(57)【要約】  強い副作用を有し、かつ高価な免疫賦活化剤及びサイトカイン療法に代わって、生体へのサイトカイン供給にあたり安価でかつ安全性の高い剤及び医薬を提供する。  アルギン酸オリゴマーを含有してなる、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進剤及びアルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなるコロニー刺激因子又はケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬の使用により、サイトカインの分泌を促進させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸オリゴマーを含有してなる、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進剤。
【請求項２】
サイトカインが、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選ばれるものである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
コロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦであり、ケモカインがＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＥｏｔａｘｉｎおよびＫＣである、請求項２記載の剤。
【請求項４】
インターロイキンがＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７であり、インターフェロンがＩＦＮ−γである、請求項２記載の剤。
【請求項５】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸の酵素分解物またはその精製物である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、請求項１〜６のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬。
【請求項９】
アルギン酸オリゴマーがアルギン酸の酵素分解物またはその精製物である請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、請求項８または９記載の医薬。
【請求項１１】
アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、請求項８〜１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の剤を摂取する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
【請求項１５】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療する方法。
【請求項１６】
サイトカインが、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群より選ばれるものである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれかに記載のサイトカインの分泌促進剤、および当該剤がＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療するために使用することができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸オリゴマーのサイトカイン分泌促進作用に基づく、アルギン酸オリゴマーの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化や環境の悪化により、癌、心筋梗塞、糖尿病による閉塞性動脈硬化症等の様々な疾患を抱える患者が急増している。これらの疾患を抱える患者に対する有効な治療薬として、各種のサイトカインが注目されている。【０００３】
コロニー刺激因子（Colony Stimulating Factor；以下ＣＳＦと表記する）の一種である顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor；以下Ｇ−ＣＳＦと表記する）は、単球、マクロファージおよび血管内皮細胞等により分泌される造血因子であり、生体内での好中球の増殖、分化、機能亢進とその末梢血への放出ならびに血管新生の促進や血管内皮細胞のアポトーシスの抑制等の作用を有することが知られている（非特許文献１参照）。一方、ケモカインの一種であるMacrophage Inflammatory Protein-1 alpha (以下ＭＩＰ−１αと表記する)およびRegulated upon Activation of Normal T cell Expressed and Secreted (以下ＲＡＮＴＥＳと表記する)は単球、リンパ球、樹状細胞を初めとする様々なエフェクター細胞に作用して遊走活性を示すことで、免疫反応に多面的に寄与している（非特許文献２および３参照）。【０００４】
現在臨床応用されているか、または臨床応用に向けて検討されている免疫療法としては、非特異的免疫賦活剤を利用した治療法およびサイトカインを利用した治療法が挙げられる。非特異的免疫賦活剤としてはピシバニール、クレスチンおよびレンチナン等が、サイトカインとしてはＧ−ＣＳＦおよび腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；以下ＴＮＦと表記する）−α等が製剤化されて現在使用されている。これらの使用は、被爆による骨髄障害の治療、抗癌剤の副作用である造血幹細胞の減少に伴う血液障害、臓器移植による免疫抑制患者の治療および放射線治療後の顆粒球減少の回復等に効果がある。また、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および後天性免疫症候群（ＡＩＤＳ）等の慢性好中球減少症等に対しても効果が期待されている。しかしながら、これらの製剤は一般に高価であり、また過剰投与による間質性肺炎等の重篤な副作用が報告されている。従って、患者自身のサイトカイン分泌能を高めることが可能であって、かつ安全性の高い薬剤等の開発が望まれている。【０００５】
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖あるいは細胞間充填物質として存在し、細胞の保護剤として機能している。アルギン酸は、β−Ｄ−マンヌロン酸（以下Ｍと表記する）とα−Ｌ−グルロン酸（以下Ｇと表記する）の２種類のウロン酸から構成され、これらが１，４−グリコシド結合により種々の割合で結合した直鎖状のポリウロニド多糖である。アルギン酸は、その分子中にＭが連なったポリ−β−Ｄ−マンヌロン酸部位（以下ＰＭと表記する）、Ｇが連なったポリ−α−Ｌ−グルロン酸部位（以下ＰＧと表記する）ならびにＭおよびＧが交互配列したセグメント部位（以下ＭＧランダムと表記する）を有し、これら３つのドメインが混在した構造を有する。【０００６】
アルギン酸はカルシウム添加によりゲル化することから、アルギン酸ゲルは、生細胞の固定剤および徐放性医薬品の担体等として幅広く利用されている。またアルギン酸そのものは、食品の増粘剤、化粧品および繊維加工等の幅広い用途に活用されている。【０００７】
アルギン酸の生理機能としては、整腸作用、血中コレステロール値の低下作用および高血圧予防作用等が一般的に知られている。しかしながら、このような機能は「ポリマーとしてのアルギン酸」に関するものであり、「アルギン酸オリゴマー」の生理機能についてはほとんど知られていなかった。【０００８】
アルギン酸のサイトカインに関連する生理活性としては、アルギン酸のある試料がヒトの単球を刺激して、ＴＮＦ−α、インターロイキン（Interleukin;以下ＩＬと表記する）−１βおよびＩＬ−６の分泌を促進すること（非特許文献４参照）、マンヌロン酸残基を高い割合で有するアルギン酸がマクロファージによるサイトカイン分泌のインデューサーとして機能する可能性があること（非特許文献５参照）が報告されている。しかしながら、精製されたＰＧおよびＰＭは、ヒトの単核細胞には何の影響も無く、一方で高分子アルギン酸によるマクロファージからのＴＮＦ放出誘導作用には、アルギン酸の分子量が５万以上であることが必要との研究報告も存する。最近、本発明者等は、アルギン酸オリゴマーが単球（マクロファージ）のＴＮＦ−α分泌を促進することを解明し、オリゴマーとしての有用性を見出した（特許文献１参照）。【０００９】
【特許文献１】特開2005-145885号公報
【非特許文献１】Anal.Biochem.195,38,1991
【非特許文献２】Blood 100, 2195-2202, 2002
【非特許文献３】Neuropharmacology 39, 2505-2513, 2000
【非特許文献４】J. Immunother., 10, 286-291, 1991
【非特許文献５】Infect. Immun., 61, 1917-1925, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、サイトカイン療法または感染症予防に用いられる、安価でかつ安全性の高い剤および医薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素分解することで得られたアルギン酸オリゴマーが、細胞を活性化してサイトカインの分泌を促進させることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）アルギン酸オリゴマーを含有してなる、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進剤。
（２）サイトカインが、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選ばれるものである、（１）記載の剤。
（３）コロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦであり、ケモカインがＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＥｏｔａｘｉｎおよびＫＣである、（２）記載の剤。
（４）インターロイキンがＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７であり、インターフェロンがＩＦＮ−γである、（２）記載の剤。
（５）アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸の酵素分解物またはその精製物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。
（６）アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の剤。
（７）アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、（１）〜（６）のいずれかに記載の剤。
（８）アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬。
（９）アルギン酸オリゴマーがアルギン酸の酵素分解物またはその精製物である（８）記載の医薬。
（１０）アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、（８）または（９）記載の医薬。
（１１）アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の医薬。
（１２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用。
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載の剤を摂取する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
（１４）（８）〜（１１）のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
（１５）（８）〜（１１）のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療する方法。
（１６）サイトカインが、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群より選ばれるものである、（１３）または（１４）に記載の方法。
（１７）（１）〜（７）のいずれかに記載のサイトカインの分泌促進剤、および当該剤がＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
（１８）（８）〜（１１）のいずれかに記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療するために使用することができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のサイトカインの分泌促進剤は、エフェクター細胞に作用し、当該細胞からサイトカインを効率的かつ用量依存的に分泌させることができる。また、本発明の剤はヒトのみならず各種動物にも用いることができ、その免疫力を高めることができる。【００１４】
本発明の医薬は、サイトカイン療法を必要とする患者に、単独で、または他の薬剤と併用して用いることにより、サイトカインの分泌を促進することができる。また本発明の医薬は、免疫力の低下した動物に対する、種々の感染症等への抵抗性を向上させるための、感染症予防薬および治療薬としても有用である。【００１５】
アルギン酸オリゴマーを使用し、医薬的に許容される担体等と製剤化することにより、ＣＳＦまたはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造することができる。【００１６】
アルギン酸オリゴマーを使用することで、サイトカイン、特にＣＳＦまたはケモカインの分泌を促進させることができるので、ＣＳＦまたはケモカインの分泌低下に起因する障害または疾患を予防および／または治療する方法を提供することができる。【００１７】
本発明の剤または医薬および当該剤または医薬に関する説明等を記載した記載物を含む商業用パッケージを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】マンヌロン酸ポリマーとグルロン酸ポリマーの調製方法を示す図である。
【図２】酵素消化したアルギン酸オリゴマー（以下、酵素処理アルギン酸オリゴマーと表記する）をゲルろ過したチャートを示す図である。
【図３】酵素処理アルギン酸オリゴマー混合物と、酸加水分解アルギン酸オリゴマー混合物のＧ−ＣＳＦ分泌促進活性の比較を示す図である。
【図４】アルギン酸オリゴマー混合物（黒丸）およびアルギン酸ポリマー（白丸）のマウス腹腔内投与による、Ｇ−ＣＳＦ分泌促進活性の経時変化を示す図である。
【図５】アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、投与量依存的なＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。
【図６−１】アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイトカイン分泌促進活性の経時変化を示す図である。
【図６−２】アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイトカイン分泌促進活性の経時変化を示す図である。
【図６−３】アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイトカイン分泌促進活性の経時変化を示す図である。
【図７】マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーのＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。
【図８】マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーのＭＩＰ−１α分泌促進活性を示す図である。
【図９】マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーのＲＡＮＴＥＳ分泌促進活性を示す図である。
【図１０−１】マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの各種サイトカイン分泌活性を示す図である。
【図１０−２】マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの各種サイトカイン分泌活性を示す図である。
【図１１】マウス腹腔内マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーのＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。
【図１２】アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与によるＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。
【図１３】アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与が、濃度依存的なＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（１）サイトカインの分泌促進剤
本明細書中「サイトカイン」とは、免疫系、造血系などにおいて主要な細胞間情報伝達を担う一群の液性因子を意味し、公知のサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、トランスフォーミング成長因子およびケモカインなどの自体公知のサイトカインだけでなく、将来発見されうるサイトカインをも意味し、ＴＮＦ−αを除く限りにおいて特に限定されない。
本発明におけるサイトカインとしては、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選ばれるサイトカインが好ましい。【００２０】
本明細書中「コロニー刺激因子（ＣＳＦ）」とは、単球系細胞（顆粒球、好中球、単球など）に特異的に作用してそのコロニー形成を誘導する機能などを有するサイトカインであり、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ（glanulocyte-macrophage）−ＣＳＦ、Ｍ（macrophage）−ＣＳＦなどが挙げられる。
本発明におけるコロニー刺激因子としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦが好ましい。【００２１】
本明細書中「ケモカイン」とは、免疫応答に関与する単球系細胞の遊走作用、活性化などを制御するサイトカインであり、例えばＣＸＣケモカイン［例、ＫＣ（keratinocyte derived chemokine：ＣＸＣＬ８）等］、ＣＣケモカイン［例、ＭＣＰ（monocyte chemoattractant protein）−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、Ｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）等］、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカインなどが挙げられる。
本発明におけるケモカインとしては、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＣＰ−１、ＫＣが好ましい。【００２２】
本明細書中「インターロイキン（ＩＬ）」とは、炎症反応、免疫反応の促進、造血、骨代謝などの様々な生体反応に関与するサイトカインであり、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ７０；ｐ４０とｐ３５のヘテロ２量体、ｐ４０、ｐ３５）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７などが挙げられる。
本発明においては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７が好ましく、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３がより好ましい。【００２３】
本明細書中「インターフェロン（Interferon；以下ＩＦＮと表記する）」とは、抗ウイルス作用、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用、免疫細胞活性化作用などの様々な生物活性を有するサイトカインであり、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどが挙げられる。本発明におけるＩＦＮとしては、ＩＦＮ−γが好ましい。【００２４】
本明細書中「腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；ＴＮＦ）」とは、種々の細胞に対する細胞傷害作用、細胞増殖抑制作用などの様々な生物活性を有するサイトカインであり、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどが挙げられる。【００２５】
本明細書中「トランスフォーミング成長因子（Transforming Growth Factor；ＴＧＦ）」とは、細胞に対する増殖抑制作用、分化調節作用、遊走作用、各種細胞外マトリックスの産生促進作用などの様々な生物活性を有するサイトカインであり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーを構成する一群のペプチド、例えばＴＧＦ−β、アクチビン、ＢＭＰなどが挙げられる。【００２６】
本発明のアルギン酸オリゴマーは、各種細胞に作用して上記サイトカインの分泌を促進させることができる。【００２７】
本発明の剤に含まれる「アルギン酸オリゴマー」は、アルギン酸を分解して得られた重合度２０未満のＧ、Ｍまたはその混合物からなるオリゴ糖を意味する。
上記アルギン酸オリゴマーは、酵素分解物（すなわち、重合度の異なるアルギン酸オリゴマーの混合物）そのものであるか、同じ重合度のアルギン酸オリゴマー精製物であることが好ましい。また、上記アルギン酸オリゴマーは、マンヌロン酸のオリゴマー（以下、Ｍオリゴマーと表記する場合がある）およびグルロン酸のオリゴマー（以下、Ｇオリゴマーと表記する場合がある）の混合物であっても、それぞれ単独であってもよいが、マンヌロン酸単独またはグルロン酸単独であることが好ましい。
さらに、本発明の剤においては、アルギン酸オリゴマーの重合度は２０未満、好ましくは２〜１５、特に好ましくは３〜９である。【００２８】
本発明の剤におけるアルギン酸オリゴマーの含有量は、通常、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。【００２９】
本発明の剤は、アルギン酸オリゴマーそのものでも良いが、任意の担体を含んでいても良い。当該担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン-アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００３０】
本発明の剤の剤形としては、例えば固形剤（例、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤およびトローチ剤等）、ならびに液剤（例、注射剤、点滴剤および点眼剤等）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。アルギン酸オリゴマーは、低分子化されており、水等の溶媒に可溶であるため、上記いずれの剤形を採っても容易に摂取することができる。【００３１】
本発明の剤が作用する細胞としては特に限定されることなく、サイトカインを分泌することが従来公知な細胞または将来発見され得る細胞全てが含まれる。中でもＣＳＦ、ケモカイン、ＩＬおよびＩＦＮからなる群から選択されるサイトカインを分泌する細胞が好ましく、例えば、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｔｈ２細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、Ｔｈ１細胞、メモリーＴ細胞、血管平滑筋、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、未成熟樹状細胞、血小板、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞または肥満細胞等のエフェクター細胞が挙げられる。
また、本発明の剤が適用される生物としても特に限定されることは無く、例えば、ヒトを含む動物（例、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類等）が挙げられる。【００３２】
本発明の剤は、単独で用いてもよいが、癌の化学療法および放射線療法等の際に併用することもできる。例えば、抗癌剤、免疫療法剤、抗炎症剤、ビタミン剤等と組み合わせて用いることができる。また、癌治療に用いる放射線照射前後にも投与することができる。これらの剤を投与することにより発生する副作用により、サイトカインの分泌が低下する場合に特に有用である。【００３３】
本発明の剤が含有するアルギン酸オリゴマーは、生体に対する毒性を有さず、また副作用も生じさせない。従って、本発明の剤を一般の飲食品、サプリメント等に配合することで、サイトカイン分泌促進機能（免疫機構増強機能）を有する機能性飲食品等を製造することもできる。アルギン酸オリゴマーを飲食品に配合して用いるには、その有効量を直接もしくは上記製剤形態で、飲食品原料の製造段階または飲食品の製造段階において、添加、配合すればよい。【００３４】
次に、アルギン酸オリゴマーの調製方法について説明する。
アルギン酸オリゴマーの調製に使用されるアルギン酸としては特に限定されず、市販されているもの（例、アルギン酸ナトリウム）を用いてもよいし、コンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻類から直接抽出したアルギン酸を用いてもよい。また褐藻類からの抽出方法は特に限定されず、自体公知の抽出方法により行うことができる。【００３５】
アルギン酸オリゴマーは、ポリマーのまま分解して製造してもよいが、予めアルギン酸からＰＧまたはＰＭを分離精製しておき、それらを分解することが好ましい。アルギン酸からのＰＧまたはＰＭの分離精製は、自体公知の方法により行うことができ、例えばＨａｕｇらの不均一酸性加水分解法に準じた方法を好ましく利用することができる（Acta. Chem. Scand., 20, 183-190, 1966; Acta. chem. Scand., 21, 691-704, 1967参照）。【００３６】
例えば図１に示すように、アルギン酸ナトリウムを０．３Ｍ塩酸水溶液に懸濁し、１００℃で加熱した後、固形物を遠心分離またはろ過によって酸性溶液から分離する。次いで得られた固形物（残渣）を０．３Ｍ塩酸水溶液で洗浄し、水に懸濁し、希水酸化ナトリウム溶液で中和（ｐＨ＝７）して可溶化した後凍結乾燥して抗分別粉末を得る。さらに、該粉末を０．１Ｍの塩化ナトリウム水溶液中に溶解し、塩酸水溶液を加えｐＨ２．８５に調整して可溶化したＰＭと沈殿したＰＧに分離する。【００３７】
沈殿したＰＧは、ｐＨ２〜３の塩酸で洗浄し、水に懸濁した後水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整し溶解する。さらにエタノール（ＰＧ溶液／エタノール＝１／２，ｖ／ｖ）を添加して、ＰＧを沈殿させる。沈殿物をエタノールで２回洗浄した後水に溶解し、凍結乾燥することで精製ＰＧ粉末を得ることができる。【００３８】
一方、可溶化したＰＭは、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整し、エタノール（ＰＭ溶液／エタノール＝１／２，ｖ／ｖ）を添加して、ＰＭを沈殿させる。沈殿物をエタノールで２回洗浄した後水に溶解し、凍結乾燥することで精製ＰＭ粉末を得ることができる。【００３９】
アルギン酸の分解は、自体公知の方法、例えば酵素分解または酸加水分解により行うことができるが、図３に示すサイトカインの分泌促進活性の点から、酵素分解により行うことが好ましい。酵素分解はアルギン酸分解酵素を用いて行うが、特にシュードアルテロモナスｓｐ．Ｎｏ．２７２株の産生するアルギン酸リアーゼ（biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 133-142, 2001参照）を用いることが好ましい。酵素分解によりアルギン酸または精製ＰＧおよび精製ＰＭを分解し、不飽和結合のウロン酸を非還元末端とするアルギン酸オリゴマーを調製することができる。
また、重合度が異なるアルギン酸オリゴマーを精製するためには、ゲルろ過や各種クロマトグラフィー等の自体公知の分離手段を制限無く用いることができる。【００４０】
本発明の剤は、以上の工程を経て調製されたアルギン酸オリゴマーを含有させ、常法により製造することができる。
例えば、固形剤（例、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、軟膏剤および経皮製剤）は所定量のアルギン酸オリゴマーを固体や顆粒として含有させることで製造することができる。一方、液剤（例、注射剤、点滴剤および点眼剤等）は水および生理食塩水のような希釈液に所定量のアルギン酸オリゴマーを溶解させることで製造することができる。【００４１】
本発明の剤は、その製剤中に含有させるアルギン酸オリゴマーの種類および配合量を調整することで、サイトカインの分泌を調節することができる。例えばオリゴマーの種類については、図７〜９の各オリゴマーによるＧ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの分泌量にそれぞれ示されるように、より多量のサイトカインの分泌を目的とする場合は、Ｇ−ＣＳＦの場合、Ｇ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７またはＭ８を選択し、ＲＡＮＴＥＳの場合、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８またはＭ９を選択する。またＭＩＰ−１αの場合は、Ｇオリゴマーに比して相対的に高い分泌活性を有するＭオリゴマーを選択すればよい。さらに他のサイトカインの場合は、図１０に示される各種サイトカイン分泌量を参考に、アルギン酸オリゴマーを選択すればよい。ここで、例えばＧ３とは、グルロン酸のみで構成され、その重合度が３であるアルギン酸オリゴマーを表し、例えばＭ７とは、マンヌロン酸のみで構成され、その重合度が７であるアルギン酸オリゴマーを表す。
またオリゴマーの配合量については、図４、図６および図１２に示されるサイトカイン分泌量の経時変化、ならびに図５に示される投与量依存的な分泌活性を参考に、アルギン酸オリゴマーの配合量および投与間隔を適宜選択すればよい。【００４２】
（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬
本発明はまた、アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬を提供する。【００４３】
本明細書において「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態」とは、生体内の各種細胞が分泌するコロニー刺激因子またはケモカイン量の低下に端を発する、生体内における好中球の減少および機能低下、造血幹細胞の分化能低下、末梢血への遊走能の低下、血管新生の減少、血管内皮細胞のアポトーシスの増加ならびにエフェクター細胞の遊走活性の低下等の状態などをいい、具体的には、「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾患」、すなわち薬剤投与および放射線治療等の副作用による顆粒球減少、種々の感染症に伴う慢性好中球減少症、冠動脈硬化等による各種免疫機能の低下、心筋梗塞および閉塞性動脈硬化症等の障害および疾患などをいう。
これらの障害等はコロニー刺激因子またはケモカインの分泌を促進させることで改善することができる。
なお、本明細書において、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を「改善する」とは、上記状態を未然に防止（予防）すること、治療することおよび上記状態における症状を改善することを含む。すなわち、本発明は、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害または疾患を予防または治療する医薬をも提供する。【００４４】
本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、サイトカイン、特にコロニー刺激因子またはケモカインの分泌を促進する。従って、本発明の医薬は、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾患、例えば免疫機能低下、動脈硬化症等の予防または治療等に好適に使用され得る。【００４５】
本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、本発明の「（１）サイトカインの分泌促進剤」で説明した通りである。
該アルギン酸オリゴマーは、酵素分解物（すなわち、重合度の異なるアルギン酸オリゴマーの混合物）であるか、同じ重合度のアルギン酸オリゴマー精製物であることが好ましい。また、上記アルギン酸オリゴマーは、マンヌロン酸およびグルロン酸の混合物であっても、それぞれ単独であってもよいが、ＭオリゴマーまたはＧオリゴマーであることが好ましい。
さらに、本発明の医薬においては、有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーの重合度は２０未満、好ましくは２〜１５、特に好ましくは３〜９である。【００４６】
本発明の医薬において、有効成分であるアルギン酸オリゴマーの配合量は、通常、０．０１〜９９．９重量％、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。【００４７】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体を含むことができる。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００４８】
本発明の医薬の投与剤形としては、例えば経口剤（例、液剤、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤等）および非経口剤（例、注射剤、点眼剤等）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また本発明の医薬は、その剤形が速放性製剤または徐放性製剤等の放出制御製剤（例、徐放性マイクロカプセル剤）であってもよい。アルギン酸オリゴマーは、低分子化されており、水等の溶媒に可溶であるため、上記いずれの剤形を採っても容易に吸収される。【００４９】
「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾患」、すなわち本発明の医薬を投与することで予防または治療され得る障害および疾患としては、例えば、自己免疫疾患［例、自己免疫性溶血性貧血、造血幹細胞の末梢血中への動員、造血幹細胞移植時の好中球数の増加促進、がん化学療法による好中球減少症等］、先天性免疫不全疾患［例、先天性・特発性好中球減少症、ＡＤ（アトピー性皮膚炎）、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）等］、後天性免疫不全疾患［例、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の治療に支障を来す好中球減少症、骨髄異形成症候群に伴う好中球減少症、再生不良性貧血に伴う好中球減少症、リウマチ性関節炎、特発性肺胞蛋白症等］等が挙げられる。また、神経芽腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍等に対して抗癌剤を投与した際の好中球等の減少に際しても好ましく用いられる。【００５０】
本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、本明細書「（１）サイトカインの分泌促進剤」中で説明した通りであり、そこに記載した方法で調製することができる。【００５１】
また、本発明の医薬は、医薬の製造法として一般的に用いられている自体公知の手段に従って、上記アルギン酸オリゴマーを有効成分として、上記医薬的に許容される担体と混合して製剤化することができる。
例えば、経口投与に好適な医薬は、水または生理食塩水のような希釈液に有効量のアルギン酸オリゴマーを溶解させて製造する（例、液剤）ことができ、また有効量のアルギン酸オリゴマーを固体や顆粒として含有させて製造する（例、カプセル剤、錠剤）ことができる。液剤を応用して、噴霧器を用いた吸入療法を行うことも可能である。一方、非経口的投与（例、静脈内注射、筋肉注射、局所注入）に好適な医薬（例、注射薬）は、例えば水性および非水性の等張な無菌の注射液に有効量のアルギン酸オリゴマーを溶解させて製造することができる。なお、これらの医薬には抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。これらの医薬は、アンプルおよびバイアルのように、単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。【００５２】
また、本発明の医薬中に含有させるアルギン酸オリゴマーの種類および配合量を調整することで、サイトカインの分泌量を調節することができる。オリゴマーの種類については、例えば図７〜９に示すように、より多量のサイトカインの分泌を目的とする場合は、Ｇ−ＣＳＦの場合、Ｇ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７またはＭ８を選択し、ＲＡＮＴＥＳの場合、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８またはＭ９を選択する。またＭＩＰ−１αの場合は、Ｇオリゴマーに比して相対的に高い分泌活性を有するＭオリゴマーを選択すればよい。さらに他のサイトカインの場合は、図１０を参考にアルギン酸オリゴマーを選択すればよい。
またオリゴマーの配合量については、図４、図６および図１２のサイトカイン分泌量の経時変化、ならびに図５の投与量依存的な分泌活性を参考に、アルギン酸オリゴマーの配合量および投与間隔を適宜選択すればよい。
本発明の医薬によれば、サイトカインの分泌を促進させるのに有効なアルギン酸オリゴマーの投与量を容易に調整することができる。【００５３】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の活性、種類または配合量、投与対象、投与ルート、対象疾患、予防または治療の目的、患者の年齢および体重等により適宜設定することができる。成人（体重約６０ｋｇ）に経口投与する場合の投与量は、アルギン酸オリゴマーが混合物の場合は、有効成分であるアルギン酸オリゴマーを１日あたり約０．１〜１００ｇ、好ましくは約０．３〜３０ｇとなるように投与することができ、アルギン酸オリゴマーが重合度ごとに精製されている（例えば重合度９のグルロン酸オリゴマー）場合は、有効成分であるアルギン酸オリゴマーを１日あたり、約０．０１〜２ｇ、好ましくは約０．１５〜１．５ｇとなるように投与することができる。本発明の医薬は、１日あたり、必要に応じて一度に、または数回に分割して投与することができ、また数日に分けて投与することもできる。【００５４】
また本発明の医薬は、ヒトだけでなく、動物用医薬としても安全に投与することができる。投与対象となる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類等が挙げられる。この場合の投与量等は、当業者であれば適切に決定することが可能である。【００５５】
（３）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用
また本発明は、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用を提供する。具体的には、アルギン酸オリゴマーを使用したコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬の製造方法を提供する。【００５６】
本発明で使用されるアルギン酸オリゴマーは、本明細書中「（１）サイトカインの分泌促進剤」で説明した通りである。またこれは、本明細書中「（１）サイトカインの分泌促進剤および（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」に記載した方法で調製することができる。本発明において、「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害または疾患」とは、本明細書中「（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」で説明した通りである。【００５７】
該使用においては、〔１〕コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するために、〔２〕アルギン酸オリゴマーを使用する、限りにおいて特に制限はなく、本明細書中「（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」に記載した方法や、自体公知の製造方法を利用することができる。【００５８】
（４）サイトカインの分泌を促進させる方法
さらに本発明は、本発明のサイトカインの分泌促進剤を摂取する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカイン、好ましくはコロニー刺激因子またはケモカインからなる群より選ばれるサイトカインの分泌を促進させる方法を提供する。
また、本発明は、本発明の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカイン、好ましくはコロニー刺激因子またはケモカインからなる群より選ばれるサイトカインの分泌を促進させる方法を提供する。
さらに本発明は、本発明の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療する方法を提供する。【００５９】
本方法の剤または医薬に有効成分として含まれるアルギン酸オリゴマーは、本明細書中「（１）サイトカインの分泌促進剤」で説明した通りである。またこれは、本明細書中「（１）サイトカインの分泌促進剤および（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」に記載した方法で調製することができる。【００６０】
本方法の対象となる「サイトカイン」とは、本明細書中「（１）サイトカインの分泌促進剤」で説明した通りであり、「コロニー刺激因子、ケモカインまたはインターフェロンの分泌低下に起因する状態」とは、本明細書中「（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」で説明した通りである。【００６１】
本方法が適用される対象、すなわち本発明の医薬を必要とする対象としては特に限定されない。例えばヒトだけでなく、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類等が挙げられる。この場合の投与量および投与方法は、本明細書中（２）コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」における記載に準じて適宜設定することができる。摂取量および摂取方法等も、当業者であれば適切に決定することが可能である。アルギン酸オリゴマーの毒性は非常に低いので、個体差に応じて摂取量の加減が容易である。【００６２】
（５）本発明の剤または医薬および当該剤または医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ
本発明は、上記（１）記載のサイトカイン分泌促進剤、および当該サイトカインの分泌促進剤がＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該サイトカインの分泌促進剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージを提供する。【００６３】
また、本発明の別の実施態様においては、上記（２）記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するために使用することができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージを提供する。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を示してさらに具体的に本発明を説明する。以下は代表的な実施例を示すものでこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００６５】
［試験例１］細胞の培養
マウス単球由来細胞株（マウスマクロファージ系株化細胞）ＲＡＷ２６４．７（ATCC No. TIB71）を培養した。生育培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０培地に抗生物質（Benzyl Penicilin Potassium、Streptomycin Sulfate）を１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに５６℃で３０分熱処理した牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものを用いた。【００６６】
細胞の培養に際しては、セラムチューブ中の細胞懸濁液（１０％  ＤＭＳＯを含む生育培地中にて−８０℃に保存されているもの）を融解し、１５ｍｌチューブに移し、これに生育培地を加えて室温にて２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行い、上清を除いた。次いで約５ｍｌの生育培地を加えて細胞を分散させ、培養フラスコ（ファルコン社製、２５ｃｍ２プラスチックフラスコ）に移し、３７℃、５％ＣＯ２ガス培養器にて培養を行った。一晩放置し、細菌等の混入がないこと、および細胞が培養フラスコの底面に接着していることを確認して、培地交換および継代培養を行った。【００６７】
該細胞の継代培養に際しては、フラスコ内の生育培地を除き、０．２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ溶液と入れ換え、３７℃、５％ＣＯ２ガス培養器内で細胞が個々に分かれるまで静置後、フラスコ内の溶液を取り除き、再びガス培養器内で約１５分静置した。フラスコ底面から細胞が剥がれてきたことを確認してから、生育培地を加え、一部の細胞を新たなフラスコ内の生育培地に分散させ、再び３７℃、５％ＣＯ２ガス培養器で培養を行った。【００６８】
［実施例１］酵素消化アルギン酸オリゴマーの調製
工程１：ＰＧ、ＰＭの調製
市販のアルギン酸ナトリウムより、Ｈａｕｇらの方法（Acta, Chem. Scand., 20, 183-190, 1966, Carbohydr. Res., 32, 217-225）に改良を加えた方法でＰＧおよびＰＭを調製した。調製のフローチャートを図１に示す。【００６９】
具体的には、アルギン酸（アルギン酸ナトリウム、ナカライテスク社製）２０ｇを２Ｌの０．３Ｍ  ＨＣｌ溶液に懸濁し、１．５時間１００℃に加熱して部分加水分解を行った。沈殿を採取して、０．３Ｍ  ＨＣｌで洗浄した後、２５０ｍｌの水に懸濁し、希ＮａＯＨでｐＨ７に中和して水に溶解させた後、凍結乾燥して、抗分別粉末を得た。該粉末５ｇを１Ｌの０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解し、１Ｌの酸性水溶液（３００ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌ＋７００ｍｌの水）を加えｐＨ２．８５に調整した。沈殿したＰＧと懸濁したＰＭとを分離した。沈殿したＰＧはｐＨ２−３のＨＣｌで洗浄し、３００ｍｌの水に懸濁させ、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し溶解した。エタノール（ＰＧ／エタノール＝１／２，ｖ／ｖ）を加えて、ＰＧを沈殿させ、沈殿したＰＧをエタノールで洗浄（２回）した後、沈殿を水に溶解し、凍結乾燥によって、精製されたＰＧの粉末（約１．５ｇ）を得た。一方、懸濁したＰＭは、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し、エタノール（ＰＭ／エタノール＝１／２，ｖ／ｖ）を添加して、ＰＭを沈殿させた。該沈殿をエタノールで洗浄（２回）した後、水に溶解し、凍結乾燥によって、精製されたＰＭの粉末（約３ｇ）を得た。【００７０】
工程２：酵素処理アルギン酸オリゴマー混合物の調製
不飽和オリゴマーの調製には、アルギン酸リアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０ｍｇ／ｍｌにした。０．２％のＰＧおよびＰＭを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．０ｍｌを３７℃で１０分間インキュベートし、この基質溶液に酵素溶液を０．２ｍｌ添加して、２分間反応を行った。２３５ｎｍにおける吸光度が１分間に０．１増加する酵素量を１単位（ｕｎｉｔ）として酵素活性を測定した。【００７１】
次いで、５ｇのＰＧおよびＰＭを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌに溶解し、アルギン酸リアーゼ０．０１ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ、比活性７．２４単位／ｍｇ）を２時間ごとに３回加え、３７℃で反応させた。このオリゴマー溶液をメンブランろ過した。次いで水を溶出液としたゲルろ過カラムを用いて脱塩操作を行った。さらに蒸留水で緩衝化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２カラム（２．５×９５ｃｍ）にリン酸塩を含む試料を供し、流速０．２６ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。リン酸塩の定量はモリブデンブルー法にて行った。リン酸塩を含まない部分のみをプールし、凍結乾燥後、乾燥標品として各オリゴマーを得た。【００７２】
工程３：重合度の異なるアルギン酸オリゴマーの調製
重合度の異なる酵素処理アルギン酸オリゴマーを得る場合は、工程２のメンブレンろ過の後、予め５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６カラム（８．８×９５ｃｍ）に１．３ｍｌ／ｍｉｎの流速で各サンプルを供した。重合度の異なるオリゴマーを含むフラクションをプールし、濃縮した。このゲルろ過の溶出曲線を図２に示す。重合度の決定は、ブルーデキストラン２，０００とガラクツロン酸を用い、Ｗｈｉｔａｋｅｒの方法に従って行った。【００７３】
［実施例２］酸加水分解アルギン酸オリゴマー（混合物）の調製
１％のＰＧおよびＰＭを含む溶液（０．１Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ４．０に調整）を１２１℃で８０分間加水分解した。冷却後、該溶液を０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した後脱塩操作を行い、凍結乾燥し、乾燥標品として該アルギン酸オリゴマー混合物を得た。【００７４】
［実施例３］アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対するＧ−ＣＳＦ分泌促進活性
酵素分解アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対するＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。【００７５】
工程１：アルギン酸オリゴマーの調製
細胞に添加するアルギン酸オリゴマーは、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ１６４０無血清培地もしくは生理食塩水で調製し、ゼータポアフィルターに通したものを使用した。【００７６】
工程２：アルギン酸オリゴマーの培養系への添加
ＲＡＷ２６４．７細胞を、平底９６ウェルプレートに１ウェルあたりの細胞数が２×１０４となるように播種した。細胞が一ヶ所に集まらないように軽く攪拌し、３７℃、５％ＣＯ２ガス培養器内で一晩培養した。各ウェルの細胞数にばらつきが無いことを顕微鏡で確認し、ここに無血清培地で１ｍｇ／ｍｌに調製した上記アルギン酸オリゴマー溶液をそれぞれ添加した。該細胞は、３７℃、５％ＣＯ２ガス培養器内で一晩培養した後、各培養上清を回収した。【００７７】
工程３：ＥＬＩＳＡによるＧ−ＣＳＦの検出
次いで、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに滅菌ＰＢＳで４μｇ／ｍｌに希釈した一次抗体（Anti-mouse G-CSF monoclonal antibody, Purified）を１ウェルあたり１００μｌ添加した。室温で一晩静置後、洗浄溶液（０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で２回洗浄し、ブロッキング溶液（４％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）を１ウェルあたり２００μｌ添加した。室温で一晩静置後、洗浄溶液で２回洗浄し、ブロッキング溶液で１％に希釈した培養上清を１ウェルあたり１００μｌ添加した。室温で１時間静置後、洗浄溶液で５回洗浄し、ブロッキング溶液で１０００倍希釈した酵素−抗体コンジュゲート（Anti-Rabbit Ig, HRP-linked Whole Ab Donkey）を１ウェルあたり１００μｌ添加した。室温で３０分間静置し、洗浄溶液で５回洗浄後、基質溶液（TMB Peroxidase SubstrateとPeroxidaseSolution Bを1:1で混合したもの）を１００μｌ添加した。室温で３０分間静置した後、反応停止剤として１Ｎのリン酸溶液を５０μｌ添加し、よく攪拌した後マイクロプレートリーダーにより吸光度（Ａｂｓ＝４５０ｎｍ）を測定した。なお、標準物質としては既知濃度の組換えＧ−ＣＳＦを用い、比較として酸加水分解により調製したアルギン酸オリゴマーを用いた。【００７８】
アルギン酸Ｇオリゴマー混合物に関する、酵素処理アルギン酸オリゴマーと酸加水分解アルギン酸オリゴマーの比較結果を図３に示す。酸加水分解で得られたアルギン酸ＧオリゴマーにはＧ−ＣＳＦ分泌促進活性はほとんど認められなかったが、酵素処理したアルギン酸Ｇオリゴマーにはマクロファージからの高いＧ−ＣＳＦ分泌促進活性が認められた。また、アルギン酸Ｍオリゴマーについても同様の結果が得られた。【００７９】
［実施例４］マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与による、血中Ｇ−ＣＳＦ量の経時変化
アルギン酸オリゴマー混合物（ＰＢＳ  １ｍｌ中、７００ｍｇ／ｋｇ）またはアルギン酸ポリマー（ＰＢＳ  １ｍｌ中、７００ｍｇ／ｋｇ）をＤＤＹマウス（６週齢、雄性、体重約３０ｇ）腹腔内に注入し、マウス血清中のＧ−ＣＳＦ量を経時的にＥＬＩＳＡ法にて測定した。
工程１：アルギン酸オリゴマー混合物の調製
アルギン酸オリゴマー混合物は、次のように調製した。
すなわち、高純度アルギン酸ナトリウム（キミカ社製）を水に溶解させて５％水溶液とし、ここに終濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにアルギン酸リアーゼ（シュードアルテロモナスｓｐ．Ｎｏ．２７２株の培地から、Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 1990-1992記載の方法で精製したもの）を加え、４０℃で３日間インキュベートした。溶液を沸騰水中で１０分間加熱することで酵素反応を停止させた。アルギン酸オリゴマー混合物は、エンドトキシンを除去するため、使用前にゼータポアフィルター（和光純薬社から購入）に通した。
工程２：マウス血清中のＧ−ＣＳＦ量の測定
上記工程１で調製したアルギン酸オリゴマー混合物をマウス腹腔内に注入し、０時間、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、６時間、９時間または２４時間後に各マウスから常法により血清を得た。血清中のＧ−ＣＳＦ量は、Iwamoto, M. et al., FEBS Lett. 2005, 579, 4423-4429に記載の方法と同様の方法で、抗マウスＧ−ＣＳＦ抗体（R&D Systems, MN, USA）を用いたＥＬＩＳＡ法によって測定した。【００８０】
結果を図４に示す（なお、実験は３回行った。図中、それぞれの点は３回の平均値を表し、各バーは標準偏差を示す）。血清中のＧ−ＣＳＦ量は、アルギン酸オリゴマー混合物を注入後速やかに増加し、２時間で最大量に達した。この高濃度は６時間後まで維持された。次いで徐々に減少し、２４時間後にはベースライン量に戻った。一方、アルギン酸ポリマーを注入した場合は、血清中のＧ−ＣＳＦ量に何も変化が認められなかった。【００８１】
［実施例５］マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与量と血中Ｇ−ＣＳＦ量との相関
アルギン酸オリゴマー混合物は、実施例４の工程１と同様の方法で調製した。種々の濃度（０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ）のアルギン酸オリゴマー混合物（ＰＢＳ  １ｍｌ中）をマウス腹腔内に投与して、３時間後のマウス血清中のＧ−ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡ法で測定した。【００８２】
結果を図５に示す（なお、実験は３回行った。図中、それぞれの点は３回の平均値を表し、各バーは標準偏差を示す）。血清中のＧ−ＣＳＦ量は、アルギン酸オリゴマー混合物の投与量の増加に伴って増加し、７０ｍｇ／ｋｇの投与量でプラトーに達した。【００８３】
［実施例６］マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与による各種サイトカイン分泌活性
上記実施例４の工程１で調製したアルギン酸オリゴマー混合物（ＰＢＳ  １ｍｌ中、７００ｍｇ／ｋｇ）をマウス腹腔内に注入し、マウス血清中の各種サイトカイン量を経時的にＢｉｏ  Ｐｌｅｘシステム（バイオラッド社製）で測定した。Ｂｉｏ  Ｐｌｅｘは少量のサンプル量で複数のサイトカインの同時定量が可能な利点を有する。原理的には通常のＥＬＩＳＡにフローサイトメトリーを組み合わせたものである。すなわち、各種サイトカインに対する抗体が結合したビーズを試験サンプルに加え、サイトカインと結合したビーズをフローサイトメトリーで検出し、分析した。【００８４】
結果を図６−１〜６−３に示す（なお、実験は２回行い、それぞれの値は２回の平均値を表す。２回の測定値の差は５％以内である）。ピーク値において、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＫＣ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１２（ｐ４０）の分泌量は５０００ｐｇ／ｍｌより高かった。
また、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳおよびＩＮＦ−γは、２４時間以内に２つのピークを示した。一方、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＫＣおよびｅｏｔａｘｉｎは、１つのピークを示した。【００８５】
［実施例７］アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対する各種サイトカイン分泌促進活性
重合度の異なる各酵素分解アルギン酸オリゴマーにつき、マクロファージに対する各種サイトカイン分泌促進活性をＥＬＩＳＡ法にて測定した。【００８６】
アルギン酸オリゴマーの調製および該オリゴマーの培養細胞への添加は、実施例３の工程１および２と同様の方法で行った。また、培養上清中のサイトカイン量はＢｉｏ  Ｐｌｅｘシステム（バイオラッド社製）で定量した。【００８７】
Ｇ−ＣＳＦ分泌促進活性に関する結果を図７に示す。アルギン酸オリゴマーのＧ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７およびＭ８に高いＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を見出すことができた。【００８８】
ＭＩＰ−１α分泌促進活性に関する結果を図８に示す。マンヌロン酸オリゴマーには分子サイズの影響はあまり見られず、いずれも強い作用が認められた。一方、グルロン酸オリゴマーではＧ８およびＧ９に他に比べて強い作用が認められた。【００８９】
ＲＡＮＴＥＳ分泌促進活性に関する結果を図９に示す。ＭＩＰ−１αに比べてオリゴマーの構造により活性が異なり、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８およびＭ９に強い作用が認められた。なお、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８およびＭ９はＧ−ＣＳＦ分泌促進についても同様に強い活性が認められ、かなり類似した構造活性相関を示した。【００９０】
他のサイトカイン分泌促進活性に関する結果を図１０−１〜１０−２に示す。Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦおよびｅｏｔａｘｉｎについては、特にＭオリゴマーによる強いサイトカイン放出誘導作用が認められた。また、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１３についても当該作用が認められ、さらにＩＬ−５、ＩＬ−１２およびＫＣについても、弱いながら当該作用が認められた。【００９１】
ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳは別名が、それぞれＣＣＬ−３およびＣＣＲ−５として知られており、類似した作用を有する事が知られている。ＭＩＰ−１αはまた、ＨＩＶ感染を抑制すること等が報告されている。以上の結果から、アルギン酸オリゴマーはこのような複数のサイトカイン放出誘導作用を発現し、多面的に生体の免疫系に影響を与えるものと推定される。【００９２】
［実施例８］アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内マクロファージに対するＧ−ＣＳＦ分泌促進活性
生体内におけるマクロファージに対しても、本発明のアルギン酸オリゴマーがＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を有するかを確認した。【００９３】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（５週齢、雌性）を１週間以上予備飼育し、該マウスに３％チオグリコレート培地（ディフコ社製）をマウス１匹あたり３ｍｌ腹腔内投与し、３日後に炭酸ガスで安楽死させ、腹腔浸出細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）にて採取した。回収した腹腔浸出細胞は、ＰＢＳで洗浄後、基礎培養液中で細胞密度の調整を行い、９６穴平底プレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。プレート遠心（５００ｒｐｍ、５分間）により細胞を沈降させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。培養終了後直ちに３７℃のＰＢＳで洗浄して非付着細胞を除去し、再度培養液に浸して、腹腔浸出細胞の単層培養を調製した。この腹腔浸出細胞の単層培養における、マクロファージの純度は９５％以上であった。培地で１ｍｇ／ｍｌに調整した各アルギン酸オリゴマー溶液を添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養後、上清中のＧ−ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡにて定量した。【００９４】
用いるアルギン酸オリゴマーの調製および該オリゴマーの培養細胞への添加は、実施例３の工程１および２と同様の方法で行った。また、ＥＬＩＳＡによる定量は、実施例３の工程３と同様の方法で行った。【００９５】
マウス腹腔内マクロファージに対するＧ−ＣＳＦ分泌促進活性に関する結果を図１１に示す。アルギン酸オリゴマーのＧ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７およびＭ８に高いＧ−ＣＳＦ分泌促進活性を見出すことができた。【００９６】
［実施例９］マウス生体に対するアルギン酸オリゴマーのＧ−ＣＳＦ分泌促進活性
マウス生体内にアルギン酸オリゴマーを投与することによって、生体中のＧ−ＣＳＦ量が増大するかを調べた。【００９７】
ＤＤＹマウス（５週齢、雌性）を１週間以上予備飼育した。該マウスに対し、１匹あたり２００ｍｇ／ｍｌの酵素消化アルギン酸オリゴマー（オリゴマー混合物）または１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸オリゴマー（Ｇ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８）各０．１ｍｌを腹腔内投与した。投与後０、０．５、１、１．５、３、９時間後に採血し、得られた血液を１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心して血清を採取した。採取した血清中に含まれるＧ−ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡで定量した。【００９８】
アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与によるＧ−ＣＳＦ分泌促進活性に関する結果を図１２に示す。アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与により、投与３時間後をピークに高いＧ−ＣＳＦ誘導活性を見出すことができた。【００９９】
［実施例１０］
生体への適切な投与量を調べる目的で、アルギン酸オリゴマーの濃度依存によるＧ−ＣＳＦ誘導活性を調べた。【０１００】
ＤＤＹマウス（５週齢、雌性）を１週間以上予備飼育した。該マウスに対し、１匹あたり０．０２、０．２、２、２０ｍｇ／ｍｌの酵素消化アルギン酸オリゴマー（オリゴマー混合物）または０．００１、０．０１、０．１、１ｍｇ／ｍｌの単独アルギン酸オリゴマー（Ｇ３、Ｇ８、Ｇ９、Ｍ７、Ｍ８）を各０．１ｍｌ腹腔内に投与した。投与後３時間後に採血し、得られた血液を１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心して血清を採取した。採取した血清から、ＥＬＩＳＡによりＧ−ＣＳＦ量を定量した。【０１０１】
アルギン酸オリゴマーの濃度依存的な投与と、Ｇ−ＣＳＦ分泌活性の関係に関する結果を図１３に示す。アルギン酸オリゴマーの単独および／または混合物をマウス腹腔内投与することにより、濃度依存的に高いＧ−ＣＳＦ誘導活性を見出した。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の剤または医薬によれば、サイトカイン、特にコロニー刺激因子またはケモカインの分泌を促進することができるので、顆粒球および好中球を増殖させ、かつ活性化することができる。本発明の医薬は、癌治療、臓器移植、免疫不全等により免疫機能が低下した患者や、恒常的な自己免疫疾患を有する患者に有用である。また原材料がアルギン酸であるため、安価で安全な剤または医薬として提供することが可能である。【０１０３】
本出願は、日本で出願された特願２００５−３６１０５６（出願日：２００５年１２月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸オリゴマーを含有してなる、コロニー刺激因子、ケモカインおよびインターフェロンからなる群より選ばれるサイトカインの分泌促進剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
コロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦであり、ケモカインがＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＥｏｔａｘｉｎおよびＫＣである、請求項１記載の剤。
【請求項４】
インターフェロンがＩＦＮ−γである、請求項１記載の剤。
【請求項５】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸の酵素分解物またはその精製物である、請求項１、３および４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、請求項１、３〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、請求項１、３〜６のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬。
【請求項９】
アルギン酸オリゴマーがアルギン酸の酵素分解物またはその精製物である請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独からなるものである、請求項８または９記載の医薬。
【請求項１１】
アルギン酸オリゴマーの重合度が３〜９である、請求項８〜１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用。
【請求項１３】
請求項１、３〜７のいずれかに記載の剤を摂取する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αを除くサイトカインの分泌を促進させる方法。
【請求項１５】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療する方法。
【請求項１６】
サイトカインが、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群より選ばれるものである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１、３〜７のいずれかに記載のサイトカインの分泌促進剤、および当該剤がコロニー刺激因子、ケモカインおよびインターフェロンからなる群より選ばれるサイトカインの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防また治療するために使用することができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
【国際調査報告】
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