(57)【要約】  フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する蛍光シリカ粒子に、定量用の蛍光で標識付けされた標的生体分子を捕捉させ、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、前記の標識付けされた標的生体分子の蛍光強度を測定して前記標的生体分子を定量する、生体分子の定量システム。
2007097377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する蛍光シリカ粒子に、定量用の蛍光で標識付けされた標的生体分子を捕捉させ、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、前記の標識付けされた標的生体分子の蛍光強度を測定して前記標的生体分子を定量することを特徴とする生体分子の定量システム。
【請求項２】
前記標的生体分子が２種以上であり、２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて各標的生体分子を特異的にそれぞれ捕捉することにより、２種以上の標的生体分子を同時に定量する、請求項１に記載の生体分子の定量システム。
【請求項３】
前記蛍光シリカ粒子の平均粒径が３００ｎｍ以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の生体分子の定量システム。
【請求項４】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子の部分の発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項５】
前記蛍光シリカ粒子の表面を修飾する、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質が、さらに蛍光で標識付けされていることを特徴とする請求項４に記載の生体分子の定量システム。
【請求項６】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、各々、１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項７】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、粒子１個毎に蛍光色素化合物含有量が異なり多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項８】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、異なる蛍光スペクトル及び／又は多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項９】
前記標的生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１０】
前記蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１１】
前記シリカ粒子の蛍光を受光するだけで、前記シリカ粒子を認識することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１２】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、定量用の蛍光で標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記の標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子の蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１３】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ、特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１４】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の分子認識物質を混合する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の分子認識物質に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程とを含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１５】
前記蛍光標識プローブが、前記標的生体分子もしくは前記分子認識物質に特異的に結合する物質で修飾されている蛍光シリカ粒子である、請求項１３又は１４に記載の生体分子の定量方法。
【請求項１６】
前記分子認識物質が抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法。
【請求項１７】
２種以上の標的生体分子を同時に定量する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法。
【請求項１８】
フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、必要に応じて分取する手段とを有することを特徴とする細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項１９】
前記蛍光シリカ粒子の表面が、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項１８に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２０】
前記蛍光シリカ粒子の表面が、標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する糖結合タンパク質で修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項１８に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２１】
前記蛍光シリカ粒子の表面が、標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体もしくはレセプターで修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項１８に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２２】
前記標的細胞が骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞又は異種移植細胞である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２３】
前記蛍光シリカ粒子の平均粒径が１０ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２４】
２種以上の標的細胞を同時に検出もしくは分取する、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム。
【請求項２５】
フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、必要に応じて分取することを特徴とする細胞の検出もしくは分取方法。
【請求項２６】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項２５に記載の細胞の検出もしくは分取方法。
【請求項２７】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する糖結合タンパク質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項２６に記載の細胞の検出もしくは分取方法。
【請求項２８】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体もしくはレセプターで修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項２６に記載の細胞の検出もしくは分取方法。
【請求項２９】
前記標的細胞が骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞又は異種移植細胞である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取方法。
【請求項３０】
蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなり、平均粒径を３００ｎｍ以上とし、耐退色性を与えた標識ビーズとしてフローサイトメトリーに用いる標的生体分子標識用蛍光シリカ粒子。
【請求項３１】
蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなり、平均粒径を１０ｎｍ〜１００ｎｍとし、耐退色性を与えた標識ビーズとしてフローサイトメトリーに用いる標的細胞標識用蛍光シリカ粒子。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の蛍光シリカ粒子からなる蛍光材料。
【請求項３３】
耐退色性を与えた標識ビーズとして複数種の請求項３０または３１に記載の蛍光シリカ粒子を少なくとも有するセットとするフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３４】
前記複数種の蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい、請求項３３に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３５】
標的生体分子もしくは標的細胞が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞及び／又は異種移植細胞であることを特徴とする請求項３３又は３４に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３６】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３７】
前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子各々が、１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることを特徴とする、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３８】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、粒子１個毎に蛍光色素化合物含有量が異なり多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【請求項３９】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、異なる蛍光スペクトル及び／又は多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光シリカ粒子を用いたフローサイトメトリーアッセイシステム及びそのアッセイ方法に関する。詳しくは、蛍光シリカ粒子標識によるフローサイトメトリーを用いた生体分子の定量システムとその定量方法、蛍光シリカ粒子標識によるフローサイトメトリーを用いた細胞の検出・分取システムとその検出・分取方法、並びにそれらシステム及び方法に用いる、フローサイトメトリーでの同時検出を可能にした特性の異なる蛍光シリカ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿、リンパ液、組織液などの体液中に含まれるサイトカイン、ホルモン、タンパク質、核酸等の生体分子の量を定量すること、または体液中に含まれる微量の生体分子を検出することは、疾病の早期診断あるいは病態の正確な把握に必要不可欠である。生体分子の定量または検出には主にＥＬＩＳＡ法、化学発光法あるいはフローサイトメーターを用いたビーズアッセイ等が行われている。
しかしながらＥＬＩＳＡ法や化学発光法は一回の反応で一種類の生体分子の検出しか出来ないため、複数の生体分子を検出する場合、測定に手間と時間がかかり、また、サンプルや試薬が多量に必要となるためコストがかかることが問題であった。
一回で複数種類の生体分子の定量が可能な方法として、フローサイトメーターを用いたビーズアッセイが注目されている（例えば、非特許文献１参照）。従来のビーズアッセイに用いられるビーズは、高分子ビーズを蛍光標識し、さらに表面処理を行って表面に官能基を導入し生体分子を導入している。このようなビーズは作製に高度な技術を要する煩雑な操作を必要とし、ビーズが大変高価であった。
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１，２５４，１０９−１１８．
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、上記のような問題点を解消するため、特性を多様化しえる蛍光シリカ粒子を捕捉ないしは標識用ビーズとしてフローサイトメトリーに用いた、生体分子の定量システム、その定量方法、細胞の検出・分取システム、その検出・分取方法、並びにそれらに用いられる蛍光シリカ粒子及び前記シリカ粒子を複数種組み合わせてなるキットを提供することにある。
【０００４】
本発明によれば、以下の手段が提供される：
（１）フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する蛍光シリカ粒子に、定量用の蛍光で標識付けされた標的生体分子を捕捉させ、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、前記の標識付けされた標的生体分子の蛍光強度を測定して前記標的生体分子を定量することを特徴とする生体分子の定量システム、
（２）前記標的生体分子が２種以上であり、２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて各標的生体分子を特異的にそれぞれ捕捉することにより、２種以上の標的生体分子を同時に定量する、（１）に記載の生体分子の定量システム、
（３）前記蛍光シリカ粒子の平均粒径が３００ｎｍ以上であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の生体分子の定量システム、
（４）前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子の部分の発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
（５）前記蛍光シリカ粒子の表面を修飾する、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質が、さらに蛍光で標識付けされていることを特徴とする（４）に記載の生体分子の定量システム、
（６）前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、各々、１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることを特徴とする、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
【０００５】
（７）前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、粒子１個毎に蛍光色素化合物含有量が異なり多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、（２）〜（６）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
（８）前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、異なる蛍光スペクトル及び／又は多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
（９）前記標的生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
（１０）前記蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
（１１）前記シリカ粒子の蛍光を受光するだけで、前記シリカ粒子を認識することを特徴とする、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム、
【０００６】
（１２）標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、定量用の蛍光で標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記の標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子の蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法、
（１３）標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ、特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法、
（１４）標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の分子認識物質を混合する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の分子認識物質に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程とを含むことを特徴とする生体分子の定量方法、
（１５）前記蛍光標識プローブが、前記標的生体分子もしくは前記分子認識物質に特異的に結合する物質で修飾されている蛍光シリカ粒子である、（１３）又は（１４）に記載の生体分子の定量方法、
（１６）前記分子認識物質が抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法、
【０００７】
（１７）２種以上の標的生体分子を同時に定量する、（１２）〜（１６）のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法、
（１８）フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、必要に応じて分取する手段とを有することを特徴とする細胞の検出もしくは分取システム、
（１９）前記蛍光シリカ粒子の表面が、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（１８）に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
（２０）前記蛍光シリカ粒子の表面が、標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する糖結合タンパク質で修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（１８）に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
（２１）前記蛍光シリカ粒子の表面が、標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体もしくはレセプターで修飾され、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（１８）に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
【０００８】
（２２）前記標的細胞が骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞又は異種移植細胞である、（１８）〜（２１）のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
（２３）前記蛍光シリカ粒子の平均粒径が１０ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、（１８）〜（２２）のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
（２４）２種以上の標的細胞を同時に検出もしくは分取する、（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取システム、
（２５）フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、必要に応じて分取することを特徴とする細胞の検出もしくは分取方法、
（２６）前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（２５）に記載の細胞の検出もしくは分取方法、
【０００９】
（２７）前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する糖結合タンパク質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（２６）に記載の細胞の検出もしくは分取方法、
（２８）前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体もしくはレセプターで修飾し、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（２６）に記載の細胞の検出もしくは分取方法、
（２９）前記標的細胞が骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞又は異種移植細胞である、（２５）〜（２８）のいずれか１項に記載の細胞の検出もしくは分取方法、
（３０）蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなり、平均粒径を３００ｎｍ以上とし、耐退色性を与えた標識ビーズとしてフローサイトメトリーに用いる標的生体分子標識用蛍光シリカ粒子、
（３１）蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなり、平均粒径を１０〜１００ｎｍとし、耐退色性を与えた標識ビーズとしてフローサイトメトリーに用いる標的細胞標識用蛍光シリカ粒子、
（３２）前記（３０）または（３１）に記載の蛍光シリカ粒子からなる蛍光材料、
【００１０】
（３３）耐退色性を与えた標識ビーズとして複数種の（３０）または（３１）に記載の蛍光シリカ粒子を少なくとも有するセットとするフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、
（３４）前記複数種の蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい、（３３）に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、
（３５）標的生体分子もしくは標的細胞が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質、悪性腫瘍細胞、ウイルス感染細胞及び／又は異種移植細胞であることを特徴とする（３３）又は（３４）に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、
（３６）前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする（３３）〜（３５）のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、
（３７）前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子各々が、１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることを特徴とする、（３３）〜（３６）のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、
【００１１】
（３８）前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子が、粒子１個毎に蛍光色素化合物含有量が異なり多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、（３３）〜（３７）のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット、及び
（３９）前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、異なる蛍光スペクトル及び／又は多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする（３３）〜（３８）のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキット
を提供するものである。
本発明において、「蛍光」は、燐光も包含する広義の意味をもつ。本発明における蛍光の蛍光寿命は特に制限されるものではなく、１０−３秒〜１日以上の蛍光寿命の発光であってもよく、１０−１０秒〜１０−１秒の蛍光寿命の発光が好ましく、１０−９秒〜１０−３秒の蛍光寿命の発光がより好ましく、１０−９秒〜１０−５秒の蛍光寿命の発光がさらに好ましい。
また、「蛍光」は蛍光色素化合物が発する固有の波長の発光であるので、吸光物質に対する入射光と透過光との強度差で定義される吸光とは相異なる現象である。よって、蛍光の測定と吸光の測定とでは、測定対象の光が異なり、測定機構等の測定系も異なる。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、得られた蛍光シリカ粒子のＴＥＭ写真像を示す図である。
【図２】図２は、４８８ｎｍで励起したときの５３０ｎｍの蛍光強度（ＦＬ１チャンネル検出）および６３５ｎｍで励起したときの６７０ｎｍの蛍光強度（ＦＬ３チャンネル検出）の２次元ドットプロットを表す図である。
【図３】図３は、６種類のゲートを掛けた図２の２次元ドットプロットを表す図である。
【図４】図４は、ＩＬ−２濃度に対するフィコエリスリンの蛍光強度（ＦＬ２チャンネル検出）の相関を示す標準曲線を表す図である。
【図５】図５は、得られた蛍光シリカ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。
【図６】図６は、実施例３のフローサイトメトリーの測定結果を示す、４８８ｎｍ励起光による５３０ｎｍの蛍光強度を横軸（ＦＬ１）に、カウント数を縦軸にしたヒストグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、「本発明の生体分子の定量システム」について説明する。
本発明の生体分子の定量システムは、耐退色性を与えた捕捉ないしは標識用ビーズとして、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する蛍光シリカ粒子に、定量用の蛍光で標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子（生理活性物質を含む。以下、同様である。）を捕捉させ、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、前記の標識付けされた標的生体分子の蛍光強度を測定して前記標的生体分子を定量することを特徴とする。
前記定量用の蛍光は、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光とは異なる波長を有することが好ましい。
本発明のシステムは、一回のフローサイトメトリー測定操作で１又は２種以上の標的生体分子を同時に定量することができる。従来のフローサイトメトリーでは粒子や細胞は大きさ（粒径）によって識別ないしは検出されたが、本発明においては、前記蛍光シリカ粒子の蛍光が、フローサイトメーターで検出され、前記標的生体分子の定量ができる。
前記標的生体分子もしくは標的生理活性物質としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。
前記標的生体分子の定量用の蛍光による標識付けは、任意の蛍光標識プローブによる標識であってもよいし、ＰＣＲ反応によってＣｙ３ないしはＣｙ５等の蛍光色素化合物が導入されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、蛍光タンパク質と融合したタンパク質等の予め標識付けされた標的生体分子としての標識付けであってもよい。
前記蛍光標識プローブとしては標的生体分子に特異的に結合または吸着する限り特に制限はなく、任意の蛍光色素化合物が結合した抗体等が挙げられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。【００１４】
次に、本発明に用いるフローサイトメーターについて説明する。
フローサイトメーターとは、粒子懸濁液を細管中に流し、浮遊している粒子を１個ずつ分別し、各粒子にレーザーを照射して、レーザーによって励起される前記粒子の蛍光発光、レーザーの前記粒子による散乱などを検出・測定する装置をいい、フローサイトメトリーとは、その分析方法をいう。
本発明に用いるフローサイトメーターは、特に制限はなく、従来用いられているフローサイトメーターをそのまま用いることができる。例えば、１又は２以上の検出域で単一波長の光を放射するレーザー（例えばＨｅ／Ｎｅ、アルゴン）源を含む。異なる検出域は、異なる波長で光を放射するレーザー源を含めることができる。前記レーザーはビーム整形レンズを用いて集束させてよい。
前記レーザー照射に先立って、シース液（例えば、ＩｓｏＦｌｏｗシース液（商品名、ベックマン・コールター社製）、ダコ  シースフルード（商品名、ダコジャパン社製等））、及び標的生体分子、蛍光シリカ粒子等が含有されたサンプル液がフローセルに導入され、ここで、前記シース液と前記サンプル液とが混じりあうことがない層流が形成される。前記フローセルから流れていくときに前記サンプル液はシース液流によって囲まれたサンプルコアを形成して流れ、レーザー照射域を通過するときにレーザーが照射される。【００１５】
本発明に用いるフローサイトメーターは、所定のフロー条件とすることにより、標的生体分子を標識している前記蛍光シリカ粒子１個だけを、各検出域に存在させることができ、それにより前記蛍光シリカ粒子１個だけの検出データを取得することができる。
それにより、前記フローサイトメトリーは、１回の測定操作で複数の標的を同時に測定することができる、いわゆるマルチプレックシング方式である。
本発明において、測定時のフロー速度は特に制限はないが、標的生体分子の定量のためには、１００〜１０００蛍光シリカ粒子数／秒の条件とすることができ、標的細胞の検出ないしは分取のためには、１００〜１０００細胞／秒の条件とすることができる。
例えば、フローサイトメーターとしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名；ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた場合、シース圧（上記シース液を流す圧力）とサンプル圧（上記サンプル液を流す圧力）の差が１ｋ〜２ｋｐｓｉである条件とすることができる。【００１６】
各検出域においては、光電子増倍管等任意の１又は２以上の蛍光チャンネル（例えば、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３）を用いて、検出域を通ってレーザーによって照射された蛍光シリカ粒子からの蛍光発光を集めることができる。また、光電子増倍管等任意の散乱光集光チャンネルを用いて、各シリカ粒子によって屈折される光（前方散乱光または側方散乱光）を集めてもよい。
本発明に用いるフローサイトメーターは、前記検出域を通った各標的生体分子に由来する蛍光発光や散乱光を、蛍光チャンネル等によって検出したデータを記録・記憶し、分析するデータ集積分析手段（ハードウエアもしくはソフトウエア）を含むのが好ましい。
前記データ集積分析手段として、ＦＡＣＳＤｉＶａ、ＥＸＰＯ３２、Ｓｕｍｍｉｔ、ＡｐｐＳａｎ、ＬｙｓｉｓＩＩ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（いずれも商品名）等市販のものを用いてもよい。
本発明の定量システムもしくは定量方法は、蛍光についてだけ異なる複数種の蛍光シリカ粒子を組み合わせて用いる場合、すなわち、粒径が実質的に揃っていて、粒径については実質的に均一である場合（散乱光の違いでは粒子間の違いを識別しにくい場合）、蛍光を受光するだけで用いるシリカ粒子を認識することができる。
具体的には、煩雑な操作を要する散乱光用の照射レーザー及び前記散乱光集光チャンネルを具備する散乱光用検出域を省いた、蛍光用照射レーザー及び前記蛍光チャンネルを具備する蛍光用検出域のみを具備する、本発明の定量システムもしくは定量方法とすることができる。これによりシステムのコンパクト化及び、煩雑な操作を要しない方法とすることができる。
一方で、本発明に用いる１又は２種以上の蛍光シリカ粒子には、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよく、そのシリカ粒子は蛍光発光しない。この場合、用いるフローサイトメーターは、散乱光用の照射レーザー及び前記散乱光集光チャンネルを具備する散乱光用検出域を具備するのが好ましい。
本発明に用いるフローサイトメーターとしては、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名；ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰＥＲＦＬＯＷ  Ａｎａ（商品名；古河電気工業社製）、ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（商品名；ベックマン・コールター社製）、ＣｙＡｎ（商品名；ダコジャパン社製）、ＪＳＡＮ（商品名；ベイバイオサイエンス社製）等市販のフローサイトメーターを用いてもよい。【００１７】
次に「本発明に用いる蛍光シリカ粒子」について説明する。
本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなり、標的生体分子（生理活性物質を含む。）を捕捉し、標識する蛍光標識用ビーズとしての蛍光材料である。
本発明において、前記蛍光シリカ粒子中には蛍光色素化合物が固定化された状態にあり、蛍光シリカ粒子に対する蛍光色素化合物の濃度が７５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
ここで、蛍光シリカ粒子に対する蛍光色素化合物の濃度とは、蛍光色素化合物のモル数を、蛍光シリカ粒子の体積で割ったものである。蛍光色素化合物のモル数は、蛍光シリカ粒子分散コロイドの吸光度から求めたものであり、また蛍光シリカ粒子の体積は、蛍光シリカ粒子コロイドから蛍光シリカ粒子のみを回収し、乾燥させ、質量を求め、シリカ粒子の比重を２．３ｇ／ｃｍ３として求めたものである。
本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、前記蛍光色素化合物が、前記蛍光シリカ粒子の内部から表面まで前記シリカ粒子全体に分布している蛍光材料であることが好ましい。
本発明において、「耐退色性を与えた」とは、分散液にアルゴンランプを３０分照射したときの蛍光強度の減衰の度合いが、同濃度の蛍光色素化合物（例えば、フルオレセイン）溶液の蛍光強度の減衰の度合いの２０％以下のことをいう。
前述のようにフローサイトメーターは、標的生体分子を捕捉している前記蛍光シリカ粒子１個１個の検出データを取得することができ、前記蛍光シリカ粒子個々を区別できるので、本発明において、バーコード標識とすることが好ましい。すなわち、本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、バーコード標識可能な蛍光材料であることが好ましい。
本発明において、「バーコード標識」とは、シリカ粒子を多様な蛍光特性で標識することをいう。【００１８】
本発明において、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい。
本発明において、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子各々が、異なる蛍光発光スペクトルを有する１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることが好ましい。
例えば、２種類の蛍光色素化合物として、５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０が含有されるように、本発明に用いる蛍光シリカ粒子の調製について後述する方法により調製された、５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有蛍光シリカ粒子、同様な方法により調製された、５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＰｅｒＣＰ（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）含有蛍光シリカ粒子、５(６)−カルボキシフルオレセイン、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）及びＤＹ６３５の３種含有蛍光シリカ粒子、５(６)−カルボキシフルオレセイン、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ及びＤＹ６３５の４種含有蛍光シリカ粒子等が挙げられる。【００１９】
【化１】
2007097377.tif 000003
【００２０】
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、前記シリカ成分と共有結合し得る基である。
前記シリカ成分と共有結合し得る基としては、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル基等の活性エステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。
また、本発明において、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子が、シリカ粒子１個毎の蛍光色素化合物含有量の違いにより複数種の段階的に異なる蛍光強度を有することが好ましい。
具体的には、ＤＹ６３０が含有されるように、本発明に用いる蛍光シリカ粒子の調製について後述する方法による調製時に、ＤＹ６３０成分（例えば、ＤＹ６３０−ＮＨＳエステル）のシリカ粒子調製反応に用いる量の違いにより、ＤＹ６３０含有濃度の異なる複数種の蛍光シリカ粒子等が挙げられる。
例えば、シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が５３ｍｍｏｌ／ＬのＤＹ６３０含有シリカ粒子、及びシリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＤＹ６３０含有シリカ粒子からなる２種類のＤＹ６３０含有シリカ粒子、
シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が５５ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子、及びシリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子からなる２種類のＤＹ６３０含有シリカ粒子等が挙げられる。【００２１】
さらに、本発明において、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子各々が、異なる蛍光発光スペクトルを有する１〜４種類の蛍光色素化合物を含有し、かつシリカ粒子１個毎の前記蛍光色素化合物各々の含有量の違いにより複数種の段階的に異なる蛍光強度を有することがより好ましい。
例えば、２種類の蛍光色素化合物を含有させ、各々の蛍光色素化合物含有量が異なり蛍光強度を蛍光色素化合物ごとに独立に４種類に段階化したものを用いる場合、その組み合わせとしては１６通りの組み合わせが得られる。すなわち、計１６種類の蛍光シリカ粒子を調製することができる。【００２２】
具体例として、
〈１〉色素が入っていない無蛍光シリカ粒子、
〈２〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子、
〈３〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子、
〈４〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子、
〈５〉シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が８ｍｍｏｌ／ＬのＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈６〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈７〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈８〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈９〉ＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−ＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１０〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１１〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１２〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１３〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１４〉ＤＹ６３０の濃度が６０ｍｍｏｌ／ＬのＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈１５〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子、及び
〈１６〉シリカ粒子に対する５(６)−カルボキシフルオレセインの濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＹ６３０の濃度が６０ｍｍｏｌ／Ｌの５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子
からなる１６種類の５(６)−カルボキシフルオレセイン及びＤＹ６３０含有シリカ粒子等が挙げられる。
本発明において、上記１６種のシリカ粒子のうちの一部を組み合わせて用いてもよい。【００２３】
本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中に含まれる定量したい前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾された蛍光シリカ粒子とするのが好ましく、前記標的生体分子を分子認識する物質で修飾された蛍光シリカ粒子とするのがより好ましい。
また、本発明において、前記検体中に含まれる定量したい前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質として、さらに蛍光で標識付けされた物質を用いることにより、蛍光特性が多様に異なるシリカ粒子を作製しても良い。
前記蛍光は、前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光または前記定量用の蛍光とは異なる波長を有することが好ましい。
例えば、〈１〉シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が５３ｍｍｏｌ／Ｌであり、かつ標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質がフルオレセインで標識されているＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈２〉シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が５３ｍｍｏｌ／Ｌであり、かつ標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質が蛍光標識されていないＤＹ６３０含有シリカ粒子、
〈３〉シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、かつ標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質がフルオレセインで標識されているＤＹ６３０含有シリカ粒子、及び
〈４〉シリカ粒子に対するＤＹ６３０の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、かつ標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質が蛍光標識されていないＤＹ６３０含有シリカ粒子
からなる４種類のＤＹ６３０含有シリカ粒子等が挙げられる。【００２４】
本発明に用いる蛍光シリカ粒子の表面に、前記標的生体分子を分子認識する物質を結合させる修飾方法は、「シリカ粒子表面修飾」として後述する。
蛍光シリカ粒子を修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質は、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、受容体等が挙げられる。
すなわち、前記蛍光シリカ粒子を修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原-抗体反応、ビオチン-アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
「吸着」とは、ファンデルワールス力、疎水性相互作用または静電的相互作用による一体化をいう。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間又はＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子（生理活性物質を含む。）間の特異的相互作用をいい、その特異的相互作用をする箇所を認識部位という。【００２５】
次に、本発明に用いる蛍光色素化合物について説明する。
上述のように、本発明に用いる蛍光色素化合物は、広義の蛍光色素化合物であり、燐光色素化合物をも包含するものである。
前記蛍光色素化合物は特に制限はないが、フローサイトメトリーに用いられるレーザーによる励起波長を有する蛍光色素化合物が好ましい。
アルゴンレーザーによる励起波長４８８ｎｍを有する蛍光色素化合物としては、例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ＰＥ（フィコエリスリン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７（いずれも商品名；アマシャム・バイオサイエンス社製）、ＤＹ４９５、ＤＹ５０５（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＡＭＲＡ−Ｘ（商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が挙げられる。【００２６】
【化２】
2007097377.tif 000004
【００２７】
式中、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、前記シリカ成分と共有結合し得る基である。
ＹＡＧレーザーによる励起波長５３２ｎｍを有する蛍光色素化合物としては、５−ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３（商品名；アマシャム・バイオサイエンス製）、ＤＹ５５０、ＤＹ５５５（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（いずれも商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が挙げられる。
半導体赤色レーザーによる励起波長６３５ｎｍを有する蛍光色素化合物としては、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ｃｙ５(商品名；アマシャム・バイオサイエンス社製)、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、ＡＰＣ(アロフィコシアニン)（いずれも商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（いずれも商品名、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）等が挙げられる。【００２８】
【化３】
2007097377.tif 000005
【００２９】
【化４】
2007097377.tif 000006
【００３０】
式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ２、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、それぞれ、前記シリカ成分と共有結合し得る基である。
次に本発明に用いる蛍光シリカ粒子の調製について説明する。
本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、蛍光色素化合物とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記蛍光シリカ粒子の調製法として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記蛍光色素化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製するのが好ましい。【００３１】
本発明者らは、蛍光シリカ粒子の調製方法について特許出願している（例えば、特願２００４−３５６６０８）。その方法に準じて行なうのがさらに好ましい。具体的には、前記蛍光シリカ粒子は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を行なうことにより調製することができる。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル等の活性エステル基を有する蛍光色素化合物（１）とアミノ基を有するシランカップリング剤（２）とを反応させて、色素シランカップリング剤複合化合物（３）を生成する工程、及び
（ｂ）前記（ａ）で得られた色素シランカップリング剤複合化合物（３）を、シリカ化合物（４）と塩基性条件下で重合させて前記蛍光シリカ粒子（５）を形成する工程。【００３２】
本発明者らは、カルボン酸化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとをエステル化反応する工程について特許出願している（例えば、特願２００４−３５６６０８）。
前記工程（ａ）で用いるＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物（１）は、そのエステル化反応工程に準じて行うことで調製することができる。但し、市販のものを入手することも可能である。【００３３】
前記ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物（１）として具体的には、５（６）−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（商品名、ロッシュ社製）、ＤＹ５５０−ＮＨＳエステル、ＤＹ５５５−ＮＨＳエステル、ＤＹ６３０−ＮＨＳエステル、ＤＹ６３５−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、５−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３−ＮＨＳエステル、Ｏｙｓｔｅｒ６５６−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）等を挙げることができる。中でも、５（６）−カルボキシフルオレセイン-ＮＨＳエステル（商品名、ロッシュ社製）、ＤＹ６３０−ＮＨＳエステル好ましい。【００３４】
前記アミノ基を有するシランカップリング剤（２）としては、特に制限されないが、例えば、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシランを挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。【００３５】
前記ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物（１）と前記アミノ基を有するシランカップリング剤（２）との反応は、ＤＭＳＯや水等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物（１）とシランカップリング剤（２）との割合は特に制限されないが、前記ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物（１）：前記アミノ基を有するシランカップリング剤（２）＝１：０．５〜４（モル比）の割合が好ましく、１：０．８〜１．２(モル比)の割合がより好ましい。【００３６】
斯くして、蛍光色素化合物（１）のカルボニル基と、アミノ基を有するシランカップリング剤（２）のアミノ基とが、アミド結合(−ＮＨＣＯ−)して、色素シランカップリング剤複合化合物（３）が得られる。すなわち、前記色素シランカップリング剤複合化合物（３）は、アミド結合を介して蛍光色素化合物とシリカ成分が結合している。【００３７】
次いで工程（ｂ）で、前記色素シランカップリング剤複合化合物（３）をシリカ化合物（４）と反応させる。前記シリカ化合物（４）としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、ＴＥＯＳ、ＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。【００３８】
色素シランカップリング剤複合化合物（３）とシリカ化合物（４）の割合は、特に制限はないが、色素シランカップリング剤複合化合物（３）１モルに対するシリカ化合物（４）のモル比として、５０〜４００００が好ましく、１００〜２０００がより好ましく、１５０〜１０００がさらに好ましい。【００３９】
この反応は、アルコール、水及びアンモニアの存在下で行うのが好ましい。ここでアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数１〜３の低級アルコールを挙げることができる。【００４０】
かかる反応系における水とアルコールの割合は、特に制限されないが、好ましくは水１容量部に対してアルコールを０．５〜２０容量部、より好ましくは２〜１６容量部、さらに好ましくは４〜１０容量部の範囲である。アンモニアの量も特に制限されないが、アンモニアの濃度が３０〜１０００ｍＭが好ましく、６０〜５００ｍＭがより好ましく、８０〜２００ｍＭがさらに好ましい。【００４１】
この反応は室温で行うことができ、また攪拌しながら行うことが好ましい。通常、数十分〜数十時間の反応で、蛍光シリカ粒子（５）を調製することができる。【００４２】
なお、前記工程（ｂ）において、使用するシリカ化合物（４）の濃度を調整したり、反応時間を調整することにより、調製するシリカ粒子の大きさ（直径）を適宜調節することができる。使用するシリカ化合物（４）の濃度を多くしたり、また反応時間を長くすることにより、より大きなシリカ粒子を調製することができる(例えば、Ｂｌａａｄｅｒｅｎｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｏｒｇａｎｏ−ｓｉｌｉｃａ  Ｓｐｈｅｒｅｓ”，Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６，１−１８．１９９３参照)。また、工程（ｂ）を複数回、繰り返し行うことによっても、より大きなシリカ粒子を調製することができる。このように、得られる蛍光シリカ粒子の粒径（直径）を、所望の大きさに、例えばｎｍオーダーからμｍオーダーへと自在に調整することができる。また必要に応じて、その後の処理により希望する粒子径分布となるように調整することもでき、斯くして所望の粒子径分布範囲にあるシリカ粒子を得ることができる。
このようにして得られる蛍光シリカ粒子は、必要に応じて、限外ろ過膜などの常法を利用して共存イオンや共存する不要物を除いて精製してもよい。
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子群が製造できる。球状に近い微粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。【００４３】
本発明の生体分子の定量システムもしくは定量方法において、フローサイトメーターの検出能（感度）の観点から、蛍光シリカ粒子の平均粒径は３００ｎｍ以上が好ましく、５００ｎｍ以上がより好ましく、８００ｎｍ以上がさらに好ましく、８００ｎｍ〜１２００ｎｍが特に好ましい。
一方、本発明の細胞の検出・分取システムもしくは細胞の検出・分取方法において、細胞の検出感度を向上させる観点から、蛍光シリカ粒子の平均粒径は１０ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ〜２００ｎｍがより好ましく、１０ｎｍ〜１００ｎｍがさらに好ましく、１０ｎｍ〜５０ｎｍが特に好ましい。
所望の粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が小さい粒子を除去することで可能である。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個のシリカ粒子の合計の投影面積からシリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。【００４４】
蛍光色素化合物をシリカ粒子内に固定し、包含させると、前記蛍光色素化合物複数個がシリカ粒子内に含有され、遊離の蛍光色素化合物よりも感度を上げることができる。
また、本発明者らは、蛍光色素化合物が自己消光を起こすことなく、多くの蛍光色素化合物をシリカ粒子内に固定もしくは包含させることができることを見出し、特許出願している（例えば、特願２００４−３５６６０８）。このため、微小な領域でも使用可能な、高感度な標識が可能である。【００４５】
次に「シリカ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明に用いる蛍光シリカ粒子群もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能であり、またその表面をメソポーラスや平滑にすることもできる。【００４６】
本発明に用いる蛍光シリカ粒子の表面修飾について、具体的には、上記工程（ｂ）で用いるシリカ化合物（４）の種類に応じて、所望の物質と結合可能なアクセプター基を表面に有する蛍光シリカ粒子群とすることができる。前記アクセプター基として、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられる。
反応に用いるシリカ化合物（４）と、それによって得られる蛍光シリカ粒子群の表面に形成されたアクセプター基との関係を表１に示す。【００４７】
【表１】
2007097377.tif 000007
【００４８】
なお、上記得られる蛍光シリカ粒子（５）について、反応に使用したシリカ化合物（４）によって表面に導入されるアクセプター基とは異なるアクセプター基を導入したい場合には、蛍光シリカ粒子（５）を、さらに工程（ｂ）で使用したシリカ化合物（４）とは異なるシリカ化合物で処理することにより達成できる。この処理は、工程（ｂ）で使用したシリカ化合物（４）とは異なるシリカ化合物を用いて、上記工程（ｂ）と同様な操作を行うことにより実施することができる。【００４９】
本発明に用いる蛍光シリカ粒子は、表面に有するアクセプター基の種類に応じて所望の標的生体分子を分子認識する物質〔例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等〕を表面に結合もしくは吸着させ、修飾させることができる。
本発明に用いる蛍光シリカ粒子の表面に、前記標的生体分子を分子認識する物質を結合させ、修飾する方法として特に制限はないが、下記（ｉ）〜（iii）の例が挙げられる。
（ｉ）ＭＰＳ等を用いて調製したチオール基を表面に有する前記蛍光シリカ粒子群は、ジスルフィド結合、チオエステル結合、またはチオール置換反応を介した結合を介して、その表面を前記標的生体分子を分子認識する物質で修飾することができる。
（ii）特に前記標的生体分子を分子認識する物質がアミノ基を有する場合には、前記蛍光シリカ粒子群が有するチオール基と、前記標的生体分子を分子認識する物質が有するアミノ基とをスクシンイミジル−トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド（ＥＭＣＳ）等の架橋剤を用いて結合することもできる。
（iii）ＡＰＳ等を用いて調製したアミノ基を表面に有する前記蛍光シリカ粒子は、前述と同様に、このアミノ基と前記標的生体分子を分子認識する物質が有するチオール基とをＳＭＣＣ、ＥＭＣＳ等の架橋剤を用いて結合することができる。また、このアミノ基と前記標的生体分子を分子認識する物質が有するアミノ基とをグルタルアルデヒド等の架橋剤で結合することもできる。さらに、アミド結合やチオウレア結合を介して、その表面を前記標的生体分子を分子認識する物質で修飾することもできる。【００５０】
本発明において、例えば溶液中に拡散して低濃度で存在する分子であっても、前記蛍光シリカ粒子の表面に結合させて濃縮することができ、こうすることでこれらの分子を高感度に検出することができる。【００５１】
次に「フローサイトメトリー用マルチプレックシングキット」について説明する。
上記蛍光特性が異なる、本発明に用いる２種以上の蛍光シリカ粒子を組み合わせて、耐退色性を与えた捕捉ないしは標識ビーズ（好ましくは、バーコード標識ビーズ）として、フローサイトメトリー用マルチプレックシングキットとすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、「マルチプレックシング」とは、複数種の標的（生体分子、細胞等）を、１回の測定操作で同時に分析（検出、定量等）することをいう。
本発明のフローサイトメトリー用マルチプレックシングキットは、すぐにフローサイトメトリーに適用する観点から、複数種ある蛍光シリカ粒子それぞれが、別個の標的（生体分子、細胞等）を分子認識するように修飾された複数種の蛍光シリカ粒子を組み合わせてなることが好ましい。
前記修飾された複数種の蛍光シリカ粒子の構築は、「シリカ粒子表面修飾」について前述した通りである。【００５２】
次に「標的生体分子の定量方法」について説明する。
本発明の定量方法において、前記標的生体分子としては標的生理活性物質も含み、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。
本発明の生体分子の定量方法は、下記第１〜３の態様が挙げられる。
本発明の生体分子の定量方法の第１の態様は、前記標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、定量用の蛍光で標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分の発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記の標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子の蛍光強度を、それぞれ、フローサイトメーターで定量する工程とを含む。【００５３】
前記第１の態様は、前記標的生体分子が予め定量用の蛍光で標識されている場合に好ましく用いられる。すなわち、前記標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾された蛍光シリカ粒子によって前記標的生体分子を蛍光シリカ粒子表面に固定した後、フローサイトメーターを用いて測定を行い、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の蛍光をそれぞれ検出し、蛍光シリカ粒子の種類ごとにデータを分け、前記標的生体分子の定量用の蛍光強度から前記標的生体分子を定量する方法である。
前記第１の態様における前記標的生体分子としては、ＰＣＲ反応によってＣｙ３ないしはＣｙ５が導入されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、蛍光タンパク質と融合したタンパク質等が挙げられる。
本発明の生体分子の定量方法の第１〜３の態様において、耐退色性を与えた標識ビーズ（好ましくは、バーコード標識ビーズ）として、前記標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾された１又は２種以上の蛍光シリカ粒子については、「本発明に用いる蛍光シリカ粒子」及び「シリカ粒子表面修飾」について前述した通りである。【００５４】
本発明の生体分子の定量方法の第２の態様は、標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ、特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程とを含む。【００５５】
前記第２の態様は、前記１又は２種以上の標的生体分子それぞれが、２つ以上の認識部位（エピトープ等）を有する場合に好ましく用いられる。すなわち、前記標的生体分子の認識部位の１つを分子認識する物質で表面修飾された蛍光シリカ粒子によって前記標的生体分子を蛍光シリカ粒子表面に固定し、さらに定量用の蛍光標識プローブにより標的生体分子の別の認識部位を定量用に蛍光標識した後、フローサイトメーターを用いて測定を行い、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の蛍光をそれぞれ検出し、蛍光シリカ粒子の種類ごとにデータを分け、前記蛍光標識プローブの蛍光強度から前記標的生体分子を定量する方法である。【００５６】
前記認識部位を分子内に２つ以上有する標的生体分子の具体例としては、任意の抗原（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、エリスロポエチン、造血幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子α及びβ、神経細胞増殖因子等）、その他、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、抗体（イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＥ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ）等が挙げられる。
前記蛍光標識プローブとしては、用いたシリカ粒子の有する蛍光波長とは異なる蛍光波長を有する蛍光物質を含有し、かつ標的生体分子に特異的に結合または吸着する限り特に制限はなく、任意の蛍光色素が結合した抗体等が挙げられ、前記標的生体分子もしくは前記分子認識物質に特異的に結合する物質で修飾されている蛍光シリカ粒子であってもよい。
前記蛍光標識プローブとしては、例えば、ＰＥ（フィコエリスリン）で標識された抗ＩＬ−２抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−４抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−５抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−１０抗体、ＰＥで標識された抗ＴＮＦ−α抗体、ＰＥで標識された抗ＩＦＮ−γ抗体、ＰＥで標識された抗エリスロポエチン抗体、ＰＥで標識された抗造血幹細胞因子抗体、ＰＥで標識された抗トランスフォーミング増殖因子α抗体、ＰＥで標識された抗トランスフォーミング増殖因子β抗体、ＰＥで標識された抗神経細胞増殖因子抗体等が挙げられる。【００５７】
本発明の生体分子の定量方法の第３の態様は、標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の分子認識物質を混合する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の分子認識物質に、それぞれ特異的に結合もしくは吸着する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程とを含む。
前記第３の態様において、前記分子認識物質は、前記標的生体分子に特異的に結合もしくは吸着する限り特に制限はなく、前記標的生体分子を分子認識する物質が好ましく、例えば、抗原、抗体（好ましくは、任意の１次抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質が挙げられる。
前記分子認識物質は前記標的生体分子を認識するように修飾された物質を挙げることもでき、例えば、ビオチンもしくはアビジンで修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、ビオチンもしくはアビジンで修飾されたマウスＩｇＧ、マルトース結合タンパクで修飾されたマウスＩｇＭ等が挙げられる。
前記標的生体分子を認識するように修飾された前記分子認識物質を構築する方法は、特開平９−１５４５９９、特表２００３−５２２１５８等に記載の方法により行なうことができる。
前記第３の態様において、定量用の前記蛍光標識プローブは、蛍光標識を有し、前記分子認識物質に特異的に結合もしくは吸着する限り特に制限はなく、例えば、前記分子認識物質がビオチン化された抗体である場合、アビジン又はストレプトアビジンと結合した蛍光標識プローブ、前記分子認識物質がアビジン化又はストレプトアビジン化された抗体である場合、ビオチンと結合した蛍光標識プローブ等が挙げられる。また、前記分子認識物質を１次抗体とした場合、蛍光標識プローブは蛍光標識された２次抗体とすることもできる。前記２次抗体としては、前記１次抗体に親和性のあるものである限り特に制限はなく、任意のいかなる抗体でもよい。【００５８】
以下、本発明の別の態様としての、標的細胞の検出もしくは分取システム、及び標的細胞の検出もしくは分取方法（以下、単に、「本発明の標的細胞の検出・分取システム及びその方法」という。）について説明する。
本発明の標的細胞の検出・分取システム及びその方法は、耐退色性を与えた標識ビーズとして、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出することを特徴とする。【００５９】
前記標的細胞としては特に制限はないが、骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）、ウイルス感染細胞（例えば、インフルエンザウイルス感染細胞）、異種移植に用いる細胞（例えば、ブタ肝臓細胞）等を挙げることができる。
本発明の標的細胞の検出・分取システム及びその方法において、前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾することが好ましい。
前記標的細胞が表面マーカーとして表層糖鎖（例えば、任意の細胞表層糖鎖中に含有されるマルトース、任意の細胞表層のシアリル・ルイスＸ含有糖鎖）を有する場合、前記蛍光シリカ粒子の表面を、標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する抗体ないしはレセプター（例えば、マルトース結合タンパク、シアリル・ルイスＸを認識する任意のセレクチン）で修飾することが好ましい。
前記標的細胞が表面マーカーとして表面抗原（例えば、ブタ肝臓細胞表層のα−Ｇａｌエピトープ）を有する場合、前記蛍光シリカ粒子の表面を、標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体（例えば、ヒト抗α−Ｇａｌ抗体）もしくはレセプターで修飾することが好ましい。【００６０】
本発明の標的細胞の検出・分取システム及びその方法において、標的細胞を分取するためには、用いるフローサイトメーターに任意のセルソーターを設けることが好ましい。前記セルソーターは水滴荷電方式、セルキャプチャー方式等任意の方式であってよい。
セルソーターは、例えば、フローサイトメーターにおいて、前述のようにレーザー照射され、各蛍光シリカ粒子について検出データが取得された後、この取得データに基づき前記サンプルコアをプラスまたはマイナスに帯電させ、電圧板を用いてソーティングする等の装置である。
本発明において、ＭｏＦｌｏ（商品名；ダコジャパン社製）等市販のセルソーターを用いてもよいし、市販のセルソーター装備フローサイトメーターとして、例えば、ＰＥＲＦｌｏｗ  Ａｌｌ（商品名；古河電気工業社製）等を用いてよい。【００６１】
本発明の生体分子の定量システムは、フローサイトメトリーを利用した蛍光シリカ粒子アッセイ法に用いることによって、複数種の生体分子をわずか一回の測定で定量することができ、臨床試料等の入手試料に限界がある場合、極微量成分を定量する場合等に有用である。
本発明の生体分子の定量システムは、シリカ粒子の蛍光を受光するだけで、前記シリカ粒子を認識することができるので、散乱光検出域を省いてコンパクト化が可能である。
本発明の生体分子の定量方法は、従来、細胞を検出することを目的としていたフローサイトメトリーに対し、任意の生体分子を定量することができる。
本発明の生体分子の定量方法は、シリカ粒子の蛍光を受光するだけで、前記シリカ粒子を認識することができるので、散乱光を用いた煩雑な操作を要しない。【００６２】
本発明の細胞の検出もしくは分取システム及びその方法は、ガン細胞表層、ウイルス感染細胞表層、異種移植細胞表層等の細胞表層の特徴に基づき、任意の複数種の細胞をわずか一回の測定で検出し、それぞれ単離することができる。臨床試料等の入手試料に限界がある場合、極微量細胞を単離する場合に有用である。
本発明の生体分子の定量システム、細胞の検出もしくは分取システムに用いられる蛍光シリカ粒子は、低コストで、任意の生体分子、細胞等を標的とするための表面修飾ができ、複数種の蛍光色素の導入ができ、蛍光強度を変えて多様に異なるシリカ粒子としえる。また、前記蛍光シリカ粒子は、蛍光材料として耐退色性に優れる。
本発明のマルチプレックシングキットは、前記蛍光シリカ粒子複数種組み合わせてなり、バーコード標識ビーズである蛍光材料として用いることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１(表面を抗体修飾した蛍光シリカ粒子をフローサイトメトリーに応用することによる多種類サイトカインの同時定量法)
ここでは蛍光シリカ粒子の調製法、及び蛍光シリカ粒子を利用した多種類サイトカインの同時定量法の実施例を示す。【００６４】
（フルオレセイン-シランカップリング剤複合体の調製）
５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ロッシュ社製)３．３ｍｇを１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、溶液Ａを得た。
(ＤＹ６３０−シランカップリング剤複合体の調製)
ＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）５．３ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温で１時間反応を行い、溶液Ｂを得た。
(色素２種類を含有したバーコード蛍光シリカ粒子の調製)
上記得られた溶液Ａ及び溶液Ｂを、それぞれ、表２に示した混合比で混合し、エタノール３．９５ｍｌ、ＭＰＳ２０μｌ、蒸留水１ｍｌ、２８質量％アンモニア水１００μｌを加え室温で２４時間反応を行った。
反応液を２０００×ｇの重力加速度で５分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え分散させ、再度２０００×ｇの重力加速度で５分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去した。
これによって、表２に示した混合比に対応して、５(６)−カルボキシフルオレセインとＤＹ６３０の２色の色素の含有量比が異なる６種類のシリカ粒子（ビーズＮｏ．１〜Ｎｏ．６）を得た。
図１に得られた蛍光シリカ粒子ビーズＮｏ．１のＴＥＭ写真像を示す。図中、黒く見える球形状物質が、得られた蛍光シリカ粒子ビーズＮｏ．１である。図１のＴＥＭ写真を観察し、前記蛍光シリカ粒子が得られたことを確認した。
下記表３にそれぞれの収率及び平均粒径を示す。【００６５】
【表２】
2007097377.tif 000008
【００６６】
【表３】
2007097377.tif 000009
【００６７】
前記平均粒径は、ＴＥＭ観察において異なる５箇所を観察し、それぞれのＴＥＭ写真から無作為に５０個ずつ選択したシリカ粒子の平均粒径として平均円相当直径を求め、さらにこれを５個所について平均したものである。
（蛍光シリカ粒子の抗体修飾）
Ｎｏ．１の蛍光シリカ粒子５０μｌに３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）と１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド（ＥＤＣ)の混合物（０．０５Ｍ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ、０．２Ｍ  ＥＤＣ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解)を４５０μｌ加え１０分間混合後、抗マウスＩＬ−２抗体(１００μｇ／ｍｌ)を５０μｌ加え、さらに１時間混合した。
遠心分離によってシリカ粒子を沈殿させ上清を除去した後、ＰＢＳに対して透析を２回行って未反応の試薬を除去した。これによってシリカ粒子の表面に抗マウスＩＬ−２抗体が導入された蛍光シリカ粒子が得られた。【００６８】
(ビーズの複数種化)
Ｎｏ．２〜Ｎｏ．６の蛍光シリカ粒子に関しても同様の方法でそれぞれ抗マウスＩＬ−４抗体、抗マウスＩＬ−５抗体、抗マウスＩＬ−１０抗体、抗マウスＴＮＦ-α抗体、抗マウスＩＦＮ−γ抗体で表面修飾し、表４に示すような、ビーズの種類と抗体の対応関係を有する６種類のビーズを調製した。【００６９】
【表４】
2007097377.tif 000010
【００７０】
（シリカ粒子上での抗原抗体反応）
サイトカイン標準サンプルとして、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γそれぞれが５μｇ／ｍｌずつ混合されたサンプルを用意した。このサンプルを１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４、１／１２８、１／２５６倍に希釈し９種類の標準サンプルを調製した。
抗体で修飾した６種類のシリカ粒子をＰＢＳ中で混合した。得られたビーズ混合液を５０μｌずつ１０本のマイクロチューブに分けた。
ここに、定量用標識プローブとして、ＰＥ（フィコエリスリン）で標識された抗ＩＬ−２抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−４抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−５抗体、ＰＥで標識された抗ＩＬ−１０抗体、ＰＥで標識された抗ＴＮＦ−α抗体、ＰＥで標識された抗ＩＦＮ−γ抗体（それぞれシリカ粒子の表面に結合した抗体とは別のエピトープに結合する抗体）が各々２０μｇ／ｍｌ含まれた溶液を５０μｌずつ加えた。
続いて、これら１０本のマイクロチューブの内、９本には標準サンプルを１種類ずつ５０μｌ、残りの１本にはマウス血清を５０μｌ加え、さらに各マイクロチューブにＰＢＳを３５０μｌずつ加えて混合し、室温で３時間反応を行った。
反応後、シリカ粒子を遠心分離で沈降させ、上清を除去した。ここに５００μｌのＰＢＳを加え分散させ、もう一度遠心分離でシリカ粒子を沈降させ、上清を除去することによりシリカ粒子の洗浄を行った。【００７１】
（フローサイトメーターによる測定とサイトカインの定量）
洗浄後、５００μｌのＰＢＳを加え、シリカ粒子を分散させた。このうち１００μｌを測定用チューブに採り、Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（商品名、ベクトン・デッキンソン社製）で２ｍｌに希釈した。この溶液をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名、ベクトン・デッキンソン社製）で測定した。２種類の蛍光励起レーザー（４８８ｎｍ及び６３５ｎｍ）を用い、測定は１００００個の粒子を検出するまで行った。
測定データから、初めに２種類の蛍光（４８８ｎｍで励起したときの５３０ｎｍの蛍光（ＦＬ１）および６３５ｎｍで励起したときの６７０ｎｍの蛍光（ＦＬ３））の２次元ドットプロットを作成した。
図２は、４８８ｎｍで励起したときの５３０ｎｍの蛍光（ＦＬ１）および６３５ｎｍで励起したときの６７０ｎｍの蛍光（ＦＬ３）の２次元ドットプロットを表す図である。
図２から明らかなように、本発明の蛍光シリカ粒子（ビーズ）のバーコード標識により、６種類のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）が区別された。【００７２】
さらに各サイトカインの定量のため、６種類の蛍光シリカ粒子のデータを１種類ずつ分けるようにゲートを掛けた。
図３は、６種類のゲートを掛けた図２の２次元ドットプロットを表す図である。図３中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれゲートを示す。
下記表５に、ビーズＮｏ．とゲートの対応関係を示す。【００７３】
【表５】
2007097377.tif 000011
【００７４】
次に、各シリカ粒子の粒子数、及び定量用プローブに由来する４８８ｎｍで励起したときの５８５ｎｍの蛍光強度（ＦＬ２）のデータから、１ビーズ当たりのフィコエリスリンの蛍光強度を算出した。
図４は、ＩＬ−２濃度に対するＦＬ２カウント数の相関を示す標準曲線を表す図である。
他のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）についても、９種類の濃度の標準サンプルから得られる、各サイトカインの濃度と１シリカ粒子当たりのフィコエリスリンの蛍光強度（ＦＬ２チャンネル検出）の相関からＩＬ−２についての標準曲線と同様な標準曲線を作成した。
図４に示したＦＬ２強度と各サイトカインの濃度の標準曲線、及び他のサイトカインについての標準曲線からマウス血清サンプル中に含まれる６種類のサイトカインの濃度各々を算出した。
同じマウス血清サンプルを用い、６回サイトカインの定量実験を行った。６回の測定から得られた各サイトカインの濃度の平均値とＣＶ値を表６に示す。【００７５】
【表６】
2007097377.tif 000012
【００７６】
表６に示した結果から明らかなように、マウス血清中の６種のサイトカインを一回のフローサイトメトリー操作で定量できた。【００７７】
実施例２(細胞標識用蛍光シリカ粒子の調製)
まず、実施例１と同様にフルオレセイン-シランカップリング剤複合体を調製した。
具体的には、５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ロッシュ社製)３．３ｍｇを１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、フルオレセイン-シランカップリング剤複合体の溶液を得た。
続いて、エタノール６．４ｍｌ、蒸留水１．６ｍｌ、２８質量％アンモニア水１００μｌを混合し、ここにフルオレセイン-シランカップリング剤複合体４０μｌ、ＴＥＯＳ２０μｌを加え、室温で２４時間反応を行った。
反応液を２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え分散させ、再度２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
これによって、５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子（平均粒径３９ｎｍ）を得た。収率４８％。
図５に得られた蛍光シリカ粒子ビーズのＳＥＭ写真像を示す。図中、白く見える球形状物質が、得られた蛍光シリカ粒子ビーズである。図５のＳＥＭ写真を観察し、前記蛍光シリカ粒子が得られたことを確認した。
蛍光シリカ粒子分散液（２ｍｇ／ｍｌ、蒸留水に分散）９ｍｌに５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍｌ加え軽く混合した。ここに蒸留水に溶解した抗マウスＣＤ４抗体６０μｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。続いて１０％ＢＳＡを１．１ｍｌ加え、軽く撹拌した。
８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。ここに２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ加え、粒子を分散させた。再度８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去後、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）を２ｍｌ加え、粒子を分散させ、抗マウスＣＤ４抗体で修飾された蛍光シリカ粒子分散液を得た（８．２ｍｇ／ｍｌ×２ｍｌ）。【００７８】
実施例３(蛍光シリカ粒子によるマウス脾細胞の標識)
マウス３匹から摘出した脾臓よりマウス脾細胞を取り出した。マウス脾細胞を０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）添加ＰＢＳで１回洗浄後、遠心分離し上清を除去した。ここに赤血球除去用トリス緩衝液（ＡＣＴＢ）を１０ｍｌ加えピペッティングによって混合後、５分間放置して赤血球破砕処理を行った。続いて０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳを２０ｍｌ加えて希釈し、遠心分離を行って上清を除去後０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで２回脾細胞を洗浄し、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ５ｍｌに分散させた。得られたマウス脾細胞分散液５００μｌに、抗マウスＣＤ４抗体で修飾された蛍光シリカ粒子分散液を１００μｌ加え０℃で３時間、抗原抗体反応を行った。
反応後、マウス脾細胞を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌの０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳに分散させた。
得られたマウス脾細胞分散液をフローサイトメーターで測定した。
図６は、前記測定結果を示す、４８８ｎｍ励起光による５３０ｎｍの蛍光強度を横軸（ＦＬ１）に、カウント数を縦軸にしたヒストグラムである。図６中、蛍光強度の弱いゲート１（Ｇ１）の領域は、ＣＤ４陰性細胞のカウント数を示し、蛍光強度の強いゲート２（Ｇ２）の領域は、ＣＤ４陽性細胞を標識付けした蛍光シリカ粒子のカウント数を示す。このヒストグラムから全体の約２０％の細胞がＣＤ４陽性細胞であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の生体分子の定量システム及び定量方法は、フローサイトメトリーを活かし、一回の測定操作で複数種の標的生体分子の同時定量が可能である。また、標的は生体分子に限られず、複数種の細胞の同時検出・分取が可能なシステム及び方法も提供される。さらに、上述のような、複数種の生体分子及び細胞の定量、検出及び分取を同時に可能とするフローサイトメトリー用の、複数種の蛍光シリカ粒子を組み合わせたセット等の蛍光材料が提供される。
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
【図１】
2007097377.tif 000013
【図２】
2007097377.tif 000014
【図３】
2007097377.tif 000015
【図４】
2007097377.tif 000016
【図６】
2007097377.tif 000017
【図５】
2007097377.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月7日(2008.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する蛍光シリカ粒子に、定量用の蛍光で標識付けされた標的生体分子を捕捉させ、前記蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をフローサイトメーターで検出し、前記の標識付けされた標的生体分子の蛍光強度を測定して前記標的生体分子を定量することを特徴とする生体分子の定量システム。
【請求項２】
前記標的生体分子が２種以上であり、２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて各標的生体分子を特異的にそれぞれ捕捉することにより、２種以上の標的生体分子を同時に定量する、請求項１に記載の生体分子の定量システム。
【請求項３】
前記蛍光シリカ粒子の平均粒径が３００ｎｍ以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の生体分子の定量システム。
【請求項４】
前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾し、前記蛍光シリカ粒子の部分の発する蛍光に耐退色性を与えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項５】
前記蛍光シリカ粒子の表面を修飾する、前記標的生体分子に特異的に吸着もしくは結合する物質が、さらに蛍光で標識付けされていることを特徴とする請求項４に記載の生体分子の定量システム。
【請求項６】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、各々、１〜４種類の蛍光色素化合物を含有していることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項７】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、粒子１個毎に蛍光色素化合物含有量が異なり多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項８】
前記２種以上の蛍光シリカ粒子が、異なる蛍光スペクトル及び／又は多段階化された異なる蛍光強度を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項９】
前記標的生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１０】
前記蛍光シリカ粒子が、蛍光色素化合物を含有していないシリカ粒子を含んでいてもよい、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１１】
前記シリカ粒子の蛍光を受光するだけで、前記シリカ粒子を認識することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体分子の定量システム。
【請求項１２】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、定量用の蛍光で標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記の標識付けされた１又は２種以上の標的生体分子の蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１３】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ、特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程を含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１４】
標的生体分子を分子認識する物質で表面修飾され、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の表面に、１又は２種以上の標的生体分子を固定する工程と、
前記１又は２種以上の標的生体分子に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の分子認識物質を混合する工程と、
定量用の蛍光を発し、かつ前記１又は２種以上の分子認識物質に、それぞれ特異的に結合する１又は２種以上の蛍光標識プローブを混合する工程と、
フローサイトメーターを用いて、前記１又は２種以上の蛍光シリカ粒子の部分が発する蛍光をそれぞれ検出し、かつ前記１又は２種以上の蛍光標識プローブの蛍光強度をそれぞれ定量する工程とを含むことを特徴とする生体分子の定量方法。
【請求項１５】
前記蛍光標識プローブが、前記標的生体分子もしくは前記分子認識物質に特異的に結合する物質で修飾されている蛍光シリカ粒子である、請求項１３又は１４に記載の生体分子の定量方法。
【請求項１６】
前記分子認識物質が抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び／又は化学物質であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法。
【請求項１７】
２種以上の標的生体分子を同時に定量する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の生体分子の定量方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明の生体分子の定量システムもしくは定量方法において、フローサイトメーターの検出能（感度）の観点から、蛍光シリカ粒子の平均粒径は３００ｎｍ以上が好ましく、５００ｎｍ以上がより好ましく、８００ｎｍ以上がさらに好ましく、８００ｎｍ〜１２００ｎｍが特に好ましい。
一方、標的細胞の検出・分取システムもしくは標的細胞の検出・分取方法において、細胞の検出感度を向上させる観点から、蛍光シリカ粒子の平均粒径は１０ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ〜２００ｎｍがより好ましく、１０ｎｍ〜１００ｎｍがさらに好ましく、１０ｎｍ〜５０ｎｍが特に好ましい。
所望の粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が小さい粒子を除去することで可能である。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個のシリカ粒子の合計の投影面積からシリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
次に「フローサイトメトリー用マルチプレックシングキット」について説明する。
上記蛍光特性が異なる、本発明に用いる２種以上の蛍光シリカ粒子を組み合わせて、耐退色性を与えた捕捉ないしは標識ビーズ（好ましくは、バーコード標識ビーズ）として、フローサイトメトリー用マルチプレックシングキットとすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、「マルチプレックシング」とは、複数種の標的（生体分子、細胞等）を、１回の測定操作で同時に分析（検出、定量等）することをいう。
前記フローサイトメトリー用マルチプレックシングキットは、すぐにフローサイトメトリーに適用する観点から、複数種ある蛍光シリカ粒子それぞれが、別個の標的（生体分子、細胞等）を分子認識するように修飾された複数種の蛍光シリカ粒子を組み合わせてなることが好ましい。
前記修飾された複数種の蛍光シリカ粒子の構築は、「シリカ粒子表面修飾」について前述した通りである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
以下、別の態様としての、標的細胞の検出もしくは分取システム、及び標的細胞の検出もしくは分取方法（以下、単に、「標的細胞の検出・分取システム及びその方法」という。）について説明する。
前記標的細胞の検出・分取システム及びその方法は、耐退色性を与えた標識ビーズとして、フローサイトメーターで検出可能な蛍光を発する１又は２種以上の蛍光シリカ粒子を用いて、検体中の１又は２種以上の標的細胞を標識付けし、前記１又は２種以上の標的細胞を標識付けした前記蛍光シリカ粒子が発する蛍光をフローサイトメーターで検出することを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
前記標的細胞としては特に制限はないが、骨髄球系細胞、Ｂリンパ系細胞、Ｔリンパ系細胞、造血幹細胞、悪性腫瘍細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）、ウイルス感染細胞（例えば、インフルエンザウイルス感染細胞）、異種移植に用いる細胞（例えば、ブタ肝臓細胞）等を挙げることができる。
前記標的細胞の検出・分取システム及びその方法において、前記蛍光シリカ粒子の表面を、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に吸着もしくは結合する物質で修飾することが好ましい。
前記標的細胞が表面マーカーとして表層糖鎖（例えば、任意の細胞表層糖鎖中に含有されるマルトース、任意の細胞表層のシアリル・ルイスＸ含有糖鎖）を有する場合、前記蛍光シリカ粒子の表面を、標的細胞の表層糖鎖に特異的に結合する抗体ないしはレセプター（例えば、マルトース結合タンパク、シアリル・ルイスＸを認識する任意のセレクチン）で修飾することが好ましい。
前記標的細胞が表面マーカーとして表面抗原（例えば、ブタ肝臓細胞表層のα−Ｇａｌエピトープ）を有する場合、前記蛍光シリカ粒子の表面を、標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体（例えば、ヒト抗α−Ｇａｌ抗体）もしくはレセプターで修飾することが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
前記標的細胞の検出・分取システム及びその方法において、標的細胞を分取するためには、用いるフローサイトメーターに任意のセルソーターを設けることが好ましい。前記セルソーターは水滴荷電方式、セルキャプチャー方式等任意の方式であってよい。
セルソーターは、例えば、フローサイトメーターにおいて、前述のようにレーザー照射され、各蛍光シリカ粒子について検出データが取得された後、この取得データに基づき前記サンプルコアをプラスまたはマイナスに帯電させ、電圧板を用いてソーティングする等の装置である。
ＭｏＦｌｏ（商品名；ダコジャパン社製）等市販のセルソーターを用いてもよいし、市販のセルソーター装備フローサイトメーターとして、例えば、ＰＥＲＦｌｏｗ  Ａｌｌ（商品名；古河電気工業社製）等を用いてよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
前記細胞の検出もしくは分取システム及びその方法は、ガン細胞表層、ウイルス感染細胞表層、異種移植細胞表層等の細胞表層の特徴に基づき、任意の複数種の細胞をわずか一回の測定で検出し、それぞれ単離することができる。臨床試料等の入手試料に限界がある場合、極微量細胞を単離する場合に有用である。
本発明の生体分子の定量システム、細胞の検出もしくは分取システムに用いられる蛍光シリカ粒子は、低コストで、任意の生体分子、細胞等を標的とするための表面修飾ができ、複数種の蛍光色素の導入ができ、蛍光強度を変えて多様に異なるシリカ粒子としえる。また、前記蛍光シリカ粒子は、蛍光材料として耐退色性に優れる。
前記マルチプレックシングキットは、前記蛍光シリカ粒子複数種組み合わせてなり、バーコード標識ビーズである蛍光材料として用いることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
参考例１(細胞標識用蛍光シリカ粒子の調製)
まず、実施例１と同様にフルオレセイン-シランカップリング剤複合体を調製した。
具体的には、５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ロッシュ社製)３．３ｍｇを１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、フルオレセイン-シランカップリング剤複合体の溶液を得た。
続いて、エタノール６．４ｍｌ、蒸留水１．６ｍｌ、２８質量％アンモニア水１００μｌを混合し、ここにフルオレセイン-シランカップリング剤複合体４０μｌ、ＴＥＯＳ２０μｌを加え、室温で２４時間反応を行った。
反応液を２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え分散させ、再度２２０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光シリカ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
これによって、５(６)−カルボキシフルオレセイン含有シリカ粒子（平均粒径３９ｎｍ）を得た。収率４８％。
図５に得られた蛍光シリカ粒子ビーズのＳＥＭ写真像を示す。図中、白く見える球形状物質が、得られた蛍光シリカ粒子ビーズである。図５のＳＥＭ写真を観察し、前記蛍光シリカ粒子が得られたことを確認した。
蛍光シリカ粒子分散液（２ｍｇ／ｍｌ、蒸留水に分散）９ｍｌに５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍｌ加え軽く混合した。ここに蒸留水に溶解した抗マウスＣＤ４抗体６０μｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。続いて１０％ＢＳＡを１．１ｍｌ加え、軽く撹拌した。
８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。ここに２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ加え、粒子を分散させた。再度８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去後、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）を２ｍｌ加え、粒子を分散させ、抗マウスＣＤ４抗体で修飾された蛍光シリカ粒子分散液を得た（８．２ｍｇ／ｍｌ×２ｍｌ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
参考例２(蛍光シリカ粒子によるマウス脾細胞の標識)
マウス３匹から摘出した脾臓よりマウス脾細胞を取り出した。マウス脾細胞を０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）添加ＰＢＳで１回洗浄後、遠心分離し上清を除去した。ここに赤血球除去用トリス緩衝液（ＡＣＴＢ）を１０ｍｌ加えピペッティングによって混合後、５分間放置して赤血球破砕処理を行った。続いて０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳを２０ｍｌ加えて希釈し、遠心分離を行って上清を除去後０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで２回脾細胞を洗浄し、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ５ｍｌに分散させた。得られたマウス脾細胞分散液５００μｌに、抗マウスＣＤ４抗体で修飾された蛍光シリカ粒子分散液を１００μｌ加え０℃で３時間、抗原抗体反応を行った。
反応後、マウス脾細胞を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌの０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳに分散させた。
得られたマウス脾細胞分散液をフローサイトメーターで測定した。
図６は、前記測定結果を示す、４８８ｎｍ励起光による５３０ｎｍの蛍光強度を横軸（ＦＬ１）に、カウント数を縦軸にしたヒストグラムである。図６中、蛍光強度の弱いゲート１（Ｇ１）の領域は、ＣＤ４陰性細胞のカウント数を示し、蛍光強度の強いゲート２（Ｇ２）の領域は、ＣＤ４陽性細胞を標識付けした蛍光シリカ粒子のカウント数を示す。このヒストグラムから全体の約２０％の細胞がＣＤ４陽性細胞であることを確認した。
【国際調査報告】
2007097377.tif 000019
2007097377.tif 000020
2007097377.tif 000021
2007097377.tif 000022