(57)【要約】  本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。本発明の微粒子は、薬物の標的へのデリバリー(delivery)などに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子。
【請求項２】
グラフトポリマーの主鎖が、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
リン酸カルシウムが、ハイドロキシアパタイトである請求項１に記載の微粒子。
【請求項４】
グラフトポリマーが、下記の一般式１
【化１】
2007116965.tif 000007
（Ｒ１は、炭素数１〜９の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数２〜９の直鎖アルキレン基を表し、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、Ｒ３は、ＯＲ４、ＳＲ５、Ｏ（ＣＨ２）ｌＮ（Ｒ６）Ｒ７またはＯ（ＣＨ２）ｌＣＯＯＲ８を表し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、または、アセチル基を表し、Ｒ８は、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、フェニル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、ｌは、２〜６の整数を表し、ｍは、１または２の整数を表す。）
および、下記の一般式２
【化２】
2007116965.tif 000008
（Ｒ９は、炭素数１〜９の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数２〜９の直鎖アルキレン基を表し、Ｒ１０は、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、Ｒ１１は、ＯＲ１２、ＳＲ１３、Ｏ（ＣＨ２）ｌＮ（Ｒ１４）Ｒ１５またはＯ（ＣＨ２）ｌＣＯＯＲ１６を表し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、または、アセチル基を表し、Ｒ１６は、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、フェニル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、ｌは、２〜６の整数を表し、ｍは、１または２の整数を表す。）
で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位と、
下記の一般式３
【化３】
2007116965.tif 000009
（Ｒ１７は、水素または陽イオンを表し、ｎは、１または２の整数を表す。）
および、下記の一般式４
【化４】
2007116965.tif 000010
（Ｒ１８は、水素または陽イオンを表し、ｎは１または２の整数を表す。）
で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位とを有するグラフトポリマーである請求項１に記載の微粒子。
【請求項５】
平均粒子径が、１ｎｍ〜１０μｍである請求項１に記載の微粒子。
【請求項６】
親水性薬物を含有する医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれかに記載の微粒子を含有する医薬組成物。
【請求項７】
親水性薬物が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸である請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、タンパク質医薬、ペプチド医薬、または、核酸医薬の製剤技術において有用な、グラフトポリマーとカルシウム化合物を含む微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノパーティクル(nanoparticle)、マイクロパーティクル(microparticle)、ナノスフィア(nanosphere)、マイクロスフィア(microsphere)あるいはマイクロカプセルなどと呼ばれる微粒子に薬剤を封入した微粒子製剤が開発され、薬物のキャリア(carrier)として用いることが検討されている。微粒子の基材としては、高分子化合物や脂質などの有機化合物および無機化合物など種々の材質が用いられている。【０００３】
生体適合性の無機化合物であるハイドロキシアパタイトを含む微粒子として、ポリエチレングリコールとポリアミノ酸からなるブロックコポリマーとハイドロキシアパタイトを利用した有機−無機ハイブリッド型ＤＮＡ内封微粒子が開示されている（特許文献１）。開示されている技術は、ＤＮＡとハイドロキシアパタイトとの高親和性を利用してアパタイトの結晶中にＤＮＡを内封し、さらにブロックポリマーのカルボン酸部位とアパタイトとの高親和性を利用して結晶の表面にブロックポリマーを被覆させることにより結晶の粒径もコントロールしている。しかしながら、ブロックポリマーを使用するため、その合成に精密な制御を要し、また微粒子表面への機能修飾のための各種官能基の導入にはポリエチレングリコールの末端のみしか利用出来ず、機能修飾の自由度が低いという欠点がある。また、カルボキシル基を含む高分子化合物とリン酸カルシウム微粒子を含有することを特徴とする化粧料が開示されている（特許文献２）。開示されている技術は、微粒子製造時に沈降物の生成が認められ粒子径の分布が大きいという問題があることに加えて、薬物の微粒子への封入を目的としておらず、薬物の微粒子への封入は示唆されていない。【０００４】
ポリアスパラギン酸とポリエチレングリコールセグメントからなるグラフトポリマーとして、ポリハイドロキシエチルアスパルタミド誘導体が開示されており、このグラフトポリマーを用いて調製した薬物（パクリタキセル）を含有するポリマーミセルが、その薬物活性や体内動態に与える影響について報告されている（非特許文献１）。しかし、本報告は高分子ミセルに関するものであり、グラフトポリマーとカルシウム化合物とからなる微粒子に関する技術ではなく、また、親水性薬物の担持には適していない。
【特許文献１】国際公開第０３／０１８６９０号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−３０２４３１号公報
【非特許文献１】ゲンナラ  カバラロ（Gennara Cavallaro）、外５名、「コロイド性薬物輸送担体機構としてのポリハイドロキシエチルアスパルタミド誘導体」（Poly (hydroxyethylaspartamide) derivatives as colloidal drug carrier systems）、ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース（Journal of Controlled Ｒelease）、2003年、89巻、p.285-295
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、微粒子に封入したインシュリンをマウスに皮下投与した場合の血中インシュリン濃度の経時変化である。
【図２】図２は、微粒子に封入したインシュリンをマウスに皮下投与した場合の血中グルコース濃度の経時変化である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。【０００８】
主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方のカルボキシル基の酸性の水酸基が遊離することでアニオン性カルボキシレート（O-）となり、このカルボキシレートとカルシウム化合物との親和性により、カルシウム化合物とグラフトポリマーが複合化して形成された微粒子である。本発明において、カルボキシル基を有するとは、カルボキシレートが任意の陽イオンとともに塩として存在している形態も含まれる。陽イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン（Na+、K+等）、アルカリ土類金属イオン（Ca2+、Mg2+等）等が挙げられる。【０００９】
本発明において、グラフトポリマーとは、一本の主鎖に一本以上のグラフト鎖が化学的に結合されているポリマーである。【００１０】
本発明において、グラフトポリマーは、カルシウム化合物との親和性を発現するために、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有する。本発明において、カルボキシル基を主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方に有するグラフトポリマーは、例えば、下記（１）〜（３）の公知の方法によって製造できる。
（１）カルボキシル基を有する主鎖にグラフト鎖を導入する方法。
（２）反応性基を有する主鎖にカルボキシル基を有するグラフト鎖を導入する方法。
（３）グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖にカルボキシル基を導入する方法。【００１１】
本発明の微粒子は、薬剤送達用キャリアーとして使用する理由から、グラフトポリマーが生体適合性であることが好ましく、微粒子の生体適合性という観点からは、グラフトポリマーの主鎖が生体適合性であることがとくに好ましい。ここで、「生体適合性」とは、生体内に投与後、生体組織に適合して生体への障害などを示さない性質、すなわち生体適合性を有することをいい、例えば、生体内で分解代謝されて、最終的には体外に排泄される性質をいう。【００１２】
本発明において、グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖としては、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリ酸無水物、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸または多糖類、あるいはこれらの類縁体が好ましい。【００１３】
前記（１）〜（３）の製造法により、カルボキシル基を有するグラフトポリマーを得るためには、グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖がポリアミノ酸または多糖、あるいはこれらの類縁体であることが、好ましい。グラフトポリマーの主鎖がポリアミノ酸または多糖、あるいはこれらの類縁体であることが、より好ましい。【００１４】
グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖となるポリアミノ酸は、天然あるいは非天然であってもよい。構成アミノ酸としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンなどが好ましい。構成アミノ酸は、１種類の重合体であるか、あるいは２種類以上のアミノ酸がブロック状あるいはランダム状に共有結合していてもよい。構成アミノ酸が、２種類以上のアミノ酸の場合、各アミノ酸の構成比は適宜決められる。アミノ酸は、Ｄ体、Ｌ体、ラセミ体のいずれでもよい。【００１５】
本発明において、ポリアミノ酸の構成アミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、システインなどが好ましく、なかでも、酸性アミノ酸であるグルタミン酸もしくはアスパラギン酸がとくに好ましい。特に、本発明の微粒子は、グラフトポリマーの主鎖が、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸であることが好ましい。【００１６】
ポリグルタミン酸は、ポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸のいずれでもよい。ポリグルタミン酸の一般的な製造法は以下である。【００１７】
ポリ−α−グルタミン酸は、カップリング法、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）法など化学合成法や酵素法等によって製造することができる。ポリ−α−グルタミン酸の工業的製造方法は、ＮＣＡ法が広く知られている。ポリ−γ−グルタミン酸は、化学合成、酵素合成の他、納豆菌等のバチルス属の菌体を用いた培養により製造することができる。納豆菌等を用いた場合には、納豆の粘質物中に含まれるポリ−γ−グルタミン酸を抽出することや、菌体が菌体外に分泌するポリ−γ−グルタミン酸を用いることができる。一般に、納豆粘質物中のポリ−γ−グルタミン酸やバチルス属が通常の培養条件で分泌するポリ−γ−グルタミン酸は、高分子量体であり、非常に粘性が高いため、用途に応じて、酸や酵素による低分子化処理をすることができる。【００１８】
ポリアスパラギン酸としては、ポリ−α−アスパラギン酸、ポリ−β−アスパラギン酸のいずれでもよい。ポリアスパラギン酸の一般的な製造法は以下である。【００１９】
ポリアスパラギン酸は、通常の生産方法では、ポリ−α、β−アスパラギン酸が得られる。ポリ−α、β−アスパラギン酸は、アスパラギン酸を加熱脱水縮合した後、加水分解することにより製造する方法や、無水マレイン酸とアンモニアを加熱反応させマレイミドを経て得られる重合物を加水分解することにより製造することができる。【００２０】
多糖は、カルボン酸基を有する多糖が好ましく、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースなどが好ましい。さらに、多糖は、水溶性多糖を、アルカリ、特に水酸化ナトリウムで加熱処理するなどして得られるカルボキシ多糖が好ましく、原料多糖としては、セルロース、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン、マンナン、アガロース、ガラクタン、アラビナンが好ましい。【００２１】
カルボン酸基を有する多糖は、カルボン酸基を有する多糖にアミノ基を有するポリエチレングリコール誘導体を脱水剤および／または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより得られるグラフトポリマーが好ましい。また、グラフトポリマー主鎖となる多糖としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン、マンナン、アガロース、ガラクタン、アラビナン、キチン、キトサンも好ましい。【００２２】
本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの数平均分子量は、３０００〜３０００００であることが好ましい。本明細書での数平均分子量とは，分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、ポリマー末端基数の算出に用いることができる。一般には，数平均分子量は、ポリマーの末端基定量を行って求めることができるが、プルランを基準物質としてゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したプルラン換算の分子量として求めることもできる。【００２３】
本発明は、グラフトポリマーと、カルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。【００２４】
ポリエチレングリコールセグメントの数平均分子量は、本発明の微粒子の粒径をコントロールする上で、１００〜５００００であることが好ましく、さらに好ましくは２０００〜２００００である。【００２５】
カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に、グラフト鎖としてポリエチレングリコールセグメントを導入する方法としては、例えば、以下の（４）および（５）の方法が挙げられる。以下の（４）および（５）の方法は、特に、カルボキシル基を有する主鎖に、グラフト鎖としてポリエチレングリコールセグメントを導入する方法として、有用である。【００２６】
（４）カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に対して、アミノ基または水酸基を有するポリエチレングリコール誘導体を所望により脱水剤および／または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより導入する方法。【００２７】
（５）カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に対して、末端の水酸基がハライド、メタンスルホニル基などの脱離性の高い官能基で置換もしくは保護されたポリエチレングリコール誘導体を塩基存在下で反応させ導入する方法。ここで用いる塩基は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエタノールアミンなどの脂肪族３級アミン、Ｎ−メチルモルホリンなどの脂環式３級アミン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリンなどの芳香族３級アミン、または炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウムなどの無機塩が挙げられる。【００２８】
本発明の微粒子のグラフトポリマーは、主鎖が、ポリ酸性アミノ酸で側鎖がポリエチレングリコールセグメントを有するものが、本発明の目的であるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のキャリアとして、生体適合性などの観点から、特に好ましい。【００２９】
本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの好ましい形態は、
グラフトポリマーが、下記の一般式１【００３０】
【化１】
2007116965.tif 000002
【００３１】
（Ｒ１は、炭素数１〜９の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数２〜９の直鎖  アルキレン基を表し、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、Ｒ３は、ＯＲ４、ＳＲ５、Ｏ（ＣＨ２）ｌＮ（Ｒ６）Ｒ７またはＯ（ＣＨ２）ｌＣＯＯＲ８を表し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、または、アセチル基を表し、Ｒ８は、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、フェニル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、ｌは、２〜６の整数を表し、ｍは、１または２の整数を表す。）
および、下記の一般式２【００３２】
【化２】
2007116965.tif 000003
【００３３】
（Ｒ９は、炭素数１〜９の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数２〜９の直鎖アルキレン基を表し、Ｒ１０は、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、Ｒ１１は、ＯＲ１２、ＳＲ１３、Ｏ（ＣＨ２）ｌＮ（Ｒ１４）Ｒ１５またはＯ（ＣＨ２）ｌＣＯＯＲ１６を表し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、または、アセチル基を表し、Ｒ１６は、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、フェニル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、ｌは、２〜６の整数を表し、ｍは、１または２の整数を表す。）
で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位と、
下記の一般式３【００３４】
【化３】
2007116965.tif 000004
【００３５】
（Ｒ１７は、水素または陽イオンを表し、ｎは、１または２の整数を表す。）
および、下記の一般式４【００３６】
【化４】
2007116965.tif 000005
【００３７】
（Ｒ１８は、水素または陽イオンを表し、ｎは１または２の整数を表す。）
で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位とを有するグラフトポリマーである。  Ｒ１、Ｒ９は、エチレン基、または、プロピレン基が好ましい。Ｒ２、Ｒ１０は、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘ（ｘは整数を表す。）で示される直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントであって数平均分子量が１００〜５０００の範囲のものが好ましい。グラフト鎖の末端となるＲ３、Ｒ１１は、水酸基（Ｒ４、Ｒ１２が水素）、メトキシ基（Ｒ４、Ｒ１２がメチル基）、チオール基（Ｒ５、Ｒ１３が水素）、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２（Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１４、Ｒ１５が水素、ｌが２）、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２（Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１４、Ｒ１５が水素、ｌが３）、Ｏ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ（Ｒ８、Ｒ１６が水素、ｌが２）、Ｏ（ＣＨ２）５ＣＯＯＨ（Ｒ８、Ｒ１６が水素、ｌが５）などが好ましい。Ｒ１７、Ｒ１８の陽イオンとしては、アルカリ金属、アルカリ土類金属などが挙げられ、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどがとくに好ましい。【００３８】
本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーは、上記以外の単量体単位を共重合成分として含んでもよい。【００３９】
一般式１または一般式２で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位と、一般式３および一般式４で表される群から選ばれる少なくとも１種の繰り返し単位とを有する前述の化学構造を有するグラフトポリマーは、例えば、ｍ＝１でｎ＝１の場合には、以下の（６）の方法で製造することができ、ｍ＝１で、ｎ＝１の場合には、（７）の方法で、ｍ＝２でｎ＝２の場合には、（７）の方法で製造することができる。【００４０】
（６）ポリコハク酸イミドに対して、アミノ基を有するポリエチレングリコールを反応させ、生成したポリマーに塩基性条件にて水を加え、ポリマー中の未反応のイミド環を加水分解することにより、グラフトポリマーを製造する方法。【００４１】
ポリコハク酸イミドの製造方法は公知の方法を用いることができる。例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，２１０７−２１１３（１９９８年）にアスパラギン酸を原料としてメシチレンとスルフォランの混溶媒中、オルトリン酸存在下２００℃で加熱縮合させる方法が開示されている。また、特公昭４８−２０６３８号公報には、８５％燐酸を触媒としてロータリーエバポレータを用いて薄膜状で反応を行うことにより、高分子量のポリコハク酸イミドを得る方法が開示されている。そして米国特許第５０５７５９７号には、工業的にポリコハク酸イミドを得る方法として、流動床によりアスパラギン酸を加熱縮合させる方法が開示されている。【００４２】
上記のポリコハク酸イミドの製造方法において、使用するポリコハク酸イミドの数平均分子量は１０００以上２０万以下が好ましい。更に好ましくは５千以上１０万以下である。使用するポリコハク酸イミドの数平均分子量は１０００以上２０万以下であると、得られるアスパラギン酸系共重合体が、高分子としての性質を発揮しやすく、ＤＤＳ等の医療用途や他の種々の用途に、より一層好適である。さらに、使用するポリコハク酸イミドの数平均分子量は１０００以上２０万以下であると、反応溶媒への溶解性が低下せず、反応溶液の粘度が高くなりすぎることがない。【００４３】
上記のポリコハク酸イミドにアミノ基を有するポリエチレングリコールを反応させてグラフト鎖を付加するためには、反応溶媒は、アミノ基を有するポリエチレングリコールとポリコハク酸イミドの少なくともいずれか一方を溶解するものが好ましい。反応を速く行わせるためには、ポリコハク酸イミドとアミノ基を有するポリエチレングリコールの両者を溶解する溶媒を用いるのが好ましく、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン、スルフォラン、およびこれらを主成分とする他の溶媒との混合溶媒が好ましく用いられる。特に好ましくは、ジメチルスルホキシドおよびＤＭＦが用いられる。【００４４】
グラフトポリマーの製造において、使用する原料（ポリコハク酸イミド、アミノ基を有するポリエチレングリコール）および反応溶媒は、あらかじめ乾燥等により水分を除去しておくことが好ましい。これらの原料はいずれも吸湿性があるため、通常数％程度の水分を含んでいることが多い。原料と溶媒とからなる反応系に含まれる水分量は、仕込みのポリコハク酸イミドの重量に対して１８％未満であることが好ましい。さらに好ましくは１％未満である。原料と溶媒とからなる反応系に含まれる水分量は、仕込みのポリコハク酸イミドの重量に対して１８％未満であると、反応中に副反応が起きにくく、目的とする構造のグラフトポリマーを容易に得ることができる。【００４５】
ポリコハク酸イミドに対するアミノ基を有するポリエチレングリコールの仕込組成比は、ポリコハク酸イミドのイミド環のモル数に対して、所望とするグラフトポリマー中のポリエチレングリコール鎖の組成比にあわせて適宜決定する。すなわち、ポリコハク酸イミドに対するアミノ基を有するポリエチレングリコールの仕込組成比が多くなると生成するグラフトポリマー中のポリエチレングリコール鎖のモル組成が上昇する。【００４６】
反応溶液のポリコハク酸イミド濃度は、一般的には、１〜４０重量％の範囲から選択される。また、使用するアミノ基を有するポリエチレングリコールに最適な濃度を選択することもできる。【００４７】
ポリコハク酸イミドとアミノ基を有するポリエチレングリコールとの反応は、特に触媒を使用しなくとも進行するが、必要に応じて塩基性の触媒を使用しても良い。使用できる触媒として、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエタノールアミン、トリエチレンジアミン（ＤＡＢＣＯ）等の脂肪族３級アミン、Ｎ−メチルモルホリン等の脂環式３級アミン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香族３級アミンおよびテトラメチルグアニジン等が挙げられ、これらは単独でまたは組み合わせて使用できる。【００４８】
ポリコハク酸イミドとアミノ基を有するポリエチレングリコールとの反応の反応温度は、０〜１００℃が好ましい。さらに好ましくは２０〜８０℃である。反応温度が０〜１００℃であると、反応の進行が早く、ポリコハク酸イミドが反応系中の不純物と副反応をおこさず、アミノ基を有するポリエチレングリコールが変性しないので、好ましい。【００４９】
上記のアミノ基の反応を繰り返し行うことにより、異なる末端基を有するポリエチレングリコールセグメントを複数導入することも可能である。【００５０】
ポリコハク酸イミドからグラフトポリマーを製造する場合、ポリエチレングリコール鎖を導入したポリマーに対し、カルボキシル基を有するアミンをポリマー中の未反応イミド環部位に作用させることにより、主鎖にカルボキシル基を導入できる。反応溶媒、反応温度、および反応濃度などの反応条件については、ポリコハク酸イミドにポリエチレングリコールアミンを導入する上記方法と同様である。【００５１】
ポリコハク酸イミド中の未反応イミド環を加水分解する方法としては、グラフト鎖を導入したポリマーに対し塩基を作用させる手法が一般的に用いられる。塩基の具体例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等のアルカリ金属酢酸塩、シュウ酸ナトリウム等の有機カルボン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。【００５２】
（７）ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸に対して、アミノ基を有するポリエチレングリコールを縮合反応させることにより、グラフトポリマーを製造する方法。【００５３】
ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸と、アミノ基を有するポリエチレングリコールとの縮合反応において、縮合反応に関与するアミノ基、カルボキシル基などの官能基は公知の方法で活性化しておいてもよく、縮合反応の際にカルボキシル基の活性化を行っても良い。官能基の活性化は自体公知の方法により行えばよく、このような方法としては、例えば、原料のカルボン酸の活性化エステル〔置換フェノール類（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノールなど）、Ｎ−置換イミド類（例えば、Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド、Ｎ−ハイドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾールなど）などとのエステル〕を形成させる方法、原料のカルボン酸に対するカルボン酸無水物、アジドなどを形成させる方法、酸クロライド法、酸化還元法（向山法）、混合酸無水物法、活性化剤としてＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド法、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ウッドワード試薬Ｋ、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＢＯＰ試薬）を用いる方法などが挙げられる。【００５４】
上記縮合反応は、通常反応を阻害しない溶媒中で行うことができる。このような溶媒としては、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、エタノール、メタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、酢酸エチルなどのエステル類、Ｎ-メチルピロリドン、Ｎ-メチルモルホリン、水などが挙げられる。反応温度は、好ましくは−３０℃〜５０℃、さらに好ましくは０℃〜４０℃である。反応時間は、例えば、１０分〜２４時間である。【００５５】
上記の製造方法（６）、（７）のようにして製造した本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。【００５６】
本発明の微粒子は、グラフトポリマー存在下でカルシウム化合物を析出させることにより１工程で製造することができる。カルシウム化合物の析出は、例えば、カルシウム化合物を構成するイオンおよび対イオンとなるイオンを含む溶液を冷却または濃縮する方法、カルシウム化合物を構成するイオンを含む溶液と対イオンとなるイオンを含む溶液の２溶液を反応させる方法、または、カルシウム化合物を構成するイオンを含む溶液のｐＨを変化させる方法によって行うことができるが、このうち２溶液を反応させる方法が好ましい。２溶液の反応に際しては、一般に３０分以内に、好ましくは５分以内、さらに好ましくは１分以内に２溶液を混合して反応させることにより微粒子が形成される。ここに示す時間は、混合開始してから終了するまでの時間を指す。この際、添加あるいは混合時間が短い程、得られる微粒子の全体直径は小さくなる。また、反応時における撹拌は、それぞれの成分が反応液中で速やかに均一となることが望ましいので、実質的に反応に用いる溶液が滴下するとほぼ同時に系内に分散する程度の撹拌速度が好ましく、反応中は継続して撹拌することが好ましい。なお、２溶液に含まれる反応性成分は所望の比率で含まれていることが望ましい。反応温度は、４〜６０℃程度が好ましい。さらに好ましくは、反応温度は、２０〜４０℃である。【００５７】
本発明の微粒子を構成するカルシウム化合物としては、グラフトポリマーのカルボキシル基に親和性を有するものが好ましく、グラフトポリマーとの複合化により粒子内に親水性薬物を封入、あるいは、吸着させる役割を有する。具体的には、生体に高い適合性を有するカルシウム化合物が好ましい。【００５８】
本発明の微粒子を構成するカルシウム化合物は、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物である。【００５９】
本発明において「リン酸カルシウム」とは、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）とリン酸イオン（ＰＯ４３−）とから形成される塩を意味する。本発明で用いるリン酸カルシウムは、アモルファスリン酸カルシウム、第一リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、第二リン酸カルシウム（ＣａＨＰＯ４）、第三リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、ハイドロキシアパタイト（（Ｃａ１０（ＯＨ）２）（ＰＯ４）６）などが好ましく、特に、ハイドロキシアパタイトが好ましい。【００６０】
「リン酸カルシウム」は、カルシウムとリン酸以外の成分を含有していても良い。「リン酸カルシウム」に含有される可能性のある成分としては、例えば、炭酸イオン、金属イオンが挙げられる。カルシウムイオンとリン酸イオンの含有割合としては、カルシウムイオンとリン酸イオンが反応してハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＯＨ）２）（ＰＯ４）６を生成するのに必要な当量より、過剰な量でカルシウムイオンが存在することが好ましい。具体的には、Ｃａ２＋対ＰＯ４３−は、モル比で５０〜２００対１であることが好ましい。カルシウムイオンとリン酸イオンがモル比で５０〜２００対１で存在すると、グラフトポリマーが、都合良く、リン酸カルシウムと相互作用し、結合もしくは架橋または吸着されやすい。カルシウムイオンとリン酸イオンがモル比で５０〜２００対１であると、グラフトポリマーおよび薬物とが、適度に、リン酸カルシウムと相互作用し、結合もしくは吸着されるので好ましい。特に、リン酸カルシウムがハイドロキシアパタイトの場合は、カルシウムイオンとリン酸イオンがモル比で５０〜２００対１であることがより好ましい。【００６１】
本発明のカルシウム化合物を含む微粒子の製造法としては、例えば、
（Ａ）薬物、カルシウムイオンおよび必要に応じて緩衝剤を含む第一の水溶液を調製し、独立して、
（Ｂ）本グラフトポリマー、リン酸イオンおよび必要に応じて緩衝剤を含む第二の水溶液を調製し、
（Ｃ）前記第一の水溶液と第二の水溶液を、ハイドロキシアパタイトが生成するのに十分な条件下で混合する
ことにより調製できる。なお、第二の水溶液には塩化ナトリウムなどの塩を含めることができ、使用する場合の緩衝剤は、最終分散液のｐＨを６．８〜７．８に調製することができるように選ぶことがとくに好ましい。また、製造時のカルシウムイオン濃度は、好ましくは、６０ｍＭ〜３００ｍＭであり、リン酸イオン濃度は、０．４ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましい。【００６２】
具体的には、グラフトポリマーに、塩化カルシウムなどのカルシウムイオン水溶液とリン酸イオン水溶液とを、攪拌下で、一般に３０分以内に、好ましくは５分以内、さらに好ましくは１分以内に混合して反応させることにより得ることができる。ここに示す時間は、カルシウムイオン水溶液とリン酸イオン水溶液とが添加あるいは混合開始してから終了するまでの時間を指す。また、反応時における撹拌は、それぞれの成分が反応液中で速やかに均一となることが望ましいので、実質的に反応に用いる溶液が滴下するとほぼ同時に系内に分散する程度の撹拌速度が好ましく、反応中は継続して撹拌することが好ましい。なお、本発明におけるカルシウムイオンは、リン酸イオンと反応する際に、所望の比率で含まれていることが望ましい。リン酸イオンに対するカルシウムイオンの比率は、好ましくは、１．６７当量以上、更に好ましくは１０当量以上、更に好ましくは２５当量以上である。反応温度は４〜６０℃程度が好ましい。さらに好ましくは２０〜４０℃である。【００６３】
本発明の微粒子は、平均粒子径が１ｎｍ〜１０μｍの微粒子が好ましい。また、平均粒子径が１０〜３００nmの微粒子であることがとくに好ましい。平均粒子径は、レーザー散乱型粒度分布計（たとえば、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  ＡＳＶＲ／Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ−ＨＲＡ（９３２０−Ｘ１００））を用いて直接測定する。微粒子の形状は、例えば、球状、楕円状、不定形のいずれであってもよい。【００６４】
本発明の微粒子は、薬物を含有していても良い。薬物としては、本発明の微粒子は、親水性薬物を含有する微粒子を含有してなる医薬組成物として使用することが好ましい。親水性薬物としては、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸が例示される。本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、親水性薬物が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸のいずれかから選択される微粒子を含有してなる医薬組成物であることが好ましい。【００６５】
本発明の医薬組成物で使用される親水性薬物のうち、生理活性タンパク質としては、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素タンパク質、抗体などがある。例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン（インシュリン）、アンギオテンシン、グルカゴン、ガストリン、成長ホルモン、プロラクチン（黄体刺激ホルモン）、ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）、サイロトロピックホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、プロチレリン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、コルチコトロピン、ソマトロピン、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）、ソマトスタチン（成長ホルモン刺激因子）、視床下部ホルモン（ＧｎＲＨ）、Ｇ?ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン類、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）類、ＢＭＰ（骨形成蛋白）類、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、リゾチーム、ワクチン等をあげることができる。これら生理活性タンパク質は、天然のタンパク質またはペプチドであっても、その配列の一部を改変した誘導体であってもよい。【００６６】
本発明の親水性薬物を包含する微粒子は、該親水性薬物を微粒子を形成するための反応液に添加しておくことで製造することが出来る。例えば、グラフトポリマーとハイドロキシアパタイトからなる微粒子の場合には、カルシウム水溶液にインシュリンなどの親水性薬物を添加し、さらに、グラフトポリマーを溶解させたリン酸水溶液を添加し、攪拌、静置することにより、親水性薬物内包微粒子を調製することができる。【００６７】
本発明の微粒子は、グラフトポリマー、無機物以外の物質を含んでいても良い。本発明の微粒子に含有される物質は、例えば、微粒子粒径、微粒子構造、微粒子の安定性、グラフトポリマーの安定性に影響を与える物質を添加することができる。また、本発明の微粒子を含む医薬組成物は、例えば、薬物の安定性、薬物の生理活性に影響を与える物質を添加することができる。【００６８】
本発明の微粒子に添加できる添加物は、微粒子内、微粒子外のいずれの場所に存在していても良い。本発明の微粒子に添加できる添加物は、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖であることができる。【００６９】
本発明の微粒子に添加できる添加物は、例えば、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。【００７０】
本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、本発明の微粒子を含有する医薬組成物と薬学的に許容される添加剤からなる粉末形態、あるいは、医薬品組成物と水等の媒体との混合物や多糖類、水等の媒体および該媒体以外の薬学的に許容される基剤との混合物等からなる液状形態、さらには、粒子製剤を薬学的に許容される基剤との組み合わせにより固形化または半固形化した形態をとることができる。【００７１】
前記基剤としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機物質が挙げられ、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸収促進剤等が挙げられる。【００７２】
本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖を含む微粒子を含有してなることが好ましい。また、安定化剤、酸化防止剤、溶解補助剤、界面活性剤、吸収促進剤、ｐＨ調節剤および分散剤など薬学的に許容される基剤を添加することができる。【００７３】
本発明の微粒子を分散させて液体状態の医薬組成物とするための媒体としては、水、水溶液または水混和性液体を用いることが好ましく、例えば、グリセリンまたはポリエチレングリコール等、もしくは薬学的に許容される非水溶媒が用いられる。水溶液は非等張性または等張性溶液のいずれであってもよい。水溶液としては、水と１種もしくは複数種の他の成分、例えば、グリセリン、マンノース、グルコール、フルクトース、キシロース、トレハロース、マンニット、ソルビット、キシリットもしくはポリエチレングリコールのような他のポリオールまたは塩化ナトリウムのような電解質を混合して調製されるものが例示される。非水溶媒としては、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、液糖、オレイン酸、オレンジ油、還元麦芽糖水アメ、クエン酸トリエチル、高果糖液糖、高ブドウ糖水アメ、小麦胚芽糖、サフラワー油、サフラワー油脂肪酸、蛇油、ジメチルポリシロキサン、ショウキョウ油、大豆レシチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、天然ビタミンＥ、トリアセチン、トリオレイン酸ソルビタン、ピペロニルブトキシド、ヒマワリ油、フィチン酸、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、ブチルフタリルブチルグリコレート、ブドウ糖果糖液糖、ポリソルベート、水アメ、ミリスチン酸オクチルドデシル、綿実油、モノオレイン酸ソルビタン、酪酸エチル、リン酸、レモン油が例示される。【００７４】
本発明の微粒子を含有する医薬組成物の投与方法および応用分野は、多岐の利用が可能である。例えば、投与方法としては、経口投与、非経口投与、経腸投与、経肺投与、局所投与（鼻、皮膚、眼）または体腔投与等が利用できる。
【実施例】
【００７５】
以下に実施例を示す。【００７６】
［参考例１］グラフトポリマー（１）の合成
グラフトポリマー（１）を、下記に記載した手法に従って合成した。【００７７】
１−１．ポリスクシイミドの合成
Ｌ−アスパラギン酸（２０．７ｇ、０．１５５ｍｏｌ）とオルトリン酸（７．８ｍｍｏｌ）をメシチレン（４６ｇ）およびスルフォラン（２０ｇ）の混合溶媒に懸濁させ、アルゴンガス雰囲気下ディーンスタークを用いた共沸条件にて加熱還流した。４．５時間後溶媒を減圧留去し、得られた残渣を水（２００ｍＬ）で３回洗浄後、さらにメタノール（２００ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を減圧下８５℃で乾燥し、ポリスクシイミド（１５．５ｇ）を得た。本ポリマーの数平均分子量は５９６０であった。（ＧＰＣ−ＭＡＬＳによる測定:  カラム  東ソー  ＴＳＫ−ｇｅｌ  α−Ｍ、ＤＭＦ系溶媒、ＭＡＬＳ  Ｗｙａｔｔ社製 ＤＡＷＮ  ＥＯＳ）。【００７８】
１−２．中間体の合成
ポリスクシイミド（０．５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．５ｍＬ）に懸濁後、メトキシ−ＰＥＧ−プロピルアミン（数平均分子量：５０００）（０．５ｇ）を加え、５０℃で２４時間攪拌した。反応混合液を水による透析によって３度精製後、残存液を凍結乾燥し、中間体（０．８７ｇ）を得た。【００７９】
１−３．グラフトポリマーの合成
中間体（０．３ｇ）を水（７．５ｍＬ）に溶解後、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下していった。滴下するたびにｐＨが上昇し、滴下をとめるとｐＨがゆっくり下がった。ｐＨが１３を越えないように滴下の速度を調整しながらゆっくりと加水分解を続け、数時間後、滴下をやめてもｐＨが下がらなくなったところで加水分解終了とした。反応混合液を水による透析によって精製後、残存液を凍結乾燥し、グラフトポリマー（１）（０．３４ｇ）を得た。【００８０】
［実施例１］グラフトポリマー（１）とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ  塩化カルシウム）、リン酸水溶液（６．０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。４ｍＬのカルシウム水溶液を３６ｍＬの純水で希釈したもの１ｍＬずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマー（１）を溶解させた１ｍＬリン酸水溶液を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し微粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００８１】
＜結果＞
グラフトポリマー（１）の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬ以上において、微粒子が形成が確認された。平均粒子径は、グラフトポリマー濃度が２．５ｍｇ／ｍＬのときに８１．８ｎｍであり、ポリマーの濃度上昇と共に平均粒子径は小さくなり、ポリマー濃度４〜１０ｍｇ／ｍＬにおいて４７．６ｎｍから４８．９ｎｍの範囲となり、ほぼ一定となった（表１）。【００８２】
［実施例２］グラフトポリマー（１）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ  塩化カルシウム）、リン酸水溶液（６．０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液を添加したもの１ｍＬずつ（インシュリン濃度  １００μｇ／ｍＬもしくは５００μｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマー（１）を溶解させた１ｍＬリン酸水溶液を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し微粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００８３】
＜結果＞
グラフトポリマー（１）の濃度が３，４，５ｍｇ／ｍＬにおいて、微粒子の形成が確認された。インシュリン濃度が１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬのいずれの場合において、微粒子の平均粒子径は大きく変化せず、平均粒子径は、５７．２〜７６．５ｎｍとなった（表１）。【００８４】
【表１】
2007116965.tif 000006
【００８５】
［参考例２］グラフトポリマ−（２）の合成
グラフトポリマ−（２）を、下記に記載した手法に従って合成した。【００８６】
２−１．活性化エステルの合成
ポリグルタミン酸（分子量：１５，０００〜５０，０００）（２００ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド（１８ｍｇ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（３０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（４ｍｌ）に溶解し、室温で２０時間攪拌した。反応溶液にアセトン（１０ｍｌ）とｎ−ヘキサン（１５ｍｌ）を加え、生成物をオイルアウト（沈殿）させた。上清を取り除いた後、再度アセトン（５ｍｌ）とｎ−ヘキサン（５ｍｌ）を加え沈殿物を洗浄した。上清を取り除き、沈殿物を減圧下室温で乾燥し、活性化エステル（２００ｍｇ）を得た。【００８７】
２−２．グラフトポリマ−（２）の合成
活性化エステル（２００ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解後、メトキシ−ＰＥＧ−プロピルアミン（分子量：５０００）（２００ｍｇ）を加え、室温で３日間攪拌した。反応混合液を水による透析によって３度精製後、残存液を凍結乾燥し、グラフトポリマ−（２）（２５６ｍｇ）を得た。【００８８】
［実施例３］グラフトポリマ−（２）とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ  塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。５ｍＬのカルシウム水溶液を４５ｍＬの純水で希釈したもの１．５ｍＬずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ−を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ３２０ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００８９】
＜結果＞
ポリマー濃度が１６０ｕｇ／ｍＬで、粒径３５０ｎｍの粒子が形成された。【００９０】
［実施例４］グラフトポリマ−（２）とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ  塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。５ｍＬのカルシウム水溶液を４５ｍＬの純水で希釈したもの１．５ｍＬずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ−を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ６４０ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００９１】
＜結果＞
最終ポリマー濃度３２０ｕｇ／ｍＬで、粒径５００ｎｍの粒子が形成された。【００９２】
［実施例５］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ２００ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。インシュリン内包率は、ＨＰＬＣ測定により決定した。【００９３】
＜結果＞
最終ポリマー濃度１００ｕｇ／ｍＬで、粒径２００ｎｍの粒子が形成された。インシュリン内包率は、約６０％であった。【００９４】
［実施例６］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ２５０ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００９５】
＜結果＞
最終ポリマー濃度１２５ｕｇ／ｍＬで、粒径１３４ｎｍの粒子が形成された。【００９６】
［実施例７］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ３００ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００９７】
＜結果＞
最終ポリマー濃度１５０ｕｇ／ｍＬで、粒径８９ｎｍの粒子が形成された。【００９８】
［実施例８］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ４００ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【００９９】
＜結果＞
最終ポリマー濃度２００ｕｇ／ｍＬで、粒径１１７ｎｍの粒子が形成された。【０１００】
［実施例９］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ５００ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【０１０１】
＜結果＞
最終ポリマー濃度２５０ｕｇ／ｍＬで、粒径１９６ｎｍの粒子が形成された。【０１０２】
［実施例１０］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．５ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ−（２）を溶解させた１．５ｍＬリン酸水溶液（グラフトポリマー濃度  ６００ｕｇ／ｍＬ、リン酸濃度  １．５ｍＭ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ））を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ−タはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。【０１０３】
＜結果＞
最終ポリマー濃度３００ｕｇ／ｍＬで、粒径２３４ｎｍの粒子が形成された。【０１０４】
［実施例１１］グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の動物皮下投与による薬理評価
１１−１．グラフトポリマ−（２）を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製
カルシウム水溶液（２．５Ｍ塩化カルシウム）、リン酸水溶液（３．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  ４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ水溶液、ｐＨ７．２）を調製した。０．５ｍＬのカルシウム水溶液を４．５ｍＬのインシュリン溶液に添加したもの１．０ｍＬずつ（インシュリン濃度５０ｕｇ／ｍＬ）を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ−（２）を溶解させた１．０ｍＬリン酸水溶液（ポリマー濃度１００ｕｇ／ｍＬ）を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩３７℃で静置し粒子を調製した。調製後、遠心操作（１８８００Ｇ、３０分）により粒子を沈降させた後、上澄みを除き、凍結乾燥を行った。インシュリン内封率は、上澄み中のインシュリン濃度をELISAにより測定することで求めた（４９％）。粒径は約５mｍであった。【０１０５】
１１−２．微粒子の皮下投与実験
凍結乾燥した微粒子に８００ｕＬのＰＢＳを添加し３０分静置した後、１５０ｕＬを１２時間絶食した雄のBALB/cマウスの背部皮下に投与した。尾部より経時採血し、血中グルコース濃度を、富士ドライケム及び血中グルコース濃度測定スライドＧＬＵ−ＷＩＩＩ（富士フィルム）を用いて測定した。血中インシュリン濃度は、ELISAにより測定した。参照実験としては、遊離インシュリンを皮下投与した。【０１０６】
＜結果＞
遊離インシュリンを投与した場合と比較して、微粒子に内封した場合は血中インシュリン濃度が持続することが明らかとなった(図１)。また、血中グルコース濃度も、遊離インシュリンでは十数時間で元の値に戻ったのに対して、微粒子化したものでは約３５時間後であった（図２）。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、グラフトポリマーとカルシウム化合物を含んでなる新たな形態の微粒子である。本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーは合成が容易である。本発明の微粒子は、安価で容易に合成できるグラフトポリマーを用いて製造することができる。本発明の微粒子は、主鎖またはグラフト鎖の置換基を変換することにより様々な機能修飾が可能であることから、薬物の標的へのデリバリー(delivery)などに有用である。特に、本発明の微粒子は、主に、タンパク質医薬、ペプチド医薬、または、核酸医薬の製剤技術において有用である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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