(57)【要約】  ウイルス等の感染から防御するために着床前初期胚を覆っている細胞外マトリックスである透明帯を除去した胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを感染させるか、核酸導入試薬を作用させることにより、栄養外胚葉細胞に特異的にかつ効率よく遺伝子を導入できることを見出した。この方法では、栄養外胚葉がバリアとなるため、導入したポリヌクレオチドが将来胎児となる内部細胞塊の細胞に感染するおそれがない。胎児には導入されず、胎盤にのみ外来遺伝子を導入する方法が提供されたことによって、胎盤異常により胎生致死となる遺伝子変異動物をレスキューして生ませることが可能となった。また、胎盤形成や胎盤機能を制御する遺伝子発現やその効果を解析することが可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意のポリヌクレオチドを栄養外胚葉細胞に特異的に導入する方法；
（ａ）胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程。
【請求項２】
任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
胚盤胞が、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意のポリヌクレオチドが栄養外胚葉細胞に特異的に導入された胚盤胞の製造方法；
（ａ）胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程。
【請求項６】
任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
胚盤胞が、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の製造方法；
（ａ）非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項１０】
任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の製造方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項１２】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる工程。
【請求項１４】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、胎生致死をレスキューするポリヌクレオチドのスクリーニング方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる工程、
（ｄ）任意のポリヌクレオチドを導入していない場合と比較して、胎生致死をレスキューさせたポリヌクレオチドを選択する工程。
【請求項１６】
非ヒト動物がマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルからなる群より選択される、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
透明帯の除去を酸性処理、酵素処理または物理的処理によって行う、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
酸性処理が酸性タイロード処理である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酵素処理がPronase処理である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドの導入を、所望のポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを胚盤胞に感染させることによって行う、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドの導入を、核酸導入試薬を作用させることによって行う、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意のポリヌクレオチドを胎盤特異的かつ胎盤全域に導入する方法に関する。また本発明は、胎生致死からレスキューされた非ヒト動物の製造方法に関する。本発明はさらに、胎生致死をレスキューするポリヌクレオチドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスベクターを用いた個体レベルでの遺伝子導入法として、レトロウイルスベクターを用いたトランスジェニックマウス作製法（非特許文献１）が知られている。レトロウイルスベクターを用いれば効率よくトランスジェニックマウスを作製することができるが、導入遺伝子のメチル化などによる遺伝子発現のサイレンシングが起きてしまうという欠点がある（非特許文献２）。【０００３】
レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターは外来遺伝子を染色体に組み込むことができるため導入遺伝子の長期発現が期待できる。さらにレンチウィルスベクターは、通常のレトロウイルスベクターとは異なり核移行シグナルを有するため、非分裂細胞への遺伝子導入が可能である。レンチウイルスベクターを用いたトランスジェニックマウス作製では、効率化が図れるだけでなく、長期遺伝子発現のサイレンシングが発生しない（非特許文献３〜５）。【０００４】
これらのトランスジェニックマウス作製法では、ウイルスベクターを受精卵に感染させると、処理した受精卵のほとんどに遺伝子が導入される。また、これらの方法では胎盤と胎児の両方に遺伝子が導入されるため、発生の研究において非常に優れた手法となっている。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, Sep; 82(18): 6148-6152
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, Oct; 82(20): 6927-6931
【非特許文献３】Mol. Cell. Biol., 2000, Oct; 20(20): 7419-7426
【非特許文献４】J. Virol., 2000, Nov; 74(22): 10778-10784
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, Feb 19; 99(4): 2140-2145
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
胚発生の過程における胎盤の遺伝子発現やその効果を解析する場合においては、胎児には外来遺伝子が導入されず、胎盤にのみ導入される必要がある。
胎盤への遺伝子導入法としては、妊娠中に開腹して注射針等により胎盤に直接的にウイルスベクター等を注入して遺伝子を導入する方法が用いられてきた。しかし、手術による負担が大きく、また、胎盤全域への遺伝子導入は期待できないという欠点があった。【０００６】
またLVを用いた胎盤への遺伝子導入方法として、受精卵（２細胞期胚）感染によるトランスジェニック法や胚盤胞内腔へのマイクロインジェクション法が知られている。前者は操作が簡便であるというメリットを有する反面、胎児、胎盤の両方に遺伝子が導入されるというデメリットも有する。
一方、後者の胚盤胞内腔へのマイクロインジェクション法では、胎盤特異的に遺伝子を導入することが可能であるが、高価なシステムと熟練した技術が必要であるため一般的ではない。また、胚盤胞に直接ガラス管を注入するため、胚へのダメージが大きいという問題点も有する。さらに、大量処理も困難である。【０００７】
また、テトラプロイドレスキュー法よる、胎盤異常による胎生致死からレスキューされた動物の作製法が知られている。本方法では、変異動物とは別に野生型動物の２細胞期胚を調整し、電気処理等により４倍体の融合胚を調整する。続いて、透明帯を除去した変異動物の８細胞期胚と、同じく透明帯を除去した４倍体の野生型の４細胞期胚を凝集させてキメラ胚を作製し、偽妊娠動物に移植してキメラ動物を作製する。
しかし本方法においても、変異動物胚に加えて野生型胚を必要とするため、実験に手間を要する。さらに野生型胚は電気融合等により４倍体化させることも必要となる。また、本方法は変異動物の胎盤機能を補うことを目的に使用される方法であり、胎盤における遺伝子機能解析には適していない。【０００８】
本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、胎盤特異的かつ胎盤全域に遺伝子を導入する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため種々の検討を行った。その結果、ウイルス等の感染から防御するために着床前初期胚を覆っている細胞外マトリックスである透明帯を除去した胚盤胞にウイルスベクターを感染させることにより、栄養外胚葉細胞に特異的に、かつ効率よく、遺伝子を導入できることを見出した。【００１０】
即ち、本発明者らは、透明帯を酸性処理や酵素処理もしくは物理的処理により取り除き、ウイルスベクターと共培養させることで、胚盤胞の外側にある栄養外胚葉に遺伝子を導入することに成功し、本発明を完成するに至った。さらに、この方法では栄養外胚葉がバリアとなるため、ウイルスベクターが将来胎児となる内部細胞塊の細胞に感染するおそれがないことを見出した。具体的には、本発明は以下〔１〕〜〔２１〕を提供するものである。
〔１〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意のポリヌクレオチドを栄養外胚葉細胞に特異的に導入する方法；
（ａ）胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程。
〔２〕任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、〔２〕に記載の方法。
〔４〕胚盤胞が、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意のポリヌクレオチドが栄養外胚葉細胞に特異的に導入された胚盤胞の製造方法；
（ａ）胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程。
〔６〕任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、〔６〕に記載の方法。
〔８〕胚盤胞が、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞である、〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の製造方法；
（ａ）非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
〔１０〕任意のポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドである、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の製造方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植する工程。
〔１２〕胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該タンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる工程。
〔１４〕胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Dlx3、Fgfr2、Fra1、Fzd5、Gab1、Gcm1、Grb2 hypomorph、Gja7、Hgf、Hsp84-1、Itgav、Junb、Lifr、ERK1、ERK2、ERK5、MEK1、MEKk3、p38alpha、p38beta、Met、Pdgfra、Pdgfb、Pparg、Rxra、Rxrb、Sos1、Vhlh、Wnt2、Ets2、Mash2、Egfr、Hsf1、Bmp5、Bmp7、Dnmt1、Itga4、Lhx1、Mrj、Tcf、Lef、Cdx2、Eomes、Fgf4、Esrrb、Hand1、Mdfi、Esx1、Arnt、Tcfeb、およびGjb2からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドである、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、胎生致死をレスキューするポリヌクレオチドのスクリーニング方法；
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる工程、
（ｄ）任意のポリヌクレオチドを導入していない場合と比較して、胎生致死をレスキューさせたポリヌクレオチドを選択する工程。
〔１６〕非ヒト動物がマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルからなる群より選択される、〔９〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕透明帯の除去を酸性処理、酵素処理または物理的処理によって行う、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕酸性処理が酸性タイロード処理である、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕酵素処理がPronase処理である、〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕ポリヌクレオチドの導入を、所望のポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを胚盤胞に感染させることによって行う、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕ポリヌクレオチドの導入を、核酸導入試薬を作用させることによって行う、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明において使用したLVベクター（LV-CAG-EGFP）の構造を示す図である。
【図２】EGFP発現ウイルスベクターを感染させて得られた13.5日胚の胎児と胎盤を示す写真である。それぞれ、上：未処理胚、中：TG法、下：本発明の方法、により得られた胎児と胎盤である。TG法では胎児と胎盤の両方に導入遺伝子の発現が見られるが、本発明の方法では胎盤のみに遺伝子発現が観察された。
【図３】EGFP発現ウイルスベクターを感染させて得られた13.5日胚の胎盤切片を示す写真である。それぞれ、上：未処理胚、中：TG法、下：本発明の方法、により得られた胎盤の薄切片である。TG法および本発明による処理で得られた胎盤では、giant cell層、spongio trophoblast層、labyrinth層のすべてにおいて、母親由来の細胞を除く殆どの細胞で遺伝子発現が観察された。aはHE染色後の写真、bは蛍光顕微鏡下の写真である。
【図４】erk2ノックアウトマウスのレスキューを示す図および写真である。aはerk2ノックアウトマウスの遺伝子座を説明する図である。エクソン２と３の間に薬剤耐性遺伝子が挿入されているため内在性のerkは発現しない。bはCAGプロモーターの制御下にerk2を発現するように構築されたレンチウイルスベクターを示す図である。cは、ヘテロ欠損マウス同士の交配により得られた胚盤胞に、本発明の方法による遺伝子導入を行った結果得られた産子の遺伝子型を示す図である。自然交配ではホモ欠損マウスは生まれてこないが、本発明による胎盤特異的遺伝子導入法ではホモ欠損マウスが16匹得られた。dは、得られた産子のPCRによる遺伝子型を示す写真である。変異型アレルのみを持ち、野生型アレルを持たないホモ欠損マウスが生まれている。eは、本発明の処理により生まれたerk2野生型(左)、ヘテロ欠損(中)、ホモ欠損(右)マウス新生児を示す写真である。fはウエスタンブロッティング結果を示す写真である。新生児の内在性erk2の発現を確認している。ホモ欠損マウスではerk2が発現していないことが確認された。
【図５】p38alphaノックアウトマウスのレスキューを示す図および写真である。aはp38alphaノックアウトマウスの遺伝子座を説明する図である。エクソン１０と１１の間に薬剤耐性遺伝子が挿入されているため内在性のp38alphaは発現しない。bはCAGプロモーターの制御下にp38alphaを発現するように構築されたレンチウイルスベクターを示す図である。cは、ヘテロ欠損マウス同士の交配により得られた胚盤胞に、本発明の方法による遺伝子導入を行った結果得られた産子の遺伝子型を示す写真である。自然交配ではホモ欠損マウスは生まれてこないが、本発明による胎盤特異的遺伝子導入法ではホモ欠損マウスが34匹得られた。dは、得られた産子のPCRによる遺伝子型を示す写真である。変異型アレルのみを持ち、野生型アレルを持たないホモ欠損マウスが生まれている。eは、本発明の処理により生まれたp38alpha野生型(左)、ホモ欠損(右)マウス新生児を示す写真である。fはウエスタンブロッティング結果を示す写真である。新生児の内在性p38alphaの発現を確認している。ホモ欠損マウスではerk2が発現していないことが確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、本発明者らによって、ウイルス等の感染から防御するために着床前初期胚を覆っている細胞外マトリックスである透明帯を除去した胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを感染させることにより、栄養外胚葉細胞に特異的に、かつ効率よく、任意の遺伝子を導入することが可能であることが見出されたことに基づく。すなわち本発明は、任意のポリヌクレオチドを栄養外胚葉細胞に特異的に導入する方法に関する。【００１３】
本発明の方法においては、まず、胚盤胞を得る。胚盤胞とは哺乳類の初期発生で卵割期の終わった胚をいう。哺乳類の卵は無黄卵で全割し割球の集塊を形成するが、32細胞期には集塊の外側を包む栄養外胚葉と内側の内部細胞塊に分かれる。内部細胞塊は将来胎児の体となり、栄養外胚葉は将来胎盤へと分化する。本発明の方法においては、任意のポリヌクレオチドは、胚盤胞の最外層を形成する栄養外胚葉細胞に特異的に導入される。【００１４】
胚盤胞は以下の方法によって作製することが出来る。すなわち、任意の動物から卵子と精子を回収し、当業者に公知の手法で受精させる。得られた受精卵を当業者に公知の手法、例えばkSOM培地にて96時間培養することによって、胚盤胞を作製することが出来る。また、これ以外の方法にも、当業者が通常行う方法（例えば、Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p201-203, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）に従い、動物から直接取り出すことによって胚盤胞を得ることも可能である。【００１５】
本発明の方法においては、次に、上記によって得られた胚盤胞の透明帯を除去する。胚（着床前初期胚）は、ウイルス等の感染防御のために、その周囲を細胞外マトリックスである透明帯によって覆われている。本発明の方法においては、この透明帯を除去する。【００１６】
透明帯の除去は公知の方法によって行うことが可能である。例えば、酸性処理、酵素処理、または物理的処理などによって行うことが可能である。酸性処理の一例としては、酸性タイロードによる処理（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p485-486, Cold Spring Harbor Laboratory Press）が挙げられる。例えば、酸性タイロード液（pH2.3〜2.5）をマイクロピペットに予め吸引しておき、固定した胚に緩やかに吹き付けることにより、透明帯の一部を溶解することが可能である。あるいは、酸性タイロード液の液中に胚を浸漬することによって、透明帯を溶解することが可能である。【００１７】
酵素処理の方法による透明帯の除去方法としては、Pronaseによる処理(Calbiochem 537088, Sigma P5147)等が挙げられる。例えば、Pronase 0.5%液中で、透明帯が溶けるまで胚を放置する。透明帯が溶けた後、胚を培地で良く洗うことにより、透明帯が除去された胚盤胞を得ることが出来る（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p731, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。【００１８】
さらに、本発明における透明帯の除去は、物理的な方法によって行うことも可能である。物理的な除去方法としては、胚を固定してマイクロピペットにより透明帯の一部分を切開する透明帯切開法（Hum. Reprod., 5:7-13, 1990）、レーザー（Hum. Reprod., 15:1061-1064, 2000）やピエゾマイクロマニピュレーター（Developmental Biology, 250:348-357, 2002）による透明帯の切開や開孔あるいは菲薄化を行う方法等が挙げられる。
透明帯の除去は上記の方法によって行うことが可能である。しかし本発明における透明帯の除去方法はこれらに限定されず、透明帯を除去することが可能なあらゆる方法が含まれる。【００１９】
本発明の方法においては、最後に、透明帯が除去された胚盤胞に任意のポリヌクレオチドを導入する。透明帯が除去された胚盤胞に任意のポリヌクレオチドを導入する方法は、特にこれに限定されるものではないが、１つの好ましい態様として、任意のポリヌクレオチドを有するベクターを胚盤胞に導入する方法が挙げられる。【００２０】
胚盤胞に導入する任意のポリヌクレオチドを有するベクターとしては、ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えばレンチウイルスベクター(Molecular Therapy 2003, 8;666-673)、レトロウイルスベクター(Molecular Therapy 2003, 8;666-673)、アデノウイルスベクター、HVJリポソーム、Lipofectamineなど、当業者の間で通常用いられる任意のウイルスベクターが挙げられる。HVJ（hemagglutinating virus of Japan：センダイウイルス）-リポソームは、細胞融合を起こすウイルスであるHVJの融合蛋白の活性と、DNA結合蛋白質HMG-1を利用して、リポソームに封印した遺伝子やオリゴヌクレオチドを効率よく生体の各臓器へ導入することができるベクターである。【００２１】
これらのベクターの中で好ましいベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスはレトロウイルスの一属であり、ヒト、サル、ネコ、ウシの免疫不全ウイルスである。ウイルスの遺伝子構造はレトロウイルスとしての基本の構造遺伝子（gag、pol、env）のほか、数種類の調節遺伝子を有する。レンチウイルスを改変して作製したレンチウイルスベクターは、外来遺伝子を染色体に組み込むことが出来るため、導入遺伝子の長期発現を期待でき、さらに他のレトロウイルスベクターとは違い核移行シグナルを有するため、非分裂細胞への遺伝子導入が可能である。【００２２】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターには、少なくともLTR、RRE、GAGを有するレンチウイルスベクターが含まれる。本発明の方法に用いられるレンチウイルスベクターは、最低限このような条件を有していればよいが、プラスアルファとして別の遺伝子、例えばdeltaU3、PPT、WPREを有していてもよい。このようなレンチウイルスベクターもまた、本発明の方法において用いられるレンチウイルスベクターとして好ましいウイルスベクターである。【００２３】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターの特に好ましい態様は、LTR (deltaU3)、GAG、RRE、PPT、WPREを有するレンチウイルスベクターである。このような構造を有するレンチウイルスベクターの代表例は、実施例１および文献Molecular Therapy 2003, 8;666-673に開示されたGFPウイルスベクターのGFP部分を目的cDNAと置き換えたベクターである。このベクターの構造および構築方法は上記文献に開示されている。【００２４】
任意のポリヌクレオチドを有するレンチウイルスベクターの胚盤胞への感染は、例えば、任意のポリヌクレオチドを有するレンチウイルスベクターを含む溶液と透明帯が除去された胚盤胞を混合し、４〜５時間放置することによって行う。この方法によって、任意のポリヌクレオチドを有するレンチウイルスベクターを、栄養外胚葉に特異的に導入することが可能である。【００２５】
また、透明帯が除去された胚盤胞への任意のポリヌクレオチドの導入は、核酸導入試薬を作用させることによって行ってもよい。本発明において核酸導入試薬とは、任意のポリヌクレオチドを胚盤胞に導入することが可能な、あらゆる試薬を指す。このような核酸導入試薬の例としては、これらに限定されるものではないが、(Lipofectoamine 2000, Invitrogen) (Effectene, Qiagen) (FuGene, Roche) が挙げられる。【００２６】
導入されるポリヌクレオチドの形態は、DNA、RNA、cDNA、mRNAもしくは人工核酸などの形態であってよい。またDNA、RNA、cDNA、mRNAには、それらの誘導体も含まれる。人工核酸としては、これらに限定されるものではないが、例えば、糖鎖の構造が修飾されたDNA、RNA、cDNA、mRNA、もしくはそれらの誘導体が含まれる。また、導入されるポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドであってもベクターに導入されたものであってもよい。ベクターを使用する場合には、当業者であれば適宜目的のそれを設計し、使用することが可能である。本発明において使用されるベクターは、導入される任意のポリヌクレオチドに加えて、発現宿主において機能する転写開始領域や転写終結領域など、任意のポリヌクレオチドの発現をより効率的に行うためのポリヌクレオチド領域を含んでいてもよい。【００２７】
本発明においては、導入されるポリヌクレオチドは特に制限されないが、好ましい態様として、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくは胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが挙げられる。【００２８】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、胎発生に直接または間接的に関与するタンパク質をコードする、あらゆるポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドの例として、例えば、Dlx3（配列番号：１）、Fgfr2（配列番号：２）、Fra1（配列番号：３）、Fzd5（配列番号：４）、Gab1（配列番号：５）、Gcm1（配列番号：６）、Grb2 hypomorph（配列番号：７）、Gja7（配列番号：８）、Hgf（配列番号：９）、Hsp84-1（配列番号：１０）、Itgav（配列番号：１１）、Junb（配列番号：１２）、Lifr（配列番号：１３）、ERK1（配列番号：１４）、ERK2（配列番号：１５）、ERK5（配列番号：１６）、MEK1（配列番号：１７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、MEKk3（配列番号：１８に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、p38alpha（配列番号：１９）、p38beta（配列番号：２０）、Met（配列番号：２１）、Pdgfra（配列番号：２２）、Pdgfb（配列番号：２３）、Pparg（配列番号：２４）、Rxra（配列番号：２５）、Rxrb（配列番号：２６）、Sos1（配列番号：２７）、Vhlh（配列番号：２８）、Wnt2（配列番号：２９）、Ets2（配列番号：３０）、Mash2（配列番号：３１）、Egfr（配列番号：３２）、Hsf1（配列番号：３３）、Bmp5（配列番号：３４）、Bmp7（配列番号：３５）、Dnmt1（配列番号：３６）、Itga4（配列番号：３７）、Lhx1（配列番号：３８）、Mrj（配列番号：３９）、Tcf1（配列番号：４０）、Lef1（配列番号：４１）、Cdx2（配列番号：４２）、Eomes（配列番号：４３）、Fgf4（配列番号：４４）、Esrrb（配列番号：４５）、Hand1（配列番号：４６）、Mdfi（配列番号：４７）、Esx1（配列番号：４８）、Arnt（配列番号：４９）、Tcfeb（配列番号：５１）、およびGjb（配列番号：５２）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２９】
上記胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば容易に入手することが可能である。一例としては、種々の生物学的サンプル、例えば胎盤組織やトロホブラスト幹細胞およびその分化細胞などを原料として、その物理化学的性質等に基づいて天然より単離することができる。また、公知の配列情報に基づき、化学的に合成してもよい。また、遺伝子組換え技術により胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより宿主細胞を形質転換し、遺伝子組換えタンパク質を産生する形質転換細胞を培養することにより、該細胞またはその培養上清中から得ることもできる。【００３０】
上記胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、種々の動物の相同性遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の動物において、上記配列番号：１〜１６、１９〜５１のポリヌクレオチド、配列番号：１７又は１８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの転写、翻訳産物と同等の生物学的機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさす。【００３１】
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１〜１６、１９〜５１に記載のポリヌクレオチド配列、配列番号：１７又は１８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列）もしくはその一部をプローブとして、また胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の動物細胞、組織（例えば胎盤組織やトロホブラスト幹細胞およびその分化細胞など）から胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することは通常行いうることである。また公知のデータベースから相同遺伝子の配列を入手してもよい。【００３２】
本発明における胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特に制限されるものではないが、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルに由来するポリヌクレオチドであり、特に好ましくはヒトに由来するポリヌクレオチドである。【００３３】
さらに、本発明において使用される任意のポリヌクレオチドの好ましい態様として、胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドの例としては、例えば、
（ａ）胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAを発現するDNA、
（ｂ）胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを発現するDNA、
（ｃ）胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAを発現するDNA、
（ｄ）胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写制御因子に特異的に結合して発現を制御するDNA、
などが挙げられる。【００３４】
本明細書における「胎発生に重要なタンパク質の発現の制御」には、胎発生に重要なタンパク質をコード遺伝子の転写の増進もしくは抑制、または、該タンパク質への翻訳の増進もしくは抑制が含まれる。【００３５】
「胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチド」の一つの態様は、胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。アンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された(Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol et. al., Nature 333: 866, 1988)、現在では動植物を問わず真核生物において、遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。【００３６】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。【００３７】
内因性の胎発生に重要なタンパク質の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。【００３８】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。【００３９】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。【００４０】
「胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチド」の他の一つの態様は、内因性の胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なdsRNA（二重鎖RNA）をコードするDNAである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、RNAi（RNA干渉、RNA interference）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC： RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子の転写産物（mRNA）を切断する。また、この経路とは別に、siRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。【００４１】
RNAiは当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。【００４２】
RNAiの登場当初は、dsRNAはある程度の長さ(40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のTuschlらは21塩基対前後の単鎖dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもPKRによる抗ウイルス反応を起こさず、RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001)）、RNAiは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。【００４３】
本発明のDNAは、標的遺伝子の転写産物（mRNA）のいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAを含み、前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。本発明における標的配列は、標的配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入した結果、胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの発現が抑制されるものであれば特に制限されない。【００４４】
本発明のdsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。【００４５】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類は異なっていることが好ましい。【００４６】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。【００４７】
RNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、Tuschlら（前掲）により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。【００４８】
本発明のDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A., et al. Nature, 407: 319, 2000、Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）を用いることもできる。【００４９】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。【００５０】
本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により作製することができる。本発明のDNAは、例えば、周知のオリゴヌクレオチド合成法によって任意の配列を合成して作製することができる。【００５１】
本発明のDNAは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内で発現させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記DNAをベクターに保持させることが好ましい。本発明のDNAを含むベクターもまた、本発明に含まれる。【００５２】
さらに、「胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するポリヌクレオチド」の他の態様として、胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAの転写制御因子に特異的に結合して発現を制御するDNAが挙げられる。このようなDNAの一例として、デコイDNAが知られている。デコイDNAは、例えばNF-kBなどの転写制御因子に相補的な配列を有する20塩基程度のDNAである。デコイDNAは転写制御因子に結合することによって、転写制御因子の機能を阻害する。その結果、該転写制御因子によって発現を制御されているタンパク質の発現も抑制される。【００５３】
このように、本発明の方法によって栄養外胚葉特異的に導入されるポリヌクレオチドには、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみならず、胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドも含まれる。胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドを胚盤胞に導入することにより、例えば、胚発生の過程における遺伝子機能の解析を行うことが可能である。【００５４】
本発明の方法によって任意のポリヌクレオチドが胚盤胞の栄養外胚葉に特異的に導入されたか否かは、導入遺伝子を増幅するPCR法やEGFP、lacZなどのレポーター遺伝子の発現を蛍光・発色などの方法により検出するなど、当業者に公知の方法を用いることによって判定することが出来る。【００５５】
なお、上記胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが導入される胚盤胞は特に制限されない。これらのポリヌクレオチドが導入される胚盤胞の一例としては、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞が挙げられる。ここで「胎発生に重要なタンパク質」とは、上述の通り、胎発生に直接または間接的に関与するタンパク質を意味する。具体的には、配列番号：１〜１６、１９〜５１に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号１７及び１８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また「胎発生に重要なタンパク質に異常を有する」とは、上記した胎発生に重要なタンパク質の構造や機能に異常を有する状態を言う。また胎発生に重要なタンパク質の発現制御に異常を有するとは、胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAのRNAへの転写、該RNAのタンパク質への翻訳の両方または一方の過程に異常を有することを意味する。さらに、転写および翻訳の両方または一方の過程に異常を有することによりタンパク質の生成が完全に阻害される場合のみならず、タンパク質の発現量や発現時期が正常とは異なる場合、または正常なタンパク質の構造や機能の一部に異常を有するタンパク質が生成される場合も、本発明における「タンパク質の発現制御に異常を有する」に含まれる。【００５６】
胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞に導入することによって、例えば、本来なら胎生致死に至るため産下しないはずの動物を産下させることなどが可能となる。【００５７】
なお胚盤胞の由来する動物としては、特にこれらに制限されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルなどが挙げられる。【００５８】
本発明の方法においては、上述したように、「胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチド」もまた、胚盤胞に導入することが出来る。このようなポリヌクレオチドの具体的な態様は上述の通りである。また、このようなポリヌクレオチドが導入される胚盤胞としては、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞、もしくは胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有さない胚盤胞が挙げられる。胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質の発現を増進するポリヌクレオチドであれば、該ポリヌクレオチドを胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する動物の胚盤胞導入することにより、例えば、本来なら胎生致死に至るため産下しないはずの動物を産下させることが可能となる。一方、胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが、胎発生に重要なタンパク質の発現を抑制するポリヌクレオチドであれば、該ポリヌクレオチドを胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有さない胚盤胞に導入することによって、例えば胎発生に重要な遺伝子の同定や、胎発生における遺伝子の機能解析を行うことが可能となる。【００５９】
このように同業者であれば、導入するポリヌクレオチド、導入される胚盤胞を適宜選択することによって、本発明の方法を様々な目的や用途に使用することが可能である。本発明の方法においては、導入するポリヌクレオチドやポリヌクレオチドが導入される胚盤胞は特に限定されない。また、導入するポリヌクレオチドとそれが導入される胚盤胞の組み合わせも制限されない。【００６０】
本発明はまた、任意のポリヌクレオチドが栄養外胚葉細胞に特異的に導入された胚盤胞の製造方法に関する。【００６１】
本発明の胚盤胞の製造方法においてはまず、胚盤胞の透明帯を除去する。ここで、胚盤胞は、任意のものを使用することが出来る。また胚盤胞は、例えば上述の方法によって入手することが出来る。また透明帯の除去も、これに限定されるものではないが、例えば上述の方法によって行うことが可能である。【００６２】
本発明の胚盤胞の製造方法においては、次に、上記の胚盤胞に任意のポリヌクレオチドを導入する。ポリヌクレオチドの導入もまた、これに限定されるものではないが、上述の方法によって行うことが可能である。【００６３】
本発明の胚盤胞の製造方法においては、導入されるポリヌクレオチドに制限はなく、任意のポリヌクレオチドを導入することが可能である。好ましい態様としては、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または胎発生に重要なタンパク質の発現を制御するポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチドの具体的な態様もまた、上述の通りである。【００６４】
さらに、上記ポリヌクレオチドが導入される胚盤胞にも制限はないが、例としては、上述の胚盤胞を使用することが出来る。【００６５】
このように、本発明の胚盤胞の製造方法においても、導入するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが導入される胚盤胞、及びそれらの組み合わせには制限はない。当業者であれば目的に応じて適宜組み合わせ、製造、使用することが可能である。【００６６】
本発明はさらに、非ヒト動物の製造方法、および、非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法に関する。【００６７】
本発明における非ヒト動物の製造方法においては、まず、非ヒト動物由来の胚盤胞の透明帯を除去する。ここで使用される胚盤胞もまた、任意のものを使用することが出来る。本発明の非ヒト動物の製造方法において使用される胚盤胞としては、これらに限定されるものではないが、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞が好ましい。このような胚盤胞にポリヌクレオチドを導入することによって、胎盤異常による胎生致死からレスキューされた非ヒト動物を製造することが可能となる。【００６８】
このような胚盤胞は上述の方法によって入手することが出来る。また透明帯の除去も任意の方法によって行うことが可能であり、例えば上述の方法によって行うことが可能である。【００６９】
本発明の非ヒト動物の製造方法においては、次に、上記の胚盤胞に任意のポリヌクレオチドを導入する。ポリヌクレオチドの導入もまた、上述の方法によって行うことが出来る。【００７０】
本発明の非ヒト動物の製造方法において導入されるポリヌクレオチドに制限はないが、好ましい態様としては、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または胎発生に重要なタンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドが挙げられる。胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの具体的な態様は上述の通りである。また胎発生に重要なタンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドとは、胎発生に重要なタンパク質をコードするDNAのRNAへの転写、該RNAのタンパク質への翻訳の両方または一方の過程に存在する異常を正常化することが可能なポリヌクレオチドが挙げられる。またここでいう正常化とは、異常が完全に正常になることのみならず、異常の一部が正常になること、または異常の程度が減少することも含まれる。【００７１】
本発明における非ヒト動物の製造方法においては、最後に、上記の胚盤胞をレシピエントに移植する。レシピエントは胚盤胞が由来する動物と同一の動物、もしくは同種の動物であることが好ましい。胚盤胞のレシピエントへの移植は当業者が通常行いうることである（Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3rd edition, p263-271, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。本発明において製造される非ヒト動物は、特にこれらに制限されるものではないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルなどが挙げられる。【００７２】
このように、本発明のポリヌクレオチドを栄養外胚葉細胞に特異的に導入する方法を用いることによって、胎生致死に至る非ヒト動物を製造することが可能である。なお、本発明の方法によって製造される非ヒト動物は、胚盤胞に導入されたポリヌクレオチドをその体内に有さず、したがってキメラ動物ではない。【００７３】
さらに本発明は、非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法を提供する。本発明における非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法においては、まず、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する。胎発生に重要なタンパク質に異常を有する非ヒト動物、胎発生に重要な該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の態様は、上述の通りである。これらの胚盤胞は、例えば上述の方法によって入手することが出来る。また、透明帯の除去も任意の方法によって行うことが可能であり、上述の方法によって行うことが可能である。【００７４】
本発明の非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法においては、次に、上記の胚盤胞に、胎発生に重要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または胎発生に重要なタンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドを導入する。ポリヌクレオチドの導入もまた、上述の方法によって行うことが出来る。【００７５】
本発明における非ヒト動物の胎生致死をレスキューする方法においては、最後に、上記の胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下する。レシピエントは胚盤胞が由来する動物と同一の動物、もしくは同種の動物であることが好ましい。胚盤胞のレシピエントへの移植および仔動物の産下は、当業者であれば通常の方法によって行うことが出来る。また本発明の方法においてレスキューされる非ヒト動物は、特にこれらに制限されるものではないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、およびサルなどが挙げられる。【００７６】
さらに本発明は、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、胎生致死をレスキューするポリヌクレオチドのスクリーニング方法を提供する。
（ａ）胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた胚盤胞に、任意のポリヌクレオチドを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる工程、
（ｄ）任意のポリヌクレオチドを導入していない場合と比較して、胎生致死をレスキューさせたポリヌクレオチドを選択する工程。【００７７】
本発明のスクリーニング方法においては、まず、胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の胚盤胞の透明帯を除去する。胎発生に重要なタンパク質または該タンパク質の発現制御に異常を有する非ヒト動物の具体的な態様は上述の通りである。また胚盤胞の除去は、それらに限定されるものではないが、上述の方法によって行うことが可能である。【００７８】
本発明のスクリーニング方法においては、次に、上記で得られた胚盤胞に任意のポリヌクレオチドを導入する。ここで導入するポリヌクレオチドは任意のものであってよく、その長さ、由来、入手方法は問わない。本発明のスクリーニング方法に使用されるポリヌクレオチドは化学的に合成されたものであっても、例えば、cDNAライブラリーなどの遺伝子ライブラリー、該遺伝子ライブリーの転写産物など天然由来のものであってもよい。またこれらのポリヌクレオチドは必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
これらポリヌクレオチドの胚盤胞への導入は、上述の方法によって行うことが可能である。【００７９】
本発明のスクリーニング方法においては、次に、上記任意のポリヌクレオチドが導入された胚盤胞をレシピエントに移植し、仔動物を産下させる。胚盤胞のレシピエントへの移植、仔動物の産下は上述のように当業者が通常行う方法によって行うことが出来る。【００８０】
本発明のスクリーニング方法においては、最後に、任意のポリヌクレオチドを導入していない場合と比較して、胎生致死をレスキューさせたポリヌクレオチドを選択する。ここで選択されたポリヌクレオチドは、胎発生に重要なタンパク質の発現制御を正常化するポリヌクレオチドとして、本来なら胎生致死に至る非ヒト動物を製造する際、または本来なら胎生致死に至る非ヒト動物をレスキューする際に有用である。またこれらのポリヌクレオチドは、胎発生に重要なタンパク質やそれらの発現制御の異常に起因する疾患の治療薬として使用することも可能である。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
材料および方法
１） LVを用いたTG作製法（従来の方法）
BDF1雌マウスにPMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）を投与し、その約48時間後にHCGを投与して過排卵を誘発し、BDF1雄マウスと交配した。交配させてから約48時間後に輸卵管より２−４細胞期胚をFHM培地中に洗い出した。透明帯を酸性タイロード処理により取り除いた後、1×108ng/ mLのウイルス溶液のスポットに受精卵を１つずつ入れ感染させた。胚盤胞まで培養し、kSOM培地で洗浄後、偽妊娠マウス（偽妊娠2.5日目）の子宮に移植した。【００８２】
２）テトラプロイドによるレスキュー（従来の方法）
テトラプロイドとは4倍体の胚のことであり、この胚は、主に胚外組織である胎盤に寄与する。胎盤異常が原因の変異マウスの胚とテトラプロイド胚とでアグリゲーションキメラを作製すれば、正常な働きをもつ胎盤のもと、変異マウスを発生させることができる。【００８３】
BDF1雌マウスにPMSGを投与、その約48時間後にHCGを投与して過排卵を誘発し、BDF1雄マウスと交配した。交配させてから約48時間後に輸卵管より２細胞期胚をFHM培地中に洗い出した。2倍体の２細胞期胚を電気的に融合させて4倍体の1細胞とし、それが４細胞まで発生した胚と、同じ日程で過排卵処理を行い+/-同士の交配で得られた８細胞期胚とを、透明帯を酸性タイロード処理により取り除いた後、密着させて凝集キメラを作製した。kSOM培地で胚盤胞まで培養し、偽妊娠マウス（偽妊娠2.5日目）の子宮に移植した。【００８４】
３）LVを用いた胎盤特異的遺伝子導入法（本発明の方法）
+/-雌マウスにPMSGを投与、その約48時間後にHCGを投与して過排卵を誘発し、+/-雄マウスと交配した。交配させてから約48時間後に輸卵管より２−４細胞期胚をFHM培地中に洗い出した。２−４細胞期胚を約48時間kSOM培地で胚盤胞まで培養し、透明帯を酸性タイロード処理により取り除いた後、1×103ng/ mLのウイルス溶液のスポットにブラストシストを１つずつ入れ感染させた。感染時間は4〜5時間とし、ウイルス溶液から回収したブラストシストを一度洗ってから、偽妊娠マウス（偽妊娠2.5日目）の子宮に移植した。【００８５】
４）組織切片
胎盤を4%パラホルムアルデヒドで4℃、12時間固定した後、PBSで2、3時間、4℃で洗浄した。PBSをアセトンに置き換え、1、2時間後に、テクノビット8400液 (0.06g/10mL) を組織1つに対して1.5mLとして置き換え、2時間程度固定した。組織が沈殿した後、8400液 (小瓶) を50μLずつ入れ、枠内に組織と樹脂を入れカバーをしてから4℃12時間、包埋して薄切片を作製し観察した。【００８６】
５）ウエスタンブロット
新生児の尻尾をホモジナイザーを用いてlysisバッファー中で破砕した。時々攪拌しながら氷上で1時間放置し、4℃で13,000rpm、20分間遠心後の上清を抽出物とした。濃度を測定して濃度を一定にした後アプライし電気泳動を行った。泳動後PVDF膜(Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA)に転写し、5%スキムミルクを含むTBS-Tバッファーでブロッキングした。その後4℃で一晩、一次抗体（ERK2：BD pan ERK #610123,p38alpha：Santa Cruz p38(C-20) #sc-535）を反応させ、TBS-Tバッファーで3回洗浄後HRP標識した抗マウス抗体あるいは抗ウサギ抗体と室温で1時間反応させた。TBS-Tバッファーで4回洗浄後、ECLTM(RPN2209)により発色させフィルムに現像した。【００８７】
６）PCR 
胎児、胎盤、および新生児の一部組織からゲノムDNAを抽出し、PCR法により遺伝子型を調べた。用いたプライマー配列とPCR条件は下記のとおり。
EGFP  Typing
Primer-1378: gagctagccaccatggtgagcaagggcgag（配列番号：52）
Primer-1382: tcaccttgatgccgttcttct（配列番号：53）
PCR条件：94度2分、(94度30秒、65度30秒、72度30秒) x 30回、72度2分、4度
ERK2  Typing
Primer-1331: taactgggtcgagcacagtgatgc（配列番号：54）
Primer-1332: tcagaattgatctggtcttcaagaccttg（配列番号：55）
Primer-1333: atgtatgctatacgaagttattagggc（配列番号：56）
PCR条件：95度2分、(95度20秒、64度40秒) x 40回、72度1分、4度
p38  Typing
Primer-1380: ccctcgtggatggttgccagcagc（配列番号：57）
Primer-1343:cttactttgcactgaacacacacatcc（配列番号：58）
PCR条件：94度2分、(94度30秒、65度30秒、72度1分) x 40回、72度2分、4度
PCR産物をEcoRV制限酵素処理することで野生型と変異型のサイズの違いから遺伝子型決定【００８８】
〔実施例１〕LV-CAG-EGFPの感染・評価
GFP遺伝子をもつLV（LV-CAG-EGFP、Molecular Therapy 2003, 8;666-673に記載の方法によって構築。CAGプロモーターの制御下にEGFPをコードするcDNAを導入したSINレンチウイルスベクタープラスミドを構築し、パッケージングプラスミド、Rev発現プラスミド、VSVG発現プラスミドと混合してリン酸カルシウム法にて293T細胞に導入。培養上清中に出てくるウイルス粒子を回収して、超遠心により濃縮して調整。プラスミドについては図１を参照）を、TG法および本発明の方法によって導入することを試みた。本実験に用いた遺伝子はGFP遺伝子であるため、導入された部分は緑色蛍光を発する。それぞれの方法で遺伝子導入された個体について、顕微鏡下での観察、組織切片、PCR等によって、感染部位の確認および感染効率の評価を行った。【００８９】
TG法の場合、E13.5の胎児・胎盤ともに緑色蛍光を発し両方に遺伝子が導入された（図2）。一方本発明の方法を用いた場合は、胎児に遺伝子導入されることなく胎盤のみに遺伝子が導入された（図2）。未処理の胎盤切片と、本発明の方法により遺伝子が導入された胎盤の切片を比較した結果、本発明の方法により遺伝子が導入された胎盤では、胎盤全体に遺伝子が導入されていることが確認された(図3)。さらに、遺伝子導入をPCRで確認したところ、TG法においては、胎盤のみに遺伝子導入される場合も存在するものの、胎盤と胎児の両方に遺伝子が導入されたケースが6割程度（66個体中38個体）存在した（表1）。一方、本発明の方法によって同じウイルスベクターを導入した場合には、69個体のすべてにおいて胎盤のみに遺伝子導入され、胎児には遺伝子が導入されなかった（表1）。また新生児91匹を解析したところ、すべて正常に産まれ、遺伝子の導入はみられなかった（表1）。以上より、本発明の方法によって胎盤特異的に遺伝子が導入されることが確認された。
【表１】
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【００９０】
〔実施例２〕ERK2、p38alphaノックアウトマウスのレスキュー
次に本発明者らは、本発明の方法によって目的の遺伝子を導入することにより、本来なら胎盤異常により胎生致死となる変異マウスを発生させることができ、生後の解析を行えるのではないかと考えた。実験には、ERK2ノックアウトマウス及びp38alphaのノックアウトマウスを用いた。【００９１】
１）ERK2ノックアウトマウス(図4)
ERK2ノックアウトマウスは、胎盤異常によりE10.5付近で胎生致死となると報告されている（Hatano N et al：Genes Cells. 2003 Nov;8(11):847-56）。Hatano Nらによると、ノックアウトの胎盤ではlabyrinthine layersが薄く、胎児では心壁が薄くなり発生が遅れ、E11.5以降の胚は確認できない。テトラプロイドレスキューによりlabyrinthine layersの薄さが改善され、心壁の異常も改善された。従ってHatano Nらは、心壁が薄くなったのは、胎盤から十分な酸素や栄養が伝わらなかったための二次的異常によると述べている。【００９２】
ERK2のcDNAをCAGプロモーター制御下に発現するレンチウイルスベクターを作製した(図3b)。ERK2 +/- x +/-の交配により得られた胚盤胞の透明帯を除去した後、ウイルスベクターを感染させ、偽妊娠マウスの子宮に移植した。得られた産子の遺伝子型をPCRにより確認したところ、16匹の個体がホモ欠損マウスであった(図4c、d)。ホモ欠損新生児は見た目が少し小さいが、元気な個体でありミルクを飲んでいることも確認された(図4e)。また、ウエスタンブロットにおいてERK2のタンパク質が消失していることが確認された（図4f)。【００９３】
２）p38alphaノックアウトマウス(図5)
p38alphaノックアウトマウスは、胎盤異常によりE10.5付近で胎生致死となると報告されている（Adams RH et al：Mol Cell. 2000 Jul;6(1):109-16、Mudgett JS et al：Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 12;97(19):10454-9）。p38alphaノックアウトマウスでは胎盤のlabyrinthine layersと胎児の心壁が薄く不完全であり、脳血管形成にも異常が見られる。テトラプロイドレスキューにより胎盤が正常となったマウスでは、心壁も脳血管形成も正常となった。Adams RHらは、胎盤以外の異常は胎盤からの酸素・栄養不足が原因であると考えられるため、胎生致死の直接の原因は胎盤異常であると報告している。【００９４】
p38alphaノックアウトマウスについても同様にレンチウイルスベクターを用いて胎盤特異的に遺伝子導入し(図5b)、 PCRにより遺伝子型を確認した。結果、34匹のホモ欠損個体が生まれた(図5c,d)。ホモ欠損新生児は見た目が少し小さいが、元気な個体でありミルクを飲んでいることも確認された(図5e)。またウエスタンブロットにおいて、p38alphaのタンパク質が消失していることが確認された(図5f)。【００９５】
以上より、胎盤特異的に遺伝子を導入する系を確立することができ、この系を用いれば胎盤異常により胎生致死となるノックアウトマウスを生ませることができることが確認された。さらに、このノックアウトマウスを用いることにより、生後の機能解析を進めることも可能となった。【００９６】
胎盤異常となる遺伝子変異マウスは、2001年の時点で40以上もの報告がされている（Rossant J, Cross JC.：Nat Rev Genet. 2001 Jul;2(7):538-48. Review）。胎盤異常により胎生致死となると、その遺伝子が生後どのような機能を有しているのかなどの解析を行うことができない。本発明の方法は、このような変異マウスのレスキュー実験に利用可能であり、生後の遺伝子機能解析が可能となる。【００９７】
また、テトラプロイドによるレスキューは異常な胚の胎盤を補い機能を正常化させているだけであるが、LVを用いれば胎盤特異的に変異型遺伝子を発現させたりRNAiと組み合わせたりすることができる。たとえば、胎盤においてERK2の変異型遺伝子がドミナントネガティブとして働けば、ERK2の胎盤での特異的な機能を解析することもできると考えられる。【００９８】
また、LVを用いれば、それぞれの遺伝子自身の詳細な解析を行えるだけでなく、遺伝子のサブファミリーやシグナル伝達経路の上流や下流にある遺伝子との関わりをも検討することもできると考えられる。このように、LVを用いた胎盤特異的遺伝子導入法の開発は、さらに検討を進めることによって、遺伝子治療や個体レベルでの遺伝子機能解析などの応用研究へとつなげることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によって、胎盤特異的かつ胎盤全域に遺伝子を導入する方法が提供された。本発明の遺伝子導入方法は、胎盤へ直接遺伝子を導入する方法ではないため、母体や胎児への負担が小さい。また、マイクロインジェクションシステムに代表されるような高価な装置や高度な技術も必要としない。【０１００】
さらに、本発明の方法によって、変異動物の胎盤機能を補うことのみならず、多種多様な遺伝子を導入することにより、胎盤における遺伝子の機能解析を行うことも可能となった。このように本発明の方法は、胚発生の過程における遺伝子機能の解析研究においても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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