(57)【要約】本発明は、マンネンタケ抽出物を有効成分として含むアンドロゲン受容体結合物質に関する。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンネンタケ処理物を含む、アンドロゲン受容体結合物質。
【請求項２】
ラノスタン型トリテルペンを含む、アンドロゲン受容体結合物質。
【請求項３】
ラノスタン型トリテルペンがマンネンタケ由来のものである、請求項２に記載のアンドロゲン受容体結合物質。
【請求項４】
Ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＴＲ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃ２，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｈ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｉ，５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ、ｌｕｃｉｄｕｍｏｌ  Ｂ，Ｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ａ，及びｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ｆからなる群から選択される少なくとも一つを含む、アンドロゲン受容体結合物質。
【請求項５】
ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂを含む、アンドロゲン受容体結合物質。
【請求項６】
アンドロゲン受容体アンタゴニストである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンドロゲン受容体結合物質。
【請求項７】
試験化合物の存在下又は非存在下において、マンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合活性を測定することを含む、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンネンタケ（霊芝）処理物を含むアンドロゲン受容体結合物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンネンタケ（霊芝）は、数々の薬効が伝承されており、特に癌に効くキノコとして知られている。マンネンタケには様々な生理作用を及ぼす物質が存在することが証明されている。
これまでに、本発明者は、マンネンタケのアルコール類等抽出物が、５α−リダクターゼ活性の阻害作用を有し、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の疾患に有効であることを見出している（特許第３５３０８８０号（ＪＰ３５３０８８０）、国際公開第２００５／０７９１６４号パンフレット）。
５α−リダクターゼは男性ホルモンの主体であるテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素であることが知られている。そして、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の疾患は、男性ホルモン刺激の増大に起因することが知られている。したがって、５α−リダクターゼの活性を阻害するマンネンタケ抽出物は、これらの疾患に対して有効な治療効果を有するものであるといえる。
最近、前立腺の増殖した肥大結節がアンドロゲン依存性を有していることが明らかにされたため、抗アンドロゲン剤が開発され、市販されている。
しかしながら、これまでに、マンネンタケ（霊芝）抽出物のアンドロゲン受容体に対する作用は研究されておらず、明らかにされていなかった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、アンドロゲン受容体結合物質を提供することを目的とする。詳しくは、マンネンタケ（霊芝）処理物を含むアンドロゲン受容体結合物質を提供することを目的とする。
また、本発明は、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者はマンネンタケ処理物の生理作用について鋭意研究を行った結果、マンネンタケ処理物が、アンドロゲン受容体結合活性を示すとともに前立腺癌細胞の細胞増殖抑制作用及び／又は前立腺癌に対する抗腫瘍作用を有することを見出した。本発明は、以上の知見から完成されたものである。
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）マンネンタケ処理物を含む、アンドロゲン受容体結合物質。
（２）ラノスタン型トリテルペンを含む、アンドロゲン受容体結合物質。
上記ラノスタン型トリテルペンは、例えば、マンネンタケ由来のトリテルペンである。
（３）Ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＴＲ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃ２，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｈ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｉ，  ５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ、ｌｕｃｉｄｕｍｏｌ  Ｂ，Ｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ａ，及びｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ｆからなる群から選択される少なくとも一つを含む、アンドロゲン受容体結合物質。
上記物質のうち、好ましくはｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂである。
上記（１）〜（３）において、アンドロゲン受容体結合物質は、好ましくはアンドロゲン受容体アンタゴニストである。
（４）試験化合物の存在下又は非存在下において、マンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合活性を測定することを含む、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーニング方法。
マンネンタケ処理物として、例えば、ラノスタン型トリテルペン又はＧａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＴＲ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃ２，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｈ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｉ，５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ、ｌｕｃｉｄｕｍｏｌ  Ｂ，Ｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ａ，及びｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ｆからなる群から選択される少なくとも一つを用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＬＮＣａＰ細胞増殖に対するｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ（２）の効果を示す図である（ｎ＝３）。Ｔはテストステロン、ＤＨＴはジヒドロテストステロン、「＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０５、及び「＊＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０１を示す。
図２は、ＬＮＣａＰ細胞増殖に対するＬａ（１２）の効果を示す図である（ｎ＝３）。Ｔはテストステロン、ＤＨＴはジヒドロテストステロン、「＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０５、及び「＊＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０１を示す。
図３は、ＬＮＣａＰ細胞増殖に対するｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ（１３）の効果を示す図である（ｎ＝３）。Ｔはテストステロン、ＤＨＴはジヒドロテストステロン、「＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０５、及び「＊＊」はＴ又はＤＨＴに対してｐ＜０．０１を示す。
図４は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）への競合的結合に対するｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ及びＤＨＴの効果を示す図である。「■」はｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂを示し、「▲」はＤＨＴを示す。
図５は、テストステロンによる前立腺肥大へのｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂの抑制効果を示す図である（ｎ＝４）。それぞれのカラムは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。Ｃは去勢ラット、Ｔはテストステロン、エタノール抽出物はＧ．ｌｕｃｉｄｕｍ．のエタノール抽出物、及び「＊」はＣ＋Ｔに対してｐ＜０．０５を示す。
図６は、アンドロゲンで刺激した細胞培養液にＧａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂを添加した際におけるＰＳＡ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現解析結果を示す図である（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。パネルａはＰＳＡの発現及びパネルｂはＡＲの発現を示す。Ｔはテストステロン及びＤＨＴはジヒドロテストステロンを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願第６０／７５９，７９５号の開示内容を包含する。
本発明は、マンネンタケ（霊芝）処理物を有効成分として含むアンドロゲン受容体の結合物質に関する。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体に結合し、受容体を介する作用に影響する。本発明の物質によるアンドロゲン受容体を介する作用への影響は、活性化効果であってもよいし、抑制効果であってもよい。受容体を介する作用の抑制効果は、例えば、前立腺癌細胞の増殖抑制効果（実施例１）、前立腺肥大防止効果（実施例５）、前立腺癌マーカーの発現抑制効果（実施例６）又はアンドロゲン受容体の発現抑制効果（実施例６）として観察される。
また、本発明者はこれまでにマンネンタケ抽出物が５α−リダクターゼ活性阻害作用を有することを明らかにしている。そこで、本発明のアンドロゲン受容体結合物質の５α−リダクターゼ活性阻害作用を測定したところ、アンドロゲン受容体結合物質の中には当該作用を有するものと、当該作用を有しないものがあった。したがって、本発明のアンドロゲン受容体結合物質のアンドロゲン受容体結合活性及び前立腺癌細胞に対する作用などは、５α−リダクターゼ活性阻害作用に依存する作用ではないといえる。すなわち、本発明によりマンネンタケ処理物の新しい作用機序が見出され、本発明はマンネンタケ処理物の新規用途を提供するものである。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、マンネンタケ処理物を有効成分として含有する。
本発明に用いるマンネンタケは、学名がＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍであり、ヒダナシタケ目マンネンタケ科に属するキノコである。マンネンタケは、一般的に霊芝と呼ばれており、古来中国では霊芝又は芝草と呼ばれ、日本ではレイシ、サイワイタケと呼ばれることもある。
本発明において、マンネンタケ処理物は、マンネンタケを抽出処理、破砕処理などすることにより得られるものである。したがって、本発明のマンネンタケ処理物には、マンネンタケ抽出物、マンネンタケ破砕物又はこれらの粉末などが含まれる。
本発明のマンネンタケの抽出物を得るための抽出処理には、メタノール、ｎ−ヘキサン、エタノール、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒又は水が用いられる。また、抽出処理はマンネンタケを含浸させ放置することにより抽出する有機溶媒抽出法及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法を適用することができるが、これらの方法に限定されず、当業者であれば公知の抽出方法を適宜選択することができる。本発明のマンネンタケ抽出物は、抽出液、その濃縮液、濃縮液を乾固させた固体又はその粉末などのいずれの形態であってもよい。
例えば、メタノール抽出法については、霊芝子実体５．０ｇを破砕し、メタノール６０ｍｌを加え、室温で一日放置し、抽出液を取り出し、残渣にさらにメタノールを加えて抽出する方法を採用することができる。この操作を合計３回行い、得られた抽出液を合わせて濃縮及び乾固させることにより、抽出物を調製する。
本発明のマンネンタケ破砕物を得るためには、ウイリーミルやボールミルで粉砕してもよいし、はさみ等で細かく切り刻んでも良い。本発明のマンネンタケ破砕物には、粉末状のマンネンタケが含まれる。また、本発明のマンネンタケ破砕物は、マンネンタケを爆砕処理することにより得ることもできる。爆砕処理により得られたマンネンタケ破砕物も、本発明のマンネンタケ処理物に含まれる。
また、本発明のマンネンタケ処理物は、アルコール飲料や清涼飲料等に上記マンネンタケ処理物を添加したような形態でもよい。
また、本発明においてマンネンタケ処理物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーによって分画操作を繰り返すことにより、さらに単離及び精製することができるが、単離及び精製はこれらの方法に限定されるものではない。また、分画、単離、精製工程において、アンドロゲン受容体結合活性を指標に使用することもできる。さらに、所望の場合は、細胞増殖抑制作用、前立腺肥大防止作用、前立腺癌マーカーの発現抑制作用等を、本発明のマンネンタケ処理物の性質を確認するための指標に採用することもできる。
上記のように分画、単離、精製することにより、アンドロゲン受容体結合活性を有する本発明のマンネンタケ処理物を得ることができる。分離、単離、精製などにより得られた処理物（例えば、単離化合物）も、本発明のマンネンタケ処理物に含まれる。
本発明のマンネンタケ処理物は、好ましくはラノスタン型トリテルペンである。本明細書において、ラノスタン型トリテルペンは、下記式（Ｉ）で示すラノスタン骨格を有するトリテルペンである。本発明のラノスタン型トリテルペンは、上記のようにマンネンタケを処理することにより取得することができる。
2007083823.tif 000002
本明細書において、ラノスタン型トリテルペン（トリテルペノイド）には、例えば、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＴＲ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃ２、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｇ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｈ、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｉ及びｇａｎｏｄｅｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ等のガノデリックアシッド体だけでなく、５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ、ｌｕｃｉｄｕｍｏｌ  Ｂ、ｇａｎｏｄｅｒｍａｔｒｉｏｌ、ｇａｎｏｄｅｒｍａｎｏｎｔｒｉｏｌ、ｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ａ及びｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ｆ等のアルコール体をも含まれる。
これらのトリテルペンの構造を下記に示す。
2007083823.tif 000003
上記表中、「Δ２４（２５）」は、２４位の炭素及び２５位の炭素が二重結合していることを意味する。
2007083823.tif 000004
2007083823.tif 000005
上記のトリテルペンの中でも、ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＴＲ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ，ｌｕｃｉｄｕｍｏｌ  Ｂ，５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ及びｇａｎｏｄｅｒｉｏｌ  Ｆは、極めて高いアンドロゲン受容体結合活性を示す。
アンドロゲン受容体（以下、「アンドロゲンレセプター」、「ＡＲ」ともいう）は、核内ホルモン受容体の一つである。核内ホルモン受容体は、ＤＮＡ結合部位（ＤＢＤ）とリガンド結合部位（ＬＢＤ）の二つのドメインからなるタンパク質である。アンドロゲンがアンドロゲン受容体のＬＢＤに結合すると、ＬＢＤの構造変化によってＤＢＤの構造が変化し、ＤＢＤがアンドロゲン応答配列に結合する。そして、応答配列の下流に存在する標的遺伝子を転写活性化することにより、アンドロゲンによるアンドロゲン受容体を介する作用が発現する。
アンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体に結合し、アンドロゲン受容体を介する作用を活性化する物質（アゴニスト）又は阻害する物質（アンタゴニスト）を意味する。アンドロゲン受容体のアゴニストは、アンドロゲン受容体を介する遺伝子の転写を促進する作用、又はテストステロンやジヒドロテストステロンによるアンドロゲン受容体を介する作用を促進する作用を有するものといえる。また、アンドロゲン受容体のアンタゴニストは、アンドロゲン受容体を介する遺伝子の転写を抑制する作用、又はテストステロンやジヒドロテストステロンによるアンドロゲン受容体を介する作用を抑制する作用を有するものといえる。本発明においてアンドロゲン受容体結合物質は、好ましくはアンタゴニストである。本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、医薬組成物として使用することもできるし、研究試薬として使用することもできる。
物質の有するアンドロゲン受容体への結合活性は、受容体結合アッセイにより確認することができる。受容体結合アッセイでは、アンドロゲン受容体、蛍光ラベルや放射ラベルした標識化標準物質及び試験物質を混合し、標識シグナルを測定することにより行うことができる。また、標準物質の偏光度を測定する蛍光偏光（ＦＰ）法（実施例１、実施例４）により実施することもできる。受容体結合アッセイでは、アンドロゲン受容体のリガンド結合部位（ＬＢＤ）を利用してもよい。また、標準物質には、テストステロン、ジヒドロテストステロンの他、アンドロゲン受容体に結合する物質を使用することができる。
また、アンドロゲン受容体結合物質の有するアンドロゲン受容体アゴニスト活性及びアンタゴニスト活性を評価する方法は、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いるレポーター遺伝子アッセイを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。
また、アンドロゲン受容体のアンタゴニストは、細胞増殖抑制作用を有することが知られているため、細胞増殖抑制作用を指標に物質のアンタゴニスト活性を評価することもできる。この際、物質の細胞増殖抑制作用がアンドロゲン受容体を介する作用であることから、当該物質について、アンドロゲン受容体への結合アッセイ（実施例２）を実施してもよい。
さらに、アンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大の抑制作用（実施例５）、前立腺癌マーカー（ＰＳＡ）の発現抑制作用（実施例６）又はアンドロゲン受容体の発現抑制作用（実施例６）を有するため、アンドロゲン受容体結合物質の性質を上記作用を指標にして評価することもできる。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大又は前立腺癌の治療若しくは予防、又はこれらの疾患の治療若しくは予防のための医薬組成物として有用であるといえる。
また、前述のように、本発明者はマンネンタケ抽出物が５α−リダクターゼ阻害活性を有することを明らかにしている。５α−リダクターゼは、テストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素である。本発明のアンドロゲン受容体アンタゴニストの中には、５α−リダクターゼ阻害活性を示すものと、阻害活性を示さないものが混在していた（実施例３）。したがって、本発明のマンネンタケ処理物によるアンドロゲン受容体の拮抗作用は、これまでにない全く新しい機序を介する作用であると言える。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質に含有されるマンネンタケ処理物の量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、単位投薬量形状あたり０．０１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜１０ｍｇとすることができる。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、マンネンタケ処理物をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容される担体により製剤化又は食品化してもよい。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アルコール飲料や清涼飲料等にマンネンタケ処理物を添加した形態でもよい。製剤化等には、具体的には、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が用いられる。固形製剤においては賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤などが用いられ、液状製剤においては溶剤、分散剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが用いられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物も用いることができる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイド、シリカ等が挙げられる。
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。
増粘剤の好適な例としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。
分散剤の好適な例としては、例えばＴｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ６０、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸クセリセリン等の界面活性剤、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤などの経口投与形態の他、静脈内点滴、若しくは注射、あるいは筋肉内注射、経腸投与などの非経口投与形態で投与し得る。投与は全身経路による投与あるいは局所投与のいずれでもよい。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質を食品として摂取することもできる。
医薬製剤の具体例を以下に示すが、これに限定されるわけではない。
（１）錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤
本発明のアンドロゲン受容体結合物質に、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤又は滑沢剤を添加して圧縮成型し、次いで必要に応じて味のマスキングを行う。腸溶性あるいは持続性を目的とするときは、所定のコーティングを行うことにより製造することができる。
（２）注射剤
本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として製造することができる。あるいは、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化し、油性注射剤として製造することができる。
（３）外用剤
本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、固状、半固状又は液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、本発明のアンドロゲン受容体結合物質をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤等を添加、混合して粉状とすることにより製造される。
上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性又は油性のゲル状、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物はいずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
（４）座剤
本発明のアンドロゲン受容体結合物質を、油性又は水性の固状、半固状又は液状の組成物とすることにより製造することができる。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、当技術分野において従来から用いられている公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。このような使用は、本発明のアンドロゲン受容体結合物質を抗腫瘍剤として用いる際に特に有効である。従来から用いられている抗腫瘍剤の好適な例としては、アドリアマイシン、シスプラチン、コルヒチン、ＣＣＮＵ（Ｌｍａｓｔｉｎｅ）、ＢＣＮＵ（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ、５−フルオロウラシル、チオテパ、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ等の１又は２種以上が挙げられる。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、通常体重１Ｋｇあたり１日に０．０１μｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１．０μｇ〜１００ｍｇの投与量で１から数回に分けて投与されるが、薬学的な有効量、投与方法又は投与手段及び投与期間は、投与対照の病理状態、性別、年齢、体重などによって左右され、当業者であれば適宜設定することができる。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介する作用に影響を与えることが可能であるので、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤又は予防剤として有効である。アンドロゲン受容体を介する疾患としては、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮癌、乳癌、ニキビ、多毛症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等が挙げられる。また、本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、その他の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への応用も可能であり、例えば、育毛料、養毛料等にも利用できる。
さらに、本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体に結合するため、アンドロゲン受容体結合物質のスクリーニング方法に使用することができる。すなわち、被験物質の存在下又は非存在下において、標識した本発明のマンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合活性を測定し、比較することにより、アンドロゲン受容体に結合し、マンネンタケ処理物とアンドロゲン受容体との結合量を変化させる物質をスクリーニングすることができる。
例えば、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体リガンド結合部位を発現する細胞の培養液に本発明のマンネンタケ処理物を添加し、所定の時間インキュベートする。本発明のマンネンタケ処理物には、放射ラベル、蛍光ラベルなどで標識されたものを用いる。インキュベートの際に、被験物質も培養液に添加する。その後、細胞を回収し、アンドロゲン受容体に結合するマンネンタケ処理物の量を、放射活性、蛍光量などの標識を指標に測定する。そして、被験物質非存在下に比べて放射活性、蛍光量などが変化した被験物質を、アンドロゲン受容体結合物質として同定することができる。また、ＦＰ法を利用してスクリーニングしてもよい。ＦＰ法では、細胞を所定の時間インキュベートした後、偏光度を測定することにより、アンドロゲン受容体結合物質を同定することができる。
前述のとおりアンドロゲン受容体は、細胞増殖、前立腺癌等に影響するため、本発明のスクリーニングでは、上記の受容体結合アッセイの他に、細胞増殖アッセイ、前立腺肥大測定、前立腺癌マーカー量の測定、アンドロゲン受容体発現量測定などにより結合活性を測定しても良い。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、実施例により本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例ではマンネンタケエタノール抽出物から１８種の単離されたトリテルペンの効果について検討した。
マンネンタケエタノール抽出物
１５ｋｇのマンネンタケ（Ｇ．ｌｕｃｉｄｕｍ）を乾燥させ、チップにした後、１２６リットルの９５％エタノールを用いて、室温で攪拌しながら抽出した。得られたエタノール抽出液を、濾紙でろ過し、濃縮及び乾固し、合計５７１グラム得た。９５％エタノール抽出物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画を行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を指標に、３５グラムのトリテルペノイド画分（ＴＬＣ，シリカゲル、ヨウ素発色、展開溶媒：酢酸エチル／ｎ−ヘキサン、７：３、Ｒｆ値０．０３−０．６７）を得た。当該トリテルペノイド画分を分取逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３，２０×２５０ｍｍ）を繰り返すことによって、以下の１８種のトリテルペノイド類を単離し、同定した。
2007083823.tif 000006
（１）〜（１１）はアシッド体であり、（１２）〜（１８）はアルコール体である。なお、（１２）の「５α−ｌａｎｏｓｔａ−７，９（１１）２４−ｔｒｉｅｎｅ−１５α，２６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｎｅ」を、「Ｌａ」と記す場合がある。
実施例１：  前立腺癌細胞の増殖抑制効果
アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０中に、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の加湿雰囲気下でインキュベートした。細胞は、分割比１：４で５〜３０回継代したものを用いた。細胞は、２×１０５個／ウェルの濃度でステロイド枯渇（ＤＣＣ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ｃＦＢＳを添加した２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を各濃度のマンネンタケ抽出物の存在下又は非存在下にコントロール（ＤＭＳＯ）又はアンドロゲン（テストステロン（Ｔ）又はジヒドロテストステロン（ＤＨＴ））でさらに３日間処置した。
細胞増殖アッセイ：細胞増殖は３−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ：ＮＲ）法により測定した。５ｍｇ／ｍｌのＮＲ溶液を作製し、培養培地で５μｇ／ｍｌに希釈した。ＮＲ抽出溶液は、水及び５０％エタノール（１％酢酸）を使用して作製した。
培養培地をＮＲ溶液に換え、３７℃で３時間培養した。続いて、ＮＲ溶液を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。５００ｍｌのＮＲ抽出溶液を各ウェルに添加し、室温で２０分間抽出処理を行った。各ウェルについて、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
図１〜３に、ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞に対するマンネンタケ抽出物の増殖抑制効果を示す。
ｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ（２）（図１）、Ｌａ（１２）（図２）及びｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ（１３）（図３）は顕著な細胞増殖抑制効果を示した。このうち、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ（１３）とＬａ（１２）は、テストステロン（Ｔ）とジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加した場合は、細胞毒性を示さない濃度で、Ｔ及びＤＨＴにより誘導される細胞増殖促進に対して抑制効果を示した。
このように、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン依存的な前立腺細胞の増殖を抑制することが可能であることが示された。
実施例２：  アンドロゲン受容体結合実験
アンドロゲン受容体競合アッセイ：エタノール抽出物のアンドロゲン受容体（ＡＲ）への結合能は、蛍光偏光（ＦＰ）法を利用して測定した。この測定方法では、室温下におけるヒトＡＲの精製再構成リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）タンパク質と高親和性の蛍光リガンド（ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ）との結合に対するエタノール抽出物の競合能を測定した。ＦＰ法は、概念的には、蛍光分子が他の分子に結合することに伴う回転速度の変化を利用してＡＲに対する試験化合物の相対親和性を定量することができる。つまり、アンドロゲン受容体−蛍光リガンドの結合複合体（ＡＲ−ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ）は、ゆっくりと回転し、高いＦＰ値を有する。一方、競合リガンドの濃度が上昇すると、ＡＲ−ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ複合体からＡＬ  Ｇｒｅｅｎが移動されて遊離する。遊離したＡＬ  Ｇｒｅｅｎは、早く回転するため、低いＦＰ値を示す。測定される偏光は、遊離ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ分子及び結合ＡＬ  Ｇｒｅｅｎ分子の平均であるため、ＦＰ法によりＡＲ−ＬＢＤからの競合置換を測定することができる。
本競合アッセイを簡単に説明する。競合アッセイは、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ａｓｓａｙ，ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。全ての試験化合物を、ＤＭＳＯ又はエタノール中のストック溶液として調製した。化合物を、３８４ウェルプレート上で３ウェルずつ、アッセイバッファーを用いて２０μＬの容量で、０．０１，０．１２５，１．２５，１２．５，２５，５０，１００，２００又は８００μＭの濃度に希釈した。最終ＤＭＳＯ濃度及び最終エタノール濃度は、いずれもキット製造元の推奨濃度を超えず、したがって、ＤＭＳＯ及びエタノールは蛍光を変化させないと予想された。
２０μｌ容量のＡＲ（ラット、最終２５ｎＭ）及びＡＬ  Ｇｒｅｅｎ（最終１ｎＭ）を、連続的に希釈された試験化合物に添加した。続いて、プレートを暗中で約４時間室温でインキュベートした。次に、偏光を、４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光干渉フィルターを用いてｂｅａｃｏｎ  ２０００  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上、偏光モードで測定した。偏光値（ｍＰ）は、試験化合物の濃度上昇に対してプロットした。
測定したＩＣ５０を表１に示す。
【表１】
2007083823.tif 000007
実施例２で低いＩＣ５０を示したｇａｎｏｄｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＤＭ（２）、Ｌａ（１２）、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ（１３）は、実施例１において細胞増殖抑制作用を示した化合物である。
表１に示すように、本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体結合活性を有することが示された。
したがって、アンドロゲン受容体結合活性を有する本発明のマンネンタケ処理物は、アンドロゲン受容体と結合することで、アンドロゲン依存性の細胞の機能（前立腺肥大症など）を阻害することができる。つまり、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大症等のアンドロゲン依存性の疾患の予防・改善に有効であるといえる。
実施例３：  ５α−リダクターゼ阻害活性
ＳＤ系雌ラット肝臓をホモジナイズしたものからミクロソーム画分を調製し、−８０℃で凍結保存しているものを５α−リダクターゼ粗酵素液とした。
反応系は全量３００μｌの系とした。［４−１４Ｃ］−テストステロン（８ｎ  Ｃｉ、０．７μＭ、全テストステロン中の０．５％程度が放射活性をもつ基質）及びコールド（非放射体）のテストステロンを含む４．５ｍＭエタノール溶液１０μｌ（反応系の最終濃度が０．１５ｍＭ）、１ｍＭジチオトレイオールを含む２０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）２２０μｌ、サンプル−ＤＭＳＯ溶液１０μｌを添加し、３７℃、１０分間インキュベートした。コントロールとしてはＤＭＳＯのみを加えた。インキュベート後、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ−ｂｕｆｆｅｒ溶液５０μｌと、先に調製した５α−リダクターゼ粗酵素液１０μｌとを添加して反応をスタートした。３７℃、１０分間インキュベート後、３Ｍ−ＮａＯＨ水溶液を１０μｌ添加して反応を止めた。エーテル９００μｌを反応系に加えてボルテックスで撹拌することによってステロイド類を抽出し、このうち２００μｌをＴＬＣ板にアプライした（展開距離は８ｃｍ）。展開溶媒は酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（７：３）の混合溶媒で展開し、このＴＬＣ板上の放射活性をイメージングアナライザー（ＦＲＡ−５０００ＲＦ、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．ＬＴＤ．）で計測した。コントロール（阻害剤なし）の活性を酵素活性１００％として、５α−リダクターゼ活性を以下のように計算した。
５α−リダクターゼ活性（％）
＝（ジヒドロテストステロンのスポットの放射活性／
アプライした位置から溶媒を展開させた上限までのＴＬＣ板全体の放射活性）×１００
５α−リダクターゼ阻害活性（％）
＝｛（コントロールの活性−サンプルの活性）／コントロールの活性｝×１００
各化合物（表１の化合物（１）〜（１８））の５α−リダクターゼ阻害活性は、表２と表３に示す。化合物の溶解度の制限で、ＩＣ５０を測定できなかった化合物は、最大溶解度における５α−リダクターゼ阻害活性を測定した。
【表２】
2007083823.tif 000008
【表３】
2007083823.tif 000009
以上の実施例の結果から、本発明のアンドロゲン受容体結合物質の有する５α−リダクターゼ阻害活性と前立腺がん細胞の細胞増殖抑制効果との間に直接的な関係は見当たらなかった。
細胞の増殖を抑制するには、様々な経路が存在している。特に前立腺がんについては、さらなる検討が必要である。
実施例４：  ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂのアンドロゲンレセプター結合試験
本実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された組み換えラットＡＲタンパク質を使用した（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）。このＡＲタンパク質は、分子量は４８．４ＫＤａであり、ヒンジ領域とリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の両者を含み、チオレドキシンと融合している。Ｐａｎ  Ｖｅｒａ社のＡＲ  ＬＢＤのアミノ酸配列はヒトＡＲ  ＬＢＤと同一である。
本実施例は実施例２と同様の蛍光偏光法を用いて行った。競合アッセイは、市販のキットである、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ａｓｓａｙ，ｇｒｅｅｎ（Ｐ３００９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添付の説明書に従って測定した。
各濃度のｇａｎｏｄｅｒｏｌ  ＢはＤＭＳＯに溶解し、２０μｌを３８４ウエルプレートに添加した。ＤＭＳＯの濃度は説明書で指示された濃度に従った。ＡＲ（２５ｎＭ）とＡＬ  Ｇｒｅｅｎ（１ｎＭ）とを混合し、その２０μｌをウエルに添加した。プレートは暗所で、４時間インキュベートした。Ｂｅａｃｏｎ  ２０００蛍光偏光測定器で蛍光偏光を測定した。
本アッセイを簡単に説明する。全ての試験化合物を、ＤＭＳＯ中のストック溶液として調製した。化合物を、３８４ウェルプレート上で３ウェルずつ、アッセイバッファーを用いて２０μＬの容量で、０．００１，１．２５，１２．５，２５，５０及び１００μＭに希釈した。最終ＤＭＳＯ濃度は、いずれも製造元の推奨濃度を超えず、したがって、ＤＭＳＯは蛍光を変化させないと予想された。
２０μｌ容量のＡＲ（最終２５ｎＭ）及びＡＬ  Ｇｒｅｅｎを、連続的に希釈された試験化合物に添加した。続いて、プレートを暗中で約４時間室温でインキュベートした。次に、偏光を、４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光干渉フィルターを用いてｂｅａｃｏｎ  ２０００ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上、偏光モードで測定した。偏光値（ｍＰ）は、試験化合物の濃度上昇に対してプロットした。
その結果、図４に示すように、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ（■）は１５μＭの濃度でＩＣ５０を示した。
実施例５：  ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂの前立腺肥大抑制効果
ＳＤ系雄３週齢ラットを一週間予備飼育した後、精巣を除去し、その４日後より連日８日間テストステロン１００μｇ／ｄａｙを皮下投与した。それらの投与と同時に、各サンプル（コントロール、Ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂ、マンネンタケエタノール抽出物）をゾンデにて強制経口投与した。ラットの飼育は室温２３．０±０．５度、湿度５５±５％で午前７時より午後７時までの１２時間を明期とした明暗サイクル下で行い、餌及び水は自由に与えた。１８時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、摘出した前立腺重量を測定した。
結果を図５に示す。図５に示したように、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂは０．１ｍｇ／ｋｇ／日及び０．００１ｍｇ／ｋｇ／日投与で有意な前立腺肥大抑制効果が発揮された。
実施例２〜４の結果によると、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂは５α−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ阻害活性が弱く、また、強いアンドロゲンレセプター結合能を示した。したがって、本実施例におけるｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂの前立腺肥大抑制効果は、アンドロゲンレセプターと結合した結果と予想できる。
本実施例により、マンネンタケ処理物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺肥大の治療に有用であることが示された。
実施例６：  前立腺癌細胞におけるｇａｎｏｄｅｒｏｌ  ＢのＰＳＡ及びＡＲ発現への影響
ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を１０％ＦＢＳ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＲＰＭＩ１６４０  ｍｅｄｉｕｍで３日間前培養した。前培養した細胞を回収し、５％ｃＦＢＳ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＲＰＭＩ１６４０  ｍｅｄｉｕｍで懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液としたものを２４ウェルに３ｍＬずつ播種した。２４時間細胞をウェルの底に接着させ、５％ｃＦＢＳ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＲＰＭＩ１６４０  ｍｅｄｉｕｍで培地交換するとともに、系内に０．１％となるようにＤＭＳＯに溶解させた各サンプルを添加した。Ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂは最終濃度４０、１０及び１μＭ、又はＴ若しくはＤＨＴは１００ｎＭとなるようにウェルに添加し、コントロールにはＤＭＳＯのみを添加した。４日間培養後、ＩＳＯＧＥＮを用いて細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡが分解されていないことを変性アガロースゲル電気泳動で確認した後、ｏｌｉｇｏ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを逆転写プライマーとし、ＴａＫａＲａ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用い逆転写反応を行った。次にｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）又はＡＲから設計した特異的プライマー（配列番号１〜４）を用いてＥｘ−Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅されたバンドの確認を行った。単一のバンドが確認できたものを、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる定量的解析を行った。
プライマー：
ＰＳＡ  ５’−ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴ−３’      （配列番号１）
５’−ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴ−３’    （配列番号２）
ＡＲ    ５’−ＧＴＧＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ−３’      （配列番号３）
５’−ＴＣＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＴＧＡ−３’    （配列番号４）
定量的解析の結果を図６に示す。ＰＳＡの発現解析結果をパネルａに示し、アンドロゲン受容体の発現解析結果をパネルｂに示す。テストステロンとＤＨＴを添加しない場合は（コントロール）、細胞のＰＳＡ発現が極めて少なかった。１００ｎＭのテストステロン又は１００ｎＭのＤＨＴは、ＰＳＡの発現が強くなった（Ｔ又はＤＨＴ）。テストステロン又はＤＨＴと、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂとを同時に添加すると、ＰＳＡの発現が抑制された。
また、特にＤＨＴとｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂとを同時に添加したときは、アンドロゲンレセプターの発現は、コントロールより弱かった。
実施例２〜４において、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂは弱い５α−リダクターゼ阻害活性と強いアンドロゲンレセプター結合活性を示した。以上の実施例の結果から、ｇａｎｏｄｅｒｏｌ  Ｂはアンドロゲンレセプターと結合して、ＰＳＡの発現を抑制して、細胞の増殖を抑制していると推定される。
ＰＳＡの発現量と前立腺癌の症状との関連性が知られているため、ＰＳＡは前立腺癌の腫瘍マーカーとして前立腺癌の診断に用いられている。したがって、マンネンタケ抽出物によりＰＳＡの発現が抑制されたことから、マンネンタケ抽出物を含む本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、前立腺癌に対する抗腫瘍効果を有する可能性が示された。
【配列表フリーテキスト】
【０００７】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明により、マンネンタケ抽出物を有効成分として含むアンドロゲン受容体結合物質が提供される。
本発明のアンドロゲン受容体結合物質は、アンドロゲン受容体を介する作用に影響を与えることができるため、アンドロゲン受容体を介するシグナルの研究試薬、又はアンドロゲン依存的な疾患もしくはアンドロゲン受容体を介する疾患の治療剤、予防剤として有効であり、特に前立腺癌及び前立腺肥大症の治療に有効である。
また、本発明の抽出物の５α−リダクターゼ活性阻害作用を測定したところ、５α−リダクターゼ阻害活性を示すものと、阻害活性を示さないものが混在していた。したがって、マンネンタケ抽出物によるアンドロゲン受容体の拮抗作用は、これまでにない全く新しい機序を介する作用であると言える。すなわち、本発明により、新規のアンドロゲン受容体結合物質が提供される。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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