(57)【要約】  本発明は、抗体医薬として利用可能なヒト型自己反応性抗体を作製する途を開く新規な抗体産生方法、およびその方法に有効に利用される抗体産生前駆細胞、並びに当該方法によって産生される抗体産生細胞を提供する。未分化Ｂ細胞の表面抗原マーカーを有する抗体産生前駆細胞をin vitroで作製し、これを免疫不全の非ヒト動物個体に移植して、当該動物の体内で抗体産生細胞に分化させることにより抗体を産生することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化Ｂ細胞を不死化することによって調製される、CD25またはB220のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項２】
SV40ラージT抗原および活性化型Ablが発現してなるプレＢ細胞である、請求項１記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項３】
増殖が温度依存性であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項４】
SV40ラージT抗原が温度感受性である請求項２に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項５】
抗体がＩｇＭである請求項１に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項６】
抗体産生前駆Ｂ細胞がマウス由来細胞である請求項１に記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項７】
非ヒト被験動物に移植し、当該動物の体内で抗体産生Ｂ細胞に分化調製するための、請求項１に記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項８】
IL7の存在下で、SV40ラージT抗原の遺伝子と活性化型Ablの遺伝子を初代培養骨髄細胞に導入する工程を有する、CD25またはB220のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞を製造する方法。
【請求項９】
更に、上記工程で得られた初代培養骨髄細胞を培養する工程を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
SV40ラージT抗原が温度感受性である、請求項８に記載する方法。
【請求項１１】
抗体がＩｇＭである、請求項８に記載する方法。
【請求項１２】
初代培養骨髄細胞がマウス由来細胞である、請求項８に記載する方法。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で分化させて製造される、抗体産生Ｂ細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至７のいずれかに記載される抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で抗体産生前駆細胞を抗体産生細胞に分化させることを特徴とする、抗体産生Ｂ細胞の製造方法。
【請求項１５】
抗体産生Ｂ細胞の製造のための請求項１乃至７のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗体産生技術に関する。より詳細には、本発明は、未分化Ｂ細胞の表面抗原マーカーを有する抗体産生前駆細胞をin vitroで作製し、これを動物個体に移植して生体内で抗体産生細胞に分化させる方法によって、抗体を産生する新規方法に関する。当該抗体産生技術は、抗体医薬として利用可能なヒト型自己反応性抗体を作製する途を開くものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞は、造血幹細胞からリンパ系幹細胞、プロＢ細胞、およびプレＢ細胞などを経て形質細胞へと分化し、抗体産生を行うことが知られている（非特許文献１参照）。形質細胞によって産生される抗体は各種解析に利用されるだけでなく、近年では抗体医薬や感染症等の診断薬として医療にも広く利用されており、抗体の需要は今後更に拡大することが予想される（非特許文献２参照）。抗体を、解析ではなく抗体医薬として利用しようとする際には、増殖因子受容体等の細胞表面のタンパク質を標的とする自己反応性抗体が必要とされることが多い（非特許文献３参照）。また、抗体医薬に利用する抗体は、免疫した宿主から得られる動物型の抗体ではなくヒト型である必要がある。これは、ヒト以外の型の抗体を投与すると、それ自身が抗原となり免疫応答を引き起こす危険性があるためである。【０００３】
抗体の作製法としては、動物個体を免疫して形質細胞を単離し、不死化した細胞と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、その中から目的の抗体を産生するクローンを選択する方法が一般的である。しかしながら、この従来の方法は以下に挙げる３つの問題を抱えている。【０００４】
(1)医療に利用可能な自己反応性の機能抗体を得るのは種類によっては困難である、
(2)遺伝子組換えを行うことにより宿主動物型からヒト型の抗体へと変換する操作は確立されてはいるが（非特許文献４参照）、手間と時間を要する、
(3)医療への利用を目的とせず宿主動物型の抗体を得たい場合であっても、免疫過程、抗体産生細胞選択過程に時間がかかるため、目的の抗体を得るまでに長い日数を要する。【０００５】
かかる問題点を解消するためには、動物個体を用いる従来の抗体作製方法では限界がある。
【非特許文献１】Matthias, P., Rolink, A.G. 2005. Transcriptional networks indeveloping and mature B cells. Nat. Rev.Immunol. 5: 497-508.
【非特許文献２】Alkan, S.S. 2004. Monoclonal antibodies: the story of a discovery that revolutionized science and medicine. Nat. Rev. Immunol. 4: 153-6.
【非特許文献３】Harlan W. Waksal. 1999. Role of an anti-epidermal growth factor receptor in treating cancer. Cancer and Metastasis Review 18: 427-436
【非特許文献４】Co MS, Deschamps M, Whitley RJ, Queen C. 1991. Humanized antibodies for antiviral therapy.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869-2873.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、in vitroでの新規な抗体産生方法を提供することを目的とする。好ましくは、抗体医薬として応用できる自己反応性抗体を作製可能な抗体産生方法、特にヒト型抗体の作製に応用可能な抗体産生方法を提供することを目的とする。また、本発明は抗体産生方法において得られる抗体産生細胞、ならびにその調製に使用される前駆細胞、好ましくは分化制御可能な前駆細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するアプローチの一つとして、本発明者らは、未分化Ｂ細胞を不死化し、in vitroで分化誘導を行って抗体産生細胞へと分化させて抗体を得る方法を考えた。既に、鶏の未熟Ｂ細胞株であるDT40においては、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるTrichostatin A（TSA）を用いた分化系が確立しているものの（Seo et al., 2005;参考文献１）、この方法は、特殊な鶏の細胞株を用いているため、ヒト形質細胞への応用が難しいという問題を含んでいる。【０００８】
そこで本発明者らは、ヒト細胞への応用を考慮して、レトロウイルスベクターを用いて癌遺伝子を導入することによってマウス未分化Ｂ細胞を不死化する技術開発を試みたところ、特定のサイトカインの存在下でSV40ラージT抗原及びv-Ab1の遺伝子を導入することによって得られた不死化細胞がプロＢまたはプレＢの段階にあるＢ細胞の表現抗原マーカーを有しており、次いでこれを動物個体に移植したところ、当該動物の体内でIgMを発現するＢ細胞へと分化することを見出し、当該分化細胞が、抗体産生細胞として有用であること、また上記in vitroで作製されるＢ細胞の表現抗原マーカーを有する細胞が、当該抗体産生細胞を作製するための材料、特に自己産生するための材料として有用であることを確信した。また、本発明者らは、上記マウス未分化Ｂ細胞の不死化に用いる癌遺伝子として、温度変化もしくは薬剤投与による機能制御が可能な遺伝子を用いることによって、Ｂ細胞の増殖と分化が自由に制御できることを確認した。【０００９】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有する。【００１０】
Ｉ．抗体産生前駆Ｂ細胞
（１）未分化Ｂ細胞を不死化することによって調製される、CD25またはB220のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞。
（２）SV40ラージT抗原および活性化型Ablが発現してなるプレＢ細胞である、（１）記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
（３）増殖が温度依存性であることを特徴とする、（１）または（２）記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
（４）SV40ラージT抗原が温度感受性である（２）または（３）記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
（５）抗体がＩｇＭである（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
（６）マウス由来細胞である（１）乃至（５）のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。
（７）被験動物に移植して当該動物の体内で分化させて抗体産生Ｂ細胞を作製するための（１）乃至（６）のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。【００１１】
II．抗体産生前駆Ｂ細胞の製造方法
（８）IL7の存在下で、SV40ラージT抗原の遺伝子と活性化型Ablの遺伝子を初代培養骨髄細胞に導入する工程を有する、CD25またはB220のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞を製造する方法。
（９）更に、上記工程で得られた初代培養骨髄細胞を培養する工程を有する、（８）に記載の方法。
（１０）SV40ラージT抗原が温度感受性である、（８）または（９）に記載する方法。
（１１）抗体がＩｇＭである（８）乃至（１０）のいずれかに記載する方法。
（１２）初代培養骨髄細胞がマウス由来細胞である（８）乃至（１１）のいずれかに記載する方法。【００１２】
III．抗体産生Ｂ細胞
（１３）（１）乃至（７）のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で分化させて製造される、抗体産生Ｂ細胞。【００１３】
IV．抗体産生Ｂ細胞の製造方法
（１４）（１）乃至（７）のいずれかに記載される抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で抗体産生前駆細胞を抗体産生細胞に分化させることを特徴とする、抗体産生Ｂ細胞の製造方法。【００１４】
V.抗体産生前駆細胞の使用
（１５）抗体産生B細胞の製造のための（１）乃至（７）のいずれかに記載される抗体産生前駆Ｂ細胞の使用。
【発明の効果】
【００１５】
現在、抗体は、研究分野に限らず、感染症等の診断薬や抗体医薬などとして医療にも広く利用されており、抗体の需要は今後更に拡大することが予想される。前述するように、動物個体を免疫することに基づく従来の抗体作製方法は、抗体医薬等の医療に利用可能な自己反応性抗体の取得が難しいことに加えて、免疫過程や抗体産生細胞選択過程に時間がかかり、その取得には多大の時間と労力を要するという問題がある。【００１６】
これに対して、本発明の抗体産生Ｂ細胞の製造方法ならびに抗体産生方法は、少ない労力で短期間に実施することができる。また本発明は、抗体産生細胞の作製に使用される前駆細胞をin vitroで調製し、免疫不全動物の体内で分化させて、抗体産生細胞ライブラリーを構築し、そのライブラリーの中から必要な抗体産生細胞を選択する方法であるため、自己反応性の機能抗体を調製することができる。特に本発明によれば、抗体産生Ｂ細胞としてＩｇＭ産生能を有するＢ細胞（IgM発現細胞）のライブラリーを提供することができる。【００１７】
本発明の抗体産生技術、並びに抗体産生細胞およびその前駆細胞は、医療分野で利用可能な抗体を作製する途を開くものとして意義あるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
Ｉ．用語の説明
Abl
「Ab1」は、マウスで白血病を起こすエイベルソンマウス白血病ウイルスが発現するタンパク質である（Abelson and Rabstein, 1970；参考文献２；Goff et al., 1982；参考文献３）。このウイルスは、RNAウイルスであり、逆転写を受けた後、宿主のゲノム内に組み込まれる。ウイルスが発現するタンパク質と宿主（マウス）が発現するタンパク質とはそれをコードするゲノム配列が類似しており、ウイルスが保持する遺伝子を「v-abl」（そのタンパク質は「v-Abl」）、宿主が保持する遺伝子を「c-abl」（そのタンパク質は「c-Abl」）と称されている。また「v-Abl」は、チロシンリン酸化酵素であり、細胞の形質転換には、その酵素活性が必要であることがわかっている。【００１９】
v-Ablとc-Abl
「c-Abl」は、N末端からSH3ドメイン、SH2ドメイン、キナーゼドメイン、プロリンリッチ領域、DNA結合領域、およびアクチン結合領域を有するタンパク質である ( reviewed in Hantschel and Superti-furga, 2004；参考文献４) 。一方のv-Ablは、上記c-AblのSH3ドメインが欠損しており、代わりにウイルス由来のGagタンパク質が融合している構造を有する (Shore et al., 2002；参考文献５)。c-Ablの酵素活性は厳密に制御されているため、細胞に過剰発現させても細胞内のチロシンリン酸化レベルはほとんど変わらないが、一方のv-Ablは恒常的な酵素活性を保持するため、細胞に過剰発現させると細胞内のチロシンリン酸化レベルが上昇する。本発明において「活性化型Abl」とは、c-Ablのチロシンリン酸化活性がより活性化され、より高いチロシンリン酸化活性を有するものを意味し、v-Abl、Bcr-AblおよびTel-Ab1はその好適なものとして例示することができる。また、c-AblのSH3ドメインを欠損したり、SH3ドメインに点変異を導入して、SH3ドメインの機能を欠失した変異型は、v-Ablと同等の恒常的チロシンリン酸化活性を有することから（Jackson and Baltimore, 1989；参考文献６）、本発明でいう「活性型Abl」に含まれる。【００２０】
ところで「活性型Abl」の一つであるv-Ablは、in vivoまたin vitroにおいて、プレＢ細胞を癌化（不死化）し、その結果、成熟Ｂ細胞に分化するために必要な免疫グロブリン遺伝子の再構成が生じないことが知られている（Rosenberg, 1994;参考文献７）。AblのインヒビターであるSTI571(Imanitib, Gleevec)（Druker et al., 1996;参考文献８）で処理することによって、v-Ablで癌化したプレＢ細胞は、再び免疫グロブリンの再構成を始めることからも、v-AblがプレＢ細胞の癌化にとって必要であるといえる（Muljo and Schlissel, 2003；参考文献９）。【００２１】
SV40
SV40は、ポリオワクチン作成の際に用いられたサルの腎臓細胞への汚染ウイルスとして見つかったウイルスである。ハムスターに感染させると腫瘍を形成することから、ワクチン接種を受けた人に対する癌化の観点で初期の研究が進行された。【００２２】
SV40 T 抗原
試験管内での細胞レベルでの癌化を形質転換というが、上記SV40の形質転換能（癌化能）は主にT抗原にあることが知られている（Graham et al., 1975；参考文献１０）。SV40 T抗原遺伝子は、オルタナティブ・スプライシングによりLarge T抗原(LT)とSmall T抗原（ST）を発現する（Rundell and Parakati, 2001；参考文献１１）。LTは癌抑制遺伝子産物であるp53とRBに結合し不活性化することが知られている。また、STはセリン・スレオニンホスファターゼであるPP2A に結合し不活性化することが知られている。【００２３】
初代培養細胞の不死化
初代培養細胞は、試験管内で数回継代を重ねると細胞老化を起こすことが知られている。マウス胎児繊維芽細胞（MEFs）は、p19ARF/p53経路が不活性化されると、老化を乗り越え不死化することが知られている（Kamijo et al., 1997；参考文献１２）。また、p53ノックアウトマウスから調製したMEFsは、細胞老化を経ることなく増殖する。【００２４】
なお、SV40 T抗原（主にLT）は、p53を不活性化することによって、げっ歯類の初代細胞を不死化させることが、変異型T抗原を用いた実験より明らかにされている(Jat and Sharp, 1986；参考文献１３)。【００２５】
温度感受性SV40 T抗原
SV40 T抗原の機能として初期に注目されたのは、ウイルスゲノム複製における役割である。温度感受性変異株を用いた実験から、許容温度下の33.5℃ではウイルスの複製が起こるが、非許容温度下の39℃では複製が起こらない変異株が見つかった。その温度感受性変異株の一つからクローニングされT抗原の変異が同定されたのが、tsA58(以下、tsTと省略)である（Tegtmeyer and Ozer, 1971;参考文献１４）。tsTは許容温度下の33.5℃では発現がみられるが、非許容温度下の39℃では発現が消失する。これは、tsTが39℃で分解しやすいためだと考えられている (Ray et al., 1992；参考文献１５)。【００２６】
tsTは、初期の研究においてはウイルスの機能を知るために用いられたが、その後、細胞の不死化などに利用されている。Jat等は、tsTを発現した初代細胞は、許容温度下の33.5℃では細胞が増殖するが、非許容温度下の39℃では増殖が停止することをみつけた（Jat and Sharp, 1989；参考文献１６）。このためtsTの利点として下記を挙げることができる。
(1)細胞の増殖を制御することができるため、例えば、目的細胞の増殖を停止させたり、分化誘導することが可能となる、
(2)Ｔ抗原を発現することで不死化した細胞について、不死化の原因が導入したＴ抗原の発現にあるか否かを検証することができる。【００２７】
前述のJat等は、この技術を個体に発展させ、主要組織適合遺伝子複合体H-2Kbのプロモーターの下流でtsTを発現するトランスジェニックマウスを作成し、ほぼ全ての組織でtsTを発現させることを可能にした。これにより様々な組織から得られた初代細胞は、tsTを発現しているため許容温度下の33.5℃で不死化していることが示された（Jat et al., 1991；参考文献１７）。またtsTトランスジェニックラットなども作成され、様々なセルラインが樹立されている（Obinata, 2001；参考文献１８）。Jat等は、tsTとヒトテロメレースの補酵素であるhTERTを用いることにより、不死化が難しいと言われているヒト細胞を不死化することにも成功している（O'Hare et al., 2001；参考文献１９)。【００２８】
サイトカイン「IL-3」
「IL-3」は、Ｔ細胞において20αヒドロキシステロイド脱水素酵素（20α-SDH）を誘導する液性因子として同定された約25kDaの糖タンパク質であり、そのcDNAは1984年に単離された。IL-3の主な作用は血液細胞の増殖である。IL-3はその発現がT細胞や肥満細胞特異的で抗原刺激依存的であることから、炎症時などに働く反応性のサイトカインと考えられている。その作用は造血幹細胞を含む比較的未分化な造血細胞の増殖・分化の促進、肥満細胞の増殖促進、ヒスタミン放出の刺激などが知られている。また、IL-3のＢ細胞の増殖・分化に対する作用は、in vitroにおいて、マウスリンパ系前駆細胞のＢ細胞への分化を阻害するとの報告がある一方で、ヒトリンパ系前駆細胞においては分化を促進するという報告もあり、IL-3のＢ細胞に対する作用は未だ不明ではある。【００２９】
サイトカイン「IL-6」
「IL-6」は、Ｂ細胞の形質細胞への最終分化を誘導するＢ細胞分化因子（BSF-2）としてcDNAがクローニングされたサイトカインである。その後、IL-6は免疫応答のみならず造血系および神経系の細胞増殖や分化、急性期反応に関与し、さらに種々の免疫異常や炎症性疾患、リンパ系腫瘍の発症とも関係していることが明らかになった。IL-6はB細胞の増殖や分化に関わる因子として重要であるとされている。特に分化に対する作用としては、未成熟B細胞から成熟Ｂ細胞への分化に関与するとの報告がある。【００３０】
サイトカイン「IL-7」
「IL-7」は骨髄のストローマから分泌され、プレＢ細胞の増殖を促進するサイトカインとして、1988年にcDNAが単離された（Namen et al., 1988；参考文献２０）。IL-7のmRNAが胸腺にも発現していることからT細胞の発達との関わりについても調べられた結果、胸腺細胞や成熟T細胞に対し、増殖促進因子として作用することも報告された。ヒトIL-7は177アミノ酸として作られた後、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断され、最終的に152アミノ酸が分泌される。ヒトとマウスのIL-7は、アミノ酸レベルでは60%の相同性がある。また、ヒトIL-7はヒトとマウスの両方で活性を示すが、マウスIL-7はヒトに対しては活性がないことが知られている。IL-7はＨ鎖再構成が始まるプロＢ細胞の時期に必須の因子であり（Grabstein et al., 1993; 参考文献２１）、細胞の増殖を促進することが知られている。IL-7を欠損したIL-7ノックアウトマウスは、極端なリンパ球減少症およびリンパ期間の形成不全を呈する（von Freeden-Jeffry et al., 1995；参考文献２２）。【００３１】
II．抗体産生前駆Ｂ細胞及びその製造方法
本発明が提供する抗体産生前駆Ｂ細胞は、それ自体に抗体を産生する能力はないものの、抗体を産生するＢ細胞（抗体産生Ｂ細胞）へと分化する能力を潜在的に有しているＢ細胞である。すなわち本発明の抗体産生前駆Ｂ細胞は、抗体産生Ｂ細胞の前駆細胞として位置づけることができる。なおここで抗体は、好適にはＩｇＭである。【００３２】
具体的には、当該抗体産生前駆Ｂ細胞は、抗体（IgM）は発現しないものの、表面抗原として、Ｂ細胞でそれぞれの分化段階を通じて広く発現しＢ細胞のマーカーとして汎用されている表面抗原B220、またはプロＢ〜プレＢ細胞で発現する表面抗原CD25のいずれか少なくとも１つを発現していることを特徴とする。【００３３】
かかる性質を有する抗体産生前駆Ｂ細胞は、未分化Ｂ細胞を不死化することによって調製することができる。【００３４】
未分化Ｂ細胞としては、動物、好ましくは哺乳動物の骨髄細胞から採取される造血幹細胞またはリンパ系前駆細胞を挙げることができる。好ましくは非ヒト哺乳動物に由来する造血幹細胞またはリンパ系前駆細胞である。より好ましくはラット、マウス、ハムスター、ウサギ、モルモット等のげっ歯動物、特に好ましくはマウスに由来する造血幹細胞またはリンパ系前駆細胞である。【００３５】
未分化Ｂ細胞を不死化する方法は、特に制限されないが、好ましくは未分化Ｂ細胞を癌化する方法を挙げることができる。【００３６】
未分化Ｂ細胞の癌化には、Ｂ細胞を癌化（不死化）する性質を有する活性化型Ablを用いることができる。具体的には、未分化Ｂ細胞に活性化型Ablの遺伝子を導入して発現させる方法を挙げることができる。かかる活性化型Ablとしては、マウスにおいてプレＢ細胞を癌化（不死化）することが知られているv-Abl（Rosenberg, 1994）、c-AblのSH3ドメインを欠損する等によってチロシンリン酸化活性がc-Ablに比して上昇してなる各種c-Abl変異型（Jackson and Baltimore, 1989；参考文献２３）、Bcr-Abl、およびTel-Ab1を挙げることができる。そして、ここでいうプレB細胞は、例えば、これに限定はされないが、表面抗原マーカがB200ポジティブ、CD25ポジティブ、IgMネガティブな細胞を含む細胞、として定義できる（Martensson, 2000；参考文献２４）。【００３７】
好ましくは、v-Ablである。ここでBcr-Ablは、ヒトにおいて癌遺伝子として機能し（Wong and Witte, 2004;参考文献２５）、Ｂ細胞を癌化することが知られている活性化型Ablである。Tel-AblもBcr-Ablと同様に、ヒトにおいて癌遺伝子として機能し、リンパ細胞を癌化することが知られている活性化型Ablである。よって、未分化Ｂ細胞としてヒト由来の細胞を用いる場合、その癌化（不死化）にはBcr-AblまたはTel-Ablを好適に使用することができる。【００３８】
なお、未分化Ｂ細胞の不死化（癌化）は、人為的に制御できることが好ましい。未分化Ｂ細胞の不死化（癌化）を制御する方法としては、上記活性化型Ablの機能発現をAbl阻害剤によって制御する方法を挙げることができる。Abl阻害剤としては、制限されないが、例えばSTI571（Imatinib, Gleevec）(Druker et al., 1996;参考文献２６）、PD173955 (Nagar et al., 2002;参考文献２７)、AMN107 (Weisberg et al., 2005；参考文献２８)、BMS-354825(Shah et al., 2004; 参考文献２９)、ON012380(Gumireddy et al., 2005;参考文献３０)、PD166326(Wolff et al., 2005;参考文献３１)、およびAP23464 (O’Hare et al., 2004；参考文献３２)を例示することができる。【００３９】
ところで、活性化型Abl、特にv-Ablを未分化Ｂ細胞（リンパ系前駆細胞）に感染させると、癌遺伝子に対する防御機構として、p53依存的なアポトーシスが生じる（Radfar et al., 1998；参考文献３３）。このため、未分化Ｂ細胞の不死化（癌化）に際しては、未分化Ｂ細胞への上記活性化型Abl遺伝子の導入と並行して、p53を不活性化することでアポトーシスを防止することが好ましい。【００４０】
p53の不活性化処理は特に制限されないが、公知の方法を用いることが出来る。非ヒト細胞におけるp53の不活性化に関しては、遺伝子改変動物が利用可能である。具体的には、p53ノックアウトマウスやp53を不活性化する癌遺伝子を発現するトランスジェニックマウスやラットを挙げることが出来る。特にヒト細胞への応用も考慮するならば、優先不全型p53を発現させる、siRNAによりp53 mRNAのノックダウンを行うなどの方法を挙げることが出来る。また、p53のシグナル伝達経路に関わる分子の制御に関しては、限定はされないが、p53の上流に位置しp53のユビキチンを介した分解に関与するMDM2を過剰発現する方法や、MDM2のネガティブレギュレーターであるp19をsiRNAにより不活性化するなどの方法を挙げることができる。ウイルス癌遺伝子を用いるp53の不活性化方法としては、限定はされないが、ヒトパピローマウイルスのE6を発現させる、アデノウイルスのE1Bを発現させるなどの方法をあげることが出来る。特に好ましくは、p53を不活性化することが知られているSV40 T抗原の遺伝子を初代骨髄細胞に導入して発現させることが出来る。T抗原は、オルタナティブ・スプライシングによりLarge T抗原(LT)とSmall T抗原(ST)を発現することが知られている。p53の不活性化にはLTが必要なことから、T抗原の中でもLTを好適に用いることが出来る。この時、T抗原の発現を自由に制御できることが好ましい。T抗原の発現制御に関しては、限定はされないが、温度制御により機能のON/OFFが可能な温度感受性Ｔ抗原(tsT)を用いることが出来る(Jat and Sharp, 1989；参考文献３４)。温度感受性変異部位はSTではなくLTに含まれるため、より好ましくは温度感受性のLT(tsLT)である。tsTは、ヒトへの応用も可能であり(O’Hare et al., 2001；参考文献３５)、不死化にはLTが大きく寄与するため、 本発明の技術(tsLT)は、ヒト細胞に応用可能であると考えられる。なおtsLTは、p53以外にもがん抑制遺伝子産物であるRBなどを不活性化することが知られており、tsLTを用いた場合には、p53不活性化以外の効果も期待することができる。【００４１】
未分化Ｂ細胞の不死化方法としては、具体的には、例えば上記活性化型AblとT抗原の両方の遺伝子を未分化Ｂ細胞を含む初代培養骨髄細胞に導入し、これらを発現させる方法等を挙げることができる。【００４２】
未分化Ｂ細胞を含む初代培養骨髄細胞は、定法に従って調製することができる（例えば「機能細胞の分離と培養」、三井洋司ら、第131-138頁、1988年、丸善など参照）。【００４３】
また未分化Ｂ細胞を含む初代培養骨髄細胞は商業的に入手可能であり、簡便にはこれを用いることもできるし、また生体から直接取りだした骨髄細胞を市販の初代培養細胞培養キットを用いて調製することもできる。【００４４】
初代培養骨髄細胞（未分化Ｂ細胞）に活性化型AblとT抗原の遺伝子を導入する方法としては、特に制限されないが、好適にはレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。具体的には、活性化型Ablの遺伝子とT抗原の遺伝子を有するレトロウイルスベクター、または活性化型Ablの遺伝子を有するレトロウイルスベクターとT抗原の遺伝子を有するレトロウイルスベクターとを調製し、これを用いて、初代培養骨髄細胞（未分化Ｂ細胞）を形質転換（感染）する方法を用いることができる。【００４５】
ここで活性化型Ablの遺伝子およびT抗原の遺伝子を導入するために用いられるレトロウイルスベクターとしては、制限されないが、一例として、pFB neoベクター  Neomycin耐性(Stratagene)、pLNCX2ベクター Neomycin耐性(Clontech)、pLHCX ベクター HygromycinB耐性(Clontech)、pLPCX ベクター Puromycin耐性(Clontech)、pDON-AIベクター  Neomycin耐性(Takara)、pBabe ベクター(Morgenstern and Land, 1990；参考文献３６)、pMX ベクター  (Onishi et al., 1996；参考文献３７)、pCX ベクター(Akagi et al., 2000；参考文献３８)、pCX4 ベクター(Akagi et al., 2003；参考文献３９)、MSCVベクター(Hawley et al., 1994；参考文献４０)、MNDベクター(Halene et al., 1999；参考文献４１)、およびMFG-Sベクター(Riviere et al., 1995；参考文献４２)を挙げることができる。【００４６】
ここでレトロウイルスは増殖する細胞にしか目的の遺伝子を組み込むことができない。そこで初代培養骨髄細胞（未分化Ｂ細胞）を選択的に増殖させる方法として、初代培養骨髄細胞（未分化Ｂ細胞）をサイトカインで処理する方法を挙げることができる。かかる方法として、具体的には、初代培養骨髄細胞（未分化Ｂ細胞）をインフェクション（レトロウイルスベクターによる活性化型AblとT抗原の遺伝子の導入）の前に予めサイトカインで処理して増殖能を付与するか、またはサイトカイン存在下でインフェクション（レトロウイルスベクターによる活性化型AblとT抗原の遺伝子の導入）を行う方法を挙げることができる（例えば、「新細胞工学実験プロトコール」、東京大学医科学研究所  制癌研究部、第163-170頁、1993年、秀潤社）。【００４７】
なお、ここで用いられるサイトカインとしては、Ｂ細胞の分化の初期に必要とされるInterleukin-7 （IL-7）、Flt3 ligand（FL）、kit ligand （SCF）を挙げることができる。好ましくはInterleukin-7（IL-7）である。【００４８】
斯くして調製される細胞の中から、上記サイトカイン、好ましくはInterleukin-7の存在下で浮遊細胞として増殖する細胞を選択することによって、CD25またはB220のいずれかの表面抗原を発現してなる本発明の抗体産生前駆Ｂ細胞として取得することができる。【００４９】
当該抗体産生前駆Ｂ細胞は、それ自体に抗体を産生する能力はないものの、抗体を産生するＢ細胞（抗体産生Ｂ細胞）へと分化する能力を潜在的に有している。このため、抗体産生Ｂ細胞を作製するための材料として有効に利用することができる。【００５０】
III．抗体産生Ｂ細胞およびその製造方法
さらに本発明は、抗体産生Ｂ細胞およびその製造方法を提供する。本発明が提供する抗体産生Ｂ細胞は、抗体産生能、好適にはＩｇＭを産生する能力を有するものである。かかる抗体産生Ｂ細胞は、前記本発明の抗体産生前駆Ｂ細胞を免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で分化させることによって製造することができる。【００５１】
ここで免疫不全動物としては、非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物を挙げることができる。より好ましくはラット、マウス、ハムスター、ウサギ、モルモット等のげっ歯動物であり、特に好ましくはマウスである。なお、免疫不全マウスとして商業的に入手できるものとしてはNOD/SCIDマウス、SCIDマウス、およびnudeマウス（以上、日本クレアなど）を挙げることができる。【００５２】
抗体産生前駆Ｂ細胞の移植方法としては、特に制限されないが、例えば簡便な方法として、抗体産生前駆Ｂ細胞を静脈中に入れる方法や当該細胞の腹腔内注射などを挙げることができる。なお、免疫不全動物の飼育は特に制限されず、定法に従うことができる。例えば、感染予防を施した環境下で滅菌処理した飼料や水を摂取させて飼育する方法を挙げることができる。【００５３】
抗体産生Ｂ細胞は、免疫不全動物に抗体産生前駆Ｂ細胞を移植し、一定期間飼育して生体内で分化させた後、骨髄または脾臓から採取した骨髄細胞または脾臓細胞から調製することができる。なお、当該骨髄細胞または脾臓細胞は、制限されないが、通常、免疫不全動物に抗体産生前駆Ｂ細胞を移植した後、２週間程度の飼育後に回収することができる。骨髄細胞または脾臓細胞から抗体産生Ｂ細胞を調製する方法としては、特に制限されないが、抗ＩｇＭ抗体を指標として、FACS vantage (BD biosciences)で細胞を分取し、さらに必要に応じて分取した細胞をin vitroで増殖させる方法を例示することができる。【００５４】
斯くして調製される抗体産生Ｂ細胞は、抗体産生能、とくにＩｇＭを産生する能力を有しており、抗体産生材料として好適に使用することができる。特に当該抗体産生Ｂ細胞は、自己反応性抗体が産生できる可能性がある点で有用な抗体産生材料である。本発明が提供する抗体産生Ｂ細胞は、好適にはＩｇＭ発現細胞であるが、クラススイッチ誘導を行うことにより、ＩｇＧ発現細胞に変換することも可能である。なお、ＩｇＭ発現細胞からＩｇＧ発現細胞に変換するためのクラススイッチ誘導法については一部、効率は低いが論文で報告されている（Cerutti，et al.,1998；参考文献４３）。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の未分化B細胞を非ヒト免疫不全動物内で抗体産生細胞へと分化させる方法は、将来的に本来の動物個体の抗体産生システムでなく、インビトロで抗体産生細胞のライブラリーを作成する方法を提供し得る。また、本発明はヒト細胞にも適用し得る。ヒト未分化B細胞を非ヒト免疫不全動物内で抗体産生細胞へと分化させる方法はいまだ確立していない。ヒト細胞を使った該方法が実施できれば、ヒト抗体産生細胞を製造することも可能である。該ヒト抗体産生細胞が多様な抗体を産生する場合、抗体産生細胞はライブラリーとして製造し得る。そのライブラリーは抗体医薬のスクリーニングにおいて、基本的な抗体医薬の候補を提供しうる。従って、本発明の方法は、新規で画期的な抗体医薬の製造方法を提供するという産業上の利用可能性がある。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明をより詳細に示すために実験例を示す。【００５７】
なお、各操作は、下記の実験例に具体的に示す操作に限られず、遺伝子組換え技術の一般方法、例えば Molecular Cloning.(1989),(Cold Spring Harbor Lab.) に記載の方法に従って行うこともできる。これらの操作に使用されるベクター、発現キットおよびパッケージング細胞は商業的に入手可能であり、簡便にはそれを用いて製造販売者の推奨するマニュアルに従って実施することができる。例えば、クロンテック（株）からは、発現キットとして、パントロピックウィルス発現系、MSCVレトロウィルス発現系、RevTet-On & RevTet-Off遺伝子発現系が、またパッケージング細胞（システム）としてEcoPack2-293 Cell Line、AmphoPack-293 Cell Line、RetroPack PT67 Cell Line、Retro-X Universal Packaging Systemを入手することができる。またタカラバイオからはRetrovirus Packaging Kit Eco、Retrovirus Packaging Kit Amphoを、さらにINGENEXからはRetroMax（商標）Retrovirus Systemを入手することができる。【００５８】
なお、下記の実験例の記載において、「％」とは特に言及しない限り「重量％」を意味する。【００５９】
実験例１    不死化の検討
（１）骨髄細胞の調製
野生型マウス（C57BL/6J、日本クレア）から骨髄細胞を採取し、0.8% NH4Cl溶液を用いて赤血球画分を除去した。得られた白血球画分を、10 容量% FBS、50mM 2-Mercaptoethanol、および抗生物質 (Antibiotic-Antimycotic; Gibco）を添加したRPMI 1640（日研生物医学研究所）に懸濁し、これにIL-3、IL-6、IL-7を単独あるいは3種組み合わせて、最終濃度が培養液の2容量%になるようにコンディションド培地（下記参照）に添加し、33.5℃、5容量％CO2で培養した。なお、IL-3、IL-6、およびIL-7は、当該サイトカインをその培養上清に放出するサイトカイン過剰発現細胞（それぞれWI3、WI6、WI7: 東京医科歯科大の烏山先生より分与）を使って調製した。そして、当該サイトカインを含む培養上清（コンディションド培地）を骨髄細胞と共に培養した。【００６０】
（２）癌遺伝子tsLT発現ベクターの調製
癌遺伝子として導入したtsLTは、以下の方法で作成した。pZip neo SV40 tsT(University College London、Jat博士から分与)を鋳型に、Pfu ポリメラーゼ (Stratagene)を用いて１番目のエキソンを5’-ggatccagatggataaagttttaaacagagag-3’ （配列番号１）と 5’-ccataggttggaatctcagttgcatcccagaagcct-3’（配列番号２）のプライマー、２番目のエキソンを5’-ggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaat-3’（配列番号３）と5’-ggatccttatgtttcaggttcaggttcagggggag-3’（配列番号４）のプライマーで増幅後、それぞれの増幅された断片を更に5’-ggatccagatggataaagttttaaacagagag-3’（配列番号５） と 5’-ggatccttatgtttcaggttcaggttcagggggag-3’（配列番号６）のプライマーで増幅し、得られた完全長のtsLTをpCRBlunt (Invitrogen) に挿入し、そのシークエンスを確認した。その後、得られた完全長のtsLTをレトロウイルスベクターpCX4 puro（大阪バイオサイエンス研究所、赤城先生より分与）に挿入した（以下、このtsLT発現べクターを、「pCX4puro tsLT」という）。このべクターを発現する細胞は、puromycinに対する抵抗性を持つので、薬剤選択が可能である。【００６１】
（３）v-Abl発現ベクターの調製
v-Abl（Columbia University、Goff博士より分与）を、レトロウイルスベクターpCX GFPに挿入することによりv-Abl発現ベクターを作成した（以下、このv-Abl発現ベクターを、「pCX GFP v-Abl」という）。なお、レトロウイルスベクターpCX GFPは、pEGFP-C1 (BDBiosciences) から切り出したEGFP断片を、bsr領域を取り除いたpCX bsrベクター（大阪バイオサイエンス研究所、赤城先生より分与）に挿入することで作成した。このべクター（pCX GFP v-Abl）を発現する細胞は、GFP（Green Fluorescent Protein）を発現するので、セルソーターにより分取が可能である。【００６２】
（４）インフェクション
ウイルス感染のため、tsLT発現べクター（pCX4 puro tsLT）をpGPおよびpeEco（Takara）とともにFugene6 (Roche)を用いてレトロウィルスパッケージング細胞、PLT-E（東京大学医学研究所、北村先生より分与）にトランスフェクションした。具体的には、pCX4 puro tsLT、pGP、peEco（Takara）、Fugene6 (Roche)およびPLT-Eを培養液（10% FBSと抗生物質[Antibiotic-Antimycotic; Gibco]を含むDMEM）に懸濁して、37℃、5容量％CO2で培養し、24時間後、培養液を交換し、更に24時間培養した後、培養上清を回収した。得られたウイルスを含む培養上清を、4℃, 8000 gで16 時間遠心し濃縮させて、細胞に感染させた。【００６３】
また、pCX4 puro tsLTウイルス感染2日後、この細胞にv-Abl発現ベクター（pCX v-Abl GFP）を、上記と同様の方法でPLT-E細胞にインフェクションして得られたウイルスを含む培養上清を濃縮後、細胞に感染させた。【００６４】
（５）サイトカイン存在下での培養
tsLTとv-Ablを導入した細胞を、サイトカイン非存在下、IL-3存在下、IL-6存在下、IL-7存在下、あるいはIL-3、IL-6およびIL-7の存在下で、33.5℃、5容量％CO2条件で培養し、増殖の状況を観察した。【００６５】
結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2007060864.tif 000002
【００６７】
表中の○印は増殖が確認されたことを、△は細胞数が維持されたことを、×印は増殖及び維持が確認されなかったことを示している。【００６８】
約2ヵ月後、IL-7の存在下で、tsLTとv-Ablを導入した細胞が浮遊細胞として増殖していることが確認された。IL-3、IL-6、及びIL-7の全てを添加した条件下では、tsLT単独、もしくはtsLTとv-Ablを導入した場合に接着細胞の増殖が確認された。IL-3単独、もしくはIL-3、IL-6およびIL-7の全てを添加し、v-Abl単独を導入した条件下では細胞数は維持されたものの、増殖は確認できなかった。また、結果は載せていないがtsLT、v-Ablを導入しない条件下では細胞の維持及び増殖は確認されなかった。【００６９】
未分化Ｂ細胞は浮遊細胞であるため、IL-7, tsLT, v-Ablの条件下で増殖してきた浮遊細胞群に含まれる可能性が示唆された。このため、以下、この条件で増殖した細胞群の解析を行うこととした。【００７０】
実験例２     不死化細胞の表面抗原の解析
IL-7の存在下でtsLTおよびv-Ablを発現させた条件で不死化された細胞の表面抗原をFACScan（BD Biosciences)により解析した。解析した表面抗原は、Ｂ細胞でそれぞれの分化段階を通して広く発現し、Ｂ細胞のマーカーとして汎用されているB220、プロＢ細胞〜プレＢ細胞で発現することが知られているCD25、免疫グロブリン遺伝子の再構成が完了したプレＢ細胞以降で発現が見られるIgMである。これらの各表面抗原を解析するために、抗体として、B220用にPerCP-conjugated anti-mouse CD45R/B220 抗体(BD Biosciences)、CD25用にPE-Cy5-conjugated anti-mouse CD25抗体（eBioscience）、IgM 用にPE-conjugated anti-mouse IgM 抗体（BD Biosciences）を用いた。また、不死化された細胞がv-Ablを発現しているかを確認するために、GFPの発現を調べた。結果を図１に示す。【００７１】
解析の結果、GFP陽性かつB220陽性細胞は78.9 容量%（図１ａ）、GFP陽性かつCD25陽性細胞は68.8容量 %（図１ｂ）であった。GFP陽性かつIgM陽性細胞については、ほとんど確認することができなかった（図１ｃ）。また、図中に示していないがGFP発現細胞は83 容量% であった。このことは、増殖してきたほとんどの細胞（83容量％）が、v-Ablを発現していることを示している。これらの結果から、IL-7, tsLT,およびv-Ablの条件下で不死化された細胞群にはＢ細胞系列の細胞が含まれ、その分化段階はプロＢ〜プレＢである可能性が示された（図１参照）。更に、IgMの発現はほとんど見られなかったことから、IL-7, tsLT,およびv-Ablの条件下で不死化された細胞は、遺伝子再構成が完了してIgMが発現する以前の未分化Ｂ細胞（例えば、限定はされないが、プレB細胞を含む）であると考えられた。【００７２】
実験例３    AT1細胞の温度依存性増殖とtsLTおよびv-Ablの発現確認
（１）AT1細胞の調製
IL-7, tsLT, v-Ablの条件で不死化された細胞群は、その大部分が大きさの一様な浮遊細胞であったものの、大きさの異なる接着系細胞や浮遊細胞も含まれていた。このため、同様の大きさと内部構造を有する細胞をFACS vantage（BD Biosciences)を利用して、Forward scatterとSide scatterで展開したのち選択し、更にv-Ablを発現する細胞を、GFPを指標として分取した。このv-Ablを発現する細胞を4μg/mlのpuromycinで処理したところ、細胞が死ななかったことから、当該細胞は同時にtsLTを発現している可能性も示唆された。この分取し、且つ薬剤選択を行った細胞群を、「AT1細胞」と名づけ、以下の実験を行った。【００７３】
(２）AT1細胞の温度依存性増殖
AT1細胞が温度依存的に増殖を行うかについて調べた。具体的には、105個のAT1細胞を12 well(22mm)のプレートに播種し、33.5℃ で培養した。24時間後、温度を33.5℃から39℃へシフトさせた。温度シフトさせた地点を0時間とし、24時間ごとに細胞数を数え（24時目、48時間目、72時間目）、３回の独立した実験の平均値を求めた。結果を図２ａに示す。図中、●は、33.5℃で継続的に培養した場合の細胞数の増加を、また▲は33.5℃から39℃にシフトし72時間培養した場合の細胞数の増加を示す。  なお、エラーバーは標準偏差で示してある。  図2aに示すように、33.5℃では細胞は安定に増殖するのに対し、39℃に温度をシフトすると細胞の増殖が抑えられた。これは、AT1細胞の増殖が、温度感受性tsLTの発現に依存していることを示唆している。【００７４】
次に、これらのAT1細胞が実際にtsLT、およびv-Ablを発現しているかをウエスタンブロットにより調べた。特にtsLTに関しては、さらにLTの発現が温度依存的に減少しているかについても調べた。具体的には、33.5℃で培養した細胞（BM(33.5℃)）、39℃で培養して24時間後の細胞（BM(39℃)24hr）、またv-Ablによって癌化したB細胞株であるAbe8（ABE-8）を、v-Abl発現のポジティブコントロールとし、それぞれの細胞について各種タンパク質（v-Abl、c-Abl、Large T、β-Actin）の発現を調べた。セミコンフルエントの細胞をlysis buffer (1容量% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM NaCl, 30 mM sodium pyrophosphate, 50 mM sodium fluoride, 20 mM β-glycerophosphate, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM sodium vanadate, 20 μg/ml aprotinin, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)に溶解し、BCA protein assay reagent (Pierce)によりタンパク質量を定量し、10μｇを10% SDS-PAGEで電気泳動を行った。【００７５】
30分のブロッキングの後、１次抗体（anti-Abl抗体(8E9; Pharmingen)、anti-LT抗体(pAB101; Pharmingen)、anti-β-Actin抗体(Ac-74; Sigma)）を終夜で反応させた。なお、使用した抗体のうち、anti-Abl抗体(8E9; Pharmingen )とanti-LT抗体(pAB101; Pharmingen )は5%スキムミルク-TBSTに希釈し、anti-β-Actin抗体(Ac-74; Sigma)は、5% BSAに希釈して用いた。許容温度である33.5 ℃で培養した細胞は、tsLTの発現が確認されたものの、非許容温度の39.0℃で培養した細胞では、tsLTの発現が有意に減少していた（図 2b、2段目）。v-Ablは、33.5℃、39.0℃ともに発現しており、細胞株であるAbe8と同等のv-Ablを発現していることが分かった。（図 2b、1段目）。 なお、１段目の下のバンドは、内在性のc-Ablである。また、β-Actinは、それぞれの細胞において等しく発現していることが確認された（図 2b、3段目）。以上の結果は、AT1細胞がtsLTとv-Ablの両方の発現によって不死化していることを示している。【００７６】
実験例４    AT1細胞のIL-7依存性
次にAT1細胞のIL-7依存性について調べた。具体的には、まず105個のAT1細胞を12well(22mm)のプレートに播種し、33.5℃でIL-7有り、またはIL-7無しの条件で培養を行った（33.5℃）。培養開始後、24時間毎に4日間にわたって細胞数の計測を行い、３回の独立した実験の平均値を求めた。結果を図３に示す。図中、●はIL-7存在下で培養した場合のAT1細胞数の増加（IL-7(＋)）を、また▲はIL-7非存在下で培養した場合のAT1細胞数の増加IL-7(−)を示している。なお、エラーバーは標準偏差で示してある。図３に示す通り、IL-7の有無によるAT1細胞の増殖に、有意な差は認められなかった。このことから、不死化AT1細胞の増殖は、IL-7に非依存的である可能性が示唆された。IL-7の非存在下で、tsLTとv-Ablを発現させても、増殖する浮遊細胞が見られなかったことから（表１）、IL-7は未成熟なB細胞を不死化する初期には必要であるが、不死化した細胞の維持には必要ではないことが示唆された。【００７７】
実験例５    AT1細胞のin vitroにおける分化能の検討
AT1細胞を用いて抗体を産生させることが可能かどうかを調べるために、in vitroでIgM発現誘導を試みた。まず2 x 105個の細胞を、35-mmプレートに播種し、IL-7存在下、33.5℃で、以下の条件で培養を行った。【００７８】
（a） 骨髄（BM）由来の間葉系細胞（BM stroma; p53の不活性化により不死化している）との共培養。
（b） 成熟B細胞への分化に関与するとされるIL-6の存在下での培養。
（c） Trichostatin A（Wako）（Seo et al., 2005；参考文献４４）の存在下での培養。
（d） IL-6とTrichostatin Aの存在下での培養。【００７９】
IL-6については、サイトカイン過剰発現細胞（WI-6：東京医科歯科大の烏山先生より分与）を3日間培養した後の上清をコンデイションドメディウムとして、これを最終濃度が培養液の5容量%になるように加えた。また、Trichostatin Aについては2.5 ng/ml となるように添加した。【００８０】
培養開始3週間後に、細胞をPerCP-conjugated anti-mouse CD45R/B220 抗体（BD Biosciences）、PE-conjugated anti-mouse IgM 抗体（BD Biosciences）により染色を行い、B220,およびIgMの発現変化をFACScanにより調べた。結果を図４に示す。【００８１】
図４からわかるように、B220に関しては、Trichostatin Aを加えることで、B220陰性の細胞が増殖しているように思われたが、IgMに関しては、全ての条件において顕著な変化は確認されなかった。従って、in vitroでのAT1細胞からIgM発現細胞への分化条件は、更に検討する必要がある。【００８２】
実験例６    AT1細胞のNOD/SCIDマウスを用いた分化能の検討
AT1細胞をマウス個体に移植した際に分化が進むかどうかを、4週齢メスのNOD/SCID マウス（日本クレア）を用いて調べた。細胞は、ficol（アマシャム）を使って白血球画分を分離した。NOD/SCID マウスは、成熟B細胞、成熟T細胞が存在しないことが知られている。このため、IgM陽性かつGFP陽性の細胞が確認できれば、移植した細胞の分化が進んだものと考えられる。【００８３】
具体的には、200μlのPBSに懸濁した2×106個のAT1細胞を、マウスの尾部から静脈中に移植注射し、2〜3週間飼育を行った。なお、移植しない個体をネガティブコントロールとして用いた。AT1細胞を移植した個体は移植後2週間目から動きに異常をきたすようになり、移植後約3週間で死亡した。(3匹/3匹)。このことは、移植を受けた個体中でAT1細胞が定着、増殖している可能性を示唆している。【００８４】
AT1細胞を移植した個体について、移植2週間後の骨髄（BM）及び脾臓（spleen）中の骨髄細胞を採取し、PE-conjugated anti-mouse IgM 抗体（BD Biosciences）により染色後、FACScanにより解析をおこなった。解析の結果、GFPを発現する細胞が確認され、移植したAT1細胞がマウス個体中で定着、増殖していることが示された。また、in vitroで継代維持、もしくは分化誘導した際にはほとんど確認することができなかったGFP陽性かつIgM陽性の細胞が（図１、図４）、骨髄由来の白血球画分、並びに脾臓由来の白血球画分に共に確認された(図５ｂ, ｄ)。一方の、コントロールとして用いたマウスからは、GFP陽性かつIgM陽性の細胞が確認できなかったことから(図５ａ,ｃ)、移植したAT1細胞がマウス個体中で分化した可能性が強く示唆された。発現細胞の割合は、骨髄では22.5容量％、脾臓では31.6容量％であり、脾臓でより多くのIgM陽性細胞が確認できた。 (図５ｂ,  ｄ)。【００８５】
以上の結果から、IL-7, tsLT, v-Ablの条件で、不死化されたAT1細胞が得られ、このAT1細胞はNOD/SCIDマウス体内でIgM発現細胞へと分化する能力を有することが示唆された。【００８６】
実験例７     AT2細胞における不死化細胞の表面抗原の解析
AT1細胞を不死化した条件と同じ条件であるIL-7の存在下で、tsLTではなくLTとv-Ablを発現させた条件で不死化された細胞の表面抗原をFACScan （BDBiosciences)により解析した。解析した表面抗原はB細胞でそれぞれの分化段階を通して広く発現し、B細胞のマーカーとして汎用されているB220、プロB〜プレB細胞で発現することが知られているCD25、免疫グロブリン遺伝子の再構成が完了したプレB細胞以降で発現が見られるIgMである。それぞれを解析するために用いた抗体はPerCP-conjugated anti-mouse CD45R/B220 抗体(BD Biosciences)、PE-Cy5-conjugated anti-mouse CD25抗体（eBioscience）、PerCP-conjugated anti-mouse IgM 抗体（BD Biosciences）である。【００８７】
また、不死化された細胞がv-Ablを発現しているかを確認するために、マーカーとして用いられたGFPの発現も調べた。【００８８】
その解析の結果、GFP陽性かつB220陽性細胞は70.7容量 %（図６-a）、GFP陽性かつCD25陽性細胞は53.6容量 %（図６-b）であった。GFP陽性かつIgM陽性細胞については、ほとんど確認することができなかった（図６-c）。また、図中に示していないがGFP発現細胞は93.2容量 % であった。この事は、増殖してきたほとんどの細胞がv-Ablを発現していることを示唆している。【００８９】
以上の結果から、IL-7, LT, v-Ablの条件下で不死化された細胞群においてもB細胞系列の細胞が含まれ、その分化段階はプロB〜プレBである可能性が示唆された。更に、IgMの発現はほとんど見られないことから、遺伝子再構成が起こるPre-B後期以前の細胞が多く含まれる細胞群であると考えられた。この細胞群をAT2細胞とした。【００９０】
実験例８    AT２細胞のNOD/SCIDマウスを用いた分化能の検討
AT2細胞をマウス個体に移植した際に分化が進むかどうかを、4週齢メスのNOD/SCID マウス（日本クレア）を用いて調べた。NOD/SCID マウスは、成熟B細胞、成熟T細胞が存在しないことが知られており、IgM陽性かつGFP陽性の細胞が確認できれば、移植した細胞の分化が進んだと考えられる。【００９１】
200μlのPBSに懸濁した2×106個の細胞を、マウスの尾部から静脈中に移植注射した。移植したマウスは2〜3週間飼育を行った。定着した細胞の分化段階が進みIgMの発現が見られる可能性を考え、移植2週間後の骨髄及び脾臓中の骨髄細胞を採取し、PerCP-conjugated anti-mouse IgM 抗体（BD Biosciences）により染色後、FACScanにより解析をおこなった。【００９２】
その解析の結果、GFPを発現する細胞が確認され、移植したAT2細胞がマウス個体中で定着、増殖していることが示された。また、in vitroで継代維持、もしくは分化誘導した際にはほとんど確認することができなかったGFP陽性かつIgM陽性の細胞が（図６）、骨髄、脾臓由来の白血球画分で共に確かめられた(図７a, b)。このことから、AT2細胞においても、AT1細胞と同じく、移植したAT2細胞が分化した可能性が強く示唆された。【００９３】
そのマウス個体中での、発現細胞の割合は、骨髄では24.2容量 %、脾臓では19.1容量 % であり、骨髄でより多くのIgM陽性細胞が確認できた。【００９４】
以上の結果をまとめると、AT2細胞はIgMを発現するB細胞へと分化する能力を有していることが示唆された。【００９５】
なお、本明細書中に引用する参考文献は下記の通りであり、その内容は本願明細書の一部として援用される。【００９６】
参考文献
1.  Seo, H., et al., 2005, Rapid generation of specific antibodies by enhanced homologous recombination. Nat. Biotechnol. 23: 731-735.
2.  Abelson and Rabstein, 1970, Lymphosarcoma: virus-induced thymic-independent disease in mice. Cancer Res. 30: 2213-22.
3.  Goff et al., 1982, Chromosomal assignment of the endogenous proto-oncogene C-abl. Science. 218: 1317-9.
4.  Hantschel and Superti-furga, 2004, Regulation of the c-Abl and Bcr-Abl tyrosine kinases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5: 33-44.
5.  Shore et al., 2002, Transforming pathways activated by the v-Abl tyrosine kinase. Oncogene. 21: 8568-76.
6.  Jackson and Baltimore, 1989, N-terminal mutations activate the leukemogenic potential of the myristoylated form of c-abl. EMBO J. 8: 449-56
7.  Rosenberg, 1994, Abl-mediated transformation, immunoglobulin gene rearrangements and arrest of B lymphocyte differentiation. Semin. Cancer Biol. 5: 95-102
8.  Druker et al., 1996, Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat. Med. 2: 561-6.
9.  Muljo and Schlissel, 2003, A small molecule Abl kinase inhibitor induces differentiation of Abelson virus-transformed pre-B cell lines. Nat. Immunol. 4: 31-7.
10.  Graham et al., 1975, Studies on in vitro transformation by DNA and DNA fragments of human adenoviruses and simian virus 40. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 39 Pt 1: 637-50.
11.  Rundell and Parakati, 2001, The role of the SV40 ST antigen in cell growth promotion and transformation. Semin. Cancer Biol. 11: 5-13.
12.  Kamijo et al., 1997, Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product p19ARF. Cell. 91: 649-59.
13.  Jat and Sharp, 1986, Large T antigens of simian virus 40 and polyomavirus efficiently establish primary fibroblasts. J. Virol. 59: 746-50.
14.  Tegtmeyer and Ozer, 1971, Temperature-sensitive mutants of simian virus 40:
infection of permissive cells. J. Virol. 8: 516-24.
15.  Ray et al., 1992, Functional characterization of temperature-sensitive mutants of simian virus 40 large T antigen. J. Virol. 66: 6509-16.
16.  Jat and Sharp, 1989, Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large-T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature
17.  Jat et al., 1991, Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5096-100.
18.  Obinata, 2001, Possible applications of conditionally immortalized tissue cell lines with differentiation functions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 667-72.
19.  O’Hare et al., 2001, Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 646-51
20.  Namen et al., 1988, . Murine interleukin 7 (IL-7) receptor. Characterization on an IL-7-dependent cell line. J Exp Med. Apr 1;171(4):1073-89.
21.  Grabstein et al., 1993, Inhibition of murine B and T lymphopoiesis in vivo by an anti-interleukin 7 monoclonal antibody. J. Exp. Med. 178: 257-64.
22.  von Freeden-Jeffry et al., 1995, Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine. J. Exp. Med. 181: 1519-26.51.   Rosenberg, 1994, Abl-mediated transformation, immunoglobulin gene rearrangements and arrest of B lymphocyte differentiation. Semin. Cancer Biol. 5: 95-102.
23.  Jackson and Baltimore, 1989, N-terminal mutations activate the leukemogenic
potential of the myristoylated form of c-abl. EMBO J. 8: 449-56
24. Martensson and Ceredig, 2000, Role of the surrogate light chain and the pre-B-cell receptor in mouse B-cell development. Immunology 101,435-441.
25.  Wong and Witte, 2004, The BCR-ABL story: bench to bedside and back. Annu. Rev. Immunol.22: 247-306.
26.  Druker et al., 1996, Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat. Med. 2: 561-6.
27.  Nagar et al., 2002, Crystal structures of the kinase domain of c-Abl in complex with the small molecule inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571).Cancer Res.;62(15):4236-43.
28.  Weisberg et al., 2005, Characterization of AMN107, a selective inhibitor of
native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell.;7(2):129-41.
29.  Shah et al., 2004, Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor. Science;305(5682):399-401.
30.  Gumireddy et al., 2005, A non-ATP-competitive inhibitor of BCR-ABL overrides imatinib resistance. Proc Natl Acad Sci U S A.;102(6):1992-7.
31.  Wolff et al., 2005, PD166326, a novel tyrosine kinase inhibitor, has greater antileukemic activity than imatinib mesylate in a murine model of chronic myeloid leukemia. Blood.;105(10):3995-4003.
32.  O’Hare et al., 2004, Inhibition of wild-type and mutant Bcr-Abl by AP23464, a potent ATP-based oncogenic protein kinase inhibitor: implications for CML.Blood. ;104(8):2532-9.
33.  Radfar et al., 1998, . p19(Arf) induces p53-dependent apoptosis during abelson virus-mediated pre-B cell transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 13194-9.
34.  Jat and Sharp, 1989, . Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large-T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.Mol. and Cell. Boil. 9, 1672-1681.
35.  O’Hare et al., 2001, Conditional immortalization of freshly isolated human
mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 646-51
36.  Morgenstern and Land, 1990, Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res.;18(12):3587-96.
37.  Onishi et al., 1996, Applications of retrovirus-mediated expression cloning. Exp Hematol.;24(2):324-9.
38.  Akagi et al., 2000, v-Crk activates the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway in transformation. Proc Natl Acad Sci U S A.;97(13):7290-5.
39.  Akagi et al., 2003, Refractory nature of normal human diploid fibroblasts with respect to oncogene-mediated transformation.Proc Natl Acad Sci U S A. 100(23):13567-72
40.  Hawley et al., 1994, Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther.;1(2):136-8.
41.  Halene et al., 1999, Improved expression in hematopoietic and lymphoid cells in mice after transplantation of bone marrow transduced with a modified retroviral vector.Blood.;94(10):3349-57.
42.  Riviere et al., 1995, Effects of retroviral vector design on expression of human adenosine deaminase in murine bone marrow transplant recipients engrafted with genetically modified cells. Proc Natl Acad Sci U S A.;92(15):6733-7.
43.  Cerutti，A. et al., 1998, CD40 ligand and appropriate cytokines induce switching to IgG, IgA, and IgE and coordinated germinal center and plasmacytoid phenotypic differentiation in a human monoclonal IgM+IgD+ B cell line. J. Immunol. 160: 2145-2157.
44. Seo, H., et al., 2005, Rapid generation of specific antibodies by enhanced homologous recombination. Nat. Biotechnol. 23: 731-735.
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】不死化細胞の表面抗原を解析した結果を示す（実験例２）。
【図２】図２ａはAT1細胞の温度依存性増殖を調べた結果を、また図２ｂはAT1細胞におけるtsLT、v-ab1の発現状況を示す（実験例３）。
【図３】AT1細胞のIL-7依存性を調べた結果を示す（実験例４）。
【図４】AT1細胞におけるin vitroにおける分化能を調べた結果を示す（実験例５）。
【図５】AT1細胞におけるNOD/SCIDマウスを用いた分化能を調べた結果を示す（実験例６）。
【図６】AT2細胞における不死化細胞の表面抗原を解析した結果を示す（実験例７）。
【図７】AT2細胞におけるNOD/SCIDマウスを用いた分化能を調べた結果を示す（実験例８）。
【図１】
2007060864.tif 000003
【図２】
2007060864.tif 000004
【図３】
2007060864.tif 000005
【図４】
2007060864.tif 000006
【図５】
2007060864.tif 000007
【図６】
2007060864.tif 000008
【図７】
2007060864.tif 000009
【配列表】
2007060864000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ７の存在下で、ＳＶ４０ラージＴ抗原の遺伝子と活性化型Ａｂｌの遺伝子を未分化Ｂ細胞を含む初代培養骨髄細胞に導入して、未分化Ｂ細胞を不死化することによって調製される、ＣＤ２５またはＢ２２０のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項２】
ＳＶ４０ラージＴ抗原および活性化型Ａｂｌが発現してなるプレＢ細胞である、請求項１記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項３】
増殖が温度依存性であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項４】
ＳＶ４０ラージＴ抗原が温度感受性である請求項２に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項５】
抗体がＩｇＭである請求項１に記載の抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項６】
抗体産生前駆Ｂ細胞がマウス由来細胞である請求項１に記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項７】
非ヒト免疫不全動物に移植し、当該動物の体内で抗体産生Ｂ細胞に分化調製するための、請求項１に記載する抗体産生前駆Ｂ細胞。
【請求項８】
ＩＬ７の存在下で、ＳＶ４０ラージＴ抗原の遺伝子と活性化型Ａｂｌの遺伝子を初代培養骨髄細胞に導入する工程を有する、ＣＤ２５またはＢ２２０のいずれかの表面抗原を発現してなる抗体非産生性の抗体産生前駆Ｂ細胞を製造する方法。
【請求項９】
更に、上記工程で得られた初代培養骨髄細胞を培養する工程を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＶ４０ラージＴ抗原が温度感受性である、請求項８に記載する方法。
【請求項１１】
抗体がＩｇＭである、請求項８に記載する方法。
【請求項１２】
初代培養骨髄細胞がマウス由来細胞である、請求項８に記載する方法。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で分化させて製造される、抗体産生Ｂ細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至７のいずれかに記載される抗体産生前駆Ｂ細胞を非ヒト免疫不全動物に移植して、当該動物の体内で抗体産生前駆細胞を抗体産生細胞に分化させることを特徴とする、抗体産生Ｂ細胞の製造方法。
【請求項１５】
抗体産生Ｂ細胞の製造のための請求項１乃至７のいずれかに記載する抗体産生前駆Ｂ細胞の使用。
【国際調査報告】
2007060864.tif 000010
2007060864.tif 000011
2007060864.tif 000012
2007060864.tif 000013