(57)【要約】  本発明のプローブ固定化用担体の製造方法は、（ａ）表面に水酸基を有する固相基体と、プローブと結合可能なリンカー部位を有するリンカー用有機シラン化合物の一種又は二種以上とを反応させ、前記水酸基の酸素原子に前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子を結合させることにより、前記リンカー用有機シラン化合物をリンカーとして前記固相基体の表面に保持する工程と、（ｂ）前記（ａ）工程後の前記固相基体の表面に残存する水酸基をキャッピング剤で保護する工程と、を含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面に水酸基を有する固相基体と、プローブと結合可能なリンカー部位を有するリンカー用有機シラン化合物の一種又は二種以上とを反応させ、前記水酸基の酸素原子に前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子を結合させることにより、前記リンカー用有機シラン化合物をリンカーとして前記固相基体の表面に保持する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程後の前記固相基体の表面に残存する水酸基をキャッピング剤で保護する工程と、
を含むプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項２】
前記（ｂ）工程では、前記キャッピング剤として前記リンカー部位を有さないキャッピング用有機シラン化合物の一種又は二種以上を使用し、前記（ａ）工程後の前記固相基体の表面に残存する水酸基の酸素原子に前記キャッピング用有機シラン化合物のケイ素原子を結合させる、
請求項１に記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項３】
（ａ）表面に水酸基を有する固相基体に対して、プローブと結合可能なリンカー部位を有するリンカー用有機シラン化合物の一種又は二種以上を、前記水酸基の酸素原子と前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子との結合を介して導入する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程後の前記固相基体に対して、前記リンカーの前記リンカー部位との水素結合による相互作用及び／又は静電的相互作用が水酸基よりも小さくなるような官能基を有する一種又は二種以上のキャッピング用有機シラン化合物を、前記水酸基の酸素原子と前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子との結合を介して導入する工程と、
を含むプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項４】
前記キャッピング用有機シラン化合物は、ケイ素原子上にアルキル基のほかアルコキシ基又はハロゲン基を有する化合物である、請求項２又は３に記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項５】
前記キャッピング用有機シラン化合物は、以下の式（１）で表される一種又は二種以上の化合物である、請求項２〜４のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
ＳｉＸmＲn  …（１）
（式（１）において、ｍ及びｎはそれぞれ１以上の整数であり、ｍ＋ｎは４であり、Ｘは、臭素、塩素、ヨウ素などのハロゲン原子又はアルコキシ基であり、ｍが２以上のときにはＸは同一であっても異なっていてもよく、Ｒは、炭化水素基であり、ｎが２以上のときにはＲは同一であっても異なっていてもよい。）
【請求項６】
前記キャッピング用有機シラン化合物は、以下の式（２）〜（８）からなる群より選ばれる一種又は二種以上の化合物である、請求項２〜４のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
2007069608.tif 000010
【請求項７】
前記リンカー用有機シラン化合物は、ケイ素原子上にアルコキシ基と前記リンカー部位を末端に有する基とを有している、請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項８】
前記リンカー用有機シラン化合物は、前記リンカー部位として、アミノ基、チオール基、エステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基からなる群より選ばれる一種又は二種以上の基を有している、請求項１〜７のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項９】
前記固相基体は、ガラス製、プラスチック製又はシリコン製である、請求項１〜１０のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法によって製造されたプローブ固体化用担体に、前記リンカー部位を利用してプローブを導入することによりＤＮＡアレイを得る、ＤＮＡアレイの製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡアレイに対して、前記プローブと相互作用する標的化合物を含む被験試料を供給することにより、前記プローブによって前記標的化合物を検出するか、あるいは、前記プローブによって前記標的化合物を捕獲して前記プローブと前記標的化合物との相互作用によって変化する又は発生するシグナルを検出する工程を有する、
標的化合物の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法によって製造されたプローブ固定化用担体。
【請求項１３】
固相基体と、
プローブと結合可能なリンカー部位を有し前記固相基体の表面上の酸素原子にケイ素原子が結合することにより前記固相基体の表面に保持されている一種又は二種以上のリンカーと、
前記固相基体の表面上の酸素原子のうち前記リンカーが結合していないものを保護するキャップと、
を備えるプローブ固定化用担体。
【請求項１４】
固相基体と、
前記固相基体の表面に保持されプローブと結合可能なリンカー部位を有する一種又は二種以上のリンカーと、
炭化水素系官能基を有し酸素原子−ケイ素原子結合を介して前記固相基体の表面に保持される一種又は二種以上のキャップと、
を備えるプローブ固定化用担体。
【請求項１５】
前記キャップは、前記リンカーの前記リンカー部位との水素結合による相互作用又は静電的相互作用が、前記リンカー部位と水酸基との水素結合による相互作用又は静電的相互作用よりも小さい官能基を有する、請求項１４にプローブ固定化用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ固定化用担体の製造方法、ＤＮＡアレイの製造方法及びプローブ固定化用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡアレイに関する種々の技術が開発されている。例えば、非特許文献１には、固相基体の表面にＤＮＡプローブを固定化する方法が記載されている。この非特許文献１には、固相基体の表面にＤＮＡプローブを固定化するにあたり、ガラスやシリカなどの固相基体の表面処理を行うこと、その表面処理剤としてアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有する各種シランカップリング剤を用いることなどが記載されている。
【非特許文献１】君塚房夫，加藤郁之進著，「蛋白質  核酸  酵素」Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１３（１９８８），ｐ５２−５９
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、各種シランカップリング剤で固相基体の表面処理を行ったとしても、固相基体の表面に存在するすべての水酸基がシランカップリング剤と結合するわけではなく一部の水酸基が残存するため、その残存する水酸基によって幾つかの問題が生じる。例えば、固相基体上に残存する水酸基は水分存在下で強酸となるため、長期保存したあとにはその強酸がシランカップリング剤と固相基体との間を切断してしまうことがある。この場合、ＤＮＡプローブと蛍光物質で標識されたターゲットとのハイブリダイゼーションを行ったとしても十分な蛍光強度が得られないという問題が生じる。また、残存する水酸基はシランカップリング剤のアミノ基等と化学結合することによりその反応性を低下させると考えられる。シランカップリング剤のアミノ基等の反応性が低下すると、十分な量のＤＮＡプローブを固相基体に保持させることができないため、やはりＤＮＡプローブと蛍光物質で標識されたターゲットとのハイブリダイゼーションを行ったとしても十分な蛍光強度が得られないという問題が生じる。なお、本明細書では、このようなシランカップリング剤をリンカーといい、シランカップリング剤が有するアミノ基等をリンカー部位ということにする。
【０００４】
本発明のプローブ固定化用担体及びその製造方法は、核酸などのプローブと結合するリンカーを安定して固相基体上に保持させることを目的の一つとする。また、固相基体上のリンカーが効率よくプローブと結合できるようにすることを目的の一つとする。
【０００５】
本発明は、上述した目的の少なくとも一つを解決するために以下の手段を採用した。
【０００６】
本発明の第１のプローブ固定化用担体の製造方法は、
（ａ）表面に水酸基を有する固相基体と、プローブと結合可能なリンカー部位を有するリンカー用有機シラン化合物の一種又は二種以上とを反応させ、前記水酸基の酸素原子に前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子を結合させることにより、前記リンカー用有機シラン化合物をリンカーとして前記固相基体の表面に保持する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程後の前記固相基体の表面に残存する水酸基をキャッピング剤で保護する工程と、
を含むものである。
【０００７】
このプローブ固定化用担体の製造方法によれば、固相基体の表面に水酸基が残存する可能性が低くなるため、残存する水酸基により固相基体上の水酸基とリンカーとの結合が切断されたり、固相基体に保持されたリンカー部位がプローブと反応しにくくなったりすることが低減される。したがって、得られたプローブ固定化用担体とプローブとを反応する際に、十分な量のプローブをプローブ固定化用担体に保持させることができる。ここで、前記（ｂ）工程では、前記キャッピング剤として前記リンカー部位を有さないキャッピング用有機シラン化合物の一種又は二種以上を使用し、前記（ａ）工程後の前記固相基体の表面に残存する水酸基の酸素原子に前記キャッピング用有機シラン化合物のケイ素原子を結合させてもよい。
【０００８】
この製造方法のスキームの一例を図１に示す。また、この製造方法によって得られるプローブ固定化用担体の一例を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。キャッピング剤はキャップとして固相基体上の水酸基を保護する。また、キャップは、図３に示すモノマー状キャップでもよく、図４に示すポリマー状キャップでもよく、両者が混在していてもよい。更に、リンカーは、図５に示すように、複数種類が混在していてもよい。
【０００９】
本発明の第２のプローブ固定化用担体の製造方法は、
（ａ）表面に水酸基を有する固相基体に対して、プローブと結合可能なリンカー部位を有するリンカー用有機シラン化合物の一種又は二種以上を、前記水酸基の酸素原子と前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子との結合を介して導入する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程後の前記固相基体に対して、前記リンカーの前記リンカー部位との水素結合による相互作用及び／又は静電的相互作用が水酸基よりも小さくなるような官能基を有する一種又は二種以上のキャッピング用有機シラン化合物を、前記水酸基の酸素原子と前記リンカー用有機シラン化合物のケイ素原子との結合を介して導入する工程と、
を含むものである。
【００１０】
このプローブ固定化用担体の製造方法によれば、固相基体の表面に水酸基が残存する可能性が低くなるため、残存する水酸基により固相基体上の水酸基とリンカーとの結合が切断されたり、固相基体に保持されたリンカー部位がプローブと反応しにくくなったりすることが低減される。したがって、得られたプローブ固定化用担体とプローブとを反応する際に、十分な量のプローブをプローブ固定化用担体に保持させることができる。
【００１１】
本発明のプローブ固定化用担体の製造方法において、前記キャッピング用有機シラン化合物は、ケイ素原子上にアルキル基のほかアルコキシ基又はハロゲン基を有する化合物としてもよい。こうすれば、キャッピング用有機シラン化合物のアルコキシ基又はハロゲン基が脱離して該シラン化合物のケイ素原子と固相基体の酸素原子とが容易に結合する。このようなキャッピング用有機シラン化合物としては、特に限定されるものではないが、たとえば式（１）で表される一種又は二種以上の化合物としてもよい。Ｘがアルコキシ基のときには、そのアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基及びｎ−プロポキシ基（好ましくは、メトキシ基及びエトキシ基）から選択される１種又は２種以上であってもよい。Ｒは、炭化水素基であり、炭素数１〜２０（好ましくは１〜８）の直鎖状又は分枝状のアルキル基が好ましく、直鎖状であることがより好ましい。このような炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクタデシル基などが挙げられる。より具体的には、式（２）〜（８）からなる群より選ばれる一種又は二種以上の化合物としてもよい。
[化１]
ＳｉＸmＲn  …（１）
（式（１）において、ｍ及びｎはそれぞれ１以上の整数であり、ｍ＋ｎは４であり、Ｘは、臭素、塩素、ヨウ素などのハロゲン原子又はアルコキシ基であり、ｍが２以上のときにはＸは同一であっても異なっていてもよく、Ｒは、炭化水素基であり、ｎが２以上のときにはＲは同一であっても異なっていてもよい。）
[化２]
2007069608.tif 000002
【００１２】
本発明のプローブ固定化用担体の製造方法において、前記リンカー用有機シラン化合物は、ケイ素原子上にアルコキシ基と前記リンカー部位を末端に有する基とを有していてもよい。あるいは、前記リンカー用有機シラン化合物は、前記リンカー部位として、アミノ基、チオール基、エステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基からなる群より選ばれる一種又は二種以上の基を有していてもよい。また、前記固相基体は、ガラス製、プラスチック製又はシリコン製としてもよい。なお、固相基体の表面に水酸基を有していない場合には、固相基体の材質に応じて処理を施すことにより表面に水酸基を生成させる。
【００１３】
ここで、リンカーの一例を図６に示す。図６はモノマー状の有機シラン部位を有するリンカーであり、２種類のものが固相基体上の酸素原子に結合しているが、１種類のリンカーだけを結合させてもよいし、３種類以上のリンカーを結合させてもよい。なお、リンカーは、リンカー部位を末端に有する炭素数１〜１０の直鎖状の炭化水素鎖としてもよい。リンカーの別の例を図７に示す。図７は有機シロキサン部位（又は有機ポリシロキサン部位）を有するリンカーである。
【００１４】
本発明のＤＮＡアレイの製造方法は、上述したいずれかのプローブ固定化用担体の製造方法によって製造されたプローブ固体化用担体に、前記リンカー部位を利用してプローブを導入することによりＤＮＡアレイを得るものである。こうすれば、十分な量のプローブが保持されたＤＮＡアレイを得ることができるため、たとえばプローブと蛍光物質で標識された標的化合物とのハイブリダイゼーションを行ったときに十分な蛍光強度が得られる。
【００１５】
ここで、ＤＮＡアレイの一例を図８（ａ）及び（ｂ）に示す。図８（ａ）は有機シロキサン部位又は有機ポリシロキサン部位を有するリンカーを用いた場合の一例であり、図８（ｂ）は有機シロキサン部位又は有機ポリシロキサン部位を有するリンカーとモノマー状の有機シラン部位を有するリンカーを混合して用いた場合の一例である。
【００１６】
本発明の標的化合物の検出方法は、上述したＤＮＡアレイに対して、前記プローブと相互作用する標的化合物を含む被験試料を供給することにより、前記プローブによって前記標的化合物を検出するか、あるいは、前記プローブによって前記標的化合物を捕獲して前記プローブと前記標的化合物との相互作用によって変化する又は発生するシグナルを検出する工程を有するものである。こうすれば、十分な量のプローブが保持されたＤＮＡアレイを用いることから、高感度で標的化合物又はシグナルを検出することができる。
【００１７】
本発明の第１のプローブ固定化用担体は、上述したいずれかに記載のプローブ固定化用担体の製造方法によって製造されたものである。本発明の第２のプローブ固定化用担体は、固相基体と、プローブと結合可能なリンカー部位を有し前記固相基体の表面上の酸素原子にケイ素原子が結合することにより前記固相基体の表面に保持されている一種又は二種以上のリンカーと、前記固相基体の表面上の酸素原子のうち前記リンカーが結合していないものを保護するキャップと、を備えるものである。本発明の第３のプローブ固定化用担体は、固相基体と、前記固相基体の表面に保持されプローブと結合可能なリンカー部位を有する一種又は二種以上のリンカーと、炭化水素系官能基を有し酸素原子−ケイ素原子結合を介して前記固相基体の表面に保持される一種又は二種以上のキャップと、を備えるものである。本発明の第１〜第３のいずれのプローブ固定化用担体によっても、プローブと反応することにより、十分な量のプローブを保持することができる。ここで、前記キャップは、前記リンカーの前記リンカー部位との水素結合による相互作用又は静電的相互作用が、前記リンカー部位と水酸基との水素結合による相互作用又は静電的相互作用よりも小さい官能基を有することが好ましい。こうすれば、残存する水酸基がリンカー部位と化学結合してプローブとの反応を妨げるのを有効に防止できる。
【００１８】
なお、本発明において、前記リンカー用有機シラン化合物及び前記キャッピング用有機シラン化合物は、それぞれ、一個以上三個以下の加水分解性基Ｘ（たとえばハロゲン原子又はアルコキシ基など）を有することができる。また、これらの有機シラン化合物は、それぞれ、加水分解性基Ｘを一個有するもの、加水分解性基Ｘを二個有するもの及び加水分解性基Ｘを三個有するもののいずれかで構成されていてもよいが、これらの加水分解性基Ｘの数が異なる二種類以上を組み合わせられていてもよい。また、加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と加水分解性基を２個以上有する有機シラン化合物とを組み合わせてもよい。例えば，加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物とを組み合わせて用いてもよいし、同一個有する有機シラン化合物と同二個有する有機シラン化合物とを用いてもよいし、同二個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物を用いてもよいし、同一個、二個及び三個有する有機シラン化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
本発明と関連する発明として、以下の構成を採用してもよい。
【００２０】
（１）上述した本発明のプローブ固定化用担体の製造方法において、前記（ａ）工程は、前記リンカー用有機シラン化合物として、前記リンカー部位を有し、一個の加水分解性基Ｘを有する第一のリンカー用有機シラン化合物と、前記リンカー部位を有し、二個以上の加水分解性基Ｘを有する第二のリンカー用有機シラン化合物と、を用いてもよい。この製造方法で用いる第一及び第二のリンカー用有機シラン化合物の一例を図９に示す。
【００２１】
（２）前記（１）に記載の製造方法において、前記（ａ）工程は、前記第一のリンカー用有機シラン化合物とともに前記第二のリンカー用有機シラン化合物を供給するか又はいずれか一方を先に供給する工程としてもよい。
【００２２】
（３）前記（１）又は（２）に記載の製造方法において、前記（ａ）工程は、前記第二のリンカー用有機シラン化合物の使用量（モル数）を前記第一のリンカー用有機シラン化合物の使用量（モル数）よりも多くしてもよい。
【００２３】
（４）上述した本発明のプローブ固定化用担体の製造方法又は前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法において、前記（ａ）工程は、有機溶媒を主体とする媒体（好ましくは有機溶媒    のみである）中で前記リンカー用有機シラン化合物と前記固相基体とを接触させる工程としてもよい。
【００２４】
（５）前記（４）に記載の製造方法において、有機溶媒は、トルエン、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ＴＨＦ及びクロロホルムから選択される１種又は２種以上としてもよい。
【００２５】
（６）上述した本発明のプローブ固定化用担体の製造方法又は前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法において、前記（ｂ）工程は、有機溶媒を主体とする媒体（好ましくは有機溶媒のみであり、好ましくは、トルエン、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ＴＨＦ及びクロロホルムから選択される１種又は２種以上である）中で前記有機シラン化合物と前記固相基体とを接触させる工程としてもよい。
【００２６】
（７）上述した本発明のプローブ固定化用担体の製造方法又は前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法において、前記（ｂ）工程は、前記キャッピング用有機シラン化合物として、前記リンカーの前記リンカー部位との水素結合による相互作用又は静電的相互作用が、前記リンカー部位と水酸基との水素結合による相互作用又は静電的相互作用よりも小さい官能基を有し、一個の加水分解性基Ｘを有する第一のキャッピング用有機シラン化合物と、前記官能基を有し、二個以上（好ましくは三個）の加水分解性基Ｘを有する第二のキャッピング用有機シラン化合物と、を用いてもよい。
【００２７】
（８）プローブ固定化用担体の製造方法は、水酸基を表面に有する固相基体に対して、プローブなどと結合可能なリンカー部位を有し、一個の加水分解性基を有する第一のリンカー用有機シラン化合物と、前記リンカー部位を有し、二個以上の加水分解性基を有する有機シラン化合物と縮重合可能な第二のリンカー用有機シラン化合物と、を供給して、該第一及び第二の有機シラン化合物を酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に導入する工程、を備えるものとしてもよい。さらに、前記第一のリンカー用有機シラン化合物のリンカー部位及び／又は前記第二のリンカー用有機シラン化合物のリンカー部位との水素結合による相互作用及び／又は静電的相互作用が水酸基よりも小さくなるような官能基を有するキャッピング用有機シラン化合物を前記固相基体の表面に導入する工程と、を備えるものとしてもよい。
【００２８】
（９）プローブ固定化用担体の製造方法は、プローブなどと結合可能なリンカー部位を有し、一個の加水分解性基を有する第一のリンカー用有機シラン化合物と、前記リンカー部位を有し、二個以上の加水分解性基を有する有機シラン化合物と縮重合可能な第二のリンカー用有機シラン化合物と、を供給して、該第一及び第二の有機シラン化合物を酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に導入する工程と、前記有機シラン化合物の導入後に、前記リンカー部位を利用してプローブを導入する工程と、を備えるものとしてもよい。この製造方法の一例を図１０に示す。この製造方法は、さらに、前記第一のリンカー用有機シラン化合物のリンカー部位及び／又は前記第二のリンカー用有機シラン化合物のリンカー部位との水素結合による相互作用及び／又は静電的相互作用が水酸基よりも小さくなるような官能基を有するキャッピング用有機シラン化合物を前記固相基体の表面に導入する工程を備えていてもよい。
【００２９】
（１０）上述した本発明の標的化合物の検出方法において、前記プローブは、天然の又は非天然の塩基を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、前記相互作用は、ヌクレオチドを構成する塩基間の水素結合に基づくハイブリダイゼーションであってもよい。
【００３０】
（１１）上述した本発明のプローブ固定化用担体において、前記リンカーにおける前記リンカー部位は、アミノ基及びチオール基から選択される一種若しくは二種以上又はエステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基から選択される一種又は二種以上の官能基を有していてもよい。あるいは、前記キャップは、前記官能基として立体障害を有するアルキル基を有していてもよい。あるいは、前記キャップは、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に保持されるモノマー状の有機シラン部位を有していてもよい。あるいは、前記キャップは、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に結合している有機シロキサン部位又は有機ポリシロキサン部位（ポリマー状の有機シラン部位ともいう。）を有していてもよい。あるいは、前記キャップは、少なくとも、前記官能基を有し一個以上三個以下の加水分解性基Ｘを有するキャッピング用有機シラン化合物の一種又は二種以上を前記固相基体の表面で縮重合させて得られるものであってもよい。なお、キャッピング用有機シラン化合物は、加水分解性基Ｘを一個有するもの、加水分解性基Ｘを二個有するもの及び加水分解性基Ｘを三個有するもののいずれかで構成されていてもよいが、これらの加水分解性基Ｘの数が異なる二種類以上を組み合わせられていてもよい。また、加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と加水分解性基を２個以上有する有機シラン化合物とを組み合わせてもよい。例えば，加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物とを組み合わせて用いてもよいし、同一個有する有機シラン化合物と同二個有する有機シラン化合物とを用いてもよいし、同二個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物を用いてもよいし、同一個、二個及び三個有する有機シラン化合物を組み合わせて用いてもよい。モノマー状のキャップは、加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物を用いることにより容易に得ることができ、ポリマー状のキャップは、二個又は三個の加水分解性基Ｘを有する有機シラン化合物（好ましくは３個の加水分解性基Ｘを有する）を少なくとも用いることにより容易に得ることができる。また、前記固相基体の表面上において、前記キャッピング用有機シラン化合物は、固相基体の表面の水酸基と縮重合（又は当該水酸基と縮重合させるとともに有機シラン化合物同士で縮重合）させる。
【００３１】
（１２）上述した本発明のプローブ固定化用担体において、前記リンカーは、リンカー部位（例えば、アミノ基である。）を末端に有する炭化水素基を有していてもよい。ここで、前記炭化水素基は、炭素数が１以上１０個以下のアルキル基から選択され、好ましくは、炭素数２以上８以下の直鎖状アルキル基（エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘキシル基及びオクチル基）から選択される。また、前記リンカーは、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に保持されるモノマー状の有機シラン部位又は有機ポリシロキサン部位を有していてもよい。なお、モノマー状やポリマー状のリンカーは、少なくとも、前記リンカー部位を有し、一個以上三個以下の加水分解性基を有する有機シラン化合物から選択される一種又は二種以上を前記固相基体の表面上で縮重合させて得ることができる。また、リンカー用の有機シラン化合物は、加水分解性基Ｘを一個有するもの、加水分解性基Ｘを二個有するもの及び加水分解性基Ｘを三個有するもののいずれかで構成されていてもよいが、これらの加水分解性基Ｘの数が異なる二種類以上を組み合わせられていてもよい。また、加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と加水分解性基を２個以上有する有機シラン化合物とを組み合わせてもよい。例えば，加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物とを組み合わせて用いてもよいし、同一個有する有機シラン化合物と同二個有する有機シラン化合物とを用いてもよいし、同二個有する有機シラン化合物と同三個有する有機シラン化合物を用いてもよいし、同一個、二個及び三個有する有機シラン化合物を組み合わせて用いてもよい。モノマー状のリンカーは、加水分解性基Ｘを一個有する有機シラン化合物を用いることにより容易に得ることができ、ポリマー状のリンカーは、二個以上の加水分解性基Ｘを有する有機シラン化合物を用いることにより容易に得ることができる。前記固相基体の表面上において、前記有機シラン化合物は、固相基体の表面の水酸基と縮重合（又は当該水酸基と縮重合させるとともに有機シラン化合物同士で縮重合）させる。
【００３２】
（１３）プローブ固定化用担体は、固相基体と、プローブなどと結合可能なリンカー部位と、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体に保持されるモノマー状の有機シラン部位と、を有する第一のリンカーと、プローブなどと結合可能なリンカー部位と、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体に保持される有機シロキサン部位又は有機ポリシロキサン部位と、を有する第二のリンカーと、を備えていてもよい。
【００３３】
（１４）プローブ固定化用担体は、固相基体上の酸素原子とケイ素原子と結合を介して前記固相基体の表面に保持されるモノマー状の有機シラン部位を有する第１のキャップと、酸素原子とケイ素原子との結合を介して前記固相基体の表面に保持されるポリマー状の有機シラン部位を有する第２のキャップとを有していてもよい。
【００３４】
（１５）ＤＮＡアレイであって、上述したいずれかの製造方法によって製造されたプローブ固定化用担体又は上述したいずれかのプローブ固定化用担体と、該プローブ固定化用担体の前記リンカー部位を介して保持された前記プローブとを有する、ＤＮＡアレイ。このとき、前記プローブは、天然又は非天然の塩基を有していてもよいオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】プローブ固定化用担体の製造方法の一例を示すスキームである。
【図２】プローブ固定化用担体を示す説明図であり、（ａ）はキャップが一種類の場合の一例を示し、（ｂ）はキャップが複数種類の場合の一例を示す。
【図３】モノマー状キャップの一例を示す説明図である。
【図４】ポリマー状キャップの一例を示す説明図である。
【図５】プローブ固定化用担体に第一及び第二リンカーが混在している一例を示す説明図である。
【図６】プローブ固定化用担体にモノマー状の有機シラン部位を有する二種類のリンカーが混在している一例を示す説明図である。
【図７】有機シロキサン部位（又は有機ポリシロキサン部位）を有するリンカーの一例を示す説明図である。
【図８】ＤＮＡアレイを示す説明図であり、（ａ）は有機シロキサン部位（又は有機ポリシロキサン部位）を有するリンカーを用いた場合の一例を示し、（ｂ）は有機シロキサン部位（又は有機ポリシロキサン部位）を有するリンカーとモノマー状の有機シラン部位を有するリンカーを混合して用いた場合の一例を示す。
【図９】第一及び第二のリンカー用有機シラン化合物の一例を示す説明図である。
【図１０】第一及び第二のリンカー用有機シラン化合物を用いてプローブ固定化用担体を製造する方法の一例を示す説明図である。
【図１１】オキサノシンの説明図である。
【図１２】実施例１で測定した蛍光強度を表すグラフである。
【図１３】実施例２で測定した蛍光強度を表すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
上述した本発明のプローブ固定化用担体の製造方法等について、更にその詳細を説明する。【００３７】
（固相基体及びリンカー）
固相基体としては、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションアッセイに用いられる従来公知の各種の担体を用いることができる。例えば、ガラス、セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、短繊維、メンブランフィルター等が挙げられる。本発明を適用するのに好ましい固相基体は、もともと表面に水酸基が存在しているものや、表面に何らかの処理を施すことにより該表面に水酸基を生成させたもの等が挙げられる。具体的には、材料に由来するシラノール性水酸基を有する固相基体や、プラズマ等による表面処理や化学処理によって表面水酸基が付与、増加又は活性化された固相基体などが挙げられる。特に好ましくは、ガラス、シリコーンポリマー、シリコンを少なくとも表層に備えている固相基体が挙げられる。【００３８】
固相基体の形態も、プローブを固定化可能であってかつターゲット核酸が供給可能な表面（内表面を含む）を有していれば特に限定しない。例えば、基板などの平板状、ビーズなどの粒子状、ファイバー状、内表面を固定化表面とするキャピラリー状等を採用することができる。【００３９】
本発明における固相基体は、プローブの固定化のために固相基体の表面にリンカー部位を備えるリンカーを有している。リンカー部位の好ましい一つの形態は、活性水素を有している。例えば、リンカー部位は、アミノ基やチオール基を含んでいる。アミノ基やチオール基は、プローブに備えられるエステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基と共有結合を形成して、プローブを固相基体に固定化する。アミノ基は無置換アミノ基でも置換アミノ基でもよい。置換アミノ基における１つ又は２つの置換基は、それぞれ独立した炭化水素基としてもよく、炭化水素基としては炭素数が１以上１８以下のものが好ましく、炭素数が１以上６以下の直鎖アルキル基がより好ましい。アミノ基は、リンカー化合物との反応性を考慮すると１級アミノ基であることが好ましい。【００４０】
リンカー部位の他の好ましい形態としては、エステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基が挙げられる。これらの官能基は、プローブに備えられるアミノ基やチオール基と共有結合を形成してプローブを固相基体に固定化する。【００４１】
こうしたリンカーは、アミノ基などのリンカー部位を備える各種のモノ−、ジ−、トリ−アルコキシシランあるいは、モノー、ジー、トリーハロゲン化シラン（リンカー用有機シラン化合物）としてもよく、その場合にはケイ素原子がガラス製の固相基体の表面に存在するシラノール基の酸素原子とシロキサン結合を形成する。アミノ基などのリンカー部位は、好ましくは末端に備えられるように設計される。アミノ基とケイ素原子との間には、適当な連結部分を存在させることが好ましい。このような連結部分は、炭素数２以上１０以下のアルキル基又は当該アルキル基の一部の炭素原子が窒素原子又はＳ原子により置換された形態が好ましい。アルキル基は、直鎖状あるいは分枝状とすることができるが、好ましくは直鎖状である。なお、リンカー用有機シラン化合物としては、加水分解性基として１個以上３個以下のアルコキシ基やハロゲン基を備えていることが好ましい。【００４２】
また、リンカー用有機シラン化合物におけるアルコキシシランのアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。また、アルコキシシランにおける残余の基（アルコキシ基及びアミノ基、アルキルアミノ基以外にＳｉに結合する基）としては、アルキル基であることが好ましい。当該アルキル基としては、炭素数１〜１０程度のアルキル基が好ましく用いられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ｎ−デシル基が挙げられる。なお、固相基体上の水酸基に導入するアルコキシシランはこれに限定するものではなく、その他各種のシラン化合物を用いることができる。なお、担体に使用することのできるシラン化合物の例を以下に示す。
[化３]
2007069608.tif 000003
【００４３】
なお、上記した説明において、アルコキシ基の代わりにハロゲン基であってもよく、アルコキシ基及びハロゲン基は加水分解性基である。【００４４】
（キャップ）
本発明のプローブ固定化用固相基体は、固相基体の表面の水酸基が保護されるのであれば、特にどのようなキャッピング剤を用いてもよい。たとえば、ケイ素原子上にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソブチル基、ｎ−ブチル基など炭化水素基を有する有機シラン化合物によってキャッピングされていることが好ましい。固相基体の表面の水酸基に対してこうしたキャップを付与するには、加水分解性基を有し、上記炭化水素基を１個以上有する有機シラン化合物を用いることができる。こうした有機シラン化合物は、ケイ素原子上にメトキシ基、エトキシ基などの低級アルコキシ基やハロゲン基などを加水分解性基として有していることが好ましい。加水分解性基の個数は特に限定しないが、加水分解性基１個を有する有機シラン化合物を用いれば、該有機シラン化合物がモノマー状に固相基体の表面に結合した形態のキャップが得られる。加水分解性基が２個の有機シラン化合物を用いれば、固相基体の表面において連結した直鎖状等のポリマー状の有機メタロキサン部位又は有機ポリメタロキサン部位が得られ、３個以上の加水分解性基を有するキャッピング用有機シラン化合物を用いれば、ネットワーク状等のポリマー状の有機メタロキサン部位又は有機ポリメタロキサン部位が得られる。１個の加水分解性基を有する有機シラン化合物（例えば、官能基としてメチル基やエチル基が好ましい。）と２個又は３個以上（好ましくは３個以上）の加水分解性基（好ましくはプロピル基やｎ−ブチル基、より好ましくはブチル基以上）を有する有機シラン化合物を用いることで効率的若しくは高効率に固相基体の表面の水酸基をキャッピングし又はプローブを立ち上がらせることができる。【００４５】
（プローブ）
プローブは、核酸、すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイのために用いられる。本発明において核酸とは、少なくとも一部に塩基対合領域を有し、該対合領域によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマー（オリゴヌクレオチド）およびポリマー（ポリヌクレオチド）の双方を含み、さらにゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、ペプチド核酸を含む概念である。なお、ここで、オリゴヌクレオチドとは、主として、ヌクレオチドが数個から好ましくは百数十以下、より好ましくは百程度以下、さらに好ましくは数十個以下の重合体を意味しており、主として化学合成等により得られるものを含んでいる。また、ポリヌクレオチドとは、主として、オリゴヌクレオチドよりも長鎖の重合体を意味しており、ＰＣＲ産物などを含んでいる。【００４６】
プローブは、好ましくはデオキシリボースを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドである。【００４７】
（リンカーユニット）
本発明において用いるプローブは、固相基体の表面に備えるリンカー部位と共有結合可能なリンカーユニットを有していてもよい。アミノ基やチオール基をリンカー部位とした場合、リンカーユニットにはエステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基を含んでいることが好ましく、エステル基、アルデヒド基、エポキシ基及びカルボキシ基をリンカー部位とした場合、リンカーユニットにはアミノ基やチオール基を含んでいることが好ましい。【００４８】
また、例えばアミノ基などの活性水素を有するリンカー部位に対しては、以下に説明するリンカー化合物をリンカーユニットとして備えていることが好ましい。なお、このリンカーユニットはプローブを構成する他のモノマーユニットと同様にヌクレオチド誘導体としてプローブに備えられていることが好ましい。【００４９】
以下、リンカー化合物について説明する。ここで例示するリンカー化合物は、式（９）に示される化合物である。また、リンカーユニットとしてプローブ中に含まれる好ましい形態を式（１０）に示す。前記Ａとしては、水素原子、その他の置換基又は糖類もしくはその誘導体とすることができる。Ａが水素であるとき、式（９）で表される化合物は、オキサニン塩基である。オキサニン塩基は、グアノシンがＮＯ又はＮＯ2により誘起される酸化的脱アミネーションされて形成される損傷塩基の一つである。なお、以下、本明細書において、オキサニンがリボース又はデオキシリボース（いずれもフラノース型）と結合したヌクレオシド形態をオキサノシンと称し、特に、デオキシリボースのときはデオキシオキサノシンと称するものとする。
[化４]
2007069608.tif 000004
［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類若しくはその誘導体を表す。］
[化５]
2007069608.tif 000005
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、あるいは置換基を表す。］【００５０】
オキサニンは、例えば、デオキシグアノシンをＮＯ及び／又はＮａＮＯ2と反応させることによってデオキシオキサノシンとして得ることができる。例えば、デオキシグアノニンにＮａＮＯ2を酸性下、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ、ｐＨ３．７）を用いて、３７℃、４時間反応させることによって得ることができる。こうした反応後、反応液をＮａＯＨで中和し、必要に応じ適宜減圧留去した後、逆相クロマトグラフィー等により精製し、乾燥することでデオキシオキサノシンを白色粉末として得ることができる。移動相としては、リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ、ｐＨ７．４）等の中性の緩衝液とアセトニトリルなどの有機溶媒との混液（アセトニトリル１０％等）とすることで良好に分離できる。オキサニンは、デオキシオキサノシンを酸加水分解し、この反応液から逆相クロマトグラフィー等によって分取することができる。酸加水分解は、例えば、１Ｍ塩酸などの酸とともに３７℃で２時間という反応条件を採用することができる。【００５１】
前記Ａは、リボースやデオキシリボースなどのペントースを始めとする糖類とすることもできる。糖類の誘導体としては、糖類の炭素原子に結合した水素あるいは水酸基に替えて、アルコキシ、アルコキシアルキルオキシ、ハロゲン等の官能基を備えたものが挙げられる。【００５２】
式（９）のリンカー化合物は、カルボジイミドで活性化されたカルボキシ基においてアミノ基との反応性が確保されていれば、どのような形態でオキサニンを備えていてもよい。好ましくは、リボース又はデオキシリボースなどのペントースと結合した形態で有することが好ましい。また、オキサニン塩基とペントースとの結合位置は、好ましくは、３位のＮ原子にペントースのＣ１’位炭素原子が結合する形態であることが好ましい。ペントースが１−β−リボフラノシルリボース又はリボフラノシルデオキシリボースのとき、リンカー化合物は、ヌクレオシド誘導体の形態を採ることになる。ヌクレオシド誘導体の形態のリンカー化合物は、既に説明したように、デオキシグアニンやデオキシグアノシンから容易に得ることができる。【００５３】
こうしたヌクレオシド誘導体形態のリンカー化合物は、化学合成によりオリゴヌクレオチドを取得するのに適した種々の修飾が施されていてもよい。例えば、リボース又はデオキシリボースのＣ３’位の水酸基やＣ５’位の水酸基は適宜修飾される。３’位の水酸基には、ホスホルアミダイト基が導入され、５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基等が導入されていることが好ましい。こうした修飾基としては、核酸の化学合成法において公知の方法を適宜用いることができる。ホスホアミダイト法による核酸の化学合成に適したリンカー化合物の例を以下に示す。
[化６]
2007069608.tif 000006
［式中、Ｒ1は２−シアノエチル、４−ニトロフェニルエチル、２−トリメチルシチルエチル、又はメチルを表す］【００５４】
こうしたリンカー化合物は、公知の核酸化学合成用モノマーの合成方法を適用して取得することができる。例えば、デオキシオキサノシンの懸濁液（溶媒としてはＤＭＦなど）にジメトキシトリチルクロライドを添加して、その後、イミダゾールとジイソプロピルエチルアンモニウムメシレートを添加し、この反応液を攪拌して均質化し、次いで、多量の水に投入し、沈殿を得、乾燥して粗精製物とする。この粗精製物をジクロロメタンなどの適当な溶媒に再溶解後、ヘキサン中で再結晶化することで、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを得ることができる。【００５５】
さらに、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンをホスホアミダイト化するには、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを適当な溶媒に溶解し、その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミドを添加し、十分に反応させた後、メタノール、ジイソプロピルエチルアミン及び酢酸エチルの添加で反応を終了させ、１０％の炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、有機相を脱水し濃縮した。この濃縮物をジクロロメタン等の適当な溶媒に再溶解し順相クロマトグラフィーにて分離した。移動相としては、例えば、酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝６５：３５：０．３３）などを採用することができる。【００５６】
さらに、こうしたリンカー化合物は、好ましくはリボース又はデオキシリボースの５位の炭素原子に結合した水酸基においてリン酸エステルの形態を採る。リン酸エステルは、３リン酸エステルとすることが好ましく、この場合、リンカー化合物は、ヌクレオチド誘導体の形態と採ることができる。このようなプローブ化合物は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手法により１００塩基以上の長鎖ＤＮＡなどの核酸を取得するのに好ましく用いることができる。ヌクレオチド誘導体としてのリンカー化合物の例を以下の式に示す。
[化７]
2007069608.tif 000007
【００５７】
なお、ヌクレオチド誘導体であるリンカーユニットを含むオリゴヌクレオチドは、公知のプローブ作製方法を適用して作製することができる。各種のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖伸長法を用いる場合には、例えば、リンカー化合物としてデオキシオキサノシン三リン酸（ｄＯＴＰ）を準備する。オキサニンは、シトシンやチミン（好ましくはシトシンである。）とそれぞれ２つの水素結合を形成して安定な塩基対合を形成することと推測される。こうした塩基対合を考慮して、所望のテンプレートと５’末端からリンカー化合物を導入しようとする所望の位置までのプライマーとを準備し、ｄＯＴＰのみを含む反応系で第１回目の伸長工程を実施する。その後、残存するｄＯＴＰを除去して、通常どおり必要なｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのいずれかあるいは２種類以上である。）の存在下で２回目以降の伸長工程を実施する。その後、必要に応じ、ｄＯＴＰのみの伸張工程を実施すれば、２以上の所望の部位に本リンカー化合物を導入することができる。【００５８】
また、ホスホアミダイト法による場合には、例えば、既に説明したデオキシオキサノシンのホスホアミダイト化誘導体を準備し、合成中のオリゴデオキシヌクレオチドに対して所望の導入順位において添加して鎖延長反応を行う。こうすることによっても、プローブの１又は２以上の所望の部位に本リンカー化合物を導入できる。【００５９】
本プローブは、ハイブリダイゼーションにおいては１本鎖核酸の形態で機能するが、取得時若しくは合成時又は固定化時においては、２本鎖の形態であってもよい。また、１本鎖の形態を採るとき、ループやヘアピン部位を有していてもよい。【００６０】
本プローブは、１又は２以上のリンカーユニットを備えることができる。リンカーユニットは、プローブにおいてもっぱら選択される担体固定部位である５’末端に備えることもできるが３’末端等それ以外の部位に備えることもできる。例えば、プローブの全長の中央近傍に備えていてもよい。また、５’末端側あるいは３’末端側にリンカーユニットを備えるようにし、このようなプローブを担体に固定したとき、該リンカー化合物部位を含むプローブの上流側と下流側で部分的にヘアピン構造やループ構造を採らせるよう設計することもできる。特にリンカーユニットがヌクレオチド誘導体の形態を採ることにより、既に説明したように化学合成によっても酵素的な鎖延長法によっても任意の部位にリンカーを導入することができる。【００６１】
本プローブにおける、ターゲット核酸とのハイブリダイズ領域は、リンカーユニットを含まないことが好ましい。したがって、プローブの全長の中央近傍や末端近傍にリンカーユニットが導入される場合には、その近傍には、ハイブリダイズに関与しないスペーサー領域を形成することが好ましい。【００６２】
また、こうしたスペーサー領域は、プローブの５’末端などにリンカーユニットが導入される場合であっても同様であり、この場合、５’末端側からリンカーユニット−スペーサー領域−ハイブリダイズ領域とすることが好ましい。【００６３】
（ＤＮＡアレイ）
ＤＮＡアレイは、プローブ固定化用担体にプローブが固定化されたものである。ここで、プローブは、リンカー化合物（プローブを固相基体のリンカー部位と結合させるための化合物あるいは該化合物が導入された部位）であるオキサニンのカルボジイミドで活性化されたカルボキシ基と担体表面のアミノ基とが反応して、アミド結合を形成した状態で固定化されていることが好ましい。【００６４】
プローブの固定化形態は、プローブにおけるリンカー化合物の導入位置により異なり、５’末端にリンカー化合物を備える場合には、プローブが１本鎖状に固定化されるであろうし、プローブ全長の中央近傍にリンカー化合物を備える場合には、プローブはＵ字等状に固定化されるであろう。また、リンカー化合物の導入部位近傍に対向して塩基対合を形成可能な配列等を有する場合には、リンカー化合物導入部位近傍でヘアピンやループ構造を採るであろう。【００６５】
（ＤＮＡアレイの製造方法）
ＤＮＡアレイは、プローブを含有する液体を準備し、この液体を上述したプローブ固定化担体の表面に供給し、前記プローブにおけるリンカー化合物のオキサニンとプローブ固定化担体に備えられるアミノ基等とを反応させることによって得ることができる。プローブ固定化担体にプローブを供給する方法は従来公知のいずれの方法も採用できる。例えば、ＤＮＡアレイとして、基板等の表面に多数個のプローブスポットを配列されたアレイを作製するには、ピンによる接触型あるいはインクジェット方式等によるプローブ含有液滴をスポット状に供給する。また、ビーズ等の粒子にプローブを供給するには、プローブ含有溶液中にビーズをディッピングするかプローブ含有溶液を噴霧するなどによることができる。【００６６】
プローブの固定化は、通常行われるこうしたプローブ溶液のスポッティングやディッピング等の操作において可能である。アミノ基を備えるプローブ固定化担体へプローブ溶液が供給されれば、リンカー化合物とアミノ基は速やかに反応することができる。なお、プローブ溶液には、有機溶媒を添加することでもきるし、また、必要に応じて、中性あるいは微酸性に調整することができる。温度やインキュベーション時間は、プローブ固定化担体やプローブの種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、３０℃〜９０℃の所定温度とし、反応時間は数十分から１時間あるいは数時間程度とすることができる、プローブ固定化担体の表面にプローブ溶液を供給した後は、リハイドレーション、ブロッキング、変性、洗浄、乾燥等の工程を実施することができる。【００６７】
（ハイブリダイズ方法）
本発明の核酸ハイブリダイズ方法は、上述したＤＮＡアレイを準備し、このＤＮＡアレイに対して核酸を供給してプローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせるものである。このハイブリダイズ方法では、本発明のプローブ固定化用担体を用いる以外は、従来公知の方法で調製した各種のターゲット核酸を常法に従い供給しハイブリダイズさせればよい。【００６８】
本明細書には、２００５年３月９日に日本国に特許出願された特願２００５−０６５９４８を引用することにより、その内容の全てが本明細書に含まれる。また、本出願は、２００５年１２月１３日に米国に仮出願された６０／７４９，５９０を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが引用により本明細書に含まれる。
【実施例１】
【００６９】
プローブ固定化担体を作製し、キャッピング効果の確認試験を行った。その手順を以下に説明する。ここでは、固相基体（以下、基板という）として、ＤＮＡマイクロアレイ用ノンコートスライドガラス（松波硝子工業製）を使用した。なお、ＡＰＳは、３−アミノプロピルトリエトキシシランの略であり、リンカー用有機シラン化合物の一例である。ＢＭＳは、ブチルトリメトキシシランの略であり、キャッピング用有機シラン化合物の一例である。【００７０】
（１）基板表面の修飾
まず、基板表面の修飾を行った。すなわち、基板２０枚を８００ｍＬのアセトン中で１０分間超音波で処理したあと、デシケータ中、室温で１０分間真空乾燥した。続いて、それらの基板２０枚を１２００ｍＬのパラハナ溶液（８４０ｍＬの９０％Ｈ2ＳＯ4と３６０ｍＬの３０％Ｈ2Ｏ2とからなる溶液）に浸して３０分間超音波で処理し、次いで８０ｍＬの蒸留水に浸し１０分間超音波で処理したあと、デシケータ中、室温で１時間真空乾燥した。再びそれらの基板を８００ｍＬの蒸留水に浸して１０分間超音波で処理したあと、デシケータ中、室温で１２時間真空乾燥し、８００ｍＬのメタノールに浸して１０分間超音波で処理し、８００ｍＬのメタノールとトルエンの１：１（体積比）混合溶液（４００ｍＬのメタノールと４００ｍＬのトルエンの混合溶液）に浸して１０分間超音波で処理し、更に８００ｍＬのトルエンに浸して１０分間超音波で処理した。このような処理を終えた基板２０枚を１２９０ｍＬの２％ＡＰＳ溶液（２５．８ｍＬのＡＰＳと１２６４．２ｍＬのトルエンの混合溶液）に浸し、インキュベータ中、２５℃で７０ｒｐｍで揺らしつつ５時間反応させた。その後、それらの基板を８００ｍＬのトルエンに浸して１０分間超音波で処理し、８００ｍＬのメタノールとトルエンの１：１（体積比）混合溶液に浸して１０分間超音波で処理し、更に８００ｍＬのメタノールに浸して１０分間超音波で処理したあと、定温乾燥機中、１１０℃で１時間乾燥し、それらの基板を遮光してデシケータ中、室温で１２時間真空乾燥した。このような処理を終えた基板のうち１０枚を、ＡＰＳの修飾のみを行った基板（以下、ＡＰＳ基板という）として保存した。【００７１】
一方、このような処理を終えた残り１０枚の基板を１２００ｍＬの２％ＢＭＳ（キャッピング剤）溶液（２４ｍＬのＢＭＳと１１７６ｍＬのトルエン）に浸し、インキュベータ中、２５℃で７０ｒｐｍで揺らしつつ５時間反応させた。その後、それらの基板を８００ｍＬのトルエンに浸して１０分間超音波で処理し、次いで８００ｍＬのメタノールとトルエンの１：１（体積比）混合溶液に浸して１０分間超音波で処理し、更に８００ｍＬのメタノールに浸して１０分間超音波で処理したあと、定温乾燥機中、１１０℃で１時間乾燥し、更にそれらの基板を遮光してデシケータ中、室温で真空乾燥し、これらをＡＰＳの修飾に加えてＢＭＳによるキャッピングを行った基板（以下、ＡＰＳ＋ＢＭＳ基板という）として保存した。【００７２】
（２）プローブのスポッティング及び固定化
続いて、オリゴＤＮＡプローブのスポッティング及び固定化を行った。ここでは、オリゴＤＮＡプローブとして、化８の配列を持つものを使用した。なお、配列中、５’末端の「Ｏ」はオキサノシンを表し、それに続く「ＴＴＴ」はスペーサを表し、スペーサに続く残りの配列つまり「ＣＡＧ・・・ＡＣＧ」（点線のアンダーラインの部分）はハイブリダイゼーションサンプルの相補配列を表す。
[化８]
2007069608.tif 000008
【００７３】
スポッティング及び固定化は、ＡＰＳ基板及びＡＰＳ＋ＢＭＳ基板のそれぞれについて２枚ずつ、以下の手順により行った。まず、オリゴＤＮＡプローブをＰＢＳに溶解し、マイクロセラミックポンプ式ＤＮＡチップ製造装置ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ製）を用いてオリゴＤＮＡを濃度５０ｐｍｏｌ／μＬでスポットした。続いて、４２℃、相対湿度４５％で一晩インキュベートし、スライドガラスラックに基板を入れて、無水コハク酸溶液に２０分間浸漬した。ここで、無水コハク酸溶液は、２．５ｇの無水コハク酸を１６０ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンに溶解し、０．２Ｍほう酸ナトリウム水溶液 （ｐＨ８．０）を１７．５ｍＬ加えて調製した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄する操作を２回繰り返したあと、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液で室温にて１５分間振とう洗浄し、沸騰させた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液中に５分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄する操作を３回繰り返したあと、１０００ｒｐｍで３分間遠心乾燥した。これにより、オリゴＤＮＡプローブを固定化したＡＰＳ基板及びＡＰＳ＋ＢＭＳ基板を、それぞれ２枚ずつ得た。【００７４】
（３）ハイブリダイゼーション
オリゴＤＮＡプローブを固定化した２枚のＡＰＳ＋ＢＭＳ基板のうち、１枚はすぐにハイブリダイゼーションを行い（固定化後０日）、もう１枚は４２℃、相対湿度５０％の条件下に７日間曝露後、ハイブリダイゼーションを行った（固定化後７日）。また、２枚のＡＰＳ基板についても同様にしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、化９に示すオリゴＤＮＡをハイブリダイゼーションサンプルとし、これを滅菌水に溶解して使用した。化９のオリゴＤＮＡは、前出のオリゴＤＮＡプローブに相補的な配列（点線のアンダーラインの部分）を持ち、５’末端をＣｙ３で標識したものである。
[化９]
2007069608.tif 000009
【００７５】
ハイブリダイゼーションは、以下の手順により行った。まず、ハイブリダイゼーションサンプルに２０×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳを加え、終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳになるように調製した。このときのハイブリダイゼーションサンプルの終濃度は1ｎＭである。次いで、基板上にサンプル液を２５μｌ滴下し、その上から静かにカバーガラスをかけ、相対湿度１００％、４２℃で一晩インキュベートした。続いて、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で室温にて５分振とうし、１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、更に０．１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうしたあと、１０００ｒｐｍで３分間遠心乾燥した。このようにしてハイブリダイゼーションを行ったあと、各基板につき蛍光シグナルの数値化を行った。Ｃｙ３の蛍光シグナルはＤＮＡマイクロアレイスキャナ（G2505A，Agilent  Technologies製）を使用して測定した。また、各スポットの蛍光シグナルはGenePixｘPro（Axon Instrument製）にて数値化した。その結果を図１２に示す。【００７６】
図１２から明らかなように、ＡＰＳ処理後に基板表面に残存する水酸基をＢＭＳでキャッピングした場合（ＡＰＳ＋ＢＭＳ）には、固定化後７日経ったあとの蛍光シグナル強度は固定化後０日とほぼ同等だったのに対して、キャッピングしなかった場合（ＡＰＳ）には、固定化後７日経ったあとの蛍光シグナル強度は固定化後０日の約６割程度に落ち込んだ。
【実施例２】
【００７７】
プローブ固定化担体を作製し、実施例１とは異なる観点でキャッピング効果の確認試験を行った。その手順を以下に説明する。本実施例でも、基板は実施例１と同様のＤＮＡマイクロアレイ用ノンコートスライドガラス（松波硝子工業製）を使用した。【００７８】
（１）基板表面の修飾
実施例１と同様にして行った。【００７９】
（２）プローブのスポッティング及び固定化
続いて、プローブのスポッティング及び固定化を行った。ここでは、プローブとして、Cy3 Mono−reactive Dye Pack（PA23001，ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を使用した。スポッティング及び固定化は、ＡＰＳ基板及びＡＰＳ＋ＢＭＳ基板のそれぞれについて１枚ずつ、以下の手順により行った。まず、マイクロセラミックポンプ式ＤＮＡチップ製造装置ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ製）を用いてＣｙ３を濃度５０ｐｍｏｌ／μＬでスポットした。続いて、４２℃、相対湿度４５％で一晩インキュベートし、スライドガラスラックに基板を入れて、無水コハク酸溶液（前出）に２０分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄する操作を２回繰り返したあと、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液で室温にて１５分間振とう洗浄し、沸騰させた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液中に５分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄する操作を３回繰り返したあと、１０００ｒｐｍで３分間遠心乾燥した。これにより、Ｃｙ３を固定化したＡＰＳ基板及びＡＰＳ＋ＢＭＳ基板を、１枚ずつ得た。【００８０】
（３）擬似ハイブリダイゼーション
Ｃｙ３を固定化したＡＰＳ＋ＢＭＳ基板及びＡＰＳ基板をすぐに（固定化後０日）用いて、疑似ハイブリダイゼーションを行った。疑似ハイブリダイゼーションは、以下の手順により行った。まず、２０×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳを混合し、終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳになるように調製し、これをＤＮＡの入っていない疑似ハイブリダイゼーションサンプル液とした。次いで、基板上にサンプル液を２５μｌ滴下し、その上から静かにカバーガラスをかけ、相対湿度１００％、４２℃で一晩インキュベートした。続いて、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で室温にて５分振とうし、１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、更に０．１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうしたあと、１０００ｒｐｍで３分間遠心乾燥した。このようにして疑似ハイブリダイゼーションを行ったあと、各基板につき蛍光シグナルの数値化を行った。Ｃｙ３の蛍光シグナルはＤＮＡマイクロアレイスキャナ（G2505A，Agilent  Technologies製）を使用して測定した。また、各スポットの蛍光シグナルはGenePixｘPro（Axon Instrument製）にて数値化した。その結果を図１３に示す。【００８１】
図１３から明らかなように、ＡＰＳ処理後に基板表面に残存する水酸基をＢＭＳでキャッピングした場合（ＡＰＳ＋ＢＭＳ）、キャッピングしなかった場合（ＡＰＳ）に比べて、蛍光強度が著しく増大した。なお、実施例１では、固定化後０日における両者の蛍光強度は、ＡＰＳ＋ＢＭＳ基板の方がＡＰＳ基板に比べてやや増大している程度であったが、これはプローブやハイブリダイゼーションサンプルが実施例１と実施例２で異なることに起因すると思われる。【００８２】
また、実施例２において、ＢＭＳの代わりにＥＴＭＳ，ＭＴＰＳ，ＯＤＴＥＳ，ＥＭＳ，ＭＭＳ（前出の化３参照）を使用して、ＡＰＳで処理した後に基板の表面上に残存する水酸基を保護し、同様にして疑似ハイブリダイゼーションを行い、蛍光シグナルを測定した。その結果を図１３に合わせて示す。図１３から明らかなように、残存する水酸基を保護した基板はいずれもＡＰＳ基板に比べて蛍光強度が増大した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ＤＮＡアレイの製造や使用に関わるバイオ関連技術に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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