(57)【要約】  ラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に対して細胞死誘導活性を示す物質を、簡便かつ安価に製造する方法を提供する。  家畜動物の乳とオレイン酸との混合物を加熱することを含む、ラクトアルブミン変性物の製造方法。本発明の方法は、固形癌、白血病リンパ球等の腫瘍細胞の細胞死を誘導する医薬として有用な物質を、家畜動物の乳という極めて安価な原料から製造することができ、原料入手が容易である、原料供給が安定している、原料が安価であるなどの利点を有する。また、バッチ式の反応によって大量の腫瘍細胞死誘導物質を製造することができること、カラム処理を必要としないことなどの特徴を有しており、工業化に有利な方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜動物の乳とオレイン酸との混合物を加熱することを含む、アルブミン変性物の製造方法。
【請求項２】
乳が脱脂された乳である、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項３】
家畜動物がウシである、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項４】
５０℃〜６０℃の温度で混合物を加熱する、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項５】
さらに加熱後の混合物を遠心分離処理して水層を回収することを含む、請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項６】
腫瘍細胞に対して細胞死誘導活性を示すラクトアルブミン変性物を製造する、請求の範囲第１項〜第５項の何れかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞に対して細胞死誘導活性を示す物質を家畜動物の乳から安価かつ効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の乳に含まれる蛋白質の中には、特定の処理を施されることにより、腫瘍細胞に代表される有害な細胞に対して細胞死を誘導してその増殖を抑制する活性を獲得する蛋白質が存在することが知られている。例えば、ヒトのラクトアルブミンをモルテングロビュール様状態にし、さらにこれを脂肪酸あるいはカゼイン画分を担持させたイオン交換カラムにアプライすることで、腫瘍細胞に対して細胞死（アポトーシス）を誘発することのできる、モルテングロビュール様状態においてオリゴマー化したα−ラクトアルブミンが得られている（特許文献１、非特許文献１）。【０００３】
しかし、係る従来技術における腫瘍細胞死誘導物質の製造は、カルシウムキレート剤との混合などを含む複数の前処理や、イオン交換カラムに脂質等を担持させなければならないなどの複雑な工程を必要とする方法である。またこの方法は、利用されるラクトアルブミンがヒトのラクトアルブミンであることから、これを組み換え的に生産する必要があること、腫瘍細胞死誘導物質の製造に用いるイオン交換カラムが高額であること、同物質の生産効率が低いこと、カラム処理という大量生産化が困難な作業が必要であること等、腫瘍細胞死誘導物質の工業生産へ適用するためには改善すべき点が多く、実用的であるとは言えない。
【特許文献１】特表２００１−５２４４９１号
【非特許文献１】スヴェンソン（Svensson）ら、プロテインサイエンス（Protein Science）、２００３年、第１２巻、第２７９４頁〜第２８０４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、より入手が容易かつ安価である原料の選択を含む、ラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に細胞死を誘導する腫瘍細胞死誘導物質の大量生産を可能とする新たな方法を開発することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、より入手が容易で安価である家畜動物の乳、特にウシの乳を原料とすることに着目し、さらにカラム等を用いないバッチ式の方法によって、ラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に細胞死を誘導する腫瘍細胞死誘導物質を製造できることを見出し、下記の各発明を完成した。【０００６】
（１）家畜動物の乳とオレイン酸との混合物を加熱することを含む、ラクトアルブミン変性物の製造方法。【０００７】
（２）乳が脱脂された乳である、（１）に記載の製造方法。【０００８】
（３）家畜動物がウシである、（１）に記載の製造方法。【０００９】
（４）５０℃〜６０℃の温度で混合物を加熱する、（１）に記載の製造方法。【００１０】
（５）さらに加熱後の混合物を遠心分離処理して腫瘍細胞死誘導物質を含む水層を回収することを含む、（１）に記載の製造方法。【００１１】
（６）腫瘍細胞に対して細胞死誘導活性を示すラクトアルブミン変性物を製造する、（１）〜（５）の何れかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、固形癌、白血病リンパ球等の腫瘍細胞の細胞死を誘導する医薬として有用な物質を、家畜動物の乳という極めて安価な原料から製造することができ、原料入手が容易である、原料供給が安定している、原料が安価であるなどの利点を有する。また、バッチ式の反応によって大量の腫瘍細胞死誘導物質を製造することができること、カラム処理を必要としないことなどの特徴を有しており、工業化に有利な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明にいうラクトアルブミン変性物とは、本発明の製造方法によって調製される変性されたラクトアルブミンを意味する。後の実施例に示すように、ラクトアルブミンとオレイン酸との単なる混合物は、本発明の方法で調製されるラクトアルブミン変性物の腫瘍細胞に対する細胞死を誘導する活性を示さない。よって本発明におけるラクトアルブミン変性物は、オレイン酸の存在下で加熱されることで天然のラクトアルブミンとは異なった状態となった、特にオレイン酸との間で官能基間の反応を通じて共有結合で結ばれているか、疎水結合その他の非共有結合で結ばれているか、あるいはその他の態様で結合している状態となったラクトアルブミンであると推察される。【００１４】
また本発明にいう腫瘍細胞死誘導物質とは、増殖し得る環境に置かれた腫瘍細胞に対して当該物質を接触可能な状態においたときに、当該腫瘍細胞の増殖能を低下ないし停止させ、あるいは細胞を死滅させることのできる物質をいう。【００１５】
本発明にいう腫瘍細胞死誘導物質の機能（腫瘍細胞の細胞死を誘導する活性）は、適当な腫瘍細胞、例えばL1210細胞を対象細胞とし、適当な培地並びに培養条件でこれら腫瘍細胞を増殖させる系に、本発明の方法で製造される腫瘍細胞死誘導物質を加えて、腫瘍細胞の生存率あるいは細胞増殖速度などを測定すればよい。【００１６】
本発明で利用可能な家畜動物の乳は、ウシ、ヒツジまたはヤギなど、乳の生産を目的の一つとして飼育される哺乳動物の乳であればいずれも使用可能であるが、原料供給量や安定的な大量供給体制が確立されているなどの観点から、ウシの乳が最も好ましい。【００１７】
本発明では、哺乳動物の乳とオレイン酸との混合物を加熱することで、極めて簡便にラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に細胞死を誘導する細胞死誘導物質を得ることができる。【００１８】
本発明で使用される乳に対しては、特許文献１に記載される方法が必要とする各種の前処理、例えばキレート剤を加える、ｐＨを酸性にする又は予め加熱するなどの操作は特に必要ではない。その一方、原料として脱脂した乳を用いると、オレイン酸の添加量を下げても細胞死誘導物質の最終的な製造量は変化しないことが確認された。従って、脱脂した乳を原料とすることで、使用するオレイン酸量に対するラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に細胞死を誘導する細胞死誘導物質の製造効率を高めることができる。乳の脱脂操作は遠心分離処理などの一般的な手法で行えばよく、特に限定はない。【００１９】
オレイン酸を加えた乳の加熱は４０℃〜６０℃、好ましくは５０℃〜６０℃で行えばよい。さらに処理温度を高めても、本発明のラクトアルブミン変性物における腫瘍細胞に細胞死を誘導する活性に大きな変化は認められなかった。また加熱時間は、使用する乳の量によるが概ね１０分〜２時間程度であればよい。オレイン酸の添加量は用いる乳の性質によって調節すればよいが、全乳１mlに対して好ましくは40μl以上のオレイン酸を、また脱脂乳1mlに対しては、概ね10〜50μlのオレイン酸を添加すればよい。全乳に対してはオレイン酸をより多く添加することで、本発明のラクトアルブミン変性物における腫瘍細胞に細胞死を誘導する活性を高めることができる。脱脂乳に対しては、オレイン酸を過剰に加えても、添加量に比例した腫瘍細胞に細胞死を誘導する活性の上昇は認められなかった。【００２０】
上記の反応によって製造されるラクトアルブミン変性物、特に腫瘍細胞に細胞死を誘導する細胞死誘導物質は、反応後そのまま利用してもよく、あるいは糖や脂質等の画分を公知の方法を用いて除去して使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法により製造される細胞死誘導物質ならびに比較例の細胞死誘導活性の比較試験の結果を示す。図中のａ）〜ｈ）は、試験例２）に示したサンプルの記号ａ）〜ｈ）に対応する。
【００２２】
以下、実施例により本発明の具体的態様をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
市販の牛乳500μlにオレイン酸12μlを加えて混合後、60℃のオイルバス中で10分間加熱した。加熱中は２分置きに牛乳を攪拌した。オイルバスから取り出した牛乳を室温に１時間置き、さらに6200rpmで５分間の遠心処理を行い、下層の水画分を回収して、ラクトアルブミン変性物（細胞死誘導物質）を得た。
【実施例２】
【００２４】
市販の牛乳を4700rpm、10分間遠心処理して上澄画分を回収し、脱脂乳を調製した。この脱脂乳500μlにオレイン酸４μlを加えて混合後、60℃のオイルバス中で 10分間加熱した。加熱中は２分置きに脱脂乳を攪拌した。オイルバスから取り出した脱脂乳を室温に１時間置き、さらに6200rpmで５分間の遠心処理を行い、下層の水画分を回収して、ラクトアルブミン変性物（細胞死誘導物質）を得た。【００２５】
＜試験例＞
１）細胞死誘導活性の確認方法
マウス由来の白血病リンパ球であるL1210細胞を、RPMI1640培地（シグマ社製）に懸濁し、２×10６個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。96穴プレートの各ウェルに細胞懸濁液90μｌと試験サンプル10μｌを加え、37℃、５％CO２でインキュベートした。インキュベート開始から30分後に10μｌのFBS（Fetal Bovine Serum）をウェルに添加し、さらに37℃、５％CO２でインキュベートを継続した。水層の添加から３時間後、L1210細胞を回収し、トリパンブルー染色を行って細胞の生存率を調べた。生存率は、水層の代わりにリン酸緩衝生理食塩水を添加したウェルの全細胞数に対する各試験ウェルの生細胞数の割合として算出した。【００２６】
２）試験サンプルの調製
試験対象サンプルとして、以下のサンプルを用意した。【００２７】
ａ）コントロール（リン酸緩衝生理食塩水）
ｂ）市販牛乳（未処理）
ｃ）実施例１で製造した腫瘍細胞死誘導物質
ｄ）実施例２で調製した脱脂乳
ｅ）実施例２において、60℃での加熱を室温で放置に代えて調製したサンプル
ｆ）実施例２において加熱温度を50℃、加熱時間を５分としたサンプル
ｇ）実施例２で製造した細胞死抑制物質
ｈ）実施例２で調製した脱脂乳を1.5mgのウシラクトアルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水に代えた他は実施例２と同じ条件で処理したサンプル。【００２８】
３）細胞死誘導活性の確認
１）に示した方法により、２）の各サンプルについて細胞死誘導活性を測定した結果を図１に示す。【００２９】
この結果から明らかなように、牛乳あるいは脱脂乳にオレイン酸を添加するだけで加熱を行わなかったサンプルでは、細胞死誘導物質の存在は認められなかった。一方、牛乳あるいは脱脂乳にオレイン酸を加えて加熱したサンプル（実施例１と２）は、ウシラクトアルブミンとオレイン酸とを加熱したサンプルｈ）に比べても有意に強い細胞死誘導活性を示した。
【図１】
2007088869.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月30日(2007.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
家畜動物の乳とオレイン酸との混合物を加熱することを含む、アルブミン変性物からなる腫瘍細胞死誘導物質の製造方法。
【国際調査報告】
2007088869.tif 000003
2007088869.tif 000004
2007088869.tif 000005
2007088869.tif 000006