(57)【要約】  本発明は外因性不死化遺伝子を発現し得る強膜細胞株、及びその製造方法を提供する。本発明の強膜細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、強膜炎等の眼疾患の病因解明、該眼疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は強膜の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工強膜の生体材料として利用できる可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性不死化遺伝子を発現し得る強膜細胞株。
【請求項２】
外因性不死化遺伝子がヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７をコードするものである、請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
ヒト由来である、請求項１記載の細胞株。
【請求項４】
下記（１）〜（３）の性質を有する、請求項１記載の細胞株：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない；及び
（３）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＭＭＰ１、ＭＭＰ３及びＨＡＳ２の発現が上昇する。
【請求項５】
更に、以下の性質を有する、請求項４記載の細胞株：
（４）ＩＬ−１βの刺激によりＭＭＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現が上昇する。
【請求項６】
上記性質が１５継代以上維持される、請求項４又は５記載の細胞株。
【請求項７】
強膜細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される、請求項１記載の細胞株。
【請求項８】
強膜細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、強膜細胞株の製造方法。
【請求項９】
外因性不死化遺伝子がヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７をコードするものである、請求項８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強膜細胞株およびその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
強膜とは、眼球の外壁を形成している膜である。強膜は、血管が少ないため白色を呈し、いわゆる白目と呼ばれる部分を構成する。強膜の厚さは約１ミリメートルで、角膜とともに眼球を保護して、眼球内圧を一定に保ち、眼球の形を維持している。強膜の異常は、種々の眼疾患（例えば、強膜炎、眼窩炎症疾患、網膜硝子体疾患等）の原因となり、視力の低下を引き起こす。特にサイトカイン等による強膜細胞外マトリクスのリモデリングは、これらの眼疾患の病態を解析し、該疾患の治療薬を開発するために非常に重要である。【０００３】
強膜細胞は、強膜に含まれる細胞であり、コラーゲン等の多様な強膜構成成分を産生する一方で、種々の分解酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ等）を産生することにより、強膜細胞外マトリクスのリモデリングに深く関与していると考えられる。そこで、強膜細胞をインビトロで培養し、その機能を解析することが、種々の眼疾患の病態を解明し、該疾患の治療薬の開発を進める上で重要である。【０００４】
しかしながら、強膜細胞は、その増殖能が非常に低く、実質的に長期的な培養が不可能であるか、培養できたとしてもその増殖は極めて困難である。また、新生仔から得られる強膜細胞は、比較的培養が容易ではあるが、その増殖能には制限があり、また、長期継代では、細胞の巨大化や変性が起こる可能性もある。そこで、強膜細胞としての本来の機能を維持したまま、長期の継代が可能な強膜細胞株の開発が望まれる。【０００５】
一方、不死化遺伝子として知られるシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）の大型Ｔ抗原遺伝子をヒト水晶体上皮細胞に導入することにより、ヒト水晶体上皮細胞株が作製された［特開平１０−５２２７２：特許文献１、Andley U.P. ら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994)：非特許文献１］。また、パピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子を導入することにより不死化細胞株を作製したことが報告されている［J. Virol., vol.65, p.473-478 (1991)：非特許文献２］。しかし、これまでに、強膜細胞を株化したという報告はない。【０００６】
【特許文献１】特開平１０−５２２７２号公報
【非特許文献１】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994)
【非特許文献２】J. Virol., vol.65, p.473-478 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、強膜の生理学的・生化学的研究や強膜炎などの眼疾患の予防および治療薬の開発のための研究手段として有用であり、また、強膜再生のため、生体中への移植が可能な強膜細胞株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、不死化遺伝子を機能的に組み込んだレトロウイルスベクターでヒト強膜細胞を感染させることによって、強膜細胞にインビトロでの無限増殖能を付与し、半永久的に継代培養可能なクローナルなヒト強膜細胞株を樹立することに成功して本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］外因性不死化遺伝子を発現し得る強膜細胞株。
［２］外因性不死化遺伝子がヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７をコードするものである、［１］記載の細胞株。
［３］ヒト由来である、［１］記載の細胞株。
［４］下記（１）〜（３）の性質を有する、［１］記載の細胞株：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない；及び
（３）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＭＭＰ１、ＭＭＰ３及びＨＡＳ２の発現が上昇する。
［５］更に、以下の性質を有する、［４］記載の細胞株：
（４）ＩＬ−１βの刺激によりＭＭＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現が上昇する。
［６］上記性質が１５継代以上維持される、［４］又は［５］記載の細胞株。
［７］強膜細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することによって樹立される、［１］記載の細胞株。
［８］強膜細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、強膜細胞株の製造方法。
［９］外因性不死化遺伝子がヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７をコードするものである、［８］記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の強膜細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、強膜炎等の眼疾患の病因解明、該疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は強膜の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工強膜の生体材料として利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】強膜細胞株の形態を示す写真である。
【図２】試験プロトコールを模式的に示す図である。
【図３】強膜細胞株のＭＭＰ１，２及び３、ＴＩＭＰ１及び２、並びにＨａｓ１，２及び３の発現に対するＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＴＧＦ−β１刺激の効果を示す図である。
【図４】試験プロトコールを模式的に示す図である。
【図５】強膜細胞株のＨＡＳ１、２及び３、ＣＤ４４、ＭＭＰ１、２及び３、並びにＴＩＭＰ１及び２の発現に対するＰＤＧＦ−ＢＢ又はＩＬ−１β刺激の効果を示す図である。１：コントロール（０時間）、２：ＰＤＧＦ−ＢＢ（６時間）、３：ＰＤＧＦ−ＢＢ（２４時間）、４：ＩＬ−１β（６時間）、５：ＩＬ−１β（２４時間）。
【図６】試験プロトコールを模式的に示す図である。
【図７】強膜細胞株のＨＡＳ１、２及び３、ＣＤ４４、ＭＭＰ１、２及び３、並びにＴＩＭＰ１及び２の発現に対するハイドロコルチゾン処理の効果を示す図である。１：コントロール、２：ＥｔＯＨ（０．１％）、３：ＥｔＯＨ（１％）、４：ハイドロコルチゾン（１０μｇ／ｍｌ）、５：ハイドロコルチゾン（１００μｇ／ｍｌ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の強膜細胞株は、外因性不死化遺伝子を含有し、該不死化遺伝子の発現の結果として、インビトロでの無限増殖能を獲得した細胞群である。【００１３】
本発明の強膜細胞株は、哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の偶蹄類、ウマ等の奇蹄類、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。本発明の強膜細胞株は、好ましくは、ヒト由来である。【００１４】
ここで「不死化遺伝子」とは、細胞を不死化し、無限増殖能を獲得させる遺伝子をいい、例えばｃ−ｍｙｃ，ｒａｓ等の癌遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ、ＳＶ４０由来の大型Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子）、ポリオーマウイルスの大型Ｔ抗原遺伝子、パピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子などが挙げられる。また、本発明において「外因性不死化遺伝子」とは、本発明の強膜細胞株の起源となる強膜細胞が生来有していない、細胞外から新たに導入される不死化遺伝子を意味する。したがって、本発明の細胞株が由来する哺乳動物以外に由来する不死化遺伝子のほか、たとえば、本発明の細胞株が由来する哺乳動物の癌遺伝子であっても、標的細胞内で発現可能な（すなわち、正常の内因性癌遺伝子が受けている発現抑制を受けない）形態に改変されたものも外因性不死化遺伝子に属するものとする。本発明の外因性不死化遺伝子として、好ましくは、ウイルス由来の不死化遺伝子、より好ましくはパピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子が用いられる。パピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子を用いることにより、ＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子等を用いたときと比較して高い効率で強膜細胞を不死化することが出来る。【００１５】
本発明の強膜細胞株は、好ましくは、組織より分離された強膜細胞に、上記の外因性不死化遺伝子を機能的に担持する、すなわち標的細胞内で発現可能な形態で担持する発現ベクターをトランスフェクトし、該細胞を適当な培地中で継代培養することによって樹立することができる。【００１６】
強膜細胞は、例えば、摘出された眼組織から強膜組織を単離し、はさみ等で細かく（約１ｍｍ角）に切断し、得られた強膜断片を、ＩＶ型コラゲナーゼで消化することにより得ることが出来る。強膜細胞は、好ましくは、強膜実質細胞である。強膜細胞は、ウシ胎児血清や仔ウシ血清１０〜２０％を含む適当な液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等に懸濁し、ＣＯ2 インキュベーター中で２日間程度培養され、トランスフェクションに供される。【００１７】
本発明で使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが例示される。ウイルスゲノムをベクターとして使用する場合は、該ベクターが導入された細胞内で、少なくとも完全なウイルス粒子が産生されないように遺伝子の一部を欠失または変異させておくことがより好ましい。【００１８】
外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターの構築方法として、例えば、外因性不死化遺伝子にパピローマウイルスのＥ６及びＥ７遺伝子を使用する場合には、以下の方法が例示される。ヒトパピローマウイルスのゲノミックＤＮＡの初期領域に存在する不死化遺伝子（すなわち、Ｅ６及びＥ７遺伝子）を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、強膜細胞中で該遺伝子を発現可能なプロモーターを含有する発現ベクターに挿入する。プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭｕＭＬＶ ＬＴＲ等が挙げられる。【００１９】
プラスミドベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ等が挙げられる。また、さらに転写終結シグナル、外因性不死化遺伝子の発現をエンハンスする特異的な配列などを当該ベクターの適当な位置に配することもできる。このようにして構築された外因性不死化遺伝子発現ベクターは、適当な宿主中、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等で大量に合成させ、常法により回収精製した後、常用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等により強膜細胞に導入される。【００２０】
ウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、レンチウイルス等のレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルス等が挙げられる。レトロウイルスによる遺伝子導入は、遺伝子が染色体へ組み込まれるように導入されるので、好ましい。また、レンチウイルスは分裂及び非分裂細胞の両方に感染し、遺伝子を導入することができる。ウイルス粒子を含む培養液中で強膜細胞を培養することにより、外因性不死化遺伝子が強膜細胞内へ導入される。この際、遺伝子導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることにより、導入効率を高めることが出来る。【００２１】
トランスフェクション後の細胞は、液体培地、例えばイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地、ハム培地Ｆ１２、勝田培地ＤＭ−１６０等で培養される。培養温度、培地ｐＨ、ＣＯ2 濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用される一般的な条件を適宜採用することができる。２〜３日ごとに新鮮な培地に交換し、細胞増殖が飽和点に達した時に継代する。一旦、細胞増殖が止まってからも培養を続け、再増殖を始めた細胞群を単クローンの細胞群として分別する。クローンの分離は以下のようにして行うことができる。トリプシンとＥＤＴＡ溶液を浸染させた小径の濾紙を目的のクローン細胞群上に静置し、培養容器より細胞を剥離して濾紙に付着させる。濾紙小片に付着したクローン細胞群を、濾紙ごと別の培養容器に移す。また、コロニーをピックアップする方法、限界希釈法や、セルソーターを用いる方法によってもクローンを分離することが出来る。クローナルな細胞株は、個々の細胞の性質が均一であるため、従来不均一な強膜細胞を用いて行われていた強膜の生理学的・生化学的研究、強膜炎等の眼疾患の病因解明および予防・治療薬の開発等のための有用なモデル細胞となり得る。【００２２】
上記のようにして得られた強膜細胞株は一般的な動物細胞培養技術により継代培養することができる。細胞の増殖能の指標として、下式により算出される細胞集団倍加数（cell population doubling level；ＰＤＬ）が用いられる。
ＰＤＬ＝ｌｏｇ10（Ｎi ／Ｎ0 ）／ｌｏｇ10２
Ｎi ＝第ｉ継代培養終了時の細胞数
Ｎ0 ＝第１継代培養開始時の細胞数
本発明の細胞株のＰＤＬは、通常１継代ごとに、通常約１．１〜２．０、好ましくは１．４〜１．５ずつ増加する。【００２３】
本発明の細胞株は、下記（１）〜（３）の性質を有し得る：
（１）増殖速度の低下がみられない；
（２）細胞の巨大化・変性が実質的にみられない；及び
（３）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＭＭＰ１、ＭＭＰ３及びＨＡＳ２の発現が上昇する。【００２４】
ここで、「細胞の巨大化・変性が実質的にみられない」とは、細胞の顕微鏡観察により、一部に伸張した細胞がみられることはあっても、その大多数（例えば約９５％以上）は本来の強膜細胞の形態的特徴を示すことを意味する。ＭＭＰ１は、タイプＩ、IIIコラーゲンを分解し得るコラゲナーゼである。ＭＭＰ３は、タイプＩＶコラーゲン、ラミニンなど多くの細胞外マトリクスを基質として分解し得るプロテアーゼである。ＨＡＳ２（Hyaluronan synthase 2）はヒアルロン酸の合成酵素である。「遺伝子の発現」とは、該遺伝子をコードするｍＲＮＡ又は該遺伝子産物（タンパク質）の発現を意味する。ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激によりＭＭＰ１、ＭＭＰ３及びＨＡＳ２の発現が上昇することは、本発明の細胞株が強膜細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。様々な眼疾患に強膜の細胞外マトリクスのリモデリングが関与していると考えられており、また、該リモデリングには、種々の分解酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ等）や合成酵素（ＨＡＳ２等）が関与していると考えられる。従って、本発明の細胞株は、特に、サイトカイン刺激により強膜細胞から放出される種々の分解酵素や合成酵素の、強膜における細胞外マトリクスリモデリングや種々の眼疾患への関与について研究するための強力なツールとなる。【００２５】
本発明の細胞株は、上記の性質に加えて、更に下記（４）の性質を有していてもよい。
（４）ＩＬ−１βの刺激によりＭＭＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現が上昇する。【００２６】
ＩＬ−１βの刺激によりＭＭＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現が上昇することも、本発明の細胞株が強膜細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。従って、本発明の細胞株は、特に、ＩＬ−１β刺激により強膜細胞から放出されるＭＭＰ３、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の、強膜における細胞外マトリクスリモデリングや種々の眼疾患への関与について研究するための強力なツールとなる。【００２７】
本発明の強膜細胞株は、１５継代以上、好ましくは２０継代以上にわたり上記性質が安定に維持されている。【００２８】
本発明の細胞株は強膜の生理学的・生化学的研究、網膜硝子体疾患の病因解明及び予防・治療薬の開発、並びに眼疾患用医薬品の安全性試験等のための有用なモデル細胞となり得る。且つ当該細胞は安定な供給が可能であるから、強膜再生を目的とした移植や人工硝子体の有用な材料となり得る。また、パピローマウイルス抗原遺伝子導入した細胞株は、細胞生物学実験にも供することができる。【００２９】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（ヒト強膜細胞の調製）
悪性メラノーマに罹患し、患部切除のため摘出された、６５歳女性の眼球より強膜組織を単離した。強膜組織をはさみで１ｍｍ角に切断した。得られた強膜組織断片を０．０５％  ＩＶ型コラゲナーゼ／ＤＭＥＭ中で３７℃にて１６時間消化した。消化産物から回収された強膜細胞をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）（１０％  ＦＢＳ）中に懸濁し、３７℃、５％  ＣＯ２にて培養した。本試験は、山形大学医学部倫理委員会により許可されたものである。上記患者より、試験前に許可書を得ている。【００３１】
（ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｅ６及びＥ７が組み込まれたパッケージング細胞ＰＡ３１７の調製及びウイルスストックの調製）
ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｅ６及びＥ７が挿入されたｐＬＸＳＮベクターが導入されたＰＡ３１７（マウスパッケージング細胞：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２０３）を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）（１０％  ＦＢＳ、高グルコース）中、３７℃、５％  ＣＯ２にて培養した。細胞を９０％  コンフルエントまで培養し、培養上清をウイルスストックとして回収し、使用時まで−８０℃にて保存した。【００３２】
（レトロネクチンのコーティング）
１ｍｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｗａｋｏ  ＃Ｔ１００Ａ）をＰＢＳ（ｐＨ７．２）にて２５μｇ／ｍｌに希釈し、３５ｍｍ培養用ディッシュに２ｍｌずつ添加した。該ディッシュをクリーンベンチ内で、室温にて２時間放置することにより、レトロネクチンコーティングを行った。その後、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを２ｍｌ添加することによりブロッキングを行い、２ｍｌ  ＰＢＳにてブロッキング液を洗浄した後、ＰＢＳを除いた。【００３３】
（強膜細胞へのレトロウイルスの感染）
レトロネクチンをコーティングした３５ｍｍ培養用ディッシュに、上記ウイルスストック液を２．５ｍｌ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２にて４〜６時間放置し、レトロネクチンとレトロウイルスベクターとの結合を行った。その後、ウイルスストック液を除去し、ディッシュをＰＢＳにて洗浄し、強膜細胞を０．５〜１．０×１０５個／２ｍｌ  ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）／３５ｍｍディッシュの濃度で加え、３７℃、５％  ＣＯ２にて２日間培養した。【００３４】
（強膜細胞株の単離）
レトロウイルスを感染させた強膜細胞を、１０ｍｍディッシュに継代し、更に５日間継代した。形成されたコロニーをピックアップし、２４穴プレートへ移し、該コロニーを培養することにより、モノクローナルなヒト強膜細胞株を樹立した。【００３５】
（細胞の継代）
単離されたコロニーを同様の条件で、第２０継代まで引続き培養した。培養を通じて、細胞は一定の比率で継代し続けることが可能であったことから、細胞の増殖速度の低下は認められなかった。５継代ごとにＰＤＬを算出した。得られた細胞株のＰＤＬは、1継代ごとに、約１．４〜１．５ずつ増加した。
顕微鏡下で細胞の形態を観察した。ＤＭＩＲＢＥ顕微鏡（Leica社製）に接続された冷却ＣＣＤカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）で細胞の様相を撮影した。撮影条件は以下の通り：対物レンズ  ５倍／接眼レンズ  １０倍／光量  ９．０Ｖ。細胞は単層からなり、繊維芽細胞様の形態を呈した（図１）。細胞の巨大化や変性は認められなかった。【００３６】
（ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｅ６及びＥ７の発現確認）
細胞から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により不死化遺伝子ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｅ６及びＥ７のｍＲＮＡ発現を確認した。【００３７】
（強膜細胞株の表現型の解析）
樹立された強膜細胞株における、ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）１、２及び３、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１、２及び３、及び組織性メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）１及び２の発現に対するＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＴＧＦ−β１の影響を調べた。該発現はＲＴ−ＰＣＲにて観察した。
即ち、強膜細胞株が６０−７０％コンフルエントのときに、該細胞の培地をウシ血清を１％を含んだＤＭＥＭに交換し、２４時間培養後、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ：最終濃度）及び／又はＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ：最終濃度）により細胞を刺激し、更に２４時間培養した。２４時間培養後、細胞を回収し、全ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成を行い、ＭＭＰ１，２及び３、ＴＩＭＰ１及び２、ＨＡＳ１，２及び３に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（図２）。ＰＣＲは、Roche FastStart High Fidelity PCR Systemを用い、Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems)上で行った。ＰＣＲの条件は以下の通り：
９５℃  ２分間  →  （９５℃  ３０秒  →  Ｘ℃  ３０秒  →  ７２℃  ３０秒）×Ｙサイクル  →  ７２℃  ７分
Ｘ＝５０、Ｙ＝３５・・・ＨＡＳ１、２及び３、ＭＭＰ２及び３
Ｘ＝６０、Ｙ＝３０・・・ＭＭＰ１、ＴＩＭＰ２
Ｘ＝５０、Ｙ＝３０・・・ＴＩＭＰ１
Ｘ＝６０、Ｙ＝２５・・・ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ【００３８】
その結果、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３及びＨＡＳ２のｍＲＮＡ発現を誘導した。ＴＧＦ-β１は試験した遺伝子の発現に対してほとんど影響を与えなかった。ＰＤ
ＧＦ−ＢＢとＴＧＦ-β１との間のクロストーク（相乗効果）は認められなかった（図３）。
以上より、得られた強膜細胞株は強膜細胞としての生理学的特徴を保持していることが示された。
【実施例２】
【００３９】
実施例１において樹立された強膜細胞株における、ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）１、２及び３、ＣＤ４４、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１、２及び３、並びに組織性メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）１及び２の発現に対するＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はIL−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の影響を調べた（図４）。該発現はＲＴ−ＰＣＲにて観察した。培養及びＲＴ−ＰＣＲの条件は実施例１に準じた。【００４０】
その結果、IL−１βは、ＭＭＰ３、およびＨＡＳ２、３のｍＲＮＡ発現を誘導した（図５）。
【実施例３】
【００４１】
実施例１において樹立された強膜細胞株における、ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）１、２及び３、ＣＤ４４、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１、２及び３、並びに組織性メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）１及び２の発現に対するハイドロコルチゾンの影響を調べた。
即ち、細胞が６０−７０％コンフルエントのときに、該細胞の培地のウシ血清１％を含んだＤＭＥＭ培地に交換し２４時間後、ハイドロコルチゾン（１０又は1００μｇ／ｍｌ）により細胞を処理し、さらに２４時間培養した（図６）。その後、細胞を回収し、全ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成をおこない、各種遺伝子を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲの条件は実施例１に準じた。【００４２】
その結果、各種遺伝子のｍＲＮＡ発現へのハイドロコルチゾン処理の影響はみられなかった（図７）。この結果より、本発明の細胞株の上記各遺伝子の発現は、ハイドロコルチゾンによってはほとんど影響されないことが示された。また、ステロイドホルモンによって細胞外マトリクスの急激な変化は起こらない可能性が示唆された。このことから、強膜細胞（組織）の細胞外マトリクスは、治療時に使用する一時的なステロイドホルモン投与により、影響されないと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の強膜細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、強膜炎等の眼疾患の病因解明、該眼疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は強膜の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工強膜の生体材料として利用できる可能性がある。
本出願は日本で出願された特願２００６−０３６９５４（出願日：２００６年２月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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