(57)【要約】  本発明は、フォワードプライマーとしての配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、およびリバースプライマーとしての配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの存在下、被験試料をＰＣＲに付す工程、並びに得られたＰＣＲ産物を解析する工程を含む、該試料中の細菌叢解析方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマーとしての配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、およびリバースプライマーとしての配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの存在下、被験試料をＰＣＲに付す工程、並びに得られたＰＣＲ産物を解析する工程を含む、該試料中の細菌叢解析方法。
【請求項２】
ＰＣＲ産物の解析が該産物のクローニングと塩基配列決定とを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
決定された塩基配列を、既知の細菌１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列のデータセットと比較し、最も高い相同性を示す細菌種を同定することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
フォワードプライマーとしての配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、およびリバースプライマーとしての配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの存在下、患者由来の被験試料をＰＣＲに付す工程、ＰＣＲ産物を解析して病原細菌を同定する工程を含む、該患者における感染症病態の検査方法。
【請求項５】
ＰＣＲ産物をクローニングして該産物の塩基配列を決定し、決定された塩基配列を既知の病原起因菌１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列のデータセットと比較し、相同性に基づいて病原細菌を同定することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡおよび配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡを含んでなる細菌叢解析用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の細菌叢解析方法およびその用途、例えばそれを使用した感染症病態の検査方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
感染症の病原起因菌を迅速に特定することは感染症の治療にとって極めて重要である。現在、感染症の病原起因菌を特定する方法としては主に培養法が使用されている。この培養法は、被験者由来の試料を、その中に含まれていると考えられる感染症の病原起因菌の培養に適する培地に接種し、各細菌の生育条件に合わせて培養し、生育した細菌の形状や性質（例：代謝産物の生産性等）などに基づいて各細菌を同定することからなっている。しかし、培養法には、病原菌の種類によっては検出に１週間以上もの時間がかかる場合がある、病原起因菌が検出できない場合がある等の問題点がある。例えば、食品衛生管理上必要欠くべからずの大腸菌群検査に使用されている各種検査法においては、いずれも選択培地での乳糖発酵性を１つの指標として大腸菌群を検出しているが、複数の試験を要する上に結果判定までに４〜５日を要している（特許文献１）。【０００３】
一方、このような表現型を指標とする同定法に代わって、DNA-DNA相同性や核酸プローブといった遺伝子型を用いた方法が利用されてきている（例えば、非特許文献１を参照）。この方法は、培養を必要とせず、難培養細菌を含めた全菌種に適用でき、その結果は外因性もしくは内因性の要因による影響を受けない等の利点を有する。【０００４】
特に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列の多様性に基づく方法が注目を集めている。ｒＲＮＡ遺伝子は真核生物や原核生物の全ての種に存在する。このうち細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は最もよく研究されており、膨大な数の配列がデータベース上に登録されている。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡともいう）には、全ての細菌で塩基配列がよく保存された領域と細菌間で多様性を示す領域とがあり、この塩基配列の違いによって各細菌を同定することができる。【０００５】
１６Ｓ ｒＤＮＡの多様性を用いて微生物群集中に存在する細菌を網羅的に検出するには、主としてＰＣＲが用いられる。即ち、全ての細菌でよく保存された塩基配列をプライマーとしてＰＣＲを行うことで、理論的には全ての細菌から増幅産物が得られる。得られた増幅産物を、ベクター中にクローニングしてそれらの塩基配列を決定するか、あるいは変性剤濃度もしくは温度勾配ゲル電気泳動を用いて分離することにより、微生物群集中に存在する細菌を同定することが可能である。ほとんど全ての細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅し得るユニバーサルプライマーとしては、これまで該遺伝子の両端に存在する保存性の高い領域の配列が利用されてきており、例えば、フォワードプライマーとしてＥ８Ｆ（大腸菌１６Ｓ ｒＤＮＡの８〜２７位に相当）、リバースプライマーとしてＵ１５１０Ｒ（同１５１０〜１４９２位）やＥ１５４１Ｒ（同１５４１〜１５２２位）等がよく知られている。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの両端以外の保存性の高い領域を利用したユニバーサルプライマーも報告されている（非特許文献２）。【０００６】
これらのユニバーサルプライマーに関して、既知配列との比較に基づく普遍性の評価はなされているが（非特許文献２）、実際の細菌叢解析におけるそれらの性能、即ち試料中に存在する種々の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡをくまなく増幅し得るか否かについては、未だ十分に解明されていない。
【特許文献１】特開平７−２１３２９７号公報
【非特許文献１】FEMS Microbiol. Rev., 15: 185-194 (1994)
【非特許文献２】J. Microbiol. Methods, 55: 541-555 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、試料中の全ての細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅することができ、且つ増幅産物が細菌を同定するのに十分な多様性を示す領域（可変領域）を含むプライマーセットを提供し、該プライマーセットを用いた細菌叢の解析方法、特に感染症の病原起因菌を特定する方法を提供することを目的としている。【０００８】
本発明の別の目的は、上記感染症の病原起因菌特定方法によって特定された病原起因菌の種類や状態などにより感染症の病態を診断する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをフォワードプライマーとし、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡをリバースプライマーとして用いることにより、意外にも、従来頻用されてきた、１６Ｓ ｒＤＮＡの両端の保存領域を用いたユニバーサルプライマーと比較して試料中の細菌叢をより正確に解析し得ること、それによって感染症の病原起因菌をより正確に特定することができることを見出した。【００１０】
したがって、本発明は、
（１）フォワードプライマーとしての配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、およびリバースプライマーとしての配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの存在下、被験試料をＰＣＲに付す工程、並びに得られたＰＣＲ産物を解析する工程を含む、該試料中の細菌叢解析方法；
（２）ＰＣＲ産物の解析が該産物のクローニングと塩基配列決定とを含むことを特徴とする、上記（１）記載の方法；
（３）決定された塩基配列を、既知の細菌１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列のデータセットと比較し、最も高い相同性を示す細菌種を同定することを特徴とする、上記（２）記載の方法；
（４）フォワードプライマーとしての配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、およびリバースプライマーとしての配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの存在下、患者由来の被験試料をＰＣＲに付す工程、ＰＣＲ産物を解析して病原細菌を同定する工程を含む、該患者における感染症病態の検査方法；
（５）ＰＣＲ産物をクローニングして該産物の塩基配列を決定し、決定された塩基配列を既知の病原起因菌１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列のデータセットと比較し、相同性に基づいて病原細菌を同定することを特徴とする、上記（４）記載の方法；および
（６）配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、および配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡを含んでなる細菌叢解析用試薬
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来の培養法などよりも迅速にかつ簡便に感染症の病原起因菌を特定することができることから、感染症の患者に対してより適切な治療を迅速に施すことができるという大きな効果がある。また、この発明に係るプライマーセットは、従来頻用されてきた、１６Ｓ ｒＤＮＡの両端の保存領域を用いたユニバーサルプライマーよりも、試料中の細菌叢をより正確に解析することができ、感染症の患者の病態をより適切にかつ迅速に診断することができるという大きな効果も有している。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Long universalプライマーセットおよびShort universalプライマーセットを用いた、モデル細菌叢（Ａ：Model flora 1；Ｂ：Model flora 2）の解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に使用することができる試料とは、１種以上の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡもしくはｒＲＮＡを含有するものであれば特に制限はない。例えば、本発明を感染症の病原起因菌の同定に用いる場合には、感染症の病原細菌類が存在する被験体、例えば、感染症を患っている、もしくは細菌への感染が疑われる人や他の動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜類、ニワトリ、アヒルなどの家禽類、イヌ、ネコなどのペット動物等）由来の生体試料（例えば、糞便、血液、尿、膣分泌物、唾液、痰など）や、感染症の病原細菌類によって汚染されていると考えられる水などの水性試料などが挙げられるが、それらに限定されない。【００１４】
本発明に係る細菌叢解析方法は、必要に応じて試料中に存在する細菌類のゲノムDNAもしくはRNAを抽出し、RNAの場合は逆転写反応によりcDNAに変換した後、ゲノムDNAもしくはcDNA鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物を自体公知の手法を用いて解析することから一般的には構成されている。【００１５】
本発明によれば、試料中に存在する細菌類のゲノムDNAやＲＮＡを抽出する方法としては、例えば、細菌類の細胞をフェノール性もしくはナトリウムトデシルサルフェイト（ＳＤＳ）などの抽出溶媒の存在下で溶菌する方法や、ＳＤＳ中での加熱後酵素処理して溶菌する方法などが使用できるが、それらに限定されず、自体公知のゲノムDNAもしくはRNA抽出法がそれぞれ使用され得る。あるいは、細菌含有試料を単に煮沸するだけでもよい場合もある。抽出されたゲノムDNAもしくはRNAは自体公知の方法により精製してもよいし、そのまま細胞溶解液としてPCRやRT-PCRに付してもよい。【００１６】
上記の抽出方法によって抽出されたゲノムDNAやRNA（さらに逆転写反応によりcDNAに変換）は、次いで、本発明のプライマーを用いたPCRに付される。【００１７】
本発明は、以下のいずれかの塩基配列から実質的になるプライマーのセットを用いることを特徴とする。
フォワードプライマー
CCTACGGGRSGCAGCAG（配列番号１）
GTGCCAGCMGCCGCGG（配列番号３）
ATTAGATACCCTGGTA（配列番号４）
リバースプライマー
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT（配列番号２）
TACCAGGGTATCTAAT（配列番号５）
ACGGGCGGTGWGTRCAA（配列番号６）
（但し、配列番号４と配列番号２または５との組み合わせ、配列番号３と配列番号５との組み合わせを除く。）
これらのプライマーセットを用いることにより、細菌群の種類や割合に関係なく、試料中に存在するあらゆる細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを効率よく増幅することができる。
上記各配列において、「R」はAもしくはG、「S」はGもしくはC、「M」はAもしくはC、「W」はAもしくはTを意味する。従って、配列番号１、２および６はそれぞれ４種、配列番号３は２種の異なる塩基配列を包括的に示しているが、本発明におけるフォワードおよびリバースプライマーは、それらのいずれか１種の配列を用いてもよいし、２種以上の混合プライマーとしてもよい。さらに、フォワードプライマーとして配列番号１、３および４のうちの２種以上、リバースプライマーとして配列番号２、５および６のうちの２種以上をそれぞれ混合プライマーとして用いることもできる。
本発明の好ましい態様においては、フォワードプライマーとして配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、リバースプライマーとして配列番号２に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡが使用される。該フォワードプライマーは、大腸菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（GenBank accession N0. AE000474を参照した）の３４１〜３５７位に相当する塩基配列からなる。一方、リバースプライマーは、大腸菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの９２６〜９０７位に相当する塩基配列（相補鎖配列）からなる。したがって、本発明の好ましい態様においては、ＰＣＲにより得られる増幅産物の長さは約５８０ｂｐである。
ここで「実質的になる」とは、例えば、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーの5’端に、ベクターへのクローニングを容易にする等の目的で制限酵素認識部位を付加するなど、プライマーとしての性能に何ら影響を与えない改変のみを有していてもよいことを意味する。
本発明の各プライマーは、公知のＤＮＡ/ＲＮＡ自動合成機を用いて合成することができる。【００１８】
ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。例えば、Takara EX TaqTM（宝酒造）を用いて、チューブあたり鋳型DNA0.1μg、添付の10x反応バッファー10μl、dNTP混合物各20nmol、各プライマー50pmol、Taq DNAポリメラーゼ2.5Uを滅菌蒸留水で全量100μlとし、例えば、変性：94℃、1分；アニーリング：65℃、1分；伸長：72℃、1.5分の反応を30サイクル行う、等が挙げられるが、これらに限定されない。【００１９】
PCR増幅によって得られたPCR産物は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製した後、好ましくは、適当なベクター中にクローニングされる。クローニング反応も、当該技術分野においては既知の方法である。増幅断片を挿入されたベクターで大腸菌を形質転換し、LB寒天などの固形培地上にプレートし、得られたコロニーから抽出したDNAを鋳型として、常法に従ってシークエンシング反応を行い、各クローンの塩基配列を決定する。【００２０】
決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベースおよび相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌１６Ｓ ｒＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高い相同性を示す既知配列を抽出することができる。例えば、日本DNAデータバンク（DDBJ）のホームページを通じて、BLAST（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）やFASTA（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）が利用できる。プログラムとしてblastnやfastaを選択し、決定された塩基配列をクエリーとし、検索対象データベースとして１６Ｓ ｒＲＮＡ（Prokaryotes）を選択して検索を実施すれば、高い相同性を示す既知配列が抽出・出力される。細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータセットを含む限りいかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる。また、上記以外の自体公知の相同性検索プログラムを用いることもできる。【００２１】
ホモロジー検索の結果、最も高い相同性を示す既知配列を有する細菌種を、該決定された塩基配列を含む試料中の細菌に最も近縁な種として同定することができる。但し、決定された塩基配列と最も高い相同性を示す既知配列とのオーバーラップする長さが増幅産物の配列のそれ（約５８０ｂｐ）に比して短すぎたり、相同性が低すぎたりする場合には、抽出された配列を含む細菌が必ずしも近縁であるとはいい難いので、分類不可と判定することができる。カットオフ値は適宜選択することが出来る。例えば、オーバーラップ長が４００ｂｐ以上かつ同一性が８０％以上でない場合は、該決定された塩基配列を含む試料中の細菌を分類不可とする等の基準が挙げられるが、それらに限定されない。【００２２】
一方、本発明の別の態様においては、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定することなく、菌種特異的な核酸プローブを利用して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法などの手法によって各ＰＣＲ産物の由来する細菌を同定することも可能である。菌種特異的な核酸プローブは、１６Ｓ ｒＤＮＡの可変領域の塩基配列を用いて設計することができる。さらに、ＰＣＲ産物をクローニングすることなく、例えば、ポリアクリルアミド変性ゲルなどを用いて、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）などの電気泳動法によって分離し、得られるバンドパターンから試料中の細菌叢を解析することもできる。適当な内部標準を用いれば、バンド強度を画像解析することによって、半定量的な解析も可能である。【００２３】
本発明の細菌叢解析方法では、従来法である培養法やその他の方法でも検出することが不可能であった感染症の病原起因菌を検出することができる。かかる病原起因菌としては、次のものが挙げられる。【００２４】
Ｐｈｙｌｕｍ（目）としては次のものが挙げられる。【００２５】
【表１】
2007081027.tif 000002
【００２６】
Ｃｌａｓｓ（綱）としては次のものが挙げられる。【００２７】
【表２】
2007081027.tif 000003
【００２８】
Ｏｒｄｅｒ（目）としては次のものが挙げられる。【００２９】
【表３】
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【００３０】
Ｆａｍｉｌｙ（科）としては次のものが挙げられる。【００３１】
【表４】
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【００３２】
Ｇｅｎｕｓ（属）としては次のものが挙げられる。【００３３】
【表５】
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【００３４】
【表６】
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【００３５】
【表７】
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【００３６】
上記に例示した属に属する種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）については、当該技術分野で常用されているいわゆるバージィーズ・マニュアル（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, second edition, Springer (www.springer-ny.com), 2001）を参照すれば明白であるので、該マニュアルの記載は本明細書の一部を構成するものとして理解されるべきである。【００３７】
本発明はまた、配列番号１、３または４に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡ、並びに配列番号２、５または６に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡを含んでなる、細菌叢解析用試薬を提供する（但し、配列番号４と配列番号２または５との組み合わせ、配列番号３と配列番号５との組み合わせを除く）。好ましくは、配列番号１と配列番号２との組み合わせである。上述の通り、当該ＤＮＡをそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いることにより、いかなる細菌の構成においても、試料中に存在するあらゆる細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅することができ、従来頻用されてきた、１６Ｓ ｒＤＮＡの両端の保存領域を用いたユニバーサルプライマーと比較して、より正確に試料中の細菌叢を解析することができる。これらのプライマーは別々にＴＥバッファーなどの適当な緩衝液中に溶解されていてもよいし、同一溶液中に混合して存在させることもできる。【００３８】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を一切限定するものではなく、本発明を例示的に説明するものにすぎないものと理解されるべきである。
【実施例１】
【００３９】
症例は、７３歳の男性で、気管支鏡下に気管支洗浄を行い、好中球優位の液を回収し、塗沫検査でグラム陰性の桿菌および双球菌を認めたが、培養検査では起因菌を検出することができなかった。
そこで、気管支洗浄液を用いて、下記のように１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析を行なった。【００４０】
（DNAの抽出）
臨床検体（肺胞洗浄液）500μlを1500rpmで遠心分離を行い、沈澱物にDNA抽出溶液（組成：0.25M EDTA、100mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM NaCl）0.9mlを加えた。100mg/mlリゾチーム溶液を40μl（終濃度4.0mg/ml）、30% SDS溶液を60μl（終濃度1.8%）加え、全量を1000μlになるように調製し、約１時間緩やかに振とうした。その後、12000rpm、3分の遠心分離を行ない、上清（約1ml）にフェノール25：クロロホルム24：イソアミルアルコール1の混合溶液（PCI）を0.6ml加え、よく攪拌し12000rpm、10分、20℃で遠心分離した。遠心後、上清0.8mlを新たなエッペンドルフチューブに入れた。残渣は同様にDNA抽出溶液、リゾチーム、SDS溶液を加え、更に2回抽出操作を行なった。合計3回分のPCI処理済上清（約2.4ml）を約60μlに濃縮し、粗DNA溶液とした。調製した粗DNA溶液をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。【００４１】
（16S rDNAの増幅）
上記の方法で抽出したDNAをテンプレートとして、（フォワード）5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'（大腸菌１６Ｓ ｒＤＮＡの341-357位に相当；配列番号１(R=A、S=G)）、（リバース）5'-CCGTCAATTCCTTT（A/G）AGTTT-3'（大腸菌１６Ｓ ｒＤＮＡの907-926位に相当；配列番号２(M=C)）のプライマーセットを用いてPCRを行った。
PCR反応液は、DNA溶液1μl、各プライマーを0.1μM、10×PCR緩衝液2.5μl、AmpliTaq-Gold DNAポリメラーゼ1.25U（PERKIN ELMER社）、dNTPs 0.2mMおよび滅菌蒸留水を加え、全量を25μlとした。サーマルサイクラー（ABI社、GeneAmp PCR System 9700）を用い、96℃、30秒間熱変性、55℃、30秒間アニーリング、72℃、60秒間伸長の各反応を30、35、40回繰り返した。PCR産物5μlを2%アガロースゲルで電気泳動し、約580bpの増幅産物の有無を確認した。PCR産物100μlは、精製後20μlに濃縮した。得られたPCR産物をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてクローニングを行った。形質転換した大腸菌は、100μl/mlアンピシリンを含むLB液体培地を80μl加えた96穴のマイクロプレートに接種し、18時間培養した。グリセリンの終濃度が25%になるように滅菌グリセリンを加え、-80℃で凍結保存した。【００４２】
（塩基配列の決定）
クローニングした形質転換大腸菌溶液1μlをテンプレートにし、M13プライマーセット（フォワード、リバース）を用いて上記と同様にPCR反応を行った。ExoSAP-IT（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて残存プライマーを除去した後、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、約700bpの増幅産物を確認した。
このPCR産物1.5μlをテンプレートとして、M13フォワードプライマー及びBigDye Terminator v3.l Cycle sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてシークエンス反応を行った。エタノール沈澱法で精製を行って、アナライザーで塩基配列を決定した。【００４３】
（16S rDNA塩基配列に基づく細菌叢解析）
決定した塩基配列についてPhredによる精度検定を行った。moving average window size10、シークエンスの5'末端のquality value（QV）が10、3'末端を25で設定し、高精度な波形領域が550bp以下のデータについては削除した。また、Phredによる波形クオリティーチェックをクリアしたデータは、PCR反応に用いたプライマーの配列でトリミングを行ない、ベクターとプライマーの配列を削除した。
精度検定及びトリミングをパスした塩基配列のみを用いて、細菌の基準株の１６Ｓ ｒＤＮＡ（4,386件）データベースに対する相同性検索（BLAST）を行った。
BLAST検索の条件は、オーバーラップ長（Overlap length）が400bp以上でかつマッチング率（matching %）が80％以上の相同性が得られた配列は既知の菌種との類似性を認め、反対にこの条件を満たさない配列（マッチング率が80％未満のデータ）については分類不可とした。
投入した塩基配列に対してBLAST検索で最も高い相同性を示した生物種の階層分類表（門、綱、目、科、属、種）を作成した。分析結果は表8（上段）に示す。
シークエンスした58クローン中、Leptotrichia（グラム陰性桿菌、嫌気性菌）が28クローン、Veillonella（グラム陰性球菌、嫌気性菌）が10クローン検出された。この細菌叢は塗沫検査における染色像と一致した。この結果から、該患者は常在性の嫌気性菌による混合感染と診断された。
培養検査では起炎菌が不明であったため多剤併用による治療を行っていたが、嫌気性菌による混合感染が明らかとなったので、クリンダマイシンを投与したところ病状が改善された。治療後の患者から採取した口腔洗浄液を試料として、同様の実験を行った結果を表8（下段）に示す。治療後の試料からはLeptotrichiaは検出されなかった。【００４４】
【表８】
2007081027.tif 000009
【実施例２】
【００４５】
膣粘液を用いて、実施例１と同様に、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析を行なった。ただし、DNAの抽出は下記の通りにおこなった。
滅菌綿棒で採取した膣粘液をDNA抽出溶液（組成：0.25M EDTA、100mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM NaCl）2.0mlにボルテックスミキサーを用いて懸濁した。懸濁液900μlに100mg/mlリゾチーム溶液を40μl（終濃度4.0mg/ml）、30% SDS溶液を60μl（終濃度1.8%）加え、全量を1000μlに調整し、約1時間緩やかに振とうさせた。その後、12000rpm、3分間の遠心分離を行ない、上清（約1ml）にフェノール25：クロロホルム24：イソアミルアルコール1の混合溶液（PCI）を0.6ml加え、よく攪拌した後、12000rpm、10分、20℃で遠心分離した。遠心後、上清0.8mlを新たなエッペンドルフチューブに入れた。残渣は、同様にDNA抽出溶液、リゾチーム、SDS溶液を加え、更に2回抽出操作を行った。合計3回分のPCI処理済上清（約2.4ml）を約60μlに濃縮し、粗DNA溶液とした。調製した粗DNA溶液をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
投入した塩基配列に対してBLAST検索で最も高い相同性を示した生物種の階層分類表（門、綱、目、科、属、種）を作成した。分析結果は表9（上段：健康女性膣分泌物；下段：膣炎分泌物）に示す。
健常者の膣内にはLactobacillus（デーデルラインの膣桿菌)が優勢を占め、膣内を酸性に保っていることが知られているが、本解析結果から、確かにLactobacillusが優占していることを示している。一方、膣炎と診断された患者由来の試料からは、培養法では検出困難な膣炎の起炎菌であるAtopobiumが検出され、本方法の有効性が確認された。【００４６】
【表９】
2007081027.tif 000010
【実施例３】
【００４７】
病死したウサギの臨床検体（ウサギ肝膿瘍）を用いて、実施例１と同様に、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析を行なった。ただし、DNAの抽出は下記の通りにおこなった。
ウサギ肝膿瘍部をメスで切除し、擦りガラスを用いて摩砕した。摩砕した試料0.3gにDNA抽出溶液（組成：0.25M EDTA、100mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM NaCl）0.9mlを加えた。100mg/mlリゾチーム溶液を40μl（終濃度4.0mg/ml）、30% SDS溶液を60μl（終濃度1.8%）加え、全量を1000μlに調整し、約1時間ローテーター（回転振盪機）で緩やかに振とうさせた。その後、12000rpm、3分間遠心分離を行ない、上清（約1ml）にフェノール25：クロロホルム24：イソアミルアルコール1の混合溶液（PCI）を0.6ml加え、よく攪拌し、12000rpm、10分間、20℃で遠心分離した。遠心後、上清0.8mlを新たなエッペンドルフチューブに入れた。残渣は、同様にDNA抽出溶液、リゾチーム、SDS溶液を加え、更に2回抽出操作を行った。合計3回分のPCI処理済上清（約2.4ml）を約60μlに濃縮し、粗DNA溶液とした。調製した粗DNA溶液をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。
投入した塩基配列に対してBLAST検索で最も高い相同性を示した生物種の階層分類表（門、綱、目、科、属、種）を作成した。分析結果は表10（上段：野ウサギメス；下段：野ウサギオス）に示す。【００４８】
【表１０】
2007081027.tif 000011
【００４９】
以上の結果から、ウサギの肝膿瘍はCoprobacillus属、Bacteroides属、Clostridium属等の嫌気性細菌の混合感染により形成されたことが明らかとなった。
【実施例４】
【００５０】
モデル細菌叢を用いた精度検証実験
本実施例では、モデル細菌叢を作成し、使用するプライマー、ＰＣＲ増幅領域の長さ等の違いが解析結果に及ぼす影響について検証を行った。
（実験方法）
5菌種の割合を変えた混合液（E.coli, Ps.aeruginosa, S.aureus, B.subtilis, S.agalactiae, M.smegmatis）をモデル細菌叢として作製した（表11）。【００５１】
【表１１】
2007081027.tif 000012
【００５２】
（DNAの抽出）
5菌種混合液1000μlを15000rpmで遠心分離を行い、沈澱物にDNA 抽出溶液（組成：0.25M EDTA、100mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM NaCl）0.9mlを加えた。30％ SDS溶液を100μlおよびガラスビーズを加え、20分間振とうした。その後15000rpm、3分の遠心分離を行ない、上清（約1ml）にフェノール25：クロロホルム24：イソアミルアルコール1の混合溶液（PCI）を0.6ml加え、よく攪拌し12000rpm、10分、20℃で遠心分離した。遠心後、上清0.8mlを新たなエッペンドルフチューブに入れた。残渣は同様にDNA抽出溶液、SDS溶液を加え更に2回抽出操作を行なった。合計3回分のPCI処理済上清（約2.4ml）をCentricon YM-100（Amicon社）で約60μlに濃縮し、粗DNA溶液とした。調製した粗DNA溶液をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。【００５３】
（16S rDNAの増幅）
PCR反応液は、DNA溶液1μl、各プライマー（表12）を0.1μM、10×PCR緩衝液2.5μl、AmpliTaq-Gold  DNAポリメラーゼ1.25U(PERKIN ELMER社）、dNTPｓ0.2mMおよび滅菌蒸留水を加え全量を25μlとした。サーマルサイクラー（ABI社、GeneAmp PCR System 9700）を用い、Long universal setの場合96℃、40秒間熱変性、55℃、60秒間アニーリング、72℃、120秒間伸長、Short universal setの場合は96℃、30秒間熱変性、53℃、30秒間アニーリング、72℃、60秒間伸長の各反応をそれぞれ30回繰り返した。PCR産物5μlを2%アガロースゲルで電気泳動し、増幅産物の有無を確認した。PCR産物100μlを、Montage PCR精製ユニット（MILLIPORE社）を用いて精製し、20μlに濃縮した。得られたPCR産物をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてクローニングを行った。【００５４】
【表１２】
2007081027.tif 000013
【００５５】
（塩基配列の決定）
クローニングした形質転換大腸菌をテンプレートにし、M13プライマーセット（フォワード、リバース）を用いて上記と同様にPCR反応を行った。ExoSAP-IT（アマシャムバイオサイエンス社)を用いて残存プライマーを除去した後、2％アガロースゲルで電気泳動を行い増幅産物を確認した。
このPCR産物1.5μlをテンプレートとして、BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてシークエンス反応を行った。プライマーとして表13記載のものを用いた。エタノール沈澱法で精製を行い、Applied Biosystems 3130xl ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社）で塩基配列を決定した。【００５６】
【表１３】
2007081027.tif 000014
【００５７】
（16S rDNA塩基配列に基づく細菌叢解析）
決定した塩基配列についてPhredによる精度検定を行った(moving average window size10、シークエンスの5'末端のquality value（QV）が10、3'末端を25で設定した)。Phredによる波形クオリティーチェックをクリアしたデータは、PCR反応に用いたプライマーの配列でトリミングを行ない、ベクターとプライマーの配列を削除した。
データベースに対する相同性検索（BLAST）を行った。【００５８】
（実験結果）
割合を変えた2種類（Model flora 1, Model flora 2）のモデル細菌叢を調製した（表14）。それぞれについてShort universal, Long universalプライマーセットを用いて細菌叢解析を行った結果を以下に示す（表15）。【００５９】
【表１４】
2007081027.tif 000015
【００６０】
【表１５】
2007081027.tif 000016
【００６１】
細菌叢解析によく用いられるE27F, E1492Rのプライマーセット（Long universal）と増幅長が短い（約580bp）E341F, E901Rのプライマーセット（Short universal）を用いて実験を行ったところ、Model flora 1ではShort universalのプライマーセットで全ての菌種を検出することが可能であった。また、Model flora 2ではM. smegmatis以外の菌種は2回とも検出された。一方、Long universalプライマーセットを用いた場合、Model flora 1ではP. aeruginosaが検出されず、Model flora 2では2回の実験両方で検出された菌種は3種（E. coli, S. aureus, B. subtilis）のみであった。これらの結果から、Short universalのプライマーセットの方が偏り無く菌種を検出できることが明らかとなった。
各菌種の検出頻度を比較すると、Model flora 1、Model flora 2のどちらの細菌叢においてもShort universalのプライマーセットの方がより正確に細菌叢を反映した結果をもたらすことが明らかになった（図１）。今回のモデル細菌叢にはあえて16S rDNAのコピー数が大きく異なる菌種を用いたが、菌数と16S rDNAのコピー数の両方が検出頻度に影響することも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
上記したように、本発明の細菌叢解析方法は、約２ないし３日という短期間で生物試料中の細菌の定性ならびに定量を直接することが可能であり、通常では検出しにくい菌種の同定もできるようになった。従って、該方法は、迅速かつ正確な、感染症の病原起因菌の特定（特に、難培養性細菌の同定）並びにその病態の診断にきわめて有用である。【００６３】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願2006-008044を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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