(57)【要約】（要約）（課題）複雑な操作が不要であり、血圧上昇抑制効果、あるいは血圧低下をもたらすことができる機能を有する血圧低下剤を提供すること。更に、小麦蛋白質からアンジオテンシン変換酵素阻害活性が低いか、あるいは該活性をほとんど示さず、しかも優れた血圧低下作用を有する血圧低下剤を提供すること。（解決手段）小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分血圧低下用組成物の有効成分とする。小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物が、小麦蛋白質の酸性プロテアーゼ加水分解物、あるいは前記加水分解液の中性又はアルカリ性プロテアーゼ加水分解物である。（選択図）      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分を有効成分として含有することを特徴とする血圧低下用組成物。
【請求項２】
水溶性成分が、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が低い水溶性成分である請求項１記載の血圧低下用組成物。
【請求項３】
小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物が、小麦蛋白質の酸性プロテアーゼ加水分解物、あるいは前記加水分解液の中性又はアルカリ性プロテアーゼ加水分解物である請求項１又は２記載の血圧低下用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の血圧低下用組成物を含有する飲食品又は飼料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の血圧低下用組成物を含有する健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分を含有する血圧低下用組成物に関する。さらには、アンジオテンシン変換酵素阻害作用がほとんど認められない水溶性成分であって、しかも小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分を有効成分として含有する血圧低下用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症に悩まされている患者を救済するため、高血圧症の理論的な解明の研究が盛んに行われ、数多くの報告がある。
その報告の一つとして、アンジオテンシン変換酵素が知られている。このアンジオテンシン変換酵素は、主に、肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンジオテンシンＩに作用して、そのＣ末端よりジペプチドを開裂遊離させ、血圧を強く上昇させる作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成させる酵素である。この酵素の活性を阻害できれば、アンジオテンシンＩＩを生成することができないので、血圧の上昇を抑制することができるし、ひいては血圧が降下することになる。従って、前記酵素を阻害できれば、高血圧症の予防、治療に有効であろうとの考えの下に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の開発研究が盛んに行われ、多数の技術が報告されてきた（例えば、特許文献１）。
さらに、それら阻害剤を経口摂取し、消化器官を通過しても、前記機能を保持することができるのであれば、その阻害剤を添加した食品を摂取することにより高血圧症を予防または治療できるのであるから、極めて好都合であるなどの考えに基づき、食品に添加・配合することができるアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する研究も行われ、数多くの報告例がある（例えば、特許文献２、特許文献３）。【０００３】
一方、従来から食品中に含まれる蛋白質は種々の生理活性を有することが知られている。
例えば、小麦胚芽、あるいは小麦グルテンからアンジオテンシン変換酵素阻害剤を調製する技術も知られている(特許文献４、特許文献５、特許文献６)。これら技術によりアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供することができたのであるが、それらアンジオテンシン変換酵素阻害剤を調製する製造工程が複雑であるという不都合さがある。例えば、前者の技術では、小麦胚芽のホモジネート液への酵素処理物を精製処理し、更にステップワイズグラジエント法により特定の画分からの濃縮物をアンジオテンシン変換酵素阻害剤とする。    
このステップワイズグラジエント法は幾種類もの溶出液を用意し、それら溶出液を順次カラムに注ぐ処理操作が必要である。後者の技術も、小麦蛋白質の酵素処理物を複数の溶媒を用いて処理する工程が必須となっている。そのうえ、従来の小麦中に含まれる蛋白質加水分解物の血圧低下に有効な成分は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つもののみであった。前記成分はアンジオテンシン変換酵素阻害機能を果たす結果として、キニン増強作用が起こり、そのために空咳、発疹、フラッシュなどの副作用を引き起こす可能性が高いという欠点も指摘されている。
これら複雑な操作が不要であり、しかも血圧上昇抑制効果、あるいは血圧低下をもたらすことができる機能を有する成分を見出すことが望まれている。また、前記欠点がなく、しかも血圧上昇抑制効果、あるいは血圧低下をもたらすことができる機能を有する成分を見出すことが望まれている。【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−５４３２６号公報
【特許文献２】特開平６−４０９４４号公報
【特許文献３】特開平６−１９７７８６号公報
【特許文献４】特開２０００−１９１６９２号公報
【特許文献５】特開平４−９１０９７号公報
【特許文献６】特開平４−３４９８９３号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２００４  Ｓｅｐ．１０（９），５３５−４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、従来の技術と比較して複雑な操作が不要であり、しかも血圧上昇抑制効果、あるいは血圧低下をもたらすことができる機能を有する成分を見出すべく、いろいろと検討を重ねたが、なかなか満足できる技術に到達できなかった。そこで、研究方針を変更し、アンジオテンシン変換酵素阻害という一つの固定観念にこだわることなく、血圧低下作用をもたらす新たな技術を開発しようという考えに至り、その方針の下に、研究開発を試みた。  
すなわち、本発明の課題は、小麦蛋白質からアンジオテンシン変換酵素阻害活性が低いか、あるいは該活性をほとんど示さず、しかも優れた血圧低下作用を有する血圧低下剤を提供することにある。また、複雑な操作が不要であり、血圧上昇抑制効果、あるいは血圧低下をもたらすことができる機能を有する血圧低下剤を提供することにある。更に、空咳、発疹、フラッシュなどの副作用を引き起こす可能性がほとんどなく、しかも優れた血圧低下作用を有する血圧低下剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、小麦蛋白質をプロテアーゼ処理し、その処理物から不溶物を除去するという簡単な操作により水溶性成分を調製してみると、意外にもその水溶性成分はアンジオテンシン変換酵素阻害作用がほとんど無いのにもかかわらず、優れた血圧低下作用を有するという知見を得た。その知見に基づき、さらに検討を重ね、ついに本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は次のとおりである。
請求項１の発明は、小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分を有効成分として含有することを特徴とする血圧低下用組成物である。また、小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分を有効成分として含有することを特徴とする血圧低下剤でもある。該請求項１の血圧低下用組成物に含まれる水溶性成分が、アンジオテンシン変換酵素阻害活性をほとんど示さない水溶性成分である発明が請求項２の発明である。とくに、アンジオテンシン変換酵素阻害活性をインビボ法で測定すると、アンジオテンシン変換酵素阻害活性は低いか、ほとんど認められない。
請求項１又は２記載の血圧低下用組成物に含まれる水溶性成分が、小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物が小麦蛋白質の酸性プロテアーゼ加水分解物、あるいは前記加水分解液の中性又はアルカリ性プロテアーゼ加水分解物である発明が、請求項３の発明であり、上記請求項１〜３のいずれか一つの血圧低下用組成物を含有する飲食品又は飼料の発明が、請求項４の発明であり、同じく前記組成物を含有する健康食品の発明が、請求項５の発明である。【０００８】
以下、本発明を詳述する。
本発明において使用する小麦蛋白質は、とくに制限されないが、具体的には小麦グルテン、あるいはその小麦グルテンにアルブミン、グロブリン等の小麦中に含有することが知られている他の蛋白質を含有させた混合物が好ましい。ここで、澱粉や繊維質など小麦粒にもともと存在する成分がごく少量共存してもよい。さらに本発明の効果を損なわない限り他の蛋白質を含有させてもよい。
前記小麦蛋白質は小麦粉から公知の方法を適用して製造することができる。また、市販品を購入してもよいし、市販品を基に調整してもよい。【０００９】
本発明は、上記小麦蛋白質をプロテアーゼ処理することが一つの大きな特徴である。ここで用いるプロテアーゼは蛋白質分解酵素を意味する。本発明ではプロテアーゼであればどのようなプロテアーゼでも使用可能であり、特に制限されない。このプロテアーゼ処理は、基質にプロテアーゼを接触させ基質を変化させる処理を意味し、通常、基質の加水分解処理を意味する。
小麦蛋白質のプロテアーゼによる加水分解の程度はとくに制限されないが、例えば分子量２００〜２，０００Ｄａのペプチド混合物をプロテアーゼ処理物に対して５０〜９０重量％含有する程度に処理することが好ましい。前記分子量は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー法によって測定される値である。【００１０】
プロテアーゼの中では酸性プロテアーゼが特に好ましい。酸性プロテアーゼとしては、ｐＨ約１.５以上７.０未満の酸性領域で作用するプロテアーゼであればどのような酸性プロテアーゼでも使用可能であるが、その中でもとくにペプシンあるいは生物とくに微生物起源の酸性プロテアーゼが好適である。その中でも、麹菌起源の酸性プロテアーゼ、バチルス属に属する菌起源の酸性プロテアーゼ、ペニシリウム属やアスペルギルス属に属する菌起源のプロテアーゼ等の微生物起源の酸性プロテアーゼ、ヒイロタケ起源のプロテアーゼ等を使用することが好ましい。【００１１】
酸性プロテアーゼは、１種類のみを使用してもよいが、複数の酵素を併用してもよい。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は、複数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を行っても、または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい。いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当たり酸性プロテアーゼを合計で約５,０００〜２５０,０００unitsの割合で用いるのがよい。ここで、１unitとはこの業界で通常用いられる考えであり、後述する。
小麦蛋白質を水性媒体中に分散または溶解させた状態で、まず酸性プロテアーゼを使用して加水分解を行う。この場合、使用するプロテアーゼの種類等により適宜調節する必要があるが、通常、水性媒体中における小麦蛋白質の濃度を約１.０〜４０.０重量％程度にして酸性プロテアーゼで加水分解するのがよい。ここで、水性媒体としては、水が好ましいが、必要に応じて他の成分を所定量加えてもよい。【００１２】
この加水分解処理は、特に制限されないのであるが、例えば加水分解度が約３０〜７０％の状態になるまで行うとよい。
酸性プロテアーゼとしてペプシンや微生物起源の酸性プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する場合は、小麦蛋白質を含有する水性媒体液のｐＨを約１.５〜５.０にして、温度約３０〜７０℃で約２〜２５時間加水分解を行うと、加水分解度が約３０〜６０％の状態になるので、その時点で酸性プロテアーゼを失活させて加水分解を停止させることが好ましい。水性媒体は水、イオン交換水、水道水などが挙げられ、ｐH調整試薬等が含まれてもよい。
酸性プロテアーゼの失活は、通常、液のｐＨを酸性プロテアーゼの活性ｐＨよりも高くする方法（例えば中性またはアルカリ性に調節する）、または高温（通常約７０〜９０℃）に加熱する方法等により行うことができるが、それら方法の複数を適宜選び、併用してもよい。【００１３】
ここで、上記加水分解度は、０.７５Ｍトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)への溶解率で示したものであり、次式で表される。
加水分解度(％)＝{(０.７５Ｍ：ＴＣＡ溶解蛋白量)／(全蛋白量)}×１００【００１４】
本発明においては、酸性プロテアーゼで処理して得た生成物をそのまま、水溶性成分を得るための原料として使用することができるが、さらに、酸性プロテアーゼで処理して得た液のｐＨを調節した後に、中性またはアルカリ性プロテアーゼで処理することもできる。
この中性またはアルカリ性プロテアーゼによる処理は、基質に中性またはアルカリ性プロテアーゼを接触させ基質を変化させる処理を意味し、通常、基質の加水分解処理を意味する。【００１５】
中性またはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解を行う場合は、通常、ｐＨ約６〜１０の領域で作用するプロテアーゼを使用するのがよく、そのようなプロテアーゼの例としては、バチルス属に属する微生物起源の酵素、サーモライシン、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、サチライシン、エスペラーゼ等を挙げることができる。そのうちでも、サーモライシンやサチライシンを使用すると、目的物であるペプチド混合物を高収率で得ることができ好ましい。【００１６】
中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは、１種類のみを使用することができるが、複数の酵素を併用してもよい。複数のプロテアーゼを使用する場合は、それらを同時に存在させて加水分解を行っても、または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい。また、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは、固定化して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当たり中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを約１０,０００〜５００,０００unitsの割合で用いるのがよい。【００１７】
この中性またはアルカリ性プロテアーゼによる加水分解処理は、特に制限されないのであるが、例えば加水分解度が約６０〜９０％の状態になるまで反応を行い、その時点で中性またはアルカリ性プロテアーゼを失活させるのがよい。例えば、サーモライシンを使用して加水分解する場合は、液のｐＨを約７.０〜８.０にして、温度約３０〜７０℃で約２〜２５時間加水分解を行い、加水分解度約６０〜９０％の状態になった時点でサーモライシンを失活させるとよい。ここで、上記加水分解度は、上述した０.７５Ｍトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)への溶解率で示したものである。
中性またはアルカリ性プロテアーゼの失活は、液のｐＨを酸性に調節する方法および／または液を高温（通常約８０〜１００℃）に加熱する方法等により行うとよい。【００１８】
ここで、本明細書中のプロテアーゼ活性（unit）はすべて下記の方法により測定したものである。
プロテアーゼ活性の測定法
基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四郎編 酵素研究法第２巻、第２３７頁（昭和３６年１月１０日、朝倉書店発行）］により測定した。反応は３０℃で３０分間行い、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵素量を１unitとした。【００１９】
次に、上記のプロテアーゼ処理液から、不溶物を分離除去して水溶性成分を得る。ここで、不溶物とは本発明で規定する基質のプロテアーゼ処理物に存在する不溶物を意味し、例えば水不溶物を挙げることができる。不溶物の除去は、従来から知られている方法を適宜使用すればよい。具体的な方法としては、遠心分離、濾過、デカンテーション等の通常の固液分離方法のいずれか単独、あるいは複数の方法を採用できる。【００２０】
不溶物を除去した後の水溶性成分をそのまま血圧低下剤の有効成分としてもよいが、まず活性炭、ケイソウ土等の吸着剤を使用してそこに含まれる不純物を吸着除去してから血圧低下剤の有効成分としてもよい。【００２１】
上記水溶性成分は、小麦蛋白質のプロテアーゼ処理による水溶性ペプチド混合物が主成分であり、さらにアミノ酸や他の水溶性の物質を含む。この水溶性成分はアンジオテンシン変換酵素阻害活性が低いか、あるいはほとんど認められないことが本発明の一つの特徴である。とくに、インビボ法での活性試験ではアンジオテンシン変換酵素阻害活性がほとんど認められない。ここで、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が低いか、あるいはほとんど認められないこととは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を、非特許文献１に記載の松井らの方法に準じて測定した結果から判断する。すなわち、試料を血圧低下作用を示す量投与後１〜４時間の間のラットの血漿中の馬尿酸の生成量の測定値(平均値)から判断したときに、該測定値が対照値と比較して５％以下の変動量のときをいう。ラット試験法での測定値は、多数のラットを用いた測定値の平均値を用い、できるだけ測定値に意味を持たせるように測定した。なお、測定する試料を添加していないほかはすべて同じ操作で調製した試料を対照とした。
ラットを用いた動物試験によると、本発明の水溶性成分はアンジオテンシン変換酵素阻害活性がほとんど認められない。アンジオテンシン変換酵素阻害活性がほとんど認められないにもかかわらず、血圧低下作用が優れていることから見て、本発明の血圧低下作用はアンジオテンシン変換酵素阻害活性剤の血圧低下作用とは異なる血圧低下の機構により血圧低下がもたらされると考えられる。【００２２】
上記方法によって得られた水溶性成分をそのまま、本発明の血圧低下用組成物（以下、血圧低下剤ということがある）とすることができるが、当該水溶性成分を乾燥処理し、固体状として血圧低下剤とすることもできる。
本発明の血圧低下剤は、ヒトおよび種々の動物に投与することができ、ヒトや動物の血圧低下および血圧上昇抑制をもたらすことができる。
本発明の血圧低下剤の好適な投与量は、投与されるヒトや動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種々の条件によって異なる。そして、本発明の血圧低下剤は経口投与および非経口投与のいずれによっても投与可能である。
本発明の血圧低下剤は、それ単独で投与してもよいし、また製薬技術分野において通常使用されている担体と共に投与してもよい。前記担体としては固体状担体又は液状担体が好ましい。なお、ここでいう担体は、前記血圧低下剤を溶解し希釈する所謂溶剤や溶解補助剤、賦形剤や崩壊剤などを含む。
前記溶剤としては、例えば精製水、エタノール等があげられ、溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、エタノール、トリスアミノメタン、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
賦形剤としては、例えば白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、軟質無水ケイ酸、貝類粉末、乳糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース、サイクロデキストリン等が挙げられ、崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、寒天等が挙げられる。
前記血圧降下剤と担体との量割合はとくに制限されないのであるが、あえて記載すれば、血圧降下剤1重量部に対して担体を０．０１〜２０００重量部とすることができる。【００２３】
さらに、本発明の血圧低下剤には、医薬、食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤を配合することができるし、種々の物質と共存させてもよい。このような物質や添加剤としては、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料および香料などが挙げられる。【００２４】
前記各種油脂としては、例えば大豆油、サフラワー油、オリーブ油等の植物油、牛脂、イワシ油等の動物油脂が挙げられる。
前記生薬としては、例えば牛黄、地黄、枸杞子、ロイアルゼリー、人参、鹿茸等が挙げられる。
前記アミノ酸としては、例えばメチオニン、ロイシン、アルギニン等が挙げられる。
多価アルコールとしては、例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール等が挙げられる。前記糖アルコールとして、例えば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール等が挙げられる。
天然高分子としては、例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテンまたはグルテン加水分解物、レシチン、デキストリン等が挙げられる。【００２５】
前記各種ビタミンとしては、例えばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ群、ビタミンＥ（トコフェロール）の他に、ビタミンＡ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、酪酸リボフラビンなどが含まれる。また、ビタミンＢ群には、ビタミンＢ1誘導体、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ビタミンＢ13、さらにビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸などの各種ビタミンＢ複合体が包含される。ビタミンＢ1誘導体には、チアミンまたはその塩、チアミンジスルフィド、フルスルチアミンまたはその塩、ジセチアミン、ビスブチチアミン、ビスベンチアミン、ベンフォチアミン、チアミンモノフォスフェートジスルフィド、シコチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミンなどのビタミンＢ1の生理活性を有する全ての化合物が包含される。【００２６】
前記ミネラルとしては、例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等の化合物が挙げられる。
食物繊維としては、ガム類、マンナン、ペクチン、ヘミセルロース、リグニン、β−グルカン、キシラン、アラビノキシランなどが挙げられる。
前記界面活性剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。【００２７】
また、種々の添加剤として、上記以外に、例えば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムＱ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、テアニン、γ−アミノ酪酸、カプサイシン、各種有機酸、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。【００２８】
それら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、一般的には０.０１〜３０質量％の範囲であり、好ましくは０.１〜１０質量％の範囲である。【００２９】
本発明の血圧低下剤は、他の薬剤と混合または組合わせて使用することができる。その際の投与形態は、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、シロップ、水溶液、注射剤、ドリンク剤、流動食等の任意の形態が可能である。
更に、本発明の血圧低下剤は、飲食品や飼料中に添加することもできる。飲食品の具体的には、コーヒー飲料、茶飲料、果汁入り飲料、清涼飲料、乳飲料、バター、マヨネーズ、ショートニング、マーガリン、種々のサラダドレッシング、パン類、麺類、米飯類、パスタ、菓子、クッキー類、チョコレート、キャンディ、チューインガム、各種調味料、流動食、各種ダイエット製品、各種健康食品などが挙げられる。
これら血圧低下剤を配合する飲食品を摂取することにより、血圧の低下又は血圧上昇抑制などの効果を期待することができる。
それら血圧降下剤の飲食品、医薬、飼料などへの配合量は、飲食品、医薬、飼料など添加剤の種類、所望の摂取量等に応じて適宜決められるのであって、一概に規定することができないが、一般的には、血圧降下剤の飲食品、医薬、飼料などへの配合量は０.０１〜３０質量％の範囲であり、好ましくは０.１〜１０質量％の範囲である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、従来技術よりも簡単な方法で血圧低下能に優れた血圧低下用組成物を提供することができる。この血圧低下用組成物はアンジオテンシン変換酵素阻害作用が低いか、あるいはほとんど認められない。それにもかかわらず優れた血圧低下用組成物を示す。さらに、この血圧低下用組成物は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用に由来する空咳、発疹、フラッシュなどの副作用がない。そのうえ、本発明の血圧低下用組成物は簡単に入手することができる原料を用いて簡単に、しかも収率良く製造することができるうえ、各種飲食品に配合することができるので、きわめて実用的な発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。【００３２】
実施例１    
反応釜に小麦グルテン（活性グルテン、Weston Foods Limited製）３００ｇ、水１９２０ｍＬ、クエン酸７．０ｇを仕込み、さらにクエン酸を用いてｐＨを４．０に調整し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社製）０．４５ｇ（２００００ｕｎｉｔ）を加えて４５℃に加温し、５時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えて溶液をｐＨ７．５に調製し、温度を８５℃にして１０分間保って酸性プロテアーゼを失活させた。
次に温度を６５℃に調整し、中性プロテアーゼ（サーモアーゼＰＣ１０Ｆ、アマノエンザイム社製）０．４５ｇ（３２００００ｕｎｉｔ）を加えて５時間反応させた後、温度を９０℃にして２０分間保って中性プロテアーゼを失活させた。
該反応液を遠心分離（８０００Ｇ、３０分）して不溶物を除去し、上清を回収して水溶性成分を得たのち、活性炭８ｇ、ケイソウ土６０ｇを添加して室温で１時間攪拌した。次いで、濾過処理し、固形物を分離除去して液体分を回収し、凍結乾燥して乾燥固体１６６ｇを得た。【００３３】
試験例１：血圧低下作用試験（単回投与）およびその評価
１２週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲラット）の収縮期血圧（ＳＢＰ）を小動物加温型非観血式血圧計（室町機械；ＭＫ−２０００）を用いて測定し、ＳＢＰ２００ｍｍＨｇ以上の動物を試験に用いた。
動物に実施例１の乾燥固体を注射用水に溶解したものを、表１に記載した量となるように調整し、単回経口投与した。投与前および、２、４、６、８時間後に血圧測定を行った。対照群には注射用水を経口投与し、１群の動物数は１０とした。
統計検定はTukeyの多重比較検定を行った。
なお、使用ラットは、1１週齢のSHR／Izm雄性ラットを日本エスエルシー株式会社より購入し、1週間以上の検疫期間を含む予備飼育の後、一般状態に異常がみられなかった動物を選択し、使用した。
測定結果を表1に示した。  【００３４】
比較例１    アンジオテンシン変換酵素阻害作用を示す水溶性成分の製造
反応釜に小麦グルテン（活性グルテン、Weston Foods Limited製）２６７ｇ、水１７００ｍＬ、クエン酸７．０ｇを仕込み、さらにクエン酸を用いてｐＨを４．０に調整し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社製）０．４ｇを加えて４５℃に加温し、５時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えて溶液をｐＨ７．５に調製し、温度を８５℃にして１０分間保って酸性プロテアーゼを失活させた。
水２０００ｍＬを加え、温度を６５℃に調整し、中性プロテアーゼ（サーモアーゼＰＣ１０Ｆ、アマノエンザイム社製）０．４ｇを加えて４時間反応させた後、温度を９０℃にして２０分間保って中性プロテアーゼを失活させた。ついで、この反応液を遠心分離（８０００Ｇ、３０分）して不溶物を除去し、上清を回収して水溶性成分を得たのち、活性炭８ｇ、ケイソウ土６０ｇを添加して室温で１時間攪拌し、濾過により固形物を分離除去して液体分を回収し、凍結乾燥して乾燥固体１５０ｇを得た。
上記乾燥固体に７５％エタノール１５０ｍＬを添加して室温で１時間攪拌した。次いで遠心分離して沈殿を除去し、上澄み液に９９.５％エタノール７５０ｍＬを添加して室温で１時間攪拌した後、沈殿物を濾過により除去し、エタノールを蒸発除去し、残留物を凍結乾燥して乾燥固体４０ｇを得た。【００３５】
試験例２：比較例１の水溶性成分の血圧低下作用試験（単回投与）
実施例１の乾燥固体の代わりに比較例１の乾燥固体を用い、それ以外は試験例１と同様な操作を行い、血圧測定を行った。
測定結果を表1に示した。  【００３６】
表１：血圧低下作用（平均値：ｍｍＨｇ）
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表１から明らかなように、本発明の実施例１の血圧低下組成物を投与した動物は、対照群および比較例１の組成物に比べても強い血圧低下作用を示すことが明らかとなった。さらに、実施例１の単位乾燥固体量を調製するために用いたグルテン量は、比較例１の単位乾燥固体量を調製するために用いたグルテン量の約０．２７倍であることからみても、本発明の実施例１の血圧低下組成物は優れていることが分かった。
また、実施例１の血圧低下組成物は、比較例１の血圧低下組成物（アンジオテンシン変換酵素阻害作用を示す成分）を１／４程度しか含んでいないのにもかかわらず、強い血圧低下作用を示すことから、実施例１の血圧低下組成物は、アンジオテンシン変換酵素が関与する血圧低下作用とは別異の血圧低下作用によるものと考えられる。【００３７】
実施例２
反応釜に小麦グルテン（活性グルテン、Weston Foods Limited製）５０ｇを水３２０ｍＬに分散させ、クエン酸を用いてｐＨを４．０±０.３に調整し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社製）０．１５ｇを加え、加熱して４５±３℃で５時間反応させた。反応終了後に水酸化ナトリウムを加えて溶液をｐＨ７．５±０.３に調製し、中性プロテアーゼ（サーモアーゼＰＣ１０Ｆ、大和化成社製）０．１５ｇを加えて、６５±３℃で５時間反応させた。該反応液を遠心分離（８０００Ｇ、３０分）して不溶物を除去し、上清を回収して水溶性成分を得たのち、塩酸を用いてｐＨ５.５に調製し、凍結乾燥して乾燥固体２５ｇを得た。
実施例２の乾燥固体を試験例１と同様な方法で血圧低下作用試験した。その結果を表２に示した。【００３８】
表２：血圧低下作用（平均値：ｍｍＨｇ）
2007119590.tif 000003
比較例１のデータを表２にも記載した。
表２から明らかなように、本発明の実施例２の血圧低下組成物を投与した動物は、対照群および比較例１の組成物に比べても強い血圧低下作用を示すことが明らかとなった。さらに、実施例２の単位乾燥固体量を調製するために用いたグルテン量は、比較例１の単位乾燥固体量を調製するために用いたグルテン量の約０．３０倍であることからみても、本発明の実施例２の血圧低下組成物は優れていることが分かった。
また、実施例２の血圧低下組成物は、比較例１の血圧低下組成物（アンジオテンシン変換酵素阻害作用を示す成分）を１／４程度しか含んでいないのにもかかわらず、強い血圧低下作用を示すことから、実施例１の血圧低下組成物は、アンジオテンシン変換酵素が関与する血圧低下作用とは別異の血圧低下作用によるものと考えられる。【００３９】
試験例３：アンジオテンシン変換酵素に対する作用（単回投与）
試験例１と同様の方法で、ＳＨＲラットに実施例１の乾燥固体を経口投与し、投与後１、４時間に採血および大動脈の摘出を行い、血漿中および大動脈組織中のアンジオテンシン変換酵素活性を測定した。対照群には注射用水を経口投与し、１群の動物数は３とした。【００４０】
（アンジオテンシン変換酵素活性の測定）
血液中のアンジオテンシン変換酵素活性は、採血１０ｍＬから血漿を用いて、組織中のアンジオテンシン変換酵素活性は大動脈のホモジナイズ試料を用いて測定した。血漿またはホモジナイズ試料上清５０μＬに、２００μＬの５ｍＭヒップリル-ヒスチジン-ロイシン（１００ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８.３）、３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣＬ）（（シグマアルドリッチ社製）を添加して３７℃で３０分間インキュベートした。反応後７５０μＬの３％メタリン酸を加えて１００００ｇ、１５分間、４℃で遠心し、除タンパクを行った。上清をとり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて馬尿酸量の定量を行った。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：  Inertsil  ODS-3（４.０ｍｍ×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス社製）
カラム温度：  ４０℃
波長：  ２２８ｎｍ
移動相：  アセトニトリル：蒸留水：トリフルオロ酢酸＝３５：６５：０．１
測定結果を表３に示した。【００４１】
表３：アンジオテンシン変換酵素活性（馬尿酸生成量の平均値）
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表３から明らかなように、本願の血圧低下組成物の投与後、血漿中、および大動脈組織中のアンジオテンシン変換酵素活性は対照に比べて変化がなく、本願の血圧低下作用にアンジオテンシン変換酵素阻害作用が関与しない事が明らかとなった。【００４２】
試験例４：血圧低下作用（連続投与）
１２週齢のＳＨＲラットの収縮期血圧（ＳＢＰ）を小動物加温型非観血式血圧計（室町機械；ＭＫ−２０００）を用いて測定し、ＳＢＰ２００ｍｍＨｇ以上の動物を試験に用いた。動物に実施例１の乾燥固体を注射用水に溶解したものを、表４に記載した量となるように調整し、２８日間連続で経口投与した。投与７、１４、２１および２８日の投与前に血圧測定した。対照群には注射用水を経口投与し、１群の動物数は１０とした。
測定結果を表４に示した。【００４３】
表４：血圧低下作用（平均値：ｍｍＨｇ）
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表４から明らかなように、本願の血圧低下組成物を投与した動物は、連続投与によっても対照群に比べて明確な血圧低下作用を示す事が明らかとなった。【００４４】
試験例５：アンジオテンシン変換酵素活性に対する作用（連続投与）
試験例４と同様の方法でＳＨＲラットに実施例１の乾燥固体を９００ｍｇ/ｋｇとなるよう２８日間連続で経口投与し、投与７、１４、２８日に採血および大動脈の摘出を行い、血漿中および大動脈組織中のアンジオテンシン変換酵素活性を測定した。対照群には注射用水を経口投与し、１群の動物数は６とした。
測定結果を表５に示した。【００４５】
表５：アンジオテンシン変換酵素活性（馬尿酸生成量の平均値）
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表５から明らかなように、本願の血圧低下組成物を連続投与しても、血漿中、大動脈組織中のアンジオテンシン変換酵素活性は対照に比べて変化がなく、本願の血圧低下作用にアンジオテンシン変換酵素阻害作用が関与しない事が明らかとなった。【００４６】
試験例６：血圧低下作用（ヒト臨床試験）
軽症高血圧者（収縮期血圧：１４０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）で降圧薬による治療を受けていない成人男女を対象者とした。血圧測定は、座位で自動血圧測定装置（日本コーリン社；ＢＰ−２０３ＲＶＩＩ）にて行った。実施例１の乾燥固体を含む顆粒剤（乾燥固体として４ｇ）を８週間連続で摂取させた。摂取開始前および８週摂取後に血圧を測定した。また、摂取開始前および８週摂取後に採血を行い、血液中のアンジオテンシン変換酵素活性を測定した。対照群として、前記乾燥固体を含まない顆粒剤を摂取させ、各群は２０名とした。
統計検定は、摂取前と８週摂取後について対応のあるｔ−検定を行った。【００４７】
測定結果を表６に示した。
表６：血圧低下作用およびアンジオテンシン変換酵素活性  
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表６から明らかなように、本願の血圧低下組成物を摂取させた被験者において、収縮期血圧および拡張期血圧が有意に低下した。その一方血液中のアンジオテンシン変換酵素活性は摂取前と変化しておらず、本願の血圧低下組成物の血圧低下作用は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用とは異なる機構による事が明らかとなった。【００４８】
実施例３
実施例１の乾燥固体８４ｇ、結晶セルロース（旭化成社製）１０ｇおよびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製）５ｇを混合し、これにエタノール３０ｍＬを添加して、湿式法により常法にしたがって顆粒を製造した。
この顆粒を乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを加えて打錠用顆粒末とし、打錠機を用いて打錠し、１錠中に実施例１の乾燥固体０．８４ｇを含む錠剤１００個を製造した。【００４９】
実施例４
実施例１の乾燥固体１００ｇ、乳糖（ＤＭＶ社製）１００ｇおよび結晶セルロース（旭化成社製）４０ｇを混合し、これに１３０ｍＬを練合機に添加し、通常の方法により５分間練合した。練合終了後、１０メッシュで篩過し、乾燥機中にて５０℃で乾燥した。乾燥後、整粒し、ダイエット剤含有顆粒２４０ｇを得た。【００５０】
実施例５
精製水４００ｇを煮沸し、これにかき混ぜながら白糖７５０ｇおよび実施例１の乾燥固体１００ｇを加えて溶解し、熱時に布ごしし、これに精製水を加えて全量を１０００ｍｌとした。【００５１】
実施例６
約６５℃の純水７００ｇにカゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）４０ｇ、マルトデキストリン（三和デンプン社製）１６０ｇおよび実施例１の乾燥固体５０ｇを添加して溶解させ、ついでビタミンミックスおよび微量ミネラルの各成分混合液を添加した。混合液をホモミキサーに投入し、約８０００ｒｐｍにて１５分間粗乳化した。得られた乳化液を約２０℃に冷却し、香料を添加後、純水を用いて最終メスアップを行い、全量を１２００ｍＬとした。この液２３０ｇをパウチへ充填後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行って流動食を得た。【００５２】
実施例７
小麦粉（強力粉）１６０ｇとドライイースト２ｇを混ぜる。別に、実施例１の乾燥固体２０ｇ、砂糖２５ｇ、食塩３ｇ、脱脂粉乳６ｇを温湯７０ｇに溶かし、鶏卵１個を添加してよく混ぜる。これを上記の小麦粉に加え、よく手でこねた後、バター約４０ｇを加えてよくこね、２０個のロールパン生地を作った。次いで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で約１５分焼き、ロールパンを作成した。外観、味、食感ともに良好であった。【００５３】
実施例８  お米２合を用いて一般的な水量に対し、実施例１の乾燥固体２ｇを加え炊飯し、これを慣用の方法に従ってレトルト用パックに充填した後、窒素置換を行いながら密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行ってレトルトご飯を得た。また外観、味、食感ともに良好であった。【００５４】
実施例９
パスタ用のミートソース一人前（１５０ｇ）を鍋に入れ、これに実施例１の乾燥固体５ｇをくわえて加温した。このソースをパウチへ充填した後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行って、パスタ用ミートソースを得た。【００５５】
実施例１０
６倍濃縮オレンジ果汁１６８ｇと、実施例１の乾燥固体５ｇとをイオン交換水に溶解し、全量を１０００ｍＬとした。これを容器に充填し、６５℃で１０分間殺菌を行って、オレンジ果汁入り飲料を得た。【００５６】
本発明を次のように記載することができる。
（１）小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分混合物から本質的になることを特徴とする血圧低下用組成物。
（２）小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分混合物の乾燥固体及び担体から本質的になることを特徴とする血圧低下用組成物。
（３）水溶性成分混合物が、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が低い水溶性成分である上記（１）又は（２）記載の血圧低下用組成物。
（４）小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物が、小麦蛋白質の酸性プロテアーゼ加水分解物、あるいは前記酸性プロテアーゼ加水分解液の中性又はアルカリ性プロテアーゼ加水分解物である上記（１）〜（３）のいずれか記載の血圧低下用組成物。
（５）小麦蛋白質をプロテアーゼ処理して小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物を得る工程、及び前記プロテアーゼ処理物から不溶物を除去して水溶性成分混合物を得る工程を含むことを特徴とする血圧低下用組成物の製造方法。
（６）上記（５）の方法で得られることを特徴とする血圧低下用組成物。
（７）小麦蛋白質のプロテアーゼ処理物から不溶物を除去して得る水溶性成分混合物の血圧低下用組成物としての使用。
（８）上記（７）記載の水溶性成分混合物に担体を含む水溶性成分混合物の血圧低下用組成物としての使用。
【国際調査報告】
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