(57)【要約】  本発明の課題は、ＮＭＲの測定において、効率的にＮＭＲでリアルタイムに測定する方法及び該方法を可能とするＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セル、ＮＭＲ測定用装置の提供である。  詳しくは、ＮＭＲ測定用磁石内のNMR検出部分であるＮＭＲ検出セルにおいて、測定試料を媒体中で固定化し、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させた条件下で、測定試料を溶液ＮＭＲでリアルタイムに測定するＮＭＲ測定方法を見出し、本発明を完成させた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セル中において、測定試料を媒体中で固定化し、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させた条件下で、測定試料を溶液ＮＭＲで測定する溶液ＮＭＲ測定方法。
【請求項２】
測定試料を固定化する方法が、測定試料を固相担体で吸着させることである請求項１に記載の溶液ＮＭＲ測定方法。
【請求項３】
外部環境の変化が、固定化された測定試料の存在する媒体における変化である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
外部環境の変化が、ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セルの送液管と廃液管によって行われる請求項１〜３の何れか一に記載の方法。
【請求項５】
溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルであって、１）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる送液管、２）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる廃液管、３）該送液管及び該廃液管に連結可能でありかつ固相担体を充填可能な分析管、を有する溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
【請求項６】
分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された請求項５に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルを有する溶液ＮＭＲ測定用装置。
【請求項８】
溶液ＮＭＲ測定用装置であって、
１）測定試料を媒体中で固定化可能な固相担体を充填した分析管、
２）固定化された測定試料の外部環境を変化させるための溶液又は候補相互作用物質を供給可能な送液管、
３）溶液又は候補相互作用物質を廃液可能な廃液管、
を有するＮＭＲ測定用装置。
【請求項９】
上記分析管が、脱着可能である請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された請求項７〜９の何れか一に記載の装置。
【請求項１１】
溶液ＮＭＲ測定をリアルタイムで測定する方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）測定試料の外部環境を連続的に変化させるために、送液管により外部環境の変化の要因を含む溶液を供給する工程、
３）２）の外部環境の変化の工程中に、測定試料の溶液ＮＭＲ測定する工程、
を含む方法。
【請求項１２】
測定試料がタンパク質であって、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させることによって、タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
候補相互作用物質のハイスループットスクリーニング方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）候補相互作用物質を送液管により固定化された測定試料に供給する工程、
３）測定試料と候補相互作用物質の相互作用を溶液ＮＭＲ測定する工程、
４）測定試料と候補相互作用物質の結合のみが解離するような溶媒を送液管から供給し、候補相互作用物質を測定試料から解離させ、続いて、廃液管を通してＮＭＲ検出セルから排除する工程、
５）２）−４）の工程を繰り返す工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液ＮＭＲによる効率的な測定方法に関する。
また、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2005-272887からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代の現在、個々の生体分子の立体構造を決定することが盛んに行われているが、今後は、これら生体分子間の相互作用、それに伴う構造変化の研究が益々重要となると考えられ、その研究のための手法開発が必要となっている。このような研究の手法の一つとしてＮＭＲ測定が有用である。
しかしながら、1000種類の低分子化合物の中から目的タンパク質と相互作用する物質を見つけ出す場合、タンパク質と10種の低分子化合物を混合した溶液を用いて１次スクリーニングを行ったとしても100検体の試料調製と100回のNMR測定・解析が必要であり、この操作を繰り返し実行するには多大の時間と労力を費やさねばならない。
この作業の効率化を図るためにはＮＭＲ測定用装置の自動サンプルチェンジャーの利用が考えられるが、これは試料交換の手間を省略できるだけであり、タンパク質の使用量、試料調製の負担、測定時間は全く軽減されない。
また、溶液ＮＭＲ測定法としては、ゲル相ＮＭＲ法や液体クロマトグラフィーＮＭＲ法等があるが、タンパク質の構造変化特にフォールディングの中間過程の追跡には不十分である。【０００３】
本願の先行するＮＭＲ技術を使い測定試料を測定する技術としては、ＮＭＲプローブ内の試料流路内に試料を吸着しうる充填剤を設け、試料を吸着させた状態でＮＭＲ測定を行うものがある（特許文献１）。しかし、この系では、試料流路内に充填剤を設けるのは、微量試料の濃縮、拡散防止のためであり、スクリーニング方法についてはいっさいの開示がない。
また、本願の先行するＮＭＲ技術を使い標的高分子物質を測定する技術としては、固相に標的高分子物質を固定化してＮＭＲ測定を行うものがある（特許文献２）。この技術は、液体環境下で固相に標的高分子物質を固定化し、これをＮＭＲで測定、或いは液体環境下で固相に標的高分子物質を固定化し、さらに候補化合物を添加して両者の相互作用の結果をＮＭＲ測定するというものであった。しかし、この系では、両者の相互作用の過程をＮＭＲ測定することはできず、さらに連続的な候補化合物の供給によるハイスループットスクリーニングも行うことはできず、試料を効率的に測定するにはほど遠いものであった。
【特許文献１】特開2002-139558
【特許文献２】特開2004-138545
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
解決しようとする問題点は、ＮＭＲの測定において、測定試料の外部環境変化による作用を効率的にＮＭＲでリアルタイムに測定する方法及び該方法を可能とするＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セル、ＮＭＲ測定用装置の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出部分であるＮＭＲ検出セルにおいて、測定試料を媒体中で固定化し、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させた条件下で、測定試料を溶液ＮＭＲでリアルタイムに測定するＮＭＲ測定方法を提供することを最も主要な特徴とする。
すなわち本発明は以下からなる。
「１．ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セル中において、測定試料を媒体中で固定化し、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させた条件下で、測定試料を溶液ＮＭＲで測定する溶液ＮＭＲ測定方法。
２．測定試料を固定化する方法が、測定試料を固相担体で吸着させることである前項１に記載の溶液ＮＭＲ測定方法。
３．外部環境の変化が、固定化された測定試料の存在する媒体における変化である前項１又は２に記載の方法。
４．外部環境の変化が、ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セルの送液管と廃液管によって行われる前項１〜３の何れか一に記載の方法。
５．溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルであって、１）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる送液管、２）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる廃液管、３）該送液管及び該廃液管に連結可能でありかつ固相担体を充填可能な分析管、を有する溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
６．分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された前項５に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
７．前項５又は６に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルを有する溶液ＮＭＲ測定用装置。
８．溶液ＮＭＲ測定用装置であって、
１）測定試料を媒体中で固定化可能な固相担体を充填した分析管、
２）固定化された測定試料の外部環境を変化させるための溶液又は候補相互作用物質を供給可能な送液管、
３）溶液又は候補相互作用物質を廃液可能な廃液管、
を有するＮＭＲ測定用装置。
９．上記分析管が、脱着可能である前項７又は８に記載の装置。
１０．分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された前項７〜９の何れか一に記載の装置。
１１．溶液ＮＭＲ測定をリアルタイムで測定する方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）測定試料の外部環境を連続的に変化させるために、送液管により外部環境の変化の要因を含む溶液を供給する工程、
３）２）の外部環境の変化の工程中に、測定試料の溶液ＮＭＲ測定する工程、
を含む方法。
１２．測定試料がタンパク質であって、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させることによって、タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡する前項１１に記載の方法。
１３．候補相互作用物質のハイスループットスクリーニング方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）候補相互作用物質を送液管により固定化された測定試料に供給する工程、
３）測定試料と候補相互作用物質の相互作用を溶液ＮＭＲ測定する工程、
４）測定試料と候補相互作用物質の結合のみが解離するような溶媒を送液管から供給し、候補相互作用物質を測定試料から解離させ、続いて、廃液管を通してＮＭＲ検出セルから排除する工程、
５）２）−４）の工程を繰り返す工程、
を含む方法。」【０００６】
より詳しくは、本発明は以下からなる。
「１．ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セル中において、測定試料を媒体中で固定化し、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させた条件下で、測定試料を溶液ＮＭＲで測定する溶液ＮＭＲ測定方法。
２．測定試料を固定化する方法が、測定試料を固相担体で吸着させることである前項１に記載の溶液ＮＭＲ測定方法。
３．外部環境の変化が、固定化された測定試料の存在する媒体における変化である前項１又は２に記載の方法。
４．外部環境の変化が、ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セルの送液管と廃液管によって行われる前項３に記載の方法。
５．外部環境の変化の要因が、共存物質の添加、不添加もしくは濃度変化、両親媒性の試薬の添加、不添加もしくは濃度変化、溶媒ｐＨの変化、塩濃度の変化、変性剤の添加、不添加もしくは濃度変化、又はこれらのいずれか２以上の組み合わせである前項１〜４の何れか一に記載の方法。
６．共存物質が、測定試料に対する候補相互作用物質である前項１〜５の何れか一に記載の方法。
７．固定化方法が、以下から選ばれる方法であって、ＮＭＲ検出セルの分析管部位に固相担体を充填する前項１〜６の何れか一に記載の方法。
１）固相担体と結合性を有しかつ十分な自由度を有するリンカーを保持する測定試料を、固相担体とリンカーを介して結合する。
２）測定試料を、固相担体と化学的に結合する。
３）測定試料を、自由度が高い固相担体で補足する。
８．自由度が高い固相担体が、デキストラン又は網目構造の高分子ゲルである前項７に記載の方法。
９．溶液ＮＭＲ測定をリアルタイムで測定する方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）測定試料の外部環境を連続的に変化させるために、送液管により外部環境の変化の要因を含む溶液を供給する工程、
３）２）の外部環境の変化の工程中に、測定試料の溶液ＮＭＲ測定する工程、
を含む前項１〜８の何れか一に記載の方法。
１０．測定試料がタンパク質であって、固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させることによって、タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡する前項１〜９の何れか一に記載の方法。
１１．候補相互作用物質のハイスループットスクリーニング方法であって、
１）測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する工程、
２）候補相互作用物質を送液管により固定化された測定試料に供給する工程、
３）測定試料と候補相互作用物質の相互作用を溶液ＮＭＲ測定する工程、
４）測定試料と候補相互作用物質の結合のみが解離するような溶媒を送液管から供給し、候補相互作用物質を測定試料から解離させ、続いて、廃液管を通してＮＭＲ検出セルから排除する工程、
５）２）−４）の工程を繰り返す工程、
を含む前項１〜９の何れか一に記載の方法。
１２．固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させることによって、測定試料の分子配列を一定方向に配向させる前項１〜９の何れか一に記載の方法。
１３．溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルであって、１）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる送液管、２）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる廃液管、３）該送液管及び該廃液管に連結可能でありかつ固相担体を充填可能な分析管、を有する溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
１４．分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された前項１３に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セル。
１５．前項１３又は１４に記載の溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルを有する溶液ＮＭＲ測定用装置。
１６．溶液ＮＭＲ測定用装置であって、
１）定試料を媒体中で固定化可能な固相担体を充填した分析管、
２）固定化された測定試料の外部環境を変化させるための溶液又は候補相互作用物質を供給給可能な送液管、
３）溶液又は候補相互作用物質を廃液可能な廃液管、
を有するＮＭＲ測定用装置。
１７．上記分析管が、脱着可能である前項１５又は１６に記載の装置。
１８．分析管の挿入側及び／又は排出側にフィルターが設置された前項１５〜１７の何れか一に記載の装置。」
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＮＭＲ測定方法は、連続的に測定試料の外部環境の変化が可能であり、効率的な測定試料と候補相互作用物質の相互作用の過程の解析が可能であり、さらにタンパク質の立体構造変化をリアルタイムに追跡可能であるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、溶液ＮＭＲ測定用装置のＮＭＲ測定用磁石内において、ＮＭＲ検出部分（ＮＭＲプローブ）内のＮＭＲ検出セルを改良することを特徴とするＮＭＲ測定方法である。
本発明におけるＮＭＲ測定法は、通常の溶液ＮＭＲに用いられる方法であれば如何なる方法も用いることができる。特に低温プローブを装着した高磁場ＮＭＲ測定用装置であれば十分な測定感度を得られるものと考える。本発明の溶液ＮＭＲ測定用装置用ＮＭＲ検出セルは、従来のＮＭＲ測定用装置のＮＭＲ検出セルとの互換性を考慮し、送液管、分析管、廃液管部位は、各々脱着可能で、特にＮＭＲ磁場の上方から差し込む型が好ましい。【０００９】
ＮＭＲ検出セル
本発明におけるＮＭＲ検出セルは、１）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる送液管（１０１）、２）ＮＭＲ測定用磁石外に通じる廃液管（１０３）、３）該送液管及び該廃液管に連結可能でありかつ固相担体を充填可能な分析管（１０２）を含んでなる（図１）。さらに、分析管に固相担体を充填し（２０４）、送液管の出口端部は分析管の入口端部内に挿入され、廃液管の入口端部は分析管の出口端部内に挿入される（図２）。また、送液管及び廃液管は適切な方法で、挿入された端部と分析管にシールされる。さらに、液漏れ防止用のパッキンを設置する。
好ましくは、分析管の入口側（挿入側）及び／又は出口側（排出側）に、測定試料が廃液管に流出する又は測定試料が送液管に拡散するのを防ぐためのフィルター（２０５）を設置することができる。さらに、複数の候補相互作用物質を、同時に測定試料に供給するために、又は複数の外部環境の要因を同時に変化させるために、複数の送廃液管を有するＮＭＲ検出セルであってもよい。
また、ＮＭＲ検出セルの材質並びに各管の長さ及び内径は、従来の溶液ＮＭＲ測定用装置に用いられるＮＭＲ検出セルにおける送液管、廃液管、分析管と同様で良い。これにより、従来の溶液ＮＭＲ測定用装置に使用されるＮＭＲ検出セルと相互性を有する。すなわち、従来の溶液ＮＭＲ測定用装置のＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セルを取り外し、本発明のＮＭＲ検出セルを導入することができる。詳しくは、分析管と送液管及び／若しくは廃液管を連結するジョイント部分をねじ状にすれば、分析管を容易に脱着可能である。【００１０】
測定試料
本発明の測定試料は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、糖、糖タンパク質、糖脂質、脂肪酸、これらの誘導体、共有結合体および複合体等が挙げられる。ポリペプチドは４０以上１０００以下のアミノ酸残基からなるものが好ましく用いられる。また、核酸、糖、糖タンパク質、糖脂質、脂肪酸としては分子量が１０００以上１０万以下のものが好ましい。具体的には、天然に存在するタンパク質、またはその一部、さらに人工的に産生されたポリペプチド、および天然に存在するタンパク質のＮ末端またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基が付加されているタンパク質などが含まれるが、これらに限らず、この場合、これらのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
測定試料の標識は、分子全体を13Ｃや15Ｎ等の安定同位体で標識してもよいし、又は注目する部位に対して特異的に安定同位体標識を導入してもよい。【００１１】
媒体
本発明の媒体は、測定試料と接触される水溶液が一般的である。水溶液は、ＮＭＲ測定に用いられ、かつ測定試料がタンパク質の場合、その立体構造を保持するものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、純水、古典的緩衝液（グリシン、酢酸、リン酸、カコジル酸、イミダゾール等）、Ｇｏｏｄ緩衝液（Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｍｅｓ、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ等）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ロイペプチン、ＥＤＴＡ、ペプスタチンＡ等）、多水酸基性化合物（ショ糖、グリセロール、ポリエチレングリコール等）、ＳＨ基保護剤、酸化防止剤（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ等）、界面活性剤（オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等）、脂質（ＤＰＣ、ＤＨＰＣ等）、有機溶媒（グリセロール、プロパノール、ＴＦＥ、ＤＭＳＯ等）等を含む上記水溶液、およびこれらを安定同位体標識したものも含む水溶液等が挙げられる。しかし、上記に限定されるものではない。【００１２】
外部環境
本発明の外部環境とは、測定試料の周辺の環境を意味する。また、本発明の外部環境の変化の要因は、共存物質の添加、不添加もしくは濃度変化、変性剤の添加、不添加もしくは濃度変化、両親媒性の試薬の添加、不添加もしくは濃度変化、媒体のｐＨの変化、塩濃度の変化、媒体自体の変化、又はこれらのいずれか２以上の組み合わせが起こることを意味する。ここで、共存物質とは、測定試料に対する候補相互作用物質である。【００１３】
候補相互作用物質
本発明の候補相互作用物質は、測定試料となんらかの相互作用をもたらす物質を意味する。相互作用とは、測定試料に対して、共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力等による結合を意味するが、特に限定されない。具体的な相互作用としては、測定試料の作用に対しアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、インヒビター、プロモーターになるような物質等を意味する。また、上記作用の結果生じることによる、測定試料との結合反応、新たな物質の合成反応、分解反応も含まれる。【００１４】
固相担体
本発明の固相担体は、溶液ＮＭＲ測定を行え得るものであれば、特に制限はないが、例えば、樹脂、ならびにガラス、セラミックス、ラテックスおよび金属などの無機化合物（ただし非磁性化合物に限る）等が挙げられる。固相の形状はこれを溶液ＮＭＲに用いることができれば如何なるものでもよいが、ビーズ等の粒子状のものが好適に例示される。樹脂の具体例は以下に示す。例えば、コンビナトリアルケミストリーに利用される樹脂［ＴｅｎｔａＧｅｌ，Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｒｅｓｉｎ，ＡｒｇｏＧｅｌ，２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  Ｒｅｓｉｎ，Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｘｉｍｅ  Ｒｅｓｉｎ，Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｒｅｓｉｎ，Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎ，Ｔｈｉｏｍｅｔｈｙｌ  Ｒｅｓｉｎ，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒｅｓｉｎ，Ｗａｎｇ  Ｒｅｓｉｎ等（ＳＩＧＭＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ社等）］、亜鉛イオンキレート樹脂［Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ固定化樹脂［Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）、ＧＳＴ・ｂｉｎｄ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等］、ＩｇＧ抗体固定化セファロース樹脂［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｐｌｕｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＢＰＶ−１（ＡＵ１）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，  ＨＡ．１１  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，  ＦＬＡＧ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，  ６−Ｈｉｓ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，  ｃ−ｍｙｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，  Ｐｏｌｙｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｔ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ  （ＣＯＶＡＮＣＥ社），  ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ１  ｏｒ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、アミロース樹脂［Ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等］、ストレプトアクチン結合樹脂［ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＰＯＲＯＳ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）等］、ストレプトアビジン結合樹脂［Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣＰＧ（ＣＰＧ社）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）、ＳｏｆｔＬｉｎｋ  ｒｅｓｉｎ、ＴｅｔｒａＬｉｎｋ  ｒｅｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等］、カルモジュリン固定化樹脂［Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等］、キチン樹脂［Ｃｈｉｔｉｎ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）等］、レクチン結合樹脂［Ｌｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、コンカナバリンＡ結合樹脂［ＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］、Ｓ−タンパク固定化樹脂［Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等］、核酸固定化樹脂［Ｐｏｌｙ（Ａ）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，  Ｐｏｌｙ（Ｕ）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，  Ｐｏｌｙ（Ｃ）  Ｔｙｐｅ６  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社）等］が挙げられるが、これらに限らない。
このようにして調製される固相担体の粒子径は、通常固相担体に用いられる粒子径で良い。
また、固相担体と測定試料の関係から、抗原に対しては抗体、ビオチンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、ホルモン受容体（例えばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばインスリン）、レクチンに対しては対応する糖鎖、などが固相担体の例として挙げられる。【００１５】
固相担体の充填方法
固相担体の充填方法は、固相担体を分析管に充填できる方法であれば、いずれの方法でも良い。
例としては、分析管の入口端部にチューブ等を接続する。次に、固相担体を含む緩衝液を該チューブ等に入れ、緩衝液中に含まれる固相担体を、該チューブ等を介して分析管に導入する。なお、分析管中の緩衝液は、分析管の出口端部から排出する。
また、測定試料がゲル状の場合には、測定試料は直接固相担体を充填した分析管に導入しても良い。なお、ゲル状の測定試料を流出しないようにフィルター及び／又は液漏れを防止するためにパッキンを設置しても良い。【００１６】
測定試料の固定化方法
測定試料の固定化とは、固相担体に測定試料であるタンパク質等を化学結合、親和性結合、抗原抗体反応を利用して固定させることである。固定化方法は、ＮＭＲ検出セルの分析管に充填された上記固相担体上に行うことが好ましい。これにより、連続的な測定試料の外部環境変化が可能となる。また、以下のような手段が適用できる。
１）測定試料に、固相担体と結合性を有しかつ十分な自由度を有するリンカーを付加する。
リンカーは、測定試料がペプチド等の場合、例えばそのSH基と架橋できるものであるものが利用できる。好ましくは片末端がSH基と反応し、もう片末端がOH基、COOH基、NH2基のいずれかと反応する化合物である。このようなリンカーとしては、例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸およびマレイミドカルボン酸等が例示される。スペーサーは、測定試料とリンカー間にあって固相担体表面と測定試料間の長さを調節できるものであれば特に限定されないが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン、及び抗体から選ばれる１又はこれらの複数の組み合わせからなる物質を利用できる。アルブミンや抗体は組換体が利用できる。
２）測定試料を、固相担体と化学的に結合する。
測定試料を固相担体と化学的に結合するには、測定試料に、固相担体表面の導入置換基と結合を形成するための反応活性基が存在する。反応活性基は、先に示した固相担体の反応性官能基と化学結合を形成する官能基であれば特に種類は問わないが、アミノ基、カルボン酸基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、エポキシ基、アルキルハライド、シリルハライド等の中から固相担体の反応性官能基に応じて適宜選択するのが好ましい。生じた化学結合の種類としては、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキルアミノ結合、イミノ結合、シリルエーテル結合等が好ましいが、特にアミド結合、チオエーテル結合が好ましい。また、該化学結合を形成する為の反応試薬は、その結合 に応じて適宜選択することができる。
３）測定試料を、自由度が高い固相担体で補足する。
固相担体が自由度の高い担体であれば、測定試料にリンカー・スペーサー等を使わずともＮＭＲ測定は可能である。しかし、上記記載したリンカー・スペーサー等と組み合わせることでより良い測定結果を得ることができる。自由度が高い担体としては、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、高分子重合体などが例示され、具体的には小胞体（リポソーム）、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、高分子ゲル特に網目構造の高分ゲル、多糖類が例示される。小胞体（リポソーム）は脂質人工膜で構成される粒子でリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から脂質二重層としてつくられる。その調製には、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法等広く公知方法が適用される。組換えアルブミンは、既知の遺伝子工学的手法により製造されたものが利用でき特に制限されない。例えば、実用化レベルにある宿主として酵母を用いて生産される組換えアルブミンは好適である。アルブミンの微粒子化（重合体化）は公知である。高分子ゲルは網目構造に調製されており、例えば乳酸及び/又はグリコール酸等を重合化して得られる高分子を微粒子化して調製できる。又、多糖類としては、デキストランは好適な担体であり、例えばアミンカップリングでリンカーと測定試料化合物を化学的に結合させることができる。【００１７】
測定方法
本発明におけるＮＭＲ測定方法は、通常の溶液ＮＭＲに用いられる方法であれば如何なる方法も用いることができる。具体的には、同種核多次元ＮＭＲ測定として、COSY、TOCSY、NOESY、ROESY等であり、異種核多次元ＮＭＲ測定法としては、ＨＳＱＣ、ＨＭＱＣ、ＣＨ−ＣＯＳＹ、ＣＢＣＡＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＨＡ、Ｈ（ＣＡＣＯ）ＮＨ、ＨＣＡＣＯ、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ／１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、１３Ｃ  ／１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、１５Ｎ／１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＳＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ等があるが特に限定されない。【００１８】
溶液ＮＭＲ測定用装置
本発明の溶液ＮＭＲ測定用装置は、ＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出部分であるＮＭＲ検出セル中において、測定試料を媒体中で固定化可能な担体を有し、かつ固定化された測定試料の外部環境を連続的に変化させることが可能な手段を有するものである。
溶液ＮＭＲ測定用装置の構成は、１）測定試料を媒体中で固定化可能な固相担体を充填した分析管、２）固定化された測定試料の外部環境を変化させるための溶液又は候補相互作用物質を供給可能な送液管、３）溶液又は候補相互作用物質を廃液可能な廃液管、を有するものである。好ましくは、複数の送廃液管を有する又は、分析管の挿入側若しくは／又は排出側にフィルターが設置されているＮＭＲ検出セルを有する。
また、従来の溶液ＮＭＲ測定用装置のＮＭＲ測定用磁石内のＮＭＲ検出セルを取り外し、本発明のＮＭＲ検出セルを導入することにより、本発明の溶液ＮＭＲ測定用装置とすることができる。【００１９】
本発明の実施態様
本発明のＮＭＲ測定方法では、以下の実施態様によれば、測定試料と相互作用する物質の同定だけではなく、従来の溶液ＮＭＲ測定では不可能であった、測定試料の外部環境を連続的に変化させることによる、１）タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡すること、２）測定試料と相互作用物質の相互作用の過程を追跡すること、３）固定化された測定試料を遊離させること、４）測定試料と相互作用する候補相互作用物質のハイスループットスクリーニングすること、５）測定試料の分子配列を一定方向に配向させること、が可能である。さらに、複数の送廃液管を有するＮＭＲ検出セルを用いれば、複数の外部環境の要因を同時に変化させることができるので、従来では測定することができなかった外部環境で溶液ＮＭＲ測定を行うことができる。
さらに、完全な水溶液状態ではない測定試料を使用する場合には、該試料を用いたシム調整（高品質のＮＭＲスペクトル測定に必要なＮＭＲ装置の磁場均一度を高めるための微調整）が困難であると考えられる。そのために、あらかじめ同型の水溶液タイプでシムを合わせておき、測定試料を充填したＮＭＲ検出セルを装着することで、シム調整を不要とすることができる。
また、測定時間は、間接観測軸側のnon-linear測定、DFT、Hadamard変換法を利用することにより短時間測定を可能にし、リアルタイムで測定試料をモニターすることができる。ＮＭＲスペクトルのシグナルの特定方法は、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられる。【００２０】
１）タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡することを可能とする測定方法
測定試料であるタンパク質をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する。続いて、タンパク質の立体構造に影響を与える例えば変性剤を送液管から固定化された測定試料に供給する。ここで変性剤の濃度を徐々に上げることにより、測定試料の立体構造を徐々に変化させ、その変化の過程をリアルタイムでＮＭＲ測定を行う。また、送液管からの送液を止めて測定を行うこともできる。加えて、測定試料に対して様々な変性剤を供給することにより、最適な測定試料のフォールディング環境条件のスクリーニングもするができる。なお、供給された変性剤を含む溶液は、廃液管を通してＮＭＲ測定用磁石外に廃液される。【００２１】
２）測定試料と相互作用物質の相互作用の過程を追跡することを可能とする測定方法
測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する。続いて、測定試料と相互作用する相互作用物質を送液管により、固定化された測定試料に供給する。ここで、測定試料と相互作用物質が共存することによる測定試料の立体構造の変化過程をリアルタイムでＮＭＲ測定を行う。詳しくは、相互作用物質を少しずつ連続的に測定試料に供給し、その連続的な供給による変化をリアルタイムでNMR測定を行う。
さらに、相互作用物質と相互作用した測定試料に、新たに相互作用する物質を、送液管を通して供給することによって、二段階さらには複数段階の相互作用する物質の解析もすることができる。
また、変化したシグナルが測定試料のどの部位であるかを特定することによれば、測定試料の相互作用物質が結合している部位を特定することもできる。【００２２】
３）固定化された測定試料を遊離させることを可能とする測定方法
測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化して、NMR測定を行う。続いて、固定化された測定試料に固相担体から遊離させることができる溶媒を送液管により供給して、固定化されていない測定試料のNMR測定を行う。そして、両NMR測定の結果を比較することにより、測定試料のどの部位が固定化に寄与しているかを検出することができる。
これにより、固定化されているときには測定できず、遊離すると測定可能になるという性質を利用した新規なＮＭＲ測定方法を行うことができる。【００２３】
４）測定試料と相互作用する候補相互作用物質のハイスループットスクリーニング
測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する。続いて、候補相互作用物質を送液管により、固定化された測定試料に供給する。ここで、測定試料と候補相互作用物質が共存することによる測定試料の立体構造変化のＮＭＲ測定又は立体構造変化の過程をリアルタイムでＮＭＲ測定を行う。続いて、測定試料と候補相互作用物質の結合のみが解離するような溶媒を送液管から供給し、候補相互作用物質を測定試料から解離させ、さらに、廃液管を通してＮＭＲ検出セルから排除する。続いて、候補相互作用物質を送液管から供給し、ＮＭＲ測定を行う。以上のような工程を繰り返すことで、候補相互作用物質をハイスループットにスクリーニングすることができる。【００２４】
５）測定試料の分子配列を一定方向に配向させることを可能とする測定方法
測定試料をＮＭＲ検出セルの分析管中の固相担体に固定化する。続いて、例えば供給する溶液の流速を変化させることにより、測定試料の分子配列を一定方向に配向させ、その配向状態に対しＮＭＲ測定を行う。【００２５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
固相担体が充填された溶液ＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セルの製造
分析管の入口端部にチューブを接続した。次に、固相担体であるレジンを含む緩衝液を該チューブに入れ、緩衝液中に含まれるレジンを、該チューブ等を介して分析管に導入した。分析管中の緩衝液は分析管の出口端部から排出した。なお、レジンはGSTに特異的結合可能な性質を持つ市販のものを使用した。
次に、送液管の出口端部をレジンが充填された分析管の入口端部に挿入し、続いて、廃液管の入口端部を該分析管の出口端部に挿入した。また、分析管の入口側（挿入側）及び出口側（排出側）にフィルターを設置した。さらに、分析管の入口側（挿入側）に液漏れ防止用のパッキンを設置した。
【実施例２】
【００２７】
本発明の溶液ＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セルを用いての測定方法
測定試料である融合タンパク質｛GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）とシグナル伝達タンパク質カルモジュリンがリンカー（LVPRGSAM-(GGGGS)4-LEVLFQGPH：配列番号１）を介して結合したタンパク質（GST-リンカー-カルモジュリン）｝を実施例１で製造した溶液ＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セルに導入した。次に、該溶液ＮＭＲ測定用ＮＭＲ検出セルをＮＭＲ磁場にセットした。続いて、２５度、ポイント数1024条件下で溶液NMR測定を行った。【００２８】
1H-15N ＨＳＱＣ測定結果
シグナル伝達タンパク質カルモジュリンの主鎖アミド基の1Hシグナル検出ができた（参照図３）。すなわち、融合タンパク質のGSTが固相担体であるレジンに結合し、シグナル伝達タンパク質カルモジュリンはリンカーを介して分析管中の液相に存在した。さらに、シグナル伝達タンパク質カルモジュリンの主鎖アミド基のスペクトルが高感度に検出することができた。【００２９】
1H-15N ＨＳＱＣ測定結果
シグナル伝達タンパク質カルモジュリンの主鎖アミド基の1H-15Nシグナル検出ができた（参照図４）。すなわち、融合タンパク質のGSTが固相担体であるレジンに結合し、シグナル伝達タンパク質カルモジュリンはリンカーを介して分析管中の液相に存在した。さらに、シグナル伝達タンパク質カルモジュリンの主鎖アミド基のスペクトルが検出することができた。【００３０】
以上の測定結果より、送液管からの溶媒供給等による測定試料の外部環境を連続的に変化させれば、１）タンパク質のフォールディングの中間過程を追跡すること、２）測定試料と相互作用物質の相互作用の過程を追跡すること、３）固定化された測定試料を遊離させること、４）測定試料と相互作用する候補相互作用物質のハイスループットスクリーニングすること、が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の産業上の利用可能性は、本発明のＮＭＲ測定方法は連続的に測定試料の外部環境の変化が可能であり、効率的な測定試料と候補相互作用物質の相互作用の過程の解析が可能であり、さらにタンパク質の立体構造変化をリアルタイムに追跡可能であるということが提供できることにある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルの概要図
【図２】固相担体が充填した溶液ＮＭＲ装置用ＮＭＲ検出セルの図
【図３】シグナル伝達タンパク質カルモジュリンでの1Hシグナル検出の結果
【図４】シグナル伝達タンパク質カルモジュリンでの1H-15Nシグナル検出の結果
【符号の説明】
【００３３】
１０１：送液管
１０２：分析管
１０３：廃液管
２０４：固相担体
２０５：フィルター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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