【手続補正書】
【提出日】令和1年10月28日(2019.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された表現型性能を有するように宿主細胞を操作するためのハイスループット方法であって、
ａ．１つ以上の遺伝子変化入力変数と、１つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
ｉ．前記１つ以上の遺伝子変化入力変数は、宿主細胞に導入された１つ以上の遺伝子変化を表し、
ｉｉ．前記１つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された１つ以上の遺伝子変化に関連する１つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
ｂ．前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
ｃ．前記１つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補宿主細胞のプールを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成するステップと、
ｄ．前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補宿主細胞のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
ｉ．少なくとも１つの設計候補宿主細胞は、ゲノム配列中に、ステップ（ａ）の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、前記組み合わせは、ステップ（ｄ）が実行される時点では表現型性能の改善について特徴付けられておらず、
ｉｉ．前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ（ａ）の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいている、ステップと、
ｅ．前記設計候補宿主細胞のサブセットを、それらの予測される表現型性能に基づいて選択するステップと、
ｆ．前記設計候補宿主細胞の前記サブセットからの宿主細胞を製造し、それによって、操作された宿主細胞を生み出すステップと、
ｇ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、前記操作された宿主細胞の表現型性能を測定するステップと、
ｈ．（ａ）の訓練データセットに、ｉ．前記操作された宿主細胞に導入された１つ以上の遺伝子変化を表す１つ以上の遺伝子変化入力変数と、ｉｉ．前記操作された宿主細胞の前記表現型性能尺度を表す１つ以上の測定された表現型性能出力変数とを加える工程と
を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）〜（ｈ）が、操作された宿主細胞が所望のレベルの改善された表現型性能を呈するまで繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測機械学習モデルが、上位性効果を組み込んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記予測機械学習モデルが、以下：線形回帰、カーネルリッジ回帰、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット過程、強化ベースの学習、クラスターに基づく学習、階層的クラスタリング、遺伝的アルゴリズム、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを組み込んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記予測機械学習モデルが、教師付き、半教師付き、または教師なしである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の遺伝子変化が、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド配列挿入、ヌクレオチド配列欠失、およびヌクレオチド配列置換からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子変化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の遺伝子変化が、内在性標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダーからの１つ以上の異種プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
改善された表現型性能を有するように微生物株を操作するためのハイスループット方法であって、
ａ．１つ以上の遺伝子変化入力変数と、１つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
ｉ．前記１つ以上の遺伝子変化入力変数は、微生物株に導入された１つ以上の遺伝子変化を表し、
ｉｉ．前記１つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された１つ以上の遺伝子変化に関連する１つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
ｂ．前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
ｃ．前記１つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補微生物株のプールを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成するステップと、
ｄ．前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補微生物株のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
ｉ．少なくとも１つの設計候補微生物株は、ゲノム配列中に、ステップ（ａ）の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、前記組み合わせは、ステップ（ｄ）が実行される時点では表現型性能の改善について特徴付けられておらず、
ｉｉ．前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ（ａ）の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいている、ステップと、
ｅ．前記設計候補微生物株のサブセットを、それらの予測される表現型性能に基づいて選択するステップと、
ｆ．前記設計候補微生物株の前記サブセットからの微生物株を製造し、それによって、操作された微生物株を生み出すステップと、
ｇ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、前記操作された微生物株の表現型性能を測定するステップと、
ｈ．それらの測定された表現型性能に基づいて前記操作された微生物株のサブセットを選択するステップと、
ｉ．（ａ）の訓練データセットに、
ｉ．前記操作された微生物株のサブセットに導入された１つ以上の遺伝子変化を表す１つ以上の遺伝子変化入力変数と、
ｉｉ．前記操作された微生物株のサブセットの前記表現型性能尺度を表す１つ以上の測定された表現型性能出力変数とを加えるステップと、
ｊ．操作された微生物株が、所望のレベルの改善された表現型性能を呈するまでステップ（ａ）〜（ｉ）を繰り返すステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記改善された表現型性能が、リシンまたはクエン酸の増加した、またはより効率的な産生である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
改善された表現型性能を有するように宿主細胞を操作するためのハイスループット方法であって、
ａ．１つ以上の遺伝子変化入力変数と、１つ以上の測定された表現型性能出力変数とを含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
ｉ．前記１つ以上の遺伝子変化入力変数は、１つ以上のライブラリーの適用を通じて宿主細胞に導入された１つ以上の遺伝子変化を表し、
ｉｉ．前記１つ以上の測定された表現型性能出力変数は、前記導入された遺伝子変化に関連する１つ以上の表現型性能尺度を表す、ステップと、
ｂ．前記訓練データセットによって設定された予測機械学習モデルを開発するステップと、
ｃ．前記１つ以上の遺伝子変化を組み込んだ設計候補宿主細胞のプールを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成するステップと、
ｄ．前記予測機械学習モデルを使用して、前記設計候補宿主細胞のプールの各メンバーの予期される表現型性能を予測するステップであって、
ｉ．少なくとも１つの設計候補宿主細胞は、ゲノム配列中に、ステップ（ａ）の遺伝子変化内からの遺伝子変化の統合された組み合わせを含み、前記組み合わせは、ステップ（ｄ）が実行される時点では表現型性能の改善について特徴付けられておらず、
ｉｉ．前記機械学習モデルによって予測される、予期される表現型性能が、ステップ（ａ）の導入される遺伝子変化と、その関連する表現型性能尺度とに基づいている、ステップと、
ｅ．操作された宿主細胞を生み出すのに使用するための前記設計候補宿主細胞のサブセットを提供するステップと、
ｆ．ステップ（ｅ）の操作された宿主細胞を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のライブラリーが、プロモータースワップライブラリー、ＳＮＰスワップライブラリー、開始／停止コドンライブラリー、最適化配列ライブラリー、ターミネータースワップライブラリー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記予測機械学習モデルが、上位性効果を組み込んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記予測機械学習モデルが、以下：線形回帰、カーネルリッジ回帰、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット過程、強化ベースの学習、クラスターに基づく学習、階層的クラスタリング、遺伝的アルゴリズム、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを組み込んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記予測機械学習モデルが、教師付き、半教師付き、または教師なしである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の遺伝子変化が、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド配列挿入、ヌクレオチド配列欠失、およびヌクレオチド配列置換からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子変化を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の遺伝子変化が、内在性標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダーからの１つ以上の異種プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記改善された表現型性能が、目的の産物の増加した、またはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝物、二次細胞外代謝物、細胞内コンポーネント分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。