(57)【要約】本発明は、ワクチンの免疫原性を高めることが可能な組成物に関する。組成物またはアジュバントは、それを必要とする動物にワクチン抗原と連続的にまたは同時に組み合わせて投与する。１つの好ましい側面においては、アジュバントは、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む、ワクシニアウイルスベクターなどの組換えポックスウイルスベクターの形態で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む、組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２】
発現制御配列に作動可能に連結した少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現ユニットをさらに含む、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３】
少なくとも１つの抗原が、ウイルスペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項４】
ウイルスペプチドまたはポリペプチドがＨＩＶまたはＳＩＶウイルスゲノムによって発現される、請求項３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項５】
ウイルスペプチドまたはポリペプチドが狂犬病ウイルスゲノムによって発現される、請求項３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項６】
ウイルスペプチドまたはポリペプチドがワクシニアウイルスゲノムによって発現され、かつ天然痘に対する保護免疫応答を惹起する、請求項３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項７】
少なくとも１つの抗原が癌特異抗原を含む、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項８】
癌特異抗原がＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドからのものである、請求項７に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原が細菌抗原である、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つの細菌抗原が、Borrelia burgdorferi、Bartonella henselea、Yersinia pestis、およびBacillus anthracisからなる群から選択される、請求項９に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１１】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、２つの異なるポリペプチドからのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１２】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、２つの異なるＨＩＶポリペプチドからのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１３】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、ＨＩＶの２つの株からのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１４】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、ＨＩＶの２つの異なる分離株からのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１５】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、ＨＩＶの２つの異なるクレードからのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１６】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、ＨＩＶポリペプチドの異なるサブ配列からのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１７】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも２つの抗原が、ＨＩＶポリペプチドの同じサブ配列に由来するが、ここで各サブ配列が、少なくとも１つのアミノ酸によって異なる、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１８】
サブ配列が、ＨＩＶポリペプチドにおける高度に易変異性の領域からのものである、請求項１７に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項１９】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも１つの抗原がＨＩＶポリペプチドからのものであり、かつ、少なくとも１つの抗原がＨＩＶ陽性患者における日和見感染に関連する感染性生物からのものである、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２０】
発現ユニットが複数の抗原をコードする配列を含み、少なくとも１つの抗原はＣＴＬ認識エピトープを含み、少なくとも１つの抗原はＴヘルパー細胞認識エピトープを含み、少なくとも１つの抗原はＢ細胞認識エピトープを含む、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２１】
ＣＴＬ認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原、Ｔヘルパー細胞認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原、およびＢ細胞認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原が、同じＨＩＶポリペプチドからのものである、請求項２０に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２２】
ワクチンウイルスがポックスウイルスである、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２３】
ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスである、請求項２２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２４】
鶏痘ウイルスがカナリアポックスウイルスである、請求項２３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２５】
１または２以上の不活性化された病原性関連配列を含む、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２６】
制限された宿主域を含む、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２７】
ワクチンベクターがヒトにおいて複製しない、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２８】
ワクチンウイルスベクターが、１または２以上のカプシドポリペプチドを含む、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項２９】
１または２以上のカプシドポリペプチドが標的化分子に結合している、請求項２８に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３０】
ＩＬ−１５をコードする配列が、それに作動可能に連結された発現制御配列を含む、請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３１】
ＩＬ−１５をコードする配列が、それに作動可能に連結された発現制御配列を含む、請求項２に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３２】
ＩＬ−１５をコードする配列と抗原をコードする配列とが、同じ時間的な発現パターンを有する発現制御配列に制御可能に連結している、請求項３１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３３】
ＩＬ−１５をコードする配列と抗原をコードする配列とが、異なる時間的な発現パターンを有する発現制御配列に制御可能に連結している、請求項３１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３４】
抗原をコードする配列が、ＩＬ−１５をコードする配列の前に発現される、請求項３３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３５】
抗原をコードする配列が、ＩＬ−１５をコードする配列の後に発現される、請求項３３に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクター。
【請求項３６】
請求項１に記載の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクターと、少なくとも１つの抗原をコードする核酸とを含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】
請求項１９に記載のベクターを含む組成物であって、少なくとも１つの抗原をコードする核酸が、第２の組換え弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクターにより発現される、前記組成物。
【請求項３８】
医薬的な担体をさらに含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項２〜３５のいずれかに記載の弱毒化または非病原性ワクチンウイルスベクターを、免疫応答を刺激するのに有効な量で動物に投与することを含む、動物に免疫応答を惹起するための方法。
【請求項４０】
請求項３６〜３８のいずれかに記載のワクチン組成物を、免疫応答を刺激するのに有効な量で動物に投与することを含む、動物に免疫応答を惹起するための方法。
【請求項４１】
免疫応答が、少なくとも１つの抗原に特異的なメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産生、少なくとも１つの抗原に特異的なメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の産生、および少なくとも１つの抗原に特異的な抗体の産生の１または２以上を含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体の少なくともいくつかが中和抗体である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
動物がヒトである、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４４】
動物が家畜である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４５】
動物がイヌまたはネコである、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４６】
動物が非ヒト霊長類である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４７】
抗原をコードする核酸とＩＬ−１５をコードする核酸とを、所定時間間隔後に再投与することをさらに含み、ここで、該間隔が最初の投与の少なくとも約６ヶ月後である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４８】
抗原を所定時間間隔後に再投与することを含み、ここで、該間隔が最初の投与の少なくとも約８ヶ月後である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４９】
抗原を所定時間間隔後に再投与することを含み、ここで、該間隔が最初の投与の少なくとも約１０ヶ月後である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項５０】
抗原を所定時間間隔後に再投与することを含み、ここで、該間隔が最初の投与の少なくとも約１２ヶ月後である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項５１】
抗原を所定時間間隔後に再投与することを含み、ここで、該間隔が最初の投与の少なくとも約１４ヶ月後である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの抗原がウイルス抗原である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項５３】
ウイルス抗原がＨＩＶウイルスからのものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ヒトが、ＨＩＶ感染のリスクが高い個体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
ヒトが、最初の投与の際にＨＩＶ陽性ではない個体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
ヒトが、最初の投与の際にＨＩＶ陽性の個体である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００２年１２月１６日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／４３３，７０３に対し優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【０００２】
本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）を発現することができる組換えワクチンベクター、および、かかるウイルスを用いて免疫応答を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２０年にわたるＡＩＤＳの流行により、世界中のおよそ４千万人の人々がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していると推定される。ＡＩＤＳは、２２００万人を超える命を奪った。２００１年だけで、３００万人の死者が出た。過去２０年にわたって得られたＨＩＶの分子生物学的、病因論的、および疫学的知見にもかかわらず、有効なＨＩＶワクチンの開発は、依然として前例のない試みであり続けている。ヒトの他の病原に対する有効なワクチンの開発において過去に成功裏に利用されていた慣用の戦略は、ＨＩＶのケースにおいては無効であることが示された。
【０００４】
ヒトにおいて保護を与える決定的な免疫関連物（immune correlates）はないが、最近の動物モデル実験に由来する証拠は、ＨＩＶに対するワクチン誘導性の免疫が可能であることを示唆している（Amara、et al.、Science 292: 69〜74、2001、Rose、et al.、Cell 106: 539〜49、2001、Barouch、et al.、Science 290: 486〜92、2000、Shiver、et al.、Nature 415: 331〜5、2000、Chen、et al.、Nat. Med. 7: 1225〜31、2001）。アカゲザルにおける病原性キメラＳＩＶ−ＨＩＶ−１（ＳＨＩＶ）による研究は、抗体がＨＩＶに対する保護に重要な役割を演じ得ることを明らかにした。例えば、受動的に注入された抗体が、ＳＨＩＶ感染を、経口または経膣チャレンジにおいてのみならず、ＳＨＩＶのチャレンジが静脈内で行われた場合でさえ防ぐことが示された（例えば、Shibata、et al.、Nat. Med. 5: 204〜10、1999、Mascola、et al.、Nat. Med. 6: 207〜10、2000参照）。細胞誘導性の免疫機構もまた、同様にウイルス複製の抑制に主要な役割を演じているようである。この主張は、非ヒト霊長類におけるＳＩＶの多くの研究において、また、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、同疾患の急性期および慢性期の両方におけるウイルス複製の制御の要であることを示したヒトにおける研究によって十分に支持されている（Walker、et al.、Nat. Med. 6: 1094〜5、2000）。
【０００５】
今までのところ、ＨＩＶ感染に対する保護を与えるのに有効なワクチンはない。より注目すべきは、最近の候補ワクチンが感染細胞に対し有効な細胞応答を誘導せず、そのため長期の保護を与えないということである。
ペプチドまたはポリペプチドワクチンは、一部の病気に成功裏に用いられているが、これらのワクチンを用いてＨＩＶに対する保護的な免疫応答を得る上での障壁は、ＨＩＶペプチドの低い免疫原性、ＨＩＶの遺伝的変異性、およびＴ細胞の患者の免疫学的バックグラウンドへの依存性を包含する。
【０００６】
一般的にペプチドの免疫原性が低いため、これらは典型的には、免疫応答を刺激するためのアジュバントとともに投与される。不完全フロイントアジュバントおよび他のオイルベースのアジュバントがより有効であり、Ｔｈ１応答の誘導に有利であるようであるが、アラムは選択的なＴｈ２応答をもたらす（Grun and Maurer、Cell Immunol. 121（1）: 134〜45、1989）。ペプチドへの応答を増強するためのアジュバントによるさらなるアプローチは、リポペプチド免疫刺激剤との共有結合、またはペプチドのリポソーム内へのエンカプシデーション（encapsidation）を含む（Kim、et al.、Int J Oncol. 21（5）: 973〜9、2002、Martinon、et al.、J Immunol. 149（10）: 3416〜22、1992）。ある種のサイトカインもまた有用であることが証明されている。マウスでの実験において、ＩＬ−１２およびＩＬ−１βの活性断片が、ペプチドに対するＴｈ１応答を増強することが示された。ＩＬ−２は、ＦＤＡにより、転移性腎細胞癌、または転移性メラノーマを有する患者の処置への使用を認可された（Antonia、et al.、J Urol. 167（5）: 1995〜2000、2002）。これは、癌用のワクチンの成分として、およびＡＩＤＳのモデルにおけるワクチンによるアプローチの要素として用いられた（http://www.actis.org/vaccinetrials.asp参照）。しかしながら、ＩＬ−２の投与は、毛細血管漏出症候群を伴うとともに、その活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）における役割のために、ＩＬ−２は、腫瘍細胞上に発現された抗原を認識するＴ細胞を死に導く可能性がある。例えば、Waldmann、et al.、Immunity 14: 105〜10、2001参照。さらにまた、ＩＬ−２はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を抑制するため、ＨＩＶワクチンにおけるアジュバントとしてのその有用性を潜在的に低減させている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ワクチンの免疫原性を高めることが可能な組成物に関する。本組成物またはアジュバントは、それを必要とする哺乳動物に、ワクチン抗原と共に順次または同時に投与される。１つの好ましい側面においては、アジュバントは、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む、ワクシニアウイルスベクターなどの組換えポックスウイルスベクターの形態で提供される。
【０００８】
ＩＬ−１５およびＩＬ−２は、両方とも共有シグナル成分を有する受容体複合体を利用するが、ＩＬ−１５およびＩＬ−２の発現および相互作用は、重複するものの、同一ではない。ＩＬ−１５のｍＲＮＡは、線維芽細胞、上皮細胞および単球に広く分布するが、ＩＬ−２の主要な給源である休止または活性化Ｔ細胞には分布しない。ＩＬ−１５は、in vitroでＴ細胞の増殖と分化とを刺激し、in vivoでＴ細胞誘導性の免疫応答を増大させることができる。さらに、ＩＬ−１５は、Ｂ細胞の増殖および分化の誘導を刺激することが示されている。抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖および分化は、特定の抗原についての保護免疫を増大させることができる。Armitage、et al.、J. Immunology 154: 483〜490（1995）は、ＩＬ−１５が、活性化ヒトＢ細胞からのＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの分泌を強力に誘導することを報告している。加えて、ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において、リンホカイン活性化（ＬＡＫ）活性を誘導することができる。
【０００９】
本発明は、ＩＬ−１５が、ＩＬ−２への応答を有意に超える、抗原に対する長期の免疫応答を増強することができるという知見を利用するものである。したがって、本発明は、病原生物による急性、慢性および不顕性感染に対する応答、ならびに悪性細胞に対する応答を生じさせる組成物および方法を提供する。
１つの側面において、本発明は、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む組換えワクチンウイルスベクターを提供する。好ましくは、ベクターはまた、発現制御配列に作動可能に連結した少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現ユニットを含む。
【００１０】
ＩＬ−１５をコードする配列と抗原をコードする配列とは、同じまたは異なる発現の時間的パターンを有する発現制御配列に作動可能に連結していてもよい。１つの側面において、抗原をコードする配列は、ＩＬ−１５をコードする配列より前に発現される。別の側面において、抗原をコードする配列は、ＩＬ−１５をコードする配列より後に発現される。
ベクターは、１または２以上の不活性化した病原性遺伝子を含んでもよく、または制限された宿主域を含んでもよく、そして好ましくは複製欠損型または複製不能型または複製減弱型である。好適なベクターは、限定されることなく、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、エプスタインバーウイルス、レンチウイルス、およびピコルナウイルスに基づく（すなわちこれらのウイルスゲノムの部分を含む）ものを包含する。１つの好ましい側面において、ベクターは組換えポックスウイルスベクターである。組換え非病原性ポックスウイルスは、好ましくはワクシニアウイルスであるが、カナリアポックスウイルスなどの鶏痘ウイルスであってもよい。
【００１１】
好ましくは、ベクターは、１または２以上のカプシドポリペプチドを含む。１つの側面においては、１または２以上のポリペプチドは、細胞（例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞、または腫瘍細胞）への選択的な感染を容易にするために標的化分子に結合している。
また好ましくは、ＩＬ−１５をコードする配列は、これに作動可能に連結した発現制御配列を含む。
【００１２】
１つの側面においては、少なくとも１つの抗原は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドからの抗原などの、癌特異抗原である。
別の側面においては、少なくとも１つの抗原は、細菌抗原、例えば、Borrelia burgdorferi、Bartonella henselea、Yersinia pestis、およびBacillus anthracisからの抗原などである。
さらなる側面においては、少なくとも１つの抗原は、ウイルスペプチドまたはポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルスゲノム、イヌジステンパーウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルスゲノム、エボラウイルスゲノム、西ナイルウイルスゲノム、エプスタインバーウイルスゲノムまたは天然痘ゲノムにより発現されるペプチド/ポリペプチドである。
特に好ましい側面においては、少なくとも１つの抗原は、ＨＩＶまたはＳＩＶウイルスゲノムにより発現されるペプチドまたはポリペプチドなどのウイルスペプチドまたはポリペプチドを含む。
【００１３】
抗原をコードする発現ユニットは、いくつかの態様においては、複数の抗原をコードする配列を含む多価発現ユニットである。１つの側面においては、少なくとも２つの抗原が２つの異なるＨＩＶポリペプチドからのものである。別の側面においては、少なくとも２つの抗原は、ＨＩＶの２つの異なる株からのものである。さらに別の側面においては、少なくとも２つの抗原は、ＨＩＶの２つの異なる分離株からのものであり、またはＨＩＶの２つの異なるクレードからのものである。
さらにまた別の側面においては、少なくとも２つの抗原は、ＨＩＶポリペプチドの異なるサブ配列からのものである。しかしながら、別の側面においては、少なくとも２つの抗原は、ＨＩＶポリペプチドの同じサブ配列に由来するが、各サブ配列は、少なくとも１つのアミノ酸によって異なる。１つの側面においては、サブ配列は、ＨＩＶポリペプチドにおける高度に易変異性の領域からのものである。
【００１４】
別の側面において、発現ユニットは、複数の抗原をコードする配列、ＣＴＬ認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原、Ｔヘルパー細胞認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原、Ｂ細胞認識エピトープを含む少なくとも１つの抗原を含む。１つの側面においては、エピトープは同じＨＩＶポリペプチドからのものである。
１つの側面においては、少なくとも１つの抗原はＨＩＶポリペプチドからのものであるが、少なくとも１つの他の抗原は、ＨＩＶ陽性患者における日和見感染に関連する感染性生物、例えばPneumocystis cariiniからのものである。
【００１５】
本発明はさらに、ＩＬ−１５をコードする核酸と、少なくとも１つの抗原をコードする核酸とを含み、ここで、少なくとも１つの抗原をコードする核酸が、第２の組換えワクチンウイルスベクターにより発現される組換えワクチンウイルスベクターを提供する。
本発明はまた、上記の任意の組換えワクチンウイルスベクターまたは組成物を、動物に、免疫応答を刺激するのに有効な量で投与することを含む、動物に免疫応答を生じさせるための方法を提供する。好ましくは、免疫応答は、少なくとも１つの抗原に特異的なメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産生、少なくとも１つの抗原に特異的なメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の産生、および少なくとも１つの抗原に特異的な抗体の産生の１または２以上を含む。また、好ましくは、少なくとも抗体のいくつかは中和抗体である。
【００１６】
１つの側面において、動物はヒトである。
別の側面において、動物は、イヌまたはネコなどの家畜である。動物はまた、キツネおよびアライグマなどの野生化動物または野生動物であってもよい。動物はまた、非ヒト霊長類であってもよい。
本方法は、天然痘または狂犬病などのウイルス病因に感染するリスクがあるか、またはすでに感染している患者に、予防または治療ワクチンを提供するために用いてもよい。１つの側面においては、本方法はＨＩＶ感染のリスクが高い個体への予防ワクチンを提供するために用いられ、そして、ワクチンは最初の投与の時にＨＩＶ陽性ではない個体に投与してもよい。しかしながら、ワクチンはまた、最初の投与の時にＨＩＶ陽性の個体に投与してもよい。
【００１７】
本発明による組成物は長期免疫応答を増強することができるため、本組成物の再投与は、従来技術のワクチンより長い間隔で行われるだろう。１つの側面において、組換えワクチンベクターの最初の投与と再投与との間の間隔は、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１４ヶ月、少なくとも約１６ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、または少なくとも約２４ヶ月である。
【００１８】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによってよりよく理解できる。
【００１９】
詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む組換えワクチンベクターを提供する。好ましくは、ベクターはまた、発現制御配列に作動可能に連結した少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現ユニットを含むが、抗原をコードする配列はまた、別個の核酸の一部として、例えば、第２の組換えワクチンベクターの一部として提供してもよい。
【００２０】
本発明の実行は、別記のない限り、従来の技術の範囲内にある慣用の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を利用する。かかる技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（1982）におけるManiatis、Fritsch & Sambrook、DNA Cloning: A Practical Approach、Volumes I and II（D. N. Glover、ed.、1985）、Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait、ed.、1984）、Nucleic Acid Hybridization（B. D. Hames & S. J. Higgins、eds.、1985）、Transcription and Translation（B. D. Hames & S. I. Higgins、eds.、1984）、Animal Cell Culture（R. I. Freshney、ed.、1986）、Immobilized Cells and Enzymes（IRL Press、1986）、B. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）を参照。ワクシニア制限フラグメント、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチドの位置に関する全ての表示は、Goebel、et al.、Virology 179: 247〜266、1990、Goebel、et al.、Virology 179: 517〜563、1990に報告されている用語に基づくものである。
【００２１】
.
定義
以下の定義は、以下の説明において用いられている特有の用語について提供される。
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかにそれ以外のものを指示しない限り、複数の参照を包含する。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞（これらの混合物を含む）を包含する。用語「核酸分子」は、複数の核酸分子を包含する。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、用語「含む」は、組成物および方法が列挙した要素を包含するが、他の要素を除外しないということを意味する。「本質的に．．．からなる」は、組成物および方法を定義することに用いる場合、組み合わせに任意の本質的な意義を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書中に定義された要素を本質的に含む組成物は、単離および精製方法からの微量な混入物、およびリン酸緩衝生理食塩水、保存剤などの医薬的に許容し得る担体を除外しない。「．．．からなる」は、他の成分の微量な要素およびこの発明の組成物を投与するための実質的な方法工程以上のものを除外することを意味するものとする。これらの中間的な用語のそれぞれによって定義された態様は、本発明の範囲内である。例えば、本質的にＩＬ−１５からなる組成物は、他のサイトカインは含まないが、サイトカインではないアジュバント、抗原、治療剤などを含むことができる。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「転写制御下にある」または「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）が、発現制御エレメントと、コード配列との適切な並列によって制御されていることを意味する。１つの側面において、ＤＮＡ配列は、発現制御配列が当該ＤＮＡ配列の転写を制御および調節する場合に、発現制御配列に「作動可能に連結」または「操作可能に連結」されている。発現制御配列に作動可能に連結した核酸配列を含む構築物は、本明細書中では「発現ユニット」または「発現カセット」と呼ぶ。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「発現制御配列」は、それぞれＲＮＡポリメーラーゼに結合するプロモーター配列、エンハンサー配列、および／またはリボソームの結合のための翻訳開始配列を意味する。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターおよび、転写開始のためにシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧ（上記Sambrook、et al.、1989）を含むことができる。同様に、真核発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡポリメーラーゼＩＩのための異種、同種またはキメラプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱離のための終止コドンを含む。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「核酸送達ベクター」は、対象となるポリヌクレオチドを細胞中に輸送することができる核酸分子のことである。好ましくは、かかるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結したコード配列を含む。
本明細書中で用いる場合、「核酸送達」または「核酸移送」は、外来性のポリヌクレオチド（例えば、発現カセットなど）の宿主細胞内への導入を意味し、導入に用いられる方法とは無関係である。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定的にまたは一過性に維持されてもよい。安定した維持は、典型的には、導入したポリヌクレオチドが宿主細胞に適合した複製起点を含有するか、または染色体外レプリコン（例えばプラスミド）もしくはミトコンドリア染色体などの、宿主細胞のレプリコン中に組み込まれることを要する。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「組換えワクチンベクター」は、in vivo、ex vivoまたはin vitroで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドであって、ワクチンウイルスからのゲノム配列および異種の核酸配列（例えば、ＩＬ−１５および／または抗原を発現するための発現ユニットなど）を含むものを意味する。好ましくは、１または２以上の病原性関連配列が、ベクター内で不活性化される。ベクターは、ウイルスカプシドタンパク質で被包されていてもよく、または裸の核酸を含んでもよく、または細胞への侵入を容易にするための１または２以上の分子（例えば、リポソームなど）と会合した核酸を含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ベクターは、１または２以上のウイルスカプシドタンパク質で被包されている。ワクチンウイルの例は、限定されることなく、以下にさらに定義されるポックスウイルスを包含する。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「弱毒化ウイルス」または１または２以上の「不活性化した病原性関連遺伝子」を有するウイルスは、複製欠損型のウイルス、または特定の宿主において野生型ウイルスより複製の効率が悪くなるウイルスを意味する。
本明細書中で用いる場合、用語「核酸を細胞に投与する」または「ベクターを細胞に投与する」とは、細胞に核酸／ベクターを感染させる（例えば、ウイルスの形態で）、形質導入する、トランスフェクトする、マイクロインジェクションする、エレクトロポレーションする、または撃ち込むことを意味する。いくつかの側面においては、分子は、標的細胞中に、標的細胞を送達細胞と接触させることにより（例えば、細胞融合により、または送達細胞を、それが標的細胞の近くにある時に溶解することにより）導入される。
【００２８】
細胞は、外来または異種核酸が細胞の内部に導入された場合に、かかる核酸によって「形質転換し」、「形質導入され」、または「トランスフェクトされた」という。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合して）いてもいなくてもよい。原核生物、酵母および哺乳類の細胞においては、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメントとして維持されてもよい。真核細胞においては、安定的に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれ、染色体の複製を介して娘細胞に受け継がれていく細胞のことである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団で構成される細胞系またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって証明される。「クローン」は、有糸分裂により単一の細胞または共通の原細胞から由来する細胞の集団のことである。「細胞系」は、in vitroで多くの世代（例えば、少なくとも約１０世代）安定した、増殖が可能な初代細胞のクローンのことである。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「ＩＬ−１５ポリペプチド」は、Grabstein、et al.、Science 264: 96、1994および米国特許第5,747,024号に記載された野生型アミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９７％または約１００％の相同性を有するポリペプチドを意味する。ＩＬ−１５の変異体、修飾体、生物学的に活性なフラグメントおよび融合体もまた、これらが少なくとも以下の特性を有している限り、この用語の範囲に包含される：ＩＬ−１５の変異体、修飾形態、生物学的に活性なフラグメントおよび融合体をコードする核酸が、野生型ＩＬ−１５配列に、以下に定義する中程度のまたは高いストリンジェンシー条件下で結合し、かつポリペプチド自体がＣＴＬＬ−２細胞の増殖を刺激することができる（例えば、Gillis and Smith、Nature 268:154、1977、ATCC TIB 214に記載されているものを参照）。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「ＩＬ−１５の変異型」とは、保存的に置換された配列を含むＩＬ−１５ポリペプチドを意味し、これは、１または２以上のアミノ酸残基が、同様の物理的および化学的特徴を有する残基と置換されていることを意味する。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基の他の残基との置換、例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａの相互の置換、または、１つの極性残基の他のものとの置換、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの間の置換を包含する。表現型の上ではサイレントでありそうなアミノ酸変化に関する手引きは、例えばBowie、et al.、Science 247: 1306〜1310、1990に見出すことができる。他のこのような保存的置換、例えば、同様の疎水特性を有する領域の置換は、この定義に包含されている。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Henikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915〜10919、1992参照）。好ましくは、ＩＬ−１５ポリペプチドは、シグナルトランスダクションに重要であることが知られているＡｓｐ５６およびＧｌｎ１５６残基を保持する。「変異体」はまた、代替的なＲＮＡスプライシング事象により生じるＩＬ−１５の形態であって、それでもなおＣＴＬＬ−２増殖アッセイにおいて機能することが可能であり、かつ野生型ＩＬ−１５と実質的に同様の活性を有するものを包含する。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１５ポリペプチドの「修飾形態」とは、ＩＬ−１５ポリペプチドの翻訳後修飾された形態（例えば、グリコシル化形態またはタンパク質分解により処理された形態など）を意味する。
本明細書中で用いる場合、「ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸配列」は、Grabstein、et al.、Science 264: 96、1994および米国特許第5,747,024号に記載された野生型ＩＬ−１５核酸配列に相当する核酸配列、ならびに縮重的な置換（degenerate substitution）により野生型ＩＬ−１５核酸配列とは異なる配列、およびＩＬ−１５ポリペプチドの変異体、修飾形態、および生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を包含する。縮重コドン置換は、１または２以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作出することにより達成することができる（例えば、Batzer、et al.、Nucleic Acid Res. 19: 5081、1991、Ohtsuka、et al.、J. Biol. Chem. 260: 2605〜2608、1985、Rossolini、et al.、1994、Mol. Cell. Probes 8: 91〜98参照）。
【００３２】
野生型タンパク質の「生物学的に活性なフラグメント」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な均等物」または「機能的な派生物」は、野生型タンパク質の生物学的活性と、該活性を検出するのに好適なアッセイ（例えば、ＩＬ−１５の生物学的に活性なフラグメントの場合は、少なくともＣＴＬＬ−２アッセイ）を用いて測定した場合、実質的に同等の（例えば、有意に異ならない）生物学的活性を保有するものである。
本明細書中で用いる場合、用語「単離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらのフラグメントが、通常自然状態で結び付いている細胞その他の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関していえば、単離されたポリヌクレオチドとは、それが染色体において通常結び付いている５’および３’配列から分離しているもののことである。当業者にとって明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらのフラグメントは、それを、天然に存在するその対応物と区別するための「単離」を必要としない。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「ポックスウイルス」は、ポックスウイルス科の任意の成員を含み、これには、Chordopoxviridae亜科（脊椎動物ポックスウイルス）およびEntomopoxviridae亜科（昆虫ポックスウイルス）が含まれる。例えば、B. Moss in Virology、ed. Fields et al.、Raven Press p. 2080（1990）参照。コルドポックスウイルスは以下の属を含む：Orthopoxvirus（例えば、ワクシニア）、Avipoxvirus（例えば、鶏痘）、Capripoxvirus（例えば、羊痘）、Leporipoxvirus（例えば、ウサギ（ショープ）線維腫、粘液腫）、およびSuipoxvirus（例えば、豚痘）。
本明細書中で用いる場合、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、個々の細胞、または外来の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質のレシピエントになることが所望される、またはレシピエントである細胞を意味する。この用語はまた、単一細胞の子孫を包含するものとし、そして該子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異のために、本来の親細胞とは必ずしも完全に同一（形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において）である必要はない。標的細胞は、他の細胞（例えば、組織内にあるような）と接触していてもよく、または生物体の内部を循環していてもよい。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「患者」は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。哺乳類は、限定されることなく、マウス、非ヒト霊長類、ヒト、農業動物、スポーツ動物、ペット、および野生化動物もしくは野生動物を包含する。
用語「癌」、「新生物」および「腫瘍」は、同義的に、そして単数形または複数形で用いられ、悪性の形質転換を受け、宿主生物に対し病的になった細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近傍から得た細胞）は、非癌性細胞から、十分に確立された技術、特に組織学的検査により、容易に識別することができる。癌細胞の定義は、本明細書中で用いる場合、原発性癌細胞のみならず、原癌細胞に由来する任意の細胞をも包含する。これは、転移した癌細胞、ならびにin vitro培養物および癌細胞に由来する細胞系を包含する。通常固形腫瘍として現れる癌のタイプについていえば、「臨床的に検出できる」腫瘍とは、腫瘍塊に基づいて、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診により検出できるもの、および／または、患者から得られる試料中の１または２以上の癌特異的抗原の発現により検出できるものである。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、用語「医薬的に許容し得る担体」とは、任意の標準的な医薬的な担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、および油／水もしくは水／油エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤を包含する。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Martin Remington’s Pharm. Sci.、15th Ed.（Mack Publ. Co.、Easton（1975））参照。
用語「抗原源」は、本明細書中で用いる場合、先天免疫または適応免疫を惹起する任意の物質をカバーする。抗原源は、抗原を生成するためにプロセシング（例えば、タンパク質分解）を要し得る。抗原源は、ポリペプチド／タンパク質、ペプチド、微生物、組織、オリゴ糖類もしくは多糖類、核酸（抗原、または抗原を含むか、もしくはそれ自体抗原となるポリペプチド/タンパク質をコードするもの）であってもよい。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、用語「抗原」、「抗原決定基」または「エピトープ」は、免疫系の成分により特異的に認識または特異的に結合される短いペプチド配列またはオリゴ糖を示すために同義的に用いる。一般的に、抗原は、抗原提示細胞上で、これらが結合するＭＨＣ／ＨＬＡ分子とコンテキストにおいて認識される。２つの抗原は、これらが同じ抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞により特異的に結合され得、かつ、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞へのエピトープの結合が、他のエピトープによる結合を実質的に阻止する（第１のエピトープの結合が、第２のエピトープの存在下において、第２のエピトープの不存在下に観察された結合の約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、そしてより好ましくは、約１０％、５％、１％、または約０．１％未満である）場合に、互いに一致する。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「ワクチン組成物」は、ＩＬ−１５ポリペプチドをコードするワクチンベクターと、少なくとも１つの抗原源とを含む。抗原源は、ワクチンベクターの一部として含まれる、または別個の核酸分子として提供される、抗原をコードする核酸を含んでもよい。ワクチン組成物の成分は、一緒にまたは順次投与してもよい。
本明細書中で用いる場合、「ワクチン」は、抗原を含む物質に対し能動免疫を提供するが、疾患は引き起こさない抗原を含有またはコードする物質を意味する。
本明細書中で用いる場合、「サブユニットワクチン」は、ウイルスまたはその他の微生物の一部、例えば、免疫応答を惹起することができるウイルスもしくは微生物のポリペプチドまたはかかるポリペプチドをコードする核酸を含むもの、のみを含有するワクチンを意味する。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「治療ワクチン」は、すでに抗原に暴露されている者に、当該抗原に対する免疫応答をブーストするために設計されたワクチンである。
本明細書中で用いる場合、「治療的に有効な量」は、異常な生理学的応答を予防、修正および／または正常化するのに十分な量を意味する。１つの側面において、「治療的に有効な量」は、臨床的に顕著な病気の特徴、例えば、ＣＤ４細胞の抑制（すなわち、ＣＤ４細胞の少なくとも３０％の増加をもたらす）、ウイルス量の減少、腫瘍塊の大きさの減少などを、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低減するために十分な量である。好ましくは、「ワクチン組成物の治療的に有効な量」は、ワクチン抗原への有益な免疫応答を少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％または少なくとも約９０％増強、すなわち、抗原に対するＣＴＬ応答を増大、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるγ−ＩＦＮの分泌を増大、ワクチン抗原に特異的な抗体の産生を増大、およびワクチン組成物の投与後のこれらの反応の持続時間を増大させる。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「増大した持続時間」を有する免疫応答は、抗原の最初の投与の少なくとも約４ヶ月、約６ヶ月、約８ヶ月、約１０ヶ月、約１２ヶ月、約１６ヶ月、約１８ヶ月、または少なくとも約２０ヶ月後において観察される有意な反応を意味する。
「抗体」は、任意の免疫グロブリンであり、抗体および、特異抗原に結合するそのフラグメントを包含する。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体（例えば、二重特異抗体）を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。典型的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、および本明細書に記載の治療方法に用いることが好ましいＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）部分を包含する、パラトープを含むこれらの免疫グロブリン分子の部分である。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、用語「免疫エフェクター細胞」は、抗原と結合することができ、かつ免疫応答を媒介する細胞を意味する。これらの細胞は、限定されることなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）、例えば、ＣＴＬセルライン、ＣＴＬクローン、および腫瘍性、炎症性もしくはその他の浸潤物からのＣＴＬを包含する。
本明細書中で用いる場合、用語「ウイルス感染」は、ウイルスが健康細胞に侵入し、細胞の増殖機構を利用して増殖もしくは複製し、そして最終的には細胞を溶解して細胞死、ウイルス粒子の放出および新たに産生された子孫ウイルスによる他の細胞の感染をもたらす、疾患の状態を表すものである。「非増殖性の感染」、すなわちワクチンウイルスベクターによるものは、ベクターが細胞内に導入されるが、病原性関連遺伝子が不活性化されているため、または宿主域が制限されているために、細胞内では複製しない感染である。
【００４１】
本明細書中で用いる場合、用語「ウイルス感染を処置または予防する」は、特定のウイルスの複製を阻害すること、ウイルスの伝播を阻害すること、または、ウイルスがその宿主内に定着するのを予防すること、および、ウイルス感染によって引き起こされた疾患の症状を改善または緩和することを意味する。
本明細書中で用いる場合、「アジュバント」は、ワクチン抗原に対する宿主の免疫応答を増強、増大または強化する物質を意味する。
用語「免疫原性」は、免疫原または抗原が免疫応答を誘導する相対的な有効性を意味する。
本明細書中で用いる場合、「ベースライン」は、測定を開始した場合に、ワクチン投与の直前の時点を意味する。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「ブースター」は、最初のワクチン抗原に対する免疫応答を増大させるために、初期用量の後に与えられる第２のまたはより後のワクチン用量を意味する。ブースター用量として与えられるワクチンは、初期ワクチンと同じであってもなくてもよい。
本明細書中で用いる場合、「チャレンジ」は、宿主動物のワクチン抗原への意図的な暴露を意味する。
本明細書中で用いる場合、「クレード」は、遺伝的類似性（エンベロープタンパク質の類似性によって測定されたものなど）にしたがって分類された、関連するＨＩＶ分離株の群を意味する。現在ＨＩＶ−１分離株には２つの群、ＭおよびＯがある。Ｍ群は、ＡからＩまでの少なくとも９つのクレードからなる。Ｏ群は、同程度の数のクレードからなると思われる。クレードＢは、北米およびヨーロッパで一般的に見られ、そして分離株ＬＡＩ  ｂ、ＭＮ、およびＳＦ−２を包含する。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「セロコンバージョン」は、特定の抗原に対する抗体の発生を意味する。
本明細書中で用いる場合、「免疫」は、免疫系により具体的な疾患に対してもたらされる先天性または後天性の抵抗力を意味する。免疫は、部分的または完全であっても、特異的または非特異的であっても、持続性または一過性であってもよい。
本明細書中で用いる場合、「殺菌的免疫（sterilizing immunity）」は、感染の成立を完全に防ぐ免疫応答を意味する。
本明細書中で用いる場合、「メモリー細胞」は、特異抗原に暴露し、そしてその後、免疫系が同じ抗原に再び遭遇した時により容易に増殖する（抗原を認識し、そして分裂する）ことができるＴ細胞およびＢ細胞のサブセットを意味する。
【００４４】
組換えベクター
本発明は、抗原に対する免疫応答を誘導または増強するための、ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むワクチンベクターを提供する。好ましくは、ワクチンベクターは、ワクシニアベクターなどのポックスウイルスベクターである。本発明は、一般的に、選択された抗原（「ワクチン抗原」）に対する細胞性または体液性免疫応答を惹起および／または増強するために実行することができる。
ＩＬ−１５のクローニングおよびシーケンシングは、Grabstein、et al.、Science 264: 96、1994および米国特許第5,747,024号に開示されている。本明細書中で用いる場合、「ＩＬ−１５核酸」は、野生型ＩＬ−１５配列に、中程度または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつＣＴＬＬ−２細胞の増殖を刺激することができる（Gillis and Smith、Nature 268: 154、1977、ATCC TIB 214）。
【００４５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約０％〜約２５％のホルムアミド濃度、および約６×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度、約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度、および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。高いハイブリダイゼーション条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄液が挙げられる。一般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１、２または３以上の洗浄工程を有し、そして洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸バッファーである。他のバッファー系を用いたＳＳＣの均等物を使うことができると理解される。
【００４６】
好ましくは、ＩＬ−１５核酸配列は、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドに対し約７０％の相同性を有する、そしてより好ましくは、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドに対し少なくとも約９０％の相同性または約１００％の相同性を有するＩＬ−１５ポリペプチドをコードする。
２配列（核酸またはポリペプチド）間のパーセント同一性（percent identity）および類似性は、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる（例えば、Computational Molecular Biology、Lesk、A. M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith、D. W.、ed.、Academic Press、New York、1993、Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin、A. M.、and Griffin、H. G.、eds.、Humana Press、New Jersey、1994、Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987、and Sequence Analysis Primer、Gribskov、M. and Devereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991参照）。
【００４７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる（例えば、最適なアライメントのためにギャップが第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入され、そして、非相同性配列は比較目的のために無視することができる）。２配列間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一の位置の数の関数であり、ギャップの数、および２配列の最適なアライメントのために導入する必要があったギャップの長さが考慮される。アミノ酸位置またはヌクレオチド位置にそれぞれ対応するアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次に比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、当該分子は、その位置において同一である（本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。
【００４８】
「比較ウインドウ（comparison window）」は、２５〜６００、普通には約５０〜約２００、より普通には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つを有するセグメントであって、２つの配列が最適にアライメントされた後、配列が、同じ数の連続位置の参照配列と比較することができるセグメントを意味する。比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野でよく知られている。
例えば、２つのポリペプチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムの一部であるNeedlemanおよびWunschのアルゴリズム（J. Mol. Biol.（48）: 444〜453、1970）を用いることにより、Smith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2: 482、1981）により、Pearson & Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444、1988）およびAltschul、et al.（Nucleic Acids Res. 25（17）: 3389〜3402、1997）の類似性検索法により、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびWisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、Wis.から入手可能）のＢＬＡＳＴ）のコンピュータによる実行により、または手動のアライメントおよび視覚的検討（例えば、上記Ausubel et al.参照）により決定することができる。
【００４９】
. 
ギャップパラメータは、ユーザーの要求に合うように変更することができる。例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージを利用する場合、ＮＷＳｇａｐＤＮＡ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイト（gap weight）、および１、２、３、４、５、または６の長さウェイト（length weight）を用いることができる。Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスを用いた典型的なギャップウェイトは、１６、１４、１２、１０、８、６、または４であり、一方典型的な長さウェイトは１、２、３、４、５、または６である。ＧＣＧソフトウェアパッケージは、核酸配列間のパーセント同一性を決定するのに用いることができる。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれた、ＰＡＭ１２０ウェイト留数表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いたE. MyersおよびW. Millerのアルゴリズム（CABIOS 4: 11〜17、1989）を用いて決定することができる。
【００５０】
本発明の１つの側面においては、ＩＬ−１５のヒトｃＤＮＡは、３１６ｂｐの５’非コード領域、および４８９ｂｐのオープンリーディングフレーム（ストップコドンを含む）、および４００ｂｐの３’非コード領域を含む１６２アミノ酸の前駆体をコードする（例えば、Grabstein、et al.、Science 264: 965、1994参照）。組換えベクターは、全長ｃＤＮＡまたはそのコード領域もしくは生物学的に活性なフラグメント（例えば、５’非コード領域および３’非コード領域の１または２以上を欠くもの）を含んでもよい。組換えベクターはまた、１１４アミノ酸のＩＬ−１５のプロセシングされた形態をコードする配列に相当する配列を含んでもよい。かかる配列は、非ＩＬ−１５分泌配列、例えば、免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナル配列に融合されていてもよい。
【００５１】
好ましくは、本発明によるベクターに発現された組換えＩＬ−１５ポリペプチドは、ＣＴＬＬ−２アッセイで決定した場合、野生型ＩＬ−１５と実質的に同じ活性を有する。上記Grabstein、et al.、1994参照。簡潔に述べると、ＣＴＬＬ−２細胞（約２×１０４〜１０６）を、９６穴プレートもしくは他の好適な容器中の組換えＩＬ−１５ポリペプチドの連続希釈物に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で３日間インキュベートする。その後、０．５mＣｉの３Ｈ−チミジンを混合物に添加する。チミジンは、細胞が増殖した場合だけ取り込まれる。一晩のインキュベーションの後、細胞を採集し（例えば、グラスファイバーフィルター上に）、そして放射活性を、ベータカウンター（例えば、Packard Instrument Company、Meridien、Conn.から入手可能な、Matrix 96ベータカウンタ）などの好適な検出器を用いて測定する。サンプル中の組換えＩＬ−１５の活性は、既知量のＩＬ−１５を用いて作成した標準曲線から決定する。標準として使用する組換えヒトＩＬ−１５は、商業的に購入することができる（例えば、PeproTech、London、UKから）。本発明による組換えＩＬ−１５ポリペプチドは、好ましくは標準曲線から約２０％未満の差を、より好ましくは約１０％未満の差を、そしてより一層好ましくは、約５％未満の差を示す。１つの側面において、組換えＩＬ−１５ポリペプチドは、製造者にしたがって、約５×１０５〜２×１０６Ｕ／ｍｇの比活性を有する。チミジン取り込みアッセイを上記したが、細胞増殖を測定するための任意の好適なアッセイを用いてもよいこと、およびそれが本発明の範囲に含まれることは、当業者に明らかであろう。
【００５２】
好ましくは、ＩＬ−１５核酸は、ＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）のαサブユニットに特異的に結合し、かつＩＬ−１５受容体複合体のβまたはγサブユニットのいずれかもしくは両方を介してシグナルを伝達できるＩＬ−１５ポリペプチドをコードする。さらなる側面においては、本発明による組換えＩＬ−１５ポリペプチドは、極性化の誘導、コラーゲンゲルへの浸潤、および接着受容体の再分布（例えば、Wilkinson and Liew、J Exp Med. 181（3）: 1255〜9、1995、Nieto、et al.、Eur. J Immunol 26（6）: 1302〜7、1996に記載されているものを参照）の１または２以上を測定することによりアッセイした場合に、ヒト末梢血Ｔリンパ球における化学誘引因子として作用する。
【００５３】
本発明による組換えＩＬ−１５発現ワクチンベクターの投与により、抗原への再暴露の際に二次応答を起こすようにプライミングされたメモリー細胞の拡大された集団が生じる。この効果は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されたワクチン抗原の存在下におけるかかる細胞の迅速に拡大する能力、または抗原への最初の暴露後でさえも迅速な抗原特異的細胞溶解反応を示すその能力によりモニターすることができる。
【００５４】
細胞死は、当該技術分野で知られたアッセイにより、例えば、血球計算板にてトリパンブルー排除細胞を計数することによりモニターすることができる。アポトーシスは、採集した細胞にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ICN）を加え、フローサイトメトリーによりＰＩを取り込んだ細胞のパーセンテージを決定することにより分析することができる。アポトーシス細胞のパーセンテージは、当該技術分野で知られているように前方散乱分析により決定することができ、そしてそれはＰＩの取り込みに相関する。好ましくは、組換えポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞死から保護し、約２０％未満、約１０％未満、そして約５％未満の細胞数の変化を、組換えＩＬ−１５濃度約０．１ｎｇ／ｍｌ以上でもたらし、かつ２０％未満、１０％未満、そして好ましくは、約５％未満の集団内のアポトーシス細胞の数の増大をもたらす。
【００５５】
組換えＩＬ−１５ポリペプチドがメモリー応答を増強する能力は、本発明によるワクチンベクターを、ワクチン抗原またはワクチン抗原をコードする配列の存在下でマウスに感染させることにより評価することができる。マウスは、抗原暴露後種々の日数で犠牲にし、ナイーブマウス、処置マウスまたはバッファーで処置したマウスからのリンパ節細胞を単離し、ワクチン抗原または無関係な抗原（例えば、鶏卵リゾチームまたはインフルエンザ抗原）で再刺激する。細胞増殖は、当該技術分野における定法を用いて（例えば、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することにより）モニターする。バッファーにより処置されたマウスまたはナイーブマウスと比べたメモリー細胞の増殖の有意な増加（当該技術分野でよく知られた統計学的方法を用いて決定されたもの）を、増強されたメモリー応答を表すものとして捉える。好ましくは、組換えＩＬ−１５を発現するウイルスベクターは、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約１００％の増殖の増大をもたらすことができる。追加的にまたは代替的に、メモリー細胞の応答は、生物学的に活性なＩＬ−１５の証として捉えられる。好ましくは、かかる応答は、ワクチン−抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解、および／またはかかる細胞によるγ−ＩＦＮの産生を包含する。好ましくは、生物学的に活性なＩＬ−１５の投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による応答の継続時間および規模を増強する。
【００５６】
上記で論じたとおり、好ましいワクチンベクターは、ポックスウイルスを包含する。これらのウイルスの大きなゲノムサイズは、少なくとも２５，０００塩基対の外来ＤＮＡを受け入れることが可能なベクターの操作を可能にする（Smith、et al.、Gene 25: 21、1983）。さらに、ポックスウイルスは、ほとんどの真核細胞腫に感染することができ、かつ細胞内に侵入するために特別の受容体を要しない。他のＤＮＡウイルスとは異なり、ポックスウイルスは専ら感染細胞の細胞質で複製するため、組換えウイルスＤＮＡと宿主染色体との遺伝子交換の可能性が低減され、そして異種遺伝子が宿主細胞の調節とは独立して発現することを可能にする。
ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意の成員から得ることができ、特にワクシニアウイルスまたはavipoxvirus（例えば、カナリア痘、鶏痘など）は、ワクチンベクターにとって好適な配列を提供する。
【００５７】
１つの側面において、ポックスウイルスベクターはワクシニアウイルスベクターである。ワクシニアウイルスは、現場条件下で物理的および遺伝子的安定性を示すため、輸送および保管における問題点および出費が低減される。組換えワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子産物に対して細胞性および体液性免疫を与え、かつ、いくつかの動物モデルにおいて感染症に対して保護することが示された。さらに、組換えワクシニアウイルはまた、ＨＩＶのｇｐ１６０エンベロープ遺伝子を発現させる臨床試験に用いられており（例えば、Cooney、The Lancet 337: 567〜572、1991、Graham、et al.、J. of Infectious Dis. 166: 244〜252、1992、Estin、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1052〜1056、1988参照）、したがって臨床的に許容されている。
【００５８】
好適なワクシニアウイルスは、限定されることなく、コペンハーゲン（ＶＣ−２）株（Goebel、et al.、Virol. 179: 247〜266、1990、Johnson、et al.、Virol. 196: 381〜401、1993）、改変コペンハーゲン株（ＮＹＶＡＣ）（米国特許第6,265,189号）、ＷＹＥＴＨ株および改変アンカラ（ＭＶＡ）株（Antoine、et al.、Virol. 244: 365〜396、1998）を包含する。しかしながら、以下の例はワクシニアウイルスに関するものであるものの、ワクチンとして用いられるのに好適な他のポックスウイルスで代用してもよく、これらもまた本発明の範囲に包含される。例えば、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣベクターなどの鶏痘株もまた、所望の特性を提供し、高度に弱毒性である（例えば、米国特許第6,265,189号、AIDS Research Reviews、Koff、et al.、eds.、Vol. 3、Marcel Dekker、N.Y.、1993におけるTartaglia et al.による総説、Tartaglia et al.、1990、Immunology 10: 13〜30、1990における総説を参照）。
【００５９】
ワクシニアウイルスベクターなどの組換えポックスウイルスベクターを構築するための方法および条件は、当該技術分野において知られている（例えば、Piccini、et al.、Methods of Enzymology 153: 545〜563、1987、米国特許第4,769,330号、米国特許第4,722,848号、米国特許第4,769,330号、米国特許第4,603,112号、米国特許第5,110,587号、米国特許第5,174,993号、EP 83 286、EP 206 920、Mayr et al.,Infection 3: 6〜14、1975、Sutter and Moss、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847〜10851、1992参照）。鶏痘ウイルスの調製は、例えばWO 96/11279に記載されている。
【００６０】
ワクチンベクターは、一般的に以下のように調製する。１つの側面において、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含むドナープラスミドを構築し、大腸菌における増殖により増幅し、そして慣用の手法により単離する。ドナープラスミドは、ワクシニアウイルス配列に相同な核酸配列を含む。ＩＬ−１５をコードする核酸は、発現制御エレメントに作動可能に連結している。好ましくは、発現制御エレメントは、上流プロモーター配列、および、必要に応じてＲＮＡプロセシングシグナルを含むウイルスの調節エレメントを含む。発現制御配列は、ワクシニアウイルスからのものでも、または他のポックスウイルスからのものでもよく（例えば、Mackett、et al.、J. Virol、49: 857、1982参照）、そしてＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結している。プロモーターの選択により、ＩＬ−１５配列の発現の時間（例えば、早期または後期）およびレベルの両方が決定される。
【００６１】
発現ユニットは、発現制御配列を含み、そしてＩＬ−１５配列は、その両端を、組換えサイトとして標的化されているワクシニアウイルスＤＮＡ配列に相同なＤＮＡで挟まれている。好ましくは、フランキング配列は、ワクシニアウイルスゲノムにおける必須ではない遺伝子座に対応する。得られたプラスミド構築物を、次に大腸菌または他の好適な宿主における複製により増幅し、そして当該技術分野における定法を用いて単離する（例えば、Maniatis、T.、Fritsch、E.F.、and Sambrook、J.、In Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）（1989）参照）。
【００６２】
好適な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、１４３Ｂ  ｔｋ細胞、ベロ細胞、肺細胞など）を、ドナーおよびレシピエント配列の両方を含む組換え体の選択のために、レシピエントワクシニアウイルス配列と一緒にドナープラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクションは、核酸の細胞内への侵入を促進するための１種または２種以上の分子を提供することにより促進してもよい。好適な送達ビヒクルは、限定されることなく、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、カチオン分子、細胞送達ビヒクル、電気穿孔を促進するためのビヒクルなどを包含する。
【００６３】
好適なレシピエント配列は、保護免疫応答を誘導および／または増強することができる組換えウイルスの産生をもたらし、かつあらゆる有意な病原特性を欠くものが選択される。したがって、１つの好ましい側面においては、レシピエント配列は、組織培養においてウイルスの増殖のために必須ではなく、その欠失または不活性化が哺乳類（例えば、マウスまたはヒトなど）などの宿主生物における病原性を低減する、１または２以上の遺伝子を含む。
【００６４】
病原性関連配列は、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ヘマグルチニン、１３．８ｋＤ分泌タンパク質、リボヌクレオチド還元酵素遺伝子、宿主域遺伝子、出血性遺伝子（hemorrhagic gene）、およびＡ型封入体領域を包含する。例えば、Hruby et al.、J. Virol. 43: 403〜409、1982、Weir、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3411〜3415、1983、Flexner、et al.、Nature 330: 259、1987、Buller、et al.、Nature 317: 813、1985、Buller、et al.、J. Virol. 62: 866、1988、 Shida et al.、J. Virol. 62: 4474、1988、Kotwal、et al.、Virology 171: 579、1989、Child、et al.、Virology 174: 626、1990参照。不活性化病原性関連配列は、完全にもしくは部分的に欠失した遺伝子配列、置換、再構成、挿入、これらの組み合わせなどを含んでもよい。変異は、操作しても、または選択してもよい。例えば、弱毒化ウイルス株は、好適な脊椎動物宿主細胞（例えば、発育鶏卵および／またはニワトリ線維芽細胞など）において繰り返し継代し、そして引き続いてプラーク精製を行い、より小さな、より遅く複製する、または、完全なもしくは部分的な弱毒化の指標を示すプラークを同定することにより、選択することができる。好ましくは、本発明によるポックスウイルスベクターは、複製不適合であり、かつ最初に感染した細胞を超えて広がることが不可能であるか、または、弱毒化されたものである。
【００６５】
アビポックスウイルスなどの宿主制限ウイルスもまた、ヒトなどの哺乳類において非病原性であるために、用いることができる。
ドナープラスミド中の相同なワクシニアウイルス配列と、ウイルスゲノムとの間の組換えにより、ＩＬ−１５をコードする配列を含むワクシニアベクターが産生される。
【００６６】
組換えは、ドナープラスミドにレポーター遺伝子配列を含め、これらの配列を有する組換えウイルスについてスクリーニングすることにより検出することができる。例えば、大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子を含むドナープラスミドは、組換え体を、親ウイルスから識別する方法を提供する（Chakrabarti、et al.、Mol. Cell. Biol. 5: 3403、1985）。かかる組換え体により形成されるプラークは、適切な指示物質の添加により形成される青色により、陽性に同定することができる。代替的に、または追加的に、レシピエント配列はレポーター配列を含んでおり、そして組換え体はレポーター配列の機能の喪失（すなわち、ドナー配列の、レシピエント配列中への挿入によりもたらされる）により検出される。１つの側面において、レシピエントレポーター配列は、病原性関連遺伝子である。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入は、チミジンキナーゼ陰性の１４３Ｂ骨肉腫細胞において、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）存在下で増殖する組換え体をもたらす。
【００６７】
しかしながら、別の側面において、レシピエントレポーター配列は、異種配列である（例えば、βガラクトシダーゼまたはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼなど）。組換えワクシニアウイルスを精製するさらなる戦略は、例えば、Scheiflinger、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9977〜9981、1992、Merchlinsky and Moss、Virology 190: 522〜526、1992に記載されている。
ウイルス粒子は、培養上清から、または溶解工程（例えば、化学的溶解、凍結／解凍、浸透圧ショック、超音波処理など）後の培養細胞から回収することができる。連続的なプラーク精製を、混入野生型ウイルスを除去するのに用いることができる。ウイルス粒子は、その後、当該技術分野において知られている技術を用いて（例えば、クロマトグラフィー法、または塩化セシウムもしくはショ糖勾配での超遠心分離により）精製することができる。
【００６８】
本発明によるベクターは、ベクターが標的細胞に成功裏に導入されたことを確認するための、検出可能なおよび／または選択可能なマーカーをさらに含んでもよい。これらのマーカーは、限定されることなく、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生などの活性をコードすることができ、または、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物もしくは組成物などのための結合部位を提供することができる。いくつかのケースでは、ドナープラスミドにより提供されるレポーター配列が、標的細胞内への導入を確認するためのマーカーとして用いられる。
検出可能な／選択可能なマーカー遺伝子の例は、限定されることなく、さもなければ毒性の化合物に抵抗性を与える産物（例えば、抗生物質）、さもなければレシピエント細胞に欠けている産物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカーなど）、遺伝子産物の活性を抑制する産物、酵素（例えば、βガラクトシダーゼまたはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼなど）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＧ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、これらの変異、修飾または増強形態など）、細胞表面タンパク質（すなわち、免疫アッセイで検出することができるもの）、をコードする核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどを包含する。
【００６９】
マーカー遺伝子は、ワクチンベクターによるＩＬ−１５遺伝子の移行が成功したことを確認するため、および／またはＩＬ−１５を発現する組換え体を単離するためのマーカーとして用いることができる。
１つの側面においては、ワクチンベクターは、ワクチンベクターの細胞内への侵入を促進するためのウイルスカプシド分子を含む。さらに、ウイルスカプシド分子は、特定の細胞種への標的化および／または選択的な侵入を促進するための標的化部分を含ませるように操作することができる。好適な標的化分子は、限定されることなく、化学的結合物（chemical conjugate）、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、WO 94/40958参照）、ビタミン、レクチン、抗体およびそのフラグメントを包含する。好ましくは、かかる標的化分子は、樹状細胞（例えば、ＣＤ４４など）などの抗原提示細胞または癌細胞の細胞特異的マーカーを認識し、これに結合する。
【００７０】
抗原をコードする配列
抗原源は、担体に結合したポリペプチドまたはペプチドの形態で投与することができ、または、抗原をコードする核酸配列の形態で投与することができる。好ましくは、抗原源は、免疫系の１種または２種以上の応答を刺激する領域を含有し、これは、例えば、限定されることなく、免疫グロブリン応答、ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩ応答、ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩＩ応答、ＮＫ応答などを包含する。ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩＩ媒介性の応答の場合、抗原源は、一般的に細胞内にリソソーム酵素によって放出され得、放出された場合に、ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩＩエピトープに該当するペプチドセグメントを含む。
【００７１】
合成抗原および改変抗原もまた、本明細書中に記載の方法に用いることができる。合成抗原は、その天然の対応物に比較して変更されたアミノ酸配列を有する（この態様においては、抗原は、ペプチドをコードする核酸よりも、むしろペプチドの形態で提供される）。また本発明の範囲に含まれるのは、任意に介在アミノ酸配列またはリンカーを含む、抗原のマルチマー（コンカテマー）である。複数の抗原が、多価抗原発現ユニットを形成する抗原発現ユニットによりコードされている場合、抗原は同じであっても異なっていてもよい。
【００７２】
１つの側面においては、多価抗原発現ユニットは、同じか、または異なる抗原源からの、少なくとも１つのＣＴＬエピトープ、少なくとも１つのヘルパーエピトープ、および少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。異なるエピトープは、同じか、または異なるタンパク質からのものであってもよい。例えば、複数の抗原配列は、感染性生物の少なくとも２種の株（例えば、ＨＩＶおよびPneumocystic cariiniからの）からの抗原、単一の感染性生物のゲノムによってコードされる異なるポリペプチドからの抗原、または単一のポリペプチドからの抗原、例えば、異なる抗原性領域もしくは同じ抗原性配列の代表的な変異体、の組み合わせであってもよい。最後の態様においては、同じ抗原性配列の変異体を、特に易変性のペプチド配列（例えば、感染性生物内のもの）に対する免疫応答を誘導または増強するために用いてもよい。
【００７３】
また本発明の範囲に含まれるのは、翻訳の最中または翻訳後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク分解性の開裂、抗体分子、膜分子もしくは他のリガンドへの結合により、異なって修飾された抗原性ペプチドである（例えば、Ferguson et al.、Ann. Rev. Biochem. 57: 285〜320、1998参照）。
好適な抗原は、限定されることなく、癌／腫瘍抗原、自己抗原（例えば、移植片拒絶において認識される抗原など）、アレルゲン、過敏症に関連する抗原、プリオン抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫もしくは菌類からの抗原、および寄生虫抗原（これらの生物の細胞壁または細胞膜に見出されるタンパク質を特に含む）を包含する。
【００７４】
特に、好適な抗原は、狂犬病（例えば、GenBank Accession No. M34678）、マラリア（Shetty、Lancet Infect Dis. 2（11）: 648、2002）、寄生虫感染症（例えば、住血吸虫症など）、ハンタウイルス（Meissner、et al.、Virus Res. 89（1）: 131、2002、Padula、et al.、J Gen Virol. 83（Pt 9）: 2117〜22、2002、Hoffacker、et al.、Nucleic Acids Res. 26（16）: 3825〜36、1998）、黄熱病（Pugachev、et al.、Vaccine 20（7-8）: 996〜9、2002）、西ナイル熱（Lanciotti、et al.、Virology 298（1）: 96〜105、2002）、麻疹（Crowley、et al.、Intervirology 28（2）: 65〜77、1987）、流行性耳下腺炎（Jin、et al.、Virus Res. 70（1-2）: 75〜83、2000）、風疹（Dominguez、et al.、Virology 177（1）:  225〜38、1990）、灰白髄炎（例えば、Kinnunen、et al.、J Gen Virol. 72（Pt 10）: 2483〜9、1991参照）、天然痘（Massung、et al.、Virology 201（2）: 215〜40、1994、Mayr、et al.、Zentralbl. Bakteriol. [B]. 167（5-6）: 375〜90、1978、Aguado、et al.、J Gen Virol. 73（Pt 11）: 2887〜902、1992、Shchelkunov、et al.、Virus Res. 36（1）: 107〜18、1995参照）、炭疽、エボラ（Sanchez、et al.、Virus Res. 29（3）: 215〜40、1993）、ウマ脳炎（Kinney、et al.、Virology 170（1）:19〜30、1989）、リフトバレー熱（Muller、et al.、Nucleic Acids Res. 19（19）: 5433、1991）、ネコ引っ掻き熱（例えば、Renesto、et al.、Res Microbiol. 151（10）: 831〜6、2000参照）、ウイルス性髄膜炎、マールブルグウイルス（上記Sanchez、et al.、1993）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ型肝炎（概してGenBank参照）、日本脳炎（例えば、GenBank Accession No. E07883）、デング熱（例えば、GenBank Accession No. M24444）、ペスト（Parkhill、et al.、Nature 413（6855）: 523〜7、2001）、野兎病（Karlsson、et al.、Microb. Comp. Genomics 5（1）: 25〜39、2000）、およびクラミジアおよびリケッチア病因を包含する、他の病原生物により起こる疾患に関連する生物のゲノムによりコードされる抗原である。
【００７５】
特に好ましい抗原は、ヒトまたは家畜に病原性を有するウイルスのゲノムによってコードされる、ウイルスによりコードされたタンパク質である。非限定的な例は、残基３６５〜８０（NP365-80）、NP50-63、およびNP147-58から構成されるインフルエンザ核タンパク質からのペプチド、および先にクラスＩ拘束細胞毒性アッセイで決定されたインフルエンザヘマグルチニンHA202-21およびHA523-45からのペプチド（Perkins et al.、1989、J. Exp. Med. 170: 279〜289）を含む。関連する原虫抗原は、記載されている（例えば、米国特許第5,609,872号参照）マラリア原虫Plasmodium falciparumにより表示されるエピトープに相当するペプチドを含む。パピローマウイルスコア抗原、ＨＣＶ構造および非構造タンパク質、およびＣＭＶ構造および非構造タンパク質、エボラＧＰ１またはＧＰ２タンパク質（例えば、Feldmann、et al.、Arch Virol Suppl. 15: 159〜69、1999、Sanchez、et al.、J. Virol 72（8）: 6442〜7、1998、Volchkov、V. E.、et al.、FEBS Lett 305（3）: 181〜4、1992参照）、または核カプシドタンパク質（Vanderzanden、et al.、Virology、246（1）: 134〜44、1998）もまた、抗原の給源を提供する。別の側面においては、抗原は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来するものである。例えば、ＲＳＶウイルス抗原は、糖タンパク質（Ｇ−タンパク質）または融合タンパク質（Ｆ−タンパク質）であってもよい。さらなる側面においては、抗原は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来する。例えば、ＨＳＶウイルス抗原は、ＨＳＶ−２からの糖タンパク質Ｄであってもよい。
【００７６】
１つの好ましい側面においては、狂犬病ウイルスが抗原の給源を提供する。現在、多価狂犬病抗原は、イヌにおいて「有効な干渉」を示している。すなわち、１種または２種以上の抗原（イヌジステンパーウイルス抗原、イヌアデノウイルス抗原、イヌコロナウイルス抗原、イヌパラインフルエンザ抗原、イヌパルボウイルス抗原、およびレプトスピラバクテリン抗原）を、狂犬病抗原と組み合わせて用いた場合、満足できる免疫応答を維持するのに失敗する。例えば、米国特許第5,843,456号参照。したがって、本発明による組換えワクシニアウイルスは、顕著に長期の免疫応答（１年を超える）を維持するその能力のために特に有用である。
したがって、本発明の１つの好ましい側面においては、本発明によるワクチン組成物は、狂犬病抗原の給源（すなわち、狂犬病抗原をコードする核酸）と、組換えＩＬ−１５を発現する配列とを含む。好適な狂犬病抗原の給源は、限定されることなく糖タンパク質Ｇを包含する。例えば、Wiktor、et al.、J. Imunol. 110: 269〜276、1973参照。狂犬病抗原をコードする配列を含むベクターは、例えば米国特許第6,210,663号に記載されている。かかる組成物は、上記のように多価ワクチンを提供するために、追加の抗原源（例えば糖タンパク質Ｇの異なる部分を含む）を含んでもよい。
【００７７】
１つの側面においては、好ましい抗原は天然痘抗原である。この態様においては、ワクシニアウイルス自体が、天然痘株へのその緊密な抗原上および遺伝子上の関連性のために、好適な抗原の給源を提供する。現在、Ｗｙｅｔｈ株などのワクシニアワクチンは、少数のワクチンにおいて、種痘性湿疹および脳炎を含む副作用を生じさせる可能性がある。天然痘が撲滅された時代においても、ワクチン接種を受けた１００万人に約１２５０人がこれらの副作用に苦しんでおり、１００万人に約１人が死亡している。２才未満の若年の小児が、特に被害を受けやすい。天然痘撲滅計画が再開されれば、集団内における免疫抑制状態にある個体のパーセントがより高いため（例えば、ＡＩＤＳを有する個体または免疫抑制剤を使用している個体）、死亡数は増加すると思われる。さらに、一般人口における湿疹の有病率は、未知の理由により上昇している（Science 296: 1592〜1595、2002、Smith、et al.、Nature Reviews/Immunology 2: 521〜526、2002参照）。これらの理由のため、より安全なワクチンが真に求められており、そしてＷｙｅｔｈおよびＭＶＡなどの株から生成された組換えＩＬ−１５を発現するワクチンは、この要求を少なくとも３つの方法で満たすことができる。第１に、ワクチンにＩＬ−１５発現配列を組み込むことにより、体液性および細胞媒介性免疫応答の両方が増大する。第２に、ヘマグルチニンなどの病原性関連遺伝子の、ＩＬ−１５配列による挿入不活性化は、ウイルスの弱毒化をもたらす。第３に、発現されたＩＬ−１５自体が、ＮＫ細胞の活性化、ならびにインターフェロンガンマおよびケモカインの産生の増強により、病原性の低減を導く。
【００７８】
別の特に好ましい側面においては、ＡＩＤＳなどの慢性疾患に関連する抗原（例えば、GenBank Accession No. U18552）が選択される。ＡＩＤＳの病原因子は、病原性レトロウイルスである、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である（例えば、Barre-Sinossi、et al.、Science 220: 868〜870、1983、Gallo、et al.、Science 224: 500〜503、1984参照）。少なくとも２つの異なるタイプのＨＩＶが存在する。ＨＩＶ−１（上記Barre-Sinossi、et al.、1983、上記Gallo、et al.、1984）およびＨＩＶ−２（Clavel、et al.、Science 223: 343〜346、1986、Guyader、et al.、Nature 326: 662〜669、1987）である。ＨＩＶのタイプは、株、分離株およびクレードにさらに分けることができる。
したがって、好ましくは、本発明による１つの側面においては、抗原は、種々のタイプのＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、株（例えば、ＨＩＶ−１のＢＨ１０およびｐＮＬ４−３株）、分離株、クレード（例えば、Ｍ群のクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）などを包含するＨＩＶを包含する、病原性ウイルスからのものである。
【００７９】
ウイルス抗原は、全長（ｇｐ１６０）、切断体（例えば、ｇｐ１２０およびｇｐ４１）のいずれかのＨＩＶエンベロープタンパク質ＥｎｖなどのＨＩＶエンベロープタンパク質であってもよく、これは挿入、欠失または置換により変更されていてもよい。ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＡＩＤＳ患者に存在する抗ＨＩＶ抗体の主要抗原であることが示されている（例えば、Barin、et al.、Science 228: 1094〜1096、1985参照）。多くのＨＩＶ株からのＨＩＶエンベロープをコードするアミノ酸およびＲＮＡ配列が知られている。Myers、G. et al.、Human Retroviruses and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences、Los Alamos National Laboratory、Los Alamos、N.M.（1992）参照。
１つの好ましい側面においては、エピトープは、ｇｐ１２０ポリペプチドのＶ３領域、Ｖ１−Ｖ２領域、ＣＤ４結合サイト、Ｃ４領域、ＣＣＲ５もしくはＣＣＲ３に関する結合領域などのＣＣＲ結合領域から選択される。Ｖ３ドメインにおける中和エピトープの位置はよく知られている。Ｖ２およびＣ４ドメインにおける中和エピトープが、それぞれ残基１６３と２００との間および約４２０と４４０との間に位置することが見出された。さらに、抗体結合のための残基はまたＶ２ドメインにおける残基１７１、１７４、１７７、１８１、１８３、１８７、１８８、およびＣ４ドメインにおける残基４２９および４３２を包含する。例えば、Berman、et al. Virology 265: 1〜9、1999、およびBerman、AIDS Res. Human Retroviruses 15: 115〜132参照。
【００８０】
別な態様においては、本発明の組換えウイルスにより発現されるＨＩＶ抗原は、グリコシル化部位に欠失および／または変異を含む改変されたＥｎｖタンパク質である。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０は、Ｎ結合グリコシル化のための２４の潜在的部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。２４のグリコシル化部位のうちの約１３は、種々のウイルス分離株において保存されている。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質の分析により、２４の潜在的なグリコシル化部位のうち１７が、炭水化物側差により修飾されていることが示され、そしてしたがって、Ｅｎｖ  ｇｐタンパク質の多大なグリコシル化のために、ｇｐ１２０のペプチド骨格の非常に少ない領域が炭水化物塊から突出しているかも知れない。いくつかのグリコシル化部位は非中和エピトープで見つかっており、これは真の中和エピトープに対する免疫を希釈し、またはデコイ（decoy）エピトープとして機能する。したがって、これらのグリコシル化部位の欠失または変異は、真の中和エピトープのマスキングを取り除くことにより、抗原への免疫を増強し得る。例えば、Mizuochi、et al. J. Biol. Chem. 265: 8519〜8524、1990、およびLeonard et al.、J. Biol. Chem. 265:10373〜10382、1990参照。
【００８１】
他のウイルス抗原は、限定されることなく、ＨＩＶ（ｇｐ１７）などのカプシドタンパク質、またはＴａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、およびＲｅｖなどのＨＩＶ調節タンパク質を包含する、全長野生型、改変、もしくはプロテアーゼ処理産物またはフラグメントを包含する。
他の好ましい抗原源は、ＨＩＶマトリックスタンパク質、またはＧａｇである。Ｇａｇ（ｇｐ２４）は、異なるＨＩＶ株およびサブタイプの中で比較的保存されており、広いクラス交差的な（broad cross-class）抗Ｇａｇ  ＣＴＬ応答が、ＨＩＶ感染患者において証明されている。暴露されたが、血清反応陰性の対象の研究は、Ｇａｇ特異的ＣＴＬが、持続的なＨＩＶ感染の成立に対する保護に関与し得ることを示している。さらに、Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、急性感染期中、ならびに感染の無症候期の間のウイルス量の制御に重要である。多数の別個のＧａｇエピトープが記載されており、細胞毒性活性を示す。さらにまた、感染した未処置の者のｐ２４特異的なＣＴＬ増殖応答のレベルは、Ｇａｇ特異的ＣＴＬレベルと正の相関を有し、血清ＨＩＶ−１ＲＮＡレベルと負の相関を有する。例えば、米国公開出願第20020160430号を参照。
【００８２】
.
他の特徴化されたＨＩＶエピトープは、Los Alamosにより毎年発行されるHIV Molecular Immunology Databaseに含まれている。例えば、HIV Molecular Immunology 2001、Bette T. M. Korber、Christian Brander、Barton F. Haynes、Richard Koup、Carla Kuiken、John P. Moore、Bruce D. Walker、およびDavid I. Watkins編、Los Alamos National Laboratory、Theoretical BiologyおよびBiophysics、Los Alamos、New Mexico. LA-UR 02-4663発行を、http://HIV-web.lanl.gov/content/immunology/maps/maps.htmlにて参照。
【００８３】
１つの側面においては、特定のクレードに適合するＨＩＶ抗原性ペプチドがワクチン抗原を提供する。様々なクレード株の配列が当該技術分野において知られており、これは、クレードＡ（Accession No: HIV-1 92UG037WHO.0108HED）、Ｂ（Accession No: pNL4-3）、Ｃ（Accession No: HIV-1 92BR025WHO.109HED）、Ｄ（Accession No: HIV-1 92UG024.2）、Ｅ（Accession No: HIV-1 93TH976.17）、Ｆ（Accession No: HIV-1 93BR020.17）、およびＧ（Accession No: HIV-1 92RU131.9）を包含する。例えば、以下のペプチドを用いることができる：p17〜SLFNTVATL（クレードＡ）、SLYNTVATL（クレードＢ）、pol A〜ILKDPVHG（クレードＡ）、ILKEPVHGV（クレードＢ）、p24〜DRFFKTLRA（クレードＡ）、DLNNMLNI（クレードＡ）、PPIPVGDIY（クレードＡ）、DLNTMLNTV（クレードＢ）、DRFYKTLRA（クレードＢ）、PPIPVGEIY（クレードＢ）、nef〜YPLTGWCY（クレードＢ）、YPLTFGWCF（クレードＤ）。これらは、アフリカのクレードで特によく見られるエピトープである。例えば、Rowland-Jones、et al. J Clin. Invest. 102（9）: 1758〜65、1998参照。
【００８４】
対応するＳＩＶ配列もまた、本発明の範囲に包含される。
上記で論じたとおり、本発明によるワクチン組成物は、複数の異なるタイプのワクチン抗原を提供し得る。例えば、ＨＩＶワクチンに関して、組成物は、上記の任意のＨＩＶ抗原の少なくとも２種を含むワクチン抗原源を提供し得る。抗原は、異なるＨＩＶポリペプチド、異なる株、異なるクレード、または同じＨＩＶポリペプチドの異なる領域からのものであってもよい。１つの側面においては、ＨＩＶポリペプチドの易変領域を代表するペプチドのパネルが提供される。ペプチドは、当該領域の既知の変異体であってもよく、および／またはランダムに生成した変異体を含んでもよい。
【００８５】
別の側面において、本発明によるワクチン組成物は、少なくとも１つのＨＩＶ抗原源と、ＨＩＶウイルスに対する保護免疫応答を増強する抗原とを提供し得る。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原からのユニバーサルＴ細胞エピトープ含有ペプチド（アミノ酸１９〜３３）が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０に特異的な抗体の産生を増強することが報告されている。例えば、Greenstein、et al.、J Immunol. 148（12）: 3970〜7、1992参照。さらに別な側面においては、少なくとも１つのＨＩＶ抗原源が、Pneumocystis cariiniまたはBartonella henseleaなどのＨＩＶ感染に関連する感染性微生物の抗原源と共に提供される。
１つの好ましい多価の組み合わせは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。別の好ましい多価の組み合わせは、ｇａｇ、ｐｏｌおよび逆転写酵素（ＲＴ）を含む。さらに別の多価の組み合わせは、ｇａｇ、ｔａｔおよびｎｅｆを含む。
【００８６】
本発明の別な側面においては、抗原源は、細菌抗原を含む。抗原の細菌性給源は、限定されることなく、Bacillus tuberculoses、Bacillus anthracis、動物にライム病を起こすスピロヘータBorrelia burgdorferi、およびネコ引っ掻き熱の病原因子であるBartonella henseleaを包含する（例えば、Renesto、et al.、Res Microbiol. 151（10）: 831〜6、2000、Regnery、et al.、Clin. Infect. Dis. 21:94-98、1995参照）。
寄生虫もまた抗原の給源となり、そして、限定されることなくクリプトスポリジウム、アイメリア、ヒストモナス、ロイコチトゾーン、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリパノソーマ、ジアルジア（例えば、GenBank Accession No. M33641）、プラスモジウム（例えば、GenBank Accession No. X53832）、鉤虫、回旋糸状虫症（例えば、GenBank Accession No. M27807）、住血吸虫症（例えば、GenBank Accession No. L08198）、トリパノソーマ症、アメーバ症、フィラリア症（例えば、GenBank Accession No. J03266）、ボレリア症の病原体、バベシア、およびタイレリアを包含する。かかる生物の抗原性ポリペプチドは、外皮タンパク質、病原性寄生虫のタンパク質などを包含する。
【００８７】
好適な微生物性および寄生虫性抗原は、限定されることなく、ジフテリア、百日咳（例えば、GenBank Accession No. M35274）、破傷風（例えば、GenBank Accession No. M64353）、結核、細菌性および真菌性肺炎（例えば、Haemophilus influenzae、Pneumocystis cariniiなど）、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ症（例えば、GenBank Accession No. L03833）、レジオネラ病、およびライム病（例えば、GenBank Accession No. U59487）を包含する疾患の原因となる既知の病原因子に、あるいはＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇなどのＢ型肝炎抗原（例えば、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、もしくはｐｒｅ−Ｓ２）、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６（例えば、Blum、et al.、TIG 5（5）: 154〜158、1989参照）、ＨＢＶ  ｐｏｌ抗原、もしくはＣ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５などのＣ型肝炎抗原に由来すると考えられる。
【００８８】
癌特異抗原もまた、本発明の範囲に包含される。これらは、限定されることなく、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥタンパク質（ＭＡＧＥ１、例えば、GenBank Accession No. M77481、ＭＡＧＥ２、例えば、GenBank Accession No. U03735、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ、チロシナーゼ関連タンパク１および２（ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２）（例えば、Boon et al.、Immunol. Today 16: 334〜336、1998参照）、ＣＤ２０、Ｍｕｃｉｎ１（例えば、GenBank Accession No. J03651）およびＭｕｃｉｎ２、ｐ５３（例えば、Harris、et al.、Mol. Cell. Biol.、6: 4650〜4656、1986参照、そしてGenBankにAccession No. M14694で寄託されている）、変異ｐ５３（例えば、GenBank Accession No. X54156およびAA494311）、ｐ２１／ｒａｓ、ｐ２１０／ｂｃｒ−ａｂｌ融合ポリペプチド、ｃ−ｍｙｃ、ｐ９７メラノーマ抗原（例えば、GenBank Accession No. M12154）、血液抗原Ｔ、ＴｎおよびシアリルＴｎ、ＥＧＦの切断形態、ルイスＹ抗原、扁平上皮癌抗原（例えば、米国特許第5,763,164号に記載の配列参照）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、Osterling、J. Urol. 145: 907〜923、1991、GenBank Accession No. X14810）、上皮膜抗原（Pinkus et al.、Am. J. Clin. Pathol. 85: 269〜277、1986）、ＣＹＦＲＡ２１−１（Lai et al.、199Jpn. J. Clin. Oncol. 29: 421〜421、1999）およびＥｐ−ＣＡＭ（Chaubal et al.、Anticancer Res. 19: 2237〜2242、1999）に由来するエピトープを含むポリペプチドを包含する。エプスタインバーウイルス遺伝子産物はまた、ホジキンリンパ腫ならびにバーキットリンパ腫およびその他のリンパ腫で発現される抗原性ポリペプチドをコードする。ＨＴＬＶ−１ゲノムの産物は成人Ｔ細胞白血病細胞で見出され、一方、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７遺伝子産物は、子宮頸癌細胞において見出された。さらに、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）のゲノム産物はカポジ肉腫で見出された。
【００８９】
移植抗原の例は、Ｔ細胞上のＣＤ３受容体を含む。ＣＤ３受容体に対する抗体による処置は、循環しているＴ細胞を迅速に除去し、そしてほとんどの拒絶エピソードを改善することが示されている。
自己抗原の例は、ＩＡＳ鎖を含む。ＩＡＳ鎖からの１８アミノ酸のペプチドによるマウスのワクチン接種が、実験的な自己免疫性脳脊髄炎に対する保護およびこれの処置をもたらすことが示された。全身性狼瘡を有する患者で見出された自己免疫ポリペプチドもまた、本発明の範囲に包含される（例えば、GenBank Accession No. D28394、Bruggen et al.、Ann. Med Interne 147: 485〜489,1996）。さらなる抗原は、βアミロイド抗原を包含する。
抗原性ペプチドはまた、Ｄｅｒ  ｐ  Ｉアレルゲン（Hoyne、et al.、Immunol. 83: 190〜195,1994）、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）（Akdis、et al.、J. Clin. Invest. 98:1676〜1683、1996）、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １（Bauer、et al.、Clin. Exp. Immunol. 107: 536〜541、1997）、および多エピトープ性組換え草アレルゲンｒＫＢＧ８．３（Cao、et al.、Immunol. 90: 46〜51、1997）などのアレルゲンを包含し得る。
【００９０】
新規な抗原を、当該技術分野でよく知られた方法を用いて同定することもできる。任意の慣用の方法、例えば、サブトラクションライブラリー、正常細胞および腫瘍細胞の比較ノザンおよび／またはウェスタンブロット分析、遺伝子発現の連続分析（米国特許第5,695,937号）およびSPHERE（PCT WO97/35035に記載）を、使用するための推定される抗原を同定するのに用いることができる。
２つの細胞系により発現される核酸配列の示差的スクリーニングは、癌細胞、そしてさらには癌細胞の特定の病期に特異的な抗原をコードする配列を選択するのに用いることができる。非標的細胞が正常細胞である場合は、示差的スクリーニングは、正常細胞に共通する核酸配列を除去または削減し、これにより正常細胞に存在する抗原に向けられた免疫応答が回避される。非標的細胞が正常細胞である場合は、示差的スクリーニングは、正常細胞に共通する配列を除去または削減し、これにより正常細胞に存在する抗原に向けられた免疫応答が回避される。
【００９１】
例えば、Kawakami et al.、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3515〜19に記載されている発現クローニングもまた、新規な腫瘍関連抗原を同定するのに用いることができる。簡潔に述べると、この方法では、腫瘍細胞に由来するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのライブラリーを発現ベクターにクローニングし、そして標的細胞に導入し、その後、細胞傷害性Ｔ細胞と共にインキュベートする。Ｔ細胞応答を刺激することができるｃＤＮＡのプールを同定し、連続希釈法およびｃＤＮＡのより単純なプールの再試験により、Ｔ細胞を刺激することができ、したがって、腫瘍抗原をコードするユニークなｃＤＮＡ配列が同定される。対応するｍＲＮＡの腫瘍特異性は、正常細胞および腫瘍細胞の比較ノザンおよび／またはウェスタンブロット分析により確認することができる。
【００９２】
ＳＡＧＥ分析は、抗原発現細胞に発現されているヌクレオチド配列を同定することにより、ＣＴＬなどの拡大された免疫エフェクター細胞によって認識される抗原の同定に用いることができる。ＳＡＧＥ分析は、抗原発現集団および当該抗原を発現しない細胞からの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を提供することから始める。両方のｃＤＮＡは、プライマーサイトに結合していてもよい。次に配列タグを、例えば、ＤＮＡを増幅するための適切なプライマーを用いて作製する。２つの細胞種の間のこれらのタグのセットにおける差異を測定することにより、抗原発現細胞集団に異常に発現されている配列を同定することができる。
【００９３】
最適なエピトープおよび新規な抗原性ペプチドを同定する別の方法は、固相エピトープ回収（Solid PHase Epitope REcovery）（「ＳＰＨＥＲＥ」）として知られる技法である。この方法は、PCT WO 97/35035に詳細に記載されている。ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬエピトープをスクリーニングするのに用いられているが、この方法は、ＣＴＬよりもむしろ、例えば、抗原特異的ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞系の刺激についてスクリーニングすることにより、クラスＩＩエピトープについてスクリーニングするように改変することができる。ＳＰＨＥＲＥにおいては、ペプチドライブラリーをビーズ上に合成し、ここで各ビーズは制御された方法で放出することができるユニークペプチドを含有する。溶出したペプチドは、任意の所望の複雑性を有するウェルを得るためにプールすることができる。一定の割合のペプチドをビーズから切断した後、これらを、上記のように、クラスＩまたはクラスＩＩ応答を刺激するその能力についてアッセイする。陽性の個々のビーズを次に解読し、反応性のアミノ酸配列を同定する。全ての陽性物の分析により、試験されたＴ細胞応答を刺激する保存的に置換されたエピトープの部分的なプロファイルがもたらされる。ペプチドは、再合成し、そして、応答を確認するために再試験してもよい。また、特定の応答により許容される誘導体の完全な範囲を列挙するために、全ての保存的置換を表示する第２のライブラリー（最小の複雑性のもの）を合成することもできる。多数のＴ細胞系を同時にスクリーニングすることにより、交差反応エピトープの検索を容易にすることができる。
【００９４】
ポリペプチド部分の好適な抗原部分は、関連するエピトープの合成と、当該技術分野における定法を用いた分析により容易に同定することができる（例えば、Manca et al. Eur. J. Immunol. 25:1217〜1223、1995、Sarobe、et al.、J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 635〜40、1994、Shirai、et al.、J. Immunol. 152: 549〜56、1994、Manca、et al.、Int. Immunol. 5: 1109〜1117、1993、Ahlers、et al.、J. Immunol. 150: 5647〜65、1993、Kundu and Merigan、AIDS 6: 643〜9、1992、Lasarte、et al. Cell Immunol. 141: 211〜8、1992、and Hosmalin et al.、J. Immunol. 146: 1667〜73、1991参照）。
【００９５】
単離ペプチドは適切な固相合成手法を用いて合成することができる（Steward and Young、Solid Phase Peptide Synthesis、Freemantle、San Francisco、CA 1968）。好ましい方法は、Merrifield法である（Merrifield、Recent Progress in Hormone Res. 23: 451,1967）。一度単離ペプチドが得られたら、それをクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度（differential solubility）を包含する標準的な方法により、または、タンパク質生成のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。免疫アフィニティークロマトグラフィーについて、１つのエピトープを、そのペプチドまたは関連ペプチドに対して作製され、かつ固定された支持体に付加された抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより単離することができる。あるいは、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ（Invitrogen）、マルトース結合ドメイン（New England Biolabs）、インフルエンザ外被配列（Kolodziej、et al.、Methods Enzymol. 194: 508〜509、1991）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをペプチドに付着させ、適切なアフィニティカラム上を通過させることにより、簡単な精製を可能にすることができる。
【００９６】
単離ペプチドはまた、タンパク質分解、各磁気共鳴、およびＸ線結晶学などの技術を用いて物理的に特徴化することができる。抗原ミミトープ（mimitope）を、コンホメーション依存性の中和抗体に結合するそれらの能力を決定することにより、コンホメーション依存性の抗原性エピトープを模倣するものについて選択することができる。
抗原性ドメインとして用いるための所望の抗原タンパク質の最も適切な部分の選択は、機能的スクリーニングにより行うことができる。具体的なスクリーニング手法は、抗原のタイプおよびその抗原活性についてのアッセイに依存する。抗原性は、抗原特異的な、ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩまたはＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩＩ特異的Ｔ細胞系またはクローンの刺激により測定することができる。あるいは、抗原性は、in vivoにおいて、抗体、または抗原に特異的なＴ細胞を生成する能力の測定により決定することができる。
【００９７】
１つの側面において、特定のＨＬＡハプロタイプにより認識されるエピトープが同定される。例えば、ＨＩＶ感染ドナーから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を得、および拡大培養物と、ＰＨＡ刺激自己リンパ芽球による約１週間の再刺激により得る。ＣＴＬは、好適な培養培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０（Gibco Life Technologies、Glasgow、Scotland）、１０％ＦＣＳ（Gibco Life Technologies）、抗生剤、および１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ  Ｔ（Biotest、Solihull、England）（ＩＬ−２）などで、もう１週間培養する。
【００９８】
標準的な５１クロム放出アッセイは、５１クロム（Amersham、Buckinghamshire、England）で標識し、ＨＬＡ分子または対照ペプチド（例えば、インフルエンザ抗原など）に結合することが予想されるエピトープペプチドのプールにより、マイクロタイタープレートの多数の異なるウェル内で約５０μＭでパルスしたＨＬＡ適合性または非適合性の標的Ｂリンパ芽球様細胞を用いて行う。ＨＬＡ分子と反応し、ＣＴＬ応答を刺激する、プールからの個別のペプチドを次に試験し、特異的に反応するペプチドエピトープを同定する。クロムをシンチレーションカウンター（例えば、Wallac、Gaithersburg、MDで入手可能なもの）で計数し、パーセント溶解を式１００×（Ｅ−Ｍ／Ｔ−Ｍ）、式中Ｅはクロムの実験的放出、Ｍは界面活性剤を含まない培地の存在下における放出（すなわち、放出は、ＣＴＬ応答のために起こる）、そしてＴは５％Triton X-100界面活性剤の存在下における放出である。結果は、ＨＩＶペプチドの認識が、少なくとも２つの別個のアッセイにおいて対照ペプチドの＞１０％上である場合に陽性とみなされる。
【００９９】
免疫原性部分はまた、動物モデルにおいて選択または確認することができる。例えば、ＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞による認識のためのモデルとして有用であることが示されている。インフルエンザおよびＢ型肝炎ウイルス系の両方において、マウスＴ細胞受容体のレパートリーは、ヒトＴ細胞により認識されるのと同じ抗原決定基を認識する。両方の系において、ＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスで生じるＣＴＬ応答は、ＨＬＡ  Ａ２．１ハプロタイプのヒトＣＴＬにより認識されるのと実質的に同じエピトープに向けられている（Vitiello et al.、J. Exp. Med. 173: 1007〜1015、1991、Vitiello et al.、Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia、1992）。特に、マウスにおけるＣＴＬの誘導は、ヒトにおける細胞性免疫原性を予想するのに用いることができる（Warner et al.、AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645〜655、1991参照）。
【０１００】
代替的に、または追加的に、ポリペプチドの免疫原性領域は、生物の様々な病原性株もしくは病気（例えば、自己免疫疾患など）に関連するポリペプチドの間で保存されている領域を同定するための、および／または特定のＭＨＣハプロタイプに結合する領域を同定するためのコンピュータプログラム（例えば、Falk、et al.、Nature 351: 290、1991参照）を用いて同定することができる。多数のソフトウェアプログラムが当該技術分野において知られている。例えば、Ｐｅｐｔｇｅｎは、重複するペプチドのマップを生成する。Ｍｏｔｉｆｓｃａｎは、ＨＬＡ結合モチーフに基づいて、ポリペプチド配列を可能なエピトープについてスキャンし、一方ＥＬＦ（エピトープ位置発見ツール）は、潜在的なＣＴＬエピトープを同定するのに用いることができる。この分析から、ペプチドは適切なin vitroまたはin vivoアッセイにおいて確認することができる。
所望のエピトープのペプチド配列を単離および同定したならば、これらのエピトープをコードする配列を含む核酸を容易にシーケンシングすることができる。
【０１０１】
発現構築物（すなわち、免疫原性部分または抗原コード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む核酸分子）に組み込まれる免疫原性部分は、様々な長さであってもよいが、一般的には、核酸が、少なくとも約８〜３０アミノ酸長、より好ましくは８〜２４アミノ酸長の部分をコードするのが好ましい。上記で論じたとおり、いくつかの場合には、任意にリンカー配列で分離された、または適切なＭＨＣ／ＨＬＡ分子による認識を容易にする補助配列に連結された、抗原の繰り返し単位を提供するのが好ましい。
【０１０２】
抗原コードベクター構築物
抗原性物質は、ＩＬ−１５コードウイルスベクターと同時に、または当該ベクターの投与の直前または後に、宿主に投与することができる。
単離されたポリペプチドワクチンが宿主に注射された場合、抗原は、宿主細胞の外部から提示され、そして、ポリペプチドが適切にプロセシングされず、かつ早いクリアランスを受けやすいため、しばしば、強い、持続性の免疫応答を生じない。したがって、好ましくは、抗原性物質は、抗原をコードする核酸を投与することにより提供される。
【０１０３】
プロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物は、線形のフラグメントまたは環状分子として、組換えＩＬ−１５ベクターと共に投与することができる。構築物は、ベクターの増幅のための少なくとも１つのタイプの宿主細胞（例えば、大腸菌など）において複製するための少なくとも１つの複製起点をさらに含むことができる。抗原をコードする発現構築物は、宿主生物に、裸のＤＮＡとして、または発現構築物の細胞内への侵入を促進するための１種または２種以上の分子を伴う送達ビヒクル中にて投与することができる。好適な分子は、限定されることなく、リポソーム、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、カチオン分子、ウイルス粒子などを包含する。
抗原をコードする発現ユニットもまた、ウイルスベクターの形態で提供することができ、そして、ベクターは、組換えＩＬ−１５発現ベクターと同じであっても、または異なっていてもよい。１つの側面においては、ベクターは、ワクシニアウイルスベクターなどのポックスウイルスベクターである。別の側面においては、抗原をコードする発現ユニットは、ＩＬ−１５をコードするウイルスベクターと同じものの一部である。１つの側面においては、抗原およびＩＬ−１５のいずれの発現も、個々のポックスウイルスプロモーターの制御下にある。
【０１０４】
ＩＬ−１５および抗原の発現の時間的な経過は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、ＩＬ−１５コード配列および抗原コード配列は、両方とも、早期、中期、または後期プロモーターの制御下にあってもよい。しかしながら、別の側面においては、配列は、ＩＬ−１５および抗原が異なる時間的発現パターンを示すように、例えば、ＩＬ−１５が最初に発現されるか、または抗原が最初に発現されるように、プロモーターの制御下にある。好ましくは、抗原をコードする配列は、ウイルスの複製サイクルの全期間におけるその発現を確保するために、早期／後期ハイブリッドプロモーターｐ７．５などの強力なプロモーターの制御下にある。さらに別の側面においては、ＩＬ−１５をコードする核酸配列およびワクチン抗原をコードする核酸は、単一のポリシストロン性ｍＲＮＡ上に協調的に（すなわち、ベクター中に１または２以上のＩＲＥＳ配列を含めることにより）発現される。例えば、EP 0 803 573に記載されているものを参照。
【０１０５】
免疫応答の増強および／または誘導
脊椎動物は、抗原に対して免疫応答を惹起するために、２つの基本的な戦略を利用している。体液性免疫は、抗体による抗原の直接的な認識を伴うものである。細胞性免疫は、異種抗原を産生する他の細胞を認識し、殺滅する特別な細胞に依存する。体液性免疫は、主に外因性（例えば、細胞外）の抗原に向けられるのに対し、細胞性システムは、一般的に細胞内抗原への応答をもたらす。
体液性システムはワクチン接種された個体を、その後の病原体からのチャレンジから保護し、そして病原体がその生活環の中で細胞外相を経由する場合は、細胞内感染の拡大を防ぐことができるが、細胞内病原体を除去することに関しては、比較的わずかなことしかできない。細胞傷害性免疫は、感染細胞を除去することにより、体液性システムを補完している。
【０１０６】
ウイルス感染の自然の過程においては、ウイルス感染細胞は、その表面に、ＭＨＣ−ＩまたはＨＬＡクラスＩ受容体のコンテキストにおけるウイルス抗原を表示する一方、ウイルス粒子は、プロフェッショナル抗原提示細胞により消化され、該細胞は抗原をＭＨＣ−ＩＩまたはＨＬＡクラスＩＩ受容体と会合した状態で表示する。体液性および細胞性応答の両方が、新たな感染を防ぐのに必要である。細胞傷害性Ｔ細胞（ＭＨＣ  Ｉ／ＨＬＡ−Ｉ分子のコンテキストで提示された抗原を認識する）および抗体が、細胞外病原体を除去するために必要である一方、メモリー細胞（すなわち、ＭＨＣ  ＩＩのコンテキストで提示された抗原を認識するＣＤ４＋細胞）は、再感染を防ぐために必要である。しかしながら、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）はまた、抗原への最初の暴露の後、長期間続くＣＴＬ応答をもたらすメモリーＴ細胞の給源を提供することができる。したがって、有効なワクチン接種は、これら全てのタイプの免疫応答を活性化すべきである。
【０１０７】
本発明によるワクチン組成物は、１または２以上の免疫応答を誘導および／または増強するのに用いる。かかる免疫応答は、一般的に、選択された抗原に特異的な抗体の産生、および抗原特異的Ｔ細胞（例えば、ヘルパー細胞、サプレッサー細胞、および／または細胞傷害性細胞）の産生、の１または２以上を伴う。好ましくは、免疫応答は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびワクチン抗原特異的抗体の産生をもたらすメモリー応答を含む。
好ましくは、本発明による組成物は、持続的でポリクローナルな交差反応性のＣＴＬ応答を誘導する。１つの側面において本発明による組成物でワクチン接種された個体は、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析で測定した場合に約１：２０００〜１：５０，０００となる、ワクチン抗原に対するＣＴＬの循環頻度を、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１４ヶ月、少なくとも約１６ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２０ヶ月、少なくとも約２２ヶ月、および少なくとも約２４ヶ月まで有する。Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を実行するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Vogel、J. Clin. Invest. 102: 1758〜1765に記載されている。
【０１０８】
このアッセイは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのペプチド特異的ＣＴＬ媒介性のＩＦＮ−γの放出を検出する。１つの側面において、アッセイを実行するために、９６穴のニトロセルロースプレートをＩＦＮ−γに対する抗体（例えば、Mabtech、Stockholm、Swedenから入手可能）で被覆し、そしてＰＢＭＣをウェルに種々の濃度（例えば、２×１０５、１０５および５×１０４）で、好ましくはデュプリケートで設置する。好適な自己標的細胞をペプチドなし、または特定のドナーのクラスＩ  ＨＬＡタイプにしたがって選択されたペプチドパネルの１つで、終濃度１０μＭにてパルスし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で約１６時間インキュベートし、ＰＢＭＣによりＩＦＮ−γを放出させ、抗体結合をモニタリングすることにより検出する。結合は、検出器とコンジュゲート抗体と、その後の色原体を用いて、当該技術分野でよく知られているように色の変化を検出することにより、視覚化できる。アッセイは、ペプチドでパルスされた標的細胞の約１０％よりも大きな特異的溶解が、少なくとも２つの別個の実験における２つの異なるエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で得られた場合に陽性とみなす。対照アッセイは、同一の条件下で、同じクラスＩ対立遺伝子を有する非感染患者からの細胞を用いて行う。
【０１０９】
１つの側面において、本発明による組成物は、中和抗体の産生を惹起するものを同定するためにスクリーニングされる。中和抗体の存在は、ウイルス試料と抗体試料（例えば、ワクチン接種した患者の血清から得たもの）とを事前に混合し、ＰＢＭＣまたは細胞系に接種し、好適な期間（例えば、約２週間まで）培養し、ウイルスの複製を測定するか（例えば、ｐ２４または逆転写酵素アッセイを介して）、細胞における細胞変性効果の欠如を検出することによって（例えば、トリパンブルーにより、または合胞体形成をモニタリングすることによる）検出することができる。感染性または細胞死の減少は、抗体試料がウイルスを中和することが可能であることを示す。感染性の減少は、ｐ２４または逆転写酵素レベルの抗体に暴露されていない対照に比較した減少により反映され、一方細胞死の減少は、有意に少ない細胞死および／または合胞体によって示される。
【０１１０】
ＰＣＲアッセイもまた、中和抗体の存在を検出するのに用いることができる。１つの側面においては、抗体およびウイルス試料を細胞と混合する。好適なインキュベーション期間の後、（例えば、２〜５時間）、細胞を回収し、ＰＣＲを実行し、ウイルス配列（ＬＴＲまたはｇａｇ配列など）を検出する。増幅された産物の、抗体を欠いた対照に比較した減少は、中和（すなわち、より少ない感染イベント）の証拠である。抗体およびウイルス試料を混合し、細胞に適用する。数時間後、細胞を回収し、ＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実行してＬＴＲまたはｇａｇ領域ＤＮＡを検出する。ＰＣＲ産物を定量し、抗体を欠く対照と比較する。中和は、より少ない感染イベントと相関するＰＣＲシグナルの減少として定義する。
さらに別の側面においては、ウイルスの感染性を測定するためにＭＡＧＩアッセイを行う。このアッセイにおいては、Ｔａｔにより活性化される切断ＨＩＶ−１  ＬＴＲに作動可能に連結された、ＣＤ４と、核に局在するように修飾されたβガラクトシダーゼ遺伝子とにより安定にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞が用いられる。したがって、βガラクトシダーゼの発現は、Ｔａｔのレベルに依存しており、Ｔａｔは、今度は、ウイルスの存在に依存している。Ｈｅｌａ細胞は青染し、そして集団内の青色細胞の数は、接種物中の感染性粒子の数に比例する。
【０１１１】
ワクチン組成物の有効性はまた、選択された抗原のレベルおよび／または抗原と特異的に交差反応する抗体の血清中における存在をモニターすることにより評価することができる。例えば、ＨＩＶワクチンの有効性は、選択した時間間隔で、ウイルス力価を、例えば、ＨＩＶに特異的な抗体を用いた免疫アッセイを行うことなどによって測定することによりモニターすることができる。また、高感度の核酸ベースの試験を、例えば、EP 617,132、WO 94/20640、WO 92/02526および米国特許第5,451,503号および第4,775,619号に記載されているように利用することができる。ウイルス量は、患者からの血漿、細胞または組織におけるＨＩＶ  ＲＮＡの量を測定することによりモニターすることができる。患者のその後のモニタリングは、ワクチン接種療法の投与後の定期的な診断試験を含んでもよい。
ワクチンは、以下の例１〜３にさらに記載のとおり、最初に非ヒト哺乳類（例えば、マウスまたは霊長類）において試験してもよい。例えば、接種マウスの免疫応答のアッセイは、より多くの抗体産生、Ｔ細胞増殖および本発明によるワクチン組成物に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を証明するのに用いることができる。ワクチンは、マウスにおいて高度に有効であるワクチン製剤がサルにおける適切な免疫応答をも惹起するか否かを決定するために、アカゲザルにおいて評価することができる。
【０１１２】
投与量および投与経路
本発明はさらに、組換えＩＬ−１５を発現するポックスウイルスベクターと、少なくとも１つの抗原源（すなわち、ワクチン抗原）とを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、抗原源は、発現制御配列に作動可能に連結した少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物である。また、好ましくは、組成物は、医薬的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤担体を含む。さらに、ワクチンは、ワクチンの活性および／または保存期間を増大させるための水性媒体または水含有懸濁液を含んでもよい。媒体／懸濁液は塩、グルコース、ｐＨバッファー、安定剤、乳化剤および保存剤を含んでもよい。
ＩＬ−１５に加えて、他のアジュバントを含めることができ、これは、例えば、限定されることなく、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオン、両親媒性物質、バチルスカルメットゲラン（ＢＣＧ）、リポ多糖類エンドトキシン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＧＫＬＨ）、およびサイトキサンを包含する。しかしながら、本発明において見出されたことは、ＩＬ−１５が他のアジュバントの使用を要さずに長期の免疫応答を増強することができるということである。
【０１１３】
本発明はまた、ＩＬ−１５をコードする組換えポックスウイルスと、抗原をコードする核酸とを含むキットを包含する。組換えポックスウイルスは、凍結乾燥形態で提供することができ、これは、例えば、等張で水性の生理食塩水バッファー中で再構成される。キットは、好適な担体、希釈剤または賦形剤を含有する分離した容器を含んでもよい。キットはまた、追加の治療剤、例えば、抗癌剤、ウイルス感染の症状を改善するための剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤、シメチジン（Smith/Kline、Pa.）、低用量シクロフォスファミド（Johnson/ Mead、N.J.）など）、および免疫補助機能を提供するタンパク質（Ｂ−７など）をコードする遺伝子などを含んでもよい。１つの側面において、キットは、代替的にまたは追加的に抗原提示細胞を含む。さらに、キットは、成分を混合または組み合わせるための、および／またはキットの構成要素を投与するための説明書を含んでもよい。
【０１１４】
１つの側面において、本発明は、本発明による治療的に有効なワクチン組成物を投与する方法を提供する。所望の治療効果は、ウイルス量を低減またはなくすこと、ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞またはワクチン抗原を認識する抗体の数を増加させること、ＣＤ４＋Ｔ細胞の全体レベルを増加させること、抗原を認識する中和抗体のレベルを増加させること、疾患の症状の数または重篤度を低減すること、癌特異マーカーの発現を低減すること、腫瘍の大きさまたは増殖速度を低減すること、腫瘍の転移を防止すること、病原性生物による感染を防止することなどの、１または２以上を含む。治療効果は、生物学的マーカーおよび／または異常な生理学的応答を評価することにより、モニターすることができる。一般的に、本発明による組成物の有効な用量は、ワクチン抗原に対する免疫応答を、例えばワクチン抗原に特異的なメモリーＴ細胞が生成されるように調節することができるウイルス力価を含む。
【０１１５】
用量および投与手段の両方を、患者の条件（例えば、年齢、体重、一般的な健康状態）、疾患を発症するリスク、または疾患の進行の状態に基づいて決定することができる。好ましい投与経路は、送達ワクチンベクターがポックスウイルスである場合は、皮内スカリフィケーションによるものである。
１つの側面において、組換えウイルスの有効量は、好ましくは、約１×１０１０〜１×１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス／ｍｌの濃度を含む生理食塩水約１０μｌ〜約２５μｌの範囲である。
【０１１６】
本発明の好ましい側面においては、プライミング免疫を行い、その後、任意に、ブースター免疫を、プライミング免疫の約３〜４週間後に行う。しかしながら、プライミング免疫後、少なくとも約４ヶ月、約６ヶ月、約８ヶ月、約１２ヶ月、約１０ヶ月、約１６ヶ月、約１８ヶ月、または約２４ヶ月までは、次の免疫を提供する必要はない。１つの側面においては、ワクチンはワクチン抗原に暴露したことがない患者、例えば、ＨＩＶ陰性の患者に投与される予防ワクチンである。別の側面において、ワクチンは、ワクチン抗原について血清反応陽性である者に（必ずしも症状を示さなくてもよい）（すなわち、例えば、ＨＩＶ陽性個体などに）、治療的に投与される。さらなる側面においては、ワクチンは免疫不全個体に投与される。この側面においては、ワクチンは、好ましくはＭＶＡまたはＡＶＩＰＯＸなどの複製欠損ウイルスに由来する。
【０１１７】
例
これから、本発明を以下の例を参照してさらに例証する。当然のことながら、以下は単なる例示を目的とするものであり、依然として本発明の範囲に含まれる細部の変更はなされてもよい。
【０１１８】
例１  二重組換えＨＩＶ ｇｐ１６０/ＩＬ−１５は、細胞性免疫応答の規模と持続時間を増大させる
免疫刺激性サイトカインとのＨＩＶ抗原との共送達がより強靱な免疫応答をもたらすことを示すために、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０をヒトＩＬ−２またはヒトＩＬ−１５とタンデムで発現する２種の組換えワクシニアウイルスを作製した。American Type Culture Collectionから商業的に入手可能なＷＲワクシニア株（ATCC No. VR-119）の組換えのために、ヒトＩＬ−１５遺伝子のコード領域をトランスファーベクターｐＳＣ１１にクローニングした。
ヒトＩＬ−１５を発現する組換えワクシニアを作出するために、開始コドンＡＴＧ上流の３個のヌクレオチド、および、終止コドンＴＧＡと、終止コドン下流の４個のヌクレオチドとを含むＩＬ−１５の全コード領域を含むＩＬ−１５のコード領域を用いた。ＩＬ−１５配列を得たプラスミドは、Burton、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4935〜4939に記載されている。
【０１１９】
ヒトＩＬ−２を発現する組換えワクシニアを作出するために、ヒトＩＬ−２遺伝子のコード領域を、ＡＴＣＣカタログ番号３９６７３から得たｐＴＣＧＦ−１１プラスミドから、コード配列に加えて、開始コドンＡＴＧ上流の１７個のヌクレオチド、および、終止コドンと終止コドン下流の２５０個のヌクレオチドとを含むＩＬ−２の全コード領域を含む０．８ｋｂのＰｓｔ−１フラグメントとして得た。
ｐＳＣ１１トランスファーベクター（例えば、Toth、et al.、Vet. Microbiol. 45（2-3）: 171〜83、1995参照）を、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を、ワクシニアゲノムのチミジンキナーゼ（「ｔｋ」）遺伝子座へ組み込むために用いた。サイトカインのみを担持する組換え体（例えば、ＩＬ−１５ワクシニアまたはＩＬ−２ワクシニア）においては、それぞれのサイトカインは、ｔｋ遺伝子座に、ウイルスｔｋ遺伝子の挿入不活性化を伴って組み込まれた。
【０１２０】
原型のｐＶＯＴＥ１ベクターは、Ward、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6773に記載されている。ｐＶＯＴＥ１を改変するにあたり、Ａｐａ−ＩサイトとＳｍａ−Ｉサイトとの間のＤＮＡ配列を除去し、早期／後期ワクシニアプロモーター:5’-CACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGTGACGGATCCC-3’に置換した。その後、この改変プラスミドを、ワクシニアゲノムのヘマグルチニン遺伝子座へＩＬ−２またはＩＬ−１５を組み込むために用いた。ＨＩＶ ｇｐ１６０と、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかとを、両方とも発現する二重組換え体においては、ｇｐ１６０を含むＨＩＶワクシニアウイルスベクターをEarl、et al.、J. Virol. 65: 31〜41、1991に記載のとおりにｔｋ遺伝子座に組み込み、そして、ヒトＩＬ−２またはＩＬ−１５コード配列のいずれかを組み込むために、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかを含む改変ｐＶＯＴＥトランスファーベクターをヘマグルチニン遺伝子座に挿入した。
【０１２１】
１４ヶ月の期間にわたってウイルス組換え体を接種されたマウスの免疫応答は、ＣＴＬ活性に関して、その規模および持続時間の両方において著しく異なっていた。近交系Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスは、１００μｌの容積中の６×１０６ｐｆｕにより皮下に（尾根部に）免疫した。３〜４週間後、動物を、最初の免疫と同じ用量のそれぞれのウイルスでブーストした。
図１および２に示したデータは、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ペプチドでパルスした標的細胞に対して細胞溶解活性を示すＣＤ８＋細胞を表したものである。各群の動物からの脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞をin vitroで１．０ｎＭの免疫優勢ＨＩＶ ｇｐ１２０Ｖ３ループペプチドＰ１８−Ｉ１０で７日間刺激した。これらのin vitroで刺激した細胞を、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、同種のペプチドでパルスした標的細胞、Ｐ８１５線維芽細胞（Ｈ−２Ｄｄハプロタイプ）を溶解するエフェクター細胞として用いた。早期応答はＩＬ−２群がより優勢であったが、後期においては、ＩＬ−１５群がより強靱な応答を示した。
【０１２２】
図から分かるとおり、組換えＩＬ−１５ベクターを受けたマウスにおける抗原特異的ＣＴＬ応答は、組換えＩＬ−２を受けたマウスにおいて観察されたＣＴＬ応答よりもはるかに長く、例えば、最初の注射後少なくとも１４ヶ月間持続した。
抗原特異的ＣＤ８＋の存在は、標識Ｈ２Ｄｄ−ｐ１８−Ｉ１０テトラマーを用いて、Klenerman、et al.、Nature Reviews/Immunology 2: 263〜272、2002に記載のアッセイにより定量した。図３に示すとおり、免疫優勢ｇｐ１２０について陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、テトラマー染色により決定したところでは、両群のマウスに存在した。組換えＩＬ−１５を受けたマウスは、組換えＩＬ−２を受けたマウスのおよそ４倍多いｇｐ１２０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでいた。
【０１２３】
図４に示すとおり、１４ヶ月の時点で、免疫優勢ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ペプチドへの暴露に際してγ−インターフェロンを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち、メモリーＣＤ８＋細胞）が、ｇｐ１６０とともにＩＬ−１５を発現するワクシニアによりワクチン接種されたマウスにおいて、ｇｐ１６０とともにＩＬ−２を発現するワクシニアによりワクチン接種されたマウスに比べてはるかに高いレベル（約４倍）で存在しており、これは、メモリーＣＤ８＋細胞の長期の増強を示すものである。
したがって、用いたすべての試験において、ＨＩＶ ｇｐ１６０/ＩＬ−２製剤を受けたマウス群は、初期にｇｐ１２０特異的ＣＴＬ活性をもたらすことにより活発に応答する一方、このＣＴＬ応答の持続時間および規模は、比較的短命であった。この群におけるＣＴＬ活性のレベルは、ワクチン接種後約１２０日までに、ワクチン接種していない対照群のベースラインレベルに低下した。これに対し、ｇｐ１６０/ＩＬ−１５製剤を受けたマウス群は、高レベルのｇｐ１２０特異的ＣＴＬ活性を、ワクチン接種後１４ヶ月を超えて維持した（図１と図２を比較されたい）。
【０１２４】
例２  二重組換え抗原/ＩＬ−１５構築物は、体液性免疫応答を増強する
ワクチン接種した動物の血清中のＨＩＶ ｇｐ１２０に特異的な抗体のレベルを当該技術分野における定法を用いたＥＬＩＳＡにより評価した。ＨＩＶ ｇｐ１６０のみを発現するワクシニアによりワクチン接種したマウスにおけるｇｐ１２０特異抗体のレベルは、ワクチン接種後８ヶ月において検出不能であった（すなわち、ワクチン接種していない動物と違いはなかった）。しかしながら、ＨＩＶ ｇｐ１６０をＩＬ−１５とタンデムに発現する二重組換えワクシニアによりワクチン接種したマウスは、高レベルのｇｐ１２０特異抗体を、この遅い時点においてさえ表示していた（図５参照）。
【０１２５】
例３  組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチンベクター
Ye、et al.、Mol. Cell. Biol. 16: 6178〜6189、1996に記載されたヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕをコードする配列を含むプラスミドを用いて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのコード領域を得、これを次にｐＳＣ１１にクローニングし、そしてワクシニアのＷＲ株のｔｋ遺伝子座に組み込み、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕワクシニアウイルスベクターを作製した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ／ＩＬ−１５二重組換え体は、ＩＬ−１５を、組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕワクシニアベクターのヘマグルチニン遺伝子座に、ＩＬ−１５を含む改変ｐＶＯＴＥベクターを用いて組み込むことにより作製した。
組換え体は、ＷＲ株（ATCC# VR-119）、Ｗｙｅｔｈ株（ATCC# VR-1536）およびＭＶＡ株（ATCC-VR1508）のバックボーンにおいて作出し、動物は、上記の例に記載されているとおりにワクチン接種した。
【０１２６】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子をＩＬ−１５とタンデムで発現する組換えワクシニアでワクチン接種した動物はまた、肺癌のマウスモデルにおいて、増強された細胞性および体液性応答を示した。このモデルでの、哺乳類組織におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子の特異的な過剰発現は、トランスジェニック動物の乳腺における自然発生的な腫瘍形成を導く（例えば、Guy、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10578〜10582、1992参照）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子をＩＬ−１５とタンデムで発現する組換えワクシニアウイルスでワクチン接種した動物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のみを発現する組換えワクシニアウイルスでワクチン接種した動物よりも低減した全身腫瘍組織量（図６および７参照）、およびより高レベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異抗体（図８参照）を示した。
【０１２７】
したがって、ＩＬ−１５をワクチンウイルスベースのワクチン製剤に組み込むことにより、ワクチン抗原に対して、それがウイルス抗原であるかまたは癌特異抗原であるかにかかわらず、細胞媒介性免疫ならびに抗体媒介性の体液性免疫の両方が増大する。感染性疾患または癌のいずれかのためのワクシニアベースのワクチンを開発するにあたり、所望の応答が、ワクチン接種を受けた対象において長期の細胞媒介性応答および抗体媒介性体液性応答を達成することである場合、例えば、ＨＩＶまたは天然痘のケースのような場合には、ＩＬ−１５を組み込むことによってよりすぐれたワクチンがもたらされる。また、要求される応答が確実な抗体応答である狂犬病ワクチンなどのサブユニットワクチンの場合においても、ＩＬ−１５を組み込むことは有益であり得る。狂犬病感染の暴露後において示されているように、抗狂犬病抗体の投与は、狂犬病の発症を有効に防ぐことができる。例えば、Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices、MMWR 1999 48（No RR-1）: 1〜21（http://www.cdc.gov/mmwrで入手可能）を参照。このことは、十分に有効な抗体レベルのみで、細胞媒介性免疫応答の一切の関与なしに、狂犬病などのワクチン抗原に対する保護を提供することができることを示すものである。
【０１２８】
例４  非ヒト霊長類における免疫応答の増強
上記の例は、ワクチンウイルスベースのベクターに免疫刺激性サイトカインを組み込むことにより、ワクチン接種対象における免疫応答を有意に増強することができるという概念を強化するものである。非ヒト霊長類における、ワクチン抗原に対する長期の保護免疫応答の生成を証明するために、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をＳＩＶ  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子と共に担持する、ＭＶＡ（改変ウイルスＡｎｋａｒａ）組換え８９．６ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｏｌウイルス（Amara、et al.、Science 292: 6974、2001参照）を用いて、相同組換えおよびＩＬ−１５配列を含むｐＶＯＴＥ改変ベクターのヘマグルチニン遺伝子座への挿入により、ＩＬ−１５を発現する二重組換え体を作出した。多価ＭＶＡベクターの構築は、上記Amara、et al.、Science、2001に一般的に記載されている。比較の目的で、同じ抗原をＩＬ−２と一緒に発現する二重組換え株（ヘマグルチニン遺伝子座への組み込みにｐＶＯＴＥ改変ベクターを使用）もまた作出した。
【０１２９】
２３頭の幼若アカゲザル（Macaca mulatta）のコホートを、上記に記載のとおりに作出した二重組換えＭＶＡウイルスを対象とした免疫化研究に用いる。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ対立遺伝子Ｍａｍｕ−Ａ＊０１を発現する動物を用いるか、または、代替的に、この対立遺伝子を発現するものを同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を用いて動物をタイピングする。プライマーA*01/R（5’-GAC AGC GAC GCC GCG AGC CAA-3’）およびA*01/R（5’-GCT GCA GCG TCT CCT TCC CC-3’）を、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１を有するサルを同定するのに用いる。
現在、テトラマー技術が、特定の抗原に特異的なＣＤ８＋細胞を定量的に評価することにおいて信頼できる技術であることは受け入れられている。アカゲザルにおいて最も信頼性が高く、かつ最も良く研究されているＳＩＶ  ｍａｃ  ｇａｇポリペプチドのためのＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ａ相同分子Ｍａｍｕ−Ａ＊０１によって拘束されている。したがって、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１ハプロタイプを有するサルを得ることにより、テトラマーＭａｍｕ−Ａ＊０１／ＳＩＶ  ｇａｇエピトープを用いて、ワクチン接種した動物においてＣＤ８＋Ｔ細胞応答を正確に定量することが可能となる。例えば、Juroda、et al.、J. Exp. Med. 187: 1373〜1381、1998参照。
【０１３０】
動物を５群に分け、以下のプロトコルに従って、１０９ｐｆｕの組換えＭＶワクシニアウイルスを皮内にワクチン接種する：
ｉ）５頭の動物は、ＳＨＩＶ抗原を発現するＭＶＡワクシニアを受ける；
ｉｉ）５頭の動物は、ＳＨＩＶ抗原をＩＬ−２と共に発現する、二重組換えＭＶＡワクシニアを受ける；
ｉｉｉ）５頭の動物は、ＳＨＩＶ抗原をＩＬ−１５と共に発現する、二重組換えＭＶＡワクシニアを受ける；
ｉｖ）４頭の動物は非ワクチン接種対照として残されるが、病原性ＳＨＩＶ８９．６Ｐウイルスを、ワクチン接種動物をこのウイルスでチャレンジする時に、感染させる；そして
ｖ）４頭の動物は実験の間中ワクチン接種および感染を受けないままであり、健常対照とする。
【０１３１】
最初のワクチン接種に引き続き、動物は、４週間間隔で２回、それぞれのウイルスでブーストし、その免疫学的パラメータを最後のブースター接種後８ヶ月間モニターする。各個の動物から４週ごとに血液を採取し、細胞性および体液性免疫応答をモニターするために次のアッセイを行う。動物を一度チャレンジしたら、免疫学的パラメーターの毎月の評価を、感染動物において、実験の終了または罹患動物の安楽死まで継続する。
【０１３２】
血清は、最初に、スクリーニング試験として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、オリゴマーＨＩＶエンベロープｇｐ１４０への抗体について試験する。Chen、et al.、Nature Medicine 7: 1225〜1231、2001に記載されているものを参照。各動物から連続的に採取した血清試料からの選択した血清検体のウイルス中和アッセイを行い、ＳＨＩＶ  ８９．６ウイルスに感染したＭＴ−２細胞を用いて、Rose、et al.、Cell 106: 539〜549、2001に記載されたアッセイにより、中和抗体の力価を決定する。抗体の力価は、体液性応答の規模および持続時間に対するＩＬ−２およびＩＬ−１５の効果を確かめるために測定する。しかしながら、ＳＨＩＶ８９．６ウイルスに対する中和抗体は、チャレンジウイルスＳＨＩＶ８９．６Ｐの抑制に影響しないようであるが、これはこれらの抗体が交差中和性ではないからである。
【０１３３】
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１組織適合型を発現する動物については、ドミナントＧａｇ−ＣＭ９エピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１テトラマーを用いて決定する。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１型以外の動物については、Ｇａｇポリペプチド全体中のエピトープを認識するＴ細胞の頻度を、重複ペプチドのプールを用いて決定する。例えば、上記Amara、et al.、2001に記載のものを参照。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を重複ｇａｇペプチドのプールでパルスした後、細胞内γ−インターフェロンの発現および表面ＣＤ４またはＣＤ８の発現のための二重標識を行う。好適なモノクローナル抗体は、例えば、Biosource International、Camarillo、CAから商業的に入手可能である。アッセイの方法は、Rose、et al.、Cell 106: 539〜549、2001に記載されている。
【０１３４】
免疫パラメータとワクチン接種動物における疾患の進行との間の相関関係を明らかにするために、上記のように処置した動物を、ＳＨＩＶ８９．６の病原性派生体、すなわちＳＨＩＶ８９．６Ｐでチャレンジした。ＳＨＩＶ８９．６ＰはＲ５／Ｘ４エンベロープを担持し、かつＣＤ４＋Ｔ細胞の早期の減少を誘導する。ワクチン接種をしていない動物においては、これは、ＡＩＤＳ様疾患の早期の発症を伴う。動物は、ワクチン誘導性エフェクター免疫応答がピークレベルではないが、メモリー相がウイルスチャレンジに対する免疫応答を決定づける上でより重要な時期である、ワクチン接種後８ヶ月にチャレンジする。ほとんどのＨＩＶ−１感染が粘膜表面を超えて伝達するため、１３粘膜感染用量（mucosal infectious dose）の無細胞ＳＨＩＶ８９．６Ｐウイルスを直腸内投与する。
【０１３５】
上記のアッセイに加えて、以下のアッセイを行う。
感染動物の臨床評価
サルを、ルーチンの血液学的検査および血液化学分析により、ウイルスチャレンジ後定期的に（１ヶ月１回）、臨床的にモニターする。
チャレンジ後のウイルス量の定量
血漿中のウイルス量を、１ｍｌあたり２００ウイルスＲＮＡコピー当量（copy equivalent）の検出限界のリアルタイムＰＣＲを用いてＳＨＩＶ  ＲＮＡを検出することにより、毎週評価する。血漿ウイルス血症が陰性に転じた場合、感染動物のＰＢＭＣからのウイルスの増殖を共培養技術によって試みる。
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の計数
末梢血ＣＤ４細胞の計数は、感染動物におけるＣＤ４細胞の任意の減少を検出およびモニターするために、ウイルスチャレンジ後毎週行う。Rose、et al.、Cell 106: 539〜549、2001。
各個の動物において別個に、連続的に免疫学的パラメータをモニターすることにより、少ない試料数および実験コホートにおける任意の遺伝的不均一性にもかかわらず、信頼性が高くかつ有意義な情報が最大化する。
【０１３６】
リンパ節生検
感染動物からのリンパ節生検を３ヶ月間隔で行い、それについて細胞形態学的分析を行って、濾胞構造の完全性、胚中心の拡大または萎縮を評価し、そして濾胞および傍皮質の減少または過形成の存在を同定する。さらに、ＳＨＩＶ８９．６ＰウイルスＲＮＡの存在を、リンパ節材料におけるin situハイブリダイゼーションにより評価する。
ＳＨＩＶ８９．６Ｐウイルス中和抗体
オリゴマーＨＩＶエンベロープｇｐ１４０についてのＥＬＩＳＡ抗体力価、ならびにＳＨＩＶ８９．６およびＳＨＩＶ８９．６Ｐに対する中和抗体の存在を、ＳＨＩＶ８９．６Ｐによるチャレンジの後、月単位で決定する。例えば、Chen、et al.、Nat Med. 7: 1225〜31、2001、Shibata、et al.、Nat. Med. 5: 204〜10、1995参照。
【０１３７】
例５  ＣＴＬ活性のＩＬ−１５による増強
ウイルス病原体および癌に対する理想的なワクチンは、高活性のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するはずであり、かつワクチンにより提供される免疫は長期間持続すべきである。図９に図解されているとおり、高活性のＣＤ８＋ＣＴＬは、ウイルス感染および腫瘍モデルにおいてより低い密度の抗原を認識することによって、より有効かつより保護的な免疫を提供する。これに対して、低活性のＣＤ８＋ＣＴＬは、有効性の低い免疫を提供するか、または免疫を提供しない。例えば、Ansari、et al.、: Cell. Immunol. 210（2）: 125〜42、2001、Gray、et al.、J. Virol. 75（21）: 10065〜72、2001、Oh、et al. J. Immunol. 170（5）: 2523〜30、2003、Pittet、et al.、J. Immunol. 171（4）:1844〜9（2003）、Romieu、et al.、J. Immunol. 161（10）: 5133〜7、1998参照。
高活性ＣＤ８＋ＣＴＬは、共刺激シグナルを増大することにより、および適切にブーストすることにより、選択的に誘導することができる。本明細書に開示のとおり、長期持続性の免疫はまた、ＩＬ−１５を分子ワクチンアジュバントとして用いることによっても達成することができる。
【０１３８】
上記の例において示したとおり、ＩＬ−１５は、長期持続する免疫をもたらすため、ＩＬ−１５をＨＩＶワクチン用のアジュバントとして用いることができる。ＩＬ−１５はまた、高活性ＣＤ８＋ＣＴＬの死をブロックすることができる抗アポトーシスタンパク質の発現を増大させることに関与している。ｇｐ１６０（ｖＰＥ１６）、ｇｐ１６０とＩＬ−１５（ｖＰＥ１６／ＩＬ−１５）、またはｇｐ１６０とＩＬ−２（ｖＰＥ１６／ＩＬ−２）を発現する組換えワクシニアで免疫した動物は、ＣＤ８＋ＣＴＬにおいて広範な機能的活性を誘導した。ＣＤ８＋ＣＴＬの活性の幅は、免疫後の期間に依存して狭くなった。しかしながら、驚くべきことに、ＩＬ−１５によって誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬは、ｖＰＥ１６およびｖＰＥ１６／ＩＬ−２によって誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬよりも１０倍低い、および１００倍低い量の抗原に応答した。図１０に示すとおり、ＩＬ−１５によって誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬは、ブースト後１４ヶ月においてより低い密度の抗原に応答した。図１１Ａ〜Ｄに示すとおり、この差は、免疫後の時間と共に拡大した。図１２Ａ〜Ｃおよび図１３Ａ〜Ｃに示すとおり、長期にわたる増大した活性は、ＣＤ８＋ＣＴＬの増大した特異的細胞溶解活性と相関する。この効果は、低濃度のペプチド（０．００１μＭ）（図１３Ａ〜Ｃ）で増殖したＣＤ８＋ＣＴＬにおいてより明確であった。同様に、ＩＬ−１５によって誘導された高活性ＣＤ８＋ＣＴＬは、in vivoにおいて、ブースト後１４ヶ月までのより長い期間存続した（図１４ＡおよびＢ）。
【０１３９】
さらに、異なる活性度を有するＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１５Ｒαの発現レベルが異なっていることが見出された（示さず）。高活性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−７Ｒαではなく、ＩＬ−１５Ｒαを高レベルで発現したが、これは、ＣＤ８＋ＣＴＬ上のＩＬ−１５Ｒαおよびin vivoにおけるＩＬ−１５が、異なる活性度のＣＤ８＋ＣＴＬの一生を制御していることを示唆するものである。この結果と一致して、データは、高活性ＣＤ８＋ＣＴＬが増大したレベルのアポトーシスタンパク質を発現し、ＩＬ−１５に応答して、低活性のＣＤ８＋ＣＴＬよりも良好に増殖したことを示した。これらの知見は、ＩＬ−１５が選択的に高活性ＣＤ８＋ＣＴＬの維持に貢献する機構を支持するものである。さらに、高活性ＣＤ８＋ＣＴＬは、より高レベルのＣＤ８βを発現する。
これらの結果は、ＩＬ−１５が、プライミングの時点で、より高い活性およびより長い寿命を有する異なる表現型のＣＴＬを選択および誘導し、ＩＬ−１５がアジュバントとして含まれた場合に、より有効なＣＴＬ免疫をもたらすことを示すものである。
【０１４０】
当業者において、本明細書中に記載されている事項の変更、改変およびその他の実施は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われるだろう。
上記に同定されたすべての参考文献、特許および特許出願は、その全体を明示的に参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ＩＬ−１５およびｇｐ１６０抗原の両方、ＩＬ−２およびｇｐ１６０の両方、またはｇｐ１６０単独を発現する本発明の組換えワクシニアウイルスを受けた２ヶ月後のマウスから得たＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ペプチドによりパルスした細胞の特異的溶解のパーセントを示したグラフである。「Ｅ／Ｔ」は、エフェクター／標的細胞比を示す。
【図２】ＩＬ−１５およびｇｐ１６０抗原の両方、ＩＬ−２およびｇｐ１６０の両方、またはｇｐ１６０単独を発現する本発明の組換えワクシニアウイルスを受けた１４ヶ月後のマウスから得たＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチドによりパルスした細胞の特異的溶解のパーセントを示したグラフである。「Ｅ／Ｔ」は、エフェクター／標的細胞比を示す。
【図３】免疫後の種々の時期の非免疫マウス、ＨＩＶ  ｇｐ１６０を発現する組換えワクシニアウイルスを受けたマウス、およびｇｐ１６０およびＩＬ−１５またはＩＬ−２を共発現するワクシニアウイルスを受けたマウスの、新鮮な脾臓における、免疫後の種々の時期での、ＨＩＶ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループペプチド（Ｐ１８−Ｉ１０）テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示した棒グラフである。
【０１４２】
【図４】免疫後の種々の時期の非免疫マウス、ＨＩＶ  ｇｐ１６０を発現する組換えワクシニアウイルスを受けたマウス、およびｇｐ１６０およびＩＬ−１５またはＩＬ−２を共発現するワクシニアウイルスを受けたマウスにおける、ＨＩＶ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループＰ１８−Ｉ１０ペプチドでパルスした細胞に暴露した際の、γ−ＩＦＮ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示した棒グラフである。
【図５】非免疫マウス、ＨＩＶ  ｇｐ１６０を発現する組換えワクシニアウイルスを受けたマウス、およびｇｐ１６０およびＩＬ−１５またはＩＬ−２を共発現するワクシニアウイルスを受けたマウスにおける、免疫の８ヶ月後の抗ｇｐ１２０抗体の力価を示した図である。
【図６】Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＩＬ−１５の両方を発現する組換えワクシニアウイルス、または対照ワクシニアウイルスを受けてから様々な時間間隔経過時における担癌マウスの数を示したグラフである。
【図７】Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＩＬ−１５の両方を発現する組換えワクシニアウイルス、または対照ワクシニアウイルスを受けた後の担癌マウスにおける腫瘍数を示したグラフである。
【０１４３】
【図８】Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＩＬ−１５の両方を発現する組換えワクシニアウイルス、または対照ワクシニアウイルスを受けたマウスの血清中の、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体のレベルを示した図である。
【図９】ＣＤ８＋ＣＴＬの反応性が、ＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性の免疫の有効性を決定することを図解した図である。
【図１０】ＩＬ−１５で誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが、ブーストの１４ヶ月後において、より低い密度の抗原に反応することを示したグラフである。
【０１４４】
【図１１】ＩＬ−１５で誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬが、より低い密度の抗原に反応す
【図１２】高濃度のペプチド（０．１μＭ）で拡大させたＣＤ８＋ＣＴＬの細胞溶解活性を示したグラフである。
【図１３】低濃度のペプチド（０．００１μＭ）で拡大させたＣＤ８＋ＣＴＬの細胞溶解活性を示したグラフである。
【図１４】ＩＬ−１５で誘導された高反応性ＣＤ８＋ＣＴＬが、in vivoでより長期間存続することを示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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