(57)【要約】  本発明は、光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造方法、より詳細には、２−置換アクロレイン誘導体の炭素−炭素二重結合を、その炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することにより、光学活性２−置換プロパナール誘導体を製造する方法に関する。  本発明によれば、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活性２−置換プロパナール誘導体、とりわけ光学活性２−アルキルプロパナール誘導体を、安価で入手容易な原料から簡便な方法で製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2006129628.tif 000010
（式中、Ｒは置換基を有するメチル基、置換基を有しても良い炭素数２〜１０のアルキル基、又は炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアラルキル基を表す。）で表される２−置換アクロレイン誘導体に、当該２−置換アクロレイン誘導体の炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式（２）：
【化２】
2006129628.tif 000011
（式中、Ｒは前記と同じ。＊は不斉炭素を表す。）で表される光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法。
【請求項２】
Ｒが、置換基を有しても良い炭素数２〜１０のアルキル基である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
Ｒが、置換基を有しても良い炭素数２〜４のアルキル基である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
前記炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、キャンディダ（Candida）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、スポロボロマイセス（Spolobolomyces）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシディフィリウム（Acidiphilium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、バシラス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、またはザントモナス（Xanthomonas）属に属する微生物由来の酵素源を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
前記炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、キャンディダ（Candida）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、スポロボロマイセス（Spolobolomyces）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、アシディフィリウム（Acidiphilium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、バシラス（Bacillus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、またはザントモナス（Xanthomonas）属に属する微生物に由来し、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
前記Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、キャンディダ・カンタレリ（Candida cantarellii）、キャンディダ・エチェルシー（Candida etchellsii）、キャンディダ・ケフィル（Candida kefyr）、キャンディダ・ムサエ（Candida musae）、キャンディダ・ニトラトフィラ（Candida nitratophila）、キャンディダ・サケ（Candida sake）、キャンディダ・ステラータ（Candida stellata）、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）、クライベロマイセス・ラクティス・バー・ドロソフィラルム（Kluyveromyces lactis var. drosphilarum）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ヒーディー（Pichia heedii）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、サッカロマイセス・ユニスポラス（Saccharomyces unisporus）、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）サッカロマイセス・セルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・カステリ（Saccharomyces castellii）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、スポリディオボルス・ジョンソニー（Sporidiobolus johnsonii）、スポリディオボルス・サルモニコラ（Sporidiobolus salmonicolor）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Spolobolomyces salmonicolor）、トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variabilis）、チゴサッカロマイセス・バイリー（Zygosaccharomyces bailii）、アースロバクター・ニコチアーネ（Arthrobacter nicotianae）、アシディフィリウム・クリプタム（Acidiphilium cryptum）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・リヘニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）バシラス・バディウス（Bacillus badius）、バシラス・ファエリクス（Bacillus sphaericus）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、シュードモナス・シュッツエリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、パエニバシラス・アルベイ（Paenibacillus alvei）及びザントモナス・スピーシーズ（Xanthomonas sp.）からなる群より選択される１種以上の微生物由来の酵素源である請求項５記載の製造法。
【請求項７】
前記Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2）遺伝子を有するベクターで形質転換された形質転換微生物の培養物である請求項５記載の製造法。
【請求項８】
前記炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、またはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物に由来し、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項９】
前記Ｓ選択的に還元する能力を有する酵素源が、アクロモバクター・キシロキダンス・サブスピーシーズ・デニトリフィカンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans）、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）、アースロバクター・クリスタロポエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アースロバクター・プロトフォロミス（Arthrobacter protophormise）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）及びエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）からなる群より選択される１種以上の微生物由来の酵素源である請求項８記載の製造法。
【請求項１０】
前記炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、EC番号（Enzyme Commission Number） 1.6.99に分類される酸化還元酵素を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１１】
前記EC 1.6.99に分類される酸化還元酵素として、EC 1.6.99.1に分類されるＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼを用い、かつ、前記式（２）で表される化合物のＲ体を製造する請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
前記ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2）である請求項１１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品または甘味料等の中間体として有用な、光学活性２−置換プロパナール誘導体、中でも光学活性２−アルキルプロパナール誘導体の製法に関する。より詳細には、安価に入手可能な２−置換アクロレイン誘導体を、その炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することを特徴とする、光学活性２−置換プロパナール誘導体、中でも光学活性２−アルキルプロパナール誘導体の製法に関する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
日本国特許２００５−１５８３９３号（２００５年５月３１日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法として、以下の様な方法が知られている。
１）プロリン誘導体を不斉補助基として用い、プロパナールを不斉アルキル化することにより、光学純度９４％ｅｅの（Ｒ）−２−メチルペンタナールを合成する方法（非特許文献１）。
２）ベアウベリア・スルフレセンス（Beauveria Sulfurescens）を用いて２−メチル−２−ペンテナールを微生物還元して光学活性２−メチル−１−ペンタノールを取得し、これを酸化して光学活性２−メチルペンタナールを合成する方法（非特許文献２）。
【非特許文献１】New Journal of Chemistry, 24(12), 973-975 (2000)
【非特許文献２】Tetrahedron, 37(22), 3825-3829 (1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記１）の方法では、不斉アルキル化反応に高価な不斉補助基が必要である。上記２）の方法では、副生物である２−メチル−２−ペンテン−１−オールが多量に生成する。【０００５】
上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活性２−置換プロパナール誘導体、中でも光学活性２−アルキルプロパナール誘導体を安価で入手容易な原料から簡便に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、安価に入手可能な２−置換アクロレイン誘導体を、その炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することにより、光学活性２−置換プロパナール誘導体を簡便に製造する方法を見出した。【０００７】
即ち、本発明の特徴の１つは、一般式（１）：【０００８】
【化３】
2006129628.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒは置換基を有するメチル基、置換基を有しても良い炭素数２〜１０のアルキル基、又は置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される２−置換アクロレイン誘導体に、当該２−置換アクロレイン誘導体（１）の炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることを特徴とする、一般式（２）：【００１０】
【化４】
2006129628.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒは前記と同じ。＊は不斉炭素を表す。）で表される光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法を提供する。【００１２】
本発明のその他の特徴およびそれらの効果は、以下の実施形態および図面によって明らかにされる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の上記方法により、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活性２−置換プロパナール誘導体を安価な原料から簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、組換えベクターｐＴＳＹＥ２Ｇ１の作製法及び構造を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．２−置換アクロレイン誘導体（出発物質）
まず、本発明の実施形態に関わる化合物について説明する。本発明の実施形態としての製造方法における出発物質は、前記式（１）で表される２−置換アクロレイン化合物である。前記式（１）における置換基Ｒとしては、置換基を有するメチル基、置換基を有していても良い炭素数２〜１０のアルキル基、又は置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアラルキル基が挙げられる。【００１６】
置換基を有する場合の置換基としては、酵素源による反応に悪影響を及ぼさない限り特に制限されず、例えばハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アミノ基またはニトロ基等の置換基が挙げられる。【００１７】
例えば、置換基を有するメチル基としては、クロロメチル基、ブロムメチル基、ヨードメチル基、ヒドロキシメチル基、アミノメチル基、又はシアノメチル基等が挙げられる。【００１８】
置換基を有しても良い炭素数２〜１０のアルキル基としては、置換又は無置換のエチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、又はｎ−ヘキシル基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、シアノ基等が挙げられるが、本発明の還元反応に悪影響を及ぼさない限りこれらに限定されるものではない。【００１９】
置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｍ−メトキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、又はピリジルメチル基等が挙げられる。【００２０】
上記のなかでもＲとして好ましくは、置換基を有しても良い炭素数２〜１０のアルキル基であり、より好ましくは置換基を有しても良い炭素数２〜４のアルキル基であり、更に好ましくはエチル基、ｎ−プロピル基またはｎ−ブチル基であり、最も好ましくはｎ−ブチル基である。【００２１】
前記式（１）で表される化合物は、工業的に入手可能、あるいは工業的に入手可能な原料から容易に合成することができる。例えば、２−ブチルアクロレインは、ｎ−ヘキサナール、ジメチルアミン塩酸塩、及び３７％ホルマリン溶液の混合物を、７０℃で２４時間攪拌することにより容易に合成することができる（Journal of chemical research, Synopses 7, 262-3 (1978)参照）。【００２２】
２．光学活性２−置換プロパナール誘導体（生成物）
実施形態としての製造方法における生成物は、前記式（２）で表される光学活性２−置換プロパナール誘導体である。前記式（２）において、Ｒは前記式（１）の場合と同じであり、＊は不斉炭素を表す。【００２３】
３．光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法
次に、本発明の実施形態としての光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法について説明する。【００２４】
実施形態においては、前記式（１）で表される２−置換アクロレイン誘導体の炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する活性を有する酵素源の存在下、当該２−置換アクロレイン誘導体（１）の二重結合を立体選択的に還元することにより、前記式（２）で表される光学活性２−置換プロパナール誘導体を製造する。【００２５】
４．酵素源
ここで、「酵素源」とは、上記還元活性を有する酵素自体はもちろんのこと、上記還元活性を有する微生物の培養物およびその処理物も含まれる。「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、また、その処理物であってもよい。「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の破砕物等を意味する。さらに上記酵素源は、公知の手段で固定化して、固定化酵素又は固定化菌体として用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。【００２６】
実施形態において、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ（Candida）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、スポロボロマイセス（Spolobolomyces）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシディフィリウム（Acidiphilium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、バシラス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、またはザントモナス（Xanthomonas）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられる。【００２７】
４−１．酵素源（Ｒ選択的に還元する活性を有する酵素源の例）
上記酵素源のうち、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合をＲ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ・カンタレリ（Candida cantarellii）、キャンディダ・エチェルシー（Candida etchellsii）、キャンディダ・ケフィル（Candida kefyr）、キャンディダ・ムサエ（Candida musae）、キャンディダ・ニトラトフィラ（Candida nitratophila）、キャンディダ・サケ（Candida sake）、キャンディダ・ステラータ（Candida stellata）、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）、クライベロマイセス・ラクティス・バー・ドロソフィラルム（Kluyveromyces lactis var. drosphilarum）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ヒーディー（Pichia heedii）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）サッカロマイセス・ユニスポラス（Saccharomyces unisporus）、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）サッカロマイセス・セルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・カステリ（Saccharomyces castellii）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、スポリディオボルス・ジョンソニー（Sporidiobolus johnsonii）、スポリディオボルス・サルモニコラ（Sporidiobolus salmonicolor）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Spolobolomyces salmonicolor）、トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variabilis）、チゴサッカロマイセス・バイリー（Zygosaccharomyces bailii）、アースロバクター・ニコチアーネ（Arthrobacter nicotianae）、アシディフィリウム・クリプタム（Acidiphilium cryptum）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・リヘニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）バシラス・バディウス（Bacillus badius）、バシラス・ファエリクス（Bacillus sphaericus）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、シュードモナス・シュッツエリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、パエニバシラス・アルベイ（Paenibacillus alvei）又はザントモナス・スピーシーズ（Xanthomonas sp.）等の微生物由来の酵素源が好ましい。【００２８】
４−２．酵素源（Ｓ選択的に還元する活性を有する酵素源の例）
また、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合をＳ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、アクロモバクター・キシロキダンス・サブスピーシーズ・デニトリフィカンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans）、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、アルカリゲネス・スピーシーズ（Alcaligenes sp.）、アースロバクター・クリスタロポエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アースロバクター・プロトフォロマイス（Arthrobacter protophormise）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）又はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の微生物由来の酵素源が好ましい。【００２９】
５．微生物
また、上記還元酵素の由来となる微生物としては、野生株または変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合または遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。【００３０】
さらにはこれら微生物由来の還元酵素を生産する能力を有する組換え微生物であってもよい。該酵素を生産する組換え微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法により得ることができる（国際公開第ＷＯ９８／３５０２５号公報に記載の方法参照）。【００３１】
上記のような組換え微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換微生物が挙げられる。また、宿主微生物としては大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。より好ましくは、上記サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2）遺伝子（The Journal of Biological chemistry, 268, 6097-6106 (1993)参照）を有するベクターで形質転換されたEscherichia coli HB101 (pTSYE2)等が挙げられる。このEscherichia coli HB101(pTSYE2)の取得方法は、後述の実施例７に記載した。【００３２】
また、上記酵素源として、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりEC 1.6.99に分類される酸化還元酵素を用いることもできる。EC 1.6.99に分類される酸化還元酵素としては、EC 1.6.99.1：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、EC 1.6.99.2：ＮＡＤ(Ｐ)Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）、EC 1.6.99.3：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、EC 1.6.99.5：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（キノン）、またはEC 1.6.99.6：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（キノン）に分類される酵素が挙げられ、なかでもEC 1.6.99.1に分類されるＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（別名：Old Yellow Enzyme）が好ましい。【００３３】
ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼとしては、キャンディダ（Candida）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、又はシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属等の酵母に広く分布していることが報告されており、とりわけ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2）が好ましい。【００３４】
酵素源として用いる微生物のための培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用することができる。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。【００３５】
６．還元反応
実施形態において、前記式（１）で表される化合物の炭素−炭素二重結合の還元反応は、適当な溶媒に、基質となる前記式（１）で表される２−置換アクロレイン誘導体、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び前記微生物の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができる。【００３６】
上記還元反応条件は用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％であり、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは基質に対して０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％、反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応のｐＨは４〜９、好ましくは５〜８であり、反応時間は１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間で行うことができる。また、反応には有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、メタノール、ジイソプロピルエーテル、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。【００３７】
基質は一括または連続的に添加することができる。また、反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。【００３８】
７．還元反応（補酵素再生系を用いる例）
実施形態の還元工程において、一般に用いられる補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系を組み合わせて用いてもよい。これにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。代表的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及びグルコースを用いる方法が挙げられる。【００３９】
還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物、すなわち、実施形態の還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要がないため、より低コストで光学活性２−置換プロパナール誘導体を製造することができる。【００４０】
上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡの両者を有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。ここで、補酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素が好ましく、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素がより好ましい。また、宿主微生物としては大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。そのような好ましい形質転換微生物として、後述の実施例で説明するEscherichia coli HB101 (pTSYE2G1)が挙げられる。【００４１】
形質転換微生物の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００４２】
また、形質転換微生物中の補酵素再生能を有する酵素の活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。【００４３】
なお、本発明の還元工程を、補酵素再生系と組み合わせて実施する、または、酵素源として上記形質転換微生物の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、補酵素として、より安価な酸化型のＮＡＤ（Ｐ）を添加して反応を行うことも可能である。【００４４】
８．光学活性２−置換プロパナール誘導体の精製
還元反応で生じた光学活性２−置換プロパナール誘導体の精製方法は特に限定されないが、反応液から直接あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の有機溶媒で抽出し、脱水後、濃縮した後、蒸留、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより精製することができる。反応液から菌体を分離する場合は、遠心分離や濾過等の常法で行うことができる。【００４５】
９．その他の誘導体への変換
上述の方法により前記式（２）で表される光学活性２−置換プロパナール誘導体を得た後、当該化合物のアルデヒド基を酸化すると、光学活性２−置換プロピオン酸誘導体を製造することができる。また、前記式（２）の化合物のアルデヒド基を還元すると光学活性２−置換プロパノール誘導体を製造することもできる。【００４６】
アルデヒド基の酸化方法としては、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）、クロム酸（ＣｒＯ3）、硝酸等を用いる化学的手法やアルデヒドデヒドロゲナーゼ等を用いる酵素的手法が挙げられ、いずれの方法を用いても良い。【００４７】
また、アルデヒド基の還元方法としては、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡｌＨ4）、ホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ4）等の金属水素化物を用いる化学的手法やアルデヒドリダクターゼ等を用いる酵素的手法が挙げられ、いずれの方法を用いても良い。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４９】
（実施例１）光学活性２−メチル−１−ヘキサナールの製造法
グルコース５％、ペプトン１％、酵母エキス１％からなる液体培地（ｐＨ６．５）を調製し、５００ｍｌ容坂口フラスコに５０ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。これらの液体培地に表１に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、菌体を水洗し、氷冷アセトンを添加した後、減圧乾燥することによりアセトン乾燥菌体を調製した。栓付試験管に、アセトン乾燥菌体５ｍｇを量り取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌに懸濁させた。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物をトリフルオロアセチル誘導体化してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析することで、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表１に示す（反応変換率は１０〜１００％）。【００５０】
分析条件、反応変換率及び光学純度の計算方法は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件］
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  ３００ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ、
カラム温度：４５℃
検出時間：（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナール  ４９．９分、（Ｓ）−２−メチル−１−ヘキサナール  ５１．５分、２−ブチルアクロレイン  ４４．６分
反応変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００  （Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである）【００５１】
【表１】
2006129628.tif 000004
【００５２】
（実施例２）光学活性２−メチル−１−ヘキサナールの製造法
肉エキス１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％からなる液体培地（ｐＨ６．５）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。これらの液体培地に表２に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌで洗浄し、同緩衝液５００μｌに再懸濁させ、栓付試験管に移した。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量を実施例１と同様の方法で分析することにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表２に示す（反応変換率は１０〜１００％）。【００５３】
【表２】
2006129628.tif 000005
【００５４】
（実施例３）光学活性２−メチル−１−アルキルプロパナールの製造法
栓付試験管に、実施例１で調製したアセトン乾燥菌体５ｍｇ、又は実施例２で調製した培養液から分離した菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌに懸濁させた。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、表３に示す各基質２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析することで、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表３に示す。【００５５】
分析条件は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件（２−メチルブタナール：基質及び生成物をトリフルオロアセチル誘導体化）］
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  ３００ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：４０℃
検出時間：（Ｒ）−２−メチル−１−ブタナール  １６．７分、（Ｓ）−２−メチル−１−ブタナール  １７．０分、２−エチルアクロレイン  １５．０分
［ＧＣ分析条件（２−メチルオクタナール）］
キャピラリーカラム：ＴＣ−ＷＡＸ  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５ｍ（ＧＬサイエンス社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  ８０ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：８０℃
検出時間：２−メチル−１−オクタナール  ２．８分、２−ヘキシルアクロレイン  ３．６分【００５６】
【表３】
2006129628.tif 000006
【００５７】
（実施例４）光学活性２−メチル−３−フェニルプロパナールの製造法
栓付試験管に、実施例１で調製したアセトン乾燥菌体５ｍｇ、又は実施例２で調製した培養液から分離した菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌに懸濁させた。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ベンジルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物をトリフルオロアセチル誘導体化してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析することで、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表４に示す。【００５８】
分析条件は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件］
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  ３００ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：８０℃
検出時間：（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール  １１３．９分、（Ｓ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール  １１６．９分、２‐ベンジルアクロレイン  ９６．２分【００５９】
【表４】
2006129628.tif 000007
【００６０】
（実施例５）サッカロマイセス・セレビジエ  Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ遺伝子（Old Yellow Enzyme 2 遺伝子）のクローニング
サッカロマイセス・セレビジエ  Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）（Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108)）株由来のＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2, 以後、ＯＹＥ２と呼ぶ）を大腸菌で発現させるために、以下に示した方法で発現ベクターを調製した（Appl Environ Microbiol., 69, 933, (2003)参照）。【００６１】
先ず、サッカロマイセス・セレビジエ  Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株の染色体ＤＮＡを鋳型とした１段階目のＰＣＲによりＯＹＥ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。次いで、１段階目のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を鋳型とした２段階目のＰＣＲにより、ＯＹＥ２遺伝子の開始コドン部分にＳａｃＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＳａｌＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを取得した。詳細を以下に示した。【００６２】
プライマー１：５’−cggtccagatatagaataaatcatcatattaag−３’（配列表の配列番号１）と、プライマー２：５’−gaaatggtgctacaaagtacggttaacac−３’（配列表の配列番号２）を合成した。このプライマー２種（プライマー１及び２）各５０ｐｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ  Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株の染色体ＤＮＡ２００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製した。熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）の条件にてＰＣＲ反応を行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の増幅を確認し、増幅断片をゲルから回収した。尚、染色体ＤＮＡは、通常のＤＮＡ単離法、例えば酢酸カリウム法等により調製した。次いで、ＯＹＥ２遺伝子の開始コドン上流に大腸菌のShine-Dalgarno配列（ＳＤ配列、９ヌクレオチド）を、さらにその直前にＳａｃＩ認識部位を付加したプライマー３：５’−atcgagctctaaggaggttaacaatgccatttgttaaggac−３’（配列表の配列番号３）、及び終始コドンの直後に新たな終始コドンとＳａｌＩ認識部位を付加したプライマー４：５’−acgcgtcgacttattaatttttgtcccaaccg−３’（配列表の配列番号４）を合成した。このプライマー２種（プライマー３及び４）各５０ｐｍｏｌ、先のＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡ断片２００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、上記と同じ条件にてＰＣＲ反応を行った。その結果、ＯＹＥ２遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のShine-Dalgarno配列（ＳＤ配列）が、さらにその直前にＳａｃＩ認識部位が付加され、かつ、終始コドンの直後に新たな終始コドンとＳａｌＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを取得した。この二本鎖ＤＮＡをＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報に記載の方法で当業者が取得可能）のＮｄｅＩ部位中のＧをＴに変換したプラスミドｐＵＣＴのｌａｃプロモーターの下流のＳａｃＩ、ＳａｌＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＹＥ２を構築した。【００６３】
（実施例６）グルコース脱水素酵素遺伝子を更に含む発現ベクターの構築
プライマー５：５’−acgcgtcgactaaggaggttaacaatgtataaagatttagaagg−３’（配列表の配列番号５）と、プライマー６：５’−gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga−３’（配列表の配列番号６）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur．J．Biochem．，186， 389 (1989)参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のShine-Dalgarno配列（ＳＤ配列）が、さらにその直前にＳａｌＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後に新たな終始コドンとＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを取得した。得られた二本鎖ＤＮＡをＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化した。これを上記の組換えベクターｐＴＳＹＥ２のＳａｌＩ認識部位とＰｓｔＩ認識部位の間に挿入して、組み換えベクターｐＴＳＹＥ２Ｇ１を構築した。ｐＴＳＹＥ２Ｇ１の作製法および構造を図１に示す。【００６４】
（実施例７）形質転換体の作製
実施例５で構築した組換えベクターｐＴＳＹＥ２を用いて大腸菌（Escherichia coli） HB101（宝酒造社製）を形質転換し、菌形質転換体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2)を得た。また、同様に、実施例６で構築した組換えベクターｐＴＳＹＥ２Ｇ１を用いて大腸菌（Escherichia coli） HB101（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2G1)を得た。【００６５】
（実施例８）形質転換体における遺伝子の発現
実施例７で得た２種類の形質転換体、及びベクタープラスミドｐＵＣＴ（実施例５参照）のみを導入した形質転換体Escherichia coli HB101 (pUCT)のそれぞれを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ液体培地（バクト・トリプトン１．６％、バクト・イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕を行い、遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＯＹＥ２活性、及びＧＤＨ活性を測定したものを表５に示した。【００６６】
実施例７で得られた２種類の形質転換体のいずれにおいても、ＯＹＥ２活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含む形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2G1)では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。【００６７】
尚、ＯＹＥ２活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−シクロヘキセノン  １ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ  ０．２ｍＭ及び粗酵素液を添加し、３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍの吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ+に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００６８】
ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００６９】
【表５】
2006129628.tif 000008
【００７０】
（実施例９）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−メチル−１−アルキルプロパナールの製造法
実施例７で得た形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2)を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌ２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％、バクト・イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を濃縮し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕を行い、遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液５０μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）４５０μｌに溶解させ、栓付試験管に移した。その後、表６に示す各基質２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量を実施例１及び３と同様の方法で分析することにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表６に示す。【００７１】
【表６】
2006129628.tif 000009
【００７２】
（実施例１０）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールの製造法
実施例９と同様に調製した形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2)の無細胞抽出液液５０μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）４５０μｌに溶解させ、栓付試験管に移した。その後、基質２−ベンジルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて栓付試験管に加え、３０℃で２時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量を実施例４と同様の方法で分析した。その結果、反応変換率９９．３％で光学純度９４．７％ｅｅの（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールが得られた。【００７３】
（実施例１１）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの製造法
実施例７で得た形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2G1)を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌ２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％、バクト・イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を濃縮し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕を行い、遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。５００ｍｌ４頭フラスコに上記無細胞抽出液３０ｍｌ、１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）１９５ｍｌ、５５％グルコース水溶液２５ｍｌ、ＮＡＤＰ２５ｍｇを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン１ｇをヘキサン１００ｍｌに溶解させ、２５分間かけて反応系中に滴下した。ｐＨ調整下、３０℃で１時間攪拌した後、ヘキサン層中の基質及び生成物量を実施例１と同様の方法で分析した。その後、反応液を分液し、減圧下にてヘキサンを留去して、収率８０％、光学純度９６．３％ｅｅの（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールを取得した。【００７４】
（実施例１２）形質転換体を用いた５−ヒドロキシ−２−メチル−１−ペンタナールの製造法
実施例１１と同様に調製した、形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2G1)の培養液５００μｌ、５５％グルコース溶液３０μｌ、ＮＡＤＰ０．５ｍｇを１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌと混合して栓付試験管に移した。その後、基質２−（３−ヒドロキシプロピル）アクロレイン１０ｍｇを加えて２時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層の基質及び生成物量を、以下に示す分析条件にてＧＣ分析した。その結果、反応変換率９６．９％で５−ヒドロキシ−２−メチル−１−ペンタナールが得られた。【００７５】
分析条件は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件］
キャピラリーカラム：β-ＤＥＸ２２５  φ０．２５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  １００ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：１２０℃
検出時間：５−ヒドロキシ−２−メチル−１−ペンタナール  ７．１分、２−（３−ヒドロキシプロピル）アクロレイン  １４．８分【００７６】
（実施例１３）形質転換体を用いた（Ｒ）−５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタナールの製造法
実施例１１と同様に調製した形質転換体Escherichia coli HB101 (pTSYE2G1)の培養液５００μｌ、５５％グルコース溶液３０μｌ、ＮＡＤＰ０．５ｍｇを１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌと混合して栓付試験管に移した。その後、基質２−（３−ベンジルオキシプロピル）アクロレイン１０ｍｇを加えて２時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層の基質及び生成物量を、以下に示す分析条件にてＧＣ分析した結果、反応変換率９９．１％で５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタナールが得られた。また、５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタナールをホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ4）で還元し、以下に示す分析条件にてＨＰＬＣ分析した結果、光学純度は９０．０％ｅｅ（Ｒ）であった。【００７７】
分析条件は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件］
キャピラリーカラム：ＴＣ−ＷＡＸ  φ０．２５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５ｍ（ＧＬサイエンス社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  ８０ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：１６５℃
検出時間：５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタナール  １１．１分、２−（３−ベンジルオキシプロピル）アクロレイン  １３．２分
［ＨＰＬＣ分析条件］
キラルカラム：ＯＢ−Ｈ  φ４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン/２−プロパノール  ９５/５
検出器：ＵＶ  ２５４ｎｍ
カラム温度：２５℃
検出時間：（Ｓ）−５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタノール  １２．２分、（Ｒ）−５−ベンジルオキシ−２−メチル−１−ペンタノール  １４．３分【００７８】
（参考例１）（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサン酸の製造法
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）５Ｕ、ＮＡＤ １３ｍｇを１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解させ、栓付試験管に移した。その後、実施例１１で取得した（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナール２ｍｇを加えて、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、６Ｎ塩酸水溶液を加えて反応液を酸性とし、酢酸エチル１ｍｌを加えて基質及び生成物を抽出して、以下に示す分析条件にてＧＣ分析した。その結果、反応変換率９９．１％で９６．５％ｅｅの（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサン酸が得られた。【００７９】
分析条件は以下の通りである。
［ＧＣ分析条件］
キャピラリーカラム：Ｇ−ＰＮ  φ０．２５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｍ（東京化成社製）
キャリアーガス：Ｈｅ  １５０ｋＰａ
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：４０℃
検出時間：（Ｒ）−２−メチルヘキサン酸  ２２．０分、（Ｓ）−２−メチルヘキサン酸  ２３．４分、２−メチル−１−ヘキサナール  １５．１分
【図１】
2006129628.tif 000012
【配列表】
2006129628000001.app
【国際調査報告】
2006129628.tif 000013
2006129628.tif 000014
2006129628.tif 000015
2006129628.tif 000016