(57)【要約】  本発明は、前処理手段を有し、信頼性で可能とする核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムを提供する。本発明の核酸検査システムは、試薬類・送液系用のエレメントを搭載した、検体ごとのチップコンポーネントと、検査装置本体として、制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成である。検体中の核酸を抽出し、濃縮する前処理工程を行う検体前処理部を有するため、希薄試料であっても該物質を濃縮することができ、同時に反応を妨害する有害物質、流路の目詰まりを起こす夾雑物を除外する。また、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に分析できる流路構成を有する。したがって、微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった深刻な問題が生じにくい。
2007055165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞から核酸を抽出し、分離する方法であって、
（i）細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルターAと、該細胞より小さい孔径のフィルターBとに順次通過させて該フィルターＢの供給口側に該細胞を保持する、
（ii）該フィルターBの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流すことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
（iii）次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すことにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
（iv）その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部のカソード側に核酸を集める、
（v）その核酸捕捉部のカソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部から回収する、
ことを特徴とする核酸の分離方法。
【請求項２】
前記ビーズが、それらを保持する該細胞破壊部の上面に付設された外部アクチュエータの作用により振動させられている、ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸の分離方法。
【請求項３】
前記の外部アクチュエータが、圧電PZTセラミック振動子であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の核酸の分離方法。
【請求項４】
前記電場が、櫛型構造の該核酸捕捉部もしくは夾雑物捕捉部の上面に付設された、１対の外部対向電極により印加される、ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸の分離方法。
【請求項５】
前記核酸捕捉部のカソード側に集まった核酸を回収する際に、電場の当初の方向を逆転するように電圧を外部対向電極に印加する、ことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の核酸の分離方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載の核酸の分離方法におけるステップ（i）およびステップ（ii）を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、
前記のフィルターAおよびフィルターBを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側と取り出し口側に配置し、これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間が形成されるともに、その側壁面に洗浄液排出管を貫通させており、入り口、取り出し口および排出管にある各穴が開閉される手段を有することを特徴とする細胞ろ過装置。
【請求項７】
細胞を含有する液を受ける検体受容部、並びに、該検体受容部から送出される細胞を破壊する細胞破壊部及び該細胞破壊部において破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する核酸捕捉部を有する検体前処理部を備えており、前記検体受容部、細胞破壊部及び核酸捕捉部が微細流路で連通されていることを特徴とする核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項８】
さらに、試薬を収容する試薬収容部、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部および各部を連通する微細流路を有し、
前記微細流路の下流に前記検体前処理部で前処理された検体液と前記試薬収容部に収容される試薬が反応する反応部を構成する流路、及び該反応部で反応して得られる反応物を検出する検出部を構成する流路が設けられていることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項９】
前記細胞破壊部は、該細胞破壊部に配置される外部アクチュエータにより振動させられて細胞を破壊するビーズを有し、
前記核酸捕捉部は、該核酸捕捉部に配置される外部電極に印加される電場により、前記細胞破壊部で破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する、ことを特徴とする請求の範囲第７項または第８項に記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項１０】
前記マイクロポンプ接続部は、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと、
を有するマイクロポンプに接続されることを特徴とする請求の範囲第８項または第９項に記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項１１】
前記廃液貯留部が、マイクロリアクタの底部に設けられ、少なくとも前記検体前処理部および前記検出部の端部と連通した中空室であることを特徴とする請求の範囲第８項乃至第１０項のいずれかに記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項１２】
分岐した微細流路と、
予め設定された圧より低い圧では液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の圧では液体の通過を許容する、送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部と、
から構成され、
分岐した流路内における液体の送液および送液量の定量を制御する送液分割手段を有することを特徴とする請求の範囲第８項乃至第１１項のいずれかに記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
【請求項１３】
細胞から抽出された核酸の検出を光学的に行う検出装置とともにマイクロポンプおよび温度の制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な請求の範囲第７項乃至第１２項のいずれかに記載の核酸検査用マイクロリアクタとからなり、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、核酸の測定を行うことを特徴とする核酸検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の分離方法、核酸検査用マイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタを含む核酸検査システムに関するものである。さらに詳しくは、核酸の分離方法を適用した前処理手段を有する核酸検査用マイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタを含む核酸検査システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、
μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。【０００３】
臨床検査を始めとする各種検査を行う現場では、場所を選ばず迅速に結果を出すこれらの分析用チップにおける測定においても、その定量性、解析の精度などが重要視される。分析チップではそのサイズ、形態の点から厳しい制約があるため、シンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題となる。そのため精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献１および２）。【０００４】
チップ上で検査などを行うために、試料の必要量を極少の量とし、必要とされる試薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロリアクタに求められる最大課題である。ところが試料によっては、検出対象である遺伝子または核酸の濃度が希薄であることがある。チップに導入できる検体量も限られていることから、そうした検体量では測定可能な範囲内に収まらない。したがって、チップに導入する前に予備的な濃縮または分離の操作が必要となってくる。あるいは微量の反応生成物を高感度でしかも簡便に検出、または定量できる機構をチップに搭載することが必要とされる。遺伝子の検出では、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法による増幅反応を利用するのが通例である。血液などの生体液を試料とする場合、そのまま検体として分析に供することができないことが多く、通常は何らかの前処理を加えることが要求されることも多い。【０００５】
生物試料から核酸を抽出、分離する方法として、化学的方法または物理的方法が用いられる。後者に属する方法として、振動するビーズの作用により細胞から核酸を抽出する方法（特許文献３）、電場を適用して分離、濃縮する方法（特許文献４および５）が報告されている。これらの方法をそのまま超微細な装置のマイクロリアクタに適用することには、多くの問題がある。【０００６】
このように簡便かつ迅速な検査手段を提供するマイクロリアクタには、実用上依然として解決すべき具体的な問題、要望が提起され、その解決が望まれている。
【特許文献１】特開2001-322099号公報
【特許文献２】特開2004-108285号公報
【特許文献３】特表2003-522521号公報
【特許文献４】特開2004-217号公報
【特許文献５】ＷＯ02/23180号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の実状に鑑みてなされた本発明は、微量または濃度が希薄な試料であっても前処理手段および廃液溜りを有するチップにより、高感度の分析を可能とする核酸検査用マイクロリアクタを提案する。しかも感染および汚染の危険の少ない分析ツールとするために、そのマイクロリアクタは、ディスポーサルタイプとしている。さらに本発明はシンプルな構成と高精度の送液システムを組み込み、しかも精度の高い分析を可能とする核酸検査システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の核酸の分離方法は、細胞から核酸を抽出し、分離する方法であって、
（i）細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルターAと、該細胞より小さい孔径のフィルターBとに順次通過させて該フィルターＢの供給口側に該細胞を保持する、
（ii）該フィルターBの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流すことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
（iii）次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すことにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
（iv）その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部のカソード側に核酸を集める、
（v）その核酸捕捉部のカソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部から
回収する、
ことを特徴としている。【０００９】
前記ビーズが、それらを保持する該細胞破壊部の上面に付設された外部アクチュエータの作用により振動させられている。この外部アクチュエータは、好ましくは圧電PZTセラミック振動子である。【００１０】
前記電場が、櫛型構造の該核酸捕捉部もしくは夾雑物捕捉部の上面に付設された、１対の外部対向電極により印加されることが望ましい。【００１１】
また、前記核酸捕捉部のカソード側に集まった核酸を回収する際に、電場の当初の方向を逆転するように電圧を外部対向電極に印加することが望ましい。【００１２】
本発明の細胞ろ過装置は、上記の核酸の分離方法における前記ステップ（i）およびステップ（ii）を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、前記のフィルターAおよびフィルターBを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側と取り出し口側に配置し、これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間が形成されるともに、その側壁面に洗浄液排出管を貫通させており、入り口、取り出し口および排出管にある各穴が開閉される手段を有することを特徴としている。【００１３】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、細胞を含有する液を受ける検体受容部、並びに、該検体受容部から送出される細胞を破壊する細胞破壊部及び該細胞破壊部において破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する核酸捕捉部を有する検体前処理部を備えており、前記検体受容部、細胞破壊部及び核酸捕捉部が微細流路で連通されていることを特徴としている。【００１４】
さらに、本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、試薬を収容する試薬収容部、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部および各部を連通する微細流路を有し、
前記微細流路の下流に前記検体前処理部で前処理された検体液と前記試薬収容部に収容される試薬が反応する反応部を構成する流路、及び該反応部で反応して得られる反応物を検出する検出部を構成する流路が設けられていることを特徴としている。【００１５】
前記細胞破壊部は、該細胞破壊部に配置される外部アクチュエータにより振動させられて細胞を破壊するビーズを有し、
前記核酸捕捉部は、該核酸捕捉部に配置される外部電極に印加される電場により、前記細胞破壊部で破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する、ことを特徴としている。【００１６】
前記マイクロポンプ接続部は、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと、
を有するマイクロポンプに接続されることを特徴としている。【００１７】
前記廃液貯留部が、マイクロリアクタの底部に設けられ、少なくとも前記検体前処理部および前記検出部の端部と連通した中空室であることを特徴としている。【００１８】
また、本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、
分岐した微細流路と、
予め設定された圧より低い圧では液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の圧では液体の通過を許容する、送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部と、
から構成され、
分岐した流路内における液体の送液および送液量の定量を制御する送液分割手段を有することを特徴としている。【００１９】
さらに、細胞から抽出された核酸の検出を光学的に行う検出装置とともにマイクロポンプおよび温度の制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な前記本発明の核酸検査用マイクロリアクタとからなり、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、核酸の測定を行うことを特徴としている核酸検査システムも本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の核酸検査システムは、試薬類・送液系用のエレメントを搭載した、検体ごとのマイクロリアクタであるチップ・コンポーネント、装置本体である制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成である。よって微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションが生じにくい。【００２１】
マイクロリアクタのチップでは検体を導入できる容量がきわめて限られているために、目的の核酸または菌の濃度が薄いとこれを捕捉することが困難となる。本発明の核酸検査用マイクロリアクタの構成によれば、細胞から分析対象物質である核酸、遺伝子を抽出し、分離して濃縮することが可能な検体前処理部を有する。したがって希薄試料でも該物質を濃縮することができ、同時に反応を妨害する有害物質、流路の目詰まりを起こす夾雑物を除外することもできる。【００２２】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、反応阻害、コンタミネーション、バックグラウンドの上昇などによる影響を排除するために、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に分析できる流路構成を有する。このようなマイクロリアクタにより、超微量の検体量であっても、信頼性の高い高精度の分析を実現する。【００２３】
本発明の核酸検査システムおよび核酸検査用マイクロリアクタを用いることによる各種遺伝子検査法は、その装置の構成と分析原理から、従来の核酸配列分析、制限酵素分析、核酸ハイブリダイゼーション分析と比べ、はるかに少ない検体量、僅かな手間と簡便な装置により高い精度の結果を得ることができることが明らかである。【００２４】
本発明の核酸検査システムは、遺伝子の種々の解析、臨床検査・診断、医薬スクリーニング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性・毒性の検査、環境分析、食品検査、法医学、化学、醸造、漁業、畜産、農産製造、農林業等で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、核酸検査用マイクロリアクタと装置本体とからなる核酸検査システムの概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態における核酸検査用マイクロリアクタの概略図である。なお、マイクロポンプは、核酸検査用マイクロリアクタとは別途の装置に属する。
【図３】図３は、本発明の細胞ろ過装置の概略図であり、上図が正面図、下図が断面図を示す。
【図４】図４は、細胞ろ過装置を使用して細胞を回収する手順を示した図である。
【図５】図５は、本発明の核酸検査用マイクロリアクタに付設された前処理部の断面図を示す。左側のコンパートメントは、細胞破壊部、右側が核酸捕捉部を表す。
【図６】図６は、ピエゾポンプを示し、図３（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、図３（ｂ）は、その上面図である。図３（ｃ）は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
【図７】図７は、ピエゾポンプをマイクロリアクタとは別体とした場合における核酸検査用マイクロリアクタのポンプ接続部周辺の構成を示した図である。
【符号の説明】
【００２６】
１  装置本体
２  マイクロリアクタ（検査チップ）
３  ペルチェ素子
４  ヒーター
５  ホトダイオード
６  ＬＥＤ
１０  駆動液タンク
１１  マイクロポンプ（ピエゾポンプ）
１２  ポンプ接続部
１３  送液制御部
１５  流路
１８  試薬収容部
１９  検体
２０  検体受容部
２４  駆動液収容部
２５  封止液収容部
２６  空気抜き用流路
３１  試薬
４１  上側基板
４２  基板
４３  振動板
４４  圧電素子
４５  加圧室
４６  第１流路
４７  第２流路
４８  第１液室
４９  第２液室
７１  シリコン基板
７２  ポート
７３  ポート
８１  入り口側
８２  取り出し口側
８３  洗浄液排出管
８４  フィルターＡ
８５  フィルターＢ
８６  ろ過空間
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
一般に、血液、尿などの生物試料は、試料に含まれる不要成分（タンパク質、脂質やイオン性物質など）を除去するために、分析に先立って検体の前処理が必要とすることが通例である。マイクロリアクタにおいても、搭載された分析システムが優れた性能を発揮できるのは、検体が標準品のような理想的な状態にある場合に限られることも往々にしてあり、検体前処理が適切に行われているかが分析の成否を左右することも多い。しかし試料の前処理自体が煩雑な時間のかかる工程であって、しかも適切に実施するのにも技術と経験が必要とされるのが現状である。特に臨床現場からの試料は、ウィルス、細菌などの感染、汚染の危険性を常に内包している。そうした試料の前処理もまた、分析・検出を行う同一のチップにおいて、その全体または一部であっても安全に実施でき、測定可能である検体を迅速かつ自動的に調製できれば、このような態様でチップ化することの意義は極めて大きい。【００２８】
以下、本発明の核酸検査用マイクロリアクタ（以下、単にマイクロリアクタということもある。）およびこのマイクロリアクタとマイクロポンプ、各種制御装置、検出装置とからなる核酸検査システムについて説明する。なお本明細書において、「検体」とは、測定対象の核酸を含有する流体である。「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡの形でいうこともある。これらとポリヌクレオチドを総称して「核酸」という。「エレメント」とは、マイクロリアクタに設置される機能部品をいう。「微細流路」は、本発明のマイクロリアクタに形成された流路のことである。【００２９】
［核酸分離方法］
本発明の核酸の分離方法は、細胞から核酸を抽出し、分離する方法であって、
（i）細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルターAと、該細胞より小さい孔径のフィルターBとに順次通過させて該フィルターＢの供給口側に該細胞を保持する、
（ii）該フィルターBの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流すことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
（iii）次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すことにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
（iv）その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部のカソード側に核酸を集める、
（v）その核酸捕捉部のカソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部から回収する、
ことを特徴とする。【００３０】
本発明の核酸の分離方法において使用されるフィルターのメッシュは、細胞、血球、ウィルス、細菌などのサイズなどを考慮する。フィルターの形態、フィルター層の厚さなども目的に応じて適切に設定する。例えば、最初に不溶性物質、塵などを濾過除去し、その後に所定の処理を行うために、サイズを変えた2種のフィルターを併用する。フィルターの形状として、層状に積載した形態、樹脂の層、中空糸の集合形態などがあるが任意に選択される。【００３１】
フィルターAは、目的の核酸を含有する、試料中の細胞より大きい孔径のフィルターであり、いわゆる「プレフィルター」として不溶性の夾雑物質、塵などをろ過除去するためのものである。他方、フィルターBは、該細胞より小さい孔径の「滅菌フィルター」であり、細胞はフィルターＢを通過できず、フィルターAおよびフィルターBで隔絶された空間内部、あるいは該フィルターＢの供給口側（取り出し口の反対側）に保持される。【００３２】
穴の大きさが大きいフィルターＡは、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織などの粗粒物質を濾過する。従って、その平均的な穴の大きさは、試料流体からそうした粗粒物質を濾過して取り除くのに充分小さく、かつ、核酸を含有する目的細胞やウィルスを通過させるのに充分大きくなるように選択される。一般に、その穴の大きさは、約２〜２５μｍの範囲にあるのが望ましく、好ましくは約５μｍである。【００３３】
穴の大きさが小さいフィルターＢは、試料流体中の細胞やウィルスを捕捉する。その平均的な穴の大きさは、目的の核酸を含有する細胞あるいはウィルスの平均的な大きさに応じて選択される。例えば、0.1〜５μｍ、好ましくは0.5〜２μｍである。【００３４】
フィルターは、市販のフィルターを装着すればよく、例えばセルロースアセテート、硝酸セルロース混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、グラスファイバーなどのメンブレン・フィルターが示され、フィルター用ハウジジングの材質としてポリビニルカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラスなどが挙げられる。【００３５】
上記フィルターBの該細胞を保持する側と反対の側である取り出し口から、洗浄液を該空間内に流し入れることにより、該細胞をその洗浄液中に取り出すことができる。次いで、細胞が分散している該洗浄液を、流路を通して、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通す。これにより、振動するビーズと衝突することにより、細胞が破壊され、その内容物が液中に放出される。放出された核酸などを含む核酸抽出液を、さらに流路を横断する方向に電場がかけられている核酸捕捉部に通す。マイナスに荷電した線状分子である核酸は、陽極側に泳動して集まる傾向を有する。該核酸捕捉部のカソード側に集められた核酸は、核酸回収液で該核酸捕捉部から分離することができる。【００３６】
上記の洗浄液、抽出液および回収液は、特に限定されないが、各種の塩溶液、緩衝液、生理食塩水といった水性の液体である。【００３７】
本発明の核酸の分離方法により簡便に細胞が採取され、その細胞から核酸が抽出され、しかも濃縮された形で分離することができる。本発明の核酸の分離方法は、以下の細胞ろ過装置、マイクロリアクタ上に設置された検体前処理部で容易に実施される。【００３８】
［細胞ろ過装置］
本発明の細胞ろ過装置は、本発明の核酸の分離方法における前記ステップ（i）およびステップ（ii）を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、以下の構成を有することを特徴としている。【００３９】
前記フィルターAおよびフィルターBを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側81と取り出し口側82に配置し、これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間（ろ過空間）86が形成され、その側壁面に洗浄液排出管83を有しており、入り口、取り出し口および排出管にある各穴は、随意に開閉できる手段を有する（図３）。【００４０】
上記空間86はろ液溜めであるが、好ましくは円筒形であり、例えば注射筒タイプの装置が好都合である。材質も透明なプラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどが取り扱いやすく、作製も容易なために好適な材質であるが、特にこれらに限定されない。【００４１】
さらに細胞を含む試料液体を導入するための入り口、ろ過液を廃棄する取り出し口、さらに洗浄液を回収する洗浄液排出管にある穴には、開閉可能な手段を有しており、処理の各段階に必要に応じてそれらの穴を開閉する。そうした手段の好ましい例として、着脱可能なスクリューキャップ、プラグ栓または三方コックなどであってもよい。【００４２】
本発明のろ過装置のサイズ、特に上記空間86のサイズは、試料の種類、濃度などによって適宜設定される。一般的には１〜50ｍｌ容量であれば、取り扱い、操作も手軽である。【００４３】
この細胞ろ過装置を用いることにより、以下のようにして本発明の核酸の分離方法における前記ステップ（i）およびステップ（ii）を簡便に実施することができる（図４）。【００４４】
採取された試料液体を収容する試料容器（採血管、尿カップ、バイアル、試料びんなど）に、本発明の細胞ろ過装置の入り口側81を試料液中に入れる。反対側の取り出し口側82から吸引して、試料液をフィルターＡ８４越しにろ過空間（ろ液溜め）86に導入する。必要な分量だけの試料液を採取したら、試料容器から細胞ろ過装置を取り出す。さらに吸引を続行して、ろ過空間中のろ液を次のフィルターＢ８５越しにろ過して、そのろ液は取り出し口側82から廃棄する。その結果当該ろ過空間に残留する部分は、フィルターＢ８５の細孔を通過できない細胞などが含まれる。【００４５】
吸引は、例えば水流ポンプを始めとする適当な減圧手段で吸引してもよいが、検体の必要量を多くする必要がない場合には、ディスポーザブルシリンジ、真空採血管などをこの取り出し口側の穴に装着して吸引してもよい。真空採血管の場合には装着後、自動的に吸引する。フィルターＢを通過したろ過液は、ディスポーザブルシリンジ、真空採血管内に収容されるために好都合である。【００４６】
次に洗浄液を、取り出し口側82から上記空間内へ送り込み、細胞を含有する液体を洗浄する。不要な洗浄液は、取り出し口側82から吸引して除去する。必要であれば、これをさらに繰り返す。【００４７】
次いで、入り口側81の穴を閉じ、それまで終始閉じてあった洗浄液排出管83の穴を開き、取り出し口側82から空気などを送り込んで加圧することにより、取り出し口側から送り込んだ洗浄液を、開いた洗浄液排管から取り出す。その洗浄液には細胞が含有されている。【００４８】
細胞が含有されている洗浄液を直接に本発明の核酸分析用マイクロリアクタの検体受容部に注入する。そのため洗浄液排出管と検体受容部は液密に接合する形態となっていることが好ましい。細胞ろ過装置の側壁に設けられた洗浄液排出管の位置、サイズなどは、チップであるマイクロリアクタとの上記関係で最適となるように設計される。簡便には洗浄液排出管にニードル・チップを装着し、マイクロリアクタの検体受容部のシリコンゴム製検体挿入口に刺して注入してもよい。【００４９】
本発明の細胞ろ過装置を核酸分析用マイクロリアクタと別途の装置とすることの利点として以下のことがらが挙げられる。【００５０】
まず、マイクロリアクタの寸法上の制約から、別途の装置とすることにより、検体の様々な事情に応じた細胞ろ過装置の形態、サイズなどをマイクロリアクタとは別個に設計できる。上記の構成で明らかなように、本発明の細胞ろ過装置は極めてシンプルな構成となっている。【００５１】
マイクロリアクタの微細流路内にフィルターを設置する必要がなくなり、フィルターの目詰まりなどによる流路抵抗の上昇、乱流の発生などのトラブルから回避できる。【００５２】
不溶性の夾雑物を予め除去できるとともに、簡便に細胞を試料液から分離することができ、目的の細胞のみを含有する洗浄液を適切な分量でマイクロリアクタの検体受容部に注入できる。【００５３】
本発明の細胞ろ過装置では、細胞を懸濁する洗浄液中の細胞数も容易に調整できる。検出の対象である核酸、特にウィルスまたは菌類（細菌、真菌類）などの微生物の遺伝子が、極めて低濃度で存在する試料が実際には多い。例えば伝染病の検出では、グラム陰性のバクテリアは血液１ミリリットルにつき１０コピー以下で存在し、クリプトスポリジウムは通常飲料水１ガロンにつきほんの２，３コピー、炭疽菌などは水１ミリリットルにつき１００コピー以下で現れる。上述したようにマイクロリアクタのチップでは検体を導入する容量がきわめて限られているため、試料液中の対象菌の濃度が薄いとこれを捕捉することが実質的に不可能となる。そこでフィルターA越しに大量の試料液を流してフィルターB内で濃縮することも可能であることは極めて有用である。【００５４】
本発明の細胞ろ過装置を使用することにより、細菌、ウィルスなどに汚染されることなく、簡便かつ清浄に細胞を分離し、本発明の核酸検査用マイクロリアクタへ検体を移すことができる。【００５５】
特に汚染の危険がなければ、市販のディスポーザブル・シリンジとシリンジ・フィルターを使用することにより、やや煩雑であるが上記と同様の処理を行うこともできる。具体的には、最初に適当な容量のプラスチックシリンジにフィルターＡに相当する市販シリンジ・フィルター（シリンジに装着するタイプの小容量ろ過フィルター）を装着し、試料液中に入れて試料液をシリンジ内に吸引する。次にフィルターＡをはずし、代わりにフィルターＢに相当する市販シリンジ・フィルターを第２番目のフィルターとして装着し、プランジャーを押すことによりシリンジ内の試料液を、当該フィルターを通してろ過する。その後、第２フィルターを装着したまま、洗浄液を吸引し、排出して、必要なら反復して洗浄操作を行う。細胞は、シリンジ内に止まっているため、洗浄操作後、第２のフィルターをはずし、代わりにニードル・チップを装着し細胞を含有する洗浄液をマイクロリアクタに移せばよい。【００５６】
［核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムの概要］
図１は、装置本体に脱着可能な核酸検査用マイクロリアクタと装置本体とからなる核酸検査システムの一実施形態における概略図である。また、図２は、本発明の一実施形態における核酸検査用マイクロリアクタの概略図である。本発明は、種々の実施の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明の核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムの全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。【００５７】
図１および図２に示した核酸検査用マイクロリアクタ２は、プラスチック樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどの１以上の部材を適宜組み合わせて作製される一枚のチップである。好ましくは、マイクロリアクタの微細流路および躯体は、加工成型が容易で安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。なかでもポリスチレン樹脂は成型性に優れ、後述するようにストレプトアビジンなどを吸着する傾向が強く、微細流路上に検出部を容易に形成することができるために望ましい。微細流路は、例えば幅１００μｍ、深さ１００μｍ程度に形成される。また、そうしたマイクロリアクタにおいて、蛍光物質または呈色反応の生成物などを光学的に検出するために、マイクロリアクタ表面のうち少なくとも微細流路の検出部を覆うその検出部分は透明である部材、好ましくは透明なプラスチックとなっていることが必要である。【００５８】
図２は、本発明の核酸検査用マイクロリアクタの典型的な流路構成の一例を示すものである。【００５９】
本発明の核酸検査システムは、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置および検出装置などが一体化された装置本体１と、この装置本体１に装着可能なマイクロリアクタ２とからなる。予め試薬が封入されたマイクロリアクタ２の検体受容部に検体液を注入して、そのマイクロリアクタ２を核酸検査システムの本体１に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされる。したがって装置本体１とこのマイクロリアクタ２とを接合させると、マイクロリアクタ２の流路も作動状態となる。好ましくは分析が開始されると、検体および試薬類の送液、混合に基づく核酸の増幅、核酸とプローブとの結合などの反応、反応物の検出および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納され、核酸の測定が自動的に行われる。【００６０】
前記検出装置とは、検査項目ごとの分析流路上の検出部に対して、例えばＬＥＤなどから測定光を照射し、フォトダイオード、光電子増倍管などの光学的検出の手段で透過光もしくは反射光を検出する装置である。光学的検出の手段として、原理を異にする各種の光学装置があるが、紫外・可視分光光度計が望ましい。上記検出装置に組み込んだ装置であってもよく、あるいは別途の装置として、使用時に連結する態様であってもよい。好ましくは、本発明の核酸検査システムは、検体に含有されている核酸の検出を光学的に行う検出装置が、上記マイクロポンプを含む送液手段および温度制御装置とともに装置本体１に組み込まれ、一体化した構成となっている。【００６１】
送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学的検出、データの収集および処理を受け持つユニットは、マイクロポンプおよび光学装置とともに本発明の核酸検査システムの本体を構成する。この装置本体１は、これに核酸検査用マイクロリアクタ２を装着することにより検体サンプルに対して共通で使用される。上記の増幅などの反応および検出は、送液順序、容量、タイミングなどについて予め設定された条件として、マイクロポンプおよび温度の制御、光学的検出のデータ処理とともにプログラムとして核酸検査システムに搭載されたソフトウェアに組みこまれている。従来の分析チップでは、異なる分析または合成などを行う場合には、変更される内容に対応するマイクロ流体デバイスをその都度構成する必要があった。これとは異なり、本発明では脱着可能な核酸検査用マイクロリアクタのみ交換すればよい。各エレメントの制御変更も必要となる場合には、装置本体１に格納された制御プログラムを適宜改変すればよい。【００６２】
本発明の核酸検査システムは、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。場所、時間を問わず迅速に測定することができるために、緊急医療での利用や、在宅医療での個人的な利用も可能である。送液に使用する多数のマイクロポンプユニットが装置本体１側に組み込まれているので、核酸検査用マイクロリアクタはディスポーザブルタイプとして使用できる。【００６３】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムは、特に遺伝子または核酸の検査に好適に用いることができる。その場合、DNA増幅のための機構が核酸検査用マイクロリアクタ上に搭載される。しかし、遺伝子以外の核酸についても基本的な構成は、ほぼ同一になるといえる。例えば逆転写酵素収容部を設置してもよい。通常は検体前処理部、試薬類、プローブ類などを変更すればよく、その場合、送液エレメントの配置、数などは変化するであろう。【００６４】
［核酸検査用マイクロリアクタ］
本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、検体受容部、検体前処理部、試薬収容部、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部および微細流路を有している。前記細胞ろ過装置からその洗浄液排出管を通して、細胞を含有する洗浄液を受ける検体受容部ならびに検体前処理部である細胞破壊部および核酸捕捉部を備えており、各部を微細流路で連通させている。該検体受容部にある、細胞、ウィルスを含有する洗浄液を、検体液として微細流路を通して該検体前処理部に送り、該検体前処理部の前処理手段を用いて検体液を前処理することにより、測定対象の核酸を抽出、分離、濃縮し、該物質を該微細流路の下流に設けられた、反応部を構成する流路、次いで検出部を構成する流路へ流して測定するとともに、核酸の濃縮および測定の結果、生じる廃液を該廃液貯留部へ移して閉じ込めることを特徴とする核酸検査用マイクロリアクタである。【００６５】
さらに各収容部、流路、ポンプ接続部に加えて、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。【００６６】
［検体前処理部］
・前処理
試料の前処理として、目的物質である核酸を増幅、検出に先立ち、分離、濃縮することが望ましい。試料によっては、検出対象の核酸濃度が極めて希薄である。そうした場合、マイクロリアクタに導入できる試料液量（数ｃｍ四方のチップで、数μL）も限られていることから、そのままでは測定可能な範囲内に収まらない。したがって、目的物質の濃縮または分離の操作が必要となってくる。さらにＲＮＡの場合、適当な逆転写酵素を利用してｃＤＮＡに変換してから分析に供することになる。【００６７】
このような前処理操作は、従来の分析チップの所定位置に一定量の検体を一度に適用し、その検体について測定する方式とは異なる操作である。本発明では、核酸検査用マイクロリアクタに適用する前の段階の前処理と、その後に核酸検査用マイクロリアクタ上で実施する前処理の二段階としている点に特徴がある。【００６８】
検体前処理部は、細胞破壊（溶菌または溶血処理）により分析対象である核酸の抽出、分離、濃縮等を予備的に行う部分である。その形状、構造などは任意であり、振動するビーズ、外部電極による電場などといった前処理手段が適用される。前処理部に連通する試薬収容部には、抽出液、洗浄液、回収液などが必要に応じて封入されている。【００６９】
検体前処理部は、流路途上にある少なくとも２つの独立した部分、細胞破壊部および核酸捕捉部で構成されている。
・細胞破壊部
微細流路を通じて、検体受容部から細胞、ウィルスを含有する検体が、検体前処理部の細胞破壊部に送られる。その細胞破壊部で、物理的に細胞やウィルスを破壊して核酸の抽出が行われる。検体受容部より下流の微細流路上に設けられた細胞破壊部は、その前後の流路より広幅で、上下にも広がった空間であり、その空間内部には、ビーズを必要な数だけ加えられて、保持されている（図５）。従ってビーズが移動したり、細胞あるいはウィルスを破裂させるための空間を提供するのに充分な厚さを備えるべきである。そのビーズのサイズは、当該空間内に留まるように、微細流路の径より大きいことが必要であり、例えば、５０〜６００μｍ、好ましくは１００〜４００μｍの範囲にある。ビーズの平均直径は、ビーズによって破裂させるべき細胞または細菌、ウィルスに応じて選択するのがよく、細胞破壊部内部の空間にとどまる限り、そのサイズを揃える必要もない。ビーズは、多孔でも無孔でもよく、その形状も特に限定されない。ビーズの材質は特に限定されないが、細胞あるいはウィルスを破裂させるのに適したビーズには、ジルコニヤ、ホウケイ酸ガラス、石灰ガラス、シリカ、およびポリスチレンのビーズなどが挙げられる。特に核酸を吸着しないような性質の材料が好ましい。【００７０】
DNA増幅を妨げる不要な物質(例えばタンパク質やペプチド)、または化学薬品(例えば塩、金属イオン、界面活性剤)を、試料から除去するビーズを収容してもよい。例えば、タンパク質を除去するためのイオン交換ビーズが知られており、イミノ二酢酸のような金属イオンキレート化剤を有するビーズは、生物学的試料から金属イオンを除去する。【００７１】
当該ビーズは、該細胞破壊部に付設された外部アクチュエータにより振動させられる。そうしたアクチュエータとして好適なものとして、圧電体PZT（チタン酸ジルコン酸鉛）セラミック振動子が挙げられる。PZT振動子により振動させられるビーズと接触したり、衝突した細胞は、その膜構造が破壊されて、細胞内の物質が細胞外へ放出される。細胞内の物質には、対象とする核酸が含まれ、このような処理により、極めて迅速に細菌細胞、ウィルスは溶菌され、その結果、核酸が液中に出て来て、核酸抽出液が得られる。ビーズの振動強度は、検体にある細胞の種類、性質などに応じて適宜設定すればよい。【００７２】
従来の溶菌、細胞破壊の方法では、物理的または化学的な方法で実施されている。本発明の核酸検査用マイクロリアクタにおける核酸の抽出と分離の方法は、以下に述べる従来の方法に見られる問題点、不都合がなく、増幅が円滑に進む核酸を分離することができる。【００７３】
化学的な方法は、細胞を破壊させ、核酸を解離するために、溶解剤（例えば界面活性剤、酵素、あるいは有機化合物など）が用いられる。その後、汚染するタンパク質（使用した酵素類）や潜在的に干渉するタンパク質を変性させるために、カオトロピック塩での上記抽出物の処理が必要となる。さらに不都合なこととして上記化学薬剤が、その後のDNA増幅を抑制し、界面活性剤、エタノールなどの変性剤は、微細流路の撥水バルブの撥水性を変更することがある。このため化学薬剤から目的の核酸を分離する工程が必要となり、煩雑のみならず、核酸の量を減少させる結果となる。また、酵素を用いる方法では、インキュベーションの手間も含めて時間がかかる。【００７４】
細胞を破壊する物理的な方法は化学薬品を必要としないが、物理的方法にもまた欠点がある。典型的な物理的方法である加熱法ではタンパク質の変性を招き、このタンパク質が解離された核酸に固着してその後のDNA増幅を妨げる。他の方法である凍結解凍も、ある種の胞子やウィルスでは破壊が不充分になることがある。高圧下で微小径の穴を通過させる方式も知られているが、そのようなシステムは大型で高価となり、制約も多い。細胞を超音波振動に曝すことによって核酸が分離できることも知られている。典型的な例では、細胞を含んだ液体の中に超音波プローブを直接配置して細胞を破裂させる。上記プローブは試料液に直接接触するため、クロスコンタミネーションやキャビテーションに起因する泡立ちが、危険で複雑な状況をもたらす。【００７５】
細胞破壊について、米国特許５,３７４,５２２号にマーフィーらによって他の方法が開示されている。この方法によると細胞の懸濁液が、小ビーズとともに容器の中に配置される。その容器は、細胞が破裂して細胞の構成要素を放出するまで、超音波槽内に入れられる。しかしながら上記槽内での超音波の分配は一様でなく、そのため、技術者は槽内の高エネルギー領域を探し当てて、この領域に上記容器を配置しなければならない。上記超音波エネルギーの一様でない分配は、首尾一貫しない結果を生む。また上記超音波槽は、容器にエネルギーを集中させないので、細胞の破裂が完了するのに数分の時間がかかることが多い。
・核酸捕捉部
核酸捕捉部は、細胞破壊部の下流側に位置し、ほぼ隣接させてもよい。当該捕捉部および対面する夾雑物捕捉部の上下に当たるチップ外表面には１対の外部電極が対向して付設されており（図５）、これらの電極に電圧を印加することにより、流路を横断する方向に電場がかけられる。本発明では、核酸の分離のために補助的に電気泳動を実施する関係で、流路を横断する方向に電場を発生させて細胞成分に適用する構成としている。流路を横断する方向、例えば流路の幅方向または高さ方向は流路の長さ方向に比べて極めて寸法が小さいために、所望の電場を発生させるのに要する印加電圧は小さくて済む。流路幅はせいぜい２００μｍ程度までであるので、流路幅間に印加する電圧は、４０〜６０V程度となる。生体分子の推進力として電気泳動を行なう場合に、数ｋVの電圧を印加する必要があることと比較すれば、極めて低電圧の印加で済むことがわかる。なお、上記電極への電圧を印加すること、ならびに細胞破壊部のＰＺＴ振動子の作用については、マイクロリアクタが装置本体に装着されている状態で、装置本体から電気的に制御される。【００７６】
対向する１対の外部電極は、白金などの電極を核酸捕捉部の上面の部または流路側壁に蒸着すればよい。あるいは、これらの電極および櫛型構造の構造体は、例えば特開2002-233792号公報に開示されているようにエッチング加工技術により作製できる。【００７７】
微細流路を通じて細胞破壊部から核酸を含有する核酸抽出液が、核酸捕捉部へと送られる。その核酸抽出液が流路を横断する方向に電場がかけられている核酸捕捉部に通されると、マイナスの電荷を有する核酸は、アノード（陽極）の方へ移動して行き、アノードにあたる櫛型構造物に結合するか、その近辺に集合するようになる。他方、プラスに荷電した夾雑物は、カソード（陰極）に相当する反対側の面部、すなわち図５で凹型の櫛型構造物に対向している平坦部の面（ここでは「夾雑物捕捉部」と名づける）にトラップされる。その他の細胞成分を含む液体はそのまま捕捉部を通過して下流へ流れる。この液体は微細流路の適当な下流位置で廃液溜め部へ送り込むようにすればよい。菌体、細胞膜残渣、夾雑物質を除去して微細流路の目詰まりを防止すること、ならびに分析のための反応を阻害する物質、一緒に反応してしまう物質なども予め除去することを目的として、当該捕捉部直後の位置で廃液貯留部に廃棄することが望ましい。検体前処理部は、検体受容部２０から検体を、試薬収容部１８（他の試薬収容部とは別個に設けてもよい）から前処理に使用する処理液を受けるとともに、試薬収容部１８から微細流路下流の反応部へ至る流路と連通している。なおチップの底面部には廃液貯留部（廃液溜り）が設けてあるために、例えば前処理部との境界に配設した弁を開いてそこへ不要な検体前処理廃液、洗浄液を捨てることができる。【００７８】
該核酸捕捉部は、好ましくはマイクロストラクチャーとしての櫛型構造をとっている。捕捉部の比較的狭い範囲内に、適用された電場の下、核酸を泳動により引き寄せて流体の流れから離れて核酸を高密度に集合させる。流体はポンプ力で送出されて行くが、核酸を櫛型部分領域に取り込んで、流体とともに流れていかないようにしている。さらに、櫛形構造をとることにより、流路断面全体を占有しておらず、流路の一部他側には何も配置されていないため、流体の流れを阻害することはなく、連続して効率的に核酸が他の成分から分離され、回収されるという利点もある。【００７９】
上記櫛型構造の代わりに当該核酸捕捉部の構造を特開2004-217号公報に開示されたような、流路を交互に広狭とするクサビ型構造において電場をかけることにより、核酸を流路幅が狭くなっている部分近辺にトラップし、リリースする方式であっても良い。【００８０】
アノード側の凹部核酸捕捉部に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部から分離することができる。その際、偏向手段により、上記とは逆向きの電場を生じさせるように対向電極に電圧を印加して、捕捉部から核酸を遊離させると、核酸の分離回収がより効率的に行なわれる。具体的には電場を切るとカソード側平坦面（夾雑物捕捉部）にトラップされていた夾雑物も離脱するが、凹部の核酸よりも先にそうした夾雑物が流れ出す傾向にある。このため電場の方向を変える場合には捕捉電圧より若干低くして、弱い電場とするような調整を行うことが望ましい。このような処理で核酸を濃縮することも可能となる。次いで、上記のように前処理された検体は、必要であれば下記の送液分割手段により、２以上の検体分析用の微細流路に分割されて、連通する下流の分析流路へ送液される。分割された検体は、サンプルポートから、試薬類が流れる微細流路へ入って合流する。【００８１】
［検体受容部］
本発明の核酸検査用マイクロリアクタの検体受容部２０は、次のような構成を有する。検体受容部２０は、検体注入部に連通して検体（すなわち上記の細胞もしくはウィルスを含む洗浄液）の一時収容および混合部への検体供給を行う。検体受容部２０に注入された細胞含有液体は、マイクロポンプ１１およびポンプ接続部１２と接続しており、これらの作用により、上記の検体前処理部へ送液される。【００８２】
また検体受容部２０の上面で検体を注入する部分（検体注入部）は、外部への漏失、感染および汚染を防ぎ、密封性を確保するために、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの樹脂、強化フィルムで覆われていることが望ましい。例えば、当該ゴム材質の栓を突き刺したニードルまたは蓋付き細孔を通したニードルでシリンジ内の検体を注入する。前者の場合、ニードルを抜くとその針穴が直ちに塞がることが好ましい。あるいは他の検体注入機構を設置してもよい。
・検体
本発明の測定対象となる検体として、生体由来の試料自体にも特に制限はないが、例えば全血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰など生体由来のほとんどの試料が該当する。遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡが分析の対象となる。検体は、このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものであってよい。したがって、上記の試料の他に、細胞培養物；ウィルス、細菌、カビ、酵母、植物、動物などの核酸含有試料；微生物などが混入または含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料などが対象となる。【００８３】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、手作業検査の場合に比べて、必要とされる検体量は極めて少ない。例えば、縦横の長さが数ｃｍのチップに２〜３μL程度の血液検体を注入するだけである。例えば、遺伝子の場合、ＤＮＡとして0.001〜100ｎｇである。このため、微量の検体しか得られない場合も含めて、本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、検体面からの制約は少なく、必然的に試薬類も少ない量で済み、検査コストの低減となる。【００８４】
［廃液貯留部］
廃液貯留部は、マイクロリアクタの底部に設けられた中空室であり、余分な検体、検体の分離・濃縮工程で生成した洗浄液、廃液、ならびに検体の反応、測定の結果、生じる廃液などをすべて収容する密閉された廃液溜りである。上記検体前処理部で、前処理としてアナライトの濃縮工程を実施する場合には、濃縮および洗浄に伴って生じる廃液を処理する必要がある。そのような廃液は、マイクロリアクタ外に排出させて処理するよりも、自動的に内部に貯留する方が煩わしくない。好ましくは、廃液貯留部はマイクロリアクタの、検体前処理部の弁部直下に設けられ、少なくとも上記検体前処理部、流路の反応部部、検出部の端部などとも通じるとともに必要な容量を有する密封構造、すなわち廃液を生じる各部と通じる貫通穴が形成されている空洞であればよい。廃液貯留部は、１つの中空室でもよく、複数の区画に分けられた多区画空洞の形態であってもよい。その容積、形状などは、特に限定されないが、チップ自体の強度、他のエレメント配設に伴うスペースの制限なども勘案される必要がある。例えば、廃液貯留部の容量は、数ｃｍ四方のチップで、その底部大半に設けた場合、数百μL〜２mLとなる。また、廃液貯留部内の廃液が、マイクロリアクタの他の部分に侵入したり、外部に漏れたりすることのないように、必要に応じて上記貫通穴の適当な場所に開閉する弁を設けてもよい。【００８５】
上記廃液貯留部の設置とその構造は、さらに使用者に次の利点を提供する。臨床検体の分析を行う作業者は、常に検体からの細菌またはウィルスなどの感染のリスクに曝されている。検体の取り扱い、その前処理のみならず、測定中の洗浄液、測定後の廃液などの処理も煩雑であるだけでなく、依然として感染のリスク、環境汚染の可能性が残っている。本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、廃液貯留部をマイクロリアクタ底部に設けており、上記の不要な検体、廃液などはすべて最後にはこの廃液溜りへ捨てられる流路の構成となっている。この廃液貯留部は、完全にマイクロリアクタ内部に密閉されており、ディスポーザブルタイプの本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、使用後はそのまま、検査室などに備え付けられたハザードボックス内に収められ、焼却処分される。【００８６】
このような廃液貯留部を設けることにより、作業者は、臨床検体をマイクロリアクタに注入した後は、検査の間、検査後の廃棄においても、一貫して全く検体などに接触する可能性はなく、感染からの安全確保が図られている。しかも廃棄処分も汚染のおそれがなく簡便に行なわれる。またチップの軽量化、製造コスト低減などの利点もある。【００８７】
［試薬収容部］
本発明の核酸検査用マイクロリアクタでは、必要な試薬類（洗浄液を含む）が予め所定の量、マイクロリアクタ内の試薬収容部１８に封入されている。したがって本発明の核酸検査用マイクロリアクタは使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。検体中の核酸を分析する場合、必要な試薬類はそれぞれ知られており、増幅用の各種試薬、検出に使用されるプローブ類、発色試薬などが挙げられる。【００８８】
［マイクロポンプおよびポンプ接続部］
本実施形態では、検体受容部２０、試薬収容部１８、さらに必要に応じてコントロール収容部のそれぞれについて、これらの収容部内容液を送液するマイクロポンプ１１が設けられている。マイクロポンプ１１は試薬収容部１８の上流側に接続され、マイクロポンプ１１により駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニットは、マイクロリアクタとは別途の装置本体（核酸検査装置）に組み込まれており、マイクロリアクタを装置本体に装着することによって、ポンプ接続部１２からマイクロリアクタに接続されるようになっている（図７）。【００８９】
本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いている。すなわち、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと
を備えたピエゾポンプであり（図６）、その詳細は特許文献1および2に記載されている。【００９０】
［反応部］
測定対象である核酸を含む検体液と、試薬（混合液）とを合流させる合流部の上流側の各流路に、前記検体が収容される検体受容部と、前記試薬液体が収容される試薬収容部とが設けられるとともに、これらの各収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部に前記マイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより前記各収容部内の前記検体液および前記試薬を押し出してこれらを合流させることによって、遺伝子増幅分析に必要な反応を開始するように構成されている。試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合しても構わない。そうした反応部の態様は特に限定されるものではなく、様々な形態および様式が考えられる。基本的には試薬および検体液を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部から先に設けられ、前記各液体が拡散混合される微細流路と、
前記微細流路の下流側端部から先に設けられ、該微細流路よりも広幅の空間と
からなり、該微細流路で拡散混合された混合液を貯留して反応を行う液溜部とを備えることが好ましい。
・DNA増幅法
本発明の核酸検査用マイクロリアクタを使用する遺伝子検査では、増幅方法を限定されない。例えばＤＮＡ増幅技術は、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、改良点も含めて各種文献などに記載されている。ＰＣＲ増幅法においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開2004−108285号公報）。このデバイスシステムを本発明の核酸検査用マイクロリアクタの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業で行う従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。【００９１】
ＰＣＲ増幅法の改良として最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第3433929号公報参照）。したがって、ＩＣＡＮ法は、本発明の核酸検査用マイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済むために好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明の核酸検査用マイクロリアクタにおいては、10〜20分、好ましくは、15分で解析まで終わる。【００９２】
［検出部］
本発明の核酸検査用マイクロリアクタでは、微細流路の反応部よりも下流上に、増幅された核酸を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。さらに微細流路上の検出部に吸着されたビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン）は、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５'末端に標識されたビオチンと特異的に結合する。これによりビオチンで標識されたプローブまたは増幅された核酸が本検出部でトラップされる。【００９３】
分離された増幅核酸を検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行なわれる。すなわち本発明の核酸検査用マイクロリアクタを用い、
（１）検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５'位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。反応部の微細流路内で、核酸を増幅する工程、微細流路内で増幅核酸を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅されたＤＮＡを一本鎖に変性処理する工程、増幅されたＤＮＡを一本鎖に変性処理した処理液を、ビオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部に送液し、前記増幅遺伝子をトラップする工程を経て、増幅核酸をトラップした微細流路内の検出部に、末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる。（予め増幅遺伝子と蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを検出部でトラップしてもよい。）
（２）上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これによりＤＮＡにハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。【００９４】
ポリスチレン基板に形成された微細流路内にストレプトアビジンを固定化する際、特別な化学的処置を行うことは必要としない。単にビオチン親和性タンパク質を増幅反応部よりも下流の微細流路上に適用して該流路上にビオチン親和性タンパク質を吸着させるだけでよい。遺伝子検査用のプローブＤＮＡとして、蛍光標識されたオリゴデオキシヌクレオチドが好ましく用いられる。そのＤＮＡ塩基配列は、検出目的の遺伝子塩基配列の一部分と相補的である配列が選択される。プローブＤＮＡの塩基配列を適切に選択することにより、目的の遺伝子に特異的に結合し、共存するＤＮＡ、バックグラウンドに影響されることなく高感度の検出が可能となる。【００９５】
プローブを標識する蛍光色素として、公知のＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ＮＢＤ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質などを用いることができる。特にＦＩＴＣが、抗ＦＩＴＣ抗体、例えば金コロイド抗ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧを入手できることから望ましい。【００９６】
蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光を測定することも可能であるが、蛍光色素の光褪色、バックグラウンドノイズなどを考慮する必要がある。最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好ましい。可視光の吸光分析が優れるのは、蛍光測光よりも機器が汎用的であり、妨害因子が少なくデータ処理も容易であるためである。金コロイド抗ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧを用いた金コロイドの光学検出を利用するかわりに、上記蛍光色素の代わりに上記プローブを西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識してもよい。検出にはこの酵素が触媒する発色反応を利用することもできる。そのための典型的な発色物質として、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)、ｐ−フェニレンジアミン(OPD)などが知られている。他にアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素・発色系も使用できる。【００９７】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタとして好ましい態様は、
一つのチップ内において、
検体もしくは検体から抽出した核酸が注入される検体受容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、
廃液貯留部とが設けられ、
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体受容部に収容された検体から抽出した核酸と、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、微細流路の反応部、例えば増幅反応部で混合して反応させた後、その下流側流路にある検出部へこの反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて核酸の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に上記反応および検出を行うとともに、
上記検体前処理部および検出部と貫通穴を介して連通しており、マイクロリアクタの底部に設けられた中空室であり、余分な検体、検体の濃縮工程で生成した洗浄液、廃液、および検体の測定の結果、生じる廃液などを収容する密閉廃液溜りである廃液貯留部を有するように構成されていることを特徴としている。
・送液分割手段
本発明において、１つの検体についてポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを同時に分析する場合には、試薬類および検体を２以上に分割して、それぞれの分析流路へ送り出す必要がある。送液分割手段はそのために設置される。送液分割手段は、分岐した微細流路、送液制御部１３および逆流防止部から構成される。【００９８】
送液制御部１３は、正方向（通常、流体をポンプで押出す方向、すなわち下流方向）への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。また流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、あるいは弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して該開口部を閉止する能動弁からなる。【００９９】
本発明の核酸検査用マイクロリアクタの微細流路においては、前記マイクロポンプ、そのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とによって、分岐した流路内における液体の送液、送液量の定量および各液体の混合が制御されている。かかる送液分割手段およびマイクロポンプ１１の働きにより、試薬類および検体は適当な比率で分割される。
・コントロールの測定
核酸の分析では、通例、分析にネガティブコントロールを加え、検体の分析と並行して行われる。コンタミネーション、例えば試薬等に混在する物質の発色、蛍光などの補正に必須であるためである。さらに分析結果の信頼性を増すためには、ポジティブコントロールも加えることも必要である。添加する試薬等における妨害因子の検出、設定した条件の適切性、非特異的な相互作用などの検証に有用である。同様にインターナルコントロールを加えることも往々必要とされ、特に定量分析には有用である。【０１００】
ポジティブコントロール、インターナルコントロールを同時に行うことは、特にＰＣＲ法による遺伝子増幅では重要である。ＰＣＲ反応が正しく起きていることのチェックも特に必要とされるためである。例えば何らかの問題が生じた場合、それが設定条件、試薬類、操作、分析系に由来するか、あるいは検体に由来するかの検証に最適である。ＰＣＲ法は検体中に存在する微量の遺伝子を数十万〜数百万倍以上にも増幅できることから、クロス・コンタミネーションといった汚染による影響は著しく深刻である。【０１０１】
偽陽性および偽陰性の判定に有用なこれらのコントロールの設定は、従来の分析技術の慣行に従う。本発明のマイクロリアクタの流路構成によれば、検体とは別個の分析流路において、同一試薬、同一条件のもとで、同時進行で行うことができる。【０１０２】
以上、本発明の好ましい実施態様の一例として示された図面を参照しながら、遺伝子検査を説明したが、本発明は、かかる態様および例に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【国際調査報告】
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