(57)【要約】本願発明は、Ｎ末端を修飾したタンパク質を大量に提供することを課題とする。  本願発明は、Ｎ末端にＡｒｇ又はＬｙｓを有する蛋白質については、当該末端にＬｅｕ又はＰｈｅを付加する能力を備えたロイシン／フェニルアラニン−ｔＲＮＡタンパク質転移酵素（ＬＦＰＴ）を用いて、修飾フェニルアラニンｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンをＮ末端アルギニンに付加させることにより、Ｎ末に修飾されたフェニルアラニンを有するタンパク質を調製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を、（１）修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅ若しくは修飾ロイシルｔＲＮＡＬｅｕ、及び（２）ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡタンパク質転移酵素の存在下で処理することによる、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。
【請求項２】
修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅが、変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素により修飾フェニルアラニンをｔＲＮＡＰｈｅに結合させることにより調製される請求項１記載の方法。
【請求項３】
修飾フェニルアラニンが下記式（１）で表される請求項２記載の方法。
【化１】
2007061128.tif 000021
上記式１中、Ｒ２は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、Ｒ３は水素又は水酸基、そして、Ｒ４は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。
【請求項４】
修飾フェニルアラニンがｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ又は蛍光標識されたフェニルアラニンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）が、配列番号２であらわされるＰｈｅＲＳのαサブユニットにおいて４１５位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させたＰｈｅＲＳである請求項２〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項１から５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を、（１）修飾フェニルアラニン若しくは修飾ロイシン、（２）ｔＲＮＡＰｈｅ若しくはｔＲＮＡＬｅｕ、（３）変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素若しくは変異型ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、及び（４）ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡタンパク質転移酵素の存在下で処理することによる、Ｎ末アルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。
【請求項８】
修飾フェニルアラニンが下記式（１）で表される請求項７記載の方法。
【化２】
2007061128.tif 000022
上記式１中、Ｒ２は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、Ｒ３は水素又は水酸基、そして、Ｒ４は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。
【請求項９】
修飾フェニルアラニンがｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ又は蛍光標識されたＰｈｅである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）が、配列番号２であらわされるＰｈｅＲＳのαサブユニットにおいて４１５位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させたＰｈｅＲＳである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項７から１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳαサブユニット、並びに
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳβサブユニットからなる変異ＰｈｅＲＳであって、
少なくとも、Ｔｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異が導入され、ｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化できる変異ＰｈｅＲＳ。
【請求項１３】
配列番号３で表されるＰｈｅＲＳαサブユニット及び配列番号２で表されるＰｈｅＲＳβサブユニットからなる野生型酵母ＰｈｅＲＳの変異体（変異ＰｈｅＲＳ）であって、
該酵母ＰｈｅＲＳの変異体はｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化でき、
少なくとも、Ｔｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異を導入した変異ＰｈｅＲＳ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、タンパク質の修飾又は修飾の技術分野に関する。更に本願発明は、タンパク質のＮ末の修飾又は標識する技術、並びに、タンパク質のＮ末に変異を与える技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に修飾を施すことにより、そのタンパク質の機能を改変又は増強する試みは種々行われている。例えば、血中に投与するタンパク質をＰＥＧ化することにより、血中滞在時間を延長させることなどが既になされている。
このような、タンパク質の修飾のため、タンパク質を合成時に、タンパク質中のアミノ酸に部位特異的にラベル化する技術として、アンバーサプレッションを用いて、ペプチド鎖中の任意の位置にラベルを導入する技術、Ｃ末端ラベル（修飾）する技術として、ピューロマイシン誘導体を用いてペプチド鎖のＣ末端にラベルを導入する方法、Ｎ末端ラベル（修飾）法として、αアミノ基を修飾した開始メチオニンを用いてペプチド鎖のＮ末端にラベルを導入する方法などが知られている。
このうち、Ｎ末端ラベル化タンパク質合成としては、（１）開始ｔＲＮＡにメチオニンをチャージした後で、αアミノ基を目的のラベル化剤で修飾し、（２）修飾メチオニル開始ｔＲＮＡを精製し、（３）大腸菌Ｓ３０抽出液でタンパク質を合成する際に上記修飾開始ｔＲＮＡを添加して合成する方法が知られている。具体的には、既に以下の方法が報告されている（特許文献１−３、及び非特許文献１−６）。
【特許文献１】米国特許第６２１０９４１号  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ
【特許文献２】米国特許第６３０３３３７号  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ
【特許文献３】米国特許６３０６６２８号  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ
【非特許文献１】Ｇｉｔｅ  Ｓ．，ａｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７９，２１８−２２５  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｇｅｌｓ
【非特許文献２】Ｏｌｅｊｎｉｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５２−２６０Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｔＲＮＡ
【非特許文献３】Ｋｕｄｌｉｃｋｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４４，３１９−３３１  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｂｏｕｎｄ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｒｈｏｄａｎｅｓｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．
【非特許文献４】Ｔｓａｌｋｏｖａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７８，７１３−７２３．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｒｉｎｏｓｏｍｅｓ．
【非特許文献５】ＭｃＩｎｔｏｓｈ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８２，１６７−１７４  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ（ｆ）ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩＦ−２
【非特許文献６】ＲａｍａｃｈａｎｄｉｒａｎＶ．Ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１７８１−１７８６  Ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ．
【発明の開示】
【０００３】
従来方法は、もっぱら、遺伝子組み換え法で調製されたタンパク質を更に分析するために分離マーカーとして使用する方法であり、アミノ酸が修飾されたタンパク質を大量に供給しようとするものではなかった。さらに、従来方法でＮ末端をラベルすると、大腸菌Ｓ３０抽出液を使用しているため、反応液内には，開始ｔＲＮＡも存在しているので、ラベル化効率（合成されたタンパク質のうち、ラベル化されたタンパク質の割合）が極めて低く、ラベルされたタンパク質を大量に入手しようとすることはできないという問題があった。
仮に翻訳反応系に存在する開始ｔＲＮＡを除く方法や、上記非特許文献３に記載の開始コドンをアンバーコドンに変異させ、サプレッサーｔＲＮＡを用いる方法によったとしても、修飾タンパク質の出現率自体は向上しても、反応系を大規模にすることは非経済的であることから、非天然アミノ酸（修飾アミノ酸）をＮ末に有する修飾タンパク質又は標識タンパク質を、経済的に大量に供給することは困難であると考えた。
そこで、本願発明は、Ｎ末端を修飾したタンパク質を大量に提供することを第１の課題とする。
本願発明者等は、Ｎ末端を修飾したタンパク質を大量に供給するためには、Ｎ末修飾蛋白質を遺伝子組み換え法により調製するよりも、未修飾蛋白質を酵素処理することにより修飾できる方法を開発するほうが効率的であると考え、酵素処理による蛋白質のＮ末端を修飾する方法の開発を検討したところ、鋭意研究の結果、酵素的に任意の蛋白質のＮ末端を修飾できる方法を見出した。
本願発明者らは、既に、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を修飾した修飾フェニルアラニン（以下フェニルアラニンアナログと呼ぶこともある）を変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）を用いてｔＲＮＡＰｈｅに結合し、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅを調製している。そこで、フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅからＰｈｅをＮ末端にアルギニン又はリジンを有するタンパク質に付加する能力を備えたロイシル／フェニルアラニル−ｔＲＮＡタンパク質転移酵素（Ｌｅｕｃｙｌ／Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下ＬＦＰＴと略することがある。）を用いることにより、本修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンを前記タンパク質のＮ末端に付加できるかどうか検討した。その結果、前記ＬＦＰＴを用いることにより、タンパク質のＮ末端を修飾できることを見出した。
すなわち、本願発明は、ＬＦＰＴ及び修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅを用いるタンパク質のＮ末端の修飾方法に関する。
第１に、本願発明は、Ｎ末端にアルギニン又はリジンを有するタンパク質については、当該末端にロイシン又はフェニルアラニンを付加する能力を備えたロイシル／フェニルアラニル−ｔＲＮＡタンパク質転移酵素（ＬＦＰＴ）を用いて、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンをＮ末端アルギニン又はリジンに付加させることにより、Ｎ末に修飾されたフェニルアラニンを有するタンパク質を調製する方法を包含する。
第２には、本願発明は、任意のタンパク質を分解することにより、Ｎ末端にアルギニン又はリジンを有する蛋白質を調製し、前記と同様に、ＬＦＰＴを用いて、修飾フェニルアラニるｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンをＮ末端アルギニン又はリジンに付加させることにより、Ｎ末に修飾されたフェニルアラニンを有するタンパク質を調製する方法を包含する。
第３には、本願発明は、任意の蛋白質のＮ末側にアルギニン又はリジンを付加したタンパク質を調製し、前記と同様に、ＬＦＰＴを用いて、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンをＮ末端アルギニン又はリジンに付加させることにより、Ｎ末に修飾されたフェニルアラニンを有するタンパク質を調製する方法を包含する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３３７５３７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＰＣＲ後のＬＦＰＴ遺伝子増幅の確認：１％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドにより染色した。Ｍはマーカーを示し、レーン１はＰＣＲ産物を流した結果である。レーン１の矢印の付近（約７００ｂｐ）に増幅したバンドがみられることから、目的とするＬＦＰＴ遺伝子（７０５ｂｐ）の増幅が確認できた。
なお、マーカーは上から１０，８，６，５，４，３．５，３，２．５，２，１．５，１，０．５ｋｂｐである。
図２は、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ後、ＬＦＰＴ遺伝子確認のための制限酵素処理：回収したプラスミドを導入に利用した制限酵素により切断した。１％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドにより染色した。Ｍはマーカーを示し、レーン１〜４が回収したプラスミドの制限酵素処理反応液を流した。矢印の付近（約７００ｂｐ）に目的とするＬＦＰＴ遺伝子に由来するバンドが確認できたので、目的遺伝子の導入が確認できた。
なお、マーカーは上から１０，８，６，５，４，３．５，３，２．５，２，１．５，１，０．５ｋｂｐである。
３番のプラスミド溶液がもっともバンドがはっきり確認できたので、これを形質転換に用いた。
図３は、ＥＲ２５６６株でのＬＦＰＴ発現と精製：ＥＲ２５６６株を形質転換し、発現を行った。破砕の後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅにより精製を行った。精製時の各サンプルを１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。Ｍはタンパク質マーカーを示し上から９７．４，６６．２，４２．４，３０，２０ｋＤａを示す。レーン１は不溶性画分、レーン２はＳ３０画分、レーン３はＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ樹脂に結合しなかった画分、レーン４は樹脂の洗浄画分そしてレーン５は要出画分である。レーン１にＬＦＰＴ（約２７ｋＤａ）と思われるバンドが確認できることから、多くは不溶性画分にあるものと思われる。しかしレーン５でもＬＦＰＴ（約２７ｋＤａ）と思われるバンドが確認でき、発現したＬＦＰＴの一部は可溶性画分に存在し、且つヒスチジンタグを有しているものと考えられる。
なお、マーカーは上から９７．４，６６．２，４２．４，３０．０，２０．０ｋＤａである。
図４は、ＲＩを用いたＬＦＰＴのアミノ酸転移反応の確認：ＬＦＰＴの活性を確認する為に、放射性アミノ酸［１４Ｃ］フェニルアラニンを利用し、アミノアシルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、アクセプタータンパク質への転移を測定した。反応後１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、イメージングプレートを用いて可視化した。Ｍはタンパク質分子量マーカーを示す。Ｃはアクセプタータンパク質にαカゼインを用いた場合、２はアクセプタータンパク質にジアミノペプチターゼであるＴＡＧＺｙｍｅによる処理を施しＮ末端にアルギニンを露出させたＥＧＦＰを用いた結果である。Ｃおよび２のどちらのレーンにおいても、［１４Ｃ］フェニルアラニンに由来するバンドが確認できることから、アミノアシルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、ＬＦＰＴの転移活性を確認することができた。
なお、マーカーは上から１７０，１３０，１００，７２，５５，４０，３３ｋＤａである。
図５は、様々なタンパク質へのＬＦＰＴによるアミノ酸転移の割合：ＬＦＰＴ活性の経時変化を確認する為に、放射性アミノ酸［１４Ｃ］フェニルアラニンを利用し、アミノアシルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、アクセプタータンパク質への転移量を測定した。０、１０、２０および３０分にサンプリングし、アクセプタータンパク質に転移した［１４Ｃ］フェニルアラニンの量を測定した。ドナーであるフェニルアラニルｔＲＮＡの調製に大腸菌由来ｔＲＮＡＰｈｅおよび大腸菌由来ＰｈｅＲＳを用い、アクセプターとしてαカゼインを利用した場合にはＬＦＰＴによるアミノ酸転移が確認できた。また、ドナーであるフェニルアラニルｔＲＮＡの調製に酵母由来ｔＲＮＡＰｈｅおよび酵母由来ＰｈｅＲＳを用いた場合でも同様にＬＦＰＴによるアミノ酸転移が確認できた。アクセプタータンパク質としてＮ末端にアルギニン又はリジンを持たないスレオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｈｒＲＳ）およびＥＧＦＰを用いた場合は転移が確認できないのに対し、ＴＡＧＺｙｍｅによりＮ末端側処理をしたＥＧＦＰではＬＦＰＴによるアミノ酸転移が確認できた。
図６は、ｐＴＡＧのクローニング：ｐＥＴ２１ａ（＋）と共発現可能なベクター（ｐＴＡＧ）の作製を示す。ｐ１５Ａ由来の複製起点を持つｐＰＲＯＬａｒＡ１２２を母体とし、ｐＥＴ２１ａ（＋）由来のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を導入した。
図７は、ｐＴＡＧＦＲＳＡとｐＥＴＦＲＳＢの構成：酵母由来ＰｈｅＲＳ  αサブユニットはｐＴＡＧにＮｄｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉにて導入し、酵母由来ＰｈｅＲＳ  βサブユニットはｐＥＴ２１ａ（＋）にＮｄｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉにて導入した。これらベクターは異なった複製起点を持ち、また薬剤耐性遺伝子も異なる為、同一ホストに２つのプラスミドを保持することが可能である。
図８は、酵母ＰｈｅＲＳの発現と精製：ＥＲ２５６６株を利用し、酵母由来ＰｈｅＲＳの発現を行った。その後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅおよびＰｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムにて精製を行い、それぞれの画分をＳＤＳＰＡＧＥにて分析を行った。Ｍはタンパク質マーカーを示し、上から９７．４，６６．２，４２．４，３０ｋＤａを示す。レーン１は大腸菌由来ＰｈｅＲＳ、レーン３は細胞破砕後のＳ３０画分、レーン４はＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅによる精製後の画分、レーン５はＰｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム精製後のサンプルである。レーン３〜５いずれのレーンにおいても、目的とする酵母由来ＰｈｅＲＳの両サブユニットに相当するバンドが確認でき発現、および精製できていることが確認できた。
図９は、酵母ＰｈｅＲＳのアミノアシル化活性測定：酵母由来ＰｈｅＲＳの酵素活性の経時変化を確認する為に、放射性アミノ酸［１４Ｃ］フェニルアラニンを利用し、アミノアシル化反応を測定した。０、５、１０、１５および２０分にサンプリングした。酵素を入れなければアミノアシル化反応は起こらないが、酵素を加えることでアミノアシル化が見られ、回収した酵素はＰｈｅＲＳ酵素機能を有していることが確認できた。
図１０は、変異型ＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５ＧとＴ４１５Ａ）の発現と精製：ＥＲ２５６６株を利用し、酵母由来ＰｈｅＲＳの発現を行った。その後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅにて精製を行い、それぞれの画分をＳＤＳＰＡＧＥにて分析を行った。レーン１はＴ４１５Ａの変異型ＰｈｅＲＳ発現菌体の破砕後のＳ３０画分、レーン２はそのＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅによる精製後の画分、レーン３はタンパク質マーカーを示し、上から９７．４，６６．２，４２．４，３０ｋＤａを示す。レーン４はＴ４１５Ｇの変異型ＰｈｅＲＳ発現菌体の破砕後のＳ３０画分、レーン５はそのＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅによる精製後の画分。レーン２および５いずれのレーンにおいても、目的とする酵母由来ＰｈｅＲＳの両サブユニットに相当するバンドが確認でき各変異型ＰｈｅＲＳの発現、および精製が確認できた。
図１１は、変異型ＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５ＧとＴ４１５Ａ）のアミノアシル化活性測定：変異型ＰｈｅＲＳの酵素活性の経時変化を確認する為に、放射性アミノ酸［１４Ｃ］フェニルアラニンを利用し、アミノアシル化反応を測定した。変異型ＰｈｅＲＳのいずれも野生型と比較すれば弱いが、本来の基質であるフェニルアラニンを認識していることが確認できた。
図１２は、パラ位に置換基をもつフェニルアラニンアナログを基質としたＰｈｅＲＳの非天然アミノ酸認識能の検索：三者複合体形成をゲル電気泳動により確認した結果を示す。
図１３は、図１２のつづき
図１４は、図１３のつづき
図１５は、ｐＥＴ２９ａのｃｌｏｎｉｎｇ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎの一部：ジアミノペプチターゼで消化した場合矢印のところで切断が起きる。切断中にアルギニンが出てきた場合、この部位で切断反応が終結するため、タンパク質Ｎ末端にアルギニンを提示した状態のタンパク質を調製することができる。
なお、矢印が切断部位、アンダーラインの部分が切断されるジペプチドを示す。
図１６は、ＥＧＦＰのＴＡＧＺｙｍｅ消化：ｐＥＴ２９にクローンされているＥＧＦＰのＴＡＧＺｙｍｅによる処理産物を１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した結果を示す。Ｍはタンパク質分子量マーカーを示し、上から１７０、１３０，１００、７２、５５、４０、３３ｋＤａである。Ｃはアクセプタータンパク質としてαカゼインを用いた場合、レーン２はＴＡＧＺｙｍｅにより処理したＥＧＦＰ，レーン３は処理しなかったＥＧＦＰである。レーン２と３を比較すると、ＴＡＧＺｙｍｅ処理により、分子量に違いが見られることから、ＥＧＦＰはＴＡＧＺｙｍｅの基質となり、切断反応が起きていることが確認できた。また更なる分解物は見られないことから、Ｎ末端にアルギニンを提示した状態で切断反応が止まっていることが示唆される。
なお、マーカーは上から１７０，１３０，１００，７２，５５，４０，３３ｋＤａである。
図１７は、ＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰへアミノ酸転移と蛍光化：フェニルアラニンアナログとしてアジドフェニルアラニンを選択し、変異型ＰｈｅＲＳを利用し、ドナーであるアミノアシルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、アクセプタータンパク質への転移を測定した。反応後アジド基選択的蛍光修飾試薬により修飾反応を行い、その後１２．５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、蛍光イメージャーにより可視化した。Ｃはアクセプタータンパク質にαカゼインを用いた場合、１はアクセプタータンパク質にジアミノペプチターゼであるＴＡＧＺｙｍｅによる処理を施しＮ末端にアルギニンを露出させたＥＧＦＰを用いた結果である。Ｃおよび１のどちらのレーンにおいても、アジド基選択的蛍光修飾試薬に由来する蛍光のバンドが確認できることから、アジドフェニルアラニルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、ＬＦＰＴによりアジドフェニルアラニンを転移できることが確認できた。
図１８は、ｐＥＴ−ＥＧＦＰのＮ末端側の改変。：ジアミノペプチターゼによるＮ末端処理にかわり、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによるアルギニン又はリジンのＮ末端提示法を検討する為にｐＥＴ−ＥＧＦＰの改変を行った。上は改変前の開始コドンからの配列の一部を示し、下は改変後の開始コドンからの配列の一部を示してある。か異変後は開始コドンの下流にＳｔｒｅｐＴａｇ配列を組み込み、且つさらに下流にＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ切断サイト（ＥＫ  ｓｉｔｅ）を導入した。これによりＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ処理によりアルギニンが露出する。
なお、上が改変前、下が改変後を表す。
図１９は、ＥＧＦＰ改１がＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより切断されていることを１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより確認した。：ＥＧＦＰ改１のＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅの処理の有無による電気泳動の移動度の違いを確認した。Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅの処理により約２．２ｋＤａ変化する。Ｍはタンパク質分子量マーカーを示し、上から９７、６６、４２および３０ｋＤａを示す。レーン１はＥＧＦＰ改１をＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したサンプル、Ｃは未処理のＥＧＦＰ改１である。移動度に差が見られることから、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより末端処理が施されていることが確認できた。なお、ＣＢＢ染色した。
図２０は、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）蛍光化したＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１の蛍光検出：アジドフェニルアラニンと変異型ＰｈｅＲＳを利用し、ドナーであるアミノアシルｔＲＮＡを同一反応系にて調製しながら、アクセプタータンパク質への転移を測定した。反応後アジド基選択的蛍光修飾試薬により修飾反応を行い、その後ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、蛍光イメージャー（ＬＡＳ３０００）により可視化した。Ｃはアクセプタータンパク質にαカゼインを用いた場合、レーン１はアクセプタータンパク質にＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによる処理を施しＮ末端にアルギニンを露出させたＥＧＦＰ改１を用いた結果、レーン２は未処理のＥＧＦＰ改１を用いた結果、レーン３はアクセプタータンパク質を反応に加えない場合を示す。レーン１において、アジド基選択的蛍光修飾試薬に由来するテトラメチルローダミンの蛍光のバンドが確認できることから、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによる処理を施しＮ末端にアルギニンを露出させたタンパク質はアクセプタータンパク質として利用できることがわかった。
図２１は、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１のＰＥＧ修飾のＰＡＧＥによる確認。：アジドフェニルアラニンの導入後、ＰＥＧを有するアジド基修飾試薬をおこない、その産物を電気泳動した。アクセプタータンパク質として用いたＥＧＦＰ由来の蛍光シグナルを蛍光イメージャー（ＬＡＳ３０００）により検出した。各レーンを比較するとＰＥＧを有するアジド基修飾試薬を加えることにより、ＥＧＦＰに由来するバンドが上にシフトしていること、また、修飾に用いたＰＥＧの平均分子量の違いも移動度に反映されていることから、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したＥＧＦＰ改１にＬＦＰＴによりアジドフェニルアラニンが転移し、その後アジド基選択的修飾試薬によりＰＥＧ修飾が導入できたと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．ＬＦＰＴを用いる修飾フェニルアラニンをＮ末に有する修飾タンパク質の製造方法
１−１．ＬＦＰＴの調製
ＬＦＰＴは、ロイシル−ｔＲＮＡＬｅｕもしくはフェニルアラニル−ｔＲＮＡＰｈｅをドナーとし、ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸（ロイシンもしくはフェニルアラニン）を、アクセプターとするタンパク質へ転移させる酵素である。アクセプタータンパク質としてはＮ末端がアルギニン又はリジンである必要が有る。本酵素はタンパク質の管理に関係があると考えられている。
本願発明で用いるＬＦＰＴとしては、ＬＦＰＴ活性（ロイシル／フェニルアラニルーｔＲＮＡタンパク質転移酵素（Ｌｅｕｃｙｌ／Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性）を有している限り、いかなる起源のＬＦＰＴであっても使用することができる。更に、天然型のＬＦＰＴを変異させた変異型ＬＦＰＴであっても、前記ＬＦＰＴ活性を有する限り使用することができる。
具体的には、ＬＦＰＴとしては、大腸菌由来のものを用いることができる。更にこれらのＬＦＰＴのアミノ酸配列（配列番号１）に対して、１〜５０個のアミノ酸、好適には、１〜２０個のアミノ酸、更に好適には１〜１０個のアミノ酸を、欠失、置換、又は付加から選ばれる１以上の変異を与えたアミノ酸配列を有し、且つ前記ＬＦＰＴ活性を有するアミノ酸配列で表される変異型ＬＦＰＴが包含される。更に具体的には、大腸菌由来の配列番号１のアミノ酸配列で示されるＬＦＰＴ及び該配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して、１〜５０個のアミノ酸、好適には、１〜２０個のアミノ酸、更に好適には１〜１０個のアミノ酸を、欠失、置換、又は付加から選ばれる１以上の変異を与えたアミノ酸配列を有し、且つ前記ＬＦＰＴ活性を有するアミノ酸配列で表される変異型ＬＦＰＴを挙げることができる。
１−２．修飾アミノ酸がｔＲＮＡに結合した修飾アミノ酸ｔＲＮＡ
本願発明で使用できる修飾アミノ酸が結合したｔＲＮＡとしては、修飾ロイシルｔＲＮＡＬｅｕ、及び修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅを用いることができる。
また、本願発明では、修飾フェニルアラニンとしては、下記式（１）で表される化合物が含まれる。
【化１】
2007061128.tif 000002
2007061128.tif 000003
上記式１中、Ｒ２は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、Ｒ３は水素又は水酸基、そして、Ｒ４は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。
なお、好適には、上記式１中のＲ２はＯＣＨ３又はＯＨ、Ｒ３はＯＨ、Ｒ４はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＮＯ２、ＯＣＨ３又はＯＨである。
なお、修飾フェニルアラニンをフェニルアラニンアナログと、修飾ロイシンをロイシンアナログと呼ぶこともある。
１−２−１．修飾アミノ酸ｔＲＮＡの調製
修飾ロイシルｔＲＮＡＬｅｕ、及び修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅは、有機合成法などの従来から周知の方法で製造できるが、例えば、修飾ロイシン、又は修飾フェニルアラニンを、それぞれを基質とする変異型のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、具体的には、変異型ＬｅｕＲＳ（Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ；ロイシルｔＲＮＡ合成酵素）又は変異型のＰｈｅＲＳ（Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ；フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素）を用いて、それぞれｔＲＮＡＬｅｕ又はｔＲＮＡＰｈｅに結合させることにより調製することができる。
１−２−２．アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、すべての生物に存在する酵素で、タンパク質合成において、ＡＴＰの加水分解エネルギーを利用し、アミノ酸を活性化しトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に結合させる酵素である。原核生物では、２０種類の天然アミノ酸に対応し、２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が存在し、真核生物では、細胞質に存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素２０種類と、ミトコンドリアに存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素２０種がある。これらのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、大きくは、クラス１とクラス２に分類され、クラス１は、アミノ酸配列中にＨＸＧＨというシグニチャー配列及びＫＭＳＫＳのヌクレオチド結合領域（ロスマンフォールド）を有している。クラスＩは、アルギニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が含まれる。
クラスＩＩは、これら特徴的配列を含んでおらず、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、及びセリンのそれぞれに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が含まれる。
それぞれのアミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、アミノ酸をｔＲＮＡに結合させる工程を触媒し、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）を例に取れば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）＋ＡＴＰ＋ｔＲＮＡＰｈｅ＋ＰｈｅＲＳ−＞  ＡＭＰ＋フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅ（Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｈｅ）＋ＰｈｅＲＳと反応する。
これまでに、種々の生物種から、それぞれのアミノ酸についての、アミノアシルＲＮＡ合成酵素が採取され、報告されている。
本発明では、ＬＦＰＴの基質は、ロイシルｔＲＮＡＬｅｕ又はフェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅであることから、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＬＲＳ又はＬｅｕＲＳと略すことがある）又はフェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＦＲＳ又はＰｈｅＲＳと略すことがある）を利用する。
１−２−３．変異型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
修飾アミノ酸でｔＲＮＡをアミノアシル化できるように、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に変異を導入することができる。
本発明では、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＬＲＳ又はＬｅｕＲＳと略すことがある）又はフェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＦＲＳ又はＰｈｅＲＳと略すことがある）に、変異を導入して、修飾アミノ酸をｔＲＮＡに結合することができる変異型ＬｅｕＲＳ又は変異型ＰｈｅＲＳを利用することができる。
変異型ＰｈｅＲＳとしては、酵母由来のＰｈｅＲＳの変異体を挙げることができる。酵母由来のＰｈｅＲＳは、２つのαサブユニット及び２つのβサブユニットからなっている。
変異型ＰｈｅＲＳとしては、αサブユニットは、例えば、配列番号３であらわされるＰｈｅＲＳαサブユニットのＴｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異を導入した変異型ＰｈｅＲＳ、好適には、４１５位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させたＰｈｅＲＳを用いることができる。なお、ＰｈｅＲＳのβサブユニットとしては、配列番号２で表される配列を用いることができる。
また、ＰｈｅＲＳβサブユニットとしては、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳβサブユニットを用い、ＰｈｅＲＳαサブユニットとしては、（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳαサブユニットを用いる、変異型ＰｈｅＲＳであって、少なくとも、Ｔｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異が導入され、ｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化できる変異型ＰｈｅＲＳを用いることもできる。
１−３．被修飾タンパク質（アクセプタータンパク質とも呼ぶ）の調製
（１）修飾フェニルアラニンまたは修飾ロイシンでＮ末を修飾しようとする対象タンパク質がＮ末にアルギニン又はリジンを有する場合は、そのタンパク質をＬＦＰＴの基質としてそのまま使用できる。
（２）修飾フェニルアラニンまたは修飾ロイシンでＮ末を修飾しようとする対象タンパク質のＮ末がアルギニン又はリジン以外の場合は、ペプチダーゼを作用させて、アルギニン又はリジンがＮ末となるようにして、対象タンパク質から被修飾タンパク質（アクセプタータンパク質）を調製することができる。ペプチダーゼとしては、例えば、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼを用いることができる。エンドペプチダーゼとしては、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫＸをＤＤＤＤＫとＸの間で切断する）、ＦａｃｔｏｒＸａ（ＩＥ／ＤＧＲの後で切断する。なおアミノ酸配列中で／で表される部分は、／の前のアミノ酸又は／の後のアミノ酸いずれでも良いことを示す。以下同様。）、ＧｅｎｅａｓｅＩ（ＰＧＡＡＨＹの後で切断する）、ＳＵＭＯプロテアーゼ（ＳＵＭＯタンパク質を認識して切断する）などを用いることができる。またＮ末側からエキソペプチダーゼを作用させてアクセプタータンパク質を調製することも可能である。その場合は、アミノペプチダーゼ、ジアミノペプチダーゼなどを用いることができ、ジアミノペプチダーゼとしては、好適にはアルギニン又はリジンで消化反応が終結する酵素が望ましく、例えば、タグザイム（ＴＡＧｚｙｍｅ）を用いることができる。
（３）対象タンパク質のＮ末にアルギニン又はリジン以外の場合であって、対象タンパク質の全長を損なうことなく修飾フェニルアラニンまたは修飾ロイシンでＮ末を修飾しようとする場合は、対象タンパク質のＮ末上流側にアミノ酸配列を付加するように調製する。
例えば、対象タンパク質をコードする塩基配列の上流にＭｅｔ−Ｘａａ−Ａｒｇ／Ｌｙｓというアミノ酸をコードする塩基配列を付加させた、付加配列つきの対象蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子組み換え法により発現させて得た、Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−対象タンパク質を、上記（２）の方法により、ジアミノペプチダーゼ、例えば、ＴＡＧＺｙｍｅで処理することにより、対象タンパク質のＮ末にアルギニン又はリジンが付加された被修飾タンパク質（アクセプタータンパク質）を調製することもできる。あるいは、シグナルペプチドのシグナル切断位置の下流にアルギニン又はリジンを有するように遺伝子を設計し、発現後シグナルペプチドの切断に伴い成熟型タンパク質のＮ末としてアルギニン又はリジンを有するものを得ることができる。
２．ＬＦＰＴを用いる修飾フェニルアラニン又は修飾ロイシンをＮ末に有する修飾タンパク質の製造法
上記１で調製されたＬＦＰＴ、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅ又は修飾ロイシル−ｔＲＮＡＬｅｕの共存下で、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質（アクセプタータンパク質）を処理することにより、アクセプタータンパク質のＮ末を前記修飾フェニルアラニン又は修飾ロイシンで修飾することができる。
更に、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅ又は修飾ロイシルｔＲＮＡは、修飾フェニルアラニン又は修飾ロイシンをそれぞれ、ｔＲＮＡＰｈｅ又はｔＲＮＡＬｅｕに変異型ＦＲＳ又は変異型ＬＲＳでの存在下で結合させて調製でき、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅ又は修飾ロイシルｔＲＮＡＬｅｕの調製とＬＦＰＴによる修飾フェニルアラニン又は修飾ロイシンの転移反応を同一工程（同一反応液）で行なうこともできる。これにより、修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅから修飾フェニルアラニンをタンパク質のＮ末に転移させることにより再生したｔＲＮＡＰｈｅを、再度修飾フェニルアラニン及び変異型ＦＲＳを用いて修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅに調製できるのでより効率的である。
例えば、（１）ＬＦＰＴ，ｔＲＮＡＰｈｅ、変異型ＦＲＳの存在下で、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を処理することにより、Ｎ末を前記修飾フェニルアラニンで修飾することができ、（２）ＬＦＰＴ，ｔＲＮＡＬｅｕ及び変異型ＬＲＳでの存在下、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を処理することにより、Ｎ末を前記修飾ロイシンで修飾できる。
具体的には、例えば、修飾フェニルアラニンとしてｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを用いて、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質（アクセプタータンパク質）のＮ末にｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを導入することができる。導入されたｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅは、例えば、クロスリンカーとして利用できるほか、アジド基修飾試薬を利用し、ポリエチレングリコールを付加すること、更に、蛍光分子やビオチンなど標識分子を付加することなどが可能である。
［参考例１］
１．Ｌｅｕｃｙｌ／ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの調製と活性確認
１−１．ＬＦＰＴ遺伝子の増幅
大腸菌ゲノムＤＮＡよりＬＦＰＴ遺伝子をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させた。ＰＣＲに用いたプライマーは次のような配列である。プライマー１：ＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＴ、プライマー２：ＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡを用いた。ＰＣＲ反応時の組成と反応条件を以下に示す。ＰＣＲ反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キット添付）４μＬ、プライマー１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、プライマー２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、大腸菌ゲノムＤＮＡ  １μＬ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬを、ｄＨ２Ｏで５０μＬとして調製した。ＰＣＲ反応は、予備変性を９８℃で４分、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、及び伸長を７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル行った。
ＰＣＲ産物は５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を溶液の１／２０量加え、エタノール沈殿を行った。沈殿を減圧乾燥し、ＤＮＡ断片を回収した。
回収したＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ＬＦＰＴ遺伝子の増幅を確認した。その結果を図１に示す。なお、図１中でＭは：マーカー（上から１０、８、６、５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．２、１．０３、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｋｂｐ）を示す。
１はＰＣＲ反応後のサンプルを表し、矢印は増幅したＬＦＰＴ遺伝子を示している。
図１より、ＬＦＰＴ遺伝子の予想される鎖長とほぼ同じところにバンドが検出されたのでＬＦＰＴ遺伝子の増幅が確認できた。
１−２．ｐＥＴ２２ｂへのクローニング
エタノール沈殿を行った残りのＰＣＲ産物をｄＨ２Ｏ  １５μＬに溶かし６×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅを２μＬ加え、１％アガロースゲルで３０分間電気泳動を行った。これを０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドの溶液に１０分間浸し、３６６ｎｍの波長のＵＶで目的バンドを確認し、かみそりで切り出した。ゲル片からのＤＮＡ抽出にはＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭを用い、プロトコルに従い次の操作を行った。切り出したゲルの３倍量のＮａＩ溶液を加え、５５℃で数分間保温し、ゲルを溶解し１０μＬのガラスパウダーを加えてよく混合し室温に５分間放置してＤＮＡを吸着させた後１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心した。上清を除き、５００μＬの洗浄用緩衝液を加えてよく懸濁した後１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心した（この操作は２回繰り返した）。上清をできるだけ取り除き、Ｈ２Ｏ  ２０μＬを加え、５５度で５分間保温してＤＮＡを抽出した後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を回収した後もう一度抽出操作を繰り返し、回収した４０μＬのＤＮＡ溶液を５５℃で５分間保温した後１０，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を別のチューブに移した。
回収したＤＮＡ断片をｐＥＴ２２ｂベクターに組み込むために、Ｎｃｏ  ＩとＸｈｏ  Ｉで消化した。反応液の組成は以下の通りで、３７℃で一晩行った。消化反応液組成は、１０×Ｒ  ｂｕｆｆｅｒ（制限酵素添付）３μＬ、回収したＤＮＡ断片１９μＬ、Ｎｃｏ  Ｉ（１０Ｕ／μＬ）２μＬ、及びＸｈｏ  Ｉ（１０Ｕ／μＬ）２μＬをｄＨ２Ｏで３０μＬにして調製した。ｐＥＴ２２ｂも同様にしてＮｃｏ  ＩとＸｈｏ  Ｉで消化した。
各消化物を混合し、キャリアーとして酵母ｔＲＮＡ  ｍｉｘｔｕｒｅを０．１  Ａ２６０ｕｎｉｔ加え、エタノール沈殿を行った。沈殿は減圧乾燥し、以下のように反応液を調製し、ライゲーション反応を行った。反応はニッポンジーンのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋを使用し、１６℃で２〜３時間行った。なお、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応溶液は、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ＤＮＡ混合物として前記沈殿、ＢＳＡ（ｋｉｔに添付）２．５μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ０．５μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬとした。
ライゲーション反応後の溶液をＪＭ１０９株コンピテントセル１００μＬに加え、氷上で５分間放置し、ＬＢ−ａｍｐ培地のプレートに溶液を塗り広げ、３７℃で一晩放置した。生えてきたコロニーをＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法を行って、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをｐＥＴ−ＬＦＰＴと名付けた。
Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法（アルカリ法）は以下の手順で行った。プラスミドＤＮＡの調製はアルカリ法により以下の操作手順で行った。プレートに生えてきたコロニーを爪楊枝でつつき、アルミキャップ付き試験管の２ｍＬのＬＢ−ａｍｐ（５０μｇ／ｍＬのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。エッペンドルフチューブに菌体培養液を１．５ｍＬ分注し、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、集菌した。培地をできるだけ取り除き、菌体を１００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉに懸濁し、２００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを加え、チューブを上下して穏やかに撹拌した。つぎに１５０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを加え、さらに撹拌した後、１５０μＬのフェノール：クロロホルム（１：１）溶液を加え、十分に懸濁し、１２，０００ｒｐｍ×１０分間遠心した。上層を回収し、エタノール沈殿した。遠心分離して得られた沈殿は３０μＬのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。なお、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＴＥ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２５ｍＭ、ＥＤＴＡ−Ｎａ（ｐＨ７．０）１０ｍＭ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ５０ｍＭを含有する。
また、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩは、ＮａＯＨ  ０．２Ｍ、ＳＤＳ１％であり、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ（１００ｍＬ）は、５Ｍ酢酸カリウム６０ｍＬ、氷酢酸１１．５ｍＬ、ｄＨ２Ｏ  ２８．５ｍＬからなる。ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ、及びＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍＭ、を含有する。
（結果）
ｐＥＴ２２ｂとのライゲーション後、ＬＦＰＴ遺伝子が組み込まれたかを確認した。
結果を図２に示す。ｐＥＴ−ＬＦＰＴをＮｃｏ  ＩとＸｈｏ  Ｉで消化した。これを１％アガロースゲル電気泳動した。
Ｍは、マーカー（上から１０、８、６、５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．２、１．０３、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｋｂｐ）を示す。
１〜４は、ｐＥＴ−ＬＦＰＴの消化反応後のサンプルを示す。バンドが予測と一致しているのでｐＥＴ−ＬＦＰＴプラスミドが構築できたことが確認できた。
１−３．発現
大腸菌ＥＲ２５６６株のコンピテントセルに調製したプラスミドＤＮＡが１ｎｇ程度になるように加え、ＬＢ−ａｍｐプレートを用いて形質転換を行った。生えてきたコロニーを白金耳で突いて１００ｍＬのＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、３７度で培養した。濁度（Ａ６００）が０．７になったら０．５ＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地の１／１０００量加え（終濃度０．５ｍＭ）さらに室温で一晩振とうした。その後、培養液を５０ｍＬチューブと１．５ｍＬチューブに移し、それぞれ４℃、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を取り除いた後、残りの培養液を同じ５０ｍＬチューブに加えさらに、４℃、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り除き、菌体を−８０℃で冷凍保存した。
１−４．Ｎｉ−ＮＴＡ  ＡｇａｒｏｓｅカラムによるＬＦＰＴの精製
５０ｍＬのファルコンチューブに回収した菌体を１５ｍＬの上記Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセリン）で懸濁し１５分間超音波処理によって菌体を破砕した後、３０，０００ｘｇで３０分間遠心し（４℃）、この上清をＳ３０とした。
Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅを１ｍＬ充填し、Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍＬで平衡化した後Ｓ３０をロードした。その後Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２Ｍ  ＮＡＣｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセリン、及び１０ｍＭイミダゾール）１０ｍＬで洗浄し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５％グリセリン、及び１０ｍＭイミダゾール）８ｍＬで溶出した。それを１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥし、ＬＦＰＴのバンドが確認できたので（図３）、溶出液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａを用いて約４００μＬまで濃縮したものをＬＦＰＴとした。また精製したＬＦＰＴは−８０℃に保存した。
１−５．ＲＩ標識を用いたＬＦＰＴの活性の測定
酵素の活性を測定するために以下の反応液を調製し３７℃、３０分間反応させた。反応液組成は、５×ＡＡＭ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５０ｍＭ、ＫＣｌ  ２００ｍＭ、及びＡＴＰ  ２０ｍＭ）４μＬ、ＬＦＰＴ  ２μＬ、ｔＲＮＡＰｈｅ０．１  Ａ２６０ｕｎｉｔ、１４Ｃフェニルアラニン（３９４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）１μＬ、ＰｈｅＲＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）１μＬ、アクセプタータンパク質（α−カゼイン又はＴＡＧＺｙｍｅ処理済ＥＧＦＰ）５０ｐｍｏｌをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。
反応液を１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥし、ゲルをバイオイメージングアナライザー  ＢＡＳ−２５００を用いて画像分析した（図４）。
また、反応液を濾紙にスポットし、それを９８℃の５％ＴＣＡで２０分間洗った後４℃の５％ＴＣＡで５分間振とうした。これを３回繰り返した。エタノールで濾紙の水分を除き、充分に乾かした後液体シンチレーションカウンターにより濾紙に残る放射能を測定することにより［１４Ｃ］Ｐｈｅのα−カゼインへの取り込みを評価した（図５）。
［参考例２］
フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素の調製と活性確認
１−１．共発現用ベクターの作成
ｐＥＴベクターとの共発現用ベクターの作製を行った。手順概略は図６に示す。
ベクターｐＥＴ２１−ａ（＋）とｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１２２の配列を基に、プライマー１（ｐＥＴ２１−ａ（＋）のＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒに対応）：５’−ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ−３’、プライマー２（ｐＥＴ２１−ａ（＋）のＴ７  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒに対応）：５’−ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ−３’、プライマー３（ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１２２ＭＣＳの上流に対応）：５’−ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＡＴＡ  ＧＧＴ−３’、プライマー４（ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１２２ＭＣＳの下流に対応）：５’−ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ−３’を設計した。なお、各プライマーは、ＫｐｎＩの制限酵素認識部位を有している。
まずプライマー１および２を用いて以下の反応組成によりＰＣＲ反応（１）を行った。ＰＣＲ反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キット添付）４μＬ、プライマー１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ、プライマー２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ、ｐＥＴ２１−ａ（＋）０．０５μｇ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬを、ｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、予備変性を９５℃で２分、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、及び伸長を７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル行った。このＰＣＲ産物をＰＣＲ産物（１）とする。
同様にプライマー３および４を用いて以下の反応組成によりＰＣＲ反応（２）を行った。ＰＣＲ反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キット添付）４μＬ、プライマー３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ、プライマー４（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ、ｐＰＲＯＬａｒＡ．１２２  ０．０５μｇ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬを、ｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、予備変性を９５℃で２分、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、及び伸長を７２℃で２分間のサイクルを３０サイクル行った。このＰＣＲ産物をＰＣＲ産物（２）とする。
反応後、１％アガロースゲルで３０分間電気泳動を行った。これを０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドの溶液に１０分間浸し、３６６ｎｍの波長のＵＶで目的バンドを確認し、かみそりで切り出した。ゲル片からのＤＮＡ抽出にはＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭを用い、プロトコルに従い次の操作を行った。切り出したゲルの３倍量のＮａＩ溶液を加え、５５℃で数分間保温し、ゲルを溶解し１０μＬのガラスパウダーを加えてよく混合し室温に５分間放置してＤＮＡを吸着させた後１００００ｒｐｍ×１０ｓｅｃ遠心した。上清を除き、５００μＬの洗浄用緩衝液を加えてよく懸濁した後１００００ｒｐｍ×１０ｓｅｃ遠心した（２回繰り返した）。上清をできるだけ取り除き、Ｈ２Ｏ  ２０μｌを加え、５５℃で５分間保温してＤＮＡを抽出した後、１００００ｒｐｍ×２分間遠心した。上清を回収した後もう一度抽出操作を繰り返し、回収した４０μＬのＤＮＡ溶液を５５℃で５分間保温した後１００００ｒｐｍ×２分間遠心し、上清を別のチューブに移した。
ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭによる精製後のＰＣＲ産物（１）溶液の５分の１量と、ＰＣＲ産物（２）溶液の全量を混ぜ合わせ、さらにキャリアーとして酵母ｔＲＮＡ  ｍｉｘ  ０．１  Ａ２６０ｕｎｉｔを加え、これをエタノール沈澱した。
回収した沈殿を、ＫｐｎＩで消化した。反応液の組成は以下の通りで、３７℃で一晩行った。消化反応液組成は、１０×Ｋｐｎ  Ｉ  ｂｕｆｆｅｒ（制限酵素添付）２μＬ、回収したＤＮＡ断片、およびＫｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μＬ）３μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。
消化反応後はエタノール沈殿を行った。沈殿は減圧乾燥し、以下のように反応液を調製し、ライゲーション反応を行った。反応はニッポンジーンのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋを使用し、１６℃で３ｈｒ行った。なお、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応溶液は、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ＤＮＡ混合物として前記沈殿、ＢＳＡ（ｋｉｔに添付）２．５μＬ、及びＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ０．５μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。
ライゲーション反応後の溶液をＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテントセル１００μＬに加え、氷上で５分間放置し、ＬＢ−ａｍｐ培地のプレートに溶液を塗り広げ、３７℃で一晩放置した。生えてきたコロニーをＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法を行って、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをｐＴＡＧと名付けた。目的の配列を有するかは日立ＤＮＡシーケンサーＳＱ５５００Ｅを用いて確認を行った。
１−２．ｐＴＡＧＦＲＳＡ及びｐＥＴＦＲＳＢの調製
酵母ＰｈｅＲＳ遺伝子をｐＴＡＧとｐＥＴ２１−ａ（＋）にクローニングするために、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムの全配列の中から、ＰｈｅＲＳのαサブユニットとβサブユニットをコードする遺伝子配列を基に、プライマー５（α遺伝子−５’末端に対応。ＰｓｔＩ及びＮｄｅＩの制限酵素部位を含む）：５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＡＧＡ−３’、プライマー６（α遺伝子−３’末端に対応。Ｐｓｔ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉの制限酵素部位を含む。）：５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴ−３’、プライマー７（β遺伝子−５’末端に対応。Ｐｓｔ  Ｉ及びＮｄｅＩの制限酵素部位を含む。）：５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ−３’、プライマー８（β遺伝子−３’末端に対応、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を含む。）：５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＴ−３’を用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅させた。
まずプライマー５および６を用いて以下の反応組成によりＰＣＲを行いＰｈｅＲＳのαサブユニット遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キット添付）４μＬ、プライマー５（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、プライマー６（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、酵母ゲノムＤＮＡ  １μＬ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬを、ｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、予備変性を９５℃で２分、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、及び伸長を７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル行った。
またプライマー７および８を用いて上記と同様の反応組成およびプログラムにてＰＣＲを行い、βサブユニット遺伝子の増幅を行った。
反応後、１％アガロースゲルで３０分間電気泳動を行った。これを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドの溶液に１０分間浸し、３６６ｎｍの波長のＵＶで目的バンドを確認し、かみそりで切り出した。ゲル片からのＤＮＡ抽出にはＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭを用い、プロトコルに従い次の操作を行った。
回収したＰｈｅＲＳのαサブユニット遺伝子およびβサブユニット遺伝子を各ベクターに組み込むために、それぞれＮｄｅＩとＮｏｔＩで消化した。反応液の組成は以下の通りで、３７℃で一晩行った。消化反応液組成は、１０×Ｒ  ｂｕｆｆｅｒ（制限酵素添付）２μＬ、回収したＤＮＡ断片沈殿、ＮｄｅＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、及びＮｏｔＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。ｐＥＴ２１−ａ（＋）およびｐＴＡＧも同様にしてＮｄｅＩとＮｏｔＩで消化した。
ＰｈｅＲＳのαサブユニット遺伝子消化物はｐＴＡＧ消化物と混合しエタノール沈殿処理をし、ＰｈｅＲＳのβサブユニット遺伝子消化物はｐＥＴ２１−ａ（＋）消化物と混合しエタノール沈殿処理を行った。沈殿は減圧乾燥し、以下のように反応液を調製し、それぞれライゲーション反応を行った。反応はニッポンジーンのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋを使用し、１６℃で２、３ｈｒ行った。なお、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応溶液は、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ＤＮＡ混合物として前記沈殿、ＢＳＡ（ｋｉｔに添付）２．５μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ０．５μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬとした。
ライゲーション反応後の溶液をＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテントセル１００μＬに加え、氷上で５分間放置し、ＬＢ−ａｍｐ培地のプレートに溶液を塗り広げ、３７℃で一晩放置した。生えてきたコロニーをＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法を行って、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをｐＴＡＧＦＲＳＡおよびｐＥＴＦＲＳＢと名付けた。目的の配列を有するかは日立ＤＮＡシーケンサーＳＱ５５００Ｅを用いて確認を行った。それぞれのベクターの構成を図７に示す。
１−３．ＰｈｅＲＳの発現
酵母ＰｈｅＲＳを発現させるために、ｐＥＴＦＲＳＢを大腸菌ＥＲ２５６６コンピテントセルに加え、形質転換を行った後、それをＬＢ−ａｍｐプレート培地にコンラージ棒で塗り広げ、３７℃で一晩放置した。プレート培地に生じたコロニーの１つを爪楊枝でつつき、ＬＢ−ａｍｐ培地で３７℃で培養しながら、６００ｎｍで培養液の濁度（ＯＤ６００）を測定し、ＯＤ６００が０．３〜０．４になったら培養液を氷上で１５分間冷やし集菌した。上清の培養液を取り除き、菌体に１×ＴＳＳ（１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ＰＥＧ  ６０００（ｗ／ｖ）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び５％ジメチルスルホキシド）を加え、液体窒素で凍結させ−８０℃で保存した。
ｐＥＴＦＲＳＢをもつＥＲ２５６６コンピテントセルにプラスミドｐＴＡＧＦＲＳＡを加え上記と同様の方法で形質転換を行い、ＬＢ−５０μｇ／ｍＬａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ・２５μｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ（ＬＢ−ａｍｐｋａｎ）プレート培地にコンラージ棒で塗り広げ、３７℃で一晩培養した。プレート培地に生じたコロニーを爪楊枝でつつきＬＢ−ａｍｐｋａｎ培地に植菌し、３７℃で培養しながらＯＤ６００が０．７〜０．９になったところで培養液にＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度５００μＭになるように加え、さらに３７℃で４ｈｒ培養し、発現させた。
１−４．酵母ＰｈｅＲＳの精製
発現させた酵母ＰｈｅＲＳを精製するために、得られた培養液の菌体をＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び５％  グリセリン）で懸濁した後、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで菌体を超音波破砕し遠心することでＳ３０画分を得た。あらかじめ平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーに前記Ｓ３０画分サンプルをロードし、前記Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒとＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭイミダゾール含有Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液）を用いてＵＶモニターによりＡ２８０を観察しながらピークがなくなるまでカラムを洗い、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ含有イミダゾールＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液）でサンプルを溶出し、ＵＶモニターでＡ２８０を観察しながらピークが現れた部分を回収した。得られたサンプルに等量のＨＧ  ３  Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１２ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び１００μＭ  ｐＡＢＳＦ）を加えて混ぜ合わせ、あらかじめＨＧ  １．５  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び５０μＭ  ｐＡＢＳＦ）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈ．Ｐ．カラム（樹脂量８ｍｌ）にロードし、ＵＶモニターでのＡ２８０が０．０３以下になるまでＨＧ  １．５  Ｂｕｆｆｅｒを流速２ｍＬ／ｍｉｎで流した。次にＨＧ  １．５  ＢｕｆｆｅｒとＨＧ  ０  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び５０μＭ  ｐＡＢＳＦ）を用いて、流速２ｍＬ／ｍｉｎで１５０分間かけて１．５Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム直線濃度勾配をかけ、サンプルを溶出した。これらを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、ＣＢＢ染色液により目的のタンパク質を検出、検討した（図８）。図８レーン４および５より、推定分子量の位置にバンドが確認できたことから、酵母由来ＰｈｅＲＳの発現、精製が確認できた。
１−５．酵母ＰｈｅＲＳの活性測定
酵素の活性を測定するために１４Ｃフェニルアラニンを使ってアミノアシル化反応を行った。下記の反応組成で酵素を除いた状態で反応液を３０℃で５分程度保温した後、酵素を加え３０℃でインキュベートし、０、５、１０、１５、２０分の各時間で５％ＴＣＡを湿らせておいた濾紙にスポットし、５％ＴＣＡに浸した。各時間の反応液をスポットし終わったら、５％ＴＣＡをいったん捨て、新たな５％ＴＣＡをビーカーに加え１０分間振とうした。これを２回繰り返したらエタノールを加えて軽く振とうし、電熱灯下で乾燥させた。その後、シンチレーターに浸し、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定した。
アミノアシル化反応液組成は、５×ＡＡＭ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）１０μＬ、酵母ｔＲＮＡＰｈｅ０．０５  Ａ２６０ｕｎｉｔ、酵母ＰｈｅＲＳ  ０．１２６μｇ、及び１４Ｃフェニルアラニン１μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。
５×ＡＡＭ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５０ｍＭ、ＫＣｌ  ２００ｍＭ、及びＡＴＰ  ２０ｍＭを含有した。
シンチレーターは、Ｄｏｔｉｔｅ  ＤＰＯ  ４ｇ、Ｄｏｔｉｔｅ  ＰＯＰＯＰ  ０．１ｇをトルエンで１Ｌに調製した。
結果を図９に示す。酵素が欠けた場合では受容が見られず、酵素を反応に加えた場合に受容が見られたことにより、発現したものはＰｈｅＲＳだと確定できた。
【実施例１】
【０００６】
変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素の調製と活性確認
１．変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（変異型ＰｈｅＲＳ）の調製
酵母変異型ＰｈｅＲＳを調製するために、種々のＰｈｅＲＳのアミノ酸配列を比較し、フェニルアラニン結合部位を推測した。その中でα遺伝子の４１５位のトレオニンをアラニンまたはグリシンに変異させるため、ｐＴＡＧＦＲＳＡの配列を基にプライマー９：５’−ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  Ｇ−３’およびプライマー１０：５’−ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  Ｇ−３’で示される配列のＤＮＡを設計した。
上記の２つのプライマーを用いてＰＣＲ法によりα遺伝子発現用プラスミドｐＴＡＧＦＲＳＡを改変した。反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（酵素添付）５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（酵素添付）４μＬ、プライマー９（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、プライマー１０（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、ｐＴＡＧＦＲＳＡ０．０５μｇ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。ＰＣＲプログラムは、予備変性を９５℃で２分間、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを５０℃で１分間、及び伸長を７２℃で１０分間を行なうサイクルを１６サイクルとした。
反応後、反応液にＤｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μＬ）を０．５μＬ加えて３７℃で１時間保温し、テンプレートであるｐＴＡＧＦＲＳＡを切断した。ＤｐｎＩ処理後の反応液２０μＬをＸＬ−１  ｂｌｕｅコンピテントセルに加え、形質転換を行い、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐによって目的のプラスミドを回収した。配列を確認することによって、ｐＴＡＧＦＲＳＡのＰｈｅＲＳα遺伝子のＴｈｒ４１５がＡｌａまたはＧｌｙに変異したプラスミド（ｐＴＡＧＦＲＳＡｔ４１５ａ、ｐＴＡＧＦＲＳＡｔ４１５ｇ）が調製できたことを確認した。
発現・精製は［参考例２］野生型酵母ＰｈｅＲＳと同様の方法で行なった。
さらに、活性は［参考例２］の１−５と同様の方法で測定した。
結果をそれぞれ、図１０及び図１１に示す。
図１０レーン２および５において、推定分子量の位置にバンドが確認できたことから、２種類の酵母由来変異型ＰｈｅＲＳのどちらも発現、精製が確認できた。
また、図１１より酵素が欠けた場合では受容が見られず、酵素を反応に加えた場合に弱いながらも受容が見られたことにより、各変異型ＰｈｅＲＳはフェニルアラニンを基質として認識できる能力を持つことがわかった。
【実施例２】
【０００７】
野生型ＰｈｅＲＳと変異型ＰｈｅＲＳが認識しうる非天然アミノ酸の検索
ＥＦ−ＴｕとＥＦ−Ｔｓは複合体を形成し、（ＥＦ−Ｔｕ・ＥＦ−Ｔｓ）２のｃｏｍｐｌｅｘを形成し、このｃｏｍｐｌｅｘにＧＴＰが接触すると、ＥＦ−Ｔｓは解離し、アミノアシルｔＲＮＡが存在するとアミノアシルｔＲＮＡ・ＥＦ−Ｔｕ・ＧＴＰの複合体を形成する。ＥＦ−ＴｕはアミノアシルｔＲＮＡと結合し複合体形成をする能力を有するが、ｔＲＮＡとは結合しない。アミノアシルｔＲＮＡと結合した複合体、未反応ＥＦ−Ｔｕ、未反応ｔＲＮＡ（アミノアシル化されなかったｔＲＮＡ）をゲル電気泳動により分離し、その移動度の違いを利用しどれくらいのアミノアシルｔＲＮＡと結合した複合体が確認できるかでアミノアシル化を判定することができる。ゲル電気泳動で、早く流れるのが未反応ｔＲＮＡで一番上に見えるのがＥＦ−Ｔｕ等で、その間（ゲル結果では中間くらい）が複合体である。
具体的には、野生型ＰｈｅＲＳ（ｗｔＰｈｅＲＳ）と変異型ＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ及びＴ４１５Ａ）が認識しうる非天然アミノ酸を三者複合体のゲル電気泳動による移動度の違いを利用して検索した。三者複合体の形成を調べるために、ｗｔＰｈｅＲＳとＴ４１５Ａ、Ｔ４１５Ｇを用いて反応液を調製し、３７℃で２０分間反応させた。反応液は５×Ｔｕ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ、ＫＣｌ  ２５０ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  ２５０ｍＭ、及びβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ２５ｍＭ）２μＬ、５ｍＭ  ＧＴＰ  ２μＬ、１０ｍＭ  ＡＴＰ  ２μＬ、Ｔ．ｔｈ．ＥＦ−Ｔｕ  １００ｐｍｏｌ、Ｔ．ｔｈ．ＥＦ−Ｔｓ  １０ｐｍｏｌ、酵母ｔＲＮＡＰｈｅ  ０．０３６Ａ２６０ｕｎｉｔ、ｗｔＰｈｅＲＳ（もしくは変異型ＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ、Ｔ４１５Ｇ））０．０４μｇおよびフェニルアラニンアナログ  １ｎｍｏｌを含みｄＨ２Ｏで全量を１０μＬにした。
反応後、６×ＬＳ（ＢＰＢ  ０．２５％、キシレンシアノール０．２５％およびグリセリン３０％）を２μＬ加え、１ｘＴＡＭ  ６％ＰＡＧＥを行った。泳動後、ＣＢＢ染色液で染色し、十分脱色した後、０．３％メチレンブルー／１  Ｍ  ＡｃＯＨ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．７）で染色しバンドを検出した。
なお、１ｘＴＡＭはＴｒｉｓ塩基２５ｍＭ、酢酸２５ｍＭおよび酢酸マグネシウム５ｍＭを含む溶液である。
結果を図１２から図１４及び表１に示す。
【表１】
2007061128.tif 000004
2007061128.tif 000005
【実施例３】
【０００８】
ＴＡＧＺｙｍｅを用いたアクセプタータンパク質の調製、及びアクセプタータンパク質のＮ末の修飾
（１）ＴＡＧＺｙｍｅを用いたＮ末端アルギニンＥＧＦＰの調製
ＴＡＧＺｙｍｅとはＱＩＡＧＥＮ社により製品化されているＮ末端特異的ジペプチド切断酵素（ＤＡＰａｓｅと略すことがある）である。ＴＡＧＺｙｍｅはＮ末端のジペプチド切断を行うが、ｓｔｏｐ  ｐｏｉｎｔと呼ばれる、リジン、アルギニン、プロリン、又はグルタミンがＮ末端に現れるとジペプチド切断が終了する（表２）。
【表２】
2007061128.tif 000006
今回利用したＥＧＦＰはｐＥＴ２９にクローニングされているため、ＴＡＧＺｙｍｅによるＮ末端特異的ジペプチド切断を行うとＮ末端にアルギニンがあらわれると考えられる（図１５）。このＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰを基質として用いることでアミノ酸転移反応が起こると考え、ＥＧＦＰのＴＡＧＺｙｍｅによるＮ末端特異的ジペプチド切断を行なった。
反応液はＤＡＰａｓｅ（１０Ｕ／ｍｌ）２．５μＬ、システアミン−ＨＣｌ（２０ｍＭ）５μＬ、１×ＴＡＧＺｙｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＭおよびＮａＣｌ  １５０ｍＭ）６７．５μＬを混合し室温で５分間放置した。そこにＥＧＦＰ（約０．３５μｍｏｌ／μＬ）を５μＬ加え、３７℃で１晩反応させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにて分析（図１６）したところＥＧＦＰのバンドのシフトが起こり、バンドが２つに分かれたため、ＥＧＦＰのジペプチド切断が確認できた。
（２）ＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰへのアミノ酸転移の確認
ＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰを基質として［参考例］１−５の操作手順で反応液を３７℃で３０分間反応させた後、１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥし、ゲルを、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ−２５００を用いて画像分析した（図４レーン２）。また、［参考例］１−５の操作手順でアミノ酸転移活性を測定した。液体シンチレーションカウンターによる放射能を測定結果からＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰはα−カゼインと同程度アミノ酸転移が認められる（図５）。
（３）ＴＡＧＺｙｍｅ消化ＥＧＦＰのテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）蛍光化
５×ＡＡＭ  ８μＬ、Ｌｅｕｃｙｌ／ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ４μＬ、０．５ｍＭアジドフェニルアラニン０．８μＬ、１００Ａ／ｍｌ  ｔＲＮＡＰｈｅ  １μＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ変異型フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素１μＬ、ＴＡＧｚｙｍｅ消化ＥＧＦＰ  ５０ｐｍｏｌを混合し、ｄＨ２Ｏで全量を４０μＬとした。３７℃で３０分間反応させ、その後上記の溶液１９μＬに、蛍光試薬（５ｍＭ  ＴＭＲ付きトリアリールホスフィン誘導体）１μＬを加え３７℃で１ｈｒ反応した。反応後１２．５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行い、富士フィルム社製ＬＡＳ３０００でタンパク質の蛍光化を確認した（図１７）。レーン１において蛍光によるバンドが確認できることから、ＴＡＧＺｙｍｅにより処理したＥＧＦＰにＬＦＰＴによりアジドフェニルアラニンが転移し、その後アジド基選択的修飾試薬により蛍光修飾が導入できたと考えられる。
【実施例４】
【０００９】
Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅを用いたアクセプタータンパク質の調製、及びアクセプタータンパク質のＮ末の修飾
（１）ｐＥＴ−ＥＧＦＰ（ｐＥＴ２９にＥＧＦＰ  ｇｅｎｅを組み込んだプラスミド）のＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ｐＥＴ−ＥＧＦＰのＮ末端側を図１８のようになるように改変を行った。
Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ後このプラスミドでＸＬ１−ＢＬＵＥを形質転換し、キュアリングの後ＬＢ−Ｋａｎプレートに植菌、翌日プレートに生えたコロニーを小試（ＬＢ−Ｋａｎ培地）で一晩培養、その後Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐを行い、プラスミドを回収した。このプラスミドのシーケンスを行ったところ図１８の改変後のように改変されたことが確認できた。このプラスミドをｐＥＴ−ＥＧＦＰ改１とする。
ＥＲ２５６６をｐＥＴ−ＥＧＦＰ改１で形質転換し、ＬＢ−Ｋａｎプレートに植菌、翌日プレートに生えたコロニーを１００ｍＬのＬＢ−Ｋａｎ培地で培養、ＯＤが０．６になったらＩＰＴＧを週濃度０．５ｍＭとなるように加え、３７℃で４時間振とう後回収した。この菌体を超音波破砕後、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製を行った。この精製されたタンパク質をＥＧＦＰ改１とした。
（２）Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅを用いたＮ末端アルギニンＥＧＦＰ改１の調製
ＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅとはＡｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  ＬｙｓのＬｙｓの後ろを切断する特異的な酵素である。今回利用したＥＧＦＰ改１はＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによる切断を行うとＮ末端にアルギニンがあらわれると考えられる（図１８）。そこでＥＧＦＰ改１のＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによる切断をＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭおよびＣａＣｌ２  ２ｍＭ）を用いて行なった。
まずＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂５０μＬを２，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を取り除き、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬで樹脂の平衡化を行った後２，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を取り除いた。次に樹脂を５０μＬのＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、そこに約６０μｇのＥＧＦＰ改１を良く混ぜた後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣに全量入れ。また樹脂をＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３００μＬでＷａｓｈし、２，０００ｒｐｍで２分間遠心して樹脂から溶液を取り除いた。Ｗａｓｈは三回行った。この樹脂をＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３００μＬで懸濁、１．５ｍＬチューブに移し、そこにＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ（２ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ加え、室温で１時間放置した。その後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣに全量戻し２，０００ｒｐｍで２分間遠心し、溶液を回収した。溶液は遠心エバポレーターまたはＶＩＶＡＳＰＩＮ５００−ＭＡＸＩＭＵＭ  ＳＰＩＮ  ＳＰＥＥＤにより濃縮した。最後に、ＥＧＦＰ改１がＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより切断されていることを１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより確認した（図１９）。レーンＣとレーン１を比較するとＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したＥＧＦＰ改１（レーン１）の分子量が短くなっていると考えられ、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅによる切断が確認できた。なお、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１は−８０℃に保存した。
（３）Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１のテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）蛍光化
５×ＡＡＭ  ４μＬ、Ｌｅｕｃｙｌ／ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２μＬ、０．５ｍＭアジドフェニルアラニン０．４μＬ、１００Ａ／ｍＬ  ｔＲＮＡＰｈｅ０．５μＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ変異型フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素０．５μＬ、及びＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１  約２μｇを混合し、ｄＨ２Ｏで全量を２０μＬとした。
３７℃で３０分間反応させ、その後上記の溶液１９μＬに、蛍光試薬（５ｍＭ  ＴＭＲ付きトリアリールホスフィン誘導体）１μＬを加え３７℃で１時間反応した。反応後１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行い、富士フィルム社製ＬＡＳ３０００でタンパク質の蛍光化を確認した（図２０）。レーン１と２を比較するとＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したＥＧＦＰ改１（レーン１）においてのみ蛍光分子によるバンドが確認でき、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したＥＧＦＰ改１にＬＦＰＴによりアジドフェニルアラニンが転移し、その後アジド基選択的修飾試薬により蛍光修飾が導入できたと考えられる。
（４）Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１のＰＥＧ修飾
上記（２）と同じ方法でアジドフェニルアラニン転移反応を行い、その後、溶液１９μＬに、５ｍＭポリエチレングリコール（ＰＥＧ）付きトリアリールホスフィン誘導体（ＧＩＦ−０５４８またはＧＩＦ−０６０２）１μＬを加え３７℃で１時間反応した。反応後１０％Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを行い、富士フィルム社製ＬＡＳ３０００でＥｎｔｒｏｋｉｎａｓｅ消化ＥＧＦＰ改１の蛍光を検出したところバンドのシフトが確認できた（図２１）。
レーンを比較するとＰＥＧを有するアジド基修飾試薬を加えることにより、ＥＧＦＰに由来するバンドが上にシフトしていること、また、修飾に用いたＰＥＧの平均分子量の違いも移動度に反映されていることから、Ｅｎｔｒｏｋｉｎａｓｅにより処理したＥＧＦＰ改１にＬＦＰＴによりアジドフェニルアラニンが転移し、その後アジド基選択的修飾試薬によりＰＥＧ修飾が導入できたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本願発明の方法により、Ｎ末に修飾されたアミノ酸を有するタンパク質を大量に調製することができるようになった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月30日(2007.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（イ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳαサブユニット、並びに
（ロ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳβサブユニットからなる変異ＰｈｅＲＳであって、
少なくとも、前記変異型のＰｈｅＲＳαサブユニットにはＴｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異が導入され、ｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化できる変異ＰｈｅＲＳにより修飾フェニルアラニンをｔＲＮＡＰｈｅに結合させることにより修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅを調製し、
（２）Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質及び前記（１）で調製された修飾フェニルアラニルｔＲＮＡＰｈｅをロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡタンパク質転移酵素の存在下で処理する、Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
修飾フェニルアラニンが下記式（１）で表される請求項１記載の方法。
2007061128.tif 000044
上記式１中、Ｒ２は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、Ｒ３は水素又は水酸基、そして、Ｒ４は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。
【請求項４】
修飾フェニルアラニンがｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ又は蛍光標識されたフェニルアラニンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）が、配列番号３であらわされるＰｈｅＲＳのαサブユニットにおいて４１５位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させたＰｈｅＲＳである請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項１、３、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質を、以下（１）−（４）の存在下で処理することによる、Ｎ末アルギニン又はリジンを有するタンパク質の修飾方法。
（１）修飾フェニルアラニン、
（２）ｔＲＮＡＰｈｅ、
（３）（イ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳαサブユニット、並びに
（ロ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳβサブユニットからなる変異ＰｈｅＲＳであって、
少なくとも、前記変異型のＰｈｅＲＳαサブユニットにはＴｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異が導入され、ｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化できる変異ＰｈｅＲＳ（変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素）、及び
（４）ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡタンパク質転移酵素。
【請求項８】
修飾フェニルアラニンが下記式（１）で表される請求項７記載の方法。
2007061128.tif 000045
上記式１中、Ｒ２は、水素、水酸基又はメトキシ若しくはアセチル、Ｒ３は水素又は水酸基、そして、Ｒ４は、水素、ハロゲン、アジド基、ニトロ基、メトキシ若しくはアセチル又は水酸基である。
【請求項９】
修飾フェニルアラニンがｐａｒａ−ａｚｉｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ又は蛍光標識されたＰｈｅである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
変異型フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｈｅＲＳ）が、配列番号３であらわされるＰｈｅＲＳのαサブユニットにおいて４１５位のトレオニンをアラニン又はグリシンに変異させたＰｈｅＲＳである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ末にアルギニン又はリジンを有するタンパク質が任意の蛋白質をペプチダーゼにて処理して調製された請求項７から１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳαサブユニット、並びに
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表される変異型のＰｈｅＲＳβサブユニットからなる変異ＰｈｅＲＳであって、
少なくとも、前記変異型のＰｈｅＲＳαサブユニットにはＴｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異が導入され、ｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化できる変異ＰｈｅＲＳ。
【請求項１３】
配列番号３で表されるＰｈｅＲＳαサブユニット及び配列番号２で表されるＰｈｅＲＳβサブユニットからなる野生型酵母ＰｈｅＲＳの変異体（変異ＰｈｅＲＳ）であって、
該酵母ＰｈｅＲＳの変異体はｔＲＮＡＰｈｅをフェニルアラニンアナログ化でき、
少なくとも、前記変異型のＰｈｅＲＳαサブユニットにはＴｙｒ４１４、及び／又はＴｈｒ４１５に変異を導入した変異ＰｈｅＲＳ。
【国際調査報告】
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