(57)【要約】  新生児における脳疾患を治療および予防するための新規薬剤が開示される。本発明の薬剤は、エリスロポエチンを有効成分とし、出生から８週間以内の新生児に投与される。本発明の治療剤または予防剤により治療しうる脳疾患の代表的なものは、後に脳性麻痺を発症する側脳室周囲白質軟化症である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出生から８週間以内の新生児に投与されることを特徴とする、エリスロポエチンを有効成分とする脳疾患治療剤または予防剤。
【請求項２】
新生児が未熟児であることを特徴とする請求項１記載の治療剤または予防剤。
【請求項３】
脳疾患が脳性麻痺である請求項１または２に記載の治療剤または予防剤。
【請求項４】
脳疾患が脳室周囲白質軟化症である請求項１または２に記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
エリスロポエチンがエリスロポエチン誘導体である請求項１〜４いずれかに記載の治療剤または予防剤。
【請求項６】
エリスロポエチン誘導体がアシアロエリスロポエチンである請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項７】
エリスロポエチン誘導体がカルバミル化されたエリスロポエチンである、請求項５または６に記載の治療剤または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳疾患の治療および予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児における脳疾患は、出生前、出生時、または出生直後に、脳において細胞や組織に損傷を受けることにより生ずる疾患であり、例えば、後に脳性麻痺を発症する脳室周囲白質軟化症が挙げられる。これらの疾患の治療は、整形外科的治療と、理学療法や作業療法との組み合わせによって行われており、現在のところ、薬剤による治療法は確立されていない。したがって、これらの疾患の有効な治療方法の開発が求められている。【０００３】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【特許文献１】特表２００５−５０２５８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新生児における脳疾患を治療および予防するための新規な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、新生児の脳疾患である脳室周囲白質軟化症を模倣する新たな動物モデルを開発し、これを用いて脳疾患に対する種々の薬剤の有効性を調べた結果、エリスロポエチンが有効であることを見いだして本発明を完成させた。【０００６】
本発明は、出生から８週間以内の新生児に投与されることを特徴とする、エリスロポエチンを有効成分とする脳疾患治療剤または予防剤を提供する。本発明の治療剤または予防剤により治療しうる脳疾患の代表的なものは、後に脳性麻痺を発症する脳室周囲白質軟化症である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、PVLモデルを用いたEPO投与による脳障害の改善を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の治療剤または予防剤は、出生から８週間以内の新生児に投与されることを特徴とする。本発明の治療剤または予防剤が対象とする新生児は、出生から８週間以内の新生児であり、好ましくは４週間以内の新生児であり、さらに好ましくは１週間以内の新生児である。なお、本発明における新生児には未熟児も含まれる。【０００９】
本発明の治療剤または予防剤は、出生から４週間以内の新生児に投与される限り特に限定されないが、主として未熟児に投与される。本発明において未熟児とは、在胎週数が３３週未満で出生した新生児のことをいう。【００１０】
本発明において脳疾患とは、神経変性、虚血、低酸素、炎症などに起因する、脳における疾患、細胞・組織の損傷のことをいう。本発明の治療剤または予防剤が対象とする疾患の代表的なものは、後に脳性麻痺を発症する脳室周囲白質軟化症（periventricular  leukomalasia:  PVL）である。脳性麻痺は、出生前、出生時または出生直後に脳に受けた障害がもとで筋肉などの制御ができなくなり、麻痺やそのほかの神経障害が起こる疾患である。また、PVLは、脳室の周りの白質の組織が壊死する疾患である。PVLにより障害を受ける箇所には、運動に関連する神経線維が存在する為、運動障害が起こりやすい。【００１１】
本発明の治療剤又は予防剤を新生児に投与することにより、PVLを治療又は予防することが可能であり、その結果として、脳性麻痺の治療又は予防が可能となる。従って、本発明は脳性麻痺又はＰＶＬの治療剤又は予防剤に関する。【００１２】
本発明に用いるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、どのようなＥＰＯでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＥＰＯであり、より具体的には、哺乳動物ＥＰＯ、特にヒトＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。【００１３】
本発明で用いるＥＰＯは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平１−３８８００号公報、など）や、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などで産生せしめ、種々の方法で抽出し、分離精製したヒトＥＰＯなどを用いることができる。本発明において用いられるＥＰＯは、遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＥＰＯが好ましい（例えば、特公平１−４４３１７号公報、Kenneth  Jacobs  et  al.,  Nature,  313  806-810  (1985)、など）。【００１４】
遺伝子組換え法により得られるＥＰＯには、天然由来のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＥＰＯと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh,  T.  et  al.  (1995)  Gene  152,  271-275；Zoller,  M.J.  and  Smith,  M.  (1983)  Methods  Enzymol.  100,  468-500；Kramer,  W.  et  al.  (1984)  Nucleic  Acids  Res.  12,  9441-9456；Kramer,  W.  and  Fritz,  H.J.  (1987)  Methods  Enzymol.  154,  350-367；Kunkel,  T.A.  (1985)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  82,  488-492；Kunkel  (1988)  Methods  Enzymol.  85,  2763-2766）などを用いて、ＥＰＯのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ＥＰＯと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。【００１５】
一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,  D.F.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1984)  81,  5662-5666；Zoller,  M.J.  &  Smith,  M.  Nucleic  Acids  Research  (1982)  10,  6487-6500；Wang,  A.  et  al.,  Science  224,  1431-1433；Dalbadie-McFarland,  G.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1982)  79,  6409-6413）。【００１６】
本発明においては、ＥＰＯと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＥＰＯとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。【００１７】
本発明においてはまた、化学修飾したＥＰＯを用いることも可能である。化学修飾したＥＰＯの例としては、例えば、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＥＰＯなどを挙げることができる。【００１８】
さらに、本発明のＥＰＯはＥＰＯ誘導体であってもよい。  本発明においてＥＰＯ誘導体とは、ＥＰＯ分子中のアミノ酸を修飾したＥＰＯ又はＥＰＯ分子中の糖鎖を修飾したＥＰＯのことをいう。ＥＰＯ分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の付加、置換、欠失などが含まれる。【００１９】
本発明において好ましい糖鎖の修飾としては、ＥＰＯ分子中のシアル酸の欠失を挙げることができる。通常、組換え動物細胞により生産したＥＰＯ、尿由来のＥＰＯのいずれにおいても、糖鎖構造の異なる多様なＥＰＯを含むＥＰＯ組成物として得られる。ＥＰＯ組成物中のＥＰＯ分子に付加しているシアル酸の数は、個々のＥＰＯ分子によって異なるが、通常、1つのＥＰＯ分子に１１個〜１５個のシアル酸が付加している。これらのシアル酸を除去することによりアシアロ化されたＥＰＯ（アシアロＥＰＯ）を作製することが可能である。アシアロ化の際に除去されるシアル酸の数は特に限定されず、全てのシアル酸を除去してもよいし、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14個のシアル酸を除去してもよい。本発明において好ましいアシアロＥＰＯは、ＥＰＯ分子に付加しているシアル酸の数が１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、特に好ましくは２個以下である。なお、本発明において用いられるシアル酸の数は、ＥＰＯ組成物に含まれているＥＰＯ分子の平均数を用いる。1分子あたりのシアル酸の平均は当業者に公知の方法によって測定することが可能である（ＥＰ0428267公報、など）。【００２０】
シアル酸が除去されたＥＰＯ（アシアロＥＰＯ）は当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、シアリダーゼなどの酵素でＥＰＯを処理すること等により作製することが可能である。シアリダーゼは市販されているものを用いることが可能である（特表2005-507426号、Nobuo  Imai  et  al.,  Eur.J.Biochem,  194,  457-462  (1990)、など)。【００２１】
ＥＰＯ分子中のアミノ酸の修飾としては、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化、などを挙げることができるが、本発明において好ましいアミノ酸の修飾はカルバミル化である。【００２２】
修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファンなどを挙げることができるが、本発明において修飾される好ましいアミノ酸はリジンである。従って、本発明においてアミノ酸が修飾されたＥＰＯの特に好ましい態様として、リジンがカルバミル化されたＥＰＯを挙げることができる（Marcel  L  et  al.  Derivatives  of  erythropoietin  that  are  tissue  protective  but  not  erythropoietic.  Science,  2004;  305:  239、  Fiordaliso  E  et  al.  A  nonerythropoietic  derivative  of  erythropoietin  protects  the  myocardium  from  ischemia-reperfusion  injury.  PNAS,  2005;  102:  2046、など)。ＥＰＯのカルバミル化には、シアナートイオン等との反応によるカルバミル化、アルキル−イソシアナート等との反応によるアルキル−カルバミル化、アリール−イソシアナート等との反応によるアリール−カルバミル化などが含まれる。【００２３】
上記のＥＰＯ、組換えＥＰＯ、化学修飾したＥＰＯ、ＥＰＯ誘導体などは、ヒトに投与しうる程度にまで高度に精製して、薬学的に許容しうる担体または賦形剤と組み合わせて製剤することができる。このような精製方法ならびに製剤方法は、当該技術分野においてよく知られている。【００２４】
本発明の治療剤または予防剤の製剤に際しては、必要に応じて、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。【００２５】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。【００２６】
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。【００２７】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。また、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することも可能である（例えば、特開平10-182481号公報など）。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は1種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる。【００２８】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。【００２９】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。【００３０】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。【００３１】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。【００３２】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。【００３３】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。【００３４】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。【００３５】
本発明の治療剤または予防剤を徐放性製剤として行う場合、徐放性製剤は公知の方法、例えば基剤としてポリマーを用いる方法などにより調製することが可能である。基剤として用いるポリマーは生体内で分解されるポリマーを用いることが好ましい。【００３６】
本発明の治療剤または予防剤は、血液脳関門が十分に成熟する前に投与されることが好ましい。本発明の治療剤または予防剤は通常、出生から８週間以内の新生児に投与する。出生から８週間以内の新生児に投与するとは、出生から８週間以内に本発明の治療剤または予防剤が少なくとも一度投与されていればよい。投与回数は一度のみでもよいし、複数回投与されてもよい。又、全ての投与が８週間以内に行われてもよいし、一部の投与のみ８週間以内に行われてもよい。【００３７】
本発明者らは、本発明の治療剤又は予防剤は低用量で投与した場合に効果があることを見出した。従って、本発明の治療剤または予防剤は、通常、EPOを0.001U〜9999U/kg/day(0.000005〜49.995μｇ/kg/day）、好ましくは0.1U〜1000U/kg/day（0.0005〜5μｇ/kg/day）、さらに好ましくは1U〜100U/kg/day（0.005〜0.5μｇ/kg/day）の投与量で投与する。本発明の治療剤または予防剤の個々の患者に対する投与量は、患者の体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。【００３８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００５−２３６８９８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例１】
【００３９】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４０】
PVLラットモデルの作成
生後２、３または４日齢のWistarラット(S.L.C.  Japan)を使用した（以下、それぞれP2、P3、P4と称する）。実験に関しては名古屋市立大学動物実験指針に基づき倫理委員会の許可を得て行った。同胞は母畜１匹に対し８−１２匹であった。母畜より分離した後、加温した手術台にてイソフルレンの吸入麻酔（導入５％、維持２％）下にて正中切開を行い、筋、結合織、迷走神経を剥離して右総頚動脈を露出し、熱凝固器にて凝固させ、切断した。閉創は6-0ナイロン糸２針にて縫合した。手術時間は１０分以内で行われた。回復と保温、授乳目的にて母畜に戻し、２時間後、酸素と加湿した窒素の混合気で６％酸素に調節した３７度の恒温槽に浸し、加温した容器内で３０−１２０分の低酸素負荷を加えた。生存した動物は回復後、母畜に戻した。【００４１】
４８時間後にネンブタールの腹腔内注射にて麻酔を行い、経心臓的に生理食塩水で潅流し、その後４％パラホルムアルデヒドにて潅流固定を行った。頚部を切断し、脳摘出の後に同様の固定液にて３−４時間の後固定を行ない、２０％スクロース液に浸けた。固定後、ドライアイスで急速凍結しスライディングマイクロトームで４０μmの冠状断で切片を作成した。切片は光学顕微鏡による組織学的評価のためヘマトキシリン・エオジン染色を行った。【００４２】
組織学的評価はヘマトキシリン・エオジン染色で行った。４段階に傷害を分類した。
No  change群は正常対照組織と差がない群。
Slight  damage群は脳梁などの白質は正常であるが皮質層構造に乱れがある群。
Mild  damage群は白質の部分的な欠落と皮質層構造の部分的な破壊がある群。
Severe  damage群は白質の広範な欠落と皮質総構造の広範な破壊がある群。
ラットにおけるPVLモデルとしては、Mild  damageが適切であると考えられた。結果を以下の表に示す。【００４３】
【表１】
2007020922.tif 000002
【００４４】
６０分未満の低酸素負荷ではP2、P3、P4のいずれについても死亡率は低く、低酸素負荷に対する耐性があると考えられた。しかしながら６０分以上の低酸素負荷を加えると、死亡率は増加傾向となった。【００４５】
以下の表に、P2、P3、P4ラットの、ヘマトキシリン・エオジン染色による障害の程度による分類を示す。【００４６】
【表２】
2007020922.tif 000003
【００４７】
P2では生存した動物にほとんど脳障害は発生していなかった。P3の場合、６０分の低酸素にてMild  damageの比率が７０％を超えていた。【００４８】
以上より、より生理的なモデルとして、P3ラットを用い、右総頚動脈閉塞の後6%酸素60分で低酸素虚血を加えると、PVLに近い状態が作成できると考えられた。
【実施例２】
【００４９】
PVLモデルを用いたEPO投与による脳障害の改善
生後3日齢のWistarラット(S.L.C.  Japan)を使用した。実験に関しては名古屋市立大学動物実験指針に基づき倫理委員会の許可を得て行った。同胞は母畜１匹に対し８−１２匹であった。母畜より分離した後、加温した手術台にてイソフルレンの吸入麻酔（導入５％、維持２％）下にて正中切開を行い、筋、結合織、迷走神経を剥離して右総頚動脈を露出し、熱凝固器にて凝固させ、切断した。閉創は6-0ナイロン糸２針にて縫合した。手術時間は１０分以内で行われた。回復と保温、授乳目的にて母畜に戻した。２時間後、腹腔内に体重6ｇあたり0.1  mlに相当する量でエリスロポエチン(1-30000  U/kg）またはカルバミル化EPO（CEPO）(50-100  U/kg）を投与した。カルバミル化EPO（CEPO）は、Jin  Zeng（Methods  in  Enzymology  205:  433-437，1991）に記載の方法に従い、EPOをシアナートイオンと反応させ、リジンをカルバミル化させることによって作製した。投与後、酸素と加湿した窒素の混合気で６％酸素に調節した３７度の恒温槽に浸し、加温した容器内で60分の低酸素負荷を加えた。生存した動物は回復後、母畜に戻した。【００５０】
４８時間後にネンブタールの腹腔内注射にて麻酔を行い、経心臓的に生理食塩水で潅流し、その後４％パラホルムアルデヒドにて潅流固定を行った。頚部を切断し、脳摘出の後に同様の固定液にて３−４時間の後固定を行ない、２０％スクロース液に浸けた。固定後、ドライアイスで急速凍結しスライディングマイクロトームで４０μmの冠状断で切片を作成した。切片は光学顕微鏡による組織学的評価のためヘマトキシリン・エオジン染色を行い、免疫組織化学的評価のためO4(1:500;  MAB345:  Chemicon)、NG2(1:400;  MAB5384:  Chemicon),  MBP(1:1000;  SMI-94:Sternburg)にて免疫染色を行った。傷害の分類は実施例１と同様に行った。結果を以下の表３および表４、ならびに図１に示す。表４では、No  change  -  Sligit  damageをameliorated、Mild  damage  -  Severe  damageをConstantとして、脳損傷によるEPO投与の効果をまとめた。【００５１】
【表３】
2007020922.tif 000004
【００５２】
【表４】
2007020922.tif 000005
【００５３】
EPO  50-100  U/kg  i.p.  を投与した場合、死亡率は40％以下まで低下した。また、１〜10000U/kg  i.p.のEPOを投与した場合に、amelioratedの比率が60％以上まで上昇し、特に50〜100U/kg  i.p.のEPOを投与した場合にamelioratedの比率は、約75〜87.5％まで上昇した。以上のことから、EPOの投与は低酸素虚血による脳損傷を改善させる作用があり、特に50〜100U/kg  i.p.のEPOを投与した場合に優れた作用があると考えられる。
また、50〜100U/kg  i.p.のカルバミル化EPO（CEPO）を投与した結果から、EPO誘導体においてもＥＰＯと同様の優れた改善作用があると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、脳疾患の治療および予防に有用である。
【図１】
2007020922.tif 000006
【国際調査報告】
2007020922.tif 000007
2007020922.tif 000008
2007020922.tif 000009