(57)【要約】  より簡便に採取可能な検体、例えば血液、正常組織を用いることにより、ゲフィチニブに代表される固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法及び検査キットを提供する。  癌患者の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子又はＨＬＡ−ＤＱα１抗原の発現量を測定し、当該発現量に応じて感受性を検査する。
2007099852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法であり、被検者由来の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子又はＨＬＡ−ＤＱα１抗原により感受性を検査する方法。
【請求項２】
被検者由来の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子又はＨＬＡ−ＤＱα１抗原の発現量を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
チロシンキナーゼ阻害剤が上皮成長因子受容体阻害剤である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上皮成長因子受容体阻害剤が、ゲフィチニブ（イレッサＴＭ）、エルロチニブ（タルセバＴＭ）、ＺＤ６４７４（ザクティマＴＭ）又はラパチニブ（lapatinib）である請求項３記載の方法。
【請求項５】
被検者由来の試料が血液試料である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血液試料が被検者由来の血液から分離された末梢血単核球である請求項５記載の方法。
【請求項７】
固形癌が肺癌である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量を測定する請求項２記載の方法。
【請求項９】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを含む固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性の検査キット。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法において使用するための、ＨＬＡ−ＤＱα１抗原に対する抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体を含む固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性の検査キット。
【請求項１２】
チロシンキナーゼ阻害剤を含有し、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性があると判定された癌患者に適用するための固形癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は本邦の悪性腫瘍による臓器別の死因の第１位であり、肺癌による死亡数は年々増加しつつある。非小細胞肺癌は肺癌のうち約９０％を占める。その治療法として、外科的に切除可能な症例は約３分の１に過ぎず、残りの約３分の２は局所進行もしくは転移性の進行肺癌として発見される。早期発見・早期治療が重要であることはいうまでもないが、近年の画像診断技術の進歩をもってしても早期肺癌の比率は増加したとはいいがたく、進行肺癌の治療を進歩させる必要性が叫ばれている。細胞毒性を有する従来の抗癌剤は転移性肺癌に対して明らかな延命効果と、肺癌による症状を改善する効果を持つが、その成績は頭打ちであり、新しい治療戦略が必要とされてきた。【０００３】
ゲフィチニブ（イレッサＴＭ）は上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor, ＥＧＦＲ）の阻害剤として開発され、新しい作用機序を持つ肺癌治療薬として２００２年に世界に先立ち本邦で始めて市販された。ゲフィチニブはある特定の症例には劇的な効果をもたらすが、薬剤性の急性肺障害を起こす症例もあり、社会問題にもなったことは記憶にも新しい。更に、本剤は１）女性、２）腺癌、３）非喫煙者、４）日本人をはじめとする東洋人に有用性が高いことが報告されている。【０００４】
ゲフィチニブ以外のチロシンキナーゼ阻害剤、特に上皮成長因子受容体阻害剤もゲフィチニブと同様の問題がある。【０００５】
したがって、チロシンキナーゼ阻害剤をより有効に臨床応用するには適切な症例選択が必要である。現在までにゲフィチニブの抗腫瘍効果規定因子として肺癌腫瘍組織におけるＥＧＦＲ遺伝子変異が報告されている（非特許文献１）。また腫瘍細胞のＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現症例もゲフィチニブをはじめとするＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍効果の規定因子として重要であることが示唆されている（非特許文献２）。【０００６】
しかしながら、進行した非小細胞肺癌でこれらの遺伝子検査に耐えうるような十分な腫瘍組織を採取することは容易ではない。本発明者らもこれらの解析を試みたが実際に解析しえた症例は約４０％に過ぎなかった。
【非特許文献１】N Engl J Med. 2004; 350(21): 2129-2139
【非特許文献２】J Natl Cancer Inst. 2005; 97(9): 643-655
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、より簡便に採取可能な検体、例えば血液、正常組織を用いることにより、固形癌のゲフィチニブに代表されるチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法及び検査キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は以下のとおりである。【０００９】
（１）  固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法であり、被検者
由来の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子又はＨＬＡ−ＤＱα１抗原により感受性を検査する方法。【００１０】
（２）  被検者由来の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子又はＨＬＡ−ＤＱα１抗原の発現量を測定することを含む前記（１）記載の方法。【００１１】
（３）  チロシンキナーゼ阻害剤が上皮成長因子受容体阻害剤である前記（１）又は（２）記載の方法。【００１２】
（４）  上皮成長因子受容体阻害剤が、ゲフィチニブ（イレッサＴＭ）、エルロチニブ（タルセバＴＭ）、ＺＤ６４７４（ザクティマＴＭ）又はラパチニブ（lapatinib）である前記（３）記載の方法。【００１３】
（５）  被検者由来の試料が血液試料である前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。【００１４】
（６）  血液試料が被検者由来の血液から分離された末梢血単核球である前記（５）記載の方法。【００１５】
（７）  固形癌が肺癌である前記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。【００１６】
（８）  ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量を測定する前記（２）記載の方法。【００１７】
（９）  ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを含む固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性の検査キット。【００１８】
（１０）  前記（２）に記載の方法において使用するための、ＨＬＡ−ＤＱα１抗原に対する抗体。【００１９】
（１１）  前記（１０）に記載の抗体を含む固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性の検査キット。【００２０】
（１２）  チロシンキナーゼ阻害剤を含有し、前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の方法により固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性があると判定された癌患者に適用するための固形癌治療剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する方法及び検査キットを提供することができ、適切な固形癌治療法を選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の対象となる固形癌としては、特に制限はなく、例えば、肺癌（例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌）、乳癌、頭頸部癌、中皮腫、大腸癌、卵巣癌が挙げられる。【００２３】
本発明のＨＬＡ遺伝子とは、ＨＬＡをコードするＤＮＡ，当該ＤＮＡを転写したｍＲＮＡを含む。【００２４】
固形癌の診断は、通常の方法により行うことができ、例えば、肺癌の診断は、画像診断（Computed tomography, ＣＴ）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）、喀痰細胞診、経気管支肺生検、経皮的肺生検などから行われる。【００２５】
本発明者らは、ゲフィチニブに代表されるチロシンキナーゼ阻害剤を投与された固形癌症例のうち、治療に奏効した症例（partial response, ＰＲ）では、不変であった症例及び増悪した症例（stable disease, ＳＤ及びprogressive disease, ＰＤ）に比較して、末梢血単核球に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量が有意に高いことを見出した。【００２６】
したがって、被検者由来の試料中のＨＬＡ−ＤＱα１抗原又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量を測定し、高値を示した被検者についてはチロシンキナーゼ阻害剤の投与により治療を行い、一方、低値を示した被検者については他の治療法、例えば細胞毒性を有する抗癌剤治療(例えば、シスプラチンなど)を行えば、より適切な固形癌治療が可能になる。【００２７】
前記被検者としては、固形癌患者、前癌症状の患者、自覚症状、各種検査で癌と疑われる患者が挙げられる。【００２８】
前記試料としては、血液試料、例えば血液から分離された末梢血単核球の他、口腔粘膜、毛髪等の正常組織から分離された試料を用いることができる。【００２９】
ＨＬＡ−ＤＱα１抗原又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を解析・測定する手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、バイオアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、免疫凝集法、蛍光抗体法、電気泳動法、ＤＮＡマイクロアレイ法又は定量的ＲＴ（reverse transcriptase）−ＰＣＲ法を用いた遺伝子解析が挙げられ、好ましくはＤＮＡマイクロアレイ法を用いた遺伝子解析が挙げられる。また、ＨＬＡ−ＤＱα１抗原測定用の抗体としては、例えば、ＨＬＡ−ＤＱα１抗原を特異的に認識する抗体、又はＨＬＡ−ＤＱ全体を認識する抗体とＨＬＡ−ＤＱα１抗原を認識しない抗体との組み合わせが挙げられる。【００３０】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量を測定する手法としては、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。【００３１】
ＨＬＡ−ＤＱα１抗原又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量の単位及び測定値は、用いる測定方法により異なるが、いずれの測定方法においても、ゲフィチニブに代表されるチロシンキナーゼ阻害剤を投与した固形癌症例について、通常１０症例以上、好ましくは２０症例以上のデータを集め、各症例のチロシンキナーゼ阻害剤の効果とＨＬＡ−ＤＱα1抗原又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量の相関より例えば奏効率が８０％となるように発現量のCut off値を定めて、当該cut off値よりも高値を示す患者は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与により治療を行い、当該cut off値よりも低値を示す患者は、他の治療法により治療を行うことにより効果的な固形癌治療が可能になる。前記のcut off値を上げるに従い、チロシンキナーゼ阻害剤による治療対象は減少するが、チロシンキナーゼ阻害剤による治療の有効率は向上する。cut off値の決定は同種の癌ごとに行うことが好ましい。また、固形癌症例の背景因子や個体差等を考慮してバイアスが少なくなるように測定した上で、cut off値を定めることが好ましい。【００３２】
例えば、ＤＮＡマイクロアレイを用いることにより測定されたＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現値を指標する場合には、発現値３，０００をcut off値として、発現値が３，０００以上の患者は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与により治療を行い、発現値が３，０００未満の患者は、他の治療法により治療を行うことにより効果的な肺癌治療が可能になる。【００３３】
また、ゲフィチニブに代表されるチロシンキナーゼ阻害剤を投与された肺癌症例のうち、治療に奏効した症例（partial response, ＰＲ）では、不変であった症例及び増悪した症例（stable disease, ＳＤ及びprogressive disease, ＰＤ）に比較して、末梢血単核球に含まれるＣ２ｏｒｆ３３、ＧＬＳ、ＫＩＡＡ１１１７、ＡＬＤＨ６Ａ１、ＰＤＣＤ５及びＤＫＦＺｐ７６１Ａ０７８の発現量は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子とは逆に、低値を示す傾向にあるので、これらの遺伝子の発現量も併せて指標とすれば、より精度が向上する。【００３４】
本発明の対象となるチロシンキナーゼ阻害剤としては、好ましくは上皮成長因子受容体阻害剤、例えばゲフィチニブ（イレッサＴＭ）、エルロチニブ（タルセバＴＭ）、ＺＤ６４７４（ザクティマＴＭ）、ラパチニブ（lapatinib）などが挙げられる。【００３５】
これらのチロシンキナーゼ阻害剤の用法・用量は、それぞれの一般的な用法・用量に従えばよく、例えばゲフィチニブ（イレッサＴＭ）の場合、通常、成人にはゲフィチニブとして２５０ｍｇを１日１回、経口投与する。【００３６】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与前に、本発明の検査方法を実施して、その結果、固形癌がチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性があると判定された癌患者のみをチロシンキナーゼ阻害剤による治療対象とすることにより、有効率が増加し、副作用の発生数を減少させることができる。【００３７】
また、チロシンキナーゼ阻害剤の添付文書等の製品説明書に、投与前に本発明の検査方法を実施し、その結果、感受性があると判定された癌患者にのみ投与することを推奨する旨を表示することにより、有効率が増加し、副作用の発生率を減少させることができる。【００３８】
ＨＬＡ−ＤＱα１抗原の発現量の測定を、ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロット法を用いて定量する場合には、ＨＬＡ−ＤＱα１抗原に対する抗体を含む検査キットが用いられる。【００３９】
前記免疫測定キットは、例えば、標識抗体を含有する緩衝液（標識抗体液）、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、更に必要に応じて、サンドイッチ法で検体と固相化抗体を反応させるための緩衝液、酵素反応のための発色液や反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。【００４０】
固相法に基づくキットの場合、固相の種類や形状は問わない。公知の通常免疫測定キットに使われるものでよい。固相の例としてはプラスチック試験管、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレンマイクロプレート、ポリエチレンテレフタレートマイクロプレート、ポリ塩化ビニルマイクロプレート、磁性粒子、ガラスビーズ、セルロース粒子、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙、ナイロン膜などが挙げられる。イムノクロマトグラフィーなどを原理とする簡易測定キットの試験片を使用することも可能である。【００４１】
固形癌のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を検査する検査キットであり、癌患者の試料中に含まれるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子により感受性を検査するキットとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的なプライマーの対と、遺伝子増幅を行うために必要とされる試薬とを含むキットが挙げられる。【００４２】
前記の検査キットは、好ましくは、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー又はＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを含む。前記少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば配列番号１〜１１に示したものから選択することができ、前記ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブとしては、例えば配列番号１〜１１に示したものが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】抗腫瘍効果別にみた各遺伝子の平均発現値を示す図である。
【図２】抗腫瘍効果別によるＨＬＡ−ＤＱＡ１発現値を示す図である。
【図３】ＨＬＡ−ＤＱＡ１レベルによる生存解析の結果を示す図である。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。【００４５】
（実施例１）
１．症例と方法
今回検討したのは金沢大学医学部附属病院呼吸器内科でゲフィチニブを投与された非小細胞肺癌症例である。治療に先立ち、病名や他の治療法、予後などについて説明し、更に末梢血単核球を用いた検討を行うことに同意を得た症例を対象とした。【００４６】
末梢血単核球は治療前に採血し、直ちに比重遠心法を用いて、単核球を分離した。分離した単核球からＲＮＡを既法（T-L. Fongら, J. Clin. Invest., 88, 1058, 1991）に従って抽出し、逆転写酵素を用いてＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、Affymetrix社製ＤＮＡマイクロアレイ（HG-U133 Plus 2.0）を用いて約５５０００の遺伝子を網羅的に解析した。解析可能であった２４症例を、治療に奏効した症例（partial response, ＰＲ）と、不変であった症例及び増悪した症例（stable disease, ＳＤ及びprogressive disease, ＰＤ）とに分類し、ｔテストで統計解析した。有意水準は０．００１未満とした。【００４７】
２．結果
１）解析した２４症例中８例がＰＲ、１６例がＳＤ及びＰＤ（ＳＤ／ＰＤ）と判定した。網羅的遺伝子解析の発現結果と抗腫瘍効果との相関を解析した。その結果、７遺伝子で抗腫瘍効果と相関が得られた（表１、図１）。７つの遺伝子のうちＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子以外は発現量が少なくＤＮＡマイクロアレイの検出限界以下と判断した。そこで、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子に注目し、更に解析を行った。
【表１】
2007099852.tif 000003
【００４８】
２）ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の検討
発現量の高かったＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の平均発現値はＳＤ／ＰＤ群で１３７４．６（２５９．０〜２９２８．６）、ＰＲ群で３４９３．３（２７９７．７〜４５３２．２）であった（表１、図２）。その結果から、発現値の３，０００をcut off値に定めて２群に分けて検討した。その場合、ＰＲの感度は７５％、特異度は１００％であった（表２）。発現値３，０００以上と未満の２群で生存分析を行った場合、無再発生存期間（図３Ａ）、全生存期間（図３Ｂ）ともに有意に発現値３，０００以上の群で延長していた。【００４９】
これらのことより、ＨＬＡ−ＤＱＡ１発現レベルはゲフィチニブの肺癌に対する有効性の予測因子となりうると結論付けた。
【表２】
2007099852.tif 000004
【００５０】
３．考察
現在のところ、ゲフィチニブ投与患者における感受性予測因子として確立したものはない。前記のごとくＥＧＦＲ遺伝子変異や遺伝子増幅は感受性予測因子となりうる可能性は高いが実際の臨床現場においては、その手技の複雑さから標準的な手法とはなりえない。また肺癌の腫瘍組織は採取が困難である。進行肺癌の症例では診断のため気管支鏡を用いた組織採取が行われるが、採取可能な組織は極めて少量（１〜３ｍｍ大）であり、また採取された組織は腫瘍以外の間質（血管や支持組織）を含むため、腫瘍組織の解析は困難を極めるのが現状である。またこれらの組織すら採取できないこともまれではない。今回本発明者らが行った末梢血単核球を用いた検討は、特別な設備を要することなくどこでも採取可能であるというメリットがある。【００５１】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１とゲフィチニブ感受性に関して報告されたものはない。ＨＬＡ遺伝子発現と悪性腫瘍に関しても報告は多くないが、ゲフィチニブが東洋人に有効性が高いことを考えると、ＨＬＡ遺伝子との関連は興味深いと考える。投与前に感受性を予測できることは、ゲフィチニブ投与に適した患者を選択できることになり、ゲフィチニブの治療を安全で有効に行うことにつながる。本方法は末梢血を用いるため、検体の採取が安全かつ容易であり対象患者の負担は少ない。また、エルロチニブ（タルセバＴＭ）、ＺＤ６４７４（ザクティマＴＭ）、ラパチニブ（lapatinib）など、同様の作用機序を有する小分子化合物（チロシンキナーゼ阻害剤、特に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤）の治療効果予測にも適用できる。ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の発現量が高いことから、本遺伝子産物（ＨＬＡ−ＤＱα１抗原）レベルでの解析も可能である。【００５２】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、固形癌の癌治療薬に対する感受性を検査する方法及び検査キットとして有用である。
【図１】
2007099852.tif 000005
【図２】
2007099852.tif 000006
【図３】
2007099852.tif 000007
【配列表】
2007099852000001.app
【国際調査報告】
2007099852.tif 000008
2007099852.tif 000009
2007099852.tif 000010
2007099852.tif 000011
2007099852.tif 000012
2007099852.tif 000013
2007099852.tif 000014
2007099852.tif 000015
2007099852.tif 000016