(57)【要約】  本発明は天然型蛋白質と同様の十分な機能・活性を有する蛋白質を容易に大量生産することのできる高コピー高発現ベクターを提供する。  （Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子のクローニング部位、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素およびメチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクターおよびその製造法。該ベクターを導入した形質転換体。該形質転換体を用いる蛋白質の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子が挿入されるクローニング部位、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター。
【請求項２】
（Ａ）目的遺伝子、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
（Ａ）目的遺伝子が挿入されるクローニング部位、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
（Ｃ）目的遺伝子の発現に必要な配列要素が、（Ｃ−１）プロモーター、（Ｃ−２）リボソーム結合部位および（Ｃ−３）転写終結部位であり、（Ｃ−２）リボソーム結合部位と（Ｃ−３）転写終結部位との間に（Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子のクローニング部位が存在する、請求項１記載のベクター（３）。
【請求項５】
転写上流側から順に、（Ｃ−１）プロモーター、（Ｃ−２）リボソーム結合部位、（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子、（Ｃ−２）リボソーム結合部位、（Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子のクローニング部位および（Ｃ−３）転写終結部位を有する塩基配列を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
（Ｃ−２）リボソーム結合部位および（Ｃ−３）転写終結部位が、pET3a由来の配列である、請求項４記載のベクター（３）。
【請求項７】
（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、宿主に適合した複製起点を含む塩基配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項８】
（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pUCoriまたはfl(+)oriを有する塩基配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項９】
（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pBluescriptII KS(+)由来の塩基配列である、請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】
（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pBluescriptII KS(+)由来をEcoRIおよびXbaIで切断した断片に含まれる、請求項１に記載のベクター。
【請求項１１】
転写上流側から順に、（Ｃ−１）Ｔ７プロモーター配列、（Ｃ−２）ＳＤ配列、（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子、（Ｃ−２）ＳＤ配列、（Ａ）目的遺伝子が挿入されるNdeI/BamHIクローニング部位および（Ｃ−３）転写終結部位を有する、請求項１記載のベクター。
【請求項１２】
（Ａ）目的遺伝子が、血液内に存在する蛋白質あるいは酸素運搬に関与する蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１記載のベクター。
【請求項１３】
（Ａ）目的遺伝子が、ヘモグロビン、アルブミンまたはその修飾体をコードする遺伝子である、請求項１記載のベクター。
【請求項１４】
（Ａ）目的遺伝子が、ヘモグロビンをコードする遺伝子である、請求項１記載のベクター。
【請求項１５】
ＳＤ配列、目的遺伝子が挿入されるNdeI/BamHIクローニング部位及）転写終結部位を含むpET3aをXbaI及びEcoRIにより消化して得られるＤＮＡ断片を、pBluescriptII KS(+)のEcoRI及びXbaI部位に挿入し、得られたベクターのXbaI及びNdeI部位に、さらに、転写上流側から順にＳＤ配列、メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子およびＳＤ配列を有するＤＮＡ断片を挿入することを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項１６】
請求項２記載のベクターを導入した形質転換体。
【請求項１７】
請求項１６記載の形質転換体を用いる蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術による蛋白質合成に使用されるメチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクターに関する。さらに詳細には、高コピー高発現タイプのベクターであって、合成された蛋白質のＮ末端メチオニン残基（以下、ファーストメチオニンということがある）が合成反応系において除去された非修飾の蛋白質を得るためのベクターおよびその製造法、ならびに該ベクターを有する形質転換体、および該形質転換体を用いて所望の蛋白質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、遺伝子組換え技術を用いて蛋白質を大量に生産するには、一旦、蛋白質をコードする遺伝子をベクターに組み込んだ大腸菌を増殖させてコード遺伝子のコピーを増幅し、そのようにして増幅した遺伝子を、蛋白質を発現するベクターに組み込んで、そのベクターを大腸菌等の宿主に導入することにより蛋白質を発現させており、多大な労力がかかっていた。【０００３】
そこで、蛋白質を容易に大量生産するために用いることができる高コピー高発現ベクターとして、遺伝子のコピーを行うための配列要素と蛋白質の発現を行うための配列要素を一つのベクター中に組み込むことによって、目的とする蛋白質を容易に大量産生するために用いる高コピー高発現ベクターが開発されている（特許文献１参照）。【０００４】
一方で、生体内での蛋白質合成過程においては、まず、開始コドンに対応するファーストメチオニンを有する状態で蛋白質が合成されるが、ファーストメチオニンを有する蛋白質は、ファーストメチオニンの除去された天然型蛋白質の有する本来の活性を有していないことが多い。すなわち、ＤＮＡが転写・翻訳され、蛋白質が発現した後に、メチオニンアミノペプチダーゼ（以下、ＭＡＰと略することがある）によりファーストメチオニンが除去されて、初めて活性を有する蛋白質となるものが多く存在する。
そこで、例えば、ヘモグロビンを発現させるための形質転換体を得るために用いるベクターに、ＭＡＰ遺伝子を組込み、発現系において同時にＭＡＰによるメチオニン残基の除去が行われるようにする技術が開発されている（非特許文献１参照）。【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載されるような高コピー高発現タイプのベクターにより得られた形質転換体を用いて蛋白質を製造する際に、生産された蛋白質のメチオニン残基の除去が、その発現系において同時に行われるようにする技術は知られていない。【０００６】
すでに、原核生物及び真核生物に由来する多種多様な遺伝子から大量の蛋白質を発現させるために、高コピー高発現ベクターが開発された。しかしながら、目的とする蛋白質（生産しようとする蛋白質、以下、目的タンパクという）がファーストメチオニンの除去によりその機能を発揮する場合、高コピー高発現ベクターを用いて発現させたファーストメチオニンを有する蛋白質は、天然型蛋白質とその機能や活性が異なってくる。【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０８６４７号公報
【非特許文献１】Tong-Jian Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.90, pp.8108-8112, September 1993, Biochemstry
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、天然型と同様の十分な機能・活性を有する蛋白質を、容易に大量生産することのできる高コピー高発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、高コピー高発現ベクターにＭＡＰ遺伝子を組み込むことによって、上記課題が達成されることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子が挿入されるクローニング部位、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター；
（２）（Ａ）目的遺伝子、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター；
（３）（Ａ）目的遺伝子が挿入されるクローニング部位、（Ｂ）該目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、（Ｃ）該目的遺伝子の発現に必要な配列要素および（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクター；
（４）（Ｃ）目的遺伝子の発現に必要な配列要素が、（Ｃ−１）プロモーター、（Ｃ−２）リボソーム結合部位及び（Ｃ−３）転写終結部位であり、（Ｃ−２）リボソーム結合部位と（Ｃ−３）転写終結部位との間に（Ａ）目的遺伝子又は目的遺伝子が挿入されるクローニング部位が存在する、上記（１）記載のベクター；
（５）  転写上流側から順に、プロモーター、リボソーム結合部位、メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子、リボソーム結合部位、目的遺伝子又は目的遺伝子のクローニング部位、転写終結部位を有する塩基配列を含む、上記（１）記載のベクター；
（６）（Ｃ−２）リボソーム結合部位および（Ｃ−３）転写終結部位がpET3a由来の配列である、上記（４）記載のベクター；
（７）（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、宿主に適合した複製起点を含む塩基配列である、上記（１）記載のベクター；
（８）（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pUCoriまたはfl(+)oriを有する塩基配列である、上記（１）記載のベクター；
（９）（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pBluescriptII KS(+)由来の塩基配列である、上記（１）記載のベクター；
（１０）（Ｂ）目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、pBluescriptII KS(+)をEcoRIおよびXbaIで切断した断片に含まれる、上記（１）記載のベクター；
（１１）  転写上流側から順に、（Ｃ−１）Ｔ７プロモーター配列、（Ｃ−２）ＳＤ配列、（Ｄ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子、（Ｃ−２）ＳＤ配列、（Ａ）目的遺伝子が挿入されるNdeI/BamHIクローニング部位及び（Ｃ−３）転写終結部位を有する、上記（１）記載のベクター；
（１２）（Ａ）目的遺伝子が、血液内に存在する蛋白質あるいは酸素運搬に関与する蛋白質をコードする遺伝子である、上記（１）記載のベクター、
（１３）（Ａ）目的遺伝子が、ベモグロビン、アルブミンまたはその修飾体をコードする遺伝子である、上記（１）記載のベクター；
（１４）（Ａ）目的遺伝子が、ヘモグロビンである、上記（１）記載のベクター；
（１５）ＳＤ配列、目的遺伝子が挿入されるNdeI/BamHIクローニング部位及び転写終結部位を含むpET3aをXbaI及びEcoRIにより消化して得られるＤＮＡ断片を、pBluescriptII KS(+)のEcoRI及びXbaI部位に挿入し、得られたベクターのXbaI及びNdeI部位に、さらに転写上流側から順にＳＤ配列、メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子およびＳＤ配列を有するＤＮＡ断片を挿入することを特徴とするベクターの製造方法；
（１６）上記（２）記載のベクターを導入した形質転換体；
（１７）上記（１６）記載の形質転換体を用いる蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のベクターを有する形質転換体を培養することにより、ファーストメチオニンが除去された天然型と同一の蛋白質を容易に大量生産することができる。例えば、人工酸素運搬体の主成分であるヒト成人ヘモグロビンを天然型と同様にファーストメチオニンが除去された状態で大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト成人ヘモグロビンα鎖のアミノ酸配列及び塩基配列を示す図である。
【図２】ヒト成人ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列及び塩基配列を示す図である。
【図３】pET3aのNdeI/BamHIクローニング部位周辺の塩基配列を示す図である。
【図４】pBluescriptII KS(+)のマルチクローニング部位周辺の塩基配列を示す図である。
【図５】実施例において、本発明のベクター（pMAX）の製造に用いる、高コピー高発現ベクター（pBEX）の製造方法を説明する図である。
【図６】転写上流側から順にXbaI認識配列、ＳＤ配列、ＭＡＰ遺伝子、ＳＤ配列およびNdeI認識配列を有するＤＮＡ断片を、pBEXのXbaI/NdeIクローニング部位に組み込み、本発明のベクター（pMAX）を製造する方法を説明する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のベクターは、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素およびＭＡＰ遺伝子を含むものである。本発明のベクターは、目的遺伝子のコピーと発現を同時に行うことが可能であり、さらに発現した蛋白質のＮ−末端メチオニンの除去も同時に行われる。【００１３】
本発明において目的遺伝子とは、目的タンパクを発現する遺伝子であり、その種類は特に限定されないが、通常、目的タンパクをコードする遺伝子である。また、目的タンパクのコード遺伝子が、宿主での発現に最適化されるよう改変された遺伝子であってもよい。さらに、生体由来の遺伝子または人工的に合成された遺伝子のいずれであってもよい。
目的タンパクとしては、例えば、生体中に存在する蛋白質等が挙げられ、具体的にはヘモグロビン、アルブミンやその修飾体等が挙げられる。好ましくは、血液内に存在する蛋白質あるいは酸素運搬に関与する蛋白質であり、さらに好ましくはヘモグロビン、最も好ましくはヒト成人ヘモグロビンである。
本発明における蛋白質は、完全な天然型蛋白質に限らず、変異体蛋白質や部分的なポリペプチドも含まれるが、好ましくは、完全な活性を有する天然型蛋白質である。
また、目的遺伝子の塩基配列は、イントロン（介在配列）を含まない配列が好ましい。
目的遺伝子の具体例としては、配列番号３及び４に記載の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。【００１４】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素とは、目的遺伝子の複製を行うために必要な塩基配列であり、例えば、宿主に適合した複製起点を含む塩基配列が挙げられる。宿主に適合した複製起点としては、例えば、宿主が大腸菌の場合には、pUCori、f1(+)oriなどが挙げられる。
上記複製に必要な配列要素は、pBluescriptII KS(+)（Stratagene社製）由来の塩基配列であることが好ましく、さらに好ましくは、pBluescriptII KS(+)をEcoRIおよびXbaIで切断したＤＮＡ断片に含まれる。【００１５】
目的遺伝子の発現に必要な配列要素は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位を含む配列であり、通常、リボソーム結合部位と転写終結部位との間に目的遺伝子またはクローニング部位が存在するような配列要素である。
さらに好ましくは、リボソーム結合部位及び転写終結部位はpET3a由来の配列である。【００１６】
プロモーターとしては、本発明のベクターの発現に用いる宿主で作動可能なものであれば特に限定されない。細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、大腸菌の Ｔ７、ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモーター、ファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモーターなどが挙げられる。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターが挙げられる。
これらの中でも、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーターが好ましく、Ｔ７プロモーターが特に好ましい。【００１７】
リボソーム結合部位としては、ＳＤ配列などが挙げられる。
本発明では、リボソーム結合部位として、プラスミドpET3a由来の配列等を使用することができる。【００１８】
転写終結部位としては、ポリアデニル化部位などが挙げられる。
本発明では、転写終結部位として、プラスミドpET3a由来の配列等を使用することができる。【００１９】
本発明のベクターは、遺伝子組換え技術により製造されるベクターであり、宿主細胞の形質転換を行うことのできるベクターである。【００２０】
本発明のベクターは、通常、転写上流から順にプロモーター、リボソーム結合部位、ＭＡＰ遺伝子、リボソーム結合部位、目的遺伝子又は目的遺伝子のクローニング部位および転写終結部位を有している。【００２１】
本発明のベクターの由来としては、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する細菌プラスミド、酵母プラスミド、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター等を挙げることができる。これらの中では、細菌プラスミドを由来とするベクターが好ましい。
本発明のベクターの製造においては、２種類以上の細菌プラスミド等に由来する塩基配列を組み合わせて使用することができる。【００２２】
本発明のベクターは、クローニング部位を有するものであってもよい。
クローニング部位はリボソーム結合部位と転写終結部位との間に位置することが好ましい。クローニング部位としては、NdeI/BamHIクローニング部位等が挙げられる。
ベクターがクローニング部位を有するものである場合には、目的遺伝子をクローニング部位に挿入することによって、該目的遺伝子を発現させるための組み換え発現ベクターを作製することができる。【００２３】
さらに、本発明のベクターは、導入マーカーを含んでいてもよい。導入マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。【００２４】
本発明のベクターの一例としては、Ｔ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＭＡＰ遺伝子、NdeI/BamHIクローニング部位および転写終結部位を含むベクターを挙げることができる。
さらに具体的には、pBluescriptII KS(+)のEcoRIおよびXbaI部位に、NdeI/BamHIクローニング部位及び転写終結部位を含むpET3a由来の塩基配列、ならびにＳＤ配列およびＭＡＰ遺伝子を含む塩基配列を挿入することによって作製された、配列番号２の塩基配列を有するベクターが挙げられる。【００２５】
上記の目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、目的遺伝子の発現に必要な配列要素およびＭＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込む方法としては、遺伝子組換え技術で用いられる種々の方法を用いることができるが、例えば、各種制限酵素で処理したＤＮＡ断片およびベクターの混合液中にリガーゼを添加し、ベクターと該ＤＮＡ断片を結合させる方法が用いられる。【００２６】
本発明のベクターを種々の宿主細胞に導入することにより、目的遺伝子を発現させるための形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞等を挙げることができる。本発明では、特に増殖能力の高い大腸菌を使用することが好ましい。【００２７】
ベクターの宿主細胞内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法により行うことができ、例えば、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、パーティクル・ガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、感染等、種々の方法が挙げられるが、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得る。【００２８】
また、本発明においては、上記形質転換体を用いる蛋白質の製造方法が提供される。
すなわち、本発明のベクターの導入により得られた上記形質転換体（好ましくは、大腸菌）を培養することにより、培養物中に目的タンパクが大量に生産される。
形質転換体を培養するための培地は公知であり、ＹＰＤ培地などの栄養培地や、ＭＢ培地などの最少培地、ＢＭＭＹ培地、ＢＭＧＹ培地等を用いることができる。
形質転換体の培養は、通常約１６〜４２℃、好ましくは約２５〜３７℃で、約８〜１６８時間、好ましくは約２４〜１２０時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌や通気を加えてもよい。形質転換体として大腸菌を使用する場合、大腸菌の培養は好ましくは３０〜４０℃で、公知の培地、例えばＴＢ培地等を用いて培養することができる。
また、目的タンパクの産生量を増加させるために、目的タンパクの合成基質を培地に添加して培養することが好ましい。目的タンパクがヘモグロビンである場合は、合成基質としてアミノレブリン酸を培地中に添加することが好ましい。【００２９】
上記の培養液中から蛋白質を公知の方法で単離し、必要に応じて精製することにより、目的タンパクが得られる。
培養物中に産生した融合タンパク質の単離・精製法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体フロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
より具体的な単離法としては、例えば、遠心分離により培養液から菌体を回収後、リン酸緩衝液等に菌体を懸濁して、超音波処理により菌体を破砕し、次いで、破砕した菌体を遠心分離して上清を回収し、これをリン酸緩衝液等で透析し、陽イオン交換カラムにて精製後、ｐＨ7.4にて陰イオン交換カラムを通過させ、さらにｐＨを8.5にして陰イオン交換カラムにて精製を行うといった方法を挙げることができる。
得られた目的タンパクは、例えば緩衝液／グリセリン混合液中に濃縮して保存することが好ましい。
上記の目的タンパクの単離・精製工程は、目的タンパクの変性が生じない温度条件下で行う必要があるが、ＭＡＰが常温より高い温度で活性が高いために、最適な温度条件を設定する必要がある。【００３０】
単離・精製した融合タンパク質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法や活性測定法等が挙げられる。また、精製された融合タンパク質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。【００３１】
本発明のベクターを用いて得られた蛋白質は、そのまま又は必要に応じて化学修飾してから、種々公知の蛋白質の利用用途に用いることができ、例えば医療用として生体に投与することができる。
蛋白質がヘモグロビン等の酸素運搬体として機能する蛋白である場合は、赤血球代替物として投与することができる。赤血球代替物として投与する際には、該蛋白質をリポソーム内に封入して投与したり、エマルジョンに分散して投与することができる。
また、本発明のベクターを用いて製造された蛋白質は、電解質、及び／又は血漿増量剤、及び／又はｐＨ調整剤、及び／又は抗酸化剤を含む医薬組成物として投与することができる。
【実施例１】
【００３２】
（１）酸素輸送蛋白質をコードするＤＮＡ（目的遺伝子）の設計
酸素輸送蛋白質としてヒト成人ヘモグロビンを対象とした目的遺伝子の設計を行った。  ヒト成人ヘモグロビンのアミノ酸配列を変えないまま、大腸菌において高発現に成功しているコドンを用いて目的遺伝子の塩基配列を設計した。設計した目的遺伝子のアミノ酸配列及び塩基配列（配列番号３及び４）を図１（α鎖）及び図２（β鎖）に示す。【００３３】
（２）ＰＣＲ
上記（１）の設計に基づいてＤＮＡオリゴマーを合成した。ヒト成人ヘモグロビンのα鎖のコード遺伝子について、各フラグメントの合成法を説明すると、まず図１に示す各オリゴマーAf1、Af2、Af3、Af4、Af5、Bf1、Bf2、Bf3、Bf4、Bf5を当モルで混合し、１回目のＰＣＲを行った。この溶液を少量とり、Af15、Ar15を加えて２回目のＰＣＲを行った。【００３４】
（３）大腸菌を用いた増殖とクローニング
ＰＣＲで増幅したフラグメントを、末端に導入した制限酵素部位NdeI、XheIを用いて切り出し、同じ酵素で処理したプラスミドpBluescriptII SK(+)(Stratagene社製)につないだ。宿主となる大腸菌XL-1 Blue MRF' (Stratagene社製)に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。３７℃で１晩培養後、大腸菌コロニーをとり、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて液体培養した。菌体回収後、プラスミドを抽出（Promega社製のMiniprepを使用）し、ＤＮＡシーケンサー（LI-COR社製）を用いて塩基配列を調べた。予期しない変異が全くなく、期待通りのフラグメントが得られていることを確認した。
同様の方法でヒト成人ヘモグロビンのβ鎖のコード遺伝子を合成した（図２）。【００３５】
（４）高コピー高発現ベクター
クローニングベクターであるpBluescriptII KS(+)(Stratagene社製)と発現ベクターであるpET3a(Stratagene社製)を用いて高コピー高発現ベクターを作成した。【００３６】
pMAX構築法の概略を図５及び６に示す。
まず、pET3aのXbaI、EcoRV部位をそれぞれ含むプライマーpXEf、pXEr（図３）を設計し、これを用いたＰＣＲによって目的配列を増幅した。この際、pXErにはEcoRVの代わりにEcoRIサイトを組み込んだ。これは、EcoRVは平滑末端を与えるのに対し、EcoRIは粘着末端を与えるため、次のライゲーションが容易になるためである。ＰＣＲによって、pET3aのＳＤ配列、NdeI/BamHIクローニング部位、ターミネーターを含むフラグメントが得られる。これをXbaI、EcoRIにて処理し、同じ制限酵素で処理したpBluescriptII KS(+)にライゲーションし、ベクター（pBEX）を得る。
次に、大腸菌JM109のＭＡＰ遺伝子上流及び下流の配列にそれぞれＳＤ配列とXbaI、NdeIの配列を加えたＤＮＡ断片を鋳型とし、ＰＣＲにより該ＤＮＡ断片を増幅した。これをXbaI、NdeIで処理し、同じ制限酵素で処理したpBEXベクターにライゲーションし、本発明のベクター（pMAX）が得られる。以下、ベクターpMAXの具体的構築方法を説明する。【００３７】
図３にpET3aのNdeI/BamHIクローニング部位周辺の塩基配列を示す。翻訳に必要なリボソーム結合部位（ＳＤ配列）と転写の終結に必要なターミネーター部位を含むＤＮＡ（図３のXbaI部位からEcoRI部位まで）を、プライマー(図３のXEfおよびXEr)を用いてＰＣＲにより増幅した。この際、pBluescriptII KS(+)へのつなぎ換えを行えるように、プライマーXErは、pET3aのEcoRVの認識配列に対応する部分をEcoRIの認識配列としている。このフラグメントをXbaIとEcoRIにて消化し、pBluescriptII KS(+)のマルチクローニング部位に挿入した。pBluescriptII KS(+)のマルチクローニング部位周辺の塩基配列を図４に示す。【００３８】
pET3aにより増殖したフラグメントをpBluescriptII KS(+)に組み込むことにより、pBluescriptII KS(+)由来のＴ７プロモーター、pET3a由来のＳＤ配列、NdeI認識配列、BamHI認識配列および転写終結部位が連結される。pBluescriptII KS(+)のものと合わせて、配列番号１に記載の全長３１４３塩基対の塩基配列を有するベクター（以下、pBEXと呼ぶ）を作製した。【００３９】
pBluescriptII KS(+)は高コピーベクターとしてクローニングに多用されており、各種の制限酵素切断部位が組み込まれたマルチクローニング部位を有する（図４）。一方、pET系のベクターは蛋白質の誘導・発現に必要なＴ７プロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを有し、pET3aではＳＤ配列下流のNdeI/BamHIクローニング部位に目的遺伝子をクローニングして蛋白質の高発現を達成する（図３）。しかし、細胞あたりのベクターのコピー数は低い。pBEXは両者の利点を生かした高コピー高発現ベクターである。【００４０】
次に、大腸菌JM109の染色体からＰＣＲによりＭＡＰ遺伝子を取り出し、転写上流側から順にXbaI認識配列、ＳＤ配列、ＭＡＰ遺伝子、ＳＤ配列、NdeI認識配列を有するＤＮＡ断片（図６参照）を作製し、このＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物を制限酵素処理（XbaIおよびNdeI）し、pBEXのXbaI/NdeIクローニング部位に組み込むことによって、配列番号２に記載の全長３９６７塩基対の塩基配列を有する新たなベクター（以下、pMAXと呼ぶ）を作製した。【００４１】
得られたpMAXをXL-1 Blue MRF'に導入し、pMAXを含む菌体を選別して、ストックとした。
pMAXベクターを用いた大量発現にはT7 ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌BL21(DE3)を宿主とすることが望ましい。【００４２】
（６）pMAXベクターを用いたリコンビナントヘモグロビン（ｒＨｂ）の大量生産
ヒトヘモグロビン（ヒトＨｂ）遺伝子を大腸菌で発現しやすいように改変した遺伝子を試験管内全合成した。大腸菌で発現しやすいように改変した遺伝子とは、ヒトＨｂ遺伝子のコドンを、一つのアミノ酸に対応する複数のトリプレットコドンのうち大腸菌での発現頻度の高いコドンに置き換えた遺伝子を意味する。こうすることで目的タンパクの発現量が多くなることが知られている。
次に、pMAXのNdeI/BamHIクローニング部位に合成したＨｂ遺伝子を組み込んだベクターを、リン酸カルシウム法により大腸菌BL21Gold(DE3)に導入した。得られた形質転換体をＬＢ培地を用いて３７℃、一晩培養後、新たなＬＢ培地に触菌した。0.5ｍＭアミノレブリン酸を加え、３７℃で７２時間大量培養した。なお、アミノレブリン酸はヘムの合成基質であり、添加することによりｒＨｂの発現量が増加する。【００４３】
（７）ｒＨｂの精製
遠心分離により菌体を回収後、20ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)にて菌体を懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。
破砕した菌体を15,000 rpmで６０分間遠心分離して上清を回収した。これを20ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ6)で透析し、SP Sepharoseカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にて精製後、ｐＨ7.4にてQ-Sepharoseカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を通過させる。さらにｐＨを8.5にしてQ-Sepharoseカラムにて精製を行う。溶出液を濃縮しバッファー交換にて20ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ7.4)とした後、ＣＯを吹き込んで４℃で保存した。【００４４】
（８）蛋白質の確認
最終試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、予想される分子量約15,000の単一バンドを検出した。またＮ末端アミノ酸分析を行い予想されるｒＨｂと同一であり、ファーストメチオニンは検出されなかった。さらにマススペクトルによりα鎖、β鎖の分子量はそれぞれ15126.0と15867.5と計算値と一致した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のベクターは、種々の宿主細胞を目的の蛋白質を大量生産するよう形質転換するために用いられる。
本発明の製造方法により得られた蛋白質は、種々の蛋白質の利用用途に用いることができ、ウイルス等の汚染の可能性がないため、特に医療用として生体に投与することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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