(57)【要約】バラ由来の新規なフラボノイド糖転移酵素及び当該酵素をコードする核酸、例えば配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するフラボノイド糖転移酵素、及び当該酵素をコードする核酸、並びに当該核酸を利用するバラの花の変色方法、及び花色変化性バラ植物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属由来の、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項２】
フラボノイドがアントシアニジンまたはフラボノールである、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有する、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項４】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し、ラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項９】
配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して中ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１１】
配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸に相補的な配列を含む核酸。
【請求項１３】
核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターにより形質転換された宿主。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸によりコードされる蛋白質。
【請求項１７】
請求項１５に記載の宿主を培養し、又は成育させ、そして該宿主からフラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸が導入された植物あるいはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織または栄養増殖体。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸が導入された、花の色が改変された植物あるいはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織または栄養増殖体。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切花。
【請求項２１】
配列表３に記載された遺伝子またはその一部を用いて開花に従い花色が変化する植物を作出する方法。
【請求項２２】
請求項２１でいう植物がバラである請求項２１の方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２の方法によって作出された、花の色が開花後に変化する植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織または栄養増殖体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切花。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフラボノイドを配糖化する酵素遺伝子その利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
花卉産業においては新しい形質を持った花は常に珍重されるため、このような花き植物の開発は産業上重要である。花の色は花卉のもっとも重要な形質である。主に交配を用いた品種改良により、さまざまな色の品種が育種されてきた。しかしながら、交配による品種改良は、利用できる遺伝子資源が、交配可能な近縁の植物に限定されているため、花の色は限定される場合が多く、単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれである。たとえば、青いバラ、カーネーション、黄色のアサガオ、ゼラニウムなどは交配による品種改良では開発することができなかった。
花の色の主な成分は、アントシアニンと総称されるフラボノイドの一群の化合物である。植物には多様なアントシアニンが存在することは知られており、それらの多くの構造が既に決定されている。アントシアニンの色は主としてその構造に依存している。バラに含まれるアントシアニンとしては、シアニジン３，５−ジグルコシド、ペラルゴニジン３，５−ジグルコシド、シアニジン３−グルコシド、ペラルゴニジン３−グルコシド、ペオニジン３，５−ジグルコシド、ペオニジン３−グルコシドが知られている。これらは、バラの花においてはオレンジ色から赤色を司っている。一部のバラには、ロザシアニン（ｒｏｓａｃｙａｎｉｎ）と総称される青い化合物が含まれていて、ロザシアニンはアントシアニジンの１種であるシアニジンの誘導体である（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）４３  ２６３７−２６３９、特開２００２−２０１３７２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００６）６２  ９６６１−９６７０）。
アントシアニンの生合成に関わる酵素や遺伝子についてはよく研究がされている（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（２００５）８０，１−２４）。これらの遺伝子を植物に導入し発現させることにより、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変えた例もある（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（２００５）８０，１−２４）。アントシアニンの生合成はアントシアニジン３−グルコシドに至るまではほとんどの顕花植物で共通であり、アントシアニジンは、まず３位にグルコースなどの糖が付加するのが一般的である（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（２００５）８０，１−２４）。また植物種によってはグルコースの代わりにガラクトースが付加し、アントシアニジン３−ガラクトシドを蓄積するものもある。
しかしながら、産業上重要な園芸植物であるバラにおいては、アントシアニジン３−糖転移酵素活性は検出されず、他の顕花植物と異なり、アントシアニジン５，３−糖転移酵素（Ａ５，３ＧＴ）が存在する、すなわち、アントシアニジンの５位にグルコースが転移した後、３位にグルコースが転移することが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ（２００５）；４３５，７５７−７５８）。一方、一部のバラに存在する青色色素ロザシアニンはシアニジンを含む構造をしている。これがシアニジンからどのように生合成されるかについては知られていないが、シアニジンに糖が転移する反応は、ロザシアニンの生合成には不要であることがロザシアニンの構造から明らかである。
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以上のことから、バラ花弁においてアントシアニジンがアントシアニンあるいはロザシアニンのいずれかに合成されるかは、アントシアニジンに対する糖転移酵素活性の有無が重要であること、すなわち、アントシアニジン糖転移酵素活性があればアントシアニンが合成され、アントシアニジン糖転移酵素活性がなければロザシアニンが合成されることが示唆された。そして、過去の知見（Ｎａｔｕｒｅ（２００５）；４３５，７５７−７５８）にもとづけば、バラの場合には、そのアントシアニジン糖転移酵素は、アントシアニジン３−糖転移酵素ではなく、アントシアニジン５，３−糖転移酵素（Ａ５，３ＧＴ）であることが示唆される。
フラボノイドを含む多様な化合物に糖を転移する酵素は、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノースなどを糖供与体とし、化合物の特異的、あるいは非特異的な位置の水酸基に転移する反応を触媒する。このような糖転移酵素は植物のゲノム中において糖転移酵素ファミリーを形成し、一つの種には１００種以上の分子種が存在することが知られている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）、１３、１３９−１４５）。
アントシアニジンを含むフラボノイドに糖を転移する糖転移酵素も、上述の糖転移酵素ファミリーに属する。このファミリーの中では、フラボノイドに糖を転移する酵素の知見は比較的多くある。フラボノイドに糖を転移する酵素は、フラボノイドの特異的な位置の水酸基に転移する反応を触媒する場合が多く、同じ位置に糖を転移する酵素のアミノ酸配列は種を超えて似通っている。
これまでに、アントシアニンを含むフラボノイドの３位、あるいは５位に糖を転移する反応は、それぞれフラボノイド（あるいはアントシアニジン）３−糖転移酵素（Ａ３ＧＴ）、アントシアニン５−糖転移酵素（Ａ５ＧＴ）と呼ばれる異なる酵素が触媒することが知られていて、それらをコードする遺伝子がいくつかの植物から得られている。また、それぞれがサブファミリーを形成する（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）４８，４０１−１１、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）８：１−１０）。また、フラボノイドの３’位と７位に糖を転移する酵素のアミノ酸配列は比較的高い相同性を示し、フラボノイドの７位に糖を転移するフラボノイド７−糖転移酵素（Ｐｌａｎｔａ．（２０００）２１０，１００６−１０１３）とアントシアニンの３’位に糖を転移するリンドウのアントシアニン３’−糖転移酵素（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３）１３２，１６５２−１６６３）は同じサブファミリーに属する。一方、バラのＡ５，３ＧＴはこれらとは別のサブファミリーに属する。
ところで、バラの中には開花後に色を変化させる品種が知られている。例えばマスカレードや絵日傘などの品種であり、蕾から開花の初期段階では黄色やクリーム色であるが、開花が進むにつれて花色を赤やピンクに変化させる。これらの色変わりバラにおいては、他の品種のバラ同様に蕾の段階でアントシアニンが合成されている。しかし、その後、赤やピンクの色に変化していくことから、おそらく開花後でも再びアントシアニンの合成が盛んになる段階があるものと思われる。１９４９年に作出されたマスカレードが花色変化花の第１号品種と言われている（バラ大百科  日本放送出版協会、ＩＳＢＮ４−１４−６４５７７６−９）。このような形質は交配によって後代に引き継がれ、新たな品種がつくられてきているが、開花後の着色は赤色やピンクに限定されている。
また、最近、同じくバラの色変わり品種であるチャールストンの培養細胞において、アントシアニン合成に伴い、Ａ３ＧＴ遺伝子が発現することが報告された。（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）２３，３７９−３８５）
現在の技術水準を持ってすれば、遺伝子組換えバラを作製し、バラの中で外来の遺伝子を過剰発現させたり、内在性の遺伝子の発現を抑制させたりすることは可能である。
【特許文献１】特開２００２−２０１３７２号公報
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）４３  ２６３７−２６３９
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（２００５）８０，１−２４
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ（２００５）；４３５，７５７−７５８
【非特許文献４】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）、１３、１３９−１４５
【非特許文献５】Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）４８，４０１−１１
【非特許文献６】Ｐｌａｎｔａ．（２０００）２１０，１００６−１０１３
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２００３）１３２，１６５２−１６６３
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００６）６２  ９６６１−９６７０
【非特許文献９】Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）２３，３７９−３８５
【発明の開示】
【０００３】
バラにおいてアントシアニジンの５位よりも先に３位に糖を転移する酵素およびその遺伝子、あるいは３位にのみ、もしくは３位を好んで糖を転移する酵素およびその遺伝子は知られておらず、このような酵素は存在しないとされていた（Ｎａｔｕｒｅ（２００５）；４３５，７５７−７５８）。このような酵素や遺伝子が入手できれば、バラのアントシアニンやロザシアニンの生合成経路を改変することができ、バラの花色を改変できることは明らかである。また開花に従い色が変化するバラにおいて見られるように、開花後の花色変化に関与するアントシアニン合成に関与する遺伝子（当該遺伝子のプロモーターなど発現調節領域を含む）が入手できれば、当該遺伝子を用いた分子育種により開花後に花色が変化するバラを作出することができる。
従って本発明は、バラ科バラ属由来の、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸を提供する。前記フラボノイドは特にアントシアニジン又はフラボノールである。
本発明はまた、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有する、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸を提供する。
本発明は更に、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸に付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸、より限定的には、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸に付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸；例えば配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸；そして更に限定的には、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し、ラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸を提供する。
本発明は更に、請求項１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して中ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸、より限定的には配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする核酸を提供する。
本発明の典型的な遺伝子は、配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を含む核酸である。
本発明の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、特にＤＮＡである。本発明は更に、このＤＮＡを含んでなるベクター、このベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明は更に、前記いずれかの核酸が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織または栄養増殖体；前記いずれかの核酸が導入された、花の色が改変された植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織または栄養増殖体；及び前記の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切花を提供する。
本発明は更に、前記種々の核酸によりコードされる蛋白質を提供する。本発明は又、前記宿主を培養し、又は成育させ、そして該宿主からフラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、バラの各品種の蕾の花弁におけるＦ３ＧＴ遺伝子およびＡ３ＧＴ遺伝子の発現を示す。アントシアニン合成の盛んな蕾の花弁からＲＮＡを抽出し、Ｆ３ＧＴ配列またはＡ３ＧＴ配列に由来するＤＩＧ  ＲＮＡプローブを用いて、ノザンハイブリダイゼーションを行った結果である。
図２は、バラ（品種：絵日傘）の各生育段階の花弁の状態（Ａ）（オレンジがかった黄色から赤色へ花色が変化している）、および各生育段階の花弁に存在するアントシアニンの量（Ｂ）を示す。
図３は、バラ（品種：絵日傘）の各生育段階の花弁におけるＡ３ＧＴ遺伝子およびＡ５，３Ｇ遺伝子の発現を示す。各生育段階におけるＡ３ＧＴ遺伝子、Ａ５，３ＧＴ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで調べた。それぞれの遺伝子配列に由来するＤＩＧラベルしたＲＮＡプローブを用いた。花の生育段階１〜４は、図２における１〜４に対応する。
図４は、バラ（品種：絵日傘）の各生育段階の花弁におけるＣＨＳ遺伝子、Ｆ３′Ｈ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子およびＡ３ＧＴ遺伝子の発現を示す。各生育段階におけるＣＨＳ遺伝子、Ｆ３′Ｈ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子およびＡ３ＧＴ遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで調べた。それぞれの遺伝子配列に由来するＤＩＧラベルしたＲＮＡプローブを用いた。花の生育段階１〜４は、図２における１〜４に対応する。
図５は、バラ（品種：ラバンデ）の宿主にＦ３ＧＴの発現を制御するｐＳＦＬ２２４を導入した場合の花の色の変化を示す。宿主の、赤味かかった紫色が形質転換体では顕著に薄くなっている。
図６は、バラ（品種：ラバンデ）の宿主およびＦ３ＧＴ抑制形質転換体（図５と同じ）におけるＦ３ＧＴ遺伝子およびＡ５，３ＧＴ遺伝子の発現を示す。ラバンデの宿主およびＦ３ＧＴ抑制形質転換体におけるＦ３ＧＴ遺伝子、Ａ５，３ＧＴ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで調べた。それぞれの遺伝子配列に由来するＤＩＧラベルされたＲＮＡプローブを用いた。Ｆ３ＧＴ  ６００ｂｐのプローブは内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子にのみ存在する部分をプローブとしたものである。花の生育段階１〜４は、図２における１〜４に対応する。
発明の具体的な形態
本発明の核酸によりコードされる、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質は、最も典型的には配列番号２又は４に示すアミノ酸を有する。しかしながら、酵素の技術分野においては、酵素タンパク質内には酵素活性や基質特異性などに関与する必須領域と酵素活性やその他の性質のために必須ではない領域が存在し、非必須領域において、アミノ酸の付加、欠失、他のアミノ酸による置換などによりアミノ酸配列の修飾がなされていても、酵素活性やその他の重要な性質が維持されることが知られている。
従って、本発明は、配列番号２又は４に示すアミノ酸を有する酵素をコードする核酸のみならず、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸に付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミ配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸をも提供する。例えば、本発明は、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸に付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸を提供する。修飾の対象となるアミノ酸の数は、５０個以下、例えば４０個以下、３０個以下、あるいは２０個以下であり、典型的には１０個以下である。
天然のアミノ酸配列に修飾を加えても酵素活性が維持されるのは上記のとおりであるところ、後で記載するように、本発明の酵素のアミノ酸配列は、同様の活性を有する既知の酵素の配列同一性の最も高いアミノ酸配列との間のアミノ酸配列の同一性は６０％未満に過ぎない。従って、本発明は、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸；配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸；そして更に限定的には、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し、ラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸を提供する。
ある酵素をコードする遺伝子がクローニングされれば、その遺伝子の配列情報を基にして設計したプローブやプライマーを用いて、同様の活性を有する別の酵素をコードする遺伝子をクローニングすることが可能であることが知られている。従って、本発明はまた、配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して中ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸；そしてより限定的には配列番号１又は３に示すコード領域の塩基配列を有する核酸に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるアミノ酸配列を有し、フラボノイドの３位の水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質、及び当該蛋白質をコードする核酸を提供する。
上記の中ストリンジェント条件とは、３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、３７℃で一晩ハイブリダイズした後、１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中、５５℃で洗浄するものであり、高ストリンジェント条件とは、５０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中、４２℃で一晩ハイブリダイズした後、１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄するものである。
本発明はまた、前記のＤＮＡを含んでなるベクター、特に発現ベクターに関する。発現ベクターは、プロモーター、ターミネーターなどの制御配列を含む。制御配列としては、使用する宿主に応じた常用のプロモーターなどの制御配列を用いることができる。原核細胞、例えば大腸菌、真核微生物、例えば酵母、糸状菌など、あるいは高等真核細胞、即ち動物培養細胞、植物培養細胞などを用いることができる。
バラのアントシアニンの合成に際しては、アントシアニジンの５位にまず糖が転移することが報告されていたが、鋭意研究の結果、意外にも、バラにおいても３位に糖を転移する酵素が存在することを明らかにすることができた。また、それをコードする遺伝子を取得することができた。この遺伝子をバラや異種の植物において発現させることにより、アントシアニンの合成を促進することができる。また、抑制することにより、アントシアニンの合成を抑制できる。また、バラにおいてはアントシアニンの合成を抑制することにより、アントシアニジン特にシアニジンの蓄積を促進し、その結果としてロザシアニンの蓄積をも促進することができる。
また、アントシアニジンの３位に糖を転移する酵素をコードする遺伝子は、バラの開花後の花色変化に関与することが明らかになった。本遺伝子の発現プロファイルから、当該遺伝子のプロモーター領域は開花後に特異的に遺伝子を発現させる働きがあると考えられる。このような開花後の花色変化に関与するアントシアニン合成系遺伝子（当該遺伝子のプロモーターなど発現調節領域を含む）を用いた分子育種により開花後に花色が変化するバラを作出することができる。
【実施例】
【０００５】
以下実施例に従って発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３）１３２，１６５２−１６６３に依った。
実施例１． バラのｃＤＮＡライブラリーの構築とその他の３ＧＴ  ｃＤＮＡ候補の取得
植物花弁に含まれるアントシアニジンの３位に糖を転移する酵素（Ａ３ＧＴ）遺伝子は、そのｃＤＮＡライブラリーを異種のＡ３ＧＴ遺伝子でスクリーニングすることにより得ることができる。例えばリンドウのＡ３ＧＴ遺伝子はキンギョソウのＡ３ＧＴ遺伝子をプローブにして得ることができた（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７、７１１−７１６）。公知の方法（たとえば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６，１０２３−１０３１）でバラ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ品種サンバ）の着色中の葉（アントシアニンを蓄積している）から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ライブラリー作製は、λＺＡＰＩＩ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡ  ライブラリー合成キット（ストラタジーン社）を用い、製造業者推奨の方法に従い行った。約５，５００，０００  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ（ｐｆｕ）のｃＤＮＡライブラリーが得られた。シソ由来Ａ３ＧＴ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）３５，９１５−９２７）、リンドウ由来Ａ３ＧＴ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７、７１１−７１６）の２種のＮ末端側配列に相当する部分をライブラリースクリーニングのプローブとして用いた。それぞれＧＴのＮ末端側配列を増幅するために、それぞれ下記のような１組のオリゴヌクレオチドを合成した。
シソＡ３ＧＴ
配列番号：５：５’−ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＴＴＣ−３’
配列番号：６：５’−ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＣＣＡ−３’
リンドウＡ３ＧＴ
配列番号：７：５’−ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＴＴＴ−３’
配列番号：８：５’−ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ−３’
プローブはノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型としてそれぞれのｃＤＮＡを含む１ｎｇのプラスミドを用い、プライマーとして、上記の各遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド１００ｎｇを使用し、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分からなる反応を１サイクルとし、これを３５サイクル行った。各遺伝子のＰＣＲ増幅産物をハイブリダイゼーションのプローブとして、上記のｃＤＮＡライブラリー（各プローブにつき約３０万ｐｆｕ）をスクリーニングした。
スクリーニングは、ノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。ハイブリダイゼーションは、３０％ホルムアミドを含む５ＸＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間行った。１次スクリーニングでシグナルが検出されたクローンについて更に２次スクリーニングを行い、最終的には１種類のｃＤＮＡ（ｐＳＰＢ１１２３）が得られた。
得られた塩基配列を配列番号：１に示し、それに対応するアミノ酸配列を配列番号：２に示した。このアミノ酸配列と既知の３ＧＴのアミノ酸配列とを比較したところ、本発明の酵素のアミノ酸配列は、シソＡ３ＧＴに対して４２％、リンドウＡ３ＧＴに対して４３％、ブドウのＡ３ＧＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：９２２４−９２３３）に対しては４４％の配列同一性を有していた。一方、既に報告されているバラのアントシアニジン５，３−糖転移酵素との同一性は２２％であった。以上のとおり、本発明の酵素は新規である。
実施例２． バラの３ＧＴ  ｃＤＮＡ候補にコードされるタンパク質の活性
ｐＳＰＢ１１２３に含まれるｃＤＮＡにコードされるタンパク質の活性を解析するために、これを酵母菌体内で発現させた。酵母内の発現には、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７、７１１−７１６）を用いた。ｐＳＰＢ１１２３のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで切り出したフラグメントをｐＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ認識配列に挿入し、酵母発現ベクターとした。これを酵母Ｇ１３１５株に挿入し、新生物学実験の手引き３（科学同人）ｐ１１４−１１８記載の方法に従いｐＳＰＢ１１２３にコードされるタンパク質の活性を測定した。
活性測定方法並びにＨＰＬＣによる生成物の測定条件はＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３２（２００３）１６５２−１６６３に記載の方法等と同様である。尚、活性測定時の基質としてアントシアニン（シアニジン、ペラルゴニジン、シアニジン３−グルコシド（シアニジン３Ｇ）、シアニジン３，５−ジグルコシド（シアニジン３，５Ｇ））、フラボノール（ケルセチン、ケンフェロール）、フラボン（アピゲニン、ルテオリン）を用いた。
この結果、ｐＳＰＢ１１２３に含まれるｃＤＮＡにコードされるタンパク質はフラボノールにグルコースを付加する顕著な活性を有し、ケンフェロールよりもケルセチンをより好む傾向が見られた。標品とのコクロマトグラフィーによって、当該生成物がフラボノールの３位配糖化物であることが確認された。シアニジンに対しても僅かにグルコースを付加するようであったが、フラボノールを基質とした場合と比べると、微量のシアニジン３−グルコシドが生成したのみであった。また、フラボンについては配糖化活性は見られなかった。したがってこのｃＤＮＡがコードする糖転移酵素はアントシアニジン３ＧＴというよりもフラボノール３ＧＴであるとわかった。また、このｐＳＰＢ１１２３に含まれるｃＤＮＡをプローブとして、同じライブラリーを再度スクリーニングしても、アントシアニジンの３位に糖を転移する酵素の遺伝子を得ることができず、バラのＡ３ＧＴを容易に得ることはできなかった。
実施例３． バラ  ゲノミックライブラリーの構築
バラ（品種ラバンデ）の花弁より、Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（アマシャム社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、λＢｌｕｅ  ＳＴＡＲ（ノバジェン社）を用いて、製造業者推奨の方法に従い、下記のようにしてゲノムライブラリーを構築した。
まず、抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後ノバジェン社推奨の方法に従い、パーシャルフィルイン反応を行い、ショ糖密度勾配遠心にて分画した。１２ｋｂから２４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、予めＸｈｏＩで切断したλＢｌｕｅＳＴＡＲベクターと連結した後、Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇキット（ストラタジーン）にてパッケージングをおこなった。約１，０００，０００ｐｆｕのゲノムライブラリーが得られた。
実施例４． バラ  Ａ３ＧＴ遺伝子のスクリーニング
すでに開示されているＧＴのうち、Ａ３ＧＴにのみ高度に保存されているＮ末端側配列に相当するＤＮＡ配列を増幅し、これをプローブとして実施例１で述べたバラのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。プローブに用いたＧＴは実施例１同様のシソ由来Ａ３ＧＴ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）３５，９１５−９２７）、リンドウ由来Ａ３ＧＴ遺伝子（（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７、７１１−７１６））に加え、キンギョソウ由来のＡ３ＧＴ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１，３７，（１９９１））、ペュニア由来Ａ３ＧＴ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４０１、（２００２））の合計４種である。シソとリンドウのＡ３ＧＴ遺伝子については実施例と同様にして、またキンギョソウとペチュニアのＡ３ＧＴ遺伝子については、それぞれＧＴのＮ末端側配列に相当するＤＮＡ配列を増幅するために、それぞれ下記のような１組のオリゴヌクレオチドを合成した。
キンギョソウＡ３ＧＴ
配列番号：９  ：５’−ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＴＴＣ−３’
配列番号：１０：５’−ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ−３’
ペチュニアＡ３ＧＴ
配列番号：１１：５’−ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＴＴＣ−３’
配列番号：１２：５’−ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ−３’
実施例１同様にして調製した各遺伝子の標識したＰＣＲ増幅産物をハイブリダイゼーションのプローブとして、実施例３に記載のバラ由来のゲノミックライブラリー（各プローブにつき約３０万ｐｆｕ）をスクリーニングした。
ライブラリーのスクリーニングはノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。ハイブリダイゼーションは、３０％ホルムアミドを含む５ＸＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間行った。１次スクリーニングでシグナルが検出されたクローンについて更に２次スクリーニングを行い、最終的にはリンドウ由来のＡ３ＧＴ遺伝子をプローブにしたものから１４個の陽性クローンを得た。リンドウ以外のＡ３ＧＴ遺伝子をプローブとしたものからは、陽性クローンは得られなかった。
実施例５． 得られたＡ３ＧＴ候補遺伝子の解析
実施例２で取得した陽性クローンからλＢｌｕｅＳＴＡＲライブラリー作製キットの製造業者推奨の方法にてプラスミドＤＮＡを回収した。クローニングされたゲノム領域のうち、何れの部分に３ＧＴ遺伝子が存在しているかを知るため、得られたプラスミドＤＮＡを、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ（以上各単独切断）、またはＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ両方の制限酵素を用いて切断した後、実施例１ならびに４で用いたのと同じリンドウのＡ３ＧＴ遺伝子由来のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。
サザンハイブリダイゼーションは、制限酵素処理した各ＤＮＡを０．８％アガロースゲルにて電気泳動したのち、前述のノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システムＤＮＡ標識及び検出キットを用い、製造者の推奨する方法に従った。得られたゲノミッククローンのうち、当該サザンハイブリダイゼーションによって強いシグナルを示したフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−ベクターにサブクローニングし、塩基配列を解析した。シークエンスはＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（アプライドバイオシステム）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって行なった。
得られたシークエンスから予想されるアミノ酸配列を他の植物で公知となっているＡ３ＧＴのものと比較した結果、クローン＃１６由来のＨｉｎｄＩＩＩ切断による約３．５ｋｂの断片（ｐＳＦＬ３３３とする）には、他の植物由来のＡ３ＧＴと高い同一性を示す配列が存在していることが明らかとなった。当該ｐＳＦＬ３３３の配列中に存在するＧＴのアミノ酸配列と他のＡ３ＧＴのアミノ酸配列の同一性は、たとえばリンドウＡ３ＧＴに対して４６％、シソＡ３ＧＴに対した４６％、ブドウのＡ３ＧＴに対しては５７％であった。また実施例１に記載のｐＳＦＬ１１２３にコードされるフラボノールの３ＧＴとのアミノ酸レベルの同一性は４２％であった。一方、既に報告されているバラのアントシアニジン５，３−糖転移酵素との同一性は２１％であった。
配列番号：３にｐＳＦＬ３３３ｃＤＮＡの全配列を示し、対応するアミノ酸配列を配列番号：４にしめす。また、このバラの３ＧＴ候補遺伝子中には、シロイヌナズナのＡ３ＧＴ（ＵＧＴ７８Ｄ１）のイントロンと対応する位置にイントロンが存在することも明らかとなった。スクリーニングで得られてきたゲノミッククローンの中には、クローン＃１６以外にもＧＴ遺伝子と考えられる配列を有するものがあったが、公知のＡ３ＧＴとは高い相同性を示さなかったことから、以後、ｐＳＦＬ３３３ｃＤＮＡに絞って解析を進めた。
実施例６． 得られたアントシアニン３ＧＴ候補遺伝子の大腸菌発現コンストラクトの作製
得られたバラの３ＧＴ候補遺伝子には配列番号：３に示すように開始メチオニンコドンから５００ｂｐほど下流に１８０ｂｐ程度のイントロンが存在していたために、大腸菌で発現させて活性を解析する際にはイントロンを除去する必要があった。
そこで（１）開始メチオニンからイントロン手前までをＲｏｓｅ３ＧＴ１６−ＮｃｏＩプライマーとＲｓｏｅ３ＧＴ１６−ＳｐｅＩ−１プライマーを用いたＰＣＲで増幅したフラグメント、（２）イントロン直後から第２エキソン内に存在するＫｐｎＩ認識配列までをＲｏｓｅ３ＧＴ−ＳｐｅＩ−３プライマーとＲｏｓｅ３ＧＴ−ＫｐｎＩプライマーを用いてＰＣＲで増幅したフラグメント、（３）第２エキソン内に存在するＫｐｎＩ認識配列から３‘非翻訳領域内に存在するＢａｍＨＩ認識配列までをゲノミッククローンから切り出したフラグメント、以上の３つのフラグメントを調整し、（２）と（３）のフラグメント、その後（１）のフラグメントの順で大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩとＢｇｌＩＩ認識配列へ挿入することにより、大腸菌発現ベクターを構築した。
なおＰＣＲにより増幅した（１）と（２）のフラグメントについては、塩基配列を確認し、連結挿入前にそれぞれＮｃｏＩとＳｐｅＩまたはＳｐｅＩとＫｐｎＩで切断した。得られた大腸菌発現ベクターをｐＳＦＬ３４４とした。以下に、（１）と（２）のフラグメントの増幅に用いたプライマーの配列を記す。
配列番号：１３：Ｒｏｓｅ３ＧＴ１６−ＮｃｏＩ  ５’−ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  Ｃ−３’
配列番号：１４：Ｒｏｓｅ３ＧＴ１６−ＳｐｅＩ−１  ５’−ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  Ｇ  −３’
配列番号：１５：Ｒｏｓｅ３ＧＴ１６−ＳｐｅＩ−３  ５’−ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＴＧ−３’
配列番号：１６：Ｒｏｓｅ３ＧＴ１６−ＫｐｎＩ  ５’−ＣＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  −３’
実施例７． バラ  アントシアニン３ＧＴの活性測定
発現用コンストラクトｐＳＦＬ３４４およびｐＱＥ６１を大腸菌株ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に導入し、３７℃で終濃度２０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩前培養した。前培養液の一部をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ，カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地、１０ｍｌに加え約２時間、Ａ６００＝０．６−１．０に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．１ｍＭになるよう加え、さらに３７℃で４時間振とう培養した。３０００ｒｐｍ，１０分間、４℃で遠心し、集菌した菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を破砕した後、１５，０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とし、以下の活性測定に用いた。
反応は３０μｌの粗酵素液、１０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５μｌの５ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、５μｌの２ｍＭデルフィニジンまたはシアニジンを混合し、３０度で１５分間保持することにより行なった。０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルを等量加えて反応を停止したのち、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２（２００３）１６５２−１６６３に記載の方法と同様にして配糖化物を検出した。ｐＳＦＬ３４４を発現させた大腸菌由来の粗酵素液を用いた反応系では、ｐＱＥ６０を導入した大腸菌由来の粗酵素液を用いた反応では見られない特異的な生成物が検出された。標品とのコクロマトおよび標品の吸収スペクトルとの一致により、当該生成物がデルフィニジン３−グルコシドまたはシアニジン３−グルコシドであることを同定した。
以上の結果から、ｐＳＦＬ３３３にコードされる遺伝子はアントシアニンの３位に糖を付加する活性を有するＡ３ＧＴをコードするものであることが確認された。
実施例８． ｐＳＰＢ１１２３  ｃＤＮＡにコードされるフラボノール３ＧＴのバラにおける発現抑制
上記で述べたバラのアントシアニンの３ＧＴ（Ａ３ＧＴ）およびフラボノールの３ＧＴ（Ｆ３ＧＴ）のバラ花弁における発現を抑制した場合の効果について検討するため、それぞれの３ＧＴの発現並びに両３ＧＴの発現を同時に抑制するためのコンストラクトを作製した。まず、ｐＳＰＢ１１２３にコードされるフラボノールの３ＧＴであるが、（１）５’側のベクター由来のＳａｃＩ認識配列認識配列からｃＤＮＡの５’末端から９００ｂｐ付近に存在するＳｐｈＩ認識配列まで、および（２）５’側のベクター配列に由来するＢａｍＨＩ認識配列からｃＤＮＡの５’末端から約７５０ｂｐの位置にＰＣＲにより挿入したＳｐｈＩ認識配列までのフラグメントを調製した。
（２）のフラグメントは、常法に従い下記のプライマー（ｐＳＰＢ１１２３−ＳｐｈＩプライマーおよびベクター配列に由来するリバースプライマー）を用いたＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断することにより調製した。
配列番号：１７：ｐＳＰＢ１１２３−ＳｐｈＩ  ５’−ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  Ｔ−３’
配列番号：１８：リバースプライマー  ５’−ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’
特許公開（ＷＯ２００５／０１７１４７）に記載の植物での発現用バイナリーベクターｐＳＰＢ５２８のＥ１２３５Ｓプロモーターとｍａｓターミネーターの間のＧＵＳ遺伝子をＢａｍＨＩとＳａｃＩ切断により除き、このＤＮＡ断片と、（１）と（２）のＤＮＡフラグメントの計３つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＳＦＬ２２４を得た。このようにして得られたプラスミドｐＳＦＬ２２４はバラに導入された場合、Ｅ１２３５Ｓプロモーターの制御下に構成的に、ｐＳＰＢ１１２３が有するフラボノール３ＧＴｃＤＮＡに由来する二本鎖ＲＮＡを転写する。その結果、ＲＮＡｉによりバラのフラボノール３ＧＴの発現を抑制されることが期待される。
実施例９． ｐＳＦＬ３３３  ｃＤＮＡにコードされるＡ３ＧＴのバラにおける発現抑制
ｐＳＦＬ３３３にコードされるアントシアニンの３ＧＴは、（１）５’末端から５０ｂｐ付近に存在するＸｈｏＩ認識配列から８３５ｂｐ付近に存在するＳｐｅＩ認識配列までのフラグメント、（２）５’側のベクター配列に由来するＢａｍＨＩ認識配列からｃＤＮＡの５’末端から約６３０ｂｐ付近に存在するＳｐｅＩ認識配列のフラグメント、以上のフラグメントをそれぞれの制限酵素切断後、電気泳動しゲルから回収することにより調製した。（１）のフラグメント調製の際は、ＳｐｅＩ切断は消化時間を制限した部分分解により行なった。
一方、ｐＢＩＮＰＬＵＳ（Ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（１９９５）２８８−２９０）のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ認識配列に、特許公開（ＷＯ  ２００５／０１７１４７）に記載のベクターｐＵＥ８から切り出したＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩ認識配列までの断片（Ｅ１２３５Ｓプロモーターからｎｏｓターミネーターに至る）を挿入したプラスミドをｐＳＰＢ１７６とした。これをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩし、ＧＵＳ遺伝子を除いたＤＮＡ断片と、上記の（１）ならびに（２）の断片の計３つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＳＦＬ２２３を得た。得られたプラスミドｐＳＦＬ２２３はバラに導入された場合、Ｅ１２３５Ｓプロモーターの制御下に構成的にｐＳＦＬ３３３に含まれるＡ３ＧＴ  ｃＤＮＡに由来する二本鎖ＲＮＡを転写する。その結果、ＲＮＡｉによりバラのＡ３ＧＴの発現を抑制されることが期待される。
実施例１０． ｐＳＰＢ１１２３およびｐＳＦＬ３３３ｃＤＮＡにコードされる両３ＧＴのバラにおける発現抑制
ｐＳＦＬ１１２３ならびにｐＳＦＬ３３３にコードされる両方の３ＧＴ活性を抑制するためのコンストラクトを作製した。特許（ＷＯ／２００５／０５９１４１）に記載のベクターｐＳＰＢ３１３をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、Ｆ３ＨｃＤＮＡを除いた後、このＤＮＡフラグメントと実施例９に記載の（１）と（２）のフラグメントを連結し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ２２５とした。ＰＳＦＬ２２５をＡｓｃＩ切断して得られるプロモーターからターミネーターに至る断片を実施例９で作製したｐＳＦＬ２２３のＡｓｃＩ認識配列に、ｐＳＦＬ２２３の発現カセットと同じ転写の向きになるように挿入して得られるコンストラクトをｐＳＦＬ２２６とした。
該ｐＳＦＬ２２６はバラに導入された場合、Ｅ１２３５Ｓプロモーターの制御下に、ｐＳＦＬ１１２３ならびにｐＳＦＬ３３３  ｃＤＮＡに由来する二本鎖ＲＮＡを転写する。その結果、ＲＮＡｉによりバラのフラボノールならびにアントシアニジン３ＧＴの両方の発現が抑制されることが期待される。
実施例１１． ｐＳＰＢ１１２３にコードされるＦ３ＧＴ遺伝子のバラにおける発現様式の解析
ｐＳＰＢ１１２３にコードされるＦ３ＧＴ遺伝子のバラにおける発現様式を解析するため、バラ品種ブラックバカラ、ローテローゼ、メデオ、マダムビオレ、およびラバンデの着色中（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６，１０２３−１０３１）の花弁からＲＮＡを抽出し、公知の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６，１０２３−１０３１）でノザンハイブリダイゼーションを行った。ノザンハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、製造業者の推奨する方法に従い行った。プローブには、ＤＩＧラベルしたＦ３ＧＴ遺伝子配列に由来するＲＮＡプローブを用いた。いずれの品種でも期待される長さの転写産物が検出された（図１）。
実施例１２． ｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴ遺伝子のバラにおける発現様式の解析
ｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴ遺伝子のバラにおける発現様式を解析するため、バラの花弁からＲＮＡを抽出し、ノザンハイブリダイゼーションを行った。ノザンハイブリダイゼーションは実施例１１に記載と同様に、ＤＩＧラベルしたＡ３ＧＴ遺伝子配列に由来するＲＮＡプローブを用いておこなった。
ブラックバラ、ローテローゼ、ラバンデ、メデオ、マダムビオレ、ローテローゼなどの品種においては、着色中の花弁で通常アントシアニン合成に関与する構造遺伝子が高いレベルで発現している蕾のステージ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６，１０２３−１０３１）においても、転写産物は殆ど検出されなかった（図１）。これらの品種のバラにおけるアントシアニン分析を行うと、通常、蕾から開花直後の花弁においては、わずかにシアニジン３Ｇが含まれているものの、シアニジン３，５Ｇがほぼ単一の生成物として存在する。
一方、品種絵日傘（京阪園芸株式会社）や品種チャールストンといった開花に従い花色が変化するバラにおいては、当初のオレンジ色がかった黄色の花弁では、上記の品種同様にシアニジン３，５Ｇが多いが、その後、開花に従い赤く着色する段階ではシアニジン３Ｇが大量に蓄積してくる事が明らかとなった（図２）。
そこで、このように開花に伴い色が変化するバラ、たとえば絵日傘の若い蕾から開花後、老化が始まる段階までの花弁（図２）からＲＮＡを抽出し、上記同様にしてｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴ遺伝子配列に由来するＲＮＡプローブを用いてノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、本Ａ３ＧＴは開花後に色変わりが始まる段階から赤色の着色が進む段階、言い換えればシアニジン３Ｇが蓄積する段階において顕著に発現していることが明らかとなった（図３）。
また、上記同様にして、アントシアニン合成に関与する構造遺伝子として作用するバラのカルコン合成酵素（ＣＨＳ）、ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、フラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３′Ｈ）、それぞれの遺伝子配列に由来するＲＮＡプローブを用いてノザンハイブリダイゼーションを行った結果、これらの遺伝子も本Ａ３ＧＴが発現するステージ４の段階で強く発現していることが明らかとなった（図４）。ＣＨＳ、ＤＦＲ、Ｆ３′Ｈ、いずれの遺伝子も、Ａ５，３ＧＴ遺伝子が高レベルに発現しているステージ１よりもむしろシアニジン３Ｇが蓄積し花弁が殆ど赤くなるステージ４の段階において高いレベルで発現していた。このことから、絵日傘など開花後の色変わりが見られる品種では、通常のバラにおいて最もアントシアニン合成が盛んである蕾の段階（ステージ１）よりも、開花後、老化が顕著になり始めた段階（ステージ４）の花弁において、アントシアニン合成系全体が活性化されるものと考えられる。
さらに上記の結果から、本Ａ３ＧＴ遺伝子のプロモーターなど転写調節領域には、開花後のステージの進んだ花弁で遺伝子を特異的に発現させる働きがあることが予測される。よって、配列番号３で示したＡ３ＧＴのプロモーター部分の配列に色素合成系遺伝子のコード領域を結合し、適当なバラへ導入すれば、開花後に色が変化するバラが作出することが可能と考えられる。たとえば、Ａ３ＧＴのプロモーター部分の配列にパンジーのＦ３′，５′ＨのｃＤＮＡ（国際公開公報ＷＯ  ２００４  ０２０６３７）を連結し、適当なバラの品種に導入すれば、開花に従い青色のデルフィニジンが合成され、花色が青色に変化していくバラが作出できると考えられる。
実施例１３． ｐＳＰＢ１１２３にコードされているＦ３ＧＴの抑制コンストラクトを導入したバラ形質転換体の解析
実施例８のようにして、ｐＳＰＢ１１２３にコードされるＦ３ＧＴの発現を抑制するためにｐＳＦＬ２２４をバラ品種ラバンデに導入した。数系統の形質転換体では、宿主と比較して花の色が薄くなった、あるいは白く変化した（図５）。このような変化が見られた系統について、花のフラボノイド含量をＨＰＬＣで分析した結果、宿主花弁が含有するアントシアニンのほぼ１００％を占めるシアニジン３，５Ｇの含量が形質転換体では約６分の１程度に減少していた。また、フラボノール含量はコントロールの２倍程度に増加していた。またロザシアニンの含有量については変化がなかった。
花弁の色に変化が見られた形質転換体の花弁からＤＮＡを抽出し、Ｆ３ＧＴ遺伝子の抑制コンストラクトであるｐＳＦＬ２２４が導入されている事を確認した。
さらに、花弁の色に変化が見られた形質転換体＃２２４−３０、および宿主ラバンデの花弁よりＲＮＡを抽出し、Ｆ３ＧＴ遺伝子の全長、Ｆ３ＧＴ遺伝子の３′側６００ｂｐ、およびパラＡ５，３ＧＴ遺伝子、それぞれの配列に由来するＲＮＡプローブを用いてノザンハイブリダイゼーションを行った（図６）。Ｆ３ＧＴ遺伝子全長の配列とプローブにした場合、Ｆ３ＧＴの転写産物は、形質転換体において宿主より高かった（図６）しかし、内在性のＦ３ＧＴ遺伝子の一部ではあるがｐＳＦＬ２２４の中には含まれない部分、すなわち内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子に特異的な部分をプローブとした場合には、宿主での転写産物は検出されたが、形質転換体においては何らの転写産物も検出されなかった。ここでプローブに用いた内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子特異的な部分とは、ｐＳＦＬ２２４に含まれない部分であり、Ｆ３ＧＴ遺伝子の開始メチオニンコドンから約９００ｂｐのところに位置するＳｐｈＩ認識部位から３’末端側約６００ｂｐの断片である。このことから、ｐＳＦＬ２２４を導入した形質転換体においては内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子の発現は抑制されているが、導入したｐＳＦＬ２２４のＦ３ＧＴ配列に由来する転写物が高レベルで存在しているものと考えられる。また形質転換体においては本来転写されるべき配列とは長さの異なる転写産物が検出された。
一方、Ａ５，３ＧＴの転写産物量は、花弁の色が薄く変化した形質転換体において著しく減少していた。ポジテイブコントロールとして用いたバラのＧＡＰＤＨ遺伝子の発現はいずれの系統でも一定であった（図６）。
以上の結果から、Ｆ３ＧＴ遺伝子の発現抑制コンストラクトｐＳＦＬ２２４導入によって、内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子の発現が抑制された上、アントシアニンの生成に必須といわれる内在性Ａ５，３ＧＴ遺伝子の発現までも抑制され、その結果、形質転換体花弁におけるアントシアニン量が減少し花色がうすく変化したものと考えられる。ＲＮＡｉコンストラクトの導入により標的遺伝子の発現を抑制する場合、ＲＮＡｉコンストラクト自身の転写産物も標的遺伝子の転写産物と同調して減少・消滅するのが一般的であるが、本事案においては標的遺伝子（バラの内在性Ｆ３ＧＴ遺伝子）の発現は抑制されたものの、導入したｐＳＦＬ２２４由来のＦ３ＧＴ配列が過剰発現したものと考えられる。
実施例１４． ｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴの発現抑制コンストラクトを導入したバラ形質転換体の解析
実施例９のようにして、ｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴの発現を抑制するためにｐＳＦＬ２２３をバラ品種ラバンデに導入した。約３０個体の形質転換体を得たが花の色に変化が見られたものはなかった。また、このうち５個体についてＨＰＬＣによる色素分析をおこなったが、開花直後の花弁においては、含有されるアントシアニン、ロザシアニン含量ともにコントロールと比べて差異はなかった。
また、実施例１２で述べたように、宿主ラバンデにおいてはｐＳＦＬ３３３にコードされるＡ３ＧＴは殆ど発現していないか、あるいはノザンで転写産物が確認できないくらい低いレベルにしか発現していない（図１）。よって形質転換体におけるＡ３ＧＴ遺伝子の転写産物の有無をノザンハイブリダイゼーションで解析したが、形質転換体においても、宿主同様、何ら転写産物は検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
実施例１３に示すように、ｐＳＦＬ１１２３にコードされるバラのＦ３ＧＴ遺伝子は、バラにおいてアントシアニン合成を抑制し、色変わりのバラを作出するために用いることができる。
一方、ｐＳＦＬ３３３にコードされるバラのＡ３ＧＴ遺伝子は、絵日傘などの色変わり品種のバラにおいて、初期の蕾の段階でのアントシアニン合成ではなく、開花後、色が変化する段階のアントシアニン合成に特異的に関与していることが明らかとなった。このことから、本Ａ３ＧＴ遺伝子、特にそのプロモーター領域は、遺伝子組換えによって開花に従い色が変化していく花を作出するために用いることができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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