(57)【要約】  本願発明者らは、U18666Aについて、HCVレプリコン阻害活性の検討を行ったところ、本化合物はHCVレプリコンRNAの複製またはHCVタンパク質の発現を阻害する効果を持つことが認められた。さらに本願発明者らは、siRNAを用いたDHCR24のノックダウン実験を行ったところ、DHCR24の発現を抑制した細胞では、有意にHCVレプリコン活性及びHCVタンパク質発現が阻害されることが明らかとなった。以上のことから、コレステロール生合成過程に関与する酵素活性を阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが出来ることを明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
【請求項２】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項１に記載の薬剤。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
【請求項３】
ＤＨＣＲ２４の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（１）
2007099869.tif 000030
〔式中、Ｘは、下記：
2007099869.tif 000031
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｗは、下記：
2007099869.tif 000032
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｙは、水素原子またはメチル基を示し；
Ｖは、酸素原子又は硫黄原子を示し；
ｎは２〜６の整数を示し；
ｍは０または１を示し；
Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル基を示し、または隣接する窒素原子と一緒になって互いに結合してモルフォリニル基を形成していてもよく；
2007099869.tif 000033
は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記式（１）で表される化合物が、下記一般式（２）
2007099869.tif 000034
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、nは、請求項３に記載のＲ1、Ｒ2、ｍ、nと同意義である。〕で表される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記式（１）で表される化合物が、下記式（３）
2007099869.tif 000035
で表される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項６】
DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、DHCR24を認識する抗体である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項７】
DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項２に記載の薬剤。
（ａ）DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）DHCR24をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
【請求項８】
HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項１から７のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）（ａ）に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程
（ｃ）（ａ）に記載の酵素と結合する被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該コレステロールの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
【請求項１４】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素が、DHCR24である、請求項９から１３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項９から１４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項９から１５のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【請求項１７】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を対象に投与する工程を含む、HCV感染症を治療または予防する方法。
【請求項１８】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項１７に記載の方法。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
【請求項１９】
HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用。
【請求項２０】
デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項１９に記載の使用。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行しそのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。
ＨＣＶは１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Hepacivirus）属に分類される。【０００３】
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。
よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。【０００４】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶ  ゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。
近年、リバビリン（Ribavirin：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。【０００５】
ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていなかった。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。
しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。
下記式（３）で表される化合物の塩酸塩U18666A（3β-(2-Diethylaminoethoxy)androst-5-en-17-one, HCl）は、細胞透過性の両イオン性アミノステロイドで、細胞膜のタンパク質透過性を阻害する化合物として知られている。
2007099869.tif 000002
3-beta-hydroxysterol delta-24-reductase活性を阻害することで、細胞内のLDL由来コレステロールの生合成と移送を阻害するものと考えられている。また，Δ8-ステロールイソメラーゼ活性を阻害することも知られている。【０００６】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】WO2006/016657
【特許文献２】WO2005/019268
【非特許文献１】Lohmann V., et al., Science, 285, 110-113 (1999)
【非特許文献２】Ye J., et al., PNAS, 100 (26), 15865-15870 (2003)
【非特許文献３】Sakamoto H., et al., Nat Chem Biol. 1(6):333-7 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリン、およびコレステロールは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、HIV等のウイルスはラフトを介して複製される（Takeda M. et al., PNAS, 100, 25(2003)、Lucero H. A., et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208(2004)、Simons K., Nature, 387, 569 (1997)、G.- Z. Leu et al. Biochemical and biophysical research communications, 318(1), 275-80 (2004)）。【０００８】
本願発明者らは、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与すること、およびスフィンゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となることを明らかにした（特許文献１、非特許文献３）。
また、コレステロールの生合成に関わる3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAレダクターゼを阻害する化合物であるロバスタチンが、HCVの複製阻害活性を有することが知られている（非特許文献２）。しかしながら、ロバスタチンのHCV複製阻害能は低く、コレステロールの生合成の阻害がHCV感染症の治療または予防に関与するか否かは定かではなかった。また、HCV感染症の治療または予防に対し、より高い効果を示す薬剤の提供が求められており、このような薬剤を提供するための効果的な薬剤のスクリーニング法も求められている。【０００９】
一方、本発明者らは、これまでにコレステロール生合成の最終段階を触媒する酵素である3-beta-hydroxysterol delta-24-reductase（DHCR24）が、肝癌患者の癌部および肝癌細胞株において高発現していることを見出し、DHCR24を認識する抗体が肝癌のマーカーとして使用可能であることを明らかにした（特許文献２）。
しかしながら、コレステロール生合成に関与するDHCR24の活性および発現阻害が、ＨＣＶの複製阻害活性を有するか否かは解明されていなかった。【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を提供することにある。また、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットの提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、細胞膜上のラフトの構成成分であるコレステロールの生合成を阻害することにより、HCV複製が阻害されるか否かについて検討を行った。まず、以下の式（３）で表される化合物の塩酸塩である、デスモステロールからコレステロールの生合成を特異的に阻害する化合物U18666Aについて、ＨＣＶレプリコンアッセイを行った。【００１２】
2007099869.tif 000003
【００１３】
U18666Aを0nMから500nMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、培養しタンパク質を回収した後、HCVタンパク由来の抗NS3ウサギ抗体を用いてウエスタン解析を行った。その結果、U18666Aに84nMの濃度でHCVタンパク質の発現を50%減少させる効果が認められた（図２）。また、U18666Aを0nMから1000nMの範囲でHCVレプリコン保持細胞FLR3-1に与え、培養後、ルシフェラーゼアッセイおよびWSTによる細胞毒性試験を行った。その結果、U18666AはHCVレプリコン阻害活性を示すことが明らかになった（図３）。さらに、U18666Aはロバスタチンよりも明らかに高いHCVレプリコン阻害活性を示した。
以上の結果より、DHCR24を特異的に阻害する化合物U18666Aは、抗HCV複製阻害活性を持ち、コレステロール生合成がHCV感染に関与していることが示唆された。【００１４】
さらに、DHCR24をsiRNAによりノックダウンして、HCVレプリコン阻害活性を測定した。具体的には、DHCR24発現を低下させた条件下で、FLR-3-1細胞におけるHCVレプリコン活性の影響を測定した。その結果、DHCR24の発現を抑制するためsiRNA処理した細胞では、コントロールsiRNA処理した細胞に対し有意にHCVレプリコン活性を阻害する効果が強く認められた（図４）。
これらの結果より、コレステロール生合成がHCV感染に関与することがわかり、該生合成過程に存在する酵素活性を阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが可能であると示唆された。【００１５】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔３２〕を提供するものである。
〔１〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
〔２〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、〔１〕に記載の薬剤。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
〔３〕  ＤＨＣＲ２４の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（１）
2007099869.tif 000004
〔式中、Ｘは、下記：
2007099869.tif 000005
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｗは、下記：
2007099869.tif 000006
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｙは、水素原子またはメチル基を示し；
Ｖは、酸素原子又は硫黄原子を示し；
ｎは２〜６の整数を示し；
ｍは０または１を示し；
Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル基を示し、または隣接する窒素原子と一緒になって互いに結合してモルフォリニル基を形成していてもよく；
2007099869.tif 000007
は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔２〕に記載の薬剤。
〔４〕  前記式（１）で表される化合物が、下記一般式（２）
2007099869.tif 000008
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、nは、請求項３に記載のＲ1、Ｒ2、ｍ、nと同意義である。〕で表される、〔３〕に記載の薬剤。
〔５〕  前記式（１）で表される化合物が、下記式（３）
2007099869.tif 000009
で表される、〔３〕に記載の薬剤。
〔６〕  DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、DHCR24を認識する抗体である、〔２〕に記載の薬剤。
〔７〕  DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（ａ）または（ｂ）である、〔２〕に記載の薬剤。
（ａ）DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）DHCR24をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
〔８〕  HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の薬剤。
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）（ａ）に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程
（ｃ）（ａ）に記載の酵素と結合する被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該コレステロールの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程
〔１４〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素が、DHCR24である、〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１５〕  HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔９〕〜〔１４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１６〕  〔９〕〜〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
〔１７〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を対象に投与する工程を含む、HCV感染症を治療または予防する方法。
〔１８〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、〔１７〕に記載の方法。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
〔１９〕  ＤＨＣＲ２４の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（１）
2007099869.tif 000010
〔式中、Ｘは、下記：
2007099869.tif 000011
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｗは、下記：
2007099869.tif 000012
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｙは、水素原子またはメチル基を示し；
Ｖは、酸素原子又は硫黄原子を示し；
ｎは２〜６の整数を示し；
ｍは０または１を示し；
Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル基を示し、または隣接する窒素原子と一緒になって互いに結合してモルフォリニル基を形成していてもよく；
2007099869.tif 000013
は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕  前記式（１）で表される化合物が、下記一般式（２）
2007099869.tif 000014
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、nは、請求項３に記載のＲ1、Ｒ2、ｍ、nと同意義である。〕で表される、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕  前記式（１）で表される化合物が、下記式（３）
2007099869.tif 000015
で表される、〔１９〕に記載の方法。
〔２２〕  DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、DHCR24を認識する抗体である、〔１８〕に記載の方法。
〔２３〕  DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（ａ）または（ｂ）である、〔１８〕に記載の方法。
（ａ）DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）DHCR24をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
〔２４〕  HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔１７〕から〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕  HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用。
〔２６〕  デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質が以下の（ａ）または（ｂ）である、〔２５〕に記載の使用。
（ａ）DHCR24の酵素活性を阻害する物質
（ｂ）DHCR24の発現を抑制する物質
〔２７〕  ＤＨＣＲ２４の酵素活性を阻害する物質が、下記一般式（１）
2007099869.tif 000016
〔式中、Ｘは、下記：
2007099869.tif 000017
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｗは、下記：
2007099869.tif 000018
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｙは、水素原子またはメチル基を示し；
Ｖは、酸素原子又は硫黄原子を示し；
ｎは２〜６の整数を示し；
ｍは０または１を示し；
Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル基を示し、または隣接する窒素原子と一緒になって互いに結合してモルフォリニル基を形成していてもよく；
2007099869.tif 000019
は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、〔２６〕に記載の使用。
〔２８〕  前記式（１）で表される化合物が、下記一般式（２）
2007099869.tif 000020
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、nは、請求項３に記載のＲ1、Ｒ2、ｍ、nと同意義である。〕で表される、〔２７〕に記載の使用。
〔２９〕  前記式（１）で表される化合物が、下記式（３）
2007099869.tif 000021
で表される、〔２７〕に記載の使用。
〔３０〕  DHCR24の酵素活性を阻害する物質が、DHCR24を認識する抗体である、〔２６〕に記載の使用。
〔３１〕  DHCR24の発現を抑制する物質が、以下の（ａ）または（ｂ）である、〔２６〕に記載の使用。
（ａ）DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）DHCR24をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
〔３２〕  HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、〔２５〕から〔３１〕のいずれかに記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAからコレステロールの生合成過程および、HCV複製までのカスケードを示す図である。
【図２】ウェスタンブロット解析による、U18666AのHCVタンパク質合成阻害活性を測定した結果を示す写真である。
【図３】U18666AのHCVレプリコン阻害活性および細胞毒性を測定した結果を示す図である。
【図４】DHCR24 siRNAのHCVレプリコン阻害活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、コレステロールの生合成過程を遮断する物質を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。
本発明において、コレステロールの生合成過程としては、より好ましくは3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAからコレステロールの生合成過程（図１）を挙げることが出来る。
本発明において、コレステロールの生合成過程を遮断する物質とは、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAからコレステロールの生合成過程に関わる生体内反応を、直接的もしくは間接的に阻害するものであれば如何なる物質であってもよい。該物質は、コレステロールの生合成過程に関わる酵素の活性を阻害する物質、コレステロールの生合成に関わる酵素の発現を阻害する物質であってもよく、また、これらの阻害剤を生成または増加させる物質であって、生合成に関わる酵素を間接的に阻害する物質であってもよい。【００１８】
本発明の「コレステロールの生合成過程に関わる酵素の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
本発明において、コレステロールの生合成過程に関わる酵素としては、より好ましくは3-beta-hydroxysterol delta-24-reductase（DHCR24）を挙げることができる。
本発明の物質としては、コレステロール生合成過程の最終段階である、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を好ましい例として挙げることができる。該生合成過程を遮断する物質としては、該生合成に関与するDHCR24の酵素活性または該酵素の発現を阻害する化合物を挙げることができる。【００１９】
本発明の、DHCR24の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましくは
下記一般式（１）
2007099869.tif 000022
〔式中、Ｘは、下記：
2007099869.tif 000023
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｗは、下記：
2007099869.tif 000024
からなる群から選ばれるいずれかの基を示し；
Ｙは、水素原子またはメチル基を示し；
Ｖは、酸素原子又は硫黄原子を示し；
ｎは２〜６の整数を示し；
ｍは０または１を示し；
Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル基を示し、または隣接する窒素原子と一緒になって互いに結合してモルフォリニル基を形成していてもよく；
2007099869.tif 000025
は、単結合または二重結合を意味する。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を挙げることができる。【００２０】
式（１）で表される化合物について、Ｘは、好ましくはオキソ基である。Ｗは、好ましくは−ＣＨ２−である。Ｖは、好ましくは酸素原子である。ｎは好ましくは２または３であり、更に好ましくは２である。ｍは、好ましくは０である。Ｒ1とＲ2は、互いに独立して、好ましくはメチル基もしくはエチル基であり、さらに好ましくはともにエチル基である。
また、
2007099869.tif 000026
としては、好ましくは二重結合である。【００２１】
式（１）で表される化合物としては、下記式（２）で表される化合物が挙げられる。
2007099869.tif 000027
式（２）中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、nは、式（１）のＲ1、Ｒ2、ｍ、nと同意義である。【００２２】
このような式（１）または（２）で表される化合物としては、好ましくは下記式（３）で表される化合物が挙げられる。
2007099869.tif 000028
上記式中、「Ａｃ」はアセチル基を意味し、「Ｅｔ」はエチル基を意味する。【００２３】
本発明において、「Ｃ１−Ｃ４アルキル基」とは、炭素原子数が１〜４のアルキル基を示す。ここで、アルキル基とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素の部分集合のことをいい、直鎖状または分枝鎖状の構造を含む。「Ｃ１−Ｃ４アルキル基」として、具体的には、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基等があげられる。【００２４】
また、式（１）で表される化合物の薬学的に許容される塩は、当該化合物と、医薬品の製造に使用可能である酸または塩基とを接触させることにより製造される。当該塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩、または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが含まれる。当該塩として、好ましくは塩酸塩が挙げられる。また、当該塩には当該化合物が形成していてもよい水和物もしくは溶媒和物を含む。式（１）で表される化合物がフリー体として得られる場合、当該化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物の状態に、常法に従って変換することができる。
このような式（１）で表される化合物は、公知の方法を用いて製造することができる。たとえば、米国特許３０００９１０、米国特許３２１０３８６、または米国特許３３８９０５１に記載された方法を用いて製造することができる。このうち、特に、式（３）で表される化合物の塩酸塩（U18666A）はCALBIOCHEM(R)により入手可能である。【００２５】
該化合物によりデスモステロールからコレステロールの生合成を特異的に阻害することができる。【００２６】
本発明の、DHCR24の発現を抑制する物質としては、DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムを挙げることができる。本発明において、発現を抑制されるDHCR24の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。【００２７】
DHCR24をコードするDNAとしてはNM_014762（配列番号：１）に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のDNA等も含まれる。「１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」は、天然型のタンパク質と同等の機能を有し、かつ高い相同性を持つものである。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００２８】
DHCR24をコードするDNAには、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNAも含まれる。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。【００２９】
本発明の「DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の一つの態様は、DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAである。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。【００３０】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【００３１】
「DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の他の一つの態様は、DHCR24をコードするDNAの転写産物と相補的なsiRNAである。本発明のsiRNAは、標的であるDHCR24遺伝子の転写産物と相補的なRNA（アンチセンスRNA鎖）および該RNAに相補的なRNA（センスRNA鎖）が結合した二重鎖RNAである。
本発明においてRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりsiRNAを作成することもできる。【００３２】
本発明のsiRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。【００３３】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。【００３４】
本発明のsiRNAは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。
本発明のsiRNAにおいてRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
本発明のsiRNA、標的遺伝子と完全に相補的である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の相補性を有する。【００３５】
本発明のsiRNAとしては、以下の（A）または（B）で表されるsiRNAを、より好ましい例として挙げることができる。
（A）配列番号：３に記載の塩基配列を含むRNA、および配列番号：４に記載の塩基配列を含むRNAからなる2重鎖RNA
（B）配列番号：５に記載の塩基配列を含むRNA、および配列番号：６に記載の塩基配列を含むRNAからなる2重鎖RNA【００３６】
本発明の「DHCR24の発現の抑制」は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。【００３７】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA 配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている。【００３８】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.Dzianottand J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyama et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。【００３９】
また本発明の、DHCR24の酵素活性を阻害する物質としては、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを認識する抗体を挙げることもできる。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド【００４０】
本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される該ペプチドを認識する抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はDHCR24と結合することにより、DHCR24の酵素活性を阻害する。その結果として、コレステロールの合成が阻害され、ラフトを介したHCVウイルスの複製が抑制されるものと考えられる。【００４１】
該ペプチドを認識する抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、該ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、該ペプチドを認識する抗体を作製するには次のようにすればよい。
該ペプチドをコードする塩基配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の該ペプチドを公知の方法で精製し、この精製ペプチドを感作抗原として用いればよい。また、該ペプチドと他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。【００４２】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519 ）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 ）等が適宜使用される。【００４３】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【００４４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000〜6000程度のPEG溶液を通常、30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。【００４５】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００４６】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００４７】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。【００４８】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。【００４９】
目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。【００５０】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。【００５１】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。【００５２】
CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。【００５３】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化PM-1抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。【００５４】
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。【００５５】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。【００５６】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。【００５７】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。【００５８】
複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。【００５９】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。【００６０】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。【００６１】
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。【００６２】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。【００６３】
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。【００６４】
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab’)2、Fv、又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。【００６５】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００６６】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又は、H鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又は、L鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。【００６７】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。【００６８】
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。【００６９】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。【００７０】
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μｇ/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG(TAG製）100μｌを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製)100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。【００７１】
本明細書における「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによって、ＨＣＶを消滅あるいは軽減させること、さらなるＨＣＶの広がりを抑制すること、ＨＣＶの感染による症状を軽減することを意味する。また、本発明において「予防」とは、HCVの感染により起こる症状を予防することをいう。ＨＣＶの感染による症状としては、好ましくはＣ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。【００７２】
本発明の化合物は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。
上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％である。【００７３】
本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。【００７４】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有することもできる。【００７５】
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。【００７６】
本発明の医薬が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。【００７７】
本発明の化合物など又はそれの製薬上許容され得る塩を医薬として投与する場合、抗ウイルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、0.1〜2000mgの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。
上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行うことができる。【００７８】
上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。【００７９】
上記局所投与（経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。
また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明の「デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質」をコードするDNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。【００８０】
上記経直腸的投与は、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物などからなる低融点固体に混入した座剤などを用いて行うことができる。【００８１】
本発明の薬剤は、少なくとも1つの既知のHCV治療剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。または、本発明の薬剤は、少なくとも1つの既知のHCV治療剤と同時に投与されてもよい。一つの態様において、本発明の薬剤および既知のHCV治療剤は、実質的に同時に投与されてもよい。【００８２】
本発明は、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質を対象に投与する工程を含む、HCV感染症を治療または予防する方法に関する。【００８３】
本発明において、「対象」とは、本発明の薬剤を投与する生物体をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。【００８４】
本発明はまた、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を製造するための、デスモステロールからコレステロールの生合成過程を遮断する物質の使用に関する。【００８５】
本発明は、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。
本発明のスクリーニング方法における「デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素（以下「該生合成酵素」として約して使用される場合もある）」としては、好ましくはDHCR24等を挙げることができる。これら酵素の由来は、特に制限はなく、例えばこれらの酵素は酵母またはヒトを含む哺乳動物等の由来のものであってもよい。【００８６】
第一の態様に用いられる生合成酵素の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。該生合成酵素が発現している細胞としては、内在性の生合成酵素を発現している細胞、または外来性の生合成酵素を発現している細胞が挙げられる。上記内在性の生合成酵素を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。また、上記外来性の生合成酵素を発現している細胞は、例えば、生合成酵素をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。このような外来性の生合成酵素が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。【００８７】
生合成酵素が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、生合成酵素をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。【００８８】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。【００８９】
本発明において「接触」は、生合成酵素の状態に応じて行う。例えば、生合成酵素が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒトを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、生合成酵素が発現している細胞へ導入する、または該ベクターを生合成酵素が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を利用することも可能である。【００９０】
第一の態様では、次いで、上記生合成酵素と被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、HCV感染症を治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもよい。【００９１】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
第二の態様では、次いで、デスモステロールからコレステロールの生合成過程で合成される化合物の量を測定する。合成される化合物としては、中間生成物等も含まれるが、より好ましくは最終生成物であるコレステロールを挙げることができる。
合成された化合物の定量は、GC-MS法、MS-MS法、LC-MS法等公知の方法によって測定することができる。本方法においては、ついで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、合成された化合物の量を減少させた場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【００９２】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
第三の態様では、次いで、デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する。該生合成酵素の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該生合成酵素のmRNAを定法に 従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該生合成酵素の発現レベルを測定することも可能である。【００９３】
また、該生合成酵素を含む画分を定法に従って回収し、該生合成酵素の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、該生合成酵素に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該生合成酵素の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。【００９４】
該生合成酵素の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該生合成酵素、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該生合成酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、該生合成酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
第三の態様においては、ついで、該生合成酵素の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【００９５】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず該生合成酵素のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第四の態様において、「機能的に結合した」とは、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、生合成酵素のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。【００９６】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。第四の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。【００９７】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc） の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
第四の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【００９８】
本発明のスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
第五の態様では、次いで、上記生合成酵素の活性を測定する。生合成酵素の活性測定は、それぞれの酵素につき公知の方法で行うことができる。一般的には、基質と生成物との間の分光学的性質の差を利用して、その時間的変化を測定する活性測定法が使用されるが、酵素上の情報基（例えばトリプトファンやチロシンのようなアミノ酸残基、および補酵素等）からの情報をストップフロー法や種々の緩和法を用いて、酵素反応をより直接的に測定する方法が選択されてもよい。活性測定法に用いられる分光学的方法としては、吸光、蛍光、CD、NMR、ESR、IR、ラマン等を挙げることができる。第五の態様においては、ついで、上記生合成酵素の活性が、被検化合物を接触させないときに比べ低下する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【００９９】
本発明は、上記に記載の5つのスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。このようなキットには、上記に記載の５つのスクリーニング方法の検出工程や測定工程に使用されるものを含みうる。例えば、デスモステロールからコレステロールの生合成に関与する酵素の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  ウェスタンブロット解析によるU18666AのHCVタンパク質合成阻害活性の測定
ウェスタンブロット解析は以下の方法でおこなった。U18666Aを0 nMから500 nMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、５％CO2存在下、37℃にて培養した。72時間後に培地を捨て、PBS (Phosphate buffered saline, Sigma cat.  no. P3813)を加え、ピペッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。6穴プレートの細胞当たり200μLのCelLyticTM-M (Sigma cat. no. C2978)と２μLのプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma cat. no. P8340)を加え、室温で15分間振とうした。遠心分離（15000回転、15分間）後、上清のタンパク定量をDye Reagent (nacalai tesque cat. no. 074-27)にておこなった（ウシγグロブリン標準液、BIO-RAD cat. no. 500-0005）。得られたタンパク質5μgを9−11%グラジエントゲル（第一化学薬品 cat. no. 317552）でトリス−グリシン−SDS緩衝液（BIO-RAD cat. no. 161-0772）を用いて電気泳動した。分子量サイズマーカーはBroad marker（BIORAD cat. no. 161-0318）を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO-RAD cat. no. 170-3930）にてメンブレン（Immobilon-FL、ミリポア cat. no. IPFL00010）に転写した。以下、オデッセイ(アロカ)のプロトコールに従い、一次抗体にHCVタンパク質由来の抗NS3ウサギ抗体 (Nature chemical biology, 2005, 1, p333)を用いてウエスタン解析を行った。その結果、U18666AによるHCVタンパク質合成の阻害の濃度依存性が確認された（図２）。各バンドの強度を定量し、HCVタンパク質の発現を50%減少させる薬剤濃度（IC50)を計算したところ、84 nMであった。【０１０１】
〔実施例２〕  U18666AのHCVレプリコン阻害活性
実験開始前日にルシフェラーゼ遺伝子を含むHCV レプリコン保持細胞 FLR 3-1を96 ウェル白色マルチウェルプレート (ルシフェラーゼアッセイ用; 発光測定) と96 ウェルマルチウェルプレート (毒性試験用; 吸光度) のそれぞれに4000個/ウェルで撒いた。この時5% H-FCSを含むD-MEM GlutaMax I 培地を使用した。試験開始当日に終濃度が0.24、0.89、3.90、62.5、250、1000 nMになるようにU18666Aを加えた。5% CO2 37℃で72時間培養後、ルシフェラーゼアッセイおよびWST-8による細胞毒性試験を行った。U18666Aを加えないものをコントロールとした。
ルシフェラーゼアッセイ法
培地交換を行い、1 well当たりの体積を75 μlにした。75 μlのBrightGlo (Promega; E2620) を加えてすぐにウェルの発光量をMithras 940 (Berthold) で測定した。
WST-8アッセイ法
TetraColor ONE (生化学工業; cat.# 800560) を培地100 μl当たりに7 μl加え、5% CO2 37℃で1時間から2時間培養した。培養後の発色をマイクロリーダーモデル550 (測定波長450 nm;対象波長650 nm; Bio-Rad)で測定した。
その結果、U18666AはHCVレプリコン阻害活性を示した（図３）。さらに、U18666Aはロバスタチンよりも明らかに高いHCVレプリコン阻害活性を示した。【０１０２】
〔実施例３〕  DHCR24 siRNAのHCVレプリコン阻害活性
細胞とトランスフェクション
実験開始前日にルシフェラーゼ遺伝子を含むHCV レプリコン保持細胞 FLR 3-1を96 ウェル白色マルチウェルプレート (ルシフェラーゼアッセイ用; 発光測定; SUMILON cat.# MS-8096) と96 ウェルマルチウェルプレート (毒性試験用; 吸光度; Falcon cat.# 353072) のそれぞれに4500個/100 μl/ウェルで撒いた。この時5% H-FCS（GIBCO, Cat#: 26140-079）を含むD-MEM GlutaMax I 培地 (GIBCO; cat.# 10569-010) を使用した。
試験開始当日、終濃度が1、3、10、30 nMになるようにDHCR24に対するsiRNA（表１）をLIC-LA3015を用いてFLR3-1にトランスフェクションした。【０１０３】
【表１】
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DHCR24 siRNAの配列（配列番号：３〜６）
DHCR24 (Gene #; NM_014762)の配列を参考にして、5’非翻訳領域を含む配列から417番目および1024番目からの二種類のsiRNAをデザインした。【０１０４】
トランスフェクション用のsiRNA/LIC-LA3015複合体は2 μM siRNA (5%グルコース溶液)に調製したsiRNAを448 ng/μl のLIC-LA3015 (5%グルコース溶液) に加え、室温で15分放置した後ソニケーションを30秒間行うことにより1 μMのsiRNA/LIC-LA3015を作製した。この溶液を300、100、30、10 nMになるように5%グルコース溶液で段階希釈して各Wellに1.1 μlずつ加えた。そのまま5% CO2、37℃で72時間培養し、ルシフェラーゼアッセイとWST-8アッセイを行い、HCV複製を定量した。
その結果、DHCR24の発現を抑制するためsiRNA処理した細胞では、コントロールsiRNA処理した細胞に対し有意にHCVレプリコン活性を阻害する効果が強く認められた（図４）。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、コレステロール生合成に関わる酵素、特にDHCR24の活性や発現を阻害する物質が、HCVの複製阻害活性を示すことが明らかとなった。また、本発明の阻害剤は、コレステロールの生合成に関わる3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAレダクターゼを阻害するロバスタチン（Ye J., et al., PNAS, 100 (26), 15865-15870 (2003)）よりも強いHCVの複製阻害活性を有していることが明かとなった。【０１０６】
このことから、本発明の阻害剤は、従来の薬剤に比べより高い効果を示すHCV感染症の有用な治療剤または予防剤となるものと考えられる。さらに本発明の、デスモステロールからコレステロールの生合成過程に関与する酵素、特にDHCR24をターゲットとするスクリーニング方法は、より効果的な抗HCV薬の探索に役立つものと考えられる。【０１０７】
これまでのHCV感染症を予防または治療する薬剤は、生体内のどのカスケードに作用するかが知られていないものが多く、副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的が明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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