(57)【要約】  簡便性と低コスト性とに優れるシアル酸の除去方法、及び、それを用いたアシアロエリスロポエチンの製造方法の提供を目的とする。本発明のシアル酸の除去方法は、エリスロポエチン含む溶液を酸性にし、かつ加熱することでエリスロポエチン分子に結合するシアル酸を除去する酸性加熱処理工程を含む。また、本発明のアシアロエリスロポエチンの製造方法は、本発明のシアル酸の除去方法により、エリスロポエチン分子に結合するシアル酸を除去するシアル酸除去工程を含む製造方法である。
2007083683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンに結合しているシアル酸の除去方法であって、前記エリスロポエチンを含む溶液を酸性にし、かつ加熱する酸性加熱処理工程を含むシアル酸の除去方法。
【請求項２】
さらに、前記酸性加熱処理工程後の前記エリスロポエチンを含む溶液を中和し、かつ冷却する中和冷却処理工程を含む請求項１記載のシアル酸の除去方法。
【請求項３】
前記酸性が、ｐＨ４．０以下である請求項１又は２に記載のシアル酸の除去方法。
【請求項４】
前記加熱が、前記溶液の温度を６０℃以上にする加熱である請求項１ないし３のいずれか一項に記載のシアル酸の除去方法。
【請求項５】
前記酸性加熱処理工程の処理時間が、１５分以上である請求項１ないし４のいずれか一項に記載のシアル酸の除去方法。
【請求項６】
前記中和が、前記溶液のｐＨを、ｐＨ５．０〜１０．０の範囲にする中和である請求項２ないし５のいずれか一項に記載のシアル酸の除去方法。
【請求項７】
前記冷却が、前記溶液の温度を０〜５０℃の範囲にする冷却である請求項２ないし６のいずれか一項に記載のシアル酸の除去方法。
【請求項８】
アシアロエリスロポエチンの製造方法であって、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のシアル酸の除去方法により、エリスロポエチンに結合しているシアル酸を除去するシアル酸除去工程を含むアシアロエリスロポエチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアル酸の除去方法及びアシアロエリスロポエチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（以下、ＥＰＯともいう。）は、赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する機能を有し、主として腎臓から産生される酸性糖タンパク質ホルモンである。血液中に最も豊富に存在する赤血球は、一定期間機能した後に脾臓等で破壊される。例えば、ヒトでは、赤血球の平均寿命は約１２０日である。一方で、赤血球は、骨髄から絶えず供給され、末梢の全赤血球数は、正常な状態では、常に一定に保たれている。エリスロポエチンは、このような生体の赤血球の恒常性維持において中心的な役割を担っている。臨床的には、エリスロポエチンは、貧血の治療や術前術後の管理に利用されている。【０００３】
近年、天然の糖鎖を有するエリスロポエチンに代えて、エリスロポエチンに結合したシアル酸を除去したアシアロエリスロポエチンを臨床的に用いることが検討されている（例えば、特許文献１（ＷＯ２００２／０５３５８０に対応）参照）。このアシアロエリスロポエチンは、通常、シアリダーゼ等の酵素によりエリスロポエチンを処理して製造されるほか、シアリルトランスフェラーゼ欠損細胞を宿主細胞として用いることで製造することができる（例えば、特許文献１参照）。アシアロ化されたエリスロポエチンは、肝臓に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターを介して速やかに代謝される。従って、投与部位から血液中に漏れ出した場合でも赤血球造血を引き起こすことなく、多血や血圧上昇が障害となるような疾患においても臨床応用が可能である。
【特許文献１】特表２００５−５０２５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記従来の酵素を用いるシアル酸の除去方法は、作業が煩雑でコストが高くなるという問題がある。また、特殊な宿主細胞を使用する方法も、同様に、作業が煩雑となるという問題や、コストが高くなるという問題がある。【０００５】
そこで、本発明は、簡便性と低コスト性とに優れるシアル酸の除去方法、及び、それを用いたアシアロエリスロポエチンの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のシアル酸の除去方法は、エリスロポエチンに結合しているシアル酸の除去方法であって、前記エリスロポエチンを含む溶液を酸性にし、かつ加熱する酸性加熱処理工程を含むシアル酸の除去方法である。または、さらに、前記酸性加熱処理工程後の前記エリスロポエチンを含む溶液を中和し、かつ冷却する中和冷却処理工程を含むシアル酸の除去方法である。【０００７】
また、本発明のアシアロエリスロポエチンの製造方法は、本発明のシアル酸の除去方法により、エリスロポエチンに結合しているシアル酸を除去するシアル酸除去工程を含むアシアロエリスロポエチンの製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者は、エリスロポエチンに結合しているシアル酸を除去する方法について鋭意研究を重ねた結果、エリスロポエチンを酸性にし、かつ加熱するだけでシアル酸を除去でき、さらに、その生物学的活性が失活しないことを見出して、本発明に到達した。【０００９】
本発明のシアル酸の除去方法及びアシアロエリスロポエチンの製造方法は、簡便性及び低コストに優れるから、アシアロエリスロポエチンを簡便、廉価に製造できる。また、本発明の製造方法で製造されるアシアロエリスロポエチンは、エリスロポエチンと遜色のない細胞増殖刺激等の生物学的機能を果たすから、例えば、治療や医薬組成物の製造等の医療分野で広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、アシアロＥＰＯ及び天然型ＥＰＯについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルの写真である（実施例１）。
【図２】図２は、アシアロＥＰＯ及び天然型ＥＰＯについてＩＥＦを行ったゲルの写真である（実施例１）。
【図３】図３は、天然型ＥＰＯとアシアロＥＰＯとの細胞増殖刺激機能を比較したグラフである（実施例１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のシアル酸の除去方法において、前記酸性は、ｐＨ４．０以下であることが好ましく、また、前記加熱は、前記溶液の温度を６０℃以上にする加熱であることが好ましい。【００１２】
本発明のシアル酸の除去方法において、前記酸性加熱処理工程の処理時間は、１５分以上であることが好ましい。【００１３】
本発明のシアル酸の除去方法は、前記酸性加熱処理工程後、さらに、前記エリスロポエチンを含む溶液を中和し、かつ冷却する中和冷却処理工程を含むことが好ましい。【００１４】
前記中和は、前記溶液のｐＨを、ｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０の範囲にする中和であることが好ましい。また、前記冷却は、前記溶液の温度を０℃〜５０℃の範囲にする冷却であることが好ましい。【００１５】
本発明において、「アシアロエリスロポエチン（以下、アシアロＥＰＯともいう）」とは、エリスロポエチン（以下、ＥＰＯともいう。）分子に結合しているシアル酸が除去されたＥＰＯのことをいう。【００１６】
通常、組換え動物細胞により生産されるＥＰＯ及び尿由来のＥＰＯのいずれにおいても、ＥＰＯは、糖鎖構造の異なる多様なＥＰＯを含むＥＰＯ組成物として得られる。シアル酸についても同様であり、前記ＥＰＯ組成物中のＥＰＯ分子に付加しているシアル酸の数は、個々のＥＰＯ分子によって異なるが、通常、１つのＥＰＯ分子に１１個〜１５個のシアル酸が付加している。本発明において、アシアロＥＰＯとは、これらのシアル酸を少なくとも１つ除去したものである。前記シアル酸の除去によりＥＰＯから除去されるシアル酸の数は、特に制限されず、例えば、全てのシアル酸を除去してもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のシアル酸を除去してもよい。本発明におけるアシアロＥＰＯとしては、ＥＰＯ分子に結合するシアル酸の数が１０個以下であることが好ましく、より好ましくは５個以下であり、特に好ましくは２個以下である。【００１７】
なお、ＥＰＯ及びアシアロＥＰＯに結合するシアル酸の数は、ＥＰＯ組成物に含まれるＥＰＯ１分子あたりの平均数で表すことができ、その１分子あたりのシアル酸の平均数は、当業者にとって従来公知の方法で測定できる（例えば、特開平８−１５１３９８号、ＥＰ０４２８２６７号公報）。例えば、ＥＰＯを０．３５Ｍの硫酸を用いて８０℃、３０分間の加水分解を行ってシアル酸をすべてＥＰＯから切断し、ＥＰＯのタンパク質及びシアル酸をそれぞれ定量し、ＥＰＯの１モル当たりのシアル酸のモル数を算出する方法等が挙げられる。【００１８】
本発明に用いるＥＰＯは、どのようなＥＰＯでも使用できるが、好ましくは高度に精製されたＥＰＯである。より具体的には、例えば、哺乳類ＥＰＯ、特にヒトＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものが好ましい。【００１９】
前記ＥＰＯの製造方法としては、特に制限されず、例えば、ヒト由来の抽出物を精製して天然のヒトＥＰＯを得る方法（例えば、特公平１−３８８００号公報（ＷＯ８６／０４０６８に対応）参照）や、あるいは、遺伝子組換え法を含む遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞等の細胞内に発現させ、種々の方法で抽出し分離精製したヒトＥＰＯ等を用いる方法が挙げられる。これらの中でも、本発明において使用するＥＰＯは、遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯが好ましく、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞を用いて製造されたＥＰＯが好ましい（例えば、特公平１−４４３１７号公報（ＷＯ８６／０３５２０に対応）、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３  ８０６−８１０  （１９８５）参照）。【００２０】
前記遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯは、天然由来のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは前記アミノ酸配列中の１又は複数個のアミノ酸を欠失、置換、付加等したものであって、天然由来のＥＰＯと同様の生物学的活性を有するものを含む。アミノ酸の欠失、置換、付加等は、当業者であれば公知の方法により行うことができる。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）等を用いて、ＥＰＯのアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＥＰＯと機能的に同様なポリペプチドを調製できる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じ得る。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ；以上は、アミノ酸の一文字表記であり、以下同様である。）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）等が挙げられる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換等により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持しうることは、既に公知である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；  Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；  Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３；  Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。【００２１】
本発明において使用するＥＰＯは、ＥＰＯと他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡと、他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームを一致するように連結して、これを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。前記他のタンパク質としては、特に制限されない。また、本発明において使用するＥＰＯとして、化学修飾したＥＰＯや糖鎖を修飾、改変したＥＰＯ等を使用してもよい。化学修飾したＥＰＯとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ビタミンＢ１２等の無機あるいは有機化合物を結合させたＥＰＯ等が挙げられる。さらに、本発明において使用するＥＰＯとして、分子中のアミノ酸が修飾されたＥＰＯ等を用いることも可能である。ＥＰＯ分子中のアミノ酸の修飾としては、例えば、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化等が挙げられる。【００２２】
次に、本発明のシアル酸の除去方法について説明する。【００２３】
本発明のシアル酸の除去方法は、ＥＰＯを含む溶液を、酸性かつ加熱条件下で処理することで、ＥＰＯ分子に結合しているシアル酸を除去する酸性加熱処理工程を含む方法である。【００２４】
前記ＥＰＯを含む溶液のＥＰＯの濃度としては、特に制限されないが、例えば、０．０１ｍｇ／Ｌ〜１００．０ｍｇ／Ｌであって、好ましくは、０．０５ｍｇ／Ｌ〜５０．０ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌ〜１０．０ｍｇ／Ｌである。【００２５】
前記酸性は、例えば、ｐＨ４．０以下であって、好ましくはｐＨ０．１〜ｐＨ４．０の範囲であり、より好ましくはｐＨ０．５〜ｐＨ３．０の範囲であり、さらにより好ましくはｐＨ１．０〜ｐＨ２．５の範囲である。【００２６】
前記ＥＰＯを含む溶液を前記範囲の酸性とする方法は、特に制限されず、当業者に公知の方法で行うことができ、例えば、塩酸溶液、リン酸溶液、酢酸溶液等の酸性溶液を前記ＥＰＯを含む溶液に添加する等して行うことができる。【００２７】
前記加熱は、シアル酸を除去するために前記ＥＰＯを含む溶液を処理するための加熱であって、その温度は、例えば、６０℃以上であって、好ましくは６０℃〜１００℃であり、より好ましくは７０℃〜９０℃であり、さらにより好ましくは、７５℃〜８５℃である。【００２８】
前記酸性加熱処理工程において、前記ＥＰＯを含む溶液を酸性とする工程と加熱する工程の順番は、特に制限されず、前記ＥＰＯを含む溶液を酸性としてから加熱してもよく、前記ＥＰＯを含む溶液を加熱してから酸性としてもよく、又は、酸性とする工程と加熱する工程とを同時に行ってもよい。これらの中でも、本発明においては、前記ＥＰＯを含む溶液を酸性とする工程の後に加熱する工程をすることが好ましい。【００２９】
本発明のシアル酸の除去方法において、ＥＰＯ分子に結合したシアル酸を除去するための前記酸性加熱処理工程の処理時間は、特に制限されないが、例えば、１５分以上であり、好ましくは３０分以上であり、より好ましくは４５分以上、さらにより好ましくは６０分以上である。前記処理時間の上限は、特に制限されないが、例えば、２４時間であり、好ましくは３６０分であり、さらに好ましくは１２０分である。【００３０】
本発明のシアル酸の除去方法は、前記の酸性加熱処理工程後、さらに、前記ＥＰＯを含む溶液を中和し、かつ冷却する中和冷却処理工程を含むことが好ましい。【００３１】
前記中和は、前記溶液のｐＨを、例えば、ｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０の範囲にする中和であって、前記中和のｐＨは、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ９．０であり、より好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５である。【００３２】
前記ＥＰＯを含む溶液を中和する方法は、特に制限されず、当業者に公知の方法で行うことができ、例えば、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ性溶液を前記シアル酸除去工程後の溶液に添加する等して行うことができる。【００３３】
前記冷却は、前記溶液の温度を、例えば、０℃〜５０℃の範囲にする冷却であって、好ましくは０℃〜４０℃であり、さらに好ましくは０℃〜３０℃である。【００３４】
前記中和冷却処理工程において、前記ＥＰＯを含む溶液を中和する工程と冷却する工程の順番は、特に制限されず、前記ＥＰＯを含む溶液を中和してから冷却してもよく、冷却してから中和してもよく、又は、中和する工程と冷却する工程とを同時に行ってもよい。これらの中でも、本発明においては、中和する工程の後に冷却する工程をすることが好ましい。【００３５】
次に、本発明のアシアロエリスロポエチンの製造方法について説明する。【００３６】
本発明のアシアロＥＰＯの製造方法は、本発明のシアル酸の除去方法により、エリスロポエチンに結合しているシアル酸を除去するシアル酸除去工程を含む製造方法である。【００３７】
前記シアル酸除去工程における、ＥＰＯを含む溶液を酸性とし、かつ加熱する処理条件、その方法及びその順番、並びに、処理時間は、前述のとおりである。【００３８】
同様に、前記シアル酸除去工程における、ＥＰＯを含む溶液を中和し、かつ冷却する処理条件、その方法及びその順番は、前述のとおりである。【００３９】
前記シアル酸除去工程により得られたアシアロＥＰＯ含有溶液中のアシアロＥＰＯは、例えば、当業者に公知の方法により、適宜精製することができ、高純度のアシアロＥＰＯを得ることができる。【００４０】
本発明のアシアロＥＰＯの製造方法により製造されるアシアロＥＰＯは、ＥＰＯと同等と生物学的活性を有するから、例えば、医薬組成物や試薬等に用いることができる。本発明において、ＥＰＯと同等の生物学的活性とは、ＥＰＯが有する活性であって、特に限定されないが、例えば、細胞増殖刺激活性、細胞・組織の再生促進、細胞・組織の保護活性等が挙げられる。【００４１】
アシアロＥＰＯを医薬組成物とする場合、必要に応じて、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加してもよい。【００４２】
前記懸濁化剤としては、特に制限されないが、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられる。【００４３】
前記溶解補助剤としては、特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等が挙げられる。【００４４】
前記安定化剤としては、特に制限されないが、例えば、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。また、前記安定化剤として、ある種のアミノ酸を添加することもできる（例えば、特開平１０−１８２４８１号公報参照）。安定化剤として添加されるアミノ酸には、例えば、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩等の塩等が含まれる。前記アミノ酸は、１種又は２種以上を組合せて添加することができ、その種類は特に制限されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンが挙げられる。【００４５】
前記等張化剤としては、特に制限されないが、例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等が挙げられる。【００４６】
前記保存剤としては、特に制限されないが、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等が挙げられる。【００４７】
前記吸着防止剤としては、特に制限されないが、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等が挙げられる。【００４８】
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、典型的には、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、天然系の界面活性剤等が挙げられる。前記非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセルモノステアレート、デカグリセルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリンモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの等が挙げられる。前記陰イオン界面活性剤としては、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等のエチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等のアルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩等が挙げられる。前記天然系の界面活性剤としては、例えば、レシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの界面活性剤は、１種又は２種以上を組合せて添加してもよい。これらの中でも好ましい界面活性剤としては、ポリソルベート２０、４０、６０又は８０等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであって、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）等）に代表されるポリオキシエチレンポリプロピレングリコールも好ましい。【００４９】
前記含硫還元剤としては、特に制限されないが、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。【００５０】
前記酸化防止剤としては、特に制限されないが、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、あるいは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤等が挙げられる。【００５１】
さらに、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩や、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウム等の有機酸等の通常添加される成分を添加してもよい。【００５２】
前記アシアロＥＰＯを含む医薬組成物を投与する場合、その投与量は、例えば、アシアロＥＰＯが、０．００１μｇ／ｋｇ／日〜１０００μｇ／ｋｇ／日であって、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日であり、さらに好ましくは０．１μｇ／ｋｇ／日〜３０μｇ／ｋｇ／日である。但し、投与量は、これらに限定されず、患者の年齢、体重、性別、症状、投与経路等を考慮して医師により決定され得る。したがって、本発明は、その他の態様として、本発明のアシアロＥＰＯの製造方法によりアシアロＥＰＯを製造する工程を含むアシアロＥＰＯ含有医薬組成物の製造方法、それにより製造された前記医薬組成物、及び、前記医薬組成物を投与することを含む治療方法、例えば、貧血の治療や術前術後の管理の方法を含んでもよい。【００５３】
以下に、実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５４】
（アシアロＥＰＯの製造）
１９０μＬの天然型のＥＰＯを含む溶液（１３００μｇ／ｍＬ）を準備し、前記溶液に、１．０ＮのＨＣｌを１０μＬ添加した後、８０℃に加熱して６０分間インキュベートすることで前記ＥＰＯに結合するシアル酸を除去した。その後、５．０ＮのＮａＯＨを２．０μＬ添加して中和するとともに、室温まで冷却して、アシアロＥＰＯを含む溶液を得た。前記ＨＣｌ添加後の溶液のｐＨは、１．０で、前記ＮａＯＨ添加後の溶液のｐＨは、７．０であった。なお、前記天然型ＥＰＯは、ＥＰＯ遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞を培養して得られたものである。【００５５】
天然型ＥＰＯとシアル酸の除去後のアシアロＥＰＯの分子量及び等電点を、それぞれ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて確認した。その結果を、それぞれ、図１及び図２に示す。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にタンパク質の染色を行ったゲルの写真であるが、同図に示すとおり、アシアロＥＰＯの分子量は、シアル酸の除去処理前の天然型ＥＰＯよりも減少した。また、図２は、ＩＥＦ後にタンパク質の染色を行ったゲルの写真であるが、同図に示すとおり、シアル酸の除去処理前の天然型ＥＰＯの等電点が、４．５５未満であったのに対し、シアル酸の除去処理後のアシアロＥＰＯの等電点は、７．３５以上であった。これらの変化は、ＥＰＯ分子からシアル酸が除去されたことと一致する。また、製造された前記アシアロＥＰＯの１分子あたりのシアル酸の平均数は、０であった。【００５６】
このように製造されたアシアロＥＰＯの生物学的活性を、前記天然型ＥＰＯの生物学的活性と比較するために、ＥＰＯ依存性細胞株の増殖刺激活性を指標として検討した。なお、本試験に用いたＡＳ−Ｅ２細胞は、ヒト白血病患者の骨髄細胞から樹立されたＥＰＯ受容体発現細胞株であり、ＥＰＯ非存在下では生存できない特徴を有している。前記アシアロＥＰＯと前記天然型ＥＰＯとをそれぞれ添加して、細胞増殖に与える影響をＷＳＴ−１アッセイにより測定した。その結果を図３に示す。同図に示すとおり、細胞増殖刺激機能について、両者とも同様の機能を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上説明したとおり、本発明のシアル酸の除去方法及びアシアロエリスロポエチンの製造方法は、簡便かつ低コストで行うことができるから、例えば、医薬組成物の製造に利用でき、広く医療分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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