(57)【要約】  脊椎動物由来のセラミド及びセラミド含有組成物、並びにこれらの製造方法を提供する。  魚体の一部又は全部を処理することを含む、セラミド及びセラミド含有組成物並びにそれらの製造方法を提供する。該セラミドは、d19:3のスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合したセラミドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚体の一部又は全部を、製造上有効な条件で処理することを含む、以下の式Ｉ：
【化１】
2007129729.tif 000006
のセラミドの製造方法。
【請求項２】
前記魚体の一部又は全部が、魚皮である、請求項1に記載の製造方法。
【請求項３】
前記魚体が、サケ目及びタラ目の魚から選択される、請求項1又は2に記載の製造方法。
【請求項４】
以下の工程 1) 〜 4) ：
1) 魚体の一部又は全部の、クロロホルム(C):メタノール(M)=1:0.4〜0.6抽出物に、塩化ナトリウム(NaCl)水溶液を加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=1:0.4〜0.6:0.3〜0.45になるようにし、但しこの際皮の重量の7割を水として計算し、充分な時間放置して下層を回収して乾固し；
2) 所望により弱アルカリ処理し；
3) Sep-Pak Silicaに供し、C:Mの容積比がそれぞれ1:0、99:1、98:2、0:1である4種の溶媒で順に溶出し、C:M=99:1、C:M=98:2、又はC:M=99:1及びC:M=98:2の溶媒で溶出した画分を得て；そして
4) 所望により工程3) で得た画分を更に分画する；
を含む、以下の式I：
【化２】
2007129729.tif 000007
のセラミドの製造方法。
【請求項５】
前記セラミドが、スフィンゴイドとしてt18:0及びt18:1を実質的に含まない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記セラミドが、
d14:1、d16:1、d18:1、d19:3及びd20:1からなる群から選択されるスフィンゴイドと、
C14:0、C14:0 (2-OH)、C16:0、C16:0 (2-OH)、C18:0、C22:1、C22:1 (2-OH)、C24:1、及びC24:1 (2-OH)からなる群から選択される脂肪酸とが、
酸アミド結合したセラミドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記魚体が、サケ目の魚から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程4) が、
前記工程3)で得た画分であって、C:M=99:1の溶媒で溶出した画分を乾固し、Silica gel 60カラムに供し、C:M:25%アンモニア水=1:0.09〜0.13:0.009〜0.013の溶媒で溶出し、1mlずつ分画して第35〜42番目のいずれかの1又は複数の画分を得る工程であるか、または前記工程3)で得た画分であって、C:M=98:2の溶媒で溶出した画分を乾固し、Silica gel 60カラムに供し、C:M:25%アンモニア水=1:0.09〜0.13:0.009〜0.013の溶媒で溶出し、1mlずつ分画して第37〜55番目のいずれかの1又は複数の画分を得る工程である、
請求項4〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記セラミドが、d19:3のスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合したセラミドである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項１０】
以下の工程 1) 〜 4) ：
1) 魚体の一部又は全部の、クロロホルム(C):メタノール(M)=1:0.4〜0.6抽出物に、塩化ナトリウム(NaCl)水溶液を加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=1:0.4〜0.6:0.3〜0.45になるようにし、但しこの際皮の重量の7割を水として計算し、充分な時間放置して下層を回収して乾固し；
2) 所望により弱アルカリ処理し；
3) Sep-Pak Silicaに供し、C:Mの容積比がそれぞれ1:0、99:1、98:2、0:1である4種の溶媒で順に溶出し、C:M=99:1、C:M=98:2、又はC:M=99:1及びC:M=98:2の溶媒で溶出した画分を得て；そして
4) 所望により工程3)で得た画分を更に分画する
により得られる、以下の式I：
【化３】
2007129729.tif 000008
のセラミド含有組成物。
【請求項１１】
セラミドが、以下の式II：
【化４】
2007129729.tif 000009
のスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合したセラミドを含む、サケ目の魚由来のセラミド含有組成物。
【請求項１２】
以下の工程 1) 〜 4)：
1) ニジマスの一部又は全部の、クロロホルム(C):メタノール(M)=2:1抽出物に、塩化ナトリウム(NaCl)水溶液を加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=8:4:3になるようにし、但しこの際皮の重量の7割を水として計算し、一晩放置して下層を回収して乾固し；
2) 所望により弱アルカリ処理し；
3) Sep-Pak Silicaに供し、C:Mの容積比がそれぞれ1:0、99:1、98:2、0:1である4種の溶媒で順に溶出し、C:M=99:1の溶媒で溶出した画分を得て；そして
4) C:M=99:1の溶媒で溶出した画分を乾固し、1.08ｘ55cmのSilica gel 60カラムに供し、C:M:25%アンモニア水=90:10:1の溶媒で溶出し、1mlずつ分画して第38〜40番目の画分を得る
により得られる、セラミド含有組成物。
【請求項１３】
以下の式II：
【化５】
2007129729.tif 000010
のスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合した、サケ目の魚由来のセラミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚由来のセラミドの製造方法及びセラミド含有組成物に関する。本発明は、化粧品、医薬、食品の分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは、シグナル伝達系を調節し、細胞のアポトーシスや分化に関与すると考えられている。またヒトにおいて皮膚の角質層に存在し、適度な水分を含有することによって皮膚に柔軟性を持たせる保湿機能や、体内の水分が出ていくのを防ぎ、外部からの異物が体内に侵入するのを防ぐバリア機能を果している。皮膚の角質内のセラミド量は加齢とともに減少すること(非特許文献1)、また、アトピー性皮膚炎患者でも減少していることが報告されており(非特許文献2)、セラミド量が減少するとバリア機能が低下することが知られている(非特許文献3)。また、ヒトの皮膚の角質層に存在するセラミドには7種類の構造があることがわかっている(非特許文献4)。その他の機能として、抗アレルギー、便秘解消、中性脂肪やコレステロールの上昇抑制等が挙げられる。【０００３】
セラミドは以前は牛脳から調製されていたが、近年、BSE(牛海綿状脳症)問題により、牛脳由来の原料を配合した製品から人間に病原体が感染する危険性が指摘され、他の原料からセラミドを調製することが望まれている。そのために、現在は植物由来のセラミドあるいは合成セラミドが汎用されている。哺乳類由来のセラミドでは、例えば豚上皮由来のセラミドは、脂肪酸としてC18:0、C18:1、C20:0、C20:1、C22:0等を、スフィンゴイドとして、d18:1等を多く含むことが知られる。【０００４】
植物性セラミド関連物質としては、コメ(Agric. Biol. Chem., 49,2753 (1985))や小麦(Agric. Biol. Chem., 49,3609 (1985))由来のものがあるが、その濃度が非常に低く、また、主要なセラミドは遊離型セラミドではなくグルコシルセラミド等の糖脂質であり、抽出、精製に多くの手間とコストとを要する。例えば、小麦のセラミド含有量は、15mg/kgである。また、植物由来のセラミドは、植物特有のフィトスフィンゴシン類を含むフィトセラミドで、例えば米や小麦では、脂肪酸としてC16:0、C22:0(2-OH)、C24:0(2-OH)等を、スフィンゴイドとしてd:18:0、t18:0等を多く含むことが知られる。【０００５】
魚類の水産加工過程では多量の皮、内臓、骨等が産業廃棄物として発生しており(例えばミナミダラ皮、スケソウタラ皮等)、その大部分は利用用途がなく経費をかけて廃棄処理が行われている。これら魚類の廃棄物(皮、内臓、骨、頭部、尾部、ヒレ、及び時として魚体全体)には、各種有用成分が多様な濃度で含まれている事が知られ、例えば特許文献1は、魚介類由来の廃棄物を用いた水不溶性の有用物質(組成物)の製造方法について記載する。【０００６】
海産物由来のスフィンゴ脂質としては、特許文献2に魚介類からスフィンゴミエリン又はセラミド2-アミノエチルホスホン酸を抽出し、切断等の処理をすることを特徴とするセラミドの製造方法が記載されている。特許文献2の実施例には、マダコのゆで汁を原料としたスフィンゴミエリン又はセラミド2-アミノエチルホスホン酸をホスホリパーゼCにより分解するセラミドの製造方法、特許文献3に腹足類、斧足類、又は頭足類の軟体部を原料とするスフィンゴ脂質の製造方法が開示されているが、その構造は特定されていない。また、特許文献2及び3に記載のセラミドはスフィンゴミエリン等由来のセラミドであり、遊離型セラミドではないため、セラミドを得るため、スフィンゴミエリン等を更に処理する工程が必要になる。
【特許文献１】特許第3408958号
【特許文献２】特開平7-265089
【特許文献３】特開2005-2324
【非特許文献１】Imokawa G, Abe A, Jin K, Higaki Y, Kawashima M, Hidano A.(199:1) J. Invest Dermatol. 96, 523-526
【非特許文献２】Ohnishi Y, Okino N, Ito M, Imayama S.(1999) Clin Diagn Lab Immunol. 6, 101-10.4
【非特許文献３】最新皮膚科学大系  中山書店
【非特許文献４】Robson KJ, Stewart ME, Michelsen S, Lazo ND, Downing DT. (1994) J. Lipid Res. 35, 20.60.20.68
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは多量に廃棄される魚類の廃棄物に着目し、これを新たにセラミドの原料として有効利用することで、安全で安心な動物セラミドを提供できることを見出した。得られたセラミドは、現在汎用されている植物由来のセラミドとは明らかに異なる構造を示した。また得られたセラミドは脊椎動物から初めて単離されたセラミドを含むことをも見出し、本発明を完成させた。このようにして得られたセラミドは、化粧品、医薬品、食品等の原料として有用である。
【０００８】
すなわち、本発明は、魚体の一部又は全部を、製造上有効な条件で処理することを含む、以下の式Ｉ：
【０００９】
【化１】
2007129729.tif 000002
のセラミドの製造方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、前記魚体の一部又は全部が、魚皮である、前記の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記魚体が、サケ目及びタラ目の魚、好ましくはニジマス及びミナミダラから選択される、前記の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、前記セラミドが、d19:3、好ましくは以下の式II：
【００１３】
【化２】
2007129729.tif 000003
のスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合したセラミドである、前記の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の製造方法により得られるセラミドは、遊離型セラミドであり、前記式Iの構造を有し、脂肪酸とスフィンゴイドとが酸アミド結合した化合物である。より特定すれば、前記化合物は、セラミダ−ゼで処理することによりスフィンゴイドと脂肪酸が得られる化合物であって、スフィンゴイド及び脂肪酸の種類並びに／又は組み合わせによっては脊椎動物から初めて単離される化合物も含まれる。例えば、以下のような脂肪酸とスフィンゴイドとの組合せのセラミドが含まれる。
【００１５】
【化３】
2007129729.tif 000004
本明細書中において、スフィンゴイドとは、二重結合及び／又はアルコール性-OH基のほかに更に-OH基を有してもよい、炭素数10〜20の長鎖アミノアルコールである。好ましくは、直鎖アミノアルコールで、0〜3個の二重結合を有する化合物である。例えば、C10スフィンゴシン(d10:1)、C12スフィンゴシン(d12:1)、C14スフィンゴシン(d14:1)、C16スフィンゴシン(d16:1)、C18スフィンゴシン(d18:1、4-スフィンゲニン、(2S, 3R, 4E)-2-アミノオクタデカ-4-エン-1, 3-ジオール)、C18スフィンガニン(d18:0、ジヒドロスフィンゴシン、(2S, 3R)-2-アミノオクタデカン-1, 3-ジオール)、C18フィトスフィンゴシン(t18:0、4-D-ヒドロキシスフィンガニン、(2S, 3S, 4R)-2-アミノオクタデカン-1, 3, 4-トリオール)、C18デヒドロフィトスフィンゴシン(t18:1、4-D-ヒドロキシ-8-スフィンゲニン)、C19デヒドロスフィンゴシン(d19:3)、C20スフィンゴシン(d20:1)が挙げられるがこれらに限定されず、それぞれの光学異性体も含む。本発明において、前記セラミドは、好ましくはスフィンゴイドとしてt18:0及びt18:1を実質的に含まず、より好ましくは、スフィンゴイドがd14:1、d16:1、d18:1、d19:3及びd20:1からなる群、さらにより好ましくは、d16:1及びd18:1からなる群から選択される。
【００１６】
なお、本明細書中において、セラミドが、スフィンゴイドとしてt18:0及びt18:1を実質的に含まない、とは、セラミドをセラミダーゼで処理してスフィンゴイドと脂肪酸を得た際に、本発明の原料である魚体に由来するセラミドのスフィンゴイドとして、t18:0及びt18:1の含有量が、定法によっては検出できない程度に低いことをいい、例えば、得られたセラミド中のt18:0及びt18:1含量が1%以下であることをいう。このような、t18:0及びt18:1を実質的に含まないセラミドは、現在汎用されている植物由来のセラミドである、フィトスフィンゴシン類を含むフィトセラミドとは明らかに異なる。
【００１７】
また、上記の脂肪酸は直鎖及び分岐脂肪酸、並びに飽和及び不飽和脂肪酸を含む。また、-OH基が付加した脂肪酸（例えば2位に-OH基が付加したもの(2-OH)）も含む。特に本発明の製造方法により得られるセラミドをセラミダーゼで処理した場合に得られる脂肪酸は、炭素数14〜24の脂肪酸であって、2重結合の数が0〜6個の脂肪酸、及びそれらの2位に-OH基が付加したものが好ましい。例えば、C14:0、C14:0 (2-OH)、C16:1n7、C16:0、C16:0 (2-OH)、C18:1n9、C18:0、C20:5n3、C22:6n3、C22:5n3、C22:1、C22:1 (2-OH)、C24:1、C24:1 (2-OH)及びC24:0が挙げられるがこれらに限定されない。より好ましくは、C14:0、C14:0 (2-OH)、C16:0、C16:0 (2-OH)、C18:0、C22:1、C22:1 (2-OH)、C24:1及びC24:1(2-OH)であり、さらにより好ましくは、C14:0、C16:0、及びC24:1である。
【００１８】
本発明はまた、上記の式IIのスフィンゴイドと、C24:1の脂肪酸とが、酸アミド結合した、サケ目の魚（好ましくは、ニジマス）由来のセラミド及び該セラミド含有組成物を提供する。
【００１９】
本発明の製造方法に用いられる魚体は、本発明の製造方法によりセラミドが得られるものであればいずれの魚類由来であってもよく、その種や属について特に限定されるものではない。本発明のセラミドの大量供給を可能にするという観点からは、漁獲量が多く、水産加工後に多量の廃棄物が得られる魚類が好ましく、特に大量の魚皮が得られるという観点からは真皮の厚い魚類が好ましい。例えば、サケ目(サケ、ニジマス、マス等)、タラ目(ミナミダラ、マダラ、スケトウダラ等)、スズキ目(マハタ、マサバ、ムツ、ブリ、マグロ、カツオ、アジ等)、カレイ目(ヒラメ、マガレイ、オヒョウ等)、カサゴ目(ホッケ等)、ダツ目(サンマ等)、サメ、エイ目等の魚類を用いることが出来るがこれらに限定されない。本発明においては、好ましくは、サケ目及びタラ目の魚、より好ましくはニジマス及びミナミダラを使用することが出来る。サケ目のうち、ニジマスはチリ、ノルウェー、タスマニアなどで海産養殖され、近年日本への輸入量が増加しているものであり、トラウトサーモンあるいはサーモントラウトとして一般に流通している。
【００２０】
本発明の製造方法において用いる魚体の一部又は全部とは、魚類の魚皮、内臓、筋肉、骨、頭部、尾部、ヒレ、及び魚体全体からなる群から選択される１又は複数の部位を指す。水産加工後の廃棄物として大量に得られ、かつ、本発明の製造方法により得られるセラミドの含有量が多いという観点からは、魚皮又は頭部を用いることが好ましい。特に好ましくは、魚皮を用いる。
【００２１】
魚皮は、上記のセラミドを含むものであればいずれのものであっても使用でき、魚体の様々な部位から得られる魚皮、例えば腹部、尾部、背部、頭部等から得られる魚皮を、それぞれ単独に、又は2以上若しくは全てを混合して用いることもできる。
【００２２】
本明細書中において、「製造上有効な条件で処理する」とは、魚体を用いて、所望のセラミドを、好ましくは最も多量に、得られるよう処理することを指し，例えば以下の記載及び／又は実施例の記載をもとに、当業者であれば適宜条件を変えて行うことが出来る。
【００２３】
本発明の製造方法においては、前記の魚体の一部又は全部を用い、まず所望のセラミドの含有量が低い部位を、完全にまたは一部除去することが出来る。除去の方法としてはナイフ等の硬いものを用いて除去する方法があげられるがこれに限定されない。例えば、鱗、皮に付いた筋肉を削って除去し、細かく切って、続く抽出溶媒との接触工程に用いることができる。
【００２４】
本発明の製造方法の一例においては、前記の魚体の一部又は全部を、抽出溶媒と接触させることを含む。用いる抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、含水エタノール、ブタノール、t-ブタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、その他のアルコール類、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、その他のハロゲン系炭化水素、アセトン、酢酸エチル、エーテル、ヘキサン等が用いられるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。特にクロロホルム−メタノール混液がセラミドを高濃度に溶解することができるので好ましい。人体への害がない溶媒を抽出溶媒とするという観点からは、エタノール等を溶媒として用いることも好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法のさらなる具体例においては、前記の魚体の魚皮をクロロホルム−メタノール混液や含水エタノール等の抽出溶媒に浸漬し、破砕し、更に抽出溶媒を加えて抽出する。例えばFolch法(Folch et al. 1957)を用いることができる。その後、濃縮して所望のセラミドを含有する粗製全脂質を得る。所望により、例えば後述の実施例に記載のように、弱アルカリ処理を行う工程を加えても良い。
【００２６】
次いで、この粗製全脂質をクロマトグラフィーにより溶媒を用いて分画し、セラミドを得る。充填剤は、技術分野において通常用いられているものから適宜選択することができ、例えば、シリカゲルやC18、フェニル、CN等の化学結合したシリカゲル等を用いることができる。
【００２７】
クロマトグラフィーを用いた分配後のフラクションからセラミドを含むフラクションを同定するには、TLCを用い、標品のセラミドとRf値を比較することができる。Rf値の比較は、オルシノール硫酸試薬、クマシーブリリアントブルー試薬染色、リンモリブデン酸試薬等の発色により行うことができる。また、MS、GC、NMR等、当業者に公知の各手法を用いて行うこともできる。
【００２８】
スフィンゴイド及び脂肪酸の同定は、例えば後述の実施例に記載のように、GC、MS、NMR等当業者に公知の手法を用いて行うことが出来る。
【００２９】
本発明の製造方法においては、まずセラミドを含む化合物を得て、その後該化合物を処理することにより所望の化合物を得ることも出来る。例えば、セラミドのスフィンゴイド末端のOH基にリン酸等が結合した化合物をホスホリパーゼ処理することにより所望のセラミドを得る方法も、本発明の製造方法に含まれる。また、セラミドを得て、その後該セラミドを処理することにより別のセラミドを得ることも出来る。
【００３０】
化合物の同定は、当業者に公知の手法を用いて行うことが出来る。例えば、適当なマトリックスを用いてFAB-MS分析によって行うことが出来る。
【００３１】
セラミドを特異的に分解する酵素であるセラミダーゼで処理することによりスフィンゴイドと脂肪酸が生成すれば、該化合物がセラミドであることが確認できる(図22)。セラミダーゼ処理、処理後のスフィンゴイド及び脂肪酸の生成の確認は、例えば図22や後述の実施例に記載のように、当業者に公知の手法を用いて行うことが出来る。
【００３２】
本発明はまた、以下の工程 1) 〜 4) ：
1) 魚体（好ましくはサケ目及びタラ目の魚から選択される魚体、より好ましくはニジマス及び／又はミナミダラ）の一部又は全部（好ましくは魚皮）の、クロロホルム(C):メタノール(M)=1:0.4〜0.6（好ましくは、1: 0.45〜0.55、より好ましくは、C:M=2:1）抽出物に、塩化ナトリウム(NaCl)水溶液を加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=1:0.4〜0.6:0.3〜0.45（好ましくは、1:0.45〜0.55:0.35〜0.4、より好ましくは、C:M:0.2%NaCl水溶液=8:4:3）になるようにし、但しこの際皮の重量の7割を水として計算し、充分な時間放置して下層を回収して乾固し；
2) 所望により弱アルカリ処理し；
3) Sep-Pak Silicaに供し、C:Mの容積比がそれぞれ1:0、99:1、98:2、0:1である4種の溶媒で順に溶出し、C:M=99:1、C:M=98:2、又はC:M=99:1及びC:M=98:2の溶媒で溶出した画分（好ましくは、C:M=98:2の溶媒で溶出した画分）を得て；そして
4) 所望により工程3) で得た画分を更に分画する；
を含む、上記式Iのセラミドの製造方法及び、該工程により得られる該セラミド含有組成物を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、前記工程4) が、前記工程3)で得た画分であって、C:M=99:1の溶媒で溶出した画分を乾固し、Silica gel 60カラムに供し、C:M:25%アンモニア水=1:0.09〜0.13:0.009〜0.013（好ましくは90:10:1）の溶媒で溶出し、1mlずつ分画して第35〜42番目（好ましくは、第38〜40番目）のいずれかの1又は複数の画分を得る工程であるか、または、
前記工程4) が、前記工程3)で得た画分であって、C:M=98:2の溶媒で溶出した画分を乾固し、Silica gel 60カラムに供し、C:M:25%アンモニア水=1:0.09〜0.13:0.009〜0.013（好ましくは90:10:1）の溶媒で溶出し、1mlずつ分画して第37〜55番目（好ましくは、第43〜49番目）のいずれかの1又は複数の画分を得る工程である、
前記のセラミドの製造方法及び、該工程により得られるセラミド含有組成物も提供する。
【００３４】
本明細書中において、溶媒の比は溶媒を構成する各成分の容積比で表す。
【００３５】
より特定すれば、上記の工程1) は、下記の実施例1 (1．C(クロロホルム):M(メタノール)=2:1による抽出)に記載の手法に従って行うことができる。工程1) において、「充分な時間放置して」とは、Folch分配に充分な時間放置することを指し、例えば一晩の放置を指す。
【００３６】
より特定すれば、上記の工程2) は、下記の実施例1 (2．弱アルカリ処理)に記載の手法に従って行うことができる。
【００３７】
上記の工程3) においては、C:M=99:1、C:M=98:2、又はC:M=99:1及びC:M=98:2の溶媒で溶出した画分のうち、所望のセラミドを含む画分を得る。よりセラミド含有量の多いセラミド含有組成物を得るという観点からは、上記の溶媒で溶出した画分のうち、はじめ及びおわりの部分を除いた画分を得ることが好ましく、例えば、下記の実施例1 (3．Sep-Pak Silicaクロマトグラフィー)の項に記載の手法で順次溶出した画分の、C:M=98:1溶出画分のNo.95〜116、C:M=98:2溶出画分のNo.134〜154、又はC:M=99:1及びC:M=98:2溶出画分のNo.95〜154を得ることにより実施できる。該画分に所望のセラミドが含まれているか否かは、例えば、下記の実施例1 (3．Sep-Pak Silicaクロマトグラフィー)の項に記載の手法に従って確認することが出来る。
【００３８】
上記の工程4)は、より具体的には、下記の実施例1 (4．Silica gel 60クロマトグラフィー)に記載の手法に従って行うことができる。工程4)において、所望のセラミドを含む、いずれかの1又は複数の画分を得る。得た画分に所望のセラミドが含まれているか否かは、例えば上記の工程3)で用いた手法と同様の手法を用いて確認することが出来る。
【００３９】
本明細書中において、「前記の工程により得られる、セラミド含有組成物」とは、前記の工程により得られたセラミド含有組成物、及びその他の方法により得られたセラミド含有組成物であって前記の工程により得られたセラミド含有組成物と同一の種類のセラミドを含む(更にその他のセラミドを含んでもよい)組成物を指す。例えば、複数のセラミドが組成物に含まれる場合に、全組成物に対する各セラミドの含有率(重量／重量)が高い順番に該複数のセラミドを並べたとき、その順が同じである組成物を指す。組成物に含まれるセラミド及びその含有率は当業者に公知の手法を用いて調べることができ、例えば、各種クロマトグラフィー、NMR、MS等を用いることができる。
【００４０】
本発明のセラミドおよび／またはその誘導体は、医薬品、医療用具、化粧料、食品などの多方面に利用することが可能である。セラミドが皮膚の細胞間に存在する成分であるとの観点からは、保湿を目的として使用される製品に配合されることが好ましい。また、セラミドが皮膚のバリア機能を向上させるという観点からは、敏感肌用化粧品に配合することもまた好ましい。本発明のセラミドおよび／またはその誘導体と併用して配合可能な成分としては、化粧品、医薬部外品や浴用剤で一般に使用される基剤や薬剤などが挙げられ、それらと共に、当業者に公知の手法を用いて任意の形態の製品とすることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1は、実施例1のSep-Pak Silicaクロマトグラフィーで溶出した各画分のTLCの結果を示す図である。
【図２】図2は、実施例1のフラクションIのSilica gel 60クロマトグラフィーで溶出した各画分のTLCの結果を示す図である。
【図３】図3は、実施例1のフラクションIIのSilica gel 60クロマトグラフィーで溶出した各画分のTLCの結果を示す図である。
【図４】図4は、実施例1のフラクションIIIのSilica gel 60クロマトグラフィーで溶出した各画分のTLCの結果を示す図である。
【図５】図5は、実施例2の脂肪酸及びスフィンゴイドの同定に用いた標品のGCチャートである。
【図６】図6は、実施例2におけるフラクションIのGCチャートである。
【図７】図7は、実施例2におけるフラクションIIAのGCチャートである。
【図８】図8は、実施例2におけるフラクションIIBのGCチャートである。
【図９】図9は、実施例2におけるフラクションIIIのGCチャートである。
【図１０】図10は、実施例3におけるフラクションIIAのFAB-MSチャートである。
【図１１】図11は、実施例3におけるフラクションIIBのFAB-MSチャートである。
【図１２】図10は、実施例3におけるフラクションIIIのFAB-MSチャートである。
【図１３】図13は、実施例4におけるフラクションIIAのセラミダーゼ処理の結果を示すTLCの図である。
【図１４】図14は、実施例5におけるフラクションIIAの未同定脂肪酸のGC:MSチャートである。
【図１５】図15は、実施例6におけるフラクションIIAの未同定スフィンゴイドのFAB-MSチャートである。
【図１６】図16は、実施例6におけるフラクションIIAの未同定スフィンゴイドのMS/MSチャートである。
【図１７】図17は、実施例6におけるMS/MS測定結果から考え得る2種のスフィンゴイドの構造である。
【図１８】図18は、実施例6において、考え得る2種のスフィンゴイドのフラグメントイオンを示す図である。
【図１９】図19は、実施例6において用いた標準品のMS/MSチャートである。
【図２０】図20は、ニジマス皮の分析スキームの概略を示す。
【図２１】図21は、ミナミダラ皮の分析スキームの概略を示す。
【図２２】図22は、セラミドをセラミダーゼ処理した場合の作用様式を示す。
【実施例】
【００４２】
実施例1
ニジマス皮からのセラミドの調製
1．C(クロロホルム):M(メタノール)=2:1による抽出
ニジマス皮からC:M=2:1により総脂質を抽出した。チリ産 ニジマス(Oncorhynchus mykiss)の皮に残っている身およびウロコを取り除き、細かく切った。皮250gに10倍量のC:M=2:1を加えホモジナイズし、ろ過した。得られた抽出液を分液漏斗に移し、1%NaCl水溶液を加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=8:4:3になるようにし、一晩静置してFolch分配を行った。その際皮の重量の7割を水として計算した。下層を回収して乾固した。【００４３】
2．弱アルカリ処理
次いで弱アルカリ処理を行うことでスフィンゴ脂質以外のグリセロ脂質を分解した。乾固した下層を30mLのC:M=2:1に溶かし、終濃度が0.2MとなるようにKOH-MeOHを加えた。37℃で1時間振とう後、350μLの酢酸を加えて中和した。1%NaClを加えて組成がC:M:0.2%NaCl水溶液=8:4:3になるようにし、一晩静置してFolch分配を行った。下層を回収して乾固した。【００４４】
3．Sep-Pak Silicaクロマトグラフィー
アルカリ処理後の乾固した下層を5mLのクロロホルムに溶かしてSep-Pak Silica (10g)に負荷した。クロロホルム(450ml, 5ml/tube)、C:M=99:1(200ml, 5ml/tube)、C:M=98:2(150ml, 5ml/tube)、C:M=95:5(150ml, 5ml/tube)、C:M=9:1(120ml, 6ml/tube)、C:M=4:1(120ml, 6ml/tube)、C:M=3:1(140ml, 7ml/tube)、C:M=2:1(210ml, 7ml/tube)、メタノール(300ml, 10ml/tube)で順次溶出した。溶出後各フラクションを乾固し、200μLのC:M=2:1に溶かした。3μLをTLCプレート(MERCK)に負荷し、C:M:25%アンモニア水=90:10:1で展開した。展開後、オルシノール硫酸試薬(オルシノール(Wako)200mg、硫酸11.4ml、水88.6ml)を噴霧し、ホットプレート(120℃)で発色させ、次いでクマシーブリリアントブルー試薬(10%エタノール中0.2%クマシーブリリアントブルーR250(nacalai tesque))で20分間染色し、20%エタノールで脱色を行った。TLCの結果から、標品セラミド(Ceramide, Natural Mixture, Bovine Brain(SRL))とRf値が近いクロロホルム溶出画分のNo.22〜30をフラクションI、C:M=99:1溶出画分のNo.95〜116をフラクションII、C:M=98:2溶出画分のNo.134〜154をフラクションIIIとして集めた(図1)。【００４５】
4．Silica gel 60クロマトグラフィー
フラクションI〜IIIについて、それぞれSilica gel 60クロマトグラフィーを行い、夾雑物を除いた。Silica gel 60(MERCK)を105℃で1時間加熱し、C:M:25%アンモニア水=90:10:1に懸濁し、カラム(カラムサイズ:1.08(直径)×55cm)に詰めた。サンプルをC:M=9:1に溶かしカラムに負荷し、1ml/tube、0.05ml/minで溶出した。溶出後フラクションを乾固し、30μLのC:M=2:1に溶かした。3μLをTLCプレートに負荷し、C:M:25%アンモニア水=90:10:1で展開した。展開後、オルシノール硫酸試薬で発色させ、次いでクマシーブリリアントブルー試薬染色を行った。TLCの結果から、フラクションIはNo.45〜51を集めた(図2)。フラクションIIはこのクロマトグラフィーによりさらに2つの画分に分けることができ、No.38〜40をフラクションIIA、No.33〜34をフラクションIIBとしてそれぞれ集めた(図3)。フラクションIIIはNo.43〜49を集めた(図4)。【００４６】
実施例2
GCによるセラミドの脂肪酸とスフィンゴイドの分析
1．脂肪酸の分析
実施例1で得られた各画分を乾固し、200μLの5%HCl-MeOH(nacalai tesque)を加えた。N2封入して、蓋を閉め、80℃で3時間反応させた。500μLのヘキサンを加え、2,000×gで10分間遠心し、2層に分離し、ヘキサン層を回収した。これを2回繰り返した。回収したヘキサン層を乾固し、50μLのヘキサンに溶かし、3μLを負荷した。分析条件は以下に示すとおりである。Column:HiCap CBP1(Shimadzu)、Initiation temperature:150℃、Initiation time:10 min、Program rate:5℃/min、Final temperature:300℃、Final time:10 min、Injection port temperature:250℃、Detector port temperature:300℃。また、GCによる脂肪酸の同定はStandard Mixture (PUFA-3 (Matrea))をもとに行った。【００４７】
2．スフィンゴイドの分析
実施例1で得られた各画分を乾固し、200μLの5%HCl-MeOHを加えた。N2封入して、蓋を閉め、80℃で3時間反応させた。500μLのヘキサンを加えた。遠心により2層に分離し、へキサン層を除いた。これを2回繰り返した。メタノール層を乾固し、50μLのシルブレンダー(nacalai tesque)を加え、室温で1時間反応させた。乾固し、50μLのヘキサンに溶かし、3μLを負荷した。分析条件は以下に示すとおりである。Column:HiCap CBP1 (SHIMADZU)、Initiation temperature:150℃、Initiation time:10 min、Program rate:5℃/min、Final temperature:300℃、Final time:10 min、Injection port temperature:250℃、Detector port temperature:300℃。また、GCによるスフィンゴイドの同定はトリメチルシリル(TMS)化した各スフィンゴイドをもとに行った。【００４８】
結果:
GCによる脂肪酸の同定はStandard Mixture (PUFA-3)をもとに、スフィンゴイドの同定はTMS化した各スフィンゴイドをもとに行った(図5)。表1は各脂肪酸及びスフィンゴイドの標品のretention timeを示す。【００４９】
【表１】
2007129729.tif 000005
フラクションIではスフィンゴイドのピークは検出されなかった。脂肪酸はStandardとは一致せず、ピークはC16:0、C18:0の間とC18:0よりやや遅いretention timeを示した。フラクションIはスフィンゴイドが検出されないことからセラミドではないと考えられる(図6)。フラクションIIAではスフィンゴイドは主にd18:1であった。主な脂肪酸はStandardとは一致せず、retention timeがC22:5n-3とC24:0の間であることから炭素鎖22以上または不飽和度の高い脂肪酸と推測された(図7)。フラクションIIBではスフィンゴイドは主にd18:1であった。脂肪酸はC14:0、C16:0と同定されたが、IIAと同様のStandardと一致しない脂肪酸が存在した(図8)。フラクションIIIのスフィンゴイドはd20:1およびStandardと一致しないものだった。また、脂肪酸もStandardとは一致しなかったが、このうちretention timeが早いほうのピークはIIAと同一の脂肪酸と推測された(図9)。【００５０】
実施例3
セラミドのFAB-MS分析
FAB-MSを用いて分子量を測定した。ニトロベンジルアルコールをマトリックスに用いpositive modeで測定した。
結果:
フラクションIIAは[M＋Na]=680、[M＋H−H2O]=640のピークと[M＋Na]=670、[M＋H−H2O]=630のピークが見られることから分子量は657、647と推定された(図10)。フラクションIIBは[M＋Na]=532、[M＋H−H2O]=492のピークと[M＋Na]=560のピークがみられることから分子量は509、537と推定され、それぞれC14-セラミドとC16-セラミドの分子量と一致した(図11)。フラクションIIIは[M＋Na]=696、[M＋H−H2O]=656のピークが見られ分子量は673と推定された(図12)。【００５１】
実施例4
セラミダーゼ処理
フラクションIIAのセラミダーゼ処理を行い、スフィンゴイドと脂肪酸が生成することを確認した。反応系は100μgのフラクションIIA、25mM Tris-HCl buffer、pH7.5、0.1% Triton X-100.2.5 mM CaCl2、100 mU 緑膿菌リコンビナントセラミダーゼとなるようにtotal 400μLとした。37℃で一晩反応させた。反応液にC:M:0.2%NaCl水溶液=8:4:3となるようにC:M=2:1を加えて分離し、下層を回収した。下層を乾固し、20μLのC:M=2:1に溶かし5μLをTLCプレートに負荷し、C:M:25%アンモニア水=90:10:1で展開した。展開後、ニンヒドリン試薬を噴霧しホットプレート(120℃)で加熱し、発色させた。また、クマシーブリリアントブルー試薬染色を行った。
結果:
酵素反応させたものはニンヒドリン試薬によりスフィンゴイドが生成していることが確認された。また、クマシーブリリアントブルー試薬染色により脂肪酸も生成していることが確認された。スフィンゴイドと脂肪酸が検出されたことからIIAはセラミドであることが確認できた(図13)。【００５２】
実施例5
未同定の脂肪酸のGC:MS分析
フラクションIIAの未同定の脂肪酸をGC:MSで分析した。
結果:
IIAの未同定の脂肪酸はサンプルデータとライブラリーデータC24:1 (15-tetracosenoic acid methyl ester)の比較からC24:1と推定された(図14)。【００５３】
実施例6
未同定セラミドの構造決定
1．FAB-MS分析
IIA画分を、移動相をメタノールとしたInertosil ODS-3 カラムで、流速1 ml/minで溶出する逆相HPLCで、さらに3画分に分離した。そのうちの、未同定のスフィンゴイドを含む画分について、JEOL 社製のFAB-MS測定装置HX110/100にて、マトリックスにトリエタノールアミンを用いて、(+) FAB normal scanスペクトルを測定した。
結果
得られたチャートを図15に示す。long chain baseを示すイオン(LCB+)はm/z 274であり、既知の標品 d18:1の値(LCB+：264)より10大きい値であることから、未同定のスフィンゴイドはd19:3と考えられた。不飽和結合のうち1つの位置は4-eneと考えられるので、残りの2個の不飽和結合と、1個分のCH2の位置を決定する必要がある。主鎖にメチレンが1個挿入されると奇数炭素鎖となるのでメチル分枝が推定された。【００５４】
2．MS/MS分析
LCB+の構造を知るために、JEOL 社製のFAB-MS測定装置HX110/100にて、m/z 274をprecursor ionとするMS/MSスペクトルを測定した。
結果
charge-remote fragmentation のイオン系列から主鎖中C8(m/z108)とC11(m/z174)の間に不飽和結合2個とメチル分枝が存在することが確認できた(図16、図17)。【００５５】
考え得る構造は、メチル基の位置が9位又は10位の2種類に絞られた。試料のMS/MSスペクトル上にm/z 148が観測されたことから、9-methylが示唆されるが、イオン強度が弱く、かつこれに相当する10-methyl体のイオンm/z 134は9-methylのイオンm/z 148からも生じるのでm/z 148とm/z 134を比較しても無意味である。【００５６】
そこで、Charge-directed product ions (=charge mediated product ions)を精査した。図18の左側に9-methylから生じ得るフラグメントイオンを示し、右側に10-methyl構造から生じ得るフラグメントイオンを示す。違いはC9−C10位間の単結合開裂イオンの質量差で、9-methyl体からはm/z 131が生じる(これは10-methyl体からは生じない)。10-methyl体で生じるm/z 117は、9-methyl体からも生じ得るためその存在を異性体の区別に用いることはできない。【００５７】
一方、standardとして用いた、ヒトデ精巣より得られたglucosylceramideの長鎖塩基のデータ(図19)、イカ神経節スフィンゴミエリンのd19:3長鎖塩基のMS/MSスペクトルとの比較から、9-methyl体の存在は確実である。しかし、10-methyl体が全く存在しないか混在するかどうかに関しては、確実には判断できなかった。【００５８】
以上、硬骨魚類ニジマスの皮に、脊椎動物には今まで存在しないと言われていた新規セラミド（スフィンゴイド：d19:3、脂肪酸：C24:1）を見いだした。その主要なメチル基の位置は、C9位であるが、微量成分としてC10位にメチル基を持つものが混在する可能性は現時点では否定できない。なお、図20に、ニジマス皮の分析スキームの概略を示す。【００５９】
実施例7
ミナミダラ魚皮由来のセラミドの分析
原料としてミナミダラ皮を用い、上記のニジマス皮における実施例の手法に準じてセラミドの調製、セラミドを構成するスフィンゴシン及び脂肪酸の分析を行った。図21に、ミナミダラ皮の分析スキームの概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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