(57)【要約】カイコのリアノジンレセプタータンパク質並びにそのｃＤＮＡを解明し、新規の殺虫成分のスクリーニング方法を確立するべく、これまで未解明であったカイコのＲｙＲタンパク質のアミノ酸配列、及びそれをコードするｃＤＮＡ（１）の塩基配列を明らかにした。また、同ｃＤＮＡ（１）をプラスミドにサブクローニングして発現プラスミド（３）を作成し、さらにカイコのＲｙＲ遺伝子定常発現細胞を作成し、この発現プラスミドを動物細胞に導入したり、定常発現細胞を利用して被験試薬に対する細胞内のＣａ２＋応答反応を蛍光測定により行うという、殺虫成分のスクリーニング方法を構築した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、リアノジン受容体活性を有するカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなり、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列からなり、カイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号３に記載の塩基配列からなり、又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の全長ｃＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
動物細胞にカイコのリアノジン受容体活性を発現させ得る発現プラスミドであって、請求項５に記載の組換えベクターを配列番号１又は３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングし、又は請求項３に記載のｃＤＮＡをサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド。
【請求項７】
請求項３又は４に記載のｃＤＮＡを導入した細胞であって、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項８】
請求項６に記載のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入した細胞からなり、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項９】
前記細胞は動物細胞である請求項７又は８に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１０】
前記動物細胞はヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞である請求項７又は８に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１１】
前記細胞には、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませている請求項７乃至１０の何れかに記載のリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１２】
殺虫成分のスクリーニング方法であって、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませた動物細胞に請求項６に記載のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入する工程と、その動物細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程と、を含む殺虫成分のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程を含む、カイコのリアノジンレセプター反応物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコのリアノジンレセプタータンパク質、及びその全長ｃＤＮＡと、それを利用する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球人口が増加し続けると予測されていることに伴って、世界規模での食糧難が懸念されている。食糧難の緩和策の一つとして、植物への食害をもたらす昆虫を効率的に駆除する新規農薬の開発が求められている。【０００３】
既知の農薬の一つであるリアノジン（Ryanodine）の標的タンパク質であるリアノジンレセプター（ＲｙＲ）は、小胞体膜に存在しており、リガンドに反応して小胞体内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を細胞外へ放出し、生体の筋収縮を引き起こす。すなわちリアノジンは、カルシウム放出チャンネルとしてのＲｙＲをターゲットとする殺虫剤であり、主に葉食性の害虫駆除に利用されている。このようなＲｙＲを利用した殺虫成分のスクリーニング系を確立することができれば、新規で有用な農薬探索に多大なる貢献をもたらすものと考えられる。【０００４】
これまで、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）（Fruit Fly，学名；Drosophila melanogaster）のＲｙＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｄ１７３８９）のクローニングが行われ、そのＲｙＲを哺乳動物由来の細胞株で発現させた研究がなされている（非特許文献１参照）。また、鱗翅目に属する主要害虫であるTobacco budworm（学名；Heliothis virescens）等のＲｙＲタンパク質の単離も試みられている（特許文献１参照）。さらに同文献では、キイロショウジョウバエのＲｙＲ遺伝子をヨトウガ（学名；Spodoptera Frugiperda）のＳｆ９細胞に一過的に（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的に（Ｓｔａｂｌｅ）導入し、ＲｙＲタンパク質を発現させることも試みられている。
【非特許文献１】Ｘｕｅｈｏｎｇ  Ｘｕ，「Molecular Cloning of cDNA Encoding a Drosophila Ryanodine Receptorand Functional Studies of the Carboxyl-Terminal Calcium Release Channel」，Biophysical Journal, Volume 78,pp1270-1281, March 2000
【特許文献１】国際公開  ＷＯ２００４−０２７０４２  （特表２００６−５１６８８４公報）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、前記特許文献１では、キイロショウジョウバエのＲｙＲ遺伝子を昆虫細胞であるＳｆ９細胞に導入させて発現させたとの開示があり、ＲｙＲ遺伝子の宿主細胞には細菌、真菌、昆虫、植物、動物が含まれる旨が述べられているが、動物細胞にキイロショウジョウバエのＲｙＲ遺伝子を導入したという具体的事実については言及されていない。【０００６】
すなわち、鱗翅目昆虫を対象とする殺虫成分を探索する場合、ショウジョウバエでは生物進化上離れているために、ショウジョウバエのＲｙＲを昆虫や哺乳動物由来の細胞株で発現させたとしても、その試験で有効な殺虫成分が葉食昆虫でも有効であるとの確証を得るのは困難である。他方、葉食昆虫であるTobacco budwormのＲｙＲタンパク質は上述のように単離されてはいるが、そのゲノムは未だ解読されておらず、殺虫成分のスクリーニング手法を容易に確立できるとは言い難い。【０００７】
また、ＲｙＲタンパク質は比較的大きいこと、ＲｙＲタンパク質の対細胞毒性が強くカルシウムイオンが多いと細胞死を引き起こすと考えられること、などの理由により、ＲｙＲタンパク質を定常的に発現する動物細胞は作成が困難であると考えられている。【０００８】
そこで本発明では、多くの葉食昆虫と同じ鱗翅目昆虫であるカイコ（silkworm，学名Bombyx Mori）のＲｙＲタンパク質並びにそのｃＤＮＡを解明するとともに、カイコのリアノジンレセプター遺伝子を定常的に発現する細胞、特に動物細胞を作成し、カイコのＲｙＲのカルシウム放出チャンネルとしての性質を利用したTobacco budwormに代表される葉食昆虫に対する殺虫成分のスクリーニング方法を確立することを主たる課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はまず、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるカイコのリアノジンレセプター（ＲｙＲ）タンパク質である。このカイコのＲｙＲタンパク質は、５０８４のアミノ酸残基数からなり、本発明において初めて特定された。或いは本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列（アミノ酸残基数；５０５８）からなり、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、前述したカイコのＲｙＲタンパク質のスプライシング変異体である。これらカイコ由来のＲｙＲタンパク質のアミノ酸配列を、既知の他の生物のＲｙＲタンパク質と比較した結果、考え得るＲｙＲの進化系統樹を図１に示す。同図に示されるように、カイコのＲｙＲタンパク質（silkworm RyR）との相同性は、例えば鱗翅目昆虫であるtobacco budworm RyRでは約９５％、ショウジョウバエ（fruit fly RyR）では約７９％であった。【００１０】
また本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなり、配列番号２に係るカイコのＲｙＲタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは、１５２５５の塩基数からなり、本発明において初めて特定された。或いは本発明は、配列番号３に記載の塩基配列（塩基数；１５１７７）からなり、又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡである。ここで、配列番号３の塩基配列からなるｃＤＮＡは、配列番号４のカイコのＲｙＲタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡである。【００１１】
このようにして解明されたカイコのＲｙＲタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡをプラスミドにサブクローニングすることで、当該ｃＤＮＡを含有する本発明の組換えベクターを得ることができる。このような組換えベクターは、葉食昆虫に対する殺虫成分のスクリーニングのために用いられる次に記載の発現プラスミドの作成に有用である。【００１２】
すなわち本発明の発現プラスミドは、動物細胞にカイコのリアノジン受容体活性を発現させ得る発現プラスミドであって、上記の組換えベクターを配列番号１又は３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングしたもの、又は上記のカイコのＲｙＲタンパク質をコードするｃＤＮＡをサブクローニングしたものである。ここで、カイコのＲｙＲを発現させる動物細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。【００１３】
また本発明は、前述したカイコのＲｙＲタンパク質をコードするｃＤＮＡを導入した細胞であって、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞である。或いはまた、本発明は、前述のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入した細胞からなり、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞である。【００１４】
このようなカイコのＲｙＲ遺伝子を安定して発現する定常発現細胞が得られることにより、トランスフェクションの技術なしでのアッセイが可能となり、アッセイの操作自体も簡易となる上に、アッセイを含む実験データの信頼性が向上し、カイコのＲｙＲタンパク質と反応する物質（殺虫成分も含む）の探索も簡易且つ安価で行うことができるようになる。【００１５】
前記細胞の生物種は、細菌、真菌、昆虫、植物、動物であり得るが、特に本発明では、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞により、前記カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞を実現することができる。斯かる動物細胞（哺乳動物細胞）としては、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞によって、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞を得ることが可能である。【００１６】
また以上に述べた細胞には、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませることで、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を投与してＲｙＲタンパク質と反応する物質の探索や、鱗翅目昆虫等に対する有用な殺虫成分の探索に供することが可能となる。すなわち、このような定常発現細胞を利用する本発明に係るスクリーニング方法は、当該カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程を含む方法である。【００１７】
また前述のような発現プラスミドを利用すれば、葉食昆虫に対する殺虫成分を効果的にスクリーニングすることができる。すなわち本発明に係るスクリーニング方法は、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませた動物細胞に上記のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入する工程と、その動物細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程と、を含む方法である。Ｃａ２＋感受性蛍光色素としては、Ｆｕｒａ２、Ｆｕｒｏ３、Ｆｕｒｏ４、Ｉｎｄｏ１、Ｑｕｉｎ２、Ｒｈｏｄ２等が挙げられる。全長ゲノムが既に解明されているカイコのＲｙＲを利用する本スクリーニング方法を利用することで、主に葉食昆虫、なかでも特に鱗翅目昆虫等に対する有用な殺虫成分の探索が容易となり、殺虫成分（薬剤）の作用機序の詳細な検討にも有利である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、カイコのリアノジンレセプタータンパク質のアミノ酸配列、並びにそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列が解明された。さらに、動物細胞にカイコのリアノジンレセプタータンパク質を発現させることで、鱗翅目昆虫等の葉食昆虫に対する殺虫成分のスクリーニング方法を確立することができたため、当該殺虫成分を効率的に探索することが可能である。特に、殺虫成分の作用を含めた詳細な検討を行うには、全長ゲノムが解明されているカイコのＲｙＲを利用する本発明が極めて適しているといえる。また、カイコのリアノジンレセプター遺伝子を定常的に発現する細胞、特に動物細胞を作成することができたことから、ＲｙＲタンパク質と反応する物質や殺虫成分の探索を簡便且つ低コストで安定的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】リアノジンレセプタータンパク質の進化系統樹を示す図である。
【図２】カイコＲｙＲｃＤＮＡの調整に用いたＰＣＲプライーマーを示す一覧図である。
【図３】カイコＲｙＲｃＤＮＡを得るためのＰＣＲ断片（ｃＤＮＡフラグメント）の構成図である。
【図４】カイコＲｙＲｃＤＮＡをサブクローニングしたベクターの構成図である。
【図５】同ベクターをサブクローニングした発現プラスミドの構成図である。
【図６】カフェインを使用した細胞内のＣａ２＋濃度変化試験結果を示す図である。
【図７】リアノジンを使用した細胞内のＣａ２＋濃度変化試験結果を示す図である。
【図８】フルベンジアミド使用した細胞内のＣａ２＋濃度変化試験結果を示す図である。
【図９】ノーザンブロッティングでカイコＲｙＲ遺伝子のｍＲＮＡが検出された細胞株のフルベンジアミド刺激前後の蛍光増加量の比較試験を示す図である。
【図１０】フルベンジアミドのカイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞への濃度−反応曲線を示す図である。
【図１１】カイコＲｙＲ遺伝子の定常発現細胞と一過的発現細胞とのフルベンジアミド刺激による蛍光応答の比較試験結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の一実施形態を、以下の実施例並びに図面を参照して説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の一例を示すものであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また各部の具体的構成についても下記の実施例に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【実施例】
【００２１】
＜カイコｃＤＮＡの調整＞
カイコガ（学名；Bombyx Mori）の組織から、ＲＮＡ抽出試薬（商品名；ISOGEN，ニッポンジーン社製）を用い、全ＲＮＡを単離した後、ポリメラーゼ逆転写連鎖反応（RT-PCR，商品名；RNA LA PCR Kit，タカラバイオ社製を使用）を行って、ｃＤＮＡに逆転写した。【００２２】
＜カイコのリアノジンレセプター（カイコＲｙＲ）ｃＤＮＡのクローニング＞
ＳＩＬＫＷＯＲＭ  ＧＥＮＯＭＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＧＲＡＭ  のＫＡＩＫＯＢＬＡＳＴプログラム（http://kaikoblast.dna.affrc.go.jp）を用いて、ショウジョウバエ（学名；Drosophila melanogaster）のリアノジンレセプター（ショウジョウバエＲｙＲ）のエキソン配列（NCBI Gen Bank No. D17389）と相同性の高いカイコゲノムショットガン配列をｔＢＬＡＳＴＸ検索した。その検索の結果、ショウジョウバエＲｙＲの各エキソン配列と相同性の高い４０種のカイコゲノム断片が得られたので、そのゲノム配列の情報を基にして図２に示すような６組のプライマーを設計してＰＣＲ反応を行った（配列番号５〜配列番号２７参照）。なお、１回目のＰＣＲで特異的なバンドが確認されなかったものについては、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。ここで、ＰＣＲ法は、BD advantage 2 PCR Enzyme System（商品名）（BD Biosciences社製）を用い、その附属マニュアルに従って行っている。【００２３】
このようにして得られたＰＣＲ産物を、pGEM-T
Easy vectors（商品名）（Promega社製）にサブクローニングした後、ＤＮＡシーケンサーにて塩基配列を同定した。図３に、相補的な領域を含む６本のｃＤＮＡフラグメント（各々、約３０００塩基長）の構成を示す。これらのｃＤＮＡフラグメントを重ね合わせることで、カイコＲｙＲｃＤＮＡ配列が得られた。しかしながらこの配列には、開始コドンが含まれていなかったため、次のような方法で５’末端を決定した。【００２４】
カイコＲｙＲｃＤＮＡの５’末端決定法として、５’ＲＡＣＥ法を用いた。５’ＲＡＣＥ法には、BD SMART RACE cDNA Amplification Kit（商品名）（BD Biosciences社製）を用いた。鋳型には、カイコの全ＲＮＡを用い、同Ｋｉｔ付属のBD SMART II A oligo とrandom 9 mer をプライマーとしてＰＣＲを行った。ｎｅｓｔｅｄＰＣＲとしては、同Ｋｉｔ付属のNested Universal Primer Aと、配列番号２８に記載の遺伝子特異的プライマーをプライマーとしてＰＣＲを行った。以上の結果、得られたＰＣＲ産物の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで決定することで、カイコＲｙＲｃＤＮＡの５’末端の配列が決定された。以上の結果から、カイコＲｙＲをコードするｃＤＮＡの全塩基配列及びカイコＲｙＲの全アミノ酸配列が決定することができた。配列表の配列番号１に、カイコＲｙＲの全長ｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号２にカイコＲｙＲのアミノ酸配列を示す。また配列番号３、４は、カイコＲｙＲｃＤＮＡ及びカイコＲｙＲのスプライシング変異体である。【００２５】
＜動物細胞発現プラスミドの構築＞
動物細胞に導入するカイコＲｙＲｃＤＮＡがｍＲＮＡからＲｙＲタンパク質へ高効率で翻訳されるようにするため、まず、カイコＲｙＲｃＤＮＡ（配列番号１）の５’末端にＫＯＺＡＫ配列を導入し、その全長ｃＤＮＡ（図中、符号１）をベクタープラスミド（商品名pGEM-T-Easy，Promega社製）にサブクローニングし、組換えベクター（図中、符号２）を作成した（図４参照）。さらにその組換えベクター２を制限酵素ＮｏｔＩで切り出して、哺乳動物細胞の発現ベクターであるベクタープラスミド（商品名；pCI-Neo vector，Promega社製）に再度サブクローニングすることによって、哺乳動物細胞におけるカイコＲｙＲ発現プラスミド（図中、符号３）を構築した（図５参照）。【００２６】
＜細胞培養、ｃＤＮＡ発現＞
哺乳動物細胞として、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞を用い、同細胞を１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）、３０unit/mlペニシリン、３０mg/ml硫酸ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養し、先の工程で得た発現プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションは、SuperFectトランスフェクション試薬（商品名）（Qiagen社製）を用い、そのユーザーズマニュアルに従って行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン／ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）で培地から剥離し、ガラスプレートに撒きなおした。その後、６〜１２時間後に、Ｃａ２＋濃度変化測定を行った。【００２７】
＜細胞内のＣａ２＋濃度変化測定＞
発現プラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞にＣａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませるために、ガラスプレートに貼り付けた細胞を、１mMのＦｕｒａ２／ＡＭ（同仁化学研究所社製）を含むＤＭＥＭ溶液で４０分間インキュベートした。その後、ガラスプレートを顕微鏡ステージの環流チャンバー上に被験試薬と共に置いて、蛍光測定を行った。細胞の蛍光イメージは、ビデオイメージ解析システム（商品名；Aqua cosmos，浜松ホトニクス社製）で行った。蛍光色素Ｆｕｒａ２の蛍光は、３４０nmと３８０nmの励起光を交互に照射した後の５１０nmの蛍光を測定し、その蛍光強度比（ratio(340/380)）を算出することによって、細胞内Ｃａ２＋濃度比を評価した。【００２８】
まず、被験試薬としてカフェイン（caffeine）を用いた試験結果を図６に示す。カフェインは比較的高濃度でＲｙＲと反応することが知られている。同図（ａ）は、細胞をカフェイン刺激した際のＣａ２＋応答（平均トレース、２０個の細胞の平均値）を示しており、（ｂ）は、カフェイン刺激前後の蛍光増加量の比較を示している。図中、コントロール（control）には、カイコＲｙＲを発現させていないＨＥＫ２９３細胞を用いている。この結果から明らかなように、カイコＲｙＲ（図中、kaikoRyR）を発現させたＨＥＫ２９３細胞では、発現させていないコントロールと比較して、カフェイン刺激後のＣａ２＋応答が明らかに大きい。【００２９】
次に、被験試薬としてリアノジン（ryanodine）を用いた試験結果を図７に示す。同図（ａ）は、細胞をリアノジン刺激した際のＣａ２＋応答（平均トレース、２０個の細胞の平均値）を示しており、（ｂ）は、リアノジン刺激前後の蛍光増加量の比較を示している。この場合も、カフェインの場合と同様に、カイコＲｙＲを発現させたＨＥＫ２９３細胞では、発現させていないコントロールと比較して、リアノジン刺激後のＣａ２＋応答が大きい。ただし、リアノジンはカフェインよりも低濃度でカイコＲｙＲと反応している。以上の結果から、本実施例ではＨＥＫ２９３細胞でカイコＲｙＲが機能発現していることが強く示唆された。【００３０】
次に、被験試薬として、フルベンジアミド（flubendiamide，N2-[1,1-dimethyl-2-(methylsulfonyl)ethyl]-3-iodo-N1-[2-methyl-4-[1,2,2,2-tetrafluoro-1-(trifluoromethyl)ethyl]phenyl]-1,2-benzendicarboxamide，日本農薬社製、新規農薬として申請中）を用いて試験を行った。フルベンジアミドは、鱗翅目昆虫に対して高い防除活性を有する化合物であり、昆虫小胞体膜上に存在するリアノジン受容体（リアノジン感受性Ｃａ２＋放出チャンネル）を特異的に活性化するとの報告がなされている（日本農薬学会誌，３０，pp354-360，２００５）。この試験では、哺乳動物であるウサギのリアノジンレセプター２種（rabbit RyR-1，rabbit RyR-2）もＨＥＫ２９３細胞で発現させて、フルベンジアミドのＣａ２＋応答を評価した。図８に試験結果を示す。同図（ａ）は、細胞をフルベンジアミド刺激した際のＣａ２＋応答（平均トレース、２０個の細胞の平均値）を示しており、（ｂ）は、フルベンジアミド刺激前後の蛍光増加量の比較を示している。２種のウサギＲｙＲを発現させたＨＥＫ２９３細胞ではフルベンジアミドを投与してもＣａ２＋上昇は認められなかったのに対して、カイコＲｙＲ（図中、kaikoRyR）を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてのみフルベンジアミドがＣａ２＋上昇を起こしたことが認められた。この結果から、フルベンジアミドはカイコＲｙＲを活性化するが、哺乳動物のＲｙＲには作用しないことが示唆される。また、同図（ｃ）は、フルベンジアミドのカイコＲｙＲへの濃度−反応曲線を示しているが、この用量反応曲線からは、フルベンジアミドのＥＣ５０値は、１０〜３０nMと見積もることができた。【００３１】
以上の結果より、カイコＲｙＲの発現システムは、リアノジンレセプターを標的とする殺虫成分のスクリーニング方法として有用であるといえる。また、カイコ以外の種のＲｙＲを同様に発現させてカイコＲｙＲと同時に評価すれば、殺虫成分の種間での選択性（他の動物種への毒性）も評価することができる。【００３２】
＜カイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞の単離＞
前記カイコＲｙＲｃＤＮＡを挿入したカイコＲｙＲ発現プラスミド（図５、符号３を参照）を、ＨＥＫ２９３細胞にSuperfectトランスフェクション試薬を用いたリポフェクション法により導入した（具体的な実験方法は＜細胞培養、ｃＤＮＡ発現＞の項を参照）。トランスフェクションの２４時間後、ジェネスチン（G418）（ＳＩＧＭＡ社製）を１mg/mLを含むＤＭＥＭ培地に播種し、３７℃で２週間培養することにより、コロニーを形成させた。その後、単一コロニーのみを回収してさらに培養した。そして、当該培養後の細胞から常法により全ＲＮＡを抽出し、カイコＲｙＲ由来のｍＲＮＡをノーザンブロッティングにより検出し、フルベンジアミドに対して活性のあるものを選択した。図９に、ノーザンブロッティングによりカイコＲｙＲ遺伝子のｍＲＮＡが検出されたＨＥＫ２９３細胞株のフルベンジアミド刺激前後における蛍光増加量（ratio(340/380)）の比較試験の結果を示す。この結果から、フルベンジアミド刺激による蛍光増加量（蛍光応答）が最も高かった細胞株（図中、ｌｉｎｅ７）を、カイコＲｙＲ遺伝子の定常発現細胞として得ることができた。【００３３】
図１０に、このようにして得られたカイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞（前記ｌｉｎｅ７）へのフルベンジアミドの濃度−反応曲線を示す。同図から分かるように、カイコＲｙＲ遺伝子を導入したＨＥＫ２９３細胞では、明らかにカイコＲｙＲ遺伝子が発現して、カイコＲｙＲタンパク質がフルベンジアミドにより活性化されている。【００３４】
＜定常発現細胞と一過的発現細胞との蛍光応答の比較＞
図１１に、カイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞（Ｓｔａｂｌｅ）と、カイコＲｙＲ遺伝子一過的発現細胞（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の、フルベンジアミド刺激による蛍光応答の比較試験の結果を示す。同図（ａ）は、フルベンジアミドの定常発現細胞と一過的発現細胞への濃度−反応曲線を示したものであり、同図（ｂ）は、定常発現細胞と一過的発現細胞のフルベンジアミド刺激前後の蛍光増加量の比較を示したものである。これらの結果から、カイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞は、一過的発現細胞と同様に、ＥＣ５０値は、１０〜３０nMと見積もることができる。さらに、カイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞は、カイコＲｙＲ遺伝子一過的発現細胞と比較して、フルベンジアミド刺激による蛍光応答強度が格段に大きいといえる。【００３５】
以上の結果より、カイコＲｙＲ遺伝子定常発現細胞を用いれば、リアノジンレセプターに作用する物質の探索や、特に鱗翅目昆虫への殺虫成分のスクリーニング評価を効率よく行うことができる。また、カイコＲｙＲ遺伝子の一過的発現細胞だけでなく、定常発現細胞を動物細胞で得ることができたため、この定常発現細胞を直接利用すれば、トランスフェクション等の操作を経ずに、リアノジンレセプターに作用する物質や殺虫成分の探索を簡便に行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、カイコのリアノジンレセプター（ＲｙＲ）のｃＤＮＡの塩基配列、カイコＲｙＲタンパク質のアミノ酸配列が解明され、また動物細胞にカイコのＲｙＲタンパク質を発現させ、ひいてはカイコＲｙＲの定常発現細胞までも作成することが可能となった。これにより、簡便に鱗翅目昆虫等の葉食昆虫に対する殺虫成分のスクリーニングを実施できるようになり、新規な殺虫成分の探索に多大な貢献をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2007094408.tif 000013
【配列表】
2007094408000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月17日(2007.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
配列番号１に記載の塩基配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、又は配列番号３に記載の塩基配列からなり又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、の何れかのｃＤＮＡを、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に導入して得られ、
又は、配列番号１に記載の塩基配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、又は配列番号３に記載の塩基配列からなり又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、の何れかの全長ｃＤＮＡを含有する組換えベクターを配列番号１又は配列番号３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド、又は配列番号１に記載の塩基配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡをサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド、の何れかのカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドをヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に導入して得られ、
安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現することを特徴とするカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１１】
前記細胞には、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませている請求項１０に記載のリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１２】
殺虫成分のスクリーニング方法であって、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませた動物細胞に、配列番号１に記載の塩基配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、又は配列番号３に記載の塩基配列からなり又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ、の何れかの全長ｃＤＮＡを含有する組換えベクターを、配列番号１又は配列番号３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド、又は配列番号１に記載の塩基配列からなるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡをサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド、の何れかのカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入してリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞を作成する工程と、そのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程と、を含む殺虫成分のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程を含む、カイコのリアノジンレセプター反応物質のスクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月22日(2008.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、リアノジン受容体活性を有するカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなり、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列からなり、カイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号３に記載の塩基配列からなり、又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の全長ｃＤＮＡを含有する組替えベクター。
【請求項６】
動物細胞にカイコのリアノジン受容体活性を発現させ得る発現プラスミドであって、請求項５に記載の組替えベクターを配列番号１又は３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングし、又は請求項３に記載のｃＤＮＡをサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド。
【請求項７】
殺虫成分のスクリーニング方法であって、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませた動物細胞に請求項６に記載のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入する工程と、その動物細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程と、を含む殺虫成分のスクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月22日(2008.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、リアノジン受容体活性を有するカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなり、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列からなり、カイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号３に記載の塩基配列からなり、又は配列番号１に記載の塩基配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、請求項１に記載のリアノジンレセプタータンパク質のスプライシング変異体であるカイコのリアノジンレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の全長ｃＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
動物細胞にカイコのリアノジン受容体活性を発現させ得る発現プラスミドであって、請求項５に記載の組換えベクターを配列番号１又は３に記載の塩基配列を残存させてサブクローニングし、又は請求項３に記載のｃＤＮＡをサブクローニングしたカイコのリアノジンレセプター発現プラスミド。
【請求項７】
請求項３又は４に記載のｃＤＮＡを導入した細胞であって、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項８】
請求項６に記載のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入した細胞からなり、安定的にカイコのリアノジンレセプター遺伝子を発現する、カイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項９】
前記細胞は動物細胞である請求項７又は８に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１０】
前記動物細胞はヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞である請求項７又は８に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１１】
前記細胞には、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませている請求項７乃至１０の何れかに記載のリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞。
【請求項１２】
殺虫成分のスクリーニング方法であって、Ｃａ２＋感受性蛍光色素を取り込ませた動物細胞に請求項６に記載のカイコのリアノジンレセプター発現プラスミドを導入する工程と、その動物細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程と、を含む殺虫成分のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のカイコのリアノジンレセプター遺伝子定常発現細胞に被験試薬を作用させて蛍光応答を測定する工程を含む、カイコのリアノジンレセプター反応物質のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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