(57)【要約】  本発明は、ラキヌム属に属する菌及び／又はシュードエゲリタ属に属する菌を培養し、該培養物からセルコスポラミドを回収することを特徴とする、セルコスポラミドの製造方法を提供する。また、本発明は、該製造方法によって取得されたセルコスポラミドを提供する。また、本発明は、新規微生物、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株及びラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）ＳＡＮＫ  １１００６株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌を培養し、その培養物よりセルコスポラミドを回収することを特徴とする、セルコスポラミドの製造方法。
【請求項２】
ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌が、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）及びラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌であることを特徴とする、請求項１に記載のセルコスポラミドの製造方法。
【請求項３】
ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌が、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株及びラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌であることを特徴とする、請求項１に記載のセルコスポラミドの製造方法。
【請求項４】
シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌を培養し、その培養物よりセルコスポラミドを回収することを特徴とする、セルコスポラミドの製造方法。
【請求項５】
シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌が、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）であることを特徴とする、請求項４に記載のセルコスポラミドの製造方法。
【請求項６】
シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌が、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株であることを特徴とする、請求項４に記載のセルコスポラミドの製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたセルコスポラミド。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたセルコスポラミドを有効成分として含有する医薬。
【請求項９】
ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株。
【請求項１０】
ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株。
【請求項１１】
ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株。
【請求項１２】
シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）ＳＡＮＫ  １１００６株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属及び／又はシュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌を用いたセルコスポラミドの製造方法、該製造方法によって製造されたセルコスポラミド、並びに、セルコスポラミドを製造する菌等に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルコスポラミド（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ）は真菌類セルコスポリデウム・ヘニングシー（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｈｅｎｉｎｇｓｉｉ）の培養液から単離された天然物質である（米国特許第4983587号公報、The Journal of Organic Chemistry、1991年、第56巻、p.909-910、Tetrahedron、1992年、第48巻、p.4757-4766、及びMolecular and Cellular Biology、1994年、第14巻、p.1017-1025参照。）。【０００３】
セルコスポラミドは抗真菌活性を有していることが知られている。また、セルコスポラミドの誘導体の中にはセルコスポラミドと同様に、抗真菌活性を有するものも知られている（米国特許第4983587号公報）。【０００４】
セルコスポラミドはその誘導体を合成するための前駆体としても有用であり、より効率的な生産方法が求められていた。【０００５】
セルコスポラミドを生産する微生物としては真菌類セルコスポリデウム・ヘニングシーが知られていたが、ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属及びシュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌がセルコスポラミドを生産することは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの目的は、微生物を用いたセルコスポラミドの製造方法を提供することである。本発明の他の１つの目的は、該製造方法によって製造されたセルコスポラミドを提供することである。本発明の他の１つの目的はセルコスポラミドを製造する微生物を提供することである。【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行ったところ、ラキヌム属及びシュードエゲリタ属に属する菌がセルコスポラミドを産生することを見出し、該菌を用いてセルコスポラミドを製造する方法を見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌を培養し、その培養物よりセルコスポラミドを回収することを特徴とする、セルコスポラミドの製造方法、
（２）ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌が、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）及びラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌であることを特徴とする、（１）に記載のセルコスポラミドの製造方法、
（３）ラキヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する菌が、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株及びラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌であることを特徴とする、（１）に記載のセルコスポラミドの製造方法、
（４）シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌を培養し、その培養物よりセルコスポラミドを回収することを特徴とする、セルコスポラミドの製造方法、
（５）シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌が、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）であることを特徴とする、（４）に記載のセルコスポラミドの製造方法、
（６）シュードエゲリタ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ）属に属する菌が、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株であることを特徴とする、（４）に記載のセルコスポラミドの製造方法、
（７）（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたセルコスポラミド、
（８）（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたセルコスポラミドを有効成分として含有する医薬、
（９）ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、
（１０）ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株、
（１１）ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株、
（１２）シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）ＳＡＮＫ  １１００６株、
からなる。【０００９】
本明細書において、「セルコスポラミド（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ）」とは、下記式（Ｉ）、【００１０】
【化１】
2007018194.tif 000002
【００１１】
（Ｉ）
で表される化合物をいう。【００１２】
セルコスポラミドは下記の物理化学的性質を示す。
１）物質の性状：弱酸性脂溶性黄褐色粉末
２）分子式：Ｃ１６Ｈ１３ＮＯ７
３）分子量：３３１（ＥＩマススペクトル法により測定）
４）高分解能ＥＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ]＋（Ｃ１６Ｈ１３ＮＯ７として）は次に示す通りである。
実測値：３３１．０６９０
計算値：３３１．０６９２
５）比旋光度：[a]Ｄ２５  −３９６．４°（c ０．５１,  アセトニトリル）
６）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（δ，ppm）
重クロロホルム中、その残存プロトンシグナル（７．２７ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は次に示す通りである。
1.75(3H, s), 2.68(3H, s), 5.99(1H, s), 6.26(1H, s), 6.38(1H, s), 6.96(1H, s), 10.55(1H, s), 12.98(1H, s), 18.83(1H, s)
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（δ，ppm）
重クロロホルム中、重クロロホルムのシグナル（７７．２３ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は次に示す通りである。
27.9(q), 32.1(q), 58.8(s), 94.0(s), 99.4(d), 101.5(d), 104.0(s), 105.6(s), 155.2(s), 158.1(s), 166.1(s), 169.8(s), 178.2(s), 191.8(s), 197.7(s), 201.9(s)
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、セルコスポラミドの製造方法、該方法によって製造されたセルコスポラミド、及びセルコスポラミドを製造するラキヌム属及びシュードエゲリタ属に属する菌が提供された。セルコスポラミドを生産する菌としてはより具体的には、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株、ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株が提供された。セルコスポラミドはそれ自体抗真菌剤として有用である他、セルコスポラミドの誘導体を製造するための前駆体としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．セルコスポラミド生産菌
本発明者らは、セルコスポラミドを生産する微生物を広く検索した結果、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株、ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株の培養物中にセルコスポラミドを見出した。【００１５】
セルコスポラミド生産菌としては、ラキヌム属又はシュードエゲリタ属に属する菌であれば特に制限されないが、好適にはラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）、ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）、及びシュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌であり、更に好適には、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株（以下「ＳＡＮＫ  １９０９６株」という）、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７  株（以下「ＳＡＮＫ  １２４９７株」という）、ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株（以下「ＳＡＮＫ  １０９０６株」という）、及び、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株（以下「ＳＡＮＫ  １１００６株」という）からなる群から選択される少なくともいずれか一つの菌である。【００１６】
以下に、ＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株の菌学的性質を示す。【００１７】
菌学上の特徴を記載するにあたり、コロニー色調の表示は「コーネルップ  アンド  ヴァンシャー  （１９７８）メチューン  ハンドブック  オブ  カラー  第三版、エリー  メチューン、ロンドン、イギリス、１−２５２；（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ，  Ａ  ＆  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，  ＪＨ  （１９７８）  Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ．  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｅｙｒｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ，  １−２５２））」に従った。【００１８】
各菌株の培養下での菌学的性状の観察には以下の各培地を使用した。【００１９】
ポテトデキストロース寒天（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ）培地（以下、「ＰＤＡ培地」という）：ニッスイ・ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）  ３９ｇを蒸留水  １０００ｍｌに溶解させ、１２１℃にて１５分間滅菌したのちプレートを作製する。【００２０】
改良ワイツマン  アンド  シルバ−ヒュンター（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｗｅｉｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ−Ｈｕｔｎｅｒ）培地（以下「ＷＳＨ培地」という）：日食オートミール  １０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、硝酸ナトリウム  １ｇ及び寒天  ２０ｇを蒸留水  １０００ｍｌに溶解させ、１２１℃にて１５分間滅菌したのちプレートを作製する。【００２１】
マルトエキス寒天（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ）培地（以下「ＭＥＡ培地」という）：マルトエキス  ２０ｇ、ポリペプトンペプトン（日本製薬）  １ｇ、グルコース  ２０ｇ及び寒天  ２０ｇを蒸留水  １０００ｍｌに溶解させ、１２１℃にて１５分間滅菌したのちプレートを作製する。【００２２】
コーンミール寒天（Ｃｏｒｎ  Ｍｅａｌ  Ａｇａｒ）培地（以下、「ＣＭＡ培地」という）：ニッスイ・コーンミールアガール（日水製薬（株）製）  １７ｇを蒸留水  １０００ｍｌに溶解させ、１２１℃にて１５分間滅菌したのちプレートを作製する。【００２３】
アブドゥラのマルトエキス寒天（Ａｂｄｕｌｌａｈ’ｓ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ）培地（以下「ＡＭＥＡ培地」という）：マルトエキス  ０．７６ｇ、グリセリン  ０．１４ｇ、デキストリン  ０．１６ｇ、ＧＥ９０Ｍ（ディーエムヴィ社製）  ０．０４６ｇ及び寒天  １５ｇを蒸留水  １０００ｍｌに溶解させ、１２１℃にて１５分間滅菌したのちプレートを作製する。【００２４】
ＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、及び、ＳＡＮＫ  １０９０６株では、ＰＤＡ培地、ＷＳＨ培地、ＣＭＡ培地、及びＭＥＡ培地をＳＡＮＫ  １１００６株ではＰＤＡ培地、ＷＳＨ培地、ＣＭＡ培地、及び、ＡＭＥＡ培地を使用した。
（１）  ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株
ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株は、ラキヌム・エスピー（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＮＫ  １９０９６株として、日本国長野県で採集された落葉に生じていた子実体から分離された。【００２５】
ＳＡＮＫ  １９０９６株の分離に用いた子実体乾燥標本の菌学的性状を以下に記す。
子のう盤は短柄、水で戻した時は、高さ２６３μｍ、直径約５５７μｍ、盤面は浅い凹状で、淡褐色を呈す。乾燥時は縁が内側に褶曲し、直径は４９９μｍで、淡褐色を呈す。托外皮層は方形菌糸組織様を呈し、淡褐色から褐色を呈し、厚壁の細胞からなり、最外層から毛様の短い突起あるいは毛を形成する。托髄層は密な交錯菌糸組織からなり、無色である。毛は円筒形で、真直あるいはやや湾曲し、先端は鈍頭、隔壁を有し、表面に粒状を有し、褐色を呈し、幅４．５−６μｍ、長さ７１−７６μｍである。毛先端部には希に結晶が付着する。柄は円筒形で、淡褐色を呈し、長さ１１５μｍである。子のうは無弁で、円筒状棍棒形であり、８胞子を含み、その大きさは３０−４３×３．５−５μｍである。子のうの先端はメルツァー試薬によって青変する。側糸は槍先状で、無隔壁、希に１−２隔壁、無色、長さ５０．９−６８．７μｍで、最も太い部分で２．７−４．１μｍ、子のう先端より９．１−１６．５μｍ長くのびる。子のう胞子は紡錘形から長楕円形で、無隔壁であり、無色、その大きさは５．５−８．５×１．３−２．２μｍである。【００２６】
ＳＡＮＫ  １９０９６株は前記各培地上で以下のような菌学的性状を示す。【００２７】
ＰＤＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  １９−２１ｍｍとなる。コロニーはビロード状から綿毛状で、中心部に向かって隆起した菌糸層よりなり、赤灰色（Ｒｅｄｄｉｓｈ  Ｇｒｅｙ（１１Ｂ２））から白色を呈する。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、中心部では灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ Ｏｒａｎｇｅ（５Ｂ４））で、縁辺部では白色を呈し、放射状のしわを有する。可溶性色素は観察されない。菌糸は有隔壁、分枝し、無色、１．５−３．５μｍとなる。【００２８】
ＷＳＨ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  ２９−３１ｍｍとなる。コロニーは羊毛状からビロード状で、薄い菌糸層よりなり、白色を呈する。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、白色を呈する。可溶性色素は観察されない。【００２９】
ＣＭＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  ３３−３４ｍｍとなる。コロニーは極めて薄い菌糸層のみで、無色となる。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、無色となる。可溶性色素は観察されない。【００３０】
ＭＥＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  ２１−２２ｍｍとなる。コロニーは中心部で綿毛状、縁辺部に向けて菌糸が密集しビロード状となり、灰黄色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｙｅｌｌｏｗ  （４Ｃ４））から黄白色（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  Ｗｈｉｔｅ（４Ａ１））を呈し、気中菌糸の密集した部分では白色を呈す、縁辺部は基底菌糸のみで茶橙色（Ｂｒｏｗｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ  （５Ｃ３））から黄灰色（Ｏｒａｎｇｅ  Ｇｒｅｙ（５Ｃ２））を呈する。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、黄茶色（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  Ｂｒｏｗｎ（５Ｄ６））から灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ（５Ｂ３））を呈し、縁辺部で白色を呈する。可溶性色素は観察されない。【００３１】
以上のような菌学的特徴はスプーナーの文献（「スプーナー（１９８７）ビブリオテカ  ミコロギカ、１１６：１−７１１」（Ｓｐｏｏｎｅｒ，ＢＭ（１９８７）  Ｂｉｂｌｉｏｔｈｃａ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｉｃａ  １１６：１−７１１））のラキヌム属の記載に一致した。したがって、本菌をラキヌム・エスピー（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｓｐ．）と同定し、ラキヌム・エスピー（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｓｐ．）  ＳＡＮＫ  １９０９６株と命名した。【００３２】
ＳＡＮＫ１９０９６株は、さらに、デニスの文献（「デニス（１９４９）マイコロジカル  ペーパーズ  ３２：１−９７」（Ｄｅｎｎｉｓ，  ＲＷＧ  （１９４９）  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｐｅｒｓ  ３２：１−９７））のダシスキファス・フセッセンス（Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ  （Ｐｅｒｓ．）  Ｇｒａｙ）及び、タナカとホソヤの文献（「タナカ＆ホソヤ（２００１）マイコサイエンス４２：５９７−６０９」  （Ｔａｎａｋａ，Ｉ  ＆  Ｈｏｓｏｙａ，Ｔ  （２００１）  Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４２：５９７−６０９））のラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ  （Ｐｅｒｓ．）  Ｐ．Ｋａｒｓｔ．）の種の記載とわずかな例外を除いて一致した。ダシスキファス・フセッセンスは現在ではラキヌム・フセッセンスの異名とされている。また、バラールとクレグルステイナーの文献（「バラール＆クレグルステイナー（１９８５）バイヘフテン  ツーア  ツァイトシュリフト  フォー  ミコロギー６：１−１６０」  （Ｂａｒａｌ，ＨＯ  ＆  Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎｅｒ，ＧＪ  （１９８５）  Ｂｅｉｈｅｆｔｅ  ｚｕｒ  Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆuｒ  Ｍｙｋｏｌｏｇｉｅ  ６：１−１６０））では、ラキヌム・フセッセンスのように毛が茶色のラキヌム属の種に対して新属ブルンニピラ（Ｂｒｕｎｎｉｐｉｌａ）属を設立しラキヌム属とは別属として取り扱っている。そして、バラールとクレグルステイナーの文献の中でラキヌム・フセッセンスはブルンニピラ・フセッセンス（Ｂｒｕｎｎｉｐｉｌａ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ  （Ｐｅｒｓ．）  Ｂａｒａｌ）の異名として扱われている。しかし、この考え方は広くは受け入れられておらず、カークらの著書「カークら編（２００１）アインスワース  アンド  ビスビー’ズ  ディクショナリー  オブ  フンギ  ９版、ＣＡＢＩインターナショナル、ウォリンフォード、イギリス、１−６５５」  （Ｋｒｉｋ，ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ  ９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＣＡＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ  ，ＵＫ，  １−６５５））ではブルンニピラ属はラキヌム属の異名として取り扱われている。したがって、本特許では、タナカとホソヤの文献に従いＳＡＮＫ  １９０９６株をラキヌム・フセッセンスと同定して、ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）ＳＡＮＫ  １９０９６と命名した。【００３３】
ＳＡＮＫ  １９０９６株は、Ｌａｃｈｎｕｍ  ｓｐ．ＳＡＮＫ  １９０９６として、２００５年５月２４日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３８が付与された。
（２）ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株
以下にＳＡＮＫ  １２４９７株の菌学的性質を示す。【００３４】
ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７株は、日本国鳥取県で採集された草本の枯れた茎に生じていた子実体から分離された。【００３５】
ＳＡＮＫ  １２４９７株の分離に用いた子実体乾燥標本の菌学的性状を以下に記す。
子のう盤は、散在又は集合性、有柄、乾燥時は縁が内側に褶曲し、高さ１２７１−１８１７μｍ、直径４３７−９１３μｍ、盤面は灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ（６Ｂ４））、毛は明茶色（Ｌｉｇｈｔ  Ｂｒｏｗｎ（７Ｄ４））から暗茶色（Ｄａｒｋ  Ｂｒｏｗｎ（７Ｆ７））、柄及び托外皮層は灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ（６Ｂ４））を呈する。托外皮層は方形菌糸組織様で、無色から褐色を呈し、厚壁の細胞からなり、最外層から毛様の短い突起あるいは毛を形成する。托髄層は密な交錯菌糸組織からなり、無色である。毛は円筒形で、真直あるいはやや湾曲し、先端は鈍頭、隔壁を有し、表面は粒状、褐色、幅３．８−５．５μｍ、長さ５８．１−１１１．６μｍである。毛先端部に付着物質があり、しばしばその上に子のう胞子が付着している。柄は円筒形で、長さ９０８−１３７４μｍ、直径１７０−２０５μｍ、無色から褐色を呈する。子のうは無弁で、円筒状棍棒形であり、先端は円錐形で、８胞子を含み、その大きさは６９．３−８０．２×３．９−６．８μｍである。子のうの先端は３％  ＫＯＨ処理後、メルツァー試薬によって青変する。側糸は槍先状で、通常無隔壁、まれに１−３隔壁、無色、長さ９８．１−１３０．２μｍで、最も太い部分で４．４−７．０μｍ、子のう先端より１３．５−３６．０μｍ長くのびる。子のう胞子は紡錘形から長楕円形で、無隔壁であり、無色、その大きさは８．８−１５．６×１．８−３．０μｍである。【００３６】
ＳＡＮＫ  １２４９７株は各培地上で以下のような菌学的性状を示す。【００３７】
ＰＤＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  ２１−２５ｍｍとなる。コロニーはビロード状から綿毛状で、中心部に向かってやや隆起した菌糸層よりなり、赤茶色（Ｒｅｄｄｉｓｈ  Ｂｒｏｗｎ（８Ｅ２））から灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ  （５Ｂ３））を呈する。コロニー周縁部は不規則に切れ込む。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、中心部で暗茶色（Ｄａｒｋ  Ｂｒｏｗｎ（６Ｆ４））から灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ  （５Ｂ３））で、周縁部で白色を呈し、放射状のしわを有する。可溶性色素は生産されない。菌糸は有隔壁、分枝し、無色から淡褐色を呈し、１．３−２．６μｍとなる。【００３８】
ＷＳＨ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径３２−３４ｍｍとなる。コロニーは薄い菌糸層よりなり、明黄色（Ｌｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（２Ａ５））から白色を呈する。コロニー周縁部は全縁となる。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は表面と同色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００３９】
ＣＭＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  ３３−３５ｍｍとなる。コロニーは極めて薄い菌糸層のみで、無色である。コロニー周縁部は全縁となる。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は表面と同色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００４０】
ＭＥＡ培地でのコロニーは、２３℃、２１日間の培養で直径  １８−２７ｍｍとなる。コロニーは薄いビロード状で、周縁部に向けて放射状のしわを有し、灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  ｏｒａｎｇｅ  （５Ｂ６））から明黄色（Ｌｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  （３Ａ４））を呈する。コロニー周縁部はまれに緩やかに切れ込む。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は、灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ  （５Ｂ６））から橙灰色（Ｏｒａｎｇｅ  Ｇｒｅｙ  （５Ｂ２））、周縁部で白色を呈する。可溶性色素は生産されない。
以上のような菌学的特徴はスプーナーの文献（「スプーナー（１９８７）ビブリオテカ  ミコロギカ１１６：１−７１１」  Ｓｐｏｏｎｅｒ，  ＢＭ  （１９８７）Ｂｉｂｌｉｏｈeｃａ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ  １１６：１−７１１））のラキヌム属の記載に一致した。さらに、レームの著書（「レーム（１８９６）  ドクター  ラーベンホルストズ  クリプトガーメン−フロラ  ボン  ドイチュラント  オーストリッチ  ウント  デル  シュヴァイツ  ツヴァイト  アオフラーゲ、ヴォル  １巻  ＩＩＩ、アブテイリルング：アスコミセーテン  ウント  ディスコミセーテン、  エドアルド  クマー、ライプチヒ、ジャーマニー、１−１２７５」（Ｒｅｈｍ，Ｈ  （１８９６）  Ｄｒ．  Ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ’ｓ  Ｋｒｙｐｔｏｇａｍｅｎ−Ｆｌｏｒａ  ｖｏｎ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ，  Ｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈｓ  ｕｎｄ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  Ｚｗｅｉｔｅ  Ａｕｆｌａｇｅ．  Ｖｏｌ．  １．  ＩＩＩ．  Ａｂｔｈｅｉｌｕｎｇ：  Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｎ：  Ｈｙｓｔｅｒｉａｃｅｅｎ  ｕｎｄ  Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｎ，  Ｅｄｕａｒｄ  Ｋｕｍｍｅｒ，  Ｌｅｉｐｚｉｇ．  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １−１２７５）のラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ  （Ｒｅｈｍ）  Ｒｅｈｍ）、ブライテンバッハとクランゼリンの著書（「ブライテンバッハ＆クランゼリン（１９８４）フンギ  オブ  スイッーアランド１巻、エルーラ  ミコロギア、ルツェルン，スイス、１−３１０」  （Ｂｒｉｅｔｅｎｂａｃｈ，Ｊ  ＆  Ｋｒａｎｚｌｉｎ，Ｆ  （１９８４）  Ｆｕｎｇｉ  ｏｆ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．  Ｖｏｌ  １  Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｍｙｋｏｌｏｇｉａ，  Ｌｕｚｅｒｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１−３１０））のダシスキファス・カリシオイデス（Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ  （Ｒｅｈｍ）  Ｓａｃｃ．）及びシェアの文献  （「シェア（１９８８）ビブリオテカ  ミコロギカ  １２３：１−２７４」（Ｓｃｈｅｕｅｒ，Ｃ  （１９８８）  Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ  １２３：  １−２７４））の  ブルンニピラ・カリシオイデス（Ｂｒｕｎｎｉｐｉｌａ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ  （Ｒｅｈｍ）  Ｂａｒａｌ）、の種の記載とわずかな例外を除いて一致した。ラキヌム・カリシオイデス、ダシスキファス・カリシオイデス、ブルンニピラ・カリシオイデスは同一の種の異名で、ダシスキファス・カリシオイデスはバラールとクレグルステイナーの文献（「バラール＆クレグルステイナー（１９８５）バイヘフテ  ツーア  ツァイトシュリフト  フォー  ミコロギ  ６：１−１６０」  （Ｂａｒａｌ，ＨＯ  ＆  Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎｅｒ，ＧＪ  （１９８５）  Ｂｅｉｈｅｆｔｅ  ｚｕｒ  Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆuｒ  Ｍｙｋｏｌｏｇｉｅ  ６：１−１６０））でブルンニピラ・カリシオイデスの異名とみなされている。しかし、シェアの文献で使用されている  ブルンニピラ属は広く受け入れられておらず、カークらの著書「カークら編（２００１）アインスワース  アンド  ビスビー’ズ  ディクショナリー  オブ  フンギ  ９版、ＣＡＢＩインターナショナル、ウォリンフォード、イギリス、１−６５５」  （Ｋｒｉｋ，ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００１���Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ＆  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ  ９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＣＡＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ  ，ＵＫ，  １−６５５））でもブルンニピラ属はラキヌム属の異名として取り扱われている。したがって、本特許ではＳＡＮＫ  １２４９７株をラキヌム・カリシオイデスと同定して、ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）  ＳＡＮＫ  １２４９７と命名した。【００４１】
ＳＡＮＫ  １２４９７株は、Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ  ＳＡＮＫ  １２４９７として、２００６年６月２９日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３６が付与された。
（３）ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株
以下にＳＡＮＫ  １０９０６株の菌学的性質を示す。【００４２】
ラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６株は、日本国神奈川県で採集された落葉に生じていた子実体から分離された。【００４３】
ＳＡＮＫ  １０９０６株の分離に用いた子実体乾燥標本の菌学的性状を以下に記す。
子のう盤は、散在又は集合性、有柄、乾燥時は縁が内側に褶曲し、高さ３９１−８５８μｍ、直径２１２−４４６μｍ、盤面は暗橙色（Ｄａｒｋ  Ｏｒａｎｇｅ（５Ａ８））を、毛は白色、柄及び托外皮層は明橙色（Ｌｉｇｈｔ  Ｏｒａｎｇｅ（６Ａ５））を呈する。水に戻した時は直径５３２−７３９μｍ、盤面は浅い凹上で、全体が淡橙色を呈する。【００４４】
托外皮層は方形菌糸組織様で、無色から淡褐色を呈し、厚壁の細胞からなり、最外層から毛様の短い突起あるいは毛を形成する。托髄層は密な交錯菌糸組織からなり、無色である。毛は円筒形で、真直あるいはやや湾曲し、先端は鈍頭、隔壁を有し、表面は粒状、無色、幅２．１−２．７μｍ、長さ４３．９−９８．９μｍである。柄は円筒形で、長さ３１０−５３０μｍ、直径５５−９０μｍ、無色から淡褐色を呈する。子のうは無弁で、円筒状棍棒形であり、８胞子を含み、その大きさは２９．８−４２．０×３．６−５．４μｍである。子のうの先端は３％  ＫＯＨ処理後、メルツァー試薬によって青変する。側糸は細長い槍先状で、無隔壁、無色、長さ３３．９−４２．６μｍで、最も太い部分で１．４−２．８μｍ、子のう先端より５−９．５μｍ長くのびる。子のう胞子は紡錘形から長楕円形で、無隔壁であり、無色、その大きさは１１．４−１７．２×１．５−２．４μｍである。【００４５】
ＳＡＮＫ  １０９０６株は各培地上で以下のような菌学的性状を示す。【００４６】
ＰＤＡ培地でのコロニーは２３℃、２１日間の培養で直径１０−１２ｍｍとなる。コロニーはビロード状から綿毛状で、灰黄色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｙｅｌｌｏｗ（４Ｃ７））から明黄色（Ｌｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（４Ａ５））を呈する。コロニー周縁部は白色を呈し、不規則に切れ込む。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は中心部では黄茶色（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  Ｂｒｏｗｎ（５Ｆ８−５Ｅ６））で、周縁部では白色を呈する。可溶性色素は生産されない。菌糸は有隔壁で、分枝し、明茶色から無色を呈し、直径１．７−５．１μｍとなる。【００４７】
ＷＳＨ培地でのコロニーは２３℃、２１日間の培養で直径１７−２０ｍｍとなる。コロニーは薄い菌糸層よりなり、部分的に白色の綿毛状の気生菌糸を形成し、白色を呈する。コロニー周縁部は全縁となる。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は白色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００４８】
ＣＭＡ培地でのコロニーは２３℃、２１日間の培養で直径３０−３４ｍｍとなる。コロニーは極めて薄い菌糸層のみで、無色である。コロニー周縁部は全縁となる。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は無色である。可溶性色素は生産されない。【００４９】
ＭＥＡ培地でのコロニーは２３℃、２１日間の培養で直径８−１１ｍｍとなる。コロニーはビロード状、茶橙色（Ｂｒｏｗｎｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ（５Ｃ４））から灰橙色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｏｒａｎｇｅ（５Ｂ３））を呈する。コロニー周縁部は白色を呈し、まれに緩やかに切れ込む。浸出液、菌核、分生子は観察されない。裏面は黄茶色（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  Ｂｒｏｗｎ（５Ｆ８））から金茶色（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｏｗｎ（５Ｄ８））、周縁部で白色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００５０】
以上のような菌学的特徴はスプーナーの文献（「スプーナー（１９８７）ビブリオテカ  ミコロギカ１１６：１−７１１」  Ｓｐｏｏｎｅｒ，ＢＭ  （１９８７）Ｂｉｂｌｉｏｔｈeｃａ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ  １１６：１−７１１））のラキヌム属の記載に一致した。ＳＡＮＫ  １０９０６株はラキヌム属の既存種では、スプーナーの文献に記載されているラキヌム・プテリドフィルム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｐｔｅｒｉｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  （Ｒｏｄｗａｙ）  Ｓｐｏｏｎｅｒ）、及び、ラキヌム・バリアンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｖａｒｉａｎｓ  （Ｒｅｈｍ）  Ｍ．Ｐ．Ｓｈａｒｍａ）に近い。しかし、ＳＡＮＫ１０９０６株は木本植物の落葉より分離されたのに対し、ラキヌム・プテリドフィルスとラキヌム・バリアンスはこれまでにヘゴ科の宿主より分離されていること、ＳＡＮＫ  １０９０６株に比較して子のうが長く、毛の幅が広いことなどからＳＡＮＫ１０９０６株とは明確に区別される。したがって、ＳＡＮＫ  １０９０６株をラキヌム属の未記載種であると判断し、本種をラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）と暫定的に命名し、ＳＡＮＫ  １０９０６株をラキヌム・カエサリアータム（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ）  ＳＡＮＫ  １０９０６と命名した。【００５１】
ＳＡＮＫ  １０９０６株は、Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ  ＳＡＮＫ  １０９０６として、２００６年６月２９日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３４が付与された。【００５２】
（４）シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株
以下にＳＡＮＫ  １１００６株の菌学的性質を示す。【００５３】
シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６株は、日本国宮崎県で採集された落枝に生じていたプロパギュールから分離された。【００５４】
ＳＡＮＫ  １１００６株のＡＭＥＡ培地に１５℃、２８日目に観察されたプロパギュール及び分離に用いた乾燥標本の菌学的性状を以下に記す。【００５５】
ＡＭＥＡ培地での菌糸は表在又は培地中に潜在し、有隔壁で、分枝し、茶色から無色、直径１．３−３．２μｍとなる。分生子柄は単生し、未分化あるいはやや分化し、有隔壁となる。分生子形成細胞は多出芽性である。プロパギュールは、球形から亜球形、基質表面に散在、まれに集合し、白色を呈し、直径  ２６．６−８０．９μｍとなる。プロパギュールは数珠状の高頻度に分枝した組織からなり、各細胞は球形から亜球形で、直径  ３．６−５．６μｍである。各細胞間には空間があり、それぞれに１−４個の娘細胞を出芽する。フィアロ型の分生子は観察されない。落枝に形成されたプロパギュールは、ＡＭＥＡ培地上とほぼ同様で、直径  ３７．０−１０６．０μｍで、各細胞は直径  ３．４−６．８μｍとなる。フィアロ型の分生子は観察されない。
ＳＡＮＫ  １１００６株は前記各培地上で以下のような菌学的性状を示す。
ＰＤＡ培地でのコロニーは、１５℃、２８日間の培養で直径  １３−１４ｍｍとなる。コロニーはビロード状で、中央に向かって隆起した菌糸層よりなり、オリーブ色（Ｏｌｉｖｅ（２Ｆ６））からオリーブ灰色（Ｏｌｉｖｅ  Ｇｒｅｙ（２Ｄ２））を呈する。コロニー周縁部は緩やかな波状である。浸出液、菌核、プロパギュールは観察されない。裏面は表面と同色を呈する。可溶性色素は生産されない。菌糸は有隔壁で、分枝し、赤褐色から無色を呈し、直径１．６−３．０μｍとなる。【００５６】
ＷＳＨ培地でのコロニーは、１５℃、２８日間の培養で直径  １３ｍｍとなる。コロニーは薄い菌糸層と羊毛状の気生菌糸よりなり、オリーブ色（Ｏｌｉｖｅ  （２Ｆ４−２Ｅ５））を呈する。コロニー周縁部は全縁である。浸出液、菌核、プロパギュールは観察されない。裏面はオリーブ色（Ｏｌｉｖｅ（２Ｆ７））からオリーブ灰色（Ｏｌｉｖｅ  Ｇｒｅｙ（２Ｆ２））呈する。可溶性色素は生産されない。【００５７】
ＣＭＡ培地でのコロニーは、１５℃、２８日間の培養で直径１３−１８ｍｍとなる。コロニーは薄い菌糸層のみで、オリーブ色（Ｏｌｉｖｅ（３Ｆ３））から灰黄色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｙｅｌｌｏｗ（３Ｂ３））を呈する。コロニー周縁部は全縁となる。コロニー中心部から周縁部にかけて、まばらに白色のプロパギュールを形成する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は表面と同色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００５８】
ＡＭＥＡ培地でのコロニーは、１５℃、２８日間の培養で直径  ６−１６ｍｍとなる。コロニーは薄い菌糸層のみで、オリーブ色（Ｏｌｉｖｅ（３Ｆ３））から灰黄色（Ｇｒｅｙｉｓｈ  Ｙｅｌｌｏｗ（３Ｂ３））を呈する。コロニー中心部から周縁部にかけて、まばらに白色のプロパギュールを形成する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は表面と同色を呈する。可溶性色素は生産されない。【００５９】
以上のような菌学的特徴はアブドゥラらの文献（「アブドゥラら（２００５）マイコロジカル  リサーチ  １０９：５９０−５９４」  （Ａｂｄｕｌｌａｈ，ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９：５９０−５９４））のシュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ    Ａｂｄｕｌｌａｈ  ＆  Ｇｕａｒｒｏ）の種の記載とわずかな例外を除いて一致した。ＳＡＮＫ  １１００６とのシュードエゲリタ・ウェブステリの記載との間には、プロパギュールの各細胞の直径がアブドゥラらの記載では３−４μｍ、ＳＡＮＫ  １１００６株では３．６−５．６μｍであるといった少しの相違しかなかった。したがって、本菌をシュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）と同定し、シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）  ＳＡＮＫ  １１００６と命名した。【００６０】
ＳＡＮＫ  １１００６株は、Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ  ＳＡＮＫ  １１００６として、２００６年６月２９日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３５が付与された。【００６１】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株はその全ての変異株を包含する。【００６２】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、セルコスポラミドを生産するＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株、それらの変異株及びそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株に包含される。【００６３】
２．培養
セルコスポラミド生産菌は、微生物による発酵生産に通常使用されるような、微生物が資化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有する培地を用いて培養することができる。【００６４】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、押麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。炭素源の含有量は、通常、培地量の１〜１０重量％で変量する。【００６５】
窒素源としては、蛋白質もしくはその加水分解物を含有する物質、無機塩等を用いることができる。そのような窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を例示することができる、それらは単独で用いるか、あるいは２つ以上を併用することができる。窒素源の含有量は、通常、培地量の０．１〜１０重量％の範囲で変量する。【００６６】
栄養無機塩としては、イオンを得ることができる通常の塩類、金属塩等を用いることができる。塩類としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等を例示することができる。金属塩としては、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属塩を例示することができる。【００６７】
また、ビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加してもよい。【００６８】
セルコスポラミド生産菌を液体培養するに際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等を消泡剤として使用することができる。セルコスポラミドを製造する目的でＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株からなる群から選択されるいずれかを培養する際の培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、通常発酵生成物を生産するために用いられるｐＨであればよい。【００６９】
ＳＡＮＫ  １９０９６株、ＳＡＮＫ  １２４９７株、ＳＡＮＫ  １０９０６株、及び、ＳＡＮＫ  １１００６株の培養温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１０℃〜３０℃であり、２０〜２６℃の範囲が生育に良好である。セルコスポラミドの生産には、２３〜２６℃が好適である。【００７０】
セルコスポラミド製造のための培養方法としては、特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養方法であればよく、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法等を使用することができる。【００７１】
以下にセルコスポラミドを製造するための方法の例としてＳＡＮＫ  １９０９６株の培養方法を示すが、セルコスポラミドを製造できる限りにおいて、本方法に限定されない。【００７２】
ＳＡＮＫ  １９０９６株の培養は、通常、１つ又は２つ以上の段階からなる種培養より開始し、ロータリー振盪培養機中で２０〜２６℃（好適には２６℃）で、５〜１０日間（好適には７日間）あるいは十分に生育するまで振とうして行う。【００７３】
ＳＡＮＫ  １９０９６株を固体培養する場合、上記の種培養液を三角フラスコなどの固体培地培養容器中の本培養培地に接種することができる。培養は、接種した固体培地培養容器を２０〜２６℃（好適には２６℃）で１０〜２０日間（好適には１４日間）静置して、生産培養を行う。このようにして得られた本培養培地（培養物）中に所望のセルコスポラミドを得ることができる。【００７４】
ＳＡＮＫ  １９０９６株を比較的小さな規模で液体培養する場合、本培養培地を含む三角フラスコに種培養液を接種し、ロータリー振盪培養機中で、２０〜２６℃（好適には２６℃）で数日間振とうする。このようにして得られた培養液（培養物）中に所望のセルコスポラミドを得ることができる。【００７５】
一方、ＳＡＮＫ  １９０９６株を比較的大きな規模で液体培養する場合、攪拌機、通気装置、保温装置等をつけた適当なタンクを用いることが好ましい。該装置を用いることにより、培地を予め該タンクの中で作製することができる。例えば、本培養培地を１２１℃にて加熱滅菌し、冷却する。次いで、種培養物を接種し、２６℃にて通気攪拌しつつ本培養を行う。このようにして得られた培養液（培養物）中に所望のセルコスポラミドを得ることができる。このような培養方法は、所望のセルコスポラミドを大量に製造するのに適している。【００７６】
本発明のセルコスポラミド生産菌を培養して該物質を製造する場合、該培養物中のセルコスポラミドの生産量は、後述する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により、経時的に追跡することができる。ＨＰＬＣ分析にて追跡する場合、予め、培養物をアセトン等の親水性溶媒で抽出し、該親水性溶媒を留去した後、酢酸エチル等の水と混和しない溶媒で抽出する。次いで、該水と混和しない溶媒を留去した後、適当な溶媒に再溶解したものを分析又は試験に供することが好ましい。【００７７】
３．セルコスポラミドの回収・精製
上記「２．培養」の項に示した方法によって培養したセルコスポラミド生産菌の固形培地(培養物)又は培養液(培養もの)よりセルコスポラミドを回収することができる。セルコスポラミドの回収及び精製方法はセルコスポラミドが回収及び精製できる限りにおいて特に制限されない。【００７８】
例えば、セルコスポラミド生産菌の液体培養終了後、培養液（培養物）にアセトン等の水と混和する有機溶媒を加え、珪藻土等を助剤とするろ過操作又は遠心分離操作等により、培養物を可溶性画分（培養上清）及び不溶性画分（菌体）に分別し、得られた培養上清に存在するセルコスポラミドをその物理化学的性状を利用して抽出精製することによってセルコスポラミドを回収することができる。また、別の方法としてはセルコスポラミド生産菌の液体培養終了後の培養液（培養物）にセライト等のろ過助剤を添加後、ろ過し、得られた菌体を含む不溶性画分を、アセトン等の水と混和する溶媒の水溶液に浸し、菌体より抽出したセルコスポラミドを更にその物理化学的性状を利用して抽出精製することによってもセルコスポラミドを回収することもできる。【００７９】
培養上清からのセルコスポラミドの精製方法としては例えば、培養上清に塩酸等の酸性物質を加え、ｐＨを３．０に調整し、次いで酢酸エチルを添加して抽出方法を挙げることができるがこれらに制限されない。【００８０】
ここで得られた抽出物を、シリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジル等の担体を用いた吸着カラム・クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャム バイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー、コスモシール１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆相カラムクロマトグラフィー、順相もしくは逆相カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製し、所望のセルコスポラミドを単離することができる。【００８１】
本発明のセルコスポラミドを精製する際の、各精製工程における該物質の挙動は、例えば、次の条件によるＨＰＬＣにより追跡することができる。【００８２】
（セルコスポラミドを検出するためのＨＰＬＣの条件）
分離カラム： ＹＭＣ Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ-Ｈ８０ Ｓ−４  ４．６ｘ１５０ｍｍ ( ワイエムシイ（ 株 ）製 )
移動相：アセトニトリル：０．４％トリエチルアミン−リン酸緩衝液(ｐＨ３．２)(４５:５５)
流速： １．０ｍｌ／分
検出： 紫外部吸収 ２２５ｎｍ
保持時間:  ９．３分
４．セルコスポラミドを含有する医薬
本発明のセルコスポラミド又はその塩は、医薬としてヒト又はヒト以外の動物に投与されるに際し、種々の形態をとり得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。軟膏等は外用剤として使用される。【００８３】
セルコスポラミドを有効成分として含有する医薬製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。【００８４】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。【００８５】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。【００８６】
注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましく、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤糖、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。【００８７】
なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。【００８８】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。【００８９】
軟膏等の外用剤の形態に成形するに際しては、賦型剤として、疎水性基剤（油脂性軟膏基剤）、吸水基剤、親水性基剤（クリーム）ならびに水溶性基剤（非グリース製軟膏基剤）のいずれか一つに属する、当該分野で公知のものを広く使用することができる。【００９０】
上述の医薬製剤に含有せしめるセルコスポラミド又はその塩の量は、特に限定されないが、上限は３０〜７０重量％、下限は１重量％であり、好適な範囲は１〜３０重量％である。【００９１】
セルコスポラミド又はその塩の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与するセルコスポラミド又はその塩の量は、上限が１００〜１，０００ｍｇ、下限が１〜１０ｍｇであり、好適な範囲は１０〜１００ｍｇである。【００９２】
セルコスポラミド又はその塩の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。【００９３】
本発明は、薬理上有効な量のセルコスポラミド又はその塩を投与することからなる感染症の治療又は予防方法、それら疾患の治療又は予防のためのセルコスポラミド又はその塩の使用をも提供する。【００９４】
５．セルコスポラミド誘導体の合成
本発明の製造方法によって製造されたセルコスポラミドはその誘導体の前駆体として用いることができる。セルコスポラミドの誘導体としてはセルコスポラミドのヒドロキシル基をエーテル結合で化学修飾した誘導体が知られているが、セルコスポラミドを前駆体として用いることができる限りにおいて誘導体に制限はない。
【実施例】
【００９５】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。【００９６】
（実施例１）  ラキヌム・フセッセンス（ Ｌａｃｈｎｕｍ ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）ＳＡＮＫ  １９０９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３８）のフラスコ培養
ＳＡＮＫ  １９０９６株のスラントより約５ｍｍ角の菌糸片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁し、ガラスポッターを用いてホモジナイズした。全量を表１に示す培地（以下、「培地Ａ」とする。）３０ｍｌを含む１００ｍｌ容 三角フラスコに無菌的に接種した。２３℃、２１０回転／分（ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ :  以下、「ｒｐｍ」と記す。）のロータリー振とう培養機中で５日間前培養を行った。【００９７】
得られた前培養液を培地Ａ  ８０ｍｌを含む５００ｍｌ容 三角フラスコに５％（容量／容量：以下「ｖ／ｖ」と記す。）接種し、２６℃、２１０ｒｐｍのロータリー振とう培養機中で７日間本培養を行った。後述の条件にてＨＰＬＣ分析を実施した。このとき培養液中にセルコスポラミドと保持時間の一致するピークを認め（図１）、ＳＡＮＫ  １９０９６株はセルコスポラミドを生産することが確認できた。図１で９．３１５分のピークがセルコスポラミドを示している。
（表１）
培地Ａ  培地組成
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
スクロース                              ２０ｇ
生ジャガイモ                        １００ｇ
ポリペプトン                           １０ｇ
リン酸二水素カリウム                  ５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物          ２．５ｇ
消泡剤ＣＢ−４４２                 １００ｍｇ
(日本油脂社製)
水道水                            １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
培地はｐＨ 無調整で１２１℃にて２０分間滅菌して用いた。【００９８】
分析用ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
分離カラム：  ＹＭＣ Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ-Ｈ８０ Ｓ−４  ４．６Φｘ１５０ｍｍ（ワイエムシイ（株）製)
移動相：アセトニトリル：０．４％トリエチルアミン−リン酸緩衝液(ｐＨ３．２)(４５:５５)
流速：  １．０ｍｌ／分
検出：  紫外部吸収 ２２５ｎｍ
保持時間:  ９．３分
（実施例２）  ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３８）の大量培養
ＳＡＮＫ  １９０９６株のスラント一本から菌糸片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁し、ガラスポッターを用いてホモジナイズした。全量を表２に示す培地（以下、「培地Ｂ」とする。）３０ｍｌを含む１００ｍｌ容 三角フラスコに接種し、２３℃、２１０ｒｐｍの条件にてロータリー振とう培養機中で７日間培養を行った。培養終了後の培養液に等量の２０％グリセロールを加え混合した。この混合液を−８０℃で保存し、シード培養液とした。【００９９】
シード培養液２ｍｌを培地Ｂ  ３０ｍｌを含む１００ｍｌ容 三角フラスコに接種した。２３℃、２１０ｒｐｍの条件にてロータリー振とう培養機中で５日間最初の前培養（第１前培養）を行った。【０１００】
培地Ｂ  ５００ｍｌを含む２Ｌ容 の三角フラスコに、第１前培養で得られた培養液（第１前培養液）を５％(ｖ／ｖ)接種し、２３℃、２１０ｒｐｍの条件にてロータリー振とう培養機中で４日間２回目の前培養（第２前培養）を行った。【０１０１】
培地Ｂ  ３０Ｌを含む６０Ｌ容 培養槽に第２前培養で得られた培養液（第２前培養液）を５％(ｖ／ｖ)植菌した。溶存酸素濃度を３から５ｐｐｍの範囲を保つよう攪拌速度を調節しながら、毎分３０Ｌの通気量で、培養温度２３℃、２日間３回目の前培養（第３前培養）を行った。【０１０２】
培地Ｂ  ３００Ｌを含む６００Ｌ容 培養槽に第３前培養で得られた培養液（第３前培養液）を５％(ｖ／ｖ)植菌した。溶存酸素濃度を３から５ｐｐｍの範囲に保つよう攪拌速度を調節しながら、毎分３００Ｌの通気量で、培養温度２３℃、２日間４回目の前培養（第４前培養）を行った。【０１０３】
培地Ｂ  ４,０００Ｌを含む６,０００Ｌ容  培養槽に第４前培養で得られた培養液（第４前培養液）を５％(ｖ／ｖ)植菌した。溶存酸素濃度を５ｐｐｍに保つよう攪拌速度を調節しながら、毎分２,０００Ｌの通気量で、培養温度２６℃、８日間培養を行った。培養４日目と５日目に２０％スクロース液をそれぞれ２００Ｌ添加した。さらに培養６日目と７日目に２０％スクロース液をそれぞれ３００Ｌ添加した。セルコスポラミド生産の確認は以下に示すＨＰＬＣの条件で行った。
（表２）
培地Ｂ  培地組成
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
グルコース                             ４０ｇ
ポテトグラニュー                      ２０ｇ
（アグラウェスト社製）
ポリペプトン                           １０ｇ
リン酸二水素カリウム                  ５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物           ２．５ｇ
消泡剤ＣＢ−４４２                  １００ｍｇ
（日本油脂社製)
水道水                             １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ｐＨ 無調整で１２１℃にて２０分間滅菌して用いた。【０１０４】
分析用ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
分離カラム： Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８  ４．６Φ x ７５ｍｍ ( インタクト（ 株 ）製 ) 移動相：アセトニトリル：０．０２％トリフルオロ酢酸(４０:６０)。溶媒の組成を８分間で（９０：１０）に変化させ、溶出した。
流速： １．０ｍｌ／分
検出： 紫外部吸収 ２２５ｎｍ
保持時間:  ５．４分
（実施例３）  ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３８）の培養液からのセルコスポラミドの精製
目的物質であるセルコスポラミドの確認は実施例２に記載のＨＰＬＣの条件で行った。【０１０５】
実施例２で得られたラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ  ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）  ＳＡＮＫ  １９０９６株の培養液４，８００Ｌをセライト５４５（セライトコーポレーション社製）をろ過助剤として用いてろ過した。得られたセライトを含む菌体７８１ｋｇに水道水２，５００Ｌを加え均一に懸濁した。懸濁液にアセトン２，５００Ｌを加え抽出した。得られた抽出液４，９７３Ｌを５０％アセトン水で平衡化したダイアイオンＨＰ−２０カラム（三菱化学製）８０Ｌに供した。ダイアイオンＨＰ−２０カラムを５０％アセトン水で洗浄し、通過液と洗浄液を合わせて５，５００Ｌの溶液を得た。【０１０６】
得られた溶液に７５％硫酸を添加してｐＨ３．０に調整した後、酢酸エチル３，０００Ｌを加え抽出した。酢酸エチルで抽出された溶液４，２１８Ｌを２５％食塩水１，０００Ｌで洗浄した。洗浄後の抽出液３，８４１Ｌより減圧下で酢酸エチルを溜去した。減圧下で８１Ｌまで濃縮したのち、２０Ｌ回転式エバポレーターを用いてさらに酢酸エチルを溜去し、濃縮液を得た。【０１０７】
得られた濃縮液約１０Ｌを４℃に放置しセルコスポラミドの結晶を晶出させた。得られた湿結晶４，７００ｇを真空乾燥しセルコスポラミドの乾燥結晶４，１４０ｇを得た。【０１０８】
（実施例４）  ラキヌム・フセッセンス（Ｌａｃｈｎｕｍ ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）ＳＡＮＫ１９０９６株（ＦＥＲＭ   ＢＰ−１０３３８）によるセルコスポラミドの生産
ＳＡＮＫ １９０９６株のスラントより約５ｍｍ角の菌糸片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁した。ガラスポッターを用いてホモジナイズし、全量を以下に記載する培地２０ｍｌを含む１００ｍｌ容 三角フラスコに無菌的に接種した。２３℃、２１０ｒｐｍのロータリー振とう培養機中で７日間前培養を行った。得られた前培養液を同じ組成の培地８０ｍｌを含む５００ｍｌ容 三角フラスコに５％（容量／容量：以下「ｖ／ｖ」と記す。）接種し、２６℃、２１０ｒｐｍのロータリー振とう培養機中で１０日間本培養を行った。分析のための抽出は以下のように行った。培養液 ２ｍｌに ３Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２）０．４ｍｌ、アセトン  １ｍｌ、ｎ−ブタノール ２ｍｌを添加し、室温で１０分間しんとう抽出した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた溶媒層に飽和食塩水２ｍｌを添加した。室温で１０分間しんとうし洗浄した。溶媒層を減圧濃縮し得られた油状エキスをジメチルスルホキシド：メタノール（７：３）溶液０．２ｍｌに溶解した。このエキス溶液を後述の条件にてＨＰＬＣ分析に供した。このときコントロールとして用いたセルコスポラミドと保持時間の一致するピーク（保持時間:  ２０．７分）を認めた。【０１０９】
培地組成
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
グルコース                                   ４０ｇ
ポテトグラニュー                             ２０ｇ
（アグラウェスト社製）
ポリペプトン                                  1０ｇ
リン酸二水素カリウム                         ５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物                ２．５ｇ
消泡剤ＣＢ−４４２                           ５００ｍｇ
(日本油脂社製)
水道水                                    １０００ｍｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ｐＨ 無調整で１２１℃にて２０分間滅菌した。【０１１０】
分析用ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
カラム： シンメトリー  Ｃ１８    ４．６Φｘ１５０ｍｍ ( ウォーターズ（ 株 ）製 )
移動相：アセトニトリル：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液(ｐＨ３．２)（５：９５）。溶媒の組成を２８分間で（９０：１０）に変化させ遊出した。
流速： １．０ｍｌ／分
検出： 紫外部吸収 ２１０ｎｍ
（実施例５）  ラキヌム・カリシオイデス（Ｌａｃｈｎｕｍ ｃａｌｙｃｉｏｉｄｅｓ）ＳＡＮＫ１２４９７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３６）によるセルコスポラミド生産
ＳＡＮＫ １２４９７株のスラントより約５ｍｍ角の菌糸片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁した。ガラスポッターを用いてホモジナイズした。以下実施例４と同様の方法で培養・抽出・分析を行った。ＨＰＬＣ分析により培養液中にセルコスポラミドと保持時間の一致するピーク（保持時間:  ２０．７分）を認めた。【０１１１】
（実施例６）  ラキヌム・カエサリアータム  （Ｌａｃｈｎｕｍ  ｃａｅｓａｌｉａｔｕｍ） ＳＡＮＫ  １０９０６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３４）によるセルコスポラミドの生産
ＳＡＮＫ １０９０６株のスラントより約５ｍｍ角の菌糸片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁した。ガラスポッターを用いてホモジナイズした。以下実施例４と同じ方法で培養・抽出・分析を行った。ＨＰＬＣ分析により培養液中にセルコスポラミドと保持時間の一致するピーク（保持時間:  ２０．７分）を認め、ＳＡＮＫ  １０９０６株がセルコスポラミドを生産することを確認した。【０１１２】
（実施例７）  シュードエゲリタ・ウェブステリ（Ｐｓｅｕｄａｅｇｅｒｉｔａ  ｗｅｂｓｔｅｒｉ）ＳＡＮＫ  １１００６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３５）によるセルコスポラミドの生産
ＳＡＮＫ １１００６株のスラントより約５ｍｍ角の菌糸片を切り取り、培地２０ｍｌを含む１００ｍｌ容 三角フラスコに無菌的に接種した。以下実施例４と同じ方法で培養・抽出・分析を行った。ＨＰＬＣ分析により培養液中にセルコスポラミドと保持時間の一致するピーク（保持時間:  ２０．７分）を認め、ＳＡＮＫ １１００６株がセルコスポラミドを生産することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
図１  ラキヌム・フセッセンス（ Ｌａｃｈｎｕｍ ｆｕｓｃｅｓｃｅｎｓ）ＳＡＮＫ  １９０９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３８）株の培養物より得られたセルコスポラミドをＨＰＬＣで分析したときのクロマトグラムを示す図。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によってセルコスポラミドの製造が可能となり、該方法によって製造されたセルコスポラミドはそれ自体医薬品の有効成分として用いることができる。また、セルコスポラミドの誘導体の前駆体としても有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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