(57)【要約】  本発明によれば、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を用いた有用物質の製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
微生物が以下の（１）〜（５）から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、請求項１または２記載の製造法。
（１）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
（２）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（３）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（４）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
（５）野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
【請求項４】
微生物がEscherichia属、Erwinia属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、Salmonella属、Serratia属、Vibrio属、Xanthomonas属、またはXylella属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
微生物がEscherichia coli、Erwinia carotovora、Pseudomonasputida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter capsulatus、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Vibrio fischeri、Xanthomonas capestrisまたはXylella fastidiosaである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いたアミノ酸等の有用物質の製造法はこれまで数多く報告されているが、そのほとんどは（１）有用物質の生合成酵素遺伝子の発現が強化された微生物、（２）該遺伝子の脱感作型変異遺伝子を有する微生物、または（３）有用物質の分解酵素遺伝子が破壊された微生物等を用いた製造法である（非特許文献１〜３）。
上記（１）〜（３）以外の微生物を用いた有用物質の製造法としては、増殖速度を低下させる活性を有する蛋白質をコードするrmf遺伝子を破壊したE. coliを用いたリジンの製造法（特許文献１）が知られている。しかしながら、一般的には間接的に有用物質の生合成の促進や分解の抑制に関与している遺伝子を特定することは困難である。【０００３】
多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献４）。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体ＤＮＡ上にある特定の遺伝子または染色体ＤＮＡ上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られている（非特許文献５）。また染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリー、および２０ｋｂｐ程度の削除可能な染色体ＤＮＡ上の領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなども作製されている（非特許文献６および７）。【０００４】
E. coliが持つ機能未知遺伝子の一つyhbC遺伝子の塩基配列は既に知られている（非特許文献８）。また、yhbC遺伝子産物が大腸菌の生育にとって必須であるという報告もある（特許文献２、および３）。一方で大腸菌の染色体上ＤＮＡ上のyhbC遺伝子を破壊した変異株が作製されており、奈良先端科学技術大学院大学より入手することが可能である（非特許文献９、１０）。【０００５】
しかしながら、染色体ＤＮＡ上のyhbC遺伝子の一部または全部が欠損したE. coliの有用物質の生産性が向上することは知られていない。
【特許文献１】特開2002-306191号公報
【特許文献２】特表2002-541819号公報
【特許文献３】特表2002-541820号公報
【非特許文献１】Microbial Production of L-Amino Acids, ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING BIOTECHNOLOGY, vol.79 (2003), Springer
【非特許文献２】核酸発酵、講談社サイエンティフィク社、1976年発行
【非特許文献３】J. Biosci. Bioeng.（ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング）, 90, 522（2000）
【非特許文献４】http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
【非特許文献５】J. Bacteriol.（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー）, 180, 2063 (1998)
【非特許文献６】蛋白質  核酸  酵素、第46巻、2386ページ、2001年
【非特許文献７】Nature Biotechnol.（ネイチャー  バイオテクノロジー）, 20, 1018（2002）
【非特許文献８】Science（サイエンス）, 277, 1453（1997）
【非特許文献９】http://ecoli.aist-nara.ac.jp/GB5/search.jsp
【非特許文献１０】http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/deletionQueryAction.do
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、有用物質の生産性が向上した微生物を用いた有用物質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記（１）の製造法。
（３）微生物が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、上記（１）または（２）の製造法。
［１］有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（４）微生物がEscherichia属、Erwinia属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、Salmonella属、Serratia属、Vibrio属、Xanthomonas属、またはXylella属に属する微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
（５）微生物がEscherichia coli、Erwinia carotovora、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter capsulatus、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Vibriofischeri、Xanthomonas capestrisまたはXylella fastidiosaである、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６）有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、有用物質を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法に用いられる微生物としては、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、YhbC蛋白質と称することもある）をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質（以下、YhbC蛋白質ホモログと称することもある）をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物をあげることができる。なお、本明細書中での遺伝子とは、構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。【００１０】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００１１】
YhbC蛋白質をコードする遺伝子、またはYhbC蛋白質ホモログをコードする遺伝子（以下、yhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称することもある）の一部または全部が欠損しているとは、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失があるため、（１）yhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子プロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、YhbC蛋白質またはそのホモログ蛋白質を発現しない微生物、（２）yhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子にフレームシフトが生じ、YhbC蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、（３）yhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物、などをあげることができ、好ましくは（３）の微生物をあげることができる。【００１２】
上記（３）の微生物として、より具体的には、配列番号２で表される塩基配列において、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号２で表される塩基配列中の構造遺伝子部分の１塩基の欠失でもよく、好ましくは構造遺伝子中の５〜１００塩基、より好ましくは該遺伝子中の１０〜１００塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の５０〜１００塩基の欠失などをあげることができる。【００１３】
本発明の製造法で用いられる微生物が生産する有用物質は、微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸および脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5- semialdehyde dehydrogenase   (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、Xylose reductase、P450、ヒト顆粒球コロニー刺激因子などをあげることができ、ペプチドとしてはグルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができ、アルコールとしては、エタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができ、脂質としては、EPA(エイコサペンタエン酸)やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。【００１４】
また、本発明の製造法で用いられる微生物は、上記したように染色体ＤＮＡ上のyhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している微生物であれば、いずれの属に属する微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはEscherichia属、Erwinia属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、Salmonella属、Serratia属、Vibrio属、Xanthomonas属、またはXylella属に属する微生物、より好ましくはEscherichia coli、Erwinia carotovora、Pseudomonas putida、Pseudomonasfluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter capsulatus、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Vibrio fischeri、Xanthomonas capestris、およびXylella fastidiosaなどをあげることができ、さらに好ましくはE. coliをあげることができる。
２．本発明の製造法に用いられる微生物の調製
本発明の製造法に用いられる微生物は、（１）有用物質を生産する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡ上に存在するyhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または（２）染色体ＤＮＡ上のyhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方法により調製することができる。【００１５】
有用物質を生産する能力を有する微生物は、１種以上の有用物質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、および公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００１６】
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。【００１７】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００１８】
アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物の調製に用いることができる。
染色体ＤＮＡ上のyhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、またはyhbC遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体ＤＮＡ上にあるyhbC遺伝子またはそのホモログ遺伝子に塩基の欠失を導入する方法により取得することができる。【００１９】
yhbC遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによりyhbC遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得し、または配列番号２で表される塩基配列に基づき設計したプライマーＤＮＡを用い、各種微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりyhbC遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定することができる。【００２０】
サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに供する染色体ＤＮＡは、いずれの微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、好ましくは、Escherichia属、Erwinia属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、Salmonella属、Serratia属、Vibrio属、Xanthomonas属、またはXylella属に属する微生物、より好ましくはEscherichia coli、Erwinia carotovora、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter capsulatus、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Vibrio fischeri、Xanthomonas capestrisおよびXylella fastidiosaなどの染色体ＤＮＡをあげることができる。【００２１】
上記でいう「ハイブリダイゼーション」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。【００２２】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００２３】
ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００２４】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２５】
具体的なyhbC遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、Erwinia carotovora由来のyhbC遺伝子の塩基配列（Genbank accession no. BX950851）、Pseudomonas fluorescens由来のyhbC遺伝子の塩基配列（Genbank accession no. AAAT00000000）、Xanthomonas capestris由来のyhbC遺伝子の塩基配列（Genbank accession no. AE008922）などをあげることができる。【００２６】
微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失が導入された変異遺伝子を、該欠失の導入対象である宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。【００２７】
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の塩基の欠失を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失が導入されたことを確認することができる。【００２８】
上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在する領域を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているエシェリヒア・コリをあげることができる。【００２９】
λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるpKD46［エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリ JM101株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有するＤＮＡの両端に有する直鎖ＤＮＡ、および
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
などをあげることができる。【００３０】
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。【００３１】
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のsacB遺伝子〔Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366（1993）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のrpsL遺伝子〔Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。【００３２】
上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の塩基の欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは10bp〜100bp程度が好ましく、20bp〜50bp程度がより好ましく、30〜40bp程度がさらに好ましい。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠損、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【００３３】
相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。【００３４】
上記直鎖ＤＮＡは、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の塩基の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。【００３５】
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。【００３６】
方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失等を有する微生物を製造することができる。
３．本発明の有用物質の製造法
上記２の本発明の製造法に用いられる微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取することにより、該有用物質を製造することができる。【００３７】
該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【００３８】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００３９】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００４０】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００４１】
培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるＤＮＡ操作等に関する方法は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載の方法を適宜用いることができる。
【実施例１】
【００４２】
yhbC遺伝子欠損株の造成
奈良先端科学技術大学院大学より入手したyhbC遺伝子が欠損しているE. coli BW25113ΔyhbC::km（以下、E. coli ΔyhbC株と表記する)よりＰ１ファージストックを以下の方法により調製した。
E. coli ΔyhbC株を20mg/lのカナマイシンを含むＬＢ液体培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加］を用いて30℃にて一晩培養した後、そこから0.5mlの培養物をとり、1.4mlの新しいＬＢ液体培地、および100μlの0.1mol/lの塩化カルシウム溶液とを加え混合した。【００４３】
該混合溶液を30℃で5〜6時間振とう培養した後、400μlの該混合液を滅菌したチューブに移した。そこに2μlのＰ１ファージストック溶液を添加し、37℃で10分間保温した後、50℃に保温したソフトアガー溶液（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mmol/l 塩化カルシウム、3g/l 寒天、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加）を3ml添加して、よく攪拌し、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mmol/l 塩化カルシウム、15g/l 寒天、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加。プレートの直径は15cm）上にまいた。【００４４】
該プレートを37℃で7時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、1500×g、4℃の条件下で10分間遠心分離した。上清1.5mlに対し100μlのクロロホルムを添加し、4℃にて一晩保存した。翌日、溶液を15000×gにて2分間遠心分離し、上清をファージストックとして4℃で保存した。
次に、取得したファージを用いてE. coli W3110株およびE. coliMG1655株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地で30℃、4時間培養したE. coli W3110株およびE. coliMG1655株の培養物を200μl分取し、ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのＬＢ液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。【００４５】
1500×g、25℃の条件下で10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのＬＢ液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地（0.15％ 肉エキス、0.15% 酵母エキス、0.5% ペプトン、0.1% グルコース、0.35% 塩化ナトリウム、0.132% リン酸水素二カリウム、1.5% 寒天、pH7.0）に塗布し、30℃で一晩培養した。【００４６】
各々の欠損導入株毎に出現したコロニー24個をそれぞれ、20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、yhbC遺伝子欠損［ΔyhbC::km］が形質導入されたE. coli W3110株およびE. coli MG1655株を取得した（以下、それぞれE. coliW3110ΔyhbC株、E. coli MG1655ΔyhbC株と標記する）。
【実施例２】
【００４７】
yhbC欠損株の生育特性の解析
E. coli BW25113ΔyhbC株、E. coliW3110ΔyhbC株およびE. coli MG1655ΔyhbC株、並びに対照株であるE. coliBW25113株、E. coli W3110株およびE. coli MG1655株を、それぞれ5mlのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養物を得た。50μlの該培養物を、5mlのＭ９液体培地（1％ グルコース、0.6％  リン酸水素二ナトリウム、 0.3％  リン酸二水素カリウム、0.05％  塩化ナトリウム、0.1％  塩化アンモニウム、0.012％  硫酸マグネシウム、0.0015％  塩化カルシウム、0.0011％  硫酸鉄）が入ったＬ字試験管に植菌し、30℃で振とう培養した。培養開始から10分毎に濁度（660nmにおける吸光度。以下、OD660nmと記載する）を測定したところ、OD660nmの値が0.3〜1.0の範囲に納まる期間は対数増殖期であることが確認され、その期間の比増殖速度μ［=ΔIn(OD660nm)/Δ培養時間］を算出した。【００４８】
yhbC遺伝子欠損株であるE. coli BW25113ΔyhbC株、E. coli W3110ΔyhbC株およびE. coli MG1655ΔyhbC株のμはそれぞれ0.34、0.34、0.35であったのに対して、各菌株の親株であるE. coliBW25113株、E. coli W3110株およびE. coli MG1655株のμはそれぞれ0.31、0.28、0.28であった。すなわち、全てのyhbC遺伝子欠損株は、親株と比較して、Ｍ９最少液体培地での生育特性が大幅に向上していた。【００４９】
以上の結果より、yhbC遺伝子が欠損した微生物を用いることにより、有用物質を効率よく製造することができることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５０】
キシリトール生産株の造成
E. coli BW25113株にキシリトールを生産する能力を以下の方法により付与した。
（１）直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えが可能なE. coli W3110red株の造成
直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えが可能なE. coli KM22株［Gene, 246, 321-330 (2000)］よりＰ１ファージを実施例１と同様の方法により調製した。【００５１】
次に、取得したファージを用いてE. coli W3110株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地で30℃で4時間培養したE. coli W3110株の培養物を200μl分取し、ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのＬＢ液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。
1500g、25℃の条件下で10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのＬＢ液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地に塗布し、30℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー24個をそれぞれ、20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えを可能とする染色体ＤＮＡ領域［Δ(recC ptr recB recD)::Plac-red kan］が形質導入されたW3110red株を取得した。
（２）キシリトール生産遺伝子群導入株の造成
（i）キシロースレダクターゼ遺伝子の単離
Kluyveromyces lactisの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４および５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、キシロースレダクターゼ遺伝子(XYL1)を含む1kbpのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、LA-Taq（タカラバイオ社製）を用いて、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ 各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。【００５２】
目的とするＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製し、PCR Cloning Kit（QIAGEN社製）を用いて、プラスミドpDrive（QIAGEN社製）にクローン化することで、プラスミドpDrive-XYL1 を取得した。
（ii）キシロース透過酵素遺伝子の導入
E. coliの染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６および７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、シャインダルガーノ配列およびキシロース透過酵素遺伝子(xylE) を含む1.5kbpのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ 各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1.5分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。【００５３】
目的とするＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製し、PCR Cloning Kitを用いて、プラスミドpDriveにクローン化することで、プラスミドpDrive-xylE を取得した。
（iii）テトラサイクリン耐性遺伝子の単離
Tn10トランスポゾンを染色体ＤＮＡ上に持つE. coli CGSC7465株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手可能）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号８および９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、テトラサイクリン耐性遺伝子(tet)を含む1.5kbpのＤＮＡ断片を増幅した。【００５４】
ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ 各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1.5分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。
目的とするＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製し、PCR Cloning Kitを用いて、プラスミドpDriveにクローン化することで、プラスミドpDrive-tet を取得した。
（iv）pQE60-XYL1-xylE-tetプラスミドの造成
プラスミドpDrive-XYL1を制限酵素NcoI、BamHIを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にてXYL1を含むＤＮＡ断片を分離し、QIA quick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてゲルから回収、精製した。同様にプラスミドpQE60（QIAGEN社製）を制限酵素BspHI、BamHIを用いて切断した後、QIA quick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。XYL1を含むＤＮＡ断片とpQE60のDNA断片をDNA ligation kit ver.2（タカラバイオ社製）を用いて添付の指示書に従いライゲーションを行った。【００５５】
10μlのライゲーション反応溶液と100μlのE. coli JM109 コンピテントセル（タカラバイオ社製）を混合して20分間氷上で保温後、42℃で30秒間、氷上で2分間保温した。混合液に1mlのSOC液体培地を加え、この内100μlを20mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し30℃で一晩培養した。出現したコロニーよりXYL1を含むプラスミドpQE60-XYL1を取得した。【００５６】
次に、プラスミドpDrive-xylEを制限酵素BamHI、BglIIを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にてxylEを含むＤＮＡ断片を分離し、QIA quick Gel Extraction Kitを用いてゲルから回収、精製した。同様に上記のプラスミドpQE60 XYL1を制限酵素BamHIを用いて切断した後、QIA quick PCR Purification Kitを用いて精製した。xylEを含むＤＮＡ断片とpQE60 XYL1のDNA断片をDNA ligation kit ver.2を用いて添付の指示書に従いライゲーションを行った。以後(i)と同様の手法によりXYL1とxylEを共に含むプラスミドpQE60-XYL1-xylEを取得した。【００５７】
次に、プラスミドpDrive-tetを制限酵素NheIを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にてtetを含むＤＮＡ断片を分離し、QIA quick Gel Extraction Kitを用いてゲルから回収、精製した。同様に上記のプラスミドpQE60-XYL1-xylEを制限酵素NheIを用いて切断した後、QIA quick PCR Purification Kitを用いて精製した。tetを含むＤＮＡ断片とpQE60-XYL1-xylEのDNA断片をDNA ligation kit ver.2を用いて添付の指示書に従いライゲーションを行った。以後(i)と同様の手法によりXYL1、xylE、tetを全て含むプラスミドpQE60-XYL1-xylE-tetを取得した。
（v）E. coli W3110redΔxylA::XYL1 xylE tet株の造成
上記pQE60-XYL1-xylE-tetプラスミドを鋳型として、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号１２であらわされる塩基配列からなるＤＮＡ［キシロースイソメラーゼ（xylA）遺伝子の５’末端側のＤＮＡ］および配列番号１３であらわされる塩基配列からなるＤＮＡ［キシロースイソメラーゼ（xylA）遺伝子の３’末端側のＤＮＡ］を有するＤＮＡ断片を増幅した。【００５８】
ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、プラスミドＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ 各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で5分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。
次に、該ＤＮＡ 1μgを用いてE. coli W3110red株の形質転換を行った。形質転換は上記（１）のエレクトロポレーションと同様の条件で行った。【００５９】
形質転換した細胞を、2mmol/lのイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシドを含む1mlのＳＯＣ液体培地を用いて30℃で3時間培養した後、50μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を1.5％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、37℃で一晩培養した。
生育してきた株は、E. coli W3110red株の染色体ＤＮＡ上のxylA遺伝子がキシロースレダクターゼ遺伝子、キシロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をE. coli W3110redΔxylA::XYL1 xylE tet株と命名した。
（vi）E. coli BW25113 ΔxylA::XYL1 xylE tet株およびE. coli BW25113 ΔyhbC::km ΔxylA::XYL1 xylE tet株の造成
E. coli W3110redΔxylA::XYL1 xylE tet株よりＰ１ファージを実施例１と同様の方法により調製した。【００６０】
次に、取得したファージを用いてE. coli BW25113株およびE. coli BW25113 ΔyhbC::km株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地を用いて30℃で4時間培養したE. coli BW25113株およびE. coli BW25113 ΔyhbC::km株の培養物を200μl分取し、E. coli W3110redΔxylA::XYL1 xylE tet株より取得したＰ１ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのＬＢ液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。【００６１】
1500g、25℃の条件下で10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのＬＢ液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地に塗布し、30℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー24個をそれぞれ、10mg/lのテトラサイクリンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、テトラサイクリン耐性株を選抜することにより、染色体ＤＮＡ上のxylA遺伝子が、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシロース透過酵素遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域と置換した形質導入株、E. coli BW25113 ΔxylA::XYL1 xylE tet株およびE. coli BW25113 ΔyhbC::km ΔxylA::XYL1 xylE tet株を取得した。
【実施例４】
【００６２】
yhbC遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造（１）
E. coli BW25113 ΔxylA::XYL1 xylE tet株およびE. coli BW25113 ΔyhbC::km ΔxylA::XYL1 xylE tet株を、それぞれ5mlのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃で20時間、振とう培養し培養物を得た。30mlの該培養物を、1000mlのＭＸ液体培地（3％ グルコース、6％  キシロース、0.0024％  イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシド、0.6％  リン酸水素二ナトリウム、 0.3％  リン酸二水素カリウム、0.05％  塩化ナトリウム、0.1％  塩化アンモニウム、0.012％  硫酸マグネシウム、0.0015％  塩化カルシウム、0.0011％  硫酸鉄）が入った2000ml容のジャーファーメンターに植菌し、30℃で培養した。上記培養において、添加したキシロースは化学量論的にキシリトールへと変換された。【００６３】
培養開始から23時間目、28.5時間目および32.5時間目に培養物の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を1000倍に希釈してダイオネクス社製のイオンクロマトグラフシステムＤＸａ−５００を用いて培養液中のキシリトール蓄積量を測定した。また分光光度計を用いて、培養物の濁度（OD660nm）を測定して生育を定量化した。結果を表１に示す。【００６４】
【表１】
2007037300.tif 000002
【実施例５】
【００６５】
yhbC遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造（２）
実施例３と同様の方法によりE. coli W3110redΔxylA::XYL1 xylE tet株より調製されたＰ１ファージを用いてE. coli W3110ΔyhbC株を形質転換し、E. coli W3110ΔyhbC::km ΔxylA::XYL1 xylE tet株を取得した。また同じＰ１ファージを用いてE. coli W3110を形質転換し、E. coli W3110 ΔxylA::XYL1 xylE tet株を取得した。【００６６】
E. coli W3110ΔxylA::XYL1 xylE tet株およびE. coli W3110ΔyhbC::km ΔxylA::XYL1 xylE tet株を、それぞれ5mlの10g/lのグルコースを含むＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃で16時間、振とう培養し培養物を得た。3.75mlの該培養物を、125mlの液体培地（60g/l グルコース、10g/l イーストエキストラクト、6.8g/l  リン酸水素二ナトリウム、3g/l リン酸二水素カリウム、0.5g/l 塩化ナトリウム、1g/l  塩化アンモニウム、0.247g/l  硫酸マグネシウム、0.015g/l  塩化カルシウム、0.028g/l  硫酸鉄）が入った250ml容のジャーファーメンターに植菌し、30℃、pH7.0（アンモニア水で調整）、通気量1vvmで培養を開始した。撹拌は500rpmで開始し、溶存酸素濃度が１ppmを保つように撹拌数を変化させた。培養開始後3.5時間目にキシロースを80g/lになるように添加して、さらに培養を継続した。【００６７】
上記培養において、添加したキシロースは化学量論的にキシリトールへと変換された。
培養開始から23.3時間目、29.3時間目、33.3時間目および47.3時間目に培養液の一部をサンプリングして遠心分離し、実施例４と同様の方法で培養物中のキシリトール濃度および培養物の濁度を測定した。結果を表２に示す。【００６８】
【表２】
2007037300.tif 000003
【００６９】
表１および２にあるとおり、yhbC遺伝子欠損株は生育が早まると同時に、キシリトール生産性が向上すること、および生産性の向上率は、生育の向上率を上回ることがわかった。
以上より、yhbC遺伝子欠損株の生育特性の改善が、有用物質、すなわち発酵過程によって生産される各種有用物質、例えばタンパク質、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などの生産性の向上につながることに加え、生育特性の向上率以上の生産性の向上も期待できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、有用物質を効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
2007037300.tif 000004
2007037300.tif 000005
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