(57)【要約】この発明は、感染症および癌の予防および治療のための方法および組成物に関する。この発明の方法は、（ａ）抗原細胞またはウイルス粒子由来の抗原タンパク質または抗原ペプチドと、１種以上の異なる熱ショックタンパク質との複合体の集団を含む組成物；ならびに（ｂ）非熱ショックタンパク質および非α-2-マクログロブリンを主体とするによる治療剤を投与することを含む。抗原ペプチドを作製するのに用いる集団またはタンパク質調製物は、抗原細胞またはウイルス粒子の様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは少なくとも50種の異なるタンパク質を含む。抗原ペプチドを作製する方法は、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物を１種以上のプロテアーゼで消化するか、またはATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に該タンパク質調製物を暴露することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１タイプの癌を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原タンパク質とを含み、ここで、上記複合体の集団は、熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを（ｉ）上記タイプの癌の細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％である抗原タンパク質、もしくは（ii）上記タイプの癌の細胞に存在する少なくとも50種の異なるタンパク質、と複合体化させることにより製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項２】
１タイプの癌を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ｉ）上記タイプの癌の細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは（ii）上記タイプの癌の細胞に存在する少なくとも50種の異なるタンパク質、を含むタンパク質調製物を少なくとも１種のプロテアーゼで消化することにより、抗原ペプチドの集団を作製した後、上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項３】
１タイプの癌を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ｉ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ii）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ａ）（Ａ）上記タイプの癌の細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは（Ｂ）上記タイプの癌の細胞に存在する少なくとも50種の異なるタンパク質、を含むタンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に暴露することにより、抗原ペプチドの集団を作製し、（ｂ）上記抗原ペプチドの集団を回収した後、（ｃ）上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項４】
１タイプの感染症を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原タンパク質とを含み、ここで、上記複合体の集団は、抗原細胞、その細胞画分、もしくは上記感染症を引き起こす因子の抗原決定基を発現するウイルス粒子に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、または少なくとも50種の異なるタンパク質である抗原タンパク質と、熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを複合体化させることにより製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項５】
１タイプの感染症を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ｉ）抗原細胞、その細胞画分、もしくは上記感染症を引き起こす因子の抗原決定基を発現するウイルス粒子に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％または少なくとも50種の異なるタンパク質を含むタンパク質調製物を１種のプロテアーゼまたは複数の異なるプロテアーゼのいずれかで消化し、（ii）上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項６】
１タイプの感染症を治療または予防する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
このような治療または予防が必要な被検者に、複合体の集団を含む組成物を投与するステップ、ここでこの複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ｉ）抗原細胞、その細胞画分、もしくは上記感染症を引き起こす因子の抗原決定基を発現するウイルス粒子に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％または少なくとも50種の異なるタンパク質を含むタンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に暴露することにより、抗原ペプチドの集団を作製し、（ii）上記抗原ペプチドの集団を回収した後、（iii）上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない少なくとも１種の治療剤を上記被検者に投与するステップ。
【請求項７】
前記抗原タンパク質の集団と熱ショックタンパク質との複合体化が、共有結合の形成によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原タンパク質の集団と熱ショックタンパク質との複合体化が、非共有結合の形成によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原ペプチドの集団と熱ショックタンパク質との複合体化が、共有結合の形成によるものである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原ペプチドの集団と熱ショックタンパク質との複合体化が、非共有結合の形成によるものである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原タンパク質の集団とα-2-マクログロブリンとの複合体化が、共有結合の形成によるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原タンパク質の集団とα-2-マクログロブリンとの複合体化が、非共有結合の形成によるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原ペプチドの集団とα-2-マクログロブリンとの複合体化が、共有結合の形成によるものである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原ペプチドの集団とα-2-マクログロブリンとの複合体化が、非共有結合の形成によるものである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、抗原タンパク質とを含む前記複合体の集団を精製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合体の集団を精製する、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体の集団を精製する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体の集団を精製する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１９】
前記同タイプの癌の細胞が転移からのものである、請求項１、２もしくは３に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療または予防しようとする癌が転移である、請求項１、２もしくは３に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原細胞が、感染症を引き起こす因子に感染したものである、請求項５、６もしくは７に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原細胞が、前記因子の変異体に感染したものであり、この変異体は該因子の抗原性を展示する、請求項５、６もしくは７に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の治療剤が、化学療法薬、抗血管形成薬、サイトカイン、生体応答調節剤、ホルモン、抗体、ポリヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、光力学療法薬もしくは放射線である、請求項１、２もしくは３に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の治療剤が、抗生物質、抗ウイルス薬、抗原生動物化合物、抗真菌化合物、抗蠕虫化合物、抗体、サイトカイン、ホルモン、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドである、請求項４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の治療剤の投与前、これと同時、もしくは投与後に前記組成物を投与する、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項２６】
前記被検者が、前記組成物を含まない前記少なくとも１種の治療剤による治療に対しすでに不応答性である、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項２７】
週単位の間隔をおいて、前記組成物の投与を繰り返す、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物の投与を前記被検者の同じ部位に繰り返す、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物の投与を内皮または皮下に実施する、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項３０】
準最適量の前記組成物を投与する、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項３１】
準最適量の前記少なくとも１種の治療剤を投与する、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項３２】
前記被検者がヒトである、請求項１、２、３、４、５もしくは６に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原タンパク質が被検者に対し自己由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原タンパク質が被検者に対し自己由来のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原ペプチドが被検者に対し自己由来のものである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原ペプチドが被検者に対し自己由来のものである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項３７】
以下のものを含んでなるキット：
複合体の集団を含む組成物を含む第１の容器であって、この複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原タンパク質とを含み、ここで、上記複合体の集団は、抗原細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは抗原細胞に存在する少なくとも50種の異なるタンパク質と、熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを複合体化させることにより製造されたものである、上記第１の容器；ならびに、
熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを含まない治療剤を含む第２の容器。
【請求項３８】
以下のものを含んでなるキット：
複合体の集団を含む組成物を含む第１の容器であって、この複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ｉ）抗原細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは少なくとも50種の異なるタンパク質を含むタンパク質調製物を少なくとも１種のプロテアーゼで消化することにより、抗原ペプチドの集団を作製した後、（ii）上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである、上記第１の容器；ならびに、
非熱ショックタンパク質または非α-2-マクログロブリンによる治療剤を含む第２の容器。
【請求項３９】
以下のものを含んでなるキット：
複合体の集団を含む組成物を含む第１の容器であって、この複合体は、（ａ）熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと、（ｂ）抗原ペプチドとを含み、ここで、上記複合体の集団は、（ｉ）抗原細胞に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、もしくは少なくとも50種の異なるタンパク質を含むタンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に暴露することにより、抗原ペプチドの集団を作製し、（ii）上記抗原ペプチドの集団を回収した後、（iii）上記抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることを含む方法により製造されたものである、上記第１の容器；ならびに、
非熱ショックタンパク質または非α-2-マクログロブリンによる治療剤を含む第２の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）により与えられた補助金番号CA/A18449に基づく政府支援により達成された。米国は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
１．序文
本発明は、感染症、ならびに原発性および転移性腫瘍性疾患の予防および治療のための方法および組成物に関する。感染症および癌の予防および治療の実施では、抗原細胞および／またはその消化産物からの細胞質ゾルおよび膜由来のタンパク質を含む組成物を、熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンと複合体化することにより、腫瘍および感染因子に対する免疫応答を高くする。また、他の治療方法と組み合わせた上記組成物の使用も包含される。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１．熱ショックタンパク質
ストレスタンパク質とも呼ばれる熱ショックタンパク質（HSP）は、初め、熱ショックに応答して細胞が合成するタンパク質として確認された。HSPは、分子量に基づき、５つのファミリー：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、およびsmHSPに分類されている。その後、これらのファミリーの多くのメンバーは、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染、のような他のストレス刺激に応答して誘導されることがわかった（Welch, 1993年5月、Scientific American 56-64；Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420；Craig, 1993, Science 260:1902-1903；Gethingら、1992, Nature 355: 33-45；ならびにLindquistら、1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677を参照）。
【０００４】
熱ショックおよびその他の生理学的ストレスに対する細胞の応答に関する研究から、HSPが、これらの有害な状態に対する細胞の防御だけではなく、ストレスを受けていない細胞における主要な生化学的および免疫学的過程にも関与していることが明らかにされた。HSPは、多種のシャペロン機能を果たす。例えば、細胞質、核、ミトコンドリア、もしくは小胞体内に位置するHSP70ファミリーのメンバー（Lingquistら、1988, Ann. Rev. Genetics 22:631-677）は、免疫系の細胞に対する抗原の提示に関与しており、さらには、正常な細胞におけるタンパク質の輸送、フォールディングおよび集合にも関与している。HSPは、タンパク質またはペプチドを結合し、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下または酸性条件下で、結合したタンパク質またはペプチドを放出することができる（UdonoおよびSrivastava, 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。
【０００５】
Srivastavaらは、近交系マウスのメチルコラントレン誘発肉腫に対する免疫応答を明らかにした（1988, Immunol. Today 9:78-83）。これらの研究では、これら腫瘍の個々に異なる免疫原性の原因となる分子が、96kDa（gp96）の糖タンパク質、ならびに84〜86kDaの細胞内タンパク質であることがわかった（Srivastavaら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3407-3411；Ullrichら、Natl. Acad. Sci. USA 83:3121-3125）。特定の腫瘍から単離したgp96またはp84/86でマウスを免疫化すると、マウスは、その特定の腫瘍に対して免疫性となったが、抗原が異なる腫瘍に対してはそうならなかった。gp96およびp84/86をコードする遺伝子の単離および特性決定により、両者の有意な相同性が明らかにされ、gp96およびp84/86が、同じ熱ショックタンパク質の小胞体および細胞質カウンターパートであることがわかった（Srivastavaら、1988, Immunogenetics 28:205-207；Srivastavaら、1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123）。さらに、HSP70は、それが単離された腫瘍に対しては免疫性を誘発するが、抗原が異なる腫瘍に対しては誘発しないことも明らかにされた。しかし、ペプチドを欠失したHSP70は、その免疫原活性を喪失することがわかった（UdonoおよびSrivastava, 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。以上の知見から、熱ショックタンパク質はそれ自体で免疫原性ではなく、抗原ペプチドと非共有結合複合体を形成し、この複合体が抗原ペプチドに対し特異的な免疫性を誘発するのではないかと考えられた（Srivastavaら、1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177；Udonoら、1994, J. Immunol., 152:5398-5403；Sutoら、1995, Science 269:1585-1588）。
【０００６】
癌細胞から精製したHSPとペプチドの非共有結合複合体は、癌の治療および予防のために用いることができ、1996年４月11日付けのPCT公開番号WO 96/10411および1997年３月20日付けのWO 97/10001（1998年５月12日発行の米国特許第5,750,119号、1998年11月７日発行の米国特許第5,837,251号；いずれもその全文を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。例えば、病原体感染細胞からのHSP−ペプチド複合体の単離および精製が記載されており、ウイルスのような病原体、ならびにその他の細胞内病原体（細菌、原生動物、真菌および寄生生物など）により引き起こされる感染の治療および予防に用いられてきた（例えば、1995年９月21日付けのPCT公開番号WO 95/24923を参照）。ストレスタンパク質と抗原ペプチドをin vitroで複合体化することにより、免疫原ストレスタンパク質−抗原複合体を作製することもでき、このような複合体を癌および感染症の治療および予防に用いることが1997年３月20日付けのPCT公開番号WO 97/10000に記載されている。養子免疫療法(adoptive immunotherapy)に使用する目的として、in vitroで抗原提示細胞を感作するためのストレスタンパク質−抗原複合体の使用が、1997年３月20日付けのPCT公開番号WO 97/10002に記載されている（1999年11月16日発行の米国特許第5,985,270号も参照）。
【０００７】
２．２．α-2-マクログロブリン
α-2-マクログロブリンは、構造的に関連するタンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、これには補体成分C3、C4およびC5も含まれる。ヒト血漿タンパク質α-2-マクログロブリン（α2M）は、プロテイナーゼ阻害物質ならびに血漿および炎症性体液プロテイアーゼスカベンジャー分子として主に知られれる720kDaホモ四量体タンパク質である（詳しくは、ChuおよびPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792を参照）。α2Mは、1474アミノ酸残基を有する前駆体として合成される。最初の23個のアミノ酸は、シグナル配列として機能し、このシグナル配列を切断することにより、1451個のアミノ酸残基を有する成熟タンパク質が得られる（Kanら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2282-2286）。
【０００８】
α2Mは、求核性アミノ酸側鎖を有するタンパク質およびペプチドと、無差別に共有結合し（Chuら、1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307）、これらを、α2M受容体（α2MR）を発現する細胞にターゲッティングする（ChuおよびPizzo, 1993, J. Immunol. 150:48）。α2Mとα2M受容体の結合は、α2Mのカルボキシ末端部分により仲介され（Holtetら、1994, FEBS Lett. 344:242-246）、鍵となる残基が確認されている（Nielsenら、1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912）。
【０００９】
プロテアーゼ活性を阻害することが一般に知られ、α2Mは、多数の結合部位を介して多様なプロテアーゼに結合する（例えば、Hallら、1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 100(1):8-16）。α2Mとプロテアーゼの相互作用により、形質転換と呼ばれる複雑な構造的再編成が起こるが、これは、プロテイナーゼがチオエステルに「捕獲」された後、α2Mの「誘引（bait）」領域内で切断が起こったためである。コンホメーションの変化により、受容体結合に必要な残基が露出することから、α2M−プロテイナーゼ複合体をα2Mに結合させることができる。メチルアミンは、プロテイナーゼが誘発したのと同様のコンホメーション変化および切断を誘発することができる。受容体に認識されないα2Mの非切断形態は、「遅速(slow)」型(s-α2Ｍ）と呼ばれることが多い。切断された形態は、「高速(fast)」型(f-α2Ｍ）と呼ばれる（詳しくは、Chuら、1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307を参照）。近年、α2Mは、HSP、例えば、gp96、hsp90、hsp70、およびカルレティキュリンに結合することもわかっている（Basuら、2001 Immunity 14(3):303-13）。
【００１０】
そのプロテイナーゼ阻害機能に加えて、α2Mは、抗原と複合体化すると、マクロファージのような抗原提示細胞により取り込まれ、２桁（100倍）までＴ細胞ハイブリドーマにin vitroで提示され（ChuおよびPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792）、Ｔ細胞増殖を誘発する（Osadaら、1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:26-31）抗原の能力を高めることができる。さらなる証拠から、抗原とα2Mとの複合体化は、粗脾細胞によるin vitroでの抗体産生を増強し（Osadaら、1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:833）、実験ウサギ（Chuら、1994, J. Immunol. 152:1538-1545）およびマウス（Mirsudaら、1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331）におけるin vivo抗体応答を誘発することが示唆されている。また、α2M−抗原ペプチド複合体が、in vivoで細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することもわかっている（Binderら、2001, J. Immunol. 166:4698-49720）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
３．発明の概要
本発明は、癌および感染症の予防および治療を目的とする、抗原タンパク質およびペプチドと熱ショックタンパク質（HSP）またはα-2-マクログロブリン（α2M）との複合体の製造および使用を包含する。上記複合体は、少なくとも１種の非熱ショックタンパク質および非α-2-マクログロブリンを主体とする治療剤（treatment modality）と組み合わせて用いるのが好ましい。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、HSPと、抗原細胞またはウイルス粒子の抗原タンパク質の集団との複合体を用いるものであり、この複合体は、抗原細胞またはウイルス粒子由来の抗原タンパク質の集団を１種以上の異なる熱ショックタンパク質とin vitroで複合体化することを含む方法により製造されるが、その際、上記集団は、抗原細胞またはウイルス粒子に存在する、もしくは抗原細胞の細胞画分に存在する少なくとも50％の異なるタンパク質または少なくとも50種の異なるタンパク質を含む。
【００１３】
別の実施形態では、前記複合体は、タンパク質調製物中のタンパク質が熱ショックタンパク質と複合体化するような条件下で、１種以上の異なる熱ショックタンパク質にin vitroで上記タンパク質調製物を接触させることを含む方法により製造する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、HSPと、抗原細胞またはウイルス粒子の抗原ペプチドの集団とを含む複合体の使用を提供するが、その際、抗原ペプチドの集団は、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物を１種のプロテアーゼで、または複数の異なるプロテアーゼで個別に消化することを含む方法により製造する。また、抗原ペプチドの集団は、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件（タンパク質調製物に存在するタンパク質複合体から抗原タンパク質を溶離させるのに十分なもの）に暴露することを含む方法により作製することもできる。前記いずれか一方または両方の方法で作製した抗原ペプチドを１種以上の異なるHSPとin vitroで複合体化する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、α2Mと、抗原細胞の抗原タンパク質の集団との複合体の使用を提供する。この複合体は、抗原細胞またはウイルス粒子由来の抗原タンパク質の集団をα2Mとin vitroで複合体化することを含む方法によって製造されるが、その際、上記集団は、抗原細胞またはウイルス粒子に存在する、もしくは抗原細胞の細胞画分に存在する少なくとも50％の異なるタンパク質または少なくとも50種の異なるタンパク質を含む。別の実施形態では、この方法は、タンパク質調製物中のタンパク質がα2Mと複合体化するような条件下で、タンパク質調製物をα2Mにin vitroで接触させることを含む。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明は、α2Mと、抗原細胞またはウイルス粒子の抗原ペプチドの集団との複合体の使用を提供するが、その際、抗原ペプチドの集団は、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物を１種のプロテアーゼで、または複数の異なるプロテアーゼで個別に消化することを含む方法により作製する。また、抗原ペプチドの集団は、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に暴露することを含む方法により作製することもできる。前記いずれか一方または両方の方法で作製した抗原ペプチドをα2Mとin vitroで複合体化する。
【００１７】
様々な実施形態では、抗原細胞は、癌細胞、もしくは病原体または感染因子に感染した細胞でよく、好ましくはヒト細胞である。抗原細胞はまた、病原体または感染因子、もしくはそれらの変異体の細胞であってもよい。抗原タンパク質／ペプチドは、癌細胞、もしくは抗原が癌または感染症に関連する病原体に感染した細胞から作製することができる。また、病原体または感染因子（ウイルス粒子を含む）を用いて、抗原ペプチドを作製することも可能である。抗原細胞のタンパク質調製物は、細胞質ゾルまたは膜由来タンパク質のいずれか一方だけか、あるいは、細胞質ゾルと膜由来タンパク質の両方を含んでいてもよい。タンパク質調製物は、分画していない粗細胞溶解物でよい。具体的実施形態では、当分野では周知の方法により、抗原細胞を溶解させ、細胞破片よび非タンパク質性材料を除去した後、随意にタンパク質を精製することによって、タンパク質調製物を調製することができる。特定の実施形態では、抗原細胞に存在する他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持する作製方法に、上記タンパク質調製物を供していない。
【００１８】
特定の実施形態では、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物を多種のプロテアーゼにより、酵素反応に好適な条件下で消化するが、このようなプロテアーゼとして、限定するものではないが、トリプシン、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ（プロテアーゼV8としても知られる）、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＧ、サーモリシン、エラスターゼおよびパパインが挙げられる。消化の程度は、サンプルを選択し、ペプチドの長さを決定する周知の方法で該サンプルを分析することによりモニタリングすることができる。尚、このようにして得られるペプチドの集団（抗原ペプチドを含む）の平均サイズが、約７〜約20アミノ酸残基であるような条件下で、消化ステップを実施するのが好ましい。また、タンパク質調製物のアリコートを様々なプロテアーゼで消化することにより、タンパク質調製物から、様々なペプチドの集団を作製するのが望ましい。様々な消化物から得られるペプチドを結合してから、HSPまたはα2Mと複合体化することができる。抗原ペプチドを含むペプチドの集団をHSPまたはα2Mと複合体化する前に、ペプチドの集団からプロテアーゼを不活性化または分離するのが望ましく、その後、随意にペプチドの集団を精製する。
【００１９】
特定の実施形態では、抗原細胞、その細胞画分、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物をアデノシン三リン酸（ATP）、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件と接触させることによって、初めにHSP複合体またはα2M複合体を単離する必要なしに抗原ペプチドを溶離することができる。この方法により溶離された抗原ペプチドは、HSP、α2M、およびMHCクラスＩおよびII分子と内在的に会合するペプチドを含む。
【００２０】
本発明の様々な実施形態では、抗原ペプチドの集団をHSPまたはα2Mとin vitroで複合体化するのに用いる方法に応じて、この反応の結果、共有結合または非共有結合のいずれかによりHSPまたはα2Mと複合体化した抗原ペプチドが生じうる。複合体化が考えられる熱ショックタンパク質として、限定するものではないが、HSP 60、HSP70、HSP 90、gp96、カルレティクリン、grp78（またはBiP）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、HSP110、ならびにgrp170が挙げられる。ヒトHSPおよびヒトα2Mが一般に好ましい。In vitroで形成したHSPまたはα2Mと抗原ペプチドの複合体は、治療または予防組成物における使用、または該組成物としての使用前に、さらに精製することができる。このような組成物は、さらにアジュバントを含んでもよい。また、HSPおよび／またはα2M、抗原細胞、タンパク質調製物、および／またはプロテアーゼと、別の治療剤を含む組合せ治療のためのキットも提供される。
【００２１】
別の形態では、１タイプの癌または感染症を治療または予防する方法であって、このような治療または予防が必要な被検者に、(ｉ)上記治療または予防に有効な量の、抗原ペプチドの集団と複合体化したHSPおよび／またはα2Mを、（ii）非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤である別の治療剤と組み合わせて投与することを含んでなる、上記方法を提供する。別の治療剤は、非ワクチン治療剤であるのが好ましい。このような治療剤の例を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない：抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌化合物、抗原生動物、抗蠕虫化合物、抗癌治療薬、例えば、化学療法薬、抗血管形成化合物、ホルモン、および放射線、ならびに生物学的治療薬および免疫療法薬。
【００２２】
別の実施形態では、１種の癌または感染症を治療または予防する方法であって、このような治療または予防が必要な被検者に、HSPおよび／またはα2Mと抗原タンパク質／ペプチドの集団との複合体で感作した抗原提示細胞を投与することを含んでなる、上記方法を提供する。感作した抗原提示細胞を被験者に投与する以外に、HSPおよび／またはα2Mと抗原ペプチドの集団との複合体；および／または非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤を被検者に投与することもできる。
【００２３】
本発明はまた、非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤の治療成果を改善する方法であって、この治療剤の投与とともに、好ましくは精製された複合体であるHSP複合体またはα2M複合体のいずれかを投与することを含んでなる、上記方法も提供する。
【００２４】
本発明の一実施形態では、非HSPおよび非α2Mの治療剤を受けている被検者において、第１の抗原細胞またはウイルス粒子に対する免疫応答を誘発するための方法であって、第２の抗原細胞またはウイルス粒子から作製した抗原タンパク質／ペプチドの集団と複合体化した、免疫原となる量のHSPおよび／またはα2Mを投与することを含んでなる、上記方法を提供する。抗原ペプチドは、抗原細胞またはウイルス粒子のタンパク質調製物をプロテアーゼで消化するか、もしくは該タンパク質調製物をATP、塩酸グアニジウムおよび／または酸性条件に暴露することにより得ることができる。第１および第２の抗原細胞またはウイルス粒子は、少なくとも１つの共有の抗原決定基を発現する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、HSP複合体またはα2M複合体を受けている被検者の治療成果を改善する方法であって、この方法が、HSP複合体またはα2M複合体の投与前、投与と同時、もしくは投与後に、別の治療剤を被検者に投与することにより実施される上記方法も提供する。非ワクチン治療剤による治療プログラムに先行する、重なる、および／またはそれに続く一定期間に、HSP複合体またはα2M複合体のいずれかを投与することができる。
【００２６】
HSP複合体またはα2M複合体の被検者への投与は、同じ部位に、定期的に、例えば、１週間おきに繰り返すことができる。組成物は、様々な経路（例えば、皮内または皮下）で投与することができる。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、前記治療剤またはHSP複合体だけの投与と比較して優れた治療プロフィールをもたらす治療方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、前記治療剤またはα2M複合体だけの投与と比較して優れた治療プロフィールをもたらす治療方法を包含する。HSP複合体またはα2M複合体と組み合わせた治療剤の投与が、相加的効力または相加的治療効果を有する方法も本発明に含まれる。本発明はまた、治療効果が相加的より大きい、相乗作用的成果も包含する。好ましくは、HSP複合体またはα2M複合体と組み合わせた治療剤の投与は、不要または有害な作用を軽減もしくは解消する。
【００２８】
本発明では、特定の実施形態において、非ワクチン治療剤の用量を減らすか、投与頻度を少なくすることにより、患者のコンプライアンスを高め、治療を改善し、および／または不要または有害な作用を軽減することができる。具体的実施形態では、化学療法または放射線療法の投与用量または頻度を少なくすることにより、不要な作用を軽減もしくは解消する。あるいは、特定の治療剤と一緒に投与する場合には、HSP複合体の用量およびα2M複合体の用量を減らすか、または投与頻度を少なくしてもよい。特定の実施形態では、前記治療剤の投与を伴わないHSP／α2M複合体の投与、またはHSP／α2M複合体の投与を伴わない前記治療剤の投与は治療に有効ではない。具体的実施形態では、HSP／α2M複合体または前記治療剤は、単独では治療に有効となるのに不十分な量を投与する。別の実施形態では、HSP／α2M複合体または前記治療剤の両方または少なくとも一方は、単独で投与した場合、治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
４．発明の詳細な説明
本発明は、癌および感染症の予防および治療に有用な熱ショックタンパク質（HSP）またはα-2-マクログロブリン（α2M）を含む組成物を製造および使用する方法を提供する。本発明の方法は、HSPまたはα2Mと、抗原細胞の抗原タンパク質およびペプチドとの複合体をin vitroで作製し、これを別の治療剤と組み合わせて用いることを含む。一実施形態では、上記方法は、抗原細胞のタンパク質調製物（この調製物は、抗原タンパク質の集団を含む）を製造し；該抗原タンパク質の集団をHSPまたはα2Mと複合体化することを含む。別の実施形態では、この方法は、抗原細胞のタンパク質調製物を少なくとも１種のプロテアーゼで消化することにより、抗原ペプチドの集団を製造した後、抗原ペプチドの集団をHSPまたはα2Mとin vitroで複合体化することを含む。本発明は、HSPおよび／またはα2Mを主体とするワクチンを製造するのに、抗原細胞の全抗原潜在能力を利用するものである。
【００３０】
本発明の治療および予防方法は、感染症または癌の治療または予防が望まれる被検者で、かつ別の治療剤を受けていたか、これから受ける被検者に免疫応答を誘発することに基づくものである。免疫応答は、癌細胞の抗原決定基、感染症を引き起こす感染因子に感染した細胞の抗原決定基、もしくは感染因子の抗原決定基に対し特異的に向けられる。HSPと抗原細胞のタンパク質／ペプチドを含む分子複合体の集団、またはα2Mと抗原細胞のタンパク質／ペプチドを含む分子複合体の集団を含んでなる組成物を個体に投与することにより、組成物中の分子複合体が、個体において免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激することができる。抗原細胞は、癌細胞または感染細胞、あるいは、抗原決定基を共有する、もしくは癌または感染細胞と類似した抗原性を展示する細胞でよい。免疫応答の結果、個体の様々な免疫エフェクター機構が、癌または感染細胞に作用し、それ自体で、または他の治療剤と一緒に、このような疾患の治療または予防を行なう。
【００３１】
感染症または癌の治療もしくは予防が望まれる個体または被検者は、動物、好ましくは哺乳動物、ヒト以外の霊長類、ならびに、最も好ましくはヒトである。本明細書で用いる「動物」という用語は、ペット、例えば、ネコおよびイヌ；動物園の動物；野生動物（シカ、キツネおよびアライグマなど）；農場の動物、家畜および家禽（ウマ、畜牛、ヒツジ、ブタ、シチメンチョウ、カモ、およびニワトリ）、ならびにげっ歯動物である。
【００３２】
本発明の組成物および方法は、天然に存在するHSP抗原ペプチド複合体を用いて、癌または感染症を治療または予防する他の組成物および方法に対し改善をもたらすものである。このような他の方法では、特定のHSPおよびその抗原ペプチドとの複合体を癌または感染細胞から単離して、これを患者に投与することにより、癌または感染細胞に対する免疫応答をin vivoで誘発する（例えば、米国特許第5,750,119号および第5,961,979号）。天然に存在する複合体は、所望されるタイプのHSPに応じて決定される方法により単離する。従って、１タイプのHSPと抗原ペプチドの天然に存在する複合体は、そのタイプのHSPと一緒に抗原細胞のコンパートメント内に共局在化した抗原ペプチドだけを含んでいる。ただ１つの細胞コンパートメントに存在するタイプのHSPもあれば、抗原細胞の特定のコンパートメントだけに存在する抗原ペプチドもある。例えば、HSP90およびHSP70は、細胞質ゾルだけに存在する。従って、これらは、細胞質ゾル内に位置する抗原ペプチドと複合体化するだけで、その他の箇所、例えば、小胞体に存在する抗原ペプチドとは複合体化しない。すなわち、抗原細胞の抗原ペプチドのサブセットだけが、特定のHSPの各々と結合することができる。従って、癌または感染細胞の最大数の抗原決定基に対する免疫応答を刺激するためには、それぞれ対応する単離方法で、癌または感染細胞からあらゆるタイプのHSPおよびそのペプチド複合体を単離してから、患者に投与しなければならない。この方法は相当の労力を要し、特定の状況下では入手不可能な抗原細胞を大量に必要とすることもある。本発明の方法は、抗原細胞のほぼすべての抗原のペプチドプロフィールをin vitroで作製し、該ペプチドを１種以上の異なるHSPおよび／またはα2Mと複合体化させることにより前記の問題を解決するものであり、こうして得られた複合体を用いて、患者の免疫応答を刺激することができる。本発明の方法を用いることにより、抗原細胞の同じコンパートメント内に共局在化していない抗原ペプチドおよびHSPでも複合体を形成することができる。本発明の方法により、特定タイプのHSPと抗原細胞の大部分、あるいはすべての抗原ペプチドとの複合体の形成が可能になる。従って、本発明の方法で製造した組成物により、抗原細胞に対してより有効な免疫応答を誘発することができる。さらには、この方法では、事前にHSP複合体および関連ペプチドを単離する必要がないため、往々にして供給が限られる出発材料を使用する量が極めて少量ですむ。
【００３３】
さらに、癌細胞、感染細胞、もしくは病原体の抗原プロフィールは、一定期間、例えば、治療期間中も変化する可能性がある。多くの病原体は、突然変異、さらには免疫細胞および抗体により認識されない突然変異タンパク質の合成によって、宿主免疫系からたくみに逃れる。癌細胞は、突然変異タンパク質（そのうちいくつかは免疫系に認識されないこともある）の合成を引き起こす突然変異により特定の薬剤に対して耐性になることが知られている。本発明の実施形態の１つを用いる利点は、癌細胞、感染細胞もしくは病原体からの細胞質ゾルおよび／または膜由来タンパク質を消化することにより、より広範な抗原タンパク質、従って、より多様な抗原ペプチドをHSPおよび／またはα2Mと複合体化させることである。その結果、免疫応答が、抗原細胞上のより多数の抗原決定基に向けられるため、癌細胞または感染細胞のような抗原細胞が免疫系による認識および作用から逃れることがこれまでより難しくなる。
【００３４】
別の具体的実施形態では、本発明の方法では、天然に存在しないα2M−ペプチド複合体を作製する。α2Mは、多種の細胞外タンパク質、特にプロテアーゼと結合し、これらを不活性化した後、細胞内環境に運搬する。α2Mは一般に接近しないため、抗原細胞の全レパトアの抗原ペプチドと複合体化することはない。本発明の方法は、細胞質ゾルまたは膜由来の、または抗原細胞の細胞質ゾルおよび膜由来タンパク質のin vitro消化により作製された、はるかに広範なペプチドとα2Mを複合体化させることができる。
【００３５】
タンパク質調製物を作製することができる抗原細胞の供給源を第４．１節に記載する。第４．２節には、抗原細胞の各種タンパク質調製物の作製方法と、タンパク質調製物を消化する方法を記載する。第４．３節には、抗原ペプチドとの複合体化に用いられるHSPまたはα2Mの単離または生産のそれぞれについて記載する。HSPと抗原ペプチドのin vitro複合体化について第４．４節に記載する。第４．５節には、癌および感染因子の予防および治療における複合体の使用方法、ならびに、治療される癌および感染症の種類を記載する。本発明の方法により製造された組成物の養子免疫療法における使用を第４．６節に教示する。第５節には、動物を癌細胞増殖から予防的に防御する上での本発明の複合体の有効性を示す実験データを記載する。
【００３６】
４．１．抗原細胞の供給源
本発明の抗原細胞は、被検者において免疫応答が求められる抗原決定基を含む。
【００３７】
癌または感染症の治療または予防のために、本発明の方法は、抗原タンパク質およびペプチドと複合体化したHSPおよびα2Mの複合体を提供するが、上記抗原タンパク質／ペプチドは癌細胞、好ましくはヒトの癌に由来するもので、例えば、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原の断片である。ペプチドは、癌細胞、または癌細胞と類似した抗原性を持つ、もしくは展示する抗原決定基を共有する抗原細胞から得たタンパク質（例えば、細胞質ゾルおよび／または膜由来タンパク質）をタンパク質分解消化することにより作製することができる。抗原ペプチドはまた、タンパク質をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸性条件に暴露することによって作製することもできる。本明細書で用いる「同型の癌の細胞または組織」という用語は、同じ組織型の癌の細胞または組織、あるいは、同じ組織型の癌から転移した細胞または組織を意味する。
【００３８】
感染症の治療または予防のために、本発明の方法は、感染症を引き起こす病原体または感染因子、すなわち、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物などの病原体に感染した細胞に由来する抗原ペプチドと複合体化したHSPおよびα2Mの組成物を提供する。好ましくは、上記病原体はヒトに感染するものである。抗原ペプチドは、感染細胞、この感染細胞と類似の抗原性を持つ、もしくは展示する抗原決定基を共有する抗原細胞から得た（例えば、細胞質ゾルおよび／または膜由来の）タンパク質をタンパク質分解消化することにより作製することができる。抗原ペプチドはまた、タンパク質をATP、塩酸グアニジウム、および／または酸に暴露することによって作製することもできる。さらに、抗原ペプチドは、感染症を引き起こす因子（病原体）またはこのような因子の変異体の抗原性を展示する抗原細胞から作製することも可能である。
【００３９】
本発明の方法では、全癌細胞、感染細胞もしくはその他の抗原細胞を用いるため、本発明の方法を用いる前に、上記抗原ペプチドを単離または特性決定する、あるいは、その正体を知る必要がない。抗原細胞の供給源は、その抗原が関連する疾患の種類に応じて選択することができる。本発明の一実施形態では、癌（多部位に転移した癌を含む）から単離したあらゆる組織または細胞を本発明の方法での抗原細胞として用いることができる。例えば、血液、リンパ液またはその他の体液中に循環する白血病細胞を用いてもよいし、充実性腫瘍組織（例えば、生検からの一次組織）を用いてもよい。本明細書で用いる「癌細胞」という用語は、正常から腫瘍形態に移行中の細胞である前腫瘍細胞も包含する。非腫瘍性細胞増殖から新形成への移行は、一般に、過形成、化生、および形成異常からなる（このような異常増殖状態について詳しくは、RobbinsおよびAngell, 1976, Basic Pathology, 第2版、W.B. Saunders Co., フィラデルフィア、pp.68-79を参照されたい）。癌（その細胞を本発明で用いることができる）の非制限的一覧を以下の第４．５．１節に記載する。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、病原体または感染因子に感染したあらゆる細胞、すなわち、感染細胞を抗原ペプチド作製のための抗原細胞として用いることができる。特に、細胞内病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物もしくは原生動物に感染した細胞が好ましい。本発明で用いることができる細胞に感染しうる感染因子の例を挙げた一覧を第４．５．２節に記載する。
【００４１】
さらに別の実施形態では、感染症を引き起こしうるあらゆる病原体または感染因子を抗原ペプチド作製のための抗原細胞として用いることができる。同じ目的の抗原細胞として、病原体または感染因子の変異体、例えば、限定するものではないが、複製能欠損変異体、非病原性または弱毒化変異体、非感染性変異体を用いることもできる。例えば、in vitroで培養したり、感染した材料から単離したりすることができる多種のウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物を抗原細胞の供給源として用いてもよい。このような病原体（ウイルス粒子を含む）を増殖させるための、当分野で周知の方法を用いることができる。抗原細胞として用いることができる病原体または感染因子の例を挙げた一覧を第４．５．２節に記載する。
【００４２】
癌組織、癌細胞、もしくは感染細胞に由来する細胞系を抗原細胞として用いることもできる。ヒト由来の癌または感染組織、細胞、もしくは細胞系が好ましい。癌細胞、感染細胞、もしくは抗原細胞は、当分野で周知のあらゆる方法を用いて確認および単離することができる。例えば、癌細胞または感染細胞は、形態学、酵素アッセイ、増殖アッセイ、もしくは病原体または癌の原因となるウイルスの存在により確認することができる。目的とする抗原の特性がわかっていれば、当分野で周知のあらゆる生化学的または免疫学的方法により抗原細胞を同定または単離することができる。例えば、癌細胞または感染細胞は、外科手術、内視鏡、その他の生検法、体液（血液など）からの単離、アフィニティークロマトグラフィー、および蛍光細胞分析分離（例えば、細胞による抗原発現に対する蛍光標識抗体を用いて）により単離することができる。類似の抗原性を展示する抗原細胞は、被検者において免疫応答が求められる（例えば、治療または予防の目的で）１種以上の抗原決定基を共通に有する。
【００４３】
被検者から取得した抗原細胞の数が不十分な場合には、細胞をin vitroで培養することにより、本発明の方法で用いる前に細胞の数を増加することができる。抗原細胞のクローンまたは均質な、もしくは精製した集団を用いるという要件はない。混合物中の十分な数の細胞に目的の抗原決定基または抗原が含まれていれば、細胞の混合物を用いてもよい。具体的実施形態では、抗原細胞および／または免疫細胞を精製する。
【００４４】
病原体に感染した細胞を作製するためには、病原体または疾患の原因となる感染因子に感染しやすい細胞型の非感染細胞をin vitroで感染させることができる。病原体または感染因子の透過様式および生物学に応じ、標準的方法を用いて、病原体または感染因子による感染、ならびに、感染細胞の増殖を促進することができる。例えば、インフルエンザウイルスを用いて正常なヒト線維芽細胞を感染させたり；マイコバクテリアを用いて正常なヒトシュワン細胞を感染させたりすることができる。様々な実施形態では、感染因子の変異体、例えば、複製能欠損ウイルス、非病原性または弱毒化変異体、もしくは温度感受性変異体を用いて、細胞を感染または形質転換させることにより、抗原ペプチド作製のための抗原細胞を製造することができる。細胞を感染させるのに多数の病原体が必要である、または病原体を抗原細胞として直接用いる場合には、当分野で周知のあらゆる方法を用いて、病原体を増殖することができる。このような方法は、病原体によって異なり、宿主を感染させる必要がないものもある。例えば、当分野では、病原性細菌、真菌およびその他の非ウイルス微生物を培養して増殖させる多数の方法（ラージスケール発酵を含む）が知られている。
【００４５】
あるいは、腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原）または病原体の抗原をコードする遺伝子が入手可能な場合には、意図する受容者からの適切な細胞型の正常細胞を、このような抗原をコードする核酸分子を含む発現構築物で、in vitroで形質転換またはトランスフェクションすることにより、上記抗原を受容者の細胞において発現させることもできる。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、正常細胞より腫瘍細胞において高レベルで発現する抗原であり、腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞においてのみ発現し、正常細胞では発現しない抗原である。随意に、１種以上のこのような抗原を上記の方法で受容者の細胞に発現させてもよく、当業者には理解されるように、Ausubelら（1989, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience）が記載しているような方法などの周知の方法を用いて、受容者の細胞において抗原遺伝子の形質転換またはトランスフェクション、ならびにこれに続く組換え発現を実施することができる。
【００４６】
このような細胞に発現させることができる好適なタンパク質およびペプチドとして、限定するものではないが、癌細胞の抗原性を展示するものが挙げられる。例えば、このような腫瘍特異的または腫瘍関連抗原を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない：KS 1/4  汎癌抗原（PerezおよびWalker, 1990, Immunol. 142:3662-3667；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）；卵巣癌抗原（CA125）（Yuら、1991, Cancer Res. 51(2):468-475）；前立腺酸性リン酸（Tailerら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928）；前立腺特異的抗原（HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910；Israeliら、1993, Cancer Res. 53:227-230）；黒色腫関連抗原p97（Estinら、1989, J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446）；黒色腫抗原gp75（Vijayasardahlら、1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）；高分子量黒色腫抗原（Nataliら、1987, Cancer 59:55-63）、前立腺特異的膜抗原、チロシナーゼ、gp100、メラン-A、およびムチン。HSP／α2Mと複合体化することのできるその他の外因性抗原としては以下のものが挙げられる：癌細胞において高い頻度で突然変異する部分またはタンパク質、例えば、癌遺伝子（例：ras、特に、４つのアミノ酸残基（12、13、59もしくは61）にしか起こらない突然変異を活性化するrasの突然変異体（Gedde-Dahlら、1994, Eur, J. Immunol. 24(2):410-414））および腫瘍抑制遺伝子（例：p53；これについては、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激することができる多様な突然変異体または多型p53ペプチド抗原が確認されている（Gnjaticら、1995, Eur, J. Immunol. 25(6):1638-1642））。
【００４７】
ウイルス性疾患を治療または予防することが求められる場合には、既知ウイルスのエピトープを含む好適なタンパク質およびペプチドを適切な細胞において発現させるのが好ましい。例えば、このような抗原決定基は以下に挙げるウイルスに由来するが、これらに限定されるわけではない：Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（HSV-I）、単純ヘルペス２型（HSV-II）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、RSウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、フンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、痘瘡ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-I）、およびヒト免疫不全ウイルス２型（HIV-II）。
【００４８】
好ましくは、細菌感染を治療または予防することが求められる場合には、既知細菌の抗原決定基を含む好適なタンパク質およびペプチドを適切な細胞において発現させることができる。例えば、このような抗原決定基は、以下に挙げる様々な細菌に由来するものでよいが、これらに限定されるわけではない：グラム陽性桿菌（例：リステリア、炭疽菌のようなバチルス属、エリシペロスリックス属種）、グラム陰性桿菌（例：バルトネラ、ブルセラ、キャンピロバクター、エンテロバクター、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、クレブシエラ、モルガネラ、プロテウス菌、プロビデンシア、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、ビブリオ、およびエルシニア属種）、スピロヘータ菌（例：ライム病を引き起こす放線菌などのボレリア種、およびレプスピラ）、嫌気性細菌（例：放線菌、ならびに、破傷風菌、ボツリヌス菌およびウェルチ菌などのクロストリジウム属）、グラム陽性および陰性球菌、連鎖球菌属種、肺炎球菌属種、ブドウ球菌属種（例：黄色ブドウ球菌、肺炎ブドウ球菌）、ナイセリア属種（例：髄膜炎菌）。
【００４９】
真菌感染を治療または予防することが求められる場合には、既知真菌のエピトープを含む好適なタンパク質およびペプチドを適切な細胞において発現させるのが好ましい。例えば、このような抗原決定基は、以下に挙げる様々な真菌に由来するものでよい：アスペルギルス属（例：煙色コウジ菌）、クリプトコッカス属（例：クリプトコッカス・ネオホルマンス）、スポロトリクス属、コクシジオイデス属、パラコクシジオイデス属、ヒストプラプラズマ属、ブラストミセス属、カンジダ属（例：カンジダアルビカンス）、リゾプス属、リゾムコール属、アブシディア属およびバシディオボールス属。
【００５０】
寄生生物感染を治療または予防することが求められる場合には、既知原生動物、線虫、もしくは蠕虫のエピトープを含む好適なタンパク質およびペプチドを適切な細胞において発現させるのが好ましい。例えば、このような抗原決定基は、以下に挙げる様々な原生動物に由来するものでよいが、これらに限定されるわけではない：エントアメーバ属、プラズモジウム属、リーシュマニア属、アイメリア科、クリプトスポジウム属、ジアルア属、トキソプラスマ属、およびトリパノソーマ属の種。
【００５１】
４．２．抗原タンパク質およびペプチドの作製
本発明によれば、本発明の組成物は、HSPと複合体化した抗原タンパク質を含み、その際、この抗原タンパク質は、目的とする抗原細胞のタンパク質の調製物から得たものである。本発明の組成物はまた、α2Mと複合体化した抗原タンパク質を含み、その際、この抗原タンパク質は、目的とする抗原細胞のタンパク質の調製物から得たものである。さらには、本発明の組成物は、HSPと抗原ペプチドの複合体、またはα2Mと抗原ペプチドの複合体を含み、この複合体は、まず、目的とする抗原細胞のタンパク質の調製物からペプチドの集団を作製した後、該ペプチドをHSPまたはα2Mと複合体化することにより製造される。
【００５２】
様々な実施形態では、抗原タンパク質およびペプチドの多様性を最大限にすると同時に、それを保存するために、抗原細胞のタンパク質調製物を調製するのに用いる方法では、抗原細胞中の他のタンパク質およびペプチドから特定のタンパク質またはペプチドを選択的に除去または保持することは一切ない。さらに、細胞質ゾルタンパク質または膜由来タンパク質を用いる特定の実施形態では、前記調製物を調製するのに用いる方法は、細胞質ゾルまたは膜由来の特定のタンパク質を選択的に除去または保持することは一切ない。従って、細胞質ゾルまたは膜に存在するタンパク質の大部分は、抗原細胞からの抗原タンパク質およびペプチドのそれぞれの調製物にも存在する。好ましい実施形態では、抗原細胞の実質的に全レパトアの抗原タンパク質およびペプチド、ならびに、細胞質ゾルまたは膜に存在する実質的にすべての抗原タンパク質およびペプチドが複合体化反応物中に存在し、HSPおよび／またはα2Mとの複合体を形成する。
【００５３】
４．２．１．抗原細胞のタンパク質調製物
本発明の一実施形態では、癌細胞、感染細胞、もしくは、病原体に由来するタンパク質調製物を提供する。例えば、癌の治療のためには、タンパク質調製物は、癌患者から得た腫瘍細胞から、手術後調製する。本発明の別の実施形態では、目的とする１種以上の抗原タンパク質を組換え発現系の導入により改変した細胞系において合成し、このような細胞を用いて、タンパク質を調製する。タンパク質は、１種以上の細胞画分、例えば、抗原細胞の細胞質から取得するか、あるいは、抗原細胞の膜または細胞壁から抽出もしくは可溶化することができる。細胞溶解、細胞内容物の分画、およびタンパク質濃縮または単離のための当分野で周知のどの方法を用いてもよい。例えば、Current Protocols in Immunology、第2巻、第8章、Coliganら（編）、John & Sons, Inc.；Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual by Rowlandら、Little Brown & Co., 1994年6月（これらの文献はその全文を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。細胞内容物を分画するのに用いる方法に応じて、細胞画分は、少なくとも20、50、100、500、1,000、5,000、10,000もしくは20,000種の異なるタンパク質を含む。
【００５４】
本明細書で用いる「タンパク質調製物」という用語は、抗原細胞、抗原細胞の細胞画分、もしくはウイルス粒子から取得したタンパク質の混合物を意味する。タンパク質は、細胞質ゾルのような細胞画分から得ることができる。タンパク質はまた、非細胞質ゾルタンパク質（例えば、細胞壁、細胞膜または細胞小器官）でも、両方でもよい。細胞画分としては、限定するものではないが、細胞質ゾル画分、膜画分、ならびに細胞小器官画分（例えば、核、ミトコンドリア、リソソーム、および小胞体由来の画分）が挙げられる。タンパク質調製物は、非組換えまたは組換え細胞のいずれからも取得することができる。また、本明細書で用いる「抗原タンパク質」という用語は、上記調製物に存在しうる抗原ポリペプチドおよび抗原ペプチドも包含する。抗原細胞またはその細胞画分、もしくはウイルス粒子から取得したタンパク質調製物は、随意に、当分野では周知の方法により様々な程度まで他の非タンパク質性材料から精製することができる。タンパク質調製物は、抗原細胞またはウイルス粒子もしくは抗原細胞の細胞画分に存在する様々なタンパク質およびペプチドの50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％を含むことができる。
【００５５】
特定の実施形態では、抗原細胞中の他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持する調製方法に前記タンパク質調製物を供していない。
【００５６】
特定の実施形態では、タンパク質調製物は、分画および／または精製されていない全細胞溶解物であり、これは、該細胞の他の非タンパク質性材料を含んでいる可能性がある。
【００５７】
別の特定の実施形態では、タンパク質調製物は、さらなる分画または精製に供していない細胞画分中の全タンパク質であり、これは、該細胞の他の非タンパク質性材料を含んでいる可能性がある。
【００５８】
さらに別の実施形態では、タンパク質調製物は、ウイルス粒子の調製物中の全タンパク質である。
【００５９】
特定の実施形態では、タンパク質調製物は、抗原細胞の全細胞タンパク質、全細胞質ゾルタンパク質、もしくは全膜結合タンパク質を含む。
【００６０】
様々な実施形態では、タンパク質調製物は、少なくとも20、50、100、500、1,000、5,000、10,000もしくは20,000種の異なるタンパク質を含む。抗原細胞のタンパク質調製物には、複数の異なる抗原タンパク質が存在する。さらに、HSPまたはα2Mとのin vitroでの複合体化の前に、タンパク質調製物中のタンパク質をプロテアーゼ消化のステップに供してもよい。あるいは、HSPまたはα2Mとのin vitroでの複合体化の前に、タンパク質調製物中のタンパク質をプロテアーゼ消化のステップに供さない。
【００６１】
抗原細胞またはウイルス粒子のタンパク質調製物を調製するために、当分野で周知の標準的プロトコルを用いて、抗原細胞の溶解、または細胞壁、細胞膜もしくはウイルス粒子構造の破壊を実施することができる。様々な実施形態では、例えば、機械的せん断、超音波処理、凍結解凍、細胞周囲の媒質の重量オスモル濃度の調節、もしくはこれら方法の組合せにより、抗原細胞を溶解させることができる。あまり好ましくない実施形態では、化学薬品、例えば、界面活性剤により抗原細胞を溶解させる。
【００６２】
いったん細胞が溶解したら、細胞破片、非タンパク質性の材料、もしくは細胞質ゾルおよび／または膜由来タンパク質を含まない材料（細胞小器官の膜中のタンパク質を含む）を除去するのが望ましい。これらの成分の除去は、低速遠心分離またはろ過などの方法により達成することができる。細胞破片およびインタクトな細胞を除去した後、高速遠心分離ステップを用いて、上清中の細胞質タンパク質を分離し、膜由来タンパク質はペレットに回収する。当分野で一般に知られる標準的な手順により、ペレットから膜由来タンパク質をさらに単離することができる。当分野で一般に知られる標準的な方法を用いて、ウイルス粒子からウイルスタンパク質を抽出することができる。これらの分離方法は、細胞質ゾルまたは膜中の抗原細胞に存在する分子の全体サイズ、密度および／または電荷に基づいて実施する。これらの分離方法は、他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持するようには設計されていない。
【００６３】
様々な実施形態では、随意に、抗原細胞からのタンパク質は、それら全般の生化学的および／または生物物理学的特性、例えば、サイズ、密度、電荷、細胞位置もしくはこれらの組合せにより分離してもよい。少なくとも20、50、100、500、1,000、5,000、10,000もしくは20,000種の異なるタンパク質を含む、あるいは、抗原細胞またはその細胞画分、もしくはウイルス粒子に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％を含むタンパク質／ペプチドの選択した画分を用いて、HSPまたはα2Mとの複合体を形成することができる。従って、抗原細胞からのタンパク質は、そのサイズ、電荷、細胞位置もしくはこれらの組合せにより分子を分離し、かつ細胞質ゾルまたは膜中の抗原細胞に存在する他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持することが一切ない方法によって調製することができる。
【００６４】
細胞質ゾルタンパク質を含むタンパク質調製物を調製するのに用いることができる方法の非制限的一例を以下に示す：
細胞（患者の生検から得た腫瘍細胞またはin vitroで培養した腫瘍細胞、もしくは病原因子に感染した細胞のいずれでもよい）を30 mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、1mM PMSFを含む1X溶解（Lysis）バッファー３容量中に懸濁させ、氷上で20分インキュベートした後、低浸透圧により膨潤した細胞をダウンス（dounce）ホモジナイザーで、＞95％の細胞が溶解するまで均質化させる。せん断に代わり、＞99％の細胞が溶解するまで細胞を超音波処理することもできる。その際、溶解は顕微鏡検査により決定する。超音波処理を用いる場合には、リン酸緩衝食塩水（PBS）（１mM PMSFを含んでもよい）のようなバッファー中に細胞を懸濁させてから、超音波処理する。
【００６５】
溶解物を1,000 x gで10分遠心分離することにより、インタクトな細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。得られた上清を約100,000 x gでさらに約１時間遠心分離した後、上清を回収する。100,000 x gの上清をPBSまたはその他の好適なバッファーに対して４℃で36時間透析（３回、各回とも100倍容量）することにより、本発明の可溶性細胞質タンパク質が得られる。必要であれば、調製物中の不溶性材料をろ過または低速遠心分離により除去することができる。
【００６６】
膜由来タンパク質を含むタンパク質調製物を調製するのに用いることができる方法の非制限的一例を以下に示す：
細胞（患者の生検から得た腫瘍細胞またはin vitroで培養した腫瘍細胞、もしくは病原因子に感染した細胞のいずれでもよい）を30 mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、1mM PMSFを含む1X溶解（Lysis）バッファー３容量中に懸濁させ、氷上で20分インキュベートした後、低浸透圧により膨潤した細胞をダウンス（dounce）ホモジナイザーで＞95％の細胞が溶解するまで均質化させる。せん断に代わり、＞99％の細胞が溶解するまで細胞を超音波処理することもできる。その際、溶解は顕微鏡検査により決定する。超音波処理を用いる場合には、１mM PMSFを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）のようなバッファー中に細胞を懸濁させてから、超音波処理する。
【００６７】
溶解物を100,000 x gで10分遠心分離することにより、細胞膜を回収する。１％デオキシコール酸ナトリウム（Ca2+およびMg2+は含まない）を含む５容量のPBS中にペレットを再懸濁させた後、氷上で１時間インキュベートすることにより、膜由来タンパク質を脂質二層から取り出し、100,000ｇペレット（膜由来タンパク質が存在する）から単離することができる。得られた懸濁液を20,000 x gで30分遠心分離した後、得られた上清を回収し、何度か取り替えるPBS（Ca2+およびMg2+は含まない）に対して透析することにより、デタージェントを除去する。得られた透析物を100,000 x gで90分遠心分離した後、上清をさらに精製する。カルシウムとマグネシムの両方を上清に添加することにより、最終濃度を２mMとする。必要であれば、ろ過または低速遠心分離により、調製物中の不溶性材料を除去することができる。
【００６８】
特定の実施形態では、抗原細胞から得た細胞質および／または膜由来タンパク質の集団を、プロテアーゼ処理もしくはさらなる抽出または選択工程なしに、HSPまたはα2Mと直接複合体化させることができる。あるいは、タンパク質をプロテアーゼ処理に供した後、複合体化してもよい。
【００６９】
４．２．２  抗原細胞からのペプチド
本発明によれば、抗原細胞から得た細胞質ゾルおよび膜由来タンパク質を随意に消化することにより、抗原ペプチドを作製することができる。一実施形態では、細胞質ゾルまたは膜由来タンパク質のいずれかを消化に用いる。別の実施形態では、消化反応において、細胞質ゾルおよび膜由来タンパク質を組み合わせることにより、抗原ペプチドを作製する。好ましい実施形態では、プロテアーゼ処理に用いるタンパク質調製物は、抗原細胞、もしくは抗原細胞の細胞質ゾルまたは膜に存在する他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持するいずれの作製方法にも、上記タンパク質調製物を供していない。
【００７０】
本発明では、多様なプロテアーゼまたはタンパク質分解酵素を用いて、抗原細胞のタンパク質調製物から、抗原ペプチドを含むペプチドの集団を製造することができる。酵素消化は、個別に、もしくは当分野でよく知られるタンパク質分解酵素のいずれかと好適に組み合わせて実施することができ、このような酵素として、限定するものではないが、トリプリン、ブドウ球菌ペプチターゼＩ（プロテアーゼV8としても知られる）、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＧ、サーモリシン、エラスターゼ、およびパパインが挙げられる。トリプシンは、リシンおよびアルギニンのカルボキシル末端側で切断する高度に特異的なセリンプロテイナーゼである。切断部位の数が限定されるため、多くのMHC結合エピトープがインタクトなまま残ると予想される。１種のセリンプロテイナーゼであるブドウ球菌ペプチターゼＩは、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基の後の切断に対して特異性を有する。単一プロテアーゼまたはプロテアーゼの混合物を用いて、消化を実施することができる。用いるプロテアーゼまたはタンパク質分解酵素は、当該酵素に適した条件下でインキュベートする。酵素を精製するのが好ましい。臭化シアン切断のような非酵素方法をペプチド作製に用いることもできる。消化しようとするタンパク質調製物を等分して、各々が異なる酵素を用いた複数の反応物に導入し、随意に、得られたペプチドを一緒にプールして用いてもよい。酵素反応物中でタンパク質を完全に消化する必要はない。これらの反応物から、タンパク質調製物に存在する各タンパク質のペプチドの多様かつ異なるセットが得られる。異なるペプチドセットを製造することにより、HSPまたはα2Mと複合体化したとき、タンパク質調製物中の抗原に対し免疫応答を誘発する能力のある抗原ペプチドを作製できる可能性がさらに大きくなる。好ましい実施形態では、消化しようとするタンパク質調製物を等分して、２つの別々の反応物に導入し、２つの異なるタンパク質分解酵素を用いて、タンパク質調製物に存在するタンパク質のペプチドの２つの異なるセットを製造する。タンパク質、酵素および反応条件によっては、未消化タンパク質が反応物中に残っていることもある。好ましい実施形態では、トリプシンとブドウ球菌ペプチダーゼＩを別々に用いて、タンパク質調製物を消化する。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、本発明で用いるタンパク質分解酵素は、プロテアソームで認められるタンパク質分解活性と同様の活性を発揮する。プロテアソームは、細胞内でミスフォールディングまたは損傷した細胞質ゾルおよび核タンパク質のリソソーム外のエンド型触媒分解を引き起こす。プロテアソームは、タンパク質を完全に分解して、単一アミノ酸にし、最適な主要組織適合性複合体クラスＩ（MHC I）−結合エピトープを生成すると共に、より長いペプチド前駆体を生成することができ、これは、細胞内の別の箇所でさらにトリミングを受け、細胞傷害性T細胞エピトープをもたらしうる。プロテアソームの切断が優先されるのは、塩基性、酸性および疎水性アミノ酸のカルボキシル（COOH）末端である。プロテアソームに存在することが知られる３つのタンパク質分解酵素活性は、キモトリプシン様活性、トリプシン様活性、ならびにペプチジルグルタミルペプチド−加水分解活性である（UebelおよびTampe, 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:2 203-208）。このように、上記の活性および特異性を有する酵素を個別または組み合わせて用いることにより、タンパク質調製物を消化することができる。好ましい実施形態では、トリプシン、キモトリプシン、および／またはペプチジルグルタミルペプチド−ヒドロラーゼを用いる。
【００７２】
こうして得られるペプチド消化物は、抗原ペプチド、非抗原ペプチド、ならびに単一アミノ酸残基を含む。この反応物はまた、未消化、または完全に消化されていない抗原タンパク質も含むことがある。本発明のタンパク質分解酵素による消化をモニタリングすることにより、望ましい長さの範囲内にあるペプチドを作製する。好ましい実施形態では、作製したペプチドは、約７〜約20アミノ酸残基である。MHCクラスＩおよびクラスIIによりT細胞に提示されるほとんどの抗原ペプチドがこの範囲に入る。様々な実施形態では、ペプチドの集団は、６〜21、８〜19、10〜20、または少なくとも７、８、９、10、11、12、15、20、25、30、40、45、もしくは50アミノ酸残基を有するペプチドを含む。好ましい実施形態では、抗原ペプチドは、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20アミノ酸残基を有する。タンパク質消化の進行をモニタリングするために、試験反応を実施する。その際、タンパク質消化物の小さなアリコートを反応物から取り出し、トリシン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「トリシン−PAGE」）、高性能液体クロマトグラフィー（「HPCL」）、もしくは質量分析法、あるいは、ペプチドのサイズを決定するのに当分野では周知の他の方法のいずれかにより、上記アリコートを消化の進行についてモニタリングする。このような試験反応を用いて、いつ特定のサイズ範囲のペプチド断片が特定の酵素濃度で作製されるかについて決定することができる。これ以外に、操作可能な反応の変数として、反応物中のタンパク質の量、温度、インキュベーションの長さ、補因子の存在などがある。
【００７３】
１種類の抗原細胞から特定サイズ範囲のペプチド断片を作製するための適正な条件を確立したら、酵素反応条件を繰り返すことにより、抗原ペプチドを作製して、これらをプールすることができる。酵素による消化を停止後、ペプチドをHSPまたはα2Mと複合体させるのが好ましい。本発明の一実施形態では、阻害剤を用いて、酵素消化を停止させることができる。本発明で用いることができる酵素阻害剤として、限定するものではないが、タンパク質消化にどの酵素を用いるかによって、PMSF、ベスタチン、アマスタチン、ロイペプチン、およびシスタチンがある。これに代わり、酵素消化を停止する別の方法として、反応物からの酵素の物理的除去がある。これは、選択した酵素を固相に結合させることにより実施するが、このような固相は、例えば、樹脂、または遠心分離やろ過のような周知の方法で反応物から容易に除去することができる材料である。タンパク質調製物を一定時間固相と接触させるか、固相上を流す。このような固定化酵素は、市販のものを購入するか、当分野で周知の酵素固定方法により製造することができる。
【００７４】
消化反応の終了時に、調製物中の低分子量材料、例えば、ジペプチド、または単一アミノ酸残基からペプチドを随意に分離することができる。例えば、Centriprep-3のような膜からの遠心分離により、ペプチドを単離することができる。随意に、ペプチドは、その一般的な生化学的および／または生物物理学的特性、例えば、サイズ、電荷、もしくはこれらの組合せにより分離することも可能である。当分野で周知のいずれかの方法を用いて、分離を実施し、これにより、少なくとも50、100、500、1,000、5,000、10,000、20,000、50,000、もしくは100,000種の異なるペプチドを含む消化済タンパク質調製物を得ることができる。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、本発明において、抗原細胞に内因的に存在するペプチドを単独で、もしくは細胞質ゾルおよび膜由来タンパク質のタンパク質分解消化により作製したペプチドと組み合わせて用いることができる。抗原細胞に内因的に存在するペプチドには、HSPおよび／またはMHCクラスＩおよびII分子とin vivoで複合体化したペプチドも含まれる。本発明によれば、抗原細胞のタンパク質調製物から直接単離したこのようなペプチドをHSPおよび／またはα2Mと複合体化させることができる。
【００７６】
具体的実施形態では、細胞質ゾルまたは膜由来タンパク質のいずれかを単離工程で用いる。別の具体的実施形態では、単離工程において、細胞質ゾルまたは膜由来タンパク質を組み合わせて用いる。好ましい実施形態では、単離に用いるタンパク質調製物は、抗原細胞、もしくは抗原細胞の細胞質ゾルまたは膜に存在する他のタンパク質から１種以上の特定のタンパク質を選択的に除去または保持するいずれの調製方法にも供されていないものである。最初に抗原ペプチドとHSP、α2Mまたは主要組織適合性複合体（MHC）分子との複合体を単離することなく、細胞のタンパク質調製から抗原ペプチドを直接単離する。好ましくは、タンパク質調製物は、少なくとも20、50、100、500、1,000、5,000、10,000、もしくは20,000種の異なるタンパク質を含む、あるいは、抗原細胞またはその細胞画分、もしくはウイルス粒子に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％を含む。
【００７７】
様々な実施形態では、この方法は、ATP、塩酸グアニジウムでタンパク質調製物を処理し、および／または、タンパク質調製物におけるHSP、α2MおよびMHCクラスIおよびII分子のようなタンパク質と結合している抗原ペプチドを溶離できるような酸性条件下に、タンパク質調製物を暴露することを含む。単離工程は、ATP、塩酸グアニジウム、もしくは酸性条件での処理の前に、タンパク質調製物のためのHSP複合体、α2M複合体、もしくはMHC複合体を精製することは含んでいない。限定するものではないが、トリフルオロ酢酸など、多様な酸を用いることができる。HSP−ペプチド複合体からペプチドを単離する方法は当分野では周知であり、例えば、Menoretら、1999、Biochem. Biophys. Res. Commun. 262(3):813-8（参照としてその全文を本明細書に組み込む）がある。タンパク質凝集体を解離するのに当分野で周知の方法、例えば、MarstonおよびHartley（1990, Meth. Enzymol. 182:264-276）も用いることができる。
【００７８】
特に、単離工程は、抗原細胞のタンパク質調製物をATPに例えば、室温で１時間暴露し、および／または0.05％〜１％TFAの範囲にある濃度でトリフルオロ酢酸（TFA）で抗原細胞のタンパク質調製物を処理することを含む。この処理は、好ましくは、0.1％TFAの存在下でタンパク質調製物を超音波処理することを含む。最も好ましい実施形態では、タンパク質調製物をまずATPに暴露した後、0.1％TFA中での超音波処理を実施する。本発明では、細胞溶解および単離工程の前に、様々なプロテアーゼ阻害剤を用いることにより、HSPまたはα2Mと内在的に結合していないペプチドを産生しうる細胞タンパク質の切断を防止もしくは低減することができる。例えば、以下に挙げる14種のプロテアーゼ阻害剤の混合物を用いることができる：フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）２mM、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）１mM、エチレングリコールビス（P-アミノエチルエーテル）N,N,N’,N’-四酢酸（EGTA）１mM（すべて、Sigma、セントルイス、MOから入手した）、ならびに、アンチパイン20 mg／ml、ベスタチン５mg／ml、ケモスタチン20 ptg／nil、E64 20 Jig／ml、ロイペプチン１ttg／ml、ペプスタチン１gg／ml、ペファブロク40Ag／ml、およびアポプロテイン10tkg／ml（すべて、Boehringer Mannheim、インディアナポリス、INから入手した）。タンパク質調製物から得られたペプチドは、少なくとも７、８、９、10、11、12、15、20、25、30、40、45、もしくは50アミノ酸残基の範囲にある様々なサイズの抗原ペプチドおよび非抗原ペプチドを有する。工程の終了時に、調製物中のタンパク質から分離することによりペプチドを回収した後、HSPまたはα2Mと複合体化させるのが好ましい。例えば、ペプチドは、以下の方法により回収することができる：Centriprep-3のような膜を介した遠心分離；減圧下での乾燥；もしくは、逆相クロマトグラフィー、例えば、水中の0.1％TFAで平衡させ、アセトニトリルによる溶離を用いたBioCad20微量分析HPLC Poros RH2カラム（Perseptive Biosystems、ケンブリッジ、MA）における分画。従って、抗原細胞中に内在的に存在し、タンパク質調製物から直接単離される抗原ペプチドをHSPおよび／またはα2Mと複合体化させることができる。あるいは、抗原細胞中に内因的に存在するペプチドと、消化済細胞質および膜由来タンパク質からのペプチドを含むペプチドの混合集団をHSPおよび／またはα2Mと複合体化させてもよい。
【００７９】
４．３．HSPおよびα2Mの作製
本発明によれば、抗原細胞に由来する抗原ペプチドをHSPおよび／またはα2Mと複合体化させる。本明細書には、本発明で用いるHSPおよびα2Mを単離および作製するのに用いることができる方法の例を記載する。
【００８０】
本発明の実施に有用な熱ショックタンパク質（本明細書では、置き換え可能に、ストレスタンパク質とも呼ばれる）は、以下の基準を満たすすべての細胞タンパク質の中から選択することができる。すなわち、細胞をストレスの多い刺激に暴露すると細胞内濃度が増加するタンパク質、他のタンパク質またはペプチドと結合することができ、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下で結合タンパク質またはペプチドを放出することができるタンパク質である。さらには、前記特性を有するいずれかの細胞タンパク質と少なくとも35％の相同性を示すタンパク質である。
【００８１】
確認しようとした最初のストレスタンパク質は熱ショックタンパク質（HSP）であった。その名称が意味するように、HSPは、熱ショックに応答する細胞により合成される。現在まで、ファミリーメンバーの分子量に基づき、５つの主要クラスのHSPが確認されている。これらのクラスは、sHSP（小熱ショックタンパク質）、HSP60、HSP70、HSP90、およびHSP100と呼ばれ、それぞれの数字は、HSPの近似分子量をキロダルトンで示している。主要HSPファミリーに加えて、小胞体に常在するタンパク質であるカルレティキュリンも、抗原分子と複合体化した場合、免疫応答を誘発するのに有用なさらに別の熱ショックタンパク質として確認されている（BasuおよびSrivastava, 1999, J, Exp. Med. 189:797-202）。本発明で用いることができる他のストレスタンパク質として、限定するものではないが、grp78（またはBiP）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、HSP110、およびgrp170（Linら、1993, Mol. Biol. Cell, 4:1109-119；Wangら、2001, J. Immunol., 165:490-497）が挙げられる。これらファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激（限定するものではないが、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、酸素圧低下、および細胞内病原体への感染）に応答して誘発されることが後にわかった。（Welch, May 1993, Scientific American 56-64；Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420；Craig, 1993, Science 260:1902-1903；Gethingら、1992, Nature 355:33-45；ならびにLindquistら、1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677を参照；これらの開示内容は、本明細書に参照として組み込む）。これらファミリーのすべてに属するHSP／ストレスタンパク質を本発明の実施に使用できると考えられる。
【００８２】
主要HSPは、ストレスを受けた細胞中に非常に高レベルまで蓄積しうるが、ストレスを受けていない細胞においては低〜中レベルまでしか蓄積しない。例えば、高度に誘発可能な哺乳動物HSP70は、通常の温度ではほとんど検出できないが、熱ショック時には、細胞中に最も活発に合成されるタンパク質の１つとなる（Welchら、1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211）。対照的に、HSP90とHSP60タンパク質は、すべてではないが大部分の哺乳動物細胞において正常温度で豊富であり、熱によりさらに誘導される（Laiら、1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-10；van Bergen en Henegouwenら、1987, Genens Dev. 1:525-31）。
【００８３】
熱ショックタンパク質は、存在する最も高度に保存されたタンパク質に含まれる。例えば、DnaK、すなわち、大腸菌由来のHSP70は、擦創からのHSP70タンパク質と約50％のアミノ酸配列同一性を有する（Bardwellら、Procl Natl. Acad. Sci. 81:848-852）。HSP60とHSP90ファミリーもまた、同様に高レベルのファミリー内保存を示す（Hickeyら、1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626；Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283）。加えて、HSP60、HSP70、およびHSP90ファミリーは、配列内にストレスタンパク質に関する、例えば、35％以上のアミノ酸同一性を有するタンパク質から構成されているが、そのタンパク質の発現レベルはストレスによって改変されないことがみいだされている。従って、本明細書で用いる熱ショックタンパク質またはストレスタンパク質の定義には、細胞内の発現レベルがストレス刺激に応答して増強される前記３つのファミリーのメンバーと少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％、最も好ましくは75％〜85％アミノ酸同一性を有する他のタンパク質、その突然変異タンパク質、類似体、および変異体も含まれるものとする。
【００８４】
HSP抗原ペプチド複合体のHSP部分を細胞から精製することが望まれる実施形態では、以下の第４．３．１〜第４．３．３節に記載するような精製手順例を用いて、HSP−ペプチド複合体を精製してから、ATPの存在下または酸性条件下で内在性HSP−ペプチド複合体からHSPを分離した後、抗原ペプチドの集団と複合体化させることができる。Pengら、1997, J. Immunol. Methods, 204:13-21；LiおよびSrivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151（それらの活性に関して参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。腫瘍細胞については記載されているが、以下に記載するプロトコルを用いて、あらゆる感染細胞、細胞内病原体に感染したあらゆる真核生物細胞、例えば、組織、単離された細胞、もしくは不死化真核生物細胞系、腫瘍細胞または腫瘍細胞系からHSPを単離することができる。
【００８５】
４．３．１．HSP70−ペプチド複合体の作製および精製
HSP70-ペプチド複合体は、以前記載されており、例えば、Udonoら、1993, J.Exp. Med. 178:1391-1396を参照されたい。限定するものではないが、例として示す手順を以下に記載する。
【００８６】
最初に、30 mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、１mM PMSFからなる1X溶解バッファー３容量中に腫瘍細胞を懸濁させる。次に、＞99％の細胞が溶解するまで、ペレットを超音波処理するが、この溶解は顕微鏡検査により決定する。超音波処理に代わり、ダウンス（Dounce）ホモジナイザーで、＞95％の細胞が溶解するまで細胞を均質化させることによって、機械的せん断により細胞を溶解させてもよい。
【００８７】
次に、溶解物を1,000 x gで10分遠心分離することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。得られた上清を約100,000gでさらに90分遠心分離した後、上清を回収し、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）で平衡させたCon A セファロース（Sepharose）と混合する。細胞を機械的せん断により溶解させる場合には、Con A セファロースと混合する前に、等容量の2X溶解バッファーで上清を希釈する。次に、上清をCon A セファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった材料を回収し、10 mMトリス酢酸 pH 7.5、0.1 mM EDTA、10 mM NaCl、1mM PMSFに対して36時間透析する（３回、各回とも100容量）。次に、透析物を17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分遠心分離した。こうして得られた上清を回収し、20 mMトリス酢酸（pH 7.5）、20 mM NaCl、0.1 mM EDTAおよび15 mM 2-メルカプトエタノール中で平衡させたMono Q FPLCカラムに載せる。次に、カラムを20 mMから500 mM NaCl勾配で展開させてから、溶離した画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分画した後、適切な抗HSP70抗体（例えば、クローンN27F3-4製、StressGen製）を用いて、イムノブロッティングすることにより特性決定する。
【００８８】
抗HSP70抗体と強度に免疫反応性の画分をプールし、HSP70−ペプチド複合体を硫酸アンモニウム（具体的には50％〜70％硫酸アンモニウム希釈液で）で沈殿させる。得られた沈殿物を17,000 rpmの遠心分離（Sorvallローター）により回収し、70％硫酸アンモニウムで洗浄する。洗浄した沈殿物を可溶化させ、残留する硫酸アンモニウムをSephadex（登録商標）G25カラム（Pharmacia）でのゲルろ過により除去する。必要であれば、このようにして得られたHSP70調製物を前記のようにMono Q FPLCカラムで再精製してもよい。
【００８９】
この方法により、HSP70−ペプチド複合体を見かけ均一性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から１mgのHSP70−ペプチド複合体を精製することができる。
【００９０】
HSP70の精製のために改善された方法は、固体支持体に付着させたATPまたは非加水分解性ATP類似体に、細胞タンパク質を接触させることにより、溶解物中のHSP70がATPまたは非加水分解性ATP類似体と結合するようにし、結合したHSP70を溶離する。好ましい方法では、固体支持体に付着させたATP（例えば、ATP−アガロース）によるカラムクロマトグラフィーを用いる。得られたHSP70調製物は純度が高く、ペプチドの汚染が全くない。HSP70の収率も約10倍以上有意に高くなる。
【００９１】
あるいは、ADPではなく、ADPの非加水分解性類似体によるクロマトグラフィーをHSP70−ペプチド複合体の精製に用いてもよい。限定するものではないが、一例として、ATP−アガロースクロマトグラフィーによる、ペプチドを含まないHSP70の精製は、以下のように実施することができる：
Meth A肉腫細胞（500×106個の細胞）を低張性バッファー中で均質化し、溶解物を４℃にて100,000gで90分遠心分離する。上清をATP−アガロースカラムにロードする。カラムをバッファーで洗浄し、５容量の３mM ATPで溶離する。HSP70は、溶離する合計15の画分のうち２〜10の画分中に溶出する。溶離した画分をSDS-PAGEにより分析する。この手順を用いて、HSP70を見かけ均一性まで精製することができる。
【００９２】
４．３．２．HSP90−ペプチド複合体の作製および精製
用いることのできる手順を非制限的に例として示すが、これを以下に記載する。
【００９３】
初めに、30 mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、１mM PMSFからなる1X溶解バッファー３容量中に腫瘍細胞を懸濁させる。次に、＞99％の細胞が溶解するまで、ペレットを超音波処理するが、この溶解は顕微鏡検査により決定する。超音波処理に代わり、ダウンスホモジナイザーで、＞95％の細胞が溶解するまで細胞を均質化させることによって、機械的せん断により細胞を溶解させてもよい。
【００９４】
次に、溶解物を1,000 x gで10分遠心分離することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。得られた上清を約100,000gでさらに90分遠心分離した後、上清を回収し、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSで平衡させたCon A セファロースと混合する。細胞を機械的せん断により溶解させる場合には、Con A セファロースと混合する前に、等容量の2X溶解バッファーで上清を希釈する。次に、上清をCon A セファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった材料を回収し、20 mMリン酸ナトリウム （pH 7.4）、１mM EDTA、250 mM NaClに対して36時間透析する（３回、各回とも100容量）。次に、透析物を17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分遠心分離した。こうして得られた上清を回収し、透析バッファーで平衡させたMono Q FPLCカラムにロードする。次に、200 mM〜600 mM NaClの塩勾配でタンパク質を溶離させる。
【００９５】
溶離した画分をSDS-PAGEで分画し、3G3のような抗HSP90抗体（Affinity Bioreagents）を用いて、イムノブロッティングすることにより、HSP90−ペプチド複合体を含む画分を確認する。この手順により、HSP90−ペプチド複合体を見かけ均一性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から150〜200μgのHSP90−ペプチド複合体を精製することができる。
【００９６】
４．３．３．GP96−ペプチド複合体の製造および精製
用いることのできる手順を非制限的に例として示すが、これを以下に記載する。
【００９７】
30 mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）と１mM PMSFからなるバッファー３容量中に腫瘍のペレットを再懸濁させ、この細胞を氷上で20分膨潤させる。次に、＞95％の細胞が溶解するまで、ダウンスホモジナイザー（ホモジナイザーの適切なクリアランスは各細胞型によって変動する）で、ペレットを均質化させる。
【００９８】
溶解物を1,000 x gで10分遠心分離することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。この遠心分離ステップから得られた上清を約100,000gでさらに90分遠心分離する。100,000ペレットまたは上清のいずれからでもgp96−ペプチド複合体を精製することができる。
【００９９】
上清から精製する場合には、上清を等容量の2X溶解バッファーで希釈し、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSで平衡させたCon A セファロースと上記上清を４℃で２〜３時間混合する。次に、スラリーをカラムにパックし、OD280がベースラインに下降するまで、スラリーを1X溶解バッファーで洗浄する。それから、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSに溶解させた10％α−メチルマンノシド（α-MM）の1/3カラム層容量でカラムを洗浄し、一枚のパラフィンでカラムをシールした後、37℃で15分インキュベートする。カラムを室温まで冷却し、カラムの底部からパラフィンを除去する。５カラム容量のα-MMバッファーをカラムに添加し、溶離液をSDS-PAGEにより分析する。典型的には、得られる材料は60〜95％純粋であるが、これは、用いた細胞型および組織：溶解バッファー比に応じて変動する。次に、５mMリン酸ナトリウム（pH 7）を含むバッファーで平衡させたMono Q FPLCカラム（Pharmacia）にサンプルをロードする。０〜１M NaCl勾配を有するカラムからタンパク質を溶離させると、gp96画分は400 mM〜550 mM NaClの間で溶離する。
【０１００】
しかし、この手順は、２つの追加ステップを単独または組み合わせて用いることにより改変し、見かけ上均質なgp96−ペプチド複合体を一貫して生産することも可能である。任意のステップの一方は、Con A精製ステップの前に硫酸アンモニウム沈殿を実施するものであり、他方は、Con A精製ステップ後で、しかもMono Q FPLCステップの前にDEAE-セファロース精製ステップを実施することを含む。
【０１０１】
例として以下に説明する第１の任意ステップでは、100,000ｇ遠心分離ステップから得られた上清に硫酸アンモニウムを添加して、最終濃度を50％硫酸アンモニウムにする。氷水のトレイ中に置いたビーカー内の溶液を穏やかに攪拌しながら、硫酸アンモニウムをゆっくりと添加する。溶液は、４℃で約1/2〜12時間攪拌し、得られた溶液を6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離する。このステップから得られる上清を除去し、硫酸アンモニウム溶液の添加により70％硫酸アンモニウム飽和物としてから、6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離する。このステップで得られたペレットを回収し、70％硫酸アンモニウムを含むPBS中に懸濁させることにより、ペレットをすすぐ。この混合物を6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離した後、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSにペレットを溶解させる。15,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で短時間遠心分離することにより、非溶解材料を除去する。次に、溶液をCon A セファロースと混合し、前述したのと同様の手順を実施する。
【０１０２】
例として以下に説明する第１の任意ステップでは、Con Aカラムから溶離した画分を含むgp96をプールし、透析により、もしくは好ましくは、Sephadex G25カラムでのバッファー交換により、5mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、300 mM NaClとバッファーを交換する。バッファー交換後、５mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、300 mM NaCl で事前に平衡させたDEAD-セファロースと溶液を混合する。タンパク質溶液とビーズを１時間穏やかに混合した後、カラムに注ぎ込んだ。次に、280 nmでの吸光度が基準線に降下するまで、５mM リン酸ナトリウムバッファー、pH 7、300 mM NaClでカラムを洗浄する。続いて、５容量の５mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、700 mM NaClを含むカラムから、結合したタンパク質を溶離させる。タンパク質を含む画分をプールし、５mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）で希釈することにより、塩濃度を175 mMまで下げる。こうして得られた材料を、５mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7）で平衡させたMono Q FPLCカラム（Pharmacia）に載せ、Mono Q FPLCカラム（Pharmacia）と結合したタンパク質を前述のように溶離させる。
【０１０３】
しかし、当業者であれば、通常の実験により、第２の任意ステップを精製プロトコルに組み込む利点を評価できることは理解されよう。加えて、任意ステップの各々を加える利点は、出発材料の供給源に左右されることも理解されよう。
【０１０４】
100,000ｇペレットからgp96画分を単離する場合には、１％デオキシコール酸ナトリウムまたは１％オキシチル(oxtyl)グルコピラノシドのいずれか（しかし、Mg2+およびCa2+は含まない）を含む５容量のPBSに懸濁させ、氷水上で１時間インキュベートする。懸濁液を20,000ｇで30分遠心分離し、得られた上清を、何度か取り替えるPBS（やはりMg2+およびCa2+は含まない）に対して透析することにより、界面活性剤を除去する。透析物を100,000ｇで90分遠心分離し、上清を回収した後、カルシウムとマグネシウムを上清に添加することにより、それぞれ２mMの最終濃度とする。次に、100,000ｇ上清からgp96−ペプチド複合体を単離する方法またはその改変された方法（前記参照）のいずれかにより、サンプルを精製する。
【０１０５】
この手順を用いて、gp96−ペプチド複合体を見かけ均一性まで精製することができる。１ｇの細胞／組織から約10〜20μgのgp96を単離することができる。
【０１０６】
４．３．４．α2Mの製造および精製
α2−マクログロブリンは、市販の供給源から購入するか、またはヒト血液からそれを精製することにより製造することができる。
【０１０７】
一般に、周知の方法により、哺乳動物の血清から回収および精製することができるが、このような方法として、硫酸アンモニウム沈殿、酸性抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１０８】
一実施形態では、アフィニティー精製方法を用いて、α2Mを血清から精製する。アフィニティークロマトグラフィーのようなタンパク質のクロマトグラフィー分画方法は、当分野ではよく知られている。簡単にいえば、アフィニティークロマトグラフィーは、固定化した結合パートナーを用いて、結合反応物中のタンパク質を特異的に捕獲する。アフィニティー捕獲アッセイの結合パートナー分子としては、例えば、α2Mに対する抗体または他のリガンド、例えば、α2Mと特異的に結合するα2M受容体結合ドメインが挙げられる。あるいは、フィルター結合アッセイは、装置、例えば、フィルターまたはカラムのような固相面を用いて、複合体と非結合反応体の物理的または化学的差異に基づいてタンパク質またはタンパク質複合体を非特異的に保持する。アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはフィルター結合分離方法を用いて、血清または本明細書に記載するその他の体液からα2Mを単離することができる。
【０１０９】
本発明の具体的実施形態では、以下のようにして血清からα2Mを単離する：α2Mの結合パートナー、すなわち、α2M結合分子を含む固相（アガロースカラムなど）と血清を接触させる。α2Mが固相と結合するのに十分な時間、血清を固相上でインキュベートする。次に、結合しない材料を固相から除去し、結合したα2Mを固相から溶離させる。
【０１１０】
α2Mの結合パートナーは、α2Mと特異的に結合する分子であればどんな分子でもよい。好ましい実施形態では、α2M結合分子は、α2Mに特異的な抗体である。α2M特異的抗体はモノクローナル抗体であるのが好ましい。別の好ましい実施形態では、α2M結合分子はα2M受容体のリガンド結合断片である。
【０１１１】
固相は、限定するものではないが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロースなど、どんな面またはマトリックスでもよい。支持組織としては、ビーズ、膜、ミクロ粒子、ならびに、微量滴定プレート、試験管もしくはその他の反応容器のような反応容器の内側面が挙げられる。
【０１１２】
好ましい実施形態では、0.04 MトリスpH 7.6、0.15 M NaClで血清を１：１に希釈することにより、マウスからの血清からα2Mを単離する。同じバッファーで平衡および溶離した65 ml Sephacryl S 300R（Signma）カラムに上記混合物をロードする。α2M−陽性画分をドットブロットにより決定し、PD-10カラムを用いて、バッファーを0.01 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.5）に取り替える。あるいは、ht e65mlカラム中のバッファーとして0.04 MトリスpH 7.6、0.15 M NaClバッファーを用いて、バッファー交換ステップを省いてもよい。複合体を含む画分をConcanavalin A セファロースカラムに載せる。結合した複合体を0.2 Mメチルマンノースピラノシド、すなわち、５％メチルマンノースピラノシドで溶離させ、0.05 M酢酸ナトリウムバッファーで平衡させたDEAEカラムにロードする。A2Mは純粋な形態で溶離されるが、これは、0.13 M酢酸ナトリウムバッファーを用いたSDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより分析する。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、血液からα2Mを単離することができ、例えば、以下に示す非制限的プロトコルを用いることができる：血液を被検者から回収し、凝固させる。次に、これを14,000 x gで30分遠心分離することにより、血清を取得し、0.04 Mトリスバッファー（pH 7.6）および0.3 M NaClで平衡させたゲルろ過カラム（Sephacryl S-300R）にロードする。約10 mlの血清について65 mlカラムを用いる。３mlの画分を回収し、α2M特異的抗体を用いたドットブロットによりα2Mの存在について各画分を試験する。α2M−陽性画分をプールし、PD10カラムにロードすることにより、PMSFを含む0.01 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.5）にバッファーを交換する。次に、リン酸バッファーで平衡させたCon Aカラム（10 ml）に、プールした画分をロードする。カラムを洗浄し、５％メチルマンノースピラノシドでタンパク質を溶離させる。溶離液をPD10カラムに通過させることにより、バッファーを酢酸ナトリウムバッファー（0.05 M；pH 6.0）に交換する。続いて、DEAEカラムを酢酸バッファーで平衡させ、サンプルをDEAEカラムにロードする。カラムを洗浄し、タンパク質を0.13 M酢酸ナトリウムで溶離させる。それからα2Mを含む画分をプールする。この手順により、α2Mを見かけ均一性まで精製することができ、この均一性は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりアッセイする。
【０１１４】
上記のほかにも、当分野で周知のα2Mの単離方法を用いることができる（Dubinら、1984, Immunotherapy 8(4):589-596；Okuboら、1981, Bio. Chem. Biophys. 688:257-267；Nieuwenhuizenら、1979, Biochem. Et Biophy. 580:129-139）。
【０１１５】
４．３．５．細胞により産生される非共有結合性HSP110-ペプチド複合体の製造および精製
以下に、用いることのできる手順（Wangら、2001, J. Immunol. 166(1):490-7）を非制限的例として示す：
細胞または組織（例えば、腫瘍細胞組織）のペレット（40〜60 ml）を５容量の低張性バッファー（30 mN炭酸水素ナトリウム、pH 7.2、およびプロテアーゼ阻害剤）中でダウンスホモジナイゼーションにより均質化する。溶解物を4,500 x g、次に100,000 x gで２時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓に由来する場合には、得られた上清を青色セファロースカラム（Pharmacia）にロードすることにより、アルブミンを除去する。あるいは、結合バッファー（20 mMトリス−HCl、pH 7.5；100 mM NaCl；1mM MgCl2；１mM CaCl2；1mM MnCl2；および15 mM 2-ME）で事前に平衡させたCon A-セファロースカラム（Pharmacia Biotech、ピスカタウェイ、NJ）に、得られた上清をロードする。15％α-D-o-メチルマンノシド（Sigma、セントルイス、MO）を含む結合バッファーで、結合したタンパク質を溶離させる。
【０１１６】
Con A-セファロース非結合材料をまず20 mMトリス−HCl、pH 7.5；100 mM NaCl；および15 mM 2-MEの溶液に対して透析してから、DEAE-セファロースカラムに載せ、100〜500 mM NaClまでの塩勾配により溶離させる。hsp110を含む画分を回収、透析した後、20 mMトリス−HCl（pH 7.5）；200 mM NaCl；および15 mM 2-MEで平衡させたMono Q（Pharmacia）10/10カラムにロードした。結合したタンパク質を200〜500 mM NaCl勾配で溶離させる。画分は、SDS-PAGE、続いて、hsp 110についてのAbによるイムノブロッティングにより分析する（Wangら、1999, J. Immunol. 162:3378に記載）。hsp 110を含むプールした画分をCentriplus（Amicon, Beverly, MA）により濃縮し、Superose 12カラム（Pharmacia）にロードする。流速が0.2 ml／分の40 mMトリス−HCl（pH 8.0）；150 mM NaCl；および15 mM 2-MEにより、タンパク質を溶離させる。
【０１１７】
４．３．６．細胞により産生される非共有結合性GRP170-ペプチド複合体の製造および精製
以下に、用いることのできる手順（Wangら、2001, J. Immunol. 166(1):490-7）を非制限的例として示す：
細胞または組織（例えば、腫瘍細胞組織）のペレット（40〜60 ml）を５容量の低張性バッファー（30 mN炭酸水素ナトリウム、pH 7.2、およびプロテアーゼ阻害剤）中でダウンスホモジナイゼーションにより均質化する。溶解物を4,500 x g、次に100,000 x gで２時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓に由来する場合には、得られた上清を青色セファロースカラム（Pharmacia）にロードすることにより、アルブミンを除去する。あるいは、結合バッファー（20 mMトリス−HCl（pH 7.5）；100 mM NaCl；1mM MgCl2；１mM CaCl2；1mM MnCl2；および15 mM 2-ME）で事前に平衡させたCon A-セファロースカラム（Pharmacia Biotech、ピスカタウェイ、NJ）に、得られた上清をロードする。15％α-D-o-メチルマンノシド（Sigma、セントルイス、MO）を含む結合バッファーで、結合したタンパク質を溶離させる。
【０１１８】
Con A-セファロース結合材料をまず20 mMトリス−HCl、pH 7.5；150 mM NaClに対して透析した後、Mono Qカラムにロードし、150〜400 mM NaCl勾配により溶離させる。プールした画分を濃縮し、スペロース（Superose）12カラム（Pharmacia）にロードする。均質なgrp170を含む画分を回収する。
【０１１９】
４．３．７．熱ショックタンパク質およびα2Mの組換え発現
本発明の特定の実施形態では、組換え手段によって、より高レベルのHSPおよびα2Mを発現する細胞からHSPおよびα2Mを作製することができる。多くのHSPおよびα2Mのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、一般に、配列データベース（例えば、GenBank）で入手可能である。コンピュータープログラム（例えば、Entrez）を用いて、データベースを閲覧し、登録番号により目的のアミノ酸配列および遺伝子配列データを検索する。これらのデータベースを検索することによって、アラインメントスコアおよび統計学により類似配列を等級付けするプログラム（例えば、FASTAおよびBLASTAなど）を用いて、当該配列に対し様々な度合いの類似性を有する配列を確認することもできる。本発明のHSPペプチド複合体の組成物、方法、および作製に用いることができるHSPのこのようなヌクレオチド配列の非制限的例を以下に挙げる：ヒトHSP70、GenBank登録番号M24743（Huntら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:6455-6489）；ヒトHSP90、GenBank登録番号X15183（Yamazakiら、Nucl. Acids Res. 17:7108；ヒトgp96、GenBank登録番号X15187（Makiら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5658-5562；ヒトBiP: GenBank登録番号M19645（Tingら、1988, DNA 7:275-286）；ヒトHSP27、GenBank登録番号M24743（Hickeyら、1986, Nucleic. Acids Res. 14:4127-45）；マウスHSP70：GenBank登録番号M35021（Huntら、1990, Gene 87:199-204；マウスgp96：GenBank登録番号M16370 (Srivastavaら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:3807-3811；マウスヒトBiP: GenBank登録番号U16277（Haasら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2250-2254）。また、HSPをコードする縮合配列も用いることができる。
【０１２０】
本明細書で用いる「α2M」という用語は、α2Mに対して少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％、最も好ましくは75％〜85％アミノ酸同一性を有するα2Mのポリペプチド断片、類似体および変異体を包含し、抗原ペプチドとの複合体を形成することができ、この複合体は、抗原提示細胞により取り込まれて、抗原分子に対する免疫応答を誘発することができる。本発明のα2M分子は、市販のものを購入するか、天然の供給源から精製する（Kureckiら、1979, Anal. Biochem. 99:415-420）、化学的に合成、もしくは組換えにより生産することができる。本発明のα2Mポリペプチドの作製に用いることができるα2M配列の非制限的例を以下に挙げる：GenBank登録番号M11313、P01023、AAA51551（Kanら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82:2282-2286）。また、α2Mをコードする縮合配列も用いることができる。
【０１２１】
選択したHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を確認したら、ヌクレオチド配列またはその断片を取得し、発現ベクターにクローン化して、組換え発現する。次に、発現ベクターを宿主細胞に導入し、HSPまたはα2Mを増殖させる。HSPまたはα2Mの組換え生産方法については、本明細書で詳しく説明する。
【０１２２】
DNAは、標準的分子生物学的方法（例えば、Methods in Enzymology, 1987, 第154巻、Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manuall, 第2版、Cold Spring Harbor Press, New York；ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編）、Greene Publishing Associates and Wiley Interscince, New Yorkを参照；いずれも、その全文を参照として本明細書に組み込む）を用いて、組織、細胞培養物、もしくはクローン化DNA（例：DNA「ライブラリー」）から直接DNA増幅または分子クローニングにより取得することができる。ゲノムDNA由来のクローンは、コード領域のほかに、調節およびイントロンDNA領域を含むこともあるが、cDNA由来のクローンは、エクソン配列だけを含むと考えられる。供給源が何であれ、HSPまたはα2M遺伝子は、遺伝子の増殖に適したベクター中でクローン化しなければならない。
【０１２３】
好ましい実施形態では、関連または相同性HSPまたはα2Mの既知配列から設計したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅により、ゲノムまたはcDNAからDNAを増幅することができる。PCRを用いて、DNAクローンもしくはゲノムまたはcDNAライブラリー内の所望の配列を増幅した後、選択する。PCRは、例えば、末端サイクラーおよびTaqポリメラーゼ（Gene Amp（登録商標））を用いて、実施することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は通常、目的の遺伝子または遺伝子断片を取得するために用いられる。例えば、所望する長さのHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームと隣接するPCRプライマーを用いて作製することができる。あるいは、制限エンドヌクレアーゼを有する適切な部位（このような部位が利用可能であれば）で、HSPまたはα2M配列を切断することにより、HSPまたはα2M遺伝子をコードするDNAの断片を放出することも可能である。好適な制限部位が利用できない場合には、当分野では周知の部位特異的突然変異誘発および／またはDNA増幅方法（例えば、Shankarappaら、1992, PCR Method APPl. 1:277-278）により適切な位置でそのような部位を形成してもよい。次に、HSPまたはα2MをコードするDNA断片を単離し、適切な発現ベクターに結合させるが、その際、適正な翻訳リーディングフレームが確実に維持されていることに注意する。
【０１２４】
別の実施形態では、ゲノムDNA由来のHSPまたはα2M遺伝子の分子クローニングのために、ゲノムライブラリーを形成するようにDNA断片を作製する。関連するHSPまたはα2Mをコードする配列のいくつかは入手可能であり、精製および標識することができるため、ゲノムDNAライブラリー内のクローン化DNA断片は、標識プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる（BentonおよびDavis, 1977, Science 196:180；GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。プローブとの実質的相同性を有するDNA断片がハイブリダイズする。また、制限酵素による消化の後、既知の制限マップに従い予想されるものと断片サイズを比較することにより、適切な断片を確認することも可能である。
【０１２５】
HSPまたはα2MゲノムDNAを単離するさらに別の方法として、限定するものではないが、既知配列から遺伝子配列自体を化学的に合成するか、あるいは、HSPまたはα2MをコードするmRNAに対するcDNAを合成するものなどがある。例えば、HSPまたはα2M遺伝子のcDNAクローニングのためのRNAは、HSPまたはα2Mを発現する細胞から単離することができる。cDNAライブラリーは、当分野では周知の方法により作製し、ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングについて開示したような方法によりスクリーニングすることができる。HSPまたはα2Mに対する抗体が入手可能であれば、HSPまたはα2Mは、標識した抗体と、HSP−またはα2M−合成クローンとの結合により確認できる。
【０１２６】
HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列をクローニングする他の具体的実施形態を非制限的例として以下に示す：具体的実施形態では、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を確認し、当分野でよく知られているストリンジェンシーの様々な条件（クロス−種ハイブリダイゼーションに用いられるものを含む）下で、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとのハイブリダイゼーションにより前記配列を取得する。
【０１２７】
発現したペプチド配列内にアミノ酸置換を形成する、あるいは、制限部位を形成／欠失させてさらに増殖を促進する目的で、当分野で周知のあらゆる突然変異誘発方法を用いて、DNA配列内の個々のヌクレオチドを改変することができる。このような方法として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchinsonら、1978, J. Biol. Chem. 253:6551）、オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発（Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463；Hillら、1987, Methods Enzymol. 155:558-568）、PCRベースのオーバーラップ伸長（Hoら、1989, Gene 77:51-59）、PCRによるメガプライマー突然変異誘発（Sarkarら、1990, Biotechniques 8:404-407）など。二本鎖ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定により改変を確認することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、非分泌HSPの分泌形態をコードする核酸を用いて、本発明の方法を実施することができる。このような核酸は、ER保持シグナルKDELのコード配列を欠失させることにより構築することができる。随意に、KDELコード配列を分子タグで置換することにより、マウスIgGlのFc部分のようなHSPの認識および精製を容易にする。別の実施形態では、天然に分泌されるHSPまたはα2Mに分子タグを添加する。PCT公開番号WO 99/42121は、gp96のER保持シグナルの欠失により、トランスフェクションした腫瘍細胞からgp96−Igペプチド−複合体の分泌が起こり、KDEL欠失gp96とマウスIgGlとの融合により、ELISAおよびFACS分析によるその検出、ならびに、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるその精製が容易になることを証明している。
【０１２９】
４．３．７．１．発現系
HSPまたはα2M分子をコードするヌクレオチド配列を、組換え細胞における増殖および発現のための発現ベクターに挿入する。本発明で用いる「発現構築物」とは、適切な宿主細胞におけるHSPまたはα2M分子の発現を可能にする１以上の調節領域と機能的に結合した、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を意味する。「機能的に結合した」とは、調節領域と、発現させようとするHSPまたはα2Mポリペプチド配列が、HSPまたはα2M配列の転写、また、後には翻訳を可能にするように結合および位置している、結合を意味する。様々な発現ベクターをHSPまたはα2Mの発現に用いることができるが、このようなベクターとして、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、もしくは改変されたウイルスがある。例として、λ誘導体のようなバクテリオファージ、もしくはpBR322またはpUCプラスミド誘導体のようなプラスミド、あるいは、Bluescriptベクター（Stratagene）などが挙げられる。典型的には、このような発現ベクターは、適切な宿主細胞におけるベクターの増殖のための複製起原、HSPまたはα2M遺伝子配列の挿入のための１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、および１個以上の選択マーカーを含む。
【０１３０】
哺乳動物宿主細胞におけるHSPまたはα2Mの発現のためには、様々な調節領域を用いることができ、例えば、SV40初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）即時型プロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（RSV-LTR）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導性プロモーターとしては、限定するものではないが、メタロチオネインII遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復配列（MMTV-LTR）、β-インターフェロン遺伝子、およびHSP70遺伝子に関連するもの（Williamら、1989, Cancer Res/ 49:2735-42；Taylorら、1990, Mol. Cell. Biol. 10:165-75）が挙げられる。宿主細胞におけるHSPまたはα2Mの発現の効率は、発現ベクターに適切な転写エンハンサーエレメントを含有させることにより増強することができ、このようなエレメントとして、SV40ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β-アクチンに存在するものがある（Bittnerら、1987, Methods in Enzymol. 153:516-544；Gorman, 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47参照）。
【０１３１】
また、発現ベクターは、１種以上の宿主におけるベクターの維持および複製、もしくは宿主染色体へのベクターの組込みを可能にする配列を含んでもよい。このような配列として、限定するものではないが、複製起原、自律複製配列（ARS）、動原体DNA、ならびにテロメアDNAが挙げられる。さらに、少なくとも２種の宿主細胞において複製および維持することができるシャトルベクターを用いるのも有利である。
【０１３２】
加えて、発現ベクターは、HSPまたはα2MをコードするDNAを含む宿主細胞を初めに単離または確認するための選択またはスクリーニングマーカーを含んでもよい、長期にわたるHSPまたはα2Mの高収率生産のためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞の場合、多数の選択系を用いることができ、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskiおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980, Cell 22: 817）遺伝子が挙げられるが、これらはtk−、hgprt−もしくはaprt−細胞にそれぞれ用いることができる。また、以下に挙げるものについての選択基準として、抗代謝剤耐性を用いることもできる：メトトレキセートに耐性を賦与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）（Wiglerら、1980, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567；O’Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1527）；マイコフェノール酸に耐性を賦与するgpt（MulliganおよびBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072）；アミノグリコシドG-418に耐性を賦与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）（Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150:1）；ならびに、ハイグロマイシンに耐性を賦与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hgr）（Santerreら、1984, Gene 30:147）。その他の選択マーカー、例えば、限定するものではないが、ヒスチジノールおよびZeocin（商標）を用いてもよい。
【０１３３】
調節領域と機能的に結合したHSPまたはα2Mコード配列を含む発現構築物を適切な宿主細胞に直接導入することにより、それ以上のクローニングなしに、本発明のHSPまたはα2M複合体の発現および生産を実施することができる（例えば、米国特許第5,580,859号を参照）。また、発現構築物は、例えば、相同的組換えにより、宿主細胞のゲノムへのコード配列の組込みを容易にするDNA配列を含んでもよい。この例では、宿主細胞においてHSPまたはα2M分子を増殖および発現させる上で適切な宿主細胞に適した複製起源を含む発現ベクターを使用する必要がある。
【０１３４】
クローン化HSPまたはα2Mコード配列を含む発現構築物は、限定するものではないが、以下に挙げるような当分野で周知の様々な方法により、哺乳動物宿主細胞に導入することができる：リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wiglerら、1977, Cell 11:223-232）、リポソーム媒介トランスフェクション（Schaefer-Ridderら、1982, Science 215: 166-168）、エレクトロポレーション（Wolffら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3344）、ならびにマイクロインジェクション（Cappechi, 1980, Cell 22:479-488）。
【０１３５】
本明細書に記載するクローニングおよび発現ベクターのいずれも、当分野でよく知られる方法により既知DNA配列から合成および集合させることができる。調節領域およびエンハンサーエレメントは、天然および合成両方の様々な起源のものでよい。ベクターおよび宿主細胞の中には市販されているものもある。有用なベクターの非制限的例は、Current Protocols in Molecular BiologyのAppendix 5, 1988, Ausubelら編、Greene Publish. Accoc. & Wiley Interscience（参照として本明細書に組み込む）；およびClontech Laboratories, Stratagene Inc.,およびInvitrogen, Inc.のような商業的供給者のカタログに記載されている。
【０１３６】
あるいは、多数のウイルス発現系を、HSPまたはα2Mの組換え発現のための哺乳動物細胞と一緒に用いてもよい。DNAウイルス主鎖を用いたベクターは、シミアンウイルス40（SV40）（Hamerら、1979, Cell 17:725）、アデノウイルス（Van Dorenら、1984, Mol. Cell Biol. 4:1653）、アデノ随伴ウイルス（McLaughlinら、1988, J. Virol. 62:1963）、ならびにウシパピローマウイルス（Zinnら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4897）から誘導されている。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、ドナーDNA配列をアデノウイルス転写／翻訳制御領域、例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列と連結させる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域への挿入（例：領域E1またはE3）により、感染した宿主において生存可能で、しかも、異種産物を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、LoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659）。
【０１３７】
ウシウシパピローマウイルス（BPV）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染し、そのDNAはエピソームのように複製する。哺乳動物細胞において安定した多コピー（20〜300コピー／細胞）染色体外エレメントとして存在する組換え遺伝子発現のために、多数のシャトルベクターが作製されている。典型的には、これらのベクターは、BPV DNAのセグメント（全ゲノムまたは69％形質転換断片）、広範な宿主域を有するプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択マーカー、および大腸菌においてベクターを増殖させる「無毒な」プラスミド配列を含む。細菌における構築および増幅後、例えば、リン酸カルシウム共沈殿またはエレクトロポレーションのような方法により、発現遺伝子構築物を、培養した哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。形質転換した表現型を発現しない宿主細胞については、優性選択マーカー（ヒスチジノールおよびG418耐性など）を用いて、形質転換体の選択を実施する。例えば、pBCMGSNeoおよびpBCMGHisのようなBPVベクターを用いて、HSPまたはα2Mを発現させ（Karasuyamaら、Eur. J. Immunol. 18:97-104；Oheら、Human Gene Therapy 6:325-33）、これらをHSPまたはα2M発現のための非常に多様な細胞型にトランスフェクションすることができる。
【０１３８】
あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを用いてもよい（例えば、Mackettら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:7415-7419）。ヒト宿主細胞を用いる場合には、エプスタイン−バーウイルス（EBN）起源（OriP）およびEBV核抗原１（EBNA-1；トランス作用複製因子）に基づくベクターを用いる。このようなベクターは、広範なヒト宿主細胞、例えば、EBO-pCD（Spickofskyら、1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:14-18）、pDR2およびλDR2（Clontech Laboratoriesから入手可能）で用いることができる。
【０１３９】
また、組換えHSPまたはα2M発現は、レトロウイルス発現系によっても達成することができる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、多様な細胞型、例えば、一次造血細胞に容易に感染し、そこに遺伝子を輸送することができる。モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスでは、ウイルス遺伝子配列の大部分を除去し、HSPまたはα2Mコード配列で置換することができると共に、欠失しているウイルス機能をトランスで供給することができる。レトロウイルスベクターによる感染の宿主域は、ベクターパッケージングに用いるエンベロープの選択により操作することもできる。
【０１４０】
例えば、レトロウイルスベクターは、5’長末端反復配列（LTR）、3’LTR、パッケージングシグナル、細菌の複製起点、および選択マーカーを含むことができる。5’LTRプロモーターからの転写がクローン化DNAを転写するように、ND-関連抗原ペプチドDNAを5’LTRと3’LTRの間の位置に挿入する。5’LTRは、プロモーター（限定するものではないが、LTRプロモーターなど）、Ｒ領域、U5領域およびプライマー結合部位を順に含む。これらのLTRエレメントのヌクレオチド配列は、当分野でよく知られている。感染細胞の選択を容易にするために、異種プロモーター、ならびに多剤選択マーカーを発現ベクターに含有させてもよい（McLauchlinら、1990, Prog. Nucleic Acid Res. and Molec. Biol. 38:91-135；Morgensternら、1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596；Choulikaら、1996, J. Viol 70:1792-1798；Boesenら、1994, Biotherapy 6:291-302；SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびに、GrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114参照）。
【０１４１】
温度、インキュベーション時間、光学密度、および培地組成の標準的条件下で、組換え細胞を培養することができる。あるいは、HSPが内在的に発現する細胞の栄養および生理学的要件をエミュレートする条件下で、細胞を培養してもよい。改変した培養条件および培地を用いて、HSP−ペプチド複合体の産生を増強することもできる。例えば、誘導性HSP発現を促進する条件下で、組換え細胞を増殖させることができる。
【０１４２】
本発明のα-2-マクログロブリンおよびHSPポリペプチドを融合タンパク質として発現させることにより、これらが発現した細胞からの回収および精製を容易にすることもできる。例えば、HSPまたはα2Mポリペプチドは、シグナル配列リーダーペプチドを含むことにより、培地への分泌のためにER膜を介したその輸送を指令することができる。さらに、HSPまたはα2Mポリペプチドは、結合抗原ペプチドに関与しないHSPまたはα2Mポリペプチドのいずれかの部分（例えば、カルボキシル末端など）に融合したアフィニティーラベル（例えば、アフィニティーラベルなど）を含んでもよい。アフィニティーラベルを用いて、アフィニティーパートナー分子との結合により、タンパク質の精製を容易にすることができる。
【０１４３】
この融合タンパク質を生産する様々な方法は、当分野でよく知られている。このような生産を起こす操作は、遺伝子またはタンパク質レベル、好ましくは遺伝子レベルで行なうことができる。例えば、当分野で周知の多数の組換えDNA方法（Sambrookら、1990, Molecular Cloning, A laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyの第８章、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）のいずれかを用いて、HSPまたはα2Mポリペプチドのクローン化コード領域を改変することができる。以下の説明から、置換、欠失、挿入、もしくはこれらいずれかの組合せを導入または組み合わせることにより、HSPまたはα2Mポリペプチドをコードする最終ヌクレオチド配列に到達することは明らかであろう。
【０１４４】
様々な実施形態において、組換えDNA技術を用いて、HSPまたはα2Mポリペプチドを含む融合タンパク質を製造する。例えば、適正なリーディングフレーム内のHSPまたはα2M 遺伝子断片を、アフィニティーラベルの配列を含むベクターに導入して、HSPまたはα2Mポリペプチドをペプチド−タグ付き融合タンパク質として発現させることにより、HSPまたはα2Mポリペプチドをコードする組換え遺伝子を構築することができる。特定の結合パートナーにより認識されるアフィニティーラベルは、HSPまたはα2Mポリペプチドのアフィニティー精製にも用いることできる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、アフィニティーラベルをそのアミノ末端で、HSPまたはα2Mのカルボキシル末端に融合させる。カルボキシル末端で融合を実施する正確な部位は重要ではない。最適部位は、通常の実験により決定することができる。
【０１４６】
当分野では周知の様々なアフィニティーラベルを用いることができ、このようなラベルとして限定するものではないが、以下のものが挙げられる：免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Petty, 1996, Metal-Chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, 第２巻、Ausubelら編、Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guanら、1987, Gene 67:21-30）、ならびに様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第5,496,934号；第5,202,247号；第5,137,819号；Tommeら、1994, Protein Eng. 7:117-123）など。その他のアフィニティーラベルとして、HSPまたはα2Mポリペプチドに蛍光特性を与えるもの、例えば、緑色蛍光タンパク質の部分などがある。以上のほかに考えられるアフィニティーラベルは、モノクローナル抗体が利用可能な短いアミノ酸配列であり、例えば、以下に挙げるよく知られる例がある：FLAGエピトープ、アミノ酸408〜439でのmycエピトープ、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）エピトープ。その他のアフィニティーラベルは、特異的結合パートナーによって認識され、固体支持体上に固定化することができる結合パートナーへのアフィニティー結合により単離を容易にする。アフィニティーラベルには、HSPまたはα2Mポリペプチドに新規の構造的特性、例えば、多量体を形成する能力を賦与するものもある。HSPまたはα2Mポリペプチドと結合ペプチドの二量体形成により、抗原提示の過程で、HSPまたはα2Mポリペプチドとそのパートナー同士の相互作用のアビディティーを高めることができる。これらのアフィニティーラベルは一般に、通常ホモポリマーとして存在するタンパク質から誘導される。CD8（Shiueら、1988, J. Exp. Med. 168:1993-2005）、またはCD8（Leeら、1990, J. Immunol. 145:344-352）の細胞外ドメイン、もしくは鎖間ジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の部分のようなアフィニティーラベルにより、多量体の形成を達成することができる。当業者には理解されるように、多くの方法を用いて、前述したアフィニティーラベルのコード領域を得ることができ、このような方法として、限定するものではないが、DNAクローニング、DNA増幅、合成方法などが挙げられる。アフィニティーラベル、ならびにその検出および単離のための試薬には市販されているものもある。
【０１４７】
好ましいアフィニティーラベルは、免疫グロブリン分子の非可変部分である。典型的には、このような部分は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に作用するCH2およびCH3ドメインを含む。また、定常ドメインのFc部分のカルボキシル末端、もしくはアミノ末端に隣接する領域を用いて、重鎖または軽鎖のCH1との融合物を作製する。好適な免疫グロブリンアフィニティーラベルは、IgG-1、-2、-3、もしくは-4サブタイプ、IgA、IgE、IgD、もしくはIgMから得られるが、IgG-1が好ましい。好ましくは、HSPまたはα2Mポリペプチドをヒトのin vivo使用に意図する場合には、ヒト免疫グロブリンを用いる。免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域をコードする多数のDNAが知られている、もしくはcDNAライブラリーから容易に入手可能である。例えば、以下を参照されたい：Adamsら、Biochemistry, 1980, 19:2711-2719；Goughら、1980, Bochemistry, 19;2702-2710；Dolbyら、1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:6027-6031；Riceら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:7862-7865；Falknerら、1982, Nature, 298:286-288；ならびに、Morrisonら、1984, Ann. Rev. Immunol, 2:239-256。免疫グロブリンの検出のために、多数の免疫学的試薬および標識系が入手可能であるため、HSPまたはα2Mポリペプチド−Ig融合タンパク質は、当分野で周知の様々な免疫学的方法、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、免疫沈降、蛍光細胞分析分離法（FACS）などを用いて、容易に検出および定量することができる。同様に、アフィニティーラベルが、容易に入手可能な抗体とのエピトープである場合には、このような試薬を前述の方法と一緒に用いて、アフィニティーラベルを含むHSPまたはα2Mポリペプチドを検出、定量および単離することができる。多くの例において、HSPまたはα2Mポリペプチドに対し特異的な抗体を作製する必要はない。
【０１４８】
特に好ましい実施形態は、HSPまたはα2Mポリペプチドとヒンジ、すなわち、ヒト免疫グロブリンG-1（IgG-1；Bowenら、1996, J. Immunol. 156:442-49）のCH2およびCH3ドメインの融合物である。このヒンジ領域は、Ig分子における他のシステインとのジスフィルド結合に通常関与している３つのシステイン残基を含む。上記システインのいずれも、ペプチドがタグとして機能することを必要としないため、これらシステイン残基の１つ以上を別のアミノ酸残基、例えば、セリンで随意に置換してもよい。
【０１４９】
細菌および哺乳動物細胞からのHSPまたはα2Mポリペプチドの効率的な分泌のために、当分野で周知の様々なリーダー配列を用いることができる（von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184:99-105）。意図する宿主細胞に基づいて、リーダーペプチドを選択するが、このようなリーダーペプチドとして、細菌、酵母、ウイルス、動物、および哺乳動物の配列が挙げられる。例えば、様々な哺乳動物細胞に使用する場合には、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄリーダーペプチドが好適である。哺乳動物細胞での使用に好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のV-J2-C領域から得られる（Bernardら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5812-5816）。細菌細胞においてHSPまたはα2Mポリペプチドをターゲッティングするのに好ましいリーダーペプチドを以下に挙げるが、これらに限定するものではない：大腸菌タンパク質OmpA（Hobomら、1995, Dev. Biol. Stand. 84:255-262）、Pho A（Okaら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212-16）、OmpT（Johnsonら、1996, Protein Expression 7:104-113）、LamBおよびOmpF（Hoffman & Wright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5107-5111）、β−ラクタマーゼ（Kadonagaら、1984, J. Biol. Chem. 259:2149-54）、エンテロトキシン（Morioka-Fujimotoら、1991, J. Biol. Chem. 266:1728-32）、および黄色ブドウ球菌プロテインＡ（Abrahmsenら、1986, Nucleic Acids Res. 14:7487-7500）、および枯草菌エンドヌクレアーゼ（Loら、Appl. Environ. Microbiol. 54:2287-2292）、ならびに人工および合成シグナル配列（MacIntyreら、1990, Mol. Gen. Genet. 221:466-74；Kaiserら、1987, Science, 235:312-317）。
【０１５０】
所望のアフィニティーラベルまたはリーダーペプチドをコードするDNA配列は、ライブラリーから容易に取得したり、合成により製造したり、あるいは、市販のものを入手したりすることができ、これらのDNA配列は本発明の実施に適している。このような方法は当分野ではよく知られている。
【０１５１】
４．４．タンパク質およびペプチドのHSPおよびα2Mとの複合体化
HSPまたはα2Mと、抗原細胞、その細胞断片、もしくはウイルス粒子から作製したタンパク質および／またはペプチドの集団をin vitroで複合体化する方法の例を本明細書で説明する。タンパク質および／またはペプチドの集団は、第４．２．１節に記載したように抗原細胞のタンパク質調製物から得る。特定の実施形態では、ペプチドは、抗原細胞、その細胞断片、もしくはウイルス粒子のタンパク質調製物の消化物から得られる。複合体化反応によって、HSPと抗原細胞またはウイルス粒子のタンパク質またはペプチドとの共有結合を形成することができる。複合体化反応によって、α2Mと抗原細胞またはウイルス粒子のタンパク質またはペプチドとの共有結合を形成することができる。また、複合体化反応により、HSPとタンパク質および／またはペプチド、もしくはα2Mとタンパク質および／またはペプチドとの非共有結合を形成することもできる。
【０１５２】
複合体化の前に、HSPをATPで前処理するか、または酸性条件に暴露することにより、ペプチドを除去し、これを目的のHSPと非共有結合させることができる。ATP法を用いる場合には、Levyら、1991, Cell 67:265-274により記載されているように、アピラナーゼの添加により過剰ATPを調製物から除去する。酸性条件を用いる場合には、pH改変試薬の添加により、バッファーを中性pHまで再調節する。HSPへの「ペプチド（平均長さ７〜20アミノ酸）の集団のin vitroでの非共有結合複合体化のためのプロトコル例を以下に説明する：
ペプチドの集団（１μg、10％〜50％ジメチルスルホキシド中に溶解させることができる）と、前処理したHSP（９μg）を混合して、約５ペプチド（またはタンパク質）：１HSPモル比とする。次に、混合物を好適な結合バッファーにおいて４℃〜45℃で15分〜３時間インキュベートするが、好適な結合バッファーとして、例えば、リン酸緩衝食塩水（pH 7.4）、または20 ｍMリン酸ナトリウム（pH 7.2）、350 mM NaCl、３mM MgCl2および１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むバッファーが挙げられる。調製物をCentricon 10アセンブリー（Millipore）により遠心分離することにより、結合していないペプチドをすべて除去する。タンパク質／ペプチドとHSPとの非共有結合は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）または質量分析法（MS）によりアッセイすることができる。
【０１５３】
HSP70とタンパク質／ペプチドの非共有結合複合体を製造するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜10マイクログラムの精製したHSP70を、100マイクロリットルの容量中20 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.5）、0.5 M NaCl、３mM MgCl2および１mM ADPにおける等モル量のタンパク質／ペプチドと37℃で１時間インキュベートする。このインキュベーション混合物をCentricon 10アセンブリー（Millipore）により必要に応じて１回以上遠心分離することにより、結合していないペプチドをすべて除去する。
【０１５４】
gp96またはHSP90とペプチドの非共有結合複合体を製造するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜10マイクログラムの精製したgp96またはHSP90を、好適なバッファー（例えば、20 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.5）、0.5 M NaCl、３mM MgCl2を含むバッファーなど）において、等モル量または過剰量のタンパク質／ペプチドと60〜65℃で５〜20分インキュベートする。このインキュベーション混合物をCentricon 10アセンブリー（Millipore）により必要に応じて１回以上遠心分離することにより、結合していないペプチドをすべて除去する。
【０１５５】
抗原タンパク質および／または抗原ペプチドと複合体化の後、例えば、以下に記載する混合リンパ球標的細胞アッセイ（MLTC）を用いて、免疫原HSP複合体またはα2M複合体を随意にアッセイすることができる。HSP−ペプチド複合体および／またはHSP−ペプチド複合体を単離および希釈したら、随意に、以下に記載する好ましい投与プロトコルおよび賦形剤を用いて、動物モデルにおいてさらに特性決定することができる。
【０１５６】
HSPとタンパク質／ペプチドの非共有結合複合体を製造する別の方法として、タンパク質／ペプチドの集団をHSPに共有結合させるものもある。
【０１５７】
一実施形態では、化学的架橋によりHSPをタンパク質調製中のタンパク質および／またはペプチドに共有結合させる。化学的架橋方法は、当分野ではよく知られている。例えば、好ましい実施形態では、グルタルアルデヒド架橋を用いることができる。グルタルアルデヒド架橋は、ペプチドとHSPの共有結合複合体の形成に用いられている（Barriosら、1992, Eur. J. Immunol. 22:1365-1372）。好ましくは、0.002％グルタルアルデヒドの存在下で１〜２mgのHSP−ペプチド複合体を架橋する。グルタルアルデヒドは、リン酸緩衝食塩水（PBS）に対し一晩透析することにより除去する（Lussowら、1991, Eur. J. Immunol. 21:2297-2302）。あるいは、HSPとタンパク質／ペプチドは、当分野では周知の条件下での紫外線（UV）架橋により架橋させてもよい。
【０１５８】
本発明の別の実施形態では、タンパク質／ペプチドをα2Mと50：１モル比でインキュベートすることにより、タンパク質調製物中のタンパク質／ペプチドの集団をα2Mと非共有結合的に複合体化させることができ、その際、50℃で10分に続き、25℃で30分インキュベートする。遊離（非複合体化）ペプチドはサイズ排除フィルターにより除去することができる。好ましくは、複合体をシンチレーションカウンターで測定することにより、モル当たりの各HSPまたはα2Mを観察して、等量のタンパク質／ペプチド（ペプチドの出発量の約0.1％）と結合していることを確認する。詳しくは、Binder, 2001, J. Immunol. 166(8):4968-72（参照としてその全文を本明細書に組み込む）を参照されたい。これらの反応物において、α2Mとタンパク質およびペプチドの共有結合複合体を形成する傾向を低減するためには、複合体化の前に、プロテアーゼ活性を阻害または除去するのが望ましい。これは、例えば、第４．２．１節に記載された方法によりプロテアーゼ阻害剤を用いて、達成することができる。また、還元剤（例えば、2-メルカプトエタノール）を反応物に添加することにより、タンパク質調製物に存在する求核的な化合物（α2Mを活性化して共有結合させる可能性がある）を中和することも望ましい。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、ペプチドをα2Mと複合体化するためのPCT公開番号WO 94/14976およびWO 99/50303（参照としてその全文を本明細書に組み込む）に記載されている方法により、タンパク質調製物中の抗原タンパク質および／または抗原ペプチドの集団をα2Mと共有結合的に複合体化することができる。例えば、求核活性化の逆転中に、熱を用いて（GronおよびPizzo, 1998, Biochemistry, 37:6009-6014；参照としてその全文を本明細書に組み込む）、抗原タンパク質および／または抗原ペプチドをアンモニアまたはメチルミン（もしくは、エチルアミンなど、その他の小アミン求核基）によりα2Mに組み込ませることができる。α2Mによるペプチドの思いがけない捕獲を可能にするこのような条件を用いて、本発明のα2M複合体を製造することができる。また、二官能基架橋剤を用いて、抗原タンパク質／ペプチドの集団とα2Mとの共有結合を実施することも可能である。このような架橋剤およびその使用方法は当分野ではよく知られている。複合体を形成後、架橋剤を不活性化および／または除去するのが好ましい。共有結合のための方法についてはすでに記載されている（Osadaら、1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:26-31；Osadaら、1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150-883；ChuおよびPizzo, 1993, J. Immunol. 150:48；Chuら、1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307；Mitsudaら、1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331）。
【０１６０】
さらに別の実施形態では、前述の非共有または共有結合方法による同じ反応で、タンパク質／ペプチドの集団をHSPまたはα2Mと複合体化することができる。
【０１６１】
被検者への投与の前に、別々の共有および／または非共有結合複合体化反応物からのHSPと抗原タンパク質および／またはペプチドの複合体を組み合わせて、組成物を形成することができる。また、別々の共有および／または非共有結合複合体化反応物からのα2Mと抗原タンパク質および／またはペプチドの複合体を随意に組み合わせて組成物を形成した後、被検者に投与することもできる。
【０１６２】
４．５．癌および感染症の予防および治療
本発明によれば、抗原細胞またはウイルス粒子の消化済細胞質ゾルおよび／または膜由来タンパク質から得た抗原ペプチドと、HSPおよび／またはα2Mとの複合体とを含む、本発明の組成物を癌または感染症に罹患した被検者に投与する。一実施形態においては、「治療」または「治療する」とは、癌または感染症、もしくはそれらの少なくとも１つの識別可能な症状の改善を意味する。別の実施形態では、「治療」または「治療する」とは、癌または感染症に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善（必ずしも被検者に認識されるわけではない）を意味する。さらに別の実施形態では、「治療」または「治療する」とは、癌または感染症の進行を、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、または生理学的に（物理的パラメーターの安定化）、もしくはその両方により、阻止することを意味する。
【０１６３】
特定の実施形態では、癌または感染症に対する予防処置として本発明の組成物を被検者に投与する。本明細書で用いる「予防」または「予防する」とは、所与の癌または感染症を獲得する危険度の低減を意味する。上記実施形態の一様式では、癌への遺伝的素因を有する被検者に、本発明の組成物を予防処置として投与する。上記実施形態の別の様式では、発癌物質（限定するものではないが、化学薬品および／または放射線など）への暴露を被る被検者、もしくは感染症の因子への暴露を被る被検者に、本発明の組成物を予防処置として投与する。
【０１６４】
例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物の投与により、該組成物の非存在下での増殖と比較して、癌細胞または感染因子の増殖が、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、もしくは少なくとも10％阻害または低減される。
【０１６５】
本発明の方法により製造される組成物は、熱ショックタンパク質と抗原ペプチドの集団との複合体、および／またはα-2-マクログロブリンと抗原ペプチドの集団との複合体を含む。この組成物は、腫瘍部位で炎症反応を誘発することがわかっており、治療を受ける癌患者における腫瘍負荷の後退を最終的にもたらすことができる。本発明の方法により製造された組成物は、被検者の免疫能を増強し、感染症因子に対し特異的な免疫、または前腫瘍および腫瘍細胞に対し特異的な免疫を誘発することができる。これらの組成物は、感染症の発症および進行を阻止し、腫瘍細胞の増殖および進行を阻害する能力を有する。
【０１６６】
組合せ療法とは、本発明のHSP複合体またはα2M複合体と、癌および感染症を予防または治療する別の治療剤の使用を意味する。本発明の複合体の投与により、抗癌薬または抗感染薬の効果を高めることができ、その逆の場合もある。好ましくは、この別の治療剤の形態は、非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤である、すなわち、この治療剤は、HSPまたはα2Mを成分として含んでいない。この手法は、一般に、組合せ療法、付加療法もしくは結合療法（本明細書ではこれらの用語は置き換え可能に用いる）と呼ばれる。組合せ療法では、相加的効力または相加的治療効果を観察することができる。治療効果が相加的効果より大きい相乗的結果も期待することができる。また、組合せ療法の使用は、前記治療剤、もしくはHSP複合体またはα2M複合体単独の投与と比較して優れた治療プロフィールをもたらすこともできる。相加的または相乗的効果により、治療薬のいずれかまたは両方の投与用量および／または投与頻度を調節して、不要または有害な作用を低減もしくは解消することができる。
【０１６７】
様々な具体的実施形態では、組合せ療法は、特定の治療剤による治療を受ける被検者に、HSP複合体またはα2M複合体を投与することを含むが、投与が行なわれるのは、単独で投与される前記治療剤が、被検者を治療する上で臨床的に十分ではなく、そのため、被検者が別の有効な療法を必要とする、例えば、HSP複合体またはα2M複合体の投与を含まない治療剤に、被検者が不応答性である場合などである。このような実施形態には、被検者が治療薬に応答するが、副作用、再発を被ったり、耐性を獲得したりするような、治療剤を受ける被検者に、HSP複合体またはα2M複合体を投与することを含む方法も包含される。このような被検者は、前記治療剤だけによる治療に不応答性または治療不応性である可能性がある；すなわち、癌細胞または病原体の少なくとも有意な部分が死滅しないか、その細胞分裂が停止されない。本発明の実施形態では、特定の治療剤単独では治療不応性の被検者にHSP複合体を投与することを含む本発明の方法が、本発明の方法に従って投与した場合、この治療剤の治療効果を改善することができるようにする。また、特定の治療剤単独では治療不応性の被検者にα2M複合体を投与することを含む本発明の方法も、本発明の方法に従って投与すると、この治療剤の治療効果を改善することができる。治療剤の効果の決定については、当分野では周知の方法を用いて、in vivoまたはin vitroで検定することができる。「治療不応性」の当分野で認められる意味は、癌に関してよく知られている。一実施形態では、癌または感染症は、癌細胞または病原体の数が、それぞれ有意に減少しないか、あるいは増加する場合に、治療不応性または不応答性であるとする。治療中の被検者の中には、化学療法または放射線療法を受ける者もいる。
【０１６８】
本発明によれば、本発明の複合体を多くの異なる治療剤と組み合わせて用いることができる。このような治療剤のいくつかは、特定タイプの癌または感染症に特に有効であり、第４．５．１および第４．５．２節に記載されている。その他多くの治療剤が、免疫系の機能状態に効果を有し、一般に、腫瘍および感染症の両方に適用可能である。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の複合体を１種以上の生体応答調節剤と組み合わせて用いることにより、癌または感染症を治療する。生体応答調節剤の一群にサイトカインがある。このような実施形態の１つでは、HSP／α2M複合体を受けている被検者にサイトカインを投与する。別の実施形態では、サイトカインと一緒に化学療法薬を受けている被検者に、HSP／α2M複合体を投与する。様々な実施形態では、１種以上のサイトカインを用いることができ、これは、以下のものからなる群より選択される：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TNFβ、G-CSF、GM-CSF、TGF-β、IL-15、IL-18、GM-CSF、INF-γ、INF-α、SLC、内皮単球活性化タンパク質-2（EMAP2）、MIP-3α、MIP-3β、もしくはHLA-B7のようなMHC遺伝子。加えて、その他のサイトカインの例として、限定するものではないが、以下に挙げるようなTNFファミリーの他のメンバーがある：TNF-α関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、TNF-α関連活性化誘導サイトカイン（TRANCE）、アポトーシスのTNF-α関連弱誘導物質（TWEAK）、CD40リガンド（CD40L）、リンホトキシンアルファ（LT-α）、リンホトキシンベータ（LT-β）、OX40リガンド（OX40）、Fas（FasL）、CD27リガンド（CD27L）、CD30リガンド（CD30L）、41BBリガンド（41BBL）、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17、およびAITR-L、もしくはその機能的部分。TNFファミリーの全般については、例えば、Kwonら、1999, Curr. Opin. Immunol. 11:340-345を参照されたい。前記治療剤の前に、HSP複合体またはα2M複合体を投与するのが好ましい。具体的実施形態では、癌の治療のためにIL-12と一緒にシクロホスファミドを受けている被検者に、本発明の複合体を投与する。
【０１７０】
別の実施形態では、免疫系の各種リガンド、受容体およびシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、１種以上の生体応答調節剤と組み合わせて、本発明の複合体を用いる。例えば、生体応答調節剤として、限定するものではないが、トール様受容体（TLR-2、TLR-7、TLR-8およびTLR-9）、LPSのアゴニスト；41BBリガンド、OX40リガンド、ICOS、およびCD40のアゴニスト；ならびに、Fasリガンド、PD1、およびCTLA-4のアンタゴニストが挙げられる。これらのアゴニストおよびアンタゴニストは、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ペプチド模擬化合物、および多糖類であってもよい。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、免疫刺激性核酸である、１種以上の生体応答調節剤と組み合わせて、本発明の複合体を用いる。このような核酸の多くは、非メチル化CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドであり、脊椎動物リンパ球の分裂促進因子であり、免疫応答を増強することが知られている。Woolridgeら、1997, Blood 89:2994-2998を参照されたい。このようなオリゴヌクレオチドについては、国際特許公開番号WO 01/22972、WO 01/51083、WO 98/40100およびWO 99/61056（各々、その全文を参照として本明細書に組み込む）、ならびに、米国特許第6,207,646号、第6,194,388号、第6,218,371号、第6,239,116号、第6,429,199号、ならびに第6,406,705号（各々、その全文を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。YpG-およびCpR-モチーフを含むホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような別種の免疫刺激性オリゴヌクレオチドについては、Kanjimallaらにより、”Effect of Chemical Modifications of Cytosine and Guanine in a CpG-Motif of Oligonucleotides: Structure-Immunostimulatory Activity Relationships”, Bioorganic & Medicinal Chemistry 9: 807-817（2001）に記載されており、この文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。また、CpGジヌクレオチドを欠失した免疫刺激性オリゴヌクレオチドも含まれ、これは、粘膜経路（低用量の投与を含む）または高用量で非経口経路により投与されると、往々にしてGpG核酸と同じくらい高度に抗体応答を増大するが、応答はTh2に偏っている（IgG1＞＞IgG2a）。米国特許第20010044416 A1号を参照されたい（その全文を参照として本明細書に組み込む）。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの活性を決定する方法は、前記特許および刊行物に記載されているように実施することができる。さらには、免疫刺激性オリゴヌクレオチドをリン酸主鎖、糖、ヌクレオベースおよびヌクレオチド間結合内で改変することにより、活性をモジュレートすることもできる。このような改変は、当業者には周知である。
【０１７２】
さらに別の実施形態では、本発明の複合体を１種以上のアジュバントと一緒に用いる。アジュバントは、個別に投与しても、本発明の複合体を含む組成物中に含有させてもよい。全身性アジュバントは、非経口経路で送達することができるアジュバントである。全身性アジュバントとしては、貯留効果を生み出すアジュバント、免疫系を刺激するアジュバント、およびその両方を果たすアジュバントがある。本明細書で用いる、貯留効果を生み出すアジュバントとは、抗原を身体中にゆっくりと放出させ、従って、抗原に対する免疫細胞の暴露を長く持続させるアジュバントである。このクラスのアジュバントとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ミョウバン（例：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；または、鉱油、非鉱油、油中水系もしくは水中油形エマルションなどのエマルションを基材とする製剤、例えば、モンタニドアジュバントのSeppic ISAシリーズ（例：Montanide ISA 720, AirLiquide、パリ、フランス）；MF-59（Span 85およびTween 80で安定化させた水中スクアレンエマルション；Chiron Corporation , エメリービル、Calif.；ならびにPROVAX（安定化デタージェントとミセル形成剤を含む水中油形エマルション；IDEC, Pharmaceuticals Corporation、サンディエゴ、Calif.）。
【０１７３】
その他のアジュバントは、免疫系を刺激する、例えば、免疫細胞にサイトカインまたはIgGを産生および分泌させる。このクラスのアジュバントとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：CpGオリゴヌクレオチドのような免疫刺激性核酸；シャボンノキの樹皮から精製したサポニン、例えば、QS21；ポリ[ジ(カルボキシラトフェン−オキシ)ホスファゼン（PCPPポリマー；Virus Research Institute, USA）；リポ多糖（LPS）の誘導体、例えば、モノホスロリルリピドＡ（MPL；Ribi ImmunoChem Research, Inc., ハミルトン、Mont.）、ムラミルジペプチド（MDP；Ribi）、アンドトレオニル−ムラミルジペプチド（t-MDP；Ribi）、OM-174（リピドＡに関連するグルコサミン二糖；OM Pharma SA、メイリン、Meyrin, スイス）；ならびにリーシュマニア延長因子（精製したリーシュマニアタンパク質；Corixa Corporation、シアトル、Wash.）。
【０１７４】
その他の全身性アジュバントとして、貯留効果を生み出し、かつ免疫系を刺激するアジュバントがある。これらの化合物は、前述した全身性アジュバントの機能の両方を有する化合物である。このクラスのアジュバントとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ISCOM（サポニン、脂質を混合して含み、抗原を保持できる孔を有するウイルスサイズの粒子を形成する免疫刺激複合体；CSL、メルボルン、オーストラリア）；SB-AS2（MPLとQS21を含む水中油形エマルションであるSmithKline Beechamアジュバント系#2：SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, ベルギー）；SB-AS4（ミョウバンとMPLを含むSmithKline Beechamアジュバント系#4：SBB、ベルギー）；CRL 1005のようなミセルを形成するノニオンブロックコポリマー（これらは、ポリオキシエチレンの鎖と隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの線状鎖を含む；Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.）；ならびに、シンテキストアジュバント製剤（Syntex Adjuvant Formulation）（SAF、Tween 80とノニオンブロックコポリマーを含む水中油形エマルション；Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.）。
【０１７５】
本発明に従う有用な粘膜系アジュバントは、本発明の複合体と一緒に、粘膜表面に投与されると、被検者において粘膜免疫応答を誘発することができるアジュバントである。粘膜系アジュバントとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：CpG核酸（例えば、PCT公開特許出願WO 99/61056）、細菌毒素：例えば、コレラ毒素（CT）、CT誘導体（例えば、限定するものではないが、CT Bサブユニット（CTB）（Wuら、1998, Tochikuboら、1998））；CTD53（Val〜Asp）（Fontanaら、1995）；CTK97（Val〜Lys）（Fontanaら、1995）；CTK104（Tyr〜Lys）（Fontanaら、1995）；CTD53/K63（Val〜Asp、Ser〜Lys）（Fontanaら、1995）；CTH54（Arg〜His）（Fontanaら、1995）；CTN107（His〜Asn）（Fontanaら、1995）；CTE114（Ser〜Glu）Fontanaら、1995）；CTE112K（Glu〜Lys）（Yamamotoら、1997a）；CTS61F（Ser〜Phe）（Yamamotoら、1997a、1997b）；CTS106（Pro〜Lys）（Douceら、1997、Fontanaら、1995）；およびCTK（Ser〜Lys）（Douceら、1997、Fontanaら、1995）、閉鎖帯毒素、zot、大腸菌熱不安定エンテロトキシン、不安定毒素（LT）、LT誘導体（例えば、限定するものではないが、LT Bサブユニット（LTB）（Verweijら、1998）；LT7K（Arg〜Lys）（Komaseら、1998、Douceら、1995）；LT61F（Ser〜Phe）（Komaseら、1998）；LT112K（Glu〜Lys）（Komaseら、1998）；LT118E（Gly〜Glu）（Komaseら、1998）；LT146E（Arg〜Glu）（Komaseら、1998）；LT192G（Arg〜Gly）（Komaseら、1998）；LTK63（Ser〜Lys）（Marchettiら、1998、Douceら、1997、1998、Di Tommasoら、1996）；およびLTR（Ala〜Arg）（Giulianiら、1998））、百日咳毒素、PT.(Lyckeら、1992, Spangler BD, 1992, FreytagおよびClemments, 1999、Robertsら、1995, Wilsonら、1995)（例えば、PT-9K/129G（Robertsら、1995、Cropleyら、1995））；毒素誘導体（以下参照）（Holmgrenら、1993, Verweijら、1998, Rappuoliら、1995, FreytagおよびClemments, 1999））；リピドＡ誘導体（例：モノホスホリルリピドＡ、MPL）（Sasakiら、1998, Vancottら、1998；ムラミルジペプチド（MDP）誘導体（Fukushimaら、1996, Ogawaら、1989, Michalekら、1983, Morisakiら、1983）；細菌外膜タンパク質（例：外側表面プロテインＡ（Osp A）ライム病ボレリアのリポタンパク質、髄膜炎菌の外膜タンパク質）（Marinaroら、1999, Van de Vergら、1996）；水中油形エマルション（例：MF59）（Barchfieldら、1999, Vershoorら、1999, O’Hagan, 1998）；アルミニウム塩（Isakaら、1998, 1999）；およびサポニン（例：QS21）Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, Me.）（Sasakiら、1998, MacNealら、1998）、ISCOM、MF-59（Span 85とTween 80で安定化した水中スクアレンエマルション；Chiron Corporation、エメリービル、Calif.）；モンタニドアジュバントのSeppic ISAシリーズ（例：Montanide ISA 720, AirLiwuide、パリ、フランス）；PROVAX（安定化デタージェントとミセル形成剤を含む水中油形エマルション；IDEC, Pharmaceuticals Corporation、サンディエゴ、Calif.）；シンテキストアジュバント製剤（Syntext Adjuvant Formulation）（SAF；Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.）；ポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン（PCPPポリマー；Virus Research Institute, USA）；ならびにリーシュマニア延長因子（Corixa Corporation, シアトル、Wash.）。
【０１７６】
４．５．１．標的癌
一実施形態において、組合せ療法は、本発明の複合体の投与に加えて、癌の予防または治療に役立つ１種以上の治療剤の補助的使用を含み、このようなの治療剤として、限定するものではないが、化学療法薬、免疫治療薬、抗血管形成薬、サイトカイン、ホルモン、抗体、ポリヌクレオチド、放射線および光力学療法薬などが挙げられる。具体的実施形態では、組合せ療法を用いて、癌の再発を予防したり、転移を阻害したり、あるいは、癌または転移の増殖および／または拡大を阻害することができる。
【０１７７】
本発明の方法により治療または予防できる癌の種類として、限定するものではないが、ヒト肉腫および癌があり、その例を以下に挙げる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、頚管癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経腫、希突起グリオーマ、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性髄膜性白血病（骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性髄膜性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真正赤血球増加、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病。
【０１７８】
別の実施形態では、癌に罹患した患者は、HSPおよび／またはα2Ｍ−ペプチド複合体の投与、もしくはHSPおよび／またはα2Ｍ−感作APCの投与の前に、抗癌治療（例：化学療法、放射線）を受けているため、免疫抑制されている。
【０１７９】
本発明により提供される免疫療法が癌患者への使用になぜ望ましいかについては、様々な理由がある。第１に、麻酔を伴う手術は免疫抑制を起こす可能性がある。手術前期間における適切な免疫療法により、この免疫抑制を防止または解消することができる。これにより、感染性の合併症が少なくなると同時に、創傷の治癒が早くなる。第２に、手術後腫瘍の嵩は最小であるため、この状態での免疫療法は最も有効となりやすい。第３の理由は、腫瘍細胞は手術時に循環中に流入する可能性があり、この時点で有効な免疫療法を実施すれば、このような細胞を排除できるからである。
【０１８０】
本発明の予防および治療方法は、癌の阻害を目的とすると共に、臨床上の最終的目的は完全な癌の後退および根絶であり、手術前または後のいずれかに癌患者の免疫能を増強し、癌細胞に対し腫瘍特異的免疫を誘発することを目指す。本発明の方法は、特定タイプの癌の高い危険にさらされている（例えば、家族の病歴または環境上の危険因子のために）個体に用いることもできる。
【０１８１】
様々な実施形態において、本発明の複合体に加えて、１種以上の抗癌薬を投与して、癌患者を治療する。抗癌薬とは、腫瘍または癌の治療に役立つ分子または化合物を意味する。本発明の方法で用いることができる抗癌薬の例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アンサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタト；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブルスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメール；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレルシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エノプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンII（組換えインターロイキンIIまたはrII2を含む）；インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-I a；インターフェロンγ-I b；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；マイコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメルナトリウム；��ルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバシン；プロマイシン；塩酸プロマイシン；ピラゾフリン；リボフリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シントラゼン；スパルファセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スプロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンプラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデスチン；硫酸ビンデスチン；硫酸ビンピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。
【０１８２】
用いることができるその他の抗癌薬として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL-TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドクス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アンルビシン；アンサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；新血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；抗背側形成(dosalizing)形態形成タンパク質-1；抗男性ホルモン、前立腺癌；抗エステロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節剤；アプリン酸；アラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタト；BCR/ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾリスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；bFGF阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドジタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポクスIL-2；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来の阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロルンズ；クロロキノキサリンスルホアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン816；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム；
シペマイシン；シタラビン；オクホスフェート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デストレリン；デキサメタゾン；デキシホスタミド；デキスラゾキサン；デキスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドクス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシジン；ジヒドロタキソール、9-；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；ホルフェニメクス；フォルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゲラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビサセタミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタト；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨウドドキソルビシン；イポメアノール、4-；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−N三酢酸；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レオトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；疎油性白金化合物；リッソクリナミンド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶菌ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタト；マソプロコル；マスピン；マトリシリン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖RNA；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁sk；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍サプレッサー１による療法薬；マスタード抗癌薬；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁���出物；ミリアポロン；N-アセチルジナリン；N-置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチプ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ヌルタミド；ニサマイシン；酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；O6-ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプタチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィメルナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグラジンJ2；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡを用いた免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、ミクロアルガール；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホソホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；rasファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；デメチル化レテリプチン；レニウムRe 186エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；RIIレチナミド；ログレチミド；ロヒツカイン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンB1；ルゴキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Sdi 1模擬物；セムスチン；セネッセンス由来のインヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメルシン阻害剤；スルフィノシン；スーパーアクティブバソアクティブインテスティナルペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブ��スチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模擬物；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；チロイド刺激ホルモン；錫エチルエピオプルプリン；チラパザミン；チタノセンビクロリド；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリブン；トリメトレキセート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシン；キナーゼインヒビター；チルホスチン；UBC阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法薬；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；ならびに、ジノスタチンスチマラメル。
【０１８３】
抗癌薬は化学療法薬でもよく、このようなものとして、限定するものではないが、以下の化合物群が挙げられる：細胞傷害性抗生物質、抗代謝剤、抗有糸分裂剤；アルキル化剤、白金化合物、ヒ素化合物、DNAトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素；ならびに、これらの合成誘導体。以下の表１に化合物群の例を挙げる：
【表１】
2006514088.tif 000002
【０１８４】
2006514088.tif 000003
【０１８５】
2006514088.tif 000004
【０１８６】
本発明では、１種以上の化学療法薬を含む組成物（例：FLAG、CHOP）も考慮する。FLAGは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ara-C）およびG-CSFを含む。CHOPは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。前記リストの各々は例示のためであり、制限を意図するものではない。
【０１８７】
一実施形態では、5-フルオロウラシル、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ヘルセプチン（登録商標）、ゲンシタビン、IL-2、パクリタキセル、および／またはVP-16（エトポシド）と一緒に、本発明の複合体を含む医薬組成物で、乳癌を治療することができる。
【０１８８】
別の実施形態では、パクリタキセル、ドセタキセル、ミトキサントロン、および／またはアンドロゲン受容体アンタゴニスト（例：フルタミド）と一緒に、本発明の複合体を含む医薬組成物で、前立腺癌を治療することができる。
【０１８９】
別の実施形態では、フルダラビン、シトシンアラビノシド、ゲンツズマブ（MYLOTARG）、ダウノルビシン、メトトレキセート、ビンクリスチン、6-メルカプトプリン、イダルビシン、ミトキサントロン、エトポシド、アルパラギナーゼ、プレドニゾンおよび／またはシクロホスファミドと一緒に、本発明の複合体を含む医薬組成物で、白血病を治療することができる。別の実施形態として、デキサメタゾンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、骨髄腫を治療することができる。好ましくは、白血病は慢性骨髄性白血病（CML）であり、HSP複合体は、hsp70-ペプチド複合体を含み、前記治療剤はイマチニブメシレートまたはグリーベク（Gleevec）（商標）である。
【０１９０】
別の実施形態では、ダカルバジンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、黒色腫を治療することができる。
【０１９１】
別の実施形態では、イリノテカンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、結腸直腸癌を治療することができる。
【０１９２】
別の実施形態では、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシドおよび／またはシスプラチンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、肺癌を治療することができる。
【０１９３】
別の実施形態では、シクロホスファミド、CHOP、エトポシド、ブレオマイシン、ミトキサントロンおよび／またはシスプラチンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、非ホジキンリンパ腫を治療することができる。
【０１９４】
別の実施形態では、シスプラチンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、胃癌を治療することができる。
【０１９５】
別の実施形態では、ゲンシタビンと一緒に本発明の複合体を含む医薬組成物で、膵臓癌を治療することができる。
【０１９６】
本発明によれば、癌の予防または治療のために、抗癌薬の前、後、もしくはこれと同時に本発明の複合体を投与することができる。癌の種類に応じて、被検者の病歴および状態、ならびに、選択した抗癌薬に応じ、化学療法薬の用量および時間的設定について本発明の複合体の使用を調整することができる。
【０１９７】
化学療法薬のプログラムに本発明の複合体の使用を加えることができる。一実施形態では、化学療法薬は、100〜1,000 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のゲンシタビンである。一実施形態では、化学療法薬は、200〜4,000 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のダカルバジンである。好ましい実施形態では、ダカルバジンの用量は、700〜1,000 mg／m2／サイクルの範囲にある。別の実施形態では、化学療法薬は、25〜50 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のフルダラビンである。別の実施形態では、化学療法薬は、200〜2,000 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のシトシンアラビノシド（Ara-C）である。別の実施形態では、化学療法薬は、1.5〜7.5 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のドセタキセルである。別の実施形態では、化学療法薬は、５〜15 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のパクリタキセルである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、５〜20 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のシスプラチンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、５〜20 mg／kg／サイクルの範囲にある用量の5-フルオロウラシルである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、２〜８mg／kg／サイクルの範囲にある用量のドキソルビシンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、40〜160 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のエピポドフィロトキシンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、50〜200 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のシクロホスファミドである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、50〜75、75から100、100〜125、もしくは125から150 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のイリノテカンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、3.7〜5.4、5.5〜7.4、7.5から11、もしくは11〜18.5 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のビンブラスチンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、0.7〜1.4、もしくは1.5〜２mg／m2／サイクルの範囲にある用量のビンクリスチンである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、3.3〜５、５から10、10〜100、もしくは100から1,000 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のメトトレキセートである。
【０１９８】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、組合せ療法プログラムの一部として投与する場合、低用量の化学療法薬の使用を含む。例えば、本発明の複合体を用いた初期の治療で、所定用量の化学療法薬による後の攻撃に対する腫瘍の感度を高めるが、その際、化学療法薬の用量は、本発明の複合体を用いずに投与する場合の下限範囲に近いか、それ以下である。
【０１９９】
一実施形態では、本発明の複合体と低用量（例えば、６〜60 mg／m2／日以下）のドセタキセルを癌患者に投与する。別の実施形態では、本発明の複合体と低用量（例えば、10〜135 mg／m2／日以下）のパクリタキセルを癌患者に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の複合体と低用量（例えば、2.5〜25 mg／m2／日以下）のフルダラビンを癌患者に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の複合体と低用量（例えば、0.5〜1.5 mg／m2／日以下）のシトシンアラビノシド（Ara-C）を癌患者に投与する。別の実施形態では、化学療法薬は、10〜100 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のゲンシタビンである。別の実施形態では、化学療法薬は、５〜10、10〜20、20〜40、もしくは40〜75 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のシスプラチン、例えば、PLATINOLまたはPLATINOL-AQ（Bristol Myers）である。さらに別の実施形態では、7.5〜75 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のシスプラチンを卵巣癌患者に投与する。さらに別の実施形態では、５〜5０ mg／m2／サイクルの範囲にある用量のシスプラチンを膀胱癌患者に投与する。別の実施形態では、化学療法薬は、２〜４、４〜８、８〜16、16〜35、もしくは35〜75 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のカルボプラチン、例えば、PARAPLATIN（Bristol Myers）である。さらに別の実施形態では、7.5〜75 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のカルボプラチンを卵巣癌患者に投与する。別の実施形態では、５〜50 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のカルボプラチンを膀胱癌患者に投与する。さらに別の実施形態では、２〜20 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のカルボプラチンを精巣癌患者に投与する。別の実施形態では、化学療法薬は、６〜10、10〜30、もしくは30〜60 mg／m2／サイクルの範囲にある用量のドセタキセル、例えば、TAXOTERE（Rhone Poulenc Rorer）である。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、10〜20、20〜40、40〜70、もしくは70〜135 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のパクリタキセル、例えば、TAXOL（Bristol Myers）である。別の実施形態では、化学療法薬は、0.5〜５mg／kg／サイクルの範囲にある用量の5-フルオロウラシルである。さらに別の実施形態では、化学療法薬は、２〜４、４〜８、８から15、15から30、もしくは30〜60 mg／kg／サイクルの範囲にある用量のドキソルビシン、例えば、ADRIAMYCIN（Pharmacia & Upjohn）、DOXIL（Alza）、RUBEX（Bristol Myers Squibb）である。
【０２００】
別の実施形態では、本発明の複合体は、抗体およびワクチンのような１種以上の免疫治療薬と組み合わせて投与する。好ましい実施形態では、抗体は、癌に対してin vivoでの治療および／または予防の用途を有する。いくつかの実施形態では、感染症の治療および／または予防に抗体を用いることができる。治療および予防抗体の例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：MDX-010（Medarex, NJ）：前立腺癌の治療のために現在臨床の現場で用いられているヒト化抗CTLA-4抗体；SYNAGIS（登録商標）（MedImmune, MD）：RSV感染患者の治療に用いられるヒト化抗RSウイルス（RSV）モノクローナル抗体；HERCEPTIN（登録商標）（Trastuzumab）（Genentech, CA）：転移性乳癌患者の治療に用いられるヒト化抗HER2モノクローナル抗体。その他の例として、以下のものが挙げられる：ヒト化抗CD18F(ab’)2（Genentech）；ヒト化抗CD18F(ab’)2であるCDP860（Celltech, UK）；CD4と融合した抗HIV gp120抗体（Progenics/Genzyme Transgenics）；ヒト抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体であるオスタビル（Protein Design Lab/Novartis）；ヒト化抗CMV IgG1抗体であるPROTOVIR（商標）（Protein Design Lab/Novartis）；マウス抗TNF-αF(ab’)2であるMAK-195（SEGARD）（Knoll Pharmas/BASF）；抗CD14抗体であるIC14（ICOS Pharm）；ヒト化抗VEGF IgG1抗体（Genentech）；マウス抗CA 125抗体であるOVAREX（商標）（Altarex）；マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX（商標）（Glaxo Wellcome/Centocor）；マウス抗インディオタイプ（GD3エピトープ）IgG抗原であるBEC2（ImClone System）；キメラ抗EGFR IgG抗体であるIMC-C225（ImClone System）；ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN（商標）（Applied Molecular Evolution/MedImmune）；ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03（Leukosite）；ヒト化抗CD33 IgG1抗体であるSmart M195（Protein Design Lab/Kanebo）；キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN（商標）（IDEC Pharm/Genetech、Roche/Zettyaku）；ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE（商標）（Immunomedics）；ヒト化抗HLA抗体であるSmart ID10（Protein Design Lab）；放射線標識したマウス抗HLA DIAGNOSTIC REAGENT抗体であるONCOLYM（商標）（Lym-1）（Techniclone）；ヒト抗IL8抗体であるABX-IL8（Abgenix）；ヒト化IgG1抗体である抗CD11a（Genentech/Xoma）；ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3（ICOS Pharm）；霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-1114（IDEC Pharm/Mitsubishi）；放射線標識したマウス抗CD20抗体であるZEVALIN（商標）（IDEC/Schering AG）；ヒト化抗CD40L抗体であるIDEC-131（IDEC/Eisai）；霊長類化抗CD4抗体であるIDEC-151（IDEC）；霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152（IDEC/Seikagaku）；ヒト化抗CD3 IgGであるSMAT抗CD3（Protein Design Lab）；ヒト化抗補体因子５（C5）抗体である5G1.1（Alexion Pharm）；抗TNF-α抗体であるD2E7（CAT/BASF）；ヒト化抗TNF-αFabフラグメントであるCDP870（Celltech）；霊長類化抗CD4 IgG1抗体であるIDEC-151（IDEC/SmithKline Beecham）；ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4（Medarex/Eisai/Genmab）；ヒト化抗TNF-αIgG4抗体であるCDP571（Celltech）；ヒト化抗α4β7抗体であるLDP-02（LeukoSite/ Genentech）；ヒト化抗CD4 IgG抗体であるOrthoClone OKT4A（Ortho Biotech）；ヒト化抗CD40 IgG抗体であるANTONA（商標）（Biogen）；ヒト化抗VLA-4 IgG抗体であるANTEGREN（商標）（Elan）；ヒト抗CD64（FcγR）抗体であるMDX-33（Medarex/Centeon）；ヒト化抗IL-5 IgG4抗体であるSCH55700（Celltech/Schering）；それぞれ、ヒト化抗IL-5および抗IL-4抗体であるSB-240563およびSB-240683（SmithKline Beecham）；ヒト化抗IgE IgG1抗体であるrhuMab-E25��Genentech/Norvatis/Tanox Biosystems）；マウス抗CD-147 IgM抗体であるABX-CBL（Abgenix）；ラット抗CD2 IgG抗体であるBTI-322（Medimmune/BioTransplant）；マウス抗CD3 IgG2a抗体であるOrthoClone/OKT3（ortho Biotech）；キメラ抗CD25 IgG抗体であるSIMULECT（商標）（Norvatis Pharm）；ヒト化抗β2-インテグリン IgG抗体であるLPD-01（LeukoSite）；マウス抗CD18 F(ab’)2である抗LFA-1（Pasteur-Merieux/Immunotech）；ヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152（Cambridge Ab Tech）；ならびにキメラ抗VII因子抗体であるコルセビンＭ（Centocor）。以上挙げた免疫反応性試薬、ならびに、その他の免疫反応性試薬は、当業者には周知のプログラム（免疫反応性試薬の供給者により推奨されるプログラムなど）に従い投与することができる。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明の複合体を１種以上の抗血管形成薬と組み合わせて投与するが、このような薬剤として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アンギオスタチン、タリドミド、クリングル５、エンドスタチン、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）抗トロンビン、フィブロネクチンの29 kDa N-末端および40 kDa C末端タンパク質分解断片、プロラクチンの16 kDaタンパク質分解断片、血小板因子４の7.8 kDaタンパク質分解断片、血小板因子４に対応する13アミノ酸ペプチド（Maioneら、1990, Cancer Res. 51：2077-2083）、コラーゲンＩの断片に対応する14アミノ酸ペプチド（Tolmaら、1993, J. Cell Biol. 122:497-511）、トロンボスポンジンIの断片に対応する19アミノ酸ペプチド（Tolsmaら、1993, J. Cell Biol. 122:497-511）、SPARCの断片に対応する20アミノ酸ペプチド（Sageら、1995, J. Cell. Biochem. 57:1329-1334）、もしくは、これらの断片、ファミリーメンバー、もしくは変異体、さらにはこれらの薬学的に許容される塩。
【０２０２】
新血管形成を阻害し、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲン、およびEGFに対応するその他のペプチドも記載されている（例えば、Cao, 1998, Prog Mol Subcell Biol. 20:161-176）。RGDタンパク質（すなわち、ペプチドモチーフArg-Gly-Aspを有する）に結合する特定のインテグリンを阻止するモノクローナル抗体および環状ペンタペプチドは、抗血管形成活性を有することが証明されている（Brooksら、1994, Science 264:569-571；Hammesら、1996, Nature Medicine 2:529-533）。さらには、受容体アンタゴニストによるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体の阻害により、新血管形成、腫瘍成長および転移が阻害される（Minら、1996, Cancer Res. 56:2428-33；Crowleyら、1993, Proc Natl Acad Sci. 90:5021-25）。本発明の複合体と組み合わせたこのような抗血管形成薬の使用も本発明により考慮される。
【０２０３】
さらに別の実施形態では、ホルモン療法薬と組み合わせて、本発明の複合体を用いる。ホルモン療法薬としては、以下のものが挙げられる：ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例：フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（LUPRON）、LH-RHアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセッシングの阻害剤、およびステロイド（例：デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エステロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例：all-transレチノイン酸（ATRA））；ビタミンD3類似体；抗ゲスターゲン（例：ミフェプリストン、オナプリストン）、ならびに、抗男性ホルモン（例：酢酸シプロテロン）。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、癌の治療における遺伝子療法プログラムと組み合わせて、本発明の複合体を用いる。一実施形態では、インターロイキン２を分泌する組換え細胞を用いた遺伝子療法薬を本発明の複合体と組み合わせて投与することにより、癌、特に乳癌を予防または治療する（例えば、Deshmukhら、2001, J Neurosurg. 94:287-92）。他の実施形態では、ポリヌクレオチド化合物（例えば、限定するものではないが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、RNA妨害分子、三重らせんポリヌクレオチドなど）を用いて、遺伝子療法を実施するが、その際、このような化合物のヌクレオチド配列は、腫瘍または癌の開始、進行、および／または病理学につながる遺伝子のDNAおよび／またはRNAのヌクレオチド配列に関連する。例えば、多くは癌遺伝子、成長因子遺伝子、成長因子受容体遺伝子、細胞周期遺伝子、DNA修復遺伝子であり、これらは当分野でよく知られている。
【０２０５】
別の実施形態では、放射線療法と一緒に、本発明の複合体を投与する。放射線治療の場合、放射線はガンマ線またはＸ線でよい。この方法は、放射線療法を含む癌の治療を包含し、例えば、外部ビーム照射療法、放射性同位元素（I-125、パラジウム、イリジウム）の壁内埋込み、ストロンチウム-89のような放射性同位元素、胸部照射療法、腹腔内P-32照射療法、および／または全腹部および／または骨盤照射療法などがある。放射線療法全般については、Hellman、第16章：Principles of Cancer Mangagement: Radiation Therapy、第6版、2001, DeVitaら編、J.B.Lippencott Campany, フィラデルフィアを参照されたい。好ましい実施形態では、または離れた線源から照射が向けられる外部ビーム照射または遠隔照射療法として、放射線治療を投与する。様々な好ましい実施形態では、線源が癌細胞または腫瘍塊近傍の身体内部に置かれる、内部治療または近接照射療法として、放射線治療を実施する。また、光増感剤、例えば、ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポルフィン（BPD-MA）、フタロシアニン、光増感剤Pc4、デメトキシ−ヒポクレリンＡ；ならびに2BA-2-DMHAの投与を含む光力学的療法と、本発明の複合体を組み合わせて用いることも包含される。
【０２０６】
様々な実施形態では、短い治療サイクルで、本発明の複合体を少なくとも１種の化学療法薬と組み合わせて癌患者に投与することにより、癌を治療する。化学療法薬を用いる治療期間は、用いる具体的な癌治療薬に応じて変動する。本発明はまた、断続的投与、または毎日の用量を数回の部分に分けて行なう投与も考慮する。特定の癌治療薬に適した治療期間は、精通した当業者により判断され、本発明は、各種癌治療薬について最適な治療スケジュールの連続した評価も包含する。本発明は、単一の治療薬または一連の治療薬を投与する少なくとも１つのサイクル、好ましくは、１以上のサイクルを考慮する。１サイクルに適した期間は、精通した当業者により判断され、サイクルの総数、およびサイクル同士の間隔も同様である。
【０２０７】
別の実施形態では、癌の症状（限定するものではないが、痛みなど）や、本発明の複合体により生じる副作用（限定するものではないが、インフルエンザ様症状、熱など）を改善する化合物と組み合わせて、本発明の複合体を用いる。従って、本発明の複合体と組み合わせて、またはこれを添加して、痛み、インフルエンザ様症状および熱を軽減することが知られる様々な化合物を用いることができる。このような化合物として、鎮痛薬（例：アセタミノフェン）、うっ血除去薬（例：シュードエフェドリン）、抗ヒスタミン剤（例：マレイン酸クロルフェニラミン）、および咳抑制剤（例：デキストロメトルファン）などが挙げられる。
【０２０８】
４．５．２．標的感染症
本発明の方法により治療または予防することができる感染症は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、および寄生生物などの感染因子により引き起こされる。本発明は、細胞内病原体に起因する感染症の治療または予防に限定されるわけではない。文献には、多数の医療関連微生物が詳細に記載されており、例えば、C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Balliere Tindall, Great Britain 1983（この文献の全文を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。
【０２０９】
組合せ療法は、本発明の複合体の投与に加えて、感染症の予防または治療に役立つ１種以上の治療剤の使用を含む。このような治療剤として、限定するものではないが、抗生物質、抗ウイルス、抗原生動物化合物、抗真菌化合物、および抗蠕虫薬が挙げられる。感染症を予防または治療するのに用いることができるその他の治療剤として、前述したような免疫療法薬、ポリヌクレオチド、抗体、サイトカイン、およびホルモンが挙げられる。
【０２１０】
ヒトおよびヒト以外の脊椎動物両方の感染性ウイルスとして、レトロウイルス、RNAウイルスおよびDNAウイルスがある。ヒトに認めらるウイルスの例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：レトロウイルス科（例：ヒト免疫不全ウイルス、例えば、HIV-1（HTLV-III、LAVまたはHTLV-III/LAV、もしくはHIV-IIIとも呼ばれる）；およびその他の単離物、例えば、HIV-LP；ピコナウイルス科（例：ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例：胃腸炎を起こす株）；トガウイルス（ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例：デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例：コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例：水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例：エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例：パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス；麻疹ウイルス；RSウイルス）；オルソミクソウイルス（例：インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例：ハンターンウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（例：出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例：レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（HSV）１および２型、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘疹ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス（例：アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例：海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部感染；クラス２非経口的感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびに、アストロウイルス）。
【０２１１】
考慮されるレトロウイルスには、単純レトロウイルスと複合レトロウイルスの両方が含まれる。単純レトロウイルスとしては、Ｂ型レトロウイルスの亜群、Ｃ型レトロウイルスおよびＤ型レトロウイルスが挙げられる。Ｂ型レトロウイルスの例として、マウス乳腺癌ウイルス（MMTV）がある。Ｃ型レトロウイルスは、Ｃ型Ａ群の亜群（例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、トリ白血病ウイルス（ALV）、およびトリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）など）と、Ｃ型Ｂ群の亜群（例えば、マウス白血病ウイルス（MLV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、マウス肉腫ウイルス（MSV）、テナガザル白血病ウイルス（GALV）、膵臓壊死ウイルス（SNV）、網内皮症ウイルス（RV）およびサル肉腫ウイルス（SSV）など）を含む。Ｄ型レトロウイルスは、マソン−ファイザーウイルス（MPMV）とサルレトロウイルス１型（SRV-1）を含む。複合レトロウイルスは、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルスおよび泡沫状(foamy)ウイルスの亜群を含む。レンチウイルスは、HIV-1を含むが、HIV-2、SIV、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ならびにウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）も含む。Ｔ細胞白血病ウイルスは、HTLV-1、HTLV-II、サルＴ細胞白血病ウイルス（STLV）、ならびにウシ白血病ウイルス（BLV）を含む。泡沫状ウイルスは、ヒト泡沫状ウイルス（HFV）、サル泡沫状ウイルス（SFV）およびウシ泡沫状ウイルス（BFV）を含む。
【０２１２】
脊椎動物における抗原であるRNAウイルスの例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：レオウイルス科、例えば、オルソレオウイルス属（哺乳動物およびトリレトロウイルスの多種血清型）など；オルビウイルス属（ブルータングウイルス、（ユージェナジー）Eugenangeeウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ疫ウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス）；ピコルナウイルス科、例えば、エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、ECHOウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ME）ウイルス、マウスポリオウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（EMC）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも113の亜型を含むヒトライノウイルス；その他のライノウイルス）、アプトウイルス属（口蹄疫（FMDV））など；カルシウイルス科、例えば、ブタウイルスのブタ水疱疹、サン・ミグエルアシカウイルス、ネコピコルナウイルスおよびノーウォークウイルスなど；トガウイルス科、例えば、アルファウイルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングンヤウイルス、オニョン−ニョンウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス）、フラビウイルス属（カ媒介性黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介性ウイルス、極東ダニ媒介性ウイルス、キャサヌール森林病、跳躍IIIウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜疾患ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）など；ブンヤウイルス科、例えば、ブンヤウイルス属（ブンヤウエラおよび近縁ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアスナバエ熱、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウウクウイルス属（ウウクニエミおよび近縁ウイルス）；オルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多数のヒト亜型）；ブタインフルエンザウイルス、ならびにトリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザウイルスＢ型（多数のヒト亜型）、およびインフルエンザウイルスＣ型（別の属の可能性がある）；パラミクソウイルス科、例えば、パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューキャッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、モルビリウイルス（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス（RSウイルス（RSV）、ウシRSウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス）；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングンヤウイルス、オニョング−ニョングウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス）、フラビウイルス属（カ媒介性黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介性ウイルス、極東ダニ媒介性ウイルス、キャサヌール森林病、跳躍IIIウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜疾患ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス科、例えば、ブンヤウイルス属（ブンヤウエラおよび近縁ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアスナバエ熱、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウウクウイルス属（ウウクニエミおよび近縁ウイルス）；オルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多数のヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、ならびにトリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザウイルスＢ型（多数のヒト亜型）、およびインフルエンザウイルスＣ型（別の属の可能性がある）；パラミクソウイルス科、例えば、パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューキャッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、モルビリウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（RSウイルス（RSV）、ウシRSウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス）；ラブドウイルス科、例えば、ベシキュロウイルス属（VSV）、チャンジプラウイルス、フランダース−ハートパークウイルス）、狂犬病ウイルス属（狂犬病ウイルス）、魚ラブドウイルス、ならびに、２種の推定ラブドウイルス（マーブルグウイルスおよびエボラウイルス）；アレナウイルス科、例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCM）、タカリベウイルス複合体、およびラッサウイルス；コロナウイルス属、例えば、感染性気管支炎ウイルス（IBV）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸コロナウイルス、およびネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネココロナウイルス）。
【０２１３】
脊椎動物における抗原であるDNAウイルスの例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：ポックスウイルス科、例えば、オルソポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サルポックスワクシニア、ウシポックス、バッファローポックス、ウサギポックス、エレクトロメリア）、ウサギポックスウイルス（ミクソーマ、線維種）、アビポックスウイルス属（禽痘、その他のトリポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウイルス属（ブタポックス）、パラポックスウイルス属（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス２および３、魚のリンパ膿腫ウイルス）；ヘルペスウイルス科、例えば、アルファ−ヘルペスウイルス（単純ヘルペス１型および２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３、偽狂犬病ウイルス、感染性ウシ角結膜炎ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎、ネコ鼻気管炎、感染性喉頭気管炎）、ベータ−ヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、ならびにブタ、サルおよびげっし動物のサイトメガロウイルス）；ガンマ−ヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（EBV）、マレック病ウイルス、リスザルヘルペス、クモザルヘルペスウイルス、ノウサギヘルペスウイルス、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）；アデノウイルス科、例えば、マストアデノウイルス（ヒト亜群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび未分類のもの）；サルアデノウイルス（少なくとも23の血清型）、感染性イヌ肝炎、ならびに畜牛、ブタ、ヒツジ、カエルおよびその他多数の種、アビアデノウイルス（ニワトリアデノウイルス）；および非培養性アデノウイルス；パポウイルス科、例えば、パピローマウイルス属（ヒト乳頭腫ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ショープウサギ乳頭腫ウイルス、ならびにその他の種の様々な病原性乳頭腫ウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サル空胞化ウイルス（SV-40）、ウサギ空胞化ウイルス（RKV）、Ｋウイルス、BKウイルス、JCウイルス、ならびに向リンパ性乳頭腫ウイルスのようなその他の霊長類ポリオーマウイルス）；パルボウイルス科、例えば、アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（イヌ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）。最後に、DNAウイルスには、前記の科に当てはまらないクルおよびクロイツフェルト−ヤコブ病ウイルスや、慢性感染性神経障害因子なども含まれる。
【０２１４】
本発明の複合体と組み合わせて用いることができる抗ウイルス化合物の多くの例が当分野では知られており、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：リファンピシン、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例：AZT、ddI、ddC、3TC、d4T）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例：エファビレンズ、ネビラピン）、プロテアーゼ阻害剤（例：アプレナビル、インジナビル、リトナビル、およびサキナビル）、イドクスリジン、シドフォビル、アシクロビル、ガンシクロビル、ザナミビル、アマンタジン、ならびにパリビズマブ。抗ウイルス剤のその他の例として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム；アデホビル；アロブジン；アルビルセプトスドトクス；塩酸アマンタジン；アラノチン；アリルドン；アテビルジンメシレート；アビルジン；シドホビル；シパンフィリン；塩酸シタラビン；デラビルジンメシレート；デシクロビル；ジダノシン；ジソキサリル；エドクスジン；エンビラデン；エンビロキシム；ファンシクロビル；塩酸ファモチン；フィアシタビン；フィアルリジン；ホサリレート；ホスカメトナトリウム；フォスホネトナトリウム；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；イドクスリジン；ケトキサール；ラミブジン；ロブカビル；塩酸メモチン；メチサゾン；ネビラピン；ペンシクロビル；ピロダビル；リバビリン；塩酸リマンタジン；サキナビルメシレート；塩酸ソマンタジン；ソリブジン；スタトロン；スタブジン；塩酸チロロン；トリフルリジン；塩酸バラシクロビル；ビダラビン；リン酸ビダラビン；リン酸ビダラビンナトリウム；ビロキシム；ザルシタビン；ジドブジン；ジンビロキシム。
【０２１５】
本発明の方法により治療または予防することができる細菌感染症は、限定するものではないが、その生活環に細胞内段階を有する細菌により引き起こされ、このような細菌として、例えば、マイコバクテリア（例：ヒト結核菌、ウシ結核菌、トリ結核菌、らい菌、もしくはマイコバクテリア・アフリカヌム）、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジア、およびレジオネラが挙げられる。考慮される細菌感染症のその他の例として、限定するものではないが、以下に挙げる細菌を原因とするものがある：グラム陽性桿菌（例：リステリア属、炭疽菌のようなバチルス属、エリシペロスリックス属の種）、グラム陰性桿菌（例：パルトネラ属、ブルセラ属、キャンピロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、フランジセラ属、ヘモフィルス属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、ビブリオ属、およびエルシニア属の種）、スピロヘータ菌（例：ライム病を引き起こすライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）を含むボレリア属の種）、嫌気性細菌（例：放線菌属およびクロストリジウム属の種）、グラム陽性および陰性球菌、エンテロコッカス属の種、連鎖球菌属の種、肺炎球菌属の種、ブドウ球菌属の種、ナイセリア属の種。感染性細菌の具体的例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：ヘリコバクターピロリ、ライム病ボレリア、レジオネラ・ニューモフィラ、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、M. interacellurare、M.kansaii、M.gordonae、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿性連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、Streptococcus agalactiae（Ｂ群連鎖球菌）、ヴィリダンス・ストレプトコッカス、糞便ストレプトコッカス、ルーメンバクテリア（Streptococcus  bovis）、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、ブタ丹毒菌、ウェルチ菌、破傷風菌、エンテロバクターエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌、Pasturella multocida、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、梅毒トレポーマ、フランベジア・トレポネマ、レプトスピラ、リケッチア、およびイスラエル放線菌。
【０２１６】
本発明の複合体と組み合わせて用いることができる抗菌薬または抗生物質としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アミノグリコシド抗生物質（例：アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パラモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン）、アンフェニコール抗生物質（例：アジダンフェニコール、クロランフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン抗生物質（例：リファミドおよびリファンピン）、カルバセフェム（例：ロラカルベフ）、カルバペネム（例：ビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン（例：セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピローム）、セファマイシン（例：セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス）、モノバクタム（例：アゼトレオナム、カルモナム、およびチゲノナム）、オキサセフェム（例：フロモキセフ、およびモキサラクタム）、ペニシリン（例：アンジノシリン、アンジノシリン、ピボキシル、アモキシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナンクシリン、ペネタメートヒドリオジド、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリン０、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピシリン、およびフェンシヒシリンカリウム）、リンコサミド（例：クリンダマイシン、およびリンコマイシン）、マクロリド（例：アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリソマイシン、ジリトロマイシン、エリスロマイシン、およびエリスロマイシンアシストレート）、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン（例：アピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン）、2,4-ジアミノピリミジン（例：ブロモプリム）、ニトロフラン（例：フラルタドン、および塩化フラゾリウム）、キノロンおよびそれらの類似体（例：シノキサシン、シプロフラキサシン、クリナフラキサシン、フルメキン、およびグレパグロキサシン）、スルホンアミド（例：アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン、およびスルファシチン）、スルホン（例：ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン）、シクロセリン、ムピロシンおよびツベリン。
【０２１７】
上記以外の抗菌薬の例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：アセダプソン、アセトスルホンナトリウム；アルメシン；アレキシジン；アンジノシリン；アンジノシリンピボキシル；アミサイクリン；アミフロキサシン；アミフロキサシンメシレート；アミカシン；硫酸アミカシン；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；硫酸アストロマイシン；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチレート；バシトラシン亜鉛；バンベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；硫酸ベタマイシン；ビアペネム；ビニラマイシン；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；硫酸ブチロシン；硫酸カプレオマイシン；カルバドクス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム、カルモナムナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナフェート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルルナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；塩酸セフェピム；セフェテコール；セフィキシム；塩酸セフンネノキシム；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セホニシド一ナトリウム；セホニシドナトリウム；セホペラゾンナトリウム；セホラニド；セホタキシムナトリウム；セホテタン；セホテタン二ナトリウム；塩酸セホチアム；セホキシチン；セホキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；硫酸セフピローム；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフトキシム；セフロキシムアキセチル；セフチゾキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトサイクリン；セトフェニコール；クロラムフェニコール；パルミチン酸クロラムフェニコール；クロラムフェニコールペントテネート複合体；コハク酸クロラムフェニコールナトリウム；クロルヘキシジンホスファニレート；クロロキシレノール；二硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クロリスロマイシン；塩酸クリナフロキサシン；クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシンパルミテート；リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン；コリスチメテートナトリウム；硫酸コリスチン；クメルマイシン；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン；シクロセリン；ダルホプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン；デノフンギン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンルナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン；ジリトロマイシン；デオキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンホスファテクス；ドキシサイクリンヒクレート；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルスクシネート；エリスロマイシングルセプテート；エリスロマイシンラクトビオネート；プロピオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；塩酸エタムブトール；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキサシリン；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシデートナトリウム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロギン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサン；イミペネム；イソコナゾール；イセパミシン；イソニアジド；ジョサマイシン；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；塩酸リンコマイシン；ロメフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシレート；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；スルホサリチル酸メクロサイクリン；リン酸メガロマイシンカリウム；メキドクス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；馬尿酸メテナミン；マンデル酸メテナミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン；塩酸ミリンカマイシン；メネンシン；メネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジキセートナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；パルミチン酸ネオマイシン；硫酸ネオマイシン；ウンデシレン酸ネオマイシン；硫酸ネチルマイシン；ニュートラマイシン；ニフラデン；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフルピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペルフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピルリマイシン；塩酸ピバムピシリン；ピバムピシリンパモエート；ピバムピシリンプロベネート；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛；酢酸キンデカミン；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン；レロマイシン；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファムピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン；酪酸ロサラマイシン；プロピオン酸ロサラマイシン；リン酸ロサラマイシンナトリウム；ステアリン酸ロサラマイシン；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフィギン；シソマイシン；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン；ステッフィマイシン；硫酸ストレプトマイシン；ストレプトニコジド；スルファベンズ；スルファベンザミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファラジン；スルファメテル；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニレート亜鉛；スルファニトラン；スルファザラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト；スルフィソキサゾール；スルフィゾキサゾールアセチル；スルフィソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；スンシリンナトリウム；塩酸タランピシリン；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン；テモシリン；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；リン酸テトラサイクリン複合体；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トフルロキサシン；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；硫酸トロスペクトマイシン；チロスリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；ビルギニアマイシン；ソルバマイシン。
【０２１８】
本発明の方法により治療または予防できる真菌疾患としては、限定するものではないが、アスペルギルス症、クリプトコックス症、スポロトリクス症、コクシジオイデス真菌症、パラコクシジオイドミコーシス；ヒプロプラスマ腫；ブラストミヤス症；接合真菌症およびカンジダ症が挙げられる。
【０２１９】
本発明の複合体と組み合わせて用いることができる抗真菌化合物として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ポリエン（例：アンホテリシンｂ、カンジシジン、メパルトリシン、ナタマイシン、およびニスタチン）、アリルアミン（例：ブテナフィン、およびナフチフィン）、イミダゾール（例：ビホナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、およびラノコナゾール）、チオカルバメート（例：トルシクレート、トリンデート、およびトルナフテート）、トリアゾール（例：フルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール、およびテルコナゾール）、ブロモサリチルクロラニリド、ブクロサミド、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロクス、アザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ピロルニトリン、シッカニン、ツベルシジン、およびビリジン。上記以外の抗真菌化合物の例を以下に挙げるが、これらに限定するわけではない：アクリソルシン；アンブルチシン；アンホテリシンＢ；アザコナゾール；アザセリン；バシフンギン；ビホナゾール；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；硝酸ブトコナゾール；ウンデシレン酸カルシウム；カンジシン；石炭酸−フクシン；クロルダントイン；シクロピロクス；シクロピロクスオラミン；シロフンギン；シスコナゾール；クロトリマゾール；クプリミキシン；デノフンギン；ジピリチオン；ドコナゾール；エコナゾール；硝酸エコナゾール；エニルコナゾール；硝酸エトナム；硝酸フェンチコナゾール；フィリピン；フルコナゾール；フルシトシン；フンギマイシン；グロセオフルビン；ハマイシン；イソコナゾール；イトラコナゾール；カラフンギン；ケトコナゾール；ロモフンギン；リジマイシン；メパルトリシン；ミコナゾール；硝酸ミコナゾール；モネンシン；モネンシンナトリウム；塩酸ナフチフィン；ウンデシレン酸ネオマイシン；ニフラテル；ニフルメロン；塩酸ニトラルアミン；ニスタチン；オクタン酸；硝酸オルコナゾール；硝酸オキシコナゾール；塩酸オキシフンギン；塩酸パルコナゾール；パルトリシン；ヨウ化カリウム；プロクロノール；ピリチオン亜鉛；ピロルニトリン；ルタマイシン；塩化サングイナリウム；サペルコナゾール；スコパフンギン；亜硫酸セレン；シンフンギン；硝酸スルコナゾール；テルビナフィン；テルコナゾール；チラム；チクラトン；チオコナゾール；トルシクレート；トリンデート；トルナフテート；トリアセチン；トリアフイギン；ウンデシレン酸；ビリドフリルビン；ウンデシレン酸亜鉛；および塩酸ジノコナゾール。
【０２２０】
本発明の方法により治療または予防することができる寄生生物による疾患として、限定するものではないが、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア、コクシジア、ジアルジア鞭毛虫症、クリプトスポリジウム症、トキソプラスマ症、およびトリパノソーマ症が挙げられる。また、各種蠕虫による感染も包含され、このような感染症として、限定するものではないが、例えば、回虫症、鉤虫症、鞭虫症、糞線虫症、トキソカラ症、旋毛虫症、オンコセルカ症、フィラリア、およびイヌ糸状虫症が挙げられる。また、各種吸虫による感染も含まれ、例えば、住血吸虫症、肺吸虫症、および肝吸虫症が挙げられる。これらの疾患を引き起こす寄生生物は、これらが細胞内または細胞外のいずれであるかによって分類することができる。本明細書で用いる「細胞内寄生生物」とは、全生活環が細胞内にある寄生生物である。ヒト細胞内寄生生物の例として、リーシュマニア属の種、プラスモディウム属の種、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ、バベシア属の種、ならびに、旋毛虫などがある。本明細書で用いる「細胞外寄生生物」とは、全生活環が細胞外にある寄生生物である。ヒトに感染することができる細胞外寄生生物としては、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、Enterocytozoon bieneusi、ネグレリア属およびアカントアメーバ属、ならびにほとんどの蠕虫が挙げられる。さらに別のクラスの寄生生物は、主に細胞外であるが、その生活環の重要な段階に絶対細胞内存在を有するものとして定義される。このような寄生生物を本明細書では「絶対細胞内寄生生物」と呼ぶ。これらの寄生生物は、細胞外環境でその寿命の大部分または小部分を過ごすが、すべてがその生活環に少なくとも１つの絶対細胞内段階を有する。後者のカテゴリーの寄生生物として、ローデシアトリパノソーマおよびガンビアトリパノソーマ、イソスポラ属の種、クリプトスポリジウム属の種、アイメリア属の種、ネオスポラ属の種、サルコシスティス属の種、および住血吸虫の種が挙げられる。
【０２２１】
寄生生物による疾患を治療するために本発明の複合体と組み合わせて用いることができる抗原生動物化合物の多くの例が当分野では知られており、限定するものではないが、キニン、クロロキン、メフロキン、プログアニル、ピリメタミン、メトロニダゾール、フロ酸ジロキサニド、チニダゾール、アンホテリシン、スチボグルコン酸ナトリウム、トリモキサゾール、およびイセチオン酸ペンタミジンが挙げられる。寄生生物による疾患を治療するために本発明の複合体と組み合わせて用いることができる抗寄生生物剤の多くの例が当分野では知られており、限定するものではないが、メベンダゾール、レバミソール、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール、イベルメクチン、ジエチルカルバマジン、およびチアゼンダゾールが挙げられる。抗寄生生物化合物のさらに別の例として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アセダプソン；塩酸アモジアキン；アンキネート；アルテフレン；クロロキン；塩酸クロロキン；リン酸クロロキン；シクログアニルパモエート；リン酸エンピロリン；塩酸ハロファントリン；硫酸ヒドロキシクロロキン；塩酸メフロキン；メノクトン；塩酸ミリンカマイシン；リン酸プリマキン；ピリメタミン；硫酸キニン；およびテブキン。
【０２２２】
それほど好ましくない実施形態では、非HSPおよび非α2Mのワクチン組成物と組み合わせて、本発明の複合体を用いることができる。ヒト用のこのようなワクチンの例がThe Jordan Report 200, Accelerated Development of Vaccines, National Instirute of Health（その全文を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。また、Bennett, K. Compenjium of Veterinary Products、第3版、North American Compendiums, Inc., 1995（その全文を参照として本明細書に組み込む）には、ヒト以外の脊椎動物を治療するための多種のワクチンが開示されている。
【０２２３】
４．５．３．オートロガス実施形態
HSPおよびα2Mの特異的免疫原性は、HSPまたはα2M自体に由来するのではなく、それらに結合した抗原タンパク質および／またはペプチドに由来する。本発明の好ましい実施形態では、癌ワクチンとして用いる本発明の組成物中の複合体は、オートロガス（すなわち、自己由来）複合体であるため、癌免疫療法で最も克服が困難な障害の２つを解消するものである。第１に、実験動物の癌と同様、ヒトの癌が抗原的に異なるという可能性である。この障害を解消するために、本発明の好ましい実施形態では、HSPおよび／またはα2Mを抗原タンパク質と複合体化し、この複合体を用いて、タンパク質またはペプチドが由来する同じ患者の癌を治療する。第２に、癌免疫療法に対する現在のほとんどの手法は、癌細胞系のCTL認識エピトープを決定することに集約される。この手法では、細胞系および癌に対するCTLを入手することが必要である。これらの試薬は、ヒト癌の圧倒的部分について入手不可能である。オートロガス抗原タンパク質および／またはペプチドの使用に関する本発明の実施形態では、癌免疫療法は、細胞系またはCTLの入手可能性に依存せず、しかも、癌細胞の抗原決定基の決定も必要としない。これらの利点により、オートロガス抗原タンパク質および／またはペプチドに結合したHSPおよび／またはα2Mの複合体は、癌に対し魅力的な免疫原となる。
【０２２４】
別の実施形態では、治療または予防のための複合体における抗原ペプチドは、該複合体を投与する被検者に同種異系の被検者からの癌と同じタイプの癌組織から作製することができる。
【０２２５】
４．６．養子免疫療法
養子免疫療法とは、癌または感染症を治療するための一治療手法であって、免疫細胞を宿主に投与し、この細胞が、患者に応じて、腫瘍細胞および／または抗原成分に対する特異的免疫、もしくは腫瘍の後退または感染症の治療を直接または間接的に媒介することを目的とする手法である。（例えば、1999年11月16日に刊行された米国特許第5,985,270号を参照されたい）。
【０２２６】
一実施形態では、養子免疫療法で用いる抗原提示細胞（APC）を、本明細書に記載した方法に従い作製した抗原タンパク質およびペプチドと複合体化させたHSPおよび／またはα2Mで感作する。この複合体は、感染症を引き起こす因子の抗原決定基を発現する抗原細胞またはウイルス粒子中に存在する様々なタンパク質の少なくとも50％、または少なくとも100の異なるタンパク質に由来する抗原タンパク質と、熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンを複合体化させることにより製造することができる。複合体はまた、（ａ）上記タイプの癌の細胞に由来するタンパク質調製物をプロテアーゼでの消化、またはATP、塩酸グアニジウム、および／または酸との接触のいずれかに供した後、（ｂ）抗原ペプチドの集団を熱ショックタンパク質またはα-2-マクログロブリンと複合体化させることにより製造することもできる。
【０２２７】
別の実施形態では、本発明の方法により作製する、in vitroで複合体化した抗原タンパク質／ペプチドとHSPおよび／またはα2Mの投与による療法と、当分野では周知の任意の方法（例えば、米国特許第5,985,270号を参照）により作製したHSPおよび／またはα2M−抗原ペプチド複合体により感作したAPCを用いる養子免疫療法とを組み合わせるが、その際、該抗原ペプチドは所望（例えば、癌または病原体のタイプの）の抗原性を展示する。感作したAPCは、単独で、in vitoで複合体化したタンパク質／ペプチドとHSPおよび／またはα2M と組み合わせて、もしくは、複合体化したタンパク質／ペプチドとHSPおよび／またはα2Mの投与の前または後に、投与することができる。特に、癌の予防および治療を目的とする感作APCの使用は、さらに、抗原タンパク質／ペプチドと複合体化した熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンを含む、前記治療または予防に有効な量の複合体を被検者に投与することを含んでなり、その際、該複合体は前記のように製造される。同様に、１タイプの感染症を治療または予防する場合の感作APCの使用は、さらに、抗原タンパク質／ペプチドと複合体化した熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンを含む、前記治療または予防に有効な量の複合体を被検者に投与することを含むものである。
【０２２８】
さらにまた、抗原タンパク質／ペプチドとin vitoで複合体化した熱ショックタンパク質および／またはα-2-マクログロブリンの投与方法は多様であり、限定するものではないが、例えば、皮下、静脈内または筋内などがあり、中でも皮内が好ましい。別の具体的実施形態では、本発明に従い製造した複合体で感作した抗原提示細胞の投与による養子免疫療法を、当分野で周知の任意の方法により調製したHSPおよび／またはα2M−抗原分子（例：ペプチド）複合体の投与による療法と組み合わせることができ（例えば、米国特許第5,750,119号、第5,837,251号、第5,961,979号、第5,935,576号、PCT公開WO 94/14976またはWO 99/50303を参照）、その際、抗原分子は、所望（例えば、癌または病原体のタイプの）の抗原性を展示する。
【０２２９】
４．６．１．抗原提示細胞の取得
抗原提示細胞（限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞など）は、Inaba, K.ら、1992, J. Exp. Med/ 176: 1693-1702により記載されているように、ヒト末梢血液または骨髄からの幹および前駆細胞からin vitroでの生産により取得するのが好ましい。樹状細胞は、当分野では周知の様々な方法のいずれかにより取得することができる。限定するものではないが、例として、Sallustoら、1994, J Exp Med 179:1109-1118およびCauxら、1992, Nature 360, 258-261（すべて、その全文を参照として本明細書に組み込む）に記載されている方法により、樹状細胞を取得することができる。好ましい形態では、ヒト血球から取得したヒト樹状細胞を用いる。
【０２３０】
APCは、当分野では周知の様々な方法のいずれかにより取得することができる。一形態では、ヒト血球から取得したヒトマクロファージを用いる。限定するものではないが、マクロファージは、例えば、以下のようにして得ることができる：
フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）勾配遠心分離により、患者（好ましくは、治療しようとする患者）の末梢血液から単核細胞を単離し、患者自身の血清またはその他のAB+ヒト血清で前コーティングされた組織培養皿に接種する。この細胞を37℃で１時間インキュベートし、非付着細胞をピペットで除去する。皿に残った付着細胞に、リン酸緩衝食塩水中の低温（４℃）１mM EDTAを添加し、皿を室温でさらに15分放置する。細胞を回収し、RPMIバッファーで洗浄し、RPMIバッファーに懸濁させた。マクロファージ−コロニー刺激因子（M-CSF）と一緒に37℃でインキュベートすることにより、増加した数のマクロファージを得ることができる。
【０２３１】
４．６．２．HSP−ペプチドまたはα2M−ペプチド複合体によるマクロファージおよび抗原提示細胞の感作
抗原ペプチドに結合したHSPまたはα2MでAPCを感作するが、その際、この複合体と一緒に上記細胞をin vitroでインキュベートすることにより感作するのが好ましい。HSP−複合体またはα2M−複合体と一緒に、37℃にて15分〜24時間in vitroでインキュベートすることにより、HSPまたはα2Mの複合体でAPCを感作する。限定するものではないが、例えば、１mlプレーンRPMI培地において、１ml当たり10マイクログラムのgp96−ペプチド複合体、または１ml当たり100マイクログラムのHSP90−ペプチド複合体と一緒に、４×107個の樹状細胞を37℃で15分〜24時間インキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、患者への注射に適した濃度（例：１×107／ml）で、好ましくは滅菌の生理学的培地中に再懸濁させる。好ましくは、感作した樹状細胞を注射する患者は、初めに樹状細胞を単離した患者である（オートロガス実施形態）。
【０２３２】
随意に、感作APCが、例えば、抗原特異的なクラスＩ−制限細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を刺激する能力は、CTLを刺激して腫瘍壊死因子を放出させる能力、およびそれらがこのようなCTLの標的として働く能力により、モニタリングすることができる。
【０２３３】
４．６．３．感作APCの再注入
通常の臨床手順により、感作APCを全身に、好ましくは内皮経路で患者に再注入する。これらの活性化細胞は、好ましくは、オートロガス患者への全身投与により再注入する。患者は、その状態に応じて、一般に約106〜1012個の感作樹状細胞を受ける。いくつかの治療プログラムでは、患者は、これに加え、限定するものではないが、サイトカインIFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNFまたはその他のサイトカイン成長因子など、適切な用量の生体応答改変剤を随意に受けることもできる。
【０２３４】
４．７．医薬製剤および投与方法
本発明により作製されたHSPおよび／またはα2Mに結合した抗原タンパク質／ペプチドの複合体を治療に有効な用量で患者に投与することにより、細胞増殖性疾患または感染症を治療または改善することができる。治療に有効な用量とは、このような疾患の症状を改善するのに十分な複合体の量を意味する。複合体の有効な用量は、別の物理療法を組み合わせて用いる場合、違ってくる可能性がある。化学療法薬、放射線療法および生物学的／免疫療法薬のような治療剤についての適切かつ推奨される用量、製剤化および投与経路は当分野において周知であり、Physician’s Desk Reference（第56版、2002年）のような文献に記載されている。
【０２３５】
４．７．１．有効な用量
抗原ペプチドの集団とHSPおよび／またはα2Mの免疫原的、有効量の複合体を含む本発明の組成物を癌または感染症の治療を必要とする被検者に、そのような癌または感染症に対する免疫応答を誘発する方法として投与する。このような複合体の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順、例えば、LD50（集団の50％に対する致死用量）およびED50（集団の50％において治療に有効な用量）を決定する手順により決定することができる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、比LD50／ED50として表すことができる。大きい治療指数を示す複合体が好ましい。有毒な副作用を呈示する複合体を用いる場合には、感染していない細胞への潜在的損傷を最小限にし、これにより副作用を低減するように、複合体を患部組織の部位にターゲッティングさせる送達系の設計に注意を払わなければならない。
【０２３６】
一実施形態では、ヒトに使用する用量の範囲を公式化するのに、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いることができる。複合体の用量は、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、用いた投与形態および使用する投与経路に応じて、上記範囲内を変動しうる。本発明の方法で用いるあらゆる複合体について、治療に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定されたIC50を含む循環血漿濃度（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を達成するように、動物モデルにおいて用量を公式化することができる。このような情報を用いて、ヒトに有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２３７】
別の実施形態では、ヒト患者の場合、約0.1マイクログラム〜約600マイクログラム、好ましくは約１マイクログラム〜約60マイクログラムの範囲にある量のhsp70−および／またはgp96−抗原分子複合体を投与する。投与されるhsp70−および／またはgp96複合体の量は、0.1、0.2、0.5、１、２、５、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500もしくは600マイクログラムである。好ましくは、この量は100マイクログラム以下である。最も好ましくは、hsp70−および／またはgp96複合体の量は、５マイクログラム、25マイクログラム、もしくは50マイクログラムである。ヒト患者の場合に、本発明により提供されるhsp-90ペプチド複合体の用量は、約５〜約5,000マイクログラムの範囲にある。好ましくは、投与されるhsp90複合体の量は、５、10、25、50、60、70、80、90、100、200、250、500、1,000、2,000、2,500、もしくは5,000マイクログラムであり、最も好ましい用量は、100マイクログラムである。このような用量を内皮または皮下経路で投与するのが好ましい。これらの用量は、毎日、隔日、毎週、隔週、もしくは毎月等々のように、１回または繰り返し投与することができる。好ましくは、約４〜６週間の間、毎週１回複合体を投与し、投与方法または部位は、投与毎に変えるのが好ましい。従って、限定するものではないが、例えば、１回目の注射は左腕の皮下に、２回目は右腕、３回目は左側腹部、４回目は右側腹部、５回目は左太腿、６回目は右太腿等々のように投与する。１回以上の注射から時間を置くのであれば、同じ部位に再度投与してもよい。また、分割注射を実施してもよい。従って、例えば、同じ日に、用量の半分を１つの部位に、もう半分を他の部位に投与することができる。あるいは、投与経路を順次変える、例えば、毎週の注射を内皮、筋内、皮下、静脈内または腹腔内に順に投与する。毎週１回の用量を４週間の間投与するのが好ましい。それから４〜６週間後、１ヶ月以上の間または複合体の供給が尽きるまで、２週間おきに注射を実施するのが好ましい。後期の注射は毎月実施してもよい。後期の注射の位置は、患者の臨床経過および免疫療法に対する応答性に応じて変えることができる。好ましい実施形態では、毎回投与部位を順次変えながら、内皮投与を実施する。
【０２３８】
従って、本発明は、被検者における癌または感染症を予防および治療する方法であって、宿主個体の免疫能を刺激し、前腫瘍および／または腫瘍細胞もしくは感染細胞に対し特異的な免疫を誘発する組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【０２３９】
具体的実施形態では、組合せ療法の際に、HSP複合体を準最適量投与するが、これは、例えば、前記治療剤を用いずに投与したとき、検出しうる治療利益を現さない量であり、当分野では周知の方法により決定される。この方法では、特定の治療剤を受ける被検者に、上記準最適量のHSP複合体を投与することにより、治療の効果が全体的に向上する。別の具体的実施形態では、組合せ療法の際に、α2M複合体を準最適量投与する。この方法では、特定の治療剤を受ける被検者に、上記準最適量のα2M複合体を投与することにより、治療の効果が全体的に向上する。
【０２４０】
好ましい実施形態では、腫瘍退縮または癌寛解を起こさない量、もしくは前記治療剤を用いずにHSP複合体を投与したとき、癌細胞が有意に減少しないか、または増加したであろう量のHSP複合体を投与する。好ましい実施形態では、特定の治療剤を受ける被検者に、このような準最適量のHSP複合体を投与することにより、治療の全体的効果を高める。別の好ましい実施形態では、腫瘍退縮または癌寛解を起こさない量、もしくは、前記治療剤を用いずにα2M複合体を投与したとき、癌細胞が有意に減少しないか、または増加したであろう量のα2M複合体を投与する。好ましい実施形態では、特定の治療剤を受ける被検者に、このような準最適量のα2M複合体を投与することにより、治療の全体的効果を高める。HSPまたはα2M複合体で治療するこれらの被検者には、化学療法または放射線療法を受ける者もいる。準最適量は、好適な動物実験により決定することができる。ヒトにおけるこのような準最適量は、動物における実験からの外挿により決定することができる。
【０２４１】
特定の具体的実施形態では、すでに、Gleevec（商標）（例：カプセルの形態で毎日400〜800 mg、毎日１回400〜600 mgの用量を投与、毎日各用量400 mg×２で800 mgを投与）のような化学療法を受けている被検者に、HSPまたはα2M複合体を投与する。Gleevec（商標）は、組み合わせて用いることができる化学療法薬の非制限的例として以下に用いる。その他多くの化学療法薬についても、同様の投与プログラムを用いることができる。このような実施形態では、Gleevec（商標）に加えたHSP／α2M複合体の投与の２日、２日〜１週間、１週間〜1ヶ月、1ヶ月〜６ヶ月、６ヶ月〜１年前に、すでにGleevec（商標）を受けている被検者に、適切なHSP／α2M複合体を初期投与する。具体的実施形態では、被検者がGleevec（商標）単独での治療に耐性を示す場合、この被検者にHSP／α2M複合体を投与する。
【０２４２】
別の実施形態では、Gleevec（商標）の最初の投与と同時に、被検者にHSP／α2M複合体を最初に投与する。
【０２４３】
さらに別の実施形態では、HSP／α2M複合体の投与を含む治療をすでに受けている被検者に、Gleevec（商標）（例：カプセルの形態で毎日400〜800 mg）を投与する。このような実施形態では、HSP／α2M複合体に加えたGleevec（商標）の投与の２日、２日〜１週間、１週間〜1ヶ月、1ヶ月〜６ヶ月、６ヶ月〜１年前に、Gleevec（商標）の非存在下でHSP／α2M複合体をすでに受けている被検者に、Gleevec（商標）を初期投与する。
【０２４４】
具体的実施形態では、Gleevec（商標）のような化学療法薬を経口投与する。別の具体的実施形態では、HSP／α2M複合体を内皮投与する。
【０２４５】
前述した方法の各々において、被検者は、例えば、50 mg〜100 mg、100 mg〜200 mg、200 mg〜300 mg、300 mg〜400 mg、400 mg〜500 mg、500 mg〜600 mg、600 mg〜700 mg、700 mg〜800 mg、800 mg〜900 mg、もしくは900 mg〜1,000 mgの化学療法薬（例：Gleevec（商標））を毎日受ける。特定の実施形態では、１日２回の用量：25 mg〜50 mg、50 mg〜100 mg、100 mg〜200 mg、200 mg〜300 mg、300 mg〜400 mg、もしくは400 mg〜500 mgの合計用量を毎日被検者に投与する。
【０２４６】
４．７．２．治療プログラム
癌および感染症の治療または予防を目的とする前記組合せ療法のいずれの場合も、非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤の投与前、投与と同時、もしくは投与後に、本発明の複合体を投与することができる。非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤は、癌または感染症の治療または予防のための前記治療剤のいずれであってもよい。
【０２４７】
一実施形態では、本発明の複合体は、合理的に、他の治療剤と同時に被検者に投与する。この方法では、例えば、同じ医師の１回の往診で、１分〜約５分、もしくは約60分までの時間内の間隔をおいて両者の投与を実施することができる。
【０２４８】
別の実施形態では、本発明の複合体と、別の治療剤を、厳密に同時に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤を順次投与するが、その際、本発明の複合体と該治療剤が一緒に作用して、それぞれ単独で投与された場合と比較して高い利益をもたらすような時間内の間隔で投与する。別の実施形態では、所望の治療または予防成果をもたらすのに十分短い間隔で、本発明の複合体と、別の治療剤を投与する。両者は各々、同時または別々に、任意の適した形態で、任意の好適な経路により投与することができる。一実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤を様々な投与経路で投与する。別の実施形態では、各々同じ投与経路で投与する。本発明の複合体は、同じまたは異なる部位、例えば、腕および脚に投与することができる。同時に投与する場合、本発明の複合体と前記治療剤を混合して、または混合せずに、もしくは同じ投与経路で同じ投与部位に投与してもよい。
【０２４９】
好ましい実施形態では、本発明の複合体は、第４．７．１節に記載したプログラムに従い投与する。様々な実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤は、１時間以下、約１時間、１時間〜２時間、２時間〜３時間、３時間〜４時間、４時間〜５時間、５時間〜６時間、６時間〜７時間、７時間〜８時間、８時間〜９時間、９時間〜10時間、10時間〜11時間、11時間〜12時間、24時間以下もしくは48時間以下の間隔をおいて投与する。別の実施形態では、本発明の複合体とワクチン組成物は、２〜４日、４〜６日、１週間、１〜２週間、１ヶ月、１〜２ヶ月、もしくは２ヶ月以上の間隔をおいて投与する。好ましい実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤は、両者がまだ活性である時間枠内に投与する。当業者であれば、投与した各成分の半減期を決定することにより、このような時間枠を決定することができよう。
【０２５０】
一実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤を１回の患者の受診時に投与する。具体的な好ましい実施形態では、前記治療剤の投与前に本発明の複合体を投与する。別の具体的実施形態では、前記治療剤の投与後に本発明の複合体を投与する。
【０２５１】
特定の実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤を被検者にサイクル投与する。サイクル療法は、所定の期間にわたり本発明の複合体を投与した後、所定期間前記治療剤を投与し、この逐次投与を繰り返すことを含む。サイクル療法によって、１種以上の治療薬に対する耐性の形成を低減し、治療薬の１つの副作用を解消または軽減し、および／または治療の効果を高めることができる。このような実施形態では、本発明は、本発明の複合体を投与して４〜６日後、好ましくは２〜４日後、さらに好ましくは１〜２日後、別の治療剤を投与するという交互投与を考慮し、その際、このようなサイクルを所望の回数繰り返すことができる。特定の実施形態では、本発明の複合体と前記治療剤は、３週間以下のサイクルで、２週間に１回、10日に１回もしくは毎週１回交互に投与する。具体的実施形態では、本発明の複合体は、別の治療剤の投与から１時間〜20時間の時間枠内で被検者に投与する。低速または連続的放出型の治療剤送達系を用いる場合には、この時間枠をさらに数日以上延長することもできる。
【０２５２】
４．７．３．製剤化および使用
本発明に従って用いる医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて、通常の方法で製剤化することができる。
【０２５３】
従って、吸入または通気法（口または鼻のいずれかを介して）、経口、口腔、非経口、直腸、もしくは経皮投与による投与のためにに、複合体とその薬学的に許容される塩および溶媒化合物を製剤化することができる。また、非侵襲性投与方法も考慮される。
【０２５４】
経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの形態でよく、これは、例えば、以下に挙げる薬学的に許容される賦形剤を用いて通常の手段により製造される：結合剤（例：前ゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例：ラクトース、微晶質セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例：ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例：ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；もしくは湿潤剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は当分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態でよい。あるいは、このような液体製剤は、使用前に水またはその他の好適なビヒクルで形成するような乾燥製剤の形態をしていてもよい。このような液体製剤は、以下に挙げる薬学的に許容される添加剤を用いて通常の手段により製造される：懸濁剤（例：ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用油）；乳化剤（例：レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例：アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールもしくは精留植物油）；ならびに防腐剤（例：メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）。製剤にはまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色および甘味料を含有させてもよい。
【０２５５】
経口投与のための製剤は、活性複合体の制御された放出のために好適に製剤化することができる。
【０２５６】
口腔投与の場合、組成物は、通常の方法で製剤化される錠剤またはロゼンジの形態でよい。
【０２５７】
吸入による投与のためには、本発明に従い用いるための複合体は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくはその他の好適なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーからエーロゾルスプレーの形態で好適に送達される。加圧エーロゾルの場合には、計量した量を送達する弁を設けることにより、用量単位を決定することができる。吸入器または空気吸入器で用いる、例えばゼラチンからなるカプセルおよびカートリッジとして製剤化することもでき、これは、複合体と好適な粉末基材（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末配合物を含む。
【０２５８】
複合体は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することもできる。注射のための製剤は、防腐剤を添加した単位用量形態、例えば、アンプル、もしくは多用量容器の形態をしていてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液もしくはエマルションのような形態でもよく、懸濁、安定化および／または分散剤のような製剤用の物質を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で形成するための粉末形態をしていてもよい。
【０２５９】
複合体は、座薬または貯留浣腸のような直腸組成物に製剤化することも可能であり、例えば、ココアバターまたはその他のグリセリドのような通常の座薬基材を含んでいる。
【０２６０】
すでに記載した製剤以外にも、複合体を貯留製剤として製剤化することもできる。このような長期作用製剤は、植込み（例えば、皮下または筋内）、もしくは筋内注射により投与することができる。従って、例えば、好適なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）もしくはイオン交換樹脂を用いて、あるいは、やや難溶の誘導体、例えば、やや難溶の塩として製剤化することができる。
【０２６１】
組成物は、所望であれば、パックまたはディスペンサー装置中に提供してもよく、これらは、活性成分を含む１以上の単位用量形態を含むことができる。このパックとしては、例えば、金属またはプラスチックフィルム、例えば、ブリスターパックが挙げられる。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明を備えてもよい。
【０２６２】
また、本発明の複合体と組み合わせた、またはこれに添加したアジュバントの使用も包含される。考えられるアジュバントとして、限定するものではないが、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒状アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫刺激性アジュバント、例えば、第４．５節に記載したものなどが挙げられる。アジュバントは、本発明の複合体との混合物として被検者に投与したり、あるいは、第４．７．２節に記載したように、複合体と組み合わせて用いたりすることができる。
【０２６３】
本発明の複合体、好ましくはgp96複合体と組み合わせた、またはこれに添加したアデノシン二リン酸（ADP）の使用も考えられる。
【０２６４】
４．７．４．キット
本発明は、本発明の方法および／または治療プログラムを実施するためのキットも提供する。
【０２６５】
一実施形態では、このようなキットは、１個以上の容器に、第２の容器に入ったHSPおよび／またはα2Mと結合させるための抗原タンパク質およびペプチドを含むタンパク質調製物を含んでいる。別の実施形態では、このようなキットは、１個以上の容器に、第２の容器に入ったHSPおよび／またはα2Mと結合させるための抗原ペプチドを含む消化済ペプチドを含んでいる。あるいは、タンパク質および／またはペプチドは、オートロガス投与のための特定の患者から単離したHSPおよび／またはα2Mと複合体化するための１個以上の容器に供給することもできる。随意に、タンパク質およびペプチドと複合体化するための精製済HSPをさらに第２の容器に提供する。
【０２６６】
別の実施形態では、このようなキットは、１個以上の容器に、薬学的に許容される形態で、治療または予防に有効な量の、好ましくは精製済のHSPおよび／またはα2Mと複合体化したタンパク質／ペプチドを含む。随意に、キットは、さらに第２の容器に、好ましくは精製済の感作APCを含む。
【０２６７】
本発明のキットの容器中のHSPまたはα2M複合体は、例えば、滅菌塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、もしくはその他の薬学的に許容される滅菌液体と組み合わせた、薬学的に許容される溶液の形態をしていてもよい。あるいは、HSPおよびα2M複合体を凍結乾燥または乾燥させてもよく、この場合、随意に、キットは、１容器に、薬学的に許容される、好ましくは滅菌の溶液（例：生理食塩水、デキストロース溶液など）をさらに含み、この溶液を用いて、HSPおよびα2MまたはHSPおよびα2M含有複合体を再構成することにより、注射液を形成する。
【０２６８】
別の実施形態では、本発明のキットは、HSPおよびα2M複合体を注射するための、好ましくは滅菌形態でパッケージされた針または注射器、および／またはパッケージされたアルコールパッドをさらに含む。随意に、臨床医または患者によるα2MおよびHSP−ペプチド複合体の投与のための説明も含まれる。
【０２６９】
また、本発明の組合せ療法を実施するためのキットも提供される。一実施形態では、キットは、精製済のHSP複合体またはα2M製剤を含む第１の容器と、癌治療のための非HSPおよび非α2Mの治療剤を含む第２の容器とを含んでなる。好ましくは、癌はCMLであり、HSP複合体は、hsp70−ペプチド複合体を含み、前記治療剤はGleevec（商標）である。具体的実施形態では、第２容器はイマチニブメシレートを含む。別の具体的実施形態では、イマチニブメシレートを精製する。
【０２７０】
具体的実施形態では、キットは、単独で投与した場合、疾患または障害を治療するのに無効な量の精製済HSP複合体またはα2M複合体を含む第１の容器と、１種の非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤を含む第２の容器とを含んでなり、その際、この治療剤は、第１容器中のHSP複合体またはα2M複合体の投与前、これと同時、または投与後に投与すると、各成分を単独で投与した場合の効果と比較して、全体的治療効果を高めるのに有効な量である。別の具体的実施形態では、キットは、単独で投与した場合、疾患または障害を治療するのに無効な量の精製済HSP複合体またはα2M複合体を含む第１の容器と、１種以上の非HSPおよび非α2Mを主体とする治療剤を含む第２の容器とを含んでなり、その際、これら治療剤は、第１容器中のHSP複合体またはα2M複合体の投与前、これと同時、または投与後に投与すると、HSP複合体またはα2M複合体を単独で投与した、または前記治療剤を単独で投与した場合の効果と比較して、全体的治療効果を高めるのに有効な量である。さらに別の具体的実施形態では、第１の容器は、単独で投与した場合、疾患または障害を治療するのに無効な量の精製済HSP複合体またはα2M複合体を含み；第２の容器および第３の容器は各々、１種以上の非HSPおよび非α2M治療剤を含むが、その際、これら治療剤は、第１容器中のHSP複合体またはα2M複合体の投与前、これと同時、または投与後に投与すると、HSP複合体またはα2M複合体を単独で投与した、または前記治療剤を単独で投与した場合の効果と比較して、全体的治療効果を高めるのに有効な量である。好ましい具体的実施形態では、本発明は、第１の容器に、本発明の非共有結合HSP−ペプチド複合体またはα2M−ペプチド複合体の集団を含む精製HSP複合体またはα2M複合体を；第２の容器に、抗癌薬を含む組成物を；第３の容器に、サイトカインまたはアジュバントを含む組成物をそれぞれ含む、キットを提供する。
【０２７１】
キットは、例えば、金属またはプラスチックフィルム（ブリスターパックなど）を含んでもよい。キットには、投与のための１以上の再使用可能なまたは使い捨ての装置（例：注射器、針、投薬ペン）および／または投与のための説明を備えてもよい。
【０２７２】
４．８．HSPおよびα2M複合体の免疫原性の決定
随意に、当分野で周知の方法を用いて、本発明のHSP−タンパク質複合体、HSP−ペプチド複合体、α2M−タンパク質複合体およびα2M−ペプチド複合体を免疫原性についてアッセイすることができる。例えば、限定するものではないが、以下の手順の１つを用いることができる。好ましい実施形態では、ELOSPOTアッセイを用いる（以下の第４．９．４を参照されたい）。
【０２７３】
４．８．１．MLTCアッセイ
手短に言えば、通常の投与経路のいずれかを用いて、所定量のHSP−および／またはα2M複合体をマウスに注射する。負の対照として、例えば、正常組織から作製したタンパク質および／またはペプチドと複合体化させたHSPを別のマウスに注射する。特異的抗原を含むことが知られる細胞、例えば、腫瘍細胞、または感染症因子に感染した細胞を、このアッセイの正の対照として用いることができる。マウスを７〜10日の間隔をおいて２回注射する。最後の免疫化から10日後、脾臓を摘出し、リンパ球を放出させた。次に、目的とする抗原を発現した死滅細胞の添加により、放出したリンパ球をin vitroで再刺激することができる。
【０２７４】
例えば、10％ウシ胎児血清を含む３ml RPMI培地において、目的の抗原を含む４×104個のマイトマイシンＣ処理またはγ照射（5〜10,000ラド）細胞（または、場合に応じて、適切な遺伝子でトランスフェクションした細胞）で、８×106個の免疫脾細胞を刺激する。場合によっては、Ｔ細胞成長因子の供給源として、33％二次混合リンパ球培養上清を培地に含有させてもよい（Glasebrookら、1980, J. Exp. Med. 151:876参照）。免疫化後の一次細胞傷害性Ｔ細胞応答を試験するために、刺激せずに脾細胞を培養してもよい。実験によっては、免疫化マウスの脾細胞を抗原が異なる細胞で再刺激することにより、細胞傷害性Ｔ細胞応答の特異性を決定することもある。
【０２７５】
６日後、４時間にわたる51Cr放出アッセイで培養物を細胞傷害性について試験する（Palladinoら、1987, Cancer Res. 47:5074-5079およびBlachereら、1993, J. Immunotherapy 14:352-356）。このアッセイでは、混合したリンパ球培養物を標的細胞懸濁液に添加することにより、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を得る（通常、１：１〜40：１）。20 mGi 51Cr/mlを含む培地中で１×106個の標的細胞を37℃で1時間インキュベートすることにより、標的細胞を前標識する。標識後、細胞を３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を３回繰り返して実施し、適当な対照を組み込むことにより、自然発生的51Cr放出（アッセイにはリンパ球は一切添加していない）および100％放出（デタージェントで溶解させた細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、細胞を200 gで５分の遠心分離によりペレット化する。上清中に放出された51Crの量をガンマカウンターで測定する。細胞傷害性の百分率は、試験サンプル中のcpmから自然放出したcpmを引いた差を、デタージェント放出した合計cpmから自然放出cpmを引いた差で割ったものとして算出する。
【０２７６】
MHCクラスＩカスケードを遮断するために、K-44ハイブリドーマ細胞（抗MHCクラスIハイブリドーマ）から得た濃縮ハイブリドーマ上清を最終濃度12.5％まで試験サンプルに添加する。
【０２７７】
４．８．２．CD4+Ｔ細胞増殖アッセイ
主に、KruseおよびSebald, 1992, EMBO J. 11:3237-3244により記載されているように、脾臓、新鮮な血液、もしくはCSFから一次Ｔ細胞を取得し、FICOLL-PAQUE PLUS（Pharmacia, Upsalla、スエーデン）を用いた遠心分離により精製する。抗原分子を発現する細胞の溶解物と一緒に、末梢血液単核細胞を７〜10日インキュベートする。溶解物中の抗原をプロセッシングおよび提示するためには、アッセイの24〜48時間前に、抗原提示細胞を培養物に添加する。次に、細胞を遠心分離により回収し、RPMI 1640培地（GibcoBRL, Gaithersburg, Md.）で洗浄する。96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清、10 mM HEPES（pH 7.5）、２mM L-グルタミン、100単位／mlペニシリンＧ、および100μ／ml硫酸ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地において、５×104個の活性化Ｔ細胞／ウェルを37℃で72時間インキュベートし、１μCi3H-チミジン（DuPont NEN、ボストン、Mass.）／ウェルでパルスし、回収した後、TOPCOUNTシンチレーションカウンターで放射能を測定する（Packard Instrument Co., Meriden, Conn.）。
【０２７８】
４．８．３．抗体応答アッセイ
本発明の特定の実施形態では、HSP−および／またはα2M−複合体の免疫原性は、複合体によるワクチン接種に応答して産生された抗体を測定することにより決定する。この実施形態の一態様では、PBS中のワクチンに用いたタンパク質／ペプチドの精製済非HSP−またはα2M−複合体化形態の0.75μg／ml溶液（50μl／ウェル）で、４℃で16時間、次に、20℃で１時間マイクロプレート（96-ウェルImmuno Plate II, Nunc）をコーティングする。ウェルを空にし、１ウェル当たり200μlのPBS-T-BSA（0.05％（v.v）TWEEN 20と１％（w/v）ウシ血清アルブミンを含むPBS）で遮断した後、PBS-Tで３回洗浄する。50μl／ウェルのワクチン接種動物（モデルマウスまたはヒト患者）由来の血漿またはCSFを20℃で１時間ロードし、プレートをPBS-Tで３回洗浄する。次に、50μl／ウェルのヒツジ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリンと一緒に20℃で１時間インキュベートした後、抗ペプチド抗体活性を熱量測定により測定し、必要に応じて、PBS-T-BSAで１：1,500希釈した西洋ワサビペロキシダーゼ（Amersham）および（前記のように、さらに３回PBS-Tで洗浄後）、50μlのo-フェニレンジアミン（OPD）-H2O2基質溶液と共役結合させる。５分後、150μlの2M H2SO4で反応を停止し、クロントンSLT-210光度計（SLT Lab-instr., ズーリッヒ、スイス）により492 nm（基準620 nm）で吸光度を決定する。
【０２７９】
４．８．４．サイトカイン検出アッセイ
本発明のHSP−またはα2M−複合体に対するCD4+Ｔ細胞増殖応答は、特定のサイトカインのレベルの検出および定量により測定することができる。一実施形態では、例えば、本発明の複合体の免疫原性について試験するIFN-γ検出アッセイを用いて、細胞内サイトカインを測定する。この方法の一例では、HSP−ペプチドまたはα2M−ペプチド複合体で治療した被検者由来の末梢血液単核細胞を所与腫瘍のペプチド抗原、または感染症因子のペプチド抗原で刺激する。次に、フローサイトメトリーにより検出可能なＴ細胞特異的標識抗体、例えば、FITC共役抗CD8およびPerCP標識抗CD4抗体で、細胞を染色する。洗浄後、細胞を固定、透過性にしてから、ヒトIFN-γ（PE-抗IFN-γ）と反応性の色素標識抗体と反応させる。標準的方法を用いて、フローサイトメトリーによりサンプルを分析する。
【０２８０】
あるいは、フィルター免疫アッセイ、酵素結合イムノスポット（ELISPOT）アッセイを用いて、Ｔ細胞周囲の特定のサイトカインを検出することもできる。一実施形態では、例えば、ニトロセルロースを支持体とするマイクロプレートを精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち、抗IFN-γでコーティングし、このプレートをブロックして、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを阻止する。HSP−ペプチドおよび／またはα2M−ペプチド複合体で治療した被検者から得たサイトカイン分泌細胞を含む単核血液細胞のサンプルをマイクロプレートのウェル上で希釈する。標識（例えば、ビオチン標識）した二次抗サイトカイン抗体を添加する。次に、抗体サイトカイン複合体を検出することができる。すなわち、酵素共役ストレプトアビジンにより、サイトカイン分泌細胞が「スポット」として現れ、これを肉眼、顕微鏡、もしくは電子検出方法により検出することができる。
【０２８１】
４．８．５．四量体アッセイ
別の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を確認するのに、「四量体染色」アッセイ（Altmanら、1996, Science 274:94-96）を用いることができる。例えば、一実施形態では、例えば、ストレプタビジンと複合体化させることにより、特定のペプチド抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）を含むMHC分子を多量体化して、可溶性ペプチド四量体を作製する。次に、HSP−またはα2M−複合体で治療した被検者から得たＴ細胞の集団と、MHC−ペプチド抗原複合体を混合する。ビオチンを用いて、目的の抗原、すなわち、腫瘍特異的抗原を発現するＴ細胞を染色する。
【０２８２】
４．９．癌予防および免疫療法時の効果のモニタリング
腫瘍性疾患の発生および進行に対する、HSP−またはα2M−複合体による免疫療法の効果は、当業者には周知の任意の方法でモニタリングすることができ、そのような方法として、限定するものではないが、以下に挙げる事項の測定がある：ａ）細胞性免疫の評価と同様、遅延型過敏症；ｂ）in vitroでの細胞傷害性Tリンパ球の活性；ｃ）腫瘍特異的抗原、例えば、癌胎児性抗原（CEA）抗原のレベル；ｄ）コンピューター連動断層撮影（CT）スキャンのような方法を用いた腫瘍の形態学的変化；ならびにｅ）極めて危険な状態にある個体における特定の癌に関する危険度の推定バイオマーカーレベルの変化、ｆ）ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化。
【０２８３】
以下のサブセクションでは、任意の手順例を記載する。
【０２８４】
４．９．１．遅延型過敏症皮膚試験
遅延型過敏症皮膚試験は、免疫能全体および抗体に対する細胞免疫において、極めて価値が高い。一群の共通皮膚抗原に反応する能力の欠如をアネルギーと呼ぶ（Sato, T.ら、1995, Clin. Immunol. Pathol. 74:35-43）。
【０２８５】
適切な皮膚試験の方法では、抗原を４℃で滅菌状態に保存し、光から保護し、使用の直前に再形成することが求められる。25〜27ゲージの針は、皮下よりもむしろ内皮経路での抗原の投与を確実にする。抗原の内皮投与から24〜48時間後、紅斑および硬化両方の最大寸法を定規で測定する。さらに高い濃度の抗原を用いた試験、もしくは、曖昧な状況では、中間試験の反復試験によって所与の抗原または抗原群に対する低活性を確認する。
【０２８６】
４．９．２．in vitroでの細胞傷害性Tリンパ球の活性
Ficoll-Hypaque遠心分離勾配方法により単離した８×106個の末梢血液由来Ｔリンパ球を、10％ウシ胎児血清を含む３ml RPMI培地における４×104個のマイトマイシンＣ処理腫瘍細胞で再刺激する。いくつかの実験では、Ｔ細胞成長因子の供給源として、33％二次混合リンパ球培養物上清またはIL-2を培地に含有させる。
【０２８７】
免疫化後の細胞傷害性Ｔリンパ球の一次応答を測定するために、刺激因子である腫瘍細胞を用いずにＴ細胞を培養する。別の実験では、抗原が異なる細胞でＴ細胞を再刺激する。６日後、培養物を４時間の51Cr放出アッセイで細胞傷害性について試験する。標的の自然発生的51Cr放出は、20％以下のレベルに達するはずである。抗MHCクラスＩ遮断活性については、W6/32ハイブリドーマの10倍濃縮上清を試験サンプルに添加し、最終濃度を12.5％とする（Heike M.ら、J. Immunotherapy 15:165-174）。
【０２８８】
４．９．３．腫瘍特異的抗原のレベル
すべての腫瘍において固有の腫瘍抗原を検出することは不可能であろうが、多くの腫瘍が正常細胞からそれらを区別する抗原を展示する。モノクローナル抗体試薬により、抗原の単離と生化学的特性決定が可能になり、非形質転換細胞からの形質転換形態の識別や、形質転換細胞の細胞系の決定に際し、診断上極めて貴重になっている。最もよく特性決定されているヒト腫瘍関連抗原は、腫瘍胎児性抗原である。これらの抗原は、胚形成時に発現するが、正常な成人組織には存在しないか、あるいは検出するのが極めて困難である。始原型抗原は、癌胎児性抗原（CEA）、すなわち、胎児の腸やヒト結腸癌細胞に認められるが、正常な成人結腸細胞には認められない糖タンパク質である。CEAは結腸癌細胞から流出し、血清中に認められるため、血清中のこの抗原の存在を用いて、結腸癌患者をスクリーニングすることができると当初考えられていた。しかし、膵臓癌および乳癌のような他の癌患者も、血清中に高いレベルのCEAを有する。従って、治療中の癌患者におけるCEAレベルの低下および上昇をモニタリングすることは、腫瘍進行および治療応答を推定する上で有用であることが証明されている。
【０２８９】
これ以外にもいくつかの腫瘍胎児抗原が、ヒト腫瘍を診断およびモニタリングするのに有用であり、例えば、α−フェトプロテイン、すなわち、胎児肝細胞および卵黄嚢細胞により通常分泌されているα−グロブリンは、肝および生殖細胞腫瘍を有する患者の血清中に認められるため、疾患状態の材料として用いることができる。
【０２９０】
４．９．４．コンピューター連動断層撮影（CT）スキャン
CTは、癌の正確な病期分類を実施する方法の選択肢を提供する。CTは、転移を検出する上で、他のどんなイメージング方法よりも感度および特異性が高いことが証明されている。
【０２９１】
４．９．５．推定バイオマーカーの測定
特定の癌の危険度を表す推定バイオマーカーのレベルを測定することにより、細胞質ゾルおよび膜由来タンパク質を含む組成物の効果をモニタリングする。例えば、前立腺癌の危険度が高い個体において、Brawer, M. K.ら、1992, J. Urol. 147:841-845およびCatalona, W. J.ら、1993, JAMA 270:948-958により記載された手順によって血清前立腺特異的抗原（PSA）を測定する；もしくは、結腸直腸癌の危険がある個体では、第４．５．３節に記載したようにCEAを測定する；また、乳癌の危険度が高い個体では、Schneider, J.ら、1982, Proc. Natil. Acad. Sci. ISA 79:3047-3051により記載された手順によってエストラジオールの16-α-ヒドロキシル化を測定する。以上引用した参考文献は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０２９２】
４．９．６．ソノグラム
ソノグラムは、癌の正確な病期分類を実施する方法の別の選択肢を提供する。
【実施例】
【０２９３】
５．実施例
以下の実験により、（ａ）細胞画分由来の抗原ペプチドと、（ｂ）HSPまたはα-2-マクログロブリン（α2M）のいずれかとの複合体が、癌細胞増殖から動物を予防的に防御する上で有効であることを明らかにする。
【０２９４】
５．１．材料および方法
５．１．１  タンパク質精製
α2Mの精製のために、マウス由来の血清を0.04 Mトリス（pH7.6）、0.15 M NaClで１：１に希釈し、同じバッファーで平衡および溶離させた65 ml Sephacryl S 300R（SIGMA）カラムにロードした。α2M陽性画分をドット−ブロットにより決定し、PD-10カラムを用いて、画分中のバッファーを0.01 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）に取り替えた。タンパク質含有画分をConcanavalin Aセファロースカラムにロードした。結合したタンパク質を0.2 Mメチルマンノースピラノシドで溶離し、0.05 M酢酸ナトリウムバッファーで平衡させたDEAEカラムにロードした。α2M は純粋な形態で溶離したが、これはSDS-PAGEおよび0.13 M酢酸ナトリウムでのイムノブロッティングにより分析した。
【０２９５】
いくつかの実験では、SIGMAからα2Mを購入した。
【０２９６】
第４．３．３節に記載した方法によりgp96を取得した。
【０２９７】
５．１．２  腫瘍拒絶アッセイ
免疫化はすべて100μl容量のPBS中で内皮的に実施した。２回の免疫化を１週間あけて行なった。注射１回当たり、７マイクログラムのα2Mまたは１μgのgp96を複合体としてまたは単独のいずれかで用いた。生きている腫瘍細胞（100,000）を洗浄して培地を除去し、PBS中に再懸濁させ、最後の免疫化から１週間後に内皮注射した。腫瘍を二次元で測定した。平均値の半分を腫瘍の半径として用いることにより、腫瘍の体積を算出した。分散の単一分類分析（ANOVA）を用いて、Ｐ値を決定した。
【０２９８】
５．１．３   複合体の製造
ダウンスホモゲナイゼーションの後、超遠心分離により生きたMeth A細胞から細胞溶解物を取得した。100,000ｇの上清を0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）と3 mM ATPで10時間処理してから、10 kDaカットオフ限界を有するCENTRICON膜フィルター（Millopore）での遠心分離にかけた。C18逆相カラムに結合させ、メタノールでペプチドを溶離し、減圧下でペプチドを乾燥させた後、複合体化に適したバッファー中でペプチドを再形成することにより、10 kDa以下のペプチド（MethA10と呼ぶ）をさらに単離した。50モル過剰量のMethA10の存在下で、gp96、α2Mもしくはアルブミン（対照として用いる）を50℃に加熱した。形成された複合体を含む反応物を室温で30分置き、次に氷上に置いた。CENTRICON 50（Millopore）を用いて、遊離した非複合体化ペプチドを除去した。このようにして製造した複合体を免疫化に用いた。
【０２９９】
５．２．結果
この実験では、Meth A腫瘍モデルを用いて、gp96−ペプチド複合体、およびα2M−ペプチド複合体により誘発される抗腫瘍免疫を明らかにした。この腫瘍の抗原MHC Iエピトープはわかっていない。Meth A細胞溶解物をATPとトリフルオロ酢酸（TFA）で処理し、10 kDa以下のペプチド（MethA10）の画分を回収し、前記のようにα2Mまたはgp96と複合体化させた。MethA10と複合体化していない、もしくは複合体したα2Mまたはgp96でBALB/cマウスを免疫化した。また、負の対照として、アルブミン−MethA10またはPBSでもBALB/cマウスを免疫化した。免疫化を１週間あけて２回実施した。最後の免疫化から１週間後、すべてのマウスを100,000個の生きたMethA細胞で、内皮経路により攻撃した。攻撃から20日後まで、５日毎に腫瘍細胞をモニタリングした。
【表２】
2006514088.tif 000005
【０３００】
表２におけるデータは、α2M- MethA10（ｐ＜0.05）またはgp96- MethA10（ｐ＜0.05）複合体で免疫化したマウスでは有意な腫瘍防御を示すが、α2Mだけ、gp96だけ、アルブミン−MethA10またはPBSで免疫化したマウスにはみられなかった。
【０３０１】
５．３．考察
本明細書に記載した腫瘍に対する免疫の実験は、癌の免疫療法に対する新規の手法を示すものであり、この手法では、腫瘍由来の全細胞ペプチド（自己ペプチドおよび抗原ペプチドを含む）の配列をHSPまたはα2Mに複合体化させる。このような複合体は、宿主の免疫系を有効に刺激して、本明細書に示したように特異的に応答させる。前記データから、予防における該手法の有用性を既存の疾患の治療、ならびに、病原体感染の治療および予防にも拡大できることがわかる。
【０３０２】
本明細書で引用した参照文献はすべて、各々の刊行物もしくは特許または特許出願が、具体的かつ個別に、あらゆる目的のためにその全文を参照として組み込むと示されている場合と同じ範囲まで、その全文を参照として、またあらゆる目的のために本明細書に組み込む。
【０３０３】
当業者には明らかであるように、本発明は、その思想および範囲を逸脱することなく、様々な改変および変更が可能である。本明細書に記載した具体的実施形態は、例として提供されるにすぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲及びこの特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲によってのみ制限される。
【国際調査報告】
2006514088.tif 000006
2006514088.tif 000007