(57)【要約】本発明はＧＰＶＩに対する抗体を産生するマウスハイブリドーマを多数樹立し、それらの産生する抗体を組み合わせることで、血漿中に存在するｓＧＰＶＩを簡便かつ高感度で測定する方法を提供する。これにより、新規な血小板活性化マーカー、その測定試薬及び方法、ならびに血小板活性化／血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの新規用途が提供される。
2007116779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を用いる、ヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の測定方法。
【請求項２】
測定感度が３０ｐｇ／ｍｌ以下である、請求項１の測定方法。
【請求項３】
ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのループ２またはループ９に特異的に結合する抗体である、請求項１又は２の測定方法。
【請求項４】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、結合部位の異なる２以上の抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、請求項１ないし３の何れかの測定方法。
【請求項５】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、少なくともＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体及びドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、請求項４の測定方法。
【請求項６】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体及びループ９に特異的に結合する抗体を用いる、請求項４または５の測定方法。
【請求項７】
サンドイッチ免疫測定方法である、請求項３ないし６の何れかの測定方法。
【請求項８】
１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用の試薬又はキット。
【請求項９】
測定感度が３０ｐｇ／ｍｌ以下である、請求項８の試薬又はキット。
【請求項１０】
ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのループ２またはループ９に特異的に結合する抗体である、請求項８又は９の試薬又はキット。
【請求項１１】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、結合部位の異なる２以上の抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、請求項８ないし１０の何れかの試薬又はキット。
【請求項１２】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、少なくともＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体抗体及びドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、請求項８ないし１１の何れかの試薬又はキット。
【請求項１３】
ＧＰＶＩ特異的結合物質として、ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体及びループ９に特異的に結合する抗体を含有する、請求項８ないし１２の何れかの試薬又はキット。
【請求項１４】
サンドイッチ免疫測定法に用いる、請求項８ないし１３何れかの試薬又はキット。
【請求項１５】
請求項１ないし１４の何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量するための方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１４の何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法。
【請求項１７】
前記疾患が血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患である、請求項１６の診断方法。
【請求項１８】
前記疾患が狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１６又は１７の診断方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１４の何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、コラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬が奏効する患者の選別方法。
【請求項２０】
前記抗血小板薬が抗ＧＰＶＩ抗体又はＧＰＶＩ−Ｆｃである、請求項１９の選別方法。
【請求項２１】
前記患者の疑われる疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患である、請求項１９又は２０の選別方法。
【請求項２２】
前記患者の疑われる疾患が血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患である、請求項１９ないし２１の何れかの選別方法。
【請求項２３】
前記患者の疑われる疾患が狭心症、急性心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１９ないし２２の何れかの選別方法。
【請求項２４】
請求項１ないし１４の何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、コラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の投与時期を決定する方法。
【請求項２５】
請求項１ないし１４の何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、コラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の治療効果もしくは副作用発現の予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法。
【請求項２６】
１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、請求項１５ないし２５の何れかの方法のための試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な血小板活性化マーカー、その測定試薬及び方法、ならびに血小板活性化／血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の死亡原因第一位は悪性新生物、第二位は心疾患、第三位は脳血管疾患である。そして、心疾患と脳血管疾患の大部分は心筋梗塞や脳梗塞などの血栓症が占めており、この両者を合わせると、癌での死亡に匹敵する。それ故、血栓症の予防・治療は、大きな問題点として残されている。そして、血栓症の予防・治療においては、血小板活性をコントロールすることが重要であり、抗血小板薬が積極的に処方されている。しかしながら、その臨床効果は決して満足できるレベルには達していない。【０００３】
血小板の機能は、損傷を受けた血管部位の内皮下組織に結合する粘着反応と、血小板同士がくっつき合う凝集反応の２つにわけられる。特に、後者は血小板に含まれている顆粒の内容物の放出を伴っている。また、血小板の活性化の過程において、様々な分子がその機能発現に関与しており、これらは血小板活性化マーカーとして利用されている。そして、このマーカーを有効に活用することにより、病的血栓に対する診断がより明確となるうえ、治療法に関しても、より適切な選択が可能となる。【０００４】
従来、血小板の活性化の指標として、血小板のα顆粒に蓄積されているβトロンボグロブリンや血小板第４因子の測定が行われてきた。しかしながら、これらは腎機能低下時に高値となる点や、採血手技の影響などを考慮する必要があり、必ずしも適切なマーカーとは言いがたい。また、βトロンボグロブリンや血小板第４因子がともに高値の場合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血小板活性化による変化である可能性が高いので注意が必要である。したがって、より高感度で特異性の高い血小板活性化マーカーの登場が望まれていた。【０００５】
近年、血小板活性化マーカーとして、Ｐセレクチンの検出が利用されつつある（Ｓｈａｔｔｉｌ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ．、１９８７年、７０巻、ｐ．３０７−３１５）（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｔ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９６年、２６巻、ｐ．９９６−１００３）。Ｐセレクチンは、血小板のα顆粒膜あるいは血管内皮細胞のＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ小体に存在する膜タンパク質であり、これらの細胞が刺激を受けた際に、細胞表面に移動してくる。現在、Ｐセレクチンは膜結合型と可溶型の２種類のタイプに分類されている。そして、膜結合型のＰセレクチンは、蛍光標識した抗Ｐセレクチン抗体とフローサイトメトリーを用いて、直接的に検出される。しかしながら、血小板におけるＰセレクチンの発現は、試料の取り扱いにより擬陽性となることがあり、安定した結果を得ることは難しい。一方、可溶型Ｐセレクチンは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法にて検出が可能である。しかしながら、Ｐセレクチンは血小板と血管内皮細胞に由来することから、血漿中の可溶性Ｐセレクチンを測定する場合、その由来が問題となる。【０００６】
血小板が種々の状況下で活性化されたり、物理的な刺激を受けると、微小な膜小胞体が生成され、この膜小胞体はマイクロパーティクルと呼ばれている。血小板マイクロパーティクルはフローサイトメトリーを用いて測定するのが一般的であり、様々な血栓性疾患の病態把握において重要であるが、（１）機器間の感度の違い、（２）マイクロパーティクル領域のゲートの囲み方、（３）測定限界がマイクロパーティクルのサイズと近いこと、（４）使用する抗体の種類による施設間差などの問題点が指摘されており、測定方法の標準化は達成されていない。【０００７】
血小板膜上に存在する糖蛋白質ＶＩ（ＧＰＶＩ）は、血小板のコラーゲン受容体であり、コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていることが明らかにされている（高山博史，日本血栓止血学会誌，２００３年，第１４巻，第２号，ｐ．７５−８１参照）。また、抗マウスＧＰＶＩ抗体は、コラーゲン刺激特異的に血小板凝集を抑制し、出血時間の著明な延長をきたすことなく、抗血栓作用を発揮することが報告されている（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９４巻、第４号、ｐ．４５９−４６９参照）。さらに、抗ヒトＧＰＶＩ抗体も出血時間の著明な延長をきたすことなく、抗血小板作用を発揮することが報告されている（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年、第１０６巻、第１１号、ｐ６１２ａ）（ＷＯ２００５／１１１０８３Ａ２）。したがって、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する薬物、例えば抗ＧＰＶＩ抗体は、安全で有効性の高い抗血小板薬となり得ることが期待されている。【０００８】
血小板に存在しているＧＰＶＩを、ウエスタンブロッティングで検出できることが報告されている（Ｔｓｕｊｉ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年第２７２巻３８号ｐ．２３５２８−２３５３１）。また、抗ＧＰＶＩ抗体を血小板に添加すると、ＧＰＶＩがｓｈｅｄｄｉｎｇし、培養上清中に可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）が出現することがウエスタンブロッティングにより証明されている（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  Ｗ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４年、第９１巻、ｐ．９５１−９５８）。このｓＧＰＶＩのｓｈｅｄｄｉｎｇはメタロプロテアーゼの作用によるものと示唆されている。しかしながら、これらの現象は生体外において生理的にはほとんど起こりえない条件下で人為的に惹起されたものであり、実際に生体内において、生理的又は病態下において、血小板ＧＰＶＩのｓｈｅｄｄｉｎｇが生じているかは全く不明であった。また、ウエスタンブロッティングによる血小板ＧＰＶＩならびにｓＧＰＶＩの検出自体は、検査に供する試料の調製および検出感度等、臨床の場において一般化するのには問題が多い。さらに、血小板表面のＧＰＶＩの存在量は血小板１個あたり約３０００個と極めて微量と推定されている。したがって、血栓・塞栓症等の診断を目的とした場合、より簡便で特異性及び検出感度の高い検査方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００９】
このように、血小板活性化／血管内皮傷害関連疾患、例えば血栓症等の診断および抗血小板薬のレスポンダーを選別する際において、信頼性の高い血小板活性化のバイオマーカー、及び、簡便で、感度が高く、安定した結果が得られる当該バイオマーカーの測定方法又は診断方法、並びにそれらのための試薬又はキットが切望されている。
【００１０】
本発明の目的は、新規な血小板活性化マーカー、その測定試薬及び方法、ならびに血小板活性化／血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの新規用途を提供するものである。
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ＧＰＶＩに対する抗体を産生するマウスハイブリドーマを多数樹立し、それらの産生する抗体を組み合わせることで、血漿中に存在するｓＧＰＶＩを簡便かつ高感度で測定することを着想した。この着想に基づき、鋭意研究を重ねた結果、血小板膜上に存在するＧＰＶＩ（以下、ｍＧＰＶＩと記載することがある）ならびに体液中に存在する可溶型ＧＰＶＩ（以下、ｓＧＰＶＩと記載することがある）を特異的かつ高感度で測定する方法を確立することに成功するとともに、これが血小板活性化マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
以下に本発明を説明する。
本発明の第１の態様は、
（１）１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を用いる、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩの測定方法、好ましくは、
（１ａ）１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を用いる、体液、特にヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の測定方法、
（１ｂ）測定感度が１００ｐｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３．０ｐｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１．０ｐｇ／ｍｌ以下である、上記何れかの測定方法、
（１−１）ＧＰＶＩ特異的結合物質が抗ＧＰＶＩ抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−１ａ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのドメイン１、好ましくは、ループ２又はループ５、より好ましくはループ２に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−１ｂ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのドメイン２、好ましくは、ループ９又はループ１１、より好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−１ｃ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのループ２またはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−２）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、結合部位の異なる２以上の抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、上記何れかの測定方法、
（１−３）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、少なくともＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体及び／又はドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、上記何れかの測定方法、
（１−３ａ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５、好ましくはループ２に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−３ｂ）前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１、好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−３ｃ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５、好ましくはループ２に特異的に結合する抗体であり、かつ、前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１、好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−４）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体及び／又はループ９に特異的に結合する抗体を用いる、上記何れかの測定方法、
（１−４ａ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体としてを用いる、上記何れかの測定方法、
（１−４ｂ）少なくともＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として用いる、上記何れかの測定方法、
（１−４ｃ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として、及び、ループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として用いる、上記何れかの測定方法、
（１−４ｄ）サンドイッチ免疫測定法である、上記何れかの測定方法、
（１−４ｅ）非固相化抗体がＦ（ａｂ’）２である、上記何れかの測定方法、
（１−４ｆ）ビオチン化非固相化抗体及びｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する系を用いる、上記何れかの測定方法、
（１−４ｇ）前記ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−１０−２抗体である、または、前記ＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−７−１抗体である、上記何れかの測定方法、
（１−５）少なくともＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体及び／又はドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、体液中、特にヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−５ａ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−５ｂ）前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−５ｃ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５に特異的に結合する抗体であり、かつ、前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−６）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体及び／又はループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を用いる、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−６ａ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体としてを用いる、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−６ｂ）少なくともＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として用いる、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−６ｃ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として、及び、ループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として用いる、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定方法、
（１−６ｄ）サンドイッチ免疫測定法である、上記何れかの測定方法、
（１−６ｅ）非固相化抗体がＦ（ａｂ’）２である、上記何れかの測定方法、
（１−６ｆ）ビオチン化非固相化抗体及びｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する系を用いる、上記何れかの測定方法、
（１−６ｇ）前記ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−１０−２抗体である、または、前記ＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−７−１抗体である、上記何れかの測定方法、である。
本発明の第２の態様は、
（２）１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩの測定試薬又はキット、好ましくは、
（２ａ）１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、体液、特にヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２ｂ）測定感度が１００ｐｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３．０ｐｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１．０ｐｇ／ｍｌ以下である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−１）ＧＰＶＩ特異的結合物質が抗ＧＰＶＩ抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−１ａ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのドメイン１、好ましくは、ループ２又はループ５、より好ましくはループ２に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−１ｂ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのドメイン２、好ましくは、ループ９又はループ１１、より好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−１ｃ）ＧＰＶＩ特異的結合物質がＧＰＶＩのループ２またはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−２）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、結合部位の異なる２以上の抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−３）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体及びドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−３ａ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５、好ましくはループ２に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−３ｂ）前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１、好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−３ｃ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５、好ましくはループ２に特異的に結合する抗体であり、かつ、前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１、好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４）ＧＰＶＩ特異的結合物質として、ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体及びループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ａ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｂ）少なくともＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｃ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として、及び、ループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｄ）サンドイッチ免疫測定法に用いる、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｅ）非固相化抗体がＦ（ａｂ’）２である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｆ）ビオチン化非固相化抗体及びｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−４ｇ）前記ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−１０−２抗体である、または、前記ＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−７−１抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−５）少なくともＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗体及び／又はドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、体液中、特にヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−５ａ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−５ｂ）前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−５ｃ）前記ＧＰＶＩのドメイン１に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ２又はループ５に特異的に結合する抗体であり、かつ、前記ＧＰＶＩのドメイン２に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体がＧＰＶＩのループ９又はループ１１に特異的に結合する抗体である、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−６）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体及び／又はループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を含有する、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−６ａ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体としてを含有する、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−６ｂ）少なくともＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として含有する、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−６ｃ）少なくともＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として、及び、ループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として含有する、上記何れかのｓＧＰＶＩの測定試薬又はキット、
（２−６ｄ）サンドイッチ免疫測定法に用いる、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−６ｅ）非固相化抗体がＦ（ａｂ’）２である、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−６ｆ）ビオチン化非固相化抗体及びｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含有する、上記何れかの測定試薬又はキット、
（２−６ｇ）前記ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−１０−２抗体である、または、前記ＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗体がＦ１２３２−７−１抗体である、上記何れかの測定試薬又はキット、である。
本発明の第３の態様は、
（３）ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩからなる血小板活性化マーカー、である。
本発明の第４の態様は、
（４）血小板活性化マーカーとしてのｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩの使用、である。
本発明の第５の態様は、
（５）試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量するための方法、又はそれらの判定方法もしくは評価方法、
（５−１）上記何れかのＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩ、より好ましくはヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量するための方法、又はそれらの判定方法もしくは評価方法、である。
本発明の第６の態様は、
（６）試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法、罹病性の判定方法又は発症リスクの評価方法、
（６−１）上記何れかのＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩ、より好ましくはヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法、罹病性の判定方法又は発症リスクの評価方法、
（６−２）前記疾患が、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、上記何れかの診断方法、罹病性の判定方法又は発症リスクの評価方法、である。
本発明の第７の態様は、
（７）試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、より好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体が奏効（著効）する患者の選別方法、
（７−１）上記何れかのＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、試料中のＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩ、より好ましくはヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、より好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体又はＧＰＶＩ−Ｆｃが奏効する患者の選別方法、
（７−２）前記患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、上記何れかの選別方法、である。
本発明の第８の態様は、
（８）試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の投与（開始）時期を決定する方法、
（８−１）上記何れかのＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩ、より好ましくはヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ＧＰＶＩ、特にｓＧＰＶＩ、より好ましくはヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記決定方法、
（８−２）前記薬剤を投与する患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、上記何れかの決定方法、である。
本発明の第９の態様は、
（９）試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の治療効果もしくは副作用発現の予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法、
（９−１）上記ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法、
（９−２）前記患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、上記何れかの予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法、である。
本発明の第１０の態様は、
（１０）１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、前記本発明第５ないし９の態様の何れかの方法のための試薬又はキット、である。
本発明の第１１の態様は、
（１１）上記診断方法又は選別方法によって、診断又は選別された患者に抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬を投与することを特徴とする疾患の予防又は治療方法、
（１１−１）上記診断方法又は選別方法によって、診断又は選別された患者に抗ＧＰＶＩ抗体又はＧＰＶＩ−Ｆｃ、好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体を投与することを特徴とする疾患の予防又は治療方法、
（１１−２）前記疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆から選ばれるいずれかである、上記何れかの予防又は治療方法、である。
本発明の第１２の態様は、
（１２）上記診断方法又は選別方法によって、診断又は選別された患者の疾患を予防又は治療するための、抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬を含有することを特徴とする薬剤、
（１２−１）上記診断方法又は選別方法によって、診断又は選別された患者の疾患を予防又は治療するための、抗ＧＰＶＩ抗体又はＧＰＶＩ−Ｆｃ、好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体を含有することを特徴とする薬剤、
（１２−２）前記疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、より好ましくは狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、上記何れかの薬剤、
である。
【００１３】
本発明の測定方法、測定試薬またはキットにより、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩが高感度に測定しうる。
また、本発明の測定方法、測定試薬またはキットを用いて、ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量することにより、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定、定量、判定もしくは評価、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断、罹病性の判定もしくは発症リスクの評価、抗血小板薬、特に抗ＧＰＶＩ抗体の奏効する患者の選別、それらの投与（開始）時期の決定、及び、それらの治療効果もしくは副作用発現の予測、モニタリングもしくは予後の判定等が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１は、ラットＧＰＶＩ遺伝子の塩基配列を示す。
図２は、ヒト及びラットＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメントならびに各ドメイン及び各ループ（Ｌ１〜Ｌ１４）の位置を示す。
図３は、ヒト及びマウスＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメントならびに各ドメイン及び各ループ（Ｌ１〜Ｌ１４）の位置を示す。
図４は、リコンビナントｒＧＰＶＩ−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図５は、Ｆ１２３９−６−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図６は、抗ラットＧＰＶＩ抗体の認識領域の解析の結果を示す。
図７は、ラット可溶型ＧＰＶＩ  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。
図８は、ヒト可溶型ＧＰＶＩ  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。
図９は、ラット血小板膜上のＧＰＶＩフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図１０は、ラット血小板インビトロｓｈｅｄｄｉｎｇサンプルにおける上清中の可溶型ＧＰＶＩ濃度を示す。
図１１は、サル血小板膜上のＧＰＶＩフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図１２は、サル血小板のＧＰＶＩウェスタン解析の結果を示す。
図１３は、サル血小板インビトロｓｈｅｄｄｉｎｇサンプルにおける上清中の可溶型ＧＰＶＩ濃度を示す。
図１４は、ヒト血小板のＧＰＶＩフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図１５は、ヒト血小板のＧＰＶＩウェスタン解析の結果を示す。
図１６は、ヒト血小板インビトロｓｈｅｄｄｉｎｇサンプルにおける上清中の可溶型ＧＰＶＩ濃度を示す。
図１７は、ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物を用いた実験結果を示す。
図１８（Ａ）は、コラーゲン惹起血栓モデル動物を用いた３０分後の実験結果を示す。
図１８（Ｂ）は、コラーゲン惹起血栓モデル動物を用いた１５分後の実験結果を示す。
図１９（Ａ）は、バルーンカテーテル血管内膜傷害モデルを用いた、血漿中可溶型ＧＰＶＩ量等の測定の実験結果を示す。
図１９（Ｂ）は、バルーンカテーテル血管内膜傷害モデルを用いた、抗ＧＰＶＩ抗体の効果を示す。
図２０は、ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における尿中の可溶型ＧＰＶＩの変化を示す。
図２１は、各種ヒト病態血漿の可溶型ＧＰＶＩの量を示す。
図２２は、ヒト血小板のＧＰＶＩウェスタン解析の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明において、測定対象であるＧＰＶＩの由来動物種は特に限定されず、哺乳類、例えば、マウス、ラット及びサルであるが、好ましくはヒトＧＰＶＩである。これらのＧＰＶＩのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知であり、マウス、ラット及びヒトＧＰＶＩのアミノ酸配列は図１〜３に示されている。ｍＧＰＶＩは膜貫通蛋白質として血小板表面に存在し、通常、全長のＧＰＶＩ分子であり、上述のアミノ酸配列からなる。ｓＧＰＶＩは、血小板から何らかの原因により遊離したものであるが、酵素、特に血小板由来の酵素、好ましくは、プロテアーゼ、より好ましくはメタロプロテアーゼにより切断されて可溶型となったものと考えられる。その分子量は、例えば、実施例で示されるように、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上約５５ｋｄであり、抗ＧＰＶＩ抗体を用いてウェスタンブロッティング等で検出可能である。
本発明において試料（以下、検体と記載することがある）、特に生体試料は、必ずしも限定されず、体液、細胞又は組織が含まれ、体液としては、例えば、血液、血漿、多血小板血漿（ＰＲＰ）乏血小板血漿（ＰＰＰ）、及び尿等、細胞としては例えば血小板である。ｍＧＰＶＩの場合、好ましくは血小板を含有する生体試料であり、特に、血液、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は血小板である。ｓＧＰＶＩの場合、好ましくは体液、特に、血液、血漿、乏血小板血漿（ＰＰＰ）及び尿等である。また、生体試料の由来動物種は、必ずしも限定されず、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサル等が含まれ、好ましくはヒトである。【００１６】
本発明の第１の態様の試料中のＧＰＶＩの測定方法は、１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を用いて、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを測定することを特徴とする。また、本発明の第２の態様の試料中のＧＰＶＩの測定試薬又はキットは、少なくとも１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有することを特徴とする。本発明において、ＧＰＶＩ特異的結合物質は、コラーゲン、ＣＲＰ及びｃｏｎｖｕｌｘｉｎ等を含むが、好ましくは、抗ＧＰＶＩ抗体である。以下、代表例として抗体を記載するが、本発明においては、適用可能な範囲で、抗体以外のＧＰＶＩ特異的結合物質についても抗体の記載に準ずることができる。
抗ＧＰＶＩ抗体は、特異的にＧＰＶＩ、特に、ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを認識又は結合する抗体であれば、必ずしも限定されない。ＧＰＶＩとの結合親和性（Ｋｄ）が、１０−７Ｍ以下、好ましくは３Ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは１Ｘ１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは３Ｘ１０−９Ｍ以下、特に好ましくは１Ｘ１０−９Ｍ以下である。
抗体の由来動物種は必ずしも限定されず、例えば、哺乳類、特にマウス、ラット、ハムスターもしくはウサギ等が挙げられ、また、遺伝子組換え技術により作製される抗体であってもよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも適用可能であるが、特異性等の性状及び物質的な均一性の点ではモノクローナル抗体は好ましい。
本発明において抗体の形態は、必ずしも限定されず、種々のものが適用可能である。例えば、本発明の抗体としては、その活性、例えば、ＧＰＶＩとの結合能を有する限りにおいて、抗体の断片もしくは一部又は誘導体でもよい。例えば、断片としては、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等、誘導体としては、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２（例えば、Ｏｒｉｔａ  Ｔ，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：５６２−５６６参照）、ｎａｎｏｂｏｄｙ（例えば、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，２８５３−２８５７，２００４参照）及びＣＤＲを含有するペプチド等が挙げられる。これらは公知の方法で作製しうる。
公知の抗ＧＰＶＩ抗体、例えば、マウス抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０２／８０９６８、ＷＯ２００５／１１１０８３等参照）、ラット抗マウスＧＰＶＩモノクローナル抗体（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、ラット抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体ｈＧＰ５Ｃ４（ＷＯ２００５／５４２９４等参照）、ヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／５４０２０等参照）及びヒト抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ０５／７８００）であってもよい。【００１７】
結合領域、結合部位もしくはエピトープが同定されている抗体等が好ましく、特定のドメイン、例えば、ドメイン１もしくはドメイン２と結合する抗体、又は、特定のループ、例えば、ループ２もしくはループ９の少なくとも一部を認識する抗体が挙げられる。具体例としては、実施例に示された抗体ならびにＷＯ２００６／１１７９１０及びＷＯ２００６／１１８３５０の実施例に記載された抗体等が挙げられる。そのような抗体の製造方法及び同定方法は種々の方法が適用でき、公知の方法を応用することもできるが、好ましくは、ＧＰＶＩの特定部位、例えば特定のドメイン、好ましくは特定のループ領域を他のアミノ酸配列、具体的には、他の動物種のＧＰＶＩの対応するアミノ酸配列で置換した変異体を免疫用抗原又は抗体の同定用抗原として用いる方法が挙げられ、具体的には本願またはＷＯ２００６／１１７９１０もしくはＷＯ２００６／１１８３５０の実施例に記載された方法を適用することができる。また、それらの抗体の認識領域等は、当該置換変異体と抗体との結合性及びＧＰＶＩと抗体との結合性を公知の方法に準じて測定することにより推定しうる。具体的な方法は実施例に示されている。
これらの結合領域等の同定された抗体を１又は２以上、好ましくは結合領域等の異なる２種類、好ましくはＧＰＶＩとの結合において互いに競合しない抗体の組合せ、例えば、ドメイン１と結合する抗体及びドメイン２と結合する抗体、又は、ループ２の少なくとも一部と結合する抗体及びループ９の少なくとも一部と結合する抗体の組合せを用いることにより、特異性、選択性及び／又は感度の高いＧＰＶＩの検出又は測定が可能であり、特に、複数のＧＰＶＩ分子種が混在する場合において、その内の特定のＧＰＶＩ分子種、例えば、ｓＧＰＶＩを特異的、選択的及び／又は高感度に測定することが可能となる。好適な例は実施例に示されている。【００１８】
本発明において、測定感度は必ずしも限定されないが、試料中の濃度で示した場合、１ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３０ｐｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、極めて好ましくは３．０ｐｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは１．０ｐｇ／ｍｌ以下である。また、検出限界濃度が、１ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３０ｐｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、極めて好ましくは３．０ｐｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは１．０ｐｇ／ｍｌ以下である。すなわち、検出限界濃度は、１ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは３０ｐｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、極めて好ましくは３．０ｐｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは１．０ｐｇ／ｍｌ以下である。試料中の濃度は、標準曲線を作成する標準物質、例えば、ＧＰＶＩ−Ｆｃの量として換算しても良い。また、測定前に試料の希釈操作を要する場合は、希釈後の値である。
試料、特に血漿中の可溶型ＧＰＶＩを測定する場合は、血漿成分の影響を受けずに特異的に血小板より遊離したＧＰＶＩを測定することが必要とされる。したがって、一般的には特異性の高い抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法が使用される。そこで本発明の測定法において重要となるのは精度よくＧＰＶＩを測定するために、できるだけ血漿成分の影響を減らすことであり、その手段としては第一に検体の希釈が選択される。また、影響を減らす目的で反応液中に界面活性剤等の成分を添加することも可能であるが、それらが測定系に影響を及ぼす可能性がある。従って、精度よくＧＰＶＩを測定するためには、検体を希釈して測定することが好ましく、必然的に高感度が要求される。実施例８に示した方法を用いた場合、正常ヒト血漿中のｓＧＰＶＩ濃度は、ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ量に換算して約０．１〜１０ｎｇ／ｍＬ（中央値０．４ｎｇ／ｍＬ）の範囲である。検体を精度よく測定するには、通常検体を５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上希釈して測定することが必要であり、そのためには測定系の感度は３０ｐｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは数ｐｇ／ｍＬ以下であることが望ましい。本発明の方法、具体的には実施例、特に、実施例８で示した方法を用いれば、３ｐｇ／ｍＬの標準物質で約４０ｍＡｂｓの吸光度差が得られ、本発明により充分な感度を得ることが可能である。
本発明の測定方法、測定試薬又はキットにおいて、抗ＧＰＶＩ抗体は標識抗体又は非標識抗体のいずれでもよいが、少なくとも１つの標識抗体を用いることが好ましい。この標識において、標識物質及び標識方法は公知の物質及び方法を用いることができ、放射性物質、酵素、蛍光物質及び化学発光物質等が用いられ、いずれも適用可能である。これらの内、酵素標識抗体を用いる方法が特殊な設備や高価な検出装置を必要とせず取り扱いも簡便である等の点で好ましい。また、標識には、直接法と間接法があり、いずれも適用可能である。
本発明の測定方法において、その測定原理等は必ずしも限定されず、一般的には免疫測定法であり、公知の方法、例えば、酵素抗体法、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチ免疫測定法、凝集法、固相直接法、固相結合法、溶液反応法、競合法、非競合法、イムノクロマト法、フロースルー法等が挙げられ、これらを単独又は組み合わせて、適用しうる（例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）等参照）。また、標識の信号を電気化学的に測定するＭＥＤＩＡ法（特開平５−２６４５５２）による測定、マイクロチップを使用したイムノアッセイ法（「バイオサイエンスとインダストリー」第６１巻４４９−４５４頁２００３年）、時間分解蛍光免疫測定法「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（米国）、１９８４年、第１３７巻、ｐ．３３５−３４３）及びホモジーニアス免疫測定法も適用できる。これらの内、サンドイッチ免疫測定法、特に、マイクロウェルプレート等の不溶性担体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が簡便であり、感度の面でも好ましい。【００１９】
サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）に記載されている。
サンドイッチ免疫測定法は、通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる２種類以上の抗体を用いて抗体−抗原−抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。サンドイッチ免疫測定法においては、通常、不溶性担体を用いるが、その場合、不溶性担体に結合させる第一の抗体を固相化（用）抗体又はキャプチャー抗体と、第二の抗体を非固相化抗体、液相抗体もしくは検出用抗体又は直接的若しくは間接的に標識される場合標識抗体と呼ぶことがある。まず、第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、固相若しくは反応場所とする。検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、洗浄して固相に特異的に結合しなかった物質を除去する。続いて標識した第二の抗体を添加する。一定時間反応させた後、洗浄して複合体を形成しなかった標識抗体を除去し、標識物に基づいて固相に特異的に結合した複合体の量を特異的に定性または定量する。サンドイッチ法は上記のように２段階で行う方法（２ステップ法）と抗原及び標識抗体を同時に加える１段階法（１ステップ法）のいずれを使用することもできる。
本発明において、固相化抗体としては、種々の抗体を用いることができるが、好ましくはドメイン２、より好ましくはループ９又はループ１１、特にループ９に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、非固相化抗体としては、種々の抗体を用いることができるが、好ましくはドメイン１、より好ましくはループ２又はループ５、特にループ２に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、これらの内、固相化抗体としてループ９に特異的に結合する抗体及び非固相化抗体としてループ２に特異的に結合する抗体の組合せが好ましい。
サンドイッチ免疫測定法において、不溶性担体を用いずに、溶液中で行うこともできる。例えば、抗原と標識抗体及び第二の標識した第二の結合物質を液相中で反応させ、該標識と該第二の標識との相互作用を測定する方法である。また、サンドイッチ免疫測定法等において、別法として競合法により測定することもできる。抗原−抗体複合体を形成させる中で、検体中の抗原と標識した抗原若しくは標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法である。
また、サンドイッチ免疫測定法において、さらに別法として第二の特異結合を利用して測定することもできる。抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質の複合体若しくは抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合物質の特異結合パートナー（以下、第二の特異結合パートナーと記載することがある）の複合体を形成させて測定する方法である。第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの組み合わせとしては、抗原とその抗体、リガンドとそのレセプター、糖鎖含有物質とレクチン、ビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジン等が挙げられる。さらに、抗体に対する抗体、すなわち、抗イムノグロブリン抗体を利用して、抗体−抗原−抗体−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させて測定する方法、また、抗イムノグロブリン抗体及び第二の特異結合を利用して、抗イムノグロブリン抗体−抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示される。【００２０】
２種類の結合部位の異なる抗体を用いる本発明の好適な例としては、第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーとしてビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジンを用いて、一方、特に、非固相化抗体をビオチン化し、これを標識、特にｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識したストレプトアビジンで検出する系が挙げられる。具体的な方法は実施例に示されている。
本発明のサンドイッチ免疫測定系で用いる不溶性担体は、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、プレート、チューブまたはメンブレン等を用いればよい。ビーズ、プレートまたはチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、ステンレス、プラスチック等が挙げられる。メンブレンは、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾紙等が挙げられる。形状としては、ビーズ、ラテックス粒子または磁性粒子等は球形として用いることができる。保存時のスペースの確保の点で有利である。プレートまたはチューブはウエル形として用いることができる。市販の自動化測定器、プレートリーダー等に対応可能な点で有利である。また、メンブレンはイムノクロマト法、フロースルー法に用いることができる。抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体の不溶性担体への結合は熱吸着法、化学結合法等により行うことができる。
また、非特異的吸着等の反応を低減し、測定系の特異性もしくは感度を高める目的で、不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、測定系に影響しない物質でブロッキング処理することが好ましい。測定系に影響しない物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質及びＴｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０等の界面活性剤等が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識としては、ペルオキシダーゼ、特に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ及びウリカーゼ等の酵素、アクリジニウム若しくはその誘導体、またはエクオリン若しくはその改変体等の化学発光物質、ＦＩＴＣまたはユウロピウム（Ｅｕ）若しくはサマリウム（Ｓｍ）等のランタノイド等の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、あるいはアイソトープが挙げられる。
例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、発色基質として３，３’，５，５’−テトラベンジジンまたは１，２−フェニレンジアミン等が、アルカリフォスファターゼを用いる場合は、発色基質として４−ニトロフェニルフォスフェート等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、発色基質として２−ニトロフェニル・β−Ｄ−ガラクトシド等が例示される。
抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体への酵素標識は、二段階グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等により行うことができる。酵素以外の標識についても熱吸着法、化学結合法等の公知の技術を利用して行うことができる。
酵素標識は、上記に例示される様な発色基質を用いれば、通常の吸光度測定系を用いて測定でき、また感度も比較的高く好ましい。化学発光物質、蛍光物質、着色標識若しくはアイソトープを標識として用いる場合は、その標識に応じた測定機器により測定できる。また、Ｅｕ、例えばクリプテート（Ｅｕ３＋  クリプテート）等の蛍光物質を用いる場合は、第二の標識としてＸＬ６６５等のアロフィコシアニン誘導体を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移を測定することもできる。また、簡易な測定キット、例えイムノクロマト法、フロースルー法を利用したキットに用いる標識は、色素、金コロイド若しくは着色ラテックスが視覚的にも観察可能であるので好ましい。凝集法で不溶性担体として用いられる粒子としては、ラテックス、赤血球（例えば羊赤血球）、ゼラチン、マイクロビーズまたはカーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。【００２１】
本発明の測定試薬又はキットは、１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質以外に任意の構成成分又は構成要素を含有してもよい。例えば、測定試薬又はキットの任意の構成成分として、安定化剤、賦形剤又は保存剤等の添加剤、また、キットの任意の構成要素として、標準物質、検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは希釈剤、標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質、ブロッキング剤、反応停止剤または洗浄剤等が例示される。希釈剤は、特に限定はないが、検体に含まれる物質を含む希釈剤が好ましい。検体が血清であり、その血清を入手するための採血をＥＤＴＡやクエン酸存在下で行われた場合、希釈剤としても同量のＥＤＴＡやクエン酸が存在することが好ましい。例えば、希釈剤中にＥＤＴＡを０．２〜１ｍｇ／ｍｌ含むことが好ましい。標準物質としては、生体試料から調製したＧＰＶＩ、特に、ｓＧＰＶＩもしくはｍＧＰＶＩ、又は、遺伝子工学的に調製した組換ＧＰＶＩ、特に、ｓＧＰＶＩ、ｍＧＰＶＩ、ＧＰＶＩ細胞外ドメインもしくはＧＰＶＩ細胞外ドメインとイムノグロブリンのＦｃ断片との融合蛋白質（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）等である。これらは公知の方法で調整しうる。
本発明の測定試薬又はキットは、以下の診断方法等において特に有用である。【００２２】
後述の実施例で示されるように、ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩは生体内及び生体外における種々の血小板刺激による影響、特に血小板の活性化に伴って変動、特に量的な変動を示すことから、生体内における血小板の活性化、特にＧＰＶＩを介した活性化の状態を推定するバイオマーカー、すなわち、血小板活性化マーカーとして利用しうる。
具体的には、例えば、生体試料中のｓＧＰＶＩが高値である場合、生体内で何らかの原因、特に、ＧＰＶＩを介した機序により血小板の活性化が惹起されていることが推定される。また、例えば、血小板のｍＧＰＶＩが高値である場合、生体内における血小板刺激、特に、ＧＰＶＩを介した刺激に対して血小板が活性化されやすい状態にあることが推定される。これらの原因、機序又は刺激としては、血管内皮傷害による血管内皮下のコラーゲンの露出等が挙げられる。
すなわち、本発明は、可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）又は血小板膜上に存在するＧＰＶＩ（ｍＧＰＶＩ）からなる血小板活性化マーカー、血小板活性化マーカーとしてのｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩの使用を提供する。【００２３】
また、ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量することにより、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断等を行なうことができる。すなわち、本発明は、
試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量するための方法、又はそれらの判定方法もしくは評価方法（本発明の第５の態様）、
試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法、罹病性の判定方法又は発症リスクの評価方法（本発明の第６の態様）、
試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、抗血小板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、より好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体が奏効する患者の選別方法（本発明の第７の態様）、
試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記の薬剤の投与（開始）時期を決定する方法（本発明の第８の態様）、
試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含む、上記の薬剤の治療効果もしくは副作用発現の予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法（本発明の第９の態様）、
１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を含有する、前記本発明の第５ないし９の態様の方法のいずれかのための試薬又はキット（本発明の第１０の態様）、
を提供する。【００２４】
上記本発明の第５〜９の態様の方法は、少なくとも試料、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量する工程を含むが、これは、少なくとも、試料と１以上のＧＰＶＩ特異的結合物質を接触させる工程を含む。試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩの検出、測定又は定量は、本発明の測定方法、測定試薬又はキットを用いて、上記本発明の第１及び２の態様の記載に準じて行なうことができる。【００２５】
試料が任意の疾患の患者又は疾患の恐れのある個体由来である場合、健常人の測定値との比較、発症前後の測定値との比較、もしくは、治療、特に抗血小板薬等の薬剤による治療の前後の測定値の比較を行なう工程を伴うことができる。例えば、予め複数の正常人の測定結果を求めておき、その測定結果の平均値若しくは範囲をとる等により標準化した正常人の値または正常人の値の範囲を、正常人の標準値として、測定した値と比較する工程である。例えば、正常人の平均値＋２ＳＤまたは３ＳＤをカットオフ値として正常人の標準値を求めればよい。また、予め疾患、例えば、血栓症患者の基準値を求めておいて、測定した値と比較する工程を行ってもよい。この工程を正常人の標準値と比較する工程の代わりに行ってもよい。これらの測定及び又は測定値の比較を行なうことで、上記した本発明第５〜９の態様の方法を効率的に実施することができる。【００２６】
本発明において、前記血小板の活性化は、必ずしも限定されないが、好ましくは血小板アゴニスト、より好ましくは、ＧＰＶＩ特異的アゴニストによるものである。当該血小板アゴニストとしては、コラーゲン、特に、血管内皮障害に伴う血管内皮下に存在するコラーゲンが挙げられ、その他に、血小板活性化作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体、ＣＲＰ及びｃｏｎｖｕｌｘｉｎ等が挙げられる。【００２７】
本発明において、血小板活性化もしくは血管内皮傷害と関連する疾患は、血小板の活性化もしくは凝集、特にコラーゲンによる血小板の活性化もしくは凝集、血管内皮傷害、又は、動脈硬化性の反応に起因する、又はそれらを伴う疾病及び血液凝固系の異常、例えば、血液凝固系の亢進に起因するもしくはそれを伴う疾患を含む。特に、血栓もしくは塞栓又は動脈硬化に起因する又はそれらを伴う疾患、すなわち、血栓性もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、例えば、血栓症及び塞栓症ならびに動脈硬化症等である。これらの疾患には、動脈性血栓症のみならず、静脈性血栓症も含まれ、また、心房細動に起因する脳梗塞も含まれる。
具体的には、狭心症、心筋梗塞、血栓溶解療法時、経皮的冠動脈内腔拡張術施行時、ステント施行時、バイパス手術施行時もしくは人工血管施行時の、またはこれらの後の血管内皮肥厚、血管再狭窄、狭心症もしくは心筋梗塞、等が挙げられる。さらに、心房細動もしくは心房粗動及びこれらに起因する血栓症、塞栓症、特に脳梗塞、等が挙げられる。その他、閉塞性血栓性血管炎、急性動脈閉塞症、閉塞性動脈硬化症または深部静脈血栓症等があり、脳梗塞（アテローム性血栓性梗塞、ラクナ梗塞、心原性梗塞）、一過性脳虚血発作、くも膜下出血後の脳血管攣縮、肺血栓、肺塞栓症、血管性紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、血液体外循環時（血液透析）の血液凝固防止、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、紫斑病性腎炎、糖尿病に伴う内皮細胞傷害、糖尿病性腎炎、糖尿病性網膜症、腎塞栓、移植治療に伴う合併症（肝静脈閉塞症、移植片対宿主病）等が挙げられる。好ましくは、血栓性もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、例えば、血栓症もしくは塞栓症又は動脈硬化症、より好ましくは、狭心症、心筋梗塞、心臓病、脳梗塞又は痴呆である。
本発明の測定方法、測定試薬又はキットを用いて、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを測定することにより、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量、判定もしくは評価、又は、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断、罹病性の判定もしくは発症リスクの評価が可能である。それらの実施においては、健常人の測定値との比較、発症前後の測定値との比較、又は、治療、特に抗血小板薬等の薬剤による治療の前後の測定値の比較を行なう工程を伴うことが好ましい。
本発明において、抗血小板薬は必ずしも限定されず、公知の薬剤が挙げられ、例えば、アスピリン、チクロピジン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト等が挙げられる。また、コラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を特異的に抑制する抗血小板薬としては、種々のものが適用可能である。例えば、コラーゲンに対する抗体、コラーゲンペプチド、その断片及び誘導体（例えば、ＷＯ９９／５０２８１等参照）、ＧＰＶＩ、その断片もしくはそれらの誘導体、例えば、ＧＰＶＩ−Ｆｃ（例えば、ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／１０４２８２等参照）などが挙げられる。好ましくは、抗ＧＰＶＩ抗体またはＧＰＶＩ−Ｆｃ、より好ましくは抗ＧＰＶＩ抗体である。抗ＧＰＶＩ抗体としては、公知の抗ＧＰＶＩ抗体、例えば、マウス抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０２／８０９６８、ＷＯ２００５／１１１０８３等参照）、ラット抗マウスＧＰＶＩモノクローナル抗体（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、ラット抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体ｈＧＰ５Ｃ４（ＷＯ２００５／５４２９４等参照）、ヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／５４０２０等参照）及びヒト抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ０５／７８００）を使用しうる。好ましくは、コラーゲン惹起血小板凝集を抑制する抗体、ＧＰＶＩ消失作用を有する抗体、ＧＰＶＩのループ９を認識する抗体が挙げられる。具体例としては、本願実施例に示された抗体ならびにＷＯ２００６／１１７９１０及びＷＯ２００６／１１８３５０の実施例に記載された抗体等が挙げられる。
本発明の測定方法等により試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量することで、これらの薬剤の奏効する患者の選別、それらの投与（開始）時期の決定、及び、それらの治療効果もしくは副作用発現の予測、モニタリングもしくは予後の判定等が可能となる。それらの実施においては、健常人の測定値との比較、または、治療、特に抗血小板薬等の薬剤による治療の前後の測定値の比較を行なう工程を伴うことが好ましい。【００２８】
心筋梗塞や脳梗塞の２次予防や、糖尿病に伴う末梢動脈閉塞症において血漿中および／あるいは尿中の可溶型ＧＰＶＩを測定し、高値を示した患者を選別し、このような患者に抗ＧＰＶＩ抗体あるいは可溶型ＧＰＶＩ−Ｆｃを投与すると、患者を選別しなかった場合に比べ、高い有効率を示すと予想される。すなわち、血中および／あるいは尿中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定することにより、心筋梗塞、脳梗塞および末梢動脈閉塞症、等の血栓症の高リスク患者を選別すること、さらには抗ＧＰＶＩ抗体や可溶型ＧＰＶＩ−Ｆｃが有効である患者を選別することができる。【００２９】
ＰＣＩ施行後に血漿中および／あるいは尿中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定する。可溶型ＧＰＶＩ量が高値を示している期間、抗血小板療法を継続した場合と継続しなかった場合を比較すると、継続した方がしなかった場合に比べ心血管イベントの発症率は低いと予想される。すなわち、血漿中および／あるいは尿中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定することにより、血栓症発症リスクを評価し、抗血小板薬の投薬期間を決めることができる。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
［実施例１］【００３１】
ラットＧＰＶＩ遺伝子のクローニング
先ず、公知であるマウスＧＰＶＩ遺伝子の情報を基に、マウスＧＰＶＩ遺伝子の各エクソンをそれぞれ増幅可能なプライマー（６対）を設計した。これらを用いて、ラットゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、特異的に増幅された遺伝子断片をシークエンスし、つなぎあわせることで、ラットＧＰＶＩ遺伝子配列を推定した。次に、この配列情報に基づいてラットＧＰＶＩ用プライマー（ｒａｔＧＰＶＩ−♯ａ，ｍＧＰＶＩ−ｄ）を再設計し、ラット骨髄由来ｃＤＮＡ（ラット骨髄由来ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写して合成）を鋳型としたＰＣＲで、ラットＧＰＶＩ全長遺伝子を増幅した。増幅産物をゲルから抽出し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｔ）ベクター（タカラバイオ）にＴＡクローニングした後、塩基配列を決定した。推定した配列と同じことを確認し、このプラスミドをｐＴＫ−２４７８とした。図１にラットＧＰＶＩ遺伝子の塩基配列を示す。【００３２】
【表１】
2007116779.tif 000003
［実施例２］【００３３】
ラットＧＰＶＩ（Ｄ１Ｄ２）マウスＧＰＶＩ（Ｄ３）−マウスＦｃ融合蛋白質（ｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ）発現プラスミドの構築
ｐＴＫ−２４７８を鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−♯ａおよびｒａｔ  ＧＰＶＩ−♯ｔ）でＰＣＲを行うことで、ラットＧＰＶＩのＤ１およびＤ２（ＧＰＶＩの細胞外領域のドメイン１およびドメイン２）をコードする遺伝子断片Ａを増幅した。同様に、ｐＴＫ−２４４０（ＷＯ２００６／１１７９１０及びＷＯ２００６／１１８３５０に記載）を鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−♯ｓおよびＩｇＧ１−ｉ）でＰＣＲを行うことで、マウスＧＰＶＩのＤ３（ＧＰＶＩの細胞外ドメインで、Ｄ１およびＤ２以外の領域）をコードする遺伝子断片Ｂを増幅した。次にＡおよびＢを混合して鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−♯ａおよびＩｇＧ１−ｉ）で再度ＰＣＲを行うことで、ラットＧＰＶＩ（Ｄ１およびＤ２）とマウスＧＰＶＩ（Ｄ３）が連結された遺伝子断片Ｃを得た。この断片Ｃの５’側をＥｃｏ  ＲＩ、３’側をＢａｍ  ＨＩで切断後、マウスＦｃ領域（ｍＦｃ）をＥＦプロモーターの下流に有するプラスミド（ｐＴＫ−２２９９：ＷＯ２００６／１１７９１０及びＷＯ２００６／１１８３５０に記載）のＥｃｏ  ＲＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位に挿入することで、ラットＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質を発現可能なｐＴＫ−２４８３を構築した。【００３４】
【表２】
2007116779.tif 000004
【００３５】
なお、ｍＦｃをヒトＦｃ領域（ｈＦｃ）に置き換えたラットＧＰＶＩ−ｈＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、マウスＧＰＶＩ−ｈＦｃ（ｍＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、ヒトＧＰＶＩ−ｈＦｃ（ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ（ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ２、５をヒトＧＰＶＩの対応する配列で置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ（ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ９、１１をヒトＧＰＶＩの対応する配列で置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）、ｈＧＰＶＩ−ｍＬ２−ｈＦｃ（ヒトＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ２をマウスＧＰＶＩの対応する配列に置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）及びｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃ（ヒトＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ９をマウスＧＰＶＩの対応する配列に置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）の各発現プラスミドを、公知のヒトＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの配列、図１のラットＧＰＶＩの配列ならびにヒト及びラットＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメント（図２）又はヒト及びマウスＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメント（図３）に示された各ループのアミノ酸配列に基づいて、公知の方法（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／５４０２０、ＷＯ２００５／７８００等参照）を参考に、実施例２と同様の手法で作製した。
［実施例３］【００３６】
ｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質の発現および精製
ＣＯＳ−１細胞は１０％牛胎児血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代した。無血清のダルベッコＭＥＭ培地にトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュダイアグノスティックス）を混和後、ｐＴＫ−２４８３を適量混和し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に培地交換したＣＯＳ−１細胞に添加した。３７℃、５％  ＣＯ２存在下で、３日間培養後上清を回収し、新たな培地でさらに３日間培養し、それらの上清をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にて精製したものを抗ラットＧＰＶＩ抗体作製用の抗原とした。得られたｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質を定法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。すなわち、５−２０％のグラジエントゲルにサンプルと分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）をアプライし、電気泳動した後、銀染色した（図４）。
なお、ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質、ｍＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質、ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ改変体蛋白質、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ改変体蛋白質およびｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃ改変体蛋白質も同様に発現及び精製した。
［実施例４］【００３７】
抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体の作製
Ａｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ）１２．５μＬとＣｐＧアジュバント１ｍｇと精製ラットＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質２０μｇを混合し、１００μＬとした投与抗原をｄｄＹマウス（メス、８週令、ＳＬＣ）の両足のフットパッド内にマイクロシリンジを用いて、それぞれ５０μＬ投与した。１１日後、投与抗原２０μｇを５０μＬの生理食塩水で希釈し、フットパッド内に各２５μＬずつ投与した。３日後、腸骨リンパ節よりリンパ球を分離し、得られたリンパ球をＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（ＡＴＴＣ）と混合した後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと記載）で精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を３μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。４℃でＯｖｅｒ  Ｎｉｇｈｔ反応後、イオン交換水で３回洗浄し、２％  Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に培養上清を各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を、１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質と反応した細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１１日後、同様にスクリーニングを行い、精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質と反応する抗体を産生するハイブリドーマを１７クローン取得した（表３）。【００３８】
【表３】
2007116779.tif 000005
［実施例５］【００３９】
ハイブリドーマが産生する抗体の調製
以後の操作は特に記載が無い限り４℃にて実施した。マウスハイブリドーマ培養液を、プレフィルターとして１μｍの孔径を有するカプセルカートリッジフィルター（東洋濾紙株式会社）、本フィルターとして０．２２μｍの孔径を有するフルオロダインフィルター（ＰＡＬＬ）およびミリパック２００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）をそれぞれ用い、室温にて清澄化し培養上清を得た。この培養上清を予めＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）にて平衡化したプロテインＡ（ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅバイオサイエンス）に吸着させ、非吸着蛋白質をＰＢＳ−にて洗浄後、非特異的に吸着している蛋白質を１０×ＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）にて溶出した。その後、プロテイＡに結合している抗体を、１００ｍＭグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．０）にて溶出した。溶出液の容量を測定し、直ちに１／１０容量の２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加し、ｐＨを中性に戻し精製抗体溶液とした。この精製抗体溶液を、攪拌式セルを用いて、分子量カット３０，０００のバイオマックスＰＢ限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により濃縮した後、生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬工場）に対して透析し、最終的な精製抗体溶液とした。得られた抗体を定法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。すなわち、５−２０％のグラジエントゲルにサンプルと分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）をアプライし、電気泳動した後、銀染色した（図５）。なお、以下の実施例では、全て、同様の方法で精製した抗体を使用した。
［実施例６］【００４０】
抗ラットＧＰＶＩ抗体の認識領域
実施例４で得られた抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体の認識ドメインの解析を行った。すなわちＰＢＳで精製ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、２％  Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に実施例５で精製したモノクローナル抗体を各種濃度に調製しポリプロピレンプレート（ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエルで添加し、さらに実施例３で得られたｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質、ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ改変体蛋白質、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ改変体蛋白質をそれぞれ５０μＬ／ウエルで添加し混合した。本混合サンプルをｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質で固相した上記のイムノプレートに５０μＬ／ウエルで添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスカッパ鎖抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ改変体蛋白質を添加した時に吸光度が低下しない抗体、つまりはループ２及び／又はループ５を認識している抗体が１種類（Ｆ１２３９−１１−１）、またｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ改変体蛋白質を添加した時に吸光度が低下しない抗体、つまりはループ９及び／又はループ１１を認識している抗体が３種類（Ｆ１２３９−４−２、Ｆ１２３９−６−１、Ｆ１２３９−２２−２）存在する事が示された（図６）。なお、上記の３種類の抗体（Ｆ１２３９−４−２、Ｆ１２３９−６−１、Ｆ１２３９−２２−２）は、同様の方法においてマウスＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質とは結合しなかった。さらに、ラットＧＰＶＩとマウスＧＰＶＩのループ１１のアミノ酸配列は同一であることを併せて考察すると、ループ１１が重要な認識領域とは考えにくく、上記の抗体は少なくともラットＧＰＶＩのループ９の一部を含有する構造を認識していると推定される。
［実施例７］【００４１】
ラット可溶型ＧＰＶＩのＥＬＩＳＡ法による測定
実施例４にて作製したマウス抗ラットＧＰＶＩ抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。すなわちＰＢＳで精製Ｆ１２３９−６−１抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に７５μＬ／ウエルで添加した。４℃でＯｖｅｒ  Ｎｉｇｈｔで反応した後、イオン交換水で５回洗浄し、５％  Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳを各ウエルに２００μＬ添加しブロッキングした。次にサンプル及びスタンダードとして用いる組換えｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を０．１％  ＢＳＡ、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳを用いて稀釈した。また、測定サンプルとして血漿を用いる場合は５倍以上で稀釈し、それぞれ５０μＬ／ウエルで添加し、３７℃で２時間攪拌しながら反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。Ｂｉｏｔｉｎ標識したＦ１２３９−７−１  Ｆ（ａｂ’）２抗体を２０％  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ  ＤＩＬＵＥＮＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含んだＰＢＳにて稀釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間攪拌しながら反応させた後、同様に５回洗浄した。次いでＰＯＬＹ−ＨＲＰ８０−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を２０％  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ  ＤＩＬＵＥＮＴ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳにて稀釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で３０分攪拌させながら反応させた後、同様の方法で６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図７にｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線を示す。
［実施例８］【００４２】
ヒト可溶型ＧＰＶＩのＥＬＩＳＡ法による測定
マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。すなわちＰＢＳで精製Ｆ１２３２−７−１抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に７５μＬ／ウエル添加した。４℃でＯｖｅｒ  Ｎｉｇｈｔで反応後、イオン交換水で５回洗浄し、５％  Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳを各ウエルに２００μＬ添加しブロッキングした。次にサンプル及びスタンダードとして用いる組換えｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を０．１％  ＢＳＡ、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳを用いて稀釈した。また測定サンプルとして血漿を用いる場合は５倍以上で稀釈し、それぞれ５０μＬ／ウエルで添加し、３７℃で２時間攪拌させながら反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。Ｂｉｏｔｉｎ標識したＦ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２抗体を２０％  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ  ＤＩＬＵＥＮＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、０．３Ｍ  塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含んだＰＢＳにて稀釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間、攪拌しながら反応させた後、同様に５回洗浄した。次いでＰＯＬＹ−ＨＲＰ８０−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を２０％  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ  ＤＩＬＵＥＮＴ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＰＢＳにて稀釈し、各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で３０分間、攪拌しながら反応させた後、同様の方法で６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図８にｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質を標準品として用いて作成した標準曲線を示す。本系では３ｐｇ／ｍＬの標準品において約４０ｍＡｂｓの吸光度の差が得られ、測定感度は少なくとも３ｐｇ／ｍｌ以下であった。
［実施例９］【００４３】
ラットＰＲＰの調製およびｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰによる血小板刺激
正常ラットから採血したクエン酸加血を１１０×ｇ、２５℃、１５分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を得た。引き続き、ＰＲＰにＡＣＤ−Ａ（ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、８３０×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離することにより血小板を回収した。回収した血小板にＡＣＤ−ＡでｐＨ６．５に調整したＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）を添加して２回洗浄した。洗浄後、ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を添加して血小板を懸濁し、洗浄血小板とした。ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２を１ｍＭとなるように添加した洗浄血小板にｃｏｎｖｕｌｘｉｎ（ＡＬＥＸＩＳ）、ＣＲＰ（ペプチド合成品）あるいはＡＤＰを添加し、室温において１時間反応させ血小板を刺激した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、１８，０００×ｇ、２５℃で１分間遠心分離し、上清画分および血小板画分を回収した。
［実施例１０］【００４４】
ラット血小板ＧＰＶＩ発現のフロサイトメトリーによる測定
実施例９に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した。対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、室温において１時間静置した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、０．５％  非働化ＦＢＳならびに２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）で洗浄後、蛍光色素Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（以下、ＰＥ）で標識したマウス抗ラットＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３９−１１−１を３×１０５個の血小板に対して０．５μｇ相当添加して室温、遮光下で３０分静置した。ＰＥ標識Ｆ１２３９−１１−１のアイソタイプ対照として、ＰＥ標識マウスＩｇＧ２ａ  κ抗体を同量添加した試料も併せて調製した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーで血小板を洗浄後、フローサイトメーターＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜表面上のＧＰＶＩ発現量について解析した。なお、ＧＰＶＩ発現量は、ＰＥ標識Ｆ１２３９−１１−１検出結果値からＰＥ標識マウスＩｇＧ２ａ  κ抗体検出結果値を差し引いて算出した。図９に結果を示す。Ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ（ＣＶＸ）およびＣＲＰ刺激血小板ではバッファーのみを添加した血小板と比較して、顕著なＧＰＶＩ発現量の減少が認められた、ＡＤＰ刺激血小板ではＧＰＶＩ発現量の低下は認められなかった。
［実施例１１］【００４５】
ラットＰＲＰの可溶型ＧＰＶＩ量のＥＬＩＳＡによる測定
実施例９に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した後、上清画分を回収した。さらに、実施例７の方法により、上清中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定した。図１０に結果を示す。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板の上清中において、顕著な可溶型ＧＰＶＩ量の上昇が認められた。一方、ＡＤＰで刺激した血小板の上清中における可溶型ＧＰＶＩ量の上昇は微弱であった。
［実施例１２］【００４６】
サルＰＲＰの調製およびＣｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰによる血小板刺激
正常サルから採血したクエン酸加血を１１５×ｇ、２５℃、１５分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を得た。、引き続き、ＰＲＰにＡＣＤ−Ａ（ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、８３０×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離することにより血小板を回収した。回収した血小板にＡＣＤ−ＡでｐＨ６．５に調整したＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）を添加して２回洗浄した。洗浄後、ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を添加して血小板を懸濁し、洗浄血小板とした。ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２を１ｍＭとなるように添加した洗浄血小板にｃｏｎｖｕｌｘｉｎ（ＡＬＥＸＩＳ）、ＣＲＰ（ペプチド合成品）あるいはＡＤＰを添加し、室温において１時間反応させ血小板を刺激した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、１８，０００×ｇ、２５℃で１分間遠心分離し、上清および血小板画分を回収した。
［実施例１３］【００４７】
サル血小板ＧＰＶＩ発現のフローサイトメーターによる測定
実施例１２に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した。対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、室温において１時間静置した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、蛍光色素ＰＥで標識したキメラ抗ヒトＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３２−３７−２あるいはキメラ抗ヒトＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３２−１０−１を４×１０５個の血小板に対して１μｇ相当添加して室温、遮光下で３０分静置した。ＰＥ標識キメラＦ１２３２−３７−２およびＰＥ標識キメラＦ１２３２−１０−１のアイソタイプ対照としてＰＥ標識ヒトＩｇＧ４抗体を同量添加した試料も併せて調製した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーで血小板を希釈後、フローサイトメーターＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜表面上のＧＰＶＩ発現量について解析した。なお、ＧＰＶＩ発現量は、ＰＥ標識キメラＦ１２３２−３７−２あるいはＰＥ標識キメラＦ１２３２−１０−１検出結果値からＰＥ標識ヒトＩｇＧ４抗体検出結果値を差し引いて算出した。結果を図１１に示す。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰ刺激血小板ではバッファーのみを添加した血小板と比較して、ＧＰＶＩ発現量の減少が認められたが、ＡＤＰ刺激血小板ではＧＰＶＩ発現量の低下は認められなかった。
［実施例１４］【００４８】
サル血小板ＧＰＶＩ量のウエスタンブロッティングによる測定
実施例１２に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した後、上清画分および血小板画分を回収し、上清画分に含まれる可溶型ＧＰＶＩおよび血小板画分に含まれるＧＰＶＩ（以下、血小板ＧＰＶＩ）をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出した。すなわち上清画分１２μＬに×４  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（＋β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＥＲＣＥ））を４μＬ添加した。血小板画分は１．９×１０６個血小板相当／μＬとなるように×１  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（＋β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＥＲＣＥ））を添加し、９９℃で５分間熱処理した。熱処理したサンプルを５−２０％の濃度勾配ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）に、１レーンあたり上清画分は全量、血小板画分は１６μＬアプライした後に、ゲル一枚につき定電流３０ｍＡで通電し電気泳動した。ブロッティングは常法に従い、セミドライ法により低蛍光のメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  ＰＶＤＦ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。ブロッティング後、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬株式会社）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。さらに、１０％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で希釈した一次抗体（ヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体）を添加し、室温で１時間、反応させた。ＴＰＢＳで洗浄した後、１０％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＴＰＢＳで希釈した二次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇｓ  ＨＲＰ）を添加し、室温で３０分間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄した後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴｙｐｈｏｏｎ９４１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可溶型ＧＰＶＩおよび血小板ＧＰＶＩの検出を行なった。結果を図１２に示す。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板では、顕著な血小板ＧＰＶＩの減少が認められた。また、ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板では著明な可溶型ＧＰＶＩの上昇が認められた。一方ＡＤＰで刺激した血小板では血小板ＧＰＶＩ発現量に大きな変動は認められず、可溶型ＧＰＶＩも検出されなかった。
［実施例１５］【００４９】
サルＰＲＰの可溶型ＧＰＶＩ量のＥＬＩＳＡによる測定
実施例１２に示した方法で、洗浄血小板をＣｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した後、上清を回収した。さらに、実施例８の方法により、上清中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定した。結果を図１３に示す。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板の上清中において、顕著な可溶型ＧＰＶＩ量の上昇が認められた。一方、ＡＤＰで刺激した血小板の上清中における可溶型ＧＰＶＩの上昇は極めて微弱であった。
［実施例１６］【００５０】
ヒトＰＲＰの調製およびＣｏｌｌａｇｅｎ、Ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰによる血小板刺激
正常ヒトから採血したクエン酸加血を１７０×ｇ、２５℃、１５分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を得た。引き続き、ＰＲＰにＡＣＤ−Ａ（ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、８３０×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離することにより血小板を回収した。回収した血小板にＡＣＤ−ＡでｐＨ６．５に調整したＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）を添加して２回洗浄した。洗浄後、ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を添加して血小板を懸濁し、洗浄血小板とした。ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を１ｍＭとなるように添加した洗浄血小板にｃｏｌｌａｇｅｎ（ｃｏｌｌａｇｅｎｒｅａｇｅｎｔ’Ｈｏｒｍ’  Ｎｙｃｏｍｅｄ）、ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ（ＡＬＥＸＩＳ）、ＣＲＰ（ペプチド合成品）あるいはＡＤＰを添加し、室温において１時間反応させ血小板を刺激した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、１８，０００×ｇ、２５℃で１分間遠心分離し、上清および血小板画分を回収した。
［実施例１７］【００５１】
ヒト血小板ＧＰＶＩ発現のフローサイトメーターによる測定
実施例１６に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｌｌａｇｅｎ、ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した。対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、室温において１時間静置した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ溶液を添加して反応を終了した後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、蛍光色素ＰＥで標識したキメラ抗ヒトＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３２−３７−２を４×１０５個の血小板に対して１μｇ相当添加して室温、遮光下で３０分静置した。ＰＥ標識キメラＦ１２３２−３７−２のアイソタイプ対照としてＰＥ標識ヒトＩｇＧ４抗体を同量添加した試料も併せて調製した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーで血小板を希釈し、フローサイトメーターＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜表面上のＧＰＶＩ発現量について解析した。なお、ＧＰＶＩ発現量は、ＰＥ標識キメラＦ１２３２−３７−２検出結果値からＰＥ標識ヒトＩｇＧ４抗体検出結果値を差し引いて算出した。結果を図１４に示す。Ｃｏｌｌａｇｅｎ刺激血小板で、ＧＰＶＩ発現量の減少が認められた。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板では、ＧＰＶＩ発現がほとんど消失していた。一方、ＡＤＰ刺激した血小板ではＧＰＶＩ発現量の低下は認められなかった。
［実施例１８］【００５２】
ヒト血小板ＧＰＶＩ量のウエスタンブロッティングによる測定
実施例１６に示した方法で、洗浄血小板をｃｏｌｌａｇｅｎ、ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した後、上清画分および血小板画分を回収し、上清画分に含まれる可溶型ＧＰＶＩおよび血小板画分に含まれるＧＰＶＩ（以下、血小板ＧＰＶＩ）をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出した。すなわち上清画分１２μＬに×４  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（＋β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＥＲＣＥ））を４μＬ添加した。血小板画分は１．９×１０６個血小板相当／μＬとなるように×１  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（＋β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＥＲＣＥ））を添加し、９９℃で５分間熱処理した。熱処理したサンプルを５−２０％の濃度勾配ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）に、１レーンあたり上清画分は全量、血小板画分は１６μＬアプライした後に、ゲル一枚につき定電流３０ｍＡで通電し電気泳動した。ブロッティングは常法に従い、セミドライ法により低蛍光のメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  ＰＶＤＦ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。ブロッティング後、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬株式会社）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。さらに、１０％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で希釈した一次抗体（ヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体）を添加し、室温で１時間、反応させた。ＴＰＢＳで洗浄した後、１０％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＴＰＢＳで希釈した二次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇｓ  ＨＲＰ）を添加し、室温で３０分反応させた。ＴＰＢＳで洗浄した後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴｙｐｈｏｏｎ９４１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可溶型ＧＰＶＩおよび血小板ＧＰＶＩの検出を行った。結果を図１５に示す。ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板では顕著な血小板ＧＰＶＩの減少が認められた。また、Ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板では可溶型ＧＰＶＩの上昇が認められた。一方ＡＤＰで刺激した血小板では血小板ＧＰＶＩの大きな変動は認められず、可溶型ＧＰＶＩも検出されなかった。
［実施例１９］【００５３】
ヒトＰＲＰの可溶型ＧＰＶＩ量のＥＬＩＳＡによる測定
実施例１６に示した方法で、洗浄血小板をＣｏｌｌａｇｅｎ、Ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ、ＣＲＰあるいはＡＤＰで刺激した後、上清を回収した。さらに、実施例８の方法により、上清中の可溶型ＧＰＶＩ量を測定した。結果を図１６に示す。Ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣｏｎｖｕｌｘｉｎおよびＣＲＰで刺激した血小板の上清中において、著明な可溶型ＧＰＶＩ量の上昇が認められた。一方、ＡＤＰで刺激した血小板の上清中における可溶型ＧＰＶＩの上昇は認められなかった。
［実施例２０］【００５４】
ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における血漿中可溶型ＧＰＶＩ量の測定
雌性Ｗｉｓｔａｒラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、右大腿静脈よりエンドトキシンを２０ｍｇ／ｋｇの用量で２時間、あるいは４０ｍｇ／ｋｇの用量で４時間、持続静脈内投与した。エンドトキシン投与終了時に、腹部大動脈より採血し、血小板数を自動血球数測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ、東亜医用電子）にて測定した、また、血液を遠心することにより血漿を分離し、可溶型ＧＰＶＩを実施例７に記載した方法で、可溶型ＩＣＡＭ−１はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒａｔ  ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて測定した。結果を図１７に示す。エンドトキシンを投与することにより、血小板数の低下が認められた。このことは、エンドトキシンの投与により血小板の活性化が生じていることを示している。また、エンドトキシンを投与することにより、血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量および可溶型ＩＣＡＭ−１量が上昇した。
［実施例２１］【００５５】
（１）ラットコラーゲン惹起血栓モデル動物における血漿中可溶型ＧＰＶＩ量の測定
雄性ＳＤラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、右大腿静脈よりコラーゲンを０．５ｍｇ／ｋｇの用量で１５分間持続静脈内投与した。コラーゲン投与開始より３０分後に、頚静脈より採血し、血小板数を自動血球数測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ、東亜医用電子）にて測定した。また、血液を遠心することにより血漿を分離し、可溶型ＧＰＶＩを実施例７に記載した方法で、可溶型ＩＣＡＭ−１はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒａｔ  ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて測定した。結果を図１８（Ａ）に示す。コラーゲンを投与することにより、血小板数の低下が認められた。このことは、コラーゲンの投与により血小板の活性化が生じていることを示している。また、コラーゲンを投与することにより、血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量ならびに可溶型ＩＣＡＭ−１が上昇した。さらに、血小板数の低下の程度と血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量の上昇の程度は一致した。
同様に、雄性ＳＤラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、右大腿静脈よりコラーゲンを０．１ｍｇ／ｋｇの用量で急速静脈内投与した。コラーゲン投与１５分後、３０分後、および６０分後に頚静脈より採血し、血小板数を自動血球数測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ、東亜医用電子）にて測定した。また、血液を遠心することにより血漿を分離し、可溶型ＧＰＶＩを実施例７に記載した方法で測定した。結果を図１８（Ｂ）に示す。血小板数の低下は軽微であったが、血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量はコラーゲン投与より１５分で速やかに上昇した。【００５６】
（２）ラットコラーゲン惹起血栓モデル動物におけるＧＰＶＩ抗体の効果
雄性ＳＤラットに抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を投与した。６日後にコラーゲンを０．８ｍｇ／ｋｇの用量で急速静脈内投与した。コラーゲンを投与してから１５分まで、生死を観察した。結果を表４に示す。抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）は、血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量が上昇する血栓モデル動物において、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の用量で動物の死亡を完全に抑制した。
従って、本発明の測定方法等により血漿中のｓＧＰＶＩを測定することで、疾患の発症前に、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量をおこなうこと、、血栓症等の血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患を診断すること、及び治療対象患者を選別することが可能であると考えられる。また、これらの患者に抗ＧＰＶＩ抗体等の抗血小板薬を投薬することで高い有効率が得られると考えられる。
【表４】
2007116779.tif 000006
［実施例２２］【００５７】
（１）ラットバルーン傷害モデル動物における血漿中可溶型ＧＰＶＩ量の測定
雄性ＳＤラットを４５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与により麻酔し、頸部および大腿部を切開した。大腿動脈にバルーンカテーテルを挿入し、先端を左頚動脈の内外頚動脈分岐部まで導いた。バルーンカテーテルが頚動脈内にあることを確認した後、バルーン内に空気を注入してバルーンを膨らませた。バルーンを膨らませた状態で、大動脈弓までバルーンカテーテルを引き抜いた。この作業を３回繰り返すことにより、血管内膜に傷害を与えた。翌日、ペントバルビタールナトリウム４５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与麻酔下で腹部大動脈より、クエン酸加血液を採取し、血漿を取得した。血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量は実施例７に記載した方法で、可溶型ＩＣＡＭ−１はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒａｔ  ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて測定した。結果を図１９（Ａ）に示す。バルーンカテーテルで血管内膜に傷害を与えることにより、血漿中の可溶型ＩＣＡＭ−１量が上昇した。このことは、バルーンカテーテルにより血管内膜が傷害を受けたことを示している。また、可溶型ＧＰＶＩ量の上昇も認められた。【００５８】
（２）ラットバルーン傷害モデル動物における抗ＧＰＶＩ抗体の効果
実施例２２に記載したモデル動物において、抗ラットＧＰＶＩ抗体の効果を検討した。すなわち、抗ラットにＦ１２３９−６−１を３ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、６日後に実施例２２の方法で血管内膜傷害を加えた。バルーン傷害より１５日後にペントバルビタール麻酔下において左右の頸動脈を採取して１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンブロックを作製した。次にパラフィンブロックを薄切してスライド標本を作製し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色をおこなった後、顕微鏡を用いて観察した。すなわち、観察した像をＣＣＤカメラを用いてデジタル画像として記録し、これを画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦを用いて解析し、内膜および内中膜の断面積を算出した。結果を図１９（Ｂ）に示す。抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）は血漿中の可溶型ＧＰＶＩの上昇が認められた動脈硬化モデル動物において、内膜の肥厚を抑制した。
従って、本発明の測定方法等により血漿中のｓＧＰＶＩを測定することで、疾患の発症前に、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定又は定量をおこなうこと、動脈硬化性疾患等の血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患を診断すること、及び治療対象患者を選別することが可能であると考えられる。また、これらの患者に抗ＧＰＶＩ抗体等の抗血小板薬を投薬することで高い有効率が得られると考えられる。
［実施例２３］【００５９】
ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における尿中可溶型ＧＰＶＩ量の測定
雌性Ｗｉｓｔａｒラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、右大腿静脈よりエンドトキシンを４０ｍｇ／ｋｇの用量で４時間、持続静脈内投与した。エンドトキシン投与終了時に、尿を取得し、実施例７の方法を用いて尿中可溶型ＧＰＶＩを測定した。結果を図２０に示す。エンドトキシンを投与することにより尿中においても可溶型ＧＰＶＩ量の上昇が認められた。
［実施例２４］【００６０】
各種ヒト病態血漿の可溶型ＧＰＶＩ量の測定
各種ヒト病態血漿中の可溶型ＧＰＶＩ量を、実施例８に示した方法で測定した。結果を図２１に示す。狭心症、急性心筋梗塞、心臓病、脳梗塞および痴呆の疾患患者血漿は、正常ヒト血漿に比較して可溶型ＧＰＶＩが高値であった。
［実施例２５］【００６１】
抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体の作製
精製ｈＧＰＶＩ−ｍＦｃ２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）又はＡｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ）及びオリゴＣｐＧと混合し、投与抗原とした。ｄｄＹマウス（メス、８週令、ＳＬＣ）に２回投与し、３日後、リンパ節又は脾臓よりリンパ球を分離した。得られたリンパ球をＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（ＡＴＴＣ）と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｓｉｇｍａ）を用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社、ｐ８３）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマをｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ及びｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃに対する結合活性を指標としてスクリーニングした。すなわち、精製ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃまたはｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃをＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウェル添加し、実施例６の記載の方法と同様にして固相化した。次に培養上清を各ウェルに添加し室温で１時間反応させた後、実施例６に記載の方法と同様にしてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ２６０）を用いて反応を行い、吸光度を測定した。その結果、精製ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃと結合し（吸光度１以上）、ｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃとは結合しない（吸光度０．５以下）抗体を産生している細胞を選択し、常法に従いクローニングした。８〜１０日後、同様にスクリーニングを行い、Ｌ９特異的マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体を産生するハイブリドーマを得た。実施例４と同様に、得られたハイブリドーマを培養し、モノクローナル抗体を精製した。各抗体のＧＰＶＩ結合活性を、上記ＥＬＩＳＡ法における吸光度が０．５以下を−、０．５〜１．０までを＋、１．０〜２．０を＋＋、２．０以上を＋＋＋として、表示した（表５）。
同様の手法を用いて、Ｌ２特異的マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体を産生するハイブリドーマ（Ｆ１２３２−１０−１及び同一クローン由来と考えられるＦ１２３２−１０−２）を得た。【００６２】
【表５】
2007116779.tif 000007
［実施例２６］【００６３】
抗ＧＰＶＩ抗体の可変領域アミノ酸配列の決定
常法に従い、ハイブリドーマＦ１２３２−３７−２及びＦ１２３２−１０−１より一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＭｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によるＰＣＲで抗ＧＰＶＩ抗体の可変領域をコードするＤＮＡを増幅し、その塩基配列を決定した。各ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｆ１２３２−３７−２及びＦ１２３２−１０−１の重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列表に示した（配列番号１８−２５）。
［実施例２７］【００６４】
抗ＧＰＶＩ抗体のヒト可溶型ＧＰＶＩ認識能の確認
実施例１６に示した方法で正常ヒトから調製した洗浄血小板にｃｏｎｖｕｌｘｉｎもしくは対照としてバッファーのみを添加し、３７℃において１時間静置した後、上清画分を回収した。実施例１８に示した方法で、マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体であるＦ１２３２−７−１もしくはＦ１２３２−１０−２、およびヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体を一次抗体としてＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によりヒト可溶化型ＧＰＶＩの検出を行った。結果を図２２に示す。Ｆ１２３２−７−１およびＦ１２３２−１０−２はヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体と同様にｃｏｎｖｕｌｘｉｎで刺激した洗浄血小板の上清画分試料において、ヒト可溶型ＧＰＶＩの存在を確認する事が可能であった。また、バッファーのみを添加した洗浄血小板の上清画分試料では、Ｆ１２３２−７−１、Ｆ１２３２−１０−２ならびにヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体によってヒト可溶型ＧＰＶＩは検出されなかった。このことから、ヒト可溶型ＧＰＶＩのＥＬＩＳＡ法で使用しているＦ１２３２−７−１およびＦ１２３２−１０−２はヒト可溶化型ＧＰＶＩを認識していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の測定方法、測定試薬またはキットにより、試料中のＧＰＶＩ、特に生体試料中のｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩが高感度に測定しうる。また、本発明の測定方法、測定試薬またはキットを用いて、ｓＧＰＶＩ又はｍＧＰＶＩを検出、測定又は定量することにより、血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、測定、定量、判定もしくは評価、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断、罹病性の判定もしくは発症リスクの評価、抗血小板薬、特に抗ＧＰＶＩ抗体の奏効する患者の選別、それらの投与（開始）時期の決定、及び、それらの治療効果もしくは副作用発現の予測、モニタリングもしくは予後の判定等が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号２は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号３は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号４は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号５は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号６は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号７は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号８は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号９は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１０は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１１は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１２は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１３は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１４は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１５は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１６は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１７は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
［配列表］
2007116779.tif 000008
2007116779.tif 000009
2007116779.tif 000010
2007116779.tif 000011
2007116779.tif 000012
2007116779.tif 000013
2007116779.tif 000014
2007116779.tif 000015
2007116779.tif 000016
2007116779.tif 000017
2007116779.tif 000018
【図１】
2007116779.tif 000019
【図２】
2007116779.tif 000020
【図３】
2007116779.tif 000021
【図６】
2007116779.tif 000022
【図７】
2007116779.tif 000023
【図８】
2007116779.tif 000024
【図９】
2007116779.tif 000025
【図１０】
2007116779.tif 000026
【図１１】
2007116779.tif 000027
【図１３】
2007116779.tif 000028
【図１４】
2007116779.tif 000029
【図１６】
2007116779.tif 000030
【図１７】
2007116779.tif 000031
【図１８（Ａ）】
2007116779.tif 000032
【図１８（Ｂ）】
2007116779.tif 000033
【図１９（Ａ）】
2007116779.tif 000034
【図１９（Ｂ）】
2007116779.tif 000035
【図２０】
2007116779.tif 000036
【図２１】
2007116779.tif 000037
【図４】
2007116779.tif 000038
【図５】
2007116779.tif 000039
【図１２】
2007116779.tif 000040
【図１５】
2007116779.tif 000041
【図２２】
2007116779.tif 000042
【国際調査報告】
2007116779.tif 000043
2007116779.tif 000044
2007116779.tif 000045
2007116779.tif 000046
2007116779.tif 000047