(57)【要約】  本発明により、コリネ型細菌による効率的なタンパク質分泌生産方法が提供される。  セリン／スレオニンフォスファターゼ活性を増強するように改変し、目的タンパク質の分泌生産能が付与されたコリネ型細菌を培養し、分泌された前記目的タンパク質を回収することを含む、目的タンパク質の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変され、かつ、目的タンパク質の分泌生産能が付与されたコリネ型細菌を培養し、分泌された前記目的タンパク質を回収することを含む、目的タンパク質の製造方法。
【請求項２】
セリン／スレオニンフォスファターゼがpstPによってコードされる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が、pstPの発現増加により増強されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が、pstPのコピー数の増加により増強されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が、pstPの発現制御領域を修飾することにより増強されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
目的タンパク質がトランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、インターフェロン、インターロイキン、インスリン、ＩＧＦ−１及びペプチド合成酵素からなる群より選択されるタンパク質である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
pstPが、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変されるコリネ型細菌に由来する遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
pstPが配列番号２または４記載の配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜６のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
pstPが配列番号１または３記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子の配列を有する、請求項１〜６のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を、コリネ型細菌で分泌生産（生産および分泌）させる方法に関する。特に、本発明は、産業上有用な酵素や生理活性タンパク質を含む各種タンパク質をコリネ型細菌で分泌生産させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジンを始めとするＬ−アミノ酸、核酸生産菌として発酵工業上、非常に有用な細菌である。また、コリネ型細菌は、タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やBacillus属細菌と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、省略化できることであり、また糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地で早く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れており、タンパク生産においても非常に有用な細菌であると考えられている。【０００３】
コリネ型細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産する方法として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼやリパーゼの分泌[米国特許第4965197号, J.Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)]及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌[非特許文献２：Appl.Environ.Microbiol., 61, 1610-1613(1995)]、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の分泌 [特表平6-502548]、コリネ型細菌を利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)]、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌方法[特開平11-169182]、トランスグルタミナーゼの分泌生産法[Appl. Environ. Microbiol., 69, 358-366(2003)]、変異株を利用したトランスグルタミナーゼの分泌生産法[WO02/81694]等がある。タンパク質の蓄積量でみると、バチルス・ズブチリス由来のサチライシン遺伝子(aprE)のプロモーター、リボソーム結合部位及びシグナルペプチドの配列を利用してディケロバクター・ノドサス（Dichelobacter nodosus）由来のアルカリ性プロテアーゼの遺伝子をC. glutamicum において発現させ、約2.5mg/mlの蓄積を認めた例[Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)]、また、トランスグルタミナーゼの分泌については、最大930mg/Lという分泌蓄積が確認されている[WO02/81694]。
また、Tat系と言われる分泌経路を利用することにより、これまでに知られていたSec系といわれる分泌経路では分泌生産が困難なタンパク質であった、イソマルトデキストラナーゼやプロテイングルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質も効率良く分泌されることが報告されている[WO2005/103278]。【０００４】
コリネ型細菌の近縁種であるマイコバクテリウム属細菌において、セリン／スレオニンフォスファターゼをコードする遺伝子であるpstP遺伝子が見出されている。pstPは、細胞の増殖・形態形成に関与するrodA遺伝子、pbpA遺伝子、また、セリン／スレオニンキナーゼをコードする遺伝子pknA、pknBと共にオペロン構造を形成している。RodA、PbpAがPknA、PknBによるリン酸化、PstPによる脱リン酸化の制御を受けることで、細胞の増殖や形態形成を制御していること、PstPはPbpAやPknA、PknBの脱リン酸化能を有することが知られている［WO2005/007880、Molecular Microbiology(2003)49(6), 1493-1508、Biochemical and Biophysical Reseach Communications 311 (2003) 112-120］。【０００５】
また、pstPを含むオペロン構造は、コリネ型細菌にも存在することが知られている［Molecular Microbiology(2003)49(6)］。コリネ型細菌におけるpstPと相同性の高い遺伝子としては、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のゲノム配列中に、NCgl0044（遺伝子名）がGenbankに登録されている(accession NC_003450.3 の46666..44802)。しかし、この遺伝子がタンパク質分泌に与える影響は明らかでなかった。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、コリネ型細菌において目的タンパク質を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、目的タンパク質をコリネ型細菌において産生させ、産生された目的タンパク質を効率的に菌体外に分泌（分泌生産）させることによって、目的タンパク質を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、タンパク質の分泌生産能が付与され、かつpstPによりコードされるセリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強されたコリネ型細菌を培養することにより、前記コリネ型細菌中で産生されたトランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ等の各種タンパク質が効率的に分泌されることを見出し、本発明を完成させた。  
【０００８】
すなわち本発明は、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変され、かつ、目的タンパク質の分泌生産能が付与されたコリネ型細菌を培養し、分泌された前記目的タンパク質を回収することを含む、目的タンパク質の製造方法である。
本発明は、セリン／スレオニンフォスファターゼがpstPによってコードされる、前記製造方法でもある。
また、本発明は、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が、pstPの発現増加により増強される、pstPのコピー数の増加により増強される、または、pstPの発現制御領域を修飾することにより増強されるように改変され、かつ、目的タンパク質の分泌生産能が付与されたコリネ型細菌を培養し、分泌された前記目的タンパク質を回収することを含む、目的タンパク質の製造方法でもある。
さらに、本発明は、目的タンパク質がトランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、インターフェロン、インターロイキン、インスリン、ＩＧＦ−１及びペプチド合成酵素からなる群より選択されるタンパク質である前記製造方法でもある。
特に本発明は、pstPが、配列番号２または４記載の配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、または、配列番号１または３記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子の配列を有する遺伝子である、前記製造方法でもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法の一態様において、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性(PstP活性)が増強するように改変されたコリネ型細菌に目的タンパク質の分泌生産能が付与される。本発明の方法の別の態様において、目的タンパク質の分泌生産能が付与されているコリネ型細菌がセリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変される。目的タンパク質は天然に分泌型のタンパク質であってもよく、天然には分泌されないタンパク質であってもよい。天然には分泌されないタンパク質である場合には、前記タンパク質を発現させる際にコリネ型細菌で機能し得るシグナルペプチドが付加された形態で発現させことによって分泌させることができる。
本発明において、フォスファターゼとは、リン酸エステル及びポリリン酸の加水分解を触媒するタンパク質であり、特にセリン／スレオニンフォスファターゼとは、タンパク質中のリン酸化されたSer残基及びThr残基の脱リン酸化を触媒するタンパク質である（EC 3.1.3.16）。本発明者らは、コリネ型細菌のセリン／スレオニンフォスファターゼをPstP、該タンパク質をコードする遺伝子をpstPと命名した。
本明細書において、「セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのセリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）分子の数が増加した場合や、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生株には、コリネ型細菌の場合、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869やATCC13032が含まれる。【００１０】
本発明の方法の一態様において、pstPによりコードされるセリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌が宿主ベクター系として用いられる。コリネ型細菌で機能し得るシグナルペプチドの下流に分泌させる目的タンパク質の遺伝子が結合された発現構築物が前記フォスファターゼ活性の増強されたコリネ型細菌内に導入され、それによって前記遺伝子が発現され、目的タンパク質が生産および分泌される。pstPによりコードされるセリン／スレオニンフォスファターゼ活性増強のための改変とタンパク質生産能の付与はどちらを先に行ってもよい。【００１１】
コリネ型細菌のセリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）をコードする遺伝子（pstP）としては、例えばGenbankに登録されている、Corynebacterium glutamicum (C.glutamicum)ATCC13032のNCg0044(accession NC_003450.3 の46666..448021)が利用できる。 C. glutamicum ATCC13032のpstPのヌクレオチド配列を配列番号１に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。またC.glutamicum ATCC13869株のpstPのヌクレオチド配列を配列番号３に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
また、本発明においてpstPは、それによってコードされるタンパク質がコリネ型細菌においてセリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性を有する限り、他の微生物に由来する、pstPのホモログを用いてもよい。pstPのホモログは、BLAST等によって配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を参照して検索出来る（http://blast.genome.jp/）。
本発明に用いることが出来るpstPは、既に明らかにされたヌクレオチド配列、例えば配列番号１または３、に基づいて作製したプライマー、例えば配列番号５及び６に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって取得することができる。さらに続いてpstPの制御領域を含む領域も取得することができる。他の微生物のpstPのホモログも、これらのプライマー対を用いて同様にして取得され得る。【００１２】
また、コリネ型細菌の種や菌株によってpstPのヌクレオチド配列に差異が存在することがあるため、本発明に用いるpstPは配列番号１または３の配列には限られず、コードされるPstPタンパク質の機能、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性を有する限り、配列番号２または４のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から２０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、pstPを保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。【００１３】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe,Trp,Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu,Ile,Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln,Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys,Arg,His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp,Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser,Thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。【００１４】
さらに、pstPとして、配列番号２あるいは４のアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、とりわけ好ましくは９９％以上の相同性を有し、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を用いることが出来る。なお、ここにいう「相同性」とは配列の全長に対して同一である割合をいい、BLAST、Genetyx等により計算されうる。さらに、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、これらの核酸分子中の少なくとも一つのコドンをpstPが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換することができる。
同様にpstPは、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは短縮されているものでもよい。例えば延長・短縮する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号２あるいは４のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長・短縮したものでもよい。【００１５】
このようなpstPと相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、上記ヌクレオチド配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プロ−ンPCR 、DNA shuffling, StEP−PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にpstPに変異を導入して活性の高いPstPをコードするpstPを取得することが出来る（Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction.）。これらのpstP相同遺伝子がセリン／スレオニンフォスファターゼをコードしているか否かは、例えば、上述の方法により酵素活性を測定することによって確かめることができる。【００１６】
またpstPは、配列番号１または配列番号３と相補的な配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80、90、95、97または99％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションのs洗浄条件である60℃、１xＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳさらに好ましくは、68℃、0.1xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。【００１７】
プローブとして、配列番号１、配列番号３のヌクレオチド配列の部分配列を用いることもできる。そのようなプローブは、該ヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、２xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳが挙げられる。【００１８】
本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいい、最終的にそのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含む。
分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。また、本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断される。このようなシグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有するが、ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生物種においても必ずしも分泌機能を発揮するということではない。【００１９】
本明細書において、シグナルペプチドおよびプロ部分の両方を有するタンパク質、すなわち、一次翻訳産物を「プレプロタンパク質」と称することがあり、また、シグナルペプチドを有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することがある。プロタンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあり、本明細書においてタンパク質の「プロ構造部／プロ構造」とタンパク質の「プロ部分」とは互換的に使用される。プレプロタンパク質またはプレタンパク質において、そのシグナルペプチドは異なるタンパク質に由来する場合であっても、目的タンパク質に天然に存在するシグナルペプチドであってもよいが、使用する宿主の分泌型タンパク質に由来することが好ましい。あるいは、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。さらに本発明の目的に使用し得るシグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。シグナルペプチドが異なるタンパク質に由来する場合はプレプロタンパク質を特に「異種融合プレプロタンパク質」と称することもある。前述したように、本発明において、目的タンパク質は本来的に分泌型のタンパク質であってもよく、天然には分泌されないタンパク質であってもよい。天然には分泌されないタンパク質である場合には、前記タンパク質を発現させる際に上述したシグナルペプチドが付加された形態で発現させることができる。本来的に分泌型のタンパク質であっても、上述のように異種のシグナルペプチドおよび／または異種プロ構造部で天然のシグナルペプチドおよび／またはプロ構造を置換してもよい。また、この目的タンパク質はプロ構造を有していてもいなくてもよい。【００２０】
例えば、目的タンパク質がプロテイングルタミナーゼの場合は、それぞれ「プレプロプロテイングルタミナーゼ」、「プロプロテイングルタミナーゼ」および「異種融合プレプロプロテイングルタミナーゼ」と称される。また、「プロ部分を切断した」タンパク質とは、ペプチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも１以上のアミノ酸を除去したタンパク質をいい、そのＮ末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全に一致するタンパク質、および、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタンパク質に比較してＮ末端にプロ部分に由来する1以上の余分のアミノ酸を有するものおよび天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。前述したいずれの形態のプロテイングルタミナーゼも本発明により効率的に分泌生産することができる。【００２１】
本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでにタンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やBacillus属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、目的タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、また糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。【００２２】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム、
コリネバクテリウム・カルナエ、
コリネバクテリウム・グルタミカム、
コリネバクテリウム・リリウム、
コリネバクテリウム・メラセコーラ、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、
コリネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム、
ブレビバクテリウム・フラバム、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、
ブレビバクテリウム・ロゼウム、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、
ブレビバクテリウム・アルバム、
ブレビバクテリウム・セリヌム、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム。【００２３】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511、
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991、
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060，ATCC13869，FERM BP-734、
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990、
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965、
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)、
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020、
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872、
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111、
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354。【００２４】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)（昭和59年３月２６日原寄託）（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号305-8566）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高いため、宿主菌として好適である(WO 02/081694参照)。
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された目的タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるCorynebacterium glutamicum (C.glutamicum) YDK010株が挙げられる（国際公開パンフレット  WO 01/23591）。【００２５】
本発明において使用される目的タンパク質の生産能を付与されたコリネ型細菌は、例えば、前述したコリネ型細菌に目的タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物を前記コリネ型細菌に導入することによって得られる。ここに、コリネ型細菌にタンパク質の生産能を付与するための遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。目的タンパク質は、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。そのような例には、PAM330(特開昭58-067699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6（特開2000-262288号公報）が含まれる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記大腸菌用ベクターに挿入すると、大腸菌及びコリネ型細菌の両方で複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することが出来る。また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。【００２６】
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えばtacプロモーター等の大腸菌（E.coli）由来のプロモーターであってもよい。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターがより好ましい。コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、PS2、SlpAの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子の各プロモーターが挙げられる。【００２７】
本発明で使用するシグナルペプチドはコリネ型細菌の菌体内で機能し得るシグナルペプチドであれば特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るどのようなシグナルペプチドも使用することができる。したがって、異種由来の、例えば大腸菌やバチルス・ズブチリス由来のシグナルペプチドも、コリネ型細菌の菌体内で機能し得る限り、本発明に使用することができる。シグナルペプチドには、それが由来する分泌性タンパク質のN末端アミノ酸配列の一部が付加されていてもよい。シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。これらのシグナルペプチドを使用する場合、目的とするタンパク質をコードする遺伝子は、シグナルペプチドをコードする遺伝子の3'-末端側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。【００２８】
本発明によって生産および分泌し得る目的タンパク質は、特に限定されず、動植物や微生物由来の菌体内タンパク質を含むタンパク質全般が含まれ、宿主となるコリネ型細菌に由来するタンパク質であっても、異種タンパク質であっても良い。本発明によって分泌生産できるタンパク質の例には、以下のものが含まれる：
トランスグルタミナーゼ（EC 2.3.2.13; Genbank Accession No. 等）；
プロテイングルタミナーゼ（EC 3.5.1; Genbank Accession No. BAB21508、Eur. J. Biochem. 268. 1410-1421 (2001)等）；
インターフェロン（Genbank Accession No. CAA23802等）；
インターロイキン２（IL2： Genbank Accession No. AAK26665等、成熟型は２１〜１５３位のアミノ酸配列）；
インスリン（特開平07-284394等）；
ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１：Genbank Accession No. CAA01954等）；
ペプチド合成酵素（WO 2004/011653号、WO2004/065610号）；
これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および／または、望みの活性を得るために改変することができ、それらには１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれる。必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。改変技術、遺伝子のクローニング技術、生産されたタンパク質の検出技術を含む、このような一般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)、F.M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)、PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press等を参照することができる。【００２９】
本発明に使用し得る遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができる。得られた遺伝子導入形質転換体は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、形質転換体は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るため、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用することができる。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行えばよく、培養期間は１〜７日間程度でよい。このような条件下で形質転換体を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され、効率よく菌体外に分泌される。【００３０】
上記のようにして目的タンパク質の分泌生産能が付与されるコリネ型細菌を、セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変する、あるいは、予めセリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するように改変しておいたコリネ型細菌に目的タンパク質の分泌生産能を付与することによって、本発明の方法によるタンパク質の製造に用いるコリネ型細菌を得ることができる。【００３１】
以下、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性が上昇するように改変したコリネ型細菌の構築方法の例を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA),2001）等のマニュアルに従って実施出来る。他の微生物も同様にしてセリン／スレオニンフォスファターゼ活性が上昇するように改変することができる。
セリン／スレオニンフォスファターゼ活性が増強するような改変は、例えば、pstPの発現量の増強によって達成することができる。pstPの発現量の増強は、例えばpstPのコピー数を増加させることによって達成される。より具体的には、pstPを含む断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物に導入して形質転換すればよい。また、野生型の微生物に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にタンパク質生産能を付与してもよい。また、コピー数の増加は、pstPをコードする断片を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にpstPが転移したことの確認は、pstPの一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。また、pstPの発現の増強は、pstPの発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、pstPのプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る（国際公開第ＷＯ００／１８９３５号パンフレット）。【００３２】
本発明の一実施態様において、pstPの発現量の増強はpstPのコピー数を増加させることによって達成される。コピー数を増加させることは、例えば、以下のようにプラスミドでpstPを増幅することによって達成出来る。まずpstPを、コリネ型細菌の染色体からクローニングする。染色体DNAは、DNA供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号５、６に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いpstPを増幅することが出来る。
PCR法により増幅されたpstPを含む遺伝子断片は、コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。【００３３】
上記DNAをコリネ型細菌で機能し得るベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-67679号公報に記載のpAM330；特開昭58-77895号公報に記載のpHM1519；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。【００３４】
pstPとコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するために、pstPの末端に合うような制限酵素でベクターを切断することができる。この制限酵素部位はあらかじめpstPの増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うことができる。
上記のように調製した組換えプラスミドをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ K-12株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）.によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。【００３５】
pstPのコピー数を増加させることは、pstPをコリネ型細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DNA上にpstPを複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、pstPをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。【００３６】
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにpstPを導入して、染色体上で増幅させる方法も適用できる。例えば用いることが出来るベクターは、pSUP301（Simo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) ）、pK18mobまたはpK19mob（Schaefer等, Gene 145, 69〜73 (1994) ）、pGEM-T（Promega corporation, Madison, WI, USA）、pCR2.1-TOPO（Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; US-A 5487993）、pCR(R)Blunt（Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993)）、pEM1（Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516）またはpBGS8（spratt等, 1986, Gene, 41：337〜342）等が挙げられる。pstPを含むプラスミドベクターをコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988)）、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994)）に記載されている。【００３７】
また、pstPの活性を上昇させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のpstPのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、pstPの発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される。(Hamilton et al,; Journal of Bacterology171:4617-4622) 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PS2プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。【００３８】
pstP上流のプロモーター等の発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりpstPの発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、pstPのコピー数を増加させることと組み合わせてもよい。
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。【００３９】
セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性が増強されたことは、既知の方法、例えば、Boitel等に記載の方法（Brigitte Boitel, Miguel Ortiz-Lombardia, Rosario Duran, Frederique Pompeo, Stewart T. Cole, Carlos Cervenansky and Pedro M. Alzari (2003) Molecular Microbiology. 49(6), 1493-1508）でPstP酵素活性を測定し、野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。また、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性が増強されたことの確認は、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）をコードする遺伝子のm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによっても確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,  Cold spring Harbor(USA),2001））。本発明において、増強されたセリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性あるいは発現量は、野生株あるいは非改変株と比較して統計的に有意に上昇していればどのような活性または発現量でもあり得る。本発明によれば、セリン／スレオニンフォスファターゼ（PstP）活性は野生株又は非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇している。【００４０】
本発明によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。本発明によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用しても良い。
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。【００４１】
実施例
実施例１．C. glutamicum ATCC13869由来の脱リン酸化酵素遺伝子pstPのクローン化とタンパク質の分泌生産に及ぼすpstPの増幅効果
（１）C. glutamicum ATCC13869のpstPのクローン化
C. glutamicum ATCC13032のゲノム配列は既に決定されている[Eur. J. Biochem., 257, 570-576(1998)]。この配列を参考にして、配列番号５と配列番号６に示したプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）調製したC. glutamicum ATCC13869の染色体ＤＮＡからpstPをコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号５の配列は制限酵素PstIの認識配列、配列番号６の配列は制限酵素EcoRIの配列を含んでいる。
（配列番号５）5'-CACGGATATCCGTACTGCAGGTACAACAGT -3'
（配列番号６）5'-CACATTTCCGTGCGGCGAATTCTTAATCGT -3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号５，６：PCRプライマー
次に増幅したＤＮＡ断片をPstI、EcoRIで消化した約1.4ｋｂの断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収し、これを特開平9-070291記載のpVC7（大腸菌およびコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトルベクター）のPstI、EcoRI部位に挿入した後、Escherichia coli JM109（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入した。pstP断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、pVpstPと名付けた。pVpstPにクローン化されている断片のヌクレオチド配列は、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）とDNAシークエンサー377A（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。ヌクレオチド配列決定の結果、得られたC. glutamicum ATCC13869のpstPのヌクレオチド配列は、C. glutamicum ATCC13032のpstPのヌクレオチド配列と一部異なっていることが判明した。C. glutamicum ATCC13869由来のpstPのヌクレオチド配列を配列番号３に、コードされる全アミノ酸配列を配列番号４に示した。また、C. efficiens YS-314のpstPのヌクレオチド配列を配列番号７に、コードされる全アミノ酸配列を配列番号８に示した。図３にこれらアミノ酸配列のアラインメントを示した。このように、pstPの配列はコリネ型細菌間においてよく保存されており、ATCC13032とATCC13869間のホモロジーはアミノ酸配列の全長に対して99.8％、ATCC13032およびATCC13869と、YS-314間のホモロジーはアミノ酸配列の全長に対して、72.3％であった。アライメントの作成および相同性の計算は、Genetyx_Version7（ゼネティックス社製）を用いて行った。【００４２】
（２）C. glutamicum  ATCC13869におけるpstP増幅によるタンパク質分泌生産量に及ぼす効果
実施例１（１）で構築したプラスミドpVpstPを用いて、C. glutamicum ATCC13869及びC. glutamlcum ATCC13869 のストレプトマイシン（sm）耐性変異株AJ12036 の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるYDK010株（WO 01/23591記載）を形質転換し、5mg/lのクロラムフェニコールを含むCM2G寒天培地（酵母エキストラクト  10g、トリプトン  10g、グルコース  5g、NaCl  5g、DL-メチオニン  0.2g、寒天  20g、水で１Lにする）で生育した菌株を選択した。次に、これらの形質転換体と、pVC7をC. glutamicum ATCC13869及びYDK010に導入したものを対照として、培養上清中に分泌されるタンパク質の生産量について比較評価した。5mg/lのクロラムフェニコールを含む上記CM2G寒天培地で30℃で一晩生育した菌株をMMTG液体培地（グルコース  60g、硫酸マグネシウム七水和物  3g、硫酸アンモニウム  30g、リン酸二水素カリウム  1.5g、硫酸鉄七水和物  0.03g、硫酸マンガン四水和物  0.03g、チアミン塩酸塩  0.45mg、ビオチン  0.45mg、DL-メチオニン  0.15g、炭酸カルシウム  50g、水で１ＬにしてｐＨ7.5に調整）にクロラムフェニコール5mg/lを添加した培地の4mlを張り込んだ大型試験管に接種し、それぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後の培養上清中のタンパク質量をProtein Assay CBB Solution（ナカライテスク社製）を用いて定量した。測定条件は業者の推奨するプロトコルに従った。その結果、C. glutamicum ATCC13869及びYDK010いずれにおいても、対照と比較してpVpstPを有することで形質転換YDK010培養上清中に分泌される総タンパク質量が約1.2倍に増加した。対照としてpVC7を用いた時との分泌量の相対比を表１、２に示した。【００４３】
表１． C. glutamicum ATCC13869のタンパク質分泌生産量に及ぼすpstP増幅効果
2008001597.tif 000002
【００４４】
表２．C. glutamicum YDK010のタンパク質分泌生産量に及ぼすpstP増幅効果
2008001597.tif 000003
【００４５】
実施例２．C. glutamicumにおける目的タンパク質の分泌生産に及ぼすpstPの増幅効果
（１）C. glutamicum ATCC13869のpstP増幅株を用いてのプロトランスグルタミナーゼの分泌生産
実施例１（１）で構築したプラスミドpVpstPを用いて、WO01/23591記載のSec系分泌シグナル配列CspAシグナル配列を持つプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドpPKSPTG1を有するC. glutamicum ATCC13869及びYDK010を形質転換し、5mg/lのクロラムフェニコールと25mg/lのカナマイシンを含む上記CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、これらの形質転換体と、pVC7及びpPKSPTG1をC. glutamicum ATCC13869及びYDK010に導入したものを対照として、分泌生産量について比較評価した。5mg/lのクロラムフェニコールと25mg/lのカナマイシンを含む上記CM2G寒天培地で30℃で一晩生育した菌株を上記MMTG液体培地にクロラムフェニコール5mg/lとカナマイシン25mg/lを添加した培地の4mlを張り込んだ大型試験管に接種し、それぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEに供した結果、pVpstPを有することでC.glutamicum ATCC13869、YDK010株のいずれも、pVC7を用いた対照と比較して、約1.5倍の分泌量増加が認められた。さらに、pVpstPを有することでSec系分泌シグナル配列を利用した場合でもC.glutamicum ATCC13869、YDK010株のいずれについてもプロトランスグルタミナーゼの分泌生産量の増加が認められた（図１）。【００４６】
（２）C. glutamicum ATCC13869のpstP増幅株を用いたプロテイングルタミナーゼの分泌生産
実施例２（１）と同様にして、実施例１（１）で構築したプラスミドpVpstPを用いて、WO02/081694記載のTat系分泌シグナル配列TorAシグナル配列を持つプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現プラスミドpPKT-PPGを有するC. glutamicum ATCC13869を形質転換し、5mg/lのクロラムフェニコールと25mg/lのカナマイシンを含む上記CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、この形質転換体と、pVC7及びpPKT-PPGをC. glutamicum ATCC13869に導入したものを対照として、分泌生産量について比較評価した。5mg/lのクロラムフェニコールと25mg/lのカナマイシンを含む上記CM2G寒天培地で30℃にて一晩生育した菌株を上記MMTG液体培地にクロラムフェニコール5mg/lとカナマイシン25mg/lを添加した培地の4mlを張り込んだ大型試験管に接種し、それぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEに供した。その結果、pVpstPを有することにより対照と比較して約1.5倍の分泌量増加が認められた。さらに、Tat系分泌シグナル配列を利用した分泌生産においてもpVpstPを有することにより形質転換C. glutamicum ATCC13869によるプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ生産量の増加が認められた（図２）。【００４７】
本発明により、コリネ型細菌を用いるタンパク質分泌生産の効率が飛躍的に高まる。すわなち、本発明によれば、目的タンパク質の分泌生産能が付与されたコリネ型細菌のセリン／スレオニンフォスファターゼ活性（PstP活性）を増強することにより、目的タンパク質の分泌効率が高まったコリネ型細菌が得られる。このコリネ型細菌を培養することにより効率的に目的タンパク質を製造する方法が提供される。【００４８】
参考文献
１．米国特許第4965197号
２．特表平6-502548号公報
３．特開平11-169182号公報
４．国際公開第02/81694号パンフレット
５．国際公開第05/103278号パンフレット
６．国際公開第 05/007880号パンフレット
７．Liebl W, Sinskey AJ, Schleifer KH 、Expression, secretion, and processing of staphylococcal nuclease by Corynebacterium glutamicum、J. Bacteriology (1992),174, 1854-1861
８．Billman-Jacobe H, Wang L, Kortt A, Stewart D, Radford A、Expression and secretion of heterologous proteases by Corynebacterium glutamicum、Applied Enviromental Microbiology、 (1995),61, 1610-1613
９．Salim K, Haedens V, Content J, Leblon G, Huygen K、Heterologous expression of the Mycobacterium tuberculosis gene encoding antigen 85A in Corynebacterium glutamicum、Applied Enviromental Microbiology, (1997),63, 4392-4400
１０．Kikuchi Y, Date M, Yokoyama K, Umezawa Y, Matsui H、Secretion of active-form Streptoverticillium mobaraense transglutaminase by Corynebacterium glutamicum: processing of the pro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-Like protease from Streptomyces albogriseolus、Applied Enviromental Microbiology, (2003),69, 358-366
１１．Brigitte Boitel, Miguel Ortiz-Lombardia, Rosario Duran, Frederique Pompeo, Stewart T. Cole, Carlos Cervenansky and Pedro M. Alzari、PknB kinase activity is regulated by phosphorylation in two Thr residues and dephosphorylatin by PstP, the cognate phospho-Ser/Thr phosphatase, in Miycobacterium tubeculosis、Molecular Microbiology, (2003), 49(6), 1493-1508
１２．Puneet Chopra, Bhuminder Singh, Ramandeep Singh, Reena Vohra, Anil Koul, Laxman S. Meena, Harshavardhan Koduri, Megha Ghildiyal, Parampal Deol, Taposh K. Das, Anil K. Tyagi, and Yogendra Singh、Phosphoprotein phosphatase of Mycobacterium tubeculosis dephosphorylates serine-threonine kinases PknA and PknB、Biochemical and Biophysical Research Communications, 311, (2003), 112-120.
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Sec系分泌シグナル配列を利用した場合におけるC.glutamicum ATCC13869、およびYDK010によるプロトランスグルタミナーゼの分泌生産量におよぼすpstP増幅の効果を示す。レーン１、２（ATCC13869/pPKSPTG1）、５および６（YDK010/pPKSPTG1）がpstP非増幅株、レーン３，４（ATCC13869/pPKSPTG1）、７および８（YDK010/pPKSPTG1）がpstP増幅株におけるプロトランスグルタミナーゼの生産をそれぞれ表す。
【図２】Tat系分泌シグナル配列を利用した場合におけるC.glutamicum ATCC13869よるプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌生産量におよぼすpstP増幅の効果を示す。レーン１および２がpstP非増幅株（ATCC13869/pPKT-PPG）、レーン３および４がpstP増幅株（ATCC13869/pPKT-PPG）におけるプロテイングルタミナーゼの生産をそれぞれ表す。
【図３】C. glutamicum ATCC13032、C. glutamicum ATCC13869、およびC. efficiens YS-314のpstPによってコードされるセリン／スレオニンフォスファターゼのアミノ酸配列のアラインメント。“＊”は3種において同一である箇所を示し、“．”はATCC13032とATCC13869とでは同一だが、YS-314では異なっているアミノ酸の位置を示す。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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