(57)【要約】  分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を宿主として用いる場合、従来のプロモーターの使用では生産量が低い、または発現が困難であって、異種タンパク質の製造を可能にしうる異種タンパク質発現系の提供。  本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベで使用される発現ベクター、シゾサッカロミセス・ポンベにその発現ベクターを導入した形質転換体、およびその形質転換体を使用した異種タンパク質の製造方法、特にシゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターを用いることによって特定のストレスの有無による遺伝子発現制御を行い、目的異種タンパク質の産生時期を制御可能とする異種タンパク質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子がコードする異種タンパク質をシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を宿主として産生させるための発現ベクターであって、シゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターと該プロモーターに支配された外来遺伝子とを含む発現ベクター。
【請求項２】
熱ショックタンパク質遺伝子がhsp16である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
hsp16のプロモーターが、hsp16のORFの5'末端側の上流1000  bp以上の領域からなる、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）用マルチクローニングベクターに、シゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターと該プロモーターに支配される外来遺伝子とを導入することを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベを宿主として前記外来遺伝子がコードする異種タンパク質を産生させるための発現ベクターを構築する方法。
【請求項５】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を請求項１、２または３に記載の発現ベクターで形質転換してなる形質転換体。
【請求項６】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を請求項４に記載の方法で構築された発現ベクターで形質転換してなる形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を産生させて採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
【請求項８】
形質転換体を培養し、次いで該形質転換体に誘導刺激を与えて異種タンパク質の産生を誘導する、請求項７に記載の異種タンパク質の製造方法。
【請求項９】
誘導刺激が、熱ストレスである請求項８に記載の異種タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
誘導刺激が、カドミウム、浸透圧上昇剤、過酸化水素、エタノールから選ばれる少なくとも一つの添加による、請求項８または９に記載の異種タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）で使用される発現ベクター、シゾサッカロミセス・ポンベにその発現ベクターを導入した形質転換体、およびその形質転換体を使用した異種タンパク質の製造方法に関する。特にシゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターを用いることによって特定のストレスの有無による遺伝子発現制御を行い、目的異種タンパク質の産生時期を制御可能とする異種タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、S.pombeという）は出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造、ゲノム複製機構、ＲＮＡスプライシング機構、転写機構、翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物のモデルとして広く用いられている（非特許文献１参照）。【０００３】
S.pombeはその様々な特徴から、より高等動物細胞に近い単細胞真核生物であると位置づけられ、外来遺伝子、特に高等動物由来遺伝子の発現用宿主として非常に有用な酵母であると考えられる。特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている（特許文献１〜特許文献７参照）。【０００４】
S.pombeを宿主として異種タンパク質を発現させるためには、通常異種タンパク質をコードする外来遺伝子の転写を促進するプロモーターが必要である。そのプロモーターとしては、S.pombeが本来有している遺伝子中のプロモーターや他の生物やウィルスが有するプロモーターが使用されている。現在、S.pombeを宿主とした異種タンパク質発現において利用されるプロモーターとしては、S.pombeが本来有するadh1のプロモーター（構成的発現）、fbp1のプロモーター、inv1のプロモーター（グルコースで抑制：特許文献５参照）、ctr4のプロモーター（銅イオンで抑制）、nmt1のプロモーター（チアミンで抑制）などの遺伝子のプロモーターが知られており、またhCMV、SV40、CaMV（構成的発現）などのウィルスのプロモーターが知られている。
【特許文献１】特許第２７７６０８５号公報
【特許文献２】特開平０７−１６３３７３号公報
【特許文献３】国際公開第９６／２３８９０号パンフレット
【特許文献４】特開平１０−２３４３７５号公報
【特許文献５】特開平１１−１９２０９４号公報
【特許文献６】特開２０００−１３６１９９号公報
【特許文献７】特開２０００−２６２２８４号公報
【非特許文献１】Giga-Hama  and  Kumagai,  eds.,  Foreign  gene  expression  in  fission  yeast  Schizosaccharomyces  pombe,  Springer-Verlag,  (1997).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
S.pombeを宿主として遺伝子工学的に異種タンパク質を発現させるために使用されるプロモーターとしては、上記のようにS.pombe由来、ウィルス由来等をあわせても数種類に限られている。しかもこれらはいずれも、発現制御が不可能（adh1、hCMV、SV40、CaMVのプロモーター）、発現誘導に長時間を要する（nmt1のプロモーター）、誘導を開始するためには菌体の生育途中での培地組成の改変が必要（nmt1、fbp1、inv1、ctr4のプロモーター）、完全な発現抑制の為には抑制因子の共発現が必要（CaMVの改変型プロモーター）といった欠点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは以上の点を鑑み検討を行った結果、発現制御が容易なプロモーターとしてS.pombeの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターを使用することにより、より効率的に異種タンパク質の製造を行うことができることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は以下よりなる。【０００７】
１．外来遺伝子がコードする異種タンパク質をシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を宿主として産生させるための発現ベクターであって、シゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターと該プロモーターに支配された外来遺伝子とを含む発現ベクター。
２．熱ショックタンパク質遺伝子がhsp16である、前項１に記載の発現ベクター。
３．hsp16のプロモーターが、hsp16のORFの5'末端側の上流1000  bp以上の領域からなる、前項２に記載の発現ベクター。
４．シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）用マルチクローニングベクターに、シゾサッカロミセス・ポンベの熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターと該プロモーターに支配される外来遺伝子とを導入することを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベを宿主として前記外来遺伝子がコードする異種タンパク質を産生させるための発現ベクターを構築する方法。
５．シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を前項１、２または３に記載の発現ベクターで形質転換してなる形質転換体。
６．シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）を前項４に記載の方法で構築された発現ベクターで形質転換してなる形質転換体。
７．前項５または６に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を産生させて採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
８．形質転換体を培養し、次いで該形質転換体に誘導刺激を与えて異種タンパク質の産生を誘導する、前項７に記載の異種タンパク質の製造方法。
９．誘導刺激が、熱ストレスである前項８に記載の異種タンパク質の製造方法。
１０．誘導刺激が、カドミウム、浸透圧上昇剤、過酸化水素、エタノールから選ばれる少なくとも一つの添加による、前項８または９に記載の異種タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
現在用いられているS.pombeを宿主とした遺伝子発現系の多くでは、発現誘導の為に生育培地を交換する、あるいは培地中の抑制物質（グルコース等）の枯渇を待つ、といった手順が必要である。一方本発明に係る熱ショックタンパク質のプロモーターは、菌体に培養温度よりも高い温度に曝して熱ストレスを与えるという極めて簡便な方法で速やかな発現誘導が可能である。さらに、該プロモーターはカドミウム、浸透圧上昇剤、過酸化水素、エタノールといった熱以外の複数種類のストレスによる発現誘導が可能であり、宿主の特徴（例えば高熱感受性株など）に応じて誘導方法を選択出来るという利点を持つ。従って該プロモーターを用いる本発明の遺伝子発現系は、高い簡便性と汎用性を併せ持つ、非常に有用な遺伝子発現系であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】熱ストレスおよびカドミウムストレスによるGFP発現誘導。図右側の矢印はGFPの分子量である約27  kDaを、図下の数字は0時間目のシグナルの強さを1としたときのおよその比を示す。
【図２】各種ストレスによるGFP発現誘導。
【図３】それぞれ、熱、塩化カリウム、過酸化水素、エタノールによるGFP発現誘導。図下の数字は0時間目のシグナルの強さを1としたときのおよその比を示す。
【図４】様々な長さのhsp16プロモーター領域を用いた場合の熱ストレスによるGFP発現誘導。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の発現ベクターの系によって産生される異種タンパク質とは、宿主が本来有していないタンパク質であり、本発明において宿主はS.pombeであるので、S.pombeが本来有していないタンパク質である。本発明の異種タンパク質は特に限定されるものではないが、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質が好ましい。特に哺乳動物（ヒトを含む）の産生するタンパク質が好ましい。このようなタンパク質はE.coliなどの原核細胞微生物宿主を用いて製造した場合には、活性の高いタンパク質が得られない場合が多く、またCHO細胞などの動物細胞を宿主として用いた場合には、通常産生効率が低い。本発明におけるS.pombeを宿主とする異種タンパク質発現系を用いる場合はこれらの問題が解決される。【００１１】
熱ショックタンパク質（heatshock  protein、hsp）とは、細胞や個体が平常温度より5〜10℃高い温度変化（熱ショック）を急激に受けたときにその合成が誘導され、シャペロンとして機能することによってタンパク質の熱変性や凝集を阻害するタンパク質の総称である。熱ショックタンパク質の生体内合成は、熱ショックの他、様々な化学物質、例えば電子伝達系の阻害剤、遷移金属、SH試薬、エタノールなどによっても誘導される。本発明では、これらの誘導刺激の可能性があるファクターを選択して、本発明の系を使ったタンパク質合成の誘導が可能である。特に好ましい誘導刺激は、熱によるストレスであって、例えば熱ショックが例示される。その他、カドミウム、浸透圧上昇剤、過酸化水素、エタノールの添加も好適な誘導刺激が可能である。【００１２】
熱ショックタンパク質は、バクテリアから高等動物にわたって広く保存されている。S.pombeの遺伝子配列データベース（S.pombe  GeneDB；http://www.genedb.org/genedb/pombe/）は公知であり、分裂酵母には熱ショックタンパク質遺伝子に分類される遺伝子が少なくとも17個存在する。S.pombe野生型株に39℃の熱ストレスを与えた場合、これら17個の遺伝子のうち、最も強く発現が誘導されるのは低分子熱ショックタンパク質のひとつをコードするhsp16（SPBC3E7.02c）である。その発現量は熱ストレスを与える前の約70倍に上昇することがマイクロアレイ解析により明らかにされている（D.  Chen  et  al.  Mol.  Biol.  Cell  14  （2003）,  214-229.）。【００１３】
本発明の熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターは、これら熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターのいずれかを意味し、特に上記hsp16が有するプロモーター（以下、hsp16プロモーターという）が好ましい。さらに、熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターとしてhsp16プロモーターを用いた場合、特にhsp16のORFの5'末端側の上流1000  bp以上の領域からなる部分を用いることが好ましい。hsp16プロモーターを含むhsp16の調節領域はORFの5'末端側の上流1800  bpまでの領域からなる。したがって、hsp16プロモーターとしては、ORFの5'末端側の上流1000  bpまでの領域〜1800  bpまでの領域を使用することが好ましい。【００１４】
本発明の発現ベクターを構築するための具体的操作方法としては、公知の方法を使用することができる。例えば、文献［J.  Sambrook  et  al.,"Molecular  Cloning  2nded.",  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press(1989)］に記載されている操作方法を使用できる。そして少なくとも、前記異種タンパク質をコードする外来遺伝子は、熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターが支配するベクター上の部位に挿入される。本発明で使用するベクターはS.pombe用のマルチクローニングベクターを使うことが好ましい。【００１５】
マルチクローニングベクターとはマルチクローニングサイトを有するベクターであり、マルチクローニングサイトに所望の外来遺伝子を導入することにより発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは外来遺伝子を有するベクターであり、外来遺伝子でコードされた異種タンパク質の発現に用いられる。発現ベクターにおいて、プロモーター遺伝子は異種タンパク質遺伝子の上流部に位置し、該遺伝子の発現を制御する。マルチクローニングベクターにおいては、マルチクローニングサイトに異種タンパク質遺伝子が導入されることにより、誘導プロモーター遺伝子はマルチクローニングサイトの上流部に位置する。【００１６】
本発明のプロモーター遺伝子がS.pombeが有するプロモーター遺伝子であることから、本発明の発現ベクターで形質転換される宿主としては、S.pombeが最適である。本発明で用いるS.pombeの菌株としては、例えばATCC38399（leu1-32h-）またはATCC38436（ura4-294h-）等が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American  Type  Culture  Collection）から入手できる。発現ベクターを用いてS.pombeを形質転換する方法は公知であり、例えば酢酸リチウム法［K.  Okazaki  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,  18,  6485-6489  (1990)］等によって、S.pombeの形質転換体が得られる。【００１７】
本発明の発現ベクターでS.pombeを形質転換してなる形質転換体を通常の培養条件下（熱ストレスなどのストレスを与えない条件下）で培養した場合は、異種タンパク質を発現することはなく（あるいは少ない発現量で発現して）S.pombeを増殖させることができる。この過程では、異種タンパク質の発現という負荷がないことから負荷がある場合に比較して増殖の効率が高く、細胞量を効率的に増大することができる。【００１８】
次に、熱ストレスなどの誘導刺激を与えた条件下で前記形質転換体を培養すると、プロモーターが該ストレスにより活性化してそれに支配された外来遺伝子の転写が促進され、異種タンパク質が発現する。この誘導刺激条件下の培養では、通常の条件下での培養に比較してS.pombeの増殖量は少なくなるのが通例であるが、前段の培養により細胞量が多くなっていることにより、培養システム全体として多量の異種タンパク質が産生される。ここで熱ストレスは、誘導刺激の一つであり、誘導刺激は前記のように種々効果を確認することによってその他の手段も利用可能である。誘導刺激の手段としては、好適には、熱、カドミウム、浸透圧上昇剤、過酸化水素、エタノール等の添加によって達成できる。【００１９】
熱による場合、熱ストレスを与える温度はそれまでの培養温度よりも少なくとも５℃高い温度、好ましくは少なくとも10℃高い温度が採用される。熱ストレスを与える温度の上限はS.pombeの生存可能な最高温度となる温度である。したがって、熱ストレス時の培養温度は、熱ストレスを与える前の培養温度に対して５℃以上、好ましくは10℃以上、高い温度であって、かつ、30〜55℃、好ましくは35〜50℃、より好ましくは40〜45℃である。熱ストレスを与える時間は、特に制限されるものではないが、数分以上で効果が確認でき、1〜29時間、好適には1〜15時間である。【００２０】
カドミウム添加による場合は、カドミウムイオンとして添加する。事例では塩化カドミウムを好適なものとして示したがこれに限定されない。カドミウムの最終濃度は、0.1〜1.5ｍＭまで、より好ましくは0.5〜1.0  mMまでである。培養する時間は、好適には５時間まで、より好ましくは3時間までである。【００２１】
浸透圧上昇剤の場合は、高濃度の電解質やソルビトールなどの浸透圧上昇剤を添加して浸透圧を高める。事例では高濃度の塩化カリウムを好適なものとして示したがこれに限定されない。カリウムの最終濃度は、0.1〜2.0  Mまで、より好ましくは0.5〜1.5  Mまでである。添加する時間は、特に制限されないが好適には1〜12時間まで、より好ましくは1〜10時間程度である。【００２２】
過酸化水素の場合は、その最終濃度は、0.1〜1.5  mMまで、より好ましくは0.5〜1.0  mMまでである。培養する時間は、特に制限されないが好適には1〜15時間まで、より好ましくは1〜12時間程度である。
エタノールの場合は、その最終濃度は、5〜20  V/V％まで、より好ましくは5〜15  V/V％までである。培養する時間は、特に制限されないが、好適には1〜20時間まで、より好ましくは1〜15時間程度である。【００２３】
上記の条件は、単独でまたは複数組み合わせて処理を行なってもよい。組み合わせ効果は、発現量を比較することで容易に確認可能である。【００２４】
かくしてS.pombeの増殖と異種タンパク質の発現をストレス条件等の誘導刺激を制御することにより、より効率的に異種タンパク質の産生を行うことができる。また、この制御により従来のプロモーターを使用した場合には産生量が低いまたは発現が困難であった異種タンパク質をより効率的に産生することができる。【００２５】
形質転換体を培養するための培地は公知であり、YPD培地等の栄養培地［M.  D.Rose  et  al.,  "Methods  In  Yeast  Genetics",  Cold  Spring  Harbor  Labolatory  Press  (1990)］またはMB培地等の最少培地［K.Okazaki  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,18,  6485-6489  (1990)］等を使用できる。形質転換体の培養は、通常16〜42℃、好ましくは25〜37℃で、8〜168時間、好ましくは48〜96時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。【００２６】
培養した形質転換体細胞を超音波破砕や機械的破砕により目的異種タンパク質を含む細胞抽出液を取り出しそこから目的異種タンパク質を単離・精製することができる。また、目的異種タンパク質が細胞外に分泌される場合は培養液から目的異種タンパク質を単離・精製することができる（例えば、WO96/23890参照）。【００２７】
前記産生したタンパク質を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。【００２８】
単離・精製したタンパク質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定法等が挙げられる。精製されたタンパク質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは最適の態様の一を例示するものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３０】
＜遺伝子発現系の構築＞
S.pombeの熱ショックタンパク質遺伝子が有するプロモーターとして、hsp16のプロモーター領域を用い、異種タンパク質としてGFP（緑色蛍光タンパク質）を用い、異種タンパク発現ベクターを構築した。GFP遺伝子を含むpEGFP-N1（CLONTECH社製）を鋳型とし、PCRにてGFPのDNA断片を増幅した。PCRに用いた上流側のプライマーの5'末端側にはHindIIIサイトおよびNdeIサイトを並べて付加し、また下流側のプライマーの5'末端側にはXhoIサイトを付加した。以下全てのプライマーの配列を表１に示す（GFPSおよびGFPAS）（配列番号１および２）。【００３１】
増幅されたDNA断片をHindIIIとXhoIで消化した後、サブクローニング用ベクターpBS-SK+（STRATAGENE社製）のマルチクローニングサイトに組み込み、さらにこのプラスミドをBamHIおよびNdeIで消化した。また、分裂酵母ARC039株（下記森田らの文献参照）由来のゲノムDNAを鋳型とし、PCRにてhsp16の翻訳開始点より約1800  bp上流域のDNA断片を増幅した。PCRに用いた上流側プライマーの5'末端側にはBamHIサイトを、また下流側プライマーの5'末端側にはNdeIサイトを付加した（表１、-1.8Sおよびhsp16AS）（配列番号３および６）。増幅されたDNA断片をBamHIおよびNdeIで消化し、前述のGFP遺伝子を含むpBS-SK+に組み込んだ。このようにして構築されたhsp16プロモーター+GFP断片を、XhoIおよびNotI消化によりpBS-SK+より切り出し、分裂酵母発現用ベクターpAL-(SK+)（下記森田らの文献参照）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。このプラスミドを、森田ら（T.Morita  and  K.  Takegawa.  Yeast  21  (2004),  613-617.）の開発した簡易形質転換法によりARC039株に形質転換し、形質転換体を得た。【００３２】
【表１】
2007026617.tif 000002
【００３３】
＜熱またはカドミウムストレスによる異種タンパク質発現誘導の確認＞
上記のようにして得られた形質転換体を用い、熱ストレスによるGFP発現誘導が可能か否かについて検討した。また、hsp16発現がカドミウムによっても強く誘導されること（D.  Chen  et  al.  Mol.  Biol.  Cell  14  (2003),  214-229.）から、カドミウムストレスによるGFP誘導が可能かどうかも同時に検討した。形質転換体を選択液体培地（MM-Leu；EMM培地にウラシル、アルギニン、リジン、グルタミン酸、ヒスチジン、アデニンを終濃度75μg/mlになるように添加したもの）で、28℃下にて対数増殖期初期（OD600=約0.3）まで培養した後、菌体を42℃下に移しそのまま振とう培養を継続した。また、菌体に最終濃度1  mMの塩化カドミウムを添加しそのまま28℃下にて振とう培養を継続した。菌体に各ストレスを与え初めてから0、1、3、6、12時間後に菌体の一部を回収し、ガラスビーズ破砕により総タンパク質を抽出した。その後抗GFP抗体を用いたウエスタン解析により、各サンプル中に含まれるGFP量を比較検討した。なおSDS-PAGEには12%アクリルアミドゲルを用い、各サンプルは1レーンあたり20μgの総タンパク質を使用した。【００３４】
その結果、図１に示すように菌体に熱ストレスを与えて1時間後には、GFP発現量が増加した。その後、経時的にGFP発現量が増加し続け、12時間後には熱ストレスを与える前の約46倍となることが明らかになった。カドミウムストレスを与えた場合にもGFP発現量は増加し、カドミウムストレスを与えて3時間後にはGFP発現量の増加がほぼ止まったが、12時間後の発現量はカドミウムストレスを与える前の約12倍であった。【００３５】
＜熱またはカドミウム以外の各種ストレス等の誘導刺激による異種タンパク質発現誘導の確認＞
熱、カドミウム以外の各種誘導刺激によってGFP発現が誘導されるか否かについて検討した。選択液体培地（MM-Leu）で、28℃下にて対数増殖期初期（OD600=約0.3）まで培養した形質転換体を5  mlずつ分注し、最終濃度1  mMの塩化水銀、塩化マンガン、第3塩化鉄、硝酸銀、塩化亜鉛、0.8  M塩化ナトリウム、0.5  M塩化リチウム、1  M  塩化カリウム、10  mM塩化カルシウム、0.5  mM過酸化水素、10  mMカフェイン、10%  エタノール、1  Mソルビトールを添加した後28℃にて浸透培養を継続した。各種誘導刺激を与えて3時間後に菌体を回収し、顕微鏡にて観察した。【００３６】
その結果、図２に示すように熱およびカドミウム以外に、塩化カリウム、過酸化水素、エタノールによってGFP産生が強く誘導されることが明らかになった。【００３７】
＜塩化カリウム、過酸化水素およびエタノールによる異種タンパク質発現誘導の検討＞
塩化カリウム、過酸化水素、エタノールの各種ストレス下におけるGFP誘導を、ウエスタン解析により詳細に検討した。選択液体培地（MM-Leu）で、28℃下にて対数増殖期初期OD600=約0.3）まで培養した３つの菌体に、最終濃度1  Mの塩化カリウム、0.5  mM過酸化水素、10  V/V%エタノールを各々添加しそのまま振とう培養を継続した。菌体に各種ストレスを与え初めてから0、1、3、6、12時間後に菌体の一部を回収し、前述と同じ手順に従ってウエスタン解析を行い、各サンプル中に含まれるGFP量を比較した。【００３８】
その結果、図３に示すように塩化カリウム、過酸化水素およびエタノールによって誘導されるGFP発現量は、熱ストレスの場合より弱いものの、各種ストレスを与える前の発現量の10倍から20倍にまで増加した。【００３９】
＜遺伝子発現制御に必要なhsp16プロモーター領域の長さの検討＞
下流遺伝子の発現制御に必要なhsp16プロモーター領域の長さの検討を行った。ARC039株由来のゲノムDNAを鋳型とし、PCRにてhsp16の翻訳開始点より約1200  bpあるいは600  bp上流域のDNA断片を増幅した。PCRに用いた上流側プライマーの5'末端側にはBamHIサイトを付加した（表１、-1.2Sおよび-0.6S）（配列番号４および５）。下流側プライマーはいずれも上述のhsp16ASを用いた。【００４０】
上記と同じ手順により、hsp16のプロモーター領域1200ｂｐあるいは600bｐの下流にGFP遺伝子を連結した遺伝子断片を構築し、分裂酵母発現用ベクターpAL-(SK+)のマルチクローニングサイトに組み込んだ後ARC039株に形質転換した。得られた各形質転換体を選択液体培地（MM-Leu）で、28℃下にて対数増殖期初期（OD600=約0.3）まで培養した後、42℃下に移し、振とう培養を継続した。菌体に各ストレスを与え初めてから0、1、（3）、6、12時間後に菌体の一部を回収し、前述と同じ手順に従ってウエスタン解析を行い、各サンプル中に含まれるGFP量を比較した。【００４１】
その結果、図４に示すように1200bｐ領域を用いた場合、1800bｐ領域を用いた場合と同様に、GFP発現は通常温度下では抑制されており、熱ストレスによって強く誘導された。一方600bｐ領域を用いた場合、菌体が通常温度下にある時点で既に強いGFP発現が見られ、熱ストレスを与えた後も発現量はほとんど増加しなかった。この結果より、hsp16プロモーターを用いて下流遺伝子の発現を制御する場合、翻訳開始点より600bｐ程度までの長さの領域では不十分であること、1200bｐ程度までの長さの領域では発現制御が可能であることが示唆された。よって、発現制御のためにはhsp16のORFの5'末端側の上流1000  bp以上の領域からなる部分を用いることが好ましいと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
上記したように、本発明に係るプロモーターは、菌体に熱ストレスを与えるという極めて簡便な方法で速やかな発現誘導が可能である。さらに熱以外の各種ストレスによる発現誘導が可能であるため、宿主の特徴に応じて誘導方法を選択出来るという利点を持つ。従って該プロモーターを用いる本発明の遺伝子発現系は、高い簡便性と汎用性を併せ持つ、非常に有用な遺伝子発現系であると考えられる。
なお、２００５年８月２９日に出願された日本特許出願２００５−２４７８１９号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１】
2007026617.tif 000003
【図２】
2007026617.tif 000004
【図３】
2007026617.tif 000005
【図４】
2007026617.tif 000006
【配列表】
2007026617000001.app
【国際調査報告】
2007026617.tif 000007
2007026617.tif 000008
2007026617.tif 000009
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