(57)【要約】生物活性が知られていなかったＴＡＴに、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進する働きを見出し、ＴＡＴを用いたサイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤のスクリーニング方法を確立した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被検物質の存在下、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを接触させる工程、及び
（Ｂ）サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する工程を含む、
被験物質非存在下に比べて該サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
該サイトカイン及び／又は接着因子が、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを接触させると産生量が増加するサイトカイン及び／又は接着因子である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
該サイトカイン及び／又は接着因子が、MCP-1及び／又はVCAM-1である請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
該細胞が、血管平滑筋細胞又は血管内皮細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体がヒトトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体である請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
動脈硬化性疾患治療剤又は予防剤を探索するものである、請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体を含有する、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤のスクリーニング方法に関する。さらに詳しくは、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）とを接触させると産生が増加するサイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）は血管内で形成されたトロンビンがアンチトロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体と結合し、さらにこの複合体からヘパリンが外れることによって形成される。アンチトロンビンＩＩＩはトロンビンと不可逆的に結合するため、トロンビンのプロテアーゼ活性は抑制される。血中に生じたトロンビンは急速に消失するので、その濃度を測定できないが、ＴＡＴの濃度は測定可能で、その増加は血管内でのトロンビン形成の促進、つまり血栓傾向の指標として用いられる（非特許文献９参照）。しかし、これまでに、ＴＡＴの生物活性が記載されている文献は無い。【０００３】
【非特許文献１】太田ら、日本臨床、５７巻、５８５−５８７頁（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は様々な疾患との関連が知られているサイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。より詳しくは、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）の刺激による血管平滑筋細胞又は血管内皮細胞内におけるサイトカイン及び／又は接着因子の産生増加量の変化を測定することにより、該サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明は、かかるスクリーニング方法により、簡便かつ迅速に、サイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤をスクリーニングすることも１つの目的とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究の結果、生物活性が全く知られていなかったＴＡＴが、血管平滑筋細胞及び血管内皮細胞において、サイトカインの一種であるMCP-1及び接着因子の一種であるVCAM-1の産生を促進する働きを持つことを発見した。これらの知見から、ＴＡＴが関与する新規メカニズムによってサイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法を開発した。【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）被検物質の存在下、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを接触させる工程、及び
（Ｂ）サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する工程を含む、
被験物質非存在下に比べて該サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法、
（２）該サイトカイン及び／又は接着因子が、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを接触させると産生量が増加するサイトカイン及び／又は接着因子である、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）該サイトカイン及び／又は接着因子が、MCP-1及び／又はVCAM-1である（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法、
（４）該細胞が、血管平滑筋細胞又は血管内皮細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体がヒトトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体である（１）〜（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（６）動脈硬化性疾患治療剤又は予防剤を探索するものである、（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体を含有する、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進する組成物、に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のスクリーニング方法により、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物を簡便かつ迅速に、スクリーニングすることができる。また、このスクリーニング方法により、従来知られているメカニズムとは異なる、ＴＡＴが関与するメカニズムによるサイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を持つサイトカイン及び／又は接着因子関連疾患の治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトＴＡＴによるラット血管平滑筋細胞でのMCP-1産生
【図２】ヒトＴＡＴによるヒト血管内皮細胞でのMCP-1産生
【図３】ヒトＴＡＴによるヒト血管内皮細胞でのVCAM-1産生
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。【００１０】
本発明のスクリーニング方法である「サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法」は、これまでに、生物活性が知られていなかったＴＡＴを使用する。ＴＡＴの刺激による細胞内のサイトカイン及び／又は接着因子の産生量増加を、抑制するサイトカイン及び／又は接着因子関連疾患の治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることを特徴とする。【００１１】
「サイトカイン」は生体諸組織の細胞に由来し、免疫応答の発現や調節等細胞間相互作用に関与する生物活性因子の総称である。主なサイトカインとしては、インターロイキン（IL）、コロニー刺激因子（CSF）、幹細胞因子（SCF）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロン（IFN）、変換成長因子（TGF）、骨形成誘導タンパク質（BMP）、上皮成長因子（EGF）、角質細胞増殖因子（KGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血小板第４因子（PF-4）、ケモカイン受容体CXCR2のリガンド（GRO）、ケモカイン受容体CXCR3のリガンド（IP-10）、マクロファージ炎症タンパク質（MIP）、単球遊走タンパク質（MCP）、正常T細胞に発現する遺伝子産物（RANTES）等が挙げられる。サイトカインの中で、白血球遊走作用があるものでお互いに類似したアミノ酸配列を持つものは、ケモカインと呼ばれる。ケモカインにはCXCケモカイン（例えば、IL-8、Groα、Groβ、SDF-1、IP-10等。）とCCケモカイン（例えば、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、TANTES、RANTES、エオタキシン、MIP-1α MIP-1β、MDC、TARC、LARC、ELC、SLC、PARC等。）があり、前者は好中球の、後者はリンパ球、好酸球の遊走に関わる。本発明のサイトカインとしては、例えば、CCケモカインファミリーに属する因子、特に、MCP-1が好ましい。【００１２】
MCP-1（monocyte chemoattractant protein-1）は単球の走化性因子として見出されたタンパク質（Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 249-255 (1989); GenBank Accession No. P13500）である。単球に対する作用は走化性の促進の他に、ライソゾーム酵素や活性酸素の放出促進、抗腫瘍活性の増強、IL-1及びIL-6の産生誘導等があり、単球活性化因子としての役割が明らかとなっている。単球以外への作用としては、好塩基球の化学伝達物質遊離促進作用、Ｔリンパ球走化性促進作用があげられる。具体的には、以下について、知られている。酸化LDLにより血管内皮細胞や平滑筋細胞でのMCP-1産生が誘導され（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5134 -5138 (1990)）、ヒト及びウサギでの動脈硬化部位のマクロファージ集積箇所においてMCP-1の発現が促進した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5252 - 5256 (1991)）。また、ヒトの動脈硬化部位の平滑筋細胞においてMCP-1の発現が促進した（J. Clin. Invest. 88: 1121 - 1127 (1991)）。バルーン血管形成術による傷害によりMCP-1 mRNAの発現が上昇した（Circ. Res. 70: 314 - 325 (1992)）。慢性関節リウマチ患者の滑液及び滑膜細胞でMCP-1の発現が認められた（J. Clin. Invest. 90: 772 - 779 (1992)）。ラット糸球体腎炎モデルにおいて糸球体でのMCP-1の発現が促進した（Kideny Int. 44: 1036 - 1047 (1993)）。これらのことから、MCP-1産生を抑制する作用を持つ化合物は、動脈硬化、慢性関節リウマチあるいは腎炎等の疾患の治療薬として有効であると考えられている。  【００１３】
「接着因子」とは、細胞同士又は細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与する細胞膜の分子のことである。多細胞組織の形態形成、維持、再生、炎症、腫瘍の転移等に関与し、重要な役割を果たす。主な接着因子として、免疫グロブリンスーパーファミリー（免疫グロブリンに類似のドメインを一つ以上細胞外に含む因子；例えば、VCAM(Vascular Cell Adhesion Molecule)、ICAM（intercellular adhesion molecule）、NCAM（Neural cell adhesion molecule）等。）、カドへリンスーパーファミリー（カルシウム依存性に細胞間の接着に関与する細胞膜タンパク質；例えば、E-カドへリン、N-カドへリン等。）、インテグリンスーパーファミリー（αβの２種のサブユニットのヘテロ二量体で、細胞と細胞外マトリックス間の接着に関与し、細胞内では細胞骨格系と密接に関係する。：例えば、VLA（Very Late Antigen）、LFA （Leukocyte Functional Antigen）、Mac-1、β3インテグリン（αIIbβ3 、αvβ3）、α４β７インテグリン等。）、セクレチンファミリー（レクチン様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインと複数の補体結合様ドメインを細胞外に持つ膜タンパク質群で、血管内皮や白血球に発現し、糖鎖を認識して、リンパ球のホーミング現象に関与する。本発明の接着因子としては、例えば、E-セクレチン、P-セクレチン、L−セクレチン等。）に属する因子が挙げられる。免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着因子、特に、VCAM-1が好ましい。【００１４】
VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、血管内皮細胞上に発現するタンパク質（Cell 59, 1203-1211 (1989); DNA Cell Biol., Vol10, 349-357(1991); GenBank Accession No. P19320）であり、リンパ球・単球・好酸球との接着に関与している。VCAM-1の未刺激の血管内皮細胞における発現は低いか又は無いが、動脈硬化、関節リウマチ、多発性硬化症、気管支喘息、アレルギー性喘息、同種移植片拒絶症、メラノーマ等の癌転移、サルコイドーシス（原因不明の肉芽腫病変がいろいろな臓器で発生する病気）及び種々の急性、慢性炎症性疾患等において、発現促進することが知られている。これらのことから、VCAM-1産生を抑制する作用を持つ化合物は、上記疾患の治療薬として有効であると考えられている。【００１５】
「トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体」とは血管内で形成されたトロンビンがアンチトロンビンＩＩＩ‐ヘパリン複合体と結合し、さらにこの複合体からヘパリンが外れることによって形成された複合体をいう。トロンビンとアンチトロンビンＩＩＩは不可逆的に結合しており、トロンビンのプロテアーゼ活性は不活化される。本発明において用いることのできるトロンビン‐アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）は、例えば哺乳動物の、具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等の血清からトロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを精製し、共にインキュベーションすることによって調製することができる。市販のトロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを用いてＴＡＴを調製することもできる。特に、ヒトＴＡＴが好ましい。
上記インキュベーションは、タンパク質の本来の機能を妨げない溶液中において、トロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持することによって行われ得る。
前記「タンパク質の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．４で、４℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜４０℃、さらに好ましくは、３７℃、１〜５時間、好ましくは3時間維持すること等が挙げられる。より具体的には、５０ mM Tris(pH７．４)中、前記条件下に維持することが挙げられる。【００１６】
「細胞」としては、例えば、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。「血管平滑筋細胞」とは、血管中の主として中膜に存在する平滑筋細胞を意味する。様々な表現型の存在が知られている。「血管内皮細胞」とは、血管内腔を裏打ちして内膜を構成する一層の細胞を意味する。本発明において用いることのできる血管平滑筋細胞及び血管内皮細胞は、例えば哺乳動物の、具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等の血管、好ましくは大動脈等の動脈から調製することができる。実験の目的に応じて適当な方法を選択することができるが、例えば、血管壁から剥離した細胞塊をコラゲナーゼ等の酵素で処理して培養する酵素分散法、血管の小片を培養ディッシュに貼り付ける移植片培養法（エクスプラント法）等を挙げることができる。また、市販の血管平滑筋細胞又は市販の血管内皮細胞を本発明に用いることもできる。【００１７】
「動脈硬化性疾患」とは、動脈が、動脈硬化の危険因子のため弾力性が失われて硬くなったり、内部にさまざまな物質が沈着して血管の通り道が狭くなったり（狭窄）、詰ったり（閉塞）、あるいは動脈壁が部分的に「こぶ」のように拡張（動脈瘤）したり、動脈全体が拡張したり（拡張症）、内膜に亀裂が入り中膜が裂けたり（解離）、破裂（出血）することにより、組織や臓器全体に血行障害を起こす病気の総称である。例えば、アテローム（粥状）動脈硬化、糖尿病性血管傷害、虚血性発作、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血等が挙げられる。【００１８】
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（Ａ）被検物質の存在下、細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを接触させる工程、及び
（Ｂ）サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する工程を含む、
被験物質非存在下に比べて該サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法、が挙げられる。【００１９】
前記工程（Ａ）の「接触」は、ＴＡＴの本来の機能を妨げない溶液中において、細胞、被験物質及びＴＡＴを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持することによって行われ得る。【００２０】
前記「ＴＡＴの本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。【００２１】
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．４で、ＣＯ２濃度１％〜２０％、好ましくは３％〜１０％、さらに好ましくは、５％、４℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜４０℃、さらに好ましくは、３７℃、１時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間、さらに好ましくは、１日維持すること等が挙げられる。【００２２】
前記（Ａ）に記載の工程において、ＴＡＴと被験物質とを細胞に接触させる順序は、どちらが先であってもよく、また同時であってもよいが、被験物質は、ＴＡＴ存在下に細胞と接触させることが好ましい。細胞と接触させるＴＡＴの濃度としては、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌであればよく、２０ｎｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌが好ましい。細胞とＴＡＴとを接触させる時間は通常１時間程度〜４日程度である。細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。細胞と被験物質とを接触させる時間は通常１時間以上４日程度であり、数時間から２日程度が好ましい。【００２３】
「被験物質」としては、いかなる化合物も使用することができる。例えば、有機化合物（アミノ酸、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体、低分子化合物、糖、高分子化合物等）、無機化合物等を使用することができる。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発しうるｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。本発明の被検物質としては、例えば、市販されている化合物のライブラリーを用いてもよい。【００２４】
また、本発明のスクリーニング方法は、血清の非存在下又はごく低濃度（５％以下、好ましくは１％以下）の血清の存在下で行うことが好ましい。「血清」とは、生体から取り出した血液を静置することにより、血球とフィブリンが凝固して分離する透明な上澄みをいう。アルブミン、グロビン等のタンパク質を始め、生体の機能維持に必要な様々な成分を含んでいる。動物の細胞培養を行うためには、合成培地に血清を添加することが必須であり、ウシやウマ、ヒト等の血清を用いることができる。血清の調製方法は、例えば、血液を凝固させて得た上澄みを遠心して血球を除き、メンブランフィルターを用いて濾過滅菌する。ウシ血清、特に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が、一般的に使用されており、本発明のスクリーニング方法において、細胞の培養に使用することができる。血清自体がサイトカイン及び接着因子の産生量増加に関与するため、血清が多量に存在すると、ＴＡＴによるサイトカイン及び／又は接着因子の産生に対する効果が正確に測定できない可能性があるためである。
例えば、下記実施例１では、血管平滑筋細胞の培養に10%ウシ胎児血清（ＩＣＮ社）を含むDulbecco´s Modified Eagle Medium培地（ＤＭＥＭ培地）を用いているが、スクリーニング時には、0.05% ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培地に交換している。該培地には、血清は含まれていない。【００２５】
本発明において、サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、該サイトカイン及び／又は接着因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量又はサイトカイン及び／又は接着因子のタンパク質量を指標として測定するのが好適である。ｍＲＮＡの検出を行う分子生物学的測定方法又はタンパク質の検出を行う免疫学的測定方法（イムノアッセイ）であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、分子生物学的測定方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法等が例示され、免疫学的測定方法（イムノアッセイ）としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、 ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が例示される。以下に、具体的に記載する。【００２６】
分子生物学的測定方法
ＰＣＲの場合、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする核酸をそれぞれ特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、被検物質の存在下及び非存在下の結果を比較することにより、サイトカイン及び／又は接着因子の産生の抑制を評価することができる。【００２７】
ＰＣＲに用いられる「プライマー対」としては、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする核酸若しくは該核酸に特徴的な配列部分からなる核酸の５’末端のアンチセンス配列に対応するプライマーと３’末端のアンチセンス配列に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。【００２８】
本明細書において、「（核酸に）特徴的な部分配列」とは、例えば、GenBank等のデータベースに登録された配列のうち、前記サイトカイン及び／又は接着因子をコードする遺伝子以外の遺伝子の塩基配列には実質的に見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、通常、２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。【００２９】
ノーザンブロット法の場合、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする核酸を検出するプローブを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、被検物質の存在下及び非存在下の結果を比較することにより、サイトカイン及び／又は接着因子の産生の抑制を評価することができる。【００３０】
マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法の場合、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする核酸を検出するプローブを少なくとも１つ以上含んだマイクロアレイ又はマクロアレイを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、被検物質の存在下及び非存在下の結果を比較することにより、サイトカイン及び／又は接着因子の産生の抑制を評価することができる。【００３１】
ノーザンブロット法やマイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法に用いられる「プローブ」としては、サイトカイン及び／又は接着因子をコードする核酸を検出するために使用される核酸が挙げられる。プローブとして用いられる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。【００３２】
免疫学的測定方法（イムノアッセイ）
イムノアッセイの場合、サイトカイン及び／又は接着因子に対する抗体又はその断片を用いてサイトカイン及び／又は接着因子の量を測定し、被検物質の存在下及び非存在下の結果を比較することにより、サイトカイン及び／又は接着因子の産生の抑制を評価することができる。【００３３】
「抗体」とは、サイトカイン及び／又は接着因子に対する抗体、その断片等が挙げられる。すなわち、前記抗体は、前記サイトカイン及び／又は接着因子に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、サイトカイン及び／又は接着因子における特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。前記抗体は、実施例１及び２に記載のように市販の抗体を用いてもよく、また、下記の記載に従って抗体を作製することもできる。得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。【００３４】
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
サイトカイン及び／又は接着因子の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清より、下記方法によりポリクローナル抗体を分離、精製することができる。抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ又はＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独又は組み合わせて処理する方法があげられる。【００３５】
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いたサイトカイン及び／又は接着因子の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。 該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276,269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1640培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及び牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００） ２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）及びアミノプテリン（４×１０-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、Antibodies, A Laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)等に述べられている 酵素免疫測定法により、サイトカイン及び／又は接着因子の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。【００３６】
ウェスタンブロット法の場合には、サンプル由来のポリペプチド調製物は、ゲル電気泳動に供され、適切なメンブレンに移され、そして抗体と反応させられる。次いで、メンブレン上の抗体の存在は、下記のように、適切な検出試薬を用いて検出され得る。【００３７】
別の実施態様において、検出方法は、タンパク質と結合し、そしてこれをサンプルの残りから取り出すための固相支持体に固定された抗体の使用を包含する。次いで、結合タンパク質は、レポーター基を有する二次抗体又は試薬を用いて検出され得る。あるいは、タンパク質がレポーター基で標識され、そして抗体とサンプルとのインキュベーション後、固定抗体と結合させられる、競合アッセイが使用され得る。サンプルの成分が標識タンパク質と抗体との結合を阻害する程度が、サンプルの固定抗体との反応性を示し、そして結果として、サンプル中のタンパク質の濃度を示す。【００３８】
固相支持体は、抗体が付着し得る、当業者に公知の、任意の物質であり得る。固相支持体は、例えば、マイクロタイタープレートの試験ウェル、若しくはニトロセルロースフィルター、若しくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、支持体は、ビーズ又はディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス又は可塑性物質（例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル））であり得る。支持体はまた、磁性粒子又は繊維光学センサー（例えば、米国特許第5,359,681号）であり得る。【００３９】
抗体は、特許文献及び科学文献に詳細に記載されている、当業者に公知の種々の技術を用いて、固相支持体に固定され得る。本発明の文脈において、用語「固定」は、非共有的会合（例えば、吸着）及び共有的付着（抗原と支持体上の官能基との間の直接的連結であり得るか、又は架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル又はメンブレンへの吸着による固定が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中の抗体を支持体と適切な時間の間接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日の間である。一般的に、プラスティックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル）のウェルと、約10ng〜約１μｇ、好ましくは約100〜200ngの抗体との接触が、適切な量のタンパク質を固定するに十分である。【００４０】
抗体の固相支持体への共有的付着はまた、一般的に、支持体と抗体上の官能基（例えば、水酸基又はアミノ基）の両方に反応する二官能性薬剤と支持体をまず反応させることにより達成され得る。例えば、抗体は、適切なポリマーコートを有する支持体に、ベンゾキノンを用いるか又は支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合により、共有的に付着され得る（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook（1991）A12〜A13を参照のこと）。【００４１】
また、二抗体サンドイッチアッセイを用いることもできる。このアッセイは、まず、固相支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）に固定されている抗体と、サンプルとを、サンプル中のポリペプチドが固定された抗体に結合するように接触させることにより行われ得る。次いで、非結合サンプルは、固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてポリペプチド上の異なる部位に結合し得る二次抗体（レポーター基を含む）が添加される。次いで、固相支持体に結合したままの二次抗体の量は、特定のレポーター基に適切な方法を用いて決定される。【００４２】
より詳細には、一旦抗体が支持体上に上記のように固定されると、支持体上の残りのポリペプチド結合部位は代表的にはブロックされる。任意の適切なブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン又はTween 20TM(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)）は、当業者に公知である。次いで、固定抗体はサンプルと共にインキュベートされ、そしてポリペプチドは抗体に結合させられる。サンプルは、インキュベーションの前に適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)）で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間である。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチド及び非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも95％の結合レベルを達成するに十分な時間である。当業者は、平衡を達成するに必要な時間は、一定時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることにより容易に決定されることを理解する。室温にて、約30分間のインキュベーション時間が一般的に十分である。【００４３】
次いで、結合していないサンプルは、固相支持体を適切な緩衝液（例えば、0.1％Tween 20TMを含むPBS）で洗浄することにより除去され得る。次いで、レポーター基を有する二次抗体が、固相支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発色基、蛍光基、及びビオチンを含む。抗体とのレポーター基との結合は、当業者に公知の標準的方法を用いて達成され得る。【００４４】
次いで、二次抗体は、固定抗体-ポリペプチド複合体と共に、結合したポリペプチドを検出するに十分な時間インキュベートされる。適切な時間は、一般的に、所定の時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、結合していない二次抗体が除去され、そして結合した二次抗体はレポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数法又はオートラジオグラフィー法が一般的に適切である。分光法は、色素、発色基及び蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常は、放射活性基若しくは蛍光基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般的に、基質の添加（一般的に特定の時間の間）、続く反応産物の分光分析又は他の分析により検出され得る。【００４５】
上記サイトカイン及び／又は接着因子の産生量を測定する方法により、種々の被験物質のサイトカイン及び／又は接着因子産生抑制能の有無を測定することによって、サイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤を選抜するスクリーニングを行うことができる。【００４６】
例えば、被験物質のサイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制率が、３０％以上を示す物質、好ましくは５０％以上を示す物質を、サイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤として選抜することができる。このように選抜された物質は、サイトカイン及び／又は接着因子を抑制することにより治療又は予防が可能であると考えられている疾患の治療剤又は予防剤、例えば、動脈硬化性疾患抑制剤の有効成分として使用され得る。該サイトカインがMCP-1の場合、選抜された物質は、動脈硬化、慢性関節リウマチあるいは腎炎等の疾患の治療薬又は予防薬として使用され得る。該接着因子がVCAM-1の場合、選抜された物質は、動脈硬化、関節リウマチ、多発性硬化症、気管支喘息、アレルギー性喘息、同種移植片拒絶症、メラノーマ等の癌転移、サルコイドーシス及び種々の急性、慢性炎症性疾患の治療薬又は予防薬として使用され得る。【００４７】
本発明は、ＴＡＴによりサイトカイン及び／又は接着因子の産生量を増加させるという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、効果的に候補化合物を選択することができる。【００４８】
本発明のスクリーニング法により、ＴＡＴによるサイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制して、前記サイトカイン及び／又は接着因子の産生に関連する疾患、例えば、動脈硬化性疾患等に対する治療又は予防作用を発揮する化合物又は塩を見出すことができる。従って、前記スクリーニング方法により得られた化合物により、サイトカイン及び／又は接着因子の産生に関連する疾患、例えば、動脈硬化性疾患等の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。【００４９】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、前記サイトカイン及び／又は接着因子の産生に関連する疾患、例えば、動脈硬化性疾患等に対して、該ＴＡＴの機能の抑制を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。従って、該医薬組成物によれば、他のメカニズムに基づく既存の抗動脈硬化性疾患薬とは異なる作用機序により動脈硬化性疾患等を改善することができるという優れた効果を発揮する。【００５０】
上記の医薬組成物中における前記化合物の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇであることが望ましい。【００５１】
上記の医薬組成物は、前記化合物を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。【００５２】
上記の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。【００５３】
また、上記の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。【００５４】
本発明は、上記のスクリーニング方法とは別の態様として、本発明のスクリーニング方法に用いるためのキットも包含する。例えば、ＴＡＴを含有するキットが挙げられる。このキットは、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する作用を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。【００５５】
本発明は、さらに別の態様として、ＴＡＴを含有する、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進する組成物（産生促進剤）を提供する。すなわち、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進するために、ＴＡＴを使用することができる。該組成物は、バッファー等を含んでいてもよい。該組成物を細胞に添加することにより、細胞にＴＡＴによる刺激を与え、細胞内におけるサイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進することができる。前記細胞を本発明のスクリーニング方法に用いることもできる。【００５６】
本発明は、さらに別の態様として、サイトカイン及び／又は接着因子の産生を促進するためのＴＡＴの使用、及びＴＡＴを投与するサイトカイン及び／又は接着因子の産生促進方法も包含する。
【実施例１】
【００５７】
ＴＡＴ刺激ラット血管平滑筋細胞によるMCP-1産生の測定
MCP-1産生の測定には、定法（J Biol Chem 268 (1993) 17045−17050）に従ってＪＣＬ−ＳＤラットより調製したラット血管平滑筋細胞を用いた。ラット血管平滑筋細胞を９６穴プレートに２×１０３／ウェルの密度で播き、１０％ウシ胎児血清（ICN社）（以下、ＦＢＳと記す。）を含むDulbecco´s Modified Eagle Medium培地（シグマ社）（以下、ＤＭＥＭと記す。）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。３日後、培地を0.05%ウシ血清アルブミン（以下、BSAと記す。）を含むDMEMに交換し、さらに1日培養したのち、再び新しい０．０５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに交換し、ＴＡＴを加えた。ＴＡＴ添加１６時間後に培地を回収し、培地中に含まれるラットMCP-1を、イムノアッセイキット（BIOSOURCE社）を用いて測定した（図１）。その結果、ＴＡＴを加えることにより、MCP-1産生量が上昇した。
【実施例２】
【００５８】
ＴＡＴ刺激ヒト血管内皮細胞によるMCP-1産生、VCAM-1産生の測定
ヒト大動脈血管内皮細胞（CRYO HAEC）（三光純薬社）を９６穴プレートに２×１０３／ウェルで播き、血管内皮細胞培養システム （三光純薬社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。１日後、培地を、１％ＦＢＳを含むMedium-199 （シグマ社）に交換し、さらに１日培養したのち、再び新しい１％ＦＢＳを含むMedium-199に交換し、ＴＡＴを加えた。ＴＡＴ添加６時間後に培地を回収し、培地中に含まれるヒトMCP-1を、イムノアッセイキット（BIOSOURCE社）を用いて測定した（図２）。その結果、ＴＡＴを加えることにより、MCP-1産生量が上昇した。
培地を回収後、細胞に発現するVCAM-1は、抗VCAM-1抗体（BD BIOSCIENCES社）を用いたイムノアッセイ（文献）により測定した（図３）。その結果、ＴＡＴ濃度依存的にVCAM-1産生量が上昇した。
【実施例３】
【００５９】
ＴＡＴのサイトカイン及び／又は接着因子の産生促進活性に対する化合物の抑制活性の測定
実施例１又は２と同様の測定を行い、ＴＡＴ添加前又は後に被検化合物を加えた場合のサイトカイン及び／又は接着因子の産生量を化合物無添加の場合の産生量と比較することによって、被検化合物のサイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制活性を求める。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のスクリーニング方法により、ＴＡＴが関与するメカニズムによるサイトカイン及び／又は接着因子の産生を抑制する化合物をスクリーニングすることがでる。スクリーニングされたサイトカイン及び／又は接着因子の産生抑制剤は動脈硬化性疾患治療剤又は予防剤として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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