(57)【要約】  口腔カンジダ症の治療剤を提供することを課題とし、有効成分として腫瘍壊死因子を含んでなる口腔カンジダ症治療剤を提供することによって、課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として腫瘍壊死因子を含んでなる口腔カンジダ症治療剤。
【請求項２】
アゾール系抗真菌剤と併用することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の口腔カンジダ症治療剤。
【請求項３】
腫瘍壊死因子を口腔カンジダ症の患者に口腔内投与することを特徴とする口腔カンジダ症の治療方法。
【請求項４】
さらに、アゾール系抗真菌剤を口腔内投与することを特徴とする請求の範囲第３項に記載の口腔カンジダ症の治療方法。
【請求項５】
腫瘍壊死因子及びアゾール系真菌剤を含んでなる口腔カンジダ症治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は口腔カンジダ症治療剤に関するものであり、とりわけ、有効成分として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を含んでなる口腔カンジダ症治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
口腔カンジダ症は、臨床症状として、口腔粘膜や舌粘膜に白苔あるいは潰瘍を認める病気であり、発生した白苔を擦ると容易に出血し、痛みを伴い、高齢者、エイズ患者などの広域抗菌剤投与患者などによく発生する。その原因はカンジダ・アルビカンスというヒトにおける常在真菌の感染であり、免疫力の低下とともに発病すると言われており、抗癌剤、副腎皮質ホルモン、抗生物質、免疫抑制剤などの投与によっても発病する場合がある。【０００３】
口腔カンジダ症の治療方法としては、フルコナゾールなどのアゾール系抗真菌剤、トリクロサン、塩化セチルピリジニウムなどの抗菌性有機物質などが用いられてきた。また、近年、特開２００３−８９６５２号公報において植物精油、特開２００１−１４９３８８号公報においてエリスリトールなどの糖アルコール、特開平９−２０６８０号公報においてアゾール系抗真菌剤とリゾチームとの併用が、口腔カンジダ症の治療法として提案されている。しかしながら、これらの方法は、一時的にカンジダ菌の増殖を阻止するのみであり、根本的な治癒を達成することは難しい。また、最も有効とされるアゾール系抗真菌剤は、他の治療薬の使用により、使用できない場合がある。【０００４】
一方、ＴＮＦ−αは、抗腫瘍効果を有するサイトカインの一種として見出されたものの、未だ臨床応用に至っていない。近年、アーノルド・ルイエ、アルドナ・エル・バルチュ、レイモンド・ピー・スミス、マリー・エイ・フランケ、ウイリアム・ジェイ・リッツ、ジャスワント・ケイ・シン、モリス・エイ・ゴードン、「Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｌｐｈａ  Ｈａｓ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ」、インフェクション・アンド・イムニティー、第６２巻、第７号、２７６１乃至２７７２頁、１９９４年において、内在性のＴＮＦ−αが各種臓器におけるカンジダ・アルビカンスの増殖を阻止していることが報告されている。しかしながら、口腔カンジダ症の治療に、ＴＮＦ−αの口腔内投与が有効であるか否かは不明である。
【発明の開示】
【０００５】
斯かる状況に鑑み、本発明は、口腔カンジダ症治療剤を提供することを課題とする。
【０００６】
本発明者等が鋭意研究したところ、ヒトＴＮＦ−αを口腔内投与することにより、口腔内のカンジダ・アルビカンスの増殖を抑制することを発見した。また、その作用は、マクロファージ細胞を活性化して貪食作用を亢進することによって発揮されること、さらには、ヒトＴＮＦ−αは直接的にカンジダ・アルビカンスに作用し、菌糸形態変化を阻害することによって発揮されることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、有効成分としてヒトＴＮＦ−αを含んでなる口腔カンジダ症治療剤を提供することによって、前記課題を解決するものである。
【０００８】
本発明によれば、口腔カンジダ症の治療に効果的であり、従来用いられているフルコナゾールなどのアゾール系抗真菌剤との併用で相乗的な効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いられるＴＮＦ−αとしては、哺乳類由来のＴＮＦ−α、好ましくは、ヒト由来のＴＮＦ−αが挙げられる。その製造方法は、本発明の効果を損ねない限り、いずれの方法を選択してもよく、例えば、ヒト細胞を適宜の誘導剤で処理することによって産生させた天然型ＴＮＦ−αであっても、動物、植物などの細胞、大腸菌、酵母などの細菌などにＴＮＦ−αの遺伝子を導入して産生させた組換型ＴＮＦ−αであってもよい。このうち、天然型ＴＮＦ−αは、分子内に糖鎖を有していることから、安定性に優れており、本発明において有利に用いられる。天然型ＴＮＦ−αの製造方法としては、特開昭６２−２３６４９５号公報に記載の方法が挙げられる。また、安定性を向上させる観点において、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子を化学的に結合させることも有利に実施できる。例えば、特開２００４−２２５１号公報に開示されるポリエチレングリコール結合のＴＮＦ−α変異体は特に有利に利用できる。さらに、国際公開ＷＯ２００５／０６６２０６号公報で開示されるヒトＴＮＦ−αの変異体蛋白質のうち、タイプ１のＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）にのみ選択的に結合するＴＮＦアゴニストは、本発明において有利に利用できる。【００１０】
本発明の口腔カンジダ症治療剤は、口腔内投与により、１日当たり有効成分としてのＴＮＦ−αを０．０２乃至２００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．２乃至１００μｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは２μｇ乃至２０μｇ／ｋｇ体重の範囲内で投与又は摂取すればよい。０．０２μｇ／ｋｇ体重未満だと、所期の効果が発揮されず、２００μｇ／ｋｇ体重を超えると、効果に対して副作用のほうが重篤になる恐れがある。【００１１】
本発明の口腔カンジダ症治療剤の使用方法としては、それ単独または他の抗真菌剤と併用して口腔内投与される。本発明の口腔カンジダ症治療剤は、カンジダ・アルビカンスなどの真菌に対して抗菌効果が確認されている従来の抗真菌剤と併用することができる。併用される抗真菌剤としては、アムホテリシンＢなどのポリエン系、フルシトシンなどのフルオロピリジン系、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾールなどのアゾール系抗真菌剤が挙げられる。このうち、フルコナゾールが有利に用いられ、その投与量は、通常１乃至２ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、重症又は難治性真菌感染症と診断される場合には最大８ｍｇ／ｋｇ体重まで投与可能である。本発明の口腔カンジダ症治療剤に併用される場合は、０．００１乃至２ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１乃至１ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。【００１２】
また、抗癌剤や免疫抑制剤の投与により、口腔カンジダ症が発病又は悪化することが予想される場合、口腔カンジダ症の発病又は悪化を予防又は軽減させるために、本発明の口腔カンジダ症治療剤を１日乃至数日前、好ましくは１日乃至５日前、さらに好ましくは１日乃至３日前に口腔内投与することが有利に実施できる。また、口腔内で発症する真菌類、例えば、カンジダ・アルビカンス以外のカンジダ属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、トリコフィトン属、マラセチア属、コキディオイデス属などの真菌に対しても適用できる。【００１３】
本発明の口腔カンジダ症治療剤は、有効成分としてのＴＮＦ−α単独であってもよく、飲食物、医薬品、医薬部外品、健康食品、飼料又は餌料などの形態の組成物とすることもできる。組成物としては、上記形態において許容される成分、例えば、水、アルコール、澱粉、蛋白質、食物繊維、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、安定剤、酸化防止剤、防腐剤などを配合することができる。例えば、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン類、ルチン、ヘスペリジン、ケルセチン、イソフラボンなどのフラボノイド又はそれらの配糖体、ヒノキチオール、シトラロール、シトロネラール、シトロネロール、ゲラニオール、リナロールなどの植物精油成分、ティートリー油、ゼラニウム油、バラ油、ラベンダー油、タイム油、ペパーミント油、スペアミント油、サンダルウッド油などの植物精油、乳酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウムなどのカルシウム塩、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥなどのビタミン類またはその誘導体、マルトース、トレハロース、マルトシルトレハロース、ラクトスクロース、ニゲロース、イソマルトース、ニゲロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、サイクロデキストリンなどの糖類、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどのアミノ糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカン、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、カルシトニン、エストロゲン、蛋白質同化ホルモンなどのホルモン類、感光素１０１号、感光素２０１号、感光素３０１号、感光素４０１号などの感光色素、藍、シソ、中国パセリ、パフィア、鹿角霊芝、アガリクス、メシマコブなどの植物、菌類又はその抽出物、さらには、ビフィズス菌増殖糖質、粉末ミルク、貝殻粉末、珊瑚粉末、プロポリスエキス、ローヤルゼリー、蜂蜜、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドなどを配合することができる。【００１４】
本発明の口腔カンジダ症治療剤の剤形としては、口腔内に投与される形態ならばどのようなものでもよいが、本発明の効果をより発揮させるためには、口腔内でのＴＮＦ−αの滞留時間がより長い形態のものが望まれる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤、バッカル剤、液剤、チュアブル剤、エアゾール剤、のど用スプレー剤、ハップ剤、軟膏剤、含嗽剤、噴霧剤、吸入剤などが挙げられる。また、マウスウオッシュ、歯磨などの医薬部外品、チューインガム、キャンディーなどの食品の形態とすることもできる。【００１５】
本発明の口腔カンジダ症治療剤の作用メカニズムを説明するに、有効成分としてのＴＮＦ−αは、マクロファージ細胞を活性化して、その貪食能を亢進することにより抗カンジダ・アルビカンス作用を発揮する。また、カンジダ・アルビカンスは、通常、球状形態と菌糸形態の２形態をとるが、マクロファージ細胞によって貪食されるのは球状形態の菌のみであり、菌糸形態の菌はほとんど貪食されない。したがって、マクロファージ細胞を介した口腔カンジダ症の治療においては、菌を球状形態にすることが非常に重要である。本発明者等は、ヒトＴＮＦ−αは、マクロファージ細胞を活性化するだけでなく、カンジダ・アルビカンスに直接的に作用して、球状形態から菌糸形態への形態変化を抑制することにより、球状形態の割合を増加させるという知見を独自に発見した。この知見から、ヒトＴＮＦ−αは、通常の生体内環境すなわちマクロファージ細胞存在下において、抗カンジダ・アルビカンス作用を発揮すると考えられる。【００１６】
以下、この発明の実施の形態につき、実験に基づいて説明する。【００１７】
＜実験１：ヒトＴＮＦ−αの調製＞
免疫抑制処理した生後間もないハムスターの皮下に、ヒト急性白血病リンパ球細胞ＢＡＬＬ−１細胞（ＪＣＲＢ００７１）を移植し、３乃至４週間飼育した。上記細胞の塊をハムスター皮下より摘出し、細切した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、細胞濃度５×１０６個／ｍｌに調製した。この細胞浮遊液にセンダイウイルス（ＨＶＪ）を１００ＨＡ／ｍｌとなるように添加し、３５℃で２０時間培養した後、培養液を遠心分離して上清を採取した。この上清は、常法にしたがい、抗ヒトＴＮＦ−α抗体セファロースによりヒトＴＮＦ−αを精製し、ヒトＴＮＦ−α標品（比活性約７×１０８Ｕ／ｍｇ）を得た。【００１８】
＜実験２：カンジダ・アルビカンスに対するインビトロでのＴＮＦ−αの効果（マクロファージ細胞の貪食能の亢進）＞
カンジダ・アルビカンス凍結保存品を融解後、Ｄｉｆｃｏサブローデキストロース培地（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー社製）中に、菌体濃度５×１０４個／ｍｌとなるように懸濁し、３７℃、インキュベーター中で２４時間静置培養した。培養後、１×１０８個の菌体を採取し、遠心して上清を除去後、１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、超音波処理を５分間行ない、菌体を分散させた。
マウスマクロファージ樹立細胞ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−７１）を１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、ＥＤＴＡ−トリプシン溶液で剥離後、同培地で、１×１０６個／ｍｌの懸濁液を調製した。このＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液を９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ播種し、さらに、実験１で調製したヒトＴＮＦ−αを最終濃度が０．００１乃至１０μｇ／ｍｌになるように０．１ｍｌ／ウェルずつ添加した後、一夜ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、各ウェルから上清を吸引除去した後、０．００１乃至１０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、及び、至適濃度のカンジダ・アルビカンスを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を２００μｌずつ添加して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。対照として、同濃度のカンジダ・アルビカンスを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを用意した。顕微鏡（４０乃至１００倍率）でカンジダ・アルビカンスのコロニー数をカウントした。対照のコロニー数に対する各試料での相対コロニー数（％）を求め、その結果を表１に示す。【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１の結果が示すとおり、マウスマクロファージ細胞の存在により、カンジダ・アルビカンスの相対菌数を１３％まで減じるところ、この系にＴＮＦ−αを添加することにより、用量依存的に、８乃至１２％までにコロニー数を減じた。この結果は、ＴＮＦ−αはマクロファージ細胞によるカンジダ・アルビカンスの貪食能を高めることを示している。【００２１】
＜実験３：カンジダ・アルビカンスに対するインビトロでのＴＮＦ−αの効果（菌糸形態変化の阻害）＞
実験２で調製したカンジダ・アルビカンス（２．５×１０６個／ｍｌ）に、最終濃度０．００１乃至１０μｇ／ｍｌとなるように、ヒトＴＮＦ−αを添加した。次いで、これを２４ウェルプレートに０．３ｍｌ／ウェルずつ播種した。この２４ウェルプレートを３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で３時間培養した後、プレートに付着したカンジダ・アルビカンスを十分ピペッティングで剥離した後、顕微鏡（４０乃至１００倍率）により菌の形状を観察し、球状菌数及び菌糸状菌数をカウントした。総菌数（球状菌数と菌糸状菌数の和）に対する菌糸状菌の割合を求め、それを菌糸形成率（％）とし、その結果を表２に示す。【００２２】
【表２】
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【００２３】
表２に示すとおり、ＴＮＦ−αはカンジダ・アルビカンスの菌糸形成率を６４％から５３％にまで阻害する作用を有することが判明した。菌糸状菌は、マクロファージ細胞により貪食されにくいことから、ＴＮＦ−αの菌糸状菌への形態変化を阻害してマクロファージ細胞による作用を増強していると考えられた。したがって、実験２及び３の結果から、ＴＮＦ−αは、マクロファージ細胞を活性化するという間接的な作用と、カンジダ・アルビカンスの菌糸状菌への形態変化を阻害するという直接的な作用を有していることが明らかになった。【００２４】
＜実験４：インビトロ系におけるフルコナゾールとの併用効果＞
実験２に記載の方法にしたがって、濃度０乃至１μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αでマウスマクロファージ細胞を前処理し、それと同濃度のＴＮＦ−αと濃度０乃至０．２μｇ／ｍｌフルコナゾール（『ジフルカン静注液』、ファイザー製薬販売）との併用による効果を調べた。処理２日後、顕微鏡（４０乃至１００倍率）により観察し、カンジダ・アルビカンスのコロニー数をカウントした。なお、ＴＮＦ−α及びフルコナゾールを添加せず、マウスマクロファージ細胞のみの系を対照とし、それに対する相対コロニー数を求め、その結果を表３に示す。【００２５】
【表３】
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【００２６】
表３の結果に示すとおり、０．１乃至１μｇ／ｍｌのＴＮＦ−αは、０．０５乃至０．２μｇ／ｍｌのフルコナゾールとの併用により、カンジダ・アルビカンスのコロニー数は相乗的に減少した。この結果は、マクロファージ細胞存在下という通常の生体内環境において、ＴＮＦ−αとフルコナゾールは、相乗的に抗カンジダ・アルビカンス作用を発揮することを示している。【００２７】
＜実験５：プレドニゾロン投与によるマウス口腔カンジダモデルにおけるＴＮＦ−αの効果＞
１５０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロン（塩野義製薬株式会社販売）を４日に１回皮下注射して免疫抑制した１０週齢雌性ＩＣＲマウスに、１×１０８個のカンジダ・アルビカンスを口腔内接種した。接種後１日後から毎日、マウスにヒトＴＮＦ−αを０．０２μｇ／ｋｇ体重乃至２００μｇ／ｋｇ体重ずつ口腔内投与した。飼育期間中、０．８３ｍｇ／ｍｌの塩酸テトラサイクリンを飲水に加えて自由摂取させた。試験開始７日後に、マウスを安楽死させた後、無菌的条件下で、舌を摘出した。摘出した舌を５（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に浸漬し、ホモジナイズした後、０．２５（ｗ／ｖ）％コラゲナーゼを添加し、３７℃で３０分間処理した。これを、遠心分離し、上清を採取し、生理食塩水で段階希釈してクロムアガープレートに播き、３７℃で４８時間培養した後、コロニー数を計測して、舌内の生菌数を求めた。また、対照として、ＴＮＦ−αを投与しない以外は同様な処理をしたマウスを用意した。対照のマウスのコロニー数に対する各試料のコロニー数の割合を求め、相対生菌数を求めた。その結果を表４に示す。【００２８】
【表４】
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【００２９】
表４の結果から、カンジダ・アルビカンスの相対コロニー数は、０．０２乃至２μｇ／ｋｇ体重のＴＮＦ−α投与により、用量依存的に減少した。この結果は、インビボモデルである口腔カンジダ症モデルマウスに対して、ＴＮＦ−αの口腔内投与によりカンジダ・アルビカンスの生菌数を減じる効果が発揮されることを示している。【００３０】
以下、実施例により、本発明の形態の詳細を示す。
【実施例１】
【００３１】
＜口腔カンジダ症治療剤＞
実験１に記載の方法に準じて、ＢＡＬＬ−１細胞をセンダイウイルスで処理し、天然型ヒトＴＮＦ−αを調製した。本品は、カンジダ・アルビカンスなどの真菌による口腔感染症を治療または予防することができる。また、本品は、フルコナゾールなどの既存の抗真菌剤と併用することにより、相乗的な効果を発揮する。
【実施例２】
【００３２】
＜液剤＞
１００ｇの実施例１に記載の天然型ヒトＴＮＦ−α、１ｇのフルコナゾール、及び、１０μｇのトレハロースを１ｍｌの生理食塩水に溶解し、常法にしたがい、除菌濾過して液剤を得た。本品は、口腔カンジダ症の症状に応じた量を投与し、さらに、うがいなどをすることにより、カンジダ・アルビカンスなどの真菌による口腔感染症を治療または予防することができる。
【実施例３】
【００３３】
＜錠剤＞
２０μｇの実施例１に記載の天然型ヒトＴＮＦ−α、２μｇのフルコナゾールを１ｇのマルトースに混合した後、常法にしたがって打錠し、錠剤を得た。本品は、口腔カンジダ症の症状に応じた量を口腔内投与し、さらに、噛み砕き、唾液に溶かすことにより、カンジダ・アルビカンスなどの真菌による口腔感染症を治療または予防することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
叙述のとおり、本発明の口腔カンジダ症治療剤は、口腔カンジダ症の治療または予防に有効である。さらに、フルコナゾールなどの従来の抗真菌剤との併用により、相乗的な作用が発揮される。
【国際調査報告】
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