(57)【要約】本発明は、ｕＰＡを含有するＥＳ細胞の分化促進剤、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤またはテラトーマの予防剤に関する。  また、本発明は、ｕＰＡをＥＳ細胞に接触させることを含むＥＳ細胞の分化促進方法、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法、またはｕＰＡをＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞を肝細胞に分化させることを含む肝細胞の調製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、ＥＳ細胞の分化促進剤。
【請求項２】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、ＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤。
【請求項３】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、テラトーマ予防剤。
【請求項４】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させることを含む、ＥＳ細胞の分化促進方法。
【請求項５】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させることを含む、ＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法。
【請求項６】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞の分化促進方法およびＥＳ細胞を用いた肝細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、体内の代謝の中心的役割を担う生体内最大の大きさの臓器である。肝臓は生体内で唯一再生する臓器であり、全重量の約８０％を切除しても、元の重量にまで再生する能力を有することが知られている。
一方、Ｃ型肝炎や肝硬変などの重篤な慢性肝疾患では、肝臓の機能的な再生は困難であるため、現在では肝臓提供者（ドナー）からの肝臓を移植する肝臓移植療法がこれらの慢性肝疾患に対する最も有効な治療法であると言われている。また、ハイブリッド型人工肝臓や細胞移植療法においても、生体由来の肝細胞を必要とする。このため、これらの療法において、ドナーの不足が深刻な問題となっている。さらに、移植後の拒絶反応またはドナーにおける組織欠損等も、これらの治療法を実施する上で、解決しなくてはならない重要な課題の一つである。
近年、このような問題点を踏まえ、臓器移植に代わる治療法として胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＥＳ細胞））を用いた細胞移植療法が注目されている。ＥＳ細胞は、受精卵の胚盤胞から株化された細胞であり、個体を構成するさまざまな機能細胞への分化誘導が可能であると考えられている。また、ＥＳ細胞の段階で、拒絶反応に関わる細胞表面抗原を改変することも可能である。したがって、ＥＳ細胞を効率よく肝細胞に分化させて細胞移植に用いることができれば、ドナー不足、拒絶反応、臓器提供者における組織欠損など移植療法に関連するさまざまな問題の解決につながるものと期待されている。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑みて、ＥＳ細胞の分化促進剤、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤、またはテラトーマの予防剤を提供することを目的とする。
別の態様において、本発明は、ＥＳ細胞の分化促進方法、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法、または肝細胞の調製方法を提供することを目的とする。
別の態様において、本発明は、肝細胞の移植方法またはテラトーマの予防方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意研究を行い、ＥＳ細胞を効率よく肝細胞へと分化誘導するための方法を確立することを試みた。その結果、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）がＥＳ細胞を肝細胞へ効率よく分化誘導することを初めて明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、ＥＳ細胞の分化促進剤。
（２）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、ＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤。
（３）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含有する、テラトーマ予防剤。
（４）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させることを含む、ＥＳ細胞の分化促進方法。
（５）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させることを含む、ＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法。
（６）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の調製方法。
また、本発明は以下に関する。
（７）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞から分化した肝細胞を生体に移植することを含む、肝細胞移植方法。
（８）ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子をＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞から分化した肝細胞を生体に移植することを含む、テラトーマの予防方法。
本発明により、ｕＰＡを含む効率的なＥＳ細胞の分化促進剤、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤、またはテラトーマの予防剤が提供される。また、本発明により、ＥＳ細胞の分化促進方法、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法、または肝細胞の調製方法が提供される。また、本発明により、テラトーマの発現確率の低い肝細胞の移植方法が提供される。さらに、本発明により、テラトーマの予防方法が提供される。
本発明により、ＥＳ細胞から肝細胞への分化はｕＰＡにより誘導されることが初めて明らかとなり、ｕＰＡを用いてＥＳ細胞から肝細胞に効率的に分化させることが可能となった。
本発明は、好ましくは、ドナー不足、拒絶反応、臓器提供者における組織欠損など移植療法に関連するさまざまな問題の解決策の一つになり得る。
さらに、本発明により得られる肝細胞は、好ましくは従来の分化誘導方法による細胞と比べて分化度が高いものである。そのため、本発明により、好ましくは、移植に起因するテラトーマ（奇形腫）を発症する危険性が低く、移植療法により適した肝細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ハンギングドロップ法による胚葉体の形成方法および分化誘導方法を示す図である。
図２は、ハンギングドロップ法で分化誘導したＥＳ細胞における各種分化マーカーの発現を示す図である。
図３は、分化誘導培養後のインドシアニングリーン取り込み細胞の観察像を示す図である。
図４は、肝細胞の発生における心筋中胚葉の役割を示す模式図である。
図５は、ＦＧＦレセプター阻害剤Ｓｕ５４０２またはａＦＧＦ添加による各種分化マーカーの発現量の変化を示す図である。
図６は、ｕＰＡ添加による各種分化マーカーの発現量の変化を示す図である。
図７は、ｐ−アミノベンザミジンがＥＳ細胞から肝細胞への分化に及ぼす影響を示す図である。
図８は、ｕＰＡ添加による遺伝子発現傾向の経時的な変化を示す図である。
図９は、ＰＡＳ染色によるグリコーゲン貯蔵細胞の染色像を示す図である。
図１０は、Ａｌｂｕｍｉｎの蛍光免疫染色像を示す図である。
図１１は、ｕＰＡ、ＤＦＰ処理ｕＰＡ、ｔＰＡ添加による遺伝子発現量の変化を示す図である。
図１２は、マウス成熟肝細胞のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。
図１３は、ｕＰＡ、ＤＦＰ処理ｕＰＡ、ｔＰＡを添加した分化誘導細胞のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。
図１４は、ＥＳ細胞由来の分化細胞を経脾的にマウスに移植する方法を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定するものではない。
明細書中の参考文献は、全体を通して本明細書に組み込まれるものとする。
１．概要
本発明は、ｕＰＡによるＥＳ細胞の分化促進作用に関するものであり、ＥＳ細胞をｕＰＡの存在下で分化させると、ＥＳ細胞が肝細胞に効率的に分化するという知見に基づいて完成されたものである。本発明により得られる肝細胞は、従来のｕＰＡを用いない方法で分化させた肝細胞に比べて分化度が高いという特徴を有する。このため、本発明は、細胞移植時に懸念されるテラトーマの発症を予防可能であるという側面をも有するものである。
２．ＥＳ細胞
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、受精後５，６日目の胚盤胞の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ；ＩＣＭ）から取り出され、培養された細胞である。ＥＳ細胞は、培養によって増殖させることができ、また、胚の初期段階から得られるために生体のいかなる細胞にも成長できる性質（多能性）を有するものである。
本発明においてＥＳ細胞の由来は特に限定されないが、レシピエントと同じ種に由来する細胞を用いることが好ましい。例えば、本発明の方法で調製された肝細胞をヒトに移植する場合は、用いるＥＳ細胞はヒト由来のＥＳ細胞であることが好ましい。
また、ＥＳ細胞が同種異系を交配して樹立したＥＳ細胞の場合は、交配に用いられるいずれかの系統がレシピエントと同じ系統であることが好ましい。
さらに、レシピエントと異なる性別に由来するＥＳ細胞を分化させ、ＥＳ細胞由来分化細胞を移植する場合は、レシピエントの臓器における性別判定マーカーの発現を調べることで、移植した細胞の生着の程度を確認することができる。
本発明において使用されるＥＳ細胞は、特に限定されないが、例えばＴＴ２細胞を挙げることができる。ＴＴ２細胞は、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（メス）とＣＢＡマウス（オス）とを交配して樹立したオスマウス由来のＥＳ細胞である（Ｙａｇｉ  Ｔｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３  Ｏｃｔ；２１４（１）：７０−６．）。ＴＴ２細胞は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスとＣＢＡマウスを交配して得られた４日胚をフィーダー細胞上で展開させて、得られた内部細胞塊を数回フィーダー細胞上で継代して株化することで製造することができる。したがって、本発明によってＴＴ２細胞由来分化細胞を移植するレシピエントには、Ｃ５７／ＢＬ６マウス、好ましくはＣ５７／ＢＬ６メスマウスを用いることができる。
ＥＳ細胞は、通常の方法で培養（継代も含む）することができ、当業者であれば適宜培養条件を設定することができる。ＥＳ細胞は、例えば、実施例に示す方法で培養することができる。
培養時には、ＥＳ細胞の分化を抑制するための添加物を培地に加えることができ、例えば、ＬＩＦ（白血病抑制因子）の存在下でＥＳ細胞を培養することができる。
また、フィーダー細胞とＬＩＦを併用してＥＳ細胞の未分化状態を維持することもできる。
ＥＳ細胞を分化させるには、まずＥＳ細胞から胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ；ＥＢ）を形成させ、そこから分化を誘導することもできる。
ＥＢを形成させる方法としては、ハンギングドロップ法およびアガロース法などが知られているが、当業者であれば、公知の手法に基づいて適宜実施することができる。例えば、実施例に記載の方法でＥＢを形成させることができる。
また、超低接着性培養器を用いてＥＳ細胞からＥＢを形成することもできる。
３．ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（単に「ウロキナーゼ」と称する場合もある）は、線溶系の酵素として知られている分子量約５４ｋＤのタンパク質（高分子型）である。
また、ｕＰＡは上記の活性型（二本鎖）の高分子型ｕＰＡのほかに、高分子型の一部が分解された分子量３１ｋＤの低分子型ｕＰＡとしても存在することが知られている。この低分子型のｕＰＡは、高分子型ｕＰＡの活性中心を含むポリペプチド断片である。さらに、ｕＰＡは不活性（一本鎖）な前駆体ｐｒｏ−ｕＰＡ（分子量約５４ｋＤ）としても存在することが知られている。これらの高分子型のｕＰＡ、低分子型のｕＰＡ、前駆体ｐｒｏ−ｕＰＡは、いずれも本発明においてｕＰＡとして使用することができる。
本発明において使用するｕＰＡの由来は特に限定されず、いずれの種に由来するものも使用することができる。
本発明において、ｕＰＡは、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含むものであり、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるｕＰＡは、ヒト由来の高分子型ｕＰＡである。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＰ＿００２６４９およびＮＭ＿００２６５８として登録されている。
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列であって、ＥＳ細胞分化促進作用を有するポリペプチドのアミノ酸配列などが挙げられる。
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、上記のアミノ酸配列の他、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ＥＳ細胞分化促進作用を有するポリペプチドのアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明において、「ＥＳ細胞分化促進作用」は、ＥＳ細胞の分化を促進させる作用、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化を促進させる作用を意味する。また、本発明において、「ＥＳ細胞分化促進作用を有する」とは、ポリペプチドが、当該ポリペプチドで処理しない対照と比べて、ＥＳ組胞の分化の速度を大きくする作用、分化する細胞の数もしくは割合を増やす作用（分化度を高める作用）またはＥＳ細胞の分化成熟の程度を高くする作用を有することを意味する。
ＥＳ細胞分化促進作用の測定方法については後述する。
前記の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列としては、例えば、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などが挙げられる。
また、本発明において使用するｕＰＡは、ＥＳ細胞分化誘導作用を有する限り、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などとの融合タンパク質であってもよい。
また、本発明において、ｕＰＡは配列番号１で示される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるポリペプチドを含むものであり、好ましくは、配列番号１で示される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるポリペプチドが挙げられる。配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡは、ヒト由来の高分子型ｕＰＡをコードするＤＮＡである。配列番号１で示される塩基配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００２６５８として登録されている。
「配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号１で示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が挙げられる。
また、「配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、上記の塩基配列の他、配列番号１で示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列であって、かつ、コードするポリペプチドがＥＳ細胞分化促進作用を有する塩基配列を挙げることができる。
前記配列番号１で示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列としては、例えば、（ｉ）配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が欠失した塩基配列、（ｉｉ）配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（ｉｉｉ）配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が付加した塩基配列、（ｉｖ）配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が挿入された塩基配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせた塩基配列などが挙げられる。
ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋ  ＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
また、配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列としては、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードするポリペプチドがＥＳ細胞分化誘導作用を有するＤＮＡの塩基配列が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、「５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃」等の条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を参照することができる。
本発明において、低分子型ｕＰＡは、配列番号２中、１５６〜４３１番目に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含むものである。また、本発明において、低分子型ｕＰＡは、配列番号１中、４６６〜１２９３番目に示される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含むＤＮＡによりコードされるタンパク質を含むものである。
また、前駆体ｐｒｏ−ｕＰＡは、プラスミンやカリクレインにより二本鎖に切断されることによって活性型のｕＰＡに転換される。本発明において、前駆体ｐｒｏ−ｕＰＡは、活性型のｕＰＡに転換することで、ＥＳ細胞の分化を促進することができる。
本発明において、ｕＰＡは生体由来のものであってもよい。例えば、ｕＰＡは尿中に含有されることが知られているため、尿から公知の方法により採取したものを用いることができる。また、ｕＰＡを発現している細胞を破砕し、破砕液から公知の方法により採取したものを用いることもできる。公知の方法としては、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、硫安沈殿、透析などを挙げることができ、当業者であれば公知の方法を適宜一つまたは複数を選択して実行することができる。
また、本発明において、ｕＰＡは市販のものを使用してもよい。例えば、ウロキナーゼ（ベネシス−三菱ウェルファーマ）、ウロナーゼ（持田製薬）、ウロキナーゼ（日本製薬−武田、わかもと−藤沢、興和）などを購入することにより入手することができる。
本発明において、ｕＰＡはそのまま用いてもよく、製剤化した医薬組成物としてもよい。医薬組成物は、ｕＰＡを含有する組成物であれば、特に限定されない。例えば、本発明において、医薬組成物としては、ｕＰＡを含む種々の剤形、例えば経口剤であれば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等、非経口剤であれば坐剤、注射剤、軟膏剤、パップ剤等があげられる。当業者であれば、公知の方法を用いてｕＰＡを製剤化することができる。
本明細書において、ｕＰＡを含む溶液の濃度は、単位溶液量あたりのｕＰＡ活性（例えば、ｕ／ｍｌ）として表すことができる。ここでのｕＰＡ活性は、国際単位によって定められた方法で測定された酵素活性を用いる。
ｕＰＡ活性は発色性合成基質Ｓ−２４４４，フィブリン標準平板法などにより測定できる。
以下の実施例で示すように、線溶系因子の一つであるｕＰＡは、ＥＳ細胞から肝細胞への分化誘導を促進する作用を有する。一方、組織由来のｔＰＡはＥＳ細胞から肝細胞への分化には影響を及ぼさなかった。また、各種阻害剤を用いた実験から、ｕＰＡによるＥＳ細胞の分化促進作用は、ｕＰＡの活性に起因する可能性が高いことが示唆されている。
４．ＥＳ細胞の分化促進方法
本発明において、ｕＰＡはＥＳ細胞の分化を促進することができる。本発明において、ｕＰＡは好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化を促進することができる。
本発明において、ＥＳ細胞は前述のように胚葉体を形成し、そこから分化させてもよいし、胚葉体（ＥＢ）を形成せずに分化させてもよい。
ＥＳ細胞は、ＬＩＦなどの分化抑制因子を含む培養培地から分化抑制因子を除いた培地で培養して分化させることができる。例えば、ＥＳ細胞をＬＩＦを含まない培地（例えば、２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）中で培養して分化させることができる。
ＥＢを形成したＥＳ細胞を分化させる場合は、例えば、ハンギングドロップ法で培養を開始７２時間〜１６８時間後のＥＢをコラーゲンコートディッシュに播種し、２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭを用いて培養することで分化させることができる。コラーゲンコートディッシュは市販のもの（例えば、Ｉｗａｋｉ，ｃｏｄｅ＃４０１０−０１０）を使用することができるし、公知の方法で作製したものを使用することもできる。
本発明において、ｕＰＡはＥＢをコラーゲンコートディッシュに播種した後、終濃度が０．１〜１０００ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｕ／ｍｌ、より好ましくは５〜５０ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｕ／ｍｌとなるように培地に添加することで、ＥＳ細胞に接触させることができる。
ＥＳ細胞にｕＰＡを接触させる条件は、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で、１〜３０日、好ましくは５〜２５日、より好ましくは１０〜２０日最も好ましくは１５日間接触させることができる。ＥＳ細胞にｕＰＡを接触させることで、ＥＳ細胞の分化、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化を促進することができる。
本発明において、ｕＰＡのＥＳ細胞分化促進作用またはＥＳ細胞の分化の態様は、分化マーカーの発現量の測定、光学顕微鏡を用いた形態観察などから判定することができる。
分化マーカーは、公知のものを使用することができ、その発現量を測定することで、ＥＳ細胞が分化した細胞の種類、分化する時期、または分化した細胞の量といったＥＳ細胞の分化の態様を知ることができる。例えば、未分化細胞のマーカーとしてｏｃｔｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４（Ｏｃｔ−４）が挙げられ、胆管系の分化マーカーとしてｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１９（ＣＫ−１９）が挙げられ、肝細胞の分化マーカーとしてａｌｂｕｍｉｎ（Ａｌｂ）、α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）（胎児期肝細胞）、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ７Ａ１（Ｃｙｐ７ａ１）、α１−ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ（ＡＡＴ）、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ＴＴＲ）が挙げられ、心筋中胚葉の分化マーカー遺伝子としてｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＣＭＡ）が挙げられる。したがって、例えばＡｌｂの発現が確認されれば、その細胞は肝細胞に分化した可能性が高いと言える。
また、ＥＳ細胞の生着を判定するために、ｓｅｘ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｇｅｎｅ（ＳＲＹ）などの性別判定マーカーを用いることができる。
分化マーカーまたは性別判定マーカーの発現量は、例えば、細胞に発現するｍＲＮＡの量またはタンパク質の量を測定することで明らかにすることができる。
ｍＲＮＡの測定は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ノザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法が挙げられ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲである。上記の方法は、当業者であれば定法に従い行うことができる。この際、対照遺伝子として、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）などのハウスキーピング遺伝子を用いてもよい。
タンパク質の測定は、例えば、免疫組織化学的方法、免疫沈降法、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーまたは蛍光標識細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの免疫化学的方法、または質量分析などによる方法が挙げられ、好ましくはウエスタンブロットが挙げられる。上記の方法は、定法に従い行うことができる。
また、肝細胞への分化は、ＰＡＳ染色によるグリコーゲン貯蔵細胞の染色によっても確認することができる。ＰＡＳ染色では、肝細胞に分化した細胞は、濃く染色させる。また、肝細胞への分化は、抗ａｌｂｕｍｉｎ抗体を用いた免疫組織染色またはＦＡＣＳ解析によっても明らかにすることができる。これらの方法は、例えば実施例で用いた方法などの公知の方法によって行うことができる。
さらに、肝細胞の分化機能の指標として、尿素合成能をジアセチルモノオキシム法により測定することもできる。例えば、細胞を洗浄後、５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ含有Ｈａｎｋ’ｓ培地中で、３７℃、２時間インキュベーションした後、培養液を回収し、培養液中に含まれる合成された尿素量を定量すればよい。
このように、ｕＰＡをＥＳ細胞に接触させることによって、ＥＳ細胞を分化を促進させることができ、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞の分化を促進させることができる。また、ｕＰＡをＥＳ細胞に接触させ、分化させることで、あるいは分化した肝細胞を採取することで肝細胞を調製することができるため、本発明は肝細胞の調製方法を提供することができる。また、ｕＰＡはＥＳ細胞の分化を促進し、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化を促進することから、本発明によりｕＰＡの新しい用途、即ち、ＥＳ細胞の分化促進剤、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤を提供することが可能となった。
また、本発明により調製される肝細胞の集団は、従来のｕＰＡを用いないＥＳ細胞の分化方法で調製される細胞集団よりも、未分化の細胞の割合の低いもの（分化度の高いもの）である。
ＥＳ細胞は、所定の分化誘導剤の存在下で培養するとどの体細胞にでも分化する能力を有している。また、分化抑制物質の存在下で培養することにより未分化状態のまま細胞を限りなく増殖させることが可能である。そのため、新たな細胞移植療法の細胞供給源として期待されている。しかし、特定の細胞へと分化を誘導することができても、細胞移植に使用できるとは限らない。その理由は、移植に用いる細胞集団の中に未分化の細胞が混在していると、テラトーマを形成する可能性があるからである。テラトーマとは、胚細胞から分化して形成される奇形腫のことである。
そこで、本発明においては、ｕＰＡによりテラトーマを予防または防止する方法、およびテラトーマの発症確率の低い肝細胞の移植方法を提供する。
以下に示す実施例では、ｕＰＡ添加（ａ）もしくは無添加（ｂ）で１８日間分化誘導培養を行ったＥＳ細胞に由来する分化細胞、または分化誘導培養を行わないで未分化状態が維持されているＥＳ細胞（ｃ）を用いて細胞移植を行った。細胞（ｂ）または細胞（ｃ）をマウスに移植すると、移植を行ったマウス全例でテラトーマが形成した。テラトーマを形成した肝臓では、未分化細胞のマーカーであるｏｃｔ−４の発現が確認された。ｕＰＡによる分化誘導を行わない細胞では、より未分化な細胞が多く含まれており、生着した臓器で多様な細胞へと分化し、テラトーマを形成したと考えられる。一方、ｕＰＡを添加して分化誘導した細胞（ａ）を用いて細胞移植を行ったマウスでは、テラトーマを形成しなかった。これらのことから、ｕＰＡ添加により分化誘導を行うと、細胞移植の際にテラトーマが形成される確率を減少させることが明らかになった。
すなわち、ＥＳ細胞は未分化細胞が多く残っている場合ではテラトーマを形成するが、ｕＰＡ添加により分化度を高めることで、テラトーマ形成の確率を下げることが可能であること、またはテラトーマの発症を予防もしくは防止することが可能であることが明らかとなった。本発明において、予防は、ｕＰＡを用いない従来の移植方法におけるテラトーマの発症率を低減すること、テラトーマの発症時期を遅らすこと、テラトーマの発症を防ぐことなどの意味を含む。
したがって、本発明により、ｕＰＡを含有するテラトーマの発症確率低減剤または予防剤が提供される。また、本発明によりｕＰＡをＥＳ細胞に接触させ、当該ＥＳ細胞から分化した肝細胞（ＥＳ細胞由来分化細胞）を生体に移植することを含む、肝細胞移植方法、およびテラトーマの発症確率低減方法またはテラトーマの予防もしくは防止方法が提供される。
ここで、細胞を移植される生体（レシピエント）は、特に限定されず、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、サル、ヒト等を挙げることができ、好ましくは、ヒトまたはマウスである。
細胞の移植方法は、公知の手法を用いることができ、例えば経脾移植、門脈注入法を挙げることができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
方法
１．ＥＳ細胞の培養と肝細胞への分化誘導
（１）ＥＳ細胞の培養方法
以下の実施例では、マウス由来のＴＴ２  ＥＳ細胞をモデル細胞として実験を行った。
まず、ゼラチン（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃  １６６３１−０５）を０．１％になるように溶解させたＰＢＳ（−）８ｍｌを１００ｍｍ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｃｏｄｅ＃３５−３００２）に入れ、３時間以上静置させたディッシュ（以下、「ゼラチンコートディッシュ」ともいう）を作製した。ＴＴ２細胞の培養は、ゼラチンコートディッシュ上で行った。培養条件は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；日水製薬株式会社，Ｃｏｄｅ＃０５９１５）に以下の物質を添加したＤＭＥＭ（以下、「ＥＳ細胞培養用培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「ＥＳＭ」ともいう）を用い、３７℃、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ存在下で細胞がコンフルエントになるまで培養した（Ｈｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  Ｓｕｐｐｌ．１９８８；１０：２５７−６６．）。
ＤＭＥＭに添加した物質
非動化済２０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；Ｂｉｏ  ｗｅｓｔ，Ｌｏｔ＃Ｓ０５１１５Ｓ１８２０，Ｃｏｄｅ＃Ｓ１８２０）
１．５ｍｇ／ｍｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃１６８−０６）
２０ｍＭ  Ｄ−（＋）−ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃３１２１３−１５）
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃１７５−１４）
１０００Ｕ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ；Ａｍｒａｄ，Ｃｏｄｅ＃５３９−２４３０１）
１００μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ；Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃２１４−１８）
１０ｍＭ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ＭＥＭ（ＮＥＡＡ；ｓｉｇｍａ，Ｃｏｄｅ＃Ｍ−７１４５）
（２）ＥＳ細胞の解凍方法
クライオチューブで液体窒素中に凍結保存しておいたＴＴ２細胞を３７℃の湯浴中で素早く解凍し、直ちにＥＳＭを入れた遠沈管に移して細胞を懸濁した。遠心分離（１０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）後、上清を除去した。この作業を二回繰り返して、細胞を洗浄した。細胞洗浄後、再度ＥＳＭ中に細胞を懸濁し、１００ｍｍゼラチンコートディッシュに細胞を播種し、２４時間後に未接着細胞を除去し、以後コンフルエントになるまで７２時間毎に培地交換を行ってＥＳ細胞を培養した。
（３）ＥＳ細胞の継代方法
細胞がコンフルエントに到達後、培地を除去してＰＢＳ（−）で洗浄した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ−ＰＢＳ）を加え、ＣＯ２インキュベーター内で１〜２分間インキュベートし、細胞をディッシュ表面から剥離させた。ＥＳＭを加え、酵素反応を停止後、細胞懸濁液を遠沈管に回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）した。分離後上清を除去し、再びＥＳＭに懸濁し、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ  ｄｉｓｈの細胞密度で１０ｃｍゼラチンコートディッシュに播種し、以後コンフルエントになるまで７２時間毎に培地交換を行って培養した。
（４）ＥＳ細胞の保存法
ＥＳ細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ−ＰＢＳ）によりディッシュから剥離、回収後、１０％ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ含有ＥＳＭに細胞密度６．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させ、クライオチューブに１ｍｌずつ分注した。１分間に１℃ずつ液体温度が下がるようにチューブを発砲スチロールの容器に入れ、−８０℃フリーザー内で静置し、２４時間後、液体窒素に移して保存した。
（５）ハンギングドロップ法によるＥＳ細胞からの胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ，ＥＢ）の形成方法
細胞培養液を、分化誘導用のＬＩＦ未添加、ＦＢＳ、ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、２−ＭＥ含有Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）（以下、「２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ」ともいう）に交換後、ハンギングドロップ法によりＥＢを形成させた。具体的には、図１に示すように、未分化培養を行っている細胞をＰＢＳ（−）により洗浄し、トリプシン処理により細胞を単離した（Ａ）。単離した細胞を２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭに懸濁させ、ドロップ中３０μｌの細胞密度が１×１０３ｃｅｌｌｓになるように、１００ｍｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｃｏｄｅ＃３５−１００５）のフタに播種し、さらにディッシュ部分には乾燥防止用のｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ（−）；日水製薬株式会社，Ｃｏｄｅ＃５９１３）を満たして５日間培養した（Ｂ）（Ｃ）。形成されたハンギングドロップ中のＥＢはｄｒｏｐ形成５日目に６０ｍｍ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｄｉｓｈ（Ｉｗａｋｉ，Ｃｏｄｅ＃４０１０−０１０）に移植し、ディッシュに接着させて２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭで分化誘導培養を行った（Ｄ）。以下、「２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ」を「分化誘導培地」ともいう。図２，８，１３に記された培養日数は、ハンギングドロップ法で培養開始後の日数を示す。
実施例において、ハンギングドロップ法を用いて形成したＥＢ由来の細胞の分化度は、分化マーカーのｍＲＮＡやそのタンパク質発現量、光学顕微鏡を用いた形態観察などから判定した。例えば、これらの細胞からＩｓｏｇｅｎ  ＴＭ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製後、ＲＴ−ＰＣＲにより各種マーカー遺伝子の発現を検討した。また、タンパク質の発現量はＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により検討した。以下にこれらの方法について記載する。
２．Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）による各種分化マーカーｍＲＮＡ発現の解析
細胞は、培養液を除去後ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、６０ｍｍディッシュに対してＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン，Ｃｏｄｅ＃３１１−０２５０１）を１ｍｌ添加して、５分間放置後、セルスクレーパーで回収した。この溶液に、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃０８４０２−５５）を０．２ｍｌ添加して１５秒間攪拌後、常温で３分間放置した。１２０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離後、上清を回収した。得られた上清に２−ｐｒｏｐａｎｏｌを０．５ｍｌ加えて転倒攪拌し、５分間常温で静置後、１２０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離後、上清を除去した。得られた沈殿に７０％ｅｔｈａｎｏｌを１ｍｌ添加して洗浄し、さらに７５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離後、沈殿は常温で自然乾燥させた。その後５０μｌのオートクレーブ処理超純水（ＤＷ）に溶解させてｔｏｔａｌ  ＲＮＡとした。
調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＤＷで１００倍希釈した後、ＵＶ法（ＲＮＡ；Ｏ．Ｄ．２６０＝４０μｇ／ｍｌ；１．０）により定量した。一定量のｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用いた。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）を用いて行った。プライマーとＰＣＲの条件は以下の通りである。
０．２５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含む５μｌの以下の反応液中でｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成後、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニッポンジーン，Ｃｏｄｅ＃３１７−０４１６１）を用い、ｃＤＮＡの増幅は、ｃＤＮＡの変性（９４℃、１分）、アニーリング反応（下記に示す各プライマーに最適な温度、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を１サイクルとし、所定のサイクル数行った。
反応液組成
５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業，Ｃｏｄｅ＃１８６−０１２５１）１μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ０．２５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｏｄｅ＃ＡＴＰ−１０１，ＴＴＰ−１０１，ＣＴＰ−１０１，ＧＴＰ−１０１）０．５μｌ
１０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（和光純薬工業，Ｃｏｄｅ＃５４７−００６０１）０．２５μｌ
１０Ｕ／μｌ  Ｍ−ＭＬＶ  ＲＮａｓｅ（和光純薬工業，Ｃｏｄｅ＃１８６−０１２５１）０．５μｌ
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ０．２５μｇ
プライマーはマウスの遺伝子情報を基にして設計合成したものを使用した。各プライマーの塩基配列、アニーリング温度、サイクル数は以下に示した通りである。
Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ＴＴＲ）（５’−ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡ（配列番号３），５’−ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＡ（配列番号４）；５５．２℃；２０ｃｙｃｌｅｓ）、
α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）（５’−ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＡ（配列番号５），５’−ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＡ（配列番号６）；５５．２℃；２５ｃｙｃｌｅｓ）、
α１−ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ（ＡＡＴ）（５’−ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＡＴ（配列番号７），５’−ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧ（配列番号８）；５４．２℃；２８ｃｙｃｌｅｓ）、
ａｌｂｕｍｉｎ（Ａｌｂ）（５’−ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＴＴＴ（配列番号９），５’−ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＡＧＴ（配列番号１０）；６０℃；３０ｃｙｃｌｅｓ）、
ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）（５’−ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣ（配列番号１１）；５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡ（配列番号１２）；６０℃；１８ｃｙｃｌｅｓ）、
ｏｃｔｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４（Ｏｃｔ−４）（５’−ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＴＴＣ（配列番号１３），５’−ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴ（配列番号１４）；６０℃；１８ｃｙｃｌｅｓ）、
ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１９（ＣＫ−１９）（５’−ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡ（配列番号１５）；５’−ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧ（配列番号１６）；５７．６℃；２２ｃｙｃｌｅｓ）、
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ７Ａ１（Ｃｙｐ７ａ１）（５’−ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ（配列番号１７）；５’−ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ（配列番号１８）；５６℃；３０ｃｙｃｌｅｓ）、
ｓｅｘ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｇｅｎｅ（ＳＲＹ）（５’−ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＴＡＣ（配列番号１９）；５’−ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＣＣ（配列番号２０）；５８℃；３６ｃｙｃｌｅｓ）、
ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＣＭＡ）（５’−ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  Ｃ（配列番号２１）；５’−ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  Ｃ（配列番号２２）；５６℃；２３ｃｙｃｌｅｓ）、
ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｕＰＡ）（５’−ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ（配列番号２３）；５’−ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＴＣ（配列番号２４）；５８℃；２５ｃｙｃｌｅｓ）。
増幅したＤＮＡは１．５％アガロースゲルでＤＮＡ分子量マーカー（株式会社ニッポンジーン，Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ，Ｃｏｄｅ＃３１５−００６６４）と共に電気泳動を行った。その後、エチジウムブロマイドを添加した超純水中で染色し、泳動像をポラロイドカメラで撮影し、スキャナーを用いてＰＣＲ産物のバンドを画像解析ソフトにより定量的に解析した。
３．Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いたａｌｂｕｍｉｎタンパク質発現量測定
各タイムポイントの細胞は、培養液を除去後ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、６０ｍｍディッシュに対しＰＢＳ（−）を５００μｌ添加し、セルスクレーパーで剥離し、回収した。さらに超音波破砕機により細胞を破砕し、これをサンプルとした。サンプルは、タンパク濃度を測定し、比較するサンプルの中で一番濃度の薄いタンパク質濃度に合わせた（１０７５〜１２００μｇ／ｍｌ）。サンプルと等量のサンプルバッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０％ＳＤＳ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，ｐＨ６．８）とを混合し、ＳＤＳ化した。ＳＤＳ化したサンプル１５μｌを１０％（ランニングゲル）、５％（スタッキングゲル）のポリアクリルアミドゲルにより８ｍＡで泳動した。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ，４６×５７ｃｍ，３ＭＭ  Ｃｈｒ，Ｃｏｄｅ＃３０３０−９１７）、メンブレン（Ａｄｖａｎｔｅｃ，ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，２２０×２２０ｍｍ０．４５μｍ，Ｃｏｄｅ＃Ａ０４５Ａ２２４Ｄ）をトランスファーバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ）で浸し、泳動終了後のランニングゲルとともにブロッティング装置にセットして、４℃、３０Ｖ、５００ｍＡ、４０Ｗの条件で１６時間ブロッティングを行った。さらに、４℃、７０Ｖ、５００ｍＡ、４０Ｗの条件で１時間ブロッティングを行った。ゲルをメンブレンから剥離し、ウォッシュバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ，ｐＨ７．４）で室温、１０分間の洗浄を２回行い、ブロッキングバッファー（３％スキムミルク，０．０５％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ  ｉｎ  ＴＢＳ，ｐＨ７．４）により室温で２時間、メンブレンをブロッキングし、一次抗体の抗原以外への結合を防いだ。ブロッキング後、ウォッシュバッファーにより室温で、１０分間の洗浄を２回行い、抗体インキュベーションバッファー（０．３％ｎｏｎ−ｆａｔ  ｍｉｌｋ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ，ｐＨ７．４）により１０００倍希釈した抗マウスアルブミンポリクローナル抗体（Ｂｉｏ  ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｔ＃０２２０−１８２９，Ｂａｔｃｈ＃２２０６２００５）を用い、４℃で２時間抗原抗体反応を行った。その後、ウォッシュバッファーにより室温、１０分間の洗浄を２回行った。さらに、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｄｅ＃１１１−０３５−００３）を抗体インキュベーションバッファーにより３０００倍希釈したものを二次抗体とし、室温で１時間反応させた。その後、ウォッシュバッファーによる洗浄を室温、２０分間で２回行い、コニカイムノステインＨＲＰ−１０００（コニカ株式会社，Ｃｏｄｅ＃ＨＲＰ−１０００）を用いてメンブレン上に濃青色のシグナルを得た。
４．タンパク質量測定
ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｏｄｅ＃２３２２７）を用いて細胞の全タンパク質濃度を測定した。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｏｄｅ＃２３２２１）とＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｏｄｅ＃２３２２４）を５０：１で良く混合し、マイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｏｄｅ＃２６９６２０）に２００μｌアプライした。サンプルを各ｗｅｌｌに５０μｌ添加し、攪拌後、３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ  ＮＪ−２３００，Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用い５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液として２ｍｇ／ｍｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃０１２−０２）を０，３１．２５，６２．５，１２５，５００，１０００，２０００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度となるように希釈し、検量線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を算出した。
５．ＰＡＳ染色法
（ｉ）試薬
１）０．５％過ヨウ素酸水溶液；過ヨウ素酸二水和物（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃２６６０５−３２）０．５ｇを超純水に溶解し、１００ｍｌにｆｉｌｌ  ｕｐした。
２）シッフ試薬；塩基性フクシン（和光純薬，Ｃｏｄｅ＃０６４−００５８２）を１ｇ、亜硫酸水素ナトリウム（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃｏｄｅ＃３１２−２０）を１ｇ、１Ｎ塩酸を２０ｍｌ超純水に加えて、遮光しながら溶解し、超純水２００ｍｌにＦｉｌｌ  ｕｐした。
３）亜硫酸水素ナトリウム（使用時調製）；１０％亜硫酸水素ナトリウムを６ｍｌ、１Ｎ塩酸を５ｍｌ超純水に加えて、超純水で１００ｍｌにｆｉｌｌ  ｕｐ後、１時間以上撹拌した。
培養細胞から培養液を除去し、ＰＢＳ（−）５ｍｌで３回細胞を洗浄した。洗浄後、９５％アルコールを５ｍｌ加え、３０分静置して固定した。３０分後、アルコール濃度を８０％，５ｍｌ、１分、続いて７０％，５ｍｌ、１分続いて５０％，５ｍｌ、１分と減少させて徐々に親水させ、最後に超純水で細胞を洗浄した。細胞の洗浄が終了後、０．５％過ヨウ素酸水溶液を加えて１０分静置した。１０分後、超純水で軽く水洗し、シッフ試薬を加えて１０分静置した。１０分後、水洗を行わずに、２％亜硫酸水素ナトリウムを加えて１分静置する作業を３回行い、流水で水洗した。水洗終了後、５０％アルコール，３分、続いて７０％アルコール，２分、続いて９５％アルコール，２分、続いて１００％アルコール，３分の操作を３回繰り返して脱水操作を行い、脱水終了後に光学顕微鏡で観察を行った。
６．蛍光免疫染色法を用いたａｌｂｕｍｉｎ陽性細胞の観察
細胞は、培地を除去し、ＰＢＳ（−）を３ｍｌ加えて、２回洗浄した。洗浄後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ（−）を３ｍｌ細胞に加えて５分静置した。氷冷１００％メタノールを加えて１分細胞固定を行い、メタノールを除去して５％スキムミルク含有ＰＢＳ（−）３ｍｌ中で１時間静置してブロッキングした。５％スキムミルク含有ＰＢＳ（−）を除去して５％スキムミルク含有ＰＢＳ（−）で５００倍に希釈したウサギ抗マウスアルブミンポリクローナル抗体（Ｂｉｏ  ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｔ＃０２２０−１８２９，Ｂａｔｃｈ＃２２０６２００５）を２ｍｌ添加し、１時間インキュベーションした。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、５％スキムミルク含有ＰＢＳ（−）で５００倍に希釈した二次抗体（ｓｈｅｅｐ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ＃５５６４７，Ｌｏｔ＃０２７５６）を２ｍｌ添加し、遮光した状態で１時間インキュベーションした。洗浄ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、倒立リサーチ顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，ＩＸ７１）で観察した。
７．Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＦＰ）を用いたｕＰＡの不活性化
ＤＦＰ（和光純薬株式会社，Ｃｏｄｅ＃０４６−２８５６１，Ｌｏｔ＃ＣＥＥ３９５１）は、水溶液中で速やかに分解される物質である。そのため、ＤＦＰの溶解・希釈はイソプロパノールを用いて行った。３０００Ｕ／ｍｌのｕＰＡ（持田製薬）に対し、ＤＦＰを終濃度５ｍＭになるように添加した。ＤＦＰ添加後、室温で２時間放置した。放置後、透析用セルロースチューブ（三光純薬，Ｃｏｄｅ＃ＵＣ３６−３２−１００）に全量を移し、ＰＢＳ（−）１Ｌに対して４℃で２４時間透析した。この間、外液を２回交換した。透析処理終了後、ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ、ｆｉｂｒｉｎ  ｐｌａｔｅを用いてｕＰＡの不活性化を確認した。確認後、ろ過滅菌を行い、培養添加実験に用いた。
８．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）を用いたａｌｂｕｍｉｎ陽性細胞の解析
培養細胞の培地を除去してＰＢＳ（−）で洗浄、０．２５％トリプシン溶液にて細胞をディッシュ表面から剥離させた後、以下の組成のコラゲナーゼ溶液を５ｍｌ加えて３０分間３７℃でインキュベートし、細胞間の接着を消化した。
コラゲナーゼ溶液
トリプシインヒビター５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｔｙｐｅ  ＩＩ−Ｏ：Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｏｄｅ＃２３２−９０６−９）
コラゲナーゼ５０ｍｇ（Ｗａｋｏ，ｃａｔａｌｏｇ＃０３５−１７６０４，Ｌｏｔ＃ＣＥＨ０３２８）
ＨＥＰＥＳ０．２３８ｇ，
ＮａＨＣＯ３０．０３５ｇ含有ハンクス溶液１００ｍｌ（日水製薬株式会社，Ｃｏｄｅ＃０５９０６）
消化後、遠心分離（１０００ｒｐｍ，４℃，５分）により細胞を回収して氷冷１００％メタノール１ｍｌを用いて細胞を固定した。細胞固定処理後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，４℃，５分）し、メタノールを除去した。ＰＢＳ（−）を５００μｌ添加し、ウサギ抗マウスアルブミンポリクローナル抗体（Ｂｉｏ  ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｔ＃０２２０−１８２９，Ｂａｔｃｈ＃２２０６２００５）を１μｌ添加して室温で１時間静置後、ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗ウサギＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ＃５５６４７，Ｌｏｔ＃０２７５６）を添加し、遮光して１時間静置した。１時間静置後、ＦＳＣ  ｖｏｌｔａｇｅを８０，ＦＩＴＣ  ｖｏｌｔａｇｅを３００，ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１０００に設定したＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で細胞を取り込み、ＢＤ  ＤｉＶａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図１２、１３は、縦軸にＦＳＣ，横軸にＦＩＴＣ強度を表示した。
９．経脾肝移植法を用いたＥＳ細胞由来分化細胞の細胞移植法ならびに検討法
先に述べたように、実施例で用いたＴＴ２細胞は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスとＣＢＡマウスを交配して樹立されたオスマウス由来のＥＳ細胞である。そこで、細胞移植実験には、レシピエントとしてＣ５７／ＢＬ６メスマウスを用いた。移植に用いるＥＳ細胞は、ハンギングドロップ法によりＥＢを作製し、コラーゲンコートディッシュに播種して分化誘導培養を行ったものを使用した。分化誘導培養時に、ｕＰＡ添加もしくは非添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）の条件下で細胞を１８日間培養し、トリプシン処理およびコラゲナーゼ処理を行い、単離した。
経脾肝細胞移植方法の手順を図１４に示す。マウスの体重２０ｇあたり２０％ＣＣｌ４溶液（２０μｌ  ＣＣｌ４に８０μｌのオリーブオイル添加）を１００μｌ腹腔内に投与し（２０μｌ  ＣＣｌ４／２０ｇマウス体重）、肝障害を誘導した（０日）。四塩化炭素投与から６時間後にＥＳ細胞由来分化細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の懸濁液１００μｌを脾臓から注入した。移植を行ってから１４日後に肝臓と脾臓を回収し、形態観察を行い、テラトーマ形成の有無を確認した。テラトーマを形成した臓器の場合はテラトーマ形成部分を含む２箇所から、テラトーマが観察されなかった肝臓では葉の中心部と端の部分から、テラトーマが観察されなかった脾臓では脾臓を３等分した下極部と中極部からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。オスマウス由来細胞が臓器に生着しているかを確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＳＲＹ）の発現を確認した（Ｋｉｄｏｋｏｒｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｆｅｂ  １５；２７８（２）：５１１−２５．）。また、生着した細胞が未分化細胞、もしくは分化細胞であるのかを確認するため、ｏｃｔ−４の発現を確認した。
実施例１：    ハンギングドロップ法による胚葉体（ＥＢ）の形成と肝細胞への分化誘導
本実施例では、マウス由来のＴＴ２  ＥＳ細胞をモデル細胞に用いて実験を行った。ＥＳ細胞から胚葉体（ＥＢ）の形成は、ハンギングドロップ法を用いた。ハンギングドロップ培養を開始して５日目のＥＢをコラーゲンコートディッシュに播種し、２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭを用いて培養して肝分化を誘導した。
図２にハンギングドロップ法で分化誘導したＥＳ細胞における各種分化マーカーの発現解析結果を示す。分化を誘導したこれらの細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離後、ＲＴ−ＰＣＲにより各種分化マーカーの発現を観察した。
図２中、Ｏｃｔ−４はｏｃｔｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４、ＣＫ−１９はｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １９、ＡＦＰはα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＴＲはｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、Ａｌｂはａｌｂｕｍｉｎ、ＡＡＴはα１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ、ＣＭＡはｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをそれぞれ示す。
上記のようにＥＳ細胞を培養した結果、未分化の細胞マーカーであるＯｃｔ−４はコラーゲンコートディッシュにおいて分化誘導させたＥＢで６日後以降に発現が確認できなくなった。Ａｌｂｕｍｉｎやα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎなどの肝細胞の分化マーカー、ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＣＭＡ）などの心筋中胚葉マーカーの遺伝子発現は、ハンギングドロップ法により形成したＥＢをｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｄｉｓｈで培養することによって誘導された。心筋のマーカーであるＣＭＡは、肝細胞の分化マーカーよりも早い段階から発現することがわかった。さらに、ＥＳ細胞はＥＢ形成開始１８日目に肝細胞への分化度が高くなっていることが示された。
また、分化誘導培養１８日後の細胞に、インドシアニングリーン（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）を取り込ませて染色した。その結果を図３に示す。図３右の写真は、左の写真の四角で囲んだ部分を拡大したものである。左の写真の矢頭は心筋様細胞を示し、右の写真の矢印は肝様細胞を示す。
その結果、肝細胞特有の大きな核を有する細胞が観察された。また、拍動する心筋様細胞の周辺でインドシアニングリーンを取り込んだ細胞、すなわち肝細胞が多数観察された。この現象は、発生における心筋中胚葉に接する前腸内胚葉が肝細胞へと分化する現象とよく似た現象である（図４）。発生時期には心筋から分泌されるＦＧＦが肝細胞の発生に重要であることも最近報告されている。
本実施例から、ＥＢを形成してＥＳ細胞を培養することにより、ＥＳ細胞から肝細胞を誘導することが可能であることが明らかになった。そして、この培養系では、まず心筋細胞が出現して心筋由来の何らかの誘導因子により肝細胞への分化が促進されることが明らかになった。
以下の実施例２〜６では、肝発生に重要であることが明らかなＦＧＦ、またはｕＰＡが、ＥＳ細胞の肝細胞への分化に及ぼす影響について検討した。
ハンギングドロップ法により作製したＥＢを、コラーゲンコートディッシュに播種し、播種と同時にａＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ，ｃｏｄｅ＃Ｆ５５４２，終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）またはヒト由来ｕＰＡ（持田製薬株式会社、終濃度１０ｕ／ｍｌ）を添加して培養し、肝細胞への分化に及ぼす影響を検討した。肝細胞への分化度の検討は、肝細胞特異的マーカー遺伝子やタンパク質の発現に加え（実施例２、３、５）、ＰＡＳ染色によるグリコーゲン貯蔵細胞（実施例４）、蛍光免疫染色によるａｌｂｕｍｉｎ産生細胞（実施例４）について検討した。さらに、ＦＡＣＳ解析により、ａｌｂｕｍｉｎ産生細胞の質的、量的変化をコラゲナーゼ潅流法により単離したマウス成熟肝細胞と対比しつつ検討した（実施例６）。
実施例２：    ＦＧＦレセプター阻害剤またはａＦＧＦ添加による各種遺伝子、タンパク質発現量の変化
本実施例では、肝臓の発生の初期段階に関与しているＦＧＦに着目し、ＦＧＦがＥＳ細胞の分化誘導に及ぼす影響を検討した。
分化誘導培地にＦＧＦレセプター阻害剤であるＳｕ５４０２またはａＦＧＦを添加して１８日間培養した。培養後、ＲＴ−ＰＣＲにて各種分化マーカーの発現を観察した。また、タンパク質の発現量はｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により解析した。
図５中、Ａｌｂはａｌｂｕｍｉｎを、ＡＡＴはα１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎを、ＴＴＲはｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを、ｕＰＡはｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒを、ＧＡＰＤＨはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを示す。
ハンギングドロップ法により作製したＥＢをａＦＧＦの存在下でｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｄｉｓｈ上で培養したところ、ａｌｂｕｍｉｎまたはｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ７Ａ１（Ｃｙｐ７ａ１）（データ示さず）などの各種肝分化マーカーの発現が有意に増加した（図５）。
また、ａＦＧＦレセプターのシグナル阻害剤であるＳｕ５４０２を添加したところ、肝細胞の分化マーカーの発現が濃度依存的に抑制された。
これらの結果から、ａＦＧＦはＥＳ細胞から肝細胞への分化を誘導する際に、ＦＧＦレセプターのシグナルを介してＥＳ細胞から肝細胞への分化を促進することが示された。
実施例３：    ｕＰＡ活性阻害剤ｐ−アミノベンザミジン（ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）またはｕＰＡ添加による各種遺伝子、タンパク質発現量の変化
ＦＧＦはｕＰＡの遺伝子発現を誘導することが報告されている。そこで、本実施例では、ｕＰＡをＥＳ細胞に加えて、その分化に及ぼす影響を検討した。
分化誘導培地にｕＰＡ活性阻害剤であるｐ−アミノベンザミジンまたはｕＰＡを添加して１８日間培養した。ＲＴ−ＰＣＲ法にて各種分化マーカーの遺伝子発現を観察した。また、タンパク質の発現量はｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により解析した。
図６または図７において、Ａｌｂはａｌｂｕｍｉｎ、ＴＴＲはｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、ＡＡＴはα１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ、ＡＦＰはα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｕＰＡはｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ＧＡＰＤＨはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｃｙｐ７ａ１はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ７Ａ１、ＣＭＡはｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎを示す。
その結果、ａＦＧＦと同様にｕＰＡはａｌｂｕｍｉｎやＣｙｐ７ａ１（データ示さず）の発現を増加させ、肝分化を誘導することが示された（図６）。
また、ｕＰＡの活性阻害剤であるｐ−アミノベンザミジン（ｐ−ａｂ）（終濃度１００μＭまたは２００μＭ）の添加によっても、肝細胞マーカーの発現が抑制された（図７）。
一方、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＦＰ）により活性を阻害したｕＰＡまたはｕＰＡと同一の基質特異性を有するｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ＰＡは、肝細胞への分化を誘導しなかった。これらの結果から、肝分化の誘導にはｕＰＡ活性が必要である可能性が高いことが明らかになった。
次に、ｕＰＡ添加による遺伝子発現傾向の経時的な変化を検討した。
分化誘導培地にｕＰＡ添加または無添加して１８日間培養を行った。ＲＴ−ＰＣＲ法によって、各種分化マーカーの発現を観察した。
図８において、Ａｌｂはａｌｂｕｍｉｎ、Ｃｙｐ７ａ１はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ７Ａ１、ＣＭＡはｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを示す。
その結果、ＦＧＦやｕＰＡを添加しないｃｏｎｔｒｏｌ細胞における肝細胞分化マーカー（Ｃｙｐ７ａ１）の発現は、心筋の分化マーカーであるＣＭＡの発現ピークが現れた後に発現が増加した。これは、心筋細胞により産生される何らかの誘導因子が肝細胞への分化に重要であることを示している（図８）。
一方、ｕＰＡを添加するとＣＭＡの発現がピークに達する前に肝細胞分化マーカーの発現が上昇した（図８）。
本実施例から、ｕＰＡがＥＳ細胞の肝細胞への分化を誘導することがはじめて明らかになった。
実施例４：    ＰＡＳ染色によるグリコーゲン貯蔵細胞の観察および蛍光免疫染色によるａｌｂｕｍｉｎ産生細胞の観察
本実施例では、ＦＧＦまたはｕＰＡ等を添加しないｃｏｎｔｒｏｌ細胞とｕＰＡ添加細胞に対して、ＰＡＳによるグリコーゲン貯蔵細胞の染色およびａｌｂｕｍｉｎの蛍光免疫染色を行った。
分化誘導培地にｕＰＡを１０ｕ／ｍｌになるように添加または無添加して培養し、１５日目にＰＡＳ染色を行い、培養９日目に抗ａｌｂｕｍｉｎ抗体を用いてａｌｂｕｍｉｎ産生細胞を検出（緑色）した。ＰＡＳ染色の結果を図９に示す。白矢印は心筋様細胞を示す。Ａｌｂｕｍｉｎの蛍光免疫染色像を図１０に示す。図１０Ａ）は明視野像を示し、Ｂ）は蛍光像を示す。図１０の左図は、分化誘導を行っていないＥＳ細胞の結果を示す。
その結果、ｃｏｎｔｒｏｌ細胞では心筋細胞周囲にＰＡＳ染色陽性のグリコーゲン顆粒陽性細胞が局在しているのに対し、ｕＰＡ添加細胞では心筋細胞の周囲以外にもグリコーゲン顆粒陽性細胞が多数観察された（図９）。さらに、ｃｏｎｔｒｏｌと比較してｕＰＡ添加細胞により強いＰＡＳ染色像が確認された。
また、ａｌｂｕｍｉｎの発現はｃｏｎｔｒｏｌ細胞ではほとんど確認できなかった。Ａｌｂｕｍｉｎを発現する細胞はＰＡＳ染色陽性細胞の局在とよく一致して、細胞が多層構造を形成している部分で観察され、ａｌｂｕｍｉｎ陽性細胞もｕＰＡ添加により増加していた（図１０）。
実施例５：    ｕＰＡ、ＤＦＰ処理ｕＰＡまたはｔＰＡ添加による遺伝子発現量の変化
分化誘導培地にｕＰＡ、ＤＦＰ処理ｕＰＡ（ＤＦＰ−ｕＰＡ）またはｔＰＡの各因子を添加、もしくは、無添加（ｃｏｎｔ）で１８日間培養した。ｕＰＡをＤＦＰで処理することによりｕＰＡを不活化することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法にて各種分化マーカーの発現を観察した。
その結果、ｕＰＡの添加により、肝分化マーカーであるａｌｂｕｍｉｎまたはＣｙｐ７ａ１の発現量が増加した（図１１）。ＤＦＰ−ｕＰＡ、ｔＰＡの添加によっては、肝分化マーカーの発現量はほとんど変化しなかった（図１１）。
実施例６：    ａｌｂｕｍｉｎ産生細胞の解析
本実施例では、肝細胞の発現マーカーであるａｌｂｕｍｉｎを産生する細胞をＦＡＣＳで解析した。すなわち、ｕＰＡの添加により分化した細胞が、肝細胞と同じ特徴を有するかをＦＡＣＳ解析により検討した。
まず、マウス成熟肝細胞のＦＡＣＳ解析を行った。コラゲナーゼ潅流法により調製したマウス成熟肝細胞を抗ａｌｂｕｍｉｎ抗体を用いてＦＡＣＳ解析を行った。その結果、マウス成熟肝細胞中に、ａｌｂｕｍｉｎ陽性な細胞集団を同定することができた（図１２）。
次に、分化誘導培地にｕＰＡ、ＤＦＰ処理ｕＰＡまたはｔＰＡを添加して９日間培養した。トリプシンおよびコラゲナーゼ処理を施して細胞を単離し、抗ａｌｂｕｍｉｎ抗体を用いてＦＡＣＳ解析を行った。
その結果、ｕＰＡを添加したＥＳ細胞由来分化細胞では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較してａｌｂｕｍｉｎを産生する細胞が増加していた（図１３）。このａｌｂｕｍｉｎを産生する細胞集団は、マウスから単離した成熟肝細胞とほぼ同様な大きさ、ａｌｂｕｍｉｎ発現量を示した。ＥＳ細胞から分化させた細胞（Ｃｏｎｔ）では、全体の２２％がこのようなａｌｂｕｍｉｎ産生細胞であるのに対し、ｕＰＡ添加により分化を誘導した細胞（ｕＰＡ）では、ａｌｂｕｍｉｎ産生細胞は全体の５２％にまで増加していた。
また、ａｌｂｕｍｉｎ産生細胞は、ＤＦＰ処理ｕＰＡ（ＤＦＰ−ｕＰＡ）を添加した細胞では全体の２７．８％であり、ｔＰＡを添加した細胞では２７．２％であった。
したがって、ｕＰＡのみがＥＳ細胞から肝細胞への誘導を促進することが明らかになった。
実施例７：    移植後の肝臓および脾臓の形態観察並びに各種分化マーカーのＲＴ−ＰＣＲ解析
マウスへの細胞移植は、（ｉ）分化誘導培養を行わないで未分化状態が維持されているＥＳ細胞を用いた群、および（ｉｉ）ｕＰＡ添加による細胞分化誘導を行わないｃｏｎｔｒｏｌ細胞を用いた群と（ｉｉｉ）ｕＰＡ添加により分化誘導を行った細胞を移植するｕＰＡ群を設け、ＥＳ細胞移植群は４匹、そのほかそれぞれの群について３匹ずつに移植を行った。移植後１４日後に臓器を回収し、テラトーマの形成を観察した。
また、細胞移植後、肝臓と脾臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収してＲＴ−ＰＣＲを行い、各種遺伝子発現を測定した。テラトーマ形成が確認された臓器では、テラトーマ形成部位からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。テラトーマ形成が確認されなかった肝臓では、葉の中心部分と端の部分からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離し、脾臓では脾臓を三等分し、細胞注入を行った下極部分と中極部分からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。
結果を表１に示す。表１中、Ｏｃｔ−４はｏｃｔｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４を示し、ＳＲＹはｓｅｘ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｇｅｎｅを示す。
【表１】
2007110966.tif 000002
Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞を移植したマウス（ｕＰＡ（−））では、肝臓で３匹中３匹にテラトーマが形成していた。また、細胞を注入した脾臓でも３匹中１匹にテラトーマの形成が確認された。一方、ｕＰＡ添加群（ｕＰＡ（＋））では、肝臓に明確なテラトーマを形成したマウスは存在しなかった。また、脾臓についてもテラトーマを形成したマウスは存在しなかった。なお、分化誘導培養を行わないで未分化状態が維持されているＥＳ細胞を細胞移植に用いると、全例でテラトーマを形成した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞（ｕＰＡ（−））を移植したマウスの肝臓では、オスのマーカーであるＳＲＹ遺伝子発現は３匹中３匹で確認されたことから、細胞移植に用いたオス細胞がメスマウスの肝臓中で生着したことが示された。また、未分化細胞のマーカーである、ｏｃｔ−４の発現も３匹中３匹で発現が確認された。脾臓でのＳＲＹ遺伝子の発現は３匹中１匹のみ確認され、ｏｃｔ−４遺伝子の発現は脾臓では１匹も確認されなかった。Ｏｃｔ−４遺伝子の発現は見られなかったものの、移植に用いた細胞がテラトーマを形成する原因であった可能性が高い。
一方、ｕＰＡ添加群（ｕＰＡ（＋））の肝臓でのＳＲＹ遺伝子発現は３匹中２匹で確認され、ｏｃｔ−４遺伝子の発現は３匹中０匹であった。脾臓でのＳＲＹ遺伝子の発現は３匹中１匹で確認され、ｏｃｔ−４の発現は３匹中０匹であった。これらのことから、ｕＰＡ添加により分化誘導を行うと、細胞移植の際にテラトーマが形成される確率を減少させることが明らかになった。
本実施例において、ｕＰＡを用いて分化させた細胞をマウスに経脾移植すると、テラトーマ形成率が低下した。また、未分化マーカーであるｏｃｔ−４遺伝子の発現も観察されなかった。また、ｕＰＡ非存在下で分化誘導した細胞を移植すると、肝臓や脾臓においてテラトーマが形成された。これらの臓器では、ｏｃｔ−４の発現が観察されたことから、ｕＰＡを用いて分化させた細胞に比べて移植した細胞の分化度が低いことが示された。このことから、ｕＰＡによる分化を行わなかった細胞では、より未分化な細胞が多数含まれており、生着した臓器で多様な細胞へと分化し、テラトーマを形成したと考えられる。そして、ｕＰＡを用いて分化させた細胞は、従来方法で分化させた細胞に比べて分化度が高いことが示された。
また、本実施例により、ＥＳ細胞は特定の機能細胞に分化させ、好ましくはその分化度を高めることにより、移植が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、ｕＰＡを含む効率的なＥＳ細胞の分化促進剤、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進剤、または効率的なＥＳ細胞の分化促進方法、好ましくはＥＳ細胞から肝細胞への分化促進方法が提供される。また、本発明により、肝細胞の調製方法が提供される。また、本発明により、テラトーマの発現確率の低い移植方法が提供される。さらに、本発明により、テラトーマの予防剤またはテラトーマの予防方法が提供される。
本発明により、ＥＳ細胞から肝細胞への分化はｕＰＡにより誘導されることが初めて明らかとなり、ｕＰＡを用いてＥＳ細胞から肝細胞に効率的に分化させることが可能となった。
本発明は、好ましくは、ドナー不足、拒絶反応、臓器提供者における組織欠損など移植療法に関連するさまざまな問題の解決策の一つになり得る。
さらに、本発明により得られる肝細胞は、好ましくは従来の分化誘導方法による細胞と比べて分化度が高いものである。そのため、本発明により、好ましくは、移植に起因するテラトーマ（奇形腫）を発症する危険性が低く、移植療法により適した肝細胞を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号３〜２４：プライマー
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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