(57)【要約】本発明は、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＲＳＫ１に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含む化合物の評価方法及び当該化合物の評価方法によって得られた化合物を提供する。また、当該化合物をシスプラチンの増強剤として利用することが可能である。本発明により、ｐ５３の異常又はＭＡＰＫパスウェイの亢進を原因とする癌細胞で特異的に働く遺伝子を見出し、当該遺伝子を用いた化合物の評価を可能とすることが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＲＳＫ１に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項２】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項３】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＲＳＫ１又はＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
該接触前と比較して、ＲＳＫ１又はＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項４】
癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、
被検化合物を、ＲＳＫ１に接触させる工程と、
該接触によるＲＳＫ１の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項５】
前記癌がｐ５３の機能異常に起因することを特徴とする請求項１〜４に記載の化合物の評価方法。
【請求項６】
前記癌が、癌細胞においてＭＡＰキナーゼパスウェイが亢進している癌種であることを特徴とする請求項１〜５に記載の化合物の評価方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とするＲＳＫ１リガンド。
【請求項８】
請求項７に記載のＲＳＫ１リガンドを含むことを特徴とするシスプラチン増強剤。
【請求項９】
請求項７に記載のＲＳＫ１リガンド及びシスプラチンを併用することを特徴とする抗癌剤の投与方法。
【請求項１０】
被検組織又は被検細胞における、ＲＳＫ１遺伝子の発現量を測定する工程と、
該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、
比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む癌の分子診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＳＫ１を用いた化合物の評価方法及び当該方法によって得られた化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞において遺伝子に異常が見られることは広く知られており、これまでに多くの癌遺伝子や癌抑制遺伝子が見出されている。また、正常細胞が癌化するには複数の遺伝子の異常を要する多段階発癌機構が存在することが明らかにされている。具体的には、正常細胞の癌化には、ＤＮＡ修復遺伝子、癌抑制遺伝子及び癌遺伝子を含む複数の遺伝子異常の蓄積が必要とされている。
なかでも、癌抑制遺伝子として知られるｐ５３は、当初、腫瘍ウイルスであるＳＶ４０のＴ抗原と複合体を形成する分子として発見された（非特許文献１）。その後、ｐ５３遺伝子が多くの癌で欠失が見られる１７番染色体の短腕（１７ｐ１３）に存在し、対立遺伝子の双方が欠失と変異により不活性化されている癌抑制遺伝子であることが明らかとなった（非特許文献２）。また、その遺伝子産物は３９３アミノ酸からなる転写制御因子で、４量体を形成して機能することが明らかとなっている。さらに、細胞周期に関与するｐ２１、１４−３−３、アポトーシスに関与するｂａｘ、ＰＩＧ３、ＧＡＤＤ４５等、非常に多くの遺伝子がｐ５３の標的遺伝子として同定されており、ｐ５３に異常が生じることにより標的遺伝子の転写制御に異常を来たすと考えられる。
実際、ｐ５３遺伝子の変異は、肺癌では７０％、胃癌では４５％、乳癌では３０％、大腸癌では６５％、膀胱癌では６１％、膵臓癌では７０％にのぼることが明らかとなっており（非特許文献３）、他の癌抑制遺伝子と比較しても顕著に高い。
このような状況の下、ｐ５３遺伝子の変異や機能異常と疾患との関連に関する研究が盛んになされている。例えば、Ｓｏｕｓｓｉらは１５０００例以上にのぼるｐ５３の変異をデータベース化しており（ｈｔｔｐ：／／ｐ５３．ｃｕｒｉｅ．ｆｒ／：非特許文献４）、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン領域内に位置するコドン１７５、２４５、２４８、２７３等には変異が頻発することを示している。また、ある種の肝細胞癌では、ＤＮＡ結合ドメイン内のコドン２４９にはＡｒｇからＳｅｒへの変異が認められることが明らかにされている（非特許文献５）。また、紫外線によって生じる皮膚癌においてもｐ５３遺伝子中のＣＣがチミンダイマー化していることが報告されている（非特許文献６）。このように、ｐ５３は多くの癌の発症に大きな影響を及ぼしているため、ｐ５３異常細胞においてのみ有効な創薬標的遺伝子の同定が望まれている。
一方、ＲＳＫ１（配列番号１：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２９５３）はＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼパスウェイの下流に位置し、ＥＲＫ１／２によって活性化される分子である（非特許文献７）。また、ＲＳＫ１は、多くの原発腫瘍や株化細胞において活性化しており、ＤＮＡに障害を誘発する薬剤によっても活性化を受けることが知られている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第３１巻、４６３頁、１９７９年
【非特許文献２】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、５２５頁、１９８８年
【非特許文献３】実験医学、第１９巻、１３５頁、２００１年
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，第２２巻、３５５１頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、４２７頁、１９９１年
【非特許文献６】ＰＮＡＳ、第８８巻、１０１２４頁、１９９１年
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７３巻、１４９６頁、１９９８年
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、ＲＳＫ１をｐ５３変異細胞特異的に有効な抗癌剤標的遺伝子とすることの可能性については何ら知見がないのが現状であった。また、ｐ５３の異常を原因とする癌細胞で特異的に有効な抗癌剤標的遺伝子についても知見が少なく、創薬標的遺伝子としてより多くの情報が望まれているのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ｐ５３の異常を原因とする癌細胞で特異的に有効な抗癌剤標的遺伝子を見出し、当該遺伝子を用いた化合物の評価を可能とすることを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ｐ５３の発現に異常を来たした細胞においてＲＳＫ１遺伝子の発現を抑制すると細胞の生存率が低下することを見出だし、本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＲＳＫ１に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法を利用することにより、ＲＳＫ１の阻害剤等、ＲＳＫ１に接触又は結合することによりＲＳＫ１の機能に影響を及ぼす化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法を利用することにより、ＲＳＫ１に接触又は結合することによりＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達に影響を及ぼす化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＲＳＫ１又はＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、該接触前と比較して、ＲＳＫ１又はＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法を利用することにより、ＲＳＫ１に接触又は結合することによりＲＳＫ１又はＲＳＫ１を介した細胞内情報伝達の発現に影響を及ぼす化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、癌の治療に有効な化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＲＳＫ１に接触させる工程と、当該接触によるＲＳＫ１の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法を利用することにより、精製された又は組換えＲＳＫ１等を用いた化合物の評価系を構築することが可能となり、ＲＳＫ１タンパク質に接触又は結合してＲＳＫ１の活性に影響を及ぼす化合物の評価又はスクリーニングが可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、前記癌がｐ５３の機能異常に起因することを特徴とする。本発明の化合物の評価方法を利用することにより、ｐ５３の機能異常に起因する癌に効果のある化合物の評価又はスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、前記癌が、癌細胞においてＭＡＰキナーゼパスウェイが亢進している癌種であることを特徴とする。本発明の化合物の評価方法を利用することにより、ＭＡＰキナーゼパスウェイの亢進に起因する癌に効果のある化合物の評価又はスクリーニングが可能となる。
また、本発明には、本発明の化合物の評価方法により単離されたＲＳＫ１リガンドも含まれる。
さらに、本発明のシスプラチン増強剤は、前記ＲＳＫ１リガンドを含むことを特徴とする。かかる増強剤により、シスプラチンの薬効を増強することが可能となる他、シスプラチンの投与量を抑えることが可能となるため、シスプラチン投与による副作用を軽減することが可能となる。
また、本発明の抗癌剤の投与方法は、前記ＲＳＫ１リガンド及びシスプラチンを併用することを特徴とする。かかる投与方法により、シスプラチンの薬効を増強することが可能となる他、シスプラチンの投与量を抑えることが可能となるため、シスプラチン投与による副作用を軽減することが可能となる。
さらに、本発明の癌の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、ＲＳＫ１遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む。かかる癌の分子診断方法により、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが亢進した癌を特異的に診断することが可能となる。
本発明者らにより、ｐ５３の異常を原因とする癌で特異的に働く遺伝子としてＲＳＫ１が見出された。同時に、多くの癌で活性が亢進しているＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの活性とＲＳＫ１の活性化との間に相関があることが明らかとなった。すなわち、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが亢進することにより癌化している細胞で特異的に働く遺伝子としてＲＳＫ１が見出された。従って、当該遺伝子を用いた化合物の評価をすることにより抗癌剤の評価、スクリーニングをすることが可能となる。また、当該化合物の評価方法によって得られた化合物とシスプラチンの併用により、より効果的な抗癌作用を有する薬剤の投与及び治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｐ５３ポジティブのＴＯＶ２１Ｇ細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を検討した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図２は、ｐ５３ネガティブのＴＯＶ２１Ｇ細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を検討した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図３は、ｐ５３ポジティブのＡ５４９細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図４は、ｐ５３ネガティブのＡ５４９細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図５は、ｐ５３ポジティブのＭＣＦ７細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図６は、ｐ５３ネガティブのＭＣＦ７細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図７は、ｐ５３ポジティブのＵ２ＯＳ細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図８は、ｐ５３ドミナントネガティブのＵ２ＯＳ細胞についてｐ５３の発現量とＲＳＫ１の発現量による生存率の変化を測定した図である。図中、□はコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を示し、■はＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
図９は、膵臓由来の２種の細胞（ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが活性化しているＳＵ８６８６細胞と活性化していないＰＡＮＣ１細胞）におけるＲＳＫ１の発現量と細胞の生存率の変化を測定した図である。下図は各細胞におけるリン酸化されたＲＳＫ１を検出した図である。
図１０は、膀胱由来の２種の細胞（ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが活性化しているＴ２４細胞と活性化していないＪ８２細胞）におけるＲＳＫ１の発現量と細胞の生存率の変化を測定した図である。下図は各細胞におけるリン酸化されたＲＳＫ１を検出した図である。
図１１は、胃由来の２種の細胞（ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが活性化しているＫＡＴＯＩＩＩ細胞と活性化していないＮＣＩＮ８７細胞）におけるＲＳＫ１の発現量と細胞の生存率の変化を測定した図である。下図は各細胞におけるリン酸化されたＲＳＫ１を検出した図である。
図１２は、ｋ−Ｒａｓの強制発現の有無とＲＳＫ１の発現量の変化により生じる細胞増殖の変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明にかかる用語について説明する。
本発明における「ＲＳＫ１」とは、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギ由来のＲＳＫ１が挙げられる。中でも、評価される化合物の投与対象がヒトであることから、ヒトＲＳＫ１遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係るＲＳＫ１遺伝子には、ＲＳＫ１と同等の生理機能を有し、キナーゼ活性を有するものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るＲＳＫ１遺伝子には、ＲＳＫ１遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明に係るＲＳＫ１タンパク質には、ＲＳＫ１と同等の生理機能を有し、キナーゼ活性を有するものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入があるものも含まれる。ここで、当該タンパク質の配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
ＲＳＫ１は、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの下流に位置するキナーゼとして知られているが、本発明者らは、ＲＳＫ１がｐ５３の発現量又はＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進に直接的に関与していることを見出した。ｐ５３の発現量は細胞の癌化と密接な関連があり、また、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進も細胞の異常増殖、すなわち癌化と密接な関連がある。従って、ＲＳＫ１の発現量や活性を測定することにより、ｐ５３又はＲａｓ／ＭＡＰＫパスウェイの異常に基づく癌の検出をすることが可能となる。また、ＲＳＫ１がｐ５３の機能異常又はＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進と直接的な関係を有することから、ＲＳＫ１は細胞の癌化と密接な関係を示す。従って、ＲＳＫ１を創薬の標的としてＲＳＫ１に作用する化合物等を探索することにより、抗癌剤を得ることが可能となる。
ここで、本発明に係る「ｐ５３の機能異常」とは、ｐ５３遺伝子における塩基の欠失（例えばナンセンス変異）、置換（例えば、ミスセンス変異、ポイントミューテーション）、挿入、フレームシフト等を原因とするものが考えられるが、本発明の対象としては、機能異常の原因は特に限定されず、これらのいずれが原因となった機能異常も含まれる。
また、ｐ５３の機能異常の具体例としては、ｐ５３タンパク質の転写活性が低下又は活性化する場合や、転写が全く起こらない場合が挙げられるが、活性には異常を認めないがコードされる遺伝子には変異を生じている場合も含まれる。具体的には、例えば、ｐ５３との関与が示唆されているＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５０巻、１２３３頁、１９９０年）、肝細胞癌（Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、３７７頁、１９９１年）、骨原性肉腫（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８４巻、７７１６頁、１９８７年）、横紋筋肉種（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８７巻、５８６３頁、１９９０年）、結腸癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、２１７頁、１９８９年）、肺癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６年、４９１頁、１９８９年）、グリア芽細胞腫（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第４７巻（ｓｕｐｐｌ．）、Ａ４、１９９０年）、食道癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８７巻、９９５８頁、１９９０年）、膀胱癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、７０６頁、１９９１年）、扁平上皮癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８８巻、１０１２４頁、１９９１年）、子宮頚癌（Ｌａｎｃｅｔ、第３３９巻、１０７０頁、１９９２年）、肺癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８９巻、７２６２頁、１９９２年）、白血病・リンパ腫（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、第９０巻、６５３頁、１９９２年）が挙げられる。
また、本発明に係る「ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進」とは、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイにおけるシグナル伝達が活性化されている状態を意味する。当該パスウェイは正常細胞においても細胞増殖・分化のシグナルを伝達しているが、癌組織では細胞が異常増殖している状態にある。従って、本発明に係るＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進としては、正常細胞と比較した場合に、当該パスウェイがより活性化されている状態であることを意味する。
本発明における「被検組織」とは、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、ｐ５３の関与を検討する必要のある癌組織や、癌診断の必要があると認められる組織であればその種類は特に限定されない。かかる組織の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。
また、本発明における「被検細胞」も同様に、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、ｐ５３の関与を検討する必要のある癌組織由来の細胞や、癌診断の必要があると認められる組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。かかる細胞の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。
（１）化合物の評価
ＲＳＫ１遺伝子又はタンパク質を用いて、ＲＳＫ１に作用する化合物の評価をすることができる。ＲＳＫ１に対する作用を検出する方法として、被検化合物のＲＳＫ１に対する特異的結合（例えば、酵素活性の阻害を生じる結合）を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じた細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物のＲＳＫ１に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＲＳＫ１に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の化合物の評価方法は、ＲＳＫ１遺伝子を導入し、ＲＳＫ１を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
また、ＲＳＫ１遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、ＲＳＫ１遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＲＳＫ１遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したＲＳＫ１を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、ＲＳＫ１が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＲＳＫ１が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをＲＳＫ１が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
ＲＳＫ１と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）のほか、ＲＳＫ１が基質ペプチドをリン酸化する反応を被検化合物が阻害することを指標とした検出（例えば、リン酸化量を放射活性や蛍光強度を用いた検出）、また、被検化合物のＲＳＫ１への結合によって生じたシグナル伝達の阻害（例えば、ＢＡＤ、ＩｋＢ、Ｍｙｔ１及びＴＳ１／２等の基質タンパク質のリン酸化、アポトーシスの誘導）を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達パスウェイ上の分子（ＲＳＫ１も含む）の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ＲＳＫ１を介した情報伝達パスウェイ上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＲＳＫ１を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたＲＳＫ１タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をＲＳＫ１タンパク質に接触させ、次に、接触によって生じたＲＳＫ１タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＲＳＫ１タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたＲＳＫ１の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により所望の方法を選択すればよく、具体的には、例えば、ＲＳＫ１に対する適当な基質を準備し、溶媒中でＲＳＫ１、基質及び被検化合物の存在下でキナーゼアッセイを実施する方法が挙げられる。この場合、酵素反応の確認は放射性標識されたリン（例えば、３２Ｐ）の取り込み等で確認することができる。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物の評価をした結果、被検化合物の存在下におけるＲＳＫ１の活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＲＳＫ１とリガンドとの結合を阻害する活性を有するアンタゴニストと判定される。アンタゴニストは、ＲＳＫ１に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、アンタゴニストは、ｐ５３の機能異常又はＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進に基づき、ＲＳＫ１を介したシグナル伝達系の異常などに起因する癌の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、ＲＳＫ１への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の下流へのシグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ＲＳＫ１への被検化合物結合後の下流へのシグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ＲＳＫ１への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、ｐ５３の機能異常又はＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進に基づく癌の治療及び診断に有効である。
また、上述した本発明の化合物の評価方法により、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いるリガンドの評価を行うことができる。ＰＥＴは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。ＰＥＴの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてＰＥＴリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。
（２）ＲＳＫ１リガンド及びシスプラチン増強剤
（１）において説明した本発明の化合物の評価方法により、ＲＳＫ１リガンドを単離することができる。かかるリガンドは単独で抗癌作用を有する薬剤として使用できる他、シスプラチンの増強剤としての使用が可能である。かかるＲＳＫ１リガンドとしては、例えば、ＳＬ０１０１−１（ＵＳ２００５／０２３３９８５号公報）が挙げられる。
ここで、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）とは下記の性質を有する白金錯体であり、抗癌剤として利用されている。日本では肺癌、頭頸部癌、食道癌等に適応があり、副作用として悪心、嘔吐、腎毒性、耳毒性、骨髄抑制等が知られている。
化学名：ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ
一般名：シスプラチン
略号：ＣＤＤＰ
化学式：Ｈ６Ｃｌ２Ｎ２Ｐｔ
分子量：３００．０５
ＣＡＳ登録番号：１５６６３−２７−１
下記実施例にて示すとおり、ＲＳＫ１の発現を抑制しつつシスプラチンを投与することにより、癌細胞の生存率が著しく低下することを本発明者らは明らかにしている。これは、ＲＳＫ１の阻害剤とシスプラチンの併用が顕著な抗癌作用を有することを示すものである。また、シスプラチンの投与量を抑えてＲＳＫ１の阻害剤と併用することにより、シスプラチンによる副作用を軽減することができる。すなわち、ＲＳＫ１の阻害剤をシスプラチンの増強剤として使用することが可能となる。
ここで、前記「併用」とは、２種以上の薬剤を同時に又は経時的に投与することをいう。投与の順序や投与量には特に制限はなく、薬剤に応じて適宜好適な条件を設定すればよい。
また、ＲＳＫ１リガンド又はシスプラチン増強剤となり得る被検化合物としては特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、ＲＳＫ１の抗体、アンチセンス、ＲＮＡｉ又はリボザイムが挙げられる。
本発明のＲＳＫ１リガンド又はシスプラチン増強剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
また、シスプラチンの投与条件としては、公知の投与方法及び投与量に従って行えばよいが、ＲＳＫ１阻害剤と併用する場合には、シスプラチンの投与量を標準的な投与量より減らしてもよい。これにより、シスプラチンを原因とする副作用を抑えることができる。
（３）癌の分子診断方法
本発明において、先ず、被検組織又は被検細胞における、ＲＳＫ１遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、被検組織又は被検細胞から抽出したゲノミックＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。ここで、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は、後述する正常組織における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。
次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する。
ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されず、健常人由来であっても癌患者由来であってもよい。また、癌組織の近辺に存在する正常組織又は正常細胞であってもよい。
本工程においては、被検組織又は細胞に発現するＲＳＫ１遺伝子と正常組織又は細胞に発現するＲＳＫ１遺伝子（対応遺伝子）の発現量を比較するが、発現量の絶対量を比較してもよく、また、比較による相対値を算出してもよい。
次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。
前記の有意差の判断手法としては特に制限
はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればよい。
被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞において発現が高いと認められた場合には当該被検組織又は被検細胞におけるＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが亢進されており、癌化している可能性があると判断できる。従って、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイの亢進との関連が知られている癌（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｃａｎｃｅｒ、第４巻、９３７頁、２００４参照）の診断が可能となる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ｐ５３ポジティブ（ｐ５３が機能している）又はネガティブ（ｐ５３が機能していない）の細胞においてＲＳＫ１が細胞の生存にどのような影響を及ぼすかを検討するため、以下の実験を行った。
先ず、ｐ５３ポジティブの細胞としてＴＯＶ２１Ｇ、Ａ５４９、ＭＣＦ７及びＵ２ＯＳ細胞を準備した。また、ｐ５３ネガティブの細胞として、前記の４種の細胞にｐ５３のｓｈＲＮＡを導入したＴＯＶ２１Ｇ−ｓｈｐ５３、Ａ５４９−ｓｈｐ５３、ＭＣＦ７−ｓｈｐ５３及びＵ２ＯＳ−ｓｈｐ５３を準備した。また、Ｕ２ＯＳ細胞にＶ１５７Ｆ  ｐ５３を導入したドミナントネガティブＵ２ＯＳ−ｍｔｐ５３も準備した。
次に、前記細胞それぞれにリポフェクション法によってＲＳＫ１のｓｉＲＮＡを導入し、シスプラチン（ＣＤＤＰ）存在下又は非存在下、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｕ２ＯＳ細胞については１０％ＦＣＳを含むＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地）にて９６時間培養した後、ＭＴＴアッセイにより生存率を測定した。ＲＳＫ１のｓｉＲＮＡとして下記３種の配列の混合物を使用した。
５’−ＣＵＧＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＵＧＡＵＡＡＴＴ−３’（配列番号２）
５’−ＣＣＡＡＧＧＡＣＣＵＧＧＵＧＵＣＣＡＡＴＴ−３’（配列番号３）
５’−ＣＡＧＵＧＡＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴ−３’（配列番号４）。
なお、それぞれの細胞においてＲＳＫ１の発現が９０％以上抑制されていることを確認した。
図１〜図８に示すとおり、ＲＳＫ１の発現抑制のみでは細胞の生存率に大きな影響は見られなかった。しかし、ｐ５３ネガティブな細胞ではシスプラチンの作用を増強し、生存率が著しく低下していた。これらの結果は、ｐ５３ポジティブ細胞よりｐ５３ネガティブ細胞により強い影響を与えていることを示している。すなわち、ＲＳＫ１は、ｐ５３の発現異常を示す癌細胞を対象とする抗癌剤の創薬標的になり得ると判断できた。
［実施例２］
ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイは多くの癌細胞において細胞増殖の促進とアポトーシスの低下を活性化しており、また、ＲＳＫ１の活性化と密接な関連があることが知られている。これより、ＲＳＫ１が不活化している細胞と比較してＲＳＫ１が活性化している細胞においてＲＳＫ１を阻害した場合の影響が大きいであろうとの仮説をたて、検証した。
先ず、ＲＳＫ１のリン酸化のレベルを確認することによりＲＳＫ１活性化細胞と不活化細胞を同定した。すなわち、ＰＢＳで洗浄した細胞にＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社）を加えて溶解した。全タンパク質２０μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開しＰＶＤＦメンブレンに転写した。ＲＳＫ１のリン酸化は、リン酸化ＲＳＫ１（Ｔｈｒ３５９／Ｓｅｒ３６３）抗体を用いてウエスタンブロッティングにより確認し、ＲＳＫ１活性化細胞としてＳＵ８６８６、Ｔ２４及びＫＡＴＯＩＩＩ細胞を得た。同様に、ＲＳＫ１不活化細胞としてＰＡＮＫ１、Ｊ８２およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞を得た。
次に、これらの細胞にＲＳＫ１のｓｉＲＮＡを導入し、約８０％のＲＳＫ１の発現が抑制されていることを確認した。次に、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を測定した。
図９〜１１に示すように、ＲＳＫ１の発現を抑制することによりＲＳＫ１が不活化した細胞より活性化した細胞で生存率に及ぼす影響が大きいことが確認できた。すなわち、ＲＳＫ１の発現がＭＡＰＫ／ＲＳＫ１が活性化した腫瘍により大きな影響を与えることが示唆された。
［実施例３］
Ｒａｓ／ＭＡＰＫパスウェイとＲＳＫ１との関連を検討した。
先ず、ｋ−Ｒａｓの形質転換細胞であるＮＩＨ３Ｔ３／ｋ−Ｒａｓ（１０００個）を９６穴プレートにて、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養した。細胞は、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔＴＭ  Ｌｉｐｉｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、培養と同時に４ｎＭのＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，ＲＰＳ６ＫＡ１，ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ）又はコントロールであるＬｕｃ  ｓｉＲＮＡで処理した。
細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、上記処理の７２時間後に測定した。また、ＲＳＫ１の発現量の測定のため、上記処理の２４時間後にＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲのプローブとしてＲｓｋ１  ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、コントロールプローブとして１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いた。
図１２に示すように、ＲＳＫ１の発現を抑制したＮＩＨ３Ｔ３／ｋ−Ｒａｓ細胞は細胞増殖が５３％抑制されたが、ＲＳＫ１の発現を抑制したＮＩＨ３Ｔ３細胞は１４％の増殖抑制が見られたに過ぎなかった。また、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ処理したコントロールと比較してもＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡ処理されたＮＩＨ３Ｔ３／ｋ−Ｒａｓは有意に増殖能が低下した。すなわち、Ｒａｓ／ＭＡＰＫパスウェイが亢進した細胞について、ＲＳＫ１の発現が低下することにより、当該細胞の増殖能が抑制されることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
ｐ５３の異常を原因とする癌に特異的に働くターゲット遺伝子としてＲＳＫ１が見出され、当該遺伝子を用いた化合物の評価が可能となる。また、ＲＡＳ／ＭＡＰＫパスウェイが亢進した癌細胞において、有効に働くターゲット遺伝子としてＲＳＫ１が見出され、当該遺伝子を用いた化合物の評価が可能となる。さらに、当該化合物の評価方法によって得られた化合物とシスプラチンの併用により、より効果的な抗癌作用を有する薬剤の投与及び治療が可能となる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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