(57)【要約】オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、カルボン酸またはステロイド骨格を有する化合物をリンカーを介して結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドを提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物または式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、固相合成により製造することができる。  【化１】2007094218.tif 000035前記式中、Ｒ1、Ｒ2、ｎ、ｍ、ＲAおよびＲSは、明細書中に定義のとおり。
2007094218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチド。
ＲA−ＣＯＯＨ      （ＩＩＩ）
前記式中、ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。
【請求項２】
式（ＩＡ）で表される請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【化１】
2007094218.tif 000032
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。
【請求項３】
前記飽和脂肪族炭化水素基が、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記不飽和脂肪族炭化水素基が、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＲAが、ＣＨ3−（ＣＨ2）14−またはＣＨ3−（ＣＨ2）7−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）7−である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。
【請求項７】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ−１）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ2―ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−      （ＩＶＡ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。
【請求項８】
二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
ＲS−ＯＨ          （ＩＩ）
前記式中、ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド類似体が、式（ＩＳ）で表される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【化２】
2007094218.tif 000033
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。
【請求項１０】
前記ＲSが、
【化３】
2007094218.tif 000034
からなる群から選択される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。
【請求項１２】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ−１）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ2―ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−      （ＩＶＳ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝情報そのものを治療の対象としてとらえるという方法論が普及しつつある。この方法論の一つに、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法がある。アンチセンス法とは、化学合成したオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜２０の塩基対から成る一本鎖DNA）を細胞に加え、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＤＮＡ等／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成させることにより、標的遺伝子の発現を塩基配列特異的に抑制し、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を阻害する方法である。アンチセンス法では、病因となるウイルスまたは遺伝子の塩基配列が既知の場合、アンチセンス分子を理論的に設計し、それを合成するのが可能であることから、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待されている。【０００３】
また、ごく最近、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制法として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference、ＲＮＡ干渉）を利用した方法に、注目が集まっている。このＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する細胞の染色体由来のＲＮＡが分解され、切断される現象を指す。このＲＮＡｉの機構は、現在のところ、次のように考えられている。先ず、長鎖二本鎖ＲＮＡが、酵素（Ｄｉｃｅｒと呼ばれる）により３’−ＵＵ型のダングリングエンド構造を持つ２１塩基程度の長さの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）と呼ばれる）に加水分解される。そのｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡとＲＮＡ／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を認識する細胞内タンパク質（ＲＩＳＣ（RNA-induced Silencing Complex）と呼ばれる）と、この二本鎖核酸とが結合し、この結合体により、標的ｍＲＮＡが切断されるというものである。このＲＮＡｉを利用する方法によると、多くの場合、アンチセンス法と比較して１／１００程度の濃度のＲＮＡを用いて同等の効果が得られている。従って、ＲＮＡｉを利用する方法も、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待が高まっている。【０００４】
アンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等、オリゴヌクレオチドを用いる方法では、細胞内に導入されたオリゴヌクレオチドを、安定に存在させる必要もあるが、細胞内外には核酸加水分解酵素（ヌクレアーゼ）が存在し、導入されたオリゴヌクレオチド、特に天然型のオリゴヌクレオチドは容易に分解されてしまうという問題があった。【０００５】
天然型オリゴヌクレオチドとの二本鎖形成能力向上および形成した二本鎖の安定性向上を目的とする、種々のオリゴヌクレオチド類似体も開発されてきた。このようなオリゴヌクレオチド類似体としては、例えば、天然型オリゴヌクレオチドのヌクレオシドのリボースの２’水酸基を、アルコキシ基（例えばメトキシ基）やハロゲン原子（例えばフッ素原子）に置き換えたオリゴヌクレオチド類似体（例えば、非特許文献１参照）等が知られている。これらのオリゴヌクレオチド類似体は、天然型オリゴヌクレオチドとの二本鎖形成能力の向上および形成した二本鎖の安定性の向上が確認されている。しかし、これらのオリゴヌクレオチド類似体は、天然型オリゴヌクレオチドと構造が類似しているため、ヌクレアーゼ耐性の向上は実現されていなかった。【０００６】
一方、前記修飾オリゴヌクレオチドとしてセンス鎖の３’末端にコレステロールを結合させた修飾ｓｉＲＮＡが、動物モデルで高脂血症の治療において有用であることが確認されている（例えば、非特許文献２参照）。【０００７】
このように、優れたヌクレアーゼ耐性という特性と、優れた二本鎖形成能力および形成した二本鎖の優れた安定性という特性は、両立するのが困難であるという問題があった。しかし、ＤＮＡチップ、遺伝子診断薬等にオリゴヌクレオチド類似体を用いる場合、安定した診断結果を得るためにも、これらの特性が優れたオリゴヌクレオチド修飾体の提供が望まれていた。
【非特許文献１】Andrew M. Kawasaki, Martin D. Casper, Susan M. Freier, Elena A. Lesnik, Maryann C. Zounes, Lendell L. Cummins, Carolyn Gonzalez and P. Dan Cook, "Uniformly modified 2'-deoxy-2'-fluoro phophorothioate oligonucleotides as nuclease-resistant antisense compounds with highly affinity and specificity for RNA targets", Journal of Medicinal Chemistry, １９９３年、第３６巻、p.831.
【非特許文献２】Jurgen Sontschek et al., Nature, 2004年、第432巻、p.173
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、ヌクレアーゼ耐性および二本鎖形成能という２つの特性が優れた３’末端が修飾されたオリゴヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドである。
ＲA−ＣＯＯＨ      （ＩＩＩ）
前記式中、ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。【００１０】
また、本発明は、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。
ＲS−ＯＨ          （ＩＩ）
前記式中、ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれるヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、カルボン酸またはステロイド骨格を有する化合物を結合させることにより修飾し、その修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性向上および二本鎖形成能の向上を実現した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１（ａ）】図１（ａ）は、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。
【図１（ｂ）】図１（ｂ）は、３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。
【図１（ｃ）】図１（ｃ）は、３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、前記のように、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドである。
ＲA−ＣＯＯＨ      （ＩＩＩ）
前記式中、ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。【００１４】
前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドとしては、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。【００１５】
【化４】
2007094218.tif 000003
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。【００１６】
前記式（ＩＡ）中、前記飽和脂肪族炭化水素基は、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基であるのが好ましい。また、前記式（ＩＡ）中、前記不飽和脂肪族炭化水素基は、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基であるのが好ましい。【００１７】
前記式（ＩＡ）中、前記ＲAは、ＣＨ3−（ＣＨ2）14−またはＣＨ3−（ＣＨ2）7−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）7−であるのがより好ましい。【００１８】
前記式（ＩＡ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基であるのが好ましい。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００１９】
前記式（ＩＡ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＡ−１）に示す二価の基であるのが好ましい。
―ＣＨ2―ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−      （ＩＶＡ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。【００２０】
前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。前記修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を有するのが好ましい。【００２１】
前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。【００２２】
本発明は、また、前記のように、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。
ＲS−ＯＨ          （ＩＩ）
前記式中、ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。【００２３】
前記オリゴヌクレオチド類似体は、式（ＩＳ）で表されるのが好ましい。【００２４】
【化５】
2007094218.tif 000004
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。【００２５】
前記式（ＩＳ）中、前記ＲSは、【００２６】
【化６】
2007094218.tif 000005
からなる群から選択されるのが好ましい。【００２７】
前記式（ＩＳ）中、  前記二価の基は、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基であるのが好ましい。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００２８】
前記式（ＩＳ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＳ−１）に示す二価の基であるのが好ましい。
―ＣＨ2―ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−      （ＩＶＳ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。【００２９】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有するのが好ましい。【００３０】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）であり、
前記ｍＲＮＡの一部が、
スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、
前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせであるのがより好ましく、前記センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、その３’末端にさらに２つの塩基配列を含むヌクレオチドを有するのがさらに好ましい。【００３１】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。【００３２】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである遺伝子発現抑制剤である。【００３３】
本発明はまた、遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、本発明の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物である。前記医薬組成物は、さらに細胞導入用賦形剤を含むのが好ましい。前記細胞導入用賦形剤は、トランスフェクション試薬であるのが好ましい。【００３４】
本発明はまた、ＲＮＡｉキットであって、前記キットが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含むキットである。【００３５】
本発明はまた、ＲＮＡｉ研究用試薬であって、前記試薬が、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む試薬である。【００３６】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を抑制する方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである方法である。【００３７】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡｉを引き起こす方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである方法である。【００３８】
本発明はまた、下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用化合物を出発原料として、
下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ1を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法である。【００３９】
【化７】
2007094218.tif 000006
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＡ）で表される基である。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００４０】
本発明はまた、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチド製造のための下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物である。【００４１】
【化８】
2007094218.tif 000007
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＡ）で表される基である。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００４２】
本発明はまた、下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用化合物を出発原料として、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ1を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法である。【００４３】
【化９】
2007094218.tif 000008
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＳ）で表される基であり、
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００４４】
本発明はまた、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチド製造のための下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物である。【００４５】
【化１０】
2007094218.tif 000009
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＳ）で表される基であり、
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００４６】
次に、本発明について具体的に説明する。【００４７】
本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、例えばヌクレオシドサブユニットのポリマーをいい、そのサブユニット数は特に限定されないが、例えば、４から１００個である。中でも、本発明の修飾オリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合には、それらのサブユニット数は、２〜１００個が好ましく、４〜３０個がより好ましく、ＲＮＡである場合には、２〜５０個が好ましく、４〜３０個がより好ましい。なお、本発明における「オリゴヌクレオチド」は、３’末端のヌクレオシドの３’−水酸基が修飾されていること以外は、特に限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドのサブユニットであるヌクレオシドについては、糖部（例えば、２’置換体）および塩基は、当業者に公知な修飾体であってもよい。【００４８】
前記のように、本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端にリンカーを介して、前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドであるが、以下、これを便宜的に酸修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶ。【００４９】
前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端にリンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた酸修飾オリゴヌクレオチドとしては、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。【００５０】
【化１１】
2007094218.tif 000010
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。【００５１】
前記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、以下のように表わすことができる。【００５２】
【化１２】
2007094218.tif 000011
前記式中、Ｗ1およびＷ2は、水素または水酸基であり、Base１およびBase２は、下記式（１）で表される基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基、下記式（４）で表される基および下記式（５）で表される基から独立して選択される。【００５３】
【化１３】
2007094218.tif 000012
前記飽和脂肪族炭化水素基としては、飽和炭化水素にカルボキシ基が置換されたものを意味し、例えば炭素数１〜２５、好ましくは１０〜２５、より好ましくは１５〜２０の飽和脂肪族炭化水素基である。飽和脂肪族炭化水素基としては、たとえば、メタン酸（ギ酸）、エタン酸（酢酸）、プロパン酸（プロピオン酸）、ブタン酸（酪酸）、２−メチルプロパン酸（イソ酪酸）、ペンタン酸（吉草酸）、３−メチルブタン酸（イソ吉草酸）、２，２−ジメチルプロパン酸（ピバル酸）、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸（ラウリン酸）、トリデカン酸、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）、ノナデカン酸、イコサン酸等が挙げられる。中でも、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）が好ましい。【００５４】
前記不飽和脂肪族炭化水素基としては、アルケン、アルキン等の不飽和炭化水素にカルボキシ基が置換されたものを意味し、例えば炭素数３〜２５、好ましくは１０〜２５、より好ましくは１５〜２０の飽和脂肪族炭化水素基である。不飽和脂肪族炭化水素基としては、たとえば、プロペン酸（アクリル酸）、プロピン酸（プロピオル酸）、２−メチルプロペン酸（メタクリル酸）、trans−ブタ−２−エン酸（クロトン酸）、cis−ブタ−２−エン酸（イソクロトン酸）、cis−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）、trans−オクタデカ−９−エン酸（ライジン酸）等が挙げられる。中でもcis−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）が好ましい。【００５５】
前記アリール基としては、全体で５〜５０の環原子を有し、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基を意味する。前記アリール基としては、例えば、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。【００５６】
前記複素環式基としては、全体で５〜５０の環原子を有し、少なくとも１つの環がヘテロ原子を有し、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基を意味する。前記複素環式基としては、たとえば、チオフェニル、フラニル、ピラニル、キサンテニル、ピロリル、イミダゾリル、ピリジル等が挙げられる。【００５７】
前記式（ＩＡ）中における前記二価の基としては、例えば、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基が挙げられるが、この基には限定されない。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００５８】
本発明の酸修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよい。本発明の酸修飾オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成能に優れるので、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等として用いるのに好ましい。酸修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖である場合、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの一方または両方の一本鎖オリゴヌクレオチドが、酸修飾オリゴヌクレオチドであるのが好ましい。前記二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の一本鎖オリゴヌクレオチドが酸修飾オリゴヌクレオチドである場合、両酸修飾オリゴヌクレオチドは、同一であっても、相違してもよい。【００５９】
前記酸修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部または全部と相補的な配列を有するのが好ましい。修飾オリゴヌクレオチドが、このようなｍＲＮＡと二本鎖を形成し、エンドヌクレアーゼ等の発現を抑制可能だからである。【００６０】
また、前記のように、本発明は、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、前記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドであるが、以下、これを便宜的にステロイド修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶ。【００６１】
前記オリゴヌクレオチド類似体としては、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。【００６２】
【化１４】
2007094218.tif 000013
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。【００６３】
前記式（ＩＳ）で表されるオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、以下のように表わすことができる。【００６４】
【化１５】
2007094218.tif 000014
前記式中、Ｗ1およびＷ2は、水素または水酸基であり、Base１およびBase２は、下記式（１）で表される基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基、下記式（４）で表される基および下記式（５）で表される基から独立して選択される。【００６５】
【化１６】
2007094218.tif 000015
前記ステロイド骨格とは、シクロペンタヒフォロフェナントレン誘導体を意味し、３つの六員環と１つの五員環とが縮合した構造を有する。前記ＲSにおいては、このステロイド骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられていてもよい。前記ＲS中の置換基とは、例えば、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、１，５−ジメチルヘキシル等）、水酸基、等である。前記置換基は、０〜１０個有していてもよい。前記ＲSとしては、例えば、以下の式に示すものが挙げられる。【００６６】
【化１７】
2007094218.tif 000016
前記式（ＩＳ）中における前記二価の基としては、例えば、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基が挙げられるが、この基には限定されない。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ2）m−または（ＣＨ2）m−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。【００６７】
前記修飾オリゴヌクレオチド（酸修飾オリゴヌクレオチドおよびステロイド修飾オリゴヌクレオチド）が二本鎖である場合、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。このような修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ研究等に有用だからである。前記エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＲＮａｓｅＬ等が挙げられる。【００６８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）であり、前記ｍＲＮＡの一部が、スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせであるのが好ましい。このようなセンス鎖は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute）等の公知遺伝子データベースを用いて、例えばエキソヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列を取得する。その遺伝子配列中、スタートコドンから７５塩基以上下流の、最初のＡＡ配列を見つける。そのＡＡ配列に続く１９塩基配列、合計２１塩基配列が、再度、公知の遺伝子データベースを用いて、目的とする遺伝子に対して特異的であることを確認する。なお、この１９塩基配列は、ＧＣ含有量が５０％前後であることも確認する。この２つを確認して、得られた１９塩基配列が、前記のようなセンス鎖である。【００６９】
前述のように修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、前記センス鎖およびアンチセンス鎖の一方またはその両方は、その３’末端にさらに２つの塩基配列を有するのが好ましい。３’末端にこのような配列を有すると、ＲＮＡｉが引き起こされやすくなるからである。このような２つの塩基配列としては、例えばＴＴ、ＴＡ等が挙げられるが、これに限定されない。【００７０】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドが、細胞内に取り込まれた際、ヌクレアーゼで分解されるのを防ぐことができ、その結果、修飾オリゴヌクレオチドの細胞内での活性を、持続させることが可能だからである。【００７１】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む。このような遺伝子発現抑制剤は、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。【００７２】
本発明の医薬組成物は、遺伝子発現に伴う疾患を治療するためであり、前記遺伝子発現抑制剤を含むものである。遺伝子発現に伴う疾患、例えば、あるタンパク質が発現されることにより疾患が引き起こされる場合、この医薬組成物により、その遺伝子発現を抑制し、その遺伝子発現に伴う疾患を治療するのに用いることが可能である。【００７３】
このような医薬組成物は、さらに細胞導入用賦形剤を含むのが好ましい。遺伝子発現に伴う疾患を治療する際、細胞内への導入を容易にすることが可能になるからである。前記細胞導入用賦形剤としては、例えば、トランスフェクション試薬等が挙げられる。前記トランスフェクション試薬とは、例えば、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を、リン脂質を用いて構成された人工脂質小胞（リポソーム）で包み込み、この人工脂質小胞を細胞懸濁液に加え、細胞表面に付着させ、細胞膜と融合させて、人工脂質小胞中のＤＮＡ分子を細胞内に取り込ませるリポフェクション方法において、用いられる、人工脂質小胞を形成する試薬である。前記トランスフェクション試薬としては、例えば、リポフェクタミン（インビトロジェン（Invitrogen）社製）、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）、オリゴフェクタミン（Oligofectamin（インビトロジェン社製））、トランスメッセンジャー（TransMessenger（キーゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製））、ｓｉＲＮＡトランスフェクション・キット・ジェットＳＩ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製）、ジーンスライサーＳｉＲＮＡトランスフェクション試薬（ジーン・セラピー・システムズ（Gene Therapy Systems）社製）等が、挙げられる。【００７４】
前述のように細胞導入用賦形剤を含むことによる他、本発明の医薬組成物は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を用いて、細胞内に導入することもできる。前記エレクトロポレーション法は、例えば、細胞に電気パルスをかけてその細胞壁に穴をあけ、その穴から本発明の医薬組成物を細胞内へ導入する方法である。前記パーティクルガン法は、金微粒子にＤＮＡ分子（前記医薬組成物）などの分子を付着させ、パーティクルガン（粒子銃）を用いて、圧縮ヘリウムガスを利用し、銃弾を撃ち込むように金微粒子を細胞膜に透過させて、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を細胞内に導入する方法である。【００７５】
本発明のＲＮＡｉキットは、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。このようなキットは、他に、ウエルと修飾オリゴヌクレオチド等とが固定されたプレート、ファイバー、バイオチップ等の固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記修飾オリゴヌクレオチド等のほかに、例えば、薬物、反応して発色する発色試薬、検出を容易にする検出試薬等を含んでもよい。【００７６】
本発明のＲＮＡｉ研究用試薬は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ研究の際、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞へ導入すると、細胞固有の防御反応が活性化され、ｍＲＮＡをランダムに分解する反応が生じたりして、細胞内でＲＮＡｉが生じているかどうかが、判断できない場合がある。このｍＲＮＡのランダム分解は、以下のメカニズムで生じると考えられている。まず、ｄｓＲＮＡにより２−５オリゴアデニル酸合成酵素（２−５ＡＳ）が活性化され、それにより生じた２−５Ａが、ＲＮＡａｓｅＬを活性化する。そのＲＮＡａｓｅＬが、ｍＲＮＡをランダムに分解するというものである。ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドは、このＲＮＡａｓｅＬの発現を抑制可能であるので、ｍＲＮＡのランダム分解を抑制でき、その結果、例えばＲＮＡｉが細胞内で生じているか否かが判断しやすくなる。【００７７】
本発明の遺伝子発現抑制方法は、修飾オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。【００７８】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす方法は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮＡｉを引き起こす方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡであるので、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。【００７９】
次に、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来製造することができなかった本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造が可能になった。【００８０】
まず、酸修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００８１】
例えば、下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ1を除去して遊離の水酸基に変換し、
前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００８２】
【化１８】
2007094218.tif 000017
前記式中、ＲAは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
ｎは、１〜２０の整数である。【００８３】
前記式（ＸＩＡ）中、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、および複素環式基については、前記式（ＩＡ）中の飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、および複素環式基について定義したとおりである。【００８４】
次に、ステロイド修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００８５】
例えば、下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ1を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００８６】
【化１９】
2007094218.tif 000018
前記式中、ＲSは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ1は、水酸基の保護基であり、
Ｒ2は、固相担体であり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
ｎは、１〜２０の整数である。【００８７】
前記式（ＸＩＳ）中のＲSについては、前記式（ＩＳ）中のＲSについて定義したとおりである。【００８８】
本発明において、前記水酸基の保護基とは、従来公知の１級アルコールの保護基、例えば、ヌクレオシド化学の分野で公知の、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４
−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、（９−フェニル）キサンテン−９−イル［ピキシル（pixyl）］等が、その保護基として用いられうる。【００８９】
本発明において、前記固相担体とは、固相担体でＤＮＡ、ＲＮＡ等を合成するのに適した固相担体であれば限定されず、例えば、ＣＰＧ（コントロール細孔ガラス）、ＨＣＰ（highly cross-linked polystyrene)等である。【００９０】
前記方法においてＲ1を除去するには、Ｒ1の種類に応じて適宜酸、アルカリ、触媒等を選択して行うことができる。【００９１】
前記方法において前記固相合成用ユニット化合物の遊離の水酸基にヌクレオチドを伸長させるには、オリゴヌクレオチド合成分野で従来公知の技術を用いて、修飾オリゴヌクレオチドの配列に従い、ヌクレオシドを順次カップリングさせて行うことができる。【００９２】
なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上の修飾オリゴヌクレオチドは、必要であればオリゴヌクレオチド側鎖の脱保護を行った後、固相担体から切り出して、粗修飾オリゴヌクレオチドを得る。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリンカー（固相担体と修飾オリゴヌクレオチドを接続する部分）構造等に応じて、従来公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗修飾オリゴヌクレオチドは、必要であれば、ＨＰＬＣ等で精製してもよい。【００９３】
次に、修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合の製造について例を挙げて説明する。例えば前記のような方法に従い、一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをまず製造する。その修飾オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドも別途、従来公知の方法に従い、製造する。次いで、得られた一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液（例えば、１００ｍＭのＫＯＡｃ水溶液、２ｍＭのＭｇＯＡｃ溶液、および３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液）中に溶解させたものと、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液中に溶解させたものとを、例えば混合し、９５℃で５分間処理し、その後、徐々に２５℃まで冷却させて、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。この二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿等をさらに行って、単離精製することができる。【００９４】
前記製造方法で用いる式（ＸＩＡ）の固相合成用ユニット化合物および式（ＸＩＳ）の固相合成用ユニット化合物は、例えば、以下のような方法で製造することができる。【００９５】
まず、ユニット化合物（ＸＩＡ）の製造についてスキーム１を参照して説明する。例えば、式（ＸＩＩ）で表される化合物と、ＲA−ＣＯＯＨおよびペプチド用縮合剤とを反応させ、式（ＸＩＩＩＡ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＩＩＩＡ）で表される化合物のＲ3を除去し、次いで下記式（ＸＩＶ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＶＡ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＶＡ）で表される化合物と、アミノ基を有する固相担体とを反応させ、前記式（ＸＩＡ）で表される化合物を得る方法により、製造することができる。【００９６】
【化２０】
2007094218.tif 000019
まず、ユニット化合物（ＸＩＡ）の製造について、スキーム１を参照しながら説明する。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体と、ＲA−ＣＯＯＨとを、ペプチド用縮合剤（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩）存在下に縮合させ、式（ＸＩＩＩＡ）の化合物を得る。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体は、市販で入手してもよいし、グリセロールの１位と３位の水酸基を保護した、例えば、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（De Napoli, et. al, Tetrahedron 1999, 55(32), 9899-9914参照）から公知文献を利用して自家製造してもよい。【００９７】
次に、得られた式（ＸＩＩＩＡ）の化合物のＲ3を除去し、次いで無水物（ＸＩＶ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、式（ＸＶＡ）の化合物を得る。【００９８】
次に、得られた式（ＸＶＡ）の化合物と、アミノ基を有する固相担体Ｒ2−ＮＨ2とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＡ）を得る。【００９９】
つぎに、ユニット化合物（ＸＩＳ）の製造についてスキーム２を参照して説明する。例えば、式（ＸＩＩ）で表される化合物と、ＲS−ＯＨおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールとを反応させ、式（ＸＩＩＩＳ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＩＩＩＳ）で表される化合物のＲ3を除去し、次いで下記式（ＸＩＶ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＶＳ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＶＳ）で表される化合物と、アミノ基を有する固相担体とを反応させ、前記式（ＸＩＳ）で表される化合物を得る方法により、製造することができる。【０１００】
【化２１】
2007094218.tif 000020
式（ＸＩＩ）のアミン誘導体と、ＲS−ＯＨとを、１，１’−カルボニルジイミダゾール存在下に縮合させ、式（ＸＩＩＩＳ）の化合物を得る。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体は、市販で入手してもよいし、グリセロールの１位と３位の水酸基を保護した、例えば、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（De Napoli, et. al, Tetrahedron 1999, 55(32), 9899-9914参照）から公知文献を利用して自家製造してもよい。【０１０１】
次に、得られた式（ＸＩＩＩＳ）の化合物のＲ3を除去し、次いで無水物（ＸＩＶ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、式（ＸＶＳ）の化合物を得る。【０１０２】
次に、得られた式（ＸＶＳ）の化合物と、アミノ基を有する固相担体Ｒ2−ＮＨ2とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＳ）を得る。【０１０３】
なお、スキーム１および２の各工程において、必要であれば、各官能基に保護基を導入したり、保護基を脱保護したり、保護基を変更してもよい。なお、官能基の種類に応じた保護基の選択、保護基の導入および保護基の除去は、当該分野で公知の方法に従い、行うことができ、例えば、「有機合成における保護基（"Protective Groups in Organic Synthesis"）, T. Greeneら著、John Wiley & Sons, Inc.出版」等を参照することができる。
【実施例】
【０１０４】
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＡＰＳ：  アンモニウム ペルオキソジサルフェート（ammonium peroxodisulfate）
ＣＰＧ：  コントロール細孔ガラス （controlled pore glass）
ＤＭＡＰ：  4-ジメチルアミノピリジン （4-dimethylaminopyridine ）
ＤＭＴｒＣｌ：  4,4'-ジメトキシトリチルクロライド （4,4'-dimethoxytritylchloride ）
ＤＭＦ：  ジメチルホルムアミド （dimethylformamide ）
ＥＤＴＡ：  エチレンジアミン-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ジナトリウム塩・de
hydrate （ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dehydrate ）
ＦＡＢ：  高速原子衝撃（fast atom bombardment ）
ＨＲＭＳ：  高分解能質量分析（high-resolution mass spectrometry ）
Ｉｍ2ＣＯ：  １−１’−カルボニルビス−１Ｈ−イミダゾール  （1-1'-Carbonylbis-1
H-imidazole ）
ｍＲＮＡ：  メッセンジャー リボ核酸 （messenger ribonucleic acid ）
ＮＢＡ：  ３-ニトロベンジルアルコール （3-nitrobenzylalchol）
ＰＡＧＥ：  ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （polyacrylamide gel electrophoresis ）
ＴＢＡＦ：  トリブチルアンモニウムフルオライド（tributylammoniumfluoride）
ＴＢＥ：  Tris-ホウ酸-EDTA（Tris-boric acid-EDTA）
ＴＥＡＡ：  トリエチルアミン-酢酸（triethylamine-acetic acid）
ＴＢＤＭＳＣｌ：  tert-ブチルジメチルシリルクロライド（tert-butyldimethylsilylchloride）
ＴＥＭＥＤ：  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（N,N,N',N'-tetr
amethyl-ethylenediamine）
ＴＨＦ：  テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran）
TRIS：  トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（tris(hydroxymethyl)aminomethane）
ＷＳＣ：  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, hydrochloride）
ＣＰＧ上の化合物の活性は、以下のようにして算出した。【０１０５】
乾燥させたＣＰＧ６ｍｇをガラスフィルターにのせ、そこへＨＣｌＯ4およびエタノールの混合物（ＨＣｌＯ4：ＥｔＯＨ＝３：２）を流し込んだ。得られたろ液の吸光度（波長４９８ｎｍ（ＤＭＴｒ基の吸収波長））を測定し、その値を以下の式に代入して算出した。【０１０６】
【数１】
2007094218.tif 000021
前記式中、Abs.は、波長４９８ｎｍにおけるＣＰＧの吸光度であり、
Vol.は、測定したろ液の容量であり、
weightは、測定したCPGの重量である。【０１０７】
１．修飾１本鎖オリゴヌクレオチドまたは修飾２本鎖オリゴヌクレオチド製造のための、モノマー製造【０１０８】
【化２２】
2007094218.tif 000022
（Ｉ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グリセロール（1-O- (4,4'-dimet
hoxytrityl)-glycerol）（２３）の製造
グリセロール（１．０ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）のピリジン（２４ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰを少量加え撹拌した。そこにＤＭＴｒＣｌ（３．６８ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）のピリジン（３０ｍＬ）溶液を加え、１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（×２）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量２．５２ｇ、６．３９ｍｍｏｌ、収率５９％）。【０１０９】
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ：2.87-2.93 (2H, m, 1-H), 3.30-3.41 (2H, m, 3-H), 3.53-3.65 (1H, m, cross), 3.71 (6H, s, -OCH3), 4.44 (1H, t, J=5.6Hz, 3-OH), 4.74 (1H, d, J=4.8Hz, 2-OH), 6.85-7.40 (13H, m, DMTr)。【０１１０】
（ＩＩ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol）（２４）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グリセロール（２４）（２．４６ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、イミダゾール（０．８５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を加えて溶解させた。そこにＴＢＤＭＳＣｌ（０．９４ｇ、６．２４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を加え、１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水（×３）、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１〜１：３）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量２．６０ｇ、５．１１ｍｍｏｌ、収率８２％）。【０１１１】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.12 (6H, s, TBDMS-CH3), 0.94 (9H, s, t-ブチル), 3.20-3.31 (2H, m, 1-H), 3.69-3.81 (2H, m, 3-H), 3.88 (7H, s, -OCH3 and cross), 7.25-7.53 (13H, m, DMTr)。【０１１２】
（ＩＩＩ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert-butyldimethyl- silylglycerol）（２５）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（２４）（２．６０ｇ、５．１１ｍｍｏｌ）のピリジン（１７ｍＬ）溶液に、Ｉｍ2ＣＯ（１．６６ｇ、１０．２２ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を溶解させ、その反応溶液を１時間撹拌した。原料の消失を確認した後、反応溶液にプトレシン（３ｍＬ、３０．６６ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を氷冷下で滴下した。３時間撹拌した後、反応溶液をクロロホルムで希釈した。前記反応溶液を、水（×３）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶液の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3＝１０〜２５％）で単離精製して、無色のオイル状の表題化合物を得た（収量３．００ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、収率９４％）。【０１１３】
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ：0.13 (6H, s, TBDMS-CH3), 0.97 (9H, s, t-ブチル), 1.72 (4H, s, ブチル), 3.62 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.94 (7H, s, -OCH3 and cross), 6.96-7.61 (13H, m, DMTr), 8.36 (1H, m, NH).
13C-NMR (100MHz, DMSO-d6) δ：-5.58, 17.73, 25.58, 26.76, 27.83, 48.53, 54.97, 61.67, 62.26, 72.52, 85.22, 113.09, 126.58, 127.62, 127.74, 129.63, 135.51, 144.85, 149.28, 155.77, 158.03.
FAB-HRMS(NBA) calcd for C35H51N2O6Si (MH+), 623.3516; found, 623.3508。【０１１４】
（ＩＶａ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-palmitoyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert- butyl- dimethylsilyl- glycerol ）(26a)の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（０．９０ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍＬ）溶液に、パルミチン酸（０．５５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加えて撹拌した。３０分間撹拌した後、前記反応溶液にＷＳＣ（０．４１ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加えて２４時間撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×１）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶液の溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量０．８５ｇ、０．９９ｍｍｏｌ、収率６９％）。【０１１５】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.01 (6H, s, TBDMS-CH3), 0.82 (9H, s, t-ブチル), 0.88-0.91 (3H, m, pal), 1.26 (14H, s, pal), 2.06-2.18 (4H, m, ブチル), 3.24 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.76-3.80 (7H, m, -OCH3 and cross), 6.81-7.46 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：-5.44, 14.09, 25.73, 29.32, 29.47, 29.60, 29.61, 29.65, 31.88, 36.74, 38.99, 40.44, 55.14, 60.37, 62.14, 74.01, 85.74, 112.96, 126.63, 127.68, 128.11, 130.02, 130.03, 136.05, 136.11, 144.92, 156.24, 158.33, 173.26。【０１１６】
（Ｖａ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N-palmitoyl-N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ａ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−グリセロール（２６ａ）（０．７５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．４ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ、２ｍｍｏｌ、２．３ｅｑ．）を滴下した後、１時間撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（×２）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記反応溶液の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ１００％）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量０．５２ｇ、０．７０ｍｍｏｌ、収率８０％）。【０１１７】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.86-0.95 (3H, m, pal), 1.25 (14H, s, pal), 2.02-2.30 (4H, m, ブチル), 3.22-3.30 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.79 (7H, m, -OCH3 and cross), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：13.85, 14.09, 20.49, 22.65, 25.74, 26.74, 27.18, 29.32, 29.47, 29.61, 29.65, 31.87, 36.75, 38.95, 40.55, 52.06, 55.17, 62.86, 63.22, 74.57, 86.12, 113.09, 126.78, 127.80, 128.01, 129.97, 135.72, 144.61, 156.57, 158.45, 173.37.
FAB-HRMS(NBA) calcd for C45H67N2O7 (MH+), 747.49485; found, 747.49549。【０１１８】
（ＶＩａ）パルミチン酸が結合されたＣＰＧユニット（２９ａ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ａ）（０．５２ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）のピリジン（７．０ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．２１ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（１７．５ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．３０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．１３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ2Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で１日ほど振とうさせた。前記反応溶液を除去した後、前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は、２８．１μｍｏｌ／ｇであった（収量０．３２ｇ）。【０１１９】
（ＩＶｂ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔブチル−ジメチル−シリルグリセロール(1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O -[N-oleoyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tertbutyl- dimethyl- silylglycerol）（２６ｂ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（１．５ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１２ｍＬ）溶液に、オレイン酸（１．１５ｍＬ、３．６２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え撹拌した。３０分撹拌した後、その溶液にＷＳＣ（０．６９ｇ、３．６２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え、さらに２６時間撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×１）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量１．８３ｇ、２．０６ｍｍｏｌ、収率８６％）。【０１２０】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.04 (6H, s, TBDMS-CH3), 0.86 (14H, s, t-ブチル and ole), 1.29-2.19 (32H, m, ole and ブチル), 3.23-3.53 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.83 (7H, m, -OCH3 and cross), 5.37-5.40 (2H, m, ole), 6.84-7.49 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：-5.44, 14.10, 18.14, 22.65, 25.74, 26.58, 27.15, 27.19, 27.51, 29.14, 29.25, 29.28, 29.49, 29.62, 29.69, 29.74, 31.87, 36.71, 39.00, 40.44, 50.62, 55.15, 60.39, 62.15, 62.38, 74.03, 85.75, 112.98, 126.64, 127.70, 128.12, 129.72, 129.95, 130.03, 136.06, 136.13, 144.93, 156.30, 158.35, 173.32.
元素分析 Calced for C53H82N2O7Si・CHCl3+1/2CH3OH : C, 71.74; H, 9.31; N, 3.61, Found : C, 64.08; H, 8.30; N, 2.75。【０１２１】
（Ｖｂ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N-oleoyl-N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ｂ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔブチル−ジメチル−シリルグリセロール（２６ｂ）（１．６６ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１８ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下した。７時間後、前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２〜０：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量１．１９ｇ、１．５４ｍｍｏｌ、収率８２％）。【０１２２】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.85 (3H, m, ole), 1.26-2.16 (32H, m, ole and ブチル), 2.68 (1H, br, 3-OH), 3.21-3.29 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.78 (7H, m, -OCH3 and cross), 5.29-5.38 (2H, m, ole), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：14.05, 22.60, 25.70, 26.68, 27.14, 29.09, 29.24, 29.45, 29.65, 29.69, 31.83, 32.53, 36.67, 38.92, 40.50, 55.12, 62.84, 63.06, 74.53, 86.06, 113.05, 126.74, 127.76, 127.98, 129.67, 129.93, 135.70, 144.60, 156.58, 158.40, 173.34.
元素分析. Calced for C47H68N2O7・10/3 CHCl3 : C, 73.02; H, 8.87; N, 3.62, Found : C, 51.79; H, 6.08; N, 2.48。【０１２３】
（ＶＩｂ）オレイン酸が結合されたＣＰＧユニット（２９ｂ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ｂ）（０．７７ｇ、１．００ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．３０ｇ、３．００ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（１２．５ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．５０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ2Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で１日ほど振とうさせた。前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は８３．２μｍｏｌ／ｇであった（収量０．５２ｇ）。【０１２４】
（ＩＶｃ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert- butyldimethylsilyl- glycerol）（２６ｃ）の製造
コレステロール（０．２２ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）のピリジン（３ｍＬ）溶液に、Ｉｍ2ＣＯ（０．１０ｇ、０．６３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、２時間撹拌した。前記反応溶液に、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（０．４３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で単離精製して、白色泡状の表題化合物を得た（収量０．３９ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、収率６４％）。【０１２５】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.10 (6H, s, TBDMS-CH3), 0.68-2.34 (58H, m, t-ブチル and chol and ブチル), 3.09-3.18 (4H, m, ブチル), 3.76-3.79 (7H, m, -OCH3 and cross), 4.48-4.74 (2H, m, 1-H), 4.96-5.37 (2H, m, 2-H), 6.80-7.44 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：-5.40, -3.60, 11.84, 17.96, 18.69, 19.31, 21.01, 22.54, 22.81, 23.80, 24.26, 25.63, 25.76, 27.27, 27.99, 28.15, 28.21, 31.84, 31.87, 35.77, 36.15, 36.52, 36.95, 38.54, 39.48, 39.71, 40.57, 42.28, 49.97, 55.17, 56.09, 56.65, 62.13, 76.68, 85.76, 112.99, 112.45, 126.63, 127.70, 128.14, 130.05, 135.62, 136.13, 139.81, 144.94, 156.10, 158.34.
元素分析 Calced for C63H94N2O8Si・2 H2O : C, 73.07; H, 9.15; N, 2.71, Found : C, 70.63; H, 9.40; N, 2.34。【０１２６】
（Ｖｃ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N- cholesteryloxycarbonyl -N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ｃ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−グリセロール（２６ｃ）（０．３４ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５．０ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（１ｍＬ、１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を滴下した後、４時間撹拌した。反応溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜０：１）で単離精製して、無色オイル状の表題化合物を得た（収量０．６１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、収率５３％）。【０１２７】
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ：0.62-2.28 (49H, m, chol and ブチル), 3.12-3.22 (4H, m, ブチル), 3.73 (8H, s, -OCH3 and cross), 4.42-4.61 (2H, m, 1-H), 4.83-5.30 (2H, m, 2-H), 6.75-7.37 (13H, m, DMTr).
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ：11.83, 18.68, 19.30, 21.01, 22.54, 22.80, 23.80, 24.26, 27.08, 27.28, 27.98, 28.14, 28.21, 31.83, 31.87, 35.77, 36.14, 36.51, 36.93, 38.52, 39.48, 39.70, 40.68, 42.27, 49.95, 55.19, 56.09, 56.65, 62.86, 63.37, 74.55, 86.18, 113.12, 122.46, 126.82, 127.84, 128.02, 129.97, 130.01, 135.71, 135.73, 139.77, 144.59, 156.21, 158.47.
元素分析 Calced for C57H80N2O8・1/3 H2O : C, 74.31; H, 8.75; N, 3.04, Found : C, 73.87; H, 8.68; N, 2.92。【０１２８】
（ＶＩｃ）コレステロールが結合されたＣＰＧユニット（２９ｃ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ｃ）（０．６０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のピリジン（１．７ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．０５１ｇ、０．５１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（２．２ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．１９ｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．０３３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ2Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で２４時間振とうさせた。前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は８８．３μｍｏｌ／ｇであった（収量０．２０ｇ）。【０１２９】
２．一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドの製造
標的タンパクはホモサピエンス・リボヌクレアーゼＬ（Homo sapiens ribonuclease L ）(2',5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent， RNase L) [gi:30795246]とし、標的配列は開始コドンから92番目から114番目にあたる配列番号１からなる塩基配列とした。修飾一本鎖オリゴヌクレオチドとして、この配列番号１からなる塩基配列に対し、３’末端にパルミチン酸、オレイン酸またはコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）と、３’末端にパルミチン酸、オレイン酸またはコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）とを製造した。比較として、配列番号１からなる塩基配列に対し、ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）およびＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）を有するｓｉＲＮＡ（Ambion社製）を用いた。【０１３０】
実施例１
３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
前記ＣＰＧユニット（２９ａ）（各々の活性に基づき１μｍｏｌに相当する量）を核酸自動合成機（Nucleic Acid Synthesis System (Expedite 8909 system, Applied Biosystems社製)）にセットして、配列番号２に従い、ホスホロアミダイト法により３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖をＣＰＧ上に合成した。【０１３１】
縮合時間は１５分とし、ＤＭＴｒ基を除去した状態で合成を終了した。ＣＰＧに結合した修飾ＤＮＡセンス鎖にエタノールとアンモニアの混合（ＥｔＯＨ：ＮＨ3＝１：３）溶液２ｍＬを加え、５５°Ｃで１２時間反応させた。反応後、得られたろ液をエッペンドルフチューブに移し、減圧下に濃縮した。得られた残渣に１ＭのＴＢＡＦのＴＨＦ溶液を１ｍＬ加え、１２時間振とうさせた。前記反応溶液を、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液で希釈し、３０ｍＬとした。この反応液を、Ｃ−１８逆相カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（ＣＨ3ＣＮ１０ｍＬ、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液１０ｍＬを流し平衡化した）に通し、修飾ＤＮＡセンス鎖混合物をカラムに吸着させた。前記カラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き、その後、８０％ＣＨ3ＣＮ水溶液３ｍＬで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮した。得られた残渣にローディング溶液（１×９０％  ホルムアミド中のＴＢＥ）１００μＬを加え、２０％ＰＡＧＥ（２０Ａ、６時間）により目的とする修飾ＤＮＡセンス鎖とその他を分離した。目的とする修飾ＤＮＡセンス鎖のバンドを前記ＰＡＧＥから切り出し、前記バンドに０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液を２０ｍＬ加え、一晩放置した。この溶液をＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）により５０％ＣＨ3ＣＮ水溶液３ｍＬで精製して表題化合物を得た。【０１３２】
前記溶液の調製方法について説明する。【０１３３】
０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液は、以下のようにして調製した。まず、２Ｎの酢酸（１１４．３８ｍＬ）およびトリエチルアミン（２７７．６ｍＬ）の混合物に、水を加えて１Ｌにした。その溶液に酢酸を加えて、ｐＨを７．０に調整し、次いでその溶液を２０倍に希釈することにより調製した。【０１３４】
２０％ＰＡＧＥは、以下のようにして調製した。まず、４０％アクリルアミド（アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝１９：１）溶液（４５ｍＬ）、尿素（３７．８ｇ）および１０×ＴＢＥ緩衝液（９ｍＬ）を混合して溶解させ、その後水を加えて９０ｍＬとした。その溶液に、ＡＰＳ（６２ｍｇ）を加えて溶解させた後、ＴＥＭＥＤ（４５μＬ）を加えて振り混ぜた。その溶液を、１．５ｍｍスペーサーを挟んで固定した２枚ガラス板の間に流し込み、１時間以上静置して固化させて、２０％ＰＡＧＥを得た。【０１３５】
０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液は、ＥＤＴＡ・４Ｎａ（１．８０ｇ）を水（４０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。【０１３６】
１×９０％  ホルムアミドは、１０×ＴＢＥ緩衝液（１ｍｌ）とホルミアミド（９ｍｌ）を混合して調製した。【０１３７】
実施例１Ｐ
配列番号２からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に32Ｐラベルを施した以外は、実施例１と同様にして、配列番号２からなる一本鎖の５’末端が32Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖を製造した。【０１３８】
実施例２
３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。【０１３９】
実施例３
３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
ＣＰＧユニット（２９ａ）の代わりにＣＰＧユニット（２９ｂ）を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。【０１４０】
実施例４
３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、実施例３と同様にして製造して、表題化合物を得た。【０１４１】
参考例１
３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
ＣＰＧユニット（２９ａ）の代わりにＣＰＧユニット（２９ｃ）を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。【０１４２】
参考例２
３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、参考例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。【０１４３】
得られたオリゴヌクレオチドを、水（１ｍＬ）に溶解させ、水で１００倍に希釈して希釈液を調製した。その希釈液の吸光度（２６０ｎｍ）を測定し、収量を算出した。その吸光度のε値、２６０ｎｍにおける吸光度および収率を、表１に示す。また、得られたオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認した。その結果も、表１に示す。【０１４４】
【表１】
2007094218.tif 000023
前記オリゴヌクレオチドの吸光度および収量は、以下のようにして測定した。【０１４５】
前記オリゴヌクレオチドを水に溶解させて、水溶液を調製し、その水溶液を、波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ260）が、吸光度計の有効範囲になるように希釈した。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用い、室温にてＡｂｓ260を測定した。ＯＤ260値の計算には以下の式（１）を用いて算出した。
ＯＤ260（ε・Ｍ・ｍＬ-1）＝Ａｂｓ260（ε・ｃｍ・Ｍ）×Ｖ-1（ｍＬ）×ｌ-1（ｃｍ）      （１）
前記式（１）中、Ａｂｓ260は、前記オリゴヌクレオチド溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を示し、Ｖは溶液の全量を示し、ｌは光路長を示し、Ｍはモル濃度を示す。【０１４６】
前記式（１）中、前記オリゴヌクレオチドのモル吸光係数ε２６０は、以下の式（２）を用いて算出した。
ε＝２｛ε（Ｎ1pＮ2）＋ε（Ｎ2pＮ3）＋・・・＋ε（Ｎn-1pＮn）｝−｛ε（Ｎ2）＋ε（Ｎ3）＋・・・＋ε（Ｎn-1）｝      （２）
前記式（２）中、ε（Ｎn）はある核酸Ｎnのε260を示し、ε（Ｎn-1pＮn）はある核酸二量体Ｎn-1pＮnのε260を示す。なお、（１１−ｓ）、（１１−ａ）、（１２−ｓ）、（１２−ａ）、（１３−ｓ）、（１３−ａ）、（Ｆ１２−ｓ）、（Ｆ１２−ａ）、（Ｐ−１２−ａ）および（Ｐ１３−ａ）については、修飾された３’末端部分のＴＴ配列をＵＵ配列としてε260を計算した。【０１４７】
濃度Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）は、以下の式（３）を用いて算出した。
Ｃ＝Ａｂｓ260×ε260-1×ｌ-1      （３）
前記式（３）中、Ａｂｓ260、ε260、およびｌは、前記のとおりである。
３．修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの製造
実施例５
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖（１ｎｍｍｏｌ）と実施例２で製造した修飾アンチセンス鎖（１ｎｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させた。その溶液を９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間の間、インキュベートして３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１４８】
実施例６
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、実施例３で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖を、実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、実施例４で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１４９】
実施例７
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、参考例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖を、実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、参考例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１５０】
得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。【０１５１】
【化２３】
2007094218.tif 000024
実施例８
実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。【０１５２】
【化２４】
2007094218.tif 000025
実施例９
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、天然型ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いた以外は実施例５と同様にして、天然型ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）および３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。【０１５３】
【化２５】
2007094218.tif 000026
（修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの評価）
１．熱的安定性
実施例５〜７で製造した修飾二本鎖オリゴヌクレオチドについて、５０％%融解温度Tmを測定した。得られた結果を表２に示す。【０１５４】
【表２】
2007094218.tif 000027
天然型ｓｉＲＮＡの構造は、以下のとおりである。【０１５５】
【化２６】
2007094218.tif 000028
前記表２から、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖形成能に優れることが確認できた。【０１５６】
２．細胞内でのＲＮａｓｅＬ発現の評価
（１）  細胞培養
細胞培養１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃でＨＴ１０８０細胞を増殖させた。指数増殖を維持するため、細胞を定期的に継代した。約２５％コンフルエンシーでのトランスフェクションの２４時間前に、ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新しい培地を用いて希釈し、３５ミリデイッシュに移した（２ｍｌ／デイッシュ）。【０１５７】
（２）  修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクション
リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン（Invitrogen）社製）を用いて、接着細胞株に対して以下に記載する方法で修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを行った。まず、ＲＰＭＩ１６４０培地（抗生物質およびＦＢＳを含まない）に、二本鎖オリゴヌクレオチド（前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭ）（実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチド）を溶解させ、５分間室温でインキュベートした。その溶液に、５０倍希釈した等量のリポフェクタミン２０００試薬を添加し、その後２０分間室温でインキュベートした。得られた溶液のうち、５００μｌを採取して、前記（１）で調製した３５ミリデイッシュへ移してトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に、その３５ミリディッシュ中の細胞をインキュベートした。なお、その後、実施例６または実施例７で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれについても、トランスフェクションされた細胞に対する毒性は確認されなかった。【０１５８】
（３）  ウエスタンブロット法によるＲＮａｓｅＬ発現のモニター
トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に得られたＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、得られた細胞ペレットを２倍量の低浸透圧緩衝液Ａ（０．５％（ｖ／ｖ）のノニデット（Nonidet）Ｐ−４０、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣＨ3ＣＯ2Ｋ、１５ｍＭの（ＣＨ3ＣＯ2）2Ｍｇ、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン）に懸濁させた。【０１５９】
得られた細胞懸濁液を１０分間氷上でインキュベートした後、タイト・フィッティング・ガラス・ドウース・ホモジナイザー（Tight-fitting glass dounce homogenizer）を用いて氷上で３０回上下へストロークしてホモゲナイズした。得られたホモジナイズ液を、超遠心機（１００００×ｇ）を用いて４℃で１０分間遠心した。その後、遠心分離された上清液を回収し、その上清液に等量の２×サンプル緩衝液（０．１４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２．８％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、適量のブロモフェノール・ブルー）を加え、沸騰水中で５分間インキュベートした。インキュベートされた上清液を７．５％のポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）を用いて２０ｍＡ、７０分間、電気泳動により分離し、その後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社（Millipore）製）へタンパクを転写した。【０１６０】
前記ＰＶＤＦメンブレンを、５％の牛血清アルブミンで２５℃で１時間の間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ（２００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．６、１．３７Ｍの塩化ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で２回リンスした。そのＰＶＤＦメンブレンを、０．５μｇ／ｍｌの抗ＲＮａｓｅＬモノクローナル抗体で４℃、１６時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。そのＰＶＤＦメンブレンを、次いでセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase）で標識された抗マウスＩｇＧ（５００μｇ／ｍＬを、１０００００倍希釈した）で２５℃で１時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。【０１６１】
前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の検出には、ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（prus western blotting detection kit）（アマシャム（Amersham）社製）を用いて行った。前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の定量は、デンシトメーター（Kodak Digital Science DC290 Zoom Digital Camera）を用いて行った。二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理を行っていない細胞におけるＲＮａｓｅＬ強度を１として、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。なお、求めた数値はＧＡＰＤＨ強度を１とし標準化した。得られた結果を図１（ａ）に示す。【０１６２】
（４）  実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例６および実施例７でそれぞれ得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、（１）〜（３）と同様にして、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。その結果は、図１（ｂ）および図１（ｃ）にそれぞれ示す。【０１６３】
前記図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上し、ＲＮＡｉ活性が向上していることが確認できた。【０１６４】
３．細胞内でのＲＮａｓｅＬに対するＩＣ50の測定
（１）  ２．（２）において用いる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度を、前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭの代わりに１ｎＭ、５ｎＭまたは１０ｎＭを用いる以外は、前記２．（１）〜（４）と同様にして修飾二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。【０１６５】
（２）  また、実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例８および９でそれぞれ得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、４．（１）と同様にして、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。【０１６６】
（３）得られた相対比からＩＣ50を求め、以下の表３に示す。【０１６７】
【表３】
2007094218.tif 000029
前記表３に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、天然型（非修飾）二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上していることが確認できた。この著しい向上は、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞膜の透過性に優れ、ヌクレアーゼ耐性が向上したことから予想される以上の優れた効果である。また、アンチセンス鎖の３’末端が修飾されている実施例９について、センス鎖の３’末端が修飾されている実施例８よりもＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が向上していることが確認できた。【０１６８】
４．ヌクレーゼ耐性
二本鎖修飾オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性の評価
二本鎖修飾オリゴヌクレオチド、天然型の二本鎖オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性を評価した。エキソヌクレアーゼとしては、ヘビ毒ホスホロジエステラーゼ（ＳＶＰ）を使用した。ＳＶＰは、リン酸ジエステル結合を選択的に切断しオリゴヌクレオチドを５’−モノリン酸ヌクレオチドに分解する。【０１６９】
実施例１Ｐで製造した５’末端が32Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖（２０μＭ、４μｌ）と天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）（Ａｍｂｉｏｎ製）（８ｐｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５０ｍＭのＭｇＣｌ2、６μｌ）および水（２６μｌ）の混合物中に溶解させた。その溶液を９５℃で５分間、次いで室温で１時間の間インキュベートして、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された、５’末端が32Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られた二本鎖の構造は、下記式に示すとおりである。【０１７０】
【化２７】
2007094218.tif 000030
前記溶液に、ＳＶＰ（０．４μｇ／ｍｌ、１０μｌ）を添加した。ＳＶＰを添加後、０、１、３、５、１０、３０、６０分後に各エッペンドルフチューブに反応液（５μｌ）をサンプリングし、８Ｍ尿素溶液（５μｌ）と混合して反応を停止させた。なお、０分後のサンプルは、ＳＶＰ水溶液を加えていないものである。得られた各時間におけるサンプルを、９５℃で５分間アニーリングを行った後、２０％変性ＰＡＧＥ（７Ｍ尿素溶液）により解析した（電気泳動緩衝液：１×ＴＢＥ、〜３００Ｖ、２時間電気泳動）。得られた結果を以下の表４に示す。【０１７１】
【表４】
2007094218.tif 000031
前記表４から、修飾オリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、疾患治療剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７３】
配列番号１  ＲＮａｓｅＬの標的配列
配列番号２  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾センス鎖
配列番号３  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾アンチセンス鎖
配列番号４  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖
配列番号５  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖
【図１（ａ）】
2007094218.tif 000036
【図１（ｂ）】
2007094218.tif 000037
【図１（ｃ）】
2007094218.tif 000038
【配列表】
2007094218000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月23日(2007.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチド。
ＲＡ−ＣＯＯＨ      （ＩＩＩ）
前記式中、ＲＡは、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。
【請求項２】
式（ＩＡ）で表される請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【化１】
2007094218.tif 000039
前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲＡは、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記ＲＡが、ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−またはＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−      （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ２）ｍ−または（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。
【請求項７】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ−１）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ２―ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−  （ＩＶＡ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。
【請求項８】
二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、前記アンチセンス鎖のみが、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
ＲＳ−ＯＨ          （ＩＩ）
前記式中、ＲＳは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド類似体が、式（ＩＳ）で表される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【化２】
2007094218.tif 000040
前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
ＲＳは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。
【請求項１０】
前記ＲＳが、
【化３】
2007094218.tif 000041
からなる群から選択される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ−    （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ２）ｍ−または（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。
【請求項１２】
前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ−１）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ２―ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−  （ＩＶＳ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。
【請求項１３】
二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、請求項１に記載の修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンス鎖のみが、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体である二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをカードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する請求項１または８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項１５に記載の修飾オリゴヌクレオチドである遺伝子発現抑制剤。
【請求項１７】
遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項１６に記載の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡｉキットであって、前記キットが、請求項１５に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含むキット。
【国際調査報告】
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