(57)【要約】  本発明の発明者らは、新規な細胞培養方法を開発し、大きさや性質が均一な細胞塊を、大量かつ簡便に生産する方法およびその回収方法を提供することを課題とする。  本発明の発明者らは、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その突出部分中で細胞を培養することにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その突出部分中で細胞を培養することを特徴とする、細胞の培養方法を提供する。本発明はまた、上記の細胞培養方法により細胞塊を形成することを特徴とする、細胞塊の作製方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の前記空洞部内に、細胞を含む培養液を注入し、
前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させ、
前記培養液の前記突出部分で細胞を培養することを特徴とする、細胞の培養方法。
【請求項２】
前記空洞部の他端が閉鎖しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記開口端を上にしかつ前記培養液の一部が前記開口端より上に突出させることによりおこない、前記開口端を下側に向けることを特徴とする、請求項1に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記一端側の開口端を下にして他端側の開口端から行い、前記培養液の注入後前記他端側の開口端を閉鎖することを特徴とする、請求項1に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記一端側の開口端を培養液に浸し、前記他端側の開口端から吸引することにより行うことを特徴とする、請求項1に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記空洞部が前記構造体に複数形成されており、それによって複数の細胞の培養を同時にできることを特徴とする、請求項1ないし4のいずれかに記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項1ないし5のいずれかに記載の細胞の培養方法により細胞を培養して細胞塊を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし5のいずれかに記載の細胞の培養方法により胚性幹細胞を培養して胚様体を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
【請求項８】
前記一端側の開口端より下側に突出した前記培養液の一部を別の培養液の液面に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収することを特徴とする、請求項6または７に記載の細胞塊の製造方法。
【請求項９】
請求項1ないし８のいずれかに記載の細胞の培養方法または細胞塊の製造方法に使用する培養器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い均一性を有する細胞の集合体である細胞塊を効率的に生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の細胞、例えば肝細胞などでは、2次元培養することにより、細胞の性質が生体内での性質と異なった状態になるものが少なくない。例えば、これらの細胞により生産されたタンパク質や細胞そのものを産業上利用する場合には、2次元培養に比べて、生態組織に近い培養条件として、細胞の3次元培養を行い、細胞塊を形成させることにより、生態組織中に存在した細胞の機能を発現させることができることが知られている（非特許文献1）。作製された細胞塊を用いて、例えば肝機能を発現させ、治療剤のスクリーニング等を行うためには、大きさや形などの状態と性質が均一な、すなわち均質な細胞塊の集団である細胞群を作製する必要がある。【０００３】
また、抗癌剤等の作用を確認する簡便な系として、2次元培養よりも、3次元培養の方が、固形癌の性質を反映しやすく、結果としてより正しい薬効を評価することができることも知られている（非特許文献2）。３次元培養を行い作製された細胞塊を用いて、抗癌剤等のスクリーニングを行う際には、ノイズの少ない、確実な結果を得るためには、用いる細胞塊間の均質性が必要となる。【０００４】
さらに、胚性幹細胞（ES細胞ともいう）は、2次元培養では分化を起こさないが、3次元培養にすることで、胚様体という細胞塊の形成を経て、発生分化のプログラムが始動し、増殖しながら多種類の生体組織細胞に分化する。このような生体組織細胞への分化を行う際には、均質な胚様体を作製し、用いることにより、所望な細胞へ適切に分化させることができ、所望な細胞への分化を効率的に行うことができる。【０００５】
上述のように、単に3次元培養するだけでは、均質な、すなわち性質と大きさや形などの状態が均一である細胞塊を得るという点で不十分であり、細胞塊を用いた産業上の十分な効果を得ることができない。従って、均一な3次元培養を行い、均質な一群の細胞塊を得ることが重要である。【０００６】
従来、細胞塊を形成する方法としては、胚性幹細胞を分化させるための胚様体を作製する目的で開発されたハンギングドロップ法、バクテリアルディッシュ法、旋回培養法、バイオリアクター法、およびメチルセルロース法等、並びに肝細胞の性質を長期に維持する目的で開発されたスフェア法、およびカプセル化法等が知られている。【０００７】
均質な一群の細胞塊を得るため、すなわち、大きさおよび形などの形態と性質が均一な一群の細胞塊を得るためには、細胞培養開始時の細胞数（以下、初期細胞数という）を一定にすることや、細胞塊を作製するための培養系における環境（例えば培養液成分、溶存ガス濃度等の培養条件）を、培養期間中一定に保つこと等が必要である。しかしながら、既知の方法では、いずれも細胞塊を形成できるものの、作製される細胞塊間の均一性が得られない点や、産業利用するために必要とされる効率性ないし生産性が得られない点等の課題があった。【０００８】
バクテリアルディッシュ法は、細胞が接着しないように処理されたプラスチック皿で細胞を培養することにより、浮遊する細胞同士を確率論的に接触させ、次第に細胞塊を形成させる方法である。しかしながら、この方法では、一つの細胞塊を構成する細胞の数が均一でなく、結果として均一な一群の細胞塊を形成できない。【０００９】
旋回培養法は、上記バクテリアルディッシュ法の変法であって、細胞接着性の低い培養容器で細胞を培養する際に旋回運動させることで、浮遊する細胞同士の接触機会をバクテリアルディッシュ法よりも増大させて、細胞塊間の大きさを均一化しようとした方法である。この方法においては、細胞塊間の均一性の点ではバクテリアルディッシュ法よりも優れているものの、均一性の点でなお課題が残り、また、培養における単位面積あたりに作製できる細胞塊の数が少ないため、生産効率が悪く、産業利用の観点において課題がある。【００１０】
バイオリアクター法（非特許文献3）は、旋回培養法と同様に、培養器具を常に一定方向に回転させる方法であるが、その回転方向は垂直方向である点で旋回培養法とは相違している。しかしながら、この方法もまた、旋回培養法と同様に、作製できる培養における単位面積あたりに作製できる細胞塊の数は少なく、生産効率が悪いため、産業利用の観点において課題がある。【００１１】
メチルセルロース法は、細胞懸濁液にメチルセルロースなどの増粘剤を加えて溶液中の対流を抑制し、個々の細胞を分離浮遊培養することによって、単細胞の増殖により細胞塊を形成する方法である。しかしながら、細胞懸濁液中の粘度が高く、溶液中の対流が抑制されているために、外気と接触している溶液部分と溶液内部との間で環境に差異が生じやすく、その培養条件の差異のために均質な細胞塊を形成することが困難である。【００１２】
スフェア法は、細胞が接着しないように表面処理した細胞培養用96ウェル丸底プレートに細胞懸濁液を注入し、細胞が自重で各ウェルの丸底の最下部に降下することを利用し、細胞塊を形成する方法である。この方法では、各ウェルにほぼ一定量の細胞懸濁液を注入することができるため、各ウェルで均一な初期細胞数に基づく細胞塊を形成させることができ、比較的均一な一群の細胞塊を作製することができる。しかし、ウェル底に存在する細胞塊を物理的に傷害することなく回収することは非常に困難である等、効率性の点で課題がある。また、効率性を増大させるために、プレート表面に細胞の接着を阻害するための特殊な処理をするためには、コストが高くなり、生産性の点で課題が生じる。【００１３】
カプセル化法（非特許文献4、非特許文献5）は、複数の細胞をゲル化したアルギン酸のカプセルに封入し、細胞をゲル内で増殖させ、細胞塊を形成することを特徴とする方法である。しかしながら、アルギン酸やアガロースなどカプセル化するための薬剤の使用が不可欠であり、作製された細胞塊を治療目的に用いるためには安全性を確認する必要がある。また、各カプセル中の複数の細胞は、それぞれ増殖して細胞塊となった後に、細胞塊同士が集合してさらに細胞塊を形成するために、各カプセルから取り出された胚様体の均一性が低いという課題がある。【００１４】
ハンギングドロップ法は、平面支持体の下面に細胞懸濁液を付着させ、表面張力を利用して、細胞懸濁液が平面支持体の下面部から垂れ下がった状態で保持させ、その垂れ下がった溶液の最下部に細胞が自重で降下し自然集合することを利用した細胞塊の作製方法である（非特許文献6）。そのため、平面支持体の下面に付着させる細胞懸濁液量を一定にすることにより、各細胞塊を形成するための初期細胞数を均一にすることが比較的容易にでき、細胞塊が存在する溶液面において外気とのガス交換が行われるために、上述した既存の方法の中では、細胞塊を作製するための培養条件を最も均一に保ちやすく、その結果、最も均一な性質を持った細胞塊を形成することができる。【００１５】
しかしながら、この方法では、平面支持体の下面に溶液を垂れ下げるため、わずかな振動によって溶液が落下したり溶液が水平移動して溶液同士が融合してしまうため、操作には細心の注意を要する。従って、平面支持体の下面に溶液を付着させるところから細胞塊の回収まで常に水平を保つことが必須であるため、慎重に手作業で行うことが必要であり、機械を用いた自動化による効率化および生産性を上げることは困難である。また、溶液の落下ないし融合を抑制するためには、溶液間の間隙を十分に取る必要があり、培養の単位面積あたりに作製できる細胞塊数には限界があり、大量生産は困難である。また、溶液の落下ないし融合を抑制するために、平面支持体に付着させる細胞懸濁液量を少なくすると、細胞塊を一定期間良好な状態で培養するために少なくとも必要な培養液量、例えばES細胞を用いた胚様体作製時の好ましい培養液量である20μL以上、を確保することが困難となる。以上のように、ハンギングドロップ法は、均質な一群の細胞塊を作製することが可能であるが、産業利用するために必要な効率性や生産性という点で課題があった。
【非特許文献１】Roberts RA and Soames AR., Fundam Appl Toxicol. 1993 21(2): 149-158
【非特許文献２】Mellor HR, et al., Br J Cancer. 2005 93(3): 302-309
【非特許文献３】Gerecht-Nir S, et al., Biotechnol Bioeng. 2004 86(5): 493-502
【非特許文献４】Magyar JP, et al., Ann N Y Acad Sci. 2001 944: 135-143
【非特許文献５】Dang SM, et al., Methods Mol Biol. 2005; 290: 353-364
【非特許文献６】Singla DK and Sobel BE, Biochem Biophys Res Commun. 2005 335(3): 637-42
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記従来の細胞の培養方法の問題点に鑑み成されたものであり、細胞を均一にかつ大量に培養可能な細胞の培養方法、並びに大きさや形などの形態および性質が均一な一群の細胞塊を、大量かつ簡便に生産する方法を提供することを課題とする。【００１７】
本発明の発明者らは、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その培養液の突出部分中で細胞を培養することにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明による細胞の培養方法は、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の前記空洞部内に、細胞を含む培養液を注入し、前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させ、前記培養液の前記突出部分で細胞を培養することを特徴とする。【００１９】
上記本発明において、前記空洞部の他端が閉鎖しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記開口端を上にしかつ前記培養液の一部が前記開口端より上に突出させることによりおこない、前記開口端を下側に向けるようにしてもよい。あるいは、上記本発明において、前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記一端側の開口端を下にして他端側の開口端から行い、前記培養液の注入後、前記他端側の開口端を閉鎖するようにしてもよい。あるいは、上記本発明において、前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記一端側の開口端を培養液に浸し、前記他端側の開口端から吸引することにより行うようにしてもよい。さらにまた、上記本発明において、前記空洞部が前記構造体に複数形成されており、それによって複数の細胞の培養を同時にできるようにしてもよい。【００２０】
本発明による細胞塊の製造方法は、上記細胞の培養方法により細胞を培養して細胞塊を形成することを特徴とする。この細胞塊の製造方法において、前記一端側の開口端より下側に突出した前記培養液の一部を別の培養液の溶液面に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は、下側の一端が開口している空洞部（1b）を有する構造体（1）内に培養液（1a）を注入して培養液を突出させた状態（1a'）で保持することによる、本願発明が提供する新しい方法を示す。
【図２】図2は、図1に示す構造体（1）を使用して、培養液の突出部分（1a'）を作製する方法を例示する。
【図３】図3は、空洞部を有する構造体（1）の空洞部（1c）の両端ともが開口し、該空洞部（1b）内に培養液（1a）を注入して培養液を突出させた状態（1a'）で保持することができる、本願発明が提供する新しい方法の別の態様を示す。
【図４】図4は、図3に示す構造体（1）を使用して、培養液の突出部分を作製する方法として、上側開口部から培養液（a）を吸引する方法を例示する。
【図５】図5は、本願発明が提供する培養方法の一例である、簡便な実施方法である、培養プレートの応用例の模式図（図5（A））およびその拡大図（図5（B））を示す。
【図６】図6は、実施例1、2に記載の、作製した細胞塊である胚様体を溶液中に回収する方法の模式図を示す。
【図７】図7は、既存プレートを用いた場合の、プレートのウェル内径と、培養液の盛り上げ部分を構成し、細胞塊を作製することが可能である適正溶液量との関係を示す。
【図８】図8は、実施例2で作製した均一な胚様体の顕微鏡写真を示す。
【符号の説明】
【００２２】
1：空洞部を有する構造体；1a：空洞部を有する構造体中の培養液；1a'：培養液の突出部分；a：培養液；1b：一端が開口し他端が閉鎖した空洞部；1c：両端ともが開口した空洞部；2：ウェル
【発明の実施の形態】
【００２３】
以下図1ないし図3を参照して本発明の細胞の培養方法の原理について説明する。
【００２４】
図1（A）および（B）において、本発明の細胞の培養方法に使用する構造体（1）が概略的に示されている。この構造体（1）には中に細胞を含んだ培養液（1a）が注入される空洞部（1b）が形成されている。図1（A）において、構造体（1）は均一直径のカップを上下反転した形状になっていて、空洞部（1b）の一端（すなわち図1で下端）は開口し、その他端（すなわち図1で上端）は閉鎖している。また、図1（B）において、構造体（1）は直径が直線状に変化するカップを上下反転した形状になっていて、これも空洞部（1b）の一端は開口し他端は閉鎖している。この閉鎖された側の形状は、どのような形状であってもよく、例えば図1（A）および（B）に例示するように角があっても、丸みがあっても良い。この空洞部（1b）の容積は、培養すべき細胞の種類、最終的に製造する細胞塊の大きさ等を考慮して決められる。
【００２５】
空洞部（1b）内には、細胞を含んだ培養液（1a）が、培養液の一部（1a'）が空洞の一端すなわち下端の開口端より下側に突出するように、注入されている。空洞部に培養液をこのように注入する方法として、図2に示されるように、まず構造体（1）をその空洞部（1b）の開口端が上側になるように配置し、その状態で、培養液（1a）を、一部（1a'）が空洞部の開口端から上に突出するようにすなわち盛り上がるように、空洞部（1b）の中に注入し、その後構造体（1）を上下反転してもよい。このようにすることによって構造体の空洞部内への培養液の注入が容易になり、空洞部の大きさ（横断面積）を培養液の粘性、表面張力を考慮して適切に決めることによって、構造体を反転しても培養液を図1に示される状態に保持することが可能である。
【００２６】
培養液（1a）を構造体（1）の空洞部（1b）内に図1に示されるように保持させることにより、培養液内に含まれた細胞は自重で培養液内を下に降下し、開口端から下側に突出した部分（1a'）内に集まり、細胞塊を形成する。
【００２７】
構造体は図1に示されるようなカップ形でなくても、図3に示されるように、両端が開口した筒形あるいは管形でもよい。すなわち、図3（A）ないし（C）において、筒形または管形の構造体（1）の空洞部（1c）は上下両端とも開口している。このように両端が開口した空洞部内に培養液を注入する方法としては、構造体（1）の上端に、いずれも図示しない供給管、流量制御弁を介して培養液供給源に接続し、その流量制御弁を開いて培養液供給源から供給管を介して構造体の空洞部（1c）内に所定量の培養液を供給し、供給後、培養液の下端が、図3（A）ないし（C）に示されるように、構造体の空洞部の下側の開口端より下に突出するようにさせる（1a'）。これは空洞部の上側開口端から培養液の上部に供給される空気の量を調整することにより可能である。
【００２８】
さらに、別の方法としては、図4に示されるように、構造体の下端を、空洞部の下側開口端が培養液で塞がれるように、培養液aの中に浸し、構造体（1）の上端に図示しない吸引管を接続して空洞部（1c）の上部から空気を吸引し、培養液（a）を構造体の空洞部（1c）内に所定量吸引し、その後構造体（1）を上昇させてその下端が培養液の液面から離すようにしてもよい。
【００２９】
上記のような本発明の方法によれば、構造体内に所定量の培養液を収容し、しかもその培養液の一部を構造体の下端すなわち空洞部の下端側の開口端より下に突出させるようにし、その突出した部分で細胞塊をつくるので、平面基材に溶液の盛り上がりを作るハンギングドロップ法などの従来の方法と比較して、均一な品質の細胞塊を効率的に作製することができる。
【００３０】
本発明の方法で細胞を培養して細胞塊を効率的に作製するためには、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に細胞懸濁培養液の突出部分を作ることが必要である。細胞群を含む溶液を収容する構造体（1）の断面は、該構造体内に細胞が懸濁された溶液を導入し、該構造体の下側開口端から溶液が盛り上がった状態が形成されるものである限り、その形状は限定されない。
【００３１】
構造体の材質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリコンなど、当該技術分野において使用されるどのようなものであってもよい。このような材質は、細胞が接着しにくい素材もしくは、細胞が接着しにくい表面処理を施した素材であることが好ましい。
【００３２】
次に、このような培養液の突出部分中で、細胞を培養して細胞塊を形成する。均一な細胞塊を形成するためには、培養開始時に空洞部内に収容する培養液（すなわち、1aと1a'の総和）中に含まれる細胞数を一定にすることが必要である。培養液中に含まれる細胞数を一定にするためには、培養液中に培養対象である細胞を一定濃度で含有させること、そして空洞部を有する構造体中に含まれる培養液量を一定に保つことが必要である。培養液中に含まれる細胞の濃度と空洞部を有する構造体中に含まれる培養液量は、細胞の増殖速度、形成させる細胞塊の大きさ、そのような細胞塊を形成するための培養日数などの諸条件を勘案して、当業者が適宜決定することができる。
【００３３】
本発明の培養方法は、細胞塊を形成しようとするどのような細胞に対しても使用することができ、適用することができる細胞には特に制限は存在しない。例えば、胚性幹細胞、肝細胞などの細胞塊を形成することが望まれる細胞の培養に、特に適している。
【００３４】
図5において、一つの平板状の構造体に複数の空洞部を形成しそれによって一度に多数の細胞塊を製造する実施形態が示されている。この実施形態は、構造体（1）として市販されている384ウェルもしくは1536ウェルなどの高密度ウェルすなわち空洞部を有する細胞培養用プレートを利用したものである。構造体であるプレート（1）には、例えば384個あるいは1536個の空洞部（1b）すなわちウェル2が整列して形成されている。このプレート（1）を、図5（A）の上段に示されるように、ウェルの開口端が上側になるようにし、各ウェル内（2）に表面が盛り上がる量の細胞懸濁培養液を注入し（1a'）、その後、同図（A）の中段に示されるようにプレート（1）を上下反転させることにより、培養液の一部がウェルの開口端より下側に突出した状態となり、培養液（1a）中の細胞は培養液の突出部分（1a'）の最下部に集まって細胞塊を形成する（同図（A）下段図示）。上述した方法を試験したところ、非常に高密度、小スペース、迅速かつ簡便に細胞塊を大量に作製可能であることが示された。このようにこの実施形態によれば、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、格段に生産性を向上させることができ、また、本願発明の方法と同様に応力を利用したハンギングドロップ法よりも、培養溶液と培養用構造体の接触面積が大きくなり、培養中の溶液が安定化できることから、均質の細胞塊を大量かつ簡便に製造できる。
【００３５】
本願発明においては、上記方法を用いて空洞部を有する構造体の下側開口端の培養液の突出部分中で形成された細胞塊を、該培養液の突出部分を別の培養液の溶液面に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収する方法を提供する（図6）。該培養液の突出部分を別の培養液の溶液面に接触させることにより、培養液の突出部分に存在した細胞塊を自然に別の培養液中に移動、沈降させることができ、非常に容易に細胞塊をプレートから回収することができる。
【００３６】
このように、本発明の方法により作製された細胞塊は、大きさが極めて均一であるだけでなく（図8）、ES細胞を使用して作製した細胞塊（胚様体）から均質な心筋細胞を作製することができることも確認し、作製された細胞塊が均質であることもまた確認した。また、本発明の方法では、従来法では不可能であった培養液の突出部分を単位面積あたりに多く作製することが可能となり、またそれにもかかわらず培養液の突出部分を作製する際の作業が迅速かつ簡便となり、細胞塊作製の効率性、および生産性が飛躍的に向上することが示された。
【００３７】
すなわち、ハンギングドロップ法では、単位面積あたりにより多くの細胞塊を作製するためには、平面支持体に付着させる細胞懸濁液量を少なくしなければならず、一方で細胞塊を一定期間良好な状態で培養するために必要な培養液量を確保しなければならなかったため、単位面積あたりに作製できる細胞塊数には限界があった。しかしながら、本発明の方法では、培養液の突出部分（図5（B）の1a'の部分）と空洞部を有する構造体内の溶液量（図5（B）の1aの部分）とを別個に設定することが可能であるため、培養液の突出部分のサイズを小さくしても、空洞部を有する構造体内の溶液量を多くすることにより、細胞塊を作製するための培養において、必要な培養液量を確保することができる。
【００３８】
また、ハンギングドロップ法では、平面の基材の下側表面に細胞懸濁液を付着させなければならないため、溶液付着の作業が煩雑であり、かつ時間や労力を必要とするものであった。しかしながら、本発明の方法では、空洞部を有する各構造体への細胞懸濁培養液の分注は機械を用いて自動化が可能であり、培養液の突出部分の作製を飛躍的に容易にする。
【００３９】
さらに、本発明の培養方法はまた、同時に培養する各細胞塊が、培養液の突出部分の表面で外気とガス交換を行うことができるため、培養条件を容易に一定に保つことができ、さらに各細胞塊を形成するために使用する細胞数を容易に一定に保つことができるという利点もまた有する。また、本願発明の方法では、下側開口端と培養液の突出部分とのあいだで生じる表面張力が、ハンギングドロップ法の場合に使用される平面と平面に付着している細胞懸濁液間に生じる表面張力よりも格段に強いため、培養液を注入したプレートの上下を反転しても、開口端部分の培養液の突出部分が安定であるという利点も有する。
【００４０】
本願発明における培養容器の空洞部を有する構造体の内径と、培養液の突出部分（図5（B）の1a'の部分に相当）の培養液量との関係についても検討した（図7）。開口部内径が1.83 mm、1.98 mm、3.00 mmおよび7.00 mmである場合、突出部分の培養液の適正量は、それぞれ、0.3〜1.5μL、0.5〜2.0μL、2.0〜20μL、20〜60μLであった。図7のグラフに基づいて、当業者であれば容易に突出部分の適正な培養液量を決定することができる。例えば、マウス胚性幹細胞100細胞を2日間培養するためには、好ましくは20μL以上の培養液が必要である。すなわち、本発明において、盛り上げ部分の適正な培養液量が20μLに満たない開口部内径を有する空洞部を有する構造体を使用する場合には、該構造内に収容される培養液によりその不足分を補償することができる。このことから、本発明においては、20μL以上の構造内容積を有する空洞部を有する構造体（培養器具）を用いることが望ましい。
【実施例】
【００４１】
実施例1：384穴のプレートを用いたマウスES細胞由来胚様体の作製
本実施例においては、市販の細胞培養用384ウェルプレートを用い、各ウェルを空洞部を有する構造体として使用して、本発明の方法を使用して、マウスES細胞から胚様体を作製することにより、プレート単位面積あたりに作製できることの細胞塊数および一群の細胞塊の作成における効率性を調べることを目的として行った。【００４２】
本実施例では、ES細胞として、EB3と呼ばれる細胞株（Niwa H, et al., Nat Genet 2000; 24: 372-376）を用い、最終濃度10％の非動化（55℃、30分）ウシ胎児血清を加えたα-MEM培養液（シグマ社製）で、ES細胞数が75個/35μLの濃度となるように希釈した。【００４３】
次いで、市販品である細胞培養用384ウェルプレート（Greiner社製、型式788161；開口部内径3.0 mm）に上記で調製したマウスES細胞を分注し、以下の方法にしたがって、胚様体を作製した。使用した384ウェルプレートにおける公称の溶液許容量は1ウェルあたり25μLであるが、溶液面を盛り上げるために、1ウェルあたり35μLを分注した。これにより、1ウェルあたりES細胞75個を分注した。この時、開口部水平面までに要した溶液量は28μLであり、盛り上げに要した溶液量は7μLであった。分注には、Theremo Labsystems社製のマルチチャンネルピペット（製品番号4610070）、または、バイオテック株式会社製の分注機械（型式LD-01）を用いた。【００４４】
ES細胞を含む培養液を分注し、培養液が盛り上がった状態のプレートを裏返して、下側開口端に培養液の突出部分を作った。この状態を保ったまま、蓋をしてインキュベーター内で37℃、5％CO2条件下にて培養し（図5）、前記下端側開口端の突出部分中でES細胞を増殖させた。培養開始後1日後に、突出した培養液面が下になっている状態のプレートを清潔なピンセットなどで保持し、別の大型容器中に満たされた最終濃度10％の非動化（55℃、30分）ウシ胎児血清を加えたα-MEM培養液（シグマ社）の表面に培養液の突出部分を接触させ、細胞塊を自重で大型容器中の培養液内へ沈降させることにより、ES細胞由来の細胞塊、すなわち胚様体を回収した（図6）。得られた胚様体は図8に示すように、大きさがほぼ均一な状態であった。【００４５】
384穴のプレートおよびバイオテック株式会社製の分注機械を用いた場合には、機械の分注等の設定にもよるが、本実施例では毎秒24個の割合でES細胞を含む培養液をプレートに分注することができた。このことから、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、培養液の突出部分を作製するために必要な時間を大幅に削減することができることが明らかになった。また、大きさがほぼ均一な胚様体を大量に作製することもできた。これらから、本発明により、産業的に利用可能な高い効率性で、細胞塊を大量かつ迅速に生産および回収することができる方法を提供することができた。【００４６】
実施例2：1536穴プレートを用いたマウスES細胞由来胚様体の作製
本実施例においては、市販の細胞培養用1536ウェルプレートを用い、各ウェルを有するプレートを空洞部を有する構造体として使用して、本発明の方法を使用して、マウスES細胞から胚様体を作製することにより、プレート単位面積あたりに作製できることの細胞塊数および一群の細胞塊の作成における効率性を調べることを目的として行った。【００４７】
本実施例では、実施例1と同様にES細胞としてEB3細胞株を用い、最終濃度10％の非動化（55℃、30分）ウシ胎児血清を加えたα-MEM培養液（シグマ社製）で、ES細胞数が75個/12.4μLの濃度となるように希釈した。【００４８】
次いで、市販品である細胞培養用1536ウェルプレート（Genentix社製、型式X1536 PS；開口部内径1.83 mm）に上記で調製したマウスES細胞を分注し、以下の方法にしたがって、胚様体を作製した。使用した1536ウェルプレートにおける公称の溶液許容量は1ウェルあたり8μLであるが、溶液面を盛り上げるために、1ウェルあたり12.4μLを分注した。この時、開口部水平面までに要した溶液量は11μLであり、盛り上げに要した溶液量は1.4μLであった。すなわち1ウェルあたりES細胞75個を分注した。分注には、バイオテック株式会社製の分注機械（型式LD-01）を用いた。【００４９】
実施例1と同様に、ES細胞を含む培養液を分注して、下端側開口端の突出部分中でES細胞を培養し、ES細胞に由来する細胞塊、すなわち胚様体を回収した。得られた胚様体は実施例1の場合と同様に、大きさがほぼ均一な状態であった。【００５０】
1536穴のプレートおよびバイオテック株式会社製の分注機械を用いた場合には、機械の分注等の設定にもよるが、本実施例では毎秒28個の割合でES細胞を含む培養液をプレートに分注することができた。このことから、本実施例においても、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、培養液の突出部分を作製するために必要な時間を大幅に削減することができることが明らかになった。また、大きさがほぼ均一な胚様体を大量に作製することもできた。これらから、本発明により、産業的に利用可能な高い効率性で、細胞塊を大量かつ迅速に生産および回収することができる方法を提供することができた。【００５１】
実施例3：各種プレート内径と培養液の突出部分の形成に必要な適正溶液量の検討
本実施例おいては、市販品である各種の細胞培養用プレートにおいて、細胞塊を作製するために培養液が突出部分を形成し、かつプレートを上下反転しても培養液が落下することのない、突出部分の形成に必要な適正溶液量と各種プレートの開口部内径の関係について検討した。【００５２】
本実施例においては、実施例1と同様に、最終濃度10％の非動化（55℃、30分）ウシ胎児血清を加えたα-MEM培養液（シグマ社製）を用いた。【００５３】
本実施例では、市販品である細胞培養用プレートであるGenentix社製の1536ウェル(X1536 PS；内径1.83 mm)、Nunc社製の384ウェル(164320)、Greiner社製の384ウェル(788161；内径3.00 mm)、住友ベークライト社製の96ウェル(MS-0096S；内径7.00 mm)を用いた。なお、Nunc社製の384ウェル(164320)を用いた際には、ウェル(内径3.00 mm)とウェル間にある小さいウェル(内径1.98 mm)を利用した。各プレートのウェルの開口部内径は、各プレートのウェルを顕微鏡写真で撮影し、同時に撮影した顕微鏡用のスケールを用いて、各プレートのウェルの開口部の直径を計測することにより得られた。【００５４】
次に、各プレートのウェルに、様々な容量の培養液を分注し、培養液の溶液面が盛り上がり、かつ培養液を分注したプレートを逆さまにしても培養液がこぼれることなく下端側開口端において培養液の突出部分を形成し、細胞培養が可能であるような培養液の突出部分の形成に必要な適正溶液量について検討した。【００５５】
その結果を図7に示した。ウェルが溶液で完全に満たされた状態（ウェル上面と溶液の面が水平）から溶液をさらに盛り上げるために必要な溶液量のうち、突出部分の安定性を判断した適正な溶液範囲の目安を示した。1536ウェルプレート（内径1.83 mm）では、0.3〜1.5μL、好ましくは1μL、384ウェルプレート（内径1.98 mm）では、0.5〜2μL、好ましくは1.5μL、384ウェルプレート（内径3.0 mm）では、2〜20μL、好ましくは15μL、96ウェルプレート（内径7.00mm）では、10〜60μL、好ましくは50μLの時に、培養液の突出部分を下向きにした場合に安定して保持できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法により、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、構造体（すなわち培養支持体）からの培養液の突出部分を作製するために必要な時間を大幅に削減することができることが明らかになった。また、大きさなどの状態および性質がほぼ均一な、すなわち均質な胚様体を容易に、また大量に作製することもできた。すなわち、本発明により、産業的に利用可能な高い効率性で、細胞塊を大量かつ迅速に生産および回収することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月26日(2007.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の前記空洞部内に、細胞を含む培養液を注入し、
前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させ、
前記培養液の前記突出部分で細胞を培養することを特徴とする、細胞の培養方法。
【請求項２】
前記空洞部の他端が閉鎖しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前記開口端を上にしかつ前記培養液の一部が前記開口端より上に突出させることによりおこない、前記開口端を下側に向けることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記空洞部が前記構造体に複数形成されており、それによって複数の細胞の培養を同時にできることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１、２または５のいずれかに記載の細胞の培養方法により細胞を培養して細胞塊を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
【請求項７】
請求項１、２または５のいずれかに記載の細胞の培養方法により胚性幹細胞を培養して胚様体を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
【請求項８】
前記一端側の開口端より下側に突出した前記培養液の一部を別の培養液の液面に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収することを特徴とする、請求項６または７に記載の細胞塊の製造方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記開口端の内径が１．８３〜３．００ｍｍである、請求項２に記載の細胞の培養方法。
【請求項１１】
前記開口端の内径が１．８３〜１．９８ｍｍである、請求項２に記載の細胞の培養方法。
【国際調査報告】
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