(57)【要約】  本発明は、新規な（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素を提供することを課題とする。また本発明は、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体を用いた光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。  本発明の実施形態のポリペプチドは、例えば、ＮＡＤ+を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用して、（Ｓ）−アセトインを生成する作用、及び、ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する作用を含む理化学的性質を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）から（２）に示す理化学的性質を有するポリペプチド。
（１）作用：
（ａ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤ+と略す）を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用して、（Ｓ）−アセトインを生成する。
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性：
（ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ+を利用する。また、還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。
（ｂ）２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を酸化するだけでなく、ｍｅｓｏ−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基も酸化する。
【請求項２】
（３）に示す理化学的性質を有する請求項１に記載のポリペプチド。
（３）基質特異性：ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる。
【請求項３】
更に、（４）から（６）に示す理化学的性質を有する請求項１または２に記載のポリペプチド。
（４）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約３０，０００、
（５）酸化至適ｐＨ：１０．０から１２．０、
（６）還元至適ｐＨ：５．０から５．５。
【請求項４】
オクロバクトラム属に属する微生物により産生される請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記オクロバクトラム属に属する微生物が、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）である請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１０】
発現ベクターがEscherichia coli  ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１）から分離しうるプラスミドｐＴＳＯＢである請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項１２】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
Escherichia coli  ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１）である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１１から１３のいずれかに記載の形質転換体の培養物を、ラセミ体のアルコールに作用させ一方の立体を有するアルコールを酸化し、もう一方の立体を有するアルコールを残存させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１１から１３のいずれかに記載の形質転換体の培養物を、カルボニル化合物に作用させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素に関する。また本発明は、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体を用いた光学活性アルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素は、２，３−ブタンジオールの生合成や代謝、または、グルコースを原料とした（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの発酵生産において重要な役割を有する酵素である。また、この酵素反応により生産される（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールは医薬品や液晶の原料として有用な化合物である。【０００３】
高度に精製され、その諸性質が明らかにされた（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素としては次の酵素があげられる。【０００４】
・Zoogloea ramigera由来の（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素（特許文献１／特開２００４−３５７６３９）
・Brevibacterium saccharolyticum Ｃ−１０１２由来の（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素（非特許文献１／Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（８），１８７６−１８７８（２００１））
これらの２つの酵素はいずれも、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールをのみ選択的に酸化する活性を有している。
【特許文献１】特開２００４−３５７６３９号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（８），１８７６−１８７８（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記文献に開示された各酵素とは基質特異性の点で異なる新規な（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素を提供することを課題とする。また本発明は、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体を用いた光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
〔１〕本発明の一つの特徴は、下記（１）から（２）に示す理化学的性質を有するポリペプチドである。
（１）作用：
（ａ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤ+と略す）を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用して、（Ｓ）−アセトインを生成する。
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性：
（ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ+を利用する。また、還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。
（ｂ）２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を酸化するだけでなく、ｍｅｓｏ−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基も酸化する。
〔２〕本発明の一つの特徴は、下記（３）に示す理化学的性質を有する〔１〕のポリペプチドである。
（３）基質特異性：ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる。
〔３〕本発明の一つの特徴は、下記（４）から（６）に示す理化学的性質を有する〔１〕または〔２〕のポリペプチドである。
（４）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約３０，０００。
（５）酸化至適ｐＨ：１０．０から１２．０。
（６）還元至適ｐＨ：５．０から５．５。
〔４〕本発明の一つの特徴は、オクロバクトラム属に属する微生物により産生される〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリペプチドである。
〔５〕本発明の一つの特徴は、前記オクロバクトラム属に属する微生物が、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）である〔４〕に記載のポリペプチドである。
〔６〕本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである。
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチド。
〔７〕本発明の一つの特徴は、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
〔８〕本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔９〕本発明の一つの特徴は、〔７〕または〔８〕に記載のＤＮＡを含む発現ベクターである。
〔１０〕本発明の一つの特徴は、発現ベクターがEscherichia coli  ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１）から分離しうるプラスミドｐＴＳＯＢである請求項９に記載の発現ベクターである。
〔１１〕本発明の一つの特徴は、〔９〕または〔１０〕に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体である。
〔１２〕本発明の一つの特徴は、前記宿主細胞が大腸菌である、〔１１〕記載の形質転換体である。
〔１３〕本発明の一つの特徴は、Escherichia coli  ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１）である〔１１〕記載の形質転換体である。
〔１４〕本発明の一つの特徴は、上記ポリペプチド又は上記形質転換体の培養物を、ラセミ体のアルコールに作用させ、一方の立体を有するアルコールを酸化してもう一方の立体を有するアルコールを残存させる工程、並びに、残存した光学活性アルコールを採取する工程からなる光学活性アルコールの製造方法である。
〔１５〕本発明の一つの特徴は、上記ポリペプチド又は上記形質転換体の培養物を、カルボニル基を有する化合物と反応させる工程、並びに、生成した光学活性アルコールを採取する工程からなる光学活性アルコールの製造方法でもある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、新規な（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する形質転換体を提供する。また、該酵素、該形質転換体を用いることにより、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオール等の有用な光学活性アルコール類の実用的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、組換えベクターｐＴＳＯＢ、ｐＴＳＯＢＧ１の構築を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施形態を用いて詳細に説明する。本発明の範囲はこれら実施形態に限定されるものではない。【００１０】
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１１】
１.ポリペプチド
実施形態の「ポリペプチド」としては、ラセミ体−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる活性を有する微生物から取得することができる。ポリペプチドの起源として用いられる微生物は特に限定されないが、例えば、オクロバクトラム属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとしてオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株を挙げることができる。上記ＫＮＫｃ７１−３株は、本発明者らによって土壌から分離された微生物である。【００１２】
以下に、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の菌学的性質を示す。
Ａ．形態
（１）細胞の大きさは０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍの桿状。
（２）鞭毛による運動性がある。
（３）胞子はない。
（４）グラム染色：陰性
（５）コロニーの形態：円形、レンズ状、全縁滑らか、クリーム色
Ｂ．生理学的性質
（１）硝酸塩還元：陰性
（２）インドール産生：陰性
（３）ブドウ糖酸性化：陰性
（４）アルギニンジヒドロラーゼ活性：陰性
（５）ウレアーゼ活性：陰性
（６）エスクリン加水分解：陰性
（７）ゼラチン加水分解：陰性
（８）β−ガラクトシダーゼ活性：陰性
（９）オキシダーゼ活性：陽性
（１０）カタラーゼ活性：陽性
（１１）資化性試験：ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マルトース、ｄｌ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウムの資化性がある。
（１２）マッコンキー寒天上での生育性：生育する
（１３）Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解：陰性
（１４）嫌気性条件下での生育性：生育しない
実施形態のポリペプチド（酵素）を産生する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、当業者に周知の、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。そのような遺伝子操作された微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する工程、この塩基配列に基づいてポリペプチドをコードするＤＮＡを得る工程、このＤＮＡを適当な宿主微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して実施形態の酵素を得る工程、を包含する、当業者に周知の方法により得られる。【００１３】
実施形態のポリペプチドとしては、例えば、以下の（１）から（２）の理化学的性質を有するポリペプチドを挙げることができる：
（１）作用：
（ａ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤ+と略す）を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用して、（Ｓ）−アセトインを生成する。
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性：
（ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ+を利用する。また、還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。
（ｂ）２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を酸化するだけでなく、ｍｅｓｏ−２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基も酸化する。【００１４】
好ましくは、上記（１）、（２）の理化学的性質に加え、さらに下記（３）の理化学的性質を有するポリペプチドを挙げることができる：
（３）基質特異性：ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる。【００１５】
さらに好ましくは、上記（１）から（３）の理化学的性質に加え、さらに下記（４）から（６）の理化学的性質を有するポリペプチドを挙げることができる：
（４）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約３０，０００。
（５）酸化至適ｐＨ：１０．０から１２．０。
（６）還元至適ｐＨ：５．０から５．５。【００１６】
また、上記ポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、または、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、２０個、好ましくは１５個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。【００１７】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有する限り上記ポリペプチドに包含される。【００１８】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来の２,３−ブタンジオール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【００１９】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【００２０】
また、置換の場合には、置換後のアミノ酸はもとのアミノ酸の同族アミノ酸であるのが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe 
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu, Asp
（第４群：塩基性アミノ酸）His, Lys, Arg
置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドがラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８０％であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。【００２１】
２．酵素精製
以下に、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株より、実施形態のポリペプチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。【００２２】
まず、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる酵素活性を有する微生物を適切な培地で培養する。培養方法としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【００２３】
培養液から菌体を遠心分離した後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、該菌体をグラスビーズ等の物理的手法、酵素などの生化学的手法などを用いて破砕または溶解し、更に遠心分離により該溶液中の固形物を除去することにより、酵素の粗酵素液を得ることができる。また、粗酵素液を当業者が通常用いる手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィー等の方法を単独でまたは組み合わせて更に精製することができる。クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを単独で、または組み合わせて用いることもできる。【００２４】
実施形態において酵素の酸化活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質０．１Ｍ、ＮＡＤ+  ２ｍＭ、及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行ない得る。また、酵素の還元活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、基質２０ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ、及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行ない得る。【００２５】
酵素の至適ｐＨ、至適温度は、例えば、上記活性測定系において反応ｐＨ、反応温度を変えて活性を測定することによって決定し得る。酵素の分子量の測定は、例えばSuperdex 200HR10/30（Pharmacia Biotech社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質の相対溶出時間から算出することにより決定し得る。また、サブユニットの分子量は、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質の相対移動度から算出することにより決定し得る。【００２６】
３．ＤＮＡ
実施形態の「ＤＮＡ」は、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で実施形態のＤＮＡを取得できる。【００２７】
以下に、実施形態の酵素をコードするＤＮＡを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。【００２８】
まず、精製した酵素を適当なエンドペプチダーゼにより消化し、切断された断片をＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＳＩＬ−０６（ＹＭＣ社製）カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製後、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Applied Biosystems社製）にて部分アミノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲプライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えばHereford法（Cell, 18, 1261 (1979)）により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部（コア配列）を増幅し、塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はジデオキシ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得る。例えば、ABI 373A DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）等を用いて行われ得る。【００２９】
コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかにするためには、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させることにより逆ＰＣＲ（Inverse PCR: Nucleic Acids Res., 16, 8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製する。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こうして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることにより、目的酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を明らかにし得る。
実施形態のＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。【００３０】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。【００３１】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。【００３２】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを残存させる活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。【００３３】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。【００３４】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。【００３５】
４．ベクター
実施形態の酵素のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。【００３６】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等）の制御因子を含み、実施形態のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）等が好適に用いられ得る。【００３７】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００３８】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００３９】
５．宿主細胞
実施形態のＤＮＡを有するベクターを導入する「宿主細胞」としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。実施形態のＤＮＡは定法により宿主細胞に導入し得る。宿主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウム法により、実施形態のＤＮＡを有するベクターを宿主細胞に導入することができる。【００４０】
６．形質転換体
実施形態の「形質転換体」は、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。上記形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００４１】
上記形質転換体の例としては、後述するＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）が挙げられる。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１の受託番号で、平成１７年１１月３０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。【００４２】
７．光学活性アルコールの製造方法
実施形態としての酵素もしくは該酵素の生産能を有する形質転換体をラセミ体のアルコールに作用させ、どちらか一方の立体を有するアルコールを優先的に酸化し、もう一方の立体を有するアルコール残存させることにより光学活性アルコールを製造する方法について詳述する。【００４３】
ラセミ体のアルコールに、上記酵素もしくは形質転換体を作用させ、一方の立体を有するアルコールを優先的に酸化する場合、補酵素としてＮＡＤ+が必要となる。反応系にＮＡＤ+を必要な量だけ添加して実施し得る。しかし、還元された該補酵素（ＮＡＤＨ）を酸化型（ＮＡＤ+）に変換する能力（以後、酸化型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素とその基質と共に、つまり、酸化型補酵素再生系を実施形態の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減することができる。【００４４】
酸化型補酵素再生能力を有する酵素としては、例えばＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素等を用いることができる。このような反応は、酸化型補酵素再生系を不斉酸化反応系内に添加することによっても行われ得るが、上記酵素をコードするＤＮＡ及びＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、酸化型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、上記酵素をコードするＤＮＡ及びＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。【００４５】
また、実施形態の形質転換体を用いた場合では、菌体内に存在するＮＡＤ+により反応を進行し、またＮＡＤ+が還元されて生じるＮＡＤＨも菌体内で再酸化されるため、補酵素や酸化型補酵素再生系を別に添加しなくても実施し得る。【００４６】
実施形態の酵素又は形質転換体の培養物を用いたラセミ体のアルコールからの光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００４７】
まず最初に、適当な溶媒中に基質となるラセミ体のアルコール、ＮＡＤ+等の補酵素、及び該形質転換体の培養物を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。反応に用いる溶媒は、水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。この反応は１０〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは６〜１２に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．１％〜７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加され得る。【００４８】
本明細書で用いられる用語「培養物」は、微生物の菌体、菌体を含む培養液または菌体の処理物を表す。菌体の処理物としては、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より実施形態の酵素を精製し、これを使用してもよい。【００４９】
また、本反応を行う際、形質転換体として実施形態の酵素とＮＡＤＨオキシダーゼの両者を生産するものを用いる場合、反応系に酸素を供給することによって、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる
上記のいずれかの方法で得られる光学活性なアルコール類の採取は、特に限定されない。例えば、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、晶析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性なアルコール類を容易に得ることが出来る。
次に、実施形態の酵素もしくは該酵素の生産能を有する形質転換体をカルボニル化合物に作用させることにより光学活性アルコールを製造する方法について詳述する。【００５０】
上記酵素もしくは形質転換体を用いて、カルボニル基を有する化合物を立体選択的に還元して光学活性アルコールを取得する場合、補酵素としてＮＡＤＨが必要となる。反応系にＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施し得る。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤ+）を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力（以後、還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり、還元型補酵素再生系を実施形態の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減することができる。【００５１】
還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が用いられる。このような反応は、還元型補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、上記酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、上記酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。【００５２】
実施形態の酵素又は形質転換体の培養物を用いたカルボニル基を有する化合物からの光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００５３】
まず最初に、適当な溶媒中に基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＨ等の補酵素、及び該形質転換体の培養物を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。反応に用いる溶媒は、水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。この反応は１０〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．１％〜７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加され得る。【００５４】
また、本反応を行う際、形質転換体として実施形態の酵素とグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系に更にグルコースを添加することによって、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる
上記のいずれかの方法で得られる光学活性なアルコール類の採取は、特に限定されない。例えば、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、晶析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性なアルコール類を容易に得ることが出来る。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００５６】
（実施例１）（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素の精製
以下に説明する各実施例では、（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素の酸化活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール  １００ｍＭ、 ＮＡＤ+  ２ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ+をＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００５７】
肉エキス  １％、ポリペプトン  １．５％、バクト・イーストエキス  ０、５％、ＮａＣｌ  ０．３％の組成からなる液体培地（ｐＨ６．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地にオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株を無菌的に接種し、３０℃で４０時間振とう培養を行った。得られた培養液３Ｌについて、遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌで洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌに懸濁した。この懸濁した菌体をＳＯＮＦＩＥＲ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離にて菌体残渣を除去して無細胞抽出液を取得した。【００５８】
この無細胞抽出液に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で３０分攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。さらに、この上清に７５％飽和となるまで硫酸アンモニウムを添加し、４℃で３０分攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により取得し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。【００５９】
透析後の酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、カラムに吸着しなかった（素通りした）（Ｓ，Ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素活性画分を回収した。【００６０】
この活性画分に１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（５０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、１Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。この活性画分に１．２Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（東ソー社製）カラム（２５ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、１．２Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。この活性画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動により解析した結果、単一なバンドであった。【００６１】
精製酵素の比活性は約１１９Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。以後、本酵素をＲＯＢと呼ぶ。精製の履歴の要約を表１に示す。【００６２】
【表１】
2007094178.tif 000002
【００６３】
（実施例２）ＲＯＢの分子量測定
実施例１で得られた精製ＲＯＢのサブユニットの分子量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動により求めた結果、約３０，０００であった。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によるＲＯＢのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約１０１，０００であった。【００６４】
（実施例３）ＲＯＢの作用至適温度
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、１０〜７０℃における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化活性を測定した。活性測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール  ０．１Ｍ、ＮＡＤ+  ２ｍＭ及び酵素溶液を添加し、１０〜７０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。その結果、作用至適温度は７０℃であった。【００６５】
（実施例４）ＲＯＢの還元反応における至適ｐＨ
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、ｐＨ４〜９における２，３−ブタンジオン還元活性を測定した。酵素活性の測定は、緩衝液に２，３−ブタンジオン  １０ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。緩衝液として１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５〜８）、及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８〜９）を用いて、ｐＨ４〜９の範囲で還元活性を測定した。その結果、還元至適ｐＨは５．０〜５．５であった。【００６６】
（実施例５）ＲＯＢの酸化反応における至適ｐＨ
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、ｐＨ６〜１２における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化活性を測定した。酵素活性の測定は、緩衝液に（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール  ０．１Ｍ、ＮＡＤ+  ２ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９〜１１）、及び１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０〜１２）を用いて、ｐＨ６〜１２の範囲で酸化活性を測定した。その結果、酸化至適ｐＨは１０．０〜１２．０であった。【００６７】
（実施例６）ＲＯＢの基質特異性
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＮＡＤ+  ２ｍＭ、表２に示した各化合物１０ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で１分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより酸化活性の測定を行った。表２に２，３−ブタンジオールに対する活性を１００とした場合の相対活性をまとめた。【００６８】
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ、表３に示した化合物１ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより還元活性の測定を行った。表３に２，３−ブタンジオンに対する活性を１００とした場合の相対活性をまとめた。【００６９】
【表２】
2007094178.tif 000003
【００７０】
【表３】
2007094178.tif 000004
【００７１】
（実施例７）ＲＯＢの立体選択性
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、２−ブタノール、２−ペンタノール、１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、及び３−クロロ−１，２−プロパンジオールのそれぞれの光学異性体を基質として酸化活性を測定した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＮＡＤ+  ２ｍＭ、上記化合物１０ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で１分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。表４に（２Ｓ，３Ｓ）−２３−ブタンジオールに対する活性を１００とした場合の相対活性をまとめた。
【００７２】
【表４】
2007094178.tif 000005
【００７３】
（実施例８）ＲＯＢの試薬に対する挙動
表５に示す種々の試薬共存下で、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化活性を測定した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＮＡＤ+  ２ｍＭ、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール  ０．１Ｍ及び酵素溶液を添加し、３０℃で１分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。表５に、試薬を含まない条件での活性を１００とした相対活性をまとめた。
【００７４】
【表５】
2007094178.tif 000006
【００７５】
（実施例９）ＲＯＢのクローニング
実施例１で得られた精製ＲＯＢを用いて、ＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。また、精製ＲＯＢを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。これらのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、プライマー１（５’−ＡＡＲＧＡＹＧＧＮＴＴＹＧＡＹＡＴＨＧＣ−３’：配列番号３）及びプライマー２（５’−ＧＣＹＴＧＮＣＣＹＧＴＤＡＴＲＴＡＲＴＣ−３’：配列番号４）を合成した。プライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各５０ｐｍｏｌ、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の染色体ＤＮＡ１４ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。本反応に用いたオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の染色体ＤＮＡの調製は、分子生物学実験プロトコール１（丸善）Ｐ．３６に記載されている細菌ゲノムＤＮＡの少量調製法により行った。【００７６】
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を除いて６２８塩基からなっていた。その配列を配列番号５に示す。以後この配列を「コア配列」と記す。【００７７】
コア配列の５’側に近い部分の塩基配列をもとに、その相補配列となるプライマー３（５’−ＡＴＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＣＴＴ−３’：配列番号６）を作成し、更に３’側に近い部分の塩基配列をもとに、プライマー４（５’−ＴＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＴＧＧＴ−３’：配列番号７）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＬＩにより消化し、その消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物１００ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプライマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。【００７８】
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株由来のＲＯＢをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。ＲＯＢをコードする遺伝子の全塩基配列を配列番号２に、また該遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に示した。【００７９】
（実施例１０）ＲＯＢ遺伝子を含む組換えベクターの作製
大腸菌においてＲＯＢを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＲＯＢ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【００８０】
実施例９で決定した塩基配列に基づき、ＲＯＢ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（５’−ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧＣＴＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴ−３’：配列番号８）、及びＲＯＢ遺伝子の終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー６（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣＣＧＣ−３’：配列番号９）を合成した。プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各５０ｐｍｏｌ、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の染色体ＤＮＡ１４ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号に開示の方法によって当業者が作製可能なプラスミドｐＵＣＮＴのｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＯＢを得た。【００８１】
（実施例１１）ＲＯＢ遺伝子上流へのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の付加
ＲＯＢ遺伝子を大腸菌内で高発現させるため、実施例１０で調製したプラスミドｐＮＴＯＢ中の同遺伝子の開始コドンの上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を新たに付加したプラスミドを以下の方法により取得した。【００８２】
まず、ＰＣＲ法により実施例１０で使用した大腸菌発現ベクターｐＵＣＮＴのＮｄｅＩ部位中のＧをＴに変換し、プラスミドｐＵＣＴを構築した。次に、実施例９で決定した塩基配列に基づき、ＲＯＢ遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー７（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＧＧＣＴＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴ−３’：配列番号１０）、及びＲＯＢ遺伝子の終始コドンの直後にＢａｍＨＩ部位を付加したプライマー８（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣＣＧＣ−３’：配列番号１１）を合成した。【００８３】
プライマー２種（プライマー７及びプライマー８）各５０ｐｍｏｌ、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３株の染色体ＤＮＡ１４ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、上記プラスミドｐＵＣＴのｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＯＢを得た。ｐＴＳＯＢの作製法及び構造を図１に示す。【００８４】
（実施例１２）ＲＯＢ遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えベクターの作製
バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後ＧＤＨと記す）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、更にその直前にＢａｍＨＩ部位を、また、終始コドンの直後にＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。【００８５】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、更にその直前にＢａｍＨＩ部位を付加したプライマー９（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＤＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’：配列番号１２）と、終始コドンの直後にＰｓｔＩ部位を付加したプライマー１０（５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡ−３’：配列番号１３）を常法に従って合成した。【００８６】
これら２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、実施例１１において構築したｐＴＳＯＢのＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えベクターｐＴＳＯＢＧ１を得た。ｐＴＳＯＢＧ１の作製法及び構造を図１に示す。【００８７】
（実施例１３）組換え大腸菌の作製
実施例１１で得た組換えベクターｐＴＳＯＢ及び実施例１２で得た組換えベクターｐＴＳＯＢＧ１のそれぞれを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）及びＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢＧ１）を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１として２００５年１１月３０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD：郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。【００８８】
（実施例１４）組換え大腸菌におけるＲＯＢの発現
実施例１３で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）、ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢＧ１）、及びベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＴ）のそれぞれを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化活性を表６に、２，３−ブタンジオン還元活性及びＧＤＨ活性を表７に示した。【００８９】
２，３−ブタンジオンの還元活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、２，３−ブタンジオン  １０ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。またＧＤＨ活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース  ０．１Ｍ、ＮＡＤＰ+  ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。
【００９０】
【表６】
2007094178.tif 000007
【００９１】
【表７】
2007094178.tif 000008
【００９２】
（実施例１５）ＲＯＢ遺伝子を導入した組換え大腸菌による（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの合成
実施例１４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）の無細胞抽出液１ｍｌに、ラセミ体１，３−ブタンジオール  １０ｍｇ、ＮＡＤ+  ５０ｍｇを添加し、３０℃で２０時間振とうした。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行い、残存する１，３−ブタンジオール及び生成した４−ヒドロキシ−２−ブタノンをキャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、検出：ＦＩＤ、カラム温度：６０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。また、残存する１，３−ブタンジオールの光学純度は、１，３−ブタンジオールの水酸基をトリフルオロアセチル化し、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｇ−ＰＮ  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（東京化成工業社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：７０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（６０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。【００９３】
その結果、４−ヒドロキシ−２−ブタノンが６．０ｍｇ生成し、残存する１，３−ブタンジオールは３．９ｍｇ、残存する１，３−ブタンジオールの光学純度は１００％ｅ．ｅ．のＲ体であった。【００９４】
（実施例１６）ＲＯＢ遺伝子を導入した組換え大腸菌による（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成
実施例１４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢ）の無細胞抽出液１ｍｌに、ラセミ体３−クロロ−１,２−プロパンジオール  ５ｍｇ、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Streptococcus mutans ＮＣＩＭＢ１１７２３由来）  １０Ｕ、ＮＡＤ+  １ｍｇを添加し、２０℃で５時間振とうした。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行い、残存する３−クロロ−１,２−プロパンジオールをキャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、検出：ＦＩＤ、カラム温度：９０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。また、残存する３−クロロ−１,２−プロパンジオールの光学純度は、３−クロロ−１,２−プロパンジオールの水酸基をトリフルオロアセチル化し、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｇ−ＰＮ  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（東京化成工業社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：９０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（６０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。その結果、３−クロロ−１,２−プロパンジオールが２．１ｍｇ残存し、その光学純度は１００％ｅ．ｅ．のＳ体であった。【００９５】
（実施例１７）ＲＯＢ及びグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌による（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの合成
実施例１４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢＧ１）の無細胞抽出液１ｍｌに、グルコース  ４０ｍｇ、ＮＡＤ+  １ｍｇ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン  １０ｍｇを添加し、３０℃で１０時間振とうした。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行い、生成した１，３−ブタンジオールを実施例１５と同様の条件で分析した。その結果、１，３−ブタンジオールが９．３ｍｇ生成し、その光学純度は１００％ｅ．ｅ．のＳ体であった。【００９６】
（実施例１８）ＲＯＢ及びグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌による（Ｓ）−２−ペンタノールの合成
実施例１４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＯＢＧ１）の無細胞抽出液１ｍｌに、グルコース  ４０ｍｇ、ＮＡＤ+  １ｍｇ、２−ペンタノン  １０ｍｇを添加し、３０℃で１０時間振とうした。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行い、生成した２−ペンタノールをキャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、検出：ＦＩＤ、カラム温度：３０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。また、得られた２−ペンタノールの光学純度は、２−ペンタノールの水酸基をトリフルオロアセチル化し、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｇ−ＰＮ  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、検出：ＦＩＤ、カラム温度：３０℃、注入温度：１５０℃、検出温度：１５０℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１）により分析した。【００９７】
その結果、２−ペンタノールが９．９ｍｇ生成し、その光学純度は９８．７％ｅ．ｅ．のＳ体であった。
【図１】
2007094178.tif 000009
【配列表】
2007094178000001.app
【国際調査報告】
2007094178.tif 000010
2007094178.tif 000011