(57)【要約】要約  転写因子結合活性が高く、かつ細胞毒性を低減したデコイオリゴヌクレオチドとして有用な二本鎖オリゴヌクレオチド及びその医薬用途が開示されている。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記式A：５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式A：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチド（ただし、センス鎖オリゴヌクレオチドがAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC（配列番号４２）又はGATCGAGGGGACTTTCCCTAG（配列番号４３）で示される塩基配列を有するものを除く）。
【請求項２】
上記式Aにおいて、mおよびnは６以下の整数である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
上記式Aにおいて、mは２〜６のいずれかの整数である、請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
上記式Aにおいて、nは０、１、２または３のいずれかの整数である、請求項２又は３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
下記式(A)：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N（m）は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味し、N（m）が、GA、TGA、TTGA、CTTGAおよびCCTTGAからなる群より選択される１つの配列である）
で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
上記式Aにおいて、N(n)が、CまたはCCである、請求項４又は５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
上記式(A)において、N(m)がCCTTGAの配列からなるオリゴヌクレオチドであり、N(n)がCCの配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
塩基間結合がホスホロチオエート結合を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、少なくともいずれか一方の鎖の末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、両末端それぞれ３塩基対内にはホスホロチオエート結合を含むが、それ以外には、両鎖ともホスホロチオエート結合で連結されている隣接する塩基対を含まない請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が４つ以上連続して存在しない請求項８ないし１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が、２または３つ連続して存在する請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である請求項８ないし１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である請求項８ないし１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合であることをさらなる特徴とする、請求項１５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
上記コンセンサス配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、EtsまたはAP-1の結合配列からなる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記コンセサス配列が、GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）(配列番号１)であるNF-κBの結合配列である請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
NF-κBの結合配列がGGGATTTCCC(配列番号２)またはGGGACTTTCC(配列番号３)である、請求項１８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
センス鎖オリゴヌクレオチドがCCTTGAGGGGATTTCCCCCC(配列番号４)の配列からなる、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
センス鎖CCTTGAGGGGATTTCCCCCC(配列番号４)中の塩基間結合において、５'から１、２、５、６、１４および１５番目の結合のみがホスホロチオエート結合であり、アンチセンス鎖中の塩基間結合において、その５'から１、２、９、１０および１１番目の結合のみがホスホロチオエート結合であることをさらなる特徴とする、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
下記式C:
５'−N(x)−コンセンサス配列−N(y)−３'        （式C）
（式C中、N(x)は５'端の付加配列であって、x個のNが連結されていることを示し、N(y)は３'端の付加配列であって、y個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、xおよびyはそれぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなり、該アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に、塩基間の結合がホスホロチオエート結合である連続する４塩基を含み、該連続する４塩基がオリゴヌクレオチドの末端の塩基は含まない二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記連続する４塩基は、前記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に１つだけ含まれる請求項２２記載のヌクレオチド。
【請求項２４】
前記連続する４塩基は、前記二本鎖ヌクレオチド内に１つだけ含まれる請求項２３記載のヌクレオチド
【請求項２５】
上記式C中の上記コンセンサス配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、EtsまたはAP-1の結合配列からなる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記コンセサス配列が、GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）(配列番号１)であるNF-κBの結合配列である請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
NF-κBの結合配列がGGGATTTCCC(配列番号２)またはGGGACTTTCC(配列番号３)である、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
上記式Cが、下記式A：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される請求項１８ないし２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
上記式Aにおいて、mおよびnは６以下の整数である、請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
上記式Aにおいて、mは２〜６のいずれかの整数である、請求項２９記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
上記式Aにおいて、nは０、１、２または３のいずれかの整数である、請求項２２ないし３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
上記式Aにおいて、N(m)が、GA、TGA、TTGA、CTTGAおよびCCTTGAからなる群より選択される１つの配列である請求項３０又は３１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
上記式Aにおいて、N(m)が、GA又はTTGAであり、nが０である請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
センス鎖オリゴヌクレオチドがGAGGGGATTTCCCCから成る請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
センス鎖GAGGGGATTTCCCC中の塩基間結合において、５'から１、２、１０及び１１番目の結合のみがホスホロチオエート結合であり、アンチセンス鎖中の塩基間結合において、その５'から１、７、８及び９番目の結合のみがホスホロチオエート結合である請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項１ないし３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドから成る転写因子阻害剤。
【請求項３７】
前記転写因子がNF-κBである請求項３６記載の転写因子阻害剤。
【請求項３８】
請求項１ないし３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの、転写因子阻害剤の製造のための使用。
【請求項３９】
前記転写因子がNF-κBである請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
請求項１ないし３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの効果量を、生体に投与することを含む、生体内の転写因子の阻害方法。
【請求項４１】
前記転写因子がNF-κBである請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜３５のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３５のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤、または悪液質の予防、改善及び／又は治療剤。
【請求項４４】
請求項１〜３５のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）または嚢胞性線維症（CF）の予防、改善及び／又は治療剤。
【請求項４５】
請求項１〜３５のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、PTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善及び／又は治療剤。
【請求項４６】
前記血管再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である請求項４５記載の予防、改善及び／又は治療剤。
【請求項４７】
前記血管再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する請求項４５に記載の予防、改善及び／又は治療剤。
【請求項４８】
請求項１８〜２１、２５〜２７のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、NF-κBに起因する疾患の予防、改善及び／又は治療のための医薬組成物。
【請求項４９】
NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの、医薬組成物の製造のための使用。
【請求項５１】
請求項１８〜２１、２５〜２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの、NF-κBに起因する疾患の治療又は予防剤の製造のための使用。
【請求項５２】
NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
請求項１８〜２１、２５〜２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの効果量を、NF-κBに起因する疾患の治療及び／又は予防を必要とする患者又は動物に投与することを含む、、NF-κBに起因する疾患の治療及び／又は予防方法。
【請求項５４】
NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内の遺伝子発現を調節するのに有効なオリゴヌクレオチドおよびその使用、ならびにそれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、核酸およびその誘導体を用いて特定の遺伝子の発現を制御することが、特定の疾患の治療および予防方法として開発されつつある。例えば、疾患の発症に関与する遺伝子の発現を抑制することにより、疾患を治療または予防することができる場合、その遺伝子発現を特異的に抑制可能な核酸またはその誘導体を、対象とする生体内またはその部位に投与すれば、その疾患の治療または予防が達成される。【０００３】
かかる方法の代表的な例としては、アンチセンス法およびデコイオリゴヌクレオチド法が挙げられる。前者は、特定の遺伝子の翻訳産物(すなわち、mRNA)に対するアンチセンスの一本鎖オリゴヌクレオチドを細胞内に送達して該特定の遺伝子の転写を抑制することにより発現を抑制するものである。後者のデコイオリゴヌクレオチド法は、疾患の発症に関与する遺伝子発現を誘導する転写因子が結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを細胞の核内に送達して、その転写因子がゲノム上の結合部位に結合することを阻害することにより、該転写因子が誘導する遺伝子発現を抑制するものである。なお、デコイ(decoy)とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。【０００４】
このデコイオリゴヌクレオチド法の機序は、簡単に述べると、以下のとおりである。特定の転写因子が誘導する遺伝子発現を抑制することを目的として、特定の転写因子を標的とする二本鎖オリゴヌクレオチドを対象とする組織または細胞に送達させる。すると、該二本鎖オリゴヌクレオチドは、核内に移行し、核内における該転写因子とゲノム上の該転写因子結合部位との結合において競合し、ゲノム上の該転写因子結合部位と該転写因子との結合が阻害されることとなるため、該転写因子により誘導される遺伝子発現が抑制される。その結果、該転写因子により誘導される遺伝子発現による生物学的事象は阻害される。【０００５】
したがって、疾患の予防または治療薬としてのデコイオリゴヌクレオチドは、標的とする転写因子に対して高い結合特異性を有していること、および細胞毒性が低いことに加えて、上記機序を効率よく作用させるために、標的とする転写因子との結合活性の高いことが重要である。【０００６】
一般的にデコイオリゴヌクレオチドの設計は、転写因子が結合するコンセンサス配列を含む配列とすることが有利であると考えられている。このように設計された種々の転写因子に対するデコイオリゴヌクレオチドが、多くの医薬用途に有効であることも知られている（例えば、特再表96/035430号公報、特許3392143号公報、WO95/11687号公報など参照のこと）。【０００７】
細胞内に送達されたデコイオリゴヌクレオチドが細胞内でいかに長時間安定して存在し得るかも、上記機序を効率よく作用させるための重要な鍵となりうることは、周知の事実である。オリゴヌクレオチドは、細胞内のヌクレアーゼにより分解されるため、細胞内および核内で安定して存在させることは難題であるが、この難題を克服するために、オリゴヌクレオチド内の塩基に種々の修飾を施す方法が試みられてきた（例えば、Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1923、特表平０８−５０１９２８）。その中でも最もよく用いられる修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）による修飾であり、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する抵抗性が高いことから、治療用オリゴヌクレオチドとして注目されている。【０００８】
しかしながら、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、天然型のホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて顕著に高いヌクレアーゼ抵抗性を有する一方で、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて、標的分子との結合能が低下すること、および標的分子への特異性が低下することなどの不利益が認められる場合が多い（Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1923、Stein & Cheng，Science 1993，261，1004）。さらにまた、ホスホロチオエート基は毒性を有するため、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて、細胞毒性が高い場合が多く（Levinら、Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1489, 69）、これもまた、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの治療薬としての用途における不利益となっている。【０００９】
これまでに、NF-κBの結合配列を含む配列を有するオリゴヌクレオチドとその相補鎖からなるNF-κBデコイオリゴヌクレオチドが、NF-κBの関連する疾患の治療に有用であることを見出している（国際公開公報WO96/35430、WO02/066070、WO03/043663、WO03/082331、WO03/099339、WO04/026342、WO05/004913、WO05/004914）。【００１０】
【特許文献１】特再表96/035430号公報
【特許文献２】特許3392143号公報
【特許文献３】国際公開公報WO95/11687
【特許文献４】特表平０８−５０１９２８号公報
【特許文献５】国際公開公報WO96/35430
【特許文献６】国際公開公報WO02/066070
【特許文献７】国際公開公報WO03/043663
【特許文献８】国際公開公報WO03/082331
【特許文献９】国際公開公報WO03/099339
【特許文献１０】国際公開公報WO04/026342
【特許文献１１】国際公開公報WO05/004913
【特許文献１２】国際公開公報WO05/004914
【非特許文献１】Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1923
【非特許文献２】Levinら、Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1489, 69
【非特許文献３】FASEB J 2002 Nov 16(13) 1811-3 Epub 2002 Sep 5
【非特許文献４】Naunyu-Schmiedeberg's Arch Pharmacol(2001) 364 422-429
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、より有効な、すなわち、転写因子結合活性がより高く、かつ細胞毒性を低減したデコイオリゴヌクレオチドとして有用な二本鎖オリゴヌクレオチド及びその医薬用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく、鋭意検討の結果、デコイオリゴヌクレオチドの付加配列中のコンセンサス配列に隣接する塩基を特定の規則に基づいて決定することにより、転写因子結合活性が向上したデコイオリゴヌクレオチドを開発するに至り、さらにまた、デコイオリゴヌクレオチドの細胞内での安定性を向上させ、かつ天然型オリゴヌクレオチドの化学修飾による細胞毒性が低減された、修飾デコイオリゴヌクレオチドを開発し、本発明を完成させるに至った。【００１３】
したがって、本発明は、以下の発明に関する：
１．  下記式A：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチド（ただし、センス鎖オリゴヌクレオチドがAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC（配列番号４２）又はGATCGAGGGGACTTTCCCTAG（配列番号４３）で示される塩基配列を有するものを除く）。【００１４】
２．  上記式Aにおいて、mおよびnは６以下の整数である、上記１記載のオリゴヌクレオチド。
３．  上記式Aにおいて、mは２〜６のいずれかの整数である、上記１または２記載のオリゴヌクレオチド。
４．  上記式Aにおいて、nは０、１、２または３のいずれかの整数である、上記２又は３記載のオリゴヌクレオチド。【００１５】
５．  下記式(A)：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N（m）は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味し、N（m）が、GA、TGA、TTGA、CTTGAおよびCCTTGAからなる群より選択される１つの配列である）
で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチド。【００１６】
６．  上記式Aにおいて、N(n)が、CまたはCCである、上記４又は５記載のオリゴヌクレオチド。
７．  上記式(A)において、N(m)がCCTTGAの配列からなるオリゴヌクレオチドであり、N(n)がCCの配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記６記載のオリゴヌクレオチド。
８．  塩基間結合がホスホロチオエート結合を含む上記１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
９．  センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、少なくともいずれか一方の鎖の末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、上記８記載のオリゴヌクレオチド。
１０．  センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、両末端それぞれ３塩基対内にはホスホロチオエート結合を含むが、それ以外には、両鎖ともホスホロチオエート結合で連結されている隣接する塩基対を含まない上記８記載のオリゴヌクレオチド。
１１．  センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が４つ以上連続して存在しない上記８ないし１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
１２．  センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が、２または３つ連続して存在する上記８ないし１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
１３．  センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である上記８ないし１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
１４．  センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である上記１３記載のオリゴヌクレオチド。
１５．  センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である上記８ないし１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
１６．  センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合であることをさらなる特徴とする、上記１５記載のオリゴヌクレオチド。
１７．  上記コンセンサス配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、EtsまたはAP-1の結合配列からなる、上記１〜１６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
１８．  前記コンセサス配列が、GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）(配列番号１)であるNF-κBの結合配列である上記１７記載のオリゴヌクレオチド。
１９．  NF-κBの結合配列がGGGATTTCCC(配列番号２)またはGGGACTTTCC(配列番号３)である、上記１８記載のオリゴヌクレオチド。
２０．  センス鎖オリゴヌクレオチドがCCTTGAGGGGATTTCCCCCC(配列番号４)の配列からなる、上記２０記載のオリゴヌクレオチド。
２１．  センス鎖CCTTGAGGGGATTTCCCCCC(配列番号４)中の塩基間結合において、５'から１、２、５、６、１４および１５番目の結合のみがホスホロチオエート結合であり、アンチセンス鎖中の塩基間結合において、その５'から１、２、９、１０および１１番目の結合のみがホスホロチオエート結合であることをさらなる特徴とする、上記２０に記載のオリゴヌクレオチド。【００１７】
２２．  下記式C:
５'−N(x)−コンセンサス配列−N(y)−３'        （式C）
（式C中、N(x)は５'端の付加配列であって、x個のNが連結されていることを示し、N(y)は３'端の付加配列であって、y個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなり、該アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に、塩基間の結合がホスホロチオエート結合である連続する４塩基を含み、該連続する４塩基がオリゴヌクレオチドの末端の塩基は含まない二本鎖オリゴヌクレオチド。
２３．  前記連続する４塩基は、前記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に１つだけ含まれる上記２２記載のヌクレオチド。
２４．  前記連続する４塩基は、前記二本鎖ヌクレオチド内に１つだけ含まれる上記２３記載のヌクレオチド
２５．  上記式C中の上記コンセンサス配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、EtsまたはAP-1の結合配列からなる、上記１〜２４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
２６．  前記コンセサス配列が、GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）(配列番号１)であるNF-κBの結合配列である上記２５記載のオリゴヌクレオチド。
２７．  NF-κBの結合配列がGGGATTTCCC(配列番号２)またはGGGACTTTCC(配列番号３)である、上記２６記載のオリゴヌクレオチド。【００１８】
２８．  上記式Cが、下記式A：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味し、コンセンサス配列は、転写因子が結合するコンセンサス配列を意味する）
で表される上記１８ないし２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
２９．  上記式Aにおいて、mおよびnは６以下の整数である、上記２８記載のオリゴヌクレオチド。
３０．  上記式Aにおいて、mは２〜６のいずれかの整数である、上記２９記載のオリゴヌクレオチド。
３１．  上記式Aにおいて、nは０、１、２または３のいずれかの整数である、上記２２ないし３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
３２．  上記式Aにおいて、N(m)が、GA、TGA、TTGA、CTTGAおよびCCTTGAからなる群より選択される１つの配列である上記３０又は３１記載のオリゴヌクレオチド。
３３．  上記式Aにおいて、N(m)が、GA又はTTGAであり、nが０である上記３２記載のオリゴヌクレオチド。
３４．  センス鎖オリゴヌクレオチドがGAGGGGATTTCCCC（配列番号８）から成る上記３３記載のオリゴヌクレオチド。
３５．  センス鎖GAGGGGATTTCCCC（配列番号８）中の塩基間結合において、５'から１、２、１０及び１１番目の結合のみがホスホロチオエート結合であり、アンチセンス鎖中の塩基間結合において、その５'から１、７、８及び９番目の結合のみがホスホロチオエート結合である上記３４記載のオリゴヌクレオチド。【００１９】
３６．  上記１ないし３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成る転写因子阻害剤。
３７．  前記転写因子がNF-κBである上記３６記載の転写因子阻害剤。
３８．  上記１ないし３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの、転写因子阻害剤の製造のための使用。
３９．  前記転写因子がNF-κBである上記３８記載の使用。
４０．  上記１ないし３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの効果量を、生体に投与することを含む、生体内の転写因子の阻害方法。
４１．  前記転写因子がNF-κBである上記４０記載の方法。【００２０】
４２．  上記１〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬組成物。
４３．  上記１〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤、または悪液質の予防、改善及び／又は治療剤。
４４．  上記１〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）または嚢胞性線維症（CF）の予防、改善及び／又は治療剤。
４５．  上記１〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、PTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善及び／又は治療剤。
４６．  前記血管再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である上記４５記載の予防、改善及び／又は治療剤。
４７．  前記血管再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する上記４５に記載の予防、改善及び／又は治療剤。
４８．  上記１８〜２１、２５〜２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、NF-κBに起因する疾患の予防、改善及び／又は治療のための医薬組成物。
４９．  NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、上記４８に記載の医薬組成物。
５０．  上記１〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの、医薬組成物の製造のための使用。
５１．  上記１８〜２１、２５〜２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの、NF-κBに起因する疾患の治療又は予防剤の製造のための使用。
５２．  NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、上記５１に記載の使用。
５３．  上記１８〜２１、２５〜２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの効果量を、NF-κBに起因する疾患の治療及び／又は予防を必要とする患者又は動物に投与することを含む、NF-κBに起因する疾患の治療及び／又は予防方法。
５４．  NF-κBに起因する疾患が、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤及び悪液質からなる群より選択される少なくとも１つである、上記５３に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、転写因子結合活性がより高く、かつ細胞毒性を低減したデコイオリゴヌクレオチドとして有用な二本鎖オリゴヌクレオチド及びその医薬用途が初めて提供された。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、生体内での安定性が高く、転写因子を効果的に阻害することができ、毒性も低いので、転写活性阻害用途に有用であり、ひいては転写因子の疎外によりよりもたらされる医薬用途において優れた性能を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】細胞内NF-κB結合試験の結果を示すグラフである。
【図２】細胞の毒性試験の結果を示す図である。
【図３】安定性試験で得られたポリアクリルアミド電気泳動の画像である。ゲルの染色は、エチジウムブロマイドで行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
第１の局面において、本発明は、下記式A：
５'−N(m)−G−コンセンサス配列−C−N(n)−３'        （式A）
（式A中、N(m)は５'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、N(n)は３'端の付加配列であって、m個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、mおよびnはそれぞれ独立して０〜２０の整数を意味する）
で表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチド（ただし、センス鎖オリゴヌクレオチドがAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC（配列番号４２）又はGATCGAGGGGACTTTCCCTAG（配列番号４３）で示される塩基配列を有するものを除く）を提供する。なお、配列番号４２及び配列番号４３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、FASEB J 2002 Nov 16(13) 1811-3 Epub 2002 Sep 5及びNaunyu-Schmiedeberg's Arch Pharmacol(2001) 364 422-429にそれぞれ記載された公知のNF-κBデコイである。なお、これらの文献には、上記式Aに包含されるオリゴヌクレオチドが記載されているが、これらのオリゴヌクレオチドは、NF-κBを阻害する実験の中で、たまたま用いられたオリゴヌクレオチドに過ぎず、コンセンサス配列の上流側に隣接する塩基がG、下流側に隣接する塩基がCの場合にNF-κBとの結合親和性が高まるという開示や示唆はない。【００２４】
なお、配列表では、塩基は小文字で表されるが、本明細書及び請求の範囲では大文字で表す。ヌクレオチドA、G、T、C及びUは、それぞれ、塩基としてアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルを有するヌクレオチドであり、配列表中のa、g、t、c及びuと同義である。【００２５】
NF-κB等の転写因子は、多くの場合、それぞれファミリーを形成しており、各ファミリーに属する転写因子が共通して結合するゲノミックDNA上の配列が「コンセンサス配列」と呼ばれている。上記式Aや後述の式C等において、「コンセンサス配列」とは、この意味である。転写因子としては、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、Ets及びAP-1等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。これらの転写因子自体は周知であり、それぞれの転写因子のコンセンサス配列も周知である。【００２６】
公知の転写因子のうち、好ましい例としてNF-κBを挙げることができる。NF-κB(nuclear factor kappa B)は、サイトカインや接着因子等、免疫反応に関する遺伝子の発現を調節する役割を持つ一群（ファミリー）の転写因子（NF-κB/Relファミリー、例えばP52、P50、P65、cRel、RelB等）の総称であり、NF-κBがゲノム遺伝子上の結合部位に結合すると、免疫反応に関する遺伝子が過剰に発現する。このため、NF-κBは、免疫反応が原因となるアトピー性皮膚炎や関節リウマチ等のアレルギー性疾患、自己免疫疾患、さらには心筋梗塞等の虚血性疾患や動脈硬化等の各種疾患に関与することが知られている。【００２７】
コンセンサス配列の例としては、NF-κBに対するコンセンサス配列にはGGGRHTYYHC（RはAまたはG; YはCまたはT; HはA,CまたはT）（配列番号１）、E2Fに対するコンセンサス配列にはTTTSSCGS（SはGまたはC）、GATA-3に対するコンセンサス配列にはWGATAR (WはAまたはT;RはAまたはG)、STAT-1に対するコンセンサス配列にはTTCNNNGAA (NはA、G、TまたはC)、STAT-6に対するコンセンサス配列にはTTCNNNNGAA (NはA、G、TまたはC)（配列番号５）、Etsに対するコンセンサス配列にはMGGAW(MはAまたはC; WはAまたはT)、およびAP-1に対するコンセンサス配列にはTGASTMA(SはGまたはC; MはAまたはC)が挙げられる。より具体的な例としては、NF-κBではGGGATTTCCC(配列番号２)及びGGGACTTTCC(配列番号３)、E2FではTTTCCCGC、ATA-3ではAGATAG、STAT-1ではTCCGGGAA、STAT-6ではTTCCCAAGAA(配列番号６)、EtsではCGGAA、およびAP-1ではTGAGTCAが、それぞれのコンセンサス配列として挙げられるが、これに限定されない。【００２８】
上記式Aにおいて、mおよびnは６以下の整数であることが好ましく、特に２〜６のいずれかの整数であることが好ましい。また、上記式Aにおいて、nは０、１、２または３のいずれかの整数であることが好ましい。一般的に、デコイオリゴヌクレオチドの付加配列は、１〜１０または１〜２０塩基であることが望ましいとされているが、本発明者らは、３'側の付加配列は１塩基以上でかつ短い方が転写因子結合活性が高く、また５'側の付加配列は長い方（ただし好ましくは２〜６の範囲内で）が転写因子結合活性が高い傾向にあることを見出した。【００２９】
上記式A中、コンセンサス配列の５'側をGで３'側をCで挟んだセンス鎖の付加配列は、任意の配列であってよいが、例えば、５'側の付加配列、すなわち、式A中のN(m)は、GA、TGA、TTGA、CTTGA、CCTTGA、ACTTGA、AGTTGA、ACCA、AGCT、AGTATC、AGGC、TTAAC、TTTG、GTCCCAC、好ましくは、GA、TGA、TTGA、CTTGAおよびCCTTGAからなる群より選択される１つの配列である。３'末端側の付加配列、すなわち、式A中のN(n)は、AGGC、TTAAC、TTTG、GTCCCAC、GC、CC、GおよびCからなる群より、独立して任意に選択されたものであることが好ましく、特にCまたはCCが好ましい。好ましい付加配列の組み合わせの具体例としては、５'側付加配列と３'側付加配列とが、それぞれ(1)CCTTGAとCC、(2)GAとCまたはCC、(3)TGAとCまたはCC、(4)TTGAとCまたはCCである。特に、上記(1)CCTTGAとCCの組合せが好ましい。【００３０】
したがって好ましい態様の例は、上述の式Aにおいて、N（m）がCCTTGAの配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつ/または上記コンセンサス配列の3'末端にN(n)がCCの配列からなる、すなわち、CCTTGAG-コンセンサス配列-CCC、GAG-コンセンサス配列-CC、GAG-コンセンサス配列-CCC、TGAG-コンセンサス配列-CC、TGAG-コンセンサス配列-CCC、TTGAG-コンセンサス配列-CC、TTGAG-コンセンサス配列-CCC、の配列を含有するセンス鎖オリゴヌクレオチドとこれに相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドである。【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の修飾された塩基を1つ以上含有していてもよい。例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メトキシエチルホスホエート、モルホリノホスホロアミデード、ペプチド核酸（peptide nucleic acid: PNA）、ロックド核酸（locked nucleic acid: LNA）ジニトロフェニル（DNP）化およびＯ-メチル化などの修飾された塩基を含んでいてもよい。場合によっては（例えば、Ｏ-メチル化、DNP化など）は、リボヌクレオシドに対する修飾であるが、本発明においては、オリゴヌクレオチド中の修飾するデオキシリボヌクレオシドを、リボヌクレオシドとしてオリゴヌクレオチドを合成し、該塩基を修飾することが可能である。中でも、ホスホロチオエート化された塩基（すなわち、ヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であること）を含有することがより好ましい。オリゴヌクレオチドを構成する塩基の全てが修飾されていてもよく、いずれか1つ以上の塩基が修飾されていてもよい。場合によっては、コンセンサス配列を構成する塩基は修飾されていないことが望ましく、また、コンセンサス配列を構成する塩基は修飾されておらず、かつコンセンサス配列を構成する塩基以外の塩基は全て修飾されているかまたは付加配列を構成する塩基のみが全て修飾されていることが望ましい。本発明の好ましい態様の１つは、5'末端の少なくとも１つのヌクレオシド間結合および/または3'末端の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である上記オリゴヌクレオチドである。5'末端と3'末端とのそれぞれの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。特に、5'末端と3'末端とのそれぞれの２つのヌクレオシド間結合ずつがホスホロチオエート結合であること、すなわち、5'および3'の両末端それぞれにおいて、末端から３塩基対内の結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。なお、ホスホロチオエート結合は、隣接するヌクレオチド間のリン酸エステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換した結合である。任意の隣接するヌクレオチド間の結合をＳ化する手法自体は周知であり、例えば、Marina A.ら、The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, Number 6, pp. 2620-2627に記載された方法により行なうことができ、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは商業的にも合成されている。【００３２】
ホスホロチオエート化等の修飾を施すと、オリゴヌクレオチドの細胞内での安定性は向上するものの、細胞毒性が増大するものと考えられる。そこで、ホスホロチオエート化する箇所を少なく留め、かつ細胞内での安定性を維持できることが望ましい。かかる目的のために、本発明者らは、ホスホロチオエート化を様々な部位に含有する種々のオリゴヌクレオチドを作成し、細胞内でデコイオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての機能を発揮しうるに十分な細胞内での安定性を有し、かつ十分な低減された細胞毒性を有するオリゴヌクレオチドの開発も試みた。そして、本発明者らはさらに、ホスホロチオエート結合を特定のパターンで含有する二本鎖デコイオリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチドとして望ましい活性を有していることを見出した。したがって、本発明は、ホスホロチオエート結合を特定のパターンで含有する二本鎖デコイオリゴヌクレオチドをも包含する。【００３３】
かかる特定のパターンの１つとしては、その両末端それぞれの２または３塩基対内に、少なくとも１つのホスホロチオエート基を含むこと、好ましくは、両末端それぞれにおいて、少なくともいずれか一方の鎖の末端３塩基内の結合がホスホロチオエート結合であることである。他のパターンとしては、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の鎖の少なくとも５'末端は、その末端３塩基内の結合がホスホロチオエート結合であることである。【００３４】
さらにまた、他の上記特定のパターンは、両方の鎖のそれぞれに、連続する２または３つのホスホロチオエート結合が繰り返されその繰り返しの間には、連続する２〜５つの連続するホスホジエステル結合が挟まれていること、を含む。このパターンの場合、二本鎖の両末端にある２または３つの塩基対部分を除いて、両方の鎖ともに同じ位置にホスホロチオエート結合を有することはないこと、すなわち、隣接する２つ塩基対において両方の鎖ともにホスホロチオエート結合で連結されていないことが好ましく、さらにまた、連続する７塩基対以上、より望ましくは6塩基対以上、さらに望ましくは５塩基対以上、特に望ましくは３または４塩基対以上が、全くホスホロチオエート結合を含まないことがないことが好ましい。【００３５】
より詳細には、(1)センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、少なくともいずれか一方の鎖の末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、(2)センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、両末端それぞれ３塩基対内にはホスホロチオエート結合を含むが、それ以外には、両鎖ともホスホロチオエート結合で連結されている隣接する塩基対を含まない、(3)センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が４つ以上連続して存在しない、(4)センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖においても、ホスホロチオエート結合が、２または３つ連続して存在する、(5)センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、(6)センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、５'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、(7)センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の２塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、及び(8)センス鎖およびアンチセンス鎖両方において、３'末端の３塩基間の結合がホスホロチオエート結合である、から選ばれる少なくとも１つを満足するものが好ましい。【００３６】
本発明の第２の局面において、本発明は、  下記式C:
５'−N(x)−コンセンサス配列−N(y)−３'        （式C）
（式C中、N(x)は５'端の付加配列であって、x個のNが連結されていることを示し、N(y)は３'端の付加配列であって、y個のNが連結されていることを示し、全てのNは互いに独立してヌクレオチドA、G、T、CまたはUを意味し、xおよびyはそれぞれ独立して１〜２０の整数を意味する）
で表される配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなり、該アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に、塩基間の結合がホスホロチオエート結合である連続する４塩基を含み、該連続する４塩基がオリゴヌクレオチドの末端の塩基は含まない二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。【００３７】
式C中、コンセンサス配列及びその好ましい例は上記した式A中のコンセンサス配列と同様である。また、式C中、xおよびyは７以下の整数であることが好ましく、特にxは３〜７のいずれかの整数、yは１、２、３又は４のいずれかの整数であることが好ましい。【００３８】
式C中、前記連続する４塩基は、前記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に１つだけ含まれることが好ましく、特に、前記連続する４塩基は、前記二本鎖ヌクレオチド内に１つだけ含まれることが好ましい。【００３９】
あるいはまた、ホスホロチオエート結合は２または３つ連続して存在し、両端のそれぞれ両末端それぞれ３塩基対内の結合以外には、両鎖ともホスホロチオエート結合で連結されている隣接する塩基対を含まないことも、本発明のホスホロチオエート化パターンに含まれる。また、かかるパターンにおいて、いずれか一方の鎖にホスホロチオエート結合が偏ることなく、いずれの鎖にも、連続する２または３つのホスホロチオエート結合が存在することが好ましい。【００４０】
また、上記式Cで表される配列が、上記式Aで表される配列に包含されるものであることが好ましい。換言すれば、上記式Aで表される塩基配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなる二本鎖オリゴヌクレオチドが、上記式Cで表される配列を有するセンス鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてなり、該アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド内に、塩基間の結合がホスホロチオエート結合である連続する４塩基を含み、該連続する４塩基がオリゴヌクレオチドの末端の塩基は含まない二本鎖オリゴヌクレオチドでもあることが好ましい。この場合、式A中の各構成要素（m及びnを包含する）並びにその好ましい例及び範囲は、式Aについて上記したものと同じである。【００４１】
以上から、好ましい本発明のNF-κBデコイオリゴヌクレオチド配列（上記本発明の第１及び第２の局面のものを包含する）としては、
5'-C*C*TTGAAGG*G*A*TTTCCCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTCAA*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTG*A*AGGGATTT*C*CCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGATTTCCCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTG*A*AGGGATTTCCCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGATTT*C*CCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-CCTTG*A*AGGGATTT*C*CCTCC-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-GGAGGGAAA*T*C*CCTTCGG-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-CCTTG*A*AGGGATTT*C*CCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-GGAGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTG*A*AGGGATTT*C*CCTCC-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTCGG-3'からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
などが挙げられる（*印はホスホロチオエート結合部位である（以下同じ））。これら8種の二本鎖オリゴヌクレオチドについては、全塩基がホスホロチオエート化された同じ塩基配列からなるデコイと比較して、活性が向上していることが分かっている。後述の実施例参照のこと。【００４２】
さらにまた、他の好ましい態様のNF-κBデコイオリゴヌクレオチド配列としては、5'-C*C*TTGAGGGGATTTCCCC*C*C-3'(配列番号４：一部にホスホロチオエート化を含む)とその相補鎖5'-G*G*GGGGAAATCCCCTCAA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTG*A*GGGGATTT*C*CCCCC-3'(配列番号４：一部にホスホロチオエート化を含む)とその相補鎖5'-G*G*GGGGAAA*T*C*CCCTCAAGG-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-G*A*GGGGATTT*C*CCC-3'（配列番号８）とその相補鎖5'-GGGGAAA*T*C*CCCTC-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-G*A*GGGGATTT*C*CCC-3'（配列番号８）とその相補鎖5'-G*GGGAAA*T*C*CCCTC-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-G*A*GGGGATTT*C*CCC-3'（配列番号８）とその相補鎖5'-GG*G*GAAA*T*C*CCCTC-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-T*T*G*A*GGGGATTT*C*CCC-3'（配列番号９）とその相補鎖5'-G*G*GGAAA*T*C*CCCTCAA-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-T*TT*G*A*GGGGATTT*C*CCC-3'とその相補鎖（配列番号１０）5'-G*GGGAAA*T*C*CCCTCAA-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-TTG*A*GGGGATTT*C*CCC-3'（配列番号９）とその相補鎖5'-GGGGAAA*T*C*CCCTCAA-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
などが挙げられる（いずれも５'末端から記載。*印はホスホロチオエート結合した部位である）。【００４３】
他には、5'-C*C*TTGAAGGGATTTCCCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGGAAATCCCT*T*C*AA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGATTTCCCT*C*C-3'（配列番号７）とその相補鎖5'-G*G*AGGG*A*A*ATCCCTTCAA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGACTTTCCT*C*C-3'（配列番号１１）とその相補鎖5'-G*G*AGGAAAGTCCC*T*T*CAA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGACTTTCCT*C*C-3'（配列番号１１）とその相補鎖5'-G*G*AGGAAAG*T*C*CCTTCAA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
5'-C*C*TTGAAGGGACTTTCCT*C*C-3'（配列番号１１）とその相補鎖5'-G*G*AGGAA*A*G*TCCCTTCAA*G*G-3'とからなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
などが挙げられる。【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の種々の方法により作製することができる。化学合成法でもよく、生化学的合成法でもよい。例えば、アミダイド重合法などにより化学合成することもできる。【００４５】
ホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドもまた、公知の方法で作製することができる。アミダイド重合により連結した末端のヌクレオチドを、脱トリチル反応と含硫化合物による酸化反応に供することによりホスホロチオエート化することができる。【００４６】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、転写因子のデコイとして用いることができ、すなわち、該転写因子の阻害剤として用いることができる。なお、言うまでもなく、ここで「転写因子」は、上記式A又は式C中のコンセンサス配列に結合する転写因子である。【００４７】
上記転写因子阻害剤は、周知の通り、その転写因子の阻害によりもたらされる薬効を発揮するので、医薬として用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の転写因子に起因する遺伝子発現または特定の遺伝子発現を抑制することから、これらの遺伝子発現が関与する疾患の予防および/または治療のための医薬組成物として有効である。【００４８】
具体的には、該医薬組成物を、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤、悪液質、血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、喘息、または慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症（CF）、PTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術、または臓器移植もしくは臓器の手術後におこる血管の再狭窄（人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因するもの、および閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因するものを含む）の、予防、改善および/または治療剤として使用することができる。目的に応じて適切な標的遺伝子を選択することは、当業者であれば容易に達成しうる。【００４９】
例えば、コンセンサス配列にNF-κBの結合配列を含み、NF-κBのデコイオリゴヌクレオチドとして機能する二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および腫瘍をはじめとするあらゆるNF-κBに起因する疾患の、予防、改善および/または治療剤として使用することができる。NF-κBの活性を低減させることにより、これらの疾患の治癒、および/または進行の遅延が得られることは、種々の文献により、当業者には既に公知である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、疾患部位の細胞に到達させることにより、デコイオリゴヌクレオチドとして作用してNF-κBと結合し、NF-κBの活性を阻害することによりNF-κBが誘発する遺伝子発現を阻害する。【００５０】
かかる医薬組成物は、上記したとおり、本発明のオリゴヌクレオチドの他に、安定化剤、希釈剤などの他の添加剤を含んでよい。さらにまた、薬学的に許容されうるキャリアーを含んでもよい。かかるキャリアーの例としては、生理的食塩水および生理的リン酸緩衝液が挙げられる。【００５１】
かかる医薬組成物は、経口投与、非経口投与、局所投与、気道内投与、経皮投与（塗布など）その他の外用の形で投与されるため、溶液、懸濁液、リポソーム製剤、カプセル剤、錠剤、軟膏、クリーム剤、ローション、乳液、点鼻剤、スプレー剤、ネブライザー剤、レスピレータ用剤、または粉体投与製剤等、投与形態に応じた剤形に製剤されうる。【００５２】
特に、遺伝子導入法に適した形態（例えば、センダイウイルスをはじめとするウイルス由来のリポソーム製剤、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに限定はされない）に製剤されることが好ましい。当業者であれば、適切な製剤方法を容易に選択可能である。【００５３】
１つの好ましい形態である、センダイウイルスエンベロープベクターに封入した形態に製剤する場合には、例えば、特開2001-286282号公報中の実施例８の記載を参考に、製剤するとよい。【００５４】
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、気道内、経皮、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。【００５５】
本発明の医薬組成物の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。投与回数および投与頻度、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜３回程度投与するのが好ましい。疾患の状態をモニターしながら投与回数を決定することもできる。通常、オリゴヌクレオチド量として、成人１日当たり0.1〜10000nmol、好ましくは1 〜1000 nmol、より好ましくは10〜100 nmolを投与することができる。【００５６】
以下の実施例において、本発明を例証するが、これら実施例の記載に限定されるわけではない。
【実施例】
【００５７】
１．NF-κBデコイオリゴヌクレオチドを用いた転写因子結合活性試験
（１）オリゴヌクレオチドの調製
(i)シリーズIオリゴヌクレオチド
下記に示すとおり、SEQ-A、SEQ-B、SEQ-E〜J、SEQ-Xの9種のオリゴヌクレオチドを作製した。さらに、SEQ-Xと同じ配列を有しているが全てのヌクレオチドがホスホロチオエート化されている完全S化オリゴヌクレオチドSEQ-x、およびSEQ-Xと同じ配列を有しているが両末端の2塩基ずつがホスホロチオエート化されている部分S化オリゴヌクレオチドSEQ-X-PS、ならびに、SEQ-Iと同じ配列を有しているが両末端の2塩基ずつがホスホロチオエート化されている部分S化オリゴヌクレオチドSEQ-I-PSの3種の、ホスホロチオエート基を含有するオリゴヌクレオチドを作製した。【００５８】
SEQ-A          AGTTGAGGGGATTTCCCCAGGC  （配列番号１２）
SEQ-B          CCTTGAAGGGACTTTCCTCC  （配列番号１１）
SEQ-E          AGTATCGGGGATTTCCCCTTAAC  （配列番号１３）
SEQ-F          AGCTGGGGATTTCCCCTTTG  （配列番号１４）
SEQ-G          ACCAGGGGATTTCCCCGTCCCAC  （配列番号１５）
SEQ-H          AGTTGAGGGGATTTCCCCGC  （配列番号１６）
SEQ-I          CCTTGAGGGGATTTCCCCCC  （配列番号４）
SEQ-J          ACTTGAAGGGATTTCCCTCC  （配列番号１７）
SEQ-X          CCTTGAAGGGATTTCCCTCC  （配列番号７）
SEQ-x          C*C*T*T*G*A*A*G*G*G*A*T*T*T*C*C*C*T*C*C  （配列番号７の全塩基をホスホロチオエート化したもの）
SEQ-X-PS       C*C*TTGAAGGGATTTCCCT*C*C  （配列番号７の両端2塩基をホスホロチオエート化したもの）
SEQ-I-PS       C*C*TTGAGGGGATTTCCCC*C*C  （配列番号４の両端2塩基をホスホロチオエート化したもの）
なお、*印はホスホロチオエート結合部位である。これらの配列を本発明の式Aに当てはめると下記表１のとおりである。【００５９】
【表１】
2006132204.tif 000002
【００６０】
それぞれのオリゴヌクレオチドは、常法のアミダイト重合法により作製した（高分子化学と核酸の機能デザイン（高分子学会／バイオ・高分子研究会 編など参考のこと)。非修飾オリゴヌクレオチドは、カラムに固定されたヌクレオチドにアミダイト（目的とするヌクレオチド）を十分量添加し重合反応させた。反応後、脱トリチル反応およびヨウ素で酸化反応させ，次のアミダイトを添加させ重合反応させた。この方法の繰り返しを行い、オリゴヌクレオチドを合成した。ホスホロチオエート化は、ホスホロチオエート化するアミダイトの重合反応の後、脱トリチル反応および硫黄を含む化学物質により酸化反応させた後、次のアミダイトを添加して重合反応に供した。【００６１】
さらに、これらそれぞれに完全に相補的な相補鎖オリゴヌクレオチドを作製し、それぞれを常法に従って、ハイブリダイズさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを調製した。ここで、これら相補鎖も、同様のパターンでホスホロチオエート基を含有するように作製した。すなわち、二本鎖オリゴヌクレオチド中の相補的塩基対をなす一方の塩基がホスホロチオエート化されている場合は、該塩基対のもう一方の塩基もホスホロチオエート化されているように作製した。【００６２】
(ii)シリーズIIオリゴヌクレオチド
上記方法を用いて、SEQ-xのホスホロチオエート化部位の異なるシリーズIIのオリゴヌクレオチドを合成した。シリーズIIのオリゴヌクレオチドは、互いに相補的な二本鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドで、相補鎖間でホスホロチオエート化塩基の位置が異なっている。各オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート化部位は以下に示す配列のとおりである： 【００６３】
SEQ-1    5'- C*C*TTGAAGG*G*A*TTTCCCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTCAA*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-2    5'- C*C*TTG*A*AGGGATTT*C*CCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-3    5'- C*C*TTGAAGGGATTTCCCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-4    5'- C*C*TTG*A*AGGGATTTCCCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-5    5'- C*C*TTGAAGGGATTT*C*CCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-6    5'- CCTTG*A*AGGGATTT*C*CCTCC -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- GGAGGGAAA*T*C*CCTTCGG -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
SEQ-7    5'- CCTTG*A*AGGGATTT*C*CCT*C*C -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- GGAGGGAAA*T*C*CCTTC*G*G -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
SEQ-8    5'- C*C*TTG*A*AGGGATTT*C*CCTCC -3'（配列番号７：一部にホスホロチオエート結合を含む）と5'- G*G*AGGGAAA*T*C*CCTTCGG -3'（一部にホスホロチオエート結合を含む）からなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
なお、*印はホスホロチオエート結合部位である。
それぞれの鎖を合成後、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させて結合活性試験に用いた。【００６４】
（２）結合活性試験
結合活性試験は、TransAM NF-κB p65 Transcription Factor Assay Kit（ACTIVE MOTIF社）を用いて実施した。【００６５】
コンプリートリシスバッファー(Complete Lysis Buffer)、コンプリート結合バッファー(Complete Binding Buffer)、1×ウォッシュバッファー(1×Wash Buffer)および1×抗体結合バッファー(1×Antibody Binding Buffer)を調製する。次にコンプリート結合バッファーで各オリゴヌクレオチドを0.00167〜167nmol/Lの濃度内で4〜7点調製した（NF-κB デコイオリゴヌクレオチド希釈液）。Jurkat 核抽出物（Jurkat nuclear extract）を125μg protein/mLになるようにコンプリートリシスバッファーで希釈した。【００６６】
予めNF-κB結合核酸が固相化されているキット付属のプレートのウェルに、上記（１）で調製したNF-κB デコイオリゴヌクレオチド希釈液を30μLずつ添加する。ブランクおよびコントロールのウェルには、コンプリート結合バッファーを30μL添加した。次に、各ウェルに上記のJurkat核抽出物希釈液を20μLずつ添加し、ブランクのウェルにはコンプリートリシスバッファーを20μLずつ添加した。室温にて1時間振とうした後、1×ウォッシュバッファー200μLで3回洗浄し、1×抗体結合バッファーで1000倍希釈したウサギ抗NFκB p65抗体を100μLずつ添加し、室温で1時間振とうした。その後1×ウォッシュバッファー200μLで3回洗浄し、1×抗体結合バッファーで1000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体を100μLずつ添加し、室温で1時間振とうした。その後、1×ウォッシュバッファー200μLで4回洗浄し、発色溶液(Developing solution)を100μLずつ添加して、暗室にて5分間発色反応させた。反応後、反応停止液（Stop Solution）を100μLずつ添加して発色反応を停止させた。各Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（株式会社パーキンエルマー）にて450nmと650nmとの吸光度を測定(それぞれの測定値からブランクのウェルの対応する測定値を引く)し、450nm/650nmの吸光度の比を算出した。コントロールのウェルの該吸光度の比を100とした場合の各NF-κBデコイオリゴヌクレオチドの各濃度における吸光度のパーセンテージを算出し、その平均値をプロットして得られた近似曲線から、各デコイオリゴヌクレオチドのIC50を算出した。【００６７】
各デコイオリゴヌクレオチドのIC50と、デコイオリゴヌクレオチドSEQ-xのIC50に対する各デコイオリゴヌクレオチドのIC50 とを下記表２および表３に示す。【００６８】
【表２】
2006132204.tif 000003
【００６９】
上記結果より、シリーズIの各デコイオリゴヌクレオチドのNF-κBに対する結合活性は、
SEQ-I>SEQ-H>SEQ-A>SEQ-G=SEQ-E>SEQ-F>SEQ-x>SEQ-B>SEQ-J=SEQ-X
の順に高いことが分かった。特に、SEQ-Iは、そのIC50がSEQ-xに比べて10倍以上小さく、最も結合活性が高かった。【００７０】
SEQ-A、SEQ-E、SEQ-F、SEQ-GおよびSEQ-Hは、SEQ-xより結合活性が高く、このことより、コンセンサス配列の5'末端側にGが、3'末端側にCが隣接する場合に結合活性が向上することが観察された。すなわち、コンセンサス配列を、その5'末端側のGとその3'末端側のCとで挟むことにより、または、コンセンサス配列の5'末端の塩基と同一の塩基(この場合はG)がその5'末端に隣接し、かつコンセンサス配列の3'末端の塩基と同一の塩基(この場合はC)がその3'末端に隣接することにより、結合活性が向上することが推察される。【００７１】
また、最も結合活性が高かったSEQ-Iの5'および3'末端の2塩基をホスホロチオエート化したSEQ-I-PSにおいても、そのIC50はSEQ-xに比べて3倍以上小さく、SEQ-xより顕著に結合活性が向上していた。かかるSEQ-I-PSは、ホスホロチオエート化による修飾を施すことにより、細胞内の安定性も向上していることが考えられるために、細胞内での安定性と高い結合活性を併せ持つNF-κBデコイオリゴヌクレオチド分子として、特に有用であると考えられる。【００７２】
【表３】
2006132204.tif 000004
【００７３】
上記のとおり、シリーズIIのオリゴヌクレオチドの全てが、SEQ-xより結合活性が向上していた。【００７４】
この結果から、末端の少なくともいずれか一方の鎖の2塩基がホスホロチオエートされているデコイオリゴヌクレオチド、および、ホスホロチオエート化された塩基は２または３塩基連続して存在し、両端のそれぞれ２塩基対を除く各相補的塩基対において、塩基対を形成する塩基の両方ともがホスホロチオエート化されていない、デコイオリゴヌクレオチドは、全塩基がホスホロチオエート化されたデコイオリゴヌクレオチドに比べて、転写因子結合活性が高いことが示唆される。【００７５】
(iii)シリーズIIIオリゴヌクレオチド
さらなる検討のために、下記表４に示す配列を有するデコイオリゴヌクレオチドを作製し、結合活性を調べた。なお、各オリゴヌクレオチドについて記載されている上下２段の塩基配列のうち、上段はセンス鎖の塩基配列、下段はその相補鎖であるアンチセンス鎖を示す。下段のアンチセンス鎖は、上段のセンス鎖と相補的であることが明瞭となるように、3'末端が左側に来るように記載してある。【００７６】
【表４−１】
2006132204.tif 000005
【００７７】
【表４−２】
2006132204.tif 000006
【００７８】
【表４−３】
2006132204.tif 000007
*：S化修飾，下線：2-Ome，太字：LNA，斜体：RNA，-：dA Ome【００７９】
まず、コンセンサス配列の5'側をG、3'側をCでそれぞれ挟むことによる結合活性への効果を検討するために、SEQ-A、SEQ-K、SEQ-B、SEQ-L、SEQ-G、SEQ-Mのデコイオリゴヌクレオチドについての結合活性を、上記SEQ-xのIC50に対する相対IC50として下記表５に示す。【００８０】
【表５】
2006132204.tif 000008
【００８１】
上記表５に示すように、SEQ-A とSEQ-K、SEQ-LとSEQ-B、SEQ−GとSEQ-Mとをそれぞれ比較した結果、やはりコンセンサス配列の5'側をG、3'側をCでそれぞれ挟むことにより、結合活性が向上することがわかった。【００８２】
また、修飾基の種類による結合活性への影響については、下記表、SEQ９〜１２の欄に示すように、SEQ−2-Ome、LNA、ｄA Omeのいずれの修飾でも結合活性は低かった。ホスホロチオエート化（S化修飾）のみが結合活性を向上させ得た。したがって、ホスホロチオエート化のみについて、位置および数と結合活性との関係について検討した。【００８３】
【表６】
2006132204.tif 000009
【００８４】
SEQ-9はSEQ-Iの配列にSEQ-8のS化修飾部位を組み合わせた部分S化修飾オリゴヌクレオチドであり、SEQ-IおよびSEQ-8の結合活性はSEQ-xより高かった。SEQ-Iの配列にSEQ-8のS化修飾部位を組み合わせたSEQ-9はSEQ-xの結合活性より約50倍高かった。SEQ-X-PSおよびSEQ-46は、両鎖の両端から連続する2ヶ所にS化修飾が入っている。SEQ-44、SEQ-45、SEQ-47、SEQ-48およびSEQ-49は両鎖の両端から連続する2ヶ所およびそのほかの部位に連続する3ヶ所のS化修飾が入っている。SEQ-48およびSEQ-49は、SEQ-X-PSのS化修飾部位に加えて、コンセンサス配列内の連続する3ヶ所にS化修飾が入っている。SEQ-47の結合活性はSEQ-46と比較して約2.5倍以上高く，SEQ-48およびSEQ-49の結合活性はSEQ-46と比較して約8.5倍以上高かった。これらの結果から、両鎖の両端から連続する2ヶ所にS化修飾が入っていること、および両末端の2箇所以外に連続する3ヶ所にS化修飾が存在することが、結合活性の向上をもたらすことがわかる。【００８５】
SEQ-X-PSとSEQ-44およびSEQ-45の比活性についてさらに詳細に検討したところ、下記表７のような結果となった。やはり、SEQ-44およびSEQ45とも、SEQ-X-PSに比べて活性が上昇していた。【００８６】
【表７】
2006132204.tif 000010
【００８７】
ついで、デコイオリゴヌクレオチドの鎖長について検討した結果を、SEQ-Iに対する比活性として下記表８に示す。【００８８】
【表８】
2006132204.tif 000011
【００８９】
SEQ-15，SEQ-16，SEQ-17，SEQ-18，SEQ-19，SEQ-23，SEQ-24，SEQ-25，およびSEQ-26の結合活性はSEQ-Iと比較して高く、センス鎖の3'末端側の付加配列は鎖長が短いほど結合活性は高く，5'末端側の付加配列は鎖長が長いほど結合活性は高いことがわかった。これらの結果から少なくとも3'末端側の付加配列は1塩基または２塩基，5'末端側の付加配列は3塩基以上あることが、結合活性の向上をもたらすと考えられる。【００９０】
さらにまた、１４塩基長または１６塩基長のオリゴヌクレオチドを部分的にS化したデコイオリゴヌクレオチド、SEQ-33，SEQ-34，SEQ-35，SEQ-36，SEQ-37およびSEQ-38の結合活性はSEQ-xと比較して約50倍〜約100倍高かった。下記表９に本検討で使用した配列およびSEQ-xに対する相対IC50値を記載した。【００９１】
【表９】
2006132204.tif 000012
【００９２】
しかしながら、上述（表２）のとおり、SEQ-8の結合活性はSEQ-6と比較して約10倍高かった。これらの結果から、20塩基のオリゴヌクレオチドにおいては両端末端側に連続して2ヶ所のS化修飾を入れる必要はあるが、14塩基および16塩基のオリゴヌクレオチドにおいては必ずしも両末端側に連続してS化修飾を2ヶ所入れる必要は無く、SEQ-6のS化修飾部位のみで結合活性は向上すると考えられる。【００９３】
３．細胞内NF-κB結合試験
（１）細胞
培養ディッシュ内で約80％コンフルエントに増殖したRAW264.7細胞を、ディッシュから培地を除去後ダルベッコ改変PBS(D-PBS)で洗浄し、適量の10％FBS含有RPMI1640培地を添加してスクレーパーにて細胞をディッシュから剥離して回収した。細胞を計数後、6ウェルプレート（コーニング）に6.0 x 105cells/well/2mLの細胞密度で播種し、5％CO2下インキュベータ内で37℃にて24時間培養する。【００９４】
（２）実験群構成
実験群は以下のとおりとした。
1群．NF-κB ss 2.0μmol/L処置および無刺激（n=3）
2群．NF-κB ss 2.0μmol/L処置およびLPS刺激（n=3）
3群．SEQ-x 0.1μmol/L処置およびLPS刺激（n=3）
4群．SEQ-x 0.3μmol/L処置およびLPS刺激（n=3）
5群．SEQ-I-PS 0.1μmol/L処置およびLPS刺激（n=3）
6群．SEQ-I-PS 0.3μmol/L処置およびLPS刺激（n=3）【００９５】
（３）NF-κB デコイオリゴヌクレオチドおよびNF-κB ssの添加
上記のとおり調製した細胞を、D-PBSで洗浄して、各ウェルにRPMI1640培地を1mL添加する。DMRIE-C(1.2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromide) 2mg/mLを、RPMI1640で0.11mg/mLに希釈した（DMRIE-C希釈液）。SEQ-xおよびSEQ-I-PSを、RPMI1640で0.2および0.6μmol/Lになるように希釈した（オリゴヌクレオチド希釈液）。NF-κB ss（配列番号７の一本鎖）をRPMI1640で0.6μmol/Lになるように希釈した（NF-κB ss希釈液）。【００９６】
DMRIE-C希釈液と各オリゴヌクレオチド希釈液またはNF-κB ss希釈液を等量で穏やかに混合し，室温で30分間静置した（混合液）。各wellに該混合液1000μLを添加し、CO2インキュベータ内で4時間静置した。4時間後、LPSを終濃度100ng/mLになるように添加し、CO2インキュベータ内で1時間静置した。反応終了後、ディッシュ内の細胞を、氷冷PBSにて2回洗浄後、スクレーパーで回収した。【００９７】
（４）核抽出物の調製
1×低張バッファー(1×hypotonic buffer)およびコンプリートリシスバッファー(Complete Lysis Buffer)を用意し、回収した細胞を1×低張バッファー100μL中に懸濁した。該懸濁液に、界面活性剤溶液(Detergent)5μLを加え、Vortexにて10秒間混合後、4℃で14000×ｇにて30秒間遠心した。上清を除去後、ペレットにコンプリートリシスバッファー20μLを添加し、4℃で30分間静置した。その後、Vortexにて30秒間混合し、4℃で14000×ｇにて10分間遠心した。上清を遠心管に回収し、-80℃で保存した。なお、全ての手順は、可能な限り４℃または氷冷下にて行う。【００９８】
（５）NF-κB p65 ELISA
上記核抽出液は、使用直前に氷冷下にて溶解させる。核抽出液は、コンプリートリシスバッファーで5倍希釈する。NF-κB p65 ELISA kitに含まれている96ウェルプレートにコンプリート結合バッファー30μLと、上記希釈した各抽出サンプル液20μLとを添加し、室温にて1時間振とうした後、1×ウォッシュバッファー200μLで3回洗浄し、1×抗体結合バッファーで1000倍希釈したウサギ抗NFκB p65抗体を100μLずつ添加し、室温で1時間振とうした。その後1×ウォッシュバッファー200μLで3回洗浄し、1×抗体結合バッファーで1000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体を100μLずつ添加し、室温で1時間振とうした。その後、1×ウォッシュバッファー200μLで4回洗浄し、発色溶液(Developing solution)を100μLずつ添加して、暗室にて5分間発色反応させた。反応後、反応停止液（Stop Solution）を100μLずつ添加して発色反応を停止させた。各Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（株式会社パーキンエルマー）にて450nmと650nmとの吸光度を測定(それぞれの測定値からブランクのウェルの対応する測定値を引く)し、450nm/650nmの吸光度の比を算出した。【００９９】
演算には、Microsoft(登録商標)Excel 2002（Microsoft）を使用した。平均値はExcelの関数AVERAGE，標準偏差（S.D.）は関数STDEVを用いて算出し、3例の平均値±標準偏差として、下記表１０に示し、グラフを図１に示した。【０１００】
【表１０】
2006132204.tif 000013
【０１０１】
SEQ-xでは0.1μmol/Lで対照であるNF-κB ss-LPS刺激群とほぼ同程度であったが、0.3μmol/LでNF-κBタンパク質に対して有意な拮抗作用を示した（抑制率：約85%）。また、SEQ-I-PSは0.1μmol/Lおよび0.3μmol/LでNF-κBタンパク質に対して有意な拮抗作用を示した（抑制率：約99%）。このことより、SEQ-xは0.3μmol/Lが活性化NF-κBタンパク質に対して拮抗作用を示すのに対し、SEQ-I-PSは、0.1μmol/Lより活性化NF-κBタンパク質に対して拮抗作用を示すことから、SEQ-I-PSは、SEQ-xと比較して3倍以上結合活性が高いと考えられる。【０１０２】
４．毒性試験
（１）96プレートへの播種
培養ディッシュ内で約80％コンフルエントに増殖した細胞を、ディッシュから培地を除去後ダルベッコ改変PBS(D-PBS)で洗浄し、適量のトリプシン-EDTAを添加して37℃、5％CO2インキュベーターで3分間静置し細胞をディッシュから剥離させた後、10％FBS含有MEM培地を添加して細胞を回収した。冷却遠心機（Beckman）にて遠心（1000rpm，5分，25℃）後、上清を除去し、細胞ペレットを10%FBS含有MEM培地中に再懸濁し、細胞を計数後、96ウェルプレート（コーニング）に5.0×103cells/well/50μLの細胞密度で播種した。【０１０３】
（２）実験群構成
1群．無処置群（n=3）
2群．SEQ-x 1.0μmol/L処置群（n=3）
3群．SEQ-x 3.0μmol/L処置群（n=3）
4群．SEQ-x 10μmol/L処置群（n=3）
5群．SEQ-x 30μmol/L処置群（n=3）
6群．SEQ-X 1.0μmol/L処置群（n=3）
7群．SEQ-X 3.0μmol/L処置群（n=3）
8群．SEQ-X 10μmol/L処置群（n=3）
9群．SEQ-X 30μmol/L処置群（n=3）
10群．SEQ-X-PS 1.0μmol/L処置群（n=3）
11群．SEQ-X-PS 3.0μmol/L処置群（n=3）
12群．SEQ-X-PS 10μmol/L処置群（n=3）
13群．SEQ-X-PS 30μmol/L処置群（n=3）
14群．SEQ-I-PS 1.0μmol/L処置群（n=3）
15群．SEQ-I-PS 3.0μmol/L処置群（n=3）
16群．SEQ-I-PS 10μmol/L処置群（n=3）
17群．SEQ-I-PS 30μmol/L処置群（n=3）【０１０４】
（３）毒性測定
細胞播種後、10%FBS RPMI培地で調製した2、6、20および60μmol/Lの各オリゴ配列を各ウェルに50μLずつ添加し、CO2インキュベータ内で24時間静置した。24時間後、WST-1を10μL添加し、CO2インキュベータ内で約30分〜1時間静置した。反応終了後、Wallac 1420 ARVOsx（株式会社パーキンエルマージャパン）で吸光度（450nm/640nm）を測定した。
まず、上記シリーズIのデコイオリゴヌクレオチド中、SEQ-X、SEQ-X-PS、SEQ-x、SEQ-I-PSについての結果を図２に示す。【０１０５】
24時間後の測定では、SEQ-Xの1、3、10および30μmol/Lを添加した群では細胞死の亢進は認められなかった。SEQ-xの1、3および10μmol/Lを添加した群では、細胞死の亢進は認められなかったが、30μmol/Lを添加した群では、約25%の細胞死が認められた。また、SEQ-X-PSおよびSEQ-I-PSの1、3および10μmol/Lを添加した群では細胞死の亢進は認められなかったが、30μmol/Lで約10%の細胞死が認められた．この結果より部分S化することで細胞毒性が軽減されたと考えられる。【０１０６】
さらに、SEQ-I、SEQ-9、SEQ-33、SEQ-34、SEQ-35、SEQ-36、SEQ-37およびSEQ-38についての毒性測定の結果として、LD50を求め下記表１１に示す。【０１０７】
【表１１】
2006132204.tif 000014
【０１０８】
表１１に示されるようにSEQ-IのLD50値（半数致死量）はSEQ-xと比較して約1.8倍高かった。部分S化修飾であるSEQ-9、SEQ-33、SEQ-34、SEQ-35、SEQ-36、SEQ-37およびSEQ-38のLD50値はSEQ-xと比較して約1.5倍〜約3倍高かった。したがって、SEQ-9、SEQ-33、SEQ-34、SEQ-35、SEQ-36およびSEQ-37はSEQ-xより毒性が軽減していた。20塩基であるSEQ-x、SEQ-IおよびSEQ-9間での比較から、S化修飾部位の数を減らすことで毒性が低減されたことがわかった。【０１０９】
５．安定性試験
各オリゴヌクレオチド配列溶液の終濃度が100ng/μL、かつマウス血漿の終濃度が10%、15%または20%となるようにサンプル溶液を調製し、これを24時間37℃にて保温した。その後、20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色を行った後、メーター（BIO-RAD）で画像解析を行った。電気泳動の結果を図３に示す。【０１１０】
実験群
1群．SEQ-x+ PBS
2群．SEQ-x+ 10% マウス血漿
3群．SEQ-x+ 15% マウス血漿
4群．SEQ-x+ 20% マウス血漿
5群．SEQ-I + PBS
6群．SEQ-I + 10% マウス血漿
7群．SEQ-I + 15% マウス血漿
8群．SEQ-I + 20% マウス血漿
9群．SEQ-I-PS + PBS
10群．SEQ-I-PS + 10% マウス血漿
11群．SEQ-I-PS + 15% マウス血漿
12群．SEQ-I-PS + 20% マウス血漿【０１１１】
SEQ-xは10%、15%および20% マウス血漿中においても安定であった。一方、SEQ-Iは10%、15%および20% マウス血漿中では分解が認められ、20% マウス血漿ではほぼ完全に分解されていた。一方、SEQ-I-PSは10%および15% マウス血漿では安定であったが、20% マウス血漿では若干の分解が認められたが、SEQ-I-PSはSEQ-Iに比べて、有意に安定であると考えられる。この結果より、デコイオリゴヌクレオチドの両端２塩基ずつをホスホロチオエート化することによって、有意に安定性を増加させることができると考えられる。【０１１２】
６．レポーターアッセイ
ここで用いたレポーターアッセイとは、細胞内に導入したレポーター遺伝子が，NFκBの活性化に依存して，転写活性化され，発現した酵素の活性を測定する系である。本評価系はシグナル伝達の阻害剤の研究等においても当業者に用いられているものである。【０１１３】
3.1. 試験方法
（１）細胞の24 well plateへの播種
細胞を観察し，異常のないことおよび約80％コンフルエントになっていることを確認した．適量のD-PBS（-）にて洗浄後，適量のTrypsin-EDTAを添加し，37℃，5％CO2インキュベータで3分間反応させ，細胞を剥離させた．剥離させた細胞を10％FBS含有MEM培地で懸濁し，遠心チューブに回収し，冷却遠心機（Beckman）にて遠心分離（1000 rpm，5分，25℃）し，上清を吸引した．沈殿させた細胞を10%FBS含有MEM培地で再懸濁し，改良型ノイウェル血球計算板を用いて細胞を計数後，24 well plate（コーニング）に4.0 x 104 cells/well/0.5 mLで播種し，37℃，5％CO2インキュベータ内で24時間培養した．【０１１４】
（２）実験群構成
実験１および実験２を独立して行った。各実験における実験群は以下のとおりとした。
実験1
1.無刺激群：FuGENE6 + pNF (pNFκB-SEAP plasmid)処置4時間→無刺激
2.TNF-α刺激群：FuGENE6 + pNF処置4時間→TNF-α刺激24時間
3.SEQ-x群：FuGENE6 + pNF +SEQ-x（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
4.SEQ-9群：FuGENE6 + pNF +SEQ-9（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
5.SEQ-33群：FuGENE6 + pNF +SEQ-33（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
6.SEQ-34群：FuGENE6 + pNF +SEQ-34（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
7.SEQ-35群：FuGENE6 + pNF +SEQ-35（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間【０１１５】
実験2
1.無刺激群：FuGENE6 + pNF 処置4時間→無刺激
2.TNF-α刺激群：FuGENE6 + pNF処置4時間→TNF-α刺激24時間
3.SEQ-x群：FuGENE6 + pNF + SEQ-x（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
4.SEQ-36群：FuGENE6 + pNF +SEQ-36（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
5.SEQ-37群：FuGENE6 + pNF +SEQ-37（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
6.SEQ-38群：FuGENE6 + pNF +SEQ-38（0.1 μmol/L）処置4時間
→TNF-α刺激24時間
各実験群はn=3で行った．【０１１６】
（３）各オリゴヌクレオチドの添加
HeLa細胞を24 well plateに播種し，24時間培養した後，D-PBS（-）で洗浄し，MEM培地250 μLを添加した．FuGENE6をMEM培地にて83.3倍希釈した（FuGENE6希釈液）．以下の組成でDNA混合溶液を調製した．【０１１７】
実験1【０１１８】
【表１２】
2006132204.tif 000015
実験2【０１１９】
【表１３】
2006132204.tif 000016
【０１２０】
調製した各DNA混合溶液とFuGENE6希釈液を等量で穏やかに混合し、30分間室温で反応させた（FuGENE6混合溶液）。反応後、24 well plateに各FuGENE6混合溶液250μLを添加し、4時間反応させた後、D-PBS（-）で洗浄し、10%FBS含有MEM培地500 μLを添加し、約20時間反応させた。反応後、D-PBS（-）で洗浄し、MEM培地500 μLを添加し、TNF-αを終濃度が50 ng/mLになるように添加し、約24時間反応させた。反応後、1.5 mLチューブに培養上清を回収し、微量高速冷却遠心機（トミー）にて10000 rpm、5分間、4℃で遠心分離を行い、上清のみを別の1.5 mLチューブに移し、細胞培養室用冷凍庫（-20℃前後）に保存した。【０１２１】
（４）レポーターの測定
5×Dilution Bufferを蒸留水にて5倍希釈し、1×Dilution Bufferを調製した。また、25 mmol/L CSPD SubstrateをChemiluminescent Enhancerにて20倍希釈し、1.25 mmol/L CSPD Substrateを調製した。【０１２２】
Chemiluminescent Enhancer、Assay Dilutionおよび調製した1×Dilution Bufferを室温に戻した。1.5mLチューブにサンプル15 μLを添加した。次に1×Dilution Buffer 45 μLを添加し、タッピングにて混合した。Water bathにて65℃、30分間反応させた。反応後、氷上に3分間放置し、1.5mLチューブを室温に戻し、Assay Dilution 60 μLを添加し、タッピングにて混合し、室温にて5分間反応させた。反応後、1.25 mmol/L CSPD Substrate 60 μLを添加し、タッピングにて混合し、10分間、室温で反応させた。反応後、96well plateに反応サンプルを移し、 Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（株式会社パーキンエルマー）で相対発光強度（RLU）を測定した。本試験においては各オリゴ配列の濃度を0.1 μmol/Lで実施した。【０１２３】
上記実験1においてTNF-α群のRLU値は無刺激群と比較して約80倍高かった。SEQ-x群のRLU値はTNF-α群と比較して同程度であった。SEQ-9、SEQ-33、 SEQ-34およびSEQ-35群はTNF-α群と比較してRLU値の低下を示し、阻害率はSEQ-9群で約70%、SEQ-33で約70%、SEQ-34で約99%、SEQ-35で約70%であった。【０１２４】
実験2においては、TNF-α群のRLU値は無刺激群と比較して約145倍高かった。SEQ-x群のRLU値はTNF-α群と比較して同程度であった。SEQ-x群のRLU値はTNF-α群と比較して同程度であった。SEQ-36、 SEQ-37およびSEQ-38群のRLU値はTNF-α群と比較して低下を示し、阻害率はSEQ-36で約80%、SEQ-37で約75%、SEQ-38で約90%であった。【０１２５】
実験群1 【０１２６】
【表１４】
2006132204.tif 000017
実験群2【０１２７】
【表１５】
2006132204.tif 000018
【０１２８】
SEQ-x群は転写活性化に対して抑制作用を示さなかった。SEQ-9、SEQ-33、SEQ-34、SEQ-35、SEQ-36、SEQ-37およびSEQ-38群は転写活性化を約70%〜約99%抑制した。これらの結果からSEQ-9、SEQ-33、SEQ-34、SEQ-35、SEQ-36、SEQ-37およびSEQ-38はSEQ-xより低濃度でNFκBシグナル依存的な遺伝子の転写活性化を抑制すると考えられる。
【図１】
2006132204.tif 000019
【図２】
2006132204.tif 000020
【図３】
2006132204.tif 000021
【配列表】
2006132204000001.app
【国際調査報告】
2006132204.tif 000022
2006132204.tif 000023
2006132204.tif 000024
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2006132204.tif 000026
2006132204.tif 000027
2006132204.tif 000028
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