(57)【要約】心電図上T波終末部が明確になる条件で麻酔したハムスターを準備し、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図QT時間延長作用の評価法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心電図上T波終末部が明確になる条件で麻酔したハムスターを準備し、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図QT時間延長作用の評価法。
【請求項２】
麻酔がペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔である、請求項１に記載の評価法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心電図QT時間延長作用の評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、薬剤による心電図QT時間の延長が問題になっており、ICHのガイドラインにもあるように、医薬品開発の早期の段階でその作用の有無に関する評価が求められている。心電図QT時間は、心室の脱分極の開始から再分極の終了までの時間であるが、QT時間が薬剤等によって延長した場合にtorsades de pointes（TdP）と言われるタイプの多形性心室頻拍が誘発される場合がある。この不整脈が誘発された際には失神発作を起こし、また、心室細動へ移行し致命的となる場合もある。薬剤投与によるQT時間の延長とTdPの誘発は、Vaugham Williams分類のIa群に属する抗不整脈薬について多く報告されていたが、近年、エリスロマイシン等の抗生物質、テルフェナジンやアステミゾールといった抗ヒスタミン剤等の非循環薬によるQT時間の延長とTdPの発生が報告されてきている。さらに薬物相互作用でTdPが発生する場合もある。したがって、ヒト用医薬品として開発途中にあるすべての化合物について、安全性薬理試験の一環として心電図QT時間に及ぼす影響を検討する必要がある。【０００３】
心電図QT時間が延長するということは、心室筋の活動電位持続時間が延長することを意味する。心室筋活動電位の再分極に関与しているイオン電流は遅延整流カリウム電流（IK）であり、IKを抑制すると活動電位持続時間は延長する。心電図QT時間を延長する薬剤の大部分は、IKの速いコンポーネント（IKr）を通過させるHERGチャネルを抑制するものとされる。【０００４】
心電図QT時間延長のin vivo評価系としては、麻酔イヌ、及び覚醒イヌでの評価が安全性薬理試験として行なわれている。しかし、探索段階の化合物のin vivo評価の場合には、イヌの使用は、実験技術面及び化合物の必要量の点から困難である。そこで、より小動物での心電図評価が検討された（非特許文献１）。IKrを選択的に抑制するとされるE4031に対する作用を、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを用いて麻酔下で検討した結果、ウサギ及びモルモットにおいてはE4031によるQT時間の延長が認められたが、ラット及びマウスでは認められなかった。【０００５】
ラット及びマウスでは、QT時間に関与するイオンチャンネルがヒトとは異なることが、QT延長の評価には使えない理由であると考えられ、同じげっ歯類であるハムスターも同様であろうと考えられていた。【０００６】
また、モルモットではQT時間の延長の程度が小さく、感受性が低いと考えられた。ウサギは感受性が高く、TdP様の心室頻拍も認められ、感度良い評価動物であると判断されたが、体重（約２kg）が大きく、多検体評価には不向きと考えられた。
【非特許文献１】J. Toxicol. Sci., 23, 344, 1998
【発明の開示】
【０００７】
心電図QT時間延長のin vivo評価系については、探索段階での化合物量が少ない時点での評価を考えると、より小動物での評価系が望まれる。従って、本発明は、小動物を用いた心電図QT時間延長のin vivo評価方法の提供を目的とする。
【０００８】
本発明者は、ハムスターを、心電図上T波終末部が明確になる条件で麻酔でき、それによりQT時間の測定が容易になること、及び、この様な条件で麻酔したハムスターにおけるQT時間に対する、IKr選択的抑制剤のE4031、ならびに、臨床でQT時間延長作用が認められている、アレルギー性疾患用剤のテルフェナジン及び消化管運動賦活調整剤のシサプリドの効果が、ヒトや麻酔下のイヌと同様であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、心電図上T波終末部が明確になる条件で麻酔したハムスターを準備し、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図QT時間延長作用の評価法を提供する。
【００１０】
麻酔の条件は、例えば、ペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】ペントバルビタール単独麻酔下のハムスターの心電図。上段より標準第I誘導心電図、第II誘導心電図、第III誘導心電図、VR誘導心電図、VL誘導心電図、及び VF誘導心電図（チャートの写真）。
【図１−２】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの心電図。上段より標準第Ｉ誘導心電図、第II誘導心電図、第III誘導心電図、VR誘導心電図、VL誘導心電図、及び VF誘導心電図（チャートの写真）。
【図２】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの標準誘導心電図（チャートの写真）。a） ヒト用の心電計で記録した標準肢誘導心電図  上段から標準第Ｉ誘導心電図（LＩ）、標準第II誘導心電図（LII）、標準第III誘導心電図（LIII）  増幅部高域周波数特性： 35 Hz（-3 dB、筋電フィルタ ON の条件下）  記録部周波数特性： 0.05 〜 100 Hz (-3 dB)、感度： 20 mm/mV。b) 生体用アンプ及びサーマルアレイレコーダで測定、記録した標準第II誘導心電図  生体用アンプの周波数特性： 0.08 〜 300 Hz、サーマルアレイレコーダの周波数特性： DC 〜 2.8 k  Hz、感度： 70 mm/mV。
【図３】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの標準第II誘導心電図（チャートの写真）（上段）及びヒトの心電図の基本波形（下段）。
【図４】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図QT時間とRR時間との関係（1例）。
【図５】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図に及ぼす E4031 の影響（チャートの写真）。  図中の破線は、QRSの開始点及びE4031投与前のT波の終点の位置を示す。
【図６】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図パラメータに及ぼす E4031 の影響。
【図７−１】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図パラメータに及ぼすテルフェナジンの影響。  黒三角：テルフェナジン、白丸：対照(control)、各値は、5 例の平均値±標準誤差で表した。＊：p < 0.05 vs control。
【図７−２】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図パラメータに及ぼすシサプリドの影響。  黒四角：シサプリド、白丸：対照(control)、各値は、5 例の平均値±標準誤差で表した。＊：p < 0.05 vs control。
【図７−３】ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図パラメータに及ぼす E4031 の影響。  黒丸：E4031、白丸：対照(control)、各値は、5 例の平均値±標準誤差で表した。＊：p < 0.05 vs control。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の評価方法は、心電図上T波終末部が明確になる麻酔条件、例えばペントバルビタール及びキシラジンの組合せで麻酔したハムスターを準備し、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することを特徴とする。【００１３】
本発明の評価方法において用いられるハムスターは、特に限定されないが、実験動物として供給されているハムスターを用いることが、飼育管理の点では好ましい。用いるハムスターは、心電図の測定に適する程度まで成長していれば、特に限定されないが、通常には、４〜３０週齢である。【００１４】
麻酔は、心電図Ｔ波の終末部が明確になってQT時間が計測可能になる条件を選択すればよい。このような条件は、心拍数が増加しないことを指標にして選択できる。例えばペントバルビタール麻酔の場合、単独麻酔では交感神経活性が相対的に高くなって心拍数が高い状態になり、心電図Ｔ波の終末部が次のP波に重なり判別し難くなって心電図QT時間の計測には適さないが、これにキシラジン麻酔を加えた混合麻酔では、ペントバルビタール単独麻酔に比べ心拍数が減少して心電図Ｔ波の終末部が次のP波と分離し明確になってQT時間の計測を可能にすることができる。【００１５】
麻酔は、心電図Ｔ波の終末部が明確になってQT時間が計測可能になる条件であれば特に限定されないが、具体的な麻酔方法としては、例えば、ペントバルビタールとキシラジンの混合麻酔、ケタミンとキシラジンの混合麻酔、ウレタン麻酔、α-クロラロース麻酔、ハロセンやイソフルレンの吸入麻酔等が挙げられ、好ましくはペントバルビタールとキシラジンの混合麻酔が望ましい。ペントバルビタールは、例えば、３０〜７０mg/kgを腹腔内投与することが挙げられる。キシラジンは、例えば、１〜３mg/kgを筋肉注射することが挙げられる。【００１６】
上記に挙げた麻酔方法の中で、ケタミンとキシラジンの混合麻酔は、イヌに対して、キシラジン 1.0 mg/kg, iv で心拍数が低下し、その後ケタミン10 mg/kg ivにより、キシラジン投与前のレベル以上に一過性に心拍数が上昇するが、その後徐々に低下し、キシラジン投与前のレベル前後に落ち着くことが報告されている（Haskins S. C., Patz J. D., and Farver T. B.: Xylazine and xylazine-ketamine in dogs.  Am. J. Vet. Res, 47, 636-641, 1986）ことから、本方法に適用可能である。【００１７】
またPettingerら（Pettinger W. A., Tanaka K., Keeton K., Campbell W. B., and Brooks S. N.: Renin release, an artifact of anesthesia and its implications in rats. Proc. Soc.Exp.Biol. Med., 148, 625-630, 1975）は、ウレタン麻酔が、ラットにおいてわずかに心拍数を上昇させる傾向があると報告しているが、同時に比較されているペントバルビタールと比較して心拍数の上昇は小さく、ウレタン麻酔も本方法に適用可能である。【００１８】
α-クロラロース麻酔については、心拍数に影響しないという報告（Marullaz R. D., Combre A., and Boucher M.: Comparison of the effects of pentobarbital and chloralose on the cardiac rhythms of the dog in chronic atrio-ventricular heart block. Eur. J. Pharmacol., 32, 393-395, 1975）と、心拍数を上昇させるという報告（Boucher M., Dubray C., Li J. H., Paire M., and Duchene-Marullaz P.: Influence of pentobarbital and chloralose anesthesia on quinidine-induce effects on atrial refractoriness and heart rate in the dog. J. Cardiovasc. Pharmacol. 17, 199-206, 1991）があるが、後者の報告でもペントバルビタールと比較して心拍数の上昇は小さく、本方法に適用可能である。【００１９】
またハロセン及びイソフルレンは、洞結節に対する直接作用としては、自動能を抑制、つまり心拍数を低下させる作用があると報告されている（Bosnjak Z. J., and Kampine J. P.: Effects of halothane, enflurane, and isoflurane on the SA node. Anesthesiol., 58, 314-321, 1983）ことから、本方法に適用可能である。【００２０】
心電図の測定における誘導は、特に限定されないが、体表面誘導が好ましく、更に好ましくは標準肢誘導I若しくはII、又は単極肢誘導VRが好ましく、特に標準肢誘導IIが好ましい。【００２１】
測定時のハムスターの体位は、特に限定されないが、仰臥位又は伏臥位が好ましく、更には仰臥位が好ましい。【００２２】
心電図の測定に用いる装置は、感度や周波数特性などの測定条件を、ハムスターの心電図測定用に調整する他は、通常の心電図測定装置でよい。心電図測定装置は、市販のものでもよいし、アンプやレコーダを組合せて構成してもよい。好ましい装置の特性としては、感度：１０〜１００mm/mV、周波数特性：０．０８Hz〜１kHzで−６dBが挙げられる。【００２３】
ハムスターの心電図の測定は、Basic Res. Cardiol., 98, 367-379, 2003、J. Pharmacol. Exp. Ther, 284, 125-135, 1998、Heart Vessels, 8, 186-193, 1993、Jap. J. Physiol., 41, 629-651, 1991、Cardiovas. Res., 25, 49-57, 1991、Jap. J. Antibio., 34, 231-252, 1986、Jap. Cir. J., 46, 1305-1312, 1982等で報告されている。それらの心電図波形と、後記実施例で記録された心電図波形とを比較すると、P波の波形には差が認められなかった。しかし、R波が二峰性である報告はなかった。文献では、心電図記録条件の記載がない報告もあったが、その心電図記録のほとんどがヒト用の心電計によるものと考えられる。後記実施例においてもヒト用心電計ではR波の二峰性は認められず、周波数特性の良い生体アンプとサーマルアレイレコーダの組み合わせで二峰性のR波が記録された。したがってR波の波形の違いは記録条件の違いであると考えられる。このように測定条件によりR波の波形は相違し得るが、混合麻酔を施したハムスターにおいて心電図QT時間が測定できる限り測定条件は限定されない。【００２４】
心電図QT時間の測定、および、被検物質の投与は、通常の方法に従って行えばよい。通常には、ペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔下のハムスターを準備し、前記ハムスターの心電図QT時間を測定し、被検物質を前記ハムスターに投与し、投与後のハムスターの心電図QT時間を測定することにより、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間を得ることができる。投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することができる。【００２５】
また、試験間のバラツキを考慮するため、評価の際には陽性対照を用いることが好ましい。陽性対照としては、心電図QT時間延長作用を有することが知られている物質であれば、特に限定されず、例えば、E4031が挙げられる。【００２６】
続いて実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なおこれらは実施の一例をして示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また以下の記載に用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくものである。
【実施例１】
【００２７】
１．  動物、試薬、及び機器
１．１．  供試動物
シリアン・ハムスター（体重：122〜150 g、週齢：７又は９〜１０）を用いた。
ハムスターは日本エスエルシー株式会社（浜松、静岡）から購入した。温度（23±2℃）、湿度（55±10 %RH）、照明（12 時間明暗照明）の管理下で予備飼育した後に実験に供した。  飼育中、実験動物用固形飼料MF（オリエンタル酵母工業株式会社（東京））、及び水道水を自由摂取させた。【００２８】
１．２．  被験物質及び試薬
１．２．１．  E4031
生理食塩水に溶解して静脈内投与した。
投与量は 1〜1000μg/kg（1 mL/kg）とした。【００２９】
【化１】
2007069453.tif 000002
【００３０】
１．２．２．  その他の試薬
動物の麻酔に用いた ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール(登録商標)）は大日本製薬株式会社（大阪）から購入した。また、塩酸キシラジン（セラクタール(登録商標)）はバイエル株式会社（東京）から購入した。セラクタール(登録商標)は、キシラジンとして20 mg/mLの溶液であり、投与時には生理食塩水で20倍希釈し、1 mg/kg（1 mL/kg）を筋注した。【００３１】
１．３．  機器及び器具
四肢誘導心電図（標準肢誘導及び単極肢誘導）は、心電計（ECG-6403、日本光電工業株式会社、東京）を用いて測定及び記録、または、生体電気用アンプ（AB-651J (S-1516)、日本光電工業株式会社、東京）を用いて測定し、サーマルアレイレコーダ（WS-682G、日本光電工業株式会社、東京）上に記録した。心房ペーシングした例は、小動物用人工呼吸器（SAR-830P、CWE Inc.、Ardmore, PA, USA）を用い、1回換気量：3 mL、呼吸回数：30回／分の条件で人工呼吸を行なった。心房ペーシングには電気刺激装置（SEN-7203682G、日本光電工業株式会社、東京）及びアイソレータ（SS-403J、日本光電工業株式会社、東京）を用い、幅1 ms、閾値の2倍の大きさの矩形波で刺激した。【００３２】
２．  方法及び結果
２．１．  心電図記録法に関する検討
ハムスターをペントバルビタールナトリウム50 mg/kg, ip. により麻酔し、仰臥位に保定した状態で記録した心電図波形を図１−１に示した。この心電図波形は、生体電気用アンプ及びサーマルアレイレコーダを用いて測定、記録したものである。心電図上の各波が明確に記録された誘導は、標準肢誘導Ｉ、II、及び単極肢誘導VRであったが、標準肢誘導Ｉは呼吸の影響を受けやすく（図１−１の5及び6拍目）、また、単極肢誘導VRは極性が逆に記録され判読し難い。したがって、心電図上のパラメータが評価しやすい誘導は標準肢誘導II（標準第II誘導心電図）であった。しかし、これらの誘導においてT波終末部が P波に重なり（波形については後述）、QT時間の計測は不可能であった。【００３３】
この動物に キシラジン2 mg/kgを筋注した後の心電図波形を図１−２に示した。キシラジン投与により心拍数が低下、すなわちRR 時間が延長し、T波終末部が明確になり、QT時間が計測可能となった。そこで以下の検討は、ペントバルビタールとキシラジンの混合麻酔下で行なうこととした。【００３４】
次に、動物の体位を変えつつ心電図記録をし、心電図波形に及ぼす体位の影響を検討した。図には示さないが、仰臥位から伏臥位に変えても心電図上の変化は認められなかった。  右横臥位にした際には、T波が二相性となりT波終末部の決定が困難となった。左横臥位にした場合には、標準肢誘導Ｉ及びIIのS波の上昇が認められた。T波終末部の見やすさ、及び操作のしやすさから、仰臥位で記録することとした。【００３５】
図２に心電図の測定装置の違いを示した。上段はヒト用心電計で記録した標準誘導心電図、下段は生体用アンプとサーマルアレイレコーダを用いて測定、記録した標準第II誘導心電図波形を示した。ヒト用心電計は、増幅部の高域周波数特性が35Hz（-3 dB、筋電フィルターONの条件下）、記録部の高域周波数特性が100Hz（-3dB）と低いため、R波の二峰性も記録できない。また、感度も最大で20 mm/mVと低いため、P波及びT波の始点及び終点が判読し難い。したがって、ハムスターの心電図測定に適した特性を有していた生体用アンプとサーマルアレイレコーダを用いて心電図記録を行なった。【００３６】
２．２．  ハムスターの心電図波形の特徴
図３の上段に標準第II誘導心電図波形及び計測パラメータを示した。下段にはヒトの心電図波形を模式的に表した。これらの図は、時間軸がほぼ等しくなるようにした。ハムスターの心電図（標準第II誘導心電図）の特徴は次のとおりであった。【００３７】
(1) Q波が認められない（正常なヒトの標準第II誘導心電図でも Q波は認められない）
(2) R波が二峰性
(3) S波が認められない
(4) T波のピークがR波に近い
(5) T波終末部がなだらかに基線に戻る
(6) RR間隔が短い【００３８】
したがって、心電図上のパラメータの計測は次のように行なった。
PQ時間（またはPQ間隔）：P波の開始点からR波の開始点まで
QRS時間（またはQRS巾）：R波の開始点から終点まで
QT時間（またはQT間隔）：R波の開始点からT波の終点まで【００３９】
以下の検討においては、ある時点でのパラメータの値は、基本的には連続する3拍の値の平均値としたが、2拍または4拍の平均値、あるいは1拍の値をその時点でのパラメータ値とした場合もあった。【００４０】
２．３．  心電図QT時間の性質に関する検討
QT時間の頻度依存性について検討した。イヌ、ウサギ、及びモルモットにおいては、QT時間は心拍数が上昇する（RR時間が短縮する）と短縮することが知られている。ハムスターを ペントバルビタール及び キシラジンの混合麻酔下に開胸し、心房ペーシングすることでRR時間を短縮しつつ標準第II誘導心電図を記録しQT時間を計測した。洞調律時のRR時間が400 msであったので、ペーシングの周期長を400 msから50 msずつ250 msまで短縮した。200 msは不応期に入り、ペーシング不能であった。各周期長のペーシングを30秒以上行なった後に標準第II誘導心電図を記録した。その際のQT時間とRR時間の関係を図４上段に示した。  ペーシング周期長を短縮しRR時間を短くするとQT時間も短縮した。ヒトにおいてもQT時間はRR時間に影響され、それを補正するためにBazettの補正式（QTc = QT/√(RR(s))）が用いられている。図４下段には、Bazettの式で補正したQTc時間を示した。この例では、Bazettの式で比較的補正できている、と考えられる。したがって、ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスターにおいては、RR時間が短縮するとQT時間が短縮し、この性質は、イヌ、ウサギ、及びモルモットと定性的には同様であると言える。【００４１】
次に、遅延整流外向きカリウム電流の速い成分であるIKrを選択的に抑制するE4031の影響を検討した。ヒトにおける薬剤性のQT延長の主因はIKr抑制によるものとされている。動物の場合、イヌ、ウサギ、及びモルモットにおいてはE4031によりQT時間の延長が認められるが、マウス及びラットではQT延長は認められないことが知られている。図５に、ペントバルビタール及び キシラジン混合麻酔下のハムスターにE4031を静脈内投与した際の標準第II誘導心電図を示す。E4031は、外頸静脈に留置したカニューレから静脈内投与した。投与量は、10、100、及び 1000μg/kgとし、10分間隔で静脈内投与した。図５の各記録は、投与1分後の標準第II誘導心電図である。10μg/kg投与後にQT時間の延長が認められ、100μg/kg投与後にQT時間はさらに延長した。1 mg/kg投与ではP波が消失し、洞房ブロックが生じたと判断した。【００４２】
E4031の最少投与量を1μg/kgに下げ、心電図パラメータに及ぼす影響を5例のハムスターで検討した結果を図６にまとめた。左側の図は絶対値で、右側は投与前値に対する%変化で表した。生理食塩水のみを静脈内投与したコントロールは、1例しか行なわなかったため、統計学的解析は行なわなかった。E4031 1 mg/kg投与後は全例において洞房ブロックが認められたため、心電図パラメータの計測は行なわなかった。E4031は、PQ時間に対して、100μg/kgでわずかに延長が認められたが、10%程度の変化であり、大きな影響はないと考えた。QRS時間に対してはほとんど影響しなかった。一方、QT時間に対しては著明な延長作用が認められた。統計学的解析は行なっていないが、1μg/kgで10%程度の延長が認められた。また、RR時間に対しても10μg/kg以上で延長が認められた。【００４３】
これらの結果から、ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスターの心電図QT時間は、RR時間が短縮するに伴い短縮し、IKr抑制により延長する性質を有することが明らかとなった。これらの性質は、ヒト、イヌ、ウサギ、及びモルモットと類似のものであり、マウスやラットとは異なるものである。【００４４】
混合麻酔ハムスターにおけるこのQT時間の延長の程度を、以前に報告されている麻酔モルモット、麻酔ウサギ、麻酔及び覚醒のイヌの結果（日薬理誌、121、384-392、2003）と比較すると、麻酔ハムスターの感受性は、麻酔モルモットよりも高く、麻酔ウサギや麻酔イヌに匹敵するものであった。しかし、麻酔ウサギのような TdP様の不整脈の誘発は認められなかった。したがって、ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスターは、IKr抑制作用を検出する評価系になると考えられる。さらに、RR時間の延長が認められない用量からQT時間の延長が認められた。従って、QT時間がRR時間に影響される、ということを考慮しなくてもよい条件で評価を実施できるという利点が認められた。
【実施例２】
【００４５】
ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスターにおける心電図QT時間に及ぼすテルフェナジン、シサプリド及びE4031の影響【００４６】
１．  実験方法
１．１．  供試動物
シリアン・ハムスター（体重：90〜119 g、週齢：６又は７）を用いた。
ハムスターは日本エスエルシー株式会社（浜松、静岡）から購入した。温度（23±2℃）、湿度（55±10 %RH）、照明（12時間明暗照明）の管理下で予備飼育した後に実験に供した。  飼育中、実験動物用固形飼料MF（オリエンタル酵母工業株式会社（東京））、及び水道水を自由摂取させた。【００４７】
１．２．  被験物質及び試薬
１．２．１．  テルフェナジン(terfenadine)
10 % PEG200 溶液を溶媒とし、等モル強の塩酸を加え溶解した。
投与方法は静脈内投与、投与量は 10〜1000μg/kg（1 mL/kg）とした。【００４８】
【化２】
2007069453.tif 000003
【００４９】
１．２．２．  シサプリド(cisapride)
10 % PEG200 溶液を溶媒とし、2〜3 倍モルのクエン酸を加え溶解した。
投与方法は静脈内投与、投与量は 1〜100μg/kg（1 mL/kg）とした。【００５０】
【化３】
2007069453.tif 000004
【００５１】
１．２．３．  E4031
10 % PEG200 溶液に溶解して静脈内投与した。
投与量は 1〜100μg/kg（1 mL/kg）とした。【００５２】
【化４】
2007069453.tif 000005
【００５３】
１．２．４．  その他の試薬
実施例１と同様であった。【００５４】
１．３．  機器及び器具
標準第II誘導心電図は、生体電気用アンプ（AB-651J (S-1516)、日本光電工業株式会社、東京）を用いて測定し、サーマルアレイレコーダ（WS-682G、日本光電工業株式会社、東京）上に記録した。【００５５】
１．４．  実験手順
ハムスターをペントバルビタールナトリウム50 mg/kg, ip. により麻酔した後、キシラジン1 mg/gを後肢に筋注した。仰臥位に保定し、右側前肢及び両側後肢に針電極を刺入し第II誘導心電図を測定した。頸部皮膚を切開し、外頸静脈にカニューレを留置し、静脈内投与用とした。テルフェナジンは、10、100、及び1000μg/kg を、シサプリド及びE4031は、1、10、及び100μg/kg を、約10分間隔で静脈内投与した。対照群は、10% PEG200 溶液1 mL/kg を10分間隔で3回静脈内投与した。例数は、テルフェナジン投与群、シサプリド投与群、E4031投与群、及び対照群の各群５例とし、総20匹の動物を用いた。なお、割り付けは例数のみを考慮した無作為で行なった。【００５６】
１．５  実験データ解析
統計検定には、SAS 6.12（株式会社SASインスティチュートジャパン、東京）を組み込んだ統計解析支援システムを使用した。心電図上のパラメータの解析は、経時型分散分析を行なった後、対応のないt検定を用い、同一時点におけるコントロール群との比較を行なった。P < 0.05の場合に有意な差とした。【００５７】
２．  結果
図７−１、７−２、７−３にそれぞれ、テルフェナジン、シサプリド、及びE4031の心電図パラメータに及ぼす影響を示した。テルフェナジンは1 mg/kg投与後にQT時間の延長が認められた。延長の程度はおよそ20%であった。同時にPQ時間の延長も認められた。QRS時間及びRR時間に対しては有意な影響を及ぼさなかった。【００５８】
シサプリドは、100μg/kgでQT時間の延長が認められ、その程度は約20%であった。PQ時間、QRS時間、及びRR時間に対しては有意な影響を及ぼさなかった。【００５９】
E4031は、10μg/kgでQT時間を有意に延長し、その程度は約20%であった。この投与量ではRR時間に対して有意な影響を及ぼさなかった。100μg/kgではQT時間はさらに延長し、50〜60%の延長を示した。また、RR時間の延長も認められた。PQ、QRS時間に対しては、ほとんど影響しなかった。【００６０】
麻酔下のイヌを用い、単相性活動電位の持続時間を指標にして、テルフェナジン、シサプリド、及びE4031のQT延長作用を検討した報告がある（Xenobiotica, 31, 633-650, 2001）。その報告の結果から、単相性活動電位の持続時間を10%延長させる静脈内単回投与量を算出すると、テルフェナジンが 300μg/kg、シサプリドが100μg/kg、E4031が10μg/kgであり、本実施例の結果とほぼ一致するものであった。したがって、ペントバルビタールとキシラジンの混合麻酔下のハムスターは、IKr抑制に基づくQT延長作用を検討する評価系として、麻酔イヌとほぼ同じ感度であると言える。なお、テルフェナジンの1 mg/kg投与後にPQ時間の延長も認められたが、これはテルフェナジンが有する Ca 拮抗作用（Cir. Res., 81, 202-210, 1997）によるものと考えられる。【００６１】
以上の結果は、混合麻酔下のハムスターは、これらの薬剤に対して、ヒトや麻酔下のイヌと同様の性質を有することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の評価方法は、小動物であるハムスターが使用されるので、被検物質の必要量が少ない。特に、探索段階の化合物のin vivo評価の場合のように、化合物量が少ない時点での評価に有利である。また、実験技術的に容易に、従来一般に使用されているイヌよりも多くの検体を試験することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【国際調査報告】
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