(57)【要約】本発明の目的は、潰瘍性大腸炎又はクローン病のような炎症性腸疾患に対する有効な治療方法及び医薬組成物を提供することである。本発明は、ＢＴＬＡ受容体と、可溶型HVEMのようなそのリガンド又は抗ＢＴＬＡ抗体のようなアゴニストを反応させることにより、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強することによる、潰瘍性大腸炎又はクローン病のような炎症性腸疾患治療方法、並びに、ＢＴＬＡ受容体のリガンド又はアゴニストを有効成分として含有する、医薬組成物、特に、炎症性腸疾患治療用医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強することによる、炎症性腸疾患治療方法。
【請求項２】
ＢＴＬＡ受容体とそのリガンドを反応させることにより、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リガンドが可溶型HVEMである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＢＴＬＡ受容体とそのアゴニストを反応させることにより、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アゴニストが抗ＢＴＬＡ抗体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＢＴＬＡ受容体のリガンドを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項８】
リガンドが可溶型HVEMである、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＢＴＬＡ受容体のアゴニストを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項１０】
アゴニストが抗ＢＴＬＡ抗体である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
炎症性腸疾患治療用医薬組成物である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１１記載の炎症性腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項１３】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列から成るポリヌクレオチドにおける、３３３番目から３３６番目までの４塩基欠損、１３０５番目のグアニン、１５４２番目のアデニン、１６６９番目のグアニン、２６０６番目のアデニン、４５４４番目のアデニン、５６８１番目のグアニン、５７０４番目のチミン、５８３２番目の１塩基欠損、５８６７番目のシトシン、５８９６番目のチミン、６２９５番目のチミン、６５６６番目のシトシンと６５６７番目のシトシン間へのグアニン２塩基の挿入、６５６７番目のシトシンと６５６８番目のチミン間へのグアニンの挿入、６５６８番目のチミンと６５６９番目のグアニン間へのアデニン−グアニン２塩基の挿入、又は６５７９番目のシトシンに対応する塩基を含む１０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを検出することによる、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の測定法を実施するための、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強することによる、炎症性腸疾患治療方法、及びそのための医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）は原因不明の重篤な疾患であり、先進国において近年患者数の急増が見られる。本疾患の発症感受性遺伝子座は少なくともIBD1〜IBD8までの８つが知られており、一部のクローン病患者で、IBD5領域に位置するNOD2（IBD5）遺伝子変異が明らかにされた。しかし、感受性遺伝子としてNOD2は、そのコードする蛋白が細胞内分子であることなどから、それ自身を標的とした治療法開発には困難を伴い、実際、NOD2を標的にした治療法は存在しない。他方、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（以下「TNF」と称する）の機能を阻害する抗TNF抗体がクローン病の治療薬として臨床応用されている。【０００３】
単純ヘルペスウイルス侵入仲介物質（以下、「Herpes Virus Entry Mediator: HVEM」と称する）は、TNF受容体ファミリーに属し、当初、単純ヘルペスウイルス（以下「HSV」と称する）糖タンパクＤ結合物質として同定され、HSVの細胞感染を制御する分子として知られる。生体内のHVEM発現細胞としてＴ細胞、B細胞、単球、樹状細胞が知られHVEMの機能としてリンパ球を介した免疫反応制御が報告されている。その機構の一つとして、HVEMがそのリガンドと結合すると、HVEMからの細胞内シグナルがＴ細胞活性化反応に促進的に働くことが明らかにされた（Kwon et al. J. Biol. Chem 272: 14272, 1997, Harrop et al. J. Immunol.161: 1786, 1998）。【０００４】
HVEMのリガンドはＬＩＧＨＴとリンフォトキシン（以下、「LＴ」と称する）α、ＢＴＬＡの３つあることが知られる。一方、ＬＩＧＨＴの受容体は少なくとも、LTβ受容体、デコイ受容体3およびHVEMの３種が知られ、同様に、LＴαの受容体はＴNF受容体Ｉ、ＴNF受容体ＩＩ、HVEMの３種が知られる。BＴLＡの受容体として証明されたのはHVEMのみである。このようにHVEMが関連したリガンド・受容体系は複雑なネットワークを形成しており、それらの生体内における機能的関連性の詳細は明らかではない。【０００５】
これまでに、疾患との関連においては、アレルギーや自己免疫疾患の患者血清中に、可溶型HVEMが検出されること、動脈硬化病変部にHVEMを発現するマクロファージが存在することが報告された（Jung HW et al. Exp Mol Med. 35:501-508, 2003、Lee WH et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21; 2004-2010, 2001）。しかし、これらの報告はHVEMを指標とした疾患重症度診断の可能性を示唆したに過ぎず、HVEMを標的とした疾患治療の可能性とは全く関連はない。又、動物実験において、可溶型LTβ受容体投与がLIGHＴ機能を抑制することにより、ラット特異的自己免疫性眼ブドウ膜炎およびマウス移植片対宿主病を抑制したとの報告がある（Shao H, et al, Eur J Immunol, 3: 1736, 2003, Tamada et al, Nat Med 6: 283, 2000, Tamada et al, J Cln Invest 109: 549, 2002）。これらの文献はLIGHTもしくは膜型LＴ機能を抑制することにより、ある種の異常免疫反応を抑制できることを示唆する。【０００６】
HVEMの第３のリガンドであるBＴLＡはそれ自身Ｔ細胞上の受容体タンパクであり、HVEMがBＴLＡに結合することにより、Ｔ細胞活性化を強力に抑制する（Nat. Immunol., 6:90, 2004）。更に、HVEM遺伝子欠損マウスのT細胞の活性化能が正常マウスのＴ細胞よりも増強されていることが明らかにされ、生体内でのHVEM-BＴLＡ結合が免疫抑制に重要である可能性が示唆された（Sedy et al, Nat Immunol, 6: 90-98, 2005, Gonzalez et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 102:1116-21, 2005）。又、一方で、HVEMシグナルが炎症性腸疾患発症を促進するとの結果が報告されている（Wang et al., J. Immunol.174:8173, 2005）。
【非特許文献１】Nat. Immunol., 6:90, 2004
【非特許文献２】Sedy et al, Nat Immunol, 6: 90-98, 2005, Gonzalez et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 102:1116-21, 2005
【非特許文献３】Wang et al., The critical role of LIGHT in promoting intestinal inflammation and Crohn’s disease, J. Immunol. 2005 Jun 15; 174 (12):8173-82
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の処、炎症性腸疾患発症原因については未だ不明であり、BＴLＡの炎症性腸疾患発症に対する関与は全く明らかにされていない。更に、HVEM-BＴLＡ系特異的にシグナルを制御した際の炎症性腸疾患発症抑制効果も不明である。【０００８】
本発明者は、動物モデルにおいて炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の発症原因のひとつがHVEMの遺伝子変異と発現不全であることを見出し、炎症性腸疾患発症にHVEMシグナルが関与することを初めて明らかにした。本発明は、かかる知見に基づきなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は以下の各態様に係る。
１．Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強することによる、炎症性腸疾患治療方法。
２．ＢＴＬＡ受容体とそのリガンドを反応させることにより、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強する、上記１記載の方法。
３．リガンドが可溶型HVEMである、上記２記載の方法。
４．ＢＴＬＡ受容体とそのアゴニストを反応させることにより、Ｔ細胞上のＢＴＬＡ受容体シグナルを増強する、上記１記載の方法。
５．アゴニストが抗ＢＴＬＡ抗体である、上記４記載の方法。
６．炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、上記１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．ＢＴＬＡ受容体のリガンドを有効成分として含有する、医薬組成物。
８．リガンドが可溶型HVEMである、上記７記載の医薬組成物。
９．ＢＴＬＡ受容体のアゴニストを有効成分として含有する、医薬組成物。
１０．アゴニストが抗ＢＴＬＡ抗体である、上記９記載の医薬組成物。
１１．炎症性腸疾患治療用医薬組成物である、上記８〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１２．炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、上記１１記載の炎症性腸疾患治療用医薬組成物。
１３．配列番号１に示されるＤＮＡ配列から成るポリヌクレオチドにおける、３３３番目から３３６番目までの４塩基欠損、１３０５番目のグアニン、１５４２番目のアデニン、１６６９番目のグアニン、２６０６番目のアデニン、４５４４番目のアデニン、５６８１番目のグアニン、５７０４番目のチミン、５８３２番目の１塩基欠損、５８６７番目のシトシン、５８９６番目のチミン、６２９５番目のチミン、６５６６番目のシトシンと６５６７番目のシトシン間へのグアニン２塩基の挿入、６５６７番目のシトシンと６５６８番目のチミン間へのグアニンの挿入、６５６８番目のチミンと６５６９番目のグアニン間へのアデニン−グアニン２塩基の挿入、又は６５７９番目のシトシンに対応する塩基を含む１０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド。
１４．上記１３に記載のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを検出することによる、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定法。
１５．上記１４に記載の測定法を実施するための、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定用キット。
【発明の効果】
【００１０】
動物モデルにおいて炎症性疾患、特に炎症性腸疾患の発症原因のひとつがHVEMの遺伝子変異と発現不全であることが解明された。従って、HVEM−BTLAシグナルを制御することにより、炎症性腸疾患の治療が可能になる。具体的には、可溶型HVEM投与あるいは抗ＢＴＬＡ抗体投与等による人為的ＢＴＬＡシグナルの増強が炎症性腸疾患治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】疾患感受性系統（C57BL/6）と疾患抵抗性系統（BALB/c）の交配により作製した（C57BL/6 x (C57BL/6 x BALB/c)）N2-OX40L-Tgマウス各個体の炎症性腸疾患重症度についての各遺伝子型によるQTL解析の結果を示す。縦軸はLodスコア、横軸は遺伝子座を表す。
【図２】疾患感受性系統（C57BL/6）と疾患抵抗性系統（BALB/c）の交配により作製した（C57BL/6 x (C57BL/6 x BALB/c)）N2-OX40L-Tgマウス各個体の大腸重量／体重比について各遺伝子型によるQTL解析の結果を示す。縦軸はLodスコア、横軸は遺伝子座を表す。
【図３】マウスゲノム遺伝子配列とヒトゲノム遺伝子配列の対応を示す。棒線で示した部位が、本発明で同定されたマウス炎症性腸疾患感受性遺伝子座、およびヒト炎症性腸疾患感受性遺伝子座IBD7（1p36）である。両者は完全に一致する。
【図４−１】疾患感受性系統C57BL/6（B6）と疾患抵抗性系統BALB/c（BALB）のHVEMゲノム遺伝子塩基配列の比較を示す。四角で囲んだ箇所に多型（変異）が同定された。
【図４−２】続き。
【図４−３】続き。
【図４−４】続き。
【図４−５】続き。
【図４−６】続き。
【図５】疾患感受性系統C57BL/6と疾患抵抗性系統BALB/c、129/Sv、FVBのHVEM cDNA塩基配列の解析により同定された、C57BL/6特異的アミノ酸変異を示す。HVEM膜貫通領域内のバリンがアラニンに置換している。
【図６】図A上段はHVEM下段はβアクチンの半定量的RT-PCR結果を示す。数字はマウス系統を示す（1:129/SvJ, 2:NOD, 3:C57BL/6, 4:C57BL/6xBALB/c F1, 5:DBA2, 6:FVB, 7:BALB/c）。C57BL/6由来の脾臓と腸管ではHVEM mRNAがほとんど検出できない。図B：TaqMan probe（アプライドバイオシステム社）を用いたリアルタイムPCRによりHVEMおよびβアクチンｍRNA量を定量した。βアクチンｍRNA量を内的対照として相対的HVEM mRNA量を計算し、グラフに示した。C57BL/6マウス脾臓および腸管におけるHVEM mRNA量はBALB/cマウスに比し、５０分の１以下であった。
【図７】マウス脾臓より単離したT細胞をプレートに固層化した抗CD3抗体で刺激し、刺激後72時間後の3H-チミジンの取り込み量を測定した。その際に、可溶型HVEM（10 mg/ml）添加（白）と無添加（黒）でその取り込み量を比較した。可溶型HVEM添加により、T細胞活性化能が抑制された。
【図８】HVEM遺伝子導入マウス（Virology, 2004 Mar 15; 320 (2): 267-75）とOX40L-Tgマウスを交配し、HVEM- OX40L二重遺伝子導入マウスを作製した。２０週齢の野生型マウス（ｎ＝９）、HVEM遺伝子導入マウス（ｎ＝１４）、OX40L-Tgマウス（ｎ＝１２）、及び、HVEM- OX40L二重遺伝子導入マウス（ｎ＝１２）における腸管重量（左）及び組織学的大腸炎重症度（右）の結果を示す。尚、左図においては各遺伝子型毎の腸管重量の平均値及び標準偏差（エラーバー）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の実施例に示されるように、本発明は、HVEM遺伝子多型（異常）がHVEM mRNAの発現不全を引き起こし、その結果、特に、本来ＢＴＬＡから供給されるはずの免疫抑制シグナルが欠如するために炎症性腸疾患が発症する、という新たな考えに基づくものである。従って、本発明の炎症性腸疾患治療方法はＢＴＬＡシグナルを増強させることを特徴とする。ＢＴＬＡシグナルの増強の方法としては、当業者に公知の任意の手段を取ることが出来る。例えば、可溶型HVEMのようなＢＴＬＡ受容体に対するリガンド、又は、抗ＢＴＬＡ抗体のようなＢＴＬＡ受容体に対するアゴニストをＢＴＬＡと反応（結合）させることによりＢＴＬＡシグナル増強することができる。【００１３】
本発明方法の主な治療対象としては、ヒトを含む哺乳動物等の高等生物を挙げることが出来る。【００１４】
可溶型HVEMは市販されており容易に入手可能である。具体的には、HVEM (human):Fc (human) Alexis社）等を挙げることが出来る。或いは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=23200040等にそのアミノ酸配列が記載されているので、それらに基づき当業者に公知の方法で作成することも可能である。【００１５】
一方、ヒトＢＴＬＡのアミノ酸配列は、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=54607121等に記載されて公知であるので、このような情報に基づき、当業者に公知の任意の方法で抗ＢＴＬＡ抗体を作成することが出来る。該抗体はモノクローナル抗体、又は、ポリクローナル抗体でも良く、更に、これらに基づき、当業者に公知の遺伝子工学的組換え技術で、抗ＢＴＬＡ活性を有する各種キメラ抗体（ヒト型化抗体）を作成することも可能である。【００１６】
ＢＴＬＡ受容体に対するリガンド又はアゴニストである有効成分と組合せて、本発明の医薬組成物に用いることのできる医薬キャリア−又は希釈剤の好適な例としては、塩化ナトリウム；塩化マグネシウム；塩化亜鉛、グルコ−ス；サッカロ−ス；ラクト−ス；エチルアルコ−ル；グリセリン；マンニト−ル；ソルビト−ル；ペンタエリスリト−ル；ジエチレングリコ−ル、プロピレングリコ−ル、ジプロピレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ル４００、他のポリエチレングリコ−ル；トリラウリン酸グリセリル、及びジステアリン酸グリセリルの如き脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセリド；ペクチン；でんぷん；アルギニン酸；キシロ−ス；タルク；石松子；オリ−ブ油、ピ−ナツ油、ヒマシ油、コ−ン油、紅花油、小麦麦芽油、ゴマ油、棉実油、ヒマワリ油及びタラ肝油の如きオイル及び油脂；ゼラチン；レシチン；シリカ；セルロ−ス；メチルヒドロキシプロピルセルロ−ス、メチルセルロ−ス、ヒドロキシエチルセルロ−スの如きセルロ−ス誘導体；ステアリン酸カルシウム、ラウリン酸カルシウム、オレイン酸マグレシウム、パルミチン酸カルシウム、ベヘン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム等の１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸の塩；シクロデキストリン類（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチル−β−シクロデキストリン、シクロアワオドリン、及びジメチル−β−シクロデキストリン等）；乳化剤（例えば、２〜２２の炭素原子，特に１０〜１８の炭素原子を有する飽和及び不飽和の脂肪酸とグリコ−ル、グリセリン、ジエチレングリコ−ル、ペンタエリスリト−ル、エチルアルコ−ル、ブチルアルコ−ル、オクタデシルアルコ−ルの如き１〜２０の炭素原子を有する一価の脂肪族アルコ−ル又は多価アルコ−ルとのエステル；及びジメチルポリシロキサンの如きシリコ−ン等が挙げられる。更に、医薬組成物に従来から用いられてきた当業者に公知の任意の追加のキャリア−も本発明の医薬組成物に使用することが出来る。【００１７】
本発明の化合物の薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段は、感染症の原因となる寄生原虫の種類、原虫の寄生部位、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及び患者の（遺伝的）人種的背景に応じて、当業者が適宜選択することができる。一般的には、本発明の化合物の投与量は１〜１０，０００ｍｇ／日／体重７０ｋｇ、より一般的には５０〜２０００ｍｇ／日／体重７０ｋｇである。【００１８】
本発明医薬組成物は投与方法・投与経路等に応じて当業者に公知の任意の形状とすることが出来る。それらは適当な方法で投与することが出来る。例えば、形状としては、液体状、粉末状、及びコロイド状等があり、上記のキャリア−又は希釈剤を伴った形で、静脈内、腹腔内、皮下に注射するか、又は、経口投与等が挙げられる。尚、有効成分は、本発明の医薬組成物の使用目的、対象、及び形状等に応じて、適当な量で含有されることが出来るが、通常、１mg〜１０，０００mg程度、好ましくは、１０mg〜３，０００mg程度含有されている。【００１９】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列は、炎症性腸疾患発症マウス（C57BL/6系統）のHVEM遺伝子のゲノム塩基配列であり、この遺伝子に特有に見られる各種変異（一塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等）の各位置に対応するヒト等の他の哺乳動物のHVEM遺伝子における同様な変異を含む適応な長さのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド断片は、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の検出に使用することが出来る。尚、配列番号１における各種変異の位置を示す塩基番号は、炎症性腸疾患発症マウス（C57BL/6系統）と疾患抵抗性系統BALB/cマウスのＨＶＥＭ遺伝子ゲノム配列をそれらの間の同一性が最大となるようにアライメントさせた場合の、疾患抵抗性系統BALB/cマウスのＨＶＥＭ遺伝子ゲノム配列における塩基番号に基づき付されたものである。【００２０】
尚、ここで、配列番号１における各種変異の位置と対応する他の哺乳動物のHVEM遺伝子における変異は、配列番号１の塩基配列と他の動物におけるHVEM遺伝子の塩基配列とを、それらの間の同一性（identity）が最大となるようにアライメントさせた場合、互いの塩基が同じ位置になることを意味し、必ずしも、対応する位置にある塩基が夫々の遺伝子において５’末端からの同じ位置（番目）存在することを意味するものではない。具体的には、図４で、疾患感受性系統C57BL/6（B6）の第1,300番目の塩基と疾患抵抗性系統BALB/c（BALB）の第1,305番目のような、両者のHVEMゲノム遺伝子の塩基配列の間の比較において四角で囲んだ塩基が夫々対応する位置にある塩基といえる。【００２１】
このような変異を検出する様々な方法は当業者に公知であり、例えば、塩基配列決定（シークエンス法）、並びに、タクマン法（Taqman PCR）、侵入法（Invader method）、ＲＣＡ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、及びＤＮＡチップ法等のスニップタイピングで使用される各種方法を挙げることが出来る。従って、本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの具体的なＤＮＡの長さは、このような検出方法等に応じて、当業者が適宜選択することが出来る。通常、１０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなる。又、本発明のキットは、上記塩基配列における変異を測定するための具体的な方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。例えば、本発明キットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを増幅するために使用される適当な長さの塩基配列からなるプロ−ブ又はプライマーを含有することが出来、それらは、図４に示された塩基配列情報に基づき当業者が適宜設計することが可能である。更に、必要に応じて、これらポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。更に、上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明を詳細に説明するために実施例を示す。尚、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００２３】
本発明者らが作製したOX40リガンド遺伝子導入（以下、「OX40L-Tg」と記す）マウスは、ヒト潰瘍性大腸炎に極めて類似の炎症性腸疾患を加齢とともに自然発症する（特開2003-102330）。OX40L-Tgマウスでみられる炎症性腸疾患はC57BL/6系統のマウスでのみ発症し、BALB/c、DBA/2、DBA/1J系統では全く発症しない。すなわち、C57BL/6系統に疾患感受性遺伝子の存在が想定された。そこで、感受性系統（C57BL/6系統）と抵抗性系統（BALB/c）を交配し、339匹の交雑OX40L-Tgマウスを作製した。それらOX40L-Tgマウスが炎症性腸疾患を発症する２０週齢に達した時点で、各個体の腸疾患重症度、腸管重量／体重比を測定すると共に、各種遺伝子マーカーを用いて遺伝子型を決定した。疾患の重症度は、以下に示すように、常法により判定した。【００２４】
上行、横行結腸、直腸の３点からの標本を評価し、一番重症度スコアの高いものをもって個体の重症度とする。
[重症度スコア]
０・・・粘膜炎症の徴候なし。
１・・・粘膜炎症の徴候あり。白血球浸潤は軽度。
２・・・粘膜炎症の徴候あり。白血球浸潤が中等度で腸管肥厚が認められる。
３・・・粘膜炎症の徴候あり。白血球浸潤が中等度以上で腸管肥厚が認められる。加えて、次の（１）〜（４）のいずれかの徴候を満たす。
（１）陰窩膿瘍形成が目立つ。
（２）びらん形成が認められる。
（３）粘膜壊死巣が認められる。
（４）高度の粘膜線維化が認められる。【００２５】
その結果、マウス第４染色体80 cM付近が両アリルとも感受性系統（C57BL/6系統）の場合に高頻度に疾患の発症が見られ、それに対して１アリルが疾患非発症マウス系統（BALB/c）由来であればほとんど疾患が発症しないことが明らかになった。【００２６】
更に、各個体の遺伝子型と腸疾患重症度（図１）および腸管重量／体重比（図２）とでQTL解析を行った結果、HVEM遺伝子部位に一致して高いピーク（Lodスコアはそれぞれ7.4（図１）、4.1（図２））を検出した。さらに、疾患重症群（スコア２以上）、疾患未発症群（スコア０）と、HVEM遺伝子多型の有無との相関を単点解析したところχ2検定でp = 4.6 x 10-8と疾患発症と遺伝子多型との間で極めて強い相関を認めた。以上より、同部位が炎症性腸疾患感受性遺伝子座であることが明らかになった。この遺伝子座はヒト炎症性腸疾患感受性遺伝子IBD７（１ｐ３６）に完全に一致していた（図３）。この事実はヒトにおいても同一の遺伝子が疾患感受性遺伝子である可能性を強く示唆するものである。【００２７】
更に、当業者に公知のダイレクトシークエンス法を用いて、同遺伝子座に存在する候補遺伝子のゲノム配列を解析したところ、疾患発症マウスが極めて高頻度にHVEM遺伝子多型（異常）を有することが明らかになった。図４において、炎症性腸疾患発症マウス（C57BL/6系統）のHVEM遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）に見られる多型（変異）を図４に示す。【００２８】
次に、常法に従い、各系統のマウス脾臓細胞RNAを抽出し、得られたRNAを検体としてRT-PCR法によりHVEMｃDNAを増幅し、ダイレクトシークエンス法により各系統のHVEMｃDNA塩基配列を決定した。
こうして得られたcDNA配列より推定されるアミノ酸配列の比較により、炎症性腸疾患発症マウスでは図５に示すアミノ酸変異（HVEM膜貫通領域内のバリンがアラニンに置換）を有していることが明らかになった。この変異は疾患を発症しないBALB/c、129/Sv、FVBの３系統には検出されなかった。【００２９】
次に、常法に従い、疾患感受性系統C57BL/6と疾患抵抗性系統BALB/cマウス脾臓細胞よりRNAを抽出し、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。作製したcDNAを鋳型として半定量的RT-PCRを行った（TaqMan Gene Expression Assays（アプライドバイオシステム社）） 。更に、TaqMan probe（アプライドバイオシステム社）を用いたリアルタイムPCRによりHVEMおよびβアクチンｍRNA量を定量した。その結果、図６に示すように、各マウスの脾臓及び腸菅の疾患発症マウス系統（C57BL/6）では、脾臓リンパ球におけるHVEM mRNAの発現量が疾患抵抗性マウス系統（BALB/c）に比し５０分の１以下であった。【００３０】
以上の結果から、C57BL/6でみられたHVEM遺伝子多型（異常）がHVEM mRNAの発現不全を引き起こし、そのために本来BTLAから供給されるはずの免疫抑制シグナルが欠如するために炎症性腸疾患が発症することが推察される。従って、これらのことから、HVEM遺伝子がマウス炎症性腸疾患発症の感受性遺伝子であると結論した。【００３１】
これを確認するために、常法に従い、マウス脾臓より単離したＴ細胞をプレートに固層化した抗CD3抗体（クローン名：145-2C11（BD Biosciences社））で刺激し、刺激後72時間後の3H-チミジンの取り込み量を測定した。ここで、実際にマウス可溶型HVEM（マウスHVEM蛋白のアミノ酸１番目〜２０４番目の領域（細胞外領域）に一致）をＴ細胞に添加すると、Ｔ細胞免疫反応が抑制されることが明らかになった（図７）。【００３２】
更に、可溶型HVEM生体内に多量に産生する遺伝子改変マウス（HVEM遺伝子導入マウス：Virology, 2004 Mar 15; 320 (2): 267-75）とOX40L-Tgマウスを交配し、HVEM- OX40L二重遺伝子導入マウスを作製した。２０週齢で炎症腸疾患重症度の指標の一つである腸管重量と組織学的大腸炎重症度を測定した。重症度の測定は、上記の[重症度スコア]に従った。HVEMの生体内発現によってOX40L-Tgマウスの腸管重量増加と腸管炎症反応が有意に抑制された（図８）。以上の結果から、可溶性HVEMあるいは抗BTLA抗体により、BTLAシグナルを人為的に供与することにより、Ｔ細胞により炎症性腸疾患惹起を抑制できると結論された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
可溶型HVEMあるいは抗ＢＴＬＡ抗体等のＢＴＬＡ受容体に対するリガンド又はアゴニストを炎症性腸疾患モデルマウスに投与し、HVEM-BTLAシグナルを制御することにより炎症性腸疾患発症が抑制でき、疾患治療が可能である。さらにそれらの物質を医薬品として臨床応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列から成るポリヌクレオチドにおける、３３３番目から３３６番目までの４塩基欠損、１３０５番目のグアニン、１５４２番目のアデニン、１６６９番目のグアニン、２６０６番目のアデニン、４５４４番目のアデニン、５６８１番目のグアニン、５７０４番目のチミン、５８３２番目の１塩基欠損、５８６７番目のシトシン、５８９６番目のチミン、６２９５番目のチミン、６５６６番目のシトシンと６５６７番目のシトシン間へのグアニン２塩基の挿入、６５６７番目のシトシンと６５６８番目のチミン間へのグアニンの挿入、６５６８番目のチミンと６５６９番目のグアニン間へのアデニン−グアニン２塩基の挿入、又は６５７９番目のシトシンに対応する塩基を含む１０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの炎症性腸疾患検出における使用。
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月24日(2007.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＬＡ受容体のリガンドを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項２】
リガンドが可溶型HVEMである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＢＴＬＡ受容体のアゴニストを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項４】
アゴニストが抗ＢＴＬＡ抗体である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
炎症性腸疾患治療用医薬組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項５記載の炎症性腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項７】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列から成るポリヌクレオチドにおける、３３３番目から３３６番目までの４塩基欠損、１３０５番目のグアニン、１５４２番目のアデニン、１６６９番目のグアニン、２６０６番目のアデニン、４５４４番目のアデニン、５６８１番目のグアニン、５７０４番目のチミン、５８３２番目の１塩基欠損、５８６７番目のシトシン、５８９６番目のチミン、６２９５番目のチミン、６５６６番目のシトシンと６５６７番目のシトシン間へのグアニン２塩基の挿入、６５６７番目のシトシンと６５６８番目のチミン間へのグアニンの挿入、６５６８番目のチミンと６５６９番目のグアニン間へのアデニン−グアニン２塩基の挿入、又は６５７９番目のシトシンに対応する塩基を含む１０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの炎症性腸疾患検出における使用。
【請求項８】
請求項７に記載のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを検出することによる、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定法。
【請求項９】
請求項８に記載の測定法を実施するための、炎症性腸疾患の発症と関連するHVEM遺伝子の変異の測定用キット。
【国際調査報告】
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