(57)【要約】  本発明は、哺乳動物由来の間葉系幹細胞を利用して、エリスロポエチン産生オルガノイドを製造する手段を提供することを課題とする。  哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児に移植して間葉系幹細胞の分化を誘導することによるエリスロポエチン産出オルガノイド（器官様組織体）前駆体の製造方法であり、特に間葉系幹細胞の移植部位が胎児における腎形成部位であり、移植時期が宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階である。  【選択図】図８【特許請求の範囲】
【請求項１】
分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分化を誘導することによるエリスロポエチン産出オルガノイド（器官様組織体）前駆体の製造方法にあたり、該間葉系幹細胞の移植部位が胎児における腎形成部位であり、移植時期が宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であることを特徴とするエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
【請求項２】
さらに、in vitro において全胚培養を行うことを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
【請求項３】
さらに、in vitroにおいて器官培養を行うことを特徴とする請求項２に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
【請求項４】
エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体が哺乳動物類の大網に移植されると、エリスロポエチン産出調製能を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
【請求項６】
以下の工程で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
（１）分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児における腎形成部位に宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階で移植することにより該間葉系幹細胞の分化を誘導する、
（２）in vitro において全胚培養を行う
（３）in vitroにおいて器官培養を行う
【請求項７】
エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体が哺乳動物類の大網に移植されると、エリスロポエチン産出調製能を有することを特徴とする請求項５又は６のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
【請求項８】
以下を少なくとも含むエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体製造用キット。
（１）分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞
（２）妊娠哺乳動物又は妊娠哺乳動物から分離した胎児
（３）全胚培養を行うための試薬
（４）器官培養を行うための試薬
（５）エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造説明書
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を哺乳動物類の大網に移植することを特徴とするエリスロポエチン関連疾患の治療方法。
【請求項１０】
エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の由来が、エリスロポエチン関連疾患レシピエントの間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体及びその製造方法並びにエリスロポエチン関連疾患の治療方法を提供するものである。
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2006-185004からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓はエリスロポエチンの主要な産生臓器であり、腎不全にともなうエリスロポエチン産生低下により腎性貧血の合併症が生じる。現在、この腎性貧血は精製したリコンビナントタンパク質を投与することにより治療している。末期腎不全患者では、透析ごとに1500-3000単位のリコンビナントタンパク質の投与が必要となるが、非常に高額な薬剤である(現在3000単位で5697円)。現在２５万人を超えるまで膨れ上がった透析患者数が、今後人口の高齢化、糖尿病の増加に伴いさらに爆発的に増えることが予想されており、経済的に多大な負担を強いられることとなる。またリコンビナントタンパク質投与により抗エリスロポエチン抗体が産生されpure red cell aplasia(赤芽球ろう)が発症することが報告されており、リコンビナントタンパク質に代わる治療法が求められている。【０００３】
これまでの治療法では、ウイルスなどを使って強制的にエリスロポエチンを発現させた細胞を皮内などに植え込む方法が報告されているが、細胞が生存している間の一過性のエリスロポエチン発現であり、また貧血改善後も強制発現が続くため多血症が危惧されていた。したがって、必要時に（つまり貧血時等に）、必要量を分泌することが可能である調節機構が必要となり、また、体内に生着させることにより長期間安定供給が可能であることが臨床応用には必要となる。【０００４】
一方、現在自己の骨髄細胞またはＥＳ細胞から特定の機能を持った細胞に分化させる方法が次世代の治療法として注目され、たとえばインスリン分泌能を持った膵臓ベータ細胞への分化誘導法などが開発されてきている。しかし、これまで骨髄またはＥＳ細胞からエリスロポエチン産生細胞への分化誘導法は開発されていない。【０００５】
さらに、臓器移植技術は、移植医療の進歩とともにこれまで改善が期待できない臓器障害に対し移植により完治が期待できるようになった。しかし世界的に慢性的なドナー不足であり、また移植がうまくいった場合でも拒絶反応回避のための免疫抑制剤の長期服用が必要となり、これに伴う副作用と戦い続けなければならない（非特許文献１）。【０００６】
従って究極的な治療目的の一つは、自己組織幹細胞からエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を製造し、自己移植片としてin vitro由来の該オルガノイド前駆体を再び個々のドナーに移植して戻すことである。
また、成人骨髄に認められるヒト間葉系幹細胞は最近、その微小環境に依存して可塑性を維持し、いくつかの異なった細胞型に分化することが明らかとなった（非特許文献２）。胚幹細胞（ES細胞）と比較して、ヒト間葉系幹細胞は自己骨髄から分離することができ、重大な倫理的問題も免疫学的結果も伴わずに治療に応用が可能である（非特許文献３）。
【非特許文献１】Transplantation 77, S41-S43(2004)
【非特許文献２】Science 276, 71-74(1997)
【非特許文献３】Birth Defects Res. 69, 250-256(2003)
【非特許文献４】J. Neurosci. Res.60, 511-519(2000)
【非特許文献５】Blood 98, 57-64 (2001)
【非特許文献６】J. Am. Soc. Nephrol.11, 2330-2337(2001)
【非特許文献７】Methods 24, 35-42(2001)
【非特許文献８】J. Clin. Invest.105, 868-873(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した欠点を克服するために、（１）免疫拒絶反応を回避できる自己由来の間葉系幹細胞から、（２）個々の患者の体内で生着することにより、エリスロポエチン発現を長期間継続可能であり、さらに、（３）エリスロポエチン発現量を調節可能な、エリスロポエチン産出オルガノイド並びにエリスロポエチン関連疾患の治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト間葉系幹細胞を成長中胎児の腎形成部位に移植し、その後、各培養工程を得ることにより、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を製造できることを見出し、本発明の一を完成した。さらに、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体をエリスロポエチン関連疾患のレシピエント（患者）の大網に移植して、エリスロポエチン産出オルガノイドとすることでエリスロポエチン関連疾患の治療方法も完成した。【０００９】
すなわち本発明は、
「１．分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分化を誘導することによるエリスロポエチン産出オルガノイド（器官様組織体）前駆体の製造方法にあたり、該間葉系幹細胞の移植部位が胎児における腎形成部位であり、移植時期が宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であることを特徴とするエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
２．さらに、in vitro において全胚培養を行うことを特徴とする前項１に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
３．さらに、in vitroにおいて器官培養を行うことを特徴とする前項２に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
４．エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体が哺乳動物類の大網に移植されると、エリスロポエチン産出調製能を有することを特徴とする前項１〜３のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法。
５．前項１〜４のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造方法で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
６．以下の工程で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
（１）分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児における腎形成部位に宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階で移植することにより該間葉系幹細胞の分化を誘導する
（２）in vitro において全胚培養を行う
（３）in vitroにおいて器官培養を行う
７．エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体が哺乳動物類の大網に移植されると、エリスロポエチン産出調製能を有することを特徴とする請求項５又は６のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体。
８．以下を少なくとも含むエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体製造用キット。
（１）分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞
（２）妊娠哺乳動物又は妊娠哺乳動物から分離した胎児
（３）全胚培養を行うための試薬
（４）器官培養を行うための試薬
（５）エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造説明書
９．前項５〜７のいずれか一に記載のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を哺乳動物類の大網に移植することを特徴とするエリスロポエチン関連疾患の治療方法。
１０．エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の由来が、エリスロポエチン関連疾患レシピエントの間葉系幹細胞であることを特徴とする前項９に記載の治療方法。」からなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、エリスロポエチン関連疾患の治療に必要なエリスロポエチン産出オルガノイド及びその製造方法を提供した。つまり、従来の一過性のエリスロポエチン産出及び／又は必要量以上のエリスロポエチン産出を行うエリスロポエチン産出細胞とは異なり、エリスロポエチン発現を長期間継続可能でありかつエリスロポエチン発現量を調節可能なエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体をエリスロポエチン関連疾患のレシピエントの大網に移植することである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】大網中に移植されたエリスロポエチン産生オルガノイドの出現を示す図である。
【図２】大網中に移植されたエリスロポエチン産生オルガノイド(２週)の組織的分析を示す図である。
【図３】エリスロポエチン産生オルガノイド内にレシピエントからの血管が構築されていることを示す図である。
【図４】大網中に移植したエリスロポエチン産生オルガノイドの電子顕微鏡写真を示す図である。糸球体係蹄内に赤血球が認められレシピエントの血流と統合されていることを示している。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲを用いたヒトエリスロポエチンmRNAの発現結果を示す図である。
【図６】抗エリスロポエチン抗体と抗ヒトβ2 マイクログロブリン抗体を用いた２重染色の結果を示す図である。
【図７】貧血前と貧血後の各ラットの血清中エリスロポエチン濃度を測定した結果を示す。
【図８】エリスロポエチン産出オルガノイドの貧血改善効果の結果を示す。
【図９】温度感受性ポリマーを用いたGDNF徐放の確認結果を示す。
【図１０】ポリマーによるGDNF徐放でヒト間葉系幹細胞由来部分が拡大している結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分化を誘導することによるエリスロポエチン産出オルガノイド（器官様組織体）前駆体の製造方法であり、特に、該間葉系幹細胞の移植部位が胎児における腎形成部位であり、移植時期が宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であることを特徴とする。【００１３】
本発明における「エリスロポエチン産出オルガノイド（器官様組織体）」とは、単一の細胞ではなく、細胞組織体であって、腎臓が本来有する機能であるエリスロポエチン産出能を有する。なお、エリスロポエチン産出オルガノイドは、その表面を除いて、各細胞が相互に三次元的に接触しており、隣接する細胞同士がさまざまな細胞間結合を介して情報交換をし、単にエリスロポエチンを産出するだけでなく、エリスロポエチン産出調製能を有する。
なお、「前駆体」とは、エリスロポエチン産出機能及び産出調製機能に必要な因子を有するが、環境的要因により、エリスロポエチン産出機能及び産出調製機能を発揮しない状態を意味する。エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体は、好適には哺乳動物類特にヒトの大網に移植されることにより、エリスロポエチン産出オルガノイドとなる。すなわち、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体は、哺乳動物類特にヒトの大網の環境下に置かれることにより、エリスロポエチン産出機能及び産出調製機能を発揮する。しかしながら、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体は、哺乳動物類特にヒトの大網と同様な環境状態にある培養条件下では、エリスロポエチン産出オルガノイドになることができる。【００１４】
ここで、本発明における「エリスロポエチン産出調製機能」とは、レシピエント（患者）の体内でエリスロポエチンが正常な状態と比較して多く必要な時（貧血時等）には、エリスロポエチンを多量（貧血を改善するのに必要な量）に産出する。しかし、レシピエント（患者）が正常な状態の時（貧血が改善された等）には、体内の正常な状態を保つために必要な量のエリスロポエチンを産出する。
すなわち、本発明のエリスロポエチン産出オルガノイドは、従来のエリスロポエチン産出細胞とは、レシピエント（患者）に必要な量のエリスロポエチンを産出することができる点、さらに、大網中の血管から必要な栄養を取り込むことにより、長期間継続してエリスロポエチンを産出することができる点で、大きく異なる。【００１５】
本発明における「エリスロポエチン関連疾患」とは、腎不全、糖尿病、潰瘍、癌、感染、透析、手術および化学療法に関連した貧血を含むエリスロポエチン産出量の低下に関連する疾患である。特に、慢性腎不全による貧血の場合は、進行性の腎実質および肝機能破壊のためエリスロポエチンが産生され得ず、循環系中のエリスロポエチン濃度が増加しないので大きな問題となっている。なお、疾患患者（レシピエント）は、ヒトを含むすべての哺乳動物類が対象である。例えば、ヒト、愛玩動物、例えばサル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ（特に競馬ウマ）、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウスなどが対象である。【００１６】
本発明で使用できる哺乳動物宿主の好適な例としては、例えばブタが例示され、その他の好適な動物としては、遺伝子組換えされた、例えばトランスジェニック、ノックアウト、ノックイン等のブタが例示される。その他、有蹄動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等が例示される。さらに、ラットもしくは上記有蹄動物の遺伝子改変動物、特にトランスジェニック動物等が好適に例示される。【００１７】
哺乳動物由来の間葉系幹細胞は、好ましくはレシピエント由来のものを使用するのが良い。例えば、レシピエントがヒトである場合には、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を移植するヒト本人の骨髄、流血中又は臍帯血から分取される。特に成人のエリスロポエチン関連疾患特に腎不全患者等を考慮すると、自己の骨髄由来のヒト間葉系幹細胞が好ましい。
分取法は、一般的な外科的医学手法による。分取された細胞は、最適条件を選択し、培養を２〜５細胞継代以上はしないことがよい。ヒト間葉系幹細胞を形質転換させないまま培養を継続する目的でCambrex BioScience社製のヒト間葉系幹細胞専用培地キットを用いる。
ヒト間葉系幹細胞は、所望により、アデノウイルス及び/又はレトロウイルス等の手技を使い所望の遺伝子を導入する。例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（Glial cellline-derived neurotrophic factor-GDNF）を発現するように遺伝子導入させる。この形質転換により、注入幹細胞由来エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の形成率を5.0±4.2％から29.8±9.2％に上昇させることを確認している。
また、上記アデノウイルス及び/又はレトロウイルスの手法以外には、GDNF含有ポリマー特に温度感受性ゲルであるメビオールゲルを哺乳動物由来の間葉系幹細胞と混和して注入することにより、GDNFを徐放させることができる。【００１８】
調製された哺乳動物類由来の間葉系幹細胞は、次いで妊娠哺乳動物宿主中の胎児に移植される。すなわち、生体内の胎児に直接哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を移植し、子宮内でエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の形成をさせることができる。移植の手法は一般的な外科的医学手法、例えば、ブタを宿主としたシステムで、子宮内の胎児にエコー下でマイクロピペット等を使用して哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を注入する。移植する細胞量は0.5〜1.0×103個で十分である。すなわち、ブタなどの大型の妊娠哺乳動物の生体内の胚に、経子宮アプローチによって、直接哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を移植し、そのまま生体内で成長を続けさせ、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体への成長をさせる。また、その後、以下に示す「全胚培養」又は「器官培養」の工程を追加することもできるが、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体は十分に成長しているので特に必要がない。なお、好ましくはヒト間葉系幹細胞を使用する。【００１９】
また、好ましくは、調製された哺乳動物類由来の間葉系幹細胞は、妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎児に移植し、その後、全胚培養を用いてin vitroにて器官形成（エリスロポエチン産出オルガノイド）の初期段階を完了するまで胎児の体内で成熟させ、その後器官培養でさらに培養して、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体となることができる。さらに、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を哺乳動物類の大網に移植して、エリスロポエチン産出オルガノイドを得ることができる。なお、好ましくはヒト間葉系幹細胞を使用する。【００２０】
本発明において、上記工程を得ることにより、哺乳動物類由来の間葉系幹細胞はエリスロポエチン産出オルガノイドに分化できることを見出し、さらにこの新規エリスロポエチン産出オルガノイドはエリスロポエチン産出調製機能を有する。【００２１】
胎児への移植の時期は、選択的である。ラットを使った実験ではE（ステージ胚日）9〜12、特にE10〜12、より好ましくはE10〜11.5、最も好ましくはE11.5が好適であった。大型の哺乳動物のブタ等でも、同様のステージ胚が好適に利用できる。しかし、その前後も条件を選定することによって適用可能である。しかし、重要なことは少なくとも移植時期は、胚の成長段階が、宿主の免疫系が未だ免疫寛容の段階であることである。【００２２】
本発明の特徴は、胎児への移植部位の選択である。つまり、胎児への哺乳動物類由来の間葉系幹細胞の移植部位が宿主の腎臓における発生相当部位である。そのため、移植は、腎臓の相当部位であることが確定できる時期であることが必要となるが、腎臓の芽細胞が発達開始前の萌芽状態であることが好ましい。例えば、哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を尿管芽発芽部位の周辺、より詳しくは体節と側板の間に移植することにより、エリスロポエチン産出オルガノイドに分化させることができる。好ましくは、後腎形成中胚葉に移植することである。なお、好ましくはヒト間葉系幹細胞を使用する。【００２３】
本発明における「全胚培養」は、哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎児に移植する場合に行う。全胚培養の概要は、子宮を母体から分離し、そこから胎児を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離したものを取り出して得た胎児に哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を移植し、これを培養瓶内等で培養する。しかしながら、本発明における「全胚培養」の目的であるエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を培養するとの目的を達成できるなら、上記培養方法に一部の改良及び／又は一部の工程を削除してもよい。より詳しくは、以下の通りであるが特に限定はされない。
若干変形を加えた以外は既述通りの方法（非特許文献７）で全胚をin vitroで培養する。実体顕微鏡等を用いて、子宮を麻酔下母体より摘出する。E9〜12、特にE10〜12、より好ましくはE10〜11.5、最も好ましくはE11.5のラット胚を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離す。さらに、哺乳動物類由来の間葉系幹細胞を注入できるように卵黄嚢及び羊膜を開くが、絨毛膜尿膜胎盤はそのままの形で残す。哺乳動物類由来の間葉系幹細胞の注入成功が確認できた胚を、遠心分離したラット血清に培養培地（ブドウ糖、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシンB）3mlを入れた培養瓶内で培養する。培養瓶はインキュベータ（型番号 RKI10-0310、Ikemoto、東京）内で回転する。培養時間は、１２時間〜６０時間、好ましくは２４時間〜４８時間、最も好ましくは４８時間である。なお、好適には、一定培養時間後に、形態的・機能的に評価し、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の器官原器を確認する。この確認の後、該器官原器を胚より分離し、好適には以下の器官培養を行う。なお、好ましくはヒト間葉系幹細胞を使用する。【００２４】
本発明における「器官培養」の概要は、上記器官原器をフィルター上に置き、その下のdishにDMEMを加える。そして、該dishを５％CO2 インキュベーター中で培養する。培養時間は、１２時間〜１４４時間、好ましくは１８時間〜７２時間、より好ましくは２４時間〜４８時間、最も好ましくは２４時間である。すなわち、２４時間の時点で大網に移植するのが一番効率が良い。また、培養温度は、２０度〜４５度、好ましくは２５度〜４０度、最も好ましくは３７度である。しかしながら、本発明における「器官培養」の目的であるエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を培養するとの目的を達成できるなら、上記培養方法に一部の改良及び／又は一部の工程を削除してもよい。詳細は、J. Clin. Invest.105, 868-873(2000)（非特許文献８）に記載されているが、特に限定はされない。【００２５】
本発明における「エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を哺乳動物類の大網に移植する」方法は、通常の外科的処方により行うことができるが、例えば、鋭利な鑷子で移植する組織をつまみ、鑷子の先で大網の脂肪組織の表面にわずかに切り口を作りその中に組織を埋め込む方法である。また、内視鏡を利用して大網に移植することができる。【００２６】
また、本発明では、上記全胚培養を２時間〜６０時間行い、次に上記器官培養を１２時間〜３６時間行い、さらに上記大網に移植する一連の操作を「改良型リレー培養」と称する。【００２７】
本発明における「エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体製造用キット」とは、少なくとも以下を含む。
（１）分取した哺乳動物類由来の間葉系幹細胞
レシピエント（患者）の骨髄細胞由来が好ましい。
（２）妊娠哺乳動物又は妊娠哺乳動物から分離した胎児
ラット、ブタが好ましいが、本明細書に記載の妊娠哺乳動物又は妊娠哺乳動物から分離した胎児なら特に限定されない。
（３）全胚培養を行うための試薬
本発明の「全胚培養」を行うための必要な試薬であって、本明細書に記載の一部又は全部であってよい。
（４）器官培養を行うための試薬
本発明の「器官培養」を行うための必要な試薬であって、本明細書に記載の一部又は全部であってよい。
（５）エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の製造説明書
医師を含む再生医療分野の技術者が、上記（１）〜（４）を使用して、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を製造する手順が記載されている。【００２８】
本発明における「エリスロポエチン関連疾患の治療方法」では、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体をレシピエント（患者）の大網に移植することである。大網中のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体は、エリスロポエチン産出オルガノイドになり、大網中の血管から必要な栄養を取り込むことにより、長期間継続してエリスロポエチンを産出する。なお、以下の実施例では、ラット大網中のエリスロポエチン産出オルガノイドは、ラットモデルの貧血改善の効果を示した。【００２９】
また、移植するエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の大きさは、エリスロポエチン産出器官である腎臓と近似の大きである必要はなく、腎臓全体の５０分の１〜１０分の１の大きさで十分である。【００３０】
なお、形成されたエリスロポエチン産出オルガノイドが、宿主由来の抗原性物質を夾雑しないようにするためには、移植細胞を、以下のような形質に変換しておくことが有効である。つまり、ヒトの間葉系幹細胞を使用した場合には、形成されたエリスロポエチン産出オルガノイドにはヒト間葉系幹細胞由来のヒト細胞と宿主動物由来の細胞が混在する。混在した宿主由来細胞はエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を人体に移植した際に、免疫拒絶反応を引き起こす可能性があるために、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体形成後、宿主由来細胞を徹底的に取り除く必要がある。これを解決するために、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物を作成し、この動物においてエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を形成する。この宿主動物胚の当該部位にヒト間葉系幹細胞を移植、エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を作成した後、宿主細胞特異的に細胞死を誘導し、人体に移植する前段階で宿主由来細胞を完全に取り除く。【００３１】
以下、本発明の代表例としてラットを使用した系により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（使用材料と方法）
１）実験動物
宿主動物は、野生型Sprague-Dawleyラットを三協ラボサービス（東京）より購入し、使用した。膣栓を認めた日の中間点を0.5日とした。動物は換気（陽圧気流）ラックの中に収容し、病原菌のない状態下で交配、飼育した。全ての実験的手順は東京慈恵会医科大学動物実験委員会により承認された。【００３３】
２）ヒト間葉系幹細胞の培養操作
健常志願者の骨髄から得られたヒト間葉系幹細胞を使用した。CD105、CD166-、CD29-、CD44-陽性及びCD14-、CD34-、CD45-陰性と確認された骨髄由来のヒト間葉系幹細胞をCambrex BioScience 社（Walkersville、MD）から購入し、製造者の提供するプロトコールに従い、培養した。ヒト間葉系幹細胞は形質変化を避けるために５細胞継代以内で用いた。ヒトGDNFcDNA（AxCAhGDNF）を有する複製欠損組み換え型アデノウイルスを既述の通り作成し、精製した（非特許文献４）。
細菌性LacZ遺伝子（MFG-LacZ）を有する組み換え型レトロウイルスを産生するパッケージング細胞（Ψ-crip）はH.  Hamada（札幌医科大学）より寄贈された。アデノウイルス感染及びレトロウイルス感染を既述の通り実施した（非特許文献５、６）。細胞は100％ジメチルホルムアミド中で1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine（DiI（MolecularProbes）0.25％（wt/vol））を用いて標識し、マイクロピペットを用いて尿管芽の発芽部位にマイクロピペットを用いて注入した。【００３４】
３）全胚培養及び器官培養操作
若干変形を加えた以外は既述通りの方法（非特許文献７）で全胚をin vitroで培養した。実体顕微鏡を用いて、子宮を麻酔下母体より摘出した。（E:ステージ胚日）E11.5のラット胚を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離した。注入できるように卵黄嚢及び羊膜を開いたが、絨毛膜尿膜胎盤はそのままの形で残した。注入の成功が確認できた胚を、直ちに100％遠心分離したラット血清にブドウ糖（10mg/ml）、ペニシリンＧ（100単位/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、及びアンフォテリシンB（0.25μg/ml）を加えた培養培地3mlを入れた15-mlの培養瓶内で培養した。培養瓶はインキュベータ（型番号 RKI10-0310、Ikemoto、東京）内で回転させた。ラット胚の ex vivoの成長は４８時間の培養期間で行った。
次に、12mm径0.4μm Nucleopore filter (Corning-Coster社製)の上に全胚培養後の器官原器を置き、その下のdishに400μLの20%PBS DMEMを加えた。そして、該dishを５％CO2インキュベーター中で２４時間３７度で器官培養を行った。【００３５】
４）大網に移植操作
上記３）で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を鋭利な鑷子でつまみ、該鑷子の先で大網の脂肪組織の表面にわずかに切り口を作りその中にエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を埋め込んだ。同時に、ラットの片腎摘を行った。２週間後に、ラットを開腹した。【００３６】
エリスロポエチン産出オルガノイドは、大網内でさらに成長を続け、大網から血管系を進入していることが確認された（図１）。この成長は腎不全状態（片腎摘出術後）でも低下せず、逆にさらに加速することが示された（図１）。この成長したエリスロポエチン産出オルガノイドの組織的解析を図２に示した。エリスロポエチン産出オルガノイドの血管内には移植前には認められない赤血球が充満しており、組織学的にも血行が開通していることが示された。さらに大網に移植する前には確認できなった糸球体メサンギウム細胞（デスミン陽性）及び高度に分化した糸球体上皮細胞（WT-1及びシナプトポジン陽性細胞）が確認された。【００３７】
５）レシピエント由来の血管であるかの確認
上記血液が、ラット（レシピエント）の血管から供給されていることを確認するため、ラットの血管がLacZで青く染まるLacZラットの大網にエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体を移植した。【００３８】
肉眼的にも大網の血管が新たに形成されたエリスロポエチン産出オルガノイドに入り込んでいることが示され（図３の上図）、組織のLacZ染色により、このエリスロポエチン産出オルガノイド内の血管がレシピエント由来の青い細胞で形成されていることが示された（図３の下図）。電子顕微鏡にても糸球体血管内に赤血球が確認され、さらに高度に分化した糸球体上皮細胞の足突起や内皮細胞、メサンギウム細胞の構築が確認された（図４）。【００３９】
６）エリスロポエチン発現の確認
大網移植前のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体及び大網移植後のエリスロポエチン産出オルガノイドが、ヒトエリスロポエチンmRNAを発現しているかの確認をRT-PCRを用いて行った。さらに、大網移植後のエリスロポエチン産出オルガノイドがヒトエリスロポエチンを特異的に発現しているかを抗エリスロポエチン抗体と抗ヒトβ2 マイクログロブリン抗体を用いた２重染色によって確認した。実験の詳細は、以下の通りである。
−１：RT-PCＲを用いたmRNAの検出方法
全RNAをRNeasy  mini  kit(QIAGEN  GnbH,  Hilden  Germany)で抽出し、SuperScript  II  Reverse  Transcriptase(Life  Technologies  BRL,  Rockville,  MD)を使ってcDNAを、添付文書プロトコルに従って合成した。ヒトエリスロポエチン（human EPO：300bp）、ラットエリスロポエチン（rat EPO：112bp）、ヒトマイクログロブリン（hMG）、ラットGAPDH（rGAPDH）がPCR後の増幅産物について評価された。プライマー配列と反応条件は以下の通りである。
プライマー配列：
ヒトマイクログロブリンのセンス配列：caggtttact cacgtcatcc agc  （配列番号１）
ヒトマイクログロブリンのアンチセンス配列：tcacatggtt cacacggcag g  （配列番号２）
ラットGAPDHのセンス配列：catcaacgac cccttcatt  （配列番号３）
ラットGAPDHのアンチセンス配列：actccacgac atactcagca c  （配列番号４）
ヒトエリスロポエチンのセンス配列 ：tacgtagcct cacttcactg ctt  （配列番号５）
ヒトエリスロポエチンのアンチセンス配列：gcagaaagta tccgctgtga gtgttc  （配列番号６）
ラットエリスロポエチンのセンス配列：tctgg gagcc cagaa ggaag ccat  （配列番号７）
ラットエリスロポエチンのアンチセンス配列：ctgga gtgtc catgg gacag  （配列番号８）
反応条件：
ヒトマイクログロブリン及びラットＧＡＰＤＨの条件：９４℃  １０分の後、９４℃  １分、６６℃を４３サイクル、その後６６℃で１０分
ラットエリスロポエチンの条件：９５℃  １５分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ３０秒を４０サイクル、その後７２℃で１０分
ヒトエリスロポエチンの条件：９４℃  １０分の後、９４℃  １５秒  ６０℃  ３０秒  ７２℃  ４５秒を３０サイクル、その後７２℃で７分
−２：抗エリスロポエチン抗体と抗ヒトβ2 マイクログロブリン抗体を用いた２重染色方法
１０％ホルマリンで固定したパラフィン包埋組織を６μmに薄切した。キシレン及びエタノールで脱パラフィンした後、ＴＵＦ(Target Unmasking Fluid, MONOSAN社製)で抗原性の賦活化を行った。２種の一次抗体「ヤギ抗ヒトＥＰＯ抗体：SANTA CRUZ社製（ｘ２００で使用）とマウス抗ヒトβ2 マイクログロブリン抗体：PharMingen社製（ｘ４００で使用）」を４℃で一晩反応させた。マウスＩｇＧはMolecular Probes社製シグナル増幅キット（Alexa Fluor 568 Signal-Amplification kit for mouse antibody）にて検出、またヤギＩｇＧはビオチン化ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）と反応させた後、Molecular Probe社製Tyramide Signal Amplification Kitsを用いて発色させ、蛍光顕微鏡下でそれぞれを観察した。【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５の結果から、大網移植前のエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体では、エリスロポエチンmRNAを発現していないが、大網移植後のエリスロポエチン産出オルガノイドはエリスロポエチンmRNAを発現している（図５（１））。また、このエリスロポエチンmRNAはヒト由来の遺伝子配列であることが確認された（図５（２））。
抗エリスロポエチン抗体と抗ヒトβ2 マイクログロブリン抗体を用いた２重染色の結果を図６に示す。図６の結果から、エリスロポエチンが発現している箇所が染色されているので、免疫組織化学的検討でもエリスロポエチンの発現が確認できた（図６（１）、（２））。さらに、図６（３）では、エリスロポエチンは、図６（５）のヒト由来のマイクログロブリンと同じ位置で染色されていることを示している（図６（４）は、（３）と（５）を重ねたものである）。すなわち、大網移植後のエリスロポエチン産出オルガノイドは、宿主由来（ラット）のエリスロポエチンではなく、ヒトエリスロポエチンmRNAを特異的に発現していることが確認できた。
以上の結果により、移植したヒト間葉系幹細胞が、エリスロポエチン産出オルガノイドに分化していることが示された。【００４１】
７）エリスロポエチン産出オルガノイドのエリスロポエチン産出能及び産出調製能の確認
エリスロポエチン産出オルガノイドがエリスロポエチン産出能及び産出調製能を有するかを確認した。詳しくは、ラットをネンブタールで全身麻酔を行った後、下大静脈より体重の２％に相当する血液を急速に脱血し、同量の生理食塩水を急速に注射し貧血を惹起した。同時に両側の腎臓の切除及び上記３）で得られたエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体をラットの大網に移植した（図７のレーン２）。なお、コントロールとして、両腎臓摘出ラット（図７のレーン１：エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の移植なし）、正常ラット（図７のレーン３）を用意した。血液の一部はエリスロポエチン測定に使用した。２４時間後再度麻酔を行い心臓穿刺で採血し、エリスロポエチン濃度を測定した。エリスロポエチン濃度は三菱化学ヤトロン社製のＲＩＡキットを用いて測定した。以上の方法により、貧血前と貧血後の各ラットの血清エリスロポエチン濃度を測定した。【００４２】
貧血前と貧血後の各ラットの血清中エリスロポエチン濃度を測定した結果を図７に示す。両腎摘出後のラットはエリスロポエチンの上昇が認められなかった（図７のレーン１）が、大網内にエリスロポエチン産出オルガノイドを持つラットでは血清中のエリスロポエチン濃度が有意に上昇した（図７のレーン２）。このことは、エリスロポエチン産出オルガノイドがエリスロポエチンを産生できることを示している。また、大網内にエリスロポエチン産出オルガノイドを持つラットの貧血前の血清エリスロポエチン濃度は、正常ラットの貧血前の血清エリスロポエチン濃度と差が認められない。これは、エリスロポエチン産出オルガノイドは、定常状態（貧血がない状態）ではエリスロポエチン産生を抑制している（調製している）ことが示された。【００４３】
８）エリスロポエチン産出オルガノイドの貧血改善効果の確認
エリスロポエチン産出オルガノイドから産生されたエリスロポエチンが、実際に骨髄に作用し、貧血を改善することが可能であるか確認した。
７）で使用した両腎摘出モデルラットは、腎不全により約２日間で死亡するため貧血改善の程度を確認することができない。よって、ラット腎臓からのエリスロポエチン産生能を低下させるモデルを使用した。詳しくは、以下の通りである。
ラットに抗糸球体基底膜抗体を注射し、急性腎炎を惹起した。２週間後に片腎摘出を行った（エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体はこの時点で大網に移植した）。これにより、腎臓からのエリスロポエチン産出能は著しく低下するため、貧血の改善が遅れる。そこで、この遅れが、エリスロポエチン産出オルガノイドが産出するエリスロポエチンによって正常化できるか確認をした。さらに２週間後に、上記７）と同様に脱血による貧血を惹起し、経時的に採血を行い血液中のヘモグロビン値を測定し、エリスロポエチン産出オルガノイドの有無による貧血の改善度を比較した。なお、Ｈｂの測定はi-statキットを用いた。ラットの処置は以下の通りである。
１．ラットに抗基底膜抗体を投与し腎炎を惹起、２週間後に片腎摘出を行った（図８中の■：エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の移植なし）。
２．ラットに抗基底膜抗体を投与し腎炎を惹起、２週間後に片腎摘出を行った（図８中の◆：エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の移植あり）。
３．ラットに抗基底膜抗体を投与し腎炎を惹起した。（図８中の▲：腎摘出及びエリスロポエチン産出オルガノイド前駆体の移植なし：正常ラット）。【００４４】
エリスロポエチン産出オルガノイドの貧血改善効果の結果を図８に示す。片腎摘ラット（エリスロポエチン産出オルガノイド前駆体移植なし）は、正常ラットと比較し、貧血からの改善が有意に遅れたことが示された（図８の■）。しかし、エリスロポエチン産出オルガノイドを大網に持ったラットは、片腎摘出されているにもかかわらず、正常ラットとほぼ同じ経過で貧血から改善していることが確認できた（図８の◆）。このことは、大網内のエリスロポエチン産出オルガノイドから産生されたエリスロポエチンが貧血を改善する効果を発揮したことを示す。【００４５】
以上の結果により、骨髄由来間葉系幹細胞より前述の特徴を持ったエリスロポエチン産生オルガノイドを患者の体内（大網）で製造することが可能であり、かつエリスロポエチン産生オルガノイドは貧血改善効果を示すことができる。【００４６】
９）ポリマーによるGDNFの間葉系幹細胞導入の確認
実施例１に記載のヒトGDNFcDNA（AxCAhGDNF）を有する複製欠損組み換え型アデノウイルスを使用しての間葉系幹細胞でのGDNF発現の代わりに、GDNF含有ポリマーと混和することによりGDNF徐放が可能であるかの確認を行った。【００４７】
−１：COS-1細胞を用いたGDNFの徐放の確認
COS-1細胞に組換えGDNFを感染させた培養上清を市販のメビオールゲルに溶かした。次に、0〜24時間、24〜48時間及び48〜72時間の間に溶出するGDNFをウェスタンブロットで確認した（図９）。なお、図９中の一番右の「hMSCs」はアデノウイルスを用いてGDNFを導入したヒト間葉系幹細胞からの培養上清のコントロールを示す。
図９では、48〜72時間の間でも十分な量のGDNFが溶出していることが確認できた。以上により、メビオールゲルに溶かしたGDNFは徐放が可能である。【００４８】
−２：GDNFの間葉系幹細胞での徐放の確認
LacZ遺伝子導入したヒト間葉系幹細胞をGDNF含有メビオールゲル（4℃）と混和しラット胚（E11.5）の腎臓形成部位に注入し、24時間全胚培養を行い、さらに、６日間の器官培養を行った（図10（1））。また、コントロールとして、アデノウイルスによりGDNF遺伝子導入したヒト間葉系幹細胞（図なし）及びGDNF遺伝子を導入していないヒト間葉系幹細胞（図10（2））をラット胚（E11.5）の腎臓形成部位に注入し、24時間全胚培養を行い、さらに、６日間の器官培養を行った。次に、X-gal染色によりLacZ陽性部分を確認した（図10）。
図10（1）では、GDNF遺伝子を導入していないヒト間葉系幹細胞（図10（2））と比較して、GDNF徐放によりヒト間葉系幹細胞由来部分（図中の青）が広く染色されていた。また、アデノウイルスを使用したGDNF遺伝子導入ヒト間葉系幹細胞と比較して、同等程度が染色されていた（図なし）。
以上により、遺伝子導入のためにアデノウイルスを使用することなく、GDNF含有ポリマー特にメビオールゲルによってGDNFの徐放が可能となり、このゲルとヒト間葉系幹細胞を混和、注入することによりヒト由来部分の拡大が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、エリスロポエチン関連疾患の治療方法の新たな展開を可能とし、例えば高額なリコンビナントタンパク質の投与を受けているようなレシピエント（患者）は、自身の間葉系幹細胞を分取し、これを妊娠宿主動物に移植し、一定成長後に自身の大網に移植すれば、長期間継続可能なエリスロポエチン産出機能及び産出調製機能を担持したオルガノイドの製造が達成出来る。
【図１】
2008004598.tif 000002
【図２】
2008004598.tif 000003
【図３】
2008004598.tif 000004
【図４】
2008004598.tif 000005
【図５】
2008004598.tif 000006
【図６】
2008004598.tif 000007
【図７】
2008004598.tif 000008
【図８】
2008004598.tif 000009
【図９】
2008004598.tif 000010
【図１０】
2008004598.tif 000011
【配列表】
2008004598000001.app
【国際調査報告】
2008004598.tif 000012
2008004598.tif 000013
2008004598.tif 000014
2008004598.tif 000015
2008004598.tif 000016
2008004598.tif 000017
2008004598.tif 000018