(57)【要約】【課題】現在知られているHIV-1のうち少なくとも２種類以上のサブタイプのウイルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ，それらを含む検出又は定量キット，及びそれらを用いた、HIV-1遺伝子の検出又は定量方法，当該プローブ配列を用いた、治療用遺伝子断片，遺伝子治療方法等を提供すること。【解決手段】配列番号２〜９から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プライマー，及び配列番号１０〜１１から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プローブ等によって達成される。【選択図】図１
2007055260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列番号１のポリヌクレオチドからなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量用プライマー及び／又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号１：cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt 
【請求項２】
下記（ア）又は（イ）から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プライマー。
（ア）配列番号２〜９から選択されるポリヌクレオチドの一種
（イ）配列番号３，５，７，９のいずれかのポリヌクレオチドの、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド。
配列番号２：ncnannncnn tnaatncnnn ggt
配列番号３：cctagaactt taaatgcatg ggt
配列番号４：ccnnanntna tnccnatgtt  
配列番号５：ccagaagtga tacccatgtt 
配列番号６：ttnannatnn gcanngnngc 
配列番号７：tttaacattt gcatggctgc 
配列番号８：antnnnnngn ntcntcnntn at 
配列番号９：attctgcagc ttcctcattg at 
【請求項３】
下記グループ(I)又は（II）に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ（III）又は（IV）に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プライマー対。
グループ(I)：配列番号２，３，又は配列番号３の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II）：配列番号４，５，又は配列番号５の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（III）：配列番号６，７，又は配列番号７の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（IV）：配列番号８，９，又は配列番号９の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
【請求項４】
下記（１）又は（２）からなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プローブ。
（１）下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
（２）一端に蛍光物質，他端に消光物質を結合された下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
グループ（V）：配列番号１０，１１，又は配列番号１１の、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（VI）：グループ（V）の相補体
配列番号１０：atcnnnnngn nnnnnnccnt nngnnanngc 
配列番号１１：atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc 
【請求項５】
下記（Ａ）乃至（Ｃ）の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用キット。
（Ａ）請求項２に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）請求項３に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）請求項４に記載のプローブの少なくとも一種
【請求項６】
下記（Ａ）乃至（Ｄ）の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量方法。
（Ａ）請求項２に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）請求項３に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）請求項４に記載のプローブの少なくとも一種
（Ｄ）請求項５に記載の検出又は定量用キット
【請求項７】
下記（Ａ）乃至（Ｄ）の少なくともいずれか一つを用い、下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかの方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量方法。
（Ａ）請求項２に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）請求項３に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）請求項４に記載のプローブの少なくとも一種
（Ｄ）請求項５に記載の検出又は定量用キット
（ａ）PCR法
（ｂ）Nested-PCR法
（ｃ）リアルタイムPCR法
（ｄ）nested-リアルタイムPCR法
【請求項８】
下記グループ(I)乃至（VI）に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片。
グループ(I)：配列番号２，３，又は配列番号３の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II）：配列番号４，５，又は配列番号５の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（III）：配列番号６，７，又は配列番号７の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（IV）：配列番号８，９，又は配列番号９の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（V）：配列番号１０，１１，又は配列番号１１の、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（VI）：グループ（V）の相補体
【請求項９】
下記グループ(I)乃至（VI）に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、人免疫不全症候群の治療方法。
グループ(I)：配列番号２，３，又は配列番号３の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II）：配列番号４，５，又は配列番号５の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（III）：配列番号６，７，又は配列番号７の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（IV）：配列番号８，９，又は配列番号９の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（V）：配列番号１０，１１，又は配列番号１１の、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（VI）：グループ（V）の相補体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人免疫不全ウイルスの検出又は定量方法，当該検出又は定量に用いるキット，当該キットに用いられるプライマー及びプローブ，及び治療用遺伝子断片，並びに遺伝子治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人免疫不全ウイルス：Human Immunodefeciency Virus（以下、HIVと記載する。）とは、後天性免疫不全症候群（AIDS）の原因となるウイルスである。このHIVとしては、HIV-1及びHIV-2の２つの群が同定されており、特に、世界中で流行しているHIV-1は、更にＡ，B，C，D，F，G，H，J，K等の９種類のサブタイプからなるグループM（Main）と、グループO（Outlier），グループN（New），更には、サブタイプAの組み換え流行株である、CRF01_AE等に分類されている。【０００３】
日本においては、HIV-1のサブタイプBが大多数であったが、感染経路の多様化等によって、B以外のサブタイプ，特にHIV-1のCRF01_AE等が増加の傾向にある。【０００４】
従って、AIDSの検査方法においては、一度にできるだけ多くのタイプのHIV遺伝子を検出又は定量できることが好ましく、特に、HIV-1の重要なサブタイプの全てについて検出又は定量することが求められている。【０００５】
ところで、HIVの検出方法としては、従来HIV抗体検査が主流であったが、感染初期には検出が困難である等の理由から、近年では、HIV遺伝子検出による検査のニーズが高まっている。【０００６】
一方、近年の核酸増幅等の技術の進歩により、微量の検体からも、HIV遺伝子が、簡単・確実に検出できるようになってきている。【０００７】
核酸増幅法としては、例えば、PCR法（ポリメラーゼ連鎖反応法，Polymerase 
Chain Reaction，EP200362等参照）やNASBA法（EP329822等参照），TAS法（WO88/10315等参照）のほか、等温遺伝子増幅法（ICAN法：Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，タカラバイオ社）等が挙げられる。【０００８】
HIV遺伝子の検出には、これらのうち、主にPCR法が用いられているが、PCR法にも、色々な種類が開発されている。
（１）治療過程での感染ウイルス遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法，
（２）感染ウイルス遺伝子（DNA，RNA，プロウイルス等）を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法，
（３）nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法（二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法），
及び、これらに、PCR法の実施前にウイルスRNAを逆転写する逆転写工程（Reverse Transcription : 
RT）を組み合わせた方法等が開発されている。
尚、リアルタイムPCR法には、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質が，他端に消光物質（クエンチャー）が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法，DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。【０００９】
これらのPCR法においては、確実に標的HIV遺伝子（DNA，RNA，プロウイルス等）を定量し、感染の有無やウイルス量の変化、又は治療効果を正確に把握するために、ミスマッチの無い、プライマーやプローブの設計が非常に重要な要素となる。【００１０】
特に、プライマーには
（１）標的遺伝子に安定してアニーリングできること（Tm値が適切な範囲である），
（２）プライマー内部やプライマー間に相補的な配列が無く、PCRの反応効率が良いこと，
（３）特異性が高く、鋳型DNA上にミスプライミングする部位がないこと
等が求められる。
そのため、適切なプライマーを選択することは、容易では無い。【００１１】
２対のプライマーを入れ子状（nested）に設定する必要があるnested-リアルタイムPCR法の場合には、プライマー，プローブの設定は、尚更困難である。【００１２】
しかも、HIVは変異の修復機構を持たないウイルスであり、このウイルスの遺伝子は、非常に変異が起こりやすい。一方、変異の起こり難い、いわゆる保存性の高い領域も存在する。変異のし易い領域にプライマーやプローブを設計すると標的遺伝子とのミスマッチが頻繁に出現し、HIV遺伝子を確実に増幅・検出することができず、誤った検査結果を導く危険性がある。その為、できるだけ多くのサブタイプを、確実に検出するためには、サブタイプ内，サブタイプ間の、いずれにおいても保存性が高い領域を見出し、その領域内にPCR及びリアルタイムPCRに適したプライマーやプローブを設計する事が必要となる。【００１３】
本発明者等は、既にリアルタイムPCR法やnested-リアルタイムPCR法によって、HIV-1DNA定量法の検討を進めてきており、例えばサブタイプBについて検出又は定量可能なプライマー及びプローブ配列を特定することに成功している。【００１４】
しかしながら、下記非特許文献１〜３のプライマー及びプローブは、いずれもサブタイプBのみの遺伝子配列をもとに設計されたものである。しかも非特許文献３においては、サブタイプBの「薬剤耐性変異の出現が疑われた、HAART施行中のHIV-1感染症患者10症例」という小さい母集団において、変異の生じていない領域を見出して、プライマー，プローブを設計したものにすぎない。【００１５】
従って、上記非特許文献１〜３によって開示されたプライマーやプローブは、様々なサブタイプの、しかも治療前（即ち、薬剤耐性変異が生じる前）の、感染HIVウイルスを検査するためのものとして適しているとは言えない。【００１６】
また、上記特許文献１では、全てのサブタイプのHIV-1の検出が可能なプライマー，プローブに関する発明が記載されているが、本願のプライマー，プローブとは、設計のもととなるHIV-1遺伝子上の領域が異なり、またこれらを用いた遺伝子検出においては、検出感度が十分とは言えず、まして定量に使用できるようなものではなかった。【００１７】
【非特許文献１】Journal of Virological Methods 124(2005) 157-165(Hiromi Nagai , Tsuguhio Kaneda, et al.)
【非特許文献２】Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)
【非特許文献３】日本エイズ学会誌（季刊）2002年，vol.4，No.4，一般演題No.61(永井裕美，金田次弘ら)
【特許文献１】特表２００１−５１２７０１号公報
【００１８】
一方、様々なサブタイプの患者からの遺伝子サンプルを入手すること自体、かなり困難な作業である。従って、プライマーやプローブの設計の実験の多くが、過去に公表された遺伝子配列をもとに行われているのが実状であり、実際に、あらゆるサブタイプの遺伝子配列を調査した上で、適切なプライマーやプローブを設計している例は、殆ど見られないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者等は、日本で初めて様々なサブタイプについて、各サブタイプ毎に多数のHIV-1感染患者の血漿を入手し、そこからRNAを抽出し、それらの遺伝子配列を実際に比較検討することによって、サブタイプ内や、サブタイプ間でも遺伝子配列が良く保存されている領域を見出すことに成功し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、現在知られているHIV-1のうち少なくとも２種類以上のサブタイプのウイルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ，それらを含む検出又は定量キット，及びそれらを用いた、HIV-1遺伝子の検出又は定量方法，当該プローブ配列を用いた、治療用遺伝子断片，遺伝子治療方法等を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述の目的は、下記（第１の発明）乃至（第９の発明）等によって達成される。
（第１の発明）
下記の配列番号１のポリヌクレオチドからなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量用プライマー及び／又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号１
（第２の発明）
下記（ア）又は（イ）から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プライマー。
（ア）配列番号２〜９から選択されるポリヌクレオチドの一種
（イ）配列番号３，５，７，９のいずれかのポリヌクレオチドの、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド。
（第３の発明）
下記グループ(I)又は（II）に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ（III）又は（IV）に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プライマー対。
（第４の発明）
下記（１）又は（２）からなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用プローブ。
（１）下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
（２）一端に蛍光物質，他端に消光物質を結合された下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
（第５の発明）
下記（Ａ）乃至（Ｃ）の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用キット。
（Ａ）第２の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）第３の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）第４の発明に記載のプローブの少なくとも一種
（第６の発明）
下記（Ａ）乃至（Ｄ）の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量方法。
（Ａ）第２の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）第３の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）第４の発明に記載のプローブの少なくとも一種
（Ｄ）第５の発明に記載の検出又は定量用キット
（第７の発明）
下記（Ａ）乃至（Ｄ）の少なくともいずれか一つを用い、下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかの方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−１遺伝子の検出又は定量方法。
（Ａ）第２の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
（Ｂ）第３の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
（Ｃ）第４の発明に記載のプローブの少なくとも一種
（Ｄ）第５の発明に記載の検出又は定量用キット
（ａ）PCR法
（ｂ）Nested-PCR法
（ｃ）リアルタイムPCR法
（ｄ）nested-リアルタイムPCR法
（第８の発明）
下記グループ(I)乃至（VI）に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片。
（第９の発明）
下記グループ(I)乃至（VI）に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、人免疫不全症候群の治療方法。
グループ(I)：配列番号２，３，又は配列番号３の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II）：配列番号４，５，又は配列番号５の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（III）：配列番号６，７，又は配列番号７の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（IV）：配列番号８，９，又は配列番号９の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（V）：配列番号１０，１１，又は配列番号１１の、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（VI）：グループ（V）の相補体
配列番号１：cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt 
配列番号２：ncnannncnn tnaatncnnn ggt 
配列番号３：cctagaactt taaatgcatg ggt 
配列番号４：ccnnanntna tnccnatgtt 
配列番号５：ccagaagtga tacccatgtt 
配列番号６：ttnannatnn gcanngnngc 
配列番号７：tttaacattt gcatggctgc 
配列番号８：antnnnnngn ntcntcnntn at 
配列番号９：attctgcagc ttcctcattg at 
配列番号１０：atcnnnnngn nnnnnnccnt nngnnanngc 
配列番号１１：atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc 
【発明の効果】
【００２１】
本発明のプライマー，プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又は定量方法によって、少なくともHIV-1遺伝子のサブタイプA,B,C,D,サブタイプの組換え流行株CRF01_AEは、確実に増幅，検出又は定量することができ、世界で感染が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマーを２対用いた、nested-PCR法やnested-リアルタイムPCR法によれば、極めて低コピーのHIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、2コピー／106細胞という驚異的な感度を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明において、ポリヌクレオチドとは、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，一本鎖又は二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。通常、プライマーやプローブとしては、核酸分子の安定性の点等から、DNAが適しているが、等温遺伝子増幅法（ICAN法）にはキメラプライマー，リアルタイムPCR法のうち一種のサイクリングプローブ法には、キメラプローブが用いられる。また、本発明のAIDS治療用遺伝子断片が、アンチセンス試薬，RNA干渉用試薬として用いる場合には、DNAの他、RNAも好適に使用される。【００２３】
本発明において、「相補体」とは、あるポリヌクレオチドと同じ塩基数であって、それと完全に相補的なものを意味する。【００２４】
尚、本件において、塩基配列中にTと記載しているのは、便宜的に示したものであって、ポリヌクレオチドがRNAの場合には、Uを意味する。また、配列表において、Sequence Typeを「DNA or RNA」と記載しているように、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの他、RNA，DNAとRNAのキメラの場合も含むものである。同様に、配列表において一本鎖として表示されているものを、相補的な鎖とともに、二本鎖として用いる場合もあり、これにはDNAとRNAのハイブリッドも含まれる。【００２５】
これらのポリヌクレオチドやその相補体は、常法に従い、DNA合成装置等を用いて人工的に合成する，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する，天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加する，目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ，RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる，これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方法によって製造することができる。【００２６】
《HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び／又はプローブ配列の選択用塩基配列》
本発明の、HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び／又はプローブ配列の選択用塩基配列は、配列番号１のポリヌクレオチドからなるものである。この領域は、実験用HIV-1遺伝子（HXB2）のgag領域にある、1234〜1423番目の配列に相当する。gag領域は、HIV-1遺伝子の生存に欠かせない領域であることから、もともと変異が少なく、あらゆるサブタイプのHIV-1遺伝子を検出又は定量するための共通指標として適している。しかしながら、gag領域内にも、変異が無い訳では無い。【００２７】
一方、HIV-1遺伝子の検出又は定量に用いるプライマーやプローブは、プライマーやプローブとしての本来の目的を達するためには、DNAポリメラーゼによって認識されるように、少なくとも３’末端において、ミスマッチ無く標的HIV-1遺伝子と結合することが必要である。つまり、プライマーやプローブとして選択する領域は、プライマーやプローブとして選択する領域のうち少なくとも３’末端からの数塩基分が、HIV-1遺伝子のあらゆる変異体においても変異の無い領域に設定されることが重要となる。しかも、プライマーだけであればともかく、プライマーを２対選択する場合や、同時にプローブも選択しなければならない場合には、それらのそれぞれについて、変異のない領域に設定しなくてはならない。このため、プライマーやプローブの配列を決定することは、かなり困難な作業を伴うものである。【００２８】
本発明者等は、このgag領域において、あらゆるサブタイプ間やサブタイプ内で安定して保存されている領域（変異の無い領域）を多く含み、しかも２対のプライマーやプローブも同時に特定できる適度な長さの領域を特定することに成功し、この配列番号１の約200塩基の領域を、複数のプライマーやプローブ等を同時に選定するのに適している選択用塩基配列とした。【００２９】
《HIV遺伝子》
現在知られているHIVは、HIV-1とHIV-2の二種に大別される。HIV-1ゲノムとは、９７１９塩基からなる、直鎖状の一本鎖RNAである。HIV-1遺伝子の遺伝情報は、約10kbのRNAに含まれている。この中に、レトロウイルスに共通の構造遺伝子として、gag 、pol 、env の３種類の遺伝子があるが、この他に調節遺伝子も数種類コードされている。これらの調節遺伝子の違いで、HIV-２と区別される。【００３０】
尚、本発明で言う“HIV-1遺伝子”とは、ウイルス粒子中のHIV-1ゲノムの本体である全長HIV-1メッセンジャーRNA（mRNA)の他、下記の(1)〜(5)をも意味するものである。
(1)逆転写されつつある一本鎖DNA 
(2)逆転写が完了した、インサート前の二重鎖DNA
(3)環状二重鎖DNA 
(4)ヒトDNA中にインサートされたプロウイルス 
(5)プロウイルスから転写された、mRNA（ゲノムに利用される全長mRNAとアクセサリー遺伝子由来のmRNA) 【００３１】
但し、(1)は、本発明のプライマー，プローブ等に対応する領域の合成が終了している段階にあるもののみが検出又は定量されることとなる。【００３２】
尚、AIDSの診断としては、このうち、(2)〜(5)が重要であり、特に(4)、(5)の測定が重要である。HIV-1遺伝子が、プロウイルスとして宿主細胞のゲノムに取り込まれない限りは、AIDS発症に至らないと考えられるからである。【００３３】
《サブタイプ》
HIVには、様々なサブタイプがある。サブタイプとは、塩基配列が、遺伝子系統樹上、独立した一つのクラスターを形成するもので遺伝学的に相互にほぼ等距離(equidistant)にあるものを言う。尚、HIVのサブタイプ間で遺伝子組換えが起こったウイルスが、地域流行株となったものを、CRFs 
( circulating recombinant forms；組換え流行株)と言う。 
HIV-1としては、A，B，C，D，F，G，H，J，K等の９種類のサブタイプからなるグループM（Main）と、グループO（Outlier），グループN（New），更には、組換え流行株である、CRF01_AE，CRF02_AG，CRF03_AB，CRF04_cpx，CRF05_DF，CRF06_cpx，CRF07_BC，CRF08_BC，CRF09_cpx，CRF10_CD，CRF11_cpx，CRF12_BF，CRF13_cpx，CRF14_BG，CRF15_01B, CRF16_A2D等が知られている。【００３４】
本発明のプライマー，プローブ，キット，又は本発明の検出又は定量方法を使用した場合には、HIV-1のサブタイプBは勿論のこと、従来法では定量PCRができていない（つまりリアルタイムPCRでPCRの立ち上がりサイクル数が極めて遅い事がフルオログラムで示される）他のサブタイプのHIV-1のうち少なくともA，C，D，CRF01_AE等についても、リアルタイムPCRのPCR立ち上がりサイクル数が小さく、かつシグモイド曲線を描くことができることが本発明者等によって今回確認された。【００３５】
つまり、本発明のプライマー，プローブの基礎となった遺伝子領域は、サブタイプの違いを超えて、しかもサブタイプ内の変異等の影響も受けずに保存されており、HIV-1ウイルスの生存にとって重要な役割を担っていることが予想される。従って、本発明のプライマー，プローブは、HIV-1のあらゆるサブタイプの検出又は定量にも有用であると考えられる。【００３６】
《プライマー》
プライマーとは、ポリヌクレオチドを酵素的に複製（又は増幅）する際に使われる２０〜３０塩基の短いポリヌクレオチド断片を言う。主にPCR法やICAN法等の核酸増幅方法において、DNAやRNA等のポリヌクレオチドを増やすときに使われ、増やしたい部分の両端に相補的に結合する塩基配列を持つものである。PCR法において用いられるプライマーには、PCR増幅反応時、一方のポリヌクレオチド鎖の3'側に結合するプライマーと、他方の鎖の3'側に結合するプライマーがあり、各々をフォワード側プライマー（センスプライマーとも言う。），リバース側プライマー（アンチセンスプライマーとも言う。）等と言うことがある。【００３７】
《本発明のプライマーグループ》
本発明のプライマーは、下記より選択されるポリヌクレオチドの一種からなるものである。
グループ(I)：配列番号２，３，又は配列番号３の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II）：配列番号４，５，又は配列番号５の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（III）：配列番号６，７，又は配列番号７の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（IV）：配列番号８，９，又は配列番号９の、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド【００３８】
尚、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、プライマーとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。 
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である
(2)ＧＣ％を40〜50%にする 
(3)配列中にGの4連鎖を含まない 
(4)プライマー内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(5)プライマー間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い 
(6)Tmが５０〜６０℃である【００３９】
尚、配列番号２，４，６，８のポリヌクレオチドは、実際の患者のHIV-1遺伝子において、変異の実例があった箇所をn（nとは、a，t（u），g，cのいずれの塩基であっても良いことを示す。）としたものである。つまりｎ以外の固定した箇所は、本発明者等が調査したあらゆる患者のHIV-1遺伝子に変異が無かった箇所である。従って、これらを固定した配列番号２，４，６，８のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者のHIV-1遺伝子を検出又は定量できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上記(1)〜（6）の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。【００４０】
《グループ(I)プライマー》【００４１】
グループ(I)は、通常のPCR法においてプライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法においては、pre-quantification用のプライマーとして好適に用いられる。【００４２】
グループ(I)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1234〜1256番目の塩基配列と、ほぼ同一の配列となるように設計された配列，およびその、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。【００４３】
このグループ(I)は全て、３’側から３塩基が鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、鋳型となるHXB2遺伝子配列と相補的な配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。【００４４】
好ましいプライマーは配列番号３，又はその３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。【００４５】
《グループ(II)プライマー》【００４６】
グループ(II)は、通常のPCR法において、プライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法において、pre-quantification後の、リアルタイムPCRにおけるプライマーとして好適に用いられる。【００４７】
グループ(II)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1285〜1304番目の塩基配列と、ほぼ同一の配列となるように設計された配列，およびその、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。このグループ(II)は全て、３’側から３塩基が鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、鋳型となるHXB2遺伝子配列と相補的な配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。【００４８】
好ましいプライマーは配列番号５，又はその３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号５の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。【００４９】
《グループ(III)プライマー》
グループ(III)は、通常のPCR法において、プライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法において、pre-quantification後のリアルタイムPCRにおける、プライマーとして好適に用いられる。【００５０】
グループ(III)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1375〜1394番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。３’側から３塩基は鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識さDNAの増幅反応が進行する。【００５１】
好ましいプライマーは配列番号７，又はその３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号７の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。【００５２】
《グループ(IV)プライマー》【００５３】
グループ(IV)は、通常のPCR法においてプライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法においては、pre-quantification用のプライマーとして好適に用いられる。【００５４】
グループ(IV)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1402〜1423番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。３’側から３塩基は鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。【００５５】
好ましいプライマーは配列番号９，又はその３’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号９の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。【００５６】
《プローブ》
プローブとは、日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、目的遺伝子を探り出す為に用いる核酸断片に、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させたものである。【００５７】
《TaqManタイププローブ》
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用プローブのうち、一端に蛍光物質，他端に消光物質を結合されたポリヌクレオチドの一種からなるプローブは、一般に「TaqManタイププローブ」と呼ばれるタイプに属するものである。TaqManタイププローブとは、「TaqManプローブTM」に代表される構造をとるプローブとして広く用いられている用語で、主にリアルタイムPCR法に適したプローブである。【００５８】
《本発明のプローブグループ》
本発明のTaqManタイププローブに用いられるポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、通常２０〜４０、好ましくは２２〜４０である。具体的な配列としては下記のグループ(V)又は（VI）のものが挙げられる。【００５９】
グループ(V)：配列番号１０，１１，又は配列番号１１の、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（VI）：グループ（V）の相補体【００６０】
尚、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、プローブとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。 
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である 
(2)GC％が40〜50%である 
(3)プローブ内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(4)プライマーとの間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い 
(5)Tmが６８〜７０℃である 
(6)全長は４０塩基よりも短い。【００６１】
尚、配列番号１０のポリヌクレオチドは、実際の患者のHIV-1遺伝子において、変異の実例があった箇所をｎ（nとは、a，t（u），g，cのいずれの塩基であっても良いことを示す。）としたものである。つまりｎ以外の固定した箇所は、本発明者等が調査したあらゆる患者のHIV-1遺伝子に変異が無かった箇所である。従って、これらを固定した配列番号１０のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者のHIV-1遺伝子を検出できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上記(1)〜（6）の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。【００６２】
このグループ(V)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2遺伝子の1309〜1338番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。このグループ(V)は、全て、少なくとも５’側（対応するHXB2遺伝子上では３’側）からの３塩基は、鋳型となるHIV-1のあらゆるサブタイプで保存されている配列と相補的であるという特徴を有している。この特徴により、グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種を用いたプローブは、例えばTaqDNAポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素が、確実にTaqManプローブを認識し、エキソヌクレアーゼ活性によって、プローブの５’側（対応するHXB2遺伝子上では３’側）から１塩基ずつ分解し、蛍光物質と消光物質を分離させることができる。【００６３】
好ましいプローブは配列番号１１，又はその５’末端の３塩基を除く他の塩基のうち、１個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすもの，又はそれらの相補体であり、特に好ましいプローブは配列番号１１の配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ又はその相補体である。【００６４】
《蛍光物質，消光物質》
蛍光物質は、レポーター蛍光物質と呼ばれることがある。また、消光物質は、クエンチャー物質等と呼ばれることがある。これらの物質の、プローブへの結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光物質が、他端にクエンチャー蛍光物質が結合される。【００６５】
プローブに蛍光物質を結合させる方法としては、公知の方法を採用することができ、例えば、Noble et al., (1984) .Nucleic Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に記載されている方法等を用いることができる。【００６６】
TaqManタイプのプローブは、一端に結合した蛍光物質が、他端に結合している消光物質の近傍に存在する際には、励起光を照射しても蛍光共鳴エネルギー転移により、発光が抑制されている。【００６７】
しかし、アニーリングのステップにおいて、標的遺伝子に特異的にハイブリダイズした後、プライマー側から、DNA鎖の伸長反応が開始されると、TaqDNAポリメラーゼのもつ５’→３’方向のエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManタイププローブは、５’側から順に分解される。つまり、蛍光物質と消光物質が遊離し、消光物質による抑制が解除されて蛍光が発せられるのである。【００６８】
一方、標的配列とプローブの間の相補性が不完全である場合，例えばプローブの５’側からの３塩基にミスプライミングがある場合等には、後述するTaqDNAポリメラーゼがTaqManタイププローブを認識できない恐れがあるため、プローブの分解も起こらず、レポーター物質の発光は抑制されたままとなり、増幅された目的遺伝子の検出又は定量の量に誤りが生じる可能性がある。【００６９】
つまり、少なくともTaqDNAポリメラーゼに認識される程度に、鋳型にハイブリダイズし得るプローブを用いた場合にのみ、発光量が遺伝子増幅量を正確に反映していることになる。別の見方をすれば、正しく増幅された標的遺伝子にハイブリダイズした場合にのみ、発光が起こる。そして、この発光量の経時的な変化を観察することによって、リアルタイムに、標的配列の増幅の様子を検査することができるのである。【００７０】
これらの蛍光物質や消光物質としては、市販のリアルタイムPCR用キットに含まれているものを用いることができるが、具体的には、下記のようなものが挙げられる。【００７１】
蛍光物質（レポーター蛍光物質）としては、FAM（６−カルボキシフルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。【００７２】
消光物質（クエンチャー物質）としては、TAMRA（６−カルボキシテトラメチルローダミン）のようなローダミン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。【００７３】
《HIV-1遺伝子の検出又は定量方法》
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法としては、公知の遺伝子検出又は定量方法において、プライマー，プローブ，それらを使用したキット等として、上記の本発明のプライマー，プローブ，キット等を用いる方法が挙げられる。
使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、具体的には、PCR法（EP200362等参照）やNASBA法（EP329822等参照），TAS法（WO88/10315等参照）、ＬＡＭＰ法（Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, NO.12，栄研化学株式会社），ＴＲＣ法（Analytical Biochemistry 314 (2003) 77−86，東ソー株式会社）等のほか、DNA鎖の置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ（BcaBESTTM DNAポリメラーゼ）、RNAとDNAの混成二本鎖のRNA鎖のみを特異的に切断するリボヌクレアーゼH（RNase H）の2種類の酵素と、RNA部分とDNA部分からなるキメラプライマーを用いて行う等温遺伝子増幅法（ICAN法：Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，タカラバイオ社）等の、核酸増幅法が挙げられる。
更に、改良型のPCR法として、リアルタイム−PCR法，nested-PCR法，nested-リアルタイムPCR法（高感度リアルタイムPCR），及びこれらに、PCR法の実施前に、ウイルスRNAをcDNAに逆転写する工程を組合せた方法等が挙げられる。
また、リアルタイムPCR法としては、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質，他端に消光物質（クエンチャー）が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法，DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法においては、リアルタイムPCR法としてTaqManプローブ法を用いたnested−リアルタイムPCR法が、検出・定量感度等の点で最適である。【００７４】
《PCR法》
PCR法とは、公知の方法であって、特定のDNA領域をはさんだ2種類のプライマーと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅反応の試験管内による繰り返しで、その特定DNA領域を短時間に簡便に数千万〜億倍に増幅する方法である。【００７５】
《nested-PCR法》 
nested-PCR法とは、公知の方法である。 
nested-PCR法とは、２対のプライマー対を使って、２段階のPCRを行う方法である。
２対とは、
(1)標的遺伝子領域を増幅するためのPCRに用いるプライマー対（フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのセットで１対）と、
(2)最初の標的遺伝子領域の増幅に使用したプライマー位置より、更に内側にフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを設定し、一段階目で増幅されたDNAを更に特異的に増幅するプライマー対
である。
この２段階のPCRに基づく増幅により、最初のPCR反応で増幅されたPCR産物（標的遺伝子＋非特異的産物）から、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である。【００７６】
《リアルタイムPCR法》
リアルタイムPCR法とは、PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし指数関数的増幅領域で定量を行う、公知の遺伝子増幅方法であり、具体的には上述の「非特許文献２」Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)や、「タカラバイオ  リアルタイムPCR実践ガイド  はじめてのリアルタイムPCR  0412V20」等に記載されている。【００７７】
TaqManタイププライマーを用いたリアルタイムPCR法の反応は、次のようにして行う。
（１）DNA増幅を行うサーマルサイクラーと、増幅DNAをモニタリングする分光蛍光光度計を一体化した、リアルタイムPCR専用装置を用いる。
（２）PCRのプローブとして、上述のTaqManタイプのプローブを予め添加しておく。
（３）Taq DNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを反応させ、５’→３’方向のエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManタイププローブを分解することで、蛍光を発生させる。この時、プローブのハイブリダイズが不完全である遺伝子増幅物（つまり、標的遺伝子以外のもの）の場合には、DNAポリメラーゼがTaqManタイププローブを認識できず、プローブの分解も起こらないために、レポーター物質の発光は抑制されたままとなる。
（４）増幅産物をリアルタイムでモニタリングし、増幅曲線を表示する。増幅曲線とは、PCRでは、1サイクルの反応により、DNA量は、指数関数的に増幅（２ｎ乗）し、やがてプラトーに達する様子を、サイクル数を横軸に、蛍光強度を縦軸に表したものである（図３等参照）。
（５）この際、DNA濃度が予め分かっているβ2ミクログロブリン(β２M)等のコントロール溶液，及び、DNA濃度が予め分かっているHIV-1遺伝子溶液を、各々段階希釈し、それぞれ増幅曲線を描いておく。尚、初期のDNA量が多いと、少ないサイクル数で蛍光強度が検出可能な量となるため、増幅曲線は、早く立ち上がる。
（６）適当な閾値（蛍光強度）における、各コントロール濃度とPCRサイクル数の間の直線関係から、コントロール及びHIV-1遺伝子の各々の検量線（図２参照）を作製する。閾値と増幅曲線が交わる点をCt値（Threshold Cycle）（LightCycler LC Fast-start kit （Roche）においては、この値(Ct値)は、Cp値（Crossing point）として表示されている。）と言う。
（７）この検量線から、標的遺伝子のCt値をもとに、標的遺伝子の初期の量が算出できる。【００７８】
このリアルタイムPCR法は、従来の、反応終了後にPCR増幅産物を確認する方法に比べて、
（ｉ）DNAやRNAの正確な定量ができること、
（ii）電気泳動が不要であるため、迅速かつ簡便に解析でき、コンタミネーションの危険性も小さいこと（タカラバイオ  リアルタイムPCR実践ガイド  はじめてのリアルタイムPCR  0412V20より引用）
など多くの利点がある。【００７９】
《nestedリアルタイム-PCR法》
nestedリアルタイム-PCR法とは、公知の方法であり、最初のPCRによって増幅された遺伝子を、リアルタイムPCR法により定量する方法である。詳細は、例えば上述の「非特許文献１」Journal of Virological Methods 124(2005) 157-165(Hiromi Nagai , Tsuguhio Kaneda, et al.)等に記載されている。この方法も、nested-PCR法の一種であるため、(1)定量前の遺伝子増幅（pre-quantification）のためのPCRに用いるプライマー対と、(2) 定量前の遺伝子増幅に使用したプライマー位置より、更に内側に設定した、定量前増幅後の遺伝子量を決定するためのPCR（リアルタイムPCR法）用のプライマー対が必要である。また、検出又は定量用プローブとしては、上述のTaqManタイププローブを用いる。【００８０】
nedted-リアルタイムPCR法を用いたHIV-1遺伝子の定量は、具体的には、例えば下記の手順に従って行うことができる（図２参照）。【００８１】
(1)検体から細胞を分離する。 
(2)分離細胞からDNAを抽出する。 
(3)定量前遺伝子増幅（pre-quantification）を行う前に、コントロールであるβ２M量を、リアルタイムPCR法により定量する。
(4)定量前遺伝子増幅（pre-quantification）反応により、HIV-1遺伝子とβ２M遺伝子を同時に増幅する。 
(5)定量前遺伝子増幅（pre-quantification）反応後の、HIV-1遺伝子とβ２M遺伝子の遺伝子量を、それぞれ、リアルタイムPCR法により定量する。
(6)β２Mについて、(5)の量を(3)の量でわり算することにより、遺伝子増幅率を算出する。尚、HIV-1遺伝子単独の場合と、HIV-1遺伝子をβ２M遺伝子と同時にPCR法にかけた場合とでは、HIV-1遺伝子の増幅量に変化が無く、β２MのPCRによる、HIV-1遺伝子のPCRに対する干渉作用が認められないことは、本発明者によって、既に確認済である（平成12〜14年度  厚生労働科学研究費補助金  エイズ対策研究事業，HIVの検査法と検査体制を確立するための研究，12．HIV-1DNAの検出と定量に関する研究，12−(2)．高感度リアルタイムPCRによるHIV-1 DNA定量法の確立（金田次弘）に掲載の図４参照）。 
(7)(6)の遺伝子増幅率は、HIV-1遺伝子にも共通する値であることから、HIV-1遺伝子の(5)の量を、この増幅率でわり算することによって、もとのHIV-1遺伝子量を算出できる。【００８２】
このnestedリアルタイム-PCR法は、上述の、nested-PCR法と、リアルタイム-PCR法の利点を併せ持っている。【００８３】
従って、本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量方法に使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、上述の検出又は定量方法の中でも、PCR法が好ましく、中でも、nested-PCR法，nested-リアルタイムPCR法が好ましく、特にnested-リアルタイムPCR法が好ましい。【００８４】
《HIV-1遺伝子検出又は定量用キット》
本発明のキットには、本発明のプライマー，プライマー対，又はプローブが少なくとも一種類含まれる。PCR法の場合には、少なくとも１対のプライマーが必要である。特に、nested-リアルタイムPCR法等のnested-PCR法の場合には、２対のプライマーを用いることが必要である。しかし、このプライマー対は、必ずしも本発明のプライマー対である必要は無く、プライマー対のうちの一つが、本発明のプライマーである場合も含まれる。また、本発明のプローブを用いる場合には、プライマーが本発明のプライマーで無くとも良い。【００８５】
《プライマー対の組合せ》
本発明のプライマーを、一対のみ用いる際には、上記グループ(I)又は（II）に属するポリヌクレオチドの一種と、上記グループ（III）又は（IV）に属するポリヌクレオチドの一種を用いることが出来、いずれの組合せでも良い。【００８６】
但し、nested-リアルタイムPCR法等のnested-PCR法の場合には、二対のプライマー対が必要である。即ち、第一段階として、標的となる遺伝子配列を予めPCRで増幅する際に用いるプライマー対と、第二段階であるリアルタイムPCRに用いるプライマー対である。第一段階のPCRでは、第二段階で増幅したい標的遺伝子配列よりも、広い領域で増幅しておくことが必要である。従って、第一段階用の一対は、グループ(I)の一種とグループ（IV）の一種からなるプライマー対とし，第二段階用のもう一対は、グループ（II）の一種とグループ（III）の一種からなるプライマー対であることが好ましい。本発明におけるグループ(I)〜（IV）は、HIV-1遺伝子の領域の５‘→３’の順に順次対応させた遺伝子領域をモデルとして設計されたものである（図1参照）。よって、グループ(I)，(IV)は、HIV-1遺伝子上、グループ(II)，（III）よりも外側の領域をもとに設計されている。【００８７】
本発明のキットには、上記プライマーやプローブの他、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素や、緩衝液を含ませることもできる。【００８８】
《耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素》
耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、例えばTaqDNAポリメラーゼ等が好適なものとして挙げられる。TaqDNAポリメラーゼとは、1976年に米国イエローストーン国立公園の温泉から採取されたThermus aquaticus TY1株から精製された酵素である。この酵素の最大の特徴は反応指摘温度が70〜80度である。そのためPCR法に適した酵素として広く用いられている。このTaqDNAポリメラーゼは、一本鎖DNAを鋳型にして、逆向きの鎖を５’から3’に向かって合成する作用を有している。また、TaqDNAポリメラーゼの特徴として、ポリメラーゼ活性と同時に、エキソヌクレアーゼ活性を有することが挙げられる。このため、TaqDNAポリメラーゼは、単なるPCR法による増幅反応の他、TaqManタイプのプローブを用いるリアルタイムPCR法，nested-リアルタイムPCR法等においても、重要な役割を果たすことができる。但し、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素は、これに限られるものでは無く、他のテルムス菌種、例えば，テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus），テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）等から得られるものも使用可能である。また、この他、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis），ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus），テルモトガ種（Thermotoga sp.）等から得られるものであっても良い。【００８９】
《緩衝液》
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用キットに用いられる緩衝液としては、Taq DNAポリメラーゼ（製品番号  1 146 165, Roche）等に使用されているものを用いることができる。具体的な緩衝液の組成としては、10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 等が挙げられる（非特許文献１の2.materials and methods 
の2.1.2 Nested real-time PCR等参照）【００９０】
《HIV遺伝子検出又は定量用検体》
本発明のプライマー，プローブ，又はキットによって測定可能な検体としては、血漿、血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液の他、細胞や組織等が挙げられる。血漿中においては、HIVはRNAとして検出又は定量される。細胞を用いた検出又は定量では、HIVウイルス自身が有する逆転写酵素によって逆転写されたcDNAや、そのcDNAが細胞内のゲノムに取り込まれたプロウイルス，或いはプロウイルスが転写されたmRNAを測定することによって、HIVが検出又は定量される。本発明の実施例においては、例として細胞内の、逆転写されたcDNA及びプロウイルスのトータル量を測定している。【００９１】
HIVが感染すると以下のステップにより宿主標的細胞内に侵入し、後天性免役不全症候群(AIDS)の一因になりうる。
（１）HIVが、感染者自身の細胞内に侵入するステップ
（２）逆転写酵素によって、cDNAとなるステップ
（３）そのcDNAが細胞内のゲノムに組み込まれ、プロウイルスとなるステップ
（４）プロウイルスがヒト転写機構によりmRNAに転写されるステップ
（５）転写されたmRNAから翻訳によってウイルスタンパク質を合成するステップ
（６）HIVウイルス粒子が複製され、感染細胞から出芽していくステップ
を経て初めて、HIVウイルスの増殖が繰り返し起こり、約10年という長い年月を経て，AIDSの発症へと進展して行く。【００９２】
従って、単に血中のHIV遺伝子量が多くても、細胞内にHIVウイルスが取り込まれたり、増殖するとは限らない。つまり、血中のHIV遺伝子量の測定では、AIDSの発症や進行の有無を正確に判定することが難しいと考えられている。【００９３】
従来、血中のウイルスRNA量とCD4陽性Tリンパ球数で病態の把握を行ってきたが、現時点ではウイルスRNA量に加えて細胞内のプロウイルスを測定することや、プロウイルスから転写された細胞内mRNA量を測定することが、より、病気の進行程度を的確にとらえることができる。このことにより、過剰な投薬・治療を防止できる指標となりうると思われる。【００９４】
抗HIV薬多剤併用療法により、血漿中のHIV-1 RNAが検出又は定量感度（血中ウイルス量＜50コピー/ml血漿）以下に抑えられた症例では、血中ウイルスRNA量の測定だけでは治療効果を評価することは無理である。これに対し、感染細胞内の残存プロウイルスの量を定量し、かつそれが産生する全長mRNA量を定量することができればプロウイルス１つあたりの転写能力が評価でき、治療効果の評価と治療中断の可否を決定するエビデンスになると思われる。【００９５】
本発明の検出又は定量方法は、細胞内の少量のcDNAやプロウイルスを測定するのに好適な方法である。特に、本発明のプライマー，プローブ，又はキット等を用い、nested-リアルタイムPCR法で測定した場合、検出限界が、２コピー未満／１０６細胞という、驚異的な感度を達成できる。【００９６】
《人免疫不全症候群治療用遺伝子断片》
本発明のグループ（I）〜（VI）に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片は、アンチセンス試薬やsmall interfering RNA（siRNA）を用いたRNA干渉(RNAi)のための部分構造等として、AIDSの遺伝子治療用に用いることができる。【００９７】
治療用遺伝子断片の遺伝子形態としては、DNAの他、ＲＮＡ，プラスミド，ウイルスベクター等が使用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。この際、siRNAを作るベクターに、DNAを組み込んで用いることもできる。プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。ウイルスベクターを用いる場合、（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）等に記載されているように、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスが挙げられる。ウイルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等が好ましく、特にアデノウイルスが好ましい。【００９８】
《人免疫不全症候群の治療方法》
遺伝子を実際に医薬として作用させ、治療するには、当該遺伝子を直接体内に導入する「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」等がある［日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等］が、ｉｎ  ｖｉｖｏ法は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましい。「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等が挙げられる。「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明のプライマー（配列番号５，配列番号７），プローブの有用性（配列番号１１）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較するため、サブタイプA,B,C,D,組換え流行株CRF01_AEに属する患者のHIV-1遺伝子の検出又は定量を実施した結果を示すが、それに先だって、実施例で用いた実験方法及び実験材料について説明する。【０１００】
《実験方法》
上述の《nestedリアルタイム-PCR法》を使用する。尚、《nestedリアルタイム-PCR法》については、下記［１］〜［６］のようにして行った。【０１０１】
［１］《nestedリアルタイム-PCR法》の検体から細胞を分離する方法
［CD4 陽性Tリンパ球の分離(StemSep Negative Cell Selection)］
（StemSep） 
StemSepとは、除去を目的とする細胞の表面に発現しているタンパク質を標的とし、それに対する抗体と磁性コロイドを結合させて、磁石にセットしたカラムにトラップさせ、細胞溶液中から不要な細胞を除去し、目的とする細胞のみを濃縮回収する方法である。【０１０２】
（StemSep試薬）
StemSep試薬とは、除去したい細胞に結合させる抗体および磁気コロイドの試薬セットである。ヒトの細胞用のStemSep試薬としては、Tetrameric Antibody Complex（四量体抗体複合物）のカクテルと磁気コロイドのセットを用いる。【０１０３】
(1)へパリン又はEDTA （ethylene-diamine-tetraacetic acid）添加全血を400×G(1200rpm) 15分間遠心し、血球層、バフィーコート（白血球層）及び血漿に分離する。
(2)バフィーコート層を採取する。
(3)赤血球溶血用塩化アンモニウム溶液(150mmol/l NH4Cl、10mmol/l KHCO3、81μmol/l EDTA 4Na)を10ml添加し20分間反応させ赤血球を溶血させる。 
(4)遠心（400×G（1200rpm）、5分）後、上清除去する。細胞沈査は10mlのリン酸緩衝化食塩水（PBS）にウシ胎児血清(Fetal Calf Serum、FCS)を2％加えた緩衝液(PBS+2％FCS)でピペッティングにより再懸濁を行う。
(5)遠心（（400×G（1200rpm）、5分）後、上清除去する。 
(6)細胞沈査に1mlのPBS+2％FCSを加え、再懸濁後、1.5mlのDNase・RNaseフリーチューブに移す。
(7)1.5ml DNase・RNaseフリーのチューブに移したバフィーコート1mlにCD4+エンリッチメントカクテル (一次抗体、STS-14052 (StemSep、ベリタス社製) )を100μl添加し、転倒混和する。 
(8)室温で15分間抗原抗体反応（氷中の場合は30分間）を行う。
(9)反応後、マグネット抗体を60μl添加し、転倒混和し室温で15分間抗原抗体反応を行う（氷中の場合は30分間）。
(10)抗原抗体反応を続行させているかたわら、別途並行してカラム（STS-12031（StemSep、ベリタス社製））をセットし、PBS+2％FCS緩衝液でカラムを洗浄する。 
(11)抗原抗体反応後、サンプルをカラムに添加し重力により目的細胞を落下させ、目的細胞を回収する。 
(12)回収後、400×G(1200rpm)、10分間遠心し、上清を除去する。
(13)細胞沈査にPBS 液を加え再懸濁する。【０１０４】
［２］《nestedリアルタイム-PCR法》の分離細胞からDNAを抽出する方法分離した細胞からの、DNAの抽出は、常法により行うことができるが、例えば、（QIAamp DNA Blood mini kit（QIAGEN）を用い、このキットに添付されている説明書に記載の方法を用い、説明書の、最後のDNA回収の段階で、Buffer AEに代えて、６０μlのDDW(double distilled water)を用い、6000×g（8000rpm）  １分で遠心することにより、DNAを回収することができる。【０１０５】
［３］β2ミクログロブリン（β2M）の定量抽出したDNA中のβ2M遺伝子コピー数を定量する事により、DNA抽出時（定量前PCR前）の細胞数を算出する。【０１０６】
《実験材料》【０１０７】
［コントロールβ2M用プライマー］
リアルタイムPCRプライマー：
β2M-F:配列番号１２
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’
β2M-R: 配列番号１３ 
5’-accccactta actatcttgg-3’ 【０１０８】
［コントロールβ2M用TaqManプローブ］
リアルタイムTaqManプローブ：
β2M-T: 配列番号１４ 
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’ 【０１０９】
Standard plasmid:
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注) 【０１１０】
［Standard 希釈液調整］
1010コピー/μl液を2倍に希釈。その後、10倍に段階希釈。使用は2μl。【０１１１】
［リアルタイムPCR法：LightCycler LC Fast-start kit （Roche）］
PCR Mixture 【０１１２】
リアルタイムPCR法のPCR反応液の組成を表１に示す。【０１１３】
【表１】
2007055260.tif 000003
【０１１４】
108,107,106,105,104,103,102,101コピー/2μlとなるように段階希釈したpGEM-B2M 
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。【０１１５】
［リアルタイムPCRプログラム］
95℃  10分間: Denature
95℃  10秒、60℃  30秒  45サイクル: PCR＋蛍光強度測定 
40℃  30秒間: Cooling 【０１１６】
《結果》【０１１７】
β2Mコピー数測定の結果記入シート例を表２に示す。【０１１８】
【表２】
2007055260.tif 000004
【０１１９】
B2M-Q：B2M測定値 
B2M：B2M×25  抽出されたDNA中の総β2Mコピー数
Total cells：B2M/2 抽出されたDNAの総細胞数を算出【０１２０】
［４］定量前増幅反応（HIV-1 DNA-β2M同時増幅法）
［プライマー］
β2M 増幅プライマー： 
β2M-F2: 配列番号１２ 
5’-cagca aggac tggtc tttct atctc t-3’ 
β2M-R : 配列番号１３ 
5’-acccc actta actat cttgg-3’ 【０１２１】
HIV-1 DNA増幅プライマー： 
Pre-quantification forward: 配列番号３ 
5’-cctagaactt taaatgcatg ggt-3’ 
Pre-quantification reverse: 配列番号９ 
5’-attctgcagc ttcctcattg at-3’ 【０１２２】
［DNA量］【０１２３】
定量前増幅反応に使用するDNA量記入シート例を表３に示す。【０１２４】
【表３】
2007055260.tif 000005
【０１２５】
DNA 使用量：定量前PCR反応に用いたDNA volume(μl) 
Water vol：Sample量を60μlに調整する為のDDW量(μl) 【０１２６】
PCR  Mixtureを表４に示す。【０１２７】
【表４】
2007055260.tif 000006
【０１２８】
［定量前増幅PCRプログラム  ＃56−20］
94℃  1分間: Denature 
94℃  30秒、55℃  30秒、72℃  1分  20サイクル: PCR 
72℃  8分間: 伸長反応 
4℃: cooling 【０１２９】
［５］β2ミクログロブリン（β2M）の定量  ２回目
定量前増幅反応後のβ2Mコピー数を定量し、PCR増幅率を算出する。【０１３０】
［プライマー及びTaqManプローブ−(3)の反応と同じ］
リアルタイムPCRプライマー： 
β2M-F2: 配列番号１２ 
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’ 
β2M-R: 配列番号１３ 
5’-accccactta actatcttgg-3’ 
リアルタイムTaqManプローブ：
β2M-T: 配列番号１４ 
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’【０１３１】
Standard plasmid:
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注) 
検量線：1010,108,106,105,104,103,102,101コピー/2μlのpGEM-B2M 
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。【０１３２】
《リアルタイムPCR法：LightCycler LC Fast-start kit （Roche）使用》
反応液組成等は(3)と同じ。【０１３３】
PCR Mixtureを表５に示す。【０１３４】
【表５】
2007055260.tif 000007
【０１３５】
［リアルタイムPCRプログラム］
95℃  10分間: Denature 
95℃  10秒、60℃  30秒  45サイクル: PCR＋蛍光強度測定 
40℃  30秒間: Cooling【０１３６】
［結果］【０１３７】
定量前増幅反応後β2Mコピー数測定の結果記入シート例を表６に示す。【０１３８】
【表６】
2007055260.tif 000008
【０１３９】
使用細胞数：Total cells(増幅PCR前)×DNA使用量/50
使用B2Mコピー数：使用細胞数×2 
B2M-ampQ：定量前PCR後B2Mコピー数測定値
Total B2M-amp：B2M-ampQ×50  定量前PCRによって増幅したB2M遺伝子の総数
増幅率：Total B2M amp/使用B2Mコピー数【０１４０】
［６］定量前増幅反応後HIV-1 DNAの定量【０１４１】
［プライマー及びTaqManプローブ］
リアルタイムPCRプライマー： 
Real-time forward: 配列番号５
5’-ccagaagtga tacccatgtt-3’ 
Real-time forward: 配列番号７ 
5’-tttaacattt gcatggctgc-3’ 【０１４２】
リアルタイムTaqManプローブ：
TaqMan probe: 配列番号１１ 
5’-6FAM-atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc-TAMRA-3’ 【０１４３】
Standard plasmid:
pUC-IIIB (5×1010コピー/μlが10μlずつ分注)【０１４４】
［Standard 希釈液調整］
5×1010コピー/μl  液を10倍ずつに段階希釈
使用は2μl 【０１４５】
108,107,106,105,104,103,102,101コピー/2μlとなるように段階希釈したpGEM-B2M 
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。【０１４６】
［リアルタイムPCR法：LightCycler LC Fast-start kit （Roche）使用］
β2M測定法と同じ【０１４７】
PCR Mixtureを表７に示す。【０１４８】
【表７】
2007055260.tif 000009
【０１４９】
［リアルタイムPCRプログラム］ 
95℃  10分間: Denature 
95℃  10秒、60℃  30秒  45サイクル: PCR＋蛍光強度測定 
40℃  30秒間: Cooling 【０１５０】
［結果］【０１５１】
定量前増幅反応後HIV-1 DNAコピー数測定の結果記入シート例を表８に示す。【０１５２】
【表８】
2007055260.tif 000010
【０１５３】
HIV-ampQ：定量前PCR後HIVコピー数測定値 
HIV-1 DNA amp：HIV-ampQ×50  定量前PCRによって増幅したHIV-1 DNAの総数 
Original HIV-1 DNA：HIV-1 DNA/増幅率  抽出したDNA中にもともと存在したHIV-1 DNAコピー数 
HIV-1 DNA：Original HIV-1 DNA×1000000/used cells  106細胞中のHIV-1 DNAコピー数【０１５４】
［実施例１，比較例１（HIV-1遺伝子サブタイプAの検出及び定量）］
本発明のプライマー，プローブの有用性（実施例１）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例１）ため、サブタイプAに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。【０１５５】
i)まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプAの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。【０１５６】
尚、用いた検体は、下記の３種類である。
（サブタイプA検体情報）
A1：DNA濃度  49ng/μl 
A2：DNA濃度  45ng/μl 
A3：DNA濃度  45ng/μl 
DNAの塩基数：453 bp 
（スタンダード）
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)【０１５７】
（実施内容） 
a)サブタイプAの検体を１０倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。 
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。 
c)Pan-HIV-1法でサブタイプAの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプAの検体を正確に定量できか否かの確認。【０１５８】
（実験結果の判定方法）
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイム PCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。【０１５９】
〈検体：サブタイプA-A1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図３に示す。【０１６０】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図４に示す。【０１６１】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０１６２】
〈検体：サブタイプA-A2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図５に示す。【０１６３】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図６に示す。【０１６４】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０１６５】
〈検体：サブタイプA-A3〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図７に示す。【０１６６】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図８に示す。【０１６７】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０１６８】
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプAの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード: pUC-IIIB 【０１６９】
〈検体: サブタイプA-A1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表９及び図９に示す。【０１７０】
〈検体: サブタイプA-A2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１０及び図１０に示す。【０１７１】
〈検体: サブタイプA-A3〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１１及び図１１に示す。【０１７２】
表中のAve.は、5回の平均値，SDは、５回の測定値のばらつき（標準偏差），Cv（変動係数＝平均値/標準偏差×100(%)）は、測定値の再現性を示す。
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプA検体のコピー数を示す。【０１７３】
《Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：サブタイプA-A1〉【０１７４】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A1検体の測定結果）【０１７５】
【表９】
2007055260.tif 000011
【０１７６】
（結果）
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では71%から109％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０１７７】
〈検体：サブタイプA-A2〉【０１７８】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A2検体の測定結果）【０１７９】
【表１０】
2007055260.tif 000012
【０１８０】
（結果）
10コピーでは期待値の62%であったが、それ以上のコピー数の実験では90%から106％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０１８１】
〈検体：サブタイプA-A3〉【０１８２】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A3検体の測定結果）【０１８３】
【表１１】
2007055260.tif 000013
【０１８４】
（結果） 
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では73%から106％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０１８５】
iii)Sub-B法でサブタイプAの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB 【０１８６】
〈検体: サブタイプA-A1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１２及び図１２に示す。【０１８７】
〈検体: サブタイプA-A2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１３及び図１３に示す。【０１８８】
〈検体: サブタイプA-A3〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１４及び図１４に示す。【０１８９】
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプA検体のコピー数を示す。【０１９０】
《Sub-B法：定量結果》
〈サブタイプA-A1検体〉【０１９１】
（Sub-B法によるサブタイプA-A1検体の測定結果）【０１９２】
【表１２】
2007055260.tif 000014
【０１９３】
（結果）
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０１９４】
〈サブタイプA-A2検体〉【０１９５】
（Sub-B法によるサブタイプA-A2検体の測定結果）【０１９６】
【表１３】
2007055260.tif 000015
【０１９７】
（結果）
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０１９８】
〈サブタイプA-A3〉【０１９９】
（Sub-B法によるサブタイプA-A3検体の測定結果）【０２００】
【表１４】
2007055260.tif 000016
【０２０１】
（結果）
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０２０２】
《まとめ》
１．発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定したところ、サブタイプAの検体3例全てにおいてPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、反応に加えたDNAコピー数が108コピーの場合、本発明の方法では10サイクル目に立ち上がったが、従来の方法では30サイクル目であった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０２０３】
２．本発明法（Pan-HIV-1法）を用いた108から10コピーのサブタイプA検体を定量した結果をまとめる。【０２０４】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプA検体の測定結果のまとめを表１５に示す）【０２０５】
【表１５】
2007055260.tif 000017
【０２０６】
10コピーでは期待値の54%であったが、それ以上のコピー数の実験では87%から103％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０２０７】
３．従来法(Sub-B法)を用いた108から10コピーのサブタイプA検体を定量した結果をまとめる。【０２０８】
（Sub-B法によるサブタイプA検体の測定結果のまとめを表１６に示す）【０２０９】
【表１６】
2007055260.tif 000018
【０２１０】
（結果）
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。この結果は、リアルタイムPCRの立ち上がりから得られる結果とも一致する。【０２１１】
（プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプAの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図１５に示す。【０２１２】
リバース側プライマーが結合する配列の5’側3塩基目（リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域）にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になり、ポリメラーゼの認識が困難となっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。【０２１３】
［実施例２，比較例２（HIV-1遺伝子サブタイプBの検出及び定量）］
本発明のプライマー，プローブの有用性（実施例２）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例２）ため、サブタイプBに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。【０２１４】
i)まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプBの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。【０２１５】
尚、用いた検体は、下記の２種類である。
（サブタイプB検体情報） 
B1：DNA濃度  31ng/μl 
B2：DNA濃度  20ng/μl 
DNAの塩基数： 453 bp 
（スタンダード）
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB) 【０２１６】
（実施内容）
a)サブタイプB-B1の検体を１０倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。 
c)Pan-HIV-1法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。【０２１７】
（実験結果の判定方法）
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。【０２１８】
〈検体：サブタイプB-B1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図１６に示す。【０２１９】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図１７に示す。【０２２０】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-HIV-1法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これは、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー，プローブを用いる方法であるため、当然の結果とも言える。【０２２１】
〈検体：サブタイプB-B2〉 
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図１８に示す。【０２２２】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図１９に示す。【０２２３】
（結果）
Pan-B法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-B法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これも、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー，プローブを用いる方法であるため、当然の結果と言える。【０２２４】
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプBの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード：ｐUC-IIIB【０２２５】
〈検体: サブタイプB-B1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１７及び図２０に示す。【０２２６】
〈検体: サブタイプB-B２〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１８及び図２１に示す。【０２２７】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプB検体のコピー数を示す。【０２２８】
《Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：サブタイプB-B1〉【０２２９】
（Sub-B法によるサブタイプB-B1検体の測定結果）【０２３０】
【表１７】
2007055260.tif 000019
【０２３１】
（結果）
108〜10コピーまで、期待値の88〜118%までと極めて良好に、また、Cv値も1.5〜16％までと再現性良く測定することができた。【０２３２】
〈検体：サブタイプB-B２〉【０２３３】
（Sub-B法によるサブタイプB-B２検体の測定結果）【０２３４】
【表１８】
2007055260.tif 000020
【０２３５】
（結果）
10コピーでは期待値の60％であったが、それ以上のコピー数の実験では74%から104％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０２３６】
iii)公知文献法(Sub-B法)でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB【０２３７】
〈検体：サブタイプB-B1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表１９及び図２２に示す。【０２３８】
〈検体：サブタイプB-B２〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２０及び図２３に示す。【０２３９】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプB検体のコピー数を示す。【０２４０】
《Sub-B法：定量結果》
〈サブタイプB-B1検体〉【０２４１】
【表１９】
2007055260.tif 000021
【０２４２】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。【０２４３】
〈サブタイプB-B2検体〉【０２４４】
【表２０】
2007055260.tif 000022
【０２４５】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。【０２４６】
《まとめ》
サブタイプBの検体はPan-HIV-1法、Sub-B法とも極めて良好な正確性、及び再現性を有し測定することが可能であった。【０２４７】
（プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプBの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図２４に示す。【０２４８】
Pan-HIV-1法、Sub-B法ともに、プライマー及びプローブの結合領域にPCR反応に影響を及ぼすような変異は見られなかった。結果、両測定法とも再現性良く正確に測定できたと考えられる。【０２４９】
［実施例３，比較例３（HIV-1遺伝子サブタイプCの検出及び定量）］
本発明のプライマー，プローブの有用性（実施例３）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例３）ため、サブタイプCに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。【０２５０】
i)まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプCの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。【０２５１】
尚、用いた検体は、下記の２種類である。
（サブタイプA検体情報） 
C1：DNA濃度  24ng/μl 
C2：DNA濃度  51ng/μl
DNAの塩基数：453 bp 
（スタンダード）
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB) 【０２５２】
（実施内容） 
a)サブタイプCの検体を１０倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。 
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。 
c)Pan-HIV-1法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。 
d)Sub-B法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。【０２５３】
（実験結果の判定方法）
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。【０２５４】
〈検体：サブタイプC-C1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図２５に示す。【０２５５】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図２６に示す。【０２５６】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０２５７】
〈検体：サブタイプC-C2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図２７に示す。【０２５８】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図２８に示す。【０２５９】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０２６０】
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプCの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード：ｐUC-IIIB 【０２６１】
〈検体: サブタイプC-C1〉【０２６２】
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２１及び図２９に示す。【０２６３】
〈検体: サブタイプC-C2〉【０２６４】
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２２及び図３０に示す。【０２６５】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプC検体のコピー数を示す。【０２６６】
《Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：サブタイプC-C1〉【０２６７】
【表２１】
2007055260.tif 000023
【０２６８】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。【０２６９】
〈検体：サブタイプC-C2〉【０２７０】
【表２２】
2007055260.tif 000024
【０２７１】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。【０２７２】
iii)公知文献法(Sub-B法)でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB【０２７３】
〈検体：サブタイプC-C1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２３及び図３１に示す。【０２７４】
〈検体：サブタイプC-C2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２４及び図３２に示す。【０２７５】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプC検体のコピー数を示す。【０２７６】
（Sub-B法によるサブタイプC-C1検体の測定結果）【０２７７】
【表２３】
2007055260.tif 000025
【０２７８】
（結果）
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０２７９】
〈サブタイプC-C2検体〉【０２８０】
（Sub-B法によるサブタイプC-C2検体の測定結果）【０２８１】
【表２４】
2007055260.tif 000026
【０２８２】
《まとめ》
１．サブタイプCの検体ではSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きく、これは、Pan-HIV-1法と比べ約20サイクルの違いを示した。
２．これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
３．実際の定量値で見てみると、Sub-B法では期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
４．一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、C1検体で期待値の72％、C2期待値の130％であったが、それ以外のコピー数ではC1検体で88％から126％の値をC2検体で83〜124％示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
５．今まで測定できなかったサブタイプCの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。【０２８３】
（プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプCの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図３３に示す。【０２８４】
Sub-B法ではリバース側プライマーの5’側3塩基目（リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域）にA→G変異が入っており、この変異のため、プライマー結合及び伸長反応が効率よく行われず、PCR反応が開始時サイクルの極端な遅れが発生し、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。【０２８５】
［実施例４（HIV-1遺伝子サブタイプDの検出及び定量）］
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性（実施例４）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例４）ため、サブタイプDに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。【０２８６】
i)まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプDの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。【０２８７】
尚、用いた検体は、下記の２種類である。
（サブタイプD検体情報）
D1：DNA濃度  25ng/μl 
D2：DNA濃度  38ng/μl 
DNAの塩基数：453 bp 
（スタンダード）
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB) 【０２８８】
（実施内容） 
a)サブタイプDの検体を１０倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。 
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。 
c)Pan-HIV-1法でサブタイプDの検体を正確に定量できるか否かの確認。 
d)Sub-B法でサブタイプDの検体を正確に定量できか否かの確認。【０２８９】
（実験結果の判定方法）
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。【０２９０】
〈検体：サブタイプD−D1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図３４に示す。【０２９１】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図３５に示す。【０２９２】
（結果） 
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。【０２９３】
〈検体：サブタイプD-D2〉 
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図３６に示す。【０２９４】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図３７に示す。【０２９５】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。【０２９６】
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプDの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード：ｐUC-IIIB 【０２９７】
〈検体: サブタイプD-D1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２５及び図３８に示す。【０２９８】
〈サブタイプD-D２〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２６及び図３９に示す。図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプD検体のコピー数を示す。【０２９９】
《Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：サブタイプD-D1〉【０３００】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D1検体の測定結果）【０３０１】
【表２５】
2007055260.tif 000027
【０３０２】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。【０３０３】
〈検体：サブタイプD-D2〉【０３０４】
（Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D2検体の測定結果）【０３０５】
【表２６】
2007055260.tif 000028
【０３０６】
（結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。【０３０７】
iii)Sub-B法でサブタイプDの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB 【０３０８】
〈検体：サブタイプD-D1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２７及び図４０に示す。【０３０９】
〈検体：サブタイプD-D２〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２８及び図４１に示す。【０３１０】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプD検体のコピー数を示す。【０３１１】
《Sub-B法  定量結果》
〈サブタイプD-D1検体〉【０３１２】
（Sub-B法によるサブタイプD-D1検体の測定結果）【０３１３】
【表２７】
2007055260.tif 000029
【０３１４】
（結果）
期待値に比べ1/10３程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０３１５】
〈サブタイプD-D2検体〉【０３１６】
（Sub-B法によるサブタイプD-D2検体の測定結果）【０３１７】
【表２８】
2007055260.tif 000030
【０３１８】
（結果）
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。【０３１９】
《まとめ》
１．サブタイプDの検体では個体間でその差はあったもののSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きかった。（108コピーのサンプルがD1では22サイクル目、D2では30サイクルで立ち上がり始めた）
２．Pan-HIV-1法と比べてみると、PCRの回数に例えるとD1検体では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。D2では220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
３．実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べD1検体で1/103程度の量、D2検体で1/105程度の量は算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
４．一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、D1検体で期待値の180％、D2期待値の70％であったが、それ以外のコピー数ではD1検体で89％から127％の値をD2検体で78〜122％示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
５．今まで測定できなかったサブタイプDの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。【０３２０】
（プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプDの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図４２に示す。【０３２１】
リバース側プライマーの5’側3塩基目（リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域）にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。【０３２２】
［実施例５（HIV-1遺伝子サブタイプ組換え流行株，CRF01_AEの検出及び定量）］
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性（実施例５）を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例５）ため、サブタイプ組換え流行株CRF01_AEに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。【０３２３】
i)まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ組換え流行株CRF01_AEの検体でリアルタイムPCR反応が理論通りに起こっているかについて検討した。【０３２４】
尚、用いた検体は、下記の２種類である。
（CRF01_AE検体情報）
CRF01_AE1：DNA濃度  54ng/μl 
CRF01_AE2：DNA濃度  35ng/μl 
DNAの塩基数：453 bp 
（スタンダード）
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)【０３２５】
（実施内容）
a)CRF01_AEの検体を段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成 
b)発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。 
c)Pan-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの確認。 
d)Sub-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できか否かの確認。【０３２６】
（実験結果の判定方法）
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。【０３２７】
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE1〉 
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図４３に示す。【０３２８】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図４４に示す。【０３２９】
（結果）
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置は3サイクルしか違わなかった。例えば、検体AE1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では13サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。【０３３０】
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE2〉 
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図４５に示す。【０３３１】
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図４６に示す。【０３３２】
（結果）
Sub-B法とではPan-HIV-1法に比べPCRの立ち上がりが12サイクル遅くなっていた。例えば、検体AE2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。【０３３３】
ii)Pan-HIV-1法で組換え流行株CRF01_AEの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード：ｐUC-IIIB 【０３３４】
〈検体: 組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表２９及び図４７に示す。【０３３５】
〈検体: 組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表３０及び図４８に示す。【０３３６】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字が組換え流行株CRF01_AE検体のコピー数を示す。【０３３７】
《Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE1〉【０３３８】
（Pan-HIV-1法によるCRF01_AE-AE1検体の測定結果）【０３３９】
【表２９】
2007055260.tif 000031
【０３４０】
（結果） 
10コピーでは期待値の165％であったが、それ以上のコピー数の実験では78％から111％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。【０３４１】
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE2〉【０３４２】
（Pan-HIV-1法によるCRF01_AE-AE2検体の測定結果）【０３４３】
【表３０】
2007055260.tif 000032
【０３４４】
（結果）
10コピーでは期待値の50％であったが、それ以上のコピー数の実験では71％から104％の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては良好である。【０３４５】
iii)Sub-B法で組換え流行株CRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB【０３４６】
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表３１及び図４９に示す。【０３４７】
〈検体：組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表３２及び図５０に示す。【０３４８】
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプCRF01_AE検体のコピー数を示す。【０３４９】
《Sub-B法：定量結果》
〈組換え流行株CRF01_AE-AE1検体〉【０３５０】
（Sub-B法によるCRF01_AE-AE1検体の測定結果）【０３５１】
【表３１】
2007055260.tif 000033
【０３５２】
（結果） 
10コピーの検体は16コピーと高値を示したが、後の検体は期待値の1/4程度のコピー数として算出され、その正確性は21〜47％と低いものであった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。【０３５３】
〈組換え流行株CRF01AE-AE2検体〉【０３５４】
（Sub-B法によるCRF01_AE-AE2検体の測定結果）【０３５５】
【表３２】
2007055260.tif 000034
【０３５６】
（結果）
全ての検体において期待値の1/1000〜1/100程度のコピー数としてしか算出されなかった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。【０３５７】
《まとめ》
１．CRF01_AEの検体の場合、Sub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に異なっていた。（108コピーのサンプルがAE1では13サイクル目、AE2では22サイクルで立ち上がり始めた）
２．Pan-HIV-1法と比較すると、PCRの回数に例えるとAE1検体ではで23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。一方、AE2では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
３．実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べAE1検体で1/4程度の誤差であったが、AE2検体では、予想通り期待値の1/1000程度の量しか測定されなかった。すなわち、Sub-B法では正確な定量が難しいことを意味する。
４．一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、AE1検体で期待値の165％、AE2検体で期待値の50％であったが、それ以外のコピー数ではAE1検体で78％から111％の値をAE2検体で71％から104％を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
５．今まで測定できなかったCRF01_AEの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。【０３５８】
（プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプ組換え流行株CRF01_AEの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図５１に示す。【０３５９】
リバース側プライマーの5’側3塩基目（リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域）にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。【０３６０】
（実施例の考察）【０３６１】
以上の結果から、本発明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)は、従来可能であったサブタイプBの１種類だけでなく、サブタイプA,C,D,及びサブタイプ組換え流行株CRF01_AE等についても、同時に検出及び定量可能であることが判明した。このことは、サブタイプ等の違いによる検出漏れを防ぐという意味で、本発明の検出又は定量方法が、実用上極めて優れていることを意味している。また、本発明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)が、濃度既知の10コピー/assay程度まで、HIV-1遺伝子の検出及び定量も正確にできたという上記の結果は、本発明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)が、微量なHIV-1遺伝子の測定に適したnested−リアルタイムPCR法を用いた際に、特にその有用性を発揮し得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０３６２】
本発明のプライマー，プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又は定量方法によって、少なくともHIV-1遺伝子のサブタイプA,B,C,D,サブタイプの組換え流行株CRF01_AEは、確実に増幅，検出又は定量することができ、世界で感染が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマーを２対用いた、nested-PCR法やnested-リアルタイムPCR法によれば、極めて低コピーのHIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、2コピー／106細胞という驚異的な感度を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０３６３】
【図１】各プライマー、プローブのベストマッチ配列の位置関係
【０３６４】
【図２】高感度リアルタイムPCR法の方法論
【０３６５】
【図３】サブタイプA-A1検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３６６】
【図４】サブタイプA-A1検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３６７】
【図５】サブタイプA-A2検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３６８】
【図６】サブタイプA-A2検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３６９】
【図７】サブタイプA-A3検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３７０】
【図８】サブタイプA-A3検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３７１】
【図９】Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A1検体の測定結果のフルオログラム
【０３７２】
【図１０】Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A2検体の測定結果のフルオログラム
【０３７３】
【図１１】Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A3検体の測定結果のフルオログラム
【０３７４】
【図１２】Sub-B法によるサブタイプA-A1検体の測定結果のフルオログラム
【０３７５】
【図１３】Sub-B法によるサブタイプA-A2検体の測定結果のフルオログラム
【０３７６】
【図１４】Sub-B法によるサブタイプA-A3検体の測定結果のフルオログラム
【０３７７】
【図１５】サブタイプA検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
【０３７８】
【図１６】サブタイプB-B1検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３７９】
【図１７】サブタイプB-B1検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３８０】
【図１８】サブタイプB-B2検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３８１】
【図１９】サブタイプB-B2検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３８２】
【図２０】Pan-HIV-1法によるサブタイプB-B1検体の測定結果のフルオログラム
【０３８３】
【図２１】Pan-HIV-1法によるサブタイプB-B2検体の測定結果のフルオログラム
【０３８４】
【図２２】Sub-B法によるサブタイプB-B1検体の測定結果のフルオログラム
【０３８５】
【図２３】Sub-B法によるサブタイプB-B2検体の測定結果のフルオログラム
【０３８６】
【図２４】サブタイプB検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
【０３８７】
【図２５】サブタイプC-C1検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３８８】
【図２６】サブタイプC-C1検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３８９】
【図２７】サブタイプC-C2検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３９０】
【図２８】サブタイプC-C2検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３９１】
【図２９】Pan-HIV-1法によるサブタイプC-C1検体の測定結果のフルオログラム
【０３９２】
【図３０】Pan-HIV-1法によるサブタイプC-C2検体の測定結果のフルオログラム
【０３９３】
【図３１】Sub-B法によるサブタイプC-C1検体の測定結果のフルオログラム
【０３９４】
【図３２】Sub-B法によるサブタイプC-C2検体の測定結果のフルオログラム
【０３９５】
【図３３】サブタイプC検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
【０３９６】
【図３４】サブタイプD-D1検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３９７】
【図３５】サブタイプD-D1検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０３９８】
【図３６】サブタイプD-D2検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０３９９】
【図３７】サブタイプD-D2検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０４００】
【図３８】Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D1検体の測定結果のフルオログラム
【０４０１】
【図３９】Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D2検体の測定結果のフルオログラム
【０４０２】
【図４０】Sub-B法によるサブタイプD-D1検体の測定結果のフルオログラム
【０４０３】
【図４１】Sub-B法によるサブタイプD-D2検体の測定結果のフルオログラム
【０４０４】
【図４２】サブタイプD検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
【０４０５】
【図４３】組換え流行株CRF01_AE-AE1検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０４０６】
【図４４】組換え流行株CRF01_AE-AE1検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０４０７】
【図４５】組換え流行株CRF01_AE-AE2検体におけるPan-HIV-1法のフルオログラム
【０４０８】
【図４６】組換え流行株CRF01_AE-AE2検体におけるSub-B法のフルオログラム
【０４０９】
【図４７】Pan-HIV-1法による組換え流行株CRF01_AE-AE1検体の測定結果のフルオログラム
【０４１０】
【図４８】Pan-HIV-1法による組換え流行株CRF01_AE-AE2検体の測定結果のフルオログラム
【０４１１】
【図４９】Sub-B法による組換え流行株CRF01_AE-AE1検体の測定結果のフルオログラム
【０４１２】
【図５０】Sub-B法による組換え流行株CRF01_AE-AE2検体の測定結果のフルオログラム
【０４１３】
【図５１】組換え流行株CRF01_AE検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
【図１】
2007055260.tif 000035
【図２】
2007055260.tif 000036
【図３】
2007055260.tif 000037
【図４】
2007055260.tif 000038
【図５】
2007055260.tif 000039
【図６】
2007055260.tif 000040
【図７】
2007055260.tif 000041
【図８】
2007055260.tif 000042
【図９】
2007055260.tif 000043
【図１０】
2007055260.tif 000044
【図１１】
2007055260.tif 000045
【図１２】
2007055260.tif 000046
【図１３】
2007055260.tif 000047
【図１４】
2007055260.tif 000048
【図１５】
2007055260.tif 000049
【図１６】
2007055260.tif 000050
【図１７】
2007055260.tif 000051
【図１８】
2007055260.tif 000052
【図１９】
2007055260.tif 000053
【図２０】
2007055260.tif 000054
【図２１】
2007055260.tif 000055
【図２２】
2007055260.tif 000056
【図２３】
2007055260.tif 000057
【図２４】
2007055260.tif 000058
【図２５】
2007055260.tif 000059
【図２６】
2007055260.tif 000060
【図２７】
2007055260.tif 000061
【図２８】
2007055260.tif 000062
【図２９】
2007055260.tif 000063
【図３０】
2007055260.tif 000064
【図３１】
2007055260.tif 000065
【図３２】
2007055260.tif 000066
【図３３】
2007055260.tif 000067
【図３４】
2007055260.tif 000068
【図３５】
2007055260.tif 000069
【図３６】
2007055260.tif 000070
【図３７】
2007055260.tif 000071
【図３８】
2007055260.tif 000072
【図３９】
2007055260.tif 000073
【図４０】
2007055260.tif 000074
【図４１】
2007055260.tif 000075
【図４２】
2007055260.tif 000076
【図４３】
2007055260.tif 000077
【図４４】
2007055260.tif 000078
【図４５】
2007055260.tif 000079
【図４６】
2007055260.tif 000080
【図４７】
2007055260.tif 000081
【図４８】
2007055260.tif 000082
【図４９】
2007055260.tif 000083
【図５０】
2007055260.tif 000084
【図５１】
2007055260.tif 000085
【配列表】
2007055260000001.app
【国際調査報告】
2007055260.tif 000086
2007055260.tif 000087
2007055260.tif 000088
2007055260.tif 000089
2007055260.tif 000090
2007055260.tif 000091
2007055260.tif 000092