(57)【要約】核酸類縁物質を含む、ｐＨが０．５以上５．０以下のシチジンジリン酸コリン溶液を、Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂と接触させ、該樹脂に吸着したシチジンジリン酸コリンを水またはイオン濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の水溶液で溶出させて、シチジンジリン酸コリンを分離精製することを特徴とするシチジンジリン酸コリンの精製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸類縁物質を含み、かつｐＨが０．５以上５．０以下のシチジンジリン酸コリン（以下、ＣＤＰ−コリンと略す）溶液を、Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂と接触させ、該樹脂に吸着したＣＤＰ−コリンを水またはイオン濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の水溶液で溶出させて、ＣＤＰ−コリンを分離精製することを特徴とする、ＣＤＰ−コリンの精製方法。
【請求項２】
該ＣＤＰ−コリン溶液が、ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）の前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有する生体触媒を、ＵＴＰの前駆体、およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩と水性媒体中で共存させ、該媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させることにより得られる該媒体から調製される溶液である、請求項１記載のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【請求項３】
生体触媒が、ＵＴＰの前駆体からＵＴＰを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＵＴＰとコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を含む生体触媒である、請求項２記載のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【請求項４】
生体触媒が、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素を含む生体触媒である、請求項２記載のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【請求項５】
ＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素が、オロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、ウリジンキナーゼ、ウリジル酸・シチジル酸キナーゼ、ヌクレオシドジリン酸キナーゼ、シチジン−５’−トリリン酸シンセターゼ、コリンホスフェートシチジルトランスフェラーゼ、およびコリンキナーゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項４記載のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【請求項６】
核酸類縁物質が、ウラシルおよびＵＴＰから選ばれる物質である、請求項１〜５記載のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は医薬品原料、栄養食品原料として有用なシチジンジリン酸コリンの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  シチジンジリン酸コリン（以下、ＣＤＰ−コリンと略す）の製造方法としては、化学的合成方法（特許文献１、特許文献２）、微生物の培養物または酵素を用いる方法（特許文献３、特許文献４）が知られている。化学合成法で製造されたＣＤＰ−コリンの精製方法としては、陰イオン交換樹脂を用いる方法（特許文献１）、強酸性イオン交換樹脂および弱塩基性イオン交換樹脂を組み合わせて用いる精製方法（特許文献２）が知られているが、後者の方法では２種のイオン交換樹脂を使用する上、ＣＤＰ−コリン溶液中に含まれるホスホリルコリン、シチジン−５’−一リン酸（以下、ＣＭＰと略す）は分離できるものの、ウラシルまたはウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）を効率よく分離できる方法ではない。
【特許文献１】特公昭６３−６５５８号
【特許文献２】特公平６−３１３０６号
【特許文献３】特許第３３６９２３６号
【特許文献４】国際公開第９９／４９０７３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明の目的は、簡便にＣＤＰ−コリンと核酸類縁物質を分離することが可能なＣＤＰ−コリンの精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）核酸類縁物質を含み、かつｐＨが０．５以上５．０以下のＣＤＰ−コリン溶液を、Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂と接触させ、該樹脂に吸着したＣＤＰ−コリンを水またはイオン濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の水溶液で溶出させて、ＣＤＰ−コリンを分離精製することを特徴とするＣＤＰ−コリンの精製方法。
（２）ＣＤＰ−コリン溶液が、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有する生体触媒を、ＵＴＰの前駆体、およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩と水性媒体中で共存させ、該媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させることにより得られる該媒体から調製される溶液である、上記（１）のＣＤＰ−コリンの精製方法。
（３）生体触媒が、ＵＴＰの前駆体からＵＴＰを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＵＴＰとコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を含む生体触媒である、上記（２）のＣＤＰ−コリンの精製方法。
（４）生体触媒が、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素を含む生体触媒である、上記（２）のＣＤＰ−コリンの精製方法。
（５）ＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素が、オロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、ウリジンキナーゼ、ウリジル酸・シチジル酸キナーゼ、ヌクレオシドジリン酸キナーゼ、シチジン−５’−トリリン酸シンセターゼ、コリンホスフェートシチジルトランスフェラーゼ、およびコリンキナーゼからなる群から選ばれる酵素である、上記（４）のＣＤＰ−コリンの精製方法。
（６）核酸類縁物質が、ウラシルおよびＵＴＰから選ばれる物質である、上記（１）〜（５）のＣＤＰ−コリンの精製方法。
【発明の効果】
【０００５】  本発明により、ＣＤＰ−コリンおよびその塩が安価に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】  本発明に用いられるＣＤＰ−コリン溶液は、核酸類縁物質を含み、かつｐＨが０．５以上５．０以下の溶液であればいずれの方法で調製された溶液であってもよく、調製されたＣＤＰ−コリン溶液のｐＨが０．５〜５．０であればそのまま、ｐＨが５．０より大きい場合には塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の酸を添加し、ｐＨが０．５より小さい場合には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを添加し、ｐＨを０．５以上５．０以下、好ましくは１．０以上３．５以下に調整して用いることができる。【０００７】  Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂としては、Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂ならば、ゲル型でもポーラス型でも良く、具体的にはザ・ダウケミカル・カンパニー社製ダウエックスシリーズ（例えば、ＨＣＲ−Ｓ、ＨＣＲ−Ｗ２、マラソンＣ、モノスフィアー６５０Ｃ、ＭＳＣ−１、モノスフィアー８８、５０Ｗ×２、５０Ｗ×４、５０Ｗ×８等）、三菱化学社製ダイヤイオンＳＫシリーズ（例えばＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２等）、三菱化学社製ダイヤイオンＰＫシリーズ（例えばＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２２０，ＰＫ２２８等）、ローム・アンド・ハース社製アンバーライトシリーズ（例えばＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２４等）等があげられる。【０００８】  Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂の架橋度は、ＣＤＰ−コリンと核酸類縁物質を分離できる架橋度であれば特に制限はないが、２〜１０％が好ましく、更に好ましくは、４〜６％である。
Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂はカラムに充填された形態で本発明に用いることが好ましいが、本発明に用いられるカラムはどのようなものでも良い。
核酸類縁物質を含み、かつｐＨが０．５以上５．０以下のＣＤＰ−コリン溶液を、Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂が充填されたカラムに通塔等することによって該樹脂に接触させることによりＣＤＰ−コリンを該樹脂に吸着させるが、例えば架橋度２〜１０％のＨ形強酸性カチオン交換樹脂の充填されたカラムに通塔する際の通塔速度はＳＶ＝０．１〜５．０、好ましくはＳＶ＝０．２〜３．０である。【０００９】  上記吸着処理により、ＣＤＰ−コリンと、溶液中に含まれる核酸類縁物質、特にオロット酸、オロチジン−５’−一リン酸（以下、ＯＭＰと略す）、ウリジン−５’−一リン酸（以下、ＵＭＰと略す）、ウリジン−５’−二リン酸（以下、ＵＤＰと略す）、ＵＴＰ、ＣＭＰ、シチジン−５’−二リン酸（以下、ＣＤＰと略す）、シチジン−５’−三リン酸（以下、ＣＴＰと略す）等のピリミジン系核酸物質を好適に分離、除去することができる。核酸類縁物質のうちウラシルまたはＵＴＰは、これらを含むＣＤＰ−コリン溶液をｐＨが０．５以上５．０以下で該樹脂に接触させても、該樹脂にはほとんど、または全く吸着しないので、ウラシルまたはＵＴＰを特に好適に分離、除去することができる。【００１０】  Ｈ形強酸性カチオン交換樹脂に吸着しているＣＤＰ−コリンは、イオン濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは、０．０３ｍｏｌ／Ｌ以下の水溶液、更に好ましくは水を通塔する等によって溶出することにより、ＣＤＰ−コリンが樹脂から溶離し、ＣＤＰ−コリンを分離精製することができる。
上記溶出工程により、採取したＣＤＰ−コリン含有液は、必要に応じて活性炭処理もしくは非極性多孔質合成吸着剤、例えば三菱化学社製ダイヤイオンＨＰシリーズ（例えばＨＰ２０、ＨＰ２１等）、三菱化学社製ダイヤイオンＳＰ８００シリーズ（例えばＳＰ８２５、ＳＰ８５０等）、三菱化学社製ダイヤイオンＳＰ２００シリーズ（例えばＳＰ２０７等）、ローム・アンド・ハース社製アンバーライトＸＡＤシリーズ（例えばＸＡＤ４、ＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００等）等を用いて脱色処理を行ってもよい。【００１１】  上記のＣＤＰ−コリン含有液または脱色液を、酸またはアルカリでｐＨ２．０〜４．０に調整し、必要に応じて濃縮後、ＣＤＰ−コリンの濃度を５０〜８００ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜７００ｇ／Ｌに調整し、有機溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、メタノール、プロパノール等の親水性の有機溶媒を用いてＣＤＰ−コリン結晶を取得することができる。
また、上記のＣＤＰ−コリン含有液または脱色液を水酸化ナトリウムにてｐＨ５．０〜９．５に調整し、必要に応じて濃縮後、ＣＤＰ−コリン濃度を５０〜８００ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜７００ｇ／Ｌに調整し、有機溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、メタノール、プロパノール等の親水性の有機溶媒を用いて、ＣＤＰ−コリンナトリウム塩結晶を取得することができる。【００１２】  有機溶媒を用いてＣＤＰ−コリン結晶を取得する方法としては、例えば、ＣＤＰ−コリン溶液に有機溶媒を添加し結晶を析出させる方法、または大量の有機溶媒中へＣＤＰ−コリン溶液を滴下して結晶を析出させる方法があげられる。
なお、本発明において、核酸類縁物質を含むＣＤＰ−コリン溶液としては、ＣＤＰ−コリンと核酸類縁物質とを含む溶液であればどのようなものでも良いが、化学合成法、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する活性（以下、ＣＤＰ−コリン生成活性と略す）を有する生体触媒を用いた方法により製造される溶液をあげることができる。【００１３】  該生体触媒としては、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する微生物の培養物、該培養物の処理物、ＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素等をあげることができる。
該微生物としては、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する微生物であればいずれの微生物でもよく、元来ＣＤＰ−コリン生成活性を有する微生物はそのままＣＤＰ−コリンの生産に用いることができ、元来ＣＤＰ−コリン生成活性を有さない微生物は、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素をコードするＤＮＡを導入することによりＣＤＰ−コリンの生産に用いることができる。該微生物としては、好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物等をあげることができる。【００１４】  エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生物をあげることができる。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物としては、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、およびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ等をあげることができる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ��ｓ等をあげることができる。ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等をあげることができる。コリネバクリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに属する微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ６８７２、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓに属する微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍに属する微生物等をあげることができる。ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４等のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍに属する微生物、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｕｍ、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｐｅｒｉａｌｅ等をあげることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ等をあげることができる。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等をあげることができる。シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ等をあげることができる。ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属に属する微生物としては、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等をあげることができる。アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ等をあげることができる。オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｐｅｒｄａｅ、およびＡｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ等をあげることができる。セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ、およびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｃａｒｔａ等をあげることができる。クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、およびＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｒａｔｈａｙｉ等をあげることができる。クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｉｄｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｉｔｒｅｕｍ、およびＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｕｍ等をあげることができる。ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ等をあげることができる。【００１５】  サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等をあげることができる。シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等をあげることができる。クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ等をあげることができる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属に属する微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ等をあげることができる。シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物としては、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。【００１６】  また、該微生物として、より好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物をあげることができ、さらに好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物をあげることができる。【００１７】  上記微生物のうち、元来ＣＤＰ−コリン生成活性を有する微生物であってもＣＤＰ−コリン生成活性が充分に強くない場合には、該微生物に、ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを常法によって導入するか、該活性を有する他の微生物の細胞を融合させることにより、該活性の強化された微生物を作製して用いてもよい。【００１８】  該活性が強化された微生物および該活性が付与された微生物としては、該反応を担う酵素をコードするＤＮＡを以下に示す方法によって微生物に導入して得られる形質転換体が好ましく用いられる。
ＵＴＰの前駆体とコリンまたはホスホリルコリンとからＣＤＰ−コリンを生成する反応を担う酵素（以下、ＣＤＰ−コリン生成酵素と略す）をコードするＤＮＡとしては、例えば、オロット酸からＯＭＰを生成する活性を有するオロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ［ＥＣ  ２．４．２．１０］、ＯＭＰからＵＭＰを生成する活性を有するオロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼ［ＥＣ  ４．１．１．２３］、ウラシルからウリジンを生成する活性を有するウリジンホスホリラーゼ［ＥＣ  ２．４．２．３］、ウラシルからＵＭＰを生成する活性を有するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ［ＥＣ  ２．４．２．９］、ウリジンからＵＭＰを生成する活性を有するウリジンキナーゼ［ＥＣ  ２．７．１．４８］、ＵＭＰからＵＤＰを生成する活性を有するウリジル酸・シチジル酸キナーゼ［ＥＣ  ２．７．１．４８］、ＵＤＰからＵＴＰを生成する活性を有するヌクレオシドジリン酸キナーゼ［ＥＣ  ２．７．４．６］、ＵＴＰからＣＴＰを生成する活性を有するシチジン−５’−トリリン酸シンセターゼ［ＥＣ  ６．３．４．２］（以下、ＰｙｒＧと略す）、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼ［ＥＣ  ２．７．１．３２］（以下、ＣＫＩと略す）をコードするＤＮＡ、およびＣＴＰとホスホリルコリンからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ［ＥＣ  ２．７．７．１５］（以下、ＣＣＴと略す）をそれぞれコードするＤＮＡ等をあげることができる。【００１９】  ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡとしては、好ましくは、ＰｙｒＧ、ＣＫＩ、およびＣＣＴをコードするＤＮＡをあげることができる。
ＰｙｒＧをコードするＤＮＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，５５６８（１９８６）］。ＰｙｒＧをコードするＤＮＡを有する組換え体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのベクターｐＵＣ８［Ｇｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）］のマルチクローニングサイトのＳｍａＩ−ＰｓｔＩ部位にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＰｙｒＧをコードするＤＮＡを含む２４２６ｂｐのＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片が挿入されたプラスミドであるｐＭＷ６［Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，９５６（１９９７）］などがあげられる。【００２０】  ＣＣＴをコードするＤＮＡは、その全塩基配列が決定されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，４７７（１９８７）］。ＣＣＴをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのベクターｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］のマルチクローニングサイトのＳｍａＩ部位に酵母由来のＣＣＴをコードするＤＮＡを含む１２９６ｂｐのＤｒａＩ断片が挿入されたプラスミドｐＣＣ４１［生化学，６０，７０１（１９８８）］などがあげられる。【００２１】  ＣＫＩをコードするＤＮＡも同様に酵母染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０５３（１９８９）］。ＣＫＩをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとしては、酵母とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのシャトルベクターＹＥｐＭ４［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２９（１９８７）］に酵母由来のＣＫＩをコードするＤＮＡを含む２６９２ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が挿入されたプラスミドｐＣＫ１Ｄ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０５３（１９８９）］などがあげられる。【００２２】  上記のプラスミドは、これらのプラスミドを保持した大腸菌から公知の方法［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７，１５１３（１９７９）］に従い単離精製できる。
上記のようにして得られるプラスミドから、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に従って、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、組換え体ＤＮＡを作製し、上記微生物を宿主細胞として形質転換を行うことにより、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒を取得することができる。【００２３】  まず、ＰｙｒＧ、ＣＣＴまたはＣＫＩをコードするＤＮＡを上記プラスミドｐＭＷ６、プラスミドｐＣＣ４１またはプラスミドｐＣＫ１Ｄより取得し、得られたＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡはＣＤＰ−コリン生成酵素の効率的製造に有用である。【００２４】  該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡを、それぞれ別個に発現ベクターに挿入してもよいし、複数のＤＮＡを同じ発現ベクターに挿入してもよい。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。【００２５】  宿主細胞としては、上記微生物をあげることができる。
発現ベクターとしては、該宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞として、細菌等の原核生物を用いる場合は、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００２６】  発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］、ｐＳＥ２８０［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製］、ｐＧＥＭＥＸ−１［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製］、ｐＱＥ−８［キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製］、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製］、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許４６８６１９１号、米国特許４９３９０９４号、米国特許５１６０７３５号）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］、ｐＥＴシステム［ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製］等をあげることができる。【００２７】  プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００２８】  リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、ＣＤＰ−コリン生成酵素をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００２９】  組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。【００３０】  宿主細胞として酵母を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。【００３１】  組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。【００３２】  微生物がＣＤＰ−コリン生成活性の一部しか有していない場合、ＣＤＰ−コリン生成活性が得られるように、適宜２種以上の微生物を組み合わせて、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。なお、微生物がＣＤＰ−コリン生成活性を有している場合でも、２種以上の微生物を組み合わせることができる。
２種以上の微生物の組合せとしては、上記微生物のいずれから選ばれてもよく、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物等から選ばれる、同一の属に属する微生物、あるいは異なる属に属する微生物の組合せがあげられる。【００３３】  例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物とエシェリヒア属に属する微生物の組合せなどをあげることができ、具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７１７）との組合せ（特許第３３６９２３６号、米国特許第６３８７６６７号）等をあげることができる。
ＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒の一つである、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する微生物の培養物としては、上記方法で得られる微生物を常法に従って培養して得られる培養物をあげることができる。【００３４】  該微生物が細菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合は、該微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。【００３５】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００３６】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜５０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３〜９に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。【００３７】  該微生物が形質転換体であって、かつ、該微生物を形質転換するために用いた組換え体ＤＮＡが抗生物質耐性遺伝子を保有している場合は、該微生物を培養する培地に、該組換え体ＤＮＡが保有する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加してもよい。
生体触媒として２種以上の微生物の培養物または該培養物の処理物を用いる場合は、それぞれの微生物を上記方法に従って別々にあるいは同一の培地中で培養して得られるものを用いることができる。【００３８】  ２種以上の微生物を同一の培地中で培養する場合、これらの微生物を同時に培養しても、一つの微生物の培養中、あるいは培養終了後に残りの微生物を該培地中に培養してもよい。
微生物の培養物の処理物としては、上記の手法で得られる微生物の培養物を界面活性剤、有機溶剤またはリゾチーム等の細胞溶解酵素で処理して得られる界面活性剤、有機溶剤または細胞溶解酵素処理培養物があげられる。界面活性剤、有機溶剤または細胞溶解酵素をそれぞれ単独で用いて該微生物の培養物を処理してもよいし、これらを組合せて該微生物の培養物を処理してもよい。また、上記の手法で得られる微生物の培養物を濃縮機もしくは乾燥機等で濃縮もしくは乾燥処理して得られる該微生物の培養物の濃縮物もしくは乾燥物、該微生物の培養物をろ過もしくは遠心分離などで固液分離して得られる菌体、該菌体を乾燥機等で乾燥処理して得られる該菌体の乾燥物があげられる。また、該菌体を界面活性剤、有機溶剤、もしくはリゾチームなどの細胞溶解酵素、またはこれらを組合せて処理して得られる該菌体の界面活性剤処理物または有機溶剤処理物、細胞溶解酵素処理物等があげられる。【００３９】  ２種以上の微生物を用いる場合、２種以上の培養物の処理物を別々にＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよく、これら培養物の処理物を混合して得られる混合物をＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。
ＣＤＰ−コリンは、上記生体触媒とＵＴＰの前駆体、およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを媒体中で接触させることによって該媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該媒体からＣＤＰ−コリンを採取することによって製造することができる。【００４０】  ＵＴＰの前駆体としては、オロット酸、ＯＭＰ、ウラシル、ウリジン、ＵＭＰおよびＵＤＰ等があげられ、好ましくはオロット酸とウラシルがあげられる。
具体的なＣＤＰ−コリンを生成蓄積させる方法としては、上記生体触媒とＵＴＰの前駆体およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを媒体中で混合して得られる混合物に、必要に応じて他の成分を添加し、ｐＨを５〜１１、より好ましくは６〜１０に維持して、２０〜５０℃で２〜４８時間保持する。【００４１】  生体触媒の使用量は、当該生体触媒の比活性等により異なる。例えば、生体触媒として微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を用いる場合は、該培養物もしくは該培養物の処理物を遠心分離して得られる湿菌体として、塩化コリン１ｍｇに対して、５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜３００ｍｇ用いることが好ましい。
コリン、ホスホリルコリンおよびそれらの塩としては、例えば、コリン、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリンなどのハロゲン化コリン、重炭酸コリン、硫酸メチルコリン、クエン酸二水素コリン、重酒石酸コリン、ホスホリルコリン、塩化ホスホリルコリンなどのホスホリルコリンのハロゲン化物などがあげられるが、コリンもしくはホスホリルコリンのハロゲン化物が好ましく用いられ、塩化コリン、塩化ホスホリルコリンがさらに好ましく用いられる。【００４２】  ＵＴＰの前駆体、コリン、ホスホリルコリンおよびそれらの塩は、化学合成して得てもよいし、発酵法などにより生物から得てもよい。また、必ずしも純粋に精製されたものでなくてもよい。また、いずれの基質も市販されており容易に入手可能である。
ＵＴＰの前駆体、コリン、ホスホリルコリンおよびそれらの塩の濃度は、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌが好ましく、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。【００４３】  必要な他の成分としては、ＣＤＰ−コリン生成に必要なエネルギー供与体、リン酸イオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、界面活性剤および有機溶剤などがあげられる。これらの成分は、生体触媒等から必要量が持ち込まれる場合には添加する必要はない。
エネルギー供与体としてはグルコース、フラクトース、シュクロースなどの糖、糖蜜、澱粉加水分解物など、グリシン、アラニンなどのアミノ酸が用いられる。これらは、０．０２〜２．０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。【００４４】  リン酸イオンとしては正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸などのポリリン酸、ポリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどの無機のリン酸塩などを用いることができる。これらのリン酸イオンは、１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
マグネシウムイオンとしては硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどの無機のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウムなどの有機のマグネシウム塩を用いることができる。マグネシウムイオンは５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。【００４５】  アンモニウムイオンとしてはアンモニア水、アンモニアガス、各種無機あるいは有機のアンモニア塩、酵母エキス、コーンスチープリカーなどを用いることができる。またアンモニウムイオンに代えてグルタミンやグルタミンを含有するペプチドやカザミノ酸などの有機栄養源を用いることもできる。これらのアンモニウムイオンの濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。【００４６】  界面活性剤としてはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（例えばラビゾールＢ−８０、日本油脂社製）、ラウロイルザルコシネートなどの陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン・セチルエーテル（例えばノニオンＰ−２０８、日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＣＤＰ−コリンの生成を促進するものであればいずれでも使用できる。これらは通常０．１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／Ｌの範囲で用いられる。【００４７】  有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール等）、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド等があげられる。これらは通常、０．１〜１００ｍＬ／Ｌ、好ましくは１〜５０ｍＬ／Ｌの濃度で用いられる。
生体触媒とＵＴＰ前駆体、およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを接触させる媒体としては、生体触媒として使用する微生物を培養するための培地、該微生物の培養物、培養物の上清等を用いてもよいし、水性媒体を用いてもよい。【００４８】  水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液があげられる。
反応を阻害しなければ該媒体に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等があげられる。【００４９】  このようなＣＤＰ−コリンの製法として、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７１７）を生体触媒として用いてＣＤＰ−コリンを生産する方法（特許第３３６９２３６号、米国特許第６３８７６６７号）があげられる。
ＣＤＰ−コリン生成酵素としては、オロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、ウリジンキナーゼ、ウリジル酸・シチジル酸キナーゼ、ヌクレオシドジリン酸キナーゼ、ＰｙｒＧ、ＣＣＴ、およびＣＫＩからなる群から選ばれる１または２以上の酵素があげられる。【００５０】  上記の酵素活性を有する微生物をホモジェナイザー等で破砕した後、さらに塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理等の、通常の酵素の精製手段を施して得られる粗酵素または精製酵素をＣＤＰ−コリン生成酵素として用いることができる。また、該微生物の破砕物をそのまま上記酵素として用いることができる。【００５１】  また、上記微生物破砕物、粗酵素または精製酵素を水不溶性の担体やゲルなどに固定化し、これを上記酵素として用いてもよい。
ＣＤＰ−コリンは、上記酵素とＵＴＰの前駆体、およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを媒体中で接触させることによって媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該媒体からＣＤＰ−コリンを採取することによって製造することができる。【００５２】  具体的なＣＤＰ−コリンを生成蓄積させる方法としては、上記酵素とＵＴＰの前駆体およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを媒体中で混合して得られる混合物に、必要に応じて他の成分を添加し、ｐＨを５〜１１、より好ましくは６〜１０に維持して、２０〜５０℃で２〜４８時間保持する。
ＣＤＰ−生成酵素の使用量は、当該酵素の比活性等により異なる。例えば、該酵素として粗酵素を用いる場合は、塩化コリン１ｍｇに対して、１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜３００ｍｇ用いることが好ましい。【００５３】  ＣＤＰ−コリン生成酵素を用いてＣＤＰ−コリンを生成蓄積させる際に添加するＵＴＰの前駆体、コリン、ホスホリルコリン、それらの塩、および必要に応じて添加する他の成分は、上記の微生物の培養物等を用いてＣＤＰ−コリンを生成蓄積させる場合と同様であるが、さらに必要に応じてエネルギー供与体としてはアデノシン−５’−三リン酸など添加してもよく、さらに５−ホスフォリボシルジリン酸を添加してもよい。【００５４】  ＣＤＰ−コリン生成酵素とＵＴＰの前駆体およびコリンもしくはホスホリルコリンまたはそれらの塩とを接触させる媒体としては、生体触媒として使用する微生物を培養するための培地、該微生物の培養液、培養上清等を用いてもよいし、水性媒体を用いてもよい。
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液があげられる。【００５５】  上記のようにＣＤＰ−コリンを生成蓄積させた媒体からＣＤＰ−コリン溶液を調製する際には、膜分離、濾過、遠心分離等の手段を用いて、該媒体から固形物を分離除去すればよい。
上記方法により調製されるＣＤＰ−コリン溶液に含まれる核酸類縁物質としては、ウラシル、ＵＴＰ等があげられる。
ＣＤＰ−コリンや核酸類縁物質は高速液体クロマトグラフィー（ＵＶ検出）を用いた常法により分析することができる。【００５６】  以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】強酸性カチオン交換樹脂を用いたＣＤＰ−コリンの精製
ＣＤＰ−コリン（和光純薬工業社製）５０ｇ、ウラシル（ナカライテスク社製）２ｇ、ＵＴＰ（ナカライテスク社製）１ｇを水に溶解し５ＬのＣＤＰ−コリン溶液を調製した。その溶液を硫酸にてｐＨ３．０に調整し、架橋度４％の強酸性カチオン交換樹脂ダイヤイオンＰＫ２０８（Ｈ形）１０Ｌを充填したカラムに通塔した。続けて水を通塔し、高速液体クロマトグラフィー分析によりウラシル、ＵＴＰの各濃度がＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満である分画を取得した。ＣＤＰ−コリン画分を１００ｍＬに濃縮し、エタノール３５０ｍＬを徐々に添加した。析出した結晶を濾取し、１００％エタノール溶液で洗浄した後、２０℃にて３日間減圧乾燥した。その結果、ウラシル、ＵＴＰの各濃度が、ＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満であるＣＤＰ−コリン結晶を４０ｇ取得した。
【実施例２】
【００５８】ＣＤＰ−コリンを生成する能力を有する微生物の培養物からのＣＤＰ−コリンの精製
ＰｙｒＧ、ＣＣＴ、ＣＫＩの酵素活性を有する大腸菌ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７１７）をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌを含み、ｐＨを７．２に調整した液体培地］１０ｍＬの入った試験管に接種し、２５℃で２４時間３００ｒｐｍにて振盪培養した。この培養液２０ｍＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ培地４００ｍＬの入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに接種し、２５℃にて１６時間、１９０ｒｐｍで回転振盪培養した。この培養液１２５ｍＬを、グルコース５ｇ／Ｌ（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２５０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ４μｇ／Ｌ（別殺菌）の組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、２５℃にて１１時間、その後３２℃にて１３時間、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下、１４％アンモニア水にてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。培養中、培養開始１１時間目から２４時間目までの間、グルコース１６７ｇ／Ｌ、ペプトン１６７ｇ／Ｌの組成からなるフィード液をペリスタポンプにより３０ｍＬ／時間の速度にて流加した。【００５９】  一方、オロット酸からからＵＴＰを生成する活性を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を、グルコース５０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（大五栄養化学社製）１０ｇ／Ｌ、イーストエキス（大五栄養化学社製）１０ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／Ｌ、およびビオチン３０μｇ／Ｌ（水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地１０ｍＬの入った試験管に接種し、２８℃にて２４時間、３００ｒｐｍで往復振盪培養した。この培養液２０ｍＬを上記と同一組成の液体培地２３０ｍＬの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２４時間１９０ｒｐｍにて回転振盪培養した。この培養液２５０ｍＬを、グルコース１００ｇ／Ｌ、肉エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、β−アラニン１５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ５ｍｇ／Ｌ（別殺菌）（水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃にて攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分��培養条件下、濃アンモニア水でｐＨを６．８に調整しつつ種培養を行った。上記種培養液の上清中のグルコースが消費された時点で、培養液を３５０ｍＬ無菌的に採取し、グルコース１８０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）、β−アラニン１５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ５ｍｇ／Ｌ（別殺菌）（水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃にて攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下、濃アンモニア水でｐＨ６．８に調整しつつ本培養を行った。培養液上清中のグルコースが消費された時点で培養を終了した。【００６０】  このようにして得られた大腸菌ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株の培養液３６０ｍＬとコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の培養液３６０ｍＬを２Ｌ容培養槽に入れ、これにグルコース１００ｇ／Ｌ、オロット酸１０ｇ／Ｌ、塩化コリン８．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ／Ｌ、キシレン２０ｍＬ／Ｌを添加し、蒸留水を加え全量を８００ｍＬとした。この混合液を、３２℃にて攪拌８００ｒｐｍ、通気量０．８Ｌ／分の条件下、１０規定水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整しつつ反応を行った。反応中、反応液上清中のリン酸濃度がＫＨ２ＰＯ４として１〜５ｇ／Ｌに保たれるように適宜ＫＨ２ＰＯ４を途中添加した。２３時間反応を行ったところ、ＣＤＰ−コリンが１１．０ｇ／Ｌ生成した。【００６１】  上記反応液４回分を硫酸にてｐＨ１．０に調整し、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を分離し、得られた上澄み液に水を添加し６Ｌになるよう調製した（ＣＤＰ−コリン６．０ｇ／Ｌ、ウラシル０．５ｇ／Ｌ、ＵＴＰ１．０ｇ／Ｌ）。このシチジンジリン酸コリン溶液を、架橋度４％の強酸性カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１０４（Ｈ形）１０Ｌを充填したカラムに通塔した。続けて水を通塔し、高速液体クロマトグラフィー分析によりウラシル、ＵＴＰの各濃度がＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満である分画を取得した。活性炭を用いてＣＤＰ−コリン画分を脱色した後、１００ｍＬになるまで濃縮した。この濃縮液にエタノール３５０ｍＬを徐々に添加し、析出した結晶を濾取した。得られた結晶を１００％エタノール溶液で洗浄した後、２０℃にて３日間減圧乾燥した。その結果、ウラシル、ＵＴＰの各濃度が、ＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満であるＣＤＰ−コリン結晶を１８ｇ得た。
【実施例３】
【００６２】ＣＤＰ−コリンを生成する能力を有する微生物の培養物からのＣＤＰ−コリンナトリウム塩の精製
実施例２と同様にして得られた反応液４回分を硫酸にてｐＨ１．０に調整し、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を分離し、得られた上澄み液に水を添加し６Ｌになるよう調製した（ＣＤＰ−コリン６．０ｇ／Ｌ、ウラシル０．５ｇ／Ｌ、ＵＴＰ１．０ｇ／Ｌ）。このシチジンジリン酸コリン溶液を、架橋度４％の強酸性カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１０４（Ｈ形）１０Ｌを充填したカラムに通塔した。続けて水を通塔し、高速液体クロマトグラフィー分析によりウラシル、ＵＴＰの各濃度がＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満である分画を取得した。ＣＤＰ−コリン画分を水酸化ナトリウムにてｐＨ７．５に調整し、活性炭を用いて脱色した後、１００ｍＬになるまで濃縮した。この濃縮液にエタノール４００ｍＬを徐々に添加し、析出した結晶を濾取した。得られた結晶を１００％エタノール溶液で洗浄した後、２０℃にて３日間減圧乾燥した。その結果、ウラシル、ＵＴＰの各濃度が、ＣＤＰ−コリンに対して０．１％（ｗ／ｗ）未満であるＣＤＰ−コリンナトリウム塩結晶を２０ｇ得た。【００６３】  以上の結果、核酸類縁物質を含むＣＤＰ−コリン溶液を、強酸性カチオン交換樹脂を用いて１回処理するだけで、不純物を含まないＣＤＰ−コリンまたはその塩を簡便に得ることができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】  本発明により、ＣＤＰ−コリンおよびその塩が安価に提供される。
【国際調査報告】
2007018259.tif 000002
2007018259.tif 000003