(57)【要約】  生体内の免疫寛容を人為的に抑制することによって、従来方法では免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の抗原に対する抗体の作製する方法を提供すること。  ＧＩＴＲアゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＴＲアゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする、当該抗原に対する抗体の作製方法。
【請求項２】
前記ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲアゴニスト活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体である、請求項１に記載の抗体の作製方法。
【請求項３】
前記抗原が、前記免疫動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質である請求項１又は２に記載の抗体の作製方法。
【請求項４】
前記免疫動物に前記抗原を投与後、前記免疫動物の免疫細胞を用いて作製したハイブリドーマで当該感作抗原に対する抗体を産生する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
【請求項５】
前記ＧＩＴＲアゴニスト活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体を投与し次いで前記抗原を投与する操作を一定間隔で繰り返し２回以上行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体の作成方法。
【請求項６】
前記抗原が、前記免疫動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
【請求項７】
前記抗原が、血球系・血管系において多く存在するペプチド又は蛋白質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
【請求項８】
前記ペプチド又は蛋白質が、細胞接着因子、ＧＰＣＲ又はそれらの断片である、請求項７に記載の抗体の作製方法。
【請求項９】
前記ＧＰＣＲがケモカイン受容体である、請求項７に記載の抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫寛容を人為的に抑制し、免疫動物が寛容となりやすいペプチドや蛋白質に対する抗体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には、動物由来、植物由来、細菌由来等の多くのペプチド及び蛋白質が存在している。生体内では、これらペプチドや蛋白質を異物と認識した場合には、異物に対する生体の拒否反応、いわゆる免疫反応が惹起してこれらを排除しようとする。一方で、生体内では、自己のペプチドや蛋白質等を異物と認識しないように、自己のペプチドや蛋白質等に対して免疫反応を惹起しないように制御する免疫寛容が維持されている。【０００３】
この免疫寛容の維持には、Ｔ細胞が関与しており、その中でもＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が関わっていることが明らかにされた（非特許文献１）。さらに、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍免疫の制御（非特許文献２）、臓器移植における拒絶反応の抑制（非特許文献３）、リウマチ等の各種自己免疫疾患の発症の抑制に深く関与していることが明らかにされた。【０００４】
ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による免疫寛容には、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーに属し、別名ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれているＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ．−ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．）が関与していることが明らかにされた（非特許文献４及び５）。【０００５】
一般的に、新規又は既知のペプチドや蛋白質の抗原から作製された抗体は、生体内分布の確認・その作用機序解明のツール、さらに疾患の治療薬等になり得る可能性がある。このため、新規又は既知のペプチドや蛋白質を採取し、採取したペプチド又は蛋白質を抗原としてマウス、ラット等動物に投与して当該抗原に対する抗体を作製することが行われている。【０００６】
しかし、採取したペプチド又は蛋白質の抗原の中には、投与した動物において免疫寛容が成立しているために当該抗原に対する抗体が作製されず、目的の抗体を回収することができない場合がある。この理由としては、生物種間において構造的にアミノ酸配列における相同性が高い場合が多く、相同性の高い蛋白質やペプチドの場合には異なる生物種由来の抗原であっても自己抗原と認識して免疫寛容のシステムが働くことが考えられている。さらに、血球系・血管系に存在するペプチドや蛋白質の多くは、免疫機構に晒される機会が多いことから免疫寛容のシステムが働きやすくなっている。例えば、ケモカイン受容体等のＧＰＣＲ（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ），細胞接着因子等が挙げられる。（非特許文献６〜１０）。【０００７】
近年では、通常のマウス等の動物で免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の抗原を，当該抗原遺伝子のノックアウトマウスに投与して当該抗原を感作させることによって、当該抗原に対する抗体を作製し回収した例が報告されるに至っている（非特許文献１０）。
【非特許文献１】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５年，１５５巻，１１５１−１１６４頁
【非特許文献２】Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年，１６３巻，５２１１−１８頁
【非特許文献３】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００１年，１８２巻，１８−３２頁
【非特許文献４】Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７年，ＵＳＡ．，９４巻，９２１６−９２２１頁
【非特許文献５】Ｊｕｎｅ，Ｓｈｉｍｉｚｕ等，Ｎａｔｕｒｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２年，３巻（２），１３５−１４２頁
【非特許文献６】Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｆ等，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，１９９３年，１９６巻（３），１４９６−１５０３頁
【非特許文献７】Ｅ．，Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ等，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｉｎｏｌ．，２０００年，５２巻，４０１−４１０頁
【非特許文献８】鎌田宣夫等，第２６回日本分子生物学会年会講演要旨集，２００３年，１ＰＣ−１６２
【非特許文献９】山田良樹等，第２６回日本分子生物学会年会講演要旨集，２００３年，１ＰＣ−１６３
【非特許文献１０】大友俊彦等，第２６回日本分子生物学会年会講演要旨集，２００３年，１ＰＣ−１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ノックアウトマウスの作製には多大な時間、労力、費用がかかる上、胎生致死の場合や、生育したノックアウトマウスに抗原を投与しても目的の抗体を回収できない場合もある。【０００９】
本発明の目的は、生体の免疫寛容を人為的に抑制することによって、従来方法では免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の抗原に対する抗体を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、ＧＩＴＲアゴニスト活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体をマウスに投与し、免疫寛容を人為的に抑制して、ＧＰＣＲの１種であるＥｄｇ１蛋白質を抗原としてマウスを感作し、当該Ｅｄｇ１蛋白質に対する抗体を効率良く作製する事に成功したことから本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、ＧＩＴＲアゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする、当該抗原に対する抗体を作製する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体で免疫寛容が成立しやすい既知又は新規のペプチドや蛋白質等の抗原に対する抗体を効率よく作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】精製ＥＤＧ１Ｆｌａｇ抗原を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）解析の結果レーン番号３１〜５６までを示した写真である。
【図２】ヒト及びマウスＥｄｇ１の相同性を比較した図である。ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ検索によりマウスＥｄｇ１とヒトＥｄｇ１の相同性を比較した図である。上段（Ｑｕｅｒｙ）はヒトＥｄｇ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿００１３９１）のアミノ酸配列を示し、下段（Ｓｂｊｃｔ）はマウスＥｄｇ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０３１９２７）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について、詳細に説明する。
免疫寛容を抑制する方法としては、例えば、ＧＩＴＲアゴニストを投与することにより免疫寛容を抑制する方法、抗ＩＬ−２受容体抗体を投与することにより免疫寛容担当細胞であるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去する方法等が挙げられるが、本発明においては、ＧＩＴＲアゴニストを投与することにより免疫寛容を抑制する。【００１５】
（１）ＧＩＴＲアゴニストの作製方法
本発明において、ＧＩＴＲは、膜蛋白質であり、ＴＮＦα−ＮＧＦレセプター遺伝子スーパーファミリーに属する蛋白質である（以下、ＧＩＴＲ蛋白質とする）。マウスにおけるＧＩＴＲのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０２１９８５、ＮＭ＿００９４００）に開示されている。
本発明において、ＧＩＴＲ蛋白質とは、全長蛋白質及びその断片の両方を意味する。ＧＩＴＲ蛋白質の断片とは、任意の領域を含む部分ポリペプチドであり、天然のＧＩＴＲ蛋白質の機能を有していなくてもよい。【００１６】
本発明において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲ蛋白質に結合し、シグナルを伝達させることが可能なものであれば如何なるものでもよく、その機能を有している限り、断片、融合蛋白質、修飾蛋白質など、如何なる形態でもよい。ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、ＴＮＦＳＦ１８（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ｌｉｇａｎｄ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  １８）並びに可溶性ＧＩＴＲリガンド、抗ＧＩＴＲ抗体等である。これらのＧＩＴＲアゴニストのうち、ＧＩＴＲアゴニスト活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体が好ましい。
本発明において、ＴＮＦＳＦ１８は、ＴＮＦスーパーファミリーに属する蛋白質でマウスアミノ酸配列及び遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿１８３３９１）に開示されている。
なお、ＧＩＴＲアゴニスト作用を有しているか否かは、Ｔａｋａｈａｓｈｉ等の方法に従って行うことが可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６９−８０（１９９８））。具体的には、ＧＩＴＲアゴニストをＴ細胞増殖測定系へ添加した後に、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による他のＴ細胞への増殖抑制作用解除効果を検定することによって検出する。【００１７】
ＧＩＴＲアゴニストの作製方法については、ＧＩＴＲアゴニスト活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体を用いて説明する。なお、抗ＧＩＴＲ抗体に限定されず、他のＧＩＴＲアゴニスト、例えばＧＩＴＲリガンドを作製してもよい。
まず、ＧＩＴＲ蛋白質を動物に投与することにより抗ＧＩＴＲ抗体を作製する。
本発明で用いられる抗ＧＩＴＲ抗体（その断片も含む。）は、免疫寛容を抑制させる動物のＧＩＴＲ蛋白質に結合するだけでなく、ＧＩＴＲに対しアゴニスト（作動）活性を有することが必要である。抗ＧＩＴＲ抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）及び形状等を問わない。【００１８】
抗ＧＩＴＲ抗体は、下記動物由来のＧＩＴＲ蛋白質をマウス、ラット、トリ、ハムスター、モルモット、ウサギ等の動物に投与して得ることができるが、好ましくは、マウス又はラット細胞由来のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体であることが好ましい。【００１９】
また、抗ＧＩＴＲ抗体は、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されたものであってもよい。【００２０】
抗ＧＩＴＲ抗体の作製方法の一例として、ハイブリドーマによる抗ＧＩＴＲ抗体作製方法を下記に説明する。
ハイブリドーマは、モノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を産生するものが好ましい。当該ハイブリドーマは、ＧＩＴＲ蛋白質を抗原として使用し、通常の免疫方法に従って免疫細胞を得、得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、さらに、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングして作製される。【００２１】
より具体的には、モノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を作製するには下記の（ｉ）から（ｖ）に説明する。
（ｉ）免疫細胞の採取
まず、抗ＧＩＴＲ抗体を作製するための抗原として使用するＧＩＴＲ蛋白質を、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０２１９８５、ＮＭ＿００９４００）に開示されたＧＩＴＲ遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。ＧＩＴＲ蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後（Ｊｕｎ  Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３（２），１３５−４２，２００２）、その宿主細胞中又は培養上清中から目的のＧＩＴＲ蛋白質を公知の方法で精製する。
ＧＩＴＲ蛋白質の由来は、特に限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット等ゲッ歯類動物由来のＧＩＴＲ蛋白質が好ましく、マウスＧＩＴＲ蛋白質又はラットＧＩＴＲ蛋白質がより好ましい。【００２２】
なお、天然のＧＩＴＲ蛋白質を精製して用いることもできる。
また、ＧＩＴＲ蛋白質の断片である部分ペプチドは、ＧＩＴＲ蛋白質のアミノ酸配列に基づく化学合成、またＧＩＴＲ遺伝子の一部の発現ベクターへの組込み、さらに天然のＧＩＴＲ蛋白質を蛋白質分解酵素による分解等によって得ることができる。部分ペプチドとして用いるＧＩＴＲ蛋白質のアミノ酸配列の部分及び大きさは限られない。【００２３】
次に、この精製されたＧＩＴＲ蛋白質を抗原として抗ＧＩＴＲ抗体の作製に用いる動物に免疫する。免疫方法としては、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、ＧＩＴＲ蛋白質の抗原をホ乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。
具体的には、ＧＩＴＲ蛋白質の抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに、通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、ホ乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。【００２４】
抗ＧＩＴＲ抗体の作製に用いる動物にＧＩＴＲ蛋白質の抗原を投与後、血清中に抗ＧＩＴＲ抗体レベルが上昇し、免疫されたのを確認した後に、当該動物から免疫細胞を採取する。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００２５】
抗ＧＩＴＲ抗体の作製に用いる動物は、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはゲッ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット或いはトリ、ウサギ、サル等が使用される。【００２６】
また、ＧＩＴＲ蛋白質抗原を抗ＧＩＴＲ抗体の作製に用いる動物に投与して免疫する際には、当該抗原に適当な担体と結合して使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体蛋白質と結合させて免疫することが望ましい。【００２７】
また、上記の他に、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞にあるＧＩＴＲ蛋白質を抗原として使用し、得ることも可能である。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の取得方法は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，１９６９−８０（１９９８）に記載されている。【００２８】
（ｉｉ）細胞融合
前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステイン等の方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。【００２９】
前記採取された免疫細胞と融合される他方の親細胞として、ホ乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が挙げられる。【００３０】
より具体的には、前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【００３１】
細胞融合の際、前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００３２】
前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加して混合することによって細胞融合させて目的とする融合細胞（以下、ハイブリドーマという。）を形成する。続いて、当該ハイブリドーマに適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００３３】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより、選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。【００３４】
なお、前記ＧＩＴＲ蛋白質を認識する抗ＧＩＴＲ抗体は、国際公開公報ＷＯ  ０３／１０４４５３に記載された方法を用いて産生してもよい。【００３５】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅後、ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗ＧＩＴＲ抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
抗ＧＩＴＲ抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。抗ＧＩＴＲ抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。【００３６】
このようにして作製されたモノクローナルな抗ＧＩＴＲ抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００３７】
（ｉｖ）抗ＧＩＴＲ抗体の産生
前記ハイブリドーマからモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を産生する方法として、上記で得られたハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から抗ＧＩＴＲ抗体を採取する方法、又は上記で得られたハイブリドーマをこれと適合性があるホ乳動物に投与して増殖させ、その腹水として抗ＧＩＴＲ抗体を得る方法等が挙げられる。前者の方法は、高純度の抗ＧＩＴＲ抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗ＧＩＴＲ抗体の大量生産に適している。【００３８】
また、上記で得られたハイブリドーマから抗ＧＩＴＲ抗体の発現する遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いてモノクローナルな抗ＧＩＴＲ抗体を産生させることができる。（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。【００３９】
具体的には、ＧＩＴＲ蛋白質に対する抗ＧＩＴＲ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＧＩＴＲ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。【００４０】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗ＧＩＴＲ抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成及び増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及びＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。【００４１】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とするそれぞれの抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。【００４２】
さらに、抗ＧＩＴＲ抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込み、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗ＧＩＴＲ抗体を発現させて産生してもよい。
このとき、抗ＧＩＴＲ抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、或いはＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。【００４３】
また、上記宿主細胞以外に、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼイン等）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。
抗ＧＩＴＲ抗体を発現する遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から抗ＧＩＴＲ抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される抗ＧＩＴＲ抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００４４】
本発明で使用される抗ＧＩＴＲ抗体の製造のための宿主細胞は、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立されたホ乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞等の動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、ホ乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞が挙げられる。【００４５】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗ＧＩＴＲ抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００４６】
（ｖ）産生された抗ＧＩＴＲ抗体の分離、精製
上記の産生された抗ＧＩＴＲ抗体を、通常の蛋白質の分離、精製法により、細胞や宿主動物から分離、精製する。
蛋白質の分離、精製法として、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、限外濾過膜、塩析、透析等の適宜選択、組み合わせが挙げられる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。このとき、抗ＧＩＴＲ抗体の検出は、抗原エライザ法、ＵＶ検出等を用いることができる。
抗ＧＩＴＲ抗体を特異的に分離、精製することができるアフィニティーカラムクロマトグラフィーが好ましく、アフィニティーカラムクロマトグラフィーとして、例えば、プロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。【００４７】
（２）所望の抗原に対する抗体の作製
本発明において、ＧＩＴＲアゴニストの投与等により免疫動物の免疫寛容を抑制し、所望の抗原を当該免疫動物に投与する。
なお、所望の抗原を免疫動物に投与し、ＧＩＴＲアゴニストの投与等により免疫動物の免疫寛容を抑制して、当該抗原に対する抗体を作製してもよい。
このことによって、免疫寛容を抑制した免疫動物が所望の抗原に感作されて、所望の抗原に対する抗体を作製することができる。
なお、ＧＩＴＲアゴニスト投与との抗原を投与することが好ましく、それぞれを順次交互に繰り返し投与する操作がより好ましく、それぞれインターバルをおいて投与する操作がさらに好ましい。
また、繰り返し投与する操作の回数、インターバル（投与間隔）及び全投与期間は、例えば、マウスやラットでは、繰り返し投与する操作の回数は２回以上が好ましく、３回〜８回がより好ましく、このときの投与間隔は、３日以上間隔が好ましく、５日〜９日間隔がより好ましく、全投与期間は、３週間以上が好ましく、５週間以上がより好ましく、７週間〜１１週間がさらに好ましい。【００４８】
本発明における所望の抗原は、いかなるペプチド又は蛋白質でもよい。好ましくは、免疫動物で免疫寛容が成立するペプチド又は蛋白質であり、免疫動物の体内、特に血球系・血管系に存在（由来）するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有する抗原であることがより好ましい。免疫動物に存在するペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗原は免疫寛容が成立しているため当該抗原を投与しても抗体が産生されにくいためである。例えばケモカイン受容体等のＧＰＣＲ等が挙げられる。さらにＧＰＣＲとして、Ｅｄｇ１抗原が挙げられる。
ここで、本発明において高い相同性とは、通常アミノ酸配列において７０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、さらに９５％以上の相同性である。この相同性の決定は、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．及びＬｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｊ．が記載したアルゴリズムによる（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）。【００４９】
本発明における血球系・血管系において存在の多いペプチド又は蛋白質とは、次のようなものを意味する。血球系についてはＢ細胞又はマクロファージ、樹状細胞等に発現されているペプチド又は蛋白質が挙げられ、血管系については内皮細胞等に発現されているペプチド又は蛋白質が挙げられる。具体的には、ケモカイン受容体等のＧＰＣＲ並びに細胞接着因子が挙げられる。【００５０】
所望の抗原の調製及び当該抗原に対する抗体の作製方法は、前記（１）ＧＩＴＲアゴニストの作製方法に記載の「ＧＩＴＲ蛋白質」を「所望の蛋白質（所望の抗原ともいう）」、「抗ＧＩＴＲ抗体」を「当該抗原に対する抗体」に置き換えた方法に準じて行うことができる。【００５１】
また、前記抗原に対する抗体を産生する感作動物の脾臓等の免疫細胞を用いて作製したハイブリドーマで抗原に対する抗体を産生させ、上述のモノクローナル抗体産生方法により抗原に対するモノクローナル抗体を作製してもよい。
なお、所望の抗原を免疫寛容が破られた（又は阻害された）免疫動物に投与して得られた所望の抗原に対する抗体を分離、精製するには、上記のアフィニティーカラムクロマトグラフィー等を用いて行うことができる。【００５２】
以上のことにより、生体で免疫寛容が成立しやすい既知又は新規のペプチドや蛋白質の抗原に対する抗体を効率よく作製することができる。また、既知又は新規のペプチドや蛋白質の作用・生体内分布及び蛋白質相互作用を解明するツールを効率良く提供するばかりでなく、新規治療薬の開発も可能にすることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５４】
＜実施例１＞
［Ｅｄｇ１の抗原の調製：（１）Ｅｄｇ１−Ｆｌａｇ発現バキュロウイルス（ＢＶ）の作製］
ヒトＥｄｇ１遺伝子を発現するＢＶは、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＣ末端にＦｌａｇタグが挿入されるようにデザインした。
具体的にはプライマーｐＥｄｇ１−Ｆ（配列番号１）とプライマーＣ−ＦＬＡＧ（配列番号２）を用いてｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｈｉｓ−Ｅｄｇ１を鋳型に用いてＰＣＲで増幅したヒトＥｄｇ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１４００）をクローニングして、ｐＢｌｕｅＢａｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔのマニュアルに従って組換えＢＶを作製した。【００５５】
＜実施例２＞
［Ｅｄｇ１の抗原の調製：（２）精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇの調製］
精製Ｅｄｇ１抗原は、Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ発現ＢＶ感染細胞の膜画分を調製し、さらにアフィニティーカラムクロマトにて精製して免疫用の感作抗原とした。
具体的には、Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ発現ＢＶを感染モイ５にて２ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度のＳｆ９細胞に感染させて２７℃にて３日間培養したものを１５００ｒｐｍの低速遠心により細胞と培養上清を分離した。細胞は一度ＰＢＳで洗浄した後、必要時まで−８０℃のフリーザーにて凍結保存した。【００５６】
２Ｌから３Ｌの感染細胞に相当する細胞の沈殿を材料にして膜画分の調製を行った。膜画分は５００ｍＬの培養あたり１０ｍＬのｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ／２ｍＭ  ＤＴＴ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ））を加えてＢｒａｎｓｏｎ社製の超音波破砕装置にて細胞を破砕した。１０，０００ｘＧ、３０分の遠心操作の後の上清を１００，０００ｘＧで一時間遠心して得られた沈殿をＴｒｉｓ／（ＮＨ４）２ＳＯ４／Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４／１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）にＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ・ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ロシュダイアグノスティックス社製）に懸濁し、１８ゲージ、２５ゲージの注射針の順で数回通すことで均一な懸濁液を作製した。【００５７】
ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ社製）にてＢＳＡをスタンダードにして蛋白定量を行い、蛋白濃度が２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＴｒｉｓ／（ＮＨ４）２ＳＯ４／Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、２％  Ｃｙｍａｌ−６／ＣＨＡＰＳＯ（１：３  ｗ／ｗ）  ｉｎ  Ｔｒｉｓ／（ＮＨ４）２ＳＯ４／Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｂｕｆｆｅｒを等量加えて４℃にて一晩回転させながら撹拌した。１００，０００ｘＧにて一時間遠心した上清を回収してこれにａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−２２２０）を加えてさらに一晩回転させながら撹拌した。これをＢｉｏＲａｄエコノカラムに詰めた後にｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％  Ｃｙｍａｌ−６／ＣＨＡＰＳＯ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４／１０％  ＧｌｙｃｅｒｏｌにＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ・ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅを加えたもので洗浄した後、１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ−３２９０）／０．５％  Ｃｙｍａｌ−６／ＣＨＡＰＳＯ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４／１０％  ＧｌｙｃｅｒｏｌにＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ・ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅを加えたもので０．５ｍＬづつ溶出した。１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離し、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を用いたＷＢによってＥＤＧ１Ｆｌａｇの含有量が多い分画をＰＢＳ／０．５％  ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅに対して透析し、所望の抗原として免疫に供した。【００５８】
＜実施例３＞
［Ｅｄｇ１の抗原の調製：（３）Ｅｄｇ１ＦｌａｇのＢＶの調製］
ＢＶの調製は、以下のようにして行った。
感染ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）５でＥｄｇ１ＦｌａｇＢＶを感染したＳｆ９細胞は感染３日目に回収し、１５００ｒｐｍで１５分遠心操作を行い、培養上清を得た。さらに得られた培養上清を３０，０００ｘＧで２時間Ｂｅｃｋｍａｎ  ＨＰ−２５にて遠心操作を行い、ＢＶを沈殿として回収した。ＰＢＳを加えて４℃で一晩静置して均一に懸濁された状態になったら１５００ｘＧで１５分間遠心操作を行い、細胞の残渣を沈殿として除き、上清部分をさらに４５，０００ｘＧで３０分間遠心操作を行ってＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶かして免疫用のＢＶ標品とした。ＢＳＡをスタンダードとしてＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）により蛋白定量を行い、免疫に用いる抗原量を計算した。【００５９】
＜実施例４＞
［抗Ｅｄｇ１モノクローナル抗体の作製：（１）免疫：マウス免疫Ａ群］
ｇｐ６４トランスジェニックマウスを用いてマウスの免疫を行った。
マウス免疫Ａ群（３匹数）は、抗原免疫と抗ＧＩＴＲ抗体の投与とを１週間間隔で交互に実施する方法で行った。このときの全投与期間は、９週間で、繰り返し回数は５回であった。一定間隔ごとに下記の実施例６の抗血清の評価を行った。
初回免疫（７週齢、平均体重５０ｇ）は、ＦＣＡ（フロイント・コンプリート・アジュバント）と１００ｎｇの百日咳毒素とともに精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原（抗原）１００μＬを腹腔に投与して免疫した。抗ＧＩＴＲ抗体投与の際には１００μｇを尾静脈より投与した。また感作抗原の免疫は、二回目以降は皮下にＥｄｇ１Ｆｌａｇ  ＢＶを０．２５ｍｇ、腹腔に精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原５０μＬをＦＩＣＡ（フロイント・インコンプリート・アジュバント）５０μＬと共に免疫した。最終免疫は、Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ  ＢＶ  ０．１２５ｍｇを皮下より免疫し、精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原２５μＬを腹腔に免疫した。【００６０】
＜実施例５＞
［抗Ｅｄｇ１モノクローナル抗体の作製：（１）免疫：マウス免疫Ｂ群］
実施例５は、実施例４と同様の手順で、マウス免疫Ｂ群（３匹）に感作抗原免疫と抗ＧＩＴＲ抗体投与を毎週実施し、感作抗原は抗ＧＩＴＲ抗体投与から３日後に免疫する方法でマウスの免疫を行った。このときの全投与期間は５週間で、繰り返し回数は５回であった。５回免疫後の６週間後に６回目の免疫を行い最終免疫とした。【００６１】
＜比較例１＞
抗ＧＩＴＲ抗体を投与せず、実施例４と同様の手順で、マウス免疫コントロール群（３匹）に感作抗原免疫と抗ＧＩＴＲ抗体の投与なしの通常の免疫方法でマウス免疫を行った。このときの全投与期間は、初回から５回免疫までに５週間、その６週間後に最終免疫し、投与回数は合計６回であった。【００６２】
＜実施例６＞
［抗Ｅｄｇ１モノクローナル抗体の作製：（２）抗血清の評価］
マウス免疫Ａ群（実施例４）、マウス免疫Ｂ群（実施例５）、マウス免疫コントロール群（比較例１）の免疫マウスの抗血清の評価は、精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原を用いたウエスタンブロットとＥｄｇ１／ＣＨＯ細胞とｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣＳ、精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原でのＥＬＩＳＡで行った。Ｅｄｇ１／ＣＨＯ細胞はマウスのＥｄｇ１遺伝子のＮ末端にＦｌａｇタグがＣ末端にＨＡタグが付加された遺伝子を発現する細胞である（文献  ＴＡＫＡＹＵＫＩ  ＫＯＨＮＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２００２；１６：９８３−９９２）。ＦＡＣＳＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理することで培養ディッシュから剥離させた細胞をＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％  ＮａＮ３）に懸濁して細胞が５０μＬ中に１００，０００個ずつ入るように９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ３５３９１０）に分注し、そこにマウス免疫各群のマウス抗血清を１μＬ加えて反応をみた。４℃で一時間反応させた後に、１５００ｒｐｍで５分間遠心操作を行い、細胞を沈殿させた後に上清を除き、２００μＬ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて懸濁後に１５００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を洗浄した。再び上清を除いた後に１００倍にＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したＦＩＴＣ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を４℃で３０分間反応させた。【００６３】
上記と同様にして洗浄操作を行った後に１００μＬ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ＨＴＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてＦＡＣＳ解析を行った。ウエスタンブロット（ＷＢ）解析では、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離した精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原と１００倍、１０００倍に希釈した抗血清と反応させてバンドの検出を行った。【００６４】
＜実施例７＞
［抗Ｅｄｇ１モノクローナル抗体の作製：（３）ハイブリドーマの作製］
マウスの脾臓を摘出し、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。マウス免疫Ａ群のマウスＮｏ．３０７５及びＮｏ．３０８３の脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞ＮＳ−１とを、ケーラーとミルステインの方法（Ｋｏｈｅｌｅｒ．Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．Ｃ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８１，７３，３−４６）を用いて細胞融合させた。すなわち、前記脾臓細胞とＮＳ−１を細胞数１０：１の割合で混合し、４００ｘＧ１０で分間遠心した後、培養上清を除去し、細胞ペレットに５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００（ロッシュダイアグノスティクス社）（ＰＥＧ）を添加してよく混合することによって、融合細胞を形成させた。続いて、１５％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）添加ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ社）１０ｍＬを逐次加える事によって融合反応をストップさせ、４００ｘＧで１０分間遠心してＰＥＧを含む培養上清を除去した。ハイブリドーマを含むペレットに、前記の培養液を逐次加えて細胞を縣濁し、０．５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製し、９６穴培養プレートに１００μＬずつまき込んだ。ハイブリドーマはＨＡＴ培養液（ＩＣＮ社）で選択培養を行い、細胞融合後８日目には、融合細胞以外の細胞は死滅し、融合細胞が複数の良好なコロニーを形成していることが確認された。この８日目の培養上清をサンプリングし、スクリーニングを実施した。【００６５】
ハイブリドーマを含むペレットに、前記の培養液を逐次加えて細胞を縣濁し、０．５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製し、９６穴培養プレートに１００μＬずつまき込んだ。ハイブリドーマはＨＡＴ培養液（ＩＣＮ社）で選択培養を行い、細胞融合後８日目には、融合細胞以外の細胞は死滅し、融合細胞が複数の良好なコロニーを形成していることが確認された。この８日目の培養上清をサンプリングし、スクリーニングを実施した。【００６６】
＜比較例２＞
マウス免疫Ａ群の脾臓に代えて比較例１のマウス免疫コントロール群のＮＯ．３０８３を実施例７と同様の手順で、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。【００６７】
＜実施例８＞
［抗Ｅｄｇ１モノクローナル抗体の作製：（４）スクリーニング］
ハイブリドーマのスクリーニングはＢＶ−ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、精製抗原のＥＬＩＳＡ，ＦＭＡＴにより進めた。ＢＶ−ＥＬＩＳＡは前述の調製法に調製したＢＶを４μｇ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにコーティングしてハイブリドーマの上清１０μＬと振とうして１時間反応させ、３０，０００倍に希釈したＨＲＰ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）反応させてＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社）を基質にして吸光度Ａ４５０を測定した。
精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇとの反応性とコントロールにおいたＧＰＣＲＦｌａｇの反応性を比較し、Ａ４５０の測定値の比が１．５以上のものと測定値の差の大きい上位１０個を二次スクリーニングに進めた。【００６８】
さらに、精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原を用いたＷＢ解析で反応性を示し、Ｅｄｇ１発現ＣＨＯ細胞（Ｅｄｇ１／ＣＨＯ）とコントロールのＣＨＯ細胞（ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）を用いてＦＡＣＳ解析でｍｅｄｉａｎ値の比が２以上を示したＢ６０１１，Ｂ６０１２を限界希釈法によりクローニングを行った（表１）。【００６９】
限界希釈法によりモノクローン化したハイブリドーマの培養上清を使って、ＷＢ解析とＦＭＡＴ解析で反応性の判定を行った。
ＷＢ解析では、精製Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗原を２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離後、１０倍希釈したハイブリドーマの上清と反応させた（図１）。
ＦＭＡＴ解析では、Ｈｉｓ−Ｅｄｇ１，Ｈｉｓ−Ｅｄｇ３発現ＢＶを感染させたＳｆ９細胞を用いて８２００ＣＤＳ（ＡＢＩ社）で解析を行った（表２）。【００７０】
【表１】
2006132272.tif 000002
【００７１】
【表２】
2006132272.tif 000003
【００７２】
実施例１〜８及び比較例１〜２の結果を図１、図２、表１及び２に示す。
マウス免疫Ａ群のマウスにおいてＥｄｇ１Ｆｌａｇ抗原に相当する大きさのバンドを染色できることを明らかにした。すなわち、抗Ｅｄｇ１Ｆｌａｇ抗体を得ることができた。
図２が示すように両者は９４％といった高い相同性を示すＧＰＣＲである。このことから、相同性が高く免疫寛容が成立しやすい抗原（比較例１のようなＥｄｇ１抗原）であっても、当該免疫マウス（ｇｐ６４トランスジェニックマウス）に一定間隔をおいて交互にＧＩＴＲアゴニスト及び当該抗原を投与して当該抗原に対する抗体（抗Ｅｄｇ１抗体）を得ることができることを明らかにした。
また、表２に示すレーン番号１９，３７，４０，４６は、Ｈｉｓ−Ｅｄｇ１に反応し、Ｈｉｓ−Ｅｄｇ３に反応しない、クローンＢ６０１１Ａ，Ｂ６０１１Ｂ，Ｂ６０１１Ｃ，Ｂ６０１２Ａを得た。
このことから、マウス免疫Ａ群のマウスＮｏ．３０７５及びＮｏ．３０８３の脾臓細胞を用いて、Ｅｄｇ１抗原に対する抗体をモノクローナルに産生するハイブリドーマを得ることができた。【００７３】
以上のことより、感作動物に抗ＧＩＴＲ抗体（ＧＩＴＲアゴニスト）を投与して免疫寛容を阻害し、通常であれば免疫寛容が成立しやすいために抗体が産生されにくいＥｇｄ１抗原を当該感作動物に投与することによって、抗Ｅｄｇ１抗体を作製することができることを明らかにした。また、当該感作動物の細胞からハイブリドーマを形成でき、モノクローナルな抗Ｅｄｇ１抗体を効率よく産生することができることを明らかにした。
【図１】
2006132272.tif 000004
【図２】
2006132272.tif 000005
【配列表】
2006132272000001.app
【国際調査報告】
2006132272.tif 000006
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