(57)【要約】  Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、結合組織増殖因子（以下ＣＴＧＦとも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−１９５〜−１５０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、結合組織増殖因子（以下ＣＴＧＦとも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−１９５〜−１５０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１６４〜−１５０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１６０〜−１５５（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１９５〜−１７４（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１９０〜−１８４（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している請求項１〜６のいずれか一項記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである請求項７記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2007034784.tif 000006
【請求項１０】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2007034784.tif 000007
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結合組織増殖因子（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）遺伝子発現抑制剤及びＣＴＧＦ関連疾患の治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧性血管疾患のような細胞増殖性疾患、血管形成術後の新生内膜形成及びアテローム性動脈硬化症には、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−βが関連していることが知られている。これらの病態における細胞増殖は種々の作用機構によって抑制できると考えられるが、そのうちの１つが、ＴＧＦ−βの発現を抑制することである。ＴＧＦ−βはほとんどの細胞に対して増殖抑制に働くが、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）などの間葉系細胞に対しては二相性増殖作用をもつため、通常状態では増殖抑制に働くが、炎症、機械的ストレスなどが加わると増殖刺激に働く。これらのことから、ＴＧＦ−βはＶＳＭＣ増殖と細胞外マトリクス形成を促進することにより血管傷害後の新生内膜形成に関与していると考えられる。ＴＧＦ−βはまた、動脈硬化症の病巣の形成にも関与している。また、ＴＧＦ−βは経皮的腎動脈形成術後の腎動脈の再狭窄にも関与していると考えられている。従って、ＴＧＦ−βの効果を調節することに向けられた局所血管療法が上記の血管増殖性疾患の軽減に有効と考えられる。【０００３】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイム、ｓｉＲＮＡなどによりＲＮＡレベルで実施できることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。【０００４】
本発明者らは、ＴＧＦ−β１遺伝子のＦＳＥ２タンパク結合領域に結合してその遺伝子の発現を抑制するピロールイミダゾールポリアミドを開発し、２００３年に特許出願をしている（特許文献１）。本発明者らはまた、その後の研究により、線維増殖性疾患、血管増殖性疾患など様々な病態でのＴＧＦ−β１遺伝子の過剰発現に関連していることが知られているＡＰ−１タンパク結合領域をターゲットとしてその領域に結合し、ＡＰ−１タンパクの該当領域への結合を抑制することにより、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制するピロールイミダゾールポリアミドを開発し、２００４年に特許出願をしている（特許文献２）。【０００５】
腎線維化は糸球体の硬化と間質の線維化とを指すものであり、慢性腎不全の病態の一つである。この線維化は、ＴＧＦ−β１などの増殖因子が直接的に又はＣＴＧＦの産生を介して間接的に腎線維芽細胞に作用して、細胞外基質の産生と線維化を引き起こしていると考えられている。ＣＴＧＦはＣＣＮファミリーに属する分子量３８ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、線維化、細胞の増殖、細胞外基質の代謝、血管形成、動脈硬化等に関与しており、線維芽細胞に対する作用としては、従来線維化において最も重要な増殖因子であると考えられていたＴＧＦ−β１による繊維増殖カスケードの下流に位置している（非特許文献１）。様々な線維増殖性疾患でＣＴＧＦの発現の増加が確認され、線維芽細胞においてＣＴＧＦはＴＧＦ−βにより選択的に誘導される。ＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター領域にはＴＧＦ−β応答配列と呼ばれる塩基配列が存在し、これによりＴＧＦ−βが直接ＣＴＧＦｍＲＮＡを誘導することも報告されている（非特許文献２）。即ち、ＴＧＦ−βがＣＴＧＦを誘導し、このＣＴＧＦが、ＴＧＦ−β１が関与する臓器や組織の線維化のメカニズムにおいて、ＴＧＦ−β１よりも下流で線維化を促進することが推察され、新たな治療ターゲットとなる可能性が考えられる。【０００６】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような核酸試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）類がＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールできることが報告されている。【０００７】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成有機化合物であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献３−５）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献３−５）。【０００８】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献４−５）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている（非特許文献６）。【０００９】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はインビトロ及びインビボの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した（非特許文献７）。【００１０】
【特許文献１】特願第２００３−３１２３６５号
【特許文献２】特願第２００４−２３８５３３号
【特許文献３】特許第３０４５７０６号
【特許文献４】特開２００１−１３６９７４
【特許文献５】ＷＯ  ０３／０００６８３  Ａ１
【非特許文献１】Takigawa:Drug News Perspect., 16:11-21(2003)
【非特許文献２】Goldschmeding et al:Nephrol. Dial Transplant,15:296(2000)
【非特許文献３】Trauger et al:Nature., 382:559-61(1996)
【非特許文献４】White et al:Chem Biol., 4:569-78(1997)
【非特許文献５】Dervan:Bioorg Med Chem., 9:2215-35(2001)
【非特許文献６】White at al:Nature., 391:468-71(1998)
【非特許文献７】Gottesfeld et al:Nature., 387:202-5(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＣＴＧＦはＴＧＦ−β１による刺激に応答してその発現が誘導され、ＴＧＦ−β１による刺激に応答してその発現が変化することが知られている線維増殖性疾患で重要な役割を担うタンパク質である。従って、ＣＴＧＦの発現の抑制は、より多くの種類の疾患に関与し得るＴＧＦ−β１の発現を抑制する場合に比べ、予想外の作用を減少させることが可能であり、より高い安全性や特異性を有する線維化抑制が可能となる。しかし、これまでＣＴＧＦの発現を特異的に抑制する有機化合物は知られていなかった。特に、ＣＴＧＦの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤又はＴＧＦ−β関連疾患の治療薬についての報告は全くなかった。
また、従来からのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムを用いたＴＧＦ−β１遺伝子やＣＴＧＦ遺伝子の発現抑制の手法は、ターゲットとする配列に制約があり、薬物の組織、細胞への移行が悪く、またリボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＣＴＧＦ遺伝子プロモータの特定の領域に特異的に結合してＣＴＧＦ遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した結果、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、ＣＴＧＦ遺伝子プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、プロモータ領域の−１９５〜−１５０の領域のうち、好ましくは−１６４〜−１５０の領域又は−１９５〜−１７４の領域、より好ましくは−１６０〜−１５５の領域又は−１９０〜−１８４の領域に結合する化合物が、ＣＴＧＦ遺伝子プロモータの活性を有意に阻害し、ＣＴＧＦ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。【００１３】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、結合組織増殖因子（以下ＣＴＧＦとも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−１９５〜−１５０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域とも言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（２）更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（３）前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１６４〜−１５０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（４）前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１６０〜−１５５（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（５）前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１９５〜−１７４（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（６）前記標的領域がＣＴＧＦプロモーターの以下に示す塩基配列−１９０〜−１８４（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（７）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（６）のいずれか一項記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
（８）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（７）記載のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
発現抑制剤。
（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2007034784.tif 000002
（１０）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2007034784.tif 000003
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特定の遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また有機化合物であるためリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤を得ることができる。本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、上記の各種線維増殖性疾患、血管増殖性疾患、動脈硬化性疾患に対する治療薬として有効である。ＣＴＧＦはＴＧＦ−β１の関与よりも下流域において線維化に作用するので、そのＣＴＧＦの遺伝子発現抑制薬はより安全性、特異性の高い線維化抑制へと導くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献３〜５参照）。【００１６】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献５）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。【００１７】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。【００１８】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。【００１９】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。【００２０】
本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＣＴＧＦプロモーターの塩基配列−１９５〜−１５０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域とも言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。【００２１】
通常ＤＮＡ二重らせんの骨格は２列の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。【００２２】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。【００２３】
ＣＴＧＦ遺伝子調節領域の塩基配列は図１及び配列番号１に示す通りである（Xin et al., J. Clin, Pathol. 49, 91-97 (1996)）。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ２１０１及びＧＢＰ２１０２は下記に示す通りである。
【化３】
2007034784.tif 000004
又は
【化４】
2007034784.tif 000005
【００２４】
ＧＢＰ２１０１は、分子式Ｃ７６Ｈ９４Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６７．７５を有し、その標的配列はＣＴＧＦ遺伝子調節領域の−１９５〜−１５０（配列番号２）の領域のうち、Ｓｍａｄ結合領域の下流域である−１６４〜−１５０（配列番号３）の領域であり、直接的にはｇｃｔｇａｇ（−１６０〜−１５５）（配列番号４）の６塩基に結合することにより、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制する。【００２５】
ＧＢＰ２１０２は、分子式Ｃ８８Ｈ１０６Ｎ３４Ｏ１７、分子量１９１２．００を有し、その標的配列はＣＴＧＦ遺伝子調節領域の−１９５〜−１５０（配列番号２）の領域のうち、Ｓｍａｄ結合領域の上流域である−１９５〜−１７４（配列番号５）の領域であり、直接的にはｇａｇｔｇｔｇ（−１９０〜−１８４）（配列番号６）の７塩基に結合することにより、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制する。【００２６】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドはインビトロ研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である。特異的なポリアミド投与下でショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりするが、これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である（Janssen et al:Mol Cell.2000;6:1013-24, Janssen at al:Mol Cell.2000;6:999-1011.）。本発明者らはＣＴＧＦプロモータの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ヒトメサンギウム細胞において示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は、遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供する。【００２７】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Lee et al:Cell.1991 Dec 20;67(6):1241-50, Starr et al:Cell.1991;67:1231-40, Courey et al:Cell.1988;55:887-98）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている。【００２８】
ＴＡＴＡボックスもイニシエーター領域（Ｉｎｒ）も含んでいない種類のプロモータもある（Javahery et al:Mol Cell Biol.1994;14:116-27;Lo et al:Gene.1996 Dec 5;182(1-2):13-22;Romeo et al:Gene.1997;189:289-95.）。高度に発現し特化された遺伝子のプロモータはＴＡＴＡボックスを有している傾向にあるが、ハウスキーピング遺伝子のプロモータにはそれが欠如している傾向がある。ＴＡＴＡのないプロモータは、低レベルで発現される遺伝子や、増殖の間に厳密なダウンレギュレーションを要求する遺伝子にとっては必要かもしれないが、そのメカニズムはなお今後の研究を要する。ｈＴＧＦ−β１プロモータはこの種類に属する。これは転写開始部位の上流の様々な領域にいくつもの陽性及び陰性の配列を含んでいる（Kim et al:J Biol Chem.1989;264:402-8.）。転写開始部位の近傍にはいくつかのＳＰ−１配列と二つのＡＰ−１配列が存在する。様々なウイルス性及び細胞性プロモータがＳＰ−１タンパク質によって活性化されるので、プロモータがＳＰ−１により刺激されるためには単一のＳＰ−１配列で十分のようである（Kadonaga et al:Cell.1987;51:1079-90, Courey et al:Cell.1988;55:887-98）。ＡＰ−１配列はＪｕｎホモダイマー又はＦｏｓ／Ｊｕｎヘテロダイマー複合体のいずれかからなるＡＰ−１転写因子に応答する。ＡＰ−１配列を介してＴＰＡ、ｖ−ｓｒｃ遺伝子産物及びｈＴＧＦ−β１自身のようないくつかの物質がｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を刺激する（Kim et al:J Biol Chem.1989;264:7041-5, Kim et al:J Biol Chem.1989;264:19373-8, Kim et al:Mol Cell Biol.1990;10:1492-7, Birchenall-Roberts et al:Mol Cell Biol.1990;10:4978-83）。【００２９】
ＳＰ−１及び／又はＡＰ−１配列がｈＴＧＦ−β１遺伝子発現の活性化を仲介すると仮定されている。重要なポリアミドは応答性の転写因子の結合を遮断するために、異なるＡＰ−１及びＳＰ−１配列に隣接する塩基対を標的とするように設計されている。しかし、これらのポリアミドがｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を阻害することができるか、又は活性化することができるかを示すに十分なデータはない。これらの結果は、設計したポリアミドがＤＮＡ等の副溝（マイナーグルーブ）中で占有する位置が不適切だったためかもしれない。本発明者らは標的配列をｈＴＧＦ−β１プロモータの上流にまで拡張した。一つのポリアミドはｈＴＧＦ−β１プロモータを標的としており、これはインビトロでプロモータの活性を阻害し、培養ｈＶＳＭＣではｈＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡとタンパク質を阻害することが示されている。ＴＡＴＡボックスを含むコアプロモータからは転写を抑制する転写リプレッサーは見つかってはいるが、ＴＡＴＡのないプロモータからは見つかっていない（Aso et al:EMBO J.1994;13:435-45, Mack et al:Nature.1993;363:281-3, Merino et al:Nature.1993;365:227-32）。ほとんどの哺乳類遺伝子の発現はプロモータとエンハンサー配列に結合した莫大な数のタンパク質の作用の組合せに依存している傾向が高いので、今回の結果を説明する最も簡単なモデルは、本発明のピロールイミダゾールポリアミドが転写因子−ＤＮＡ相互作用を遮断し、ＣＴＧＦプロモータ活性に対して阻害効果を示すということである。【００３０】
プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Berger et al:Mol Cell.2001;5:263-8, McKeown Annu Rev Cell Biol.1992;8:133-55, Decker et al:Trends Biochem Sci.1994;19:336-40, Kozak Annu Rev Cell Biol.1992;8:197-225）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Gottesfeld et al:J Mol Biol.2002;321:249-63;Gottesfeld et al:J Mol Biol.2001;309:615-29.）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはＣＴＧＦ遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがＣＴＧＦ遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。【００３１】
ＣＴＧＦは腎疾患（ＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症）において、線維化に深く関与していることが報告されている（Qi W et al: Am J Physiol Renal Physiol Nov 9, 2004、Okada H et al:J Am Soc Nephrol 16(1) 133-43, 2004、Kanemoto K et al: Lab Invest 83(11) 1615-25, 2003、Zhou G et al:Am J Pathol 165(6) 2033-43, 2004、Crean JK et al: 18(13) 1541-3, 2004）。これらの事実より、本発明のCTGF遺伝子発現抑制薬は、上記の各種腎疾患に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３２】
ＣＴＧＦは血管内皮細胞や血管平滑筋細胞においても発現し、血管増殖性疾患において、アンギオテンシンＩＩによる血管の細胞増殖、硬化に重要な役割を担っていることが示されている（Ruperez M et al: Circulation 108(12) 1499-505, 2003、Kaji T et al: Biochem Biophys Res Commun 322(1) 22-8, 2004、Chowdhury I et al: Eur J Biochem 271(22) 4436-50, 2004）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、血管増殖性疾患に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３３】
ＣＴＧＦは心疾患においても、心筋の肥大、線維化に重要な役割を担うことが示されている（Ahmed MS et al:J Mol Cell Cardiol 36(3) 393-404, 2004、Matsui Y et al: J Mol Cell Cardiol 37(2) 477-81, 2004）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、心筋症に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３４】
肝臓の線維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生において重要な役割を果たしている（Bataller R et al : Gastroenterology 118 : 1149, 2000）。ＣＴＧＦは星細胞の活性化や接着に重要な役割を担い（Gao R et al:J Biol Chem 279(10) 8848-55）、ＣＴＧＦの抑制は肝臓の線維化を抑制することが知られている（Uchio K et al: Wound Repair Regen 12(1) 60-6）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、肝臓の線維増殖性疾患に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３５】
現在行われている慢性腎不全に対する治療は大別して血液透析とＣＡＰＤとに分けられる。このうちＣＡＰＤは血液透析と異なり、患者が自宅、勤務先などで施行するため、頻回の通院を必用とせず、患者の社会復帰のために非常に有効な治療法として確立されている。しかしながらＣＡＰＤを行っている患者では腹膜の線維化が進み、著明な腹膜の硬化をきたし、ＣＡＰＤの効率が低下してＣＡＰＤの続行が困難となるばかりでなく、全身状態の悪化を招くこともある、被嚢性腹膜硬化症の発症が問題となっている。この被嚢性腹膜硬化症においてＣＴＧＦの発現が過剰となり、その発症、進展に深く関わっていることが報告された。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、被嚢性腹膜硬化症に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３６】
肺線維症モデル動物において、ＣＴＧＦはその発症、進展に重要な役割を担っていることが報告されている（Xie S et al: Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 288(1) L68-76, 2004）。また、気道の細胞におけるＣＴＧＦ発現はＴＧＦ−βに関連していることも報告されている（Bonniaud P et al: Am J Respir Cell Mol Biol 31(5) 510-6, 2004）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬である本発明は、肺線維症に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３７】
強皮症の病因としＴＧＦ−βが提唱されているが、ＣＴＧＦも本疾患の線維芽細胞において重要な役割を担っていることが報告されている（Leask A: Keio J Med 53(2)74-7、Chujo S et al:J Cell Phisiol Dec 16 2004）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬である本発明は、皮膚線維化疾患に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。【００３８】
ＣＴＧＦは糖尿病性網膜症において、網膜細胞での分布が変化し、その進展に重要な役割を担うことが報告されている（Kuiper EJ et al: Br J Ophthalmol 88(8) 1082-7, 2004）。これらの事実より、本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制薬は、糖尿病性網膜症に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。
【実施例】
【００３９】
Ｉ．材料及び方法
（１）ＣＴＧＦプロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ＣＴＧＦプロモータの−１６０〜−１５５又は−１９０〜−１８４の塩基対に結合するように、上記のようなＧＢＰ２１０１又はＧＢＰ２１０２を設計した。【００４０】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。【００４１】
ＦＩＴＣカップリング：  ４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。【００４２】
カルボン酸としての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：  最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。【００４３】
（３）ヒトメサンギウム細胞培養
ヒトメサンギウム細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を１０％仔ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞をＣａ２＋，Ｍｇ２＋フリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのトリプシン処理により継代し、７５−ｃｍ２組織培養フラスコで培養した。培地は４〜５日毎に交換し、５〜１０継代の間の細胞について実験を行った。
（４）培養ヒトメサンギウム細胞におけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
継代ヒトメサンギウム細胞を１０５／ｃｍ２の密度で２４時間、２４ウェルのフラスコで培養した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、２時間後に洗浄し、以後、蛍光顕微鏡で１時間ごとに観察した。【００４４】
（５）ゲルシフトアッセイ
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ＣＴＧＦプロモーターの塩基対に対応する１２種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。二本鎖ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．９，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。【００４５】
（６）ＲＮＡ抽出及び成長因子ｍＲＮＡのための逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
培養細胞をＰＢＳで洗浄し、１０００μＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、１００μＬのクロロホルムと混合し、遠心分離し、上部水相を等体積のイソプロパノールと混合してＲＮＡを沈澱させた。ＲＮＡペレットを５００μＬの７５％エタノールで二回洗浄し、乾燥後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。６５℃で１５分間変性させた後、ＲＮＡ試料を室温で４５分間、０．５ｍｌのＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、０．５Ｕ  ＤＮアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）で処理した。ＤＮアーゼは０．５ｍＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによって不活化した。【００４６】
等量のＲＮＡ（１μｇ／２０μＬ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  デオキシＮＴＰ類、及び２．５μＭランダムヘキサマー中、２．５Ｕ／２０μＬトリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中に逆転写させた。２μＬの希釈ｃＤＮＡ生成物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μＬ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々０．２μＭとともに混合し合計２５μＬとした。センスプライマー（5’-ＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＴ-3’）（配列番号７）及びアンチセンスプライマー（5’-ＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧ-3’）（配列番号８）をＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ヒト１８ＳリボゾームＲＮＡについてセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３’）（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号１０）を内部対照として使用した。ＰＣＲをサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）で行った。ＰＣＲ条件は９４℃２分の初期変性、次いで３０サイクルの変性９４℃１分、アニーリング５８℃１分、伸張７２℃１分を行い、最後に７２℃１０分の伸張反応を行うものであった。１８Ｓ ｒＲＮＡについてのプライマーによるＰＣＲを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノムＤＮＡがＰＣＲによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しなかった。ｍＲＮＡの半定量的分析のために、ＰＣＲ産物がゲル上で検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。連続した１０倍希釈のｃＤＮＡ（１００、１０及び１ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物はｃＤＮＡの量を増加していくとより早いサイクルの段階で検出可能となった。標的ｍＲＮＡの各々に対応するＰＣＲ産物の量は２０〜３５サイクルで直線的に増加した。ＰＣＲ産物の定量は、Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。【００４７】
（７）統計解析
結果は平均値±ＳＥＭで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデントｔ検定 により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとした。【００４８】
ＩＩ．結果
（１）合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＧＢＰ２１０１及びＧＢＰ２１０２の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む５０塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチド
センス        ctgtgagctggagtgtgccagctttttcagacggaggaatgctgagtgtc（配列番号１１）
アンチセンス  GACACTCAGCATTCCTCCGTCTGAAAAAGCTGGCACACTCCAGCTCACAG（配列番号１２）
を作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖ＤＮＡを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。ＧＢＰ２１０１及びＧＢＰ２１０２ともに二本鎖ＤＮＡ（ＤＳ）にピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を加えると、ＤＳのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、ＤＳとＰｙ−Ｉｍとの結合が証明された。結果を図２に示す。【００４９】
（２）ＧＢＰ２１０１によるＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ（12‐O‐tetradecanoylpholbol‐13‐acetate）を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ２１０１）を加えてそのＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はguanidium thiocyanate法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、avian myeloblastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はAgilent Bioanalyzerにより定量した。ＣＴＧＦ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＣＴＧＦ遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。
ＣＴＧＦ遺伝子発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ２１０１添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図３）。【００５０】
（３）ＧＢＰ２１０１によるＣＴＧＦタンパク質の発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ（12‐O‐tetradecanoylpholbol‐13‐acetate）を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ２１０１）を加えてそのＣＴＧＦ蛋白の発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はSDSにて可溶化し、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後ニトロセルロース膜へ転写した。ニトロセルロース膜へ転写された蛋白は一次抗体に抗ヒトCTGF抗体、二次抗体に抗ヤギIgG抗体を用いてwestern blotを行った。発色はECL（Amersham-Pharmacia）を用い、NIH Imageを用いて定量した。
ＣＴＧＦ蛋白発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ２１０１添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図４）。【００５１】
（４）  ＧＢＰ２１０２によるＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＴＧＦ−β１を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ２１０２）を加えてＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＴＧＦ−β１と各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はguanidium thiocyanate法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、avian myeloblastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はAgilent Bioanalyzerにより定量した。ＣＴＧＦ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＣＴＧＦ遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。
ＣＴＧＦ遺伝子発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ２１０２添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図５）。【００５２】
（５）  ＧＢＰ２１０２によるＣＴＧＦタンパク質の発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ（12‐O‐tetradecanoylpholbol‐13‐acetate）を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ２１０２）を加えてそのＣＴＧＦ蛋白の発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はSDSにて可溶化し、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後ニトロセルロース膜へ転写した。ニトロセルロース膜へ転写された蛋白は一次抗体に抗ヒトCTGF抗体、二次抗体に抗ヤギIgG抗体を用いてwestern blotを行った。発色はECL（Amersham-Pharmacia）を用い、NIH Imageを用いて定量した。
ＣＴＧＦ蛋白発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ２１０２添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＣＴＧＦ遺伝子発現抑制剤はＴＧＦ−β、ひいてはＣＴＧＦの産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒトＣＴＧＦ遺伝子の調節領域の塩基配列を示す。
【図２】Ｐｙ−Ｉｍポリアミド−オリゴヌクレオチド錯体のゲルシフトアッセイを示す。
【図３】ＧＢＰ２１０１によるＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。
【図４】ＧＢＰ２１０１によるＣＴＧＦタンパク質の発現抑制効果を示すグラフである。
【図５】ＧＢＰ２１０２によるＣＴＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。
【図６】ＧＢＰ２１０２によるＣＴＧＦタンパク質の発現抑制効果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号７  センスプライマー
配列番号８  アンチセンスプライマー
配列番号９  センスプライマー
配列番号１０  アンチセンスプライマー
配列番号１１  ゲルシフトアッセイのセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１２  ゲルシフトアッセイのアンチセンスオリゴヌクレオチド
【図１】
2007034784.tif 000008
【図２】
2007034784.tif 000009
【図３】
2007034784.tif 000010
【図４】
2007034784.tif 000011
【図５】
2007034784.tif 000012
【図６】
2007034784.tif 000013
【配列表】
2007034784000001.app
【国際調査報告】
2007034784.tif 000014
2007034784.tif 000015
2007034784.tif 000016
2007034784.tif 000017