(57)【要約】(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、物質(b)を物質(a)および／または物質(c)と組み合わせてなる、メモリーCTL誘導増強剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）および(ｃ)：
（ａ）抗原提示細胞の活性化物質、
（ｂ）Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、
（ｃ）抑制性Ｔ細胞の抑制物質、
のうち、物質（ｂ）を、物質（ａ）および／または物質（ｃ）と組み合わせてなる、メモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２】
前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）とを組み合わせてなる、請求項１記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３】
前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）を同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、請求項２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、請求項２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が前記物質（ａ）を含有する薬剤と前記物質（ｂ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、請求項２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項６】
前記物質（ａ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項７】
前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項８】
前記物質（ａ）がＴＬＲ活性化物質である、請求項２〜７いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項９】
ＴＬＲ活性化物質がＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド、またはＴＬＲ３リガンドである、請求項８記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項１０】
前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、請求項２〜９いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項１１】
Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、請求項１０記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項１２】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、請求項２〜１１いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項１３】
癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、請求項２〜１２いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項１４】
哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）とを投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項１５】
前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、請求項１４記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項１６】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、請求項１４または１５記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項１７】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、請求項１４〜１６いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項１８】
前記物質（ａ）および前記物質（ｂ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用。
【請求項１９】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、請求項１８または１９記載の使用。
【請求項２１】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、請求項１８〜２０いずれか記載の使用。
【請求項２２】
前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）とを組み合わせてなる、請求項１記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２３】
前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）を同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、請求項２２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２４】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、請求項２２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２５】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が前記物質（ｂ）を含有する薬剤と前記物質（ｃ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、請求項２２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２６】
前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２７】
前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２８】
前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、請求項２２〜２７いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項２９】
Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、請求項２８記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３０】
前記物質（ｃ）が抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１５２抗体または抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかである、請求項２２〜２９いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３１】
前記物質（ｃ）が抗ＣＤ２５抗体である、請求項３０記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３２】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、請求項２２〜３１いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３３】
癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、請求項２２〜３２いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項３４】
哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）とを投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項３５】
前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、請求項３４記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項３６】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、請求項３４または３５記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項３７】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、請求項３４〜３６いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項３８】
前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用。
【請求項３９】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、請求項３８または３９記載の使用。
【請求項４１】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、請求項３８〜４０いずれか記載の使用。
【請求項４２】
前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質(ｃ)を組み合わせてなる、請求項１記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４３】
前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）のいずれかを同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、請求項４２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４４】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、請求項４２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４５】
メモリーＣＴＬ誘導増強剤が、前記物質（ａ）を含有する薬剤、前記物質（ｂ）を含有する薬剤、および前記物質（ｃ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、請求項４２記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４６】
前記物質（ａ）を含有する薬剤および前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４７】
前記物質（ａ）を含有する薬剤および前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４８】
前記物質（ｂ）を含有する薬剤および前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項４９】
前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与した後に投与される、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬの誘導増強剤。
【請求項５０】
前記物質（ａ）を投与する前に投与される、前記物質（ｂ）および／または前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬの誘導増強剤。
【請求項５１】
前記物質（ａ）がＴＬＲ活性化物質である、請求項４２〜５０いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５２】
ＴＬＲ活性化物質がＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド、またはＴＬＲ３リガンドである、請求項５１記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５３】
前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、請求項４２〜５２いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５４】
Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、請求項５３記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５５】
前記物質（ｃ）が抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１５２抗体または抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかである、請求項４２〜５４いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５６】
前記物質（ｃ）が抗ＣＤ２５抗体である、請求項５５記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５７】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、請求項４２〜５６いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５８】
癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、請求項４２〜５７いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤。
【請求項５９】
哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項６０】
前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、請求項５９記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項６１】
前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与後に前記物質（ａ）を投与することを特徴とする、請求項６０記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項６２】
抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、請求項５９〜６１いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項６３】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、請求項５９〜６２いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項６４】
前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用。
【請求項６５】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、請求項６４記載の使用。
【請求項６６】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与後に前記物質（ａ）を投与する、請求項６５記載の使用。
【請求項６７】
メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、請求項６４〜６６いずれか記載の使用。
【請求項６８】
癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、請求項６４〜６７いずれか記載の使用。
【請求項６９】
（ｂ）Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質を有効成分として含有する、（ａ）抗原提示細胞の活性化物質および／または（ｃ）抑制性Ｔ細胞の抑制物質によるメモリーＣＴＬ誘導増強の、増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なメモリーＣＴＬ誘導増強剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、物質(b)を物質(a)および／または物質(c)と組み合わせてなる、メモリーCTL誘導増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法であるワクチンの歴史は、ジェンナーの牛痘を用いた天然痘の予防接種に始まる。牛痘に感染したウシの乳搾りは天然痘に罹りにくいという説から、人為的に牛痘を接種し天然痘を予防することを考え、その有効性を確かめた。そして、パスツールは弱毒した病原菌を接種することで病気を予防し、人為的な獲得免疫を実証した。予防接種、即ちワクチンによる予防効果は、初回抗原暴露に対する１次免疫応答に比較して２回目以降の免疫応答が時間的、量的、質的に優れているという獲得免疫に依存している。この獲得免疫は主に抗原特異的な認識能を有する、かつそれを記憶（メモリー）し得るT細胞に依存している。HIVによる獲得免疫不全の病態の発症はT細胞の機能不全に相関することからも明らかである。よって、ワクチンによる獲得免疫の成立には抗原特異的なT細胞の効果的なメモリー化が重要である。【０００３】
獲得免疫は主に細胞性免疫および液性免疫に大別される。これまでワクチンによる獲得免疫は主に液性免疫である抗体産生に注目が集まっていた。近年、ワクチンによる獲得免疫における細胞性免疫の重要性が問われ、その主要細胞のCD8陽性T細胞である細胞障害性T細胞（CTL）の必要性が提唱された。現在、ワクチンによるCTL誘導の最適化はなされておらず、今後の技術革新が期待されている。【０００４】
これまでのワクチンは主にウイルスや微生物本体、およびその構成成分などが用いられてきた。安全でより有効なワクチンの開発という観点で、有効成分の最小単位のワクチンが望まれている。T細胞による抗原認識の最小単位はMHC分子によって提示されるペプチドによって既定されている。CD8陽性T細胞はMHCクラスI分子によって提示される主に８〜１１残基のペプチドを認識する。この最小単位のペプチドをワクチンとして用い効果的なCTLを誘導できれば、より安全でより有効なワクチンを創製できることになる。【０００５】
上記背景から、より安全でより有効なワクチンによる獲得免疫の成立には、特異的に認識される最小単位であるペプチドを用いて誘導したCTLが効果的にメモリー化されることが重要となる。これまで臨床応用されたペプチドワクチンの癌に対する治療効果は有効率5 %程度と低い（非特許文献１を参照)。ペプチドワクチンによる特異的CTLの誘導率は低く、平均で血液中CD8陽性T細胞の0.1〜1 %程度である（非特許文献２、３、４を参照）。一方、急性ウイルス感染時では血液中CD8陽性細胞中のウイルス抗原特異的CTLの割合は10 %を超える(非特許文献５を参照）。よって、ウイルス感染に匹敵するようなCTL誘導率を示すペプチドワクチンを開発することができれば、癌の治療効果を飛躍的に高めることが期待できる。【０００６】
急性ウイルス感染並みにCTLを増殖させるには、ワクチンの反復投与によるCTLの継続的な増幅が重要となる。CTLが継続して増殖するには効果的にメモリー化されることが重要である。CTLのメモリー化にはCD4陽性T細胞のヘルプが必要である(非特許文献６を参照）。正常なCD4陽性T細胞からのヘルプがない場合、抗原刺激により一過的にCTLは増殖するが、活性化に依存した細胞死が誘導され、継続的な増幅に必要なメモリーCTLは誘導されない(非特許文献７を参照）。抗原認識の最小単位であるペプチドのみのワクチンでは、正常なCD4陽性T細胞からのヘルプが期待できない。よって、継続的増幅可能なメモリーCTLを誘導するにはペプチドワクチンに他の因子を追加する必要がある。【０００７】
正常なCD4ヘルプに匹敵するメモリーCTL誘導に関わる因子として、(1)抗原提示細胞の活性化、(2)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation、(3)抑制性T細胞の抑制、などに関わる因子が知られており、各々単独でのアジュバント作用(CTL誘導増強作用)は報告されているものの、CTLの中でも特にメモリーCTLを効率よく誘導したという報告は無い。また前記(1)のカテゴリーに属するTLR9リガンドのCpG-DNAおよび前記(3)のカテゴリーに属する抗CD25抗体を組み合わせてアジュバントとして用いた報告があるが、ペプチドワクチンによるメモリーCTL誘導（recall response）に対して、両アジュバントの組合せによる明確な相加・相乗効果はないと報告されている（非特許文献８を参照）。【０００８】
【非特許文献１】Rosenberg SA et al., Nat. Med. 10:909-915 (2004）
【非特許文献２】Slingluff CL et al., Clin. Cancer Res. 7:3012-3024 (2001)
【非特許文献３】Schaed S et al., Clin. Cancer Res. 8:967-972 (2002)
【非特許文献４】Walker EB et al., Clin. Cancer Res. 10:668-680 (2004)
【非特許文献５】Hislop AD et al., J. Exp. Med. 197:893-905 (2002）
【非特許文献６】Janssen EM et al., Nature 421:852-856 (2003）
【非特許文献７】Janssen EM et al., Nature 434:88-93 (2005）
【非特許文献８】Toka FN et al., J.Viol. 78:13082-13089 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、物質(b)を物質(a)および／または物質(c)と組み合わせてなる、メモリーCTL誘導増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者はワクチンによるメモリーCTLの誘導を効果的に増強することの可能なアジュバント(メモリーCTLの誘導増強剤)につき鋭意検討を行った。その結果、以下の(a)、(b)および(c)：
(a)抗原提示細胞の活性化物質、
(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、
(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質、
のカテゴリーうち、
・(a)に属する物質と(b)に属する物質の組み合わせ、
・(b)に属する物質と(c)に属する物質の組み合わせ、
・(a)に属する物質、(b)に属する物質および(c)に属する物質の組み合わせ、
により、各々単独での使用、もしくは従来知られていた組み合わせ((a)に属する物質と(c)に属する物質の組み合わせ)での使用に比して、格段に効率良くメモリーCTLを誘導増強できることが明らかとなった。特に前記3種類の物質の組み合わせにより、ワクチンによるメモリーCTLの誘導が劇的に向上し、ワクチンの反復投与によるCTLの継続的な増幅が、これら3種の物質の組み合わせにより可能となることが明らかとなった。
このように本発明は、メモリーCTLの誘導増強にあたり、前記(b）に属する物質を、前記(a)に属する物質および／または前記(c)に属する物質に必ず組み合わせて用いることが重要であるという概念をも提供するものでもある。【００１１】
具体的には本発明者は、前記(a)に属する物質としてtoll-like receptors（TLR）の活性化物質であるTLR7リガンド(R848)（Hemmi H et al., Nat. Immunol. 3:196-200(2002)）、TLR9リガンド(CpG)(Hemmi H et al., Nature 408:740-745(2000))、TLR3リガンド(ポリ（A:U))(Alexopoulou L et al., Nature 413:732-738(2001))を、前記(b)に属する物質としてシクロホスファミド（Lutsiak ME et al., 2005 Blood 105:2862-2868）、カルムスチン(Maze R et al., J. Immunol. 158:1006-1013(1997))を、また前記(c)に属する物質として抗CD25抗体（Pasare C & Medzhitov R, 2003 Science 299:1033-1036）、抗CD152抗体(Takahashi T et al., 2000 J. Exp. Med. 192:303-310)、抗GITR抗体(Shimizu J et al., 2002 Nat. Immunol. 3:135-142)を選択し、検討を行うことにより、前記の結論に至った。【００１２】
なおシクロホスファミドは従来、前記(c)に属する物質であるという見解が主流であったところ（Ercolini AM et al., J. Exp. Med. 201:1591-1602(2005)）、後述の実施例において、前記(c)に属する物質である抗CD25抗体との組み合わせにより相乗効果が認められたことから、(c)のカテゴリーではなくむしろ前記(b)に属する物質であることが示された。このようにシクロホスファミドが前記(b)に属する物質であるということが本発明により明らかになったため、当該シクロホスファミドを別のカテゴリーである前記(c)に属する物質と組み合わせようとの発想が可能となったのである。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。【００１３】
すなわち本発明は、
(1)  以下の（ａ）、（ｂ）および(ｃ)：
（ａ）抗原提示細胞の活性化物質、
（ｂ）Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、
（ｃ）抑制性Ｔ細胞の抑制物質、
のうち、物質（ｂ）を、物質（ａ）および／または物質（ｃ）と組み合わせてなる、メモリーＣＴＬ誘導増強剤、【００１４】
(2)  前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）とを組み合わせてなる、前記(１)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(3)  前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）を同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、前記(２）記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(4)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、前記(２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(5)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が前記物質（ａ）を含有する薬剤と前記物質（ｂ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、前記(２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(6)  前記物質（ａ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(7)  前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(8)  前記物質（ａ）がＴＬＲ活性化物質である、前記(２)〜(７)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(9)  ＴＬＲ活性化物質がＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド、またはＴＬＲ３リガンドである、前記(８)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(10)  前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、前記(２)〜(９)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(11)  Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、前記(１０)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(12)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、前記(２)〜(１１)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(13)  癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、前記(２)〜(１２)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、【００１５】
(14)  哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）とを投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(15)  前記物質（ａ）と前記物質（ｂ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、前記(１４)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(16)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、前記(１４)または(１５)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(17)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、前記(１４)〜(１６)いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(18)  前記物質（ａ）および前記物質（ｂ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用、
(19)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、前記(１８)記載の使用、
(20)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、前記(１８)または(１９）記載の使用、
(21)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、前記(１８)〜(２０)いずれか記載の使用、【００１６】
(22)  前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）とを組み合わせてなる、前記(１)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(23)  前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）を同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、前記(２２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(24)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、前記(２２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(25)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が前記物質（ｂ）を含有する薬剤と前記物質（ｃ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、前記(２２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(26)  前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(27)  前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(28)  前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、前記(２２)〜(２７)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(29)  Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、前記(２８)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(30)  前記物質（ｃ）が抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１５２抗体または抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかである、前記(２２)〜（２９)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(31)  前記物質（ｃ）が抗ＣＤ２５抗体である、前記(３０)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(32)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、前記(２２)〜(３１)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(33)  癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、前記(２２)〜(３２)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、【００１７】
(34)  哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）とを投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(35)  前記物質（ｂ）と前記物質（ｃ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、前記(３４)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(36)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、前記(３４)または(３５)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(37)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、前記(３４)〜(３６)いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(38)  前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用、
(39)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、前記(３８)記載の使用、
(40)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、前記(３８)または(３９)記載の使用、
(41)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、前記(３８)〜(４０)いずれか記載の使用、【００１８】
(42)  前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質(ｃ)を組み合わせてなる、前記(１)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(43)  前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）のいずれかを同時に、別々に、または経時的に投与することを特徴とする、前記(４２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(44)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が配合剤であることを特徴とする、前記(４２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(45)  メモリーＣＴＬ誘導増強剤が、前記物質（ａ）を含有する薬剤、前記物質（ｂ）を含有する薬剤、および前記物質（ｃ）を含有する薬剤を含むキットであることを特徴とする、前記(４２)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(46)  前記物質（ａ）を含有する薬剤および前記物質（ｂ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(47)  前記物質（ａ）を含有する薬剤および前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ｂ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(48)  前記物質（ｂ）を含有する薬剤および前記物質（ｃ）を含有する薬剤と組み合わせて用いるための、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(49)  前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与した後に投与される、前記物質（ａ）を含有するメモリーＣＴＬの誘導増強剤、
(50)  前記物質（ａ）を投与する前に投与される、前記物質（ｂ）および／または前記物質（ｃ）を含有するメモリーＣＴＬの誘導増強剤、
(51)  前記物質（ａ）がＴＬＲ活性化物質である、前記(４２)〜(５０)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(52)  ＴＬＲ活性化物質がＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド、またはＴＬＲ３リガンドである、前記(５１)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(53)  前記物質（ｂ）がLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質である、前記(４２)〜(５２)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(54)  Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質がシクロホスファミドまたはカルムスチンである、前記(５３)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(55)  前記物質（ｃ）が抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１５２抗体または抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかである、前記(４２)〜（５４)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(56)  前記物質（ｃ）が抗ＣＤ２５抗体である、前記(５５)記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(57)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に用いられる、前記(４２)〜(５６)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、
(58)  癌またはウイルス感染症の治療または予防に用いられる、前記(４２)〜(５７)いずれか記載のメモリーＣＴＬ誘導増強剤、【００１９】
(59)  哺乳動物に、活性成分として、有効量の前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与することを特徴とする、メモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(60)  前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を同時に、別々にまたは経時的に投与することを特徴とする、前記(５９)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(61)  前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与後に前記物質（ａ）を投与することを特徴とする、前記(６０)記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(62)  抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に投与することを特徴とする、前記(５９)〜(６１)いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(63)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のための、前記(５９)〜(６２)いずれか記載のメモリーＣＴＬの誘導増強方法、
(64)  前記物質（ａ）、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）の、メモリーＣＴＬ誘導増強剤の製造における使用、
(65)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、同時に、別々にまたは経時的に使用される、前記(６４)記載の使用、
(66)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、前記物質（ｂ）および前記物質（ｃ）を投与後に前記物質（ａ）を投与する、前記(６５)記載の使用、
(67)  メモリーＣＴＬの誘導増強において、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドと共に使用される、前記(６４)〜(６６)いずれか記載の使用、
(68)  癌またはウイルス感染症の治療または予防のために用いられる、前記(６４)〜(６７)いずれか記載の使用、【００２０】
(69)  (ｂ)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質を有効成分として含有する、（ａ）抗原提示細胞の活性化物質および／または(ｃ)抑制性Ｔ細胞の抑制物質によるメモリーＣＴＬ誘導増強の、増強剤、
(70)  (ａ)抗原提示細胞の活性化物質を有効成分として含有する、(ｂ)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質および／または(ｃ)抑制性Ｔ細胞の抑制物質によるメモリーＣＴＬ誘導増強の、増強剤、ならびに
(71)  (ｃ)抑制性Ｔ細胞の抑制物質を有効成分として含有する、(ａ)抗原提示細胞の活性化物質および／または(ｂ)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質によるメモリーＣＴＬ誘導増強の、増強剤、に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、物質(b)を、物質(a)および／または物質(c)と組み合わせて用いることにより、効率よくメモリーCTLの誘導増強を行うというものである。本発明のメモリーCTL誘導増強剤および誘導増強方法は、癌若しくはウイルス感染症の免疫療法において有効に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、以下の(a)、(b)および(c)：
(a)抗原提示細胞の活性化物質、
(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、
(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質、
のうち、物質(b)を、物質(a)および／または物質(c)と組み合わせてなる、メモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法を提供する（以下、これらメモリーＣＴＬ誘導増強剤または誘導増強方法を併せて、単にメモリーＣＴＬの誘導増強剤と称することがある）。【００２３】
より具体的には、以下の３つの形態にかかるメモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法を提供する：
(1) 前記物質(a)と前記物質(b)とを組み合わせてなる、メモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法、
(2) 前記物質(b)と前記物質(c)とを組み合わせてなる、メモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法、
(3) 前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)を組み合わせてなる、メモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法。
このうち前記(3)の、前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)を組み合わせてなるメモリーＣＴＬの誘導増強剤または誘導増強方法が最も好ましい。【００２４】
前記において「(a)抗原提示細胞の活性化物質」とは、抗原提示細胞の活性化作用を有するものとして従来知られている物質であれば、特に制限されない。代表的なものとして、Toll-like receptors（TLR）の活性化物質（Akira S & Hemmi H Immunol. Lett. 85:85-95(2003)）が挙げられる。【００２５】
当該TLRの活性化物質として具体的には、TLR2リガンド、TLR2/4デュアルリガンド、TLR3リガンド、TLR4リガンド、TLR5リガンド、TLR7リガンド、またはTLR9リガンドなどが挙げられる。【００２６】
TLR2リガンドとしては、例えばペプチドグリガン、リポプロテイン、グリコリピッド、リポアラビノマンナン、Zymosan、外膜プロテインAなどが挙げられる。
TLR2/4デュアルリガンドとしては、例えばLPS、Lipid A、Heat Shock Proteinなどが挙げられる。
TLR3リガンドとしては、例えば二本鎖RNA、ポリ（I:C）、ポリ（A:U）などが挙げられる。
TLR4リガンドとしては、例えばFlavolipin、Fプロテイン、Taxolなどが挙げられる。
TLR5リガンドとしては、例えばFlagellinなどが挙げられる。
TLR7リガンドとしては、例えばイミダゾキノリン系化合物（R837、R848）、アデニン系化合物、一本鎖RNA、Loxoribineおよびその構造類縁体、Bropirimineおよびその構造類縁体などが挙げられる。
TLR9リガンドとしては、例えばCpGあるいはCpR配列を含む免疫刺激性DNAなどが挙げられる。
これらの物質のうち、好ましくはTLR7リガンド、TLR9リガンド、TLR3リガンドが挙げられ、より好ましくはTLR7リガンドが挙げられる。【００２７】
以上に示した物質はいずれも公知の物質である。このうち、アデニン系化合物の構造および製造方法についてはWO 98/1448号公報、WO 99/28321号公報、WO 02/85905号公報などに記載されている。また一本鎖RNAの構造および製造方法については WO 03/086280号公報、Heil F et al., Science 303:1526-1529（2004)、Diebold SS et al., Science 303:1529-1531（2004）などに記載されている。またCpR免疫刺激性DNAの構造および製造方法については Kandimalla ER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:6925-6930（2005) などに記載されている。それ以外の前記物質の構造および製造方法については、Akira S & Hemmi H Immunol. Lett. 85:85-95(2003)などに記載されている。
なおTLRの活性化がアジュバント活性を有することは、例えば Pasare C & Medzhitov R, Immunity 21:733-741(2004)などに示されている。【００２８】
前記において「(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質」とは、Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導作用を有するものとして従来知られている物質であれば、特に制限されず、Lymphopeniaの誘導に関与する物質であっても、Homeostatic proliferationの誘導に関与する物質であっても良い。代表的なものとして、Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質(癌化学療法剤）、放射線(放射線照射)、およびHomeostatic proliferationを誘導するcommonγchainをレセプターとするT細胞増殖因子などが挙げられる。【００２９】
Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質としては、例えばシクロホスファミドまたはカルムスチンが挙げられる（Morrissey PJ et al., J. Immunol. 146:1547-1552(1991)およびMaze R et al., J. Immunol. 158:1006-1013(1997)）。
Lymphopeniaを誘導するために照射する放射線としては、例えばX線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線などが挙げられる（Peacock CD et al., J. Immunol. 171:655-663(2003)）。【００３０】
Homeostatic Proliferationを誘導するcommonγchainをレセプターとするT細胞増殖因子としては、例えばIL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21などが挙げられる（Kovanen PE & Leonard WJ, Immunol. Rev. 202:67-83(2004)）。
これらの物質のうち、好ましくはLymphopeniaを誘導する癌化学療法物質が挙げられる。当該癌化学療法物質として好ましくはシクロホスファミド、カルムスチンが挙げられ、より好ましくはシクロホスファミドが挙げられる。【００３１】
以上に示した物質はいずれも公知であり、その構造および製造方法については前記文献等を参照されたい。
なお代表的なものとして、シクロホスファミドがアジュバント活性を有することは、例えば Ghiringhelli F et al., Eur. J. Immunol. 34:336-344(2004)、Lutsiak ME et al., Blood 105:2862-2868(2005)、Bosco N et al., J. Immunol. 175:162-170(2005)、Mihalyo MA et al., J. Immunol. 172:5338-5345(2004）などに示されている。【００３２】
前記において「(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質」とは、抑制性Ｔ細胞に対する抑制作用を有するものとして従来知られている物質であれば、特に制限されない。代表的なものとして、抑制性T細胞上の表面抗原に結合する抗体および低分子合成化合物が挙げられる。
抑制性T細胞上の表面抗原に結合する抗体としては、例えば抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗CD152抗体、または抗GITR抗体などが挙げられる（Takahashi T et al., 2000 J. Exp. Med. 192:303-310、Shimizu J et al., 2002 Nat. Immunol. 3:135-142）。【００３３】
抑制性T細胞を抑制する低分子化合物としては、例えば P2X7Rリガンド、ATP、NAD、ベンンゾイルベンゾイルATPなどが挙げられる（Aswad F et al., 2005 J. Immunol. 175:3075-3083）。
これらの物質のうち、好ましくは抑制性T細胞上の表面抗原に結合する抗体が挙げられる。好ましくは抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗CD152抗体または抗GITR抗体が挙げられる。より好ましくは抗CD25抗体が挙げられる。【００３４】
以上に示した物質はいずれも公知であり、その構造および製造方法については前記文献を参照されたい。
なお代表的なものとして、抗CD25抗体がアジュバント活性を有することは、例えばCasares N et al., J. Immunol. 171:5931-5989(2003)、Toka FN  et al., J. Virol. 78:13082-13089(2004)、Yu P et al., J. Exp. Med. 201:779-791(2005）などに示されている。【００３５】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、
(1)前記物質(a)と前記物質(b)との組み合わせ、
(2)前記物質(b)と前記物質(c)との組み合わせ、または
(3)前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)の組み合わせ、
に係るものであれば、これに属する如何なる物質の組み合わせであっても良い。また前記(a)、(b)、(c)の各カテゴリーから1種のみならず2種以上の物質を選択することができる。【００３６】
前記のうち(1)の「前記物質(a)と前記物質(b)との組み合わせ」としては、(a)TLR活性化物質と（b)Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質との組み合わせが好ましい。中でも(a)TLR7リガンド、TLR9リガンドまたはTLR3リガンドと、(b)シクロホスファミドまたはカルムスチンの組み合わせが好ましい。
前記のうち(2)の「前記物質(b)と前記物質(c)との組み合わせ」としては、(b)Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質と(c)抑制性T細胞上の表面抗原に結合する抗体との組み合わせが好ましい。中でも(b)シクロホスファミドまたはカルムスチンと、(c)抗CD25抗体、抗CD152抗体または抗GITR抗体の組み合わせが好ましい。特に(b)シクロホスファミドと(c)抗CD25抗体の組み合わせが好ましい。【００３７】
前記のうち(3)の前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)の組み合わせとしては、(a)TLR活性化物質、(b)Lymphopeniaを誘導する癌化学療法物質、(c)抑制性T細胞上の表面抗原に結合する抗体の組み合わせが好ましい。中でも(a)TLR7リガンド、TLR9リガンドまたはTLR3リガンド、(b)シクロホスファミドまたはカルムスチン、(c)抗CD25抗体、抗CD152抗体または抗GITR抗体の組み合わせが好ましい。特に(a)TLR7リガンド、(b)シクロホスファミド、(c)抗CD25抗体の組み合わせが好ましい。
前記(1)、(2)、(3)のうち、(3)の「前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)の組み合わせ」が特に好ましい。【００３８】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（ワクチン）と共に用いられ、当該抗原タンパク質または抗原ペプチドによるメモリーCTL誘導を増強することができる。他方、生体に存在する内因性のメモリーCTLの誘導を増強することも可能である。【００３９】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤が抗原タンパク質または抗原ペプチドと共に用いられる場合、当該抗原タンパク質および抗原ペプチドとしては、従来公知の抗原タンパク質および抗原ペプチドであれば、特に制限されない。具体的には、癌抗原タンパク質およびそれに由来する癌抗原ペプチド、あるいはウイルス抗原タンパク質およびそれに由来するウイルス抗原ペプチドが挙げられる。【００４０】
癌抗原タンパク質としては、例えばMAGE（Science，254:p1643 (1991))、gp100（J.Exp.Med.，179:p1005(1994)）、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:p3515 (1994)）、チロシナーゼ（J.Exp.Med.，178:p489 (1993)）、MAGE関連タンパク質群（J.Exp.Med.，179:p921 (1994)）、β−カテニン（J.Exp.Med.，183:p1185(1996)）、CDK4（Science ，269 ：p1281(1995)）、HER2/neu(J.Exp.Med.，181:p2109(1995)）、変異型p53（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:p14704(1996)）、CEA（J.Natl.Cancer.Inst.，87:p982(1995)）、PSA（J.Natl.Cancer.Inst.，89:p293(1997)）、WT1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101:p13885(2004))、HPV（J.Immunol.，154:p5934(1995)）、EBV（Int.Immunol.，7:p653(1995)）などが挙げられる。【００４１】
ウイルス抗原タンパク質としては、HIV、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、HPV、HTLV、EBV等のウイルス由来の抗原タンパク質が挙げられる。【００４２】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、従来なく効率的にメモリーCTLの誘導を増強することができるため、特異的CTLの誘導率が低い抗原ペプチド（ペプチドワクチン）とも組み合わせて用いることができる。以下に具体的な抗原ペプチドについて例示する（各数字は癌抗原タンパク質のアミノ酸配列上の位置を示す）。【００４３】
(1）癌抗原に由来する癌抗原ペプチド
・MAGEA3ペプチド168-176（Coulie PG et al.,Immunol. Rev. 188:33(2002))、
・gp100ペプチド209-217（Rosenberg SA et al., Nat. Med. 4:321(1998)）、
・Melan-Aペプチド27-35（Cormier JN et al., Cancer J. Sci. Am. 3:37(1997)）、
・Melan-Aペプチド26-35、Tyrosinaseペプチド1-9、Tyrosinaseペプチド368-376、gp100ペプチド280-288、gp100ペプチド457-466（Jager E et al., Int. J. Cancer 67:54(1996)）、
・HER-2ペプチド369-384、HER-2ペプチド688-703、HER-2ペプチド971-984（Knutson KL et al., J. Clin. Invest. 107:477(2001)）、
・MAGE-A12ペプチド170-178（Bettinotti MP et al., Int. J. Cancer 105:210(2003)）、
・gp100ペプチド280-288（Phan GQ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8372(2003)）【００４４】
(2)ウイルス抗原に由来するウイルス抗原ペプチド
・インフルエンザマトリックスプロテインペプチド58-66（Jager E et al., Int. J. Cancer 67:54(1996)）、
・HPV16 E7ペプチド86-93（van Driel WJ et al., Eur. J. Cancer 35:946(1999)）、
・HPV E7ペプチド12-20（Scheibenbogen C et al., J. Immunother 23:275(2000)）、
・HPV16 E7ペプチド11-20（Smith JWI et al., J. Clin. Oncol. 21:1562(2003)）【００４５】
抗原タンパク質は、Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratoy Press(1989)等の基本書に従って、抗原タンパク質をコードするcDNAをクローニングし宿主細胞で発現させることにより調製することができる。
抗原ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis）, Interscience，New York, 1966；ザ・プロテインズ（The Proteins）, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成, 丸善（株）, 1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）, 1985；医薬品の開発  続  第14巻・ペプチド合成, 広川書店, 1991）などに記載されている方法が挙げられる。【００４６】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、癌またはウイルス感染症の治療または予防として用いられる。【００４７】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤の有効成分である以下の(a)、(b)、(c)：
(a)抗原提示細胞の活性化物質、
(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、
(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質、
に属する各物質は、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤、乳化剤などと混合して製剤化することができる。製剤中における前記各物質の量は、メモリーCTLの誘導増強が可能であれば特に限定されない。例えば非経口剤の場合、1回の投与当たり、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜100mg、より好ましくは0.01mg〜10mgとなるように製剤化されていれば良い。【００４８】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤の有効成分である前記物質(a)、(b)、(c)は、製剤として用いるにあたり、非経口的または経口的に投与することができる。すなわち溶液、乳化剤、懸濁液等の液剤の型にしたものを注射剤として投与することができ、必要に応じて緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。坐剤の形で直腸投与することもできる。また、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の形で経口的に投与することができる。このような投与剤形は通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤などと有効成分（メモリーCTLの誘導増強作用を有する本発明物質）を配合することにより、一般的方法に従って製造することができる。【００４９】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤の投与方法としては、経口投与および非経口投与のいずれでも良いが、非経口投与が好ましい。非経口投与の場合、皮下注射、持続皮下注射、皮内注射、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、腹腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、経鼻投与等が挙げられる。また浸透圧ポンプなどを用いて連続的に徐々に投与することや、徐放性製剤を調製し、埋め込むことも可能である。本発明のメモリーCTL誘導増強剤の各成分（前記物質(a)、(b)、(c)）は、それぞれ同じ投与方法（投与ルート）で投与されても異なる投与方法(投与ルート)で投与されても良い。投与回数は特に限定されないが、通常、数日ないし数ヶ月に１回投与、あるいは数日ないし数ヶ月間隔の休薬期間を取る連日投与を行う。【００５０】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、
(1)前記物質(a)と前記物質(b)との組み合わせ、
(2)前記物質(b)と前記物質(c)との組み合わせ、または
(3)前記物質(a)、前記物質(b)及び前記物質(c)の組み合わせ、
に係るものであれば、以下のいずれの形態においても用いることができる：
(A)前記各組み合わせに係る物質を混合して得られる配合剤（合剤）の形態。
(B)前記各組み合わせに係る物質を個別に含有する薬剤を含むキットの形態。
(C)前記各組み合わせに係る物質を個別に含有する薬剤を、同時に、別々に、または経時的に投与する併用の形態。
このうち前記(3)の組み合わせに係る(A）、(B）及び(C）の各形態が好ましい。【００５１】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤が配合剤（合剤）の場合、前記物質(a)と前記物質(b)の配合比、前記物質(b)と前記物質(c)配合比、また前記物質(a)、(b)及び(c)の配合比は特に制限されるものではない。当該メモリーCTL誘導増強剤の１回の投与当たりに、各有効成分が前記投与量で投与されるように当該メモリーCTL誘導増強剤中に含有されていれば良い。当該配合剤は、配合剤として製剤化されたものであっても良く、また患者への投与時に用時調製(混合)されても良い。【００５２】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤がキットの場合、前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)は、別々に製剤化され別々の容器中に封入される。キットとは、これら各薬剤を含有する容器を１つの梱包容器中に存在させた形態である。
キットに含まれる各薬剤(各成分)は、患者への投与時に用時調整（混合）して用いることができる。また、キットに含まれる各薬剤（各成分）を同時に、別々に、または経時的に使用することもできる（詳細は下記の併用形態を参照のこと）。【００５３】
本発明のメモリーCTL誘導増強剤を同時に、別々に、または経時的に投与する併用の場合、前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)は別々に製剤化され別々の容器中に封入されたものを使用する。前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)を同時に、別々に、または経時的に投与する際の投与方法（皮下注射、皮内注射、静脈注射といった投与ルート）は同じ投与方法であっても異なる投与方法であっても良い。
別々に投与する場合、前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)のいずれが先でいずれが後であっても良く、また個々の物質の投与回数もメモリーCTLの誘導増強作用が認められる限り制限はない。
経時的に投与する場合、前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)のいずれが先でいずれが後であっても良く、また個々の物質の投与回数もメモリーCTLの誘導増強作用が認められる限り制限はない。【００５４】
別々若しくは経時的に投与する場合、前記物質(a)、前記物質(b)、前記物質(c)の投与間隔としては、先の製剤を投与した直後でも良く、約１日〜6ヶ月間をおいた後であっても良い。1日〜2週間おいた後の投与が好ましい。
以下に好ましい投与方法について記載する。【００５５】
抗原提示細胞の活性化、Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導、抑制性Ｔ細胞の抑制、の各々の作用を有するそれぞれの物質（前記物質(a)、(b)、(c))は、効果を発現するに要する時間が異なることから、効果を最大にするには、それぞれの効果発現の最適な時間を考慮してワクチンと組み合わせて投与することが望ましい。【００５６】
例えば抗原提示細胞の活性化を誘導するTLR7リガンドのR848は、投与1時間後からサイトカインの産生が認められることが知られている（Hemmi H et al., 2002 Nat. Immunol. 3:196-200）。また抑制性T細胞の抑制を誘導する抗CD25抗体を投与すると、投与３日後に抑制性T細胞の量が最低になることが知られている（Pasare C & Medzhitov R, 2003 Science 299:1033-1036）。さらにLymphopenia誘導後のHomeostatic proliferationを誘導するシクロホスファミドを投与すると、３〜４日後にリンパ球の減少がピークとなることが知られている（Lutsiak ME et al., 2005 Blood 105:2862-2868）。【００５７】
従って、例えば抑制性T細胞の抑制に関わる前記物質(c)、およびLymphopenia誘導後のHomeostatic proliferationに関わる前記物質(b)を同日に投与し、その約３日後に、抗原提示細胞の活性化を誘導する前記物質(a)をワクチンと共に投与することにより、得られる効果が最大となると考えられる。【００５８】
従って本発明の好ましい投与方法として、以下の投与方法が例示される：
(1)前記物質(a)および前記物質(b)を併用する場合：
前記物質(b)を投与した後に前記物質(a)を投与する。
(2)前記物質(b)および前記物質(c)を併用する場合：
前記物質(b)と前記物質(a)を同日に投与する。
(3)前記物質(a)、前記物質(b)および前記物質(c)を併用する場合：
前記物質(b)および前記物質(c)を投与した後に、前記物質(a)を投与する。
このうち、前記物質(b)および前記物質(c)を投与した後に、前記物質(a)を投与する投与方法が特に好ましい。【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
ワクチンによるメモリーCTL誘導増強剤の最適な組合せの検討
ワクチン投与による特異的CTLの増殖を直接検出することは感度的に困難である。よって、モデルペプチド（OVA257-264ペプチド）をワクチンとして用い、そのペプチド特異的に増殖するCTLクローン（OT-I）を用いて検出感度を高め、メモリーCTL誘導増強剤の作用を比較した。メモリーCTL誘導増強剤として、シクロホスファミド、抗CD25抗体、およびTLR活性化剤のR848（TLR7リガンド）を用い検討を行った。【００６１】
OT-Iマウス（C57BL/6-Tg(OT-I)-RAG1tm1Mom、Taconic）（Mombaerts P et al., 1992 Cell 68:869-877、Hogquist KA et al., 1994 Cell 76:17-27）より脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分でmashした。ACKバッファー（0.15M NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA,pH7.2-7.4）により赤血球を溶解し、Nylon meshでろ過し、脾臓細胞を調製した。PBSに懸濁した5 x 105のOT-Iマウスの脾臓細胞をワイルドマウス（C57BL/6NCrj、日本チャールズ・リバー）の尾静脈内に投与した（300μL／匹）。
PBS を用いて15 mg/ml シクロホスファミド（SIGMA） を調整し、OT-Iマウス脾臓細胞を移入した翌日に腹腔内に投与した（150 mg/kg、10 ml/kg）。コントロール群はPBSを投与した。【００６２】
更に同日、抗CD25抗体（クローン：PC61、BD Pharmingen）を尾静脈内に50μg／300μl／mouse投与した。コントロール群はアイソタイプ抗体（クローン：A110-1、BD Pharmingen）を尾静脈内に50μg／300μl／mouse投与した。
PBSに溶解した100μｇのOVA257-264ペプチド（配列：SIINFEKL）のみを、あるいは100μｇのOVA257-264ペプチドおよび50μgのR848（合成法はWO 94/17043に開示）をシクロホスファミドおよびPC61抗体投与3日後にマウス尾根部皮下に投与した（100μl）。
また、初回ペプチド投与21日後にPBSに溶解した100μｇのOVA257-264ペプチドのみをマウス尾根部皮下に再投与した。【００６３】
初回ペプチド投与4日後、あるいは再投与4日後に脾臓を摘出し、フロストスライドガラス、ACKバッファー、Nylon mesh等を用い、脾臓細胞を調製した。2 % FCS／PBSで洗浄し、3 x 106 cells／100μlで96穴V底プレートに播いた。2μlのanti-mouse CD16/CD32（クローン：2.4G2、BD Pharmingen）を添加し4℃で15分間インキュベートし、Fc部位のブロッキングによる非特異的吸着を防いだ。PE conjugated H-2Kbテトラマー／SIINFEKL（免疫生物研究所）5μlおよびPerCP conjugated anti-CD8a抗体（クローン：53-6.7、BD Pharmingen）を2μl添加し、室温で30分間インキュベートした。染色細胞を2 % FCS／PBSで洗浄し、１％ホルマリン／PBSで固定した。染色細胞をFACSCan（ベクトン・ディッキンソン）により分析し、データ解析ソフトCELLQuest（ベクトン・ディッキンソン）を用いてCD8陽性細胞中の特異的テトラマー陽性率を求めた。【００６４】
各種メモリーCTL誘導増強剤を組合せた初回投与後およびペプチドのみを再投与した後の脾臓内CD8陽性細胞に対する投与ペプチド特異的テトラマー陽性細胞の比率を図１に示す。抗CD25抗体（PC61)とシクロホスファミドの組み合わせ、シクロホスファミドとR848の組み合わせ、およびCD25抗体（PC61)、シクロホスファミド、R848の3種の組み合わせにより、効率よくメモリーCTL誘導が増強されることが明らかとなった。【００６５】
更に、初回投与後に増殖した特異的CTL中で、再投与後に増殖可能なメモリーCTLの比率を求めるため、初回投与後のテトラマー陽性率に対する再投与後のテトラマー陽性率の比を算出した。結果を図２に示す。抗CD25抗体（PC61)とシクロホスファミドの組み合わせ、またシクロホスファミドとR848の組み合わせにより、各々単剤の場合に比べてメモリーCT誘導の増幅が認められた。さらに、このメモリー誘導率が１以上であれば、反復投与による継続的なメモリーCTL誘導の増幅が期待される。図２に示したように、それぞれメカニズムの異なる３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、TLR７リガンドR848）を組み合わせることで、ワクチンによるメモリー誘導を劇的に向上させることが明らかとなった。
【実施例２】
【００６６】
ワクチンと３種のメモリーCTL誘導増強剤の組み合わせによるメモリーCTLの継続的増幅
実施例１により３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組合わせにより、ワクチンによるメモリーCTL誘導を劇的に増強することが明らかとなった。次にこのメモリーCTL誘導増強剤の組合せが、OT-I細胞を移入しない条件においてもワクチンのメモリー誘導を増強し、それが継続的に増幅するかについて検討した。【００６７】
実施例１と同様に調整したシクロホスファミドをナイーブワイルドマウスの腹腔内に投与した（150 mg/kg、10 ml/kg）。更に同日、抑制性T細胞除去抗体である抗CD25抗体（クローン：PC61）を尾静脈内に50μg／300μl／mouse投与した。その３日後、PBSに溶解した100μｇのOVA257-264ペプチドおよび50μgのR848をマウス尾根部皮下に投与した（100μl）。これを２週間隔あるいは３週間隔で繰り返した。【００６８】
最終投与７日後、脾臓を摘出し、実施例１と同様の方法でCD8陽性細胞中のOVA257-264ペプチド特異的H-2Kbテトラマー陽性細胞の比率を求めた。
３種のメモリーCTL誘導増強剤を組み合わせてペプチドワクチンを繰り返し投与した結果、２回以上の繰り返し投与によりテトラマー陽性細胞を検出でき、投与回数に依存して特異的CTLが増殖することが明らかとなった（図３）。この結果から、３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）を組合せ、ペプチドワクチンに追加することで継続的増幅可能なメモリーCTLを誘導できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００６９】
２種又は３種のメモリーCTL誘導増強剤の組み合わせによるメモリーCTLの継続的増幅の比較
実施例２において、３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組合わせにより、OT-I細胞を移入しない条件においても投与回数に依存して特異的CTLが増殖することが明らかとなった。次に、実施例２と同様にOT-I細胞を移入しない条件で２種または３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組み合わせによる、投与回数に依存した特異的CTLの増殖を比較した。その結果、抗CD25抗体（PC61)とシクロホスファミドの組み合わせ、またシクロホスファミドとR848の組み合わせ投与により、投与回数に依存したCTL誘導作用が見出された。また２種の組み合わせに比較して３種の組み合わせ（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）のほうが、投与回数に依存したCTL誘導作用が強かった（図４）。
【実施例４】
【００７０】
メモリーCTL誘導増強剤の組み合わせによって誘導されたメモリーCTLによるin vivo抗腫瘍効果
ペプチドワクチンおよび３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組合わせによって誘導されたCTLによるin vivoにおける腫瘍増殖抑制作用を検討した。実施例１と同様の条件でペプチドワクチンおよび３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）をワイルドマウス（C57BL/6NCrj、日本チャールズ・リバー）に投与した。ペプチド投与２１日後、PBSに懸濁した5 x 106 / 100μLのEG7（OVAを発現するEL4：ATCC）を毛狩り後の右腹側皮内へ27G注射針を用いて移植した。EG7移植１週間後から２８日後まで週に２回電子ノギスを用いて腫瘍径（短径、長径）を測定し、腫瘍体積を求めた。その結果、PBS投与に比較してペプチドワクチンとR848との併用投与で若干の増殖抑制作用が認められた。それに対し、ペプチドワクチンと３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組み合わせにより、腫瘍移植28日までほぼ完全に腫瘍増殖を抑制した（図５）。よって、ペプチドワクチンおよび３種のメモリーCTL誘導増強剤（シクロホスファミド、抗CD25抗体、R848）の組み合わせにより、in vivoにおいて強力に腫瘍増殖を抑制するCTLを誘導することが明らかとなった。
【実施例５】
【００７１】
他のメモリーCTL誘導増強剤の組み合わせによるメモリーCTLの増強
これまでの検討では、(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、(a)のカテゴリーからR848、(b)のカテゴリーからシクロホスファミド、(c)のカテゴリーから抗CD25抗体を用いた。更に、その他の物質についても２種および３種の組み合わせの効果を検討した。（a）としてTLR9リガンドであるCpG（北海道システムサイエンス)またはTLR3リガンドであるポリ（A：U）(SIGMA)、（b）としてカルムスチン(SIGMA)、（c）として抗CD152抗体(クローン4F10：BD Pharmingen)または抗GITR抗体(クローンDTA1：eBioscience)を用い、（a）+（b）、（b）+（c）、（a）+（b）+（c）の組み合わせ効果を検討した。実施例１と同様にOT-Iマウスを用い、同様の投与条件におけるペプチドのみ再投与４日後の脾臓中ペプチド特異的CTLの量をテトラマーにより定量した。その結果、図６（（a）+（b））、図７（（b）+（c））いずれにおいても単剤に比べて顕著な併用効果が認められた。また図８（（a）+（b）+（c））では、いずれにおいても、既に検討済みのR848、シクロホスファミド、および抗CD25抗体(PC61)の組み合わせと同等以上のCTL誘導能を示した。よって、ここで検討した（a）+（b）、（b）+（c）、（a）+（b）+（c）のいずれの物質の組合せにおいてもメモリーCTL誘導増強の併用効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、(a)抗原提示細胞の活性化物質、(b)Lymphopenia誘導後のHomeostatic proliferation誘導物質、および(c)抑制性Ｔ細胞の抑制物質のうち、物質(b)を、物質(a)および／または物質(c)と組み合わせてなる、メモリーCTL誘導増強剤が提供される。本発明のメモリーCTL誘導増強剤は、メモリーCTLの誘導を効率よく増強することができるため、癌若しくはウイルス感染症の免疫療法において有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】各種メモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体：PC61、シクロホスファミド：CYP、TLR7リガンド：R848）およびその組合せを追加した条件、または追加しない条件（図中(-)）での、ペプチドワクチン投与１回目の脾臓内テトラマー陽性率（白抜き）、およびペプチドのみの再投与後の脾臓内テトラマー陽性率（黒塗り）を示したグラフである。
【図２】各種メモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体：PC61、シクロホスファミド：CYP、TLR7リガンド：R848）およびその組合せを追加した条件、または追加しない条件（図中(-)）での、ペプチドワクチンによるメモリーCTL誘導率を示したグラフである。
【図３】２週間隔（2W）および３週間隔（3W）で３種のメモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体：PC61、シクロホスファミド：CYP、TLR7リガンド：R848）とペプチドワクチンを繰り返し投与し、最終投与１週間後の脾臓内テトラマー陽性率を測定した結果を示すグラフである。図中横軸の数字（1、2、3、4）は投与回数を示す。
【図４】２週間隔で２種または３種のメモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体：PC61、シクロホスファミド：CYP、TLR7リガンド：R848）とペプチドワクチンを２回繰り返し（白抜き）および３回繰り返し（黒塗り）投与し、最終投与１週間後の脾臓内テトラマー陽性率を測定した結果を示すグラフである。
【図５】各種メモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体：PC61、シクロホスファミド：Chemo、TLR7リガンド：R848）の組合せとペプチドワクチンによるin vivoにおける腫瘍増殖抑制作用を示したグラフである。白四角がPBS投与、黒四角がペプチドワクチンとR848の投与、白丸がペプチドワクチンと３種のメモリーCTL誘導増強剤（抗CD25抗体、シクロホスファミド、R848）の組合せ投与で、それぞれ２１日後に移植したEG7の増殖のタイムコースを示す。
【図６】各種メモリーCTL誘導増強剤（（a）TLR7リガンド：R848、TLR9リガンド：CpG、TLR3リガンド：polyAU.（b）シクロホスファミド：CYP、カルムスチン：CAR.）、またはその組合せを追加した条件、あるいは追加しない条件（図中(-)）での、ペプチドワクチン再投与４日後の脾臓内テトラマー陽性率を示したグラフである。
【図７】各種メモリーCTL誘導増強剤（（b）シクロホスファミド：CYP.（c）抗CD25抗体：クローンPC61、抗CD152抗体：クローン4F10、抗GITR抗体：クローンDTA1.）、またはその組合せを追加した条件、あるいは追加しない条件（図中(-)）での、ペプチドワクチン再投与４日後の脾臓内テトラマー陽性率を示したグラフである。
【図８】各種メモリーCTL誘導増強剤（（a）TLR7リガンド：R848、TLR9リガンド：CpG、TLR3リガンド：polyAU.（b）シクロホスファミド：CYP. （c）抗CD25抗体：クローンPC61、抗CD152抗体：クローン4F10、抗GITR抗体：クローンDTA1.）の組合せを追加した条件、または追加しない条件（図中(-)）での、ペプチドワクチンの再投与４日後の脾臓内テトラマー陽性率を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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