(57)【要約】  蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質に結合する性質を有する分子シャペロン蛋白質を利用して、薬理作用を有する化合物が標的蛋白質と結合することによる該標的蛋白質の立体構造の変化を検出することによる、薬理作用を有する化合物の標的蛋白質の同定方法を開示する。また、前記同定方法で見出された、糖尿病治療薬であるビグアナイドの標的蛋白質を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に利用可能なスクリーニングツール、及び該スクリーニング方法によって得られた物質を含有する糖尿病治療用医薬組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド、あるいは（４）（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された細胞と、試験物質とを接触させる工程、並びに
［２］該ポリペプチドと試験物質との結合を分析する工程、
を含む、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
［１］の工程が、ビグアナイド共存下で接触させる工程である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＡＭＰＫを活性化することを確認する工程、及び／又は糖尿病治療活性を有することを確認する工程を更に含む、請求項１又は請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
（１）請求項１に記載のポリペプチド、（２）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（３）請求項１に記載の形質転換された細胞からなる、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール。
【請求項５】
（１）請求項１に記載のポリペプチド、（２）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（３）請求項１に記載の形質転換された細胞の、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングのための使用。
【請求項６】
請求項１乃至請求項３に記載の方法によって得られた物質を含有する糖尿病治療用医薬組成物。
【請求項７】
請求項１乃至請求項３に記載の方法によって得られた物質を糖尿病治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、糖尿病治療方法。
【請求項８】
請求項１乃至請求項３に記載の方法によって得られた物質の、糖尿病治療用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項９】
［１］（１）試験薬剤、分子シャペロン蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）分子シャペロン蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法。
【請求項１０】
分子シャペロン蛋白質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／若しくは配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、あるいは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／若しくは配列番号２７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドからなる蛋白質である請求項９に記載の同定する方法。
【請求項１１】
分子シャペロン蛋白質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項９に記載の同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質に結合する性質を有する分子シャペロン蛋白質を利用して、薬理作用を有する化合物が標的蛋白質と結合することによる該標的蛋白質の立体構造の変化を検出することによる、薬理作用を有する化合物の標的蛋白質の同定方法に関する。
また、本発明は、本発明の同定方法により見出された標的蛋白質を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤として使用されている低分子化合物には、薬理作用が明確でありながらその作用機序が不明な分子が多数存在する。一般に薬剤の多くは生体内で特定の蛋白質に作用して該蛋白質の機能を変化させ、結果として薬理作用を惹起する。作用機序が不明な薬剤では、その標的となる蛋白質が同定されていない。近年、分子レベルで生体内のシグナル伝達系の解明が進んだ結果、特定の薬理作用を引き出すために必要な特定の蛋白質分子が数多く同定された。その結果、今日ではそれら特定の蛋白質分子を標的とした分子標的薬と呼ばれる薬剤の開発が進み、その割合は急速に増加している。標的となる蛋白質が明らかな化合物は生体への作用機序が明確であり、また該蛋白質との結合の強度、あるいは該蛋白質が有する酵素活性の変化を指標として化合物の構造を改変できる。このため吸収や分解を含む体内動態、さらには薬理活性の向上を目的とする改良研究が容易であり、薬剤を開発する上で非常に有利である。反対に標的蛋白質が不明な化合物は、たとえ明確な薬理作用が見出されている場合でも、当該活性を向上させる目的で化合物構造の改良を図ることが容易ではない（非特許文献１参照）。
また、薬剤は程度の違いはあるが、一般に望ましい薬理作用（主作用）の他に望ましくない薬理作用（副作用）を併せ持っている。既に上市され、主作用を担う標的蛋白質が明らかである分子標的薬の中にも、副作用に関わる標的蛋白質についての情報は乏しい例が多く、これが副作用の回避、改善のための研究に時間、コストを要する原因となっている（非特許文献１参照）。
有意な薬理作用が知られながら標的蛋白質が明確でない薬剤は現実に多数存在している。代表的な例として、糖尿病の治療薬として古くから利用されているビグアナイド剤（非特許文献２参照）や、多発性骨髄腫の劇的な治療効果からその存在が見直されているサリドマイドを挙げることができる（非特許文献３参照）。ビグアナイドは有意な血糖降下作用を、サリドマイドは有意な血管新生阻害作用を有しているにもかかわらず、これらの薬剤はいずれも生体内における直接の標的蛋白質が同定されていない。そのため、これらの薬剤は有用な薬理作用を有していながら、その効果を高める改良研究が困難であった。加えて、ビグアナイドには乳酸アシドーシス（非特許文献４参照）、サリドマイドには催奇形性（非特許文献３参照）といった重篤な副作用が知られているが、これらを回避するための研究も標的が不明なため進展していない。従って、これら薬剤の標的蛋白質の同定が望まれていた。【０００３】
従来、低分子化合物が作用する標的蛋白質を同定する手段としては、該化合物と直接結合する蛋白質を物理的及び／又は化学的な手段で検出し分離する方法が一般的であった。例えば、化合物構造の一部分を改変して高分子量のアフィニティービーズと結合させることにより、重力など物理的な力によって化合物と結合した標的蛋白質を分離・精製する方法が知られている。また、化合物構造の一部分に標識となるタグをつけることで該化合物と結合した標的蛋白質を化学的に検出することも行われている（非特許文献５参照）。近年では酵母ツーハイブリッド法（非特許文献６参照）やファージディスプレイ法（非特許文献７参照）などの分子生物学的な手法を応用して、目的の化合物と結合する蛋白質をコードする遺伝子断片をｃＤＮＡライブラリー中からスクリーニングし、同定する試みも行われている。
しかしながら、上述した様々な手法による試みにもかかわらず、これまでに進められた該分野の研究から実際に薬剤の標的蛋白質が同定された例は多くはない。成功する確率が低い原因として、上述の方法においては、いずれの場合もプローブとする化合物にビーズやタグを結合させるために、化合物の一部構造を改変する必要があることから、本来の化合物とは異なる人工的な構造体に対して、結合する蛋白質を探索せざるを得ない点が挙げられる（非特許文献１および５参照）。これは即ち、タグやビーズ、あるいはそれらと化合物の複合体といった、本来の薬理活性を持つ薬剤とは異なる人工物へ結合する非特異的な蛋白質を標的蛋白質と誤って同定する原因となる。また、化合物構造の改変は、該化合物の薬理作用に影響しない部位に施されることが真の標的蛋白質を見出すために必須であるが、標的不明の薬剤や化合物は概して構造とその薬理活性の相関についての情報が乏しく、任意の部位で修飾した化合物を利用せざるを得ない例が多い。このため、本来の薬理活性を失った化合物をプローブとして選択する確率も高い。本来は修飾によりタグやビーズを付加された該化合物がもとの薬理活性を維持している事実を確認した後にそれらをプローブとして用いることが好ましいが、細胞膜透過性や安定性など様々なパラメーターが影響するため薬理活性の有無の判断は容易ではない。また、化合物構造の修飾は時間と費用、特殊な技術を要することから、上述の方法が汎用的な研究手法になりにくい原因となっている。
一方、化合物の分子内の元素をラジオアイソトープに置換することにより標識した化合物（構造は標識前と同じ）を用いて特定の蛋白質との結合を確認することは可能であったが、固定可能な修飾ではない為、多数の蛋白質の中から標的蛋白質を探索することは容易ではなかった。また、この方法では、標識により化合物が不安定になったり、コストがかかるといった難点もあった。
従来法による化合物標的探索の成功確率が低い別の原因として、上述の方法ではいずれも化合物と蛋白質の直接の結合を指標として標的の検出・分離を行うために、化合物と標的蛋白質の結合親和性が高くなければ標的発見が困難である点が挙げられる。実際に上述の方法で標的を見出した数少ない成功例は、いずれも化合物と蛋白の結合親和性の高いものである（非特許文献４参照）。しかしながらこれまでの知見から化合物の薬理活性の高さと標的蛋白質との結合親和性は必ずしも相関しない。むしろ不可逆な阻害を除いては薬理作用の惹起に化合物が標的蛋白質と強固に結合する必要はないとも考えられている（非特許文献８参照）。以上の問題点から、従来の手法では見出すことができなかった薬剤の標的蛋白質を同定する方法が望まれていた。【０００４】
分子シャペロンは蛋白質分子の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）や変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）、多量体形成等の蛋白質の構造形成を介助する一群の蛋白質である（非特許文献９参照）。今日では熱刺激によって発現量が亢進することが知られている熱ショック蛋白質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と総称される分子の多くがシャペロンとして働くことが知られている。分子シャペロンの中でも、Ｈｓｐ６０ファミリーと総称される分子群は、典型的な分子シャペロンとして特に「シャペロニン」と呼ばれている。
熱ショック蛋白質に代表されるこれら分子シャペロンは、翻訳過程で立体構造が完成していない不安定な蛋白質と相互作用してそれらを安定に保つ他に、環境変化に伴って細胞内の蛋白質の機能に影響が生じないように，蛋白質の構造を維持・管理し、異常な状態になった基質に対してはユビキチン化されて分解されるのを促進する作用を持つ（非特許文献１０参照）。
このようにシャペロンは基質となる蛋白質分子の非天然構造を認識する機能分子としての性質を有している。
一方、リガンド候補存在下又は非存在下での標的蛋白質の重畳状態（ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅ）及び展開状態（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅ）の程度を決定することに分子シャペロンを用いた、既知の標的蛋白質のリガンドを同定するためのスクリーニング方法が報告されている（特許文献１〜６参照）。
【０００５】
インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産又は分泌に障害をもつ１型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくくなる２型の２つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、１型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、２型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の細胞における取り込み又は消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。２型糖尿病は遺伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの２型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の９５％を占めている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性の改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療の必要性が増大している。
現在１型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方、２型糖尿病患者に処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤（ＳＵ剤）や、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内への糖の取り込みと細胞内における糖利用の促進である。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（非特許文献１１参照）。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、脂肪蓄積や、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献１２参照）。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用であることから、インスリン抵抗性改善のために、ＰＰＡＲγにかわるより有用な創薬標的分子が求められている。これらの他に糖代謝改善作用をもたらす有力な薬剤として、古くから用いられているビグアナイド系血糖降下剤（非特許文献１３参照）が知られている。ビグアナイド剤は嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、食欲の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つことが報告されており、それらの結果、ビグアナイドは肝臓、筋肉におけるインスリン感受性を向上させる。ビグアナイドはすい臓には働きかけず、インスリンの分泌は増やさないことから、肥満を招かず低血糖も起こしにくいという特徴がある。ビグアナイドの作用は前述のチアゾリジン誘導体やインスリン製剤が有する好ましくない作用を含まないものであり、実際に前述の他の血糖降下剤と併用されて処方される例が多い。近年その有力な薬理作用が見直されたこともあり、ビグアナイド剤は現在インスリン抵抗性改善薬としてチアゾリジン誘導体に次ぐ地位にある。だが一方で、ビグアナイド剤には乳酸の蓄積を増大させ乳酸アシドーシス（非特許文献１４参照）を引き起こす副作用が知られている。ビグアナイド剤は薬としての歴史が非常に古いにもかかわらず、チアゾリジン誘導体のＰＰＡＲγにあたるような明確な標的蛋白質が未だに同定されていない。このためにビグアナイド剤は標的蛋白質との構造活性相関情報が得られておらず、今日まで乳酸アシドーシスの改善といった副作用との乖離研究だけでなく、血糖降下という主作用の増大を目指した改良研究も困難であった。
ＡＴＰ５Ｂ蛋白質はゲノム上にコードされ、ミトコンドリアに輸送されて働くＦ１Ｆ０−ＡＴＰ合成酵素のβサブユニットである（非特許文献１５及び１６参照）。またＡＴＰ５Ｂの存在量は、２型糖尿病患者の筋肉においては健常人のそれと比較して遺伝子発現量、蛋白量ともに低下することが報告されている（非特許文献１７及び１８、特許文献７参照）。また、糖尿病患者の筋肉におけるＡＴＰ５Ｂのリン酸化レベルと空腹時血糖値は逆相関すること（非特許文献１８及び特許文献７参照）、ＡＴＰ５Ｂの発現を制御するもの、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに結合する化合物（例えば核酸フラグメント）等が糖尿病関連疾患治療薬になるとの報告がされている（特許文献７参照）。ＡＴＰ５Ｂを含むヒト心臓ミトコンドリアプロテオームに含まれる種々のポリペプチド（３０２５個）を開示し、これらはミトコンドリア機能に関する疾患（糖尿病を含む）治療薬のスクリーニングに関すると記載した報告がある（特許文献８）。しかしながら、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質とビグアナイドが結合するという報告はなかった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５５８５２７７号明細書
【特許文献２】米国特許第５６７９５８２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／０５５１２３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／１９１８３５号明細書
【特許文献５】特許第２９５２８４８号
【特許文献６】欧州特許第０７７０８７６号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／０２０９６３号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／０８７７６８号パンフレット
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オブ  アンティバイオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」Ｈ  Ｈａｔｏｒｉら，  ２００４年  第５７巻７号ｐ．４５６−４６１．
【非特許文献２】「日本臨床」Ｙ．Ｙａｍａｃａｋｉら２００２年、第６０巻９号  ｐ．３８９−９２
【非特許文献３】「ドラッグ・ディスカバリー・トウデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ）」Ｔｅｏ  ＳＫら，  ２００５年  第１５巻１０号（２）ｐ．１０７−１１４．
【非特許文献４】「ドラッグス」Ｌａｌａｕ  ＪＤら、１９９９年  第５８巻１号  ｐ．５５−６０／７５−８２
【非特許文献５】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（英国）２０００年、Ｎ  Ｓｈｉｍｉｚｕら、第１８巻、ｐ．８７７−８８１
【非特許文献６】「バイオケミカル  ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」２００２年、Ｄ  Ｈｅｎｔｈｏｒｎら  第６３巻９号ｐ．１６１９−１６２８
【非特許文献７】「ケミストリー  ＆  バイオロジー（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｓｃｈｅ  ＰＰら，１９９９年  第６巻１０号：ｐ．７０７−７１６．  ＰＭＩＤ：１０５０８６８５
【非特許文献８】「生化学（ＯＵＴＬＩＮＥＳ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」１９８７年、Ｅｒｉｃ  Ｅ．  ＣＯＮＮら
【非特許文献９】「ファーマコロジー＆セラピュティックス（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」２００４年、  Ａ  Ｓｒｅｅｄｈａｒら  第１０１巻３号ｐ．２２７−２５７
【非特許文献１０】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」１９９２年、Ｇｅｔｈｉｎｇ  ＭＪ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら：第３５５巻６３５５号：ｐ．３３−４５
【非特許文献１１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９５３−１２９５６
【非特許文献１２】「ダイアビーティーズ  フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１１−８１８
【非特許文献１３】「日本臨床」Ｙ．Ｙａｍａｓａｋｉら２００２年、第６０巻９号  ｐ．３８９−９２
【非特許文献１４】「ドラッグス」Ｌａｌａｕ  ＪＤら、１９９９年  第５８巻１号  ｐ．５５−６０／７５−８２
【非特許文献１５】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（米国）、１９９７年、第３８６巻、ｐ．２９９−３０２
【非特許文献１６】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（米国）、１９９４年、第３７０巻（６４９１）、ｐ．６２１−６２８
【非特許文献１７】「ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」２００２年、第５１巻、ｐ．１９１３−１９２０
【非特許文献１８】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）」２００３年、第２７８巻、ｐ．１０４３６−１０４４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は低分子化合物の標的蛋白質を、該化合物と蛋白質の結合ではなく化合物に応答した蛋白質の立体構造の変化を指標として、しかも前記化合物の構造修飾を必要とすることなく、同定する方法の提供を課題とする。
また、本発明は新規な糖尿病治療薬のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
化合物が作用して標的となる蛋白質の機能に影響を与える場合、該蛋白質の立体構造が化合物との相互作用により変化を受けると予想される。従って化合物がもたらす薬理作用に必要なのは、化合物と標的間の単純な結合ではなく、化合物の作用による標的蛋白質の立体構造の変化であると考えられる。そこで、本発明者らは、該変化を指標として蛋白質を探索することが可能であれば、化合物と蛋白質の結合を指標とした従来の化合物標的探索手法より高い確率で、化合物の薬理作用を担う真の標的蛋白質を検索できると考えた。さらに、前記変化を化合物の側からではなく、化合物に応答した標的蛋白質の側から捕捉及び検出する手法を開発することにより、従来の手法で不可避であった化合物構造の修飾を必要とせずに、該化合物の標的蛋白質を同定することを可能にした。
即ち、本発明者らは、基質となる蛋白質分子の非天然構造を認識する機能分子として知られている分子シャペロン蛋白質が、化合物（標的蛋白質が不明な薬剤）による蛋白質の立体構造の変化を認識することを見出し、細胞内蛋白質と分子シャペロン蛋白質との結合の変化を指標に化合物（標的蛋白質が不明な薬剤）の標的蛋白質を検出し同定する方法を構築した。具体的には、本発明者らは低分子化合物である１７β−エストラジオールの標的蛋白質としてエストロゲン受容体の検出に成功し（実施例２）、また、ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質としてＦＫＢＰ１２の検出、デキサメタゾンの標的蛋白質としてグルココルチコイド受容体の検出、ジヒドロテストステロンの標的蛋白質としてアンドロゲン受容体の検出、アルドステロンの標的蛋白質としてミネラルコルチコイド受容体の検出、及びメトトレキサートの標的蛋白質として水素葉酸還元酵素の検出（実施例３）に成功した。さらに従来標的蛋白質が不明であった糖尿病の治療薬ビグアナイドの標的蛋白質の検出と同定に成功し、これがＡＴＰ５Ｂであることを見出した（実施例４）。加えて本発明の方法により、今日まで標的蛋白質が不明であったサリドマイドの標的蛋白質としてＴＡＲＤＢＰを見出すことに成功した（実施例８）。【０００９】
また、本発明者らが糖尿病治療薬であるビグアナイド剤と結合することを見出した、ミトコンドリア膜に存在するＦ１Ｆ０−ＡＴＰ合成酵素のβサブユニットである上記ＡＴＰ５Ｂ蛋白質を細胞内で過剰に発現させると、ビグアナイドによる細胞内のＡＭＰキナーゼ（以下、ＡＭＰＫ）の活性化が妨げられることを明らかにした（実施例５）。これらの知見から、本発明者らはＡＴＰ５Ｂ蛋白質がビグアナイド剤の薬理作用（主作用）に関わる標的蛋白質であることを明らかにし、該蛋白質を利用した新たな糖尿病治療薬のスクリーニング方法を構築した。確かに、本発明のスクリーニング方法で得られた物質が、糖尿病治療効果を有し、また副作用を有さないことを見出し、新たな糖尿病治療薬のスクリーニングツール及びスクリーニング方法並びに糖尿病治療用医薬組成物を提供した。【００１０】
すなわち、本発明は、
＜１＞［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド、あるいは（４）（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された細胞と、試験物質とを接触させる工程、並びに
［２］該ポリペプチドと試験物質との結合を分析する工程、
を含む、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法、
＜２＞［１］の工程が、ビグアナイド共存下で接触させる工程である＜１＞に記載のスクリーニング方法、
＜３＞ＡＭＰＫを活性化することを確認する工程、及び／又は糖尿病治療活性を有することを確認する工程を更に含む、＜１＞又は＜２＞に記載のスクリーニング方法、
＜４＞（１）＜１＞に記載のポリペプチド、（２）＜１＞に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（３）＜１＞に記載の形質転換された細胞からなる、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール、
＜５＞（１）＜１＞に記載のポリペプチド、（２）＜１＞に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（３）＜１＞に記載の形質転換された細胞の、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングのための使用、
＜６＞  ＜１＞乃至＜３＞に記載の方法によって得られた物質を含有する糖尿病治療用医薬組成物、
＜７＞  ＜１＞乃至＜３＞に記載の方法によって得られた物質を糖尿病治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、糖尿病治療方法、
＜８＞  ＜１＞乃至＜３＞に記載の方法によって得られた物質の、糖尿病治療用医薬組成物を製造するための使用、
＜９＞［１］（１）試験薬剤、分子シャペロン蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）分子シャペロン蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法、
＜１０＞分子シャペロン蛋白質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／若しくは配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、あるいは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／若しくは配列番号２７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドからなる蛋白質である＜９＞に記載の同定する方法、
また、
＜１１＞分子シャペロン蛋白質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び／又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である＜９＞に記載の同定する方法
に関する。【００１１】
本願優先日においては、基質となる蛋白質分子の非天然構造を認識する機能分子としての分子シャペロンの性質（非特許文献９、非特許文献１０）、分子シャペロンを用いた既知の蛋白質のリガンドを同定する方法（特許文献１〜６）は知られていたものの、低分子化合物の標的タンパク質を、分子シャペロンを用いて同定する方法は全く知られていなかった。
本願優先日においては、２型糖尿病患者の筋肉におけるＡＴＰ５Ｂの存在量の低下（非特許文献１７及び１８、特許文献７参照）、糖尿病患者の筋肉におけるＡＴＰ５Ｂのリン酸化レベルと空腹時血糖値は逆相関すること（非特許文献１８及び特許文献７参照）は知られていたが、特許文献７では、ＡＴＰ５Ｂ自体や抗体が糖尿病関連疾患治療薬になるとの記載があり、ＡＴＰの発現をどのように制御すれば糖尿病治療効果が出るかについて不明であった。ＡＴＰ５Ｂを含むヒト心臓ミトコンドリアプロテオームに含まれる多数（３０２５個）のポリペプチドを開示し、これらは糖尿病を含む多数のミトコンドリア機能に関する疾患治療薬のスクリーニングに関すると記載した報告があるが（特許文献８）、ＡＴＰ５Ｂが糖尿病治療薬のスクリーニングに関するという根拠は全くない。また、本願優先日後に公開された文献（国際公開第２００５／０９０９９２号パンフレット）には、ＡＴＰ５Ｂを含む複数のＰＴＥＮ経路のモディファイヤーであるポリペプチドが開示され、それらモディファイヤーと候補化合物の結合を検出する系が開示されているが、モディファイヤーに特異的に結合する薬剤と糖尿病との関係は記載も示唆もされていない。これら何れの文献にも、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質とビグアナイドが結合するという報告はなく、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質とビグアナイドが結合することは本発明者らが初めて見出した知見であり、ＡＴＰ５Ｂを用いた、ビグアナイドと同様の主作用を有する糖尿病治療薬のスクリーニング方法（特には、ビグアナイド共存下で行うＡＴＰ５Ｂを用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法）は、本発明者らが初めて行った発明である。
【発明の効果】
【００１２】
化合物の構造修飾を必要とせず、かつ、該化合物と標的蛋白質との結合の強度を指標とせずに、標的蛋白質の立体構造の変化を指標として化合物に応答する標的蛋白質を同定する本発明の方法は、既存の薬剤の改良研究に有用な標的蛋白質の同定方法として有用であり、従来の化合物標的蛋白質の探索法にあった種々の課題を一掃する新規の手法である。【００１３】
本発明のスクリーニングツール（例えばビグアナイドの標的蛋白質であるＡＴＰ５Ｂ）を用いた本発明のスクリーニング方法により、ビグアナイドの構造類似化合物に加え、糖尿病治療薬となる構造非類似の新たな母核の化合物を取得できる。この構造非類似な化合物は、ビグアナイド剤の特徴である、肥満を引き起こさず、かつ低血糖を起こしにくい効果を有する、新たな糖尿病治療薬となりうる。加えて、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質との結合を指標にすることによって、取得された化合物の主作用を維持したままその分子構造を改変することが可能であり、従来のビグアナイド剤と比較してより主作用に高い活性を有し、副作用をより低減させた糖尿病治療薬の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】分子シャペロン蛋白質をプローブとしたプルダウン法により、Ｅ２の存在依存的に変化が検出されたＥＲαのバンドを示す図である。レーン１及び２は、ＧＳＴを用いた結果を、レーン３〜６は、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４を用いた結果を示す。
【図２】ヒトＡＴＰ５Ｂとフェンフォルミンの結合を示す図である。図中の「＋」はＭＴＸ−フェンフォルミン添加の場合を、「−」はＭＴＸ−フェンフォルミン未添加の場合を示す。「Ｉｎｐ．」は、インプット（ｉｎｐｕｔ）を示す。
【図３】ヒトＡＴＰ５Ｂの変異によるフェンフォルミン結合能の消失を示す図である。「ＷＴ」は野生型ＡＴＰ５Ｂを、「Ｅ１７５Ｖ」はＧｌｕ１７５Ｖａｌ変異型ＡＴＰ５Ｂを、「Ｄ２９５Ｖ」はＡｓｐ２９５Ｖａｌ変異型ＡＴＰ５Ｂを使用した場合を示す。図中の「＋」はＭＴＸ−フェンフォルミン添加の場合を、「−」はＭＴＸ−フェンフォルミン未添加の場合を示す。「Ｉｎｐ．」は、インプット（ｉｎｐｕｔ）を示す。
【図４】ヒトＡＴＰ５Ｂの過剰発現によるフェンフォルミン（ＰＦ）のＡＭＰＫ活性化能の消失を示す図である。上パネルは、抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体を用いた結果を、下パネルは、抗ＡＭＰＫα抗体を用いた結果を示す。図中の「＋」はフェンフォルミン（ＰＦ）を添加した場合を、「−」はフェンフォルミン未添加の場合を示す。
【図５】フェンフォルミン（ＰＦ）の濃度に依存する、ヒトＡＴＰ５ＢとＭＴＸ−フェンフォルミン（ＭＴＸ−ＰＦ）の結合を示す図である。縦軸はカウント（ＡＴＰ５Ｂ量）を示す。
【図６】ヒトＡＴＰ５Ｂとフェンフォルミンの結合を示す実験において、試験物質（フリーのフェンフォルミン；ＰＦ）を接触させてその結合に影響を与えるか否かを検出した図である。縦軸はカウント（ＡＴＰ５Ｂ量）を示す。
【図７】ＡＴＰ５Ｂとフェンフォルミンの結合を示す実験において、試験物質（化合物Ａ又は化合物Ｂ）を接触させてその結合に影響を与えるか否かを検出した図である。縦軸はカウント（ＡＴＰ５Ｂ量）を示す。
【図８】化合物Ａ及び化合物Ｂがｉｎ  ｖｉｖｏで乳酸蓄積を引き起こすことなく血糖降下作用を有することを示す図である。ｄｂ／ｄｂマウスに化合物Ａ（中抜き四角印）、メトフォルミン（黒丸印）、又は溶媒（黒菱形印）を腹腔内投与した時の、０分、９０分、１８０分後の血糖値（Ａ）及び乳酸値（Ｂ）の経時変化を示す。同様に化合物Ｂ（黒四角印）、メトフォルミン（黒丸印）又は溶媒（黒菱形印）をｄｂ／ｄｂマウスに腹腔内投与した時の、０分、９０分、１８０分後の血糖値（Ｃ）及び乳酸値（Ｄ）の経時変化を示す。Ａ及びＣは、いずれも０分における測定値を基準に溶媒投与群における各測定時間の値を１００としてそれらに対する相対値を表示しており、縦軸は血糖値変化率（％）を示す。Ｂ及びＤは、いずれも０分における測定値を１００としてそれらに対する相対値を表示しており、縦軸は乳酸値変化率（％）を示す。＊は有意差検定におけるｐ値が０．０５以下、＊＊は同０．０１以下であることを示す。
【図９】ｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰを導入したＨｅＬａＳ３細胞におけるＴＡＲＤＢＰの発現量を示す図である。縦軸は、ＴＡＲＤＢＰ／β−アクチンの値を示す。
【図１０】空ベクター導入細胞又はｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰ導入細胞における、オカダ酸（ＯＡ）によるＴＮＦ−αの産生量に及ぼすサリドマイド（Ｔｈａ）の影響を示す図である。縦軸はＴＮＦ−α／β−アクチンの値を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明について詳細に説明する。本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能であり、蛋白質操作技術は特に断りのない限り「タンパク実験プロトコール」（秀潤社、１９９７年）等の公知技術に従って実施可能である。【００１６】
本発明の一つは、生体内で蛋白質の立体構造の変化を認識する機能を有する蛋白質分子である分子シャペロン蛋白質を利用して、特定の化合物（標的蛋白質が不明な薬剤）の添加、未添加時における分子シャペロンと内在性の蛋白質（標的蛋白質）との結合の変化の差を網羅的に調べ、試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質を選択することにより、化合物に応答して立体構造が変化した蛋白質（標的蛋白質）を同定する方法である。【００１７】
本発明の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、分子シャペロン蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）分子シャペロン蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。
本明細書において、試料細胞内蛋白質とは、探索したい標的蛋白質を含むと考えられる細胞（以下試料細胞と称する）に含まれる（発現している）蛋白質群を意味する。本発明の同定方法においては、試験薬剤、分子シャペロン蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とが、接触する限り、接触の順序、分子シャペロン蛋白質の状態（単離されているか、細胞に発現しているか、又は細胞の抽出液に含まれているか）、及び試料細胞内蛋白質の状態（生細胞内に発現しているか、細胞の抽出液に含まれているか）によって限定されない。即ち、本発明の同定方法には、単離精製した分子シャペロン蛋白質及び試料細胞の抽出液に含まれている試料細胞内蛋白質を用いる方法（第一の同定方法）、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドの一部若しくは全長域を含むベクターで形質転換した試料細胞に発現している分子シャペロン蛋白質及び前記形質転換した試料細胞（生細胞）に発現している試料細胞内蛋白質を用いる方法（第二の同定方法）、前記形質転換した細胞の抽出液に含まれた状態の分子シャペロン蛋白質及び同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質を用いる方法（第三の同定方法）が含まれる。
本発明の第一の同定方法では、分子シャペロン蛋白質を単離する。例えば分子シャペロン蛋白質の一部若しくは全長域、又はＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた分子シャペロン蛋白質の一部若しくは全長域を、大腸菌などのバクテリア、酵母、又は昆虫細胞等に発現させる、あるいは化学的な合成法によって大量に産生させた後、分子シャペロン蛋白質の抗体又は分子シャペロン蛋白質に融合させた各種タグの抗体あるいはタグと親和性の高いアフィニティービーズ又はアフィニティーカラムを用いて精製することができる。あるいは試験管内で分子シャペロン遺伝子のＤＮＡ断片を転写、翻訳させることにより分子シャペロン蛋白質を産生し、精製することも可能である。本発明の第一の同定方法では、試料細胞から抽出した蛋白質混合液（即ち、試料細胞内蛋白質を含む液）に、精製した分子シャペロン蛋白質を試験薬剤添加又は未添加の状態で試験管内で混合し接触させた後、分子シャペロン蛋白質とそこに結合する蛋白質を上述と同様の方法に従って濃縮する。好ましくは、実施例２（２）（３）、３、４又は８に記載の方法により、試験薬剤未添加時のみ分子シャペロン蛋白質に結合する試料細胞由来の蛋白質又は試験薬剤添加時のみ分子シャペロン蛋白質に結合する試料細胞由来の蛋白質を検出することができる。【００１８】
本発明の第二の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞に発現している分子シャペロン蛋白質、及び前記形質転換された試料細胞に発現している試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞に発現している分子シャペロン蛋白質と前記形質転換された試料細胞に発現している試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。
本発明の第三の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞の細胞抽出液に含まれた状態の分子シャペロン蛋白質及び前記抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞の細胞抽出液に含まれた状態の分子シャペロン蛋白質と前記抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。【００１９】
本発明の第二の同定方法及び第三の同定方法には、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドの一部若しくは全長域を含むベクターで、探索したい標的蛋白質を含むと考えられる細胞を形質転換し、分子シャペロン蛋白質であるポリペプチドの一部若しくは全長域、又はＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた該ポリペプチドの一部若しくは全長域を、該細胞に発現させる工程が含まれる。第二の同定方法では、前記形質転換された生きている状態の細胞に、標的蛋白質を探索したい化合物（以下、試験薬剤と称する）を添加（接触）する又は添加しない（未添加）。これにより、前記形質転換された試料細胞に発現している分子シャペロン蛋白質、試料細胞内蛋白質及び試料薬剤とを、あるいは前記形質転換された試料細胞に発現している分子シャペロン蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させることができる。第三の同定方法では、前記形質転換された細胞から抽出した蛋白質混合液（即ち、分子シャペロン蛋白質及び試料細胞内蛋白質を含む試料細胞抽出液）に試験薬剤を添加（接触）する又は添加しない（未添加）。これにより、前記形質転換された試料細胞の抽出液に含まれた状態の分子シャペロン蛋白質、同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質及び試料薬剤とを、あるいは前記形質転換された試料細胞の抽出液に含まれた状態の分子シャペロン蛋白質と同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させることができる。
本発明の第二の同定方法及び第三の同定方法では、分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を第一の同定方法と同様の方法に従って濃縮する。【００２０】
＜分子シャペロン蛋白質＞
本発明の同定方法で用いることのできる分子シャペロン蛋白質としては、公知の、分子シャペロン蛋白質を用いることが出来る。具体的にはＨｓｐ９０（ＨｔｐＧ；カッコ内は大腸菌の名称を示す）、Ｈｓｐ７０（ＤｎａＪ）、Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）、Ｈｓｐ４０（ＤｎａＪ）、Ｈｓｐ２７（ＩｂｐＡＢ）、Ｈｓｐ１０４（ＣｌｐＢ）、ＧＲＰ７８（ＤｎａＫ）の各ファミリーに属する代表的な蛋白質群が挙げられる（Ａ  Ｓｒｅｅｄｈａｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００４年、  第１０１巻３号ｐ．２２７−２５７；  Ｄ．Ｓ．  Ｌａｔｃｈｍａｎら、Ｃａｒｄｉｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１年  ５１巻ｐ．６３７−６４６）。他に、ＦＫＢＰ５６やｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１として知られるＨｓｐ３２、低分子のｓＨＳＰｓ（ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等も同様にシャペロンとして利用が可能である（Ｐ  Ｌａｋｓａｎａｌａｍａｉ，Ｅｘｔｒｅｍｐｈｉｌｅｓ，２００４年８巻１号ｐ１−１１）。【００２１】
本発明の同定方法において用いることができる分子シャペロン蛋白質としては、公知の分子シャペロン又は公知の分子シャペロン蛋白質を表すアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）が含まれる。また、上記に挙げた分子シャペロン蛋白質を表すアミノ酸配列との同一性が９０％以上（好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）が含まれる。
また、本発明の機能的等価改変体及び相同ポリペプチドの起源は特定の生物種に限定されない。更には、機能的等価改変体及び相同ポリペプチドのいずれかに該当する限り、天然ポリペプチドに限定されず、公知の分子シャペロン蛋白質を表すアミノ酸配列を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。
なお、本明細書における前記「同一性」とは、NEEDLE program（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EDNAFULL【００２２】
本発明の同定方法で用いる分子シャペロン蛋白質としては、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，及び／又は２７に示す蛋白質（ヒトＨＳＰＡ１Ａ；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００５３３６、ヒトＨＳＰＨ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００６６３５、ヒトＨＳＰＣＡ；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００５３３９、ヒトＨＳＰＤ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿９５５４７２、ヒトＤＮＡＪＡ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１５３０、ヒトＨＳＰＢ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１５３１、ヒトＨＳＰＥ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００２１４８、ヒトＨＳＰＡ４；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００２１４５、ヒトＨＳＰ９０Ｂ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００３２９０、ヒトＣＣＴ６Ｂ；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００６５７５、ヒトＴＣＰ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿１１０３７９、ヒトＨＳＰＡ１４；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０５７３８３、ヒトＨＳＰＡ９Ｂ；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００５３３８、ヒトＳＴＣＨ；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００８８７９、ヒトＨＹＯＵ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００６３８０、ヒトＨＳＰＢ５；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１８７６、ヒトＨＳＰＢ２；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１５３２、ヒトＤＮＡＪＡ２；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００５８７１、ヒトＤＮＡＪＢ１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００６１３６、ヒトＤＮＡＪＢ２；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００６７２７、ヒトＨＣＧ３；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００１００１３９４、ヒトＤＮＡＪＢ１１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０５７３９０、ヒトＤＮＡＪＣ１１；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０６０６６８、ヒトＤＮＡＪＣ７；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００３３０６、ヒトＤＮＡＪＣ６；ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０５５６０２）、及び配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，及び／又は２７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、又は、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，及び／又は２７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上（好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体���造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドが好ましい。
「蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合する」とは、試験薬剤と結合することによる蛋白質の立体構造の変化に応答して、分子シャペロン蛋白質が該蛋白質に結合する、あるいは、未変化の状態の蛋白質に結合していた分子シャペロン蛋白質が、試験薬剤と結合することによる蛋白質の立体構造の変化に応答して、乖離することを意味する。分子シャペロン蛋白質が蛋白質の立体構造の変化に応答して「結合する」か否かは、本発明の同定方法の「分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する」方法と同様にして確認することができる。特に、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，及び／又は２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能的等価改変体及び相同ポリペプチドについて「蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合する」ことは、ビグアナイド（試験薬剤）と結合することによるＡＴＰ５Ｂ蛋白質の立体構造の変化に応答して、未変化の状態のＡＴＰ５Ｂ蛋白質に結合していた分子シャペロン蛋白質が、ビグアナイドと結合することによるＡＴＰ５Ｂ蛋白質の立体構造の変化に応答して乖離することで確認する。又は、サリドマイド（試験薬剤）と結合することによるＴＡＲＤＢＰ蛋白質の立体構造の変化に応答して、分子シャペロン蛋白質が該蛋白質に結合することで確認する。これらの確認は、実施例４又は実施例８の条件下で、実施例４又は実施例８において用いた分子シャペロン蛋白質の代わりに検討対象の機能的等価改変体及び相同ポリペプチドを用いることによって実施する。【００２３】
本発明の同定方法においては、分子シャペロン蛋白質のうち、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，及び／又は２７に示す蛋白質の利用が特に好ましい。これらの蛋白質は、それぞれが前述の分子シャペロンの異なる各ファミリー（Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ１０４、ＧＲＰ７８）に属しており、それらシャペロン蛋白質の各ファミリーに特有の性質をそれぞれが保持していると期待される。【００２４】
＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞
本発明の同定方法において、分子シャペロン蛋白質は、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて一般的な遺伝子工学的及び／又は生化学的手法により容易に製造し取得することが出来る。該ポリヌクレオチドは本明細書に開示された配列情報又は公知の遺伝子配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造及び取得することが出来る。例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等］）でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のポリペプチドを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。【００２５】
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することができる。例えば、ヒトの肝臓、脳、乳腺といった組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチド又はその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することが出来る。【００２６】
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することができる。【００２７】
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することができる。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法により製造することができる。合成はアミノ酸を１個ずつ逐次結合させても、数アミノ酸からなるポリペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは公知の各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
配列の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変して作製することも出来る。本発明は、該変異の原因及び手段を問わない。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５０，１７８、１９６８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うポリヌクレオチドを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりポリヌクレオチド分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。【００２８】
上述のように得られた分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで分子シャペロン蛋白質を試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることができる。
具体的には上述のように得られたポリヌクレオチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による分子シャペロン蛋白質の発現が可能である。
あるいは分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で該ポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において分子シャペロン蛋白質を発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明の方法に利用する目的に十分量の分子シャペロン蛋白質の発現が実現できるものであればよい。宿主細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，  Ｙ．  （１９８１）  Ｃｅｌｌ，  ２３，  １７５−１８２）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｌ．  Ａ．（１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４２１６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ＶｉｒｕｓのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）等が挙げられる。【００２９】
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。分子シャペロン発現細胞の製造に用いる発現ベクター（分子シャペロン発現用発現ベクター）は、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。公知の発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ  （Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １，  ８５４−８６４）、ヒトのエロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ  （Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８，  ５３２２）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターを有するｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＭＥ１８Ｓ、  （Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．  （１９９０）  Ｍｅｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０，  ２７−３２）、  ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，  Ｂ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２９，  ８４０−８４２）  等が挙げられる。分子シャペロン蛋白質は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞を形質転換し、該細胞中で上記ポリペプチドを発現させることにより得ることができる。より具体的には、所望のポリヌクレオチドをバクテリアの発現ベクターに組み込むことにより、所望の分子シャペロン蛋白質をバクテリア細胞中で大量に産生させることができる。また、酵母や昆虫細胞等を用いても分子シャペロン蛋白質を大量に産生することができる。また所定のプロモーター下流に結合した上記ポリヌクレオチドを用いて、公知の手法により試験管内で所望の分子シャペロン蛋白質を生産することができる。より具体的にはＴＮＴシステム（プロメガ社）を用いて、上述のプロモーター下流に結合した上記ポリヌクレオチドを鋳型とする試験管内での転写・翻訳反応により、所望の分子シャペロン蛋白質を試験管内で生産することができる。【００３０】
前述の細胞を培養することにより細胞中で産生した分子シャペロン蛋白質を検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、分子シャペロン蛋白質と結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により該蛋白質を検出、精製することが可能である。あるいは、該蛋白質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により該蛋白質を検出することが出来る。さらにはこれらタグ蛋白質を利用して前記蛋白質を精製することが出来る。より具体的には以下のようにしてタグ蛋白質を利用して前記蛋白質を精製することができる。
本発明の方法において分子シャペロン蛋白質（例えば、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，又は２７で表されるポリペプチド）は、これらをコードするポリヌクレオチドを、例えばＧＳＴタグ又はＨｉｓタグが発現させた目的の蛋白質に付加されるベクター、より具体的には例えば実施例１に記載のｐＧＥＸ−６Ｐ１（アマシャム）、あるいは市販のｐＥＴ−２８ａ（ノバジェン社）等に組み込んでバクテリアに導入し、前者はＧＳＴ融合型蛋白質、後者の場合はＨｉｓ融合型蛋白質として分子シャペロン蛋白質を発現させることができる。該融合型蛋白質は、それらを発現させたバクテリア細胞由来の蛋白質抽出液中から、ＧＳＴあるいはＨｉｓタグの性質を利用して精製することができる。例えば実施例１においてｐＧＥＸ−６Ｐ１を用いて作製したシャペロン発現プラスミドは、いずれも分子シャペロン蛋白質のＮ−末端にＧＳＴタグが付加されるように設計されている。これにより、それらのＧＳＴタグを利用して、所望の分子シャペロン蛋白質を発現させた細胞から該蛋白質を精製することができる。より具体的には公知のＧＳＴ−プルダウン（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）に従って、破砕した細胞の抽出液よりＧＳＴタグと融合した分子シャペロン蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ；アマシャムファルマシア社）に結合させて遠心分離により単離することができる。一方Ｈｉｓタグを利用して、所望の分子シャペロン蛋白質を発現させた細胞から該蛋白質を精製するのも公知の方法（実験医学別冊  タンパク質の分子間相互作用実験法、１９９６年３２頁  中原ら）に従って、破砕した細胞の抽出液よりＨｉｓタグと融合した分子シャペロン蛋白質をＮｉ2+−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（フナコシ）に結合させて遠心分離により単離することができる。
あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、例えば、分子シャペロン蛋白質を、その物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。【００３１】
＜試験薬剤＞
試験薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ，  ４（１）：４１，１９９９  ）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物（ポリヌクレオチド、ポリペプチドを含む）、あるいは、それらを化学的又は生物学的に修飾した化合物で、明確な薬理作用を有するものを挙げることができる。該薬理作用には医療における望ましい作用のみでなく、生体に有害な作用も含まれる。特に本発明の方法の利用が、既存の方法に比較してより有用であると考えられる化合物として、（１）化学構造上、修飾を加えることが困難な化合物、（２）修飾によって上述の薬理作用が失われる、あるいは失われると予測される化合物、（３）分解あるいは代謝産物、その他の共雑物の混合により、薬理活性をもたらす化学構造が未定の化合物、（４）合成や精製、あるいは原材料の入手が困難で利用可能な量が限られる化合物（天然物を含む）、等を挙げることができる。【００３２】
＜細胞抽出液＞
本発明の方法で用いる細胞抽出液は、試験薬剤が有する薬理活性を惹起するための一次標的組織、あるいは該組織の性質の多くを維持する培養細胞から蛋白質を抽出した液を使用することができる。細胞からの蛋白質の抽出方法は、目的に応じた調製方法を用いることが好ましい。具体的には、公知の蛋白質抽出法に従い、ＳＤＳ，トリトンＸ−１００、あるいはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの各種界面活性剤から目的に適合するものを選択し、それらを目的に適した濃度で含む緩衝液を用いて上述の細胞を破砕し、遠心分離後上澄を分離及び回収した後に、本発明の方法における細胞抽出液として用いる。より具体的には、破砕のために用いる緩衝液中には生体由来の各種蛋白質分解酵素の阻害剤、例えばＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＥＧＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）等を含むことが好ましく、本発明の方法に適用するまでは凍結され蛋白質が安定に維持される−８０℃以下の状態で保存されることが好ましい。【００３３】
＜分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程＞
分子シャペロン蛋白質は、いずれも各分子あたり多数の基質蛋白質に応答すると考えられている。しかしその種類により、基質特異性は異なると考えられている。従って様々な構造を有する化合物の標的を真に網羅的に探索するためには、多種類の異なるファミリーに属する分子シャペロン蛋白質を揃えてプローブとして同時に利用することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施例２（３）、３、４及び８に示すとおり、異なるシャペロンファミリー由来の複数の分子シャペロン蛋白質を揃えて、同時に利用することが望まれる。
また生化学的な実験系においては、プローブとする蛋白質（本発明においては分子シャペロン蛋白質）が基質となる蛋白質に比較して大過剰に存在する場合、プローブの基質特異性は薄れ、本来の基質以外の蛋白質であっても該基質に類似の分子であればプローブに認識されることが期待できる。従って本発明の実施例２（２）に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウン法のように、基質となる細胞由来蛋白質に比較して大量のプローブ蛋白質を反応させうる系の利用が、化合物の網羅的な標的探索を可能にする上ではより好ましい。
また、分子シャペロン蛋白質の多くは生体内で多量体を形成して作用することが報告されている。従って本発明の方法を実施するにあたっては、実施例２（２）及び４に示されるような、分子シャペロン蛋白質（プローブ）と複合体を形成しうる内在性のシャペロンが混在する生体試料由来の細胞抽出液、及び蛋白質の分離条件を用いることがより好ましい。より具体的には、本発明の実施例２（２）に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウン法のように、内在性のシャペロンを含む細胞由来の細胞抽出液に対して分子シャペロン蛋白質（プローブ蛋白質）を反応させる系の利用が好ましい。【００３４】
「分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する」ためには以下の操作を行う。試験薬剤を添加した又は未添加の細胞から抽出した試料細胞抽出液あるいは試験薬剤を添加した又は未添加の試料細胞抽出液のそれぞれから、分子シャペロン蛋白質の抗体、又は分子シャペロン蛋白質に融合させたタグの抗体を用いた公知の免疫沈降法により、分子シャペロン蛋白質と分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を濃縮することができる。あるいは上述のタグに親和性を有するアフィニティービーズやアフィニティーカラムを用いた公知の方法によっても同様に分子シャペロン蛋白質と分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質の濃縮が可能である。具体的な方法としては、ＧＳＴなどのタグをつけて精製した該ペプチドを用いたＧＳＴ−プルダウン法を挙げることができる。
上記で得られた分子シャペロン蛋白質及びその結合蛋白質の濃縮液を、公知の蛋白質分離法により分離し、分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を検出する。例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、銀染色法、クーマジーブリリアントブルー染色法、又はネガティブゲル染色法（和光純薬）等の既存の蛋白質染色法など公知の蛋白質を検出する種々の方法（「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」  平野久  東京化学同人  １９９３年  ｐ３７−ｐ４０）により、分子シャペロン蛋白質及び分子シャペロン蛋白質に結合した試料細胞に由来する蛋白質を検出することができる。ここで本発明の工程に用いる方法は、蛋白質を検出することが可能であれば、上記の方法に限られない。
上記により検出した蛋白質について、試験薬剤添加の場合と未添加の場合での分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を比較する。両者を比較することにより、試験薬剤添加又は未添加時に分子シャペロン蛋白質への結合が変化した試料細胞由来の蛋白質（即ち、試験薬剤の標的蛋白質）を同定することができる。試験薬剤添加又は未添加時で得られる試料細胞由来の蛋白質群を検出して比較する方法として、公知のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられる。その場合に二次元電気泳動法で展開することにより、より正確な比較が可能である。電気泳動法で展開された、試験薬剤添加時の結果及び試験薬剤未添加の場合の結果について、バンドを比較し（即ち、試験薬剤の添加時のみバンド量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみバンド量が減少するものがあるか、比較し）試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質を選択することができる。試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質としては、試験薬剤の添加時のみ結合する、又は試験薬剤の添加時のみ結合しない蛋白質を選択することが好ましい。
続いて、上記方法により検出し選択された蛋白質を同定する。公知の蛋白質精製法及び蛋白質同定法（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）により、その分子内に存在するアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列情報をもとに、試験薬剤の添加又は未添加時に分子シャペロン蛋白質との結合が変化する蛋白質（即ち試験薬剤の標的蛋白質）を同定することができる。具体的には、試験薬剤の標的蛋白質は、ゲルから回収して精製した後、マススペクトル法、公知の手法によりそのアミノ酸配列を決定し、蛋白質を同定することができる。より具体的には、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルにより分離された目的の蛋白質を、トリプシン等を用いて断片化し、生じたペプチド混合物をゲルより回収し、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行うことができる（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）。あるいは、ゲルから電気溶出法等により目的蛋白質を溶出させた後、もしくはゲル上の目的蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）等の膜にブロッティングした後、必要ならば酵素消化、化学的分解により断片化し、さらに必要ならば得られた断片化ペプチドを液体クロマトグラフ法、キャピラリー電気泳動法等により分離した後、マススペクトル解析、もしくはＮ末端又はＣ末端アミノ酸配列解析により、蛋白質の同定を行うことができる（平野  久  プロテオーム解析ー理論と方法ー  東京化学同人、２００１年）。ここで本発明の方法に用いる同定方法は、精製した該標的蛋白質群の同定が可能である限り、上記の方法に限られない。
より具体的には、実施例４及び実施例８に記載のように、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルにより分離された標的蛋白質は、トリプシン等を用いてタンパク質を断片化し、生じたペプチド混合物をゲルより回収し、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行うことができる。【００３５】
本発明の方法で同定された標的蛋白質は、公知の遺伝子機能解析技術により、試験薬剤の薬理作用をもたらす真の標的蛋白質であることを確認することが可能である。まず、具体的には、以下に示す方法により、試験薬剤と得られた標的蛋白質分子の直接的な結合の有無を調べることができる。
結合するか否かの検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域、またはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域を細胞に発現させる。該細胞からＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグとの親和性を利用したアフィニティ精製法、あるいは該タグに応答する抗体を利用した免疫沈降法等により、発現させた検討対象のポリペプチドを単離・精製する。続いて精製した該ポリペプチドと試験薬剤を混合し、該試験薬剤とポリペプチドが結合して形成された複合体を単離する。次に該複合体を酸、熱その他の刺激により変性させて化合物を再度分離させて蛋白質のみを除去した後、マススペクトロメトリーを用いた質量分析法による解析を行って同試料中に該試験薬剤が含まれるかどうかを調べることによって、検討対象のペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。また別の手法として、試験薬剤の分子構造の一部を標識することにより作成した標識試験薬剤をプローブとして、公知のＥＬＩＳＡ法、ファーウエスタン法、バインディングアッセイ法等の方法により検討対象のポリペプチドと該試験薬剤が結合するか否かを確認することができる。試験薬剤の標識は、標的蛋白質との結合に影響を与えないラジオアイソトープを用いるのが好ましい。具体的には、例えば、試験薬剤の分子内の元素をラジオアイソトープに置換することにより標識した化合物を作製することができる。該標識試験薬剤をプローブとして利用することにより、上述の方法により精製した検討対象のポリペプチドを固定したＥＬＩＳＡ法により、該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。あるいは、検討対象のポリペプチドを公知のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、ニトロセルロース膜上に転写した後、上述標識試験薬剤をプローブとして利用したファーウエスタン法により、やはり該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。また、あるいは標識させた試験薬剤と上述の方法により精製した検討対象のポリペプチドを混合し、フィルター上にトラップして洗浄した後に、標識プローブ由来の放射線量を測定することにより形成された化合物とペプチドの複合体の総量を検出する、いわゆるバインディングアッセイによって該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。
また公知の蛋白質の立体構造予測手法（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｄｅｃ  ３０；４７  （２７）：６８０４−１１）により、本発明の方法で同定された標的蛋白質に該試験化合物が結合しうる鍵穴となる構造が存在するかどうかを調べることができる。さらに公知のＲＮＡ干渉技術（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．  ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２，  ２０（５）：ｐ４４６−４４８．）を用いた細胞レベルでの遺伝子ノックダウン実験、同じく細胞レベルでの公知の遺伝子過剰発現実験、さらには遺伝子ノックアウト動物の作製、又は遺伝子過剰発現動物の作製、等の各種生化学的及び／又は遺伝子工学的実験手法により、上記標的蛋白質の発現量を増大、あるいは減少させることができるが、これらの条件下で試験薬剤の主作用又は副作用を試験した場合において、主作用又は副作用が亢進、あるいは抑制される効果が見出されることにより、発現を変動させた遺伝子がコードする標的蛋白質は真の標的蛋白質であると確認できる。
本発明の同定方法では、試験薬剤の薬理作用をもたらす試験薬剤の標的蛋白質を同定することができるが、本発明の同定方法は、試験薬剤の薬理作用の内、望ましい薬理作用（主作用）をもたらす標的蛋白質を同定する方法として、より適している。
【００３６】
＜本発明のスクリーニングツール及びスクリーニングのための使用＞
本発明のスクリーニングツールは、下記（１）〜（３）からなる。
（１）ヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、ＡＴＰ５Ｂ機能的等価改変体（配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド）、並びにＡＴＰ５Ｂ相同ポリペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上（好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチド）（以下、ツール用ポリペプチド）からなる、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール（以下、本発明のポリペプチド型スクリーニングツールと称する）、
（２）ツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ツール用ポリヌクレオチド）からなる、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール（以下、本発明のポリヌクレオチド型スクリーニングツールと称する）、あるいは
（３）ツール用ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、ツール用ポリペプチドを発現している細胞（以下、ツール用細胞）からなる、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール（以下、本発明の細胞型スクリーニングツールと称する）。
また、
（１）ツール用ポリペプチド、
（２）ツール用ポリヌクレオチド、又は
（３）ツール用細胞
の、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングのための使用
も本発明に含まれる。【００３７】
本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングのために用いるもの（具体的には、スクリーニングのために用いるポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞）をいう。「ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬のスクリーニングツール」とは、ビグアナイドと薬効標的を共有する糖尿病治療薬をスクリーニングするために、本発明のスクリーニング方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞又はポリペプチド、あるいは、試験化合物を接触させる対象となるポリペプチドを取得若しくは発現させるためのポリヌクレオチドである。【００３８】
ＡＴＰ５Ｂ機能的等価改変体及びＡＴＰ５Ｂ相同ポリペプチドの起源はヒトに限定されない。ツール用ポリペプチドのいずれかに該当する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列のヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、脊椎動物からバクテリアにいたるまであらゆる生物由来のものが含まれ、また、天然ポリペプチドに限定されず、配列番号２で表されるアミノ酸配列を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。また、ビグアナイドと結合する、及び／又は過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害する限り、ＡＴＰ５Ｂ機能的等価改変体又はＡＴＰ５Ｂ相同ポリペプチドに後述のマーカー配列を含むポリペプチドも、ツール用ポリペプチドに含まれる。
後述の実施例５（５）及び（６）において、ＡＴＰ５Ｂとビグアナイドとの結合には、サイト２０の周辺構造に関与するアミノ酸残基、特には、ヒトＡＴＰ５Ｂの場合Ｇｌｕ１７５及びＡｓｐ２９５が重要であることがわかった。従って、変異を入れる場合には、サイト２０の周辺構造に関与するアミノ酸残基、特には、ヒトＡＴＰ５Ｂの場合Ｇｌｕ１７５及びＡｓｐ２９５は保存し、これ以外の部分に変異を入れることにより、ビグアナイドとの結合活性を維持した改変ポリペプチドを容易に製造できる。【００３９】
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとしては、ツール用ポリペプチドの内ヒトＡＴＰ５Ｂポリペプチドが、本発明のポリヌクレオチド型スクリーニングツールとしては、ツール用ポリヌクレオチドの内ヒトＡＴＰ５Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（特に好ましくは配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド）が、本発明の細胞型スクリーニングツールとしては、ツール用細胞の内、ヒトＡＴＰ５Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、ヒトＡＴＰ５Ｂを発現している細胞がより好ましい。【００４０】
ツール用ポリヌクレオチドは、本明細書に開示された配列情報又は公知の遺伝子配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造し取得することが出来る。そのような手法としては、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載のように、公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年  等］、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のポリペプチドを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載したように、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。【００４１】
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、ヒトの骨格筋、あるいは心臓といった組織からｍＲＮＡを抽出し、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載したのと同様に第一鎖ｃＤＮＡを用い、ツール用ポリヌクレオチドの一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、ツール用ポリヌクレオチド又はその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例５（１）に記載の方法によりツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法、
化学合成法を用いた方法でも、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載したのと同様に、ツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。【００４２】
上述のように得られたツール用ポリヌクレオチドは、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載したのと同様に、公知の方法（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等に記載の方法）により、適当なプロモーターの下流に連結することでツール用ポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることができる。
ツール用細胞の製造に用いる発現ベクター（ツール用発現ベクター）は、ツール用ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、ツール用ポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。ツール用ポリペプチドは、例えば、ツール用発現ベクターにより所望の宿主細胞を形質転換し、該細胞中でツール用ポリペプチドを発現させることにより得ることができる。より具体的には、ツール用ポリヌクレオチドをバクテリアの発現ベクターに組み込むことにより、ツール用ポリペプチドをバクテリア細胞中で大量に産生させることができる。また所定のプロモーター下流に結合したツール用ポリヌクレオチドを用いて、公知の手法により試験管内でツール用ポリペプチドを生産することができる。より具体的には実施例５（４）に記載のように、ＴＮＴシステム（プロメガ社）を用いて、上述のプロモーター下流に結合したツール用ポリヌクレオチドを鋳型とする試験管内での転写・翻訳反応により、ツール用ポリペプチドを試験管内で生産することができる。【００４３】
ツール用細胞は、ツール用発現ベクターで形質転換され、ツール用ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、ツール用ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、ツール用ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。形質転換に用いる細胞としてはビグアナイドに応答する細胞が好ましく、より具体的にはＨｅＬａＳ３細胞、肝臓由来細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。ツール用細胞としては、ツール用ポリヌクレオチドに該当する限り、後述のマーカー配列を含んだポリヌクレオチドを含んでいても良い。本明細書の細胞型スクリーニングツールとしてはツール用発現ベクターで形質転換された細胞が好ましい。【００４４】
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養によりツール用ポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＨｅＬａＳ３細胞であれば、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地を使用できる。【００４５】
上記により、生産されるツール用ポリペプチドは、必要に応じて該ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離又は精製することが出来る。また、ツール用ポリペプチドにマーカー配列（タグ蛋白質）が含まれる場合は、タグ蛋白質を利用して、該ポリペプチドの発現の確認、精製等が可能である。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）、ヘマグルチンタグ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｔａｇ）、ｍｙｃエピトープ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）などがある。
また、マーカー配列とツール用ポリペプチドの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入した融合ポリペプチドを発現させ、タグ蛋白質を利用して精製した後、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去し、ツール用ポリペプチドを得る事も可能である。【００４６】
より具体的には、ツール用ポリペプチドは、例えば目的の蛋白質にＧＳＴタグ又はＨｉｓタグが付加されるベクター、より具体的には例えば市販のｐＧＥＸ−６Ｐ１（アマシャム社）又はｐＥＴ−２８ａ（ノバジェン社）等を用いて、前者はＧＳＴ融合型蛋白質、後者の場合はＨｉｓ融合型蛋白質として発現させることができる。該融合型蛋白質は、それらを発現させたバクテリア細胞由来の蛋白質抽出液中から、ＧＳＴあるいはＨｉｓタグの性質を利用して、上述の＜分子シャペロン蛋白質の製造方法＞に記載したのと同様に、精製することができる。【００４７】
本明細書において、「ビグアナイドと結合するポリペプチド」とは、ビグアナイドに分類される低分子化合物（メトフォルミン、フェンフォルミン、ブフォルミン等）と結合するポリペプチドを意味しており、ポリペプチドがビグアナイドと「結合する」か否かは以下の方法により確認することができる。【００４８】
結合するか否かの検討対象ポリペプチドを単離精製する。ポリペプチドの発現及び単離精製は上記の方法を利用することができる。続いて、実施例５（４）の方法により、フェンフォルミンと結合するか否かを確認する。該実施例の条件で、添加するフェンフォルミンの濃度が好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１．０μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下で結合が確認できるポリペプチドを、ビグアナイドと結合するポリペプチドであると判断する。【００４９】
また、「過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害する」とは、あるポリペプチドが細胞中で通常よりも過剰に存在する条件下において、ビグアナイドで刺激された場合の細胞中のＡＭＰＫの活性化、すなわちリン酸化の程度が通常の状態の細胞と比較して減少することを意味する。「ＡＭＰＫ活性化を阻害する」か否かは実施例５（７）の方法により確認することができる。実施例５（７）の条件で、コントロール（検討対象のポリペプチドを過剰発現していない細胞）に比較して検討対象のポリペプチドを過剰発現した細胞におけるフェンフォルミン刺激によるＡＭＰＫのリン酸化の増大が５０％、好ましくは７０％、更に好ましくは９０％減少した場合、検討対象ポリペプチドは過剰発現によりビグアナイドによるＡＭＰＫ活性化を阻害するポリペプチドであると判断する。【００５０】
＜本発明のスクリーニング方法＞
本発明者らは、ツール用ポリペプチドの一つであるヒトＡＴＰ５Ｂ（配列番号２）をＨｅＬａＳ３細胞に過剰発現させると、フェンフォルミンあるいはメトフォルミン等ビグアナイドの処理による該細胞内のＡＭＰＫ活性化が妨げられることを見出した（実施例５（７））。これは、細胞内でＡＴＰ５Ｂ蛋白質の存在量が変化することでビグアナイドの薬効に寄与するＡＭＰＫの活性化能が変化することを意味しており、ビグアナイドの細胞内シグナルにおいてＡＴＰ５Ｂが明らかにＡＭＰＫの上流に位置することを示している。さらに、本発明者らは、ビグアナイドの一種であるフェンフォルミンと生化学的に結合することを見出した（実施例５（４））。これらの知見により、ＡＴＰ５Ｂは、ビグアナイドに結合し、かつ該化合物の薬効（主作用）に寄与する真の標的蛋白質であると結論することができる。該知見に従って、本発明者らは、ツール用ポリペプチドと結合し、ＡＭＰＫを活性化させる低分子化合物をスクリーニングすることにより、ビグアナイドの有する糖尿病治療効果と同様の薬効を示しうる化合物を新規に取得できることを明らかにし、糖尿病治療薬のスクリーニング方法を完成させた。【００５１】
本発明のスクリーニング方法には、以下の方法が含まれる。
＜Ｉ＞結合分析スクリーニング方法
［１］ツール用ポリペプチド又はツール用細胞と、試験物質とを接触させる工程、並びに
［２］該ポリペプチドと試験物質との結合を分析する工程、
を含む、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。【００５２】
＜ＩＩ＞競合阻害スクリーニング方法
［１］の工程が、ビグアナイド共存下で接触させる工程である＜Ｉ＞に記載のスクリーニング方法。【００５３】
本明細書における「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、及び、ある試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質であるか否かを検出することの両方を含む。【００５４】
＜ツール用ポリペプチドを用いる結合分析スクリーニング方法＞
ツール用ポリペプチドと試験物質とを接触させる工程を含む、本発明のスクリーニング方法には、精製したツール用ポリペプチドと試験物質を混合して接触させ（接触させる工程）、該試験物質とポリペプチドが結合して形成された複合体を単離した後に変性させて分離した化合物を質量分析法により同定することにより、該ポリペプチドに直接結合し作用する物質（即ち糖尿病治療薬）を分析し（結合を分析する工程）、ツール用ポリペプチドと結合する物質（即ち糖尿病治療薬）を選択する方法が含まれる。このような方法は、アフィニティセレクション−質量分析法（ＡＳ−ＭＳ法；ファルマシア（日本薬学会）Ｖｏｌ．４１  Ｎｏ．６  ｐ５６４  ２００５、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  １６，  ５，  ５０５−５１１、Ｊ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  １，  ８２−９０、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２４  （２００４）  ２４１−２４９、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ９（６）；２００４  ４９８−５０５参照）により実施できる。本発明のスクリーニング方法において、これらの工程は、具体的には、例えば、以下のように実施できる。ツール用ポリペプチドを細胞に発現させる。該細胞からＧＳＴ、ＦｌａｇやＨｉｓなどのタグとの親和性を利用したアフィニティ精製法、あるいはツール用ポリペプチドに応答する抗体（例えば抗ＡＴＰ５Ｂ抗体、タグ抗体）を利用した免疫沈降法等により、発現させた該ポリペプチドを単離精製する。続いて精製した該ポリぺプチドと試験物質とを混合し接触させた後、該ポリペプチドと結合しない物質を、低分子化合物を吸着する樹脂等で除去する。残った蛋白質と試験物質の複合体を単離した後、該複合体を酸、熱その他の刺激により変性させて複合体中の低分子物質を分離させ、残った蛋白質のみを除去する。マススペクトロメトリーを用いた質量分析法による解析を行って同試料中に含まれる物質を同定することにより、ツール用ポリペプチドと結合する物質を選択する。上記記載の方法で、ツール用ポリペプチドの濃度が１μＭ又は１０μＭであるとき、添加する試験物質の濃度が１μＭの条件下で、試験物質を吸着除去する過程を経ないコントロールと比較して回収される該試験物質の総量が好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは５０％以上の物質をツール用ポリペプチドと結合する物質として選択する。
また、本発明の方法には、試験物質群に特定の標識を施し、公知のＥＬＩＳＡ法、ファーウエスタン法、バインディングアッセイ法等の方法を利用してツール用ポリペプチドに結合する試験物質を選択する方法も含まれる。この様な具体例としては、実施例５（４）の方法を挙げることができる。これらの方法においては、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下の濃度でツール用ポリペプチドとの結合を検出可能な試験物質をツール用ポリペプチドと結合する物質として選択する。【００５５】
＜ツール用ポリペプチドを用いる競合阻害スクリーニング方法＞
ビグアナイド共存下でツール用ポリペプチドと試験物質とを接触させる工程を含む、本発明のスクリーニング方法は、標識又は修飾したビグアナイドとツール用ポリペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法、ファーウエスタン法、あるいはバインディングアッセイ等によって該ポリペプチドとビグアナイドとの結合を検出する工程において、試験物質を同時に存在させた場合に生じる、該結合の変化を測定することによって達成できる。
具体的には、以下に例示する各種の実験手法を利用する。ツール用ポリペプチドを細胞に発現させる。該細胞からタグとの親和性を利用したアフィニティ精製法、あるいはツール用ポリペプチドに応答する抗体（例えば抗ＡＴＰ５Ｂ抗体、タグ抗体）を利用した免疫沈降法等により、発現させたツール用ポリペプチドを単離・精製する。続いて精製したポリぺプチド、試験物質及びビグアナイドとを混合し、形成された複合体を単離する。次に該複合体を酸、熱その他の刺激により変性させて試験物質及びビグアナイドを再度分離させて蛋白質のみを除去した後、マススペクトロメトリーを用いた質量分析法による解析を行って同試料中に該当するビグアナイド化合物が含まれるかどうかを調べることによって、ツール用ポリペプチドとビグアナイドの結合が試験物質によって阻害されるか否かを調べる。また別の手法として、ビグアナイドを修飾し、それらの分子構造の一部を標識することにより作製した標識ビグアナイドをプローブとして、公知のＥＬＩＳＡ法、ファーウエスタン法、又はバインディングアッセイ法等の方法によりツール用ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認することができる。具体的には、例えば、ビグアナイドの分子内の元素をラジオアイソトープに置換することにより標識した化合物を作製する。該標識ビグアナイドをプローブとして利用することにより、精製したツール用ポリペプチドを固定したＥＬＩＳＡ法により、該ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認する。あるいは、ツール用ポリペプチドを公知のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、ニトロセルロース膜上に転写した後、上述標識ビグアナイドをプローブとして利用したファーウエスタン法により、やはり該ポリペプチドとビグアナイドの結合を確認する。また、あるいは標識ビグアナイドと精製したツール用ポリペプチドを混合し、フィルター上にトラップして洗浄した後に、標識プローブ由来の放射線量を測定することにより、形成された化合物とペプチドの複合体の総量を検出する、いわゆるバインディングアッセイによってツール用ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認する。ビグアナイドの標識は、ラジオアイソトープに限らず、その薬理活性に影響を及ぼさない範囲であれば、分子構造の一部を修飾することによって達成することが可能である。例えばフェンフォルミン、メトフォルミン、あるいはブフォルミンの分子構造の一部分を修飾してビオチン化することにより標識することができる。この場合もビオチンとアビジンの結合を利用し、標識したアビジン抗体等の利用によって、上述と同様ＥＬＩＳＡやファーウエスタン法によりツール用ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認する。好ましくは、実施例５（４）の方法により、ツール用ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認する。
上述のツール用ポリペプチドとビグアナイドとの結合を確認する工程において、ビグアナイドと同時に試験物質を存在させることにより、該ポリペプチドとビグアナイドの結合が阻害されるか否かを調べる。ビグアナイドの濃度が１０μＭであるとき、ＩＣ５０が好ましくは１０μＭ以下の物質を、より好ましくは１μＭ以下の物質を、更に好ましくは０．１μＭ以下の試験物質を糖尿病治療薬として選択する。特定の試験物質の存在により、ツール用ポリペプチドとビグアナイドの結合が妨げられる場合、同現象はツール用ポリペプチドの分子内にあるビグアナイド結合部位に該試験物質が結合したことにより、ビグアナイドと該ポリペプチドとの結合が競合的に阻害された結果であると判断できる。明らかに試験物質による競合的な結合阻害であることの確認は、同時に存在させるビグアナイドと試験物質の濃度の比率を段階的に変化させることによって、該ポリペプチドに結合するビグアナイドが段階的に妨げられることを調べることによって確認することができる。同手法により、ビグアナイドに競合して、ツール用ポリペプチドと結合する物質（即ち、糖尿病治療薬）を選択できる。より具体的には、例えば後述の実施例６に示す方法により、ツール用ポリペプチドと結合する物質を選択できる。【００５６】
＜ツール用細胞を用いる結合分析スクリーニング方法＞
ツール用細胞と試験物質とを接触させる工程を含む、本発明のスクリーニング方法は、ツール用細胞と試験物質を混合して接触させ（接触させる工程）、該試験物質とポリペプチドが結合して形成された複合体を単離した後に変性させて分離した化合物を質量分析法により同定することにより、該ポリペプチドに直接結合し作用する物質（即ち糖尿病治療薬）を分析し（結合を分析する工程）、ツール用ポリペプチドと結合する物質（即ち糖尿病治療薬）を選択する方法が含まれる。結合を分析する方法は、前述のＡＳ−ＭＳ法等を利用することができる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
まず、ツール用ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換することにより、ツール用ポリペプチドを発現させたツール用細胞と試験物質とを接触させる。
前記細胞からＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグとの親和性を利用したアフィニティ精製法、あるいはツール用ポリペプチドに応答する抗体（例えば抗ＡＴＰ５Ｂ抗体、タグ抗体）を利用した免疫沈降法等により、ツール用ポリペプチドとそこに結合する試験物質の複合体を濃縮する。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。該ポリペプチドと結合しない物質を、低分子化合物を吸着する樹脂等で除去した後、次に得られたツール用ポリペプチドおよびそこに結合する試験物質の複合体を酸、熱その他の刺激により変性させて複合体中の低分子物質を分離させ、残った蛋白質のみを除去する。マススペクトロメトリーを用いた質量分析法による解析を行って同試料中に含まれる物質を同定することにより、ツール用ポリペプチドと結合する物質を試験物質中から選択する。具体的には、添加する試験物質の濃度が１μＭの条件下で、試験物質を吸着除去する過程を経ないコントロールと比較して回収される該試験物質の総量が好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは５０％以上の物質をツール用ポリペプチドと結合する物質として選択する。【００５７】
＜ツール用細胞を用いる競合阻害スクリーニング方法＞
ビグアナイドの共存下でツール用細胞と試験物質とを接触させることにより、ツール用ポリペプチドとビグアナイドの結合が該試験物質により競合的に阻害され、試験物質とツール用ポリペプチドが結合するか否かを調べることができる。具体的には、例えば、ビグアナイドの共存下で、上述の＜ツール用細胞を用いる結合分析スクリーニング方法＞と同様の工程により細胞から本発明のポリペプチドとそこに結合するビグアナイドの複合体を濃縮する。続いて、ツール用ポリペプチドと試験物質との結合を分析する。結合の分析は、上述の＜ツール用ポリペプチドを用いる競合阻害スクリーニング方法＞に記載したのと同様の方法で実施できる。例えば標識ラベル等の修飾されたビグアナイドを用いた場合には、公知のバインディングアッセイ法等の方法によりツール用ポリペプチドとビグアナイドの結合を定量することにより実施できる。試験物質の存在によりツール用ポリペプチドとビグアナイドの結合が妨げられた場合、試験物質によりビグアナイドとツール用ポリペプチドとの結合が競合的に阻害され、ツール用ポリペプチドと試験物質が結合したと判断できる。【００５８】
本発明のスクリーニング方法では、ツール用ポリペプチドと試験物質との結合を分析し、ツール用ポリペプチドと結合する物質を選択した後、選択された試験物質が、ＡＭＰＫを活性化することを確認する工程、及び／又は糖尿病治療活性を有することを確認する工程を更に含むことが好ましい。【００５９】
選択された物質がＡＭＰＫを活性化することを確認する工程は、例えば、以下のように実施できる。ツール用ポリペプチドを発現している細胞（例えばＨｅＬａＳ３細胞）に試験物質又は溶媒コントロールを添加し、培養する。培養した細胞を溶解して調製した細胞溶解液を用いて、公知のＳＤＳ電気泳動法及び抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体（例えばＰｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫ−α（Ｔｈｒ１７２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、第一化学薬品）を用いたウエスタンブロット法により細胞内のＡＭＰＫのリン酸化レベル（即ち活性化レベル）を検出する。好ましくは、実施例５（７）の方法により、選択された物質がＡＭＰＫを活性化することを確認することができる。コントロールに比較し、ＡＭＰＫリン酸化を亢進させる物質をＡＭＰＫを活性化する物質として選択する。ＡＭＰＫリン酸化を亢進させる物質としては、コントロールに比較して５０％、好ましくは７０％、更に好ましくは９０％以上ＡＭＰＫリン酸化を亢進させるものを選択する。【００６０】
選択された物質が糖尿病治療活性を有することを確認する工程としては、公知の評価方法、例えば、以下のような選択された物質の糖尿病治療効果を分析する方法を実施する工程が挙げられる。
本発明のスクリーニング法により選択された化合物を糖尿病モデル動物に連続投与し、常法に従って随時血糖低下作用を確認することにより、あるいは、経口糖負荷試験後の血糖上昇抑制作用の確認を行なうことにより、糖尿病治療効果の有無を判定する。又は、ヒトのインスリン抵抗性を測定し、その値の改善を指標に２型糖尿病治療効果を分析する。インスリン抵抗性はヒトでは主に２つの方法で測定されている。一つは絶食後に血糖値とインスリン濃度を測定するものであり、他方はブドウ糖負荷試験といわれるもので、グルコース液を経口投与し、血液循環からのクリアランス率を知る方法である。さらに、より正確な試験としてはオイグリセミック・高インスリン血症クランプ法が挙げられる。この試験は、血中のインスリンとグルコースは一定濃度に維持されるという原理を利用したもので、時間の経過に伴って投与されたグルコース液の総量と代謝に利用されるインスリン濃度を測定するものである（「糖尿病」中川理  １９９９年  ４２巻（２）：頁１１１−１１３）。好ましくは実施例７に記載の方法により、選択された物質が糖尿病治療活性を有することを確認することができる。【００６１】
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ，  ４（１）：４１，１９９９）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。【００６２】
＜糖尿病治療用医薬組成物、糖尿病治療方法、糖尿病治療用医薬組成物を製造するための使用＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法によって得られた物質［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする糖尿病治療用医薬組成物が包含される。また、本発明には、本発明のスクリーニング方法によって得られた物質を糖尿病治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、糖尿病治療方法が包含される。更に、本発明には、本発明のスクリーニング方法によって得られた物質の、糖尿病治療用医薬組成物を製造するための使用が包含される。
本発明の医薬組成物における有効成分は、本発明のスクリーニング方法により選択することができる。本発明のスクリーニング方法で選択された化合物としては、後述の実施例６（２）、７記載の２−［（Ｅ）−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イリミノ）メチル］フェノール及び６−クロロ−９Ｈ−プリン−２−アミンを挙げることができる。
なお、糖尿病治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる（上記「選択された物質が糖尿病治療活性を有することを確認する工程」参照）。
本発明のスクリーニング方法により得られた物質［例えば、ＤＮＡ、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られた物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。【００６４】
＜実施例１＞分子シャペロン蛋白質の構築
（１）分子シャペロン遺伝子のクローニング及びＧＳＴ融合分子シャペロン蛋白質発現プラスミドの作製
配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，又は２７のアミノ酸配列で表される２５種類のシャペロン蛋白質（ヒトＨＳＰＡ１Ａ、ヒトＨＳＰＨ１、ヒトＨＳＰＣＡ、ヒトＨＳＰＤ１、ヒトＤＮＡＪＡ１、ヒトＨＳＰＢ１、ヒトＨＳＰＥ１、ヒトＨＳＰＡ４、ヒトＨＳＰ９０Ｂ１、ヒトＣＣＴ６Ｂ、ヒトＴＣＰ１、ヒトＨＳＰＡ１４、ヒトＨＳＰＡ９Ｂ、ヒトＳＴＣＨ、ヒトＨＹＯＵ１、ヒトＨＳＰＢ５、ヒトＨＳＰＢ２、ヒトＤＮＡＪＡ２、ヒトＤＮＡＪＢ１、ヒトＤＮＡＪＢ２、ヒトＨＣＧ３、ヒトＤＮＡＪＢ１１、ヒトＤＮＡＪＣ１１、ヒトＤＮＡＪＣ７、ヒトＤＮＡＪＣ６）の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２８−７７（偶数番号５’側、奇数番号３’側）で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし（例えばヒトＨＳＰＡ１Ａに対するプライマーセットは、配列番号２８及び配列番号２９。以下同様）、ＨＳＰＨ１、ＨＳＰＥ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ９Ｂ及びＤＮＡＪＣ１１はヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）、ＨＳＰＣＡ、ＨＳＰＡ１Ａ及びＨＳＰＤ１はヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）、ＤＮＡＪＡ１及びＨＳＰＡ４はＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）、ＨＳＰＢ１はヒト乳腺由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）、ＴＣＰ１、ＨＳＰＡ１４、ＨＹＯＵ１及びＨＳＰＢ２はヒト骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）、ＣＣＴ６Ｂ、ＳＴＣＨ、ＨＳＰＢ５、ＤＮＡＪＡ２、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＡＪＢ２、ＨＣＧ３、ＤＮＡＪＢ１１、ヒトＤＮＡＪＣ７及びヒトＤＮＡＪＣ６は市販のｃＤＮＡ（ＵｌｔｉｍａｔｅＴＭ  ＯＲＦ  Ｃｌｏｎｅｓ、インビトロジェン社）をそれぞれ鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、宝酒造社）を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを３５回、さらに７４℃７分間の条件のＰＣＲを行って取得した。これにより生成した約２．５８ｋｂｐ（ＨＳＰＨ１）、２．２ｋｂｐ（ＨＳＰＣＡ）、１．９３ｋｂｐ（ＨＳＰＡ１Ａ）、１．７２ｋｂｐ（ＨＳＰＤ１）、１．１９ｋｂｐ（ＤＮＡＪＡ１）、０．６２ｋｂｐ（ＨＳＰＢ１）、０．３ｋｂｐ（ＨＳＰＥ１）、２．５２ｋｂｐ（ＨＳＰＡ４）、２．４１ｋｂｐ（ＨＳＰ９０Ｂ１）、２．０４ｋｂｐ（ＨＳＰＡ９Ｂ）、１．６８ｋｂｐ（ＤＮＡＪＣ１１）、１．６７ｋｂｐ（ＴＣＰ１）、１．０５ｋｂｐ（ＨＳＰＡ１４）、３．０ｋｂｐ（ＨＹＯＵ１）、０．５３ｋｂｐ（ＨＳＰＢ２）、１．５９ｋｂｐ（ＣＣＴ６Ｂ）、１．４２ｋｂｐ（ＳＴＣＨ）、０．５３ｋｂｐ（ＨＳＰＢ５）、１．２４ｋｂｐ（ＤＮＡＪＡ２）、１．０２ｋｂｐ（ＤＮＡＪＢ１）、０．９８ｋｂｐ（ＤＮＡＪＢ２）、０．４４ｋｂｐ（ＨＣＧ３）、１．０７７ｋｂｐ（ＤＮＡＪＢ１１）、１．４６ｋｂｐ（ヒトＤＮＡＪＣ７）、及び２．７４ｋｂｐ（ＤＮＡＪＣ６）のＤＮＡ断片を取得した。これらｃＤＮＡは、いずれも両末端に、プライマーに含まれた配列により以下の制限酵素サイトが付加される様設計した。ＨＳ���Ｈ１のｃＤＮＡの場合には、ＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサイトが、ＨＳＰＡ４のｃＤＮＡの場合にはＥｃｏＲＶサイトとＮｏｔＩサイトが、ＳＴＣＨ、ＨＳＰＢ５、ＤＮＡＪＣ６及びＤＮＡＪＣ１１のｃＤＮＡの場合にはＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトが、ＴＣＰ１のｃＤＮＡの場合にはＢｇｌＩＩサイトとＮｏｔＩサイトが、ＤＮＡＪＡ２のｃＤＮＡの場合はＢａｍＨ１サイトとＮｏｔＩサイトが付加される。それ以外のｃＤＮＡの場合には、ＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトが付加される様設計した。これらのｃＤＮＡをＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス社）に挿入するため、上述のＰＣＲ反応で得られた各ｃＤＮＡ断片を、それぞれに付加した制限酵素サイトで、それぞれ切断した。１）ＢａｍＨＩ（又はＢｇｌＩＩ）及びＸｈｏＩで切断したｃＤＮＡに対しては、ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで、２）制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＮｏｔＩで切断したｃＤＮＡに対しては、ベクターを制限酵素ＳｍａＩ及びＮｏｔＩで、３）制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断したｃＤＮＡ断片に対しては、ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで、４）制限酵素ＢｇｌＩＩ又はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切断したｃＤＮＡ断片に対しては、ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩでそれぞれ切断し、直鎖状にして用いた。制限酵素処理した各シャペロンのｃＤＮＡ断片とベクターを混合したものをＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ；宝酒造社）と混合して１６℃で３時間処理し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマルチクローニングサイトに各シャペロンｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを作製した。配列番号８６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、報告されている各塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００５３４５、ＮＭ＿００６６４４、ＮＭ＿００５３４８、ＮＭ＿１９９４４０、ＮＭ＿００１５３９、ＮＭ＿００１５４０、ＮＭ＿００２１５７、ＮＭ＿００２１５４、ＮＭ＿００３２９９、ＮＭ＿００６５８４、ＮＭ＿０３０７５２、ＮＭ＿０１６２９９、ＮＭ＿００５３４７、ＮＭ＿００６９４８、ＮＭ＿００６３８９、ＮＭ＿００１８８５、ＮＭ＿００１５４１、ＮＭ＿００５８８０、ＮＭ＿００６１４５、ＮＭ＿００６７３６、ＮＭ＿００１００１３９４、ＮＭ＿０１６３０６、ＮＭ＿０１８１９８、ＮＭ＿００３３１５、ＮＭ＿０１４７８７）であり、各分子シャペロンのｃＤＮＡのコード領域とｐＧＥＸベクターのＧＳＴタグの翻訳フレームが一致して挿入されているものをそれぞれ選択した。【００６５】
（２）ＧＳＴ融合分子シャペロン蛋白質の精製
上述の（１）で得られた、２５種類の分子シャペロンをクローニングしたＧＳＴ融合発現プラスミド群を、ヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）法による形質転換でそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ株式会社）に導入した。２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（シグマ社）を添加し、更に３時間振盪培養してそれぞれのＧＳＴ融合シャペロン蛋白質（以下、各々ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ（約９６ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１（約１２３ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ（約１１１ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＤ１（約８７ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ１（約７１ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ１（約５９ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＥ１（約３７ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４（約１２０ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰ９０Ｂ１（約１１８ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ９Ｂ（約１００ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ１１（約８９ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＴＣＰ１（約８６ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１４（約８１ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＹＯＵ１（約１３７ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ２（約４６ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＣＣＴ６Ｂ（約８４ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＳＴＣＨ（約７８ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ５（約４６ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ２（約７２ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ１（約６４ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ２（約６２ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＨＣＧ３（約４３ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ１１（約６７ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ７（約８１ｋＤａ）、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ６（約１２５ｋＤａ）と略記する）（カッコ内は各々の期待される分子量）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知のＧＳＴ−プルダウン法に従ってＧＳＴ融合分子シャペロン蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ上に精製した。コントロールとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１で形質転換した大腸菌ＢＬ２１からＧＳＴタグ部分のみの蛋白質（以下ＧＳＴ蛋白質と略記する；期待される分子量約２６ｋＤａ）を上述と同様に発現誘導して精製した。公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジーブリリアントブルー染色を行い、各々期待される分子量の蛋白質が精製されていることを確認した。【００６６】
＜実施例２＞１７−βエストラジオールの標的蛋白質であるエストロゲン受容体の検出
（１）エストロゲン受容体遺伝子のクローニング及びＶ５タグ融合エストロゲン受容体発現プラスミドの作製
公知のデータベースに示されたヒトのステロイドホルモン受容体の一種であるエストロゲン受容体α（以下、ＥＲα）の全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡを、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００１２５に示される配列に従って設計した２種類のＤＮＡプライマー（配列番号７８及び配列番号７９）を用いてクローニングした。具体的には、配列番号７８及び配列番号７９のプライマーセットを用いて、ＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＥＲαの全長域をコードする約１．７８ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。得られた同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  システム（インビトロジェン社）を用いてサブクローニングした。このとき用いた配列番号７９に示すプライマーは、ストップコドン配列を除き、クローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，  １５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，  １４０−１４９，１９９７）がＥＲα遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように設計した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ；インビトロジェン社；配列番号８９）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００１２５に示されるヒトＥＲαをコードするｃＤＮＡが前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＥＲと略記する。【００６７】
（２）ヒトエストロゲン受容体発現細胞の作製、及び本発明の同定方法による１７−βエストラジオール標的蛋白質の検出
１０ｃｍシャーレ上で７０％コンフルエント状態に培養したＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）に、リポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン社）を用いて、上記ｐｃＤＮＡ−ＥＲを一過性に導入した。３０時間培養した後、培地を除去し、氷冷したＰＢＳで細胞を洗浄した後に、１．０ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５％  ＮＰ−４０）を加えて溶解した。この細胞抽出液を１５００ｒｐｍで５分遠心して沈殿物を除き、上澄みの可溶画分（以下、ＥＲ受容体発現細胞抽出液）を集めた。この細胞抽出液の可溶画分中には、１７−βエストラジオール（以下、Ｅ２と略記する）の薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｇｒｅｅｎ  Ｓ．  ＆  Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １９８８  Ｎｏｖ；４（１１）：ｐ３０９−３１４．）ＥＲαが含まれている。また、コントロールとして何も導入しないＣＯＳ−７細胞の細胞抽出液可溶画分（以下、コントロールＣＯＳ−７細胞抽出液）を同様に調製した。Ｅ２の存在下で、標的蛋白質であるＥＲを、シャペロン蛋白質であるＨＳＰＡ４蛋白質を用いた本発明の同定方法で実際に検出できるかどうか調べた。公知のＧＳＴ−プルダウン法に従って、まずグルタチオンセファロースビーズ上に精製したＧＳＴ−ＨＳＰＡ４蛋白質又はＧＳＴ蛋白質（上述実施例１（２）で作製）１μｇと、上記のＥＲ受容体発現細胞抽出液又はコントロールＣＯＳ−７細胞抽出液とをそれぞれ混合し、１０μＭのＥ２の添加又は未添加状態でそれぞれ４℃で１時間振盪した。その後遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ−ＨＳＰＡ４又はＧＳＴ蛋白質に結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述のバッファーＡ’（バッファーＡのＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに置換した緩衝液）０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返した後、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗ＥＲα抗体（ＭＣ−２０；サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロット法により、Ｅ２の標的蛋白質であるＥＲαの量を比較した。その結果（図１）、ＥＲ受容体発現細胞抽出液を用いた場合には、コントロールＣＯＳ−７細胞抽出液を用いた場合には検出されない約７０ｋＤａのＥＲαのバンドがＥ２の未添加条件で検出された（レーン５）。一方、Ｅ２を添加した条件下ではＥＲαのバンドは微かにしか検出されなかった（レーン６）。これらの結果から、実際に分子シャペロン蛋白質を用いて、分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、化合物を修飾する必要なしに、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが証明された。【００６８】
（３）本発明の同定方法による１７−βエストラジオールの標的蛋白質の検出
上述の実施例２（２）で、分子シャペロン蛋白質を用いて、分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが証明された。以下の実施例では、上述の実施例２（２）で用いた以外の分子シャペロンを用いても、本発明の同定方法が有用であることを確認した。
すなわち、本実施例（３）では、実施例１（２）の２５種類のシャペロン蛋白質を用いて、上述の実施例２（２）と同様に、標的蛋白質であるＥＲを、本発明の同定方法で実際に検出できるかどうかを調べた。シャペロン蛋白質として、ＨＳＰＡ４蛋白質を用いる代わりに、上述の２５種類のＧＳＴ融合蛋白質（実施例１（２））を、分子量に従って３群８又は９種類ずつに分けて各０．２μｇずつ混合したもの、あるいはＧＳＴ蛋白質１．４μｇを用いること、及びＥＲに付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５抗体（インビトロジェン社）を用いてウエスタンブロット法を行い、得られたバンドのシグナルの強度を、ＶｅｒｓａＤｏｃ  Ｉｍａｇｅｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社）を用いて、単位面積あたりの密度の測定値として数値化すること以外は、実施例２（２）と同様に実験を行った。混合した各８又は９種類のＧＳＴ融合シャペロン蛋白質の内訳は、比較的高分子量のシャペロン群である、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＹＯＵ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ６、ＧＳＴ−ＨＳＰ９０Ｂ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ９Ｂ、及びＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ１１を混合した群、中程度の分子量のシャペロン群である、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＳＴ−ＨＳＰＤ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ１、ＧＳＴ−ＴＣＰ１、ＧＳＴ−ＣＣＴ６Ｂ、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１４、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ７、及びＧＳＴ−ＳＴＣＨを混合した群、比較的低分子量のシャペロン群である、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＥ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ２、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ１１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＢ２、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ２、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ５、及びＧＳＴ−ＨＣＧ３を混合した群の各３群である。その結果（表１）、いずれのシャペロン蛋白質混合群を用いた場合でも、ＥＲ受容体発現細胞抽出液からは、コントロールＣＯＳ−７細胞抽出液を用いた場合には検出されない約７０ｋＤａのＥＲαのバンドがＥ２の未添加条件で検出され、Ｅ２を添加した条件下ではＥＲαのバンドは微かにしか検出されなかった。表中のER（L)、ER（M)およびER（H)は、それぞれ上述の比較的低分子量のシャペロン群、中程度の分子量のシャペロン群および比較的高分子量のシャペロン群を用いた結果を示している。
これらの結果により、多種類の分子シャペロン蛋白質を同時に用いた場合でも、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが確認された。
【００６９】
以下、実施例３、実施例４及び実施例８において、種々の分子シャペロンを用いて、本発明の同定方法で種々の各薬剤の標的蛋白質が同定できたことを示す。各実施例で詳細に述べていない点については、上述の実施例２に従って実験を行った。なお、ウエスタンブロット法により得られたバンドのシグナルの強度は、ＶｅｒｓａＤｏｃ  Ｉｍａｇｅｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社）を用いて、単位面積あたりの密度の測定値として数値化した。【００７０】
＜実施例３＞種々の分子シャペロンを用いた本発明の同定方法
ＦＫＢＰ１２はＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質の一つであることが知られている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９３  Ｎｏｖ  ５；２６８（３１）：２２９９２−２２９９９、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００５  Ｆｅｂ  １０；５０９（１）：１１−１９）。
ヒトのステロイドホルモン受容体の一種であるグルココルチコイド受容体（以下、ＧＲ）は、デキサメタゾンの薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５  Ｊｕｎ；９５（６）：２４３５−２４４１）。
ヒトの水素葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：以下ＤＨＦＲと略記する）はメトトレキサート（以下ＭＴＸ）の薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０００  Ｏｃｔ  １９；４３（２１）：３８５２−３８６１）。
ヒト前立腺由来細胞であるＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ）の可溶画分中には、５ａ−ジヒドロテストステロン（以下ＤＨＴ）の標的蛋白質であることが知られている（Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９３  Ｄｅｃ；４６（６）：６９９−７１１）アンドロゲン受容体（以下ＡＲ）が含まれている。
ヒト血管由来細胞であるＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ）の可溶画分中には、アルドステロンの標的蛋白質であることが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８７  Ｊｕｌ  １７；２３７（４８１２）：２６８−２７５）ミネラルコルチコイド受容体（以下ＭＲ）が含まれている。【００７１】
以下の各細胞抽出液可溶画分を調製し、該細胞抽出液可溶画分中に存在する上記各薬剤の標的蛋白質が、各シャペロン蛋白質群を用いた本発明の同定方法で検出できるかどうか調べた。なお、薬剤の内、ＦＫ５０６（特公平０３−０３８２７６号）及びＦＫ１７０６（欧州特許第３４６４２７号）は合成し、その他の薬剤はシグマ社から購入して用いた。ＦＫＢＰ１２、ＧＲ、及びＤＨＦＲのバンドはいずれも上述実施例２（３）同様、各標的蛋白質に付加したＶ５タグを認識する抗体を用いたウエスタンブロットで、ＡＲ、ＭＲのバンドは市販の抗体（Ｎ-２０及びＣ-１９、サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロットでそれぞれ検出した。
（ａ）ヒトのＦＫＢＰ１２の全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０５４０１４）を過剰発現させたＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ）の細胞抽出液可溶画分（以下、ＦＫＢＰ１２発現細胞抽出液）／シャペロン蛋白質群；ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＹＯＵ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ６、ＧＳＴ−ＨＳＰ９０Ｂ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ及びＧＳＴ−ＤＮＡＪＣ１１の各蛋白質を混合した群
（ｂ）ＧＲの全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００１０２４０９４）を過剰発現させたＨｅＬａＳ３細胞の細胞抽出液可溶画分（以下、ＧＲ発現細胞抽出液）／シャペロン蛋白質群；ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４の各蛋白質の混合群
（ｃ）ＤＨＦＲの全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００７９１）を過剰発現させたＨｅＬａＳ３細胞の細胞抽出液の可溶画分（以下、ＤＨＦＲ発現細胞抽出液）／シャペロン蛋白質群；ＧＳＴ−ＨＳＰＤ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＥ１の各蛋白質の混合群
（ｄ）ＬＮＣａＰ細胞可溶画分／シャペロン蛋白質群；ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４の各蛋白質の混合群
（ｅ）ＨＵＶＥＣ可溶画分／シャペロン蛋白質群；ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４の各蛋白質の混合群
（ｆ）ＨｅＬａ細胞の細胞抽出液可溶画分（以下、コントロールＨｅＬａ細胞抽出液；上記（ａ）〜（ｃ）のコントロール）
その結果（表１）、ＦＫＢＰ１２発現細胞抽出液、ＧＲ発現細胞抽出液、及びＤＨＦＲ発現細胞抽出液を用いた場合には、コントロールＨｅＬａ細胞抽出液を用いた場合には検出されないＦＫＢＰ１２、ＧＲ、及びＤＨＦＲのバンドが、各薬剤の非添加条件に比較して、添加条件でより明確に検出された。また、ＡＲのバンドは、ＤＨＴの未添加条件下でより明らかに検出され、ＭＲのバンドはアルドステロンを添加した条件下でより明確に検出された。これらの結果から、実施例２と同様、種々の分子シャペロン蛋白質を用いて、分子シャペロン蛋白質に結合する蛋白質を、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが確認された。【００７２】
【表１】
2007020853.tif 000002
【００７３】
＜実施例４＞分子シャペロンを用いたビグアナイドの標的蛋白質の同定
上述実施例２（２）に示した方法を用いて、これまで糖尿病治療薬として有意な薬効をもちながらも、直接の標的蛋白質が不明であったビグアナイドの標的蛋白質の探索を試みた。まずラット骨格筋由来細胞であるＬ６細胞（ＡＴＣＣ社）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むα最小必須培地（αＭＥＭ、インビトロジェン社）に懸濁し、コラーゲンコートした１５ｃｍ径のプレート（旭テクノグラス社）上でコンフルエント状態になるまで培養した。この細胞を氷冷したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１５ｍｌで２回洗浄した後に、上述のバッファーＡ  ２．０ｍｌを加えて溶解し、スクレーパーを用いて細胞抽出液を収集した。この細胞抽出液を１５００ｒｐｍで５分遠心して沈殿を除き、上澄みの可溶画分を集めた。この細胞抽出液の可溶画分中に、ビグアナイドの一種で臨床で血糖降下作用が認められている（ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）  Ｇｒｏｕｐ：Ｌａｎｃｅｔ，３５２，８５４（１９９８年））フェンフォルミン（シグマ社）を終濃度５０μＭになるように添加した、あるいは未添加の状態で、上述実施例２（２）と同様にグルタチオンセファロースビーズ上に精製したＧＳＴ−ＨＳＰＡ４蛋白質１μｇを加えてプルダウン実験を行った。４℃で１時間振盪した後、遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ−ＨＳＰＡ４に結合する蛋白質を共沈殿させた。なお、ここでは分子シャペロン蛋白質をビーズ上から脱落させないために、あらかじめ分子シャペロン蛋白質とビーズを公知の方法により化学的に架橋させて用いた。具体的には、グルタチオンセファロースビーズ上に精製したＧＳＴ−ＨＳＰＡ４蛋白質を０．２Ｍのホウ酸ナトリウム溶液で洗浄した後、２０ｍＭ  ＤＭＰでけん濁して４℃で４５分処理した。これを０．２Ｍモノエタノールアミン溶液で洗浄して反応を停止したのち、２０ｍＭグルタチオン溶液を加えて洗浄し、架橋されていない分子シャペロン蛋白質を除いたものをプローブとして利用した。ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４に結合する蛋白質を共沈殿させた後、終濃度５０μＭのフェンフォルミンを添加、あるいは未添加の上述のバッファーＡ’０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返した後、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、公知の銀染色法により蛋白質を検出した。その結果、未添加時に比較し、フェンフォルミンの添加時に分子シャペロン蛋白質との結合量が減少する約６０ｋＤａの大きさの蛋白質バンドの存在を検出した。該蛋白質はフェンフォルミンの添加により立体構造に変化をもたらされる、フェンフォルミンの標的蛋白質の一つであると考えられる。そこで、このバンドを切り出し、トリプシンを用いてタンパク質を断片化した後、生じたペプチド混合物をゲルより回収して公知の方法（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）に従い、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行った。その結果、該バンド中の蛋白質はＡＴＰ５Ｂ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿５９９１９１）であることが明らかになった。【００７４】
＜実施例５＞ＡＴＰ５Ｂとビグアナイドの結合、及びＡＴＰ５Ｂのビグアナイド応答性の検証
（１）ヒトＡＴＰ５Ｂ遺伝子のクローニング及びヒトＡＴＰ５Ｂ発現プラスミドの作製
まずヒトＡＴＰ５Ｂ遺伝子のクローニングを行った。配列番号８０及び配列番号８１で表される塩基配列のプライマーを合成し、該プライマーを用いて、ヒト骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）中からＰＣＲ法によりヒトＡＴＰ５Ｂの全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）、５８℃（１．５分）、７２℃（４分）のサイクルを３５回繰り返し、そのＰＣＲ産物を鋳型にしてさらに同じ条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約１６００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  システム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。このとき用いた配列番号８１に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，  １５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，  １４０−１４９，１９９７）がヒトＡＴＰ５Ｂ遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように、ヒトＡＴＰ５Ｂのストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ／インビトロジェン社；配列番号８９）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示すヒトＡＴＰ５Ｂの全長ｃＤＮＡ配列を含むクローンであることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂと略記する。
本発明の同定方法により見出された、ビグアナイドの標的蛋白質と考えられるＡＴＰ５Ｂがビグアナイドの薬理作用（主作用）をもたらす真の標的蛋白質であることを、以下の実験により検証した。なお、従来の化合物の標的蛋白質の探索手法はいずれも化合物と蛋白質の直接の結合のみを指標とするため、該化合物に結合する蛋白質は多数得られるが、実際に化合物の薬効に関わる蛋白質が見出される確率は概して低かった。本発明の方法は、従来法と異なり、化合物が結合した蛋白質の立体構造の変化を指標として化合物の標的を見出そうとするものであり、必然的に、見出される蛋白質は単なる化合物の結合蛋白質でなく、該化合物により機能を大きく変化させられる蛋白質分子であることが期待できる。【００７５】
（２）ＤＨＦＲ遺伝子のクローニング及びＧＳＴ融合型ＤＨＦＲ発現プラスミドの作製
前述実施例３で述べたＤＨＦＲはＭＴＸと結合することが知られている蛋白質である。（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ８７巻８号  ：２９５５−２９５９頁１９９０年）。後述する実施例においてＡＴＰ５Ｂとビグアナイドの生化学的な結合を検出するためのツールとして利用するため、ヒトＤＨＦＲ遺伝子の全長ｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００７９１）を、ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型とし、配列番号８４及び配列番号８５で表される塩基配列のプライマーを用いて、実施例２（１）と同じ条件でクローニングした。得られた約５６０塩基対のＤＨＦＲのｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニングした後、ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの断片を上記プライマーの両端に付加した制限酵素サイトＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを利用してベクターから切り出した。同時にＧＳＴ融合蛋白質発現ベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム社）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩでそれぞれ切断し、直鎖状にした。両者を混合したものをＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ；宝酒造社）と混合して１６℃で３時間処理し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマルチクローニングサイトにＤＨＦＲ  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＧＥＸ−ＤＨＦＲと略称する）を作製した。配列番号８６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、前述実施例と同様に塩基配列の決定を行い、ＤＨＦＲのｃＤＮＡのコード領域とｐＧＥＸベクターのＧＳＴタグ翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。【００７６】
（３）ＧＳＴ融合型ＤＨＦＲ蛋白質の発現及び精製
上記実施例５（２）で作製したｐＧＥＸ−ＤＨＦＲをヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）法による形質転換で大腸菌ＢＬ２１に導入した。２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（シグマ社）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合ＤＨＦＲ蛋白質（以下ＧＳＴ−ＤＨＦＲと略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知のＧＳＴ−プルダウン法に従ってＧＳＴ−ＤＨＦＲをグルタチオンセファロースビーズ上に精製した。コントロールとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１で形質転換した大腸菌ＢＬ２１からＧＳＴタグ部分のみの蛋白質（以下ＧＳＴ蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジーブリリアントブルー染色を行い、期待される分子量の蛋白質（ＧＳＴ−ＤＨＦＲ；４５ｋＤａ、ＧＳＴ蛋白質；２６ｋＤａ）が精製されていることを確認した。【００７７】
（４）ビグアナイドとＡＴＰ５Ｂの生化学的な結合
上述実施例５（３）で作製したＧＳＴ−ＤＨＦＲ蛋白質を利用してビグアナイドとＡＴＰ５Ｂ蛋白質の生化学的な結合の有無を調べた。具体的には、ＤＨＦＲがメトトレキサート（ＭＴＸ）と結合する性質を利用して、ビグアナイドの一種であるフェンフォルミンの分子構造の一部にメトトレキサートを融合させた化合物（２Ｓ）−５−［（３−｛［｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝（イミノ）メチル］アミノ｝プロピル）アミノ］−２−（｛４−［［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］（メチル）アミノ］ベンゾイル｝アミノ）−５−オキソペンタン酸  ２塩酸塩（以下ＭＴＸ−フェンフォルミンと略記する）を作製し、この化合物を、グルタチオンセファロースビーズ上に精製したＧＳＴ−ＤＨＦＲにＭＴＸの部分で結合させて固定し、突き出したフェンフォルミン側でＡＴＰ５Ｂ蛋白質との結合の有無をＧＳＴ−プルダウン法によって確認した。
まず、ＭＴＸ−フェンフォルミンは、以下の反応式に従って周知の有機合成技術を用いて調製した。
【化１】
2007020853.tif 000003
続いて、合成した上記ＭＴＸ−フェンホルミンと、ＧＳＴ−ＤＨＦＲ蛋白質とを用いたＧＳＴ−プルダウン法により、フェンフォルミンとＡＴＰ５Ｂの結合を調べた。まず上述実施例５（１）で作製したｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂの１．０μｇを鋳型として、ＴＮＴ  システム（ＴＮＴRＱｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社）４０μｌ及びラジオアイソトープ（ｒｅｄｉｖｕｅ  Ｐｒｏ−ｍｉｘ  Ｌ−［35Ｓ］；アマシャム）０．７４ＭＢｑを混合し、添付のプロトコールに従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳によりラジオアイソトープラベルされたヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質を調製した。このヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質調製液１５μｌとグルタチオンセファロースビーズ上に精製したＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−ＤＨＦＲの各１μｇを混合し、０．３ｍｌのバッファーＡを添加して４℃で１時間振盪した。その後遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−ＤＨＦＲに結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述のバッファーＡ’０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返したのち、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィによりプローブに結合した蛋白質を検出した。この実験において、すべての工程でバッファー中に前述のＭＴＸ−フェンホルミンを終濃度１０μＭ添加、あるいは非添加の各条件で実施し、結果を比較した。その結果、図１に示す通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された約６０ｋＤａのヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質のバンドがＭＴＸ−フェンフォルミンを添加した条件下でのみ、ＧＳＴ−ＤＨＦＲと結合して検出された。このヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質のバンドは、ＧＳＴ蛋白質を混合した場合、あるいはＭＴＸ−フェンフォルミンを添加しない条件下では検出されなかった。これにより、ツール用ポリペプチドの１つであるヒトＡＴＰ５Ｂは、フェンフォルミンに直接結合することがわかった。【００７８】
（５）ＡＴＰ５Ｂ分子表面に存在するビグアナイド結合部位の予測
上述の実施例５（４）の結果から、ツール用ポリペプチドの１つであるヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質は、フェンフォルミンと直接結合することが確認された。そこで、ＡＴＰ５Ｂの蛋白質分子表面にビグアナイドが結合しうる鍵穴となる構造が存在するのかを、ウシＡＴＰ５ＢのＸ線結晶構造解析のデータをもとに計算機上で調べた。具体的には、Ｆ１Ｆ０−ＡＴＰ合成酵素（Ｆ１は細胞外、Ｆ０は細胞内多量体を示す）のサブユニットの一つであるＡＴＰ５Ｂの蛋白質表面上において、ビグアナイドの結合が可能と判断される部位（サイト）の予測を行った。
結晶構造データを「ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ」から１ＢＭＦというＩＤで取得した。１ＢＭＦには、ウシミトコンドリアＦ１−ＡＴＰ合成酵素（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ）の７量体分子（αサブユニット３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ鎖）、βサブユニット３つ（Ｄ、Ｅ、Ｆ鎖）とγサブユニット１つ（Ｇ鎖））が納められている。ＡＴＰ５ＢはＦ１Ｆ０−ＡＴＰ合成酵素の細胞外領域であるＦ１−ＡＴＰ合成酵素のβサブユニットであり（Ｎａｔｕｒｅ．  １９９７；３８６：２９９−３０２、Ｎａｔｕｒｅ．  １９９４；３７０（６４９１）：６２１−６２８）、ウシＡＴＰ５Ｂは、ヒトＡＴＰ５Ｂと９９％のアミノ酸残基における同一性を保持している（ヒトＡＴＰ５Ｂは５２９残基であり、ウシＡＴＰ５Ｂは４８２残基である。ヒトＡＴＰ５Ｂの方がＮ末端で４６残基長く、Ｃ末端では１残基長い）。解析には、上記ウシミトコンドリアＦ１−ＡＴＰ合成酵素の７量体分子の内、ウシＡＴＰ５Ｂであるβサブユニットの一つであるＤ鎖とその隣接するαサブユニットであるＡ鎖及びＣ鎖のみ（以後複合体αβαと記載する）を使用した。解析にはケミカルコンピューティンググループ社（ＣＣＧ社；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）のＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）ソフトウェアに用意されている機能であるＰｈ４Ｄｏｃｋを用いた。Ｐｈ４Ｄｏｃｋとは、リガンドと受容体の３次元構造を与えるだけで、計算機を利用してその結合位置も含めて自動的に安定な複合体構造を探索する機能である（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｄｅｃ  ３０；４７（２７）：６８０４−１１）。この機能を利用してビグアナイドの一種であるメトフォルミン及びフェンフォルミンの構造情報と複合体αβαの構造情報を与え、複合体αβα上でのこれらの化合物が結合する部位を探索した。以下表２にメトフォルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、フェンフォルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）各々と複合体αβαが結合して安定な複合体形成を可能にするウシＡＴＰ５Ｂ蛋白質分子表面上の部位を探索した結果を示す。【００７９】
【表２】
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表２はメトフォルミン、フェンフォルミン各々が結合した部位と、その時の結合に関するエネルギー値（Ｕ＿ｅｌｅ＋Ｕ＿ｖｄｗ）を示している。表中におけるサイトは結合部位を表しており、便宜的により大きくより疎水性の高い結合部位に順に番号を付けている。Ｕ＿ｅｌｅは静電相互作用エネルギーを、Ｕ＿ｖｄｗはファンデアワールスエネルギーをそれぞれ表しており、Ｕ＿ｅｌｅ＋Ｕ＿ｖｄｗの値が小さい順に上から２０個の候補を並べて表記した。力場はｍｍｆｆ９４ｓを使用した。ここでメトフォルミン、フェンフォルミンが同じ分子を薬効標的としているという仮定に基づくと、メトフォルミンとフェンフォルミンが共通に結合する結合部位はサイト２０とサイト２９のみとなる。また、上述の実施例５（４）より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写・翻訳させて作製したヒトＡＴＰ５Ｂがフェンフォルミンと結合したことから、ＡＴＰ５Ｂは複合体の状態ではなくても単独でビグアナイドと結合しうることがわかる。そこでＡＴＰ５Ｂが単独で結合部位を形成している部位に限定するとサイト２０のみが候補として残る。以上より、メトフォルミン及びフェンフォルミンは複合体αβαのサイト２０に結合すると予測された。
上述の予測、すなわちフェンフォルミンが直接サイト２０に結合している事を検証する為には、フェンフォルミンが結合する為に最も重要な残基を見出し、その残基を変異させることで結合能が無くなることを実験的に示せばよい。そこで、フェンフォルミンとサイト２０との結合を観察した結果、３パターンの結合様式の存在が予測された。それら結合様式のいずれにおいても、ＡＴＰ５Ｂ分子内のアミノ酸残基であるＧｌｕ１２５，Ｇｌｕ２４１，Ａｓｐ２４５の３箇所（数字はいずれもウシＡＴＰ５Ｂ分子におけるアミノ末端側から数えたアミノ酸残基の位置を示す）での共同的な分子認識が行われている事が分かった。そこで、以下の実施例に示す方法に従い、上記のウシＡＴＰ５Ｂの３アミノ酸残基のうちヒトＡＴＰ５Ｂ分子上でそれらＧｌｕ１２５、Ａｓｐ２４５に相当するＧｌｕ１７５、Ａｓｐ２９５をそれぞれ置換した変異型ヒトＡＴＰ５Ｂを実際に作製し、フェンフォルミンとの結合能を調べた。【００８０】
（６）変異型ヒトＡＴＰ５Ｂ発現プラスミドの作製及び変異型ヒトＡＴＰ５Ｂのビグアナイド結合能の検証  
前述の発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂを鋳型として、配列番号８７と配列番号８１、及び配列番号８０と配列番号８８で表される塩基配列のプライマーの各セットを用いて、ＰＣＲ法によりヒトＡＴＰ５Ｂの１７５番目のアミノ酸であるＧｌｕがＶａｌに置換する変異を生じたｃＤＮＡの５’側約５３０塩基対、３’側約１０８０塩基対の２つのＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応、クローニング工程、塩基配列の決定はいずれも実施例５（１）に示した方法と同一である。得られた２本のＰＣＲ産物を等量ずつ混合したものを鋳型にして、今度は配列番号８０と配列番号８１に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより約１６００塩基対のＧｌｕ１７５Ｖａｌ変異型ＡＴＢ５Ｂをコードする全長ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にクローニングした後、配列番号９０に示す合成ＤＮＡプライマーを用いてベクターに挿入された塩基配列を同定し、ＡＴＢ５ＢにＧｌｕ１７５Ｖａｌ変異が生じていることを確認した。得られた発現プラスミドは以後ｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂ（Ｅ１７５Ｖ）と略記する。次に、配列番号９１と配列番号８１、及び配列番号８０と配列番号９２で表される塩基配列のプライマーの各セットを用いて、同様の方法により、Ａｓｐ２９５Ｖａｌ変異型ＡＴＢ５Ｂをコードする全長ｃＤＮＡを取得し、発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂ（Ｄ２９５Ｖ）を作製した。
上記で作製したｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂ（Ｅ１７５Ｖ）及びｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂ（Ｄ２９５Ｖ）を用いて上述の実施例５（４）に示した方法に従って、Ｇｌｕ１７５ＶａｌもしくはＡｓｐ２９５Ｖａｌ変異型ＡＴＰ５Ｂ蛋白質とフェンフォルミンの結合能をプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）により検証した。その結果、図３に示すとおり、野生型ＡＴＰ５Ｂで確認できるフェンフォルミンとの結合がバンドで確認できているが、Ｇｌｕ１７５Ｖａｌ及びＡｓｐ２９５Ｖａｌ変異型ＡＴＰ５Ｂではバンドが消失し、結合が確認できなかった。この事実により、ヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質のＧｌｕ１７５、Ａｓｐ２９５がフェンフォルミンとの結合に重要であることが実験的に裏付けられた。また、実施例５（４）の結果で示された通り、ツール用ポリペプチドの１つであるヒトＡＴＰ５Ｂ蛋白質は、フェンフォルミンと直接結合していることがわかった。【００８１】
（７）ヒトＡＴＰ５Ｂ又はＬＫＢ１の過剰発現細胞におけるビグアナイドのＡＭＰＫ活性化能の検出
ビグアナイドはこれまで直接の標的蛋白質は不明であったが、細胞内のＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）をリン酸化し、活性化することが明らかにされている（Ｚｈｏｕ  ＧらＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００１  Ｏｃｔ；１０８（８）：１１６７−７４）。ＡＭＰＫの活性は細胞への糖取り込みを促進し、糖代謝を改善することから、このＡＭＰＫの活性化はビグアナイドの薬効である糖尿病治療効果をもたらす主要な作用経路であると考えられている。本発明の同定方法により見出されたＡＴＰ５Ｂがビグアナイドの薬効（主作用）を担う真の標的分子であるなら、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質はビグアナイドにより作動する細胞内シグナル伝達系において、ＡＭＰＫの活性化より上流に位置しているはずである。そこで、実験においてビグアナイドに結合するＡＴＰ５Ｂ分子が、実際にＡＭＰＫ活性化の上流にあることを検証するため、細胞にＡＴＰ５Ｂを過剰に発現させた状態で、ビグアナイドによるＡＭＰＫの活性化が影響を受けるかどうかを調べた。【００８２】
上記の目的のため、まず、ヒトＡＴＰ５Ｂと対比するコントロールとして、ＡＭＰＫをリン酸化する酵素の一つであることが示されている（Ｈａｒｄｉｅ  ＤＧ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００４  Ｎｏｖ  １；１１７（Ｐｔ  ２３）：ｐ５４７９−５４８７）ＬＫＢ１蛋白質をコードする遺伝子ｃＤＮＡのクローニング及びＬＫＢ１発現プラスミドの作製を行った。
上述の実施例５（１）で述べた方法と同様にして、配列番号８２及び配列番号８３で表されるＤＮＡオリゴプライマーを作製し、ヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型としてＰＣＲ法によりヒトＬＫＢ１遺伝子の全長ｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲ反応は上述の実施例５（１）と同じ条件で行い、増幅された約１３００塩基対のＤＮＡ断片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯへ挿入した。完成したプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号ＮＭ＿０００４５５に示されたヒトＬＫＢ１の全長ｃＤＮＡ配列からなるクローンであることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＬＫＢ１と略記する。
この発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＬＫＢ１、上述の実施例５（１）で作製したｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂ、又は空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）（インビトロジェン社）をＨｅＬａＳ３細胞に導入した。ＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ）は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。培地を、ウェルあたり１ｍｌの無血清培地ＯＰＴＩ  ＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン社）に置換し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）、ｐｃＤＮＡ−ＬＫＢ１、又はｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂの各３．０μｇ／ウェルを一過性に導入した。１２時間培養後、チャコール処理により低分子を除いた牛胎児血清を１０％含むＤＭＥＭの２ｍｌ／ウェルで置換し、さらに３６時間培養した。そこへフェンフォルミン（シグマ社）を終濃度１ｍＭ添加、あるいは溶媒（ＤＭＳＯ）のみを添加した条件下でさらに１時間（１ｈｒ）培養した。培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．１５ｍｌの上述バッファーＡ（但し、ＮａＣｌ濃度は１５０ｍＭで各種フォスファターゼ阻害剤；２ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4，１０ｍＭ  ＮａＦ，２５ｍＭ  β−グリセロホスフェート，０．２ｍＭ  Ｍａ2ＭｏＯ4，２０ｎＭ  オカダ酸を添加）を加えて細胞を溶解した。公知のＳＤＳ電気泳動法、及び抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫ−α（Ｔｈｒ１７２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、第一化学薬品）を用いたウエスタンブロット法により細胞中のＡＭＰＫの活性を分子のリン酸化レベルとして検出した。このとき、ＡＭＰＫα（リン酸化をうけるＡＭＰＫのサブユニット）の蛋白質量は各試料間で差がないことを確認するため、同時に抗ＡＭＰＫα抗体（第一化学薬品）を用いたウエスタンブロットを行った。その結果、図４に示す通り、上述の空ベクターを導入した細胞、及びｐｃＤＮＡ−ＬＫＢ１を導入してＬＫＢ１を発現させた細胞では、いずれも溶媒で処理した場合と比較して、フェンフォルミンで処理した場合にＡＭＰＫのリン酸化レベルが顕著に亢進し、活性化されているのが観察された。ところが、ｐｃＤＮＡ−ＡＴＰ５Ｂを導入してヒトＡＴＰ５Ｂを発現させた細胞では、フェンフォルミン処理によるＡＭＰＫの活性化が見られなくなった。
フェンフォルミンの代わりにメトフォルミン（シグマ社）を終濃度１０ｍＭ添加し、同様の実験を行ったところ、ヒトＡＴＰ５Ｂを発現させた細胞ではフェンフォルミン処理した場合と同様に、ＡＭＰＫの活性化がみられなくなった。
これらは、細胞内でＡＴＰ５Ｂ蛋白質の存在量が変化することでフェンフォルミンやメトフォルミンなどのビグアナイドの薬効に寄与するＡＭＰＫの活性化能が変化することを意味し、ビグアナイドの細胞内シグナルにおいてＡＴＰ５Ｂが明らかにＡＭＰＫの上流に位置することを示している。この事実と、上述の実施例においてＡＴＰ５Ｂとフェンフォルミンの生化学的な結合が示された事実と併せ考えることにより、ＡＴＰ５Ｂは、ビグアナイドに結合し、かつ該化合物の薬効に寄与する真の標的蛋白質であると結論できる。なお、ＡＴＰ５Ｂの過剰発現によってビグアナイドによるＡＭＰＫの活性化、即ちリン酸化の亢進が妨げられた現象は、以下のいずれかの説により説明される。ＡＴＰ５Ｂが元々ＡＭＰＫのリン酸化を抑制する作用を有しており、ビグアナイドはＡＴＰ５Ｂに結合してそのＡＭＰＫ抑制作用を妨げることでＡＭＰＫを活性化しているという機序により説明される。又は、内在性分子と複合体を形成することで作用するＡＴＰ５Ｂ分子を単独で過剰発現させたために、ビグアナイドが過剰な単体のＡＴＰ５Ｂに結合してパージ（ｐｕｒｇｅ）された（取り除かれた）結果、本来ビグアナイドがＡＴＰ５Ｂを含む複合体分子を介して起こるＡＭＰＫのリン酸化の亢進が見られなくなったと説明される。なお、この様な、標的蛋白質の過剰発現により化合物の作用が相殺される現象は一般に知られており、特定蛋白質が化合物の標的蛋白質であることを同定する手段としても利用されている（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００２；４１（３）：ｐ１４２−１４９、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００５；２８０（１３）：ｐ１２２３１−１２２３８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９６；９３（２１）：１１９１９−１１９２４、Ｙｅａｓｔ，１９９８  １４（１０）：９３５−９４２）。上記いずれの説の説明によっても、ＡＴＰ５Ｂは、ビグアナイドの薬効に寄与する標的蛋白質であることに変わりはなく、ＡＴＰ５Ｂに結合する物質は、ビグアナイドと同じ薬効（主作用）を有する。
以上の結果により、ＡＴＰ５Ｂを含むツール用ポリペプチドを糖尿病治療薬であるビグアナイドの標的蛋白質として利用する（即ち糖尿病治療薬スクリーニングツールとして使用する）ことによって、糖尿病治療薬であるビグアナイドがもたらす薬効と同じ主作用効果を、同一の細胞内シグナル経路を利用することによって惹起しうる化合物（即ち糖尿病治療薬）を選択できることが示された。
また、本発明の同定方法によって、化合物の主作用に寄与する、試験薬剤の標的タンパク質を同定できることが証明された。【００８３】
＜実施例６＞ツール用ポリペプチドを利用した糖尿病治療薬のスクリーニング方法
（１）スクリーニング方法
ビグアナイドとツール用ポリペプチドの一つであるＡＴＰ５Ｂ蛋白質を用いて、該ポリペプチドとビグアナイドの結合の変化を指標にして、該ポリペプチドに結合する試験物質（即ち糖尿病治療薬）を選択することのできるスクリーニング方法を示す。
上述の実施例５（４）で述べた方法に従って、ＡＴＰ５Ｂとビグアナイドの結合を検出することができる。図５に示す通り、実施例５（４）で述べた方法において、存在させるＭＴＸ−フェンフォルミンの濃度（１．０，１０，１００μＭ）を高くすると、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質との結合はより明確に検出された。この系に、試験物質として、フリーのフェンフォルミン（１０μＭ）を添加すると、図６に示す通り、該蛋白質とＭＴＸ−フェンフォルミンとの結合が妨げられることが示された。ここで添加したフェンフォルミンを評価したい試験物質に置き換えることにより、該試験物質がＡＴＰ５Ｂ蛋白質とＭＴＸ−フェンフォルミン（ビグアナイド）との結合に変化を与えるか否かを調べることができ、ビグアナイドとツール用ポリペプチドとの結合を競合阻害し、ツール用ポリペプチドと結合する物質、即ち糖尿病治療薬をスクリーニングすることができる。上述に記載の条件のうち、ＭＴＸ−フェンフォルミンの濃度が１０μＭであるとき、ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくは１μＭ以下の物質を、更に好ましくは０．１μＭ以下の物質を糖尿病治療薬として選択する。【００８４】
（２）糖尿病治療薬のスクリーニング
上記（１）のスクリーニング方法に従い、ＭＴＸ−フェンフォルミン（ＭＴＸ−ＰＦ）の濃度が１０μＭの条件下で、試験物質として、フリーのフェンフォルミンの代わりに各種化合物を添加してスクリーニングを実施した結果、２種類の化合物、２−［（Ｅ）−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イリミノ）メチル］フェノール  （メイブリッジ社、以後化合物Ａと略記）及び６−クロロ−９Ｈ−プリン−２−アミン  （オーロラ社、以後化合物Ｂと略記）がヒット化合物として見出された。即ち、図７に示すとおり、これらの各２化合物は、１０μＭの添加で、ＡＴＰ５Ｂ蛋白質とＭＴＸ−フェンフォルミンとの結合を妨げることを示した。さらに、これら各化合物は前述の実施例５（７）に示したＡＭＰＫ活性化能の検出実験においていずれも有意なＡＭＰＫ活性化能を示し、同活性化能は実施例５（７）に示したフェンフォルミン、メトフォルミンの場合と同様に、ＡＴＰ５Ｂの過剰発現により消失した。これらの結果は、上記の化合物Ａ及び化合物ＢがいずれもＡＴＰ５Ｂのビグアナイド結合部位に直接相互作用し、細胞内のＡＭＰＫを活性化することを示している。同時に、実施例６（１）に示した本明細書のポリペプチドを利用した糖尿病治療薬のスクリーニング方法により、実際にビグアナイドと同様のＡＭＰＫ活性化能を有する化合物が選択できることが確認された。【００８５】
＜実施例７＞ヒット化合物の血糖降下作用、及び血中乳酸値に与える影響の測定
上述実施例６に記した通り、本発明のスクリーニング方法で見出された化合物Ａ及び化合物Ｂは、細胞のＡＭＰＫ活性化能を有する。次にこれらの化合物がビグアナイド同様にｉｎ  ｖｉｖｏで血糖降下作用を有するかどうかを調べた。同時にビグアナイドの副作用である血中の乳酸値増加についても上述２化合物の作用を調べた。糖尿病モデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋  Ｌｅｐｒｄｂ／＋  Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌ；日本クレア）の１１週齢の雄１５匹を５匹ずつ３群に分けた。メトフォルミン（シグマ社）及び上述化合物Ａを溶媒（５％クレモホール、０．２％メチルセルロース：ＭＣ）でそれぞれ３０ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。上記マウス各５匹にメトフォルミンは体重あたり３００ｍｇ／ｋｇ、化合物Ａは体重あたり１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ腹腔内に投与し、同容量の溶媒（５％クレモホール、０．２％ＭＣ）のみを投与した群と比較した。投与と同時に絶食させ、開始から０分、９０分、１８０分後にそれぞれ尾部から採血して血糖値及び血中乳酸値を測定した。血糖値は簡易血糖測定装置（アキュ・チェックアクティブＩＩ；ロッシュ）を用いて測定し、血中乳酸値は簡易乳酸測定装置（ラクテート・プロ；アークレイマーケティング（株）を利用してそれぞれ測定した。同様にｄｂ／ｄｂマウスの１８週齢雄１２匹を４匹ずつ３群に分けた。メトフォルミン（シグマ社）及び上述化合物Ｂを生理食塩水でそれぞれ３０ｍｇ／ｍｌ又は９ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。上記マウス各４匹にメトフォルミンは体重あたり３００ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂは体重あたり９０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ腹腔内に投与し、同容量の溶媒（生理食塩水）のみを投与した群と比較した。前述と同様、投与と同時に絶食させ、開始から０分、９０分、１８０分後にそれぞれ上述と同様に血糖値及び血中乳酸値を測定した。
その結果、メトフォルミンはいずれの実験においても溶媒投与群に比較して９０分、１８０分で有意な血糖降下作用を示した。化合物Ａ及び化合物Ｂは、いずれも、９０分、１８０分で有意差を持って血糖降下作用を示した（図８Ａ、Ｃ）。一方で、メトフォルミン投与群はいずれの実験でも９０分後に有意な血中乳酸値の上昇を引き起こしたが、化合物Ａ又は化合物Ｂのいずれも血中乳酸値の上昇を引き起こさなかった（図８Ｂ，Ｄ）。この結果から、本発明のスクリーニング法により、実際にビグアナイドと同様の有意な血糖降下作用を持つ新たな糖尿病治療薬を見出せることが確認された。加えて、上記２種の化合物がいずれもビグアナイドの副作用として知られる血中乳酸値の上昇を引き起こさないことから、本発明のスクリーニング方法により、主作用（ビグアナイドの薬理作用；すなわち糖尿病治療効果）を有し、副作用（即ち血中乳酸値の上昇）を有さない新たな糖尿病治療薬のスクリーニングができることが確認された。【００８６】
＜実施例８＞分子シャペロンを用いたサリドマイドの標的蛋白質の同定
サリドマイドは、睡眠誘導薬、多発性骨髄腫、ＨＩＶ、ハンセン氏病等に対して有意な薬効を有しているが、これまでサリドマイドの直接の標的蛋白質は不明であった。そこで、上述実施例２（２）に示した方法を用いて、サリドマイドの標的蛋白質の探索を試みた。ヒト血球系培養細胞であるＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ社）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む最小必須培地（ＲＰＭＩ１６４０、インビトロジェン社）６０ｍｌに懸濁し、１５ｃｍ径のプレート（旭テクノグラス社）上で１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるまで培養した。この細胞を１２００ｒｐｍで３分の遠心分離により集め、氷冷したＰＢＳ１０ｍｌで１回洗浄した後に、上述のバッファーＡ  ２．０ｍｌを加えて溶解し、細胞抽出液を収集した。この細胞抽出液を１５００ｒｐｍで５分遠心して沈殿を除き、上澄みの可溶画分を集めた。サリドマイド（（−）−ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ，シグマ社）を終濃度１００μＭになるように添加又は未添加の条件下で、この細胞抽出液の可溶画分に、グルタチオンセファロースビーズ上に精製した８種類のＧＳＴ融合シャペロン蛋白質（ＧＳＴ−ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＳＴ−ＨＳＰＨ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＣＡ、ＧＳＴ−ＨＳＰＤ１、ＧＳＴ−ＤＮＡＪＡ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＢ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＥ１、ＧＳＴ−ＨＳＰＡ４の混合物；各蛋白質０．５μｇずつを混合）を混合し、プルダウン実験を行った。なおプルダウン実験の工程、及び条件は上述実施例２（２）と同様にして行った。すなわち４℃で１時間振盪した後、遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ融合シャペロン蛋白質混合物に結合する蛋白質を共沈殿させた。上述実施例４と同様に、あらかじめ各シャペロン蛋白質とビーズは公知の方法により化学的に架橋させて用いた。シャペロン蛋白質混合物に結合する蛋白質を共沈殿させた後、終濃度１００μＭのサリドマイドを添加又は未添加の上述のバッファーＡ’０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返した後、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、ネガティブ染色法（和光純薬）により蛋白質を検出した。その結果、サリドマイドの添加時のみ存在する複数の蛋白質バンドの存在を検出した。これら蛋白質は、サリドマイドの添加により該蛋白質と分子シャペロン蛋白質混合物との結合が変化した蛋白質群、すなわちサリドマイドの添加により立体構造に変化がもたらされた蛋白質群である。これらのバンドを切り出し、トリプシンを用いてタンパク質を断片化した後、生じたペプチド混合物をゲルより回収して実施例４の方法と同じく、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行った。その結果、サリドマイドの添加時のみ存在する約４５ｋＤａのバンドに含まれる蛋白質がＴＡＲＤＢＰ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿０３１４０１）であることが判明した。【００８７】
＜実施例９＞ＴＡＲＤＢＰのサリドマイド応答性の検証
ＴＡＲＤＢＰはＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との結合活性を持つ転写因子であり、ＨＩＶの抑制作用を有することが知られている（Ｏｕ  ＳＨら、Ｖｉｒｏｌ．  １９９５  Ｊｕｎ；６９（６）：３５８４−３５９６）。サリドマイドには有意な抗ＨＩＶ作用が知られており（Ｆｒａｎｋｓ  ＭＥら、Ｌａｎｃｅｔ．  ２００４；３６３（９４２３）：１８０２−１８１１．）、ＴＡＲＤＢＰはサリドマイドの標的蛋白質と考えて矛盾が無い。
サリドマイドの直接の標的となる蛋白質はいまだに知られていないが、細胞からの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）等のサイトカイン産生を抑制することが報告されている（Ｆｒａｎｋｓ  ＭＥら、Ｌａｎｃｅｔ．  ２００４；３６３（９４２３）：１８０２−１８１１．）。そこで前述の実施例８において本発明の方法により見出されたサリドマイドの標的蛋白質ＴＡＲＤＢＰが、サリドマイドの主作用を担う真の標的分子であるかを、細胞からのＴＮＦ−α産生の変化を指標にした実験により検証を試みた。【００８８】
（１）  ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のクローニング及びＴＡＲＤＢＰ発現プラスミドの作製
ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００７３７５に示されているヒトＴＡＲＤＢＰの遺伝子配列に従って配列番号９３及び配列番号９４で表される塩基配列のプライマーを合成し、該プライマーを用いて、ヒトリンパ球由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法によりヒトＴＡＲＤＢＰの全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）・５８℃（１．５分）・７２℃（４分）のサイクルを３５回繰り返し行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約１２５０塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  システム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。このとき用いた配列番号９４に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，  １５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，  １４０−１４９，１９９７）がＴＡＲＤＢＰ遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように、該遺伝子のストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ／インビトロジェン社；配列番号８９）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００７３７５（配列番号９５）に示すヒトＴＡＲＤＢＰの全長ｃＤＮＡ配列を含むクローンであることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰと略記する。【００８９】
（２）ＴＡＲＤＢＰ高発現細胞の作製及び該細胞のＴＮＦ−α発現量の測定
ｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰ又は空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）（インビトロジェン社）をＨｅＬａＳ３細胞に導入した。具体的には、まずＨｅＬａＳ３細胞を１２ウェル培養プレートの培養皿に各ウェル１ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。ウェルあたり０．５ｍｌの無血清培地ＯＰＴＩ  ＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン社）に置換し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰ又はｐｃＤＮＡ３．１の各０．８μｇ／ウェルを一過性に導入した。１２時間培養後、牛胎児血清を１０％含むＤＭＥＭの１ｍｌ／ウェルで置換し、さらに１２時間培養した。そこへ、オカダ酸（和光純薬）を終濃度５０ｎＭ添加又は未添加の条件下でさらに１６時間培養した。このとき一部の細胞はオカダ酸処理と同時に１００μＭのサリドマイドを添加した。培地を除去し、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄した後にこれらの細胞を−８０℃で凍結、保存した。【００９０】
（３）細胞中のＴＮＦ−α発現量の測定
ＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて、説明書に従い、上述実施例９（２）で凍結した各細胞から全ＲＮＡを調製した。調製した各々の全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ（ニッポンジーン社）を用いて処理し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解した。この全ＲＮＡ１μｇを用い、逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅTM  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写を行った。
６つのオリゴヌクレオチド（配列番号９７−配列番号１０２）を遺伝子発現量測定のためのＰＣＲのプライマーとして設計し、合成した。ヒトβ−アクチン遺伝子に対しては配列番号９７と配列番号９８の組合せ、ヒトＴＮＦ−α遺伝子に対しては配列番号９９と配列番号１００の組み合わせ、ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子に対しては配列番号１０１と配列番号１０２の組み合わせでそれぞれ使用した。
上記６種、３セットのプライマーを用いたＰＲＩＳＭTM７７００シークエンスディテクションシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）によるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は、２５μｌの系で説明書に従い実施した。各系において１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。ここで１本鎖ｃＤＮＡは（２）で保存したものを１００倍希釈して使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃１０分に続いて９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるヒトＴＮＦ−α遺伝子、及びヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現量は、下記式に基づいてβアクチン遺伝子の発現量で補正した。
［ＴＮＦ−α又はＴＡＲＤＢＰの補正発現量］＝［ＴＮＦ−α又はＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現量（生データ）］／［βアクチン遺伝子の発現量（生データ）］
各細胞におけるＴＮＦ−α及びＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現量の比較においては、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を導入し、溶媒（ＤＭＳＯ）のみで処理した細胞における発現量を１００とした相対量を算出し、図９及び図１０に示した。図の値は平均±ＳＥを示している。
図９に示すとおり、ｐｃＤＮＡ−ＴＡＲＤＢＰを導入した細胞（ＴＡＲＤＢＰ高発現細胞）では、空ベクター導入細胞（コントロール細胞）に比較し、ＴＡＲＤＢＰの発現量が約７倍に亢進したことが確認された。
図１０に示す通り、オカダ酸処理によりコントロール細胞からのＴＮＦ−αの発現が大幅に上昇（〜８０倍）することが観察された。サリドマイドの添加は、このオカダ酸によるＴＮＦ−αの発現亢進を５０％近くに抑制しており、該細胞においてサリドマイドの作用を検出できることが確認された。
一方、コントロール細胞と比較して、ＴＡＲＤＢＰ高発現細胞の場合は、オカダ酸の添加による細胞からのＴＮＦα発現の亢進作用はほぼ同等であったが、サリドマイドの添加によるＴＮＦ−αの発現抑制作用が観察されなかった。この結果は、ＴＡＲＤＢＰの過剰発現によって細胞内のサリドマイドと過剰量のＴＡＲＤＢＰ蛋白質が結合したことにより、本来作用すべきサリドマイドが細胞内からパージ（ｐｕｒｇｅ）された（取り除かれた）ためと考えることにより容易に説明ができる。ＴＡＲＤＢＰはＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との結合活性を持つ転写因子であることが知られている。すなわち、ＴＡＲＤＢＰはＴＮＦ−αの発現誘導に必須な複数の転写因子からなる機能複合体中の一分子であると考えられ、そのものを単体で過剰発現してもＴＮＦ−αの発現誘導を亢進させないが、サリドマイドにより該分子の機能が阻害されるとＴＮＦ−αの発現誘導に必須な転写複合体の機能が失われる結果、ＴＮＦ−αの産生が抑制されると考えられる。
以上の結果から、本発明の同定方法によって見出された、サリドマイド添加時のみ分子シャペロンに結合する蛋白質ＴＡＲＤＢＰは、サリドマイドの薬効を担う分子機構のひとつと考えれているＴＮＦαの発現制御に関わる分子であると考えられた。
これにより、上述の実施例に示したビグアナイド標的のＡＴＰ５Ｂの同定とあわせて、本発明の同定方法は、試験薬剤の修飾を施すことなく標的蛋白質の同定に用いることが可能であることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のスクリーニング方法は、糖尿病治療薬のスクリーニングの用途に適用することができる。本発明のスクリーニングツールは、前記スクリーニングに利用できる。
本発明の同定方法は、既存の薬剤の改良研究に有用な標的蛋白質の同定方法として有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２８〜７７、８４〜８９、９１及び９２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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