(57)【要約】  本発明は、樹状細胞上に発現するＴ細胞接着分子の提供を目的とする。本発明によれば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質が提供される。
2007037430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表されるアミノ酸配列、あるいは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質。
【請求項２】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、膜タンパク質または分泌タンパク質：
（ｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｉｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表される塩基配列を含んでなる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｖ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
以下の（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、および（ｘｉｉ）から選択される膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片：
（ｉｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【請求項８】
請求項１または２に記載の膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項７に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項８に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１０】
以下の（ｉｘ’）、（ｘ’）、（ｘｉ’）、および（ｘｉｉ’）から選択される膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項７に記載の抗体またはその機能的断片：
（ｉｘ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【請求項１１】
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片である、請求項１０に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７６の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される、請求項１１に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７６の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１４】
以下の（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、（ｘｖ）、および（ｘｖｉ）から選択されるタンパク質：
（ｘｉｉｉ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｘｉｖ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｘｖ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｘｖｉ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
以下の（ｘｖｉｉ）、（ｘｖｉｉｉ）、（ｘｉｘ）、および（ｘｘ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｘｖｉｉ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｘｉｘ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｘｘ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載のタンパク質に対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１８】
請求項７〜１２、および１７のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤。
【請求項１９】
関節リウマチの治療に用いられる、請求項１８に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項２０】
請求項７〜１２、および１７のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、Ｔ細胞接着阻害剤。
【請求項２１】
ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ａ）被験物質の存在下および非存在下において、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞とを接触させる工程；および
（ｂ）前記ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との結合活性を測定する工程
を含んでなり、前記ＴＡＲＭタンパク質が、以下の（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、および（ｘｉｉ）から選択される膜タンパク質または分泌タンパク質：
（ｉｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質
である、スクリーニング方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）の後に、（ｃ）被験物質の存在下における結合活性と被験物質の非存在下における結合活性とを比較する工程を更に含んでなる、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞が活性化Ｔ細胞である、請求項２１または２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
活性化Ｔ細胞が活性化Ｔｈ２細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
樹状細胞の活性化を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ｄ）被験物質の存在下および非存在下において、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片と樹状細胞とを接触させる工程；および
（ｅ）前記樹状細胞の活性化の程度を測定する工程
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２６】
工程（ｅ）において、樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１産生量を指標にして測定する、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
工程（ｅ）の後に、（ｆ−１）被験物質の存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１産生量と、被験物質の非存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１産生量とを比較する工程を更に含んでなる、請求項２６に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
工程（ｅ）において、樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＦｃＲγ鎖の発現量を指標にして測定する、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
工程（ｅ）の後に、（ｆ−２）被験物質の存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量と被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでなる、請求項２８に記載のスクリーニング方法。
【請求項３０】
ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法であって、下記工程：
（ｇ）被験物質の存在下および非存在下において、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片と樹状細胞とを接触させる工程；および
（ｈ）前記樹状細胞におけるＦｃＲγ鎖の発現量を測定する工程
を含んでなり、前記ＴＡＲＭタンパク質が、以下の（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、および（ｘｉｉ）から選択される膜タンパク質または分泌タンパク質：
（ｉｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質
である、スクリーニング方法。
【請求項３１】
工程（ｈ）の後に、（ｉ）被験物質の存在下における発現量と被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでなる、請求項３０に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、骨髄由来の樹状細胞上に発現するＴ細胞接着分子およびその遺伝子、並びにＴ細胞上に発現する、該接着分子（受容体）に対するリガンドおよびその遺伝子に関する。本発明はまた、該接着分子または該リガンドに対する抗体およびその用途に関する。本発明はさらに、該接着分子を利用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｔ細胞上に発現する樹状細胞活性化因子としてクローニングされていた分子が、破骨細胞の分化を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたことをはじめ（Yasuda,H., et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:3597-3602）、免疫系と骨代謝が密接に関係していることが明らかになってきた。【０００３】
免疫系制御分子による骨代謝の制御に関する研究は急速に進み、破骨細胞分化の制御に関わるシグナル伝達についても解明が進んできている。【０００４】
例えば、破骨細胞の分化に関与する分子として、Ｏｓｃａｒ（Osteoclast-associated receptor）が知られている。Ｏｓｃａｒは免疫グロブリン様受容体であり、ＦｃＲγ鎖と会合し、ＦｃＲγ鎖のＩＴＡＭモチーフを介してホスホリパーゼＣγにシグナルを伝達することがこれまでに報告されている（Kim,N., et al.(2002)J Exp Med 195:201-209）。【０００５】
また、樹状細胞上に発現し、Ｔ細胞と接着して、Ｔ細胞と樹状細胞との間の免疫応答に関する相互作用に関与する分子としては、ＣＤ８０−ＣＤ２８、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１など様々な相互作用が報告されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは今般、サブトラクション法により骨髄由来の樹状細胞上に特異的に発現する遺伝子を同定した。本発明者らはまた、該遺伝子にコードされるタンパク質がＩｇＥ受容体であるＦｃＲγ鎖と結合すること、ＬＰＳ刺激により該タンパク質の発現が増強されること、該タンパク質への抗体架橋刺激により樹状細胞が活性化すること、該タンパク質がＴ細胞への接着機能を有すること、該タンパク質に対する抗体が関節リウマチの疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルに対して治療効果を有することを見出した。本発明者らはさらに、Ｔ細胞上に発現する、該タンパク質に対するリガンドの遺伝子を同定した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明によれば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表されるアミノ酸配列、あるいは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質（以下、本発明による第一の態様の新規タンパク質という）が提供される。
【０００８】
本発明によれば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、膜タンパク質または分泌タンパク質（以下、本発明による第二の態様の新規タンパク質という）が提供される：
（ｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｉｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【０００９】
本発明によれば、本発明による第一の態様および第二の態様の新規タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１０】
本発明によればまた、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択される、ポリヌクレオチドが提供される：
（ｖ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明によれば、以下の（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、および（ｘｉｉ）から選択される膜タンパク質または分泌タンパク質（以下、ＴＡＲＭ（T cell-interacting Activating Receptor on Myeloid cells）タンパク質と呼ぶことがある）に対する抗体およびその機能的断片（以下、本発明による第一の態様の抗体という）が提供される。
【００１２】
（ｉｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【００１３】
本発明によれば、以下の（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、（ｘｖ）、および（ｘｖｉ）から選択される、本発明による新規タンパク質のリガンドとなる新規リガンドタンパク質（以下、本発明による新規リガンドタンパク質、またはＴＡＲＭ−Ｌ（ＴＡＲＭ  ｌｉｇａｎｄ）タンパク質と呼ぶことがある）が提供される：
（ｘｉｉｉ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｘｉｖ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｘｖ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｘｖｉ）配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【００１４】
本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
本発明によればまた、以下の（ｘｖｉｉ）、（ｘｖｉｉｉ）、（ｘｉｘ）、および（ｘｘ）から選択される、ポリヌクレオチドが提供される：
（ｘｖｉｉ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされ、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｘｉｘ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｘｘ）配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１６】
本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質に対する抗体およびその機能的断片（以下、本発明による第二の態様の抗体という）が提供される。
【００１７】
本発明によれば、本発明による第一の態様および第二の態様の抗体（以下、これらを併せて、「本発明による抗体」と呼ぶことがある）またはそれらの機能的断片を有効成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤およびＴ細胞接着阻害剤が提供される。
【００１８】
本発明によれば、以下に示すスクリーニング方法が提供される。
本発明による第一の態様のスクリーニング方法によれば、下記工程：
（ａ）被験物質の存在下および非存在下において、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞とを接触させる工程；および
（ｂ）ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着活性を測定する工程
を含んでなる、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法が提供される。
【００１９】
本発明による第二の態様のスクリーニング方法によればまた、下記工程：
（ｄ）被験物質の存在下および非存在下において、本発明による抗体またはその機能的断片と樹状細胞とを接触させる工程；および
（ｅ）前記樹状細胞の活性化の程度を測定する工程
を含んでなる、樹状細胞の活性化を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法が提供される。
【００２０】
本発明による第三の態様のスクリーニング方法によればまた、下記工程：
（ｇ）被験物質の存在下および非存在下において、本発明による抗体またはその機能的断片と樹状細胞とを接触させる工程；および
（ｈ）前記樹状細胞におけるＦｃＲγ鎖の発現量を測定する工程
を含んでなる、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】マウスＴＡＲＭ遺伝子（ｍ１〜４およびｓ１）のアミノ酸配列を示した図である。下線はイムノグロブリン（ＩＧ）ループ構造部分を表し、太字は膜貫通部分を表す。
【図２】マウス組織におけるＴＡＲＭのｍＲＮＡ発現を、プライマーセット１を用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。
【図３】各種細胞におけるＴＡＲＭのｍＲＮＡ発現を、プライマーセット１を用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。
【図４】Ａは、抗ＴＡＲＭタンパク質抗体の作製に用いられる細胞外領域の構造およびアミノ酸番号を示した図である。Ｂは、該抗体のＴＡＲＭタンパク質に対する特異性について検討した結果を示した図である。
【図５】骨髄由来樹状細胞におけるマウスタンパク質の発現について解析した結果を示した図である。
【図６】正常マウスの免疫組織由来細胞におけるマウスタンパク質の発現について解析した結果を示した図である。
【図７】ｃ−ｋｉｔ陽性腹腔肥満細胞におけるマウスタンパク質の発現について解析した結果を示した図である。
【図８】ＬＰＳ炎症刺激によるマウスリンパ節由来細胞におけるマウスＴＡＲＭタンパク質の発現について解析した結果を示した図である。矢印はマウスＴＡＲＭタンパク質の発現を示す。
【図９】Ａは、抗ＴＡＲＭタンパク質抗体刺激による、成熟骨髄樹状細胞からのＩＬ−６の産生の誘導について示した図である。Ｂは、抗ＴＡＲＭタンパク質抗体刺激による、未熟骨髄樹状細胞からのＭＣＰ−１の産生の誘導について示した図である。
【図１０】マウスＴＡＲＭタンパク質の細胞表面上への発現の増加に伴うＦｃＲγ鎖の増加について示した図である。
【図１１】マウスＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖の複合体形成を免疫沈降法により解析した結果を示した図である。
【図１２】活性化Ｔ細胞におけるマウスＴＡＲＭタンパク質に結合する分子の発現解析した結果を示した図である。
【図１３】活性化Ｔ細胞のマウスＴＡＲＭタンパク質に対する接着能について示した図である。
【図１４】抗マウスＴＡＲＭタンパク質抗体によるＴｈ２細胞のマウスＴＡＲＭタンパク質への接着の阻害を示した図である。
【図１５】抗マウスＴＡＲＭタンパク質抗体を投与されたコラーゲン誘導関節炎モデルにおける外見的所見および体重の経時的変化を示した図である。
【図１６】コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の血清アミロイドＡ濃度に対する抗マウスＴＡＲＭタンパク質抗体投与の効果を示した図である。
【図１７】コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の抗コラーゲン抗体価に対する抗マウスＴＡＲＭタンパク質抗体の投与の効果を示した図である。
【図１８】ヒト組織におけるＴＡＲＭタンパク質のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。
【図１９】ヒト由来のＴＡＲＭタンパク質のアミノ酸配列を示した図である。下線はイムノグロブリン（Ｉｇ）ループ構造部分を表し、太字は膜貫通部分を表す。また、囲み部分は、ｈＴＡＲＭとＬＯＣ４４１８６４の間で相違する配列を表す。
【図２０】活性化Ｔ細胞のヒトＴＡＲＭタンパク質に対する接着能、および抗ヒトＴＡＲＭタンパク質抗体によるＴ細胞のヒトＴＡＲＭタンパク質への接着の阻害を示した図である
【図２１】Ａは、マウス細胞株におけるマウスＴＡＲＭタンパク質に結合する分子の発現を解析した結果を示した図である。Ｂは、マウス細胞株におけるｍＴＡＲＭ−Ｌ候補分子であるＥＮＳＭＵＳＧ００００００３５０９５のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。
【図２２】Ａは、マウスＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の、ｍＴＡＲＭ−Ｌ発現Ｂ３００．１９細胞への特異的な結合を示した図である。Ｂは、ｍＴＡＲＭ−Ｌ発現Ｂ３００．１９細胞の、マウスＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質への特異的な細胞接着を示した図である。
【図２３】ヒトおよびマウスＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の相同性を解析した結果を示した図である。
【図２４】ヒトＴＡＲＭタンパク質およびマウスＴＡＲＭタンパク質（ｍ３）の相同性を解析した結果を示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示であり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【００２３】
［新規タンパク質およびポリヌクレオチド］
本発明において同定した骨髄由来の樹状細胞上に特異的に発現する遺伝子のうちマウス由来の遺伝子には５種のアイソフォームが存在する。マウス由来の遺伝子のアイソフォームとしては、膜結合型タンパク質（膜タンパク質）の遺伝子としてｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４が、分泌型タンパク質（分泌タンパク質）の遺伝子としてｓ１が、それぞれ挙げられる。それぞれのアイソフォームの塩基配列およびアミノ酸配列は下記の配列番号と対応する。
ｍ１：配列番号：１１および１２
ｍ２：配列番号：１および２
ｍ３：配列番号：３および４
ｍ４：配列番号：５および６
ｓ１：配列番号：７および８
【００２４】
本発明において同定した骨髄由来の樹状細胞上に特異的に発現する遺伝子のうちヒト由来の遺伝子としては、１種類の膜タンパク質の遺伝子が挙げられる。この遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：９および１０に記載される。
【００２５】
本発明において同定した遺伝子の塩基配列はシグナルペプチドをコードするため、該遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質または分泌タンパク質を形成する。本発明による膜タンパク質は、そのＣ末端を改変することにより（例えば、膜貫通部分を削除することにより）、分泌タンパク質とすることができる。本発明による分泌タンパク質は、そのＣ末端を改変することにより（例えば、膜貫通部分を付加することにより）、膜タンパク質とすることができる。
【００２６】
本願明細書において、「アミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされた」および「ポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸あるいはヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸およびヌクレオチドの改変の個数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個であることができる。
【００２７】
改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、１または複数個（好ましくは１または数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２８】
改変塩基配列は、好ましくは、その塩基配列が、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能に影響を与えない変異を有する塩基配列であることができる。
【００２９】
本願明細書において「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３０】
本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを意味する。具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、標的ヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダイズしたものを洗浄するときの条件は、０．２または２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、温度２０−６８℃で行うことができる。ストリンジェント（high stringency）な条件にするかマイルド（low stringency）な条件にするかは、洗浄時の塩濃度または温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー（high stringency wash buffer）として０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、マイルド洗浄バッファー（low stringency wash buffer）として２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は６８℃、中等度（moderate stringency）の場合は４２℃、マイルドの場合は室温（２０−２５℃）でいずれの場合も０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行えばよい。
【００３１】
通常、プレハイブリダイズを実施する場合にはハイブリダイズと同じ条件で実施するが、ハイブリダイズとプレ（予備）洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
【００３２】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】
本願明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列について「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基あるいはヌクレオチド残基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)）。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ(Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 (1990))、 Smith-Waterman〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)等の相同性検索ソフトウエアを用いることができる
「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００３４】
本発明による第二の態様の新規タンパク質において、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００３５】
本発明による第二の態様の新規タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号：９で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列は、好ましくは、９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列であることができる。
【００３６】
本発明による第一の態様の抗体において、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００３７】
本発明において、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
【００３８】
従って、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３９】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができ、例えば、そのタンパク質を遺伝子組み換え技術により発現させ、樹状細胞の活性化受容体として機能するかどうかを評価することにより決定することができる。配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＴ細胞と相互作用し、樹状細胞を活性化する機能を有することから、評価に当たっては下記機能を指標とすることができる：
−  Ｔ細胞に対する接着機能（実施例５、６、１０および１１）、
−  抗体架橋刺激による樹状細胞活性化機能（実施例３）、
−  ＦｃＲγ鎖との複合体形成機能（実施例４）、または
−  上記機能の一部またはすべての組み合わせ。
【００４１】
［新規リガンドタンパク質およびポリヌクレオチド］
本発明において同定した、ＴＡＲＭタンパク質のリガンドとして活性化Ｔ細胞上に特異的に発現する遺伝子のうちマウス由来の遺伝子としては、１種類の膜タンパク質の遺伝子が挙げられる。この遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１３および１４に記載される。また、ＴＡＲＭタンパク質のリガンドとして活性化Ｔ細胞上に特異的に発現する遺伝子のうちヒト由来の遺伝子としては、１種類の膜タンパク質の遺伝子が挙げられる。この遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１５および１６に記載される。
【００４２】
本発明による新規リガンドタンパク質において、配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
本発明による新規リガンドタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列であることができる。
【００４３】
本発明において、配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
【００４４】
従って、配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：１３または配列番号：１５で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００４５】
配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
本願明細書において、配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができ、例えば、そのタンパク質を遺伝子組み換え技術により発現させ、樹状細胞の活性化受容体のＴ細胞上のリガンドとして機能するかどうかを評価することにより決定することができる。配列番号：１４または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＴＡＲＭタンパク質と結合することから、評価に当たっては、例えば、ＴＡＲＭタンパク質に対する結合機能（実施例１２）を指標とすることができる。
本発明による新規リガンドタンパク質は、１回膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外とする向きで細胞表面に発現している。従って、該タンパク質を利用して、該タンパク質に対する抗体を作製することができる。
本発明によれば、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１５９番目、または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１５８番目のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質が提供される。該タンパク質は、ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質のアミノ酸配列の細胞外領域に相当する部分を含んでなることから、該タンパク質に対する抗体を作製するための抗原として用いることができる。
本発明によれば、本発明による新規リガンドタンパク質に対する抗体を作製するための、本発明による新規リガンドタンパク質の使用が提供される。
【００４７】
［抗体］
本発明による抗体は、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質を特異的に認識することができる。従って、本発明による抗体を得るためのＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質は、ＴＡＲＭまたはＴＡＲＭ−Ｌの抗原性を有していればよく、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al.(1984)Science 224:1431-3;Dalbadie-McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409-13)。あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,(1987-1997),Section8.1-8.5;Hashimoto-Goto et a1.(1995)Gene 152:271-5;Kinkel(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82:488-92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:350-67;Kunke1(1988)Method.Enzymo1.85:2763-6)。
【００４８】
本発明による抗体には、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれる。
【００４９】
即ち、本発明の抗体を得るためのＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質には、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片も含まれる。本明細書におけるＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質のポリペプチド断片は、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。
【００５０】
好ましい断片としては、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定し、さらにコンピュータープログラム(Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
【００５１】
本発明による抗体は、好ましくはＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の機能に影響を与える抗体である。ＴＡＲＭタンパク質の機能に影響を与えるとは、例えば、本発明による第一の態様の抗体によるＴＡＲＭタンパク質の架橋刺激により、樹状細胞を活性化すること（実施例３）、該抗体がＴＡＲＭタンパク質と結合することにより、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害すること（実施例６および実施例１１）、および該抗体がＴＡＲＭタンパク質と結合することにより、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害すること（実施例４）である。ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の機能に影響を与えるとは、例えば、本発明による第二の態様の抗体がＴＡＲＭ−Ｌタンパク質と結合することにより、ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質とＴＡＲＭタンパク質との結合を阻害することである。
【００５２】
本発明による抗体には、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質を抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されキメラ抗体およびヒト型抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体が含まれる。本発明による抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用の観点から、ヒト抗体が望ましい。
【００５３】
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子をマウスに導入して作製することができる。例えば、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報； ＷＯ９４／２５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；および特表平６−５００２３３号公報に記載の方法を参照して作製することができる。また、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。例えば、Marks, J. D. et al.: J. Mol. Biol., Vol.222, p.581-597, 1991に記載の方法を参照して作製することができる。
【００５４】
「ヒト型抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域）の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体である。例えば、特表平４−５０６４５８号公報および特開昭６２−２９６８９０号公報等に記載の方法を参照して作製することができる。
【００５５】
「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を連結した抗体である。具体的には、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合して作製することができる。例えば、特公平３−７３２８０号公報に記載の方法を参照して作製することができる。
【００５６】
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
【００５７】
免疫抗原としては、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【００５８】
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。
【００５９】
免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
【００６０】
細胞融合の操作は既知の方法、例えば、Nature, 256,495, 1975に従って実施できる。
【００６１】
融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体 産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
【００６２】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ法、ＴＡＲＭタンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などが挙げられる。
【００６３】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、また、上記免疫化学的方法に代えて、該抗体がＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の機能に影響を与えるか否かによりスクリーニングすることができる。本発明による第一の態様の抗体がＴＡＲＭタンパク質の機能に与える影響、例えば、本発明による第一の態様の抗体によるＴＡＲＭタンパク質の架橋刺激により、樹状細胞が活性化されるか否か（実施例３）、該抗体とＴＡＲＭタンパク質との結合により、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着機能を阻害できるか否か（実施例６および実施例１１）、あるいは該抗体とＴＡＲＭタンパク質との結合により、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害するか否か（実施例４）により、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。本発明による第二の態様の抗体がＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の機能に与える影響、例えば、本発明による抗体の第二の態様とＴＡＲＭ−Ｌタンパク質との結合により、ＴＡＲＭタンパク質とＴＡＲＭ−Ｌタンパク質との結合機能を阻害できるか否かにより、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法により、本発明の抗体の好ましい様態であるＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の機能に影響を与える抗体を選択することができる。またこのスクリーニングは、ＴＡＲＭタンパク質またはＴＡＲＭ−Ｌタンパク質と結合する抗体を産生するか否かにより選択する上記免疫化学的方法スクリーニングに次いで行う、２次スクリーニングとして行っても良い。
【００６４】
このようなウェルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
【００６５】
モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムｙ、さらにＴＡＲＭタンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
【００６６】
本発明による「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、本発明のタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられる。
【００６７】
本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としては、本発明による第一の態様の新規タンパク質に対する抗体およびその機能的断片が挙げられる。
【００６８】
本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としてはまた、本発明による第二の態様の新規タンパク質に対する抗体およびその機能的断片が挙げられる。
【００６９】
本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としては更に、下記タンパク質に対する抗体が挙げられる。
（ｉｘ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；
（ｘｉ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質；および
（ｘｉｉ’）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する膜タンパク質または分泌タンパク質。
【００７０】
本発明による第一の態様の抗体のより好ましい例としては、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
【００７１】
具体例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７６のもと受託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
【００７２】
従って、本発明によれば、２００５年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７６のもと寄託されたハイブリドーマ（＠ＴＡＲＭ＃６．１１）が提供される。
【００７３】
本発明による第一の態様の抗体のより好ましい例としてはまた、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
【００７４】
本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としては、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
【００７５】
本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としてはまた、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列もしくは１または複数個の保存的置換を有する配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含んでなる膜タンパク質または分泌タンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
本発明による第二の態様の抗体のより好ましい例としては、ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質の細胞外に発現しているポリペプチド部分を認識する抗体またはその機能的断片が挙げられる。このような抗体としては、例えば、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１５９番目、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１５８番目のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質に対する抗体またはその機能的断片が挙げられる。
【００７６】
［抗体の用途および医薬組成物］
自己免疫疾患
免疫応答に関与するリンパ球であるＴ細胞は、Ｔ細胞に対する抗原提示機能を有する細胞として知られている樹状細胞との協働作用により様々な免疫応答を担っている（Kroczek,RA., et al.(2004)Current Opinion in Immunology 16:321-327）。後記実施例により示されるように、炎症刺激により樹状細胞上のＴＡＲＭタンパク質の発現が増強され（実施例２）、ＴＡＲＭタンパク質を介して、樹状細胞とＴ細胞とが接着することが明らかとなった（実施例５および実施例１０）。また、結合刺激されたＴＡＲＭタンパク質により樹状細胞が活性化し、ＩＬ−６の産生が誘導されることが確認された（実施例３）。ＩＬ−６の過剰産生は自己免疫疾患と関連していることが報告されている（Ishihara,K., et al.(2002) Cytokine&Growth Factor Reviews 13:357-368）。更に、ＴＡＲＭタンパク質に対する抗体により、Ｔ細胞と樹状細胞との接着が顕著に抑制された（実施例６および実施例１１）。
【００７７】
また、後記実施例では、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて、本発明による抗体が実際に治療効果を有することが確認された（実施例７）。コラーゲン誘導関節炎モデルは、自己免疫疾患の一つである関節リウマチのモデルである。
【００７８】
従って、本発明による第一の態様の抗体は、自己免疫疾患の治療に有用である。
【００７９】
自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチが挙げられる。
【００８０】
同様に、ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質に対する抗体により、Ｔ細胞と樹状細胞との接着が抑制されると考えられる。従って、本発明による第二の態様の抗体は、自己免疫疾患の治療に有用である。
【００８１】
本発明によれば、自己免疫疾患治療剤の製造のための、本発明による抗体の使用が提供される。
【００８２】
本発明によれば、治療上の有効量の本発明による抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、自己免疫疾患の治療方法が提供される。
【００８３】
Ｔ細胞接着阻害剤
後記実施例において示されるように、ＴＡＲＭタンパク質に対する抗体により、Ｔ細胞と樹状細胞との接着が顕著に抑制された（実施例６および実施例１１）。従って、本発明による第一の態様の抗体は、Ｔ細胞接着阻害剤として用いることができる。
【００８４】
同様に、ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質に対する抗体により、Ｔ細胞と樹状細胞との接着が抑制されると考えられる。従って、本発明による第二の態様の抗体は、Ｔ細胞接着阻害剤として用いることができる。
【００８５】
本願明細書において、「Ｔ細胞接着」とは、樹状細胞とＴ細胞との接着、すなわち樹状細胞上に発現したＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞上に発現したＴＡＲＭ−Ｌタンパク質との結合を意味する。本発明のＴ細胞接着阻害剤を用いて、樹状細胞上に発現したＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞上に発現したＴＡＲＭ−Ｌタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞とＴ細胞の相互作用によって生じる免疫応答、例えば、樹状細胞およびＴ細胞の活性化、増殖、分化、サイトカイン・ケモカイン産生を抑制することができる。
【００８６】
医薬組成物
本発明による抗体の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含むほ乳類に投与することができるが、非経口投与、特に静脈注射、が好ましい。
【００８７】
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体などと混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００８８】
薬学上許容される担体としては、例えば、製剤分野において常用され、かつ本発明による抗体と反応しない物質が用いられる。薬学上許容される担体には、例えば、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
【００８９】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。
【００９０】
例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【００９１】
経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トローチ剤などが挙げられる。
【００９２】
本発明による医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよく、また、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。
【００９３】
本発明による抗体の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）あたり、経口投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは１０〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは５０〜２０００ｍｇ／日を、注射投与では１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、さらに好ましくは５０〜２０００ｍｇ／日を、１回または数回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与範囲から逸脱することがある。
【００９４】
［スクリーニング方法］
ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明による第一の態様のスクリーニング方法によれば、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
【００９５】
ＴＡＲＭタンパク質は樹状細胞上に発現し、樹状細胞とＴ細胞との間の免疫応答に関する相互作用に関与している。また、ＴＡＲＭタンパク質へ結合刺激が加わることにより、自己免疫疾患の原因ともなるＩＬ−６の産生が誘導される。従って、本発明による第一の態様のスクリーニング方法は、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞との接着を阻害する物質のスクリーニングに用いることができ、好ましくは、自己免疫疾患、より好ましくは、関節リウマチの治療に有用な物質のスクリーニングに用いることができる。
【００９６】
本発明による第一の態様のスクリーニング法においては、工程（ｂ）の後に、（ｃ）被験物質の存在下における結合活性と被験物質の非存在下における結合活性とを比較する工程を更に含んでいてもよい。
【００９７】
工程（ｃ）においては、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在下における結合活性を下回る場合に、好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質が本発明によるタンパク質とＴ細胞との結合を阻害すると判定することができる。
【００９８】
工程（ａ）において、「接触させる」とは、ＴＡＲＭタンパク質とＴ細胞とが直接接触する態様であれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＡＲＭタンパク質を固相化したプレートに標識したＴ細胞を添加する方法、あるいはＴ細胞を含むプレートに標識したＴＡＲＭタンパク質を添加する方法により実施できる。
【００９９】
Ｔ細胞は、好ましくは、活性化Ｔ細胞、より好ましくは、活性化Ｔｈ２細胞である。
【０１００】
工程（ｂ）において、結合活性の測定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、ＴＡＲＭタンパク質を固相化したプレートに標識したＴ細胞を添加し、一定時間培養後、洗浄等により接着していない細胞を取り除き、接着した細胞について測定することにより結合活性を測定することができる。
【０１０１】
前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質（蛍光タンパク質を含む）、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁社製）等、また、蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰ等を用いることができる。これら酵素および蛍光タンパク質は、細胞に遺伝子を導入して発現させることも可能である。発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルシゲニン等を用いることができる。場合によっては、前記リガンドと標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
【０１０２】
また、Ｔ細胞を標識しないで添加し、接着したＴ細胞をＴ細胞に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体、あるいはヘルパーＴ細胞に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ４抗体により検出することもできる。
【０１０３】
結合活性は、添加した細胞についてあらかじめ測定しておいて、添加した細胞に対する接着した細胞の割合で表すことができる。
【０１０４】
樹状細胞の活性化を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明による第二の態様のスクリーニング方法によれば、樹状細胞の活性化を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
【０１０５】
結合刺激されたＴＡＲＭタンパク質により樹状細胞を活性化することができる（実施例３および４）。従って、ＴＡＲＭ抗体により架橋刺激された樹状細胞系を用いて、樹状細胞の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【０１０６】
前述したように、樹状細胞の活性化により自己免疫疾患が引き起こされることが示された。従って、本発明による樹状細胞の活性化を阻害する物質のスクリーニング法は、好ましくは、自己免疫疾患、より好ましくは、関節リウマチの治療に有用な物質のスクリーニングに用いることができる。
【０１０７】
樹状細胞上に発現したＴＡＲＭタンパク質に架橋刺激を与えると樹状細胞が活性化するが、その際に、ＴＡＲＭタンパク質はシグナル伝達分子として知られているＦｃＲγ鎖と複合体を形成するとともに、自己免疫疾患の原因ともなるＩＬ−６や、単球の走化性因子であるＭＣＰ−１の産生が誘導される。従って、本発明による第二の態様のスクリーニング方法の工程（ｅ）においては、樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量を指標にして測定することができ、あるいは樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＦｃＲγ鎖の発現量を指標にして測定することができる。
【０１０８】
本発明による第二の態様のスクリーニング法において、樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量を指標にして測定する場合には、工程（ｅ）の後に、（ｆ−１）被験物質の存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量と被験物質の非存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量とを比較する工程を更に含んでいてもよい。  工程（ｆ−１）においては、被験物質の存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量が被験物質の非存在下におけるＩＬ−６および／またはＭＣＰ−１の産生量を下回る場合に、好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質が樹状細胞の活性化を阻害すると判定することができる。
【０１０９】
本発明による第二の態様のスクリーニング法においては、また、樹状細胞の活性化の程度を、樹状細胞におけるＦｃＲγ鎖の発現量を指標にして測定する場合には、工程（ｅ）の後に、（ｆ−２）被験物質の存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量と被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでいてもよい。
【０１１０】
工程（ｆ−２）においては、被験物質の存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量が被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量を下回る場合に、好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質が樹状細胞の活性化を阻害すると判定することができる。
【０１１１】
工程（ｄ）において、「接触させる」とは、樹状細胞上のＴＡＲＭタンパク質が、本発明による抗体により架橋刺激される態様であれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明による抗体を含む培地で樹状細胞を培養することにより行うことができる。
【０１１２】
工程（ｅ）において、タンパク質の産生量や発現量の測定は、公知の方法に従って行うことができるが、市販のキットを使用することもできる。
【０１１３】
ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明による第三の態様のスクリーニング方法によれば、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
【０１１４】
ＴＡＲＭタンパク質は樹状細胞上に発現し、シグナル伝達分子としてよく知られているＦｃＲγ鎖と複合体を形成する。また、ＦｃＲγ鎖は、ＴＡＲＭタンパク質と複合体を形成することによって細胞表面への発現が増加することが示唆されている。従って、本発明によるスクリーニング方法は、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害する物質のスクリーニングに用いることができ、好ましくは、自己免疫疾患、より好ましくは関節リウマチの治療に有用な物質のスクリーニングに用いることができる。
【０１１５】
本発明によるスクリーニング法においては、工程（ｈ）の後に、（ｉ）被験物質の存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量と被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量とを比較する工程を更に含んでいてもよい。
【０１１６】
工程（ｉ）においては、被験物質の存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量が被験物質の非存在下におけるＦｃＲγ鎖の発現量を下回る場合に、好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質が本発明によるタンパク質とＦｃＲγ鎖との複合体形成を阻害すると判定することができる。
【０１１７】
工程（ｇ）において、「接触させる」とは、ＴＡＲＭタンパク質とＦｃＲγ鎖を発現させた樹状細胞と本発明の抗体とが直接接触する態様であれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明による抗体を含む培地で樹状細胞を培養することにより行うことができる。
【０１１８】
工程（ｈ）において、発現量の測定は、公知の方法に従って行うことができるが、例えば、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
【０１１９】
本願明細書において、「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、実施例では「ＴＡＲＭタンパク質」を単に「ＴＡＲＭ」、「ＴＡＲＭ−Ｌタンパク質」を単に「ＴＡＲＭ−Ｌ」ということがある。また、マウス由来のＴＡＲＭタンパク質を単に「ｍＴＡＲＭ」、ヒト由来のＴＡＲＭタンパク質を単に「ｈＴＡＲＭ」ということがある。【０１２１】
［実施例１］  マウスＴＡＲＭ遺伝子の単離および発現解析
（１）ｍＴＡＲＭ遺伝子の単離
マウス脾臓より分離したＣＤ４  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｕｌｔｕｒｅによりＴｈ１あるいはＴｈ２に分化させ、それぞれからドライバーあるいはテスターに用いるｃＤＮＡ断片を作製し、高感度サブトラクション（Ｎ−ＲＤＡ）法を行う過程で得られたｃＤＮＡ断片の配列を用いてＢｌａｓｔ検索を行った。その結果、機能未知の細胞膜タンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１７７３６３）が得られた。【０１２２】
ＧｅｎＢａｎｋＴＭの配列（ＮＭ＿１７７３６３）の配列をもとに、ＰＣＲ用プライマーを下記のように設計し、マウスの各臓器におけるｍＴＡＲＭ遺伝子の発現を検討した。
ｍＴＡＲＭ  Ｆ１：GTGACTTTGCAGTGCCAGAA（配列番号：１７）
ｍＴＡＲＭ  Ｒ１：TGCACAGGAGTTGAGTGTCC（配列番号：１８）【０１２３】
各臓器の全ＲＮＡ（Promega社製）からＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ７７００（AppliedBiosystems社製）でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の反応液組成（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（QIAGEN社製）  １２．５μｌ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Invitrogen社製）  ０．２５μｌ、１００μＭ  ｍＴＡＲＭ  Ｆ  プライマー  ０．１２５μｌ、１００μＭ  ｍＴＡＲＭ  Ｒ  プライマー  ０．１２５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（１０倍希釈）  ２．５μｌ、蒸留水  ７．２５μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で１０分間処理した後、９４℃で３０秒、６０℃で１分の反応を３５サイクルで行った。その結果、ｍＴＡＲＭは腎臓で発現していた。【０１２４】
そこで、腎臓の全ＲＮＡを用いて５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥを行い、ｍＴＡＲＭの全長遺伝子配列の決定を試みた。【０１２５】
まず、マウス腎臓の全ＲＮＡからｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてｃＤＮＡを精製した。つぎにａｄ２９アダプター（ａｄ２９Ｓ：acatcactccgt（配列番号：１９）とａｄ２９Ａ：acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct（配列番号：２０）をアニリーングさせたもの）を付加し、ＲＡＣＥの鋳型とした。【０１２６】
１ｓｔ  ＰＣＲは、以下の反応液組成  （１０×ＥｘＴａｑ  バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ，  １００μＭ  プライマー  （５’ＰＣＲ４）  ０．５μｌ、１００μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μｌ、ａｄ２９アダプター付加ｃＤＮＡ（２５倍希釈）  １μｌ、蒸留水  ３８．７５μｌ）で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
５’ＰＣＲ４：AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG（配列番号：２１）
ｍＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿５’＿４：CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT（配列番号：２２）、あるいは
ｍＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿３’＿４：GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC（配列番号：２３）
ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で１分、７２℃で５分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間反応した。【０１２７】
２ｎｄ  ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×ＥｘＴａｑ  バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ、１００μＭ  プライマー  （５’ＰＣＲ１）  ０．５μｌ、１００μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μｌ、１ｓｔ  ＰＣＲ  産物（１００倍希釈）  １μｌ、蒸留水  ３８．７５μｌ）で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
５’ＰＣＲ１：GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG（配列番号：２４）
ｍＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿５’＿３：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT（配列番号：２５）、あるいは
ｍＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿３’＿３：CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC（配列番号：２６）
ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間反応した。増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１  （Invitrogen社製）にクローニングした後、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザー（AppliedBiosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。【０１２８】
その結果、５’ＲＡＣＥでは２種類、３’ＲＡＣＥでは３種類のｃＤＮＡが得られ、スプライシングアイソフォームの存在が明らかとなった。【０１２９】
ＲＡＣＥで得られた塩基配列情報を用いて、各スプライシングアイソフォームを増幅するプライマーの設計を行った。マウス骨髄の全ＲＮＡからｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてｃＤＮＡを精製した。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×ＥｘＴａｑ  バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ、１００μＭ  ５’プライマー  ０．５μｌ、１００μＭ  ３’プライマー  ０．５μｌ、ｃＤＮＡ（２５倍希釈）  １μｌ、蒸留水  ３８．７５μｌ）で行った。
プライマーは、下記の配列を使用した。
ｍＴＡＲＭ＿５’ＵＴＲ: GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC（配列番号：２７）
ｍＴＡＲＭ＿３’ＵＴＲ−ｌ: GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG（配列番号：２８）、あるいは
ｍＴＡＲＭ＿３’ＵＴＲ−２: TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA（配列番号：２９）
ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で５分間反応した。2種類のプライマーセットで6種類のスプライシングアイソフォームを確認することができる。結果、スプライシングアイソフォーム６種類の組合せのうち５種類で増幅産物が得られたので、増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Invitrogen社製）にクローニングした後、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を決定した。【０１３０】
その結果、４種類の膜結合型ＴＡＲＭ遺伝子（ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４）と１種類の分泌型ＴＡＲＭ遺伝子（ｓ１）をコードするスプライシングアイソフォームの存在が明らかとなった（図１）。【０１３１】
（２）ｍＴＡＲＭ遺伝子の発現解析
ｍＴＡＲＭ遺伝子のマウス正常組織での発現解析を行った。上記のようにスプライシングアイソフォームが存在しているので、３つのプライマーセットを設計した。
セット１（ｍ１、ｍ２アイソフォームを特異的に増幅するように設計）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＦ２：TCTGTGATAGACAACCATCT（配列番号：３０）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＲ２：GTCATTGTACCCGGGGTCTT（配列番号：３１）
セット２（ｍ３、ｍ４アイソフォームを特異的に増幅するように設計）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＦ４：ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA（配列番号：３２）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＲ３：TCATTTTTCTCCTGGGGCAC（配列番号：３３）
セット３（ｓ１アイソフォームを特異的に増幅するように設計）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＦ３：GATCTCTGTGATAGATGCAAG（配列番号：３４）
ｍＴＡＲＭ＿ｑＲ２：GTCATTGTACCCGGGGTCTT（配列番号：３５）【０１３２】
マウス臓器からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いて調製した全ＲＮＡあるいは購入した各臓器の全ＲＮＡ（Promega社製）からＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ７７００でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の反応液組成（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）  １２．５μｌ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Invitrogen社製）  ０．２５μｌ、１００μＭ  Ｆ  プライマー０．１２５μｌ、１００μＭ  Ｒ  プライマー０．１２５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（１０倍希釈）  ２．５μｌ、蒸留水  ７．２５μｌ）で行った。【０１３３】
ＰＣＲは、９４℃で１０分間処理した後、９４℃で３０秒、６０℃で１分の反応を３５サイクルで行った。【０１３４】
その結果、ｍＴＡＲＭは骨髄で強く発現していることが明らかとなった（図２）。【０１３５】
つぎに、ｍＴＡＲＭの各種細胞における発現解析を行った。【０１３６】
マウス脾臓から分離精製した細胞、イン・ビトロで培養した細胞および各種細胞株からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成して鋳型とし、ＡＢＩ７７００でリアルタイムＰＣＲをマウス正常組織での発現解析と同様に行った。【０１３７】
その結果、ｍＴＡＲＭは骨髄由来樹状細胞で強く発現していることが明らかとなった（図３）。【０１３８】
［実施例２］  マウスＴＡＲＭに対する抗体の作製と発現解析
（１）ｍＴＡＲＭ遺伝子発現細胞の作製
ｍＴＡＲＭ遺伝子発現ベクターの作製は、以下のように行った。
プライマーは、アイソフォームｍ１の塩基配列をもとに設計した。
ｍＴＡＲＭ  Ｆ２：cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT（配列番号：３６）
ｍＴＡＲＭ  Ｒ２：gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG（配列番号：３７）【０１３９】
骨髄の全ＲＮＡからＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成して鋳型に用いた。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭプライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、蒸留水  ３６μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Stratagene社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ（Oncogene(2000)19(27):3050-3058）に挿入して、ｍＴＡＲＭ遺伝子発現ベクターを作製した。【０１４０】
組換えレトロウイルスの作製は以下のように行った。【０１４１】
２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株（Invitrogen社製）３×１０６個を培地（Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）に懸濁して１０ｃｍディッシュに播き、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。翌日、培地を交換し、以下のように調製したトランスフェクション溶液を加えてトランスフェクションを行った。トランスフェクション溶液は、５ｍｌチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL社製）を６００μｌとＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TaKaRa社製）２４μｌを加えて混合して室温５分静置した後、発現ベクター  ９ｕｇとパッケージングベクターであるｐＣＬ−Ｅｃｏ（Imgenex社製）  ９ｕｇを加えて室温５分静置して調製した。４８時間後に、培養上清を回収して０．４５ｕｍのフィルターろ過を行い、組換えウイルス液を得た。【０１４２】
この組換えウイルスを以下のようにＢ３００．１９細胞株（EMBO J. (1984）3: 1209-1219）に感染させ、ｍＴＡＲＭ遺伝子発現細胞を作製した。Ｂ３００．１９細胞  １×１０６個を１５ｍｌチューブに加え、１２００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心後、培養上清を吸引除去した。細胞に、組換えウイルス液  ２ｍｌにｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）  ２μｌと５５μＭ  ２−メルカプトエタノール  ２μｌを加えて混合した溶液を加え、２５００ｒｐｍ、３０℃で２時間遠心して感染を行った。感染後に組換えウイルス液を除去し、培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／５５ｕＭ  ２−メルカプトエタノール）を加えて培養を行った。ＥＧＦＰ陽性細胞をセルソーティングにより分離することでｍＴＡＲＭ発現細胞を得た。【０１４３】
（２）ｍＴＡＲＭの細胞外領域とＳＥＡＰおよびＦｃキメラタンパク質の作製
まず、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０−Ｎｅｏベクターを、以下のように作製した。【０１４４】
ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏベクター（Invitrogen社製）の内在性のＳａｌＩサイトは、ＳａｌＩで消化した後、平滑化を行うことにより欠損させた。ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０のｃＤＮＡ断片は、ｐＤＲＥＦ−ＳＥＡＰ  Ｈｉｓ６−Ｈｙｇ（J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521）を鋳型として、ＨｉｎｄＩＩＩを付加した５’プライマーとＸｈｏＩを付加した３’プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。得られたｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化した後、ＳａｌＩサイトを欠損させたｐＣＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏベクターに挿入した。【０１４５】
次に、ｍＴＡＲＭの細胞外領域は、ｍＴＡＲＭ全長ｃＤＮＡを鋳型として、ＳａｌＩを付加した５’プライマー（ｍＴＡＲＭ＿Ｆ２：（配列番号：３６））とＮｏｔＩを付加した３’プライマー（ｍＴＡＲＭ＿Ｒ３：cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat（配列番号：３８））を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭプライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、蒸留水  ３６μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Stratagene社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡ断片をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した後、上記ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０−Ｎｅｏベクターに挿入して、ｍＴＡＲＭ−ＡＰ発現ベクターを作製した。【０１４６】
これにより、ｍＴＡＲＭの細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが３個のアミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ）で結合され、さらにＣ末端に１０個のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）１０のついた分泌キメラタンパク質（以下ＡＰキメラタンパク質）の発現が可能となる。得られたＡＰキメラタンパク質発現ベクターは、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TAKARA社製）を用いて２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株へ導入し、４から５日間培養を行った。培養上清中に分泌されたＡＰキメラタンパク質は、遠心分離により培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過した後、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）とアジ化ナトリウムをそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、０．０２％となるように加えて４℃で保存した。ＡＰキメラタンパク質の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性をＡｕｒｏｒａ  ＡＰ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ICN社製）を用いて測定して算出した。【０１４７】
（３）ｍＴＡＲＭに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用の抗原として用いるために、まず、ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の精製を行った。【０１４８】
精製は、ＡＰキメラタンパク質のＣ末端に存在するヒスチジンタグを利用して、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  Ｋｉｔ（Amersham Biosciences社製）を用いて行った。ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質を含む培養上清を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（Amersham Biosciences社製）に添加し、１０ｍＭ  イミダゾール溶液で洗浄した後、５００ｍＭ  イミダゾール溶液でｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質をカラムから溶出した。ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の濃度は、Ａｕｒｏｒａ  ＡＰ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ICN社製）を用いた酵素活性測定とＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  ＩＩ（BIO-RAD社製）を用いたタンパク定量により算出した。【０１４９】
得られたｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質は、ＴｉｔｅｒＭａｘと混合してＷＫＹラット（日本SLC社より入手）に免疫した。免疫したラットからリンパ球を単離して、Ｐ３ミエローマ細胞（ATCC）とリンパ球の比率が１：５となるように混合し、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー社製）を用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（Invitrogen社製）でハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマの培養上清は、ｍＴＡＲＭ−Ｆｃキメラタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。陽性ウェルからクローニングを行い、３種類のクローン（＃６、＃２１、＃３７）を得た。ｍＴＡＲＭ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを導入したＢ３００．１９細胞に、作製した抗ｍＴＡＲＭ抗体を反応させてＦＡＣＳにより解析した結果、作製した抗体はＥＧＦＰを発現しているＢ３００．１９細胞のみに反応し（図４Ｂ）、抗ｍＴＡＲＭ抗体の特異性が確認された。【０１５０】
得られた抗ｍＴＡＲＭモノクローナル抗体＃６、＃２１、＃３７を産生するハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に接種し腹水を得て、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムを用いて抗体を精製した。抗ｍＴＡＲＭモノクローナル抗体＃６を産生するハイブリドーマは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７６のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。【０１５１】
（４）骨髄由来の培養樹状細胞におけるＴＡＲＭタンパク質の発現
得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いてｍＴＡＲＭタンパク質の骨髄由来の培養樹状細胞表面上への発現を検討した。【０１５２】
骨髄由来の培養樹状細胞は、下記の方法で作製した。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（日本SLC社より入手）の骨髄細胞を２×１０６個／１０ｍｌになるように、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（R&D system社製）を含む培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％  ＦＢＳ／１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム／５５μＭ  ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、無処理１０ｃｍディッシュに播いて培養した。３日後に、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地１０ｍｌを加えて培養を継続した。さらに３日後、培養液１０ｍｌを回収して遠心した後、細胞塊を新鮮なマウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地１０ｍｌで懸濁して、元の無処理１０ｃｍディッシュに戻して２日間培養した。このようにして得られた未熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Sigma社製）を含む培地に１×１０７個／１０ｍｌになるように懸濁し、細胞培養処理済１０ｃｍディッシュに播いて１日間培養して、成熟樹状細胞を得た。【０１５３】
骨髄由来の未熟樹状細胞を５％マウス血清を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／１  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、抗体＃６あるいは抗体＃２１（１０μｇ／ｍｌ）と反応させた後、ＰＥ標識ロバ抗ラットＩｇＧ二次抗体（Jackson社製）と反応させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson社製）を用いて測定した。その結果、抗体＃６、抗体＃２１ともに陰性コントロールのラットＩｇＧに比べて強い陽性反応が認められた。【０１５４】
そこで、詳細にｍＴＡＲＭ発現細胞を解析するために、抗体＃６をＡｌｅｘａ  ６４７モノクローナル抗体標識キット（Molecular Probe社製）を用いて蛍光標識を行った。次に、未熟樹状細胞あるいはＬＰＳ刺激で得た成熟樹状細胞を５％マウス血清、５％ラット血清を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＦｃＲブロッキング溶液（BD Pharmingen社製）を加えて氷上で１０分反応させた後、蛍光標識抗ｍＴＡＲＭ抗体と抗ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカー抗体および抗ＣＤ４０活性化マーカー抗体と氷上で３０分反応させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定した。【０１５５】
その結果、ｍＴＡＲＭタンパク質は未熟および成熟樹状細胞で発現していること、成熟骨髄樹状細胞では未熟樹状細胞に比べてｍＴＡＲＭタンパク質の発現が増強されること、活性化マーカーＣＤ４０が発現する細胞でｍＴＡＲＭタンパク質の発現が強いことが明らかとなった（図５）。【０１５６】
（５）正常マウスにおけるＴＡＲＭタンパク質の発現
骨髄由来樹状細胞でのｍＴＡＲＭの発現が認められたことから、正常マウスの免疫組織でのｍＴＡＲＭタンパク質の発現を解析した。【０１５７】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの骨髄、末梢血、脾臓、腸管リンパ節、パイエル板から細胞調整し、５％マウス血清、５％ラット血清を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＦｃＲブロッキング溶液を加えて氷上で１０分反応させた。次に、蛍光標識抗ｍＴＡＲＭ抗体と種々の蛍光標識細胞系列マーカー抗体と氷上で３０分反応させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定した。【０１５８】
その結果、正常マウスの免疫組織では、脾臓（ＳＰ）におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞、ＤＸ５陽性ＮＫ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性骨髄系細胞、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞、また、末梢血（ＰＢＬ）におけるＢ２２０陽性Ｂ細胞、Ｆ４／８０陽性単球／マクロファージ、ＳＳＣ  ｈｉｇｈ／Ｇｒ１陽性好中球、ＳＳＣ  ｈｉｇｈ／Ｆ４／８０陽性好酸球のいずれにおいてもｍＴＡＲＭタンパク質の発現は認められなかった（図６）。【０１５９】
そこで、正常マウス末梢組織での発現を、腹腔から調製した細胞を用いて解析した。【０１６０】
その結果、ｍＴＡＲＭタンパク質は、腹腔のＣＤ３陽性Ｔ細胞、ＤＸ５陽性ＮＫ細胞、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞、Ｂ２２０陽性Ｂ細胞、Ｆ４／８０陽性単球／マクロファージ、ＳＳＣ  ｈｉｇｈ／Ｇｒ１陽性好中球では発現が認められなかったが、ＣＤ１１ｂ陽性骨髄系細胞の一部で発現が認められたため、さらに解析を進めた結果、ｃ−ｋｉｔ陽性肥満細胞でｍＴＡＲＭタンパク質が発現していることが明らかとなった（図７）。【０１６１】
（６）ＬＰＳ炎症刺激による樹状細胞でのＴＡＲＭタンパク質の発現誘導
ｍＴＡＲＭタンパク質は、培養樹状細胞では発現しているが、マウス免疫および末梢組織の樹状細胞では発現が見られないことから、イン・ビボでは炎症刺激により発現が誘導されることが考えられた。そこで、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに１００μｇのＬＰＳを腹腔内投与し、１４時間〜１８時間後に腸間膜リンパ節から細胞を回収して、ｍＴＡＲＭタンパク質の発現を解析した。【０１６２】
その結果、ＬＰＳ炎症刺激により腸間膜リンパ節に移動したＣＤ１１ｃ陽性／ＣＤ１１ｂ＋陽性の骨髄系樹状細胞でｍＴＡＲＭタンパク質の発現が認められた（図８）。したがって、ｍＴＡＲＭタンパク質は、イン・ビボにおける正常時の樹状細胞では細胞表面上に発現していないが、炎症時には樹状細胞とりわけ骨髄系樹状細胞に選択的に発現していることが明らかとなり、ｍＴＡＲＭタンパク質は炎症時に樹状細胞で機能していることが示唆された。【０１６３】
［実施例３］  抗ＴＡＲＭ抗体による骨髄由来の培養樹状細胞の活性化
ｍＴＡＲＭは、樹状細胞で選択的に発現していることから、ｍＴＡＲＭの架橋刺激による樹状細胞の活性化について検討した。【０１６４】
骨髄由来の未熟樹状細胞あるいは成熟樹状細胞は、１×１０８個を３５０μｌのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＦｃＲブロッキング溶液（Miltenyi社製）を５０μｌ加えて４℃で１０分反応させた後、ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Miltenyi社製）を１００μｌ加えて４℃で３０分反応させた後、Ａｕｔｏ  ＭＡＣＳ（Miltenyi社製）を用いてＣＤ１１ｃ陽性細胞を分離精製して調整した。９６穴プレートにＦ（ａｂ）’２抗ラットＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ）（Jackson社製）を３７℃で２時間固相化し、ＰＢＳで洗浄した後に抗ｍＴＡＲＭ抗体＃６、＃２１もしくは陰性コントロールのラットＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間固相化させた。プレートをＰＢＳで洗浄後、精製したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を培地あるいは最終濃度  ２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０活性化抗体（BD Pharmingen社製）を含む培地で培養した。２４時間もしくは４８時間後に培養上清を回収し、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ（R&D社製）を用いてサイトカインの検出を行った。【０１６５】
その結果、抗ｍＴＡＲＭ抗体は、骨髄由来の成熟樹状細胞からのＩＬ−６の産生を抗ＣＤ４０抗体と同程度に誘導し、さらに抗ＣＤ４０抗体との相加効果があることが明らかとなった（図９Ａ）。同様に、未熟樹状細胞でもＩＬ−６の産生を誘導する傾向が認められた。さらに、未熟骨髄樹状細胞からのＭＣＰ−１の産生を抗ｍＴＡＲＭ抗体が誘導したが、抗ＣＤ４０抗体では誘導が認められなかった（図９Ｂ）。抗ｍＴＡＲＭ抗体によるＭＣＰ−１の産生誘導は、成熟骨髄樹状細胞では認められなかった。その他、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＫＣの産生誘導も解析したが、抗ｍＴＡＲＭ抗体では、未熟樹状細胞と成熟樹状細胞のいずれにおいても顕著な影響は認められなかった。【０１６６】
以上の結果から、樹状細胞上のｍＴＡＲＭは、特定のサイトカインやケモカイン（例えば、ＩＬ−６やＭＣＰ−１）の産生に関与していることが明らかとなった。【０１６７】
［実施例４］  ＴＡＲＭとＦｃＲγ鎖との複合体形成
ｍＴＡＲＭが樹状細胞の活性化受容体として機能することが明らかとなったので、シグナル伝達分子の解明を試みた。ｍＴＡＲＭは破骨細胞の分化に関与するＯｓｃａｒと細胞膜貫通部位が似ている。ＯｓｃａｒはＩｇＥ受容体としてよく知られているシグナル伝達分子ＦｃＲγ鎖と複合体を形成することが知られており、この会合はＯｓｃａｒの細胞膜貫通領域の塩基性アミノ酸とＦｃＲγ鎖の酸性アミノ酸の相互作用が関与すると考えられている。ｍＴＡＲＭも細胞膜貫通領域に塩基性アミノ酸を有している。一方、ＦｃＲγ鎖と同様に細胞膜貫通領域に酸性アミノ酸を有する活性化シグナル伝達分子としてＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２が知られている。そこで、ＦｃＲγ鎖、ＤＡＰ１０、あるいはＤＡＰ１２がｍＴＡＲＭと複合体を形成するか否かを検討した。【０１６８】
ＦｃＲγ鎖、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２の発現ベクターは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋＴＭのＮＭ＿０１０１８５、ＡＦ０７２８４６、ＮＭ＿０１１６６２に記載の塩基配列をもとに設計した下記のプライマー
ＦｃＲγ  Ｆ：cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT（配列番号：３９）
ＦｃＲγ  Ｒ：gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT（配列番号：４０）
ＤＡＰ１０  Ｆ：cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC（配列番号：４１）
ＤＡＰ１０  Ｒ：gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT（配列番号：４２）
ＤＡＰ１２  Ｆ：cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT（配列番号：４３）
ＤＡＰ１２  Ｒ：gcgggcggccgcTCATCTGTAATATTGCCTCTGTGT（配列番号：４４）
を用いて増幅したｃＤＮＡ断片を、Ｆｌａｇタグ配列がＮ末端に付加された型で細胞表面上に発現するように設計された発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏに挿入して作製した。そして、ｍＴＡＲＭの発現細胞の作製と同様の方法で組換えレトロウイルスを作製し、ｍＴＡＲＭ発現Ｂ３００．１９細胞に感染させ、ピューロマイシン存在下で培養することで感染細胞を選択した。得られたＢ３００．１９強制発現細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、最終濃度１０μｇ／ｍｌの抗体＃６およびマウス抗Ｆｌａｇ抗体（Sigma社製）と反応させた後、ＰＥ標識ロバ抗ラットＩｇＧ二次抗体（Jackson社製）およびＣｙ５標識ロバ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Jackson社製）と反応させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson社製）を用いて測定した。【０１６９】
その結果、ｍＴＡＲＭとＦｃＲγ鎖を同時に発現させた場合に、ＦｃＲγ鎖の細胞表面上への発現がｍＴＡＲＭの細胞表面上への発現量に伴って増加することが明らかとなった。ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の細胞表面上への発現はｍＴＡＲＭの発現量に依存していなかった。したがって、ＦｃＲγ鎖はｍＴＡＲＭと複合体を形成することで細胞表面への発現が増加することが示唆された（図１０）。【０１７０】
次に、生化学的にｍＴＡＲＭの結合タンパク質を解析した。【０１７１】
Ｂ３００．１９強制発現細胞を１％  ｄｉｇｔｏｎｉｎを含む細胞溶解液（１％  ｄｉｇｔｏｎｉｎ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＮａＦ／  １ｍＭ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ／ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Roche社製））で可溶化して、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降を行い、抗ｍＴＡＲＭ抗体＃６でイムノブロットを行った。【０１７２】
その結果、ＦｃＲγ鎖と共にｍＴＡＲＭが免疫沈降されており、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２とｍＴＡＲＭは共に免疫沈降されなかった（図１１Ａ）。抗Ｆｌａｇ抗体でＦｃＲγ鎖、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２がそれぞれ免疫沈降されていることは、抗Ｆｌａｇ抗体によるイムノブロットで確認した。また、Ｂ３００．１９強制発現細胞でのｍＴＡＲＭとＦｌａｇタグを付加したＦｃＲγ鎖、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の発現は、細胞溶解液を抗ｍＴＡＲＭ抗体＃６あるいは抗Ｆｌａｇ抗体によるイムノブロットで確認している。したがって、Ｂ３００．１９強制発現細胞において、ＦｃＲγ鎖とｍＴＡＲＭが複合体を形成していることが明らかとなった。【０１７３】
さらに、骨髄由来の成熟樹状細胞を１％  ｄｉｇｔｏｎｉｎを含む細胞溶解液で可溶化して、陰性コントロールのラットＩｇＧ、抗ｍＴＡＲＭ抗体＃２１、抗ＣＤ５４抗体および抗ＦｃＲγ鎖抗体で免疫沈降を行い、抗ＦｃＲγ鎖抗体でイムノブロットを行った。【０１７４】
その結果、ｍＴＡＲＭと共にＦｃＲγ鎖が免疫沈降されており、別の細胞膜タンパク質のＣＤ５４とＦｃＲγ鎖は共に免疫沈降されなかった（図１１Ｂ）。したがって、成熟樹状細胞においても、ＦｃＲγ鎖とｍＴＡＲＭが複合体を形成していることが明らかとなった。【０１７５】
これらの結果より、ｍＴＡＲＭの架橋刺激による樹状細胞の活性化は、ＦｃＲγ鎖からのシグナル伝達を介していることが示唆された。【０１７６】
［実施例５］  固相化したＴＡＲＭに対する活性化リンパ球の接着
（１）活性化Ｔ細胞上でのｍＴＡＲＭ結合分子の発現
樹状細胞は、抗原提示細胞としてＴ細胞と相互作用することが知られている。したがって、ｍＴＡＲＭと結合する分子がＴ細胞上に発現し、この分子を介して樹状細胞の活性化が制御されていると考えられた。そこで、Ｔ細胞上にｍＴＡＲＭ結合分子が存在するか否かについて検討した。【０１７７】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの脾臓細胞４×１０７個を７０μｌのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＦｃＲブロッキング溶液（Miltenyi社製）を１０μｌ加えて４℃で１０分間反応させ、さらにＣＤ４マイクロビーズ（Miltenyi社製）を１００μｌ加えて４℃で１５分間反応させた後、Ａｕｔｏ  ＭＡＣＳを用いて休止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞を得た。ＭＡＣＳで精製したＣＤ４陽性細胞は１×１０６個／ｍｌになるように培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％  ＦＢＳ／１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム／５５ｕＭ  ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、抗ＣＤ３抗体（eBioscience社製）を１μｇ／ｍｌ溶液により３７℃で２時間固相化したプレートに加え、抗ＣＤ２８抗体（Pharmingen社製）２μｇ／ｍｌ存在下で刺激した。Ｔｈ１へ分化させる場合は、マウスＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）（Peprotech社製）と抗マウスＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）（ＭＰ４−２５Ｄ２；Pharmingen社製）存在下で、Ｔｈ２へ分化させる場合は、マウスＩＬ−４（１５ｎｇ／ｍｌ）（Genzyme社製）と抗マウスＩＬ−１２抗体（１５μｇ／ｍｌ）（２４９１０．１； PharMingen社製）存在下で抗ＣＤ３抗体刺激を行った。刺激から２日後、Ｔｈ１条件ではマウスＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）（Genzyme社製）とマウスＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、またＴｈ２条件ではマウスＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）とマウスＩＬ−４（１５ｎｇ／ｍｌ）を加え培養を行った。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γの産生により、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４の産生によりそれぞれ分化していること確認した。【０１７８】
ＭＡＣＳで精製した直後の休止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ３刺激後２日および８日後の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて、ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の細胞表面上への結合活性を検討した。細胞はＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ）に懸濁し、最終濃度３０μｇ／ｍｌのｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質あるいは陰性コントロールのＡＰタンパク質と氷上で３０分間反応させ、ウサギ抗ＰＬＡＰ抗体（６０００倍希釈）（コスモバイオ社）を加え氷上で３０分間反応させた後、さらにＰＥ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（５０倍希釈）（Jackson社製）を加え氷上で３０分間反応させた。ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の結合は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定した。【０１７９】
その結果、ｍＴＡＲＭ結合分子が、休止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞には発現していないが、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞で発現が誘導されることが明らかとなった（図１２）。ｍＴＡＲＭ結合分子は、刺激２日後ではすでに発現しており、８日後でも発現が維持されていた。Ｔｈ１、Ｔｈ２いずれの分化条件でもｍＴＡＲＭ結合分子は発現していたが、８日後ではＴｈ２細胞での発現がＴｈ１細胞に比較して強い傾向が認められた（図１２）。【０１８０】
（２）活性化Ｔ細胞のｍＴＡＲＭ組換えタンパク質への接着
次にｍＴＡＲＭが活性化Ｔ細胞に対する接着分子として機能するか否かを検討した。【０１８１】
まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製）に抗アルカリフォスファターゼ抗体（１０μｇ／ｍｌ）（Seradyn社製）を５０μｌずつ加え、３７℃で３０分間静置して固相化した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）で非特異的結合部位をブロックした。ＡＰキメラタンパク質（１０ｎＭ）を各穴に加え、室温で３０分間静置して固相化した。刺激６から９日後の活性化Ｔ細胞は、細胞接着緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０／０．５％  ＢＳＡ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．４））に懸濁して、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁社製）で蛍光標識した後、１穴あたり１×１０５個ずつ加え、３７°Ｃで１時間反応させた。非接着細胞を洗浄して除き、細胞溶解液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えた後、Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ  １４２０  ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ（Perkin Elmer社製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、検出波長５３５ｎｍで測定し、接着細胞を定量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割合をパーセントで表した。【０１８２】
その結果、ｍＴＡＲＭは活性化Ｔ細胞に対する接着分子として機能することが明らかとなった（図１３）。Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞いずれもｍＴＡＲＭに対する接着活性を示したが、Ｔｈ２細胞のｍＴＡＲＭに対する接着活性がＴｈ１細胞に比較して高い傾向が認められた。【０１８３】
［実施例６］  抗ＴＡＲＭ抗体の細胞接着阻害活性
ｍＴＡＲＭを介したＴｈ２細胞の細胞接着に及ぼす抗ＴＡＲＭ抗体の効果を検討した。【０１８４】
Ｔｈ２細胞に抗ｍＴＡＲＭ抗体１０μｇ／ｍｌを加えて室温で１０分間前処理した後、ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質を固相化したプレートにこれを加え、抗体存在下での細胞接着活性を検討した。【０１８５】
その結果、Ｔｈ２細胞のｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質への接着は、抗ｍＴＡＲＭ抗体＃６、＃２１、＃３７のいずれにおいても顕著に抑制された（図１４）。【０１８６】
［実施例７］  コラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗ＴＡＲＭ抗体の治療効果
コラーゲン誘導関節炎（Collagen-Induced Arthritis:CIA）モデルは自己免疫性の関節リウマチの疾患モデルであり、ＩＩ型コラーゲンに反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞および抗体が検出されることから、両者が協同して関節炎を惹起すると考えられている。また、ＣＩＡモデルでは、ＭＨＣクラスＩＩに拘束があると言われている。ＴＡＲＭは、樹状細胞に発現する活性化分子であり、またＴＡＲＭの結合分子を介して活性化Ｔ細胞の細胞接着を誘導する。したがって、抗ＴＡＲＭ抗体により樹状細胞と活性化Ｔ細胞の相互作用を阻害することで、樹状細胞や活性化Ｔ細胞の関与する免疫応答を抑制する可能性が考えられた。そこで、ＣＩＡモデルにおける抗ＴＡＲＭ抗体の治療効果を検討した。【０１８７】
ウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン３％溶液  （コラーゲン技術研修会社製）と完全フロイントアジュバント（Difco社製）を等量混合してエマルジョンを作製し、５週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（チャールズリバー社より入手）に一匹あたり１００μｌ（１５０μｇ／匹）を、−２１日目（初回免疫）と０日目（追加免疫）に臀部皮内に免疫した。抗ｍＴＡＲＭ抗体＃６は、追加免疫時から５００μｇ／１回で週２回、尾静脈に投与した。追加免疫から３日目より体重測定と外見的評価を行い、１３日目に屠殺した。外見的所見は、以下の様にスコア化して評価した。０：非発症、１：紅斑と足根もしくは足首の関節に軽い腫脹、２：紅斑と足首から足根にかけて軽い腫脹、３：紅斑と足首から中足の関節にかけての中程度の腫脹、４：紅斑と足首、足、指全体に重度の腫脹。【０１８８】
その結果、抗ｍＴＡＲＭ抗体投与により、肉眼的所見において明らかな症状の軽減と、体重減少の抑制が認められた（図１５）。【０１８９】
また、屠殺したマウスの腹部大静脈よりヘパリン採血をおこない、血漿中の血清アミロイドＡ（Ｓｅｒｕｍ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ：ＳＡＡ）濃度とコラーゲンに対する抗体価を測定した。ＳＡＡは炎症刺激により産生されたサイトカインの作用により、肝細胞で産生される血漿タンパク質であり、血漿中のＳＡＡ濃度は炎症の指標となる。コラーゲンに対する抗体価は抗原特異的免疫応答の指標となる。【０１９０】
血漿中のＳＡＡの濃度は、血漿を８０００倍希釈し、ＥＬＩＳＡキット（バイオソース社製）を用いて測定した。【０１９１】
また、血漿中のコラーゲンに対する抗体価の測定は、以下のように行った。【０１９２】
まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製）に５μｇ／ｍｌのウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン溶液を５０μｌずつ加え、４℃で一晩静置して固相化した。Ｔ−ＰＢＳ（０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で洗浄後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的結合部位をブロックした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで１０万倍希釈した血漿を５０μｌずつ各穴に加え、室温で２時間静置した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ１（BD社製）、ビオチン化抗マウスＩｇＧ２ａ（BD社製）をＴ−ＰＢＳで１０００倍希釈して５０μｌずつ各穴に加え、室温で２時間静置した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Pierce社製）をＴ−ＰＢＳで５０００倍希釈して５０μｌずつ各穴に加え、室温で３０分間静置した。その後、発色基質を用いて発色させた。【０１９３】
その結果、血漿中のＳＡＡの濃度が、抗ｍＴＡＲＭ抗体の投与により減少していた（図１６）。また、血漿中の抗コラーゲン抗体価は、抗ｍＴＡＲＭ抗体の投与により変化が認められなかった（図１７）。【０１９４】
［実施例８］  ヒトＴＡＲＭ全長遺伝子配列の決定
ヒトＴＡＲＭ遺伝子を同定するために、マウスＴＡＲＭ遺伝子配列を用いてＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、マウスＴＡＲＭ  ｃＤＮＡ配列と相同性が高い配列Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿４９７６４２を見出した。しかしながら、ＸＭ＿４９７６４２がコードするアミノ酸配列（ＬＯＣ４４１８６４）にはシグナルシーケンス配列が存在せず、細胞膜タンパク質として機能するとは考えられなかった。ＸＭ＿４９７６４２は推定上の配列であり、ゲノム配列からのｃＤＮＡ配列推定が間違っていると考えられた。そこで、ヒトＴＡＲＭの完全長遺伝子配列の決定を試みた。ＴＡＲＭの発現組織を同定し、５’−、３’−ＲＡＣＥを行ってＴＲＡＭ  ｃＤＮＡの完全長配列を推定した後、ＴＡＲＭタンパク質をコードする領域の配列をもとにプライマーを設計して完全長ｃＤＮＡの単離を行った。【０１９５】
（１）ヒトＴＡＲＭ遺伝子の発現解析
まず、ｈＴＡＲＭのヒト組織での発現解析を行った。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿４９７６４２の配列をもとにプライマーを設計した。
ｈＴＡＲＭ  Ｆ１：TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC（配列番号：４５）
ｈＴＡＲＭ  Ｒ１：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT（配列番号：４６）
ヒト各臓器の全ＲＮＡ（Clontech 社製）からＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ７７００でリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の反応液組成（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（QIAGEN社製）  １２．５μｌ、Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（Invitrogen社製）  ０．２５μｌ、１００μＭ  Ｆ  プライマー  ０．１２５μｌ、１００μＭ  Ｒ  プライマー  ０．１２５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（１０倍希釈）  ２．５μｌ，  蒸留水  ７．２５μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で１０分間処理した後、９４℃で３０秒、６０℃で１分の反応を３５サイクルで行った。【０１９６】
その結果、ｈＴＡＲＭ遺伝子もｍＴＡＲＭ遺伝子と同様に骨髄で強く発現していることが明らかとなった（図１８）。【０１９７】
（２）ヒトＴＡＲＭ遺伝子の単離
ｈＴＡＲＭ遺伝子は骨髄において発現がみられたので、骨髄の全ＲＮＡを用いて５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥでｈＴＡＲＭの全長遺伝子配列の決定を試みた。【０１９８】
まず、骨髄の全ＲＮＡからｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（TAKARAｓ社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いてｃＤＮＡを精製した。次にａｄ２９アダプターを付加し、ＲＡＣＥの鋳型とした。  １ｓｔ  ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ、１００μＭ  プライマー  （５’ＰＣＲ４）  ０．５μｌ、１００μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μｌ、ａｄ２９アダプター付加ｃＤＮＡ（２５倍希釈）  １μｌ、蒸留水  ３８．７５μｌ）で行った。【０１９９】
プライマーは、
５’ＰＣＲ４：AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG（配列番号：２１）
ｈＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿５’＿４：CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT（配列番号：４７）、あるいは
ｈＴＡＲＭ＿ＲＡＣＥ＿３’＿４：GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC（配列番号：４８）を用いた。
ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で１分、７２℃で５分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間反応した。【０２００】
２ｎｄ  ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ、１００μＭ  プライマー  （５’ＰＣＲ１）  ０．５μｌ、１００μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μｌ、１ｓｔ  ＰＣＲ  産物（１００倍希釈）  １μｌ、蒸留水  ３８．７５μｌ）で行った。【０２０１】
プライマーは以下の配列を用いた。
５’ＰＣＲ１（配列番号：２４）、
ｈ２９Ｂ１４０  Ｆ１：TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC（配列番号：４９）、あるいは
ｈ２９Ｂ１４０  Ｒ１：TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT（配列番号：５０）
ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間反応した。増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Invitrogen社製）にクローニングした後、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を決定した。【０２０２】
その結果、ＸＭ＿４９７６４２に記載の配列と全く異なる５’および３’の塩基配列が得られた（配列番号：９）。【０２０３】
ＲＡＣＥで得られた塩基配列情報を用いて設計したプライマー
ｈ２９Ｂ１４０＿ＳａｌＩ−Ｋｏｚａｃ＿Ｆ：cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC（配列番号：５１）
ｈ２９Ｂ１４０＿ＮｏｔＩ−Ｒ：cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC（配列番号：５２）
と、骨髄の全ＲＮＡからＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭ  プライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、蒸留水  ３６μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Stratagene社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を決定した。得られたｈＴＡＲＭ  ｃＤＮＡの塩基配列はＲＡＣＥで決定した配列と一致していた（配列番号：９）。ｈＴＡＲＭ  ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列（配列番号：１０）は、細胞膜タンパク質として機能するために必要なシグナルシーケンスがＮ末端に存在した。ｈＴＡＲＣとＸＭ＿４９７６４２がコードするアミノ酸配列（ＬＯＣ４４１８６４）では、Ｎ末端とＣ末端が異なっていた。したがって、ゲノム配列からの推定ｃＤＮＡ配列ＸＭ＿４９７６４２は実際には存在せず、ｈＴＡＲＭ  ｃＤＮＡが細胞膜タンパク質ｈＴＡＲＭをコードする実在する遺伝子であることが明らかとなった（図１９）。【０２０４】
［実施例９］  ヒトＴＡＲＭに対する抗体の作製
（１）ヒトＴＡＲＭ遺伝子発現細胞の作製
ヒトＴＡＲＭ遺伝子発現ベクターは、実施例８で得られたｈＴＡＲＭ  ｃＤＮＡを発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ（Oncogene(2000)19(27):3050-3058）に挿入して作製した。【０２０５】
組換えレトロウイルスの作製は以下のように行った。
２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株（Invitrogen社製）３ｘ１０６個を培地（Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）に懸濁して１０ｃｍディッシュに播き、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。翌日、培地を交換し、以下のように調製したトランスフェクション溶液を加えてトランスフェクションを行った。トランスフェクション溶液は、５ｍｌチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL社製）を６００μｌとＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TaKaRa社製）２４μｌを加えて混合して室温５分静置した後、発現ベクター  ９μｇとパッケージングベクターであるｐＣＬ−Ｅｃｏ（Imgenex社製）  ９μｇを加えて室温５分静置して調製した。４８時間後に、培養上清を回収して０．４５μｍのフィルターろ過を行い、組換えウイルス液を得た。【０２０６】
この組換えウイルスを以下のようにＢ３００．１９細胞株に感染させ、ｈＴＡＲＭ遺伝子発現細胞を作製した。Ｂ３００．１９細胞  １ｘ１０６個を１５ｍｌチューブに加え、１２００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心後、培養上清を吸引除去した。細胞に、組換えウイルス液  ２ｍｌにｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）  ２μｌと５５μＭ  ２−メルカプトエタノール  ２μｌを加えて混合した溶液を加え、２５００ｒｐｍ、３０℃で２時間遠心して感染を行った。感染後に組換えウイルス液を除去し、培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／５５ｕＭ  ２−メルカプトエタノール）を加えて培養を行った。ＥＧＦＰ陽性細胞をセルソーティングにより分離することでｈＴＡＲＭ発現細胞を得た。【０２０７】
（２）ｈＴＡＲＭの細胞外領域とＳＥＡＰおよびＦｃキメラタンパク質の作製
ｈＴＡＲＭの細胞外領域は、ｈＴＡＲＭ全長ｃＤＮＡを鋳型として、ＳａｌＩを付加した５’プライマー（ｈ２９Ｂ１４０＿ＳａｌＩ−Ｋｏｚａｃ＿Ｆ：cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC（配列番号：５１））とＮｏｔＩを付加した３’プライマー（ｈ２９Ｂ１４０＿ＮｏｔＩ＿ＳＥＡＰ＿Ｒ：gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT（配列番号：５３））を用いてＰＣＲで増幅した。    ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭプライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌ、蒸留水  ３６μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Stratagene社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡ断片をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した後、実施例２に記載のｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０−Ｎｅｏベクターに挿入して、ｈＴＡＲＭ−ＡＰ発現ベクターを作製した。【０２０８】
これにより、ｈＴＡＲＭの細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが３個のアミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ）で結合され、さらにＣ末端に１０個のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）１０のついた分泌キメラタンパク質（以下、ＡＰキメラタンパク質という）の発現が可能となる。得られたＡＰキメラタンパク質発現ベクターは、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TAKARA社製）を用いて２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株へ導入し、４から５日間培養を行った。培養上清中に分泌されたＡＰキメラタンパク質は、遠心分離により培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過した後、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）とアジ化ナトリウムをそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、０．０２％となるように加えて４℃で保存した。ＡＰキメラタンパク質の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性をＡｕｒｏｒａ  ＡＰ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ICN社製）を用いて測定して算出した。【０２０９】
（３）ｈＴＡＲＭに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用の抗原として用いるために、まず、ｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の精製を行った。【０２１０】
精製は、ＡＰキメラタンパク質のＣ末端に存在するヒスチジンタグを利用して、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  Ｋｉｔ（Amersham Biosciences社製）を用いて行った。ｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質を含む培養上清を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（Amersham Biosciences社製）に添加し、１０ｍＭ  イミダゾール溶液で洗浄した後、５００ｍＭ  イミダゾール溶液でｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質をカラムから溶出した。ｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の濃度は、Ａｕｒｏｒａ  ＡＰ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ICN社製）を用いた酵素活性測定とＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  ＩＩ（BIO-RAD社製）を用いたタンパク定量により算出した。【０２１１】
つぎに、コージンバイオ株式会社に委託して、得られたｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパクを抗原としてＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した。免疫したマウスからリンパ球を単離して、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とリンパ球を混合し、ＰＥＧ法にて細胞融合を行った。得られたハイブリドーマの培養上清を用いてｈＴＡＲＭ−Ｆｃキメラタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。陽性ウェルからクローニングを行い、６種類のクローン（＃１１、＃１８、＃１９、＃２２、＃２６、＃４０）を得た。ＦＡＣＳにより特異性を検討した結果、各クローンともにｈＴＡＲＭ発現Ｂ３００．１９細胞のみに反応し、親株のＢ３００．１９細胞には反応しなかった。得られた抗ｈＴＡＲＭモノクローナル抗体＃１１、＃１８、＃１９、＃２２、＃２６、＃４０を産生するハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に接種し腹水を得て、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いて抗体を精製した。【０２１２】
［実施例１０］  活性化ヒトＴ細胞のｈＴＡＲＭ組換えタンパク質への接着
ヒト末梢血をヘパリン採血し、等量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Amersham Biosciences）を加え、４００ｘｇ  ３０分の比重遠心分離法により単核球を単離した。ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％  ＦＢＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＦｃＲブロッキング溶液（Miltenyi社製）を５μｌ／１×１０７個で加え、４℃で１５分間反応させた。ヒトＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Miltenyi社製）とＡｕｔｏ  ＭＡＣＳを用いて休止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞を得た。ＭＡＣＳで精製したＣＤ４陽性細胞は、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（Miltenyi社製）とＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（Miltenyi社製）をそれぞれ溶液の１／１１容量加え４℃で２０分間反応させ、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（BD Biosciences）を用いてＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞を得た。ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞はＴ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｈｕｍａｎ（Miltenyi社製）を用いて活性化させた。刺激後３日目からヒトＩＬ−２（２ｎｇ／ｍｌ）を加え、刺激後６日目と８日目の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて、ｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質が活性化Ｔ細胞に対する接着分子として機能するか否かを検討した。【０２１３】
まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製）に抗アルカリフォスファターゼ抗体（１０μｇ／ｍｌ）（Seradyn社製）を５０μｌずつ加え、３７℃で３０分間静置して固相化した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）で非特異的結合部位をブロックした。ＡＰキメラタンパク質（１ｎＭ）を各穴に加え、室温で３０分間静置して固相化した。活性化Ｔ細胞は、細胞接着緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０／０．５％  ＢＳＡ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５５ｎM  ２ME  （ｐＨ  ７．４））に懸濁して、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁社製）で蛍光標識した後、１穴あたり５ｘ１０４個ずつ加え、３７°Ｃで１時間反応させた。非接着細胞を洗浄して除き、細胞溶解液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えた後、Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ  １４２０  ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ（Perkin Elmer社製）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、検出波長５３５ｎｍで測定し、接着細胞を定量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割合をパーセントで表した。【０２１４】
その結果、ｈＴＡＲＭは活性化ヒトＴ細胞に対する接着分子として機能することが明らかとなった（図２０）。【０２１５】
［実施例１１］  抗ＴＡＲＭ抗体の細胞接着阻害活性
ｈＴＡＲＭを介した活性化ヒトＴ細胞の細胞接着に及ぼす抗ＴＡＲＭ抗体の効果を検討した。【０２１６】
ＡＰキメラタンパク質を各穴に加え、室温で３０分間静置して固相化した後、各穴に抗ｈＴＡＲＭ抗体（＃１１、＃１８、＃１９、＃２２、＃２６、＃４０）１０μｇ／ｍｌを加えて室温で３０分間前処理した。その後蛍光標識した活性化Ｔ細胞を加え、各抗体存在下での細胞接着活性を検討した。なお、＃１１、＃１９、＃２６、＃４０については抗ＩｇＧ２ａ抗体を、＃１８、＃２２については抗ＩｇＧ２ｂ抗体を対照として用いた。【０２１７】
その結果、活性化T細胞のｈＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質への接着は、抗ｈＴＡＲＭ抗体＃１８、＃１９、＃２２、＃２６において顕著に抑制され、＃１１、＃４０において部分的な抑制がみられた（図２０）。【０２１８】
[実施例１２]  ｍＴＡＲＭに対する新規リガンドｍＴＡＲＭ−Ｌの同定
（１）ｍＴＡＲＭ−Ｌ（ｍＴＡＲＭ  Ｌｉｇａｎｄ）候補分子の選択  
活性化Ｔ細胞上にｍＴＡＲＭ結合分子が存在することから（実施例５）、マウス免疫細胞由来の細胞株（Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ細胞株、ＢＷ５１４７細胞株、Ｒａｗ２６４．７細胞株）にもｍＴＡＲＭ結合分子が存在するか否かについて実施例５に記載の方法を用いて検討した。【０２１９】
その結果、ｍＴＡＲＭ結合分子が、Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ細胞株で強く発現しているが、ＢＷ５１４７細胞株およびＲａｗ２６４．７細胞株ではほとんど発現していないことが明らかとなった（図２１Ａ）。【０２２０】
次に、ｍＴＡＲＭに対する未知のリガンドがイムノグロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属すると仮定して、Ｍｏｕｓｅ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅのデータベースを検索して４７個のＩｇＳＦ候補に着目して、免疫細胞における発現をリアルタイムＰＣＲで調べた。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ細胞、ＢＷ５１４７細胞、Ｒａｗ２６４．７細胞から単離した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ存在下でＡＢＩ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔ  ｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ (PE Applied-Biosystems)を用いて行った。【０２２１】
その結果、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３５０９５（Ａ５３００６５Ｉ１７Ｒｉｋ，  ＮＭ＿１７６９５３）のｍＲＮＡ発現（プライマー＃２５５８：  CAGCTGGCAAGAGGAACAGT（配列番号：５４），＃２５５９：  GAGCATCGGCACTTATCTCC（配列番号：５５）を使用）がｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質の細胞への結合活性と相関するパターンを示した（図２２Ｂ）。しかしながら、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３５０９５がコードするアミノ酸配列には細胞膜貫通領域が存在せず、細胞膜タンパク質として機能するとは考えられなかった。このアミノ酸配列は推定上の配列であり、ゲノム配列からのｃＤＮＡ配列の推定が間違っていると考えられた。そこで、まず、ヒト相同遺伝子産物の同定を試みて、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３５０９５がコードするアミノ酸配列を用いてデータベース検索を行った。その結果、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３５０９５がコードするアミノ酸配列と相同性が高いヒトアミノ酸配列ＬＯＣ１９６２６４を見出した。このアミノ酸配列は、１つのイムノグロブリンループ構造領域を含む細胞膜タンパク質を呈していた。したがって、ＬＯＣ１９６２６４がＴＡＲＭ−Ｌ候補の完全長ヒトアミノ酸配列であると考えられた。つぎにＬＯＣ１９６２６４のアミノ酸配列を用いてデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索をおこなった。その結果、マウスＢＡＣクローンＡＣ１２２３０５のゲノム塩基配列に、ＬＯＣ１９６２６４のアミノ酸配列に相同性がある配列をコードする領域を見出した。この配列からマウスＴＡＲＭ−Ｌ候補のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を推定してプライマー
＃２６９３： CGCGTCGACGCCACCATGCAGCTGGCAAGAGGAACAGTA（配列番号：５６）
＃２６９４： GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC（配列番号：５７）
を設計し、完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離を行った。テンプレートには、Ｔｈ１  ｄａｙ２の全ＲＮＡを用い、実施例１に記載の方法でｃＤＮＡを増幅した。増幅したｃＤＮＡを発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ（Oncogene(2000)19(27):3050-3058）に挿入して、ｍＴＡＲＭ−Ｌ候補遺伝子発現ベクターを作製して、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を決定した（配列番号：１３）。【０２２２】
（２）ｍＴＡＲＭ−Ｌの同定  
つぎに、ｍＴＡＲＭ−Ｌ候補がＴＡＲＭに対する未知のリガンドであるかどうかを調べるため、この分子の発現細胞を実施例２に記載の方法で作製した。ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質のｍＴＡＲＭ−Ｌ候補発現細胞の細胞表面上への結合活性と固相化したｍＴＡＲＭに対するｍＴＡＲＭ−Ｌ候補発現細胞の接着活性の測定は実施例５に記載の方法で行った。【０２２３】
その結果、ｍＴＡＲＭ−ＡＰは、ＥＧＦＰ陽性のｍＴＡＲＭ−Ｌ発現Ｂ３００．１９細胞に特異的に結合したが、ＥＧＦＰ陽性のコントロールベクターを導入したＢ３００．１９細胞には結合しなかった（図２２Ａ）。陰性コントロールのＡＰは、ＥＧＦＰ陽性のｍＴＡＲＭ−Ｌ発現Ｂ３００．１９細胞に結合しなかった（図２２Ａ）。【０２２４】
さらに、ＡＰおよびｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質に対するｍＴＡＲＭ−Ｌ発現Ｂ３００．１９細胞との接着活性を調べたところ、ｍＴＡＲＭ−ＡＰキメラタンパク質のみに細胞が接着した（図２２Ｂ）。【０２２５】
以上の結果より、ｍＴＡＲＭ−Ｌ候補分子が実際に新規なＴＡＲＭに対するリガンドであることが明らかとなり、該リガンドをｍＴＡＲＭ−Ｌ（ＴＡＲＭ  Ｌｉｇａｎｄ）と命名した。【０２２６】
ｈＴＡＲＭ−Ｌは、ＬＯＣ１９６２６４のアミノ酸配列をコードするＮＭ＿１９８２７５の塩基配列をもとにしてプライマー
＃２７２１：  CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTGGA（配列番号：５８）
＃２７２２：  GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA（配列番号：５９）
を設計し、完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離を行った。テンプレートには、骨髄の全ＲＮＡを用い、実施例１に記載の方法でｃＤＮＡを増幅した。増幅したｃＤＮＡを発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ（Oncogene(2000)19(27):3050-3058）に挿入して、ＴＡＲＭ−Ｌ遺伝子発現ベクターを作製して、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を決定した（配列番号：１５）。【０２２７】
ヒトおよびマウスＴＡＲＭ−ＬのＣｌｕｓｔａｌＷによる相同性解析の結果を図２３に示す。ｈＴＡＲＭ−Ｌは２３５アミノ酸、ｍＴＡＲＭ−Ｌは２３７アミノ酸であり、相同性は８６％であった。一方、ｈＴＡＲＭ（２７１アミノ酸）と最も相同性が高いｍＴＡＲＭ  ｍ３（２９３アミノ酸）の相同性は５０％であった（図２４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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