(57)【要約】トランスグルタミナーゼ含有物に夾雑するプロテアーゼを、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなく低減することができる処理方法、プロテアーゼを含有するトランスグルタミナーゼ含有物を温度０℃以上５０℃未満、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満、１０分以上６０時間以下保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法、該処理方法に従って得られるトランスグルタミナーゼ含有物、該トランスグルタミナーゼ含有物を配合したトランスグルタミナーゼ製剤、および該トランスグルタミナーゼ製剤を添加した食品の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼが夾雑するトランスグルタミナーゼ含有物を温度０℃以上５０℃未満、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満で、１０分以上６０時間以下保持することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
【請求項２】
前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性を０．０００２４以下となるまで保持することからなる請求項１記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
【請求項３】
前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる請求項１又は２に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
【請求項５】
請求項４に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
【請求項６】
請求項４に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
【請求項７】
請求項４に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び／又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
【請求項８】
請求項４に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。
【請求項１０】
請求項４に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び／又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
【請求項１１】
請求項４、５、８のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、プロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物とその製造方法に関する。特に本発明は、トランスグルタミナーゼ含有物に夾雑するプロテアーゼ活性の低減方法に関する。また、プロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグルタミナーゼ製剤、およびトランスグルタミナーゼ製剤を用いた食品の製造方法に関する。
【背景技術】  トランスグルタミナーゼは、タンパク質含有素材の物性を改質する酵素物質として知られており、タンパク含有素材に直接添加してその物性を改質したり、トランスグルタミナーゼをタンパク質含有素材、特にゼラチンや乳タンパク質の溶液と混合し、接着剤組成物として各種素材に使用されている。ところが、入手可能なトランスグルタミナーゼ含有物、特に微生物由来のトランスグルタミナーゼ含有物を用いて製造したトランスグルタミナーゼ製剤は、他の酵素製剤同様、そのロット間で品質にばらつきがあった。
トランスグルタミナーゼ製剤のタンパク質含有素材に対する効果がロット間でばらつきがある主な理由は、トランスグルタミナーゼ含有物のトランスグルタミナーゼ活性のばらつきに起因するものと考えられてきたが、トランスグルタミナーゼ活性を制御してもなお品質にばらつきが残り、事業上の大きな課題であった。
トランスグルタミナーゼはタンパク質分子を架橋重合する機能を有するのに対し、プロテアーゼはタンパク質を分解する機能を有している。プロテアーゼは、トランスグルタミナーゼのタンパク質に対する機能とは逆の機能を有しているため、トランスグルタミナーゼ含有物中にプロテアーゼが夾雑することは、トランスグルタミナーゼ含有物及びそれを原料として配合したトランスグルタミナーゼ製剤として好ましくないと考えられる。しかしながら、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活又は除去する効率的な方法は知られていない。
そのためトランスグルタミナーゼ製剤の品質を確保するためには、試作試験によってプロテアーゼ活性の低いトランスグルタミナーゼ含有物を選定することや、混在しているプロテアーゼ活性に応じて、トランスグルタミナーゼ含有物の配合率を高くするなどの対策が必要であった。これらの対策は、人的および原材料のコスト上昇を招き、トランスグルタミナーゼ製剤の製造コストを大きく押し上げていた。
このためトランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、トランスグルタミナーゼ含有物に含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させる技術が切望されていた。
一般に、トランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼ活性を制御する方法としては、トランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼの活性を選択的に失活させるか、トランスグルタミナーゼ含有物から選択的に除去する処理を施すことが考えられる。特に、インヒビターやその他の化学的処理により、プロテアーゼを働かないようにするのが基本的な回避策である。
特定の酵素である耐塩性グルタミナーゼに関して、プロテアーゼ活性を選択的に失活させる方法として、ｐＨ９．８、３７℃、１６時間処理することによりプロテアーゼ、α―アミラーゼ等の夾雜酵素活性を除く方法が知られている（特許文献１）。
しかしながら、当該酵素は、アルカリ性で極めて安定であることが知られていたのに対し、トランスグルタミナーゼにおいて同様のアルカリ処理をすることによって、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれるプロテアーゼ活性のみを選択的に失活できるかどうかは知られていなかった。
また、プロテアーゼ活性の低減方法に関連するものとしては、ラクターゼ中のプロテアーゼをγ線照射によって失活させる方法が知られている（特許文献２）。しかし、この放射線処理がトランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼ活性の選択的な失活手段として適用できるかどうか、また、この処理によるトランスグルタミナーゼのプロテアーゼ活性低下程度がタンパク質含有素材への効果と密接に相関するかどうかは不明であるし、放射線を使用する処理手段である点でも商業的な価値は低い。
【特許文献１】特開平１１−４２０８６号公報
【特許文献２】特開昭５１−７６４５９号公報
【発明の開示】
本発明は、トランスグルタミナーゼ含有物に混在するプロテアーゼを、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなく低減することができる処理方法を提供することを目的とするものである。
本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を配合した、トランスグルタミナーゼ製剤を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を配合した、トランスグルタミナーゼ製剤を用いた食品の製造方法を提供することを目的とするものである。
なお、本発明において特に限定のない限り、ＴＧはトランスグルタミナーゼの略語を意味する。
本発明は、以下の各発明を包含する。
（１）プロテアーゼが夾雑するトランスグルタミナーゼ含有物を温度０℃以上５０℃未満、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満で、１０分以上６０時間以下保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（２）前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性を０．０００２４以下となるまで保持することからなる（１）項記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（３）前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる（１）項又は（２）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（４）（１）項〜（３）項のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
（５）（４）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
（６）（４）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
（７）（４）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び／又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
（８）（４）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤。
（９）（４）項〜（７）項のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。
（１０）（４）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び／又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
（１１）（４）項、（５）項、（８）項のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。
（１２）プロテアーゼが夾雑するトランスグルタミナーゼ含有物を温度５〜５０℃、ｐＨ９．５〜１３．０で１０分〜６０時間保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（１３）前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性を０．０００２４以下となるまで保持することからなる（１２）項記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（１４）前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる（１２）項又は（１３）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
（１５）（１２）項〜（１４）項のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
（１６）（１５）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
（１７）（１５）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び／又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
（１８）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を魚肉すり身に添加することからなる魚肉すり身製品の製造方法。
（１９）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を畜肉及び／又は家禽肉のひき肉に添加することからなるひき肉製品の製造方法。
（２０）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を植物蛋白に添加することからなる植物蛋白含有食品の製造方法。
（２１）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を魚卵蛋白に添加することからなる魚卵製品の製造方法。
（２２）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を鶏卵製品に添加することからなる鶏卵食品の製造方法。
（２３）（１６）項又は（１７）項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を、タンパク質含有素材の接着剤として用いることからなる接着成型食品の製造方法。
（２４）（１５）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び／又は乳蛋白とを混合した溶液を、タンパク質含有素材に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
（２５）（１５）項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することからなる食肉単身品の製造方法。
本発明の処理方法を適用することによって得られるトランスグルタミナーゼ含有物は、そのプロテアーゼ活性が極めて低い水準に低減されており、製剤の品質を確保するための、試作試験によるトランスグルタミナーゼ含有物の選別や、配合率を高めに設定するなどの対策を行う必要がなく、高品質のトランスグルタミナーゼ含有物及びトランスグルタミナーゼ製剤を低コストで製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、試料液の処理ｐＨを変化させた場合の試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。
図２は、特定処理ｐＨにおいて処理時間を変化させた場合の試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。
図３は、特定処理ｐＨにおいて処理温度を変化させた場合の試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。
図４は、特定処理ｐＨにおいて高いプロテアーゼ活性を有するトランスグルタミナーゼ含有物を処理したときと、処理しないときの接着力比較を示す図である。
図５は、特定処理ｐＨにおいて高いプロテアーゼ活性を有するトランスグルタミナーゼ含有物をｐＨ１１で保持したときと、保持しないときの蒲鉾物性値の比較を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明の実施の形態について説明する。
トランスグルタミナーゼ含有物中にプロテアーゼが夾雑することは知られていたが、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させることは困難であった。
本発明者らは、トランスグルタミナーゼ含有物中に夾雑するプロテアーゼ活性の低減方法について鋭意検討した結果、前記処理方法を開発し、この処理方法で製造したプロテアーゼ活性の低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を使用することにより、高品質なトランスグルタミナーゼ製剤を低コストで製造することを可能ならしめたものである。
本発明におけるプロテアーゼとは、タンパク質を分解する酵素であり、その由来は、トランスグルタミナーゼ含有物を製造する際に、原料から移行するプロテアーゼか、もしくは微生物が分泌するプロテアーゼである。
本発明におけるトランスグルタミナーゼとは、アシル基転移反応を触媒するトランスフェラーゼの一種である。
本発明に用いるトランスグルタミナーゼとしては、組織由来、微生物由来の双方ともに利用できるが、微生物由来トランスグルタミナーゼは安価に入手できる点で好ましい。また、本発明に用いるトランスグルタミナーゼはＣａ依存性及びＣａ非依存性のどちらでも使用できるが、Ｃａ非依存性トランスグルタミナーゼの方が、その効果が添加対象におけるＣａ濃度に依存しない点で好ましい。
本発明におけるトランスグルタミナーゼ含有物とは、トランスグルタミナーゼを含む生体組織もしくは微生物の培養液から得られ、必要に応じて濾過や精製工程を経た液体、またはそれらを乾燥させた粉末を指す。トランスグルタミナーゼ活性を一定に揃えたり、その酵素活性を安定化させるために、賦形剤や安定化剤が混合されることもある。
また、本発明におけるトランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、目的に応じて選択された副剤とを混合したものを指す。
ここで、副剤としては、タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等が用いられる。
トランスグルタミナーゼ含有物又はトランスグルタミナーゼ製剤の添加対象である、本発明におけるタンパク質含有素材とは、トランスグルタミナーゼの基質となるグルタミン残基を含むタンパク質を含む素材であり、可食、不可食を問わない。可食性のタンパク質含有素材としては、その由来は植物性タンパク質、動物性タンパク質、微生物タンパク質、藻類タンパク質、などが挙げられ、植物性タンパク質としては、大豆たん白、小麦たん白、えんどう豆たん白などが、動物性タンパク質としては、畜肉、家禽肉、魚肉、鶏卵、乳及びこれらの単離精製物、魚卵、血漿たん白、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられる。
塩類としては、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、焼成カルシウム、リン酸３ナトリウム、炭酸ナトリウム等が使いやすい。糖類としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができる。賦形剤としては、前記の糖類が使用され、特に味への影響が小さいデキストリン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。
本発明において、トランスグルタミナーゼ含有物の処理条件は、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満の領域が好ましく、ｐＨ９．５以上ｐＨ１２．５以下がより好ましく、さらに好ましくはｐＨ１０．５以上ｐＨ１２．５以下である。また、ｐＨ９．５〜１３の領域であってもよい。処理時の温度条件及び処理時間は、トランスグルタミナーゼが失活しない温度及び処理時間であれば特に制限はなく、一般的には０℃以上５０℃未満、好ましくは１０℃以上４０℃以下の温度、１０分以上６０時間以下、好ましくは１０分以上１８時間以下の処理時間が採用される。また、０℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜４０℃の温度であってもよい。
本発明において、前記トランスグルタミナーゼ含有物の処理は、プロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性の比を０．０００２４以下とする処理が好ましく、さらに好ましくは０．０００１７以下とする処理である。経験的にみて、実用的な最低限の接着強度が５０ｇ、更に好ましくは１００ｇとされており、上記活性比は、上記接着強度に対応する。
また、前記処理は、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程における、発酵液からトランスグルタミナーゼを単離する工程における処理として行うことができる。また、一度粉末化したトランスグルタミナーゼ含有物を再度溶媒に溶解した溶液を処理しても、同様の効果が得られる。さらには、トランスグルタミナーゼ含有物と目的に応じて選択された副剤（タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等）とが混合された溶液を処理しても同様の効果が得られる。
本発明でいう接着用トランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材を粉粉混合したもの、もしくは両者を別々に包装してセットとして供給できるようにしたものを指す。前者は粉末のまま、もしくは水を加えて水溶液として被接着物にまぶすか、塗布するか、被接着物と混合して用いられ、後者は両者を直前に粉粉混合して前者と同様に用いるか、水にトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材を投入して溶解し、これを被接着物に塗布するか、被接着物と混合して用いられる。また、流通に耐え得る十分な保存安定性が得られるのであれば、製剤の形態は粉末に限らず、液体製剤として供給することもできる。
接着製剤において配合されるタンパク質含有素材の由来としては、前述のタンパク質含有素材から選択することができる。特にカゼインを主体とする乳たん白、水溶性が高いゼラチン、フィブリンを主体とする血漿たん白は接着製剤の副剤として優れている。ゼラチンの中では、魚ゼラチンが特に望ましい。ゼラチンを副剤とする接着用トランスグルタミナーゼ製剤は、接着力が非常に高い反面、プロテアーゼの影響を比較的受けやすいため、本発明の適用によりその品質は格段に向上する。
本発明でいう水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤とを使用することを特徴とする製剤をさす。
カルシウム塩としては、カルシウムを含む塩であればよく、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、焼成カルシウム、卵殻カルシウム、貝カルシウムなどが挙げられる。アルカリ性塩類としては、魚肉すり身のｐＨを上昇させうるものであればよく、リン酸３ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウムなどが使いやすい。水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤に配合されるタンパク質含有素材としては、カゼインナトリウム、カゼインカリウム、大豆蛋白、小麦蛋白などが挙げられる。賦形剤としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができ、特に味への影響が小さいデキストリン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。
本発明のトランスグルタミナーゼ含有物またはトランスグルタミナーゼ製剤は、接着成型食品や水産練製品に使用することができ、魚肉すり身、畜肉や家禽肉のひき肉、ゼラチン、植物蛋白、魚卵、鶏卵製品等に添加することができる。また、トランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することによって食肉単身品の製造に使用することができる。
本発明でいう接着成型食品とは、食品原材料を接着してなる食品を指す。ここでいう食品原材料とは、牛肉、豚肉、馬肉、羊肉、山羊肉、家禽肉、鶏肉などいわゆる食肉ばかりでなく、各種魚肉、貝類、エビ、カニなどの甲殻類、イカ、タコなどの軟体動物、いくら、スジコ、タラコ、カズノコなどの魚卵類なども利用できる。また、野菜、果実などもこの食品原材料に含まれる。もちろん、これ以外の原料も使用可能であり、また２種類以上の原材料を組み合わせて使用してもかまわない。
本発明においては、プロテアーゼ活性の単位を以下のとおり定義する。
「１分間に１ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に相当する非たん白性のＬｏｗｒｙ試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１ユニット（１Ｕ）とする。」
なお、プロテアーゼ活性は、測定条件によって変化するため、同一の測定条件によって測定された値のみ直接比較することができる。
本発明におけるトランスグルタミナーゼの活性単位は、次のように測定され、かつ、定義される。すなわち「温度３７℃でｐＨ６．０のトリス緩衝液中、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系でＴＧａｓｅを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させた後、５２５ｎｍにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量線により求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量を１ユニット（１Ｕ）とする。」（日本特許公開公報−昭６４−２７４７１号参照）。
【実施例】  以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
（トランスグルタミナーゼの処理方法）
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕１ｇを蒸留水２０ｇに溶解した水溶液０．４ｇを、ｐＨ３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２に調製した０．１Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ  １．６ｇに混合した。各水溶液を２０℃、３０分保持したものを試料液とした。
（トランスグルタミナーゼ活性測定）
上述の条件にて調製した試料液にｐＨ６．０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕として０．２％になるように希釈した。その後、３７℃でベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグルタミナーゼ含有物を作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体にする。次に、反応系の５２５ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したヒドロキサム酸量を検量線により求める。そして、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量をトランスグルタミナーゼの活性単位、即ち１ユニット（１Ｕ）とする。
（プロテアーゼ活性測定）
上述の条件にて調製した試料液に、２％ＫＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  りん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕として０．５％になるように希釈した。スターラーで６０分間攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間、２０℃）し、その上澄を孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過する（用時調製）。
ジメチルカゼイン〔ＳＩＧＭＡ  Ｃ９８０１、Ｃａｓｅｉｎ，Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ〕２．５ｇを正確に量りとり５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌを加え、常温で約３０分以上攪拌して溶解する（用時調製）。
アルカリ性銅試液  ２％Ｎａ２ＣＯ３  ｉｎ  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ：２％酒石酸ナトリウム溶液：１％硫酸銅５水和物  を５０：１：１で混合する。（用時調製）
２倍希釈フェノール試液（和光純薬製フェノール試薬）と蒸留水を体積比１：１で混合する。（用時調製）
サンプル：ジメチルカゼイン溶液を５℃±０．５℃に設定した恒温槽中（温度を標準温度計で確認する）で冷却しておく。試験管に試料溶液０．４ｍＬを量り取り、恒温槽中で約１０分間以上静置した後、ジメチルカゼイン溶液２ｍＬを加え、直ちに振り混ぜ、５℃±０．５℃で正確に２４時間静置する。反応停止時間に、順次５％トリクロロ酢酸を２ｍｌ加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。３７℃±０．５℃に設定した恒温槽中に入れて３０〜４５分間静置し、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間２０℃）し、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収する。
ブランク：ジメチルカゼイン溶液２ｍＬを試験管に加えて５℃±０．５℃で２４時間静置する。５％トリクロロ酢酸を２ｍｌ加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。各試料溶液０．４ｍＬを加えて、直ちに攪拌する。３７℃±０．５℃に設定した恒温槽中に入れて３０〜４５分間静置し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間、２０℃）し、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収する。
試験管にろ液０．４ｍＬを量り取り、アルカリ性銅試液２ｍＬを加えて振り混ぜ、室温で１０分間放置する。次に、水で２倍に希釈したフェノール試薬（和光純薬製）０．２ｍＬを加えて直ちに攪拌する。続いて、３７℃±０．５℃に設定した恒温槽中に入れて３０分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長７００ｎｍにおける吸光度（サンプルの吸光度をＡ１、ブランクの吸光度をＡ２とする）を測定する。
市販の標準用精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ  濃度既知）に対し、蒸留水による２倍希釈（１→２）を繰り返し、２倍、４倍、８倍希釈溶液を調製する（例：ＢＳＡ溶液の濃度が１．２ｍｇ／ｍｌの場合、希釈溶液の濃度はそれぞれ  ０．６，  ０．３，  ０．１５ｍｇ／ｍｌとなる）。試験管に希釈したＢＳＡ溶液０．４ｍＬを量り取り、アルカリ性銅試液２ｍＬを加えて振り混ぜ、室温で１０分間放置する。次に、水で２倍に希釈したフェノール試薬０．２ｍＬを加えて直ちに攪拌する。続いて、３７℃±０．５℃に設定した恒温槽中に入れて３０分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長７００ｎｍにおける吸光度（Ｓ１）を測定する。別に、ＢＳＡ溶液の代わりに蒸留水を用い、同様に操作して、吸光度（Ｓ０）を測定する。各標準蛋白質溶液の濃度、及び各Ｓ１からＳ０を差し引いた吸光度差を用い、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」により散布図を作成し、多項式近似・次数２として近似曲線を作成し、数式を求める。Ａ１及びＡ２の吸光度からＳ０を差し引いた値を数式に代入して、それぞれの蛋白質濃度（ＰＡ１，ＰＡ２）を算出する。
１分間に１ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に相当する非たん白性のＬｏｗｒｙ試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とし、次式により算出する。
プロテアーゼ活性（Ｕ／ｇ）＝（ＰＡ１−ＰＡ２）×４．４÷０．４÷Ｔ×Ｖ÷Ｗ
上記式中、
ＰＡ１              酵素反応溶液の蛋白質濃度（ｍｇＢＳＡ／ｍｌ）
ＰＡ２              ブランクの蛋白質濃度（ｍｇＢＳＡ／ｍｌ）
４．４÷０．４      反応停止後の総液量への換算係数
Ｔ                  反応時間（分）
Ｖ                  粉末試料溶解体積（ｍｌ）
Ｗ                  粉末試料採取量（ｇ）
を表す。
各条件で処理した試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性について、ｐＨ処理を行わなかった活性値を１００％としたときの相対活性を図１にまとめた。
ｐＨ３〜９までは、トランスグルタミナーゼ相対活性値とプロテアーゼ相対活性値（ｐＨ処理する前のトランスグルタミナーゼ活性を１００％としたときの相対活性）は、ほぼ同等であり、すなわち当該ｐＨ領域で保持してもトランスグルタミナーゼ活性を低下させずに、プロテアーゼ活性を低減させることはできないことが明らかとなった（図１）。一方ｐＨ９より高い条件にて保持した場合、トランスグルタミナーゼ相対活性値よりプロテアーゼ相対活性値の方が、低くなることが明らかとなった。さらには、ｐＨ１３以上になるとトランスグルタミナーゼ活性は急激に低下することも確認された。以上より、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満の条件で、トランスグルタミナーゼ溶液を保持することにより、トランスグルタミナーゼ活性を低減させずに、プロテアーゼ活性を低減することができ、より高品質のトランスグルタミナーゼを製造可能であることが確認された。
実施例２
（トランスグルタミナーゼの処理方法）
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕１ｇを蒸留水２０ｇに溶解した水溶液０．４ｇを、ｐＨ９，１０，１１，１２に調製した０．１Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ１．６ｇに混合した。各水溶液を２０℃、３０分〜６時間保持したものを試料液とした。
（トランスグルタミナーゼ活性測定方法）
実施例１記載の方法に準じ、測定した。
（プロテアーゼ活性測定方法）
実施例１記載の方法に準じ、測定した。
実施例１の結果と同様に、ｐＨ９で６時間保持してもトランスグルタミナーゼ相対活性値とプロテアーゼ相対活性値に差は認められなかったのに対し、ｐＨ９より高い条件で保持した場合では、トランスグルタミナーゼ相対活性値よりプロテアーゼ相対活性値の方が低いことが確認された（図２）。さらには、ｐＨ１１以上で３０分以上処理することにより、トランスグルタミナーゼ相対活性を８０％以上に保ったまま、プロテアーゼ相対活性を２０％以下に低減することが可能であることが確認された。さらに、ｐＨ１２以上３０分以上処理することにより、トランスグルタミナーゼ相対活性を８０％以上に保ったまま、プロテアーゼ相対活性を１０％以下に低減することが可能であることが認められた。
実施例３
（トランスグルタミナーゼの処理方法）
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕１ｇを蒸留水２０ｇに溶解した水溶液０．４ｇを、ｐＨ１１に調製した０．１Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ１．６ｇに混合した。調製した水溶液を１０、２０、３０、４０、５０℃で３０分保持したものを試料液とした。
（トランスグルタミナーゼ活性測定方法）
実施例１記載の方法に準じ、測定した。
（プロテアーゼ活性測定方法）
実施例１記載の方法に準じ、測定した。
各温度帯でトランスグルタミナーゼ水溶液を保持することにより、プロテアーゼ活性を低下させることができることが確認された（図３）。ただし、５０℃で保持した場合には、トランスグルタミナーゼ活性の低下も顕著であることから、５０℃未満で保持条件により、トランスグルタミナーゼ活性を維持したまま、プロテアーゼ活性を低減させることができることが確認された。
実施例４
プロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性が０．０００２４より大きい試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕０．１８ｇ、魚コラーゲン〔Ｋｅｎｎｙ＆Ｒｏｓｓ  Ｌｔｄ．製〕１．２ｇを、水１２ｇに溶解し、トランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液とした。
調製したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液を豚もも肉の小片（約２ｃｍ角）３００ｇを添加し混合後、無水リン酸３ナトリウム０．３ｇ添加し、さらに混合し折り幅７５ｍｍのケーシングチューブに詰めた。
別試験区として、上述のとおり調製したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン溶液に無水リン酸３ナトリウム０．３ｇを添加混合し、ｐＨ１１の水溶液を調製した。このｐＨ１１水溶液にて２５℃で、３０分および２時間保持した後、それぞれの水溶液を豚もも肉の小片（約２ｃｍ角）３００ｇへ添加し、混合後折り幅７５ｍｍのケーシングチューブに詰めた。
上述のとおりケーシングチューブに詰めたトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を５℃２時間放置し、トランスグルタミナーゼ反応を進行させた。放置後、−４０℃の冷凍庫に入れ、評価するまで冷凍保存した。冷凍したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を厚さ９ｍｍ、幅２．５ｃｍにスライスし、解凍後、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製テクスチャーアナライザーで引っ張り試験により接着強度を測定した。
実用的な最低限の接着強度は経験的に５０ｇ／ｃｍ２とされている。結果より、ｐＨ１１で処理を行わなかったトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液を使用した場合の接着強度は実用的な最低限の接着強度５０ｇ／ｃｍ２以下であった（図４）。一方、同じ試料トランスグルタミナーゼを用いｐＨ１１水溶液で３０分、２時間処理した場合、実用強度５０ｇ／ｃｍ２以上の接着強度が得られることが確認された。実用強度が得られなかった試料トランスグルタミナーゼ中のプロテアーゼ活性が、ｐＨ１１水溶液で保持することで、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなく低減され、実用強度が得られたと考えられる。
実施例５
プロテアーゼ活性／トランスグルタミナーゼ活性が０．０００２４より大きい試料トランスグルタミナーゼ（高プロテアーゼＴＧ）と、０．０００２４以下の試料トランスグルタミナーゼ（低プロテアーゼＴＧ）〔商品名「アクティバＴＧ」、味の素（株）社製〕それぞれ０．３３６ｇを１％食塩水４０ｍｌに添加溶解させた。トランスグルタミナーゼ水溶液に、１％リン酸三ナトリウム水溶液５ｍｌを添加しｐＨ１１に調製し、２５℃３０分、保持した。その後０．４％フマル酸水溶液５ｍｌを添加しｐＨ７に中和したものをｐＨ１１処理トランスグルタミナーゼ含有物とした。一方、１％リン酸三ナトリウム水溶液５ｍｌと０．４％フマル酸水溶液５ｍｌをあらかじめ混合した水溶液をトランスグルタミナーゼ水溶液に添加混合したものをコントロールとし、以上処理を行ったトランスグルタミナーゼ含有物を用いて、下記に示す手順に従い蒲鉾を試作した。
フレークにした冷凍すり身（すけそうだら、ＦＡ級）１０００ｇをステファンカッターで、温度が−２〜０℃になるまでカッティングする。食塩３０ｇを添加し、氷水３５０ｇを加え、ステファンカッターで温度が７〜８℃になるまでカッティングする。グラニュー糖２０ｇ、馬鈴薯澱粉４０ｇ、氷水３５０ｇ、水産練製品用製剤２ｇを加え、温度が７〜８℃になるまでカッティングする。得られた生地を、直径３０ｍｍの筒状の塩化ビニリデン製ケーシングに詰め、４０℃の蒸気中で３０分、続いて８５℃の蒸気中で２０分加熱し、氷水に浸して冷却する。
テクスチャーアナライザーを用い、破断試験を行う。円柱形の蒲鉾を高さ３０ｍｍに切断し、直径５ｍｍの球形のプランジャーを蒲鉾の断面中央に対して１ｍｍ／秒の速さで突刺し、破断した時点の応力（破断応力）を測定する。蒲鉾の破断応力と、試料トランスグルタミナーゼ原末の各条件のプロテアーゼ活性について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製ソフト「Ｅｘｃｅｌ」を用いて相関係数を求める。
経験的に蒲鉾の破断強度を比較する場合、強度の差が５％以上あれば食感上の差異が認められる。結果を図５に示す。図５より低プロテアーゼＴＧの蒲鉾破断応力を１００％（５１１．０ｇ）としたときの高プロテアーゼＴＧ蒲鉾破断応力は９０．８％（４６４．２ｇ）であり、食感上の差異が認められる。
一方、高プロテアーゼＴＧをｐＨ１１で３０分保持した場合には、蒲鉾破断応力は９９．６％（５０９．１ｇ）となり、食感上差異が認められない強度になることが確認された。高プロテアーゼ活性のトランスグルタミナーゼ含有物を、ｐＨ１１水溶液で保持することで、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなくプロテアーゼ活性が低減され、低プロテアーゼ活性のトランスグルタミナーゼ含有物と同等の効果が得られたと考えられる。
【産業上の利用可能性】  以上に詳述したとおり、本発明の方法によれば、トランスグルタミナーゼ活性を低減させずに、選択的にプロテアーゼ活性を低減することができるので、より高品質のトランスグルタミナーゼ製剤を製造することが可能である。トランスグルタミナーゼの基質となるグルタミン残基を有するタンパク質を含む各種素材の品質改善のための添加剤、特に接着製剤用、水産練製品製剤用の成分として有用な高品質のトランスグルタミナーゼ含有物を安価に提供することができるので、上記タンパク質含有素材の利用分野を食品分野以外の分野にも拡大せしめるものである。
本出願は日本国で出願された特許出願番号２００５−２４８７７１を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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