(57)【要約】  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のmRNAの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを封入したリポソームを含有し、該リポソームが眼球に到達するリポソームである、組成物等を提供する。ＮＡを封入したリポソームは、例えば、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、該脂質二重膜は、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有し、該リポソームが眼球に到達するリポソームである、組成物。
【請求項２】
リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ＲＮＡを封入したリポソームが、リード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項８〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ＲＮＡを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項１１または１２記載の組成物。
【請求項１４】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項１１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤。
【請求項１７】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項１６記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項１８】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項１６記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項１９】
リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２０】
カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤。
【請求項２１】
カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項１９または２０記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２２】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１９〜２１のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２３】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項１９〜２２のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２４】
ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項１６〜２３のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２５】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、請求項１６〜２３のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２６】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、請求項１６〜２３のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２７】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、請求項１６〜２３のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２８】
ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、請求項１６〜２７のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
【請求項２９】
リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を哺乳動物に投与する眼球における疾患の治療方法。
【請求項３０】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項２９記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３１】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項２９記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３２】
リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３３】
カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を哺乳動物に投与する眼球における疾患の治療方法。
【請求項３４】
カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項３２または３３記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３５】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項３２〜３４のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３６】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項３２〜３５のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３７】
ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項２９〜３６のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３８】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、請求項２９〜３６のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項３９】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、請求項２９〜３６のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項４０】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、請求項２９〜３６のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項４１】
ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、請求項２９〜４０のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
【請求項４２】
リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物の、眼球における疾患の治療剤の製造のための使用。
【請求項４３】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項４２記載の使用。
【請求項４５】
リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項４２〜４４のいずれかに記載の使用。
【請求項４６】
カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物、眼球における疾患の治療剤の製造のための使用。
【請求項４７】
カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項４５または４６記載の使用。
【請求項４８】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項４５〜４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項４５〜４８のいずれかに記載の使用。
【請求項５０】
ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項４２〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、請求項４２〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５２】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、請求項４２〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、請求項４２〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５４】
ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、請求項４２〜５３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼球において標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的遺伝子の発現を抑制する方法として、例えばＲＮＡ干渉（RNA interference、以下、ＲＮＡｉとよぶ）を利用した方法等が知られており、具体的には、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖ＲＮＡを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象が報告されている［“ネイチャー(Nature)”，1998年，第391巻，第6669号，p．806-811参照］。また、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖ＲＮＡの代わりに、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることが見出され、これはshort interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）と名づけられている（国際公開第０１／７５１６４号パンフレット参照）。【０００３】
哺乳類細胞では、長い二本鎖ＲＮＡを導入した場合、ウイルス防御機構によりアポトーシスが起こり、特定の遺伝子の発現を抑制することができなかったが、２０〜２９塩基のｓｉＲＮＡであれば、このような反応が起こらず、特定の遺伝子の発現を抑制できることが見出された。中でも２１〜２５塩基のものの発現抑制効果が高い［“ネイチャー(Nature)”，2001年，第411巻，第6836号，p.494-498、“ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス(Nature Reviews Genetics)”，2002年，第3巻，第10号，p．737-747、“モレキュラー・セル(Molecular Cell)”，(米国)，2002年，第10巻，第3号，p.549-561、“ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)”，(米国)，2002年，第20巻，第5号，p．497-500]。また、二本鎖ＲＮＡでなく、分子内ハイブリダイズにより、ヘアピン構造を有する一本鎖ＲＮＡも、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを示すことが報告されている［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)”, 2002年，第99巻，第9号，p．6047-6052参照］。【０００４】
ＲＮＡｉについては、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験においても多く検証されており、５０塩基対以下のｓｉＲＮＡを用いた胎児の動物での効果（特許文献１参照）および成体マウスでの効果（特許文献２参照）が報告されている。また、ｓｉＲＮＡをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓および肝臓の各臓器で特定の遺伝子の発現抑制効果が確認されている（非特許文献１参照）。さらに、脳細胞においてもｓｉＲＮＡを直接投与することで特定の遺伝子が発現抑制されることが報告されている(非特許文献２参照)。
一方、例えば糖尿病網膜症、未熟児網膜症または加齢黄斑変性等の眼球における疾患は、米国および世界における失明の主要な原因であり、これらのプロセスに関連する生化学的事象は未だ完全には解明されていない。
糖尿病網膜症は、網膜が傷んだ結果起こる。網膜は、光や色を感じ、それを脳に伝える役割をもっているが、そこには細かい血管(細小血管)が無数に張り巡らされている。糖尿病では、血液中に糖分を多く含み、血管壁が傷害をうけたり、細小血管がつまったりして、細小血管症を起こす。そのため、網膜の酸素や栄養が不足し、病的新生血管が出現し、眼底出血や硝子体出血等の症状を示す網膜症が起こる。
未熟児網膜症は，低出生体重児に起こる網膜の出血や剥離である。低出生体重児の場合、網膜の血管が充分に発達していないことがあり、出生直後の酸素投与等を契機に病的新生血管が生じて、網膜剥離や視力低下の原因となる。【０００５】
加齢黄斑変性は、眼底の中心にあり視力に最も影響する黄斑に、病的新生血管が生じて出血したり、網膜の組織が傷んだりする疾患である。該疾患は、加齢が大きな要因と考えられているが、原因ははっきりしていない。社会の高齢化に伴って、患者は増加しており、米国では、老人の失明の原因のトップになっている。【０００６】
現在、加齢黄斑変性を対象にして、ｓｉＲＮＡ医薬の臨床試験が進められているが、いずれも眼球内投与で行われており、体への侵襲性が高い。
すなわち、眼球において標的遺伝子の発現を抑制することを目的として、眼球内投与に代わる、全身投与によって該標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを標的組織に効率よく送達する方法の開発が求められている。【０００７】
一方、核酸の細胞内への送達手段として、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーを用いる方法が知られている。しかし、該方法では、核酸を含有するカチオニックリポソームやカチオニックポリマーを静脈内に投与後、血中から速やかに核酸が除去されてしまい、標的組織が肝臓や肺以外の場合、例えば腫瘍部位等の場合には核酸を標的組織に送達することができず、十分な作用の発現を可能とするに至っていない。そこで、核酸が血中で速やかに除去されるという問題点を解決した核酸封入リポソーム(リポソーム内に核酸を封入したリポソーム)が報告されている(特許文献３〜５および非特許文献３参照)。特許文献３では、核酸等を含有するリポソームの製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の水溶液とメタノールを加えて混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質／ＯＤＮの複合体を移行させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、特許文献４および非特許文献３では、ＯＤＮを、ｐＨ３．８のクエン酸水溶液に溶解し、脂質（エタノール中）を加え、エタノール濃度を２０ｖ／ｖ％まで下げてＯＤＮ内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにｐＨ７．５にて透析してリポソーム表面に付着したＯＤＮを除去してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームが製造されている。【０００８】
これらに対して特許文献５では、液体中で微粒子を脂質二重膜で被覆する方法で核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造することが報告されている。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、微粒子が脂質二重膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの脂質二重膜で被覆された微粒子（被覆微粒子）が、すぐれた効率で製造されており、また、特許文献５では微粒子の例として例えば水溶性薬物とカチオン脂質からなる静電的相互作用により形成される複合体が例示されている。複合粒子を被覆した被覆微粒子の粒子径は、被覆される複合粒子に応じて異なるが、ＯＤＮ−脂質複合体を被覆して得られた被覆微粒子は、粒子径が小さく、注射剤として使用可能であること、該被覆微粒子は、静脈内に投与した場合、高い血中滞留性を示し、腫瘍組織に多く集積したことが報告されている。
【特許文献１】国際公開第０２／１３２７８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／１０１８０号パンフレット
【特許文献３】特表２００２−５０８７６５号公報
【特許文献４】特表２００２−５０１５１１号公報
【特許文献５】国際公開第０２／２８３６７号パンフレット
【非特許文献１】ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)，2002年，第32巻，第1号，p．107-108
【非特許文献２】ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)，2002年，第20巻，第10号，p．1006-1010
【非特許文献３】バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta)，2001年，第1510巻，p．152-166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、眼球における標的遺伝子の発現を抑制するための組成物および眼球における疾患治療剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の（１）〜（５４）に関する。
（１）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有し、該リポソームが眼球に到達するリポソームである、組成物。
（２）  リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、（１）記載の組成物。
（３）  ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、（１）または（２）記載の組成物。
（４）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）  ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）  ＲＮＡを封入したリポソームが、リード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）  極性有機溶媒がアルコールである、（８）記載の組成物。
（１０）  極性有機溶媒がエタノールである、（８）記載の組成物。
（１１）  リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１２）  ＲＮＡを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（１３）  カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、（１１）または（１２）記載の組成物。
（１４）  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の組成物。
（１５）  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）  リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤。
（１７）  極性有機溶媒がアルコールである、（１６）記載の眼球における疾患の治療剤。
（１８）  極性有機溶媒がエタノールである、（１６）記載の眼球における疾患の治療剤。
（１９）  リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、（１６）〜（１８）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２０）  カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤。
（２１）  カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、（１９）または（２０）記載の眼球における疾患の治療剤。
（２２）  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、（１９）〜（２１）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２３）  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、（１９）〜（２２）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２４）  ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、（１６）〜（２３）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２５）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、（１６）〜（２３）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２６）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、（１６）〜（２３）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２７）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、（１６）〜（２３）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２８）  ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、（１６）〜（２７）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療剤。
（２９）  リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を哺乳動物に投与する眼球における疾患の治療方法。
（３０）  極性有機溶媒がアルコールである、（２９）記載の眼球における疾患の治療方法。
（３１）  極性有機溶媒がエタノールである、（２９）記載の眼球における疾患の治療方法。
（３２）  リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、（２９）〜（３１）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（３３）  カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を哺乳動物に投与する眼球における疾患の治療方法。
（３４）  カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、（３２）または（３３）記載の眼球における疾患の治療方法。
（３５）  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、（３２）〜（３４）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（３６）  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、（３２）〜（３５）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（３７）  ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、（２９）〜（３６）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（３８）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、（２９）〜（３６）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（３９）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、（２９）〜（３６）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（４０）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、（２９）〜（３６）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（４１）  ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、（２９）〜（４０）のいずれかに記載の眼球における疾患の治療方法。
（４２）  リード粒子と眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物の、眼球における疾患の治療剤の製造のための使用。
（４３）  極性有機溶媒がアルコールである、（４２）記載の使用。
（４４）  極性有機溶媒がエタノールである、（４２）記載の使用。
（４５）  リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、（４２）〜（４４）のいずれかに記載の使用。
（４６）  カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームを含有する組成物であり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物、眼球における疾患の治療剤の製造のための使用。
（４７）  カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、（４５）または（４６）記載の使用。
（４８）  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、（４５）〜（４７）のいずれかに記載の使用。
（４９）  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、（４５）〜（４８）のいずれかに記載の使用。
（５０）  ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、（４２）〜（４９）のいずれかに記載の使用。
（５１）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子である、（４２）〜（４９）のいずれかに記載の使用。
（５２）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子が、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ｅｔｓ転写因子、核因子および低酸素誘導因子のいずれかについての遺伝子である、（４２）〜（４９）のいずれかに記載の使用。
（５３）  眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡがＫＬＦ５  ｍＲＮＡである、（４２）〜（４９）のいずれかに記載の使用。
（５４）  ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのｍＲＮＡである、（４２）〜（５３）のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、眼球における該疾患に関連した標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、眼球における疾患に関連した該標的遺伝子の発現を抑制することで、眼球における疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１で得られた製剤を投与２時間後の蛍光眼底造影写真を示す図である。
【図２】実施例１で得られた製剤を投与８時間後の蛍光眼底造影写真を示す図である。
【図３】実施例１で得られた製剤を投与１６８時間後の蛍光眼底造影写真を示す図である。
【図４】実施例１で得られた製剤を投与の病変の各画素の輝度の合計の推移を表す図である。
【図５】実施例１で得られた製剤を投与２時間後の網膜切片におけるＦＩＴＣに由来する蛍光を示す図である。
【図６】実施例１で得られた製剤を投与４時間後の網膜切片におけるＦＩＴＣに由来する蛍光を示す図である。
【図７】実施例１で得られた製剤を投与１６８時間後の網膜切片におけるＦＩＴＣに由来する蛍光を示す図である。
【図８】実施例１で得られた製剤を投与２時間後の網膜切片におけるＦＡＭに由来する蛍光を示す図である。
【図９】実施例１で得られた製剤を投与４時間後の網膜切片におけるＦＡＭに由来する蛍光を示す図である。
【図１０】実施例１で得られた製剤を投与１６８時間後の網膜切片におけるＦＡＭに由来する蛍光を示す図である。
【図１１】実施例２で得られた製剤を２４時間ごとに３回投与し、初回投与の７２時間後の脈絡膜血管新生を示す図である。
【図１２】実施例３で得られた製剤を２４時間ごとに３回投与し、初回投与の７２時間後の脈絡膜血管新生を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の眼球における疾患に関連した標的遺伝子としては、ほ乳類の眼球においてｍＲＮＡを産生して発現する眼疾患関連遺伝子であれば特に限定されないが、眼疾患関連遺伝子として、例えば、眼疾患の病態形成に関与する遺伝子が好ましく、眼疾患における血管新生に関与する遺伝子等がより好ましく、例えば血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下ＶＥＧＦと略す)、血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor、以下ＶＥＧＦＲと略す)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子(Kruppel-like factor、以下ＫＬＦと略す)、Ets転写因子、核因子、低酸素誘導因子等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられ、具体的にはＶEＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦＲ遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、Ｅｔｓ転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子等が挙げられ、好ましくはＶEＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦＲ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子等が挙げられ、より好ましくはＫＬＦ遺伝子が挙げられ、さらにより好ましくはＫＬＦ５遺伝子が挙げられる。【００１４】
ＫＬＦはＫＬＦファミリーを含む。該ファミリーは、Ｃ末端のジンク・フィンガー(zinc finger)モチーフを特徴とする、転写因子のファミリーであり、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５またはＫＬＦ１６等が含まれる。哺乳類において、ＫＬＦファミリーは、様々な組織や細胞、例えば赤血球、血管内皮細胞、平滑筋、皮膚またはリンパ球等の分化に重要であること、また癌、心血管疾患、肝硬変、腎疾患または免疫疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry),2001年,第276巻,第37号,p.34355-34358、ジェノム・バイオロジー(Genome Biology),2003年,第4巻,第2号,p.206］。【００１５】
ＫＬＦファミリーのうちのＫＬＦ５は、ＢＴＥＢ２（basic transcriptional element binding protein 2）あるいはＩＫＬＦ（intestinal-enriched Kruppel-like factor）ともよばれる。血管平滑筋におけるＫＬＦ５の発現は、発生段階で制御を受けており、胎児の血管平滑筋では、高い発現を示すのに対し、正常な成人の血管平滑筋では発現が見られなくなる。また、バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋では、ＫＬＦ５の高い発現がみられ、動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でもＫＬＦ５の発現がみられる［サーキュレーション(Circulation)，2000年，第102巻，第20号，p．2528-2534]。【００１６】
ＶＥＧＦは、1983年に、Ferraraらにより発見された血管内皮細胞に特異的な増殖因子である。同年に、Senger、Dvorakらにより血管透過性作用を有する因子が発見されＶＰＦ（vascular permeability factor）と名付けられた。タンパク質のアミノ酸配列解析の結果、２つは同一のものであることがわかった。ＶＥＧＦは血管の内側にある内皮細胞の受容体に結合して増殖を促す。ＶＥＧＦは胎児期に血管をつくるだけではなく、病的な血管をつくるときにも作用している。例えば癌がある程度大きくなって酸素不足になると、ＶＥＧＦとその受容体が増加して血管新生が起こる。また血管透過性亢進作用により癌性腹水の原因になるとも考えられている。糖尿病が進行すると網膜に新生血管ができるが、これにもＶＥＧＦが働いている。つまり、新しい血管をつくるタンパクである。低酸素状態によりその発現が誘導されることにより血管新生への重要な役割を担っているといえる。また血管新生のみならず、腫瘍または炎症性病変等にみられる浮腫のメカニズムを説明するうえで本因子の関与が強く示唆されている。【００１７】
一方、ＶＥＧＦＲは血管内皮細胞や癌細胞自身が持っており、これらの物質が受容体と結合することにより受容体自身がリン酸化（活性化）され、その結果細胞内に増殖や遊走等様々な命令が伝達される。この受容体のリン酸化を阻害することで細胞内の伝達を阻害し、血管新生を阻害することが知られている。【００１８】
本発明におけるＲＮＡとしては、前記標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列および該配列と相補的な配列を含んでいるＲＮＡがあげられる。本発明におけるＲＮＡには、リボ核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。また、本発明におけるＲＮＡとしては、好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡがあげられる。ここではＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを例にとって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡについて説明する。他の遺伝子の場合も同様の構造を有し、また同様の操作で得ることができる。【００１９】
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡは、ＫＬＦ５  ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列（以下配列Ｘとする）および該配列と相補的な配列（以下、相補配列Ｘ’とする）を含んでいる。ＲＮＡとしては、（Ａ）配列Ｘの鎖（センス鎖）および相補配列Ｘ’の鎖（アンチセンス鎖）からなる二本鎖ＲＮＡの配列Ｘの鎖もしくは相補配列Ｘ’の鎖またはそれぞれの鎖の３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが同一または異なって付加された二本鎖ＲＮＡであってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ（以下、このような構造のＲＮＡをＫＬＦ５ｓｉＲＮＡとよぶ）、（Ｂ）配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが付加された、ヘアピン構造を有するＲＮＡであってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ（以下、このようなＲＮＡをＫＬＦ５ｓｈＲＮＡとよぶ）等があげられる。これらのＲＮＡに付加されるヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか１種または複数種でもよく、またＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、ウリジル酸（Ｕ）およびデオキシチミジル酸（ｄＴ）のいずれか１種または２種が好ましい。またスペーサーオリゴヌクレオチドとしては６〜１２塩基のＲＮＡが好ましく、その５’端の配列は２個のＵであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの配列からなるＲＮＡがあげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよい。また、いずれの場合も、相補配列Ｘ’の３’端側に隣接して付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、ｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接する塩基の配列と相補的な配列としてもよく、この構造がより好ましい。配列Ｘは、ＫＬＦ５  ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列であれば、いずれの配列でもよいが、国際公開第２００５／０１０１８５号パンフレットに記載の方法で設計した１９塩基の配列が最も好ましい。【００２０】
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制できるＲＮＡとして、具体的にはマウスＫＬＦ５の連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含む表１に示したＲＮＡがあげられる。なお、表１のＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．２〜４および７〜１１は、マウスＫＬＦ５  ｃＤＮＡと、ヒトＫＬＦ５  ｃＤＮＡを、配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、マウスで選択された配列と対応するヒトの配列を得ることができる。【００２１】
【表１】
2007080902.tif 000002
【００２２】
なお、表１のＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１は、例えば株式会社日本バイオサービス等に依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製できる。表１のＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．２〜１１はサイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット(Silencer（登録商標）siRNA Construction Kit、アンビオン社製)を利用したインビトロ転写により調製できる。インビトロ転写の鋳型作製に用いるＤＮＡは、例えば北海道システムサイエンス株式会社等に化学合成を依頼して得ることができる。【００２３】
本発明の組成物におけるリポソーム（以下リポソームＡ）としては、眼球における疾患に関連した標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームが好ましい。該リポソームＡは標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームであれば特に限定されないが、例えばリード粒子と前記ＲＮＡから構成される複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム等があげられ、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることが好ましい。また、リポソームＡとしては、好ましくはカチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームもあげられ、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることがより好ましい。
なお、本発明において、分散とは、溶解せずに分散することを意味する。【００２４】
本発明におけるリード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤等を構成成分とする微粒子があげられ、好ましくはリポソームを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤等を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。【００２５】
リード粒子の構成成分としての脂質集合体またはリポソーム（以下リポソームＢ）は、例えば脂質および／または界面活性剤等によって構成されるのが好ましい。該脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、中性脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド、ステロールまたはカチオン性脂質等があげられるがこれらに限定されない。好ましくはリン脂質またはカチオン性脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤(後記の界面活性剤と同義)または高分子(後記の高分子と同義、具体的にはデキストラン等)もしくはポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリエチレングリコール等)等の脂質誘導体も含まれる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または両性界面活性剤等があげられる。【００２６】
上記リード粒子を構成する脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。【００２７】
上記リード粒子を構成する脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等があげられる。【００２８】
上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等があげられる。【００２９】
上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の−ＮＨ2を−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）xＣＨ3(式中、ｘは０〜１８の整数を表し、中でも６、１２または１８が好ましい)に変換したもの等があげられる。【００３０】
上記リード粒子を構成する脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは３β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）等があげられる。【００３１】
上記リード粒子を構成する脂質におけるカチオン性脂質としては、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）またはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等があげられる。【００３２】
上記リード粒子を構成する非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸エステル（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）またはグリセリン脂肪酸エステル等があげられる。【００３３】
上記リード粒子を構成するアニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７〜２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
上記リード粒子を構成するカチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ−アルキルアミノプロピルアミンまたは脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。【００３４】
上記リード粒子を構成する両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸またはＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等があげられる。【００３５】
リポソームＢにおいては、これら脂質および界面活性剤は、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いられ、好ましくは２種以上組み合わせて用いられる。２種以上組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ＥＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。【００３６】
また、リポソームＢは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。これら安定化剤は１種単独でまたは２種以上組み合わせて使用し得る。【００３７】
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルＩ、ヘキサゴナルＩＩおよび脂質２分子以上からなる会合体等があげられる。【００３８】
エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンや水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョン粒子等があげられる。【００３９】
高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸またはＤＮＡ等の天然高分子、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子あるいはそれらの塩等があげられる。【００４０】
ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等があげられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩があげられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩があげられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩があげられる。【００４１】
金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウムまたは鉛等を含む金属コロイドがあげられる。【００４２】
微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクルまたは高分子ミセル等があげられる。【００４３】
また、本発明におけるリード粒子は、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤等を含有することができる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、リード粒子の構成成分として含有されてもよく、リード粒子の構成成分に加えて用いてもよい。【００４４】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、分子の一部がリード粒子の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分がリード粒子の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、２面性をもつ物質であるのが好ましい。【００４５】
糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等の核酸と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられる。【００４６】
また、糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。【００４７】
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。【００４８】
ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質（具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ）等）、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類（具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。【００４９】
ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質（具体的にはポリグリセリン−ホスファチジルエタノールアミン等）またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。【００５０】
界面活性剤としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた界面活性剤、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。【００５１】
上記したリード粒子は、正電荷をもつものが好ましい。ここで述べる、正電荷とは、前記ＲＮＡ内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。リード粒子が正電荷をもつには、リード粒子は、カチオン性物質を含有するのが好ましく、リード粒子は、カチオン性脂質を含有するのがより好ましい。【００５２】
リード粒子に含有されるカチオン性物質は、カチオン性を呈する物質であるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質に分類され得るものも含まれる。これらカチオン性物質は、リード粒子の構成成分として含有されてもよく、リード粒子の構成成分に加えて用いてもよい。【００５３】
カチオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。
カチオン性脂質としては、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ等があげられる。
カチオン性高分子としては、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（polyfect）またはキトサン等があげられる。【００５４】
等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。該蛋白質またはペプチドとしては、例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシンまたはリボヌクレアーゼＴ１等があげられる。【００５５】
本発明におけるリード粒子は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、リード粒子の１つであるリポソームＢを構成成分とするリード粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム（Bangham）らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J．Mol．Biol．)”，1965年，第13巻，p．238-252参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J．Cell Biol．)”，1975年，第66巻，p．621-634参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ(FEBS Lett．)”，1979年，第99巻，p.210-214参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch．Biochem．Biophys．)”，1981年，第212巻，p．186-194参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)”，1978年，第75巻， p．4194-4198参照］またはｐＨ勾配法（例えば特許第２５７２５５４号公報、特許第２６５９１３６号公報等参照）等があげられる。リポソームＢの製造の際にリポソームＢを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームＢの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームＢを製造することができる。【００５６】
また、例えば非イオン性界面活性剤(前記と同義)、カチオン性界面活性剤(前記と同義)、アニオン性界面活性剤(前記と同義)または高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソームＢ等のリード粒子の表面改質も任意に行うことができる［ラジック(D．D．Lasic)、マーティン(F．Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国)，シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc)，1995年，p．93-102参照］。表面改質に使用し得る高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート８０、プルロニックＦ６８、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコールまたはＰＥＧ−ＤＳＰＥ等があげられる。リポソームＢ等のリード粒子の表面改質は、リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させる方法の１つとしても用いることができる。【００５７】
リポソームＢの平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記するリード粒子径とするのが好ましい。リポソームＢの平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を機械的に粉砕（具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用）する方法［ミュラー(R．H．Muller)、ベニタ(S．Benita)、ボーム(B．Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”，ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart)，1998年，p．267-294参照］等があげられる。【００５８】
また、リード粒子を構成する例えば脂質集合体、リポソームＢ、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤等から選ばれる２つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で例えば脂質、高分子等を混合するだけでもよく、所望によりさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、前記複合体の製造は例えばアセトンまたはエーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。【００５９】
本発明におけるリード粒子の大きさは、平均粒子径が数ｎｍ〜数十μｍであるのが好ましく、約１０ｎｍ〜１０００ｎｍであるのがより好ましく、約５０ｎｍ〜３００ｎｍであるのがさらに好ましい。【００６０】
本発明におけるリード粒子とＲＮＡを含む複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質または界面活性剤等があげられ、好ましくは、脂質または界面活性剤のうちの中性脂質があげられる。ここで、前記中性脂質とは、脂質または界面活性剤のうちの、前記リード粒子が正電荷をもつ場合におけるカチオン性物質の中であげたカチオン性脂質とカチオン性界面活性剤および後記の付着競合剤の中であげたアニオン性脂質とアニオン性界面活性剤を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等があげられる。より好ましくはリン脂質があげられ、さらに好ましくはＥＰＣがあげられる。これら脂質または界面活性剤は１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。【００６１】
また、複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分は、極性有機溶媒に可溶であることが好ましく、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液中には、分散可能であることが好ましい。特定の濃度で該極性溶媒を含む液中の該極性溶媒の濃度は、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度が好ましい。該極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコールまたはポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール等があげられ、中でも、アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。
本発明における極性有機溶媒を含む液中の、極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等が挙げられ、好ましくは水が挙げられる。また、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。溶媒は１種または２種以上を用いることができるが、２種以上用いる場合は、相溶する組み合わせが好ましい。【００６２】
また、複合粒子を被覆する脂質二重膜に用いられる脂質としては、例えば合成脂質等も好ましくあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤または臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。【００６３】
また、複合粒子を被覆する脂質二重膜は、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体もしくは脂肪族炭化水素誘導体または前記界面活性剤を含有することが好ましい。水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、例えば前記の糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、前記水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体がより好ましく、前記ポリエチレングリコール化リン脂質がさらに好ましく、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンが最も好ましい。本発明における水溶性物質の脂肪族炭化水素誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるものがあげられる。【００６４】
糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトールまたは乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチドまたはグルタチオン等のペプチド、あるいは例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡまたはＯＤＮ等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。【００６５】
水溶性高分子の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体またはポリグリセリン誘導体等の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。【００６６】
また、脂質二重膜に用いられる脂質として、例えば合成脂質等もあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤または臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。
また、脂質二重膜は、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体もしくは脂肪族炭化水素誘導体または前記界面活性剤等を含有することが好ましく、前記水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含有することがより好ましく、前記ポリエチレングリコール化リン脂質を含有することがさらに好ましく、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンを含有することが最も好ましい。【００６７】
本発明における水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、例えば前記の糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。【００６８】
水溶性物質の脂肪族炭化水素誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるもの等があげられる。【００６９】
糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトールまたは乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチドまたはグルタチオン等のペプチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡまたはＯＤＮ等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。【００７０】
水溶性高分子の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体またはポリグリセリン誘導体等の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。【００７１】
リード粒子がリポソームＢを構成成分とする微粒子である場合、リポソームＢと前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるものがリポソームＡとなり、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームＢを構成成分とする微粒子以外である場合でも、脂質二重膜で被覆されているので、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子がリポソームＢを構成成分とする微粒子であることがより好ましい。【００７２】
本発明におけるリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子は、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に、該ＲＮＡをリード粒子に付着または封入して複合粒子を製造でき、さらに該複合粒子の製造後または複合粒子の製造と同時に、脂質二重膜で該複合粒子を被覆することによりリポソームＡを製造することができる。リポソームＡは、例えば、特表２００２−５０８７６５号公報、特表２００２−５０１５１１号公報、“バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)”，2001年，第1510巻，p．152-166、国際公開第０２／２８３６７号パンフレット等の公知の製造方法またはそれに準じて製造するか、例えばリード粒子に前記ＲＮＡを付着または封入して複合粒子を製造後、該複合粒子および被覆層成分を、該被覆層成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該被覆層成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる工程および該複合粒子を該被覆層成分で被覆する工程を含む製造方法で製造することができる。【００７３】
本発明の組成物におけるリポソームＡの好ましい製造方法としては、以下のリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子を製造する工程（工程１）および該複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程（工程２または工程３）を含む製造方法があげられる。【００７４】
工程１）  リード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子を製造する工程
リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に該ＲＮＡを付着させることが好ましい。工程１において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましい。凝集抑制物質としては、前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が好ましくあげられる。また、リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、該ＲＮＡと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該ＲＮＡとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と前記ＲＮＡの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての溶解度が、工程２または３で用いる脂質二重膜の構成成分よりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。【００７５】
付着競合剤としては、例えばアニオン性物質等があげられる。該アニオン性物質は、分子内の電荷、分子内分極等による静電的引力により、リード粒子の構成成分に静電的に付着する物質を包含する。付着競合剤としてのアニオン性物質は、アニオン性を呈する物質であるが、アニオン性の基とカチオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてアニオン性物質に分類され得る。【００７６】
アニオン性物質としてはアニオン性脂質、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性高分子等または等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質、ペプチドもしくは核酸等があげられ、好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。これらアニオン性物質は１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。【００７７】
アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジン酸等があげられる。【００７８】
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼまたはリゾチーム等があげられる。【００７９】
アニオン性物質としての核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡまたはＯＤＮ等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。【００８０】
付着競合剤は、リード粒子の構成成分に静電的に付着することが好ましく、リード粒子の構成成分に付着してもリード粒子の構成成分を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内に付着する部分と、付着に反発してリード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。【００８１】
工程１は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる操作（例えば該リード粒子が分散した液中に、該ＲＮＡを加えて分散または溶解させる操作、該リード粒子が分散した液中に、該ＲＮＡが分散または溶解した液を加える操作等）を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、該カチオン性脂質を含有するリポソームＢを構成成分とする微粒子に該ＲＮＡが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に前記ＲＮＡが付着して形成される複合粒子、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に前記ＲＮＡが付着して形成される複合粒子があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる操作が、該ＲＮＡが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、該ＲＮＡと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。【００８２】
リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に前記ＲＮＡが付着できれば特に限定されるものではないが、約１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、約０．１〜５００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。【００８３】
工程２）  複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程（その１）
工程１で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質二重膜の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する操作、次いで、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を脂質二重膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームＡが製造できる。この場合、リポソームＡは分散液（液Ｂ）の形態で得られる。液Ａにおける溶媒は、該脂質二重膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させた液Ｂでは、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能であることが好ましい。液Ａ中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒（液Ｃ）を加えること、および／または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合を減少させることができる。ここで、液Ｃは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む液が好ましいが、極性有機溶媒も液Ａにおける極性有機溶媒の割合より低ければ含んでいてよい。【００８４】
工程２における極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、液Ａおよび液Ｃは、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。これら溶媒は１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。【００８５】
極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Ａおよび液Ｂ中の溶媒ならびに液Ｃに対する、複合粒子および脂質二重膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、複合粒子については、液Ａおよび液Ｂ中の溶媒ならびに液Ｃのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、脂質二重膜の構成成分は、液Ｂ中の溶媒および液Ｃに対しての溶解度が低いことが好ましく、液Ａ中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、「複合粒子の溶解度が低い」とは、複合粒子に含有されるリード粒子、ＲＮＡおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液Ａ中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、リード粒子が正電荷をもつ場合、ＲＮＡ内の電荷、分子内分極等に対して静電的に結合し、液Ａ中の溶媒に対する溶解度が低くなれば、複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液Ａ中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームＡの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。【００８６】
液Ａにおける極性有機溶媒の割合は、脂質二重膜の構成成分が可溶で、複合粒子が分散可能であれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約３０ｖ／ｖ％以上、より好ましくは約６０〜９０ｖ／ｖ％である。また、液Ｂにおける極性有機溶媒の割合は、液Ａよりも低い濃度で該極性有機溶媒を含み、脂質二重膜の構成成分が分散可能で、複合粒子も分散可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは約５０ｖ／ｖ％以下である。【００８７】
液Ａを調製する工程としては、極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、または極性有機溶媒以外の溶媒を加えて液Ａを調製する工程があげられる。極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、または極性有機溶媒以外の溶媒は、複合粒子が溶解しなければ、それらを加える順序に特に制限はないが、好ましくは、例えば該複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｄ）を調製し、液Ｄ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に該脂質二重膜の構成成分を溶解させた液（液Ｅ）を調製し、液Ｄと液Ｅを混合して調製する工程があげられる。液Ｄと液Ｅを混合して液Ａを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。【００８８】
工程３）  複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程（その２）
工程１で得られた複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該脂質二重膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液（液Ｆ）中に分散させる操作を含む製造方法でリポソームＡが製造でき、この場合、リポソームＡは分散液の状態で得られる。液Ｆにおける溶媒は、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該極性有機溶媒を含む溶媒であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子がともに分散可能な特定の濃度で液Ｆに含まれている。【００８９】
液Ｆの調製方法はいかなる形態をも取ることができる。例えば複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を調製した後、両液を混合して液Ｆを調製してもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させて液Ｆを調製してもよい。複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を混合する場合には、複合粒子の分散媒は、あらかじめ極性有機溶媒を含んでいてもよく、また脂質二重膜の構成成分は溶解していてもまたは分散していてもよく、脂質二重膜の構成成分の溶媒または分散媒は極性有機溶媒を含む液または極性有機溶媒のみで構成される液であってもよい。一方、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、該分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加える場合には、該分散液は、極性有機溶媒を含む液であることが好ましい。なお、液Ｆを調製した後に複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲であれば極性有機溶媒を加えてもよく、極性有機溶媒を除去してもよく、または濃度を減少させてもよい。一方、液Ｆを調製した後に複合粒子は溶解していないが、脂質二重膜の構成成分が溶解している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を除去するかまたは濃度を減少させればよい。また、複合粒子と脂質二重膜の構成成分をあらかじめ極性有機溶媒以外の溶媒中で混合し、そこに複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えてもよい。その場合には、複合粒子および脂質二重膜の構成成分のそれぞれを極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、両分散液を混合した後で、極性有機溶媒を加えてもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方を極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させた後で、極性有機溶媒を加えてもよい。また、複合粒子および脂質二重膜の構成成分が分散し、極性有機溶媒を含有する液を、複合粒子が脂質二重膜で被覆されるに充分な時間、静置または混合する操作を含むことが好ましい。複合粒子と脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後、静置または混合する時間は、複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後に瞬時に終了させるのでなければ制限はないが、脂質二重膜の構成成分や、極性有機溶媒を含有する液の種類に応じて任意に設定することができ、得られたリポソームＡの収率が定常量となる時間を設定することが好ましく、例えば約３秒〜３０分である。【００９０】
液Ｆにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば工程２における極性有機溶媒以外の溶媒で例示した物があげられ、好ましくは水があげられる。【００９１】
液Ｆにおける極性有機溶媒の割合は、複合粒子と、脂質二重膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約１〜８０ｖｏｌ％、より好ましくは約１０〜６０ｖｏｌ％、さらに好ましくは約２０〜５０ｖｏｌ％、最も好ましくは約３０〜４０ｖｏｌ％である。【００９２】
本発明において、「脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に対して可溶」とは、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶化剤等を用いることにより脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒中で凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し得る性質をもつ場合等を包含する。また、「脂質二重膜の構成成分が分散する」とは、脂質二重膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。なお、「脂質二重膜の構成成分が溶解する」とは、脂質二重膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態を包含しない。【００９３】
本発明において、「複合粒子が分散する」とは、複合粒子が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化している状態のことであり、複合粒子の一部が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、複合粒子の一部が乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。「複合粒子が溶解しない」とは、前記の複合粒子が分散すると同義である。【００９４】
本発明におけるリポソームＡの製造方法において用いられる、極性有機溶媒含有水溶液中の複合粒子の濃度は、複合粒子を脂質二重膜で被覆できれば特に限定されるものではないが、約１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、約０．１〜５００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。また、用いられる脂質二重膜の構成成分の濃度は、複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、約１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、約０．１〜４００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。【００９５】
本発明のリポソームＡに対する脂質二重膜の割合は、重量比で約１：０．１〜１：１０００が好ましく、約１：１〜１：１０がより好ましい。【００９６】
また、本発明におけるリポソームＡの大きさは、平均粒子径が約３００ｎｍ以下であるのが好ましく、約２００ｎｍ以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。【００９７】
さらに、上記で得られるリポソームＡに抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物または高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームＡに包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られるリポソームＡに対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチドまたは脂肪酸類等による脂質二重膜の表面修飾を行うこともできる［ラジック(D. D. Lasic)、マーティン(F. Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc)，1995年，p．93-102参照］。また、リポソームＡに例えば水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体による表面改質も任意に行うことができ、これら表面改質に用いられる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体は、前記脂質二重膜の構成成分としての水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体と同義である。【００９８】
本発明の組成物は、人を含む哺乳動物に投与することで、前記ＲＮＡを標的遺伝子の発現部位である眼球内へ送達することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでほ乳類の細胞に、例えば、ＶＥＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦＲ遺伝子、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ等を導入することができ、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子等の発現の抑制ができる。本発明の組成物によって、例えばＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子等の発現が抑制され、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本発明の組成物を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う糖尿病網膜症、未熟児網膜症または加齢黄斑変性等の眼球における疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。また、本発明の組成物におけるＲＮＡを、補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物も、同様に眼球内へ送達することができ、眼球における疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する眼球における疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、眼球における疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物および本発明の組成物におけるＲＮＡを、補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物は、眼球における疾患の治療剤または予防剤に関するｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング系においてピーオーシー［ＰＯＣ(Proof of concept）］取得のツールとして使用することもできる。【００９９】
本発明の組成物および本発明の組成物におけるＲＮＡを、補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物は、例えば血液成分等の生体成分（例えば血液、消化管等）中での前記ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質または核酸の安定化、副作用の低減または眼球への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。【０１００】
本発明の組成物および本発明の組成物におけるＲＮＡを、補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物を、医薬品の眼球における疾患等の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えばＲＮＡに換算した１日投与量が約０．１μｇ〜１０００ｍｇとなるように投与すればよい。【０１０１】
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製したリポソームＡの分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースまたはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記のリポソームＡの分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥したリポソームＡに、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはＥＤＴＡ等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。【０１０２】
本発明の眼球における疾患の治療剤としては、例えば、リポソームＡのうち、リード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソーム、またはカチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソームを含有する眼球における疾患の治療剤等があげられる。
また、本発明は、上記説明した本発明の組成物の、眼球における疾患の治療剤の製造のための使用も提供する。【０１０３】
次に、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例１において用いたＲＮＡは、前記表１のＫＬＦ５ｓｉＲＮＡのうちＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．４の１本鎖ＲＮＡのそれぞれの５’端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で修飾し、それぞれの３’端に付加していたＵＵをｄＴｄＴに換えたＲＮＡ［ＦＡＭ−ＡＡＧＣＵＣＡＣＣＵＧＡＧＧＡＣＵＣＡｄＴｄＴ（配列番号２３）、ＦＡＭ−ＵＧＡＧＵＣＣＵＣＡＧＧＵＧＡＧＣＵＵｄＴｄＴ（配列番号２４）］を、北海道システムサイエンス社から入手し、アニーリングさせることにより調製した（以下、ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡという）。また、実施例２において用いたＲＮＡは、ラットＫＬＦ遺伝子のｍＲＮＡの連続する１９塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡ［５’−ＧＣＡＵＣＡＡＣＡＵＧＡＡＣＧＵＣＵＵ−３’（配列番号２５）、５’−ＡＡＧＡＣＧＵＵＣＡＵＧＵＵＧＡＵＧＣＵＧ−３’（配列番号２６）］であり（以下、ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ−２という）、実施例３において用いたＲＮＡは、ＶＥＧＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡの連続する１９塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡ［５’−ＣＵＧＡＧＵＵＵＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２７）、５’−ＧＧＧＵＧＣＣＵＵＵＵＡＡＡＣＵＣＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２８）］であり（以下、ＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡという）、それぞれ北海道システムサイエンス社から入手し、アニーリングさせることにより調製した。
【実施例１】
【０１０４】
ＤＯＴＡＰ（アバンチポーラルリピッズ社製）／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（日本油脂製、以下同様）／蒸留水を３０ｍｇ／１２ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた分散液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に２４回通してリード粒子を調製した。得られたリード粒子の分散液０．１８ｍＬに、ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの８ｍｇ／ｍＬ水溶液０．０９ｍＬを添加し、エタノール０．３６ｍＬを加えて複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液に、脂質二重膜の構成成分のＥＰＣ（日本油脂製）／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．０９ｍＬを添加し、次に蒸留水８．３ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整しリポソームを調製した。得られたリポソームの分散液を超遠心分離（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再分散させてリポソーム分散液を得た。ＥＰＣ  １２０重量部に対して５０重量部のＰＥＧ−ＤＳＰＥを少量（リポソーム分散液の約１／２５容量）のエタノールに溶解した（ＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液）。リポソーム分散液とＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液をそれぞれ７０℃で２分間加熱した。ついで、ＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液にリポソーム分散液を添加し、混合後、７０℃で２分間の加熱後、水冷し、製剤を得た。【０１０５】
試験例１
例えば加齢黄斑変性等の脈絡膜新生血管を生じる疾患モデル(Ryan SJ.Subretinal neovascularization after argon laser photocoagulation.Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 1980;215(1):29-42参照)を用い、次の方法により、実施例１で得られた製剤が、眼球に到達することを確認した。
Ｃ５７  ＢＬ／６ｊ（１０〜１２週齢）マウスの腹腔内に塩酸ケタミンを投与し、全身麻酔を行った。マウス右眼底に、半導体レーザーを、出力２００ｍＷ、凝固時間２０ｍｓｅｃ、凝固径φ２００μｍの照射条件で、３カ所照射した。照射時は、眼底に気泡が現れブルッフ膜が欠損し、網膜が白濁することを確認した。レーザー照射５日後、マウス陰茎静脈より実施例１で得られた製剤１００μＬ（ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ  １５０μｇに相当）を投与し、製剤投与後それぞれ１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間（１日）、４８時間（２日）、７２時間（３日）、９６時間（４日）、１２０時間（５日）、１４４時間(６日）および１６８時間（７日）後の蛍光眼底造影（眼底カメラTRC-50IX, TOPCON, Tokyo, Japan)(Y. Yanagi, Y. Tamaki, R. Obata, K. Muranaka, N. Homma, H. Matsuoka, and H. Mano, Subconjunctival administration of bucillamine suppresses choroidal neovascularization in rat, Invest Ophthalmol Vis Sci 43 (2002) 3495-3499参照)を行った。得られた蛍光眼底撮影写真を８ｂｉｔに変換し、病変の各画の輝度を合計してＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの網膜病変部位への集積を計算した。
図１〜３に、実施例１で得られた製剤投与後２、８および１６８時間後の蛍光眼底造影写真を示した。また、図４に、ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの網膜病変部位への集積の時間変化を示した。図１〜３には中心から放射状に走る正常血管が観察でき、さらに正常血管の間隙にレーザー障害による３箇所の障害部位が円形に造影されている。ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡが、障害部位に投与後８時間後に最大強度で造影され、さらに１６８時間後においても障害部位へ分布していることが観察でき、実施例１で得られた製剤は、眼球に到達していることが明らかとなった。【０１０６】
試験例２
試験例１と同様に、レーザーをマウス眼底に照射し、５日後にマウス陰茎静脈より実施例１で得られた製剤１００μＬ（ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ  １５０μｇに相当）を投与した。投与後２時間、４時間、７日後にマウスを全身麻酔下に開胸し、右心耳を切除し脱血した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識レクチン（Concanavalin A:VECTOR Laboratories Inc.(CA.USA)  FL-1001）１０質量％溶液４０μＬをＰＢＳ５ｍＬに希釈し、４０μｍのフィルタで濾過し、左心室へ注入・灌流した。さらに、ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄灌流した。実施例１で得られた製剤を投与後それぞれ２、４、１６８時間後に眼球を摘出し、１０μｍ厚の連続凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡でＦＩＴＣ由来の蛍光とＦＡＭ由来の蛍光をそれぞれ同じ視野で観察した。
図５〜７に、実施例１で得られた製剤を投与後それぞれ２、４、１６８時間後の網膜のＦＩＴＣに由来する蛍光写真を示した。図８〜１０には、実施例１で得られた製剤を投与後それぞれ２、４、１６８時間後の網膜のＦＡＭに由来する蛍光写真を示した。
図５および７は上方に網膜、下方に脈絡膜および強膜が位置する。図６は左下方に網膜、右上方に脈絡膜および強膜が位置する。緑色の蛍光が強く認められる部分はＦＩＴＣの集積を示す。脈絡膜においてびまん性に広がるＦＩＴＣに由来する蛍光が認められ、脈絡膜に新生血管が生じていることがわかる（Antonia M. Joussen, Toshinori Murata, Akitaka Tsujikawa, Bernd Kirchho, Sven-Erik Bursell and Anthony P. Adamis Leukocyte-Mediated Endothelial Cell Injury and Death in the Diabetic Retina American Journal of Pathology. 2001;158:147-152参照）。図８、９および１０は、図５、６および７とそれぞれ同一標本および同一視野で撮像されている。図８、９および１０において、ＦＡＭに由来する蛍光を示す部分はすべて、図５、６および７において新生血管を示すＦＩＴＣに由来する蛍光部位の範囲内に分布している。また、図７および１０からは、投与後７日までＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡが新生血管部位に残存していることがわかる。
【実施例２】
【０１０７】
実施例１におけるＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡを、ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ−２に換え、同様に製剤を得た。【０１０８】
試験例３
試験例１と同じ疾患モデルを用い、次の方法により、実施例２で得られた製剤が脈絡膜血管新生を抑制することを確認した。
Ｃ５７  ＢＬ／６ｊ（１０〜１２週齢）マウスの腹腔内に塩酸ケタミンを投与し、全身麻酔を行った。マウス両眼底に、半導体レーザーを、出力２００ｍＷ、凝固時間２０ｍｓｅｃ、凝固径φ２００μｍの照射条件で、３カ所照射した。照射時は、眼底に気泡が現れブルッフ膜が欠損し、網膜が白濁することを確認した。レーザー照射時、２４時間（１日）、４８時間（２日）後に、マウス尾静脈より実施例２で得られた製剤を毎回マウス体重２０ｇあたり１００μＬ（ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ−２  １００μｇに相当）を投与した。初回投与７２時間（３日）後に、０．７％フルオレセインを生理食塩水に溶かした溶液を毎回マウス体重２０ｇあたり２０μＬ（フルオレセイン  １４０μｇに相当）腹腔内に投与し、蛍光眼底造影を行った。得られた蛍光眼底撮影写真を８ｂｉｔに変換し、病変の各画の輝度を合計して脈絡膜血管新生を定量化した。また、対照として、実施例２で得られた製剤に換えて、ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ−２の生理食塩水溶液を毎回マウス体重２０ｇあたり１００μＬ（ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ−２  １００μｇに相当）投与して同様に試験した（対照１）。
図１１に、初回投与の７２時間後の脈絡膜血管新生を示す棒グラフを示した。実施例２で得られた製剤の投与は、対照１に対して有意に脈絡膜血管新生を抑制し、眼球における疾患の治療剤または予防剤として有用であることが明らかとなった。対照1に対する抑制率は２３％、ｐ＝０．０４５９であった。
【実施例３】
【０１０９】
実施例１におけるＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡを、ＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡに換え、同様に製剤を得た。【０１１０】
試験例４
実施例３で得られた製剤を毎回マウス体重２０ｇあたり１００μＬ（ＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ  １００μｇに相当）、対照として生理食塩水を毎回マウス体重２０ｇあたり１００μＬ（対照２）およびＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡの生理食塩水溶液を毎回マウス体重２０ｇあたり１００μＬ（ＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ  １００μｇに相当）（対照３）投与して試験例２と同様に試験した。
図１２に、初回投与の７２時間後の脈絡膜血管新生の抑制を示す棒グラフを示した。実施例３で得られた製剤の投与は、対照２および３に対して有意に脈絡膜血管新生を抑制し、眼球における疾患の治療剤または予防剤として有用であることが明らかとなった。対照２に対する抑制率は４２％、ｐ＝０．００５４であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係る組成物は、糖尿病網膜症、未熟児網膜症または加齢黄斑変性等の眼球における疾患の予防または治療剤として有用である。
【図１】
2007080902.tif 000003
【図２】
2007080902.tif 000004
【図４】
2007080902.tif 000005
【図１１】
2007080902.tif 000006
【図１２】
2007080902.tif 000007
【図３】
2007080902.tif 000008
【図５】
2007080902.tif 000009
【図６】
2007080902.tif 000010
【図７】
2007080902.tif 000011
【図８】
2007080902.tif 000012
【図９】
2007080902.tif 000013
【図１０】
2007080902.tif 000014
【配列表】
2007080902000001.app
【国際調査報告】
2007080902.tif 000015
2007080902.tif 000016
2007080902.tif 000017
2007080902.tif 000018
2007080902.tif 000019
2007080902.tif 000020
2007080902.tif 000021
2007080902.tif 000022