(57)【要約】  本発明は重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解する技術を提供することを目的とする。  本発明は、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法に関する。
2007043657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法。
【請求項２】
前記微生物が、セラチア・マルセセンス又はコベチア・マリナに属する細菌である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５）又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６）である請求項１記載の方法。
【請求項４】
重金属がＦｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ａｕ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｚｎ、Ｃｄ及びＨｇからなる群から選択されるものである請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
有機物質が難分解性芳香族化合物である請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５）。
【請求項７】
コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６）。
【請求項８】
重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、
セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第１処理物を得る工程、
重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程、及び
前記第２処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物を有用資源化する工程を含む前記方法。
【請求項９】
前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、前記爆砕生成物中のセルロース又はヘミセルロースを糖化又は発酵により有用資源化する工程である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、爆砕生成物中のリグニン成分を樹脂化することにより有用資源化する工程である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、
セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第１処理物を得る工程、
重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程、及び
前記第２処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物から重金属を回収する工程を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重金属存在下で有機物質を分解する方法、並びに重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェノールなどを含む有機性廃水は、製鉄工業、石炭石油工業、プラスチック工業、製薬工業など多くの分野の工場から排出され、しかもその多くに銅や鉄などの重金属が含まれている。また、汚染された地下水などは重金属や有機物質を多く含む。重金属と有機物質とで汚染された土壌等の処理法の開発が急がれている。【０００３】
廃水や汚染土壌中の有機物質を微生物を用いて分解する方法は数多く研究されているが、従来の方法で用いられる微生物は重金属により活性阻害を受けるため、重金属と有機物質とで汚染された土壌等の処理には用いることができないという問題があった。【０００４】
現在、重金属を多く含む有機性廃水の処理のほとんどは、活性炭などの物理的処理や化学的処理によって重金属を除去した後に、残った有機物質を活性汚泥法などで分解処理している。この方法では重金属を処理した際に生じる廃棄物に有機物質を多く含むため、さらなる二次処理の問題が生じている。また、活性汚泥法は余剰汚泥などの廃棄物が生じ、その処理が問題となっている。重金属を含む有機性廃水処理に関する技術を開示した特許文献のうち、生物のみを用いた環境負荷低減型・廃棄物抑制型のものはほとんどない。例えば、「有機性汚水の処理方法」（特開平９−１５０１９３号公報）では、生物処理・オゾン処理・熱分解処理・ガス化処理・沈殿処理のいくつもの処理法を用いてリン、窒素を高速に除去し、余剰汚泥の発生を少なくし、焼却灰からの重金属の溶出を失くした有機性汚水の処理方法を提供している。余剰汚泥の減量化には成功しているものの、最終的に余剰汚泥は生ゴミといっしょに焼却していることから、廃棄物が発生しないとは言いがたい。また、この処理システムはオゾン処理、熱分解処理、ガス化処理に多くのエネルギーを必要とするという問題がある。また、「廃棄物の安定化処理方法」（特開２００４−２１６２６６号公報）では、活性汚泥法による排水処理で生じた余剰汚泥を乾留処理により炭化し、廃棄物の安定化材として埋め立処分場における覆土材に混合して施用している。しかしながら、この方法では余剰汚泥に含まれる重金属などによる二次汚染のおそれもある。また、余剰汚泥を覆土材としてのみ再利用するのであって再利用の用途が限定的であるという問題もある。【０００５】
一方、本発明者らはこれまでに重金属を吸収する性質を有する植物を用いて、重金属汚染された土壌等を浄化するファイトメディエーション技術を開発している（特開２００５−１９９２０９号公報）。しかしながら植物による重金属の吸収作用は多くの場合、有機物質により阻害を受けるから、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌の浄化のために上記ファイトメディエーション技術を適用することは難しい。
【特許文献１】特開平９−１５０１９３号公報
【特許文献２】特開２００４−２１６２６６号公報
【特許文献３】特開２００５−１９９２０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解する技術を提供することを目的とする。【０００７】
本発明が目的とする、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解する技術が提供されれば、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解し、続いて上記の特開２００５−１９９２０９号公報に開示されたファイトメディエーション技術を用いて重金属を植物体に吸収させるとともに吸収後の植物体を有用資源化することが可能になる。すなわち、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌の、生物的処理方法のみを用いた環境負荷低減型・廃棄物抑制型の浄化方法が実現される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の発明を包含する。【０００９】
（１）セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法。【００１０】
（２）前記微生物が、セラチア・マルセセンス又はコベチア・マリナに属する細菌である（１）記載の方法。【００１１】
（３）前記微生物が、セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５）又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６）である（１）記載の方法。【００１２】
（４）重金属がＦｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ａｕ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｚｎ、Ｃｄ及びＨｇからなる群から選択されるものである（１）〜（３）の何れかに記載の方法。【００１３】
（５）有機物質が難分解性芳香族化合物である（１）〜（４）の何れかに記載の方法。【００１４】
（６）セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５）。【００１５】
（７）コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６）。【００１６】
（８）重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第１処理物を得る工程、重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程、及び前記第２処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物を有用資源化する工程を含む前記方法。【００１７】
（９）前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、前記爆砕生成物中のセルロース又はヘミセルロースを糖化又は発酵により有用資源化する工程である（８）記載の方法。【００１８】
（１０）前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、爆砕生成物中のリグニン成分を樹脂化することにより有用資源化する工程である（８）記載の方法。【００１９】
（１１）重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第１処理物を得る工程、重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程、及び前記第２処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物から重金属を回収する工程を含む前記方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解する技術が提供される。【００２１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-300682号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る、重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法の概略を示す図である。
【図２】新規海洋細菌を用いた重金属含有フェノール水溶液の処理における菌体光学密度及びフェノール濃度の経時的変化を示す図である。
【図３】ホンモンジゴケを用いた重金属含有水溶液の処理における植物体乾燥重量及び銅濃度の経時的変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法に関する。本方法によれば重金属と有機物質とを共に含む汚染水、汚染土壌等において有機物質を生物的に分解することができる。【００２４】
上記重金属としては例えばＦｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ａｕ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｚｎ、Ｃｄ及びＨｇからなる群から選択されるものが挙げられる。これらの重金属は典型的には塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩等あるいはイオン化した形態で汚染水又は汚染土壌中に存在する。【００２５】
上記有機物質としては典型的には難分解性芳香族化合物が挙げられる。難分解性芳香族化合物としては、特に限定されないが、例えば、フェノール類（ビスフェノール類、ハロゲン化フェノール類、アルキルフェノール類等を含む）、ダイオキシン類、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）類、フタル酸エステル類、エストラジオール、ベンゾフェノン、トリクロロエチレン等が挙げられる。【００２６】
本発明ではフェノール類が特に好適に分解される。フェノール類とは、フェニル基の水素原子をヒドロキシ基で置換したヒドロキシフェニル基を少なくとも１個有する化合物又はその誘導体を意味する。誘導体としては、ベンゼン環の水素原子が炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のエーテル基及びハロゲンから選ばれる１〜５個の置換基で置換されたヒドロキシフェニル基を有する化合物、フェノールのアルキルエーテル部分（例えば、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、プロポキシフェニル基など）を有する化合物などが含まれる。フェノール類としては、具体的には、フェノール、ビスフェノール、ハロゲン化フェノール、アルキルフェノール及びこれらの上記誘導体が挙げられる。【００２７】
上記ビスフェノールとは、ヒドロキシフェニル基が、好ましくはそれぞれパラ位で、２価の基を介して結合した化合物を意味する。ここで２価の基としては、スルホニル基、スルフィニル基、２価の有機基、例えば、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキレン基、炭素数３〜６の２価の脂環式炭化水素基、フェニレン基、フェニレンジアルキリデン（オルト、メタ、パラ）等が挙げられる。これらの２価の有機基は、ハロゲン基、フェニル基等で置換されていてもよい。ビスフェノールとしては、具体的には、ビスフェノールＡ（２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン）、ビスフェノールＦ（ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン）、ビスフェノールＡＦ（２，２’−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ヘキサフルオロプロパン）、ビスフェノールＳ（４，４’−ジヒドロキシジフェニルスルホン）、ビスフェノールＭ（４，４’−（１，３−フェニレンジイソプロピリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＥ（４，４’−エチリデンビスフェノール）、ビスフェノールＰ（４，４’−（１，４−フェニレンジイソプロピリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＡＰ（４，４’−（１−フェニルエチリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＺ（４，４’−シクロヘキシリデンビスフェノール）等が挙げられる。【００２８】
上記ハロゲン化フェノールとは、フェノールの水素原子が１個以上のハロゲン（例えば、フッ素、塩素及び臭素、好ましくは塩素）で置換されたフェノールを意味する。例えばペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、クロロフェノール、ジクロロフェノール等が挙げられ、ハロゲン化フェノール誘導体としては、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールレッド等が挙げられる。【００２９】
上記アルキルフェノールとは、フェノールのベンゼン環に結合した水素原子が１〜５個のアルキル基で置換された化合物を意味する。前記アルキル基としては例えば炭素数１〜９、好ましくは炭素数４〜９の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられる。上記アルキルフェノールは、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のエーテル基及びハロゲンから選ばれる１〜４個の置換基で更に置換された誘導体であってもよい。好適なアルキルフェノールとしては、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、イソペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）等が挙げられ、アルキルフェノール誘導体としては、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等が挙げられる。これらアルキルフェノールは、アルキル基がヒドロキシ基に対してオルト、メタ又はパラ位にあるいずれの異性体であってもよい。【００３０】
上記ダイオキシン類としては、例えば、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン等のジベンゾ−ｐ−ジオキシンの多塩素化物；２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾフラン、２，３，４，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾフラン等のジベンゾフランの多塩素化物等が挙げられる。【００３１】
上記ＰＣＢ類としては、例えば３，３’，４，４’−テトラクロロビフェノール、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェノール、３，３’，４，４’，５，５’−ヘキサクロロビフェノール等のコプラナー（Ｃｏｐｌａｎａｒ）ＰＣＢが挙げられる。【００３２】
上記フタル酸エステル類としては、ジブチルフタレート、ブチルベンジルフタレート、ジ−２−エチルヘキシルフタレート等が挙げられる。【００３３】
本発明に用いることができる微生物としては、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物であれば特に限定されない。【００３４】
上記微生物は好気性微生物であることが好ましい。好気性微生物は有機物質を分解する際に酸素を消費して二酸化炭素を放出するが、放出された二酸化炭素は、後述するファイトメディエーション法において植物により資化され、有用資源化され得るからである。【００３５】
上記微生物はより好ましくは、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌポリペプトン、１００ｍｇ／Ｌフェノール、及び５０ｍｇ／Ｌ塩化銅を含む水溶液中に３０℃の温度において初期菌体光学密度（波長６１０ｎｍ）０．０１で添加されたときに、５５時間以内、好ましくは２０時間以内でフェノールの全量を分解することができる微生物である。【００３６】
上記微生物としてはセラチア・マルセセンス又はコベチア・マリナに属する細菌が挙げられるがこれらには限定されない。セラチア・マルセセンスのなかでも特に５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌポリペプトン、１００ｍｇ／Ｌフェノール、及び５０ｍｇ／Ｌ塩化銅を含む水溶液中に３０℃の温度において初期菌体光学密度（波長６１０ｎｍ）０．０１で添加されたときに、２０時間以内でフェノールの全量を分解することができる細菌が好ましい。コベチア・マリナのなかでも特に５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌポリペプトン、１００ｍｇ／Ｌフェノール、及び５０ｍｇ／Ｌ塩化銅を含む水溶液中に３０℃の温度において初期菌体光学密度（波長６１０ｎｍ）０．０１で添加されたときに、５５時間以内でフェノールの全量を分解することができる細菌が好ましい。【００３７】
上記微生物として最も好ましいものは、セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５）又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４（受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６）である。これらの菌は重金属が高濃度（例えば５０〜１００ｍｇ塩化銅）で含有された有機物質汚染廃水又は土壌中で、重金属による阻害を受けることなく有機物質を分解することができる。【００３８】
セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３は本発明者らが海洋生物アメフラシの腸内容物から単離した新規微生物であり、２００５年８月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９５として寄託された（国内寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−２０６２８よりブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管された）。【００３９】
コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４は本発明者らが海洋魚類メゴチの腸内容物から単離した新規微生物であり、２００５年８月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６９６として寄託された（国内寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−２０６２９よりブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管された）。【００４０】
セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３及びコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４は次の形態及び生理・生化学性状試験の結果を示す。
【表１】
2007043657.tif 000003
【００４１】
セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３及びコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の帰属分類群は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列約５００ｂｐを用いて推定した。常法に従ってゲノムＤＮＡの抽出を行ない、抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）のうち５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された塩基配列をシーケンシングし、１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列を得た。決定されたセラチアｓｐ．ＥＢＲ０３及びコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２として配列表に示す。【００４２】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列を用いて相同性検索を行なうとともに、検索された上位１０株と検体の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列を用いて近隣結合法により分子系統樹を作製し、近縁種及び帰属分類群を検討した。相同性検索及び系統樹の作製にはＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１を、相同性検索を行なう際のデータベースとしてＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用した。更にまた、ＢＬＡＳＴを用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性検索を行なった。【００４３】
セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列は、ＭｉｃｒｏＳｅｑを用いた解析の結果、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡに対して９９．２４％の相同性を示した。分子系統樹上でもセラチア・マルセセンスの１６Ｓ  ｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示された。ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索では、Ｓ．  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｕｅｎｓｉｓ  ＫＲＥＤ株（基準株）の１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し９９．４％の相同性を示した。塩基配列が完全に一致するものは認められなかったことから、海洋生物アメフラシの腸内容物から単離した本微生物はセラチア属に属する新規微生物であると判断した。【００４４】
コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列はＭｉｃｒｏＳｅｑを用いた解析の結果、コベチア・マリナ（Ｃｏｂｅｔｉａ  ｍａｒｉｎａ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡに対して９９．８１％の相同性を示した。分子系統樹上でもコベチア・マリナの１６Ｓ  ｒＤＮＡとほぼ同じ枝に位置した。ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索では、Ｃ．  ｍａｒｉｎａ  ＤＳＭ  ４７４１株（基準株）の１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し９９．６％の相同性を示した。塩基配列が完全に一致するものは認められなかったことから、海洋魚類メゴチの腸内容物からから単離した本微生物はコベチア属に属する新規微生物であると判断した。【００４５】
本発明には、セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の変異株もまた好適に使用される。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３の変異株としては、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが、配列番号１の塩基配列と９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する部分塩基配列を有するものであることが好ましい。コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の変異株としては、その１６Ｓ  ｒＤＮＡが、配列番号２の塩基配列と９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する部分塩基配列を有するものであることが好ましい。【００４６】
本発明において上記微生物はいずれも、微生物自体の懸濁液として使用することができるだけでなく、適当な担体に担持させた、固定化された形態で使用することもできる。【００４７】
上記微生物の重金属及び有機物質を含有する系への投与量は特に限定されないが、好ましくは６１０ｎｍ波長の菌体光学密度として０．０１から０．１程度で十分である。【００４８】
上記微生物を用いて有機物質を分解する際の培養条件は特に限定されないが、例えば、処理対象が重金属及び有機物質を含有する土壌である場合、温度は５℃から４０℃において生育及び分解処理可能であり、ｐＨは中性が好ましいが酸性条件下でも生育及び分解処理可能である。処理対象が重金属及び有機物質を含有する水である場合、温度は５℃から４０℃において生育及び分解処理可能であり、ｐＨは中性が好ましいが酸性条件下でも生育及び分解処理可能である。【００４９】
上記で説明した方法を用いれば重金属及び有機物質を含有する土壌又は水において有機物質を分解することが可能になる。また本発明者らはこれまでに重金属を吸収する性質を有する植物を用いて、重金属汚染された土壌等を浄化するファイトメディエーション技術（特開２００５−１９９２０９号公報）を開発していることは先に述べた通りである。そこで本発明者らは両技術を組合せ、本発明の次の形態を完成するに至った。【００５０】
すなわち本発明はまた、重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第１処理物を得る工程、重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程、及び、前記第２処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物を有用資源化する工程を含む前記方法に関する。本発明は更にまた、上記の爆砕生成物を有用資源化する工程に換えて、又は同工程に加えて、前記爆砕生成物から重金属を回収する工程を含む、重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法に関する。本実施形態の一例をフローチャートとして図１に示す。【００５１】
重金属耐性のある上記微生物を用いて有機物質を分解して第１処理物を得る工程は本明細書でこれまでに詳述した有機物質の処理方法にほかならない。本工程は通常、水分を多く含んだ懸濁液又は水溶液中で行なわれるから、得られる第１処理物もまた懸濁液又は水溶液の形態であることが多い。本工程は攪拌手段を備えた処理槽中で行われることが好ましい。微生物は、微生物自体の懸濁液として使用することができるだけでなく、適当な担体に担持させた、固定化された形態で使用することもできる。微生物が固定化された形態である場合、有機物質分解処理後の第１処理物から微生物を分離することが容易であるため好ましい。微生物が固定化されていない懸濁液の状態で用いられる場合、ろ過、透析等の常法により有機物質分解処理後の第１処理物から微生物を分離することができる。また、第１処理物から微生物を分離せずに直接次の重金属処理工程に供することもできる。すなわち以下の重金属処理工程における「第１処理物」とは微生物が分離されたものと分離されていないものの両方を包含する。【００５２】
重金属を吸収する植物を用いて前記第１処理物を処理して第２処理物を得る工程で用いることができる植物としては、重金属を吸収・蓄積する能力を有する植物（Ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒ）であれば特に限定されないが、例えばホンモンジゴケ、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｈｙｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ナズナ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｃａｌａｍｉｎａｒｅ等）、ブタクサ（Ａｌｐｉｎｅ  ｐｅｎｎｙｃｒｅｓｓやＡｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉａｅｆｏｌｉａ  ｖａｒ．  ｅｌａｔｉｏｒ等）、マリーゴールド（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ、Ｔａｇｅｔｅｓ  ｐａｔｕｌａ等）、ブライダルベール（Ｇｉｂａｓｉｓ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）、ヘビノネゴザ（Ａｔｈｒｉｕｍ  ｙｏｋｏｓｃｅｎｓｅ）等が挙げられる。特にホンモンジゴケは原糸体細胞として第１処理物中に懸濁するなどして分散させて重金属吸収処理を行なうことができるため好ましい。ホンモンジゴケによる処理条件としては、例えば温度は、一般的な外気温の範囲内（５℃から４０℃）、時間は約１週間程度で処理することができる。ヨウシュヤマゴボウ等による第１処理物の処理は、第１処理物を培地としてヨウシュヤマゴボウ等を裁培することにより第１処理物中に含まれる重金属を吸収させることによって行なうことができる。あるいは、処理対象水を用いた水耕栽培によって重金属を吸収処理することができる。【００５３】
重金属を吸収する本工程では植物の生育に必要な二酸化炭素として空気中に存在する二酸化炭素だけでなく有機物質処理工程で好気性微生物から排出された二酸化炭素を利用することもできる。【００５４】
第２処理物から植物を分離する方法としては特に限定されないが、植物としてホンモンジゴケの原糸体細胞を用いる場合、原糸体細胞を沈殿させることにより分離することができる。植物分離後の第２処理物は重金属及び有機物質を実質的に含まないから、処理水として環境中に放出することができる。【００５５】
分離された重金属吸収後の植物から有用物質の再資源化と重金属の回収を行なうために、前記植物の水蒸気爆砕を行なう。水蒸気爆砕装置は通常、水蒸気発生器、高圧反応器、生成物受器、凝縮器を備えている。水蒸気爆砕の温度、圧力等の諸条件は特に限定されず、被爆砕物に合わせて適宜決定できる。なお有機物質の分解に用いられた微生物菌体又はその死骸、破片等の残存物が植物体中に混入していることがあるが、その場合は、混入した微生物菌体又はその上記残存物も同様に水蒸気爆砕を受け、下記の有用資源化工程で利用される。【００５６】
植物体には主としてセルロース成分、ヘミセルロース成分、及びリグニン成分が含まれ、水蒸気爆砕によりこれらの成分が利用可能となる。セルロース成分及びヘミセルロース成分の有用資源化の例としては特に限定されないが、メタン発酵、糖化、食品添加剤原料としての利用、エタノール資源化、パルプ化等が挙げられる。リグニン成分は分子量に応じて種々の有用資源化が可能である。例えば、低分子リグニンは接着剤や樹脂材料に変換して使用することができ、高分子リグニンは活性炭や、土壌改良剤等に変換して使用することができる。【００５７】
重金属の回収方法は特に限定されないが爆砕生成物又は爆砕生成物から上記有用資源化工程を経て残存した成分に含まれる有機物を燃焼させた後に残存した成分として回収することができる。あるいは、中和沈殿法、硫化物沈殿法、シアン化銅回収法、金属置換法、バクテリアリーチング法、電解回収法、溶媒抽出法、塩化揮発法等でも回収することができる。【００５８】
以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明するが本発明は実施例の内容には限定されない。
【実施例】
【００５９】
下記実験で用いた試薬はすべて和光純薬工業株式会社製のものを用いた。【００６０】
１．重金属耐性細菌によるフェノールの分解
５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌポリペプトン、１００ｍｇ／Ｌフェノール、５０ｍｇ／Ｌ塩化銅を含む水溶液を調製した。【００６１】
上記水溶液にそれぞれセラチアｓｐ．ＥＢＲ０３又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４を菌体光学密度（波長６１０ｎｍ）０．０１となるように添加した。比較実験として、セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３又はコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４に代えて、フェノール分解菌として知られるアシネトバクター・カルコアセチカスＡＨ（大阪大学より入手）を菌体光学密度（波長６１０ｎｍ）０．０１となるように上記水溶液に添加した。菌体添加後、３０℃にて攪拌しながら６０時間、培養を行なった。【００６２】
培養中の菌体光学密度を分光光度計（島津製作所製ＵＶ−ｍｉｎｉ１２４０）で経時的に測定した。フェノール濃度はＷａｋｏｓｉｌ  Ａｇｒｉ―９カラムを装着した液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−１０Ａ）を用いて経時的に測定した。【００６３】
結果を図２に示す。新規海洋細菌であるセラチアｓｐ．ＥＢＲ０３及びコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４が添加された水溶液中では、菌体の増殖とともにフェノールが分解された。セラチアｓｐ．ＥＢＲ０３は約２０時間で、コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４は約５５時間でほぼ完全にフェノールを分解することができた。一方、従来のフェノール分解菌であるアシネトバクター・カルコアセチカスＡＨが添加された水溶液中では菌体増殖もフェノール分解も見られなかった。これは重金属である銅による阻害作用が原因であると考えられる。【００６４】
重金属を高濃度含有している有機物質含有廃水は、従来の細菌では分解処理できないが、発明者らが単離した新規海洋細菌を用いることによって、分解処理可能である。【００６５】
２．植物による重金属の吸収
０．００１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．０１８４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＮＯ３、及び０．０４５ｍＭ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む基本培地に重金属として塩化銅を銅イオン濃度として１００ｍｇ／Ｌで添加した溶液を調製した。【００６６】
上記溶液を１００ｍＬ容量植物培養試験管（相互理化学硝子製作所製培養５号）に入れ、ホンモンジゴケを乾燥重量約５ｇ/Ｌの量添加した。【００６７】
上記溶液を、バイオシェーカー（タイテック製ＢＲ−３０Ｌ）に蛍光灯を４本取り付けて改造した装置に設置し、４５９０ルクスの連続照射のもと、温度２５℃、回転数５０ｒｐｍで培養を行なった。【００６８】
経時的にサンプルを採取し、溶液中の銅イオン濃度（ｍｇ／L）及び１リットル当たりの植物体（ホンモンジゴケ）の乾燥重量（ｇ／L）を測定した。銅イオン濃度はＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−８０ＴＳカラムを装着した液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−１０Ａ）を用いて経時的に測定した。植物体（ホンモンジゴケ）の乾燥重量は培養液１ｍＬを適宜サンプリングし、８０℃のオーブン（ＹＡＭＡＴＯ製ＤＸ−５８）で２４時間乾燥させた後電子天秤（メトラートレド製ＡＢ１０４−Ｓ）にて測定した。結果を図３に示す。ホンモンジゴケの増殖とともに銅イオンは減少し、初期濃度１００ｍｇ／Ｌから約７日で排水基準の３ｍｇ／Ｌ以下の約２ｍｇ／Ｌに達し、９日後には検出できない程度まで減少した。このように、高濃度の重金属を含む廃水は、ホンモンジゴケを用いることによって、高効率で吸収処理することが可能であった。【００６９】
３．海洋細菌とホンモンジゴケの有用資源化
海洋細菌（コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４）とホンモンジゴケを物理的破砕効果と化学的加水分解効果のある水蒸気爆砕法によって粉砕・分解した。有機物質及び重金属等を吸収・蓄積した海洋細菌（コベチアｓｐ．ＥＢＲ０４）とホンモンジゴケの混合物は乾燥重量１０ｇを使用した。この混合物は次の手順で調製した。上記１の手順で有機物質を分解処理した後のコベチアｓｐ．ＥＢＲ０４の培養液１Ｌ（１００ｍＬ×１０本）を遠心分離して菌体を回収した。遠心分離は島津製作所製ＣＳＴ−１５１ＭＴにより１５０００ｒｐｍで５分間行った。一方、上記２の手順で重金属を吸収処理した後のホンモンジゴケの培養液１Ｌ（１００ｍＬ×１０本）を遠心分離してコケを回収した。遠心分離は島津製作所製ＣＳＴ−１５１ＭＴにより１５０００ｒｐｍで１０分間行った。回収された海洋細菌菌体とコケとを混合し、８０℃のオーブン（ＹＡＭＡＴＯ製ＤＸ−５８）で２４時間乾燥させたものを水蒸気爆砕処理に用いた。なお、本実験において敢えて細菌とコケとを混合した理由は、本発明の方法を工業化する際には両者を混合状態で処理することが想定されるからである。水蒸気爆砕装置は水蒸気発生器、高圧反応器、生成物受器、凝縮器からなり、最高使用温度２７５℃、最高使用圧力６．０ＭＰａである。実施例として、温度２２５℃、圧力２．５５ＭＰａの水蒸気を用いて行った。また、爆砕生成物中のセルロース・ヘミセルロース成分の資源化例としてメタン発酵によってメタンに資源化した。次に、メタン化された後の残渣をメタノール抽出し、メタノール可溶性成分からリグニン樹脂を製造した。さらに、メタノール抽出後の残渣物から金属を回収した。【００７０】
以下、その結果を順次説明する。【００７１】
３―１．成分抽出比
有機物質及び重金属等を吸収・蓄積した海洋細菌とホンモンジゴケの水可溶性ヘミセルロース、ホロセルロース、メタノール可溶性リグニン（低分子リグニン）とＫｌａｓｏｎリグニン（高分子リグニン）の各成分抽出比を検討した。凍結乾燥後の爆砕生成物５ｇに蒸留水３００ｍＬを加え、室温で１２時間浸透しながら抽出した。ろ液は乾燥後その残渣の重量を測定して水可溶性成分（水可溶性ヘミセルロース）とした。水で抽出した残渣はすばやく乾燥し、乾燥残渣１ｇは１００ｍＬのメタノールを用いたソックスレー抽出器で１２時間抽出した。メタノールで抽出された成分の乾燥重量を測定し、メタノール可溶性リグニン量とした。メタノール抽出後の残渣中にはメタノール不溶性リグニン（Ｋｌａｓｏｎリグニン）とホロセルロース（多糖成分）が含まれる。残渣中のリグニン量は硫酸を用いたＫｌａｓｏｎ法によって定量し、ホロセルロース量は残渣量からＫｌａｓｏｎリグニン量を差し引くことによって求めた。【００７２】
３−２．セルロース・ヘミセルロースのメタン化
凍結乾燥後の海洋細菌とホンモンジゴケ爆砕生成物５ｇを５００ｍＬ容量三角フラスコに入れ、下水処理汚泥５００ｍＬを加え、ｐＨ７、温度３７℃で培養した。フラスコ内の気相は予めアルゴンガスで置換した。発生したガスは塩化ビニル管によりアクリル樹脂製のガス収集管に導き、飽和食塩水中で水上置換により捕集した。なお、水蒸気爆砕処理しなかった海洋細菌とホンモンジゴケから同様の実験を行ったが、メタンはほとんど生成されなかった。【００７３】
３−３．メタノール可溶性リグニンの樹脂化
メタン発酵後の残渣物を凍結乾燥した。乾燥残渣は１００ｍＬメタノールを用いたソックスレー抽出器で１２時間抽出した。メタノールで抽出された成分の乾燥物をエポキシ樹脂化の原料として用いた。エポキシ反応は試料２ｇをエポクロルヒドリン１００ｍＬに溶解させ、１０ＮのＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを１１０℃でゆっくり滴下し、水を除去しながら３時間反応させた。反応終了後、生成したＮａＣｌを取り除くために蒸留水で洗浄した後、溶媒をエバポレートしてエポキシ化リグニンを得た。エポキシ化リグニンからエポキシ化リグニン樹脂を作成するためのゲル化反応には硬化剤としてジエチレントリアミンを用いた。その結果、約５ｇのエポキシ化リグニン樹脂が得られた。【００７４】
３−４．残渣物からの重金属回収
前記、メタノール可溶性リグニンの樹脂化において用いなかった残渣物（Ｋｌａｓｏｎリグニン）から有価金属を回収した。残渣物約６００ｍｇをるつぼにとり、９０℃、１２時間乾固させた。さらに、５００℃、６時間加熱し、炭素を二酸化炭素にして取り除いた。処理した試料をるつぼ内で１０％硝酸水溶液１０ｍＬに溶解させ、金属回収溶液とした。【００７５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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