(57)【要約】アシフルオルフェン耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、及びその遺伝子等を提供するものである。シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入し、トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊して、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜し、破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を特定し、破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を単離することにより、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を同定する。この手法は、ラン藻由来のポルフィリノーゲンオキシダーゼなど、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつラン藻由来であることを特徴とするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ。
【請求項２】
ラン藻が、シネコシスティス属に属するラン藻であることを特徴とする請求項１記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ。
【請求項３】
生物が、植物であることを特徴とする請求項１又は２記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示すタンパク質。 
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が２０％以上であり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項５】
ラン藻由来であることを特徴とする請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、又は請求項４若しくは５記載のタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ。 
【請求項７】
下記（ｄ）又は（ｅ）に示すプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ。 
（ｄ） 配列番号１に示される塩基配列からなるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ 
（ｅ） 配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ
【請求項８】
配列番号１に示される塩基配列に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ。 
【請求項９】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、ラン藻に由来することを特徴とする請求項７又は８のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクター。 
【請求項１１】
請求項１０記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換体。 
【請求項１２】
形質転換体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有することを特徴とする請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
形質転換体が微生物であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の形質転換体。 
【請求項１４】
形質転換体が植物であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の形質転換体。
【請求項１５】
光合成能が向上したことを特徴とする請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害活性能の評価方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
以下の（ｆ）〜（ｊ）の工程を含む、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の単離方法。
（ｆ）シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程
（ｇ）トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程
（ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程
（ｉ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を特定する工程
（ｊ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を単離する工程
【請求項１９】
請求項４又は５記載のタンパク質の、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとしての使用方法。
【請求項２０】
請求項４又は５記載のタンパク質を、プロトポルフィリノーゲンIXと人為的に接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法。
【請求項２１】
請求項６〜９のいずれか記載のＤＮＡの、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子としての使用方法。
【請求項２２】
請求項６〜９のいずれか記載のＤＮＡを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトポルフィリノーゲンIXと接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法。
【請求項２３】
以下の１）〜５）の工程を含む、特定生物における所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
１）特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質をコードする遺伝子を、特定生物に導入して形質転換体を作製する工程
２）形質転換体の遺伝子をランダムに破壊して形質転換体の変異株を作製する工程
３）所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する工程
４）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定する工程
５）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程
【請求項２４】
変異処理が、トランスポゾンを用いた変異処理であることを特徴とする請求項２３記載の遺伝子の単離方法。
【請求項２５】
特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質が、シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであることを特徴とする請求項２３又は２４記載の遺伝子の単離方法。
【請求項２６】
所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤が、アシフルオルフェンであることを特徴とする請求項２５記載の遺伝子の単離方法。
【請求項２７】
特定生物における所定の機能を有するタンパク質が、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであることを特徴とする請求項２５又は２６記載の遺伝子の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシフルオルフェン（ACIFLUORFEN）に対する耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、特にラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びその遺伝子並びに該遺伝子を組み込んだ形質転換体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、ヘムおよびクロロフィル合成の最終段階の反応、すなわちプロトポルフィリノーゲンIXから６個の電子を奪ってプロトポルフィリンIXを合成する反応を触媒する酵素である。ヘムはヘモグロビン、シトクロムなどのヘムタンパク質の補因子として、呼吸やエネルギー代謝、酸素ストレスに対する防御に不可欠な分子である。ヘム合成経路は微生物、植物、動物に共通して存在し、δ-アミノレブリン酸を前駆体としてヘムを合成する経路である。また、植物においてはヘムおよびクロロフィルは、δ-アミノレブリン酸を前駆体としてプロトポルフィリンIXまで共通の経路で合成されており、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼはこの２つの合成経路の調節的な役割も担っていると考えられている。陸上植物においてクロロフィル代謝系を担うこのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素は、ジフェニルエーテル（以下ＤＰＥと略することがある）系除草剤の標的酵素となる。ＤＰＥ系除草剤によってプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの活性が阻害されると、該酵素の基質であるプロトポルフィリノーゲンIXが葉緑体中に蓄積していき、ついにはプロトポルフィリノーゲンIXが細胞質ゾル中に漏れ、そこでペルオキシダーゼによりそれが酸化されてプロトポルフィリンIXを生じる。プロトポルフィリンIXが、光と酸素にさらされると、プロトポルフィリンIXは一重項酸素及びさらに別の反応性酸素種を生成させ得る。脂質の過酸化及びこれが必然的に伴う膜損傷の結果として、植物細胞は急速に死亡する（Lee et al., 1993, Plant Physiol., 102, 881）。一方、ラン藻ではＤＰＥ系除草剤存在下でも生育が可能であることが知られていたが、その要因やメカニズムは全く知られていなかった。【０００３】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子はいくつかの生物ですでに単離されている。例えば、タバコのPPX1遺伝子（Genbank accession Y13465）、PPX2遺伝子（Genbank accession Y13466）、シロイヌナズナのPPOX遺伝子（Genbank accession D83139）、バチルス サブチリスのHemY遺伝子（Genbank accession M97208）、マウスのPPX遺伝子（Genbank accession D45185）、ヒトのPPX遺伝子（Genbank accession D38537）、サッカロマイセス セレビシエのPPX遺伝子（Genbank accession Z71381）、エシェリヒア コリのhemG遺伝子（Genbank accession X68660）などが知られている。【０００４】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの利用法として、例えば特許文献１は、ＤＰＥ系除草剤に対する抵抗性を付与する枯草菌（Bacillus subtilis）に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを植物体内で発現させる方法、及び該プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを発現するトランスジェニック植物を開示している。また、例えば特許文献２は、植物の育種に適するポルフィリン生合成系の酵素タンパク質の遺伝子として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物から得られうる１．７ｋｂｐの長さを有する遺伝子であり、５'末端から１．３ｋｂｐの部位に制限酵素EcoRI の認識塩基配列５'-GAATTC-３' が存在することを特徴とするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を開示している。さらに、例えば特許文献３は、ラット又はコナミドリムシ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を評価するための簡便な方法として（１）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損した宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモーター、およびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導入されてなり、前記ＤＮＡ断片に存在するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化合物の存在下または非存在下に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質的に含まない培地で培養して各条件下における該形質転換体の増殖度を測定する工程、（２）該増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による前記形質転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を含むことを特徴とする方法を開示している。【０００５】
一方、ラン藻では、その遺伝子データベースの解析から、大腸菌hemK類似遺伝子がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであると推定されていたが、ラン藻の該hemK類似遺伝子は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼでは無いことがその後実際に明らかとなった。しかし、ラン藻の遺伝子データベースには、これまでに同定されている他の生物種のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと相同なタンパク質はラン藻では見い出されておらず、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは未だに単離されていなかった (例えば非特許文献１参照) 。【０００６】
【特許文献１】特願平９−１０７８３３号公報
【特許文献２】特開平９−１４０３８１号公報
【特許文献３】特願平１１−３４６７８７号公報
【非特許文献１】ドミトリ(Dmitrii V.Vavilin) , ウイム(Wim F. J. Vermaas) 「Regulation of the tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll in plants and cyanobacteria（植物とラン藻におけるヘムおよびクロロフィルへと導くテトラピロール生合成経路の調節）」Physiologia Plantarum 第115巻、第9頁、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、他の生物種由来の既知のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと相同なタンパク質は、ラン藻の遺伝子データベースでは見い出すことができず、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼはこれまで単離されていなかった。本発明の課題は、アシフルオルフェン耐性を付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、及びその遺伝子、並びに該遺伝子を組み込んだ形質転換体等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ラン藻由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの単離を目的として、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損大腸菌を用いた相補的スクリーニングを試みた。この方法は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを欠損した大腸菌にラン藻ゲノム断片を導入して相補する遺伝子を探索し、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンIXの酸化に関与する遺伝子を特定する方法である。使用したベクターは異なるが、シロイヌナズナやタバコ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子は同様の方法を用いて単離された。前記相補的スクリーニングの概略を以下に示す。【０００９】
まず、ラン藻（シネコシスティス PCC6803）からＤＮＡを取得した。ＤＮＡライブラリーの作製の際にはファージベクターとしてλZAPIIベクター（STRATEGENE社製）を用いた。該ラン藻の全塩基配列は既に報告されているので（約３,５００kｂ）、ベクターのマルチクローニングサイトに含まれる６種の制限酵素配列について、該ラン藻のゲノム配列を調べたところ XbaI、SpeI、EcoRIの３種類がライブラリー作製に適していると考えられた。そこで、この３種類の制限酵素処理を基本としてファージライブラリーを作製した。作製したライブラリーをプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損大腸菌に導入し、その形質転換体のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を調べることによって、相補試験を行ったが、明らかな相補性を示すものは認められなかった。この結果より、該ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがこの３種類の制限酵素配列を運悪く持っていたか、該ラン藻のプロモーターがうまく働かなかった等いくつかの可能性が考えられた。【００１０】
そこで、新たに制限酵素Tsp5091を用いた限定分解でライブラリーを作製し再度検討した。Tsp5091は４塩基認識の制限酵素である。前回のライブラリー作製に用いた３種類の制限酵素(EcoRI、SpeI、XbaI)は６塩基認識であり、サイズの大き過ぎる断片がどうしても生じる。また、ラン藻プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの遺伝子配列内にこれら制限酵素の認識配列が存在した場合、完全長のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をクローニングできない。一方、４塩基認識の制限酵素を用いてＤＮＡを完全に切断すると、数百ｂｐの細かい断片が大量にできてしまう。この問題を解決するために、４塩基認識の制限酵素で不完全にＤＮＡを切断する方法（限定分解）を用いてライブラリーを作製した。そのライブラリーを用いたが、大腸菌のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損能を相補することはできなかった。【００１１】
次に、プラスミドの状態にすれば生育復帰が認められるかもしれないと考え、Tsp5091ラン藻ゲノムファージライブラリーについて大量のプラスミドの切り出しを行い、Tsp5091ラン藻ゲノムプラスミドライブラリーを作製して検討したが顕著に生育復帰するクローンは認められなかった。このことより、ラン藻プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが大腸菌のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損を相補しないか、または相補していても非常に軽微である可能性が考えられた。【００１２】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ラン藻がアシフルオルフェンに対する耐性を有するという知見に基づき、トランスポゾンを利用したラン藻変異体スクリーニングを利用することにより、ラン藻（シネコシスティス PCC6803）由来のポルフィリノーゲンオキシダーゼを初めて単離し、そのポルフィリノーゲンオキシダーゼがアシフルオルフェン耐性を付与する活性を有していることを見い出すと共に、その遺伝子を同定することにより、本発明を完成するに至った。また、上記トランスポゾンを利用した遺伝子スクリーニングの手法は、ラン藻由来のポルフィリノーゲンオキシダーゼなど、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として有効であるとの知見を得て、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち本発明は、（１）アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつラン藻由来であることを特徴とするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼや、（２）ラン藻が、シネコシスティス属に属するラン藻であることを特徴とする上記（１）記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼや、（３）生物が、植物であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに関する。【００１４】
また本発明は、（４）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示すタンパク質、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が２０％以上であり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質や、（５）ラン藻由来であることを特徴とする上記（４）記載のタンパク質に関する。【００１５】
また本発明は、（６）上記（１）〜（３）のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、又は上記（４）若しくは（５）記載のタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（７）下記（ｄ）又は（ｅ）に示すプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、（ｄ） 配列番号１に示される塩基配列からなるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、（ｅ） 配列番号1に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（８）配列番号１に示される塩基配列に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（９）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が、ラン藻に由来することを特徴とする上記（７）又は（８）のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。【００１６】
また本発明は、(１０）上記（６）〜（９）のいずれか記載のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターに関する。【００１７】
また本発明は、(１１）上記（１０）記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換体や、（１２）形質転換体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有することを特徴とする上記（１１）記載の形質転換体や、（１３）形質転換体が微生物であることを特徴とする上記（１１）又は（１２）記載の形質転換体や、（１４）形質転換体が植物であることを特徴とする上記（１１）又は（１２）記載の形質転換体や、（１５）光合成能が向上したことを特徴とする上記（１４）記載の形質転換体に関する。【００１８】
また本発明は、（１６）上記（１１）〜（１５）のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害活性能の評価方法や、（１７）上記（１１）〜（１６）のいずれか記載の形質転換体を用いた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する。【００１９】
また本発明は、（１８）以下の（ｆ）〜（ｊ）の工程を含む、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の単離方法、（ｆ）シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程；（ｇ）トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程；（ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程；（ｉ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を特定する工程；（ｊ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を単離する工程；に関する。【００２０】
また本発明は、（１９）上記（４）又は（５）記載のタンパク質の、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとしての使用方法や、（２０）上記（４）又は（５）記載のタンパク質を、プロトポルフィリノーゲンIXと人為的に接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法や、（２１）上記（６）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡの、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子としての使用方法や、（２２）上記（６）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトポルフィリノーゲンIXと接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法に関する。【００２１】
さらに本発明は、（２３）以下の１）〜５）の工程を含む、特定生物における所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法、１）特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質をコードする遺伝子を、特定生物に導入して形質転換体を作製する工程；２）形質転換体の遺伝子を変異処理等によりランダムに破壊して形質転換体の変異株を作製する工程；３）所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する工程；４）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定する工程；５）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程、に関する。【００２２】
また本発明は、（２４）変異処理が、トランスポゾンを用いた変異処理であることを特徴とする上記（２３）記載の遺伝子の単離方法や、（２５）特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質が、シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであることを特徴とする上記（２３）又は（２４）記載の遺伝子の単離方法や、（２６）所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤が、アシフルオルフェンであることを特徴とする上記（２５）記載の遺伝子の単離方法や、（２７）特定生物における所定の機能を有するタンパク質が、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであることを特徴とする上記（２５）又は（２６）記載の遺伝子の単離方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】配列番号２に示されるアミノ酸配列と、ラン藻由来の機能未知の遺伝子がコードするアミノ酸配列とのアラインメント。
【図２】配列番号２に示されるアミノ酸配列と、他の生物由来の機能未知の遺伝子がコードするアミノ酸配列とのアラインメント。
【図３】シネコシスティスのslr1790遺伝子破壊用コンストラクト（pslr1790SKM  ６．４ｋｂ）を示す図である。
【図４】プロトポリフィリンIXのサンプル(Ａ）、slr1790の遺伝子破壊株の抽出液（Ｃ）、および野生株の抽出液（Ｂ）に関する、プロトポリフィリンIXのクロマトグラムを示す図である。
【図５】pBI121の概略を示す図である。
【図６】pBIslr1790の概略を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有する。ここで、「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」とは、適当な生物中に、そのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを導入し、該酵素をその生物中で適当に発現させた場合に、その生物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上するようなプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを意味する。その生物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかは、例えば、アシフルオルフェンの、その生物に対する４８時間後のＬＣ５０値が、該酵素を導入する前に比べて、該酵素を導入した後に向上したかどうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフェンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記酵素を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記酵素を植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯化する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、前記酵素を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記酵素を植物中で適当に発現させた植物において増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフェンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフェンの、その生物に対する４８時間後のＬＣ５０値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、その生物に該酵素を導入する前に比べて１．１倍以上に向上することが好ましく、１．５倍以上に向上することがより好ましく、２倍以上に向上することがさらに好ましく、３倍以上に向上することが最も好ましい。【００２５】
また、本発明の「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」には、該プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ自体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有している場合も含まれる。ここで、「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ自体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有している」とは、１μＭのアシフルオルフェンを含む適当な溶媒中におけるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの比活性が、アシフルオルフェン非存在下におけるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの比活性の５０分の１以上、好ましくは２０分の１以上、より好ましくは１０分の１以上であることを意味する。ここで「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性」とは、プロトポルフィリノーゲンIXを酸化してプロトポルフィリンIXを生成する酵素活性をいう。あるタンパク質のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ比活性は、そのタンパク質とプロトポルフィリノーゲンIXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリンIXの生成量を調べたりするなどして容易に確認することができる。また、「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有する」における「生物」は、特に制限されず、植物であっても微生物であってもよいが、植物であることが好ましく、中でもシロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ムギ類（コムギ、オオムギ等）、イモ類（ジャガイモ等）であることが好ましい。【００２６】
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有している限り、ラン藻由来でなくてもよいが、ラン藻由来であってもよい。ラン藻は特に制限されないが、例えば、シネコシスティス属、アナベナ属、グロエオバクター属、プロクロロコッカス属、シネココッカス属、ロドシュードモナス属等に属するラン藻が挙げられ、より具体的には、シネコシスティスＰＣＣ６８０３、アナベナＰＣＣ７１２０、グロエオバクター ビオラセウスＰＣＣ７４２１、プロクロロコッカス マリナスＳＳ１２０、プロクロロコッカス マリナスＭＩＴ９３１３、プロクロロコッカス マリナスＭＥＤ４、シネココッカスＷＨ８１０２、ロドシュードモナス パルストリス等が挙げられる。これらのうち、シネコシスティス属に属するラン藻が好ましく、シネコシスティスＰＣＣ６８０３がより好ましい。【００２７】
本発明において、「ラン藻に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」とは、実際にラン藻に存在するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのほか、そのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと同一である限り、形質転換等の手法を用いてラン藻以外の微生物等によって発現されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼも含む意味で用いられる。【００２８】
本発明のタンパク質は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、及び、（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対する相同性が２０％以上であり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、のいずれかに示すタンパク質である。以下、これらの本発明のタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある。【００２９】
本発明の上記タンパク質（２）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されないが、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該アミノ酸番号１〜３４のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列と、該アミノ酸番号４８〜１７６のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列との間に１０〜１６個、好ましくは１２〜１４個、より好ましくは１３個の任意のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、さらにアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該アミノ酸番号１〜３４のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列と、該アミノ酸番号４８〜１９３のアミノ酸配列に対応するアミノ酸との間に１０〜１６個、好ましくは１２〜１４個、より好ましくは１３個の任意のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、さらにアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。ここで、アミノ酸番号ｍ〜ｎのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列とは、アミノ酸番号ｍ〜ｎのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のことを意味する。【００３０】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。【００３１】
本発明において「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する」とは、プロトポルフィリノーゲンIXを酸化してプロトポルフィリンIXを生成する酵素活性を有することをいう。あるタンパク質がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するかどうかは、そのタンパク質とプロトポルフィリノーゲンIXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリンIXの生成を調べることで容易に確認することができる。【００３２】
また、「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」とは、適当な生物中に、そのタンパク質を導入し、そのタンパク質をその生物中で適当に発現させた場合に、その生物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上するようなタンパク質を意味する。その生物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかは、例えば、アシフルオルフェンの、その生物に対する４８時間後のＬＣ５０値が、そのタンパク質を導入する前に比べて、そのタンパク質を導入した後に向上したかどうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフェンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記タンパク質を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記タンパク質を植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯化する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、前記タンパク質を植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記タンパク質を植物中で適当に発現させた植物において増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフェンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフェンの、その生物に対する４８時間後のＬＣ５０値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、その生物にそのタンパク質を導入する前に比べて１．１倍以上に向上することが好ましく、１．５倍以上に向上することがより好ましく、２倍以上に向上することがさらに好ましく、３倍以上に向上することが最も好ましい。【００３３】
また、本発明の「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」には、そのタンパク質自体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有している場合も含まれる。ここで、「そのタンパク質自体が、アシフルオルフェンに対する耐性を有している」とは、１μＭのアシフルオルフェンを含む適当な溶媒中におけるそのタンパク質の比活性（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関する）が、アシフルオルフェン非存在下における比活性（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関する）の５０分の１以上、好ましくは２０分の１以上、より好ましくは１０分の１以上であることを意味する。ここで「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性」とは、プロトポルフィリノーゲンIXを酸化してプロトポルフィリンIXを生成する酵素活性をいう。あるタンパク質の比活性（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に関する）は、そのタンパク質とプロトポルフィリノーゲンIXを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、プロトポルフィリンIXの生成量を調べたりするなどして容易に確認することができる。また、「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有する」における「生物」は、特に制限されないが、植物及び微生物が好ましく、植物が特に好ましい。【００３４】
本発明の上記タンパク（３）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列（slr1790）、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対する相同性が２０％以上であり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有し、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である限り特に制限されないが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対するその相同性は、４５％以上であることが好ましく、５４％以上であることがより好ましく、６５％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。ここで、本発明において「アミノ酸番号ｏ〜ｐ及びｑ〜ｒに記載のアミノ酸配列に対する相同性がＸ％以上」とは、アミノ酸番号ｏ〜ｐのアミノ酸配列とアミノ酸番号ｑ〜ｒのアミノ酸配列とをこの順に有し、かつアミノ酸番号ｏ〜ｐのアミノ酸配列とアミノ酸番号ｑ〜ｒのアミノ酸配列との間に１０〜１６個、好ましくは１２〜１４個、より好ましくは１３個の任意のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列に対する相同性がＸ％以上であることを意味する。上記タンパク（３）における「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」、及び「アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するタンパク質」並びにそれらの好ましい態様は、上記タンパク（２）におけるそれらのタンパク質と同様の意味である。【００３５】
なお、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質をＢＬＡＳＴで検索したところ、配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする機能未知の遺伝子がいくつか示された。そのうち、ラン藻由来の機能未知の遺伝子を以下の表１に示す。また、その遺伝子がコードするアミノ酸配列と、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性（％）も表１に示す。これらも、本件タンパク質に含まれる。なお、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列は、後述の実施例に記載されているように、シネコシスティスＰＣＣ６８０３由来のslr1790遺伝子にコードされるアミノ酸配列であることが本発明者らによって明らかとなったものである。【００３６】
【表１】
2007034953.tif 000002
【００３７】
また、表１に示した遺伝子がコードするアミノ酸配列のアラインメントを以下の図１に示す。【００３８】
図１のアラインメントでは、７遺伝子すべてで共通するアミノ酸の下にアスタリスクを付している。また、４〜６遺伝子で共通するアミノ酸の下にはドットを付している。表１及び図１から分かるように、シネコシスティスＰＣＣ６８０３以外の７種のラン藻のこれらのアミノ酸配列は、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子がコードするアミノ酸と相同性が高く、さらに特定の領域がよく保存されている。したがって、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子以外のこれらの遺伝子がコードするタンパクも、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子がコードするタンパク（配列番号２のアミノ酸配列）と同様に、アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであると予想される。なお、図１のアラインメントから、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は配列番号１に示される塩基配列の中でも、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列（配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列）、特に、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列（配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列）の保存性が高く、これらの部分の配列が該酵素の性質に重要な役割を果たしていることが予想される。【００３９】
また、配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする遺伝子としてＢＬＡＳＴ検索で示された遺伝子のうち、ラン藻以外の生物由来の遺伝子を以下の表２に示す。これら遺伝子の発現産物も、本件タンパク質に含まれる。【００４０】
【表２】
2007034953.tif 000003
【００４１】
また、表２に示した遺伝子がコードするアミノ酸配列のアラインメントを以下の図２に示す。【００４２】
図２のアラインメントでは、５遺伝子すべてで共通するアミノ酸の下にアスタリスクを付している。また、３遺伝子で共通するアミノ酸の下にはドットを付している。表２及び図２から分かるように、シネコシスティスＰＣＣ６８０３以外の４種の生物のこれらのアミノ酸配列は、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子がコードするアミノ酸と相同性が高く、さらに特定の領域がよく保存されている。したがって、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子以外のこれらの遺伝子がコードするタンパクも、シネコシスティス ＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子がコードするタンパク（配列番号２のアミノ酸配列）と同様に、アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼであると予想される。【００４３】
本発明はまた、上記の本件タンパク質のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとしての使用方法に関する。ここで、「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとしての使用」とは、例えば、本件タンパク質を、インビトロ又はインビボにおいて基質プロトポルフィリノーゲンIXと人為的に接触させて、反応生成物プロトポルフィリンIXが生成する反応に使用することなど意味し、本件タンパク質がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するという知見は本発明によりはじめて明らかにされた全く新しい知見である。また本発明の本件タンパク質をプロトポルフィリノーゲンIXと人為的に接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法における「人為的に接触させる」とは、インビトロ又はインビボにおいて人為的に接触させることを意味し、例えば、ラン藻細胞内における非人為的な接触は含まれない。【００４４】
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡは、（１）本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ又は本件タンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、（２）配列番号１に示される塩基配列からなるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、（３）配列番号１の塩基配列、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列、並びに配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、及び、（４）配列番号１の塩基配列、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列、並びに配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、のいずれかのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡである。これらの本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを総称して「本件遺伝子ＤＮＡ」ということがある。【００４５】
本発明の上記ＤＮＡ（２）は、配列番号１に示される塩基配列、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列、並びに配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡであれば特に制限されないが、配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡや、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつ該塩基番号１〜１０２の塩基配列に対応する塩基配列と、該塩基番号１４２〜５２８の塩基配列に対応する塩基配列との間に３０〜４８（但し３の倍数に限る）個、好ましくは３６〜４２（但し３の倍数に限る）個、より好ましくは３９個の任意の塩基配列を有する塩基配列からなり、さらにアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡや、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み、かつ該塩基番号１〜１０２の塩基配列に対応する塩基配列と、該塩基番号１４２〜５８２の塩基配列に対応する塩基配列との間に３０〜４８（但し３の倍数に限る）個、好ましくは３６〜４２（但し３の倍数に限る）個、より好ましくは３９個の任意の塩基配列を有する塩基配列からなり、さらにアシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有することを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡが好ましく挙げられる。ここで、塩基番号ｍ〜ｎの塩基配列に対応する塩基配列とは、塩基番号ｍ〜ｎの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列のことを意味する。【００４６】
上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。【００４７】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（以後、モレキュラークローニング第２版と略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。【００４８】
上記「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００４９】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号１の塩基配列、配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５２８に記載の塩基配列、並びに配列番号１の塩基番号１〜１０２及び１４２〜５８２に記載の塩基配列のいずれかの塩基配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。ここで、本発明において「塩基酸番号ｓ〜ｔ及びｕ〜ｖに記載の塩基配列に対する相同性がＸ％以上」とは、塩基番号ｓ〜ｔの塩基配列と塩基番号ｕ〜ｖの塩基配列とをこの順に有し、かつ塩基番号ｓ〜ｔの塩基配列と塩基番号ｕ〜ｖの塩基配列との間に３０〜４８（但し３の倍数に限る）個、好ましくは３６〜４２（但し３の倍数に限る）個、より好ましくは３９個の任意の塩基配列を有する塩基配列に対する相同性がＸ％以上であることを意味する。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとして、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１７６に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号２のアミノ酸番号１〜３４及び４８〜１９３に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列に対して２０％以上、好ましくは４５％以上、より好ましくは５４％以上、さらに好ましくは６５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを好適に例示することができる。【００５０】
本発明はまた、上記の本件ＤＮＡのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子としての使用方法に関する。ここで、「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子としての使用」とは、例えば、本件ＤＮＡをインビトロ又はインビボにおいて人為的に発現させ、その発現産物であるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを、基質プロトポルフィリノーゲンIXと接触させて反応生成物プロトポルフィリンIXを生成させる反応に使用することなど意味し、本件ＤＮＡの発現産物がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するという知見は本発明によりはじめて明らかにされた全く新しい知見である。本件ＤＮＡのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子として使用することにより、例えば、アシフルオルフェンに対して耐性を有していない生物に、アシフルオルフェン耐性を付与することができる。また本発明の本件ＤＮＡを人為的に発現させ、その発現産物を、プロトポルフィリノーゲンIXと接触させてプロトポルフィリンIXに転換する方法における「人為的に発現させ」とは、インビトロ又はインビボにおいて人為的に発現させることを意味し、例えば、ラン藻細胞内における非人為的な発現は含まれない。【００５１】
本件タンパク質、本件遺伝子ＤＮＡの単離方法は特に制限されず、分子遺伝学的方法、酵素学的方法など一般に知られている方法で得られたものであってもよいが、既知のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとの相同性が低いプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを単離する場合は、（ｆ）シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子をラン藻に導入する工程；（ｇ）トランスポゾンを用いてラン藻の遺伝子を破壊する工程；（ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が破壊された株を選抜する工程；（ｉ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を特定する工程；（ｊ）破壊されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を単離する工程を含む、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の単離方法を用いるのが好ましい。【００５２】
採取源となる生物としては、アシフルオルフェンに対して耐性を有していない生物であってもよいが、アシフルオルフェンに対して耐性を有していることが好ましい。以下、アシフルオルフェンに対して耐性を有している生物を採取源とした場合の方法を述べる。
採取源となる生物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが欠損しても、その生物が生育できるように、変異原処理前に、その生物の近縁の生物等に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を採取源となる生物にあらかじめ導入し、その近縁の生物等に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を、採取源となる生物内で発現させる。なお、その近縁の生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、アシフルオルフェンに耐性を示さないことが確認されているものを用いる。次に、採取源となるその生物に対して、トランスポゾンを利用した変異原処理を行い、得られた変異体についてアシフルオルフェン（ジフェニルエーテル系除草剤）を用いたスクリーニングを行う。採取源となる生物はアシフルオルフェンに耐性を示すが、その近縁の生物等に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼはアシフルオルフェンに耐性を示さない（感受性を示す）。従って、その近縁の生物等に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を導入した採取源（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損株）は、アシフルオルフェンに感受性を示す。そこで、アシフルオルフェン処理しない場合は通常に生育し、アシフルオルフェン処理した場合にアシフルオルフェン感受性を示した変異株を選抜する。例えば、実施例３に記載の方法等により、アシフルオルフェンに感受性を示した株について、トランスポゾンの挿入位置を解析することによって遺伝子を特定することができる。このようにして、採取源由来のアシフルオルフェンに耐性を示すプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子を単離することができる。【００５３】
本発明においてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の採取源として使用する生物は、既存のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと低い相同性を示す酵素を有するものが好ましい。本発明の既存のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと低い相同性を示す遺伝子とは、具体的には例えばタバコＰＰＸ１遺伝子（Genbank accession Y13465）に対するアミノ酸レベルでの相同性が２０％未満である遺伝子を意味する。本発明においてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の採取源として使用する生物としては、原核生物が好ましく、ラン藻がより好ましく、入手の容易さや扱い易さなどからシネコシスティス（Synechocystis sp. PCC6803）のグルコース耐性株が最も好ましい。これらの菌株は、例えばパスツール研究所（Institute Pasteur）より容易に入手できる。この株の培養条件は、一般的に知られている方法によって行うことができるが、一定の光の存在下、３０℃でＢＧ１１培地[Hihara Y, et al. Plant Physiol(1998) 117:pp.1205]にTES−KOH(pH-8.2)を最終５ｍＭとなるように調整して行うのが望ましい。【００５４】
本件遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示される塩基配列情報又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて例えばシネコシスティスＰＣＣ６８０３やそれ以外のラン藻等の生物のゲノムＤＮＡライブラリー等から目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。また、ゲノムＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件遺伝子ＤＮＡをゲノムＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。また、変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡとホモロジーが高い塩基配列をもつＤＮＡを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。【００５５】
本発明の組換えベクターとしては、本件遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切に導入することにより構築することができる。例えば、本件遺伝子ＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだ構造物を好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子の発現に関与するプロモーター、ターミネーター等の制御配列及び転写制御因子の遺伝子を含有しているものを好適に使用することができる。【００５６】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pUC118(宝酒造社製)、pUC19〔Gene,33, 103(1985)〕等のｐＵＣ系統やpGEMEX-1(Promega社製)等のpGEM系統、pKK223-2(Pharmacia社製)、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)等の公知又は市販のものを例示することができる。
また、細菌用のプロモーターとしては、例えば、T7ファージプロモーター、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、recAプロモーター、λＰLプロモーター、λＰRプロモーター、lppプロモーター、PSEプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。【００５７】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕、pLAN411やpLAN421（Plant Cell Reports 10(1991) 286-290）を例示することができる。また、植物用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392）等が挙げられる。また、トウモロコシ由来アルコール脱水素酵素のプロモーター（Maydica 35 (1990) 353-357）、シロイヌナズナ由来ＩＲＥ遺伝子のプロモーター（特開２０００−２７０８７３号公報）等を例示することができる。【００５８】
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入された形質転換体であれば特に制限されず、宿主としては、細菌等の微生物や、植物、動物などを挙げることができるが、微生物や植物が好ましい。細菌として、具体的には、例えばエシェリヒア属細菌、シュードノカルディア属細菌、ストレプトミセス属細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等を挙げることができる。また、植物として、具体的には、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ムギ類（コムギ、オオムギ等）、イモ類（ジャガイモ等）等を挙げることができる。【００５９】
上記本発明の組換えベクターを宿主微生物に導入する方法としては、モレキュラークローニング第２版など多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換等により行うことができる。また、上記本発明の組換えベクターを植物に導入する方法としては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等を挙げることができる。【００６０】
本発明の組換えベクターが導入された形質転換体、好ましくは形質転換植物は、アシフルオルフェンに対する耐性を有していると考えられる。ここで、「アシフルオルフェンに対する耐性を有している形質転換体」とは、本発明の組換えベクターを導入する前に比べて、アシフルオルフェンに対する耐性が向上した形質転換体を意味する。その形質転換体のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかは、アシフルオルフェンの、その形質転換体に対する４８時間後のＬＣ５０値が、その組換えベクターを導入する前に比べて、その組換えベクターを導入した後に向上したかどうかを確認することによって調べることができる。また、特に生物が植物であるときは、例えば、特定量のアシフルオルフェンを植物の栽培土壌に施用した場合に、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させた植物が黄化、褐変若しくは枯化する程度が低減することを確認したり、同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させる前の植物に比べて、前記組換えベクターを植物中で適当に発現させた植物において増加することを確認するなどして、その植物のアシフルオルフェンに対する耐性が向上したかどうかを調べることができる。なお、アシフルオルフェンに対する耐性の向上の程度は特に制限されないが、アシフルオルフェンの、その生物に対する４８時間後のＬＣ５０値、又は同程度の黄化、褐変若しくは枯化を生じさせるのに必要なアシフルオルフェンの単位面積当たりの施用量が、その生物にその組換えベクターを導入する前に比べて１．１倍以上に向上することが好ましく、１．５倍以上に向上することがより好ましく、２倍以上に向上することがさらに好ましく、３倍以上に向上することが最も好ましい。【００６１】
例えば、本発明の形質転換体を適当な培地で培養することによって、本件タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、さらに、該培養物から本件タンパク質を採取することにより、本件タンパク質を大量に製造することが可能である。また、形質転換植物の場合、農薬・除草剤としてのアシフルオルフェンを撒布したとき、栽培目的の形質転換植物は生存するが、アシフルオルフェン感受性の雑草は死滅し、選択的に栽培目的の形質転換植物を育成することができる。【００６２】
本発明の形質転換植物は、光合成能が向上していなくてもよいが、光合成能が向上していることが好ましく、アシフルオルフェン存在下での光合成能が向上していることがより好ましい。本発明の形質転換植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが多く発現することから光合成能が向上することが期待できる。光合成能が向上しているかどうかは、本発明の組換えベクターを導入する前の宿主植物の光合成能と、導入後の形質転換植物の光合成能を比較することにより、確認することができる。ここで、光合成能が向上しているかどうかは、光合成蒸散測定装置による測定値から算出された光合成速度を比較したり、一定期間同条件で培養した後の植物体の乾燥重量を比較するなどして確認することができる。【００６３】
本発明の形質転換体は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害活性能の評価方法に使用することができる。該評価方法は特に制限されないが、例えば、（１）該形質転換体の宿主を被検物質存在下で培養して生育曲線を記録し；（２）該形質転換体を（１）と同様の被検物質存在下で培養して生育曲線を記録し；（３）段階（１）と段階（２）で記録した生育曲線を比較することを含む評価方法が挙げられる。【００６４】
また、本発明の形質転換体は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤のスクリーニング方法にも使用することができる。該スクリーニング方法としては、例えば、上記の評価方法と同様の方法が挙げられる。【００６５】
なお、アシフルオルフェンは、ジフェニルエーテル系除草剤の１種である。本件タンパク質は、アシフルオルフェンに対する耐性を生物に付与する活性を有しているので、作用機作が類似している他のジフェニルエーテル系除草剤に対する耐性を、その生物に付与する活性についても有していると考えられる。同様のことが、本件プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び本発明の形質転換体についても当てはまると考えられる。【００６６】
次に、本発明の特定生物（例えば、ラン藻）における所定の機能を有するタンパク質（例えば、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）をコードする遺伝子の単離方法について説明する。この遺伝子の単離方法は以下の１）〜５）の工程を含み、既知のタンパク質（例えば、シロイヌナズナ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）と相同な他の生物種由来のタンパク質（例えば、ラン藻由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合の遺伝子の単離手法として特に有効である。
１）特定生物以外の他の生物から所定の機能を相補するタンパク質をコードする遺伝子を、特定生物に導入して形質転換体を作製する工程
２）形質転換体の遺伝子をランダムに破壊して形質転換体の変異株を作製する工程
３）所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する工程
４）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定する工程
５）破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する工程【００６７】
上記変異処理として、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、２,６−ジアミノプリン（ＤＡＰ）等の薬剤を用いて細胞を処理する変異処理や、紫外線を用いて細胞を処理する変異処理を挙げることもできるが、遺伝子レベルの変異を導入できるトランスポソームを用いる変異処理を好適に例示することができる。トランスポソームはトランスポゾンとトランスポゼースの複合体であり、多くの微生物に遺伝子レベルの変異を容易に導入できるものである（Hoffman, L.M., Jendrisak, J.J., Meis, R.J., Coryshin, I.Y. and Rezhikof, S.W. Genetica, 108, 19-24（2000））。例えば、トランスポソームを用いる方法として、EZ::TNTM<KAN-2>Tnp Transposome（EPICENTRE社製）などを用いる方法が知られている。【００６８】
トランスポゾンを用いる突然変異誘発法は、遺伝子解析の強力なツールとして当技術分野で公知である。遺伝子破壊株は例えばトランスポゾンによって導入された特定の抗生物質に対する耐性マーカーなどによって選抜することができる。
こうして得られた遺伝子破壊株についてさらに、所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤を用いて、あるいは、培養条件を変化させ、スクリーニングすることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子がトランスポゾンの導入により破壊された変異株を選抜することができる。このトランスポゾンに隣接するヌクレオチド配列は、例えばチェーンターミネーション法（Sanger F.S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、75:5463-5467（1977））によって決定することができる。このようにトランスポゾンタグの挿入位置の解析を行うことにより、破壊された所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定することができる。【００６９】
上記「所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤」としては、シロイヌナズナ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに作用し、ラン藻由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに作用しないアシフルオルフェン（ジフェニルエーテル系）、ピラフルフェンエチル（フェニルピラゾール系）、フルミオキサジン（ジカルボキシイミド系）を好適に挙げることができる。【００７０】
ところで、ヘムとクロロフィルは共通した前駆体であるδ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）から合成される。植物や大腸菌等ではＡＬＡは、１）グルタミン酸にグルタミル−ｔＲＮＡシンターゼが作用しグルタミル−ｔＲＮＡが生成するステップ、２）生成したグルタミル−ｔＲＮＡにグルタミル−ｔＲＮＡレダクターゼが作用しグルタミン酸１−セミアルデヒドが生成するステップ、３）生成したグルタミン酸１−セミアルデヒドにグルタミン酸１セミアルデヒドアミノムターゼを含む３段階の反応“Ｃ５型”で合成されるが、動物やアグロバクテリア属細菌ではスクシニルＣｏＡとグリシンにＡＬＡシンターゼが作用してＡＬＡが生成する１段階の反応“Ｃ４型”で合成される。上記のように、アグロバクテリア属細菌は“Ｃ４型”でＡＬＡを合成し、その酵素ＡＬＡシンターゼの存在自体は既知であるがその遺伝子が同定されていない場合、植物由来のグルタミル−ｔＲＮＡシンターゼ、グルタミル−ｔＲＮＡレダクターゼ及びグルタミン酸１セミアルデヒドアミノムターゼをコードする遺伝子をアグロバクテリア属細菌にコ・インフェクションし、形質転換アグロバクテリア属細菌の遺伝子をトランスポゾン等によってランダムに破壊して変異株を作製し、その変異株の中から、グルタミン酸１セミアルデヒドアミノムターゼ阻害剤であるするギャバクリンの非存在下で生育し、ギャバクリンの存在下で死滅する変異株を選抜し、当該選抜した変異株のトランスポゾンタグの挿入位置の解析を行うことにより、アグロバクテリア属細菌由来のＡＬＡシンターゼ遺伝子を同定することができる。したがって、前記「所定の機能を相補するタンパク質に作用し、所定の機能を有するタンパク質に作用しない薬剤」として、植物や大腸菌由来のグルタミン酸１セミアルデヒドアミノムターゼに作用し、動物やアグロバクテリア属細菌由来のδ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼに作用しないギャバクリンを挙げることができる。
また、培養条件を変化させることにより、所定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された変異株を選抜する方法としては、例えば、温度条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常の培養温度と高温（もしくは低温）で培養して生育に差が認められる変異株を選抜する方法や、例えば、光条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常の光条件と強光下（もしくは弱光下）で培養して生育に差が認められる変異株を選抜する方法や、例えば、ｐＨ条件により選抜する場合は、遺伝子破壊株を通常のｐＨ条件と高ｐＨ（もしくは低ｐＨ）条件下で培養し生育に差が認められる変異株を選抜する方法などを例示することができる。【００７１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
(ラン藻へのシロイヌナズナ由来プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の導入)
シロイヌナズナのロゼット葉から、RNeasy RNA extraction kit（Qiagen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡからポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡを常法によって精製した。得られたポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡを鋳型とし、ReverTra-Plus- Kit（TOYOBO社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型とし、制限酵素AseI部位を持つプライマーATHPPOX.Ase1f（配列番号３）及びプライマーATHPPOX.r（配列番号４）並びにTaKaRaLA Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いて、シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子（1.6kbp）をＰＣＲで増幅した後、そのＰＣＲ産物をAseIで切断した。ＰＣＲは、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５２℃、４５秒）、伸長（７２℃、１２０秒）を２８サイクル行った。【００７３】
ベクターは、ラン藻への形質転換に利用でき、カナマイシン耐性を持つpFS10を使用した[Jansson, et al. Methods Enzymol (1998) 297:pp166]。このpFS10ベクターを制限酵素NdeIとHincIIで切断し、前述のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子のＰＣＲ産物と連結し、組換えベクターを作製した。この組換えベクターをヒートショック法で大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、カナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、その培養物からプラスミドを精製した。後の工程であるトランスポゾンを用いた変異原処理ではカナマイシン耐性を選択マーカーとして利用する。そのためカナマイシン耐性遺伝子を除去し、新たに別の抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）を導入する必要がある。【００７４】
pFS10ベクターを鋳型とし、XbaI部位を持つプライマーChloram.r（配列番号５）とプライマーSPE2Xba1.r（配列番号６）並びにPyrobest Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いて一次ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、伸長（７２℃、３０秒）を２５サイクル行った。このＰＣＲにより、約５００ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を鋳型とし、先ほど得られたＰＣＲ産物及びプライマーChloram. Xba1.f（配列番号７）並びにPyrobest Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いて二次ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５０℃、４５秒）、伸長（７２℃、９０秒）を２５サイクル行った。該ＰＣＲにより得られたクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＰＣＲ産物を、制限酵素XbaIで切断した。【００７５】
一方、シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子とpFS10ベクターとを連結した前述の組換えベクターも制限酵素XbaIで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を除去後、前述のXbaIで切断したクロラムフェニコール耐性遺伝子断片と連結し、新たな組換えベクターを得た。この組換えベクターを、前述と同様の方法で大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、クロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で培養し、その培養物からプラスミドを精製した。このプラスミドでシネコシスティスＰＣＣ６８０３を形質転換し、シロイヌナズナ由来プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを発現させたシネコシスティス（以下「ＡＴ株」と呼ぶことがある）を作製した。なお、シネコシスティスＰＣＣ６８０３の形質転換の方法は、文献[Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167:pp766]の方法に従った。
【実施例２】
【００７６】
(トランスポゾンを利用したラン藻変異体の作製)
シネコシスティスＰＣＣ６８０３から抽出したゲノムをTsp5091で限定分解し、ラムダ・ザップIIベクターキット（Stratagene社製）を用いて、ゲノムプラスミドライブラリーを作製した。EZ::TNTM<KAN-2> Insertion Kit（Epicentre社製）を用いて、ゲノムプラスミドライブラリーに対してトランスポゾンをin vitroで挿入した。トランスポゾンの挿入方法は、Epicentre社が開示するマニュアルに従った。このトランスポゾンタグの挿入されたシネコシスティスゲノムプラスミドライブラリーを用いて、ＡＴ株に対し相同組み換えによる形質転換を行い、シロイヌナズナ由来プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを発現させた上でのシネコシスティス変異体を作製した。
【実施例３】
【００７７】
(ラン藻プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損株のスクリーニング)
アシフルオルフェンに対する感受性を選択マーカーとして用いて、実施例２で作製したシネコシスティス変異体の中から、ラン藻プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ欠損株のスクリーニングを行った。具体的には、以下のような手順で行った。【００７８】
アシフルオルフェンを終濃度５００μＭとなるように含むＢＧ１１寒天培地に、実施例２で作製したシネコシスティス変異体を接種し、白色蛍光灯による連続光照射（光強度３０μｍｏｌ ｓ-1ｍ-2）下、３０℃で２週間、静置培養を行った。また、同様の培養を、アシフルオルフェンを含まないＢＧ１１寒天培地を用いて行った。これらの培養の結果を踏まえ、アシフルオルフェン非存在下では生育するが、アシフルオルフェン存在下では死滅する変異体として９株が選抜された。この９株のうち、アシフルオルフェン存在下での生育の阻害の程度が最も高かった菌株を３２１６株と命名し、以下に説明するように、トランスポゾンタグの挿入位置を解析したところ、タンパク質slr1790の転写調節領域と推定される位置にトランスポゾンタグが挿入されていた。
（ラン藻変異体の遺伝子解析）
トランスポゾンタグ挿入位置を確認する方法として２パターンを想定した。
（１）使用したトランスポゾンはタグとしてカナマイシン耐性遺伝子が導入されているので、この抗生物質耐性を利用して選抜する。
具体的には、変異株よりＤＮＡを取得し、カナマイシン耐性遺伝子に含まれていない制限酵素配列を利用してＤＮＡを断片化する。ＤＮＡを切断した同様の制限酵素でカナマイシン耐性遺伝子を持たないベクターを切断する。それらを連結させて大腸菌へ形質転換し、カナマイシンを含んだ培地上で生育してきたクローンについてプラスミドを精製し、シーケンスを解析する。
（２）inverse PCR法を用いる。（１）と同じく変異株よりＤＮＡを取得し、トランスポゾンタグに含まれていない制限酵素配列を利用して断片化する。これをセルフライゲーションさせ（環状化させる）、トランスポゾンタグの外側に向かうプライマーを設計してＰＣＲ反応を行い、増幅したＰＣＲ産物についてシーケンスを解析する。
まずは（１）に示した抗生物質耐性を利用した方法で検討した。
（１）カナマイシン耐性を利用した検討
＜ラン藻変異体ＤＮＡ抽出＞
ラン藻変異体（３２１６株）をＢＧ１１液体培地にて３０℃、明所にて１２日間培養した。培養終了後、集菌しＳＤＳ法を用いて抽出したところ約８００μｇのラン藻変異体ＤＮＡを得た。
＜制限酵素による切断＞
制限酵素としてはEcoR1、Sac1をそれぞれ用い、ラン藻変異体ＤＮＡおよびベクター（ｐＵＣ１１８）を切断した。制限酵素処理終了後、断片化したラン藻変異体ＤＮＡはスピンカラムにて精製した。ベクターに関してはセルフライゲーションを防ぐためにアルカリフォスファターゼ処理を行った。
＜ライゲーション＞
データベースから上記の３種類の制限酵素で切断すると得られる平均断片長はEcoR1では６ｋｂ、Sac1では１０ｋｂであった。平均断片長を参考にインサート／ベクターのモル比を３／１と９／１に調整し１２℃、１６時間でライゲーションした。
＜大腸菌への形質転換＞
ライゲーション液の一部を用いてヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。その結果、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地ではコロニーは認められなかった。
また、ライゲーションの際のインサート／ベクターの混合比率をインサート大過剰にしても同様の結果であった。抗生物質耐性を利用した選抜方法は理論的には可能なはずであるが、今回の場合、例えはインサート／ベクター比の条件が合わなかった等の問題が考えられる。条件検討の余地はあったが、（２）で示したinverse PCR法で検討することにした。
（２）inverse PCR法を利用した検討
表現型の強かった３２１６株について検討した。ＤＮＡ取得は上記と同様の方法で行い、制限酵素としてはEcoR1、Kpn1を用いた。制限酵素処理終了後、ＤＮＡ断片をスピンカラムにて精製した。
＜セルフライゲーション＞
スピンカラムにて精製したＤＮＡ断片を用いて１２℃、１６時間でセルフライゲーションさせた。
＜1stおよび2nd PCR＞
inverse PCR法の場合、非特異的なバンドの増幅させてしまう懸念があったので、ＰＣＲ反応は２段階に分けて行うことにした。
プライマーはトランスポゾンタグの外側に向かうプライマーを２組設計した。
なお、2nd PCRのプライマーはキット付属のシーケンスプライマーを使用した。
（1st PCR用プライマー）
KAN-2-fr (配列番号１７) 
KAN-2-rev (配列番号１８)
（2nd PCR用プライマー）
KAN-2ＦＰ1 (配列番号１９)
KAN-2ＲＰ1 (配列番号２０)
セルフライゲーションさせたゲノム断片をテンプレートとして1st PCRを行った。1st PCR条件は９８℃１０秒（変性）、５５℃３０秒（アニーリング）、７２℃７分（伸長）を３０サイクルでEX taq polymerase(Takara社製)を使用し、プライマー濃度は最終各０．５μＭで行った。
テンプレートの最終濃度は上記ライゲーション液５０倍希釈、２５０倍希釈、１２５０倍希釈の３段階で検討した。ＰＣＲ産物を５μｌ取り、アガロースゲル電気泳動で確認した。
電気泳動の結果、EcoR1で切断したテンプレートを用いた場合のみ７ｋｂ付近に特異的なバンドの増幅が認められた。プライマー除去のため、1st PCR産物をスピンカラムにて精製し、2nd PCRのテンプレートとした。
2nd PCR条件は９８℃１０秒（変性）、６０℃３０秒（アニーリング）、７２℃５分（伸長）を３サイクルした後、９８℃１０秒（変性）、５８℃３０秒（アニーリング）、７２℃５分（伸長）を２０サイクルでEX taq polymerase(Takara社製)を使用し、プライマー濃度は最終各０．５μＭで行った。
ＰＣＲ産物を５μｌ取り、アガロースゲル電気泳動で確認した。
その結果、プライマー設計の通り、1st PCR産物より数百ｂｐ低い位置にバンドの増幅は認められたが、同時に非特異的なバンドの増幅も認められた。
＜ＴＡクローニングおよびプラスミドの精製＞
2nd PCRの条件検討を行ったが、非特異的なバンドの増幅を抑えることができなかったので1st PCRで特異的に増幅した７ｋｂ付近のバンドについてゲル回収を行った。これをインサートとしてＴＡクローニング(pGEM-T Easy ベクター使用、Promega社製)を行い、ヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。プレート上に現れたコロニーを４つ選抜し、アンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、ミニプレップ法にてプラスミドの精製を行った。pGEM-T Easy ベクターはEcoR1処理により、インサートの切り出しができるので精製したプラスミドをEcoR1処理し、アガロースゲル電気泳動で確認した。
電気泳動の結果、プラスミド１および２は５ｋｂ、３ｋｂ（ベクター）、１．８ｋｂ付近にバンドが認められた。インサート由来のバンドの合計サイズは７ｋｂ程度であり、目的のクローンであると判断した。プラスミド１および２についてEcoR1処理でベクター由来も含め切断されたバンドが３つ認められたのは、最初のライゲーションの段階で環状ではなく、コンカテマーを形成した可能性が考えられる。シーケンス解析には問題がないのでプラスミド１についてシーケンス反応を行った。
＜シーケンス＞
プラスミド１についてジデオキシ法によるサイクルシーケンスで塩基配列を解析した。シーケンスプライマーとしては2nd PCRで用いたKAN-2ＦＰ1およびKAN-2ＲＰ1を使用した。使用したシーケンスプライマーはトランスポゾンタグのＤＮＡ領域とアニールするため、得られるシーケンスデータの始めの部分はトランスポゾンタグのＤＮＡ領域となる。inverted repeatシーケンスはトランスポゾン挿入クローンのターゲットＤＮＡとトランスポゾンタグの接点で見つかる19bp Transposon Mosaic End Transposase認識配列であり、このシーケンスはターゲットとトランスポゾンタグを識別する目印にできる。
また、Transposaseによって触媒されるトランスポゾン挿入は、挿入したトランスポゾンの側面を守るために9-bpのターゲットサイト重複配列を生成する。
これらを参考にして得られたシーケンスを解析するとトランスポゾンタグはラン藻ゲノムの２５６６７７番目のＴから２５６６８５番目のＧの間（Mosaic end配列および9-bp重複配列確認）に挿入されていることが確認できた。この位置はＯＲＦ領域には含まれていないが、下流にある推定タンパク質slr1790(256698-257279, 193aa)の転写調節領域であると考えられた。【００７９】
アシフルオルフェン非存在下では成育するが、アシフルオルフェン存在下では死滅する９変異株のうち、３２１６株以外の８株についても、同様の解析をおこなったところ、いずれの株も３２１６株と同様の遺伝子（slr1790）にトランスポゾンタグが挿入されていた。
【実施例４】
【００８０】
(推定タンパク質slr1790の遺伝子破壊株の作製)
slr1790遺伝子（シネコシスティスゲノム256698から257279の600bp）がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているのかどうかを確認するために、slr1790のコード領域にカナマイシン耐性遺伝子を挿入した組換えベクターを用いて、シネコシスティスＰＣＣ６８０３のslr1790遺伝子について遺伝子破壊を行った。ラン藻の形質転換は相同組換えで行うので、slr1790遺伝子の上流７００ｂｐおよび下流６００ｂｐの配列（シネコシスティスゲノム255999から257920の１．９ｋｂｐ）をもとにプライマーを設計した。シネコシスティスＰＣＣ６８０３から抽出したＤＮＡを鋳型とし、それらのプライマーSlr1790 km EcoR1 f（配列番号８）及びプライマーSlr1790 km Hind3 r（配列番号９）、並びにTaKaRa EX Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いたＰＣＲにより、slr1790遺伝子の上流７００ｂｐおよび下流６００ｂｐの配列を含む配列を増幅させ、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは、変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１２０秒）を２８サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をpGEM-T Easyベクター（Promega社製）に連結した。【００８１】
slr1790遺伝子を含む配列が連結されたベクターをヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、アンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、その培養物からプラスミド（pslr1790S）を精製した。次に、トランスポゾンタグに含まれるカナマイシン耐性遺伝子（１．３ｋｂｐ）を鋳型とし、Nhe1部位を持つプライマーKm Nhe1 f（配列番号１０）及びプライマーKm Nhe1 r（配列番号１１）並びにTaKaRa EX Taqポリメラーゼ（Takara社製）を用いたＰＣＲにより、カナマイシン耐性遺伝子を含むＰＣＲ産物を増幅させた。ＰＣＲは、変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長（７２℃、８０秒）を２８サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をNhe1で切断し、それを、ベクター内のslr1790遺伝子中流のNhe1部位に連結した。これをヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーを、カナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、その培養物からプラスミド（pslr1790SKM）を精製した。slr1790遺伝子破壊用のこのコンストラクトを図３に示す。シネコシスティスＰＣＣ６８０３を、このpslr1790SKMで形質転換し、その形質転換体を、カナマイシンを含むＢＧ１１寒天培地で培養して、slr1790遺伝子破壊株を選抜した。なお、シネコシスティスＰＣＣ６８０３の形質転換の方法は、文献[Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167:pp766]の方法に従った。
【実施例５】
【００８２】
(推定タンパク質slr1790の遺伝子破壊株の解析)
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが破壊された場合、基質であるプロトポルフィリノーゲンIXが蓄積することが予想されるが、プロトポルフィリノーゲンIXは非常に不安定であるために、抽出過程において空気中の酸素と反応し容易にプロトポルフィリンIXに酸化されるため、空気中で抽出操作を行った後のプロトポルフィリンIXの量を測定することによって、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが破壊されたどうかを判定することができる。slr1790の遺伝子破壊株についてのプロトポルフィリンIX量の測定は以下のような方法で行った。【００８３】
実施例４で得られたslr1790遺伝子破壊株を試験管を用いて、白色蛍光灯による連続光照射（光強度３０μｍｏｌ ｓ-1ｍ-2）下、３０℃で１週間、通気したＢＧ１１液体培地５０ｍｌで培養し、培養液を得た。得られた培養液から、９０％アセトンを用いて、プロトポルフィリンIXを含む色素を抽出し、色素抽出液を得た。この色素抽出液をＨＰＬＣにセットし、１．２ｍｌ／分のフローレート、カラムオーブン４０℃の条件下、オクチルシリカカラム(Waters Symmetry C8(１５０×４．６ｍｍ))及びメタノール（溶出剤）を用いてＨＰＬＣ分析を行った（ポンプLC-10ATVP及びオートサンプラーSIL-10ADVPは(株)島津製作所社製）。プロトポルフィリンIXのモニタリングは、励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長６３３ｎｍで行った（蛍光検出器RF−10AXL  は(株)島津製作所社製）。その結果を図４のＣ）に示す。また、slr1790遺伝子破壊株の代わりに、その遺伝子破壊を行っていないシネコシスティスＰＣＣ６８０３を用いて同様の解析を行った結果を図４のＢ）に示す。また、プロトポルフィリンIXのサンプルのクロマトグラムを図４のＡ）に示す。【００８４】
図４の結果から、slr1790遺伝子破壊株では、その遺伝子破壊を行っていない株に比べて、２０倍以上のプロトポルフィリンIXの蓄積が認められた。このことと、ラン藻のプロトポルフィリノーゲンIXあるいはプロトポリフィリンIXの代謝に関与する酵素のうち、同定されていないのはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのみであることとを考え合わせると、slr1790がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしていることが明らかとなった。なお、slr1790は、既知のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとの相同性は極めて低い。slr1790に対する、既知のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのアミノ酸レベルでの相同性を以下の表３に示す。【００８５】
【表３】
2007034953.tif 000004
【実施例６】
【００８６】
（ラン藻プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼslr1790のシロイヌナズナへの導入）
植物用発現ベクターとしてpBI121を使用した。pBI121の概略図を図５に示す。
植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは葉緑体、ミトコンドリアに存在する酵素であるが、今回はslr1790が葉緑体で発現するようにシロイヌナズナ由来クロロフィル a オキシゲナーゼ(CAO, Genbank accession BT002075)の葉緑体移行シグナルをslr1790遺伝子に連結して導入した。移行シグナルの予測は、TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)を利用した。具体的には以下のような手順で行った。【００８７】
pBI121ベクター（１４．８ｋｂｐ）を制限酵素BamH1およびSac1を用いてＧＵＳ遺伝子（１．９ｋｂｐ）を除き、残りのベクター部分（１２．９ｋｂｐ）をゲル回収にて精製した。また、ＣＡＯ由来の葉緑体移行シグナル（０．２ｋｂｐ）は、実施例１で得られたシロイヌナナズナｃＤＮＡを鋳型として、制限酵素BamH1、Sac1認識部位をそれぞれ持つプライマーBamSma CAO fr. (配列番号１２)とSac CAO rev. (配列番号１３)並びにKOD-Plus-ポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲは、変性（９４℃、１５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（６８℃、１５秒）を３０サイクル行った。【００８８】
こうして得たＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性を持つpTA2ベクター（TOYOBO社製、KOD-Plus-用TAクローニングベクター、２．９ｋｂｐ）へ連結後、ヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーをアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、プラスミド（pTACAO）を精製した。プラスミドpTACAOを制限酵素BamH1およびSac1を用いて切断し、ＣＡＯ由来の葉緑体移行シグナルの切り出しを行い、ゲル回収にて精製した。この精製したＣＡＯ由来の葉緑体移行シグナルをインサートとして、先にＧＵＳ遺伝子を除去したpBI121ベクターに連結した。これをヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換後、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、プラスミド（pBICAO、１３．１ｋｂｐ）を精製した。pBICAOは制限酵素Sac1にて切断し、セルフライゲーションを防ぐためＣＩＰ処理後、ゲル回収にてベクター断片を精製した。【００８９】
次にslr1790遺伝子（０．６ｋｂｐ）はシネコシスティスから抽出したゲノムを鋳型とし、制限酵素Sac1認識部位を持つプライマー、Sac slr1790fr. (配列番号１４)とSac slr1790 rev. (配列番号１５) 並びにKOD-Plus-ポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲは、変性（９４℃、１５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（６８℃、３５秒）を３０サイクル行った。こうして得たＰＣＲ産物をアンピシリン耐性を持つpTA2ベクターへ連結後、ヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーをアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養し、プラスミド（pTAslr1790Sac）を精製した。プラスミドpTAslr1790Sacを制限酵素Sac1を用いて切断し、slr1790遺伝子の切り出しを行い、ゲル回収にて精製した。この精製したslr1790遺伝子をインサートとして、先に制限酵素Sac1にて切断したpBICAOに連結した。これをヒートショック法にて大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換後、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。現れたコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、プラスミド（pBIslr1790、１３．６ｋｂｐ）を精製した。pBIslr1790の概略図を図６に示す。【００９０】
次に凍結法にてpBIslr1790を導入したAgrobacterium tumefaciens C58株を用いて、in planta法にてシロイヌナズナを形質転換した。
まず、pBIslr1790を保持したAgrobacterium tumefaciens C58株の菌体濃度がＯＤ６００＝０．８−１．０付近となるように３００ｍＬの形質転換バッファー（５％  ｓｕｃｒｏｓｅ，０．０２％  ＳｉｌｗｅｔＬ−７７）に懸濁した。次ぎに、蕾の付いたポット植えのシロイヌナズナの地上部を前記懸濁液に３０秒間浸漬し、その後、各ポットをビニール袋で２日間覆った。覆いを取った後、さらに栽培を続け、種子を得た。栽培はグロースチャンバー（２４ｈ明、温度２２℃、光強度７０μｍｏｌｓ−１ｍ−２）内で行った。得られた種子を殺菌し、３５ｐｐｍのカナマイシン、０．６％の寒天を含む１／２濃度のMurashige−Skoogの培地 [T. Murashige and F. Skoog Physiol.Plant(1962) 15: pp473]に播種し、形質転換体を得た(ｓｌｒ系)。この形質転換体を土に移植し、グロースチャンバー内で栽培し、２世代目の種子を得た。
【実施例７】
【００９１】
（形質転換体のアシフルオルフェンに対する耐性効果）
アシフルオルフェンに対する耐性効果は形質転換体２世代目のうち、遺伝子導入が確認できたものについてアシフルオルフェンに対する耐性を検討した。
遺伝子導入の有無については以下の手法により確認した。【００９２】
グロースチャンバー内で草丈１−２ｃｍ程度まで生育させた形質転換シロイヌナズナｓｌｒ系より、葉を直径２ｍｍ程度それぞれの形質転換体より回収し、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入した遺伝子のＮ末端およびＣ末端とアニールするプライマーAtCAO-tra-up(配列番号１６)とSac slr1790 rev. (配列番号１５) 並びにTaq DNA polymerase（SIGMA社製）を用いてＰＣＲで増幅させ、アガロースゲル電気泳動にてバンドの有無を確認した。ＰＣＲは、変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、伸長（７２℃、６０秒）を４０サイクル行った。【００９３】
遺伝子導入が確認できた形質転換体について、アシフルオルフェンに対する耐性効果を検討した。アシフルオルフェンはジメチルホルムアミドおよびポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤を混合、溶解して有効成分４％となるように乳剤を作成した。これをアシフルオルフェン濃度が最終１０μＭとなるように水で希釈し、マイクロピペットを用いて、グロースチャンバー内で草丈１−２ｃｍ程度まで生育させたシロイヌナズナ野生株および遺伝子導入を確認した形質転換シロイヌナズナｓｌｒ系の葉面にそれぞれ５μｌ滴下処理した。
調査は薬液処理７日後まで継続して行い、壊死の程度を目視にて評価した（０−５の６段階評価、０は影響なし）。処理７日後の結果を表４に示した。その結果、シロイヌナズナ野生株と比較して、slr1790を導入したシロイヌナズナはアシフルオルフェンに対する耐性が確認できた。【００９４】
【表４】
2007034953.tif 000005
【実施例８】
【００９５】
（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤の阻害能試験）
実施例１で得られたＡＴ株および実施例４の方法でＡＴ株のslr1790遺伝子を破壊したATΔslr1790株を用いた。培地は前記のＢＧ１１液体培地を使用し、遺伝子の欠落および復帰変異を抑えるため、ＡＴ株にはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと同時にクロラムフェニコール耐性遺伝子も導入してあるのでクロラムフェニコールを、ATΔslr1790株はその遺伝子破壊の際にカナマイシン耐性遺伝子を導入しているのでカナマイシンをそれぞれ最終２５μｇ／ｍｌとなるように添加した。ＢＧ１１液体培地で振とう前培養を行った増殖期のＡＴ株、ATΔslr1790株を集菌し、抗生物質を加えた新たなＢＧ１１液体培地にＡ７３０が０．１となるように懸濁して検討に用いた。【００９６】
披験化合物の原体をＤＭＳＯに溶解し、各ウェルに最終薬剤処理濃度が１．０×１０−４Ｍから１．０×１０−９．５Ｍとなるように添加した（最終ＤＭＳＯ濃度０．５％）。試験は９６穴プレート１ウェルあたり１００μｌスケールで実施し、培養温度３０℃、光強度１０００ｌｕｘの条件下で振とう培養した。試験開始６日後に濁度を測定し、溶媒処理区と比較してｐＩ５０値を算出した。
ｐＩ５０値＝−ｌｏｇ  （５０％活性阻害処理濃度（Ｍ））【００９７】
（除草処理活性）
２００ｃｍ2 のポットに土壌を充填し、表層にイヌビユの種子を播き、軽く覆土後、草丈が５〜１０ｃｍになるまで温室内で生育させた。各披験化合物の水希釈液を所定の薬量になるように、１０００リットル／ｈａ散布量相当量で小型噴霧器にてイヌビユの茎葉部に散布した。温室内で育成させ、処理２週間後にイヌビユの除草効果を下記の調査基準に従って調査し、殺草指数で表した。結果を以下の表に示す。【００９８】
【表５】
2007034953.tif 000006
【００９９】
【表６】
2007034953.tif 000007
【０１００】
【表７】
2007034953.tif 000008
【０１０１】
ATΔslr1790株はジフェニルエーテル系型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤であるアシフルオルフェン以外の剤にも感受性を示し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤全般的に阻害活性を示した。また、各披験化合物のATΔslr1790株に対するｐＩ５０値の傾向はそれぞれの茎葉処理活性を反映するものであり、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害活性能の評価に有効であるといえる。
【実施例９】
【０１０２】
（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤に特異的な化合物スクリーニング法）
上記の実施例からプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤はＡＴ株に感受性を示さず、ATΔslr1790株には感受性を示した。一方、非プロトポルフィリノーゲン阻害剤用ＡＴ株およびATΔslr1790株の両方にも同程度の阻害活性を示した。このようにＡＴ株とATΔslr1790株の化合物に対する阻害能を比較することにより、各披験化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害能を判定する。
【産業条の利用可能性】
【０１０３】
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは既知の該酵素とかなり異なる構造を有するため、新規なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤の選抜への応用が期待できる。また、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤に対する耐性を有する光合成植物の育種若しくはストレス環境条件に抵抗性を有する植物の育種への応用が期待できる。さらに、本発明の遺伝子の単離方法によると、既知のタンパク質と相同な他の生物種由来のタンパク質が、他の生物種の遺伝子データベースでは見い出すことができない場合であっても、他の生物種の遺伝子を単離することができる有効手法を提供することができる。
【図１】
2007034953.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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