(57)【要約】本発明はＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させることを含む、ＲＮＡポリメラーゼをユビキチン化する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させることを含む、当該ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法。
【請求項２】
ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットがＲＰＢ８である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＰＢ８のアミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることを特徴とする、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１によるユビキチン化を抑制する方法。
【請求項４】
細胞内のＲＰＢ８のアミノ酸配列を変異させてＲＰＢ８のユビキチン化を抑制することにより、当該細胞に、ＤＮＡ損傷環境に対する感受性を付与することを特徴とする、ＤＮＡ損傷環境に対する感受性細胞を作製する方法。
【請求項５】
ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１又はその遺伝子を含む医薬組成物。
【請求項６】
癌を治療するための請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼのユビキチン化の分野に関し、特にユビキチン化を制御するＢＲＣＡ１の機能に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌および卵巣癌の抑制タンパク質であるＢＲＣＡ１は  癌の進行を防止する多くの細胞経路のハブタンパク質として働く。乳癌に関する生涯リスクのおよそ８０％が、生殖系列におけるこの重要な遺伝子の変異が原因である（Ｋｉｎｇら、２００３）。従って、他のメカニズムによるこのタンパク質のダウンレギュレーションが散発性の乳癌を引き起こすことを想像するのは難しくない（Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら、２００３；ＣａｔｔｅａｕおよびＭｏｒｒｉｓ、２００２）。ＢＲＣＡ１を欠損しているすべての細胞は、ＤＮＡ損傷、染色体異常の存在、および多数の遺伝子座におけるヘテロ接合性の消失への過敏性によって明らかなようにゲノム不安定性を示す（Ａｌ−ＷａｈｉｂｙおよびＳｈｉｊｅｐｃｅｖｉｃ、２００５；Ｘｕら、１９９９）。これらの結果は、ＤＮＡ損傷の修復、転写制御、アポトーシス誘導、Ｓ期中またはＧ２−Ｍ期のチェックポイント機能、および中心体複製の制御において機能するＢＲＣＡ１の欠損から生じた可能性が高い（Ｄｅｎｇ、２００２；Ｏｈｔａ及びＦｕｋｕｄａ、２００４；Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ、２００２；Ｚｈｅｎｇら、２０００）。ＢＲＣＡ１を介した複雑な細胞機構を解読することは、乳癌および卵巣癌の発癌を理解する上で、さらに言い換えるとこれらの癌の効果的な治療法を開発する上で、必須のステップである。
ＢＲＣＡ１が多数の細胞経路に関与することは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）としての酵素的機能により理論的に示された。この酵素的機能について、ＢＲＣＡ１は多数のタンパク質基質と相互作用する可能性を有し、さらに、多くの点で細胞の生物学的反応に影響する可能性を有する。ＢＲＣＡ１は、ユビキチンリガーゼに見られる共通モチーフであるＮ末端のＲＩＮＧフィンガードメインを含む。
ＢＲＣＡ１は、ＲＩＮＧヘテロダイマーとして高次構造的に類似する別のＲＩＮＧフィンガータンパク質であるＢＡＲＤ１に結合した場合に、重要なユビキチンリガーゼ活性を獲得する（Ｂａｅｒ及びＬｕｄｗｉｇ、２００２；Ｂｒｚｏｖｉｃら、２００３；Ｃｈｅｎら、２００２；Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｍａｌｌｅｒｙら、２００２）。ユビキチンリガーゼは、酵素Ｅ１およびＥ２により連続的に活性化されたユビキチン分子を用いてイソペプチド結合を介して基質タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の形成を触媒する（ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、１９９８）。最も一般的なポリユビキチン鎖は、ほとんどの場合でユビキチンのＬｙｓ４８に結合し、プロテアソーム依存性タンパク質分解経路による速やかな基質の分解のシグナルとして機能する（Ｃｈａｕら、１９８９）。しかしながら、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１は、Ｌｙｓ６結合性のポリユビキチン鎖の生成を触媒する特殊な機能を有している（Ｍｏｒｒｉｓ及びＳｏｌｏｍｏｎ、２００４；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４；Ｗｕ−Ｂａｅｒら、２００３）。これらの鎖はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて２６Ｓプロテアソームによって認識されるが、分解のためではなく、ユビキチンアルデヒドに対して感受性を有し、脱ユビキチン化するためである（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４）。自己ユビキチン化したＢＲＣＡ１を含む、ＢＲＣＡ１のＬｙｓ６結合性ユビキチン化の基質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、分解されずに安定化することが示された（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｓａｔｏら、２００４）。これらの知見は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を介したユビキチン化が、分解以外のプロセスへのシグナルとなることができるという可能性を示唆する。
家族性乳癌で発見されたＢＲＣＡ１のＲＩＮＧフィンガードメインにおける有害なミスセンス変異は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のＥ３リガーゼ活性を失わせるものである（Ｂｒｚｏｖｉｃら、２００３；Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｒｕｆｆｎｅｒら、２００１）。そしてこのことは、Ｅ３リガーゼ活性がＢＲＣＡ１の癌抑制タンパク質としての役割を果たすために重要であることを示している。
ＢＲＣＡ１の最も重要な機能的特徴の一つは、それがＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）ホロ酵素の構成要素であることである（ＣｈｉｂａおよびＰａｒｖｉｎ、２００２；Ｓｃｕｌｌｙら、１９９７ａ）。非損傷細胞においては、ＢＲＣＡ１は、プロモーターで見出された低リン酸化ｐｏｌ  ＩＩ（ＩＩＡ）よりもむしろ高リン酸化された進行的ｐｏｌ  ＩＩ（ＩＩＯ）の大部分と特異的に相互作用する（Ｋｒｕｍら２００３）。ＤＮＡ障害を受けると、ＢＲＣＡ１はＡＴＭ／ＡＴＲファミリーキナーゼによりリン酸化され（Ｃｏｒｔｅｚら、１９９９；Ｔｉｂｂｅｔｔｓら、２０００）、進行的ｐｏｌ  ＩＩ複合体から解離する（Ｋｒｕｍら、２００３）。続いて、リン酸化ＢＲＣＡ１は、Ｒａｄ５０−Ｍｒｅ１１−Ｎｂｓ１修復複合体、又は、Ｒａｄ５１またはＰＣＮＡと協同し、損傷したＤＮＡを修復する（Ｓｃｕｌｌｙら、１９９７ｂ；Ｚｈｏｎｇら、１９９９）。
ＢＲＣＡ１は、ゲノムスキャニング機能の一部として、ｐｏｌ  ＩＩＯ複合体と結合することが提唱されてきた（Ｌａｎｅ、２００４）。しかしながら、仮にそのようなことがあったとしても、ＤＮＡ損傷後ＢＲＣＡ１が修復機構へ移行する前の初期段階の間に、ＢＲＣＡ１がｐｏｌ  ＩＩ複合体にどの程度影響するのかは解明されていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法、ユビキチン化を抑制する方法、及びＤＮＡ損傷に対する感受性細胞を樹立する方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＲＩＮＧフィンガータンパク質であるＢＲＣＡ１と別のＲＩＮＧフィンガータンパク質であるＢＡＲＤ１とのヘテロダイマー（ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１）が各種ＲＮＡポリメラーゼに共通するサブユニットをユビキチン化することを見出した。また、本発明者は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットのアミノ酸配列を変異させると上記ユビキチン化を抑制し得ることを見出した。さらに、このようにユビキチン化を抑制すると、紫外線（ＵＶ）などによるＤＮＡ損傷環境に対し感受性を付与することを見出した。本発明は、このような知見により完成されたものである。すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）ＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させることを含む、当該ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法。
ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットとしては、ＲＰＢ８が挙げられる。
（２）ＲＰＢ８のアミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることを特徴とする、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１によるユビキチン化を抑制する方法。
（３）細胞内のＲＰＢ８のアミノ酸配列を変異させてＲＰＢ８のユビキチン化を抑制することにより、当該細胞に、ＤＮＡ損傷環境に対する感受性を付与することを特徴とする、ＤＮＡ損傷環境に対する感受性細胞を作製する方法。
（４）ＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させることを含む、癌の治療方法。
上記癌の治療は、当該ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化することにより生体内に抗癌活性が付与される点を利用するものである。
（５）ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を含む医薬組成物。
（６）ＢＲＣＡ１をコードする遺伝子及びＢＡＲＤ１をコードする遺伝子を含む医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、癌の治療に使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１はエピルビシン処理によって影響を受けるタンパク質のスクリーニング結果を示す図である。
Ｔ４７Ｄ細胞（パネルＡおよびＢ）およびＨＣＣ１９３７細胞（パネルＣおよびＤ）を、全く処理しないか、あるいは０．２μｇ／ｍｌのエピルビシンで３時間処理し、それぞれ７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素含有緩衝液で溶解した。エピルビシンで処理していない細胞、およびエピルビシンで処理した細胞から得たタンパク質（５０μｇ）を蛍光色素Ｃｙ３（パネルＡおよびＣ）およびＣｙ５（パネルＢおよびＤ）でそれぞれ標識した。標識したサンプルを共に混合し、２Ｄゲル（ｐＨ幅は左から右に３−１０）で分離し、蛍光イメージアナライザーでスキャンした。黄色矢印はタンパク質のスポットを示しており、そのスポットのレベルはエピルビシン処理により大きく変化した。赤矢印は、エピルビシン処理によってＴ４７Ｄ細胞でのみ著しく減少したタンパク質を示している。ゆっくり移動したタンパク質はＲＰＢ８と同定し、速く移動したタンパク質はミオシン軽鎖と同定した。
図２はエピルビシン処理後のＲＰＢ８修飾について免疫ブロッティングを行った結果を示す図である。
Ａ：Ｔ４７Ｄ細胞またはＨＣＣ１９３７細胞を、処理しない（対照）か、あるいは０．２μｇ／ｍｌのエピルビシンで３時間処理し、それぞれ７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素含有緩衝液で溶解した。溶解液（５００μｇ）を２Ｄゲル（ｐＨ幅３−１０）で分離した。ゲルの一部は抗ＲＰＢ抗体で免疫ブロッティングに供した。矢印はＲＰＢ８を示している。
Ｂ：Ｔ４７Ｄ細胞またはＨＣＣ１９３７細胞を０．２μｇ／ｍｌのエピルビシンで所定時間処理し、０．５％ＮＰ−４０含有緩衝液で溶解し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後抗ＲＰＢ８抗体または抗チューブリン抗体で免疫ブロッティングを行った。
図３はＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１との相互作用について免疫ブロッティングを行った結果を示す図である。
Ａ：トランスフェクトしたＲＰＢ８はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と相互作用する。２９３Ｔ細胞に所定のプラスミドをトランスフェクトした。全細胞溶解液（上部３パネル）または免疫沈降物（下部３パネル）を、所定の抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。抗ＨＡ／Ｍｙｃ抗体は抗ＨＡ抗体で免疫ブロッティング及びそれに続く抗Ｍｙｃ抗体でのリプローブを指定する。
Ｂ：内在性ＲＰＢ８はＢＡＲＤ１と相互作用する。所定の細胞株から調製した細胞溶解液を抗ＲＰＢ１抗体、抗ＲＰＢ８抗体、または抗ＲＰＢ８についての免疫前ウサギ血清（Ｐｒｅ）を用いて免疫沈降させ、所定の抗体を使用した免疫ブロッティングにより分析した。
Ｃ：ＲＰＢ８とＢＡＲＤ１とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相互作用。Ｈｉｓ−ＢＡＲＤ１１４−１８９（４μｇ）を４μｇのＧＳＴ又はＧＳＴ−ＲＰＢ８と混合し、グルタチオンビーズと２時間インキュベートし、続いて十分に洗浄した。ビーズに結合したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色を行った。
Ｄ：ＵＶ照射後、ＲＰＢ８はＢＲＣＡ１と相互作用する。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、未処理（レーン１）のもの、又はＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）してから５分後（レーン２）、１０分後（レーン３）、６０分後（レーン４）または３６０分後（レーン５）に回収したものを用いた。全細胞溶解液（上部２つのパネル）または抗ＲＰＢ抗体の免疫沈降物（下部３つのパネル）を所定の抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。矢印は、修飾された形態のＢＲＣＡ１を示しており、矢じりはストレート免疫ブロッティングにおけるＢＲＣＡ１の通常の移動位置を示している。アステリスク：非特異的な反応生成物。
Ｅ：Ｔ４７Ｄ細胞は、未処理のもの（レーン１）またはＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）から１０分後に回収したもの（レーン２および３）を用いた。抗ＲＰＢ８抗体（レーン１および２）または免疫前動物から得た抗体（レーン３）で免疫沈降した細胞溶解液は、所定の抗体で免疫ブロッティングにより分析した。
Ｆ：Ｔ４７Ｄ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ（レーン１−３）またはＢＲＣＡ１のｓｉＲＮＡ（レーン４−６）のいずれかをトランスフェクトした。細胞はＭｏｃｋ処理を施したもの（レーン１及び４）、またはＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）から１０分後（レーン２及び５）または６０分後（レーン３及び６）に回収したものを用いた。全細胞溶解液（上部２つのパネル）または抗ＲＰＢ８抗体の免疫沈降物（下部２つのパネル）を所定の抗体を用いて免疫ブロッティングにより分析した。
ＩＰ：免疫沈降物、ＩＢ：免疫ブロッティング
図４は、ＲＰＢ８のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるユビキチン化及び安定化について免疫ブロッティングを行った結果を示す図である。
Ａ：所定のプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を１％ＳＤＳ溶解緩衝液中で煮沸し、０．１％ＳＤＳに希釈し、抗ＦＬＡＧ抗体架橋ビーズを用いて免疫沈降した。ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をＦＬＡＧペプチドで溶出し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。
Ｂ：ＲＰＢ８のポリユビキチン化は図に示す一個のＬｙｓ残基を有するＨＡ−Ｕｂをトランスフェクトしたことを除き、Ａと同様の方法で検出した（レーン１−３）。細胞溶解液の一部を、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロッティングに供し、タンパク質発現の対照として細胞内の全ＨＡ−Ｕｂ結合タンパク質を検出した（レーン４−６）。
Ｃ：ｐ１００プレート中の２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をコードするプラスミド（レーン１−４、０．３μｇ）、並びに量を増加させたＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２およびＨＡ−ＢＡＲＤ１（レーン２、２μｇ；レーン３、４μｇ；レーン４、７．３５μｇ）をトランスフェクトした。全プラスミドＤＮＡの量を、空のｐｃＤＮＡ３ベクターを加えることにより、プレート当たり１５μｇになるよう調整した。各タンパク質の定常状態レベルを、抗Ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、又は抗チューブリン抗体を用いて分析した。
Ｄ：２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をコードするプラスミド（０．２μｇ）、並びに空のｐｃＤＮＡ３ベクター（２μｇ、上部パネル）又はＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１プラスミド（それぞれ１μｇ、下部パネル）のいずれか一つをトランスフェクトした。細胞はシクロヘキサミド（１０μＭ）中でインキュベートし、所定時間追跡した。細胞溶解液は、次に抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫ブロッティングした。
ＩＰ；免疫沈降物、ＩＢ；免疫ブロッティング、アステリスク；ＩｇＧ
図５は、ＵＶ照射に対する反応におけるＲＰＢ８のＢＲＣＡ１依存性ポリユビキチン化について免疫ブロッティングをした結果を示す図である。
Ａ：野生型（レーン１−３）又はＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体（レーン４−６）を安定発現するＨｅＬａ細胞株をＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）し、照射して所定時間後に回収した。ユビキチン化したＲＰＢ８は、抗ユビキチン抗体を免疫ブロッティングに用いた点を除いて、図４Ａで示した方法と同様の方法で検出した（上部パネル）。膜は抗ＲＰＢ８抗体でリプローブした（下部パネル）。
Ｂ：野生型ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を安定発現するＨｅＬａ細胞株に、対照ｓｉＲＮＡ（レーン１）またはＢＲＣＡ１用ｓｉＲＮＡ（レーン２）のトランスフェクション、または対照ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスの感染（レーン３）、あるいはＢＲＣＡ１用ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスの感染（レーン４）のいずれかを行った。次に細胞をＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）し、照射から１０分後に回収した。細胞を１％ＳＤＳ緩衝液中で煮沸し、抗ＢＲＣＡ１抗体（上部パネル）または抗チューブリン抗体（中部パネル）のいずれかを用いた免疫ブロッティング、あるいはＡと同様の方法によるＲＰＢ８ユビキチン化の検出（下部パネル）に供した。
ＩＰ：免疫沈降物、ＩＢ：免疫ブロッティング、アステリスク：ＩｇＧ
図６はユビキチン抵抗性ＲＰＢ８変異体の構築およびそのＲＮＡポリメラーゼ活性試験の結果を示す図である。
Ａ：ＲＰＢ８変異体のコンストラクト。図示する通り、ＲＰＢ８のＬｙｓ（Ｋ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基に置換した。
Ｂ：Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＢＡＲＤ１、ＨＡユビキチンを、野生型又は変異型ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を用いて２９３Ｔ細胞のいずれかにコトランフェクトした。ＲＰＢ８のポリユビキチン化は図４Ａに示したのと同様の方法で検出した。
Ｃ：２９３Ｔ細胞に、空のｐｃＤＮＡ３ベクター（−）、野生型またはＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体をトランスフェクトした。全細胞溶解液（上部４つのパネル）又は等量の全細胞溶解液から生成した抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降（下部３つのパネル）を、所定の抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
Ｄ：図Ｃで示した方法で得た抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物を、４５ヌクレオチドのＲＮＡ転写産物を生成するよう設計された鋳型二本鎖ＤＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏラン−オフ転写アッセイに供した。放射標識したＲＮＡ生成物を１２％ポリアクリルアミド／尿素ゲルで分離し、Ｔｒｙｐｈｏｏｎ９４００（登録商標）イメージアナライザーでスキャンした。
ＩＰ：免疫沈降物、ＩＢ：免疫ブロッティング、アステリスク：ＩｇＧ
図７はユビキチン抵抗性ＲＰＢ８はＵＶ感受性を引き起こすことを示す図である。
Ａ：野生型（ＷＴ−１及びＷＴ２）またはＲＰＢ８の５ＫＲ変異体（５ＫＲ−１及び５ＫＲ−２）のいずれかを安定発現するＨｅＬａ細胞のそれぞれ２つのクローンから得た細胞溶解液、およびＨｅＬａ細胞の親株から得た細胞溶解液を抗ＲＰＢ８抗体を用いて免疫沈降し、その後抗ＲＰＢ８抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。矢印：ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８、矢じり：ＲＰＢ８
Ｂ：Ａで示したＨｅＬａ細胞株を所定の線量でＵＶ照射した。照射から４８時間後、細胞生存率をトリパンブルー排除法により測定した。０時間（０Ｊ／ｍ２として示す）での細胞数を１００％とする。３つ組で行った測定値の平均値およびＳＤ値を示す。少なくとも２回の実験を繰り返したが、結果は同様であった。
ＣおよびＤ：３５Ｊ／ｍ２のＵＶ照射の前（ｃｏｎｔ．、左パネル）又は４８時間後（ＵＶ、右パネル）の所定のＨｅＬａ細胞の細胞生存率を位相差顕微鏡観察（Ｃ）又はＬｉｌｌｉｅ’ｓクリスタルバイオレット染色（Ｄ）のいずれかで観察した。
図８は、ユビキチン抵抗性ＲＰＢ８はＵＶ照射後に長期間のＲＰＢ１の高リン酸化をＵＶ照射後に引き起こすことを示す図である。
野生型又はＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体のいずれかを安定発現するＨｅＬａ細胞をＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）し、所定時間培養した。全細胞培養液（上部２つのパネル）又は等量の全細胞溶解液から生成した抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物（下部２つのパネル）を、所定の抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
ｐ−Ｓ５：ＲＰＢ１のリン酸化Ｓｅｒ５を認識するリン酸化特異的抗体
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書で引用したすべての特許出願、特許、文献およびウェブサイトは、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
本発明者は、ＤＮＡ損傷に対する反応においてＢＲＣＡ１が３種のＲＮＡポリメラーゼのすべてに共通するサブユニットであるＲＰＢ８（ｈＲＰＢ１７またはＰＯＬＲ２Ｈとも呼ばれる）をユビキチン化することを示した。
タンパク質のスクリーニングにより、エピルビシン処理後のＢＲＣＡ１陽性細胞中で修飾されたタンパク質としてＲＰＢ８を同定した。ＲＰＢ８はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１複合体と相互作用し、ＲＮＡｉによるＢＲＣＡ１のノックダウンに感受性であり、ＵＶ照射後すぐにポリユビキチン化された。これに対し、ＲＰＢ８の５つのリシン残基をアルギニン残基に置換することによって、ＲＰＢ８はそのポリメラーゼ活性は保持しつつ、ユビキチン化されなくなった。興味深いことに、ＲＰＢ８のこのユビキチン抵抗性の形態として安定発現しているＨｅＬａ細胞株は、ＵＶに感受性であり、ＵＶによるＤＮＡ損傷後におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩのリン酸化を長期化させた。この特徴は、コケイン症候群細胞に留まった（ｓｔａｌｌｅｄ）ｐｏｌ  ＩＩとして観察することができる（Ｒｏｃｋｘら、２０００；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）。この結果は、ＢＲＣＡ１が、ＲＰＢ８を新規基質としてＥ３リガーゼ活性を媒介し、ＤＮＡ損傷に反応する新しい機構を示唆するものである。ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１によるユビキチン化は、転写共役ＤＮＡ修復経路を適切に処理するのに非常に重要である。
本発明においては、ＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させることにより、当該ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法を提供する。また、ＲＰＢ８のアミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることにより、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１によるユビキチン化を抑制する方法も提供する。
本発明において、ＲＮＡポリメラーゼをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に接触させる方法は特に限定されるものではなく、遺伝子工学的手法によりＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１発現プラスミドから得られたＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１にＲＮＡポリメラーゼを作用させればよい。ＲＮＡポリメラーゼの作用条件は当業者が適宜設定することができる。例えば、適切な緩衝剤と供に３７度１時間以上反応させる方法もある。
また本発明においては、細胞内のＲＰＢ８のアミノ酸配列を変異させてＲＰＢ８のユビキチン化を抑制することにより、当該細胞に、上記ＤＮＡ損傷環境に対して感受性を付与することができる。このようなＤＮＡ損傷環境に対して感受性が付与された細胞を作製する方法も、本発明に含まれる。
使用する細胞の種類は特に限定されるものではなく、正常細胞、癌細胞など各種細胞が挙げられる。細胞は哺乳動物由来のものであることが好ましい。
アミノ酸配列の変異は、それをコードするＤＮＡに変異を導入する通常の部位特異的突然変異誘発法を利用することができる。例えばＫｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、具体的にはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
１．定義
ＢＲＣＡ１は、乳癌及び卵巣癌の癌抑制遺伝子であり、乳癌研究の分野で最も重要な遺伝子の一つである。また、ＢＲＣＡ１は、ＢＡＲＤ１と共にＲＩＮＧヘテロダイマー（複合体）を形成すると、高いユビキチンリガーゼ活性を獲得する。マウスのＢｒｃａ１遺伝子の標的破壊により中心体の過剰増幅とゲノム不安定性がおこる。分裂期の間にＢＲＣＡ１は中心体に局在する。また、ＢＲＣＡ１はγ−チューブリンと結合することが報告されている。
ＢＡＲＤ１は、ＢＲＣＡ１と結合するＲＩＮＧフィンガー蛋白質（ＢＲＣＡ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｒｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ１）として同定された。
ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、互いに結合して複合体を形成し、ＲＩＮＧヘテロダイマー型ユビキチンリガーゼを形成するが、家族性乳癌の原因となるＢＲＣＡ１におけるミスセンス変異により、このリガーゼ活性は完全に失活する。
ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１は、ＤＮＡ修復、細胞周期の進行及び中心体の複製等の様々な細胞の過程を調節する。免疫細胞染色実験によれば、細胞周期の各期のＮＰＭ（ヌクレオフォスミン）、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の挙動は以下の通りである。すなわち、間期においてＮＰＭは核小体に存在するが、ＢＲＣＡ１とＢＡＲＤ１は核小体以外の核内に存在する。しかし、分裂期には、それらは、紡垂体付近の核周辺及び中心体（紡錘体極）に共在する。さらに、チミジン−ノコダゾールブロックによって細胞周期を分裂期に同調させたＨｅＬａ細胞を用いた試験により、ＮＰＭは、分裂期からＧ１期に移行する短期間にポリユビキチン化されることが判明した。細胞周期の間の細胞内局在及びＮＰＭとの共在を観察するために、ＢＡＲＤ１のＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を調製して用いることができる。細胞周期の同調はフローサイトメトリーでモニターし、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＰＭユビキチン化をＩＰ−ウェスタン解析により評価することができる。
さらに、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によって触媒されるポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解のシグナルとして機能する従来のＬｙｓ−４８結合型ではなくＬｙｓ−６結合型のユビキチン鎖であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではこれらの鎖が２６Ｓプロテアソームによって脱ユビキチン化される２，３。ＮＰＭも、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によりユビキチン化され、安定化するが、このユビキチン化は、２６Ｓプロテアソーム依存性タンパク質分解のシグナルとしては機能しない。
ここで、本発明において使用されるＢＲＣＡ１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６、アミノ酸配列を配列番号７に示す。また、ＢＡＲＤ１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８、アミノ酸配列を配列番号９に示す。
本発明において使用されるＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、上記配列番号６又は８に示す塩基配列を有するものに限定されるものではなく、コード領域又はその一部であってもよい。ＢＲＣＡ１のコード領域は、例えば配列番号６に示す塩基配列のうち１９５−２２９４番の領域であり、ＢＡＲＤ１のコード領域は、配列番号８に示す塩基配列の７４−２４０７番の領域である。さらに、これらの塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＲＰＢ８をユビキチン化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜５００ｍＭ、好ましくは１５０〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件を意味する。さらに、配列番号６又は８で示される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性（相同性）を有する塩基配列も本発明において使用し得る。
また、本発明においては、配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列であってＲＰＢ８をユビキチン化する活性を有するタンパク質を使用することができる。このようなアミノ酸配列としては、例えば、（ｉ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列に１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換される場合、置換前のアミノ酸の性質に似た性質のアミノ酸に置換することが望ましい。したがって、例えば、酸性アミノ酸同士、塩基性アミノ酸同士など、性質の似たアミノ酸間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。置換されるアミノ酸の数及び部位は特に限定されない。さらに、配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性（相同性）を有するタンパク質も本発明において使用し得る。さらに、これらのアミノ酸配列の一部の配列を使用することも可能である。
配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製する。
また、上記のように変異を有するタンパク質を調製するためにＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤは、それぞれをコードする遺伝子を発現させてタンパク質を産生させ、それらを混合することにより得ることができる。また、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤを共発現させることもできる。これらの手法は、当分野において周知である（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を参照）。
ＮＰＭは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼの基質である。全ての細胞において、リボゾーム生合成、アポトーシス抑制、ヒストンシャペロン機能など、多様な生物学的活性を有する。ヌクレオフォスミンには、例えば、ヌクレオフォスミン／Ｂ２３／ＮＯ３８（ＮＰＭ）が含まれる。
本明細書において、「ユビキチン化」（Ｕｂ化）とは、ポリユビキチン鎖による細胞内タンパク質の迅速かつ可逆性の翻訳後修飾を意味し、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同して、基質となるタンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。
この過程はＥ１とＵｂのＣ末端とのチオールエステル結合の形成で開始し、その後Ｅ２の活性部位であるＣｙｓにＵｂが転移する。この過程のほとんどの部分について、ＵｂのＣ末端と基質のリシン残基とのイソペプチド結合の形成は、Ｅ３として知られるタンパク質またはタンパク質複合体を伴う。Ｅ３はＥ２を認識し、Ｅ２から基質へのＵｂの転移を促進する。Ｅ３は、基質におけるＵｂ分子鎖の形成を触媒するうえで重要な役割を果たし、プロテアソームによる認識において非常に重要である。
７６残基を有するポリペプチドであるユビキチンは、他の細胞内タンパク質との共有結合を介して真核生物において本質的な機能を果たす。この修飾における最も特徴的な役割は、少なくとも４つのユニットのユビキチン鎖が転移した後に、２６Ｓプロテアソームによりタンパク質を分解するための標的にすることであり、ユビキチン上のＬｙｓ−４８を介したユビキチン−ユビキチン連結による。これはポリユビキチン化と呼ばれる。近年、一つのタンパク質部位への一つのユビキチンの付加（モノユビキチン化）、または複数のタンパク質部位に一つのユビキチンが付加すること（マルチユビキチン化）が報告されている。また、最近、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１が従来とは異なるＬｙｓ−６結合型ポリユビキチン鎖の形成を触媒することが見出されたが、それは、分解の標的とされる代わりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製２６Ｓプロテアソームにより脱ユビキチン化されるというものである。
「ユビキチン化を抑制する」とは、上記ユビキチン化が完全に又は部分的に起こらないようにすることを意味する。
本明細書において、「ＲＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡ鎖を鋳型として用いて５’→３’方向にｍＲＮＡを合成する酵素を意味する。ＲＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼおよび上述した活性を有する変異型酵素を含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む。
本明細書において、「共通サブユニット」とは、すべてのＲＮＡポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ）が共有するサブユニットを意味する。
本明細書において、「ＤＮＡ損傷環境」とは、放射線等によりＤＮＡ分子に生じる構造変化を起こす環境、すなわち、ＤＮＡ合成、ＤＮＡからＲＮＡへの転写、及びそれに続くタンパク質翻訳のいずれかが阻害される環境を意味し、ＲＮＡポリメラーゼの不活性化、ＤＮＡポリメラーゼの不活性化、ＤＮＡリガーゼの不活性化、ヌクレオチド除去修復機能の機能抑制、ＤＮＡメチル化などが生じる環境をいう。このようなＤＮＡ損傷環境としては、例えば紫外線（ＵＶ）照射、Ｘ線照射、化学物質、活性酸素などが挙げられる。
２．ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットのユビキチン化
ＢＲＣＡ１はユビキチンリガーゼとして生化学的に機能するが、その生物学的な重要性は特にＤＮＡ損傷反応においてあまり知られていない。
本発明者は、ＢＲＣＡ１欠損細胞におけるＵＶ感受性の根底にあるメカニズムを同定した。ＲＰＢ８をユビキチン化するＢＲＣＡ１の欠損によって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの長期間のリン酸化に加えてＵＶ感受性が生じる。この結果は、ＤＮＡ損傷反応におけるＢＲＣＡ１のユビキチンリガーゼ活性の重要性を強調するだけではなく、発癌においてＲＮＡポリメラーゼが果たしている役割を更に分析することを可能にする。さらに、本発明者の結果は、ＤＮＡ損傷を起こす抗癌剤に対する乳癌の感受性を予測する手段を提供することにより、臨床に応用して癌の治療の成功につなげることができる。
ＢＲＣＡ１はＳ期の間、分散した核のｆｏｃｉに局在する。ＤＮＡ損傷後、ＢＲＣＡ１はＡＴＭ／ＡＴＲファミリーキナーゼによってリン酸化され（Ｃｏｒｔｅｚら、１９９９；Ｔｉｂｂｅｔｔｓら、２０００）、ＢＲＣＡ１  ｆｏｃｉは３０分で分散する（Ｓｃｕｌｌｙら、１９９７ｂ）。これら病巣は異なるｆｏｃｉに徐々に再会合し、その場所でＢＲＣＡ１はＲａｄ５０−Ｍｒｅｌ１−Ｎｂｓ１複合体（Ｚｈｏｎｇら、１９９９）またはＲａｄ５１およびＰＣＮＡ（Ｓｃｕｌｌｙら、１９９７ｂ）と協同し、損傷したＤＮＡを修復する。ｆｏｃｉは、ＤＮＡ損傷が発生してからおよそ１時間後に観察され始め、６時間から８時間後にピークに達し、損傷後１２時間まで残存する（Ｚｈｏｎｇら、１９９９）。ほとんどの部分は、Ｓ期のｆｏｃｉはＢＲＣＡ１で構成されて進行的であり、高リン酸化されたｐｏｌ  ＩＩからなり、それはＤＮＡ損傷で解離する（Ｋｒｕｍら、２００３）。
ｐｏｌ  ＩＩは、転写共役ＤＮＡ修復経路において非常に重要な役割を果たす。ｐｏｌ  ＩＩは、損傷したＤＮＡ部位を迅速に認識し、その部位に留まることにより損傷の存在をシグナル提示する。ｐｏｌ  ＩＩはＣＳＡ（コケイン症候群Ａ群遺伝子産物（Ｃｏｃｋａｙｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｒｏｕｐ  Ａ））およびＣＳＢ（Ｃｏｃｋａｙｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ）で置換され、その後ＴＦＩＩＨ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｈ）、並びにＸＰＧ（色素性乾皮症（ｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）Ｇ群遺伝子産物）、ＸＰＦ（色素性乾皮症Ｆ群遺伝子産物）、及びＥＲＣＣ１（ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｒｏｄｅｎｔ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ  １）を含む複合体が動員され、ヌクレオチド除去修復機能を提供する（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）。無傷の細胞では、ｐｏｌ  ＩＩの高リン酸化形態はその後、前開始複合体の新しい領域に組み込まれるために脱リン酸化される。
ＢＲＣＡ１は、進行的ｐｏｌ  ＩＩ複合体と会合するため（Ｋｒｕｍら、２００３）、ｐｏｌ  ＩＩ複合体が細胞に留まるときに、ｐｏｌ  ＩＩ複合体と共に存在すると考えられる。従って、ＢＲＣＡ１はＤＮＡ損傷のセンサーとして機能するようである（Ｌａｎｅ、２００４）。しかしながら、ＤＮＡ損傷後、ＢＲＣＡ１がＳ期のｆｏｃｉから解離する前（留まったｐｏｌ  ＩＩに対するＢＲＣＡ１の役割を含む）に起こる初期段階の現象は、明らかではなかった。
本発明においては、ＢＲＣＡ１が、このＤＮＡ損傷後の初期段階においてｐｏｌ  ＩＩ複合体の要素であるＲＰＢ８をポリユビキチン化することを示すものである。この現象のタイミングは、留まったｐｏｌ  ＩＩからＢＲＣＡ１が解離する前の期間と一致する。重要なことに、ＲＰＢ８のユビキチン抵抗性変異体は活性型ＲＮＡポリメラーゼを形成することができるが、ＵＶ照射から６時間の間、ＲＰＢ１の高リン酸化形態に結合したままであった。このことは、ＢＲＣＡ１によるＲＰＢ８のユビキチン化は、損傷ＤＮＡからｐｏｌ  ＩＩの解離を引き起こすことを示すものである。
ＢＲＣＡ１の機能を欠損した細胞は、ＩＲやＵＶ照射を含む一連のＤＮＡ損傷剤に感受性を示すことがよく知られている（Ａｂｂｏｔｔら、１９９９；Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ、２００２）。しかしながら、この現象の根底にあるメカニズムは十分に理解されていない。このメカニズムとして、チェックポイント機能が欠損すると感受性の原因となる、という可能性があるが、Ｓ期チェックポイントの選択的抑止もＧ２チェックポイントそれ自身の選択的抑止もＤＮＡ損傷後の細胞生存率の低下に帰するものではないことが報告されてきた（Ｘｕら、２００２ａ；Ｘｕら、２００２ｂ）。従って、ＢＲＣＡ１のＳ期またはＧ２期の細胞周期調節機能以外のいくつかの機能がＤＮＡ損傷後の細胞生存率に影響し得ることが提唱されてきた（Ｘｕら、２００２ｂ）。
本発明においては、ＲＰＢ８のユビキチン抵抗性変異体を安定発現する細胞はＵＶ感受性を有することが示された。したがって、本発明は、従来明確にされていなかった理論的不備を補うＢＲＣＡ１の機能を提供するものである。
本発明において、変異体ＲＰＢ８を含むｐｏｌ  ＩＩ複合体をＵＶ照射すると、ＲＰＢ１の長期間の高リン酸化が観察された。これは、損傷部位に留まったポリメラーゼとして特徴付けられる形態に類似しており（Ｒｏｃｋｘら、２０００；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）、極めて毒性の高いＤＮＡ損傷により生ずる効果である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）。さらに、ＵＶ照射により転写の阻害が引き起こされるが、転写が阻害されると、アポトーシスを強力に誘導する（ＬｊｕｎｇｍａｎおよびＺｈａｎｇ、１９９６）。
ユビキチン抵抗性ＲＰＢ８変異細胞において、かなりの量の内在性野生型ＲＰＢ８の発現が見られることは興味深い（図７Ａ）。このことは、細胞の生存に非常に重要な遺伝子を沈黙させてＲＮＡポリメラーゼの回復を部分的に抑制するだけで、細胞死を誘導することができることを示している。また、損傷部位に留まった変異型ＲＰＢ８を含むｐｏｌ  ＩＩ複合体は、続いて野生型複合体の後にさらなる足止めを引き起こす可能性がある。この考えを支持する根拠としては、核においてマイクロビームを用いたＵＶ照射により局所的損傷を誘導することによって、核の至る所で転写阻害が引き起こされたことが挙げられる（Ｔａｋｅｄａら、１９６７）。
最近、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるリン酸化ＲＰＢ１のユビキチン化が２つのグループから報告された（Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５；Ｓｔａｒｉｔａら、２００５）。一つのグループは、ＲＰＢ１−ＣＴＤ（ＲＰＢ１のＣ末端側ドメイン）のＳｅｒ５の高リン酸化形態の選択的ユビキチン化を示した（Ｓｔａｒｉｔａら、２００５）。ＲＰＢ１のＣＴＤ中にある８つのＬｙｓ残基すべての変異は、ＵＶ照射後においてユビキチン化に影響しなかったので、このユビキチン化は既に報告されているＤＮＡ損傷後のＲＰＢ１のユビキチン化と異なる可能性が高い（Ｒａｔｎｅｒら、１９９８）。もう一つのグループは、ポリメラーゼ複合体中のリン酸化したＲＰＢ１のユビキチン化を示した（Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５）。彼らの条件下では切断された高リン酸化型ＲＰＢ１−ＣＴＤ断片のユビキチン化は検出されなかった。ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１をダブルノックダウンすると、ＵＶ照射により抑制されてきたリン酸化ｐｏｌ  ＩＩの発現レベルが回復したので、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１は、留まったＲＰＢ１の分解を開始し得ることが提唱された。しかしながら、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１ダブルノックダウンは、ＵＶ照射後におけるリン酸化型ＲＰＢ１のユビキチン化には影響しなかった。
従って、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１ダブルノックダウンによるリン酸化ｐｏｌ  ＩＩの発現レベルの回復は、間接的な影響による可能性があった（Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５）。
本発明の結果を考慮すると、ＵＶ照射後におけるリン酸化ＲＰＢ１の発現レベルの上昇は、ＲＰＢ８のユビキチン化の欠損による可能性があった（図８）。しかしながら、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるリン酸化ＲＰＢ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのユビキチン化（Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５）は、その直接的な役割を強く支持する。
すなわち、ＲＰＢ８のユビキチン化はＢＲＣＡ１によって生じ、ＤＮＡ損傷時に転写を停止させ、細胞のアポトーシスを防ぐ作用があると考えられる。
ＢＲＣＡ１欠損株ではＤＮＡはＩＲやＵＶ照射に対して感受性を有し、また、ＲＰＢ８のユビキチン抵抗株（即ちユビキチン化が起こらない変異体）でもＵＶ照射感受性を示している。この結果は、ＢＲＣＡ１を介したＲＰＢ８のユビキチン化が細胞におけるＵＶ抵抗性に関与することを示すものと考えられる。
また、ＲＰＢ８のユビキチン化に対し抵抗性を示す細胞では、長時間のＵＶ照射によるＲＰＢ１の高リン酸化が検出されている。
Ｋｌｅｉｍらの実験から、ＵＶ照射によるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１欠損株のＲＰＢ１のリン酸化は、間接的な影響によるものと示唆される。
つまり、後述の実施例で示された結果は、ＲＰＢ１のリン酸化と、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を介したＲＰＢ８のユビキチン化との間には関連がある事を強く示唆したものである。言い換えると、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によりＲＰＢ８がユビキチン化されることによりリン酸化を受けたＲＰＢ１もユビキチン化され分解される。実施例のデータは、ＵＶ照射等によりＤＮＡが損傷を受けた状態では、ポリメラーゼＩＩとの解離が生じ、転写等がストップするという事を示唆したものである。
この点を解析する方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＰＢ１のユビキチン化のタイミングを分析することである。以前の報告で示されたＲＰＢ１のユビキチン化はＵＶ照射後２時間で起こり、そのときＢＲＣＡ１は、すでにｐｏｌ  ＩＩから解離し、ＤＮＡ修復機構に再局在するというものであった（Ｃｏｒｔｅｚら、１９９９；Ｔｉｂｂｅｔｔｓら、２０００）。
ＤＮＡ損傷後初期の段階で、ＲＰＢ１及びＲＰＢ８はＢＲＣＡ１によって一時的に、同時にユビキチン化される可能性があり、このことはＤＮＡ損傷部位からｐｏｌ  ＩＩホロ酵素を解離する結果となり得る。これを支持する根拠として、ＲＰＢ１がｐｏｌ  ＩＩ複合体においてＲＰＢ８と直接相互作用することが挙げられる（Ｃｒａｍｅｒら、２００１）。後期段階で生じるＲＰＢ１のユビキチン化および分解は、Ｒｓｐ５などの他のＥ３リガーゼによって媒介される可能性がある（Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅら、１９９７）（Ｂｅａｕｄｅｎｏｎら、１９９９）。
ＮＣＢＩデータベース：
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においては、ヒトＲＰＢ８の翻訳領域において、ＲＰＢ８のアミノ酸配列の１３番目のリシンをアスパラギン酸に変異させる置換を有する多型（Ｋ１３Ｅ）及びＲＰＢ８のアミノ酸配列の１９番目のアラニンをグリシンに変異させる置換を有する多型（Ａ１９Ｇ）という２つの一塩基多型（ＳＮＰｓ）が存在することは注目に値する。
ＢＲＣＡ１によるＲＰＢ８のユビキチン化は、Ｋ１３が変異した場合わずかに減少した（図６）。Ａ１９Ｇの置換もまた、それが連続した２つのリシン残基であるＫ２０／Ｋ２１の直前にある場合にユビキチン化に影響する可能性がある。
ＲＰＢ８のアミノ酸配列のうち、５個のＬｙｓ残基をＡｒｇ残基に置換すると、内在性の野生型タンパク質と比較して少ない発現量ではあるが、ＤＮＡ損傷に対する感受性を引き起こす。従って、ＲＰＢ８のＳＮＰｓは、癌につながる軽度の遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある。また、それらのＳＮＰｓは抗癌剤に対する感受性を引き起こし得る。これらのＳＮＰｓのユビキチン化能についての臨床的関連性は、明らかにすべき最も重要な事項の一つである。
ＲＰＢ８がＲＮＡポリメラーゼの３種のクラス全てに共通することは注目すべきである（Ｂｒｉａｎｄら、２００１；Ｓｈｐａｋｏｖｓｋｉら、１９９５）。ｐｏｌ  ＩＩは全ＲＮＡのうち約５％に過ぎないｍＲＮＡを合成するのに対し、ｐｏｌ  Ｉ及びｐｏｌ  ＩＩＩは、全ＲＮＡのうち残り９５％を構成するｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び全ての非翻訳短鎖ＲＮＡを合成する。従って、それらの複合体の修飾は、ｐｏｌ  ＩＩよりもむしろ、細胞条件に非常に大きな影響を与えるかもしれない。例えば、最近の研究により、癌発生においてｐｏｌ  ＩＩＩによる転写（Ｗｈｉｔｅ、２００４）に関する重要な役割が明らかにされた。
ＲＰＢ１は活発に研究されてきたが、ＤＮＡ損傷反応におけるＲＰＢ８の役割は不明なことが多い。しかしながら、本発明において、ＢＲＣＡ１によって媒介されるＲＰＢ８のユビキチン化は、ＤＮＡ損傷時又は非損傷時に対する反応のいずれに対しても、発癌におけるＲＮＡポリメラーゼの役割について更なる証拠を提供するとともにＢＲＣＡ１の癌抑制機能に新しい知見を提供するものである。
したがって、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼのユビキチン化によるアポトーシスおよび転写制御の分野に使用することができ、ＢＲＣＡ１を介するＲＰＢ８のユビキチン化を制御する事により、細胞のＤＮＡ損傷に対する感受性を変化させ、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤による癌などの治療に利用できる点で有用である。
３．ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤを含む医薬組成物
本発明は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、又はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤをコードする遺伝子を含む、癌を治療する方法、及び癌を治療ための医薬組成物に関する。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１は、ＲＰＢ８をユビキチン化して癌を抑制する。したがって、本発明の医薬組成物は、癌を治療するため用いられる。
本発明の医薬組成物の適用疾患としては、癌などの細胞増殖性疾患が挙げられる。本発明の医薬組成物を疾患に適用するにあたり、上記疾患は単独の場合であっても複数の疾患が併発した場合であってもよい。
本発明の医薬組成物を癌の治療剤として使用する場合は、癌の種類は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）等を対象として適用される。
上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医学的組成物は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられる。
本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、適当な剤型、例えば錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物により投与が可能である。非経口投与の場合は、経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に直接的又は間接的に患部に投与することができる。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。この場合、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１は、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤを共発現させる形態で使用することも、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１複合体をコードするように融合遺伝子として使用してもよい。
上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。本発明の医薬組成物を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等から全身投与する。脳等に局所投与することもできる。本発明の医薬組成物を目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。また、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の合成リン脂質を用いることができる。
リポソームの製造方法は、遺伝子が保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ、Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ、Ｊら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６））等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に有するものを用いることにより、電気的に陰性の遺伝子の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。このようにして得られるリポソームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えば、センダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダウイルスから精製された膜融合促進タンパク質、ポリエチレングルコール等を添加することができる。
本発明の医薬組成物は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容されるキャリアーを含むものであってもよい。このようなキャリアーは添加物であってもよく、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ又はその遺伝子を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば以下のものが挙げられる。すなわち、マンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などである。
所望により、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤又は可溶化剤を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、疾患の徴候又は状態を軽減する量である。医薬組成物の治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、あるいはＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば１回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。アデノウイルスを投与する場合の投与量は、１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。但し、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
１．材料と方法
まず、本実施例において採用された各種実験手法を以下に示す。
（１）２Ｄ−ＤＩＧＥ
２Ｄ−ＤＩＧＥ解析は、使用説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って実施した。すなわち、エピルビシンで処理していない細胞又は処理した細胞のいずれか一方を回収し、冷洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＭｇＡｃ）で３回すすぎ、溶解緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％  ＣＨＡＰＳ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））中で超音波処理により可溶化した。可溶化液は１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。エピルビシンで処理していないサンプル、処理したサンプル、又はそれらの両方を１：１で混合したサンプルのいずれかから得られた５０μｇのタンパク質をそれぞれ蛍光色素Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ２で標識した。
異なる標識をした３つのサンプルすべてを混合し、一次元電気泳動による分離に関しては２４ｃｍのシグモイド固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動ゲル（ＩＰＧ）（ｐＨ３−１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ）ストリップにアプライした。等電点電気泳動はＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて実施した。
次にＩＰＧストリップを、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％  ＳＤＳ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．５％  ＤＴＴを含有する溶液で１５分間平衡化し、ＤＴＴを４．５％のヨードアセトアミド含有平衡緩衝液で置換することによりブロックした。
次に、目的タンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲルにより分離した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。２Ｄ分離ゲルはＴｙｐｈｏｏｎ  ９４００（登録商標）イメージアナライザー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてスキャンした。対照サンプルとエピルビシン処理したサンプルとで有意に異なるタンパク質のスポットを、Ｃｙ２で標識した混合タンパク質を内部標準として用いてＤｅｃｙｄｅｒ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により同定した。
タンパク質の同定のためには、エピルビシンで処理していない細胞と処理した細胞との混合物１ｍｇを上記の２Ｄゲルによって分離し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色した。目的のタンパク質のスポットはゲルから切り出し、Ｉｎ  Ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて使用説明書に従いトリプシンで消化した。ペプチド断片は上記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４）。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベースで検索して得られた衝突誘起解離スペクトルをＭａｓｃｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）で解析した。
（２）プラスミド
ヒトＲＰＢ８の全長ｃＤＮＡは、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより増幅した。増幅したヒトＲＰＢ８の全長ｃＤＮＡを、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを有するｐｃＤＮＡ３ベクターまたはＮ末端側にＧＳＴタグを有するｐＧＥＸベクターにインフレームでサブクローニングした。ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１、ユビキチン、およびその変異体の哺乳類発現プラスミドは公知のものを使用した（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４）。
ＲＰＢ８のＬｙｓ残基を部位特異的変異（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりＡｒｇ残基に置換する点突然変異を導入した。使用したプラスミドはすべてＤＮＡシークエンシングにより配列を確認した。
（３）細胞培養およびトランスフェクション
Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＨＣＣ１９３７乳癌由来細胞株、ＨｅＬａ子宮頚癌由来細胞株、および形質転換されたヒト腎臓由来細胞株２９３Ｔを、１０％牛胎児血清および１％  抗菌−抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）で５％ＣＯ２、３７℃で培養した。正常ヒト上皮細胞ＭＣＦ１０Ａを２．５％牛胎児血清、１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、５００ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌインスリン、および１％抗菌−抗真菌剤を添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地で増殖させた。エピルビシン処理に関しては、細胞は０．２μｇ／ｍｌのエピルビシン（Ｐｆｉｚｅｒ）含有培地において所定時間インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の半減期を調べるために、細胞を１０μｇ／ｍｌシクロヘキサミド（Ｗａｋｏ）中で所定期間インキュベートした。２９３Ｔ細胞は、標準的なリン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトした。それぞれのトランスフェクションに関し、全プラスミドＤＮＡ量は、ｐｃＤＮＡ３空ベクターを加えることで等量に調整した。野生型ＲＰＢまたは変異型ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８のいずれか一方を安定発現する細胞株を作製するために、それぞれのタンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３を、ＦｕＧＥＮＥ６（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションから４８時間後に細胞懸濁液を希釈し、播種し、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で選別した。２週間培養を行った後形質転換体のコロニーを得て、クローン化した細胞をさらに増殖させ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で維持した。ＵＶ照射実験に関しては、細胞をＰＢＳで洗浄し、所定の線量でＵＶ光（２５４ｎｍ；ＵＶＰ  Ｉｎｃ，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）を照射し、新鮮培地で所定期間培養した。細胞生存率を位相差顕微鏡観察、トリパンブルー排除法、又はＬｉｌｌｉｅ’ｓクリスタルバイオレット染色により測定した。
（４）抗体
ＨＡ（１２ＣＡ５，Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｍｙｃ（９Ｅ１０，ＢａｂＣｏ）、ＦＬＡＧ（Ｍ２，Ｓｉｇｍａ）、ユビキチン（ＦＫ１，Ａｆｆｉｎｉｔｉ）、ホスホ−Ｓ５  ＲＰＢ１（Ｈ１４、ＣＯＶＡＮＣＥ）、α−及びβ−チューブリン（ＤＭＩＡ＋ＢＭＩＢ，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、並びにアクチン（Ｃ２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する各マウスモノクローナル抗体と、ＢＲＣＡ１（Ｃ２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びＲＰＢ１（８ＷＧ１６，ＣＯＶＡＮＣＥ）に対する各ウサギポリクローナル抗体は市販品を購入した。ＢＡＲＤ１及びＲＰＣ１５５に対する各ウサギポリクローナル抗体は、それぞれコロンビア大学のリチャード・ベア博士（Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｂａｅｒ）およびコールドスプリングハーバー研究所のノーリア・ヘルナンデス博士（Ｄｒ．Ｎｏｕｒｉａ  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ）から供与された。ウサギ抗ＲＰＢ８ポリクローナル抗体は、全長ヒトＧＳＴ−ＲＰＢ８を抗原として作製した。免疫したウサギから得られた粗精製の血清を、ＧＳＴ結合グルタチオンアガロースビーズとともにインキュベートして抗ＧＳＴ抗体を精製除去し、次にプロテインＡアガロースクロマトグラフィーを行った。対照の免疫前ウサギ血清も同様に処理した。
（５）ｓｉＲＮＡ
ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ（登録商標）ＢＲＣＡ１のｓｉＲＮＡ混合物および対照ｓｉＲＮＡ混合物はＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から購入した。二本鎖ＲＮＡ（最終濃度５０ｎＭ）は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて使用説明書に従って細胞にトランスフェクトした。レトロウイルスが発現する、ＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの配列：
５’ＣＵＡＧＡＡＡＵＣＵＧＵＵＧＣＵＡＵＧ３’（配列番号１）
を標的とするｓｈＲＮＡは、ｐＧＰベクター、ｐＥ−ａｍｐｈｏベクター、及びオリゴヌクレオチド：
５’ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴ３’（配列番号２）
をあらかじめサブクローニングしたｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６レトロウイルスベクターを、使用説明書（ＴａＫａＲａ）に従って２９３Ｔへコトランスフェクトすることにより作製した。
オリゴヌクレオチド：
５’ＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＡＴ３’（配列番号３）
は、レトロウイルスが発現する対照ｓｈＲＮＡに使用した。
レトロウイルスを含む上清は、使用するまで−８０℃で保存した。細胞への感染に関して、１５０ｍｍのプレートで培養したＨｅＬａ細胞は、ウイルス含有上清と、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含有する新しい培養培地とを１：１０で混合した混合液１５ｍｌで培養した。細胞はトランスフェクション又は感染を行ってから４８時間後に分析した。
（６）免疫沈降および免疫ブロッティング
免疫沈降法および免疫ブロッティング法は、煮沸した１％ＳＤＳ含有緩衝液を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化された基質を検出することを含むものであり、公知方法に従った（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら２００４；Ｓａｔｏら、２００４）。
２Ｄゲル電気泳動後の免疫ブロッティング解析に関しては、細胞を上記の７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素含有緩衝液で溶解した。
（７）ＧＳＴプルダウンアッセイ
ＧＳＴまたはＧＳＴ融合全長ＲＰＢ８タンパク質は、細菌ＢＬ２１において標準的な手法により発現させた後、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。４μｇのＧＳＴ融合タンパク質は、４μｇのＨｉｓ−ＢＡＲＤ１１４−１８９、並びに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％  ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ及び１ｍＭジチオスレイトールを含む１ｍｌの緩衝液中２５μｌのグルタチオンアガロースビーズと混合した。４℃で２時間回転混合させた後、グルタチオン−アガロースビーズに結合したＧＳＴ融合タンパク質を３回洗浄し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーで溶出した。
（８）ラン−オフ転写法
使用したラン−オフ転写法は公知方法に従った（Ｋｒｕｍら、２００３）。概要を説明すると、ラン−オフの対象となる鋳型は、６５マーのオリゴヌクレオチド：
５’ＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３’（配列番号４）及び
相補的な４５マーのオリゴヌクレオチド：
５’ＧＡＣＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＡＡＴ３’（配列番号５）
を、それぞれ５０ｐｍｏｌずつ、２００μｌのアニーリング混合液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．２Ｍ  ＮａＣｌ）中で、アニールさせて作製した。
ラン−オフ転写反応物（２０μｌ）は、８．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μｇ牛血清アルブミン、２５０ｎＭ  ＮＴＰｓ、５ｕｎｉｔのＲｎａｓｅ阻害剤、５０ｎｇのｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）、０．０５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｐｍｏｌのアニールしたオリゴヌクレオチド、及び０．５μＣｉの［α−３２Ｐ］ＣＴＰを含む。
Ｍ２ビーズ（１０μｌ）に結合したＦＬＡＧ−ＲＰＢ８免疫複合体を平衡化したものを、反応液（２０μｌ）に添加し、３０℃で４０分間インキュベートし、５０μｌのＰＫ緩衝液（３００ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｎｇのｔＲＮＡ、及び１０μｇのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）で反応を停止した。次に、反応混合物を５５℃で２０分間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで転写産物を抽出した後、エタノールを用いて沈殿させた。１本鎖ＲＮＡ転写産物を、１２％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上の変性条件下で分離し、Ｔｒｙｐｈｏｏｎ  ９４００（登録商標）イメージアナライザー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でスキャンした。
２．結果
（１）エピルビシン処理後のＢＲＣＡ１陽性細胞中で修飾を受けたタンパク質であるＲＰＢ８の同定
ＤＮＡ損傷に反応するＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１Ｅ３リガーゼの候補基質を探索するために、本発明者は、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）技術（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ−ＤＩＧＥ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。
乳癌由来のＢＲＣＡ１陽性Ｔ４７Ｄ細胞及びＢＲＣＡ１欠損ＨＣＣ１９３７細胞を、トポイソメラーゼＩＩ（ＤＮＡの二本鎖の切断を誘導する）の阻害剤であるエピルビシン存在下で３時間インキュベートした。細胞は７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素含有緩衝液で溶解し、そのプロテオームを２Ｄ−ＤＩＧＥ法により解析し、エピルビシンで処理していない細胞のプロテオームと比較した。
興味深いことに、Ｔ４７Ｄ細胞においては、エピルビシン処理により発現レベルに影響を受けたタンパク質はほんのわずかであったのに対し、ＨＣＣ１９３７細胞（図１）においては、約１００種類のタンパク質の発現レベルが変化した（図１、黄矢印）。さらに興味深いことには、Ｔ４７Ｄにおいて発現レベルが著しく低下した二種類のタンパク質は、ＨＣＣ１９３７細胞においては発現量が変化しなかった（図１、左下隅の２つの赤矢印）。同様の結果は、他のＢＲＣＡ１無傷の細胞株においても得られた。従って、本発明者は、発現量の低下はＢＲＣＡ１の存在に依存するのではないかと推測した。
タンパク質のスポットはゲル中で消化し（ｉｎ−ｇｅｌ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ）、ナノスケールキャピラリーの液体クロマトグラフ−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）（ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）ａｎａｌｙｓｉｓ）に供した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、これらのサンプルは３種のＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットであるＲＰＢ８、およびミオシン軽鎖であることが明らかとなった。ＲＰＢ８は非常に酸性度が高く、算出した分子量が１７．１ｋＤａの小タンパク質であり、等電点はｐＩ  ４．３４である（Ｓｈｐａｋｏｖｓｋｉら、１９９５）。ｐｏｌ  ＩＩホロ酵素はＢＲＣＡ１と相互作用することから、また、ｐｏｌ  ＩＩ中最大のサブユニットであるＲＰＢ１はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１Ｅ３リガーゼの基質の可能性が高いことから、本発明者はＲＰＢ８に注目して更なる分析を行った。
質量分析データの確かさを確認するために、本発明者は免疫ブロッティング解析に用いるウサギ抗ＧＳＴ−ＲＰＢ８ポリクローナル抗体を作製した。細胞はエピルビシン処理し、２Ｄゲルにより分離したタンパク質について免疫ブロッティング解析を行った。その結果、タンパク質のスポットが実際にＲＰＢ８であることを確認した。ＲＰＢ８はＴ４７Ｄ細胞（図２Ａ）においてのみエピルビシン処理によって再び著しく減少した。興味深いことに、抗ＲＰＢ８抗体に反応性のある数種類のタンパク質ラダーが検出され、このラダーは、エピルビシン処理後に高い分子量領域であってより塩基性のｐＨ領域に移動したものである。これらのラダーはＲｕｂｙ染色では検出できなかったので、本発明者はこれらのタンパク質が少量でしか存在していないものと結論づけた。
タンパク質が少量でしか存在しない理由のひとつの可能性として、それらのタンパク質が、ユビキチンと共有結合修飾を受けたＲＰＢ８の形態を示しているということが考えられる。しかしながら、細胞を０．５％  ＮＰ−４０含有緩衝液により溶解し、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した場合、ＲＰＢ８の発現レベルの低下もタンパク質ラダーも免疫ブロッティングにより検出されなかった（図２Ｂ）。このことは、２Ｄゲル分析により観察されたＲＰＢ８の発現レベルの低下は、タンパク質分解によるものではなく、むしろ、ＤＮＡ損傷に応じてＲＰＢ８がＢＲＣＡ１依存性の共有結合修飾を受けた形態に変換したことによるものであることを示している。
（２）ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１との相互作用
観察されたＲＰＢ８の修飾についての分子基盤を分析するために、本発明者は、ＲＰＢ８とＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１との相互作用を、外来性の発現タンパク質を用いて試験した。
２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１、及びＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をコトランスフェクトし、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１の免疫沈降物からＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の存在を探索した。その結果、対照と比較して多量のＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を、抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体による免疫複合体の両者において検出した。これに対し、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の免疫複合体と共精製したＨＡ−ＢＡＲＤ１は対照と同じく検出しなかった（図３Ａ）。
次に本発明者は、細胞内在性のＲＰＢ８がＢＲＣＡ１およびＢＡＲＤ１と相互作用するか否かを試験した。ＢＡＲＤ１は、対照と比較して、未処理のＨｅＬａ細胞から単離したＲＰＢ８と極めて多量に共免疫沈降した（図３Ｂ、上パネル）。図３Ｂの下パネルはＭＣＦ１０Ａについての結果を示すが、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ及び２９３Ｔを含む、試験に用いたすべての細胞株において同じ結果が観察された。
ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の両者は、いずれもｐｏｌ  ＩＩホロ酵素と相互作用する（Ｃｈｉｂａ及びＰａｒｖｉｎ、２００２）。従って、ホロ酵素はＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１とＲＰＢ８とを架橋している可能性がある。ＢＡＲＤ１とＲＰＢ８との相互作用が直接のものであるか否かを検討するため、本発明者は、細菌で発現させた組換え型ＧＳＴ−ＲＰＢ８タンパク質及び組換え型Ｈｉｓ−ＢＡＲＤ１（１４−１８９）タンパク質を精製した。Ｈｉｓ−ＢＡＲＤ１（１４−１８９）タンパク質は、ＢＡＲＤ１の全長アミノ酸配列のうち、Ｎ末端側１３個のアミノ酸を欠如させたものである。そして、ＧＳＴ−ＲＰＢ８をＨｉｓ−ＢＡＲＤ１（１４−１８９）と共沈させた。しかしながら、ＧＳＴは検出されなかった（図３Ｃ）。この結果は、ＲＰＢ８がＢＡＲＤ１のＮ末端に直接相互作用していることを示唆している。
ＢＡＲＤ１はＢＲＣＡ１に結合し、活性型Ｅ３リガーゼを形成する。本発明者は多量のＢＡＲＤ１をＲＰＢ８の免疫沈降物において検出したが、ＢＲＣＡ１は検出できなかった。従って、本発明者は、ＢＲＣＡ１はＤＮＡ損傷などの特別の条件下においてのみＢＡＲＤ１及びＲＰＢ８と相互作用するのかもしれないと推測した。このことを試験するために、本発明者はＭＣＦ１０Ａ細胞をＵＶ照射し、照射後いくつかの異なるタイミングで細胞を回収した。回収した細胞を溶解し、細胞溶解液は、抗ＲＰＢ８抗体を用いた免疫沈降に供し、続いて抗ＢＲＣＡ１抗体、抗ＢＡＲＤ１抗体、又は抗ＲＰＢ８抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。
ＢＡＲＤ１は、分析したすべての時点で、抗ＲＰＢ８抗体の免疫複合体を容易に検出することができた。一方、ＢＲＣＡ１は、照射から１０分後では明確に検出したが、６０分後にはほんのわずかの検出であった（図３Ｄ）。図３Ｅ及び３ＦはＭＣＦ１０Ａ細胞についての結果を示すが、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＨｅＬａ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞においても同様の結果が観察された。
不思議なことに、ＲＰＢ８と共精製したＢＲＣＡ１は、全細胞抽出物から得られたＢＲＣＡ１よりもゆっくりと移動した。従って、本発明者は、このタンパク質が実際にＢＲＣＡ１であることをｓｉＲＮＡの使用により証明することとした。
Ｔ４７Ｄ細胞に対照ｓｉＲＮＡまたはＢＲＣＡ１  ｓｉＲＮＡのいずれか一方をトランスフェクトし、次にＵＶをトランスフェクションから４８時間後に照射した。
免疫ブロッティングによって、ＢＲＣＡ１の発現は、全細胞抽出物と比較して特異的に減少することが確認された（図３Ｆ最上パネル）。さらに、ＵＶ照射から１０分後にＲＰＢ８と共に検出できるＢＲＣＡ１タンパク質はＢＲＣＡ１  ｓｉＲＮＡにより除去されたが、対照ｓｉＲＮＡによっては除去されなかった（下から２番目のパネル、レーン２と５とを比較）。このことは、ＲＰＢ８免疫沈降物中のゆっくりと移動した生成物は、ＢＲＣＡ１の修飾された形態であることを確認するものである。
（３）ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＲＰＢ８のユビキチン化および安定化
本発明者は次に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＲＰＢ８がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によりユビキチン化するか否かを試験した。
ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をＨＡユビキチン、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）、及びＢＡＲＤ１と共に２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。細胞をトランスフェクトしてから３６時間後に回収し、１％ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸し、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＲＰＢ８沈降物を、抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロッティングにかけた。その結果、ポリユビキチン化したＲＰＢ８に特徴的なラダーが示された（図４Ａ）。
ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８、ＨＡユビキチン、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）又はＢＡＲＤ１のいずれかを除いた場合は、すべてＲＰＢ８ラダーが消失した。この結果は、ＲＰＢ８がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１依存的にユビキチン化されるという考えを支持するものである。
ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１は、Ｌｙｓ６結合ポリユビキチン鎖を触媒する唯一の公知Ｅ３リガーゼである（Ｍｏｒｒｉｓ及びＳｏｌｏｍｏｎ、２００４；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４；Ｗｕ−Ｂａｅｒら、２００３）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＰＢ８ユビキチンラダーが直接ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１リガーゼ活性によるものであることを証明するために、本発明者は、ユビキチンがＬｙｓ６に結合することによりＲＰＢ８が修飾されるかどうかを確認した。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのユビキチン化アッセイのため、結合可能な１つのＬｙｓ残基を有する、ＨＡタグを付けたユビキチンを使用した。予想したとおり、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１依存性ポリユビキチン化は、Ｌｙｓ４８またはＬｙｓ６３ではなくＬｙｓ６のみが結合可能なＨＡユビキチンを共発現させた場合に、大部分が検出された（図４Ｂ）。従って、この結果により、観察されたｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＰＢ８のポリユビキチン化は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によって直接触媒されることが示された。
ところで、ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１触媒によりその基質であるＢＲＣＡ１自身又はＮＰＭがＬｙｓ６結合ポリユビキチン化されることは、プロテアソームによる分解のためのシグナルではない（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４；Ｓａｔｏら、２００４）。従って、本発明者は、これがＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１依存性ＲＰＢ８ユビキチン化の場合もあてはまるのか否か、すなわちＲＰＢ８のユビキチン化も、プロテアソームによる分解のシグナルではないのかどうかを分析した。
２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）及びＢＡＲＤ１を共発現させた場合の、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の定常状態レベル及びタンパク質半減期を試験した。ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の定常状態レベルは、用量依存的なＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の共発現により増加した（図４Ｃ）。細胞をシクロヘキサミドで処理しても、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１はＲＰＢ８を安定化した（図４Ｄ）。これらの知見は、本発明者が報告してきた他の基質（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら、２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００４；Ｓａｔｏら、２００４）と同様に、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−媒介ユビキチン化が、非タンパク質分解機構によりＲＰＢ８の機能に影響することを示すものである。
（４）ＵＶ照射後の、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１依存性ユビキチン化
ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−媒介ユビキチン化は、本発明者にこの活性の生物学的な意義を研究するよう促すものである。
ＢＲＣＡ１は、転写共役ＤＮＡ修復において長期間役割を果たしてきた（Ａｂｂｏｔｔら、１９９９；Ｌｅ  Ｐａｇｅら、２０００）。そしてｐｏｌ  ＩＩの最大のサブユニットであるＲＰＢ１のユビキチン化は、ＤＮＡ損傷に対する反応において示されてきた（Ｂｅａｕｄｅｎｏｎら、１９９９；Ｂｒｅｇｍａｎら、１９９６；Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５；Ｌｅｅら、２００２；Ｓｔａｒｉｔａら、２００５）。従って、本発明者は、ＤＮＡ損傷に対する反応においてＲＰＢ８がユビキチン化されるかどうかを試験した。
細胞をエピルビシンに継続的に曝すよりも、本発明者はＵＶ照射を採用して、ＤＮＡ損傷後のＲＰＢ８のユビキチン化の時期を正確に決定した。本発明者はＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を安定発現するＨｅＬａ細胞株を樹立し（図７Ａ）、抗ＦＬＡＧ免疫沈降物のユビキチン化を分析した。ＵＶ照射後のいくつか異なる時点で細胞を回収し、１％ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸し、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を免疫沈降した。次に、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をＦＬＡＧペプチドとともに抗体から溶出し、溶出液は抗ユビキチン抗体を用いて色疫ブロッティングした。ＲＰＢ１のユビキチン化はＵＶ照射後１−２時間で起こることが報告されてきたため（Ｂｒｅｇｍａｎら、１９９６；Ｋｌｅｉｍａｎら、２００５；Ｒａｔｎｅｒら、１９９８；Ｓｔａｒｉｔａら、２００５）、本発明者はこれらの時点を分析した。しかしながら、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８のユビキチン化は何ら検出されなかった。
これに対し、ユビキチン化したＦＬＡＧ−ＲＰＢ８はＵＶ照射から約１０分後に容易に現れた（図５Ａ、上パネル、レーン３）。この約１０分というタイムポイントは、ＲＰＢ８がＢＲＣＡ１と相互作用するのに必要とされる条件、すなわちＵＶ照射１０分後に反応する結果（図３Ｄ、レーン３）と一致する。
さらに、抗ＲＰＢ８抗体で膜をリプローブすることにより、検出したラダーがユビキチン化したＲＰＢ８であることを確認した（図５Ａ、下部パネル）。そのようなラダーは、ユビキチン抵抗性変異体、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８５ＫＲ（後述）を安定発現するＨｅＬａ細胞株を対照として用いた場合は全く検出されなかった（図５Ａ、レーン４−６）。
ＲＰＢ８のＵＶ照射誘導性ユビキチン化には、ＢＲＣＡ１が必要とされることを確認する目的で、ＲＮＡｉを再度採用して内在性ＢＲＣＡ１の発現をノックダウンした。ＲＮＡｉの発現には２つの手法を採用した。１つは、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８を安定発現するＨｅＬａ細胞に、ＢＲＣＡ１特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。もう１つの手法として、本発明者はＢＲＣＡ１に対するｓｈＲＮＡを発現するように設計されたレトロウイルスを構築した。トランスフェクションまたは感染から４８時間後、細胞にＵＶ（３５Ｊ／ｍ２）を照射し、その１０分後に細胞を回収した。
ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞、およびｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスを感染した細胞の両者とも、対照と比較してＢＲＣＡ１の発現を沈黙させることに成功した（それぞれ、＞９０％および＞７５％の減少）（図５Ｂ、上パネル）。予想したとおり、ＵＶ照射後のＲＰＢ８のユビキチン化は、ＢＲＣＡ１のノックダウンによって両者とも劇的に減少した（図５Ｂ、下パネル）。２８−３０ｋＤａ周辺に移動した顕著な二重のバンドはＢＲＣＡ１のノックダウンによって完全に消失した。これらの結果は、ＤＮＡ損傷の初期段階において、ＲＰＢ８がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によってポリユビキチン化されるという考えをさらに支持するものである。
（５）ＲＰＢ８のユビキチン抵抗性形態とそのポリメラーゼ活性との関係
ＵＶ照射後のＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−媒介ユビキチン化によって引き起こされる生理学的結果を調べる目的で、本発明者は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によってユビキチン化されないＲＰＢ８変異体を作製した。ＲＰＢ８はタンパク質全体で８つのＬｙｓ残基を有する。本発明者は最初、一つのＲＰＢ８のＬｙｓ残基に変異を導入し、それがユビキチン化される可能性を試験した。しかしながら、ＲＰＢ８のユビキチン化はそれぞれ一つの残基の変異では劇的に減少しなかった（図６Ｂ、レーン２及び７）。その代わりに、ＲＰＢ８のユビキチン化はＬｙｓ残基からＡｒｇ残基への置換数が増加するにつれて減少した。この結果は、本発明者が、ＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化に関する研究、およびＢＲＣＡ１−媒介ＮＰＭユビキチン化に関する研究の間に観察したことを再現するものである。
８つのＬｙｓ残基中５つの残基をＡｒｇに置換した場合（５ＫＲ）、ＲＰＢ８のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１への結合能は減少しないが、ＲＰＢユビキチン化は検出不可能になった（図６Ｂ、レーン５）。
ユビキチン化に抵抗性のＲＰＢ８を作製するために必要とされる多くの変異を導入しても、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしての基本的機能は障害を受けないことを確認するために、本発明者は５ＫＲ変異体がＲＰＢ１またはＲＰＣ１５５（それぞれｐｏｌ  ＩＩおよびＩＩＩの最大サブユニットである）にｉｎ  ｖｉｖｏで結合できるかどうかを確認した。
野生型ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８または５ＫＲを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ免疫複合体を単離した。結合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＲＰＢ１抗体または抗ＲＰＣ１５５抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。ＲＰＢ１及びＲＰＣ１５５は、両者ともＦＬＡＧ−５ＫＲ中および野生型免疫複合体中で多量に検出された（図６Ｃ）。
次に本発明者は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降物の触媒活性をラン−オフ転写法を用いて測定した。５ＫＲ変異体の免疫複合体は、野生型免疫複合体と同等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物生成能を有する（図６Ｄ）。従って、ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体は、ポリメラーゼ活性を維持しながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効なＲＮＡポリメラーゼ複合体を構成する。このことは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＲＰＢ８のユビキチン化がＲＮＡポリメラーゼ活性を必要としていないことを示している。
（６）ＲＰＢ８のユビキチン抵抗性変異体のＵＶに対する感受性
ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体を安定発現すると、内在性のＢＲＣＡ１が存在していても、ＲＰＢ８のユビキチン化は生じない。
一方、ＢＲＣＡ１が欠損すると、ＤＮＡ損傷に対する感受性を引き起こす（Ａｂｂｏｔｔら、１９９９；Ｒｕｆｆｎｅｒら、２００１；Ｓｈｅｎら、１９９８）。ＢＲＣＡ１欠損株は、ＲＰＢ８をユビキチン化しないため、５ＫＲ変異体と同じ表現型の原因になる。ＲＰＢ８はＵＶ照射後にＢＲＣＡ１によってユビキチン化されるため（図５）、このユビキチン化されないことが同じ表現型の原因となる可能性がある。この可能性を試験するために、本発明者は、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体を安定発現するＨｅＬａ細胞株を樹立した。
２種の野生型のクローン（ＷＴ−１及びＷＴ−２）および２種の５ＫＲ変異体（５ＫＲ−１及び５ＫＲ−２）の細胞株を得た。これらのクローンにおけるＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の発現を確認した（図７Ａ）。これらの細胞を用いて、本発明者は変異型ＲＰＢ８の発現がＵＶ照射後の細胞生存率に影響するか否かを試験した。細胞生存率はＵＶ照射から４８時間後にトリパンブルー排除法により測定した。
その結果、２０または３５Ｊ／ｍ２のＵＶ照射後の５ＫＲクローンの細胞生存率は、０時間の未処理の細胞と比較して、それぞれ約３８％及び２３％であったのに対し、野生型クローンの場合はそれぞれ約７２％及び５３％であった（図７Ｂ）。ＨｅＬａ細胞の親株は野生型クローンと同様の細胞生存率を示した（図７Ｂ）。ＵＶ照射（３５Ｊ／ｍ２）から４８時間後に位相差顕微鏡観察により観察された細胞を図７Ｃに、およびＬｉｌｌｉｅ’ｓクリスタルバイオレット染色により染色した培養プレートを図７Ｄに示した。
これらの結果から、ユビキチン抵抗性のＲＰＢ８の発現は、細胞にＵＶ感受性を引き起こすといえる。
（７）ＲＰＢ８のユビキチン抵抗性変異体におけるＵＶ照射後の長期間のＲＰＢ１のリン酸化
本発明者は次に、ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体細胞株のＵＶ感受性に関し根底にあるメカニズムを解析した。ＤＮＡ損傷に関する転写共役修復経路において、コケイン症候群Ａ（ＣＳＡ）タンパク質およびＣＳＢタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体を損傷部位から置換する上で重要な役割を果たしている。このことは、後にＴＦＩＩＨを含む修復複合体を動員することを可能にする（Ｒｏｃｋｘら、２０００；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）。ＲＰＢ１は、ＲＮＡ伸長の間、Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）において高リン酸化の状態になり、ＢＲＣＡ１は、おそらくはＤＮＡ損傷のセンサーとして、特にこの形態と相互作用する。ｐｏｌ  ＩＩが損傷部位に残存した場合、ｐｏｌ  ＩＩはその高リン酸化状態をＵＶ照射後およそ１時間維持する。複合体はＣＳＮ／ＣＳＢに置換した場合、脱リン酸化する（ＵＶ照射から６時間以内に）（Ｒｏｃｋｘら、２０００）。この過程は細胞の生存に重要であり、損傷部位にｐｏｌ  ＩＩをリン酸化形態で長期間留めることは非常に細胞毒性が高い（Ｌｊｕｎｇｍａｎ及びＺｈａｎｇら、１９９６；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍら、２００２）。
ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体を発現する細胞が有するＵＶ感受性によって、ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体はＵＶ傷害の後にＲＰＢ１の長期間のリン酸化を引き起こすのかどうかが興味の対象となる。
そこでこの点を確認するため、野生型または５ＫＲ変異ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８のいずれか一方を安定発現するＨｅＬａ細胞株をＵＶ照射した。細胞をＵＶ照射から１又は６時間後に回収し、ＣＴＤリピート中のＳｅｒ５がリン酸化したＲＰＢ１を認識するＨ１４抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
その結果、野生株と変異株の両方において、リン酸化ＲＰＢ１の量はＵＶ照射後１時間でわずかに増加し、続いて照射後６時間の時点で減少した（図８、１段目のパネル）。
リン酸化ＲＰＢ１の電気泳動移動度はＵＶ照射後減少するが、このことは、それぞれの分子におけるリン酸化部位の数も増加していることを示している。これらの結果は、ＵＶ照射後の留まったｐｏｌ  ＩＩならびにその後に続く置換および脱リン酸化についての報告（Ｒｏｃｋｘら、２０００）と一致する。しかしながら、ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８の５ＫＲ変異体の免疫沈降物中のＲＰＢ１リン酸化状態は、対照として用いた野生型複合体で起こる通常の脱リン酸化と対照的に、ＵＶ照射後６時間の時点でもリン酸化状態のままであった（図８、３段目のパネル）。このことは、５ＫＲ細胞に存在するＲＰＢ１の大部分は内在性の野生型ＲＰＢ８と相互作用し（正確には脱リン酸化され）、一方５ＫＲ変異体の複合体中のＲＰＢ１は相互作用しなかったことを示している。
同時に、この結果は、ＤＮＡ損傷部位からｐｏｌ  ＩＩを置換する上で重要な役割を果たすＢＲＣＡ１によりＲＰＢ８がユビキチン化されるという仮説と一致する。このことはさらに、ポリメラーゼを脱リン酸化し、再利用して次の前開始複合体に組み入れることを可能にする。この過程がなければ、留まったｐｏｌ  ＩＩは細胞死を引き起こす。
参照文献
１）Ａｂｂｏｔｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎ，Ｃ．，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）．ＢＲＣＡ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，１８８０８−１８８１２．
２）Ａｌ−Ｗａｈｉｂｙ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｌｉｊｅｐｃｅｖｉｃ，Ｐ．（２００５）．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０９，４９１−４９６．
３）Ｂａｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．（２００２）．Ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ，ａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １２，８６−９１．
４）Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ，Ｇ．，Ｂａｔｔｉｓｔａ，Ｓ．，Ｂｅｌｌｅｔｔｉ，Ｂ．，Ｔｈａｋｕｒ，Ｓ．，Ｐｅｎｔｉｍａｌｌｉ，Ｆ．，Ｔｒａｐａｓｓｏ，Ｆ．，Ｆｅｄｅｌｅ，Ｍ．，Ｐｉｅｒａｎｔｏｎｉ，Ｇ．，Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｕｓｃｏ，Ａ．（２００３）．Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＨＭＧＡ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＲＣＡ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３，２２２５−２２３８．
５）Ｂｅａｕｄｅｎｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｕａｃａｎｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ，Ｊ．Ｍ．（１９９９）．Ｒｓｐ５  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９，６９７２−６９７９．
６）Ｂｒｅｇｒｎａｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｈａｌａｂａｎ，Ｒ．，ｖａｎ  Ｇｏｏｌ，Ａ．Ｊ．，Ｈｅｎｎｉｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｗａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９６）．ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｏｃｋａｙｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，１１５８６−１１５９０．
７）Ｂｒｉａｎｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ｆ．，Ｒｅｍａｔｉｅｒ，Ｐ．，Ｂｏｓｃｈｉｅｒｏ，Ｃ．，Ｌａｂａｒｒｅ，Ｓ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｓｈｐａｋｏｖｓｋｉ，Ｇ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｔｈｕｒｉａｕｘ，Ｐ．（２００１），Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｏｆ  Ｒｐｂ８ｐ，ａ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  Ｉ，ＩＩ  ａｎｄ  ＩＩＩ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１，６０５６−６０６５．
８）Ｂｒｚｏｖｉｃ，Ｐ．Ｓ．，Ｋｅｅｆｆｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｆｏｘ，Ｄ．，３ｒｄ，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｏｈｔａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋｌｅｖｉｔ，Ｒ．（２００３）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｇａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，５６４６−５６５１．
９）Ｃａｔｔｅａｕ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．（２００２）．ＢＲＣＡ１  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １２，３５９−３７１．
１０）Ｃｈａｕ，Ｖ．，Ｔｏｂｉａｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｂａｃｈｍａｉｒ，Ａ．，Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｄ．，Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｎｄａ，Ｄ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．（１９８９）．Ａ  ｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｉｓ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，１５７６−１５８３．
１１）Ｃｈｅｎ，Ａ．，Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｆ．Ｅ．，Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｏｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｐａｎ，Ｚ．Ｑ．（２００２）．Ａｕｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１＊ＢＡＲＤ１  ＲＩＮＧ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，２２０８５−２２０９２．
１２）Ｃｈｉｂａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．（２００２）．Ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＡＲＤ１  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２，４２２２−４２２８．
１３）Ｃｏｒｔｅｚ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｑｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．（１９９９）．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＴＮ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｃａ１  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，１１６２−１１６６．
１４）Ｃｒａｍｅｒ，Ｐ．，Ｂｕｓｈｎｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．（２００１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ａｔ  ２．８  ａｎｇｓｔｒｏｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，１８６３−１８７６．
１５）Ｄｅｎｇ，Ｃ．Ｘ．（２００２）．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｉｎ  ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，６２２２−６２２７．
１６）Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｒ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｍａｅｄａ，Ｉ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｏｙａｋｅ，Ｄ．，Ｙａｂｕｋｉ，Ｙ．，Ｏｇａｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｈｔａ，Ｔ．（２００１）．Ｔｈｅ  ＲＩＮＧ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  ｉｓ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，１４５３７−１４５４０．
１７）Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．（１９９８）．Ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７，４２５−４７９．
１８）Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｅａｕｄｅｎｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｉｓ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｓｐ５  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，３６５６−３６６１．
１９）Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．，Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．（２００３）．Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，６４３−６４６．
２０）Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｆ．Ｅ．，Ｗｕ−Ｂａｅｒ，Ｆ．，Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｄ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．，Ｂａｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．（２００５）．ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ３’ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９，１２２７−１２３７．
２１）Ｋｒｕｍ，Ｓ．Ａ．，Ｍｉｒａｎｄａ，Ｇ．Ａ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｔ．Ｆ．（２００３）．ＢＲＣＡ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，５２０１２−５２０２０．
２２）Ｌａｎｅ，Ｔ．Ｆ．（２００４）．ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３，５２８−５３３．
２３）Ｌｅ  Ｐａｇｅ，Ｆ．，Ｒａｎｄｒｉａｎａｒｉｓｏｎ，Ｖ．，Ｍａｒｏｔ，Ｄ．，Ｃａｂａｎｎｅｓ，Ｊ．，Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｍ．，Ｆｅｕｎｔｅｕｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｒａｓｉｎ，Ａ．（２０００）．ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ８−ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，５５４８−５５５２．
２４）Ｌｅｅ，Ｋ．Ｂ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２００２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，４２３９−４２４４．
２５）Ｌｊｕｎｇｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（１９９６）．Ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ｕ．ｖ．ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３，８２３−８３１．
２６）Ｍａｌｌｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｉｏｍ，Ｋ．（２００２）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｙ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎｓ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２１，６７５５−６７６２．
２７）Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｅ．（２００４）．ＢＲＣＡ１：ＢＡＲＤ１  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  Ｋ６  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ，ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １３，８０７−８１７．
２８）Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｏｏｋａ，Ｓ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ａｒｉｍａ，Ｋ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｊ．，Ｋｌｅｖｉｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｏｈｔａ，Ｔ．（２００４）．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  Ｌｙｓ−６−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，３９１６−３９２４．
２９）Ｏｈｔａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．（２００４）．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，２０７９−２０８８．
３０）Ｒａｔｎｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｂ．，Ｃｏｒｄｅｎ，Ｊ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｒｅｇｍａｎ．Ｄ．Ｂ．（１９９８）．Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，５１８４−５１８９．
３１）Ｒｏｃｋｘ，Ｄ．Ａ．，Ｍａｓｏｎ，Ｒ．，ｖａｎ  Ｈｏｆｆｅｎ，Ａ．，Ｂａｒｔｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｉｔｔｅｒｉｏ，Ｅ．，Ｂｒｅｇｍａｎ，Ｄ．Ｂ．，ｖａｎ  Ｚｅｅｌａｎｄ，Ａ．Ａ．，Ｖｒｉｅｌｉｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒｓ，Ｌ．Ｈ．（２０００）．ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，１０５０３−１０５０８．
３２）Ｒｕｆｆｎｅｒ，Ｈ．，Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，Ｈｅｍｍａｔｉ，Ｄ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．（２００１）．Ｃａｎｃｅｒ−ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＲＩＮＧ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１：ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，５１３４−５１３９．
３３）Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｈａｙａｍｉ，Ｒ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｏｋｕｄａ，Ｙ．，Ｏｇａｔａ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｏｈｔａ，Ｔ．（２００４）．Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３  ｉｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，３０９１９−３０９２２．
３４）Ｓｃｕｌｌｙ，Ｒ．，Ａｒｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｍ．，Ｗｅｉ，Ｗ．，Ｙｅ，Ｌ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９７ａ）．ＢＲＣＡ１  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，５６０５−５６１０．
３５）Ｓｃｕｌｌｙ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｏｃｈｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｋ．，Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．，Ｆｅｕｎｔｅｕｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９７ｂ）．Ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．Ｃｅｌｌ  ９０，４２５−４３５．
３６）Ｓｈｅｎ，Ｓ．Ｘ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｚ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｇｕａｎ，Ｘ．Ｙ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｃ．Ｘ．（１９９８）．Ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂｒｃａ１  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｇａｍｍａ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，３１１５−３１２４．
３７）Ｓｈｐａｋｏｖｓｋｉ，Ｇ．Ｖ．，Ａｃｋｅｒ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｚｅｒｉｔｈ，Ｍ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｈｕｒｉａｕｘ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｍ．（１９９５）．Ｆｏｕｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｒｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５，４７０２−４７１０．
３８）Ｓｔａｒｉｔａ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ａ．，Ｋｅｏｇｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｃ．，Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｈｉｂａ，Ｎ．（２００５）．ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，２４４９８−２４５０５．
３９）Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｎａｒｕｓｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｙａｔａｎｉ，Ｒ．（１９６７）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｕｌｔｒａ−ｖｉｏｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｂｅａｍ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ，ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２１３，６９６−６９７．
４０）Ｔｉｂｂｅｔｔｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｄ．，Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｃｕｌｌｙ，Ｒ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．，Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｂｒａｈａｍ，Ｒ．Ｔ．（２０００）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ＡＴＲ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，２９８９−３００２．
４１）ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｍ，Ｖ．，Ｊａｓｐｅｒｓ，Ｎ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｗ．（２００２）．Ｗｈｅｎ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  ｇｅｔ  ｓｔｕｃｋ−−ｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ：ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｕｉｃｉｄｅ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２４，７８０−７８４．
４２）Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ，Ａ．Ｒ．（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２．Ｃｅｌｌ  １０８，１７１−１８２．
４３）Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．（２００４）．ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，３２０８−３２１６．
４４）Ｗｕ−Ｂａｅｒ，Ｆ．，Ｌａｇｒａｚｏｎ，Ｋ．，Ｙｕａｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｂａｅｒ，Ｒ．（２００３）．Ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｅｓ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｌｙｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｋ６  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，３４７４３−３４７４６．
４５）Ｘｕ，Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．，Ｌｉｍ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．（２００２ａ）．Ｔｗｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｇ（２）／Ｍ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ａｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２，１０４９−１０５９．
４６）Ｘｕ，Ｂ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．（２００２ｂ）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  １３８７  ｉｎ  Ｂｒｃａ１  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｔｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２，４５８８−４５９１．
４７）Ｘｕ，Ｘ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｚ．，Ｌｉｎｋｅ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｇｏｔａｙ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｗ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｃ．Ｘ．（１９９９）．Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｇ２−Ｍ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１  ｅｘｏｎ  １１  ｉｓｏｆｏｒｍ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３，３８９−３９５．
４８）Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｂｏｙｅｒ，Ｔ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｗ．Ｈ．（２０００）．Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，６１５９−６１７５．
４９）Ｚｈｏｎｇ，Ｑ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｘｉａｏ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｈａｒｐ，Ｚ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｗ．Ｈ．（１９９９）．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈＲａｄ５０−ｈＭｒｅ１１−ｐ９５  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，７４７−７５０．
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、ＲＮＡポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法、ユビキチン化を抑制する方法、及びＤＮＡ損傷に対する感受性細胞を樹立する方法が提供される。また、本発明により、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を含む医薬組成物が提供される。本発明の方法は、ＲＮＡポリメラーゼのユビキチン化によるアポトーシスおよび転写制御の分野に使用することができ、ＢＲＣＡ１を介するＲＰＢ８のユビキチン化を制御する事により、細胞のＤＮＡ損傷に対する感受性を変化させ、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤による癌などの治療に利用できる点で有用である。また、本発明の医薬組成物は、癌の治療に有用である。
［配列表］
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2007046538.tif 000019
【図１】
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【図２】
2007046538.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
2007046538.tif 000026
【図７Ｃ−Ｄ】
2007046538.tif 000027
【図８】
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【国際調査報告】
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