(57)【要約】  ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤が開示される。ｐ７５ＮＴＲ阻害剤には，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体，およびｐ７５ＮＴＲの転写または翻訳を阻害しうるアンチセンス核酸，二本鎖ＲＮＡ等が含まれる。本発明の鎮痛剤は，炎症性の痛みの治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤。
【請求項２】
前記ｐ７５ＮＴＲ阻害剤が，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体である請求項１記載の鎮痛剤。
【請求項３】
前記ｐ７５ＮＴＲ阻害剤が，ｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を阻害する物質である請求項１記載の鎮痛剤。
【請求項４】
鎮痛剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をｐ７５ＮＴＲと接触させ，前記試験物質がｐ７５ＮＴＲの機能を阻害するか否かを判定することを含む方法。
【請求項５】
鎮痛剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をｐ７５ＮＴＲと接触させ，前記試験物質がｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を阻害するか否かを判定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鎮痛剤に関する。より詳細には，本発明は，炎症性疼痛を治療するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
強度の有害刺激および組織炎症は，末梢および中枢感作の両方に起因する痛み過敏性を生じさせる（Woolf, C. J. Nature 306, 686-688 (1983)；Woolf, C. J., &
Salter, M. W., Science 288,
1765-1769 (2000)）。末梢の炎症により，後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの細胞体において神経ペプチド，イオンチャネル，およびレセプターのレベルが変化する（Noguchi, K. et al, Brain
Res. 464, 31-35 (1988); Woolf, C. J.
et al., Neuroscience 62,
327-331 (1994); Ji, R. R. et al., J. Neurosci. 15, 8156-8166 (1995); Voilley, N. et al.,
J. Neurosci. 21, 8026-8033 (2001)）。したがって，これは高閾値レセプターの感度を増加させ，したがって正常より低い強度の刺激がこれらを活性化することができる（Sammons, M. J. et al., Brain
Res. 876, 48-54 (2000)）。炎症の結果，多数の異なるサイトカインに応答して，ＮＧＦレベルが上昇する。ＮＧＦはそれ自体サイトカイン様の機能を有し，肥満細胞，マクロファージおよび好中球を変化させる（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994); Andreev,
N. Yu. et al., Pain 63,
109-115 (1995)）。ＮＧＦは，末梢の感作を推進し，末梢終末に直接作用して短時間のうちに熱痛覚過敏を生ずることにより，炎症性の痛みにおいて重要な役割を果たす（Chuang, H. H. et al., Nature
411, 957-962 (2001)）。【０００３】
ＮＧＦは，広範な範囲の炎症動物モデル，例えば，フロインドアジュバント誘導性炎症（Woolf, C. J. et al., Neuroscience 62, 327-331 (1994)），カラギーナン誘導性炎症（Sammons, M. J. et al., Brain Res. 876, 48-54 (2000); McMahon, S. B. et al, Nat.
Med. 1, 774-780 (1995)），およびヒトの関節炎患者（Aloe, L. Turveri, M. A. & Carcassi,
U., Arthritis Rheumat. 35,
351-355 (1992)）においてアップレギュレートされている。実験的炎症において，抗ＮＧＦ抗体（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994)）またはＮＧＦ特異的免疫接着分子ｔｒｋＡ−ＩｇＧ（McMahon, S. B. et al., Nat.
Med. 1, 774-780 (1995)）を用いてＮＧＦの増加を妨害すると，痛覚過敏が消失する。このことはＮＧＦが炎症性痛覚過敏の生成に必要であることを示す。また，ＮＧＦの局所または全身の投与は熱および機械的痛覚過敏を誘導するため，ＮＧＦは成人ネズミ動物において痛覚過敏を生成するのに十分であることが示されている（Sammons, M. J. et al, Brain
Res. 876, 48-54 (2000); Andreev, N.
Yu. et al., Pain 63, 109-115 (1995); Lewin, G.
R. et al., J. Neurosci. 13,
2136-2148 (1993)）。さらに，ＮＧＦはＤＲＧニューロンの細胞体に逆行的に輸送され，ここで遺伝子発現が増加する（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994); Lindsay,
R. M. & Harmar, A. J., Nature 337, 362-364 (1989)）。ＮＧＦは，一次知覚ニューロンの末梢終末で，脂肪細胞の脱顆粒を通して間接的に，または直接的に，作用することにより，その痛覚過敏効果を生ずる（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994)）。すなわち，ＮＧＦは炎症痛覚過敏の生成に対する主要な寄与因子であることが示唆されている。【０００４】
皮膚における多くの細胞タイプ，例えば脂肪細胞，交感神経節後細胞および好中球が，ＮＧＦにより引き出される急速に起こる末梢感作に寄与する。脂肪細胞はｔｒｋＡレセプターを発現しており，ＮＧＦ刺激に応答してその内容物を脱顆粒する（Mazurek, N. et al., FEBS
Lett. 198, 315-20 (1986)）。脂肪細胞が涸渇すると，ＮＧＦ刺激から３０分および３時間の時点においてＮＧＦ誘導性痛覚過敏が低下する（Lewin, G.R. et al, Eur. J.
Neurosci. 6, 1903-12 (1994)）。【０００５】
しかし，インビボで化合物４８／８０で処理して脂肪細胞を脱顆粒させた調製物においては，感作は生じなかった（Rueff, A. et al., Pain 66, 359-372 (1996)）。さらに，ＮＧＦ誘導性痛覚過敏は，処置の第１日には防止されたが，毎日脱顆粒処置を行っても，翌日以降は防止されなかった。これらのデータを一緒にすると，外因性ＮＧＦが脂肪細胞由来ＮＧＦの放出を引き起こすトリガーとして作用すること，およびＮＧＦが一次求心性終末を直接感作し，痛み関連遺伝子の発現を制御していることが示唆される。【０００６】
ＮＧＦのレセプターには，１回貫膜レセプターチロシンキナーゼであるＴｒｋＡと，全ニューロトロフィンレセプターｐ７５（ｐ７５ＮＴＲ）の２種類がある。上述のように、ＮＧＦは炎症性痛覚過敏のメカニズムに関して重要な役割を果たすことが知られているが、ＮＧＦが神経細胞上の二つの受容体、ＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲのどちらに働いているのかについては全く不明であった。また、ＮＧＦは前駆体またはｐｒｏ−蛋白質として合成され，成熟ＮＧＦの生成には蛋白質分解的切断が必要であることが知られているが（Lee, R. et al., Science 294, 1945-1948 (2001)）、ｐｒｏＮＧＦが炎症性痛覚過敏のメカニズムに関与している可能性はこれまでに示唆されていない。【０００７】
【非特許文献１】Woolf, C. J. et al., Neuroscience 62, 327-331 (1994)
【非特許文献２】McMahon, S. B. et al., Nat. Med. 1, 774-780 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は，新規な鎮痛剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは，ｐ７５ＮＴＲに特異的な中和抗体が知覚ニューロンにおいてＮＧＦの感作作用をブロックしうること，ならびにｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合がＮＧＦ誘導性痛覚過敏に関与していることを見いだした。この知見に基づいて，ｐ７５ＮＴＲの阻害剤が新規なメカニズムの鎮痛剤として利用しうることを見いだして，本発明を完成した。【００１０】
本発明は，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤を提供する。好ましくは，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤は，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体である。また好ましくは，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤は，ｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を阻害する物質である。【００１１】
別の観点においては，本発明は，鎮痛剤の候補物質を同定する方法を提供する。この方法は，試験物質をｐ７５ＮＴＲと接触させ，前記試験物質がｐ７５ＮＴＲの機能を阻害するか否かを判定することを含む。特に好ましい態様においては，本発明の方法は，試験物質をｐ７５ＮＴＲと接触させ，前記試験物質がｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を阻害するか否かを判定することを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば，新規な鎮痛剤が提供される。本発明の鎮痛剤は，特に炎症性痛覚の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
炎症性の痛みは，侵害受容閾値の低下により特徴づけられ，炎症メディエータの作用により生ずる。鍵となる分子の１つは神経成長因子（ＮＧＦ）である。本発明においては，下記の実施例に示されるように，ニューロトロフィンレセプターｐ７５（ｐ７５ＮＴＲ）に対する中和抗体を投与することにより，完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）誘導性炎症またはＮＧＦの足底内注射により発生させた痛覚過敏をブロックすることが見いだされた。また，ＣＦＡの注射により一次知覚ニューロンにおけるＣＧＲＰレベルがアップレギュレートされるが，ｐ７５ＮＴＲのブロックはこの効果を破壊すること，神経終末で標識されたｐ７５ＮＴＲは，ＣＦＡ誘導性炎症の後，逆行的に知覚ニューロンの細胞体に輸送されることが明らかになった。【００１４】
すなわち，本発明においては，ｐ７５ＮＴＲを阻害することによりＣＦＡ誘導性およびＮＧＦ誘導性痛覚過敏が減少することが示された。ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体は，炎症に関連する痛みを治療するのに有用であろう。【００１５】
さらに，本発明においては，ｐｒｏＮＧＦがインビボでｐ７５ＮＴＲの支配的なリガンドであることが示された。ｐｒｏＮＧＦを分解する目的でプラスミン処置を行うと，ＣＦＡ誘導性痛覚過敏が改善された。炎症の間に内因性ｐｒｏＮＧＦが過剰産生され，ｐ７５ＮＴＲに結合してこれを活性化することができる機能型の分泌が生じ，このことによりインビボで熱過敏性が誘導されると考えられる。【００１６】
下記の実施例に示されるように，足底内ＣＦＡ注射後にプラスミンで処置すると，熱過敏性が有意に低下した。ｐｒｏＮＧＦがｐ７５ＮＴＲに対して成熟ＮＧＦより高いアフィニティーを示すことと一致して，ｐｒｏＮＧＦは，ｐ７５ＮＴＲ媒介性細胞応答のより強い誘導物質であるかもしれない。すなわち，ＮＧＦの生物学的作用は，蛋白質分解性切断により制御されており，プロ型が優先的にｐ７５ＮＴＲを活性化して，知覚ニューロン過敏性を媒介しているのかもしれない。【００１７】
ｐ７５ＮＴＲは神経系において種々の役割を有しており，これには，先祖細胞数の制御，軸索伸長の調節，およびニューロンおよび稀突起神経膠細胞の生存および死の制御が含まれる。下記の実施例に示されるデータは，ｐｒｏＮＧＦ，ならびに成熟ＮＧＦが，ｐ７５ＮＴＲを介して知覚過敏性を伝達するのに役割を果たしているかもしれないことを示す。したがって，内因性ｐｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を破壊することにより，炎症関連痛みの治療の新規な治療方法を提供しうると考えられる。【００１８】
ｐ７５ＮＴＲ阻害剤
すなわち，本発明にしたがう鎮痛剤は，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する。ここで，「ｐ７５ＮＴＲ阻害剤」とは，ｐ７５ＮＴＲがリガンドと結合してそのシグナルを下流に伝達する活性を消失又は少なくとも有意に減少させる物質を意味する。ｐ７５ＮＴＲの活性は，後述する実施例に記載の通りに調べることができる。【００１９】
本発明のｐ７５ＮＴＲ阻害剤として特に好ましいものは抗ｐ７５ＮＴＲ抗体である。本明細書において，「抗ｐ７５ＮＴＲ抗体」とは，ｐ７５ＮＴＲと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。【００２０】
ｐ７５ＮＴＲに結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，ｐ７５ＮＴＲを感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清から得ることができる。ｐ７５ＮＴＲに結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，ｐ７５ＮＴＲを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。【００２１】
本発明のモノクローナル抗体には，ハイブリドーマにより産生される抗体に加えて，抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体，キメラ抗体，ＣＤＲ移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。【００２２】
遺伝子組み換え抗体は，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体を生産するハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。ｐ７５ＮＴＲに結合しうる抗体断片としては，Fab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等があげられる。【００２３】
抗体産生細胞の作製
ｐ７５ＮＴＲに結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。ｐ７５ＮＴＲを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず，抗原となるｐ７５ＮＴＲを製造する。ヒトのｐ７５ＮＴＲは，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５９５４４に記載される遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列にしたがって，通常の方法により組換え的に生成することができる。ヒトのｐ７５ＮＴＲのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNSCKQNKQGANSRPVNQTPPPEGEKLHSDSGISVDSQSLHDQQPHTQTASGQALKGDGGLYSSLPPAKREEVEKLLNGSAGDTWRHLAGELGYQPEHIDSFTHEACPVRALLASWATQDSATLDALLAALRRIQRADLVESLCSESTATSPV（配列番号１）【００２４】
次に，このようにして製造したｐ７５ＮＴＲを抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは，抗原としてｐ７５ＮＴＲの部分ペプチドを用いてもよい。【００２５】
抗原の投与は，１−３週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量をＥＬＩＳＡ法などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後，この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が市販されている。融合は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例えばＰＥＧの存在下で行い，ＨＡＴ培地で融合細胞を選択する。培養上清をＥＬＩＳＡ法などによりアッセイして，抗原と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることができる。【００２６】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。【００２７】
抗体遺伝子の塩基配列の解析
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。【００２８】
抗体の特異性の確認
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，ｐ７５ＮＴＲを固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。【００２９】
組換え型抗体
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗ｐ７５ＮＴＲモノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。【００３０】
キメラ抗体
キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，ｐ７５ＮＴＲに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。【００３１】
ＣＤＲ移植抗体
ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，ｐ７５ＮＴＲに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。【００３２】
抗体断片
ｐ７５ＮＴＲに結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗ｐ７５ＮＴＲモノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。【００３３】
抗体以外のｐ７５ＮＴＲ阻害剤
ｐ７５ＮＴＲ阻害剤の他の例としては，ＮＧＦとｐ７５ＮＴＲの結合を阻害するペプチド、例えばＮＧＦの部分配列を有するペプチドを挙げることができる。【００３４】
さらに，本発明の鎮痛剤は，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤として，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等を含むものであってもよい。これらの核酸は，ｐ７５ＮＴＲ遺伝子またはｐ７５ＮＴＲをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，ｐ７５ＮＴＲをコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。【００３６】
リボザイムとは，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。【００３７】
医薬製剤
ｐ７５ＮＴＲ阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもよい。【００３８】
本発明の鎮痛剤の投与経路は，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。好ましくは，炎症を起こしている部位に直接または経皮的に投与するか，あるいは，カテーテル等を用いて直接注入してもよい。【００３９】
投与量は，ｐ７５ＮＴＲ阻害剤の種類や投与経路，神経損傷の程度等に応じて適宜選択されるが，炎症部位に直接投与する場合，通常，0.1mg〜10mg，好ましくは，1mg〜5mgである。直接投与以外の非経口投与，例えば静脈注射等では，通常，上記投与量の１０倍程度である。【００４０】
別の観点においては，本発明は，鎮痛剤の候補物質を同定する方法を提供する。この方法は，試験物質をｐ７５ＮＴＲと接触させ，この試験物質がｐ７５ＮＴＲの機能を阻害するか否かを判定することを含む。ｐ７５ＮＴＲの機能の阻害には，ｐ７５ＮＴＲに結合してｐ７５ＮＴＲの正常な機能の発揮を阻害すること，ならびにｐ７５ＮＴＲとそのリガンド（ＮＧＦまたはｐｒｏＮＧＦ）との結合を阻害することが含まれる。試験物質がｐ７５ＮＴＲと結合する能力，あるいはｐ７５ＮＴＲとそのリガンドとの結合を阻害する能力は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアッセイ，放射性標識競合アッセイ，クロマトグラフィーによる分画などにより判定することができる。これらのアッセイにより，ｐ７５ＮＴＲの機能を阻害するものとして同定された物質は，鎮痛剤の候補物質であると考えられる。【００４１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４２】
動物
雄ＩＣＲマウス（２５−３５ｇ）およびＷｉｓｔｅｒラット（１５０−２００ｇ）を用いた。すべての動物は，動物ユニットで２１℃で１２時間の明暗サイクル（０８：３０−２０：３０ｈ）で飼育し，ペレット餌および水道水を自由に摂取させた。実験は，大学の倫理規定およびＮＩＨのガイドラインにしたがって実施した。【００４３】
痛覚過敏の動物モデル
すべての操作は５０％Ｏ２中３％ハロタン麻酔のもとで行った。３０Ｇ針を用いてＣＦＡ（１０ｕｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をマウス後肢の足底表面の皮下に注射した（ｎ＝１９）。１９匹のうちの７匹マウスには，ＣＦＡ処置の３０分前に，５ｕｌの抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）をマウス左後肢の足底表面に注射した。４匹のマウスで，プラスミンの影響を試験した。ＣＦＡ注射の１時間後，１０ｕｇのプラスミン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を足底表面の同じ部位に注射した。【００４４】
別の組の実験においては，神経成長因子ベータ（ＮＧＦ−β，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）をウシ血清アルブミンを含む通常の食塩水中で希釈して最終濃度０．１ｕｇ／ｍｌとした。ＮＧＦ−β（１．０ｕｇ／肢；１０μｌ）をマウス左後肢の足底表面に注射した（ｎ＝１６）。ＮＧＦ注射の３０分前，５ｕｌの抗ｐ７５ＮＴＲ抗体を足底表面の同じ部位に注射した（ｎ＝８）。対照実験として，マウス（ｎ＝４）にウシ血清アルブミンを含む通常の食塩水を注射した。次にマウスを麻酔から回復させた。マウスは５分以内に完全に動けるようになった。【００４５】
挙動評価
後肢の熱侵害受容閾値は，Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ）を用いて評価した。簡単には，マウスを試験箱に入れ，２７−２９℃に維持した窓ガラスの床に置いた。試験すべき肢の足底表面の下に配置した直径０．５ｃｍの放射熱源を用いることにより，熱刺激（１ｃｍ２あたり１５０ミリカロリー／ｓｅｃ）を与えた。熱源を各後肢の下に交互に配置し，動物による予想を回避するために，最初に刺激する肢は無作為に選択した。刺激の開始から肢逃避までの時間を最も近い０．１秒まで測定し，２０．０秒の絶対カットオフ時間を用いて組織障害を防止した。両方の後肢を無作為の順番で試験し，３回の測定を行って，各後肢についての平均を求めた。【００４６】
侵害受容閾値はＮＧＦ−βの足底内注射の前（基底対照として）および１，２，３，６および２４時間後に測定した。また，別の一連の実験においては，ＣＦＡの足底内注射の前および１，２，３，６，２４および４８時間後に測定した。【００４７】
肢深度測定
炎症の程度は，ベニエカリパスを用いて肢深度の変化により評価した。肢深度は，注射の直前，および有害な熱刺激を適用した３，６，２４および４８時間後に測定した。【００４８】
免疫組織化学
ＣＦＡで１８時間処置したマウス（ｎ＝４）または抗ｐ７５ＮＴＲ抗体プラスＣＦＡで処置したマウス（ｎ＝４），またはナイーブ対照マウス（ｎ＝４）を，０．９％食塩水で，次に０．１Ｍリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で，心臓経由で潅流した。次に，同側のＬ５  ＤＲＧを切除した。標本を同じ固定液に４℃で一晩浸漬し，その後，これを２０％ショ糖に移し，４℃で一晩インキュベートした。低温槽を用いてＤＲＧから連続切片（１２μｍ厚）を作製し，ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドにマウントした。切片をウサギポリクローナル抗ＣＧＲＰ抗体（１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後，切片をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−コンジュゲート化ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（５μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに２時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し，Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）中に包埋した。【００４９】
ｐ７５ＮＴＲの分布を調べるために，正常皮膚の切片を，ＰＢＳ中に１％ＢＳＡおよび５％スキムミルク，および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むブロッキング溶液中で室温で１時間インキュベートした。ｐ７５ＮＴＲおよび神経線維を二重に検出するために，切片をＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび５％スキムミルク，および０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中の抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＴｕＪ−１（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに４℃で一晩同時にインキュベートした。次に，切片を，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギ抗体（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＡ，ＵＳＡ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６標識ヤギ抗マウス抗体（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＡ，ＵＳＡ）とともに室温で２時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し，Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に包埋した。【００５０】
免疫エンドサイトーシスアッセイ
抗ｐ７５ＮＴＲ抗体であるＭＣ１９２を免疫エンドサイトーシスアッセイにおいて用いて，ｐ７５ＮＴＲのリガンド誘導性取り込みを可視化した。ラットｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインを認識するＭＣ１９２（１００ｎｇ；５０μｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をラットの足底内に注射し，３０分後にＣＦＡ処置を行うかまたは行わなかった（各ｎ＝４）。ＭＣ１９２の注射の１８時間後にラットを深い麻酔下で（４０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム，ｉ．ｐ．Ｓａｎｏｆｉ  Ｓａｎｔｅ  Ｉｎｃ）犠牲死させ，０．９％食塩水で，次に０．１Ｍリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド固定液で心臓経由で潅流し，次にＬ５  ＤＲＧを切除した。【００５１】
標本を同じ固定液に４℃で一晩浸漬し，次に２０％ショ糖に移し，４℃で一晩インキュベートした。低温槽を用いてＤＲＧから連続切片（１２μｍ厚）を作製し，ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライド上にマウントした。切片はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６標識ヤギ抗マウス抗体（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＡ，ＵＳＡ）とともに室温で２時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し，Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に包埋した。【００５２】
ｐｒｏＮＧＦアッセイ
足底皮膚を溶解バッファー（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０），１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１０ｍＭフッ化ナトリウム，１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４，１ｍＭ  ＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中でホモジナイズした。ホモジネートを５００ｇで１５分間遠心分離し，ペレットを廃棄した。上清のアリコート（合計５００μｇの蛋白質）を取り出し，溶解バッファーで希釈した。溶解物を抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に，溶解物をプロテインＡセファロースとともに３時間インキュベートし，よく洗浄した。【００５３】
蛋白質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（１２％；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離し，ＰＶＤＦフィルターに移した。ブロットを５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングし，抗ＮＧＦ抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）または抗ｐｒｏＮＧＦ抗体（１：５００；Ａｌｏｍｏｎｅｌａｂｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次にブロットをＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし，ＥＣＬ溶液（ＮＥＮ）中で１分間発色させ，Ｘ線フィルム（ｓｕｐｅｒｆｉｌｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）に２−１０分間露光した。各実験は，少なくとも３回繰り返した。【００５４】
プラスミン処置
１０μｌの足底内ＣＦＡ注射によりマウスに痛覚過敏を誘導し，ＣＦＡ注射の１，２，３，６，２４，および４８時間後にＰＷＬを測定した。ＣＦＡの足底内注射の１時間後，１０μｇのプラスミン（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を同じ部位に注射した。【００５５】
統計学的分析
免疫染色切片の画像をＣＣＤカメラで取り込み，免疫反応性細胞の数のプロファイルを盲検様式で計数した。対照および処置切片を同じスライド上にマウントし，同じ条件下で加工した。一連の連続切片から５つごとに切片を取り出し，４つの切片を計数した。ウエスタンブロット用には，フィルムをスキャンし，特定のバンドの密度を測定し，対照バンドに対して標準化させた。すべてのデータは片側ｔ検定により分析し，＜０．０５のｐ値を統計学的に有意として，平均±ＳＥＭとして示した。【００５６】
ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体によるＣＦＡ誘導性痛覚過敏の防止
最初に，免疫組織化学によりマウス足底皮膚におけるｐ７５ＮＴＲの発現を調べた。ｐ７５ＮＴＲおよびＴｕｊ１に対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行ったところ，表皮内および表皮下のＴｕｊ−１−免疫反応性神経線維がｐ７５ＮＴＲを発現していることが確認された。このことは，ｐ７５ＮＴＲが足底皮膚の皮下組織の遊離神経終末で発現されていることを示す。【００５７】
次に，局在化した末梢炎症が末梢神経中のｐ７５ＮＴＲと関連するか否かを試験するため，マウス左後肢の足底表面にＣＦＡを注射して実験的炎症を起こし，局所的知覚過敏性を生じさせた。ＣＦＡは局所的炎症を誘導し，これは数分間かけて発症して，一週間以上持続し，腫脹および紅斑，ならびに熱および機械的痛み過敏性を伴う（２８）。ＣＦＡ注射の４８時間後までの観察期間の間，肢逃避反応潜時（ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗ  ｌａｔｅｎｃｉｅ，ＰＷＬ）の有意な低下がみられた（図１ａ）。縦軸は，ＰＷＬ値マイナス対照ＰＷＬを示す。このことは，ＣＦＡが熱痛覚過敏を誘導したことを示す。ＣＦＡ誘導性炎症は，末梢神経および炎症を起こした皮膚においてＮＧＦの上昇を引き起こすことが示されている（４，２９，３０）。【００５８】
ｐ７５ＮＴＲがＣＦＡ誘導性痛覚過敏に関与しているか否かを調べるために，マウスｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体を使用して，ＮＧＦのｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害した。ＣＦＡの注射の３０分前に抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（１０ｕｌ／肢）を足底内注射により投与すると，ＣＦＡ誘導性痛覚過敏が有意に減少した（図１ａ）。抗ｐ７５ＮＴＲ抗体処置群においては，足底内ＣＦＡ注射の３時間後から熱過敏性の低下が認められた（−３．２１±１．６７ｓ，ＣＦＡ注射単独−５．９５±１．１１ｓと比較して，ｐ＜０．０５）。この低下は，観察期間中，４８時間まで持続した（−０．９６±２．３４〜−２．６８±０．８８ｓ，ｐ＜０．０５）。ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体はＮＧＦのｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害するため，これらの結果は，ＮＧＦのｐ７５ＮＴＲへの結合が炎症誘導性痛覚過敏に関与していることを示唆する。【００５９】
肢深度は炎症の重篤度を表す。足底内ＣＦＡ注射の３時間後に肢深度の有意な増加がみられ（３．３５±０．２１ｍｍ，ｐ＜０．０１），４８時間まで持続した（３．６±０．０８ｍｍ）（図１ｂ）。縦軸は深さ（ｍｍ）を示す。Ｂａｓｅ，対照（食塩水注射）；ｐｒｅ，注射前。しかし，３時間から４８時間までの観察期間のいずれにおいても，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体処置による肢深度の有意な減少はみられなかった。このことは，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体の効果は炎症の抑制には依存していないことを示唆する。【００６０】
ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体によるＮＧＦ媒介性痛覚過敏の防止
ＮＧＦは炎症痛覚過敏の生成に対する主要な寄与因子であると示唆されており（４），ＮＧＦのマウス後肢への足底内注射は，熱痛覚過敏に対する時間依存的効果を生ずる（７）。ＮＧＦ（１．０μｇ／肢；１０μｌ）を左後肢の足底内に注射すると，注射後１，２および６時間において，ベヒクル対照（生理食塩水溶液１０μｌ）群（白四角，破線；ｎ＝４）と比較して，統計学的に有意の熱痛覚過敏がみられた（ｎ＝８）。ＮＧＦ注射の１時間後に肢逃避反応潜時（ＰＷＬ）の有意な低下がみられ，２時間で最大に達した（−０．３１±０．７０ｓ（ベースライン）から−５．８２±１．１９ｓ（２時間）へのＰＷＬの低下，ｐ＜０．０１）（図２）。このＮＧＦ誘導性痛覚過敏は，６時間では持続していたが，２４時間では持続していなかった。予測されたように，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（１０μｌ／ｐａｗ）を予め足底内投与すると，１，２および６時間において，ＮＧＦにより誘導された熱痛覚過敏がブロックされた（＊ｐ＜０．０１）（ｎ＝８）。抗ｐ７５ＮＴＲ抗体それ自体の注射によっては，ＰＷＬ（１．０８±０．９９ｓ）の変化はなかった。縦軸はＰＷＬマイナス対照ＰＷＬの値を示す。食塩水処置動物と反対側の肢では肢逃避反応潜時の有意な相違はなかった。これらの結果は，ＮＧＦのｐ７５ＮＴＲへの結合の阻害がＮＧＦ誘導性痛覚過敏を有効に低下させることを示す。【００６１】
ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体による痛み関連遺伝子の発現の低下
次に，挙動試験における所見を実証するために，ＣＧＲＰの発現を調べた。ＣＦＡの足底内注射により生じさせた実験的炎症は，炎症を起こした組織に分布する一次知覚ニューロンにおいて，神経ペプチド，サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）をアップレギュレートする（４）。抗ＮＧＦ中和抗体の全身投与は，ＣＧＲＰのアップレギュレーションを妨害するが，腫脹および紅斑は変化しない（４）。ＣＧＲＰの発現は小から中サイズのＤＲＧニューロンにおいて見出されたが，発現レベルは足底内ＣＦＡ注射の１８時間後にアップレギュレートされた。【００６２】
ＣＦＡ注射後のＤＲＧ中のＣＧＲＰ−ポジティブニューロンの数（５２．９２±９．３０細胞／０．１ｍｍ２）は，対照（３３．７１±７．５１細胞／０．１ｍｍ２）と比較して優位に増加していた（ｐ＜０．０１）（図３）。しかし，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（１０μｌ／肢）により前処置を行うと，ＣＧＲＰ−ポジティブニューロンの数に及ぼすＣＦＡの影響は完全になくなった（３２．５４±４．７２）（＊＊ｐ＜０．０１，各群ｎ＝５）。これらの結果は，挙動試験から得られた結果と一致する。【００６３】
ｐ７５ニューロトロフィンレセプターのリガンド誘導性逆行性輸送
ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体がＣＦＡ誘導性ならびにＮＧＦ誘導性痛覚過敏を低下させたため，リガンド−レセプター複合体がシグナリング複合体としての役割を果たすのかもしれないと考えられた。したがって，次に，ＮＧＦ注射の後にｐ７５ＮＴＲが逆行的に輸送されるか否かを調べた。【００６４】
内部に取り込まれたｐ７５ＮＴＲをモニターするために，ｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインに対する抗体であるＭＣ１９２を用いた。この抗体はラットｐ７５ＮＴＲに特異的であるため，この実験ではラットを使用した。ＮＧＦ処置ありまたはなしで，ＭＣ１９２を注射した１８時間後に，Ｌ５のレベルのＤＲＧを調べた。ＮＧＦ処置をしていないＤＲＧのニューロンにおいては，内部に取り込まれたＭＣ１９２はみられなかった。このことは，基底レベルのニューロトロフィンはｐ７５ＮＴＲの内部取り込みを誘導しないであろうことを示唆する。興味深いことに，ＮＧＦ処置の１８時間後，ＤＲＧニューロンの細胞体においてＭＣ１９２がみられた（図４）。このことは，リガンドによる刺激が末梢終末でｐ７５ＮＴＲの内部取り込みおよびＤＲＧ軸索を介するｐ７５ＮＴＲの輸送を促進したことを示す。ＮＧＦが結合すると，ｐ７５ＮＴＲは内部に取り込まれ，おそらくはＮＧＦおよび／またはＴｒｋＡとともに逆行的に輸送されたと考えられる。【００６５】
ＰｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合
上述の結果は，ＣＦＡ誘導性熱痛覚過敏にはｐ７５ＮＴＲへのリガンドの結合が必要であることを強く示唆する。したがって，次に，ＮＧＦが実際にインビボでｐ７５ＮＴＲに結合するか否かを調べた。足底内ＣＦＡ注射の１８時間後に，炎症を起こしたマウス足底皮膚を回収し，ＮＧＦ発現のプロファイルを調べた。抗ＮＧＦ抗体を用いるウエスタン分析を行ったところ，ＣＦＡ注射の後に末梢組織で１４ｋＤａのバンドとして検出されるＮＧＦ発現が強く誘導されていた（図５ａ）。また，分子量２４−３２ｋＤａの多数のバンドが明確に見られた。２６ｋＤａのバンドはｐｒｏＮＧＦに対応し，これは抗ｐｒｏＮＧＦ抗体で確認された。１４ｋＤａのバンドは成熟ＮＧＦに対応する。ＰｒｏＮＧＦは，炎症を起こした皮膚でアップレギュレートされていた。【００６６】
抗ＮＧＦ抗体で検出された蛋白質の分子量（１４ｋＤａ，２４−３２ｋＤａ）は，末梢炎症の間に成熟ＮＧＦおよびｐｒｏＮＧＦの両方ともアップレギュレートされたことを示唆する。すなわち，この結果は，ｐｒｏＮＧＦがＣＦＡ誘導性痛覚過敏において役割を果たしている可能性を示唆する。【００６７】
ただし，溶解物中のｐｒｏＮＧＦが分泌されたものであるか，細胞の内部で合成され残留したものであるかという疑問が残った。このため，ｐｒｏＮＧＦがＣＦＡ誘導性炎症状態におけるｐ７５ＮＴＲのリガンドであるか否かをさらに調べた。ｐｒｏＮＧＦがインビボで産生され分泌されているか否かを調べるために，ＣＦＡ注射後の皮膚を回収した。次に，皮膚の溶解物を抗ｐ７５ＮＴＲ抗体を用いて免疫沈殿させ，次に抗ＮＧＦ抗体を用いてｐ７５ＮＴＲ免疫複合体におけるｐｒｏＮＧＦまたは成熟ＮＧＦの存在を調べた。結果を図５ｂに示す。ＣＦＡ注射後に２６ｋＤａのＮＧＦ免疫反応性生成物がｐ７５ＮＴＲとともに沈殿したが，対照組織では共沈殿はみられなかった。１４ｋＤａの生成物も免疫沈殿したが，その量は２６ｋＤａの生成物と比較してはるかに少なかった。２６ｋＤａの生成物は，特異的抗ｐｒｏＮＧＦ抗体を用いるイムノブロットによりｐｒｏＮＧＦであることが示された（図５ｃ）。これらの結果は，ＣＦＡ誘導性痛覚過敏モデルにおいては，Ｐ７５ＮＴＲに結合するｐｒｏＮＧＦが大量に増加しており，ｐｒｏＮＧＦがｐ７５ＮＴＲの支配的なリガンドであることを示す。【００６８】
プラスミンによるｐｒｏＮＧＦの分解
上述の結果は，ｐｒｏＮＧＦがＣＦＡ誘導性痛覚過敏において役割を果たすことを示唆する。細胞外に分泌されたｐｒｏＮＧＦは，セリンプロテアーゼであるプラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼ７により分解される（１７）。ｐｒｏＮＧＦが炎症過敏性に必要であるか否かを調べるために，次に，ＣＦＡ誘導性炎症モデルにおいて，ＣＦＡ処置の後にプラスミンを足底内注射してｐｒｏＮＧＦを分解した。プラスミン処理により，ｐｒｏＮＧＦの量は減少し，成熟ＮＧＦの量は増加するはずである。すなわち，ｐｒｏＮＧＦが成熟ＮＧＰより強力な痛覚過敏の誘導剤であれば，ＣＦＡ誘導性痛覚過敏はプラスミン処置により軽減すると考えられる。【００６９】
予測されたように，プラスミン処置（１０μｇ／肢）の後では，熱過敏性は，足底内ＣＦＡ注射の６時間後に，プラスミン処置なしの足底内ＣＦＡ注射（−４．６９±１．８９ｓ，ｐ＜０．０１）と比較して有意に低下した（−１．６３±０．９６ｓ）（図６）。これらの知見は，ｐｒｏＮＧＦがｐ７５ＮＴＲの支配的なリガンドであり，リガンドの結合をブロックすると，炎症誘導性熱過敏性が低下するという概念を裏付ける。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の鎮痛剤は，炎症性の痛みの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は，ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体によるＣＦＡ誘導性痛覚過敏の防止を示す。
【図２】図２は，ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体によるＮＧＦ媒介性痛覚過敏の防止を示す。
【図３】図３は，ｐ７５ＮＴＲに対する中和抗体による痛み関連遺伝子の発現の低下を示す。
【図４】図４は，ｐ７５ニューロトロフィンレセプターのリガンド誘導性逆行性輸送を示す。
【図５】図５は，ＰｒｏＮＧＦとｐ７５ＮＴＲとの結合を示す。
【図６】図６は，プラスミンによるｐｒｏＮＧＦの分解の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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