(57)【要約】  特定の増殖因子及び少なくとも１つのリン脂質を含有する培地、並びに当該培地を作製するための組成物、キット及び方法を提供する。これにより、無血清培地又は低血清培地でありながら血清含有培地に匹敵する動物細胞増殖促進効果を有する技術を実現する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有することを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤。
【請求項２】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項３】
少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項４】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の培地用添加剤。
【請求項５】
コレステロールをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の培地用添加剤。
【請求項６】
ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項７】
脂質酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項８】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の培地用添加剤。
【請求項９】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１０】
界面活性剤をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１１】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の培地用添加剤。
【請求項１２】
インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１３】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１４】
前記動物細胞が未分化細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１５】
前記動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１６】
請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤を構成する成分を含有していることを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項１７】
請求の範囲第１６項に記載の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１項に記載の培地用添加剤を備えていることを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項１９】
ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を別々に備えていることを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項２０】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２１】
少なくとも１つの脂肪酸をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２２】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２３】
コレステロールをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２４】
ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２５】
脂質酸化防止剤をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２６】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２７】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤。
【請求項２８】
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２９】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項３０】
インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項３１】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項３２】
前記動物細胞が未分化細胞であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項３３】
前記動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項３４】
請求の範囲第１９項に記載の培地用添加剤キットに備えられた成分を含有していることを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項３５】
請求の範囲第３４項に記載の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項３６】
動物細胞を無血清培養するための培養方法であって、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項３７】
前記基礎培地に少なくとも１つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の培養方法。
【請求項３８】
分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項３９】
少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第３８項に記載の培地用添加剤。
【請求項４０】
分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有することを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項４１】
少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項４２】
分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養する培養方法であって、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項４３】
前記基礎培地に少なくとも１つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することを特徴とする請求の範囲第４２項に記載の培養方法。
【請求項４４】
初代培養間葉系幹細胞を培養するための培地用添加剤であって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項４５】
初代培養間葉系幹細胞を培養するための培地用添加剤キットであって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を備えていることを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項４６】
初代培養間葉系幹細胞を培養するため培養方法であって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項４７】
マウス線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
・ＴＧＦ−β、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項４８】
マウス線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
・ＴＧＦ−β、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を備えていることを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項４９】
マウス線維芽細胞を連続継代培養する培養方法であって、
・ＴＧＦ−β、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項５０】
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項５１】
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を備えていることを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項５２】
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養する培養方法であって、
・ＰＤＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項５３】
ヒト線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
・ＦＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項５４】
ヒト線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
・ＦＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を備えていることを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項５５】
ヒト線維芽細胞を連続継代培養する培養方法であって、
・ＦＧＦ、
・少なくとも１つのリン脂質、
・少なくとも１つの脂肪酸、並びに
・ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞の培養培地に添加する組成物、キット及びその利用に関するものであり、より詳細には、動物細胞を、無血清条件下又は低血清条件下において培養するための組成物、キット及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨髄等の組織中に存在する体性幹細胞の一つであり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等へ分化する多分化能、及び自己増殖能を有する幹細胞として知られている。現在、間葉系幹細胞は、再生医療分野において移植用細胞として利用されており、間葉系幹細胞の適用対象である疾患は、骨欠損、軟骨欠損、歯周病、心筋梗塞、難治性皮膚疾患、骨粗しょう症、変形性関節病、脊髄損傷、造血支持、臓器移植での拒絶反応抑制等、多岐にわたる。今後、間葉系幹細胞の適用対象となる疾患は、さらに増えるものと予想される（例えば、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、腎臓疾患等）。【０００３】
この間葉系幹細胞は、骨髄、骨膜等の組織中に存在している。これらの生体組織から採取された間葉系幹細胞を、増殖させ、さらに所望の細胞へと分化させることにより、組織再生医療において利用され得る組織を調製する。しかしながら、生体組織中に存在する間葉系幹細胞の数は少量であるので、間葉系幹細胞を移植用細胞として用いるためには、組織から採取された細胞を十分に増殖させる必要がある。【０００４】
通常、動物細胞の培養は、ウシ胎仔血清等の非ヒト動物由来の血清が５〜２０％添加された培地を用いて行われる。この血清は、生体外での細胞の成長及び／又は増殖を促進するための栄養源、又はホルモン等の生理活性物質の供給源として用いられている。しかしながら、血清は、非常に高価であり、また天然製品であるがゆえにロット毎に成分の差が生じる。また、培養後の細胞から血清由来のタンパク質等を除去するために精製する必要があり、作業が煩雑になる。さらに、血清中に混入している未知の病原体（ウイルス、病原性プリオン等）により培養細胞が汚染される危険性がある。【０００５】
一方、非ヒト動物由来の血清を用いることなく動物細胞を培養する技術が開発されている。例えば、自家移植治療（すなわち、患者から採取した細胞を培養後に同じ患者へと戻す治療法）において用いられる細胞の培養には、その同じ患者から得た自家ヒト血清を用いる。これにより、培養細胞の汚染は回避される。しかし、血清作製のために大量の血液が必要となるため、患者に多大な負担を与える。【０００６】
これらの問題を回避するために、血清を含まない培地（無血清培地）又は血清含有量の低い培地（低血清培地）の開発が進められている。培地中の血清濃度を低下させることにより、細胞はその増殖性を著しく低下させるか又は死滅する。このため、細胞の増殖性を失うことなく培養することが可能な培地を作製するために、血清に替わる細胞増殖因子を培地中に添加する必要がある。従来、血清に替わる細胞増殖因子として、各種ペプチドホルモン、増殖因子等が用いられている（例えば、特許文献１及び２を参照のこと）。このような無血清培地として、例えば、ＨＡＭのＦ１２培地を基礎培地とし、この培地中にインスリン、トランスフェリン等を添加した無血清培地が知られている。【０００７】
無血清培地に増殖因子以外に脂肪酸を含ませることにより、治療に適用するための軟骨細胞を培養する方法もまた知られている（例えば、特許文献３及び４を参照のこと）。さらに、特許文献５には、神経幹細胞を長期培養するための方法及び組成物が記載されている。
〔特許文献１〕
日本国公開特許公報「特開平８−３０８５６１号公報（公開日：１９９６年１１月２６日）」
〔特許文献２〕
日本国公開特許公報「特開平９−１９１８７４号公報（公開日：１９９７年７月２９日）」
〔特許文献３〕
日本国公開特許公報「特表２００５−５１５７７７号公報（平成１７年６月２日公開）」
〔特許文献４〕
日本国公開特許公報「特表２００２−５２９０７１号公報（平成１４年９月１０日公開）」
〔特許文献５〕
日本国公開特許公報「特表２００３−５１６１４１号公報（平成１５年５月１３日公開）」
【発明の開示】
【０００８】
しかしながら、上記のような培地を用いた場合においても、１０％血清含有培地と比較して、必ずしも十分な細胞増殖促進効果を得るに至っていない。特に、従来の技術では、大量培養に必須の長期培養ができなかった。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、無血清培地でありながら１０％血清含有培地に匹敵する動物細胞増殖促進効果を有する技術を提供することにある。
【００１０】
本発明に係る培地用添加剤は、動物細胞を無血清培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００１２】
本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有することが好ましい。
【００１３】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【００１４】
本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
【００１５】
本発明に係る培地用添加剤は、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有してもよい。
【００１６】
本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
【００１７】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることが好ましいが、他の還元剤であってもよい。
【００１８】
本発明に係る培地用添加剤は、塩化リチウムをさらに含有してもよい。
【００１９】
本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
【００２０】
本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【００２１】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有してもよい。
【００２２】
本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに含有してもよい。
【００２３】
本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は未分化細胞であることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は特別な分化能を失って未分化状態に近い細胞（例えば、サル腎臓由来のＣＯＳ細胞）であることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る培養培地は、動物細胞を無血清培養するために上記の培地用添加剤を構成する成分を含有していることを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために上記の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る培地用添加剤キットは、動物細胞を無血清培養するために上記の培地用添加剤を備えていることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る培地用添加剤キットは、動物細胞を無血清培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を別々に備えていることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも１つの脂肪酸をさらに備えていることが好ましい。
【００３１】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂肪酸はリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
【００３４】
本発明に係る培地用添加剤キットは、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに備えていてもよい。
【００３５】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸化防止剤をさらに備えていてもよい。
【００３６】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることが好ましいが、他の還元剤であってもよい。
【００３７】
本発明に係る培地用添加剤キットは、塩化リチウムをさらに備えていてもよい。
【００３８】
本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【００３９】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【００４０】
本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに備えていてもよい。
【００４１】
本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン、または他のグルココルチコイドをさらに備えていてもよい。
【００４２】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、動物細胞は未分化細胞であることが好ましい。
【００４３】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、動物細胞は間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００４４】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記動物細胞は特別な分化能を失って未分化状態に近い細胞（例えば、サル腎臓由来のＣＯＳ細胞）であることが好ましい。
【００４５】
本発明に係る培養培地は、動物細胞を無血清培養するために、上記の培地用添加剤キットに備えられた成分を含有していることを特徴としている。
【００４６】
本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために、上記の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４７】
本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【００４８】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に少なくとも１つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することが好ましい。
【００４９】
本発明に係る培地用添加剤は、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有することを特徴としている。
【００５０】
本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有することが好ましい。
【００５１】
本発明に係る培地用添加剤キットは、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を備えていることを特徴としている。
【００５２】
本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも１つの脂肪酸をさらに備えていることが好ましい。
【００５３】
本発明に係る培養培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有していることを特徴としている。
【００５４】
本発明に係る培養培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。
【００５５】
本発明に係る培養方法は、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【００５６】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に少なくとも１つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することが好ましい。
【００５７】
本発明に係る培地用添加剤は、初代培養幹細胞を培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を含有することを特徴としている。
【００５８】
本発明に係る培地添加剤は、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含有してもよい。
【００５９】
本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００６０】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【００６１】
本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
【００６２】
本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
【００６３】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【００６４】
本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
【００６５】
本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【００６６】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有してもよい。
【００６７】
本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに含有してもよい。
【００６８】
本発明に係る培地用添加剤キットは、初代培養幹細胞を培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を備えていることを特徴としている。
【００６９】
本発明に係る培地添加剤キットは、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに備えてもよい。
【００７０】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００７１】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【００７２】
本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
【００７３】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸化防止剤をさらに備えていてもよい。
【００７４】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【００７５】
本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【００７６】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【００７７】
本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに備えていてもよい。
【００７８】
本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに備えていてもよい。
【００７９】
本発明に係る培養方法は、初代培養幹細胞を培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【００８０】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
【００８１】
本発明に係る培地用添加剤は、マウス線維芽細胞を連続継代培養するために、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を含有することを特徴としている。
【００８２】
本発明に係る培地用添加剤は、ＦＧＦ及び／又はＨＧＦをさらに含有してもよい。
【００８３】
本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００８４】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【００８５】
本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
【００８６】
本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
【００８７】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【００８８】
本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
【００８９】
本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【００９０】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有してもよい。
【００９１】
本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに含有してもよい。
【００９２】
本発明に係る培地用添加剤キットは、マウス線維芽細胞を連続継代培養するために、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を備えていることを特徴としている。
【００９３】
本発明に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ及び／又はＨＧＦをさらに備えていてもよい。
【００９４】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【００９５】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【００９６】
本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
【００９７】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸化防止剤をさらに備えていてもよい。
【００９８】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【００９９】
本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【０１００】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【０１０１】
本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに備えていてもよい。
【０１０２】
本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに備えていてもよい。
【０１０３】
本発明に係る培養方法は、マウス線維芽細胞を連続継代培養するために、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【０１０４】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、ＦＧＦ及び／又はＨＧＦを添加する工程をさらに包含してもよい。
【０１０５】
本発明に係る培地用添加剤は、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を含有することを特徴としている。
【０１０６】
本発明に係る培地用添加剤は、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含有してもよい。
【０１０７】
本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【０１０８】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【０１０９】
本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
【０１１０】
本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
【０１１１】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【０１１２】
本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
【０１１３】
本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【０１１４】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有してもよい。
【０１１５】
本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに含有してもよい。
【０１１６】
本発明に係る培地用添加剤キットは、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を備えていることを特徴としている。
【０１１７】
本発明に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに備えていてもよい。
【０１１８】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【０１１９】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【０１２０】
本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
【０１２１】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸化防止剤をさらに備えていてもよい。
【０１２２】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【０１２３】
本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【０１２４】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【０１２５】
本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに備えていてもよい。
【０１２６】
本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに備えていてもよい。
【０１２７】
本発明に係る培養方法は、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するために、ＰＤＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【０１２８】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
【０１２９】
本発明に係る培地用添加剤は、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を含有することを特徴としている。
【０１３０】
本発明に係る培地用添加剤は、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ及びＰＤＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含有してもよい。
【０１３１】
本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【０１３２】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【０１３３】
本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
【０１３４】
本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
【０１３５】
本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【０１３６】
本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
【０１３７】
本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【０１３８】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有してもよい。
【０１３９】
本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに含有してもよい。
【０１４０】
本発明に係る培地用添加剤キットは、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を備えていることを特徴としている。
【０１４１】
本発明に係る培地用添加剤キットは、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ及びＰＤＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに備えていてもよい。
【０１４２】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
【０１４３】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることが好ましく、栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リノレイン酸及びアラキドン酸が特に好ましい。
【０１４４】
本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
【０１４５】
本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸化防止剤をさらに備えていてもよい。
【０１４６】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
【０１４７】
本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【０１４８】
本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
【０１４９】
本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに備えていてもよい。
【０１５０】
本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、または他のグルココルチコイドをさらに備えていてもよい。
【０１５１】
本発明に係る培養方法は、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養するために、ＦＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの脂肪酸、並びにＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
【０１５２】
本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、ＴＧＦ−β、ＨＧＦおよびＰＤＧＦからなる群より選択される少なくとも１つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
【０１５３】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図２】無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形態学的な変化を示す図である。
【図３】無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化能の評価を示す図である。
【図４】無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の脂肪分化能の評価を示す図である。
【図５】無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨分化能の評価を示す図である。
【図６】無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨分化能の評価を示す図である。
【図７】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図８】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図９】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図１０】無血清培地への血清代替物質の添加によるＣ２Ｃ１２細胞の増殖に対する影響を示した図である。
【図１１】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞増殖シグナル伝達系に対する影響を示した図である。
【図１２】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞増殖シグナル伝達系に対する影響を示した図である。
【図１３】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の無血清培地に添加する血清代替物質を示す図である。
【図１４】Ｃ２Ｃ１２細胞の無血清培地に添加する血清代替物質を示す図である。
【図１５（ａ）】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図１５（ｂ）】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図１６（ａ）】無血清培地への血清代替物質の添加による初代ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図１６（ｂ）】無血清培地への血清代替物質の添加による初代ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する影響を示した図である。
【図１７（ａ）】無血清培地への血清代替物質の添加による１０Ｔ１／２細胞の増殖に対する影響を示した図である。
【図１７（ｂ）】無血清培地への血清代替物質の添加によるＣＨＯ細胞の増殖に対する影響を示した図である。
【図１７（ｃ）】無血清培地への血清代替物質の添加によるヒトのヒフ由来の線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の増殖に対する影響を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５５】
上述したように、血清を含まない培地（無血清培地）において増殖性を失わせることなく細胞を培養するために、各種ペプチドホルモン、増殖因子、脂質等が用いられている。しかし、これらの血清代替成分を添加した培地は、血清含有培地と比較して、十分な細胞増殖促進効果を必ずしも有していない。そこで、本発明者らは、低血清（０．５〜２％）の条件下であっても、１０％血清含有培地を用いる従来の培養方法に匹敵するヒト間葉系幹細胞培養法を検討した。その結果、特定の増殖因子群と脂肪酸複合物とを基礎培地に添加することにより、低血清条件下であっても１０％血清の場合と同等以上の細胞増殖を導くことを見出し、ヒト間葉系幹細胞を培養するための「基本培地」を完成させた。また、この条件をさらに検討することにより、特定の因子をさらに添加することにより無血清条件下であっても１０％血清の場合と同等以上の細胞増殖を導く条件を見出した。【０１５６】
本発明を用いれば、動物細胞を低血清条件下又は無血清条件下の培養系において大量に増殖させることができる。特に、間葉系幹細胞のような再生医療用途を有する細胞について、試験管内だけでなく工業規模での細胞増殖を実現し得、生産コストを大きく低減し得る。【０１５７】
（１）動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤を提供する。本発明に係る培地用添加剤は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している。【０１５８】
本発明に係る培地用添加剤が含有しているリン脂質としては、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン及びフォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、本発明に係る培地用添加剤はこれらのリン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤はフォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて含有している。また、これらのリン脂質は、動物由来であっても、植物由来であってもよい。【０１５９】
一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。本実施形態に係る培地用添加剤が含有している脂肪酸としては、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン等が挙げられ、本実施形態に係る培地用添加剤はこれらの脂肪酸を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。また、本実施形態に係る培地用添加剤は、上記脂肪酸以外にさらにコレステロールを含有していてもよい。【０１６０】
本明細書中で使用される場合、ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ−１など他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢであることが好ましい。さらに、本明細書中で使用される場合、ＴＧＦ−βは、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＴＧＦ−β３であることが好ましいが、他のＴＧＦ−βファミリーから選択されてもよい。【０１６１】
本発明に係る培地用添加剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。【０１６２】
本明細書中で使用される場合、アスコルビン酸化合物は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）もしくはアスコルビン酸２リン酸、またはこれらに類似する化合物が意図される。【０１６３】
なお、本発明に係る培地用添加剤に含有されている増殖因子は、天然のものであっても、遺伝子組換えによって製造されたものであってもよい。【０１６４】
１つの局面において、本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤を含有していることが好ましい。一実施形態において、本実施形態に係る培地用添加剤に含有される脂質酸化防止剤は、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であり得る。本発明に係る培地用添加剤はまた、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、本実施形態に係る培地用添加剤に含有される界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８またはＴｗｅｅｎ  ８０であり得る。【０１６５】
本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。本発明に係る培地用添加剤はさらに、デキサメタゾン、あるいは他のグルココルチコイドを含有していてもよい。【０１６６】
（２）動物細胞を無血清培養するためのキット
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤キットを提供する。本発明に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を備えている。本発明に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子と、少なくとも１つのリン脂質とを同一容器内に備えていても、これらの成分を別々に備えていてもよい。【０１６７】
一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも１つの脂肪酸をさらに備えていることが好ましい。本実施形態に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子と、少なくとも１つのリン脂質と、少なくとも１つの脂肪酸とを同一容器内に備えていても、これらの成分を別々に備えていてもよい。【０１６８】
本明細書中で使用される場合、「組成物」は各主成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各主成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。よって、本発明に係る培地用添加剤キットに備えられている増殖因子、リン脂質及び脂肪酸は、培地用添加剤について上述したものと同一であることが容易に理解される。【０１６９】
（３）動物細胞を無血清培養するための培養培地
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培養培地を提供する。本発明に係る培養培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している。本発明に係る培養培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子と、少なくとも１つのリン脂質とを含有していればよく、これらの成分は基礎培地に同時に添加されても別々に添加されてもよい。すなわち、本発明に係る培養培地は、上述した培地用添加剤に含有されている成分または培地用添加剤キット中に備えられている成分を含んでいればよいといえる。【０１７０】
一実施形態において、本発明に係る培養培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。本実施形態に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子と、少なくとも１つのリン脂質と、少なくとも１つの脂肪酸とを含有していればよく、これらの成分は基礎培地に同時に添加されても別々に添加されてもよい。すなわち、本発明に係る培養培地は、上述した培地用添加剤に含有されている成分または培地用添加剤キット中に備えられている成分を含んでいればよいといえる。【０１７１】
本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地などが挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合した培地が好ましい。【０１７２】
（４）動物細胞を無血清培養するための培養方法
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培養方法を提供する。本発明に係る培養方法は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している培養培地中において動物細胞を培養する工程を包含している。上記培養培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していてもよい。すなわち、本発明に係る培養方法は、動物細胞を培養する際に、上述した培養培地を用いればよいといえる。【０１７３】
一実施形態において、本発明に係る培養方法は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質とを、基礎培地に同時に添加する工程を包含してもよい。上記基礎培地は、上述したように当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されない。【０１７４】
（５）さらなる用途
上述したように、本発明は、無血清培地であっても１０％血清含有培地において培養した場合と同等又はそれ以上の速度で、動物細胞をその特性を保持したまま増殖させることができる。本発明に従って幹細胞（特に、ヒト間葉系幹細胞）を培養すると、その特性（骨分化能、脂肪分化能など）を高レベルに維持したまま連続的に継代培養することができる。実施例に示すように、本発明に係る無血清培地を用いれば、培養開始時の少なくとも１００００倍以上に細胞数を増やすことができる。すなわち、本発明はまた、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤、培地用添加剤キット、培養培地及び培養方法を提供する。【０１７５】
１つの局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤を提供する。本発明に係る培地用添加剤は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している。一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。【０１７６】
他の局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットを提供する。本発明に係る培地用添加剤キットは、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している。一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。【０１７７】
別の局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培養培地を提供する。本発明に係る培養培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している。一実施形態において、本発明に係る培養培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。【０１７８】
さらなる局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培養方法を提供する。本発明に係る培養方法は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有している培養培地中において動物細胞を培養する工程を包含している。上記培養培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していてもよい。すなわち、本発明に係る培養方法は、幹細胞を連続継代培養する際に、上述した培養培地を用いればよいといえる。【０１７９】
なお、実施例において詳述するように、本発明は、幹細胞などの未分化細胞に対してより強い効果を示すが、特別な分化能を失って未分化状態に近い細胞（例えば、サル腎臓由来のＣＯＳ細胞）の無血清条件での培養においても非常に有効である。すなわち、本発明の適用対象となり得る細胞は、未分化細胞が好ましく、未分化細胞は、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、胚性幹細胞等の幹細胞、または線維芽細胞であり得、間葉系幹細胞がより好ましい。なお、これらの細胞を用いる際に留意すべき培養方法は、各細胞について既知の培養方法に従えばよい。【０１８０】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。【０１８１】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１８２】
〔材料の調製〕
１０ｍｇの３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ（ＰＣ，Ｗａｋｏ：１６３−２１１８１）又は３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ（ＰＡ，Ｓｉｇｍａ：Ｐ９５１１）を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０（−）を含有するＰＢＳ１０ｍｌに添加し、次いで、超音波を用いてこの液体を５分間懸濁した。この懸濁液を、氷中にて３０秒間超音波処理した後、室温にて５分間遠心分離（２５００ｒｐｍ）した。沈殿が生じた場合は氷上にて５分間さらに超音波処理を行い、沈殿が消失するまでこの操作を繰り返した。得られた溶液を０．４５μｍ径のフィルターにて濾過し、窒素ガスで封入した後、遮光下にて冷蔵保存した。これらをいずれも培地の１／１００量添加した。脂肪酸複合体としてのＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤ，Ｇｉｂｃｏ：１１９０５−０３１）を培地の１／１００量添加した。なお、この脂肪酸複合体に含有される脂質を図１３及び図１４に示す。図１３は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養に用いた培地中の成分を示し、図１４は、Ｃ２Ｃ１２細胞の培養に用いた培地中の成分を示す。なお、これらの成分については、図１３及び図１４に示した値の上限より高濃度であってもよい。【０１８３】
３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む培地に溶解してストック溶液（１００倍溶液）を作製した。１０００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを、培地に溶解してストック溶液（１００倍溶液）を作製した。１０００μｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎを培地に溶解してストック溶液（１００倍溶液）を作製した。これらをいずれも１００倍希釈で使用した。Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを最終濃度１０−８Ｍで使用した。【０１８４】
〔実施例１：骨髄由来の間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）の無血清培養〕
〔Ｉ：リン脂質の効果〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（３継代目：Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞を２４ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。【０１８５】
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地２）１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地４）増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）。【０１８６】
なお、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の成分はロット毎に差があるので、ＦＢＳのロット毎に培養細胞への増殖効果が異なる。そこで、本実施例において培地２に添加するＦＢＳとして、間葉系幹細胞に特に高い増殖効果をもたらすものを用いた。【０１８７】
無血清培地の基礎培地の組成を表１に示す。培地に添加した種々の成分は図１３及び図１４に示した会社から購入した。基礎培地であるＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ：Ｍ−６７７０）培地は、ニワトリ胚線維芽細胞のクローン増殖用に開発されたものであり、完全な微量元素（ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでいる。従来の間葉系幹細胞の基礎培地ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２と比べて、ＭＣＤＢ２０１／ＤＭＥＭ（１：１）を用いることにより、間葉系幹細胞の最適な増殖促進が示された（図示せず）。【０１８８】
【表１】
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2007080919.tif 000003
【０１８９】
本発明に係る基本培地（培地３）は、増殖因子群（ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ）及び脂肪酸複合物（アラキドン酸、レチノイン酸、リノレン酸、オレイン酸、リノレイン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン酸）を含み、これら以外に、培地添加サプリメントとして知られるインスリン、トランスフェリン、セレネート（セレン酸ナトリウムなど）、並びにコレステロール、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、脂質酸化防止剤としてのビタミンＥ、界面活性剤としてのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８及びＴｗｅｅｎ  ８０をさらに含んでいる。【０１９０】
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日又は３日毎に交換した。細胞を、コンフルエントになる前にＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン及び０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のＴｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を３回洗浄した後、細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測した。結果を図１に示す。【０１９１】
また、細胞を継代するために、各々の培地を使用して、再懸濁した細胞を２４ウェルプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で再播種した。７日毎に継代培養を繰り返して、５継代目まで培養した。各々の培地毎に実験を三連にて行った実験の平均値±ＳＤを図１に示す（ｎ＝３）。【０１９２】
本発明に係る基本培地（培地３）は、２％ＦＢＳを添加すると従来の１０％ＦＢＳ含有培地と同等の細胞増殖効果を示した（図示せず）。この基本培地を無血清条件下で用いた場合、１０％ＦＢＳ含有培地よりは劣るが、優れた細胞増殖効果を示した（１０％ＦＢＳ含有培地における細胞増殖レベルの約４５％：図１）。基本培地（培地３）に動物由来のリン脂質（フォスファチジン酸（ＰＡ）、フォスファチジルコリン（ＰＣ））をさらに添加した場合（培地４）、血清非存在下であっても優れた細胞増殖効果を示した（１０％ＦＢＳ含有培地における細胞増殖レベルの約８．５倍：図１）。【０１９３】
以上より、増殖因子群及び脂肪酸群を含有する無血清培地中にリン脂質を添加することにより、ヒト間葉系幹細胞の無血清培養を有意に改善することができることがわかった。【０１９４】
〔ＩＩ：脂肪酸の効果〕
次いで、基本培地における脂肪酸の重要性について検討した。
（培地１）添加なし
（培地２）１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地５）増殖因子群＋リノレイン酸＋レシチン＋ＥＧＦ＋ビタミンＣ（ＶＣ）。【０１９５】
培地５は、基本培地（培地３）からリノレイン酸以外の脂肪酸群を除去して植物由来のリン脂質（レシチン）を添加した。なお、植物由来のリン脂質（レシチン）は以下の方法で調製した。【０１９６】
植物由来のレシチン（Ｌｅｃｉｔｈｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｙｂｅａｎ，Ｗａｋｏ：１２０−００８３２）２００ｍｇをクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に添加した。これを、窒素ガス蒸留法を用いて乾燥させた後、ＰＢＳ（−）２０ｍｌを添加した。この溶液を、室温にて１５分間超音波処理を行うことにより平衡化し、窒素ガス下で氷上にてさらに３０秒〜２分間超音波処理を行った後、室温にて５分間遠心分離（２５００ｒｐｍ）した。沈殿があればさらに氷上にて５分間超音波処理を行った後、室温にて５分間遠心分離（２５００ｒｐｍ）した。この工程を繰り返した後に回収した上清を０．４５μｍ径のフィルターにて濾過し、窒素ガスで封入した後、遮光下にて冷蔵保存した。【０１９７】
図１に示すように、培地５は、血清非存在下であっても基本培地（培地３）と同等の優れた細胞増殖効果を示した（１０％ＦＢＳ含有培地における細胞増殖レベルの約４０％：図１）。【０１９８】
以上より、増殖因子群を含有する無血清培地中に脂肪酸が少なくとも１種類含まれていれば、ヒト間葉系幹細胞の無血清培養におけるリン脂質の効果を導くことができることがわかった。【０１９９】
〔ＩＩＩ：増殖因子の効果〕
次いで、基本培地（培地３）から増殖因子をいずれか１つ除去した培地を用いて、無血清条件下での間葉系幹細胞の増殖を比較することにより、培地中に添加する増殖因子について検討した：
（培地１）添加なし
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地３−１）培地３よりＰＤＧＦのみを除去
（培地３−２）培地３よりＴＧＦ−βのみを除去
（培地３−３）培地３よりＨＧＦのみを除去
（培地３−４）培地３よりＦＧＦのみを除去
（培地３−５）培地３よりデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のみを除去。
（培地３−６）培地３よりインスリン、トランスフェリン、セレネートを除去。【０２００】
図１に示すように、増殖因子群に含まれる増殖因子が１つでも欠落すると無血清条件下での間葉系幹細胞の活発な増殖は阻害されることがわかった。例えば、ＨＧＦ、ＴＧＦ−βのみを除去すると本培養での増殖が明らかに低下した。また、ＨＧＦ及びＴＧＦ−βの両者を除去すると細胞増殖は著しく阻害された（データ示さず）。【０２０１】
また、図１には示さないが、リン脂質に加えてＥＧＦ及びＶＣをさらに添加した培地（培地４＋ＥＧＦ＋ＶＣ）を用いることにより無血清培地での間葉系幹細胞の増殖をさらに促進し得ることがわかった（図１０：培地４−２）。【０２０２】
〔ＩＶ：培地による間葉系幹細胞の形態に対する影響〕
本実施例において用いた無血清培地にて培養した間葉系幹細胞の形態を図２に示す。図２に示されるように、無血清培地で培養した細胞（３継代目）は、１０％ＦＢＳ含有培地で培養した細胞と比較して、間葉系幹細胞に典型的な紡錘形の形を示していた。また、ＴＧＦ−β又はＨＧＦのみを除いた無血清培地では、細胞増殖が低減した。【０２０３】
〔実施例２：無血清培養した間葉系幹細胞の分化能の評価〕
〔Ｉ：骨芽細胞への分化誘導〕
実施例１にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分化能を評価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した３代目のヒト腸骨由来の間葉系幹細胞を収集した後、骨分化誘導培地（α−ＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１００ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０ｍＭ  β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ、及び５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む。）へ移した。骨分化誘導培地中の間葉系幹細胞を、５％炭酸ガス存在下にて３７℃で培養し、さらに２〜３日おきに同一の分化誘導培地と交換し、合計２８日間培養した。骨分化して石灰化した細胞層をアリザリン赤にて染色した。結果を図３に示す。【０２０４】
図３に示すように、無血清培地で培養した間葉系幹細胞（４継代目）を骨分化誘導培地で２８日間培養した結果、骨芽細胞に特徴的な石灰化を示すアリザリン赤による染色性を示し、カルシウムの沈着が観察された。しかも、１０％ＦＢＳ含有培地と比較して、無血清培地で培養した間葉系幹細胞はいずれも、高い骨分化能力（石灰化能）を保持していた。特に、２種類のリン脂質を追加したもので最も高い骨分化能が観察された。【０２０５】
〔ＩＩ：脂肪細胞への分化誘導〕
実施例１にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分化能を評価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した３代目のヒト腸骨由来の間葉系幹細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、トリプシンにて分散させた後に収集し、脂肪分化誘導培地（高グルコース含有ＤＭＥＭ、１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、０．２ｍＭ  Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、１μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．５ｍＭ  ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、及び１０％ＦＢＳからなる）に移した。脂肪分化誘導培地中の間葉系幹細胞を、５％炭酸ガス存在下にて３７℃で培養し、さらに２〜３日おきに同一の分化誘導培地と交換し、合計２８日間培養した。細胞をオイルレッドＯにて染色することによって脂肪分化の評価を行った。結果を図４に示す。【０２０６】
図４に示すように、無血清培地で培養した間葉系幹細胞（４継代目）を脂肪分化誘導培地で２８日間培養した結果、脂肪を示すオイルレッドＯによる染色性を示した。しかも、１０％ＦＢＳ含有培地と比較して、無血清培地で培養した間葉系幹細胞はいずれも、高い脂肪分化能力を保持していた。【０２０７】
〔ＩＩＩ：軟骨細胞への分化誘導〕
実施例１にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分化能を評価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した５代目のヒト腸骨由来の間葉系幹細胞を収集した後、軟骨分化誘導培地（高グルコースα−ＭＥＭ、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β３、１００ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２‐ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１００μｇ／ｍｌ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、ＩＴＳ−プラス（６．２５μｇ／ｍｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、６．２５μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、６．２５ｎｇ／ｍｌ  ｓｅｌｅｎａｔｅ、５．３３μｇ／ｍｌ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン：ＢＳＡ）を含む。）へ移した。なお、遠心管（１５ｍｌ用）に、２０万個の細胞を入れ、０．５−１ｍｌの以下の培地でインキュベートした。また、上記の軟骨分化誘導培地からＴＧＦ−βを除いたコントロール培地に間葉系幹細胞を移した。軟骨分化誘導培地およびコントロール培地中の間葉系幹細胞を、５％炭酸ガス存在下にて３７℃で培養した。培養開始から２４時間後には、細胞は球状のペレットを形成した。さらに２〜３日おきに同一の分化誘導培地と交換し、２１日間培養した。硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ：ＧＡＧ）定量用キット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて培養後のペレットのＧＡＧを定量した。結果を図５に示す。なおＧＡＧ量は細胞のＤＮＡ含量によってノーマライズした。また、培養後の軟骨分化誘導培地中の軟骨分化した細胞をトルイジンブルーにより染色した。結果を図６に示す。【０２０８】
図５に示すように、無血清培地および１０％ＦＢＳ含有培地で培養した間葉系幹細胞を軟骨分化誘導培地で２１日間培養した結果、無血清培地で培養した間葉系幹細胞（５継代目）は、１０％ＦＢＳ含有培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、著しく高いＧＡＧ量を示した（ｐ＜０．０１）。なお、無血清培地および１０％ＦＢＳ培地で培養した間葉系幹細胞をそれぞれコントロール培地で２１日間培養した結果、いずれの培地中においてもＧＡＧ量の増加が観察されなかった（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２０９】
また、図６に示すように、無血清培地および１０％ＦＢＳ含有培地で培養した間葉系幹細胞を軟骨分化誘導培地で２１日間培養した結果、無血清培地で培養した間葉系幹細胞（５継代目）は、１０％ＦＢＳ含有培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、著しく高いレベルのトルイジンブルーによる染色性を示し、マトリックスの蓄積が観察された。【０２１０】
〔実施例３：骨髄由来の間葉系幹細胞の無血清培養における増殖因子の作用〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（３代目）を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞を２４ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。【０２１１】
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地２）１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地３−２）培地３よりＴＧＦ−βのみを除去
（培地３−３）培地３よりＨＧＦのみを除去
（培地３−７）培地３よりＴＧＦ−β及びＨＧＦを除去
（培地３−８）培地３＋ＥＧＦ
（培地３−９）培地３＋ＶＣ
（培地４）増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）
（培地４−１）培地４＋ＥＧＦ＋ビタミンＣ（ＶＣ）＋ビタミンＥ（ＶＥ）
（培地５）増殖因子群＋リノレイン酸＋レシチン＋ＥＧＦ＋ＶＣ。【０２１２】
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日又は３日毎に交換した。培養８日目の細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （同仁化学）を用いて測定した。結果を図７に示す。【０２１３】
図７に示すように、無血清培地（培地３−８、培地４、培地４−１、又は培地５）で培養した間葉系幹細胞は、培地３で培養した場合と比較して、培養８日目の細胞増殖率が亢進した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。特に、この効果は、培地４又は培地４−１で培養した場合に、顕著であった。このことより、リン脂質だけでなく、ＥＧＦ、ＶＣ及び高濃度のＶＥもまた間葉系幹細胞の増殖を促進するに有効であることがわかった。一方、ＴＧＦ−β又はＨＧＦの少なくとも一方を基本培地（培地３）から除去した場合、間葉系幹細胞の細胞増殖率が顕著に低下した。このことより、ＴＧＦ−β及びＨＧＦは間葉系幹細胞の無血清培養に必須であることがわかった。【０２１４】
また、植物由来のレシチン（動物由来のフォスファチジルコリン（ＰＣ）に相当する）を主成分とする脂質混合物を含有する培地（培地５）もまた、多数の脂肪酸を主成分とする脂質混合物を含有する培地（培地４）と同様に間葉系幹細胞の無血清培養に有用であることがわかった（図７）。【０２１５】
〔実施例４：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養における追加増殖因子の作用〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（３継代目）を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞を２４ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。【０２１６】
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地６）培地３＋ＶＥＧＦ
（培地７）培地３＋ＣＴＧＦ。【０２１７】
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日又は３日毎に交換した。培養８日目の細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （同仁化学）を用いて測定した。結果を図８に示す。【０２１８】
図８に示すように、無血清培地（培地６又は培地７）で培養した間葉系幹細胞は、培地３と比較して、培養８日目の細胞増殖率が亢進した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２１９】
〔実施例５：骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（３代目）を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞を２４ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。【０２２０】
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地３）増殖因子群及び脂肪酸群
（培地７）増殖因子群＋リノレイン酸＋ＰＣ
（培地８）増殖因子群＋リノレイン酸＋ＰＡ
（培地９）増殖因子群＋リノレイン酸＋レシチン。【０２２１】
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日又は３日毎に交換した。培養８日目の細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （同仁化学）を用いて測定した。結果を図９に示す。【０２２２】
図９に示すように、無血清培地（培地７又は培地８）で培養した間葉系幹細胞は、培地３で培養した場合と同等の細胞増殖率を示した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。また、植物由来のリン脂質レシチンを主成分とする脂質混合物及びレチノイン酸を含有する培地（培地９）で培養した間葉系幹細胞も、基本培地（培地３）で培養した場合と同等の細胞増殖率を示した。すなわち、脂肪酸１種類とリン脂質１種類との組み合わせであっても、本発明を特徴付ける増殖因子が培地中に含有されている場合は、増殖速度は低いものの間葉系幹細胞の増殖が可能であり、より多くの脂質が組み合わされている場合は、脂肪酸１種類とリン脂質１種類との組み合わせ又は多数の脂肪酸を主成分とする脂質混合物単独もしくは植物由来のリン脂質レシチンを主成分とする脂質混合物単独の場合よりも、大量培養を高速にて行うことができることがわかった（図１と図９との比較）。【０２２３】
〔実施例６：未分化細胞株の無血清培養〕
マウス間葉系幹細胞Ｃ２Ｃ１２細胞（あるいはマウス軟骨細胞株ＡＴＤＣ５又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞）を、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を含む１０ｃｍプレートにて、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン及び０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のＴｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を３回洗浄した後、細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測した。結果を図１０に示す。【０２２４】
さらに、再懸濁した細胞を、以下の異なる培地条件を使用して、２４ウェルプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で再播種した。
（培地１）無添加
（培地２）１０％ＦＢＳ
（培地４−２）増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）＋ＥＧＦ＋ＶＣ
（培地４−３）増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）＋ＥＧＦ＋ＶＣ−ＨＧＦ。【０２２５】
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日又は３日毎に交換した。培養８日目の細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （同仁化学）を用いて測定した。結果を図１０に示す。【０２２６】
図１０に示すように、無血清培地（培地４−２）で培養した細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞は、通常の１０％ＦＢＳ含有培地（培地２）よりはるかに優れた細胞増殖を示した。しかしその培地からＨＧＦのみを除去した培地（培地４−３）を用いると、この細胞株の増殖能は著しく低下した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２２７】
なお、間葉系幹細胞からすでに軟骨へと分化したマウスＡＴＤＣ５細胞株を用いた場合は、本無血清培地（培地４−２）を用いても、１０％ＦＢＳ含有培地（培地２）に匹敵するほどの細胞増殖促進効果を導くことはできなかった。すなわち、本無血清培地（培地５）は、未分化細胞により効果が強いことが示された。また、特別な分化能を失って未分化状態に近い細胞（例えば、サル腎臓由来のＣＯＳ７細胞）の無血清条件での培養にも、本発明の無血清培地は有効であり、１０％ＦＢＳ含有培地（培地２）に匹敵する増殖促進効果が得られた。【０２２８】
〔実施例７：無血清培地中における細胞増殖メカニズム〕
無血清培地中における細胞増殖メカニズムを明らかにするために、無血清培地中に添加された各添加因子による細胞増殖シグナル伝達系の活性化について検討した。各添加因子による細胞増殖シグナル伝達系の活性状態を、ウエスタンブロット法により検出した。ここで、特に細胞増殖に密接に関連しているタンパク質リン酸化酵素のうち、細胞外シグナル制御キナーゼＥｒｋ１／２（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ‐ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ１／２）、およびＡｋｔ（ＰＩ３Ｋの下流に位置して細胞機能の制御に関連するタンパク質リン酸化酵素）に注目した。Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔはリン酸化されると活性型に変換される。１２ウェルプレートの１０％ＦＢＳ含有培地において、ヒト間葉系幹細胞（３株）をサブコンフルエントまで培養した。培養細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有する無血清培地において、さらに１６時間培養した。その後、培養細胞を、各成長因子（Ｅ：ＥＧＦ、Ｆ：ＦＧＦ、Ｇ：ＰＤＧＦ、Ｈ：ＨＧＦ、Ｉ：Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｊ：ＴＧＦ−β）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｔ）、および脂肪酸関連因子（Ａ１：Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ａ２：Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ａ３：Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ａ４：Ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ａ５：Ｂ１、Ａ６：Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ、Ａ７：Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）をそれぞれ含有する刺激液中、ならびにこれらを含有しないコントロール溶液中において５分間インキュベートした。さらに、各刺激液およびコントロール溶液を氷上において吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後の細胞を、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。細胞溶解液を６．５００ｇで、１０分間遠心し、上清を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。分画されたタンパク質をＰＶＤＦメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）上に移し、抗リン酸化Ｅｒｋ１／２抗体、または抗リン酸化Ａｋｔ抗体（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、分画を検出した。結果を図１１および１２に示す。【０２２９】
図１１に成長因子（Ｅ〜Ｊ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄ）、およびＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｔ）によって細胞を刺激したときのタンパク質分画を示す。図１１に示すように、コントロール細胞（刺激されていない細胞）と比較して、ＥＧＦ（Ｅ）、ＦＧＦ（Ｆ）、ＰＤＧＦ（Ｇ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｉ）、およびＨＧＦ（Ｈ）によって刺激された細胞において、Ｅｒｋ１／２がリン酸化されることを示した。特にＨＧＦによって刺激された細胞においては、濃度依存的にＥｒｋ１／２のリン酸化が促進されると共に、Ａｋｔのリン酸化も促進された。  【０２３０】
図１２に脂肪酸関連因子（Ａ１‐Ａ７）によって細胞を刺激したときのタンパク質分画を示す。図１２に示すように、コントロール細胞（刺激されていない細胞）と比較して、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ６）によって刺激された細胞において、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔのリン酸化が強く促進された。また、Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ１）、Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ２）、Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ３）、Ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（Ａ４）、および（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ（Ａ７）によって刺激された細胞において、Ｅｒｋ１／２のリン酸化が促進された。すなわち、これらの脂肪酸関連因子は、培養細胞に対して単にエネルギーや膜成分を供給するだけでなく、成長因子として細胞増殖シグナル伝達系を活性化することが示された。【０２３１】
〔実施例８：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養における追加基本因子の作用〕
１０％ＦＢＳを含有する培地に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を添加することによって、ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔ（ｗｎｔ）シグナル経路が活性化されることにより、ヒト間葉系幹細胞の増殖を促進することが知られている。また、抗酸化剤（還元剤）としてのＬ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅが、ヒトの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の無血清培養に用いられている。そこで、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）及びＬ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅの間葉系幹細胞の増殖に対する影響を検討するために、以下に示す無血清培地に塩化リチウム又はＬ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを添加した培地を用いてヒト間葉系幹細胞を培養した。【０２３２】
ヒト腸骨骨髄液由来の間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を含む１０ｃｍプレートにおいて、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。サブコンフルエントになった培養細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．０５％トリプシン及び０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより分散させた後、血清を含有しない植物由来のＴｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （Ｓｉｇｍａ：Ｔ６５２２）とともに再懸濁した。さらに、培養細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計数した。次に、再懸濁した細胞を以下に示す各培地を用いて、９６ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で再播種した。
（培地２）１０％ＦＢＳ
（培地４−２）増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）＋ＥＧＦ＋ＶＣ
（培地４−４）培地４−２＋塩化リチウム（１ｍＭ：Ｓｉｇｍａ‐Ｌ４４０８）
（培地４−５）培地４−２＋Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（２μｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ‐Ｇ６０１３）
各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日または３日毎に交換した。培養８日目の細胞の数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８（同仁化学）を用いて測定した。結果を図１５（ａ）および（ｂ）に示す。【０２３３】
図１５（ａ）に示すように、培地４−２および培地２で培養した細胞の増殖能と比較して、培地４−４で培養した細胞の増殖能は、培養８日目で著しく高かった（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２３４】
図１５（ｂ）に示すように、培地４−２および培地２で培養した細胞の増殖能と比較して、培地４−５で培養した細胞の増殖能は、培養８日目で著しく高かった（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２３５】
〔実施例９：骨髄由来の間葉系幹細胞の無血清初代培養における増殖因子の作用〕
初代培養幹細胞を培養する培地中に添加する増殖因子について検討するために、広島大学附属病院倫理審査委員会の承認および入院患者の同意を得た上で、広島大学付属病院の入院患者から腸骨由来の骨髄液を採取した。採取した腸骨由来の骨髄液を、密度勾配遠心法によって単核球画分（ＭＳＣを含む）を分離した。次に、以下に示す各培地において、２４ウェルのプレートに１×１０６個（有核）細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて、３７℃で培養した。【０２３６】
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地２）１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）
（培地３）増殖因子群および脂肪酸群
（培地１０）増殖因子群および脂肪酸群、ならびにリン脂質（ＰＡ、ＰＣ）＋ＥＧＦ＋ＶＣ（図１０：培地４−２）
（培地１０−１）培地１０よりＦＧＦのみを除去
（培地１０−２）培地１０よりＴＧＦ−βのみを除去
（培地１０−３）培地１０よりＨＧＦのみを除去
（培地１０−４）培地１０よりＦＧＦおよびＴＧＦ−βを除去
（培地１０−５）培地１０よりＦＧＦおよびＨＧＦを除去
（培地１０−６）培地１０よりＴＧＦ−βおよびＨＧＦを除去
（培地１０−７）培地１０よりＦＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦを除去
（培地１１）間葉系幹細胞増殖培地ＭＦ‐ｍｅｄｉｕｍ（ＴＯＹＯＢＯ製、Ｎｏ：ＴＭＭＦＭ−００１）
各々の培地毎に実験を三連（三培養系）にて行った（ｎ＝３）。培地を２日または３日毎に交換した。培養１４日後、培地をＰＢＳで２回洗浄した後、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることによって細胞を回収した。回収した細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）を用いて測定した。結果を図１６（ａ）および（ｂ）に示す。【０２３７】
図１６（ａ）に示すように、継代培養で高い細胞増殖効果を示す培地３および培地１０は、骨髄由来の間葉系幹細胞の初代培養では細胞増殖促進能力が低かった。このことは、おそらく骨髄単核球画分に含まれる間葉系幹細胞以外の多数の造血系細胞が、間葉系幹細胞の増殖に影響するためであると考えられる。これらの非接着性造血系細胞は、培地を交換する毎に除去され、一回継代培養した後はほとんど存在しない。しかしながら、培地１０に含まれる増殖因子を１〜３つ除去したとき（培地１０−１〜培地１０−７）、無血清条件下での間葉系幹細胞の増殖能は向上した。例えば、培地１０−１では培養細胞の増殖が促進された。また、培地１０−４では、培養細胞の増殖能が明らかに向上した。さらに、培地１０−７では、培養細胞の増殖能が著しく上昇した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。このように、間葉系幹細胞以外の細胞、例えば造血細胞等が無血清培地中に多数存在するとき、最適な血清代替物質の組成が変化することが示された。【０２３８】
また、図１６（ｂ）に示すように、骨髄液から採取した初代間葉系幹細胞を培地２、および市販されている培地１１で培養した培養細胞と比較して、骨髄液から採取した初代間葉系幹細胞を培地１０−７で培養した培養細胞は、著しく高いレベルの増殖能を示した（いずれもｐ＜０．００１）（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。
〔実施例１０：未分化細胞株の無血清培養〕
未分化細胞株を継代培養する培地中に添加する増殖因子について検討するために、マウス間葉系細胞株１０Ｔ１／２（理化学研究所  バイオリソースセンター提供）、チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞株ＣＨＯ細胞（理化学研究所  バイオリソースセンター提供）、およびヒトのヒフ由来の線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（ヒューマンサイエンス研究資源バンク提供）を以下に示す培地において培養した。
基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ＝１：１に以下の添加物を添加して培養に用いた：
（培地１）添加なし
（培地２）１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）
（培地１０−５）培地１０よりＦＧＦおよびＨＧＦを除去
（培地１０−７）培地１０よりＦＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦを除去
（培地１０−８）培地１０よりＴＧＦ−β、ＨＧＦおよびＰＤＧＦを除去
１０Ｔ１／２細胞、ＣＨＯ細胞、およびＦｉｂｒｏｂｌａｓｔを、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を含む１０ｃｍプレートにて、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。サブコンフルエントになった細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離した。剥離した細胞を、血清を含有しない植物由来のＴｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を３回洗浄した後、細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測した。さらに、再懸濁した細胞を、上記異なる培地条件を使用して、９６ウェルのプレートに５０００個／ｃｍ２の密度で再播種した。各々の培地毎に実験を三連にて行った（ｎ＝３）。培地を２日または３日毎に交換した。培養８日目の細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８（同仁化学）を用いて測定した。結果を図１７（ａ）〜（ｃ）に示す。【０２３９】
図１７（ａ）に示すように、培地１０−５で培養した細胞株１０Ｔ１／２細胞は、培地２で培養した細胞株１０Ｔ１／２細胞とほぼ同等の細胞増殖能を示した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。また、図１７（ｂ）に示すように、培地１０−７で培養したＣＨＯ細胞は、有効な細胞増殖能を示した（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。さらに、図１７（ｃ）に示すように、培地１０−８で培養したＦｉｂｒｏｂｌａｓｔの増殖能は、培地２で培養したＦｉｂｒｏｂｌａｓｔの増殖能と比較して、培養８日目で著しく高かった（数値は三連にて行った実験の平均値±ＳＤを示す）。【０２４０】
本発明に従えば、動物細胞を、無血清培地であっても１０％血清含有培地において培養した場合と同等又はそれ以上の速度で、その特性を保持したまま増殖させることができる。血清に起因する細胞増殖効果には個体差があるが、本発明に従えば、その個体差を考慮しなくてもよい。また、本発明に従えば、ヒト間葉系幹細胞を、その特性（骨分化能、脂肪分化能など）を高レベルに維持したまま連続的に継代培養することができる。【０２４１】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２４２】
本発明を用いれば、細胞培養に必要な血清の濃度を減らすことによりコストを削減することができるとともに、再生医療で用いられる間葉系幹細胞を安全かつ低コストにて供給することができる。
【図１３】
2007080919.tif 000004
【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５（ａ）】
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【図１５（ｂ）】
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【図１６（ａ）】
2007080919.tif 000020
【図１６（ｂ）】
2007080919.tif 000021
【図１７（ａ）】
2007080919.tif 000022
【図１７（ｂ）】
2007080919.tif 000023
【図１７（ｃ）】
2007080919.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月25日(2008.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤。
【請求項２】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の培地用添加剤。
【請求項３】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の培地用添加剤。
【請求項４】
コレステロールをさらに含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項５】
ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項６】
脂質酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項７】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求項６に記載の培地用添加剤。
【請求項８】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項９】
界面活性剤をさらに含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１０】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求項９に記載の培地用添加剤。
【請求項１１】
インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１２】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに含有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の培地用添加剤を構成する成分を含有していることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項１４】
請求項１３に記載の培養培地中にて間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を培養する工程を包含することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の培地用添加剤を備えていることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項１６】
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を別々に備えていることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項１７】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の培地用添加剤キット。
【請求項１８】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の培地用添加剤キット。
【請求項１９】
コレステロールをさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２０】
ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２１】
脂質酸化防止剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２２】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求項２１に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２３】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２４】
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２５】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求項２４に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２６】
インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２７】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の培地用添加剤キットに備えられた成分を含有していることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項２９】
請求項２８に記載の培養培地中にて間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を培養する工程を包含することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項３０】
間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項３１】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項３２】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項３３】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を連続継代培養する培養方法であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、無血清培地でありながら、間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞増殖促進効果を有する技術を提供することにある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
本発明に従えば、間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を、無血清培地であっても、その特性を保持したまま増殖させることができる。血清に起因する細胞増殖効果には個体差があるが、本発明に従えば、その個体差を考慮しなくてもよい。また、本発明に従えば、ヒト間葉系幹細胞を、その特性（骨分化能、脂肪分化能など）を高レベルに維持したまま連続的に継代培養することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月19日(2009.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤。
【請求項２】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の培地用添加剤。
【請求項３】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の培地用添加剤。
【請求項４】
コレステロールをさらに含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項５】
ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項６】
脂質酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項７】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求項６に記載の培地用添加剤。
【請求項８】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項９】
界面活性剤をさらに含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１０】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求項９に記載の培地用添加剤。
【請求項１１】
インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）及びセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）をさらに含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１２】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに含有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培地用添加剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の培地用添加剤を構成する成分を含有していることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項１４】
請求項１３に記載の培養培地中にて間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を培養する工程を包含することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の培地用添加剤を備えていることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項１６】
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を別々に備えていることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培地用添加剤キット。
【請求項１７】
前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の培地用添加剤キット。
【請求項１８】
前記脂肪酸がリノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の培地用添加剤キット。
【請求項１９】
コレステロールをさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２０】
ＣＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも１つの因子をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２１】
脂質酸化防止剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２２】
前記脂質酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、Ｌ−グルタチオン（Ｌ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）又は２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）であることを特徴とする請求項２１に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２３】
塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２４】
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２５】
前記界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であることを特徴とする請求項２４に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２６】
インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２７】
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）をさらに備えていることを特徴とする請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の培地用添加剤キット。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の培地用添加剤キットに備えられた成分を含有していることを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養培地。
【請求項２９】
請求項２８に記載の培養培地中にて間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を培養する工程を包含することを特徴とする間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法。
【請求項３０】
間葉系幹細胞又はサル腎臓由来未分化細胞株ＣＯＳ７細胞を無血清培養するための培養方法であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【請求項３１】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする培地用添加剤。
【請求項３２】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を含有することを特徴とする培地用添加剤キット。
【請求項３３】
分化能を維持したまま間葉系幹細胞を連続継代培養する培養方法であって、
ＦＧＦ、
ＰＤＧＦ、
ＴＧＦ−β、
ＨＧＦ、
ＥＧＦ、
少なくとも１つのリン脂質、並びに
少なくとも１つの脂肪酸を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
【国際調査報告】
2007080919.tif 000025
2007080919.tif 000026
2007080919.tif 000027
2007080919.tif 000028
2007080919.tif 000029
2007080919.tif 000030
2007080919.tif 000031
2007080919.tif 000032
2007080919.tif 000033