(57)【要約】  本発明は、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、並びにＴＬＲ４からのシグナルをレポーター遺伝子の発現を指標として検出し得る、（１）野生型ＴＬＲ４を発現する細胞および（２）変異型ＴＬＲ４を発現する細胞を含んでなる、該方法のためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
当該結合部位が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号６５２〜８３９で示される領域内に存在する１以上のシステイン残基である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
当該結合部位が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基である、請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
以下の（１）〜（４）の工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
（１）ＴＬＲ４またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル１）と、ＴＬＲ４の細胞内領域の１以上のシステイン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル２）とをそれぞれ調製する。
（２）試験化合物の存在下でサンプル１およびサンプル２をそれぞれ培養する。
（３）培養後、サンプル１およびサンプル２における当該遺伝子の発現を測定する。
（４）サンプル１における当該遺伝子の発現量が、サンプル２におけるそれに比べて約２０％以上減少した場合に、当該試験化合物を、ＴＬＲ４の細胞内領域内で該分子と結合して、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質として選択する。
【請求項５】
当該システイン残基が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基である、請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
当該遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の（１）〜（２）の構成を含むことを特徴とする、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択するためのスクリーニングキット：
（１）ＴＬＲ４またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、
（２）ＴＬＲ４の細胞内領域の１以上のシステイン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞。
【請求項８】
ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質が、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬である請求項７記載のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスまたはセプティックショックの予防・治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、（ｉ）式：【０００３】
【化１】
2007114296.tif 000002
【０００４】
［式中、Ｒは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式：−ＯＲ1（式中、Ｒ1は水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基または式：【０００５】
【化２】
2007114296.tif 000003
【０００６】
（式中、Ｒ1bは水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を、Ｒ1cはＲ1bと同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基を示し、
Ｒ0は水素原子または脂肪族炭化水素基を示すか、あるいはＲ1とＲ0は一緒になって結合手を形成し、
環Ａは（１）置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、（２）置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、（３）式：−ＯＲ11（式中、Ｒ11は水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基および（４）ハロゲン原子から選ばれる１〜４個で置換されたシクロアルケンを示し、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を示し、
式：【０００７】
【化３】
2007114296.tif 000004
【０００８】
で表される基は、式：【０００９】
【化４】
2007114296.tif 000005
【００１０】
で表される基を示し、ｎは１〜４の整数を示す。］で表される化合物、および
（ii）式：【００１１】
【化５】
2007114296.tif 000006
【００１２】
［式中、Ｒaは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式：−ＯＲ1a（式中、Ｒ1aは水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基または式：【００１３】
【化６】
2007114296.tif 000007
【００１４】
（式中、Ｒ4aおよびＲ5aは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基を示し、
Ｒ0aは水素原子または脂肪族炭化水素基を示すか、あるいはＲaとＲ0aは一緒になって結合手を形成し、
Ａｒaは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を示し、
式：【００１５】
【化７】
2007114296.tif 000008
【００１６】
で表される基は、式：【００１７】
【化８】
2007114296.tif 000009
【００１８】
で表される基を示し、
ｎは１〜４の整数を示す。］で表される化合物、これらの化合物の塩並びにこれらのプロドラッグが、
また、特許文献２には、式：【００１９】
【化９】
2007114296.tif 000010
【００２０】
［式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式：−ＯＲ1a（式中、Ｒ1aは水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基または式：【００２１】
【化１０】
2007114296.tif 000011
【００２２】
（式中、Ｒ1bおよびＲ1cは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基を示し、
Ｘはメチレン基、ＮＨ、硫黄原子または酸素原子を示し、
Ｙは置換基を有していてもよいメチレン基または置換基を有していてもよいＮＨを示し、環Ａは（１）置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、（２）置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、（３）式：−ＯＲ2（式中、Ｒ2は水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基および（４）ハロゲン原子からなる群より選ばれる１乃至４個の置換基を有していてもよい５ないし８員環を示し、
Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を示し、
式：【００２３】
【化１１】
2007114296.tif 000012
【００２４】
で表される基は式：【００２５】
【化１２】
2007114296.tif 000013
【００２６】
で表される基を示し、
ｍは０乃至２の整数を示し、
ｎは１乃至３の整数を示し、
ｍとｎの和は４以下である；
ただし、Ｘがメチレン基の場合、Ｙは置換基を有していてもよいメチレン基を示す。］で表される化合物またはその塩あるいはそのプロドラッグが、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用およびＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生抑制作用を有しており、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、セプティックショックなどの疾患の予防・治療剤として有用であることが、それぞれ記載されている。
特許文献３には、上記の化合物がＴＬＲシグナル阻害剤、重症セプシスの予防・治療剤として有用であることが記載されている。
【特許文献１】国際出願公開第９９／４６２４２号パンフレット
【特許文献２】国際出願公開第０１／１０８２６号パンフレット
【特許文献３】国際出願公開第０３／８４５２７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスまたはセプティックショックの予防・治療薬をスクリーニングするために有用な方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記疾患の予防・治療薬をスクリーニングするために有用なキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＴＬＲ４のシグナル伝達阻害作用を有し、セプシス等の治療薬として有用なシクロアルケン化合物が予想外にもＴＬＲ４の細胞内領域に結合することを見出した。本発明者らは、この知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００２９】
すなわち、本発明は、
［１］ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、
［２］当該結合部位が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号６５２〜８３９で示される領域内に存在する１以上のシステイン残基である、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［３］当該結合部位が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基である、上記［２］記載のスクリーニング方法、
［４］以下の（１）〜（４）の工程を含む上記［１］記載のスクリーニング方法、
（１）ＴＬＲ４またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル１）と、ＴＬＲ４の細胞内領域の１以上のシステイン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル２）とをそれぞれ調製する。
（２）試験化合物の存在下でサンプル１およびサンプル２をそれぞれ培養する。
（３）培養後、サンプル１およびサンプル２における当該遺伝子の発現を測定する。
（４）サンプル１における当該遺伝子の発現量が、サンプル２におけるそれに比べて約２０％以上減少した場合に、当該試験化合物を、ＴＬＲ４の細胞内領域内で該分子と結合して、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質として選択する。
［５］当該システイン残基が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基である、上記［４］記載のスクリーニング方法、
［６］  当該遺伝子がレポーター遺伝子である、上記［４］記載のスクリーニング方法、
［７］以下の（１）〜（２）の構成を含むことを特徴とする、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択するためのスクリーニングキット：
（１）ＴＬＲ４またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、
（２）ＴＬＲ４の細胞内領域の１以上のシステイン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、および
［８］ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質が、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬である上記［７］記載のスクリーニングキットに関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のスクリーニング法は、試験化合物のＴＬＲ４の細胞内領域への結合と、該結合による該受容体からのシグナル伝達阻害を検定することにより、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスまたはセプティックショックの予防・治療活性を有する物質を効率よく選択し得るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＴＩＲＡＰ、ＴＬＲ２のＴＩＲドメイン、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインとＧＳＴとの融合蛋白質と３Ｈラベルした化合物Ａとの反応物をゲル電気泳動したもののＣＢＢ染色像（Ａ）およびオートラジオグラフ（Ｂ）を示す図である。レーン１：ＧＳＴ；レーン２：ＧＳＴ−ＴＩＲＡＰ融合蛋白質；レーン３：ＧＳＴ−ＴＬＲ２細胞内ＴＩＲドメイン融合蛋白質；レーン４：ＧＳＴ−ＴＬＲ４細胞内ＴＩＲドメイン融合蛋白質
【図２】野生型ＴＬＲ４および各種変異ＴＬＲ４への３Ｈラベルした化合物Ａの結合能を示す図である。上段パネルはＴＬＲ蛋白質発現量を示すイムノブロット像、下段パネルは化合物Ａの結合を示すオートラジオグラフを示す。ＷＴ：野生型ＴＬＲ４；１ＣＡ：ＴＬＲ４Ｃ６６６Ａ（第６６６番目のＣがＡに置換されていることを示す。以下同様）；２ＣＡ：ＴＬＲＣ７０６Ａ；３ＣＡ：ＴＬＲ４Ｃ７４７Ａ；４ＣＡ：ＴＬＲＣ８３１Ａ；ＰＨ：ＴＬＲＰ７１４Ｈ；１ＫＲ：ＴＬＲＫ６５３Ｒ；２ＫＲ：ＴＬＲＫ６６６Ｒ；３ＫＲ：ＴＬＲＫ６９４Ｒ；４ＫＲ：ＴＬＲＫ７２９Ｒ；５ＫＲ：ＴＬＲＫ７３２Ｒ；６ＫＲ：ＴＬＲＫ７７３Ｒ；７ＫＲ：ＴＬＲＫ７７６Ｒ；８ＫＲ：ＴＬＲＫ８１３Ｒ；９ＫＲ：ＴＬＲＫ８１９Ｒ
【図３】野生型ＴＬＲ４および各種変異ＴＬＲ４を発現する細胞を、化合物Ａ(図３−１)、化合物Ｂ (図３−２)、化合物Ｃ (図３−３)、化合物Ｄ (図３−４) の存在下および非存在下でＬＰＳ刺激を与えて培養した場合の、ＮＦ−κＢの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子の発現量を示す図である。ＷＴ：野生型ＴＬＲ４；１ＣＡ：ＴＬＲ４Ｃ６６６Ａ；２ＣＡ：ＴＬＲＣ７０６Ａ；３ＣＡ：ＴＬＲ４Ｃ７４７Ａ；４ＣＡ：ＴＬＲＣ８３１Ａ；ＰＨ：ＴＬＲＰ７１４Ｈ；１ＫＲ：ＴＬＲＫ６５３Ｒ；２ＫＲ：ＴＬＲＫ６６６Ｒ；３ＫＲ：ＴＬＲＫ６９４Ｒ；４ＫＲ：ＴＬＲＫ７２９Ｒ；５ＫＲ：ＴＬＲＫ７３２Ｒ；６ＫＲ：ＴＬＲＫ７７３Ｒ；７ＫＲ：ＴＬＲＫ７７６Ｒ；８ＫＲ：ＴＬＲＫ８１３Ｒ；９ＫＲ：ＴＬＲＫ８１９Ｒ；ＥＶ：ベクターのみ
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、ＴＬＲ４のシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする。
ＴＬＲ４は１回膜貫通型受容体であり、Ｎ末端側から細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を有する。「ＴＬＲ４の細胞内領域」とは、例えば、配列番号：２で表わされるヒトＴＬＲ４の場合、アミノ酸番号６５２〜８３９で示されるアミノ酸配列からなる領域を意味する。
「ＴＬＲ４のシグナル伝達の阻害」としては、結果的にＮＦ−κＢ依存性の炎症性サイトカイン誘導やＩＲＦ３依存性のインターフェロンおよびインターフェロン誘導性遺伝子の発現誘導に至らない限り、ＴＬＲ４からのシグナル伝達のいかなる過程を阻害してもよい。【００３３】
本発明のスクリーニング方法により選択されるＴＬＲ４からのシグナル伝達阻害物質は、ＴＬＲ４の細胞内領域のいかなる部位に結合してもよく、細胞内領域の１つの部位に結合してもよいし、複数の部位に結合してもよい。好ましくは、該シグナル阻害物質は、ＴＬＲ４の細胞内領域内の１個以上のシステイン残基（例えば、配列番号：２で表されるヒトＴＬＲ４の場合、該アミノ酸配列の第６６４番目、第７０６番目、第７４７番目および第８３１番目のシステイン残基）、より好ましくは、細胞質内におけるシグナル経路を活性化するToll-IL-1 receptor（ＴＩＲ）ドメイン（ヒトＴＬＲ４の場合、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号６７４〜８３９で示される領域）内に存在する１個以上のシステイン残基、さらに好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基に結合する。【００３４】
ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択する、本発明のスクリーニング方法は、ＴＬＲ４の細胞内領域の全部もしくは一部を含むポリペプチドを用いることを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記ポリペプチドは、目的とするシグナル伝達阻害物質が標的とする結合部位を最低限含んでいればよく、該結合部位はＴＬＲ４の細胞内領域内で任意に設定することができるが、好ましくは上記したシステイン残基である。したがって、より好ましくは、本発明のスクリーニング方法に用いられるポリペプチドは、少なくとも配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基を含む、該アミノ酸配列の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドである。該ポリペプチドの長さは、目的とするシグナル伝達阻害物質が標的とする結合部位に結合し得るに十分な隣接アミノ酸配列を含む限り特に制限はなく、例えば、１０アミノ酸以上、好ましくは５０アミノ酸以上、より好ましくは１００アミノ酸以上、さらに好ましくは２００アミノ酸以上である。該ポリペプチド長の上限も特に制限はないが、例えばＴＬＲ４の全長（ヒトＴＬＲ４の場合、８３９アミノ酸（シグナルペプチドを含む））等が挙げられる。【００３５】
例えば、該ポリペプチドの長さを短くすれば、シグナル伝達阻害物質の結合部位の特定が容易となる反面、該ポリペプチドはシグナル伝達作用を喪失している場合が多いので、該ポリペプチドに結合した試験化合物について、シグナル伝達阻害作用の有無を別途試験する必要がある。したがって、試験化合物の標的部位への結合とシグナル伝達阻害作用とを同時に検定するには、本発明で用いられるポリペプチドは、ＴＬＲ４がシグナル伝達作用を発揮するのに必要な領域を少なくとも含んでいる必要があり、例えば、上記ＴＩＲドメインを含むポリペプチド、細胞内領域全体を含むポリペプチド、さらに膜貫通領域を含むポリペプチド、あるいはＴＬＲ４全長などであることが望ましい。この場合、試験化合物が所望の標的部位に結合するか否かは、後述するように、該標的部位のアミノ酸を欠失させるか、他のアミノ酸で置換したポリペプチドを作製し、該ポリペプチドへの試験化合物の結合能の有無を調べることにより検定することができる。
一方、該ポリペプチドと試験化合物との結合の検出を容易にする目的で、該ポリペプチドはＮ末端もしくはＣ末端にタグを有する融合ポリペプチドとして提供されてもよい。そのようなタグの例としては、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ、Flagタグ、などが挙げられる。このようなタグ配列を含むポリペプチドは、それぞれグルタチオン、金属キレート、マルトース、抗Flag抗体担体を用いてプルダウンすることができ、試験化合物をＲＩ（例えば３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ等）などでラベルしておけば、該担体上のラベルを測定することにより容易に試験化合物の該ポリペプチドへの結合を検出することができる。【００３６】
本発明におけるＴＬＲ４蛋白質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
ＴＬＲ４蛋白質は、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋、腹膜など］に由来する蛋白質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。【００３７】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。【００３８】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。【００３９】
より好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００４０】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」とは、前記の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をいう。
「実質的に同質の活性」とは、(1) シグナル伝達活性（即ち、ＬＰＳ刺激によりＮＦ−κＢおよび／またはＩＲＦ３の活性化をし、炎症性サイトカインおよび／またはインターフェロンおよびインターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導する活性）、並びに(2) ＴＬＲ４の細胞内領域に結合して上記シグナル伝達を阻害する化合物との結合活性をいう。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同様であることを示す。従って、シグナル伝達活性およびシグナル伝達阻害物質との結合活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい（例えば、活性については、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍の範囲内が挙げられる）。
ＴＬＲ４のシグナル伝達活性は、公知の方法、例えば、ＴＬＲ４発現細胞における炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ等）やインターフェロン（ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α）もしくはインターフェロン誘導性遺伝子（例えば、ＩＰ−１０、ＧＡＲＧ１６、ＩＲＧ−１等）の発現変動を測定したり、転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３、ＡＰ−１、C/EBP）の活性化を、それらの転写因子に特異的なシスエレメントを含むプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標として測定することができるが、それらに限定されない。一方、シグナル伝達阻害物質との結合活性は、例えば、上述のプルダウンアッセイや表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光エネルギー転移等を用いて測定することができる。あるいは後述するように、所望の標的部位のアミノ酸を欠失させるか、他のアミノ酸で置換した変異ポリペプチドを別に作製し、野生型ポリペプチドと変異ポリペプチドのそれぞれについて試験化合物の存在下で上記のようにしてシグナル伝達活性を測定することにより、試験化合物の結合活性とシグナル伝達阻害とを一括して検定することもできる。【００４１】
また、本発明で用いられるＴＬＲ４には、例えば、(1) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質も含まれる。
但し、１または２個以上のアミノ酸を欠失する場合、該欠失部位は所望のシグナル伝達阻害物質の結合部位以外の部位であり、好ましくは細胞内領域のシステイン残基およびその近傍以外の部位である。また、１または２個以上のアミノ酸が挿入されるか、他のアミノ酸で置換される場合、所望のシグナル伝達阻害物質の結合部位以外の部位（好ましくは細胞内領域のシステイン残基およびその近傍以外の部位）であるか、あるいは当該部位であっても、その挿入もしくは置換の結果、当該部位の活性（即ち、当該部位に結合するＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と結合する活性）に質的な影響を与えないものである必要がある。【００４２】
本明細書に記載される蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のスクリーニング方法に用いられるＴＬＲ４は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＴＬＲ４がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＴＬＲ４に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【００４３】
さらに、ＴＬＲ４には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。【００４４】
本発明で用いられるＴＬＲ４の部分ペプチドは、上記したＴＬＲ４の部分アミノ酸配列（即ち、細胞内領域の一部もしくは全部の配列）を有し、且つＴＬＲ４と実質的に同質の活性を有するペプチドである。ここで「実質的に同質の活性」とはＴＬＲ４の細胞内領域に結合して上記シグナル伝達を阻害する化合物との結合活性をいう。好ましくは、該部分ペプチドは、シグナル伝達活性（即ち、ＬＰＳ刺激によりＮＦ−κＢおよび／またはＩＲＦ３の活性化をし、炎症性サイトカインおよび／またはインターフェロンおよびインターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導する活性）をさらに保持するものである。「実質的に同質の活性」の測定はＴＬＲ４において上記したと同様の方法で行うことができる。
本明細書においては、ＴＬＲ４蛋白質および当該部分ペプチドを、以下「阻害物質結合型ポリペプチド」と称することもある。【００４５】
ＴＬＲ４の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、ＴＬＲ４について前記したと同様のものが挙げられる。これらのペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【００４６】
さらに、ＴＬＲ４の部分ペプチドには、上記したＴＬＲ４と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。【００４７】
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドは遊離体であってもよいし、塩であってもよい。ＴＬＲ４またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００４８】
一方、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドにおいて、所望のシグナル伝達阻害物質の結合部位（好ましくは細胞内領域のシステイン残基、例えば、配列番号：２で表されるヒトＴＬＲ４においては、該アミノ酸配列の第６６４番目、第７０６番目、第７４７番目および第８３１番目のシステイン残基の１以上、より好ましくは第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基）が欠失するか、あるいは他のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはアラニンが挙げられる）で置換されたポリペプチドは、目的とするシグナル伝達阻害物質に対する結合活性がないので、該標的結合部位に特異的に結合してシグナル伝達を阻害する化合物と接触させてもこれと結合しない。また、当該変異部分ペプチドがシグナル伝達活性をさらに保持するものである場合、該標的結合部位に特異的に結合してシグナル伝達を阻害する化合物と接触させてもシグナル伝達は阻害されない。
本明細書においては、当該変異ＴＬＲおよび変異部分ペプチドを、以下「阻害物質非結合型ポリペプチド」と称することもある。【００４９】
ＴＬＲ４またはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、ＴＬＲ４またはその塩を製造することができる。【００５０】
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＴＬＲ４を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
(4) 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【００５１】
このようにして得られたＴＬＲ４またはその部分ペプチドは、公知の精製法により単離・精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。【００５２】
上記方法で得られるＴＬＲ４またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にＴＬＲ４またはその部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。【００５３】
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドの合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質もしくはペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質（ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（ペプチド）またはそのアミド体を取得する。【００５４】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。【００５５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。【００５６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および用いられる保護基、その保護基の脱離、並びに反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。【００５７】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。【００５８】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。【００５９】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。【００６０】
蛋白質（ペプチド）のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、蛋白質（ペプチド）を構成する部分ペプチドの各Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護し、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長（隣接する部分ペプチドのＣ末端アミノ酸と連結されるべきアミノ酸）まで延ばした後、Ｃ末端側ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドと、Ｎ末端側ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によって保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（ペプチド）のアミド体を得ることができる。【００６１】
蛋白質（ペプチド）のエステル体は、例えば、Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、上記のアミド体の場合と同様に処理して得ることができる。【００６２】
ＴＬＲ４の部分ペプチドまたはその塩は、ＴＬＲ４またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。【００６３】
さらに、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＴＬＲ４またはその部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。【００６４】
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などや血球系の細胞］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋、腹膜など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。【００６５】
ＴＬＲ４をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（即ち、シグナル伝達活性および標的結合部位でのＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質との結合活性など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。【００６６】
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。【００６７】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【００６８】
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００６９】
ＴＬＲ４をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１で表される塩基配列を含有するヒトＴＬＲ４ＤＮＡもしくはそのアレル変異体、または他の温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ortholog）等である。【００７０】
阻害物質結合型ポリペプチド（部分ペプチド）をコードするＤＮＡは、ＴＬＲ４の細胞内領域の全部もしくは一部［目的とするＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質の標的結合部位（好ましくは細胞内領域のシステイン残基、例えば、配列番号：２で表されるヒトＴＬＲ４においては、該アミノ酸配列の第６６４番目、第７０６番目、第７４７番目および第８３１番目のシステイン残基の１個以上、より好ましくは第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基）を少なくとも含む］をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。【００７１】
また、阻害物質非結合型ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＴＬＲ４もしくはその部分ペプチドをコードする塩基配列において、目的とするＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質の標的結合部位（好ましくは細胞内領域のシステイン残基、例えば、配列番号：２で表されるヒトＴＬＲ４においては、該アミノ酸配列の第６６４番目、第７０６番目、第７４７番目および第８３１番目のシステイン残基の１以上、より好ましくは第７０６番目および／または第７４７番目のシステイン残基）をコードするコドンが欠失するか、あるいは他のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはアラニンが挙げられる）をコードするコドンで置換された塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。【００７２】
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００７３】
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。従って、阻害物質非結合型ポリペプチドをコードするＤＮＡは、阻害物質結合型ポリペプチドをコードするＤＮＡに、上記方法に従って変異を導入することにより得ることができる。【００７４】
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。【００７５】
上記のＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、ＴＬＲ４をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【００７６】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。【００７７】
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【００７８】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。【００７９】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加するか、あるいはネイティブなシグナル配列（もしくはプレプロ配列）と置換してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。【００８０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら, イン・ヴィボ（In Vivo）, 13, 213-217 (1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら, ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２ (１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが用いられる。【００８１】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０ (１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１ (１９７９)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５ (１９８８)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６ (１９７３)に記載の方法に従って形質転換することができる。【００８２】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５ (１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。【００８３】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）, １９５巻, ７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。【００８４】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１ (１９５２)〕、ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６ (１９５９)〕、ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association），１９９巻，５１９ (１９６７)〕、１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１ (１９５０)〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。【００８５】
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にＴＬＲ４またはその部分ペプチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。【００８６】
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるＴＬＲ４またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。【００８７】
かくして得られるＴＬＲ４またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。【００８８】
なお、形質転換体が産生するＴＬＲ４またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。【００８９】
かくして得られるＴＬＲ４またはその部分ペプチドの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。【００９０】
さらに、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、ＴＬＲ４またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M. et al., Transcription and Tranlation, 179-209, Hames B.D. & Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE. coli S30 extract system (Promega社製)やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM (TOYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957)あるいはErickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができる。【００９１】
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt J.M. et al. (1984) 前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Spirin A.S. et al., Science, 242, 1162-1164 (1988)）、透析法（木川等、第21回日本分子生物学会、WID6）、あるいは重層法（PROTEIOSTM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書：TOYOBO社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開2000-333673）等を用いることができる。【００９２】
本発明のスクリーニング方法は、上記のいずれかの方法によって得られる阻害物質結合型ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドのＴＬＲ４細胞内領域への試験化合物の結合、および該ポリペプチドがシグナル伝達活性を保持する場合には、試験化合物存在下でのシグナル伝達活性を測定することを特徴とする。
具体的には、例えば、ＴＬＲ４細胞内領域への試験化合物の結合は、阻害物質結合型ポリペプチドを固相化（例えば、マイクロプレートなど）して、標識した試験化合物を含む溶液を該固相に添加して一定時間インキュベートした後、溶液を除去し、固相に吸着した標識量を測定することにより行うことができる。あるいは、阻害物質結合型ポリペプチドが適当なタグ（例えば、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ）を有する融合ポリペプチドである場合には、該ポリペプチドと標識した試験化合物とを溶液中で反応させた後、該タグ配列と特異的に結合する物質を含む担体（例えば、グルタチオン、金属キレート、マルトース等を固相化したビーズなど）を用いて該ポリペプチドをプルダウンし、固相に吸着した標識量を測定することによっても試験化合物のＴＬＲ４細胞内領域への結合を検定することができる。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。【００９３】
あるいは、阻害物質結合型ポリペプチドと試験化合物との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて、市販のセンサーチップ（例えば、Biacore製）の表面上に、常法に従って阻害物質結合型ポリペプチドを固定化し、これに試験化合物を接触させた後、該センサーチップに特定の波長の光を特定の角度から照射し、共鳴角度の変化を指標にして、固定化した阻害物質結合型ポリペプチドへの試験化合物の結合の有無を判定することができる。あるいはまた、質量分析計に適合可能なプロテインチップの表面上に阻害物質結合型ポリペプチドを固定化し、これに試験化合物を接触させた後、MALDI-MS、ESI-MS、FAB-MSなどのイオン化法と質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法により、試験化合物に相当するピークの出現を検出することによっても、阻害物質結合型ポリペプチドと試験化合物との結合を測定することができるが、これらの方法に限定されず、いかなる公知の他の方法も利用可能である。【００９４】
試験化合物が、阻害物質結合型ポリペプチドにおけるＴＬＲ４細胞内領域内の標的結合部位に結合することの確認は、阻害物質結合型ポリペプチドの代わりに阻害物質非結合型ポリペプチドを用いて、上記と同様にして試験化合物の結合活性を測定することにより行うことができる。
その結果、阻害物質結合型ポリペプチドに結合するが、阻害物質非結合型ポリペプチドには結合しない物質を、ＴＬＲ４細胞内領域内の標的結合部位に結合する化合物として選択することができる。【００９５】
試験化合物のＴＬＲ４シグナル伝達阻害活性の測定は、試験化合物の存在下および非存在下における、ＴＬＲ４を発現する細胞のＴＬＲ４シグナル伝達を調べることにより行うことができる。具体的には、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの発現や、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βもしくはインターフェロン誘導性遺伝子の発現変動を、ノーザンブロットやＲＴ−ＰＣＲなどのＲＮＡレベルで測定するか、あるいは各遺伝子産物の抗体を用いて蛋白質レベルで測定するかにより調べることができる。ＴＬＲ４を発現する細胞としては、内在のＴＬＲ４を発現している哺乳動物細胞、もしくはＴＬＲ４もしくはその部分ペプチドの製造において上記した、ＴＬＲ４もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞（一過的発現を含む）、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞が挙げられる。
例えば、試験化合物の存在下で上記遺伝子の発現量が２０％以上減少した場合に、当該試験化合物を、ＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質として選択することができる。【００９６】
ＴＬＲ４シグナルによる炎症性サイトカインの発現誘導は、ＮＦ−κＢの活性化を介して該転写因子に特異的なシスエレメントをプロモーター領域に有する炎症性サイトカイン遺伝子の転写が活性化されることにより起こる。また、ＴＬＲ４シグナルによるＩＦＮ−βやインターフェロン誘導性遺伝子の発現誘導は、ＩＲＦ３の活性化を介して該転写因子に特異的なシスエレメントをプロモーター領域に有するＩＦＮ−βやインターフェロン誘導性遺伝子の転写が活性化されることにより起こる。したがって、より好ましい実施態様においては、試験化合物のＴＬＲ４シグナル伝達阻害活性の測定は、阻害物質結合型ポリペプチドを発現し、且つＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子、好ましくはレポーター遺伝子を含む細胞を、試験化合物の存在下および非存在下で一定時間培養した後、当該遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。【００９７】
阻害物質結合型ポリペプチドを発現する細胞としては、上記したと同様のものが挙げられる。ＴＬＲ４シグナルはＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳによって活性化されるので、使用される阻害物質結合型ポリペプチドは、ＬＰＳ刺激に応答し得るように、ＴＬＲ４の細胞外領域内のＬＰＳ結合領域を含んでいることが好ましい。また、該ポリペプチドが正しく膜に結合し得るように、該ポリペプチドは膜貫通領域と、細胞に適合したシグナルペプチドを含んでいることが望ましい。ＮＦ−κＢ結合配列としては、GGGRNNYYCC（配列番号：３）が、ＩＲＦ３結合配列としてはGAAASSGAAANY（配列番号：４）がそれぞれ挙げられるが、該転写因子の発現制御を受けることが知られている遺伝子のプロモーター領域における、それらの結合する配列であれば、上記コンセンサス配列以外のものであってもよい。使用するプロモーターとしては、用いる宿主細胞内で機能的なものであれば特に制限はなく、宿主細胞に応じて上記したいずれかのプロモーターがそれぞれ例示される。宿主細胞として動物細胞を用いる場合は、使用するプロモーターは、使用するＮＦ−κＢ結合配列もしくはＩＲＦ３結合配列の由来するプロモーターであってよい。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子などが挙げられるが、それらに限定されない。ＮＦ−κＢもしくはＩＲＦ３結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子は、宿主細胞に応じて上記したベクターのいずれかに挿入し、上記した適当な遺伝子導入法を用いて宿主細胞に導入することができる。【００９８】
上記細胞の培養は、宿主細胞に応じて、上記した各種培地もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの中で、上記と同様の方法で行うことができる。培地もしくは緩衝液中には、試験化合物の他、阻害結合型ポリペプチドがリガンド結合領域を含む場合には、ＬＰＳを添加してＴＬＲ４シグナルのベースライン（試験化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量）を高くすることができる。培養終了後、レポーター遺伝子の発現量を測定する。当該測定方法は、各レポーター遺伝子について自体公知の方法がそれぞれ使用され得る。
例えば、試験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現量が２０％以上減少した場合に、当該試験化合物を、ＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質として選択することができる。【００９９】
本発明のスクリーニング方法の特に好ましい態様においては、阻害物質結合型ポリペプチドを発現する細胞（サンプル１）と、目的とするＴＬＲ４シグナル阻害物質の結合部位を変異させた阻害物質非結合型ポリペプチドを発現する細胞（サンプル２）とをそれぞれ用いて、上記レポーターアッセイを実施することにより、試験化合物の標的結合部位への結合の有無と、試験化合物のＴＬＲ４シグナル伝達阻害活性とを一括して測定することができる。即ち、サンプル２では、標的部位に結合するＴＬＲ４シグナル阻害物質は阻害物質非結合型ポリペプチドに結合しないので、ＴＬＲ４シグナルを阻害せず、レポーター遺伝子の発現量の減少はみられない。したがって、当該方法によれば、試験化合物非存在下で細胞を培養し、レポーター遺伝子の発現量を測定する必要がない。
例えば、サンプル１におけるレポーター遺伝子の発現量がサンプル２における発現量に比べて２０％以上減少した場合に、試験化合物を、ＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質として選択することができる。【０１００】
従って、本発明はまた、上記の阻害物質結合型ポリペプチドを発現する細胞と、目的とするＴＬＲ４シグナル阻害物質の結合部位を変異させた阻害物質非結合型ポリペプチドを発現する細胞とを構成として含む、ＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質のスクリーニング用キットを提供する。当該キットは、細胞の培養のための培地や容器、レポーター遺伝子の発現の検出用試薬等をさらに構成として含んでもよい。【０１０１】
本発明のスクリーニングで得られる、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、ＴＬＲ４のシグナル伝達を阻害する物質（以下、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と略記する）は、例えば、哺乳動物(例、ラット、マウス、モルモット、サル、ウシ、イヌ、ブタ、ヒト等)に対する一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生抑制剤、ＴＬＲシグナル阻害剤（特に、ＴＬＲ４シグナル阻害剤）などとして有用である。
また、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、例えば、哺乳動物(例、ラット、マウス、モルモット、サル、ウシ、イヌ、ブタ、ヒト等)に対する重症セプシスを含むセプシス、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプティックショック、免疫機能低下症などの疾患、例えば、敗血症、エンドトキシンショック、エキソトキシンショック、全身性炎症反応症候群（SIRS）、代償性抗炎症反応症候群（CARS）、熱傷、外傷、手術後合併症、心不全、ショック、低血圧、リウマチ関節炎、骨関節炎、胃炎、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害および拒絶反応、虚血再潅流障害、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓（播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）など）、虚血性脳障害、動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、膵炎、ネフローゼ症候群、腎炎、腎不全、インシュリン依存性糖尿病、インシュリン非依存性糖尿病、肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、腫瘍、骨髄腫、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、痴呆、アルツハイマー病、多発性硬化症、ビタミンＥ欠乏性、老化、サンバーン、筋ジストロフィー、心筋炎、心筋症、心筋梗塞、心筋梗塞後遺症、骨粗鬆症、肺炎、肝炎、乾癬、疼痛、白内障、インフルエンザ感染症、マラリア、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、放射線障害、火傷、体外受精効率化、高カルシウム血症、硬直性脊椎炎、骨減少症、骨ペーチェット病、骨軟化症、骨折、急性バクテリア髄膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染症、侵襲性ブドウ状球菌感染症、結核、全身性真菌感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、水痘−帯状疱疹ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、急性ウイルス脳炎、脳炎、髄膜炎、感染症に伴う免疫機能低下、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、逆流性食道炎、発熱、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、痛風、胃アトニー、痔疾、全身性エリテマトーデス、脊髄損傷、不眠症、統合失調症、癲癇、肝硬変、肝不全、不安定狭心症、心弁膜症、透析による血小板減少症または低血圧症、急性虚血性脳卒中、急性期脳血栓症、癌転移、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、ホジキン病、非ホジキン性リンパ腫、抗癌剤や免疫抑制剤投与による副作用などの予防・治療剤としても有用である。
さらに、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、例えば、哺乳動物(例、ラット、マウス、モルモット、サル、ウシ、イヌ、ブタ、ヒト等)に対する臓器障害等の予防・治療剤としても有用である。ここでいう臓器とは、中枢神経系、循環器系、呼吸器系、骨・関節系、消化器系または腎・尿路系の各種臓器をいう。より具体的には、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、ＴＬＲシグナルの変化に起因する、
（１）中枢神経系疾患〔(i)神経変性疾患（例、老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー等）、(ii)脳循環器障害（例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳循環不全等）時、頭部外傷・脊髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経障害、(iii)記憶障害（例、老年期痴呆、健忘症等）など〕、特にアルツハイマー病、
（２）循環器系疾患〔(i)急性心筋梗塞，不安定狭心症等の急性冠動脈症候群、(ii)末梢動脈閉塞症、(iii)冠動脈インターベンション（経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、アテレクトミー（DCA）、ステント留置等）後の再狭搾、(iv)冠動脈バイパス手術後の再狭窄、(v)その他の末梢動脈におけるインターベンション（血管形成術、アテレクトミー、ステント留置等）及びバイパス手術後の再狭窄、(vi)心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、(vii)間歇性跛行、(viii)脳卒中（脳梗塞、脳塞栓、脳出血など）、(ix)ラクネ梗塞、(x)脳血管性痴呆、(xi)動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症など）およびこれらに起因する疾患（例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患および脳梗塞・脳卒中等の脳血管障害など）、（xii）心不全、（xiii）不整脈、(xiv)動脈硬化巣の進展、(xv)血栓形成、（xvi）低血圧症、（xvii）ショック、（xviii）ショック性血管塞栓（播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）など）〕、特に動脈硬化症、
（３）呼吸器系疾患〔呼吸窮迫症候群、呼吸不全、肺気腫、肺炎、気管支炎、細気管支炎など〕、
（４）骨・関節系疾患〔慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、骨軟化症、骨減少症、骨ペーチェット病など〕、特に慢性関節リウマチ、
（５）消化器・肝胆膵系疾患〔潰瘍性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、肝硬変、肝不全、肝炎、胆嚢炎、膵炎など〕、特に潰瘍性大腸炎、
（６）腎・尿路系疾患〔腎炎、腎不全、膀胱炎など〕
またはこれらが組み合わさった疾患（多臓器不全など）などの予防・治療剤としても有用である。さらに、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、ＴＬＲ４シグナルの変化に起因する感染症、特に臓器障害を伴うセプシス（重症セプシス）の予防・治療剤として有用である。
さらに、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、臓器障害、重症セプシスなどの感染症、アルツハイマー病などの中枢神経系疾患、動脈硬化症などの循環器系疾患、慢性関節リウマチなどの骨・関節系疾患、潰瘍性大腸炎などの消化器系疾患などの予防・治療剤としても有用である。【０１０２】
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は他の薬物と併用して使用することができる。そのような併用薬としては、例えば、抗菌薬、抗真菌薬、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド薬、抗凝血薬、抗血小板薬、血栓溶解薬、免疫調節薬、抗原虫薬、鎮咳・去たん薬、鎮静薬、麻酔薬、麻薬拮抗薬、抗潰瘍薬、高脂血症治療薬、動脈硬化症治療薬、HDL増加薬、不安定プラーク安定化薬、心筋保護薬、甲状腺機能低下症治療薬、ネフローゼ症候群治療薬、慢性腎不全治療薬、利尿薬、高血圧治療薬、心不全治療薬、筋弛緩薬、抗てんかん薬、強心薬、血管拡張薬、血管収縮薬、不整脈治療薬、糖尿病治療薬、昇圧薬、精神安定薬、抗精神病薬、アルツハイマー病治療薬、抗パーキンソン薬、筋萎縮性脊髄側索硬化症治療薬、神経栄養因子、抗うつ薬、精神分裂病治療薬、抗腫瘍薬、ビタミン薬、ビタミン誘導体、関節炎治療薬、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、抗喘息薬、アトピー性皮膚炎治療薬、アレルギー性鼻炎治療薬、頻尿・尿失禁治療薬、タンパク質分解薬、タンパク質分解酵素阻害薬、抗ＳＩＤＳ薬、抗セプシス薬、抗セプティックショック薬、エンドトキシン拮抗薬あるいは抗体、シグナル伝達阻害薬、炎症性メディエーター作用抑制薬、炎症性メディエーター作用抑制抗体、炎症性メディエーター産生抑制薬、抗炎症性メディエーター作用抑制薬、抗炎症性メディエーター作用抑制抗体、抗炎症性メディエーター産生抑制薬、α１アドレナリン作動薬などが挙げられ、なかでも抗菌薬、抗真菌薬、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド薬、抗凝血薬などが好ましい。具体的には以下のものが挙げられる。【０１０３】
（１）抗菌薬
(i)サルファ剤
スルファメチゾール、スルフィソキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファメチゾール、サラゾスルファピリジン、スルファジアジン銀など。
(ii)キノリン系抗菌薬
ナリジクス酸、ピペミド酸三水和物、エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トシル酸トスフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、フレロキサシンなど。
(iii)抗結核薬
イソニアジド、エタンブトール（塩酸エタンブトール）、パラアミノサリチル酸（パラアミノサリチル酸カルシウム）、ピラジナミド、エチオナミド、プロチオナミド、リファンピシン、硫酸ストレプトマイシン、硫酸カナマイシン、サイクロセリンなど。
(iv)抗酸菌薬
ジアフェニルスルホン、リファンピシリンなど。
(v)抗ウイルス薬
イドクスウリジン、アシクロビル、ビタラビン、ガンシクロビルなど。
(vi)抗ＨＩＶ薬
ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、硫酸インジナビルエタノール付加物、リトナビルなど。
(vii)抗スピロヘータ薬
(viii)抗生物質
塩酸テトラサイクリン、アンピシリン、ピペラシリン、ゲンタマイシン、ジベカシン、カネンドマイシン、リビドマイシン、トブラマイシン、アミカシン、フラジオマイシン、シソマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ピペラシリン、チカルシリン、セファロチン、セファピリン、セファロリジン、セファクロル、セファレキシン、セフロキサジン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォトアム、セフロキシム、セフォチアム、セフォチアムヘキセチル、セフロキシムアキセチル、セフジニル、セフジトレンピボキシル、セフタジジム、セフピラミド、セフスロジン、セフメノキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフピロム、セファゾプラン、セフェピム、セフスロジン、セフメノキシム、セフメタゾール、セフミノクス、セフォキシチン、セフブペラゾン、ラタモキナセフ、フロモキセフ、セファゾリン、セフォタキシム、セフォペラゾン、セフチゾキシム、モキサラクタム、チエナマイシン、スルファゼシン、アズスレオナムまたはそれらの塩、グリセオフルビン、ランカシジン類〔ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（J．Antibiotics），３８，８７７−８８５（１９８５）〕など。
（２）抗真菌薬
(i)ポリエチレン系抗生物質（例、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、トリコマイシン）
(ii)グリセオフルビン、ピロールニトリンなど
(iii)シトシン代謝拮抗薬（例、フルシトシン）
(iv)イミダゾール誘導体（例、エコナゾール、クロトリマゾール、硝酸ミコナゾール、ビホナゾール、クロコナゾール）
(v)トリアゾール誘導体（例、フルコナゾール、イトラコナゾール、アゾール系化合物〔２−〔（１Ｒ，２Ｒ）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロピル〕−４−〔４−（２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ）フェニル〕−３（２Ｈ，４Ｈ）−１，２，４−トリアゾロン〕）
(vi)チオカルバミン酸誘導体（例、トリナフトール）
(vii)エキノカンジン系誘導体（例、カスポファンジン、ミカファンジン、アニデュラファンジン）など。
（３）非ステロイド性抗炎症薬
アセトアミノフェン、フェナセチン、エテンザミド、スルピリン、アンチピリン、ミグレニン、アスピリン、メフェナム酸、フルフェナム酸、ジクロフェナックナトリウム、ロキソプロフェンナトリウム、フェニルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、フルルビプロフェン、フェンブフェン、プラノプロフェン、フロクタフェニン、エピリゾール、塩酸チアラミド、ザルトプロフェン、メシル酸ガベキサート、メシル酸カモスタット、ウリナスタチン、コルヒチン、プロベネジド、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロン、アロプリノール、金チオリンゴ酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、塩酸モルヒネ、サリチル酸、アトロピン、スコポラミン、モルヒネ、ペチジン、レボルファイノール、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキシモルフォンまたはその塩など。
（４）ステロイド薬
デキサメサゾン、ヘキセストロール、メチマゾール、ベタメサゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルオロメトロン、プロピオン酸ベクロメタゾン、エストリオールなど。
（５）抗凝血薬
ヘパリンナトリウム、クエン酸ナトリウム、活性化プロテインC、組織因子経路阻害剤、アンチトロンビンIII、ダルテパリンナトリウム、ワルファリンカリウム、アルガトロバン、ガベキサート、クエン酸ナトリウムなど。【０１０４】
（６）抗血小板薬
オザクレルナトリウム、イコサペンタ酸エチル、ベラプロストナトリウム、アルプロスタジル、塩酸チクロピジン、ペントキシフィリン、ジピリダモールなど。
（７）血栓溶解薬
チソキナーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼなど。
（８）免疫調節薬
シクロスポリン、タクロリムス、グスペリムス、アザチオプリン、抗リンパ血清、乾燥スルホ化免疫グロブリン、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、インターロイキン、インターフェロンなど。
（９）抗原虫薬
メトロニダゾール、チニダゾール、クエン酸ジエチルカルバマジン、塩酸キニーネ、硫酸キニーネなど。
（１０）鎮咳・去たん薬
塩酸エフェドリン、塩酸ノスカピン、リン酸コデイン、リン酸ジヒドロコデイン、塩酸イソプロテレノール、塩酸メチルエフェドリン、塩酸ノスカピン、アロクラマイド、クロルフェジアノール、ピコペリダミン、クロペラスチン、プロトキロール、イソプロテレノール、サルブタモール、テレプタリン、オキシペテバノール、塩酸モルヒネ、臭化水素酸デキストロペトルファン、塩酸オキシコドン、リン酸ジモルファン、ヒベンズ酸チペピジン、クエン酸ペントキシベリン、塩酸クロフェダノール、ベンゾナテート、グアイフェネシン、塩酸ブロムヘキシン、塩酸アンブロキソール、アセチルシステイン、塩酸エチルシステイン、カルボシステインなど。
（１１）鎮静薬
塩酸クロルプロマジン、硫酸アトロピン、フェノバルビタール、バルビタール、アモバルビタール、ペントバルビタール、チオペンタールナトリウム、チアミラールナトリウム、ニトラゼパム、エスタゾラム、フルラザパム、ハロキサゾラム、トリアゾラム、フルニトラゼパム、ブロムワレリル尿素、抱水クロラール、トリクロホスナトリウムなど。
（１２）麻酔薬
（１２−１）局所麻酔薬
塩酸コカイン、塩酸プロカイン、リドカイン、塩酸ジブカイン、塩酸テトラカイン、塩酸メピバカイン、塩酸ブピバカイン、塩酸オキシブプロカイン、アミノ安息香酸エチル、オキセサゼインなど。
（１２−２）全身麻酔薬
(i)吸入麻酔薬（例、エーテル、ハロタン、亜酸化窒素、インフルラン、エンフルラン）、
(ii)静脈麻酔薬（例、塩酸ケタミン、ドロペリドール、チオペンタールナトリウム、チアミラールナトリウム、ペントバルビタール）など。
（１３）麻薬拮抗薬
レバロルファン、ナロルフィン、ナロキソンまたはその塩など。
（１４）抗潰瘍薬
メタクロプロミド、塩酸ヒスチジン、ランソプラゾール、メトクロプラミド、ピレンゼピン、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ウロガストリン、オキセサゼイン、プログルミド、オメプラゾール、スクラルファート、スルピリド、セトラキサート、ゲファルナート、アルジオキサ、テプレノン、プロスタグランジンなど。【０１０５】
（１５）高脂血症治療薬
HMG-CoA還元酵素阻害薬(例、フルバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチンなど)、フィブラート系薬剤（例、シンフィブラート、クロフィブラートアルミニウム、クリノフィブラート、フェノフィブラートなど）、胆汁酸吸着薬（例、コレスチラミンなど）、ニコチン酸製剤（例、ニコモール、ニセリトロール、ニコチン酸トコフェロールなど）、プロブコール及びその誘導体、多価不飽和脂肪酸誘導体（例、イコサペント酸エチル、ポリエンフォスファチジルコリン、メリナミドなど）、植物ステロール（例、ガンマ−オリザノール、ソイステロールなど）、エラスターゼ、デキストラン硫酸ナトリウム、スクワレン合成酵素阻害薬、スクワレンエポキシダーゼ阻害薬、CETP阻害薬、２−クロロ−３−〔４−（２−メチル−２−フェニルプロポキシ）フェニル〕プロピオン酸エチル〔ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chem.  Pharm. Bull），３８，２７９２−２７９６（１９９０）〕、LDL受容体増加薬、コレステロール吸収阻害薬（Ezetimibeなど）、MTP阻害薬、回腸胆汁酸トランスポーター阻害薬、SCAPリガンド、FXRリガンドなど。
（１６）動脈硬化症治療薬
ＭＭＰ阻害薬、キマーゼ阻害薬、ACAT阻害薬（Avasimibe、 Eflucimibeなど）、apoAI Milanoとその類似物質、スカベンジャー受容体阻害薬、15-リポキシゲナーゼ阻害薬、ホスホリパーゼA2阻害薬、ABCA1活性化薬、LXRリガンド、スフィンゴミエリナーゼ阻害薬、パラオキソナーゼ活性化薬、エストロジェン受容体作動薬など。
（１７）HDL増加薬
スクワレン合成酵素阻害薬、CETP阻害薬、LPL活性化薬など。
（１８）不安定プラーク安定化薬
ＭＭＰ阻害薬、キマーゼ阻害薬、ACAT阻害薬、リピド・リッチ・プラーク退縮剤など。
（１９）心筋保護薬
心臓ＡＴＰ−Ｋ用口薬、エンドセリン拮抗薬、ウロテンシン拮抗薬など。
（２０）甲状腺機能低下症治療薬
乾燥甲状腺（チレオイド）、レボチロキシンナトリウム（チラージンＳ）、リオチロニジンナトリウム（サイロニン、チロミン）など。
（２１）ネフローゼ症候群治療薬
プレドニゾロン（プレドニン）、コハク酸プレドニゾロンナトリウム（プレドニン）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム（ソル・メドロール）、ベタメタゾン（リンデロン）など。
（２２）慢性腎不全治療薬
利尿薬〔例、フロセミド（ラシックス）、ブメタニド（ルネトロン）、アゾセミド（ダイアート）〕、降圧薬〔例、ＡＣＥ阻害薬、マレイン酸エナラプリル（レニベース）、Ｃa 拮抗薬（マニジピン）、α受容体遮断薬、ＡＩＩ拮抗薬（カンデサルタン）〕など。
（２３）利尿薬
サイアザイド系利尿薬（ベンチルヒドロクロロチアジド、シクロペンチアジド、エチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ペンフルチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジドなど）、ループ利尿薬（クロルタリドン、クロフェナミド、インダパミド、メフルシド、メチクラン、ソトラゾン、トリバミド、キネタゾン、メトラゾン、フロセミドなど）、カリウム保持性利尿薬（スピロノラクトン、トリアムテレンなど）。【０１０６】
（２４）高血圧治療薬
(i)交感神経抑制薬
α２刺激薬（例、クロニジン、グアナベンズ、グアンファシン、メチルドパなど）、神経節遮断薬（例、ヘキサメトニウム、トリメタファンなど）、シナプス前遮断剤（例、アルサーオキシロン、ジメチルアミノレセルピナート、レシナミン、レセルピン、シロシンゴピンなど）、ニューロン遮断薬（例、ベタニジン、グアネチジンなど）、α１遮断薬（例、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジルなど）、β遮断薬（例、プルプラノロール、ナドロール、チモロール、ニプラジロール、ブニトロロール、インデノロール、ペンブトロール、カルテオロール、カルベジロール、ピンドロール、アセブトロール、アテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ラベタロール、アモスラロール、アロチノロールなど）など。
(ii)血管拡張薬
カルシウムチャンネル拮抗薬（例、マニジピン、ニカルジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ベニジピン、アムロジピン、アラニジピンなど）、フタラジン誘導体（例、ブトララジン、カドララジン、エカラジン、ヒドララジン、トドララジンなど）など。
(iii)ACE阻害薬
アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、リジノプリル、テモカプリル、トランドラプリル、キナプリル、イミダプリル、ベナゼプリル、ベリンドプリルなど。
(iv)AII拮抗薬
ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、フォラサルタンなど。
(v)利尿薬（例えば前述の利尿薬など）
（２５）心不全治療薬
強心薬（例、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナトシドＣ、プロスシラリジンなど）、α、β刺激薬（例、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、ドパミン、ドカルパミン、ドブタミン、デノパミンなど）、ホスホジエステラーゼ阻害薬（例、アムリノン、ミルリノン、塩酸オルプリノンなど）カルシウムチャンネル感受性増強薬（例、ピモベンタンなど）、硝酸薬（例、ニトログリセリン、硝酸イソソルビドなど）、ACE阻害薬（例えば前述のACE阻害薬など）、利尿薬（例えば前述の利尿薬など）、カルペリチド、ユビデカレノン、ベスナリノン、アミノフィリンなど。
（２６）筋弛緩薬
プリジノール、ツボクラリン、パンクロニウム、塩酸トルペリゾン、カルバミン酸クロルフェネシン、バクロフェン、クロルメザノン、メフェネシン、クロゾキサゾン、エペリゾン、チザニジンなど。
（２７）抗てんかん薬
フェニトイン、エトサクシミド、アセタゾラミド、クロルジアゼポキシド、トリペタジオン、カルバマゼピン、フェノバルビタール、プリミドン、スルチアム、パルプロ酸ナトリウム、クロナゼパム、ジアゼパム、ニトラゼパムなど。
（２８）強心薬
トランスバイオキソカンファー、テレフィロール、アミノフィリン、エチレフリン、ドパミン、ドブタミン、デノパミン、アミノフィリン、ベシナリン、アムリノン、ピモベンダン、ユビデカレノン、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナトシドＣ、Ｇ−ストロファンチンなど。
（２９）血管拡張薬
オキシフェドリン、ジルチアゼム、トラゾリン、ヘキソベンジン、バメタン、クロニジン、メチルドパ、グアナベンズなど。
（３０）血管収縮薬
ドパミン、ドブタミン、デノパミンなど。
（３１）不整脈治療薬
(i)ナトリウムチャンネル遮断薬（例、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、アジマリン、シベンゾリン、リドカイン、ジフェニルヒダントイン、メキシレチン、プロパフェノン、フレカイニド、ピルジカイニド、フェニトインなど）、
(ii)β遮断薬（例、プロプラノロール、アルプレノロール、プフェトロール、オクスプレノロール、アテノール、アセブトロール、メトプロロール、ビソプロロール、ピンドロール、カルテオロール、アロチロールなど）、
(iii)カリウムチャンネル遮断薬（例、アミオダロンなど）、
(iv)カルシウムチェンネル遮断薬（例、ベラパミル、ジルチアゼムなど）など。
（３２）昇圧薬
ドパミン、ドブタミン、デノパミン、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナトシドＣ、Ｇ−ストロファンチンなど。
（３３）糖尿病治療薬
スルホニル尿素剤（例、トルブタミド、クロルプロパミド、グリクロピラミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド、グリブゾールなど）、ビグアナイド剤（例、塩酸メトホルミン、塩酸ブホルミンなど）、α−グルコシダーゼ阻害薬（例、ボグリボース、アカルボースなど）、インスリン抵抗性改善薬（例、ピオグリタゾン、ロジグリタゾン、トログリタゾンなど）、インスリン、グルカゴン、糖尿病性合併症治療薬（例、エパルレスタットなど）など。【０１０７】
（３４）精神安定薬
ジアゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、クロルジアゼポキシド、メダゼパム、オキサゾラム、クロキサゾラム、クロチアゼパム、ブロマゼパム、エチゾラム、フルジアゼパム、ヒドロキシジンなど。
（３５）抗精神病薬
塩酸クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリフロペラジン、塩酸チオリダジン、マレイン酸ペルフェナジン、エナント酸フルフェナジン、マレイン酸プロクロルペラジン、マレイン酸レボメプロマジン、塩酸プロメタジン、ハロペリドール、ブロムペリドール、スピペロン、レセルピン、塩酸クロカプラミン、スルピリド、ゾテピンなど。
（３６）アルツハイマー病治療薬
(i)ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、ＴＡＫ−１４７等のコリンエステラーゼ阻害剤、
(ii)イデベノン、メマンチン、ビンポセチン等の脳機能賦活薬など。
（３７）抗パーキンソン薬
Ｌ−ドーパ、デプレニル、カルビドパ＋レボドパ、ペルゴライド、ロピニロール、カベルゴリン、プラミペキソール、エンタカプロン、ラザベミドなど。
（３８）筋萎縮性脊髄側索硬化症治療薬
リルゾール、メカセルミン、ガバペンチンなど。
（３９）抗うつ薬
イミプラミン、クロミプラミン、ノキシプチリン、フェネルジン、塩酸アミトリプチリン、塩酸ノルトリプチリン、アモキサピン、塩酸ミアンセリン、塩酸マプロチリン、スルピリド、マレイン酸フルボキサミン、塩酸トラゾドンなど。
（４０）精神分裂病治療薬
オランザピン、リスペリドン、クエチアピン、イロペリドンなど。
（４１）抗腫瘍薬
６−Ｏ−（Ｎ−クロロアセチルカルバモイル）フマギロール、ブレオマイシン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、テトラヒドロフリル−５−フルオロウラシル、ピシバニール、レンチナン、レバミゾール、ベスタチン、アジメキソン、グリチルリチン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ヘプロマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、塩酸イリノテカン、シクロフォスファミド、メルファラン、ズスルファン、チオテパ、塩酸プロカルバジン、シスプラチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、テガフール、カルモフール、シタラビン、メチルテストステロン、プロピオン酸テストステロン、エナント酸テストステロン、メピチオスタン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸リュープリン、酢酸ブセレリンなど。
（４２）ビタミン薬
(i)ビタミンＡ類：ビタミンＡ1、ビタミンＡ2およびパルミチン酸レチノール
(ii)ビタミンＤ類：ビタミンＤ1、Ｄ2、Ｄ3、Ｄ4およびＤ5
(iii)ビタミンＥ類：α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、ニコチン酸dl−α−トコフェロール
(iv)ビタミンＫ類：ビタミンＫ1、Ｋ2、Ｋ3およびＫ4
(v)葉酸（ビタミンＭ）
(vi)ビタミンＢ類：ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ3、ビタミンＢ5、ビタミンＢ6およびビタミンＢ12
(vii)ビオチン（ビタミンＨ）など。
（４３）ビタミン誘導体
ビタミンの各種誘導体、例えば、アスコルビン酸、５，６−トランス−コレカルシフェロール、２，５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１−α−ヒドロキシコレカルシフェロールなどのビタミンＤ3誘導体、５，６−トランス−エルゴカルシフェロール等のビタミンＤ2誘導体など。【０１０８】
（４４）抗アレルギー薬
ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、トリペレナミン、メトジラミン、クレミゾール、ジフェニルピラリン、メトキシフェナミン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト、レピリナスト、アンレキサノクス、イブジラスト、ケトチフェン、テルフェナジン、メキタジン、アセラスチン、エピナスチン、塩酸オザグレル、プランルカスト水和物、セラトロダストなど。
（４５）抗喘息薬
塩酸イソプレナリン、硫酸サルブタモール、塩酸プロカテロール、硫酸テルブタリン、塩酸トリメトキノール、塩酸ツロブテロール、硫酸オルシプレナリン、臭化水素酸フェノテロール、塩酸エフェドリン、臭化イプロトロピウム、臭化オキシトロピウム、臭化フルトロピウム、テオフィリン、アミノフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト、レピリナスト、アンレキサノン、イブジラスト、ケトチフェン、テルフェナジン、メキタジン、アゼラスチン、エピナスチン、塩酸オザグレル、プランルカスト水和物、セラトロダスト、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プロピオン酸ベクロペタゾンなど。
（４６）アトピー性皮膚炎治療薬
クロモグリク酸ナトリウムなど。
（４７）アレルギー性鼻炎治療薬
クロモグリク酸ナトリウム、マレイン酸クロルフェニラミン、酒石酸アリメマジン、フマル酸クレマスチン、塩酸ホモクロルシクリジン、テルフェナジン、メキタジンなど。
（４８）頻尿・尿失禁治療薬
塩酸フラボキサートなど。
（４９）抗セプシス薬
ｒBPI-21（バクテリシダルパーミアビリティ  インクリージング  プロテイン）、BI-51017（アンチトロンビンIII）、SC-59735（ｒTFPI）、r-ＰＡＦアセチルヒドラーゼ、LY-203638（r-活性化プロテインＣ）、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＣＤ１４抗体、CytoFab、アルカリフォスファターゼ（LPS不活性化剤）等のペプチド性化合物、JTE-607、E-5531、E-5564、S-5920、FR-167653、ONO-1714、ONO-5046(sivelestat)、GW-273629、RWJ-67657、GR-270773、NOX-100、GR-270773、NOX-100、等の非ペプチド性化合物など。
（５０）制吐剤
フェノリアジン誘導体、5-HT3受容体アンタゴニストなど。
（５１）メトヘモグロビン上昇防止剤
メチレンブルー、アスコルビン酸など。
（５２）その他
ヒドロキシカム、ダイアセリン、メゲストロール酢酸、ニセロゴリン、プロスタグランジン類など。【０１０９】
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と他の薬物とを併用した場合、次のような効果を有する。
（１）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質や併用薬物を単独投与した場合よりも、これらの投与量を軽減することができる。
（２）相乗的な治療効果が得られる。
（３）菌感染などの疾患に伴い発症する種々の疾患に対して、広く治療効果を発揮する。
（４）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質の副作用を軽減できる。
併用に際しては、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と併用薬物の投与時期は限定されず、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
併用の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物；併用薬物またはその医薬組成物の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。【０１１０】
本発明の併用剤における本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質と併用薬物との配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
例えば、本発明の併用剤におけるシクロアルケン化合物または化合物Ａの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約０．０１ないし９９．８重量％、好ましくは約０．１ないし５０重量％、さらに好ましくは約０．５ないし２０重量％程度である。
本発明の併用剤における併用薬物の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約０．０１ないし９９．８重量％、好ましくは約０．１ないし５０重量％、さらに好ましくは約０．５ないし２０重量％程度である。
本発明の併用剤における担体等の添加剤の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約１ないし９９．９８重量％、好ましくは約１０ないし９０重量％程度である。
また、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。【０１１１】
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質をヒトに投与する場合、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、経口投与剤（例、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤など）、非経口投与剤（例、注射剤、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮投与製剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）などの医薬組成物として経口的または非経口的に安全に投与することができる。
これらの製剤は、例えば、製剤の製造において通常一般に用いられる自体公知の方法を適用することにより製造することができる。製剤中の本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質の配合割合は、その形態によっても異なるが、例えば前記した経口投与剤においては約１０ないし約９５重量％が好ましく、例えば前記した非経口投与剤では約０.００１ないし約９５重量％が好ましい。【０１１２】
例えば注射剤は、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を可溶化剤（例、β−シクロデキストリン類など）、分散剤（例、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖など）などとともに常法に従って水性注射剤にすることもでき、あるいは植物油（例、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、綿実油、コーン油など）、プロピレングリコールなどに、適宜溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形することもできる。
経口投与製剤は、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質に、例えば、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール6000など）などを適宜添加して圧縮成形し、次いで必要に応じて、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のための自体公知の方法でのコーティングなどを施すことにより製造することもできる。コーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン80、プルロニック F68、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギッド（ローム社製、西ドイツ、メタアクリル酸、アクリル酸共重合）、色素（例、酸化チタン、ベンガラなど）などが適宜用いられる。【０１１３】
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、固状、半固状あるいは液状の外用剤としても用いることができる。
例えば、固状の外用剤は、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質をそのまま、あるいは賦形剤（例、グリコール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など）などを添加、混合し、粉状の組成物とすることにより製造されることもできる。半固状の外用剤は、常法に従って製造し、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏剤として用いることが好ましい。液状の外用剤は、注射剤の製造に用いる手段あるいはそれに準じた手段により、油性あるいは水性の懸濁剤とすることにより製造されることもできる。
また、固状、半固状または液状の外用剤に、pＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを適宜加えてもよい。具体的には、例えばワセリン、ラノリンなどを基剤として、１ｇあたり本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を通常約０.１乃至約１００mg含有する軟膏剤として、用いることもできる。
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質は、油性または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とすることもできる。坐剤を製造する際の油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセライド（例、カカオ脂、ウィテップゾール類（ダイナマイトノーベル社製）など）、中級脂肪酸（例、ミグリオール酸（ダイナマイトノーベル社製）など）、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが適宜用いられる。また水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコールなどが用いられ、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが適宜用いられる。【０１１４】
本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質の投与量は、年齢、体重、症状、剤形、投与方法、投与期間などにより異なるが、例えば、セプシス治療を目的として患者（成人、体重約６０ｋｇ）一人あたり、通常、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質として１日約０．０１ないし約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ、とりわけ約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇを、なかでも約１．５ないし約３０ｍｇ／ｋｇを１日１回から数回に分けて経口または非経口投与される。もちろん、前記したように投与量は種々の条件で変動するので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
本発明の併用剤の投与量は、化合物の種類、年齢、体重、症状、剤形、投与方法、投与期間などにより異なるが、例えば、セプシス治療を目的として患者（成人、体重約６０ｋｇ）一人あたり、通常、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質および併用薬物として、それぞれ１日約０．０１ないし約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ、とりわけ約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇを、なかでも約１．５ないし約３０ｍｇ／ｋｇを１日１回から数回に分けて静脈投与される。もちろん、前記したように投与量は種々の条件で変動するので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
併用薬物は、副作用が問題とならない範囲でどのような量を設定することも可能である。併用薬物としての一日投与量は、症状の程度、投与対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、薬物の量として通常、たとえば経口投与で哺乳動物１ｋｇ体重あたり約０．００１〜２０００ｍｇ、好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ、さらに好ましくは、約０．１〜１００ｍｇ程度であり、これを通常１日１〜４回に分けて投与する。
本発明の併用剤を投与するに際しては、同時期に投与してもよいが、併用薬物を先に投与した後、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を投与してもよいし、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を先に投与し、その後で併用薬物を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、併用薬物を先に投与する場合、併用薬物を投与した後１分〜３日以内、好ましくは１０分〜１日以内、より好ましくは１５分〜１時間以内に本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を投与する方法が挙げられる。本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を先に投与する場合、本発明のＴＬＲ４シグナル伝達阻害物質を投与した後、１分〜１日以内、好ましくは１０分〜６時間以内、より好ましくは１５分から１時間以内に併用薬物を投与する方法が挙げられる。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例を記載し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【０１１６】
実施例１
定法によりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって各種cDNAの3’-および5’-末端に制限酵素サイトを付加したDNAを増幅した。プライマーは以下のとおり。
TIRAP:
5’-GCGCGGATCCATGGCATCATCGACCTCCCT-3’（配列番号：５）
5’-GCGCGCGGCCGCTCAAAGTAGATCAGATA-3’（配列番号：６）
TLR2細胞内TIRドメイン:
5’-GGATCCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGT-3’ （配列番号：７）
5’-AAGCGGCCGCCTAGGACTTTATCGCAGCTCTCAG-3’（配列番号：８）
TLR4細胞内TIRドメイン:
5’-GGATCCTATGATGCCTTTGTTATCTACTCA-3’（配列番号：９）
5’-AAGCGGCCGCTCAGATAGATGTTGCTTCCTGCCA-3’（配列番号：１０）
上記プライマーDNAおよびTAKARA Ex Taqを用い、サーマルサイクラーにて、最初95℃で2分間置いた後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1反応サイクルとして30サイクル繰り返し、最後に72℃で10分間伸長反応を行った。増幅したDNA断片をTA Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローニングした。得られたプラスミドベクターを制限酵素処理してアガロースゲルで電気泳動し、Sephaglas BandPrep Kit (Amersham)によりバンド切り出し精製を行った。これをインサートとして、DNA ligation kit Ver.2 (TAKARA)を用いてにベクタープラスミドpGEX-4T-1 (Amersham)に挿入した。
完成したプラスミドで大腸菌を形質転換し、10 mLのampicillin含有LB培地中で37℃、18時間培養した。菌液2.4 mLを130 mLのampicillin含有LB培地に接種、振とう培養しOD600が0.9前後になったら1 mol/Lのisopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを130μL添加し30℃で4時間培養した。培養後、菌体を集め、10 mLのLysis Buffer (10 mmol/L Tris pH7.5, 150 nmol/L NaCl, 0.5% triton-X-100, 1 mmolp/L PMSF)を添加した。菌体を超音波破砕後、遠心して得られた上清に300μLのGlutathione Sepharose 4B (Amersham)を添加し、4℃で60分穏やかに振とうした。反応後、GST融合蛋白結合ビーズを0.1% Triton X-100添加TBS (Tris buffered saline, 50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl)で洗った。
完成したGST融合蛋白結合ビーズと3H-化合物Ａ（アマシャム社で合成）を4℃で一夜反応させた。反応後、0.1% Triton X-100添加TBS でビーズを洗い、5% 2-mercaptoethanol (ME)含有sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)用sample bufferを加え、100℃で5〜10分間加熱した。遠心し上清をラベル化蛋白サンプルとして分取し、SDS-PAGEで蛋白を分離した。蛋白を分離したゲルを40% メタノール-10% 酢酸溶液で固定してからCBB染色し（図１Ａ）、ろ紙上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた。乾燥ゲルとイメージングプレートTR2040 (富士写真フィルム)を密着させ感光し、BAS-2500 (富士写真フィルム)で蛋白に結合した3H量を測定した (オートラジオグラフィー)。3H-化合物ＡはGST-TLR4細胞内TIRドメイン融合蛋白に選択的に結合し、それ以外のGST融合蛋白やGSTには結合しなかった（図１Ｂ）。【０１１７】
実施例２
PCR法を用いて定法によりTLR4をコードするcDNAを得て、発現ベクターpEFBosに組み込んだ。各点変異体はStratagene 社製のQuikChange II Site-directed Mutagenesis Kitを用いて作製した。プライマーは、キットの説明書にしたがい、両側に変異に相当するミスマッチを導入した。作製したプライマーは下記の通り（変異導入部位を下線で示す）。以後はキットの説明書に従い変異体を作製し、コンピテントセルを形質転換した。シングルコロニーをピックアップし、定法に従いプラスミドを調製後DNA配列を確認し各変異体TLR4を含むプラスミドを得た。
1CA:
5’-TGATGCTTCTTGCTGGCGCCATAAAGTATGGTAGAG-3’（配列番号：１１）
5’-CTCTACCATACTTTATGGCGCCAGCAAGAAGCATCA-3’（配列番号:１２）
2CA:
5’-CCTCCATTTCAGCTCGCCCTTCACTACAGAGA-3’（配列番号：１３）
5’-TCTCTGTAGTGAAGGGCGAGCTGAAATGGAGG-3’（配列番号：１４）
3CA:
5’-ATCCAGAGCCGCTGGGCTATCTTTGAATATGA-3’（配列番号：１５）
5’-TCATATTCAAAGATAGCCCAGCGGCTCTGGAT-3’（配列番号：１６）
4CA:
5’-ACAGTGGGTACAGGAGCCAATTGGCAGGAAGC-3’（配列番号：１７）
5’-GCTTCCTGCCAATTGGCTCCTGTACCCACTGT-3’（配列番号：１８）
PH:
5’-TACAGAGACTTTATTCACGGTGTGGCCATTGC-3’（配列番号：１９）
5’-GCAATGGCCACACCGTGAATAAAGTCTCTGTA-3'（配列番号：２０）
1KR:
5’-CAGTTCTGGTCTATAGGTTCTATTTTCACCTG-3’（配列番号：２１）
5’-CAGGTGAAAATAGAACCTATAGACCAGAACTG-3’（配列番号：２２）
2KR:
5’-TGCTGGCTGCATAAGGTATGGTAGAGGTG-3’（配列番号：２３）
5’-CACCTCTACCATACCTTATGCAGCCAGCA-3’（配列番号：２４）
3KR:
5’-GGAATGAGCTAGTAAGGAATTTAGAAGAAGG-3’（配列番号：２５）
5’-CCTTCTTCTAAATTCCTTACTAGCTCATTCC-3’（配列番号：２６）
4KR:
5’-CATGAAGGTTTCCATAGAAGCCGAAAGGTGATT-3’（配列番号：２７）
5’-AATCACCTTTCGGCTTCTATGGAAACCTTCATG-3’（配列番号：２８）
5KR:
5’-CCATAAAAGCCGAAGGGTGATTGTTGTGG-3’（配列番号：２９）
5’-CCACAACAATCACCCTTCGGCTTTTATGG-3’（配列番号：３０）
6KR:
5’-CATTGTCCTGCAGAGGGTGGAGAAGACC-3’（配列番号：３１）
5’-GGTCTTCTCCACCCTCTGCAGGACAATG-3’（配列番号：３２）
7KR:
5’-CAGAAGGTGGAGAGGACCCTGCTCAGGC-3’（配列番号：３３）
5’-GCCTGAGCAGGGTCCTCTCCACCTTCTG-3’（配列番号：３４）
8KR:
5’-GAGACGACTCAGAAGAGCCCTGCTGGATG-3’（配列番号：３５）
5’-CATCCAGCAGGGCTCTTCTGAGTCGTCTC-3’（配列番号：３６）
9KR:
5’-CCTGCTGGATGGTAGATCATGGAATCCAGA-3’（配列番号：３７）
5’-TCTGGATTCCATGATCTACCATCCAGCAGG-3’（配列番号：３８）
作製したプラスミドで大腸菌を形質転換させ、EndoFree(R) Plasmid Maxi Kit (Quiagen)を使用して各々500〜700μg程度精製した。アフリカミドリザル腎由来細胞COS-7をOPTI-MEM (Invitrogen)で2回洗い、培地を10%FCS添加、100μg/mL streptomycinおよび100 U/mL penicillin含有DMEM (Invitrogen)からOPTI-MEM 5mL/dishに変えた。FLAG-TLR4 WT或いは各変異体をコードするプラスミドをPLUS試薬 (Invitrogen)及びLipofectAMINE試薬(Invitrogen)を用いて定法に従いCOS-7細胞にトランスフェクションし、37℃、5%CO2存在下で3時間培養した。20%FCS添加DMEMを6.5 mL/dishとなるよう加え、更に2日間培養した。
培地を1%FCS添加DMEM 5mLに置き換え、3H-化合物Ａ（アマシャム社で合成）を最終濃度100 nmol/Lとなるよう作用させ37℃、5%CO2存在下で6時間培養した。培養後、細胞をPBS 5 mLで1回洗って1mL/dishとなるようlysis buffer (10 mmol/L Tris pH7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1 % Nonidet P-40, 0.05 % 3-((3-cholamidopropyl dimethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS), 30 mmol/L NaF, 1 mmol/L Na3VO4および Protease inhibitor cocktail (Sigma))を加えた。Lysis bufferを加えたシャーレを氷上に15分置き、細胞を可溶化させた。遠心 (12000rpm, 4℃, 10min)して不溶性画分を除き上清を採取し、これをtotal cell lysateとした。
得られたtotal cell lysateを用いて定法に従い抗FLAG抗体による免疫沈降を行った。anti-FLAG M2抗体 (Sigma) 30μgを添加し、4℃で穏やかに振とうしながら3時間反応させ、更に50μLのprotein A Sepharose beadsを加えて4℃で穏やかに振とうしながら一晩反応させた。翌日、ビーズをlysis bufferで3回洗い、5% 2-ME含有SDS-PAGE用sample bufferを加えて100℃で10分間加熱処理した。遠心してビーズを捨てた上清を免疫沈降物とした。
免疫沈降物をSDS-PAGEにより蛋白を分離し、泳動後のゲルをブロッティング用bufferに15分間浸してSDSを除去した後、ゲルをpolyvinylidene difluoride(PVDF)膜に密着させ、ウエット式転写装置でゲル中の蛋白をPVDF膜に転写した。蛋白の転写されたPVDF膜を3%(W/V) nonfat milk含有Tris-HCl buffer (50 mmol/L Tris, 138 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, pH8.0)中でブロッキングし、一次抗体 (anti-FLAG M2 10μg/mL)を3% milk含有Tris-HCl buffer中で2時間反応させた。洗浄後2次抗体(HRP-anti mouse IgG) と1時間反応させた後、ECL試薬を用いてHRP標識抗体が結合した蛋白を発光させた。バンドの発光をX線フィルム Kodak Biomax-MSで撮影し、蛋白発現レベルを確認した（図２；上段パネル）。撮影の終了したPVDF膜をPBS-Tで洗って乾燥させ、イメージングプレートTR-2040に7日間感光させて、BAS-2500 (富士写真フィルム)で発現蛋白に結合した3H量を測定した。TLR4の747番目のシステインをアラニンに変異させた場合のみ3H-化合物Ａの結合量が顕著に低下した（図２；下段パネル）。化合物Ａは747番目のシステインに選択的に結合していることが判明した。【０１１８】
実施例３
ヒト胎児腎由来HEK293を10%FCS添加DMEM 中に懸濁し、96ウェルプレートに2x104cells/wellとなるよう播種し37℃、5% CO2存在下で一夜培養した。トランスフェクション直前に培地をOPTI-MEM (Invitrogen) 50μL/wellに置換した。FLAG-TLR4 WT或いはその変異体0CA〜3CA、PH、1KR〜9KRをコードするプラスミドを各々0.5 ng/wellとなるように添加し、PLUS試薬 (Invitrogen)及びLipofectAMINE試薬 (Invitrogen)を用いて定法に従いトランスフェクションし、37℃、5%CO2存在下で3時間培養した。培養後、20%FCS添加DMEMを100μL/wellとなるよう加え、更に一夜培養し、強制発現細胞とした。なお、共通DNAとしてpNiFty (NF-kB活性化測定用plasmid) 15 ng/well、phRL-TK (内部標準plasmid) 15 ng/well、 MD-2 plasmid 10 ng/well、CD14 plasmid 10 ng/wellを野生型TLR4や各変異体とともにトランスフェクションした。
トランスフェクション翌日、強制発現細胞の培地を1%FCS添加DMEMに置き換え、化合物Ａ（エチル (6R)-6-[N-(2-クロロ-4-フルオロフェニル)スルファモイル]-1-シクロへキセン-1-カルボキシラート）、化合物Ｂ（d-エチル 6-[N-(2,4-ジフルオロフェニル)スルファモイル]-1-シクロへキセン-1-カルボキシラート）、化合物Ｃ（エチル 6-[N-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)スルファモイル]-1-シクロへキセン-1-カルボキシラート）、化合物Ｄ（d-エチル 6-[(2-クロロ-4-フルオロベンジル)スルホニル]-1-シクロへキセン-1-カルボキシラート）を最終濃度0、30、100、300 nmol/Lとなるよう作用させ37℃、5%CO2存在下で２時間培養した。100 ng/mLとなるようLPSを添加し、更に4時間培養した。培養後、Dual-GloTM Luciferase Assay System (Promega)を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。測定は、firefly luciferase (FL, NF-kB活性化由来)およびrenilla luciferase (RL, 内部標準)による発光量を測定し、FLのCPS (counts per second)値をRLのCPSで補正した値、すなわちFL/RL ratioを求めた。結果を図３に示す。
TLR4の747番目のシステインをアラニンに変異させた場合のみ化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄによるシグナル抑制作用が消失した。したがって、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄは747番目のシステインに選択的に結合し、シグナルを抑制していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、ＴＬＲ４のシグナル伝達を阻害する物質を選択することができ、得られた物質は心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスまたはセプティックショックの予防・治療薬として有用である。【０１２０】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願2006-095936を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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