(57)【要約】  簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の５−メチルシトシン検出法および検出キットを実現する。塩基のメチル化の有無を検出することができない従来のインベーダー法を改変し、標的ＤＮＡ中の５−メチルシトシン部位を選択的に切断する方法と組み合わせる。具体的には標的ＤＮＡ中の５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、５’断片を得る。当該５’断片とハイブリダイズし得るＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを用いて酵素反応を行い、蛍光を検出する。
2007111324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡの当該５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片を取得する工程（１）；
上記ＤＮＡ断片、または上記ＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる工程（２）；および
反応混合物の蛍光を検出する工程（３）
を包含することを特徴とする遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項２】
上記工程（１）において、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項３】
上記光機能性核酸が、次に示す一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’      …（１）
（ただし、一般式（１）中、ＡおよびＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
によって表されることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項４】
上記一般式（１）中のＺが、次の化学式（２）〜（６）
【化１】
2007111324.tif 000022
【化２】
2007111324.tif 000023
【化３】
2007111324.tif 000024
【化４】
2007111324.tif 000025
【化５】
2007111324.tif 000026
（ただし、上記の化学式（２）〜（６）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。）
の何れか１つによって表されることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項５】
上記一般式（１）中のＺが、上記化学式（２）によって表されることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項６】
上記光機能性核酸が、標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつ、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置に上記ナフトキノンが挿入されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする遺伝子中の５−メチルシトシン検出キット。
（ａ）標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつ、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置にナフトキノンが挿入されている光機能性核酸
（ｂ）標的ＤＮＡ中に存在する検出対象の５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブ
（ｃ）フラップエンドヌクレアーゼ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法および検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子中のシトシンのメチル化はＤＮＡとタンパク質との相互作用を変化させ、遺伝子発現を制御していることが知られている。このため、遺伝子中の５−メチルシトシン部位を検出することは遺伝子解析を行う上で非常に重要であり、現在までに様々な検出法が開発されてきた。【０００３】
既存の５−メチルシトシン塩基の検出システムとしては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法、重亜硫酸ナトリウム処理を伴うＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体と酵素処理を用いる方法などがこれまでに報告されている（非特許文献１〜４）。【０００４】
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法では、ＤＮＡをヒドラジンで処理することにより、ＤＮＡのシトシン塩基に選択的に損傷を与える。このとき、メチル化されていないシトシンはヒドラジン処理によって切断され、一方、メチル化されたシトシンはヒドラジン処理によって切断されない。よって、ヒドラジン処理をしたＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で解析すると、シトシンのメチル化／非メチル化を、切断によって生じるバンドの有無によって検出することができる。【０００５】
しかしながら、このＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学修飾法の場合、５−メチルシトシンの存在は、ＰＡＧＥ上での切断バンドの欠損として検出される。このため、メチル化が部分的にでも非特異的に切断されるとバックグラウンドの切断バンドが表れてしまい、５−メチルシトシンの存在を判定できなくなるという問題が度々生じてしまう。【０００６】
また、ＭＳＰ法は、重亜硫酸ナトリウムに対する５−メチルシトシンと非メチルシトシンとの反応性の違いを利用したものである。この方法では、ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理する。その結果、ＤＮＡ中の非メチルシトシンは脱アミノ化されウラシルへと変換されるが、５−メチルシトシンは反応性が低いため脱アミノ化されずにそのまま残る。その後、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うと、もともとシトシンであった部位はチミン（ウラシル）として増幅され、一方、５−メチルシトシンはシトシンとして増幅される。よって、増幅されたサンプルをシークエンシングすると、本来５−メチルシトシンであった部分はシトシンとして検出され、非メチルシトシンであった部分はチミンとして検出される。これにより、シトシンのメチル化／非メチル化を判定することができる。【０００７】
しかしながら、この方法では、重亜硫酸ナトリウム処理に通常２０〜４０時間を要し、検出に時間がかかる点が問題となっている。【０００８】
また、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を用いる方法では、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を制限酵素で処理することにより、ＤＮＡ中の５−メチルシトシンを検出する。しかしながら、制限酵素による処理を用いるため、制限酵素が認識する配列のみにしか適用できないという問題があった。また、５−メチルシトシンの検出は蛍光の消失によって検出されるため、度々バックグラウンドの問題が生じてしまう。【０００９】
これらのことから、簡便で一般的な他の５−メチルシトシン検出法の開発が大きな研究課題になっている。【００１０】
ところで、ビタミンＫ３として知られる２−メチル−１，４−ナフトキノンは光酸化剤として機能し、各種核酸塩基を一電子酸化することが報告されている（非特許文献５）。具体的には、ナフトキノン存在下では、紫外線照射により５−メチル−２’−デオキシシチジンが５−ホルミル−２’−デオキシシチジンや５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンなどの酸化体に変換されることが報告されている。【００１１】
ナフトキノンの有するこのような特性に着目し、本願発明者らは、ナフトキノンの光化学反応特性を応用し、５−メチルシトシンの検出が可能であることを報告している（非特許文献６、７）。この方法によれば、上述の各検出方法が有している問題を解消することができる。【００１２】
この方法では、５−メチルシトシンの検出対象となるＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡオリゴマーの末端部分または中央部にナフトキノンを導入し、修飾ＤＮＡオリゴマーを合成し、この修飾ＤＮＡオリゴマーを対象ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。そして、ハイブリダイゼーションした二本鎖ＤＮＡに光照射を行う。このとき、５−メチルシトシンはナフトキノンの光酸化によって切断され、一方、非メチルシトシンは切断されない。よって、光照射した後の二本鎖ＤＮＡをＰＡＧＥにより解析することによって、５−メチルシトシンの存在を、切断バンドとして検出することができる。【００１３】
一方、インベーダー法（米国  Ｔｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、遺伝子増幅の必要がなく、迅速、低コストで遺伝子変異を検出できる方法として知られており、一塩基多型の解析に広く利用されている（特許文献１、非特許文献８）。
【特許文献１】特表２００１−５２６５２６号公報（平成１３年１２月１８日公表）
【非特許文献１】Church, G. M., Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 1991.
【非特許文献２】Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Gigge, G. W., Molloy, P. L., Paul, C. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 1827.
【非特許文献３】Herman, H. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9821.
【非特許文献４】Okamoto, A., Tanabe, K., Satio, I. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10262.
【非特許文献５】Douki, T., Cadet, J. Int. J. Radiat. Biol. 1999, 75, 571.
【非特許文献６】Yamada, H., Tanabe, K., Nishimoto, S. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 665
【非特許文献７】Yamada, H., Tanabe, K., Nishimoto, S. Nucleic Acids Symposium Series 2005, No.49,149-150
【非特許文献８】Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17 (3) 292-296 (1999)
【発明の開示】
【００１４】
しかしながら、本願発明者らが開発した、ナフトキノンを利用した５−メチルシトシンの検出方法は、５−メチルシトシンの存在を、ＤＮＡ断片としてＰＡＧＥにより解析しなければならず、検出感度、並びに検出操作の煩雑さ、所要時間およびコストの面で課題を有している。すなわち、より簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の５−メチルシトシン検出法への改良が期待されている。
【００１５】
一方、遺伝子変異、特に一塩基多型の検出に広く利用されているインベーダー法では、その原理から塩基のメチル化の有無を検出することはできない。すなわち、メチル化の有無に関わらず、相補的な塩基と対合するからである。
【００１６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子中の５−メチルシトシンの検出に適用できるようにインベーダー法を改変し、簡便、短時間、低コスト、かつ高感度の５−メチルシトシン検出法を実現することにある。
【００１７】
本発明に係る遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法は、検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡの当該５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片を取得する工程（１）；上記ＤＮＡ断片、または上記ＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる工程（２）；および反応混合物の蛍光を検出する工程（３）を包含することを特徴としている。
【００１８】
上記工程（１）において、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いることが好ましい。ここで、「光機能性核酸」とは、５−メチルシトシン検出用の核酸で、かつ、外部から光を照射することによりナフトキノンが５−メチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。
【００１９】
上記光機能性核酸は、次に示す一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’      …（１）
（ただし、一般式（１）中、ＡおよびＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
によって表されることが好ましい。
【００２０】
また、上記一般式（１）中のＺが、次の化学式（２）〜（６）
【００２１】
【化１】
2007111324.tif 000003
【００２２】
【化２】
2007111324.tif 000004
【００２３】
【化３】
2007111324.tif 000005
【００２４】
【化４】
2007111324.tif 000006
【００２５】
【化５】
2007111324.tif 000007
（ただし、上記の化学式（２）〜（６）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。）
の何れか１つによって表されることが好ましく、化学式（２）によって表されることがより好ましい。
【００２６】
また、上記光機能性核酸は、標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつ、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置に上記ナフトキノンが挿入されていることが好ましい。
【００２７】
本発明に係るキットは、遺伝子中の５−メチルシトシンを検出するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴としている。
（ａ）標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつ、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置にナフトキノンが挿入されている光機能性核酸
（ｂ）標的ＤＮＡ中に存在する検出対象の５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブ
（ｃ）フラップエンドヌクレアーゼ。
【００２８】
本発明に係る方法は、５−メチルシトシンの存在を蛍光により検出できるものである。それゆえ、煩雑な操作を必要とせず、簡便かつ低コストで５−メチルシトシンを検出できるという効果を奏する。また、標的ＤＮＡの切断により生じるＤＮＡ断片量より多くの蛍光分子が遊離するので、サンプル中の標的遺伝子が少量であっても増幅検出が可能であるという効果を奏する。また、従来法では、検出までに数日を要したが、本発明に係る方法を用いれば、数時間程度で５−メチルシトシンを検出できるという効果を奏する。
【００２９】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る方法の原理を示す模式図である。
【図２】ナフトキノンのヒドラジン誘導体の合成方法を示す図である。
【図３】実施例で使用したＦＲＥＴプローブを示す図である。
【図４（Ａ）】標的ＤＮＡ（ＯＤＮ１）から目的の５’断片が生成していることを確認した、光照射およびピペリジン処理を行った反応液のＨＰＬＣプロフィールである。
【図４（Ｂ）】標的ＤＮＡ（ＯＤＮ１）から目的の５’断片が生成していることを確認した、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートである。
【図５】本発明に係る方法により標的ＤＮＡ中の５−メチルシトシンを検出できたことを示す蛍光スペクトルチャートである。
【図６】本発明に係る方法において、光照射を行わない場合、および、ピペリジン処理を行わない場合には蛍光発光が観測されないことを示す蛍光スペクトルチャートである。
【図７】本発明に係る方法において、標的ＤＮＡから生成する５’断片の相補配列を有しないプローブオリゴマー（ＦＲＥＴプローブ）を用いた場合には蛍光発光が観測されないことを示す蛍光スペクトルチャートである。
【図８】本発明に係る方法における検出限界を検討した結果を示す蛍光スペクトルチャートである。
【図９（Ａ）】本発明に係る方法において、標的ＤＮＡにＯＤＮ２を用い、光照射０時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９（Ｂ）】本発明に係る方法において、標的ＤＮＡにＯＤＮ２を用い、光照射２時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９（Ｃ）】本発明に係る方法において、標的ＤＮＡにＯＤＮ１を用い、光照射０時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９（Ｄ）】本発明に係る方法において、標的ＤＮＡにＯＤＮ１を用い、光照射２時間の結果を示す蛍光顕微鏡写真であり、５−メチルシトシン検出シグナルを蛍光顕微鏡により可視化し得ることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。【００３２】
１．５−メチルシトシン検出方法
本発明に係る遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法は、以下の（１）〜（３）の工程を包含するものであればよい。
工程（１）：検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡの当該５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片を取得する。
工程（２）：上記ＤＮＡ断片、または上記ＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる。
工程（３）：反応混合物の蛍光を検出する。
本発明に係る遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法の概略を図１に示した。以下、各工程について詳細に説明する。【００３３】
〔工程（１）〕
工程（１）では、検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡの当該５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片を取得する。このようなＤＮＡ断片を取得する方法としては、例えば、本発明者らが開発したポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法（非特許文献６、７を参照）、四酸化オスミウムによる酸化反応を用いる方法（Okamoto, A., Tainaka, K. Nucleic Acids Symposium Series No.49,45-46, 2005）などを挙げることができる。中でも、反応試薬に毒劇物を用いないことから、本発明者らが開発したポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法が好ましい。【００３４】
以下、ポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有する光機能性核酸を用いる方法を例に挙げて説明する。【００３５】
光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖と、このポリヌクレオチド鎖内部にナフトキノンを有している。光機能性核酸は、ポリヌクレオチド鎖部分によって、検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。また、ハイブリダイズした光機能性核酸および標的ＤＮＡに対して光照射を行うと、標的ＤＮＡにおける、光機能性核酸の近傍のシトシンがメチル化されている場合は、ナフトキノンによって５−メチルシトシン部分でＤＮＡ鎖が切断され、一方、シトシンがメチル化されていない場合は切断されない。【００３６】
本明細書において「光機能性」とは、上述したように、外部から光を照射することによって、ナフトキノンが５−メチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有していることを指す。従って、本明細書において「光機能性核酸」とは、外部から光を照射することによりナフトキノンが５−メチルシトシンに対して酸化的切断を起こす機能を有している核酸のことを指す。【００３７】
また、本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。【００３８】
また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、ＤＮＡの形態の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。また、ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの結合数は２個以上であればいくつでもよい。ポリヌクレオチドは、化学合成したものであってもよいし、自然環境から抽出したものであってもよい。【００３９】
また、「ポリヌクレオチド鎖内部」とは、ポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドを指す。【００４０】
本明細書において、「ナフトキノン」とは、下記の化学式【００４１】
【化６】
2007111324.tif 000008
によって表されるナフトキノン構造を有する化合物を指し、本発明に係る光機能性核酸は上記何れかのナフトキノン構造を含んでいればよい。なお、光機能性核酸が含むナフトキノンとしては、１，４−ナフトキノン、１，２−ナフトキノンに限定されるものではなく、それぞれのナフトキノンに置換基が導入された誘導体であってもよい。このような誘導体としては、例えばビタミンＫ３として知られる２−メチル−１，４−ナフトキノンや、その２位のメチル基を他のアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、またはアミノ基に置換したものなどが挙げられる。さらに、芳香環上に、各種置換基（電子供与基としてアルキル基、アミノ基、アルコキシ基、若しくはヒドロキシ基等；または電子吸引基としてニトロ基、若しくはハロゲン基等）が導入されていてもよい。本明細書では、以下、これらの誘導体を含むナフトキノン構造を有する化合物を単にナフトキノンという。【００４２】
ナフトキノンは、ポリヌクレオチド鎖の末端（５’末端または３’末端）に有していてもよく、両末端以外の部分、すなわち「ポリヌクレオチド鎖内部」に有していてもよい。ナフトキノンの可動範囲が限定され、非特異的なグアニン連続配列の酸化的切断を抑制するという観点から、「ポリヌクレオチド鎖内部」にナフトキノンを有していることが好ましい。なお、光機能性核酸は、ヌクレオチドにナフトキノンが付加された化合物であってもよいし、あるいは、ヌクレオチドがナフトキノンによって置換されたものであってもよい。【００４３】
ポリヌクレオチド鎖内部のヌクレオチドがナフトキノンによって置換された光機能性核酸は、下記の一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’      …（１）
（ただし、一般式（１）中、ＡおよびＢはそれぞれ１塩基以上の直鎖状のヌクレオチドを表し、Ｚはナフトキノンを含有する化合物を表す）
と表すことができる。【００４４】
上記の一般式（１）において、ナフトキノンを含有する化合物Ｚは、ヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基およびヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基と結合していることが好ましい。ポリヌクレオチドとナフトキノンとの結合方法は特に限定されるものではないが、例えば、上記の一般式（１）におけるＺが下記の化学式（２）【００４５】
【化７】
2007111324.tif 000009
で表されるものであってもよい。【００４６】
ただし、上記の化学式（２）において、「５’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＡ側を表し、「３’」は上記一般式（１）中のヌクレオチドＢ側を表し、５’末端の酸素原子はヌクレオチドＡの３’末端のリン酸基の酸素原子を表し、３’末端の酸素原子はヌクレオチドＢの５’末端のリン酸基の酸素原子を表す。【００４７】
また、これ以外の化合物Ｚの例として、次の化学式（３）〜（６）【００４８】
【化８】
2007111324.tif 000010
【００４９】
【化９】
2007111324.tif 000011
【００５０】
【化１０】
2007111324.tif 000012
【００５１】
【化１１】
2007111324.tif 000013
であってもよい。これらの合成方法については、後述の〔光機能性核酸の合成方法〕において説明する。【００５２】
なお、ポリヌクレオチドとナフトキノンとを結合するリンカー部分は、なるべく短いものが好ましい。これにより、リンカー部分の構造的自由度が限定され、ナフトキノンによる非特異的な酸化的切断をさらに抑制することができる。【００５３】
また、上記のポリヌクレオチドＡおよびＢは、標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列であることを要する。ハイブリダイズし得る限りにおいて、標的ＤＮＡの検出対象の５−メチルシトシンを含む領域の塩基配列に対する相補配列と１００％の同一性を有するものでなくてもよい。１００％の同一性がなくてもハイブリダイズ可能であることを当業者は容易に理解する。具体的には、上記一般式（１）の５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’を例にすると、Ｚを一つの塩基と仮定した場合、ポリヌクレオチドＡ−Ｚ−Ｂが、標的ＤＮＡの５−メチルシトシンを含む部分領域に相補的な配列と８０％以上の同一性を有していることが好ましい。この場合、標的ＤＮＡ側の塩基配列において、Ａの５’末端よりも５’側のミスマッチは同一性の算出には考慮せず、同様に、Ｂの３’末端よりも３’側のミスマッチも考慮しない。同一性は、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、Ｚ以外の配列が１００％一致することが最も好ましい。【００５４】
また、上記一般式（１）において、Ｚの位置は、光機能性核酸と標的ＤＮＡとがハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置であることが望まれる。ここで、「対向する位置」とは、ポリヌクレオチドＡ−Ｚ−Ｂ（光機能性核酸）と標的ＤＮＡとがハイブリダイズするとき、検出対象の５−メチルシトシンと対合するヌクレオチドから５’側または３’側に５塩基以内に存在するヌクレオチドと結合していることが意図される。好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内、さらに好ましくは１塩基以内、最も好ましくはＺの位置が検出対象の５−メチルシトシンと対合する位置である。これにより、ハイブリダイゼーションの際に、ナフトキノンを検出対象の５−メチルシトシンに近接させることができるため、検出対象の５−メチルシトシン以外の塩基における酸化的切断を抑制することができる。【００５５】
工程（１）における、具体的な手順としては、まず、光機能性核酸と標的ＤＮＡとをハイブリダイズさせる。なお、ハイブリダイゼーションは、定法に従って行えばよい。【００５６】
次に、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖を形成している標的ＤＮＡおよび光機能性核酸に対して、光照射を行う（図１参照）。なお、光照射反応は、光機能性核酸と標的ＤＮＡの間の二重鎖解離温度(Ｔｍ値)以下で行わなければならない。また、照射する光は、４００ｎｍ以下の波長であることが好ましく、３５０ｎｍ以下であることがより好ましく、３３０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。これにより、ナフトキノンの酸化的切断を誘起することができる。【００５７】
続いて、反応溶液にピペリジンを添加して処理することにより、５−メチルシトシン部位が完全に切断される。ピペリジン処理は、例えば、１０μＬの反応溶液に１０％ピペリジン水溶液を５０μＬ加え、９０℃で２０分加熱すればよい。これにより標的ＤＮＡの切断断片を含む乾燥ＤＮＡペレットが得られる。【００５８】
ここで、図１の上段に示すように、ナフトキノンの近傍のシトシンがメチル化状態である場合、ＤＮＡ鎖の酸化的切断が起こる。一方、ナフトキノンの近傍のシトシンが非メチル化状態である場合は、図１の下段に示すように、ＤＮＡ鎖の酸化的切断は起こらない。【００５９】
標的ＤＮＡ中に検出対象の５−メチルシトシンが存在した場合、標的ＤＮＡは５−メチルシトシン部位が欠損した状態で２つの断片に切断される。このうち、工程（２）に必要な断片は５’断片、すなわち、５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片である。当該標的ＤＮＡの５’断片を単離して、次の工程（２）に供してもよいが、当該標的ＤＮＡの５’断片を含む乾燥ＤＮＡペレットをそのまま工程（２）に供することができる。作業の簡便さから標的ＤＮＡの５’断片を含む乾燥ＤＮＡペレットをそのまま工程（２）に供することが好ましい。【００６０】
〔工程（２）〕
工程（２）では、工程（１）で生成した標的ＤＮＡの５’断片、ＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼ（以下、「ＦＥＮ」と略記する場合がある）を反応させる。上述のように、工程（１）で得られた乾燥ＤＮＡペレットを適当な緩衝液で溶解し当該溶液に直接ＦＲＥＴプローブおよびＦＥＮを添加すればよい。乾燥ＤＮＡペレットを溶解する溶液としては、例えば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１０×ＲＥＣＴＭリアクションバッファー１２、および添加用１×ＢＳＡを含有する緩衝液を挙げることができるが、ＦＥＮの酵素反応を阻害しないものであれば、これに限定されない。【００６１】
例えば工程（１）で得られた乾燥ＤＮＡペレットを１５μＬの緩衝液に溶解した場合、ＦＲＥＴプローブが１μＭ〜５μＭ、ＦＥＮが１ユニット〜５ユニットとなるようにＦＲＥＴプローブおよびＦＥＮを添加することが好ましい。ただしこれに限定されるものではなく、適宜好適な添加量を設定すればよい。【００６２】
反応条件としては、３０℃で１分間〜５分間の反応を標準とすればよい。反応時間を長くすれば、バックグラウンドも含めて生じる蛍光の強度が増加することが発明者らにより確認されている。【００６３】
反応終了後は、直ちに次の工程（３）に進み、反応混合物（反応溶液）の蛍光を検出することができる。したがって、本発明に係る検出方法を用いれば、従来と比較して非常に短時間で遺伝子中の５−メチルシトシンの存在を検出することができる。【００６４】
ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer：蛍光共鳴エネルギー転移）プローブは、例えば図３に示すような塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。すなわち、ＦＲＥＴプローブの３’末端領域は、標的ＤＮＡの５−メチルシトシン部分で選択的に切断された５’断片の３’領域とハイブリダイズし得る塩基配列を有している（図３の線で囲った塩基配列）。したがって、ＦＲＥＴプローブの当該領域の塩基配列は、標的ＤＮＡおよび検出対象５−メチルシトシンに応じて適宜変更することができる。当該塩基配列は上記５’断片の３’領域の相補配列と１００％の同一性を有するものでなくてもよい。１００％の同一性がなくてもハイブリダイズ可能であることを当業者は容易に理解する。ただし、１００％の同一性を有することが好ましい。【００６５】
なお、上記標的ＤＮＡの５’断片とハイブリダイズし得るＦＲＥＴプローブの３’領域の最も５’側の塩基は、標的ＤＮＡ中の検出対象５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基（上記５’断片の３’末端の塩基）の相補塩基であることを要する。この部分がＦＥＮの認識部位となるからである。【００６６】
ＦＲＥＴプローブの５’末端側は、回文配列になっており、自ら二本鎖を形成してヘアピン構造を構成する。また、５’末端の塩基は、上記標的ＤＮＡの５’断片の３’末端の塩基と同一である。この５’末端の塩基を除き、ヘアピン構造を構成する回文配列は特に限定されない。また、標的ＤＮＡおよび検出対象５−メチルシトシンに応じて変更する必要はない。【００６７】
標的ＤＮＡの５’断片とハイブリダイズし得るＦＲＥＴプローブの３’末端領域の塩基数は５塩基〜２０塩基が好ましい。５塩基より短いと酵素（ＦＥＮ）の基質となり得ないことがあり、２０塩基より長いと酵素（ＦＥＮ）による切断効率が低下することがある。また、ヘアピン構造を構成するＦＲＥＴプローブの５’末端領域の塩基数は、特に限定されないが、２５塩基〜４０塩基が好ましい。【００６８】
ＦＲＥＴプローブの５’末端の塩基は蛍光色素で標識されており、５’末端近傍にはその蛍光強度を抑制する消光剤（クエンチャー）が結合している。なお、逆に、消光剤が５’末端で蛍光色素がその近傍でもよい。蛍光色素と消光材が同一のプローブに結合されている場合には、蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、同一のプローブに結合されていない状態では、蛍光強度は抑制されない。上記標的ＤＮＡの５’断片がＦＲＥＴプローブとハイブリダイズすることで、ＦＥＮが認識する構造が構成され、その結果５’末端の蛍光色素が切断されることにより、５−メチルシトシンの存在を蛍光強度として検出することができる。【００６９】
ＦＲＥＴプローブに用いられる蛍光色素としてはＦＭＡ（６−カルボキシ−フルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５などが挙げられる。また消光材（クエンチャー）としては4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid (dabcyl)、4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonic acid (dabsyl)などが挙げられる。【００７０】
ＦＲＥＴプローブは、市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる（実施例を参照）。その際、蛍光色素で標識されたホスホロアミダイト、消光剤で標識されたホスホロアミダイトを用いればよい。【００７１】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための一般的なインベーダー法では、一般にシグナルプローブおよびインベーダープローブと称される２種類の非標識オリゴヌクレオチドとＦＥＮとを用いてシグナルプローブからフラップアームを切り出し、このフラップアームとＦＲＥＴプローブとのハイブリダイズによりＦＥＮ認識部位を構成し蛍光色素を遊離させる。この際、ハイブリダイズした錯体にマッチ配列があるか、ミスマッチ配列があるかで、ＳＮＰｓを検出する。これに対して、本発明に係る５−メチルシトシン検出方法では、５−メチルシトシン部位で切断された標的ＤＮＡの断片を予め作製し、得られた標的ＤＮＡの５’断片がＦＲＥＴプローブにハイブリダイズ（インベイド）することによりＦＥＮ認識部位を構成し、蛍光色素を遊離させる。すなわち、標的ＤＮＡの切断断片の有無により蛍光色素の遊離を制御し、メチル化の有無を検出する。また、この場合は、いわゆるシグナルプローブおよびインベーダープローブを用いない。【００７２】
〔工程（３）〕
工程３では、反応混合物（反応溶液）の蛍光を検出すればよい。蛍光を検出する方法は特に限定されないが、例えば蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定する方法を挙げることができる。この場合、反応混合物をそのまま蛍光光度計に供し、用いた蛍光物質に応じて、使用する機器の推奨する方法で測定することができる。蛍光強度を測定する場合は、対照を設けて蛍光強度を比較することにより、より正確に対象の５−メチルシトシンの存在を検出することができる。対照としては、例えば、標的ＤＮＡを添加しないもの、フラップエンドヌクレアーゼを添加しないもの、などを挙げることができる。対照の蛍光強度と比較して１１０％以上の蛍光強度が測定された場合に、５−メチルシトシン陽性の判定をすることが好ましい。【００７３】
蛍光を検出する他の方法としては、例えば、蛍光顕微鏡で観察する方法を挙げることができる。蛍光顕微鏡で観察する場合、反応混合物にアガロースなどを添加してゲル化し、その一部をスライドグラス上に置き、カバーグラスで挟んで観察することができる。用いた蛍光物質に応じて、励起波長、検出波長、露光時間を選択すればよい。後述の実施例で示すように、ゲル全体が蛍光を発光していれば、５−メチルシトシン陽性の判定をすることができる。【００７４】
〔光機能性核酸の合成方法〕
光機能性核酸は、ナフトキノンを導入する位置のヌクレオチドを脱塩基したポリヌクレオチド鎖に対して、ナフトキノン誘導体を縮合させることによって合成することができる。具体的な縮合方法の一例を以下に示すが、これに限定されるものではなく、公知の他の様々な方法を用いてもよい。【００７５】
まず、図２に示すように、２−メチル−１，４−ナフトキノンの３位にカルボン酸を導入し、その後、ヒドラジンを縮合することによってナフトキノンのヒドラジン誘導体を合成する。【００７６】
一方で、ホスホロアミダイト法（後藤俊夫、芝哲夫、松浦輝夫監修『有機化学実験の手引き４  −合成反応ＩＩ−』化学同人）によって、下記の一般式（７）
５’−Ａ−Ｙ−Ｂ−３’      …（７）
で表される脱塩基前駆体修飾部を含む修飾ポリヌクレオチド鎖をＤＮＡシンセサイザー上で合成する。なお、一般式（７）において、ＡおよびＢは上述した標的ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチド鎖である。また、Ｙは脱塩基前駆体修飾部であり、例えば下記の化学式【００７７】
【化１２】
2007111324.tif 000014
によって表される化合物とすることができる。【００７８】
そして、Ｙが上記の化学式で表される場合、修飾ポリヌクレオチド鎖に含まれるＹのジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムなどでホルミル基に変換する。【００７９】
そして、上述したナフトキノンのヒドラジン誘導体を修飾ポリヌクレオチド鎖のホルミル基と縮合させることによって、下記の一般式（１）
５’−Ａ−Ｚ−Ｂ−３’      …（１）
（ただし、Ｚは、【００８０】
【化１３】
2007111324.tif 000015
である）
で表される光機能性核酸を得ることができる。【００８１】
なお、ホルミル基とヒドラジンとの縮合反応は酸性条件下で行うことが好ましく、ｐＨ５以上７以下がより好ましく、ｐＨ６が特に好ましい。また、反応温度は、室温以下で行うことが好ましく、１０℃以下がより好ましく、４℃が特に好ましい。これにより、修飾ポリヌクレオチド鎖にナフトキノンを導入することができる。【００８２】
また、上述の例においては、修飾ポリヌクレオチド鎖とナフトキノンとを、ホルミル基とヒドラジンとの縮合によって結合させたが、これに限定されるものではなく、例えば、アルキルアミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンイミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させてもよい。この反応式の一例を次の反応式（８）に示す。【００８３】
【化１４】
2007111324.tif 000016
なお、上記の反応式（８）の詳細は、“Bergeron et al., Nucleic Acids Res., 2004, 32, 6154-” に記載されており、本明細書ではこれを援用する。【００８４】
また、別の例として、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とスクシンイミジル基を導入したナフトキノン誘導体とを縮合させた例を次の反応式（９）に示す。【００８５】
【化１５】
2007111324.tif 000017
なお、上記の反応式（９）において、アミノ基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば“Okamoto, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 126, 14732-14733, 2004”に記載されている方法を参照して合成することができる。【００８６】
また、さらに別の例として、アルキルチオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基またはチオール基を導入したナフトキノンの誘導体とを縮合させてもよい。チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖とマレイミド基を導入したナフトキノンとを縮合させる反応式の一例を次の反応式（１０）に示す。【００８７】
【化１６】
2007111324.tif 000018
なお、上記の反応式（１０）において、チオール基を導入した修飾ポリヌクレオチド鎖は、例えば“Sun, S. et al. J. Org. Chem. 1996, 61, 5708-5709”に記載されている方法を参照して合成することができる。【００８８】
さらには、ナフトキノンを有する修飾核酸塩基（一塩基の修飾ヌクレオチド）を合成しておき、ＤＮＡシンセサイザーによって、任意の部分にこの修飾核酸塩基が挿入された修飾ポリヌクレオチド鎖を合成してもよい。例えば、下記の式（１１）のように、修飾核酸塩基としてナフトキノン含有ウリジン誘導体を合成しておき、これを含んだポリヌクレオチド鎖をＤＮＡシンセサイザーによって合成してもよい。【００８９】
【化１７】
2007111324.tif 000019
なお、上記の反応式（１１）において、ナフトキノン含有ウリジン誘導体は、例えば“Okamoto, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 126, 4820-4827, 2004”に記載されている方法を参照して合成することができる。【００９０】
本発明において使用し得る光機能性核酸は、ナフトキノンを含有するポリヌクレオチド鎖であれば、上記の方法や他の公知の方法によって得られる様々な産物が含まれる。【００９１】
２．５−メチルシトシン検出キット
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）を備える、遺伝子中の５−メチルシトシン検出キットを提供する。
（ａ）標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなり、かつ、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に、検出対象の５−メチルシトシンと対向する位置にナフトキノンが挿入されている光機能性核酸
（ｂ）標的ＤＮＡ中に存在する検出対象の５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブ
（ｃ）フラップエンドヌクレアーゼ
本キットを用いることにより、上記本発明に係る遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法を簡便かつ迅速に実施することができる。【００９２】
光機能性核酸、ＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼについては、既に詳細に説明したので、ここでの説明は省略する。【００９３】
本キットは、上記（ａ）〜（ｃ）をそれぞれ溶液や凍結乾燥物などの形態で備えていればよい。上記（ａ）〜（ｃ）以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、反応用緩衝液、反応用チューブ、ピペリジン溶液などを挙げることができる。【００９４】
本明細書中において用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。【００９５】
本発明に係る遺伝子中の５−メチルシトシン検出キットの使用については、上述の遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法の実施形態に準じればよく、ここでの説明は省略する。【００９６】
〔実施例〕
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９７】
１．実験方法等
〔機器・試薬等〕
Ａｂｓｓｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、５’−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｄａｂｃｙｌ−ｄＴなどのＤＮＡ合成試薬はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｃｈより購入した。オリゴマー（ＯＤＮｓ）の質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ、加速電圧２１ｋＶ、ネガティブモード）において、マトリクスとして２’,３’，４’−トリヒドロキシアセトフェノン、内部標準としてＴ８（［Ｍ−Ｈ］−２３７０．６１）、Ｔ１７（［Ｍ−Ｈ］−５１０８．３７）およびＴ２７（［Ｍ−Ｈ］−８１５０．３３）を用いて行った。【００９８】
逆相ＨＰＬＣは、６Ａ  ＨＰＬＣシステム（島津社）、Ｄ−７０００  ＨＰＬＣシステム（日立社）またはＬ−２４００  ＨＰＬＣシステム（日立社）を用いて行った。逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、ＧＬ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍもしくはφ１０ｍｍ×１５０ｍｍ、またはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＭＦ  ＳＨＩＳＥＩＤＯ、φ１０ｍｍ×２５０ｍｍ）試料溶液を注入した。カラム溶出は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収でモニターした。【００９９】
アルカリホスファターゼ（ウシ腸由来）はＰＲＯＭＥＧＡから、ヌクレアーゼＰ１はＹＡＭＡＳＡから、ホスホジエステラーゼＩはＩＣＮからそれぞれ購入した。λｅｘ＝３１２ｎｍの光照射はＬｏｕｒｍａｔ  ＴＦＸ−２０Ｍ  トランスイルミネーターを用いて行った。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕｎｉｔｅｓ／ｍＬ）はニッポンジーンからそれぞれ購入した。ヒトフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉ（Ｈｕｍａｎ ＦＥＮ−Ｉ）、１０×ＲＥＣＴＭリアクションバッファー１２および添加用１０×ＢＳＡはＴｒａｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入した。すべての溶液の調製には純水（ヤマト社製、ＷＲ６００Ａ）を使用した。蛍光スペクトルの測定には、島津社製蛍光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ）を使用した。【０１００】
〔３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）の合成〕
まず、２−メチル−１，４−ナフトキノン（和光純薬工業株式会社製）をコハク酸と反応させ、コハク酸の酸化的脱カルボキシル化を通じて、３−カルボキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのカルボン酸誘導体１）を得た（参考文献：Salmon-Chemin, L.; Buisine, E.; Yardley, V.; Kohler, S.; Debreu, M-A.; Landry, V.; Sergheraert, C.; Croft, S. L.; Krauth-Siegel, L.; Davioud-Charvet, E. J. Med. Chem. 2001, 44, 548.）。次に、１００ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）の３−カルボキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノンを１ｍＬのＤＭＦに溶解した溶液に対して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド１塩酸塩（１５７ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１１０ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。この反応混合物に、ヒドラジン１水和物（６４ｍｇ，２ｍｍｏｌを０．２ｍＬのＤＭＦに溶解したもの）を加え、周囲温度で２時間攪拌した。この反応混合物を水で希釈した後、エチル酢酸によって反応混合物を抽出した。得られた有機層を鹹水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。【０１０１】
次に、得られた粗製産物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，５０〜１００％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）の淡黄色固体を得た。【０１０２】
なお、この固体の性質は以下の通りであった：融点１８２〜１８３℃，１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ９．００  （ｂｒ，１Ｈ），δ  ８．０６〜７．９６（ｍ，２Ｈ），７．８９〜７．８１（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｂｒ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １８３．８，１７０．３，１４３．５，１３５．４，１３１．６，１２６．１，３２．１，２６．８，１２．４；ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ）ｍ／ｚ  ２５９  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］；ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］  ２５９．１０８３，ｆｏｕｎｄ  ２５９．１０８２。【０１０３】
〔トリオール基を含むオリゴデオキシヌクレオチドの合成〕
Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ＤＮＡ／ＲＮＡ  合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位（脱塩基前駆体修飾部）を含むオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「オリゴマー」と記す）を標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。合成したオリゴマーの塩基配列については後述する。自動合成の後、得られたオリゴマーを逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配および８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）によって精製した。【０１０４】
次に、乾燥させたオリゴマーを２００μＬの８０％酢酸に懸濁し、室温にて３０分インキュベーションした。３０分後、反応混合物に等量の脱イオン水を加え、ＤＭＴおよびＴＢＤＭＳ基を取り除くためにさらに４時間室温にてインキュベーションした。【０１０５】
続いて、完全に脱保護されたオリゴマーを、逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配および８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）によって精製した。【０１０６】
得られたオリゴマーの純度および濃度を、３７℃においてアルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼＰ１およびホスホジエステラーゼＩで４時間消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ分析装置によって確かめた（ｍ／ｚ  ６２４８．８７  （ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｈ］−  ６２４８．０１））。【０１０７】
〔ＤＮＡ鎖の内部に２−メチル−１，４−ナフトキノンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＮＱ−ＯＤＮ）の合成〕
脱塩基部位前駆体として機能する修飾部位をもつオリゴマー（１００μＭ）を、０．１ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０，８０μＬ）に溶かした０．５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムとともに４℃の遮光条件下で１時間インキュベーションした。得られた反応混合物に対して、上述のナフトキノンのヒドラジン誘導体３をアセトニトリル（５ｍＭ，８０μＬ）に溶解したものを加え、周囲温度で１４時間インキュベーションした。そして、得られた反応混合物を逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から３０％へのアセトニトリルの一次勾配および８０分以上に亘る３０％から１００％へのアセトニトリルの一次勾配）で精製し、ＮＱ−ＯＤＮ２を得た。【０１０８】
得られたＮＱ−ＯＤＮの純度および濃度は、アルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼＰ１およびホスホジエステラーゼＩによって３７℃で一晩完全に消化することによって求めた。合成したオリゴマーであるかどうかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ分析装置によって確かめた（ｍ／ｚ  ６４５５．２６  （ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｈ］−  ６４５６．２２））。【０１０９】
〔プローブオリゴマー（ＦＲＥＴプローブ）の合成〕
蛍光標識および４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  （ｄａｂｃｙｌ）標識のホスホロアミダイトを用いてＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３４００）で合成した。合成後、逆相ＨＰＬＣ（０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）の溶媒混合物による溶離、流量３．０ｍＬ／分での６０分以上に亘る０％から６０％へのアセトニトリルの一次勾配）で精製した。アルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼＰ１およびホスホジエステラーゼＩで完全に消化した後、プローブオリゴマーの精製度および濃度を測定した。【０１１０】
〔〔ＮＱ−ＯＤＮの光酸化：蛍光測定〕
標的オリゴマーを（５０ｎＭ−５０ｐＭ）を２−メチル−１，４−ナフトキノンユニットを持つ相補的なオリゴマー（１００ｎＭ−１００ｐＭ）と、２ｍＭカコジル酸ナトリウムを含むＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬ中でハイブリダイズさせた。サーモサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ｉＣｙｃｌｅｒ）を用いて試料を９０℃で５分間加熱した後、ゆっくりと４℃まで下げることにより、ハイブリダイゼーションを完了した。続いて、標的の二本鎖オリゴマーにトランスイルミネーターを用いて０℃で３１２ｎｍの光を照射した。照射後、５０μＬの１０％ピペリジン（ｖ／ｖ）を添加し、９０℃で２０分間処理して濃縮した。乾燥ＤＮＡペレットを１０μＬの脱イオン水で溶解した後、８００μＬのエタノールを加えて沈澱させた。沈渣ＤＮＡを１００μＬの８０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。得られたＤＮＡペレット（光照射した標的サンプル）を蛍光強度の測定および蛍光顕微鏡観察に供した。【０１１１】
〔フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによるプローブオリゴマーの酵素反応手順〕
すべての反応は、全量１５μＬに調製して行った。すなわち、１．５μＬの１μＭプローブオリゴマーを１１．５μＬの光照射した標的サンプル溶液に添加した。ここで、標的サンプル溶液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１０×ＲＥＣＴＭリアクションバッファー１２、および添加用１×ＢＳＡを含有する緩衝液中に５００ｆｍｏｌ−５００ａｍｏｌの標的ＤＮＡを含む。【０１１２】
続いて、２μＬのフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉ（１ユニット）を添加し、３０℃で５分間インキュベートした。酵素反応終了後、反応液（１０μＬ）を３９０μＬの脱イオン水で希釈し、蛍光強度の増加をモニターした（励起波長４９５ｎｍ）。【０１１３】
〔蛍光顕微鏡観察〕
上述の酵素反応後、５μＬの１．７％アガロースゲル溶液を反応液に添加し、混和した反応液を室温で一夜放置した。ゲル片をカバーグラスで挟み、蛍光顕微鏡観察に供した。蛍光はＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−８０００でモニターした（励起４８０／３０ｎｍ、検出５１０ｎｍ、露光時間５５ｍｓ）。
２．実験結果
〔使用オリゴマー〕
ｐ５３がん抑制遺伝子配列には、メチル化された５’−ＣｐＧ−３’が変異のｈｏｔ  ｓｐｏｔとして存在することが報告されている（Tornaletti, S., Pfeifer, G. P. Oncogene 1995, 10, 1493.; Baylin, S. B., Herman, J. G. Trends Genet. 2000, 16, 168.; Esteller, M., Corn, P. G., Baylin, S. B., Herman, J. G. Cancer Res. 2001, 61, 3225.）。本実施例では、その一つであるｃｏｄｏｎ２８２（下記のＯＤＮ１，２の配列におけるＣＧＧ）を含む塩基配列を持つＤＮＡオリゴマーを検出対象に選んだ。なお、各実験手順の詳細は上述の通りである。【０１１４】
検出対象となるオリゴマーのうち、５−メチルシトシンを有するオリゴマーをＯＤＮ１（５’−ＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣｍＧＧＣＧＣＡＣＡＧ−３’：配列番号１）とし５−メチルシトシンを有しないオリゴマーをＯＤＮ２（５’−ＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ−３’：配列番号２）とした。これらのオリゴマーは、インビトロジェン社から購入した。【０１１５】
また、ナフトキノンを導入する対象となるオリゴマーの配列は、基本的にはＯＤＮ１およびＯＤＮ２と相補的な配列とし、ＯＤＮ１およびＯＤＮ２のｃｏｄｏｎ２８２のメチル化されうるシトシン塩基の相補部位のみをトリオール基を有する化合物とした。具体的には、５’−ＣＴＧＴＧＣＧＣＣＹＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧ−３’とし、Ｙを、【０１１６】
【化１８】
2007111324.tif 000020
とした。【０１１７】
そして、このオリゴマーを過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、トリオール基をホルミル基に変換した後、３−（ヒドラジノカルボニルエチル）−２−メチル−１，４−ナフトキノン（ナフトキノンのヒドラジン誘導体３）と縮合させ、ナフトキノンを導入したＤＮＡオリゴマー、ＮＱ−ＯＤＮを得た。このＮＱ−ＯＤＮ２の配列は、５’−ＣＴＧＴＧＣＧＣＣＺＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧ−３’であり、Ｚは、【０１１８】
【化１９】
2007111324.tif 000021
である。【０１１９】
プローブオリゴマー（ＦＲＥＴプローブ）は、図３に示す２種類を合成した。プローブオリゴマー１（配列番号３）は標的ＤＮＡの５’断片の３’領域の相補配列を有しており、プローブオリゴマー２（配列番号４）は標的ＤＮＡの当該領域の相補配列を有しない。合成手順は上述の通りである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより目的のプローブオリゴマーであることを確認した（プローブオリゴマー１：ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  １３１３０．７７，ｆｏｕｎｄ  １３１３０．９０、プローブオリゴマー２：ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  １３８６６．２７，ｆｏｕｎｄ  １３８６７．１０）。【０１２０】
〔光酸化、ピペリジン処理後に生成するＤＮＡ断片の同定〕
ＯＤＮ１とＮＱ−ＯＤＮとを上述のようにハイブリダイズさせ、光照射およびピペリジン処理を行った後、ＨＰＬＣで目的の５’断片（５’−ＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣ−３’：配列番号５）のリテンションタイムの位置（図４（Ａ）のｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を粗く分取し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを図４（Ｂ）に示した。その結果、目的の５’断片が生成していることが確認できた（ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  ３４０５．２４，ｆｏｕｎｄ  ３４０５．７５）。【０１２１】
〔フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験１）〕
ＯＤＮ１（標的ＤＮＡ）５０ｎＭ（５００ｆｍｏｌ）およびＮＱ−ＯＤＮ１００ｎＭ（１ｐｍｏｌ）を含有する試料をハイブリダイズさせ、光照射、ピペリジン処理を行い、乾燥ペレットを得た。全量が１５μＬとなるように緩衝液、プローブオリゴマー１およびフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉを添加して３０℃で５分間インキュベートした。これを４０倍に希釈して蛍光を測定した。【０１２２】
対照として、標的ＤＮＡをＯＤＮ２としたもの、標的ＤＮＡを添加しないもの、フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉを添加しないものを設けた。【０１２３】
結果を図５に示した。図５から明らかなように、メチル化したシトシン（ｍＣ）を有するＯＤＮ１を用い、かつ、フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉを添加した場合のみ強い蛍光発光が観測された。この結果から、本系を用いることによりｍＣを含有する標的ＤＮＡを蛍光の強度を測定することにより検出できることが示された。【０１２４】
〔フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験２）〕
上記実験１と同様の条件で、光照射を行わない場合、および、ピペリジン処理を行わない場合について、実験を行った。【０１２５】
結果を図６に示した。図６から明らかなように、光照射を行わない場合、および、ピペリジン処理を行わない場合は、標的ＤＮＡを添加しない場合と同様に蛍光発光が観測されなかった。【０１２６】
〔フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによるプローブオリゴマーの酵素反応（実験３）〕
上記実験１と同様の条件で、標的ＤＮＡから生成する５’断片の相補配列を有しないプローブオリゴマー２を用いて実験を行った。試料として、プローブオリゴマー１／ＯＤＮ１、プローブオリゴマー２／ＯＤＮ１、プローブオリゴマー２／標的ＤＮＡなし、プローブオリゴマー２／ＯＤＮ１／フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉなし、の４種類の組み合わせを用いた。【０１２７】
結果を図７に示した。図７から明らかなように、プローブオリゴマー２／ＯＤＮ１を組合せた試料では、標的ＤＮＡを添加しない場合およびフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉを添加しない場合と同様に蛍光発光が観測されなかった。【０１２８】
以上、実験１−３の結果から、光照射およびピペリジン処理により生成する５’断片と当該５’断片の相補配列を有するプローブオリゴマーが複合体を形成し、インベース部分をフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉが認識した結果、切断に至り、蛍光が発光することが確認された。【０１２９】
〔検出限界の検討〕
試料に含まれるＯＤＮ１の量を５００ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌおよび５００ａｍｏｌと減少させ、上記実験１と同様の条件でフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによるプローブオリゴマーの酵素反応を行った。対照として、標的ＤＮＡをＯＤＮ２としたものを設けた。なお、プローブオリゴマー１を用い、すべての試料にフラップエンドヌクレアーゼ−Ｉを添加した。【０１３０】
結果を図８に示した。図８から明らかなように、ＯＤＮ１の量が５００ａｍｏｌのレベルまで、対照と比較して蛍光強度の違いを検出できた。この結果から、本系を用いれば、ｆｍｏｌ未満の標的ＤＮＡ量でも検出できることが明らかとなった。【０１３１】
〔５−メチルシトシン検出シグナルの可視化（蛍光顕微鏡観察）〕
上記実験１と同様の条件で、５００ｆｍｏｌのＯＤＮ１またはＯＤＮ２を標的ＤＮＡとして、フラップエンドヌクレアーゼ−Ｉによる酵素反応を行った。上述の通り反応液にアガロースゲル溶液を添加してゲル化し、蛍光顕微鏡で観察した。なお、それぞれの標的ＤＮＡについて、光照射を０時間（光照射なし）および２時間の２通り行った。【０１３２】
結果を図９（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）および（Ｂ）はＯＤＮ２を標的ＤＮＡとした場合、（Ｃ）および（Ｄ）はＯＤＮ１を標的ＤＮＡとした場合の結果を示す。図９（Ａ）〜（Ｄ）から明らかなように、５−メチルシトシンを有するＯＤＮ１を標的ＤＮＡとし、２時間の光照射を行った場合、強い蛍光発光が観察された。一方、光照射を行わなかった場合や標的ＤＮＡにＯＤＮ２を用いた場合は、蛍光発光が観察されなかった。この結果から、ＤＮＡ内の５−メチルシトシンを視覚的に検出できることが示された。【０１３３】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。【０１３４】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用の可能性】
【０１３５】
本発明によれば、簡便、かつ、高感度なシトシンのメチル化判定方法を実現できる。本発明のメチル化判定方法は、任意の塩基配列を持つ遺伝子に適用可能であるため、遺伝子診断、遺伝子解析、さらには遺伝子が関与する生体分子の相互作用の解明等、医学・生物学上幅広い分野で利用することができる。
【図２】
2007111324.tif 000027
【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
2007111324.tif 000031
【図６】
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【図７】
2007111324.tif 000033
【図８】
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【図１】
2007111324.tif 000035
【図９（Ａ）】
2007111324.tif 000036
【図９（Ｂ）】
2007111324.tif 000037
【図９（Ｃ）】
2007111324.tif 000038
【図９（Ｄ）】
2007111324.tif 000039
【配列表】
2007111324000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月6日(2007.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
検出対象の５−メチルシトシンを含む標的ＤＮＡの当該５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、当該５−メチルシトシンの５’側に隣接する塩基を３’末端に有するＤＮＡ断片を取得する工程（１）；
上記ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片の３’末端領域とハイブリダイズし得る塩基配列を３’末端領域に有するＦＲＥＴプローブ、およびフラップエンドヌクレアーゼを反応させる工程（２）；ならびに
反応混合物の蛍光を検出する工程（３）
を包含することを特徴とする遺伝子中の５−メチルシトシン検出方法。
【国際調査報告】
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