(57)【要約】  分子中に官能基を有していてもよいフラーレンに、水溶性高分子と、金属イオンの配位したキレート形成分子、または磁性体の結合した分子を、必要に応じて連結分子を介して結合させたフラーレン誘導体を含有する造影剤は、ＭＲＩの造影剤として適しており、癌に特異的に長時間蓄積し、生体内での測定時間が長く、免疫原性が低いという優れた効果を有する。
2007061036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中に官能基を有していてもよいフラーレンに、水溶性高分子と、金属イオンの配位したキレート形成分子、または磁性体の結合した分子を、必要に応じて連結分子を介して結合させたフラーレン誘導体を含有する造影剤。
【請求項２】
連結分子がアミノ酸類またはアミノアルキレンウレタン類であるフラーレン誘導体を含有する請求項１記載の造影剤。
【請求項３】
アミノ酸類が塩基性アミノ酸であるフラーレン誘導体を含有する請求項２記載の造影剤。
【請求項４】
フラーレンの官能基の数が０〜５個であるフラーレン誘導体を含有する請求項１から３のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項５】
フラーレンの官能基の数が１個で、官能基がカルボキシ基であるフラーレン誘導体を含有する請求項４記載の造影剤。
【請求項６】
フラーレンがＣ６０フラーレンであるフラーレン誘導体を含有する請求項１から５のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項７】
水溶性高分子が分子量１，０００〜１，０００，０００のポリエチレングリコール類であるフラーレン誘導体を含有する請求項１から６のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項８】
キレート形成分子がジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレン−ビス（オキシ−エチレンニトリロ）テトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸またはその誘導体であるフラーレン誘導体を含有する請求項１から７のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項９】
キレート形成分子に配位した金属イオンが原子番号２１−２９、４２、４４、５６−７１、７６、８２、８３の金属元素から選択される元素の陽イオンまたは放射性のイオンであるフラーレン誘導体を含有する請求項１から８のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１０】
磁性体がフェライトであるフラーレン誘導体を含有する請求項１から７のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１１】
水溶性高分子が、片末端に不活性基を有し他端に反応性基または両端に反応性基を有するポリエチレングリコール類であり、金属イオンの配位したキレート形成分子が、Ｇｄ３＋またはＭｎ２が配位したエチレントリアミンペンタ酢酸であるフラーレン誘導体を含有する請求項１から９のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１２】
物理的刺激により活性酸素を発生するフラーレン誘導体を含有する請求項１から１１のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体の凝集体を含有する造影剤。
【請求項１４】
凝集体の大きさが２０〜４００ｎｍである凝集体を含有する請求項１３記載の造影剤。
【請求項１５】
造影剤がＭＲＩ用である請求項１から１４のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１６】
造影部位が腫瘍部位である請求項１から１５のいずれか一項に記載の造影剤。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体。
【請求項１８】
下記式（１）で表される請求項１７に記載のフラーレン誘導体。
【化１】
2007061036.tif 000008
［式中、Ｍは金属イオンを示す］
【請求項１９】
下記式（２）で表される請求項１７に記載のフラーレン誘導体。
【化２】
2007061036.tif 000009
［式中、Ｍは金属イオンを示す］
【請求項２０】
下記式（３）で表される請求項１７に記載のフラーレン誘導体。
【化３】
2007061036.tif 000010
［式中、Ｍは金属イオンを示す］
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体の凝集体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラーレン誘導体またはその凝集体を用いる造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の身体における異常を的確に検出することは、疾病の診断と適切な治療のための必要条件である。そのために、例えば、Ｘ線ＣＴ法を含むＸ線診断法、超音波診断法や磁気共鳴画像（ＭＲＩ）診断法があり、これらは疾病の診断と治療にとって重要な手法である。中でもＭＲＩは組織非侵襲性であり、放射線による術者及び患者の被曝もない特徴を有する。
ＭＲＩにおいては、正常と異常の区別、例えば、正常組織と腫瘍組織の区別は縦緩和時間Ｔ１、或いは横緩和時間Ｔ２の差に基づいて理論的には可能である。これらの差は、示差シグナル強度を生じ、ＭＲＩのコントラストとして現れる。しかしながら、病的あるいは異常な組織でも正常組織と同程度のシグナル強度を持つことが多く、実際上、造影剤を用いなければ正常組織と区別することは困難である。【０００３】
ガドリニウム（ＩＩＩ）ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）は臨床に用いられている比較的低分子（分子量５３８）の造影剤であるが、Ｇｄ−ＤＴＰＡの血中の半減期は２０分以下であり、ヒトにおけるＧｄ−ＤＴＰＡの生物学的期間（生体中で測定可能な時間）は約９０分であるため、脳以外の器官においてＭＲＩ血管造影にＧｄ−ＤＴＰＡを使用することには限界がある。更に、Ｇｄ−ＤＴＰＡは低分子であるため容易に毛細血管から組織に移行し、結果として血管／組織のシグナル比の急速な減少を招き、異常及び疾病の正確な検出を困難にする。また、Ｇｄ−ＤＴＰＡは抗原性があるため同一患者に対する反復投与に向いていない。【０００４】
造影剤には、ＤＴＰＡのような金属キレート形成部位を多数に有する天然高分子（例えば、たんぱく質及び多糖類等）や合成高分子もあり、これらはＧｄ−ＤＴＰＡと比較して高い緩和性を持つ。しかしながら、例えば、ＤＴＰＡを血清アルブミンに結合した造影剤はマクロファージによって認識されやすく、血管内皮細胞上にアルブミン受容体があるため、血中半減期を大幅に延長することは難しい。更に、免疫原性や毒性の恐れもあり、ＭＲＩへの使用には限度がある。【０００５】
また、血中の半減期及び免疫原性に関する問題を克服するために、例えば、種々の天然高分子または合成高分子により修飾された化合物も使われている。デキストラン、合成ポリアミノ酸、またはポリエチレングリコールがよく用いられるが、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそのモノメチルエーテル（ＭＰＥＧ）が使用されることが多い。ＰＥＧまたはＭＰＥＧを用いた医用画像診断用の造影剤が知られている。【０００６】
造影剤の中には治療剤として使用できる物もある（特許文献１、２）が、治療剤として細胞増殖抑制剤等が用いられており、癌の罹患者以外を対象として施用することには問題が多い。【０００７】
フラーレン、ポルフィリン誘導体等は、可視光等を照射することにより一重項酸素やスーパーオキシドアニオン等の活性酸素を発生することが知られている。【０００８】
フラーレンは、Ｃｎ（炭素）クラスターの総称であるが、物理的に安定で、ｎの数に応じてＣ６０、Ｃ７０等の純炭素物質や金属（若しくは金属酸化物）を内包した炭素クラスター等の化合物がある（非特許文献１）。フラーレンは水不溶性であるため生体内への投与が困難である。このため生体内への投与を可能とするべく水溶性を付与するために、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、プルラン、デンプン、及びこれらの高分子の誘導体等の水溶性高分子をフラーレンと結合させることが検討されている（非特許文献２、特許文献３）が、水溶性高分子を結合したフラーレン誘導体について造影剤としての用途は知られていない。
また、フラーレンに１分子の高分子を結合させた分子は凝集体を形成しやすいため、正常組織に比べて癌組織に移行しやすく、また、がん組織に長く滞留する傾向があるというＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ：非特許文献３）が期待される（特許文献４）。【０００９】
【特許文献１】特表平８−５０１０９７号公報
【特許文献２】特表２００５−５１９８６１号公報
【特許文献３】特開平９−２３５２３５号公報
【特許文献４】国際公開第２００５／０９５４９４号パンフレット
【非特許文献１】化学，５０（６）（１９９５）
【非特許文献２】ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７，３０−３７（１９９７）
【非特許文献３】松村ら、癌と化学療法、Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，８２１−８２９（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
臨床現場では各種の腫瘍に長時間蓄積するような生物学的期間が長く、免疫原性が低い造影剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明者等は鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）から（２１）の発明に関する：
（１）  分子中に官能基を有していてもよいフラーレンに、水溶性高分子と、金属イオンの配位したキレート形成分子、または磁性体の結合した分子を、必要に応じて連結分子を介して結合させたフラーレン誘導体を含有する造影剤；
（２）  連結分子がアミノ酸類またはアミノアルキレンウレタン類であるフラーレン誘導体を含有する上記（１）記載の造影剤；
（３）  アミノ酸類が塩基性アミノ酸であるフラーレン誘導体を含有する上記（２）記載の造影剤；
（４）  フラーレンの官能基の数が０〜５個であるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（３）のいずれか一項に記載の造影剤；
（５）  フラーレンの官能基の数が１個で、官能基がカルボキシ基であるフラーレン誘導体を含有する上記（４）記載の造影剤；
（６）  フラーレンがＣ６０フラーレンであるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（５）のいずれか一項に記載の造影剤；
（７）  水溶性高分子が分子量１，０００〜１，０００，０００のポリエチレングリコール類であるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の造影剤；
（８）  キレート形成分子がジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレン−ビス（オキシ−エチレンニトリロ）テトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸またはその誘導体であるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（７）のいずれか一項に記載の造影剤；
（９）  キレート形成分子に配位した金属イオンが原子番号２１−２９、４２、４４、５６−７１、７６、８２、８３の金属元素から選択される元素の陽イオンまたは放射性のイオンであるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（８）のいずれか一項に記載の造影剤；
（１０）  磁性体がフェライトであるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（７）のいずれか一項に記載の造影剤；
（１１）  水溶性高分子が、片末端に不活性基を有し他端に反応性基または両端に反応性基を有するポリエチレングリコール類であり、金属イオンの配位したキレート形成分子が、Ｇｄ３＋またはＭｎ２が配位したエチレントリアミンペンタ酢酸であるフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（９）のいずれか一項に記載の造影剤；
（１２）  物理的刺激により活性酸素を発生するフラーレン誘導体を含有する上記（１）から（１１）のいずれか一項に記載の造影剤；
（１３）  上記（１）から（１２）のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体の凝集体を含有する造影剤；
（１４）  凝集体の大きさが２０〜４００ｎｍである凝集体を含有する上記（１３）の造影剤。
（１５）  造影剤がＭＲＩ用である上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載の造影剤；
（１６）  造影部位が腫瘍部位である上記（１）から（１５）のいずれか一項に記載の造影剤；【００１２】
（１７）  上記（１）から（１２）のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体；
（１８）  下記式（１）で表される上記（１７）に記載のフラーレン誘導体；
【化１】
2007061036.tif 000003
［式中、Ｍは金属イオンを示す］
（１９）  下記式（２）で表される上記（１７）に記載のフラーレン誘導体；
【化２】
2007061036.tif 000004
［式中、Ｍは金属イオンを示す］
（２０）  下記式（３）で表される上記（１７）に記載のフラーレン誘導体；
【化３】
2007061036.tif 000005
［式中、Ｍは金属イオンを示す］、及び【００１３】
（２１）  上記（１７）から（２０）のいずれか一項に記載のフラーレン誘導体の凝集体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の造影剤は、Ｘ線やＭＲＩの造影剤として適し、各種の腫瘍に長時間蓄積し、生体内での測定時間が長く、免疫原性が低いという優れた効果を有するもので、特に、ＭＲＩ等の画像コントラストを明瞭にすることができ、更に、物理刺激、好ましくは、光照射または超音波照射等により活性酸素を発生させることができる。そのために、癌の光線力学的治療剤、超音波力学的治療剤等としても用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の造影剤は、分子中に官能基を有していてもよいフラーレンに、水溶性高分子と、金属イオンの配位したキレート形成分子、または磁性体の結合した分子を、必要に応じて連結分子を介して結合させたフラーレン誘導体を含有する。【００１６】
連結分子を用いる場合、該連結分子は特に限定されるものではなく、アミノ酸類またはアミノアルキレンウレタン類が好ましい。
アミノ酸類とは、アミノ酸やそれがアミド結合したペプチドを意味する。特に好ましくは１個の塩基性アミノ酸、例えば、リジン、Ｓ−２−アミノエチルシステイン等が挙げられる。
アミノアルキレンウレタン類とはアミノエチレンウレタン構造、アミノトリメチレンウレタン構造等を有する連結分子を意味し、アミノエチレンウレタンなどのアミノＣ１−６アルキルウレタン構造を有するものが好ましい。【００１７】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体におけるフラーレンは特に限定されるものではなく、活性酸素を発生するものが好ましい。例えば、炭素原子数が６０の純炭素物質Ｃ６０フラーレン、炭素原子数が７０の純炭素物質Ｃ７０フラーレン、純炭素物質であるナノチューブフラーレン、各種高次フラーレン、金属内包フラーレン等が挙げられる。該金属内包フラーレンとしては、内包される金属が、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｅｒ等でこれらが１〜３個含まれるものが挙げられる。
これらのフラーレンとしては市販されているものでもよく、例えば、本荘ケミカル（株）、三菱商事（株）、東京化成工業（株）等から入手することができる（商品名：Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレン、マルチウオールナノチューブ、シングルウオールナノチューブ等）でもよい。中でも、供給及び取り扱いの容易さの点からＣ６０フラーレンが特に好ましい。【００１８】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体における分子中に官能基を有していてもよいフラーレンの官能基としては、例えば、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、チオール基等が挙げられる。その結合数は１〜５個が好ましく、１〜２個がより好ましい。特に好ましくは１個のカルボキシ基であり、このようなフラーレンは、例えば、（株）サイエンスラボラトリーズ等の試薬会社から市販されており、それを用いてもよく、また、以後の参考例１に示すように、文献「テトラヘドロンレターズ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３８，６８４３（１９９５）」記載の方法にて合成して用いてもよい。【００１９】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体における水溶性高分子とは特に限定されるものではなく、連結分子と反応できるものが好ましく、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、プルラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン等の非イオン性水溶性高分子；これらの修飾物；これらの２成分若しくは３成分の共重合体または複合体；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体等が挙げられ、フラーレン誘導体分子中に１〜５個含有するのが好ましい。中でも、分子量が１，０００〜１，０００，０００の非イオン性水溶性高分子であるポリエチレングリコール類が好ましく、４，０００〜５０，０００のポリエチレングリコール類が特に好ましい。これら水溶性高分子としては市販されているものを使用しても、公知文献に記載の方法または公知文献を参考にした方法にて調製して使用してもよい。【００２０】
更に、ポリエチレングリコール類として片末端に不活性基を有し他端に反応性基または両端に反応性基を有するものが殊に好ましい。不活性基としては、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ベンジル基、その他通常保護基として使用されるものが挙げられ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基が好ましい。Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられ、入手の容易性からメチル基が好ましい。反応性基とは、フラーレン誘導体を構成する他の分子との反応性があれば特に限定されず、例えば、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、シアノ基、チオール基等が挙げられ、中でも、カルボキシ基、アミノ基、水酸基等の脱水縮合反応性を有する基が好ましく、アミノ基がより好ましい。反応性基の結合位置は特に限定されず、水溶性高分子の末端に位置するのが好ましい。また、反応性基がアルキレン基等を介して結合していてもよい。反応性基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、反応性基を導入する必要がある。
ポリエチレングリコール類としては片末端メチル基で他端トリメチレンアミノ基のポリエチレングリコールが特に好ましい。【００２１】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体におけるキレート形成分子としては特に限定されるものではなく、文献公知の各種キレート分子を使用することができる。フラーレン誘導体中におけるその結合数は１〜１０個が好ましく、特に１〜３個が好ましい。【００２２】
該キレート形成分子としては、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレン−ビス（オキシ−エチレンニトリロ）テトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、あるいは１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸またはそれらの誘導体等が挙げられ、ジエチレントリアミンペンタ酢酸が好ましい。【００２３】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体におけるキレート形成分子に配位する金属イオンとしては造影作用を有すれば特に限定されないが、原子番号２１−２９、４２、４４、５６−７１、７６、８２、８３の金属元素から選択される元素の陽イオンや放射性のイオンが挙げられ、例えば、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｂｉ、Ｐｂ若しくはＢａの陽イオンまたは放射性のイオンである５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ若しくは１１１Ｉｎのイオンが好ましく、特にＭＲＩ用としてＧｄ３＋またはＭｎ２＋が好ましい。【００２４】
本発明の造影剤のフラーレン誘導体において、磁性体の結合した分子を用いる場合に、磁性体としては、例えば、マグネタイト、ヘマタイト、フェライト等が挙げられ、これらの磁性体が結合した分子としては、例えば、アルコキシシランの重合体等の分子が挙げられる。【００２５】
本発明の造影剤に用いるフラーレン誘導体は生体への投与が可能な程度の水溶性を有しているのが好ましい。また、本発明で用いるフラーレン誘導体は水系溶媒中では、一定の大きさの凝集体を形成し、この凝集体も造影剤として使用することが可能であり、この凝集体も本発明に含まれる。水系溶媒としては、例えば、水、水−アセトニトリル等が挙げられる。凝集体としての粒径は、癌等の組織への移行と集積のしやすさ及び正常細胞への移行を考慮して、光散乱法による測定において２０〜４００ｎｍ程度が好ましく、３０〜２００ｎｍ程度がより好ましい。
本発明の造影剤におけるフラーレン誘導体は、上記記載のとおり、各種構成部分、すなわち、分子中に官能基を有していてもよいフラーレン、水溶性高分子、金属イオンの配位したキレート形成分子、または磁性体の結合した分子、必要に応じて連結分子を適宜組み合わせて結合して得られる化合物であり、該化合物も本発明に含まれ、例えば、上記の式（１）〜式（３）で表される化合物（Ｍは金属イオン、特にＧｄ３＋またはＭｎ２＋が好ましい）が挙げられる。【００２６】
また、上記記載の各構成部分の他に、酵素、酵素基質のホモログ、レクチン、レクチンに認識される糖鎖、接着分子、葉酸、シアル酸等の腫瘍抗原に対するポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体または抗体の断片を結合させ、腫瘍指向性を高めたフラーレン誘導体及びそれを含有する造影剤も本発明に含まれる。【００２７】
本発明の造影剤に含有されるフラーレン誘導体の製造方法は、例えば、後記の実施例に示すように、連結分子を介して、分子中に官能基を有してもよいフラーレン、水溶性高分子、キレート形成分子または磁性体の結合した分子を結合し、キレート形成分子を用いた場合には、更に検出用金属イオンを配位させる方法が挙げられる。この際、これらの構成部分の結合順序、結合態様等は得ようとするフラーレン誘導体の構造により適宜変更することが可能である。例えば、フラーレンに連結分子が結合し、この結合した連結分子に、水溶性高分子及び金属イオンが配位した形成分子、または磁性体の結合した分子が結合してもよく、あるいは、フラーレンに水溶性高分子が結合し、その水溶性高分子に連結分子が結合し、その連結分子に金属イオンが配位した形成分子、または磁性体の結合した分子が結合してもよい。【００２８】
反応は、例えば、縮合反応、付加反応、置換反応等の化学結合を生成させる公知の反応が挙げられ、アミド結合やエステル結合を生成させるような脱水縮合反応や置換反応が好ましく、特にカルボキシ基とアミノ基からアミド結合を生成させる脱水縮合反応あるいは酸無水物とアミノ基からアミド結合を生成させる置換反応が好ましい。該脱水縮合反応としては通常のペプチド縮合反応が挙げられ、この際の脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド；１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド等のカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート等のホスホニウム塩；ジフェニルホスホリルアジド等が挙げられ、ジイソプロピルカルボジイミドが好ましい。脱水縮合剤の使用量は、カルボキシ基に対して０．５〜１０モル当量であり、好ましくは１〜２モル当量である。反応は、添加剤存在下または非存在下で行われ、添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール等が挙げられ、好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。添加剤を使用する場合、その使用量はカルボキシ基に対して０．５〜１０モル当量程度、好ましくは１〜２モル当量程度である。
酸無水物とアミノ基からアミド結合を生成させる置換反応は通常のアミノ基の酸無水物によるアシル化条件を適用すればよい。【００２９】
また、特開２００２−２４１３０７号公報に記載の方法に準じて、分子中に官能基を持たないフラーレンとアミノ基が置換したポリエチレングリコールとを結合し、次いでキレート形成分子を結合後、検出用金属イオンを配位させる方法でもよい。【００３０】
これらの反応で使用される有機溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されず、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン、１，２−ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等のアミド類；Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア類；これら溶媒の混合溶媒等が挙げられる。
連結分子と水溶性高分子の反応または連結分子とキレート形成分子等の反応はジメチルホルムアミドが好ましく、連結分子とフラーレンの反応はブロモベンゼンが好ましい。【００３１】
反応温度は、−２０〜１００℃、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは室温〜３７℃であり、反応時間は１〜８４時間、好ましくは２４〜７２時間である。本反応は遮光下で行うのが好ましい。得られた反応生成物は、自体公知の分離手段、例えば、減圧濃縮、溶媒抽出、結晶化、クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等を適用して単離、精製することができる。【００３２】
上記したフラーレン誘導体を含有する本発明の造影剤は、フラーレン誘導体の水溶液や含水溶媒の溶液として、通常の造影剤と同様に使用可能である。特に、ＭＲＩ用造影剤としての使用が好ましい。この造影剤に光を照射すると活性酸素が発生し、また、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光によっても活性酸素が発生し、それによる癌の治療にも適用できる。該活性酸素には、一重項酸素（１Ｏ２）、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）等が含まれる。【００３３】
照射する光の波長としては、紫外線領域（２２０〜３８０ｎｍ）〜可視光領域（３８０〜７８０ｎｍ）、好ましくは３００〜６００ｎｍを使用することができる。
照射する超音波としては、周波数約１００ＫＨｚ〜２０ＭＨｚ、特に約０．５〜３ＭＨｚのものを好ましく使用することができる。照射は、約０．１〜１０Ｗａｔｔ／ｃｍ２、中でも約１〜５Ｗａｔｔ／ｃｍ２の出力で行うのが好ましい。照射時間は、用いる周波数、照射出力によっても異なるが、約５〜３００秒、好ましくは約３０〜１２０秒であり、パルス照射の場合、そのＤｕｔｙｃｙｃｌｅは約１〜１００％、好ましくは約１０％である。
これより本発明の造影剤は癌の診断と同時に光線力学的治療や超音波力学的治療を可能とする。【００３４】
本発明の造影剤は、注射剤、分散剤、流動性剤、固形粉末剤等のあらゆる剤型とすることができる。例えば、注射剤とする場合には本発明の造影剤を、注射剤に一般に用いられる緩衝剤、生理食塩水、保存剤、注射用蒸留水等の各種添加剤を配合して注射剤とすることができる。本発明の造影剤は静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。【００３５】
癌組織や炎症組織には、正常組織と比較して高分子物質が移行しやすく、且つ、蓄積しやすい。従って、水溶性高分子やフラーレンからなるフラーレン誘導体を含有する本発明の造影剤は、生体に投与されると正常組織に比べて癌組織や炎症組織に集積され、正常組織におけるよりも高濃度で長く癌組織や炎症組織に滞留する。一方、正常組織においては癌組織や炎症組織におけるよりも速やかに本発明の造影剤が排泄されるため、造影剤を生体に投与後、ある程度の時間をおけば、癌組織や炎症組織における本造影剤の濃度は正常組織における濃度よりも有意に高いものとなり、本造影剤が癌組織や炎症組織に特異的に高濃度で分布することになる。従って、特に各種の腫瘍に長時間蓄積するような生体内で測定時間が長い腫瘍部位を造影する造影剤とすることができる。
また、フラーレン誘導体の構成部分としてポリエチレングリコール類等の水溶性高分子の使用により免疫原性の低下も予測される。【００３６】
以下に、実施例、参考例及び試験例を示し本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
参考例１
（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸の合成
テトラヘドロンレターズ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３８，６８４３（１９９５）に記載の方法により得られる（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５４０ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）をトルエン（３８０ｍＬ）に溶解し、４−トルエンスルホン酸１水和物（２２２ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加えて１０時間加熱還流した。析出した褐色沈殿物をろ取し、トルエン、蒸留水及びエタノールにて順次洗浄後、減圧下乾燥して（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸（３３８ｍｇ，収率６７％）を褐色結晶として得た。
ＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）：ｍ／ｚ  ７７９（Ｍ＋Ｈ）＋；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＤＭＳＯ−ｄ６（１：１），ｐｐｍ）：５．１５（１Ｈ，ｓ）【００３７】
参考例２
Ｃ６０ＤＴＰＡ−ＰＥＧ５０００の合成
５０ｍＭの片末端メチル基で他端トリメチレンアミノ基のポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２，分子量５０００，日本油脂製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０ｍＬに１．５倍モル量のＮ−α−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｎ−ε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（α−Ｚ−ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン、国産化学製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１０ｍＬを加え、１．５倍モル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、２４時間、遮光条件下で攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。ろ別した沈殿物を蒸留水に溶解後、陰イオン交換樹脂カラム（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ，ＯＨ型）及び陽イオン交換樹脂カラム（ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ，Ｈ＋型）に通塔した。溶出液を凍結乾燥し、リジンのカルボキシ基にＰＥＧの結合したα−Ｚ−ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）を得た。【００３８】
２ｇのＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅを３０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、０．４ｇの５％パラジウム炭素（Ｎ．Ｅ．ＣｈｅｍＣａｔ製、５５％含水）を加え、水素雰囲気下、４０℃、２時間攪拌することにより、接触加水素分解を行った。反応液に活性炭を添加し、ハイフロースーパーセル（国産化学製）を用いてろ過後、ジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物を５％塩化ナトリウム水溶液に溶解後、ＨＰ−２０カラム（三菱化学製）に通塔した。５％塩化ナトリウム水溶液及び蒸留水で洗浄後、５０％及び８０％アセトニトリル水溶液で溶出した溶出液を凍結乾燥し、リジンのベンジルオキシカルボニル基が脱離し、カルボキシ基にＰＥＧが結合したε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）を１．４２ｇ得た。【００３９】
０．４ｇのＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅのブロモベンゼン溶液２０ｍＬと１．６倍モル量の（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸を含むブロモベンゼン溶液１２５ｍＬを混和し、１．６倍モル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び３．３倍モル量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、７２時間、遮光条件下で攪拌した。反応液を等量の蒸留水にて抽出後、凍結乾燥した。この全量を１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、３ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、４℃、１８時間でＢｏｃ基の脱保護を行った。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物を５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、陰イオン交換樹脂カラム通塔後、溶出液を凍結乾燥し、フラーレンのカルボキシ基に、連結分子としてリジンを介してＰＥＧが結合したα−フラーレン−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｃ６０＞ＣＨＣＯ−Ｌｙｓ−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）０．３３ｇを得た。【００４０】
５．６ｍＭのＣ６０＞ＣＨＣＯ−Ｌｙｓ−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液５ｍＬに２０倍モル量のジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ無水物、和光純薬）を添加し、室温、７２時間反応後、ジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物は１０ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを含む５０％アセトニトリル溶液に再溶解し、室温にて、２４時間処理することにより未反応の酸無水物を加水分解した後、透析、凍結乾燥を順次行い、フラーレンのカルボキシ基に、連結分子としてのリジンのα−アミノ基が結合し、そのリジンを介してＰＥＧ及びＤＴＰＡが結合した、０．２２ｇのＣ６０ＤＴＰＡ−ＰＥＧ５０００が得られた。【００４１】
参考例３
ＤＴＰＡＣ６０−ＰＥＧ５０００の合成
５０ｍＭの片末端メチル基で他端トリメチレンアミノ基のＰＥＧ（分子量５０００，日本油脂製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０ｍＬに１．５倍モル量のＮ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ε−（２−クロロベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（α−Ｂｏｃ−ε−（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｌ−リジン、国産化学製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１０ｍＬを加え、１．５倍モル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、２４時間、遮光条件下で攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。ろ別した沈殿物を蒸留水に溶解し、陰イオン交換樹脂カラム及び陽イオン交換樹脂カラムに通塔後、溶出液を凍結乾燥し、リジンのカルボキシ基にＰＥＧが結合したα−Ｂｏｃ−ε−（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）を得た。【００４２】
２ｇのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅを３０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、０．３４ｇの５％パラジウム炭素を加え、水素雰囲気下４０℃、２時間攪拌することにより接触加水素分解を行った。反応液に活性炭を添加し、ハイフロースーパーセルを用いてろ過後、ジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物を５％塩化ナトリウム水溶液に溶解後、ＨＰ−２０カラムに通塔した。５％塩化ナトリウム水溶液及び蒸留水で洗浄後、５０％及び８０％アセトニトリル水溶液で溶出した溶出液を凍結乾燥し、リジンのベンジルオキシカルボニル基が脱離し、カルボキシ基にＰＥＧが結合したα−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）を１．４１ｇ得た。【００４３】
０．４ｇのＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅのブロモベンゼン溶液２０ｍＬと１．６倍モル量の（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸を含むブロモベンゼン溶液１２５ｍＬを混和し、１．６倍モル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び３．３倍モル量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、７２時間、遮光条件下で攪拌した。反応液を等量の蒸留水にて抽出後、凍結乾燥した。この全量を１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、３ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、４℃、１８時間でＢｏｃ基の脱保護を行った。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物を５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、陰イオン交換樹脂カラム通塔後、溶出液を凍結乾燥し、フラーレンのカルボキシ基に、連結分子としてリジンを介してＰＥＧが結合したε−フラーレン−Ｌ−リジン−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ＜Ｃ６０）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）０．３３ｇを得た。【００４４】
５．６ｍＭのＬｙｓ（ＣＯＣＨ＜Ｃ６０）−ＮＨ−（ＣＨ２）３Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液５ｍＬに２０倍モル量のＤＴＰＡ無水物を添加し、室温、７２時間反応後、ジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物は１０ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを含む５０％アセトニトリル溶液に再溶解し、室温にて、２４時間処理することにより未反応の酸無水物を加水分解した後、透析、凍結乾燥を順次行い、フラーレンのカルボキシ基に、連結分子としてのリジンのε−アミノ基が結合し、そのリジンを介してＰＥＧ及びＤＴＰＡが結合した、０．２２ｇのＤＴＰＡＣ６０−ＰＥＧ５０００が得られた。【００４５】
参考例４
Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡの合成
４ｍＭの片末端トリメチレンアミノ基のＰＥＧ（分子量５０００，日本油脂製）のブロモベンゼン溶液２０ｍＬと１．５倍モル量の（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸を含むブロモベンゼン溶液１００ｍＬを混和し、１．５倍モル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び３倍モル量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、７２時間、遮光条件下で攪拌した。反応液を等量の蒸留水にて抽出し、陽イオン交換樹脂カラムに通塔後、溶出液を凍結乾燥し、末端に水酸基を有するＰＥＧ１分子が、その片末端トリメチレンアミノ基のアミノ基を介して結合した、０．４６ｇのフラーレンを得た。
９．３ｍＭの得られた該フラーレンのジメチルスルホキシド溶液４ｍＬに１０倍モル量のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し、室温、２時間反応後、１００倍モル量のエチレンジアミンのジメチルスルホキシド溶液２ｍＬに攪拌しながら少量ずつ滴下し、室温、２４時間反応した。反応液をＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス製）でゲルろ過後、凍結乾燥し、末端にアミノ基を有するウレタン結合を持つＰＥＧ１分子が、その片末端トリメチレンアミノ基のアミノ基を介して結合した、０．１８ｇのフラーレンを得た。【００４６】
１．３ｍＭの得られた該フラーレンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０ｍＬに２０倍モル量のＤＴＰＡ無水物を添加し、室温、７２時間反応後、ジイソプロピルエーテルを添加し沈殿物を得た。沈殿物は１０ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液に再溶解し、室温にて２４時間処理することにより未反応の酸無水物を加水分解した後、透析、凍結乾燥を順次行い、末端にアミノ基を有するウレタン結合を持つＰＥＧ１分子が、その片末端トリメチレンアミノ基のアミノ基を介してフラーレンに結合し、更にそのウレタン結合のアミノ基にＤＰＴＡが結合した、Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡが得られた。【００４７】
実施例１
Ｃ６０ＤＴＰＡ（Ｍｎ）−ＰＥＧ５０００の調製
参考例２の化合物Ｃ６０ＤＴＰＡ−ＰＥＧ５０００を０．５Ｍの２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ，ｐＨ  ７．０、同仁化学）に最終濃度１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、この溶液に塩化マンガンを８ｍＭになるように添加して、室温で２４時間攪拌した。反応液をＰＤ−１０でゲルろ過することで、過剰のマンガンイオンを除去し、Ｃ６０ＤＴＰＡ−ＰＥＧ５０００にマンガンイオンが配位した式（１）で表されるフラーレン誘導体（Ｃ６０ＤＴＰＡ（Ｍｎ）−ＰＥＧ５０００）の溶液（最終濃度７．１ｍｇ／ｍＬ）を得た。【００４８】
実施例２
ＤＴＰＡ（Ｍｎ）Ｃ６０−ＰＥＧ５０００の調製
参考例３の化合物ＤＴＰＡＣ６０−ＰＥＧ５０００を０．５ＭのＭＥＳ溶液に最終濃度１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、この溶液に塩化マンガンを８ｍＭになるように添加し、室温で２４時間攪拌した。反応液をＰＤ−１０でゲルろ過することで、過剰のマンガンイオンを除去し、ＤＴＰＡＣ６０−ＰＥＧ５０００にマンガンイオンが配位した式（２）で表されるフラーレン誘導体（ＤＴＰＡ（Ｍｎ）Ｃ６０−ＰＥＧ５０００）の溶液（最終濃度７．１ｍｇ／ｍＬ）を得た。【００４９】
実施例３
Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡ（Ｍｎ）の調製
参考例４の化合物Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡを０．５ＭのＭＥＳ溶液に最終濃度１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、この溶液に塩化マンガンを８ｍＭになるように添加し、室温で２４時間攪拌した。反応液をＰＤ−１０でゲルろ過することで、過剰のマンガンイオンを除去し、Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡにマンガンイオンが配位した式（３）で表されるフラーレン誘導体（Ｃ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡ（Ｍｎ））の溶液（最終濃度７．１ｍｇ／ｍＬ）を得た。【００５０】
試験例１
フラーレン誘導体におけるマンガンイオン配位数の測定
実施例１〜３で得られた本発明のフラーレン誘導体についてマンガンイオンの配位数を測定した。実施例１〜３で得られた各化合物溶液を用いて、塩化マンガンの５０ｍＭのＭＥＳ溶液を標準物質とし原子吸光光度計ＡＡ−６８００（島津製作所）にて測定した。その測定結果を表１に示した。【００５１】
【表１】
2007061036.tif 000006
【００５２】
測定結果より、本発明のフラーレン誘導体はすべて１分子に１個のマンガンイオンを含むことが示された。【００５３】
試験例２
フラーレン誘導体の凝集体の確認
実施例１〜３で得られた本発明のフラーレン誘導体について光散乱法による粒径測定を行った。実施例１〜３で得られた各化合物溶液を最終濃度１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭのＭＥＳ溶液で希釈した。この溶液を光散乱測定装置ＤＬＳ−７０００（大塚電子株式会社）で測定し、その測定結果を図１に示した。
測定結果より、本発明のフラーレン誘導体はすべて約１００ｎｍを中心粒子径とする凝集体であることが示された。これらの粒子径は、高分子物質が正常組織に比べてがん組織に移行しやすく、また、がん組織に長く滞留する傾向があるというＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）を示すのに適した大きさであり、本発明の造影剤はＥＰＲ効果を有するといえる。【００５４】
試験例３
フラーレン誘導体のＭＲＩ造影能の評価
実施例１〜３で得られた本発明のフラーレン誘導体についてＭＲＩ造影能を評価した。実施例１〜３で得られた各化合物溶液を最終濃度５００μＭ、５０μＭ及び５μＭになるように５０ｍＭのＭＥＳ溶液で希釈した。この溶液を５０ｍＭのＭＥＳ溶液を陰性標準、５００μＭ塩化マンガンのＭＥＳ溶液を陽性標準とし、４．７テスラの生体用核磁気共鳴装置ＢｉｏＳｐｅｃ（ブルカー・バイオスピン社）で測定した。その測定結果を表２に示した。【００５５】
【表２】
2007061036.tif 000007
【００５６】
測定結果より、本発明のフラーレン誘導体またはその凝集体は同濃度のマンガンイオンと同程度以上の造影能を有することが示され、これにより本発明のフラーレン誘導体がＭＲＩ用造影剤となることが示された。【００５７】
試験例４
フラーレン誘導体の光照射による活性酸素の発生量の測定
受田の報告（ＤＯＪＩＮ  ＮＥＷＳ，Ｎｏ．９６，１−６（２０００））を参考に生細胞数測定試薬ＳＦを用いて、本発明のフラーレン誘導体について、光照射による活性酸素（スーパーオキシドアニオン，Ｏ２−）の発生量を測定した。実施例１〜３で得られる各化合物溶液を最終濃度１００μＭになるように５０ｍＭのＭＥＳ溶液で希釈し、該溶液を４８ウエルプレートに２００μＬずつ分注した。これに１６０μＬの５０ｍＭのＭＥＳ溶液と４０μＬの生細胞数測定試薬ＳＦを混合し、高出力ＬＥＤ光照射器ブルーフェーズ（イボクラールビバデント社）を用いて、直径８ｍｍのプローブで、４３０〜４９０ｎｍの青色可視光を１．１Ｗａｔｔ／ｃｍ２の出力で４分間照射した。照射後、溶液の４５０ｎｍの吸光度を分光光度計ＤＵ−６５０（ベックマン社）で測定した。化合物を添加せずに光照射を行った溶液をコントロールとし、１分間当りのＯ２−発生量を図２に示した。
測定結果より、本発明のフラーレン誘導体またはその凝集体は、その構造に関わらず、高効率でＯ２−の発生が観察された。このことは本発明のフラーレン誘導体が光照射による癌の光線力学的治療剤に適用できる事を示している。【００５８】
試験例５
フラーレン誘導体の超音波照射による活性酸素の発生量の測定
試験例４と同様の試験を光照射に替えて超音波照射で実施した。実施例１〜３で得られた各化合物溶液を最終濃度１００μＭになるように５０ｍＭのＭＥＳ溶液で希釈した溶液２ｍＬと、１．６ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ溶液及び４００μＬの生細胞数測定試薬ＳＦを混合した合計４ｍＬの溶液を、直径３２ｍｍの照射面の周囲にビニールテープを巻いた１ＭＨｚ用超音波プローブ（ギンセン社製）に滴下した。超音波プローブは、信号発生器ＷＦ１９６６（エヌエフ回路設計ブロック）と高速バイポーラ電源ＨＳＡ４１０１（エヌエフ回路設計ブロック）を用いて、３Ｗａｔｔ／ｃｍ２の出力で１ＭＨｚの正弦波をバーストモード（Ｍａｒｋ５００００サイクル、Ｓｐａｃｅ５００００サイクル）で振動させ、３分間超音波照射を行った。照射後、溶液の４５０ｎｍの吸光度を分光光度計ＵＶ−１２００（島津製作所）で測定した。１分間当りのＯ２−発生量を図３に示した。
測定結果より、本発明のフラーレン誘導体またはその凝集体は、超音波照射によってもＯ２−の発生が観察され、特に実施例３のＣ６０−ＰＥＧ５０００ＤＴＰＡ（Ｍｎ）は高いＯ２−発生を示した。従って、本発明のフラーレン誘導体は超音波力学的治療にも適用できる。【００５９】
試験例６
フラーレン誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＲＩ造影能の評価
実施例２で得られた本発明のフラーレン誘導体について担癌マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＲＩ造影能を評価した。担癌マウスは、マウス結腸癌Ｃｏｌｏｎ２６細胞（癌研究会  癌化学療法センターより供与）をＢＡＬＢ／ｃ−ｎｎ（雌、日本チャールズ・リバー社）皮下移植にて継代した腫瘍隗を摘出し、細切片をＣＤＦ１マウス（雌、日本チャールズ・リバー社）の右大腿部皮下に移植することによって作製した。移植後に皮下に直径５〜１０ｍｍ程度の腫瘤を形成したマウスを担癌マウスとして実験に用いた。
１．８％イソフルラン（フォーレン、ダイナボット社）持続麻酔下で１２０回／分の呼吸同調を行った担癌マウスに、実施例２で得られた化合物溶液を最終濃度１４ｍＭになるようにＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ＹＭ−３（ミリポア社）を用いて濃縮し、マウス尾静脈内に３００μＬ投与した。４．７テスラの生体用核磁気共鳴装置ＢｉｏＳｐｅｃ（ブルカー・バイオスピン社）で測定した担癌マウスの下肢のＴ２強調画像（腫瘍などの病変部位が強調される画像）を図４に示す。図４中の右側の灰色の部分が腫瘍組織である。
造影効果は同装置を用いたＴ１強調画像にて、図５から図８に示した。本発明のフラーレン誘導体の投与前、投与１時間後、投与６時間後及び投与１２時間後の測定結果を示す図５〜図８から、本発明のフラーレン誘導体は投与後１２時間以上、Ｔ２強調画像で示された腫瘍部位周辺の造影強度を増強し、反対側の正常組織では変化が見られなかったことから、癌特異的造影剤であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のフラーレン誘導体を含有する造影剤は、ＭＲＩの造影剤として適しており、癌に特異的に長時間蓄積し、生体内での測定時間が長く、免疫原性が低いという優れた効果を有するので、ＭＲＩの画像コントラストを明瞭にすることができ、更に、光照射や超音波照射等の物理的刺激により活性酸素を発生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１〜３のフラーレン誘導体の粒子径を光散乱法により測定した結果を示す。
【図２】実施例１〜３のフラーレン誘導体の光照射による活性酸素発生量を測定した結果を示す。
【図３】実施例１〜３のフラーレン誘導体の超音波照射による活性酸素発生量を測定した結果を示す。
【図４】生体用核磁気共鳴装置ＢｉｏＳｐｅｃ（ブルカー・バイオスピン社）で測定した担癌マウスの腫瘍部位のＴ２強調画像を示す。
【図５】生体用核磁気共鳴装置ＢｉｏＳｐｅｃ（ブルカー・バイオスピン社）で測定した担癌マウスの腫瘍部位のＴ１強調画像を示す。
【図６】実施例２のフラーレン誘導体の投与後１時間の腫瘍部位のＴ１強調画像を示す。
【図７】実施例２のフラーレン誘導体の投与後６時間の腫瘍部位のＴ１強調画像を示す。
【図８】実施例２のフラーレン誘導体の投与後１２時間の腫瘍部位のＴ１強調画像を示す。
【図１】
2007061036.tif 000011
【図２】
2007061036.tif 000012
【図３】
2007061036.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007061036.tif 000017
【図８】
2007061036.tif 000018
【国際調査報告】
2007061036.tif 000019
2007061036.tif 000020
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