(57)【要約】ラクトフェリンを含んだリポソームを経口投与することによって、破骨細胞の増加が抑制される。このため、ラクトフェリンを含んだリポソームの経口投与によって、破骨細胞が関与する骨疾患が効果的に予防又は治療される。本発明は、ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する破骨細胞増加抑制剤、経口組成物、骨疾患（骨粗鬆症、リウマチ、歯槽骨吸収をともなう歯周疾患など）予防又は治療剤、骨疾患予防又は治療方法等を提供するものである。本発明によれば、破骨細胞の増加を抑制し、破骨細胞増加亢進による骨疾患を予防又は治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する破骨細胞増加抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載の破骨細胞増加抑制剤を含有する経口組成物。
【請求項３】
ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する骨疾患予防又は治療剤。
【請求項４】
骨疾患が骨粗鬆症である請求項３に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
骨疾患がリウマチである請求項３に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である請求項３に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
ラクトフェリンを含んだリポソームを骨疾患の予防又は治療に有効な量で哺乳動物に投与することを特徴とする骨疾患の予防又は治療方法。
【請求項８】
骨疾患が骨粗鬆症である請求項７に記載の予防又は治療方法。
【請求項９】
骨疾患がリウマチである請求項７に記載の予防又は治療方法。
【請求項１０】
骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である請求項７に記載の予防又は治療方法。
【請求項１１】
骨疾患予防又は治療剤を製造するためのラクトフェリンを含んだリポソームの使用。
【請求項１２】
骨疾患が骨粗鬆症である請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
骨疾患がリウマチである請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞の増加を抑制する破骨細胞増加抑制剤、経口組成物、及び骨疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は骨構成細胞と細胞間基質から構成されており、重量的には後者が主体を占めている。細胞間基質としては、膠原線維と無機成分が挙げられる。この骨組織においては、自身の形態変化や血中カルシウム濃度の恒常化を行なうため、常にリモデリングが生じている。通常成人でのリモデリングでは、骨吸収量と骨形成量が釣り合っているために、骨重量はほとんど変化しない。しかし、骨吸収量に見合うだけの骨形成量が得られない状態になると、骨粗鬆症に代表される骨疾患を発症する。骨リモデリングの状態を考慮した要因で分類すると、(1)閉経早期の骨粗鬆症や甲状腺機能亢進症に代表される骨吸収機能の促進に伴う骨重量の減少；(2) 老人性骨粗鬆症、糖尿病性骨粗鬆症に代表される骨吸収および骨形成機能の低下に伴う骨重量の低下；(3)骨吸収および骨形成機能は正常であるが、結果として骨吸収量が骨形成量を上回ることに伴う骨重量の低下（例えば、カルシウムの摂取不足）：の３つに分けることができる。このように、骨粗鬆症は、加齢と共にその発症率は増大し、しかも、閉経後の女性に急増する。【０００３】
現在、骨疾患の治療または予防として用いられている代表的な方法としては、(1)カルシウム／マグネシウムの補給；(2)カルシトニンの投与；(3)運動療法の採用（特に高齢者を対象）；(4)活性型ビタミンＤの投与（特に高齢者を対象）；(5)エストロゲン製剤の投与（特に閉経後の女性を対象）；(6)副甲状腺ホルモンの投与：などが挙げられ、通常は原因を考慮した上で、これらを組み合わせて実施される。【０００４】
しかし、この中で、ホルモン製剤は、予防としては用いることはできない上に、治療に用いた場合でも副作用が発生するリスクが高いため、使用に際しては医師の厳重な管理下で行なう必要がある。また、ホルモン治療を併用しない他の方法では、充分な効果が得られていない。従って、副作用のリスクを伴わない治療または予防法の開発が望まれており、多くの提案がなされている。代表的なものとしては、吸収率の高いミネラル素材やその組み合わせに着眼した提案（特許文献１、特許文献２）、ミネラルの吸収率を向上させる成分とミネラルを併用する事に着眼した提案（特許文献３、特許文献４）、骨構成細胞の機能を向上させる物質に着眼した提案（特許文献５、特許文献６）などが挙げられる。
【特許文献１】特開昭６２−５０１８４３号公報
【特許文献２】特表平０６−５００５５２号公報
【特許文献３】特開平０６−４０９２２号公報
【特許文献４】特開平０６−７０７２６号公報
【特許文献５】特公平０７−７６２３５号公報
【特許文献６】特開平０２−３０３４５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記提案をもってしても骨疾患の予防や治療を十分に行う事が出来ず、さらに効果の高い提案が望まれている。具体的には、上記の骨疾患の予防又は治療においては、骨形成量と骨吸収量をバランスさせることが必要となる。  骨のリモデリングは主として骨形成と骨吸収のバランスにより制御されている。骨吸収を担うのは破骨細胞であり、破骨細胞の分化、破骨細胞の骨吸収活性の調節、破骨細胞のアポトーシスによって骨吸収が調節されていると考えられている。このため、破骨細胞の増加を抑制することによって、骨吸収を抑制することが可能である。骨粗鬆症では、破骨細胞の働きにより骨吸収が増大して骨形成と骨吸収のバランスが乱れ、骨量の低下が進行して骨が脆弱化する。また、関節リウマチでは、炎症滑膜によって産生される種々のプロテアーゼによる直接的な基質破壊と共に、破骨細胞による軟骨及び骨の破壊が発生している。したがって、破骨細胞の増加を抑制することによって骨粗鬆症や関節リウマチをはじめとする破骨細胞が関与する骨疾患の予防又は治療が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ラクトフェリンを含んだリポソームが優れた破骨細胞増加抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
即ち、本発明は、下記の各項に係る破骨細胞増加抑制剤、経口組成物、骨疾患予防又は治療剤、予防又は治療方法、及び使用を提供するものである。
項１．ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する破骨細胞増加抑制剤。
項２．項１に記載の破骨細胞増加抑制剤を含有する経口組成物。
項３．ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する骨疾患予防又は治療剤。
項４．骨疾患が骨粗鬆症である項３に記載の予防又は治療剤。
項５．骨疾患がリウマチである項３に記載の予防又は治療剤。
項６．骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である項３に記載の予防又は治療剤。
項７．ラクトフェリンを含んだリポソームを骨疾患の予防又は治療に有効な量で哺乳動物に投与することを特徴とする骨疾患の予防又は治療方法。
項８．骨疾患が骨粗鬆症である項７に記載の予防又は治療方法。
項９．骨疾患がリウマチである項７に記載の予防又は治療方法。
項１０．骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である項７に記載の予防又は治療方法。
項１１．骨疾患予防又は治療剤を製造するためのラクトフェリンを含んだリポソームの使用。
項１２．骨疾患が骨粗鬆症である項１１に記載の使用。
項１３．骨疾患がリウマチである項１１に記載の使用。
項１４．骨疾患が歯槽骨吸収をともなう歯周疾患である項１１に記載の使用。【０００８】
また、本願は下記の破骨細胞増加を抑制する方法を包含しうる。
項i．ラクトフェリンを含んだリポソームを破骨細胞増加抑制に有効な量で投与することを特徴とする破骨細胞増加を抑制する方法。【０００９】
本発明において、リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができ、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的にDDS製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため安全性が高いことも知られている。【００１０】
一般的に、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム（MLV）と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にSUV（small unilamella vesicle）、LUV（large unilamella vesicle）、GUV（giant unilamella vesicle）などに分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはMLVである。本発明では、リポソームの大きさは、通常30〜1000nm、好ましくは30〜600nm、より好ましくは50〜200nmである。【００１１】
本発明において使用されるラクトフェリンを含んだリポソームにおいて、ラクトフェリンはリポソーム膜に囲まれる空間に封入されていることが好ましいが、ラクトフェリンがリポソーム膜構成成分として含まれていても良いし、多重膜リポソームを構成する多重膜の間に含まれていても良いし、リポソーム膜のうちの最も外側の膜にラクトフェリンが付着又は結合する形態で含まれていても良い。【００１２】
ラクトフェリンを含んだリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所望量のレシチン及び必要に応じて所望量のステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これにラクトフェリンや任意の生理活性物質を含む水溶液を添加して、例えば、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより、ラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。【００１３】
また、この方法とは別に、所望量のレシチン及び必要に応じて所望量ステロールを少量のエタノールに溶解後、水溶液又は緩衝液に分散して予備乳化を行った後、高圧で分散させて脂質二重層を形成させてリポソーム懸濁液を調製することによってもラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。【００１４】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中のラクトフェリンを除去する操作、例えば懸濁液を濾過後，得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。【００１５】
リポソームの懸濁液は、液状のままでも使用できるが、凍結乾燥した乾燥物として使用することもできる。リポソームは、その乾燥物を錠剤やカプセル化したものをはじめ、様々な経口摂取に適した形態とすることが可能である。【００１６】
本発明に用いるラクトフェリンはその由来は限定されないが、例えば哺乳動物（ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）から得られるラクトフェリンを使用することができる。このうちウシ又はヒト由来のラクトフェリンが好ましい。ラクトフェリンはこれら動物の乳又は乳処理物（脱脂乳、ホエー等）から常法により分離されることにより得られる。また、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン 、各種飽和度で金属を飽和したラクトフェリン又はそれらの２種以上の任意の混合物などを使用できる。その他に、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、動物等で生産した各種ラクトフェリンを使用してもよい。また、本発明においては加水分解処理したラクトフェリンを用いることもできる。これらのラクトフェリン又はラクトフェリン誘導体は市販のものを用いてもよい。【００１７】
ラクトフェリンの好ましい分子量は1000〜200000程度である。また、リポソームに含まれるラクトフェリンには、ラクトフェリンの加水分解物も包含され、この加水分解物は好ましい態様の一つである。ラクトフェリンを含んだリポソーム中におけるラクトフェリンの含有量は通常、10〜99重量％程度、好ましくは20〜95重量％程度、より好ましくは30〜90重量％程度である。【００１８】
レシチンとしては、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどを１種単独で又は２種以上組み合わせて使用することができるがこれらに限定されない。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール ３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用できる。特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンが好ましい。具体的には、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。【００１９】
ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、エルゴスタディエノール、シトステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロール等が挙げられ、１種単独で又は２種以上組み合わせて使用できる。これらの中でも、コレステロール又はフィトステロールが好ましく用いられる。【００２０】
リポソームにおけるレシチンとステロールのモル比は、55：45〜95：5程度が好ましく、60：40〜90：10程度がより好ましく、75：25〜85：15程度が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。【００２１】
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるレシチンの含有量は、通常1〜80重量％程度、好ましくは3〜65重量％程度、より好ましくは5〜50重量％程度である。【００２２】
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるステロールの含有量は、通常0〜40重量％程度、好ましくは0.1〜30重量％程度、より好ましくは1〜20重量％程度である。【００２３】
レシチン又はステロールの含有量は既知の方法で測定できる。例えば、レシチンの含有量はFiske-Subbarow法など、ステロールの含有量はHPLC、比色法などによって定量できる。【００２４】
さらに、ラクトフェリンを含んだリポソームの表面をコーティングすることができ、このコーティング物も有効成分として利用できる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類によるコーティングがあげられる。硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、該硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものも包含され、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。【００２５】
硫酸基含有多糖類としては、分子量が5000〜300000程度のものが好ましく用いられる。これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。【００２６】
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン100重量部に対して、10〜500重量部程度が好ましく、20〜200重量部程度がより好ましい。【００２７】
コーティングは、例えば、ラクトフェリンを含んだリポソームを含む懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。【００２８】
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされていることは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。【００２９】
ラクトフェリンを含んだリポソームにはレシチン、フィトステロール以外にも必要に応じて、トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等を加えることができる。【００３０】
また、ラクトフェリンを含んだリポソームには、必要に応じて、ラクトフェリンに加えて、様々な物質を内容物として封入することができる。例えば、クロラムフェニコール、硫酸フラジオマイシン、エデト酸ナトリウム・セトリミド、エピジヒドロコレステリン、塩化亜鉛、塩化デカリニウム、塩化ベンゼトニウム、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フッ化ナトリウム、非ステロイド性抗炎症薬、副腎皮質ステロイド薬、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ペニシラミン、ブシラミン、ロベンザリット二ナトリウム、サラゾスルファピリジン、アクタリット、メトトレキサート、ミゾリビン、抗TNF抗体、可溶性TNFレセプター、抗インターロイキン1抗体、抗インターロイキン6抗体、エストラジオール、エストリオール等のエストロゲン製剤、塩酸ラロキシフェン、アレンドロネート、エチドロネート、リセドロネート等のビスホスホネート製剤、エルカトニン、カルシトニン、イプリフラボンなどである。【００３１】
本発明の破骨細胞増加抑制剤、経口組成物及び予防又は治療剤におけるラクトフェリンを含んだリポソームの含有量は、剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。【００３２】
本発明の破骨細胞増加抑制剤は、経口組成物に配合することが可能であり、経口組成物の中でも食品組成物又は医薬組成物としての利用が特に好ましい。【００３３】
本発明の破骨細胞増加抑制剤を食品組成物として利用する場合には、リポソームを必要に応じてその食品の形態に応じた可食性担体、食品素材、食品添加物などと組み合わせて、通常の方法により調製することができる。食品の形態としては、飲料などの液状の食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレットなどの固形の食品等として利用することができる。また、ヨーグルトなどの半固形の食品としても利用することができる。具体的な食品の形態としては、ジュース、清涼飲料水、ティー等の液体飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューインガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、フィルムシート、ウエハース、グミ、煎餅、饅頭等の菓子類；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類、麺類、こんにゃく、練り製品（かまぼこ等）、ふりかけ、口腔用スプレー、トローチ等が挙げられる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。【００３４】
本発明の経口食品組成物は、骨疾患の予防又は治療のため、歯槽骨吸収を伴う歯周病の予防又は治療のため、歯周病の予防又は治療のため、加齢にともなう歯周病の予防又は治療のため、健全な歯を保つため、歯の損失を防ぐため、リウマチの予防又は治療のため、骨粗鬆症の予防又は治療のため、健全な骨を保つため等の健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品等の用途に用いることができる。【００３５】
経口食品組成物の担体として例えば、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコール類、結晶セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸塩類、リン酸塩類等の賦形剤、ゼラチン、アルギン酸、キサンタンガム、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、プルラン、ペクチン等の粘結剤、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、酵素処理レシチン、酵素分解レシチン、サポニン等の乳化剤、アスコルビン酸、トコフェロール等の抗酸化剤、乳酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の酸味料、ビタミン類、アミノ酸類、乳酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩などの強化剤、二酸化ケイ素等の流動化剤、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸塩類等の滑沢剤、ラクチュロース、ラフィノース、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖等のオリゴ糖、難消化性デキストリン、サイリウム、ビートファイバー等の食物繊維、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、グリシルリチン等の甘味料、香料を使用することができる。【００３６】
本発明の経口食品組成物において経口食品組成物全量に対するラクトフェリンを含んだリポソーム含有量は組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。【００３７】
また、本発明の破骨細胞増加抑制剤を医薬組成物として利用する場合には、フィトステロールを含んだリポソームに、必要に応じて薬学的に許容される担体を配合し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な形態の医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、経口医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。このような医薬組成物は骨疾患予防又は治療剤として用いることができる。【００３８】
担体として例えばマルチトール、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、タルク、リン酸一水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、カカオ脂等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、クロスポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、結晶セルロース、粉末セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カリウム、アラビアゴム末、プルラン、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン、キサンタンガム、トラガント、トラガント末、マクロゴール等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。カプセル剤は有効成分を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。【００３９】
液体製剤は水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の添加剤を用いて常法に従い、調製される。【００４０】
着香剤または香料としては、例えば、ハッカ油、ユーカリ油、ケイヒ油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、ローズ油、フルーツフレーバー、ミントフレーバー、ペパーミントパウダー、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール等が挙げられる。【００４１】
本発明の経口医薬組成物において経口医薬組成物全量に対するラクトフェリンを含んだリポソーム含有量は、組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。【００４２】
本発明の破骨細胞増加抑制剤及び経口組成物の摂取量（投与量）は、成人一人１日あたり、ラクトフェリンを含んだリポソームの摂取重量が、通常10mg〜10000mg程度、好ましくは50mg〜2000mg程度となる量である。【００４３】
本発明の破骨細胞増加抑制剤及び経口組成物は有効成分であるラクトフェリンを含んだリポソームの破骨細胞増加抑制作用を利用する分野において利用でき、例えば、骨疾患の予防又は治療に有用である。特に、本発明の破骨細胞増加抑制剤が破骨細胞増加抑制作用を示すことから、骨疾患の中でも骨重量の低下を伴う疾患に有用である。骨重量の低下を伴う疾患としては、骨粗鬆症、リウマチ、変形関節症、歯槽骨吸収をともなう歯周疾患（歯肉炎、歯周炎など）、不正咬合、歯牙物理的損傷、根幹治療に伴う歯槽骨吸収、口腔内の膿胞や腫瘍による歯槽骨吸収などがあげられる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の破骨細胞増加抑制剤及び経口組成物は破骨細胞増加を抑制する作用を有し、骨疾患の予防又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下に実施例及び試験例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(1)
薄膜水和法により、ラクトフェリンを封入したリポソーム製剤を調製した。ラクトフェリンはウシ由来のものを使用した。卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が7：3となるように量りとり（卵黄レシチン 63.0mg、フィトステロール 14.55mg）、エタノール 6mlを加えて溶解した。この溶液からロータリーエバポレーターにて溶媒留去し、薄膜を形成させた。この薄膜にラクトフェリン180mgを溶解させたクエン酸緩衝液（pH 6.69）の6mlを加え、ボルテックスミキサーにより2000rpmにて3分間程度撹拌を行い、リポソーム懸濁液を得た。この懸濁液を0.4μmの孔径のポリカーボネート膜を用いて濾過し、ラクトフェリン封入リポソームを得た。なお、このリポソームを1％リンタングステン酸処理によりネガティブ染色し、乾燥後、これを電子顕微鏡で観察して、多重膜リポソームが形成されていることを確認した。【００４７】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(2)
卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が84:16となるように、卵黄レシチン 1g、フィトステロール 0.12gを量り、エタノール5mlを加えて溶解した。この溶液に3重量%のラクトフェリン水溶液 95mlを加えて予備乳化を行った後、高圧ホモジネーションによりラクトフェリン封入リポソームを得た。ラクトフェリンはウシ由来のものを使用した。なお、このリポソームを1重量%リンタングステン酸処理によりネガティブ染色し、乾燥後、これを電子顕微鏡で観察して、多重層リポソームが形成されていることを確認した。【００４８】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(3)
薄膜水和法により、ラクトフェリンを封入し、フコイダンによりコーティングされたリポソーム製剤を調製した。ラクトフェリンはウシ由来のものを使用した。卵黄レシチンとフィトステロールをモル比が7：3になるように量りとり（卵黄レシチン 63.0 mg、フィトステロール 14.55 mg）、エタノール 6 mLを加えて溶解した。この溶液からロータリーエバポレーターにて溶媒留去し、薄膜を形成させた。この薄膜にラクトフェリン 180 mgを溶解させたクエン酸緩衝液（pH 6.69）の6 mLを加え、ボルテックスミキサーにより2,000 rpmにて3分間程度撹拌を行い、リポソーム懸濁液を得た。この懸濁液を0.4 μmの孔径のポリカーボネート膜を用いてろ過し、得られたろ液をセルロースエステル膜（MWCO 300,000）を用いて透析することによりリポソーム外液中のラクトフェリンを除去し、ラクトフェリン封入リポソームを得た。得られたラクトフェリンリポソーム懸濁液 6 mLに36 mgのフコイダンを加え、ボルテックスミキサーにより強く撹拌し、フコイダンでコーティングしたラクトフェリン封入リポソームを得た。【００４９】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(4)
ウシ由来のラクトフェリンをヒト由来のラクトフェリンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(1)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５０】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(5)
ウシ由来のラクトフェリンをヒト由来のラクトフェリンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(2)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５１】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(6)
ウシ由来のラクトフェリンをヒト由来のラクトフェリンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(3)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５２】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(7)
卵黄レシチンを大豆レシチンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(1)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５３】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(8)
卵黄レシチンを大豆レシチンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(2)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５４】
ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(9)
卵黄レシチンを大豆レシチンに変更した以外は、前記ラクトフェリンを含んだリポソームの調製(3)と同様の方法にてラクトフェリン封入リポソームを得た。【００５５】
試験例１
LPSを局所適用されたラットにおけるラクトフェリン含んだリポソームによる組織学的応答
7週齢Wistar系雄性ラットを、ラクトフェリン水溶液（MLF）群（30匹）、ラクトフェリンを封入したリポソーム分散液（SLF）群（30匹）及びコントロール群（30匹）に分け、それぞれの被検試料を７日間経口投与した。ラット１匹あたりのラクトフェリン投与量は500mg/kg/日である。なお、コントロール群には飲料水のみを摂取させた。なお、ラクトフェリンはウシ由来のものを使用し、レシチンは卵黄レシチンを使用した。【００５６】
〔被検試料〕
コントロール：飲料水
MLF：ラクトフェリン含有量0.2125重量％
SLF：ラクトフェリン含有量0.2125重量％、レシチン含有量0.071重量％、フィトステロール含有量0.0085重量％【００５７】
その後、5mg/mlのLPS（リポポリサッカライド（破骨細胞増加因子））溶液を浸潤させた綿栓をラット上顎臼歯口蓋側辺縁歯周組織に1時間静置して、歯肉溝からLPSの浸透投与を行った。0（LPS投与直前）時間、LPS投与3時間及び2, 3, 7日後に各6匹のラットを解剖し、１ラットあたり２個所の辺縁歯周組織（ｎ＝１２）を摘出し、染色し、歯槽骨の歯根膜側において、歯槽骨頂部から下へ1mmの範囲（図１）に含まれる多核の破骨細胞数をカウントした。標本組織はヘマトキシリン・エオジン（HE）及び酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）で染色した。HE染色では、単核の細胞と多核の細胞の区別が容易となる。TRAP染色では破骨細胞及び前駆破骨細胞に特異的に赤っぽく染色でき、破骨細胞及び前駆破骨細胞と他の細胞との区別が容易となる。両染色によってカウントされた破骨細胞数及びTRAP染色陽性細胞数を各々図２及び３に示す。なお、TRAP染色された細胞の内、多核の細胞が破骨細胞、単核の細胞が前駆破骨細胞である。また、TRAP染色陽性細胞数は破骨細胞数及び前駆破骨細胞数の総数に該当する。0時間後、3時間後及び3日後の組織のHE染色顕微鏡写真を図４〜６に示す。なお、それぞれの被検試料はLPS投与後も引き続き投与又は摂取された。【００５８】
〔試験条件〕
実験動物：Wistar系雄性ラット（7週齢）
被検試料：ラクトフェリン（MLF）、500mg/kg/日
ラクトフェリンを封入したリポソーム（SLF）、500mg/kg/日
LPS溶液： 大腸菌由来LPSの生理食塩水溶液（5mg/ml）
投与時間：LPS浸透投与1時間
観察期間：LPS投与直前及び投与開始より3時間後及び2, 3, 7日目
観察部位：上顎臼歯口蓋側辺縁歯周組織【００５９】
図２に示されるように、コントロール群ではLPS投与後に破骨細胞が増加した。特に、3時間後及び3日後に破骨細胞数が多かった。リポソーム化されていないラクトフェリンの経口投与によって破骨細胞の増加が抑制された（MLF群）。しかしながら、ラクトフェリンを封入したリポソームの経口投与によって、破骨細胞の増加がさらに抑制された。MLF群とSLF群との比較では、両群のラクトフェリン投与量は同量であるものの、SLF群の破骨細胞増加抑制作用が有意に高かった。これらの傾向は、TRAP染色陽性細胞数（図３）においても同様であった。破骨細胞とその前駆細胞が染色されるTRAP染色（図３）において、SLF投与群における陽性細胞の数が減少していたことから、破骨細胞増加抑制は前駆破骨細胞から破骨細胞への分化の段階で抑制されていることが確認された。【００６０】
試験例２
１群あたりのラット数を6匹とし、被検試料のSLF及び観察期間を下記のように変更した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。なお、各観察期間において解剖されるラットは2匹である。【００６１】
ラクトフェリンを封入したリポソーム（S’LF）、100mg/kg/日
観察期間：LPS投与直前及び投与開始より3時間後及び3日目【００６２】
本試験の結果、MLF群とS’LF群との比較では、破骨細胞増加抑制作用は同程度であった。S’LF群のラクトフェリン投与量がMLF群の同投与量の1/5であることから、ラクトフェリンを封入したリポソームはラクトフェリンより低投与量で同等の作用を得られることが示された。【００６３】
製造例１：錠剤
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリン（Ａ成分）を用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分（Ｂ成分）を用いて常法により、下記の組成の錠剤を製造した。
卵黄レシチン              4.0重量％（Ａ成分）
植物性ステロール        1.0重量％（Ａ成分）
ラクトフェリン             15.0重量％（Ａ成分）
マルチトール            42.0重量％（Ｂ成分）
乳糖                       20.0重量％（Ｂ成分）
ラクチュロース           15.0重量％（Ｂ成分）
ショ糖脂肪酸エステル    3.0重量％（Ｂ成分）
合計                         100重量％【００６４】
製造例２：顆粒剤
下記のレシチン及びラクトフェリン（Ａ成分）を用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分（Ｂ成分）を用いて常法により、下記の組成の顆粒剤を製造した。
卵黄レシチン           5.0重量％（Ａ成分）
ラクトフェリン         20.0重量％（Ａ成分）
乳糖                   33.3重量％（Ｂ成分）
デンプン              40.0重量％（Ｂ成分）
キサンタンガム       1.0重量％（Ｂ成分）
トコフェロール       0.1重量％（Ｂ成分）
グルコン酸            0.1重量％（Ｂ成分）
香料                   0.5重量％（Ｂ成分）
合計                  100重量％【００６５】
製造例３：飲料
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリン（Ａ成分）を用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームと下記の他の成分（Ｂ成分）を用いて常法により、下記の組成の飲料を製造した。
卵黄レシチン            0.5重量％（Ａ成分）
植物性ステロール       0.1重量％（Ａ成分）
ラクトフェリン             2.0重量％（Ａ成分）
クエン酸                  0.5重量％（Ｂ成分）
クエン酸ナトリウム     0.05重量％（Ｂ成分）
果糖・ブドウ糖液糖   10.0重量％（Ｂ成分）
ビタミンC                 0.5重量％（Ｂ成分）
香料                     0.15重量％（Ｂ成分）
精製水                  残部（Ｂ成分）
合計                     100重量％【００６６】
製造例４：チュアブル
下記のレシチン、ステロール及びラクトフェリン（Ａ成分）を用いてラクトフェリンを含んだリポソームを調製し、このリポソームをフコイダン（Ａ成分）でコーティングし、このコーティングリポソームと下記の他の成分（Ｂ成分）を用いて常法により、下記の組成のチュアブルを製造した。
大豆レシチン                4.0重量％（Ａ成分）
植物性ステロール         0.8重量％（Ａ成分）
ラクトフェリン              40.0重量％（Ａ成分）
フコイダン                  1.4重量％（Ａ成分）
マルチトール             30.0重量％（Ｂ成分）
キシリトール               20.0重量％（Ｂ成分）
ショ糖脂肪酸エステル    3.0重量％（Ｂ成分）
香料                         0.8重量％（Ｂ成分）
合計                         100重量％
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の破骨細胞増加抑制剤及び経口組成物は有効成分であるラクトフェリンを含んだリポソームの破骨細胞増加抑制作用を利用する分野において利用でき、例えば、破骨細胞増加亢進による骨疾患の予防又は治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】細胞数をカウントした部位を示す垂直断面図である。JEは接合上皮、Rは歯根、ABは歯槽骨を示す。
【図２】試験例１においてカウントした破骨細胞数を表すグラフである。横軸はLPS投与後の時間（時間又は日数）、縦軸は破骨細胞数（個）を示す。３種類の棒グラフは左からコントロール、ラクトフェリン、リポソーム化ラクトフェリンを表す。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３】試験例１においてカウントしたTRAP染色に陽性を示した細胞の数を表すグラフである。横軸はLPS投与後の時間（時間又は日数）、縦軸はTRAP染色陽性細胞数（個）を示す。３種類の棒グラフは左からコントロール、ラクトフェリン、リポソーム化ラクトフェリンを表す。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図４】試験例１において観察された、染色されたLPS投与0時間後のラット歯周組織の顕微鏡写真である（各スケールバーは100μmを示す）。左側及び中央の列はHE染色された歯周組織を示し、右側の列はTRAP染色された歯周組織を示す。中央の列において破骨細胞は矢印で示されている。
【図５】試験例１において観察された、染色されたLPS投与3時間後のラット歯周組織の顕微鏡写真である（各スケールバーは100μmを示す）。左側及び中央の列はHE染色された歯周組織を示し、右側の列はTRAP染色された歯周組織を示す。中央の列において破骨細胞は矢印で示されている。
【図６】試験例１において観察された、染色されたLPS投与3日後のラット歯周組織の顕微鏡写真である（各スケールバーは100μmを示す）。左側及び中央の列はHE染色された歯周組織を示し、右側の列はTRAP染色された歯周組織を示す。中央の列において破骨細胞は矢印で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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