(57)【要約】  本発明の課題は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株を提供することである。その解決手段としての本発明の癌様変異株は、正常胃粘膜細胞を形質転換してなる。本発明の癌様変異株は、例えば、正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることで作製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常胃粘膜細胞を形質転換させてなる癌様変異株。
【請求項２】
正常胃粘膜細胞が非ヒト動物のものである請求項1記載の癌様変異株。
【請求項３】
非ヒト動物がラットである請求項2記載の癌様変異株。
【請求項４】
正常胃粘膜細胞が正常胃粘膜上皮細胞である請求項1記載の癌様変異株。
【請求項５】
正常胃粘膜上皮細胞が独立行政法人理化学研究所細胞バンクに細胞番号RCB0876として寄託されているRGM-1細胞株である請求項4記載の癌様変異株。
【請求項６】
癌様変異株が独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10619として寄託されているRGK-1細胞株である請求項1記載の癌様変異株。
【請求項７】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10619として寄託されているRGK-1細胞株。
【請求項８】
正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることによる癌様変異株の作製方法。
【請求項９】
請求項1記載の癌様変異株に対する作用を指標にして行う抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項1記載の癌様変異株を少なくとも含んでなる抗癌剤のスクリーニングキット。
【請求項１１】
被験物質を正常胃粘膜細胞に作用させることで癌様細胞に形質転換されるか否かを指標にして行う発癌性の評価方法。
【請求項１２】
正常胃粘膜細胞を少なくとも含んでなる発癌性の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療においては、種々の抗癌剤が化学療法に用いられているが、効力や副作用などの点で改善の余地があるものも多く、より優れた抗癌剤の研究開発が精力的に行われていることは周知の通りである。【０００３】
抗癌剤の研究開発において、被験物質の抗癌作用を評価する方法の1つとして、被験物質をシャーレ内で癌細胞と接触させることで、癌細胞を死滅させたりその増殖を抑制したりするかどうかを調べる方法が実施されている。例えば、被験物質の胃癌に対する抗癌作用の評価は、MKN-1, MKN-45, MKN-74, St-4などの胃由来の癌細胞から樹立されたヒト胃癌細胞株を用いて行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記のような胃由来の癌細胞から樹立された胃癌細胞株を用いた方法では、当該癌細胞に対して直接的に比較対照とすることができる正常細胞が存在しないため、被験物質の胃癌に対する抗癌作用が、癌細胞に特異的なものなのかどうか、即ち、癌細胞に対する感受性を必ずしも正確に評価するといったことができなかった。
そこで本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ラットの正常胃粘膜から分離された上皮細胞株である、独立行政法人理化学研究所細胞バンクに細胞番号RCB0876として寄託されている公知のRGM-1細胞株を、発癌性物質であるN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG：N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）の存在下で培養すると、癌様細胞に形質転換されることを見出し、RGM-1細胞株とこうして得られた癌様細胞（RGK-1細胞株）を用いることで、癌細胞に対する感受性に優れた抗癌剤のスクリーニングや、発癌性物質か否かの判定などを簡易かつ迅速に行うことができる方法論を確立した。【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の癌様変異株は、請求項1記載の通り、正常胃粘膜細胞を形質転換させてなる。
また、請求項2記載の癌様変異株は、請求項1記載の癌様変異株において、正常胃粘膜細胞が非ヒト動物のものである。
また、請求項3記載の癌様変異株は、請求項2記載の癌様変異株において、非ヒト動物がラットである。
また、請求項4記載の癌様変異株は、請求項1記載の癌様変異株において、正常胃粘膜細胞が正常胃粘膜上皮細胞である。
また、請求項5記載の癌様変異株は、請求項4記載の癌様変異株において、正常胃粘膜上皮細胞が独立行政法人理化学研究所細胞バンクに細胞番号RCB0876として寄託されているRGM-1細胞株である。
また、請求項6記載の癌様変異株は、請求項1記載の癌様変異株において、癌様変異株が独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10619として寄託されているRGK-1細胞株である。
また、本発明のRGK-1細胞株は、請求項7記載の通り、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10619として寄託されている。
また、本発明の癌様変異株の作製方法は、請求項8記載の通り、正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることによる。
また、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、請求項9記載の通り、請求項1記載の癌様変異株に対する作用を指標にして行う。
また、本発明の抗癌剤のスクリーニングキットは、請求項10記載の通り、請求項1記載の癌様変異株を少なくとも含んでなる。
また、本発明の発癌性の評価方法は、請求項11記載の通り、被験物質を正常胃粘膜細胞に作用させることで癌様細胞に形質転換されるか否かを指標にして行う。
また、本発明の発癌性の評価キットは、請求項12記載の通り、正常胃粘膜細胞を少なくとも含んでなる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】RGM-1細胞株の顕微鏡写真
【図２】RGK-1細胞株の顕微鏡写真
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の癌様変異株は、正常胃粘膜細胞を形質転換してなる。本発明の癌様変異株は、例えば、正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることで作製することができる。ここで、出発細胞となる正常胃粘膜細胞としては、ラットやマウスなどの非ヒト動物の正常胃粘膜上皮細胞が例示される。具体的には、ラットの正常胃粘膜から分離された上皮細胞株である、独立行政法人理化学研究所細胞バンクに細胞番号RCB0876として寄託されているRGM-1細胞株が挙げられる。RGM-1細胞株は、本発明の発明者の1人である松井裕史の承諾の下に上記の細胞バンクから入手できる（必要であればIn Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 32:259-261, May 1996を参照のこと）。発癌性物質としては、例えば、MNNGなどを用いることができる。癌様変異株の作製は、例えば、正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培養液に、発癌性物質をその含量が0.1%〜10%程度になるように添加し、ここに正常胃粘膜細胞を103個/mL〜107個/mLの割合で播いて通常の培養条件のもとに継代培養を10日〜3ヶ月行えばよい。正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培養液としては、例えば、（DMEM:HamF12=1:1+5%〜20%FBS）などが挙げられる。また、正常胃粘膜細胞の通常の培養条件としては、例えば、36℃〜38℃、4%〜6%CO2といった条件が挙げられる。RGM-1細胞株を形質転換して得られる癌様変異株としては、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6）に受託番号FERM BP-10619として寄託されているRGK-1細胞株（分類学上の位置：動物細胞）が例示される（寄託日：2005年4月5日）。【００１０】
正常胃粘膜細胞が癌様変異株に形質転換されたかどうかは、例えば、以下に示す方法から選ばれる1つまたは複数の方法に基づいて判定すればよい。判定の正確性を高めるためには複数の方法に基づくことが望ましい。
（1）増殖因子依存性の低下
癌様変異株に形質転換されることで増殖因子に対する依存性が低下する。
（2）増殖速度の向上
癌様変異株に形質転換されることで増殖速度が速くなる。
（3）形態変化
癌様変異株に形質転換されることで形や大きさが不揃いになる。
（4）接触阻止の喪失とパイルアップ
癌様変異株に形質転換されることでシャーレ一杯にまで増殖しても増殖が止らず、細胞の上に細胞が盛り上がるようにして増殖する。
（5）フォーカス形成
癌様変異株に形質転換されることで細胞がパイルアップしたコロニー（フォーカス）を形成する。
（6）クリスクロス
癌様変異株に形質転換されることで細胞同士がクロスして増殖する。
（7）運動性
癌様変異株に形質転換されることで運動性が低下する。
（8）足場依存性の喪失
癌様変異株に形質転換されることで軟寒天やアガロースゲルに混ぜて播き込んでも細胞が球状のまま増殖してコロニーを形成する。
（9）分化機能の変化
癌様変異株に形質転換されることで分化機能の発現が変化する。
（10）造腫瘍性の獲得
癌様変異株に形質転換されることでラットやマウスに移植すると腫瘍を形成する。【００１１】
本発明の癌様変異株の利用方法としては、被験物質をシャーレ内で本発明の癌様変異株と接触させ、被験物質が細胞を死滅させたり増殖を抑制したりするかどうか、即ち、抗癌作用を有するかどうかを調べるために利用する方法が例示されるが、これに限定されるものではない。本発明の癌様変異株を所定のチューブに入れて凍結保存するなどしてキット化しておけば、抗癌剤のスクリーニングを簡便に行うことができる。また、本発明の癌様変異株とその由来となった正常胃粘膜細胞に同一濃度の被験物質を接触させ、それぞれに対する作用を評価することで、被験物質の抗癌作用が癌細胞に特異的なものなのかどうか、即ち、癌細胞に対する感受性を正確に評価することができる。【００１２】
また、本発明により、発癌性物質を用いて正常胃粘膜細胞を癌様変異株に形質転換できることが明らかになったので、この現象を利用すれば、正常胃粘膜細胞が癌様変異株に形質転換されるか否かを指標にして被験物質の発癌性の評価を行うことができる。正常胃粘膜細胞が癌様変異株に形質転換される過程を追跡することで、正常胃粘膜細胞の癌化についての経時的な遺伝子レベルの解析を行うこともできる。正常胃粘膜細胞を所定のチューブに入れて凍結保存するなどしてキット化しておけば、このような評価や解析を簡便に行うことができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。【００１４】
実施例1：RGM-1細胞株からRGK-1細胞株の作製
培養液（DMEM:HamF12=1:1+10%FBS）に、発癌性物質としてMNNGをその含量が3%になるように添加し、ここにRGM-1細胞株を105個/mLの割合で播いて約30日間継代培養することで作製した（培養条件：37℃、5%CO2）。図1にRGM-1細胞株の顕微鏡写真（倍率：20倍）を、図2にRGK-1細胞株の顕微鏡写真（倍率：20倍）を示す。【００１５】
実施例2：RGK-1細胞株の特性
（1）接触阻止の喪失とパイルアップ（膜の流動性）
12穴シャーレ中で、RGK-1細胞株を培養液（同上：以下同じ）に105個/mLの割合で播き、孔径が1μmのフィルタを上部に被せて培養したところ（培養条件は上記の通り：以下同じ）、培養開始から3日目にフィルタ表面において細胞の増殖が認められ、7日目にはフィルタ表面における増殖がコンフルエントな状態になった。ヒト胃癌細胞株として知られているMKN-45細胞株を用いて同様の実験を行っても結果は同じであった。従って、RGK-1細胞株は癌様細胞に形質転換されていると判定できた。【００１６】
（2）軟寒天コロニー形成
上層が1%ゼラチン含有培養液で下層が2%ゼラチン含有培養液で構成される寒天培地上に、RGK-1細胞株を105個/mLの割合で播いて培養したところ、細胞は球状のまま増殖し続け、培養開始から7日目にコロニーの形成が認められた。MKN-45細胞株を用いて同様の実験を行っても結果は同じであった。従って、RGK-1細胞株は癌様細胞に形質転換されていると判定できた。【００１７】
（3）造腫瘍性の獲得
4週令で購入後2週間予備飼育したヌードマウス（BALB/cA-nu, 雄, 日本チャールスリバー社より購入）の右大腿皮下に、RGK-1細胞株が105個/mL濃度の生理食塩水懸濁液0.2mLを接種しところ（n=7）、約2週間ですべてのマウスに腫瘍が形成された。MKN-45細胞株を用いて同様の実験を行っても結果は同じであった。従って、RGK-1細胞株は癌様細胞に形質転換されていると判定できた。【００１８】
実施例3：RGK-1細胞株に対する抗癌剤の作用
12穴シャーレ中で、RGK-1細胞株を0.1Mマイトマイシン含有培養液に105個/mLの割合で播いて培養したところ、その増殖が抑制された。従って、RGK-1細胞株を用いて抗癌剤の抗癌作用を評価できたことから、RGK-1細胞株は抗癌剤のスクリーニングに利用できることがわかった。【００１９】
実施例4：RGM-1細胞株に対する発癌性物質の作用
MNNGとともに発癌性物質として知られているメチルニトロソウレア（MNU：N-methyl-N-nitrosourea）の発癌作用をRGM-1細胞株が癌様変異株に形質転換されることで確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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