(57)【要約】機能未知蛋白質ファミリーの機能を明らかにすることにより、癌に関する知見を得て、抗癌剤ならびに腫瘍マーカーを開発する上での手がかりとなる新規な蛋白質及びその利用方法を提供する。新規な蛋白質は、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する。新規な蛋白質は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質である。新規な蛋白質を用いて、例えば、その抗体を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲第２項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求の範囲第３項記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求の範囲第４項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同等の機能を有する蛋白質を回収することを特徴とする前記蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項７】
請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体。
【請求項８】
塩基配列が、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡの全部または一部に相補する配列であることを特徴とするアンチセンス核酸。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質を発現している細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記発現レベルを変化させる化合物を選択する工程。
【請求項１１】
前記薬剤が、抗癌剤、細胞増殖制御剤又は神経回路再生剤のいずれか１つであることを特徴とする請求の範囲第９項または第１０項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛋白質及びその利用方法に関し、より詳しくは、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する新規な蛋白質及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムが解読され多くの未知遺伝子発見が続いている現在、これまでゲノム解析におかれていた研究の重点は遺伝子より発現する蛋白質の機能解析へと移りつつある。そのため、蛋白質の立体構造を解明し、その立体構造に基づいて各蛋白質の機能を推定・解明することなどが行われているが、依然として機能未知である蛋白質は存在する。【０００３】
近年、癌細胞において発現が上昇する機能未知蛋白質が報告されており、例えば非特許文献１及び２には、ヒトの肺腫瘍及びマウスの精巣腫瘍においてＴＤＥ１（前記機能未知蛋白質ファミリーのメンバー）の発現が増加することが開示されている。また、非特許文献３には、酵母ＴＭＳ−１（前記機能未知蛋白質ファミリーのメンバー）がアミノ酸トランスポーターと似た１１個の膜貫通型セグメントを有する膜トポロジーを取ると推測されることが報告されている。さらに、非特許文献４には、マウスＴＭＳ−１及びＴＭＳ−２（前記機能未知蛋白質ファミリーのメンバー）が神経で発現し、膜に局在することが報告されている。非特許文献５には、培養した乏突起神経膠細胞の最終分化段階においてＴＰＯ１（前記機能未知蛋白質ファミリーのメンバー）の発現が誘導されることが開示されている。
【非特許文献１】Bossolasco, M., Lebel, M., Lemieux, N., and Mes-Masson, A. M. (1999) Mol Carcinog 26(3), 189-200.
【非特許文献２】Lebel, M., and Mes-Masson, A.M.(1994) DNA Seq 5(1), 31-9.
【非特許文献３】De Hertogh, B., Carvajal, E., Talla, E., Dujon, B., Baret, P., and Goffeau, A. (2002) Funct Integr Genomics 2(4-5), 154-70.
【非特許文献４】Grossman, T. R., Luque, J. M., and Nelso, N.(2000) J Neurosci 13(7), 1459-63.
【非特許文献５】Krueger, W. H., Gonye, G. E., Madison, D. L., Murray, K. E., Kumar, M., Spoerel, N., and Pfeiffer, S. E. (1997) J Neurochem 69(4), 1343-55.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述の非特許文献１〜５のような報告は、前記機能未知蛋白質ファミリーが細胞生理において多くの面で重要な機能を果たすことを示唆している。しかしながら、前記機能未知蛋白質は複数のサブタイプをもち、生物間で蛋白質ファミリーを構成していることが知られているが、既知の蛋白質との相同性を示さず、その機能も明らかになっていなかった。【０００５】
また、これまでに知られている多くの抗癌剤の作用は、癌細胞のＤＮＡ合成、ＲＮＡへの転写、蛋白質への翻訳の各段階に作用するものであったが、癌細胞において発現が上昇する前記機能未知蛋白質は、新たな抗癌剤を開発する上での手がかりとなる物質となる可能性が示唆されていた。【０００６】
そこで、本発明は、前記機能未知蛋白質ファミリーの機能を明らかにすることにより、癌に関する知見を得て、抗癌剤ならびに腫瘍マーカーを開発する上での手がかりとなる新規な蛋白質及びその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有し、膜脂質の合成を促進させることができる新規な蛋白質を見出した。本発明の新規な蛋白質は、本発明者らによりセリンクと名付けられた。さらに、神経回路の可塑・再生においてもセリンクｍＲＮＡの発現量が変化することを見出した。これらのことは、既存の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程においてセリンクの作用が必要であることを示唆しており、このことにより本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の通りである。【０００８】
本発明の請求の範囲第１項は、以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質である。：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。【０００９】
本発明の請求の範囲第２項は、以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載のＤＮＡである：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。【００１０】
本発明の請求の範囲第３項は、請求の範囲第２項記載のＤＮＡを含有する組換えベクターである。【００１１】
本発明の請求の範囲第４項は、請求の範囲第３項記載の組換えベクターを含む形質転換体である。【００１２】
本発明の請求の範囲第５項は、請求の範囲第４項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同等の機能を有する蛋白質を回収することを特徴とする前記蛋白質の製造方法である。【００１３】
本発明の請求の範囲第６項は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質に対する抗体である。【００１４】
本発明の請求の範囲第７項は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体である。【００１５】
本発明の請求の範囲第８項は、塩基配列が、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡの全部または一部に相補する配列であることを特徴とするアンチセンス核酸である。【００１６】
本発明の請求の範囲第９項は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法である。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程。
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の活性を測定する工程。
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。【００１７】
本発明の請求の範囲第１０項は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法である。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質を発現している細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記発現レベルを変化させる化合物を選択する工程。【００１８】
本発明の請求の範囲第１１項は、前記薬剤が、抗癌剤、細胞増殖制御剤又は神経回路再生剤のいずれか１つであることを特徴とする請求の範囲第８項または第９項に記載のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の請求の範囲第１項によれば、機能未知であったセリンク蛋白質ファミリーの性質や機能を明らかにすることにより、抗癌剤、腫瘍マーカー等を開発する上での手がかりとなる物質を提供することができる。【００２０】
本発明の請求の範囲第２項によれば、機能未知であったセリンク蛋白質ファミリーの性質や機能を明らかにすることにより、抗癌剤、腫瘍マーカー等を開発する上での手がかりとなる物質を提供することができる。【００２１】
本発明の請求の範囲第３項によれば、セリンク遺伝子を含有する組換えベクターを得たことにより、セリンク遺伝子を保持できる。【００２２】
本発明の請求の範囲第４項によれば、セリンク遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体を得たことにより、セリンク遺伝子を保持できる。【００２３】
本発明の請求の範囲第５項によれば、組換えセリンク蛋白質を生産することができる。【００２４】
本発明の請求の範囲第６項によれば、セリンク蛋白質に対する抗体を得たことにより、セリンクを特異的に認識することができる。これにより、新たな腫瘍マーカーとしての利用と癌に対する選択的な攻撃が可能となる。【００２５】
本発明の請求の範囲第７項によれば、新たな腫瘍マーカーとしての利用と癌に対する選択的な攻撃が可能となる。【００２６】
本発明の請求の範囲第８項によれば、アンチセンス核酸を得たことにより、セリンク蛋白質の活性を変化させることができる。【００２７】
本発明の請求の範囲第９項によれば、セリンクの活性を指標として、薬剤を効率的にスクリーニングできる。【００２８】
本発明の請求の範囲第１０項によれば、セリンクの発現量を指標として、薬剤を効率的にスクリーニングできる。【００２９】
本発明の請求の範囲第１１項によれば、請求の範囲第９項または第１０項において前記薬剤を抗癌剤、細胞増殖制御剤又は神経回路再生剤のいずれか１つとすることにより、抗癌剤、細胞増殖制御剤又は神経回路再生剤を効率的にスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ラットセリンクを用いた酵母２ハイブリッド実験を示した図である。プレイ（ｐｒｅｙ）としてＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２を用いたときとコントロールの実験結果を示す。
【図２】図２は、セリンク蛋白質ファミリーのアミノ酸配列のアライメントを示した図である。
【図３】図３は、薄層クロマトグラフィーを用いた［３Ｈ］フォスファチジールセリンと［３Ｈ］スフィンゴ脂質の分離解析を示した図である。図３Ａの左図は、ニンヒドリン染色によって検出したフォスファチジールセリン（ＰＳ）とフォスファチジールエタノールアミン（ＰＥ）である。図３Ｂのバンドは、３−ケトジハイドロスフィンゴシン（ＫＳ）である。
【図４】図４は、インサイツハイブリダイゼーションを用いたセリンク１、セリンク２、セリンク５のラット脳内ｍＲＮＡ分布と誘導の解析を示した図である。左の脳切片（Ｃ−ｓｉｄｅ）は正常ラットに由来し、右の脳切片（Ｓ−ｓｉｄｅ）はカイニン酸刺激を受けたラットに由来する。セリンクｍＲＮＡが変化している部位が→と＊で示されている。黒矢印はｍＲＮＡの増加を、白抜き矢印はｍＲＮＡの減少を示す。略号：ａｒｂ：小脳活樹、ｃｃ：脳りょう、ＣＡ：海馬ＣＡ領域、ｄｇ：海馬歯状回、ｅｃ：外包、ｇｃｌ：小脳顆粒細胞層、ｈｉｐ：海馬、ｎｅｏ：新皮質、ｐｃ：頭頂葉皮質、ｐｃｌ：小脳プルキンエ細胞層
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明について説明する。【００３２】
本発明は、セリン合成酵素と結合し細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する新規な蛋白質及びその利用方法に関する。【００３３】
（新規な蛋白質（セリンク蛋白質））本発明者は、癌細胞において発現が増加することが知られている未知遺伝子の１つが規定する哺乳類蛋白質の機能が、細胞膜の脂質合成においてアミノ酸セリンを取り込むことであることを発見し、前記蛋白質を「セリンク」と命名した（以下、セリン合成酵素と結合し細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をセリンクと称す）。セリンクは、複数のサブタイプをもち蛋白質ファミリーを形成するが、そのアミノ酸配列は既知の蛋白質との相同性を示さないという独特の構造を有する。ＮＣＢＩのデータベースサーチによって、哺乳動物セリンクのサブタイプとして、セリンク１、２、３、３Ｂ、４、４Ｂ、５が同定された（前述のＴＭＳ−１、ＴＭＳ−２、ＴＤＥ１、ＴＰＯ１は、それぞれセリンク３、セリンク１、セリンク３、セリンク５に相当する）。セリンクのアミノ酸配列は、配列番号１〜９のいずれか１に記載の配列で表される。すなわち、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるセリンクは、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質である。配列番号１〜９に記載のアミノ酸配列の各々の詳細については、実施例に示す。本発明の蛋白質は、真核生物の細胞または組織（例えば、癌細胞や神経細胞）から公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ペプチド合成法に準じて製造することもできる。【００３４】
（セリンクの機能）ラットのセリンク１とセリン合成酵素（ＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２）の相互作用に関して、酵母２ハイブリッド実験を実施したところ、セリンク１はそれぞれのセリン合成酵素と結合することが示された。また、セリンク１をＣＯＳ７細胞に発現させたところ、細胞膜の構成成分であるフォスファチジールセリンとスフィンゴ脂質の合成の活性が促進された。これらのことより、セリンクは、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有することが明らかとなった。【００３５】
さらに、カイニン酸を投与して、てんかん発作を人為的に生じさせたラットの脳において、セリンク１、２、５のｍＲＮＡの発現量変化を調べたところ、興奮性刺激により細胞可逆性が生じる海馬と大脳皮質においてセリンクｍＲＮＡの発現が大きく変化していた。このことより、神経活動により神経細胞回路が再構築される過程にセリンク蛋白質が作用することが明らかとなった。癌細胞、神経細胞といった多様な細胞での変化とその膜脂質合成促進作用は、多様な細胞が従来の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程においてセリンクが必要とされることを示唆している。このため、セリンクは癌の浸潤及び転移のメカニズムに関して新たに知見を与える。また、神経系においては、セリンクは神経細胞とグリア細胞の接触を制御して、新しい神経回路の形成と再生を促進するという新たな知見を与える。セリンクのこれらの機能より、セリンクの活性又は発現を制御する物質は、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤となりうることが示唆される。【００３６】
（セリンク変異体）ある酵素がその酵素活性を発揮するには、生来のアミノ酸配列の全てがそのまま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりアミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮することが知られている。したがって、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質を含む。これらはセリンク変異体とみなすことができる。セリンク変異体は、例えば、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失していてもよい。また、少なくとも１個のアミノ酸が付加していいてもよく、あるいは、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、セリンク変異体は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えば変異誘発剤を用いた突然変異誘発法やＰＣＲ等を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。【００３７】
（セリンクをコードするＤＮＡ）本発明は、セリンク遺伝子を提供する。セリンク遺伝子とは具体的には、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡのことである。【００３８】
さらに、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む。【００３９】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいい、例えば、温度が５０℃、塩濃度が５×ＳＳＣ（又はこれと同等の塩濃度）といった条件である。ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然のものでもよく、ＰＣＲ法等による人工的なものでもよい。例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング等により得ることができる。【００４０】
（セリンクをコードするＤＮＡの調整）本発明のＤＮＡを調整するために、まずｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングを行う。セリンクを発現している組織または細胞中のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成する。作製したｃＤＮＡライブラリーから放射性同位体で標識化したプローブ等を用いて目的のクローンを単離する。本発明のＤＮＡの一部をプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション等を行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。それぞれのクローンについてｃＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列分析装置を用いて分析することにより、前記ＤＮＡの塩基配列を決定する。それぞれのｃＤＮＡの塩基配列が新規な配列を有しているかどうかは、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどのデータベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子と比較することができる。ＤＮＡの塩基配列に基づいて蛋白質のアミノ酸配列を特定できる。また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを取得することもできる。これらの方法はいずれも当業者によく知られており、いずれの方法も用いることができる。【００４１】
（組換えベクター）本発明は、請求の範囲第２項記載のＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。本発明の請求の範囲第２項記載のＤＮＡを適当なベクターに挿入することにより、組換えベクターを得ることができる。そのようなベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスやバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。ベクターにＤＮＡを挿入するには、精製ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要に応じてその上流に転写を制御するプロモーター配列を付加し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。発現ベクターは適当な宿主に導入された時、目的ＤＮＡを発現するために、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー等を含有することが好ましい。これらの方法はいずれも当技術分野で既知である。【００４２】
（形質転換体）また、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞が挙げられる。従来から知られている方法に従って、組換えベクターで宿主細胞を形質転換させることができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに上記セリンク遺伝子を導入して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することができる。【００４３】
（製造方法）本発明は、請求の範囲第４項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同等の機能を有する蛋白質を回収することを特徴とする前記蛋白質の製造方法を提供する。セリンクをコードするＤＮＡを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主を培養し、常法に従って培養する。培養物もしくは菌体を水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵素含有水溶液が得られる。酵素含有液から酵素を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用いればよい。例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を組合せて使用することができる。なお、本発明は組換え法で得られる蛋白質のみならず、組織から単離精製された蛋白質、あるいはペプチド化学合成により製造されるものも包含する。【００４４】
（セリンクに対する抗体）本発明は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質に対する抗体を提供する。抗体は特定の分子を特異的に認識するため、分子のマーカーとなり得る。また、癌細胞等の特定の細胞又は分子を標的とすることができるため、標的細胞又は分子だけを攻撃する有効な医薬品となり得る。上記のように、セリンクが、癌細胞や神経細胞等の多様な細胞が従来の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程に関与していることが示されている。したがって、本発明の抗体は、新たな腫瘍マーカー及び癌選択的攻撃薬として用いることができる。【００４５】
また、本発明は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体を提供する。上記のようにセリンクは、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する。したがって、請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体は、セリンクのマーカーとなりうる。請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質としては、具体的には、スフィンゴ脂質、フォスファチジールセリン等が挙げられる。これら脂質に関しては以下の実施例で詳しく説明する。これら膜脂質の抗体も、請求の範囲第１項に記載の蛋白質に対する抗体同様に、新たな腫瘍マーカー及び癌選択的攻撃薬として用いることができる。【００４６】
請求の範囲第６項または第７項に記載の本発明のモノクローナル抗体を得るため、モノクローナル抗体産生細胞を作成する。まず、セリンク蛋白質、そのフラグメント又は膜脂質を含む抗原を用いて動物を免疫する。免疫は、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内に投与することにより行う。哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。【００４７】
抗原で免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物のミエローマ細胞との細胞融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。ミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。ミエローマ細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの動物のミエローマ細胞が挙げられる。細胞融合操作は、既知の方法に従って行う。例えば、動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば３：１）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在の下で、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により行うことにより、細胞融合を達成できる。細胞融合操作に関しては、例えば、以下の文献を参照できる（Kohler, G.; Milstein, C. (1975) Nature. 256:495-97）。【００４８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かでスクリーニングすることができる。このとき、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、免疫染色法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ等によってスクリーニングすることができる。例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。【００４９】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。樹立したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取するには、通常の細胞培養法等を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマを血清含有培地で培養し、その培養上清から抗体を取得する。抗体の精製が必要とされる場合は、既知の方法に従って精製ができる。例えば、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択することにより精製することができる。【００５０】
上記のモノクローナル抗体と同様に、当技術分野で既知の方法に従って、免疫した動物の免疫血清を採取することにより本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を製造することができる。本発明は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又の部分である断片を含む。【００５１】
請求の範囲第１項に記載の蛋白質又は請求の範囲第１項に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質を検出するための前記抗体を用いる方法としては、特に限定されず、従来から知られている方法を用いることができる。例えば、免疫染色法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ等があげられる。【００５２】
（アンチセンス核酸）本発明は、塩基配列が、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列であることを特徴とするアンチセンス核酸を提供する。ここで、アンチセンス核酸は、二本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖のＤＮＡ又はそのアンチセンス鎖のＤＮＡに対応するＲＮＡであって、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合し、セリンクの発現を調節するものを意味する。アンチセンス核酸によって、生体内において核酸レベルでのセリンク生合成を抑制できる。アンチセンス核酸は、当技術分野でよく知られており、公知の方法で製造することができる。天然のＤＮＡやＲＮＡでもよく、セリンクをコードするＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。【００５３】
（スクリーニング方法）本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程。
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の活性を測定する工程。
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。【００５４】
前記スクリーニング方法において、請求の範囲第１項に記載の蛋白質は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質が含まれていればよく、請求の範囲第１項に記載の蛋白質を発現している形質転換体も含む。【００５５】
前記活性は、セリン合成酵素と結合し、細胞膜の脂質合成においてアミノ酸セリンを取り込むというセリンクの性質に基づく。【００５６】
本発明の前記スクリーニング方法により、本発明の蛋白質の活性を変化させる化合物として単離される化合物は、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の治療薬の候補化合物となるものと期待される。【００５７】
本発明の上記スクリーニング方法は、請求の範囲第１項に記載の蛋白質と作用し、かつ前記蛋白質の活性を変化させる作用を有する物質が得られる方法であればいかなるものであってもよい。例えば、はじめに請求の範囲第１項に記載の蛋白質と被検化合物とを接触させ、前記蛋白質との結合活性を指標として選抜した後に、前記蛋白質の活性の変化を指標として被検化合物をさらに選抜する方法を用いることもできる。【００５８】
被検物質としては、請求の範囲第１項に記載の蛋白質と相互作用して、前記蛋白質の活性に影響を及ぼす可能性のある物質であればいかなるものであってもよい。具体的には、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。被検化合物と前記蛋白質との結合活性の解析法としては、従来から知られている方法を用いることができる。具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法が挙げられる。請求の範囲第１項に記載の蛋白質との結合活性を指標として選抜した後に、前記蛋白質の活性の変化を指標として解析することによって、被検化合物をさらに選択する解析することができる。例えば、細胞質の脂質合成においてアミノ酸セリンの取り込む活性を変化させる候補化合物を選択することにより、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の薬剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。セリンクが細胞質の脂質合成においてアミノ酸セリンの取り込む活性の解析法としては、下記の実施例で示すように、セリンクが、放射性同位体や蛍光色素等で標識したセリンを、細胞膜の脂質構成成分へ組み込むかどうかを評価する方法が挙げられる。【００５９】
また、本発明のスクリーニング方法においては、セリンクの発現レベルを指標とできる。すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を含む。
（ａ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質を発現している細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）請求の範囲第１項に記載の蛋白質の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記発現レベルを変化させる化合物を選択する工程。【００６０】
蛋白質の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、セリンクを発現する細胞からセリンクｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによってセリンクの遺伝子レベルでの測定を行うことができる。また、セリンクを発現する細胞からタンパク質画分を回収し、セリンクの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、セリンクの発現の測定を行うこともできる。さらに、セリンクに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、セリンクの発現の測定を行うことも可能である。前述のことより、セリンの発現量を変化させる候補化合物を選択することにより、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の薬剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。【００６１】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
（実験１：セリンク蛋白質の同定）
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてカイニン酸により刺激したラットの海馬から単離された５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。カイニン酸で刺激したラット及びカイニン酸で刺激をしていないラットの海馬からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの逆転写によって調整した［３２Ｐ］ｃＤＮＡを用いて上記ｃＤＮＡライブリーをスクリーニングした。カイニン酸で刺激したラット及びカイニン酸で刺激をしていないラットで異なって発現するｃＤＮＡの塩基配列の分析により、そのｃＤＮＡがコードされる機能未知蛋白質（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＤＱ１０３７０８）が同定されて、セリンク１（配列番号１）と名付けられた。【００６３】
次に、セリンク１をＮＣＢＩデータベースで検索を行った。セリンク１は、報告されている機能未知蛋白質ＴＤＥ１とＴＰＯ１と相同性をそれぞれ５８％と３８％示し、それぞれをセリンク３（配列番号３）とセリンク５（配列番号５）と名付けた。さらに、データベースによる検索でセリンク２（配列番号２）、セリンク３Ｂ（配列番号６）、セリンク４（配列番号４）、セリンク４Ｂ（配列番号７）が同定された。これらの蛋白質は３１％〜５８％の高い相同性を示し、セリンク蛋白質ファミリーを形成することが明らかとなった。また、上記セリンク４（配列番号）はマウス由来であるが、ヒト・セリンク４（配列番号８）が後に同定された。さらに、前述のように、酵母ＴＭＳ１（配列番号９）はセリンク蛋白質ファミリーに属していて、セリンク３に相当する。上記セリンクのＧｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒを以下に示す。セリンク１（配列番号１）：ＤＱ１０３７０８、セリンク２（配列番号２）：ＤＱ１０３７０９、セリンク３（配列番号３）：ＮＭ＿００６８１１、セリンク４（配列番号４）：ＢＣ０２６４５９、セリンク５（配列番号５）：ＤＱ１０３７１０、セリンク３Ｂ（配列番号６）：Ｕ４９１８８、セリンク４Ｂ（配列番号７）：ＡＫ０４４４７９、ヒト・セリンク４（配列番号８）：ＤＱ１０３７１１、酵母・セリンク３（ＴＭＳ１）（配列番号９）：ＮＰ＿０１０３９０。【００６４】
（実験２：ラットセリンクを用いた酵母２ハイブリッド実験）
実験：Sasakiらにより、Saccharomyces cervisiaeの約６０００の蛋白質の間の２ハイブリッド相互作用を調べるシステムが開発され、その解析がおこなわれた（Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., Hattori, M., and Sasaki, Y. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (8), 4569-74）。本発明者は、このシステムより、酵母のＴＭＳ１（酵母のセリンクファミリーのメンバー：配列番号９）が２つの酵母の蛋白質ＳＥＲ３とＹＧＰ１と相互作用することを見出した。ＳＥＲ３とＹＧＰ１は、セリンの生合成に関与し、セリン合成酵素として機能することが報告されている。このため、ＴＭＳ１は細胞内のセリン合成に関与していることが示唆された。【００６５】
哺乳動物のセリンクの機能を明らかとするため、ラットセリンク１（配列番号１）と上記蛋白質との相互作用に関して調べた。酵母の３蛋白質（ＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２）に対して、ラットセリンク１をベイト（ｂａｉｔ）として酵母２ハイブリッド実験をした。ここで、ＰＨＯ１２はＳＥＲ３に直接結合する酸性ホスファターゼである。酵母２ハイブリッド実験は、以下の文献の方法に修正を加えて行った（Cagney, G., Uetz, P., and Fields, S.(2000) Methods Enzymol 328, 3-14）。このとき、ＤＮＡ結合ドメインベクターであるｐＯＢＤ２と、Ｇａｌ４活性化ドメインベクターであるｐＯＡＤとを用いた。ｐＯＢＤ２−ラットセリンク１（ラットセリンク１をｐＯＢＤ２に導入したベクター）を、ＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２をＧａｌ４活性化蛋白質として発現する酵母株ＰＪ６９−４ａへ形質転換することによって、スクリーニングを行った。このとき、形質転換試薬としてＳ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた。トリプトファン・ロイシン欠失合成培地上に酵母懸濁液を画線し、３０℃で７日間インキュベートした。コロニーが生じた後、トリプトファン・ロイシン・ヒスチジン欠失合成培地上へコロニーを画線した。ｈｉｓ３・２ハイブリッドレポーター遺伝子を発現する細胞のみが前記培地上で成育できることより、２ハイブリッドによる活性を検出した。コントロールとして、Ｇａｌ４活性化蛋白質のみを発現する酵母株ＰＪ６９−４ａを用いた。成長速度を示すために、前記トリプトファン・ロイシン・ヒスチジン欠失合成培地で成育したコロニーを等量、前記培地に画線した。【００６６】
結果：ラットセリンクを用いた酵母２ハイブリッド実験の結果を図１に示す。ＳＥＲ３とＹＧＰ１ではコロニーの著しい成長が見られた。コントロールではコロニーが生じなかった。ＰＨＯ１２では弱いながらもコロニーの成長が見られた。このことより、ラットセリンク１はＳＥＲ３とＹＧＰ１に対して強い結合力、ＰＨＯ１２に対して弱い結合力を有することが示された。この結果は、ラットセリンク１は、酵母のセリンクファミリーのメンバーであるＴＭＳ１と同様に、セリン合成酵素へ特異的に結合をすることを示している。この結果により、セリンクがセリン合成酵素へ特異的に結合するという機能は、セリンクファミリーの異なるメンバー間で保存されていることが明らかになった。図２に、哺乳動物の５つのセリンクサブタイプ（セリンク１、２、３、４、５）と酵母ＴＭＳ１のアミノ酸配列のアライメントを示す。３つ以上の蛋白で保存されたアミノ酸残基が色付で表示され、膜貫通部位と予測される１１個の領域がＩ-ＸＩで表示される。【００６７】
（実験３：薄層クロマトグラフィーを用いた［３Ｈ］フォスファチジールセリンと［３Ｈ］スフィンゴ脂質の分離解析）
哺乳動物細胞においては、既存のリン脂質の頭部基がセリンに代わる塩基交換反応によって、細胞膜の構成成分であるフォスファチジールセリンが合成される。【００６８】
また、哺乳動物においては、フォスファチジールセリンと異なるスフィンゴ脂質も細胞膜の構成成分として知られている。セリン・パルミトイルトランスフェラーゼは、セリン・パルミトイルＣｏＡとセリンを縮合し、３−ケトジハイドロスフィンゴシン（ＫＳ）を生成する。３−ケトジハイドロスフィンゴシン（ＫＳ）の生成は、スフィンゴ脂質合成経路全体の速度を決定する律速段階である。【００６９】
実験３の目的は、セリンクが細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有することを確認することである。そのため、セリンクによる、［３Ｈ］セリンのフォスファチジールセリン及び３−ケトジハイドロスフィンゴシンへの組み込みを調べた。【００７０】
以下に実験３の方法を述べる。【００７１】
１０％ウシ胎仔血清を補填したＤＭＥＭ培地でＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ−７）細胞を培養した。８μｇのｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５ＤＥＳＴ−Ｓｅｒｉｎｃ１（ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５ＤＥＳＴにラットセリンク１遺伝子を導入したベクター）、空ベクター（インビトロジェン社製）を１０ｃｍ培養皿中の１×１０６のＣＯＳ７細胞中に遺伝子導入した。遺伝子導入の後、細胞を６０時間インキュベートし、アッセイバッファー２４０μｌで懸濁した。マイクロプローブを用いて氷上で懸濁した細胞０．２５ｍｌを１分間超音波処理した。【００７２】
塩基交換反応混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭの［３Ｈ］セリン（６０μＣｉ）及び所定の量の細胞破壊液を全量で０．３５ｍｌ含ませた。３７℃で２０分間インキュベートした後、１．５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１／２、ｖ／ｖ）を加えて反応をストップさせた。以下の文献のBlighとDyerの方法によって、リン脂質を抽出した（Bligh, E. G., and Dyer, W. J. (1959) Can J Biochem Physiol 37(8), 911-7）。【００７３】
セリン・パルミトイルトランスフェラーゼ反応混合物は、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５ｍＭのジチオスレイトール、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭの５−リン酸ピリドキサール、０．２ｍＭのパルミトイルＣｏＡ、１ｍＭの［３Ｈ］セリン（６０μＣｉ）及び所定の量の細胞破壊液を全量で０．３ｍｌ含ませた。３７℃で１０分間インキュベートした後、１．５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１／２、ｖ／ｖ）を加えて反応をストップさせた。２５μｇのスフィンガニンをキャリアーとして加え、以下の文献の方法によってリン脂質生成物を抽出した（Williams, R.D., Wang, E. and Merrill, A. H., Jr. (1984) Arch Biochem Biophys 228(1), 282-91）。【００７４】
上記の脂質抽出物を薄層クロマトグラフィーで分析した。【００７５】
まず、脂質抽出物を窒素下で乾燥し、クロロホルム／メタノール（２：１）中に溶解し、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  ＨＰＴＬＣ  プレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。フォスファチジールセリンのアッセイのとき、クロロホルム／メタノール／酢酸（６５／２５／１０）を用いて、薄層クロマトグラフィーにおいて脂質抽出物を展開した。３−ケトジハイドロスフィンゴシンのアッセイのとき、クロロホルム／メタノール／２ＮのＮＨ４ＯＨ（８０／２０／１）を用いて、薄層クロマトグラフィーにおいて脂質抽出物を展開した。放射性バンドを検出するため、０．４％２，５−ヂフェニルオキサゾールを含む２−メチルナフタレンでプレートを処理し、−８０℃で１〜４日間、Ｘ−ＯＭＡＴフィルムにさらした。各々のバンドの放射性活性を定量するため、シリカゲルを切り出し、Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒを用いて液体シンチレーション計測をした。
結果：図３Ａの左図は、ニンヒドリン染色によって検出したフォスファチジールセリン（ＰＳ）とフォスファチジールエタノールアミン（ＰＥ）である。図３Ａの右図は、［３Ｈ］で標識化されたセリンがフォスファチジールセリン（ＰＳ）へ取り込まれることを示している。図４は、［３Ｈ］で標識化されたセリンが３−ケトジハイドロスフィンゴシン（ＫＳ）へ取り込まれることを示している。【００７６】
図３より、セリンク１の発現によって、［３Ｈ］フォスファチジールセリンの合成が２．８倍に増加することが明らかになった。このことより、セリンク１の発現によって、フォスファチジールセリンの合成を促進することが示された。また、図３より、セリンク１の発現によって、［３Ｈ］セリンの３−ケトジハイドロスフィンゴシンへの組み込みを２．１倍以上増加させることが明らかになった。このことより、セリンク１の発現を増加させることによって、３−ケトジハイドロスフィンゴシンの生成を促進させることがわかった。３−ケトジハイドロスフィンゴシン生成はスフィンゴ脂質合成全体の律速段階であるので、セリンク１の発現を増加させることによって、スフィンゴ脂質の生合成を促進することが示された。【００７７】
（実験４：インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを用いたラットセリンク１、セリンク２、セリンク５のラット脳内ｍＲＮＡ分布と誘導解析）
実験：セリンクの制御に関する研究で成体ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を用いた。カイニン酸による刺激を以下のように行った：カイニン酸（体重１ｋｇにつき８ｍｇ）をラットの皮下に注入した。この３．５時間後に、大量のジエチルエーテル麻酔下で殺した。切り取った脳切片はドライアイス上に置いたプラスチックの型ですぐに凍結した。コントロール及び披験組織を同一の組織ブロックで凍結し、保存及びインサイツハイブリダイゼーションの過程で完全な同一条件となるよう配慮した。ゼラチンで被覆したスライドガラスへ凍結した１０μｍの厚さの切片をマウントし使用するまで−２０℃で乾燥させて保存した。以下の文献で記載されている方法に従って、３５Ｓでラベルされた３つのラットセリンク（セリンク１、２、５）のリボプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った（Ingi, T., and Aoki, Y. (2002) Eur J Neurosci 15(5), 929-36）。【００７８】
結果：カイニン酸を投与し、てんかん発作を人為的に生じさせたラットの脳を取り出して、セリンク１、２、５のｍＲＮＡの発現の変化を調べた。左の脳切片（Ｃ−ｓｉｄｅ）は正常ラットに由来し、右の脳切片（Ｓ−ｓｉｄｅ）はカイニン酸刺激を受けたラットに由来する。ｍＲＮＡ変化している部位が→と＊で示されている。また、黒矢印はｍＲＮＡの増加を、白抜き矢印はｍＲＮＡの減少を示す。その結果より、興奮性刺激により細胞可塑変化が生じる海馬と大脳皮質においてセリンクｍＲＮＡの発現が大きく変化していることが示された。神経細胞とグリア細胞ではそれぞれ増加と減少の逆方向にｍＲＮＡが変化している。この図より神経活動により神経細胞回路が可塑変化を起こし再構築される過程にセリンク蛋白質が作用することが示される。【００７９】
実験２〜実験４の結果より、セリンクはセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有することが明らかとなった。また、癌細胞の異常増殖だけでなく、神経細胞の新しい回路形成においてもセリンクｍＲＮＡ量の変化が見られることが明らかとなった。癌細胞、神経細胞といった多様な細胞での変化とその膜脂質合成促進作用が密接な関係があることは、幅広い細胞が従来の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程においてセリンク作用が必要とされることを示している。
【図１】
2007010651.tif 000002
【図２】
2007010651.tif 000003
【図３】
2007010651.tif 000004
【図４】
2007010651.tif 000005
【配列表】
2007010651000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月22日(2007.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加するスフィンゴ脂質に対する抗体。
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（Ａ）以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程、
（Ｂ）以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸セリンを取り込む活性を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
前記薬剤が神経回路再生剤であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
非特許文献４：Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｕｑｕｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏ，Ｎ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３（７），１４５９−６３．
非特許文献５：Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｗ．Ｈ．，Ｇｏｎｙｅ，Ｇ．Ｅ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｋ．Ｅ．，Ｋｕｍａｒ，Ｍ．，Ｓｐｏｅｒｅｌ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｓ．Ｅ．（１９９７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６９（４），１３４３−５５．
発明の開示
発明が解決しようとする課題
［０００４］
上述の非特許文献１〜５のような報告は、前記機能未知蛋白質ファミリーが細胞生理において多くの面で重要な機能を果たすことを示唆している。しかしながら、前記機能未知蛋白質は複数のサブタイプをもち、生物間で蛋白質ファミリーを構成していることが知られているが、既知の蛋白質との相同性を示さず、その機能も明らかになっていなかった。
［０００５］
また、これまでに知られている多くの抗癌剤の作用は、癌細胞のＤＮＡ合成、ＲＮＡへの転写、蛋白質への翻訳の各段階に作用するものであったが、癌細胞において発現が上昇する前記機能未知蛋白質は、新たな抗癌剤を開発する上での手がかりとなる物質となる可能性が示唆されていた。
［０００６］
そこで、本発明は、前記機能未知蛋白質ファミリーの機能を明らかにすることにより、癌に関する知見を得て、抗癌剤ならびに腫瘍マーカーを開発する上での手がかりとなる新規な蛋白質及びその利用方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［０００７］
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有し、膜脂質の合成を促進させることができる新規な蛋白質を見出した。本発明の新規な蛋白質は、本発明者らによりセリンクと名付けられた。さらに、神経回路の可塑・再生においてもセリンクｍＲＮＡの発現量が変化することを見出した。これらのことは、既存の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程においてセリンクの作用が必要であることを示唆しており、このことにより本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の通りである。
［０００８］
［０００９］
［００１０］
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
［００１１］
［００１２］
［００１３］
［００１４］
以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加するスフィンゴ脂質に対する抗体。
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。
［００１５］
［００１６］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（Ａ）以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程、
（Ｂ）以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸セリンを取り込む活性を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。
（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質。
［００１７］
［００１８］
前記薬剤が神経回路再生剤であることを特徴とするスクリーニング方法。
発明の効果
［００１９］
本発明によれば、機能未知であったセリンク蛋白質ファミリーの性質や機能を明らかにすることにより、抗癌剤、腫瘍マーカー等を開発する上での手がかりとなる物質を提供することができる。そして、セリンク蛋白質に対する抗体を得たことにより、セリンクを特異的に認識することができる。これにより、新たな腫瘍マーカーとしての利用と癌に対する選択的な攻撃が可能となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
［００２０］
［００２１］
［００２２］
［００２３］
［００２４］
［００２５］
［００２６］
［００２７］
また、本発明によれば、セリンクの活性を指標として、薬剤を効率的にスクリーニングできる。
［００２８］
［００２９］
さらに、本発明によれば、前記薬剤を神経回路再生剤とすることにより、神経回路再生剤を効率的にスクリーニングできる。
図面の簡単な説明
［００３０］
［図１］図１は、ラットセリンクを用いた酵母２ハイブリッド実験を示した図である。プレイ（ｐｒｅｙ）としてＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２を用いたときとコントロールの実験結果を示す。
［図２］図２は、セリンク蛋白質ファミリーのアミノ酸配列のアライメントを示した図である。
［図３］図３は、薄層クロマトグラフィーを用いた［３Ｈ］フォスファチジールセリンと［３Ｈ］スフィンゴ脂質の分離解析を示した図である。図３Ａの左図は、ニンヒドリン染色によって検出したフォスファチジールセリン（ＰＳ）とフォスファチジールエタノールアミン（ＰＥ）である。図３Ｂのバンドは、３−ケトジハイドロスフィンゴシン（ＫＳ）である。
［図４］図４は、インサイツハイブリダイゼーションを用いたセリンク１、セリンク２、セリンク５のラット脳内ｍＲＮＡ分布と誘導の解析を示した図である。左の脳切片（Ｃ−ｓｉｄｅ）は正常ラットに由来し、右の脳切片（Ｓ−ｓｉｄｅ）はカイニン酸刺激を受けたラットに由来する。セリンクｍＲＮＡが変化している部位が→と＊で示されている。黒矢印はｍＲＮＡの増加を、白抜き矢印はｍＲＮＡの減少を示す。略号：ａｒｂ：小脳活樹、
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
ｃｃ：脳りょう、ＣＡ：海馬ＣＡ領域、ｄｇ：海馬歯状回、ｅｃ：外包、ｇｃｌ：小脳顆粒細胞層、ｈｉｐ：海馬、ｎｅｏ：新皮質、ｐｃ：頭頂葉皮質、ｐｃｌ：小脳プルキンエ細胞層
発明を実施するための最良の形態
［００３１］
以下、本発明について説明する。
［００３２］
本発明は、セリン合成酵素と結合し細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する新規な蛋白質及びその利用方法に関する。
［００３３］
（新規な蛋白質（セリンク蛋白質））本発明者は、癌細胞において発現が増加することが知られている未知遺伝子の１つが規定する哺乳類蛋白質の機能が、細胞膜の脂質合成においてアミノ酸セリンを取り込むことであることを発見し、前記蛋白質を「セリンク」と命名した（以下、セリン合成酵素と結合し細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をセリンクと称す）。セリンクは、複数のサブタイプをもち蛋白質ファミリーを形成するが、そのアミノ酸配列は既知の蛋白質との相同性を示さないという独特の構造を有する。ＮＣＢＩのデータベースサーチによって、哺乳動物セリンクのサブタイプとして、セリンク１、２、３、３Ｂ、４、４Ｂ、５が同定された（前述のＴＭＳ−１、ＴＭＳ−２、ＴＤＥ１、ＴＰＯ１は、それぞれセリンク３、セリンク１、セリンク３、セリンク５に相当する）。セリンクのアミノ酸配列は、配列番号１〜９のいずれか１に記載の配列で表される。すなわち、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるセリンクは、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質である。配列番号１〜９に記載のアミノ酸配列の各々の詳細については、実施例に示す。本発明の蛋白質は、真核生物の細胞または組織（例えば、癌細胞や神経細胞）から公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ペプチド合成法に準じて製造することもできる。
［００３４］
（セリンクの機能）ラットのセリンク１とセリン合成酵素（ＳＥＲ３、ＹＧＰ１、ＰＨＯ１２）の相互作用に関して、酵母２ハイブリッド実験を実施したところ、セリンク１はそれぞれのセリン合成酵素と結合することが示された。また、セリンク１をＣＯＳ７細胞
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
に発現させたところ、細胞膜の構成成分であるフォスファチジールセリンとスフィンゴ脂質の合成の活性が促進された。これらのことより、セリンクは、セリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有することが明らかとなった。
［００３５］
さらに、カイニン酸を投与して、てんかん発作を人為的に生じさせたラットの脳において、セリンク１、２、５のｍＲＮＡの発現量変化を調べたところ、興奮性刺激により細胞可逆性が生じる海馬と大脳皮質においてセリンクｍＲＮＡの発現が大きく変化していた。このことより、神経活動により神経細胞回路が再構築される過程にセリンク蛋白質が作用することが明らかとなった。癌細胞、神経細胞といった多様な細胞での変化とその膜脂質合成促進作用は、多様な細胞が従来の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程においてセリンクが必要とされることを示唆している。このため、セリンクは癌の浸潤及び転移のメカニズムに関して新たに知見を与える。また、神経系においては、セリンクは神経細胞とグリア細胞の接触を制御して、新しい神経回路の形成と再生を促進するという新たな知見を与える。セリンクのこれらの機能より、セリンクの活性又は発現を制御する物質は、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤となりうることが示唆される。
［００３６］
（セリンク変異体）ある酵素がその酵素活性を発揮するには、生来のアミノ酸配列の全てがそのまま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりアミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮することが知られている。したがって、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質を含む。これらはセリンク変異体とみなすことができる。セリンク変異体は、例えば、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失していてもよい。また、少なくとも１個のアミノ酸が付加していいてもよく、あるいは、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、セリンク変異体は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
挙げられる。このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えば変異誘発剤を用いた突然変異誘発法やＰＣＲ等を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。
［００３７］
（セリンクをコードするＤＮＡ）本発明は、セリンク遺伝子を提供する。セリンク遺伝子とは具体的には、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡのことである。
［００３８］
さらに、本発明は、配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む。
［００３９］
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいい、例えば、温度が５０℃、塩濃度が５×ＳＳＣ（又はこれと同等の塩濃度）といった条件である。ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然のものでもよく、ＰＣＲ法等による人工的なものでもよい。例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング等により得ることができる。
［００４０］
（セリンクをコードするＤＮＡの調整）本発明のＤＮＡを調整するために、まずｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングを行う。セリンクを発現している組織または細胞中のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成する。作製したｃＤＮＡライブラリーから放射性同位体で標識化したプローブ等を用いて目的のクローンを単離する。本発明のＤＮＡの一部をプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション等を行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。それぞれのクローンについてｃＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列分析装置を用いて分析することにより、前記ＤＮＡの塩基配列を決定する。それぞれのｃＤＮＡの塩基配列が新規な配列を有しているかどうかは、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどのデータベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子と比較することができる。Ｄ
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ＮＡの塩基配列に基づいて蛋白質のアミノ酸配列を特定できる。また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを取得することもできる。これらの方法はいずれも当業者によく知られており、いずれの方法も用いることができる。
［００４１］
（組換えベクター）本発明は、（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。上記のいずれかのＤＮＡを適当なベクターに挿入することにより、組換えベクターを得ることができる。そのようなベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスやバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。ベクターにＤＮＡを挿入するには、精製ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要に応じてその上流に転写を制御するプロモーター配列を付加し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。発現ベクターは適当な宿主に導入された時、目的ＤＮＡを発現するために、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー等を含有することが好ましい。これらの方法はいずれも当技術分野で既知である。
［００４２］
（形質転換体）また、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞が挙げられる。従来から知られている方法に従って、組換えベクターで宿主細胞を形質転換させることができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに上記セリンク遺伝子を導入して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することができる。
［００４３］
（製造方法）本発明は、上記の形質転換体を培養し、得られる培養物から（ａ）配列番
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列で表される蛋白質と同等の機能を有する蛋白質を回収することを特徴とする前記蛋白質の製造方法を提供する。セリンクをコードするＤＮＡを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主を培養し、常法に従って培養する。培養物もしくは菌体を水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵素含有水溶液が得られる。酵素含有液から酵素を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用いればよい。例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を組合せて使用することができる。なお、本発明は組換え法で得られる蛋白質のみならず、組織から単離精製された蛋白質、あるいはペプチド化学合成により製造されるものも包含する。
［００４４］
（セリンクに対する抗体）本発明は、（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質に対する抗体を提供する。抗体は特定の分子を特異的に認識するため、分子のマーカーとなり得る。また、癌細胞等の特定の細胞又は分子を標的とすることができるため、標的細胞又は分子だけを攻撃する有効な医薬品となり得る。上記のように、セリンクが、癌細胞や神経細胞等の多様な細胞が従来の細胞間連携を脱して新たな細胞間膜結合を構築する過程に関与していることが示されている。したがって、本発明の抗体は、新たな腫瘍マーカー及び癌選択的攻撃薬として用いることができる。
［００４５］
また、本発明は、（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体を提供する。上記のようにセリンクは、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する。したがって、上記の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対する抗体
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
は、セリンクのマーカーとなりうる。上記の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質としては、具体的には、スフィンゴ脂質、フォスファチジールセリン等が挙げられる。これら脂質に関しては以下の実施例で詳しく説明する。これら膜脂質の抗体も、上記の蛋白質に対する抗体同様に、新たな腫瘍マーカー及び癌選択的攻撃薬として用いることができる。
［００４６］
上記の蛋白質に対するモノクローナル抗体、又は、上記の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質に対するモノクローナル抗体を得るため、モノクローナル抗体産生細胞を作成する。まず、セリンク蛋白質、そのフラグメント又は膜脂質を含む抗原を用いて動物を免疫する。免疫は、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内に投与することにより行う。哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。
［００４７］
抗原で免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物のミエローマ細胞との細胞融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。ミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。ミエローマ細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの動物のミエローマ細胞が挙げられる。細胞融合操作は、既知の方法に従って行う。例えば、動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば３：１）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在の下で、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により行うことにより、細胞融合を達成できる。細胞融合操作に関しては、例えば、以下の文献を参照できる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−９７）。
［００４８］
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かでスクリーニングすることができる。このとき、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、免疫染色法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ等によってスクリーニングすることができる。例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
［００４９］
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。樹立したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取するには、通常の細胞培養法等を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマを血清含有培地で培養し、その培養上清から抗体を取得する。抗体の精製が必要とされる場合は、既知の方法に従って精製ができる。例えば、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択することにより精製することができる。
［００５０］
上記のモノクローナル抗体と同様に、当技術分野で既知の方法に従って、免疫した動物の免疫血清を採取することにより本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を製造することができる。本発明は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又の部分である断片を含む。
［００５１］
上記の蛋白質又は上記の蛋白質が細胞膜に発現した際に増加する膜脂質を検出するための前記抗体を用いる方法としては、特に限定されず、従来から知られている方法を用いることができる。例えば、免疫染色法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ等があげられる。
［００５２］
（アンチセンス核酸）本発明は、塩基配列が、（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列であることを特徴とするアンチセンス核酸を提供する。ここで、アンチセンス核酸は、二本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖のＤＮＡ又はそのアンチセンス鎖のＤＮＡに対応するＲＮＡであって、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合し、セリンクの発現を調節するものを意味する。アンチセンス核酸によって、生体内において核酸レ
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ベルでのセリンク生合成を抑制できる。アンチセンス核酸は、当技術分野でよく知られており、公知の方法で製造することができる。天然のＤＮＡやＲＮＡでもよく、セリンクをコードするＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。
［００５３］
（スクリーニング方法）本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
（Ａ）（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質と被検化合物を接触させる工程。
（Ｂ）上記のいずれかの蛋白質の活性を測定する工程。
（Ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を変化させる化合物を選択する工程。
［００５４］
前記スクリーニング方法において、上記の蛋白質は、上記のいずれかの蛋白質が含まれていればよく、上記のいずれかの蛋白質を発現している形質転換体も含む。
［００５５］
前記活性は、セリン合成酵素と結合し、細胞膜の脂質合成においてアミノ酸セリンを取り込むというセリンクの性質に基づく。
［００５６］
本発明の前記スクリーニング方法により、本発明の蛋白質の活性を変化させる化合物として単離される化合物は、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の治療薬の候補化合物となるものと期待される。
［００５７］
本発明の上記スクリーニング方法は、上記の蛋白質と作用し、かつ前記蛋白質の活性を変化させる作用を有する物質が得られる方法であればいかなるものであってもよい。例えば、はじめに上記の蛋白質と被検化合物とを接触させ、前記蛋白質との結合活性を指標として選抜した後に、前記蛋白質の活性の変化を指標として被検化合物をさらに選抜する方法を用いることもできる。
［００５８］
被検物質としては、上記の蛋白質と相互作用して、前記蛋白質の活性に影響を及ぼす可能性のある物質であればいかなるものであってもよい。具体的には、例えば、ペプチド、
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
蛋白質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。被検化合物と前記蛋白質との結合活性の解析法としては、従来から知られている方法を用いることができる。具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法が挙げられる。上記の蛋白質との結合活性を指標として選抜した後に、前記蛋白質の活性の変化を指標として解析することによって、被検化合物をさらに選択する解析することができる。例えば、細胞質の脂質合成においてアミノ酸セリンの取り込む活性を変化させる候補化合物を選択することにより、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の薬剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。セリンクが細胞質の脂質合成においてアミノ酸セリンの取り込む活性の解析法としては、下記の実施例で示すように、セリンクが、放射性同位体や蛍光色素等で標識したセリンを、細胞膜の脂質構成成分へ組み込むかどうかを評価する方法が挙げられる。
［００５９］
また、本発明のスクリーニング方法においては、セリンクの発現レベルを指標とできる。すなわち、本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を含む。
（Ａ）（ａ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、（ｂ）配列番号１〜９のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリン合成酵素と結合し、細胞膜にアミノ酸セリンを取り込むことにより膜脂質合成を増大させる機能を有する蛋白質を発現している細胞に、被検化合物を接触させる工程
（Ｂ）上記のいずれかの蛋白質の発現レベルを測定する工程
（Ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記発現レベルを変化させる化合物を選択する工程。
［００６０］
蛋白質の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、セリンクを発現する細胞からセリンクｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによってセリンクの遺伝子レベルでの測定を行うことができる。また、セリンクを発現する細胞からタンパク質画分を回収し、セリンクの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
出することにより、セリンクの発現の測定を行うこともできる。さらに、セリンクに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、セリンクの発現の測定を行うことも可能である。前述のことより、セリンの発現量を変化させる候補化合物を選択することにより、抗癌剤、細胞増殖制御剤、神経回路再生剤等の薬剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
［００６１］
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例
［００６２］
（実験１：セリンク蛋白質の同定）
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてカイニン酸により刺激したラットの海馬から単離された５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。カイニン酸で刺激したラット及びカイニン酸で刺激をしていないラットの海馬からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの逆転写によって調整した［３２Ｐ］ｃＤＮＡを用いて上記ｃＤＮＡライブリーをスクリーニングした。カイニン酸で刺激したラット及びカイニン酸で刺激をしていないラットで異なって発現するｃＤＮＡの塩基配列の分析により、そのｃＤＮＡがコードされる機能未知蛋白質（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＤＱ１０３
【国際調査報告】
2007010651.tif 000006
2007010651.tif 000007
2007010651.tif 000008
2007010651.tif 000009
2007010651.tif 000010