(57)【要約】  本発明者らは、 sc(Fv)2の異性化反応を抑制する安定化剤・安定化条件を見出した。また、凍結乾燥製剤化することで上記異性化反応を抑制できることを見出した。すなわち、見出された安定化剤・安定化条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、sc(Fv)2型分子のbivalent scFv型からsingle chain diabody型への異性化反応、および/あるいは、single chain diabody型からbivalent scFv型への異性化反応の両方向あるいは一方向の異性化反応を抑制することが可能であることを明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加した、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
【請求項２】
塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アミノ糖が、メグルミンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
糖アルコールが、マンニトールである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アミノ酸が、リジンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
pHが4.5〜9.0であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
【請求項８】
pHが6.0〜9.0であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
【請求項９】
塩濃度が50mM〜1000mMであることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
single chain diabody型sc(Fv)2、またはbivalent scFv型sc(Fv)2を高純度で含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物の異性化反応を抑制する工程。
【請求項１４】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程。
【請求項１５】
塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アミノ糖が、メグルミンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
糖アルコールが、マンニトールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アミノ酸が、リジンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物のpHを4.5〜9.0にする工程。 
【請求項２１】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物のpHを6.0〜9.0にする工程。 
【請求項２２】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物の塩濃度を50mM〜1000mMにする工程。
【請求項２３】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
（ａ）sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、並びに／または、pH3.0〜6.0、および／もしくは、塩濃度が500mM以下にてインキュベートすることによって、single chain diabody型の含有比率がbivalent scFv型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）生成したsingle chain diabody型のsc(Fv)2を取得する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得したsingle chain diabody型sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。
【請求項２４】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
（ａ）sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、並びに／または、pH3.0〜6.0、および／もしくは、塩濃度が500mM以下にてインキュベートすることによって、bivalent scFv型の含有比率がsingle chain diabody型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）生成したbivalent scFv型のsc(Fv)2を取得する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得したbivalent scFv型sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。
【請求項２５】
以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物を凍結乾燥する工程。
【請求項２６】
塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
【請求項２７】
塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アミノ糖が、メグルミンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
糖アルコールが、マンニトールである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸が、リジンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
pHを4.5〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
【請求項３３】
pHを6.0〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
【請求項３４】
塩濃度を50mM〜1000mMにする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
【請求項３５】
凍結乾燥する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
【請求項３６】
医薬組成物中の有効成分がsc(Fv)2である、請求項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含有する、sc(Fv)2の異性化反応を抑制するために用いる安定化剤。
【請求項３８】
塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、請求項３７に記載の安定化剤。
【請求項３９】
アミノ糖が、メグルミンである、請求項３７に記載の安定化剤。
【請求項４０】
糖アルコールが、マンニトールである、請求項３７に記載の安定化剤。
【請求項４１】
アミノ酸が、リジンである、請求項３７に記載の安定化剤。
【請求項４２】
pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、請求項３７に記載の安定化剤。
【請求項４３】
以下の工程を含む、sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質のスクリーニング方法
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製されたsc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる工程、
(iii) 被検物質の接触させたsc(Fv)2組成物において、sc(Fv)2の異性化反応の抑制の有無を測定する工程、
(iv) sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、sc(Fv)2を含有する医薬組成物およびその製造方法に関する。さらに詳しくは異性化反応が抑制されたsc(Fv)2を含有する医薬組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
sc(Fv)2は2つの軽鎖可変領域（VL）と2つの重鎖可変領域（VH）の4つの可変領域をリンカーなどで結合して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。【０００３】
例えば、VH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4やVL2-linker-VH1-linker-VL4-linker-VH3の配列を有する一本鎖抗体が知られている。sc(Fv)2の構造は、Fv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するsc(Fv)2と、VH1とVL4、VH3とVL2がそれぞれFvを形成するsc(Fv)2の2種類の構造異性体が存在すると考えられる。
しかしながら、これまで、sc(Fv)2の研究はBispecific sc(Fv)2に関するものが多かった為、sc(Fv)2の構造異性体についてはほとんど報告がない。【０００４】
Bispecific sc(Fv)2は、VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列において、VH1とVL4、および、VH3とVL2（あるいはVH1とVL2、および、VH3とVL4）が異なるモノクローナル抗体由来の可変領域をもつsc(Fv)2である。Bispecific sc(Fv)2の場合には、VH1とVL4、または、VH3とVL2（あるいはVH1とVL2、または、VH3とVL4）が同じモノクローナル抗体由来であることからFvを形成する効率が高くなり、構造異性体の出現はある程度抑制されると考えられる。実際に、リンカー長を15-5-15と15-15-15のbispecific sc(Fv)2を作製しても、活性は変らないことが報告されている（非特許文献５）。従って、Bispecific sc(Fv)2の場合は構造異性体に関しては詳細な言及がされていないことが多い。例えば、非特許文献３、４、８、９は、bispecificな結合活性を確認することにより正しい組み合わせのFvが存在することは示しているが、正しくないFvの組み合わせの存在比率や両者の存在比の定量的な評価に関する記載はない。また、非特許文献６は、Bispecific sc(Fv)2のリンカーの長さを変化させること（両端あるいは中央のリンカーの長さの改変）により、monomer、dimerの構造変換を確認しているが、sc(Fv)2の構造異性体については分子構造モデル予測での議論に留まっており、実際の試料における構造異性体の存在比率や構造の同定に関する記載はない。【０００５】
また、sc(FV)2の構造異性体について着目されていなかったので、構造異性体の制御についても詳細な検討はなされていない。非特許文献１０においても、リンカーの長さを5-15-5あるいは15-5-15にすることで、それぞれsingle chain diabodyあるいはbivalent scFvの構造を取ることを予測している。これは、scFvにおいてリンカーの長さが12以下の場合、一般的に隣り合うVHとVLはFvを形成しにくい（つまりmonomerを形成しにくい）ことが報告されているためである。しかしながら、非特許文献２において、リンカーの長さが10あるいは5のFvにおいても少量だがmonomerが形成することが報告されており、非特許文献１０におけるリンカーの長さを5-15-5あるいは15-5-15の場合においても、得られたsc(Fv)2は必ずしも100％のsingle chain diabodyあるいはbivalent scFvの構造であるとは限らない。【０００６】
これまでの報告では構造異性体に関してはFvの組み合わせとリンカーの長さからの構造予測のみで、構造異性体の含有比率の定量的分析や得られた構造が目的の構造であるかどうかの確認・証明は行われておらず、構造異性体が十分に評価および制御されているとは言えない。すなわち、いかなるリンカーの長さのsc(Fv)2においても、Fvの組み合わせとリンカーの長さからは構造異性体の存在比を予測することは極めて困難であり、2組のVH、VLを有するsc(Fv)2型分子においては２つの構造異性体の存在は考えなければならない問題である。【０００７】
低分子化合物に関しては、光学異性体や幾何異性体の分離方法は多数知られているが、これまでにタンパク質の異性体を分離する方法は報告されていない。タンパク質の１アミノ酸の違いを分離するような方法はすでに多数報告されているが、完全に同一なアミノ酸一次配列を有する２つの構造的な異性体を分離する方法はこれまでに報告がない。sc(Fv)2の構造異性体に関しても同様で、従来技術ではsc(Fv)2の2種類の構造異性体の分離分析法、確認方法はこれまでに存在しなかった。【０００８】
これまでにsc(Fv)2の構造異性体の分離方法が存在しなかったことから、2種類の構造異性体の間での活性の違いに着目した報告はない。Bispecific sc(Fv)2においては、構造異性体により正しいFvの組み合わせと正しくないFvの組み合わせの間で活性が大きく異なることは当然予想されるが、Monospecific sc(Fv)2においては、同じ２価である構造異性体間で活性の違いに関しては予想し難い。非特許文献１０においては、２つの構造異性体間で活性が異なる可能性は考えず、活性（結合活性）は構造異性体の混合物で測定している。これはｓc(Fv)2の構造異性体の分離精製の困難さから、それぞれの構造異性体を高純度に調製し活性を厳密に比較することができなかったためである。【０００９】
リンカーの長さを改変したsc(Fv)2においても、リンカーの長さから想定される２つの構造異性体をそれぞれモデル予測ではなく"同定"し、その構造異性体の含有比率を定量的に評価することはこれまで不可能であった。そのため、sc(Fv)2のリンカーの長さと構造異性体の含有比率の関係を明らかにした定量的な検討はこれまで実施されておらず、実質的にリンカーの長さにより構造異性体の含有比率をコントロールした報告はない。【００１０】
リンカーの長さを変化させることはsc(Fv)2の2つの抗原結合部位間の距離を変えることになることから、リンカーの長さはその生物活性（特にレセプターを二量体化するようなアゴニスト活性）に影響する可能性がある。そのため抗原の種類により、2つの抗原結合部位間距離はリンカーの長さによって任意に調節可能であることが望ましい。また、リンカーの長さは安定性に大きく影響を及ぼすことが報告されており（非特許文献１、非特許文献２）、scFvでは一般にリンカーが短いほど安定性が低いことが知られている。sc(Fv)2においても同様に考えられ、中央のリンカーを短くすることによって、会合体(dimer)が生成しやすくなることが報告されており（非特許文献６）、安定性の高いsc(Fv)2を作製するためにはリンカーの長さは任意に調節可能であることが望ましい。このようなことから、sc(Fv)2を医薬品として開発する場合、任意のリンカーの長さにおいて目的の構造異性体を単離できることが望ましいと考えられる。しかしながら、これまで任意のリンカー長を持つsc(Fv)2において、bivalent scFvとsingle chain diabodyの2種類の構造異性体をそれぞれ単離した報告はない。【００１１】
すでに、抗ヒトMpl抗体のsc(Fv)2がTPO様アゴニスト活性を示すことが報告され、sc(Fv)2が医薬品になりうることが明らかになっている（非特許文献１２）。構造異性体を含むsc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的の構造異性体のみを分離精製し、構造異性体の一方のみを含む原薬を製造すること、あるいは、原薬が構造異性体混合物の場合には、2種類の構造異性体の性質を決定し、各構造異性体の含有比率を定量的に分析する規格試験を実施することが必要となる。しかしながら、これまでsc(Fv)2の構造異性体の分離精製・定量的分析・構造同定する方法は知られていない。【００１２】
また、リンカーの長さによるscFvのmonomer/dimer/trimer/tetramerの存在比率を制御する方法が報告されているが、sc(Fv)2の構造異性体に関しては、上述のとおり、構造異性体の定量的分析法が見出されていないため、リンカーの長さによる構造異性体存在比率の制御方法はこれまでに報告されていない。【００１３】
【非特許文献１】Protein Engineering, 1993, 6(8), 989-995
【非特許文献２】Protein Engineering, 1994, 7(8), 1027-1033
【非特許文献３】Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374
【非特許文献４】Journal of Immunology, 1995, 154, 4576-4582
【非特許文献５】PNAS, 1995, 92, 7021-7025
【非特許文献６】Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56
【非特許文献７】Protein Engineering, 2001, 14(10), 815-823
【非特許文献８】Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111
【非特許文献９】Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66
【非特許文献１０】Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281
【非特許文献１１】Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772
【非特許文献１２】Blood, 2005, 105, 562-566
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
PCT/JP06/306800において、sc(Fv)2組成物中の2種の構造異性体であるbivalent scFvとsingle chain diabodyを分離取得する方法、分離された2種の構造異性体の構造を同定する方法、及び、2種の構造異性体を定量的に分析する方法が提供された。またリンカー長を調節することによりsc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる方法が提供された。これらの方法を利用することにより、sc(Fv)2の特定の構造異性体を有効成分として含有する医薬組成物を製造することができ、従来と比較して高活性の医薬組成物を提供することが可能となった。また、医薬品としての開発に必要な規格試験により、構造が同定された構造異性体の含有比率を規定したsc(Fv)2を医薬品組成物として提供することが可能となった。【００１５】
一方、2種類の構造異性体を取りうるsc(Fv)2を医薬品として開発するにあたっては、目的の構造異性体が、医薬品原薬および製剤において安定に存在する必要がある。一般にタンパク質の劣化経路としては、可溶性の多量体の形成や沈殿・不溶物の生成等のタンパク質分子の物理的会合化に伴う劣化経路(Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30)と、加水分解・脱アミド化反応・メチオニン酸化反応等による化学的修飾による劣化経路（Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188）が知られている。医薬品としてタンパク質を開発するにあたっては、これら両方の劣化経路を最小限に抑え、保存中にそのタンパク質の生物学的活性の低下が起こらない製剤を提供する必要がある。このような劣化経路を最小限に抑制する方法として、溶液pHの最適化、緩衝液・塩の種類と濃度、安定化剤の種類と濃度の最適化が行われる。【００１６】
本発明者らは、2種類の構造異性体を取りうるsc(Fv)2に2種類の構造異性体の間で相互に構造変換（異性化）すること、すなわち、bivalent scFv型からsingle chain diabody型への構造変換反応（異性化反応）、及び、single chain diabody型からbivalent scFv型への構造変換反応（異性化反応）が起こることを見出した（図１）。タンパク質２分子間のmonomer/dimerの平衡反応はすでに報告されており、抗体のIgG分子ではBiochemistry, 1999, 38, 13960-13967においてmonomerとdimerが可逆的な平衡状態として存在していることが報告されている。単分子内の平衡反応としては、Science. 2003, 299(5611), 1362-7において抗体のIgG分子のCDR領域において２種類のCDRループ構造が可逆的な平衡状態として存在していることが報告されている。これは抗体の全体構造のうちのCDR部位の局所的な異性化反応であり、この２種類の異性体を溶液中で安定に分離することはできない。また、Biochemistry, 1996, 35, 1897-1903において抗体のIgG分子のアスパラギン酸残基がイソアスパラギン酸残基に異性化することが報告されている。これは抗体中の１アミノ酸の化学的な異性化反応であり、この異性化反応はタンパク質の一次配列の変化を伴う。このような異性化反応とは異なり、本発明者らが見出したsc(Fv)2型分子のこのようなタンパク質単分子の全体的な立体構造変化を伴う相互異性化反応はこれまでに報告がなく、従来のタンパク質では見られなかったsc(Fv)2特有の反応であると考えられた。この異性化反応を抑制することは、sc(Fv)2の製剤化における非常に重要な課題である。【００１７】
すなわち、bivalent scFv型とsingle chain diabody型で活性が異なる場合（例えば、ヒト化抗ヒトMpl抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2やマウス抗ヒトMpl抗体mVB22B sc(Fv)2においてはsingle chain diabody型に比べてbivalent scFv型のアゴニスト活性が極めて低い：PCT/JP06/306800）、製剤保存中の異性化反応は活性の変化を意味することから、sc(Fv)2においては上述の会合化と化学修飾による劣化経路に加えて、従来のタンパク質では報告されていない異性化反応による劣化経路が存在することが明らかとなった。また、bivalent scFv型とsingle chain diabody型で活性が同等である場合にも、製剤保存中に異性化反応が進行することは保存前後で含有する構造異性体含有比率が変化することを意味し、好ましくない。【００１８】
本発明者らが見出したsc(Fv)2型分子の構造異性体間の相互異性化反応は、全てのsc(Fv)2型分子で起こりうると考えられ、そのためsc(Fv)2型分子を医薬品として開発するためには、この異性化反応を抑制することが必須である。しかしながら、これまでこのような異性化反応を抑制する方法は報告されていない。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、異性化反応が抑制されたsc(Fv)2を含有する安定化製剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、sc(Fv)2の異性化反応を抑制する安定化剤・安定化条件を見出した。また、凍結乾燥製剤化することで 上記異性化反応を抑制できることを見出した。すなわち、見出された安定化剤・安定化条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、sc(Fv)2型分子のbivalent scFv型からsingle chain diabody型への異性化反応、および/あるいは、single chain diabody型からbivalent scFv型への異性化反応の両方向あるいは一方向の異性化反応を抑制することが可能であることを明らかにした。【００２０】
本発明は、以下の〔１〕〜〔４３〕を提供するものである。
〔１〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加した、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔２〕塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕アミノ糖が、メグルミンである、〔１〕に記載の医薬組成物。
〔４〕糖アルコールが、マンニトールである、〔１〕に記載の医薬組成物。
〔５〕アミノ酸が、リジンである、〔１〕に記載の医薬組成物。
〔６〕pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、〔１〕に記載の医薬組成物。
〔７〕pHが4.5〜9.0であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔８〕pHが6.0〜9.0であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔９〕塩濃度が50mM〜1000mMであることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔１０〕剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１１〕剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、sc(Fv)2を含有する医薬組成物。
〔１２〕single chain diabody型sc(Fv)2、またはbivalent scFv型sc(Fv)2を高純度で含む、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１３〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物の異性化反応を抑制する工程。
〔１４〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程。
〔１５〕塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕アミノ糖が、メグルミンである、〔１４〕に記載の方法。
〔１７〕糖アルコールが、マンニトールである、〔１４〕に記載の方法。
〔１８〕アミノ酸が、リジンである、〔１４〕に記載の方法。
〔１９〕pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、〔１４〕に記載の方法。
〔２０〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物のpHを4.5〜9.0にする工程。 
〔２１〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物のpHを6.0〜9.0にする工程。 
〔２２〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物の塩濃度を50mM〜1000mMにする工程。
〔２３〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
（ａ）sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、並びに／または、pH3.0〜6.0、および／もしくは、塩濃度が500mM以下にてインキュベートすることによって、single chain diabody型の含有比率がbivalent scFv型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）生成したsingle chain diabody型のsc(Fv)2を取得する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得したsingle chain diabody型sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。
〔２４〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法
（ａ）sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、並びに／または、pH3.0〜6.0、および／もしくは、塩濃度が500mM以下にてインキュベートすることによって、bivalent scFv型の含有比率がsingle chain diabody型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）生成したbivalent scFv型のsc(Fv)2を取得する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得したbivalent scFv型sc(Fv)2組成物を安定化させる工程。
〔２５〕以下の工程を含むsc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法 
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii) 調製されたsc(Fv)2組成物を凍結乾燥する工程。
〔２６〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
〔２７〕塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕アミノ糖が、メグルミンである、〔２６〕に記載の方法。
〔２９〕糖アルコールが、マンニトールである、〔２６〕に記載の方法。
〔３０〕アミノ酸が、リジンである、〔２６〕に記載の方法。
〔３１〕pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、〔２６〕に記載の方法。
〔３２〕pHを4.5〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
〔３３〕pHを6.0〜9.0にする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
〔３４〕塩濃度を50mM〜1000mMにする工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
〔３５〕凍結乾燥する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法。
〔３６〕医薬組成物中の有効成分がsc(Fv)2である、〔２６〕〜〔３５〕のいずれかに記載の方法。
〔３７〕塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含有する、sc(Fv)2の異性化反応を抑制するために用いる安定化剤。
〔３８〕塩が、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩である、〔３７〕に記載の安定化剤。
〔３９〕アミノ糖が、メグルミンである、〔３７〕に記載の安定化剤。
〔４０〕糖アルコールが、マンニトールである、〔３７〕に記載の安定化剤。
〔４１〕アミノ酸が、リジンである、〔３７〕に記載の安定化剤。
〔４２〕pH調整剤が、クエン酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのpH調整剤である、〔３７〕に記載の安定化剤。
〔４３〕以下の工程を含む、sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質のスクリーニング方法
(i) sc(Fv)2組成物を調製する工程、
(ii)調製されたsc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる工程、
(iii) 被検物質の接触させたsc(Fv)2組成物において、sc(Fv)2の異性化反応の抑制の有無を測定する工程、
(iv) sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質を選択する工程。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】sc(Fv)2の異性化反応を示す模式図である。
【図２】peak1 91.4%から開始した場合における、25℃-6weeks後のpeak1の割合を示す図である。
【図３】peak2 99.6%から開始した場合における、25℃-6weeks後のpeak2の割合を示す図である。
【図４】peak1 91.4%から開始した場合における、25℃-5days後のpeak1の割合を示す図である。
【図５】peak2 99.6%から開始した場合における、25℃-5days後のpeak2の割合を示す図である。
【図６】peak2を各条件で25℃-20days後のpeak1の割合を示す図である。
【図７】peak1 〜99%から開始し、各溶液条件における25℃-5days後のpeak2の割合を示す図である。
【図８】intialおよび40℃-1week後のbivalent scFvの割合を示す図である。
【図９Ａ】peak1を25℃各条件下でインキュベートすることによるpeak2への異性化を示す図である。
【図９Ｂ】ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2のinitialと、50℃-10days後のbivalent scFv型存在比率を示す図である。pH5.5以上で異性化反応が抑制可能であることが示された。
【図１０】(a) VB22B sc(Fv)2のVH1-linker-VL1-linker-VH2-linker-VL2構造を示す図である。(b) VH1-linker-VL1-linker-VH2-linker-VL2構造の2種類の構造異性体を示す図である。VH1/VL1とVH2/VL2がそれぞれ会合したbivalent scFv構造（左）と、VH1/VL2とVH2/VL1がそれぞれ会合したsingle chain diabody構造（右）を示す。
【図１１】peak1とpeak2の陰イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である。
【図１２】peak1、peak2、VB22B sc(Fv)2のsubtilisin処理前後の還元SDS-PAGEの結果を示す写真および図である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
【図１３】bivalent scFvとsingle chain antibodyの構造の違いにより生じるsubtilisin限定分解後の分解パターンの違いを示す図である。Bivalent scFv構造の場合、点線で囲った低分子量断片が生じる。
【図１４】Subtilisinによるpeak1、peak2、VB22B sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置を示した。
【図１５】VB22B sc(Fv)2構造異性体のTPO様アゴニスト活性評価の結果を示す図である。
【図１６】peak1とpeak2の陽イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である。
【図１７】陽イオン交換クロマトグラフィーより分離したpeak1とpeak2のペプチドマッピングを示す図である。
【図１８】peak1、peak2、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のsubtilisin処理後の還元SDS-PAGEの結果を示す写真および図である。得られたバンドの構造を右に示した。
【図１９】Subtilisinによるpeak1、peak2、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置を示した。
【図２０】hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2構造異性体のTPO様アゴニスト活性評価の結果を示す図である。
【図２１】各リンカー改変体のコンストラクトを示す図である。Gxxは中央のリンカー長がxxであり、Lxxは両端のリンカー長がxxであり、それぞれリンカーとして(GGGGS（配列番号：７）)n配列を用いたコンストラクトである。Pxxはリンカーとして(GGPGS（配列番号：１３）)n配列を用いて中央のリンカー長をxxにしたコンストラクトである。
【図２２】各リンカー改変体の陰イオン交換クロマトグラフィー分析結果と構造異性体の得られた存在比率を示す図である。bivalent scFv型構造のパーセントにより示した。
【図２３】hydroxyapatiteカラムのクロマトグラムと精製画分のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図２４】SOURCE 15Sカラムのクロマトグラムの分析結果を示す図である。
【図２５】陽イオン交換クロマトグラフィーの分析結果を示す図である。
【図２６】大量精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak１とhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2のSDS-PAGEの分析結果を示す写真である。
【図２７】大量精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak１とhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2のゲルろ過分析結果を示す図である。
【図２８】u2-wz4、改変体v1、改変体v3のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２９】u2-wz4、改変体v1、改変体v3の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３０】u2-wz4、u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3の等電点電気泳動の結果を示す写真および図である。
【図３１】u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3のプロテアーゼ限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図３２】u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3 のTPO様アゴニスト活性評価の結果を示す図である。
【図３３】u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3のDSC分析の結果を示す図である。
【図３４】u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3の熱加速試験におけるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図３５】u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、改変体v1、改変体v3の熱加速試験における陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図３６】ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2の陽イオン交換クロマトグラフィーよる分離の結果を示す図である。
【図３７】精製したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2の陽イオン交換クロマトグラフィーよる分析結果を示す図である。
【図３８】ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2のsubtilisin処理後の還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。得られたバンドの推定構造を右に示した。
【図３９】Subtilisinによるヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2の限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。矢印により低分子量ピークの溶出位置を示した。
【図４０】ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2のBaF3/gp130におけるIL-6中和活性評価の結果を示す図である。
【図４１】VB22B sc(Fv)2のpeak1を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0, 40℃でインキュベートした試料の陰イオン交換クロマトグラフィー分析し経時的にpeak2が増加することを示した図である。
【図４２】VB22B sc(Fv)2のpeak1、peak2、及び、40℃で6日間incubateした試料のアゴニスト活性を評価し、peak1がpeak2に異性化することによって活性が増加することを確認した図である。
【図４３】hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のpeak1を25℃で10日間、各条件下でincubateすることによるpeak2への異性化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者らは、sc(Fv)2の構造異性体を解析する過程で、2種の構造異性体であるbivalent scFvとsingle chain diabodyが相互に構造変換（異性化）することを見出した（図１）。さらに、この構造異性体間の相互異性化反応を抑制する安定化剤を見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。
本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、およびpH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加した、sc(Fv)2を含有する医薬組成物を提供する。【００２３】
本発明の医薬組成物は、目的の構造異性体を安定に存在させ、他の構造異性体への異性化を最小限に抑制した安定化製剤であり、医薬分野において、大変有用である。
本発明においてsc(Fv)2は、4つ以上の抗体可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である。例えば、[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４] の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられる。【００２４】
また、通常、sc(Fv)2は2つのVLと2つのVHの4つの可変領域をリンカーなどで結合して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。この２つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体由来であってもよい。例えば、Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374に開示されるような 2種類の抗原、あるいは2種類のエピトープを認識する二重特異性(bispecific) sc(Fv)2が挙げられる。
sc(Fv)2は、当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。scFvには、抗体のVHおよびVLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する（scFvの総説については、Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113（Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994）を参照）。【００２５】
また、本発明のsc(Fv)2としては、２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられるが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
本発明のsc(Fv)2は抗体可変領域、リンカー以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。【００２６】
本発明で用いられる抗体の可変領域は、可変領域の全長でもよいが、抗原への結合活性を維持する限り可変領域の部分配列でもよい。又、可変領域中のアミノ酸配列は置換、欠失、付加、挿入などがされていてもよい。例えば、抗原性を低下させるために、キメラ化やヒト化されていてもよい。
また本発明のsc(Fv)2は、そのN末端あるいはC末端にIgGのFc部分等の別のタンパク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。また本発明のsc(Fv)2は、PEG等のキャリアー高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。また糖鎖付加配列を挿入し、糖鎖を付加してもよい。【００２７】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは5アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーをもちいてもよい。【００２８】
例えば、ペプチドリンカーの場合：
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１２）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。【００２９】
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。【００３０】
本発明において医薬組成物とは、sc(Fv)2を含有する組成物であって、疾患の治療・予防などの為にヒトに投与されることを目的とした医薬品組成物を意味する。構造異性体を含むsc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的の構造異性体を高純度で分離精製し、分離精製された構造異性体を高純度に含む原薬を製造すること、また、目的の構造異性体の割合を高めることで、該構造異性体を高純度に含む原薬を製造することが望ましい。一方の構造異性体を高純度に含むsc(Fv)2を取得する方法として、PCT/JP06/306800において、sc(Fv)2組成物中の2種の構造異性体であるbivalent scFvとsingle chain diabodyを分離取得する方法、分離された2種の構造異性体の構造を同定する方法、及び、2種の構造異性体を定量的に分析する方法が提供された。具体的には、PCT/JP06/306800に示されたとおり、2種の構造異性体の混合物からイオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、一方の構造異性体を高純度に精製する方法がある。一方の構造異性体が高純度に精製されたかどうかは、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、および、プロテアーゼによる限定分解により確認可能である。あるいはPCT/JP06/306800に示されたとおり、2種の構造異性体の混合物を特定の緩衝液条件・温度においてインキュベートすることで、一方の構造異性体の純度を高めることが可能である。また、PCT/JP06/306800に示されたとおり、sc(Fv)2のリンカーの長さを調節したり、VH/VL界面改変型sc(Fv)2を作製することにより、一方の構造異性体の純度を高めることが可能である。一方の構造異性体を高純度に含む本発明の医薬組成物は、異性化反応が抑制されたsc(Fv)2を含有することが好ましい。【００３１】
本発明における「異性化反応」とは、sc(Fv)2の分子内の構造変換反応、すなわち、１）bivalent scFv型からsingle chain diabody型への構造変換反応、２）single chain diabody型からbivalent scFv型への構造変換反応、並びに、３）bivalent scFv型からsingle chain diabody型、およびsingle chain diabody型からbivalent scFv型への相互構造変換反応（相互異性化反応）を意味する（図１）。【００３２】
また、本発明の「抑制」には、異性化反応の「完全な抑制」だけでなく、「不完全な抑制」も含まれる。
sc(Fv)2の異性化反応の抑制は、当業者に周知の方法によって確認することができる。例えば、sc(Fv)2をある条件で一定期間保存後の構造異性体含有比率を、後述の方法や実施例に記載の方法を用いて分析することでその条件における構造異性体の異性化を評価することができ、その条件下において異性化反応が抑制されたかどうかを確認することができる。【００３３】
本発明の医薬組成物は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質とsc(Fv)2組成物を混合することで製造できる。例えば、sc(Fv)2組成物に該物質を添加することによって、また該物質にsc(Fv)2組成物を添加することによって製造することができる。
本発明の塩としては、特に制限はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウムが挙げられる。【００３４】
また、本発明のアミノ糖としては、メグルミン（meglumine）が例示できるが、これに限定されない（なお、メグルミンは糖アルコールにも分類される）。
本発明において、「メグルミン」とは、別名Ｎ-メチルグルカミン、化学式1-Deoxy-1-methylamino-D-glucitolおよび、以下の化学式で示される化合物である。【００３５】
【化１】
2006132352.tif 000002
【００３６】
本発明において「メグルミン」には、メグルミン誘導体やメグルミンの塩等が含まれる。メグルミン誘導体やメグルミンの塩としては、アミドドリゾ酸メグルミン、アミドドリゾ酸ナトリウムメグルミン、カドペンテト酸メグルミン、ガドテル酸メグルミン、イオタラム酸メグルミン、イオトロクス酸メグルミン、ガドベン酸メグルミン、ヨードキサム酸メグルミン、フルニキシンメグルミン、メグルミンアンチモネート、ガストログラフィン（メグルミン硫酸塩）等を挙げることが出来るがこれらに限定されるものではない。また、上記のメグルミンの水酸基、アミノ基等が、化学的に修飾を受けたものも、本発明のメグルミンに含まれる。【００３７】
また、本発明の糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール、ペンタエリスリトール、イノシトール、メグルミンが挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、本発明のアミノ酸は、以下を例示できるが、これらに限定されるものではない。塩基性アミノ酸としては、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等であることができ、アミノ酸は好ましくはその無機塩の形（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸として）で使用される。【００３８】
遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。 好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン又はオルニチンである。【００３９】
また、酸性アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）が例示できる。また、中性アミノ酸としては、例えばイソロイシン、ロイシン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、及びシステイン、芳香族アミノ酸としては、例えばフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン、N-アセチルトリプトファンを使用することもできる。【００４０】
また、本発明のpH調整剤は、酸またはアルカリによって変化させたpHを適切に調整するための緩衝物質または緩衝液を意味する。本発明のpH調整剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸ナトリウム緩衝液など）、ヒスチジン塩酸塩、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸等  他の有機酸等、あるいは、トリス緩衝液（例えばトリス塩酸緩衝液など）、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、炭酸緩衝液、乳酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液が例示できるが、これらに制限されるものではない。緩衝液の濃度は一般には１〜500mMであり、好ましくは5〜100mMであり、さらに好ましくは10〜20mMである。
本発明の医薬組成物中のsc(Fv)2の異性化を抑制し安定に保存するためには、本発明の医薬組成物中における本発明の塩の濃度は50mM〜1000mMの範囲であることが好ましく、より好ましくは150mM〜300mMの範囲であることが好ましいが、これに限定されるものではない。pH値は4.5〜9.0の範囲であることが好ましく、より好ましくは6.0〜9.0の範囲であることが好ましいが、これに限定されない。
また、本発明の医薬組成物におけるアミノ糖、糖アルコール、およびアミノ酸の最終濃度としては、特に制限はないが、それぞれ、1mM〜500mM、1mM〜500mM、1mM〜500mMの範囲が挙げられる。【００４１】
本発明の医薬組成物には、上記物質以外に、薬学的に許容される担体が含まれてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。【００４２】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。【００４３】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。【００４４】
本発明の医薬組成物には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の医薬組成物で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０の場合では、一般には0.001〜100mg/mLであり、好ましくは0.003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは0.005〜2mg/mLである。
また、本発明の医薬組成物は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物を含んでいてもよい。
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。【００４５】
注射用の水溶液とする場合には、例えばブドウ糖等の等張液が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。【００４６】
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。【００４７】
本発明の医薬組成物の形態（剤形）としては、注射剤形、凍結乾燥剤形、溶液剤形などが例示できるが、これらに限定されるものではない。
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、例えば、注射投与が可能である。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。
また、sc(Fv)2を凍結乾燥製剤化やスプレードライによって製剤化することで、異性化反応が抑制されたsc(Fv)2を含有する医薬組成物を製造することもできる。すなわち、本発明は、剤形が凍結乾燥製剤やスプレードライ製剤であることを特徴とする上記医薬組成物（以下、凍結乾燥製剤と称す）もまた提供する。【００４８】
凍結乾燥は、当業者に周知の方法によって実施できる（Pharm Biotechnol, 2002, 13, 109-33、Int J Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60、Pharm Res. 1997, 14(8), 969-75）。例えば、溶液を凍結乾燥に用いるバイアル等の容器に適当量分注し、凍結庫または凍結乾燥庫中にて行なうか、またはアセトン／ドライアイス、液体窒素などの冷媒中に浸漬して行なう。また、実施例に記載の方法によって凍結乾燥することもできる。また、スプレードライ製剤化は当業者に周知の方法によって実施できる（J Pharm Sci. 1998 Nov;87(11):1406-11）。
本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤は、使用前に、溶液製剤とすることができる。従って、本発明は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤、および薬学的に許容される担体を含むキットもまた提供する。薬学的に許容される担体は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤を溶液製剤化できるものであれば、担体の種類、組み合わせの有無等に制限はないが、薬学的に許容される担体として、またその一部として、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を用いることで、溶液製剤中でのsc(Fv)2の異性化反応を抑制することができる。【００４９】
本発明においてsc(Fv)2組成物とは、sc(Fv)2の構造異性体を１つ含有する組成物、またはsc(Fv)2の構造異性体を複数含有する組成物（構造異性体混合物）を指す。
sc(Fv)2組成物は、当業者に周知の方法で作製することができる。例えば、sc(Fv)2をコードするDNAを挿入したベクターを宿主細胞へ導入し、sc(Fv)2を発現させ、発現産物を回収することで、2種類以上の構造異性体を取りうるsc(Fv)2を作製できる。【００５０】
該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のsc(Fv)2を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でsc(Fv)2を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。【００５１】
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。sc(Fv)2を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。【００５２】
sc(Fv)2組成物の回収は、本発明のsc(Fv)2が培地に分泌される場合は、培地を回収することで実施できる。また、sc(Fv)2が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にsc(Fv)2組成物を回収する。
本発明のsc(Fv)2組成物は、sc(Fv)2の構造異性体を１または複数含有する組成物である限り、どのような状態であってもよく、例えば、組換え細胞培養物等のクルードな状態の組成物、精製された状態の組成物等が例示できるが、これらに制限されるものではない。また存在する複数の構造異性体の存在比率はどのような比率であっても良いが、好ましくは、後述の方法で取得（単離)されたものであることが望ましい。【００５３】
本発明において構造異性体とは、アミノ酸配列は同一であるが、立体構造（二次構造あるいは三次構造）が異なるタンパク質同士のことをいう。通常、構造異性体同士では化学的、生物学的、又は物理的性質のうち少なくとも1つは異なる。
sc(Fv)2における構造異性体としては、例えば、single chain diabody型とbivalent scFv型の構造異性体が存在する。【００５４】
本発明においてsingle chain diabody型とは、sc(Fv)2が、[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいる場合、可変領域１と可変領域４が会合し、かつ可変領域２と可変領域３が会合した状態の構造を有するsc(Fv)2をいう。
また、本発明においてbivalent scFv型とは、可変領域１と可変領域２が会合し、かつ可変領域３と可変領域４が会合した状態の構造を有するsc(Fv)2のことをいう。【００５５】
single chain diabody型、bivalent scFv型としては、例えば図１に記載の構造を有するsc(Fv)2が挙げられる。sc(Fv)2の構造異性体がsingle chain diabody型またはbivalent scFv型のどちらの構造を有しているかは、後述される構造異性体の同定方法によって確認することができる。また、ＮＭＲを用いた解析、結晶構造解析などにより同定することができる。
医薬組成物の製造に使用するsc(Fv)2組成物は、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いものが好ましく、１）sc(Fv)2組成物から取得された特定の構造異性体、および、２）特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物が例示できる。
上記「特定の構造異性体」とは、single chain diabody型またはbivalent scFv型を意味し、「他の構造異性体」とは、特定の構造異性体がsingle chain diabody型であるときはbivalent scFv型、特定の構造異性体がbivalent scFv型であるときはsingle chain diabody型を意味する。【００５６】
本発明において、sc(Fv)2組成物から特定の構造異性体を取得する方法は、当業者に周知の方法によって実施することができる。例えば、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離し、分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する。すなわち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される医薬組成物もまた提供するものである。
（ａ）sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
（ｂ）分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程【００５７】
取得（単離）された特定の構造異性体の純度は、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことが好ましい。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。ここで、純度とは、取得された全ての構造異性体に対する特定の構造異性体の割合を意味する。
sc(Fv)2組成物中の構造異性体の分離および取得（精製）は、例えば、sc(Fv)2組成物をイオン交換カラムやHydroxyapatiteカラムにかけ、特定の構造異性体を取得あるいは除去することで行うことができるが、これに制限されず、各種クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動、透析、再結晶等の当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００５８】
クロマトグラフィーとしては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。クロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合、使用されるイオン交換カラムの種類は特に制限されず、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラムのいずれも使用することができ、目的の抗体や構造異性体などにより適宜決定することができる。例えば、SPイオン交換体カラム、Q イオン交換体カラムなどを用いることが可能であるが、これらに限定されるものではない。吸着クロマトグラフィーとしては、Hydroxyapatiteクロマトグラフィーが例示できるが、これに限定されるものではない。
本発明により、これらの精製方法を用い、特定の構造異性体の精製品を取得することもできる。【００５９】
また、sc(Fv)2組成物中の構造異性体間で活性に差が生じる場合に、sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定し、sc(Fv)2組成物中の構造異性体から高活性の構造異性体を分離取得することができる。さらに、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する前に、後述の方法により、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカーの長さを決定し、決定されたリンカー長を有するsc(Fv)2組成物を作製することもできる。また、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する前に、リンカーの長さが異なる複数のsc(Fv)2組成物を作製し、後述される構造異性体比率の分析法によって構造異性体比率を分析し、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値となるリンカーを有するsc(Fv)2を選択し、選択されたsc(Fv)2のsc(Fv)2組成物を作製することもできる。【００６０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、および該方法によって製造される医薬組成物もまた提供するものである。
（１）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定する工程
（ｂ）sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
（ｃ）工程（ａ）により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
（ｄ）工程（ｃ）で取得された高活性の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（２）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカーの長さを決定する工程
（ｂ）工程（ａ）で決定されたリンカーの長さを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
（ｃ）作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
（ｄ）分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
（ｅ）工程（ｄ）で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（３）以下の工程を含む方法。
（ａ）リンカーの長さが異なる複数のsc(Fv)2組成物を作製する工程
（ｂ）sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値となるリンカーを有するsc(Fv)2を選択する工程
（ｃ）工程（ｂ）で選択されたsc(Fv)2のリンカーと同じ長さのリンカーを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
（ｄ）作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
（ｅ）分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
（ｆ）工程（ｅ）で取得された特定の構造異性体および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程【００６１】
本発明において高活性の構造異性体とは、構造異性体間で活性に差が生じる場合、活性が高い構造異性体、好ましくは最も活性の高い構造異性体のことをいう。例えば、２種類の構造異性体が存在する場合、活性の高い方の構造異性体が本発明でいう高活性の構造異性体に該当する。
高活性の構造異性体の決定は当業者に公知の方法で行うことができ、例えば、それぞれの構造異性体を単離し、同一の条件下で目的の活性を測定することにより高活性の構造異性体を決定することができる。【００６２】
本発明において活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性など、いかなる活性でもよく、特に限定されないが、生体、組織、細胞、タンパク質、DNA、RNA等に量的及び／又は質的な変化、影響をもたらす活性であることが好ましく、特にアゴニスト活性が好ましい。
アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。【００６３】
本発明において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、などを挙げることができる。受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存在し、例えば、Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USA、Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203-212.、Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067-1070.、Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol., 10: 295-331.、Taga T. and Kishimoto T. (1992) FASEB J., 7: 3387-3396.、Fantl WI., et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481.、Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959-962.、Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234.、宮坂昌之監修, 細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック」(1994) （秀潤社, 東京, 日本）等が挙げられる。【００６４】
上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン(EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体、ヒト又はマウストロンボポイエチン(TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等を例示することができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D'Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.; mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.; hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hInsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761.; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPDGFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hIFNα／βR: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225-234.及びNovick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.）。【００６５】
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1(SLX)などを挙げることができる。
MHC抗原には、MHC class I抗原とMHC class II抗原に大別され、MHC class I抗原には、HLA-A,-B,-C,-E,-F,-G,-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR,-DQ,-DPが含まれる。【００６６】
分化抗原には、CD1,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD13,CD14,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD32,CD33,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43,CD44,CD45,CD45RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,CD54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD73,CD95,CD102,CD106,CD122,CD126,CDw130などが含まれる。【００６７】
活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び／又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系(cell free assay)の指標、細胞系(cell-based assay)の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。
無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、DNA、RNAの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、DNA、RNAの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。【００６８】
細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、mRNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、mRNA量、Ca2+やcAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。【００６９】
組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。【００７０】
例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はBEACON（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはBIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはARVOなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で2種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、2種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。【００７１】
本発明において、アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞に、アゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、WST-8のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。【００７２】
アゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、G-CSF受容体、mpl、neu、GM-CSF受容体、EPO受容体、c-kit、FLT-3等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、BaF3、NFS60、FDCP-1、FDCP-2、CTLL-2、DA-1、KT-3等を挙げることができる。【００７３】
また、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物としては、特定の構造異性体の含有比率が80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上のsc(Fv)2組成物が例示できる。より具体的には、single chain diabody型の含有比率が80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上のsc(Fv)2組成物、又はbivalent scFv型の含有比率が80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上のsc(Fv)2組成物を挙げることができる。【００７４】
本発明において特定の構造異性体の含有比率が80％とは、sc(Fv)2組成物に含まれる全ての構造異性体に対する特定の構造異性体の割合が80％であることを意味する。例えば、sc(Fv)2組成物中にsingle chain diabody型とbivalent scFv型の2種類の構造異性体が存在する場合、single chain diabody型の含有比率が80％とは、sngle chain diabody型とbivalent scFv型の比率が80：20であることを意味する。
本発明において80％以上、90％以上、95％以上の含有比率の上限は特に限定されないが、100％若しくは100％に近いことが好ましい。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。構造異性体の含有比率は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動等を用いて構造異性体を分離することにより、測定することが可能である。【００７５】
sc(Fv)2組成物を医薬組成物として使用する場合、通常、活性は高い方が好ましいので、高活性の構造異性体の含有比率が80％以上のsc(Fv)2組成物を有効成分として含有することが好ましい。例えば、抗Mpl抗体のアゴニスト活性はsingle chain diabody型の方が高いので、Mplに対するsc(Fv)2をアゴニストとして使用する場合には、single chain diabody型の含有比率が80％以上であるsc(Fv)2組成物を有効成分として含有する、医薬組成物であることが好ましい。【００７６】
特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物は、例えば、上述したsc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体を分離取得する方法を使用することによって、また、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を他の構造異性体の含有比率より増加させることによって製造できる。
例えば、sc(Fv)2組成物中の高活性の構造異性体の割合を高くすることにより、活性が高いsc(Fv)2組成物を製造することが可能であり、逆に、sc(Fv)2組成物中の高活性の構造異性体の割合を低くすることにより、活性を抑えたsc(Fv)2組成物を製造することが可能である。【００７７】
single chain diabody型の活性がbivalent scFv型よりも高い場合、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の含有比率を増加させることにより、sc(Fv)2組成物の活性を増加させることができ、bivalent scFv型の含有比率を増加させることにより、sc(Fv)2組成物の活性を低下させることができる。逆に、bivalent scFv型の活性がsingle chain diabody型よりも高い場合、sc(Fv)2組成物中のbivalent scFv型の含有比率を増加させることにより、sc(Fv)2組成物の活性を増加させることができ、single chain diabody型の含有比率を増加させることにより、sc(Fv)2組成物の活性を低下させることができる。single chain diabody型とbivalent scFv型のどちらが高活性であるかは、目的とする活性に依存するが、当業者は公知の方法により容易に測定することが可能である。【００７８】
sc(Fv)2を医薬組成物として使用する場合、通常、活性は高い方が好ましいことが多いので、sc(Fv)2組成物中に含まれる特定の構造異性体の割合を変化させることにより、医薬組成物の活性を増加させることが可能である。
sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を他の構造異性体の含有比率より増加させる方法は如何なる方法により行われてもよく、例えば、sc(Fv)2組成物を得た後に特定の構造異性体の含有比率を高くしてもよいし、特定の構造異性体の含有比率が高くなるようにsc(Fv)2をコードするDNAを設計してもよい。【００７９】
sc(Fv)2組成物を得た後に特定の構造異性体の含有比率を高くする具体的な方法としては、例えば、得られたsc(Fv)2組成物から目的の構造異性体を単離（あるいは目的でない構造異性体を除去）する方法を挙げることができる。目的の構造異性体の単離は、上記のように当業者に公知のタンパク質の分離取得方法により行うことが可能である。
例えば、sc(Fv)2組成物を加熱した状態でインキュベートすることにより、特定の構造異性体の含有比率を増加させることもできる。また、sc(Fv)2組成物を低pHおよび／または低塩濃度でインキュベートすることにより、特定の構造異性体の含有比率を増加させることもできる。すなわち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される医薬組成物を提供する。
（ａ）sc(Fv)2組成物を加熱した状態、低pHおよび／または低塩濃度でインキュベートすることによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程【００８０】
本発明者らは、sc(Fv)2組成物がbivalent scFv型とsingle chain diabody型の混合物であり、bivalent scFv型を多く含有する場合、sc(Fv)2組成物を一定温度でインキュベートすることにより、bivalent scFv型をsingle chain diabody型に異性化させることでsingle chain diabody型の含有比率を増加させることが可能であることを見出している。sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、好ましくは20℃〜40℃、特に好ましくは25℃〜35℃にてインキュベートすることにより、single chain diabody型の含有比率を増加させることが可能である。インキュベートされたsc(Fv)2組成物は、その後、元の温度に戻しても、増加したsingle chain diabody型の含有比率は維持される。
また、sc(Fv)2組成物がbivalent scFv型とsingle chain diabody型の混合物であり、bivalent scFv型を多く含有する場合、sc(Fv)2組成物をpH3〜6、好ましくはpH4〜4.5、にてインキュベートすることにより、bivalent scFv型をsingle chain diabody型に異性化させることでsingle chain diabody型の含有比率を増加させることが可能である。なお、sc(Fv)2組成物をインキュベートする場合、塩濃度はpHに依存するが、インキュベート時の塩濃度が0mM〜500mMであることが好ましく、より好ましくは0mM〜150mMが好ましい（図９Ａ）。インキュベートによりsingle chain diabody型の含有比率を増加させたsc(Fv)2組成物をPCT/JP06/306800に示された方法によりsingle chain diabody型を高純度に精製することが可能である。これより得られた高純度のsingle chain diabody型のsc(Fv)2の異性化を抑制し安定に保存するためには、塩濃度は50mM〜1000mMの範囲であることが好ましく、より好ましくは150mM〜300mMの範囲であることが好ましい。pH値は4.5〜9.0の範囲であることが好ましく、より好ましくは6.0〜9.0の範囲であることが好ましい。
また、同様にして、sc(Fv)2組成物がbivalent scFv型とsingle chain diabody型の混合物であり、single chain diabody型を多く含有する場合、sc(Fv)2組成物を一定温度でインキュベートすることにより、single chain diabody型をbivalent scFv型に異性化させることでbivalent scFv型の含有比率を増加させることも可能であることを見出している。
このように、sc(Fv)2組成物中の構造異性体異性体の存在状態を平衡状態に戻すことにより、低含量（マイナー成分側）の構造異性体の量を増やすことができる。その後、一方の構造異性体を取得して、該構造異性体を安定化することにより、目的の医薬組成物を製造することができる。
すなわち、本発明は、一つの様態として、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される医薬組成物を提供する。
（ａ）sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃、好ましくは20℃〜40℃、特に好ましくは25℃〜35℃、並びに／または、pH3.0〜6.0、および／もしくは、塩濃度が500mM以下にてインキュベートすることによって、single chain diabody型の含有比率がbivalent scFv型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）生成したsingle chain diabody型のsc(Fv)2を取得（精製）する工程
（ｃ）工程（ｂ）で取得したsingle chain diabody型sc(Fv)2組成物を安定化させる工程
single chain diabody型sc(Fv)2組成物を安定化させる具体的な工程としては、pH値を4.5〜9.0の範囲、より好ましくは6.0〜9.0の範囲で調整する工程および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程あるいはこれらの工程を組み合わせた工程があげられる。
また、同様にして、安定化されたbivalent scFv型sc(Fv)2組成物を製造することができる。【００８１】
特定の構造異性体の含有比率が高くなるようにsc(Fv)2をコードするDNAを設計する方法としては、例えば、上述のように適切なリンカーの長さになるようようにDNAを設計する方法が挙げられる。
さらに、sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することで、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させることも可能である。具体的には、sc(Fv)2の可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基を改変すべく、sc(Fv)2をコードするDNAを改変する。【００８２】
本発明における「会合」とは、例えば、sc(Fv)2の可変領域が相互作用する状態を指すものと換言することができる。
本発明において「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御することを言い、より具体的には、sc(Fv)2内において望ましくない会合が形成されないように制御することを言う。
本発明における「界面」とは、通常、会合（相互作用）する際の会合面を指し、界面を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供されるsc(Fv)2の可変領域に含まれる１もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近するアミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含まれる。
本発明における「界面を形成するアミノ酸残基」とは、詳述すれば、界面を構成するsc(Fv)2の可変領域において、該可変領域に含まれるアミノ酸残基を言う。【００８３】
本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元（改変前）のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
本発明の上記方法において「DNAを改変する」とは、本発明における「改変」によって導入されるアミノ酸残基に対応するようにDNAを改変することを言う。より具体的には、元のアミノ酸残基をコードするDNAについて、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするDNAへ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元のDNAに対して、少なくとも1塩基を挿入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このようなDNAの改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。【００８４】
本発明の好ましい態様においては、例えば、sc(Fv)2の可変領域の界面を形成する２残基以上のアミノ酸残基が、同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入する。界面において会合に関与する2以上のアミノ酸残基が互いに同種の電荷となるように改変されることにより、その電荷の反発力によって、これらアミノ酸残基の会合が阻害されるものと考えられる。従って、上記方法において、改変されるアミノ酸残基は、界面を形成するsc(Fv)2の可変領域間において、会合の際に互いに接近した２以上のアミノ酸残基であることが好ましい。
会合の際に接近するアミノ酸残基は、例えば、sc(Fv)2の立体構造を解析し、該sc(Fv)2の会合の際に界面を形成する可変領域のアミノ酸配列を調べることにより見出すことができる。界面において互いに接近したアミノ酸残基は、本発明の方法における「改変」の好ましいターゲットとなる。【００８５】
アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸（負電荷アミノ酸）としては、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)等が知られている。従って、好ましくは、本発明において同種の電荷のアミノ酸とは、正の電荷同士のアミノ酸、あるいは負の電荷同士のアミノ酸を言う。【００８６】
本発明においては、界面を形成するアミノ酸残基が同種の電荷となるように改変されることが好ましく、同種のアミノ酸の中でも、同一のアミノ酸であればさらに好ましい。例えば、改変後のアミノ酸残基は、リジンとアルギニンであってもよいが、２つのリジン、あるいは２つのアルギニンであることがより好ましい。
また、改変によって導入されるアミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中に電荷を持たないアミノ酸残基が少数程度含まれていてもよい。【００８７】
本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、抗原との結合活性を低下させないために、なるべく少数のアミノ酸残基を改変することが好ましい。上記「少数」とは、例えば、１〜１０個程度の数、好ましくは、１〜５程度の数、より好ましくは１〜３程度の数、最も好ましくは１または２を表す。
なお、元のsc(Fv)2において、界面を形成するアミノ酸残基(X)が既に電荷を有する場合、あるいは水素結合を形成している場合、会合の際に該アミノ酸残基と近接し相対するアミノ酸残基を、該アミノ酸残基(X)と同一のアミノ酸残基（もしくは同種の電荷のアミノ酸残基）となるように改変することも本発明の好ましい態様の一つである。この態様においては、界面を形成するアミノ酸残基の一方を改変すればよい。【００８８】
また、本発明の好ましい態様においては、sc(Fv)2の可変領域の界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように、該界面にアミノ酸残基の変異を導入する。
一般的に、「疎水性コア（hydrophobic core）」は、会合したポリペプチドの内側に疎水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸は、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリンなどが含まれる。また、疎水性コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸残基（例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側鎖が外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動力となる。異なる2つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露されるとエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、2つのドメインは自由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性アミノ酸は分子内部に埋もれ、疎水性コアを形成することになる。【００８９】
ポリペプチドの会合の際に、形成された疎水性コアを形成するアミノ酸残基から電荷を持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結果、ポリペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。ポリペプチドであるsc(Fv)2も同様に、可変領域の会合により疎水性コアが形成される。よって、この疎水性コアのアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸に置換することにより、可変領域の会合を制御できるものと考えられる。
当業者においては、所望のsc(Fv)2についてアミノ酸配列を解析することにより、疎水コアの存在の有無、および形成部位（領域）等を知ることが可能である。【００９０】
また、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基において、望ましい会合を促進するためにknobs-into-holes (特表2001-523971)技術を利用することも考えられる。knobs-into-holesは、ヘテロマルチマー形成を促進し、ホモマルチマー形成を抑制するように、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補的な相互作用を導入する(例えば、非天然のジスルフィド結合が第一のポリペプチドと第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チオール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を導入する)方法であるが、本発明に利用することができる。knobs-into-holesは当業者に公知の技術であり、当業者は適宜、sc(Fv)2に導入することが可能である。さらに、上記技術を組み合わせて利用することもできる。【００９１】
可変領域は、通常3つのCDR領域と４つのFR領域によって構成されている。本発明の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、例えば、CDR領域あるいはFR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することができる。一般的にCDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低下させる場合がある。従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、特に限定されるものではないが、FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することが好ましい。【００９２】
当業者であれば、本発明の方法によって会合を制御したい所望のsc(Fv)2について、会合した際のFRの界面において接近するアミノ酸残基の種類を適宜知ることが可能である。
例えば、会合した際のFRの界面において接近するアミノ酸残基の具体例として、VH上の39位(FR2領域)のグルタミン(Q)と、相対（接触）するVL上の38位の(FR2領域)のグルタミン(Q)を挙げることができる。さらに、VH上の45位(FR2)のロイシン(L)と、相対するVL上の44位の(FR2)のプロリン(P)を好適に例示することができる。なお、これら部位のナンバーリングについては、Kabatらの方法(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)を参考にしている。【００９３】
これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られている(J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)ことから、実施例に示すsc(Fv)2以外のsc(Fv)2についても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変することによって、sc(Fv)2の可変領域の会合を制御することができる。
[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいるsc(Fv)2において、single chain diabody型の含有比率を増加させる方法を例示する。【００９４】
該sc(Fv)2において、bivalent scFv型が生じる場合は、可変領域１と可変領域２の会合および可変領域３と可変領域４の会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域４の会合および可変領域２と可変領域３の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該sc(Fv)2において、可変領域１と可変領域３が会合し、かつ可変領域２と可変領域４が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域４の会合および可変領域２と可変領域３の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。【００９５】
該sc(Fv)2において、可変領域１と可変領域３が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域４の会合および可変領域２と可変領域３の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該sc(Fv)2において、可変領域２と可変領域４が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域４の会合および可変領域２と可変領域３の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。【００９６】
また、[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいるsc(Fv)2において、bivalent scFv型の含有比率を増加させる方法を例示する。
該sc(Fv)2において、single chain diabody型が生じる場合は、可変領域１と可変領域４の会合および可変領域２と可変領域３の会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域２の会合および可変領域３と可変領域４の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該sc(Fv)2において、可変領域１と可変領域３が会合し、かつ可変領域２と可変領域４が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、これらの会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域２の会合および可変領域３と可変領域４の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。【００９７】
該sc(Fv)2において、可変領域１と可変領域３が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域２の会合および可変領域３と可変領域４の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。
該sc(Fv)2において、可変領域２と可変領域４が会合した状態の構造を有する構造異性体が生じる場合は、この会合を抑制し、かつ、可変領域１と可変領域２の会合および可変領域３と可変領域４の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）、可変領域の界面を形成しているアミノ酸残基に置換変異を導入する。【００９８】
以下に、より詳細な例を示すが、これに限定されるものではない。
例えば、［VH1］リンカー［VL2］リンカー［VH3］リンカー［VL4］の順に並んでいるsc(Fv)2において、bivalent scFv型の割合を減少させて、single chain diabody型の割合を増加させるには、例えば、VH1とVL2の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換し、VH3とVL4の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷を有するアミノ酸残基であって、VH1とVL2に導入したアミノ酸残基と反発しない電荷（好ましくは親和性のある電荷）を有するアミノ酸残基に置換する。また、例えば、VH1とVL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、VH3とVL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換する。このような置換により、VH1とVL2の会合およびVH3とVL4の会合を抑制し、かつ、VH1とVL4の会合およびVL2とVH3の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）制御できる。【００９９】
また、［VH1］リンカー［VL2］リンカー［VH3］リンカー［VL4］の順に並んでいるsc(Fv)2において、single chain diabody型の割合を減少させて、bivalent scFv型の割合を増加させるには、例えば、VH1とVL4の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換し、VH3とVL2の界面を形成しているアミノ酸残基を同種の電荷を有するアミノ酸残基であって、VH1とVL4に導入したアミノ酸残基と反発しない電荷（好ましくは親和性のある電荷）を有するアミノ酸残基に置換する。また、例えば、VH1とVL4の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、VH3とVL2の界面を形成しているアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換する。このような置換により、VH1とVL4の会合およびVH3とVL2の会合を抑制し、かつ、VH1とVL2の会合およびVH3とVL4の会合を抑制しないように（あるいは促進するように）制御できる。【０１００】
本発明においては、以下の（１）および（２）、または（３）および（４）のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換することにより、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させることが可能である。
（１）sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における39位に相当するアミノ酸残基
（２）sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
（３）sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（４）sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基【０１０１】
さらに本発明においては、以下の（１）および（２）のいずれか一方のアミノ酸残基、または（３）および（４）のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換することにより、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させることが可能である。
（１）sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における39位に相当するアミノ酸残基
（２）sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
（３）sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（４）sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基【０１０２】
上記（１）〜（４）に記載のアミノ酸残基は、通常、ヒトおよびマウスにおいては、それぞれ、（１）グルタミン(Q)、（２）グルタミン(Q)、（３）ロイシン(L)、（４）プロリン(P)であるが、必ずしもこのアミノ酸残基に限定されず、このアミノ酸に相当する他のアミノ酸であってもよい。例えば、VL上のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸として、ヒトの場合、例えば、ヒスチジン(H)であってもよい。当業者においては、公知文献等（例えば、J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120）を参照することにより、任意の位置について、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を知ることが可能である。【０１０３】
本発明は、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、および該方法によって製造される医薬組成物を提供するものである。
（１）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（２）以下の工程を含む方法。
（ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｉ）sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
（ｉｉ）sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（３）以下の工程を含む方法。
（ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｉ）sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（ｉｉ）sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（４）以下の工程を含む方法。
（ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｉ）sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
（ｉｉ）sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
また、sc(Fv)2の両端のリンカー又は／及び中央のリンカーの長さを調節することにより、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有比率を増加させることも可能である。すなわち、本発明は、以下の工程を含む方法、および該方法によって製造される医薬組成物を提供する。
（ａ）sc(Fv)2のリンカーの長さを調節することによって、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程【０１０４】
本発明において両端のリンカーとは、sc(Fv)2が[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいる場合、リンカー1とリンカー3が両端のリンカーとなり、リンカー2が中央のリンカーとなる。
具体的には、両端のリンカーを0〜12アミノ酸とし、中央のリンカーを10〜30アミノ酸とすることにより、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の比率を増加することが可能となり、両端のリンカーを12〜30アミノ酸とし、中央のリンカーを0〜10アミノ酸とすることにより、sc(Fv)2組成物中のbivalent scFv型の比率を増加させることが可能となる。【０１０５】
また、両端のリンカーを0〜12アミノ酸とし、中央のリンカーを0〜10アミノ酸とすることにより、single chain diabody型の含有比率が80％以上のsc(Fv)2組成物を製造することが可能であり、両端のリンカーを12〜30アミノ酸とし、中央のリンカーを0〜10アミノ酸とすることにより、bivalent scFv型の含有比率が80％以上のsc(Fv)2組成物を製造することが可能となる。【０１０６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、および該方法によって製造される医薬組成物を提供する。
（１）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを10〜30アミノ酸に調節することによって、single chain diabody型の含有比率がbivalent scFv型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（２）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節することによって、single chain diabody型の含有比率がbivalent scFv型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程
（３）以下の工程を含む方法。
（ａ）sc(Fv)2の両端のリンカーを12〜30アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節することによって、bivalent scFv型の含有比率がsingle chain diabody型の含有比率より高いsc(Fv)2組成物を製造する工程
（ｂ）工程（ａ）で製造されたsc(Fv)2組成物および塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を混合する工程【０１０７】
あるsc(Fv)2組成物が、特定の構造異性体の含有比率が他の構造異性体の含有比率より高いsc(Fv)2組成物であるか否かは、当業者に周知の方法、例えばＮＭＲを用いた解析、結晶構造解析などにより同定することができる。また、sc(Fv)2のリンカー部位を切断する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の構造を同定する方法によっても確認することができる。【０１０８】
本発明においてリンカー部位とは、リンカーおよびリンカー近傍領域を含んだ部位のことをいう。リンカー近傍領域とは、リンカーに隣接したアミノ酸から可変領域側に20番目のアミノ酸までの20アミノ酸からなる領域のことをいう。従って、リンカー部位は、リンカーの両端にそれぞれ20アミノ酸からなる領域が付加された部位となる。
sc(Fv)2のリンカー部位を切断する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の構造を同定する方法は、クロマトグラフィー等によるsingle chain diabody型、bivalent scFv型の解析方法に比較して、より簡便な方法である。クロマトグラフィーでは構造異性体の分離が出来ても、分離されたsc(Fv)2の構造の同定を行うことは出来ない。この方法によりクロマトグラフィー等で分離された構造異性体の構造を同定することが可能である。【０１０９】
single chain diabody型とbivalent scFv型で立体構造が違うことから、酵素などにより3つのリンカー部位のうちいずれか1つのリンカー部位が切断された場合、single chain diabody型とbivalent scFv型では切断後の生成物に違いがでる。
具体的には、sc(Fv)2が[可変領域１](リンカー１)[可変領域２](リンカー２)[可変領域３](リンカー３)[可変領域４]の順で並んでいる場合、bivalent scFv型では、リンカー１または３の部位で切断されると、4つの可変領域は共有結合又は非共有結合で結合しているので、2つのscFvに分離することはないが、リンカー２の部位で切断された場合、可変領域１と２からなるscFvと可変領域３と４からなるscFvの２つのscFvに分離される。single chain diabody型ではリンカー１、２または３のいずれのリンカー部位で切断された場合でも4つの可変領域は共有結合又は非共有結合に結合しているので、2つのscFvに分離することはない（図１３）。【０１１０】
従って、bivalent scFv型では3つのリンカー部位のうちいずれか1つのリンカー部位を切断した場合、4つの可変領域を含む生成物と2つの可変領域を含む生成物の2種類が生成されるが、single chain diabody型では3つのリンカー部位のうちいずれか1つのリンカー部位を切断した場合、4つの可変領域を含む生成物のみが生成される。
以上のように、sc(Fv)のリンカー部位のうちの1つを酵素などで切断し、切断後の生成物を比較することにより、sc(Fv)2がsingle chain diabody型、bivalent scFv型のいずれであるかを調べることが可能である。【０１１１】
sc(Fv)2のリンカー部位を切断する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の構造を同定する方法としては、（ａ）sc(Fv)2組成物中のsc(Fv)のリンカー部位を切断する工程、（ｂ）切断後の生成物の分子量または構造を測定する工程を含む方法が例示できる。【０１１２】
一般にsc(Fv)2のリンカー部分は、高次構造を取っていないため、プロテアーゼ等の分解を受けやすいことが知られている（Hoedemaeker et al、J Biol Chem. 1997; 272 : 29784-29789）。リンカーを切断する方法は特に限定されないが、酵素による切断が好ましく、特にプロテアーゼによる切断が好ましい。使用されるプロテアーゼは特に限定されず、エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼのいずれでもよいが、リンカーを切断するという目的からエンドペプチダーゼが好ましい。エンドペプチダーゼは、セリンプロテアーゼ、チオールペプチダーゼ、酸性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼなど如何なるものでもよく、当業者であれば、リンカーの種類やアミノ酸配列に応じて適宜選択することが可能である。例えば、セリンプロテアーゼとして、Arg, Lys残基のC末端側を特異的に加水分解するトリプシンやタンパク質・ペプチドを非特異的に加水分解するサブチリシンなどが挙げられる。また、チオールプロテアーゼとして、タンパク質・ペプチドのN末端のpGlu残基を特異的に加水分解するピログルタメートアミノペプチダーゼやタンパク質・ペプチドを非特異的に加水分解するパパインなどが挙げられる。【０１１３】
切断されるリンカーの数は限定されるものではないが、1つであることが好ましい。リンカーを1つ切断する場合の条件は当業者に公知の方法で決定することができる。
又、切断後の生成物の分子量または構造の測定は、可変領域間の非共有結合を維持したまま測定することが好ましく、例えば、native pageやゲルろ過などを用いることが可能である。【０１１４】
本発明は、sc(Fv)2に、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程を含む、sc(Fv)2の異性化を抑制する方法を提供する。本発明の方法によって、sc(Fv)2の特定の構造異性体を安定化することができるので、本発明の方法は、sc(Fv)2の特定の構造異性体の分析等に利用できる。【０１１５】
また、sc(Fv)2を含有する医薬組成物において、本発明の物質は、特定の構造異性体を安定に存在させるために、また存在する複数の構造異性体の存在比を保存中一定に保つために有用であり、医薬品原薬や製剤の保存時の安定化剤として利用できる。すなわち、本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を添加する工程を含む、医薬組成物中の有効成分の異性化を抑制する方法もまた提供するものである。また、sc(Fv)2の異性化の抑制は、該sc(Fv)2を凍結乾燥することによっても実施することができる。【０１１６】
さらに、本発明は、塩、アミノ糖、糖アルコール、アミノ酸、pH調整剤からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含有する、sc(Fv)2の異性化反応を抑制するために用いる安定化剤、その使用方法を提供するものである。また、本発明の安定化剤の製造における、塩、アミノ糖、アミノ酸、または、pH調整剤の使用、またはsc(Fv)2の異性化反応を抑制するための塩、アミノ糖、アミノ酸、または、pH調整剤の使用も提供する。すなわち、本発明は、塩、アミノ糖、アミノ酸、または、pH調整剤の新規な用途を提供するものである。本発明の安定化剤は、当業者に周知の方法で調製することができる。本発明の安定化剤に含まれる物質の製造元、販売元は、当業者に周知である。
また、本発明は、sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。スクリーニングされた物質は、sc(Fv)2の異性化反応を抑制するために用いる安定化剤として使用できる。【０１１７】
該方法では、まず、調製されたsc(Fv)2組成物に被検物質を接触させる。本発明の方法における「被検物質」としては、特に制限はなく、例えば、公知の薬学的に許容される担体、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。また、本発明において「接触」は、sc(Fv)2組成物に被検物質を添加することにより、あるいは被検物質にsc(Fv)2組成物を添加することにより行う。【０１１８】
該方法では、次いで、sc(Fv)2の異性化反応の抑制の有無を測定し、sc(Fv)2の異性化反応を抑制する物質を選択する。sc(Fv)2の異性化反応の抑制は、上述のとおり、当業者であれば周知の方法によって測定することができる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１１９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【０１２０】
〔実施例１〕ヒト化抗ヒトMpl抗体hVB22B sc(Fv)2の異性化反応の安定化剤の検討
図１に示すように、sc(Fv)2は２種類の構造異性体間を相互に構造変換（異性化）する。sc(Fv)2の相互異性化反応を抑制するために、高純度に精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の2種類の構造異性体であるpeak1(91.4% peak1)、及び、peak2(99.6% peak2)を用いて、それぞれの構造異性体（bivalent scFv型であるpeak1あるいはsingle chain diabody型であるpeak2）の異性化反応を抑制する安定化剤の検討を試みた。【０１２１】
具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後の構造異性体存在比を測定した。
<安定性試験条件>
20mM sodium citrate, pH6.5, + following additives
Additives: none, 10% sucrose, 10% mannitol, 10% meglumine, 50mM magnesium chloride, 100mM lysine hydrochloride
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1: 62ug/mL 
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2: 62ug/mL 
25℃-3weeks【０１２２】
上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、25℃-6weeks後の構造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。
<溶離条件>
カラム : Bioassist S (TOSOH)
移動相 A : 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B : 20mM sodium phosphate, 500mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.8ml/min
Detection : 220nm【０１２３】
図２に、peak1 91.4%から開始した場合における、25℃-6weeks後のpeak1の割合を示した。peak1 percentageは、peak1 peak area/(peak1 +peak2 peak area)*100により計算した。
安定化剤非存在下(none)においては、25℃-6weeks後のpeak1の割合が45%程度まで減少し、半分以上がpeak2へ異性化した。それに対して、NaCl、meglumine、MgCl2、lysineを添加した条件においては、大幅に異性化反応が抑制され、25℃-6weeks後のpeak1の割合は80%程度であった。mannitolを添加した場合は若干の異性化抑制効果のみ確認され、sucroseではほとんど安定化効果が認められなかった。【０１２４】
また図３に、peak2 99.6%から開始した場合における、25℃-6weeks後のpeak2の割合を示した。peak2 percentageはpeak2 peak area/(peak1 +peak2 peak area)*100により計算した。
安定化剤非存在下(none)においては、25℃-6weeks後のpeak2の割合が95%程度まで減少し、5%程度がpeak1へ異性化した。それに対して、NaCl、meglumine、MgCl2、lysineを添加した条件したにおいては、大幅に異性化反応が抑制され、25℃-6weeks後のpeak2の割合は98%以上であった。特にmeglumineを添加した際の異性化抑制効果が最も高かった。mannitolを添加した場合は若干の異性化抑制効果のみ確認され、sucroseではほとんど安定化効果が認められなかった。【０１２５】
以上より、hVB22B sc(Fv)2の構造異性体の相互異性化反応を抑制する安定化剤が明らかとなった。安定化剤としては、NaCl、meglumine、MgCl2、lysineに大きな効果が見られたことから、NaClのような塩類、meglumineのようなアミノ糖、MgCl2のような２価の塩、lysineのようなアミノ酸を添加することによって、異性化反応が抑制可能であることが判明した。【０１２６】
〔実施例２〕hVB22B sc(Fv)2の異性化反応のpH依存性およびNaCl濃度依存性
次に、高純度に精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の2種類の構造異性体であるpeak1(91.4% peak1)、及び、peak2(99.6% peak2)を用いて、それぞれの構造異性体（peak1あるいはpeak2）の異性化反応を抑制することができるpHおよびNaCl濃度の検討を行った。【０１２７】
具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後の構造異性体存在比を測定した。
<安定性試験条件>
20mM sodium citrate,
0 / 150 / 300mM NaCl, 
pH 3.0 / 3.5 / 4.0 / 4.5 / 5.0 / 5.5 / 6.0 / 6.5 / 7.0 / 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1 : 0.2mg/mL
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak2 : 0.2mg/mL
25℃-5days【０１２８】
上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、25℃-5days後の構造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。
<溶離条件>
カラム : Bioassist S (TOSOH)
移動相 A : 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B : 20mM sodium phosphate, 500mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.8ml/min
Detection : 220nm【０１２９】
図４に、peak1 91.4%から開始した場合における、25℃-5days後のpeak1の割合を示した。また図５に、peak2 99.6%から開始した場合における、25℃-5days後のpeak2の割合を示した。peak1 percentageおよびpeak2 percentageの計算方法は、実施例１と同様である。
これらよりpeak1からpeak2への異性化反応、peak2からpeak1への異性化反応は共に、大きなpH依存性、NaCl濃度依存性を示した。pHが低いほど、またNaCl濃度が低いほど、異性化が促進されることが明らかとなった。通常のIgGはpH5.5〜6.0付近で安定であり、塩濃度は会合化に対して大きな影響は与えない（Pharm. Res. 1994, 11(5), 764-771）ことが知られていることから、sc(Fv)2の異性化反応はIgGの会合化とは全く異なるプロファイルを示した。【０１３０】
これまでにタンパク質のこのような異性化反応を報告されておらず、本研究によって、hVB22B sc(Fv)2における異性化反応はpHやNaCl濃度により抑制できることを初めて見出した。【０１３１】
〔実施例３〕hVB22B sc(Fv)2 single chain diabody型の異性化反応の緩衝液・pH依存性およびNaCl濃度依存性
高純度に精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体であるpeak2(99.6% peak2)を用いて、single chain diabodyであるpeak2からbivalent scFvであるpeak1への異性化反応を抑制することができるpHおよびNaCl濃度の検討を２種類の緩衝液種を用いて行った。特にNaCl濃度に関して詳細な検討を行った。【０１３２】
具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後の構造異性体存在比を測定した。
<安定性試験条件>
Buffer : 20mM sodium citrate / 20mM histidine HCl
NaCl : 0mM / 35mM / 75mM / 100mM / 150mM / 300mM
pH : 6.0 / 6.5 / 7.0
25℃-20days【０１３３】
上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、25℃-5days後
の構造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。
<溶離条件>
カラム : Bioassist S (TOSOH)
移動相 A : 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B : 20mM sodium phosphate, 500mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.8ml/min
Detection : 220nm【０１３４】
また図６に、peak2 99.6%の25℃-20days後のpeak1の割合を示した。peak1 percentageの計算方法は、実施例１と同様である。
これらよりpeak2からpeak1への異性化反応は共に、大きなpH依存性、NaCl濃度依存性を示した。pHに関しては実施例２と同様の傾向が見られた。NaCl濃度に関してはより詳細な検討を行った結果、異性化反応はNaCl濃度が増加するに従って抑制されることが分かり、特にNaCl濃度約50mM以上で抑制効果が大きくなるが分かった。この傾向は、いずれのpH、及び、緩衝液種においても確認された。このことから、sc(Fv)2の製剤にNaClを添加することによって異性化反応を抑制できることが分かった。【０１３５】
〔実施例４〕マウス抗ヒトMpl抗体mVB22B sc(Fv)2 bivalent scFv型の異性化反応のpH依存性およびNaCl濃度依存性
高純度に精製したmVB22B sc(Fv)2の2種類の構造異性体のうちbivalent scFvを用いて、bivalent scFvであるpeak1からsingle chain diabodyであるpeak2への異性化反応を抑制することができるpHおよびNaCl濃度の検討を試みた。【０１３６】
具体的には、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後の構造異性体存在比を測定した。
<安定性試験条件>
20mM sodium citrate,
0 / 150 / 300mM NaCl, 
pH 5.0 / 5.5 / 6.0 / 6.5 / 7.0 / 7.5
mVB22B sc(Fv)2 peak1 : 0.1mg/mL
40℃-2,4,8days【０１３７】
上記条件で反応後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、intialおよび40℃-2,4,8days後の構造異性体存在比を測定した。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。
<溶離条件>
カラム : MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A : 50mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B : 50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : 220nm【０１３８】
図７に、各溶液条件におけるpeak1の40℃-2,4,8daysの安定性試験後の異性化によって生成したpeak2の割合を示した。peak2 percentageの計算方法は、実施例１と同様である。
これらよりpeak1からpeak2への異性化反応は大きなpH依存性、NaCl濃度依存性を示した。pHが低いほど、またNaCl濃度が低いほど、異性化が促進されることが明らかとなった。通常のIgGはpH5.5〜6.0付近で安定であり、塩濃度は会合化に対して大きな影響は与えない（Pharm. Res. 1994, 11(5), 764-771）ことが知られていることから、sc(Fv)2の異性化反応はIgGの会合化とは全く異なるプロファイルを示した。【０１３９】
これまでにタンパク質のこのような異性化反応を報告されておらず、本研究によって、mVB22B sc(Fv)2における異性化反応はpHやNaCl濃度により抑制できることを初めて見出した。【０１４０】
〔実施例５〕異性化反応の凍結乾燥製剤下による安定化
異性化反応の抑制法として凍結乾燥製剤化の有効性を検討した。そこで、mVB22B sc(Fv)2の2種類の構造異性体の混合物を凍結乾燥製剤化することで異性化反応が抑制可能か検討を試みた。
<凍結乾燥製剤および溶液製剤の調製条件>
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, 5% sucrose, 
〜% polysorbate 80, pH7.0
VB22B sc(Fv)2 : 0.2, 1.0, 5.0 mg/mL
Scale : 500uL【０１４１】
上記条件で凍結乾燥製剤、および、溶液製剤を調製した。凍結乾燥製剤は、予め-50℃に予備凍結した凍結乾燥機（KYOWAC Triomaster IIA-04、協和真空）にサンプルをローディングし、1時間放置した。品温が-40℃以下になったことを確認し、0.1Torr以下に真空引きした後、-20℃で一次乾燥、30℃で二次乾燥を実施した。【０１４２】
上記条件でintialおよび40℃-1week後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、構造異性体存在比を測定した（peak2 percentageの計算方法は、実施例１と同様である）。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は以下の通りである。
<溶離条件>
カラム : MONO Q (Amershambioscience)
移動相 A : 50mM Tris-HCl, pH8.0
移動相 B : 50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : 220nm【０１４３】
図８にintialおよび40℃-1week後のbivalent scFvの割合を示した。
溶液条件では、実施例４に示したようにbivalent scFvはsingle chain diabodyへの異性化したのに対して、凍結乾燥状態では異性化は抑制された。これより、sc(Fv)2を凍結乾燥製剤化することによって異性化反応を抑制することを見出した。２分子間の反応である会合化や水分子が関与する脱アミド化反応に関しては、凍結乾燥製剤化することはこれまでに報告されている。しかしながら、これまでにタンパク質のこのような異性化反応を報告されておらず、本研究によって異性化反応は凍結乾燥製剤化することで抑制できることを初めて見出した。【０１４４】
これまでにタンパク質のこのような異性化反応を報告されておらず、本研究によって、sc(Fv)2における異性化反応は凍結乾燥製剤化することで抑制できることを初めて見出した。【０１４５】
〔実施例６〕bivalent scFv あるいはsingle chain diabodyを高収率で得る方法
高純度に精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体であるpeak1(91.4% peak1)を用いて、peak1からpeak2への異性化反応を促進することができるかどうか検討した。hVB22B sc(Fv)2はpeak1とpeak2の混合物として発現細胞から分泌されるが、製造工程中において、peak1をpeak2に異性化することが出来れば、peak2の収率を向上することができる。そこで以下に示すpHおよびNaCl濃度でpeak1からpeak2への異性化の検討を行った。【０１４６】
具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、下記条件における反応後の構造異性体存在比を測定した。
<peak1→peak2異性化試験条件>
20mM sodium citrate
0mM/150mM/300mM NaCl
pH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5/7.0/7.5
25℃-5days【０１４７】
上記条件で反応後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、25℃-5days後の構造異性体存在比を測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。peak1 percentageの計算方法は、実施例１と同様である。
<溶離条件>
カラム : Bioassist S (TOSOH)
移動相 A : 20mM sodium phosphate, pH7.0
移動相 B : 20mM sodium phosphate, 500mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.8ml/min
Detection : 220nm【０１４８】
実施例１に示した陽イオン交換クロマトグラフィーの方法でpeak1とpeak2比を測定した結果、図９Ａに示すように、peak1のピークエリアが減少し、それに代わって、peak2のピークエリアが増大した。これよりhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においても、bivalent scFvであるpeak1は、single chain diabodyであるpeak2に構造変換することを見出した。その異性化速度は、低pH及び低塩濃度ほど早いことを見出した。peak1からpeak2に異性化させる本方法を用いることで、細胞より産生されたpeak1とpeak2の混合物からpeak1をpeak2に異性化させることによって、高収率でsingle chain diabodyであるpeak2を得ることが可能である。
〔実施例７〕ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2の異性化反応のpH依存性
参考例７に示された方法で得られたヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2の異性化反応を抑制することができるpHの検討を行った。
<安定性試験条件>
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH 4.5 / 5.5 / 6.5 / 7.5
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2 : 0.1mg/mL
50℃-10days
上記条件で反応後、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、50℃-10days後の構造異性体存在比率を測定した。参考例７に示されているとおり、、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、bivalent scFv型がsingle chain diabody型よりも早く溶出することを用いて両者の存在比率を測定した。ゲルろ過クロマトグラフィーの溶離条件は下記の通りである。
<溶離条件>
カラム : TSKgel SuperSW2000 (TOSOH)
移動相 : 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.2ml/min  
図９Ｂに、initialと50℃-10days後の構造異性体存在比率（bivalent scFv型存在比率）を示した。ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2は、50℃-10days pH4.5においてsingle chain diabody型からbivalent scFv型の構造へ異性化反応が進行しbivalent scFv型の存在比率が増加した。hVB22B sc(Fv)2はbivalent scFv型からsingle chain diabody型へ異性化反応が進行したのに対して、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2においてはsingle chain diabody型からbivalent scFv型の構造へ異性化反応が進行した。図９Ｂに示されたとおり、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2の異性化反応はpH5.5以上で抑制されることから、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体sc(Fv)2の異性化反応はpHにより抑制できることが明らかになった。【０１４９】
〔参考例１〕VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評価
1-1.   マウス抗ヒトMpl抗体mVB22B sc(Fv)2の作製
マウス抗ヒトMpl抗体mVB22B sc(Fv)2（以下、VB22B sc(Fv)2と称する）は、Blood, 2005, 105, 562-566に示す通りに作製した。具体的には、抗ヒトMpl抗体を産生するマウスハイブリドーマVB22Bの抗体可変領域cDNAをクローニングし、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3（配列番号：１）をコードする塩基配列およびFLAG配列（AspTyrLysAspAspAspAspLys）（配列番号：２）をコードする塩基配列を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VL−Flagタグ配列で構成される塩基配列（配列番号：３）を持つようなDNAを作製した。このDNA断片を発現ベクターpCXND3にクローニングしてVB22B sc(Fv)2発現ベクターを構築し、CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター（25μg）とPBSに懸濁したCHO-DG44細胞（1×107細胞/mL）の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後にGene PulserII（BioRad）を用いて1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin（Invitrogen）を含むCHO-S-SFMII培地（Invitrogen）に加えて選抜し、VB22B sc(Fv)2産生CHO細胞株を樹立した。【０１５０】
続いて、この細胞株より培養上清を20mM リン酸緩衝液（pH6.8）で平衡化したMacro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio-Rad)カラムにかけ、250mM リン酸緩衝液（pH6.8）で段階的に溶出した。溶出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、HiLoad 26/60 Superdex200pgカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、分子量が約70kD〜40kDに相当する画分を分取した。この画分を、50mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡化したAnti-Flag M2 Affinity Gel（SIGMA-ALDRICH）カラムに吸着させ、100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)で溶出させた。溶出画分は、直ちに1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行い、HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham-Bioscience)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、20 mM酢酸 (pH6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。【０１５１】
1-2.   VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造はVH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図１０）。VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記の溶離条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーMONO Q (Amersham Bioscience)を用いることによりVB22B sc(Fv)2の各種構造異性体の分離に成功した。
<溶離条件>
移動相A : 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相B : 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速 : 1.0ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)【０１５２】
上記条件により、VB22B sc(Fv)2は4つのピークに分離した。図１１に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークからそれぞれ、pre peak1、pre peak2、peak1、peak2と命名した。【０１５３】
peak1及びpeak2に関して、Q-TOF型質量分析計(Q Tof Ultima, Micro Mass)に、Infusionにて試料溶液を導入し得られた多価イオンスペクトル(+)を付属ソフト(MassLynx)を用いたデコンボリューションを行った結果、それぞれの分子量はpeak1;54115Da、peak2;54112Daであったことから、peak1とpeak2は同一の分子量を有することが分かった。【０１５４】
VB22B sc(Fv)2は糖鎖付加がないこと、またpeak1とpeak2は同一のアミノ酸一次配列を持ち、且つ、イオン交換クロマトグラフィーで分離される互いに異なる立体構造を有することから、peak1とpeak2は構造異性体(conformational isomer)であることが示唆された。公知文献では、構造異性体の存在は示唆されていたが、本検討により初めて構造異性体を分離することが可能になった。【０１５５】
1-3.  VB22B sc(Fv)2の構造異性体の構造決定
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると予想されることから、peak1とpeak2はこれらの構造異性体であると考えられた。【０１５６】
本検討により2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解法を見出した。sc(Fv)2のリンカー部分は、比較的自由な構造を取っていると考えられ、プロテアーゼに対する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種であるsubtilisin Aを用いて、以下の条件でpeak1及びpeak2及びVB22B bulk (peak1 : peak2 〜 1 : 3)と反応させた。
<反応条件>
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
VB22B sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.14mg/mL
Subtilisin A : 1ug/mL
37℃, 30min【０１５７】
上記の反応後、TrisGlycine SDS gel 12%を用いて、還元SDS-PAGEを行った。その結果、VB22B bulk（構造異性体分離前）、peak1、peak2はいずれも同様のバンドパターンを示した（図１２）。VB22B sc(Fv)2の3箇所のリンカー部分の切断によると思われる各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いることで、VB22B sc(Fv)2のリンカー部分を部分的且つ限定的に分解できることが判明した。【０１５８】
2種類の構造異性体において、3箇所のリンカーの中で1箇所の切断が起こった場合、図１３に示すように、未変性状態ではVHとVLの間の非共有的な結合によりsingle chain diabody型の構造においては、3箇所のリンカーの中でどのリンカーに切断が起こっても見かけの分子量には変化が見られないが、bivalent scFv型においては、中央のリンカーに切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生成する。そこで、上記反応条件により部分的にリンカーを切断した、VB22B bulk、peak1、peak2をTSK Super2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。その結果、図１４に示すように、peak2では低分子量のピークが全く確認されなかったのに対して、peak1は低分子量（約半分の分子量）のピークが確認された。peak1とpeak2の混合物であるVB22B bulkは、peak1の存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、peak1はbivalent scFv型、peak2はsingle chain diabody型であると同定された。【０１５９】
一連の手法により、VB22B sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、その構造を同定することが可能となった。公知文献では、構造異性体の構造はモデル予測にて推定していたが、本検討により分離された構造異性体の構造を同定する方法を見出した。またイオン交換クロマトグラフィーのピーク面積から、VB22B sc(Fv)2に含有するbivalent scFv構造とsingle chain diabody構造の構造異性体の存在比を定量的に評価することが可能となった。【０１６０】
1-4.  VB22B sc(Fv)2の構造異性体の生物活性評価
抗ヒトMpl抗体VB22B sc(Fv)2は、文献（Blood 2005;105:562-566）においてTPO様アゴニスト活性を示すことが報告されている。そこで、TPO依存性増殖を示すBaF3-human MplまたはBaF3-monkey Mplを用いて分離した構造異性体のTPO様アゴニスト活性を評価した。【０１６１】
各細胞を1% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含むRPMI1640 (Invitrogen)で2回洗浄した後、4x105cells/mLとなるように10% Fetal Bovine Serumを含むRPMI1640に懸濁し、60μL/wellで96well plateに分注した。rhTPO (R&D)または構造異性体サンプルの濃度を振り、各wellに40μL加え、37℃、5%CO2条件下で、24時間培養した。10μL/wellでWST-8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスク）を加え、直後にBenchmark Plusを用いて450nmの吸光度(対照655nm)を測定し、2時間培養後に、再度450 nmの吸光度(対照655nm)を測定した。WST-8試薬は生細胞数に応じて450nmの発色反応を呈することから、2時間の吸光度変化を指標にTPO様アゴニスト活性を評価した。【０１６２】
精製したVB22B sc(Fv)2の構造異性体を用いて、BaF3-human Mpl、BaF3-monkey MplにおけるTPO様アゴニスト活性を評価した結果をそれぞれ図１５に示す。peak1とpeak2の構造異性体のアゴニスト活性を比較すると、peak2の方が著しく高い活性を示すことが明らかになった。このことから、抗Mpl抗体sc(Fv)2がTPO様アゴニスト活性を発揮するためには、single chain diabodyの構造を取る必要があることが示唆された。【０１６３】
〔参考例２〕hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定、および活性評価
2-1.  ヒト化抗ヒトMpl抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の作製
参考例1で作製したVB22B sc(Fv)2の可変領域のフレームワーク領域(以下、FR)に相補性抗原決定領域（以下、CDR）を移植したヒト化抗体を作製した。具体的には、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3（配列番号：１）をコードする塩基配列をコードする塩基配列を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VLで構成される塩基配列（配列番号：４）を持つような遺伝子になるように、50base程度の合成オリゴDNAを約20base程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴDNAをPCR法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、参考例1-1の方法と同様に発現ベクター構築、定常発現CHO-DG44細胞株の作製を行い、培養上清を回収した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2はFlagタグを付加していないことから、培養上清からの精製は、VB22B sc(Fv)2が認識するエピトープであるMG10(ヒトMplアミノ酸配列のGln213からAla231)とGST融合蛋白質を利用して行った。MG10とGST融合蛋白質の精製は、Glutathione Sepharose 4B（Amersham Biosciences社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製した。さらに、精製したMG10 とGST融合蛋白質をメーカーのプロトコールに従って、HiTrap NHS-activated HP（Amersham Biosciences社製）に固定化し、アフィニティカラムを作製した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現CHO細胞の培養上清をMG10-GST融合蛋白質固定化カラムに流し、ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を吸着させ、100mM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに1M Tris-HCl(pH7.4)で中和を行い、HiLoad 16/60 Superdex200pg（Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、20mMクエン酸緩衝液（pH7.5）, 300mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。【０１６４】
2-2.  hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、VB22B sc(Fv)2と同様に構造はFv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図１０）。【０１６５】
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、陽イオン交換クロマトグラフィーBioAssist S(TOSOH)を用いて、下記の溶離条件によりhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の各種成分の分離できることが示唆された。
移動相A : 20mM sodium phosphate, pH7.5
移動相B : 20mM sodium phosphate, 500mM NaCl, pH7.5
流速 : 0.8ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)
上記条件により、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は2つのピークに分離した。図１６に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークからそれぞれ、peak1、peak2と命名した。【０１６６】
peak1及びpeak2に関して、Q-TOF型質量分析計(Q Tof Ultima, Micro Mass)を用いて分子量の測定を行った。Q-TOFにinfusionにて試料溶液を導入し、得られた多価イオンスペクトル(+)を、付属ソフト(MassLynx)を用いたデコンボリューションを行った結果、peak1の分子量として53768Da、peak2の分子量とし53769Daを得た。このことから、peak1とpeak2は同一の分子量を有することが分かった。【０１６７】
peak1及びpeak2に関して、ペプチドマッピングを行った。還元変性、carboxymethyl化後、トリプシンを用いてペプチド断片に分解し、逆相クロマトグラフィー（YMC-Pack-ODS）によりペプチドマップを得た。peak1とpeak2のペプチドマップを比較したところ、図１７に示すようにpeak1とpeak2のマッピングのパターンは同一であったことから、アミノ酸一次構造は同一であることが分かった。【０１６８】
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は糖鎖付加がなく、peak1とpeak2はTOF-MASS測定による分子量が同一であること、peak1とpeak2はマッピングのパターンが同一であることから、peak1とpeak2は互いに異なる立体構造を有する構造異性体(conformational isomer)であることが分かった。【０１６９】
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、図１０に示すとおり、構造はFv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在し、peak1とpeak2はそれぞれbivalent scFv型とsingle chain diabody型のどちらかの構造であると考えられた。【０１７０】
2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解法を見出した。sc(Fv)2のリンカー部分は、比較的自由な構造を取っているためプロテアーゼに対する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種であるsubtilisin Aを用いて、以下の条件でpeak1及びpeak2及びhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (peak1 : peak2 〜 1 : 4)と反応させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.15mg/mL
Subtilisin A : 10ug/mL
37℃, 30min【０１７１】
反応後、Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元SDS-PAGEを行った。その結果、図１８に示すとおり、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk、peak1、peak2いずれも同様のバンドパターンを示した。hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の3箇所のリンカー部分の切断によると思われる各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用いることで、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のリンカー部分を部分的且つ限定的に分解できることが分かった。【０１７２】
bivalent scFv型とsingle chain diabody型の構造において、３つのうちのリンカーの一箇所の切断が起こった場合、図１３に示すように、未変性状態では、VHとVLの間の非共有的な結合によりsingle chain diabody型の構造においては、３つのうちのどのリンカーに切断が起こっても見かけの分子量には変化が見られないが、bivalent scFv型においては、中央のリンカーに切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生成する。そこで、上記反応条件により部分的にリンカーを切断した、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk、peak1、peak2をTSK SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。その結果、図１９に示すように、peak2においては低分子量のピークが全く確認されなかったのに対して、peak1においては低分子量（約半分の分子量）のピークが確認された。peak1とpeak2の混合物であるhVB22B sc(Fv)2 u2-wz4 bulkは、peak1の存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、本結果より、peak1がbivalent scFv型であり、peak2がsingle chain diabody型であると同定された。【０１７３】
2-3.  hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の結合活性評価
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より分離したpeak1、peak2及びhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の結合活性の評価を以下のとおり行った。Biacore 3000(Biacore社製)にSensor Chip CM5(Biacore社製)を装着し、アミンカップリング法にて2-1で示したMG10（ヒトMplのGln213からAla231とGST融合蛋白質）を固定化した。測定のランニングバッファーはHBS-EP Buffer(Biacore社製)を使用し、流速は20μL/minとした。HBS-EP Bufferにより、およそ5 nMから150 nM程度の6点の濃度になるように、ヒト化VB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peak1, peak2を調製し、前述のMG10固定化セルに、これらのサンプルをそれぞれ、2分間添加して結合領域を得た後に、解離領域を2分間測定した。MG10-GST融合蛋白質に結合したVB22B sc(Fv)2は、20mM HClを1分間添加して除去し、固定化セルを再生した。得られたセンサーグラムより、BIAevaluation ver.3.1ソフトウェア(Biacore社製)を用いて、Bivalent analyte modelを適用し、結合速度定数(ka)・解離速度定数(kd)を算出した。その結果、表１に示すとおり、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peak1, peak2の解離定数(KD)は、それぞれ 1.02x10-8 M, 1.24x10-8 M, 9.92 x10-9 Mであり、ほぼ２つの構造異性体はほぼ同等の結合活性を持つことが分かった。【０１７４】
【表１】
2006132352.tif 000003
【０１７５】
2-4.  hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体のアゴニスト活性評価
peak1及びpeak2及びhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のアゴニスト活性の評価を行った。図２０に示すように、アゴニスト活性は構造異性体間で大きく異なり、single chain diabody構造のpeak2が非常に高いアゴニスト活性を示したのに対して、bivalent scFv構造のpeak1の活性は極めて小さかった。2つの構造異性体は、結合活性はほぼ同程度であったのに対して、アゴニスト活性は著しく異なった。公知文献においては構造異性体の分離・同定が行われていなかったため、本検討で初めて2種類の構造異性体の間で生物学的な活性が異なることが見出された。【０１７６】
本参考例において、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有する構造異性体を分離し、その構造を同定することが可能となった。またクロマトグラフィーのピーク面積により、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2に含有するbivalent scFv構造とsingle chain diabody構造の構造異性体の存在比を定量的に分析することが可能となった。hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においてはbivalent scFv構造とsingle chain diabody構造ではアゴニスト活性に著しい違いがあることが分かり、これらの活性の著しく異なる構造異性体を含むhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、2種類の構造異性体の性質を決定し、各構造異性体の含有比率を定量的に分析する規格試験は必要不可欠である。【０１７７】
〔参考例３〕VB22B sc(Fv)2リンカー改変体の構造異性体存在比の分析および構造異性体比の制御
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、構造はFv(VH,VL間で非共有結合した分子）の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる。【０１７８】
中央のリンカーをmiddle linkerとし、両端のリンカーをedge linkerとし、図２１に示すようなmiddle linkerあるいはedge linkerの長さの異なる各種VB22B sc(Fv)2を作製し、それらの構造異性体存在比の定量的な分析を以下の条件で行った。
カラム : MONO Q (Amershambioscience)
移動相A : 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相B : 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速 : 1.0ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)【０１７９】
その結果、図２２に示すように、任意の長さのリンカーにおいて参考例２に示した分析法により２つの構造異性体を分離することができ、構造異性体存在含有比率を測定することが出来た。リンカーの長さによって、bivalent scFv型とsingle chain diabody型の比を制御することが可能であることが分かり、本分析法を用いることにより目的の構造異性体比を得ることが出来る適切なリンカー長を設計することが可能となった。【０１８０】
公知文献では、２つの構造異性体の構造同定法、及び、定量的な分析法が見出されていなかったため、このようなリンカーの長さと構造異性体の存在比を定量的に評価することは出来なかった。Protein Engineering, 1993, 6(8), 989-995やProtein Engineering, 1994, 7(8), 1027-1033等においてリンカーの長さが12以下の場合は、近接するVHとVL同士はFvを形成しにくいことが一般的に報告されていたが、本検討により、G5やG10においては、近接するVHとVL同士がFvを形成したsingle chain diabody型の構造が少量ながら存在することが分かった。すなわち、いかなるリンカーにおいても２つの構造（すなわち構造異性体）が存在する可能性が考えられた。そのため医薬品としてsc(Fv)2型の分子を開発するためには、いかなるリンカーにおいても構造異性体の存在比率を定量的に分析する必要があると考えられ、このことから構造異性体の存在比率を定量的に分析可能且つ分離生成可能な本分離分析法は、sc(Fv)2型の医薬品分子を開発するにあたって極めて有用である。【０１８１】
〔参考例４〕陽イオン交換クロマトグラフィー（SOURCE 15S）による構造異性体の大量精製
参考例2-1で使用したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現CHO細胞の培養上清から精製を行った。培養上清は、精製水で3倍に希釈した後、1 M酢酸でpHを6.0に調整した。この後、20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0で平衡化したSP Sepharose Fast Flow column(Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中0 Mから0.5 MまでのNaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した（第一工程）。得られた画分をTrisGlycine SDS gel 12%を用いた還元SDS-PAGEで分析し、hVB22B u2-wz4を含む画分を集めた。【０１８２】
第一工程のhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2画分は、10 mMリン酸緩衝液、pH 6.8で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム, タイプI, 20 μm (BIO-RAD社製)に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、pH 6.8のリン酸緩衝液濃度を160 mMまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した（図２３）。メインピークの後に、小さなピークが溶出したが、SDS-PAGE分析の結果、これらはいずれもhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2であることが確認された。図２３右に示したように、Superdex 200 PC 3.2/30 column(Amersham Biosciences社製)を使用した分析ゲルろ過により、メインピークはほとんどがhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマーであり、後ろのピークはhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のダイマー以上のアグリゲート画分であることがわかった。以上より、この工程でhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分を分離できることがわかった。【０１８３】
第二工程で得られたhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のモノマー画分は、精製水で5倍に希釈した後、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0で平衡化したSOURCE 15S column(Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中0 mMから36 mMまでのNaClの直線濃度勾配をかけたのち、2つのピークを最大限に分離して溶出させるため、一旦36 mM でNaClの濃度を固定した。図２４に示すように、2つのhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のピークが溶出されたのち、再びNaClの濃度を上げて、さらに強くカラムに吸着したポリペプチドを溶出しカラムを洗浄した。これら２つのピークは、2-2で示したBioAssist Sカラムによる分析で、先に溶出するメインピークがpeak2で、後から溶出するのがpeak1であることが判明した(図２５)。【０１８４】
精製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のpeak1とpeak2は、前述のSDS gelを用いて還元と非還元両条件でSDS-PAGE分析をおこなったところ、いずれも分子量約55 kDaの位置にシングルバンドとして観察された(図２６)。さらにhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のpeak1とpeak2は、1-3で示したTSK Super2000カラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分析で、いずれもシングルピークで見かけ上の分子量約50 kDaを示した(図２７)。
以上より、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の目的とする構造異性体のモノマーのみを、大量精製に不向きなゲルろ過クロマトグラフィーを使用せずに精製する方法の開発に成功した。【０１８５】
〔参考例５〕VH/VL界面改変型sc(Fv)2の作製、構造異性体分析および同定
5-1. VH/VL界面改変型sc(Fv)2の作製
参考例２で作製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2（以下、u2-wz4）のVH/VL界面を形成するアミノ酸であるVHの39番目（WO2005/56604の配列番号：289に記載のアミノ酸配列における39位）のGlnとVLの38番目（WO2005/56604の配列番号：291に記載のアミノ酸配列における43位）のGlnを以下のようにして改変した。u2-wz4は［VH1］リンカー［VL2］リンカー［VH3］リンカー［VL4］の順にアミノ酸リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3（配列番号：１）で連結されており、配列番号４で記載した塩基配列で転写、翻訳される。はじめに、VH1の39番目のGln（遺伝子コドンCAG）をGlu（遺伝子コドンGAG）に、VL2の38番目のGln（遺伝子コドンCAG）をGlu（遺伝子コドンGAG）に、VH3の39番目のGln（遺伝子コドンCAG）をLys（遺伝子コドンAAG）に、VL4の38番目のGln（遺伝子コドンCAG）をLys（遺伝子コドンAAG）に改変した遺伝子hVB22B u2-wz4(v1) sc(Fv)2（以下v1、塩基配列を配列番号：１４に、アミノ酸配列を配列番号：１５に示す）を作製した。さらに、VH1の39番目のGln（遺伝子コドンCAG）をGlu（遺伝子コドンGAG）に、VL2の38番目のGln（遺伝子コドンCAG）をLys（遺伝子コドンAAG）に、VH3の39番目のGln（遺伝子コドンCAG）をLys（遺伝子コドンAAG）に、VL4の38番目のGln（遺伝子コドンCAG）をGlu（遺伝子コドンGAG）に改変した遺伝子hVB22B u2-wz4(v3) sc(Fv)2（以下v3、塩基配列を配列番号：１６に、アミノ酸配列を配列番号：１７に示す）を作製した。遺伝子の改変はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各遺伝子の塩基配列を確認した後、DNA断片を発現ベクターpCXND3にクローニングして発現ベクターを構築し、CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター（20μg）とPBSに懸濁したCHO-DG44細胞（1×107細胞/mL）の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後にGene Pulser Xcell（BioRad）を用いて1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin（Invitrogen）を含むCHO-S-SFMII培地（Invitrogen）に加えて選抜し、v1産生CHO細胞株およびv3産生CHO細胞株を樹立した。【０１８６】
VH/VL界面改変型sc(Fv)2はFlagタグを付加していないことから、培養上清からの精製は、VB22B sc(Fv)2が認識するエピトープであるMG10(ヒトMplアミノ酸配列のGln213からAla231)とGST融合蛋白質を利用して行った。MG10とGST融合蛋白質の精製は、Glutathione Sepharose 4B（Amersham Biosciences社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製した。さらに、精製したMG10 とGST融合蛋白質をメーカーのプロトコールに従って、HiTrap NHS-activated HP（Amersham Biosciences社製）に固定化し、アフィニティカラムを作製した。v1発現CHO細胞株またはv3発現CHO細胞株の培養上清をMG10-GST融合蛋白質固定化カラムに流し、v1またはv3を吸着させ、100mM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに1M Tris-HCl(pH7.4)で中和を行い、HiLoad 16/60 Superdex200pg（Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、モノマー分子を精製した。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、20mMクエン酸緩衝液（pH7.5）, 300mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。図２８に示したゲルろ過クロマトグラフィーの結果から、改変体v1, v3は培養上清中でダイマー以上の凝集体が低下し、モノマー比率は改変前のu2-wz4の59%と比較して、v1が89%、v3が77%と上昇していることが明らかになった。改変体v1, v3はVH/VL界面のアミノ酸を改変することにより、電荷的な反発により好ましくない会合を阻害し、好ましい会合を促進したことが推測される。以上のことからこの会合制御により、効率的なモノマー分子の発現に成功した。【０１８７】
5-2.VH/VL界面改変型sc(Fv)2の構造異性体分析および同定
得られたVH/VL界面改変体であるv1、v3および未改変体であるu2-wz4の構造異性体存在比を陽イオン交換クロマトグライフィーおよび等電点電気泳動により分析した。また、プロテアーゼ限定分解法による構造同定を実施した。
陽イオン交換クロマトグラフィーは以下のとおり実施した。
カラム：TSK-gel Bioassist S，4.6 mmφ×50 mm（TOSOH社製）
流速：0.8mL/min
検出波長：220nm
溶出条件：
Eluent A：20 mmol/L Phosphate buffer（pH 7.0）
Eluent B：20 mmol/L Phosphate buffer / 500 mmol/L NaCl（pH7.0）
グラジエント：
Time(min)      B%
0             0
5             0
25            30
25.1        100
35           100
35.1           0【０１８８】
等電点電気泳動は以下のとおり実施した。PhastGel Dry IEFゲル(Amersham Biosciences社製)を以下のゲル膨潤液にて30分以上膨潤した。試料を先に膨潤させたゲルに添加し、PhastSystemにより以下の泳動条件で電気泳動した。泳動後、20%TCA溶液に30分間浸した後、ミリQ水で５分間×3回以上洗浄し、試料のタンパク質濃度に応じてクマシー染色、または銀染色した。クマシー染色では、染色液として0.1%CuSO4(w/v)を含む0.02%CBBを用い、染色を行い、10%酢酸を含む30％メタノールで脱色した。銀染色では、Silver stain kit, Protein（Amersham Biosciences社製）を用い、キットに添付された標準プロトコールにより染色を行った。
<ゲル膨潤液>
Pharmalyte 8.5-10        80μL
Biolyte 7-9                 10μL
Biolyte 3-9                 10μL
20％ Glycerol    2.0mL
<電気泳動プログラム>
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2         0Vh
SAMPLE APPLICATION UP AT step3              0Vh
Step 1  2000V  2.5mA  3.5W    15℃               75Vh
Step 2  200V   2.5mA  3.5W    15℃                15Vh
Step 3  2000V  2.5mA  3.5W    15℃             410Vh【０１８９】
プロテアーゼ限定分解法による構造同定は以下の条件で実施した。subtilisin Aを用いて、以下の条件でu2-wz4精製peak1とu2-wz4精製peak2、及び、改変体v1と改変体v3を反応させた。
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.15mg/mL
Subtilisin A : 10ug/mL
37℃, 30min【０１９０】
得られた反応液をゲルろ過クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
Column : TSKgel Super2000sw (TOSOH)
Eluent : 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.2ml/min
Detection : 220nm【０１９１】
図２９および図３０に示した陽イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による構造異性体の分析結果から、u2-wz4は24%がbivalent scFv型、76%がsingle chain diabody型として両構造異性体の混合物として発現しているのに対して、改変体v1は100%がsingle chain diabody型の構造異性体として発現しており、改変体v3は100%がbivalent scFv型の構造異性体として発現していることが分かった。また図３１に示すとおり、プロテアーゼ限定分解の結果からも、改変体v3はu2-wz4精製peak1と同様に低分子のピークが見られ、改変体v1はu2-wz4精製peak2と同様に低分子のピークが見られなかったことから、改変体v1はsingle chain diabody型の構造異性体として発現しており、改変体v3はbivalent scFv型の構造異性体として発現していることが示された。【０１９２】
〔参考例６〕VH/VL界面改変型sc(Fv)2の活性評価および安定性評価
6-1. VH/VL界面改変型sc(Fv)2の生物活性評価
参考例１に示す方法に従って、VH/VL界面改変体v1およびv3のアゴニスト活性の評価を行った。アゴニスト活性は構造異性体間で大きく異なり図２０に示すように、single chain diabody構造のpeak2が非常に高いアゴニスト活性を示すのに対して、bivalent scFv構造のpeak1の活性は極めて低下する。図３２に示すとおり、改変体v1はpeak2と同等の活性を示し、改変体v3はpeak1とほぼ同等の活性を示した。以上のことから生物活性においても、改変体v1がsingle chain diabody構造を、改変体v3がbivalent scFv構造を形成していることが確認された。【０１９３】
6-2. VH/VL界面改変型sc(Fv)2の安定性評価
u2-wz4精製peak1とu2-wz4精製peak2、および、改変体v1と改変体v3の安定性評価として、示走査型熱量測定（Differential Scanning Calorimetry）を用いて変性中間温度（Tm値）の測定を以下の条件下で行った。
DSC : N-DSCII (Applied Thermodynamics社製)
溶液条件：20mM sodium citrate, 300mM NaCl, pH7.0
タンパク質濃度：0.1mg/mL
スキャニング速度：１℃/分【０１９４】
各DSC測定の結果を図３３に示した。u2-wz4精製peak2と改変体v1のTm値は未改変体とほぼ同等であり、安定性は同等であることが分かった。u2-wz4精製peak1と改変体v3とでは、若干改変体v3のほうが低い安定性を示した。knobs-into-hole 技術を用いた方法による界面制御においては、例えばIgGのCH3ドメインのヘテロ会合において、未改変CH3ドメインのTm値が80.4℃であったのに対して、改変CH3ドメインのTm値は69.4℃であり、大幅にTm値が低下し安定性が低下してしまうことが報告されている（Acta Pharmacologica Sinica, 2005, 26, 649-658）。それに対して、本発明においては安定性を低下させること無く会合を制御できることが確認された。【０１９５】
続いて、u2-wz4精製peak1とu2-wz4精製peak2およびVH/VL界面改変体である改変体v1と改変体v3の安定性評価として、以下の条件における熱加速試験による安定性評価を実施した。
<熱加速条件>
溶液条件：20mM sodium citrate, pH6.0
タンパク質濃度：0.25mg/mL
加速条件：40℃-6day, 12day
熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。【０１９６】
図３４に示すとおり、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析の結果、u2-wz4精製peak2と改変体v1のモノマー残存率はほぼ同等であり、会合化に対する安定性はほぼ同等であることが確認された。また、u2-wz4精製peak1と改変体v3のモノマー残存率もモノマー残存率はほぼ同等であり、両構造異性体において会合化に対する安定性はほぼ同等であることが分かった。【０１９７】
図３５に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析の結果、未改変体の精製peak1は異性化反応によりpeak2に異性化し、未改変体精製peak2は異性化反応によりpeak1に異性化したのに対して、VH/VL界面改変体v1とv3は熱加速後も異性化反応は起こさなかった。VH/VL界面の改変を適用することによって、2種類の構造異性体のうち一方のみの構造異性体が100%の状態で発現できることに加えて、得られた各構造異性体は異性化反応を起こさず安定に保存可能であることが分かった。【０１９８】
本参考例において、v1およびv3に適用したVH/VL界面改変を用いることによって、2種類の構造異性体のうち一方のみの構造異性体が100%存在する状態で発現できることを見出した。目的の構造の一本鎖抗体を得るためのVH/VL界面制御としては、knobs-into-hole 技術を用いてBispecific diabodyの構造を制御する方法（Protein Sci. 1997 Apr;6(4):781-8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.）が知られている。この方法では、VH/VL界面あたり合計4箇所のアミノ酸を改変することにより目的のヘテロダイマー構造の形成率が72%から92%まで上昇したことを報告している。それに対して、本発明は4箇所のアミノ酸（VH/VL界面あたりでは2箇所のアミノ酸）を改変することにより、熱安定性および構造異性体の安定性を低下させることなく、目的の構造を100%の比率で取得することに成功した。【０１９９】
〔参考例７〕ヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定
6-1.  ヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体sc(Fv)2の作製
Sato K.ら（Cancer Research 1993;53:851-856）により報告されているヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体のVHとVLを用いて、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3（配列番号：１）をコードする遺伝子を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VLで構成されるように連結したsc(Fv)2遺伝子（アミノ酸配列；配列番号：１８、塩基配列；配列番号：１９）を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、発現ベクターpMCDNに挿入した。本ベクターpMCDNの構築の流れについて、以下に述べる。pUC19ベクターにマウスサイトメガロウイルス(mCMV)エンハンサーおよびプロモーター、シミアンウイルス-40(SV40)の後期ポリアデニル部位を挿入したベクターをpMCと命名した。次に、DHFR-ΔE-rVH-PM1-f（WO92/ 19759参照）の抗体H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI, SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI-NotI-BamHI adaptor（宝酒造）をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。pCHOIのDHFR遺伝子発現部位とpCXN（Niwaら、Gene 1991；108：193-200）の制限酵素のNeomycin耐性遺伝子発現部位をpMCベクターに挿入した発現ベクターをpMCDNと命名した。構築したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2発現ベクターを制限酵素で直鎖上にしたのちに、CHO-DG44細胞に遺伝子導入して抗体発現細胞株を樹立した。【０２００】
安定発現細胞株の作製は次に示すようにして行った。細胞への遺伝子導入は、GenePulserXcell（Bio-Rad）を用いたエレクトロポレーション法により行った。各抗体発現ベクターとPBSに懸濁したCHO細胞（1×10７細胞/ｍL）の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、HT supplement（Invitrogen）を1倍濃度で含むCHO-S-SFMII培地（Invitrogen）40mLに懸濁した。同様の培地で10-50倍希釈液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μL/wellで分注した。CO2インキュベーター（5% CO2）で24時間培養後、Geneticin（Invitrogen）を0.5mg/mLになるように添加して、2週間培養した。薬剤耐性を示す形質転換細胞のコロニーを順次拡大培養し、樹立した高産生細胞株を用いて大量培養を行い、培養上清を得た。【０２０１】
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 のL鎖がProtein Lに結合することを利用して、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2発現CHO細胞の培養上清をProtein L（Actigen社製）を充填したカラムに流し、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2を吸着させ、100mM Glycine-HCl(pH2.7)で溶出させた。溶出画分は直ちに1M Tris-HCl(pH8.5)で中和を行い、HiLoad 26/60 Superdex200pg（Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、ダルベッコPBSを使用した。【０２０２】
6-2.  ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、参考例１のVB22B、参考例２のhVB22Bと同様にFv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造はVH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図１０）。ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記の溶離条件下で陽イオン交換クロマトグラフィーBioAssist S (TOSOH)を用いることによりヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離に成功した。
<溶離条件>
移動相 : 20mM Tris-HCl pH8.5, 75 mM NaCl
流速 : 0.8ml/min
グラジエント : イソクラティック（グラジエント無し）
上記条件により、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2は2つのピークに分離した。図３６に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークをpeak1、長いピークをpeak2と命名した。同方法によりPeak1とpeak2を精製することができた。精製後のpeak1とpeak2の陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を図３７に示した。【０２０３】
6-3.  ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の同定
分取したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2は構造異性体と考えられたためで、2種類の構造異性体を同定する分析法として、参考例１、２、３で実施したプロテアーゼ限定分解法を用いた。以下の条件でヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1およびpeak2と反応させた。
PBS (pH7.4)
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.05mg/mL
Subtilisin A : 0.5ug/mL
37℃, 60min
上記反応後、Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元SDS-PAGEを行った。その結果、図３８に示すとおり、peak1、peak2いずれも同様のバンドパターンを示した。上記反応条件により部分的にリンカーを切断した、peak1、peak2を以下の条件でTSK  SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。
移動相 : 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速 : 0.2ml/min【０２０４】
その結果、図３９に示すように、peak1においては低分子量のピークがほとんど確認されなかったのに対して、peak2においては低分子量（約半分の分子量）のピークが確認された。よって、本結果より、peak1がsingle chain diabody型であり、peak2がbivalent scFv型であると同定された。図３６よりヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2においてはpeak1よりもpeak2の含量が多いことから、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2においてはbivalent scFv型が主成分であり、single chain diabody型はマイナー成分であることが分かった。参考例１におけるVB22B sc(Fv)2、および参考例２におけるhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においては、single chain diabody型が主成分であったことから、sc(Fv)2の可変領域配列の違いにより、構造異性体の含有率が大きく変化することが分かった。構造異性体含有率がsc(Fv)2の可変領域配列により大きく変化することから、sc(Fv)2を医薬品として開発するにあたっては、構造異性体の分離と構造同定は重要であると考えられる。【０２０５】
〔参考例８〕ヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の活性評価
7-1. ヒトgp130発現BaF3細胞株、ヒトgp130/ヒトIL-6受容体共発現BaF3細胞株の樹立
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
全長ヒトgp130 cDNA (Hibiら、Cell 1990；63：1149-1157 (GenBank # NM_002184))をPCRにより増幅し、pCHOI (Hirataら、FEBS Letter 1994；356：244-248)のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。
10μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞(0.8x107cells) に混合し、Gene Pulser (Bio-Rad)を用いて0.33kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2ng/mLのmouse interleukin-3（Peprotech）、10% Fetal Bovine Serum（以下FBS、HyClone）を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で一昼夜培養し、100ng/mLのhuman interleukin-6(R&D)、100ng/mL のhuman interleukin-6 soluble receptor (R&D systems)および10％FBSを含むRPMI1640培地を加えて選抜し、ヒトgp130発現BaF3細胞株（以下、BaF3/gp130）を樹立した。【０２０６】
7-2. ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体のヒトIL-6中和活性評価
IL-6依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、以下に示すとおり、IL-6中和活性を評価した。精製したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体を10μg/mLになるように10% FBSを含むRPMI1640に希釈した。この溶液を用いて希釈公比3、合計6系列の希釈液を調製し、96well-plate(FALCON)の各wellに50μLずつ分注した。次に、BaF3/gp130を10% FBS (HyClone)を含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5x104cells/mLとなるように60ng/mLのhuman interleukin-6 (R&D systems)、60ng/mL の可溶性ヒトIL-6受容体（自社調製品）および10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、抗体サンプルを分注したwellに50μLずつ混合した。ヒト可溶性IL-6受容体は以下に示す方法で調製した。ヒト可溶性IL-6受容体(Yamasakiら、Science 1988；241：825-828 (GenBank # X12830))の1番目から344番目のアミノ酸をコードする遺伝子をCHO細胞に導入後に培養上清から精製して調製した。
37℃、5%CO2条件下で、72時間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所）を20μL/wellで加え、直後にSUNRISE CLASSIC(TECAN)を用いて450nmの吸光度(参照波長620nm)を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度(参照波長620nm)を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6中和活性を評価した。【０２０７】
その結果、図４０に示すとおり、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体(peak1, peak2)は、分画前の精製品(bulk)と中和活性が同等であった。参考例１のVB22B sc(Fv)2および参考例２のhVB22B sc(Fv)2においては、２つの構造異性体の間で活性に大きな違いが見られたが、本参考例のヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2においては中和活性に違いが見られなかった。このようにsc(Fv)2の２つの構造異性体の活性の差は、ターゲットとなる抗原の種類やsc(Fv)2分子のアミノ酸配列によって異なることが考えられ、sc(Fv)2分子を医薬品として開発するにあたっては、構造異性体の分離と構造同定および構造異性体の制御は重要であると考えられる。また参考例６で示されるように各構造異性体は保存中に異性化反応が起きる可能性があり、sc(Fv)2製剤の品質規格の点からも構造異性体の分離と構造同定および構造異性体の制御は重要であると考えられる。【０２０８】
〔参考例９〕VB22B sc(Fv)2のsingle chain diabodyを高収率で得る方法
VB22B sc(Fv)2より精製したsingle chain diabody (peak2)とbivalent scFv (peak1)をそれぞれ、20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の条件下、40℃においてインキュベートした。参考例１に示した陰イオン交換クロマトグラフィーの方法でpeak1とpeak2比を測定した結果、図４１に示したように、peak1のピークエリアが減少し、それに代わって、peak2のピークエリアが増大した。そこで、peak1を同条件下で6日間インキュベートしたサンプルを参考例１に示した方法でアゴニスト活性を評価したところ、図４２に示したようにincubateする前のサンプルに比べて大幅にアゴニスト活性が増大した。参考例１に示したとおりpeak1はsingle chain diabodyであるpeak2に比べて著しく活性が低いことから、bivalent scFvであるpeak1は、20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0, 40℃でインキュベートすることによって、高活性のsingle chain diabodyであるpeak2に構造変換する（構造異性体が異性化する）ことが分かった。すなわち、これによりbivalent scFvとsingle chain diabodyの混合物を適当な条件下に暴露することによって、bivalent scFvであるpeak1をsingle chain diabodyであるpeak2に変換することが可能であり、peak2の含有率を増加させることが可能であることが示された。peak1からpeak2に異性化させる本方法を用いることで、細胞より産生されたpeak1とpeak2の混合物からpeak1をpeak2に異性化させることによって、高収率でsingle chain diabodyであるpeak2を得ることが可能である。【０２０９】
〔参考例１０〕hVB22B sc(Fv)2のsingle chain diabody型を高収率で得る方法
参考例４においてhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より精製したbivalent scFv (peak1)を20mM sodium citrate, 0mM/150mM/300mM NaCl, pH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5/7.0/7.5の計30条件下、25℃において10日間インキュベートした。参考例１に示した陽イオン交換クロマトグラフィーの方法でpeak1とpeak2比を測定した結果、図４３に示したように、 インキュベート前に比べてpeak2存在比が増大した。これよりhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においても、bivalent scFvであるpeak1は、single chain diabodyであるpeak2に構造変換することを見出した。その異性化速度は、低pH及び低塩濃度ほど早いことを見出した。Peak1からpeak2に異性化させる本方法を用いることで、細胞より産生されたpeak1とpeak2の混合物からpeak1をpeak2に異性化させることによって、高収率でsingle chain diabodyであるpeak2を得ることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明の安定化剤・安定化条件、または凍結乾燥製剤化を適用することで、sc(Fv)2の異性化反応を抑制できる。すなわち、sc(Fv)2組成物中の2種の構造異性体間の相互異性化反応を抑制し、どちらか一方の構造異性体を安定に存在させること、および、sc(Fv)2組成物から取得された特定の構造異性体の異性化反応を抑制し、該異性体を安定に存在させることが可能となった。    【０２１１】
sc(Fv)2を医薬品として開発するためには、目的物質であるどちらか一方の構造異性体を安定に存在させ、製剤保存中に他方の構造異性体への異性化を最小限に抑制することが必要である。あるいは製剤中の構造異性体存在比を規格された構造異性体の含有比率内にコントロールする必要がある。本発明の安定化剤・安定化条件、または凍結乾燥製剤化をsc(Fv)2製剤に適用することで、規格された構造異性体の含有率を確保した安定な製剤を提供することが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３８】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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