒以内に辿り着けなかったマウスは、プラットホーム到達時間を９０秒とする。
但し、第１日目でマウスがプラットホームに辿り着けなかった場合は、測定後にプラットホーム上に３０秒間のせ、飼育ケージに戻す。また、第２日目〜４日目で９０秒以内にプラットホームに辿り着けなかったマウスは、そのまま飼育ケージに戻す。また、測定中にマウスがプラットホームに着いたが、もう一度プールに入った場合は、プラットホームの位置を確認してないとみなし、そのまま測定を続ける。なお、第２日目〜４日目の測定時刻は第１日目とできる限り同じ時刻に実施する。【００３５】
（２）プローブ試行（プラットホームを取り外して、その付近にどれだけとどまるか観察：動物の空間認知及び場所学習の習得の程度確認）
プローブ試行は第５日目の午前に実施する。マウスを頭が円形プールの壁に向くように入れ、０〜３０秒、３０〜６０秒、及び６０〜９０秒の観察時間内にマウスが第四象限（習得試行時にプラットホームが設置されていた象限）に滞在した時間（第四象限の遊泳時間：秒）及びプラットホームのあった位置の通過回数（第四象限内のプラットホームのあった場所を通過した回数）を測定する。
習得試行でのプラットホームまでの到達時間の延長及び／又はプローブ試行での第四象限での遊泳時間短縮及び／又は第四象限通過回数の減少があった場合、記憶学習障害があると判断され、統合失調症の認知障害を表しているとみなされる。
また、遊泳中の無動時間があった場合、無動化増強があると判断され、統合失調症の陰性症状を表しているとみなされる。【００３６】
４）恐怖条件付け試験
マウスをフィアードコンディション計測装置（Acti Metrics社）の中に入れ、恐怖条件付けの電気刺激を行う。このときの条件は１５秒毎に１秒の０．４ｍＡの電気刺激負荷を４分間とする。
翌日、マウスを再度、フィアードコンディション計測装置実験装置に入れ、電気ショック無しの条件で４分間の無動時間を測定する。
無動時間の短縮があった場合、記憶学習障害があると判断され、統合失調症の認知障害を表しているとみなされる。【００３７】
［４］統合失調症治療剤スクリーニング法
本発明のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、次いで被検物質を投与した動物の統合失調症関連障害を分析（好ましくは測定）し、統合失調症治療効果を有する物質を選択することにより、統合失調症治療剤のスクリーニングが可能である。また、本発明のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、次いで被検物質を投与した動物の統合失調症の陰性症状及び／又は認知機能障害を分析（好ましくは測定）し、陰性症状及び／又は認知機能障害治療効果を有する物質を選択することにより、陰性症状及び／又は認知機能障害治療剤のスクリーニングが可能である。【００３８】
本発明のスクリーニング法で使用する被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［N.K.Terrett，M.Gardner，D.W.Gordon，R.J.Kobylecki，J.Steele，Tetrahedron，51，8135−73（1995）］によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。【００３９】
［５］統合失調治療用医薬組成物の製造方法
本発明のスクリーニング法により選択される統合失調症治療剤、特には陰性症状及び／又は認知機能障害治療剤を主成分として、医薬を得ることができる。これらの医薬は、統合失調症治療、特には陰性症状及び／又は認知機能障害治療に有用である。【００４０】
統合失調症治療剤を有効成分とする医薬製剤は、有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。投与は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げられる。特に胃で消化されるペプチドにあっては静注等の非経口投与が望ましい。【００４１】
本発明による経口投与のための固体組成物は、一つ又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することにより、調製することができる。前記固体組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解剤、又は溶解補助剤などを含有することができる。錠剤や丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記液体組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。【００４２】
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、植物油（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、若しくはオリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。【００４３】
本発明のスクリーニング法により得られた統合失調症治療剤を有効成分とする医薬の投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明は下記実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、遺伝子操作技術に関しては公知の方法（例えば、Maniatis、T. et al. (1982) :「Molecular Cloning- A Laboratory Manual」
Cold Spring Harbor Laboratory、NY）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には、市販品の指示書に従って実施可能である。【００４５】
《実施例１：SREB2過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入ポリヌクレオチドの構築》
α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII遺伝子のプロモーター領域の下流にSREB2 DNAとSV40由来ポリA付加シグナルとをつないだ遺伝子からなる、SREB2過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入ポリヌクレオチド（配列番号１）を製造した。【００４６】
α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIのプロモーター領域は、C57BL/6マウスのゲノムDNAを鋳型としたPCRによって互いにオーバーラップする部分を持つ２つの断片として取得した。C57BL/6マウスのゲノムDNAは、同マウスの血液からゲノムDNA抽出キット（QIAamp
DNA Blood Midi Kit、QIAGEN社）を用いて精製した。プライマーは遺伝子データベースGenBankに登録されている配列（Accession
No. AJ222796）をもとに設計した。フォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて4.6kbのDNA断片を得た。前記フォワードプライマーの5’末端側にはAatII認識配列が付加してある。また、フォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて3.7kbのDNA断片を得た。前記リバースプライマーの5’末端側にはSalI認識配列が付加してある。それぞれのPCRは、DNAポリメラーゼ（Pfu
Turbo、Stratagene社）を用いて99℃（1分）の後、99℃（15秒）、58℃（15秒）、75℃（10分）を45サイクル、あるいは、95℃（１分）の後、95℃（15秒）、62℃（15秒）、75℃（8分）を40サイクル実施した。4.6kb断片と3.7kb断片のオーバーラップする部分に存在する内存性のXmaI認識配列を利用して両断片を結合し、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIのプロモーター領域を得た。また、SV40由来ポリA付加シグナルは、プラスミドpME18S（丸山ら、新生化学実験講座、123-133、1991年）を鋳型としてフォワードプライマー（配列番号７）、リバースプライマー（配列番号８）を用い、DNAポリメラーゼ（Pfu
Turbo、Stratagene社）を用いたPCRにより取得した。前記リバースプライマーにはKpnI、NotI認識配列を付加してある。【００４７】
SREB2 DNAは、マウス染色体を鋳型としてPCRにより取得した。フォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれSREB2
ORF上流配列と下流配列とから設計した。PCRはDNAポリメラーゼ（Pfu Turbo、Stratagene社）を用いて96℃（1分）の後、96℃（15秒）、60℃（15秒）、75℃（8分）を30サイクル実施した。前記フォワードプライマーの5’末端側にはSalI認識配列、リバースプライマーの5’末端側にはXbaI認識配列が付加してある。得られた4.5kb断片を、上記α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIのプロモーター領域とSalI認識配列を利用して、SV40由来ポリA付加シグナルとXbaI認識配列を利用して連結し、AatII、KpnIで消化したプラスミドpUC18（東洋紡績社）にクローニングすることでSREB2過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入ポリヌクレオチド（13kb）を持つプラスミド（pCM-SREB2と命名した）が得られた。SREB2過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入ポリヌクレオチド（13kb）は、pCM-SREB2からAatII及びNotI制限酵素を用いて切り出した後、単離精製した。【００４８】
《実施例２：SREB2過剰発現トランスジェニックマウスの作製及び同定》
実施例１で作成した導入ポリヌクレオチドをC57BL／6とDBA2マウスのF1交雑マウスの受精卵にマイクロインジェクションした後、前記受精卵を仮親ICRマウスの卵管に移植した［Hogan、B.
et al. (1986). Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual、Plainview、New
York: Cold Harbor Press］。妊娠マウスを自然分娩させ、得られた仔マウス53匹についてトランスジェニックマウスの同定を行った。【００４９】
トランスジェニックマウスの同定は、仔マウスのSREB2遺伝子の染色体上のコピー数を比較することにより行った。まず、マウスの尻尾からゲノムDNA抽出キット（MagExtractor
-Genome-、東洋紡績社）を用いてゲノムDNAを抽出及び精製した。次いで、SREB2 DNA配列に基づきフォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し、リアルタイム定量PCR法［PRISM(登録商標)
7700 Sequence Detection System、ABI社、蛍光試薬SYBR Green、Molecular Probes社］によりSREB2遺伝子の染色体上のコピー数を比較した。その結果、仔マウス53匹中7匹はコピー数が野生型と比較して2倍以上であり、トランスジェニックマウス（F0）であることが同定された。これらトランスジェニックマウス（F0）とC57BL／6との交配により生まれた仔マウス（F1）のSREB2遺伝子の染色体上のコピー数を比較することによりジャームライントランスミッションを検定したところ、7匹中2匹でF1マウスへの導入遺伝子のトランスミッションが確認され、それぞれの系統をYM2、YM4と命名した。染色体上に導入されたSREB2遺伝子数は、YM2で約10コピー、YM4で約20コピーであった。【００５０】
《実施例３：SREB2 mRNAの定量》
導入されたポリヌクレオチドが実際に機能しSREB2 mRNAが過剰発現していることを確認するため、トランスジェニックマウスの脳でのSREB2 mRNAの発現を解析した。実施例２で得られたF1ヘテロトランスジェニックマウス（7週齡）及び同腹野生型マウスから前脳と小脳を摘出し、それぞれRNAを単離した。各RNAは、ゲノムDNAの混入を防ぐため、DNアーゼ（DNase、Promega社）で消化した。得られたRNA中のSREB2
mRNAコピー数を実施例２に記載のリアルタイムPCR法により定量した。リアルタイムPCRの鋳型として、各RNAから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応キット（Advantage
RT-for-PCR kit、クロンテック社）により合成した一本鎖cDNAを用いた。【００５１】
リアルタイム定量PCRの結果、YM4系統のF1ヘテロトランスジェニックマウス前脳で野生型の約4倍のSREB2 mRNA過剰発現が認められた。一方、小脳では発現量の増加は2倍未満であった。YM2系統F1ヘテロトランスジェニックマウスでは野生型の約2倍の前脳でのSREB2
mRNA過剰発現が認められ、小脳での発現増加は2倍未満であった。【００５２】
《実施例４：SREB2過剰発現トランスジェニックマウスの脳の形態学的解析》
SREB2過剰発現の脳の形態に与える作用を解析するため、YM2、YM4系統ヘテロトランスジェニックマウスと同腹野生型マウスの脳を摘出し、重量を測定後、形態を観察した。【００５３】
実施例２と同様に作成したF1を用い、常法によりYM2、YM4系F2ヘテロトランスジェニックマウスを作成した。生後5週齢での比較で、野生型に比べYM2、YM4系F2ヘテロトランスジェニックマウスともに脳重量が減少していることが判明した（YM2
0.36±0.01g, YM4 0.33±0.01g, 野生型 0.46±0.01g, N=2〜5）。脳重量の減少率は、YM4系（28％）のほうがYM2系（22％）よりも大きく、SREB2発現量と相関していた。脳切片の形態学的観察より、脳実質の減少に伴って脳室の拡大が起きていることが見出された。脳実質の減少及び脳室の拡大は統合失調症患者の脳で観察される表現型と一致する。【００５４】
以上の結果は、トランスジェニックマウスでは統合失調症の脳に類似した形態学的変化が引き起こされていることを示し、２系統のヘテロトランスジェニックマウスで同様の表現型が観察されたことは、これらの表現型がSREB2の過剰発現によることを示す。【００５５】
《実施例５：SREB2過剰発現トランスジェニックマウスの行動学的解析》
以下の行動解析には、脳重量の減少率が低いYM2系統のF3ヘテロトランスジェニックマウスを用いた。驚愕反応解析（プレパルスインヒビション試験）は統合失調症患者が障害を呈する情報処理機能の定量的解析として汎用されている。「［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法  １）驚愕反応解析（プレパルスインヒビション試験）」に示した方法に則り解析を行ったところ、YM2ヘテロトランスジェニックマウスはプレパルスインヒビション（プレパルスによる驚愕反応抑制）の低下を示した。これらは統合失調症患者で観察される表現型と一致する。【００５６】
また、10週齢以上の雄性トランスジェニックマウス（Tg）10匹に対して同腹の雄性野生型マウス（WT）10匹を比較対照群とし、以下の試験を行った。【００５７】
１）プレパルスインヒビション試験
「［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法  １）驚愕反応解析（プレパルスインヒビション試験）」に示した方法に則り解析を行ったところ、YM2ヘテロトランスジェニックマウス（Tg）は野生型対照群（WT）と比較して有意にプレパルスインヒビション（プレパルスによる驚愕反応抑制）が低下していた（図２）。なお、図２において、横軸に記載の記号「3D」は、73dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルスを負荷した場合の結果であることを示す。記号「6D」は、76dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルスを負荷した場合の結果であることを示す。記号「12D」は、82dB（20ms）のプレパルス＋120dB（40ms）のパルスを負荷した場合の結果であることを示す。また、縦軸は「プレパルスインヒビション（％）」である。この結果から、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスが情報処理機能の障害を呈することが示された。この表現型は統合失調症患者で観察される表現型と一致する。【００５８】
２）社会性行動試験
社会性行動の障害は、統合失調症の陰性症状の指標となっている。「［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法  ２）社会性行動試験」に示した方法に則り解析を行ったところ、YM2ヘテロトランスジェニックマウスは野生型対照群と比較して社会的探索動作回数が有意に減少していた（WT 66.8±4.2, Tg
54.2±3.9, P<0.05）。この結果から、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスが社会性行動の障害を呈することが示された。この表現型は統合失調症患者で観察される表現型と一致する。【００５９】
３）モーリスの水迷路学習課題
統合失調症では、陽性症状、陰性症状に加え、認知機能の障害が引き起こされる。モーリスの水迷路学習課題は、認知機能の定量的解析法として汎用されている。「［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法  ３）モーリスの水迷路学習課題」に示した方法に則り解析を行ったところ、YM2ヘテロトランスジェニックマウス（Tg）は野生型対照群（WT）と比較して習得試行でのプラットホーム到達時間が有意に延長していた（図３）。なお、図３において、横軸は「習得試行回数」であり、縦軸は「プラットホーム到達時間（秒）」である。また、プローブ試行においてプラットホームのあった位置（第四象限）での通過回数が有意に減少していた（WT
7.3±0.9, Tg 3.1±0.9, P<0.01）。この結果から、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスが認知機能の障害を呈することが示された。この表現型は統合失調症患者で観察される表現型と一致する。
また、本試験においてYM2ヘテロトランスジェニックマウス（Tg）は野生型対照群（WT）と比較して遊泳中の無動時間が有意に延長していた（図４）。なお、図４において、横軸は「習得試行回数」であり、縦軸は「無動時間（秒）」である。遊泳中の無動時間の延長（すなわち、無動化増強）は統合失調症の陰性症状と関連すると報告されている（Noda
et al. Br J Pharmacol. 116, 2531-2537, 1995）。この結果から、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスが統合失調症陰性症状に類似した表現型を呈することが示された。【００６０】
４）恐怖条件付け試験
恐怖条件付け試験は、認知機能の定量的解析法として知られている。「［３］統合失調症関連障害測定方法及び統合失調症治療効果の検出法  ４）恐怖条件付け試験」に示した方法に則り解析を行ったところ、YM2ヘテロトランスジェニックマウスは野生型対照群と比較して無動時間が有意に短縮していた（測定時間中の無動時間％, WT 17.87±2.88,
Tg 8.79±1.34, P<0.05）。この結果から、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスが認知機能の障害を呈することが示された。この表現型は統合失調症患者で観察される表現型と一致する。【００６１】
以上の結果は、SREB2過剰発現トランスジェニックマウスYM2では脳の形態学的変化だけでなく、行動学的にも統合失調症に類似した障害が引き起こされていることを示し、統合失調症モデル動物になることが分かる。SREB2トランスジェニックマウスYM2を用い、統合失調症関連障害の改善を指標に、統合失調症治療剤のスクリーニングが可能である。【００６２】
《実施例６：SREB2トランスジェニックマウスを用いた統合失調症治療剤、陰性症状治療剤及び認知機能障害治療剤のインビボスクリーニング》
統合失調症治療剤のインビボスクリーニングを、実施例５と同様の驚愕反応解析、社会性行動試験、モーリスの水迷路学習課題、及び恐怖条件付け試験にて実施する。被検物質は、0.5%メチルセルロース生理食塩水に懸濁し、腹腔内投与する。被検物質投与SREB2トランスジェニックマウス群で、コントロールの0.5%メチルセルロース生理食塩水投与群に比較して、プレパルスインヒビション（プレパルスによる驚愕反応抑制）の低下、社会性行動障害の改善、記憶学習障害の改善があれば、被検物質は統合失調症治療効果を有すると判断し、統合失調症治療剤として選択することができる。
また、社会性行動試験において社会性行動障害の改善を示すか、あるいは、モーリスの水迷路学習課題において無動化増強の改善を示せば、被検物質は統合失調症の陰性症状治療効果を有すると判断し、陰性症状治療剤として選択することができる。モーリスの水迷路学習課題及び／又は恐怖条件付け試験において記憶学習障害が改善されれば、被検物質は統合失調症の認知機能障害治療効果を有すると判断し、認知機能障害治療剤として選択することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のスクリーニング方法によって、統合失調症治療剤、特に陰性症状及び認知機能障害治療剤として有用な物質をインビボスクリーニングすることができ、より良い治療剤を選択することができる。
本発明のトランスジェニック動物は、統合失調症治療剤スクリーニングのために使用する統合失調症治療剤、特に陰性症状及び認知機能障害治療剤スクリーニングツールである統合失調症モデル動物として有用である。
本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とし、担体、賦形剤及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、統合失調症治療、特に陰性症状及び認知機能障害治療用医薬組成物を製造することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列表の配列番号１の配列で表される塩基配列は、トランスジェニックマウス作製用配列である。また、配列表の配列番号３〜１２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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