(57)【要約】  本発明の目的は、ろ過滅菌及び人への静脈内投与が可能であって、かつ核酸含有複合体製剤に含有されているポリヌクレオチドの安定性が保持される、核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することにある。  本発明は、二本鎖を形成し得る２つのポリヌクレオチド（例えば、ポリＩとポリＣ）を同一溶液中に一本鎖の状態で含有する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖を形成し得る２つのポリヌクレオチドを同一溶液中に一本鎖の状態で含有する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、ポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジン酸）、ポリシチジル酸・ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（１−ビニルシチジル酸）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、デコイ、アプタマー又はＲＮＡ干渉を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項１に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸又はＲＮＡ干渉を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項１に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項６】
カチオン性担体が、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性担体である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項７】
リン脂質が、レシチンである、請求項６に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）やポリＩ：Ｃ等のポリヌクレオチドの医薬への応用が検討されている（例えば、特許文献１〜３を参照）。しかしながら、ポリヌクレオチドは、細胞内への取り込みが極めて低いため、その生理活性を細胞内で効率的に発揮させる必要がある。その方法として、ポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体を形成させ、投与する方法が知られている。【０００３】
ポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体を調製する方法としては、二本鎖を形成しているポリヌクレオチドとカチオン性担体とを混合する方法が一般的である。しかしながら、かかる方法により調製されたポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体は、その粒子径が数μｍ〜数百μｍと一般に非常に大きい。そのため、かかる複合体を含有する核酸含有複合体製剤は、ろ過滅菌をすることができず、また、人に静脈内投与した場合に、毛細血管に塞栓等を生ずるおそれがある等の問題点を有している。【０００４】
上記問題点を解決する方法として、２つのポリヌクレオチドを、それぞれ別々に一本鎖の状態でカチオン性担体と混合し、分散処理することを特徴とする製造方法が公開されている（例えば、特許文献４を参照）。【０００５】
ところで、主薬となるポリヌクレオチドは核酸分解酵素や温度による分解を受けやすく、より安定である方が好ましいことは言うまでもない。【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／２０２８３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／４８５３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／１０６５１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９９／６１０３２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ろ過滅菌及び人への静脈内投与が可能であって、かつポリヌクレオチドの安定性を保持しうる、核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、相補的な２つのポリヌクレオチドとカチオン性担体とを用いて核酸含有複合体製剤を製造する際に、２つの一本鎖ポリヌクレオチドを同一溶液中に溶解させた後に、かかる溶液とカチオン性担体とを混合し、分散処理することにより、上記目的を達成しうることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
本発明としては、例えば、下記（１）、（２）を挙げることができる。
（１）二本鎖を形成し得る２つのポリヌクレオチドを同一溶液中に一本鎖の状態で含有する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
（２）上記（１）の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係る「ポリヌクレオチド」には、ポリデオキシリボヌクレオチド及びポリリボヌクレオチドが含まれる。また、ポリデオキシリボヌクレオチドにはオリゴデオキシリボヌクレオチドが、ポリリボヌクレオチドにはオリゴリボヌクレオチドが、それぞれ含まれる。【００１１】
ポリデオキシリボヌクレオチドは、その一部がリボヌクレオチドに置換されていてもよい。ポリリボヌクレオチドは、その一部がデオキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。【００１２】
ポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリイノシン酸（以下、「ポリＩ」という）、ポリシチジル酸（以下、「ポリＣ」という）、ポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジン酸）、ポリシチジル酸・ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（１−ビニルシチジル酸）やアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、デコイ、アプタマー、ＲＮＡ干渉［ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（以下、「ＲＮＡｉ」という）］を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖、アンチセンス鎖を挙げることができる。また、ＲＮＡｉを発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を挙げることができる。なお、「ＲＮＡｉ」とは、当業者にとって自明であるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、導入した二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖と相補的な配列をもつｍＲＮＡが特異的に分解され、その結果、かかるｍＲＮＡのコードする遺伝子産物の合成が抑制される現象である。【００１３】
ポリヌクレオチドの塩基数は、特に制限されず、例えば、５０００以下が適当であり、２０００以下が好ましい。かかる塩基数は、ポリヌクレオチドの性質により適宜選択することができる。なお、本発明において、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドとは、構成する塩基数が２〜９９の範囲内のものを意味する。ここでいう「塩基数」とは、例えば、いわゆるサイズ排除クロマトグラフィーにより、分子量標準品のクロマトグラムのピークと試料のクロマトグラムのピークとから算出される塩基数をいう。即ち、当該クロマトグラムの最大頻度から算出される塩基数を意味する。【００１４】
本発明に係る「ポリヌクレオチド」が、ポリIやポリＣである場合には、その塩基数は、３０〜２０００の範囲内が適当であり、６０〜１０００の範囲内が好ましく、１００〜５００の範囲内がより好ましい。【００１５】
本発明に係る「ポリヌクレオチド」が、ＲＮＡｉを発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖やアンチセンス鎖である場合には、その塩基数は、１０〜５０の範囲内が適当であり、１２〜４０の範囲内が好ましく、１５〜３０の範囲内がより好ましい。【００１６】
ポリヌクレオチドは、その全部又は一部が化学修飾されたものでもよい。かかる化学修飾されたポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリ（７−デアザイノシン酸）、ポリ（２’−アジドイノシン酸）等の部分的に化学修飾されたポリＩやポリ（５−ブロモシチジル酸）、ポリ（２−チオシチジル酸）、ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）等の部分的に化学修飾されたポリＣを挙げることができる。また、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖成分又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。【００１７】
ポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法により製造することができる。例えば、ホスホアミダイト法又はトリエステル法による固相合成法又は液相合成法により、核酸自動合成機又は手動にて製造することができる。また、二本鎖を形成しているポリヌクレオチドに、６０℃以上の加熱を行う非酵素処理又はヘリカーゼ等を用いた酵素処理により、二本鎖を解離させ、製造することもできる。【００１８】
本発明に係る「２つのポリヌクレオチド」としては、二本鎖を形成し得るものであれば特に制限されず、例えば、ポリデオキシヌクレオチドとポリリボヌクレオチドとの組み合わせであってもよい。また、２つのポリヌクレオチドの塩基数は、必ずしも、同数である必要はない。【００１９】
「二本鎖を形成し得る」とは、生理的条件下で、２つのポリヌクレオチドを混合した場合に、二本鎖を形成し得る程度に相補的な配列を有することを意味する。ここで、上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のｐＨ、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、室温下、ｐＨが５〜８の範囲内であって、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの条件下を挙げることができる。【００２０】
本発明に係る「カチオン性担体」としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下、「化合物Ａ」という）とリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性担体（以下、「担体Ａ」という）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドとリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性担体、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）又はＴｒａｎｓＩＴ  ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）を挙げることができる。それらの中で、特に担体Ａが好ましい。【００２１】
本発明に係る「カチオン性担体」の製造方法を、担体Ａを例として掲げ、以下に説明する。【００２２】
担体Ａを構成する化合物Ａは、国際公開第９４／１９３１４号パンフレットに開示されている方法により合成することができる。【００２３】
担体Ａを構成するリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されず、例えば、卵黄ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン又は卵黄レシチンや大豆レシチン等のレシチンを挙げることができる。それらの中で、特にレシチンが好ましい。【００２４】
担体Ａは、例えば、化合物Ａとリン脂質とを混合し、常法により、溶液中で分散処理することにより調製することができる。分散処理には、乳化分散機等を適宜用いることができる。かかる乳化分散機としては、医薬用途で用いられるものであれば特に制限されず、例えば、ＳＯＮＩＦＩＥＲ（登録商標）（ＢＲＡＮＳＯＮ社製。以下同じ。）等の超音波分散機やマイクロフルイダイザー（登録商標）（マイクロフルイディックス社製。以下同じ。）、ナノマイザー（登録商標）（吉田機械興業社製。以下同じ。）、ＤｅＢＥＥ２０００（登録商標）（ＢＥＥ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製。以下同じ。）、アルティマイザー（登録商標）（スギノマシン社製。以下同じ。）、Ｎａｎｏ２０００（登録商標）（日本ビーイーイー社製。以下同じ。）等の高圧乳化分散機を挙げることができる。【００２５】
化合物Ａとリン脂質を分散させる溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。【００２６】
分散させる際の処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択することができる。【００２７】
担体Ａを調製する際に用いる、化合物Ａとリン脂質との混合比率（リン脂質の重量／化合物Ａの重量）は、用いるリン脂質の種類や核酸含有複合体製剤を製造する際に担体Ａと混合する２つのポリヌクレオチドの性質等により異なるが、０．１〜１０の範囲内が適当であり、０．５〜５の範囲内が好ましく、１〜２の範囲内がより好ましい。【００２８】
本発明に係る核酸含有複合体製剤（以下、「本発明製剤」という）は、２つのポリヌクレオチドを同一溶液中に溶解させた後に、かかる溶液とカチオン性担体が分散している溶液又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、常法により、分散処理することにより製造することができる。分散処理には、乳化分散機等を適宜用いることができる。かかる乳化分散機としては、医薬用途で用いられるものであれば特に制限されず、例えば、ＳＯＮＩＦＩＥＲ（登録商標）等の超音波分散機やマイクロフルイダイザー（登録商標）、ナノマイザー（登録商標）、ＤｅＢＥＥ２０００（登録商標）、アルティマイザー（登録商標）、Ｎａｎｏ２０００（登録商標）等の高圧乳化分散機を挙げることができる。【００２９】
ポリヌクレオチドを溶解させる溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。【００３０】
分散させる際の処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択することができる。【００３１】
本発明製剤を製造する際に用いる、ポリヌクレオチドとカチオン性担体との混合比率（ポリヌクレオチドの総重量／カチオン性担体の重量）は、用いるポリヌクレオチドやカチオン性担体の性質等により異なるが、０．０００５〜１の範囲内が適当であり、０．００１〜０．４の範囲内が好ましい。また、カチオン性担体が担体Ａである場合には、０．０００５〜１の範囲内が適当であり、０．００１〜０．４の範囲内が好ましく、０．０１〜０．２の範囲内がより好ましい。【００３２】
本発明製剤には、２つのポリヌクレオチドとカチオン性担体以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤としては、例えば、乳化補助剤（例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸又はドコサヘキサエン酸等の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明製剤中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。【００３３】
上記添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。【００３４】
本発明製剤は、分散処理後、必要に応じて、０．２μｍのメンブランフィルターを用いて、ろ過滅菌を行うことができる。【００３５】
本発明製剤は、凍結乾燥製剤とすることができる。かかる凍結乾燥製剤は、常法により、液状の本発明製剤を凍結乾燥することにより調製することができる。例えば、液状の本発明製剤を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して、凍結乾燥することができる。そして、一般的には、バイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して、本発明製剤の凍結乾燥製剤を得ることができる。【００３６】
本発明製剤の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し、使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜５倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。【００３７】
本発明製剤の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、直腸内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜投与が好ましい。また、投与形態に応じて、適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤として投与することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例、比較例、試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
実施例１〜７及び比較例１で行われた分散処理後の０．２μｍのメンブランフィルターによるろ過滅菌において、いずれもフィルターの目詰まりもなくろ過滅菌を行うことができ、またろ液中の回収率も、いずれも９８〜１０２％の範囲内であり、ほぼ１００％のろ過滅菌が可能であった。【００３９】
実施例1
３ｇの化合物Ａ、５ｇの精製卵黄レシチン（キューピー社製。以下同じ。）及び５０ｇのマルトース（林原社製。以下同じ。）に２１５ｍＬの注射用水（大塚製薬社製。以下同じ。）を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機［マイクロフルイダイザー（登録商標）。以下同じ。］を用いて、処理圧１０８ＭＰａで３０分間分散処理し、８ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約１７０である、２５０ｍｇのポリＩと、塩基数が約１８０である、２５０ｍｇのポリＣとを２００ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液２００ｍＬをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで２時間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を２ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に１．８ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置［Ｎｉｃｏｍｐ３７０（登録商標）：Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製。以下同じ。］によって測定したところ、１５２ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４０】
実施例２
１．５ｇの化合物Ａ、２．５ｇの精製卵黄レシチン及び５０ｇのマルトースに２２１ｍＬの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで３０分間分散処理し、４ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約４００である、１２５ｍｇのポリＩと、塩基数が約３８０である、１２５ｍｇのポリＣとを２００ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液２００ｍＬをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで２時間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に５ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置粒子径測定装置によって測定したところ、１４６ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４１】
実施例３
３ｇの化合物Ａ、５ｇのパルミトイル−オレイル−ホスファチジルコリン（日本油脂社製。）及び５０ｇのマルトースに２１５ｍＬの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで３０分間分散処理し、８ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約３１０である、２５０ｍｇのポリＩと、塩基数が約３３０である、２５０ｍｇのポリＣとを２００ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液２００ｍＬをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで２時間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を２ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に１．８ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４２ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４２】
実施例４
０．１２ｇの化合物Ａ、０．２ｇの精製卵黄レシチン及び２ｇのマルトースに注射用水を加えて１０ｍＬにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理し、０．３２ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約３１０である、１０ｍｇのポリＩと、塩基数が約３３０である、１０ｍｇのポリＣとを５０ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液５ｍＬをカチオン性担体の分散液５ｍＬに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機［ＳＯＮＩＦＩＥＲ（登録商標）。以下同じ。］を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．８７ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４５ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４３】
実施例５
０．１２ｇの化合物Ａ、０．２ｇの精製卵黄レシチン及び２ｇのマルトースに注射用水を加えて１０ｍＬにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理し、０．３２ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約３１０である、３０ｍｇのポリＩと、塩基数が約３３０である、３０ｍｇのポリＣとを１０ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液５ｍＬをカチオン性担体の分散液５ｍＬに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．８７ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１６３ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４４】
実施例６
０．１６ｇのＮ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（東京化成工業社製。）、０．１６ｇのジオレイルホスファチジルエタノールアミン（日本油脂社製。）及び２ｇのマルトースに注射用水を加えて１０ｍＬにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理し、０．３２ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約３１０である、１０ｍｇのポリＩと、塩基数が約３３０である、１０ｍｇのポリＣとを１０ｍＬの注射用水に加え、溶解させた。この溶液５ｍＬをカチオン性担体の分散液５ｍＬに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機を用いて、出力１００Ｗで１５分間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．８７ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１５１ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４５】
実施例７
０．６ｇの化合物Ａ、１ｇの精製卵黄レシチン及び１０ｇのマルトースに注射用水を加えて５０ｍＬにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて処理圧１３５ＭＰａで９０分間分散処理し、１．６ｇのカチオン性担体の分散液を得た。次に、５ｇのマルトースに注射用水を加え２５ｍＬにした溶液に、塩基数が共に２１である、互いに相補的な配列を有する２つのオリゴリボヌクレオチドを、それぞれ２５ｍｇ溶解させた。この溶液２５ｍＬをカチオン性担体の分散液２５ｍＬに、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧１３５ＭＰａで４０分間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．８７ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４７ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４６】
比較例１
３ｇの化合物Ａ、５ｇの精製卵黄レシチン及び５０ｇのマルトースに２１５ｍＬの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで３０分間分散処理し、８ｇのカチオン性担体の分散液を得た。この分散液全量に塩基数が約１８０である、２５０ｍｇのポリＩを含む１００ｍＬの水溶液と塩基数が約２００である、２５０ｍｇのポリＣを含む１００ｍＬの水溶液を同時に攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧１０８ＭＰａで２時間分散処理した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、比較製剤を得た。
その後、この比較製剤を２ｍＬづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に１．８ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の比較製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４９ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。【００４７】
試験例１
実施例１で得られた本発明製剤と比較例１で得られた比較製剤に含有されているポリＩとポリＣの温度に対する安定性を、ポリＩとポリＣのそれぞれの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で、２週間保存した後、ジエチルエーテル（ナカライテスク社製。以下同じ。）を用いて脱脂を行った。その後、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬカラム（東ソー社製。以下同じ。）を用い、サイズ排除クロマトグラフィーの一種であるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、２５０ｎｍと２６０ｎｍの吸光度を測定し、ポリＩとポリＣのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表１に示す。
表１から明らかな通り、比較例１で得られた比較製剤中のポリＩ及びポリＣは、保存中に、その塩基数は減少したのに対して、実施例１で得られた本発明製剤中のポリＩ及びポリＣは、保存前後で、その塩基数は変動せず、比較製剤より温度に対して安定であった。【００４８】
【表１】
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【００４９】
試験例２
実施例２及び実施例３で得られた本発明製剤に含有されているポリＩとポリＣの温度に対する安定性を、ポリＩとポリＣのそれぞれの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で、６ヶ月保存した後、ジエチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムを用い、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、２５０ｎｍと２６０ｎｍの吸光度を測定し、ポリＩとポリＣのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表２に示す。
表２から明らかな通り、実施例２及び実施例３で得られた本発明製剤中のポリＩ及びポリＣは、保存前後で、その塩基数は変動せず、共に温度に対して安定であった。【００５０】
【表２】
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【００５１】
試験例３
実施例７で得られた本発明製剤に含有されているオリゴリボヌクレオチドの温度に対する安定性を、オリゴリボヌクレオチドの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で、６ヶ月保存した後、ジエチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００カラム（ＤＩＯＮＥＸ社製。）を用い、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、オリゴリボヌクレオチドの塩基数を算出した。
その結果を表３に示す。
表３から明らかな通り、実施例７で得られた本発明製剤中のオリゴリボヌクレオチドは、保存前後で、その塩基数は変動せず、温度に対して安定であった。【００５２】
【表３】
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【００５３】
試験例４
実施例２で得られた本発明製剤を、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で、６ヶ月保存した後の薬理活性の変動を、ヒト扁平上皮がん由来の細胞株であるＡ４３１細胞に対する増殖抑制作用から評価した。
１）実験方法
細胞濃度を１０５個／ｍＬに調整したＡ４３１細胞の細胞浮遊液を、９６穴ウエルプレートに９０μＬずつ分注した後、４〜６時間静置し、Ａ４３１細胞をプレート底面に接着させた。その後、種々の濃度の本発明製剤を添加し、その３日後に、ＭＴＴ法により呈色反応を行った後に、マイクロプレートリーダーを用いて、各ウエルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、本発明製剤の代わりに、生理食塩水を添加し、同様に培養した細胞を陰性対照細胞とした。
２）評価方法
評価は、次式より算出した細胞増殖阻害率（％）に基づき、ＩＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）を算出することにより行った。なお、ＩＣ５０は、ポリＩとポリＣとを合わせた濃度である。
細胞増殖阻害率（％）＝（１−［薬剤処理細胞の吸光度／陰性対照細胞の吸光度］）×１００
３）試験結果
その結果を表４に示す。
表４から明らかな通り、実施例２で得られた本発明製剤は、保存前後で、そのＩＣ５０に変動はなく、薬理活性は保持されていた。【００５４】
【表４】
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【００５５】
試験例５
核酸含有複合体製剤中の２つのポリヌクレオチドの存在形態を、蛍光共鳴エネルギー移動［Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（以下、「ＦＲＥＴ」という）］法を用い、２つのポリヌクレオチド間の距離を測定することにより評価した。
ＦＲＥＴ法とは、当業者に既知の方法であり、具体的には、光吸収により発生する励起エネルギー供与体蛍光分子と励起エネルギー受容体蛍光分子の相対的位置関係を蛍光のシグナルとして測定する方法である。
１）試験用試料の調製
i）蛍光標識したポリＩ及びポリＣの調製
当業者に既知の方法により、塩基数が約１７０であるポリＩにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製。）を導入し、蛍光標識したポリＩ（以下、「蛍光化ポリＩ」という）を調製した。同様に、塩基数が約１８０であるポリＣにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製。）を導入し、蛍光標識したポリＣ（以下、「蛍光化ポリＣ」という）を調製した。
ii）本発明製剤及びその比較対照用試料の調製
上記ｉ）で得られた蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを用いて、実施例１と同様の条件下で、蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを共に含有する本発明製剤と、蛍光化ポリＣのみを含有する本発明製剤の比較対照試料を調製した。
iii）比較製剤及びその比較対照用試料の調製
上記ｉ）で得られた蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを用いて、比較例１と同様の条件下で、蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを共に含有する比較製剤と、蛍光化ポリＣのみを含有する比較製剤の比較対照試料を調製した。
iv）陽性対照試料及びその比較対照用試料の調製
上記ｉ）で得られた蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを用いて、同一の生理食塩水中に、蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを共に溶解させた陽性対照試料と、蛍光化ポリＣのみを溶解させた陽性対照試料の比較対照試料を調製した。
２）評価方法
評価は、上記１）で調製した本発明製剤、比較製剤、陽性対照試料及びそれぞれの比較対照試料の蛍光強度を測定し、その値よりＦＲＥＴ効率を算出することにより行った。なお、ＦＲＥＴ効率とは、蛍光化ポリＩと蛍光化ポリＣとを共に含有する試験用試料の蛍光強度を、蛍光化ポリＣのみを含有する当該試験用試料の比較対照試料の蛍光強度で除した値を、１より引いた値である。
ＦＲＥＴ効率が高くなるほど、試験試料中のポリＩとポリＣの間の距離は近いと判断される。
３）試験結果
試験結果を表５に示す。
表５から明らかな通り、本発明製剤中のポリＩとポリＣの間の距離は、比較製剤中のポリＩとポリＣの間の距離よりも短く、陽性対照試料中のポリＩとポリＣの間の距離と同等であった。即ち、本発明製剤中のポリＩとポリＣは、二本鎖を形成しているポリＩとポリＣの距離と同等であることが示された。【００５６】
【表５】
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【国際調査報告】
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