(57)【要約】糖化アルブミン由来のイプシロンフルクトシルリジンへの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な改変型フルクトシルアミン酸化酵素を提供すること。フルクトシルアミン酸化酵素であって、該酵素を構成する少なくとも１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ該酵素よりもフルクトシルバリンに対する高い選択性を有することを特徴とする。本発明よれば、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な改変型フルクトシルアミン酸化酵素を提供することができる。
2007055282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトシルアミン酸化酵素であって、該酵素を構成する少なくとも１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ該酵素よりもフルクトシルバリンに対する高い選択性を有することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項２】
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項３】
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項４】
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基がアルギニン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項５】
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジンあるいはリジン残基に置換されており、かつ５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項６】
配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジンあるいはリジン残基に置換されており、かつ５１番目のヒスチジン残基がアルギニン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
【請求項７】
請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素であって、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び／又は
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表す。)
【請求項８】
請求項１に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素であって、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表し、(a)及び(b)ペプチドが前記酸化酵素内に存在するとき、
Ｙが、アスパラギン残基（Ａｓｎ）、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはヒスチジン
残基（Ｈｉｓ）のとき
Ｘが、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはアルギニン残基（Ａｒｇ）を示す）。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子を含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンアッセイキット。
【請求項１４】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトシルアミン酸化酵素に関する。さらに詳しくは、フルクトシルアミン酸化酵素の構造遺伝子上にアミノ酸置換が導入された変異フルクトシルアミン酸化酵素及び該フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子断片を組み込んでなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することによる変異フルクトシルアミン酸化酵素の製造方法に関する。また、本発明は、変異フルクトシルアミン酸化酵素を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質主鎖及び側鎖のアミノ基は、グルコース等の還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。また、血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；以下、ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。【０００３】
糖尿病患者は、健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が非常に高い。また、ＨｂＡ１ｃの血中濃度は、過去数ヶ月の一定期間の血糖値に反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度の測定値は、糖尿病の病状の診断及び病状の管理において重要な指標となっている。このようにＨｂＡ１ｃ血中濃度の測定値は、糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。【０００４】
このＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端のバリンにグルコースが結合している構造を有していることから、フルクトシルバリンをＨｂＡ１ｃの低分子モデル化合物として用いることができる。すなわち、フルクトシルバリンに対して特異性を有する酵素を用いて、ＨｂＡ１ｃをアッセイすることが可能である。【０００５】
近年、酵素の有する基質、構造、位置等の特異性に着目し、その酵素反応を利用して血中の糖化蛋白質を定量することが提案されている。例えば、これまでに、種々の菌株から糖化蛋白質に対して作用する酵素が単離されており、これらの酵素を用いて糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトサミン等の糖化蛋白質を分析し得ることが示唆されている（特許文献１〜６及び非特許文献１〜８）。【０００６】
また、フルクトシルバリンと反応するフルクトシルアミン酸化酵素として、フルクトシルアミン酸化酵素生産能を有する酵母及びピキア属（Pichia）の菌由来のフルクトシルアミン酸化酵素が開示されている（特許文献７）。【０００７】
しかしながら、上記これらのフルクトシルアミン酸化酵素は、血中に存在する糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンのみならず、ＨｂＡ１ｃ由来のフルクトシルバリンにも、これを基質として反応してしまう特質を有する。したがって、従来のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて、ＨｂＡ１ｃの計測をしても、糖化アルブミン共在下においては、ＨｂＡ１ｃのみの計測は、きわめて困難であるという問題点があった。【０００８】
また、全血を対象とする従来のフルクトシルアミン酸化酵素を用いたＨｂＡ１ｃの計測法においては、上記酸化酵素が蛋白質の状態での糖化部位の酸化が行えないため、まず蛋白質分解酵素によって、検体試料中（全血）の糖化された蛋白質を蛋白質分解酵素によって処理し、その後フルクトシルアミノ酸を遊離させ、これをフルクトシルアミン酸化酵素で計測を行なければならないという問題点があった。【０００９】
すなわち、フルクトシルアミン酸化酵素の反応を利用した血中の糖化蛋白質の定量による臨床分析技術においては、フルクトシルバリンに対するきわめて高い選択性を有するフルクトシルアミン酸化酵素が必要となる。つまり、血中に存在する糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンへの反応性に対して、フルクトシルバリンにのみ特異的なフルクトシルアミン酸化酵素の開発が切望されているところである。【００１０】
またフルクトシルアミン酸化酵素の立体構造は、全く明確にされていないため、同酸化酵素の構造情報に基づき、同酵素の基質特異性を改変することはきわめて困難であった。このため、フルクトシルアミン酸化酵素に変異を導入し、εフルクトシルリジンへの反応性に対して、フルクトシルバリンにのみ特異的なフルクトシルアミン酸化酵素を開発したという報告はまったくない。【００１１】
なお、本発明に関連する先行技術としては、以下のものがある。
【特許文献１】特開昭６１−２６８１７８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２８０２９７号公報
【特許文献３】特開平  ３−１５５７８０号公報
【特許文献４】特開平  ５−１９２１９３号公報
【特許文献５】特開平  ７−２８９２５３号公報
【特許文献６】特開平  ８−１５４６７２号公報
【特許文献７】特開２００４−２７５１６８号公報
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989
【非特許文献２】Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338, 1991
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 269(44), 27297-27302, 1994
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., 61(12), 4487-4489, 1995
【非特許文献５】Biosci. Biotech. Biochem., 59(3), 487-491, 1995
【非特許文献６】J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995
【非特許文献７】J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、フルクトシルアミン酸化酵素の構造を解析し、同酸化酵素の基質特異性に関与される位置に変異を導入することにより、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンにのみ特異的な改変型フルクトシルアミン酸化酵素を構築し、その遺伝子情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い、該酵素の製造方法ならびにこれを用いる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、フルクトシルアミン酸化酵素の構造を解析し、同酸化酵素の基質特異性に関与される位置に変異を導入することにより、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンへの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な改変型フルクトシルアミン酸化酵素を構築し、さらにその情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い該酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、該培養物から改変型フルクトシルアミン酸化酵素採取することによって改変型フルクトシルアミン酸化酵素を大量生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、以下の事項に関する。すなわち、
（１）フルクトシルアミン酸化酵素であって、該酵素を構成する少なくとも１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ該酵素よりもフルクトシルバリンに対する高い選択性を有することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（２）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（３）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基に置換されていることを特徴とする（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
フルクトシルアミン酸化酵素であって、該酵素を構成する少なくとも１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ該酵素よりもフルクトシルバリンに対する高い選択性を有することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（４）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基がアルギニン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（５）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジンあるいはリジン残基に置換されており、かつ５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基に置換されていることを特徴とする（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（６）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジンあるいはリジン残基に置換されており、かつ５１番目のヒスチジン残基がアルギニン残基あるいはリジン残基に置換されていることを特徴とする（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
（７）（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素であって、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び／又は
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表す。)
（８）（１）に記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素であって、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とする改変型フルクトシルアミン酸化酵素。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表し、(a)及び(b)ペプチドが前記酸化酵素内に存在するとき、
Ｙが、アスパラギン残基（Ａｓｎ）、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはヒ
スチジン残基（Ｈｉｓ）のとき
Ｘが、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはアルギニン残基（Ａｒｇ）を示す）。（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子。
（１０）（９）に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
（１１）（９）に記載の遺伝子を含むことを特徴とする形質転換体。
（１２）（９）に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれていることを特徴とする形質転換体。
（１３）（１）〜（８）のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンアッセイキット。
（１４）（１）〜（８）のいずれかに記載の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビンセンサーに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明よれば、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な改変型フルクトシルアミン酸化酵素を提供することができる。【００１６】
同時に、本発明によれば、上記酸化酵素の遺伝子情報を特定し、該酸化酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片を組み込んでなる組み換えベクター及び形質転換体を提供することができる。【００１７】
さらに、本発明によれば、上記形質転換体を培養し、該培養物から改変型フルクトシルアミン酸化酵素を採取することによって改変型フルクトシルアミン酸化酵素を大量生産できる。【００１８】
また、本発明によれば、血中の糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジン存在下においても、ＨｂＡ１ｃのみを選択的に簡易かつ高感度に計測することができる。【００１９】
つまり、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、従来のフルクトシルアミン酸化酵素と比較して、フルクトシルバリンに対する選択性がきわめて向上しており、特に、εフルクトシルリジンに対する反応性と比較してフルクトシルバリンに対する反応性が高い。したがって、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーは、フルクトシルバリン測定に関して選択性が高く、糖化アルブミン試料が混在する血液試料を用いても高感度にＨｂＡ１ｃを検出できるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】フルクトシルアミン酸化酵素のアミノ酸配列を記載した配列番号１を示す。
【図２】フルクトシルアミン酸化酵素の遺伝子配列を記載した配列番号２を示す。
【図３】アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５．０ｍＭ）。
【図４】アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５．０ｍＭ）。
【図５】アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５００ｍＭ）。
【図６】アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５００ｍＭ）。
【図７】アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５．０ｍＭ）。
【図８】アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換し、かつ３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５．０ｍＭ）。
【図９】アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５００ｍＭ）。
【図１０】アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５００ｍＭ）。
【図１１】アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換し、かつ３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによる基質濃度の測定結果を示す（緩衝溶液濃度５００ｍＭ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。【００２２】
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素＞
本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的であることを特徴とするものである。すなわち、従来のフルクトシルアミン酸化酵素生産能を有する酵母及びピキア属（Pichia）の菌由来のフルクトシルアミン酸化酵素に比較して、フルクトシルバリンに対するきわめて高い選択性を有するものである。具体的に、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、ピキア属（Pichia sp. N1-1株）[独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２６]由来フルクトシルアミン酸化酵素の第３５４残基あるいは第５１残基、または他の種における同等の領域においてアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする。すなわち、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換されているか、あるいは第５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基あるいはリジン残基あるいはアルギニン残基で置換されているものである。【００２３】
また別の態様においては、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換されており、かつ、第５１番目のヒスチジン残基がグリシン残基あるいはアラニン残基あるいはリジン残基あるいはアルギニン残基で置換されているものである。【００２４】
また別の態様において本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、糖化アルブミン由来のεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的であって、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とするものである。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び／又は
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表す。)【００２５】
さらに別の観点においては本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、以下のアミノ酸配列で表されるペプチドが存在することを特徴とするものである。
(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
及び
(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表し、(a)及び(b)ペプチドが前記酸化酵素内に存在するとき、Ｙが、アスパラギン残基（Ａｓｎ）、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはヒスチジン残基（Ｈｉｓ）のとき
Ｘが、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはアルギニン残基（Ａｒｇ）を示す）。【００２６】
これらの残基は、その酸化酵素の構造上、基質との相互作用はまったく不明である。そこで、酸化酵素中のこれら残基を単独あるいは双方同時に他のアミノ基により置換し、フルクトシルアミン酸化酵素に変異を導入し、基質の選択性や酵素活性を大きく変化させたものである。つまり、本発明は、フルクトシルアミン酸化酵素生産能を有する酵母及びピキア属（Pichia）の菌由来のフルクトシルアミン酸化酵素の特定位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、変異を導入することにより、フルクトシルバリンに対するきわめて高い選択性の向上を可能としたものである。【００２７】
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素の製造方法＞
本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素の改変前のフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、フルクトシルアミン生産菌株から得ることができる。具体的には、フルクトシルアミン酸化酵素生産能を有するピキア属（Pichia sp.）の菌株が好ましい。フルクトシルアミン酸化酵素生産能を有する菌株としては、フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含んでいれば特に制限されるものでないが、例えば、ピキア  アカシアエ（Pichia acaciae）、ピキア  アルニ（Pichia alni）、ピキア  アムブロシアエ（Pichia ambrosiae）、ピキア  アメリカナ（Pichia Americana）、ピキア  アミフィリア（Pichia amyloｐＨilia）、ピキアンゴフォラエ（Pichia angoｐＨrorae）、ピキア  アングスタ（Pichia angusta）、ピキア  アノマラ（Pichia anomala）及びピキア  バアケリ（Pichia barkeri）等を例示することができる。なかでも、入手容易の観点から、ピキア属（Pichia sp. N1-1株）[独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２６]が最も好ましい。フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子は、上記菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらには、いわゆるＰＣＲ法等の利用によりフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子断片を容易に得ることができる。【００２８】
上記フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法を例示することができる。例えば染色体を分離、精製した後、超音波、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡを平滑末端又は付着末端においてＤＮＡリガーゼ等により結合閉鎖させて組み換えベクターを構築する。該組み換えベクターを副生可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターを保持する微生物を得る。【００２９】
次いで、上記組み換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌株から該組み換えベクターを分離、精製、該発現ベクターから
フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子を採取することがでる。【００３０】
本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子は、野生型のフルクトシルアミン酸化酵素をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための方法は、特に限定されるものではないが、当該技術分野において知られている種々の公知技術を採択することにより容易に行なうことができる。例えば、Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory Manual”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。【００３１】
このようにして得られたフルクトシルアミン酸化酵素の変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。【００３２】
なお、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素においては、フルクトシルバリン選択性が向上した酵素活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、上記同様に当該技術分野においてよく知られている種々の公知技術を採用することができる。【００３３】
さらに、本発明においては、他の微生物に由来するフルクトシルアミン酸化酵素についても、その蛋白質の一次構造とピキア属（Pichia sp.） N1-1株由来フルクトシルアミン酸化酵素の一時構造を並列して比較することにより、ピキア属（Pichia sp.） N1-1株由来フルクトシルアミン酸化酵素の第３５４残基および第５１残基と同等の領域を容易に認識することができる。この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、他の微生物に由来するフルクトシルバリン選択性の向上した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を容易に得ることができる。【００３４】
また、他の微生物に由来するフルクトシルアミン酸化酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、ピキア属（Pichia sp.） N1-1株由来フルクトシルアミン酸化酵素の第３５４残基および第５１残基と同等の領域を容易に認識することができる。この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、フルクトシルバリン選択性の向上した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を容易に得ることもできる。さらに、上記方法に限定されず、他の方法によっても、他の微生物に由来するフルクトシルアミン酸化酵素のピキア属（Pichia sp.） N1-1株由来フルクトシルアミン酸化酵素の第３５４残基および第５１残基と同等の領域を認識することにより、該領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、フルクトシルバリン選択性の向上した改変型フルクトシルアミン酸化酵素を得ることもできる。例えばフルクトシルアミン酸化酵素内にフルクトシルアミン酸化酵素活性を有する、フルクトシルアミン酸化酵素内に以下のアミノ酸配列で表されるペプチドを存在させることによって得ることができる。（(a)  Ｌｙｓ−ＩｌｅＰｈｅ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ及び(b)  Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(上記(a)、(b)において、Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸を表し、(a)及び(b)ペプチドが前記酸化酵素内に存在するとき、Ｙが、アスパラギン残基（Ａｓｎ）、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはヒスチジン残基（Ｈｉｓ）のときＸが、リジン残基（Ｌｙｓ）あるいはアルギニン残基（Ａｒｇ）を示す）。【００３５】
上述のようにして得られた、改変型フルクトシルアミン酸化酵素を発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これを超遠心分離し、フルクトシルアミン酸化酵素を含む水溶性画分を得ることができる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を調製する。なお、本発明においてはこのようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライ等の種々の公知技術により粉末化して流通させることができる。【００３６】
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素の酵素活性の測定＞
次に、酵素活性の測定方法の原理について説明する。本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、フルクトシルアミノ酸を酸化して当該アミノ酸とグルコソンならびに溶存酸素を電子受容体として過酸化水素を生成する反応を触媒する作用を有する。また、改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、適当な人工電子受容体の存在下で還元型電子受容体を生成する。したがって、これら生成反応の結果生じる、還元型電子受容体を色調あるいは電気化学的分析により還元型電子受容体を定量することができ、これにより、酵素活性を計測できる。【００３７】
上記電子受容体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。【００３８】
＜フルクトシルバリンに対する選択性の評価＞
本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、フルクトシルバリン選択性が向上した酵素活性を有することを特徴とするものである。本発明において、改変型フルクトシルアミン酸化酵素のフルクトシルバリンに対する選択性は、基質として、フルクトシルバリンおよびεフルクトシルリジンのフルクトシルアミノ酸を用いて上述のように酵素活性を測定し、フルクトシルバリンを基質とした場合の活性に対するεフルクトシルリジンの相対活性を調べることにより評価することができる。【００３９】
＜フルクトシルバリン計測キット＞
本発明においては、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を用いてフルクトシルバリン計測キットを構築することができる。本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素に加えて、計測に必要な緩衝溶液、適当なメディエータ及び必要な場合には、ぺルオキシターゼ等の酵素、キャブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリン若しくはその誘導体の標準溶液、並びに使用に指針を含む。本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、種々の形態で、例えば凍結された試薬や、適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。【００４０】
また、上記本発明のフルクトシルバリン計測キットは、改変型フルクトシルアミン酸化酵素の酸化還元反応の結果生じる過酸化水素を検出する原理に基づいても構築できる。すなわち、改変型フルクトシルアミン酸化酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、ならびに過酸化水素検出系としてペルオキシダーゼならびにその発色基質である4アミノアンチピリンとTODB（Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホプロピル）−３−メチルアニリン２ナトリウム）、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリン標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、種々の形態で例えば、凍結乾燥された試薬として又は適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。【００４１】
本発明のフルクトシルバリン計測キットは、改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含むフルクトシルバリンアッセイキットであることを特徴とする。しかも、本発明のフルクトシルバリン計測キットは、フルクトシルバリンに対する高い選択性を有する改変型フルクトシルアミン酸化酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量を含有することを特徴とする。【００４２】
＜ＨｂＡ１ｃアッセイキット＞
さらに本発明においては、フルクトシルバリンに対する高い選択性を有する改変型フルクトシルアミン酸化酵素を用いてＨｂＡ１ｃアッセイキットを構築できる。ＨｂＡ１ｃを酵素的または化学的に分解することによりフルクトシルバリンが生成し、これを本発明のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて定量することによりＨｂＡ１ｃをアッセイすることができる。したがって、本発明のＨｂＡ１ｃアッセイキットは、上述のフルクトシルバリン計測キットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含む。【００４３】
＜計測用センサー＞
また、本発明のフルクトシルアミン酸化酵素を用いて、フルクトシルバリン計測用センサーおよびＨｂＡ１ｃ計測用センサーを構築できる。すなわち、本発明のフルクトシルアミン酸化酵素の作用により消費される酸素または発生する過酸化水素を計測することにより、基質であるフルクトシルバリンの濃度を決定することができる。酸素又は過酸化水素を測定する種々のセンサー系が当該技術分野において知られている。電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。【００４４】
酸素電極を用いる場合には、電極表面に本発明の酵素を固定化して、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて電流の減少値を測定する。【００４５】
さらにカーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわち、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子マトリックスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。【００４６】
作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。【００４７】
いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度のフルクトシルバリン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めることができる。【００４８】
また、ＨｂＡ１ｃ計測用センサーとして用いる場合は、上述のフルクトシルバリン計測用センサーに、さらに蛋白質分解酵素（例えばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、複合センサーを構築する。このような、複数の酵素の組み合わせによる連続的反応を用いる複合センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばBiosensors -Fundamental and Applications-Anthony P. F. Tuner, Isao Karube and Geroge S. Wilson, Oxford University Press 1987に記載されている。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明につき、実施例を用いて説明するが、本発明は、なんらこれに限定されるものではない。【００５０】
（実施例１）
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素の構築＞
改変型フルクトシルアミン酸化酵素の構築は、野生型フルクトシルアミン酸化酵素に部位特異的変異導入により、目的の残基にアミノ酸置換を導入した。具体的には、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基あるいはリジン残基、及び／又は５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基、アラニン残基、アルギニン残基、あるいはリジン残基のいずれかの残基に置換した酸化酵素を作製した。部位特異的変異導入はQuik Change法（登録商標）により行った。【００５１】
テンプレートとしては、ピキア属（Pichia sp.） N1-1株由来フルクトシルアミン酸化酵素の構造遺伝子が大腸菌発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入されたベクタープラスミド、ｐＴＮ１を用いた。このｐＴＮ１をテンプレートとし、変異導入用プライマーを用いてPCR増幅を行った。なお変異導入用プライマーは、表１（表中、上から順に配列番号３〜１０とする。）示したプライマー（フォワード）を使用した。以下、表1に変異導入用プライマー及び表２にPCR増幅反応の条件を示した。なお、プライマー（リバース）の変異導入用プライマーは、上記プライマー（フォワード）に基づいて作製した。【００５２】
【表１】
2007055282.tif 000003
【００５３】
【表２】
2007055282.tif 000004
【００５４】
続いて、PCR後の試料にＤｐｎＩ(10U)を加え３７℃、３０分インキュベートすることでテンプレートＤＮＡのみを消化し、この試料を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。L寒天培地により一晩培養後、ランダムに選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。【００５５】
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素の生産および精製＞
変異導入の確認されたｐＴＮ１により形質転換した大腸菌ＤＨ５αをL培地により培養後、OD
660
=0.5〜0.8付近にて、IPTG(f.c. 0.3 ｍＭ)を添加し改変型フルクトシルアミン酸化酵素の発現を誘導し、３０℃にてOD
660
=3付近まで培養した。遠心分離(５０，０００×g、４℃、１０分)により集菌、洗浄後(０．７５％ 塩化ナトリウム水溶液)、フレンチプレスまたは超音波ホモジナイザーにより破砕を行った。得られた菌体破砕液を遠心分離(１０，０００×g、４℃、２０分)、及び超遠心分離(40,000×g、4℃、１．５時間)後、得られた上清を１００倍量の１０ ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ ７．０又は８．０）に対し透析し、(４℃、overnight)、水溶性画分を調整した。【００５６】
続いて、液体クロマトグラフィーにより改変型フルクトシルアミン酸化酵素を精製した。使用する緩衝液は、全てフィルターろ過、脱気を行った。なお、試料は、カラムにチャージする前にフィルターろ過を行った。精製度の確認は、SDS-PAGEにより行った。【００５７】
調製した水溶性画分を１０ ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)により平衡化した陰イオン交換カラム(Resource Q 6ml/Amersham Biosciences)にチャージした。溶出は１０ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)＋１M塩化ナトリウム水溶液 を用い、リニアグラジエント(0-25%/10CV)により行った。フルクトシルアミン酸化酵素活性のみられた画分を回収し、次の段階に用いた。【００５８】
得られた画分を１０ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 6.5)＋35%硫酸アンモニウムにより平衡化した疎水性相互作用カラム(Resource ＰＨe 1ml/Amersham Biosciences)にチャージした。溶出は、１０ ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 6.5)を用い、リニアグラジエント(４５〜６５%/20ＣＶ)により行った。フルクトシルアミン酸化酵素活性のみられた画分を回収し次の段階に用いた。【００５９】
このようにして得られた画分を、試料1mlに対し硫酸アンモニウム０．４５gを加え、４℃、３０分インキュベートした。遠心分離(１５，０００×g、4℃、２０分)後、得られた沈殿を１０ ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)＋1%マンノースに溶解し、１００倍量の同緩衝液に対し透析した(４℃、６時間)。さらに、１００倍量の１０ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)に対し透析し(4℃、６時間)、１０ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)により平衡化した陰イオン交換カラム(Resource Q 6ml/Amersham Biosciences)にチャージした。溶出は１０ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 8.0)＋１M 塩化ナトリウム水溶液を用い、リニアグラジエント(5-15%/15CV)により行った。フルクトシルアミン酸化酵素活性のみられた画分を１００倍量の１０ ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ 7.0)に対し透析し（4℃、overnight）、精製酵素とした。【００６０】
＜酵素活性の測定＞
改変型フルクトシルアミン酸化酵素の活性測定は、酸化還元反応により生成する過酸化水素を定量することにより行った。上記反応条件は、断りのない限り、以下の条件で行った。【００６１】
本発明の酸化酵素溶液を含む反応溶液(5ｍＭ ＰＰＢ (ｐＨ7.0)＋1.5 ｍＭ 4アミノアンチピリン＋1.5 ｍＭ TODB＋2 U ペルオキシダーゼ)に基質を加えることで反応を開始し、ＴＯＤＢと基質の反応により生成する酸化縮合生成物の波長である５４６nm吸光度変化（ΔAｂｓ）を測定した。上記吸光度変化の測定は、島津製作所製（商品名：ＢｉｏＳｐｅｃ１６００）により行なった。【００６２】
この測定値より、本発明の酸化酵素を使用した場合のフルクトシルバリン（ＦＶ）及びεフルクトシルリジン（εＦＫ）に対する酵素活性値をそれぞれ算出した。酵素活性は、1分間（ｍｉｎ）に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量を１U（unit）とした。以下に、吸光度変化から活性値を算出する式を示す。【００６３】
【数１】
2007055282.tif 000005
【００６４】
なお、上記算出式中、ＴＯＤＢの吸光係数（３８）は、その商品カタログ（株式会社同仁化学研究所発行：ＤＯＪＩＮＤＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ第２４版／総合カタログ、平成１６年２月１日発行）に基づいた。【００６５】
＜改変型フルクトシルアミン酸化酵素の基質特異性＞
本発明により構築した改変型フルクトシルアミン酸化酵素の基質特異性についてリン酸緩衝液５．０ｍＭにおいて検討した。上記のように、５４６nm吸光度変化（ΔAｂｓ）を測定することによって、酵素活性値を算出した。【００６６】
また、得られた活性値（U／ｍｌ）に当該サンプル中の蛋白質密度（ｍｇ／ｍｌ）の逆数を乗じて、単位グラムあたりの活性値（U／ｍｇ）を算出することができる。上記これらのフルクトシルバリン（ＦＶ）及びεフルクトシルリジン（εＦＫ）に対する酵素活性値に基づいて基質特異性を算出した。その結果を表３に記す。なお、本発明における改変型フルクトシルシルアミン酸化酵素の基質特異性とは、該酵素のεフルクトシルリジンに対するフルクトシルバリンに対する選択性を意味するものである。基質特異性（％）は、上記算出されたそれぞれの酵素活性の比を採り、以下のように定義して算出した。【００６７】
【数２】
2007055282.tif 000006
【００６８】
（実施例２〜実施例４）
実施例２〜実施例４においては、以下のようにフルクトシルアミン酸化酵素を構成する特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した以外は、実施例１と同様に酸化酵素を構築し、その酵素活性を測定した。これらの酵素活性の値から基質特異性を算出した。結果を表３に示す。なお、実施例２においては、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した酵素を使用し、実施例３においては、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換した酸化酵素を使用し、実施例４においては、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換し、かつアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した酸化酵素を使用した。【００６９】
（実施例５〜実施例８）
リン酸緩衝液の濃度をリン酸緩衝液５００ｍＭとした以外は、実施例１〜４と同様に酸化酵素を構築し、その酵素活性を測定し、その基質特異性を算出した。【００７０】
（比較例１及び比較例２）
野生型のフルクトシルアミン酸化酵素を使用し、リン酸緩衝液の濃度を
５．０ｍＭ及び５００ｍＭとしてそれぞれ酵素活性を測定した。同様に、その基質特異性を算出した。【００７１】
【表３】
2007055282.tif 000007
【００７２】
リン酸緩衝５ｍＭにおいては、野生型酵素を使用した場合（比較例１）、フルクトシルバリンへの活性を１００％としたとき、εフルクトシルリジンへの活性が１６０％であるのに対して、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例１）を使用した場合では１８％となっている。すなわち、本発明の改変型酸化酵素は、野生型酸化酵素に比較して、εフルクトシルリジンへの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な酸化酵素であることが理解される。【００７３】
同様に、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例２）を使用した場合では１１％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例３）を使用した場合では３２％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基、
アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例４）を使用した場合では、４％となっており、本発明の改変型酸化酵素は、いずれも野生型酸化酵素と比較してεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な酸化酵素であった。【００７４】
また、リン酸緩衝５００ｍＭにおいては、野生型酵素を使用した場合（比較例２）、フルクトシルバリンへの活性を１００％とすると、εフルクトシルリジンへの活性が４２％であるのに対して、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例５）を使用した場合では２％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例６）を使用した場合では３％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例７）を使用した場合では３％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をグリシン残基、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例８）を使用した場合では、２％となった。【００７５】
（実施例９〜実施例１４）
実施例９〜実施例１４においては、以下のようにフルクトシルアミン酸化酵素を構成する特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した以外は、実施例１と同様に酸化酵素を構築し、その酵素活性を測定した。これらの酵素活性の値から基質特異性を算出した。結果を表４に示す。なお、実施例９〜実施例１０においては、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基あるいはリジン残基に置換した酸化酵素を使用し、実施例１１〜実施例１４においては、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基あるいはリジン残基に置換し、かつアミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換した酸化酵素を使用した。なお、リン酸緩衝液の濃度は、５．０ｍＭとしてそれぞれ酵素活性を測定した。【００７６】
【表４】
2007055282.tif 000008
【００７７】
（実施例１５〜実施例２１）
リン酸緩衝液の濃度をリン酸緩衝液５０ｍＭとした以外は、実施例２及び実施例９〜実施例１４と同様に酸化酵素を構築し、その酵素活性を測定し、その基質特異性を算出した。結果を表５に示す。【００７８】
（比較例３）
野生型のフルクトシルアミン酸化酵素を使用し、リン酸緩衝液の濃度を
５０ｍＭとして、比較例１と同様に、酵素活性を測定し、その基質特異性を算出した。【００７９】
【表５】
2007055282.tif 000009
【００８０】
（実施例２２〜実施例２７）
リン酸緩衝液の濃度をリン酸緩衝液５００ｍＭとした以外は、実施例９〜実施例１４と同様に酸化酵素を構築し、その酵素活性を測定し、その基質特異性を算出した。結果を表６に示す。【００８１】
【表６】
2007055282.tif 000010
【００８２】
表４からも明らかなように、リン酸緩衝５ｍＭにおいては、野生型酵素を使用した場合（比較例１）、フルクトシルバリンへの活性を１００％としたとき、εフルクトシルリジンへの活性が１６０％であるのに対して、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例１０）を使用した場合では１１０％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した場合（実施例９）では０％であった。【００８３】
また、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した場合（実施例１１及び実施例１２）ではいずれも０％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例１３）では２％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例１４）では０％となっている。すなわち、本発明の改変型酸化酵素は、いずれも野生型酸化酵素と比較してεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な酸化酵素であることが理解される。【００８４】
同様に、表５からも明らかなように、リン酸緩衝５０ｍＭにおいては、野生型酵素を使用した場合（比較例３）、フルクトシルバリンへの活性を１００％とすると、εフルクトシルリジンへの活性が１３０％であるのに対して、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例１５）を使用した場合では４％、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例１６）を使用した場合では２％であり、またリジン残基に置換した場合（実施例１７）は２１％であった。アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した場合（実施例１８及び実施例１９）ではいずれも０％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例２０）では１％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例２１）では０％となっている。すなわち、本発明の改変型酸化酵素は、いずれも野生型酸化酵素と比較してεフルクトシルリジンの反応性に対して、フルクトシルバリンに特異的な酸化酵素であることが明らかとなった。【００８５】
表６からも明らかなように、リン酸緩衝５００ｍＭにおいては、野生型酵素を使用した場合（比較例２）、フルクトシルバリンへの活性を１００％とすると、εフルクトシルリジンへの活性が４２％であるのに対して、アミノ酸配列の５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した変異を導入した改変型酸化酵素（実施例２２）を使用した場合では０％であり、またリジン残基に置換した場合（実施例２３）は３％であった。アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基あるいはリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をアルギニン残基に置換した場合（実施例２４及び実施例２５）ではいずれも０％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例２６）では０％、アミノ酸配列の３５４番目のアスパラギン残基をリジン残基に置換し、かつ５１番目のヒスチジン残基をリジン残基に置換した場合（実施例２７）では０％となっている。【００８６】
このように、リン酸緩衝液の濃度が５．０ｍＭ、５０ｍＭ及び５００ｍＭのいずれの場合においても、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、野生型のフルクトシルアミン酸化酵素に比較し、フルクトシルバリンに対する高い選択性を有していることが判った。本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素は、フルクトシルバリンに特異的なフルクトシルアミン酸化酵素であることが明らかとなった。【００８７】
すなわち、本発明においては、フルクトシルアミン酸化酵素を構成する少なくとも１個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換し変異を導入することにより、野生型酸化酵素に比較して、εフルクトシルリジンの反応性に対しフルクトシルバリンに対する高い選択性を有する酸化酵素に改変することができた。【００８８】
なお、表３〜表６において、フルクトシルアミン酸化酵素のフルクトシルバリンへの反応性がリン酸緩衝液の濃度によって異なり、緩衝溶液の濃度が大きいほどフルクトシルバリンへの活性が高まることは、特開２００１−２０４４９４号公報において開示されているとおりであり、当業界の技術常識である。【００８９】
（実施例２８）  
＜フルクトシルバリンの検出＞
上記実施例１及び実施例２使用した改変型フルクトシルアミン酸化酵素並びに同酵素反応の結果生じる過酸化水素を検出する反応系を組み合わせた計測キットを作製した。そして、当該各計測キットを用い、基質濃度を測定した。測定結果を図３及び図４に示す。なお、リン酸緩衝溶液の濃度は、５．０ｍＭとした。【００９０】
（実施例２９）
実施例２８と同様にして計測キットを作製した。当該各計測キットを用い、リン酸緩衝溶液の濃度を５００ｍＭとして基質濃度を測定した。測定結果を図５及び図６に示す。【００９１】
＜フルクトシルバリンの検出＞
（実施例３０〜実施例３１）
上記実施例９〜実施例１１で使用した改変型フルクトシルアミン酸化酵素並びに同酵素反応の結果生じる過酸化水素を検出する反応系を組み合わせた計測キットを作製した。そして、当該各計測キットを用い、基質濃度を測定した。測定結果を図７及び（実施例９の改変型フルクトシルアミン酸化酵素）、図８（実施例１１の改変型フルクトシルアミン酸化酵素）に示す。なお、リン酸緩衝溶液の濃度は、５．０ｍＭとした。【００９２】
（実施例３２〜実施例３４）
上記実施例９〜実施例１１で使用した改変型フルクトシルアミン酸化酵素並びに同酵素反応の結果生じる過酸化水素を検出する反応系を組み合わせた計測キットを作製した。そして、当該各計測キットを用い、基質濃度を測定した。当該各計測キットを用い、リン酸緩衝溶液の濃度を５００ｍＭとして基質濃度を測定した。測定結果を図９（実施例９の改変型フルクトシルアミン酸化酵素）、図１０（実施例１０の改変型フルクトシルアミン酸化酵素）、図１１（実施例１１の改変型フルクトシルアミン酸化酵素）に示す。【００９３】
以上、図３〜図１１から理解されるように、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットは、各緩衝液濃度においても、いずれの改変型フルクトシルアミン酸化酵素を使用した場合においても高感度にフルクトシルバリンの計測が可能である。すなわち、本発明の本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットによれば、糖化アルブミン試料が混在する血液試料を用いてもきわめて高感度にフルクトシルバリンの計測が行うことができる。【００９４】
一方、本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素を含む計測キットを用いた場合、εフルクトシルリジンは、ほとんど検出できなかった。【００９５】
このことから特に、血清中の糖化アルブミンならびにその加水分解産物のεフルクトシルリジン濃度である数１００μＭ付近においては、改変型酵素はεフルクトシルリジンをほとんど基質としないことが明瞭に理解される。このことから、血清試料に対応する濃度域においては、本発明の改変型酵素を用いた計測キットによってフルクトシルバリンを選択的に計測できる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の改変型フルクトシルアミン酸化酵素及びこれを用いたフルクトシルバリンならびにＨｂＡ１ｃの検出方法、計測キット及びセンサーは、糖尿病の診断や臨床検体の分析等の臨床試験に大きく貢献することができるものであり、医療分野の技術革新に寄与することができる。【００９７】
すなわち、本発明は、改変型フルクトシルアミン酸化酵素を用いており、フルクトシルバリン測定に関して選択性が高く、糖化アルブミン試料が混在する血液試料を用いた場合であっても、高感度にＨｂＡ１ｃを検出できるため、糖尿病に代表される生活習慣病等の医療技術の更なる進歩に大きく寄与することができる革新的な技術である。
【図１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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