(57)【要約】本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターは、少なくとも配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含む。本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターは、広宿主域で安定に形質転換可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むプラスミド。
【請求項２】
配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むプラスミド。
【請求項３】
配列番号１の１位から８８４６位の塩基配列で示されるプラスミドｐＬＣ４９４。
【請求項４】
配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を含む、組換え用ベクター。
【請求項５】
配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を含む、組換え用ベクター。
【請求項６】
細菌由来の複製必須領域をさらに含む、請求項４または５に記載の組換え用ベクター。
【請求項７】
選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の組換え用ベクター。
【請求項８】
配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、大腸菌由来の複製必須領域、および選択マーカー遺伝子を含み、以下に示す制限酵素地図：
2007034581.tif 000012
を有する、組換え用プラスミドベクターｐＪＬＥ４９４２。
【請求項９】
配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、大腸菌由来の複製必須領域、および選択マーカー遺伝子を含み、以下に示す制限酵素地図：
2007034581.tif 000013
を有する、組換え用プラスミドベクターｐＪＬＥ１２１。
【請求項１０】
組換え用ベクターを作製する方法であって、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片と、任意のＤＮＡ断片とを連結する工程を含む、方法。
【請求項１１】
組換え用ベクターを作製する方法であって、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片と、任意のＤＮＡ断片とを連結する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ断片を請求項３に記載のプラスミドから取得する工程をさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記任意のＤＮＡ断片が、細菌由来の複製必須領域を含むＤＮＡ断片である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プラスミドベクターが、選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項４から９のいずれか一項に記載の組換え用ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１６】
前記形質転換細胞が乳酸菌である、請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される乳酸桿菌である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
前記形質転換細胞が大腸菌である、請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
乳酸菌を形質転換する方法であって、請求項４から９のいずれか一項に記載の組換え用ベクターを乳酸菌に導入する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される乳酸桿菌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記導入がエレクトロポレーションによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の形質転換が可能なプラスミドおよびベクターに関する。より詳細には、本発明は、広宿主域を有する、乳酸菌の形質転換のためのプラスミドおよびベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの乳酸菌の菌株が、発酵食品の製造において必須の生体触媒機能を有している。ヒトは、発酵食品の成分として、有害な作用がもたらされることなくこれらの微生物を摂取している。このため、これらの微生物は、「食品グレード」に分類される。したがって、乳酸菌は、食品および食品成分の栄養価や質を向上させる乳酸菌培養物を開発することを目標とした研究の標的となっている（ＳＯＭＫＵＴＩ，Ｇ．Ａ．，ＳＴＥＩＮＢＥＲＧ，Ｄ．Ｈ．：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，４７３−４７７（２００３））。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（乳酸桿菌）種は、ヒトおよび動物の胃腸管の常在菌であり、そしてその腸内平衡を改善することによって宿主に対して有益な効果を供給する一種のプロバイオティクスである（Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｇ．Ｗ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，３１８９−３１９４（２００４））。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（以下、「Ｌｂ．ｃａｓｅｉ」という）は、乳酸菌の一種であり、ヒトの胃腸管だけでなく、多くの食用製品（例えば、植物、乳および肉の発酵品）、サイレージ、他の自然環境などにおいて見られる。近年、Ｌｂ．ｃａｓｅｉは、本来の風味を有する新規発酵乳製品の製造に使用され、ある種の健康上の利益が要求されている（ＧＯＳＡＬＢＥＳ，Ｍ．Ｊ．，ＶＩＣＥＮＴＥ，Ｍ．，ＧＡＳＰＡＲ，Ｐ．Ｍ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３１，３９２８−３９３４（１９９９）およびＧＡＳＳＯＮ，Ｍ．Ｊ．，ＤＥ  ＶＯＳ，Ｗ．Ｍ．：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ，第１版Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａ．＆  Ｐ．，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９４））。この理由から、Ｌｂ．ｃａｓｅｉは、「一般に安全な」（ＧＲＡＳ）生物であり、プロバイオティクスとして商業的に使用されている（ＩＳＡＢＥＬ，Ｐ．Ａ．，ＧＡＳＰＡＲ，Ｐ．Ｍ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２２，１２３−１２７（２００３））。プロバイオティクスとは、食物に添加され、健康を増進させる生菌である。このようなプロバイオティク微生物には、乳酸桿菌、ビフィズス菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、大腸菌などがある。これらの微生物は、生存可能な形で口から摂取されると、以下のような利益をもたらすと考えられている：腸への付着；病原体の成長阻止；発癌性物質の結合または分解；他の細菌の競合的排除または他の細菌の代謝の変化；抗腫瘍物質の生産；免疫機能の刺激。
このグループのＧＲＡＳ生物に関する遺伝子操作技術を迅速に開発し、そしてそれらの遺伝子構造、遺伝子発現、および蛋白質分泌の知識を増やすことにより、乳酸菌は、食物製品および医薬の新規品や改良品の開発といった新たなバイオテクノロジー適用に対して有用となり得る（ＬＥＥＮＨＯＵＴＳ，Ｋ．，ＢＯＬＨＵＩＳ，Ａ．，ＶＥＮＥＭＡ，Ｇ．，ＫＯＫ，Ｊ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，４１７−４２３（１９９８））。そこで、乳酸菌に由来するプラスミドが多くの研究の焦点となっており、これにより種々のシャトルベクターおよび組込みベクターの開発が行われている（ＪＡＮＧ，Ｓ．Ｊ．，ＨＡＭ，Ｍ．Ｓ．，ＬＥＥ，Ｊ．Ｍ．，ＣＨＵＮＧ，Ｓ．Ｋ．，ＬＥＥ，Ｈ．Ｊ．，ＫＩＭ，Ｊ．Ｈ．，ＣＨＡＮ，Ｈ．Ｃ．，ＬＥＥ，Ｊ．Ｈ．，ＣＨＵＮＧ，Ｄ．Ｋ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２４，１９１−１９５（２００３）およびＢＩＥＴ，Ｆ．，ＣＥＮＡＴＩＥＭＰＯ，Ｙ．，ＦＲＥＭＡＵＸ，Ｃ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，６４５１−６４５６（２００２））。多くのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、種々の大きさの天然に常在するプラスミドを１つ以上有している（ＲＥＮ，Ｄ．，ＷＡＮＧ，Ｙ．，ＷＡＮＧ，Ｚ．，ＣＵＩ，Ｊ．，ＬＡＮ，Ｈ．，ＺＨＯＵ，Ｊ．Ｐｌａｓｍｉｄ  ５０，７０−７３（２００３））。これらのプラスミドには、種々の機能が既に見出されている。その中には、ラクトース代謝、バクテリオシン合成、エキソ多糖（ＥＰＳ）産生、またはＤＮＡ制限修飾に関する遺伝子がある。分子生物学の発展およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの機能的遺伝子解析の進行とともに、潜在的に有用な食品グレードのベクターとしてのレプリコン自体の特徴づけに関する関心も高まっている（ＡＬＰＥＲＴ，Ｃ．Ａ．，ＣＲＵＴＺ−ＬＥ  ＣＯＱ，Ａ．Ｍ．，ＭＡＬＬＥＲＥＴ，Ｃ．，ＺＡＧＯＲＥＣ，Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，５５７４−５５８４（２００３））。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌属の多くの細菌がエレクトロポレーションによって形質転換可能であることが示されている。したがって、これらの細菌は、組換えＤＮＡ技術を受けることができ、最終的には菌株を改善することができる（Ｉｓａｂｅｌ，Ｐ．Ａ．，Ｍａｎｕｅｌ，Ｚ．，Ｇａｓｐａｒ，Ｐ．Ｍ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ４６，１０６−１１６（２００１））。いくつかのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、例えば、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ（Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４，１７３−１７７（１９８７））、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（以下、「Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ」という）（Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｓ．Ｄ．，Ｍａｇｕｉｎ，Ｅ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４６−５２（２００２））、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｂｈｏｗｍｉｋ，Ｔ．，Ｓｔｅｅｌｅ，Ｊ．Ｌ．：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，１４３３−１４３９（１９９３））、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ（以下、「Ｌｂ．ｓａｋｅｉ」という）（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．，Ｚａｇｏｒｅｃ，Ｍ．，Ｍａｒｉｅ，Ｃ．Ｖ．，Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｓ．Ｄ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ，Ｍ．Ｄ．：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２，１２７３−１２７９（１９９６））について、エレクトロポレーション技術が開発されている。例えば、Ｌｂ．ｃａｓｅｉのエレクトロポレーションに関するＣｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ら（前出）には、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌株からプラスミドｐＬＺ１５を抽出し、エレクトロポレーションで元の菌株（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）に形質転換することが記載されている。
遺伝子操作により乳酸菌の機能性などを向上させるために、特にヒトへの利用を考慮した場合に、安全性の面から、ベクターとして、食経験のある乳酸菌由来のプラスミドを用いたベクターを利用し、乳酸菌の形質転換を行うことが望まれている。以下のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ由来のプラスミドは、全ヌクレオチド配列が分析されている：ｐＬＡ１０３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（以下「Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ」という）由来、Ｋａｎａｔａｎｉ，Ｋ．，Ｔａｈａｒａ，Ｔ．，Ｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｓａｎｏ，Ｋ．，Ｕｍｅｚａｗａ，Ｃ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３，１２７−１３０（１９９５））；ｐＲＶ５００（Ｌｂ．ｓａｋｅｉ由来、ＡＬＰＥＲＴ，Ｃ．Ａ．ら，前出；ｐＭＤ５０５７（Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ４８，９８−１０３（２００２））、ｐＬＰ２０００およびｐＬＰ９０００（ＲＥＮ，Ｄ．ら，前出）（いずれもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（以下「Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ」という）由来）；ｐＴＣ８２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ由来：Ｌｉｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｆｕｎｇ，Ｚ．Ｆ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｌ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｔ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ３６，１１６−１２４（１９９６））；およびｐＬＣ２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ由来：Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｕｌｒｉｃｈ，Ｃ．，Ｐｌａｐｐ，Ｒ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ３０，１４−２９（１９９３））。これらは、その複製蛋白質遺伝子または機能的蛋白質遺伝子を使用することによって、クローニングベクターまたは発現ベクターの構築のために使用されている。特開２００４−１４１０６５号公報には、食経験豊富な乳酸菌であるＬｂ．ｃａｓｅｉにプラスミドが存在し、当該プラスミドにより菌の増殖が高められていることを見出したこと、および当該プラスミド由来の複製必須領域を用いた乳酸菌用シャトルベクターが記載されている。
また、バイオテクノロジー適用について広範な宿主に利用可能なベクターは、有用である。このため、広域の乳酸菌宿主において安定に複製可能なプラスミドを用いたベクターを得ることが望まれている。このような広宿主域プラスミドとして、ｐＳＹ１（特開平５−１７６７７６号公報）およびｐＭＴ１（特開２００２−２５３２６０号公報）が報告されている。ｐＳＹ１は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓの一株から分離されたプラスミドであり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属やＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、さらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の２つの亜種ｌａｃｔｉｓとｂｕｌｇａｒｉｕｓにおいて複製が可能で、それらの菌を形質転換させる能力を有している（特開平５−１７６７７６号公報）。ｐＭＴ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプラスミドであり、θ型の複製を行い、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーモフィルス菌）およびチーズ乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）で複製できることが報告されている（特開２００２−２５３２６０号公報）。
プロバイオティクスを好適に利用するために、ヒトへの摂取に適した微生物の性質のさらなる向上を可能としたベクターを得ることが望ましい。したがって、プロバイオティク微生物として認められている種々の乳酸菌において安定に複製可能なプラスミドが期待されている。特に、Ｌｂ．ｃａｓｅｉを初めとする乳酸桿菌（他に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ（以下「Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ」という）、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが含まれる）を安定に形質転換できるベクターが期待されている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、広宿主域を有する、乳酸菌の形質転換のためのプラスミドおよびベクターを提供することを目的とする。
本発明は、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むプラスミドを提供する。
本発明はまた、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むプラスミドを提供する。
本発明はさらに、配列番号１の１位から８８４６位の塩基配列で示されるプラスミドｐＬＣ４９４を提供する。
本発明は、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を含む、組換え用ベクターを提供する。
本発明はまた、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を含む、組換え用ベクターを提供する。
一つの実施形態では、本発明の組換え用ベクターは、細菌由来の複製必須領域をさらに含む。
さらなる実施形態では、本発明の組換え用ベクターは、選択マーカー遺伝子をさらに含む。
本発明は、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、大腸菌由来の複製必須領域、および選択マーカー遺伝子を含み、以下に示す制限酵素地図：
2007034581.tif 000002
を有する、組換え用プラスミドベクターｐＪＬＥ４９４２を提供する。
本発明はまた、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、大腸菌由来の複製必須領域、および選択マーカー遺伝子を含み、以下に示す制限酵素地図：
2007034581.tif 000003
を有する、組換え用プラスミドベクターｐＪＬＥ１２１を提供する。
本発明は、組換え用ベクターを作製する方法を提供し、該方法は、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片と、任意のＤＮＡ断片とを連結する工程を含む。
本発明はまた、組換え用ベクターを作製する方法を提供し、該方法は、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片と、任意のＤＮＡ断片とを連結する工程を含む。
一つの実施形態では、上記の組換え用ベクターを作製する方法は、上記ＤＮＡ断片をプラスミドｐＬＣ４９４から取得する工程をさらに含む。
別の実施形態では、上記の組換え用ベクターを作製する方法において、上記任意のＤＮＡ断片は、細菌由来の複製必須領域を含むＤＮＡ断片である。
さらなる実施形態では、上記の組換え用ベクターを作製する方法において、上記プラスミドベクターは、選択マーカー遺伝子をさらに含む。
本発明はまた、上記のいずれかのプラスミドまたは組換え用ベクターを含む形質転換細胞を提供する。
一つの実施形態では、上記形質転換細胞は乳酸菌である。
さらなる実施形態では、上記乳酸菌は、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される乳酸桿菌である。なおさらなる実施形態では、上記乳酸菌はＬｂ．ｃａｓｅｉである。
別の実施形態では、上記形質転換細胞は大腸菌である。
本発明は、乳酸菌を形質転換する方法を提供し、該方法は、上記のいずれかの組換え用ベクターを乳酸菌に導入する工程を含む。
一つの実施形態では、上記乳酸菌はＬｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される乳酸桿菌である。なおさらなる実施形態では、上記乳酸菌はＬｂ．ｃａｓｅｉである。
別の実施形態では、上記の形質転換方法において、上記導入は、エレクトロポレーションによって行われる。
本発明によれば、広宿主域を有する、乳酸菌の形質転換のためのプラスミドおよびベクターが提供される。本発明のプラスミドおよびベクターはまた、乳酸桿菌において、安定に複製可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、プラスミドｐＬＣ４９４の模式図である。
図２は、プラスミドｐＬＣ４９４の潜在リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、推定プロモーター、および反復配列領域（推定複製起点）の位置および配列を示す図である。
図３は、シャトルベクターｐＪＬＥ４９４２の構築を示す模式図である。
図４は、ｐＪＬＥ４９４２で形質転換された大腸菌および種々の乳酸桿菌から抽出したプラスミドＤＮＡの電気泳動写真である。
図５は、ｐＪＬＥ４９４２で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞およびＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞から抽出したプラスミドＤＮＡの電気泳動写真である。
図６は、シャトルベクターｐＪＬＥ１２１の構築を示す模式図である。
図７は、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞の形質転換効率に対する電気パラメーターの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のプラスミドは、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域を含むプラスミドである。あるいは、本発明のプラスミドは、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域を含む。配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域は、本発明のプラスミドの複製において必須の領域（以下「複製必須領域」という）であり、反復配列領域（推定複製起点）および複製蛋白質遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）を含む。特に、上記反復配列領域の上流に位置する配列番号１の１９２３位から２４１４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域は、このプラスミドを含む宿主中でプラスミドが安定に複製するために必要である。
本発明のプラスミドは、Ｌｂ．ｃａｓｅｉから単離し得る。Ｌｂ．ｃａｓｅｉとしては、ヒト腸管由来のＬｂ．ｃａｓｅｉが挙げられる。このようなヒト腸管由来のＬｂ．ｃａｓｅｉ株としては、例えば、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９株が挙げられる。Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９株は、乳幼児の糞便より単離された菌株である。Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９から得られたプラスミドｐＬＣ４９４は、本発明のプラスミドに包含される。
本発明のプラスミドは、通常用いられる遺伝子工学的手法に従って、Ｌｂ．ｃａｓｅｉから分離して調製することができる。例えば、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９株を培養し、次いでこれを集菌し、乳酸菌を溶菌させるための公知の方法（例えば、リゾチームを用いる方法）により溶菌し、得られた溶菌物から、例えばクロロホルム−イソアミルアルコールでＤＮＡを抽出し、遠心分離のような通常用いられる方法によってプラスミドを分離・精製することにより、得ることができる。
培養は、通常乳酸菌に用いられる培地や培養条件により行えばよい。例えば、培地として、乳糖を添加したＭＲＳ培地等を用い、静置培養等の培養法により、約３４℃〜約３７℃の範囲で、通常約１日間〜約２日間培養するのが好ましい。
得られたプラスミドは、公知のプラスミドと同様に、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーション（連結）などの遺伝子操作を行うことができる。
プラスミドの構造決定は、通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を用いることができる。すなわち、本発明のプラスミドの各種制限酵素消化断片を、大腸菌を宿主生物とするプラスミドベクターに挿入し、大腸菌を形質転換した後、当該プラスミドベクターのＤＮＡを抽出し、これを市販の塩基配列決定装置（シーケンサー）に供する。決定された塩基配列は、市販のパーソナルコンピュータ用の遺伝子解析ソフトウェアなどを使用すれば、制限酵素地図の作成や既知の核酸塩基配列データとの比較検討などを行うことができる。
また、本明細書中に記載の配列情報をもとにＰＣＲなどの方法を用いて、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ菌または他の微生物から本発明のプラスミドの複製必須領域を有するプラスミドを取得すること、および塩基配列を決定することによってそれらが本発明のプラスミドと同一の複製必須領域を有するか否かを容易に確認できる。
Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９から単離されたプラスミドｐＬＣ４９４は８８４６ｂｐの大きさを有し、その制限酵素地図は図１に示す通りである。プラスミドｐＬＣ４９４の全ＤＮＡ配列は、配列番号１に示す通りである（配列番号１の１〜８８４６位）。プラスミドｐＬＣ４９４は、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域を含み、これは、図１に示す制限酵素地図中のＢａｍＨＩからＯＲＦ４（ｒｅｐＡ）の終止コドンの前までの部位に対応する。あるいは、配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域を含み、これは、図１に示す制限酵素地図中のＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの部位に対応する。プラスミドｐＬＣ４９４においては、上記領域が複製必須領域であり、反復配列領域（配列番号１の２４５８位〜２５４５位）（図１中「反復領域」）、および複製蛋白質遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）（配列番号１の２６１９位〜３４６４位）（図１中「ＯＲＦ４（ｒｅｐＡ）」）を含む。反復配列は、３つの完全な２２ｂｐの反復領域と１つの不完全なモチーフとで構成される、推定複製起点である。特に、反復配列領域の上流に位置する配列番号１の１９２３位から２４１４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域（図１に示す制限酵素地図中のＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩまでの部位に対応）は、このプラスミドを含む宿主中でプラスミドが安定に複製するために必要である。
本発明のプラスミドは、シータ（θ）型の複製を行うプラスミドであると考えられる。θ型プラスミドでは、一つの複製起点からθ型の中間体分子を経て複製が進行し、構造的に安定であることが知られている。θ型プラスミドは２つのグループに大別される。第１は、ｐＡＭβ１などの広宿主域の接合伝達プラスミドであり、これらは、３０ｋｂ前後と大きいものが多いため遺伝子操作の際の取扱いが難しい。そのため、欠失などによって小さくしたプラスミドをベクターとして用いることが多い。第２は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のｐＣＩ３０５に代表され、比較的小さく構造的にも安定であるが宿主域が狭いプラスミドである（特開２００２−２５３２６０号公報）。本発明のプラスミドは、比較的小型であり、かつＬｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ、およびＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓで複製可能であることが示されたように、広宿主域を有する。
さらに、配列番号１の１９２３位から３４６４位または配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能力を有するＤＮＡ断片もまた、本発明のプラスミドの複製必須領域として用いることができる。このようなＤＮＡ断片は、上記配列番号１の１９２３位から３４６４位または配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列またはその一部の相補配列をプローブとしてコロニーまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件は、所定の相同性に応じて適宜決定され得、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度などを調節することにより作り出すことができる。ハイブリダイゼーションの手順としては、まず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロースなどの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐなどで標識したプローブ（上記配列番号１の１９２３位から３４６４位または配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィーなどによりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の断片が挿入され得る。この断片がプラスミドの複製必須領域であることは、例えば、下記実施例３および４の記載または下記実施例５の記載に本質的に基づいて組換えベクターを作製し、大腸菌および乳酸菌に形質転換することにより確認できる。また、ストリンジェント条件における数値範囲の最適化または好適化を図ることは、当業者であれば通常の創作能力発揮の範囲内にある。
本発明のプラスミドの複製必須領域はまた、その機能を変更しない限り（例えば、θ型の複製能力を有する）、配列番号１の１９２３位から３４６４位または配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
本発明のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡを用いることにより、乳酸菌に対して形質転換が可能な組換え用ベクターを作製することができる。さらに、本発明のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡ断片と、大腸菌などの細菌で自律複製可能なプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡ断片とを連結し、乳酸菌と大腸菌との双方で自律複製が可能なシャトルベクターとすることもできる。このシャトルベクターを利用することにより、プラスミドの調製、目的遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドの調製などの操作を、大腸菌を用いて行うことができる。
本発明の組換え用ベクターは、本発明のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡ断片を含む。上記ＤＮＡ断片は、好ましくは、ｐＬＣ４９４プラスミドに由来する。本発明の組換え用ベクターの残りの領域には、ベクターの宿主細胞への導入、ならびにベクターが導入された宿主細胞の生存、増殖、および機能に有害な影響を与えない限り、いかなるＤＮＡ分子を含んでいてもよい。
本発明の組換え用ベクターは、本発明のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡ断片と、任意のＤＮＡ断片とを連結することにより作製される。すなわち、上記ＤＮＡ断片と、ベクターの宿主細胞への導入ならびにベクターが導入された宿主細胞の生存、増殖、および機能に有害な影響を与えない任意のＤＮＡ断片とを連結してプラスミドベクターを作製する。上記ＤＮＡ断片は、好ましくは、ｐＬＣ４９４プラスミドに由来する。ｐＬＣ４９４プラスミドに由来するＤＮＡ断片を用いて組換え用ベクターを作製する場合、ｐＬＣ４９４プラスミドに由来するＤＮＡ断片は、少なくとも、配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示される領域（図１に示す制限酵素地図中のＢａｍＨＩからＯＲＦ４（ｒｅｐＡ）の終止コドンの前までの部位に対応）または配列番号１の１９２３位から３８０９位の塩基配列で示される領域（図１に示す制限酵素地図中のＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの部位に対応）を含み、より長いものであってもよい。但し、ｐＬＣ４９４プラスミドに由来のＤＮＡ断片は、ベクターの宿主細胞への導入または安定な複製を妨げるものであってはならない。
一つの実施形態では、本発明の組換え用ベクターは、細菌由来の複製必須領域をさらに含む。特に大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターを作製するためには、細菌由来の複製必須領域として、大腸菌で自律複製可能である大腸菌由来プラスミドの複製必須領域が好ましい。大腸菌由来プラスミドとしては、制限酵素地図、配列などが公知の、ｐＵＣ１９、ｐＪＩＲ４１８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＡＣＹＣ１７７などが挙げられる。複製必須領域として、複製開始部位とｒｅｐ遺伝子とを含み、さらにマルチクローニングサイトを含む点で、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＪＩＲ４１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７などが好ましい。特に、ｐＵＣ１９およびｐＪＩＲ４１８が好ましい。また、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ２４、ｐＶＡ８３８などの、枯草菌や酵母由来ベクターの複製開始領域などの使用も可能である。
本発明の組換え用ベクターはまた、上記ＤＮＡ断片と細菌由来の複製必須領域を含むＤＮＡ断片とを連結してプラスミドベクターを作製することによって作製され得る。細菌由来の複製必須領域を含むＤＮＡ断片は、複製必須領域を含むものであれば、その細菌由来プラスミドの全体であってもよく、あるいは一断片であってもよい。例えば、大腸菌由来プラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡ断片としては、ｐＵＣ１９由来の複製開始部位を含むＤＮＡ断片、ｐＪＩＲ４１８由来のｐＭＢＩを含むＤＮＡ断片などが挙げられる。
また、本発明の組換え用ベクターが、選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む場合、形質転換細胞中での選択マーカー遺伝子の表現型によって、形質転換細胞の検出が容易となる。乳酸菌および大腸菌に使用可能なマーカー遺伝子は、大腸菌で複製可能である大腸菌複製必須領域とともにこれを保有するプラスミドを用いることによっても、本発明の組換え用ベクターに挿入できる。乳酸菌および大腸菌に使用可能なマーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子（エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子など）がある。ヒトへの利用を考えた場合、乳酸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ、菌体外プロテアーゼなどの酵素を産生する遺伝子などが、食品使用という観点から好ましい選択マーカー遺伝子である。また、食品用ベクターのために、相補マーカー（乳糖代謝またはピリミジン代謝）も好ましく使用できる。
本発明の組換え用ベクターは、例えば、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９から単離されたプラスミドｐＬＣ４９４を、複製必須領域を含む断片を得るのに適当な制限酵素（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ）で切断し、得られた断片を、大腸菌で複製可能でありかつ大腸菌と乳酸菌で選択可能なマーカー遺伝子を保有するプラスミドに挿入し、大腸菌内で増幅した後、乳酸菌に形質転換することにより製造することができる。
このようにして得られる本発明の組換え用ベクターの例としては、図３に示すＪＬＥ４９４１およびｐＪＬＥ４９４２、および図６に示すｐＪＬＥ１２およびｐＪＬＥ１２１が挙げられる。
本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターは、乳酸菌および大腸菌中で複製できる。特に、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどの乳酸桿菌のための遺伝子工学ツールとして有用である。当業者が通常用いる方法によりこれらのプラスミドまたは組換え用ベクターのいずれかの位置に外来遺伝子を挿入し、得られるプラスミドまたは組換え用ベクターで宿主微生物を形質転換すれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主微生物内で発現させることが可能となる。
本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターを用いる乳酸菌および大腸菌の形質転換は、当業者が通常用いる方法によって実施できる。例えば、大腸菌の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹによる記載に基づいて実施できる。乳酸菌の形質転換のためにエレクトロポレーション技術が使用可能であり、このような技術の種々のプロトコルが公知である（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら，前出；Ｃｏｆｆｅｙ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｉｏｎ，Ａ．，Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｋ．，Ｄａｌｙ，Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｇ．：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０，２２６３−２２６９（１９９４）；ＧＡＳＳＯＮ，Ｍ．Ｊ．ら，前出；Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．ら，前出）。本発明の組換え用ベクターは、例えば、１．０％グリシンを含有するＭＲＳブロス中で細胞を培養し、得られた細胞を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液で洗浄し、そして１０％グリセロールエレクトロポレーション溶液中に再懸濁し、次いで１．７５ｋＶ、２００Ω、および２５μＦの静電容量でエレクトロポレートすることによって、Ｌｂ．ｃａｓｅｉを好都合に形質転換できる。
以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
【実施例】
【０００６】
（実施例１：Ｌｂ．ｃａｓｅｉ細胞からのプラスミドｐＬＣ４９４の調製）
乳酸菌からのプラスミドＤＮＡの分離は、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＭｃＫａｙ（１９８３）の方法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ＭｃＫａｙ，Ｌ．Ｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６，５４９−５５２（１９８３））にいくらかの変更を加えて実施した。より詳細には、以下のとおりである。
ヒト腸管由来Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９細胞（本菌株は、乳幼児の糞便より単離した菌株である。岡山大学より入手）を、プラスミド抽出のために使用した。遠心分離によって細胞を採取し、次いで１ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７％スクロース、ｐＨ８．０）で洗浄した。細胞を３８０μｌのＴＥＳ緩衝液中に懸濁し、そして３７℃で５分間インキュベートした。次に、１００μｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）溶液（１ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に５０μｇリゾチームを溶解；ｐＨ８．０）を添加し、そしてこの懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。懸濁液を５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および３０μｌの２０％ＳＤＳ溶液（２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に溶解、ｐＨ８．０）と混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、３０秒間ボルテックスにかけ、そして２８μｌの３Ｎ  ＮａＯＨと混合した後、氷上で１０分間冷却した。次に、５０μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、そしてこの懸濁液を室温で６０分間維持した。さらに７０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、そしてこの懸濁液を氷上で２０分間維持した。次いで、遠心分離（１４，０００ｒｐｍで１５分間）して変性したＤＮＡを取り出した。続いて、７００μｌの３％  ＮａＣｌ飽和フェノールで溶解物を抽出した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍで１０分間）後、水相を新たな管に移し、ＤＮＡを５００μｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１，ｖ／ｖ）で抽出した。プラスミドＤＮＡを、５００μｌのイソプロパノールを−８０℃で２０分間添加し、その後１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより、最終的に沈殿させた。次いで、このプラスミドＤＮＡを乾燥し、そして２０μｌのＴＥ緩衝液（２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを含有）中に再懸濁した。
（実施例２：プラスミドｐＬＣ４９４のヌクレオチド配列決定および分析）
プラスミドｐＬＣ４９４の全ヌクレオチド配列を、重複するサブクローンの配列決定によって決定した。実施例１にてＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９細胞から抽出された５つのプラスミドのうち、ｐＬＣ４９４を、Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて溶出した。精製されたｐＬＣ４９４を制限酵素ＳａｃＩによって消化し、２１９１ｂｐおよび６６５５ｂｐの２つの断片を得た。さらに、この６６５５ｂｐの断片をＳｐｈＩによって処理し、４つの断片を得た。プラスミドｐＬＣ４９４および上記制限酵素消化により得た全部で５つの制限断片を、０．８％アガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）中で電気泳動し、その後臭化エチジウムで染色した。得られた５つの断片のそれぞれを、同じ制限酵素で処理したｐＵＣ１９を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞中にクローニングした。ここで、大腸菌細胞由来のプラスミドは、アルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出））によって単離した。製造者の指示書に従って制限酵素および修飾酵素を使用した。一般的なクローニングの手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）による記載のとおりに実施した。これらの組換えプラスミドをそれぞれ、ｐＬＣ４９４１（ＳａｃＩを用いて得られた２１９１ｂｐ断片）、ｐＬＣ４９４２（ＳａｃＩとＳｐｈＩとを用いて得られた１６７７ｂｐ断片）、ｐＬＣ４９４３（ＳｐｈＩを用いて得られた１４１８ｂｐ断片）、ｐＬＣ４９４４（ＳｐｈＩを用いて得られた２７４９ｂｐ断片）、およびｐＬＣ４９４５（ＳｐｈＩとＳａｃＩとを用いて得られた８１１ｂｐ）と命名した。これらの５つの組換えプラスミドを鋳型として用いて配列分析を実施した。ユニバーサルプライマーＭ１３−Ｍ４（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ：配列番号３）およびＭ１３−ＲＶ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ：配列番号４）を用いて、ＰＣＲを行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを備えたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者の推奨書に従って用いて、ＤＮＡ配列決定を行った。オープンリーディングフレームの分析を、Ｆｒａｍ  Ｐｌｏｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｊ．，Ｈｏｔｔａ，Ｋ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４，２２５１−２２５３（１９９９））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／￣ｊｕｎ／ｃｇｉ−ｂｎ／ｆｒａｍｅｐｌｏｔ．ｐｌ）を用いることにより実施した。ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．Ｎｏｖ）の現行版を用いる配列類似性検索を、ＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．Ｍ．，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ，Ａ．Ｓ．，Ｊｉｎｇｈｕｉ，Ｚ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｗｅｂｂ，Ｍ．，Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２（１９９７））プログラムを用いて実行した。
プラスミドｐＬＣ４９４の全ＤＮＡ配列を分析し、そのプラスミドの長さを測定したところ８８４６ｂｐであった（配列番号１の１位〜８８４６位）。このプラスミドは、Ｇ＋Ｃ含量が４１．５％であり、９つの推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する（図１）。
ＯＲＦ４（配列番号１の２６１９位〜３４６４位）の翻訳蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）は、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ８９１２由来プラスミドｐＬＡ１０３（１３，９１３ｂｐ）の複製蛋白質ＲｅｐＡ（Ｋａｎａｔａｎｉ，Ｋ，ら，前出）に対して１００％の同一性を示した。ＯＲＦ４の翻訳蛋白質のアミノ酸配列は、Ｌｂ．ｓａｋｅｉ由来プラスミドｐＲＶ５００（４７％）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ由来ｐＵＣＬ２８７（４５％）、およびＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ｐＭＤ５０５７（４６％）の複製蛋白質に対してもまた有意な相同性を有した。ＯＲＦ５（配列番号１の３６５６位〜４１６２位）の翻訳蛋白質のアミノ酸配列は、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ８９１２由来プラスミドｐＬＡ１０３の複製蛋白質ｒｅｐＢに対して９９％の類似性を示し、そしてＬｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ｐＭＤ５０５７の複製蛋白質ｒｅｐＢに対しては２６％の類似性を示した。さらに、潜在リボソーム結合部位（ＲＢＳ）（ＧＧＡＧＧ）（配列番号１の２６０８位〜２６１２位）、推定プロモーター（（−３５領域）ＴＴＡＡＣＧ（配列番号１の２５５７位〜２５６２位）；（−１０領域）ＴＡＴＡＡＴ（配列番号１の２５８１位〜２５８６位））、および反復配列領域（３つの完全な２２ｂｐの反復領域と１つの不完全なモチーフとで構成される；推定複製起点）（配列番号１の２４５８位〜２５４５位）が、ＯＲＦ４のＡＴＧ開始コドンの上流において見られた（図２）。この配置は、ｐＬＡ１０３の配置と同一である。
Ｂｅｎａｃｈｏｕｒ，Ａ．，Ｆｒｅｒｅ，Ｊ．，Ｎｏｖｅｌ，Ｇ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８，１６７−１７５（１９９５）では、２種のｒｅｐ遺伝子と２２ｂｐ反復配列（複製起点）とで構成される領域を含有するプラスミドｐＵＣＬ２８７が、乳酸菌の新規なθ型レプリコンファミリーであると同定されている。θ型レプリコンは、以下の３つの重要な成分に対するそれらの依存性に従って分類することができる。これらの３つの重要な成分とは、プラスミドにコードされた複製開始因子Ｒｅｐ蛋白質（鎖の開放および／または開始複合体の他の成分との相互作用に必要）、特定のＤＮＡ構造編成を伴う複製起点（一般に「ｏｒｉ」と呼ばれる）（鎖の開放および開始因子と蛋白質との結合のため）、および宿主にコードされたＤＮＡポリメラーゼＩ（新生鎖ＤＮＡ合成のため）である（ＡＬＰＥＲＴ，Ｃ．Ａ．ら，前出）。ＡＬＰＥＲＴ，Ｃ．Ａ．ら（前出）は、ｐＬＡ１０３、ｐＲＶ５００、およびｐＭＤ５０５７のプラスミドがｐＵＣＬ２８７ファミリーに属することを報告している。上述の配列分析により、プラスミドｐＬＣ４９４において見られる、２種のｒｅｐ遺伝子と２２ｂｐ反復配列とで構成される領域は、ｐＬＡ１０３の対応する領域と同様であることが分かった。従って、プラスミドｐＬＣ４９４は、θ型プラスミドに属することが示唆される。
（実施例３：大腸菌および乳酸菌用シャトルベクターｐＪＬＥ４９４２の作製）
大腸菌／乳酸菌シャトルベクターの構築のために、プラスミドｐＬＣ４９４の複製起点を使用した。大腸菌由来プラスミドｐＪＩＲ４１８（Ｓｌｏａｎ，Ｊ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ｔ．，Ｂａｎｎａｍ，Ｔ．Ｌ．，Ｂｅｒｒｙｍａｎ，Ｄ．Ｉ．，Ｒｏｏｄ，Ｊ．Ｉ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ２７，２０７−２１１（１９９２））をＡｖａＩで消化して、グラム陽性クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ（Ｒ））を含有する４．９ｋｂ断片を得た。この４．９ｋｂ断片を、ＡｖａＩで消化した大腸菌由来プラスミドｐＵＣ１９（Ｂｒｉｎｇｅｌ，Ｆ．，Ｆｒｅｙ，Ｌ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．：Ｐｌａｓｍｉｄ  ２２，１９３−２０２（１９８９））に連結して、プラスミドｐＪＩＲＵＣ１を得た。ＢａｍＨＩとＮｈｅＩとで二重消化したｐＪＩＲＵＣ１の断片（４１１６ｂｐ）をクレノウ断片（ＴａＫａＲａ）で処理し、次いで自己連結して、プラスミドｐＪＩＲＵＣ１１を得た。一方、ｐＬＣ４９４をＨｉｎｄＩＩＩで消化して２１６８ｂｐの断片を得、同じ制限酵素で処理したｐＵＣ１９にこの断片を連結して、プラスミドｐＬＵ１を生成した。プラスミドｐＬＵ１は、ｐＬＣ４９４の反復領域およびｒｅｐＡ遺伝子を含む。ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで二重消化したｐＪＩＲＵＣ１１に、同じ制限酵素で処理したｐＬＵ１の１８８７ｂｐの断片を連結して、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。この構築されたプラスミドをｐＪＬＥ４９４１と命名した。構築されたプラスミドｐＪＬＥ４９４１は、大腸菌にもＬｂ．ｃａｓｅｉＬ−４９−４（プラスミドなし）にも首尾よく導入された。そして、ｐＪＬＥ４９４１をＢａｍＨＩとＨｐａＩとで二重消化し、次いで自己連結して、ｐＪＬＥ４９４２を得た。したがって、ｐＪＬＥ４９４１およびｐＪＬＥ４９４２は、ｐＵＣ１９由来のアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ（Ｒ））および複製開始部位（ｏｒｉ）；ｐＪＩＲ４１８由来のグラ厶陽性クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ（Ｒ））；およびｐＬＣ４９４由来の反復領域およびｒｅｐＡ遺伝子を有する（図３）。
（実施例４：シャトルベクターｐＪＬＥ４９４２を用いた大腸菌および乳酸菌の形質転換）
実施例３にて作製したシャトルベクターｐＪＬＥ４９４２を用いて、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９細胞からプラスミドを除去したもの）、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ  ３４１４３、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＩＡＩ  Ｌ−５４、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ７２３５、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ  ＪＣＭ  １１３０、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（以下「Ｌｅｕｃ．Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ」という）ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＯＲ−１−２、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（以下「Ｌｃ．Ｌａｃｔｉｓ」という）ＮＩＡＩ  Ｎ−７（これらはいずれもプラスミドが除去されたものである）、ならびに大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行った。上述した乳酸菌の形質転換は、種々のプロトコル（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら，前出；Ｃｏｆｆｅｙ，Ａ．ら，前出；ＧＡＳＳＯＮ，Ｍ．Ｊ．ら，前出；Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．ら，前出）に従って、エレクトロポレーションによって行った。大腸菌の形質転換は、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献による記載のとおりに実施した。連結したＤＮＡとコンピテント大腸菌細胞とを混合し、これらを氷上で３０秒間維持した。形質転換する細胞試料を０．１ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＫ）に移し、そしてジーンパルサ（ピーク電圧１．５ｋＶ；静電容量２５μＦ；抵抗２００Ω；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で形質転換した。次いで、形質転換した大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有するＬＢ寒天培地（ナカライテスク株式会社）上に播種し、そして振盪させながら３７℃で３０分間インキュベートし、生存細胞を選抜した。形質転換した乳酸菌細胞は、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上に播種し、振盪せずに３７℃で３０分間インキュベートし、生存細胞を選抜した。
ベクターｐＪＬＥ４９４２は、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換されるとともに、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４（１．３×１０５（１μｇＤＮＡ当たりの形質転換体数））、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ  ３４１４３（２．４×１０２）、Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ  ＪＣＭ  １１３０（＜１０１）、およびＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＩＡＩ  Ｌ−５４（４．９×１０３）に導入された。また、図４は、ｐＪＬＥ４９４２で形質転換された大腸菌および種々の乳酸桿菌から抽出したプラスミドＤＮＡの電気泳動写真である。形質転換された大腸菌および種々の乳酸桿菌からのプラスミドＤＮＡの抽出は、実施例１と同様にして行った。図４は、ベクターｐＪＬＥ４９４２が大腸菌細胞および種々の乳酸桿菌に導入されたことを示す（レーン１：大腸菌ＤＨ５α細胞；レーン２：Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４；レーン３：Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ  ３４１４３；レーン４：Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＩＡＩ  Ｌ−５４；レーンＭは分子量マーカーである）。一方、ｐＪＬＥ４９４２の形質転換体は、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ７２３５、Ｌｅｕｃ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＯＲ−１−２、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、およびＬｃ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＩＡＩ  Ｎ−７からは得られなかった。
さらに、ｐＪＬＥ４９４２を上記と同様にして大腸菌ＤＨ５α細胞およびＬｂ．ｃａｓｅｉＬ−４９−４細胞に導入し、次いでこの導入されたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α細胞およびＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞の形質転換体から実施例１と同様にして抽出した。抽出したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ；ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩ；またはＥｃｏＲＩで消化した。これらの制限酵素の消化により得られた断片をアガロースゲル電気泳動に供し、分析した。図５に、制限酵素の消化により得られた断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す（レーン１〜３は大腸菌ＤＨ５α細胞、レーン４〜６はＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞の結果を示す：レーン１および４はＨｉｎｄＩＩＩ処理；レーン２および５はＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩ処理；レーン３および６はＥｃｏＲＩ処理；両端の２つのレーンＭは１ｋｂラダーである）。図５に示すように、制限酵素分析の結果は、プラスミドがいかなる構成再配置も示さなかったことを明らかにした。
（実施例５：大腸菌および乳酸菌用シャトルベクターｐＪＬＥ１２１の作製およびこれらのシャトルベクターを用いた大腸菌および乳酸菌の形質転換）
ｐＪＩＲ４１８をＮｄｅＩで消化して、ｐＩＰ４０４  ＯｒｉおよびｐＩＰ４０４  Ｒｅｐを除去した。次いで、これを自己連結して、５５３３ｂｐのプラスミドｐＪＩＲ１を得た。次に、ＢａｍＨＩとＮｈｅＩとで二重消化したｐＬＣ４９４の断片（２４６６ｂｐ；ｏｒｉ，ｒｅｐＡおよびｒｅｐＢを含有する）を、同じ酵素で処理したｐＪＩＲ１を用いて大腸菌にクローニングした。この構築したベクターをｐＪＬＥ１２（６２９７ｂｐ）と称した。最後に、ＥｃｏＲＶで消化したｐＪＬＥ１２の自己連結断片（４６９１ｂｐ）を用いてｐＪＬＥ１２１を構築した（図６）。ｐＪＬＥ１２およびｐＪＬＥ１２１は、ｐＪＩＲ４１８由来の複製開始部位（ｐＭＢＩ）およびエリスロマイシン耐性遺伝子（グラム陽性菌および陰性菌の両方に対する選択マーカー）と、ｐＬＣ４９４由来のｏｒｉ（２２ｂｐ反復領域）およびｒｅｐＡとを有する。
シャトルベクターｐＪＬＥ１２またはｐＪＬＥ１２１を用いたこと以外は、実施例４と同様にして、大腸菌ＤＨ５α細胞およびＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の形質転換を行った。Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の形質転換は、Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら（前出）の記載に従い、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換は、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献による記載のとおりに実施した。電気形質転換後、大腸菌ＤＨ５α細胞を最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）を含有するＬＢ（ナカライ）寒天プレート上播種し、振盪させながら３７℃で３０分間インキュベートし、生存細胞を選抜した。そしてＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞を最終濃度１６μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＲＳ寒天プレート上に播種し、振盪させずに３７℃で３０分間インキュベートし、生存細胞を選抜した。シャトルベクターｐＪＬＥ１２およびｐＪＬＥ１２１は、大腸菌ＤＨ５α細胞およびＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４に首尾よく導入された。
（実施例６：シャトルベクターｐＪＬＥ１２１によるＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４のエレクトロポレーション）
シャトルベクターｐＪＬＥ１２１によるＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の形質転換効率を最適化するために、種々のパラメーターの影響を検討した。
Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ら（前出）に記載の方法およびＢｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら（前出）に記載の方法を用いたＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の形質転換効率は、他の方法（Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．ら，前出、Ｂｈｏｗｍｉｋ，Ｔ．ら，前出）の形質転換効率よりも高かった（データは示さず）。従って、Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ら（前出）に記載の方法およびＢｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら（前出）に記載の方法に基づいて、パラメーターを種々に変更し、形質転換効率に対するその影響を検討した。
（１．洗浄溶液およびエレクトロポレーション／保存溶液の組成の影響）
試験した洗浄溶液およびエレクトロポレーション／保存溶液の組成を以下の表１に示す。
【表１】
2007034581.tif 000004
種々の溶液で洗浄したＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞をｐＪＬＥ１２１と混合し、そして標準条件（ピーク電圧８．７５ｋＶ／ｃｍ；静電容量２５μＦ；抵抗２００Ω）下でエレクトロポレートした。電気形質転換をＣｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．ら（前出）に記載の方法に従って実施した場合、細胞を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液で洗浄して１０％グリセロールエレクトロポレーション溶液中に再懸濁した場合に最も高く、１μｇのＤＮＡ当たり２．７×１０３の形質転換体が形成された。電気形質転換をＢｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら（前出）に記載の方法に従って実施した場合、細胞を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液で洗浄して１０％グリセロールエレクトロポレーション溶液中に再懸濁した場合に、最も高い形質転換効率を得た（１μｇのＤＮＡ当たり１．７×１０４の形質転換体；表１）。従って、以下の実験は、これらの溶液を用いて行った。
（２．増殖段階の影響）
Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の形質転換効率に対する増殖段階の影響を調べるために、エレクトロポレーションを行う前に、種々のＯＤ６００値（０．２５、０．４５、０．７、０．９、１．２６、および１．５６）で細胞を採取した。細胞を洗浄し、そして１０％グリセロール中で約１５〜１６のＯＤ６００に等価な最終濃度になるように調整した。懸濁した細胞をｐＪＬＥ１２１と混合し、そして標準条件下でエレクトロポレートした。７２時間インキュベートした後、最も高い形質転換効率（１μｇのＤＮＡ当たり１．７×１０４の形質転換体）は、初期の対数増殖期で得られた（ＯＤ６００＝０．２５）。この結果は、増殖段階が形質転換効率に対して有意に影響を与えることを示した。
（３．増殖培地組成の影響）
細胞壁に対するグリシンの影響を調べた。グリシンに関しては、以下の知見がある。グリシンの濃度は、Ｌｂ．ｓａｋｅｉ（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら，前出）の形質転換になんら効果を有さず、一方、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．ら，前出）の形質転換を有意に改善しなかった。対照的に、Ｌｂ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｊｕｇｕｒｔｉ（ＨＡＳＨＩＢＡ，Ｈ．，ＴＡＫＩＧＵＣＨＩ，Ｒ．，ＩＳＫＩＩ，Ｓ．，ＡＯＹＡＭＡ，Ｋ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４  １５３７−１５４１（１９９０））およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＡＵＫＲＵＳＴ，Ｔ．，ＮＥＳ，Ｉ．Ｆ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５２  １２７−１３２（１９８８））はそれぞれ、１．２％のグリシンおよび１．０％のグリシンによって形質転換効率が顕著に改善された。
Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞を、０．２〜３．０％（ｗ／ｖ）グリシンを添加したＭＲＳブロス中で、および対照実験として何も添加していないＭＲＳブロス中で、ＯＤ６００が約０．２〜０．３になるまで増殖させた。細胞を採取し、そして１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液で洗浄して１０％グリセロールエレクトロポレーション溶液中に再懸濁して、次いで標準条件下でエレクトロポレートした。１．０％グリシンをＭＲＳブロスに添加した場合、対照実験および試験した他の濃度に比べて、最も高い形質転換効率が生じた（１μｇのＤＮＡ当たり１．２×１０５の形質転換体）。従って、続く実験では、１．０％グリシンを添加したＭＲＳブロスを用いた。
（４．電気的パラメーターの影響）
形質転換効率に対する電気的パラメーターの影響を決定するために、２５μＦの固定静電容量で、種々の電圧（１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、および２．５ｋＶ）およびパルスコントロール抵抗（２００、４００、および６００Ω）で、細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションのためのコンピテント細胞を、上記の至適条件に従って調製した。ＤＮＡとコンピテント細胞とを混合し、そしてこれらの試料を０．２ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加し、ジーンパルサで形質転換した。細胞を２．５μＦの静電容量で１．７５ｋＶかつ２００Ωに供した場合に、最も高い形質転換効率（１μｇのＤＮＡ当たり１．５×１０５の形質転換体）が得られた（図７）。
以上のように、ｐＪＬＥ１２１を用いるＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４の最適な形質転換効率は、１．０％グリシンを含有するＭＲＳブロス中で培養した細胞（ＯＤ６００＝０．２５）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液で洗浄し、そして１０％グリセロールエレクトロポレーション溶液中に再懸濁し、次いで１．７５ｋＶ、２００Ω、および２５μＦの静電容量でエレクトロポレートした場合に得られた。
（実施例７：ｐＬＣ４９４の複製必須領域の解析）
実施例５において得られたｐＪＬＥ１２１ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、自己連結して、図６に示すＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩの部分が欠失したベクターΔ（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ）ｐＪＬＥ１２１を作製した。欠失体ベクターΔ（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ）ｐＪＬＥ１２１および対照の欠失させていないベクターｐＪＬＥ１２１を用いて、実施例５と同様の方法でＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞へ形質転換し、最終濃度１６μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＲＳ寒天プレート上に播種し、振盪させずに３７℃で３０分間インキュベートし、生存細胞を選抜した。この結果、ｐＪＬＥ１２１によってＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９−４細胞の１×１０３の形質転換効率が得られたのに対し、ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩの部分が欠失したベクターΔ（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ）ｐＪＬＥ１２１ではうまく形質転換できなかった。以上から、ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩの部分（配列番号１の１９２３位から２４１４位の塩基配列に対応）は、ｐＬＣ４９４の複製に必要な領域であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、広宿主域を有する、乳酸菌の形質転換のためのプラスミドおよびベクターが提供された。本発明のプラスミドおよびベクターはまた、乳酸桿菌において、安定に複製可能である。本発明によって、Ｌｂ．ｃａｓｅｉおよび他の乳酸菌（特に、乳酸桿菌）を遺伝子操作で改良し産業的に応用する可能性が一段と拡がった。また、本発明のプラスミドおよびベクターは、ＧＲＡＳ生物であり、プロバイオティクスとして商業的に使用されているＬｂ．ｃａｓｅｉに由来するので、食品および医薬品の開発のために有用となる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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