(57)【要約】本発明は、被験者の口腔由来のサンプルから得られたＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子及びＴ２Ｒファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子の発現量と、当該被験者のサンプルから得られた血清亜鉛濃度とを関連づけることを特徴とする、亜鉛欠乏性味覚異常検査方法、並びに当該検査に用いるためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の口腔由来のサンプルから得られたＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子及び／又はＴ２Ｒファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子の発現量と、当該被験者のサンプルから得られた血清亜鉛濃度とを関連づけることを特徴とする、亜鉛欠乏性味覚異常の検査方法。
【請求項２】
ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、ＴＨＴＲ１，２，３，４，５，６，７，９，１１，１２および１４からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ味覚受容体として機能するポリペプチド
【請求項４】
ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドである請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９若しくは２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９若しくは２１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ味覚受容体として機能するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項５】
Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、Ｔ２Ｒ１，３，４，５，７，８，９，１０，１３，１４および１６からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ味覚受容体として機能するポリペプチド
【請求項７】
Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドである請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ味覚受容体として機能するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項８】
口腔由来のサンプルが、擦過法で採取される舌組織サンプルである請求項１記載の方法。
【請求項９】
味覚受容体遺伝子の発現量は、遺伝子を増幅することにより検査し、増幅が、味覚受容体の全長をＲＴ−ＰＣＲにより増幅するものである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから設計されるプライマーを含むことを特徴とする亜鉛欠乏性味覚異常を検査するためのキット。
（ａ）配列番号４５〜８８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号４５〜８８で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呈味性物質反応性組成物（味覚受容体）の発現量および血清亜鉛濃度を指標に用いて亜鉛欠乏性味覚異常を検査する方法、及び亜鉛欠乏性味覚異常検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
味覚は、生活上重要な感覚である。そのため、味覚の異常は、患者の精神に強いストレスを与える。しかし、味覚は、それを感じる本人にしか認識できない主観的なものであるため、その病態を客観的にとらえることは難しく、現状では味覚異常に対して有効な治療が施されているとは言い難い。さらに、味覚障害はヒトの生死に直接結びつくものではないため、研究者の興味の対象になることが多くない。これまでに、味覚異常の検査は大きく分けて２種類の方法で行われている。１つは、電気味覚検査と呼ばれるものであり、舌に弱い電流を流し、味に似た電気刺激を与えたときの感じ方の程度で味覚障害を判定するという方法である。しかし、この方法は、甘味、苦みといったそれぞれの味質についての異常を検出することは困難である。もう１つは、濾紙ディスク法と呼ばれる方法である。濾紙ディスク法では、種々の濃度の呈味物質をしみこませた濾紙を舌の各所に乗せて、被験者に味の有無を聴取する方法がとられており、甘味、塩味、酸味、苦みといった４基本味の感じ方の程度や正しさを検出することが可能である。しかし、この検査を理解できる年齢や知識がないとよい結果を得ることができないことが問題である。さらに味を感じてもどのように表現すればよいか分からないときなども、また同様に問題である。このことから乳幼児を対象とする場合、あるいは高齢で耳に障害がある患者を対象とする場合は、このような検査はほとんど意味をなさない。
また、上記の方法を用いると、味覚の異常の有無を検出することが可能であるが、味覚異常の原因を明らかにすることはできない。
ところで、哺乳動物の味覚は、甘味、苦味、旨味、酸味及び塩味の５つに分類されると考えられている。そして、それぞれの味質は異なる情報伝達系を介すると考えられており、甘味、苦味、旨味はＧタンパク質共役型受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＧＰＣＲ）が関与し、塩味、酸味はイオンチャネルが深く関与すると言われているが、受容体と呈味物質との関連は未だに明らかにされていない。外界からの化学刺激に対して、これらの味覚受容体（ＧＰＣＲ又はチャネルタンパク質）が選択的に活性化又は不活性化すると、受容体を発現する舌の細胞（味覚細胞）が応答を発信し、呈味性物質に対する情報が中枢神経へと伝達されると考えられている。
前述の通り、いくつかの味覚受容体は７回膜貫通型構造を有するＧタンパク質共役受容体に属している。呈味性物質のＧタンパク質共役受容体についての研究が近年進んでおり、現在Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒ、ＴＨＴＲファミリー（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２０，９７−１０１，２００２）が味覚受容体として同定されている（特表２００３−５３００９８号公報）、特表２００３−５１００３７号公報）。しかし、これらの受容体、特にＴＨＴＲファミリーがどのような物質をリガンド（アゴニスト）としているかはほとんど不明である。
従って、味覚受容体を解明し、呈味性物質としてのリガンドを探索することが望まれている。また、被験者の主観に依存しない新しい味覚異常の検査法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、亜鉛欠乏性味覚異常を検出するための方法、及び味覚異常を検出するためのキットを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、味覚障害例の原因別に味覚受容体遺伝子の発現頻度を比較することにより、亜鉛欠乏性味覚異常を検査する方法を完成するに至った。即ち本発明は以下の通りである。
（１）被験者の口腔由来のサンプルから得られたＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子及び／又はＴ２Ｒファミリーに属する味覚受容体をコードする遺伝子の発現量と、当該被験者のサンプルから得られた血清亜鉛濃度とを関連づけることを特徴とする、亜鉛欠乏性味覚異常の検査方法。
（２）ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、ＴＨＴＲ１，２，３，４，５，６，７，９，１１，１２および１４からなる群から選択される少なくとも１つである、（１）記載の方法。
（３）ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである（１）記載の方法。
（ａ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ味覚受容体として機能するポリペプチド
（４）ＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドである（１）記載の方法。
（ａ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９若しくは２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９若しくは２１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ味覚受容体として機能するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（５）Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、Ｔ２Ｒ１，３，４，５，７，８，９，１０，１３，１４および１６からなる群から選択される少なくとも１つである、（１）記載の方法。
（６）Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである（１）記載の方法。
（ａ）配列番号２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ味覚受容体として機能するポリペプチド
（７）Ｔ２Ｒファミリーに属する味覚受容体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドである（１）記載の方法。
（ａ）配列番号２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ味覚受容体として機能するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（８）口腔由来のサンプルが、擦過法で採取される舌組織サンプルである（１）記載の方法。
（９）味覚受容体遺伝子の発現量は、遺伝子を増幅することにより検査し、増幅が、味覚受容体の全長をＲＴ−ＰＣＲにより増幅するものである（１）記載の方法。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから設計されるプライマーを含むことを特徴とする亜鉛欠乏性味覚異常を検査するためのキット。
（ａ）配列番号４５〜８８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号４５〜８８で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
本発明により、亜鉛欠乏性味覚障害検査法が提供される。本発明の方法は、従来のようなヒトの感覚に頼らない方法であり、味覚異常をより客観的に検査することができる。また、本発明の検査法を利用して、亜鉛欠乏性味覚障害の診断、及び亜鉛欠乏性味覚障害例における予後診断をすることが可能であり、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、味覚障害の原因別分類結果、及び原因別に味覚受容体遺伝子の発現頻度を比較した結果を示す図である。
図２は、亜鉛欠乏性味覚障害例の治療経過における味覚受容体遺伝子の発現頻度を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。なお、本明細書において引用した文献、特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本出願、特願２００５−３７６７１７号の開示内容を包含する。
１．概要
本発明は、甘味、苦味、旨味を受容すると言われるＧＰＣＲ型の複数の受容体の舌組織における発現量の変化と、血清亜鉛濃度との関連性に基づいた味覚異常の検査方法を提供する。本発明は、従来のようにヒトの感覚を判断の指標にした味覚検査ではなく、口腔由来のサンプルを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により複数の味覚受容体の発現を確認するとともに、この発現量と血清亜鉛濃度とを関連づけることによって行う味覚異常の検査方法を提供する。
本発明者は、味覚障害患者を亜鉛欠乏性、特発性、感冒性及び薬剤性の味覚障害に分類し、それぞれの患者の舌組織中に発現する味覚受容体遺伝子について、味覚異常検査を実施した。すなわち、味覚受容体としてすでに報告された１１種類の受容体（Ｔ２Ｒ１，３，４，５，７，８，９，１０，１３，１４，１６）、そしてＴａｋｅｄａら（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２０，９７，２００２）が味覚受容体の候補としてあげている１１種類の受容体（ＴＨＴＲ１，２，３，４，５，６，７，９，１１，１２，１４）について上記患者の組織（ヒト舌組織）における発現量をＲＴ−ＰＣＲ法で検出し、この遺伝子発現量と血清亜鉛濃度とを関連させて解析した。
その結果、亜鉛欠乏性味覚障害例は、他の原因（例えば特発性、感冒性、薬剤性等）に比較して舌組織中の味覚受容体遺伝子の発現頻度が低い傾向がみられた。また、亜鉛欠乏性味覚障害治療過程において、味覚障害が改善しない例では味覚受容体遺伝子の発現頻度に変化はなく、一方、亜鉛製剤の投与を続けるにしたがって味覚障害が改善している症例では味覚受容体遺伝子の発現頻度が増加し、治療効果を反映している傾向がみられた。
このことから、本発明は、味覚異常をより客観的に検査することができ、また、亜鉛欠乏性味覚障害の診断に利用することが可能であり、亜鉛欠乏性味覚障害例において予後診断にも応用することが可能となった。
呈味性物質による情報の受け口である受容体の発現量の変化は、味覚異常に結びつくことが予想され、受容体の発現量の変化を検査することにより味覚異常の有無とその原因、さらには治療ターゲットを知ることが可能となる。
さらに、本発明は味覚異常の検査を実施するにあたり、口腔由来の組織の採取方法が、メスを用いた組織採取によるのではなく、ほとんど無痛で非観血的な採取による点（被験者の負担が少ない点）で有用である。
２．呈味性物質反応性組成物（味覚受容体）
本発明の呈味性物質反応性組成物（以下、味覚受容体とも称する。）は、呈味性物質を受容し、呈味性物質による情報を体内に発信する機能を有する。本発明で用いる味覚受容体は、味覚受容体の中でもＧＰＣＲに含まれるＴＨＴＲとＴ２Ｒのファミリーに属するものである。特に、ＴＨＴＲファミリーには、ＴＨＴＲ１，２，３，４，５，６，７，９，１１，１２，１４（アミノ酸配列：配列番号１〜２２（偶数番号のみ）、（２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２））を、また、Ｔ２Ｒファミリーには、Ｔ２Ｒ１，３，４，５，７，８，９，１０，１３，１４，１６（アミノ酸配列：配列番号２３〜４４（偶数番号のみ）、（２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４））を用いることができる。その際、上記のＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体、若しくはＴＨＴＲファミリーに属する味覚受容体とＴ２Ｒファミリーに属する味覚受容体の２２個の全ての受容体を用いてもよいし、又はその複数を適宜組み合わせて用いてもよい。本発明で用いる上記の受容体の名前と塩基配列、及びアミノ酸配列を示す配列番号の一覧を表１に示す。
【表１】
2007074937.tif 000002
表１の受容体名中、ＴＡＳ２ＲＸ（Ｘは任意の番号）はＧｅｎＢａｎｋにおける登録名を意味する。
本発明においては、上記受容体遺伝子のうち、ＴＨＴＲファミリーについてはＴＨＴＲ１１、ＴＨＴＲ４、ＴＨＴＲ９を使用することが好ましく、Ｔ２ＲファミリーについてはＴ２Ｒ３，Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３及びＴ２Ｒ１６を使用することが好ましい。
また、ＧＰＣＲタイプの上記味覚受容体は、甘味、苦味、旨味に関する受容体であるが、これらの受容体の中には、リガンドである呈味性物質が未同定であるために、そのアミノ酸配列の相同性から味覚受容体として推定されているものも含まれている。
さらに、本発明で用いる味覚受容体は、味覚受容体として機能する限り、上記の配列番号１〜４４に示すアミノ酸配列（配列番号１〜４４のうち、偶数番号のもの）からなるポリペプチドのうち複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じているものであってもよい。
アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
「味覚受容体としての機能」としては、例えば、呈味性物質との結合活性、呈味性物質を介したシグナル情報伝達作用などが挙げられる。「味覚受容体として機能する」とは、例えばそれぞれの配列番号に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とほぼ同等の機能を有することを指す。従って、配列番号１〜４４（配列番号１〜４４のうち、偶数番号のもの）に示すアミノ酸配列（配列番号１〜４４のうち、偶数番号のもの）のうち、複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を含むタンパク質の活性が、それぞれの配列番号に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同等又はそれ以上（０．５〜１．５倍程度）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、本発明において使用する味覚受容体としては、当該受容体の部分ペプチドも包含される。そのような部分ペプチドとしては、例えば、受容体分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、受容体結合活性を有するものなどが用いられる。具体的には、受容体の部分ペプチドとしては、ヒドロパシープロット解析において細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用いることもでき、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。本発明において、当該部分ペプチドには、アミノ酸配列に、前述の欠失、置換、付加等の変異が生じているものであってもよい。
本発明で用いる味覚受容体をコードするＤＮＡは、配列番号１〜４４に示すアミノ酸配列（配列番号１〜４４のうち偶数番号のもの）を有するポリペプチド若しくはその上記変異体、またはその部分をコードするものであればよい。そのようなＤＮＡには、例えば配列番号１〜４４で示す塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１〜４４のうち奇数番号のもの（１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３））を挙げることができる。さらに、味覚受容体として機能するものであれば、配列番号１〜４４で示す塩基配列（配列番号１〜４４のうち奇数番号のもの）のうち、１塩基以上の欠失、置換、付加等の変異が生じているものであってもよい。さらに、本発明で用いる味覚受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡには、配列番号１〜４４で示す塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号１〜４４のうち奇数番号のもの）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできるＤＮＡであって、味覚受容体として機能するポリペプチドをコードするものも含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。具体的なストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件が挙げられる。
上記の味覚受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ量を検出するためには、それぞれに特異的なＤＮＡを用いるＰＣＲ法を用いることができる。
本発明で用いる味覚受容体の塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース上で公開されており、この遺伝子情報を用いて本発明のプライマーを設計することができる。プライマーは、ＰＣＲ法に用いたときに、目的の受容体のみを増幅できるように設計するべきである。本発明は、味覚受容体発現量の変化の検出に使用するＤＮＡとして、味覚受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡのうち、ＰＣＲ法により当該味覚受容体を特異的に増幅することのできる前記部分配列（プライマー）の他、当該味覚受容体に特異的にハイブリダイズする部分配列（プローブ）を含むＤＮＡも含めることができる。高感度に受容体遺伝子の発現を検査するには、ＰＣＲ法によって受容体遺伝子を増幅することが好ましい。このような部分配列は、ＴＨＴＲファミリー、Ｔ２Ｒファミリーの全長を増幅するものであってもよい。また、例えばこのような部分配列は、本発明で用いる味覚受容体ポリペプチド（例えば配列番号１〜４４（偶数番号のもの）とその変異体）をコードするＤＮＡと、その相補的な塩基配列からなるＤＮＡのそれぞれから設計されるものであってもよい。あるいは、本発明で用いる味覚受容体をコードするＤＮＡ（例えば配列番号１〜４４（奇数番号のもの）とその変異体）と、その相補的な塩基配列からなるＤＮＡのそれぞれから設計される部分配列であってもよい。本発明において、プライマーは、１８〜２７の塩基長のいずれかであることが好ましい。いずれの場合も、増幅部分として、全長の他、３００〜１０００塩基長、好ましくは５００〜９００塩基長、より好ましくは７００〜８００塩基長の部分配列を設計できる。
さらに、本発明の部分配列、特にプライマーには、例えば、後に示す表２に挙げた味覚受容体を増幅するためのプライマー、配列番号４５〜８８又は配列番号４５〜８８で示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできるＤＮＡを挙げることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは前述の通りである。
配列番号（２ｎ＋４３）（ｎは１〜２２までの整数を表す）に示す塩基配列（配列番号４５，４７，・・・，８５，８７）は、配列番号（２ｎ−１）（ｎは１〜２２までの整数を表す）に示す塩基配列（配列番号１，３，・・・，４１，４３）のうち１番目の塩基から１８〜２６番目の塩基までの配列を表す。配列番号（２ｎ＋４４）（ｎは１〜２２までの整数を表す）（配列番号４６，４８，・・・，８６，８８）は、配列番号（２ｎ−１）に示す塩基配列のうち最後の１８〜２６塩基の相補配列を示す。従って、配列番号（２ｎ＋４３）と（２ｎ＋４４）とはペアプライマーであり、ＰＣＲ法により配列番号（２ｎ−１）に示す塩基配列を有するＤＮＡの全長を増幅することができる。
本発明のプライマーは、目的受容体の特異的増幅を示す限り、タグや制限酵素認識配列等を適宜その５’末端側に付加することができる。
本発明のプライマーで増幅されるＤＮＡの長さは、味覚受容体ポリペプチド全長又は一部分をコードするＤＮＡであるが、検出の感度と増幅の特異性から、増幅するＤＮＡは味覚受容体ＤＮＡの全長であることが望ましい。さらに、本発明で用いられる味覚受容体を増幅するためのＤＮＡは、その５’末端側に必要な配列を付加することもできる。そのような配列としては、制限酵素認識配列等を挙げることができる。
本発明の上記プライマー又はプローブは、公知の方法に従って、あるいは市販のＤＮＡ合成装置を使用して製造することができる。
【表２】
2007074937.tif 000003
３．口腔由来組織の採取方法
本発明において、味覚受容体の発現量の変化は、被験者の口腔由来組織、例えば舌組織サンプルから抽出したＲＮＡを用いて検出することができる。前述のとおり、本発明は味覚異常の検査を実施するにあたり、メスを用いて舌組織を採取するのではなく、ほとんど無痛で非観血的に（出血させることなく）採取できるという特徴をもつ。
舌組織の採取は、例えば擦過法により行う。この場合、通常、エッペンドルフチューブといわれる滅菌済みの使い捨て微量高速遠沈管を用いることができる。チューブのフタのフランジ（エッジ）の部分を利用して、舌組織の舌背部、茸状乳頭組織、葉状乳頭付近又はほおの裏側の口腔内粘膜組織（医学書院、系統看護学講座  専門基礎１  人体の構造と機能［１］解剖生理学  日野原重明著より）を１〜１０回、好ましくは２〜７回、より好ましくは２〜５回程度擦過して、舌表層又はほおの組織を得る。採取部位は好ましくは、葉状乳頭付近である。なお、一度擦過した後は、２〜３日の間、同じ擦過部位から組織を採取せずに放置しておくことが好ましい。微量高速遠沈管は市販されており、例えば、エッペンドルフ社、アシスト社などから購入することができる。遠沈管は、未滅菌の状態のものを購入し、オートクレーブで滅菌したものを用いても、滅菌済みのものを購入して用いてもよい。一度使用した遠沈管は、廃棄し、舌組織の採取の目的で再使用しないことが好ましい。
舌組織サンプルの採取にあたっては、口腔内を水などでよく洗浄してから採取する。そして、組織サンプルを採取した直後に、ＲＮＡ抽出試薬、例えばＴＲＩｚｏｌをチューブに０．５ｍＬ加え、撹拌混和した後、−２０℃で使用まで保存することができる。
４．味覚受容体の検出方法
上記「２．口腔由来組織の採取方法」で採取された組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを施行する。このとき、組織からのＲＮＡ抽出方法は例えばＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることができる。得られたＲＮＡは、適宜ＤＥＰＣ処理水（例えばＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に溶解し、濃度を測定し、−８０℃で保存することもできる。
また、逆転写反応には逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プライマーとしてランダムプライマー、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー、配列特異的プライマー等を利用できる。逆転写反応は、酵素に添付されたマニュアルに従って行えばよい。
ＰＣＲ反応にはＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘ  Ｔａｑを用いることができる。ＰＣＲ反応に用いるプライマーは、上記「１．呈味性物質反応性組成物（味覚受容体）」に記載したプライマー（例えば表２に示すプライマー）を用いることができる。ＰＣＲは、当業者であれば公知の方法に従い適宜設定することができるが、例えば、９４℃に３分間処置した後、９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で１分のセットを３５サイクル行い、７２℃で７分間処置し、４℃で反応を終了させる条件で実施することができる。
本発明におけるＲＴ−ＰＣＲの実施方法は２つの特徴を有する。一つはＰＣＲのサイクルを３５回以上とすること、そしてもう一つはＰＣＲによって、増幅対象の受容体を特異的に確実に増幅して検出することである。
ＰＣＲのサイクル数については、ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲ産物の生成量との関係は、初めはＰＣＲ産物が指数関数的に増えていくが、３５サイクル付近では、ＰＣＲ産物はすでにプラトーに達することが知られている（秀潤社  バイオ実験イラストレイテッド３、本当にふえるＰＣＲ、中山広樹著）。本発明において、３５サイクル以上でＰＣＲを行うことは、初期のテンプレート量に関わらず、反応生成物（ＰＣＲ産物）がプラトーに達し、一定の値を取るようになる（秀潤社  バイオ実験イラストレイテッド３、本当にふえるＰＣＲ、中山広樹著）。したがって、組織内の味覚受容体ＲＮＡの発現量の多寡を検討することよりも、むしろ、発現する味覚受容体ＲＮＡの有無を検討することになる。すなわち、味覚受容体の発現については、定量性はあまり考慮せず、主として定性的な検出を考慮する。そのため、ＰＣＲ反応産物の検出段階（例えばアジレント社の２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いたＰＣＲ産物の検出段階）において、薄いバンドとして見えるＰＣＲ産物は、ほとんど発現していないと解釈できる。つまり、ＰＣＲ生成量がプラトーに達した反応生成物を用いて、味覚受容体の発現を定性的に検討することが本発明の特徴の１つである。以上より、本発明において、ＰＣＲのサイクル数は３５〜５０サイクル、好ましくは３５〜４０サイクル、より好ましくは３５サイクルである。
次に、増幅対象の受容体を特異的に確実に増幅して検出することは、相同性の高い受容体ファミリーの発現の有無をＰＣＲ法によって検出する場合には必要不可欠である。増幅産物が対象とする受容体であり、他の受容体ではないことを確実にするには、増幅産物の塩基配列を解析すること、対象とする受容体の全長をＰＣＲ法で増幅すること、又は増幅される塩基長を受容体毎に異なものとすることなどの方法が考えられる。味覚受容体をコードする遺伝子の少なくとも一部を増幅してもよいが、なかでも、プライマー設計の簡便性点、あるいは類似塩基配列の増幅防止の点から、全長をＰＣＲ法で増幅することが望ましい。
対象とする味覚受容体の全長をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅する意義は、ＰＣＲで増幅する場合、増幅されたＰＣＲ産物そのものをチェックすることは困難を伴うため、増幅されたＰＣＲ産物の大きさを指標に正常な増幅が行われ、増幅対象である味覚受容体を確実に増幅したことを確認することにある。また、全長を増幅する場合、サンプルＲＮＡ中に検出対象の味覚受容体の全長に相当するＲＮＡが存在しなければ増幅されないことから、味覚受容体遺伝子の少なくとも一部を増幅する場合よりもより確実にチェックを行うことができる。さらに、味覚受容体の全長をＰＣＲ法で増幅する利点には、ごく少量の、検出対象以外の味覚受容体のＲＮＡがサンプル中に存在する場合、当該他の受容体遺伝子の増幅は多量に発現している検出対象の味覚受容体よりも困難になるため、本発明の目的である舌における味覚受容体の定性的な観測にとって、より有利である点が挙げられる。そこで、ＰＣＲ用プライマーは、受容体のコード領域全部を増幅できるように設計することが好ましい（前述）。
ＰＣＲ産物の大きさや量を測定するには、アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物を泳動し、その大きさ毎に分離してバンドの濃さによって測定する方法や、ＤＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＰＣＲ産物に含まれるフラグメントの分子量を測定する方法を用いることができる。中でも、ＰＣＲ産物の大きさを正確に、かつ高感度に測定できるアジレント社の２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒが本発明の検査には有効である。このようにして得られたＰＣＲ産物のバンドの濃さ及び／又は数を指標として、味覚受容体が発現しないことによる味覚異常の有無等を検討するのが本発明である。すなわち、複数のＴＨＴＲ受容体およびＴ２Ｒ受容体のうち、例えば、異なる１０個受容体の発現を検討した場合、ＰＣＲ産物の濃いバンドが所定数以上出現したとき、あるいは所定数以上出現しなかったときを、味覚異常、舌痛症、又はストレスの状態と判断する。本発明はＰＣＲ反応生成物がプラトーに達するまでＰＣＲを行うことから、薄いバンドとして見えるＰＣＲ産物はほとんど受容体が発現していないと考えられる。したがって、このような薄いバンドは出現したバンドの数には加算しない。
薄いバンドとはピークエリア数値（ピーク面積）が１０以下のものをさす。本発明ではＰＣＲ産物の塩基の長さと増幅された遺伝子産物量の測定にはアジレント社の２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いた。２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒは、ＰＣＲ等で増幅した産物をはじめ、遺伝子産物に対し電気泳動を行い、その量と塩基の長さを測定する装置である。この測定装置は、電気的な力によってキャピラリー中を泳動する遺伝子産物が検出器を通過するまでの時間から塩基の長さ（大きさ）を求め、また検出器が検出するシグナルの強さを表すピークエリアの面積の大小をバンドの濃淡として示すものである。２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒは遺伝子産物シグナルのピークエリアの大きさを味覚受容体遺伝子発現パターンの擬似電気泳動像として示している。この擬似電気泳動像測定時に記録されているピークエリアの数値が２０以上の場合、濃いくっきりしたバンドで表されるため、本発明ではこれを「濃いバンド」として示し、舌上皮組織における味覚受容体遺伝子が発現しているものと判断する。一方、このピークエリアの値が５以下の場合は非常に薄いバンドとして表現され、本件では味覚受容体遺伝子がほとんど発現していないことを示している。５以上１０以下の数値が得られた場合は、「わずかに発現」としているが、発現はあるものの組織中に発現する受容体数が少ないため、味覚受容体として機能していないと想像される。２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを構成する解析ソフトが認識しないほどの小さなピークでは味覚受容体遺伝子の発現がないと判断する。本件を味覚検査の集団検診に用いた場合ピークエリア数値が１０以下のものは「味覚受容体遺伝子発現がない（遺伝子発現はあっても味覚を感じるほどの機能はない）」と判断してもよい。
５．血清亜鉛濃度と遺伝子発現量との関係
本発明は、亜鉛欠乏性味覚異常を検査する方法である。したがって、本発明においては、上記味覚受容体遺伝子の発現量を測定するとともに、血清亜鉛濃度を測定し、遺伝子の発現量と血清亜鉛濃度との関係を関連づけて味覚異常であるか否かを判断することができる。
血清亜鉛濃度は、患者の血清などから公知方法（例えば原子吸光法）によって測定することができる。血清中の亜鉛の正常値は、６５〜１１０μｇ／１００ｍｌである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｃｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ／ｍａｉｎ．ａｓｐ？ｆｉｅｌｄ＝０１＆ｍ＿ｃｌａｓｓ＝０９＆ｓ＿ｃｌａｓｓ＝００１５  三菱化学ビーシーエル検査項目解説参照）。
なお、三菱化学ビーシーエルにおける正常値は６４−１１１μｇ／１００ｍｌである。臨床的には血清亜鉛の過剰に遭遇することは稀であり、血清亜鉛の低下をきたす病態の方がはるかに多く、かつ重要である。亜鉛欠乏により成長発育障害、性腺機能不全、皮膚病変、味覚・嗅覚異常などの障害が惹起される。また、従来から血清亜鉛不足と味覚障害はよく知られている。この解説によると、臨床的意義としては、亜鉛は血清中の代表的な必須微量金属であり、欠乏すると皮膚炎や味覚障害をきたすと記されており、血清亜鉛濃度の測定は、中心静脈栄養・経腸栄養に伴う亜鉛欠乏症の診断に重要であることが記載されている。
そこで本発明においては、血清亜鉛濃度が低く舌における味覚受容体遺伝子発現を示す電気泳動のバンドの大部分が認められないときには亜鉛欠乏性味覚障害であると判断する。血清亜鉛濃度が低く、本件の電気泳動図において、ＰＣＲ産物のバンドの濃淡にバランスを欠いたものの、薄いながらもバンドが認められる場合は亜鉛欠乏性の味覚障害の傾向があると判断することができる。
６．キット
本発明のプライマーは、亜鉛欠乏性味覚異常を検査するためのキットとして提供することができる。本発明の検査用キット（以下、「本キット」という）は、当該プライマーの他、本発明の検査方法を実施するために有用な成分を含むものである。そのような成分としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のものを挙げることができる。
（ａ）組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出する際に使用する器具又は試薬
ＴＲＩｚｏｌ溶液、１ｍＬ針付きディスポーザブルシリンジ（例えば、トップ、ディスポーザブルトッププラスチックシリンジ２５Ｇ×１″Ｒ．Ｂ．）、イソプロパノール、リンス用７０％エタノール、及びＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ
上記（ａ）の試薬、器具の使用方法は、以下のとおりである。１サンプルあたり０．５〜１ｍｌ（好ましくは、０．５ｍｌ）のＴＲＩｚｏｌ溶液を、口腔内サンプルを採取したチューブに入れて激しく攪拌することによって、チューブのフタに付着した口腔内サンプルとＴＲＩｚｏｌを混和する。そして、このシリンジを使ってＴＲＩｚｏｌ中の口腔内サンプルをチューブ中で２０〜３０回程度、強く吸引、吐出することによって、サンプルからＲＮＡを抽出しやすくすることができる。イソプロパノールは、使用したＴＲＩｚｏｌの半量を用いて、ＲＮＡ沈殿に使用する。ＲＮＡ沈殿で使うチューブはＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅであることが望ましい。リンス用７０％エタノールは、イソプロパノールで沈殿させたｔｏｔａｌ  ＲＮＡをリンスするために使用する。ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒは、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを溶解するために使用する。
（ｂ）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写するための器具・試薬
反応用チューブ（ＤＮａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｔｕｂｅ）、ｄＮＴＰ、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ混合液、逆転写用バッファー、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＤＴＴ、逆転写反応酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が好ましい）、ＲＮａｓｅ  Ｈ
（ｃ）ＰＣＲ反応を行うための器具・試薬
反応用チューブ（ＤＮａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｔｕｂｅ）、ＰＣＲ反応用バッファー、ｄＮＴＰ溶液、ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｘ  Ｔａｑ，Ｔａｋａｒａが好ましい）
上記のバッファーには、例えば、ｐＨ４〜１０のリン酸バッファー、トリス塩酸バッファーなどが挙げられ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含んでいてもよい。さらに本キットには、口腔内サンプルを擦過法にて採取するための微量高速遠沈管、サンプルからＲＮＡを抽出するためのカラム、バッファー、界面活性剤等を含んでもよい。
本キットを利用することにより、本発明の味覚異常検査方法、舌痛症の検査方法、ストレス検査方法を簡便に行うことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
味覚受容体遺伝子の増幅
（１）組織採取方法
被験者の左右の葉状乳頭をエッペンドルフチューブのフタのフランジ（エッジ）部分で２〜３回擦過して採取した。
上記のように採取した直後に、これら組織にインビトロゲン社のＴＲＩｚｏｌを０．５ｍｌ加え、よく攪拌混和し、−２０℃で保存した後使用した。
（２）ＲＮＡ抽出方法
採取した組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出方法はＴＲＩｚｏｌに添付された説明書に従った。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡは１０μｌのＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶かし、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ濃度を測定した後、−８０℃で保存した。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ実施方法
得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．６５μｇをｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写反応を行った。ここで得られた反応液０．５μｌをテンプレートにしてＥｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、５０μｌの系でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＴＨＴＲファミリー遺伝子についてはＴＨＴＲ１１、ＴＨＴＲ４、ＴＨＴＲ９に対して行い、Ｔ２Ｒファミリー遺伝子についてはＴ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３及びＴ２Ｒ１６に対して行った。用いたプライマーを表２に示す。逆転写反応もＰＣＲ反応も添付されたマニュアルに従って行った。ＰＣＲはアプライドバイオシステムズ社のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用いた。ＰＣＲの条件は９４℃で３分間反応させた後、９４℃−３０秒、５９℃−３０秒、７２℃−１分を３５サイクル、そして、７２℃−７分処置した後、４℃でアジレント社の２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで測定するまで保存した。
（４）ＰＣＲ産物の検討
上記の条件で得られたＰＣＲ産物をアジレント社の２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて検討した。
（５）結果
（５−１）味覚障害の原因別味覚受容体遺伝子発現頻度の比較
味覚障害患者を亜鉛欠乏性、特発性、感冒性及び薬剤性の味覚障害に分類した（図１）。
被験者の年齢分布及び性別は表３の通りである。
【表３】
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各味覚障害と症例数は以下の通りである（図１）。
亜鉛欠乏性：９例（３９％）
特発性：７例（３１％）
感冒性：３例（１３％）
薬剤性：４例（１７％）
それぞれの味覚障害であることの判断は以下の通り行った。なお味覚障害の判断は濾紙ディスク法でおこなった。
亜鉛欠乏性：濾紙ディスク法で味覚障害と判断され、血清亜鉛濃度が低いもの。
薬剤性：濾紙ディスク法で味覚障害と判断され、味覚障害を起こしやすい薬剤（例えば血清カルシウムに拮抗作用を示す降圧剤）などの服用が認められるもの。
感冒性：濾紙ディスク法で味覚障害と判断され、流行性感冒に罹患しているもの。
特発性：濾紙ディスク法で味覚障害と判断されるが、上記のような原因がないもの。
それぞれの患者の舌組織中に発現する味覚受容体遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲを施行したとき、電気泳動の結果からＰＣＲ産物の明瞭なバンドが出願するか否かを検討した。目視したときに薄いバンド（たとえば３Ｈや４Ｈのような固い芯の鉛筆で弱々しく描かれたような程度の薄いバンド）はほとんど発現していないとみなし、濃い明瞭なＰＣＲのバンド（たとえると２Ｂや３Ｂという太くて柔らかい芯の鉛筆で力強く描かれたような程度の濃いバンド）の発現頻度（％）を図１に示した。
図１において、各受容体遺伝子又は受容体候補遺伝子に示す４本のグラフは、左から亜鉛欠乏性、特発性、感冒性、薬剤性の味覚障害原因を示す。
図１において、ＴＨＴＲ４味覚受容体候補遺伝子は９例の亜鉛欠乏性味覚異常患者の全例で発現が認められず、Ｔ２Ｒ１３味覚受容体遺伝子では９例中３例で発現が認められたことを示している。この図１をみると、特に亜鉛欠乏性味覚障害例は、他の原因に比較して舌組織中の味覚受容体遺伝子の発現頻度が低い傾向が認められた。このことから、本発明の方法は、亜鉛欠乏性味覚障害の診断に利用できることが示された。
（５−２）亜鉛欠乏性味覚障害例の治療経過における味覚受容体遺伝子の発現頻度の比較亜鉛欠乏性味覚障害例について、亜鉛製剤投与による治療を行い、５週間ごとに、ろ紙ｄｉｓｋ法による味覚検査と舌組織中の味覚受容体遺伝子発現の検討を行った。
結果を図２に示す。図２は、亜鉛欠乏性味覚障害例の治療経過における味覚受容体遺伝子の発現頻度を比較した結果を示す図（電気泳動の結果）である。カッコ内の数字は、血清中の亜鉛濃度を示す。
電気泳動のバンドは、図の左から順に、ＤＮＡサイズマーカー、３種類の味覚受容体遺伝子ＴＨＴＲファミリーＴＨＴＲ１１、ＴＨＴＲ４及びＴＨＴＲ９、並びに６種類のＴ２ＲファミリーＴ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３及びＴ２Ｒ１６の発現状態を表す。最も右のバンドは、逆転写反応をチェックするための遺伝子として選ばれたβアクチンの発現を示したバンドである。
図２上段に示すように、味覚障害が改善しない例では味覚受容体遺伝子発現頻度に変化はない。これに対し、味覚障害が改善している４例では、図２下段に示すように亜鉛製剤の投与を続けるにしたがって味覚受容体遺伝子の発現頻度が増加し、治療効果を反映していることが示された。
したがって、本発明の方法は、亜鉛欠乏性味覚障害例において予後診断に利用きることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０００７】
配列番号４５〜配列番号８８：プライマー
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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