(57)【要約】小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子を欠損したマウスをモデル動物として用い、口蓋裂、臍帯ヘルニアや中枢性疾患の発症メカニズム解明、治療法及び治療薬の開発を行う。
2007080710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子が不活性型小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子に置換されたことにより、小胞性ＧＡＢＡトランスポータータンパク質の機能が欠損した、小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
【請求項２】
不活性型小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子が、エクソン２及びエクソン３が欠損した小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子である、請求項１に記載の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
【請求項３】
口蓋裂のモデルマウスである、請求項１又は２に記載の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
【請求項４】
請求項３に記載のマウスを用いることを特徴とする、口蓋裂の解析方法。
【請求項５】
臍帯ヘルニアのモデルマウスである、請求項１又は２に記載の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
【請求項６】
請求項５に記載のマウスを用いることを特徴とする、臍帯ヘルニアの解析方法。
【請求項７】
中枢性疾患のモデルマウスである、請求項１又は２に記載の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
【請求項８】
請求項７に記載のマウス又は該マウスから得られる神経細胞を用いることを特徴とする、中枢性疾患の解析方法。
【請求項９】
請求項７に記載のマウス又は該マウスから得られる神経細胞に試験化合物を投与又は添加することを特徴とする、中枢性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口蓋裂、臍帯ヘルニアや中枢性疾患などのモデル動物として有用な小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとで構成される神経ネットワークの集まりからできている。抑制性ニューロンの主要な神経伝達物質（抑制性神経伝達物質）は、γ−アミノ酪酸 (GABA) とグリシンである。GABAを神経伝達物質として放出する神経細胞がGABAニューロンであり、脳および脊髄に広範囲に分布する。一方、グリシンを放出する神経細胞がグリシンニューロンであり、主に脳幹と脊髄に分布する。抑制性伝達物質は神経の電位活動の制御を司り、覚醒、睡眠、概日リズムや学習、運動、感覚情報処理など脳の機能を構築する上で中心的役割を果たしていることが知られている。GABAはてんかん病やアルコール精神病をはじめとする精神神経疾患、不安や抑うつなどの精神症状との関連が報告されている。さらに、非神経組織でもGABAやGABA受容体の存在が確認されており、GABA神経伝達は神経系以外での機能も示唆されている。一方、グリシンはびっくり病（startle disease）との関連が知られている。
従って、(1)GABAやグリシンの作用機序を明らかにすること、(2)GABAやグリシンを介した神経伝達機能を明らかにすることは、脳や神経の機能を理解し、上記疾患の発症機序の解明や治療法の確立に貢献できる。
GABAとグリシンは、小胞型GABAトランスポーター(以下、VGATと呼ぶ)によってシナプス小胞に蓄積された後に、シナプス間隙に放出される（非特許文献１）。VGATは、抑制性ニューロン（GABAニューロンとグリシンニューロン）に特異的に発現することから、抑制性ニューロンのマーカーとしても使用されている。しかしながら、VGAT遺伝子のノックアウトマウスは報告されておらず、生体内でのVGATの役割はまだ十分には解明されていない。【０００３】
口蓋裂は、口蓋（上あご）が生まれつき裂けている状態をいう。一般に、口蓋は、妊娠7週〜12週目頃に左右の口蓋突起が中央部分で癒合することにより形成されるが、何らかの理由により口蓋の部分がうまく癒合せず、口蓋裂が生じることがある。口蓋裂の原因の多くは不明であり、関連遺伝子やモデル動物も限定されている。
一方、臍帯ヘルニアは、腸管や肝臓などがヘルニア嚢に包まれて臍帯中に脱出している状態をさす。治療法として手術により臓器を還納し、腹壁を閉鎖する方法がある。臍帯ヘルニアの原因の多くは不明であり、関連遺伝子やモデル動物も限定されている。
【非特許文献１】Nature. 1997 Oct 23;389(6653):870-6.
【発明の開示】
【０００４】
本発明は口蓋裂、臍帯ヘルニアやVGATを介した神経伝達の障害による中枢性疾患のモデル動物を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、VGAT遺伝子を欠損させたマウスが、口蓋裂や臍帯ヘルニアなどの症状を呈することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）染色体上の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子が不活性型小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子に置換されたことにより、小胞性ＧＡＢＡトランスポータータンパク質の機能が欠損した、小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
（２）不活性型小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子が、エクソン２及びエクソン３が欠損した小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子である、（１）の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
（３）口蓋裂のモデルマウスである、（１）又は（２）の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
（４）（３）のマウスを用いることを特徴とする、口蓋裂の解析方法。
（５）臍帯ヘルニアのモデルマウスである、（１）又は（２）の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
（６）（５）のマウスを用いることを特徴とする、臍帯ヘルニアの解析方法。
（７）中枢性疾患のモデルマウスである、（１）又は（２）の小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子欠損マウス。
（８）（７）のマウス又は該マウスから得られる神経細胞を用いることを特徴とする、中枢性疾患の解析方法。
（９）（７）のマウス又は該マウスから得られる神経細胞に試験化合物を投与又は添加することを特徴とする、中枢性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】VGAT遺伝子の不活性化の手順を示す図。（ａ）は野生型マウスの染色体上のVGAT遺伝子座を示し、（ｂ）はターゲッティングベクターを示し、（ｃ）はターゲッティングベクターとの相同組換えが起こったVGAT遺伝子座を示し、（ｄ）はCAG-Creマウスと掛け合わせた後のVGAT遺伝子座を示す。B：BstEII, E：EcoRI、H：HindIII、K：KpnI、X：XbaI。
【図２】抗VGAT/3抗体を用いたウエスタン法の結果を示す図（写真）。野生型マウス（lane 1）、ヘテロ接合体のVGAT遺伝子欠損マウス（lane 2, 3）、ホモ接合体のVGAT遺伝子完全欠損マウス（lane 4, 5）の胎生18.5日の脳でのVGAT蛋白質の発現を示す図。
【図３】出生日の野生型マウス及びVGAT遺伝子完全欠損マウスの口蓋を示す図（写真）。
【図４】胎生18.5日の野生型マウス及びVGAT遺伝子完全欠損マウスの腹壁前部を示す図（写真）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明のVGAT欠損マウス（VGATノックアウトマウス）は、染色体上のVGAT遺伝子が不活性型VGAT遺伝子に置換されたことにより、VGATタンパク質の機能が欠損したマウスである。「不活性型VGAT遺伝子」とは、VGAT遺伝子の一部の欠損、VGAT遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入などにより、正常なVGATタンパク質を発現できない遺伝子をいう。欠損型VGAT遺伝子としては、エクソン２及び３が欠損した遺伝子などが挙げられるが、これには限定されない。「VGATタンパク質の機能が欠損した」とは、GABAやグリシンの輸送などのVGATタンパク質の機能が失われたことをいい、好ましくは、VGATタンパク質の機能が完全に失われたことを意味するが、ヘテロノックアウトマウスのように片方のアレルのみ不活性型に置換されて、VGATタンパク質の機能が一部失われたような場合も含む。
なお、本発明のVGAT欠損マウスは胎児の状態にあるものも含む。【０００９】
VGAT遺伝子としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列を有するマウスVGAT遺伝子を挙げることができる。この塩基配列は、GenBankにアクセッションナンバーAB080232で登録されており、コード領域やエクソンの情報はこの番号を参照することによって得ることができる。なお、VGAT遺伝子は、種によっても異なるため、配列番号１のホモログ遺伝子であってもよい。ホモログ遺伝子は、マウスの染色体上のVGAT遺伝子と相同組換えを起こしうる程度の相同性、例えば、配列番号１の塩基配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の相同性を有するものが挙げられる。また、ホモログ遺伝子は配列番号1の塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイズを行い、６５℃、１ x ＳＳＣ，0.1％ ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、0.1 x ＳＳＣ，0.1％ ＳＤＳの条件で洗浄する条件が挙げられる。【００１０】
本発明のVGAT遺伝子欠損マウスは、公知の遺伝子組み換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。例えば、以下のようにして作製することができる。
先ず、VGAT遺伝子の部分断片を用意し、VGAT遺伝子を欠損型に置換するためのターゲティングベクターを作製する。
組み換え体の選別のため、ターゲティングベクターには薬剤耐性遺伝子を組み込むことが好ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。
また、VGAT遺伝子の部分配列を欠損させるためにCre-loxPのシステム（R．Kuhn et al．Science，269,1427-1429，1995）やFLP/FRTのシステム（Rodriguez et al. Nat Genet 25:139-40.）を用いてもよい。その場合、欠損させる部分配列がloxP配列あるいはFRT配列の間に挟まれるようにターゲティングベクターを構築する。【００１１】
以下に、上記のようなターゲティングベクターを用いてVGAT遺伝子欠損マウスを得るための一般的な方法について述べる。ただし、本発明のマウスは以下の方法により得られるものには限定されない。
上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組み換えを行う。相同組換えには胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いることができる。現在マウス由来のＥＳ細胞株がいくつか確立されており、CCE細胞株、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株、Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞株等を使用することができる。ターゲティングベクターは公知の方法に準じてマウスＥＳ細胞に導入することができる。例えば、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が利用できる。
次いで、染色体上の野生型VGAT遺伝子がターゲティングベクター中の変異VGAT遺伝子に置換された細胞クローンを選択する。選択は薬剤耐性などに基づいて行うことができ、さらに、サザンブロッティングやPCRなどにより相同組み換えを確認することが好ましい。【００１２】
こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を、野生型マウスの胚に導入する。そして、このＥＳ細胞導入胚を偽妊娠状態の仮親マウスの子宮に移植し、出産させることによりキメラ動物を作製することができる。ＥＳ細胞を胚盤胞期胚等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、マイクロインジュクション法がより好ましい。仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。【００１３】
次いで、このキメラマウスを純系のマウスと交配し、生殖系列を通してＥＳ細胞に由来するマウスを作製する。胚内に移植された組み換えＥＳ細胞が生殖系列に移行した動物を選択し、その動物を繁殖させることにより、VGAT遺伝子を欠損したヘテロ接合体を得ることができる。
得られたVGAT遺伝子欠損ヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、VGAT遺伝子欠損ホモ接合マウスを得ることができる。【００１４】
なお、本発明のノックアウトマウスを作製するにあたり、コンディショナルなノックアウトマウスの作製において汎用されている、上述のCre/loxPのシステムやFLP/FRTのシステムを用いることも可能である。Cre/loxPのシステムを用いる場合、大腸菌のＰ１ファージ由来の組み換え酵素であるCre組換え酵素を発現している動物と交配させるか、またはCre遺伝子を含むウイルスベクターを感染させることにより、Cre組換え酵素がloxP配列で挟まれた配列を認識して除去するため、VGAT遺伝子欠損マウスを作出することができる。また、組織特異的にCre組換え酵素を発現しているマウスと交配させることにより、組織特異的に遺伝子が欠損した特性を有するノックアウトを作製することもできる。同様に、FLP/FRTのシステムを用いる場合は、FLP組換え酵素を発現する動物と交配させることにより、VGAT遺伝子欠損マウスを作出することができる。
また、時期特異的にCre組換え酵素やFLP組換え酵素を発現するマウスと交配させるか、あるいは時期特異的にCre遺伝子またはFLP遺伝子を含むウイルスベクターを感染させることにより、時期特異的にVGAT遺伝子が欠損するマウスを得ることもできる。【００１５】
上記のようにして作製されたVGAT遺伝子欠損マウスは、口蓋裂や臍帯ヘルニアを呈する。したがって、このマウスを用いることにより、口蓋裂や臍帯ヘルニアの発症メカニズムの解明や治療法の開発を行うことができる。
また、口蓋裂や臍帯ヘルニアをもつヒトの遺伝子解析をする際に、VGAT遺伝子を原因の候補遺伝子として、その遺伝子変異などを解析することも可能である。特に、家族性口蓋裂や臍帯ヘルニアでは重要な情報になる。【００１６】
また、VGAT遺伝子欠損マウスはこれらの疾患に限らず、VGATが関連する各種疾患の発症メカニズムの解明にも利用することができる。VGATが関連する疾患としては、例えば、中枢性疾患、特に抑制性神経伝達が関与する中枢性疾患が挙げられ、具体的には、てんかん病、アルコール依存症、不安症、抑鬱症などの精神神経疾患が挙げられる。解析には、VGAT遺伝子欠損マウスから得られる神経組織や神経細胞を用いてもよい。
また、VGAT遺伝子欠損マウスは上記疾患の治療薬のスクリーニングにも用いることができる。例えば、VGAT遺伝子欠損マウスに化合物を投与し、化合物の症状改善効果を評価することにより、上記疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ、これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。該動物を被検物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射等の通常用いられる公知の方法が挙げられ、試験動物の症状、被検物質の性質等に合わせて適宜選択すればよい。また、本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝子改変動物から得られる神経細胞や神経組織を用いて行うこともできる。
条件付きVGATノックアウトマウスは、脳の部位特異的および時間特異的に抑制性神経伝達を遮断することで、てんかん発作や不安症の発症機序をより詳細に検討することができる。さらに、多くの脳の機能（情動、呼吸、日内リズム等）は抑制性神経伝達が重要な役割を果たすと考えられており、VGATノックアウトマウスは脳機能およびその障害を解明することにも利用できる。
【実施例】
【００１７】
VGAT遺伝子を含む大腸菌人工染色体 (BAC)クローンを129Sv系統マウス由来BACライブラリー（Genome system社、St. Louis, MO, U.S.A.）をPCR法でスクリーニングし、３クローン同定した(Ebihara et al., Mol. Brain Res. 110, 126-139, 2003)。これらのクローンをGenome system 社から購入し、精製したBAC由来のDNAを制限酵素で消化した後にpBlueScript(+)（Stratagene）に組み込み、サザン法とシークエンス法を用いてVGAT遺伝子領域を含む遺伝子地図を作成した（図1A）。PGK-neo遺伝子破壊用カセット（Yanagawa et al., Transgenic Res. 8, 215-221, 1999）を用意し、その前後にFRTサイトを、３'側にloxPサイトを連結することにより得られたDNA構築物をVGAT遺伝子の３'側に存在するKpnIサイトに転写の向きが同じになるように挿入した。もう一つのloxPサイトを第１イントロンに存在するXbaIサイトに挿入した。さらに、ネガティブ選択用のジフテリア毒素遺伝子 (Taniguchi et al., Neuron 19, 519-530, 1997) を組み込んだターゲッティングベクターを得た（図１ｂ）。
次にエレクトロポレーション法を用いてES細胞にターゲッティングベクターを導入した。129Sv系統マウスに由来するES細胞を使用し、A. L. Joyner et al.（Gene Targeting Second Edition: A Practical Approach. OXFORD University Press, New York, 2000）に記載された方法にしたがって、細胞培養及びエレクトロポレーションを行った。ターゲティングベクターを導入したES細胞をジェネティシン (G418) 含有培地で培養することにより、G418耐性形質転換体をクローニングしてセルライン化した。つづいて、ターゲティングベクターによる相同組換え体（図１ｃ）をサザン法によって確認した。
ターゲティングベクターが染色体上に組み込まれた相同組換え体ES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞期胚に注入した。偽妊娠させた仮親マウスに、ＥＳ細胞を注入した胚盤胞期胚を移植し、出産させてキメラマウスを得た。
このキメラマウスを野生型マウスと交配してヘテロ接合体を得た。次にCreを発現するトランスジェニックマウス（CAG-Creマウス：Sakai & Miyazaki, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237, 318-24, 1997）と掛け合わせて、VGAT 遺伝子の第２、第３エクソンが欠損したヘテロ接合体マウス（VGAT（+/-）マウス）を得た（図１d）。さらにこのVGAT（+/-）マウスを掛け合わせて、ホモ接合体のVGAT遺伝子完全欠損マウス（VGAT（-/-）マウス）を得た。
VGAT蛋白質の発現について野生型マウス、VGAT（+/-）マウス、VGAT（-/-）マウスの胎生18.5日の脳をサンプルとして、抗VGAT/3抗体 (Takamori et al., J. Neurosci., 20, 4904-4911, 2000) を用いたウエスタン法で検討した。野生型マウスに比較してVGAT（+/-）マウスではVGAT蛋白質の発現量が減少していた。VGAT（-/-）マウスでは、VGAT蛋白質が検出できなかった（図２）。
このVGAT遺伝子完全欠損マウス（ホモ接合体）について調べた結果、口蓋裂（図３）、臍帯ヘルニア（図４）を呈しており、出生日に死亡を観察した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明のVGAT遺伝子欠損マウスは口蓋裂や臍帯ヘルニアのモデル動物としてこれらの疾患の発症機序の解明や治療法の開発に使用することができる。また、脳機能における抑制性神経伝達の役割の解明とそれに基づく薬剤の開発、不安、抑鬱、てんかん、神経細胞死などの抑制性神経伝達が関与する中枢性疾患の検索とそれに基づく薬剤の開発にも使用することができる。
【図１】
2007080710.tif 000003
【図２】
2007080710.tif 000004
【図３】
2007080710.tif 000005
【図４】
2007080710.tif 000006
【配列表】
2007080710000001.app
【国際調査報告】
2007080710.tif 000007
2007080710.tif 000008
2007080710.tif 000009
2007080710.tif 000010