(57)【要約】  本発明のチョウ目昆虫用人工飼料は、蛋白質と糖質とを含有するチョウ目昆虫用人工飼料であって、このチョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０原子％以上である。また、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料の製造方法は、微生物を脱脂処理する脱脂処理工程と、微生物を熱水溶液で抽出処理する熱水溶液抽出処理工程と、脱脂処理工程及び熱水溶液抽出処理工程が行われた微生物に由来する蛋白質並びに糖質を混合する混合工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質と糖質とを含有するチョウ目昆虫用人工飼料であって、このチョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０原子％以上であるチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項２】
前記蛋白質が微生物に由来する請求項１に記載のチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項３】
前記微生物が、藻類、光合成細菌類を含む細菌類、真菌類、及び酵母類からなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項２に記載のチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項４】
前記微生物が、脱脂処理され、かつ熱水溶液で抽出処理されたものである請求項２に記載のチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項５】
無機塩及びビタミンをさらに含有する請求項１に記載のチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項６】
前記安定同位体が１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏ、及び３３Ｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項１に記載のチョウ目昆虫用人工飼料。
【請求項７】
微生物を脱脂処理する脱脂処理工程と、
微生物を熱水溶液で抽出処理する熱水溶液抽出処理工程と、
脱脂処理工程及び熱水溶液抽出処理工程が行われた微生物に由来する蛋白質並びに糖質を混合する混合工程とを含むチョウ目昆虫用人工飼料の製造方法。
【請求項８】
安定同位体の含有率が５０％以上であるチョウ目昆虫。
【請求項９】
蛋白質と糖質とを含有し、安定同位体の含有率が５０原子％以上であるチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育した請求項８に記載のチョウ目昆虫。
【請求項１０】
遺伝子組換えバキュロウイルスが感染した請求項８に記載のチョウ目昆虫。
【請求項１１】
請求項１に記載のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育する工程を含むチョウ目昆虫の製造方法。
【請求項１２】
遺伝子組換えバキュロウイルスを感染処理する工程をさらに含む請求項１１に記載のチョウ目昆虫の製造方法。
【請求項１３】
請求項８に記載のチョウ目昆虫が製造した生体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質に関する。
本願は、２００６年５月１９日に日本国に出願された特願２００６−１４０７４７号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多種の生物において全ゲノム配列が決定されている。そして、それらの情報を元にゲノム上にコードされている蛋白質の立体構造を網羅的に決定する研究が盛んに行われている。
蛋白質の立体構造決定を行う手法の一つとして核磁気共鳴分光法（以下、「ＮＭＲ」と略記する。）がある。ＮＭＲで蛋白質を測定する際、一般に１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ等の安定同位体を対象蛋白質に導入する必要がある。
また、最近のマススペクトロメトリー分析技術の進展、及び汎用型質量分析装置の普及により、種及び個体レベルにおける生体物質の定性分析及び定量分析が広く行われてきている。この技術分野においても、特に定量分析において、安定同位体を生体物質に導入することが重要とされている。
なお、生体物質とは、生物が産生する蛋白質、糖質、脂質、及びその他の生物由来物質の総称をいう。【０００３】
例えば、ＮＭＲによる蛋白質の解析を目的とした、蛋白質への安定同位体導入法としては、安定同位体で標識された炭素源（例えば、Ｄ−グルコース−１３Ｃ６、メタノール−１３Ｃ）、窒素源（例えば、塩化アンモニウム−１５Ｎ、硫酸アンモニウム−１５Ｎ）、又は水（例えば、Ｄ２Ｏ、Ｈ２１８Ｏ）を含む培地で遺伝子組換え大腸菌や酵母を培養し、目的の蛋白質を細胞内又は細胞外に大量に発現させることにより、所望の安定同位体標識蛋白質を合成する技術が確立されている。【０００４】
しかしながら、上記遺伝子組換え大腸菌を用いる安定同位体標識蛋白質の合成法においては、高等生物の蛋白質の機能に極めて重要な糖鎖付加、リン酸化、メチル化、アセチル化などの翻訳後修飾が行われないため、活性を持った蛋白質が得られない場合が多い。
また、遺伝子組換え酵母を用いる場合では、翻訳後修飾は行われるものの、高等生物の場合と修飾される位置や糖鎖の種類が異なるなどの問題があった。さらに、生体内で重要な機能を持つと言われている膜蛋白質についても上記従来技術では合成が極めて困難であった。【０００５】
一方、近年、糖蛋白質、リン酸化蛋白質などの翻訳後修飾された蛋白質や膜蛋白質を含む種々の蛋白質を合成する方法として、昆虫に特異的に感染するバキュロウイルスの遺伝子を操作し、遺伝子組換えバキュロウイルスをカイコ蛾などのチョウ目昆虫に感染させ、所望の蛋白質を大量合成する技術が確立している（例えば、特許文献１〜３参照）。この方法では、上記遺伝子組換え大腸菌や酵母では困難であった、高等生物で広く共通した翻訳後修飾が行われた蛋白質や膜蛋白質を高い確率で合成することが可能である。また、この遺伝子組換えバキュロウイルスが感染したチョウ目昆虫やトランスジェニックチョウ目昆虫を用いた蛋白質生産は既に実用化段階であり、動物向け医薬品生産や研究用蛋白質受託製造などで事業化されている。
なお、本発明において、チョウ目昆虫とは、天然型チョウ目昆虫、バキュロウルスを感染させたチョウ目昆虫、及びトランスジェニックチョウ目昆虫の総称をいう。【０００６】
チョウ目昆虫などの高等生物由来の生体物質を分析する場合は、上述の通り、安定同位体を生体物質に導入する必要がある。従って、先ず安定同位体を高等生物に高度に導入する必要がある。
この導入方法として、安定同位体で標識した食物を所望の動物に摂食させる方法が提案されている（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、チョウ目昆虫などの高等生物の多くは、微生物と異なり、その種類により食物に嗜好性があるため、たとえ栄養的に十分であっても嗜好性を満足しない食物は使用できない。つまり、高等生物の嗜好性を満足する食物を安定同位体で標識しなければならない。
特許文献４には、チョウ目昆虫の食草を、完全に密閉されたチャンバー内で適度に調節された１３ＣＯ２ガス及び１５Ｎで標識された栄養塩で栽培する方法が開示されている。しかしながら、このような方法では、食草の栽培設備が高価となり、食草の生育に１ヶ月以上の時間が掛かり、かつ安定同位体標識原料の利用効率が極めて低い。このような問題があるため、特許文献４に記載の方法は、経済的観点から現実的でない。
【特許文献１】特開昭６１−９２８８号公報
【特許文献２】特開昭６１−９２９７号公報
【特許文献３】特開昭６２−２０８２７６号公報
【特許文献４】特開２００６−５３１００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、安定同位体で高度に標識され、かつチョウ目昆虫を良好に生育可能なチョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫及びその製造方法、並びに安定同位体で高度に標識された生体物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、
本発明の第１の態様は、蛋白質と糖質とを含有するチョウ目昆虫用人工飼料であって、このチョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０原子％以上であるチョウ目昆虫用人工飼料である。
なお、本発明において、安定同位体の含有率とは、同一元素間における安定同位体の量比（原子％）をいう。また、安定同位体の含有率の計算にあたっては、チョウ目昆虫用人工飼料の内、チョウ目昆虫が分解吸収可能な成分のみを計算対象成分とする。すなわち、チョウ目昆虫用人工飼料の内、チョウ目昆虫が分解吸収できない成分については、計算対象成分としない。【０００９】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料においては、前記蛋白質が微生物に由来することが好ましい。また、前記微生物が、藻類、光合成細菌類を含む細菌類、真菌類、及び酵母類からなる群から選ばれる１種又は２種以上であることが好ましい。また、前記微生物が、脱脂処理され、かつ熱水溶液で抽出処理されたものであることが好ましい。また、無機塩及びビタミンをさらに含有することが好ましい。また、前記安定同位体が１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏ、及び３３Ｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上であることが好ましい。【００１０】
本発明の第２の態様は、微生物を脱脂処理する脱脂処理工程と、微生物を熱水溶液で抽出処理する熱水溶液抽出処理工程と、脱脂処理工程及び熱水溶液抽出処理工程が行われた微生物に由来する蛋白質並びに糖質を混合する混合工程とを含むチョウ目昆虫用人工飼料の製造方法である。【００１１】
本発明の第３の態様は、安定同位体の含有率が５０原子％以上であるチョウ目昆虫である。
本発明のチョウ目昆虫は、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育したものであることが好ましい。また、遺伝子組換えバキュロウイルスが感染したものであることが好ましい。【００１２】
本発明の第４の態様は、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育する工程を含むチョウ目昆虫の製造方法である。
本発明のチョウ目昆虫の製造方法においては、遺伝子組換えバキュロウイルスを感染処理する工程をさらに含むことが好ましい。【００１３】
本発明の第５の態様は、本発明のチョウ目昆虫が製造した生体物質である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を用いることにより、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫を得ることができる。
また、このチョウ目昆虫を用いることにより、従来技術では製造が困難であった、安定同位体で高度に標識された生体物質、特に翻訳後修飾蛋白質及び膜蛋白質を製造することができる。
また、上記生体物質は、安定同位体で高度に標識されているため、質量分析を用いて定性分析及び定量分析を行うことができる。
また、上記蛋白質は、安定同位体で高度に標識されているため、ＮＭＲを用いて蛋白質、翻訳後修飾蛋白質、及び膜蛋白質の立体構造を解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態について、詳しく説明する。【００１６】
（チョウ目昆虫用人工飼料）
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料は、蛋白質と糖質とを含有する。また、このチョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率は、５０原子％以上であり、好ましくは７０原子％以上、より好ましくは９０原子％以上である。
安定同位体の含有率が５０原子％以上であると、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を用いてチョウ目昆虫を生育した際、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫を得ることができる。また、このようなチョウ目昆虫から抽出した生体物質は、安定同位体で高度に標識されているため、ＮＭＲの測定において、高い感度を得ることができる。従って、生体物質を正確に解析することができる。一方、安定同位体の含有率が５０原子％未満であると、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫及び生体物質を得ることができない。このような生体物質をＮＭＲで測定しても、感度不足のため、正確に解析することができない。
安定同位体の含有率が７０原子％以上であると、ＳＮ比（信号と雑音の比）が向上するとともに、ＮＭＲの測定時間を短縮することができる。また、安定同位体の含有率が９０原子％以上であると、多核種の多次元解析が可能となり、より複雑な蛋白質等の生体物質を解析することができる。【００１７】
本発明において、安定同位体の含有率の上限値は１００原子％である。安定同位体の含有率が１００原子％であると、ＮＭＲの測定における感度が極めて高くなる。ただし、現在の技術では安定同位体の含有率が１００原子％になることは実現不可能なので、上限値は１００原子％に近い１００原子％未満の数値とする。よって、安定同位体の含有率の数値範囲は、５０原子％以上１００原子％未満、好ましくは、７０原子％以上１００原子％未満、より好ましくは、９０原子％以上１００原子％未満である。
なお、質量分析においても、生体物質における安定同位体の含有率が高いと、検出が容易となり、正確な定量分析が可能になる。【００１８】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料に用いられる蛋白質は、安定同位体で標識されていればよく、蛋白質の種類は特に限定されない。この蛋白質における安定同位体の含有率は、チョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０原子％以上となるように、蛋白質以外の成分量を考慮しながら、適宜調整すればよい。
上記蛋白質は、動物、植物、及び微生物のいずれか１つ又は２つ以上に由来してもよいが、安定同位体の導入が容易なことから、微生物に由来することが好ましい。この微生物としては、藻類、光合成細菌類を含む細菌類、真菌類、酵母類が挙げられるが、光合成による１３ＣＯ２の固定が可能なことから、藻類及び光合成細菌類が好ましい。なお、従来技術に記載のように、動物は食物に対して嗜好性を有する問題を有し、植物は安定同位体標識原料の利用効率が極めて低いという問題を有する。従って、動物及び植物に由来の蛋白質は、これらの問題を解決した上で使用する必要がある。【００１９】
微生物に安定同位体を導入する方法としては、種々の方法が開発され、公知となっているので、目的に合わせて適正な方法を選択すればよい。例えば、安定同位体で標識された、炭素源、窒素源、又は水を含む培地で微生物を培養する方法を選択できる。【００２０】
微生物には、チョウ目昆虫が摂食を忌避する忌避物質（例えば、酸化脂肪酸）や成長阻害物質が含まれているため、それらを除去した後、使用することが好ましい。除去方法としては、脱脂処理及び熱水溶液抽出処理が好ましい。【００２１】
脱脂処理は、微生物を有機溶媒において加熱抽出する方法であり、これにより、忌避物質及び成長阻害物質中における疎水性成分を除去することができる。上記有機溶媒としては、メタノール、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、又は塩化メチレンなどが挙げられる。これらの有機溶媒を１つ又は２つ以上を組合わせて使用してもよい。有機溶媒の温度は、室温以上から還流できる温度までであればよく、用いる有機溶媒に応じて決定される。脱脂処理の時間は、用いる微生物及び有機溶媒により異なるが、例えば、１〜１０時間が例示される。なお、脱脂処理の回数は１回に限らず、必要に応じて複数回でもよい。【００２２】
熱水溶液抽出処理は、微生物を熱水溶液において加熱抽出する方法であり、これにより、忌避物質及び成長阻害物質中における親水性成分を除去することができる。上記熱水溶液には、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、無機塩類等を適宜添加することができる。熱水溶液の温度は、室温以上から還流できる温度までであればよく、具体的には９０〜１４０℃が例示される。
熱水溶液の時間は、用いる微生物により異なるが、例えば、０．５〜５時間が例示される。なお、熱水溶液抽出処理の回数は１回に限らず、必要に応じて複数回でもよい。【００２３】
このように、微生物中の忌避物質及び成長阻害物質を除去することにより、嗜好性及び生育性に優れたチョウ目昆虫用人工飼料を製造することができる。
なお、脱脂処理と熱水溶液抽出処理の順番は特に限定されない。【００２４】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料に用いられる糖質は、安定同位体で標識されていればよく、チョウ目昆虫が資化可能であれば、糖質の種類は特に限定されない。
チョウ目昆虫用人工飼料の成分として用いられる澱粉、寒天、及びセルロースはチョウ目昆虫の摂食性を向上させるが、チョウ目昆虫の多くはこれらを分解する消化酵素を持たないため、本発明における糖質には該当しない。
この糖質における安定同位体の含有率は、チョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０原子％以上となるように、糖質以外の成分量を考慮しながら、適宜調整すればよい。
上記糖質は、市販品を購入することにより、入手可能である。【００２５】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料には、上記蛋白質及び糖質以外に、脂質、有機酸、無機塩、ビタミン、又は植物由来粉末等のチョウ目用人工飼料として許容できる成分を適宜添加することができる。これらの成分は、チョウ目昆虫用人工飼料の安定同位体の含有率を高める観点から、安定同位体で標識されていることが好ましい。【００２６】
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料に用いる安定同位体は、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏ、及び３３Ｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上であることが好ましい。これらの安定同位体は、蛋白質等の生体物質を構成する元素であるため、質量分析及びＮＭＲによる解析に有用である。また、前記安定同位体は、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種又は２種以上であることがより好ましい。１３Ｃ、１５Ｎ、及び１７Ｏは、ＮＭＲ測定において検出可能な核種であり、蛋白質等の生体物質の構造に関して多くの知見を与える。また、２Ｈは、１Ｈと置換することにより、この１Ｈに由来するピークを消去することができる。結果、ＮＭＲの測定データを単純化し、解析を容易にすることができる。【００２７】
（チョウ目昆虫用人工飼料の製造方法）
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料の製造方法は、微生物を脱脂処理する脱脂処理工程と、微生物を熱水溶液で抽出処理する熱水溶液抽出処理工程と、脱脂処理工程及び熱水溶液抽出処理工程が行われた微生物に由来する蛋白質並びに糖質を混合する混合工程とを含む。【００２８】
上述の通り、微生物中には、チョウ目昆虫が摂食を忌避する忌避物質（例えば、酸化脂肪酸）や成長阻害物質が含まれているため、上記脱脂処理及び熱水溶液抽出処理を用いて、微生物から忌避物質や成長阻害物質を除去することが好ましい。これにより、嗜好性及び生育性に優れたチョウ目昆虫用人工飼料を製造することができる。脱脂処理及び熱水溶液抽出処理の操作条件は、上記と同様である。
混合工程は、特に限定されず、公知の方法が選択可能である。例えば、上記微生物由来の蛋白質、糖質、及びその他の成分を公知の方法で混合することにより、チョウ目昆虫用人工飼料を製造できる。
なお、混合工程の後に得られたチョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体の含有率が５０％以上となるように、蛋白質、糖質、及びその他の成分における安定同位体の含有率を調整することが好ましい。【００２９】
（チョウ目昆虫及びトランスジェニックチョウ目昆虫）
本発明のチョウ目昆虫は、その安定同位体の含有率が５０原子％以上であることを特徴とする。また、チョウ目昆虫における安定同位体の含有率は、７０原子％以上であることが好ましく、９０原子％以上であることがより好ましい。
安定同位体の含有率が５０原子％以上であると、本発明のチョウ目昆虫から抽出した生体物質は、安定同位体で高度に標識されているため、ＮＭＲの測定において、高い感度を得ることができる。従って、生体物質を正確に解析することができる。一方、安定同位体の含有率が５０原子％未満であると、安定同位体で高度に標識された生体物質を得ることができない。このような生体物質をＮＭＲで測定しても、感度不足のため、正確に解析することができない。
安定同位体の含有率が７０原子％以上であると、ＳＮ比が向上するとともに、ＮＭＲの測定時間を短縮することができる。また、安定同位体の含有率が９０原子％以上であると、多核種の多次元解析が可能となり、より複雑な蛋白質等の生体物質を解析することができる。【００３０】
本発明において、安定同位体の含有率の上限値は１００原子％である。安定同位体の含有率が１００原子％であると、ＮＭＲの測定における感度が極めて高くなる。ただし、現在の技術では安定同位体の含有率が１００原子％になることは実現不可能なので、上限値は１００原子％に近い１００原子％未満の数値とする。よって、安定同位体の含有率の数値範囲は、５０原子％以上１００原子％未満、好ましくは、７０原子％以上１００原子％未満、より好ましくは、９０原子％以上１００原子％未満である。
なお、質量分析においても、生体物質における安定同位体の含有率が高いと、検出が容易となり、正確な定量分析が可能になる。【００３１】
本発明のチョウ目昆虫は、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料で生育可能であれば、その種類は特に限定されない。例えば、チョウ目昆虫用人工飼料による生育が良好なことから、特定の食草を持たずに比較的広食性を示す広食性チョウ目昆虫を好適に用いることができる。このような広食性チョウ目昆虫としては、例えば、エリサン、ヨトウムシ、アメリカシロヒトリ、シンジュサン、又はクスサン等が挙げられる。【００３２】
また、主に養蚕業において、チョウ目昆虫の嗜好性を低下させて広食性を獲得させるため、長期間の人工的な交配により品種改良されたチョウ目昆虫も好適に用いることができる。このような広食性に品種改良されたチョウ目昆虫としては、例えば、旧蚕糸・昆虫農業技術研究所（現農業生物資源研究所）で育種された広食性蚕である、「あさぎり」、「しんあさぎり」、「はばたき」、又は「ほのぼの」等が挙げられる。
これらのチョウ目昆虫を本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育することにより、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫を得ることができる。【００３３】
本発明のチョウ目昆虫においては、遺伝子組換えバキュロウイルスが感染していることが好ましい。これにより、所望の蛋白質をコードする外来遺伝子をチョウ目昆虫に導入することができる。結果、チョウ目昆虫に生来の生体物質に加え、所望の蛋白質（膜蛋白質を含む）であって、安定同位体で高度に標識され、かつ、高等生物で広く共通した翻訳後修飾が行われたものをチョウ目昆虫の体液及び組織内に大量に製造することができる。【００３４】
また、本発明のチョウ目昆虫として、ゲノム上に外来遺伝子を挿入したトランスジェニックチョウ目昆虫を用いることができる。トランスジェニックチョウ目昆虫とは、昆虫に感染するウイルスより発見されたトランスポゾンと呼ばれる特殊なベクターを利用することにより、チョウ目昆虫のゲノム上に外来遺伝子を挿入する技術を用いて作出された遺伝子組換えチョウ目昆虫のことをいう。このトランスジェニックチョウ目昆虫を用いることにより、遺伝子組換えバキュロウイルスを感染させたチョウ目昆虫と同様の効果を得ることができる。【００３５】
（チョウ目昆虫の製造方法）
本発明のチョウ目昆虫の製造方法は、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育する工程を有する。給餌方法としては、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を、チョウ目昆虫の孵化時から給餌しても、生育途中から安定同位体を含有しない人工飼料に代えて給餌してもよい。特に、５齢から終齢にかけてはチョウ目昆虫の食欲が旺盛であるため、この時期に本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌することが経済的観点から好ましい。【００３６】
生育方法は特に限定されず、公知の方法が使用可能である。但し、安定同位体として２Ｈ、１７Ｏ、又は１８Ｏ等の大気中の水分と交換する恐れのある核種を用いる場合は、密閉されたボックスを用いて、密閉空間内で生育することが好ましい。これらの核種を用いない場合は、特に密閉空間内で生育する必要はない。
このように、本発明のチョウ目昆虫の製造方法を用いることにより、安定同位体で高度に標識されたチョウ目昆虫を得ることができる。【００３７】
本発明のチョウ目昆虫の製造方法においては、遺伝子組換えバキュロウイルスを感染処理する工程をさらに有することが好ましい。具体的には、所望の蛋白質をコードする遺伝子をバキュロウイルスに遺伝子工学的手法を用いて組込み、得られた遺伝子組換えバキュロウイルスを、公知の方法でチョウ目昆虫に感染させる方法を用いることができる。これにより、チョウ目昆虫に生来の生体物質に加え、所望の蛋白質（膜蛋白質を含む）であって、安定同位体で高度に標識され、かつ、高等生物で広く共通した翻訳後修飾が行われたものを、チョウ目昆虫の体液及び組織内に大量に製造することができる。【００３８】
なお、チョウ目昆虫としてトランスジェニックチョウ目昆虫を用いる場合には、本発明のチョウ目昆虫用人工飼料を給餌して生育する工程のみで、遺伝子組換えバキュロウイルスを感染処理する工程をさらに有する本発明のチョウ目昆虫の製造方法と同様の効果が得られる。【００３９】
（生体物質）
本発明の生体物質は、本発明のチョウ目昆虫が産生する蛋白質、糖質、脂質、及びその他のチョウ目昆虫由来物質である。これらの生体物質は、安定同位体で高度に標識されているため、ＮＭＲ及び質量分析等による解析に有用である。
本発明の生体物質を得るためには、先ず、本発明のチョウ目昆虫又はトランスジェニックチョウ目昆虫を上記方法により製造し、次いで、産生された生体物質を公知の抽出方法で抽出する。具体的には、チョウ目昆虫又はトランスジェニックチョウ目昆虫を破砕あるいは磨砕し、遠心分離機にかける方法を用いることができる。このようにして得られた抽出溶液から、目的の生体物質に好適な精製方法を用いて精製することにより、本発明の生体物質が得られる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。本発明は下記実施例に何ら制限されるものではない。
（実施例１）
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料に添加する蛋白質として、藻類の一種であるスピルリナ由来の蛋白質を用いた。スピルリナは、１５Ｎ標識硝酸ナトリウムを含む表１の組成の培養液で１４日間培養した。培養後、培養液中のスピルリナを連続遠心分離機で集藻し、イオン交換水で洗浄後、液体窒素で凍結し、そのまま凍結乾燥機で凍結乾燥させた。【００４１】
【表１】
2007135953.tif 000002
【００４２】
乾燥して得られたスピルリナ藻体約２５ｇを細かく粉砕し、２Ｌ容ナスフラスコに全量入れた。続いて、メタノール、クロロホルム（２：１）の混合溶媒１Ｌを加え、オイルバスで９０℃に加熱しながら、３時間還流加熱抽出することにより、脱脂処理を行った。その後、室温に戻し、テフロン製フィルターでろ過した。得られたろ過物を真空乾燥機にて乾燥させることにより、約２０ｇの脱脂スピルリナ藻体を得た。【００４３】
乾燥脱脂スピルリナを再び２Ｌ容ナスフラスコに入れ、イオン交換水を１Ｌ加えて、オイルバスで１２０℃に加熱しながら、１時間還流下で熱水抽出することにより、熱水溶液抽出処理を行った。１時間経過後、室温に戻し、内容物を遠心分離機で８，０００回転、３０分間遠心分離した。上精をデカンテーション及びピペットで除き、再び沈殿物を２Ｌ容ナスフラスコに移し、還流下で熱水抽出することにより、熱水溶液抽出処理を行った。さらに上記熱水溶液抽出処理を２回繰り返した後、冷イオン交換水で２回、７０％エタノールで２回それぞれ洗浄した。得られた沈殿をジエチルエーテルで洗浄して完全に乾燥させることにより、約１１ｇの１５Ｎ標識スピルリナ粗蛋白質抽出画分を得た。【００４４】
上記１５Ｎ標識スピルリナ粗蛋白質画分を含むチョウ目昆虫用人工飼料を、表２のＫ２５に示す組成で混合し、加熱しながら均一に練り合わせた後、蒸して短冊状に成型した。一方、蛋白質源として、１５Ｎ標識スピルリナ粗蛋白質画分の代わりに、脱脂大豆粉末、又はこれと桑葉粉末の両方を含むチョウ目昆虫用人工飼料を、表２のＫＳ４０、ＫＭ２５に示す組成で同様に作成し、コントロールとして用いた。
Ｋ２５のチョウ目昆虫用人工飼料においては、飼料成分中のほとんどの窒素が１５Ｎに置換されていることになり、チョウ目昆虫用人工飼料における安定同位体（１５Ｎ）の含有率が９０原子％以上となった。【００４５】
【表２】
2007135953.tif 000003
【００４６】
また、表２における無機塩混合物及びビタミン等混合物の各組成を表３及び４に示す。【００４７】
【表３】
2007135953.tif 000004
【００４８】
【表４】
2007135953.tif 000005
【００４９】
Ｋ２５のチョウ目昆虫用人工飼料をチョウ目昆虫の一種であるエリサンの５齢幼虫に給餌した。また、コントロールであるＫＳ４０及びＫＭ２５のチョウ目昆虫用人工飼料も、同じくエリサンの５齢幼虫に別々に給餌した。このように、Ｋ２５、ＫＳ４０、又はＫＭ２５のチョウ目昆虫用人工飼料を、エリサンに１２日間給餌し、蛹化するまで成育した。なお、各チョウ目昆虫用人工飼料の給餌量は同等であった。【００５０】
Ｋ２５のチョウ目昆虫用人工飼料で生育したエリサンを解剖し、脂肪体を含む表皮と絹糸腺の１５Ｎ含有率を質量分析計で測定した。その結果を表５に示す。１２日間コントロールと同等量の安定同位体含有飼料を食べ続けたエリサンでは、表皮及び絹糸腺における１５Ｎ含有率が、それぞれ５８．２原子％、８７．４原子％となり、極めて高い安定同位体の含有率を示した。
一方、ＫＳ４０又はＫＭ２５のチョウ目昆虫用人工飼料で生育したエリサンを解剖し、脂肪体を含む表皮と絹糸腺の１５Ｎ含有率を質量分析計で測定したところ、15Nの含有率は、窒素の天然存在量しか検出されなかった。【００５１】
【表５】
2007135953.tif 000006
【００５２】
（実施例２）
本発明のチョウ目昆虫用人工飼料に添加する蛋白質として、酵母サッカロミセス・セルビシエNBRC0203由来の蛋白質を用いた。サッカロミセス・セルビシエは、１５Ｎ標識硫酸ナトリウムを含む表６に記載の組成の培養液で２２時間培養した。培養後、培養液中のサッカロミセス・セルビシエを遠心分離により回収し、イオン交換水で洗浄後、液体窒素で凍結し、そのまま凍結乾燥器で凍結乾燥させた。【００５３】
【表６】
2007135953.tif 000007
【００５４】
乾燥して得られた15Ｎ標識サッカロミセス・セルビシエ約37.3ｇ  を細かく粉砕し、２Ｌ容ナスフラスコに全量入れた。続いて、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含む水溶液１Ｌを加え、オイルバスで１００℃に加熱しながら、１．５時間還流加熱抽出することにより、脱糖処理及び水溶性の低分子成分の抽出除去処理を行った。その後、室温に戻し、溶液を500ｍＬ容遠沈管に移して8000回転 で30分間遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物にエタノールを加えて懸濁することにより沈殿物を洗浄し、8000回転 30分間遠心分離して、沈殿物を回収した。この作業を2回繰り返した後、恒温真空乾燥器で2日間乾燥させた。【００５５】
乾燥させたサッカロミセス・セルビシエ抽出物を再び２Ｌ容ナスフラスコに入れ、メタノール、クロロホルム（２：１）の混合溶媒１Ｌを加えて、オイルバスで９０℃に加熱しながら、１．５時間還流加熱抽出することにより、脱脂処理を行った。その後、室温に戻し、テフロン製フィルターでろ過した。得られたろ過物をメタノールで洗浄し、更にジエチルエーテルで洗浄しながら脱水、乾燥させることにより、約17.2ｇの酵母由来15Ｎ標識粗蛋白質画分を得た。【００５６】
上記１５Ｎ標識酵母粗蛋白質画分を含むチョウ目昆虫用人工飼料（S25M5）を、表７に示す組成で混合し、加熱しながら均一に練り合わせた後、蒸して短冊状に成型した。一方、コントロールとして、実施例１の表２に示した非標識昆虫用人工飼料ＫＳ４０、ＫＭ２５を用いて非標識カイコ及びエリサンを飼育した。S25M5のチョウ目昆虫用人工飼料においては、安定同位体（１５Ｎ）の含有率が９０原子％以上となった。【００５７】
【表７】
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【００５８】
また、表７における無機塩混合物及びビタミン等混合物の各組成は表８及び９に示す。【００５９】
【表８】
2007135953.tif 000009
【００６０】
【表９】
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【００６１】
S25M5のチョウ目昆虫用人工飼料をチョウ目昆虫の一種であるカイコおよびエリサンの５齢幼虫に給餌した。また、コントロールであるＫＳ４０及びＫＭ２５のチョウ目昆虫用人工飼料も、同じくカイコおよびエリサンの５齢幼虫に別々に給餌した。なお、各チョウ目昆虫用人工飼料の摂食量は、15N標識、非標識に関わらずカイコ、エリサン何れの場合でも同等であった。上記カイコ、エリサンは、蛹化するまで飼育を継続した。【００６２】
同様に、カイコおよびエリサンの脱皮直後の5齢幼虫に核多角体病ウイルス液（カイコ50μＬ、エリサン100μＬ）を注射器で接種し、S25M5の15N標識チョウ目昆虫用人工飼料を摂食させ、25℃で飼育した。ウイルス感染による致死直後（カイコは接種後5日後、エリサンは9日後）の幼虫をフリーザー（−20℃）で冷凍保存した。凍結したカイコ及びエリサンの幼虫を少量のフェニルチオウレアを添加したリン酸緩衝塩類溶液中で摩砕し、3枚重ねのガーゼでろ過した。ろ液を3000回転 15分間の低速遠心分離にかけ、上清を除去した。得られた沈殿物に蒸留水を加え、懸濁し、数日間冷蔵（4℃）保存した。上記懸濁液を3000回転 15分間の低速遠心にかけ、上清を除去した。沈殿物を蒸留水：パーコール＝3：5に懸濁し、超遠心分離（日立ハイテクノロジーズ社製  SW27.5）を25000回転、30分間実施した。超遠心分離後の上清を除去し、粗精製多角体を含む沈殿を水洗後、約1mlの蒸留水に懸濁させた。多角体懸濁液を、50〜80％のショ糖密度勾配液に重層し、 20000回転で30分間、超遠心分離を行った。70％のショ糖付近に形成される多角体のバンドを注射器で回収し、蒸留水で10倍以上に希釈した後、希釈液を3000回転 15分間の低速遠心にかけ、上清を除去した。さらに数回水洗し、ショ糖を十分除去し、精製多角体を沈殿として回収した。【００６３】
S25M5の15N標識チョウ目昆虫用人工飼料及びコントロールの人工飼料であるＫ４０，ＫＳ２５で生育させたカイコ及びエリサンの繭の切片及び精製した核多角体の１５Ｎ含有率を質量分析計で測定した。その結果を表１０及び１１に示す。【００６４】
【表１０】
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【表１１】
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【００６５】
コントロールの非標識人工飼料では、カイコ及びエリサンの繭、核多角体何れの場合においても、質量分析による15Nの含有率は、窒素の天然存在量しか検出されなかったのに対し、15N標識チョウ目昆虫用人工飼料の場合では、カイコ及びエリサンの繭、核多角体全ての結果で高い15Nを検出した。
すなわち、15N標識チョウ目昆虫用人工飼料で飼育されたチョウ目昆虫が分泌した絹糸が極めて高い濃度の15Nで標識されていることを示した。さらに、15N標識されたチョウ目昆虫に核多角体ウイルスを感染させると、チョウ目昆虫の幼虫体内で増殖し、ウイルス粒子を包埋して形成された核多角体が非常に高濃度の15Nで標識されていることを示した。これは、安定同位体標識された昆虫を宿主とした核多角体病ウイルスによる安定同位体標識組換えタンパク質生産が可能であることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によって製造された生体物質は、安定同位体で高度に標識されているため、その立体構造をＮＭＲを用いて解析することができる。また、質量分析を用いて定性分析及び定量分析を行うことができる。よって、本発明は、バイオ産業において極めて有用である。
【国際調査報告】
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