(57)【要約】  ペプチド及びタンパク質濃度を高感度で効率的に且つ簡便に分析することができる試薬として有用な、下記式Ｉで表される化合物、及び該化合物を含む試薬を使用した分析方法を提供する。  式Ｉ：    【化１】2006132030.tif 000013［式中、Ｒ１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択されたものであり、ｎは1〜5の整数である。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉで表される化合物：
【化１】
2006132030.tif 000012
［式中、Ｒ１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択されたものであり、ｎは1〜5の整数である。］
【請求項２】
Ｒ１が、置換されていてもよい、フェニル基又はナフチル基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基からなる群より選択されたものであり、ｎが１であることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載された化合物を含むことを特徴とするペプチド又はタンパク質の分析用試薬。
【請求項５】
ペプチド又はタンパク質を含有する試料と請求項４に記載の試薬とを混合し、該混合物の蛍光又は発色を測定することを特徴とするペプチド又はタンパク質の分析方法。
【請求項６】
前記試料と前記試薬との混合が液相中で行われることを特徴とする請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記試料と前記試薬との混合が、前記試薬を含有する溶液と、ゲル電気泳動を用いて分離された前記試料を含有するゲルとを接触させることにより行われることを特徴とする請求項５に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、該化合物を含むペプチド又はタンパク質の分析用試薬、及び該分析試薬を使用する分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内のタンパク質を網羅的に調べて病気の状態や原因を探るプロテオーム研究が進められており、例えば、ガンマーカータンパク質のように疾患の目印となるタンパク質を決定しようとする研究が急速に加速している。特に、タンパク質表面、タンパク質表面間の分子認識は生命現象における共通の言語と考えられ、細胞外からの情報の多くは細胞膜や細胞内部でのタンパク質表面を介した相互作用によって増幅し伝達される。【０００３】
また、近年ではDNAチップ技術の向上によりRNAの発現を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析も盛んに行われている。しかしながら、このRNA発現プロファイルとタンパク質の発現プロファイルとは必ずしも一致するわけでなく、その相関は50％以下であると言われている。そのためには、RNAの網羅的解析に加えて、タンパク質の網羅的解析が重要であり、最近では著しく発達している二次元電気泳動法や質量分析さらにはプロテインチップのようなゲノム解析に匹敵するハイスループット分析を駆使して、タンパク質の機能を明らかにする試みがなされている。【０００４】
試料中のタンパク質を定量する代表的な方法として、（ａ）吸光光度法、（ｂ）Biuret試薬を用いたBiuret法、（ｃ）フェノール試薬とBiuret法を組み合わせたLowry法、（ｄ
）Bradford法、（ｅ）ELISA法等が挙げられる。以下にそれぞれの方法の原理、長所、および短所について記す。【０００５】
（ａ）吸光光度法
原理：タンパク質中のチロシンやトリプトファンに起因する280nm付近の吸収帯を利用してタンパク質濃度を算出する方法。タンパク質の種類によってチロシンやトリプトファンの含量が異なるので280nmにおける吸光度は変動するが、通常1mg/mlの濃度の時A280nmは1.0として計算できる。
長所：操作が簡便であり、測定後サンプルの回収が可能である。
短所：タンパク質の種類により吸光度が変動する。また280nmに吸収を持たないタンパク質（コラーゲン、ゼラチンなど）は測定できない。さらに紫外部に吸収を持つ物質が混入すると定量が困難となる。【０００６】
（ｂ）Biuret法
原理：タンパク質をアルカリ性条件下でＣｕ２+溶液と反応させると、Ｃｕ２+がポリペプチド鎖中の窒素原子と配位結合して赤色に発色する現象を利用して、540nmにおける吸光度を測定する方法。
長所：タンパク質の違いによる発色率の差が少ない。操作が簡単である。
短所：感度が低く、低濃度試料には向かない。【０００７】
（ｃ）Lowry法
原理：リンモリブデン酸とリンタングステン酸を酸性溶液に溶解したフェノール試薬を用いて、タンパク質中のチロシン、トリプトファンおよびシステインと反応させることにより、青色を呈色させる方法である。ペプチド結合に由来する発色効果が強く表れるためBiuret法よりはるかに感度が高い。
長所：感度が高く、最も一般に使用されている方法である。
短所：還元反応によって呈色させるため、他の還元物質により発色が妨害される。操作が煩雑で測定までに時間がかかる。タンパク質によって発色率に差がある。【０００８】
（ｄ）Bradford法
酸性溶液中、トリフェニルメタン系青色色素のCoomassie Brilliant Blue G-250がタンパク質と結合すると、極大吸収波長が465nmから595nmにシフトし、色調が赤紫色から青色に変化する。この現象を利用してタンパク質を定量する方法である。
長所：妨害物質の影響を受けにくい。操作が非常に簡単である。
短所：タンパク質の種類により発色率に差がある。また界面活性剤の混入により発色が妨害される。【０００９】
（ｅ）ELISA法
特定のタンパク質とだけ結合する抗体を利用した免疫学的な手法。
短所：対象となるタンパク質(抗原)と抗体の結合反応を繰り返す必要があるため、測定に6時間以上かかるなど、迅速に結果を求めることができない。【００１０】
この他には、蛍光光度法を利用してペプチド又はタンパク質を分析する方法が知られている。蛍光光度法は、種々の化学物質を分析する慣習的な方法であり、高感度で、試料が少量ですみ、大掛かりな装置、熟練した技術を必要としないといった利点がある。【００１１】
これまでにも蛍光光度法を利用したタンパク質定量の報告はあり、例えば、フルオレサミンは1級アミンと反応すると、495nmに蛍光を発する強い蛍光物質となることを利用した方法やシアニン系色素を用いた分析が代表的である（Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th ed.; Molecular Probes Inc.: Leiden, 2002.）。【００１２】
しかしながらこの方法では色素とタンパク質とを共有結合を介して反応させるため、反応時間が遅い、タンパク質の種類によって反応性が変わる、検量線が直線でない、色素同士の会合による測定誤差、ストークスシフトが小さいといった問題点がある。【００１３】
【特許文献１】米国特許第５６１６５０２号
【非特許文献１】Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th ed.; Molecular Probes Inc.: Leiden(2002)
【非特許文献２】L. J. Jones, R. P. Haugland, V. L. Singer, Biotechniques, 34, 850(2003)
【非特許文献３】R. F. Pasternack, C. Fleming, S. Herring, P. J. Collings, J.DePaula, G. DeCastro, E. J. Gibbs, Biophys. J., 79, 550(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
タンパク質の網羅的な解析によるプロテオーム研究は重要であるが、従来の分析方法は、感度・精度が低かったり、操作が煩雑であったり、時間がかかる等の欠点があった。【００１５】
そこで、本発明では、上記問題点を解決し、ペプチド及びタンパク質濃度を高感度で効率的に且つ簡便に分析することができる試薬として有用な新規化合物、及び該新規化合物を含む試薬を使用したペプチド又はタンパク質の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、複素環とオレフィン共役系とを有する新規な蛍光化合物を合成し、該化合物がペプチド及びタンパク質濃度を高感度で効率的に且つ簡便に分析することができる試薬として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。【００１８】
（１）次の式Ｉで表される化合物：
【化１】
2006132030.tif 000002
【００１９】
［式中、Ｒ１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択されたものであり、ｎは1〜5の整数である。］【００２０】
（２）Ｒ１が、置換されていてもよい、フェニル基又はナフチル基であることを特徴とする（１）に記載の化合物。【００２１】
（３）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基からなる群より選択されたものであり、ｎが１であることを特徴とする（２）に記載の化合物。【００２２】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載された化合物を含むことを特徴とするペプチド又はタンパク質の分析用試薬。【００２３】
（５）ペプチド又はタンパク質を含有する試料と（４）に記載の試薬とを混合し、該混合物の蛍光又は発色を測定することを特徴とするペプチド又はタンパク質の分析方法。【００２４】
（６）前記試料と前記試薬との混合が液相中で行われることを特徴とする（５）に記載の分析方法。【００２５】
（７）前記試料と前記試薬との混合が、前記試薬を含有する溶液と、ゲル電気泳動を用いて分離された前記試料を含有するゲルとを接触させることにより行われることを特徴とする（５）に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００２６】
従来の方法では、感度・精度が低かったり、操作が煩雑であったり、時間がかかる等の欠点があったが、本発明の新規化合物を含む試薬及び分析方法を用いれば、試料中のペプチド及びタンパク質の存在又は濃度を、短時間で正確に且つ簡便に測定することができる。また、本発明の方法では蛍光や発光の変化を測定するので、従来のような高価な装置や熟練した技術は必要とせず、経験がなくても容易に正確な測定をすることができる。また使用する分析試薬となる化合物は安価な出発物質から容易に合成することができ、高価な試薬は使用しないので分析にかかるコストを大幅に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】タンパク質と色素の複合体形成による蛍光発光の模式図である。
【図２】色素１に種々の濃度のBSAを添加したときの吸収スペクトルである。
【図３】色素１に200μg/mLのBSAを添加したときの3次元蛍光スペクトルである。
【図４】色素１に種々の濃度のBSAを添加したときの蛍光スペクトルである。
【図５】色素１と種々の濃度のBSAを添加したときの写真観察図である。
【図６】色素１の蛍光強度をBSA濃度に対してプロットした検量線である。
【図７】実施例７において、SDS-PAGEによって分離されたBSAまたはIgGの電気泳動写真である。
【図８】実施例７において、タンパク質のスポットの蛍光強度とタンパク質濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の試薬として有用な化合物は、下記の式Ｉで表される。：
【化２】
2006132030.tif 000003
【００２９】
［式中、Ｒ１は置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択されたものであり、ｎは1〜5の整数である。］【００３０】
アリール基としては、例えば、フェニル、２〜４個のベンゼン環が縮合した多環芳香族基（例えば、ナフチル、アントリル、ピレニル）等が挙げられる。また、ヘテロアリール基とは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子をその環原子として含有するアリール基をいう。これらのアリール基又はヘテロアリール基はさらに別の芳香環又は複素芳香環と縮合したものであってもよい。アリール基及びヘテロアリール基の具体例としては、例えば、ピリジル基、フリル基、ダンシル基、クマリン、ベンゾチアゾ−ル、フルオレセイン、ローダミン、アゾベンゼン等が挙げられる。【００３１】
前記アリール基又はヘテロアリール基は、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアルキル基、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜６）のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択される１つ以上の基により置換されていてもよい。前記アリール基又はヘテロアリール基は、水溶性及び電子供与性の付与のために水酸基で置換されていることが好ましい。【００３２】
化合物の蛍光基又は発色基（紫外部、可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定が可能なもの）となる部分は、式Ｉのオレフィン部分-(CH=CH)n-と共役系を形成するものであり、式ＩＩ：【００３３】
【化３】
2006132030.tif 000004
で表される構造を有する。【００３４】
［式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、結合、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェニル基（該フェニル基はアミノ基、ハロゲン及びニトロ基から選択される１つ以上の基により置換されていてもよい）、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基（若しくはその塩、エステル、アミド）、スルホン酸（若しくはその塩、エステル、アミド）、チオール基、水酸基（若しくはその塩）、炭素数１〜１０のアシル基、ハロゲン及び糖からなる群より選択されたものである。］
中でも、下記式：【００３５】
【化４】
2006132030.tif 000005
で表される基が好ましい。【００３６】
蛍光基又は発色基である上記構造に、アルケニル基及び芳香族基を接続することにより共役系が伸長し、蛍光・発色波長の長波長化が促される。【００３７】
式Ｉの化合物は、公知の方法により容易に合成することができる。例えば、下記式：【００３８】
【化５】
2006132030.tif 000006
の化合物は、４-ヒドロキシベンズアルデヒドと4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピランとをエタノール中、塩基（例えばピペリジン等のアミン）の存在下で反応させることにより製造することができる。【００３９】
本発明の試薬は式Ｉの化合物を含有するものであるが、その使用時の形態は特に限定されるものではなく、例えば、水に式Ｉの化合物を溶解させて水溶液としたものでもよいし、又は、ろ紙、シリカシート、アルミナシート等に式Ｉの化合物の溶液を染み込ませ、場合により乾燥させたものでもよい。【００４０】
次に、本発明の試薬を用いるペプチド又はタンパク質（以下、単に「タンパク質」とも言う）の分析方法について説明する。【００４１】
本発明の方法の原理を図１に示す。式Ｉの化合物と測定対象物であるタンパク質とを混合するとこれらは複合体を形成し、式Ｉの化合物に蛍光発光又は発色が生じる。この蛍光・発色の変化（例えば、波長、強度）はタンパク質量と相関関係があるので、この変化を測定することにより、タンパク質の定性分析又は定量分析を行うことができる。【００４２】
本発明の試薬とタンパク質含有試料との混合は、液相（例えば、水溶液）中で行ってもよいし、又は前記試薬を染み込ませた固相（例えば、ろ紙、シリカシート、アルミナシート）と前記試料を含有する溶液とを接触させることにより行うことができる。【００４３】
試料中にタンパク質が存在する場合、式Ｉの化合物は疎水性相互作用及び電荷移動相互作用によりタンパク質と複合体（電荷移動錯体）を形成し、それにより式Ｉの化合物に固有の吸収波長や吸収強度または蛍光波長や蛍光強度に変化が生じる。この変化は色調の変化として目視で観察できる場合もあり、これにより試料中のタンパク質の存在を容易に確認することができる。あるいは、市販の蛍光光度計・吸光光度計等の測定機器を用いて測定してもよい。この変化量・変位量からタンパク質の濃度を正確に定量することができる。【００４４】
また、試料をアガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動にかけて試料に含まれるタンパク質を分離し、次いで電気泳動後のゲルに本発明の分析試薬を接触させることによりゲル中に存在するタンパク質を染色し、これを蛍光イメージアナライザー等を用いて画像として取り込むことにより、試料中のタンパク質を定性／定量分析することも可能である。
【実施例】
【００４５】
以下に、本発明を実施例によりより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４６】
（実施例１：色素１の合成）
【化６】
2006132030.tif 000007
【００４７】
50ml三口フラスコに、4-ヒドロキシベンズアルデヒド0.70g(5.81mmol)、4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エタノ
ール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率  30％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, r.t., TMS, d/ppm) 1.71 (s, 3H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.68 (d, 2H), 7.13 (d, 2H).【００４８】
（実施例２：色素２の合成）
【化７】
2006132030.tif 000008
【００４９】
50ml三口フラスコに、バニリン0.70g(5.81mmol)、4-(ジシアノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エタノール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率  20％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, r.t., TMS, δ/ppm) 1.71 (s, 3H), 4.03 (s, 3H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.68 (d, 2H), 7.13 (d, 2H).【００５０】
（実施例３：色素３の合成）
【化８】
2006132030.tif 000009
【００５１】
50ml三口フラスコに、4-ヒドロキシ-1-ナフトアルデヒド0.70g(5.81mmol)、4-(ジシア
ノメチレン)-2,6-ジメチル-4H-ピラン1.0g(5.81mmol)、ピペリジン0.50g(5.81mmol)、エ
タノール50mlを加え、Ar気流下、12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3 : MeOH = 10 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。収率  25％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, r.t., TMS, δ/ppm) 1.71 (s, 3H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.59 (d, 1H), 7.21 (d, 1H), 7.35 (t, 1H), 7.38 (t, 1H), 8.08 (d, 1H).【００５２】
（実施例４：色素１とタンパク質(BSA)との複合体化による吸収スペクトルの変化）
本発明の試薬として色素1を用いた。これと種々の濃度のBSA溶液とを混合し、吸収スペクトルの変化を観察した。吸収スペクトルの測定条件は以下のとおりである。
濃度：[色素１] ＝ 1.0 × 10-5M
[BSA]    ＝ 0 〜 200 μg/mL
溶媒：0.9 ％ NaCl水溶液
温度：25 ℃【００５３】
測定された吸収スペクトルを図２に示す。図２において、曲線（Ａ）は［ＢＳＡ］＝０μｇ/ｍＬ、曲線（Ｂ）は［ＢＳＡ］＝２００μｇ/ｍＬを表す。BSAの濃度の増加に伴い、400nm〜500nmの吸収帯の吸光度がわずかに増加した。色素２および色素３についても同様の結果が得られた。【００５４】
（実施例５：色素１とタンパク質(BSA)との複合体化による蛍光スペクトルの変化）
色素１とBSAとの相互作用を蛍光スペクトル測定により解析するにあたり、最適な励起波長を決定するために、色素１とBSA (200 μg/mL)とを混合し、３次元蛍光スペクトル(励起波長範囲：350nm〜500nm、蛍光波長範囲：400nm〜750nm)を測定した。その結果を図３に示す。励起波長が長波長側へ行くに伴い、590nmに極大蛍光波長を持つ蛍光スペクトルが観察された。500nmの測定においては散乱光が蛍光に大きくかぶさるために、以後の蛍光スペクトル測定の励起波長は470nmとした。色素２および色素３についても同様の測定を行い、励起波長を決定した。【００５５】
蛍光スペクトルの測定は以下の条件で行なった。
濃度：[色素] ＝ 1.0 × 10-5M
[BSA]  ＝ 0 〜 200 μg/mL
溶媒：0.9 ％ NaCl水溶液
温度：25 ℃
励起波長：色素1  350nm, 470nm
色素2  350nm, 470nm
色素3  500nm【００５６】
色素１に（0,25,50,100,200μg/mL）のBSAを添加したときの蛍光スペクトル変化を測定し、その結果を図４に記載した。図４において各曲線は下から順にＢＳＡ濃度（0,25,50,100,200μg/mL）の測定結果を表す。図４に示すように、BSA濃度の増加に伴って蛍光強度の増加が観察された。BSAを200μg/mL添加した時の蛍光強度は、色素１単独のときよりも約20倍増加した。色素２および色素３についても、BSA濃度の増加に伴って蛍光強度が増加することが確認された。【００５７】
色素１にBSAを添加する前(0μg/ml)、および添加した後(100μg/ml)の溶液に紫外線ランプを照射したときの写真観察図を図５に示す。BSAを添加することにより橙色に発光している様子が観察された。【００５８】
色素１にBSAを添加した時の590nmにおける蛍光強度(I)から、色素１単独の590nmにおける蛍光強度(Io)を差し引いた値(I-Io)をBSA濃度に対してプロットした図を図６に示す。相関係数が0.9974という良好な直線関係が得られた。また検出限界は100ng/mLであり、Bradfold法よりも約20倍感度が良いことが分かった。色素２および色素３についても同様に検量線を作成したところ、蛍光強度とタンパク質濃度との間に良好な直線関係があることが分かった。【００５９】
上記の各色素のＢＳＡとの相互作用の前後における光学的データを表１に示す。
【表１】
2006132030.tif 000010
【００６０】
全ての色素において、BSAの添加の前後で極大吸収波長のシフトは観察されず、モル吸光係数がわずかに増加したのみであった。一方、蛍光スペクトルにおいては、極大蛍光波長のシフトは観察されなかったものの、BSAの添加により大きな蛍光強度の増加が観察された。相対蛍光強度Ｉ/Ｉ０（I0 : 色素単独での590nmにおける蛍光強度、I : 色素にBSA(200 mg/mL)を添加した時の590nmにおける蛍光強度）を算出したところ、色素1および色素3の場合、17〜18倍の蛍光強度の増加があり、ストークスシフトが大きいので、極微量のタンパク質でも鋭敏に検出できることが分かった。【００６１】
（実施例６：妨害物質に対する影響について）
無機塩、界面活性剤、核酸などの妨害物質が、色素とタンパク質との相互作用にどの程度、影響を与えるかを、以下のようにして確認した。
（測定条件）
[色素3] = 1.0 × 10-5 M
[BSA] = 1000 μg/mL
溶媒：0.9 % NaCl水溶液
温度：25 °C
励起波長：色素3  500nm
（妨害物質として使用した化合物）
グリシン、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、アスパラギン、炭酸水素ナトリウム、塩化亜鉛（II）、Bicine、Bis-Tris、塩化ニッケル、酢酸ナトリウム、Tricine、リン酸ナトリウム、グアニジン・HCL、イミダゾール、塩化カルシウム、トリエタノールアミン、クエン酸ナトリウム、HEPES、B-PER Reagent、塩化コバルト（II）、核酸（鮭精巣由来）、SDS、CHAPS、Tweem-20、Triton X-100、EDTA、EGTA、システイン、グルコース、メリビオース、２−メルカプトエタノール、チメロサール、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、Phenol Red、尿素、グリセロール、チオシアン酸カリウム、スクロース【００６２】
（結果）
色素とBSAが混合している状態で、上記の各妨害物質を添加することによって、蛍光強度が10%変化したときの核物質の濃度を測定し、表2に示す。観察された妨害物質の濃度は、通常の実験条件下において利用される濃度よりも大過剰の濃度であった。従って、色素とタンパク質との相互作用は、妨害物質によって影響を受けないことが分かった。【００６３】
【表２】
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【００６４】
（実施例７：電気泳動試験）
合成した色素の応用例として、電気泳動によって分離されたタンパク質を検出するための染色剤として利用することが出来るかどうかを、次のようにして検討した。
（実験条件）
・SDS-PAGE装置:  Sure Blot F1 Gel system (Astellas Pharma, Inc., Tokyo).  
・[色素3] = 0.1 mg/mL (又は0.2mg/mL) in MeOH : H2O = 1 : 1v/v
・固定化液および洗浄液: AcOH : MeOH : H2O = 3 : 10 : 87
・検出装置: a ProXpress imaging system (Perkin-Elmer, U.K.) 又は LS400 scanner (Tecan, USA)) 
（操作）
１） BSA 、Human IgG、Chymotrypsinogen又はTransferrin のSDS-PAGEを行った。
２） ゲルを固定化液中で30分間浸した。
３） ゲルを色素溶液に30分間または1時間浸した。 
４） ゲルを洗浄液に30分間浸した。
５）蛍光検出を行った(ex; 543 nm, em; 590 nm又はex; 480 nm, em; 530nm).【００６５】
（結果）
SDS-PAGEによって分離されたBSAまたはIgGの電気泳動写真を、図７に示す。タンパク質は色素によって染色され、綺麗な電気泳動画像を得ることに成功した。
図７において、各数字は次のものを表す：
（１）ＩｇＧ０．０２μｇ、（２）ＩｇＧ０．１μｇ、（３）ＩｇＧ０．４μｇ、（４）ＩｇＧ１．１μｇ、（１）ＩｇＧ３．３μｇ、（６）ＢＳＡ０．０１μｇ、（７）ＢＳＡ０．０２μｇ、（８）ＢＳＡ０．１μｇ、（９）ＢＳＡ０．４μｇ、（１０）ＢＳＡ１。１μｇ、（１１）ＢＳＡ３．３μｇ、（１２）ＢＳＡ１０．０μｇ。
また、タンパク質のスポットの蛍光強度とタンパク質濃度との関係を、図８に示す。良好な直線関係が得られ、かつタンパク質間ごとの検量線の傾きに大きな違いは観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の新規化合物を利用するタンパク質の分析用試薬及び分析方法は、例えば、生化学、医療、分析化学等の分野において、高感度、網羅的かつ簡便なタンパク質の分析に有用である。さらには、タンパク質の分析だけに留まらず、電気泳動においてタンパク質を分離したときに使用される染色剤や生細胞内のタンパク質の可視化イメージング色素等にも利用できる。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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