(57)【要約】本発明は、リガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法、特に、リガンドと受容体との特異的結合によってＳＮＰを検出する方法を提供する。本発明はまた、測定操作が一回の簡便かつ測定時間が短い核酸の検出方法を提供する。本発明はまた、液体と固体の界面での反応において、リガンドと受容体との特異的結合反応を使用し、高感度かつ高精度の核酸の検出方法を提供する。本発明はまた、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）検出対象の核酸に第一および第二のリガンドを結合させる工程と、
（２）前記リガンドを結合させた核酸において、前記第一のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸−固相担体の複合体を得る工程と、
（３）前記複合体において、前記第二のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体と結合させる工程と、
（４）前記標識物質を検出することにより、前記核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項２】
前記第一のリガンドが前記第二のリガンドと同一または異なる請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
検出対象である複数種類の核酸を検出する方法であって、
（１）前記複数種類の核酸それぞれに第一および第二のリガンドを結合させるにあたり、前記核酸の種類ごとに第一のリガンドの種類が異なるように、前記第一および第二のリガンドを結合させる工程と、
（２）前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体を、前記第一のリガンドの種類ごとに用意するとともに、前記第一のリガンドをそれぞれに対応する前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドの種類ごとに前記核酸を分離する工程と、
（３）前記固相担体と結合した核酸において、前記第二のリガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体を、前記第二のリガンドに結合させる工程と、
（４）前記標識物質を検出することにより、前記複数種類の核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項４】
検出対象である複数種類の核酸を同時に検出する方法であって、
（１）前記複数種類の核酸それぞれに第一および第二のリガンドを結合させるにあたり、前記核酸の種類ごとに第二のリガンドの種類が異なるように、前記第一および第二のリガンドを結合させる工程と、
（２）前記第一のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸−固相担体の複合体を得る工程と、
（３）前記複数種類の第二のリガンドそれぞれと特異的に結合する複数種類の受容体であって、前記リガンドの種類ごとに異なる標識物質で修飾された複数種類の受容体を用意するとともに、前記第二のリガンドにそれぞれに対応する前記受容体を結合させる工程と、
（４）前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記複数種類の核酸を同時に検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項５】
前記検出対象の核酸にリガンドを結合させる工程において、
前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付きプライマーと、前記プライマーとの関係で、前記核酸をＰＣＲ法によって増幅可能な第二のリガンド付きプライマーとを含む検査試薬を、前記核酸を含むサンプルに添加し、ＰＣＲ法によって増幅された前記第一および第二のリガンドを結合させた核酸を得る請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記検出対象の核酸にリガンドを結合させる工程において、
前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付き核酸プローブと、前記核酸上で前記核酸プローブとライゲーション反応を行うことができる第二のリガンド付き核酸プローブとを含む検査試薬を、前記核酸を含むサンプルに添加し、次に前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブを前記核酸上にハイブリダイズさせ、最後に前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブをライゲーション反応によって結合させ、前記第一および第二のリガンドを結合させた核酸を得る請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
前記ライゲーション反応を行う前に、ＰＣＲ法によって少なくとも前記ライゲーション反応を行う核酸の部分を含む領域をあらかじめ増幅させる請求項６に記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する方法であって、
（１）（ｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付きプライマーと、（ｉｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端にもたず、前記標準部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第二のリガンド付きプライマーと、（ｉｉｉ）前記第一および第二のリガンド付きプライマーとの関係で、前記変異部分および標準部分を含む核酸をＰＣＲ法によって増幅可能なように設計した第三のリガンド付きプライマーとを含む検査試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
（２）前記第一および第三のリガンド付きプライマーの間、および／または、前記第二および第三のリガンド付きプライマーの間でＰＣＲを行い、増幅された前記第一および第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および／または、前記第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
（３）前記第一または第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体をそれぞれ用意するとともに、前記第一または第二のリガンドをそれぞれに対応する前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸と、前記第二のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸とを分離する工程と、
（４）前記固相担体と結合した核酸において、前記第三のリガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体を、前記第三のリガンドに結合させる工程と、
（５）前記標識物質を検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項９】
核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する方法であって、
（１）（ｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付き核酸プローブと、（ｉｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端にもたず、前記標準部分に対応する塩基を結合側末端に有する第二のリガンド付き核酸プローブと、（ｉｉｉ）前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブの結合側末端とライゲーション反応が可能なように設計された第三のリガンド付き核酸プローブとを含む検査試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
（２）前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブを前記変異部分を含む核酸上、および／または、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブを前記標準部分を含む核酸上でハイブリダイズさせる工程と、
（３）前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブの間、および／または、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブの間でライゲーション反応を行い、前記第一および第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および／または、前記第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
（４）前記第一または第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体をそれぞれ用意するとともに、前記第一または第二のリガンドをそれぞれに対応する前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸と、前記第二のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸とを分離する工程と、
（５）前記固相担体と結合した核酸において、前記第三のリガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体を、前記第三のリガンドに結合させる工程と、
（６）前記標識物質を検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記ライゲーション反応を行う前に、ＰＣＲ法によって前記ライゲーション反応を行う核酸の部分をあらかじめ増幅させる請求項９に記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する方法であって、
（１）（ｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付きプライマーと、（ｉｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端にもたず、前記標準部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第二のリガンド付きプライマーと、（ｉｉｉ）前記第一および第二のリガンド付きプライマーとの関係で、前記変異部分および標準部分を含む核酸をＰＣＲ法によって増幅可能なように設計した第三のリガンド付きプライマーとを含む検査試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
（２）前記第一および第三のリガンド付きプライマーの間、および／または、前記第二および第三のリガンド付きプライマーの間でＰＣＲを行い、増幅された前記第一および第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および／または、前記第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
（３）前記第三のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸−固相担体の複合体を得る工程と、
（４）前記第一または第二のリガンドとそれぞれ特異的に結合する異なる標識物質で修飾された二種類の受容体を用意するとともに、前記第一および第二のリガンドにそれぞれに対応する前記受容体を結合させる工程と、
（５）前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を同時に検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項１２】
核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を検出する方法であって、
（１）（ｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付き核酸プローブと、（ｉｉ）前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端にもたず、前記標準部分に対応する塩基を結合側末端に有する第二のリガンド付き核酸プローブと、（ｉｉｉ）前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブの結合側末端とライゲーション反応が可能なように設計された第三のリガンド付き核酸プローブとを含む検査試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
（２）前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブを前記変異部分を含む核酸上、および／または、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブを前記標準部分を含む核酸上でハイブリダイズさせる工程と、
（３）前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブの間、および／または、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブの間でライゲーション反応を行い、前記第一および第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および／または、前記第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
（４）前記第三のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸−固相担体の複合体を得る工程と、
（５）前記第一または第二のリガンドとそれぞれ特異的に結合する異なる標識物質で修飾された二種類の受容体を用意するとともに、前記第一および第二のリガンドにそれぞれに対応する前記受容体を結合させる工程と、
（６）前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸および／または標準部分を含む核酸を同時に検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記ライゲーション反応を行う前に、ＰＣＲ法によって前記ライゲーション反応を行う核酸の部分をあらかじめ増幅させる請求項１２に記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記固相担体が磁性を帯びた粒子状の支持体であって、外部から磁力を加えることによって前記磁性粒子を一箇所に集めることができることを特徴とする請求項１〜４、８〜１０のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記リガンドおよび受容体がそれぞれ抗原または抗体であって、前記リガンドと受容体との特異的結合が抗原抗体反応によって行われる請求項１〜４、８〜１０のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
検出されるべき標的核酸と分散性微粒子との架橋反応によって生じる凝集に基づいて、前記標的核酸を検出する方法であって、
（１）種類の異なる第一および第二のリガンドが結合した標的核酸と、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の微粒子と、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、
（２）一つの前記標的核酸が前記第一および第二の微粒子に結合することによって、前記第一および第二の微粒子が連結し、かつ、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、前記標的核酸のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて生じる凝集を、分光光度法によって測定する工程と
を具備する核酸の検出方法。
【請求項１７】
（１）前記種類の異なる第一および第二のリガンドがそれぞれ一以上結合した濃度が既知の標的核酸を、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分光光度法によって測定する工程と、
（２）前記工程を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程と、
（３）前記検出されるべき標的核酸を、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分光光度法によって測定する工程と、
（４）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程と
を具備する請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項１８】
前記標的核酸が、３種類以上のリガンドが結合された標的核酸であり、かつ、前記分散性微粒子が、前記３種類以上のリガンドのそれぞれに特異的に結合する受容体が結合された分散性微粒子である請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項１９】
複数種類の標的核酸を含む試料において、標的核酸の種類毎に異なる一種または二種のリガンドが結合され、かつ、前記分散性微粒子が、検出すべき標的核酸に結合されたリガンドと特異的に結合する受容体を結合された分散性微粒子であり、前記複数種類の標的核酸を含む試料から前記検出すべき標的核酸のみを検出する請求項１８に記載の核酸の検出方法。
【請求項２０】
前記分散性微粒子が、粒径３００ｎｍ以下のラテックス粒子である請求項１９に記載の核酸の検出方法。
【請求項２１】
前記リガンドが、親水性有機化合物、ジオキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、残基数が６以上のポリペプチド、糖が２つ以上の糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ＨＡ、ＧＳＴ、およびＦｌａｇから選択される請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項２２】
前記リガンドが結合された標的核酸が、第一のリガンドを結合させた第一のプライマーと、第一のリガンドと異なる種類の第二のリガンドを結合させた第二のプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によって調製される請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項２３】
前記リガンドが結合された標的核酸が、所望のリガンドを結合させたヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によって調製される請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、核酸を検出する方法に関する。さらに詳しくは、リガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法に関する。さらに詳しくは、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、オーダーメイド医療を実現するために、一塩基多型（ＳＮＰ）の解析の必要性が高まっている。一般に、ＳＮＰの解析はマイクロアレイ技術に基づいて行われている。例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社が販売しているＡｍｐｌｉＣｈｉｐ  Ｐ４５０は、代表的なＳＮＰ測定デバイスであり、ＳＮＰ診断キットとしてＦＤＡの許可を取得している。【０００３】  しかし、マイクロアレイによる核酸の検出は、核酸同士のハイブリダイゼーションによって行われる。核酸同士のハイブリダイゼーションは、一般に反応条件を４５℃以上の高温にする必要があり、かつ反応させる核酸の塩基配列中のＧＣ含量や核酸の長さなどによって反応条件が異なり、常に最適な反応条件を設定することは難しい。さらに、マイクロアレイによる核酸の検出は、液体溶液中の試料核酸を、固体基板上の標識核酸にハイブリダイズさせることによって行われる。液体と固体の界面での反応はお互いの化学的状態が大きく異なるので反応条件の設定が難しい。その結果、低反応および偽反応の問題が起こる。【０００４】  これに対し、抗原抗体反応をはじめとしたリガンドと受容体との特異的反応は、ハイブリダイゼーション反応と比較して、反応条件の設定が容易であり、かつ反応の感度および再現性が高いという利点がある。このリガンドと受容体との特異的反応を利用したアレイが、例えば日本国の公表特許公報２００３−５３５５６９号に開示されている。しかし、溶液ハイブリダイゼーションとエンドヌクレアーゼ反応を含んでおり、二度の測定操作を行う必要があり、操作が煩雑で測定に時間を要する。さらに、酵素反応を行う必要がある。酵素反応は、固体基板上の核酸に対して行われるので、前述した液体と固体の界面での反応を要し、低反応および偽反応の問題が起こる。
【発明の開示】
【０００５】  本発明は、リガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法、特に、リガンドと受容体との特異的結合によってＳＮＰを検出する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、測定操作が一回の簡便かつ測定時間が短い核酸の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、液体と固体の界面での反応において、リガンドと受容体との特異的結合反応を使用し、高感度かつ高精度の核酸の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出することを目的とする。
【０００６】  本発明の一態様に係る核酸の検出方法は、（１）検出対象の核酸に第一および第二のリガンドを結合させる工程と、（２）前記リガンドを結合させた核酸において、前記第一のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸−固相担体の複合体を得る工程と、（３）前記複合体において、前記第二のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体と結合させる工程と、（４）前記標識物質を検出することにより、前記核酸を検出する工程とを具備する。
【０００７】  本発明の他の態様に係る核酸の検出方法は、（１）種類の異なる第一および第二のリガンドが結合した標的核酸と、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の微粒子と、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、（２）一つの前記標的核酸が前記第一および第二の微粒子に結合することによって、前記第一および第二の微粒子が連結し、かつ、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、前記標的核酸のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて生じる凝集を、分光光度法によって測定する工程とを具備する。
【０００８】  本発明の核酸の検出方法は、高感度かつ高精度で核酸を検出することができる。その結果、測定結果の高い再現性が保証される。また、ハイブリダイゼーション反応を使用せず、リガンドと受容体との特異的結合を使用するので、反応条件を３７℃付近の低温に抑えることができる。さらに、測定操作は一回なので、操作が簡便であり、短時間の測定が可能になる。その結果、低コスト化を実現することができる。
【０００９】  さらに、分散性高分子の凝集反応を使用して核酸を検出することにより、より簡便かつ高精度な核酸の検出が可能になり、その結果、測定結果のより高い再現性が保証される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、核酸にリガンドを結合させる工程についての模式図である。
【図２】図２は、競合反応条件下で、核酸にリガンドを結合させる工程についての模式図である。
【図３】図３は、複数種類の核酸に異なるリガンドを結合させる工程についての模式図である。
【図４】図４は、リガンドで修飾された核酸の検出方法の一覧図である。
【図５】図５は、リガンドで修飾された核酸の検出工程についての模式図である。
【図６】図６は、本発明のリガンドのアミノ酸配列である。
【図７】図７は、本発明のプライマーの塩基配列である。
【図８】図８は、検出対象の核酸の塩基配列である。
【図９】図９は、本発明の核酸プローブの塩基配列である。
【図１０】図１０は、実施例のプライマーの塩基配列である。
【図１１】図１１は、実施例の核酸プローブの塩基配列である。
【図１２】図１２は、実施例の結果を示した棒グラフである。
【図１３】図１３は、変形例の結果を示した棒グラフである。
【図１４】図１４は、リガンドが結合された標的核酸の概念図である。
【図１５】図１５は、受容体が結合された分散性微粒子の概念図である。
【図１６】図１６は、微粒子の凝集を示す概念図である。
【図１７】図１７は、分光光度法によって測定する際の概念図である。
【図１８】図１８は、ＰＣＲ−ＳＳＰ法を用いて核酸の変異を検出する原理を示す概念図である。
【図１９】図１９は、ライゲーションを用いて核酸の変異を検出する原理を示す概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明を詳細に説明する。前段では、本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法について説明する。そして、後段では、本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法において、特に、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法について説明する。【００１２】  Ｉ．本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法
以下、本発明を、検出対象の核酸をリガンド物質で修飾する工程と、リガンドで修飾された核酸を検出する工程とに大別し、詳細に説明する。【００１３】  １．検出対象の核酸をリガンド物質で修飾する工程
（１）検出対象の核酸が１種類の場合
検出対象の核酸とは、試料中に存在する特定の核酸分子を意味する。検出対象の核酸としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡなど、全ての種類のＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。本発明では、特に生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する。【００１４】  検出対象の核酸が１種類の場合において、第一のリガンドとは、固相担体に担持された受容体と特異的に結合する物質を意味する。一方、第二のリガンドとは、標識物質で修飾された受容体と特異的に結合する物質を意味する。【００１５】  リガンド物質には、ハプテン、ビオチン、ジオキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、糖鎖、ペプチド、蛋白質、ポリヒスチジン、抗原／抗体物質、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｔａｐ、Ｆｌａｇなど、本発明で利用可能な全ての物質が含まれる。ビオチン、ジオキシゲン、フルオロセイン、アレクサ等は、市場からの入手が容易で低価格である。糖鎖やペプチドは、化学構造のデザインに自由度が高く、複数種類のハプテンをそろえることが容易であり、必要に応じて選択し得る。ハプテンは親水性有機化合物が好ましく、糖鎖は２種以上の単糖からなるものが好ましく、ペプチドはアミノ酸残基数が６以上のものが好ましい。免疫反応を利用して核酸の検出を行うために抗原／抗体物質を用いてもよい。リガンドと受容体との間の特異的結合を抗原抗体反応によって達成することができる。【００１６】  標識物質には、当業者に知られた任意の標識物質が含まれる。特に、蛍光、発光（化学発光、生物発光）のような光シグナルを発生し得る光マーカーが好ましい。【００１７】  検出対象の核酸に第一および第二のリガンドを結合させる方法には、リガンドで修飾されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法（図１（ｉ））、リガンドで修飾された核酸プローブを用いて検出対象の核酸上でライゲーション反応を行う方法（図１（ｉｉ））などがある。ＰＣＲ法を用いると、検出対象の核酸をリガンドで修飾するとともにその数を増幅させることができる（図１（ｉ））。ライゲーション反応を行う場合は、ライゲーション反応を行う核酸の部分を予めＰＣＲ法によって増幅させておくのが好ましい。これにより、核酸の他の領域にある類似配列への核酸プローブの結合を予め防ぐことができ、精度の高いライゲーション反応を行うことができる。増幅された核酸領域で前記ライゲーション反応が行われ、その後に変性させることによってリガンドで修飾された核酸を得ることができる（図１（ｉｉ））。【００１８】  また、図２（ｉ）に示すように、競合反応を利用してＰＣＲ−ＳＳＰ法によって核酸にリガンドを結合させることができる。すなわち、前記第一のリガンドで修飾されたプライマーと類似するプライマーを予め作製する。このプライマーは、検出対象の核酸上で前記第一のリガンドで修飾されたプライマーと同じ位置に結合することができるが、その伸長側末端がミスマッチするため、ポリメラーゼによる伸長反応を行うことができない。このような擬似配列をもつプライマーを含む状態でＰＣＲ法を行うことによって、検出対象の核酸へのリガンドの修飾を精度よく行うことができる。図２（ｉｉ）には、同じく競合反応を利用して��イゲーション反応によって核酸にリガンドを結合させることができる。第一のリガンドで修飾された核酸プローブと類似する核酸プローブを予め作製する。この核酸プローブは、検出対象の核酸上で前記第一のリガンドで修飾された核酸プローブと同じ位置に結合することができるが、その結合側末端がミスマッチするため、その後にライゲーション反応を行うことができない。このような擬似配列をもつ核酸プローブを含む状態でライゲーション反応を行うことによって、ライゲーション反応の精度を高めることができる。ライゲーションが完了した後、変性させることにより、第一および第二のリガンドで修飾された核酸を得ることができる。このとき、第一のリガンドで修飾されたプライマーまたはプローブと擬似配列を有するプライマーまたはプローブに第三のリガンドを修飾しておき、第一のリガンドおよび第二のリガンドで修飾された核酸と第三のリガンドおよび第二のリガンドで修飾された核酸を同じ溶液中で同時に得ることも可能である。その場合、第一のリガンドで修飾された核酸と第三のリガンドで修飾された核酸をそれぞれ検出し、第一のリガンドと第三のリガンドの検出量の比率を測定することで、検出対象の核酸の濃度やプローブの非特異反応の影響を受けることなく更に精度の高い測定が可能となる。【００１９】  なお、第一のリガンドと第二のリガンドは、同一であっても異なるものであってもよい。また、第一のリガンドと第二のリガンドは必ずしも１分子からなる必要はなく、各々が２分子以上で構成されていてもよい。【００２０】  （２）検出対象の核酸が複数種類の場合
複数種類の核酸をリガンドと受容体との反応を介して検出するためには、複数種類の核酸をそれぞれ異なるリガンドの組合せで修飾しなければならない。このような核酸とリガンドとの関連づけには様々な方法が想起されるが、本願発明では、特に１種類の一塩基多型（すなわち、変異部分を含む核酸と、標準部分を含む核酸の２種類）について着目し、この多型をリガンドと受容体との特異的結合を介して検出する方法について説明する。【００２１】  先ず、ＰＣＲ−ＳＳＰ法によって２種類の核酸（１種類のＳＮＰ）に異なるリガンドを結合させる方法について説明する（図３（ｉ））。ＰＣＲ−ＳＳＰ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）は、２種類のプライマーの片方の伸長側末端を検出対象の核酸のＳＮＰ部位と重なるように設計し、ＳＮＰ部位とプライマーの伸長側末端とのマッチングの有無によって増幅を制御する方法である。【００２２】  図３（ｉ）に示すように、第一ないし第三のリガンドで修飾された３種類のプライマーを用意する（以下、それぞれ第一ないし第三のプライマーという）。第一のプライマーは、変異部分を含む塩基配列に対応する配列をもち、かつその伸長側末端がその変異部分の塩基と対応する。一方、第二のプライマーは、標準部分を含む塩基配列に対応する配列をもち、かつその伸長側末端がその標準部分の塩基と対応する。第三のプライマーは、前記第一および第二のプライマーとの関係でＰＣＲを行うことができる塩基配列をもつ。ここで、一塩基多型とは、遺伝子の塩基配列が１箇所だけ異なる状態およびその部位を指す。すなわち、その多型の前後の塩基配列は標準型および変異型のいずれの核酸において同一であるから、第一のプライマーと第二のプライマーの塩基配列は、その伸長側末端が１塩基異なるのみでその他の塩基配列は同一である。このような２つのプライマーを含む条件下でハイブリダイゼーションを行うと、前記第一および第二のプライマーは、互いに競い合って核酸に結合する（競合反応）。しかし、図に示すように、競合反応条件下で、第一のリガンドで修飾されたプライマーは、標準型の核酸上ではその伸長側末端がミスマッチするため、ポリメラーゼによる伸長反応を行うことができない。一方、第二のリガンドで修飾されたプライマーは、変異型の核酸上ではその伸長側末端がミスマッチするため、ポリメラーゼによる伸長反応を行うことができない。このような競合反応条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより核酸とリガンドとの関連付けをより確実に行うことができる。【００２３】  その後、ＰＣＲ法によって核酸を増幅し、リガンドで修飾された核酸を得る（図３（ｉ））。変異部分を含む核酸は第一および第三のリガンドで修飾された核酸として、一方、標準部分を含む核酸は第二および第三のリガンドで修飾された核酸として、それぞれ関連付けが行われる。この関連付けは競合反応条件下で行っているために極めて精度が高い。【００２４】  次に、ライゲーション反応によって２種類の核酸（１種類のＳＮＰ）に異なるリガンドを結合させる方法について説明する（図３（ｉｉ））。上記ＰＣＲ−ＳＳＰ法と同様、ライゲーション反応によっても核酸とリガンドとの関連づけが可能である。図３（ｉｉ）に示すように、第一ないし第三のリガンドで修飾された３種類の核酸プローブを用意する（以下、それぞれ第一ないし第三の核酸プローブという）。第一の核酸プローブは、変異部分を含む核酸配列に対応する塩基配列をもち、かつその結合側末端がその変異部分の塩基と対応する。一方、第二の核酸プローブは、標準部分を含む核酸配列に対応する塩基配列をもち、かつその結合側末端がその標準部分の塩基と対応する。第三の核酸プローブは、前記第一および第二の核酸プローブとの関係でライゲーション反応を行うことができる塩基配列をもつ。上記したように、１塩基多型の前後の塩基配列は標準型および変異型のいずれも同じであるから、前記第一および第二の核酸プローブの塩基配列は、その結合側末端だけが異なり、その他の配列は同じである。従って、前記第一および第二の核酸プローブは、互いに競い合って核酸に結合する（競合反応）。しかし、図に示すように、競合反応条件下で、第一の核酸プローブは、標準型の核酸上ではその結合側末端がミスマッチするため、その後に第三のリガンドで修飾された核酸プローブとの間でライゲーション反応を行うことができない。一方、第二の核酸プローブは、変異型の核酸上ではその結合側末端がミスマッチするため、第三の核酸プローブとの間でライゲーション反応を行うことができない。その後、変異型の核酸上で第一の核酸プローブと第三の核酸プローブとをライゲーションさせ、標準型の核酸上で第二の核酸プローブと第三の核酸プローブとをライゲーションさせる。続いて変性反応を経て、リガンドで修飾された核酸を得る（図３（ｉｉ））。こうして、変異部分を含む核酸は第一および第三のリガンドで修飾された核酸として、一方、標準部分を含む核酸は第二および第三のリガンドで修飾された核酸として、それぞれ関連付けが行われる。【００２５】  ライゲーション反応では、サンプルを増幅させる工程がないので、より反応工程が簡略化し、コスト低減と時間の短縮が可能である。ただし、感度が悪くなることと、プローブ設計がＳＮＰサイトの前後しか選択できず、不自由である。サンプルによっては検出対象のＳＮＰサイトとは違う位置に同様の配列が存在する可能性もあり、この場合には精度が悪くなる欠点がある。したがって、感度向上と精度向上のために検出対象のＳＮＰサイトの周辺でＰＣＲ反応を行い、検出対象のＳＮＰを含む核酸を増幅させることで問題を解決することができる。【００２６】  なお、図１〜３では、最も単純なリガンドの構成を示した。プライマーおよび核酸プローブは、３〜６０塩基数が好ましい。リガンドの数および種類はこれに限定されることなく、前記第一ないし第三のリガンドが、それぞれ２分子以上で構成されていてもよい。また、第一または第二のリガンドのいずれか一方が無い状態でも核酸を検出することができる。さらに、リガンドの数を減少させることによって反応系をより単純にすることができる。【００２７】  次に、図６〜９に示す具体的なリガンド物質、プライマー、核酸プローブ、および検出対象の核酸を示しながら上記実施形態を例示する。【００２８】  （ｉ）ＰＣＲ−ＳＳＰ法
リガンド物質としてハプテンａ〜ｃ（ポリペプチド）を使用し（図６）、それぞれハプテンａ〜ｃで修飾されたプライマーａ〜ｃを用意する（図７）。次に、図８に示すサンプルに対してＰＣＲ−ＳＳＰ法で増幅反応を行った。このとき、サンプルのＳＮＰサイト（図８の♯の位置）が塩基Ａ（アデニン）と塩基Ｇ（グアニン）の２タイプがアリルとして存在するとき、アリルタイプは、Ａ／Ａのホモ、Ａ／Ｇのヘテロ、Ｇ／Ｇのホモと３タイプとなる。サンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ａのホモである場合、図７のプライマーａがＳＮＰサイトとマッチングし、プライマーｃとともにＰＣＲによって増幅が行われる。プライマーｂでは増幅が行われないので、増幅産物は両５’端にそれぞれハプテンａとハプテンｃが修飾された２本鎖ＤＮＡとなる。同様な考え方でサンプルのＳＮＰサイトがＧ／Ｇであった場合、ＰＣＲ産物は両５’端にそれぞれハプテンｂとハプテンｃが修飾された２本鎖ＤＮＡとなる。さらにサンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ｇであった場合、ハプテンａとハプテンｃが修飾された２本鎖ＤＮＡとハプテンｂとハプテンｃが修飾された２本鎖ＤＮＡが混合した増幅産物が得られる。【００２９】  なお、上記方法において、プライマーを３種類用意せず、例えばプライマーａとプライマーｃのみで増幅を行っても良い。このときは別の容器でプライマーｂとプライマーｃのみで増幅を行った結果とあわせることで対応できるが、この方法は精度が悪い。【００３０】  上述の実施の形態によって、核酸のＳＮＰを検出する場合にその多型に対応したハプテンで修飾された核酸に変換することが可能となる。【００３１】  さらに、検出対象の核酸のＳＮＰを複数検出することも可能となる。この場合、ＳＮＰサイトが異なるごとに異なるハプテンを修飾したプライマーを用意して、ＰＣＲ−ＳＳＰ法により検出対象の核酸を増幅させればよい。【００３２】  （ｉｉ）ライゲーション反応
リガンド物質としてハプテンａ〜ｃ（ポリペプチド）を使用し（図６）、それぞれハプテンａ〜ｃで修飾された核酸プローブａ〜ｃを用意する（図９）。次に、図８に示すサンプルに対してライゲーション反応を行う。サンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ａのホモである場合、図４のプローブａがＳＮＰサイトとマッチングし、プローブｃとともにライゲースによってライゲーション反応が行われる。プローブｂではライゲーション反応が行われない。反応後にバッファーのｐＨをアルカリ性にするなどによって２本鎖核酸を１本鎖に変性反応すると、反応物は５’端と３’端の両端にそれぞれハプテンａとハプテンｃが修飾された１本鎖ＤＮＡとなる。同様な考え方でサンプルのＳＮＰサイトがＧ／Ｇであった場合、ライゲーション産物は両端にそれぞれハプテンｂとハプテンｃが修飾された１本鎖ＤＮＡとなる。さらにサンプルのＳＮＰサイトがＡ／Ｇであった場合、ハプテンａとハプテンｃが修飾された１本鎖ＤＮＡとハプテンｂとハプテンｃが修飾された１本鎖ＤＮＡが混合したライゲーション産物が得られる。なお、上記方法において、プローブを３種類用意せず、例えばプローブａとプローブｃのみで増幅を行っても良い。このときは別の容器でプローブｂとプローブｃのみでライゲーション反応を行った結果とあわせることで対応できるが、この方法は精度が悪い。【００３３】  上述の実施の形態によって、核酸のＳＮＰを検出する場合にその多型に対応したハプテンで修飾された核酸に変換することが可能となる。【００３４】  ここまで、１種類のＳＮＰを検出する方法について説明してきたが、本発明によって複数種類のＳＮＰを検出することもできる。複数種類のＳＮＰに対しては、各ＳＮＰごとにそれぞれ競合反応を設定するため、プライマー／プローブはＳＮＰの位置の種類に応じて種類が多くなる。２種類のＳＮＰであれば、６つのプライマー／プローブになり、リガンドも第四、第五のリガンドが最低限必要になる。第三のリガンドについては第三のリガンドに対応する第六のリガンドを用いることもできるが、第三のリガンドを各種ＳＮＰの検出に対し共通に用いることで反応後のＢＦ分離を簡単且つ低コストにすることもできる。ここで、各種ＳＮＰの検出を別々の容器で実行してもよいし、同一の容器で同時に実行してもよい。特に、同一の容器で２種類以上のＳＮＰの検出を行う場合は、第三のリガンドに対応する各ＳＮＰごとに異なるリガンド（第六のリガンド、第九のリガンド・・・）を用いることによりＳＮＰの種類について任意の順番でＢＦ分離等の工程を行うことができる。また、同一の容器で２種類以上のＳＮＰの検出を共通の第三のリガンドを用いて行うことにより、各種の測定を同時に且つ低コストで実行できるという利点がある。【００３５】  ２．リガンドで修飾された核酸を検出する工程
（１）検出対象の核酸が１種類の場合
図４にリガンドで修飾された核酸の検出方法を示す。核酸の検出方法には様々な態様があり、本発明は本発明を実施可能な全ての態様を含む。このうち、代表的態様として蛍光色素で検出する方法が挙げられる。図４（ｉ）に示すように、固相担体に第一のリガンドと特異的に結合する受容体を予め担持させておく。また、第二のリガンドと特異的に結合する受容体を蛍光色素で予め修飾しておく。リガンドで修飾された核酸を、第一のリガンドを介して固相担体に結合させる。次に、第二のリガンドに蛍光色素で修飾された受容体を結合させる。その後、この蛍光色素を光学装置を用いて検出することにより核酸を検出することができる。図４（ｉｉ）に示すように、固相担体に第一のリガンドを予め担持させておいてもよい。この場合、最初に、前記担持された第一のリガンドに対し、これと特異的に結合する受容体を結合させる。次に、リガンドで修飾された核酸のうち第一のリガンドを前記受容体に結合させる。リガンド物質を担持させた固相担体は、前記受容体を担持させた固相担体と比べて保存性に優れており、検査方法の実用化に際して大きな貢献を果す。【００３６】  また、図４（ｉｉｉ）に示すように、酵素反応で検出することもできる。酵素は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどを使用することができる。この場合、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体を酵素で予め修飾しておき、この酵素に基質を反応させることによって生じる化学発光を検出する。また、蛍光色素の場合と同様、第一のリガンドを予め担持させた固相担体を使用してもよい（図４（ｉｖ））。【００３７】  次に、図４（ｉ）〜（ｉｖ）のうち、図４（ｉｉｉ）に示す態様の検出工程についてより詳細に説明する（図５）。図５（ｉ）に示すように、先ず、固相担体に受容体を担持させる。代わりに受容体を予め担持させた固相担体を用いてもよい。次に、リガンドで修飾された検出対象の核酸を、受容体とリガンドとの特異的結合を介して前記固相担体に結合させる。このとき、未結合の遊離の核酸をＢＦ分離によって取り除く（図５（ｉｉ））。その後、酵素で修飾された抗体を第二のリガンドに結合させる。このとき、未結合の遊離の標識抗体をＢＦ分離によって取り除く（図５（ｉｉｉ））。最後に酵素−基質反応によって化学発光を生じさせ、これを検出することによって検出対象の核酸を特定する（図５（ｉｖ））。図４（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）に示す核酸の検出方法についても同様の検出工程で行うことができる。【００３８】  （２）検出対象の核酸が複数種類の場合
検出対象の核酸が複数種類の場合でも、検出工程は同じである。図４および図５では説明の便宜上、第一および第二のリガンドで修飾された核酸を使用した。複数種類の核酸を使用する場合、特にＳＮＰを検出する場合は、第一および第三のリガンドで修飾された核酸、および／または、第二および第三のリガンドで修飾された核酸を検出する。例えば、上記１塩基多型の例では、変異型の核酸は第一および第三のリガンドで修飾され、標準型の核酸は第二および第三のリガンドで修飾されている。従って、第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と、第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体とを用意し、これによって変異型の核酸と標準型の核酸を検出することができる。【００３９】  また、第三のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体を使用して、前記変異型の核酸と標準型の核酸とを同時に検出することもできる。第三のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体には、前記変異型の核酸と標準型の核酸の両方が結合することができる。この核酸−固相担体では、変異型の核酸は第一のリガンドが未結合の状態にあり、標準型の核酸は第二のリガンドが未結合の状態にある。従って、第一のリガンドと特異的に結合する受容体と、第二のリガンドと特異的に結合する受容体とをそれぞれ異なる標識物質で予め修飾しておき、この標識物質を使用することによって変異型の核酸と標準型の核酸とを同時に検出することができる。【００４０】なお、第一または第二のリガンドのいずれか一方が無い状態でも核酸を検出することができる。リガンドの数を減少させることによって反応系をより単純にすることができる。【００４１】  次に、本発明で使用される受容体と固相担体について説明する。【００４２】  （ｉ）受容体
受容体とは、リガンド物質と特異的に結合する物質を意味する。例えば、リガンドとしてビオチンを選択した場合、アビジンが受容体となり、リガンドとしてハプテンを選択した場合、抗ハプテン抗体が受容体となる。抗ハプテン抗体について特に制限はないが、アフィニティー精製を行ったものか、モノクローナル抗体であると、特異性が向上して検出の精度が向上するのでより望ましい。また、リガンドおよび受容体がそれぞれ抗原または抗体であって、前記リガンドと受容体との特異的結合が抗原抗体反応によって行われてもよい。免疫反応を用いて核酸を検出することにより、反応性が高くかつ高精度の検出が可能になる。【００４３】  （ｉｉ）固相担体
ｉ）基板状の支持体
固相担体とは、前記受容体を担持可能な任意の支持体を意味する。支持体の材質、形状に特に制限はない。材質としてはガラス、シリコン、金属、金属酸化物、樹脂、ゴム、セラミックスなどが考えられる。リンカー剤と反応させるためには、支持体表面に水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基などの活性基があるとよりよい。また、金表面であればチオール基との配位結合が可能であるので活性基が無くても良い場合もある。形状としては高感度に蛍光測定が可能なＤＮＡマイクロアレイスキャナーを利用するならばスライドガラス形状（約２５×７５×１ｍｍ）が良いし、化学発光のプレートリーダーを利用するならばマイクロプレート形状（約８６×１２８ｍｍ）が良い。さらに支持体は液透過性であっても液不透過性であってもかまわない。液透過性支持体は多くの場合多孔質体であるので、表面積が大きく、抗体固定化量が増えることや、液の移動方向に自由度が高まるので反応を自動化しやすいなどの利点がある。しかし、材質の選択の幅が狭まることや場合によっては検出装置の改良が必要になるなど不利な面もあるので、場合に応じて選択することが必要となる。【００４４】  ここで、例として一連の反応を示す。下記内容に限らず、上述の内容を満たせば本発明に使用することが可能である。【００４５】  支持体として低蛍光シリカガラスを使用する。ガラスはアルコールでよく脱脂した後、純水で洗浄する。次にエタノール中にアミノプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社製）を３重量％になるように溶液を調整する。この溶液中にガラスを室温で浸漬し、攪拌しながら１時間反応させ、エタノールと純水で順に洗浄した後、１３０℃で２０分間乾燥させる。【００４６】  次にＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＭＥＳバッファーに５重量％になるように溶解させ、この溶液に処理済のガラスを室温で浸漬し、攪拌しながら１時間反応させる。反応後、ＭＥＳバッファーと純水で順に洗浄し、スピンドライ法により室温で乾燥させる。【００４７】  抗ハプテン抗体は、図６のハプテンａとハプテンｂに対応した抗ハプテンａ抗体と抗ハプテンｂ抗体をアフィニティー精製したものをＭＥＳバッファーに５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した溶液を調製し、この溶液をガラス上の別の位置に点着した。点着方法は触針式の点着装置ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェア社製）を用いる。それぞれの溶液をガラス上の各４箇所に点着した後、室温にて１時間反応させ、その後ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を０．１重量％の濃度で溶解させたＰＢＳバッファーに室温で１時間浸漬させる。浸漬後、ＰＢＳバッファーと１／１０濃度のＰＢＳバッファーで順に洗浄した後、スピンドライ法で乾燥させ、冷暗所に乾燥状態で保管する。【００４８】  上述のように支持体の作製が可能である。また、抗ハプテン抗体は２種類ではなく更に複数種類を固定化することもできるので、検出対象の核酸の種類をさらに増加させることも可能である。【００４９】  ｉｉ）粒子状の支持体
本発明の他の態様では、固相担体として粒子状の支持体を使用し、これに前記受容体を担持させることもできる。【００５０】  粒子状支持体としては、樹脂製が多く用いられる。天然ゴム、スチレンおよびスチレン共重合体、ポリウレタン、アクリル樹脂などが代表的な材料であるが、本発明に用いる粒子状支持体として特に材質の制限は無い。また、粒子状支持体に磁性を有する物質を混入させることができる。粒子状支持体に磁性を持たせることで粒子状支持体のハンドリングが容易になる。【００５１】  前記受容体を粒子状支持体に担持させる方法としては、物理吸着、化学吸着などがあり、どちらでもかまわない。工程が単純であるために物理吸着も多く用いることができるが、抗ハプテン抗体の活性を維持し、安定した反応を実現させるためには化学吸着も良い。化学吸着は多くの場合リンカー剤と呼ばれる化学物質を介して支持体と抗体とを共有結合で強固に結合させる。リンカー剤は支持体の材質や表面状態、抗体の種類によって最適な種類を選択することができる。【００５２】  また、リガンドとしてビオチン、その受容体としてアビジンまたはストレプトアビジンを使用するような場合は、アビジンまたはストレプトアビジンを固定した磁性ビーズが市販されており、これを使用することもできる。【００５３】  前記受容体を担持させた固相担体を作製した後、前記リガンドで修飾された核酸の少なくとも１つのリガンドを介して前記固相担体に結合させることにより、核酸−固相担体の複合体を得ることができる。【００５４】  （３）実施の形態
（ｉ）基板状の支持体
以下、図８に示す１塩基多型を含む核酸を用いた核酸の検出工程について説明する。使用するハプテン、プライマー、およびプローブは、上述のＰＣＲ−ＳＳＰ法およびライゲーション反応と同様、それぞれ図６、７および９に示す。【００５５】  前記ハプテンで修飾された核酸をＭＥＳバッファーに溶解し、これを支持体上に滴下し、３７℃で２時間反応させた後、ＭＥＳバッファーで洗浄する。このとき、支持体上に滴下した溶液中にハプテンａで修飾された核酸が存在すると、それに対応する抗ハプテンａ抗体と結合し、同様にハプテンｂで修飾された核酸が存在すると、それに対応する抗ハプテンｂ抗体と結合する。その結果、検出する核酸のＳＮＰサイトがＡ／Ａの場合にはハプテンａに対応する抗ハプテンａ抗体が固定された支持体上の位置には未結合のハプテンｃが存在することになる。ハプテンｂに対応する抗ハプテンｂ抗体が固定された支持体上の位置にはハプテンｃは存在しない。同様に検出する核酸のＳＮＰサイトがＧ／Ｇの場合にはハプテンｂに対応する抗ハプテンｂ抗体が固定された支持体上の位置には未結合のハプテンｃが存在することになる。ハプテンａに対応する抗ハプテンａ抗体が固定された支持体上の位置にはハプテンｃは存在しない。さらに検出する核酸のＳＮＰサイトがＡ／Ｇの場合にはハプテンａ、ハプテンｂそれぞれに対応する抗ハプテンａ抗体と抗ハプテンｂ抗体が固定された支持体上の位置には未結合のハプテンｃが存在することになる。【００５６】  この反応後の支持体にハプテンｃに対応する抗ハプテンｃ抗体に蛍光色素としてＣＹ５を標識した抗体溶液をＭＥＳバッファーに１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた溶液を滴下し、３７℃で２時間反応させる。その後、ＭＥＳバッファーと１／１０濃度のＭＥＳバッファーで順に洗浄しスピンドライで乾燥させる。この反応により、ハプテンｃが存在する支持体上の位置にのみＣＹ５が存在することになる。【００５７】  支持体をＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＡＸＯＮ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、励起波長６３５ｎｍ、検出波長域６５０ｎｍ〜６９０ｎｍでスキャンして測定する。スキャン画像において蛍光強度と支持体上の位置情報をあわせて解析することで、検出対象の核酸のＳＮＰを検出することが可能となる。【００５８】  また、前記ＣＹ５を標識した抗ハプテンｃ抗体の代わりに、酵素、例えばアルカリフォスファターゼを標識した抗ハプテンｃ抗体を使用してもよい。この場合、上記と同様の反応で支持体上のハプテンｃとアルカリフォスファターゼ標識抗ハプテンｃ抗体との結合を行い洗浄した後、基質（例えばＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｃａｌｂｉｏ．ｃｈｅｍ．社製））溶液を滴下し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ（ＡＴＴＯ社製）で化学発光量を測定し、支持体上の位置情報とあわせて検出対象の核酸のＳＮＰを検出することが可能となる。【００５９】  また、支持体に抗ハプテン抗体を担持させる代わりに、ハプテンａ、ハプテンｂを担持させてもよい。このとき、固定法としては、ハプテンのＣ末端のカルボキシル基を使用すればリンカー剤などの処理条件はまったく同一でよい。このようにして作製したハプテン固定支持体は、固定化しているハプテンａ、ハプテンｂに対応する抗ハ���テンａ抗体と抗ハプテンｂ抗体の混合溶液を滴下し、３７℃で２時間反応させ、同様な方法で洗浄する。これにより、支持体上には、固定化したハプテンａ、ハプテンｂの位置に抗ハプテンａ抗体と抗ハプテンｂ抗体がそれぞれ存在することになり、その後は上記と同様に検出することが可能となる。【００６０】  （ｉｉ）粒子状の支持体
次に、磁性を帯びた粒子状支持体を用いた核酸の検出工程について説明する。【００６１】  磁性を帯びた粒子状支持体に抗ハプテンｃ抗体を担持させ、これを用いて核酸の検出を行う。抗ハプテンｃ抗体を担持させた前記粒子状支持体をリン酸バッファー中に分散させておき、これに前記ＳＮＰに対応したハプテンで修飾された核酸を混合させ、前記核酸を前記粒子状支持体に結合させる。粒子状支持体は磁性を帯びているので、外部から磁力を加えることによって移動させることができ、粒子を溶液中の一箇所に集めておくことができる。例えば、磁石を使用することによって前記粒子状支持体を容器壁面に固定させる。前記粒子状支持体を容器璧面に固定した状態で溶液を取り除き、新たなリン酸バッファーを加える。その後、磁石をはずして粒子状支持体を前記新たなリン酸バッファー溶液中に拡散させる。この工程を数回繰り返すことで、溶液中の未反応核酸や副生成物などを除去することができる（ＢＦ分離工程）。ＢＦ分離工程後、リン酸バッファー中に粒子状支持体が均一に分散している溶液を２つに分注する。分注する数は測定対象核酸の数と使用するハプテンの数に応じて決まる。検出対象の核酸は、ハプテンｃを介して前記粒子状支持体に結合しているから、Ａ／Ａの場合にはハプテンａ、Ｇ／Ｇの場合にはハプテンｂ、Ａ／Ｇの場合にはハプテンａおよびハプテンｂが未結合の状態にある。従って、標識化された抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体を使用することによって検出対象の核酸を検出することができる。【００６２】  前記２つに分注した粒子状支持体を含む溶液のそれぞれに酵素標識抗ハプテンａ抗体と酵素標識抗ハプテンｂ抗体を別々に投入し、反応させる。反応後、上述のＢＦ分離工程を再度繰り返し、未反応の酵素標識抗ハプテン抗体を除去する。このとき、酵素としてはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシターゼなどが好適に用いられるが、これに限定されるものではない。【００６３】  最後に、酵素の基質となる化合物をそれぞれの容器に混合させ、一定時間反応させた後にその発光強度、吸光度変化などを測定することで、検出対象の核酸のＳＮＰを同時に検出することが可能となる。【００６４】  酵素の代わりに、抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体に蛍光色素を標識しておくことで、蛍光強度により検出対象の核酸のＳＮＰを同時に検出することが可能となる。【００６５】  また、抗ハプテンａ抗体を担持させた支持体と抗ハプテンｂ抗体を担持させた支持体を使用することによって、核酸を検出することができる。磁性を持つ粒子状支持体へ固定する抗体を抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体とし、それぞれの抗体ごとに粒子状支持体を含む容器を別に用意しておく。ここに検査対象の核酸のＳＮＰに対応したハプテンを修飾した核酸を２つに分注してそれぞれ別容器で反応させる。ＢＦ分離後に酵素標識抗ハプテンｃ抗体を投入し、反応させる。反応後、上述のＢＦ分離工程を再度繰り返し、最後に酵素の基質となる化合物をそれぞれの容器に混合させ、一定時間反応させた後にその発光強度、吸光度変化などを測定することで、検出対象の核酸のＳＮＰを検出することが可能となる。ここで、上述の理由により粒子状支持体への抗体固定は測��対象核酸の数と使用するハプテンの数に応じて決まる。さらに酵素の種類や蛍光色素への変形例も適用することができる。【００６６】  なお、磁性を帯びていない粒子状支持体を用いてＢＦ分離工程を行うこともできる。この場合、（ｉ）フィルターで粒子状支持体をトラップして行う、（ｉｉ）静置、遠心分離などで粒子状支持体を沈殿させて、上清を取り除いて行う、（ｉｉｉ）大きな粒子径を持つ粒子状支持体を使うと、ピペットで吸引できないので、そのまま溶液交換を行う、などの方法がある。【００６７】  上記実施の形態は、全て核酸のＳＮＰを測定するものであったが、本発明は核酸の変異や発現量にも用意に適用できる。すなわち、前記プライマーやプローブをそれぞれ変異や発現量を検出したい配列に設定することで、後の処理はまったく同じでよい。【００６８】  ［実施例］
図８に示す一塩基多型を含む核酸をライゲーション反応によって検出した。ライゲーション反応を行う前に、擬似配列を除きかつ検出感度を高めるために、前記一塩基多型の前後の塩基配列をＰＣＲによって増幅した。支持体には磁性を帯びた粒子を使用し、酵素基質反応によって核酸を検出した。【００６９】  １．試薬調製、準備
以下の試薬を用意する。【００７０】  ・サンプル：図８に示す配列を有するヒトゲノムＤＮＡの組み合わせ
組み合わせｉ：Ａアリル（図８の♯の位置の塩基がＡ）とＡアリルの組み合わせ（Ａ／Ａ）
組み合わせｉｉ：ＡアリルとＧアリルの組み合わせ（Ａ／Ｇ）
組み合わせｉｉｉ：ＧアリルとＧアリルの組み合わせ（Ｇ／Ｇ）
・ＰＣＲプライマー：図１０に示す配列を有するＰＣＲプライマー
・ＰＣＲ試薬：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ」カタログＮｏ．１２３４１−０１２
・プローブ：図１１に示すプローブの組み合わせ。【００７１】  組み合わせＩ：図９に示す配列を有するプローブのうち、プローブａの５’端にジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）を修飾し、且つプローブｂの５’端は未修飾、且つプローブｃの３’端にビオチンを修飾し、５’端がリン酸化したプローブ
組み合わＩＩ：図９に示す配列を有するプローブのうち、プローブａの５’端は未修飾、且つプローブｂの５’端にジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）を修飾し、且つプローブｃの３’端にビオチンを修飾し、５’端がリン酸化したプローブ
・ライゲース：ＢｉｏＬａｂｓ社製「Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ」カタログＮｏ．Ｍ０２０８Ｓ
・磁性化粒子状支持体：ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」カタログＮｏ．１１２．０６
・酵素標識抗体：ＤＡＫＯ社製「Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ＡＬＰ）カタログＮｏ．Ｄ５１０５
・発光基質：Ｗａｋｏ社製「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」カタログＮｏ．６９０８６
２．反応
サンプルの組み合わせ３種類ごとに上記試薬を用いて以下の手順で反応を行う。【００７２】  ・５ｎｇ／μｌに調整したサンプル    １μｌ
・ＰＣＲ試薬                  １０μｌ
・１μＭに調整したプライマー        各１μｌ（計２μｌ）
・純水                        ７μｌ
合計  ２０μｌ
上記内容でＰＣＲ溶液を調整し、サーマルサイクラーで下記反応を行う。【００７３】  （１）９４℃、２分間
（２）９４℃、３０秒間
（３）６８℃、６分間
（４）上記（２）、（３）を４０回繰り返す
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物量を吸光度測定し、４ｎｇ／μｌに希釈する。【００７４】  希釈したサンプルを２つに分注し、
・４ｎｇ／μｌに調整した上記サンプル                  １μｌ
・Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅバッファー（キット付属）    ３μｌ
・４０Ｕ／μｌのＴａｑ  Ｌｉｇａｓｅ          ０．５μｌ
・１０ｎＭに調整したプローブ組み合わせＩまたはＩＩ  各１μｌ（計３μｌ）
・純水                                      ２２．５μｌ
合計    ３０μｌ
とそれぞれに調整し、インキュベーターで下記反応を行う。【００７５】  （１）９５℃、５分間
（２）５８℃、１５分間
反応後、磁性化粒子状支持体５μｌを加え、室温で５分反応させる。【００７６】  反応後、リン酸バッファーで２回ＢＦ分離反応を行う。【００７７】  それぞれに１００倍に希釈した酵素標識抗体を２０μｌ加え、室温で６０分反応させる。【００７８】  リン酸バッファーでそれぞれ３回ＢＦ分離反応を行う。【００７９】  それぞれに基質１００μｌを加え、室温で１分間反応させる。【００８０】  測定用９６ｗｅｌｌブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ＡＴＴＯ社製Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲＩＩ）中で１０秒間積算測定を行う。【００８１】  ３．測定結果
上記反応をそれぞれのサンプルに対して９回繰り返した結果を図１２に示す。図１２はそれぞれのサンプルとプローブの組み合わせにおいて発光量の平均値を示したグラフであり、サンプルのＳＮＰに対応した結果が発光量となって得られていることが分かる。特にサンプルのＡ／ＡとＡ／ＧとＧ／Ｇの組み合わせが明確に区別できており、従来の方法では難しいかったＡ／ＡとＡ／Ｇ、Ｇ／ＧとＡ／Ｇの区別を１回の反応で区別できる点で非常に有用である。【００８２】  ［変形例］
以下、変形例を示す。本変形例はＰＣＲ法による核酸増幅ではなく、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で核酸を増幅して一塩基多型を含む核酸を検出した。【００８３】  ＬＡＭＰ法の反応および測定として、以下の試薬を用いて反応を行う。【００８４】１００μＬ  中
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
４ｍＭ  ＭｇＳＯ４
１Ｍ  ベタイン
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ
８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
以下の配列を有するプライマーを反応液中に入れ、反応溶液を作成した。インナープライマーＦＡ（Ｇ）およびインナープライマーＲＡ（Ｇ）は検体のアリルＧを検出するためのプライマーでプライマー５’端にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を標識させた。また、インナープライマーＦＡ（Ａ）およびインナープライマーＲＡ（Ａ）はアリルＡを検出するためのプライマーでプライマー５’端にジゴギジゲニン（Ｄｉｇ）を標識させた。【００８５】プライマー：
１６００ｎＭインナープライマーＦＡ（Ｇ）
ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡ  ＡＣＡＴＡＡＣＡＴＡ  ＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴ  ＡＡＧＴＣＧＣＡＴＡ  ＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣ
１６００ｎＭインナープライマーＦＡ（Ａ）
Ｄｉｇ−ＴＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡ  ＡＣＡＴＡＡＣＡＴＡ  ＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴ  ＡＡＧＴＣＧＣＡＴＡ  ＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣ
１６００ｎＭインナープライマーＲＡ（Ｇ）
ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＣＡＴＡＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴ
１６００ｎＭインナープライマーＲＡ（Ａ）
Ｄｉｇ−ＴＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＣＡＴＡＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴ
４００ｎＭアウタープライマーＦ３
ＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣ
４００ｎＭアウタープライマーＲ３
ＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ
反応液調製中に反応が進まないように調製は氷上で行った。【００８６】  増幅の目的ポリヌクレオチド（鋳型核酸）は、熱変性をしない１×１７２塩基のλＤＮＡ（配列番号１）を用いた。【００８７】＜配列番号１＞
ＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＧＧＴＡＡＧＴＣＧＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＧＧＧＡ♯ＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣ
配列番号１において塩基配列の第９２番目の♯の配列は一塩基多型を示しＧまたはＡである。標的領域、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３に対応する領域は以下の通りである。【００８８】標的領域（一塩基多型領域）：配列番号１に示す塩基配列の第９２番目のＧまたはＡのみ
Ｆ１ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第６８〜９１番目（２４ｂｐ）
Ｆ２ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第２５〜５０番目（２６ｂｐ）
Ｆ３ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第１〜２４番目（２４ｂｐ）
Ｒ１：配列番号１に示す塩基配列の第９３〜１１５番目（２３ｂｐ）
Ｒ２：配列番号１に示す塩基配列の第１２９〜１５２番目（２４ｂｐ）
Ｒ３：配列番号１に示す塩基配列の第１５３〜１７２番目（２０ｂｐ）
また、ネガティブコントロールとして、鋳型核酸を入れないサンプルを用意した。【００８９】  サンプルは配列番号１に示す塩基配列の第９２番目がＧの配列を含む検体を２検体（検体番号１〜２、アリル組み合わせＧ／Ｇ）、配列番号１に示す塩基配列の第９２番目がＡの配列を含む検体を２検体（検体番号３〜４、アリル組み合わせＡ／Ａ）、配列番号１に示す塩基配列の第９２番目がＧとＡの配列を含む検体を混合させた検体を２検体（検体番号５〜６、アリル組み合わせＡ／Ｇ）、ネガティブコントロールとなる鋳型の入ってない検体が２検体（検体番号７〜８）の合計８検体を用意した。【００９０】  サンプルチューブ内の反応溶液に検体番号１〜８の鋳型核酸を添加し、６５℃に設定したヒートブロックに乗せ、各チューブがちょうど４５分後になるようにヒートブロックから順次取り上げるように反応させた。【００９１】  検出を行うために、以下の検出試薬を用意、調製した。【００９２】・抗体固定化磁性粒子
抗ビオチン抗体標識磁性粒子（ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ」にＤＡＫＯ社製「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ  ０７４３」を標識）
抗ジゴキシゲニン抗体標識磁性粒子（ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ」にＣＯＶＡＬＡＢ  Ｒ＆Ｄ社製Ａｎｔｉ  Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ」を標識）
・酵素標識抗体
アルカリフォスファターゼ標識抗ビオチン抗体（ＤＡＫＯ社製「Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｄ５１０７」）
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ＤＡＫＯ社製「Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ＤＩＧ／ＡＰ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆ（ａｂ’）Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｄ  ５１０５」）
ＬＡＭＰ反応後、ＬＡＭＰ産物量を２つに分注し、以下の反応を行った。【００９３】・分注したそれぞれに抗ビオチン抗体標識磁性粒子と抗ジゴキシゲニン抗体標識磁性粒子を５μＬを加え、室温でそれぞれ５分反応させる。【００９４】・反応後、リン酸バッファーで２回ＢＦ分離反応を行う。【００９５】・それぞれの分注溶液に対応した１００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ビオチン抗体とアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体をそれぞれ２０μＬ加え、室温で６０分反応させる。【００９６】・リン酸バッファーでそれぞれ３回ＢＦ分離反応を行う。【００９７】・それぞれに基質１００μＬを加え、室温で１分間反応させる。このとき、発光基質はＷａｋｏ社製「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」カタログＮｏ．６９０８６を使用した。【００９８】・測定用９６  ｗｅｌｌブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ＡＴＴＯ社製Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲＩＩ）中で１０秒間積算測定を行う。【００９９】  測定結果
上記反応の結果を表１および図１３に示す。表１はそれぞれのサンプルと検出試薬の組み合わせにおいて発光量（単位：ｃｐｓ）を示した表であり、図１３はこれをグラフで表わしている。サンプルのＳＮＰに対応した結果が発光量となって得られていることが分かる。特にサンプルのＡ／ＡとＡ／ＧとＧ／Ｇの組み合わせが明確に区別できており、ＰＣＲ法以外の増幅法においても従来の方法では難しいかったＡ／ＡとＡ／Ｇ、Ｇ／ＧとＡ／Ｇの区別を１回の反応で区別できる点で非常に有用である。【０１００】  本変形例において使用したリガンドには制限はなく、特異的に反応する受容体が用意できるものであれば変更してもかまわない。また、インナープライマーＦＡ（Ｇ）およびインナープライマーＲＡ（Ｇ）と、インナープライマーＦＡ（Ａ）およびインナープライマーＲＡ（Ａ）の両方にリガンドをつけなくても検出可能であり、例えばインナープライマーＦＡ（Ｇ）のみのプライマー５’端にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を標識させ、インナープライマーＦＡ（Ａ）のみのプライマー５’端にジゴギジゲニン（Ｄｉｇ）を標識させても良い。
【表１】
2006129770.tif 000002
【０１０１】  ＩＩ．本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法において、特に、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法
本発明は、上述したような核酸の検出方法において、分散性粒子の凝集反応を利用することによって、より簡便かつ高精度な、高い再現性のある核酸の検出方法を提供する。【０１０２】  上述した本発明の核酸の検出方法では、検出対象の核酸が固定基板上に捕捉され、この捕捉された核酸を、酵素基質反応等によって検出した。【０１０３】  これに対し、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法では、固定基板を使用せず、代わりに分散性粒子を使用する。分散性粒子の表面には複数の受容体が配置されており、検出対象の核酸はこの受容体を介して分散性粒子に結合する。分散性粒子は、検出対象の核酸を介して次々に連結され、大きな凝集塊が生まれる。これを分光光度計によって測定する。当該方法では、受容体を酵素で予め修飾する必要性や、酵素に基質を添加する必要性がなく、分散性粒子の凝集という物理的現象によって確実かつ迅速に核酸を検出することができる。以下、当該方法について詳細に説明する。【０１０４】  本発明は、検出されるべき標的核酸と分散性微粒子との架橋反応によって生じる凝集に基づいて、前記標的核酸を検出する方法であって、種類の異なる第一および第二のリガンドが結合した標的核酸と、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の微粒子と、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、一つの前記標的核酸が前記第一および第二の微粒子と結合することによって、前記第一および第二の微粒子が連結し、かつ、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、前記標的核酸のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて生じる凝集を、分光光度法によって測定する工程とを具備する核酸の検出方法を提供する。【０１０５】  また、本発明は、前記種類の異なる第一および第二のリガンドがそれぞれ一以上結合した濃度が既知の標的核酸を、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分光光度法によって測定する工程と、前記工程を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程と、前記検出されるべき標的核酸を、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分光光度法によって測定する工程と、前記検量線に基づいて前記検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程とを具備する核酸の定量が可能な方法を提供する。【０１０６】  本発明に拠れば、核酸にリガンドを結合し、受容体を結合した分散性微粒子と反応させ、前記微粒子の凝集に基づいて核酸を検出することが可能であり、簡便かつ正確な核酸の検出が可能である。【０１０７】  本発明の核酸検出方法は、分散性微粒子を用い、該微粒子の凝集を測定することによって核酸の検出を行う方法である。以下、本発明の方法を順に説明する。【０１０８】  まず、検出されるべき標的核酸にリガンドを結合する。ここで、標的核酸は、生体試料に含まれる核酸や、任意の検体に含まれる核酸であってよいが、これらに限定されない。また、核酸とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡを含む全ての核酸または核酸類似体であり、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであって���よい。【０１０９】  標的核酸に結合されるリガンドは、例えば、親水性有機化合物、ジオキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、残基数が６以上のポリペプチド、糖が２つ以上の糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫのペプチド）等を用いることができるが、これらに限定されない。ビオチン、ジオキシゲン、フルオロセイン、アレクサなどは市場からの入手が容易で低価格という特徴をもっている。また、糖鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高く、複数種類をそろえることが容易である。検出対象の標的核酸、試料等によって、使用するリガンドを適宜選択してよい。【０１１０】  標的核酸には、種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドがそれぞれ一以上結合される。標的核酸にリガンドを結合する方法は、（ｉ）光、プラチナまたはリンカーを用いて核酸内部および末端部の塩基に共有結合させる手法（図１４ａ）、例えば、核酸の５’末端のアミノ基と、リガンドのカルボキシル基を共有結合させる方法、（ｉｉ）核酸合成時にリガンドを結合させたプライマーを用いてポリメラーゼにより伸長させる方法（図１４ｂ）、（ｉｉｉ）核酸合成時にリガンドを結合させたヌクレオチドを取り込ませて伸長させる方法（図１４ｃ）、（ｉｖ）ターミナルデオキシジルトランスフェラーゼを用いてリガンドを結合させたヌクレオチドを核酸の３’末端にテーリングする手法（図１４ｄ）、等の各種方法を用いることができる。【０１１１】  生体試料または任意の検体等のように、標的核酸が他の核酸と共に存在する試料では、（ｉｉ）（ｉｉｉ）の手法を用いることができる。検出されるべき標的核酸が単独で存在する場合には、何れの手法を用いてもよい。なお、例えば生体試料等に含まれる標的核酸は、ＰＣＲ法によって増幅させてから検出しても良いが、増幅させずにそのまま検出に供してもよい。【０１１２】  標的核酸に結合されるリガンドには、図１４に示したように二種類のリガンドを用いる。核酸の構造は柔軟であり、本方法においては、後述するように、核酸が二つの微粒子を連結することが必須であるため、二種類のリガンドを用いることが望ましい。【０１１３】  また、標的核酸に結合される二種類のリガンドは、それぞれ一つずつでも良いが、二つ以上結合されてもよい。「核酸」対「粒子」の体積比は極めて大きいため、一つの核酸に三つ以上の粒子が結合する可能性は低い。従って、一本の核酸に、複数のリガンドが結合していても、微粒子の凝集度には影響を与えないものと考えられる。【０１１４】  次に、分散性微粒子に、標的核酸に結合したリガンドと特異的に結合する受容体を結合する。本発明に用いる分散性微粒子とは、例えばコロイド粒子のように溶液中で分散する粒子を意味し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに限定されない。分散性微粒子としては、粒径が約８０〜３００ｎｍ程度の微粒子であることが、免疫比濁法装置で比濁を測定するには好適である。【０１１５】  ラテックス粒子は主にポリスチレンから成り、親水性と分散性とを高めるためメタクリル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプと官能基を有する官能基タイプがある。プ��ーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の存在のために負の電荷を有しており、タンパク質の正の電荷をもつ領域とイオン結合することができる。また、疎水結合させることも可能である。プレーンタイプのラテックス粒子はタンパク質と混合するだけで、タンパク質が吸着するので、タンパク質の固定操作が容易である。【０１１６】  官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基やアミノ基等が露出するように設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。ラテックス粒子に受容体を結合させる方法は、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ方法、ＥＤＣとＮＨＳとをあらかじめ混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基でタンパク質を結合する方法等がある。本発明においては既存のいかなる方法を用いてもよいが、特にＥＤＡＣ法が望ましい。なお、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、周知の方法によって受容体を結合することができる。【０１１７】  分散性微粒子に結合される受容体は、検出する標的核酸に結合されたリガンドと特異的に結合する受容体を用いる。受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン、Ｎｉ等を用いることができるが、これらに限定されない。タンパク質、特に抗体が好適に用いられる。受容体を微粒子に結合させる方法は、微粒子によって適した周知の方法を用いればよい。【０１１８】  一つの態様において、一つの分散性微粒子には、単一種類の受容体を結合させる。本態様によれば、標的核酸には少なくとも二種類のリガンドが結合されているため、一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の分散性微粒子を準備する。即ち、第一のリガンドに対応する受容体が結合された第一の分散性微粒子（図１５ａ）と、第二のリガンドに対応する受容体が結合された第二の分散性微粒子（図１５ｂ）とを準備する。【０１１９】  他の態様においては、一つの分散性微粒子に二種類以上の受容体を結合させてもよい。本態様では、一つの標的核酸に結合された二種類のリガンドのうち、一つのリガンドに対応する受容体と、もう一つのリガンドに対応する受容体以外の受容体を結合させる。即ち、標的核酸の二種のリガンドの双方が微粒子に結合しないように設計する。【０１２０】  なお、本工程による分散性微粒子への受容体の結合は、核酸を検出する際に実施してもよいが、予め受容体を結合させた分散性微粒子を検出に使用してもよい。また、本工程は、上記の標的核酸を調製する工程と前後して実施してよい。【０１２１】  次に、標的核酸と微粒子を結合させる工程を説明する。上記したようなリガンドが結合された標的核酸と、受容体が結合された第一および第二の分散性微粒子を反応させて結合させる。この反応は、標的核酸が含まれる溶液と分散性微粒子が含まれる二つの溶液を同時に混合して行ってもよく、或いは、各分散性微粒子を順に混合して、逐次的に行ってもよい。【０１２２】  図１６に、標的核酸と微粒子が結合した模式図を示す。図１６において、標的核酸３０に結合した第一のリガンド３１は、第一の微粒子３３と結合する。また、標的核酸３０に結合した第二のリガンド３２は、第二の微粒子３４と結合する。即ち、一つの標的核酸が第一の微粒子と第二の微粒子に結合することによって、第一および第二の微粒子が連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、その標的核酸のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結された結果、微粒子の凝集が生じることになる。なお、図１６において受容体から延ばされた点線は、核酸を簡易的に表したものである。【０１２３】  これにより、標的核酸が試料中に存在している場合、微粒子の凝集が生じ、これによって標的核酸を検出することができる。ここで、微粒子の凝集の有無は、上述した光マーカーでラベリングすることにより光シグナルの分散状態を検出してもよいが、好ましくは光マーカーを用いずに分光光度法で吸光度を測定することによって判定する。【０１２４】  図１７に模式図を示したように、単独の微粒子は近赤外光を殆ど散乱しない（図１７ａ）。一方、凝集した微粒子は、単独の微粒子に比べて見かけ上の径が大きく、近赤外光の散乱を生じさせることができる（図１７ｂ）。従って、近赤外領域の入射光に対する透過光の光度を光度計で測定することにより、微粒子の凝集度を測定することができる。このとき、粒径３００ｎｍ以下の微粒子は、凝集すると近赤外光を散乱させるため、粒径が３００ｎｍ以下の微粒子を用いることが好ましい。【０１２５】  微粒子を含む溶液は、混合後（凝集前）の最終濃度が、ＯＤ値で０．０１〜１の範囲であり、さらに、凝集後のＯＤ値が３以下であるように調製されることが好ましい。標的核酸を含む溶液と、微粒子を含む溶液を混合する際、リガンドと受容体との結合の偏在を避けるため、一方の容量が他方の容量の２０％を下回らないようにすることが望ましく、また、混合ラテックスミキサーやピペッティングですばやく攪拌することが好ましい。反応系に用いるバッファーは、凝集を促進する溶液を使用することが好ましい。異なるバッファーを用いる場合は、当該異なるバッファーで微粒子を２〜３回洗浄して用いることが好ましい。【０１２６】  リガンド−受容体に抗原抗体を用いる場合は、０℃以上３７℃以下の温度で、５分〜３０分で反応させることが好ましい。その他のリガンド−受容体は、反応に適した温度、時間、バッファーを用いればよく、これらは適宜選択可能である。【０１２７】  なお、混合後の反応溶液を分光光度測定に供する際、凝集していない微粒子は近赤外光を散乱しないため、Ｂ／Ｆ分離する必要がなく、反応系を直接測定に供することができる。また、標的核酸をＰＣＲによって調製したとき、リガンドが結合した未反応のプライマーや、未反応のヌクレオチド等によって測定誤差を生じるおそれがある場合、これらを分離してもよい。分離する方法は、例えば一方のリガンドにビオチンを結合し、アビジン又はストレプトアビジンを結合した磁性粒子を用いてＢ／Ｆ分離する。このとき、該磁性粒子は、分散性微粒子として用いてよい。【０１２８】  ［核酸の定量を行う方法］
次に、本発明の方法を用いて核酸の定量を行う方法を説明する。定量を行う際には、上記したようなリガンドを結合した標的核酸を用い、該標的核酸を各種濃度で含む溶液を調製する。各濃度の核酸溶液を、上述した方法に従って微粒子と反応させて分光光度法により吸光度を測定する。該測定結果に基づいて、核酸濃度と吸光度による検量線を作成する。この検量線に基づいて、検出対象の標的核酸の吸光度を測定した結果から核酸濃度を決定する。これによって、標的核酸の定量を行うことができる。【０１２９】  また、複数種類の標的核酸が含まれる試料において、標的核酸の種類毎に異なる二種のリガンドを結合させ、検出すべき標的核酸に結合されたリガンドと特異的に結合する受容体を結合された分散性微粒子のみを反応に供することによって、複数種類の標的核酸を含む試料から、所望の標的核酸を同時に検出することができる。【０１３０】  ここで、核酸に結合するリガンドは、全て異なるリガンドをもちいてよい。或いは、二種類のリガンドのうち、一方のリガンドは、他の核酸と共通のリガンドを用いてもよい。【０１３１】  なお、上述した検出方法では、一つの標的核酸について二種類のリガンドを用いたが、３種類以上のリガンドを用いてもよく、各種類のリガンドに特異的に結合する受容体が結合された分散性微粒子を用いてもよい。【０１３２】  ［核酸の塩基配列における変異を検出する方法］
次に、本発明に従って核酸の塩基配列における変異を検出する方法を説明する。核酸の変異としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入等が挙げられる。ここで、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）とは、ゲノムＤＮＡ上に散見され、個体によって異なる一塩基の多様性をいう。【０１３３】  本発明の第一の態様として、ＰＣＲ−ＳＳＰ法を用いた核酸変異検出方法が提供される。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う方法であるが、このＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡと完全にハイブリダイズしていないと殆ど作用しない。【０１３４】  従って、標準型の標的核酸配列と相補的な配列を有するプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅産物が生じた場合は変異がなく、反対に、増幅産物が生じない場合は変異があることが判明する。【０１３５】  この方法で用いる一つのプライマーは、標的核酸配列に相補的な配列を有し、その３’末端が前記標的核酸配列における変異部位に対応する、第一のリガンドが結合された検出用プライマーである。もう一方のプライマーは、前記標的核酸の該変異部位より５’末端側の配列に相補的な配列を有する、前記第一のリガンドとは異なる第二のリガンドが結合された共通プライマーである。【０１３６】  図１８に本態様の概念図を示した。図１８（ａ）は、変異のない標的核酸５０、即ち標準型の標的核酸５０であり、変異が存在し得る部位を黒丸５２で表している。図１８（ａ）では、検出用プライマー５４が完全にハイブリダイズし、共通プライマー５６との間でＰＣＲによる増幅産物を得ることができる。一方、図１８（ｂ）は変異型の標的核酸５０である。この場合、検出用プライマー５４はその３’末端がハイブリダイズせず、ＰＣＲによる増幅が生じない。【０１３７】  以下、本態様における工程を順に説明する。まず、（ｉ）前記標的核酸、及び、前記二種類のプライマー５４、５６によってＰＣＲを行う。このＰＣＲでは、上述したように、検出用プライマー５４が標的核酸と完全にハイブリダイズした場合にのみ増幅産物が得られる。なお、共通プライマー５６は、標的核酸の変異の有無に関係なくハイブリダイズする。【０１３８】  次に、（ｉｉ）前記工程で得られたＰＣＲ産物、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させる。【０１３９】  さらに、（ｉｉｉ）一つの前記ＰＣＲ産物が前記第一の分散性微粒子及び第二の分散性微粒子と結合することによって、該第一及び第二の分散性微粒子が連結し、且つ、一つの分散性微粒子に複数のＰＣＲ産物が結合し、該ＰＣＲ産物のそれぞれが他の分散性微粒子と結合することによって、多数の分散性微粒子が互いに連結されて生じる凝集を、分光光度法によって測定する。【０１４０】  これらの工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、上記で詳細に説明した分散性微粒子を用いた検出方法についての記載の通りに実施される。次いで、（ｉｖ）該測定結果から、前記ＰＣＲによる核酸の増幅を判定する。微粒子の凝集が生じた場合、増幅産物が得られたことが分かる。従って、凝���が生じた場合には、標的核酸における変異が存在しないことが分かる。【０１４１】  以上に述べた本態様に拠れば、核酸配列における一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、又は挿入等の変異が簡便且つ迅速に検出可能である。【０１４２】  さらに、標的核酸配列における変異が一塩基多型である場合、本態様の他の実施形態として、標準型と変異型の双方の標的核酸のための検出用プライマーを用いてもよい。即ち、検出用プライマーとして、標準型用リガンドが結合され、標準型の標的核酸に相補的な配列を有する第一のプライマー、並びに、変異型用リガンドが結合され、変異型の標的核酸に相補的な配列を有する第二のプライマーを用いる。これらの二種類の検出用プライマーは、別個にＰＣＲに供してもよいが、同一の反応系で同時にＰＣＲを行ってもよい。【０１４３】  本実施形態においては、第一の分散性微粒子として、それぞれのプライマーに結合されたリガンドに対応した微粒子を使用する。即ち、標準型用リガンドと特異的に結合する受容体が複数結合された標準型用分散性微粒子、及び、変異型用リガンドと特異的に結合する受容体が複数結合された変異型用分散性微粒子を用いる。【０１４４】  これに伴い、本実施形態では、前記第一の態様の工程（ｉｉｉ）における凝集反応を、標準型用微粒子と変異型微粒子のそれぞれについて別個に行う。ＰＣＲ反応液中には、標準型用プライマーによるＰＣＲ産物と、変異型用プライマーによるＰＣＲ産物の何れか一方、又は両方が存在している。従って、この反応液中に、標準型用微粒子と第二の分散性微粒子との組み合わせを混合して、凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標的核酸は標準型であることが分かる。これとは別に、変異型用微粒子と第二の分散性微粒子との組み合わせを用いて凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標的核酸は変異型であることが分かる。さらに、何れの凝集反応でも凝集が生じた場合、標的核酸は標準型及び変異型の双方が存在することが分かる。これは例えば、ある人物のゲノムＤＮＡが検体であって、その一塩基多型における遺伝子型がヘテロである場合等にも起こり得る。【０１４５】  本実施形態に拠れば、一度のＰＣＲ反応によって、一塩基多型における塩基型が判明し、さらに、Ｂ／Ｆ分離操作が必要ないため、極めて簡便、且つ、精確に塩基型を決定することができる。【０１４６】  なお、本態様では、リガンドはプライマーに結合させたが、これに限らず、ヌクレオチドに結合させてもよい。リガンドが結合されたヌクレオチドを用いてＰＣＲすることによって、増幅産物にリガンドを結合させることもできる。【０１４７】  また、本態様の方法は、例えばゲノムＤＮＡ等を試料とし、多数の変異部位を同時に検出する際にも用いることができる。【０１４８】  本発明の第二の態様として、ＰＣＲ−ＳＳＰ法を用い、さらにＴａｇ配列を用いた核酸変異検出方法が提供される。ここで、Ｔａｇ配列とは、人工的に設計された塩基配列であり、好ましくは染色体等の生体試料中に存在せず、互いにミスハイブリがなく解離温度が同一に設計された配列である。このＴａｇ配列は、検出すべき変異部位毎に設計・調製する。【０１４９】  本態様においては、前記第一の態様における検出用���ライマーに、リガンドの代わりにＴａｇ配列を結合させる。このＴａｇ配列は、検出用プライマーの５’末端に結合されることが望ましい。また、前記第一の態様における共通プライマーに、リガンドの代わりにビオチンが結合される。【０１５０】  本態様における工程では、まず、（ｉ）前記標的核酸、及び、前記二種類のプライマーによってＰＣＲを行う。このＰＣＲでは、上記第一の態様で記載したように、検出用プライマーが標的核酸と完全にハイブリダイズした時、即ち、標的核酸に変異がない場合にのみ増幅産物が生じる。【０１５１】  次いで、（ｉｉ）上記（ｉ）で得られたＰＣＲ反応液から、ビオチンが結合したＰＣＲ産物を、アビジン又はストレプトアビジンが結合した磁性粒子を用いて分離する。ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジンと結合するため、この結合を介して磁性粒子に増幅産物を結合させ、磁力を用いて該磁性粒子をＰＣＲ反応液から分離することが可能である。【０１５２】  次に、このようにして分離されたＰＣＲ産物を、（ｉｉｉ）Ｔａｇ配列に相補的な配列を有し、第一のリガンドが結合した第一のプライマー、及び第二のリガンドが結合した第二のプライマーを用いたＰＣＲに供する。これにより、Ｔａｇ配列の増幅産物が得られる。即ち、標的核酸に変異がない場合に、プライマーの増幅産物が生じ、これからＴａｇ配列の増幅産物が生じる。従って、変異部位の配列がＴａｇ配列へ変換されると言える。上記したように、Ｔａｇ配列はＰＣＲで容易且つ誤差なく増幅するような配列であるように設計されるため、この変換は円滑に行われることができる。【０１５３】  このＴａｇ配列の増幅産物は、第一及び第二のリガンドが結合されたものである。よって、（ｉｖ）第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させることにより、上述したように凝集が生じ得、（ｖ）この凝集を分光光度法によって測定すればよい。最後に、（ｖｉ）測定結果から、ＰＣＲによるＴａｇ配列の増幅を判定する。即ち、Ｔａｇ配列の増幅が確認されれば、標的核酸に変異がないことが判明する。【０１５４】  以上記載した本態様における方法も、例えばゲノムＤＮＡ等を試料とし、多数の変異部位を同時に検出する際に用いることができる。さらに、このようなＴａｇ配列を用いることによって、リガンドの種類に制限されることなく、多数の変異部位を同時に検出することが可能である。【０１５５】  なお、以上記載した本態様の方法では、標的核酸に変異がない場合を例に説明したが、例えば一塩基多型であって、変異型を検出する場合にも同様に行うことができる。この場合、検出用プライマーに変異型の標的核酸と相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、上記と同様に検出することができる。【０１５６】  本発明の第三の態様として、ライゲーションを用いた核酸変異検出方法が提供される。本態様において検出される核酸変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。本態様においては、標的核酸配列に相補的な配列を有し、その３’末端が前記一塩基多型部位に対応する、第一のリガンドが結合された検出用プライマー、及び、前記標��核酸の該多型部位より５’末端側の配列に相補的な配列を有し、その５’末端が、該多型部位に隣接する塩基に対応する、第二のリガンドが結合された共通プライマーを用いる。【０１５７】  図１９に本態様の概念図を示した。図１９（ａ）は、変異のない標的核酸６０、即ち標準型の標的核酸であり、変異が存在し得る部位を黒丸６２で表している。図１９（ａ）では、検出用プライマー６４が完全にハイブリダイズし、その３’末端が、共通プライマー６６の５’末端と隣接している。従って、これらをライゲーション反応に供することによって、二つのプライマーの間が連結される。一方、図１９（ｂ）は変異型の標的核酸である。この場合、検出用プライマー６４はその３’末端がハイブリダイズしないため、ライゲーション反応が起こらない。なお、共通プライマー６６は、標的核酸の変異の有無に関係なくハイブリダイズする。【０１５８】  以下、本態様における工程を順に説明する。まず、（ｉ）前記二種類のプライマー６４、６６を、前記標的核酸６０にハイブリダイズさせる。続いて、（ｉｉ）ライゲーションを行い、前記二種類のプライマーを連結する。ここで得られた連結されたプライマーを、（ｉｉｉ）前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させる。【０１５９】  この反応によって生じた凝集を、（ｉｖ）分光光度法によって測定し、（ｖ）該測定結果から、前記ＰＣＲによる核酸の増幅を判定し、該判定結果によって、前記標的核酸配列における一塩基多型を判別する。【０１６０】  本態様に拠れば、ライゲーション反応によって変異の有無を検出することができ、ＰＣＲを行う必要がない。よって、反応工程がより簡略化し、コスト低減と時間の短縮が可能である。しかしながら、プローブの配列が変異部位の前後しか使用できないために制限される。よって、例えばＤＮＡゲノム配列等を試料とする場合は、検出対象の変異部位を含む領域をＰＣＲによって増幅し、切り出してもよい。これによって、本態様の検出感度及び精度を向上させる効果も得られる。【０１６１】  本態様においては、リガンドをプライマーに結合する場所や数に制限はないが、ライゲースの反応を阻害しないように変異部位の近傍以外の位置、例えば変異部位と反対の末端に結合することが好ましい。【０１６２】  さらに、本態様における他の実施形態として、標準型と変異型の双方の標的核酸のための検出用プライマーを用いてもよい。即ち、検出用プライマーとして、標準型用リガンドが結合され、標準型の標的核酸に相補的な配列を有する第一のプライマー、並びに、変異型用リガンドが結合され、変異型の標的核酸に相補的な配列を有する第二のプライマーを用いる。これらの二種類の検出用プライマーは、別個にライゲーション反応に供してもよいが、同一の反応系で同時に反応を行ってもよい。【０１６３】  このような実施形態においては、第一の分散性微粒子として、それぞれのプライマーに結合されたリガンドに対応した微粒子を使用する。即ち、標準型用リガンドと特異的に結合する受容体が複数結合された標準型用分散性微粒子、及び、変異型用リガンドと特異的に結合する受容体が複数結合された変異型用分散性微粒子を用いる。【０１６４】  これに伴い、該実施形態では、前記工程（ｉｉｉ）における凝集反応を、標準型用微粒子と変異型微粒子のそれぞれについて別個に行う。ライゲーション後の反応液中には、標準型用プライマーによる産物と、変異型用プライマーによる産物の何れか一方、又は両方が存在している。この反応液中に、標準型用微粒子と第二の分散性微粒子との組み合わせを混合して、凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標的核酸は標準型であることが分かる。これとは別に、変異型用微粒子と第二の分散性微粒子との組み合わせを用いて凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標的核酸は変異型であることが分かる。さらに、何れの凝集反応でも凝集が生じた場合、標的核酸は標準型及び変異型の双方が存在することが分かる。これは例えば、ある人物のゲノムＤＮＡが検体であって、その一塩基多型における遺伝子型がヘテロである場合等にも起こり得る。【０１６５】  本実施形態に拠れば、一度のライゲーション反応によって、一塩基多型における塩基型が判明し、さらに、Ｂ／Ｆ分離操作が必要ないため、極めて簡便、且つ、精確に塩基型を決定することができる。【０１６６】  本発明の第四の態様として、ライゲーションを用い、さらにＴａｇ配列を用いた核酸変異検出方法が提供される。本態様において検出される核酸変異は、一塩基多型である。【０１６７】  本態様においては、上記第二の態様と同様にＴａｇ配列を用いる。また、上記第三の態様と同様にライゲーション反応を用いて変異を検出する。【０１６８】  即ち、標的核酸配列に相補的な配列を有し、その３’末端が前記標的核酸配列における変異部位に対応し、その５’末端にＴａｇ配列が結合された検出用プライマー、及び、前記標的核酸の該変異部位より５’末端側の配列に相補的な配列を有し、ビオチンが結合された共通プライマーを用い、
（ｉ）前記二種類のプライマーを、前記標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）に続いてライゲーションを行い、前記二種類のプライマーを連結する工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）における反応系から、ビオチンが結合した連結されたプライマーを、アビジン又はストレプトアビジンが結合した磁性粒子を用いて分離する工程と、
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた連結されたプライマー、及び、前記Ｔａｇ配列に相補的な配列を有し、第一のリガンドが結合した第一のプライマー、及び第二のリガンドが結合した第二のプライマーを用いてＰＣＲを行い、該Ｔａｇ配列のＰＣＲ産物を得る工程と、
（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られたＰＣＲ産物、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させる工程と、
（ｖｉ）一つの前記ＰＣＲ産物が前記第一の分散性微粒子及び第二の分散性微粒子と結合することによって、該第一及び第二の分散性微粒子が連結し、且つ、一つの分散性微粒子に複数のＰＣＲ産物が結合し、該ＰＣＲ産物のそれぞれが他の分散性微粒子と結合することによって、多数の分散性微粒子が互いに連結されて生じる凝集を、分光光度法によって測定する工程と、
（ｖｉｉ）該測定結果から、前記ＰＣＲによる核酸の増幅を判定し、該判定結果によって、前記標的核酸配列における変異を検出する工程とを具備する。【０１６９】  本態様における方法は、例えばゲノムＤＮＡ等を試料とし、多数の変異部位を同時に検出する際に用いることができる。さらに、このようなＴａｇ配列を用いることによって、リガンドの種類に制限されることなく、多数の変異部位を同時に検出することが可能である。また、ライゲーション反応によって変異の有無を検出することができ、ＰＣＲを行う必要がない。よって、反応工程がより簡略化し、コスト低減と時間の短縮が可能である。【０１７０】  以上述べた本発明の各種の態様は、さらに標的核酸の定量に用いることもできる。定量を行う際には、検出対象である標的核酸を既知の濃度で含む溶液を調製し、上記の方法と同様に測定する。これを各濃度の核酸溶液で行い、その測定結果に基づいて、核酸濃度と吸光度による検量線を作成する。この検量線に基づいて、検出対象の標的核酸の吸光度を測定した結果から核酸濃度を決定する。これによって、標的核酸の定量を行うことができる。【０１７１】  また、以上述べた本発明の各種の態様は、複数種類の標的核酸が含まれる試料や、変異部位が多数存在する核酸において、所望の標的核酸の変異を同時に検出することができる。これは、複数箇所の変異について、ＰＣＲやライゲーション反応を同時に行い、該反応溶液を分注して、それぞれの変異箇所を検出するための分散性微粒子を用いて凝集反応を行うことにより、簡便且つ同時並行的に複数箇所の変異を検出することができる。【０１７２】  なお、以上述べた検出方法では、一つの標的核酸について二種類のリガンドを用いたが、３種類以上のリガンドを用いてもよく、各種類のリガンドに特異的に結合する受容体が結合された分散性微粒子を用いてもよい。【０１７３】  以上詳述したように、本願発明の方法によれば、所望の核酸が簡便で迅速、且つ精度良く検出することができる。これにより、例えば臨床検査の簡便化と迅速化に役立ち、さらに簡易検査から全自動分析に至るまで幅広く応用することも可能である。【０１７４】  本発明の方法を実施する際に用いる材料は、例えば、３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子（ＣＭＰ）Ｇ０２０１（０．１０４ｍｅｑ  ＣＯＯ／ｇ）（ＪＳＲ社）、ＥＤＡＣ（Ｓｉｇｍａ社）、ウサギ抗ビオチン抗体（ＢＥＴＨＹＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｃ．）、ウサギ抗ジゴゲシニン（Ｄｉｇ．）抗体（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｏｒｐ．）、鋳型ＤＮＡ、５’ビオチン化ＳＤプライマー、３’Ｄｉｏｇ．化ＥＤプライマー、Ｔｉｔａｎｉｕｍｎ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＤ社）、ＭＥＳ（ＷＡＫＯ社）を用いることができる。また、使用する機器としては、ロテーター、ボルテックスミキサー、タンジェンタルフローシステム、透析膜、マグネティックスターラー、分光光度計、セル等を用いてよい。【０１７５】  なお、上述したＩおよびＩＩの方法は、いずれも反応性が高くかつ特異性も高い。さらには、マルチプレックスな反応も容易な為、キュベットやマイクロウェルのような溶液系の反応にとって非常に都合が良い。従って、分注ノズルを組合せた液体ハンドリングによるハイスループットな自動分析装置に最適な検出方法を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】  本発明の核酸の検出方法は、核酸の多型、変異、発現量の検査を行う際に使用される。特に、本発明の核酸の検出方法は、ＳＮＰの検出を行う際に使用される。本発明の核酸の検出方法によって個々人のＳＮＰが明らかになり、個々人の病的遺伝背景が明らかになる。これによって、個々人に最適な医薬品の開発が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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