(57)【要約】  血小板特異的な発現を誘導するプロモーターに機能的に結合された血液凝固因子遺伝子を含むレンチウイルスベクターを有効成分とする血液凝固異常の治療剤が提供された。第VIII因子、あるいは第IX因子をコードする遺伝子を応用することによって、血友病ＡあるいはＢの治療剤が提供される。本発明の治療剤を造血幹細胞などに感染させることによって、血液凝固異常を遺伝子治療によって治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤。
【請求項２】
プロモーターが、GPIbプロモーターまたはそのバリアントである請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドが、5'UTRを介して前記プロモーターに結合している請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
血液凝固異常が血友病Aであり、血液凝固因子が第VIII因子またはその変異体である請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
血液凝固異常が血友病Bであり、血液凝固因子が第IX因子またはその変異体である請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
血液凝固異常が血友病Ａ、あるいは血友病Ｂのいずれかの疾患であり、血液凝固因子が第VII因子またはその変異体である請求項１に記載の治療剤。
【請求項７】
レンチウイルスベクターがサル免疫不全ウイルスベクターである請求項１に記載の治療剤。
【請求項８】
レンチウイルスベクターが、ウマ伝染性貧血ウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス２ベクター、ネコ免疫不全ウイルスベクター、ウシ熱性疾患ウイルスベクター、およびヤギ関節炎・脳炎ウイルスベクターからなる群から選択されるいずれかのベクターである請求項１に記載の治療剤。
【請求項９】
巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞。
【請求項１０】
巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた巨核球、及び／又はその派生産物である血小板。
【請求項１１】
巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程と、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞を巨核球およびその派生産物である血小板のいずれか、または両方を含む細胞群に分化するまで培養する工程を含む、血液凝固因子を蓄積した巨核球および血小板のいずれか、または両方の製造方法。
【請求項１２】
次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法；
(1) 巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程、および
(2) 工程(1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程。
【請求項１３】
造血幹細胞が、患者から採取された造血幹細胞を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞が骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞のいずれか、または両方を含む細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程(1)の造血幹細胞を培養した後に患者に投与する請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
次の要素を含む、血液凝固異常の治療用キット；
a: 巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、および
b: 造血幹細胞の採集試薬。
【請求項１７】
下記の要素cを付加的に含む、請求項１６に記載の血液凝固異常の治療用キット；
c: 造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地。
【請求項１８】
造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地が、少なくとも次の成分を含む請求項１７に記載の血液凝固異常の治療用キット；
トランスフェリン；
インスリン；
幹細胞因子 （stem cell factor）；
トロンボポエチン；
インターロイキン−６；
Flt-3リガンド；および
可溶性インターロイキン−６受容体。
【請求項１９】
血液凝固異常の治療剤の製造のためのレンチウイルスベクターの使用であって、該レンチウイルスベクターが巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固異常の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液は、出血を止める（止血）ためのメカニズムを備えている。血管の損傷によって出血が起こる。止血は、主に、血管の損傷部位に血小板が集まる工程（一次止血；primary hemostasis）と、血小板の間をフィブリンで充填する工程（二次止血;Secondary Hemostasis）によって達成される。止血のための一連の工程は、血液凝固(blood coagulation)と呼ばれる。血液凝固は、数多くの物質が複合的に関与する、複雑な生理反応である。一次止血は、損傷部位をふさぐ過程である。障害された内皮細胞下に露出した結合組織は、コラーゲンなどを含んでいる。この結合組織に血小板がフォン・ヴィレブランド因子を介して結合後に、血小板が凝集塊を形成していく。【０００３】
一方、後者のフィブリンの形成と蓄積を中心とする工程は、二次止血(Secondary Hemostasis)と呼ばれている。フィブリンは、血液中の前駆体（フィブリノーゲン）がトロンビンなどのプロテアーゼ活性によって活性化されて形成される繊維状の蛋白質である。一次止血で形成された血小板の集合構造は、フィブリンの凝集塊を形成するための足場となるとともに、フィブリンによって構造自体が強化される。二次止血の中心となるフィブリン形成に関与する因子として、現在までに第I因子(Factor I)から第XIII因子(Factor XIII)の１２種類の物質が同定されている（第VI因子は欠番）。これらの物質は、たとえば他の因子の活性の調節によって、あるいはフィブリンの安定化等を通じて血液凝固のための一連の反応に関与している。【０００４】
血液凝固に関与する多くの因子は、正常な状態では、血液中でその活性を巧妙に制御されている。そのため、血管内を流れている血液は、正常な状態では凝固しない。しかしいったん出血が起きると、直ちに一次止血が開始される。更に二次止血を構成する複数の因子の活性化が次々と起こる。正常な状態であれば、一連の工程は秒単位で進行する迅速な生理反応である。【０００５】
血液凝固に関与する因子群の量や活性に異常が生じると、血液凝固メカニズムの異常が起きる。たとえば、血液凝固を支えるいずれかの因子の発現や活性の低下が起きると、正常な止血システムが動作しなくなる。このような状態を血液凝固異常という。種々の原因に起因する血液凝固異常が知られている。血友病(hemophillia)は血液凝固異常をともなう代表的な疾患である。【０００６】
血友病は、その原因によって、血友病Ａと血友病Ｂに分類される。血友病Ａは、第VIII因子の量的、あるいは質的異常が原因である。一方、血友病Ｂは第IX因子の欠乏を原因とする。まず第VIII因子は、トロンビンによって活性化される血液凝固因子である。活性化された第VIII因子（第VIIIa因子）は、活性化した第IX因子(第IXa因子)と結合して第X因子を活性化する。活性化された第X因子（第Xa因子）は、トロンビンを活性化してフィブリン形成につながる。一方第IX因子は活性化された第XI因子（第XIa因子）によって活性化され、同じく活性化されたVIIIa因子とともに第X因子の活性化因子となる。第VIII因子と第IX因子は、いずれも、二次止血の最終段階に必要なトロンビンの活性化を支える重要な因子である。したがって、これらの因子の不足に起因する血友病は、その程度によっては、重篤な血液凝固不全をともなう。【０００７】
血友病は、一般に、遺伝性の疾患である。したがって、現在のところ、疾患の原因である遺伝的な原因を修復することは困難である。そのため血友病は、不足する因子の補充によって治療されている（補充療法）。補充療法には、ヒト血液から精製された第VIII因子や第IX因子が利用された。しかしヒト血液を原料とする血液製剤の投与によって、ヒト免疫不全ウイルスや肝炎ウイルスなどの感染症の被害が生じた。これらの感染症は、感染血液の排除や、病原ウイルスの不活性化技術の確立などにより、その可能性を低くするための努力が続けられている。更に、これらの因子を遺伝子工学的に製造した精製蛋白質製剤の実用化によって、血液凝固因子の投与に起因する感染性疾患のリスクはほぼなくなったと考えられている。【０００８】
感染の危険性が低下したとしても、現在の補充療法は、患者の日常生活を制約する可能性がある。一般に、補充療法における血液凝固因子の投与量と投与スケジュールは、血液凝固因子の不足の程度に応じて設定される。通常、血液凝固因子は、投与後、半日間程度は投与時の効果を維持し、その後、時間の経過とともに効果が低下する。したがって血液凝固因子は、６〜２４時間おきに投与される。蛋白製剤である血液凝固因子は、静脈注射によって投与される。このような頻繁な静脈注射は、患者の日常生活における制約となりかねない。【０００９】
更に、血友病の補充療法には、自己抗体の産生という問題も指摘されている。補充療法を受けた血友病患者において、投与された血液凝固因子に対する中和抗体（インヒビター）が検出されることがある。患者が産生する抗体は、投与した血液凝固因子を中和し、その活性を奪ってしまう。その結果、自己抗体を有する患者においては、通常の投与量では十分な治療効果を得られない。【００１０】
血友病の補充療法に対して、静脈注射を必要としない血液凝固因子の投与方法として、遺伝子治療の試みが報告されている。たとえば、第VIII因子をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニックマウスの血小板で第VIII因子の発現が観察され、遺伝子治療による血友病の治療の可能性が示された(Blood 2003,; 102: 4006-4013)。しかし実際にヒトの治療に応用するには、トランスジェニック動物以外の方法で、外来性の第VIII因子遺伝子の発現を誘導する必要がある。【００１１】
トランスジェニック動物ではなく、ウイルスベクターによる第VIII因子遺伝子の発現の誘導が試みられた。ウイルスベクターであれば、ヒトへの臨床応用の可能性がある。すなわち、第VIII因子をコードするDNAを組み込んだレンチウイルスベクターが骨髄細胞などに導入された。そしてこの骨髄細胞が、血液凝固異常モデルマウス(第VIII因子ノックアウトマウス)に移植された(Mol Ther. 2003, May;7( 5 Pt 1):623-631)。しかしこの報告においては、in vitroでは第VIII因子の強い発現が見られたものの、移植マウスの末梢血においては十分な第VIII因子活性を検出できなかった。マウスにおいて、第VIII因子に対する中和抗体が誘導されたことが、in vivoにおける第VIII因子活性の低下の原因として予測された。【００１２】
本発明者らは、第VIII因子を組み込んだサル免疫不全ウイルスベクターをヒト臍帯血のCD34陽性細胞に導入した。そしてこの細胞をNOD/SCIDマウスに移植して血中における第VIII因子の発現を観察した。その結果、少なくとも60日間にわたり、導入された第VIII因子の発現が継続することを確認した(J Gene Med. 2004 Oct.;6(10):1049-1060)。しかし実験に用いたNOD/SCIDマウスは、重度の免疫不全状態にあるため、自己抗体の影響については評価されていない。あるいは、グランツマン血小板無力症(Glanzmann thrombasthenia;GT)モデルマウスにおいて、血小板における接着因子であるインテグリンをGPIIbプロモーターで発現させることによって、血小板の活性が増強された(Fang J. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671-9. Epub 2005 Jun 21.)。
【非特許文献１】Yarovoi HV. et al., Blood 2003; 102: 4006-4013
【非特許文献２】Kootstra NA. et al.,Mol Ther. 2003, May;7( 5 Pt 1):623-631
【非特許文献３】Kikuchi J. et al. J Gene Med. 2004 Oct.;6(10):1049-1060
【非特許文献４】Fang J. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671-9. Epub 2005 Jun 21.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、遺伝子治療による血液凝固異常の治療技術の提供を課題とする。より具体的には、本発明の課題は、トランスジェニック動物などの技術に頼らず、血液凝固因子をコードする遺伝子の生体中での発現を実現し、遺伝子治療による血液凝固異常の治療技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するために、血液凝固因子をコードする遺伝子の発現を、血小板特異的に誘導することができれば有効であろうと考えた。血小板において発現した血液凝固因子は、血小板内部に保持され、生体の免疫システムとの接触が絶たれる。そのため、従来技術において問題とされた中和抗体を誘導する可能性が低いと考えられた。他方、血小板は、出血時には速やかに血管の損傷部位に集合する。そして出血部位において活性化された血小板は、止血に必要なさまざまな因子を細胞外に放出する。このとき、細胞内に蓄積された血液凝固因子の細胞外への放出が期待できる。【００１５】
本発明者らは、血小板特異的な血液凝固因子の発現誘導は、血液凝固異常の遺伝子治療においては、理想的な遺伝子発現系であろうと考えた。このような考え方に基づいて、本発明者らは、血小板特異的な血液凝固因子の発現のためのシステムの構築を試みた。そして、血小板特異的な遺伝子発現を可能とするプロモーターの利用によって、血小板における血液凝固因子の発現に成功した。【００１６】
更に、継続的な血液凝固因子の供給が必要な血液凝固異常の治療を目的として、レンチウイルスベクターの応用について検討した。つまりレンチウイルスベクターに血小板特異的なプロモーターの制御下に発現する血液凝固因子遺伝子を搭載した血液凝固異常の遺伝子治療用ベクターを構築した。そして、この遺伝子治療用ベクターを導入した細胞を移植したモデル動物において実際に血液凝固能が改善されることを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、次の血液凝固異常の治療剤、治療方法、並びに治療用キットを提供する。【００１７】
〔１〕巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤。
〔２〕プロモーターが、GPIbプロモーターまたはそのバリアントである〔１〕に記載の治療剤。
〔３〕血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドが、5'UTRを介して前記プロモーターに結合している〔２〕に記載の治療剤。
〔４〕血液凝固異常が血友病Aであり、血液凝固因子が第VIII因子またはその変異体である〔１〕に記載の治療剤。
〔５〕血液凝固異常が血友病Bであり、血液凝固因子が第IX因子またはその変異体である〔１〕に記載の治療剤。
〔６〕血液凝固異常が血友病Ａ、あるいは血友病Ｂのいずれかの疾患であり、血液凝固因子が第VII因子またはその変異体である〔１〕に記載の治療剤。
〔７〕レンチウイルスベクターがサル免疫不全ウイルスベクターである〔１〕に記載の治療剤。
〔８〕レンチウイルスベクターが、ウマ伝染性貧血ウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス２ベクター、ネコ免疫不全ウイルスベクター、ウシ熱性疾患ウイルスベクター、およびヤギ関節炎・脳炎ウイルスベクターからなる群から選択されるいずれかのベクターである〔１〕に記載の治療剤。
〔９〕巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞。
〔１０〕巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた巨核球、及び／又はその派生産物である血小板。
〔１１〕巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程と、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞を巨核球およびその派生産物である血小板のいずれか、または両方を含む細胞群に分化するまで培養する工程を含む、血液凝固因子を蓄積した巨核球および血小板のいずれか、または両方の製造方法。
〔１２〕次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法；
(1) 巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程、および
(2) 工程(1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程。
〔１３〕造血幹細胞が、患者から採取された造血幹細胞を含む〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕造血幹細胞が骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞のいずれか、または両方を含む細胞である〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕工程(1)の造血幹細胞を培養した後に患者に投与する〔１２〕に記載の方法。
〔１６〕次の要素を含む、血液凝固異常の治療用キット；
a: 巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、および
b: 造血幹細胞の採集試薬。
〔１７〕下記の要素cを付加的に含む、〔１６〕に記載の血液凝固異常の治療用キット；
c: 造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地。
〔１８〕造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地が、少なくとも次の成分を含む〔１７〕に記載の血液凝固異常の治療用キット；
トランスフェリン；
インスリン；
幹細胞因子 （stem cell factor）；
トロンボポエチン；
インターロイキン−６；
Flt-3リガンド；および
可溶性インターロイキン−６受容体。
〔１９〕血液凝固異常の治療剤の製造のためのレンチウイルスベクターの使用であって、該レンチウイルスベクターが巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターである、使用。【００１８】
あるいは本発明は、巨核球、及び／又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターの、血液凝固異常の治療剤の製造における使用に関する。また本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターと、血液凝固異常の治療に用いるためのものであることを表示した指示書を含む、血液凝固異常の治療用医薬パッケージを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に基づいて、血液凝固異常の新たな治療方法が実現した。本発明の血液凝固異常の治療剤を用いれば、血液凝固因子が長期間にわたって血小板において発現され、血液凝固能の改善効果が継続する。長期間にわたって治療効果が期待できるので、少ない治療回数で十分な治療が実現できる。具体的には、血友病などの慢性の血液凝固異常においても、本発明によれば、たとえば数ヶ月に一度の治療（投与）によって、血液凝固能を安定に維持できる可能性がある。【００２０】
血友病患者には、しばしば治療目的で投与された血液凝固因子に対する中和抗体が誘導され、その治療効果を制限する現象が観察される。中和抗体の誘導を防ぐことができる治療方法が実用化されれば、血友病の治療方法として有用である。本発明においては、血小板で発現した血液凝固因子は、細胞内部に保持される。その結果、患者の免疫システムが外来性の血液凝固因子と接触する機会が著しく制限される。つまり本発明によれば、治療のために投与された血液凝固因子に対する中和抗体の誘導が防止される。【００２１】
更に、既に中和抗体を有している血友病患者の治療においても、本発明による血液凝固異常治療は有用である。中和抗体を有する患者においては、血中に投与された血液凝固因子は、中和抗体と結合してその活性が低下してしまう。一方、本発明においては、血小板内で発現した血液凝固因子は、血小板内部に保持される限り、血流中の中和抗体と接触しないので、その活性が中和されることなく維持される。そして出血部位において活性化した血症板から放出された血液凝固因子が、出血部位において血液凝固を助けるのである。本発明における、血流中の中和抗体からの保護と、出血部位における血液凝固因子の放出の様子を図８に示した。【００２２】
本発明による血液凝固因子に対する中和抗体の誘導の防止効果は、正常な状態で、血液中に分泌されている血液凝固因子において、特に有利である。これらの液性因子は、通常、血液凝固因子を血中に存在させることで、治療効果が達成される。したがって、治療に当たり、投与された蛋白質と患者の免疫システムとの接触は避けれられない。すなわち中和抗体の誘導を防ぐことは、きわめて難しい課題であった。一方本発明においては、血小板中に必要な血液凝固因子を保持させることによって、液性因子であっても、十分な治療効果を達成することができる。更に、血小板に保持された血液凝固因子は、免疫システムとの接触を避けることができる。すなわち本発明は、液性の血液凝固因子の投与において、治療効果と、中和抗体の誘導防止の、２つの困難な課題のいずれをも解決することができる方法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】血小板特異的プロモーター活性の比較を示す図である。（A）実験で使った血小板特異的プロモーターの図解プレゼンテーションが示される。プロモーターなしのベクター（基本）およびコントロールベクター（SV40/Enhancer）と共に、各構築物をUT-7/TPO（B）、CD34+由来巨核球（C）、およびHUVEC（D）にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの48時間後に測定し、SV40プロモーター（SV40/Enhancer）に促進された活性と比較して示される。各実験は、重複サンプルで5回実行された。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す。
【図２】CMVまたはGPIbαプロモーターで促進されたeGFP遺伝子を有するSIVベクターで形質導入されたUT-7/TPO細胞およびCD34+由来巨核球におけるeGFP発現を示す図である。（A）本研究で使ったSIV構築物の概略図が示される。UT-7/TPO（B）およびCD34+由来巨核球（C）を指定されたMOIにおいてSIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIbα-eGFPで感染させる。細胞内のeGFPの発現は、フローサイトメトリーによって分析した。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（n＝3）。（D）ヒトCD34+細胞の巨核球分化の間のGPIIbおよびGPIbの細胞表面発現は、フローサイトメトリーによって0日目、5日目、7日目、12日目、および15日目に調べた。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（n＝3）。（E）分化の開始後の0日目、3日目、7日目、および14日目におけるCD34+由来巨核球を、30のMOIにおいてSIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIbα-eGFPで形質導入した。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（n＝3）。
【図３】SIV-CMV-eGFPによるKSL細胞の形質導入を示す図である。培養KSL細胞を、24時間の間増加された濃度のSIV-pCMV-eGFPで（A）、または種々のインキュベーション時間での固定濃度（MOI＝30）においてトランスフェクトした（B）。指定されたインキュベーションの後、KSL細胞内でのeGFPの発現をフローサイトメトリーによって分析した。eGFPを発現している形質導入細胞のパーセンテージを示す。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（n＝3）。
【図４ａ】インビボでの血液細胞におけるeGFP発現に対するプロモーターの相違の効果を示す図である。培養KSL細胞を、SIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIbα-eGFPで30のMOIにおいて形質導入した。放射線照射された各マウスは、5×105個の非分割の全体骨髄細胞と共に100，000個の形質導入細胞を受容した。（A）CD45+リンパ球におけるeGFP陽性細胞ならびに末梢血の中の顆粒球、赤血球（RBCs）および血小板の代表的なフローサイトメトリー分析が示される。
【図４ｂ】（B）移植後の14日目、30日目および60日目のCD45+リンパ球（左）および血小板（右）におけるeGFP陽性細胞のパーセンテージが示される。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（グループにつきn＝5）。
【図４ｃ】（C）移植後60日に、Bリンパ球（B220）、Tリンパ球（CD3）、顆粒球（Gr1）、マクロファージ（CD11b）、および赤芽球（TER119）を検出するために、抗体を使って骨髄細胞を染色した。各系統細胞の中のGFP陽性細胞をフローサイトメトリーによって測定した。データは3つの実験の代表値である。
【図５】hFVIII形質導入KSL細胞で移植されたマウスから得られた器官におけるhFVIIIの発現を示す図および写真である。（A）形質導入されていないKSL細胞（コントロール）またはSIV-pCMV-hFVIIIもしくはSIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞を、「材料および方法」の項で記述されるように、致命的な放射線照射を受けたCL57/B6マウスに注射した。示された器官におけるhFVIII遺伝子由来の複製についてのRT-PCR分析が示される。コントロールのために、RNAのマウスGAPDHについてのRT-PCRを同時に行った。データは4つの実験の代表値である。（B）SIVベクター由来のmRNA発現を、「材料および方法」の項で記述されるようにリアルタイム定量RT-PCRによって定量化した。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（グループにつきn＝4）。
【図６】移植マウスにおける骨髄および脾臓でのhFVIIIの発現を示す写真である。（A）SIV-pCMV-hFVIIIまたはSIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞を移植されたマウス由来の単離骨髄細胞を、マウスGPIbα（左）およびhFVIII（中央）について免疫染色した。2つのイメージは右のコラムで重ね合わせられており、SIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入された骨髄細胞において、GPIbαおよびFVIII発現の重複する部位が存在することを示している。（B）各移植マウス（陽性染色：灰色）の脾臓でのhFVIIIについての免疫組織化学。コントロールのために、ベクター感染なしのKSL細胞を移植されたマウスから得られた脾臓の切片を抗FVIII抗体で同時に処理した。オリジナル倍率×400。
【図７】血小板標的遺伝子送達による血友病Aマウスの表現型修正を示す図である。（A）SIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたかまたは形質導入されていないKSL細胞を移植されたFVIII欠損マウス由来の血液を、50μg/mlのコラーゲンおよび1μMのPMAで15分間刺激するかまたは刺激しない。遠心分離の後に、血小板が欠乏した血漿を得て、そしてhFVIII抗原レベルをELISAによって測定した。コラムおよびエラーバーは、平均±SDを表す（グループにつきn＝4）。（B）コントロールのKSL細胞またはSIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞（コントロールでn＝10、GPIbαでn＝8）を移植されたマウスの尾切断の後の24時間以内の死亡率。死亡率は統計学的にカイ二乗検定によって評価した。
【図８】血流中での、血小板内による導入遺伝子産物（血液凝固因子）の中和抗体からの保護と、出血部位における、活性化された血小板からの導入遺伝子産物（血液凝固因子）の放出の様子を模式的に示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤に関する。本発明者らは、血小板特異プロモーターによって、血小板において目的とする血液凝固因子の発現を誘導できることを確認した。更に当該遺伝子をレンチウイルスベクターで造血幹細胞に導入することによって、血液凝固因子が長期にわたって安定に発現され、実際に血液凝固能を改善できることを確認した。【００２５】
本発明において、血液凝固因子とは、血液凝固に関与するタンパク質である。たとえば第I因子〜第XIII因子（第VI因子は欠番）、ならびにその活性化型は、本発明における血液凝固因子に含まれる。VWFなどの一次止血に関与する蛋白質もまた、本発明における血液凝固因子に含まれる。本発明における血液凝固因子は、治療をすべき患者の動物種に由来するものであることが望ましい。したがって、ヒトを治療の対象とするときには、ヒト由来の血液凝固因子を用いるのが好ましい。【００２６】
本発明において、血液凝固因子は、人工の蛋白質を含む。具体的には、次の蛋白質は本発明における血液凝固因子に含まれる。
（１）天然の血液凝固因子と同等の活性を有する変異体
たとえば、ヒト第VIII因子は、そのN末端を構成するBドメインを欠損しても血液凝固因子としての活性が維持されることが知られている(Blood Vol.81, No.11, 1993: pp 2925-2935, Blood Vol.84, No.12, 1994: pp 4214-4225, Eur J Biochem 1995 Aug.; 232(1): pp19-27)。したがって、Bドメインを欠損する第VIII因子の変異体は、本発明の血液凝固因子に含まれる。Bドメインを欠損したヒト第VIII因子のアミノ酸配列を配列番号：１０に、そしてそれをコードするcDNAのコード領域の塩基配列を配列番号：９に示した。
そのほかの血液凝固因子についても、アミノ酸配列の付加、欠失、置換、および挿入のいずれか、もしくは複数を含み、天然の血液凝固因子と同等の活性を維持した変異体は、いずれも本発明における血液凝固因子に含まれる。【００２７】
第VIII因子は２３３２個のアミノ酸からなる巨大な蛋白質である。第VIII因子をコードするDNAは約７kbに及ぶ。公知のベクターでは、このような大きな蛋白質を十分に発現できないものもあり、少しでも発現産物を小さくするためにＢドメインを欠いた変異体（１４５７アミノ酸残基）が利用されることもあった。しかし本発明において血液凝固因子遺伝子を搭載するレンチウイルスベクターは、大きな外来性遺伝子を搭載できるという特徴を持つ。したがって、Ｂドメインを欠いた変異体のみならず、たとえば第VIII因子の全長をコードするDNAを搭載し、安定な発現を維持することもできる。
一方、本発明における血液凝固因子は、蛋白質に翻訳された後、分泌されることなく血小板内部に保持されるのが好ましい。血液凝固因子が血流中に分泌されると、中和抗体の誘導、あるいはインヒビターによる中和の原因となる。したがって、本発明における血液凝固因子には、リーダー配列を持たない構造とするのが好ましい。【００２８】
（２）天然の血液凝固因子よりも強い活性を有する変異体
天然の血液凝固因子と同等な活性を有する蛋白質のみならず、天然の血液凝固因子よりも強い活性、あるいは改変された性質を有する蛋白質も、本発明における血液凝固因子として利用することができる。血液凝固因子としての活性、あるいは生体中における安定性、あるいは生体に対する免疫原性などを改変した血液凝固因子を取得することができる。これらの、天然の血液凝固因子に対して変異を含み、治療上、望ましい形質を付加された変異体は、本発明における血液凝固因子として利用することができる。
たとえば、第VIII因子の改変体(EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE, Vol. 34, No. 3, 233-238, July 2002)、あるいは第VII因子の改変体(Biochem. J. (2004) 379 (497-503))等が報告されている。これらの改変体は、本発明における血液凝固因子に含まれる。【００２９】
本発明において、たとえば以下に示すような血液凝固因子は、それぞれ次に示すような血液凝固異常を伴う疾患の治療に有用である。各血液凝固因子に対して、上記（１）あるいは（２）で述べたような変異体を本発明における血液凝固因子として利用することもできる。
血友病Ａ（第VIII因子、第VIIa因子）
血友病Ｂ（第IX因子）
フォン・ヴィルブランド病（フォン・ヴィルブランド因子）
第I因子欠乏症、無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症（第I因子）
第II因子欠乏症（プロトロンビン）
第V因子欠乏症、パラ血友病（第V因子）
第VII因子欠乏症（第VII因子）
第X因子欠乏症（第X因子）
第XI因子欠乏症（第XI因子）
第XIII因子欠乏症（第XIII因子）【００３０】
これらの疾患のうち、特に患者数の多い、血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォン・ヴィルブランド病は、社会的に重要な疾患である。したがってそれぞれの疾患の治療に有用な、第VIII因子、第VIIa因子、第IX因子、およびフォン・ヴィルブランド因子、並びにこれらの各因子と同等な活性を有する変異体は、本発明における好適な血液凝固因子である。【００３１】
当業者は、本発明における血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。たとえば、ヒト由来のVWFや第I因子〜第XIII因子のアミノ酸配列、あるいはcDNAの塩基配列は公知である。したがって、cDNAの塩基配列の一部または全部をプローブとして、肝臓のcDNAライブラリーから、目的とするポリヌクレオチドを調製することができる。あるいは、既知の塩基配列の一部をプライマーとして、肝などの適当な組織のmRNAを鋳型として、公知の核酸増幅法によって目的とするポリヌクレオチドを合成することもできる。【００３２】
本発明において、血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドは、血小板特異的なプロモーターと機能的に結合される。本発明において、機能的な結合とは、血小板特異的なプロモーターの活性に応じて血液凝固因子をコードする遺伝子の転写が起こるように、該プロモーターの下流に血液凝固因子をコードする遺伝子を連結することを言う。あるいは、プロモーターと遺伝子の機能的な結合は、血小板特異的なプロモーターの制御下に血液凝固因子をコードする遺伝子が発現することを意味する。【００３３】
一方、本発明において、血小板特異的なプロモーターとは、任意の宿主細胞に導入されたときに、血小板細胞においてプロモーター活性を発現するDNAを言う。より具体的には、血小板特異的プロモーターは、たとえば造血幹細胞に導入されたときに、血小板あるいはその前駆細胞である巨核球細胞においてプロモーター活性を検出することができる。本発明における好ましいプロモーターは、巨核球の分化の後期における転写活性が高いプロモーターである。一方、血小板に対する特異性の無いプロモーターは、血小板や巨核球細胞以外の細胞においてプロモーター活性が検出される。【００３４】
プロモーターの各細胞における活性は、レポーターアッセイの原理に基づいて評価することができる。すなわち、活性を評価すべきプロモーターにレポーター遺伝子を機能的に結合したコンストラクトを調製し、種々の細胞に導入する。当該コンストラクトを導入された細胞においてレポーター遺伝子に起因するシグナルが検出されれば、プロモーター活性が検出される。レポーター遺伝子としては、蛍光活性や酵素活性などの各種のシグナルを生成する遺伝子が公知である。より具体的には、GFP（蛍光活性）、LacZあるいはLuc（酵素活性）などをレポーター遺伝子として利用することができる。【００３５】
本発明において、血小板特異的なプロモーター活性とは、当該プロモーターが導入される細胞群の中で、血小板に対する特異性を有していれば良い。たとえば造血幹細胞や骨髄細胞に導入する場合、導入された細胞群の中で、最終的に、血小板特異的なプロモーター活性が確認されるプロモーターは、本発明における血小板特異的なプロモーターに含まれる。本発明において、血小板特異的なプロモーターの種類は限定されない。必要な活性を有する限り、由来する動物種も任意である。あるいは人為的に改変されたプロモーターを利用することもできる。【００３６】
たとえば、血小板特異的膜糖タンパク質GPIbα・プロモーターは、血液凝固因子遺伝子の血小板あるいは巨核球特異的な発現に好適なプロモーターである。具体的には、GPIbαのプロモーター活性は、特に巨核球の分化の後期で強化される。すなわち、血小板への分化の進行に応じて活性が強まる。したがって、血小板における特異性の高いプロモーターである。更に、同じく血小板特異プロモーターとされているGPIIbよりもプロモーター活性が強い。【００３７】
本発明において利用することができるGPIbαプロモーターの塩基配列を、配列番号：７に示す。更に、配列番号：７に記載の塩基配列を含むプロモーターは、その制御下に発現する遺伝子のコード領域との間に非翻訳領域(5'UTR)を配置することによって、転写活性が向上する。したがって、たとえば第VIII因子遺伝子を当該プロモーターと機能的に結合する場合には、第VIII因子遺伝子の5'UTRをGPIbαと第VIII因子遺伝子との間に介在させることができる。GPIbα（配列番号：７）の下流に第VIII因子遺伝子の5'UTRを付加した塩基配列を配列番号：８に示した。【００３８】
本発明において、GPIbαプロモーターには、当該プロモーターと機能的に同等なプロモーターが含まれる。機能的に同等なプロモーターは、たとえば配列番号：７に記載の塩基配列（ヒト）を基に、ホモロジー検索等により探し出すことができる (例えばBLAST; Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。あるいは、配列番号：７に記載の塩基配列を基に設計したプライマーを用いたジェノミックＰＣＲにより得ることもできる。あるいはヒト以外の動物種のゲノムライブラリーを、配列番号：７に記載の塩基配列を有するプローブを使って、ストリンジェントな条件におけるハイブリダイゼーションにより、ヒト以外の種に由来する相同なプロモーターを得ることもできる。具体的には、GPIbαプロモーターを含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズすることを検出することにより、目的とするプロモーターを同定することができる。【００３９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5×SSC (1×SSC は 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、48℃、好ましくは50℃、より好ましくは52℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは60℃、さらにこの好ましくは65℃、最も好ましくは68℃で2×SSC中、好ましくは1×SSC中、より好ましくは0.5×SSC中、より好ましくは0.1×SSC中で、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。【００４０】
このようにして取得されるプロモーターは、GPIbαプロモーターと高いホモロジーを有する配列を含んでいる。高いホモロジーとは、70％以上、好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する配列である。配列の同一性は、例えばBLASTプログラムにより決定することができる (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはblastnプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはblastpプログラムを用い、例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて"Low complexity"などのフィルターの設定は全てOFFにして、デフォルトのパラメータを用いて計算を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）。パラメータには、たとえば次のような数値を用いることができる。
open gapのコストはヌクレオチドは5、
extend gapのコストはヌクレオチドは2、
nucleotide mismatchのペナルティーは-3、
nucleotide matchの報酬は1、
expect valueは10、
wordsizeはヌクレオチドは11、
Dropoff (X) for blast extensions in bitsはblastnでは20、
final X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastnでは50
２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、GPIbαプロモーター全体（例えば配列番号：７の全長）に対する同一性の値を計算する。【００４１】
また、GPIbαプロモーターには多型およびバリアントが存在する可能性もある。また、一般に、塩基配列の部分的な置換や欠失、あるいは挿入によっても、プロモーター活性が維持されることは多い。このような、GPIbαプロモーターのバリアントを本発明に使用することができる。GPIbαプロモーターのバリアントは、一般に配列番号：７の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、および/または挿入された配列を含み得る。配列番号：７に記載の塩基配列との違いは、通常30塩基以内、好ましくは20塩基以内、好ましくは10塩基以内、より好ましくは5塩基以内、より好ましくは3塩基以内、より好ましくは2塩基以内である。バリアントのプロモーター活性は、たとえば先に述べたレポーターアッセイなどの方法によって確認することができる。その結果、GPIbαプロモーターと同等、あるいはそれ以上の活性を有することが確認されたプロモーターは、本発明におけるGPIbαプロモーターとして好ましい。【００４２】
本発明の血液凝固異常の治療剤において、血小板特異的なプロモーターに機能的に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターに組み込まれる。以下、本発明に利用することができるレンチウイルスベクターについて説明する。【００４３】
ウイルスの生活環は大きく感染と増殖の段階に分けられる。一般にウイルスベクターは、ウイルスの感染システムを利用して、遺伝子を効率よく宿主の細胞内に導入出来ることが特徴である。多くのウイルスベクターは、安全性確保のため、増殖システムを排除して自己複製能を欠如させ、導入された細胞内での増殖を防止する措置がとられている。【００４４】
ベクター粒子の構造を簡単に説明する。まずベクター粒子には、カプシドと呼ばれる蛋白質の外殻がある。カプシドはgag遺伝子産物の構造蛋白質から構成されている。そのカプシドの外側にエンペロープと呼ばれる膜構造がある。エンベロープは、感染する細胞の種類を決定する機能を有する。カプシドの中には、２コピーのベクターゲノムRNA、pol遺伝子産物である逆転写酵素が存在している。ウイルスベクターは宿主細胞に感染すると、ベクターゲノムRNAは自らの上記逆転写酵素により逆転写された後、宿主染色体に組み込まれてプロウイルスDNAとなり、感染を成立させる。【００４５】
一般にウイルスベクターは、パッケージングベクターとジーントランスファーベクターによって調製することができる。パッケージングベクターは、パッケージングシグナルが除去されたウイルスDNAを搭載している。ウイルスDNAには、ウイルスタンパク質配列が含まれている。パッケージングベクターが導入された宿主細胞は、特にパッケージング細胞と呼ばれる。パッケージングベクターを宿主に導入すると、宿主細胞では、パッケージングシグナルがないために、空のウイルス粒子が作られる。【００４６】
一方のジーントランスファーベクターは、宿主染色体DNAに組み込まれるために必要なウイルス由来の遺伝子配列と、導入する外来遺伝子を搭載している。本発明においては、血小板特異的なプロモーターと血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを連結したコンストラクトが、ジーントランスファーベクターに外来遺伝子として搭載される。このジーントランスファーベクターをパッケージング細胞に導入すると、ジーントランスファーベクターから供給されるベクターゲノムDNAが宿主染色体に組み込まれた後、転写によってベクターゲノムRNAが作られる。このベクターゲノムRNAが、パッケージング細胞によって作られるウイルス粒子に取り込まれ、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子が生成される。【００４７】
一般に、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を「ウイルスベクター」と呼ぶ。特に遺伝子組み換え技術により構築されたウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスベクターと呼ばれる。ウイルスゲノムをコードするDNAとパッケージング細胞を用いて構築したウイルスベクターは、組み換えウイルスベクターに含まれる。本発明におけるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するウイルスゲノムを含み、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子である。
レンチウイルスとは、レンチウイルス亜科（Lentivirus）に属するレトロウイルスを指す。たとえば次のようなウイルスが、レンチウイルスに含まれる。
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus; HIV）；
（例えばHIV1またはHIV2）、
サル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus; SIV）、
ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、
マエディ・ビスナウイルス、
ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、
ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）【００４８】
本発明においては、任意の株およびサブタイプに由来するレンチウイルスベクターを利用することができる。例えば HIV-1としては、全てのメジャー（M）サブタイプ（AからJを含む）、Nおよび outlier（O）が含まれる（Hu, D. J. et al., JAMA 1996; 275: 210-216; Zhu, T. et al., Nature 1998, 5; 391(6667): 594-7; Simon, F. et al., Nat. Med. 1998, 4(9): 1032-7）。SIV単離株としては、SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等が例示できる。これらのレンチウイルスベクターの中でも、サル免疫不全ウイルス（SIV）ベクターは特に好ましいウイルスベクターである。
本発明におけるSIVベクターとして利用することができるSIVのゲノムの塩基配列を配列番号：１４に示した。あるいは公知のSIVゲノムの塩基配列を利用することもできる(Fukasawa et al.  Nature  Vol. 333, p457-461, 1988; GenBank Accession No. X07805)。【００４９】
本発明において「サル免疫不全ウイルス（SIV）ベクター」とは、ウイルス粒子中の核酸分子のうち、ウイルスベクターとしての機能に必須な配列がSIVゲノムに基づく配列であるベクターを指す。本発明において「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」とは、5’側から順に、下記の領域を示すことができる。
5'LTRのR領域；
U5領域；
パッケージングシグナル（φ）、
RRE；
3'LTRのプロモーター領域以外のU3領域；
R領域；【００５０】
本発明におけるSIVベクターを構成する各領域の塩基配列として、たとえば次の塩基配列を示すことができる。
配列番号：１／5'LTR領域からパッケージングシグナルまでの塩基配列
配列番号：２／RRE配列
配列番号：３／3'LTRのプロモーター領域を欠如したU3領域からR領域までの塩基配列
これらの塩基配列はその一例であって、同等の機能を有する塩基配列であれば、本発明に利用できることはいうまでも無い。すなわち上述の定義に当てはまる限り、本発明におけるSIVベクターは、改変を含むことができる。例えば、「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」がSIV由来である限り、他にSIV由来の配列またはSIV以外の由来の配列を含んでいてもよい。好適に含まれ得る配列として、例えば、後述するcPPT （central polypurine tract)、内部プロモーター（CMV）、WPRE （woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)を挙げることができる。【００５１】
サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus, SIV）はサルにおけるHIV類似ウイルスとして発見され、HIVとともにPrimates Lentivirusグループを形成している（井戸栄治, 速水正憲, サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性. 蛋白質 核酸 酵素: Vol..39, No.8. 1994）。このグループはさらに大きく次の４つのグループに分類される。
1)ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）の原因となるHIV-1とチンパンジーより分離されたSIVcpzを含むHIV-1グループ
2)スーティーマンガベイ Cercocebus atys より分離されたSIVsmmとアカゲザル Macaca mulatta より分離されたSIVmac、ヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すHIV-2（Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997）よりなるHIV-2グループ、
3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiops から分離されたSIVagmに代表されるSIVagmグループ、
4)マンドリル Papio sphinx から分離されたSIVmndに代表されるSIVmndグループ【００５２】
このうち、SIVagmおよびSIVmndには自然宿主における病原性の報告はない（Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; 速水正憲, 日本臨床, 47, 1, 1989）。特に本実施例で用いたSIVagmの一種であるTYO-1株は、自然宿主でも、カニクイザル Macaca facicularis 、アカゲザル Macaca mulatta に対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), :367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990）。【００５３】
SIVagmのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていない。一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少ない。あるいは感染した場合にも、その発症頻度が低い、あるいは発症後の進行が遅いという傾向がある（Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997）。従って、SIVagm、特にSIVagm TYO-1株をベースとして作製したウイルスベクターは、HIV-1や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられる。つまりSIVagm TYO-1株をベースとして作製したレンチウイルスベクターは、本発明における好ましいベクターである。SIVagm TYO-1株のゲノム塩基配列を配列番号：１４に示す。【００５４】
本発明におけるサル免疫不全ウイルスベクターは、他のレトロウイルスのゲノムRNA配列の一部を含むことができる。例えば、次に示すような、SIV以外のレンチウイルスのゲノム配列の一部をSIVのゲノムの一部と置換したキメラ配列を有するベクターも、本発明におけるSIVベクターに含まれる。
ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus; HIV）；
ネコ免疫不全ウイルスFeline Immunodeficiency Virus（FIV）（Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998）；
ヤギ関節炎脳炎ウイルスCaprine Arthritis Encephalitis Virus（CAEV）（Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998）【００５５】
本発明におけるレンチウイルスベクターは、血小板特異的なプロモーターに機能的に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを搭載している組換えSIVベクターを含む。本発明において、血液凝固因子として第VIII因子を利用する場合、第VIII因子をコードするポリヌクレオチドを搭載したSIVベクターを、SIV-FVIIIベクターと記載する。本発明におけるSIV-FVIIIベクターは、上述の定義に該当する限り、種類や構造を制限されない。本発明における好ましいSIV-FVIIIベクターは、第VIII因子をコードするポリヌクレオチドが挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。【００５６】
本発明のSIV-FVIIIベクターは、VSV-Gシュードタイプ化されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化とは、ベクターのエンベロープに水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）の表面糖蛋白質であるVSV-G蛋白質を含ませることを言う。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また、VSV-G蛋白質は、天然由来の蛋白質から１または複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加などにより改変されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化ベクターは、ウイルスの産生時にVSV-G蛋白質を共存させることにより製造することができる。【００５７】
例えば、VSV-G発現ベクターのトランスフェクションや、宿主染色体DNAに組み込んだVSV-G遺伝子からの発現誘導により、パッケージング細胞内でVSV-Gを発現させることにより、この細胞から産生されるウイルス粒子がVSV-Gでシュードタイプ化される。VSV-G蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくい。またVSV-Gでシュードタイプ化されたウイルス粒子は、遠心分離によって高濃度に濃縮することができる（Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13. 1995）。【００５８】
本発明におけるSIV-FVIIIベクターは、付加的に他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を含むことができる。SIV-FVIIIベクターに付加できるエンベロープ蛋白質として、例えば、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。エンベロープ蛋白質は、特に制限されない。たとえば、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などを、SIV-FVIIIベクターに付加することができる。
具体的には、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（MuLV）4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。また、MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばpCL-10A1(Imgenex)（Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)）。その他、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのgB、gD、gH、gp85蛋白質、EBウイルスのgp350、gp220蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、B型肝炎ウイルスのS蛋白質などが挙げられる。【００５９】
本発明における組換えサル免疫不全ウイルスベクターは、LTR（long terminal repeat）に改変を加えることもできる。LTRはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。5'LTRはプロモーターとして働き、プロウイルスからのmRNAの転写を促す。したがって、ウイルス粒子内にパッケージングされるウイルスRNAゲノムをコードするジーントランスファーベクターの5'LTRのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターのmRNA転写量が増大し、パッケージング効率、並びにベクター力価を上昇させることができる。【００６０】
さらに、例えばレンチウイルスの場合、5'LTRはウイルス蛋白質tatによる転写活性の増強を受けることが知られている。したがって5'LTRをtat蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、パッケージングベクターからtatを削除することができる。【００６１】
さて、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスRNAは逆転写された後、両端のLTRを結合させた環状構造となる。次いでLTR間の結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にウイルスゲノムがインテグレートされる。
プロウイルスから転写されるmRNAは5'LTR内の転写開始点より下流、3'LTRのpolyA配列までである。5'LTRのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、5'LTRのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作製することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの5'側プロモーターを置換して、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。【００６２】
また、3'LTRの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターmRNAが転写されることを防止する自己不活性化型ベクター（Self Inactivating Vector：SINベクター）の作製により、安全性を高めることもできる。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、3'LTRのU3部分を5' 端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターの転写産物は、逆転写後、標的細胞の染色体に組み込まれた状態では 5'端にU3が配置され、そこからジーントランスファーベクターからの転写産物と同様の構造を持つRNAが転写されることになる。【００６３】
仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、転写されたRNAが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また3'LTRのプロモーターにより、ウイルスゲノムの3' 側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてSINベクターが開発された(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 83(10), 3194-8, 1986)。【００６４】
ジーントランスファーベクター上の3'LTRのU3部分を欠失させることにより、標的細胞内では5'LTRや3'LTRのプロモーターが無くなるため、全長のRNAや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターは、本発明において好適である。SINベクターの構築は、公知の方法または本発明者らによる特許出願：国際公開番号WO2002/101057の実施例１−４に記載の方法などに従えばよい。【００６５】
レトロウイルスベクターなど、ゲノムにLTR配列を含むウイルスベクターを用いた遺伝子治療の問題点の一つに、導入遺伝子の発現が次第に低下することがある。これらのベクターは宿主ゲノムに組み込まれると、宿主側の機序によりそのLTRがメチル化され、導入遺伝子の発現が抑制されてしまうことが原因の一つと考えられている（Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994）。自己不活性化（SIN）型ベクターでは、宿主ゲノムに組み込まれるとLTR配列の大部分を失うため、LTRのメチル化による遺伝子発現の減弱を受けにくい利点がある。【００６６】
本発明者らによって、ジーントランスファーベクターの3'LTRのU3領域を他のプロモーター配列に置換して製造した自己不活性化型ベクターは、霊長類ES細胞に導入後、２ヵ月以上にわたって安定した発現を維持することが判明している（WO2002/101057）。このように、LTR U3領域の改変により自己不活性化するように設計されたSINベクターは、本発明において特に好適である。
具体的には、3'LTRのU3領域の1または複数の塩基が置換、欠失、および/または付加により改変されたベクターは、本発明に含まれる。このU3領域は、単に欠失させてもよいし、あるいはこの領域に他のプロモーターを挿入してもよい。このようなプロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、またはCAGプロモーターなどを挙げることができる。【００６７】
また、本発明においてレンチウイルスベクターに搭載される血液凝固因子遺伝子は、血小板特異的なプロモーターにより転写されるように設計される。例えば、上記のようにLTR U3領域を非LTRプロモーターである血小板特異プロモーターと置換した場合には、この改変LTRにより血液凝固因子遺伝子を駆動することができる。あるいは、実施例において示されるように、LTR領域の間に血小板特異プロモーターを配置し、その下流に血液凝固因子遺伝子を連結することにより、LTRに依存せずに血液凝固因子遺伝子の発現を誘導することができる。【００６８】
HIVベクターをはじめとするレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムがHIVプロウイルスをすでに保持している場合、外来ベクターと内因性プロウイルスの間で組み換えが生じ、複製可能ウイルスが発生しないかという危惧が指摘されている。これは、将来実際にHIV感染患者にHIVベクターを用いる時には確かに大きな問題になろう。しかしSIVベクターは、HIVとの相同配列はほとんどない。その上SIVベクターは、ウイルス由来の配列を80％以上取り除いた複製不能ウイルスなので、複製可能なウイルスが構成される危険性は極めて小さい。つまり、他のレンチウイルスベクターに比べてSIVベクターは安全性が高い。【００６９】
本発明におけるSIVベクターは、上述の「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」以外のSIVゲノム配列が一定以上除去されたベクターである。本発明において、好ましいSIVベクターは、このベクターが由来するSIVのゲノム配列の40％以上、通常50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上が取り除かれた複製不能ウイルスである。【００７０】
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを転写させ、gag、pol蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。パッケージング細胞内のgag、pol蛋白質はパッケージングベクターを用いて供給することができる。エンベロープ蛋白質は、パッケージングベクターによって供給することもできるし、あるいは別のベクターによって供給されてもよい。例えばVSV-G発現ベクターによって供給することもできる。【００７１】
本発明のジーントランスファーベクターは、少なくとも次の要素を含む。
5'LTR、
パッケージングシグナル配列、
血小板特異的プロモーター、
血液凝固因子遺伝子、および
3'LTR配列
LTR配列は、SIVベクターの改変として上述したように改変することができる。また、上述のcPPT配列、CMV配列、あるいはRRE配列等を組み込むことができる。ジーントランスファーベクターDNAにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい。【００７２】
一方で、該ベクターDNA上のパッケージングシグナルと、gag、pol蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためには、これらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターDNAの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。【００７３】
例えば、パッケージングベクターをSIVagm由来のものにした場合は、HIV由来のジーントランスファーベクターはパッケージングされない。そのため、ジーントランスファーベクターDNAに用いられるパッケージングシグナルは、SIV由来に制限されると考えられる。ただし、HIV由来のパッケージングベクターを用いた場合、SIV由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされる。したがって組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることも可能である。このようにして製造されたSIVベクターも、本発明のベクターに含まれる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、HIVとSIV）であることが好ましい。【００７４】
ジーントランスファーベクターDNAでは、gag蛋白質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスgag蛋白質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。gag蛋白質を発現しないようにするためには、gagの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、gag蛋白質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。【００７５】
一般にウイルスのパッケージングには、gag蛋白質のコード領域の5'側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、gag蛋白質のC末側のコード領域を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いgagコード領域を欠失させることが好ましい。また、gag蛋白質の開始コドン（ATG）をATG以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収することができる。【００７６】
さらに、血液凝固因子遺伝子の導入効率および発現効率を高めるために、ジーントランスファーベクターDNAを改変することができる。たとえば、導入効率を上昇させるために、cPPT配列を導入することができる。cPPTは、もともとSIVゲノムに存在する配列である。HIVウイルスにおいてはかなり以前から報告がある（P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431, 1991）。HIVベクターにおいてはcPPTを導入するとベクターゲノムの核への移行が良くなり、遺伝子導入効率が上昇することが報告されている(A.Sirven et al. : Blood 96:4103-4110, 2000)。【００７７】
本実施例で使用したcPPTの塩基配列を配列番号：４に示す。また発現効率を高める改変の例としては、WPRE配列の導入を挙げることができる。WPREは遺伝子発現効率を高める機能を有する因子である（US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use）。他のレンチウイルスベクターではCPPTとWPREの２つの因子の同時導入は個々の効果を更に高める結果が報告されている(SC.Barry et al. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108, 2001)。本実施例で使用したWPREの塩基配列を配列番号：５に示す。【００７８】
本発明のSIV-FVIIIベクターにおいて、cPPTは、一般的なレンチウイルスベクターにおける配置と同様の配置とすることができる。例えば、cPPTをプロモーターと外部遺伝子との間に配置してもよく、またはRRE配列の上流に配置することもできるが、好ましくは、血液凝固因子の転写を駆動する上述の血小板特異プロモーターの上流に配置する（図２Ａ）。一方WPREは、血液凝固因子遺伝子の下流に配置することができる。【００７９】
本発明において、パッケージングベクターは、血液凝固因子遺伝子導入に必要でない配列を取り除くことができる。必要でない配列として、修飾遺伝子と呼ばれるvif、およびvpr、並びに制御遺伝子のtat、およびrevを例示することができる。修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが報告されており(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されている。パッケージングベクターからrevを除いた場合は、別に、rev発現ベクターを構築し、該rev発現ベクターを本発明のSIV-FVIIIベクターの製造において使用することができる。SIVagm TYO-1株のrevの塩基配列を配列番号：６に示す。【００８０】
上記のようにして構築されたパッケージングベクターは、例えば、プロモーター配列、ウイルスコアタンパク質配列（gag）、逆転写酵素配列（pol）、polyA配列を含む構成とすることができ、実施例に示すように上記構成にさらにRRE配列を含むことができる。またrev発現ベクターは、rev配列の上流に該配列を制御するためのプロモーター、rev配列の下流にpolyA配列を配置した構成とすることができる。【００８１】
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW480細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、Molt-4細胞、HeLa細胞、HT1080細胞、TE671細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、COS1細胞、COS7細胞、CV-1細胞、BMT10細胞などが挙げられる。【００８２】
本発明のSIV-FVIIIベクターは、実質的に純粋になるよう精製することができる。具体的には、フィルター濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法によりベクターを精製することができる。例えば、ベクター溶液を0.45μmのフィルターにて濾過後、42500×g、90分、４℃で遠心を行うことで、ベクターを沈殿・濃縮することができる。【００８３】
本発明の血液凝固異常の治療剤は、血液凝固異常を伴う疾患の治療および予防に使用することができる。具体的には血友病の治療および予防に用いることができる。たとえば、血液凝固因子として第VIII因子あるいは第VIIa因子（活性化型第VII因子）を用いた場合には血友病Ａの治療剤とすることができる。あるいは第IX因子を血液凝固因子として応用することにより、血友病Ｂの治療剤とすることができる。上述した血小板特異的プロモーターに機能的に結合した血液凝固因子遺伝子を搭載したSIV-ベクターは、必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と適宜組み合わせて上記疾患用の治療剤とすることができる。
「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などと適宜組み合わせることができる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。【００８４】
上記の血液凝固異常の治療剤を血小板前駆細胞に感染させ、血小板前駆細胞移植組成物を製造することができる。あるいは当該細胞を巨核球あるいは血小板に分化させることによって、血液凝固異常の治療用の巨核球あるいは血小板を製造することもできる。すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた血小板前駆細胞に関する。
本発明において、血小板前駆細胞とは、血小板への分化能を有する任意の細胞が含まれる。たとえば、造血幹細胞は、血小板への分化能を有する細胞である。あるいは造血幹細胞から分化した巨核球は、更に分化を経て血小板となる細胞である。したがって、巨核球も血小板前駆細胞である。【００８５】
血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを血小板前駆細胞に感染させる工程と、レンチウイルスベクターを感染させた血小板前駆細胞を巨核球および血小板のいずれか、または両方を含む細胞群に分化するまで培養する工程を含む、血液凝固因子を蓄積した巨核球および血小板のいずれか、または両方の製造方法に関する。【００８６】
たとえば造血幹細胞は、適当なサイトカイン類などの存在下で培養することによって、巨核球細胞への分化が誘導される。培養を継続すれば、血小板前駆細胞である巨核球は、血小板への分化が進む。造血幹細胞の、巨核球や血小板への分化は、各細胞に特異的なマーカーの消滅あるいは出現を確認することによって検出することができる。あるいは、細胞の形態の変化を観察して、巨核球や血小板への分化を確認することもできる。巨核球や血小板は、特徴的な形状を持つ細胞なので、形態の変化を捉えることは容易である。【００８７】
本発明において、造血幹細胞(hematopoietic stem-cell; HSC)とは、巨核球または血小板の少なくともいずれかの血液細胞に分化し得る細胞を言う。言い換えれば、血小板に分化するあらゆる血小板前駆細胞は、本発明における造血幹細胞に含まれる。本発明では、造血幹細胞として、当該細胞を含む細胞群を利用することもできる。具体的には、たとえば、骨髄や臍帯血を、造血幹細胞を含む細胞群として利用することができる。あるいは、末梢血幹細胞を造血幹細胞に利用することもできる。【００８８】
各血液細胞は、その形態や染色の特異性から同定することができる。染色法としては、ギムザ染色、ライト染色、メイ−ギムザ染色、メイ−グリュンワルド−ギムザ染色、ペルオキシダーゼ染色、エラスターゼ染色、PAS染色等を用いることができる（新生化学実験講座8, 血液(上), 1987, 8-15ページ参照）。【００８９】
造血幹細胞は、骨髄のみならず末梢血および臍帯血中にも存在する。これらの細胞に本発明におけるレンチウイルスベクターを感染させ、患者に投与することによって本発明に基づく血液凝固異常の治療が実施される。本発明において造血幹細胞の投与とは、造血幹細胞を含む細胞組成物を患者に投与することを言う。具体的には、骨髄移植（BMT）、末梢血幹細胞移植（PBSCT）、および臍帯血幹細胞移植（CBSCT）などが含まれる。すなわち本発明は、骨髄細胞移植のみならず、末梢血造血幹細胞移植および臍帯血移植においても適用することができる。HSCは、顆粒球、単球の前駆細胞をコロニーアッセイ法で算定したり、HSCに特徴的と考えられるCD34（抗原）陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより同定することができる。【００９０】
具体的には、造血細胞としては、マウスであれば c-kit+、Thy1.1low、lin-、Sca-1+（Osawa M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H. Science. 1996; 273: 242-245.）、ヒトではCD34+、Thy+、Lin-、c-kitlow（Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94:5320-5325）の表現型を有する細胞が挙げられる。lin- (lineage negative) の表現型は、適宜市販のキット等を用いて同定および選択することができるが、例えば GPA、CD3、CD2、CD56、CD24、CD19、CD14、CD16、および CD99b が全てnegativeのものである。【００９１】
ヒト造血幹細胞の分離方法は、以下の文献でも参照することができる。
Leary AG, Blood 69: 953, 1987; 
Sutherland HJ, Blood 74: 1563, 1989; 
Andrews RG, J Exp Med 169: 1721. 1989; 
Terstappen LWMM, Blood 77: 1218, 1991; 
Lansdorp PM, J Exp Med 175: 1501, 1992; 
Briddell RA, Blood 79: 3159, 1992; 
Gunji Y, Blood 80: 429, 1992; 
Craig W, J Exp Med 177: 1331, 1993; 
Gunji Y, Blood 82: 3283, 1993; 
Traycoff CN, Exp Hematol 22: 215, 1994; 
Huang S, Blood 83: 1515, 1994; 
DiGinsto D, Blood 84: 421, 1994; 
Murray L, Blood 85: 368, 1995; 
Hao QL, Blood 86: 3745, 1995; 
Laver JH, Exp Hematol 23: 1515, 1995; 
Berardi AC, Science 267: 104, 1995; 
Kawashima I, Blood 87: 4136, 1996; 
Leemhuis T, Exp Hematol 24: 1215, 1996; 
Civin CI, Blood 88: 4102, 1996; 
Larochelle A, Nature Med 2: 1329, 1996; 
Tajima S, J Exp Med 184: 1357, 1996; 
Sakabe H, Stem Cells 15: 73, 1997; 
Sakabe H, Leukemia 12: 728, 1998; および
原田実根他編, 新しい造血幹細胞移植, 南江堂, 1998, 9-23ページ【００９２】
例えばマウスの骨髄細胞は、大腿骨、及び頸骨より骨髄細胞をフラッシュにて採取し、Lysing buffer（0.38% NH4Cl in Tris-HCl, pH7.65）にて赤血球除去後、抗Thy1.2抗体およびウサギ補体を用いた抗体補体反応による成熟Ｔ細胞の除去後に得られる（Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K. J Immunol. 1990; 144: 463-473.）。または、採取骨髄細胞を抗B220（Ｂ細胞）抗体、抗ＣＤ3（Ｔ細胞）抗体、抗Gr-1（顆粒球）抗体、抗Mac-1（マクロファージ）抗体、抗DX-5（NK細胞）抗体等の抗体でビーズあるいは遠心法にてlineageを除去して得られる（Sato T, Laver JH, Ogawa M. Blood. 1999; 94: 2548-2554.）。【００９３】
ヒト造血細胞を骨髄より採取する場合は、全身麻酔下、腹臥位で、腸骨の左右それぞれ３〜５ヶ所から、１回に数mL程度の骨髄液を採取する（末梢血混入を避けるため）。採取量は同種移植の場合では細胞数は3（2〜5）×108/kg（患者体重あたり）、自家移植の場合で1〜3×108/kg を目標として骨髄採取する。骨組織などの混入があるためメッシュを通した後、バッグにつめる。骨髄移植の際には粗いフィルターを通して投与される。本発明においては、こうして採取された骨髄液そのもの、骨髄液から単離された造血幹細胞を含む細胞群、あるいは単離された造血幹細胞に、レンチウイルスベクターを導入することができる。【００９４】
同種移植の場合は、ヒト白血球抗原（human lymphocyte antigen；HLA）適合ドナーを選択することが好ましい。但し、GVHD予防法の確立、新しい免疫抑制剤の開発、およびCD34陽性細胞の純化技術などにより、HLA不一致のドナーでも移植は可能になってきている。ドナーとしては、HLA-A、-B、および-DRの３組６抗原のうち、4種類以上、より好ましくは5種類以上、より好ましくは全てがレシピエントと一致することが好ましい。ＡＢＯmajor不適合移植の場合、遠心分離により赤血球を除去したものを用いる。ＡＢＯminor不適合の場合、遠心分離にて血漿を除去したものを用いる。（森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第２版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、（1999年）p260-277、参照 ）。【００９５】
末梢血より末梢血幹細胞を採取する場合は、G-CSF 1 日400μg/m2（又は10μg/kg）を1 回、または2 回に分割し、5 日間または採取終了時まで連日皮下注射し、投与開始4日目から6日目までの期間に1から3 回、末梢血（静脈）から血球分離装置を用いて造血幹細胞を採取することができる（日本造血細胞移植学会のウェブページにおける造血幹細胞移植に関するガイドラインの説明資料を（2003年4月21日改訂第3版）を参照）。末梢血幹細胞（PBSC）の動員については、Harada M et al., J. Hematother 5: 63-71, 1996、Waller CF et al., Bone Marrow Transplant 18: 279-283, 1996、Anderlini P et al., Blood 90: 903-908, 1997、原田実根他編, 新しい造血幹細胞移植, 南江堂, 1998, 67-72ページ、名古屋BMTグループ編, 造血細胞移植マニュアル改訂三版, 2004, 237-240ページも参照のこと。【００９６】
動員に用いるG-CSFとしては、野生型蛋白質の他、N末端を改変した誘導体（nartograstinなど）、糖鎖が付加された修飾蛋白質（lenograstinなど）を用いることができる。またG-CSFと他の造血因子を併用してもよい。例えば、GM-CSF、IL-3、またはSCFなどを併用することができる（Huhn RD et al., Exp Hematol 24: 839-847, 1996; Begley CG et al., Blood 90: 3378-3389, 1997; Lane TA et al., Blood 85: 275-282, 1995）。G-CSF投与中は、腰痛、骨痛および発熱などの全身症状の軽減のため、aspirinを投与することができる。【００９７】
ヒト末梢血造血幹細胞（CD34+細胞）を得るには、上記で得られた末梢血幹細胞からCD34陽性細胞をCD34抗体磁気ビーズでの濃縮法Isolex system（Baxter社など）、CliniMACS（AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、Cellpro社）、CD34抗体をフラスコに固定化し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流す（CELLECTOR、AIS社）等の方法でCD34陽性細胞を分離採取することで得られる（森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第２版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、（1999年）p260-277、参照 ）。【００９８】
ヒト臍帯血細胞移植では、採取した臍帯血に、赤血球沈降剤血球を加え、重量によって各血液画分に分け、移植時には不要となる血漿画分、赤血球画分を除き、必要な造血幹細胞を得る。更にCD34陽性細胞をIsolex system（Baxter社）、CliniMACS（AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、Cellpro社）、CD34抗体をフラスコに固定化し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流す（CELLECTOR、AIS社）等の方法によって純化することで臍帯血ＣＤ34陽性造血幹細胞を得ることができる（森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第２版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、（1999年）、p661-680、参照 ）。【００９９】
単離した造血幹細胞は、例えばメチルセルロース法により、SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF、Epoを添加した培地で培養することができる（Sonoda Y. et al., Blood 84: 4099-4106, 1994; Kimura T. et al., Blood 90: 4767-4778, 1997）。造血細胞は1×102から1×104/ml程度で添加し、例えば 37℃、5% CO2、5% O2 下で培養する。但し、培養条件は適宜調整してよい。【０１００】
自家移植においては、簡便性の点から末梢血幹細胞移植が選択されることが多いが、自家骨髄移植も適用される。その場合、通常は、化学療法の影響のない造血回復期に、骨髄の正常造血を確認後、全身麻酔下に腸骨および胸骨から採取する。目標細胞数は、骨髄有核細胞3×108から5×108/kg程度である。連続式血液成分分離装置で得られた細胞浮遊液は、顆粒球や赤血球の混入が非常に少ないため、単核球分離操作を省略することができる。顆粒球や赤血球が多く含まれる場合には、Ficoll比重遠心法により単核球を分離することができる。骨髄液の場合は、顆粒球や赤血球の除去と濃縮のため、Ficoll処理または血液分離装置による単核球分離を行うことができる。【０１０１】
採取した細胞を凍結保存する場合は、10％自己血清、10％DMSOを含むRPMI1640培地に浮遊させて凍結させ、programmed freezerで凍結、液体窒素中で保存する。細胞濃度は2×107から6×107/mlとすることができる。比較的短期間の細胞保存のためには、細胞浮遊液（1×108/ml以下の濃度）に終濃度 6% Hydrodyethyl Starch (HES)、5% DMSO、4% albumin となるように、氷冷した等量の保存液を混合し、-80℃のdeep freezerで凍結保存することができる（Knudsen LM et al., J. Hematother. 5: 399-406, 1996）。【０１０２】
安全な自家移植に必要なCD34陽性細胞数は、およそ2×106/kgである（Schots R et al., Bone Marrow Transplant. 17: 509-515, 1996; Zimmerman TM et al., Bone Marrow Transplant. 15: 439-444, 1995）。CD34陽性細胞数は、通常の2 color flowcytometryで計測することができる。具体的には、骨髄細胞や末梢血アフェレーシス細胞を溶血処理により赤血球を除去した後、forward scatterと抗CD45抗体で展開し、gateを決めて赤血球および血小板を除く。次に、このgateをside scatterと抗CD34抗体で展開し、好中球などの非特異反応部分を除いた分画中の細胞数の全細胞数に対する割合で算定する。この値と、予め血球計測機で測定した血球数から、全CD34陽性細胞数が算出できる。
凍結保存した細胞に含まれるviableな幹細胞の数は、コロニー形成法によりCFU-GMを数える方法で知ることができる。移植に必要なCFU-GMの基準は、一般的には 1×105〜2×105/kgである。【０１０３】
上記のように調整した造血幹細胞、あるいは造血幹細胞を含む細胞群を本発明の血液凝固異常治療剤と接触させることにより、血液凝固因子遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを造血幹細胞に導入することができる。レンチウイルスベクターと造血幹細胞は、体内（in vivo）または体外（in vitroまたはex vivo) で接触させることができる。例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中で両者を接触させて、レンチウイルスベクターを細胞中に導入することができる。このとき、ポリブレンやレトロネクチンなどの存在下で両者を接触させることにより、レンチウイルスベクターの感染効率を高めることができる。【０１０４】
ベクターと造血幹細胞との接触においては、MOI（多重感染度; １細胞あたりの感染ウイルス数）を1〜500の間で調節することができる。MOIは、通常2〜300、たとえば3〜200、好ましくは5〜100、さらに好ましくは7〜70である。このような条件において、レンチウイルスベクターは、ごく短時間で造血幹細胞に導入される。具体的には、両者の接触時間を、1分以上、通常3分以上、たとえば5分以上、好ましくは10分以上、あるいは20分以上とすることができる。例えば1〜60分程度、より具体的には5分〜30分程度、両者を接触させることができる。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。【０１０５】
ベクターを導入した造血幹細胞は、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせて造血幹細胞移植組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、生細胞を懸濁できる溶液であれば制限はない。例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が挙げられる。【０１０６】
また造血幹細胞移植組成物は、ベクターを導入していない造血細胞が含まれていてもよい。ベクターを導入した造血細胞と、ベクターを導入していない造血細胞を混合することにより、造血細胞の生着効率は上昇し得る。混合比率は、それに限定されないが、例えばベクター導入造血細胞：非導入造血細胞を1：10〜10：1の間で適宜調整してよい。【０１０７】
また本発明は、前記レンチウイルスベクターが導入された造血細胞から巨核球あるいは血小板を分化誘導する方法に関する。この方法は、（ａ）血小板特異的プロモーターと機能的に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを搭載したレンチウイルスベクターを造血幹細胞に接触させる工程、および（ｂ）工程（ａ）の造血幹細胞を動物に注入する工程、を含む。【０１０８】
あるいは本発明は、次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法に関する。
(1) 血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程、および
(2) 工程(1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程
本発明において、血液凝固異常の治療に用いられる造血幹細胞の由来は限定されない。治療対象である、患者から採取された造血幹細胞であれば、生着が容易でGVHDなどの危険性も無い。しかし免疫抑制剤などを利用すれば、異なる個体の造血幹細胞を本発明に応用することもできる。本発明による治療方法において、造血幹細胞は、血小板に分化しうる細胞であれば、その由来は限定されない。具体的には、骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞のいずれか、または両方を含む細胞などを用いることができる。たとえば骨髄細胞は、本発明の治療方法における、好ましい造血幹細胞である。【０１０９】
本発明において、レンチウイルスベクターを感染させた後の造血幹細胞は、適宜培養した後に患者に投与することもできる。たとえば、前記レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞を、分化誘導用培地で培養して、巨核球への分化を誘導することで、本発明による血液凝固異常の治療効率を高めることができる。通常、造血幹細胞は、巨核球（血小板前駆細胞）のみならず、赤血球や白血球への分化能も有している。そのため、単に造血幹細胞を生体に戻すだけでは、レンチウイルスベクター感染細胞は、巨核球のみならず、赤血球や白血球へも分化する可能性がある。【０１１０】
しかし本発明においては、血液凝固因子を血小板特異プロモーターの制御下に発現させるため、これらの血小板以外の血液細胞では、血液凝固因子が発現できない可能性がある。したがって、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞に占める巨核球に分化する細胞の割合を高めることが、本発明の治療効果の向上につながる。巨核球への分化を誘導することができる培養条件は公知である。【０１１１】
たとえば患者から採取された骨髄が、下記の組成のIMDMで２４時間程度培養される。培養後、レンチウイルスベクターを接触させ、更に１０時間〜２４時間経過後に細胞は洗浄され、患者に投与される。培養にはレトロネクチンは必須ではない。
IMDM 1% 血清アルブミン
200 micro-g/mL of transferrin（トランスフェリン）
10 micro-g/mL of insulin（インスリン）
100 ng/mL of SCF（幹細胞因子；stem cell factor）
10 ng/mL〜100 ng/mL of TPO（トロンボポエチン）
100 ng/mL of IL-6（インターロイキン−６）
100 ng/mL of Flt-3L（Flt-3リガンド）
400 ng/ml of sIL-6R（可溶性IL-6受容体）
上記組成中、血清アルブミンには、たとえば、脂肪酸除去ウシ血清アルブミン(fatty acid-free BSA)、あるいはウイルスフリーのヒト血清アルブミン製剤等を利用することができる。またTPOの添加量としては、具体的には、たとえば100 ng/mL を加えることができる(Mostoslavsky et al.Mol. Ther. 11, 932-940, 2005)。【０１１２】
本発明による血液凝固異常の治療方法に利用する要素を予め組み合わせて、治療用キットとして供給することもできる。すなわち本発明は、次の要素を含む、血液凝固異常の治療用キットに関する。
a: 血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、および
b: 造血幹細胞の採集試薬。【０１１３】
本発明の治療用キットにおいて、前記レンチウイルスベクターは、治療に必要な量を個別にパッケージすることができる。たとえば臍帯血移植の場合には、一般に生着に必要な造血幹細胞は2-3 × 107 cell/kgとされている。したがって、50 kgの体重の方を予測すると、計算上、1-1.5 × 109 個の細胞が必要である。MOI 10、Functional Titerが1 × 1010/mlと仮定すると、ウイルス液量は1-1.5 mlとなる。もしもMOI 30であれば、液量は単純にその３倍である。【０１１４】
あるいは公知の重症複合型免疫不全症の患者に対して、骨髄細胞からCD34陽性細胞を分離して、14-38 × 106/kgの細胞が投与されている (N Engl J Med. 2002 Apr 18;346(16):1185-93)。なおこの報告の条件では、投与された細胞中、遺伝子導入された細胞は5-20 × 106/kgである。同様の条件で本発明を実施する場合、おそよ2 × 107/kgの細胞の全てにレンチウイルスベクターを感染させてを50 kgのヒトに投与するとして、1 × 109 の細胞が必要となる。この処理に必要なウイルス液量は、MOI 10で1 mlである。したがって、本発明の治療用キットにおいて、レンチウイルスベクターは、MOI 10として、たとえば0.05〜50 mL、通常0.5〜20 mL、具体的には0.8〜10 mL、あるいは0.8〜2 mLの液量とすることができる。【０１１５】
更に本発明者らの知見によれば、本発明においては、レンチウイルスベクターは、投与される全ての細胞ではなく、半分程度の細胞に感染させることで、十分な治療効果を期待できる。したがって、レンチウイルスベクターの使用量は、更に少量とすることもできる。具体的には、MOIを１５程度として、同量のウイルス液量でキットを構成することができる。あるいは、感染させる細胞の数を、上記条件のたとえば半分程度としても、治療効果は期待できる。【０１１６】
一方、同じく本発明の治療用キットを構成する造血幹細胞の採集試薬とは、前記レンチウイルスベクターを感染させるべき、造血幹細胞を得るための試薬である。ヒトの造血幹細胞を単離するための方法は公知である。具体的には、たとえば、造血幹細胞を単離するための細胞マーカーに結合する抗体は、造血幹細胞を得るための試薬に含まれる。【０１１７】
本発明の治療キットは、付加的に造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地を含むことができる。既に述べたように、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞は、巨核球に分化する割合を高めることによって、本発明の治療効率を高めることができる。造血幹細胞を巨核球に誘導しうる培地は公知である。たとえば、以下のサイトカイン類などを含む培地は、骨髄細胞の分化誘導ための培養に有用である。
トランスフェリン；
インスリン；
幹細胞因子 （stem cell factor）；
トロンボポエチン；
インターロイキン−６；
Flt-3リガンド；および
可溶性インターロイキン−６受容体【０１１８】
あるいは、由来が異なる造血幹細胞（ドナー）の患者（レシピエント）への移植によって本発明に基づく治療方法を実施することもできる。すなわち、ドナーから採取された造血幹細胞に、レンチウイルスベクターを感染させる。そして得られた造血幹細胞が、必要に応じて培養した後に、血液凝固異常を有する患者に投与される。通常の条件では、造血幹細胞は、患者の免疫応答によって排除される可能性が高い。しかし、予めレシピエントを免疫抑制処置することによって、ある程度の造血幹細胞は生着することが明らかにされている。このように、骨髄組織の完全な破壊を伴わない移植方法は、ミニ移植などと呼ばれる。したがって、ドナーの造血幹細胞を用いても、本発明に基づいて血液凝固異常の治療方法を実施することができる。【０１１９】
ドナーの造血幹細胞を利用して本発明の治療方法を実施する場合、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞を血液凝固異常の治療剤として供給することもできる。すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞に関する。
あるいは本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞を有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤を提供する。更に本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞の、血液凝固異常の治療剤の製造における使用に関する。【０１２０】
更に、本発明においては、レンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞から分化した巨核球あるいは血小板を血液凝固異常の治療剤として供給することもできる。すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞から分化した、巨核球および血小板のいずれか、または両方を提供する。本発明において、これらの巨核球および血小板を、血液凝固因子導入細胞と記載する。
あるいは本発明は、前記血液凝固因子導入細胞を有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤を提供する。更に本発明は、前記血液凝固因子導入細胞の、血液凝固異常の治療剤の製造における使用に関する。【０１２１】
加えて本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを感染させた造血幹細胞と、当該造血幹細胞が血液凝固異常の治療に用いられることを記載した指示書を含む、血液凝固異常の治療用医薬パッケージに関する。同様に本発明は、前記血液凝固因子導入細胞と、当該血液凝固因子導入細胞が血液凝固異常の治療に用いられることを記載した指示書を含む、血液凝固異常の治療用医薬パッケージを提供する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。    
【実施例】
【０１２２】
＜材料および方法＞
（１）マウス
FVIII遺伝子のエクソン16の標的破壊のある血友病Aマウスは、H.H.Kazazian Jr.（ペンシルバニア大学、フィラデルフィア、PA、米国）から提供された（Bi, L., Lawler, A.M., Antonarakis, S.E., High, K.A., Gearhart, J.D., and Kazazian, H.H.Jr. (1995) Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nat. Genet. 10, 119-121）。C57BL/6（B6-Ly5.2）マウスは、日本SLC（静岡、日本）から購入した。Ly5遺伝子座（B6-Ly5.1）に遺伝子を導入したC57BL/6マウスは、Sankyo-Labサービス（筑波、日本）から購入した。動物管理は、自治医科大学における規格化された動物管理および関連委員会のガイドラインに従った（Madoiwa, S., Yamauchi, T., Hakamata, Y., Kobayashi, E., Arai, M., Sugo, T., Mimuro, J., and Sakata, Y. (2004) Induction of immune tolerance by neonatal intravenous injection of human factor VIII in murine hemophilia A. J. Thromb. Haemost. 2, 754-762）。【０１２３】
（２）サイトカインおよび抗体
組換えヒトトロンボポイエチン（TPO）および組換えヒト幹細胞因子（SCF）は、キリンビール社（群馬、日本）から提供された。以下の材料は示された供給元から入手した。
組換えヒトIL-6（IL-6）、組換えヒト可溶性IL-6受容体（sIL-6R）および組換えヒトFlt3-リガンド（Flt3-L）（PeproTech EC、ロンドン、英国）；
組換えヒトIL-3（IL-3）（TECHNE社、ミネアポリス、MN）；
抗マウスc-キットモノクローナル抗体（MoAb）（クローン2B8）、抗マウスSca-1 MoAb（クローンD7）、抗マウスLy5（CD45）MoAb（クローン30-F11）および抗マウスLy5.1（CD45.1）MoAb（クローンA20）（BD Pharmingen社、CA）；
抗マウスGPIbα MoAb（クローンXia.G5）（Emfret Analytics GmbH社、Wurzberg、ドイツ）；抗ヒトGPIIb/IIIa MoAb（クローン5B12）、抗ヒトGPIbαMoAb（クローンAN51）および抗ヒトCD34 MoAb（クローンBIRMA-K3）（DakoCytomation、Glostrup、デンマーク）。【０１２４】
（３）細胞培養
ヒト巨核芽球細胞株UT-7/TPOは、Norio Komatsu博士（山梨大学、山梨、日本）から提供された（Komatsu, N., Kunitama, M., Yamada, M., Hagiwara, T., Kato, T., Miyazaki, H., Eguchi, M., Yamamoto, M., and Miura, Y. (1996) Establishment and characterization of the thrombopoietin-dependent megakaryocytic cell line, UT-7/TPO. Blood 87, 4552-4560）。その細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および10ng/mLのTPOを補ったIscove's modified Dulvecco培地（IMDM）で培養した。
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）を入手し、前述されるように維持した（Hisano, N., Yatomi, Y., Satoh, K., Akimoto, S., Mitsumata, M., Fujino, M.A., and Ozaki, Y. (1999) Induction and suppression of endothelial cell apoptosis by sphingolipids: a possible in vitro model for cell-cell interactions between platelets and endothelial cells. Blood 93, 4293-4299）。【０１２５】
（４）巨核球分化
臍帯血由来のヒトCD34+細胞を、AutoMACS磁気細胞分類システム（Miltenyi Biotec.、Auburn、CA）を製造業者の指示に従って用いることにより単離した。単離されたCD34+細胞の純度は、90％を越えていた（データは示していない）。CD34+細胞を、50ng/mlのTPOおよび10ng/mlのIL-3を補った、1％の脱脂肪酸BSA、200μg/mlのヒト鉄飽和トランスフェリンおよび10μg/mlのヒト組換えインシュリンを含むIMDMで増殖させて巨核球に分化させた（Majka, M., Rozmyslowicz, T., Lee, B., Murphy, S.L., Pietrzkowski, Z., Gaulton, G.N., Silberstein, L., and Ratajczak, M.Z. (1999) Bone marrow CD34+ cells and megakaryoblasts secrete  -chemokines that block infection of hematopoietic cells by M-tropic R5 HIV. J. Clin. Invest. 104, 1739-1749）。14日間の培養の後に、細胞の75〜90％がGPIIb/IIIに対して陽性であった（図2C）。【０１２６】
（５）ルシフェラーゼリポータープラスミド、一過性トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイの構築
最大のプロモーター活性を有するとされる以下のDNAフラグメントを、ヒトゲノムDNAをテンプレートとして用いたPCRによって増幅した。
GPIIbプロモーター：-554〜＋28（Prandini, M.H., Uzan, G., Martin, F., Thevenon, D., and Marguerie, G. (1992) Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within the glycoprotein IIb promoter. J. Biol. Chem. 267, 10370-10374）；
GPIbαプロモーター：-254〜＋330（Hashimoto, Y., and Ware, J. (1995) Identification of essential GATA and Ets binding motifs within the promoter of the platelet glycoprotein Ib  gene. J. Biol. Chem. 270, 24532-24539）；および
GPVIプロモーター：-320〜＋28（Holmes, M.L., Bartle, N., Eisbacher, M., and Chong, B.H. (2002) Cloning and analysis of the thrombopoietin-induced megakaryocyte-specific glycoprotein VI promoter and its regulation by GATA-1, Fli-1, and Sp1. J. Biol. Chem. 277, 48333-48341）【０１２７】
PCR-Blunt-TOPO（Invitrogen社、Carlsbad、CA）にサブクローニングした後、フラグメントをpGL3-塩基性、プロモーターのないルシフェラーゼプラスミド（Promega社、マディソン、CA）に引き続いてクローンした。50万個の細胞（UT-7/TPOおよびCD34+由来巨核球）6ウェルプレートの各ウェルにあるIMDM（FBSまたは成長要因なし）の中に置き、DMRIE-C試薬（Invitrogen社）を用いた4μgのプラスミドDNAでトランスフェクトした。4時間後、2×成長因子を補った等量のIMDMを各ウェルに添加した。細胞を37℃で48時間インキュベートし、そしてルシフェラーゼ活性を製造会社の指示（ルシフェラーゼアッセイシステム、Promega社）に従ってアッセイした。【０１２８】
（６）SIVベクターの構築および生成
複製不能の自己不活性化されたSIVベクターを、前述のように構築した（Nakajima, T., Nakamaru, K., Ido, E., Terao, K., Hayami, M., and Hasegawa, M. (2000) Development of novel simian immunodeficiency virus vectors carrying a dual gene expression system. Hum. Gene. Ther. 11, 1863-1874）。全長のヒトFVIII（hFVIII）cDNAは、J.A.van Mourik博士（血液凝固作用、Sanquin、アムステルダム、オランダ）から提供された。そして、human B domain-deleted （BDD）FVIII（hBDD-FVIII）cDNAを前述されるようにPCRベースの突然変異誘発により作成した（Lind, P., Larsson, K., Spira, J., Sydow-Backman, M., Almstedt, A., Gray, E., and Sandberg, H. (1995) Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIII molecules. Construction and biochemical characterization. Eur. J. Biochem.232, 19-27）。【０１２９】
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターで駆動されるeGFP遺伝子（またはhFVIII遺伝子）をSIV由来ベクターのLTR含有エレメント（U3、R、U5）の間に挿入してSIV-pCMV-eGFP/hFVIIIとした。同様に、GPIbαプロモーターで駆動されるeGFP遺伝子（またはhFVIII遺伝子）をSIV由来ベクターのLTR含有エレメント（U3、R、U5）の間に挿入してSIV-pGPIbα-eGFP/hFVIIIとした（図2A）。【０１３０】
遺伝子導入プラスミドを、リポフェクトアミンプラス試薬（Invitrogen社）を使って293T細胞に、3つのパッケージプラスミド（gag-pol、rev、およびVSV-G envをコード）と共にトランスフェクトした。12時間後に、ウィルス粒子を回収するために培養培地を取り換えた。培養培地を48時間で回収し、ウィルス粒子を遠心分離により濃縮した。eGFPを有するSIVベクターの形質導入ユニットを293個の細胞の感染によって測定し、次いでFACS分析によってeGFP発現を測定した。SIV-CMV eGFPベクターの平均的な感染性は、2〜5×108TU/mlの範囲にあった。様々なプロモーターまたは標的遺伝子の間のウィルスの感染性を比較するために、ウィルス粒子力価をリアルタイム定量RT-PCRによって同時に測定した。QIAampウィルスRNAミニキット（QIAGEN社、バレンシア、CA）を使って、ウィルスRNAを単離し、その単離したRNAをSuperScript II（Invitrogen社）を使って逆転写させた。【０１３１】
ウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）配列由来のベクター特異的転写後調節因子の複製物をQuantiTectプローブPCRシステム（Qiagen社）を用いたリアルタイム定量PCRによって測定して、ベクター粒子を定量化した。WPREの配列をWPREフォワードプライマーである5'-GCTTTCATTTTCTCCTCCTT-3'（配列番号：１１）およびWPREリバースプライマーである5'-GGCCACAACTCCTCATAA-3'（配列番号：１２）により増幅した。FAM標識プローブ配列は、5'-ATCCTGGTTGCTGTCTC-3'（配列番号：１３）であった。【０１３２】
PCRは、95℃で15分間の最初のインキュベーションステップで開始した。熱サイクルは、94℃で15秒間、56℃で30秒間、そして76℃で30秒間の45サイクルとした。PCRのアニーリング段階の間に、特異プローブからのリポーター螢光シグナルをABI PRISM 7700シーケンスデテクターシステム（PE Applied Biosystems、Foster City、CA）で検出した。SIVベースベクターの平均ウイルス粒子力価は、1〜2×1010TU/mlの範囲にあった。SIVベクターの感染性（感染多重度：MOI）は、粒子力価のSIV-CMV-eGFPに対する比率から算定した。【０１３３】
SIVベクターによるUT-7/TPOおよびCD34+由来巨核球の形質導入のために、1×105個の細胞を8μg/mlのポリブレンを含む100μLの培養培地に再懸濁させた。24時間のテストで示された種々のMOIのSIVベクターで細胞を形質導入した。次いで、0.5％ BSAおよび2mMのEDTAを含む300μlのPBSの中で、細胞を再懸濁させ、そしてeGFP陽性細胞をFACS分析によって分析した。【０１３４】
（７）造血幹細胞単離およびウィルス形質導入
マウス大腿骨およびマウス脛骨から得られた骨髄細胞から、系統細胞除去キット（Miltenyi Biotec）を使った磁気分離によって系統細胞マーカー（B220、CD5、CD11b、Gr-1およびTer-119）を発現する細胞を除去した。次いで、Sca-1+およびc-kit+細胞（KSL）をFACS（FACSAria cell sorter、Becton Dickinson）で単離した。【０１３５】
新たに単離したKSL細胞をSIVベクターで直接感染させた場合、形質導入の後にPI陽性細胞（死んでいる細胞）が増え、形質導入の効率は減少した（データは示していない）。そこで、SIV形質導入および細胞生存能力を改善するKSL細胞の培養条件を調べた。単離したKSL細胞をIL-3、IL-6およびSCFと共に培養した場合、KSL細胞の中でのeGFP遺伝子のSIV形質導入は、より低い形質導入効率（25〜35％：30のMOI）およびPI陽性細胞のかなりの増加（20〜30％）をもたらした（データは示していない）。
一方、SCF、IL-6、sIL-6R、Flt-3LおよびTPOと一緒にKSL細胞を3〜7日間培養することによって、eGFPの高いレベルの発現が得られた（図３参照）。そしてeGFP形質導入の後のPI陽性細胞が際立って減少した（8〜12％）。そのため、KSL細胞は、ウィルス導入の前に以下の成分を補ったIMDM 1％の脱脂肪酸BSA、200μg/mlのトランスフェリン、および10μg/mlのインスリンでプレ培養した。
100ng/mlのSCF、
10ng/mlのTPO、
100ng/mlのIL-6、
100ng/mlのFlt-3L、および
400ng/mlのsIL-6R【０１３６】
50μg/mlのRetroNectin（TakaraBio社、東京、日本）で覆われたプレート中で細胞にSIVを感染させた。培養されたKSL細胞（1×105個の細胞または1×106個の細胞）を、10％ FBSを含む100μlまたは1mlのIMDMに再懸濁させた。前述の同じサイトカインの組み合わせの存在下での12時間の場合の種々のMOIで、細胞にSIVベクターを導入し、そして37℃においてインキュベートした。ポリブレン（最高4μg/ml）の使用は、マウスKSLおよびヒトCD34+細胞（データは示していない）の形質導入効率を際立って改善しなかったので、幹細胞形質導入においては、ポリブレンなしで行われた。次いで、幹細胞移植のために1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む100μlのPBSで細胞を再懸濁するか、あるいは細胞をFACS分析のために結果に示した日数の間インキュベートした。【０１３７】
（８）幹細胞移植
ドナー細胞とレシピエント細胞とを区別することを可能にするために、B6-Ly5.1から骨髄細胞を得た。レシピエントマウス（生後8〜12週間B6-Ly5.2）に9.5 Gyの単一の致死量の放射線照射を行なった（60Co、Gamma Cell；Nortion International、ON、カナダ）。SIV形質導入なしまたはSIV形質導入ありのB6-Ly5.1由来の10万個の培養KSL細胞を、競合細胞として5×105個の新たに単離したLy5.2非分画骨髄細胞とともに注射した。骨髄の再構成を評価するために、ヘパリンコートのマイクロピペットで眼窩静脈叢（retro-orbital sinus）から末梢血を取り出し、Ly5.1（ドナー由来）リンパ細胞および骨髄細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。本発明者らの移植手順では、Ly5.1細胞による移植は、移植後4カ月でのリンパ細胞および骨髄細胞において40〜55％であった。【０１３８】
（９）hFVIIIトランス遺伝子の転写の検出
hFVIIIトランス遺伝子の転写をRT-PCRによって検出した（Kikuchi, J., Mimuro, J., Ogata, K., Tabata, T., Ueda, Y., Ishiwata, A., Kimura, K., Takano, K., Madoiwa, S., Mizukami, H., Hanazono, Y., Kume, A., Hasegawa, M., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2004) Sustained transgene expression by human cord blood derived CD34+ cells transduced with simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vectors carrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice. J. Gene. Med. 6, 1049-1060）。RNA単離キット（RNeasy Protectキット；QIAGEN社）を使ってマウス器官からRNAを単離した。hFVIII（17）のための1対のプライマーを使ったRT-PCRおよびRT-PCRキット（スーパースクリプトワンステップRT-PCRシステム、Invitrogen社）にRNAサンプルを供した。マウスGAPDH mRNA（R&Dシステム社、ミネアポリス、MN）のためのプライマー対をコントロールRT-PCR実験で使用した。【０１３９】
SIVベクター由来のmRNA発現を、QuantiTectプローブRT-PCRシステム（Qiagen社）を使ったリアルタイム定量RT-PCRによって定量した。マウスGAPDH（mGAPDH）コントロール試薬（Qiagen社）を使って、分析されたRNAの量を見積もった。SIV遺伝子転移ベクターの連続希薄系列を分析することによって、標準曲線を確立した。組織から抽出した50ナノグラムの精製RNAをテンプレートとして使用した。各サンプルに対して、標準コントロール曲線と比較したWPRE配列の量を見積もり、そしてmGAPDH配列のコピー数でWPRE配列のコピー数を割ることによって、WPRE配列の量を決定した。【０１４０】
（１０）免疫組織化学
Cytospin3（Shandon、ThermoShandon社、PA）を使ってガラススライドに付着している骨髄細胞を、3％のパラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定し、次いで、0.2％のTriton X-100で浸透（permeabilized）させた。1％BSAでブロックした後に、試料をビオチンでコンジュゲートしたポリクローナル抗FVIII抗体と共に4℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、試料をPBSで洗浄し、次いでストレプトアビジンでコンジュゲートしたAlexa 594（Molecular Probes、ユージーン、OR）、およびFITC標識抗マウスGPIbαモノクローナル抗体と共にインキュベートした。免疫蛍光染色を観察し、付属カメラ付きの蛍光顕微鏡を使って写真を撮った。【０１４１】
マウス組織におけるhFVIII分子の免疫組織化学的な検出のために、4％のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）中で4℃において2時間脾臓を固定し、シュクロース（10〜30％）を含んだPBSと共にインキュベートし、次いでドライアイス/エタノール中のOCT化合物の存在下で凍結した。-25℃に凍結された組織から切片を調製し、ポリリシンコートのガラススライドに付着させた。hFVIIIの検出のために、1％ウサギ血清とTriton-X100（0.1％）を含むPBS中で組織切片をブロックし、ヒツジポリクローナル抗ヒトFVIII抗体（Cedarlane試験所、Homby、オンタリオ、カナダ）と共に4℃において16時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、ビオチンコンジュゲートウサギ抗ヒツジIgG抗体に続いてABC試薬（Vectastain ABC Elite kit；ベクター、Burlingame、CA）およびDABキット（ベクター）と共に切片をインキュベートした。【０１４２】
（１１）hFVIII抗原、中和抗体および表現型改変の測定
抗hFVIII特異的ELISAキット（Affinity Biological、Hamilton、ON、カナダ）によってhFVIII抗原を測定し、そしてヒト標準プール血漿中の測定値と比較した。血小板の活性を阻害するために30μlのクエン酸ナトリウムおよび1μMのPGI2を含んだシリンジを使って、270mlの全血を麻酔されたマウスの上大静脈から抜き出した。結果に示す時間に1μMのホルボールミリスチン酸アセテート（PMA）および50μg/mlのコラーゲンをその血液に添加し、血小板を活性化させた。遠心分離の後、FVIII抗原の分析まで血小板欠乏血漿を-80℃で凍結させた。マウスの中で誘導されたhFVIIIに対する中和抗体を、FVIII欠乏血漿および通常のプール血漿を用いるBethesda法によって分析した（Madoiwa, S., Yamauchi, T., Hakamata, Y., Kobayashi, E., Arai, M., Sugo, T., Mimuro, J., and Sakata, Y. (2004) Induction of immune tolerance by neonatal intravenous injection of human factor VIII in murine hemophilia A. J. Thromb. Haemost. 2, 754-762）。何匹かの移植マウスにおいて、ジエチルエーテルでマウスに麻酔をかけ、それらの尾1.5cmを切ることによって、表現型矯正を試験した。24時間後にマウスの生存を観察した。
実験に用いた血友病Aマウスの表現型は、血液凝固機能の欠損である。したがって、この表現型が矯正されなければ、尾を切断された個体はやがて失血によって死亡する。もしも生存率が改善されれば、形質導入された血小板の第VIII因子によって、血液凝固機能が補完されたことが確認できる。すなわち表現型の矯正が、尾を切断した血友病Aマウスの生存によって確認できる。【０１４３】
＜結果＞
［実施例１］血小板特異的プロモーターによって促進されたルシフェラーゼリポーター発現の比較
血小板において標的とされた遺伝子の効率的な発現を達成するために、本発明者らは最初に巨核球細胞内の3つの血小板特異的遺伝子、GPIIb、GPIbαおよびGPVIのプロモーター活性を比較した。図１Ａは、本研究で使われた血小板特異的プロモーターの模式図をそれら固有の調節因子と共に示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使って、種々のプロモーターの間でのプロモーター活性を比較した。本発明者らは、以前の研究で最も高い活性を持っていたプロモーターにおけるヌクレオチド領域を使った(Prandini, M.H., Uzan, G., Martin, F., Thevenon, D., and Marguerie, G. (1992) Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within the glycoprotein IIb promoter. J. Biol. Chem. 267, 10370-10374; Hashimoto, Y., and Ware, J. (1995) Identification of essential GATA and Ets binding motifs within the promoter of the platelet glycoprotein Ib  gene. J. Biol. Chem. 270, 24532-24539; Holmes, M.L., Bartle, N., Eisbacher, M., and Chong, B.H. (2002) Cloning and analysis of the thrombopoietin-induced megakaryocyte-specific glycoprotein VI promoter and its regulation by GATA-1, Fli-1, and Sp1. J. Biol. Chem. 277, 48333-48341)。【０１４４】
GPIbαプロモーターは、UT-7/TPO細胞、巨核芽球細胞株におけるルシフェラーゼの最も強力な発現を導く（図１Ｂ）。GPIbαプロモーターの相体効率は、CD34+由来巨核球においてさらに著しくなる（図１Ｃ）。報告されるところによれば、GPIbおよびGPVIは内皮細胞内で発現されるので（Konkle, B.A., Shapiro, S.S., Asch, A.S., and Nachman, R.L. (1990) Cytokine-enhanced expression of glycoprotein Ib  in human endothelium. J. Biol. Chem. 265, 19833-19838、Sun, B., Tao, L., Lin, S., Calingasan, N.Y., Li, J., Tandon, N.N., Yoshitake, M., and Kambayashi, J. (2003) Expression of glycoprotein VI in vascular endothelial cells. Platelets 14, 225-232）、本発明者らは、これらの血小板特異的プロモーター活性が内皮細胞で刺激されていたかどうかを調べた。【０１４５】
PAI-1プロモーター（Mimuro, J., Muramatsu, S., Hakamada, Y., Mori, K., Kikuchi, J., Urabe, M., Madoiwa, S., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2001) Recombinant adeno-associated virus vector-transduced vascular endothelial cells express the thrombomodulin transgene under the regulation of enhanced plasminogen activator inhibitor-1 promoter. Gene Ther. 8, 1690-1697）が効率的にルシフェラーゼ発現を導く条件下で、GPIIb、GPIbα、およびGPVIプロモーターは、HUVECにおいてルシフェラーゼ発現を導かなかった（図１Ｄ）。したがって、本発明者らはGPIbαを使うことに決め、本研究において標的遺伝子の直接の血小板特異的発現を方向付けた。【０１４６】
［実施例２］SIVベースベクターによる巨核球細胞の効率的な変換
本発明者らは、CMVプロモーター（SIV-pCMV-eGFP）またはGPIbαプロモーター（SIV-pGPIbα-eGFP）のいずれかの制御の下で、eGFP遺伝子を含む2つのSIVベースのレンチウイルスベクターを構築した。CMVプロモーター（pCMV）またはGPIbαプロモーター（pGPIbα）の下流に位置しているトランス遺伝子をSIV由来ベクターのLTRを含む因子（U3、R、U5）（図2A）の間に挿入した（図２Ａ）。形質導入細胞内で遺伝子発現を増やすために、ウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）由来の転写後制御因子を発現した遺伝子の下流に挿入した。【０１４７】
巨核球のeGFP遺伝子形質導入を調べるために、UT-7/TPOまたはCD34+由来の巨核球を、種々の濃度のSIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIbα-eGFPの存在下で24時間インキュベートした。両方の構築物は、UT-7/TPOまたはCD34+由来の巨核球（図２Ｂ）の中に効率的にeGFP遺伝子を形質導入した。それぞれ約1および3のMOIにおいてSIV-pCMV-eGFPおよびSIV-pGPIbで細胞をインキュベートしたとき、eGFPの最大半量の発現を達成した。一方、リポフェクションを使った形質導入は、eGFP遺伝子を8〜12％のみのUT-7/TPOまたはCD34+由来の巨核球の中に導入した（データは示していない）。【０１４８】
次に、本発明者らは、エクスビボでの巨核球分化が遺伝子発現に影響を与えるかどうか調べた。臍帯血由来のCD34+細胞がIL-3およびTPOによって巨核球に分化される条件の下で、細胞上でのGPIIbおよびGPIbの表面発現をフローサイトメトリーにより調べた。GPIbは0日目には発見されなかったのに対して、細胞の約18％がGPIIb（図２Ｄ）に対して陽性であった。さらに、前述（Lepage, A., Leboeuf, M., Cazenave, J.P., de la Salle, C., Lanza, F., and Uzan, G. (2000) The  IIb 3 integrin and GPIb-V-IX complex identify distinct stages in the maturation of CD34+ cord blood cells to megakaryocytes. Blood 96, 4169-4177）されるように、GPIb発現は、巨核球分化過程の後期に発現するように思われた（図２Ｄ）。CMVプロモーターによって促進されたeGFP発現は、巨核球分化によって影響を受けなかった（図２Ｅ）。一方、pGPIbαプロモーターの制御の下で、eGFP発現は、CD34+細胞（図２Ｄ）の巨核球分化の間に促進された。【０１４９】
［実施例３］SIVベクターを有するKSL細胞の効率的な形質導入の確立
CMVプロモーターによって促進されたeGFP遺伝子を含むSIVベクターを使うことによって、本発明者らは次にKSL細胞の形質導入プロトコルを最適化した。培養KSL細胞でのeGFPの形質導入効率は、60〜80％に達した（図３Ａ）。形質導入のプラトー値は、10〜30のMOIで観察した。ウィルスベクターとのインキュベーションの後の1日（24時間）で、形質導入遺伝子の高い発現を達成するのに十分であった。eGFP発現は、それから次第に低下した（図３Ｂ）。eGFP発現の減少は、細胞生存能力の減少のためである可能性もある。なぜなら、PI陽性細胞（死んでいる細胞）は、時間と共に増加したからである（データは示していない）。したがって、本発明者らは、30のMOIにおいてKSLを24時間培養し、そして次の実験においてレシピエントマウスの中にその細胞を移植した。【０１５０】
［実施例４］インビボでのGPIbαプロモーターを潜在的に有するSIVベクターを使った血小板での優先的なeGFP発現
CMVおよびGPIbαプロモーターの強度および特異性を比較するために、そしてインビボでのSIVベクターによるeGFP形質導入を評価するために、SIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIb-eGFPで形質導入したKSL細胞をレシピエントマウス（Ly5.2）に移植した。SIV-pCMV-eGFPまたはSIV-pGPIbα-eGFP（30のMOI）で形質導入した10万個の培養KSL細胞（Ly5.1）を5×105個の競合細胞（Ly5.2）と一緒に移植した。【０１５１】
SIV-pCMV-eGFPで形質導入したKSL細胞を移植した場合、eGFP発現が、末梢血中でCD45+細胞の35〜45％および血小板の7〜11％で観察された（図４Ａ、４Ｂ）。興味深いことに、GPIbαプロモーターを潜在的に有するSIVベクターの形質導入は、血小板（16〜27％）に効率的な遺伝子マーキングをもたらしたが、CD45+細胞ではそうではなかった（図４Ａ、４Ｂ）。本発明者らは、次にマクロファージ、顆粒球、Bリンパ球、Tリンパ球および赤芽球を識別するための特定のマーカーを使って、移植マウス由来の骨髄細胞を分析した。SIV-pCMV-eGFPで形質導入したKSL細胞を受容したマウスのこれらの系統細胞においてeGFPを発現させたのに対して、GPIbαプロモーターは、これらの系統細胞においてeGFP発現を促進せず、巨核球および血小板での活性の特異性を確かめた（図４Ｃ）。【０１５２】
［実施例５］SIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞を移植された血友病AマウスにおけるhFVIIIの発現および表現型修正
血小板依存性遺伝子療法がFVIIIの持続的な発現を可能にするかどうか決定するために、本発明者らは、CMV（SIV-pCMV-hFVIII）またはGPIbαプロモーター（SIV-pGPIbα-hFVIII）の制御の下でhBDD-FVIII cDNAを含む２つのSIVベクターを構築した。本発明者らは、1×105個の形質導入KSL細胞をマウスに移植し、次いで致命的なγ照射を行なった。最初に本発明者らは、移植の3カ月後において移植受容体の器官中のhFVIII遺伝子転写体の存在量を分析した。CMVプロモーターによって促進させられたhFVIII転写の分析により、hFVIII遺伝子が骨髄で主に発現し、より小さい程度で脾臓で発現したことを明らかにした（図５Ａ、パネル中）。興味深いことに、hFVIII mRNAは、SIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞の受容体において骨髄と共に大部分は脾臓で見いだされた（図５Ａ、パネル下）。【０１５３】
各器官でのmRNA発現レベルを定量化するために、ベクター特異的WPRE発現をリアルタイム定量RT-PCRにより測定した。RT-PCRからの結果に基づいて予期されたように、骨髄および脾臓は、SIVベクターで形質導入されたKSL細胞を移植されたマウスの主要な部位である（図５Ｂ）。hFVIII転写についてのデータに従って、hFVIII分子が、両方のタイプの形質導入マウスで骨髄と脾臓において免疫組織化学的に検出された（図６）。注目すべきは、GPIbαを発現している細胞は、SIV-pGPIbα-hFVIIIを形質導入されたマウスから得られた骨髄で同時にhFVIIIを発現していた（図６Ａ）。【０１５４】
最終的に、本発明者らは、SIV-pGPIbα-hFVIIIを使った血小板特異的遺伝子形質導入がFVIII欠損血友病Aマウスの表現型を矯正するかどうかを評価した。血小板活性があるまたは血小板活性がない血漿FVIII抗原レベルを、移植後30日または60日の移植FVIII欠損マウスで測定した。本発明者らは、移植マウスにおいてFVIII活性を検出し、そこではSIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞を移植されたマウスの血漿に1〜2％の矯正が注目された（図７Ａ）。血小板がコラーゲンおよびPMAで刺激された場合、血漿FVIIIレベルは2〜3.5％に高められる（図７Ａ）。尾切断の後の死亡率は形質導入マウスで際立って改善された（図７Ｂ）。さらに、異所的に発現したhFVIIIレベルは弱められなかった。また、移植後60日のSIV-pGPIbα-hFVIIIで形質導入されたKSL細胞を移植されたマウスにおいて、hFVIIIに対するインヒビターは検出されなかった（データは示していない）。【０１５５】
本発明において、インビボでの血小板特異的プロモーターを含むSIVレンチウイルスベクターを使って、血小板および巨核球への遺伝子形質導入を試みた。トランス遺伝子生成物の生産に血小板を用いることについては、トランスジェニックマウスでの試みがある（Kufrin, D., Eslin, D.E., Bdeir, K., Murciano, J.C., Kuo, A., Kowalska, M.A., Degen, J.L., Sachais, B.S., Cines, D.B., and Poncz, M. (2003) Antithrombotic thrombocytes: ectopic expression of urokinase-type plasminogen activator in platelets. Blood 102, 926-933; Yarovoi, H.V., Kufrin, D., Eslin, D.E., Thornton, M.A., Haberichter, S.L., Shi, Q., Zhu, H., Camire, R., Fakharzadeh, S.S., Kowalska, M. A., Wilcox, D.A., Sachais, B. S., Montgomery, R.R., and Poncz, M. (2003) Factor VIII ectopically expressed in platelets: efficacy in hemophilia A treatment. Blood 102, 4006-4013）。しかしながら、トランスジェニック動物の手法を治療に応用することはできない。本発明者らのシステムにおいて、SIVレンチウイルスベクターを有する造血幹細胞の形質導入は、血小板の約20％にトランス遺伝子の発現をもたらして、そして血友病Aマウスの表現型も矯正することができた。血小板への血液凝固因子遺伝子の形質導入によって、出血性障害の表現型を矯正できることが本発明によって初めて明らかにされた。【０１５６】
巨核球は、約10日から21日の有限の寿命を有する（Wilcox, D.A., and White II, G.C. (2003) Gene therapy for platelet disorders: studies with Glanzmann's thrombasthenia. J. Thromb. Haemost. 1, 2300-2311）。そのため、血小板内で標的タンパク質の長期の発現を確立するために、造血幹細胞は、遺伝子導入にとって巨核球よりいっそう実用的な標的である。レンチウイルスは、ある特定のタイプの静止細胞に感染することができるので、造血性細胞の形質導入へのレンチウイルス由来ベクターの応用に対しての大きな興味があった。
そして、実際にレンチウイルスベクターが効率的に造血幹細胞に形質導入することができることが示された（Woods, N.B., Ooka, A., and Karlsson, S. (2002) Development of gene therapy for hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Leukemia 16, 563-569）。本発明者らは、その潜在的な安全性から効率的な血小板標的遺伝子形質導入のためにSIVレンチウイルスシステムを使った。SIVレンチウイルスシステムは、SIVagmTYO1に由来し、そしてその自然の宿主および実験的に感染されたアジアのマカクザルに対して非病原性である（Nakajima, T., Nakamaru, K., Ido, E., Terao, K., Hayami, M., and Hasegawa, M. (2000) Development of novel simian immunodeficiency virus vectors carrying a dual gene expression system. Hum. Gene. Ther. 11, 1863-1874）。複製能力のあるウイルス粒子は、ベクターに感染した細胞において検出されない。HIVキャリア患者において複製能力のあるレンチウイルス粒子の出現は、HIVベースのベクターより際立って低い。したがって、SIVベクターは、安全性問題および遺伝子治療の臨床的応用に関して有利な点を有している。【０１５７】
大方の報告された研究は、巨核球特異的遺伝子形質導入および血小板特異的遺伝子形質導入のためにGPIIbプロモーターを使っていた。本発明者らは、この研究において血小板特異的プロモーターとしてGPIbαプロモーターを使った。なぜなら、GPIbαのプロモーター活性は、UT-7/TPOおよびCD34+由来の巨核球のプロモーター活性よりいっそう能力が高いからである。本発明者らがこの血小板特異的プロモーターを選択したもう1つの理由は、巨核球増生の遅い段階に働くということである。GPIIb遺伝子は血小板および巨核球において発現するが、巨核球増生については早い段階の遺伝子である（Lepage, A., Leboeuf, M., Cazenave, J.P., de la Salle, C., Lanza, F., and Uzan, G. (2000) The  IIb 3 integrin and GPIb-V-IX complex identify distinct stages in the maturation of CD34+ cord blood cells to megakaryocytes. Blood 96, 4169-4177）。【０１５８】
チミジンキナーゼ遺伝子がGPIIbプロモーターによって促進される条件付きのノックアウトマウスにおいて、ガンシクロビルの投与は血小板総数の劇的な減少を導いた（Tropel, P., Roullot, V., Vernet, M., Poujol, C., Pointu, H., Nurden, P., Marguerie, G., and Tronik-Le Roux, D. (1997) A 2.7-kb portion of the 5' flanking region of the murine glycoprotein  IIb gene is transcriptionally active in primitive hematopoietic progenitor cells. Blood 90, 2995-3004）。骨髄において、赤芽球前駆細胞および骨髄始原細胞もまた影響を受けていた。そして、そのことは、前駆細胞でのGPIIbの存在を示していた（Tropel, P., Roullot, V., Vernet, M., Poujol, C., Pointu, H., Nurden, P., Marguerie, G., and Tronik-Le Roux, D. (1997) A 2.7-kb portion of the 5' flanking region of the murine glycoprotein  IIb gene is transcriptionally active in primitive hematopoietic progenitor cells. Blood 90, 2995-3004）。【０１５９】
実際のところ、ヒトCD34+造血性幹細胞の18％はすでにGPIIbを発現しており、GPIbの出現は、GPIIbの出現と比較して著しく遅れている。そのことは、GPIbが巨核球成熟のより遅いマーカーであることを示している。したがって、GPIbαプロモーターを使った血小板は、GPIIbプロモーターを使った場合より、特異的で制限された遺伝子生成物の発現を可能とすることが見込まれた。【０１６０】
ここでのもう1つの重要な実験結果は、CMVプロモーターによって促進されるeGFP遺伝子が、インビボでCD45+細胞の形質導入効率が高いにもかかわらず、血小板で発現が際立って減少したことを示した。一般に、短縮されたタンパク質半減期によって起こされたトランス遺伝子の発現の減少は、最終分化した血液細胞においていっそう顕著であった（Wahlers, A., Schwieger, M., Li, Z., Meier-Tackmann, D., Lindemann, C., Eckert, H.G., von Laer, D., and Baum, C. (2001) Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Ther. 8, 477-486）。それは、分化の間にトランス遺伝子のダウンレギュレーションによって仲介され得る。コード化されたタンパク質の安定性は、分化細胞においてRNAプロセシングに影響を与えているプロモーターまたはシス要素の選択と少なくとも同じぐらいトランス遺伝子の発現について関係している（Wahlers, A., Schwieger, M., Li, Z., Meier-Tackmann, D., Lindemann, C., Eckert, H.G., von Laer, D., and Baum, C. (2001) Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Ther. 8, 477-486）。この状況において、後期の巨核球分化を促進するGPIbαプロモーターの使用は、最終分化した無核血小板の遺伝子形質導入にとって重要であり得る。【０１６１】
血小板依存性遺伝子形質導入の本発明者らの戦略は、遺伝性血小板障害（Glanzmann血小板無力症（thromboasthemia）およびBernard-Sourlier症候群）だけではなく、他の出血性障害に対しても可能性を持っている。血友病Aは、FVIII遺伝子の欠陥によって起こされるX染色体に関係する出血性障害であり、1：5000の割合の男性が罹患している（Hoyer, L. W. (1994) Hemophilia A. N. Engl. J. Med. 330, 38-47）。血友病は、遺伝子治療に適していると考えられている。なぜなら、その疾患は1つの遺伝子異常によって起こされ、そして治療の凝固因子レベルが広い範囲（5％〜100％）にわたって変化し得るからである（Hoyer, L. W. (1994) Hemophilia A. N. Engl. J. Med. 330, 38-47）。【０１６２】
FVIIIの持続的な治療的な発現は、さまざまな組織を標的とした広い範囲の遺伝子転送技術を使ったプレ臨床研究で達成された（Lozier, J. (2004) Gene therapy of the hemophilias. Semin. Hematol. 41, 287-296）。しかし、中和抗体の発生は臨床的応用をしばしば制限し（High, K. (2005) Gene transfer for hemophilia: can therapeutic efficacy in large animals be safely translated to patients? J. Thromb. Haemost. 3, 1682-1691）、造血幹細胞の標的化も例外ではない。造血幹細胞へのレンチウイルスFVIII遺伝子形質導入によって、治療のレベルのFVIIIを生産することができる（Kikuchi, J., Mimuro, J., Ogata, K., Tabata, T., Ueda, Y., Ishiwata, A., Kimura, K., Takano, K., Madoiwa, S., Mizukami, H., Hanazono, Y., Kume, A., Hasegawa, M., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2004) Sustained transgene expression by human cord blood derived CD34+ cells transduced with simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vectors carrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice. J. Gene. Med. 6, 1049-1060，Kootstra, N.A., Matsumura, R., and Verma, I.M. (2003) Efficient production of human FVIII in hemophilic mice using lentiviral vectors. Mol. Ther. 7, 623-631）。しかしこれまでの方法では、FVIIIに対する中和抗体が誘導され、FVIII活性レベルの減少の原因となっていた（Kootstra, N.A., Matsumura, R., and Verma, I.M. (2003) Efficient production of human FVIII in hemophilic mice using lentiviral vectors. Mol. Ther. 7, 623-631）。【０１６３】
血小板を利用した血友病Aのための遺伝子治療は、臨床応用における優位性を持つ。なぜなら、抗原提示細胞におけるFVIIIの発現を妨げることによって、血小板特異的システムの使用がインヒビター（中和抗体）の誘導を防止できるからである。さらに、血友病A患者の10〜30％は、血液凝固因子の投与に起因するインヒビターを持っている。そのため、凝固作用が低下し大出血に結びつく恐れがある。このようなインヒビターを有する患者の治療においても、血友病Aの血小板依存性遺伝子治療は有用である。なぜなら、血小板に保持された血液凝固因子は、血流中でインヒビターから保護される。そして、血栓形成部位においてそれらを放出し、血液凝固を活性化することができる。【０１６４】
GPIIbプロモーターの制御の下でGPIIIa cDNAを含むHIVレンチウイルスベクターを使うことによって、GPIIIa欠損マウスにおけるGPIIb/IIIaの治療の発現が報告された（Fang, J., Hodivala-Dilke, K., Johnson, B.D., Du, L.M., Hynes, R.O., White II, G.C., Wilcox, D.A. (2005) Therapeutic expression of the platelet-specific integrin,  IIb 3, in a murine model for Glanzmann thrombasthenia. Blood (in press)）。その研究は、幹細胞移植および遺伝子形質導入のためのソースとして骨髄細胞の不均一集団を使っていた。【０１６５】
本発明者らは、GPIbαプロモーターを有するSIVベクターによってKSLマウスの造血性細胞の効率的な形質導入および血友病Aマウスの表現型矯正を実証した。初期のKSL細胞は、ほとんど均一な集団であり、そして単一のKSL細胞は、しばしば致命的な放射線照射されたマウスの長期の多系統（multilineage）移植を与えることができる（Nakauchi, H., Sudo, K., and Ema, H. (2001) Quantitative assessment of the stem cell self-renewal capacity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 938, 18-24）。初期の造血幹細胞を標的化することは、より安全なアプローチであると思われる。なぜなら、再構成のために必要とした形質導入細胞の数は、不均一の骨髄集団を使うときに必要とされる数よりずっと低いからである。【０１６６】
レトロウイルスベクター形質導入された骨髄細胞を移植された、複合型免疫不全症を持っている2人の子供における白血病の進行は、染色体DNAの中にプロウイルス配列を組み込むリスクについて新たな懸念を生じさせた（Hacein-Bey-Abina, S., von Kalle, C., Schmidt, M., Le Deist, F., Wulffraat, N., McIntyre, E., Radford, I., Villeval, J.L., Fraser, C.C., Cavazzana-Calvo, M., and Fischer, A. (2003) A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med. 348, 255-256）。挿入突然変異のリスクを減らす1つの理論的な方法は、遺伝的に改変された細胞の合計の数を最小にする導入プロトコルを採用することであろう（Mostoslavsky, G., Kotton, D.N., Fabian, A.J., Gray, J.T., Lee, J.S., and Mulligan, R.C. (2005) Efficiency of transduction of highly purified murine hematopoietic stem cells by lentiviral and oncoretroviral vectors under conditions of minimal in vitro manipulation. Mol. Ther. 11, 932-940）。この点に関して、SIVレンチウイルスシステムで形質導入されたKSL細胞を使った本発明者らの手順は、臨床的応用において血小板特異的遺伝子改変のための実用的なアプローチである。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明は、血液凝固因子の量的な、あるいは活性の異常に起因する血液凝固異常の治療に有用である。より具体的には、本発明に基づいて、血液凝固因子の発現レベルや活性の低下を原因とする血液凝固異常を治療することができる。本発明によって治療が可能な疾患として次のような血液凝固異常性疾患を示すことができる。カッコ内に各疾患の治療に有用な血液凝固因子の名称を記載した。すなわち、下記のような血液凝固因子をコードする遺伝子を本発明に応用することによって、それぞれ次のような血液凝固異常疾患を治療することができる。【０１６８】
血友病Ａ（第VIII因子、第VIIa因子）
血友病Ｂ（第IX因子）
フォン・ヴィルブランド病（フォン・ヴィルブランド因子）
第I因子欠乏症、無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症（第I因子）
第II因子欠乏症（プロトロンビン）
第V因子欠乏症、パラ血友病（第V因子）
第VII因子欠乏症（第VII因子）
第X因子欠乏症（第X因子）
第XI因子欠乏症（第XI因子）
第XIII因子欠乏症（第XIII因子）【０１６９】
これらの血液凝固異常性疾患のうち、特に血友病Ａや血友病Ｂは、強い出血傾向を伴う場合があり、患者数も多い重要な疾患である。血友病に本発明を応用することによって、少ない治療回数で高い治療効果を達成することができる。すなわち、血友病患者の日常生活に対して制約の少ない治療方法を実現できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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