(57)【要約】  本発明によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化に関連する特定の新規変異を有する変異型ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、およびｍｓｒＲ遺伝子をコードするものである。このような新規変異を検出することにより、グリコペプチド低感受性菌を迅速かつ簡便に検出することができる。本発明によれば、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化に関連する変異型遺伝子およびそれにおける遺伝子変異をコードするポリヌクレオチド、およびそのような変異を検出するための核酸分子、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出方法、該ポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質を提供することができる。
2007080874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
アミノ酸変異が、下記（ａ１）〜（ａ８）からなる群より選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド：
（ａ１）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のＲ（アルギニン）がＨ（ヒスチジン）またはＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｈ９１、またはアミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）；
（ａ２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１９番目のＷ（トリプトファン）がＲ（アルギニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｗ→Ｒ１１９）；
（ａ３）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２５番目のＴ（トレオニン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）；
（ａ４）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２６番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１２６）；
（ａ５）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５４番目のＩ（イソロイシン）がＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｖ１５４）；
（ａ６）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７３番目のＬ（ロイシン）がＷ（トリプトファン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｗ１７３）；
（ａ７）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７４番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）；および
（ａ８）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の２２２番目のＳ（セリン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ２２２）。
【請求項３】
前記（ａ１）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の２７２番目のＧがＡまたはＴに変異することによるものであり、
前記（ａ２）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３５５番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ａ３）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３７４番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ａ４）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３７６番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ａ５）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の４６０番目のＡがＧに変異することによるものであり、
前記（ａ６）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５１８番目のＴがＧに変異することによるものであり、
前記（ａ７）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５２０番目のＣがＴに変異することによるものであり、かつ
前記（ａ８）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の６６５番目のＣがＴに変異することによるものである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が１μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ
アミノ酸変異が、
（ａ１’）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のＲ（アルギニン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）；および
前記（ａ２）〜（ａ８）の変異
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ
アミノ酸変異が、前記（ａ１’）、（ａ２）、（ａ６）および（ａ７）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、
配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記（ｂ１）〜（ｂ１６）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド：
（ｂ１）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８番目のＩ（イソロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｆ８）；
（ｂ２）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６番目のＩ（イソロイシン）がＭ（メチオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｍ４６）；
（ｂ３）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の５４番目のＬ（ロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｆ５４）；
（ｂ４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８７番目のＥ（グルタミン酸）がＫ（リジン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ８７）；
（ｂ５）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８８番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｇ→Ｄ８８）；
（ｂ６）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の１３８番目のＶ（バリン）がＭ（メチオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ｍ１３８）；
（ｂ７）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の１７２番目のＡ（アラニン）がＴ（トレオニン）またはＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ａ→Ｔ１７２、またはアミノ酸変異Ａ→Ｖ１７２）；
（ｂ８）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３４番目のＭ（メチオニン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｍ→Ｉ２３４）；
（ｂ９）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３６番目のＶ（バリン）がＡ（アラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ａ２３６）；
（ｂ１０）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２４６番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ２４６）；
（ｂ１１）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２６０番目のＡ（アラニン）がＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ａ→Ｖ２６０）；
（ｂ１２）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２６４番目のＴ（トレオニン）がＡ（アラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｔ→Ａ２６４）；
（ｂ１３）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３０７番目のＬ（ロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｆ３０７）；
（ｂ１４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２１番目のＦ（フェニルアラニン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｆ→Ｌ３２１）；
（ｂ１５）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２８番目のＤ（アスパラギン酸）がＮ（アスパラギン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｄ→Ｎ３２８）；および
（ｂ１６）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３３８番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ３３８）。
【請求項８】
前記（ｂ１）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２２番目のＡがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ２）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１３８番目のＡがＧに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ３）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１６０番目のＣがＴに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ４）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２５９番目のＧがＡに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ５）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２６３番目のＧがＡに変異することによるものであり、
前記（ｂ６）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の４１２番目のＧがＡに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ７）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の５１４番目のＧがＡに変異に変異することによるか、または、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の５１５番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ８）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７０２番目のＧがＡに変異することによるものであり、
前記（ｂ９）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７０７番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ｂ１０）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７３６番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１１）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７７９番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１２）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７９０番目のＡがＧに変異することによるものであり、
前記（ｂ１３）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９１９番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１４）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９６１番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ｂ１５）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９８２番目のＧがＡに変異することによるものであり、かつ
前記（ｂ１６）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１０１２番目のＣがＴに変異することによるものである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ
アミノ酸変異が、前記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ５）、（ｂ７）、（ｂ１０）、（ｂ１５）および（ｂ１６）からなる群より選択される、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、
配列番号６で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列が、下記（ｃ１）および（ｃ２）からなる群より選択される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド：
（ｃ１）  配列番号６で表されるアミノ酸配列の１４番目のＶ（バリン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ｉ１４）；および
（ｃ２）  配列番号６で表されるアミノ酸配列の１８番目のＩ（イソロイシン）がＴ（トレオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｔ１８）。
【請求項１３】
前記（ｃ１）のアミノ酸変異が、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の４０番目のＧがＡに変異することによるものであり、かつ
前記（ｃ２）のアミノ酸変異が、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の５３番目のＴがＣに変異することによるものである、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｍｓｒＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、
配列番号８で表されるアミノ酸配列において、下記（ｄ１）〜（ｄ３）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド：
（ｄ１）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の２３０番目のＲ（アルギニン）がＣ（システイン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｃ２３０）；
（ｄ２）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の２９２番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ２９２）；および
（ｄ３）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の１４６番目のＥ（グルタミン酸）がＫ（リジン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ１４６）。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、前記（ｄ１）および（ｄ２）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記（ｄ１）のアミノ酸変異が、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の６８８番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｄ２）のアミノ酸変異は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の８７４番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｄ３）のアミノ酸変異は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の４３６番目のＧがＡに変異することによるものである、請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｔｃａＡ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、
配列番号９で表されるヌクレオチド配列において、下記（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有してなる、ポリヌクレオチド：
（ｅ１）  配列番号９で表されるヌクレオチド配列の２１１番目のＡがＴに置換されてなる変異（ナンセンス変異）；
（ｅ２）  配列番号９で表されるヌクレオチド配列の１０３番目と１０４番目の間に、ＣＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴ（配列番号１１）の１１塩基が挿入されてなる変異（フレームシフトの結果、ナンセンス変異を伴う）；および
（ｅ３）  配列番号１２で表されるトランスポゾンの挿入によるｔｃａＡ遺伝子の機能欠失を伴う変異。
【請求項２０】
グリコペプチド低感受性化が、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
下記（ｉ）〜（iii）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）  請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸変異に関与する部位以外の領域において、さらに、アミノ酸配列の１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド；
（ii）  請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされてなるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチドであって、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に、該微生物のグリコペプチド感受性を低下させる機能を有する、ポリヌクレオチド；および
（iii）  請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して７０％以上の同一性を有する配列からなる、ポリヌクレオチドであって、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に、該微生物のグリコペプチド感受性を低下させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ブドウ球菌属に属する微生物が黄色ブドウ球菌である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされてなる、ポリペプチド。
【請求項２４】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するための核酸分子であって、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと、ハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２５】
ヌクレオチド断片が、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアミノ酸変異をコードするヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列を含む領域にハイブリダイズする、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
鎖長が１０〜１００ヌクレオチドの核酸プローブである、請求項２４または２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するためのプライマーセットであって、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアミノ酸変異を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができる、プライマーセット。
【請求項２８】
グリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物の検出方法であって、
被検体のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子において、請求項２、７、１２、１５および１９に記載の（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異を、少なくとも１種検出することを含んでなる、方法。
【請求項２９】
前記（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異を検出することに加えて、
下記（ｂ１７）および（ｂ１８）、からなる群より選択される少なくとも１種の変異の検出を組み合わせて行う、請求項２８に記載の方法：
（ｂ１７）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の５番目のＩ（イソロイシン）がＮ（アスパラギン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）；
（ｂ１８）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２９番目のＳ（セリン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ３２９）。
【請求項３０】
変異の検出を、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子と、被検体由来のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、またはｔｃａＡ遺伝子とがハイブリダイゼーションするか否か確認することによって行う、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
変異の検出を、請求項２７に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅法を行い、増幅産物が得られるか否かを確認することによって行う、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
２種以上の変異を検出した場合に、被検体がグリコペプチド低感受性ブドウ球菌であると判定する工程をさらに含んでなる、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子における変異を検出する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
下記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれか１つの変異の組み合わせが共に検出された場合に、検体がグリコペプチド低感受性の微生物であると判定する工程をさらに含んでなる、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法：
（Ａ）  前記（ｂ１）〜（ｂ１８）から選択される変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）〜（ｄ３）から選択される変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｂ）  前記（ｂ１７）の変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｄ３）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｃ）  前記（ｂ１）〜（ｂ１８）から選択される変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）〜（ｅ３）から選択される変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｄ）  前記（ｂ２）の変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｅ３）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｅ）  前記（ａ１）〜（ａ８）から選択される変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）〜（ｄ３）から選択される変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｆ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｇ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ２）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｈ）  前記（ａ１）〜（ａ８）から選択される変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）〜（ｅ３）から選択される変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｉ）  前記（ａ３）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；および
（Ｊ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ２）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ。
【請求項３５】
ブドウ球菌属に属する微生物が黄色ブドウ球菌である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するためのグリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物の検出用キットであって、
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項２７に記載のプライマーセットを含んでなる、キット。
【請求項３７】
目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するためのＤＮＡチップであって、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子が基板上に固定されてなる、ＤＮＡチップ。
【請求項３８】
請求項２３に記載のポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質。
【請求項３９】
請求項２３に記載のポリペプチドを用いる、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質のスクリーニング方法であって、
請求項２３に記載のポリペプチドと結合し得る候補物質を、該ポリペプチドとの親和性に基づいて選択し、得られた候補物質を、グリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物に適用して、微生物のグリコペプチド感受性の変化を測定することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２００６−２５９９号（出願日：２００６年１月１０日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、黄色ブドウ球菌のようなブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化に関連する変異遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。詳しくは、本発明は、ブドウ球菌の染色体上に特異的に存在する、ＳＡ１７０２遺伝子、およびｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲ遺伝子の計５遺伝子において、ブドウ球菌のグリコペプチド感受性の低下と相関する新規な変異遺伝子をコードするポリヌクレオチド、そのような変異を検出するための核酸分子、および、そのような変異に基づいてグリコペプチド低感受性のブドウ球菌を検出する方法に関する。さらには、本発明は、前記ポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質にも関する。
【０００３】
背景技術
黄色ブドウ球菌は、ペニシリン、セフェム、カルバペネムなどのβ−ラクタム系抗菌薬に耐性を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：methicillin-resistant Staphylococcus aureus、以下において「ＭＲＳＡ」と略すことがある）を含み、院内感染の主要な原因菌として、有効な抗菌薬が限られているために、大きな医療問題となっている。
【０００４】
ＭＲＳＡ感染治療は、アミノ配糖体系抗菌薬であるアルベカシンに加えて、バンコマイシンなどのグリコペプチド系抗菌薬に頼ってきたが、１９９７年に、日本の病院において、バンコマイシン治療の奏功しなかった臨床症例から、グリコペプチド系抗菌薬に対しても低感受性であるＭＲＳＡが検出された［Hiramatsu, K. et al.,J.Antimicrob.Chemother. 40:135-136, 1997］。この菌株は、ＶＲＳＡ（vancomycin-resistant S.aureus）、ＶＩＳＡ（vancomycin-intermediate S.aureus）、あるいはＧＩＳＡ（glycopeptide-intermediate S.aureus）と呼ばれ、１９９７年以降、米国、フランス、韓国、南アフリカ、ブラジルなどの世界各国においても分離されるようになり、現代医療の大きな問題となっている［Hiramatsu, K. et al.,Lancet Infect. Dis.1:147-155, 2001］。
【０００５】
１９９７年に、ＶＩＳＡのみならず、ＶＩＳＡを高頻度に生み出す前駆細胞株へテロＶＩＳＡが存在することが明らかとされた［Hiramatsu, K. et al.,Lancet.350:1670-1673］。ＶＩＳＡの分離頻度が稀であるのに対し、ヘテロＶＩＳＡの分離頻度は、報告によって差はあるものの１０％前後と考えられ、近年、世界各国よりその分離が報告され上昇傾向が認められる［Song, JH. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.48:4926-4928, 2004］。ヘテロＶＩＳＡの臨床的意義については、未だ議論の余地はあるものの、同菌の感染によってバンコマイシンによる治療に抵抗を示すことがある［Moore, MR. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.47:1262-1266, 2003］。さらに、ＶＩＳＡの出現はヘテロＶＩＳＡの流行と密接に関連があると考えられており、ＶＩＳＡの出現を防止する意味からも、ヘテロＶＩＳＡの存在は問題視されている。
【０００６】
バンコマイシン、テイコプラニンなどのグリコペプチド系抗菌薬は、ＭＲＳＡの数少ない治療薬であるから、感度の良いグリコペプチド感受性テストが実施されることが望ましい。しかしながら、ＶＩＳＡは、従来の自動化された最小発育阻止濃度（以下「ＭＩＣ」と略すことがある）測定機器や、ディスク拡散法などを用いた検査では容易に検出することができないとされている［Tenover, FC. et al.,J. Clin. Microbiol.36:1020-1027, 1998］。さらに、ヘテロＶＩＳＡにいたっては、これら汎用される従来の感受性テストでは、いずれも感受性菌と区別ができず、きわめて厳密な品質管理化におけるＭＩＣ測定でも、ヘテロＶＩＳＡは検出できないとされている［Wootton, M. et al.,J. Antimicrob. Chemother. 47:399-403, 2001］。
【０００７】
ヘテロＶＩＳＡの検出には、理想的にはポピュレーション解析が望ましいが、多大な労力および費用が必要となるため、より簡易的かつ精度の高い検出方法の開発が求められている。一般的なヘテロＶＩＳＡの定義は、ＭＩＣではバンコマイシンに感受性（バンコマイシンのＭＩＣ：≦４μｇ／ｍＬ）であるが、１０−６以上の頻度でＶＩＳＡを生み出すこととされている［Hiramatsu, K. et al.,Lancet.350:1670-1673］。しかしながら、この定義に従った検出方法については、ヘテロＶＩＳＡの存在について否定的な報告もあり［Ike, Y. et al.,J. Clin. Microbiol.39:4445-4451, 2001］、データの再現性も乏しいとされている［Howe, RA. et al.,J. Antimicrob. Chemother. 44:675-678, 1999］。さらには、各施設の研究者間で検出方法が異なっており、コンセンサスが得られていない［Liu, C. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.47:3040-3045, 2003］。
【０００８】
近年、ヘテロＶＩＳＡの検出方法としてＭｕ３培地を用いる方法が開発されている［特許第３０１４０９０号公報（日本国特許公報）］。この方法はβ−ラクタム系抗菌薬とバンコマイシンの併用時の拮抗現象を利用したものである。しかしながら、この方法は、ＶＩＳＡとヘテロＶＩＳＡの区別がつきにくい点、および、感受性菌とヘテロＶＩＳＡの中間に属する場合の判定が難しいという点で、課題が残されていた。また、この方法による判定結果は、植菌量やＭｕ３培地に含まれるバンコマイシン濃度に影響を受けるため、拮抗現象がヘテロＶＩＳＡに特異的な現象とは必ずしも言えない。
【０００９】
また、バンコマイシンの耐性化機構が細胞壁の肥厚であることから、菌の生理活性（細胞壁合成能力）を利用したグリコペプチド低感受性黄色ブドウ球菌の検出方法が見出されている［特開２００１−２７５６９６号公報（日本国特許公開公報）］。しかしながら、この方法もＭｕ３培地による検出方法と同様に、ＶＩＳＡとヘテロＶＩＳＡの区別がつき難く、感受性菌とヘテロＶＩＳＡの中間に属する場合の判定が難しいものである。また、一般にグリコペプチド耐性はその性質が不安定とされており［Boyle-Vavra, S. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.44:272-277, 2000］、この方法では、ＶＩＳＡとヘテロＶＩＳＡの定義を明確にするのは難しいと考えられる。
【００１０】
このように、ＶＩＳＡやヘテロＶＩＳＡをその表現形に基づいて検出することは極めて困難であると言うことができ、従来のグリコペプチド低感受性黄色ブドウ球菌の検出方法では、充分な検出結果を得ることは難しいと考えられる。このため、グリコペプチド低感受性を引き起こす遺伝子および遺伝子変異を見出すことは、極めて重要であると言える。
【００１１】
黄色ブドウ球菌におけるグリコペプチド耐性の発現に関与する遺伝子は染色体上に存在すると想定されており、これまでにその探索が様々に行われてきた。
臨床でのＶＩＳＡの分離頻度は稀であるため、これまでは主に、実験的に取得したグリコペプチド低感受性菌を用いて解析が進められてきた。例えば、グリコペプチド低感受性に関与する因子として、ｔｃａＡ［Maki, H. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.48:1953-1959, 2004］、および、ｓｉｇＢオペロン［Bischoff, M. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.45:1714-1720, 2001］などが報告されている。また、一部の臨床分離株についても解析が進められている。特に、ＶＩＳＡであるＭｕ５０株は、その全ゲノム配列が解読されており、in silico比較解析で、機能が欠損していると考えられる遺伝子が明らかとなっている［Avison, MB. et al.,J. Antimicrob. Chemother. 49:255-260, 2002］。しかしながら、そのような遺伝子がグリコペプチド低感受性に関与しているか否かについては何ら示されていない。また、Ｍｕ５０株以外のＶＩＳＡに至っては、本発明者らの知る限り、解析はほとんど行われていない。
【００１２】
このように、黄色ブドウ球菌において、グリコペプチド低感受性化に関与する因子は多数存在することが予想されるものの、未だ充分に解明されておらず、未同定・未報告の遺伝子および遺伝子変異が少なからず存在するものと考えられる。  
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは今般、実験的に取得したグリコペプチド感受性の異なる変異株の遺伝子を詳細に解析して、ブドウ球菌において、グリコペプチド低感受性に関与する遺伝子および遺伝子変異を同定することに成功した。まず本発明者らは、グリコペプチド低感受性への関与が疑われる因子として、細菌の種々の環境応答に関わる制御系として幅広く知られているシステム、すなわち二成分制御系に着目した。そして、グリコペプチド低感受性への何らかの関与が既に報告されている遺伝子を加え、それらと染色体上で近傍に存在する遺伝子も含めて網羅的に解析した。最終的に計６８遺伝子の配列を解析した結果、目的とする遺伝子および遺伝子変異を発見し、同定することに成功した。さらに、臨床分離のブドウ球菌についても同様に解析を行ったところ、グリコペプチド感受性の低下したほぼすべての株が、実験株では存在しなかった新規の遺伝子変異を含め、特定の遺伝子上に変異を有することを見出した。すなわち、新たにブドウ球菌の染色体上に特異的に存在するＳＡ１７０２遺伝子が、グリコペプチド低感受性へ関与していることが明らかとなった。ＳＡ１７０２遺伝子に、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲを加えた計５遺伝子において、グリコペプチド感受性の低下と相関する新規な遺伝子変異を見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１４】
よって本発明は、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化に関連する変異型遺伝子およびそれにおける遺伝子変異をコードするポリヌクレオチド、およびそのような変異を検出するための核酸分子、プライマーセット、および、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出方法、さらには、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出用キットを提供することをその目的とする。さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質を提供することもその目的とする。
【００１５】
本発明の第一の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。
【００１６】
本発明の第一の態様の好ましい態様によれば、前記アミノ酸変異は、下記（ａ１）〜（ａ８）からなる群より選択される：
（ａ１）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のＲ（アルギニン）がＨ（ヒスチジン）またはＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｈ９１、またはアミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）；
（ａ２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１９番目のＷ（トリプトファン）がＲ（アルギニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｗ→Ｒ１１９）；
（ａ３）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２５番目のＴ（トレオニン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）；
（ａ４）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２６番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１２６）；
（ａ５）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５４番目のＩ（イソロイシン）がＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｖ１５４）；
（ａ６）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７３番目のＬ（ロイシン）がＷ（トリプトファン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｗ１７３）；
（ａ７）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７４番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）；および
（ａ８）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の２２２番目のＳ（セリン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ２２２）。
【００１７】
本発明の第二の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、下記（ｂ１）〜（ｂ１６）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである：
（ｂ１）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８番目のＩ（イソロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｆ８）；
（ｂ２）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６番目のＩ（イソロイシン）がＭ（メチオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｍ４６）；
（ｂ３）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の５４番目のＬ（ロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｆ５４）；
（ｂ４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８７番目のＥ（グルタミン酸）がＫ（リジン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ８７）；
（ｂ５）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の８８番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｇ→Ｄ８８）；
（ｂ６）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の１３８番目のＶ（バリン）がＭ（メチオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ｍ１３８）；
（ｂ７）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の１７２番目のＡ（アラニン）がＴ（トレオニン）またはＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ａ→Ｔ１７２、またはアミノ酸変異Ａ→Ｖ１７２）；
（ｂ８）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３４番目のＭ（メチオニン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｍ→Ｉ２３４）；
（ｂ９）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３６番目のＶ（バリン）がＡ（アラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ａ２３６）；
（ｂ１０）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２４６番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ２４６）；
（ｂ１１）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２６０番目のＡ（アラニン）がＶ（バリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ａ→Ｖ２６０）；
（ｂ１２）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の２６４番目のＴ（トレオニン）がＡ（アラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｔ→Ａ２６４）；
（ｂ１３）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３０７番目のＬ（ロイシン）がＦ（フェニルアラニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｌ→Ｆ３０７）；
（ｂ１４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２１番目のＦ（フェニルアラニン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｆ→Ｌ３２１）；
（ｂ１５）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２８番目のＤ（アスパラギン酸）がＮ（アスパラギン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｄ→Ｎ３２８）；および
（ｂ１６）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３３８番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ３３８）。
【００１８】
本発明の第三の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。好ましくはこのポリヌクレオチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、下記（ｃ１）および（ｃ２）からなる群より選択されるアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである：
（ｃ１）  配列番号６で表されるアミノ酸配列の１４番目のＶ（バリン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｖ→Ｉ１４）；および
（ｃ２）  配列番号６で表されるアミノ酸配列の１８番目のＩ（イソロイシン）がＴ（トレオニン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｔ１８）。
【００１９】
本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｍｓｒＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、下記（ｄ１）〜（ｄ３）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである：
（ｄ１）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の２３０番目のＲ（アルギニン）がＣ（システイン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｃ２３０）；
（ｄ２）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の２９２番目のＰ（プロリン）がＳ（セリン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ２９２）；および
（ｄ３）  配列番号８で表されるアミノ酸配列の１４６番目のＥ（グルタミン酸）がＫ（リジン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ１４６）。
【００２０】
本発明の第五の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｔｃａＡ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号９で表されるヌクレオチド配列において、下記（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有してなるものである：
（ｅ１）  配列番号９で表されるヌクレオチド配列の２１１番目のＡがＴに置換されてなる変異（ナンセンス変異）；
（ｅ２）  配列番号９で表されるヌクレオチド配列の１０３番目と１０４番目の間に、ＣＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴ（配列番号１１）の１１塩基が挿入されてなる変異（フレームシフトの結果、ナンセンス変異を伴う）；および
（ｅ３）  配列番号１２で表されるトランスポゾンの挿入によるｔｃａＡ遺伝子の機能欠失を伴う変異。
【００２１】
本発明によるポリペプチドは、本発明によるポリヌクレオチドによりコードされてなるものである。
【００２２】
本発明による核酸分子は、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するためのものであって、本発明によるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと、ハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００２３】
本発明によるプライマーセットは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するためのものであって、前記したアミノ酸変異を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができるものである。
【００２４】
本発明によるグリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物の検出方法は、被検体のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子において、前記（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異を、少なくとも１種以上検出することを含んでなる。
【００２５】
本発明によるグリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物の検出用キットは、目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するためのものであって、本発明による核酸分子、および／または本発明によるプライマーセットを含んでなるものである。
【００２６】
本発明によるＤＮＡチップは、目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するためのものであって、本発明による核酸分子が基板上に固定されてなるものである。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明によるポリペプチドを用いる、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質のスクリーニング方法であって、該ポリペプチドと結合し得る候補物質を、該ポリペプチドとの親和性に基づいて選択し、得られた候補物質を、グリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物に適用して、微生物のグリコペプチド感受性の変化を測定することを含んでなる方法が提供される。
【００２９】
本発明によれば、ブドウ球菌属に属する微生物の染色体上に存在するＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子における特定の変異を検出することにより、表現形の解析を必要とせずに、グリコペプチド低感受性菌を迅速かつ簡便に検出することが可能となる。さらに本発明によれば、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性に関連する複数の変異を組み合わせて検出することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００３０】
また本発明によれば、ブドウ球菌属に属する微生物による感染症の診断（遺伝子診断）を一層確実に行うことを可能とし、さらに、必要に応じて従来公知の変異もしくは将来見出される変異の情報を組み合わせることによって、より一層確実なグリコペプチド低感受性の遺伝子診断が可能となる。また本発明によれば、そのような感染症の治療または予防のために有用な情報および物質を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＭＳＣ０７８０９株より実験的に取得した変異株について、配列を解析した計６８遺伝子の一覧を示した図である。
【図２】ＭＳＣ０７８０９株より実験的に取得した変異株について、グリコペプチド系抗菌薬に対する感受性とアミノ酸変異を示した図である（実施例１）。
【図３ａ】ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲの５遺伝子について、臨床分離黄色ブドウ球菌における２６パターンのアミノ酸変異とテイコプラニン感受性との相関を示した図である（実施例２）。
【図３ｂ】ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲの５遺伝子について、臨床分離黄色ブドウ球菌における２６パターンのアミノ酸変異とテイコプラニン感受性との相関を示した図である（実施例２）。
【図４ａ】図は、図３で示した２６パターンのアミノ酸変異のうち、１５パターンのアミノ酸変異に着目し、テイコプラニン感受性との相関を示した図である。
【図４ｂ】図は、図３で示した２６パターンのアミノ酸変異のうち、１５パターンのアミノ酸変異に着目し、テイコプラニン感受性との相関を示した図である。
【図５】実施例３で行ったＰＣＲ反応産物の電気泳動写真を含む図である。
【図６】図は、臨床分離のグリコペプチド低感受性ブドウ球菌で明らかとなった、ｔｃａＡ遺伝子の欠失を伴うトランスポゾンの挿入について示した図である。Ｎ３１５株のゲノム配列と比較して、変異株ではｔｃａＡの一部（開始コドンより３３９ｂｐ）に加えて、ｔｃａＲの全長ＤＮＡを含む領域が欠失しており、配列番号１２で示されるトランスポゾンの挿入が確認された。
【発明の具体的説明】
【００３２】
変異型遺伝子をコードするポリヌクレオチド
本発明によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型のＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、およびｍｓｒＲ遺伝子をコードするものである。
【００３３】
本明細書で記載するＯＲＦ ＩＤ：ＳＡ１７０２および遺伝子名：ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲとは、Ｎ３１５株（ｐｒｅ−ＭＲＳＡ：ｍｅｃＡを保有するが発現していない菌株）のゲノム配列情報（ＮＣＢＩのデータベースにおけるアクセッション番号：ＮＣ＿００２７４５）に基づいた表記である。本明細書においては、Ｎ３１５株に限定されるものではなく、黄色ブドウ球菌の染色体上に普遍的に存在するＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲの遺伝子を意味する。また本発明において、これら遺伝子を、ＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｔｃａＡ遺伝子、およびｍｓｒＲ遺伝子とそれぞれ表記することがある。
【００３４】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸、その他に関する表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法またはその規定、および「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成９年３月、特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。
【００３５】
また、本明細書における遺伝子変異およびアミノ酸変異の表記方法に関し、一例を挙げて説明すると、ｍｓｒＲの遺伝子変異（Ｇ→４３６Ａ）とは、ｍｓｒＲ遺伝子における塩基配列４３６位のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に点変異（置換）していることを意味する。また、ｍｓｒＲ遺伝子のアミノ酸変異（Ｅ→Ｋ１４６）とは、アミノ酸配列１４６位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に点変異していることを意味する。なお、本発明で用いる塩基の位置およびアミノ酸の位置は、変異遺伝子においても、正常な遺伝子の配列（例えばＮ３１５株の遺伝子配列）を基準として表記する。
【００３６】
ここでいうグリコペプチドとは、dalbaheptide、すなわちD-alanyl-D-alanine binding antibiotics with a heptapeptidic structureのことを意味し、例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、アボパルシンなどが包含される。
【００３７】
本発明においてポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。一本鎖には、センス鎖と、該センス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）とが含まれる。
【００３８】
以下は、特定の理論に拘泥することなく本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
ＳＡ１７０２遺伝子は、機能は全く未知とされているが、アミノ酸配列から膜蛋白質と推定される。ＳＡ１７０２遺伝子に加えて、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、およびｍｓｒＲの遺伝子と高い相同性を有するポリペプチドは、ブドウ球菌属に普遍的に見出される。例えば、Staphylococcus haemolyticusにおいて、アミノ酸配列でＳＡ１７０２：８１％、ｖｒａＳ：９１％、ｖｒａＲ：９５％、ｔｃａＡ：５３％、ｍｓｒＲ：７５％の相同性を有し、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）において、アミノ酸配列でＳＡ１７０２：８３％、ｖｒａＳ：９３％、ｖｒａＲ：９５％、ｔｃａＡ：５８％、ｍｓｒＲ：７６％の相同性を有す。したがって、本発明によるポリペプチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において、グリコペプチド低感受性に関与していると理解することができる。
【００３９】
よって、本発明において、ブドウ球菌属（genus Staphylococcus）に属する微生物は、好ましくは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Staphylococcus haemolyticus、または表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）であり、より好ましくは、黄色ブドウ球菌である。
【００４０】
本発明において、変異型遺伝子における変異は、下記のステップ（１）および（２）のようにして検出し、同定して得られたものである。
【００４１】
ステップ（１）：  グリコペプチド高感受性のＭＳＣ０７８０９株（ＭＲＳＡ：明治製菓株式会社  横浜研究所保存の菌株）から、グリコペプチド感受性の異なる菌株を実験的に取得し、グリコペプチドの感受性低下と相関する遺伝子および遺伝子変異を同定する。実験的にグリコペプチド感受性の異なる菌を取得する手法および供試菌については、感受性の低下と密接に関連した遺伝子および遺伝子変異を同定することが目的である限り特に限定はなく、例えば、グリコペプチド感受性菌から薬剤選択やトランスポゾンの挿入などにより、感受性の低下した菌を取得する方法、グリコペプチド低感受性菌から感受性の回復した菌を取得する方法、供試菌のグリコペプチド感受性の異なるポピュレーションの中から、様々な耐性度の菌を取得する方法、およびこれらの方法を適当に組み合わせた方法などが挙げられ用途に応じて適宜選択することができる。ポリヌクレオチドの配列情報は、基本的には菌株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法にて該ポリヌクレオチドを増幅後、塩基配列を決定することによって得ることができる。ポリヌクレオチドにおける変異部位の特定は、グリコペプチド感受性の低下した黄色ブドウ球菌の塩基配列を、例えばＮ３１５株のゲノム配列情報、ＭＳＣ０７８０９の塩基配列、または臨床分離のグリコペプチド高感受性黄色ブドウ球菌の塩基配列と比較検討することにより行うことができる。
なお、前記菌株、ＭＳＣ０７８０９株は、「ＭＳＣ０７８０９」の表示で、平成１７（２００５）年１０月１２日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７２１（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２０６７９より移管）である。
【００４２】
ステップ（２）：  グリコペプチド感受性の異なる臨床分離の黄色ブドウ球菌を入手し、これを供試菌として、各菌株よりゲノムＤＮＡを調製した後、ステップ（１）と同様に、グリコペプチドの感受性低下と相関する遺伝子および遺伝子変異を同定する。
このようなステップを含む手法を利用することにより、未同定の株における遺伝子変異を確認することができる。
【００４３】
グリコペプチド低感受性化には複数の遺伝子が関与することが従来から知られている。本発明者らはまず、ＭＳＣ０７８０９株をイミペネム含有培地で培養し、生育したコロニーからグリコペプチド感受性の異なる菌株を取得した。これらの変異株について、遺伝子を解析した結果、ＳＡ１７０２、およびｖｒａＳの遺伝子領域に、グリコペプチド感受性の低下と相関する１アミノ酸置換を伴う変異を見出した。すなわち、図２に示すように、テイコプラニンの最小発育阻止濃度（「ＭＩＣ」）が１μｇ／ｍＬへの低感受性化に関与する遺伝子変異は、ＳＡ１７０２遺伝子のＧ→Ａ２７２変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｈ９１）であり、２μｇ／ｍＬへの低感受性化に関与する遺伝子変異は、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ３７４変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）である。さらに、テイコプラニンのＭＩＣが４μｇ／ｍＬへの低感受性化に関与する遺伝子変異は、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）と、ｖｒａＳ遺伝子のＣ→Ｔ９８６変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ３２９）である。また、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ３７４変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）とＣ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）、およびｖｒａＳ遺伝子のＣ→Ｔ９８６変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ３２９）はバンコマイシンの感受性低下にも関与する。
【００４４】
このうち、ｖｒａＳ遺伝子のＣ→Ｔ９８６変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ３２９）は、バンコマイシンヘテロ耐性の表現形に関与するとして既に報告されている（第７７回  日本細菌学会総会、２００４年）。しかしながら、ｖｒａＳ遺伝子のこの変異に加え、新たにＳＡ１７０２遺伝子の変異がグリコペプチド感受性の低下と相関することは、これまで知られていなかった。
【００４５】
次に、イミペネム含有培地から得られた変異株のうち、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ３７４変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）株と、Ｃ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）株の２株について、テイコプラニン含有培地で継代培養し、グリコペプチド耐性度がさらに上昇した変異株を取得した。これらの変異株の遺伝子を解析したところ、上記の変異に加えて、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子に、グリコペプチド感受性の低下と相関する新規な変異を見出した。すなわち、テイコプラニンのＭＩＣが８μｇ／ｍＬへの低感受性化に関与する変異として、以下の２パターンのアミノ酸変異を伴う遺伝子変異を見出した。一つは、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）に加えて、ｍｓｒＲ遺伝子のＣ→Ｔ６８８変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｃ２３０）またはＣ→Ｔ８７４変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ２９２）が重複するものであり、もう一つは、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ３７４変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）に加えて、ｔｃａＡ遺伝子の機能欠損を伴うＡ→Ｔ２１１変異（ナンセンス変異）が重複するものである。ｍｓｒＲ遺伝子の変異がグリコペプチド感受性の低下と相関することは、これまで知られていなった。
【００４６】
さらに、テイコプラニンのＭＩＣが１６μｇ／ｍＬへの低感受性化に関与する変異として、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）に加えて、ｔｃａＡの機能欠損を伴う変異（ヌクレオチド配列の１０３番目と１０４番目の間に、配列番号１１の１１塩基の挿入によるフレームシフトの結果、ナンセンス変異を伴う）が重複することを見出した。また、上記変異の組み合わせはバンコマイシンのＭＩＣが２μｇ／ｍＬへの低感受性化にも関与することを見出した。
【００４７】
ｔｃａＡの機能が欠損するとグリコペプチド感受性が低下することが、既に報告されている（Maki, H. et al.,Antimicrob. Agents Chemother.48:1953-1959, 2004）。従って、ｔｃａＡ遺伝子変異は、ナンセンス変異、フレームシフトによる一部のアミノ酸の欠失など、機能欠損を伴う変異である限り、何ら限定されるものではなく、様々なパターンが存在するものと考えられる。事実、本発明によりｔｃａＡの機能欠損を伴う新規変異が明らかとされ、本発明のｔｃａＡ変異は、複数の変異パターンの一部を構成するものと考えられる。
【００４８】
また、臨床分離のグリコペプチド低感受性黄色ブドウ球菌が保有する遺伝子変異を解析した結果、図３（図３ａおよび３ｂ）に示すようにＭＳＣ０７８０９株由来の実験株でグリコペプチド低感受性化への関与を明らかとしたＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｍｓｒＲ、ｔｃａＡ遺伝子において、感受性低下と相関する新たな複数の変異を見出した。また、ｖｒａＲ遺伝子の変異がグリコペプチド感受性の低下と相関することを新たに見出した。なおこのうち、ｖｒａＳ遺伝子のＴ→Ａ１４変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）は、バンコマイシンヘテロ耐性の表現形に関与するとして既に報告されているものである（第７７回  日本細菌学会総会、２００４年）。
【００４９】
Ｍｕ５０株の配列情報（ＮＣＢＩのデータベースにおけるアクセッション番号：ＮＣ＿００２７５８）と文献（Ohta, T. et al.,DNA Res.11:51-56, 2004）に基づくと、本発明で明らかとされた新規な変異のうち、ｍｓｒＲ遺伝子のＧ→Ａ４３６変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ１４６）については、Ｍｕ３株（ヘテロＶＩＳＡ）とＭｕ５０株（ＶＩＳＡ）も同変異を有する。しかしながら、グリコペプチド低感受性との関連については、これまで何ら知られていなかった。
【００５０】
さらに、従来公知の変異と、新たにグリコペプチド感受性との関連が明らかとなった変異との組み合わせの一例として、ｖｒａＳ遺伝子のＴ→Ａ１４変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）とｍｓｒＲ遺伝子のＧ→Ａ４３６変異（アミノ酸変異Ｅ→Ｋ１４６）の組み合わせが挙げられる。この組み合わせは、臨床分離株において検出頻度が高いものであり、より精度の高いグリコペプチド低感受性菌の検出を可能とするものである。
【００５１】
本発明で提供される複数の変異として、図３（図３ａおよび図３ｂ）に示す２７箇所の変異部位に着目すると、２６パターンのアミノ酸変異に分類され、これらのいずれかの変異を保有する菌株は、テイコプラニンの最小発育阻止濃度を２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化するものである。また、図４（図４ａおよび４ｂ）に示す１４箇所の変異部位に着目すると、１５パターンのアミノ酸変異に分類され、これらのいずれかの変異を保有する菌株は、テイコプラニンの最小発育阻止濃度を４μｇ／ｍＬ以上に低感受性化するものである。すなわち、これら変異に基づいて、菌株を判別することによって、テイコプラニンの最小発育阻止濃度を２（あるいは４）μｇ／ｍＬ以上に低下し得る株をきわめて高い精度で検出することが可能となる。これらの変異はテイコプラニンのＭＩＣが２（あるいは４）μｇ／ｍＬ以上の株でのみみられるため、該変異がグリコペプチド低感受性化に関与していることは明らかである。
【００５２】
本発明者らが解析した限り、ＳＡ１７０２遺伝子変異とｖｒａＳ遺伝子変異は重複しないことが明らかとなっている。また、図３に示すように、ＳＡ１７０２遺伝子変異またはｖｒａＳ遺伝子変異のいずれかを有する菌株の検出率は、テイコプラニンのＭＩＣが０．２５μｇ／ｍＬ以下で０％（０／３株）、０．５μｇ／ｍＬで０％（０／６株）、１μｇ／ｍＬで０％（０／３０株）、２μｇ／ｍＬで４９％（１７／３５株）、４μｇ／ｍＬで７３％（２４／３３株）、８μｇ／ｍＬで９４％（１５／１６株）、１６μｇ／ｍＬで５０％（１／２株）であり、グリコペプチド低感受性菌は上記遺伝子変異のいずれかを持つ確率がきわめて高いと考えられる。さらに、ｖｒａＲ遺伝子を加えて解析することよって、１６μｇ／ｍＬで１００％（２／２株）とより精度の高い検出が可能となる。従って、ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ遺伝子の３遺伝子は、グリコペプチド低感受性菌の検出にきわめて重要であるといえ、このうち特にＳＡ１７０２遺伝子とｖｒａＳ遺伝子とに着目することが重要であると考えられる。また、ｍｓｒＲ遺伝子やｔｃａＡ遺伝子は、その変異の重複により、ブドウ球菌にさらなる低感受性を寄与するものであり、これらの遺伝子も該低感受性菌の検出に大きな役割を果たすものと理解できる。
【００５３】
さらに、図６に示すように、ｔｃａＲ、ｔｃａＡの新規変異として、配列番号１２のトランスポゾンの挿入によってｔｃａＲ、ｔｃａＡ遺伝子が機能欠失することを見出した。このトランスポゾンは、Enterococcus faecium strain E59で同定されたトランスポザーゼ（ＮＣＢＩのデータベースにおけるアクセッション番号：ＡＹ８８７０８５）と高い相同性（塩基配列で９９％）を有しており、異なる菌種間での遺伝子の伝達により、菌がグリコペプチド低感受性を獲得することもある。
【００５４】
さらに、本発明における変異は、ｍｅｃＡ遺伝子の保有の有無に関わらず、グリコペプチド感受性の低下した株で普遍的に認められることも明らかとなっている。すなわち、本発明により明らかとされたグリコペプチド低感受性化機構は、ｍｅｃＡ遺伝子にコードされたpenicillin-binding protein 2'の発現に依存せず、ブドウ球菌属に属する微生物に普遍的に存在する機構であると考えられる。
【００５５】
変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードするポリヌクレオチド
よって、前記したように、本発明の第一の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。また本発明の第一の態様の好ましい態様によれば、前記アミノ酸変異は、前記した（ａ１）〜（ａ８）からなる群より選択される。
【００５６】
なお本明細書において、変異型遺伝子の有する変異を、アミノ酸変異として表した場合には、ヌクレオチド配列における変異は、特定されたアミノ酸変異を行う限り、遺伝子コード表の範囲で、コドンが正確に翻訳される範囲で適宜選択することができる。すなわちコドンの縮重を考慮して変異するアミノ酸に基づいて、ヌクレオチド配列における変異を特定することができる。したがって、例えば、上記変異型ＳＡ１７０２遺伝子の場合には、変異が、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２５番目のＴ（トレオニン）がＩ（イソロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｔ→Ｉ１２５）である場合、これに対応するヌクレオチド配列変異は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３７４番目のＣがＴに変異することによるものの他に、上記アミノ酸変異を起こすものであれば、いずれであっても良いことを意味する。
【００５７】
本発明のより好ましい態様によれば、
前記（ａ１）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の２７２番目のＧがＡまたはＴに変異することによるものであり、
前記（ａ２）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３５５番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ａ３）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３７４番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ａ４）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の３７６番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ａ５）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の４６０番目のＡがＧに変異することによるものであり、
前記（ａ６）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５１８番目のＴがＧに変異することによるものであり、
前記（ａ７）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５２０番目のＣがＴに変異することによるものであり、かつ
前記（ａ８）のアミノ酸変異が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の６６５番目のＣがＴに変異することによるものである。
【００５８】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が１μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである。
【００５９】
本明細書において、「グリコペプチド低感受性」とは、対象となる菌株が、後述する実施例に記載の「感受性試験」に基づいて測定した最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が、非変異株であるグリコペプチド感受性株（例えば、ＭＳＣ０７８０９株）に比べて、高い状態にあることを意味する。具体例を挙げると、「グリコペプチド低感受性」は、例えば、菌株のテイコプラニンの最小発育阻止濃度が１μｇ／ｍＬ以上（好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４μｇ／ｍＬ以上）であることを意味する。また、微生物（ブドウ球菌）を「グリコペプチド低感受性化する」とは、グリコペプチド感受性株に対して遺伝子変異を有することにより、その株が「グリコペプチド低感受性」になっていることを意味する。
【００６０】
本発明の別の一つのより好ましい態様によれば、変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、
グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ
アミノ酸変異は、
（ａ１’）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のＲ（アルギニン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（またはアミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）；および
前記（ａ２）〜（ａ８）の変異
からなる群より選択される。
【００６１】
本発明の別の一つのさらに好ましい態様によれば、変異型ＳＡ１７０２遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、
グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ
アミノ酸変異が、前記（ａ１’）、（ａ２）、（ａ６）および（ａ７）からなる群より選択される。
【００６２】
変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードするポリヌクレオチド
前記したように、本発明の第二の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、前記（ｂ１）〜（ｂ１６）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。
【００６３】
本発明のより好ましい態様によれば、
前記（ｂ１）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２２番目のＡがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ２）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１３８番目のＡがＧに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ３）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１６０番目のＣがＴに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ４）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２５９番目のＧがＡに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ５）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の２６３番目のＧがＡに変異することによるものであり、
前記（ｂ６）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の４１２番目のＧがＡに変異に変異することによるものであり、
前記（ｂ７）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の５１４番目のＧがＡに変異に変異することによるか、または、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の５１５番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ８）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７０２番目のＧがＡに変異することによるものであり、
前記（ｂ９）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７０７番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ｂ１０）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７３６番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１１）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７７９番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１２）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７９０番目のＡがＧに変異することによるものであり、
前記（ｂ１３）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９１９番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｂ１４）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９６１番目のＴがＣに変異することによるものであり、
前記（ｂ１５）のアミノ酸変異が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の９８２番目のＧがＡに変異することによるものであり、かつ
前記（ｂ１６）のアミノ酸変異は、配列番号３で表されるヌクレオチド配列の１０１２番目のＣがＴに変異することによるものである。
【００６４】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである。
【００６５】
本発明の別の一つのより好ましい態様によれば、変異型ｖｒａＳ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することであり、かつ、アミノ酸変異は、前記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ５）、（ｂ７）、（ｂ１０）、（ｂ１５）および（ｂ１６）からなる群より選択される。
【００６６】
変異型ｖｒａＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチド
前記したように、本発明の第三の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｖｒａＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。また、本発明の第三の態様の好ましい態様によれば、前記アミノ酸変異は前記（ｃ１）および（ｃ２）からなる群より選択されるである。
【００６７】
本発明のより好ましい態様によれば、
前記（ｃ１）のアミノ酸変異が、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の４０番目のＧがＡに変異することによるものであり、かつ
前記（ｃ２）のアミノ酸変異が、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の５３番目のＴがＣに変異することによるものである。
【００６８】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、変異型ｖｒａＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである。
【００６９】
変異型ｍｓｒＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチド
前記したように、本発明の第四の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｍｓｒＲ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、前記（ｄ１）〜（ｄ３）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものである。本発明の一つの好ましい態様によれば、該ポリヌクレオチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、前記（ｄ１）および（ｄ２）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有してなるアミノ酸配列をコードしてなるものであることができる。
【００７０】
本発明のより好ましい態様によれば、
前記（ｄ１）のアミノ酸変異は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の６８８番目のＣがＴに変異することによるものであり、
前記（ｄ２）のアミノ酸変異は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の８７４番目のＣがＴに変異することによるものであり、かつ
前記（ｄ３）のアミノ酸変異は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列の４３６番目のＧがＡに変異することによるものである。
【００７１】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、変異型ｍｓｒＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである。
【００７２】
変異型ｔｃａＡ遺伝子をコードするポリヌクレオチド
前記したように、本発明の第五の態様によるポリヌクレオチドは、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型ｔｃａＡ遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドであって、配列番号９で表されるヌクレオチド配列において、前記（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有してなるものである。
【００７３】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、変異型ｔｃａＡ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、グリコペプチド低感受性化は、ブドウ球菌属に属する微生物をテイコプラニンの最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍＬ以上に低感受性化することである。
【００７４】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドは、下記（ｉ）〜（iii）からなる群より選択される、改変もしくは相同ポリヌクレオチドであることができる：
（ｉ）  前記したいずれかの変異型遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸変異に関与する部位以外の領域において、さらに、アミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチド；
（ii）  前記したいずれかの変異型遺伝子をコードするポリヌクレオチドによりコードされてなるアミノ酸配列に対して５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列をコードしてなる、ポリヌクレオチドであって、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に、該微生物のグリコペプチド感受性を低下させる機能を有する、ポリヌクレオチド；および
（iii）  前記したいずれかの変異型遺伝子をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して７０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する配列からなる、ポリヌクレオチドであって、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に、該微生物のグリコペプチド感受性を低下させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
【００７５】
前記（ｉ）のポリヌクレオチドにおいては、アミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が保存的置換されてなるものをコードしてなるものが好ましい。ここで「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００７６】
前記（ｉ）において、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００７７】
なお本明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００７８】
これらの改変もしくは相同ポリヌクレオチドが、所望の作用を有するか否かは、これらをコードする遺伝子を含む組換えベクターを調製し、該組換えベクターにより微生物を形質転換し、その微生物のグリコペプチド感受性を、慣用の方法、例えば後述する実施例のに記載の方法、にしたがって測定することにより容易に確認できる。
【００７９】
本発明によるポリヌクレオチドは、上記の情報に基づいて、当業者であれば慣用の方法により適宜調製することができる。したがって、例えば、ポリヌクレオチドを特異的に増幅させる公知の方法を適宜利用することができる。具体例を挙げると、周知のＰＣＲ法を利用することができる。まずＮ３１５株やＭｕ５０株等のゲノム配列情報等に基づいて、目的のポリヌクレオチドを増幅できるプライマーのセットを設計する。設計したプライマーセットと、鋳型であるゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲを実施することにより、目的とするポリヌクレオチドを得ることができる。また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーは、ターゲットとなるヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば特に限定されない。
【００８０】
核酸分子
本発明の別の態様によれば、前記したように、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するための核酸分子であって、本発明によるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと、ハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子が提供される。
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計することができる。
【００８１】
ここで、「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子（ポリヌクレオチド）にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド断片とは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、変異型遺伝子の変異を含む核酸分子に対応する領域と、ヌクレオチド断片とが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有することをいう。またここで、ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、必要に応じて、当業者に周知の教科書または文献を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。具体例を挙げると、「ストリンジェントな条件」とは当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜６０ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜３０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００８２】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。好ましくは、核酸分子はＤＮＡである。
【００８３】
ハイブリダイズするヌクレオチド断片の塩基長は、選択する遺伝子領域の配列によっても異なるが、通常１０ヌクレオチド程度以上、好ましくは２０ヌクレオチド程度以上である。
【００８４】
本発明による核酸分子は、変異型遺伝子における変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この場合、本発明による核酸分子は、変異型のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子における、前記（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００８５】
本発明による核酸分子を、変異部位における変異を検出するための核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は、変異部位を含む約１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。
【００８６】
本発明による核酸分子はまた、グリコペプチド低感受性の遺伝子診断に供される被験物質として使用してもよい。ＰＣＲ法等の核酸増幅法または核酸伸長法を含む核酸合成法を用いて被験物質を調製するための鋳型としてもよい。
【００８７】
本発明による核酸分子は、例えば診断用の被験物質として用いる場合、核酸分子の鎖長は、変異部位を含む約１００〜５００ヌクレオチド、好ましくは２００〜３００ヌクレオチドである。
【００８８】
本発明による核酸分子はまた、変異部位における変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。したがって、前記したように、本発明の別の好ましい態様によれば、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するためのプライマーであって、前記したアミノ酸変異を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができるものが提供される。
【００８９】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長はプライマーとして機能する限り特に限定されないが、通常は、１０〜５０ヌクレオチド程度であり、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらにより好ましくは１５〜３０ヌクレオチド、特に好ましくは２０〜３０ヌクレオチド程度、最も好ましくは２０〜２５ヌクレオチド程度である。
【００９０】
核酸増幅は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。
【００９１】
グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出方法
本発明の別の態様によれば、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出方法であって、前記した変異型遺伝子において明らかとなった変異、具体的には、被検体のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子における、前記した（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異を、少なくとも１種検出することを含んでなる方法が提供される。
【００９２】
ゲノム研究を臨床的な観点から考察すれば、ブドウ球菌が本発明で明らかとした遺伝子上に変異を有しているか否かを迅速に判別することは重要な問題である。この判別によって、グリコペプチド低感受性のリスクを事前に予測することができれば、有効な予防計画が可能となる。また、このような遺伝子変異を有する株と、その株に対して有効な抗菌薬との相関データが蓄積されれば、かかる変異を有する株に対してより適切な抗菌薬あるいは治療法の開発が可能になる。
【００９３】
本発明の好ましい態様によれば、前記（ａ１）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異を検出することに加えて、
下記（ｂ１７）、および（ｂ１８）からなる群より選択される少なくとも１種の変異の検出を組み合わせて行うことができる：
（ｂ１７）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の５番目のＩ（イソロイシン）がＮ（アスパラギン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）；および
（ｂ１８）  配列番号４で表されるアミノ酸配列の３２９番目のＳ（セリン）がＬ（ロイシン）に置換されてなる変異（アミノ酸変異Ｓ→Ｌ３２９）。
これらの変異は、ｖｒａＳ遺伝子において、グリコペプチド感受性の観点から公知の変異である。これら変異と、本発明において見出された前記変異とを組み合わせて検出し、判定することにより、より精度の高い検出が可能となる。
【００９４】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明による検出方法は、２種以上の変異を検出した場合に、被検体がグリコペプチド低感受性ブドウ球菌であると判定する工程をさらに含んでなる。複数の変異を組み合わせて判定を行うことにより、より精度の高い検出が可能となる。この場合、複数の変異は、ＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、およびｔｃａＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子における変異、すなわち、遺伝子の異なる変異であることが好ましい。
【００９５】
本発明の別のより好ましい態様によれば、本発明による検出方法は、下記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれか１つの変異の組み合わせが共に検出された場合に、検体がグリコペプチド低感受性の微生物であると判定する工程をさらに含んでなる：
（Ａ）  前記（ｂ１）〜（ｂ１８）から選択される変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）〜（ｄ３）から選択される変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｂ）  前記（ｂ１７）の変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｄ３）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｃ）  前記（ｂ１）〜（ｂ１８）から選択される変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）〜（ｅ３）から選択される変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｄ）  前記（ｂ２）の変異（変異型ｖｒａＳ遺伝子における変異）と、前記（ｅ３）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｅ）  前記（ａ１）〜（ａ８）から選択される変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）〜（ｄ３）から選択される変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｆ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ１）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｇ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｄ２）の変異（変異型ｍｓｒＲ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｈ）  前記（ａ１）〜（ａ８）から選択される変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）〜（ｅ３）から選択される変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；
（Ｉ）  前記（ａ３）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ１）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ；および
（Ｊ）  前記（ａ７）の変異（変異型ＳＡ１７０２遺伝子における変異）と、前記（ｅ２）の変異（変異型ｔｃａＡ遺伝子における変異）との組み合わせ。
【００９６】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、前記した変異（ａ１’）〜（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異に基づいて微生物の検出をおこなうことにより、テイコプラニンのＭＩＣが２μｇ／ｍＬ以上に低下した株をきわめて高い精度で検出することが可能となる。
【００９７】
本発明のさらに別の一つの好ましい態様によれば、前記した変異（ａ１’）、（ａ２）、（ａ６）、（ａ７）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ５）、（ｂ７）、（ｂ１０）、（ｂ１５）、（ｂ１６）、（ｃ１）、（ｄ１）〜（ｄ３）および（ｅ１）〜（ｅ３）からなる群より選択される変異に基づいて微生物の検出をおこなうことにより、テイコプラニンのＭＩＣが４μｇ／ｍＬ以上に低下した株をきわめて高い精度で検出することが可能となる。
【００９８】
検出方法において、判別しようとする対象遺伝子を含む被験物質は、被検体としての微生物自体、患者または健常人より採取した血液、その他の組織から当業者に周知の方法によって得ることができる。被験物質は、グリコペプチド低感受性化関連遺伝子の全長を含むものであってもよいが、該遺伝子の変異部位を含む部分ＤＮＡを含むものであってもよい。
【００９９】
ここで、変異を検出する方法としては、特に限定はされないが、サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ジデオキシ塩基配列決定法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence specific primers）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Restriction fragment length polymorphism：ＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法（Specific sequence oligonucleotide：ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法などが挙げられる。
【０１００】
また変異の検出を、本発明による核酸分子と、被検体由来のＳＡ１７０２遺伝子、ｖｒａＳ遺伝子、ｖｒａＲ遺伝子、ｍｓｒＲ遺伝子、またはｔｃａＡ遺伝子とがハイブリダイゼーションするか否か確認することによって行ってもよい。ハイブリダイゼーションするか否かは、ハイブリダイゼーション複合体の存在を検出することにより行うことができる。すなわち、ハイブリダイゼーション複合体が存在するとされた場合には、被検体由来の上記遺伝子に、変異にかかるいずれかのアリルが存在することを示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用してもよい。ハイブリダイゼーションは、前記したようなストリンジェントな条件にて行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【０１０１】
変異の検出はまた、本発明によるプライマーを用いて核酸増幅法を行い、増幅産物が得られるか否かを確認することによって行ってもよい。例えば、そのようなプライマーとして、アリル特異的ＰＣＲ法を実施できるように設計したものを用いることができる。具体的には、一方のプライマーを変異部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを変異部位を含まない領域に対合できるように設計する。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記変異にかかるいずれかのアリルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアリルの有無を判定することができる。
【０１０２】
このような検出方法の具体例として、図５（実施例３）に示したものを挙げることができる。
この方法によれば、変異が疑われる遺伝子に対して、３’末端に変異部位を含む２種のプライマー（正常アリルあるいは変異アリル特異的プライマー）を用い、増幅産物が得られるか否かで、極めて簡便に所定の遺伝子変異の有無を判別することができる。この方法では、予め所望の塩基配列を有するように設計された合計３本のプライマーを用いることが望ましい。そのうち２本は、正常アリルまたは変異アリルを増幅対象とするセンスプライマーであり、残りの１本はそれぞれに共通のアンチセンスプライマーである。これら２種類のセンスプライマーを、共通のアンチセンスプライマーと組み合わせ、それぞれについて同条件下でＰＣＲ反応を行うと、３’末端がミスマッチしたプライマーでは増幅されないため、ゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色を行うなど慣用の方法により所望の変異の有無を検出することができる。
【０１０３】
この場合、プライマーの設計は、当業者であれば、３’末端における塩基の決定と、増幅されるＰＣＲ産物の分子量（塩基対数）が適当な大きさとなるように留意して、判別しようとする遺伝子の塩基配列と変異の位置に基づいて適宜行うことができる。プライマーの調製自体は、いわゆるＤＮＡ自動合成機、その他の汎用機器や慣用の合成手法により容易に行うことができる。ＰＣＲ反応も、特別な試薬や反応段階を含まない一般的な反応条件下で行うことができ、市販されているＰＣＲ反応キットやサーマルサイクラーなどの汎用機器を利用することができる。
なお、この方法はＰＣＲ反応とＰＣＲ産物の確認という２段階の作業で終了するものであり、ＰＣＲ産物を数時間かけて制限酵素処理しなければならないＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に比べて、判別に要する時間を著しく短縮することができる。
【０１０４】
本発明による検出方法は、核酸プローブおよびプライマーを使用して、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を利用して行うこともできる。これにより、被検体の遺伝子型を決定することができる。
【０１０５】
したがって、本発明による検出方法は、ブドウ球菌感染症の原因菌の究明等に利用することができる。すなわち、本発明による検出方法により、グリコペプチド低感受性の遺伝子診断が可能となる。
臨床における抗菌薬治療に貢献する意義はきわめて高いといえる。本発明の変異に基づくグリコペプチド低感受性の遺伝子診断には、基本的には本発明で提供するヌクレオチドに特定の遺伝子変異が存在するか否かを検出することによって行われる。よって被験物はグリコペプチド低感受性化関連遺伝子の全長であってもよいが、必ずしもその必要はなく、該遺伝子の変異部位を含む部分ＤＮＡであっても良い。
【０１０６】
前記したように、本発明の別の好ましい態様によれば、ブドウ球菌属に属する微生物において発現した場合に該微生物をグリコペプチド低感受性化する変異型遺伝子の変異を検出するためのプライマーセットであって、前記したアミノ酸変異を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができるものである。プライマーセットは、前記したようなプライマーペアからなるものであってもよく、また正常アリルまたは変異アリルを増幅対象とするセンスプライマーと、それぞれに共通のアンチセンスプライマーとの３本からなるものであってもよい。よって、本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明の検出方法において、変異の検出を、該プライマーセットを用いて核酸増幅法を行い、増幅産物が得られるか否かを確認することによって行うことを含む方法が提供される。
【０１０７】
キット、ＤＮＡチップ
本発明のさらに別の態様によれば、目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するための、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の検出用キットであって、本発明による核酸分子、および／または本発明によるプライマーセットを含んでなるものが提供される。このキットには、変異を検出するための具体的手段に応じて、必要な試薬類、反応容器、説明指示書等をさらに含んでいてもよい。
【０１０８】
本発明によればさらに、目的とするブドウ球菌属に属する微生物がグリコペプチド低感受性であるか否かを判別するためのＤＮＡチップであって、本発明による核酸分子が基板上に固定されてなるものが提供される。ＤＮＡチップを構成する基材やその製造方法は当業者に周知のものを適用することができる。
【０１０９】
ポリペプチドその他
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、アミノ酸変異部位を含む限りにおいて、必要に応じて切断された部分ポリペプチドであってもよい。
【０１１０】
このようなポリペプチドは、本発明によるポリヌクレオチドの配列に基づいて当業者であれば種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって適宜調製することができる。例えば、遺伝子工学的手法の場合、目的とするポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって部分ポリペプチドを調製することもできる。
【０１１１】
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリペプチドが関与する、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質が提供されうる。ここで、グリコペプチド低感受性化の抑制には、グリコペプチド低感受性の獲得の抑制、グリコペプチド低感受性の軽減などが含まれる。
【０１１２】
この物質は、該ポリペプチドに作用しうる物質、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストであるといえる。この物質は、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制できるほか、耐性を獲得した同微生物を脱薬剤耐性化させ、グリコペプチド低感受性ブドウ球菌の感受性を回復させることができる。従って、このような物質を有効成分として含む医薬は、グリコペプチド低感受性化の抑制のための医薬、または、既に獲得されたグリコペプチド低感受性の軽減のための医薬品となり、グリコペプチド系抗菌薬と併用することにより、該低感受性菌の感染症に対して有効な予防または治療剤となる。
【０１１３】
このような物質は、精製された本発明によるポリペプチドと、候補化学物質とを反応させ、例えば、結合による蛍光のクエンチングを測定することにより、ポリペプチドと高い親和性で結合する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングにより得られた物質がポリペプチドに作用するかどうかは、グリコペプチド感受性が低下した形質転換株の耐性度が、該物質の添加により低下することを観察することにより、確認することができる。
【０１１４】
よって、本発明のさらに別の態様によれば、本発明によるポリペプチドを用いる、ブドウ球菌属に属する微生物のグリコペプチド低感受性化を抑制し得る物質のスクリーニング方法であって、該ポリペプチドと結合し得る候補物質を、該ポリペプチドとの親和性に基づいて選択し、得られた候補物質を、グリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物に適用して、微生物のグリコペプチド感受性の変化を測定することを含んでなる、方法が提供される。
【０１１５】
またこのような物質は、いくつかの従来公知の方法によっても得ることができる。本発明の変異から、該ポリペプチドの機能に必須とされる部位は推定し得る。例えば、まずこれらのペプチドに特定の変異を導入したポリペプチドを発現する組換えプラスミドを作製し、グリコペプチド感受性の黄色ブドウ球菌に導入する。次に、精製された本発明によるポリペプチドの結晶を作製し、Ｘ線構造解析により３次元構造を決定し、その上で、活性部位に相当する部分の３次元構造に結合し得る化学物質を設計し合成する。
【０１１６】
本発明による該物質は、グリコペプチド低感受性のブドウ球菌属に属する微生物による感染症の予防もしくは治療用の医薬として用いることができる。このような物質は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。したがって、本発明による該物質を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。必要な投与量範囲は、当業者であれば適宜選択可能であるが、通常、物質の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右されうる。適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇである。
【実施例】
【０１１７】
以下、実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に何ら制限されるものではない。【０１１８】
実施例１：グリコペプチド感受性の異なる変異株の単離と遺伝子解析
（１−ａ）  グリコペプチド感受性の異なる変異株の単離
グリコペプチド感受性株として、黄色ブドウ球菌ＭＳＣ０７８０９株（明治製菓株式会社  横浜研究所保存の菌株）を用いた。
まず、ＭＳＣ０７８０９株をイミペネム８μｇ／ｍＬ含有のBrain Heart Infusion Agar（以下「ＢＨＩＡ」ということがある）で３５℃にて一晩培養し、生育したコロニーからグリコペプチド感受性の異なる変異株を実験的に取得した。引き続いて、上記菌株のうち、グリコペプチド感受性の低下の認められた一部の菌株について、テイコプラニン８または１６μｇ／ｍＬ含有のＢＨＩＡを用いて計３回継代培養し、生育したコロニーからグリコペプチド感受性がさらに低下した株を取得した。
取得した変異株のグリコペプチド感受性は、以下の感受性試験にて測定した。【０１１９】
（１−ｂ）感受性試験
ＮＣＣＬＳ（National Committee for Clinical Laboratory Standards（米国臨床検査標準化委員会）、またはＣＬＳＩ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定法に準じた寒天平板希釈法でＭＩＣを測定した。但し、菌株の前培養にはcation adjusted Mueller-Hinton brothを用い、ＭＩＣ測定にはMueller-Hinton agarを用いた。【０１２０】
（１−ｃ）遺伝子解析
ゲノムＤＮＡの調製
ＭＳＣ０７８０９株から取得したグリコペプチド感受性の異なる変異株（２８株）と、ＭＳＣ０７８０９株、ＡＴＣＣ  ７００６９８（Ｍｕ３）株、ＡＴＣＣ  ７００６９９（Ｍｕ５０）株を加えた計３１株について、ＢＨＩＡで３５℃にて一晩培養し、生理食塩水で懸濁後、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN GmbH、Hilden、Germany）を用い、添付文書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１２１】
ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、二成分制御系センサーおよびグリコペプチド低感受性への関与が報告されている遺伝子を中心に計６８遺伝子（図１）を含む領域をＰＣＲにより増幅した。具体的には、Ｎ３１５株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７４５）とＭｕ５０株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７５８）をもとに、各遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを設計し、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）で添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動により、目的のサイズであることを確認した。【０１２２】
ＤＮＡシーケンサーによる配列の解析
ＰＣＲ産物は、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＰＣＲプレート（Millipore Corporation、Bedford、MA、USA）にて精製後、シーケンス反応に供した。Ｎ３１５株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７４５）とＭｕ５０株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７５８）をもとに、各ＰＣＲ産物をシーケンシングできるプライマーセットを設計し、シーケンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Applied Biosystems）を用いた。シーケンス反応は添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied Biosystems）で実施した。シーケンス反応産物は、あらかじめ水で膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（Amersham Biosciences AB、Uppsala、Sweden）をつめたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＶプレート（Millipore Corporation）で精製後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡアナライザー（Applied Biosystems）を用いて配列解析を行った。【０１２３】
結果は図２に示されるとおりであった。
図２中、ＴｙｐｅＡ〜Ｅは、イミペネム含有培地より取得した変異株を示す。ＴｙｐｅＣ’は、ＴｙｐｅＣの株をテイコプラニン含有培地で選択して取得した変異株を示す。ＴｙｐｅＤ’、ＴｙｐｅＤ’’、ＴｙｐｅＤ’’’は、ＴｙｐｅＤの株をテイコプラニン含有培地で選択して取得した変異株を示す。
ＭＳＣ０７８０９由来株における変異は、（ａ１）のアミノ酸変異Ｒ→Ｈ９１、（ａ３）、（ａ７）、（ｂ１８）、（ｄ１）、（ｄ２）、（ｅ１）および（ｅ２）に関連するものである。このうち、テイコプラニンのＭＩＣが１μｇ／ｍＬの低感受性化に関与する変異は、（ａ１）のアミノ酸変異Ｒ→Ｈ９１であり、２μｇ／ｍＬの低感受性化に関与する変異は（ａ３）であり、４μｇ／ｍＬ以上の低感受性化に関与する変異は（ａ７）、（ｂ１８）、（ｄ１）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｅ２）である。また、（ａ３）、（ａ７）、（ｂ１８）、（ｅ２）はバンコマイシンの低感受性化にも関与する。
イミペネム含有培地より得られたグリコペプチド感受性の低下した株は、ＳＡ１７０２遺伝子変異またはｖｒａＳ遺伝子変異のいずれかを有し、ｍｓｒＲ遺伝子変異やｔｃａＡ遺伝子変異の重複により、さらにグリコペプチド感受性が低下すると考えられる。【０１２４】
グリコペプチド感受性の低下した株の配列をＮ３１５株およびＭＳＣ０７８０９株の配列と比較検討した結果、ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｍｓｒＲ、ｔｃａＡ遺伝子において見出された変異が、グリコペプチド感受性の低下と相関することが明らかとなった。【０１２５】
なお、ＳＡ１７０２遺伝子のＣ→Ｔ５２０変異（アミノ酸変異Ｐ→Ｓ１７４）と、ｍｓｒＲ遺伝子のＣ→Ｔ６８８変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｃ２３０）との両方の変異を保有する２重変異株は、「ＭＳＣ１５５６１」の表示で、平成１７（２００５）年１０月１２日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２２（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２０６８０より移管）である。【０１２６】
実施例２：グリコペプチド感受性の異なる臨床分離黄色ブドウ球菌の遺伝子解析
（２−ａ）使用菌株
日本の臨床施設において各種臨床材料より分離されたグリコペプチド感受性の異なる黄色ブドウ球菌１２２株を試験に供した。なお、これらの株は、明治製菓株式会社 横浜研究所に保管されている。なお、ｍｅｃＡ遺伝子（黄色ブドウ球菌においてβ−ラクタム耐性に関与する主要遺伝子）の関与の有無を明らかとするため、ｍｅｃＡ遺伝子の保有の有無に関わらず菌株を収集した。また、米国にて分離のＡＴＣＣ  ７００７８７株、ＡＴＣＣ  ７００７８８株およびＡＴＣＣ  ７００７８９株を試験に供した。【０１２７】
（２−ｂ）感受性試験
ＮＣＣＬＳの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定法に準じた寒天平板希釈法でＭＩＣを測定した。菌株の前培養にはcation adjusted Mueller-Hinton brothを用い、ＭＩＣ測定にはMueller-Hinton agarを用いた。【０１２８】
（２−ｃ）遺伝子解析
ゲノムＤＮＡの調製
臨床分離の黄色ブドウ球菌１２５株について、ＢＨＩＡで３５℃にて一晩培養し、生理食塩水で懸濁後、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN GmbH、Hilden、Germany）を用い、添付文書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１２９】
ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
ＭＳＣ０７８０９由来の実験株において、グリコペプチド低感受性への関与を明らかとした遺伝子を中心に、ＳＡ１７０３、ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｖｒａＲ、ｔｃａＡ、ｍｓｒＲの６遺伝子含む領域をＰＣＲにより増幅した。具体的には、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）で添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動により、目的のサイズであることを確認した。【０１３０】
ＤＮＡシーケンサーによる配列の解析
ＰＣＲ産物は、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＰＣＲプレート（Millipore Corporation、Bedford、MA、USA）にて精製後、シーケンス反応に供した。Ｎ３１５株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７４５）とＭｕ５０株のゲノム配列情報（ＮＣ＿００２７５８）をもとに、各ＰＣＲ産物をシーケンシングできるプライマーセットを設計し、シーケンス反応にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Applied Biosystems）を用いた。シーケンス反応は添付の説明書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Applied Biosystems）で実施した。シーケンス反応産物は、あらかじめ水で膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（Amersham Biosciences AB、Uppsala、Sweden）をつめたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＶプレート（Millipore Corporation）で精製後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems）を用いて配列解析を行った。【０１３１】
結果は図３および図４に示されるとおりであった。
図３ａのグラフ中の斜線部は、遺伝子変異（ａ１’）、（ａ２）、（ａ４）〜（ａ６）、（ａ８）、（ｂ１）〜（ｂ１７）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ３）および（ｅ３）に関連する株を示す。これらは、テイコプラニンのＭＩＣが２μｇ／ｍＬ以上に低下した株に相当する。
図４ａのグラフ中の斜線部は、遺伝子変異（ａ１’）、（ａ２）、（ａ６）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ５）、（ｂ７）、（ｂ１０）、（ｂ１５）、（ｂ１６）、（ｂ１７）、（ｃ１）、（ｄ３）、（ｅ３）に関連する株を示す。これらは、テイコプラニンのＭＩＣが４μｇ／ｍＬ以上に低下した株に相当する。【０１３２】
グリコペプチド感受性の低下した株の配列を、Ｎ３１５株および臨床分離のグリコペプチド高感受性株の配列と比較検討した結果、実験株では存在しなかった新規の遺伝子変異を含め、ＳＡ１７０２、ｖｒａＳ、ｍｓｒＲ、ｔｃａＡ遺伝子にグリコペプチド感受性の低下と相関する変異を見出した。また、新たにｖｒａＲにおいて見出された変異がグリコペプチド感受性の低下と相関することが明らかとなった。【０１３３】
なお、ｖｒａＳ遺伝子のＡ→Ｇ１３８変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｍ４６）に加えて、配列番号１２のトランスポゾンの挿入により、ｔｃａＲ、ｔｃａＡ遺伝子が欠失している変異株は、「ＭＳＣ１５５７９」の表示で、平成１７（２００５）年１０月１２日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７２３（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２０６８１より移管）である。【０１３４】
実施例３：ＰＣＲによる遺伝子変異の検出
（３−ａ）ゲノムＤＮＡの調製
臨床分離の黄色ブドウ球菌のうち、ＳＡ１７０２遺伝子にＧ→Ｔ２７２変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）を保有する株、ｖｒａＳ遺伝子にＴ→Ａ１４変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）を保有する株、または、いずれの変異も保有しない株を、ＢＨＩＡで３５℃にて一晩培養し、生理食塩水で懸濁後、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN GmbH、Hilden、Germany）を用い、添付文書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１３５】
なお、ＳＡ１７０２遺伝子にＧ→Ｔ２７２変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）を保有する変異株は、「ＭＳＣ０３０７４」の表示で、平成１７（２００５）年１０月１２日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７２４（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−２０６８２より移管）である。【０１３６】
（３−ｂ）ＰＣＲ反応と反応産物の確認
３’末端に変異部位を含む２種のセンスプライマー（正常アリルまたは変異アリル特異的プライマー）と、共通のアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が得られるか否かで変異の有無を判断した。【０１３７】
プライマーの設計
正常なＳＡ１７０２遺伝子に特異的なセンスプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧ−３’（配列番号１４））、およびＧ→Ｔ２７２変異（アミノ酸変異Ｒ→Ｌ９１）を３’末端に有するセンスプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１５））をそれぞれ常法に従い設計した。
同様に、正常なｖｒａＳ遺伝子に特異的なセンスプライマー（５’−ＡＴＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴ−３’（配列番号１６））、およびＴ→Ａ１４変異（アミノ酸変異Ｉ→Ｎ５）を３’末端に有するセンスプライマー（５’−ＡＴＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡ−３’（配列番号１７））をそれぞれ設計した。
また、ＳＡ１７０２とｖｒａＳ遺伝子の増幅に共通用のアンチセンスプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＣＧＴＧ−３’（配列番号１８））も同様に設計した。【０１３８】
ＰＣＲ反応
先に調製したゲノムＤＮＡ５０〜２００ｎｇを、最終組成として０．０５ユニット／μＬのｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社(TOYOBO CO.,LTD)）、０．２ｍＭのｄNＴＰ、０．４μＭの各プライマーＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２０μＬの反応液に加えてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９８℃で３０秒間変性させ、続いて９５℃で３０秒、６１℃（ＳＡ１７０２遺伝子のＧ→Ｔ２７２変異を検出する場合）または６５℃（ｖｒａＳ遺伝子のＴ→Ａ１４変異を検出する場合）で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回行い、最後は７２℃で５分間の最終伸長反応を行わせるというものであった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルでの電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって可視化した。【０１３９】
結果は図５に示されるとおりであった。
図５においてレーンＭは、サイズマーカー（100bp DNA Ladder、Promega）を電気泳動したものである。ＳＡ１７０２遺伝子とｖｒａＳ遺伝子のいずれにも変異を保有しない株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型としたサンプル（レーン１、２、５、６）では、正常アリルに特異的なセンスプライマーと、共通のアンチセンスプライマーとの組み合わせでのみＰＣＲ産物が観察された（レーン１、５）。また、変異株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型としたサンプル（レーン３、４、７、８）では、変異アリルに特異的なプライマーと、共通のアンチセンスプライマーとの組み合わせでのみＰＣＲ産物が観察され（レーン４、８）、所定の遺伝子変異の有無を判定することができた。【０１４０】
この方法により、正常アリルに特異的なセンスプライマーと、共通のアンチセンスプライマーとの組み合わせでのみＰＣＲ産物が観察されるサンプルを正常型、変異アリルに特異的なプライマーと、共通のアンチセンスプライマーとの組み合わせでのみＰＣＲ産物が観察されるサンプルを変異型と判定することが可能であり、所定の遺伝子変異の有無を判別することができた。
【図１】
2007080874.tif 000003
【図２】
2007080874.tif 000004
【図３ａ】
2007080874.tif 000005
【図３ｂ】
2007080874.tif 000006
【図４ａ】
2007080874.tif 000007
【図４ｂ】
2007080874.tif 000008
【図６】
2007080874.tif 000009
【図５】
2007080874.tif 000010
【配列表】
2007080874000001.app
【国際調査報告】
2007080874.tif 000011
2007080874.tif 000012
2007080874.tif 000013
2007080874.tif 000014
2007080874.tif 000015