(57)【要約】（１）SFRP4の産生、（２）Wnt5aの産生、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用から選ばれるいずれかの作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成誘導化合物のスクリーニング方法。該スクリーニング方法によって得られた化合物、Wnt5a、又はSFRP4を有効成分とする硬組織形成誘導剤。Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する硬組織形成誘導化合物スクリーニング用細胞。並びにWnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する細胞及び該細胞を未分化の状態で保持する成分を含むスクリーニング用キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）SFRP4の産生、（２）Wnt5aの産生、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用、
及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用から選ばれるいずれかの作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成誘導化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
（１）SFRP4の産生抑制、（２）Wnt5aの産生促進、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相
互作用促進、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用抑制から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成促進化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
（１）SFRP4の産生促進、（２）Wnt5aの産生抑制、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相
互作用抑制、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用促進から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成抑制化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られた化合物、Wnt5a及びSFRP4から選ばれる１以上を有効成分とする硬組織形成誘導剤。
【請求項５】
下記(w1)又は(w2)に記載の蛋白質を有効成分とする硬組織形成促進剤：
（w1）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するWnt5a、
（w2）配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成促進活性を有する蛋白質。
【請求項６】
Wnt5aとSFRP4との分子間相互作用を介した請求項５に記載の硬組織形成促進剤。
【請求項７】
下記(s1)又は(s2)に記載の蛋白質を有効成分とする硬組織形成抑制剤：
（s1）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するSFRP4、
（s2）配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成抑制活性を有する蛋白質。
【請求項８】
Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する、硬組織形成誘導化合物スクリーニング用細胞。
【請求項９】
Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する細胞、及び、該細胞を未分化の状態で保持する成分を含む硬組織形成誘導化合物スクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硬組織形成を誘導する化合物のスクリーニング方法、該化合物を有効成分とする硬組織形成誘導剤、及び該化合物をスクリーニングするための手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨折等による骨欠損部や歯周病により破壊された歯周組織の再生療法が、臨床の現場でも実施されるようになってきており、一定の成果を上げている。【０００３】
しかし、現行の療法には、部分的にしか再生できなかったり、硬組織の過形成が生じたりするなどの克服すべき問題が残されている。このため、現在も、新しい考えに基づく硬組織再生療法の開発が切望されている。【０００４】
一方、歯周組織のうち、軟組織である歯根膜は、歯槽骨・セメント質の新生を伴う歯周組織再生に必須の細胞群のreservoirとして重要な役割を担っている。in vitroで歯根膜細胞を石灰化誘導培地にて長期培養すると、アルカリフォスファターゼ(ALPase)活性が上昇し、石灰化ノジュールの形成が認められる。つまり歯根膜は、生体内で軟組織の状態を維持しているが、硬組織形成能を有する細胞を保持する機能も有している。このような歯根膜の恒常性維持には様々な因子が関与していると考えられており、歯根膜に関する遺伝子レベルの解析が進められている（非特許文献１参照）。【０００５】
しかし、これまで、歯根膜細胞等の硬組織形成に関し、どの因子がどのように関与しているかは十分には明らかにされていなかった。【０００６】
一方、形態形成に関わるシグナル分子としてWntファミリーが知られている。Wntのシグナルは，Frizzled（FZD）遺伝子がコードする7回膜貫通型受容体（以下、「Frizzled受容体」ともいう。）などを介して，標的細胞へと伝達されることが知られている。しかし、その仕組みは多様で、少なくとも19種以上のWntがあることが知られている。また、Wntの形態形成関与は複雑で、Wntファミリーで活性化されるシグナル経路が少なくとも3種以上あることが知られており、どのWntによりどの経路が活性されるかは、十分に明らかとなっていない（非特許文献２参照）。【０００７】
また、Wntに対する阻害作用を有する分子として、SFRPファミリーが知られており、こ
れまで5種以上のメンバーが知られている。しかし、その作用には、選択性があり、どのSFRPメンバーがどのWntに作用するかについては、十分に明らかとなっていない。
【非特許文献１】Gene, 275(2001),279-286
【非特許文献２】Annu.Rev.Cell Dev. Biol.,2004,20:780-810
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Wnt5a／SFRP4シグナル系を利用して、硬組織形成を適切に誘導する硬組織形成誘導剤を得ることを主な目的とする。並びに、同剤の有効成分となる化合物を効率よくスクリーニングする方法及びスクリーニング用手段を得ることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、硬組織形成を誘導する過程について鋭意検討を重ねた結果、SFRP4及びWnt5aの関与により、硬組織形成の誘導が制御されていることを見出し、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は次の事項に関する。【００１１】
項１：（１）SFRP4の産生、（２）Wnt5aの産生、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用から選ばれるいずれかの作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成誘導化合物のスクリーニング方法。【００１２】
項１Ａ：（１）〜（４）の作用が、歯根膜細胞における作用である項１に記載のスクリーニング方法。【００１３】
項１Ｂ：（ｉ）SFRP4遺伝子導入歯根膜細胞と被験化合物とを接触させる工程、及び（ii）歯根膜細胞の硬組織形成能の変化を分析する工程を含む項１に記載のスクリーニング方法。【００１４】
項１Ｃ：（ｉ）Wnt5a存在下及び非存在下に歯根膜細胞と被験化合物とを接触させる工程、及び（ii）接触後の歯根膜細胞の硬組織形成能をWnt5a存在下と非存在下とで比較する工程を含む、項１に記載のスクリーニング方法。【００１５】
項１Ｄ：（ｉ）Wnt5a存在下に、歯根膜細胞と被験化合物とを接触させる工程、及び、
（ii）歯根膜細胞の硬組織形成能の変化を分析する工程を含む、項１に記載のスクリーニング方法。【００１６】
項１Ｅ：（ｉ）被験化合物の存在下及び非存在下において、Wnt5aとSFRP4とを共存させる工程、（ii）被験化合物の存在下と非存在下におけるWnt5aとSFRP4との相互作用を比較する工程を含む、項１に記載のスクリーニング方法。【００１７】
項２：（１）SFRP4の産生抑制、（２）Wnt5aの産生促進、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用促進、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用抑制から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成促進化合物のスクリーニング方法。【００１８】
項３：（１）SFRP4の産生促進、（２）Wnt5aの産生抑制、（３）Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用抑制、及び（４）Wnt5aとSFRP4との相互作用促進から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とする硬組織形成抑制化合物のスクリーニング方法。【００１９】
項４：項１、項１Ａ〜１Ｅ、項２又は項３に記載のスクリーニング方法によって得られた化合物、Wnt5a及びSFRP4から選ばれる１以上を有効成分とする硬組織形成誘導剤。
項４には、項２に記載のスクリーニング方法によって得られた硬組織形成促進化合物、Wnt5a及びリコンビナントWnt5aから選ばれる１以上を有効成分とする硬組織形成促進剤、項３に記載のスクリーニング方法によって得られた硬組織形成抑制化合物、SFRP4及びリコンビナントSFRP4から選ばれる１以上を有効成分とする硬組織形成抑制剤が含まれる。【００２０】
項５：下記(w1)または(w2)に記載の蛋白質を有効成分とする硬組織形成促進剤：
（w1）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するWnt5a、
（w2）配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成促進活性を有する蛋白質。
項５の態様には、Wnt5a又はリコンビナントWnt5aを有効成分とする硬組織形成促進剤が含まれる。【００２１】
項６：Wnt5aとSFRP4との分子間相互作用を介した項５に記載の硬組織形成促進剤。
項６の態様には
下記(w1)または(w2)に記載の蛋白質を有効成分とする、Wnt5aとSFRP4との分子間相互作用を介した硬組織形成促進剤：
（w1）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するWnt5a、
（w2）配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成促進活性を有する蛋白質
が含まれる。【００２２】
項７：下記(s1)又は(s2)に記載の蛋白質を有効成分とする硬組織形成抑制剤：
（s1）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するSFRP4、
（s2）配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成抑制活性を有する蛋白質。
項７の態様には、SFRP4又はリコンビナントSFRP4を有効成分とする硬組織形成抑制剤が含まれる。【００２３】
項８：Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する、硬組織形成誘導化合物スクリーニング用細胞。
項８Ａ：歯根膜細胞である項８に記載の細胞。  
項８Ｂ：Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子を導入してなる項８に記載の細胞。
項８Ｃ：Wnt5a及び／又はSFRP4のsiRNAを導入してなる項８に記載の細胞。【００２４】
項９：Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する細胞、及び、該細胞を未分化の状態で保持する成分を含む硬組織形成誘導化合物スクリーニング用キット。
項９Ａ：細胞を未分化の状態で保持する成分がサイトカインである項９に記載のキット。
項９Ｂ：細胞を未分化の状態で保持する成分がFGF-2である項９に記載のキット。【００２５】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。【００２６】
Ｉ．硬組織形成
本発明において、硬組織とは生体硬組織を意味し、頭蓋および体幹の骨格を形成する骨組織と、歯周組織を構成する歯槽骨及びセメント質等を含む。【００２７】
歯槽骨は、歯の周囲に存在し、歯を支え維持する骨組織である。セメント質は、歯根表面に存在する硬組織であり、歯と歯槽骨とを強固に繋いでいるシャーピー線維末端が埋入している。【００２８】
硬組織形成のしくみとしては、間葉系幹細胞から骨芽細胞やセメント芽細胞への分化メカニズムが一般に知られている。歯周組織における硬組織形成のしくみは他の生体組織における硬組織形成と類似していると考えられており、歯根膜細胞中に存在する間葉系幹細胞が骨芽細胞やセメント芽細胞へ分化して硬組織を形成する。【００２９】
本発明は、このような硬組織形成の分化を誘導、換言すると制御する化合物を提供する。【００３０】
なお、本明細書において、硬組織形成誘導には、硬組織形成を促進的に誘導する硬組織形成促進、及び硬組織形成を抑制的に誘導する硬組織形成抑制が含まれる。【００３１】
細胞における硬組織形成能の分析は、公知の方法から適宜選択して実施することができる。【００３２】
例えば、硬組織形成能を分析する手法としては、（ａ）アルカリフォスファターゼ活性を測定する方法、（ｂ）石灰化物（或いは石灰化ノジュール）の形成量を測定する方法、（ｃ）硬組織関連蛋白質産生量を測定する方法、（ｄ）硬組織関連遺伝子発現量を測定する方法、からなる群から選ばれる１以上の方法を挙げることができる。【００３３】
（ａ）の測定には、例えば、Bessay法を用いることができる。【００３４】
（ｂ）の石灰化物（又は石灰化ノジュール）の形成量の測定は、例えば、アリザリン（Alizarin）染色により行うことができる。【００３５】
（ｃ）の硬組織関連蛋白質には、硬組織形成を促進又は抑制させる蛋白質が含まれる。具体的には、Osteopontin, Osteocalcin, Collagen type I, Periostin, PLAP-1等の細胞外基質タンパクや、Runx2, Osterixなどの転写因子などが含まれる。【００３６】
（ｄ）の硬組織関連遺伝子には、Osteopontin, Osteocalcin, Collagen type I, Periostin, PLAP-1等の細胞外基質タンパクや、Runx2, Osterixなどの転写因子をコードする遺伝子が含まれる。【００３７】
（ｃ）における蛋白質の産生量及び（ｄ）における遺伝子の発現量を測定する手段は、公知の方法から、適宜選択して設定することができる。【００３８】
上記のような分析手法を用い、アルカリフォスファターゼ活性が向上、石灰化物（或いは石灰化ノジュール）の形成量が増加している場合には、細胞の硬組織形成能が促進されたと評価することができる。【００３９】
また、アルカリフォスファターゼ活性が低下、石灰化物（或いは石灰化ノジュール）の形成量が減少している場合には、細胞の硬組織形成能が抑制されたと評価することができる。【００４０】
さらに、硬組織関連蛋白質の産生量の変化、あるいは硬組織関連蛋白質をコードする遺伝子の発現量の変化を指標として細胞の硬組織形成能を評価することができる。【００４１】
II．硬組織形成誘導化合物のスクリーニング方法
II-1.SFRP4の硬組織形成関与
SFRP4(secreted frizzled-related protein4)は、SFRPファミリーの一つであり、シス
テイン−リッチドメイン（CRD）を有している。【００４２】
SFRP4は、硬組織形成分化に対して抑制的に働く。このことから、SFRP4の産生を促進又は抑制する化合物は、SFRP4の硬組織形成過程への関与を制御、換言すると、硬組織形成を促進又は抑制する機能を有すると考えられる。【００４３】
例えば、SFRP4の産生を促進する化合物は、硬組織形成を抑制する効果を奏し得る。一方、SFRP4の産生を抑制する化合物は、硬組織形成を促進する効果を奏し得る。【００４４】
従って、SFRP4の産生を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することにより、硬組織形成誘導化合物を効率よくスクリーニングすることができる。例えば、SFRP4の産生を促進させる機能を有する化合物を、硬組織形成抑制化合物として選択することができる。また、SFRP4の産生を抑制させる機能を有する化合物を、硬組織形成促進化合物として選択することができる。【００４５】
被験化合物が、SFRP4の産生を促進又は抑制する機能を調べる手法は、公知の方法から適宜選択することができ、特に限定されない。【００４６】
例えば、（ｉ）SFRP4遺伝子の発現をコントロールした歯根膜細胞と被験化合物とを接触させて、（ii）接触前後における該歯根膜細胞の硬組織形成能の変化を分析することにより、調べることができる。【００４７】
SFRP4遺伝子の発現をコントロールした細胞としては、SFRP4遺伝子過剰発現歯根膜細胞や、SFRP4遺伝子発現抑制歯根膜細胞を挙げることができる。【００４８】
スクリーニングの手順は、本発明の効果を奏する範囲内で公知の方法から適宜選択設定することができる。例えば、適当なチップ又はマイクロアレイ上で、複数の被験化合物を一斉にスクリーニングすることもできる。【００４９】
II-2．Wnt5aの硬組織形成関与及びWnt5aとFrizzled受容体との相互作用
Wnt5aは、Wntファミリーの一つであり、システインに富む、疎水性シグナルタンパク質である。【００５０】
本発明において、Wnt5aが、硬組織形成に対し促進的に働くことが明らかとなった。このことから、Wnt5aの産生を促進又は抑制する化合物は、Wnt5aの硬組織形成過程における関与を制御し、硬組織形成を促進的又は抑制的に誘導する働きを奏すると考えられる。【００５１】
例えば、Wnt5aの産生またはWnt5a遺伝子の発現を促進する化合物は、硬組織形成を促進する効果を奏する。一方、Wnt5a の産生またはWnt5a 遺伝子の発現を抑制する化合物は、硬組織形成を抑制する効果を奏する。【００５２】
従って、Wnt5aの産生を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することにより、硬組織形成誘導化合物を効率よくスクリーニングすることができる。【００５３】
例えば、Wnt5a産生を促進する化合物を硬組織形成促進化合物としてスクリーニングすることができる。また、Wnt5a産生を抑制する化合物を硬組織形成抑制化合物としてスクリーニングすることができる。【００５４】
また該Wnt5aのシグナルはFrizzled受容体を介して行われることが知られている。更に、そのWnt5aによるFrizzled受容体を介したシグナルが、JNK伝達系を経由することが知られている。また、Wnt5aノックアウトマウスでは骨格系の形成不全が観察されることから、Wnt5aシグナル系の硬組織形成への関与が示唆されている。【００５５】
このことから、Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用を促進又は抑制する化合物は、Wnt5aの硬組織形成過程における関与を制御し、硬組織形成を促進的又は抑制的に誘導する働きを奏すると考えられる。【００５６】
例えば、Wnt5a とFrizzled受容体との相互作用を促進する化合物は、硬組織形成を促進する効果を奏し得る。一方、Wnt5a とFrizzled受容体との相互作用を抑制する化合物は、硬組織形成を抑制する効果を奏し得る。【００５７】
従って、Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することにより、硬組織形成誘導化合物を効率よくスクリーニングすることができる。【００５８】
例えば、Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用を促進する化合物を、硬組織形成促進化合物としてスクリーニングすることができる。また、Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用を抑制する化合物を硬組織形成抑制化合物としてスクリーニングすることができる。【００５９】
被験化合物がWnt5a の産生を促進又は抑制するかは、公知の方法から適宜選択することができ、特に限定されない。例えば、Wnt5a 蛋白質産生量の増減、或いは、Wnt5a遺伝子の発現量の増減を公知の手法を用いて分析することにより、調べることができる。【００６０】
また、被験化合物がWnt5aとFrizzled受容体との相互作用を促進又は抑制するかを調べる方法も、公知の方法から適宜選択することができ、特に限定されない。例えば、Wnt5aとFrizzled受容体との相互作用又は分子間結合を、公知の蛋白−蛋白相互作用分析手段を用いることにより、調べることができる。【００６１】
また、Wnt5a存在下及び非存在下において、歯根膜細胞と被験化合物とを接触させて、Wnt5a存在下と非存在下における歯根膜細胞の硬組織形成能を比較して分析することにより、スクリーニングを行うこともできる。【００６２】
例えば、Wnt5a存在下において、歯根膜細胞と被験化合物とを接触させて、歯根膜細胞のアルカリフォスファターゼ活性及び／又は石灰化ノジュール形成量の変化を分析することにより、スクリーニングを行うこともできる。【００６３】
具体的には、歯根膜細胞のアルカリフォスファターゼ活性及び／又は石灰化ノジュール形成の変化を比較し、アルカリフォスファターゼ活性を向上及び／又は石灰化ノジュール形成量を増加させる化合物を、硬組織形成促進化合物として選択することができる。逆に、該歯根膜細胞のアルカリフォスファターゼ活性を低下及び／又は石灰化ノジュール形成量を低減する化合物を、硬組織形成抑制化合物として選択することができる。【００６４】
スクリーニングの手順は特に限定されず、本発明の効果を奏する範囲内で、公知の方法から適宜設定することができる。例えば、溶液中で被験化合物を１つずつスクリーニングすることもでき、適当なチップ又はマイクロアレイ上で複数の化合物を一斉にスクリーニングすることもできる。【００６５】
II-3．Wnt5aとSFRP4との相互作用
本発明においては、SFRP4がWnt5aのアンタゴニストであり、Wnt5aとSFRP4とが直接的な分子間相互作用を行っていることが明らかとなった。更に該相互作用によって、硬組織形成が制御されていることも明らかとなった。【００６６】
このことから、Wnt5aとSFRP4との相互作用（換言すると、Wnt5aとSFRP4との分子間結合）を阻害又は促進する化合物は、硬組織形成を促進的又は抑制的に誘導する働きを奏すると考えられる。【００６７】
例えば、Wnt5aとSFRP4との相互作用を促進する化合物は、硬組織形成を抑制する効果を奏する。一方、Wnt5a とSFRP4との相互作用を抑制または阻害する化合物は、硬組織形成を促進する効果を奏する。【００６８】
従って、Wnt5aとSFRP4との相互作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することにより、硬組織形成誘導化合物を効率よくスクリーニングすることができる。例えば、Wnt5aとSFRP4との相互作用を促進する化合物を評価することにより、硬組織形成抑制化合物としてスクリーニングすることができる。また、Wnt5aとSFRP4との相互作用を抑制する化合物を、硬組織形成促進化合物としてスクリーニングすることができる。【００６９】
被験化合物が、或いは、Wnt5a とSFRP4との相互作用を促進又は抑制するかを調べる方法は、公知の方法から適宜選択することができる。【００７０】
また、被験化合物の存在下及び非存在下において、Wnt5aとSFRP4とを共存させ、被験化合物の存在下と非存在下におけるWnt5aとSFRP4との相互作用を比較することにより、スクリーニングを行うこともできる。蛋白―蛋白相互作用を調べる方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択して、設定することができる。例えば、共沈法、ELISA法、競合阻害法等を挙げることができる。【００７１】
スクリーニングの手順も特に限定されず、本発明の効果を奏する範囲内で、公知の方法から適宜設定することができる。例えば、適当なチップ又はマイクロアレイ上で複数の被験化合物を一斉にスクリーニングすることもできる。【００７２】
III．硬組織形成誘導剤
本発明によれば、硬組織の形成を適切に誘導する硬組織形成誘導剤が提供される。【００７３】
硬組織形成誘導剤には、硬組織形成を促進する硬組織形成促進剤、及び、硬組織形成を抑制する硬組織形成抑制剤が含まれる。【００７４】
硬組織形成誘導化合物には、上記スクリーニング方法によって得られる化合物、Wnt5a、SFRP4等が含まれる。Wnt5aにはリコンビナントWnt5aが含まれる。またSFRP4にはリコンビナントSFRP4が含まれる。有効成分となる化合物は、本発明の効果を奏する範囲内であれば、１種でもよく、また、２種以上用いてもよい。【００７５】
リコンビナントWnt5aおよびリコンビナントSFRP4は、公知の手法に従って、適宜取得することができる。【００７６】
例えば、リコンビナントWnt5aは、ヒトWnt5a遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞或いは大腸菌に導入し、産生されたタンパク質を精製することにより得られる。同様に、リコンビナントSFRP4は、ヒトSFRP4遺伝子を有する発現ベクターを、動物細胞又は大腸菌に導入し、産生されたタンパク質を精製することにより得られる。【００７７】
本発明の硬組織形成誘導剤は、これらの硬組織形成誘導化合物を有効成分として、適宜製剤化することにより、得ることができる。【００７８】
硬組織形成促進剤は、上記スクリーニング方法によって得られる硬組織形成促進化合物、Wnt5a又はリコンビナントWnt5aを有効成分とすることにより得ることができる。【００７９】
また、硬組織形成抑制剤は、上記スクリーニング方法によって得られる硬組織形成抑制化合物、SFRP4、又はリコンビナントSFRP4を有効成分とすることにより得ることができる。【００８０】
また、硬組織形成促進剤は、下記(w1)または(w2)に記載の蛋白質を有効成分とすることにより得ることができる。
（w1）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するWnt5a蛋白質、
（w2）配列番号１に記載の配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成促進活性を有する蛋白質。【００８１】
例えば、Wnt5aとSFRP4との分子間相互作用を介した硬組織形成促進剤は、下記(w1)または(w2)に記載の蛋白質を有効成分とすることにより得ることができる。
（w1）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するWnt5a蛋白質、
（w2）配列番号１に記載の配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成促進活性を有する蛋白質。【００８２】
また、硬組織形成抑制剤は,下記(s1)又は(s2)に記載の蛋白質を有効成分とすることにより、得ることができる。
（s1）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するSFRP4蛋白質、
（s2）配列番号２に記載の配列の一部が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ硬組織形成抑制活性を有する蛋白質。【００８３】
硬組織形成誘導剤は、上記有効成分となる化合物そのものを製剤化したものであってもよいし、該化合物を有効成分として薬学上又は衛生上許容される担体を配合して製剤化されたものであってもよい。【００８４】
また、硬組織形成誘導剤には、本発明の効果を阻害しない限りで、他の薬効成分や添加物を配合することもできる。【００８５】
かかる担体又は添加物等の種類及び配合量は、本発明の効果を損なわないことを限度として、適宜設定することができる。【００８６】
硬組織形成誘導剤の形態は、特に制限されず、使用方法等に応じて、任意に調製することができる。例えば、液状、クリーム状、ゲル状、粉末状、顆粒状等の形態に調製することができる。【００８７】
また、投与方法も、投与目的や投与部位等に応じて、適宜設定することができる。【００８８】
例えば、歯周組織の再生を目的として、歯周外科手術時に歯槽骨欠損部に、硬組織形成誘導剤の局所投与を行うことが考えられる。【００８９】
また、骨疾患の骨組織再生を目的として、整形外科手術時に骨欠損部位に局所投与することが考えられる。この場合、欠損部位は、歯周外科時よりも大きいことが想定されるので、ゲル化あるいは賦形性を有する担体を用いることが好ましい。【００９０】
本発明の硬組織形成誘導剤は、硬組織形成の促進又は抑制により、症状の治癒、緩和、予防が可能な種々の疾患の治療薬又は治療薬の成分として利用することができる。【００９１】
例えば、歯科の領域であれば、歯周病によって破壊された歯槽骨・セメント質の再生等を含む歯周組織再生用医薬、歯科用インプラント治療の前処置用等に用いられる歯槽骨増生用医薬、歯科用インプラント等に適用し得るオステオインテグレーション促進用医薬、或いはそれらの有効成分などとして利用可能である。【００９２】
また、整形外科の領域であれば、骨折等の骨疾患に対する骨組織再生用医薬、病的な異所性石灰化の抑制用医薬などとして利用可能である。【００９３】
IV．硬組織形成誘導化合物スクリーニング用細胞
本発明により、Wnt5a及びSFRP4の作用又は機能を硬組織形成の指標として用い得ることが明らかとなった。このことから、Wnt5a及び／又はSFRP4遺伝子を発現可能な状態で保持する細胞、換言すると、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子の発現能を有する細胞は、硬組織形成誘導化合物のスクリーニング用細胞として好適に用い得ると考えられる。また、該細胞、及び該細胞を未分化の状態で保持する成分を含むキットは、硬組織形成誘導化合物スクリーニング用キットとして、好適に用い得ると考えられる。【００９４】
IV-1.スクリーニング用細胞
Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子の発現能を有する細胞とは、換言すると、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子を有するがその一部又は全部が完全に発現していないもしくは極めて低発現の細胞である。該細胞は、硬組織形成能を有する幹細胞が未分化の状態で維持されている。【００９５】
スクリーニング用細胞としては、特に、歯根膜細胞が好適に用いられる。歯根膜細胞は、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子を高発現し得る能力を保持しており、Wnt5a及び／又はSFRP4の作用又は発現の変動を容易に調べることができる。【００９６】
細胞の由来は、特に限定されず、例えば、マウス由来、ヒト由来の細胞等を用いることができる。【００９７】
細胞の種類は、適宜設定し得るが、例えば、歯根膜細胞クローン、初代培養歯根膜細胞、継体培養細胞などが含まれる。【００９８】
具体的態様の例には、限界希釈法によりクローン化されたマウス由来歯根膜細胞クローン、ヒト初代培養歯根膜細胞、MC3T3-E1などの骨芽細胞株などが挙げられる。【００９９】
このうち、マウス由来歯根膜細胞クローンは、外来遺伝子導入に優れる点、また、マウス由来細胞であってヒトの遺伝子・分子を解析する際、内在性遺伝子・分子との区別が容易である点などから、好適に用いられる。【０１００】
また、スクリーニング用細胞は、遺伝子導入してなる細胞であってもよい。【０１０１】
例えば、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子を導入してなる細胞であってもよい。【０１０２】
Wnt5a遺伝子導入細胞は、例えば、配列番号１に記載の配列を有するヒトWnt5a遺伝子を用いて動物細胞用発現ベクターを作製し、該ベクターでマウス歯根膜細胞クローンを形質転換して得ることができる。【０１０３】
また、SFRP4遺伝子導入細胞は、例えば、配列番号２に記載の配列を有するヒトSFRP4遺伝子を用いて動物細胞用発現ベクターを作製し、該ベクターでマウス歯根膜細胞クローンを形質転換して得ることができる。【０１０４】
また、スクリーニング用細胞は、Wnt5a及び／又はSFRP4のsiRNAを導入したものであってもよい。【０１０５】
siRNA導入細胞は、例えば、SFRP4のsiRNAを直接歯根膜細胞に導入するか、或いは、siRNA発現ベクターに組み込んで歯根膜細胞に導入することにより、作製することができる。【０１０６】
IV-2.スクリーニング用細胞の使用方法
前述のスクリーニング用細胞を使用することにより、硬組織形成誘導化合物のスクリーニングをin vitroで効率よく行うことができる。【０１０７】
スクリーニング用細胞の使用方法としては、例えば、歯根膜細胞クローンに、リコンビナントWnt5aあるいはリコンビナントSFRP4タンパクと被験化合物とを接触させ、該歯根膜細胞クローンの硬組織形成能の変化を分析することを含む方法が挙げられる。該方法により、歯根膜細胞クローンの硬組織形成能を向上させる化合物を硬組織形成促進化合物として選択し、歯根膜細胞クローンの硬組織形成能を低下させる化合物を硬組織形成抑制化合物として選択することができる。【０１０８】
また、本発明のスクリーニング用細胞は、上述のスクリーニング方法において、好適に使用することができる。例えば、（ｉ）SFRP4遺伝子導入歯根膜細胞と被験化合物とを接触させて、SFRP4の産生を促進又は抑制するかを指標として、スクリーニングを行う方法が挙げられる。該方法において、SFRP4の産生を抑制させる化合物を硬組織形成促進化合物として選択し、SFRP4の産生を促進させる化合物を硬組織形成抑制化合物として選択することができる。【０１０９】
IV-3．スクリーニング用キット
スクリーニング用細胞及び該細胞を未分化の状態で維持する成分を組み合わせることにより、硬組織形成誘導化合物スクリーニングに好適に使用できるキットが提供される。【０１１０】
該キットは、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する細胞を、未分化の状態で長期間保持することを可能にする。これにより、該細胞が、スクリーニングに適した状態で維持される。【０１１１】
スクリーニングの際に、スクリーニング用細胞と、細胞を未分化の状態で保持する成分を分離し、次いで、スクリーニング用細胞に、被験化合物を接触させることにより、スクリーニングを実施することができる。【０１１２】
細胞を未分化の状態で維持する成分としては、サイトカインが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、FGF-2、LIF等が挙げられる。【０１１３】
具体的な態様の例には、マウス歯根膜細胞クローン及びFGF-2を含むキットが挙げられる。該キットにおいては、マウス歯根膜細胞クローンが、未分化な状態、換言すると、Wnt5a遺伝子及び／又はSFRP4遺伝子発現能を有する状態で、長期に継代可能な細胞として維持されている。【０１１４】
本発明のキットには、必要に応じて、他の成分や手段を、本発明の効果を奏する範囲内で、適宜含めることができる。他の成分としては、Wnt5a及び／又はSFRP4検出用試薬等が挙げられる。
【発明の効果】
【０１１５】
本発明により明らかとなった硬組織形成誘導の仕組みを適応することにより、本来の形態と機能を有した形での組織再生を可能とする硬組織形成誘導剤が提供される。【０１１６】
生理的な状況において、骨組織は、恒常的な硬組織の形成と抑制が同時に行われることにより、その恒常性を維持しており、その調和が適切に維持されなければ、柔軟性に欠いた骨組織の造成や過度の石灰化や軟組織との癒合といった病的な硬組織の再生が生じる。従来使用されているFGF-2やBMP-2等のサイトカインは、硬組織の形成を促進する働きが強すぎる場合もあったが、本発明におけるWnt5a及びSFRP4の作用を利用すれば、生理的な硬組織形成のフィードバック機構が適切に制御された形で硬組織の形成を誘導することができる。【０１１７】
従って、本発明により、適度な硬組織の形成と過剰な石灰化の抑制を行うことができ、柔軟性に欠いた骨組織の造成や病的な硬組織の形成が抑制され、調和の取れた骨組織や歯周組織の再生誘導を行うことのできる、硬組織形成誘導剤を得ることが可能になる。    【０１１８】
このような特徴により、本発明の硬組織誘導剤は、骨折等による長管骨欠損部の再建や歯周病によって破壊された歯槽骨・セメント質を含む歯周組織の再生用として好適な誘導剤としても利用し得る。【０１１９】
また、本発明により、硬組織形成の誘導に好適な化合物のスクリーニングをin vitro
で、効率よく行うことが可能となる。【０１２０】
更に、本発明のスクリーニング用細胞及びキットは、硬組織形成誘導化合物をスクリーニングするための指標が適切に保持されており、効率よく硬組織形成誘導化合物のスクリーニングを実施することを可能にする。【０１２１】
このように、本発明は、硬組織形成を適切に誘導する化合物並びに該化合物を効率よくスクリーニングするための手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】SFRP4遺伝子導入MPDL22におけるALPase活性の経時的変化を示した図面である。
【図２】SFRP4遺伝子導入MPDL22における、培養12日目及び15日目における石灰化ノジュール形成をアリザリン染色で調べた結果を示す図面である。
【図３】siRNA導入MPDL22におけるALPase活性の経時的変化を示した図面である。
【図４】siRNA導入MPDL22における、培養9〜18日目における石灰化ノジュール形成をアリザリン染色で調べた結果を示す図面である。
【図５】ヒト歯根膜細胞におけるWnt family遺伝子の発現の解析結果を示した図面である。Lka-PDL、Yod1-PDL及びYY-PDLは、異なったドナーから樹立したヒト歯根膜細胞株3種を示す。Caco2はヒト大腸癌由来細胞株である。
【図６】Wnt5a添加によるMPDL22における硬組織分化に及ぼす影響をALPase活性により解析した結果を示した図面である。
【図７】Wnt5a添加によるMPDL22における硬組織分化に及ぼす影響を、アリザリン染色による石灰化ノジュール形成で解析した結果を示した図面である。左図は、アリザリン染色の濃度をデンシトメーターにて解析した染色像を示したものである。また、右図は、コントロールのアリザリン染色の濃度を１とした場合のmWnt5aを添加した場合の濃度をグラフで示したものである。
【図８】免疫共沈法（co-immunoprecipitation assay）によるWnt5aとSFRP4相互作用の検出結果を示した図面である。
【図９】Wnt5aがJNK活性化に及ぼす影響を、抗リン酸化JNK抗体を用いて解析した結果を示す。また同じサンプルを、抗JNK抗体を用いて解析した結果を示す。
【図１０】Wnt5aによるJNK活性化に対するSFRP4の影響を、抗リン酸化JNK抗体を用いて解析した結果を示す。また同じサンプルを、抗JNK抗体を用いて解析した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２３】
以下、本発明を更に具体的に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されることはない。
【実施例】
【０１２４】
[材料と方法]
(1)歯根膜細胞クローンの作成
2．5週齢BALB/cマウスの下顎臼歯の歯根面より歯根膜組織を採取し、24穴培養プレートに10％ウシ血清及び60μg/mlカナマイシン含有アルファ変法イーグル培地（α-MEM培地）中で37度、5％CO2気相下で培養を行い、遊走増殖した細胞をマウス歯根膜細胞（MPDL）とした。12代継代培養後、1μg/mlFGF-2含有継代培地にて限界希釈法によりMPDLを2回クローニングした。得られた細胞株のアルカリフォスファターゼ（ALPase）活性を測定し、同クローン細胞中から最もALPase活性が高く、in vitroでWnt5a遺伝子及びSFRP4遺伝子発現能を有するMPDL22を本実験に使用した。【０１２５】
(2)硬組織形成能の分析方法
以下の実施例において、硬組織形成能は、ALPase活性及び石灰化ノジュール形成を測定して分析した。ALPase活性の比較検討には、Bessay法を用いた。また、石灰化ノジュール形成の比較検討にはアリザリン（Alizarin）染色を用いた。【０１２６】
実施例１：SFRP4の硬組織形成関与解析
（1）SFRP4遺伝子導入細胞によるSFRP4解析
ヒトSFRP4発現ベクターを次の方法で作製した。まず、ヒト歯根膜細胞から抽出した全RNAから逆転写反応により、cDNAを得て、それを鋳型としたポリメラーゼ・チェイン（PCR）反応によりヒトSFRP4のタンパクコード部位をクローニングした。同CDS部位をp3xFLAG-CMVベクターに組み込み、ヒトSFRP4発現ベクターを構築した。【０１２７】
ヒトSFRP4発現ベクターをEffectene Transfection Reagentを用いてMPDL22に遺伝子導入し、ネオマイシン400μg/mlにて薬剤選択培養を行い、ヒトSFRP4恒常発現株を樹立した。この恒常発現株を、10％ウシ血清含有α-MEM培地に10mMβグリセロリン酸および50μg/mlアスコルビン酸を添加した培地（以下、「石灰化誘導培地」ともいう。）にて培養し、ALPase活性及び石灰化ノジュール形成を、empty vectorを導入したコントロール株と比較検討した。【０１２８】
培養3日目、および培養6日目のMPDL22におけるALPase活性を測定した結果を図１に示す。その結果、ヒトSFRP4過剰発現MPDL22は、ベクターのみを遺伝子導入したコントロール株と比較して、統計学的に有意な抑制を示した。  【０１２９】
また、培養12日目および培養15日目におけるアリザリン染色の結果を図２に示す。その結果、ヒトSFRP4過剰発現MPDL22は、ベクターのみを遺伝子導入したコントロール株と比較して、石灰化ノジュール形成が抑制されていることが示された。【０１３０】
実施例２：siRNA導入細胞によるSFRP4機能解析
Reynoldsらの報告（Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30）をもとにマウスSFRP4遺伝子に特異的な19merの塩基配列を2種類選択し、核酸合成した。【０１３１】
合成したそれぞれのDNAをpSilencer siRNA発現ベクターに組み込み、MPDL22に遺伝子導入した。ネオマイシン400μg/mlにて薬剤選択培養を行い、siRNA恒常発現株、MPDL22/RNAi-1およびMPDL22/RNAi-2を得た。また、ランダムな19塩基対の核酸配列を組み込んだsiRNA発現ベクターを構築し、MPDL22に遺伝子導入することで、コントロール株を得た。それぞれの細胞株における内在性SFRP4遺伝子発現は、細胞株から抽出したRNAにおけるSFRP4特異的逆転写ポリメラーゼ・チェイン（RT-PCR）法により、解析した。また、各細胞株を石灰化誘導培地にて培養し、ALPase活性および石灰化ノジュール形成を比較検討した。【０１３２】
ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHを用いた半定量性RT-PCR解析の結果、PDL22/RNAi-1およびMPDL22/RNAi-2の内在性SFRP4遺伝子の発現は、コントロール株の約1/2に低下していることが確認された。【０１３３】
培養3日目、培養6日目、培養9日目におけるALPase活性を調べたところ、MPDL22/RNAi-1およびMPDL22/RNAi-2ともに、コントロール株と比較して、統計学的に有意なALPase活性の促進を示した（図３参照）。【０１３４】
さらに、培養9日目、培養12日目、培養15日目および培養18日目において、PDL22/RNAi-1およびMPDL22/RNAi-2のいずれにおいても、コントロール株と比較して、高い石灰化ノジュール形成が示された（図４参照）。【０１３５】
実施例３：歯根膜細胞におけるWntファミリーの発現
ヒトWntファミリー遺伝子（Wnt1、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt11、Wnt14）に対するプライマーを設計した。該プライマーを用いて、樹立したヒト歯根膜細胞株におけるWntファミリー遺伝子の発現を解析した。【０１３６】
ヒト歯根膜細胞株は、実験目的を了解し組織提供を応諾した矯正治療中の患者から提供を受けた、第一小臼歯の歯根中央部から健全な歯根膜組織を採取し、α-MEM中で細切し、3回洗浄した後、レイトンチューブに移し、10％ウシ血清を加えたα-MEM培地にて培養した。培養は、5％CO2、37℃、湿度95％の条件下で行った。細切組織片より増殖してきた細胞を0.05％トリプシン、0.02％EDTA添加のリン酸緩衝液で処理し、付着細胞を遊離させ、ハンクス緩衝液にて洗浄後、100mm×20mm細胞培養プレート中で継代培養し、継代7代から13代目までの細胞を樹立した。【０１３７】
異なったドナーから樹立したヒト歯根膜細胞株3種を用いて、Wntファミリー遺伝子の発現を、RT-PCR法により解析した。また、ヒト大腸癌由来細胞株であるCaco2は、多種類のWnt遺伝子を発現していることから、ポジティブコントロールとしてRT-PCR解析に用いた。結果を図５に示す。【０１３８】
その結果、全ての細胞株で発現しているものはWnt5aのみであり、高い発現をしめすことが明らかとなった。一方、一つの細胞株で、Wnt3およびWnt7bの遺伝子発現も認められたが、他の2種の細胞株での発現は検出されなかった。  【０１３９】
実施例４：Wnt5aの硬組織形成関与解析  
Wnt5a発現遺伝子が組み込まれたマウスL細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地にて4日間培養し、その培養上清を回収し、冷凍保存した。さらに新しい培地を細胞に添加し、3日間培養し、上清を回収し、冷凍保存した培養上清と混合することでリコンビナントWnt5aを得た。培養上清中のリコンビナントWnt5aの存在は、抗Wnt5a抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。一方、野生型L細胞の培養上清を同様の方法で回収し、これをリコンビナントWnt5aに対するコントロールとして、以下の実験に用いた。【０１４０】
リコンビナントWnt5aをMPDL22の長期培養系に添加することにより、ALPase活性を調べた。培養3日目、培養6日目、培養9日目における結果を図６に示す。その結果、Wnt5a添加により、コントロールと比較してMPDL22のALPase活性が有意に促進することが示された。【０１４１】
さらにリコンビナントWnt5aをMPDL22の長期培養系に添加することによる石灰化ノジュール形成をアリザリン染色で調べた。図７に、培養後12日目におけるアリザリン染色の結果を示す。左図に、アリザリン染色の濃度をデンシトメーターにて解析した結果を染色像で示す。また、右図に、コントロールのアリザリン染色の濃度を１とした場合のmWnt5aを添加した場合の濃度をグラフで示す。その結果、Wnt5a添加により、コントロールと比較して、MPDL22の石灰化ノジュール形成が有意に促進することが示された。【０１４２】
実施例５：Wnt5aとSFRP4との相互作用解析
ヒト胎児腎細胞株293細胞にマウスWnt5a発現ベクターおよびFLAGタグ付きのマウスSFRP4発現ベクターを同時に遺伝子導入した。細胞可溶化画分から、それぞれの分子に対する特異抗体を用いた共免疫沈降実験（co-immunoprecipitation assay）を行い、Wnt5a/SFRP4分子間相互結合を解析した。遺伝子導入は、Effectene Transfection Reagentを用いて行った。遺伝子導入24時間後に、細胞を回収し可溶化した。細胞可溶化画分から、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物を還元10％SDSゲルにて展開し、泳動されたタンパク質をメンブレンに転写した後、抗FLAG抗体及び抗マウスWnt5a抗体にてウエスタンブロット解析を行うことにより、SFRP分子とWnt5a分子の結合を解析した。さらに加えて、上記細胞可溶化画分から、抗マウスWnt5a抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物を還元10％SDSゲルにて展開し、泳動されたタンパク質をメンブレンに転写した後、抗FLAG抗体及び抗マウスWnt5a抗体にてウエスタンブロット解析を行うことにより、Wnt5a分子を免疫沈降した際に、SFRP4分子が共沈降するか否かについて検討した。なお、ウエスタンブロットでのタンパクの検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識の2次抗体及び基質としてECLを用いて行った。検出結果を図８に示す。【０１４３】
その結果、SFRP4を免疫沈降した場合、Wnt5aが共沈し、一方、Wnt5aを免疫沈降した場合には、SFRP4が共沈することが明らかとなった。このことから、Wnt5aとSFRP4とが、直接的な分子間相互結合を示すことが明らかとなった。【０１４４】
実施例６：Wnt5aによるJNKシグナル伝達系活性化に関する解析
リコンビナントWnt5aでMPDL22を刺激し、抗リン酸化JNK抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、Wnt5aによるJNKシグナル伝達系活性化を検討した。【０１４５】
上記のリコンビナントWnt5aあるいは、コントロールにてMPDLを30分間刺激し、細胞を回収、可溶化した。可溶化画分を10％SDSゲルに泳動し、メンブレンに転写した。次に、抗リン酸化JNK抗体、HRP標識2次抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い、リコンビナントWnt5aでMPDLを刺激した際のリン酸化JNKの量を、コントロールで刺激した対照群と比較した。また、同じサンプルを、抗JNK抗体を用いたウエスタンブロット解析し、リコンビナントWnt5a刺激細胞と対照群でのSDSゲルに泳動したタンパク量に相違がないことを確認した。抗リン酸化JNK抗体及びJNK抗体は、p54及びp46のいずれのJNK蛋白をも認識する特異抗体を用いた。解析結果を図９に示す。【０１４６】
その結果、対照群と比較して、リコンビナントWnt5a刺激MPDLでは、リン酸化JNK量が増加していることが明らかとなり、歯根膜細胞においてWnt5aにより、JNKシグナルが活性化されていることがわかった。【０１４７】
実施例７：Wnt5aによるJNK活性化に対するSFRP4の影響に関する解析
さらに、実施例６と同様の条件下において、リコンビナントWnt5aでMPDLを刺激した際に、同時に各種濃度のリコンビナントSFRP4（R&D System社より購入）を添加することにより、Wnt5a刺激によるJNKシグナル活性化に対するSFRP4の影響を、実施例６と同様に、抗リン酸化JNK抗体及びJNK抗体を用いて検討した。結果を図１０に示す。【０１４８】
その結果、濃度依存的にリコンビナントSFRP4は、歯根膜細胞においてWnt5aにより活性化されるJNKのリン酸化を抑制することが明らかとなり、SFRP4は、Wnt5aによるJNKシグナル伝達系活性化を阻害することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月25日(2008.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＳＦＲＰ４の産生、（２）Ｗｎｔ５ａの産生、（３）Ｗｎｔ５ａとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用、及び（４）Ｗｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との相互作用から選ばれるいずれかの作用を促進又は抑制する機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成誘導化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
（１）ＳＦＲＰ４の産生抑制、（２）Ｗｎｔ５ａの産生促進、（３）Ｗｎｔ５ａとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用促進、及び（４）Ｗｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との相互作用抑制から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成促進化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
（１）ＳＦＲＰ４の産生促進、（２）Ｗｎｔ５ａの産生抑制、（３）Ｗｎｔ５ａとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用抑制、及び（４）Ｗｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との相互作用促進から選ばれるいずれかの機能を指標として、被験化合物を評価することを特徴とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成抑制化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｗｎｔ５ａ又はＳＦＲＰ４を有効成分とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成誘導剤。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＷｎｔ５ａを有効成分とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成促進剤。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＳＦＲＰ４を有効成分とするＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成抑制剤。
【請求項７】
Ｗｎｔ５ａ遺伝子及び／又はＳＦＲＰ４遺伝子発現能を有する、ＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成誘導化合物スクリーニング用細胞であって、Ｗｎｔ５ａ遺伝子及び／又はＳＦＲＰ４遺伝子を導入、或いは、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＳＦＲＰ４のｓｉＲＮＡを導入してなる細胞。
【請求項８】
Ｗｎｔ５ａ遺伝子及び／又はＳＦＲＰ４遺伝子発現能を有する細胞、及び、該細胞を未分化の状態で保持する成分を含むＪＮＫシグナル伝達系におけるＷｎｔ５ａとＳＦＲＰ４との分子間相互作用を介した硬組織形成誘導化合物スクリーニング用キット。
【国際調査報告】
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