(57)【要約】  ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法、該製造方法により得られるブナシメジ由来抽出物、ならびに該抽出物を含有する食品及び医薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法。
【請求項２】
得られた抽出物を酸により中和する工程を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
さらに乳化剤を添加する工程を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
アルカリ性の水性溶媒が、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
抽出溶媒での抽出が、４０〜１２０℃の温度で行われる、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の製造方法で得られうる、ブナシメジ由来抽出物。
【請求項７】
テルペン化合物を乾固物換算で０．４重量％以上含む、請求項６記載のブナシメジ由来抽出物。
【請求項８】
請求項６又は７記載のブナシメジ由来抽出物を含有する食品。
【請求項９】
請求項６又は７記載のブナシメジ由来抽出物を含有する医薬。
【請求項１０】
下記（ａ）及び（ｂ）の各工程を含む、テルペン化合物の製造方法
（ａ）ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の水性溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた抽出物からテルペン化合物を精製する工程。
【請求項１１】
アルカリ性の水性溶媒が、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
アルカリ性の水性溶媒での処理が、４０〜１２０℃の温度で行われる、請求項１０又は１１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブナシメジ由来抽出物の製造方法、該製造方法によって得られるブナシメジ由来抽出物、該抽出物を含む食品、及び該抽出物を含む医薬に関する。更には、ブナシメジ由来のテルペン化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、担子菌類からの生理活性物質検索が盛んであり、様々な報告がなされている。ブナシメジ由来の生理活性成分としては、ＳＢＳという物質が血小板凝集抑制作用および抗発ガンプロモーター作用を有していることが知られている（例えば、特許文献１）。このＳＢＳは、苦味成分であるテルペン化合物（テルペノイド）の一種であり、ブナシメジには他にも種々のテルペン化合物が含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１）。【０００３】
テルペン化合物は、多くの植物に存在する有機化合物であり、炭素数が５の倍数で、ｎ個のイソプレンあるいはイソペンタンから構成される前駆物質に由来する。ｎ＝２のものはモノテルペン、ｎ＝３はセスキテルペン、ｎ＝４はジテルペン、ｎ＝５はセスタテルペン、ｎ＝６はトリテルペン、ｎ＝８はテトラテルペン、それ以上はポリテルペンと称される。テルペン化合物にはアポトーシスを誘発する作用も知られており、たとえば、トリテルペンのアポトーシス誘発作用の報告など、数多く存在する。【０００４】
ブナシメジ由来のテルペン化合物は水に難溶性であることが知られており（例えば、特許文献１）、該テルペン化合物を抽出する方法としては、ブナシメジ子実体より酢酸エチル等の有機溶媒で抽出する方法（例えば、特許文献１）や、熱処理したブナシメジ子実体を７０％エタノールで抽出する方法（例えば、非特許文献１）が知られている。
【特許文献１】特開平４−１０４７９５号公報
【非特許文献２】Ｓａｗａｂｅ  Ａ．他３名，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１９９６年，Ｖｏｌ．３１，Ｐ９２１−９２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような従来の方法でブナシメジよりテルペン化合物を抽出する場合、大量の有機溶媒、例えばエタノール、酢酸エチルを使用する必要がある。ところが、エタノールや酢酸エチルは危険物として取り扱われるものであり、工業化にあたっては安全性の観点から、その取り扱いや保管、管理、使用などには十分な注意を要する。また、それらの保管、管理の為の設備も必要となる。これらが相まって、テルペン化合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物の製造原価を押し上げる要因となっており、工業化に際して大きな課題となっている。【０００６】
また、上記のような従来の方法で得られたブナシメジ由来抽出物を食品に用いる場合、有機溶剤の抽出物中への残留が食品の風味を損ねるという問題や、有機溶剤が毒性物質である場合には人体へ悪影響を及ぼす恐れがある。たとえこれらの問題を回避するために残留有機溶媒を除去する工程を加えたとしても、完全に残留有機溶剤を除去する事は困難である。また、有機溶剤を除去する工程を加える事により、製造原価がさらに上昇する事となる。【０００７】
従って、本発明の目的は、有機溶剤を用いる事なくブナシメジよりテルペン化合物を効率よく抽出し、テルペン化合物を多く含むブナシメジ由来抽出物を低コストにて提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ブナシメジをアルカリ性の抽出溶媒で処理する事により、有機溶剤を用いることなく、テルペン化合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物を製造できる事を見出し、本発明を完成させた。【０００９】
即ち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法に関する。第１の発明においては、得られた抽出物を酸により中和する工程をさらに含んでも良い。また、第１の発明においては、さらに乳化剤を添加する工程を含んでいても良い。
第１の発明に使用されるアルカリ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液が例示される。
第１の発明において、抽出溶媒での抽出としては、４０〜１２０℃の温度で行われる抽出が例示される。【００１０】
本発明の第２の発明は、第１の発明の製造方法によって得られうる、ブナシメジ由来抽出物に関する。第２の発明のブナシメジ抽出物としては、テルペン化合物を乾固物換算で０．４重量％以上含むものが例示される。【００１１】
本発明の第３の発明は、第２の発明のブナシメジ由来抽出物を含有する食品に関する。【００１２】
本発明の第４の発明は、第２の発明のブナシメジ由来抽出物を含有する医薬に関する。【００１３】
本発明の第５の発明は、テルペン化合物の製造方法に関し、
（ａ）ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の抽出溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程、及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた抽出物からテルペン化合物を精製する工程、
を含む製造方法に関する。
第５の発明に使用されるアルカリ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液が例示される。
第５の発明において、アルカリ性の水性溶媒での処理としては、４０〜１２０℃の温度で行われる処理が例示される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、テルペン化合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物の製造方法が提供される。該製造方法は、製造に有機溶剤を必要としないため、食品に適した抽出物を製造する事ができる。更には、従来の製造方法に比べて製造原価を低減する事ができる。また、該製造方法により、テルペン化合物を豊富に含む、食品に適したブナシメジ由来抽出物が提供される。また、本発明により、該ブナシメジ由来抽出物を含有する食品及び医薬が提供される。更には、安価なテルペン化合物の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ブナシメジは自然界においては秋期に種々の広葉樹の枯れ木に叢生あるいは離生しており、他のきのこと比較して形がよく、歯切れのよい肉質のため、美味なきのことして採食されてきた。また、近年ではオガクズに米糠やその他の栄養源を配合した培養基を用いて、ビン又は箱で栽培を行う菌床人工栽培法が確立され、季節に関係なく一年を通じて安定してきのこを収穫できるようになっている。すなわち、本発明の抽出物の原料となるブナシメジは安価に入手でき、医薬や健康食品原料としても適している。【００１６】
原料として使用されるブナシメジは天然のものでも人工栽培品でもよいが、好適にはＬｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｍ−８１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４１５、寄託日：１９８６年８月２３日）、又はＬｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｋ−０２５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２９８１、寄託日：１９９２年６月２日）が例示される（これらの菌株はいずれも、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）。また、これらの菌株は、商品名「やまびこほんしめじ（登録商標）」もしくは「Ｓｕｐｅｒやまびこしめじ（登録商標）」として市場に流通されている。ブナシメジとして人工栽培品を使用する場合は、製造されるブナシメジ由来抽出物中のテルペン化合物の含有量を向上させるという物質、例えばマメカワを含有する培地で栽培されたブナシメジの子実体が好適に使用される。子実体は株のままでも粉砕したものでも原料として使用することができ、生のものでも加熱乾燥、天日乾燥、凍結乾燥等で乾燥された子実体乾燥物であっても原料として使用できる。また、原料としてブナシメジの菌糸体やその凍結乾燥物を使用することもできる。また、上記の子実体又は菌糸体を熱水により洗浄したものも、原料として使用することができる。【００１７】
本発明者らは、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる事により、有機溶剤を用いる事無く、水に難溶性のテルペン化合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物を製造する事に成功した。なお、本発明において、テルペン化合物としては前述の非特許文献１に記載されているようなブナシメジ由来のポリテルペンが例示される。【００１８】
本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法に用いる抽出溶媒としては、有機溶剤を含まないアルカリ性の水性溶媒であれば特に限定はなく、例えば、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；炭酸マグネシウム、炭酸バリウムなどのアルカリ土類金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸アンモニウム；アンモニアなど）を含むアルカリ性水溶液、有機塩基（例えば、酢酸ナトリウム、プロピオン酸カリウムなどのアルカリ金属の有機酸塩；ギ酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属の有機酸塩；トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ピペリジンなどのアミン類；ピリジンなどの含窒素複素環化合物など）を含むアルカリ性水溶液、及び陰イオン交換樹脂を含むアルカリ性の懸濁液を用いることができ、そのうち、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液を好適に用いることができる。【００１９】
更には、抽出物を中和した場合に抽出物由来の沈殿物を生じにくく、中和後の抽出液が発泡しにくいという事から、陰イオン交換樹脂懸濁液をより好適に用いることができる。【００２０】
抽出溶媒中の無機塩基、有機塩基又は陰イオン交換樹脂の含有量は、特に制限はなく、抽出溶媒のｐＨが後述の範囲内になるよう、調整することができる。【００２１】
また、抽出溶媒のｐＨはアルカリ性であれば特に限定されないが、好ましくは８〜１２であり、より好ましくは９〜１２である。【００２２】
抽出溶媒での処理温度は、テルペン化合物を所望の量抽出できる温度であれば特に限定はなく、例えば４〜１２０℃で処理する事ができるが、短時間でより多くのテルペン化合物を抽出する事ができるという点で、高温で処理を行う事が好ましい。この様な処理温度としては、好ましくは４０〜１２０℃であり、より好ましくは８０〜１１０℃であり、更に好ましくは８５〜１０５℃であり、最も好ましくは、９０〜１００℃である。【００２３】
抽出溶媒での処理時間は、処理温度により異なるが、例えば４〜６０℃の処理温度の場合は、１６〜２４時間、９０〜１０５℃の処理温度の場合は０．５〜５時間が好適である。【００２４】
上記製造方法によって得られた抽出物を、酸により中和する工程を更に含むブナシメジ由来抽出物の製造方法も、本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法に包含される。中和に用いる酸としては、抽出物を食品に用いる場合には、食品添加物として用いられる酸が好ましい。食品添加物として用いられる酸としては、例えば、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸及び酒石酸が挙げられる。そのうち、クエン酸が最も好適である。【００２５】
また、上記の製造方法においては、さらに適当な乳化剤を添加する工程を含む事が好ましい。乳化剤による安定化により、水に難溶性のテルペン化合物の沈殿を抑える事ができ、また、製造工程における機械器具、副材料への吸着も抑えることができる。乳化剤の添加時期は、アルカリ性の水性溶媒による抽出前、抽出後、または抽出中のいずれのタイミングでもよく、例えば、後述の実施例４に記載の通り、抽出後に添加することが好ましい。また、乳化剤の添加後に上記の中和工程を施す事が好ましい。本発明に使用される乳化剤としては、特に限定はないが、例えばポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ステアロイル乳酸カルシウム、大豆由来レシチン、卵黄由来レシチン等が使用できる。【００２６】
乳化剤の添加量は、特に制限はないが、例えば、抽出物１００重量部に対して、０．１〜３重量部であることが好ましい。【００２７】
上記製造方法によって得られた抽出物より、さらに抽出残渣を取り除く事により、本発明のブナシメジ由来抽出物が得られうる。抽出残渣を取り除く工程としては、遠心分離、濾過、限外濾過が例示されるが、大規模生産に適した濾過法をより好適に使用できる。濾過に際しては濾過助剤を用いる事ができ、濾過助剤としてはＣｅｌｉｔｅ＃５４５が例示される。【００２８】
本発明において抽出物とは、抽出溶媒を用いて抽出操作を行う工程により得られる物質のことを言う。また、該物質にさらに濾過、遠心分離、濃縮、限外濾過、分子ふるい、中和等の処理を施して得られる物質も本発明の抽出物に包含される。また、上記物質を公知の方法で分画することによって得られる画分や、分画操作を複数回繰り返すことによって得られる画分も、本発明の抽出物に包含される。上記の分画手段としては、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等が挙げられる。【００２９】
本発明において、本発明の抽出物の形状は特に限定はないが、粉状、固形状、液状のいずれの形状であっても良い。粉状とする場合、特に限定はないが、原料よりアルカリ性の水性溶媒により抽出された抽出物を濃縮し、さらにデキストリン、ショ糖脂肪酸エステル、乳糖等の賦形剤を添加し、乾燥、粉砕する事により、本発明の抽出物を得ることが出来る。また、当該抽出物を公知の方法で造粒して得た粒状の固形物を、本発明の抽出物として使用することもできる。造粒方法としては、特に限定はないが、転動造粒、攪拌造粒、流動層造粒、気流造粒、押出し造粒、圧縮成型造粒、解砕造粒、噴射造粒又は噴霧造粒等が例示される。また、液状の抽出物としては、前記抽出物の製造方法により得られた液体そのもの、その濃縮物や希釈物の他、前記の粉状の抽出物を液体、例えば水やアルコール等に溶解して液状としたものが例示される。【００３０】
本発明のブナシメジ由来抽出物は、ブナシメジ由来の生理活性成分であるＳＢＳ等のテルペン化合物を多く含む事を特徴とし、例えば、乾固物換算で０．４重量％以上のテルペン化合物を含む抽出物であり、より具体的には、乾固物換算で０．４重量％〜１．０重量％のテルペン化合物を含む抽出物である。乾固物換算での重量％とは、液体をエバポレーター等で乾燥させた場合に得られる乾燥物全体の重量に占める、目的とする成分の重量を百分率で示した値のことを言う。【００３１】
本発明の食品は、上記のブナシメジ由来抽出物を含有する。本発明の食品はＳＢＳ等のブナシメジ由来のテルペン化合物を多く含むため、血小板凝集抑制作用、抗発ガンプロモーター作用、及び抗癌作用を有することが期待できる。当該食品としては、例えば血小板凝集抑制作用、抗発ガンプロモーター作用、又は抗癌作用による所望の効果の発現のために用いられるものである旨の表示を付した健康食品（特定保健用食品）とすることもできる。【００３２】
本発明の食品の製造方法に特に限定はない。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品のものに従えばよく、それらの製造方法により製造することができ、得られた食品に本発明に係る前記抽出物が含有されていれば良い。また、本発明のブナシメジ由来抽出物そのものを食品としたものであっても良い。【００３３】
なお、本発明の食品において「含有」とは、含有、添加および／または希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品中に本発明で使用される抽出物が含まれるという態様を、「添加」とは食品の原料に、本発明で使用される抽出物を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される抽出物に、食品の原料を添加するという態様をいうものである。【００３４】
本発明の食品は、特に限定するものではないが、例えば、穀物加工品（例、小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（例、可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（例、豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（例、ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（例、冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（例、原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（例、ペースト類、ジャム類、漬物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（例、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール類（例、日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（例、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、健康飲料、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（例、しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰・袋詰食品、半乾燥または濃縮食品（例、レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類等）、乾燥食品（例、即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済食品、調理済飲料、調理済スープ等）、冷凍食品等が挙げられる。【００３５】
本発明の食品は、前記抽出物が含有されるものであれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、前記抽出物にグリセリン等を添加して、前記抽出物が濃縮された健康食品とすることもできる。【００３６】
本発明の食品中の前記抽出物の含有量は特に限定はなく、その官能と活性発現の観点から適宜設定できるが、例えば食品中における前記抽出物の乾燥重量で、０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜９５重量％、更に好ましくは１〜９０重量％である。【００３７】
本発明の食品は、ブナシメジ由来抽出物の苦味を押さえ、味をまろやかにできる事から、前述の抽出物の製造方法において、乳化剤を添加して得られたブナシメジ由来抽出物を使用することが好ましい。【００３８】
なお、本発明の食品としては、テルペン化合物の体内への吸収が良いという点で、実施例４に記載のような飲料が特に好適である【００３９】
本発明の医薬は、前記のブナシメジ由来抽出物を含有する。本発明の医薬としては、本発明に係る前記抽出物を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。【００４０】
本発明の医薬は、通常、前記抽出物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより製造され、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。【００４１】
医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが担体として利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。なお、本発明の抽出物は経口投与によっても十分な効果を発揮することから、その投与の簡便性の観点から経口投与用の医薬とするのか好適な形態である。【００４２】
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記抽出物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。【００４３】
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。【００４４】
以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における抽出物の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該抽出物を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の医薬中の前記抽出物の含有量としては、乾燥重量で０．１〜１００重量％程度である。【００４５】
本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記抽出物量を乾燥重量で表した場合の投与量で、例えば成人１日当り１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好適には５μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好適には１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【００４６】
本発明のテルペン化合物の製造方法は、（ａ）ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の水性溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程、及び（ｂ）工程（ａ）により得られた抽出物からテルペン化合物を精製する工程を含む、テルペン化合物の製造方法である。当該製造方法において、（ａ）工程により得られた抽出物としては、前述の本発明のブナシメジ由来抽出物が例示される。また、当該テルペン化合物の製造方法においては、本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法と同様に、アルカリ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液を好適に用いることができ、抽出溶媒での処理温度は、テルペン化合物を所望の量抽出できる温度であれば特に限定はなく、例えば４〜１２０℃で処理する事ができる。本発明のブナシメジ由来本発明のテルペン化合物の製造方法は、ブナシメジ子実体又は菌糸体よりテルペン化合物を豊富に含む抽出物を抽出する工程において有機溶媒を必要としない為、テルペン化合物を安価に製造する事ができる。【００４７】
本発明のテルペン化合物の製造方法により製造され得るブナシメジ由来のテルペン化合物としては、特開平４−１０４７９５号に記載の物質ＳＢＳが挙げられる。なお、この物質は沢辺らの文献（Ｓａｗａｂｅ  Ａ．他３名，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１９９６年，Ｖｏｌ．３１，Ｐ９２１−９２５）に記載されている、ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ９と同一物質である。また、ＳＢＳ以外の本発明のテルペン化合物の製造方法により製造され得るテルペン化合物としては、前記沢辺らの文献に記載の、ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１２、Ｃ９等のブナシメジ由来テルペン化合物が例示される。【００４８】
ブナシメジをアルカリ性の水性溶媒で処理する事により得られる抽出物よりテルペン化合物を精製する方法としては、公知の方法を用いる事ができ、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、及びこれらの方法の組み合わせが挙げられる。カラムクロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィーが例示され、本発明においては、逆相高速液体クロマトグラフィーを好適に用いる事ができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５０】
調製例１  標準物質の調製
特開平４−１０４７９５号の実施例１に記載の方法に従い、ブナシメジ由来抽出物の抽出、シリカゲルカラムによる精製、及び逆相高速液体クロマトグラフィーによる分画操作を行った。得られた画分のうち、画分Ｇ、及びＳＢＳを含む画分をＨＰＬＣ／ＭＳ法を用いて解析し、これら２つの画分の精製物が、それぞれ異なる構造を持つテルペン化合物である事を確認した。なお、画分Ｇは、沢辺らの文献（Ｓａｗａｂｅ  Ａ．他３名，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１９９６年，Ｖｏｌ．３１，Ｐ９２１−９２５）に記載されている、ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ８と同一物質であった。また、ＳＢＳは、上記沢辺らの文献に記載されている、ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ９と同一物質であった。こうして得られた画分Ｇ、及びＳＢＳの精製物を、それぞれブナシメジ由来テルペン化合物の標準物質ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ８、及びＳＢＳとした。【００５１】
実施例１  アルカリ性溶媒による抽出１
ブナシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｍ−８１７１）の子実体をＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｏｖｅｎ（Ｙａｍａｔｏ社製）で十分乾燥させた後、乾燥物をクッキングミル（ＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）により粉砕し、ブナシメジ乾燥粉砕物を得た。次に該ブナシメジ乾燥粉砕物５ｇに１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（ｐＨ１１．９３）０．１Ｌを加え、９５℃で３時間熱処理を行った。熱処理後、１０，０００ｒ／ｍｉｎ、１０分の遠心分離操作（遠心分離装置（ＴＯＭＹ社製））で不溶物を除き、得られた抽出物を逆相高速液体クロマトグラフィー（カラム＝μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８  Φ０．３９×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、溶媒＝メタノール：エタノール：水＝３：４：４（容量比）、流速＝０．７ｍＬ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度＝４０℃、検出波長＝２１０ｎｍ）に付し、該抽出物に含まれるテルペン化合物量を定量した。定量には、前述の調製例で調製した２種類のテルペン化合物を標準物質として用いた。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図１Ａに示す。図１Ａの縦軸は、吸光度（２１０ｎｍ）を、横軸は、溶出時間（分）を示す。【００５２】
比較例１  蒸留水による抽出
１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に換えて蒸留水（ｐＨ６．７８）を用いる点を除いて、実施例１と同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペン化合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図１Ｂに示す。図１Ｂの縦軸は、吸光度（２１０ｎｍ）、横軸は、溶出時間（分）を示す。【００５３】
比較例２  ＫＣｌ水溶液による抽出
１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に換えて０．１５Ｍ  ＫＣｌ水溶液（ｐＨ６．５４）を用いる点を除いて、実施例１と同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペン化合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図１Ｃに示す。図１Ｃの縦軸は、吸光度（２１０ｎｍ）、横軸は、溶出時間（分）を示す。【００５４】
比較例３  酸性溶媒による抽出
１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に換えて１％クエン酸水溶液（ｐＨ２．４６）を用いる点を除いて、実施例１と同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペン化合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図１Ｄに示す。図１Ｄの縦軸は、吸光度（２１０ｎｍ）、横軸は、溶出時間（分）を示す。【００５５】
実施例１および比較例１〜３のテルペン化合物量の定量結果を合わせて表１に示す。【００５６】
【表１】
2007018095.tif 000002
【００５７】
表１の通り、蒸留水、０．１５Ｍ  ＫＣｌ、１％クエン酸水溶液を抽出溶媒として用いた場合の抽出物（比較例１〜３）は、テルペン化合物含有量が定量限界以下であったのに対して、実施例１の１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液を抽出溶媒として用いた場合の抽出物は、１４２μｇ／ｍＬのテルペン化合物を含有していた。【００５８】
実施例２  種々のアルカリ性溶媒による抽出と抽出物の中和【００５９】
実施例２−１  Ｎａ２ＣＯ３水溶液による抽出
実施例１と同じ方法で抽出物を調製し、抽出物中のＳＢＳ量を定量した。続いて、該抽出物を食品又は飲料に用いるため、クエン酸粉末を加えて該抽出物を中和した。該中和後の抽出物について、デジタル糖度計  Ｐａｌｅｔｔｅ（ＡＴＡＧＯ社製）を用いて糖度を測定した。また、色調、発泡の有無及び沈殿の有無についても、目視で確認を行った。なお、色調については目視での確認の他に、分光光度計ＵＶ−１６０Ａ（島津製作所（株）製）による測定も行った。【００６０】
実施例２−２  ＮａＯＨ水溶液による抽出
０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ１１．５２）を１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に換えて用いる点以外は実施例１と同様の方法で抽出物を調製し、実施例２−１と同様の方法でＳＢＳ含有量測定、中和、及び糖度測定を行い、色調、発泡、沈殿についても観察した。【００６１】
実施例２−３  陰イオン交換樹脂による抽出
５％イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＡ１０ＡＯＨ（日本錬水社製）懸濁水（ｐＨ１０．５４）を１％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に換えて用いる点以外は実施例１と同様の方法で抽出物を調製し、実施例２−１と同様の方法でＳＢＳ含有量測定、中和、及び糖度測定を行い、色調、発泡、沈殿についても観察した。実施例２−１〜実施例２−３の結果を合わせて表２に示す。【００６２】
【表２】
2007018095.tif 000003
【００６３】
表２に示したとおり、いずれのアルカリ性抽出溶媒を用いた場合においても、ＳＢＳを多く含む抽出物を得ることが出来た。また、抽出に陰イオン交換樹脂を用いた場合には、他のアルカリを用いた場合に比べて抽出物の糖含有量が少なく、純度の比較的高いＳＢＳを得ることが出来た。さらに、抽出に陰イオン交換樹脂を用いた場合には、抽出物を中和した後に発泡や沈殿が発生しなかった。これは、抽出物の濃縮等、その後の取り扱いが容易であるという点において、有利である。【００６４】
実施例３  冷アルカリによる抽出
５％イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＡ１０ＡＯＨ（日本錬水社製）懸濁水を用いて低温条件下（５℃、２４時間）で抽出した抽出物について、５℃、２４時間処理を行う点以外は、実施例２−３と同様の方法で調製し、ＳＢＳ含有量の測定を行った。結果を表３に示す。【００６５】
【表３】
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【００６６】
その結果、５℃、２４時間の抽出条件でもＳＢＳを多量に含む抽出物を得られることが明らかとなったが、そのＳＢＳ含有量は９５℃、３時間処理を行った場合に比べて少ないものであった。【００６７】
実施例４  テルペン化合物含有飲料の製造
ブナシメジの子実体をＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｏｖｅｎ（Ｙａｍａｔｏ社製）で十分乾燥させた後、乾燥物をクッキングミル（ＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）により粉砕した。蒸留水１リットルにブナシメジ粉砕物５０ｇ及び熱水洗浄済みイオン交換樹脂ダイヤイオンＳＡ１０ＡＯＨ（日本錬水社製）５０ｇを混合した。オートクレーブを用い、設定温度９５℃で１時間ごとに撹拌を続け３時間保温した。次いで冷却し、冷却物１．１リットルを得た。次いで５０メッシュ篩（目の開き３００μｍ）を用い、冷却物よりイオン交換樹脂を除去し、約１リットルの上清液を調製した。上清液に大豆由来レシチンを２ｇ添加し、３０分室温で撹拌を行った。【００６８】
次いで、クエン酸を用いてｐＨを１０．２５から６．８５に調整した。該ｐＨ調整液より抽出残渣を取り除く為、上記ｐＨ調整液１リットルに６０グラムの濾過助剤Ｃｅｌｉｔｅ＃５４５を添加した後、濾過助剤Ｃｅｌｉｔｅ＃５４５を３グラムでプレコートしたヌッチェで吸引濾過を行った。こうして得られた濾過液８５０ミリリットルのブナシメジ由来抽出物を、テルペン化合物含有飲料とした。該飲料は、実施例１〜３の抽出物と比べて、苦味の感じ方が軽減され、飲みやすい飲料であった。【００６９】
実施例５  アルカリ性溶媒による抽出２
実施例１と同様の方法で、ブナシメジ乾燥粉砕物を得た。次に該ブナシメジ乾燥粉砕物５００ｇに蒸留水１０Ｌを加え、熱水洗浄を９５℃で１時間行った。熱洗浄後、４，５００ｒ／ｍｉｎ、３０分の遠心分離操作（遠心分離装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社製））により上清を除き、ブナシメジ子実体熱水洗浄物を得た。次に、ブナシメジ子実体熱水洗浄物に蒸留水１０Ｌおよび熱水洗浄済みイオン交換樹脂ダイヤイオンＳＡ１０ＡＯＨ（日本錬水社製）５００ｇを加え、９５℃で３時間熱処理を行った。熱処理後、５０メッシュ篩（目の開き３００μｍ）を用い、冷却物よりイオン交換樹脂を除去し、約１０リットルの上清液を調製した。上清液に大豆由来レシチンを２０ｇ添加し、３０分室温で撹拌を行った。次いで、クエン酸を用いてｐＨを９．７５から６．４４に調整した。このｐＨ調整液を４，５００ｒ／ｍｉｎ、２０分の遠心分離操作（遠心分離装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社製））で不溶物を除いた。得られたｐＨ調整液の上清１０リットルに１００グラムの濾過助剤Ｓｉｌｉｋａ＃６００Ｓを添加した後、濾過助剤Ｓｉｌｉｋａ＃６００Ｓを１００グラムでプレコートしたヌッチェで吸引濾過を行った。こうして得られた濾過液９５００ミリリットルをロータリーエバポレーターで濃縮・凍結乾燥したものを、ブナシメジ由来抽出物とした。【００７０】
実施例６  ブナシメジ由来抽出物の腫瘍増殖抑制活性
ＣＤＦ１マウス（日本エスエルシー社）は、６週齢の雌を購入して使用した。ＩＭＣ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  （以下ＩＭＣ）腫瘍細胞は、ＣＤＦ１マウスの腹腔に移植して腹水をつくり、７日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して７日目の腹水を採取し、ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＢＵＦＦＥＲＥＤ  ＳＡＬＴＳ（タカラバイオ社）緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、５×１０７個／ｍＬとなるように調整した。この０．１ｍＬをＣＤＦ１マウスの右側腹部皮下に移植し、７日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になるように、１群１０匹となるようにマウスを群分けした。【００７１】
次に、実施例５のブナシメジ由来抽出物を重量比で１．４％となるよう、通常の粉末飼料ＣＥ−２に対して混ぜてマウスに与えた。また、比較対照として、アガリクス由来抽出物（仙生露エキスゴールド（サンドリー社））を重量比で２．４％となるよう、粉末ＣＥ−２飼料に対して混ぜ、これを乾燥させてマウスに与えた。投与量は表４のとおりである。コントロール群にはＣＥ−２のみを与えた。腫瘍の大きさは、ＩＭＣ細胞移植後４週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、以下の計算式にしたがって体積を算出して比較した。２回の実験を行った結果を表４に示す。【００７２】
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長径）×（短径）２／２
また、腫瘍抑制活性は、以下の計算式にしたがって算出した。
腫瘍抑制活性（％）＝（コントロール群の腫瘍体積−抽出物投与群の腫瘍体積）／コントロール群の腫瘍体積×１００【００７３】
【表４】
2007018095.tif 000005
【００７４】
その結果、比較対照のアガリクス由来抽出物を投与した群では、ＩＭＣ固形腫瘍増殖の抑制がほとんどみられなかった。これに対して、ブナシメジ由来抽出物を投与した群では、いずれの実験においてもＩＭＣ固形腫瘍増殖の抑制がみられた。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、テルペン化合物を豊富に含む、食品、医薬に適したブナシメジ由来抽出物を安価に製造する事ができる。また、本発明により、テルペン化合物を安価に製造する事ができる。よって、本発明は食品や医薬分野において特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ブナシメジ由来抽出物の逆相クロマトグラフィーの結果を示す図である。図中Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれアルカリ性溶媒による抽出、蒸留水による抽出、ＫＣｌ水溶液による抽出および酸性溶媒による抽出の結果を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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