(57)【要約】Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、ｆａｓＲ遺伝子の発現が増強されるように改変したコリネ型細菌を培地で培養して、Ｌ−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、ｆａｓＲ遺伝子の発現が増強されるように改変され、当該遺伝子の発現が増強されていない株と比較して界面活性剤に対する感受性が向上したコリネ型細菌。
【請求項２】
前記ｆａｓＲ遺伝子が（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１に記載のコリネ型細菌：
（ａ）配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、コリネ型細菌においてその発現を増強することにより、コリネ型細菌の界面活性剤に対する感受性を向上させる活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
ｆａｓＲ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強されるように改変された請求項１又は２に記載のコリネ型細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養して、Ｌ−グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵工業に関し、詳しくは、Ｌ−グルタミン酸の製造法及びそれに用いるコリネ型細菌に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられる。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
コリネ型細菌の野生株は、一般的にビオチンが過剰量存在している条件ではＬ−グルタミン酸を生成しない。従って、従来のＬ−グルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限した培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有する原料を使用する場合、培地に添加することが必要なビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となっていた。（非特許文献１）。
これに対し、コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与するタンパク質（ＤＴＳＲ蛋白）をコードする遺伝子（ｄｔｓＲ遺伝子）の存在を突き止め、この遺伝子が破壊されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成すること、及び、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、ｄｔｓＲ遺伝子を増幅するとＬ−リジンを生産する能力が増強されることが明らかになっている。
また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定してＬ−グルタミン酸を発酵生産することができること、及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感受性株にＬ−リジン生産性を付与することにより、ビオチン存在下でも、安定してＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に発酵生産することができることを見出している。そして、コリネ型細菌にビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与する手段の一つとして、温度感受性変異型ＤＴＳＲ蛋白をコードする変異型ｄｔｓＲ遺伝子を用いた遺伝子置換を開示している（特許文献２）。
しかし、これまでにコリネ型細菌で発現量を増加させることにより界面活性剤に対する感受性を向上させる遺伝子は知られていなかった。
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（７），１１０９−１１１２，１９９７
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７  Ｍａｙ  ８；２３４（１）：１５７−６１．
【特許文献１】ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット
【特許文献２】ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレット
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造において、Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
本研究者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、コリネ型細菌のｆａｓＲ遺伝子を細胞内で増幅することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能が向上することを見出し、また、ペニシリン、界面活性剤などのビオチン作用抑制物質を添加することなく、ビオチン高含有培地でＬ−グルタミン酸を生成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、ｆａｓＲ遺伝子の発現が増強されるように改変され、当該遺伝子の発現が増強されていない株と比較して界面活性剤に対する感受性が向上したコリネ型細菌。
（２）前記ｆａｓＲ遺伝子が（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）に記載のコリネ型細菌：
（ａ）配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、コリネ型細菌においてその発現を増強することにより、コリネ型細菌の界面活性剤に対する感受性を向上させる活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）ｆａｓＲ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強されるように改変された（１）又は（２）に記載のコリネ型細菌。
（４）（１）〜（３）に記載のコリネ型細菌を培地で培養して、Ｌ−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ｆａｓＲ遺伝子増幅用プラスミドｐＶＫＦＡＳＲの構築手順を示す図。
【図２】ｆａｓＲ遺伝子増幅株の界面活性剤存在下での生育曲線を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜１−１＞  本発明のＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌はＬ−グルタミン酸生産能を有し、ｆａｓＲ遺伝子の発現が増強されるように改変され、当該遺伝子の発現が増強されていない株と比較して界面活性剤に対する感受性が向上したことを特徴とするコリネ型細菌である。
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９９１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ  ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム  ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム  ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９（コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３８６９）
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ＡＴＣＣ１９２４０
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２
ブレビバクテリウム・アルバム  ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム  ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＡＪ１２３４０株は、１９８７年１０月２７日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター）（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
本発明において、「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培地中または菌体内にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。さらに後述するようにして、ｆａｓＲ遺伝子の発現を増強させることによりＬ−グルタミン酸の生産能が付与されたものでもよい。
育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。
これらの遺伝子の発現を増強するための方法としては、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットＷＯ９５／３４６７２号参照）。例えば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターのー３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、ＷＯ００−１８９３５号パンフレット、欧州特許出願公開１０１０７５５号明細書等に記載された微生物が例示できる。
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタムΔＳ株（国際公開９５／３４６７２号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム  ＡＪ１２８２１（ＦＥＲＭＢＰ−４１７２；フランス特許公報９４０１７４８号明細書参照）
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１２８２２（ＦＥＲＭＢＰ−４１７３；フランス特許公報９４０１７４８号明細書参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１２８２３（ＦＥＲＭＢＰ−４１７４；フランス特許公報９４０１７４８号明細書参照）
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２：８６１１−８６１７（１９９７）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、ＩＳ因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第６３０３３８３号、又は特開平０５−００７４９１号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、ｐ４８Ｋ及びｐＳＦＫＴ２（以上、米国特許第６３０３３８３号参照）、ｐＨＳＣ４（フランス特許公開１９９２年２６６７８７５号公報、特開平５−７４９１号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも２５℃では自律複製することができるが、３７℃では自律複製できない。ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒア・コリ  ＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター）（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１１７６３として寄託され、１９９１年８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２４の受託番号で寄託されている。
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、ベンゾピロンまたはナフトキノン類に耐性を付与する方法（特開昭５６−１８８９）、ＨＯＱＮＯ耐性を付与する方法（特開昭５６−１４０８９５）、α−ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭５７−２６８９）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭５６−３５９８１）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平４−８８９９４）、ダウノマイシン耐性（特開昭５８−１５８１９２）を付与する方法などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１１３５５（ＦＥＲＭ  Ｐ−５００７；特開昭５６−１８８９号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１１３６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−Ｐ−５０２０；特開昭５６−１８８９号公報参照）
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１１２１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−４３１８；特開昭５７−２６８９号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１１２１８（ＦＥＲＭ−Ｐ４３１９；特開昭５７−２６８９号公報参照）
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１１５６４（ＦＥＲＭ  Ｐ−５４７２；特開昭５６−１４０８９５公報参照）
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１１４３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−５１３６；特開昭５６−３５９８１号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム  Ｈ７６８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３００４；特開平０４−８８９９４号公報参照）
また本発明の親株に用いるコリネ型細菌は、培地中のビオチン濃度を制限した条件、あるいは培地中に高濃度のビオチンを含みかつビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地中に含有させた条件で、Ｌ−グルタミン酸を蓄積する株が好ましい。ここで界面活性剤とは、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等の飽和脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、シュクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール・ポリプロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル等の脂肪酸エステル型非イオン性界面活性剤、及び、Ｎ−パルミトイルグリシン、Ｎ−パルミトイルアラニン、Ｎ−パルミトイルバリン、Ｎ−パルミトイルロイシン、Ｎ−パルミトイルスレオニン、Ｎ−パルミトイルメチオニン、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸、Ｎ−ミリストイルグルタミン酸、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸、Ｎ，Ｎ′−ジパルミトイルオルニチン、Ｎ，Ｎ′−ジパルミトイルリジン等のＮ−アシルアミノ酸が挙げられる。また、抗生物質としては、ペニシリン、セファロリジン等のラクタム系抗生物質が挙げられる。（山田浩一、高橋穣二、中村淳二：発酵工学会誌，２０，３４８−３５０（１９６２）、宇田川清、阿部重雄、木下祝郎：発酵工学会誌，４０，６１４−６１９（１９６２））。
ここで、ビオチン濃度を制限した条件とは、Ｌ−グルタミン酸生産条件での培地中の含有濃度は、３０μｇ／Ｌ以下、好ましくは、２０μｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは、１０μｇ／Ｌ以下であり、培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。培地中に高濃度のビオチンを含みかつビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地中に含有させた条件では、ビオチンの濃度は５０μｇ／Ｌ以上、好ましくは１００μｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２００μｇ／Ｌ以上で含んでおり、かつ添加するビオチン作用抑制物質として、抗生物質の培地中の添加濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは、０．２Ｕ／ｍｌ以上、さらに好ましくは、０．４Ｕ／ｍｌ以上であり、界面活性剤の添加濃度は、０．４ｇ／Ｌ以上、好ましくは、１ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは、２ｇ／Ｌ以上であるが、Ｌ−グルタミン酸生成が誘導される限り、いかなる添加濃度であってもよい。
例えば、上述のようなＬ−グルタミン酸生産条件でＬ−グルタミン酸を蓄積する株として適しているものとしては、上述のコリネ型細菌の野生株、あるいは、以下のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１１２１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−４３１８；特開昭５７−２６８９号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１１２１８（ＦＥＲＭ−Ｐ４３１９；特開昭５７−２６８９号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム  ＡＪ１１４２６（ＦＥＲＭ−Ｐ５１２３  特開昭５６−０４８８９０参照）
コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＪ１１４４０（ＦＥＲＭ−Ｐ５１３７  特開昭５６−０４８８９０参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１１７９６（ＦＥＲＭ−Ｐ６４０２  特開昭５８−１５８１９２参照）
＜１−２＞  ｆａｓＲ遺伝子の発現量増強
「ｆａｓＲ遺伝子の発現量が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのＦａｓＲ産物分子の数が増加した場合や、ＦａｓＲ産物分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のコリネ型細菌とは、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９やＡＴＣＣ１３０３２である。ここで、コリネ型細菌のＦａｓＲ遺伝子の発現量が上昇させるように改変すると、コリネ型細菌の界面活性剤の感受性が増大する。
本発明において、「界面活性剤に対する感受性を向上させる活性」とは、本発明のｆａｓＲ遺伝子産物が持つ活性をいう。具体的には、ｆａｄＲ遺伝子の発現量を上昇させることによって、培地中に高濃度のビオチンを含む培地で、Ｌ−グルタミン酸を生成できることを意味する。ここで「培地中に高濃度のビオチンを含む培地」とは、培地中にビオチンの濃度は５０μｇ／Ｌ以上、好ましくは１００μｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２００μｇ／Ｌ以上含んでおり、ペニシリン、界面活性剤などのビオチン作用抑制物質は含まないか、低減されていることが望ましい。ここでビオチン作用抑制物質としては、添加する界面活性剤の濃度の濃度が０．１ｇ／Ｌ以下、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．０１ｇ／Ｌ以下の濃度で添加されていることが望ましく、全く添加されていなくてもよい。
また親株が高濃度のビオチンを含有する培地にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有している場合は、ｆａｓＲ遺伝子増幅により、Ｌ−グルタミン酸の生産能が向上する。ここで、非増幅株よりも、ｆａｓＲ遺伝子増幅株のＬ−グルタミン酸の培地中の蓄積量が多いか、又はＬ−グルタミン酸の生産速度が高ければ、ｆａｓＲ遺伝子増幅株はＬ−グルタミン酸生産能が向上しているといえる。例えば、親株あるいは非改変株と比べて、ｆａｓＲ遺伝子の発現量が向上することにより、対糖収率で２％以上上昇していること、望ましくは対糖収率で４％以上上昇していること、さらに望ましくは対糖収率で６％以上向上しているとＬ−グルタミン酸生産能が向上しているといえる。
ここでｆａｓＲ遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、ｆａｓＲのｍ−ＲＮＡの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲが挙げられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），２００１））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
本発明のｆａｓＲ遺伝子がコードするタンパクとは、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の一種、またはそのホモログであり、その発現を増強することにより、コリネ型細菌の界面活性剤の感受性を向上させる活性を示すタンパク質である。（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ｆａｓＲ）コリネ型細菌のｆａｓＲをコードする遺伝子（ｆａｓＲ遺伝子）としては、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９由来の配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列を含むＤＮＡ、あるいはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２由来の配列番号５の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２のｆａｓＲ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００３４５０として登録されているゲノム配列中の３１８９８７８−３１９０３５１にコードされており、ＮＣｇｌ  ２８８６として登録されている。また、本発明の遺伝子は、コリネ型細菌において増幅することにより界面活性の感受性を増強することが出来る限り、他の微生物由来のｆａｓＲのホモログ遺伝子を用いてもよい。ｆａｓＲ遺伝子のホモログは、ＢＬＡＳＴ等によってＮＣｇｌ２８８６の遺伝子配列を参照して、検索出来る（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／）。
本発明に用いることが出来るｆａｓＲ遺伝子は、既に配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列番号１及び２に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）参照）によって、ｆａｓＲとｆａｓＲの制御領域を含む、その隣接領域を取得することができる。他の微生物のｆａｓＲのホモログも、同様にして取得され得る。
また、コリネ型細菌の種や菌株によってｆａｓＲ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明に用いるｆａｓＲ遺伝子は配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の配列、または配列番号５には限られず、コードされるＦａｓＲタンパク質の機能、すなわち増幅することにより界面活性剤の感受性を向上させることが出来る限り、配列番号４または６のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から２０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｆａｓＲ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、ｐｈｅ，ｔｒｐ，ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、ｌｅｕ，ｉｌｅ，ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、ｇｌｎ，ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、ｌｙｓ，ａｒｇ，ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、ａｓｐ，ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ｓｅｒ，ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。
さらに、ｆａｓＲ遺伝子は、配列番号４あるいは６のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、発現を増強することによりコリネ型細菌の界面活性剤の感受性を向上させることが出来るタンパク質をコードする配列を用いることが出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれｆａｓＲが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にｆａｓＲ遺伝子は、増幅することによりコリネ型細菌の界面活性剤の感受性を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、Ｃ末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で５０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。より具体的には、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸、Ｃ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸延長・削除したでもよい。
このようなｆａｓＲ遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５の塩基配列を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号３の塩基列番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５に示す塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プロ−ン  ＰＣＲ、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，ＳｔＥＰ−ＰＣＲによって、遺伝子組換えにより人工的にｆａｓＲに変異を導入して活性の高いｆａｓＲ遺伝子を取得することが出来る。（Ｆｉｒｔｈ  ＡＥ，Ｐａｔｒｉｃｋ  ＷＭ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ  ２；Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．）これらのｆａｓＲ相同遺伝子が発現量を増強することにより界面活性剤の感受性を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し、界面活性剤を添加しない培地でＬ−グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。
またｆａｓＲ遺伝子は、配列番号３の塩基配列番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５の塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ発現を増強することにより、コリネ型細菌の界面活性剤に対する感受性を向上させるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０，９０，９５，９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号３の塩基番号５０６〜９７６の塩基配列、または配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
ｆａｓＲ遺伝子の発現量の増強は、ｆａｓＲ遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ｆａｓＲを含む遺伝子をコードする断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを上述のようなＬ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えＤＮＡを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−グルタミン生産能を付与してもよい。また、コピー数の上昇は、ｆａｓＲをコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にｆａｓＲ遺伝子が転移したことの確認は、ｆａｓＲ遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
また、ｆａｓＲ遺伝子の発現の増強は、ｆａｓＲ遺伝子の発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、ｆａｓＲのプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る。（国際公開第ＷＯ００／１８９３５号パンフレット）
以下、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、ｆａｓＲ遺伝子の発現量が上昇するように改変したコリネ型細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），２００１）等のマニュアルに従って実施出来る。
同遺伝子の発現量の増強は、ｆａｓＲ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでｆａｓＲ遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずｆａｓＲ遺伝子は、コリネ型細菌の染色体からクローニングする。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｉｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ  ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号１、２に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いｆａｓＲ遺伝子を増幅することが出来る。
ＰＣＲ法により増幅されたｆａｓＲ遺伝子を含む遺伝子断片は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９，ｐＨＳＧ３９９，ｐＨＳＧ３９８，ＲＳＦ１０１０，ｐＢＲ３２２，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＭＷ２１９等が挙げられる。
上記ＤＮＡをコリネ型細菌で機能するベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等、特開平１０−２１５８８３号公報に記載のｐＶＫ７を挙げることができる。
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ｆａｓＲ遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、ｆａｓＲの末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめｆａｓＲの増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
上記のように調製した組換えプラスミドをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。また、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報）や、接合伝達法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）．１９９１  Ｊａｎ；９（１）：８４−７）．によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
ｆａｓＲのコピー数を高めることは、ｆａｓＲをコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上に複数コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上にｆａｓＲを複数コピー導入するには、染色体ＤＮＡ上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｆａｓＲをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。（特開平２−１０９９８５号、特開平７−１０７９７６号、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４５，３９７−４０５（１９９４）、Ｐｌａｓｍｉｄ．２０００  Ｎｏｖ；４４（３）：２８５−９１）。
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにｆａｓＲ遺伝子を導入して、染色体上で増幅させる方法が考えられる。例えば用いることが出来るベクターは、ｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，７８４〜７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等，Ｇｅｎｅ  １４５，６９〜７３（１９９４））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ（１９９４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｙ  ２６９：３２６７８〜８４；ＵＳ−Ａ  ５４８７９９３）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３４：５３４〜５４１（１９９３））、ｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ等，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：４５１０〜４５１６）またはｐＢＧＳ８（ｓｐｒａｔｔ等，１９８６，Ｇｅｎｅ，４１：３３７〜３４２）等が挙げられる。ｆａｓＲ遺伝子を含むプラスミドベクターをコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，７５６〜７５９（１９９４））に記載されている。形質転換法は、例えばＴｈｅｉｒｂａｃｈ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，３５６〜３６２（１９８８））、ＤｕｎｉｃａｎおよびＳｈｉｖｉｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，１０６７〜１０７０（１９８９））およびＴａｕｃｈ等（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３，３４３−３４７（１９９４））に記載されている。
また、ｆａｓＲの活性を上昇させる手段として染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上のｆａｓＲのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、ｆａｓＲの発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される。（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｌｏｇｙ  １７１：４６１７−４６２２）例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＳ２プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，１９９５，１，１０５−１２８）等に記載されている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＣＡ配列に、−１０領域をＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＡＣ配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
また、発現量の上昇は、ｍ−ＲＮＡの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。ｆａｓＲ遺伝子上流のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりｆａｓＲ遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、ｐ４８Ｋ及びｐＳＦＫＴ２（以上、特開２０００−２６２２８８号公報）、ｐＨＳＣ４（フランス特許公開１９９２年２６６７８７５号公報、特開平５−７４９１号公報）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも２５℃では自律複製することができるが、３７℃では自律複製できない。なお、発現調節配列の改変は、ｆａｓＲ遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
＜２＞Ｌ−グルタミン酸の製造法
上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
また、本発明の場合は、ｆａｓＲ遺伝子を増幅することにより、Ｌ−グルタミン酸生成誘導に必要な界面活性剤量を低減させることが可能であるので、培地にビオチンを高濃度含んでいてもよい。ここでビオチン濃度は、５０μｇ／Ｌ以上、好ましくは１００μｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは２００μｇ／Ｌ以上含んでいることが望ましい。
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
［実施例１］
＜Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のｆａｓＲ増幅株の作製＞
遺伝子ｆａｓＲを増幅するためのプラスミドを作製した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの全ゲノム配列は既に決定されているので、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９からＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔ（（株）エムエステクノシステムズ製）を用いて染色体を抽出し、この染色体を鋳型として配列番号１、２記載の組み合わせプライマーを用いたＰＣＲを行い（反応条件は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）を用いて、変性９８℃  １０秒、会合５５℃  ３０秒、伸長反応７２℃  ２分の条件で２５サイクル）、約９００ｂｐの断片を増幅した。なお、配列番号１、２のプライマーは、５’末端にＫｐｎ  Ｉ配列を付加してあり配列番号３に記載の遺伝子番号１１１−１０１０の領域が増幅されるように設計している。
増幅した断片をＫｐｎ  Ｉによる完全分解を行い、同じくＫｐｎ  Ｉによって完全分解したｐＶＫ７ベクター（特開平１０−２１５８８３記載）と連結反応を行い（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ製）を使用）、ｐＶＫＦＡＳＲを構築した（構築図は図１に記載）。
電気パルス法（特開平２−２０７７９１）にてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９へｐＶＫＦＡＳＲを導入し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−２Ｂ寒天培地（ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、酵母エキス  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ビオチン  １０μｇ／ｌ、寒天  ２０ｇ／ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）に塗布し、生育してきた株をｆａｓＲ増幅株としてＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲと命名した。
［実施例２］
＜ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲ株のグルタミン酸生成能の確認＞
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲ株のグルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。野生株にベクターを導入した対照株ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫ７、ｆａｓＲ増幅株ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲ株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＣＭ−２Ｂ寒天培地（ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、酵母エキス  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ビオチン  １０μｇ／ｌ、寒天  ２０ｇ／ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）で３１．５℃で一昼夜培養を行い、シード培地（グルコース  ８０ｇ／ｌ、硫安  ３０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ２００μｇ／ｌ、大豆蛋白加水分解液  ０．４８ｇ／ｌ、ビオチン  ３００μｇ／ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整）２０ｍｌに接種し予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム１ｇを添加した後、３１．５℃、速度１１５ｒｐｍで振とう培養を行った。完全に糖を消費し尽くしたことを確認後、次にメイン培地（グルコース  ８０ｇ／ｌ、硫安  ３０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ２００μｇ／ｌ、大豆蛋白加水分解液  ０．４８ｇ／ｌ、ビオチン  ３００μｇ／ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整）２０ｍｌにシード培養液を１ｍｌ接種し予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム１ｇを添加した後、３１．５℃、速度１１５ｒｐｍで振とう培養を行った。培養開始２．５時間後にＴｗｅｅｎ４０を無添加もしくは０．０１、０．１、１ｇ／ｌ添加し、４１時間目の菌体量（６２０ｎｍの吸収を測定）、グルタミン酸蓄積量、残糖量を表１に示した。
その結果、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲ株はＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫ７株がグルタミン酸を蓄積しない界面活性剤無添加条件や微量の界面活性剤添加条件においてグルタミン酸を約１０ｇ／ｌ蓄積した。以上の結果から遺伝子ｆａｓＲを増幅することが、界面活性剤不要化に有効であること、グルタミン酸生成誘導に必要な界面活性剤量を低減させることに有効であることを確認した。
【表１】
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［実施例３］
＜ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫＦＡＳＲ株の界面活性剤感受性の変化＞
ｆａｓＲ増幅株は低濃度の界面活性剤を添加するだけで、グルタミン酸生成が誘導されることから、界面活性剤に対する感受性が対照株（ベクター導入株ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＶＫ７）と比較し増していることが推定される。そこで、ｆａｓＲ増幅株の界面活性剤に対する感受性について見当を行った。ＣＭ−２Ｂ寒天培地上で３１．５℃、一昼夜培養した菌体をＣＭ−２Ｂ液体培地に接種し、Ｔｗｅｅｎ４０を無添加もしくは０．０１、０．１、０．２５、０．５ｇ／ｌ添加した。試験管培養にて、ＯＤ６２０ｎｍの吸収を経時的に測定し、比増殖速度を算出した結果を図２に示した。遺伝子ｆａｓＲ増幅株は０．０１ｇ／Ｌの界面活性剤を添加した条件で著しい比増殖速度の低下が認められ、ｆａｓＲ遺伝子が界面活性剤に対する感受性に変化を与える遺伝子であることが確認された。
［配列表］
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2007024010.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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