(57)【要約】  少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素、好ましくはさらにメディエーター、さらに好ましくはこれにタンパク質分解酵素が固定されているヘモグロビンA1cセンサ。このヘモグロビンA1cセンサは、ヘモグロビンA1cの簡便、迅速な測定を可能とし、またヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素を固定した作用極をFPOXを固定した作用極とは別に設けることにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素が固定されていることを特徴とするヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項２】
試料が、血球を含有する試料である請求項１記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項３】
試料が、界面活性剤で処理された試料である請求項１または２記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項４】
作用極上に、さらにメディエーターが固定されている請求項１乃至３のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項５】
作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている請求項１乃至４のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項６】
電極が、過酸化水素電極または酸素電極である請求項１乃至５のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項７】
さらに参照極を有する請求項１乃至６のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項８】
電極が絶縁性基板上に形成されている請求項１乃至７のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項９】
さらにヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定された作用極が設けられた請求項１乃至８のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ、電圧印加部および電流値測定部を有するヘモグロビンA1c測定装置。
【請求項１１】
さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビンA1c濃度演算部が設けられた請求項１０記載のヘモグロビンA1c測定装置。
【請求項１２】
さらにヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設けられた請求項１０または１１記載のヘモグロビンA1c測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビンA1cセンサに関する。さらに詳しくは、簡易な操作により精度よくヘモグロビンA1cの測定を可能とするヘモグロビンA1cセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病等の疾病の診断、管理および予防を行ううえで、糖化タンパク質の測定はグルコースの測定とともに重要である。この糖化タンパク質は、タンパク質主鎖又は側鎖のアミノ基とグルコースなどの還元糖の還元末端とが非酵素的に反応して生成する。また、糖化タンパク質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転位を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれている。【０００３】
かかる糖化タンパク質は、生体内の血液、唾液等の体液、毛髪等の生体試料中やジュース、キャンデー、調味料、粉末食品等の食品中等に含有されている。血液中に存在する糖化タンパク質の濃度は、血中のグルコース等の還元糖の濃度に強く依存している。糖尿病では糖化タンパク質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖化アルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映している。グルコースは、現在の血糖状態を示すのに対し、1,5-アンヒドログルシトールは約数日間前の、糖化アルブミンは約1〜2週間前の、糖化ヘモグロビンは約1〜2ヶ月前の血糖値を反映するため、これらの糖化タンパク質の測定は、血中グルコース濃度を経時的に判断できるという点で、糖尿病の症状の経時的診断あるいは症状管理に重要である。【０００４】
現在、糖尿病診断の指標として用いられている糖化タンパク質としては、アルブミンなどのタンパク質中のリジン残基のε-アミノ基が糖化された糖化アルブミンや、ヘモグロビンなどのタンパク質のＮ末端のアミノ酸のα-アミノ基が糖化された糖化ヘモグロビンなど、種々の糖化タンパク質が知られている。【０００５】
ヘモグロビンA1cは、糖化ヘモグロビンの１つであり、ヘモグロビンβ-サブユニットのN末端アミノ酸にグルコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転位により結果的にフルクトースが結合した構造を有する糖化タンパク質である。ヘモグロビンA1cは、臨床的に過去1〜2ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病管理の指標として重要であり、迅速且つ正確な定量法が求められている。【０００６】
現在ヘモグロビンA1cを定量する方法として、例えば、HPLC等のクロマトグラフィー法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法などの抗体を利用する免疫測定方法、糖化タンパク質に作用する酵素を用いる酵素法などが知られている。【０００７】
このうち酵素法としては、糖化タンパク質をタンパク質分解酵素で分解し、遊離した糖化アミノ酸に糖化アミノ酸酸化酵素の一種であるフルクトシルアミノ酸酸化酵素(以下、FAOXと略する)を作用させ、生成する過酸化水素を吸光光度法などにより測定する方法が提案されている。また、タンパク質分解酵素により糖化タンパク質から遊離した糖化アミノ酸に応答する、FAOX固定化電極を作用極とするヘモグロビンA1cセンサも提案されている。
【特許文献１】特開平５−１９２１９３
【特許文献２】特開２００３−２７４９７６
【０００８】
しかるに、現在用いられているフルクトシルアミノ酸酸化酵素は、遊離の糖化アミノ酸に対し高い反応性を有しているものの、プロテアーゼにより糖化タンパク質を分解して得られる糖化ペプチドにはほとんど作用しないため、かかる酵素法は、必ずしも精度のよい方法とはいえないものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヘモグロビンA1cの簡便、迅速でかつ正確な測定を可能とするヘモグロビンA1cセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる本発明の目的は、少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素が固定されていることを特徴とするヘモグロビンA1cセンサによって達成される。
本発明は、下記（１）〜（１２）に関する。
（１）  少なくとも対極および作用極よりなる電極を有する、試料中のヘモグロビンA1c測定用センサであって、作用極上にフルクトシルペプチド酸化酵素（以下、FPOXと略する）が固定されていることを特徴とするヘモグロビンA1cセンサ
（２）  試料が、血球を含有する試料である（１）記載のヘモグロビンA1cセンサ
（３）  試料が、界面活性剤で処理された試料である（１）または（２）記載のヘモグロビンA1cセンサ
（４）  作用極上に、さらにメディエーターが固定されている（１）乃至（３）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（５）  作用極上に、さらにタンパク質分解酵素が固定されている（１）乃至（４）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（６）  電極が、過酸化水素電極または酸素電極である（１）乃至（５）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（７）  さらに参照極を有する（１）乃至（６）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（８）  電極が絶縁性基板上に形成されている（１）乃至（７）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（９）  さらにヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素が固定された作用極が設けられた（１）乃至（８）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ
（１０）  （１）乃至（９）のいずれかに記載のヘモグロビンA1cセンサ、電圧印加部および電流値測定部を有するヘモグロビンA1c測定装置
（１１）  さらにヘモグロビン測定部およびヘモグロビンA1c濃度演算部が設けられた（１０）記載のヘモグロビンA1c測定装置
（１２）  さらにヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための測定部が設けられた（１０）または（１１）記載のヘモグロビンA1c測定装置
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るヘモグロビンA1cセンサは、作用極上にFPOXが固定されているため、試料中に含まれるヘモグロビンA1c濃度を簡易に測定することができる。また、血球の存在下であっても試料の特別な前処理を必要とすることがないといったすぐれた効果を奏する。さらに、試料を界面活性剤で処理することにより、より良好な測定感度かつ正確な測定を可能とする。【００１２】
ここで、作用極上に、FPOXに加えてメディエーターを固定した場合には、より大きな出力値を得ることができるため、測定試料のヘモグロビンA1c濃度をより正確に測定することができる。【００１３】
なお、作用極上にFPOXまたはFPOXおよびメディエーターに加え、タンパク質分解酵素を固定した場合には、試料の前処理を行うことなく、直接ヘモグロビンA1cの測定に供することができる。【００１４】
一方、ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを同時に測定可能な装置を用いることにより、同一試料から、異なる機能の複数の糖尿病マーカーを同時に測定することが可能となり、被検者の血糖状況の変化を把握することが可能となるのみならず、血糖管理も可能とし得るといったすぐれた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のバッチ式ヘモグロビンA1cセンサを具備する測定装置の一例を示す。
【図２】本発明のフロー式ヘモグロビンA1cセンサを具備する測定装置の一例を示す。
【図３】本発明のフロー式ヘモグロビンA1cセンサを具備する測定装置の他の例を示す。
【図４】ヘモグロビンA1cに対する本ヘモグロビンA1cセンサの応答性を示すグラフである。
【図５】グルコースに対する本ヘモグロビンA1cセンサと併設されたグルコースセンサの応答性を示すグラフである。
【図６】FPOXまたはFAOXを用いた吸光光度法による糖化アミノ酸の測定結果を示すグラフである。
【図７】FPOXまたはFAOXを作用極上に固定したヘモグロビンA1cセンサによる糖化アミノ酸に対する応答性を示すグラフである。
【図８】FPOXまたはFAOXを作用極上に固定したヘモグロビンA1cセンサによる、血球存在下における糖化アミノ酸に対する応答性を示すグラフである。
【図９】FPOXまたはFAOXを用いた吸光光度法による、血球存在下における糖化アミノ酸の測定結果を示すグラフである。
【図１０】本ヘモグロビンA1cセンサによる、血球存在下での糖化アミノ酸に対する応答性において、界面活性剤の効果を示すグラフである。
【図１１】本ヘモグロビンA1cセンサによる、糖化ヘキサペプチドに対する応答性において、界面活性剤の効果を示すグラフである。
【図１２】FPOXまたはFAOXを作用極上に固定したヘモグロビンA1cセンサによる、血球および界面活性剤の存在下での糖化ヘキサペプチドに対する応答性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１６】
１    試料添加部
２    電圧印加部
３    ヘモグロビンA1cセンサ
４    電流値測定部
５    ヘモグロビン測定部
６    濃度演算部
７    配線
８    廃液排出部
９    チューブ
１０  キャリアー
１１  ポンプ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ヘモグロビンA1cセンサ
本発明のセンサは、少なくとも対極および作用極の２つの電極を有し、作用極上にFPOX、好ましくはメディエーターおよび／またはタンパク質分解酵素が固定されている。本発明のセンサとしては、さらに参照極が設けられた３つの電極を有するものが好ましい。【００１８】
ここで、作用極と対極の２つの電極を有するセンサは小型化に適し、作用極、対極および参照極の３つの電極を有するセンサは、高い測定精度の測定に適するといった特徴を有する。【００１９】
電極材料としては、酵素が安定に保持される素材であれば特に制限はなく、例えば白金、白金黒、金、銀、パラジウム、カーボン、カーボンペースト、カーボンナノチューブ、イリジウム、ダイヤモンド等が挙げられる。白金黒としては、例えばスパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法で形成された白金等が挙げられ、またカーボンナノチューブとしては、例えばアーク放電法、気相成長法、レーザー蒸発法等の方法で製造されたものが用いられ、多層または単層のいずれの構造のものも用いられる。対極および参照極と作用極とは、同じ材料でも異なる材料でもよいが、好ましくは作用極と対極は同じ材料からなり、参照極は、これらとは異なる材料のものが用いられる。【００２０】
電極は、そのまま測定試料中に浸漬することによっても使用できるが、絶縁性基板上に形成することもできる。絶縁性基板の素材としてはセラミック、ガラス、プラスチック、生分解性材料、不織布または紙等が挙げられ、基板上への電極の形成は、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって行われる。電極が形成された基板は、フローインジェクションアナリシス(FIA)方式のセンサ部として、またディスポーザブルタイプの簡易センサとして用いられる。【００２１】
糖化ペプチドに作用し、過酸化水素を生成する酵素であるFPOXとしては、例えばフルクトシルバリルヒスチジン(以下Fru-Val-Hisと略記する)、フルクトシルバリン(以下Fru-Valと略記する)を基質とする酵素等が挙げられ、市販品、例えばFPOX-CE(キッコーマン社製)、FPOX-EE（同社製）等がそのまま用いられる。
【特許文献３】特開２００４−２７５０１３
【００２２】
タンパク質分解酵素としては、試料中の糖化タンパク質を糖化ペプチドに分解し得る酵素であれば特に制限はなく、切断を受ける糖化タンパク質あるいは糖化ペプチドの種類に応じ、好適なものを適宜選択して用いることができる。【００２３】
タンパク質分解酵素としては、例えば、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン(ズブチリシン)、カルボキシペプチダーゼＢ、パンクレアチン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼGlu-C、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のペプチド分解酵素をも含めたタンパク質分解酵素が挙げられる。【００２４】
本発明において、特に糖化ジペプチドを効率よく生成するタンパク質分解酵素としては、アスペルギルス由来タンパク質分解酵素、リゾパス由来タンパク質分解酵素、バチルス由来タンパク質分解酵素、ストレプトマイセス由来タンパク質分解酵素、トリチラチウム由来タンパク質分解酵素、スタフィロコッカス由来タンパク質分解酵素、植物由来タンパク質分解酵素、動物由来タンパク質分解酵素等が挙げられる。【００２５】
アスペルギルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「IP酵素」、「AOプロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、「モルシン」(以上キッコーマン社製)、「プロテアーゼA5」(協和化成社製)、「ウマミザイム」、「プロテアーゼA」、「プロテアーゼM」、「プロテアーゼP」(以上天野エンザイム社製)、「スミチームMP」、「スミチームLP-20」、「スミチームLPL」、「スミチームAP」(以上新日本化学工業社製)、「プロテイナーゼ6」(フルカ社製)、「プロテイナーゼTypeXXIII」(シグマ社製)等が挙げられる。【００２６】
リゾパス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「ペプチダーゼR」（天野エンザイム社製)等が挙げられる。【００２７】
バチルス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「ディスパーゼ」(ロシュ社製)、「サチライシン」(ベーリンガー社製)、「プロテイナーゼN」（フルカ社製)、「プロテイナーゼTypeVII」(シグマ社製)、「プロテイナーゼ,Bacterial」(フルカ社製)、「プロテアーゼN」、「プロテアーゼS」、「プロテアーゼN「アマノ」G」、「プロレザーFG-F」、「プロテアーゼS「アマノ」G」(以上天野エンザイム社製)、「プロテイナーゼTypeX」(シグマ社製)、「サーモリシン」(大和化成社製)、「プロナーゼE」(科研化学社製)、「中性プロテアーゼ」(東洋紡績社製)等が挙げられる。【００２８】
ストレプトマイセス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「プロナーゼ」(ベーリンガー・マンハイム社製)、「プロテイナーゼTypeXIV」(シグマ社製)、「アルカリプロテアーゼ」(東洋紡績社製)等があげられる。【００２９】
トリチラチウム由来プロテアーゼとしては、「プロテイナーゼK」(ロシュ社製、和光純薬工業社製)等が挙げられる。【００３０】
スタフィロコッカス由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「Glu-C」(ベーリンガー社製)等が挙げられる。【００３１】
植物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えばパパイン(ロシュ社製、和光純薬工業社製、シグマ社製、天野エンザイム社製、アサヒ社製)、フィシン(シグマ社製)、ブロメライン(天野エンザイム社製、シグマ社製)等が挙げられる。【００３２】
動物由来タンパク質分解酵素の具体例としては、例えば「パンクレアチン」(和光純薬工業社製)、カテプシンB(シグマ社製)等が挙げられる。【００３３】
上記タンパク質分解酵素は、単独で用いても、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ヘモグロビンA1cは、エンドプロテイナーゼGlu-Cにより、糖化ヘキサペプチドFru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu（以下、Fru-6Pと略記する）が生成することが示されている。そのため、Glu-Cと上記糖化ジペプチドを生成するタンパク質分解酵素を組み合わせることは、ヘモグロビンA1cから糖化ジペプチドを製造するのに極めて有効な方法である（Clin. Chem. 1997, 43 1944-1951頁）。【００３４】
FPOX、又はFPOXとタンパク質分解酵素を作用極上に固定する方法としては、該作用極上に酵素を安定に保持し得る方法であれば特に制限はないが、酵素溶液を電極上に滴下して乾燥させる方法、アルブミン-グルタルアルデヒドを用いた架橋法、水溶性光架橋性樹脂を用いた包括法、ミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジョール、テトラフルオロエチレンまたはナフィオン中に混合する方法、試薬を用いた共有結合法などが挙げられる。【００３５】
作用極上には、これらの酵素に加えて好ましくはメディエーターが用いられる。メディエーターとしては、FPOX存在下において電子を生じる反応に関与し、電子と電極との間の授受を効率化するための物質であれば特に制限はないが、例えばフェリシアン化カリウム、メトキシフェナジンメトスルフェート、キノン誘導体、フェロセンまたはその誘導体、オスミウム錯体等が挙げられる。メディエーターを用いることにより、より大きな出力値を得ることができるため、測定試料中のヘモグロビンA1c濃度をより正確に測定することができる。【００３６】
作用極の構成としては、例えば下記の態様が挙げられる。
(1)同一作用極にFPOXのみが固定されている
(2)同一作用極にFPOXとメディエーターが固定されている
(3)同一作用極にFPOXおよびタンパク質分解酵素が固定されている
(4)同一作用極にFPOX、メディエーターおよびタンパク質分解酵素が固定されている【００３７】
作用極上のFPOX、メディエーターおよびタンパク質分解酵素は、少なくとも２種を同一層として形成することもできるが、それぞれ別の層とする多層を形成することもできる。多層を形成する場合には、FPOXが作用極上に直接固定され、タンパク質分解酵素がFPOX層の上に積層されていることが好ましく、またメディエーターが用いられる場合にあっては、作用極とFPOX層との間に、メディエーター層を形成させることが好ましい。【００３８】
さらに、電極上に酵素を効率よく、かつ酵素活性を保持した状態で固定することを目的として、電極上に高分子物質層を設置することもできる。高分子物質としては、例えば、合成高分子物質、多糖類、多孔質等が挙げられ、高分子物質層が設けられる場合には、FPOXを高分子層上に固定することが好ましい。【００３９】
電極は、過酸化水素電極でも酸素電極のいずれであってもよく、過酸化水素電極の場合には、酵素反応によりヘモグロビンA1cから生成した過酸化水素の量を電気化学的に測定することにより、また酸素電極の場合には、ヘモグロビンA1cの酵素反応において消費された酸素の量を電気化学的に測定することにより、ヘモグロビンA1cの濃度が測定される。【００４０】
具体的には、ヘモグロビンA1cにタンパク質分解酵素を作用させることにより生じたFru-Val-Hisに、さらにFPOXを作用させた際に発生するH2O2を、過酸化水素電極では、以下の反応式により生成した電子または消費される電子を電流値として測定することにより、ヘモグロビンA1cより発生した過酸化水素の量が電気化学的に測定される。
電極による酸化の場合：H2O2 → O2 + 2H+ + 2e- 
電極による還元の場合：H2O2 + 2H+ + 2e- → 2H2O【００４１】
また、酸素電極の場合、以下の反応式により消費される電子を電流値として測定することにより、ヘモグロビンA1cの酵素反応において消費された酸素の量が電気化学的に測定される。
O2 + 2H+ + 2e- → H2O2【００４２】
酵素反応により生成または消費される電子の測定法としては、電子を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えばクロノアンペロメトリー、サイクリックボルタンメトリー、クーロメトリー等が用いられる。【００４３】
ヘモグロビンA1c測定用試料としては、ヘモグロビンA1cを含有している試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球を含有する試料等が挙げられる。測定に際しては、試料に遠心分離、洗浄操作、希釈、濃縮、界面活性剤添加、加熱等の処理を施すことができる。また、試料は予め前述のタンパク質分解酵素を作用させたものを用いることができる。【００４４】
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられ、好ましくは両性界面活性剤が用いられる。【００４５】
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。【００４６】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。【００４７】
陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。【００４８】
両性界面活性剤としては、例えばベタイン類、グリシン類、アラニン類、2-アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。【００４９】
本発明に係るヘモグロビンA1cセンサの形態は、利用者がこのセンサを利用できる形態であれば特に制限はない。またこのセンサは繰り返し使用することもできるが、使い捨てされてもよい。【００５０】
本発明に係るヘモグロビンA1cセンサを用いたヘモグロビンA1cの測定方法としては、試料中のヘモグロビンA1cの測定を可能とする形式であれば特に制限はなく、例えば試料が流路を通じて電極に到達するフロー式、１反応容器内で試料と電極が接触するバッチ式あるいは電圧印加・出力測定器に電極の一端部の端子を接続するチップ式などが挙げられる。【００５１】
ヘモグロビンA1c測定方法
本発明のヘモグロビンA1c測定方法は、本発明のヘモグロビンA1cセンサを用いて、試料中のヘモグロビンA1cを測定する方法である。測定は、例えば以下の工程を含有して行うことができる。
（１）検量線を作成する工程
（２）試料を本発明のヘモグロビンA1cセンサに適用して、該試料のヘモグロビンA1cに対する電流値を測定する工程
（３）上記（１）で作成した検量線と（２）での電流値から試料中のヘモグロビンA1cを測定する工程【００５２】
ここで、試料中の総ヘモグロビン濃度から、総ヘモグロビンに対するヘモグロビンA1cの割合を算出することができる。総ヘモグロビンの濃度は、公知のヘモグロビンを測定する方法であればいかなる方法も用いることができ、例えばメトヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（SLS）法、アルカリヘマチン法、緑色発色団形成法またはオキシヘモグロビン法などが挙げられる。【００５３】
なお、検量線の作成に使用する標準品としては、既知濃度のヘモグロビンA1c、あるいは、Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu、Fru-Val-His等の糖化ペプチド、Fru-Val等の糖化アミノ酸を用いることができる。【００５４】
ヘモグロビンA1c測定装置
ヘモグロビンA1c濃度は、ヘモグロビンA1c測定装置によって測定される。測定装置は、少なくともヘモグロビンA1cセンサが試料と接触した場合に発生する電流値を検出する機構を備えているものであり、好ましくはヘモグロビン測定部と、ヘモグロビンA1c(％)を算出する濃度演算部などを具備するものである。例えば、バッチ式のヘモグロビンA1cセンサを用いた場合の測定装置を図１に、フロー式のヘモグロビンA1cセンサを用いた場合の測定装置を図２および図３に測定装置の一例として示す。いずれの場合においても、試料添加部１より供給された試料について、電圧印加部２に接続されたヘモグロビンA1cセンサ３により試料中のヘモグロビンA1c量に応じた電流値を電流値測定部４で測定する一方で、ヘモグロビン測定部５によってヘモグロビン濃度を測定し、最終的にこれらの値より濃度演算部６においてヘモグロビンA1c濃度を算出するといった態様となっている。図１および図２は、ヘモグロビン測定部とヘモグロビンA1cセンサが並列である装置を示し、図３は、ヘモグロビン測定部とヘモグロビンA1cセンサが直列である装置を示している。【００５５】
電流値測定部４は、試料添加部１より供給されたヘモグロビンA1cとヘモグロビンA1cセンサ３の作用極上に固定された酵素との反応において生成または消費された電子を、ポテンシオスタット等の電圧印加部２によって電圧を印加することにより電流値として測定し、表示する部位である。【００５６】
ここでヘモグロビン測定部５においては、ヘモグロビン量が測定される。これは、試料添加部１より供給されたヘモグロビンA1c量のヘモグロビン量に対する割合を算出することによりヘモグロビンA1c濃度を測定するために必要である。このヘモグロビン量の測定には、周知の方法を用いることができ、好ましくは吸光度測定が用いられる。ヘモグロビン測定部は、特にバッチ式などの場合、センサと同一部とすることもできる。【００５７】
濃度演算部６は、ヘモグロビンA1cセンサ３により測定されたヘモグロビンA1c量と、ヘモグロビン測定部５において測定されたヘモグロビン量とから、ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1c量の割合を算出する部位である。【００５８】
フロー式のヘモグロビンA1cセンサを具備するヘモグロビンA1c測定用装置を用いる場合のキャリアー１０としては、試料を検出部位まで送液するための水性媒体であれば特に制限はないが、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、好ましくは緩衝液が用いられる。緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられ、そのpHは好ましくは1〜11、さらに好ましくは4〜10で用いられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、好ましくは0.001〜2.00mol／L、さらに好ましくは0.005〜1.00mol／L、特に好ましくは0.01〜0.50mol／Lで用いられる。かかるキャリアーには、必要に応じて、界面活性剤、高分子物質、塩類、糖類、pH調整剤、防腐剤等を添加することもできる。【００５９】
またポンプ１１としては、試料を上記のキャリアー１０により、チューブ９を通じてヘモグロビンA1cセンサ３に送達させ得るものであれば特に制限はなく、廃液排出部８は、ヘモグロビンA1cセンサ３またはヘモグロビン測定部５を通過した反応液が排出される部位である。【００６０】
ヘモグロビンA1cおよび他の糖尿病マーカーの同時測定センサまたは同時測定装置
本発明に係るヘモグロビンA1cセンサは、ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーを検出するための酵素を固定した作用極をFPOXを固定した作用極とは別に設けることにより、あるいは測定装置の構成として、ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーの測定部をヘモグロビンA1cセンサとは別に設けることにより、ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーをヘモグロビンA1cと同時に測定することが可能となる。【００６１】
ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーとしては、例えばグルコース、グリコアルブミン、1,5-アンヒドログルシトール等が挙げられる。測定装置の構成として、ヘモグロビンA1c以外の糖尿病マーカーの測定部を設ける場合には、その測定部としてはセンサ、または必要に応じて分光光度計で目的物質を測定するための試薬等を具備した分光光度計などが用いられる。【００６２】
例えばグルコースを測定するにあたっては、グルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素が固定された作用極などを、グリコアルブミンを測定するにあたっては、タンパク質分解酵素およびFAOXが固定された作用極などを、1,5-アンヒドログルシトールを測定にあたっては、ヘキソキナーゼおよび1,5-アンヒドログルシトール-6-リン酸脱水素酵素が固定された作用極などを有するセンサなどが用いられうる。【００６３】
また、分光光度計を用いた測定方法としては例えば、酸化還元酵素反応によって生成した過酸化水素を、酸化発色型色原体およびパーオキシダーゼなどの過酸化活性物質により色素を検出物質として測定する方法、脱水素酵素反応におけるNADなどの酸化型補酵素の変化量を、補酵素が反応することにより生成する還元型補酵素をその極大吸収波長域付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用いて直接定量する方法、生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェートなどの電子キャリアーおよびニトロテトラゾリウム、WST-1（同仁化学研究所社製）、WST-8（同社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用いて間接的に測定する方法、またはこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例について本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６５】
実施例１
ヘモグロビンA1cとグルコースの同時測定
セラミック基板上に、スクリーン印刷法を用いて対極および作用極からなる白金電極を、いずれも面積が1 mm2となるように作製し、作用極上に下記組成からなるドープ液5 μLを滴下し、40℃で30分間乾燥して作用極上に0.5 unitsのフルクトシルペプチド酸化酵素を含有する膜が形成されたヘモグロビンA1cセンサを作製した。
＜ドープ液＞
FPOX (FPOX-CE：キッコーマン社製)                           100 units
牛血清アルブミン(A-4503：シグマ社製)                          10 mg
20%グルタルアルデヒド水溶液(和光純薬工業社製)            10 μL
純水                                                                       1 mL【００６６】
次いで、上記ヘモグロビンA1cセンサの作製において、ドープ液調製に用いられたFPOXの代わりに、グルコース酸化酵素(G-7016：シグマ社製)2000 unitsを用いて同様にセンサの作製を行い、作用極上に10 unitsのグルコース酸化酵素を固定化した膜を形成したグルコースセンサを作製した。【００６７】
得られたヘモグロビンA1cセンサおよびグルコースセンサを、プランジャーポンプ、1/16インチチューブよりなるキャリアー流路、インジェクター、ヘモグロビンA1cセンサ用セル、グルコースセンサ用セル、ポテンシオスタット(BAS社製)を備えた測定装置のヘモグロビンA1cセンサ用セル、グルコースセンサ用セルにそれぞれセットした。【００６８】
上記測定装置を用いて、ヘモグロビンA1cおよびグルコースの測定を行った。キャリアーとして、pH7.5の0.1 mol/L Tris-HClバッファーを用い、室温、流速1.4 mL/分、作用極への印加電圧0.6 Vという条件下で測定を行った。基質サンプルとして、下記サンプルをそれぞれ20 μLずつ用いた。
＜ヘモグロビンA1c測定用サンプル＞
ヘモグロビンA1cのβ鎖N末端の６アミノ酸配列を有する糖化ヘキサペプチド(Fru-6P：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)を所定濃度となるようにpH7.5の0.1 mol/L Tris-HClバッファー溶液に溶解した溶液に、タンパク質分解酵素(プロテイナーゼTypeXXIII)を1 unit/mLとなるように作用させて調製したフルクトシルジペプチドFru-Val-Hisをサンプルとした。
＜グルコース測定用サンプル＞
グルコース(シグマ社製)を所定濃度となるようにpH7.5の0.1 mol/L Tris-HClバッファー溶液に溶解したものをサンプルとした。【００６９】
得られた結果は、図４および図５のグラフに示される。これらのグラフに示される如く、上記測定装置により、ヘモグロビンA1cとグルコースを同時に測定し得ることが確認された。【００７０】
参考例１
吸光光度法によるFAOXを用いた糖化アミノ酸の測定
PBS(0.05 mol/Lリン酸ナトリウム、pH 7.5、0.9% 塩化ナトリウム)を用いて調製した、所定濃度の基質サンプルを含有する0.25 units/mLのFAOX(FAODL：キッコーマン社製)溶液 0.5mLを、37℃で30分間加温した。ここで、基質サンプルとして、ヘモグロビンA1cのβ鎖N末端の糖化アミノ酸(Fru-Val；ペプチド研究所社製)を用いた。次いで、PBSを用いて調製した0.025 mmol/LのN-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4,4′-ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン・ナトリウム塩(DA-64：和光純薬工業社製)および10 U/mLの西洋わさび由来パーオキシダーゼ(東洋紡績社製)を含有する発色用溶液0.5 mLを添加し、37℃で5分間加温し、727 nmにおける吸光度を測定して、吸光光度法におけるFAOXの糖化アミノ酸に対する応答性を評価した。【００７１】
参考例２
吸光光度法によるFPOXを用いた糖化アミノ酸の測定
参考例１において、FAOX溶液の代わりに同濃度のFPOX(FPOX-CE)溶液が同量用いられた。【００７２】
参考例１および２で得られた結果は、図６のグラフに示される。このグラフに示されるように、FPOXを用いた場合(●)にも、FAOX(□)と同感度で糖化アミノ酸を測定できることが確認された。【００７３】
実施例２
FPOXを用いた電極法による糖化アミノ酸の測定
面積が7mm2の対極および作用極からなる白金電極を用い、作用極上に下記組成からなるドープ液10 μLを滴下し、40℃、30分間乾燥して作用極上に1 unitのFPOXを含有する膜が形成されたヘモグロビンA1cセンサを作製した。
＜ドープ液＞
FPOX(FPOX-CE)                                              100 units
牛血清アルブミン(Proliant社製)                              10 mg
20%グルタルアルデヒド水溶液(和光純薬工業社製)       10 μL
純水                                                                 1 mL【００７４】
次いでヘモグロビンA1cセンサを、電気化学アナライザー(BAS社製)を接続したバッチ式の測定装置にセットした。この測定装置を用いて、所定濃度の基質サンプルを含有する4 mLのPBS中で、作用極への印加電圧0.6 V、室温の条件下で基質サンプルの測定を行った。ここで、基質サンプルとしては、参考例１と同じものを用いた。【００７５】
比較例１
FAOXを用いた電極法による糖化アミノ酸の測定
実施例２において、ドープ液の調製にFPOXの代わりに、FAOX(FAODL)100 unitsを用いる以外は実施例２と同様の方法によりヘモグロビンA1cセンサの作製と、当該センサを用いた測定を行った。【００７６】
以上の実施例２および比較例１で得られた結果を、図７のグラフに示す。実施例２(●)の方が、比較例１(□)よりも高い電流値が得られることを確認した。【００７７】
実施例３
FPOXを用いた電極法による血球存在下での糖化アミノ酸の測定
実施例２において、基質サンプル含有PBSの代わりに、該基質サンプル含有PBSに洗浄血球を1％存在させたものを用いる以外は実施例２と同様の方法により測定を行った。洗浄血球は、EDTA・2Na採血管で採取した血液に、4倍の容量のPBSを添加して、3000 rpmで10分間遠心分離後、上清を除いたうえ、沈殿の血球に4倍の容量のPBSを添加して懸濁し、3000 rpmで10分間遠心分離して、上清を除く洗浄操作を3回繰り返した後、得られた沈殿に対して9倍容量の蒸留水を添加して血球を溶血させ、10％の洗浄血球溶液として調製したものを用いた。【００７８】
比較例２
FAOXを用いた電極法による血球存在下での糖化アミノ酸の測定
実施例２において、ドープ液の調製にFPOXの代わりに、FAOX(FAODL)100 unitsを用いる以外は実施例２と同様の方法により作製されたヘモグロビンA1cセンサと、基質サンプル含有PBSの代わりに、該基質サンプル含有PBSに洗浄血球を１％存在させたものとを用いる以外は実施例２と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例３と同じものを用いた。【００７９】
以上の実施例３および比較例２で得られた結果を、図８のグラフに示す。実施例３(●)では、比較例２(□)に比べて著しく高感度に糖化アミノ酸を測定できることを確認した。【００８０】
比較例３
吸光光度法によるFPOXを用いた血球存在下での糖化アミノ酸の測定
参考例２において、基質サンプル含有FPOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を１％存在させた基質サンプル含有FPOX溶液を用いる以外は参考例２と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例３と同じものを用いた。【００８１】
比較例４
吸光光度法によるFAOXを用いた血球存在下での糖化アミノ酸の測定
参考例１において、基質サンプル含有FAOX溶液の代わりに、さらに洗浄血球を１％存在させた基質サンプル含有FAOX溶液を用いる以外は参考例１と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例３と同じものを用いた。【００８２】
以上の比較例３および比較例４で得られた結果を、図９のグラフに示す。このグラフに示される如く、血球が酵素溶液に存在する条件ではFPOX(比較例３：●)とFAOX(比較例４：□)のいずれの酵素を用いた場合にも糖化アミノ酸は測定できないことが確認された。【００８３】
実施例４
界面活性剤の効果：電極法による血球存在下での糖化アミノ酸の測定
実施例３において、基質サンプル含有PBS溶液の代わりに、さらに界面活性剤であるドデシルジメチルアミンオキサイド(アンヒトール20N：花王社製)を0.5％存在させた基質サンプル含有PBS溶液を用いる以外は実施例３と同様の方法で測定を行った。得られた結果を、実施例３の結果とともに、図１０のグラフに示す。界面活性剤非存在下(実施例３：□)と比較して、糖化アミノ酸の測定において界面活性剤が存在することにより、電流値が上昇することを確認した(実施例４：●)。【００８４】
実施例５
電極法による糖化ヘキサペプチドの測定
実施例２において、基質サンプル含有PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化ヘキサペプチド(Fru-6P：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)および1000 units/mLのタンパク質分解酵素を含むPBS溶液を37℃、10分間加温した後、95℃、5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例２と同様の方法により測定を行った。【００８５】
実施例６
界面活性剤の効果：電極法による糖化ヘキサペプチドの測定
実施例２において、基質サンプル含有PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化ヘキサペプチド(Fru-6P：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)、1000 units/mLのタンパク質分解酵素および0.5％ドデシルジメチルアミンオキサイド(アンヒトール20N)を含むPBS溶液を37℃、10分間加温した後、95℃、5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例２と同様の方法により測定を行った。【００８６】
以上の実施例５および６で得られた結果を、図１１のグラフに示す。このグラフに示される如く、電極法による糖化ヘキサペプチドの測定においても、界面活性剤非存在下(実施例５：□)と比較して、界面活性剤存在下(実施例６：●)では、電流値が上昇することを確認した。【００８７】
実施例７
界面活性剤の効果：電極法による血球存在下での糖化ヘキサペプチドの測定
実施例２において、基質サンプル含有PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化ヘキサペプチド(Fru-6P：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)、1000 units/mLのタンパク質分解酵素、１％洗浄血球および0.5％ドデシルジメチルアミンオキサイド(アンヒトール20N)を含むPBS溶液を37℃、10分間加温した後、95℃、5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は実施例２と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例３と同じものを用いた。【００８８】
比較例５
比較例１において、基質サンプル含有PBS溶液の代わりに、所定濃度の糖化ヘキサペプチド(Fru-6P：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；ペプチド研究所社製)、1000 units/mLのタンパク質分解酵素、１％洗浄血球および0.5％ドデシルジメチルアミンオキサイド(アンヒトール20N)を含むPBS溶液を37℃、10分間加温した後、95℃、5分間加温することによりタンパク分解酵素を失活させたものを用いる以外は比較例１と同様の方法により測定を行った。ここで、洗浄血球としては、実施例３と同じものを用いた。【００８９】
以上の実施例７および比較例５で得られた結果を、図１２のグラフに示す。このグラフに示されるが如く、電極法による血球および界面活性剤の存在下での糖化ヘキサペプチドの測定において、FPOXを用いて作製されたセンサを用いた実施例７(●)はFAOXを用いて作製されたセンサを用いた比較例５(□)に比べて著しく高感度に糖化ペプチドを測定できることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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