(57)【要約】  ＨＧＦペプチド構造において、ＨＧＦのα鎖の領域又はそのα鎖のＣ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域と、ＨＧＦのβ鎖の領域又はそのβ鎖のＮ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域との間に、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Ｘが挿入された配列を有するＨＧＦ前駆体蛋白質改変体であって、ペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる蛋白質がＨＧＦの活性を有することを特徴とするＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦペプチド構造において、ＨＧＦのα鎖の領域又はそのα鎖のＣ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域と、ＨＧＦのβ鎖の領域又はそのβ鎖のＮ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域との間に、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Ｘが挿入された配列を有するＨＧＦ前駆体蛋白質改変体であって、ペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる蛋白質がＨＧＦの活性を有することを特徴とするＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項２】
ペプチド鎖Ｘが、プロテアーゼ認識配列を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項３】
プロテアーゼ認識配列がGenenase  Ｉの認識配列、エンテロキナーゼの認識配列、血液凝固第Ｘａ因子の認識配列、トロンビンの認識配列、ＴＥＶプロテアーゼの認識配列、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼの認識配列及びFurinの認識配列から選択される少なくとも１の認識配列であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項４】
プロテアーゼ認識配列がＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項５】
ＨＧＦがヒト、ネコ又はイヌ由来ＨＧＦであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項６】
ＨＧＦがヒト由来ＨＧＦであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項７】
ＨＧＦが、
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質、
であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項８】
α鎖が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４９４位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第４９５位から第７２８位で表されるアミノ酸配列、
であるか、α鎖が、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４８９位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の第４９０位から第７２３位で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体。
【請求項９】
請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体における、ペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１０】
切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１１】
プロテアーゼがGenenase  Ｉ、エンテロキナーゼ、血液凝固第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも１のプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１２】
切断が、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−ＨｉｓのＣ末側で行われることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１３】
切断がGenenase  Ｉ処理によって行われることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１４】
切断が化学的な切断方法によって行われることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時にペプチド鎖Ｘ中の少なくとも１ヶ所を切断することによって前記ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を活性型ＨＧＦ蛋白質改変体に変換することを特徴とする活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法。
【請求項１６】
切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法。
【請求項１７】
プロテアーゼがGenenase  Ｉ、エンテロキナーゼ、血液凝固第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも１のプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法。
【請求項１８】
ペプチド鎖ＸがＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓの配列を有し、かつ２〜２０残基のアミノ酸を有するペプチド鎖であって、該ペプチド鎖Ｘを挿入した配列を有する一本鎖のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時に該ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をGenenase  Ｉで処理することを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡと、ペプチド鎖Ｘを切断するプロテアーゼをコードするＤＮＡとを同時に宿主に導入し、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体とペプチド鎖Ｘを切断するプロテアーゼを同時に前記宿主に発現させ、当該プロテアーゼにペプチド鎖Ｘを切断させることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法。
【請求項２０】
請求の範囲第９〜１４項のいずれかに記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を有効成分として含有することを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清を使用せずとも活性化可能なＨＧＦ前駆体蛋白質改変体に関する。より詳細には、本発明は、ＨＧＦのα鎖の領域とβ鎖の領域の間にプロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Ｘが挿入された配列からなる一本鎖のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体に関する。また、本発明は、該ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をもとに、挿入したペプチド鎖Ｘのアミノ酸配列中の１ヶ所を切断することにより得られる活性型ＨＧＦ蛋白質改変体に関する。さらに、本発明は活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は肝実質細胞の増殖活性を有する蛋白質として発見されたが、その後の研究から、ＨＧＦは肝実質細胞の増殖作用以外にも様々な薬理作用を示す生理活性蛋白質であることが判明しており、その薬理作用については、例えば非特許文献１に記載されている。ＨＧＦの名称は、活性の多彩さにもとづき、ＨＧＦ以外にもＳＦ（scatter  factor）、ＴＣＦ（Tumor  cytotoxic  factor）等が使用されているが、本発明ではこれらの公知の肝実質細胞増殖活性を有する蛋白質をＨＧＦと総称する。ＨＧＦはその薬理作用から、肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤（例えば、特許文献１〜１４参照）等としての開発が期待されている。【０００３】
ＨＧＦは、肝臓、腎臓、肺、脳、骨髄、ひ臓、胎盤等の臓器あるいは血小板や白血球等の血液細胞等から分泌されるが、生体内には極微量にしか存在しないため、ＨＧＦを医薬製剤として用いるためには、遺伝子工学的手法により細胞を用いて大量に生産する必要がある。従来、ＨＧＦはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の動物細胞を用いて生産できることが知られている（例えば、特許文献１５、１６参照）。
従来動物細胞の培養にはウシ胎児血清が添加されてきたが、近年では無血清培養法も進歩しており、医薬製剤として用いられる蛋白質をＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いて生産する場合は無血清条件で培養が行われるのが一般的である。これは、ウシ胎児血清を使用しないことにより生産コストの削減が可能なことに加え、蛋白質製剤にウシ胎児血清に由来するウイルスや異常プリオンが混入する可能性を回避することができるためである。ＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いてＨＧＦを生産する場合にも無血清培養は可能であるが、その場合、ＨＧＦは不活性型のＨＧＦ前駆体蛋白質としてしか製造できないという問題がある。
ＨＧＦの生合成では、まず一本鎖のＨＧＦ前駆体蛋白質が合成されて細胞から分泌されるが、このＨＧＦ前駆体蛋白質は不活性な前駆体である。ＨＧＦ前駆体蛋白質がＨＧＦアクチベーター（ＨＧＦＡ）と呼ばれるプロテアーゼの作用によって切断を受け、二本鎖に変換されて初めてＨＧＦは活性型となる。活性型となったＨＧＦは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーである。ＨＧＦＡ自体も、もとは不活性な一本鎖前駆体（以下、プロＨＧＦＡともいう。）として生合成され、通常は血漿中をプロＨＧＦＡの形で循環している。組織傷害時には血液凝固系等と連動してトロンビンの作用によりプロＨＧＦＡが切断を受け、二本鎖の活性型ＨＧＦＡとなり、ＨＧＦ前駆体蛋白質を活性化する。血清はすでに血液凝固系が作用した後のものなので、血清中ではＨＧＦＡが活性型として存在する。したがって、ＨＧＦをコードするＤＮＡを組み込んだＣＨＯ細胞を血清存在下で培養すると、血清中の活性型ＨＧＦＡの作用により、ＨＧＦは活性型に変換された状態で培養液中に産生される。しかし、無血清条件でＣＨＯ細胞を培養すると、ＨＧＦＡが存在しないことからＨＧＦは不活性型のＨＧＦ前駆体蛋白質としてしか産生されない。ＨＧＦＡを血清の代わりにＣＨＯ細胞の培養系に添加することも考えられるが、上記のようにＨＧＦＡも不活性な一本鎖のプロＨＧＦＡとして細胞から分泌された後に血液凝固系と連動した活性化を受けて初めて活性型ＨＧＦＡが生じるというカスケードが存在するため、活性型ＨＧＦＡを血清非存在下で得ることにも難がある。したがって、従来の技術では血清を添加する条件でなければ活性型ＨＧＦを効率的に生産できないというのが実状である。【０００４】
そこで、血清を添加せずともＨＧＦ前駆体蛋白質を活性化する方法の開発が望まれている。そのような方法が開発できれば、無血清条件でＣＨＯ細胞を培養しても活性型ＨＧＦを安全に生産することができ、ウイルスや異常プリオン混入の危険性を回避できる。またＨＧＦの組換え生産のための宿主として酵母や昆虫固体等血清を使用しない宿主システムの利用も可能となり、ＣＨＯ細胞より高いレベルで組換えＨＧＦの発現が期待できる生産システムへの応用も可能である。
しかし、血清を添加せずともＨＧＦ前駆体蛋白質を活性化する方法は従来知られていなかった。
【特許文献１】特開平４−１８０２８号公報
【特許文献２】特開平４−４９２４６号公報
【特許文献３】特開平７−１７９３５６号公報
【特許文献４】特開平６−２５０１０号公報
【特許文献５】特開平６−３４０５４６号公報
【特許文献６】特開平６−１７２２０７号公報
【特許文献７】特開平７−８９８６９号公報
【特許文献８】特開平６−４０９３４号公報
【特許文献９】特開平６−５０３９４９号公報
【特許文献１０】特開平６−４０９３５号公報
【特許文献１１】特開平６−５６６９２号公報
【特許文献１２】特開平７−４１４２９号公報
【特許文献１３】特許第３３９５１８１号公報
【特許文献１４】特開平５−２１３７２１号公報
【特許文献１５】特開平１１−４６９６号公報
【特許文献１６】特開平１０−１９１９９１号公報
【非特許文献１】実験医学、１９９２年、第１０巻、第３号（増刊）、ｐ．３３０−３３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、血清を使用せずとも活性型ＨＧＦ蛋白質改変体（活性型ヘテロダイマー）への変換が可能なＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を提供すること、及びその活性型ＨＧＦ蛋白質並びにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべくＨＧＦ前駆体蛋白質の活性化に関する研究を鋭意重ねた結果、ＨＧＦのα鎖の領域とβ鎖の領域の間にプロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド開裂（又は切断）しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Ｘを挿入したＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、血清を用いずとも活性型の二本鎖のＨＧＦ蛋白質改変体に変換できることを見出した。該開裂しうる配列を切断できるプロテアーゼ又は化学的処理剤を用いてα鎖の領域と、β鎖の領域の間に挿入したペプチド鎖Ｘの配列を切断することにより、該ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体はＳ−Ｓ（ジスルフィド）結合でつながったヘテロダイマーの活性型ＨＧＦ蛋白質改変体となり、ＨＧＦの生物活性を示す。以上の発見に基づき、本発明者らはさらに研究を重ね本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、血清を使用せずとも活性型ヘテロダイマーへの変換が可能なＨＧＦ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質、さらにはその製造方法を提供するものである。さらに、本発明は、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を有効成分として含有する医薬製剤を提供する。【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］ＨＧＦペプチド構造において、ＨＧＦのα鎖の領域又はそのα鎖のＣ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域と、ＨＧＦのβ鎖の領域又はそのβ鎖のＮ末端からアミノ酸残基を１乃至２０個欠失するポリペプチドの領域との間に、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド切断しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖Ｘが挿入された配列を有するＨＧＦ前駆体蛋白質改変体であって、ペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる蛋白質がＨＧＦの活性を有することを特徴とするＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［２］ペプチド鎖Ｘが、プロテアーゼ認識配列を有することを特徴とする前記［１］に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［３］プロテアーゼ認識配列がGenenase  Ｉの認識配列、エンテロキナーゼの認識配列、血液凝固第Ｘａ因子の認識配列、トロンビンの認識配列、ＴＥＶプロテアーゼの認識配列、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼの認識配列及びFurinの認識配列から選択される少なくとも１の認識配列であることを特徴とする前記［２］に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［４］プロテアーゼ認識配列がＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓであることを特徴とする前記［２］に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［５］ＨＧＦがヒト、ネコ又はイヌ由来ＨＧＦであることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［６］ＨＧＦがヒト由来ＨＧＦであることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［７］ＨＧＦが、
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質、
であることを特徴とする前記［６］に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［８］α鎖が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４９４位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第４９５位から第７２８位で表されるアミノ酸配列、
であるか、α鎖が、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４８９位で表されるアミノ酸配列であり、β鎖が、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の第４９０位から第７２３位で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする前記［６］に記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体、
［９］前記［１］〜［８］のいずれかで示されるＨＧＦ前駆体蛋白質改変体における、ペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって得られる活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１０］切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする前記［９］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１１］プロテアーゼがGenenase  Ｉ、エンテロキナーゼ、血液凝固第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも１のプロテアーゼであることを特徴とする前記［１０］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１２］切断が、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−ＨｉｓのＣ末側で行われることを特徴とする前記［１０］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１３］切断がGenenase  Ｉ処理によって行われることを特徴とする前記［１０］又は［１２］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１４］切断が化学的な切断方法によって行われることを特徴とする前記［９］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体、
［１５］前記［１］〜［８］のいずれかに記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時にペプチド鎖Ｘ中の少なくとも１ヶ所を切断することによって前記ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を活性型ＨＧＦ蛋白質改変体に変換することを特徴とする活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法、
［１６］切断がプロテアーゼ処理又は化学的処理によって行われることを特徴とする前記［１５］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法、
［１７］プロテアーゼがGenenase  Ｉ、エンテロキナーゼ、血液凝固第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ及びFurinから選択される少なくとも１のプロテアーゼであることを特徴とする前記［１６］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法、
［１８］ペプチド鎖ＸがＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓの配列を有し、かつ２〜２０残基のアミノ酸を有するペプチド鎖であって、該ペプチド鎖Ｘを挿入した配列を有する一本鎖のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を製造し、続いてあるいは同時に該ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をGenenase  Ｉで処理することを特徴とする前記［１５］に記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法、
［１９］前記［１］〜［８］のいずれかに記載のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡと、ペプチド鎖Ｘを切断するプロテアーゼをコードするＤＮＡとを同時に宿主に導入し、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体とペプチド鎖Ｘを切断するプロテアーゼを同時に前記宿主に発現させ、当該プロテアーゼにペプチド鎖Ｘを切断させることを特徴とする前記［１６］〜［１８］のいずれかに記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の製造方法、及び
［２０］前記［９］〜［１４］のいずれかに記載の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を有効成分として含有することを特徴とする医薬、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、無血清条件下でＳ−Ｓ結合でつながった活性型ヘテロダイマー（活性型ＨＧＦ蛋白質改変体）に変換でき、ウシ胎児血清に由来する異常プリオン混入の危険性を回避できる。また、血清を用いない発現システムでの活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の生産が可能となり、安価に活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を製造できるので経済的にも有利である。本発明により製造される活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は、ＨＧＦと実質的に同一の活性を有するので、ＨＧＦの代替医薬として使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をGenenase  Ｉで処理した場合と非処理の場合のサンプルを還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＨＧＦポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った結果を示す図である。図中、Ｐｒｏ−ＨＧＦはＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質又はＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を示し、αはＨＧＦ−ＮＧのα鎖を又は活性型ＨＧＦ蛋白質改変体のα鎖に相当する鎖を、βはＨＧＦ−ＮＧのβ鎖又は活性型ＨＧＦ蛋白質改変体のβ鎖に相当する鎖を示す。
【図２】ＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質又はＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をGenenase  Ｉで処理した場合（＋）と非処理の場合（−）のサンプルを非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＨＧＦポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った結果を示す図である。
【図３】ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質をGenenase  Ｉで処理（＋）して得られるサンプルの活性について、ＭＤＣＫ細胞に対するscatter活性で評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＨＧＦのα鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入されるペプチド鎖Ｘは、プロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド開裂しうる少なくとも２残基のアミノ酸配列を有するペプチド鎖であれば、特に限定されない。ペプチド鎖Ｘを構成するアミノ酸数は約２０アミノ酸残基以内が好ましい。より好ましいペプチド鎖Ｘのアミノ酸数は約２〜１０残基であり、さらに好ましくは約２〜６残基である。【００１１】
プロテアーゼ反応によってペプチド開裂しうるアミノ酸配列としては、例えばプロテアーゼ認識配列（プロテアーゼによってペプチド開裂し得る配列）等が好ましく挙げられる。プロテアーゼ認識配列は、基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列であれば特に制限はないが、プロテアーゼ認識配列がＨＧＦのアミノ酸配列に含まれないことがさらに好ましい。プロテアーゼ認識配列としては、例えばGenenase  Ｉ（Carter．P．et  al．，Proteins，6，240-248(1989)）の認識配列であるＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓ；エンテロキナーゼ［Kunitz，M．，J．Gen．Physiol．22，429-446（1939），LaVallie，E．R．et al．Journal  of  Biological Chemistry，268，23311-23317（1993），Vozza，L．A．et al．Biotechnology（NY）．14，77-81（1996）］の認識配列であるＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３）；血液凝固第Ｘａ因子の認識配列であるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号５）；トロンビンの認識配列であるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号６）;ＴＥＶ(tobacco  etch  virus)プロテアーゼ［Dougherty  WG  et  al．，Microbiological  Reviews，57，781−822（1992）］の認識配列であるＧｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す；配列番号７）又はＧｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す；配列番号８）；Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ［Walker  PA，et  al．，Biotechnology（NY），12（6），601−605（1994）］の認識配列であるＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号９）；Furin［Hosaka  M，et  al．，Journal  of  Biological Chemistry，266，12127−12130（1991）］の認識配列であるＡｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す；配列番号１０）又はＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す；配列番号１１）等が好ましく挙げられる。Genenase  Ｉの認識配列であるＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓは認識配列が短いことから特に好ましい。ただし、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓの配列のＮ末側を延長してＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号１２）やＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号１３）等の配列とすることにより、Genenase  Ｉの認識性を向上させることができる。Ｘａａの任意のアミノ酸残基は、天然の２０種類のアミノ酸及び非天然アミノ酸から選択され得る。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。【００１２】
化学反応によってペプチド開裂しうるアミノ酸配列としては、ヒドロキシルアミンによる反応で切断されるＡｓｎ−Ｇｌｙ；塩酸グアニジンを含む酢酸で切断されるＡｓｐ−Ｐｒｏ等が挙げられる。【００１３】
本発明に係わるＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、ヒト由来のＨＧＦ又は哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウシ、チンパンジー、ウマ、ブタ、ヒツジ等）由来のＨＧＦのアミノ酸配列をもとに設計できる。このようなＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えばヒト由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２，Ｐ１４２１０，ＢＡＡ１４３４８，ＡＡＣ７１６５５等）、マウス由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＡＡＢ３１８５５，ＮＰ＿０３４５５７，ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿５８７１３等）、ウシ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６，ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）又はチンパンジー由来ＨＧＦ（例えばAccession  No．ＸＰ５１９１７４等）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、前記ＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは数個（例えば、約２〜３０個、好ましくは約２〜２０個、より好ましく約２〜１０個、さらにより好ましくは２〜５個；以下において同じ）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦとしては、例えばAccession  No．Ｐ１４２１０として登録されているＨＧＦに対して５アミノ酸が欠損するＨＧＦ（Accession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２）等を挙げることができる。また、挿入されるペプチド鎖Ｘ中に存在するプロテアーゼ反応又は化学反応によってペプチド開裂させる配列が、ＨＧＦのアミノ酸配列に含まれているときには、実質的にＨＧＦと同じ作用を有する限り、ＨＧＦに存在するペプチド開裂配列の１若しくは数個のアミノ酸を公知の手段で置換、欠失若しくは付加させてもよい。公知の手段としては、例えば後述する部位特異的変異導入手法等が含まれる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」は、アミノ酸が遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（１〜数個、数個の定義は前述した通りである。）、欠失、置換若しくは付加等されている場合を含む。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦには、例えば天然のＨＧＦに付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等が含まれる。具体的には、例えばAccession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２（配列番号２）のＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ［配列番号１４；Fukuta  K  et  al．，Biochemical  Journal，388，555-562（2005）��等を挙げることができる。さらに、ＨＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質も上記ＨＧＦに含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸の一致の程度の意味である（以下において同じ）。【００１４】
上記ＨＧＦの具体的なアミノ酸配列としては、例えば配列番号１（Accession  No．Ｐ１４２１０）又は配列番号２（Accession  No．ＮＰ＿００１０１０９３２）で表されるアミノ酸配列等が好ましく挙げられる。また、本発明におけるＨＧＦのアミノ酸配列には、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸を別のアミノ酸と置換させたアミノ酸配列又は１〜数個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質のアミノ酸配列が含まれる。なお、配列番号２で表されるＨＧＦは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１６２番目のフェニルアラニン残基から第１６６番目のセリン残基までの５アミノ酸残基を欠失する。このため、配列番号２で表されるＨＧＦは、５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦということもある。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、ＤＮＡによりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。また、本発明におけるＨＧＦのアミノ酸配列には、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質のアミノ酸配列が含まれる。配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列としては、例えばＮＣＢＩのデータベース等にAccession  No．ＮＰ＿００１０１０９３４、ＢＡＡ１４３４８、ＡＡＣ７１６５５、ＡＡＢ３１８５５、ＮＰ＿０３４５５７、ＢＡＡ０１０６５、ＢＡＡ０１０６４、ＮＰ＿５８７１３、ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６，ＢＡＤ０２４７５、ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９、ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０又はＸＰ５１９１７４等として登録されているＨＧＦのアミノ酸配列等が挙げられるが、これらに限定されない。【００１５】
本発明の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は、以下の工程１乃至工程４を含む方法により製造できるが、これら工程に限定されず、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体が製造できればよい。
工程１：
工程１によって、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡが作製される。該工程には、ＨＧＦのα鎖の領域とβ鎖の領域の間にペプチド鎖Ｘを挿入してＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを作製する工程が含まれる。
ペプチド鎖ＸをＨＧＦのα鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入する場合、天然のＨＧＦのα鎖とβ鎖の境界にペプチド鎖Ｘを単に挿入するだけでもよい。この場合はＨＧＦの全アミノ酸数が挿入配列の分だけ増加することになる。また、ＨＧＦのα鎖とβ鎖の境界を挟みα鎖のＣ末端からアミノ酸残基を約１乃至２０個及び／又はβ鎖のＮ末端からアミノ酸残基を約１乃至２０個欠失させ、その欠失させた領域にペプチド鎖Ｘを挿入してもよい。
ＨＧＦにおけるα鎖とβ鎖としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４９４位で表されるアミノ酸配列からなるα鎖、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第４９５位から第７２８位で表されるアミノ酸配列からなるβ鎖、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の第３２位から第４８９位で表されるアミノ酸配列からなるα鎖、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第４９０位から第７２３位で表されるアミノ酸配列からなるβ鎖等が挙げられる。α鎖とβ鎖の境界を構成するアミノ酸残基は、例えば配列番号１で表されるＨＧＦの場合は配列番号１の第４９４位のアルギニンと第４９５位のバリンである。また、例えば配列番号２で表される５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦにおけるα鎖とβ鎖の境界を構成するアミノ酸残基は、配列番号２の第４８９位アルギニンと第４９０位のバリンである。【００１６】
ＨＧＦのα鎖とβ鎖の境界へのペプチド鎖Ｘの挿入は、蛋白質の部位特異的変異導入手法等によって行なうことができる。前記手法としては、例えばＨＧＦのα鎖をコードするＤＮＡとβ鎖をコードするＤＮＡの境界に該当する塩基配列の部分に目的のペプチド鎖Ｘをコードする塩基配列が挿入されるか、又は目的の配列への置換が起こるように変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば変異を導入したい部分に対応する変異プライマーを合成し、例えばクンケル法［Kunkel，T．A．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．82，488−492（1985）］等の既知の技術を用いて行うことができる。また、市販の変異導入キット等を用いるとより簡便に変異を導入することができる。変異導入キットとしては、例えばMutazyme  DNA  polymeraseを含むGeneMorph  Random  Mutagenesis  Kit（Stratagene社製）、GeneTailor（登録商標）  Site−Directed  Mutagenesis  System（Invitrogen社製）、Mutan（登録商標）−Super  Express  Km（タカラバイオ株式会社製）、QuikChange（登録商標）  XL  Site-Directed  Mutagenesis  Kit（東洋紡績社製）又はGeneEditor  in  vitro  Site-Directed  Mutagenesis  System（Promega社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。前記クンケル法や変異導入キット等によって変異が導入されたＤＮＡ（ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ；以下、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡという。）は、該ＤＮＡに変異させた及び／又は増殖させたプラスミドやファージ等から、制限酵素によって切り出され得る。切り出されたＤＮＡは、公知の方法で精製されてもよく、後記する適当な発現用ベクターに直接挿入されてもよい。前記精製は、市販キットを使用することができ、例えばQIAquick  Gel  extraction  Kit（Qiagene社製）又はS．N．A．P．UV−Free  Gel  Purification  Kit（Invitrogen社製）等を使用し得るが、これらに限定されない。また、上記したＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡは、従来公知の方法を用いて化学合成により製造することもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法等が挙げられる。【００１７】
ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターは、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡを、ＨＧＦの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて結合して作製することが出来る。組み換え発現ベクターは、必要により、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン及びターミネーター等を含む。組み換え発現ベクターは、例えば転写の下流方向に順番に、(１)プロモーター、（２）リボソーム結合部位、（３）開始コドン、（４）本発明のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡ、（５）終止コドン、及び（６）ターミネーターを含むように構築されるのが好ましい。本発明で用いることが出来る発現ベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合はｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（東洋紡績社製）等のプラスミドを、枯草菌を宿主とする場合はｐＵＢ１１０（シグマ社製）等のプラスミドを、酵母を宿主とする場合はｐＹＥＳ２（Invitrogen社製）又はｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ３７０６２）等のプラスミドを挙げることができる。動物細胞用の発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ及びｐＣＸＮ２［Niwa，H．，Yamamura，K．and Miyazaki，J．，Gene，第108巻，p．193-200（1991），特開平０３‐１６８０８７］又はｐｃＤＬ-ＳＲα［Takebe，Y．ら、Mol．Cell．Biol．，第8巻，p．466-472（1988）］等が挙げられる。その他、発現ベクターとしては、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン社製）、ウイルスＳＶ４０（ＢＲＬ社製）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０３）又はレトロウイルスの遺伝子由来のベクター等が挙げられるが宿主内で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はされない。【００１８】
プロモーター及びターミネーターに関しても、目的とするＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡの発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。プロモーターの例としては、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター又はｌｐｐプロモーター等が挙げられ、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター又はＡＤＨプロモーター等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＡＧプロモーターの他、ラウス肉腫ウイルス（ウイルスＲＳＶ）、ＭＰＳＶ、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスゲノムから得られるプロモーター、メタロチオネインプロモーター又はヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、高等哺乳動物宿主を用いる際には、ベクターにエンハンサーを導入するのが好ましい。エンハンサーを導入することにより転写が増大し得る。エンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、ポリオマーエンハンサー又はアデノウイルスのエンハンサー等が挙げられる。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネーター又は１ｐｐターミネーター等を、宿主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターミネーター等を、宿主が酵母の場合、ＣＹＣ１ターミネーター等を、宿主が動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネーター又はＨＳＶ１ＴＫターミネーター等を例示することが出来る。これらのプロモーターとターミネーターは用いる宿主に応じて適宜に組み合わされる。【００１９】
工程２：
工程２によって、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体が合成される。該工程では工程１で構築された組み換え発現ベクターが宿主に導入されて形質転換体が作製され、その形質転換体においてＨＧＦ前駆体蛋白質改変体が合成される工程が含まれる。
工程１で構築されたＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターが、コンピテント細胞法(J．Mol．Biol．，53，154，1970)、プロトプラスト法［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1929，（1978）］、リン酸カルシウム法［Science，221，551（1983）］、ＤＥＡＥデキストラン法［Science，215，166（1982）］、電気パルス法［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81，7161，（1984）］、インビトロパッケージング法［Proc．Nat．Acad．Sci．USA，72，581（1975）］、ウイルスベクター法（Cell，37，1053，1984）又はマイクロインジェクション法［Exp．Cell．Res．，153，347（1984）］等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。
宿主として用いることのできる細胞としては、特に制限はなく、動物、植物、昆虫、真核微生物等の真核細胞、又は原核微生物等の原核細胞等が挙げられる。これらの細胞は個体を形成していてもよく、動物個体、植物個体又は昆虫個体等を宿主としてもよい。真核細胞では、付着性細胞又は浮遊性細胞等の何れも使用でき、例えばＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を細胞内に生産蓄積する真核細胞でもよく、あるいはＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を細胞外に分泌生産する真核細胞でもよい。動物細胞では、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＣ１２７細胞又はＨｅｌａ細胞等が挙げられる。植物細胞では、例えばイネ、タバコ又はシロイヌナズナ等を挙げることができ、昆虫細胞では、例えばＳｆ９やＳｆ２１等の細胞を挙げることができる。昆虫個体では例えばカイコを挙げることができる。真核微生物ではSaccharomyces  cerevisiae、Schizosaccharomyces  pombe、Candida  boidinii又はPichia  pastoris等の酵母、あるいはAspergillus属、Trichoderma属又はMucor属等の糸状菌等を挙げることができる。原核微生物では、大腸菌又は枯草菌等が挙げられる。【００２０】
得られた形質転換体は、目的とする組換えＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養されるのが好ましい。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。培地の例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）又はＭ９培地[J．Exp．Mol．Genet．，Cold Spring  Laboratory，New  York，431（1972）]等が挙げられ、宿主が酵母の場合はＹＥＰＤ培地(Genetic  Engineering，vol．1，Plenum  Press，New  York，1979，p．117)等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合、培地としては、２０容量％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ（Minimum  Essential  Medium）培地、ＤＭＥＭ（Dulbecco's  Modified  Eagle's  Medium）培地又はＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）等を挙げることが出来る。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気又は撹拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビース、あるいはアセチルセルロースフォローファイバー等の担体を好ましく用いることができる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育できれば実施でき、これらに限定されるものではない。
作製された形質転換体は、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体をコードするＤＮＡを発現し、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を合成し得る。【００２１】
さらに、本発明のＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、無細胞蛋白質合成システムを利用して得ることもできる。無細胞蛋白質合成システムとは、大腸菌、ウサギ網状赤血球細胞、小麦胚芽等から調製した細胞抽出液を用いるか、あるいは細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を利用して、目的蛋白質をコードするＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として、生細胞を用いずに蛋白質合成を行う方法を含む。細胞抽出液にはリボソーム、ｔＲＮＡ及び翻訳因子等の蛋白質合成に必要な分子群が含まれているため、これにＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー源及び基質となるアミノ酸を添加すると、蛋白質が合成される。細胞抽出液の代わりに、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を混合して用いてもよい。【００２２】
工程３：
工程３によって、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体（以下において、単に前駆体ということもある）を活性型ＨＧＦ蛋白質改変体に変換させる。
工程２において合成されたＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は不活性であることから、α鎖の領域とβ鎖の領域の間に挿入されたペプチド鎖Ｘ中の少なくとも一ヶ所を切断することによって該前駆体を開裂して、二本鎖に変換し、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体に変換させることが好ましい。
切断の方法は、前駆体に存在するペプチド鎖Ｘ中の特定のアミノ酸配列が切断されれば特に限定されない。該方法には、例えばプロテアーゼによる処理又は化学的な処理を含む。【００２３】
特定のアミノ酸配列を切断し得るプロテアーゼとしては、特に限定されないが、ペプチド鎖Ｘ中の特定のアミノ酸配列を認識し得る基質特異性が高い例えばGenenase  Ｉ、エンテロキナーゼ、血液凝固第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼ又はFurin等が好ましい。例えば、Genenase  Ｉの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にGenenase  Ｉを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、Genenase  Ｉの認識配列のＨｉｓ−Ｔｙｒ又はＴｙｒ−Ｈｉｓの間で行なわれる。エンテロキナーゼの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にエンテロキナーゼを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、エンテロキナーゼの認識配列のＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３）のリジン残基のＣ末端部で行なわれる。同様に、血液凝固第Ｘａ因子の認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体に血液凝固第Ｘａ因子を作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、血液凝固第Ｘａ因子の認識配列のＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号５）のうち、Ｇｌｙ−Ａｒｇの間で行なわれる。また、トロンビンの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にトロンビンを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、トロンビンの認識配列のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号６）のＡｒｇ−Ｇｌｙの間で行なわれる。ＴＥＶプロテアーゼの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にＴＥＶプロテアーゼを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、ＴＥＶプロテアーゼの認識配列であるＧｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（配列番号７）のセリン残基のＣ末端部又はＧｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号８）のグリシン残基のＣ末端部で行なわれる。Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にRhinovirus  ３Ｃプロテアーゼを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、Rhinovirus  ３Ｃプロテアーゼの認識配列であるＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号９）のうちＧｌｎ−Ｇｌｙの間で行なわれる。Furinの認識配列が挿入された前駆体であれば一本鎖の該前駆体にFurinを作用させることで該前駆体を活性化することができる。この場合の切断は、Furinの認識配列であるＡｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１０）又はＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１１）のＣ末アルギニン残基のＣ末端部で行なわれる。【００２４】
プロテアーゼには、生体や細胞又は菌等から分離して精製されたもの、組換え蛋白質として精製されたもの、あるいは市販されているもの等が含まれる。プロテアーゼは、上記形質転換体を培養する培地に添加してもよいし、形質転換体等から抽出して精製したＨＧＦ前駆体蛋白質改変体に作用させてもよい。
また、プロテアーゼをＨＧＦ前駆体蛋白質改変体に作用させる他の方法としては、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体を生産させる形質転換体にプロテアーゼをコードするＤＮＡも組み込んで、該形質転換体にＨＧＦ前駆体蛋白質改変体と同時に該プロテアーゼを発現させる方法等が挙げられる。この場合、ペプチド鎖Ｘに含まれるプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼをコードするＤＮＡを組み込むのが好ましい。形質転換体は、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体と同時にプロテアーゼを生産するので、該形質転換体が生産するＨＧＦ前駆体蛋白質改変体はペプチド鎖Ｘに含まれるプロテアーゼ認識配列部位で自動的に切断され、活性化され得る。【００２５】
化学的な処理によってＨＧＦ前駆体蛋白質改変体のペプチド鎖Ｘ部位を開裂する方法としては、化学的処理剤、例えばヒドロキシルアミン又は塩酸グアニジンを含む酢酸（［好ましくは例えば約７Ｍ塩酸グアニジンを含む約１０容量％酢酸（ｐＨ約２．５）］等をＨＧＦ前駆体蛋白質改変体と接触させて反応させる方法が挙げられる。例えばヒドロキシルアミンによる反応ではＡｓｎ−Ｇｌｙ結合が切断され、塩酸グアニジンを含む酢酸ではＡｓｐ−Ｐｒｏの結合が切断され蛋白質が開裂され得る。前記化合物は、形質転換体が生育できる限りにおいて、形質転換体の培養培地に添加してもよい。【００２６】
プロテアーゼによる処理又は化学的な処理は、例えば還元剤［例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等］や変性剤（例えばＳＤＳ、尿素、塩酸グアニジン等）などの存在下で行なわれてもよい。この場合には、ペプチド鎖Ｘの切断後にrenaturation（蛋白質の再生）反応を行なうことが好ましい。Renaturation反応は、公知の方法、例えばMolecular  Cloning：A  Laboratory  Manual．3d  Edition．Sambrook，J．and  Russell，D．W．，eds．（2991）Cold  Spring  Harbor  Press，pp．A4．39に記載の方法等に従って行なうことができる。【００２７】
工程４：
工程４によって、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体が分離、精製される。形質転換体の培養上清中又は形質転換体中に生成した活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等又はそれらを組み合わせて分離精製することが出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィー、へパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィー、及びフェニルセファロース逆相クロマトグラフィーの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィー、及び抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせ等が好ましく有効な精製法である。【００２８】
本発明の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体はＨＧＦと実質的に同質の活性を有するので、ＨＧＦと同様に、蛋白質医薬品として、ヒト及び哺乳動物（イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、モルモット等）の各種疾患治療薬又は予防薬として用いることができる。用途としては、例えば、肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、創傷治療剤、皮膚潰瘍治療剤、毛根細胞増殖剤、制ガン剤、肺傷害治療剤又はガン療法用副作用防止剤等の用途が挙げられる。より具体的には、ＨＧＦを適用できる疾患、例えば、肝疾患（例えば、肝炎、肝硬変、肝不全、外科手術後の肝再生等）、腎疾患（例えば、糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の腎傷害等）、皮膚疾患（例えば、白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚潰瘍、禿頭症等）、血液疾患（例えば、血小板減少症、骨髄移植等）、眼疾患（例えば、角膜潰瘍等）、肺疾患（例えば、肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺線維症等）、胃十二指腸疾患（例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等）、癌疾患及びその関連疾患（例えば、各種癌、癌療法による副作用、例えば肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛等の予防等）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎等）、中枢疾患（例えば、神経分化異常症等）などの予防・治療に有用である。【００２９】
本発明の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を含有する医薬製剤は、一般的な医療製剤の形態で用いられる。医薬製剤の形態としては、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとり得る。一般的には有効成分である活性型ＨＧＦ蛋白質改変体と結合性物質のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされ得るが、注射剤が好適である。注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。当該注射剤は常法により調製することができる。例えば水性注射剤とする場合、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、アラニン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体含量としては、通常０．０００２〜３質量％程度、好ましくは０．００１〜２質量％程度に調製される。なお、水性注射剤等の液状製剤とした場合はこれを凍結保存してもよいが、凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用され得る。【００３０】
また、経口薬としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、腸溶錠を含む）、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟もしくは硬カプセル剤（腸溶カプセル剤を含む）、液剤、乳剤、懸濁剤又はシロップ剤等の剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。
また、本発明で用いられる活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類；コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体；ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子と活性型ＨＧＦ蛋白質改変体の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、活性型ＨＧＦ蛋白質改変体が約０．０１〜３０質量％程度が好ましい。【００３１】
また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。製剤中の活性型ＨＧＦ蛋白質改変体含量は、剤形、適用疾患等に応じて適宜調整することができる。
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油又はジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。【００３２】
坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤又は等張化剤等を含んでいてもよい。【００３３】
本発明の製剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、本発明の製剤を注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下又は筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の疾患、症状、年齢又は体重等により適宜調整され得るが、例えば、成人に対し、通常ＨＧＦとして０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜１００ｍｇであり、さらに好ましくは０．０５〜５０ｍｇ、とりわけ好ましくは０．０５〜２０ｍｇである。これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。【００３４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は次の通りである。
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
ＬＢ培地：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地
ＤＭＥＭ培地：ダルベッコ改変イーグル培地
Ａｍｐ：アンピシリン
ＦＣＳ：牛胎児血清
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
ＰＶＤＦ：ポリフッ化ビニリデン
Ａ：アデニン
Ｃ：シトシン
Ｇ：グアニン
Ｔ：チミン
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｌｙｓ：リジン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｈｉｓ：ヒスタミン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｐｒｏ：プロリン
また、％は特記しない場合は質量％を示す。
【実施例１】
【００３５】
配列番号１４に示されるＨＧＦ［５アミノ酸欠失・糖鎖欠損型ヒトＨＧＦ；天然型のα鎖−β鎖境界配列Ａｒｇ（４８９位）−Ｖａｌ（４９０位）を有し、糖鎖付加部位に変異を有するＨＧＦ。；以下、ＨＧＦ−ＮＧと称する］をコードする塩基配列（配列番号１５）の両端にＢａｍＨＩ認識配列（GGATCC）を含む塩基配列とＸｂａＩ認識配列（TCTAGA）を含む塩基配列を付与した後、これをｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen社製）のＢａｍＨＩサイトとＸｂａＩサイトの間に組み込んだ。得られたベクターをｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧと称する。
ＨＧＦ−ＮＧのα鎖とβ鎖の境界にGenenase  Ｉ認識配列（Ｈｉｓ−Ｔｙｒ）が導入された改変体として、該ＨＧＦα鎖のＣ末端２残基（Ｌｅｕ−Ａｒｇ）がＨｉｓ−Ｔｙｒに変換された改変体（ＨＧＦ−Ｇ１と称する）、該ＨＧＦα鎖のＣ末端１残基（Ａｒｇ）がＴｙｒに、ＨＧＦβ鎖のＮ末端１残基（Ｖａｌ）がＨｉｓに変換された改変体（ＨＧＦ−Ｇ２と称する）及び該ＨＧＦα鎖のＣ末端６残基（配列番号１４の第４８４−４８９位；Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）がＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号１２）に変換された改変体（ＨＧＦ−Ｇ３と称する）を以下のように調製した。
まず、ＨＧＦ−Ｇ１、ＨＧＦ−Ｇ２、ＨＧＦ−Ｇ３を発現させるためのベクターを作製した。このためには、上記のｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧをテンプレートとして、クンケル法によりＨＧＦのα鎖とβ鎖の境界をコードする領域の塩基配列に変異を導入し、この変異導入鎖を増幅させた。具体的には、ＨＧＦ−Ｇ１を発現するベクターの調製のためには配列番号１６のプライマー（５’−リン酸化）を、ＨＧＦ−Ｇ２を発現するベクターの調製のためには配列番号１７のプライマー（５’−リン酸化）を、ＨＧＦ−Ｇ３を発現するベクターの調製のためには配列番号１８のプライマー（５’−リン酸化）を用い、ｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧをテンプレートとしてDNA  polymeraseにKOD  Plus（東洋紡績社製）を用いて変異導入鎖を伸長させ、増幅させた。その後、テンプレートＤＮＡをＤｐｎＩ処理により消化し、残った変異導入鎖を、塩化カルシウム法により作製した大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（ニッポンジーン社製）にトランスフォーム（形質導入）することによって、変異ベクターを調製した。【００３６】
【表１】
2007122975.tif 000002
【００３７】
ＬＢ／Ａｍｐプレート上でＡｍｐ耐性コロニーをピックアップし、得られた各クローンからQIAprep  Spin  Miniprep  Kit（キアゲン社製）を用いて各変異ベクターを抽出した。各変異ベクターにおけるＨＧＦ−ＮＧをコードする塩基配列を解析することによって、目的のクローンを選択した。具体的には変異ベクターにおける配列番号１４に示されるＨＧＦをコードする塩基配列部分について、Big Dye  Terminator  v3.1  Cycle  Sequence  Kit（アプライドバイオシステム社製）を用いてシークエンス反応を行なった後、3100  Genetic  Analyzer（アップライドバイオシステム社製）を用いて塩基配列の解析を行なった。それによってＨＧＦ−ＮＧのα鎖とβ鎖の境界部分に目的の変異導入を確認できたベクターを選択し、以後の実験に用いた。
配列番号１６の変異プライマーを用いて配列番号１４の第４８８−４８９位がＬｅｕ−ＡｒｇからＨｉｓ−Ｔｙｒに置換されるように変異を導入したベクターはｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ１と称する。配列番号１７の変異プライマーを用いて、配列番号１４の第４８９−４９０位がＡｒｇ−ＶａｌからＴｙｒ−Ｈｉｓに置換されるように変異を導入した変異ベクターはｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ２と称する。配列番号１８の変異プライマーを用いて、配列番号１４の第４８４−４８９位がＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＡｒｇからＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒに置換されるように変異を導入した変異ベクターはｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ３と称する。【００３８】
次に、ｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ及び各変異ベクター（ｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ１、ｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ２及びｐＣＤＮＡ−ｄＨＧＦ−ＮＧ−Ｇ３）をそれぞれヒト胎児腎細胞株２９３Ｔ細胞［DuBridge  RB，et  al．，Molecular  Cellular  Biology，7，379-387（1987）］にトランスフェクションした。トランスフェクションを行なうにあたり、２９３Ｔ細胞はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０容量％添加した培地で前培養した。トランスフェクションの直前にこのＤＭＥＭ培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換し、LIPOFECTAMINE 2000（Invitrogen社製）を用いてリポフェクション法によってトランスフェクションを行った。トランスフェクション後も無血清ＤＭＥＭ培地で培養を継続し、トランスフェクションの６時間後にヘパリンを１μｇ／ｍＬとなるように添加した。これを３日間培養し、各ベクターが産生するＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質又はＨＧＦ前駆体蛋白質改変体（ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質，ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質）を無血清ＤＭＥＭ培地中にそれぞれ蓄積させた。３日後にそれぞれ３枚のシャーレから培地を回収して混合し、０．２２μｍフィルターで濾過した後、精製に供するまで−８０℃で保存した。培地中に分泌されたＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質の濃度はＥＬＩＳＡ法によって分析した。ＥＬＩＳＡ法は、イムニスキット（特殊免疫研究所製）を用い、キットに記載のプロトコルに従った。
上記の培地を解凍し、再度０．２２μｍフィルターで濾過した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したHeparin  Sepharose樹脂（Amersham  Biosciences社製）を添加し、室温でＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質を樹脂に結合させた。樹脂を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、２Ｍ  ＮａＣｌでＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質を溶出させることにより、ＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質を部分精製した。【００３９】
ヘパリン樹脂で部分精製したＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質，ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質又はＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質（各２００ｎｇ）に重量比１／２量（１００ｎｇ）のGenenase  Ｉ（New England Laboratory製）を加え、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、２Ｍ  ＮａＣｌ中で２５℃にて１２時間処理した。なお、Genenase  Ｉ認識配列を挿入していない天然型のα鎖−β鎖境界配列を有するＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質は、ＦＣＳを１容量％の濃度で添加して５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、２Ｍ  ＮａＣｌ中で３７℃にて１２時間インキュベートした。【００４０】
Genenase  Ｉで処理した後に得られた各活性型ＨＧＦ蛋白質改変体（活性型ＨＧＦ−Ｇ１、活性型ＨＧＦ−Ｇ２又は活性型ＨＧＦ−Ｇ３）を還元条件下又は非還元条件下にてウエスタンブロットを行なった。ウエスタンブロットは、以下により行なった。
ウエスタンブロット：Genenase  Ｉで処理した後の活性型ＨＧＦ−Ｇ１、活性型ＨＧＦ−Ｇ２又は活性型ＨＧＦ−Ｇ３を還元条件下（１００ｍＭ  ＤＴＴの存在下）又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。ＰＶＤＦメンブレンに転写された蛋白質は、ヒトＨＧＦをウサギに免疫することによって作製されたヒトＨＧＦポリクローナル抗体（Matsumoto  K，et  al．，Proceedings  for  National  Academy  of  Science  of  the  United  States  of  America，89，3800-3804(1992)）をプローブとして検出した。【００４１】
還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった時のウエスタンブロットの結果を図１に示す。Genenase  Ｉ認識配列を挿入していない天然型のα鎖−β鎖境界配列を有するＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質では、Genenase  Ｉ処理の有無でバンドの位置に変化はなく、いずれも一本鎖のＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質の位置にバンドが認められた（図１；レーン１、２）。このことから、天然型のα鎖−β鎖境界配列を有するＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質はGenenase  Ｉによる切断を受けないことが確認された。一方、このＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質にＦＣＳを添加して３７℃、１２時間処理することにより、α鎖とβ鎖の二本のバンドが検出され、活性型となったことが確認された（レーン３）。Genenase  Ｉ認識配列を挿入したＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質及びＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質においては、いずれもGenenase  Ｉ非処理の場合は一本鎖のＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質と同じ位置にバンドが認められた（図１；レーン４、６、８）が、Genenase  Ｉ処理によりＨＧＦ−ＮＧにおけるα鎖とβ鎖と同じ位置にバンドが検出されるようになり（図１；レーン５、７、９）、二本鎖に変換されたと考えられた。【００４２】
非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった時のウエスタンブロットの結果を図２に示す。天然型のα鎖−β鎖境界配列を有するＨＧＦ−ＮＧ前駆体蛋白質は、活性化処理前に加えてＦＣＳによる活性化処理後も一本のバンドとして検出される（図２；レーン１，３）。このことは、活性型ＨＧＦ−ＮＧ構造はＳ−Ｓ結合でつながっていることを意味している。ＨＧＦ−ＮＧはGenenase  Ｉ処理によっては活性化されず、その他の切断もないので、一本のバンドのままである（図２；レーン２）。Genenase  Ｉ認識配列を挿入したＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質及びＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質においても、Genenase  Ｉ非処理（図２；レーン４，６，８）に加えてGenenase  Ｉ処理後のバンドも一本である（図２；レーン５，７，９）。これらのことから、ＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、Genenase  Ｉによって切断された後もＳ−Ｓ結合でつながっていると考えられた。
【実施例２】
【００４３】
実施例１で調製した活性型ＨＧＦ−Ｇ１又は活性型ＨＧＦ−Ｇ３を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。ＰＶＤＦメンブレンに転写された蛋白質を、クーマシーブリリアントブルー染色によって染色し、ＨＧＦβ鎖に対応する３０ｋＤａのバンドを切り出した。アミノ酸シークエンサー（Applied  Biosystems社  Procise  491  cLC）によりＮ末端アミノ酸の配列を解析した。ＨＧＦ−Ｇ１及びＨＧＦ−Ｇ３のβ鎖と考えられるバンドのＮ末端アミノ酸配列は共にＶＶＮＧＩ（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ）であった。このことから、Genenase  Ｉ認識配列を導入したＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、Genenase  Ｉ処理によって設計通りにGenenase  Ｉ認識配列の部分で切断されていることが確認された。
【表２】
2007122975.tif 000003
【実施例３】
【００４４】
イヌ腎臓上皮細胞ＭＤＣＫ株［Montesano  R，et  al．，Cell，66，697-711（1991）］をＤＭＥＭ培地（１０容量％ＦＣＳを含む）に懸濁して２４ｗｅｌｌプレートに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（４８０μＬ／ｗｅｌｌ）で播き、ここに活性型５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦ又は実施例１で調製した活性型ＨＧＦ−Ｇ１、活性型ＨＧＦ−Ｇ２もしくは活性型ＨＧＦ−Ｇ３を含む被検サンプル２０μＬを添加し、３７℃で２０時間培養した後、scatterの有無を顕微鏡で観察した（図３）。被検サンプルは、該サンプル２０μＬを培地に添加した後の５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦ、活性型ＨＧＦ−Ｇ１、活性型ＨＧＦ−Ｇ２又は活性型ＨＧＦ−Ｇ３の濃度が各々２、５又は１０ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。
Genenase  Ｉ認識配列を挿入したＨＧＦ−Ｇ１前駆体蛋白質、ＨＧＦ−Ｇ２前駆体蛋白質及びＨＧＦ−Ｇ３前駆体蛋白質は、いずれもGenenase  Ｉ処理をしない（図３；−）と細胞遊走活性を示さなかったが、これらをGenenase  Ｉで処理した（図３；＋）後の活性型ＨＧＦ−Ｇ１、活性型ＨＧＦ−Ｇ２及び活性型ＨＧＦ−Ｇ３はいずれも、活性型５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦと同等の細胞遊走活性を示した。このことから、Genenase  Ｉ認識配列を挿入したＨＧＦ前駆体蛋白質改変体は、Genenase  Ｉで二本鎖構造に変換されることにより、ＨＧＦ活性を有する活性型ＨＧＦ蛋白質改変体になることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明に係る活性型ＨＧＦ蛋白質改変体は、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有するのでＨＧＦの代替医薬として有用である。
【図１】
2007122975.tif 000004
【図２】
2007122975.tif 000005
【図３】
2007122975.tif 000006
【配列表】
2007122975000001.app
【国際調査報告】
2007122975.tif 000007
2007122975.tif 000008
2007122975.tif 000009
2007122975.tif 000010
2007122975.tif 000011
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