(57)【要約】  長年市販され食経験の長いキサントモナス由来のキサンタンガムに、リムラス陽性糖脂質が存在することを見いだし、これを精製し、このリムラス陽性糖脂質に免疫賦活作用があることを見いだした。安全、かつ、安価に高濃度に免疫賦活物質を含むリムラス陽性糖脂質を製造する方法を提供する。本発明のリムラス陽性糖脂質製造方法は、リムラス陽性糖脂質を、キサンタンガムより抽出することを特徴とする。上記リムラス陽性糖脂質が配合されているリムラス陽性糖脂質配合物は、医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、及び浴用剤など多様な用途に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リムラス陽性糖脂質を、キサンタンガムより抽出することを特徴とするリムラス陽性糖脂質製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のリムラス陽性糖脂質製造方法で得られることを特徴とするリムラス陽性糖脂質。
【請求項３】
請求項２記載のリムラス陽性糖脂質が配合されていることを特徴とするリムラス陽性糖脂質配合物。
【請求項４】
前記リムラス陽性糖脂質配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤であることを特徴とする請求項３記載のリムラス陽性糖脂質配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物（具体的には家畜、愛玩動物など）、鳥類（具体的には養鶏、愛玩鳥類など）、両生類、は虫類、魚類（具体的には、愛玩魚類など）、無脊椎動物及び植物などの動植物に及ぶ医薬品、医薬部外品、化粧品、機能性食品、飼料、肥料及び浴用剤などに添加しても安全な免疫賦活物質であるキサンタンガムリムラス陽性糖脂質の製造方法、及びそのリムラス陽性糖脂質を配合した配合物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む哺乳動物（具体的には家畜、愛玩動物など）、鳥類（具体的には養鶏、愛玩鳥類など）、両生類、は虫類、魚類（具体的には、愛玩魚類など）、無脊椎動物及び植物に関して、感染防除技術を含む疾病予防・治療法を確立することは喫緊の課題である。しかもこれを達成する上では、化学物質を用いず、環境汚染がなく、耐性菌を生ずることなく、人体に蓄積性がない方法が強く求められている。本発明者らは如上の課題に関して、すでに天然物由来の免疫賦活物質が疾病予防・治療効果を安全に達成することを発見した（非特許文献１）。その一例として小麦粉常在菌であるパントエア・アグロメランスから得たリポ多糖を用いることができる（非特許文献１）。リムラス陽性糖脂質には強い免疫増強活性があることが知られている（非特許文献２）。この中にはいわゆるリポ多糖も含まれる。リポ多糖は、グラム陰性菌の細胞外壁の主要構成成分であるとともに、リポ多糖は、Ｃｏｌｅｙ’ｓ（コウレイ）ワクチンの主成分のひとつであり、強力な免疫賦活活性を持つことが知られている（非特許文献３）。【０００３】
本発明者らは小麦粉中にリムラス陽性糖脂質が存在すること、その一部は小麦共生細菌のリポ多糖であること、これらが強力に自然免疫を賦活することを発見した（非特許文献４）。そして、上記２者は経皮、経口で投与することで、安全かつ、強力に自然免疫を賦活し、感染症を含む広範な疾患に対して予防・治療効果を示す（非特許文献５）。さらに小麦粉を小麦粉常在菌のパントエア・アグロメランスによって発酵することでパントエア・アグロメランス由来のリポ多糖の含有量を増強しただけでなく小麦由来の成分を含んだ新規な免疫賦活物質である小麦発酵エキスは、畜産・水産養殖分野において抗生・化学物質に代わる安全・安心な天然素材として感染防除効果を発揮することを報告してきた。【０００４】
リポ多糖の基本構造はリピドＡと呼ばれる脂質とこれに共有結合した各種の糖（多糖）からなっている。リピドＡに続く部分は、近縁の菌では比較的均一な構造をとるＲコアとこれに続き菌種によって異なる構造をとるＯ抗原多糖部分からなっている（非特許文献７）。また、Ｏ抗原はLPS（リポ多糖）を特徴づける同一のオリゴ糖の繰り返し構造を有する（非特許文献１）。従って、一般にリポ多糖は複数の分子量を有する混合物を形成する。また、リポ多糖は由来する微生物により、構造が異なることが知られている。例えば、サルモネラ菌由来のリポ多糖と大腸菌由来のリポ多糖では構造が異なるし、生物活性も異なる。しかし、一般にリポ多糖の構造を決定することは容易ではないため、多くのグラム陰性菌リポ多糖の構造や機能の詳細は知られていない。そこで、一般的に機能的な違いがあることに基づいてリポ多糖として新規な構造をもつとされている。【０００５】
ところで、最近の研究でリポ多糖がTLR4を介して自然免疫を活性化することが明らかとなった（非特許文献６）。リポ多糖のリピドＡ部分がTLR4との結合に必須であること、多糖部分がTLR4の細胞内情報伝達の効率に大きく影響を与えることが見いだされている。以上のことから、リポ多糖の細胞応答の差は構造的な差を示すことが推察される。【０００６】
リポ多糖が経皮、経口投与で安心・安全であることを立証することは、リポ多糖の有用性確立に向けて重要である。そこで、食品の製造、発酵などに古来用いられているグラム陰性菌に注目した。すなわち、食品の製造に用いられ、あるいは発酵生産物と共に食用に供されるグラム陰性菌にリムラス陽性糖脂質なかんずくリポ多糖が存在すれば、この事実はリムラス陽性糖脂質あるいはリポ多糖の食経験を立証することになる。このことは、リムラス陽性糖脂質あるいはリポ多糖が経皮、経口投与で安心・安全であることを強力に示す知見であると共に、これら物質を用いた新たな化粧品・食品などのヘルスケア商品、医薬品などの開発を可能とするはずである。
【非特許文献１】河内千恵  外6名、「小麦発酵抽出物の自然免疫調節作用」、New Food Industry (2006) Vol.48, p19-27
【非特許文献２】Ulmer, A.J. 外２名、"Lipopolysaccharide: Structure, Bioactivity, Receptors, andSignal Transduction."、Trends in Glycoscience andGlycotechnology、(2002) Vol.14, p.53-68
【非特許文献３】Starnes, C. O.、"Coley's toxins in perspective."、Nature、(1992) Vol.357, p.11-12
【非特許文献４】Nishizawa, T. 外７名, Chem. Pharm. Bull., (1992), Vol.40, p479-483
【非特許文献５】稲川裕之 外８名、「マクロファージ活性化作用を有する小麦粉由来リポ多糖(LPSw)の種々の疾患に対する治療または予防効果」、Biotherapy、(1991) Vol.5, p.617-621
【非特許文献６】Kiyoshi Takeda 外１名、"Toll-like receptors in innate immunity."、International Immunology、Vol.17, p.1-14
【非特許文献７】生化学事典第二版(1990)、東京化学同人、p.1949
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
経口・経皮でヒトや動物に投与するためには、食経験に裏付けられた安全性が求められている。例えば、造酢に用いられている酢酸菌はグラム陰性菌であり、菌体成分が発酵産物に含まれることから、長い食経験があるといえる。パントエア・アグロメランスはライ麦パンの乳酸増殖に必要な葉酸を供給しており、ライ麦パンを食するときには相当量の菌体成分を摂取していることになる。【０００８】
キサンタンガムはグラム陰性菌のキサントモナス（Xanthomonas campestris）から産生される多糖類で、マンノース、グルコース、グルクロン酸からなり、β-1,4結合したグルコースを主鎖とし、側鎖は主鎖のグルコース残基１つおきにマンノース２分子とグルクロン酸が結合している。粘度が高く、酸、塩分、熱に安定で食品の増粘剤として広く利用されている。日本には約30年前に導入され、現在では年1300トン以上が日本で消費されている。これらのことから、キサンタンガムは食経験が長いグラム陰性菌発酵産物である。【０００９】
本願では長年市販され食経験の長いキサントモナス由来のキサンタンガムに、これまで知られていないリムラス陽性糖脂質が存在することを見いだし、これを精製し、このリムラス陽性糖脂質に免疫賦活作用があることを見いだした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のリムラス陽性糖脂質製造方法は、リムラス陽性糖脂質を、キサンタンガムより抽出することを特徴とする。【００１１】
また、本発明のリムラス陽性糖脂質は、上記リムラス陽性糖脂質製造方法で得られることを特徴とする。【００１２】
また、本発明のリムラス陽性糖脂質配合物は、上記リムラス陽性糖脂質が配合されていることを特徴とする。【００１３】
また、上記リムラス陽性糖脂質配合物は、医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、長年市販され食経験の長いキサンタンガムに、リムラス陽性糖脂質が存在することを見いだしたので、安心かつ安全なリムラス陽性糖脂質を得ることができる。そして、これを精製し、このリムラス陽性糖脂質に免疫賦活作用があることを見いだしたので、このリムラス陽性糖脂質は、これを配合したヘルスケア商品、医薬品など多様な用途に用いることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００６−１９４９６５の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質の抽出
【実施例】
【００１６】
１）キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質の抽出
キサンタンガム1.00g（大日本住友製薬）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１リットルに加え、ポリトロンを用いて10分間、目盛り６で均一化した。得られたキサンタンガム0.1%（w/v%）のＰＢＳ溶液にポリミキシンＢ固定化樹脂（アフィプレップポリミキシンサポート：BIO-RAD社製、カリフォルニア）5mlを添加し、攪拌機（マグネチックスターラー）を用いて４時間攪拌した。ポリミキシンＢはリピドＡ等の脂溶性の高い分子と結合することが知られている。攪拌終了後、溶液を50mlの遠心チューブに移し、室温にて2000回転／分(rpm)で、10分間遠心分離を行った。遠心終了後、上清は捨て、アフィプレップポリミキシンサポートを沈殿として回収した。沈殿に１０ｍｌのＰＢＳを加え、攪拌し、室温にて2000rpmで遠心分離により沈殿を回収した。沈殿に0.02Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５ｍｌを加え、１分間攪拌し、室温にて2000rpmで、10分間遠心分離を行った。遠心終了後、上清を別の容器に回収した。再度0.02Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５ｍｌを沈殿に加え、１分間攪拌し、室温にて2000rpmで、10分間遠心分離を行った。遠心終了後、上清を併せた。直ちに、１モル/リットル(M)トリス塩酸ｐＨ７.0を１ｍｌを加え中和した。得られた液は糖を含むことがフェノール硫酸法で確認された。そこで、この液をキサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質含有抽出液とした。【００１７】
リムラス陽性糖脂質をエンドスペシー（生化学工業、β1,3グルカンとは反応しないリムラステスト）で測定したところ、約4mgのリムラス陽性糖脂質が存在した。キサンタンガム1gには約5mg程度のリムラス陽性糖脂質が含まれていたので、約80%が回収された。【００１８】
２）リムラス陽性糖脂質の免疫賦活作用の測定
マウスのマクロファージ系の培養細胞株であるRAW264.7に、リムラス陽性糖脂質を添加した後の、細胞からの一酸化窒素（NO）産生を測定した。【００１９】
RAW264.7細胞は弱い付着性の細胞なので、培養フラスコからピペッティングにより回収し、培養液により細胞濃度を8×105個/mlに調整した。細胞懸濁液100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、細胞がほぼ付着する６時間後に試験に用いた。【００２０】
リムラス陽性糖脂質をパントエア・アグロメランスのリポ多糖濃度に換算して4000ng/mlになるように調整した。さらに10倍ずつ５段階の段階希釈を行った。各希釈液を培養液でさらに２倍希釈したものと、各希釈液を40μg/mlのポリミキシンＢ含有培養液でさらに２倍希釈したものをそれぞれ調製し、細胞の入ったウェルへの添加用標品とした。【００２１】
同時に、キサントモナス  カンペストリスの菌体から精製したリポ多糖（LPSx）も試験した。各標品を予め細胞を添加してある96穴平底プレートの各穴に100μlずつ添加した。
20時間37℃、5%炭酸ガス培養器内で培養し、培養終了後、上清50μlを回収した。常法に従いGriess試薬を用いて培養液中の一酸化窒素の代謝物である亜硝酸量を測定した。【００２２】
表１、表２に測定結果を示した。キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質抽出液は100ng/ml以上の濃度においてRAW264.7細胞からのＮＯ産生を示した。LPSxとリムラス陽性糖脂質のNO産生能は7.0μMの産生能を比較すると22倍の差があった（7μMの亜硝酸濃度を示すために添加する必要があるLPSxは2.8ng/mlであるのに対して、キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質では61.2ng/mlであることから、61.2／2.8＝22）。また、ポリミキシンＢ添加群では、両サンプルともに100ng/mlではNO産生は認められず、1000ng/mlでNO産生が認められたことから、ポリミキシンＢと結合する構造を有することが確認された。
【００２３】
【表１】
2008007476.tif 000002
【００２４】
【表２】
2008007476.tif 000003
以上の結果から、キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質はマクロファージからNO産生を誘導する作用を有するが、キサントモナスの菌体から得られるリポ多糖(LPSx)とは生物活性が異なることが認められ、この結果は両者間に構造的な差異が存在することを示している。【００２５】
３）キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質の分子量の測定
キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質の分子量を調べた。そこで、リムラス陽性糖脂質4μgをサンプル緩衝液と混ぜ、トリシンを用いたドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−PAGE）を行った。泳動後、リポ多糖の分子を可視化させる目的でシルベストステイン（Cat  No30642-41、ナカライテスク、日本）キットにより銀染色を行った。分子量サイズマーカーとして、Prestained Protein Marker, Broad Range（Premixed Format）（Cat  No 7708L、NEW ENGLAND BioLabs）を用いた。その結果、LPSxは2000から4500ダルトン（Da）と30キロダルトン(kDa)から80kDaに多数の階段状のバンドが認められた。キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質は2000から4000Daにバンドが検出された。このように、LPSxの分子量は、2000から4500Da及び30から80kDaであるのに対して、キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質の分子量は2000から4000Daであり、この結果は両者間に構造的な差異が存在することを示している。【００２６】
４）キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質のLPSxとの抗原性の違い
キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質とキサントモナスの菌体から得られたリポ多糖（LPSx）に構造的な差異があれば、抗原の差異を生じ、抗体の反応性が異なる可能性がある。そこで、次に、LPSxに対するモノクローナルでキサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質の抗体染色を行った。リムラス陽性糖脂質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（BIO-RAD社製）に滴下後、PVDF膜は3%牛血清アルブミン(BSA)含有PBS溶液中で室温にて30分間、非特異的反応の防御（ブロッキング）した。その後、0.05%ツイーン２０(Tween 20)含有トリス緩衝生理食塩水（TBS：20mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl）にて５回洗浄操作を行った。洗浄後、一次抗体としてキサントモナスの菌体から得たリポ多糖に対する特異抗体（キサントモナスリポ多糖特異的モノクローナル抗体は以下の方法で作製した。キサントモナス加熱死菌を完全フロイトアジュバントと混合し、BALB/cマウス腹腔内に一匹当り１×１０８個投与し、２週間間隔で３回腹腔内に投与した。最終投与3日後に、脾臓から細胞を取り出し、ミエローマ（P3U1）と５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を用いて細胞融合した。融合細胞を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＨＡＴ培地に懸濁させ９６穴平底プレートで３７℃、５％ＣＯ２下で静置しながら、７日間培養し、コロニー形成が見られた上清中を、キサントモナスのリポ多糖を抗原とした公知慣用のＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法で測定した。上記で得られたモノクローナル抗体産生細胞を公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。その結果、抗キサントモナスリポ多糖マウスモノクローナルＩｇＧ抗体を21種得た。）を含む培養液を5ml加え、室温で60分間反応させた。その後、0.05%Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水（TBS：20mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl）にて5回洗浄操作を行った。洗浄後、二次抗体としてアルカリホスファターゼ標識抗マウス IgMヤギ免疫グロブリン（A9688、シグマ）を1％BSA含有PBS溶液で1000倍希釈したものを5ml加え室温で60分間反応させた。その後、0.05%Tween 20含有TBSにて５回洗浄操作を行った。洗浄後、発色基質0.0165% 5-ブロモ-4-クロロ-3インドリルリン酸（025-08651、和光純薬、日本）、0.033%ニトロブルーテトラゾリウム（N-6876、シグマ）を含むアルカリホスファターゼ緩衝液(50mMTris HCl pH9.5、1mM MgCl2)を5ml加えた後に、蒸留水中にPVDF膜を移し反応を停止した。その結果、LPSxは21種類すべての抗体で検出されたが、キサンタンガムからのリムラス陽性糖脂質は20種類の抗体とは反応しなかったが、わずかに一種類の抗体とのみ反応した。このように、キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質は、キサントモナス菌のリポ多糖（LPSx）とは抗原性が異なることが分かった。この結果より、キサンタンガムから抽出されたリムラス陽性糖脂質の構造は、キサントモナス菌のリポ多糖（LPSx）と構造が異なるものであることが示された。【００２７】
５）キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質の機能性食品実施例
キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質入りアメの製造
原材料としてグラニュー糖、水飴、水に１）で製造したキサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質を加えたものを５：５：５：１の割合で混合し、加熱して１２０℃〜１４０℃で煮詰めたものを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして１ｇ前後の粒状に成型し、キサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質入りのアメを作製した。【００２８】
本アメ適量を水２０ｍｌに入れ、加熱することで溶解させた。この溶液中のキサンタンガムから抽出したリムラス陽性糖脂質量を測定したところ、６μｇ/ｇであった。このアメを、風邪をひいてのどの痛みのある男女６名に摂取させた。その後、直ちにのどの痛みに対するアンケート調査を行った。のどの痛みについては、６名とも痛みが軽減したと感じた（一標本符号検定：Ｐ＜０．０３）。【００２９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【国際調査報告】
2008007476.tif 000004
2008007476.tif 000005
2008007476.tif 000006
2008007476.tif 000007