(57)【要約】  悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の予防及び／又は治療効果を予測する方法であって、患者の悪性腫瘍から採取された試料中のp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスにおいてp160ファミリー分子群優位である場合にRAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する工程を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を予測する方法であって、患者の悪性腫瘍におけるp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し各発現量のバランスを確認する工程を含む方法。
【請求項２】
患者の悪性腫瘍におけるp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群との発現量のバランスを比較し、p160ファミリー分子群優位である場合に、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
p160ファミリー分子群のうち、AIB1、SRC-1又はTIF2の発現量を測定する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
SP110ファミリー分子群のうち、SP110bの発現量を測定する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
患者の悪性腫瘍から採取された試料中のAIB1とSP110bの発現量を測定し、その発現量の比(AIB1の発現量/SP110bの発現量)が0.05を超える場合にRAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
患者の悪性腫瘍から採取された試料中のSRC-1とSP110bの発現量を測定し、その発現量の比(SRC-1の発現量/SP110bの発現量)が0.3を超える場合にRAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
患者の悪性腫瘍から採取された試料中のTIF2とSP110bの発現量を測定し、その発現量の比(TIF2の発現量/SP110bの発現量)が0.1を超える場合にRAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
悪性腫瘍が肝臓癌、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌の固形癌及び白血病、リンパ腫、骨髄腫の血液癌からなる群から選ばれる悪性腫瘍である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
悪性腫瘍が肝臓癌である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
悪性腫瘍が肝細胞癌である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
RAR-α作動薬が4-[3,5-ビス(トリメチルシリル)ベンズアミド]安息香酸である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
悪性腫瘍の治療方法であって、下記の工程：
(a)悪性腫瘍の患者から悪性腫瘍の試料を採取する工程；
(b)該試料中のp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定する工程：
(c)p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスにおいてp160ファミリー分子群優位である場合にRAR-α作動薬をその患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項１３】
悪性腫瘍の治療のための医薬であって、RAR-α作動薬を有効成分として含み、患者におけるp160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスがp160ファミリー分子群優位である場合に投与される医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は悪性腫瘍の患者に対するRAR-α作動薬の有効性の予測方法に関する。より具体的には、肝臓癌などの悪性腫瘍の患者におけるRAR-α作動薬の治療効果を簡便かつ正確に予測する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓癌は悪性度が非常に高く、この疾患で毎年100万人の患者が死亡し、患者数は世界で第５位を占めている［El-Serag, H. B., and Mason, A. C., Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States., N. Engl. J. Med., 340, pp.745750, 1999; Taylor-Robinson, S. D., Foster, G. R., Arora, S., Hargreaves, S., and Thomas, H. C., Increase in primary liver cancer in the UK, 197994 Lancet, 350, pp.11421143, 1997］。【０００３】
肝臓癌は、肝炎ウィルスやアルコールの肝臓への曝露により、複数の癌細胞が別々の場所より同時に又は相前後して発生して発症すると考えられている［Slaughter DP, Southwick HW, Smejkal W., "Field cancerization" in oral stratified squamous epithelium; Clinical implications of multicentric origin., Cancer, 6, pp.963-968, 1953］。日本国では、肝臓癌の発生原因は主としてC型肝炎ウィルス感染によるものと考えられている。一時的に癌細胞を除去あるいは死滅させてもC型肝炎ウィルスを除去できたわけではないので、癌の再発の可能性が大きい。1990年から1997年までに再発率16〜29%との報告がなされている［肝臓癌, I 患者数の推移 3. 患者数の算出方法, がん患者動向と治療法別実態, 株式会社メディカルリサーチ, pp.20-30, 2001］。【０００４】
肝臓癌の治療方法については、可視病巣を対象とする外科的肝切除、ラジオ波焼灼療法、エタノール注入療法、及びマイクロウェーブ凝固壊死療法等があるが、当該療法では対処し得ない場合があり、全身療法としての化学療法が望まれている。
現在、化学療法としては、上述の治療法及び肝動脈塞栓術の適応とならない進行例や、これらの治療後に再発した症例に対して、CDDP、ADMや5-FUの動脈内注射（動注）療法が行われている。しかしながら、油性造影剤リピオドールと上記薬剤との併用による肝動注化学療法では著効13.0％、有効30.0％であり、肝動脈塞栓療法及びリピオドールとの併用を除く化学療法では著効2.5％、有効3.1％と報告されているのみであり、治療成績は必ずしも良好とは言えない。さらに、この併用療法では潰瘍等の合併症を生じる等の問題がある［谷川久一, 局注療法及び動注療法, 癌の臨床, 40, pp.1490-1497, 1994］。【０００５】
このように、肝臓癌に対してある程度の治療成績を安定に保証する標準的な治療方法は未だ存在しない。特に、動脈内注射は手技の面及び患者の負担の面から問題があり、これに代わる化学療法の開発が望まれている。さらに、肝臓癌は化学療法抵抗性が高く、一時的な腫瘍安定化、即ち腫瘍を増殖させずに延命を図る治療ですら困難とされているところから、腫瘍の温存療法を可能にする化学療法の開発も切望されている。【０００６】
4-[3,5-ビス(トリメチルシリル)ベンズアミド]安息香酸（以下、本明細書で「TAC-101」と呼ぶ場合がある。）は下記構造式(1)で表される合成レチノイドであり、癌治療剤、癌細胞の分化誘導剤、癌転移抑制剤、血管性疾患治療剤、又は心肥大症治療剤として有用であることが知られている（特開平2-247185号公報、国際公開WO96/32101号公報、国際公開WO03/089005号公報等）。
【化１】
2007049542.tif 000002
【０００７】
TAC-101は、核内受容体ファミリーに属する転写因子であるレチノイン酸受容体のサブタイプα（以下、「RAR-α」と呼ぶ場合がある）に結合して同受容体を介する転写を活性化する作用を有するRAR-α作動薬であり、転写活性化により抗腫瘍効果を発揮する。肝臓癌ではRAR-αの発現が増加していることが知られており(Clin. Cancer Res., 9, pp.3679-3683, 2003)、肝臓癌の動物モデルを用いた薬効薬理試験においてTAC-101の抗腫瘍活性が認められている(Clin. Exp. Metastasis. 16, pp.633-643, 1998; Clin. Exp. Metastasis., 16, pp.323-331, 1998; J. Cancer Res., 90, pp.1254-1261, 1999)。ヒトの肝臓癌に対するTAC-101の臨床効果については、米国第２相試験において43%の腫瘍進行停止が確認されている。【０００８】
RAR-αの活性化にはレチノイン酸などのリガンド分子の結合が必要であることが知られている。リガンドの結合により活性化された核内受容体は標的とするDNA配列に結合してDNAの翻訳を開始するが、DNAはヒストンと結合してクロマチン構造を形成していることから、転写活性化にはヒストンのアセチル化によるクロマチン構造の変化が必須である。RAR-αの転写活性化を高めるコアクチベーターは、ヒストンアセチル化に必要なヒストンアセチル化酵素そのもの、又はヒストンアセチル化酵素の転写活性化部位へのリクルートを担っている分子群であり、主に前者としての役割を担うp300ファミリー分子群(Curr. Biol., 7(9), pp.689-692, 1997)と、後者としての役割を担うp160ファミリー分子群(Mol. Endocrinol., 17(9), pp.1681-1692, 2003)に大別される。これらのコアクチベーター分子群は転写活性を正に調節する。p160ファミリー分子群のひとつであるAIB1(Amplified In Breast Cancer-1)は乳癌細胞で過剰発現するステロイド受容体コアクチベーターの１つであり、ステロイドホルモン応答性癌の診断に有用であることが知られている（国際公開WO98/57982号公報）。また、前立腺癌の予測、乳癌のタモキシフェン感受性の予測に有用であることも知られている（国際公開WO02/10452号公報、国際公開WO03/189号公報、国際公開WO03/89904号公報等）。また、SRC-1(Steroid Receptor Coactivator-1)もステロイド受容体コアクチベーターの１つであり、ステロイドレセプター活性に関わる疾患の治療に有用であることが知られている（国際公開WO97/10337号公報）。更に、TIF2(translation initiation factor-2)も同様にステロイド受容体コアクチベーターとして核内受容体のAF-2部位に作用し、リガンド依存性の転写活性化作用を促進する因子であることが知られている(EMBO J., Jul 15, pp.3667-3675, 1996)。【０００９】
また、RAR-αの転写活性を抑制するコレプレッサー分子群の存在も知られている。これらはヒストン脱アセチル化酵素としての活性を持つものが多く、ヒストンのクロマチン化を促すことで核内受容体によるDNA翻訳を負に調節する(White JH, et al , Vitam. Horm., 68, pp.123-143, 2004)。近年、肝細胞癌で発現しているSP110ファミリー分子群がRAR-α選択的コレプレッサーであることが報告された(Watashi K., et al , Mol. Cell Biol., 23(21), pp.7498-7509, 2003)。核内受容体による転写活性化機構はこれらのコアクチベーター及びコレプレッサーのバランスによって制御されていると考えられる。また、国際公開WO02/8383号公報においてはSP110bを含むSP110ファミリー分子群が単離され、原発性胆汁性硬化症(PBC)の診断に有用であることが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、肝臓癌などの悪性腫瘍の患者におけるTAC-101などのRAR-α作動薬の有効性の判定方法を提供することにある。より具体的には、肝臓癌などの悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を簡便かつ正確に予測する方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決すべく研究を行なううち、RAR-αが未発現の状態ではTAC-101などのRAR-α作動薬は肝臓癌に対して有効性を示さないものの、RAR-αの発現強度は必ずしも転写調節機能の強弱とは関連しておらず、RAR-α作動薬の肝臓癌に対する抗腫瘍活性とRAR-αの発現との間には明確な相関は認められないことを見出していた。また、コアクチベーター分子群のうちAIB1、SRC-1又はTIF2などのp160ファミリー分子群とRAR-α作動薬により誘導されるRAR-αの転写活性とが正相関しており、一方、RAR-α選択的なコレプレッサーであるSP110bの発現とRAR-α作動薬により誘導されるRAR-αの転写活性とが負相関しているものの、それらのコアクチベーター及びコレプレッサーの発現量は各癌細胞においてまちまちであり、RAR-α作動薬の肝臓癌に対する有効性を判断する指標としての利用が困難であることを見出していた。【００１２】
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を進めた結果、コアクチベーターであるp160ファミリー分子群の発現量とコレプレッサーであるSP110ファミリー分子群の発現量の比がRAR-α作動薬により誘導されるRAR-αの転写活性化と極めて高い相関を示すことを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。【００１３】
すなわち、本発明により、悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を予測する方法であって、患者の悪性腫瘍におけるp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し各発現量のバランスを確認する工程を含む方法が提供される。
また、本発明により、悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を予測する方法であって、患者の悪性腫瘍におけるp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスを確認し、p160ファミリー分子群優位である場合に、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する工程を含む方法が提供される。【００１４】
上記の発明の好ましい態様によれば、p160ファミリー分子群のうちAIB1、SRC-1又はTIF2の発現量を測定する上記の方法；SP110ファミリー分子群としてSP110bの発現量を測定する上記の方法；悪性腫瘍が肝臓癌である上記の方法；RAR-α作動薬が4-[3,5-ビス(トリメチルシリル)ベンズアミド]安息香酸である上記の方法が提供される。また、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量とのバランスに相関して変動する血中マーカーを測定する工程を含む上記の方法も本発明により提供される。【００１５】
別の観点からは、本発明により、患者の悪性腫瘍から採取された試料中のp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量をそれぞれ測定するための試薬の組み合わせを含むキットが提供される。
さらに別の観点からは、本発明により、悪性腫瘍の治療方法であって、下記の工程：
(a)悪性腫瘍の患者から悪性腫瘍の試料を採取する工程；
(b)該試料中のp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定する工程：
(c)p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量とのバランスを確認し、p160ファミリー分子群優位である場合にRAR-α作動薬をその患者に投与する工程
を含む方法、及び悪性腫瘍の治療のための医薬であって、RAR-α作動薬を有効成分として含み、患者におけるp160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスがp160ファミリー分子群優位である場合に投与される医薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は樹立ヒト由来肝細胞癌株におけるp160ファミリー分子群のひとつであるAIB1の発現を確認した結果を示す。
【図２】図２は樹立ヒト由来肝細胞癌株におけるp160ファミリー分子群のひとつであるSRC-1の発現を確認した結果を示す。
【図３】図３は樹立ヒト由来肝細胞癌株におけるp160ファミリー分子群のひとつであるTIF2の発現を確認した結果を示す。
【図４】図４は樹立ヒト由来肝細胞癌株におけるSP110ファミリー分子群のひとつであるSP110bの発現を確認した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の方法は、悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を予測する方法であって、患者の悪性腫瘍において、RAR-αの転写活性化を高めるコアクチベーターであるp160ファミリー分子群の発現量及びRAR-αの転写活性化を抑えるコレプレッサーであるSP110ファミリー分子群の発現量を測定し各発現量のバランスを確認することを特徴としている。また、患者の悪性腫瘍におけるp160ファミリー分子群の発現量及びSP110ファミリー分子群の発現量を測定し、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスを確認し、p160ファミリー分子群優位である場合に、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する工程を含むことを特徴としている。【００１８】
本発明におけるRAR-α作動薬の治療効果とは、原発腫瘍における腫瘍縮小・腫瘍消失又は腫瘍安定化のみならず、腫瘍の再発防止、転移防止、再燃防止効果も含まれる。
p160ファミリー分子群としては、例えば、AIB1、SRC-1又はTIF2などを挙げることができるが、本発明の方法においてはAIB1の発現量を測定することが好ましい。AIB1についてはステロイド受容体コアクチベーターとしての作用などが知られており、肝細胞癌における予後予測にも利用できることが知られているので(Cancer, 95(11), pp.2346-2352, 2002)、当業者はAIB1の発現量を容易に測定することが可能である。また、SRC-1及びTIF2もステロイド受容体コアクチベーターとしての作用などが知られており、当業者はSRC-1又はTIF2の発現量を容易に測定することが可能である（国際公開WO97/10337号公報）。
SP110ファミリー分子群としては、例えばSP110bなどを挙げることができる。SP110bについてはRAR-α選択的なコレプレッサーであることが知られており(Hijikata, W.k. et al, Mol. Endocrinol., 17(9), pp.1681-1692, 2003）、当業者はSP110bの発現量を容易に測定することができる。【００１９】
本明細書において、「p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスを確認する」とは例えば、試料中の各分子群の発現量を測定し、その発現量の比（コアクチベーター／コレプレッサー、即ちp160ファミリー分子群の発現量／SP110ファミリー分子群の発現量）を確認することを意味している。本明細書において、「p160ファミリー分子群優位である」とは、例えば、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量とを相対的に比較した場合、RAR-α転写活性を有意に増加させるようなp160ファミリー分子群の発現量が認められることを意味する。例えば、AIB1とSP110bとの組合せの場合、患者の悪性腫瘍から採取された試料中の各々の発現量を測定し、その発現量の比(AIB1の発現量/SP110bの発現量)を算出し、その比が0.05を超える場合、好ましくは0.1を超える場合にp160ファミリー分子群優位であり、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する。SRC-1とSP110bとの組合せの場合、患者の悪性腫瘍から採取された試料中の各々の発現量を測定し、その発現量の比(SRC-1の発現量/SP110bの発現量)を算出し、その比が0.3を超える場合、好ましくは0.5を超える場合にp160ファミリー分子群優位であり、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する。TIF2とSP110bとの組合せの場合、患者の悪性腫瘍から採取された試料中の各々の発現量を測定し、その発現量の比(TIF2の発現量/SP110bの発現量)を算出し、その比が0.1を超える場合、好ましくは0.12を超える場合にp160ファミリー分子群優位であり、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定する。【００２０】
本発明の方法による判定の対象となる悪性腫瘍の種類は特に限定されないが、例えば、肝臓癌、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌等の固形癌及び白血病、リンパ腫、骨髄腫等の血液癌からなる群から選ばれる悪性腫瘍を挙げることができ、好ましい判定対象は肝臓癌又は肺癌であり、より好ましくは肝細胞癌であり、特に好ましくは進行性の原発性肝細胞癌である。本発明の方法は、化学療法及び／又は放射線療法などの癌治療を行う前の患者に対して適用することができるほか、RAR-α作動薬以外の化学療法剤及び／又は放射線療法による一次療法に抵抗性を示し期待された効果を得ることができなかった患者に対して二次療法としてRAR-α作動薬による化学療法を行うための判定方法としても利用できる。【００２１】
本発明の方法を行うにあたり、通常は患者の悪性腫瘍から生体試料を生体外に取り出す必要があるが、一般的には生検又は手術などにより悪性腫瘍組織を採取することが可能である。血液癌を対象とする場合には採血を行うことにより試料を採集できる場合がある。
本発明におけるp160ファミリー分子群およびSP110ファミリー分子群遺伝子またはその遺伝子産物蛋白を測定する手段としては、本発明の実施例に記述したRT-PCRの他に確定診断時に採取された組織標本を用いたIn-situ hybridization（Genome Research, 13, pp.1324-1334, 2003）または免疫組織染色法（Journal of Pathology, 185, pp.25-31, 1998）などが挙げられるが、同様に測定できる手段であればこれらに限定されることはない。【００２２】
本発明の方法により有効性を判定可能なRAR-α作動薬の種類は特に限定されないが、例えば、TAC-101（4-[3,5-ビス(トリメチルシリル)ベンズアミド]安息香酸, Yamakawa T., et al., J. Med. Chem., 33, pp.1430-1437, 1990）Am80（4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)カルバモイル]安息香酸, Hashimoto, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, pp.1300-1307, 1990）、Am580（4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)カルボキサミド]安息香酸，Kagechika H，et al., J Med Chem., 31, 2182-2192, 1988）、E6060（4-[5-[7-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾ[b]フラン-2-イル]-1H-ピロロ-2-イル]安息香酸，Yamauchi T., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 312, pp938-944, 2005）、及びER-38925（4-(5-ベンゾフラン-2-イル-1H-ピロール-2-イル)安息香酸，  Yoshimura H.,  J. Med. Chem., 43, pp2929-2937, 2000）などを挙げることができる。もっとも、RAR-α作動薬はこれらに限定されることはない。本発明の方法により、好ましくはTAC-101の有効性を判定することができる。RAR-α受容体サブタイプに対する被検薬の結合親和性は、例えば、トリチウム等の放射標識を施した被検薬とリガンド結合領域を有する各種受容体サブタイプとの親和性に対する競合試験により容易に測定することができる(Pijnappel WW., et al., Nature (London), 366, pp.340-344, 1993; Apfel C., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(15), pp.7129‐7133, 1992)。例えば、TAC-101がRAR-α選択的作動薬であることは、Hashimoto Y., et al., Biol. Pharm. Bull., 19(10), pp.1322-1328, 1996又はSun SY, et al., Cancer Res., 57(21), pp.4931-4939, 1997などに記載されている。なお、上記論文中でTAC-101はAm555Sと呼称されている。【００２３】
本発明の方法によれば、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスにおいてコアクチベーターであるp160ファミリー分子群優位である場合に、RAR-α作動薬がその患者の悪性腫瘍の治療に有効であると判定することができる。従来、RAR-α作動薬が抗腫瘍作用を有することは知られていたが、RAR-αの発現量に相関した抗腫瘍作用は認められず、RAR-α作動薬が特定の患者に対して抗腫瘍剤として有効に作用するか否かを投与前に確実に予測できる方法は知られていなかった。【００２４】
本発明の方法を用いることにより、RAR-α作動薬が特定の患者に対して抗腫瘍剤として有効に作用するか否かを簡便かつ正確に判定することが可能になり、適切な抗腫瘍治療が可能になる。上記の目的のためには、試料中のp160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量をそれぞれ測定して、その比（p160ファミリー分子群/ SP110ファミリー分子群）を求めてもよいが、例えば、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量との比に相関して変動する血中マーカーを利用することによって、患者の血液を採取して該マーカーの濃度を測定し、上記の比の替わりのパラメーターとして利用することもできる。【００２５】
また、本発明によれば、悪性腫瘍の治療方法も提供される。この治療方法では、悪性腫瘍の患者から悪性腫瘍の試料を採取し、該試料中のp160ファミリー分子群の発現量及びコレプレッサーの発現量を測定し、p160ファミリー分子群の発現量とSP110ファミリー分子群の発現量のバランスにおいてp160ファミリー分子群優位である場合に、RAR-α作動薬をその患者に投与することができる。SP110ファミリー分子群優位である場合にもRAR-α作動薬を該患者に投与しても差し支えないが、著効又は有効性は期待できない場合が多い。【００２６】
例えば、本発明の方法を用いてTAC-101により肝臓癌の治療を行う場合には、肝臓癌患者に対してTAC-101を一日あたり10〜30 mg投与することが好ましく、一日あたり15〜25 mg投与することがより好ましく、一日あたり20 mg投与することが特に好ましい。さらに、上記の投与量を用いて1〜4週間の連日投与後、1〜3週間休薬する治療コースにより治療を行なうことが好ましく、2週間の連日投与後、1週間休薬する治療コースにより治療を行なうことも好ましく、あるいは上記のいずれかの治療コースを少なくとも4回繰り返すことも好ましい。なお、肝臓癌の種類は特に限定されないが、原発性肝臓癌であることが好ましく、さらに進行性の原発性肝細胞癌であることが好ましい。肝臓癌の治療として外科的肝切除、ラジオ波焼灼療法、エタノール注入療法、及びマイクロウェーブ凝固壊死療法からなる群から選ばれる療法を併用してもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
図１、図２及び図３は樹立ヒト由来肝細胞癌株におけるp160ファミリー分子群であるAIB1、SRC-1及びTIF2の発現、図４はSP110ファミリー分子群であるSP110bの発現を確認した結果を示す。各因子の発現量の確認試験は、下記の通り行った。
ヒト肝癌細胞からRNAを抽出し（RNeasyTM Mini Kit， QIAGEN社）、cDNAを作成した（2.1.5.1 Reverse Transcription System, Promega社）。p160ファミリー分子群各種及びSP110ファミリー分子群それぞれに特異的なPCR検出用プライマーを作成した（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）。【００２８】
AIB1プライマー配列：
forward: GCAGGCTGCATCCATCTATCA
reverse: TGCCATTCATGTGCACCATAC
SRC-1プライマー配列：
forward: GCAGAGAACCATCTTATGCCAGA
reverse: GCTAAGCATTGTCCCATCATTCA
TIF2プライマー配列：
forward: TGGCAAGAAGAGTTCCCATGA
reverse: TTCTTACCAGGTCCTCCCAGC
SP110bプライマー配列：
forward: GTTGGATCCATGAGCACAAATCC
reverse: GTTCTCGAGTCACCCGGGCTGAGCCC【００２９】
前述のcDNAを用いてReal-time PCRを実施した。蒸留水で25倍希釈したcDNA 25μLと0.4μM 検出用プライマー、0.2μM 検出用プローブ(Universal PCR Master Mix)をPCRプロダクト自動検出 / 定量システム（ABI PRISM7700, アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）に供し遺伝子増幅反応を行った。内部標準との相対値を以下の式に従い算出した。内部標準との相対値＝(各測定因子の検出用プローブ・プライマーによる測定値)/(TaqManTM β-actin Control Reagentsによる測定値)。【００３０】
RAR-α転写活性の確認試験は、以下の通り行った。
各肝細胞癌細胞にRAR-α結合配列を含み下流にSEAP遺伝子を組み込んだレポータープラスミド(pRARE-SEAP-TA-vector, clontech社)を導入した細胞にRAR-α作動薬を処置した後、培養上清中のSEAPアルカリフォスファターゼ活性を測定した。培養肝細胞癌細胞に培養液とFuGENE6液を100：6の比率で調製したトランスフェクション試薬と混合したRAREレポータープラスミドを導入し24時間培養した。RAR-α作動薬であるTAC-101を含有した培養液に置換し、さらに24時間培養後、培養上清を回収し、アルカリフォスファターゼ活性測定試薬（SEAP検出キット，clontech社）を用い、転写活性を確認した。RAR-αの転写活性については、薬剤無処理の状態の転写活性を100とした場合の、薬剤処理を施したものの転写活性を相対値(T/C)として求め、T/C値が200以上のレスポンスが見られる癌株をRAR-α転写活性が有意に高いとした。【００３１】
表１、表２及び表３には各種のヒト由来肝細胞癌株におけるp160ファミリー分子群／SP110ファミリー分子群の発現量の比とRAR-αの転写活性との関係を示す。これより、p160ファミリー分子群／SP110ファミリー分子群の比が高い、即ちp160ファミリー分子群優位であるほどRAR-α転写活性が強いことを示している。【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
また、これらコファクターバランスと治療効果について検討した結果、p160ファミリー分子群優位であるHCC-CおよびHCC-E細胞ではRAR-α作動薬であるTAC-101により誘導されるRAR転写活性が強く、一方、SP110b優位であるHCC-D細胞ではRAR転写活性が弱かった。
次に、これらの細胞株はヌードマウスの肝臓に移植することで、肝同所再建モデルを実施することが可能であったため、RAR-α作動薬への感受性に関する治療実験を検討した。培養した肝癌細胞1×106個をヌードマウス肝外側左葉（BALB/cA Jcl-nu, 日本クレア株式会社）に移植し、RAR-α作動薬であるTAC-101を0.5%ハイドロキシプロピルメチルセルロース懸濁液（信越化学）として連日経口投与し、3週間後に肝に形成された腫瘍の重量を測定し、平均値の抑制率を求めた。これらの肝癌モデルにおける結果を表４に示す。HCC-C及びHCC-Eモデルでそれぞれ81%、 67%の腫瘍増殖抑制効果が確認された。またこれらの抗腫瘍効果は両側スチューデントT検定において統計的に有意な抑制作用であることも確認された。一方、HCC-Dモデルでは抑制率-3%であり、治療効果は認められなかった。【００３６】
さらに延命評価の可能な癌細胞株を用いて、コファクターバランスと延命効果の関係について検討した。AIB1/SP110b比が0.08であり、SP110b優位である大腸癌株CAC細胞と前述のHCC-E細胞は、ヌードマウス脾臓に接種すると容易に肝内播種を起こし、肝内転移病態を形成する。CAC又はHCC-E細胞1×106個を移植しTAC-101を4週間連日経口投与した後、それぞれのモデル動物の生存期間を観察した。延命効果の結果を表５に示す。SP110b優位であるCACモデルでは26%の生存期間延長にとどまったが、p160ファミリー分子群優位であるHCC-Eモデルでは、81%と2倍近い生存期間の延長作用が確認された。またこのHCC-Eモデルにおける効果は統計的にも有意な結果（P<0.001）であった。これらの結果は前述のp160ファミリー分子群／SP110ファミリー分子群発現比においてp160ファミリー分子群優位である癌種に対してRAR-α作動薬が有効であることを明確に示している。【００３７】
【表４】
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【００３８】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法により、肝臓癌などの悪性腫瘍に対するRAR-α作動薬の治療効果を簡便かつ正確に予測することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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