(57)【要約】  癌等の発症に関与すると考えられるヒトＰＥＲＰ（ｐ５３  ａｐｏｔｏｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＰＭＰ−２２）遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体が求められている。本発明により、可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体を提供する。該抗体はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現する各種疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と記す）にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）の全ての相補性決定領域（Ｃｏｍｐｒｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと記す）にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項３】
抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項４】
抗体のＶＬのＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項５】
抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項６】
抗体のＶＨのＣＤＲ２が、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変および１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変のうち、少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項７】
配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変が、９番目のＡｓｎを極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、請求項６に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項８】
極性側鎖を有するアミノ酸残基がＴｙｒまたはＳｅｒである、請求項７に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項９】
配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変が、９番目のＡｓｎをＧｌｙに置換する改変である、請求項６に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項１０】
配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変が、１１番目のＳｅｒを非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項１１】
非極性側鎖を有するアミノ酸残基がＡｌａである、請求項１０に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項１２】
抗体のＶＨのＣＤＲ２が、配列番号４および６〜１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項１３】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項１４】
ヒト型キメラ抗体のＶＨが、配列番号１４〜１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
【請求項１５】
ヒト型キメラ抗体のＶＬが配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
【請求項１６】
ヒト型キメラ抗体のＶＨが、配列番号１４〜１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
【請求項１７】
ヒト化抗体のＶＨが、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列または配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項１８】
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号３６で示されるアミノ酸配列または配列番号３６で示されるアミノ酸配列の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項１９】
ヒト化抗体のＶＨが、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列または配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号３６で示されるアミノ酸配列または配列番号３６で示されるアミノ酸配列の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、
請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２０】
ヒト化抗体のＶＨが、配列番号５１〜５６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２１】
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号５８〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２２】
ヒト化抗体のＶＨが、配列番号５１〜５６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号５８〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２３】
ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項２４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項２５】
該立体構造が、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｓｐ、６２番目のＧｌｕおよび６３番目のＧｌｕを少なくとも含む立体構造である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項２９】
請求項２８に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片の製造方法。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有効成分として含有するＰＥＲＰ遺伝子が関与する疾患の治療剤。
【請求項３１】
ＰＥＲＰ遺伝子が関与する疾患が癌である、請求項３０に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ（ｐ５３  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＰＭＰ−２２）遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬に関する。更に、本発明は該遺伝子組換え抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体および該形質転換体を培養することを特徴とする抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＥＲＰ（あるいはＴＨＷまたはＰＩＧＰＣ１とも称される）の遺伝子配列は公知であり（特許文献１〜１３）、該ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドは１９３アミノ酸からなる蛋白質で、一次配列から４回膜貫通蛋白であると推定されている。ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドはｐ５３依存性アポトーシスに関わる蛋白質であることが知られている（非特許文献１）。さらにＰＥＲＰ遺伝子ノックアウトマウスより調製した胸腺細胞と神経細胞では、ＤＮＡダメージの際のアポトーシス誘導が部分的に阻害されることが示された（非特許文献２）。また、ＰＥＲＰは高転移性癌細胞においては発現が低下する遺伝子としても報告されている（非特許文献３）。【０００３】
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体（以下、抗ＰＥＲＰ抗体と表記する）としては、これまでに、ＰＥＲＰ遺伝子産物のＣ末端細胞内の部分ペプチドまたは第一細胞外ループの部分ペプチドを免疫原として用いて作製されたポリクローナル抗体が知られている（非特許文献４、５）。これらのポリクローナル抗体はウェスタンブロッティングあるいは免疫組織染色に使用可能であることが示されている。これまでにＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体は知られていない。【０００４】
一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体  （Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）  が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献６〜９）、マウス抗体の体内からの消失を速め（非特許文献７、１０、１１）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献１２、１３）。【０００５】
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体の作製が試みられている。
ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特許文献１４、１５）。すなわち、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。【０００６】
また、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）（Ｈ鎖Ｃ領域を、ＣＨと表記する）としてｇ１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞傷害（以下、ＡＤＣＣと表記する）活性などのエフェクター機能の高いヒト型キメラ抗体やヒト化抗体を作製することができ（非特許文献１４）、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（非特許文献１５）。特にＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現細胞数を減少させる治療においては、抗体のＦｃ領域（抗体Ｈ鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）やＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性の高さがその治療効果に重要であるために、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体はマウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較して望ましい（非特許文献１６、１７）。【０００７】
さらに、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（非特許文献１８）、２量体化Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（非特許文献１９）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（非特許文献２０）、ＣＤＲを含むペプチド（非特許文献２１）などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（非特許文献２２）。【０００８】
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体よりもヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体または該抗体断片の方が望ましいことを示している。
抗体を含め、生体内に存在する多くの蛋白質は糖鎖により修飾されている。糖鎖は、アスパラギン残基に特異的に結合するＮ結合型糖鎖と、セリン残基やスレオニン残基に結合するＯ結合型糖鎖に分類される。特にＮ結合型糖鎖を有する糖蛋白質には該糖鎖が結合するための、３アミノ酸残基からなる、コンセンサス配列（アスパラギン−任意のアミノ酸−セリンまたはスレオニン）が存在する（非特許文献２３）。但し、全てのコンセンサス配列にＮ結合型糖鎖が結合するわけではない。たとえば、成熟型ヒトＴＮＦ−α受容体ＩＩでは、２ヵ所のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列うち、１ヵ所は１００％Ｎ結合型糖鎖が結合しているが、もう１ヵ所には５０％程度の確率でしかＮ結合型糖鎖は結合しない（非特許文献２４）。同様の現象がウシＤＮａｓｅＩでも確認されており、さらに遺伝子組換え体生産のための宿主細胞が変わると糖鎖結合のパターンが大きく変化し、同一のアミノ酸配列でも蛋白質発現の環境によりその糖鎖付加の状態は一定ではない（非特許文献２５）。【０００９】
通常ＩｇＧ型のヒト抗体には、その定常領域に１ヵ所のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有している。しかし、可変領域中にもＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有している抗体は、糖鎖の結合が変化し、医薬品として均一な抗体の安定供給が困難となる。さらに、糖鎖は蛋白質同士の結合に必須である場合もあり、例えばＬＦＡ−３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ３）ではＣＤ２との結合にＮ結合型糖鎖が必要であると報告されており、抗体の結合部位である可変領域に糖鎖が結合することにより、抗体の抗原への結合性が変化してしまう可能性が考えられる（非特許文献２６）。
【特許文献１】ＷＯ９８／５５５０８
【特許文献２】ＷＯ９９／５４４６１
【特許文献３】ＷＯ００／５５３５０
【特許文献４】ＷＯ０１／２２９２０
【特許文献５】ＷＯ０１／６６７１９
【特許文献６】ＷＯ００／６１６１２
【００１０】
【特許文献７】ＷＯ０２／００１７４
【特許文献８】ＷＯ０２／４７５３４
【特許文献９】ＵＳ２００３−００６４９４７
【特許文献１０】ＵＳ２００３−００６５１５７
【特許文献１１】ＷＯ００／５５６２９
【特許文献１２】ＷＯ０２／６０３１７
【特許文献１３】ＵＳ２００２−０１１９４６３
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４，７０４（２０００）
【非特許文献２】Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１３，１９８５（２００３）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，２８０１（２０００）
【００１２】
【非特許文献４】Ｐｒｏ  Ｓｃｉ社ホームページ、［ｏｎ  ｌｉｎｅ］、［平成１６年３月３１日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｓｃｉ−ｉｎｃ．ｃｏｍ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＴＤＳ／２４５１％２０ＰＥＲＰ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社ホームページ、［ｏｎ  ｌｉｎｅ］、［平成１６年３月３１日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｕｓ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｉｎｔ＿ｄａｔａ＿ｓｈｅｅｔ．ｐｈｐ／４４００＞
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）
【非特許文献７】Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）
【００１３】
【非特許文献８】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２４２（１９８５）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８）
【非特許文献１２】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）
【非特許文献１３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６）
【００１４】
【非特許文献１４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）
【非特許文献１５】Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０）
【非特許文献１７】Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３（１９８８）
【非特許文献１８】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８）
【非特許文献１９】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７）
【非特許文献２０】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５）
【００１５】
【非特許文献２１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６）
【非特許文献２２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２）
【非特許文献２３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９５，６３９（１９８１）
【非特許文献２４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３１３１（１９９３）
【非特許文献２５】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５５，２４５  （２００１）
【非特許文献２６】Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１  （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
医薬品として均一な抗体を安定に供給するためには、アミノ酸置換等でＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を改変する必要がある。しかしながら、相補性決定領域は抗体の抗原への結合性に直接寄与している領域であるため、抗原への結合性を保持したままアミノ酸改変を行うことは容易ではない。本発明の課題は、可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または抗体断片、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、以下の（１）〜（３１）に関する。
（１）  抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と記す）Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（２）  抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）の全ての相補性決定領域（Ｃｏｍｐｒｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと記す）にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（３）  抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列を含む、（１）または（２）記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（４）  抗体のＶＬのＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む、（１）または（２）記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（５）  抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む、（１）または２記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（６）  抗体のＶＨのＣＤＲ２が、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変および１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変のうち、少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（７）  配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変が、９番目のＡｓｎを極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、（６）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（８）  極性側鎖を有するアミノ酸残基がＴｙｒまたはＳｅｒである、（７）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（９）  配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変が、９番目のＡｓｎをＧｌｙに置換する改変である、（６）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１０）  配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変が、１１番目のＳｅｒを非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、（４）〜（９）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１１）  非極性側鎖を有するアミノ酸残基がＡｌａである、（１０）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１２）  抗体のＶＨのＣＤＲ２が、配列番号４および６〜１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１３）  遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１４）  ヒト型キメラ抗体のＶＨが、（１４）〜（１９）のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１５）  ヒト型キメラ抗体のＶＬが配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１６）  ヒト型キメラ抗体のＶＨが、配列番号１４〜１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１７）  ヒト化抗体のＶＨが、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列または配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（１８）  ヒト化抗体のＶＬが、配列番号３６で示されるアミノ酸配列または配列番号３６で示されるアミノ酸配列の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（１９）  ヒト化抗体のＶＨが、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列または配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、
ヒト化抗体のＶＬが、配列番号３６で示されるアミノ酸配列または配列番号３６で示されるアミノ酸配列の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、
（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（２０）  ヒト化抗体のＶＨが、配列番号５１〜５６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（２１）  ヒト化抗体のＶＬが、配列番号５８〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（２２）  ヒト化抗体のＶＨが、配列番号５１〜５６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号５８〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、（１３）に記載のヒト化抗体または抗体断片。
（２３）  ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（２４）  抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（２３）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２５）  該立体構造が、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｓｐ、６２番目のＧｌｕおよび６３番目のＧｌｕを少なくとも含む立体構造である、（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（２６）  （１）〜（２５）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２７）  （２６）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（２８）  （２７）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２９）  （２８）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（２５）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片の製造方法。
（３０）  （１）〜（２５）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有効成分として含有するＰＥＲＰ遺伝子が関与する疾患の治療剤。
（３１）  ＰＥＲＰ遺伝子が関与する疾患が癌である、（３０）に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または抗体断片、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１に、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＣＤＲｖ１〜ｖ６の造成工程を示す。
【図２】図２に、精製した抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％グラジェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。Ａは還元条件、Ｂは非還元条件での結果をそれぞれ示す。Ａ、Ｂ共に、レーン１と９が分子量マーカー、２が抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１、３〜８が左から順に抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．１〜ｖｅｒ．６の泳動パターンをそれぞれ示す。
【図３】図３に、フローサイトメトリーでの各抗体の反応性を示す。図の縦軸は平均蛍光強度を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。図中、◇は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を、■は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．１を、▲は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．２を、◆は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．３を、●は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．４を、□は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．５を、△は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．６を、○は陰性対照である抗ＣＣＲ４キメラ抗体をそれぞれ示す。
【図４】図４に、各抗体のＡＤＣＣ活性を示す。各図の縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。図中、◇は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を、■は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．１を、▲は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．２を、◆は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．３を、●は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．４を、□は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．５を、△は抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体ｖｅｒ．６をそれぞれ示す。
【図５】図５に、ＰＥＲＰ遺伝子導入細胞のクローン毎のＰＥＲＰ発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す。図中のクローンナンバーは、４種のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞の各クローンを示す。Ｎｅｇａは、遺伝子を導入していないＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を示す。図中の矢印は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチド鎖の分子量である約２５ｋＤａを示す。
【図６】図６に、ＦＭＡＴでのＫＭ３４１１の反応性を示す。グラフは縦軸に蛍光強度と細胞数の積算値を示す。
【図７】図７に、フローサイトメトリーでのＫＭ３４１１の反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。
【図８】図８に、プラスミドｐＫＭ３４１１ＶＨ９とｐＫＭ３４１１ＶＬ１１の造成工程を示す。
【図９】図９に、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１の造成工程を示す。
【図１０】図１０に、精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％グラジェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った結果である。レーン１と６が分子量マーカー、２と４が抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１、３と５が抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の泳動パターンをそれぞれ示す。
【図１１】図１１に、抗ＰＥＲＰヒト化抗体作製の工程を示す。
【図１２】図１２に、フローサイトメトリーでの、作製した抗ＰＥＲＰヒト化抗体の、ｈＰＥＲＰ発現細胞ＣＨＯ／ｈＰＥＲＰ（ＫＣ１３５９）に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。Ａは、単にＣＤＲをヒトフレームワークに挿入したヒト化抗体および、Ｈ鎖あるいはＬ鎖のみアミノ酸改変を加えたヒト化抗体の反応性を示す。Ｂは、アミノ酸改変残基数を減らしたヒト化抗体の反応性を示す。
【図１３】図１３に、フローサイトメトリーでの、作製した抗ＰＥＲＰヒト化抗体の、ｈＰＥＲＰ発現細胞ＣＨＯ／ｈＰＥＲＰ（ＫＣ１３５９）に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。Ａ，Ｂ，Ｃでは、アミノ酸改変残基の最適化を行った抗ＰＥＲＰヒト化抗体の反応性を示す。
【図１４】図１４に、フローサイトメトリーでの、作製した抗ＰＥＲＰヒト化抗体の、ｈＰＥＲＰ発現細胞ヒト肺癌細胞株ＰＣ−９に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。Ａ，Ｂ，Ｃでは、アミノ酸改変残基の最適化を行った抗ＰＥＲＰヒト化抗体の反応性を示す。
【図１５】図１５に、作製した各抗ＰＥＲＰヒト化抗体のヒト肺癌細胞株ＰＣ−９に対するＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
【図１６】図１６に、作製した各抗ＰＥＲＰヒト化抗体のヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３に対するＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
【図１７】図１７に、作製した各抗ＰＥＲＰヒト化抗体のｈＰＥＲＰ発現ＣＨＯ細胞ＣＨＯ／ｈＰＥＲＰ（ＫＣ９０３３）に対するヒト肺癌細胞株ＰＣ−９に対するＡＤＣＣ活性を示す。各図の縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
【図１８】図１８に、Ｎ型糖鎖の結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト型キメラ抗体ＫＭ３８２１の、エピトープ解析の結果に基づく変異ＰＥＲＰの模式的な図を示した。
【図１９】図１９に、フローサイトメトリーでのＰＥＲＰの細胞外領域を認識する抗体を用いた、各変異ＰＥＲＰに対する反応性を示した。グラフ中の数値は、ＫＭ３８２１の反応性である。ＫＭ３８２１の反応性は、ＫＭ３８２１のｈＰＥＲＰに対する反応性を１００％とした時の、各変異ＰＥＲＰあるいはサルＰＥＲＰに対する反応性（％）で示した。
【図２０】図２０に、フローサイトメトリーでの、各変異ＰＥＲＰ発現細胞に対するＫＭ３８２１の反応性から明らかになったエピトープを、模式的に示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または該抗体断片に関する。
ＰＥＲＰ遺伝子としては、配列番号１で示される塩基配列があげられる。上記の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を含む遺伝子、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子、ならびに配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＰＥＲＰ遺伝子に包含される。【００２１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味し、具体的には、ハイブリダイズしたコロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ、もしくは該配列を有するＰＣＲ産物もしくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターもしくはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９５）］などに記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、よりさらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２２】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＰＥＲＰ遺伝子に包含される。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。【００２３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。【００２４】
本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ〕においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などがあげられる。
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ  （Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ  の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。【００２５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、こうして作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。【００２６】
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、例えば配列番号２で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）または予測プログラムＴＭＨＭＭ  ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）などを用いて予測された領域があげられる。【００２７】
具体的には、ＳＯＳＵＩを用いた場合には配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５〜７５番目および１３０〜１５４番目に相当する領域が、ＴＭＨＭＭ  ｖｅｒ．２を用いた場合には配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６〜７６番目および１２９〜１４７番目に相当する領域が細胞外領域としてあげられる。このとき、予測に用いられるパラメータはこれらの予測プログラムにデフォルトの値が用いられる。【００２８】
また、本発明におけるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域としては、文献［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４，７０４（２０００）］で予測される細胞外ドメインの３３〜７５番目および１２９〜１５０番目に相当する領域であってもよい。
本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造を認識し、かつ該ポリペプチドの細胞外領域に安定的に結合することができる。細胞外領域としては、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域のループ１およびループ２があげられる。細胞外領域としては、少なくとも細胞外領域のループ１の４０番目のＡｓｐを含む領域があげられ、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列の４０番目のＡｓｐ，６２番目のＧｌｕおよび６３番目のＧｌｕを少なくとも含む立体構造があげられる。【００２９】
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造としては、配列番号１で示される塩基配列を有するＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが天然状態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有していればいずれでもよい。
本発明の遺伝子組換え抗体が結合することを確認する方法としては、例えば、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法が用いられ、蛍光細胞染色法などの特定の抗原が発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を確認する方法が好適に用いられる。具体的には、参考例１（２）−４に記載の蛍光抗体染色法があげられる。また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。【００３０】
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞としては、ヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞などがあげられる。
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該ポリペプチドが発現している細胞があげられる。【００３１】
ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から得られた該ポリペプチドが発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ポリペプチドが発現している細胞株があげられ、例えば、ヒトから樹立された細胞株である膵癌細胞株Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８０）またはＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２２）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）またはＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１８）、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２０）またはＮＣＩ−Ｈ６９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１９）、乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）または子宮癌細胞株ＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ  ０２４０）などがあげられる。【００３２】
遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられ、具体的には、参考例１に記載のＰＥＲＰ遺伝子発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨを導入し、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられる。【００３３】
本発明のＶ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体としては、Ｖ領域の全てのＣＤＲにＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、遺伝子組換え抗体があげられ、具体的には、抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む、遺伝子組換え抗体があげられる。【００３４】
上記の抗体のＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３および５で示されるアミノ酸配列を含む、遺伝子組換え抗体において、抗体のＶＨのＣＤＲ２としては、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗体のＶＨのＣＤＲ２であって、かつ、該ＣＤＲ２を有する遺伝子組換え抗体が、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合することができれば特に限定されないが、例えば、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変および１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変のうち、少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ２があげられる。配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変としては、例えば、９番目のＡｓｎを極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変があげられる。極性側鎖を有するアミノ酸残基としては、具体的には、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、ＴｈｒおよびＳｅｒなどがあげられる。他に、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の９番目のＡｓｎを他のアミノ酸残基に置換する改変としては、Ｇｌｙに置換する改変があげられる。配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１１番目のＳｅｒを他のアミノ酸残基に置換する改変としては、例えば、１１番目のＳｅｒを、非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換するアミノ酸残基に置換する改変があげられる。非極性側鎖を有するアミノ酸残基としては、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＧｌｙなどがあげられる。上記の抗体のＶＨのＣＤＲ２としては、具体的には、配列番号４、６〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２などがあげられる。【００３５】
本発明の遺伝子組換え抗体の具体例としては、抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、配列番号４および６〜１０のいずれか１つおよび配列番号５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体があげられる。  具体的には、
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、６および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、７および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、８および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、９および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、および
抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、１０および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体、
などがあげられるが、抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、８および５でそれぞれ示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体が好ましい。【００３６】
本発明の遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよび軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体をいう。【００３７】
本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして作製することができる。まず、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、その配列を鋳型として変異導入プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さないＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させることにより、ヒト型キメラ抗体を製造することができる。【００３８】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。【００３９】
本発明のヒト型キメラ抗体としては、具体的には、抗体のＶＨが配列番号１４〜１９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体などがあげられる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）などともいう。【００４０】
本発明のヒト化抗体は、以下のように作製することができる。まず、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列から、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さないＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を設計し、設計したＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させることにより、ヒト化抗体を製造することができる。【００４１】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。【００４２】
ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。【００４３】
本発明のヒト化抗体としては、具体的には、抗体のＶＨが配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、４９番目のＩｌｅ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号３６で示されるアミノ酸配列、または配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をそれぞれ含むヒト化抗体などがあげられる。【００４４】
抗体のＶＨは配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、４９番目のＩｌｅ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａのうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、導入される改変の数に特に制限はないが、好ましくは抗体のＶＨが配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、４１番目のＰｒｏ、４９番目のＩｌｅ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａが、さらに好ましくは２７番目のＧｌｙ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体などがあげられる。
抗体のＶＨにおいて、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、４９番目のＩｌｅ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。【００４５】
８つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列があげられる。【００４６】
７つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００４７】
６つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００４８】
５つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００４９】
４つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、および４９番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５０】
３つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５１】
２つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、および
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、および３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
１つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３０〜３５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列中の
２７番目のＧｌｙをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列、
４１番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
４４番目のＬｙｓをＡｓｎに置換したアミノ酸配列、
４５番目のＧｌｙをＡｒｇに置換したアミノ酸配列、
４９番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
７２番目のＶａｌをＡｒｇに置換したアミノ酸配列、および
９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
があげられる。【００５２】
抗体のＶＬにおいて、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒおよび７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列としては、導入される改変の数は、特に制限はないが、好ましくは３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕが、さらに好ましくは４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕが、最も好ましくは４６番目のＬｅｕ、および７０番目のＰｈｅが置換されたアミノ酸配列があげられる。
抗体のＶＬにおいて、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。【００５３】
９つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列などがあげられる。【００５４】
８つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７１番目のＴｈｒをＳｅｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７１番目のＴｈｒをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５５】
７つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列などがあげられる。【００５６】
６つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、および
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５７】
５つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
３番目のＧｌｎをＶａｌに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、および
４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、６９番目のＡｓｐをＳｅｒに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７１番目のＴｈｒをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５８】
４つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
３番目のＧｌｎをＶａｌに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、および
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００５９】
３つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
３番目のＧｌｎをＶａｌに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、および４６番目のＬｅｕをＴｒｐに置換したアミノ酸配列、および
４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列などがあげられる。【００６０】
２つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、および７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
３番目のＧｌｎをＶａｌに、および５番目のＴｈｒをＩｌｅに置換したアミノ酸配列、および
７０番目のＰｈｅをＴｙｒ、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。【００６１】
１つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の
３番目のＧｌｎをＶａｌに置換したアミノ酸配列、
５番目のＴｈｒをＩｌｅに置換したアミノ酸配列、
３５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、
４２番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
４６番目のＬｅｕをＴｒｐに置換したアミノ酸配列、
６９番目のＡｓｐをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、
７０番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列、
７１番目のＴｈｒをＳｅｒに置換したアミノ酸配列、および
７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
本発明のヒト化抗体のＶＨとしては、具体的には配列番号５１〜５６に表されるいずれかのアミノ酸配列があげられるが、好ましくは、配列番号５１、５３、５５および５６に表されるいずれかのアミノ酸配列があげられ、よりこの好ましくは配列番号５３で表されるアミノ酸があげられる。
本発明のヒト化抗体のＶＬとしては、具体的には配列番号５８〜６３に表されるいずれかのアミノ酸配列があげられるが、好ましくは、配列番号５８、５９、６０、６２および６３に表されるいずれかのアミノ酸配列があげられ、より好ましくは配列番号６２で表されるアミノ酸配列があげられる。
本発明のヒト化抗体としては、上述のアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬからなるヒト化抗体があげられるが、具体的には、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号５９に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号６０に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５５、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５１、ＶＬが配列番号５８に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号５８に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号６３に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５６、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体
があげられる。より好ましくは、
ＶＨが配列番号５５、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５１、ＶＬが配列番号５８に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号５８に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号６３に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５６、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
ＶＨが配列番号５３、ＶＬが配列番号６２に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体、
などがあげられる。【００６２】
また、本発明の遺伝子組換え抗体としては、ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する遺伝子組換え抗体も包含される。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。【００６３】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００６４】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。【００６５】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００６６】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００６７】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００６８】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法〔Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）〕に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。【００６９】
本発明のｄｓＦｖは、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００７０】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００７１】
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の遺伝子組換え抗体は、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた融合抗体を包含する。【００７２】
本発明の融合抗体は、本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、金光修著、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。【００７３】
また、本発明の融合抗体は、可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。【００７４】
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社（１９９６）］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。【００７５】
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特開昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。【００７６】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２などがあげられる。また、癌細胞を直接傷害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。【００７７】
融合抗体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用する場合の薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があげられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレシン・イソチアネート（ＦＩＴＣ）、ＲＩＴＣなどの蛍光物質などがあげられる。【００７８】
以下に、本発明の遺伝子組換え抗体の製造方法について、具体的に説明する。
１．ハイブリドーマが産生する、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
本発明において用いられるポリペプチドは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）］などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。【００７９】
まず、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、完全長ｃＤＮＡをもとにしてポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、上記完全長ｃＤＮＡの代わりに該ＤＮＡ断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。【００８０】
宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への組込が可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。【００８１】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合には、該組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明において用いられるＤＮＡおよび転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１  ［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［大腸菌  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３などをあげることができる。【００８２】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロモーターなどをあげることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。【００８３】
また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とするポリペプチドの生産率を向上させることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００８４】
このような宿主細胞として用いられる原核生物としては、例えば、エシェリヒア属などに属する原核生物を用いることができ、具体的には大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９などが用いることができる。【００８５】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］に記載の方法などをあげることができる。【００８６】
本発明において用いられるポリペプチドを大腸菌で生産した場合には、ベクターの種類により該ポリペプチドは、細胞質内に可溶型として、細胞質内に不溶性顆粒としてまたはペリプラズミックスペースに可溶型としてなどの発現様式で発現させることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３などをあげることができる。【００８７】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００８８】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７細胞（特開昭６３−２９９）などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などをあげることができる。【００８９】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］に記載されている方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。【００９０】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。【００９１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清などを添加した培地などを用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。  【００９２】
上記のとおり、本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞など由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養して該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。
ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞から、適切な方法を選択することができる。また、任意の蛋白質と蛋白質工学的に融合させて融合ポリペプチドとして発現させて生産させてもよい。【００９３】
ポリペプチドが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）、特開平０５−３３６９６３またはＷＯ９４／２３０２１］などに記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることもできる。また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。  【００９４】
ポリペプチドは、例えば、以下のようにして、上記の培養物などから単離・精製することができる。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００９５】
また、ポリペプチドが細胞質内に不溶性顆粒を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ポリペプチドの不溶性顆粒を回収する。回収した該蛋白質の不溶性顆粒を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造にまき戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。【００９６】
ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより、固形物を取り除いた培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００９７】
また、本発明において用いられるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分ペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
上記の方法により得られるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分配列を有するペプチドを抗原として用いることができる。【００９８】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。【００９９】
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。【０１００】
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として用いる。【０１０１】
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該ポリクローナル抗体が、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する活性を有していることは、後述（６）に記載の方法で調べることができる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供する。【０１０２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。【０１０３】
（４）細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬを、１×１０８個の抗体産生細胞に加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。【０１０４】
培養後、培養上清の一部をとり後述するハイブリドーマの選択方法により、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを含むウェルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。【０１０５】
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。【０１０６】
（６）ハイブリドーマの選択方法
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択する方法としては、以下の方法があげられる。【０１０７】
天然型の立体構造を保っているＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域に結合できる性質の抗体を選択するには、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内から樹立された細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞に対する結合性を調べることができる方法であればいずれでもよく、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体染色法やフローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法などの方法があげられる。具体的な方法としては、実施例４の（３）または実施例５の（２）に記載の方法などがあげられる。【０１０８】
また、これらの反応性を確認するための方法は、公知の免疫学的測定法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）］、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせることもできる。【０１０９】
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内から樹立した細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、前述した細胞があげられるが、該ポリペプチドの発現の有無が明らかである遺伝子組換え技術により得られたＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞を用いるのが好ましい。このような、遺伝子組換え技術により得られた細胞は、陰性対照として該ポリペプチドが発現していない細胞の調製が容易である。【０１１０】
前述の方法で選択される、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの具体例としては、モノクローナル抗体ＫＭ３４１１を生産するハイブリドーマ細胞株ＫＭ３４１１などがあげられる。ハイブリドーマＫＭ３４１１は平成１６年２月２４日付でブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所  特許性物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３として寄託されている。【０１１１】
２．Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体の作製
Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有する抗体の当該コンセンサス配列に改変を導入することにより、抗体のＶ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗体を作製することができる。以下にその作製例を示す。【０１１２】
（１）Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有する抗体のＶ領域をコードする遺伝子配列またはアミノ酸配列の解析
Ｖ領域の遺伝子配列またはアミノ酸配列を解析することにより、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列である、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を、Ｓｅｒ／ＴｈｒはＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基であることをそれぞれ示す）が、Ｖ領域に含まれているか否かを調べる。【０１１３】
Ｖ領域の遺伝子配列は、例えば、以下のようにして抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、決定することができる。抗体のアミノ酸配列は、上記のｃＤＮＡの遺伝子配列から推定するか、または、抗体を直接ペプチドシーケンサーなどを用いて解析することにより決定できる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］。【０１１４】
以下にマウス抗体などを産生するハイブリドーマから、抗体可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングする方法を示す。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。【０１１５】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。【０１１６】
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。【０１１７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ
ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０  （１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。【０１１８】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。【０１１９】
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲと表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。【０１２０】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【０１２１】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。【０１２２】
更にＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］等の配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。【０１２３】
（２）Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体の作製
Ｖ領域に、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有さない抗体のＶ領域は、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列のＡｓｎ残基および／またはＳｅｒ残基／Ｔｈｒ残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、作製することができる。【０１２４】
抗体のＶ領域、特にＣＤＲは、抗体の抗原への結合性を規定する重要な領域である。従って、抗体のＶ領域、特にＣＤＲにおける、任意のアミノ酸残基への置換は、抗体の抗原への結合性が変化してしまう可能性がある。従って、上記コンセンサス配列を有さないＶ領域を作製する際には、抗体の抗原への結合性が変化しないアミノ酸配列に改変する必要がある。その具体的な方法を以下に示す。【０１２５】
Ｖ領域のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列中のＡｓｎ残基、並びにＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基を抗体の抗原への結合性が変化しないアミノ酸配列に改変するためには、直接抗原との結合に影響する改変や抗体の立体構造に変化を及ぼし、間接的に抗原との結合に影響する改変を除外する必要がある。
直接抗原との結合に影響する改変や抗体の立体構造に変化を及ぼし、間接的に抗原との結合に影響する改変を除外するためには、抗原への結合性に影響を与える可能性の少ないアミノ酸残基の部位特異的変異を如何に効率よく予測するかが、最も重要である。そのためにＸ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築および解析を行う。しかしながら、これら抗体の立体構造の情報に基づいても、抗体のＶ領域、特にＣＤＲへの変異の導入は、抗体の抗原への結合性を変化させる可能性がある。そのため、変異の導入に際しては、数種の改変体を作製し、アミノ酸の改変との抗原結合活性との相関を検討する等の、試行錯誤が必要である。【０１２６】
このようにして、抗体の抗原への結合性に影響を与える可能性の少ないアミノ酸残基の部位特異的変異を推定した後、変異が導入された抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲを行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。【０１２７】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、後述する本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターに容易に変異が導入された抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。
ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにそれぞれクローニングし、本項（１）に記載の方法により塩基配列を決定し、抗体のＶ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体のＶ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドが取得されたことを確認する。【０１２８】
または、変異を導入する基となった抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡにクンケル法などの公知の部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９］を用いたり、変異を導入する基となった抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡ中に存在する制限酵素認識部位を利用して、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を含む部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、ＰＣＲ等で変異を導入し、変異を導入する基となった抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡと置換して、設計したＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドを作製することもできる。【０１２９】
Ｖ領域のアミノ酸残基は、上記のようにして得られた遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドの塩基配列を本項（１）に記載の方法により決定し、目的の改変が施されたことを確認する。【０１３０】
（３）遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
（３）−１  ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターの構築
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。【０１３１】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることも、ｃＤＮＡを用いることもできるが、ｃＤＮＡを用いるのが好ましい。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＧＥ１０３（〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）、ｐＨＳＧ２７４〔Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）〕、ｐＫＣＲ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）〕、ｐＳＧ１ｂｄ２−４〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）〕、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター〔Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）〕とエンハンサー〔Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）〕などがあげられる。【０１３２】
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターの方が好ましい〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）〕。タンデム型のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８〔Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）〕などがあげられる。
構築したヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の動物細胞での発現に使用できる。【０１３３】
（３）−２  ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするそれぞれのｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、Ｖ領域のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入された抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。【０１３４】
（３）−３  ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。
まず、Ｖ領域のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入された抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）をそれぞれ有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。【０１３５】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項（３）−１で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにそれぞれクローニングし、本項（１）に記載の方法により塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。【０１３６】
（３）−４  ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、Ｖ領域のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入された抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，  １５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。【０１３７】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項（３）−３に記載のＰＣＲを行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項（１）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。【０１３８】
（３）−５  ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。【０１３９】
例えば、本項（３）−３および（３）−４でヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項（３）−１に記載のヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングすることができる。【０１４０】
（３）−６  ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の一過性発現
作製したヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項（３）−３および（３）−５に記載のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体発現ベクターを用いてヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。【０１４１】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］等により測定できる。【０１４２】
（３）−７  ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の安定発現
本項（３）−２および（３）−５に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターまたはヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。【０１４３】
ヒト型キメラ抗体発現ベクターまたはヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］、α１−６フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（ＷＯ０５／３５５８６）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）などがあげられる。【０１４４】
上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくはＷＯ０５／３５５８６に記載のα１−６フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞などを用いることもできる。【０１４５】
発現ベクターの導入後、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する：ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。【０１４６】
ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７，６８０（１９７０）］やウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で測定することができる。【０１４７】
３．本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片の活性評価
精製した本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片の抗原への結合性、ＰＥＲＰ発現細胞株に対する結合性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭなどを用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価することができる［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］。また、これらの結果を、本発明の遺伝子組換え抗体作製の基となった、上記１．に記載の、Ｖ領域に改変を導入していない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体での測定結果と比較することにより、Ｖ領域に導入した改変による、抗体の抗原への結合性への影響がわかる。【０１４８】
４．本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明の可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。【０１４９】
ＰＥＲＰ遺伝子が関与する疾患としては、該遺伝子が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば癌があげられる。癌としては、上皮由来の癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌または膵臓癌などがあげられる。【０１５０】
本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有効成分として含有する治療剤には、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を制御することを特徴とする治療剤、およびＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性、あるいはアポトーシス誘導作用による治療剤が含まれる。
遺伝子組換え抗体の有するＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性は、例えば、特開平６−２０５６９４に記載の方法で測定することができる。このような活性を有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、特定の抗原が発現した細胞を傷害することができるため、疾患の治療薬として用いることができる。ヒトＩｇＧクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体は治療剤として、有効に用いられる［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）］。【０１５１】
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、変性を受けていない天然型のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを認識することができるので、生体内で存在するＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している細胞を認識することができる。従って、本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＥＲＰ遺伝子が発現している細胞を傷害することができる。特に、ＰＥＲＰ遺伝子は癌において発現が亢進していることから、本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片は癌の治療剤として使用することができる。また、高いＡＤＣＣ活性が付与された本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子が発現している細胞を減ずる治療に用いられる治療剤として、特に有効に用いられる。【０１５２】
本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片、またはこれらの融合抗体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。【０１５３】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。【０１５４】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。【０１５５】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【０１５６】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）  可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の作製
参考例１（２）に記載の方法で作製された、抗ＰＥＲＰ抗体産生ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３）から生産される抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を基に、本発明の遺伝子組換え抗体を作製した。該抗体は、参考例２（１）−３に記載されているように、配列番号２１で示されるＶＨ中に、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有していた。以下、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体のＶＨのアミノ酸配列の設計を行った。
（１）Ｖ領域にＮ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体のＶＨのアミノ酸配列の設計
Ｖ領域にＮ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない改変抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。【０１５８】
Ｎ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列の５９番目のＡｓｎ、６０番目のＴｙｒおよび６１番目のＳｅｒからなる配列である。配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、ＣＤＲ２は配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号４５で示されるアミノ酸配列において、Ｎ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列は、９番目のＡｓｎ、１０番目のＴｙｒおよび１１番目のＳｅｒからなる配列である。【０１５９】
配列番号４５で示されるアミノ酸配列において、１０番目のアミノ酸は任意であることから、９番目のＡｓｎと１１番目のＳｅｒを改変候補残基とした。既存の抗体配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較やアミノ酸の性質等を勘案し、抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて解析し、アミノ酸配列の設計を行った。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従って行った。得られた結果を抗ＰＥＲＰマウス抗体の三次元構造と比較し、抗原結合部位の三次元構造を変化させず、抗体の結合活性に影響を与えないと考えられるアミノ酸と置換するアミノ酸として、９番目のＡｓｎについてはＳｅｒ、ＧｌｙまたはＴｙｒを置換するアミノ酸として、および／または１１番目のＳｅｒについてはＡｌａを置換するアミノ酸としてそれぞれ選択した。【０１６０】
これらの設計されたアミノ酸改変ＶＨとして、少なくとも１以上のアミノ酸残基を置換し、以下の６種類の、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体のＶＨを設計した。以下、５９番目のＡｓｎをＳｅｒに置換したＶＨをｖｅｒ．１、Ｇｌｙに置換したｖｅｒ．２、Ｔｙｒに置換したＶＨをｖｅｒ．３、６１番目のＳｅｒをＡｌａに置換したＶＨをｖｅｒ．４、５９番目のＡｓｎをＳｅｒに、かつ６１番目のＳｅｒをＡｌａに置換したＶＨをｖｅｒ．５、５９番目のＡｓｎをＧｌｙに、かつ６１番目のＳｅｒをＡｌａに置換したＶＨをｖｅｒ．６とそれぞれ略記する。【０１６１】
（２）−１  Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体の発現ベクターの作製
参考例２（１）−２で作製したプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９を鋳型として、アミノ酸改変を導入するための以下の配列番号２２〜２７で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２８で示されるＤＮＡ配列を有するプライマーとを用いてＰＣＲを行い、目的のｃＤＮＡ断片を増幅した。ｖｅｒ．１を作製するためには配列番号２４、ｖｅｒ．２を作製するためには配列番号２５、ｖｅｒ．３を作製するためには配列番号２３、ｖｅｒ．４を作製するためには配列番号２２、ｖｅｒ．５を作製するためには配列番号２６、ｖｅｒ．６を作製するためには配列番号２７に記載の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）をそれぞれプライマーとして用いた。これら６種類の合成ＤＮＡの３’末端には、参考例２の（２）−１に記載のｐＫＡＮＴＥＸ３４１１と組み換えるための制限酵素の認識配列が含まれる。ＰＣＲは９４℃３分間加熱後、９４℃３０秒間、５８℃３０秒間、７４℃１分間からなる反応サイクルを２５回行った後、７２℃で１０分間反応させた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物のサイズはいずれも約３００ｂｐであった。【０１６２】
参考例２（２）−１に記載の抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１と上記で得られたＶｅｒ．１〜Ｖｅｒ．６をコードするＤＮＡを含むＰＣＲ産物とを用いて、ＶＨ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体（以下、改変抗体と記す）発現ベクターをそれぞれ構築した。なお、ＶＨにおいてはＶｅｒ．１〜Ｖｅｒ．６であるものの、発現ベクターの名称は、ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＣＤＲｖ１〜ｖ６と略記する。
得られた６種類のＰＣＲ産物は制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）とＸｈｏＩ（宝酒造社製）で消化後、反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．３ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を回収した。ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）で消化後、反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を回収した。また、ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）とＸｈｏＩ（宝酒造社製）でも消化し、同様の方法で約３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片も回収した。【０１６３】
得られた３種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理を行い、目的の約０．３ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片が挿入された、図１に示した改変抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＣＤＲｖ１〜ｖ６が得られたことを確認した。得られたベクターは、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００により塩基配列を解析し、目的の改変が施された、改変抗体発現ベクターが得られたことを確認した。【０１６４】
（２）−２  改変抗体の動物細胞での発現
本実施例の（２）−１で得られた改変抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＣＤＲｖ１〜ｖ６を用いて、該抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＣＤＲｖ１〜ｖ６が導入された６種類の形質転換株を取得した。【０１６５】
（３）  精製抗体の取得
本実施例（２）−２で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。得られた培養上清よりＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、改変抗体ｖｅｒ．１〜６をそれぞれ精製した。【０１６６】
得られた抗体のＶＨ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない改変抗体ｖｅｒ．１〜６の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（ＡＴＴＯ社製、カタログ番号：Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて電気泳動を行った後、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。対照としては参考例２に記載の抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を用いた。【０１６７】
結果を図２に示した。精製した改変抗体は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の１本のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致し、改変抗体が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。【０１６８】
（実施例２）  改変抗体の活性評価
（１）  膜表面上のＰＥＲＰへの結合性（蛍光抗体法）
実施例１で精製した抗ＰＥＲＰＣＤＲ改変抗体のＰＥＲＰ発現細胞株への結合活性を以下の方法により確認した。【０１６９】
細胞株としては、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現していることが確認された細胞株である非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９株［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５（１９７６）］を用いた。
１ウェル当たり２×１０５個のＰＣ９細胞を９６ウェルＵ字プレートに分注し、改変抗体をＦＣＭ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて５０μｇ／ｍＬから５倍希釈で６段階に希釈した改変抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、氷中で３０分間反応した。ＦＣＭ用緩衝液で２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ベックマン・コールター社製）をＦＣＭ用緩衝液にて５０倍に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、ＦＣＭ用緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。尚、対照として参考例２に記載の抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を、陰性対照として抗ＣＣＲ４抗体ＫＭ２７６０（ＷＯ０１／６４７５４）を用いて、同様にして蛍光強度を測定した。【０１７０】
結果を図３に示した。縦軸には平均蛍光強度（ＭＦＩ）、横軸には、抗体濃度を示した。６種類すべての改変抗体がＰＣ９細胞に結合することが示され、その結合の強さは抗体の濃度依存的であった。【０１７１】
（２）  改変抗体のＡＤＣＣ活性
実施例１で取得した改変抗体のＡＤＣＣ活性を、以下のようにして測定した。標的細胞にはＰＣ９を用い、エフェクター細胞溶液の調製にはｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を用いた。【０１７２】
（２）−１  標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地［ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を用いて培養した各細胞株を遠心分離操作および懸濁によりＡＤＣＣ活性測定用培地であるＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（５）［５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］で洗浄した後、ＡＤＣＣ活性測定用培地によって、細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。【０１７３】
（２）−２    エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ  社製）を用いて添付の使用説明書に従い、単核球（ＰＢＭＣ）画分を分離した。分離したＰＢＭＣ画分は、ＡＤＣＣ活性測定用培地で遠心分離して３回洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。【０１７４】
（２）−３  ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に上記（２）−１で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）−２で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（エフェクター細胞と標的細胞の比が２０：１になるように希釈したもの）を添加した。更に、改変抗体をＡＤＣＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．００１〜１μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用い、反応終了の４５分前に１５μＬの９％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。尚、対照として参考例２に記載の抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を用いて、以下の式によりＡＤＣＣ活性を測定した。【０１７５】
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（検体の吸光度−エフェクター細胞自然遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度）／（標的細胞全遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度）}×１００
結果を図４に示した。ＰＣ９細胞に対して、改変抗体はＡＤＣＣ活性を有しており、その活性は抗体の濃度依存的であった。【０１７６】
（実施例３）  Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体の作製
（１）Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。【０１７７】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＨのＣＤＲ１、配列番号４、６〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨのＣＤＲ２および配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計することとした。より結合活性の高い抗ＰＥＲＰヒト化抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体である、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。【０１７８】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩおよびＨＳＧＩＩＩの相同性はそれぞれ５４．０％、７４．７％および６０．９％であった。従って、ＫＭ３４１１のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩと最も高い相同性を有していた。【０１７９】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号３７に記載のＫＭ３４１１のＶＨのアミノ酸配列中の４７番目のＩｌｅ、８６番目のＩｌｅ、１００番目のＧｌｎ、１０７番目のＧｌｕ、および１１１番目のＴｈｒは、カバットらがあげるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ３４１１のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号３０〜３５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する含む、抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計した。また、実施例２の結果から、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない改変抗体ｖｅｒ．１〜６の中で、最も結合活性が高かった抗体はｖｅｒ．４であったことから、このＶ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない改変抗体ｖｅｒ．４（以下、ＫＭ３８２１と記す）のＣＤＲ２を有するＨＶをＨＶ０（配列番号３３）とした。【０１８０】
次に、抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号１１〜１３でそれぞれ示される抗体ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこでＶＨの場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体である、抗ＰＥＲＰマウスＫＭ３４１１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。【０１８１】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩおよびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ６７．５％、６２．５％、６６．２％および６５．０％であった。従って、ＫＭ３４１１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。【０１８２】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号３６に記載の抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。【０１８３】
上記で設計した抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多い。結合活性の低下を回避するため、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、改変することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。【０１８４】
まず、上記で設計した抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＰＥＲＰマウスモノクローナル抗体ＫＭ３４１１のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１と異なっているアミノ酸残基について順次、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。【０１８５】
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＨＶ０では２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、４９番目のＩｌｅ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａを、ＬＶ０では３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕをそれぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をマウス抗体ＫＭ３４１１の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。具体的には、抗体ＶＨについては、配列番号３０〜３５のいずれかで示されるアミノ酸配列の２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４１番目のＰｒｏをＰｈｅに、４４番目のＬｙｓをＡｓｎに、４５番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＩｌｅをＭｅｔに、７２番目のＶａｌをＡｒｇに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。また、ＶＬについては、配列番号３６で示されるアミノ酸配列の３番目のＧｌｎをＶａｌに、５番目のＴｈｒをＩｌｅに、３５番目のＴｙｒをＰｈｅに、４２番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＴｒｐに、７０番目のＰｈｅをＴｙｒに、および７７番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０１８６】
（２）  抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。【０１８７】
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号３７の１〜１８番目に示される抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計４本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチド（配列番号６４〜６７）を合成した。【０１８８】
各オリゴヌクレオチド（配列番号６４〜６７）を最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ  Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ  Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（９４℃  ３０秒間、５０℃  ３０秒間、７４℃  ６０秒間のサイクルを３０サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株の株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列（配列番号５０）を有するプラスミドを得た。【０１８９】
次に、本実施例（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＨＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１に見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、以下、特に記載の無い場合、９４℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ６０秒間のサイクルを３５サイクルのＰＣＲ反応で反応させた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。また、以下で使用した合成オリゴＤＮＡはファスマック社製のものである。なお、以下において、改変するアミノ酸残基はアルファベット一文字で標記し、右上に改変するアミノ酸残基の番号を記載した。【０１９０】
（ａ）Ｇ２７Ｓ３０Ｐ４１Ｋ４４Ｇ４５Ｉ４９Ｖ７２Ａ９７をＦ２７Ｔ３０Ｆ４１Ｎ４４Ｒ４５Ｍ４９Ｒ７２Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ８）の作製
０．１μｍｏｌ／Ｌのアミノ酸変異を有する合成ＤＮＡ（配列番号６４、６９、６８、７０）と、その両端に位置するプライマーＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および、Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）を０．４μｍｏｌ／Ｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を、Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、０．８−１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４５ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。特異的な制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＢｌｕｓｅｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｓｋ（−）（以下、ｐＢＳ）にサブクローニングを行い、目的の遺伝子（配列番号５１）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ８を取得した。【０１９１】
（ｂ）Ｇ２７Ｐ４１Ａ９７をＦ２７Ｆ４１Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ３）の作製
上記（ａ）と同様にして、合成ＤＮＡ（配列番号６４、７９、６６、７０）とその両端に位置するＭ１３ＲＶおよびＭ１３Ｍ４プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号５２）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ３を取得した。【０１９２】
（ｃ）Ｇ２７Ｐ４１Ｖ７２Ａ９７をＦ２７Ｆ４１Ｒ７２Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ４）
上記と同様にして、合成ＤＮＡ（配列番号６４、７９、８０、７０）とその両端に位置するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号５３）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ４を取得した。【０１９３】
（ｄ）Ｇ２７Ｓ３０Ｐ４１Ａ９７をＦ２７Ｔ３０Ｆ４１Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ４−２）
上記（ｂ）で作製したｐＢＳ／ＨＶ３を鋳型にして、Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号８４）を用いてＰＣＲ反応を行い、約０．３ｋｂｐの遺伝子断片５’−ＧＳを取得した。また、同様にｐＢＳ／ＨＶ３を鋳型にして合成オリゴＤＮＡ（配列番号８５）およびＭ１３Ｍ２０プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．４ｋｂｐの遺伝子断片３’−ＰＡを取得した。これら、作製した遺伝子断片およびＭ１３ＲＶ、Ｍ１３Ｍ２０  プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて増幅遺伝子断片を抽出した。その後、特異的な制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで酵素処理を行い、０．８−１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４５ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。抽出した遺伝子断片を、ｐＢＳの適切な場所に挿入し、目的の遺伝子（配列番号５４）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ４−２を取得した。【０１９４】
（ｅ）Ｇ２７Ｓ３０Ｉ４９Ｖ７２Ａ９７をＦ２７Ｔ３０Ｍ４９Ｒ７２Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ５−２）
上記（ｄ）で作製した、ｐＢＳ／ＨＶ４−２を鋳型にして、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および合成オリゴＤＮＡ（配列番号８６）を用いてＰＣＲ反応を行い、５’−ＧＳＰＩ遺伝子断片を取得した。また、上記（ｃ）で作製したｐＢＳ／ＨＶ４を鋳型にして、Ｔ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および合成オリゴＤＮＡ（配列番号８７）を用いてＰＣＲ反応を行い、３’‐ＶＡ遺伝子断片を取得した。これら、作製した遺伝子断片とＴ３、Ｔ７プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂｐのＧＳＰＩＶＡ遺伝子断片を作製した。この遺伝子断片を鋳型にして、Ｔ３プライマーと合成オリゴＤＮＡ（配列番号９２）を用いてＰＣＲ反応を行い５’−ＨＶ５−２遺伝子断片を、またＴ７プライマーと合成オリゴＤＮＡ（配列番号９１）を用いてＰＣＲ反応を行い３’−ＨＶ５−２遺伝子断片を取得した。作製した２つの遺伝子断片およびＴ３、Ｔ７プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は上記（ｃ）と同様にして、目的の遺伝子（配列番号５５）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ５−２を取得した。【０１９５】
（ｆ）Ｇ２７Ｐ４１Ｉ４９Ｖ７２Ａ９７をＦ２７Ｆ４１Ｍ４９Ｒ７２Ｔ９７へ改変したＶＨ（以下、ＨＶ５−３）
上記（ｃ）で作製したＨＶ４を鋳型にして、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号８６）を用いてＰＣＲ反応を行い、５’−ＧＰＩ遺伝子断片を取得した。また、同様にしてＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号８７）を用いてＰＣＲ反応を行い、３’−ＶＡ遺伝子断片を取得した。作製した遺伝子断片とおよびＴ３、Ｔ７プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は上記（ｃ）と同様にして、目的の遺伝子（配列番号５６）を含むベクターｐＢＳ／ＨＶ５−３を取得した。【０１９６】
（３）抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＰＥＲＰヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。【０１９７】
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号３８の１〜２２番目に示される抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＬ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計４本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチド（配列番号７１〜７４）を合成した。【０１９８】
各オリゴヌクレオチド（配列番号７１〜７４）を最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ  Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ  Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、上記（３）と同様にＰＣＲを行った。反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列（配列番号５７）を有するプラスミドｐＢＳ／ＬＶ０を取得した。【０１９９】
次に、本実施例（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＬＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
また以下、特に記載の無い場合、９４℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ６０秒間のサイクルを３５サイクルのＰＣＲ反応で反応させた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。また、以下で使用した合成オリゴＤＮＡはファスマック社製のものである。以下において、改変するアミノ酸残基はアルファベット一文字で標記し、右上に改変するアミノ酸残基の番号を記載した。【０２００】
（ａ）Ｇ３Ｔ５Ｙ３５Ａ４２Ｌ４６Ｆ７０Ｌ７７をＶ３Ｌ５Ｆ３５Ｓ４２Ｗ４６Ｙ７０Ｍ７７へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ７）
０．１μｍｏｌ／Ｌのアミノ酸変異を有する合成ＤＮＡ（配列番号７５〜７８）と、その両端に位置するプライマーＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）および、Ｍ１３Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）を０．４μｍｏｌ／Ｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を０．８−１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＢｌｕｓｅｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｓｋ（−）（以下、ｐＢＳ）にサブクローニングを行い、目的の遺伝子（配列番号５８）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ７を取得した。【０２０１】
（ｂ）Ｌ４６Ｆ７０をＷ４６Ｙ７０へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ２）
上記（ａ）と同様に、４本の合成オリゴＤＮＡ（配列番号７１、７２、８１、７４）と両端に位置するＭ１３ＲＶプライマー、Ｍ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は上記（ａ）同様にして、目的の遺伝子（配列番号５９）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ３を取得した。【０２０２】
（ｃ）Ｌ４６Ｆ７０Ｌ７７をＷ４６Ｙ７０Ｍ７７へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ３）
上記（ａ）と同様に、４本の合成オリゴＤＮＡ（配列番号７１、７２、８１、７８）と両端に位置するＭ１３ＲＶプライマー、Ｍ１３Ｍ４プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は上記（ａ）同様にして、目的の遺伝子（配列番号６０）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ３を取得した。【０２０３】
（ｄ）Ａ４２Ｌ４６Ｆ７０をＳ４２Ｗ４６Ｙ７０へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ３−２）
上記（ｂ）で作製したｐＢＳ／ＬＶ２を鋳型として、Ｍ１３ＲＶプライマーと合成オリゴＤＮＡ（配列番号９４）を用いてＰＣＲ反応を行い、５’−ＡＬ遺伝子断片を取得した。また、Ｍ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号９３）を用いて、３’−Ｆ遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片およびＭ１３ＲＶプライマー、Ｍ１３Ｍ２０プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて増幅遺伝子断片を抽出した。その後、特異的な制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで酵素処理を行い、０．８−１．５％のアガロース電気泳動を行い、目的の０．４ｋｂｐ付近の遺伝子断片をＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。抽出した遺伝子断片を、制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列を組み込んだｐＢＳの適切な場所に挿入し、目的の遺伝子（配列番号６１）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ３−２を取得した。【０２０４】
（ｅ）Ｙ３５Ｌ４６Ｆ７０Ｌ７７をＦ３５Ｗ４６Ｙ７０Ｍ７７へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ４）
上記（ｃ）で作製したｐＢＳ／ＬＶ３を鋳型として、Ｔ３プライマーおよび合成オリゴＤＮＡ（配列番号９０）を用いてＰＣＲ反応を行い、５’−ＬＶ４遺伝子断片を取得し、また同様にしてＴ７プライマーおよび合成オリゴＤＮＡ（配列番号８９）を用いてＰＣＲ反応を行い、３’−ＹＬＦＬ遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片およびＴ３、Ｔ７プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は（ｄ）と同様にして目的の遺伝子（配列番号６２）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ４を取得した。【０２０５】
（ｆ）Ａ４２Ｌ４６Ｄ６９Ｆ７０Ｔ７１をＳ４２Ｗ４６Ｓ６９Ｙ７０Ｓ７１へ改変したＶＬ（以下、ＬＶ５−２）
上記（ｄ）で作製したｐＢｓ／ＬＶ３−２を鋳型とし、Ｔ７プライマーと合成オリゴＤＮＡ（配列番号８３）を用いてＰＣＲ反応を行い、５’−ＤＦＴ遺伝子断片を取得し、また、同様にしてＴ３プライマーと合成オリゴＤＮＡ（配列番号８２）を用いてＰＣＲ反応を行い、３’−ＤＦＴ遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片およびＴ７，Ｔ３プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、以下は（ｄ）と同様にして目的の遺伝子（配列番号６３）を含むベクターｐＢＳ／ＬＶ５−２を取得した。【０２０６】
（４）抗ＰＥＲＰヒト化抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に本実施例（２）および（３）で得られたＨＶ０およびＬＶ０をコードするそれぞれのｃＤＮＡ、あるいはそれらの改変体をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ＰＥＲＰヒト化抗体発現ベクターを構築した（図１１）。
ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ８ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ７、ＨＶ４ＬＶ２、ＨＶ４ＬＶ３、ＨＶ８ＬＶ７、ＨＶ４ＬＶ７、ＨＶ４ＬＶ５−２、ＨＶ５−２ＬＶ４、ＨＶ５−３ＬＶ４およびＨＶ４ＬＶ４の１１種類のＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体を作製した。
（５）抗ＰＥＲＰヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得
抗ＰＥＲＰヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、実施例１（２）−２および（３）に記載の方法と同様にして行った。【０２０７】
（実施例４）  Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体の活性評価
（１）ヒトＰＥＲＰ（ｈＰＥＲＰ）発現細胞の作製
参考例１（１）と同様にして、ｐｃＰＥＲＰｍＨを用いてＣＨＯ／ＤＧ４４（ＫＣ８６１）の形質転換株を作製した。その結果、ｈＰＥＲＰを中程度発現する形質転換株（ＫＣ１３５９）、および高発現している形質転換株（ＫＣ９０３３）を取得した。【０２０８】
（２）  膜表面上のＰＥＲＰへの結合性（蛍光抗体法）
実施例３（５）で精製したＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体の、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現しているＣＨＯ／ＰＥＲＰ（ＫＣ１３５９）あるいは実施例１（１）で用いているＰＣ９細胞に対する結合活性を、蛍光抗体法を用いて、下記のように実施した。【０２０９】
１ウェル当たり２‐３×１０５個のＣＨＯ／ＰＥＲＰあるいはＰＣ９細胞を９６ウェルＵ字プレートに分注し、各Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体をＦＣＭ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて１０μｇ／ｍＬから２倍希釈で８段階に希釈した改変抗体を１００μＬ／ウェルで分注し、あるいは１０μｇ／ｍＬから５倍希釈で８段階に希釈した改変抗体を１００μＬ／ウェルで分注して、氷中で３０分間反応した。ＦＣＭ用緩衝液で１回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ベックマン・コールター社製）をＦＣＭ用緩衝液にて５０倍に希釈した溶液を１００μＬ／ウェルで加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、ＦＣＭ用緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。陽性対象として、参考例２記載の抗ＰＥＲＰヒト型キメラ抗体ＫＭ３４８１、あるいは実施例１で作製したＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト型キメラ抗体ＫＭ３８２１（ＫＭ３８２１）を用いた。
その結果、ＫＭ３８２１のＣＤＲを単にヒトフレームワークに移植したＨＶ０ＬＶ０、およびＬ鎖のみアミノ酸改変を加えたＨＶ０ＬＶ７は、ＣＨＯ／ＰＥＲＰに対する結合活性が殆ど無かったが、Ｈ鎖のアミノ酸改変を加えたＨＶ８ＬＶ０は、ＫＭ３８２１の約１／５まで結合活性が増加した（図１２−Ａ）。更に、アミノ酸改変残基数を減らし、Ｈ鎖Ｌ鎖両方にアミノ酸改変を加えたＨＶ４ＬＶ２およびＨＶ４ＬＶ３では、ＨＶ８ＬＶ０と同等まで結合活性が増加した（図１２−Ｂ）。【０２１０】
更に、アミノ酸改変残基数を増やしたＨＶ４ＬＶ７、ＨＶ８ＬＶ７では、ＨＶ４ＬＶ３よりも活性が増加し、いずれの抗体ともＫＭ３８２１と同等の結合活性を有していた（図１３−Ａ）。【０２１１】
これらの結果から、ＨＶ４ＬＶ３で改変しているＬ鎖のアミノ酸改変残基Ｌ４６Ｆ７０Ｌ７７以外の、Ｇ３Ｔ５Ｙ３５Ａ４２のアミノ酸改変、あるいはＨＶ４で改変しているアミノ酸Ｇ２７Ｐ４１Ｖ７２Ａ９７以外のＳ３０Ｋ４４Ｇ４５Ｉ４９のアミノ酸改変が、活性上昇に関与する可能性が考えられたため、以下のようにＶＨに更なるアミノ酸改変を行った抗ＰＥＲＰヒト化抗体の結合活性を測定した。【０２１２】
その結果、ＨＶ５−２ＬＶ４、ＨＶ５−３ＬＶ４、ＨＶ４ＬＶ４およびＨＶ４ＬＶ５−２では、いずれもＨＶ４ＬＶ３よりも活性が増加し、ＫＭ３８２１と同等の結合活性を有していた（図１３−Ｃ）。この中で、最もアミノ酸改変残基数が少ないＨＶ４ＬＶ４は、ＨＶ４ＬＶ３のアミノ酸改変にＬ鎖のＹ３５からＦ３５へのアミノ酸改変を加えた可変領域であり、Ｙ３５のアミノ酸改変が、Ｎ型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体の活性上昇に大きく関与していることが明らかとなった。また、ヒト肺癌細胞株ＰＣ−９に対する結合活性も同様な反応性を有していた（図１４−Ａ，Ｂ，Ｃ）【０２１３】
（３）  改変抗体のＡＤＣＣ活性
以下の方法を用いて、改変抗体であるＨＶ５−２ＬＶ４、ＨＶ５−３ＬＶ４、ＨＶ４ＬＶ４およびＨＶ４ＬＶ５−２のＡＤＣＣ活性のＡＤＣＣ活性の測定を行った。【０２１４】
（３−１）  標的細胞溶液の調製
ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３およびヒト肺癌細胞株ＰＣ−９は、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地［１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を用いて培養を行い、ヒトＰＥＲＰ発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（ＫＣ１３５９およびＫＣ９０３３）はＩＭＤＭ−ＣＨＯ培地［１０％ＦＣＳ、１×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８（ナカライテスク社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を用いて培養した。各細胞を拡大培養後、遠心分離操作および懸濁によりＡＤＣＣ活性測定用培地であるＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１）［１％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］で洗浄した後、ＡＤＣＣ活性測定用培地によって、細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、標的細胞溶液とした。【０２１５】
（３−２）  エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を用いて添付の使用説明書に従い、単核球（ＰＢＭＣ）画分を分離した。分離したＰＢＭＣ画分は、ＡＤＣＣ活性測定用培地で遠心分離して２回洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。【０２１６】
（３−３）  ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に上記（２）−１で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）−２で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（エフェクター細胞と標的細胞の比が２０：１になるように希釈したもの）を添加した。更に、改変抗体をＡＤＣＣ活性測定用培地で、３μｇ／ｍＬから５倍希釈で８段階希釈したものを５０μＬ加え、全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用い、反応終了の４５分前に２０μＬの９％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加して細胞を破壊し、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。尚、対照としてＫＭ３８２１を用いて、実施例２と同様にしてＡＤＣＣ活性を測定した。【０２１７】
その結果、今回作製し、ＣＨＯ／ＰＥＲＰに対する結合活性が、ＫＭ３８２１と同等であったＨＶ８ＬＶ７、ＨＶ５−３ＬＶ４およびＨＶ４ＬＶ４は、いずれの抗体もＫＭ３８２１と同等のＡＤＣＣ活性を有していた。更に、ＡＤＣＣ活性は、ヒト肺癌細胞株（図１５）、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３（図１６）およびＣＨＯ／ＰＥＲＰ高発現細胞株（ＫＣ９０３３）（図１７）いずれの標的細胞においても、ＫＭ３８２１と同等であった。しかし、ＨＶ５−２ＬＶ４は、ＫＭ３８２１と比べて、わずかにＡＤＣＣ活性が低い傾向が認められた。【０２１８】
（実施例５）  ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識する、ＫＭ３８２１のエピトープ解析
（１）変異ＰＥＲＰ発現ベクターの構築
ヒトＰＥＲＰとマウスＰＥＲＰの細胞外領域ループ１あるいはループ２のアミノ酸残基を比較し、アミノ酸残基の異なる部分をマウスのアミノ酸残基に改変するため、参考例１で作製したヒトＰＥＲＰ発現ベクターｐｃＰＥＲＰｍＨを鋳型にして、アミノ酸変異有するプライマーおよびｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターに特異的なプライマー（配列番号１１２あるいは１１３）を用いて、各変異ＰＥＲＰ発現ベクターを作製した（図１８）。アミノ酸残基改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、マウスＰＥＲＰ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０７１３１５）で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、以下、特に記載の無い場合、９４℃  ３０秒間、５８℃  ３０秒間、７２℃  ６０秒間のサイクルを２５−３５サイクルのＰＣＲ反応で反応させた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。また、以下で使用した合成オリゴＤＮＡはファスマック社製のものである。以下において、改変するアミノ酸残基はアルファベット一文字で標記し、右上に改変するアミノ酸残基の番号を記載した。【０２１９】
（ａ）Ｄ４０Ｇ４２Ｋ５０Ｓ５２Ｑ５３Ｅ６２Ｅ６３をＮ４０Ｉ４２Ｒ５０Ｆ５２Ｄ５３Ｄ６２Ｄ６３へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ｍＬ−１）
参考例１で作製されたｐｃＰＥＲＰｍＨを鋳型として、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０３）を用いてＰＣＲ反応を行い、１．５％アガロース電気泳動を行い約０．３ｋｂｐの遺伝子断片を、Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出し、５’−ｍＬ−１遺伝子断片を取得した。同様にして、ｐｃＰＥＲＰｍＨを鋳型として、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１３）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０２）を用いてＰＣＲ反応を行い、約０．７ｋｂｐの３’−ｍＬ−１遺伝子断片を取得した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅させた約０．８ｋｂｐの遺伝子断片ををＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。抽出後、特異的な制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで酵素処理を行い、アガロース電気泳動を行い、約０．７ｋｂｐの遺伝子断片を上記と同様に抽出した。取得した遺伝子断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１＋の適切な位置に挿入し、目的の遺伝子（配列番号９６）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍＬ−１を取得した。【０２２０】
（ｂ）Ｔ１３８Ａ１４１Ｔ１４６をＲ１３８Ｄ１４１Ｎ１４６へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ｍＬ−２）
（ａ）と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０５）を用いて、約０．６ｋｂｐの５’−ｍＬ−２遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１３）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０４）を用いて、約０．４ｋｂｐの３’−ｍＬ−２遺伝子断片を作製した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号９７）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍＬ−２を取得した。【０２２１】
（ｃ）Ｄ４０Ｇ４２Ｋ５０Ｓ５２Ｑ５３Ｅ６２Ｅ６３Ｔ１３８Ａ１４１Ｔ１４６をＮ４０Ｉ４２Ｒ５０Ｆ５２Ｄ５３Ｄ６２Ｄ６３Ｒ１３８Ｄ１４１Ｎ１４６へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ｍＰＥＲＰ）
（ｂ）で作製したｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍＬ−２を鋳型にして、（ａ）と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０３）を用いてＰＣＲ反応を行い、約０．３ｋｂｐの５’−ｍＰＥＲＰ遺伝子断片を作製し、同様にｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍＬ−２を鋳型として、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１３）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０２）を用いてＰＣＲ反応を行い、約０．７ｋｂｐの３’−ｍＰＥＲＰ遺伝子断片を取得した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号９８）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍＰＥＲＰを取得した。【０２２２】
（ｄ）Ｄ４０Ｇ４２をＮ４０Ｉ４２へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ＤＧ）
（ａ）と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０７）を用いて、約０．３５ｋｂｐの５’−ＤＧ遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０６）を用いて、約０．７ｋｂｐの３’−ＤＧ遺伝子断片を作製した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号９９）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ＤＧを取得した。【０２２３】
（ｅ）Ｋ５０Ｓ５２Ｑ５３をＲ５０Ｆ５２Ｄ５３へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ＫＳＱ）
（ａ）と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０９）を用いて、約０．４ｋｂｐの５’−ＫＳＱ遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１３）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１０８）を用いて、約０．６ｋｂｐの３’−ＫＳＱ遺伝子断片を作製した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号１００）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ＫＳＱを取得した。【０２２４】
（ｆ）Ｅ６２Ｅ６３をＤ６２Ｄ６３へ改変した変異ＰＥＲＰ（以下、ＥＥ）
（ａ）と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１２）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１１１）を用いて、約０．４ｋｂｐの５’−ＥＥ遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配列番号１１３）と、ＰＥＲＰ遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１１０）を用いて、約０．６ｋｂｐの３’−ＫＳＱ遺伝子断片を作製した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号１１２、１１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子（配列番号１０１）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ＥＥを取得した。【０２２５】
（２）サルＰＥＲＰ遺伝子クローニング
国立感染症研究所カニクイザルｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＰＥＲＰ遺伝子配列を検索子にして検索を行った結果、カニクイサル延髄由来ｃＤＮＡクローン（ＱｍｏＡ−１１４６４）と高い相同性を示した。この遺伝子から予測されるアミノ酸配列（配列番号１１６）から、サルＰＥＲＰ細胞外領域ループ１およびループ２に、ヒトＰＥＲＰヒトＰＥＲＰの細胞外領域と２つのアミノ酸が異なることが分かった。従って、サルＰＥＲ遺伝子をクローニングし、サルＰＥＲＰを発現させた細胞を構築した。【０２２６】
サルＰＥＲＰの遺伝子を含む発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を鋳型とし、特異的な制限酵素ＥｃｏＲＩおよび、ＨｉｎｄＩＩＩの配列を含む合成オリゴＤＮＡ（配列番号１１４，１１５）を用いて、ＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。タンパク質のＣ末端にＭｙｃタグおよびＨｉｓタグが挿入できる発現ベクターｐＢＳ−ｍｙｃＨｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、アミノ酸のコドンが適切に合うように挿入し、ｐＢＳ−ＰＥＲＰｔａｇを作製した。さらに、発現ベクターｐＢＳ−ＰＥＲＰｔａｇから、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を行い、得られた遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターの、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、目的のサルＰＥＲＰｍＨ（配列番号１１７）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１＋／ｍｏｎＰＥＲＰを取得した。【０２２７】
（３）変異ＰＥＲＰ発現細胞の構築
上記実施例５（１）で作製した各発現ベクターおよび参考例１で作製したヒトＰＥＲＰ発現ベクターｐｃＰＥＲＰｍＨを、エレクトロポレーション法によりＣＨＯ／ＤＧ４４（ＫＣ８６１）に遺伝子導入を行い、形質転換株の取得を行った。エレクトロポレ―ション後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）薬剤耐性を獲得した変異ＰＥＲＰ発現細胞を取得した。エレクトロポレ―ションを行った後、終濃度０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク社製）を添加し、１０−２０日間培養を行い、変異ＰＥＲＰが導入された各形質転換株、ＣＨＯ／ｈＰＥＲＰ、ＣＨＯ／ｍＰＥＲＰ、ＣＨＯ／ｍＬ−１、ＣＨＯ／ｍＬ−２、ＣＨＯ／ＤＧ、ＣＨＯ／ＫＳＱ、およびＣＨＯ／ＥＥを作製した。【０２２８】
（４）ＫＭ３８２１のヒトＰＥＲＰ発現細胞または変異ＰＥＲＰ発現細胞に対する反応性の検討
実施例３（５）で精製したＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰキメラ抗体の、上記実施例５（２）で作製したヒトＰＥＲＰあるいは変異ＰＥＲＰ形質転換株に対する結合活性を、蛍光抗体法を用いて、下記のように実施した。【０２２９】
（５）Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰヒト化抗体の反応
１ウェル当たり１‐３×１０５個の新鮮な各形質転換株、あるいは上記細胞内染色処理を行った形質転換細胞株に、各Ｎ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗ＰＥＲＰキメラ抗体をＦＣＭ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を、１００μＬ／ウェルで分注し、氷中で３０−６０分間反応した。ＦＣＭ用緩衝液で１回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ベックマン・コールター社製）をＦＣＭ用緩衝液にて５０倍に希釈した溶液を１００μＬ／ウェルで加えた。遮光し氷中で３０−６０分間反応後、ＦＣＭ用緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。【０２３０】
図１９中の細胞外染色における、各変異ＰＥＲＰに対するＫＭ３８２１の反応性は、ＫＭ３８２１のｈＰＥＲＰに対する反応性を１００％とした時の、各変異ＰＥＲＰあるいはサルＰＥＲＰに対する反応性（％）で示した。【０２３１】
その結果、ＫＭ３８２１は、マウスＰＥＲＰの細胞外領域を有するｍＰＥＲＰ、およびＰＥＲＰ細胞外領域のループ１のみがマウスのアミノ酸であるｍＬ−１にはまったく反応せず、ＰＥＲＰ細胞外領域のループ２のみがマウスのアミノ酸であるｍＬ−２には反応したことから、ヒトＰＥＲＰ細胞外領域のループ１に反応することが明らかになった（図１９）。更に、ＫＭ３８２１は、ＰＥＲＰ細胞外領域のループ１の中心部分にあたる５０番目、５２番目および５３番目がマウスのアミノ酸であるＫＳＱには反応するが、４０番目、４２番目がマウスのアミノ酸であるＤＧには、ｈＰＥＲＰに対する反応性に比べ１／１０以下まで、ＫＭ３８２１の反応性が低下し、また、６２番目、６３番目がマウスのアミノ酸であるＥＥでも、ｈＰＥＲＰに比べ約１／３までＫＭ３８２１の反応性が低下していた（図１９）。【０２３２】
一方、ＫＭ３８２１は、ＰＥＲＰ細胞外領域のループ１内の４２番目のアミノ酸と、ループ２内の１３８番目のアミノ酸が、ヒトＰＥＲＰのアミノ酸と異なるサルＰＥＲＰに対して、ｈＰＥＲＰと同等に反応したことから、４２番目と１３８番目のアミノ酸は、ＫＭ３８２１のｈＰＥＲＰに対する結合に対する影響は少ないと考えられる。【０２３３】
以上の結果から、ＫＭ３８２１は、ヒトＰＥＲＰ細胞外領域のループ１内の４０番目のＡｓｐを強く認識し、このアミノ酸残基と６２番目のＧｌｕ、６３番目のＧｌｕからなる、立体構造を認識していることが明らかになった（図１９および図２０）。
【０２３４】
（参考例１）  ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体の作製
（１）ＰＥＲＰ発現細胞の造成
ヒトＰＥＲＰ遺伝子を含むプラスミドＨＥＭＢＡ１００６３３５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＡＫ０７４５８５、１ｎｇ／μＬ）を１μＬ、１０×ＥｘＴａｑ  緩衝液２μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰを２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌの配列番号３９および配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ  ２μＬ、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．５μＬ、滅菌水１０．５μＬからなる溶液を、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応を２５サイクル、７２℃で７分間反応させた。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約０．６ｋｂの増幅断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。該断片と、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターとをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、ヒトＰＥＲＰ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＩＩ−ＰＥＲＰを取得した。【０２３５】
ＰＥＲＰ断片の３’末端側にｍｙｃ−Ｈｉｓタグ配列を付加するためのクローニングベクターとしてｐＢＳｍＨを以下のようにして作製した。
ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製］をＰｍｅＩで消化し、上記と同様にして約１７０ｂｐのｍｙｃ−Ｈｉｓタグをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。該断片と、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）で末端の平滑化を行ったｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）とをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により、連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドｐＢＳｍＨを取得した。ｐＢＳｍＨは、制限酵素ＸｂａＩで該プラスミドを消化し、約２．９ｋｂｐおよび約１６０ｂｐの２本の断片が生じた。【０２３６】
上記のｐＣＲＩＩ−ＰＥＲＰをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＥＲＰ遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＳｍＨとをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドｐＢＳ−ＰＥＲＰｍＨを取得した。【０２３７】
ｐＢＳ−ＰＥＲＰｍＨをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ＰＥＲＰ遺伝子およびｍｙｃ−Ｈｉｓタグをコードする遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、ヒトＰＥＲＰの発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨを取得した。【０２３８】
ｐｃＰＥＲＰｍＨは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により以下のようにしてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（６），５５５（１９８６）］へ導入した。
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジー社製）、１×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ライフテクノロジー社製）、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ライフテクノロジー社製）を添加したＩＭＤＭ培地（ライフテクノロジー社製）（以下、Ａ３培地と表記する）で培養したものを用いた。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｎｍｏｌ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム緩衝液］に懸濁して８×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、該細胞懸濁液２００μＬを上記発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨ  ４μｇと混和した。該混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（バイオラッド社製）装置を用いてパルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液をＡ３培地中に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。１日間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（カルビオケム社製）を添加したＡ３培地に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約２週間後に、Ｇ４１８に耐性を有する形質転換細胞株を取得した。【０２３９】
得られた形質転換細胞を１．２５細胞／ｍＬとなるよう０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を添加したＡ３培地で希釈後、９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注して、限界希釈法によるクローニングを行った。
上記で取得された形質転換細胞  １〜５×１０５個を１５μＬの１×ＰＡＧＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解して９５℃で５分間処理し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（ＭＢＬ社製）を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、検出はＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。
図５に結果を示した。分子量２５ｋＤａ付近にシグナルが認められた株をＰＥＲＰ発現株（以下、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞と表記する）とした。【０２４０】
（２）  モノクローナル抗体の作製
（２）−１  免疫原の調製
上記（１）で造成したＰＥＲＰ発現株を１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養後、１匹あたりの細胞数が６×１０６個から１×１０７個の細胞数となるようにＰＢＳに懸濁した。【０２４１】
（２）−２  動物の免疫と抗体産生細胞の調製
参考例１（２）−１で調製した細胞を、百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス３匹に投与した。投与１週間後より、毎週１回、計５回投与した。該マウスの眼底より部分採血し、その血中抗体価を以下に示す細胞を用いた蛍光抗体染色法を行い、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）およびフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定し、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。【０２４２】
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。【０２４３】
（２）−３  細胞を用いた蛍光抗体染色法（ＦＭＡＴ：Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
アッセイ用の細胞は参考例１（１）で造成したＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地［インビトロジェン社］で２〜３日培養し、Ｔｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製）で剥離した細胞を同一の培地に懸濁し、ＦＭＡＴ用黒色９６ウエルプレートに７×１０３個／１００μＬ培地／ウェルで播種し、１晩培養した。該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を５μＬ／ウェルで分注し、二次抗体としてＡＬＥＸＡ６４７標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、遮光下で４時間放置した。レーザー光６３３ｎｍＨｅ／Ｎｅで励起される  ６５０ｎｍ〜６８５ｎｍの波長をＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）で測定した。【０２４４】
（２）−４  細胞を用いた蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）
アッセイ用の細胞は参考例１（１）で造成したＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養し、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離した細胞をＰＢＳで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、氷温中で２０分ブロッキングした。１×１０６個／１００μＬ／ＢＳＡ−ＰＢＳとなるように９６ウェルＵ字プレートに分注し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、２分間）した後、上清を除いて一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、氷温中で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、二次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ社製）を２０μＬ／ウェル加えて氷温で遮光下、３０分間反応させた。再びＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍＡｒで励起される５１０〜５３０ｎｍの波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。【０２４５】
（２）−５  マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１：Ｐ３−Ｕ１［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９７：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。【０２４６】
（２）−６ハイブリドーマの作製
上記（２）−２で得られたマウス脾細胞と（２）−５で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８マウス脾細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。【０２４７】
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、培養上清を本参考例（２）−３および（２）−４に記載した蛍光抗体染色で調べ、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に反応してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に反応しないウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰ抗体産生ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８６４３）を確立した。【０２４８】
図６には、ハイブリドーマＫＭ３４１１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体の、ＦＭＡＴ法におけるＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対する反応性を示した。ハイブリドーマＫＭ３４１１が生産するモノクローナル抗体ＫＭ３４１１は、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞にのみ特異的に反応した。【０２４９】
（２）−７  モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に参考例１（２）−５で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）した。【０２５０】
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製することにより取得した。サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により、精製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のサブクラスを決定したところ、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のサブクラスはＩｇＧ１であった。【０２５１】
（２）−８  モノクローナル抗体の反応性の検討―蛍光細胞染色（フローサイトメトリー）
上記（２）−４  に示した方法に従って行なった。結果を図７に示す。ＫＭ３４１１はＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞および大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に反応して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＰＥＲＰｍＲＮＡが発現してないＰＣ１には反応しなかった。【０２５２】
（参考例２）  ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰキメラ抗体の作製
（１）  ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗ＰＥＲＰマウス抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析【０２５３】
（１）−１  抗ＰＥＲＰマウス抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
参考例１に記載のハイブリドーマＫＭ３４１１より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞４×１０７細胞より約３９μｇのｍＲＮＡを調製した。【０２５４】
（１）−２  抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
上記（１）−１で取得した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のｍＲＮＡの１μｇから、ＢＤ  ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、５’側にキット添付のＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＩＩＴＭ  Ａ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を有するｃＤＮＡを取得した。そのｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡｍｉｘと、配列番号４１で示したマウスＩｇ（γ）特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行いＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。またＩｇ（γ）特異的プライマーの代わりに配列番号４２で示したマウスＩｇ（κ）特異的プライマーを用いてＰＣＲを行いＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０２５５】
ＰＣＲは、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、７０℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを３０回それぞれ行った後、７２℃で１０分間反応させた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はＨ鎖、Ｌ鎖共に約５００ｂｐのサイズであった。【０２５６】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定するため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡを約０．０５ｐｍｏｌと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．５ｐｍｏｌをＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを６μＬ、制限酵素ＳｍａＩを０．３μＬ入れ合計１２．３μＬとし、２２℃で一晩、反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用い添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４が取得された。【０２５７】
（１）−３  抗ＰＥＲＰマウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号４３に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を配列番号３７に、プラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号４４におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号３８にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較、並びに精製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号３７に記載のアミノ酸配列の１から１８番目が、Ｌ鎖については配列番号３８に記載のアミノ酸配列の１から２２番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。【０２５８】
次に、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］により検索した。その結果、ＶＨ、ＶＬともに完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。【０２５９】
また、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３、４５および５に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示した。【０２６０】
（２）  抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（２）−１  抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と上記（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９およびｐＫＭ３４１１Ｌ＃４を用いて抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を以下のようにして構築した。【０２６１】
抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法によって得るために配列番号４６と４７の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、ＶＬをコードするｃＤＮＡを得るために配列番号４８と４９の塩基配列を有する合成ＤＮＡをそれぞれ設計、合成した。それぞれの合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）は５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。上記（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号４６と４７に示される塩基配列の合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応サイクルを２５サイクル行った。同様に、参考例２（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号４８と４９でそれぞれ示される塩基配列の合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記の方法でＰＣＲを行なった。該反応液４０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４７ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物、約０．４５ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。【０２６２】
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したＤＮＡ０．０５ｐｍｏｌと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．５ｐｍｏｌを滅菌水に加えて１０μＬとし、さらにＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）１０μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．５μＬを加えて２２℃で一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する図８に示したプラスミドｐＫＭ３４１１ＶＨ９およびｐＫＭ３４１１ＶＬ１１が得られたことを確認した。【０２６３】
次にヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と上記で得られたｐＫＭ３４１１ＶＬ１１をそれぞれ制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）で消化後、引き続き制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化した。消化後の反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４５ｋｂのＶＬのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片と、約１２．７ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ回収した。【０２６４】
得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片が挿入された、図９に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬが得られたことを確認した。【０２６５】
次に、上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬとｐＫＭ３４１１ＶＨ９をそれぞれ制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）で消化後、引き続き制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した。消化後の反応液をアガロースゲル電気泳動した後、約１３．２ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片、約０．４７ｋｂのｐＫＭ３４１１ＶＨ９由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片が挿入された、図９に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１が得られたことを確認した。該プラスミドに関して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００により塩基配列を解析した結果、目的のＫＭ３４１１のＶＨをコードするｃＤＮＡおよびＶＬをコードするｃＤＮＡがそれぞれクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。【０２６６】
（２）−２  抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞での発現
上記（２）−１で得られた抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を用いて抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１が導入された形質転換株ＫＭ３４８１を取得した。【０２６７】
（３）  精製抗体の取得
上記（２）−２で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。得られた培養上清よりＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を精製した。【０２６８】
得られた抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（ＡＴＴＯ社製、カタログ番号：Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を対照として同時に泳動した。
結果を図１０に示した。精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の１本のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致し、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のアミノ酸配列は配列番号２９に示される。
【産業上の利用可能性】
【０２６９】
本発明によると、Ｖ領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または抗体断片、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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