(57)【要約】本発明は、ｐｒｅ−ＴＣＲによるシグナル伝達の分子機構に基づいてＴ細胞の分化および癌化を調節する新しい型の薬剤を提供する。本発明はまた、種々の細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を簡便に検出できるシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節する物質を含む、Ｔ細胞分化調節剤。
【請求項２】
前記物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を促進する物質である、請求の範囲１に記載のＴ細胞分化調節剤。
【請求項３】
前記プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を促進する物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖をコードする核酸分子である、請求の範囲２に記載のＴ細胞分化調節剤。
【請求項４】
前記物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を抑制する物質である、請求の範囲１に記載のＴ細胞分化調節剤。
【請求項５】
前記プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を抑制する物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖に対する、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡまたは抗体；あるいはプレＴ細胞抗原レセプターα鎖の細胞外ドメインのフラグメントである、請求の範囲４に記載のＴ細胞分化調節剤。
【請求項６】
プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節する工程を含む、Ｔ細胞分化を調節する方法。
【請求項７】
被験物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節するか否かを評価する工程を含む、Ｔ細胞分化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
Ｔ細胞分化調節剤をスクリーニングするためのキットであって、ｐＴαと蛍光物質とのキメラタンパク質を発現した細胞、あるいは、ｐＴαとエリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターとのキメラタンパク質を発現したＩＬ−３依存性細胞を含む、キット。
【請求項９】
細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出する方法であって、
第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質をコードする核酸分子、ならびに
第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子
を導入した、ＩＬ−３依存性細胞を、ＩＬ−３の非存在下で培養し、該細胞の増殖の有無を確認する工程を含む、方法。
【請求項１０】
第１のタンパク質と第２のタンパク質が、同種のタンパク質である、請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１１】
第１のタンパク質と第２のタンパク質が、異種のタンパク質である、請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１２】
第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質、ならびに
第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質
を発現した、ＩＬ−３依存性細胞。
【請求項１３】
第１のタンパク質と第２のタンパク質が、同種のタンパク質である、請求の範囲１２に記載の細胞。
【請求項１４】
第１のタンパク質と第２のタンパク質が、異種のタンパク質である、請求の範囲１２に記載の細胞。
【請求項１５】
細胞表面タンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、キメラタンパク質。
【請求項１６】
請求の範囲１５に記載のキメラタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１７】
請求の範囲１６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出するためのキットであって、以下：
エリスロポイエチンレセプターもしくはトロンボポイエチンレセプターまたはそれらの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸分子；
発現ベクター；ならびに
ＩＬ−３依存性細胞
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞分化調節剤、Ｔ細胞分化調節剤のスクリーニング方法、およびＴ細胞分化を調節する方法に関する。本発明はまた、細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用の検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用は、しばしば、細胞の増殖、分化、生存などを制御する細胞内シグナル伝達系において重要な役割を果たし得る。
例えば、エリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）は、赤血球前駆体の分化および増殖を誘導する因子であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の細胞表面レセプターであり、ＥＰＯＲは、その細胞外領域にＥＰＯが結合することにより二量体化して、ＥＰＯのシグナルを細胞内へ伝達し、赤血球の増殖および分化を制御する。このＥＰＯ／ＥＰＯＲによるシグナル伝達機構に関して、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａらは、ＥＰＯ無しで自己二量体化するような細胞外領域変異を起こしたＥＰＯＲが、増殖にＩＬ−３を必要とする細胞（本明細書において、「ＩＬ−３依存性細胞」という）であるＢＡＦ３細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導し得ることを報告している（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８，６４７−６４９（１９９０）参照）。
また、血小板の増殖に関与するトロンボポイエチンレセプター（ＴＰＯＲ）も、そのリガンド無しで自己二量体化するように変異させた場合、ＩＬ−３依存性細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導し得ることが報告されている（Ｏｎｉｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ，８８，１３９９−１４０６（１９９６））。
他方、初期Ｔ細胞の発達においては、プレＴ細胞抗原レセプター（以下、「ｐｒｅ−ＴＣＲ」ともいう）が重要な役割を果たす。
造血幹細胞からのαβＴ細胞の発生は胸腺の中で生じる。胸腺中の初期Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠いている細胞（以下、「ＤＮ細胞」ともいう）であり、ＤＮ細胞は、プレＴ細胞抗原レセプターを発現する。
ｐｒｅ−ＴＣＲは、Ｔ細胞抗原レセプターβ鎖（ＴＣＲβ）と、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖（ｐＴα）と、ＣＤ３分子（ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３ε鎖およびＣＤ３ζ鎖）から構成される複合体であり、その発現は、豊富なＴＣＲβ再構成物を有するＤＮ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ細胞（以下、「ＤＰ細胞」ともいう）へと分化させる。このプロセスは、β選択といわれる（Ｆｅｈｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５，７９５−８（１９９５）参照）。実際に、ｐｒｅ−ＴＣＲは、ＣＤ４およびＣＤ８の生存、増殖、および発現；Ｔｃｒａの再構成；Ｔｃｒｂ遺伝子座の対立遺伝子排除を引き起こすことが報告されている（Ｆｅｈｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５，７９５−８（１９９５）参照）。
多くの研究は、ｐｒｅ−ＴＣＲが、リガンド非依存的な様式でシグナルを伝達し得ることを示唆している。例えば、Ｉｒｖｉｎｇらは、細胞外Ｉｇ様ドメインが、シグナル伝達に必要ではないことを報告している（Ｉｒｖｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，９０５−８（１９９８）参照）。また、Ｓａｉｎｔ−Ｒｕｆらは、ｐｒｅ−ＴＣＲを発現する細胞株において、ｐｒｅ−ＴＣＲがｒａｆｔに存在し、そして外因性リガンドへのライゲーションを伴わずにシグナル伝達することを示している（Ｓａｉｎｔ−Ｒｕｆら、Ｎａｔｕｒｅ，４０６，５２４−７（２０００）参照）。
これまで、膜に接するｐＴαの細胞内システインが、ｒａｆｔ局在を担い得るとの主張がされてきた。しかし、このシステインのアラニンへの置換は、ｐｒｅ−ＴＣＲ機能を損なわないことが見出されている（Ａｉｆａｎｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，４８３−８（２００２）参照）。さらに、適切なｐｒｅ−ＴＣＲ機能には、ｐＴαの細胞質テール（Ａｉｆａｎｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，４８３−８（２００２）参照）および細胞外ドメイン（Ｂｏｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９，６０７−１５（２００４）参照）を必要とすることが示唆されている。
Ｈａｋｓらは、ｐｒｅ−ＴＣＲのリガンド非依存的なシグナル伝達の機構として、ＤＮ細胞に関する低い活性閾値を提唱している（Ｈａｋｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，２８５３−６１（２００３）参照）。しかし、最近の広範にわたる分析は、ｐＴαが、単なるＴＣＲαの代わりの鎖ではなく、むしろ、ｐＴαが、ＴＣＲαのシグナル伝達ポテンシャルとは異なる、ｐＴα独自のシグナル伝達ポテンシャルを有することが示されている（Ｂｏｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９，６０７−１５（２００４）；Ｈｕａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４，１５３２−４１（２００４）参照）。
また、ｐｒｅ−ＴＣＲを介するシグナルは、白血病細胞において癌化の引き金となることも示唆されている（Ｂｅｌｌａｖｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，３７８８−３７９３（２００２））。
このように、ｐｒｅ−ＴＣＲによる初期Ｔ細胞発達に関して広範な種々の研究が行われているにもかかわらず、ｐｒｅ−ＴＣＲによる自律的シグナルの基礎を成す分子機構はとらえにくく、未だに明らかになっていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ｐｒｅ−ＴＣＲによるシグナル伝達の分子機構を明らかとし、該機構に基づいてＴ細胞の分化および癌化を調節する新しい型の薬剤を提供することを第１の目的とする。本発明者らは、ｐｒｅ−ＴＣＲによるシグナル伝達の分子機構を明らかにするために、ｐｒｅ−ＴＣＲに固有の構成成分であるｐＴαの構造および機能に焦点を合わせて研究を行った。その結果、ｐＴαが、その細胞外領域に存在する荷電したアミノ酸残基による静電的相互作用を介して、自己二量体を自発的に形成することを見出した。さらに、これらのアミノ酸残基の置換によるｐＴαの自己オリゴマー化の阻害は、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への正常な移行を阻害した。このことから、本発明者らは、ｐＴαの自己二量体形成が、ｐｒｅ−ＴＣＲの自律的シグナル伝達の本質的な分子機構であると考えた。
また、本発明は、種々の細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を簡便に検出できるシステムを提供することを第２の目的とする。本発明者らは、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインとＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を、ＩＬ−３依存性細胞に導入して発現させると、該細胞外ドメイン同士が相互作用した場合に、該キメラタンパク質が二量体を形成して、該細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導することを見出した。すなわち、本検出システムのキメラタンパク質発現系を用いれば、細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン間の相互作用を、ＩＬ−３非依存的な細胞増殖を指標として検出し得ることを見出した。
本発明者らは、上記の知見に基づき、さらに研究を続けた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の通りである：
［１］  プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節する物質を含む、Ｔ細胞分化調節剤；
［２］  前記物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を促進する物質である、［１］に記載のＴ細胞分化調節剤；
［３］  前記プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を促進する物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖をコードする核酸分子である、［２］に記載のＴ細胞分化調節剤；
［４］  前記物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を抑制する物質である、［１］に記載のＴ細胞分化調節剤；
［５］  前記プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を抑制する物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖に対する、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡまたは抗体；あるいはプレＴ細胞抗原レセプターα鎖の細胞外ドメインのフラグメントである、［４］に記載のＴ細胞分化調節剤；
［６］  プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節する工程を含む、Ｔ細胞分化を調節する方法；
［７］  被験物質が、プレＴ細胞抗原レセプターα鎖の自己二量体形成を調節するか否かを評価する工程を含む、Ｔ細胞分化調節剤のスクリーニング方法；
［８］  Ｔ細胞分化調節剤をスクリーニングするためのキットであって、ｐＴαと蛍光物質とのキメラタンパク質を発現した細胞、あるいは、ｐＴαとエリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターとのキメラタンパク質を発現したＩＬ−３依存性細胞を含む、キット；
［１Ａ］  細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出する方法であって、
第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質をコードする核酸分子、ならびに
第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子
を導入した、ＩＬ−３依存性細胞を、ＩＬ−３の非存在下で培養し、該細胞の増殖の有無を確認する工程を含む、方法；
［２Ａ］  第１のタンパク質と第２のタンパク質が、同種のタンパク質である、上記［１Ａ］に記載の方法；
［３Ａ］  第１のタンパク質と第２のタンパク質が、異種のタンパク質である、上記［１Ａ］に記載の方法；
［４Ａ］  第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質、ならびに
第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質
を発現した、ＩＬ−３依存性細胞；
［５Ａ］  第１のタンパク質と第２のタンパク質が、同種のタンパク質である、上記［４Ａ］に記載の細胞；
［６Ａ］  第１のタンパク質と第２のタンパク質が、異種のタンパク質である、上記［４Ａ］に記載の細胞；
［７Ａ］  細胞表面タンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、キメラタンパク質；
［８Ａ］  上記［７Ａ］に記載のキメラタンパク質をコードする、核酸分子；
［９Ａ］  上記［８Ａ］に記載の核酸分子を含む、発現ベクター；ならびに
［１０Ａ］  細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出するためのキットであって、以下：
エリスロポイエチンレセプターもしくはトロンボポイエチンレセプターまたはそれらの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸分子；
発現ベクター；ならびに
ＩＬ−３依存性細胞
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１ａは、再構成したｐｒｅ−ＴＣＲおよびαβＴＣＲの表面染色を示す。ＴＣＲ  αｎｕｌｌＴ細胞ハイブリドーマ（ＴＧ４０β）に、ｐＭＸ−ｐＴα／ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２またはｐＭＸ−ＴＣＲα／ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２を感染させ、そしてＭＡＣＳを用いて抗ｒＣＤ２により選別した。細胞を、ＡＰＣ標識抗ＴＣＲβを用いて染色し、そしてフローサイトメトリーに供した（左パネル群および中央パネル群）。細胞をまた、蛍光顕微鏡により分析した。代表的な画像を、デコンボリューションされた蛍光画像（右パネル群）（ＢＺ８０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）として示す。１０を超える蛍光スポットを有する細胞の頻度を、マルチスキャン画像から決定した。この頻度は、２．７±３．９％（ＴＣＲα／ＧＦＰ）および８７．９±１．７％（ｐＴα／ＧＦＰ）であった。
図１ｂは、インターナライズされたｐｒｅ−ＴＣＲは、リソソーム中に局在することを示す。細胞を、５０ｎＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９を用いて３０分間処理し、次いで、広視野蛍光顕微鏡（ＩＸ−８１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）により分析した。
図１ｃは、ｐｒｅ−ＴＣＲの迅速かつ構成的なインターナリゼーションを示す。細胞を、ＰＥ標識抗ＴＣＲβを用いて予備染色し、次いで、３７℃にて３０分間インキュベーションし、そして共焦点蛍光顕微鏡（ＤＭＩＲＥ２，Ｌｅｉｃａ）により分析した。スケールバーは、５μｍを表す。
図１ｄは、ｐｒｅＴＣＲは、細胞表面上でオリゴマーを形成する傾向があることを示すグラフである。
図２ａは、ｐＴα／ＥＰＯＲキメラおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラの模式図である。
図２ｂは、ＥＰＯＲキメラの発現を示す。ＢＡＦ３細胞株に、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター中のｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラを感染させ、そして各々の発現を抗ＥＰＯＲイムノブロットにより分析した。
図２ｃは、ＥＰＯＲキメラの発現を示す。ＢＡＦ３細胞株に、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター中のｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラを感染させ、そして各々の発現を抗ＥＰＯＲ染色により分析した。
図２ｄは、ＩＬ−３枯渇後の各ＢＡＦ３トランスフェクタントの細胞生存度を示す。ＩＬ−３枯渇の２日後の明視野とＧＦＰとの代表的なマージ画像を示す（上パネル群）。ＩＬ−３枯渇後の細胞生存度を、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を計数することにより決定した。各日におけるＧＦＰ−細胞（キメラを発現しない細胞：○）またはＧＦＰ＋細胞（キメラを発現する細胞：●）の生存度を、０日目の生細胞数を１００とした相対百分率として表す。各条件についての感染効率は、全ての実験および類似の結果を示した４つの独立した実験において５０％〜８０％であった。
図２ｅは、ｐＴα／ＣＦＰおよびｐＴα／ＹＦＰを共発現するＴ細胞におけるＦＲＥＴの生成を示す。ＴＧ４０β細胞に、ｐＴα／ＹＦＰのみ（左パネル群）、ｐＴα／ＣＦＰおよびｐＴα／ＹＦＰ（中央パネル群）、またはｐＴαＲ１０２／１１７ＡＣＦＰおよびｐＴαＲ１０２／１１７Ａ／ＹＦＰ（右パネル群）を形質導入した。ｐｒｅ−ＴＣＲの表面発現を、図１ａに記載されるように、３つの細胞株の各々の抗ＴＣＲβ染色により検証した。ＹＦＰｈｉｇｈ細胞（１０，０００細胞；黒い点）中のＦＲＥＴポジティブ細胞（四角のゲート）の割合（パーセント）を示す。
図３ａは、マウスｐＴαの細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号７）。成熟タンパク質のアミノ酸番号を示す。
図３ｂは、ｐＴαの細胞外ドメイン内の荷電したアミノ酸の置換を示す。図に示す変異（ｍ１〜ｍ１９）を有するｐＴα／ＥＰＯＲを、図２ｄのように、ＢＡＦ３における増殖促進活性について試験した。値は、ＩＬ−３枯渇の２日後の、ＷＴ  ｐＴα／ＧＦＰ活性を１００とした相対活性（％）を表す。
図３ｃは、ｐＴα−ＴＣＲβ複合体の三次元構造モデルの立体図を示す。機能的に重要な荷電したアミノ酸（Ｄ２２、Ｒ２４、Ｒ１０２およびＲ１１７）を、球棒模型（ｂａｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）により表す。
図３ｄは、ｐＴα−ＴＣＲβ複合体の三次元構造モデルの立体図を示す。置換可能な荷電したアミノ酸（Ｄ５６、Ｄ６７、Ｅ８１、Ｅ８２、Ｅ８４およびＥ８７）を、球棒模型（ｂａｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）により表す。
図４ａは、Ｒ１０２／Ｒ１１７がｐｒｅ−ＴＣＲの自発的なインターナリゼーションに必須であることを示す。ｐＴαＷＴ／ＧＦＰおよびｐＴαＲ１０２／１１７Ａ／ＧＦＰを、ＴＧ４０β細胞へ導入し、そして表面ｐｒｅ−ＴＣＲ発現を、抗ＴＣＲβ  ＡＰＣ（グレーのヒストグラム）およびコントロールＡｂ（白いヒストグラム）を用いて分析した。
図４ｂは、細胞内ＧＦＰ小胞を有する細胞の頻度を示す。細胞を蛍光顕微鏡により分析し、そしてマルチスキャン画像を、１０を超える明るい小胞を有する細胞数の計数に用いた。データは、５つの独立した視野の平均パーセント±ｓ．ｄである。
図４ｃは、ＢＭＴ再構成アッセイを示す。Ｓｃａ−１＋  ｐＴα−／−  ＢＭ細胞に、個別に、ＷＴ  ｐＴαＷＴ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ８またはｐＴαＲ１０２／１１７Ａ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ２を感染させた。ｒＣＤ８またはｈＣＤ２ポジティブ細胞を選別し、そして、個別に、照射したＲａｇ２−／−レシピエントマウスへと注入した。注射の３週間後、胸腺細胞を、ｈＣＤ８＋集団（中央パネル群）またはｒＣＤ２＋集団（右パネル群）におけるＣＤ４／ＣＤ８（上パネル群）およびＣＤ２５（下パネル群）の発現について分析した。ｐＴαＷＴの表面発現と比較して高いｐＴαＲ１０２／１１７Ａの表面発現を、抗ｐＴαを用いる染色により確認した。
図４ｄは、競合的ＢＭＴ再構成アッセイを示す。ｐＴαＷＴ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２またはｐＴαＲ１０２／１１７Ａ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８を個別に感染させた、Ｓｃａ−Ｉ＋  ｐＴα−／−  ＢＭ細胞を、１：１の割合で混合し、そして照射したＲａｇ２−／−レシピエントマウスに同時に注入した。３週間後、胸腺細胞を、ｈＣＤ８＋（ＷＴ）ゲート集団またはｒＣＤ２＋（Ｒ１０２／１１７Ａ）ゲート集団におけるＣＤ４／ＣＤ８の発現について分析した。データは、類似の結果を有する代表的な３つの独立した実験である。
図５は、ＩＬ−３枯渇後のＢＡＦ３トランスフェクタントの細胞生存度を表す。各日におけるＧＦＰ−細胞（キメラを発現しない細胞：○）およびＧＦＰ＋細胞（キメラを発現する細胞：●）の生存度を、０日目の生細胞数を１００とした相対百分率として表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に、本明細書中で用いられる各用語について説明する。
本明細書において、「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのことを意味する。本明細書において、「ヌクレオチド配列」とは、特に言及しない限り、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴで表す）の配列、またはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵで表す）の配列を意味する。本明細書中において、特に言及しない限り、一本鎖ヌクレオチド配列は、左端が５’末端、右端が３’末端を表す。
本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸の表記は、アミノ酸に関する標準的な表記である１文字略号または３文字略号を使用する。本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸配列は、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）を表す。
本明細書において、「Ｔ細胞前駆体」とは、ＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠いている胸腺細胞（「ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ胸腺細胞」または「ＤＮ細胞」ともいう）を意味する。
本明細書において、「Ｔ細胞分化を調節する」とは、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ胸腺細胞（ＤＮ細胞）から、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞（ＤＰ細胞）へと分化するプロセス（すなわち、β選択）を、促進または抑制することを意味する。
本明細書において、「プレＴ細胞抗原レセプターα鎖（ｐＴα）の自己二量体形成を調節する」とは、ＤＮ細胞の細胞表面におけるｐＴαの自己二量体化を促進または抑制することを意味する。
本発明に用いる場合、「プレＴ細胞抗原レセプターα鎖（ｐＴα）」とは、好ましくは、ヒト由来のｐＴαもしくはそれと実質的に同一のタンパク質を意味する。
ここで、「実質的に同一」とは、ヒト由来のｐＴαのアミノ酸配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは、約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列を有するタンパク質がヒト由来のｐＴαと実質的に同質の活性を有するような配列をいう。
ここで、「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、水酸基を有するアミノ酸、側鎖の小さいアミノ酸などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は、タンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムであるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用いて、以下の条件（期待値＝１０、ギャップを許す、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、フィルタリング＝ＯＦＦ）で計算することができる。
アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらは同様に好ましく用いられ得る。
ｐＴαにはいくつかのスプライスバリアントが知られているが、本発明では、そのいずれを用いてもよい。
本発明に用いられるヒトｐＴαとしては、好ましくは、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号ＮＰ＿６１２１５３（配列番号２）に示されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
また、本発明に用いられるヒト由来のｐＴαと実質的に同一のタンパク質としては、例えば、以下のアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、ヒトｐＴαと実質的に同質の活性を有するタンパク質等も含まれる：
（１）配列番号２に示されるヒトｐＴαのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
（２）配列番号２に示されるヒトｐＴαのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるヒトｐＴαのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列；
（４）配列番号２に示されるヒトｐＴαのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；あるいは
（５）上記（１）〜（４）を組み合わせたアミノ酸配列。
アミノ酸配列が、欠失、付加、挿入または置換されている場合、その欠失、付加、挿入または置換の位置は、当該タンパク質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
ｐＴαについて、実質的に同質の活性としては、ｐＴαが自己二量体を形成して、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への移行（すなわち、β選択）を誘導する活性などが挙げられる。
ここで、「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に同等であることを意味する。従って、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
ｐＴαの自己二量体形成は、後述するスクリーニング方法に記載される方法により確認および定量できる。また、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への移行は、細胞表面に発現するＣＤ４分子およびＣＤ８分子を、これらの各々に特異的に反応する抗体を用いて検出することにより確認および定量できる。該抗体の検出法としては、例えば、蛍光を利用する方法（例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）法）、酵素反応を利用する方法（例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法）、ラジオアイソトープを利用する方法などが挙げられる。
本明細書において、タンパク質の「細胞外ドメイン」とは、特に言及しない限り、細胞表面タンパク質の細胞外に存在する領域（ドメイン）の全部またはその任意のフラグメントを意味する。
本明細書において、タンパク質の「膜貫通ドメイン」とは、特に言及しない限り、細胞表面タンパク質の細胞膜を貫通する領域（ドメイン）の全部またはその任意のフラグメントを意味する。
本明細書において、タンパク質の「細胞質ドメイン」とは、特に言及しない限り、細胞表面タンパク質の細胞質内に存在する領域（ドメイン）の全部またはその任意のフラグメントを意味する。
本明細書において、「キメラタンパク質」（以下、単に「キメラ」ともいう）とは、特に言及しない限り、異なるタンパク質に由来する２つ以上のドメインから構成される融合タンパク質を意味する。
本明細書において、「ＩＬ−３依存性細胞」とは、生存／増殖にＩＬ−３を必要とする細胞（換言すれば、ＩＬ−３の非存在下では増殖できない細胞）のことを意味する。
以下、本発明の実施形態について説明する。
第１の局面において、本発明は、Ｔ細胞分化調節剤、Ｔ細胞分化を調節する方法、およびＴ細胞分化調節剤のスクリーニング方法に関する。
（Ｔ細胞分化調節剤およびＴ細胞分化を調節する方法）
本発明は、ｐＴαの自己二量体形成を調節する物質を含むＴ細胞分化調節剤を提供する。より具体的には、本発明は、ｐＴαの自己二量体形成を促進する物質を含むＴ細胞分化促進剤およびｐＴαの自己二量体形成を抑制する物質を含むＴ細胞分化抑制剤を提供する。
（Ｔ細胞分化促進剤）
１つの実施形態において、本発明のＴ細胞分化調節剤は、Ｔ細胞分化促進剤であり、該促進剤は、Ｔ細胞前駆体（すなわち、ＤＮ細胞）の細胞表面におけるｐＴαの自己二量体形成を促進する物質を含む。このような物質は、ｐＴαの自己二量体形成を直接的または間接的に促進することによって、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への移行（すなわち、β選択）を促進することができる。
ｐＴαの自己二量体形成を促進する物質としては、他の遺伝子および／またはタンパク質に及ぼす影響を最小限にするために、標的分子であるｐＴαに特異的に作用し得る物質であることが望ましい。このような物質としては、例えば、ｐＴαをコードする核酸分子、および後述するスクリーニング方法によって得られる物質が挙げられる。
「ｐＴαをコードする核酸分子」とは、ＤＮ細胞に導入された場合に、該細胞においてｐＴαを発現させることができる核酸分子のことを意味する。該核酸分子により発現したｐＴαは、それらの間で、または該核酸分子を導入した細胞が生来有するｐＴαと二量体を形成して、β選択を促進させることができる。
ｐＴαをコードする核酸分子としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ｐＴαをコードする核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などによって増幅することができる。
ｐＴαをコードする核酸分子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１３８２９６（配列番号１）に示されるヒトｐＴαの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ、配列番号２に示されるｐＴαのアミノ酸配列を含有するタンパク質と、実質的に同質の活性（細胞外領域のアミノ酸残基の相互作用によって、自己二量体を形成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
本明細書において、塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件：期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３にて計算することができる。
塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭであり、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃である条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭであり、温度が約６５℃である場合が好ましい。
当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダイゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができることを理解する。
ｐＴαをコードする核酸分子は、例えば、適切な発現ベクターに挿入した後、当該分野で公知の方法（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法）に従って、Ｔ細胞前駆体（ＤＮ細胞）に導入され得る。
ｐＴαをコードする核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、ｐＴαをコードする核酸分子から目的とする断片を調製し、該断片を発現ベクター中の適切なプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
発現ベクターとしては、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター（例えば、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＭＥ１８Ｓ）などが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応する適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、例えば、ＬＣＫ近位プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。
発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含み得る。
選択マーカーおよびレポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
（Ｔ細胞分化抑制剤）
別の実施形態において、本発明のＴ細胞分化調節剤は、Ｔ細胞分化抑制剤であり、該抑制剤は、Ｔ細胞前駆体（すなわち、ＤＮ細胞）の細胞表面におけるｐＴαの自己二量体形成を抑制する物質を含む。このような物質は、ｐＴαの自己二量体形成を直接的または間接的に抑制することによって、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への移行（すなわち、β選択）を抑制することができる。
ｐＴαの自己二量体形成を抑制する物質としては、他の遺伝子および／またはタンパク質に及ぼす影響を最小限にするために、標的分子であるｐＴαに特異的に作用し得る物質であることが望ましい。このような物質としては、例えば、ｐＴαに対する、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよび抗体；ｐＴαの細胞外ドメインのフラグメント；ならびに後述するスクリーニング方法によって得られる物質が挙げられる。
ｐＴαに対する、アンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡは、Ｔ細胞前駆体中のｐＴαをコードする核酸分子に作用し、ＤＮ細胞におけるｐＴαの発現そのものを抑制することができる。
アンチセンス核酸は、生理的条件下で、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつハイブリダイズした状態で標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるタンパク質またはポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸であり得る。
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によって、そのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、酵素分解に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）、２’−Ｏ−メチル型などの修飾ヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸を合成してもよい。
アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
アンチセンス核酸の長さは、標的ｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はないが、例えば、少なくとも約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
また、アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡである標的遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
リボザイムとは、核酸を切断する酵素活性を有する核酸分子（主に、ＲＮＡ）をいう。本発明では、ｐＴαのｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るものを意図する。
また最近では、当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、リボザイムは、配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。
リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。
ｓｉＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相当する二本鎖オリゴＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから（Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１））、リボザイムの代替技術として注目されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、例えば、ｐＴαのｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号１）に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。
ｓｉＲＮＡは、例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分間程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後、リガーゼを用いてライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
ｐＴαに対する抗体、およびｐＴαの細胞外ドメインのフラグメントは、ｐＴαの自己二量体形成に関与するアミノ酸残基の１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）に作用することによって、ｐＴαの自己二量体形成を抑制することができる。
「ｐＴαの自己二量体形成に関与するアミノ酸残基」は、ｐＴαの細胞外に存在する領域（ドメイン）に存在する荷電したアミノ酸残基であり得る。例えば、ヒトｐＴαの場合、ｐＴαの自己二量体形成に関与するアミノ酸残基としては、配列番号２のアミノ酸配列中の３８番目のＡｓｐ；４０番目のＬｙｓ；１１８番目のＡｒｇ；および１３３番目のＡｒｇが挙げられる。
これらのアミノ酸は、種の間で高度に保存されているので、ヒト以外の種を対象とする場合、上記に対応するアミノ酸残基を標的とすればよい。
ｐＴαに対する抗体は、ｐＴαの二量体形成を阻害し得る限り、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよく、以下に例示するような、当該分野で周知の免疫学的手法により作製することができる。さらに、抗ｐＴα抗体のフラグメントもまた、ｐＴαの二量体形成を阻害し得る限り用いられ得る。このような抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
ポリクローナル抗体は、例えば、ｐＴαまたはそのフラグメントを抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。
抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
上記抗原としてｐＴαのフラグメントを用いる場合、該フラグメントは、ｐＴαの自己二量体形成に関与するアミノ酸残基の１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）を含む。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、例えば、細胞融合法により作製することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
この細胞融合は、ＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］で行ってもよいし、電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］で行ってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
上記抗ｐＴα抗体は、ヒトに用いる場合の効果と安全性を考慮すると、ヒトと他の動物（例えば、マウス等）のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましく、完全ヒト抗体であることが特に好ましい。
ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部（Ｖ領域）とヒト由来の定常部（Ｃ領域）を有する抗体のことをいい、「ヒト化抗体」とはＣＤＲを除いて他の領域をすべてヒト抗体に置き換えた抗体のことをいう。
キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子からＶ領域もしくはＣＤＲをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体のＣ領域をコードするＤＮＡと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。
完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生動物、またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
ヒト抗体産生動物としては、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ社製）；Ｈｕ−Ｍａｂ  Ｍｏｕｓｅ（Ｍｅｄａｒｅｘ社製）；ＫＭマウス（キリンビール社製）などが挙げられる。
ファージディスプレイライブラリーとしては、ＣＡＴ社のライブラリー；ＭＲＣ社のライブラリー；Ｄｙａｘ社のライブラリー；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー；Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー等が挙げられる。
ｐＴαの細胞外ドメインのフラグメントとは、ＤＮ細胞の生来のｐＴαとのオリゴマー形成能力を有するが、ＤＮ細胞からＤＰ細胞への移行（すなわち、β選択）を誘導することができない、ｐＴαの細胞外領域（ドメイン）の任意のフラグメントのことを意味する。このようなフラグメントは、ＤＮ細胞の生来のｐＴαに対して、別の生来のｐＴαと競合的に結合することで、生来のｐＴα同士の結合を阻害することができる。具体的には、本発明で用いられるｐＴαの細胞外ドメインのフラグメントは、自己二量体形成に関与するアミノ酸残基の１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）を含むが、ＤＮ細胞の生来のｐＴαと結合してもβ選択を誘導することができないフラグメントである。
ここで、該フラグメント中の自己二量体形成に関与するアミノ酸残基は、ヒトｐＴαについて上記したアミノ酸残基が挙げられるが、これらのアミノ酸残基は、二量体形成能が失われない限り、類似アミノ酸により置換されていてもよい（例えば、ＡｓｐとＧｌｕ；ＡｒｇとＬｙｓとの間の保存的アミノ酸置換）。
本発明はまた、インビトロまたはインビボにおいて、ｐＴαの自己二量体形成を調節することによって、Ｔ細胞分化を調節する方法を提供する。
１つの実施形態において、本方法は、インビトロにおいて、ｐＴαの自己二量体形成を調節することによって、Ｔ細胞分化を調節する方法に関し、該方法は、上記のＴ細胞分化調節剤の存在下で、Ｔ細胞前駆体（すなわち、ＤＮ細胞）を培養することを含む。
Ｔ細胞分化調節剤として核酸分子を用いる場合、該核酸分子は、単独で、又はプラスミド若しくはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）などの適切なベクターに挿入した後、当該分野で周知の方法に従って、Ｔ細胞前駆体に導入され得る。
また、Ｔ細胞分化調節剤としてタンパク質を用いる場合、該タンパク質は、そのまま培地に混合され得る。あるいは、当該タンパク質をコードする核酸分子を単独又は適切なベクターに挿入した後、当該分野で周知の方法に従って、細胞に導入してもよい。
細胞を培養する培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、１９９培地などが用いられる。
培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１日〜約１週間、好ましくは、約１日〜約３日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
別の実施形態において、本方法は、インビボにおいて、ｐＴαの自己二量体形成を調節することによって、Ｔ細胞分化を調節する方法に関し、該方法は、上記のＴ細胞分化調節剤を哺乳動物に投与することを含む。
哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ、特に限定はされないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
Ｔ細胞分化調節剤として核酸分子を用いる場合、該核酸分子を単独で、又はプラスミド、ウイルスベクターなどの適切なベクター（例えば、上記で発現ベクターとして列挙したもの）に挿入した後、当該分野で周知の方法に従って、哺乳動物に投与することができる。
また、Ｔ細胞分化調節剤としてタンパク質を用いる場合は、剤形を工夫することによって、当該分野で公知のＤＤＳ（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）技術により当該タンパク質自体を哺乳動物に投与することができる。あるいは、当該タンパク質をコードする核酸分子を単独で、又は適切なベクター（例えば、上記で発現ベクターとして列挙したもの）に挿入した後、当該分野で周知の方法に従って投与することもできる。
本発明のＴ細胞分化調節剤は、薬学的に許容され得る担体をさらに含み得る。薬学的に許容され得る担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、粘稠剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。本発明のＴ細胞分化調節剤は、上記の担体の一つ以上を用いることにより、経口あるいは非経口的に投与することができる。
Ｔ細胞分化調節剤の投与量は、投与対象、投与方法、処理時間、あるいは該剤に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常、成人（体重６０ｋｇとして）一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲で投与することができる。
なお、ヒト以外の哺乳動物の場合も、上記値を当該哺乳動物の体重で換算した量を投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
（Ｔ細胞分化調節剤のスクリーニング方法）
本発明はまた、Ｔ細胞分化調節剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質がｐＴαの自己二量体形成を調節（促進または抑制）するか否か評価することを含む。具体的には、該評価は、被験物質の存在下と非存在下でのｐＴαの自己二量体形成の程度を比較することで行うことができる。
本スクリーニング方法に用いられる「被験物質」は、いかなる公知化合物でも新規化合物でもよい。被験物質としては、特に制限はされないが、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、抗体、有機もしくは無機の低分子化合物、有機もしくは無機の高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物等由来の天然成分等が挙げられる。
ｐＴαの自己二量体形成は、例えば、以下の方法によって検出および定量することができる：
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質を用いる方法；ならびに
ｐＴαとエリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）とのキメラタンパク質を発現した細胞、またはｐＴαとトロンボポイエチンレセプター（ＴＰＯＲ）とのキメラタンパク質を発現した細胞を用いる方法。
（ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質を用いるスクリーニング方法）
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質を用いるスクリーニング方法としては、例えば、全反射蛍光（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＩＲＦ）顕微鏡分析；蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎａｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）分析が挙げられる。
ＴＩＲＦ顕微鏡分析を用いるスクリーニング方法は、ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラを発現した細胞を用いて、ｐＴαの単体と二量体を、その輝点の蛍光強度から区別して検出し得る。
この分析に用いられる蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−ｏｒａｎｇｅなどが挙げられる。
ＦＲＥＴ分析を用いるスクリーニング方法は、第１蛍光タンパク質（励起光波長λ０；蛍光波長λ１）とｐＴαとのキメラタンパク質と、第２蛍光タンパク質（励起光波長λ１；蛍光波長λ２）とｐＴαとのキメラタンパク質の両方を発現した細胞を用いて、該細胞に波長λ０の光を照射して、二量体の形成を示す波長λ２の蛍光を検出し得る。
この分析に用いられる第１と第２の蛍光タンパク質の組合わせとしては、ＣＦＰとＹＦＰなどが挙げられる。
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質に用いられるｐＴαとしては、好ましくは、ヒトｐＴαが用いられる。ヒトｐＴαとしては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が用いられる（ここで、「実質的に同一」とは、上記と同義である）。
ｐＴαにはいくつかのスプライスバリアントが知られているが、そのいずれを用いてもよい。
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質を発現する細胞は、該キメラタンパク質をコードする核酸分子を作製し、該核酸分子を適切な細胞に導入することにより作製できる。
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質をコードする核酸分子は、ｐＴαをコードする核酸分子、ならびに所望の蛍光タンパク質をコードする核酸分子を用いて、当該分野で公知の遺伝子組換技術（例えば、ＰＣＲ法を用いる技術）によって作製され得る。
ｐＴαをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。
このような核酸分子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１３８２９６（配列番号１）に示されるヒトｐＴαの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ、配列番号２に示されるｐＴαのアミノ酸配列を含有するタンパク質と、実質的に同質の活性（細胞外領域のアミノ酸残基の相互作用によって、自己二量体を形成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
種々の蛍光タンパク質の塩基配列に関する情報は、公に利用可能な情報源（例えば、学術文献、特許文献、遺伝子およびタンパク質のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなど））から入手可能である。また、種々の蛍光タンパク質遺伝子は、例えば、ＢＤ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されている。
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、該キメラタンパク質をコードする核酸分子から目的とする断片（目的遺伝子）を調製し、該断片を適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
発現ベクターおよびプロモーターとしては、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター（例えば、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＭＥ１８Ｓ）などが用いられる。
ＦＲＥＴ分析に用いられる、２種類の蛍光タンパク質を発現した細胞を作製する場合、第１蛍光タンパク質とのキメラタンパク質をコードする核酸分子と、第２蛍光タンパク質とのキメラタンパク質をコードする核酸分子とは、同一ベクター上に挿入してもよいし、別個のベクター上に挿入してもよい。
同一ベクター上に挿入する場合、両核酸分子は、別個のプロモーターの制御下におかれてもよいし、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターを用いて、同一プロモーターの制御下におくこともできる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、例えば、ＬＣＫ近位プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。
発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含み得る。
選択マーカーおよびレポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
発現ベクターとしては、目的遺伝子が選択マーカーまたはレポーターと共に同一ｍＲＮＡから発現される、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターが好ましい。ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターとしては、例えば、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，６７，３５１−９（１９９８））、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ社により市販されているベクターなどが挙げられる。
細胞への遺伝子導入は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法）に従って行うことができる。
ｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラタンパク質をコードする核酸分子を導入する細胞としては、好ましくは、生来ｐＴαを発現していない細胞（例えば、ＴＧ４０β、ＢＷ５１４７など）が挙げられる。
細胞への遺伝子導入の確認は、例えば、上記の選択マーカーおよびレポーターを利用する方法などにより行われ得る。
細胞を培養する培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、１９９培地などが用いられる。
培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１日〜約１週間、好ましくは、約１日〜約３日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
ＴＩＲＦ顕微鏡分析において、細胞は、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３５，４７−５３（１９９７）；Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−９（１９９５））を用いて画像化され得る。得られた画像の記録および分析は、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）などを用いて行われ得る。また、蛍光強度は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−９（１９９５）に記載の方法に従って決定され得る。
ＦＲＥＴ分析において、細胞における第１蛍光物質から第２蛍光物質への蛍光共鳴エネルギー転移は、例えば、フローサイトメトリーを用いて検出され得る。
（ｐＴαとＥＰＯＲとのキメラタンパク質を発現した細胞、またはｐＴαとＴＰＯＲとのキメラタンパク質を発現した細胞を用いるスクリーニング方法）
エリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）およびトロンボポイエチンレセプター（ＴＰＯＲ）は、変異により強制的に自己二量体を形成させた場合に、増殖にＩＬ−３を必要とする細胞（以下、「ＩＬ−３依存性細胞」という）の増殖を、ＩＬ−３の非存在下で誘導し得ることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３４８，６４７−６４９（１９９０）；Ｂｌｏｏｄ，８８，１３９９−１４０６（１９９６））。
このことから、ｐＴαの細胞外ドメインとＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインと含むキメラタンパク質（以下、「ｐＴα／ＥＰＯＲキメラ」ともいう）を発現させたＩＬ−３依存性細胞、または、ｐＴαの細胞外ドメインとＴＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインと含むキメラタンパク質（以下、「ｐＴα／ＴＰＯＲキメラ」ともいう）を発現させたＩＬ−３依存性細胞を用いれば、ＩＬ−３の非存在下での該細胞の増殖を指標として、ｐＴαの自己二量体の形成を評価することができる。
上記キメラタンパク質に用いられるｐＴαとしては、好ましくは、ヒトｐＴαが用いられる。ヒトｐＴαの細胞外ドメインとしては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ヒトｐＴαの全長アミノ酸配列）中、アミノ酸番号１７〜１４７で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が用いられる（ここで、「実質的に同一」とは、上記と同義である）。
また、ｐＴαにはいくつかのスプライスバリアントが知られているが、そのいずれを用いてもよい。
上記キメラタンパク質に用いられるＥＰＯＲとしては、好ましくは、ヒトＥＰＯＲが用いられる。ヒトＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとしては、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＡＡＡ５２４０３（配列番号４）で示されるアミノ酸配列（ヒトＥＰＯＲの全長アミノ酸配列）中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が用いられる（ここで、「実質的に同一」とは、上記と同義である）。
上記キメラタンパク質に用いられるＴＰＯＲとしては、好ましくは、ヒトＴＰＯＲが用いられる。ヒトＴＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとしては、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＮＰ＿００５３６４（配列番号６）で示されるアミノ酸配列（ヒトＴＰＯＲの全長アミノ酸配列）中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が用いられる（ここで、「実質的に同一」とは、上記と同義である）。
好ましくは、ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲは、その膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全部が、キメラを構成するタンパク質として用いられるが、該キメラタンパク質が二量体を形成した場合に、これらの部分に起因して生じる活性（ＩＬ−３依存性細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導する活性）が失われない限り、これらのドメインの任意の部分であってもよい（但し、該部分は、自律的二量体化をしない）。
また、ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲには、いくつかのスプライスバリアントが知られているが、そのいずれを用いてもよい。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはｐＴα／ＴＰＯＲキメラを発現するＩＬ−３依存性細胞は、該キメラタンパク質をコードする核酸分子を作製し、該核酸分子をＩＬ−３依存性細胞に導入することにより作製できる。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはｐＴα／ＴＰＯＲキメラをコードする核酸分子は、ｐＴαまたはその細胞外ドメインを含むフラグメントをコードする核酸分子、ならびにＥＰＯＲもしくはＴＰＯＲまたはそれらの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むフラグメントをコードする核酸分子を用いて、当該分野で公知の遺伝子組換技術（例えば、ＰＣＲ法を用いる技術）によって作製され得る。
ｐＴαをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ｐＴαの細胞外ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって増幅することができる。
ｐＴαをコードする核酸分子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１３８２９６（配列番号１）に示されるヒトｐＴαの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ、配列番号２に示されるｐＴαのアミノ酸配列を含有するタンパク質と、実質的に同質の活性（細胞外領域のアミノ酸残基の相互作用によって、自己二量体を形成する活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
ＥＰＯＲをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって増幅することができる。
ＥＰＯＲをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６０４５９（配列番号３）に示されるヒトＥＰＯＲの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号４に示されるＥＰＯＲのアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（二量体の形成により、ＩＬ−３依存細胞をＩＬ−３の非存在下で増殖させる活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
ＴＰＯＲをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ＴＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって増幅することができる。
ＴＰＯＲをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００５３７３（配列番号５）に示されるヒトＴＰＯＲの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号６に示されるＴＰＯＲのアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（二量体の形成により、ＩＬ−３依存細胞をＩＬ−３の非存在下で増殖させる活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはｐＴα／ＴＰＯＲキメラをコードする核酸分子を含む発現ベクターは、上記のｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラと同様の方法で作製することができる。
ＩＬ−３依存性細胞への遺伝子導入は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法）に従って行うことができる。
ＩＬ−３依存性細胞としては、例えば、マウスプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３（ＢＡＦ３）、マウス肥満細胞株ＩＣ２、マウス骨髄細胞株Ｆ−３６Ｐが挙げられる。好ましくは、ＢＡＦ３が、ＩＬ−３依存性細胞として用いられ得る。
ＩＬ−３依存性細胞への遺伝子導入の確認は、例えば、上記のｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラにおいて例示したような選択マーカーおよびレポーターなどを利用する方法；ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲに対する抗体を用いたブロッティング；またはこれらの任意の組合わせにより行われ得る。
ＩＬ−３依存性細胞を培養する培地および条件としては、上記のｐＴαと蛍光タンパク質とのキメラにおいて例示したような培地および条件が挙げられる。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラまたはｐＴα／ＴＰＯＲキメラの、ｐＴα部分の間での相互作用の有無は、遺伝子導入したＩＬ−３依存性細胞のＩＬ−３非存在下での生存度により確認できる。細胞の生存度は、例えば、フローサイトメトリーにより、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を計数することにより決定され得る。
本発明はまた、ｐＴαの自己二量体形成を調節する物質を検出するためのキットを提供する。該キットは、上記スクリーニング方法において記載したｐＴαと蛍光物質とのキメラタンパク質を発現した細胞、または、ｐＴαとＥＰＯＲまたはＴＰＯＲとのキメラタンパク質を発現したＩＬ−３依存性細胞を含む。使用者は、本発明のキットを用いて上記のスクリーニング方法を実施することができる。
また、第２の局面では、本発明は、種々の細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を簡便に検出できるシステム（以下、「本発明の検出システム」と略記することがある）に関する。本発明の検出システムは、第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質をコードする核酸分子、ならびに第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子を導入した、ＩＬ−３依存性細胞を、ＩＬ−３の非存在下で培養し、該細胞の増殖の有無を確認する工程を含む、細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」と略記することがある）を提供する。
本発明の検出システムはまた、第１のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第１のキメラタンパク質、ならびに第２のタンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、第２のキメラタンパク質を発現した、ＩＬ−３依存性細胞を提供する。
本発明の検出システムはまた、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプターまたはトロンボポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む、キメラタンパク質を提供する。
本発明の検出システムに用いられるキメラタンパク質は、タンパク質間の相互作用について試験される細胞表面タンパク質の細胞外ドメインと、エリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）またはトロンボポイエチンレセプター（ＴＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから構成される。
本発明の検出システムにおいて、「第１のタンパク質」および「第２のタンパク質」とは、タンパク質間の細胞外領域における相互作用について試験される細胞表面タンパク質を意味する。
ここで、「第１のタンパク質」と「第２のタンパク質」は、同種のタンパク質であってもよいし、異種のタンパク質であってもよい。本発明の検出システムにおいて、「第１のタンパク質」もしくは「第２のタンパク質」またはこれらをまとめて、「被験タンパク質」ともいう。
本発明の検出システムにおける被験タンパク質としては、任意の天然または人工の細胞表面タンパク質が選択され得る。例えば、種々の細胞表面レセプターは、細胞の増殖、分化、生存などを制御する細胞内シグナル伝達系において重要な役割を果たし得るので、該レセプターを構成するタンパク質は、本発明の検出システムにおける被験タンパク質となり得る。
本発明の検出システムにおける被験タンパク質の具体例としては、ｐＴα（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ＿１３８２９６；ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号ＮＰ＿６１２１５３；Ｓａｉｎｔ−Ｒｕｆ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１２０８−１２１２，１９９４を参照）；ＴＣＲα（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ４７５２２０；ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＡＡＳ４８０６０を参照）；ＴＣＲβ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ４７５２１８；ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＡＡＳ４８０５８を参照）などが挙げられるが、これらに限定されず、疎水性プロット（例えば、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性分析）により膜貫通（膜結合）タンパク質と推定される任意のタンパク質であってもよい。
本発明の検出システムにおいて、「タンパク質の細胞外ドメイン」とは、細胞表面タンパク質の細胞外に存在する領域（ドメイン）の全部またはその任意のフラグメントを意味する。
本発明の検出システムにおいて、「エリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン」とは、好ましくは、ヒトＥＰＯＲの、細胞膜を貫通する領域（ドメイン）および細胞質内に存在する領域（ドメイン）、またはそれと実質的に同一のタンパク質を意味する（以下、「ＥＰＯＲの活性ドメイン」と略記する場合がある）。
ここで「実質的に同一」とは、ヒトＥＰＯＲの活性ドメインのアミノ酸配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトＥＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性を有するようなタンパク質をいう。
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、水酸基を有するアミノ酸、側鎖の小さいアミノ酸などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は、タンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムであるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用いて、以下の条件（期待値＝１０、ギャップを許す、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、フィルタリング＝ＯＦＦ）で計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらは同様に好ましく用いられ得る。
ＥＰＯＲにはいくつかのスプライスバリアントが知られているが、そのいずれを用いてもよい。
好ましくは、ＥＰＯＲの活性ドメインとしては、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＡＡＡ５２４０３で示されるアミノ酸配列（即ち、ヒトＥＰＯＲの全長ＯＲＦからなるアミノ酸配列（配列番号４））中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
「ヒト由来のＥＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性」としては、二量体の形成により、それを発現するＩＬ−３依存性細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導する活性などが挙げられる。
ここで、「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に同等であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
また、本発明の検出システムにおいて用いられるヒト由来のＥＰＯＲの活性ドメインと実質的に同一のタンパク質としては、例えば、以下のアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、ヒトＥＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性を有するタンパク質等も含まれる：
（１）配列番号４のアミノ酸配列中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
（２）配列番号４のアミノ酸配列中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列に、１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列；
（３）配列番号４のアミノ酸配列中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列に、１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列；
（４）配列番号４のアミノ酸配列中、アミノ酸番号２５１〜５０８で示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；あるいは
（５）上記（１）〜（４）を組み合わせたアミノ酸配列。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同義である。
アミノ酸配列が、欠失、付加、挿入または置換されている場合、その欠失、付加、挿入または置換の位置は、当該タンパク質の活性を損なわず、かつ自己二量体化を引き起こさない限り、特に限定されない。
本発明の検出システムにおいて、「トロンボポイエチンレセプター（ＴＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン」とは、好ましくは、ヒトＴＰＯＲの、細胞膜を貫通する領域（ドメイン）および細胞質内に存在する領域（ドメイン）、またはそれと実質的に同一のタンパク質を意味する（以下、「ＴＰＯＲの活性ドメイン」と略記する場合がある）。
ここで「実質的に同一」とは、ヒトＴＰＯＲの活性ドメインのアミノ酸配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトＴＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性を有するようなタンパク質をいう（ここで「相同性」とは、上記と同義である）。
ＴＰＯＲにはいくつかのスプライスバリアントが知られているが、そのいずれを用いてもよい。
好ましくは、ＴＰＯＲの活性ドメインとしては、ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＮＰ＿００５３６４で示されるアミノ酸配列（即ち、ヒトＴＰＯＲの全長ＯＲＦからなるアミノ酸配列（配列番号６））中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
「ヒト由来のＴＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性」としては、二量体の形成により、それを発現するＩＬ−３依存性細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導する活性などが挙げられる。
ここで、「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に同等であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
また、本発明の検出システムにおいて用いられるヒト由来のＴＰＯＲの活性ドメインと実質的に同一のタンパク質としては、例えば、以下のアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、ヒトＴＰＯＲの活性ドメインと実質的に同質の活性を有するタンパク質等も含まれる：
（１）配列番号６のアミノ酸配列中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
（２）配列番号６のアミノ酸配列中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列に、１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列；
（３）配列番号６のアミノ酸配列中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列に、１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列；
（４）配列番号６のアミノ酸配列中、アミノ酸番号４６８〜６１０で示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；あるいは
（５）上記（１）〜（４）を組み合わせたアミノ酸配列。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同義である。
アミノ酸配列が、欠失、付加、挿入または置換されている場合、その欠失、付加、挿入または置換の位置は、当該タンパク質の活性を損なわず、かつ自己二量体化を引き起こさない限り、特に限定されない。
本発明の検出システムにおいて、ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲは、好ましくは、その膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全部が、本検出システムに用いられるキメラタンパク質を構成するタンパク質として用いられるが、該キメラタンパク質が二量体を形成した場合に、それらに由来するドメインに起因して生じる活性（ＩＬ−３依存性細胞の増殖をＩＬ−３の非存在下で誘導する活性）が失われない限り、これらのドメインの任意の部分であってもよい（但し、該部分は、自律的二量体化をしない）。
また、本発明の検出システムに用いられるキメラタンパク質は、ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに加えて、それらの細胞外領域の一部を含んでいてもよい。
本発明の検出システムに用いられるキメラタンパク質をコードする核酸分子は、被験タンパク質またはその細胞外ドメインを含むフラグメントをコードする核酸分子、ならびにＥＰＯＲもしくはＴＰＯＲまたはそれらの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むフラグメントをコードする核酸分子を用いて、当該分野で公知の遺伝子組換技術（例えば、ＰＣＲ法を用いる技術）によって作製され得る。
被験タンパク質をコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。被験タンパク質の細胞外ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法などによって増幅することができる。
被験タンパク質の候補となり得る、種々の細胞表面タンパク質またはその細胞外ドメインの塩基配列およびアミノ酸配列に関する情報は、公に利用可能な情報源（例えば、学術文献、特許文献、遺伝子およびタンパク質のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎＰｅｐｔなど））から入手可能である。
ＥＰＯＲをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって増幅することができる。
ＥＰＯＲをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６０４５９（配列番号３）に示されるヒトＥＰＯＲの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号４に示されるＥＰＯＲのアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（二量体の形成により、ＩＬ−３依存細胞をＩＬ−３の非存在下で増殖させる活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。
ＴＰＯＲをコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としては、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。ＴＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって増幅することができる。
ＴＰＯＲをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００５３７３（配列番号５）に示されるヒトＴＰＯＲの全コード領域の塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号６に示されるＴＰＯＲのアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（二量体の形成により、ＩＬ−３依存細胞をＩＬ−３の非存在下で増殖させる活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列と、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡが用いられ得る。塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件：期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３にて計算することができる。
塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。持に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダイゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができることを理解する。
本発明の検出システムに用いられるキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、本発明の検出システムに用いられるキメラタンパク質をコードする核酸分子から、目的とする断片（目的遺伝子）を調製し、該断片を適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
発現ベクターとしては、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター（例えば、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＭＥ１８Ｓ）などが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、例えば、ＬＣＫ近位プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。
発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含み得る。
選択マーカーおよびレポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
発現ベクターとしては、目的遺伝子が選択マーカーまたはレポーターと共に同一ｍＲＮＡから発現される、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターが好ましい。ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターとしては、例えば、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，６７，３５１−９（１９９８））、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ社により市販されているベクターなどが挙げられる。
第１のタンパク質と第２のタンパク質とが異種である場合、第１のキメラタンパク質をコードする核酸分子と、第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子とは、同一ベクター上に挿入してもよいし、別個のベクター上に挿入してもよい。
同一ベクター上に挿入する場合、両核酸分子は、別個のプロモーターの制御下におかれてもよいし、上記ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターを用いて、同一プロモーターの制御下におくこともできる。
ＩＬ−３依存性細胞への遺伝子導入は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法）に従って行うことができる。
ＩＬ−３依存性細胞細胞としては、例えば、マウスプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３（本明細書において、「ＢＡＦ３」とも表記する）、マウス肥満細胞株ＩＣ２、マウス骨髄細胞株Ｆ−３６Ｐが挙げられる。
本発明の検出システムにおいて、好ましくは、ＢＡＦ３が、ＩＬ−３依存性細胞として用いられ得る。
ＩＬ−３依存性細胞への遺伝子導入の確認は、例えば、上記の選択マーカーおよびレポーターを利用する方法、ＥＰＯＲまたはＴＰＯＲに対する抗体を用いたブロッティング、またはこれらの任意の組合わせにより行われ得る。
細胞を培養する培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、１９９培地などが用いられる。
培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１日〜約１週間、好ましくは、約１日〜約３日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
第１のタンパク質と第２のタンパク質が、特定のリガンドの存在下で相互作用し得る場合は、適当な濃度の該リガンドが培地に添加され得る。
従って、本発明の検出システムはまた、相互作用することが既知であり、かつそのリガンドが未知である細胞表面タンパク質のスクリーニング方法を提供する。
あるいは、本発明の検出システムはまた、リガンドが公知である細胞表面タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
本発明の検出システムにおいて、細胞外領域での第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の有無は、遺伝子導入したＩＬ−３依存性細胞の生存度により確認できる。細胞の生存度は、例えば、フローサイトメトリーにより、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を計数することにより決定され得る。
第１のタンパク質と第２のタンパク質が異種である場合、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の他に、第１のタンパク質間の相互作用および／または第２のタンパク質間の相互作用も考えられる。
従って、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の有無は、第１のキメラタンパク質をコードする核酸分子と第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子の両方をＩＬ−３依存性細胞に導入した場合の該細胞のＩＬ−３非存在下での生存度と、第１および第２のキメラタンパク質をコードする核酸分子をそれぞれ単独でＩＬ−３依存性細胞に導入した場合の生存度とを、比較することにより検討することがより望ましい。
本発明の検出システムはまた、細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を検出するためのキットを提供する。本検出キットは、ＥＰＯＲもしくはＴＰＯＲまたはそれらの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸分子；発現ベクター；ならびにＩＬ−３依存性細胞を含む。
本検出キットの使用者は、試験する細胞表面タンパク質またはその細胞外ドメインをコードする核酸分子を準備すれば、本検出キットを使用して、上記の手順に従って、被験タンパク質間の細胞外領域における相互作用の有無を確認することができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００６】
（実施例１）
（方法）
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＲａｇ２−／−マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから入手した。ｐｒｅ−Ｔα−／−マウスは、Ｈ．ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ博士（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）から提供された。全てのマウスを、層流方式クリーンルーム内で維持し、そして標準的な実験用飼料および水を適宜与えた。全ての動物実験を、本発明者らの施設のガイドラインに従って行った。
（細胞および試薬）
ハトシトクロムｃ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ（２Ｂ４）およびそのα−β−バリアント（ＴＧ４０）を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。ＴＧ４０に、ｐＭＸ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクターを用いて、Ｐ１４  ＴＣＲβ鎖を感染させた（ＴＧ４０β）。
抗ＣＤ４  ｍＡｂ、抗ＣＤ８  ｍＡｂ、抗ＴＣＲβ  ｍＡｂ、抗ＣＤ２５  ｍＡｂ、および抗ｈＣＤ８ｍＡｂを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
抗ｐＴα（２Ｆ５）ｍＡｂを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
抗ｒＣＤ２  ｍＡｂを、ＣｅｄａｒＬａｎｅから入手した。
抗ｈＥＰＯＲ  ｍＡｂをＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手した。
（キメラタンパク質の構築）
ｐＴα／ＧＦＰを、ＰＣＲ法によって、ｐＴα鎖のＣ末端にＧＦＰを融合させることにより作製した。
ＴＣＲα／ＧＦＰを、ＰＣＲ法によって、Ｐ１４  ＴＣＲα鎖のＣ末端にＧＦＰを融合させることにより作製した。
ｐＴα／ＥＰＯＲを、ＰＣＲ法によって、ヒトエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインにｐＴαの細胞外ドメインを融合させることにより作製した。
ＴＣＲα／ＥＰＯＲを、ＰＣＲ法によって、ヒトエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインにＰ１４  ＴＣＲαの細胞外ドメインを融合させることにより作製した。
具体的には、ｐＴαの全長を含むプラスミドを鋳型にしてｐｒｉｍｅｒ（１）とＥＰＯＲの膜貫通ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（２）にてｐＴαの細胞外ドメインを増幅した。一方、ＴＣＲαの全長を含むプラスミドを鋳型にしてｐｒｉｍｅｒ（１）とＥＰＯＲの膜貫通ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（３）にてＴＣＲαの細胞外ドメインを増幅した。
ｐＴαの細胞外ドメインの増幅物を、ＥＰＯＲの全長を含むプラスミドを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ（４）とｐＴαの細胞外ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（５）を用いて増幅したＥＰＯＲの膜貫通ドメイン〜細胞内ドメインにアニールさせ、ｐｒｉｍｅｒ（１）およびｐｒｉｍｅｒ（４）を用いて増幅して、目的とするｐＴα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを得た。一方、ＴＣＲαの細胞外ドメインの増幅物を、ＥＰＯＲの全長を含むプラスミドを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ（４）とＴＣＲαの細胞外ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（６）にて増幅したＥＰＯＲの膜貫通ドメイン〜細胞内ドメインにアニールさせ、ｐｒｉｍｅｒ（１）およびｐｒｉｍｅｒ（４）にて増幅して、目的とするＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを得た。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへサブクローニングし、以下の解析に供した。
ｐｒｉｍｅｒ（１）ＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴ（配列番号８）
ｐｒｉｍｅｒ（２）ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣ（配列番号９）
ｐｒｉｍｅｒ（３）ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＧＴ（配列番号１０）
ｐｒｉｍｅｒ（４）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１１）
ｐｒｉｍｅｒ（５）ＧＧＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号１２）
ｐｒｉｍｅｒ（６）ＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号１３）
ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２は、Ｍ．Ｋｕｂｏ博士（Ｒｉｋｅｎ）より提供された。
ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８は、ＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ中のＧＦＰのＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントを、細胞質領域を欠失した短縮型ヒトＣＤ８α（Δ１９８〜２１４）と交換することにより構築した。
（骨髄移植）
骨髄移植（ＢＭＴ）に関して、Ｒａｇ２−／−マウス由来のＳｃａ−１＋  ＢＭ細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により選別し、そして１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７および１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で、１×１０６／ｍｌにて培養した。レトロウイルス媒介遺伝子移入を、Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ，１０３，３０９３−１０１（２００４）に記載される方法に従って行った。１日目および２日目に、１０倍に濃縮したレトロウイルス上清を加え、そしてこれを、３２℃で、２０００ｒｐｍにて１時間、遠心分離した。感染の４日後に、ｈＣＤ８＋細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて選別し、そして照射（７Ｇｙ）したＲａｇ２−／−マウスに静脈内注入した。ＢＭＴの６週間後、マウスから胸腺細胞または脾細胞を取り出して分析した。
（競合的ＢＭＴ）
ｐＴα−／−マウス由来のＳｃａ−１＋  ＢＭ細胞に、上記のように、野生型ｐＴα−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８をコードするレトロウイルスベクターまたはｐＴαＲ１０２／１１７Ａ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２をコードするレトロウイルスベクターを感染させた。感染の４日後、ｈＣＤ８＋細胞またはｒＣＤ２＋細胞を、ＭＡＣＳを用いて選別した。各集団由来の５×１０５細胞を混合し、そして照射（４Ｇｙ）したＲａｇ２−／−マウスへと注入した。ＢＭＴの３週間後、胸腺細胞をＦＡＣＳを用いて分析した。
（ｐＴα−βヘテロ二量体複合体の分子モデリング）
マウスｐＴαの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１１１９５）を、ＮＣＢＩサーバーから入手した。ｐＴαの１０番目の残基〜１１９番目の残基の範囲の部分配列を抽出し、そしてその三次元構造を、ホモロジーモデリングのための一般的な方法を用いて予想した。ＴＣＲαの結晶構造（ＰＤＢ−エントリー：１ｎｆｄ）（Ｗａｎｇら、Ｅｍｂｏ．Ｊ．，１７，１０−２６（１９９８））を、ホモロジーモデルを作成するためのテンプレートとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２８，２３５−４２（２０００））から入手した。ｐＴαの部分配列を、ＮＷ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−５３（１９７０））を用いてテンプレートタンパク質と整列させた。適切な整列を得るために、ｐＴα中のギャップおよびＣｙｓ残基を、テンプレートタンパク質のＣｙｓ残基の対応する位置に向けて手動で移動させた。適切な整列を達成すると、標的タンパク質中の主鎖原子を、ＴＣＲαのテンプレートタンパク質中の対応する残基の配位に割り当てた。ループ領域の挿入および欠失を、公知の構造のタンパク質のフラグメントから作成されたフラグメントデータベースから、適切な構造を検索することにより、モデリングした。側鎖を、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ法を用いて、ｐＴαモデルバックボーン上に構築した。構造を緩和させるために、５００ｐｓ  分子ダイナミックスシミュレーションを、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓパッケージＡＭＢＥＲ８（Ｃｏｒｎｅｌｌら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｐｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０４，４０−Ｃｏｍｐ（１９９２）；Ｐｅａｒｌｍａｎら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９１，１−４１（１９９５））を用いて行った。図を、ＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を用いて作成した。
（単分子の分析）
細胞を、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡（Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３５，４７−５３（１９９７）；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−９（１９９５））を用いて画像化した。固体レーザー（４８８ｎｍ、２０ｍＷ、ＳＡＰＰＨＩＲＥ  ４８８−２０−ＯＰＳ，ＣＯＨＥＲＥＮＴ，ＣＡ）からのビームを、照射のために、倒立顕微鏡（ＩＸ−８１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）に導入した。画像を、ＥＢ−ＣＣＤカメラ（Ｃ−７１９０−２３，Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いてキャプチャーした。画像の記録および分析を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて行った。細胞を、ポリ−Ｌ−リジンをコートしたガラス底皿（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）上で、葉酸およびリボフラビンを含まないフェノールレッドフリー  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ中で分析した。
（蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））
ＣＦＰおよびＹＦＰを、テンプレートとしてｐＥＣＦＰ−Ｃ１およびｐＥＹＦＰ−Ｃ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲにより、上記のｐＴα／ＧＦＰ融合タンパク質と同じ様式で、ｐＴαまたはｐＴαＲ１０２／１１７Ａと融合させた。ＴＣＲαｎｕｌｌ  ＴＧ４０β細胞を、これらの蛍光タンパク質を用いて、レトロウイルスにより再構成した。フローサイトメトリーによるＦＲＥＴの検出のために、細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、ＹＦＰ（励起４８０ｎｍ；発光５３０ｎｍ）、ＣＦＰ（励起４０７ｎｍ；発光５１０ｎｍ）およびＦＲＥＴ（励起４０７ｎｍ；発光５３５ｎｍ）について分析した。ＦＲＥＴを、ＣＦＰ励起により得られるＹＦＰ発光として表し、これをＹＦＰ励起によるＹＦＰ発光に対してプロットした。
（結果）
（ｐｒｅ−ＴＣＲの構成的インターナリゼーションおよびリソソーム局在）
ｐｒｅ−ＴＣＲは、リガンド非依存的な様式で作用することが提唱されているが、このような自律的シグナル伝達の基礎を成す分子機構は、明らかではない。
この問題に取り組むために、本発明者らは、ｐＴαおよびＴＣＲαのＧＦＰ融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）を用いて、同じ細胞状況下でｐｒｅ−ＴＣＲおよびαβＴＣＲの亜細胞局在および動的輸送（ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を可視化した。
蛍光標識したｐｒｅ−ＴＣＲおよびαβＴＣＲを、それぞれ、ｐＴα／ＧＦＰおよびＴＣＲα／ＧＦＰを導入することによって、ＴＣＲαｎｕｌｌＴ細胞ハイブリドーマ（ＴＧ４０β）において再構成した。
抗ＴＣＲβ染色は、ｐｒｅ−ＴＣＲの表面発現レベルが、αβＴＣＲのレベルよりもかなり低い（図１ａ、左パネル群および中央パネル群）が、これら２つの株の総ＧＦＰ発現レベルは、類似していた（図１ａ、中央パネル群）ことを示した。これらの観察と一致して、ＴＣＲα／ＧＦＰではなく、ｐＴα／ＧＦＰのかなりの画分が、細胞内小胞区画（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）において見出され（図１ａ、右パネル群）、これらは、リソソームのマーカーと同時局在していた（図１ｂ）。抗ＴＣＲβ  ｍＡｂを用いて標識したＴＣＲβ鎖表面は、３７℃にて３０分間インキュベートした後、ｐＴα／ＧＦＰと同時局在していた（図１ｃ）。このことは、ｐｒｅ−ＴＣＲ複合体が、細胞表面から迅速にインターナライズされることを示した。これらの観察は、ｐｒｅ−ＴＣＲが、自律的に結合され得ることを示唆した。
ＴＧ４０β細胞の表面上のｐＴα／ＧＦＰを含むレセプター複合体、またはＴＣＲα／ＧＦＰを含むレセプター複合体の自己オリゴマー化能力を、先に記載したように、ＴＩＲＦ顕微鏡により評価した。
細胞表面上の単一のレセプタークラスター内のＧＦＰ分子の数を、ｐＴα／ＧＦＰまたはＴＣＲα／ＧＦＰを用いて評価した。細胞表面上のレセプターの単一クラスターを反映する単一の明るいスポットの各々の蛍光強度を、Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−９（１９９５）に記載されるように決定した。個々の表面の明るいスポットを分析し、そしてそれらの蛍光を、度数分布のヒストグラムとして表す（図１ｄ）。組換えＧＦＰから同時に決定された単一のＧＦＰ分子の平均蛍光強度は、１５８５±５６ａ．ｕ．（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ）であった。オリゴマーを反映する高い蛍光強度を有するクラスターが、ｐＴα／ＧＦＰを発現する細胞においてのみ観察され（図１ｄ、下パネル）、そしてＴＣＲα／ＧＦＰを発現する細胞では観察されなかった（図１ｄ、上パネル）ことは注目に値する。
上記と一致して、細胞表面上のｐＴα／ＧＦＰの、単分子レベルでの、顕微鏡分析は、ｐｒｅ−ＴＣＲ複合体が、原形質膜内でオリゴマーを形成する能力を有することを示唆した（図１ｄ）。
（ｐＴα／ＥＰＯＲキメラは、自律的増殖を誘導する）
上記に示したｐｒｅ−ＴＣＲの固有の特性は、ｐＴαに完全に依存する。なぜならば、細胞状況および他のレセプター成分（ＴＣＲβおよびＣＤ３複合体）が、これらの２つの細胞株の間で一致するからである。従って、本発明者らは、ｐＴαの構造および機能に焦点を合わせ、そしてｐＴαのリガンド結合の非存在下でのオリゴマー化能力を試験する新規のシステムを利用した。
ｐＴαおよびＴＣＲαの細胞外ドメインを、ヒトエリスロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合した（それぞれ、ｐＴα／ＥＰＯＲおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲという）（図２ａ）。形質導入したＢＡＦ３細胞における各キメラレセプターの発現を、抗ＥＰＯＲイムノブロット及び染色により確認した（図２ｂ、図２ｃ）。ｐＴα／ＥＰＯＲを形質導入したＢＡＦ３細胞は、ＩＬ−３の非存在下でさえ、かなりの増殖を示し、他方、偽感染（ｍｏｃｋ）またはＴＣＲα／ＥＰＯＲ感染は、ＢＡＦ３増殖に影響を与えなかった（図２ｄ）。これらの結果は、ｐＴαの細胞外ドメイン自体が、自発的にオリゴマーを形成する能力を有することを示した。
ｐＴα／ＣＦＰおよびｐＴα／ＹＦＰを用いるＦＲＥＴ分析もまた、ｐｒｅ−ＴＣＲが細胞表面上にオリゴマーを形成する能力を有することを示した（図２ｅ）。
（ｐＴαの特定の荷電した残基は、ｐＴα／ＥＰＯＲ活性に重要である）
ｐＴαのオリゴマー化のための構造的要件を解明するために、ｐＴα／ＥＰＯＲにより誘導される細胞増殖を利用して、突然変異誘発を行った。
本発明者らは、ヒトおよびマウスのｐＴαに関して保存されている荷電したアミノ酸残基に注目した（図３ａ）。ｐＴαのこれらのアミノ酸の全てを、個別かつ同時に変異させ、そしてＢＡＦ３増殖に対するこれらの影響を評価した。
本発明者らは、Ｄ２２、Ｒ２４、Ｒ１０２、およびＲ１１７が、ｐＴα／ＥＰＯＲ機能に重要であることを見出した。なぜならば、これらの残基の各々のアラニン置換は、増殖を支持する活性を無効にしたからである（図３ｂ、ｍ５、ｍ９−ｍ１１）。
Ｒ２４の、かさ高いアミノ酸残基（Ｑ）、親水性のアミノ酸残基（Ｓ）、または酸性のアミノ酸残基（Ｅ）との置換は、ｐＴα／ＥＰＯＲ活性を完全に無効にし（図３ｂ、ｍ１２−ｍ１４）、他方、Ｒ２４、Ｒ１０２、およびＲ１１７の、塩基性アミノ酸残基（Ｋ）との置換は、この活性を維持した（図３ｂ、ｍ１５−ｍ１９）。
このことは、これらの残基の正電荷が、活性に重要であることを示唆する。同様に、Ｄ２２Ａ変異は、活性を抑止したが、負電荷を保持したＤ２２Ｅ変異は、活性を維持した（図３ｂ、ｍ６）。まとめると、これらの観察は、２２位、２４位、１０２位、および１１７位の荷電したアミノ酸は、ｐＴαの自己オリゴマー化特性に重要であることを示唆する。
ｐＴα−ＴＣＲβヘテロ二量体の三次元構造の状況下で、これらの荷電した残基を配置することを試みるために、分子モデリングを、αβＴＣＲヘテロ二量体の結晶構造（Ｗａｎｇら、Ｅｍｂｏ．Ｊ．，１７，１０−２６（１９９８））に基づいて行った（詳細については、前述のとおりである）。
このモデルは、機能的に重要なアミノ酸である、Ｄ２２、Ｒ２４、Ｒ１０２、およびＲ１１７が、ｐＴα−ＴＣＲβ複合体の分子表面上に位置付けられることを示す（図３ｃ）。このことは、これらの残基が、オリゴマー形成を導く静電的相互作用を促進するように適切に配置されていることを示唆する。
明らかに対照的に、他の荷電した残基である、Ｅ８１、Ｅ８２、Ｅ８４、Ｅ８７、Ｄ３５、およびＤ４２は、ＴＣＲβと向い合うことが示された（図３ｄ）。このことは、これらの残基が、ｐｒｅ−ＴＣＲの自己オリゴマー化に関与する可能性が低いことを示唆する。
この仮定と一致して、これらの残基は、胸腺細胞におけるｐＴα−ＴＣＲβ複合体形成において役割を果たし得るにもかかわらず、ｐＴα／ＥＰＯＲタンパク質の自己オリゴマー化に必須ではなかった。
（ｐＴαのＲ１０２／Ｒ１１７は、インビボでのβ選択に重要である）
上記の荷電した残基が、ｐｒｅ−ＴＣＲ機能に実際に寄与するか否かを検討した。４つの重要な荷電した残基の中で、Ｒ１０２およびＲ１１７は、ｐＴα−β境界面から別々の方向に離れていることから、Ｒ１０２／１１７Ａ変異を有するｐＴα／ＧＦＰ融合タンパク質（ｐＴαＲ１０２／１１７Ａ／ＧＦＰ）を、ＴＣＲαｎｕｌｌＴ細胞へと導入し、そして、上記と同じように、インターナリゼーションについて分析した。
ｐＴαＲ１０２／１１７Ａ／ＧＦＰを発現する細胞の細胞表面上のｐｒｅ−ＴＣＲ発現は、野生型（ＷＴ）における発現よりもかなり高かった（図４ａ）。さらに、構成的なインターナリゼーションを反映するｐｒｅ−ＴＣＲを含有する細胞内小胞は、Ｒ１０２／１１７Ａ変異体によりかなり減少される（図４ｂ）。これらの結果は、これらの荷電した残基が、効果的なｐｒｅ−ＴＣＲインターナリゼーションに重要であることを示す。
本発明者らは、次いで、放射線ＢＭＴ実験において、インビボでの胸腺細胞の発達におけるこの変異体ｐＴαの機能を分析した。
ｐＴα−／−マウス由来のＢＭ細胞に、ｐＴαＷＴ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８またはｐＴαＲ１０２／１１７Ａ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２をレトロウイルスにより形質導入し、そして、照射したＲａｇ２−／−マウスに注入した。３週間後、レシピエントマウス由来の胸腺細胞を、ｈＣＤ８＋集団またはｒＣＤ２＋集団におけるＣＤ４およびＣＤ８発現について分析した（図４ｃ、上パネル群）。ＷＴ  ｐＴαを発現する細胞は、効果的なＤＰ移行を示し（ＤＰ細胞は、ｈＣＤ８＋胸腺細胞の８５．６％を表した）、他方、ＤＰ胸腺細胞は、ｐＴαＲ１０２／１１７Ａを発現する細胞（ｒＣＤ２＋）のわずか１０．８％を表した。さらに、β選択と関連する別の事象である、ＣＤ２５のダウンレギュレーションは、ｐＴαＲＲ１０２／１１７ＡではなくｐＴαＷＴを発現するｐＴα−／−マウス由来の胸腺細胞において顕著であった（図４ｃ、下パネル群）。
これらの結果はまた、競合的ＢＭＴ実験においても確認された。ｐＴα−／−ＢＭ細胞に、ｐＴαＷＴ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８またはｐＴαＲ１０２／１１７Ａ−ＩＲＥＳ−ｒＣＤ２を別々に形質導入し、１：１の割合で混合し、そして照射したＲａｇ２−／−レシピエントマウスへと注射した。再度、Ｒ１０２／１１７Ａ変異体（ｒＣＤ２＋）を発現する胸腺細胞は、ＷＴ（ｈＣＤ８＋）よりも効果の低いＤＰ移行を示した。従って、ｐＴαの細胞外ドメイン内のＲ１０２および／またはＲ１１７は、β選択チェックポイントのトラバース（インビボでのｐｒｅ−ＴＣＲの生理学的機能）に重要であると考えられる。
（実施例２）
ｐｒｅ−ＴＣＲは、リガンド非依存的な様式で作用することが提唱されている（Ｉｒｖｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，９０５−８（１９９８））が、このような自律的シグナル伝達の基礎となる分子機構は明らかではない。
発明者らは、ｐｒｅ−ＴＣＲに固有のタンパク質であるｐＴαに焦点を合わせ、ｐＴαのオリゴマー化能力を試験するために本発明のシステムを利用した。
ｐＴαの細胞外ドメインおよびＴＣＲαの細胞外ドメインを、それぞれ、ＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したキメラタンパク質（図２ａ；以下、それぞれ、ｐＴα／ＥＰＯＲおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲという）を発現するＢＡＦ３細胞を作製した。
ｐＴαの全長を含むプラスミドを鋳型にしてｐｒｉｍｅｒ（１）とＥＰＯＲの膜貫通ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（２）を用いてｐＴαの細胞外ドメインを増幅した。一方、ＴＣＲαの全長を含むプラスミドを鋳型にしてｐｒｉｍｅｒ（１）とＥＰＯＲの膜貫通ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（３）を用いてＴＣＲαの細胞外ドメインを増幅した。
ｐＴαの細胞外ドメインの増幅物を、ＥＰＯＲの全長を含むプラスミドを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ（４）とｐＴαの細胞外ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（５）を用いて増幅したＥＰＯＲの膜貫通ドメイン〜細胞内ドメインにアニールさせ、ｐｒｉｍｅｒ（１）およびｐｒｉｍｅｒ（４）を用いて増幅して、目的とするｐＴα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを得た。一方、ＴＣＲαの細胞外ドメインの増幅物を、ＥＰＯＲの全長を含むプラスミドを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ（４）とＴＣＲαの細胞外ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（６）にて増幅したＥＰＯＲの膜貫通ドメイン〜細胞内ドメインにアニールさせ、ｐｒｉｍｅｒ（１）およびｐｒｉｍｅｒ（４）にて増幅して、目的とするＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを得た。
ｐＴα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへサブクローニングし、以下の解析に供した。
ｐｒｉｍｅｒ（１）ＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴ（配列番号８）
ｐｒｉｍｅｒ（２）ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣ（配列番号９）
ｐｒｉｍｅｒ（３）ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＧＴ（配列番号１０）
ｐｒｉｍｅｒ（４）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１１）
ｐｒｉｍｅｒ（５）ＧＧＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号１２）
ｐｒｉｍｅｒ（６）ＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号１３）
ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター中のｐＴα／ＥＰＯＲおよびＴＣＲα／ＥＰＯＲを、それぞれ、ＢＡＦ３細胞にトランスフェクトし、ＢＡＦ３細胞トランスフェクタントにおける各キメラレセプターの発現を、抗ＥＰＯＲイムノブロット（図２ｂ）及び抗ＥＰＯＲ染色（図２ｃ）により確認した。
ＩＬ−３枯渇後の細胞生存度を、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を計数することにより決定した。
図２ｄに、ＧＦＰ−細胞（キメラを発現しない細胞：○）またはＧＦＰ＋細胞（キメラを発現する細胞：●）の生存度を、０日目の生存細胞数を１００とした相対百分率として表す。各条件についての感染効率は、全ての実験および類似の結果を示した４つの独立した実験において５０％〜８０％であった。
ＩＬ−３の非存在下でさえ、ｐＴα／ＥＰＯＲを導入したＢＡＦ３細胞は、かなりの増殖を示し、他方、偽感染（Ｍｏｃｋ）またはＴＣＲα／ＥＰＯＲ感染は、ＢＡＦ３増殖に影響を与えなかった（図２ｄ）。
上記の結果は、ｐＴαの細胞外ドメイン自体が、自発的にオリゴマーを形成する能力を有することを示唆した。
また、細胞外ドメインのＳ−Ｓ結合によりホモ二量体として存在することが既知な分子であるＣＤ８を用いて実験を行った。
ＣＤ８の細胞外ドメインを、ＥＰＯＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したキメラタンパク質（以下、ＣＤ８／ＥＰＯＲという）を発現するＢＡＦ３細胞を作製した。
具体的には、ＣＤ８の全長を含むプラスミドを鋳型にしてｐｒｉｍｅｒ（７）とＥＰＯＲの膜貫通ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（８）にてＣＤ８の細胞外ドメインを増幅した。ＣＤ８の細胞外ドメインの増幅物を、ＥＰＯＲの全長を含むプラスミドを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ（９）とＣＤ８の細胞外ドメインの一部を含むｐｒｉｍｅｒ（１０）を用いて増幅したＥＰＯＲの膜貫通ドメイン〜細胞内ドメインにアニールさせ、ｐｒｉｍｅｒ（７）及びｐｒｉｍｅｒ（９）を用いて増幅し、目的とするＣＤ８／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡを得た。ＣＤ８／ＥＰＯＲキメラ分子をコードするｃＤＮＡをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへサブクローニングし、以下の解析に供した。
ｐｒｉｍｅｒ（７）ＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴ（配列番号１４）
ｐｒｉｍｅｒ（８）ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣ（配列番号１５）
ｐｒｉｍｅｒ（９）ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣ（配列番号１６）
ｐｒｉｍｅｒ（１０）ＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ（配列番号１７）
ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター中のＣＤ８／ＥＰＯＲを、ＢＡＦ３細胞にトランスフェクトした。
ＩＬ−３枯渇後の細胞増殖度を、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の細胞を計数することにより決定した。
図５に、ＧＦＰ＋細胞（キメラを発現する細胞：●）またはＧＦＰ−細胞（キメラを発現しない細胞：○）の細胞増殖度を、０日目の生存細胞数を１００とした相対百分率として表す。図５から、ＣＤ８／ＥＰＯＲキメラは細胞増殖を誘導していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明は、ｐＴαの自己二量体形成を調節することによってＴ細胞分化を調節する新規作用機序の薬剤を提供する。本発明はまた、このような薬剤のスクリーニング方法、およびこのような薬剤を用いたＴ細胞分化の調節方法を提供する。
本発明のＴ細胞分化調節剤は、インビトロおよびインビボの両方において、新規作用機序でＴ細胞分化を調節する薬剤として有用である。このようなＴ細胞分化調節剤は、Ｔ細胞の異常な分化またはＴ細胞の増加もしくは減少により特徴付けられる疾患（例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病など）を予防または治療するための医薬として有用であり得る。
また、本発明により、種々の細胞表面タンパク質間の細胞外領域における相互作用を簡便に検出できるシステムが提供される。
本発明により、細胞外領域におけるタンパク質間の相互作用を簡便に検出できるシステムが提供される。本発明の検出システムは、細胞表面タンパク質が関与する細胞事象（例えば、細胞の分化、増殖および生存）における分子機構を解析するツールとして有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００５−２８８６４０および特願２００５−２８９１３６を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
2007043200.tif 000002
2007043200.tif 000003
2007043200.tif 000004
2007043200.tif 000005
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2007043200.tif 000013
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2007043200.tif 000018
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2007043200.tif 000020
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2007043200.tif 000023
2007043200.tif 000024
2007043200.tif 000025
2007043200.tif 000026
【図１ａ】
2007043200.tif 000027
【図１ｂ】
2007043200.tif 000028
【図１ｃ】
2007043200.tif 000029
【図１ｄ】
2007043200.tif 000030
【図２ａ】
2007043200.tif 000031
【図２ｂ】
2007043200.tif 000032
【図２ｃ】
2007043200.tif 000033
【図２ｄ】
2007043200.tif 000034
【図２ｅ】
2007043200.tif 000035
【図３ａ】
2007043200.tif 000036
【図３ｂ】
2007043200.tif 000037
【図３ｃ】
2007043200.tif 000038
【図３ｄ】
2007043200.tif 000039
【図４ａ】
2007043200.tif 000040
【図４ｂ】
2007043200.tif 000041
【図４ｃ】
2007043200.tif 000042
【図４ｄ】
2007043200.tif 000043
【図５】
2007043200.tif 000044
【国際調査報告】
2007043200.tif 000045
2007043200.tif 000046
2007043200.tif 000047
2007043200.tif 000048
2007043200.tif 000049
2007043200.tif 000050