(57)【要約】  本発明によれば、被検物質が、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、被検物質とＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩を用いることを特徴とする方法が提供される。本発明によるスクリーニング方法によれば、ＣＣＫやＧＬＰ−１のような消化管ホルモンの分泌に関与する物質をスクリーニングすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、
被検物質と、
ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩
を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１、またはホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＣ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＤ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＥ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＦ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIII分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＶ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較する工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合との間で、結果に相違が出た場合に、その物質をＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であると決定する工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被検物質が細胞刺激活性を上昇させる場合に、その物質をＧＰＲ１２０アゴニストと決定する工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
被検物質が細胞刺激活性を低下させる場合に、その物質をＧＰＲ１２０アンタゴニストと決定する工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
細胞刺激活性の測定を、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化を検出するレポーターアッセイ系により測定するか、または、細胞内カルシウムイオン遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、および、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性からなる群より選択されるパラメータを測定することによって行う、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ１２０が、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１２】
ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩と
を少なくとも含んでなる、スクリーニング用キット。
【請求項１３】
ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするためのものである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＧＰＲ１２０が、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる、請求項１３に記載のキット：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１５】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＣ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＤ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＥ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＦ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIII分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＶ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１７】
ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするための、
ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩
の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である、特願２００５−２５４６４３号（出願日：２００５年９月２日）に基づくものであって、それらの優先権の利益を主張するものであり、それらの開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質であるＧＰＲ１２０と、ホスホリパーゼまたはその塩との相互作用を変化させる物質（詳しくは、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質）をスクリーニングする方法、およびそのようなスクリーニングを実施するためのスクリーニング用キットに関する。
【０００３】
背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を介して、生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは、細胞膜を７回貫通する構造を有しており、細胞内で三量体のＧタンパク質 (guanine nucleotide-binding protein) と共役していることから、Ｇタンパク質共役型受容体 (ＧＰＣＲ： G-protein coupled receptor) と呼ばれている。
【０００４】
ＧＰＣＲは、各種の細胞、臓器、および器官の機能細胞表面に存在し、それらの機能を調節する分子との結合を介してシグナルを細胞内に伝達して、細胞の賦活化や抑制化をする。このため、ＧＰＣＲは各種臓器および器官において重要な役割を担っている。このような生理活性物質とＧＰＣＲとの関係を明らかにすることは、生体の機能を解明し、それと密接に関連した医薬品開発をする上で重要である。医薬品を開発するためには、ＧＰＣＲのアゴニストやアンタゴニストを効率良くスクリーニングして、生体内で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解析し、それらを適当な発現系で発現させる必要がある。
【０００５】
近年、ＥＳＴデータベース等のｃＤＮＡ配列のランダム解析や、ゲノムＤＮＡの網羅的解析により、多くの新規遺伝子の存在が明らかとなってきている。ＧＰＣＲは、７個の膜貫通領域を有し、さらにそれ以外にも多くの共通配列を有している。このため、このような多くの新規遺伝子の中から新規ＧＰＣＲが見出されている。このようにして見出された新規ＧＰＣＲは通常そのリガンドは未同定である。リガンドが未同定のＧＰＣＲ、すなわちオーファンＧＰＣＲ、に対してリガンドを見出したり、その機能を解析したりすることは、新たな治療薬の開発につながる可能性があり、重要視されている。
【０００６】
そしてほとんどの場合、オーファンＧＰＣＲのリガンドの予測は困難である。ＧＰＣＲのリガンドは、生体アミン、アミノ酸、核酸とその代謝物、ペプチド、タンパク質（ホルモン、ケモカイン）、脂質など多様である。リガンドを抽出物などから精製を行う場合、それぞれの物質の種類に適した抽出方法が必要となる。また、細胞に発現させたオーファンＧＰＣＲが、リガンドに応答した後にいかなる２次情報伝達系を作動させるかは一般的に不明であり、様々な系について検討する必要がある。リガンドの存在する組織の予想は容易でないため、種々の組織抽出物を用意しなければならない。このように、オーファンＧＰＣＲのリガンド探索は多くの困難さを伴う。新たなＧＰＣＲのリガンドを見出して、該リガンドを直接利用するか、または該リガンドを用いた医薬のスクリーニング系を利用することによって、今までにない新規な作用機序を有する医薬の開発が期待できる。
【０００７】
ＧＰＲ１２０は、ＧＰＣＲの一つとして知られている（ＷＯ００／００６１１、およびＷＯ００／５０５９６）。ＧＰＲ１２０のリガンドは完全には解明されているとは言えないが、リガンドの一つとして脂肪酸が報告されている（ＷＯ２００４／０６５９６０、および（特開２００５−１５３５８号公報）。
【０００８】
ＧＰＲ１２０は、腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１細胞からのコレシストキニン（ＣＣＫ）の分泌促進作用との関連が知られており、ＧＰＲ１２０のアゴニスト、アンタゴニストは、過食症、拒食症に代表される摂食異常およびそれに伴う大腸疾患等の治療への応用が期待される（特開２００５−１５３５８号公報）。また、ＧＰＲ１２０は、腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１細胞から、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌促進作用を有することが報告されており、ＧＰＲ１２０に作用する物質は、糖尿病の治療への応用が期待される（Akira Hirasawa et al., Nature Medicine, 11, 90-94, 2004）。さらに、ＧＰＲ１２０は下垂体に発現しており、ストレス調節に関与している可能性も示唆されている（ＷＯ２００４／０６５９６０）。
【０００９】
上述のとおり、ＧＰＲ１２０のリガンドの一つとして脂肪酸が報告されているが、脂肪酸は、水系の溶媒への溶解度が低いため、リガンド溶液の調製が困難となることが多い。また脂肪酸は、スクリーニングに用いるプラスチックやガラスへの吸着が大きく、さらに、不飽和脂肪酸は酸化され易い。さらに、脂肪酸は、アルブミンとの結合率が高いことが知られている。脂肪酸は、生理的には、遊離脂肪酸として存在するのはごくわずか（１％程度）であり、ほとんどは血中のアルブミンに結合した状態で存在する。このため、脂肪酸を用いたＧＰＲ１２０のスクリーングにおいて、実際に、牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）による、脂肪酸とレセプターとの反応性の阻害が観察されており、スクリーニングを血清やアルブミン非存在下で行う必要性があることが報告されている（例えば、Akira Hirasawa et al., Nature Medicine, 11, 90-94, 2004）。一方、一般的に細胞やタンパク質を用いた医薬品のスクリーニングは、より生理的条件に近いことが求められるため、血清またはアルブミン（ＢＳＡ等）の存在下で行われることが多い。血清非存在下でスクリーニングを行うと、血清非存在の条件では細胞が損傷を受けるため、長時間の培養は通常困難である。このため、血清入り培地等で細胞を予め培養した後、スクリーニングをする時に血清除去培地と置換することが必要となるが、作業が繁雑になる。
【００１０】
このため、脂肪酸を直接使用しない、ＧＰＲ１２０のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング系の開発が望まれている。
【００１１】
ホスホリパーゼは、グリセロリン脂質のエステル結合を加水分解する酵素群の総称であり、その加水分解するエステル結合の位置により、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、ＣおよびＤ等に分類される。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）はさらに、分泌型（ｓＰＬＡ２）、細胞質型（ｃＰＬＡ２）、およびカルシウム非依存型（ｉＰＬＡ２）に分類でき、このうちｓＰＬＡ２は１０種類が知られている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは今般、驚くべきことに、ホスホリパーゼ、特に分泌型のホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２が、Ｇタンパク質であるＧＰＲ１２０を介する細胞刺激活性を活性化すること見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
よって本発明は、ＧＰＲ１２０とホスホリパーゼとの相互作用を変化させる物質、より詳しくはＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質、をスクリーニングする方法、およびそのような方法に使用されるキット等を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明によれば、被検物質が、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、被検物質と、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩を用いることを特徴とする方法が提供される。ここでいう「生体膜」には、細胞膜や細胞を構成するオルガネラ等の膜、脂質二重膜などを含む。また、リポソームなどの再構成膜も含む。本発明において、好ましくは、ＧＰＲ１２０を含む生体膜は、ＧＰＲ１２０を含む細胞膜と言うことができる。
【００１５】
本発明の一つの態様によれば、ＧＰＲ１２０、それを含む細胞膜、またはそれらを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩と、を用いることを特徴とする、ＧＰＲ１２０とホスホリパーゼまたはその塩との相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法が提供される。このとき好ましくは、スクリーニングされる物質はＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質である。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、この方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較する工程を含んでなる。
【００１７】
さらに本発明によれば、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを少なくとも含んでなる、スクリーニング用キットが提供される。また本発明によれば、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするための、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩の使用が提供される。
【００１８】
本発明によるスクリーニング方法によれば、ＣＣＫやＧＬＰ−１のような消化管ホルモンの分泌に関与する物質をスクリーニングすることができる。このため、本発明によれば、糖尿病、糖尿病網膜症若しくは糖尿病腎症等の糖尿病合併症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、下垂体機能障害、精神障害、免疫系疾患、炎症性疾患、マクロファージや樹状細胞が関与する疾患、癌、および、過食症、拒食症に代表される摂食障害、さらにはそれに伴う大腸疾患等の予防または治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ１２０）ＩＨの構築図を示す。
【図２】ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。
【図３】ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。
【図４】ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＭの構築図を示す。
【図５】ＧＰＲ１２０のマウスにおける臓器発現分布を示す。
【図６Ａ】Vydac218TP C18 reversed phase カラムで分画したラット精巣抽出物のＨＰＬＣのＵＶ吸収と、各分画のＧＰＲ１２０特異的ＰＬＡＰ促進活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された。
【図６Ｂ】ＳｕｎＦｉｒｅ C１８カラムを用いたラット精巣抽出物中に存在するＧＰＲ１２０を特異的に活性化するタンパクの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と、矢印で示したピークのＰＬＡＰ活性を示す。コントロールびＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞を比較した。
【図７】ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養メディウムを用いて、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、およびコントロール細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した結果を示す。
【図８】ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞の培養メディウムを用いて、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、およびコントロール細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した結果を示す。
【図９Ａ】ニッケルカラムで精製したＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いた、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、コントロール細胞におけるＰＬＡＰ活性を示す。この図９ＡではｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓを用いた場合の結果を示す。
【図９Ｂ】ニッケルカラムで精製したＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いた、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、コントロール細胞におけるＰＬＡＰ活性を示す。この図９ＢではｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓを用いた場合を示す。
【図１０Ａ】市販ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１０Ｂ】市販ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２を用いたｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１１Ａ】市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１１Ｂ】市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１２Ａ】市販ヘビ毒由来ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１２Ｂ】市販ヘビ毒由来ＰＬＡ２を用いたｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１３Ａ】Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１３Ｂ】Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１４Ａ】Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１４Ｂ】Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、コントロール細胞の場合と比較した結果を示す。
【図１５Ａ】ディフクイックによる肺胞マクロファージの染色像を示す。
【図１５Ｂ】Ｃ５７ＢＬ／６より採取した肺胞マクロファージ、および肺におけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１５Ｃ】ＢＡＬＢ／ｃより採取した肺胞マクロファージ、および肺におけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１５Ｄ】ＳＤラットより採取した肺胞マクロファージ、および肺におけるｒａｔＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１６】種々マクロファージにおけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１７Ａ】播種直後の肺胞マクロファージの顕微鏡写真である。
【図１７Ｂ】播種後６日目の肺胞マクロファージの顕微鏡写真である。
【図１７Ｃ】採取直後の肺胞マクロファージ、および、初代培養６日目の肺胞マクロファージにおけるｍＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１８】マウス脂肪組織におけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図１９】マウス由来脂肪細胞におけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【図２０】マウス骨髄由来樹状細胞におけるｍＧＰＲ１２０のＲＮＡ相対発現量を示す。
【発明の具体的説明】
【００２０】
ホスホリパーゼ
本発明のスクリーニング方法には、ホスホリパーゼを使用する。ホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、ＣおよびＤが挙げられるが、本発明においては、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２が好ましく、ホスホリパーゼＡ２がより好ましい。ホスホリパーゼＡ２は、性質により、分泌型（ｓＰＬＡ２）、細胞質型（ｃＰＬＡ２）、およびカルシウム非依存型（ｉＰＬＡ２）に分類できるが、本発明においては、分泌型が好ましい。また、ハチ毒およびヘビ毒のホスホリパーゼＡ２を用いることもできる。本発明によれば、ホスホリパーゼは、分泌型のホスホリパーゼＡ２およびハチ毒ホスホリパーゼＡ２がより好ましいものとして挙げられる。
【００２１】
分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）は、ＩＢ、IIＡ、IIＣ、IIＤ、IIＥ、IIＦ、III、Ｖ、Ｘ、ＸIIＡの１０種類のグループに分類することができ、本発明においては、好ましくは、グループＩＢ、IIＡ、Ｖ、Ｘであり、より好ましくは、グループＩＢ、Ｘであり、さらに好ましくはグループＸである。
【００２２】
ホスホリパーゼは、公知の酵素であるため、当業者であれば容易に入手することが出来る。例えば、所望するホスホリパーゼを含む生物から、常法にしたがって、抽出または精製の工程を経て調製することができる。また、ホスホリパーゼは、その市販品を購入して、使用することができる。さらにこれらのシグナル配列、プレプロ配列、およびマチュア体の配列は、これらのデータベースの配列や公知文献から容易に知ることができるのでそれに従って、所望のホスホリパーゼを発現し得るポリヌクレオチドを入手し、これを遺伝子工学的手段により発現可能なように組み込んだ細胞等を調製し、これを利用しても良い。
【００２３】
ホスホリパーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている。例えば、分泌型ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０４０５４（ヒト型グループＩＢ）、Ｑ９Ｚ０Ｙ２（マウス型グループＩＢ）、Ｐ０４０５５（ラット型グループＩＢ）、Ｐ００５９２（ブタ型グループＩＢ）、Ｐ１４５５５（ヒト型グループIIＡ）、Ｐ３１４８２（マウス型グループIIＡ）、Ｐ４８０７６（マウス型グループIIＣ）、Ｑ９ＵＮＫ４（ヒト型グループIIＤ）、Ｑ９ＮＺＫ７（ヒト型グループIIＥ）、Ｑ９ＢＺＭ２（ヒト型グループIIＦ）、Ｑ９ＮＺ２０（ヒト型グループIII）、Ｐ３９８７７（ヒト型グループＶ）、Ｐ９７３９１（マウス型グループＶ）、Ｏ１５４９６（ヒト型グループＸ）、Ｑ９ＱＸＸ３（マウス型グループＧＸ）、Ｑ９ＱＺＴ３（ラット型グループＧＸ）、および、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０３０８２１（ヒト型グループIIＡ）などが報告されている。また、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ００６３０などが報告されている。さらに、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：ＳＰ６２０２２、Ｐ００６０２などが報告されている。本発明において用いるホスホリパーゼは、このような公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
【００２４】
また、ホスホリパーゼの中には、前駆体ホスホリパーゼからプロセシングを受けて活性型となるものが存在する（例えば、分泌型ホスホリパーゼＡ２や、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２など）。また、前駆体からシグナル配列がとれたプレプロ体から、さらに、プレプロ配列がとれて活性体となるものも存在する（例えばグループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２など）。本発明において用いるホスホリパーゼは、前駆体ホスホリパーゼ、プレプロホスホリパーゼ、および活性型ホスホリパーゼのいずれであってもよいが、活性型ホスホリパーゼがより好ましい。なお、実験的には、活性型ホスホリパーゼを単にホスホリパーゼということもある。これらの本発明において用いる前駆体、プレプロ体および活性型ホスホリパーゼは、公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
【００２５】
具体的には、本発明におけるホスホリパーゼは下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる：
（Ａ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）を含む、ポリペプチド；
（Ｂ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；
（Ｃ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（Ｄ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；および、
（Ｅ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【００２６】
本発明に使用するホスホリパーゼとしては、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。本発明において用いるこれらのホスホリパーゼは、公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
なお前記「ジスルフィド結合をしたもの」とは、ホスホリパーゼの分子内において、特定箇所アミノ酸と、別の特定箇所のアミノ酸とが−Ｓ−Ｓ−結合により架橋されている状態をいう。
【００２７】
ここで、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列」とは前記に列記したアクセッション番号により所定の公知のデータベースより特定されるアミノ酸配列のことであり、好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号３５で表されるアミノ酸配列である。
【００２８】
ここで、ポリペプチドが「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」とは、そのポリペプチドが、ＧＰＲ１２０に直接的または間接的に活性化作用を有し、ＧＰＲ１２０を介したシグナル情報伝達作用、より詳しくは、ＧＰＲ１２０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出、細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、前記（Ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」と言うことがある）は、そのアミノ酸配列が、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００３０】
本願明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３１】
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００３２】
この改変ポリペプチドには、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものも包含されてよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。またＮ末端のアミノ基が慣用の保護基により保護されたもの等も改変ポリペプチドに包含され得る。
【００３３】
前記（Ｂ）のポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のホスホリパーゼもしくはその変異体が挙げられる。具体的には例えば、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列（ラット由来、マウス由来、ブタ由来、ハチ由来（セイヨウミツバチ由来））からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
前記（Ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」と言うことがある）は、ホスホリパーゼのアミノ酸配列に関して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、ホスホリパーゼに関して、同一性が８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドである。
【００３５】
本願明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のホスホリパーゼもしくはその変異体が含まれる。
【００３６】
具体的には、前記（Ｃ）の相同ポリペプチドとしては、例えば、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列（ラット由来、マウス由来、ブタ由来、ハチ由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３７】
なお、本明細書において、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００３８】
さらに、本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ホスホリパーゼのアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００３９】
ホスホリパーゼの調製方法
これら本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、その改変ポリペプチド、その相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ホスホリパーゼまたはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００４０】
以下、本発明に使用するホスホリパーゼの調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００４１】
ホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、前記ホスホリパーゼ、前記改変ポリペプチド、前記相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本願明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、具体的には下記の（Ｉ）〜（VI）からなる群より選択されるものが挙げられる：
（Ｉ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列）からなる、ポリヌクレオチド；
（II）  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
(III)  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）を含み、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（IV）  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（Ｖ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（VI）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列）に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００４２】
ここで、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列」とは前記に列記したアクセッション番号により所定の公知のデータベースより特定される塩基配列（または、それより特定されるアミノ酸配列をコードしてなる塩基配列）のことであり、好ましくは配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０表される塩基配列、より好ましくは、配列番号２５で表される塩基酸配列である。
【００４３】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００４４】
アミノ酸の付加、欠失および／または置換による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失、挿入および／または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００４５】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００４６】
尚、ホスホリパーゼの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、挿入および／または置換し、次いで連結する方法もある。
【００４７】
本明細書において、「欠失」には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したものおよびアミノ酸は配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
【００４８】
「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したものおよびアミノ酸残基の途中にアミノ酸残基を欠失したものも含まれる。
【００４９】
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、または配列番号４１で表されるアミノ酸配列）またはその酵素活性部分をコードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０表される塩基配列（マウス由来、ラット由来、ブタ由来およびハチ由来）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５１】
本願明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、例えば配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ホスホリパーゼのアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０の塩基を含む塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、上述の相同性の決定と同様にBLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。上述の塩基配列についてのプログラムBLASTNの他に、このアルゴリズムに基づいたアミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてBLASTX(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、利用可能である。具体的な解析方法については先に挙げたように、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。
【００５３】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、ホスホリパーゼのアイソフォームやアレリック変異体等を、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０に表される塩基配列を基に設計したプライマーを利用して得ることができる。
【００５４】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の方法により配列決定して確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等による確認が可能である。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００５５】
本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号２１および２４で表されるアミノ酸配列をコードしてなる塩基配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００５６】
本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（例えば、配列番号２５で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号２５で表される塩基配列は、４４１番目〜４４３番目のＡＴＧで始まり、９３６番目〜９３８番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５７】
プラスミド
プラスミドに本願発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Sambrook, J.ら,モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second edition）、Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53(1989)」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドは、宿主細胞（例えば、E.coli TB1，LE392またはXL-1Bluc等）に導入する。形質転換に使用するプラスミドは、上記のようなホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知のベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。例えば、ホスホリパーゼ単独でもよいし、ホスホリパーゼとタグとなるようなタンパク質（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））との融合タンパク質を発現ベクターに組み込んでもよい。
【００５８】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNA）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322などが例示されるがこれらに限定されない。
【００５９】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６０】
形質転換体
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞、または人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００６１】
特に、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００６２】
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。
【００６３】
発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００６４】
本発明に用いた発現ベクターの宿主細胞への導入[形質転換（形質移入）]は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E．coli，Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，2110（1972）]、プロトプラスト法[Mol．Gen．Genet．，168，111（1979）]やコンピテント法[J．Mol．Biol．，56，209（1971）]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1927（1978）]やリチウム法[J．Bacteriol．，153，163（1983）]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology，52，456（1973）]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol．Cell．Biol．，3，2156-2165（1983）]によってそれぞれ形質転換することができる。植物細胞の場合は、アグロバクテリウムを用いる方法（Horsch et al., Science, 227, 129(1985)、Hiei et al., Plant J., 6, 271-282(1994)）、エレクトロポレーション法（Fromm et al., Nature, 319, 791(1986)）、PEG法（Paszkowski et al., EMBO J., 3, 2717(1984)）、マイクロインジェクション法（Crossway et al., Mol. Gen. Genet., 202, 179(1986)）、微小物衝突法（McCabe et al., Bio/Technology, 6, 923(1988)）によって形質転換することができる。
【００６５】
本発明において、ホスホリパーゼは、例えば、上記の如く調整された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
【００６６】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地及び培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐHが５〜８である培地としてLB培地、M9培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol. Genet.、Cold Spring Harbor Laboratory、第431頁、1972年）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、攪拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行なうことができる。宿主が、Bacillus属菌の場合、必要により通気、攪拌しながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行なうことができる。
【００６７】
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培地（ボスチアン（Bostian）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第77巻、第4505頁、1980年）が挙げることができ、ｐHは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むMEM培地（サイエンス（Science）、第122巻、第501頁、1952年）、DMEM培地（バイロロジー（Virology）、第8巻、第396頁、1959年）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc.、第１９９巻、第519頁、1967年）、199培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第73巻、第1頁、1950年）などを用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましく、培地は通常３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。
【００６８】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace’s培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第82巻、第8404頁、1985年）などが挙げることができ、そのｐHは約５〜８であることが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５時間〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。
【００６９】
ホスホリパーゼの発現、精製方法に関しては、公知の文献が数多く存在する（例えば、Kohji Hanasaki,et al., The Journal of Biological Chemistry 274(48), 34203-34211, 1999など）。
【００７０】
形質転換体の培養物（発現細胞や培養上清）から所望のポリペプチドを精製する方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００７１】
本発明において使用されるホスホリパーゼは、その塩の形態であってもよい。ここで、「塩」は、薬学的に許容される塩を示し、ホスホリパーゼと薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えばハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【００７２】
また、本発明で使用するホスホリパーゼは、ＧＰＲ１２０の細胞刺激活性を有するものであって、実質的にホスホリパーゼと同様の活性を有するものであれば断片であってもよい。
【００７３】
ここで、上記断片が「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」とは、その断片が、ＧＰＲ１２０を介したシグナル情報伝達作用、より詳しくは、ＧＰＲ１２０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出、細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００７４】
ＧＰＲ１２０
本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ１２０は、ホスホリパーゼ（例えば、ｓＰＬＡ２）による活性化作用を有し、ＧＰＲ１２０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出、細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばＧＰＲ１２０を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、ＧＰＲ１２０の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばホスホリパーゼによる細胞刺激活性化作用を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。
【００７５】
具体的には、本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ１２０は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質の一種であり、そのアミノ酸配列（ヒト、マウスおよびラット由来のもの）およびそれをコードするＤＮＡが報告されている［例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８５９５２９（ヒト型）、ＮＰ＿８６１４１３（マウス型）、ＸＰ＿２１５２８１（ラット型）、ＧＰＲ１２０は１４２７３とも称されている］ポリペプチドである。具体的には、ＧＰＲ１２０は下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【００７６】
本発明に使用するＧＰＲ１２０としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。
【００７７】
ここで、ポリペプチドが「ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する」とは、そのポリペプチドが、ホスホリパーゼ（例えば、ｓＰＬＡ２）による活性化作用を有し、ＧＰＲ１２０を介したシグナル情報伝達作用、より詳しくは、ＧＰＲ１２０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出、細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００７８】
本発明の好ましい態様によれば、前記（ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」と言うことがある）は、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００７９】
本願明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００８０】
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００８１】
改変ポリペプチドには、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものも包含されてよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。またＮ末端のアミノ基が慣用の保護基により保護されたもの等も改変ポリペプチドに包含され得る。
【００８２】
前記（ｂ）のポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ１２０もしくはその変異体が挙げられる。具体的には配列番号４および配列番号６で表されるアミノ酸配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００８３】
前記（ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」と言うことがある）は、ＧＰＲ１２０のアミノ酸配列に関して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、ＧＰＲ１２０に関して、同一性が８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドである。
【００８４】
本願明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものとを有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ１２０もしくはその変異体が含まれる。具体的には配列番号４および配列番号６で表されるアミノ酸配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００８５】
さらに、本発明に使用するＧＰＲ１２０（すなわち、ＧＰＲ１２０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性（例えばアラキドン酸またはγ−リノレン酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチド）を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ＧＰＲ１２０のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００８６】
ＧＰＲ１２０の調製方法
これら本発明に使用するＧＰＲ１２０（すなわち、ＧＰＲ１２０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ＧＰＲ１２０またはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００８７】
以下、本発明に使用するＧＰＲ１２０の調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００８８】
ＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するＧＰＲ１２０（すなわち、ＧＰＲ１２０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、前記ＧＰＲ１２０、前記改変ポリペプチド、前記相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本願明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドは、具体的には下記の（ｉ）〜（vi）からなる群より選択されるものが挙げられる：
（ｉ）  配列番号１で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ii）  「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
(iii)  「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（iv）  「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（ｖ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（vi）  配列番号１で表される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００８９】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００９０】
アミノ酸の付加、欠失および／または置換による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失、挿入および／または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００９１】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００９２】
尚、ＧＰＲ１２０の生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、挿入および／または置換し、次いで連結する方法もある。
「欠失」には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したものおよびアミノ酸は配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
【００９３】
「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したものおよびアミノ酸残基の途中にアミノ酸残基を欠失したものも含まれる。
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列またはその酵素活性部分をコードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００９４】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ１２０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には配列番号４および配列番号６で表される塩基配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００９５】
本願明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件としては、前記したホスホリパーゼの場合と同様であることができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については上記ホスホリパーゼの項を参照することができる。
【００９６】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、ホスホリパーゼのアイソフォームやアレリック変異体等を、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから、配列番号１、３、または５に記載の塩基配列を基に設計したプライマーを利用して得ることができる。
【００９７】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の方法により配列決定して確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等による確認が可能である。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００９８】
本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００９９】
本発明に使用するＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号１で表される塩基配列は、１番目〜３番目のＡＴＧで始まり、１０８４番目〜１０８６番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、配列番号３および配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１００】
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
【０１０１】
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＧＰＲ１２０を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【０１０２】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばEscherichia coli JM109株）または酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞、Ｓｆ−９細胞）を挙げることができる。
【０１０３】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【０１０４】
ＧＰＲ１２０を含有する細胞は、ＧＰＲ１２０を細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＧＰＲ１２０の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＧＰＲ１２０をコードするＲＮＡを注入し、ＧＰＲ１２０の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
【０１０５】
細胞膜断片
また、ＧＰＲ１２０を含有する本発明に使用する細胞膜断片は、例えば前記のＧＰＲ１２０を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
【０１０６】
スクリーニング方法
前記したように、本発明によれば、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを用いることを特徴とする、ＧＰＲ１２０とホスホリパーゼまたはその塩との相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、この方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とにおける測定結果を比較することを含んでなる。
【０１０７】
本発明のより好ましい態様によれば、前記方法は、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合との間で、結果に相違が出た場合に、その物質をＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であると決定する工程をさらに含んでなる。
【０１０８】
このスクリーニング方法によれば、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して被検物質（または被検化合物）をスクリーニングすることができる。すなわち、このスクリーニング方法では、ホスホリパーゼとＧＰＲ１２０との相互作用を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ＧＰＲ１２０の活性化に影響を与える化合物を、より具体的には、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質、さらに具体的には、ＧＰＲ１２０の機能を促進する物質（アゴニスト）あるいはＧＰＲ１２０の機能を阻害する物質（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることができる。
【０１０９】
したがって、被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が上昇する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ１２０の機能を促進する物質（ＧＰＲ１２０アゴニスト）と決定することができる。被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が低下する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ１２０の機能を阻害する物質（ＧＰＲ１２０アンタゴニスト）と決定することができる。
【０１１０】
本発明の好ましい態様によれば、細胞刺激活性の測定は、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化を検出するレポーターアッセイ系により測定するか、または、細胞内カルシウムイオン遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）分泌活性、コレシストキニン（ＣＣＫ）分泌活性、および、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）分泌活性からなる群より選択されるパラメータを測定することによって行うことができる。より好ましくは、ポーターアッセイ系や細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を測定することができる。
【０１１１】
本発明においては、例えばＧＰＲ１２０を介する細胞内カルシウム濃度の上昇やレポーター遺伝子の転写量の増加を公知の手法で測定すればよく、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＧＰＲ１２０にホスホリパーゼが作用することにより生じる細胞内シグナル伝達、例えば、細胞内カルシウム濃度の上昇作用を利用するものである。
【０１１２】
例えばＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ１２０を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にホスホリパーゼを作用すると細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
【０１１３】
ＧＰＲ１２０の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＧＰＲ１２０を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質（例えばホスホリパーゼ）に代わり、被検物質を単独で接触させて細胞内の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する化合物を選択すると良い。
【０１１４】
ＧＰＲ１２０の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、ホスホリパーゼまたはその塩、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。ホスホリパーゼの作用で細胞内カルシウムの濃度が上昇するが、被検物質がホスホリパーゼの作用に拮抗する場合には、細胞内カルシウムの濃度の上昇が抑制され。このときには、前記被検物質はＧＰＲ１２０の機能を阻害する化合物として選択できる。
【０１１５】
細胞内カルシウム濃度は、例えば、カルシウム蛍光プローブ（例えば、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３など）を用いて測定することができる。また、市販のカルシウム測定キットを使用することもできる。
【０１１６】
本発明においては、また、ＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ１２０を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この場合は、細胞内に種々のシグナルが伝わると前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が促進されることを利用している。
【０１１７】
以下、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
前記ＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子を導入されている細胞においては、例えば、細胞内のｃＡＭＰの濃度上昇や細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇により、レポーター遺伝子の発現量が増加する。また、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばフォルスコリンなど）で細胞の基礎的なｃＡＭＰ量を増大させておいて活性を測定することもできる。レポーター遺伝子産物の発現量は、細胞培養上清や細胞抽出物に含まれるレポーター遺伝子産物と反応した基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定する方法、もしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定する方法などにより容易に測定することが可能である。
【０１１８】
また、ホスホリパーゼまたはその塩を加えると、細胞内のシグナル伝達の活性化が生じ（例えば細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇）結果として、レポーター遺伝子産物の発現量が増加する。したがって、ＧＰＲ１２０の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＧＰＲ１２０を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質に代わり被検物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を上昇させる化合物を選択すると良い。
【０１１９】
ＧＰＲ１２０の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、ホスホリパーゼまたはその塩、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。また、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばフォルスコリンなど）で細胞の基礎的なｃＡＭＰ量を増大させておいてから活性を測定することもできる。ホスホリパーゼの作用で培養上清中や細胞内のレポーター遺伝子産物の発現量は上昇するが、被検物質がホスホリパーゼの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現を抑制する。このときには、前記被検物質はＧＰＲ１２０の機能を阻害する化合物として選択できる。
【０１２０】
被検物質による作用が、ＧＰＲ１２０を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ１２０に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ１２０に対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【０１２１】
本発明の別の態様によれば、ホスホリパーゼとＧＰＲ１２０との相互作用を変化させる物質として、ホスホリパーゼのＧＰＲ１２０への結合性を変化させる物質をスクリーニングすることができる。この場合、本発明によるスクリーニング方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞へのホスホリパーゼまたはその塩の結合量を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較することを含んでなる。このスクリーニング方法によれば、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被検化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、この態様の方法が適用可能な場合、この方法により、ホスホリパーゼとＧＰＲ１２０との相互作用を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ホスホリパーゼのＧＰＲ１２０への結合性を変化させる化合物を、より具体的には、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を有する化合物を、スクリーニングすることができる。
【０１２２】
具体的には、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ１２０と、標識したホスホリパーゼとを接触させ、前記条件下におけるＧＰＲ１２０へのホスホリパーゼの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ１２０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被検物質非存在下におけるＧＰＲ１２０へのホスホリパーゼの特異的結合量に対して、被検物質存在下における前記特異的結合量が低下する場合には、その被検物質は、ホスホリパーゼとＧＰＲ１２０との相互作用を変化させる物質であると、具体的には、ホスホリパーゼのＧＰＲ１２０への結合性を変化させる化合物であると、より具体的には、ＧＰＲ１２０アゴニストあるいはＧＰＲ１２０アンタゴニストであると、決定することができる。
【０１２３】
結合量を測定する場合、ホスホリパーゼまたはその塩は、標識することができる。前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［１２５Ｉ］、［３５Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。また、遺伝子工学的手法により、ホスホリパーゼと標識蛋白（例えばＧＦＰなど）のキメラ蛋白を作製し用いることもできる。
【０１２４】
また、ＧＰＲ１２０は、コレシストキニン（ＣＣＫ）やグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌との関連が示唆されていることから、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、細胞における消化管ホルモン量（例えば、ＣＣＫ量やＧＬＰ−１量など）を指標として解析したり、または、投与後の自発運動などを指標に解析したりすることによって、過食症、拒食症に代表される摂食障害、肥満症やそれに伴う糖尿病、糖尿病網膜症若しくは糖尿病腎症等の糖尿病合併症、高脂血症、動脈硬化、および高血圧症、消化機能調節、下垂体ホルモン分泌、ストレス調節などに影響を与える化合物であるか否かを確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物や遺伝子改変動物でもよい。被検物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングなどの指標としては、例えば、消化管収縮運動、胆嚢収縮運動、消化管ホルモン分泌、下垂体ホルモン分泌、体重の変化、インスリン分泌、血中脂質量などを測定する試験などを行うことも有効である。被検物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被検物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
【０１２５】
本発明に使用する被検物質は、どのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。
【０１２６】
スクリーニング用キット
本発明によるスクリーニング用キットは、ＧＰＲ１２０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを少なくとも含んでなる。好ましくは、このキットは、ＧＰＲ１２０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするためのものである。前記スクリーニング用キットは、所望により、本発明によるスクリーニング方法を実施するための種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。
【０１２７】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、ホスホリパーゼまたはその塩、およびＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ１２０を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばフォルスコリン）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、コントロールとして、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【０１２８】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、ホスホリパーゼまたはその塩、およびＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ１２０を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）した細胞を少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばカルシウム蛍光プローブ（例えばＦｕｒａ−２など）、反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、コントロールとしてＧＰＲ１２０を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬
ＧＰＲ１２０は、後述する実施例８、および２８〜３３に示されるように、下垂体、肺、腸管（特に、回腸、盲腸、大腸）、精巣、前立腺、甲状腺、副腎、各種脂肪組織(皮下脂肪、腸間膜脂肪、副睾丸脂肪、および、褐色脂肪)、肺胞マクロファージ、樹状細胞、リンパ節で高い発現が検出された。中でも腸管や下垂体、肺、肺胞マクロファージ、脂肪組織、樹状細胞等で高い発現が検出された。このため、本発明によれば、糖尿病、糖尿病網膜症若しくは糖尿病腎症等の糖尿病合併症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、下垂体機能障害、精神障害、免疫系疾患、炎症性疾患、マクロファージや樹状細胞が関与する疾患、癌、および、過食症、拒食症に代表される摂食障害、さらにはそれに伴う大腸疾患等の予防または治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。また、ＧＰＲ１２０は、腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１細胞からのコレシストキニン（ＣＣＫ）の放出促進作用との関連が報告されている（特開２００５−１５３５８号公報）。ＣＣＫは末梢領域において、迷走神経を介した摂食抑制作用を有する。また、ＣＣＫは胃や十二指腸などの消化管臓器から放出され、胃酸分泌、胆嚢の収縮、膵臓の酵素分泌促進、および腸の運動など、消化管ホルモンとしての様々な機能も有する。これらのことから、ＧＰＲ１２０が、過食症、拒食症に代表される摂食異常、肥満症およびそれに伴う糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、および消化機能の調節と関連していることが予想される。
【０１３０】
さらにＧＰＲ１２０は、腸内分泌細胞株ＳＴＣ−１細胞からのグルカゴン様ペプチド‐１（ＧＬＰ−１）の放出促進作用が報告されている（Akira Hirasawa et al., Nature Medicine, 11, 90-94, 2004）。ＧＬＰ−１はインスリン分泌促進や代謝のホメオスタシスに関わる重要なホルモンであることから、ＧＰＲ１２０が、糖尿病などの代謝異常疾患と関連していることが予想される。
【０１３１】
また、水浸拘束ストレスを負荷したラットの下垂体でＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ発現量の上昇が検出されており、ＧＰＲ１２０がストレス調節に関与していることが示唆されている（国際公開ＷＯ２００４／０６５９６０号パンフレット）。また、ＧＰＲ１２０の発現が下垂体に多いことから、下垂体ホルモン（例えばＡＣＴＨなど）の分泌への関与も示唆される。
【０１３２】
したがって、本発明によるスクリーニング方法により得られる化合物は、過食症、拒食症に代表される摂食障害の治療用の医薬、肥満症やそれに伴う糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、免疫疾患、炎症性疾患、癌などの治療剤、消化機能調節剤、下垂体ホルモン分泌異常改善薬、ストレス調節剤として用いることができる。
【０１３３】
よって、本発明によるスクリーニング方法により得られる化合物は、過食症、拒食症に代表される摂食障害、肥満症やそれに伴う糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、免疫疾患、炎症性疾患、癌など、また、消化機能不良、さらには、下垂体ホルモン分泌異常、ストレス症などの治療に有効な化合物である。
【０１３４】
当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は溶媒和物（例えば、水和物、アルコール和物、エーテル和物）を形成していてもよい。ここで「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【０１３５】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が挙げられる。結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン���ブロックポリマー、メグルミン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが挙げられる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が挙げられる。上記の成分は、その塩またはその水和物であってもよい。
【０１３６】
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１３７】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば
（1A）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（1B）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（1C）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと等を含む。
【実施例】
【０１３８】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。【０１３９】
実施例１：  ＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドの調製
（１）ヒトＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドの調製
ヒトＧＰＲ１２０（以下、ヒトＧＰＲ１２０を、単にＧＰＲ１２０またはｈＧＰＲ１２０と称することもある）をコードするポリヌクレオチドの単離のため、配列番号１で表される１０８６ｂｐの核酸配列を基にして、常法にしたがって、５’側プライマー（５’−GATATCGCCGCCACCATGTCCCCTGAATGCGCGCGGGCA−３’）（配列番号７）と３’側プライマー（５’−GATATCTTAGCCAGAAATAATCGACAAGTC−３’）（配列番号８）とで表されるＰＣＲプライマーを設計した。【０１４０】
鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト大腸癌細胞由来Ｃａｃｏ−２細胞から調製したＲＮＡを逆転写することにより得た。具体的には、７５ｃｍ２フラスコに培養したＣａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ）からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてマニュアルに従いtotal ＲＮＡを抽出した。その後、TaqMan Reverse Transcription Reagents（アプライドバイオシステムズ社）を用い、２５℃１０分、４８℃６０分、９５℃１０分で逆転写を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、上記の配列番号７と配列番号８との組合せからなるＰＣＲプライマーと、Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）とを用い、９５℃５分の後、９５℃１分、５７℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。増幅した約１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン（Invitrogen）社）に挿入し、ABI prism DNA sequencing kit（Perkin-Elmer Applied Biosystems社）により配列を確認した。その結果、ｐＣＲ２．１に挿入された１０８６塩基対の配列は、配列番号１における１番目から１０８６番目と同一配列であり、ＧＰＲ１２０−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１４１】
（２）マウスＧＰＲ１２０をコードするポリヌクレオチドの調製
マウスＧＰＲ１２０（以下、ｍＧＰＲ１２０と称する）をコードするポリヌクレオチドの単離のため、配列番号３で表される１０８６ｂｐの塩基配列を基にして、常法に従って、５’側プライマー（５’−GATATCGCCGCCACCATGTCCCCTGAGTGTGCACAGACGACG−３’）（配列番号９）および３’側プライマー（５’−GATATCTTAGCTGGAAATAACAGACAAGTCA−３’）（配列番号１０）とで表されるＰＣＲプライマーを設計した。６週令のＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウス（日本エスエルシー株式会社）の大腸からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製したＲＮＡを鋳型として、上述の配列番号９および配列番号１０のプライマー、Ｔａｑ Ｍａｎ逆転写試薬、および、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社）を用いることによりＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅したＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１に挿入し、常法に従って配列を確認した。その結果、挿入された１０８６ｂｐのｃＤＮＡ配列は、配列番号３における１番目から１０８６番目と同一配列であり、ｍＧＰＲ１２０−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１４２】
実施例２：  レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ(Morgenstern J.P. and Land H. Nucleic Acids Res. 18(12):3587-96, 1990)（配列番号１１）をＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除いた後、末端をクレノー断片（Klenow fragment）（宝酒造株式会社）により平滑化した。ここへ、ｐＩＲＥＳｈｙｇ（Clontech社）をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することにより切り出し、Ｔ４ポリメラーゼ（宝酒造株式会社）により末端を平滑化したＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を挿入し、ｐＢａｂｅＸＩＨを得た。【０１４３】
このｐＢａｂｅＸＩＨをＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、５’−ＬＴＲ−packaging signalを除いた。ここへ、ｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）をＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ promoter-packaging signalを挿入して、ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。【０１４４】
実施例３：  ＧＰＲ１２０、および、ｍＧＰＲ１２０遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
実施例２で得たレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを、制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１（１）で得たＧＰＲ１２０−ｐＣＲ２．１を、ＥｃｏＲＶで切断することにより切り出したＧＰＲ１２０をコードするｃＤＮＡを挿入しすることにより、ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ１２０）ＩＨを得た（図１）。同様にして実施例１（２）で得たｍＧＰＲ１２０−ｐＣＲ２．１を用いて、ｐＢａｂｅＣＬ（ｍＧＰＲ１２０）ＩＨを得た。【０１４５】
実施例４：  ＧＰＲ１２０、および、ｍＧＰＲ１２０遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０６個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を、ＤＭＥＭ培地（シグマ社）（１０％ fetal bovine serum（ＦＢＳ）、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍｌを用いて、１０ｃｍ径コラーゲンコートディッシュ（旭テクノグラス社）で培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶｐａｃｋ−ＧＰ（Stratagene社）をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Stratagene社）、および実施例３で得た遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ１２０）ＩＨ、または、ｐＢａｂｅＣＬ（ｍＧＰＲ１２０）ＩＨ）それぞれ３．３μｇを、リポフェクション試薬であるFuGENE 6 Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（Millipore社）でろ過し、ＧＰＲ１２０遺伝子導入用レトロウイルスベクターを得た。【０１４６】
実施例５：  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築
（１）  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
Durocher Y et al. Anal Biochem 284(2):316-26, 2000 を参考にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に応じた転写が見られるユニットを以下のように構築した。
ｃＡＭＰ responsive element（ＣＲＥ）を含むユニットの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として、配列番号１２(5’-cccaagcttgatatcgaattcgacgtcacagtatgacggccatgggaattcgacgtcacagtatgacggccatggggatcccg-3’）および配列番号１３（5’-cgggatccccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcgatatcaagcttggg-3’）で表されるオリゴＤＮＡを、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号１４（5’-tgcactgcaggaattcccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcccatggccgtcatactgtgacgtcggatcccg-3’）および配列番号１５（5’-cgggatccgacgtcacagtatgacggccatgggaattcgacgtcacagtatgacggccatgggaattcctgcagtgca-3’）で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。それぞれの組合せから成るオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥ２ｘｈｂ，およびＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥ２ｘｈｂをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Stratagene社）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋））を一度に連結し（ligation）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した。【０１４７】
次にＶＩＰ（vasoactive intestinal peptide）プロモーターを含むＤＮＡを得るために、５’側プライマー（５’−tcgactgcagcccatggccgtcatactgtg−３’）（配列番号１６）および３’側プライマー（５’−tgcactgcaggtcggagctgactgttctgg−３’）（配列番号１７）で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。
ヒトゲノムＤＮＡ（Roche Diagnostics社）を鋳型とし、上述の配列番号１６および配列番号１７の組合せからなるＰＣＲプライマーと、組換えＴａｑポリメラーゼ（Takara社）を用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４ｂｐのＤＮＡ（配列番号１８）が得られた。この２６４ｂｐのＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２）。このＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を、ＨｉｎｄIIIとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行った。【０１４８】
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図３）。ＰＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、末端平滑化した上述のＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ(Placental Alkaline Phosphatase：ＰＬＡＰ)（Goto M et al., Mol. Pharmacol. 49(5):860-73, 1996）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図４）。【０１４９】
（２）  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２」と称する）を以下の実験に供した。【０１５０】
実施例６：  ウイルスベクターによるＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞の作成 【０１５１】
実施例５で構築したＳＥ３０２細胞を、コラーゲンコート６穴プレート（旭テクノグラス社）に１穴当たり１．２×１０５個になるように播種した。培地はＤＭＥＭ（シグマ社））（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）を用い、２ｍｌ／穴の容量で培養した。翌日、実施例４で得たＧＰＲ１２０、または、ｍＧＰＲ１２０含有ウイルスベクター液、および、最終濃度８μｇ／ｍｌのpolybrene（別名 hexadimethrine bromide, シグマ社）をＳＥ３０２細胞に加えた。５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（インビトロジェン社）含有の培養液で培養し、この条件で増殖してきた細胞をＧＰＲ１２０遺伝子導入ＳＥ３０２細胞、および、ｍＧＰＲ１２０遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、それぞれ「ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞」、「ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞」と称する）として実験に供した。【０１５２】
実施例７：  遺伝子導入ＳＥ３０２細胞における転写活性の測定
前記実施例６で構築したＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、もしくはｍＧＰＲ１２０-ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭに６５℃にて３０分熱処理したＦＢＳを最終濃度１０％になるように加えたもの）にて懸濁した後、９６穴プレート（ベクトンディッキンソン社）に、１×１０４細胞／ｗｅｌｌで播種した。また、コントロール細胞としては、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)を発現させたＳＥ３０２細胞（以下、「ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞」を用いた。）具体的には、実施例３、４に示す方法にＧＦＰ発現用ウイルス得た後、実施例６に示す方法でＳＥ３０２に感染させてＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞を作製した。細胞播種２４時間培養後、最終濃度１．０μＭとなるように調製したフォルスコリンおよび試料を添加した。更に２４時間培養後、細胞上清を５μｌ回収してポリプロピレン製３８４穴ホワイトプレート（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社）に移し、２０μｌのアッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ１０）および２５μｌのＬｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Lumigen社）を添加した。室温で２時間反応させた後、各穴の化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（Perkin Elmer社）にて測定し、転写活性量とした。この測定値をもとにして、転写活性量促進／抑制を以下に示した式（Ｉ）で計算し、［％ of control］で表した。試料添加群の活性は、それぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。【０１５３】
［％ of control］  ＝  （Ｘ−Ｃ）／（Ｆ−Ｃ）ｘ１００        （Ｉ）
ここで、上記式中、
Ｘ：  試料添加群のＰＬＡＰ転写活性
Ｆ：  ポジティブコントロール（試料無添加、フォルスコリン刺激あり）の２穴のＰＬＡＰ転写活性の平均値
Ｃ：  ネガティブコントロール（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２穴のＰＬＡＰ転写活性の平均値
である。【０１５４】
実施例８：  ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ法を用いたＧＰＲ１２０のマウスにおける臓器発現分布
ｍＲＮＡの発現量の定量には、ABI PRISM 7700 Sequence Detector（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマー５’側プライマー（５’−TCCGAGTGTCCCAACAAGACT−３’）（配列番号１９）、および３’側プライマー（５’−GGATCAAGATGAGGAGGATGG−３’）（配列番号２０）は、マウスＧＰＲ１２０の塩基配列（配列番号３）を基に、ABI PRISM Sequence Detector専用のソフトウエアPrimer Express を利用して設計した。【０１５５】
７週令のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社より入手）から各種臓器を摘出し、RNeasy Mini kit （ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、マニュアルにしたがってＤＮａｓｅ処理を行うプロトコールで、total ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理は、DNaseI （RNase Free）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、２５℃で１５分間行った。得られたtotal ＲＮＡ  ５０ｎｇ相当を、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（TaqMan Reverse Transcription Reagents）（アプライドバイオシステムズ社）を用い、２５℃１０分、４８℃６０分、９５℃１０分で逆転写を行うことによりｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応液はSYBR Green PCR Core Reagents Kitを用いて、１０ｘSYBR Green ２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３．０μｌ、dNTP mix ２．０μｌ、AmpliTaq Gold ０．１２５μｌ、ｃＤＮＡ溶液となるように混ぜ合わせ、蒸留水で２５μｌとして調製した。ABI PRISM 7700 Sequence Detectorでの反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。【０１５６】
各種臓器でのｍＲＮＡの発現分布は図５に示されたとおりであった。図５のように、下垂体、肺、腸管（特に、回腸、盲腸、大腸）、精巣、前立腺、甲状腺、副腎で高い発現が検出された。【０１５７】
実施例９：  マウス腸管および精巣抽出物におけるＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞特異的にＰＬＡＰを上昇させる活性物質の検出
実施例８に示すマウスの発現分布に基づき、ＧＰＲ１２０の発現量が多かった腸管および精巣の抽出物を用いて、以下に示す方法でＧＰＲ１２０に特異的なリガンド活性を示す物質の探索を行った。【０１５８】
６週令のＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウス（日本エスエルシー株式会社）から腸管１８ｇおよび精巣20ｇを摘出後、直ちにドライアイスで凍結し、−８０℃で使用時まで保管した。凍結した臓器の重量の１０倍量のホモジネートバッファー（７０％ アセトン、１Ｍ  酢酸、２０ｍＭ 塩酸、予め４℃で冷却）に、臓器を凍結したまま入れて、家庭用ファイバーミキサーＭＸ−Ｘ１０３（松下電器産業株式会社）で粉砕した。２時間氷冷下で抽出後、５００ｍｌ容遠心瓶（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社）に移し、１０，０００ｘｇで３０分４℃にて遠心した。遠心後、上清をキャップ付ガラス瓶に移し、等容量のジエチルエーテルを加えて３分間よく振った後、３０分間４℃で静置し、上層の脂質を含むエーテル層と下層の水層に分離させた。エーテル層をアスピレーターで除去後、残った水層に対して、再び等容量のジエチルエーテルを加え、３分間よく振った。３０分間４℃で静置した後、再び上層のエーテル層をアスピレーターにより除去した。【０１５９】
得られた水層を５０ｍｌ容オークリッジ遠沈管（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社）に移し、２０，０００ｘｇで３０分、４℃にて遠心した。遠心後、中間の水層を採取し、抽出液とした。抽出液を１００μｍナイロン製セルストレイナー（ベクトンディッキンソン株式会社）でろ過後、水で２．５倍に希釈し、HF MEGA BOND ELUTE C18 カラム（１０ｇ樹脂、６０ｍｌ容量、バリアン社）に付した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略す）８０ｍｌで洗浄後、０．１％  ＴＦＡを含む５０％  アセトニトリル４０ｍｌで溶出した。このとき、カラム１本あたりに適用する抽出物は、出発材料の臓器重量が４０ｇ以下となるようにし、それ以上の場合には複数本のカラムを用い溶出後に１つにまとめた。【０１６０】
溶出液を凍結乾燥することにより得られた粉末を１Ｍ酢酸で溶解し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  ０．２２μｍ  ＰＶＤＦ  フィルター（ミリポア社）でろ過後、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、４．６Φ ｘ ３００ｍｍ、ワイエムシイ株式会社）に付した。溶出は２４−４８％アセトニトリルの濃度勾配により行い、１分毎に分画した各分画を減圧下、濃縮・乾固した。これらを０．１％ ＴＦＡに溶かし、実施例７に示した方法にしたがってＰＬＡＰ活性を測定した。その結果、アセトニトリル３４％付近の分画に、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２において顕著なＰＬＡＰ活性の上昇が確認された。このＰＬＡＰ上昇活性は他のレセプター発現細胞では認められなかったことから、マウス腸管および精巣抽出物両方において、ＧＰＲ１２０特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。【０１６１】
実施例１０：  ラット腸管および精巣抽出物におけるＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞特異的にＰＬＡＰを上昇させる活性物質の検出
ラットの精巣および腸管にも、マウスと同様に、ＧＰＲ１２０に特異的なリガンド活性を示す物質が存在するか検討を行った。
９週令のＷｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー株式会社より入手）１００匹から、精巣約３００ｇと腸管約４５０ｇを摘出し、直ちにドライアイスで凍結した。実施例９に示した方法で、腸管および精巣の抽出物を作成した。凍結乾燥した粉末を１Ｍ酢酸で溶解し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ  ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社）でろ過後、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、４．６Φ ｘ ３００ｍｍ、ワイエムシイ株式会社）に付した。２４−４８％アセトニトリルの濃度勾配溶出法により溶出させた液を１分毎に分取した。ここで、ＯＤＳカラムでの分取は、１回あたりのサンプルの付加量が出発の臓器重量として２０ｇ以下となるように、複数回に分けて行い、後にサンプルを１つにまとめて以後の実験に供した。各分画を減圧下、濃縮・乾固させ、実施例７に示す方法でＰＬＡＰ活性を測定した。【０１６２】
その結果、マウス抽出物を用いた場合と同様に、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞特異的なＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。よって、ラットの腸管および精巣の抽出物中にも、ＧＰＲ１２０特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。以後の実験には、臓器重量が多いラットを用いることにした。【０１６３】
実施例１１：  ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞に対して特異的にＰＬＡＰ活性を上昇させる活性物質のラット腸管からの精製およびアミノ酸配列の決定
実施例１０で得られたラット腸管抽出物の活性フラクションの乾燥粉末を、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム（リン酸でｐＨを３に調整したもの）に溶解した後、陽イオン交換カラム（TSKgel SP-5PW、７．５Φ ｘ ７５ｍｍ、東ソー株式会社）に付した。１０％アセトニトリル存在下で、１０ｍＭから１．０Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配により溶出した。活性は、ギ酸アンモニウム  ２８０ｍＭ付近に回収された。活性分画を、Diphenylカラム（Vydac219TP Diphenyl Reversed Phase、４．６Φ ｘ ２５０ｍｍ、GRACE VYDAC）に付した後、０．１％ ＴＦＡを含む２１％から４８％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出した結果、アセトニトリル３０％付近に活性が検出された。
活性分画を０．１％  ＴＦＡで３倍希釈した後、ＯＤＳカラム（Vydac218TP C18 Reversed Phase、４．６Φ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＲＡＣＥ  ＶＹＤＡＣ）に付し、０．１％  ＴＦＡを含む２７％から４２％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出した。活性はアセトニトリル３４％付近に認められた。【０１６４】
活性分画を０．１％  ＴＦＡで３倍希釈し、μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８カラム（４．６Φ ｘ １００ｍｍ、アマシャムバイオサイエンス株式会社）に付した後、０．１％  ＴＦＡを含む２４％から４８％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリ３５％付近に認められた。【０１６５】
活性分画を、０．１％  ヘプタフルオロ酪酸（以下、ＨＦＢＡと記す）で３倍希釈した後、ＯＤＳカラム（YMC-Pack ProC18、２．０Φ  ｘ  １５０ｍｍ、株式会社ワイエムシイ）に付した。０．１％  ＨＦＢＡを含む２４％から４８％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル３５％付近に得られた。【０１６６】
活性分画を、株式会社アプロサイエンスの受託分析サービスにアミノ酸分析を依頼し、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ ｃＬＣ（Applied Biosystems, USA）を用いたＮ末アミノ酸分析法によりアミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末から１７残基までに、ＸＬＬＥＬＡＧＴＬＤＸＶＧＰＲＳＰ（配列番号２１）の配列が得られた。この配列は、シークエンスが読めなかったＸの残基を除いて、前駆体ラットGroup X secretory Phospholipase A2（ＧＸ−ｓＰＬＡ２）（配列番号２２、Ｓｗｉｓｓ‐Ｐｒｏｔ アクセッション番号：Ｑ９ＱＺＴ３）の２９番目から４５番目まで、すなわち、ラットＧＸ−ｓＰＬＡ２（配列番号２３）のＮ末から１７残基までと１００％一致した。配列番号２１の１番目のＸは機器のトラブルで１サイクル目のクロマトグラムの一部が得られなかった。また配列番号２１の１１番目のＸは収量的に相当するアミノ酸が検出されなかったが、この残基はデータベース配列Ｑ９ＱＺＴ３（配列番号２２）からシステインと推測された。【０１６７】
実施例１２：  ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞に対して特異的にＰＬＡＰ活性を上昇させる活性物質のラット精巣からの精製およびアミノ酸配列の決定
実施例１０で得られたラット精巣抽出物の活性フラクションの乾燥粉末を、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム（リン酸でｐＨを３に調整したもの）に溶解した後、陽イオン交換カラム（TSKgel SP-5PW，７．５Φ ｘ ７５ｍｍ、東ソー株式会社）に付した。１０％アセトニトリル存在下で、１０ｍＭから１．０Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配により溶出した。活性は、ギ酸アンモニウム２８０ｍＭ付近に回収された。活性分画を、Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラム（Vydac219TP Diphenyl Reversed Phase、４．６Φ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＲＡＣＥ ＶＹＤＡＣ）に付した後、０．１％ ＴＦＡを含む２１％から４８％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出した結果、アセトニトリル３０％付近に活性が検出された。【０１６８】
活性分画を０．１％  ＨＦＢＡで３倍希釈した後、ＯＤＳカラム（Vydac218TP C18 Reversed Phase、４．６Φ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＲＡＣＥ  ＶＹＤＡＣ）に付した後、０．１％  ＨＦＢＡを含む２７％から５１％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出した結果、活性はアセトニトリル４４％付近に認められた(図６-Ａ)。【０１６９】
活性分画を０．１％  ＨＦＢＡで３倍希釈し、ＯＤＳカラム（ＳｕｎＦｉｒｅ（商標） Ｃ１８  ３．５μｍ、２．１Φ ｘ １５０ｍｍ、Waters）に付した後、２８．８％から４６．８％の濃度勾配により溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル３６％付近に単一ピークとして得られた（図６-Ｂ）。【０１７０】
活性分画を、株式会社アプロサイエンスの受託分析サービスにアミノ酸分析を依頼し、Procise 494 cLC（Applied Biosystems, USA）を用いたＮ末アミノ酸分析法によりアミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末から１５残基までに、ＧＬＬＥＬＡＧＴＬＤＸＶＧＰＲ（配列番号２４）の配列が得られた。この配列は、シークエンスが読めなかったＸの残基を除いて、前駆体ラットＧＸ−ｓＰＬＡ２（配列番号２２）の２９番目から４３番目まで、すなわち、ラットＧＸ−ｓＰＬＡ２（配列番号２３）のＮ末から１５残基までと１００％一致した。配列番号２４のＸは収量的に相当するアミノ酸が検出されなかったが、この残基はデータベース配列（配列番号２２）からシステイン残基と推測された。【０１７１】
実施例１３：  ヒトおよびマウスのＧＸ−ｓＰＬＡ２の前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット腸管および精巣の抽出物から得られたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞に対して特異的にＰＬＡＰ活性を上昇させる物質として同定されたＧＸ−ｓＰＬＡ２のヒト、およびマウスのホモログの前駆体をコードするｃＤＮＡを、以下に示す方法にしたがって行った。【０１７２】
（１）  ヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２）の前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２の前駆体をコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号２５（GenBank アクセッション番号ＮＭ＿００３５６１）であらわされる核酸配列を基にして、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２のコード領域４４１番目から９３８番目に対してプライマーを設計し５’側プライマー（５’−ATGGGGCCGCTACCTGTGTGCCTGCC−３’）（配列番号２６）および３’側プライマー（５’−TCAGTCACACTTGGGCGAGTCCGGC−３’）（配列番号２７）、Human Lung QUICK-Clone cDNA（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲを行った。FastStart High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、６１℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。増幅された約５００ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に挿入し、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を得た。
ABI prism DNA sequencing kit（Perkin-Elmer Applied Biosystems社）により配列を確認した結果、ｐＣＲ２．１に挿入された４９８塩基対の配列は、配列番号２５における４４１番目から９３８番目と同一配列であった。【０１７３】
（２）  マウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２をコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０１１９８７）であらわされる核酸配列を基にして、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２のコード領域１７５番目から６３０番目に対してプライマー５’側プライマー（５’−ATGCTGCTGCTACTGCTGCTGTTGC−３’）（配列番号２９）および３’側プライマー（５’−TCAATTGCACTTGGGAGAGTCCTTC−３’）（配列番号３０）を設計した。鋳型なるｃＤＮＡは、実施例８に記したＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウスの大腸のＲＮＡを実施例８と同様の方法で逆転写したものを用いた。FastStart High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、５８℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。増幅された約４５０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に挿入し、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を得た。
ABI prism DNA sequencing kit（Perkin-Elmer Applied Biosystems社）により配列を確認した結果、ｐＣＲ２．１に挿入された４５６塩基対の配列は、配列番号２８における      １７５番目から６３０番目と同一配列であった。【０１７４】
実施例１４：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２（ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）の遺伝子導入用レトロウイルスベクターの作成
（１）  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２（ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）のクローニング
Ｃ末Ｈｉｓタグ付きヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）は、実施例１３で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として５’側プライマー（５’−GATATCGCCGCCACCATGGGGCCGCTACCTGTG−３’）（配列番号３１）および３’側プライマー（５’−GATATCTCAATGGTGATGGTGATGATGGTCACACTTGGGCGAGTC−３’）（配列番号３２）のプライマーを用いてＰＣＲを行った。同様に、Ｃ末Ｈｉｓタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）は、実施例１３で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として５’側プライマー（５’−GATATCGCCGCCACCATGCTGCTGCTACTGCTG−３’）（配列番号３３）および３’側プライマー（５’−GATATCTCAATGGTGATGGTGATGA TGATTGCACTTGGGAGAGTC−３’）（配列番号３４）のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、FastStart High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、６１℃１分（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２の場合）もしくは５８℃１分（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２の場合）、７２℃３分のサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。得られたＰＣＲ産物を再びｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に挿入し、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１を得た。【０１７５】
（２）  ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６のレトロウイルスベクターの調製
ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１をＥｃｏＲＶで切断し、それぞれｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６を切り出した。これを、制限酵素ＨｐａＩで切断したｐＢａｂｅＣＬＸＩＨ（実施例２に記載）にサブクローニングし、ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅ（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）ＩＨおよびｐＢａｂｅ（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）ＩＨを得た。これらを、実施例４と同様の方法を用いて、レトロウイルスベクター溶液を作成した。【０１７６】
実施例１５：  ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞作成
１．２×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン  １００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）２ｍｌを用いて６well plate（日本ベクトンディッキンソン株式会社）に培養した。翌日、培地を取り除き、実施例１４で調製したレトロウイルスベクター４ｍｌおよび１．６ｍｇ／ｍｌ polybrene ２０μｌ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、３５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン含有の培養液で培養することにより生き残ってきた細胞を、ヒトおよびマウスＨｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞（それぞれ、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞）として以下の実験に供した。【０１７７】
実施例１６：  Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２発現ＨＥＫ細胞作成
１．２×１０５個のＨＥＫ細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、ペニシリン  １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）２ｍｌを用いてコラーゲンコート6well plate（旭テクノグラス社）に培養した。翌日、培地を取り除き、実施例１４で調製したレトロウイルスベクター４ｍｌおよび１．６ｍｇ／ｍｌ polybrene ２０μｌ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン含有の培養液で培養することにより、生き残ってきた細胞をヒトおよびマウスＨｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２発現ＨＥＫ細胞（それぞれ、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞）として以下の実験に供したとして以下の実験に供した。【０１７８】
実施例１７：  ヒトおよびマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養メディウムを用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性  
ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）１０ｍｌを用いて、１０ｃｍ径シャーレ（ベクトンディッキンソン社）に培養した。コンフルエントに達してから２日培養後、培地を回収し、実施例７に示す方法にしたがってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性を測定した。図７に示すように、両細胞のメディウム中に、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を上昇させる活性が存在することが明らかになった。【０１７９】
実施例１８：  ヒトおよびマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞の培養メディウムを用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ＨＥＫ細胞を、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）１０ｍｌを用いて、コラーゲンコート１０ｃｍ径シャーレ（旭テクノグラス社）に培養した。コンフルエントに達してから２日培養後、培地を回収し、実施例７に示す方法にしたがってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性を測定した。図８に示すように、両細胞のメディウム中に、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２におけるＰＬＡＰ活性を上昇させる活性が存在することが明らかになった。【０１８０】
実施例１９：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の遺伝子導入用バキュロウイルスの作製
Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の遺伝子導入用バキュロウイルスは、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （インビトロジェン株式会社）を用いて、キットに含まれるマニュアルに従って作製した。具体的には、実施例１４で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６―ｐＣＲ２．１、および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じくＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩで切断しておいたｐＦＡＳＴＢＡＣ１プラスミドに挿入することにより、それぞれｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＦＡＳＴＢＡＣおよび、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＦＡＳＴＢＡＣを得た。これらプラスミドを、キット付属のＤＨ１０ＢＡＣ コンピテントセルにトランスポジションすることにより、バクミドＤＮＡを回収した。ＳＦ９００ ＩＩ ＳＦＭ（インビトロジェン社）で培養したＳｆ９細胞に、バクミドＤＮＡをセルフェクチン（インビトロジェン社）によりトランスフェクションし、３日後に培養上清を回収することにより、ヒトおよびマウスＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２遺伝子導入用バキュロウイルスを得た。【０１８１】
実施例２０：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の精製
実施例１９で得たヒトおよびマウスＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２遺伝子導入用バキュロウイルスを、それぞれＳｆ９細胞に感染させ、三角フラスコ中で振とう培養を行った。６０時間後に培養液を遠心することにより培養上清を得た。培養上清にＦｉｎａｌ １０ ｍＭ イミダゾール（シグマ社）を加え、 Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に付した。カラムの５倍量のＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した後、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を０．１％ ＴＦＡで５倍希釈した後、ＨＦ ＭＥＧＡ ＢＯＮＤ ＥＬＵＴＥ Ｃ１８カラム（バリアン社）に付した。カラムを、０．１％ ＴＦＡを含む５０％ アセトニトリルで溶出し、凍結乾燥により、ヒトおよびマウスの精製Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２（それぞれ、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ、および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ）を得た。【０１８２】
実施例２１：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２におけるＰＬＡＰ活性の測定
実施例２０で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＨｉｓおよびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓの凍結乾燥粉末を、適量の０．１％ ＴＦＡ溶液に溶かした。これらを用いて、実施例７記載の方法によりｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図９に示すように、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ（図９−Ａ）および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ（図９−Ｂ）の濃度に応じて、ｍＧＰＲ−ＳＥ３０２細胞おけるＰＬＡＰ活性の上昇が観察され、ＧＰＲ１２０がレコンビナントのＧＸ−ｓＰＬＡ２によっても活性化されることが明らかになった。  【０１８３】
実施例２２：  市販ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２（Phospholipase A2from porcine pancreas (ammonium sulfate suspension (using soybean L-α-phosphatidylcholine)６００ユニット／ｍｇ protein，ｐＨ８．０，３７℃)）を遠心後、ペレットを水に溶かし、実施例７に記載する方法にしたがってＰＬＡＰ活性を測定した。図１０に示すように、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１０−Ａ）、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１０−Ｂ）において濃度依存的なＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。このブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２は、主にＧｒｏｕｐＩＢ  ｓＰＬＡ２（ＧＩＢ−ｓＰＬＡ２）（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５９２）であることが確認されていることから（Ta-min Chang et al., J. Biol. Chem. 274(16):10758-10764, 1999）、ＧＰＲ１２０は、ＧＸ−ｓＰＬＡ２のみでなくＧＩＢ−ｓＰＬＡ２によっても活性化されることが示された。【０１８４】
実施例２３：  市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ハチ毒ＰＬＡ２（ｂｖＰＬＡ２）（Phospholipase A2 from honey bee venom (salt-free, lyophilized powder, 600‐1800ユニット／ｍｇ protein)）を水に溶かし、実施例７に記載する方法にしたがってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図１１に示すように、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１１−Ａ）、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２（図１１−Ｂ）において、濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。このことから、ＧＸ−ｓＰＬＡ２やＧＩＢ−ｓＰＬＡ２などの分泌型ＰＬＡ２のみではなく、ハチ毒由来のＰＬＡ２によってもＧＰＲ１２０が活性化されることが示された。【０１８５】
実施例２４：  市販ヘビ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ヘビ毒ＰＬＡ２（ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ＰＬＡ２）（Phospholipase A2 from Naja mossambica mossambica、シグマ社）を水に溶かし、実施例７に記載する方法に従ってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図１２に示すように、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１２Ａ）、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２（図１２Ｂ）において、濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。このことから、ヘビ毒由来のＰＬＡ２によってもＧＰＲ１２０が活性化されることが示された。【０１８６】
実施例２５：  Ｃ末ＦＬＡＧ  タグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２のｃＤＮＡクローニング
実施例１３で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として、配列番号３１に示す５’側プライマー、および、３’側プライマー（５’−GATATCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTCACACTTGGGCGA−３’）（配列番号４２）を用いてＰＣＲを行うことにより、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ）（配列番号４３）を得た。同様に、実施例１３で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として、配列番号３３に示す５’側プライマー、および、３’側プライマー（５’−GATATCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCATTGCACTTGGGAGA−３’）（配列番号４４）のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ）を得た（配列番号４５）。得られたＰＣＲ産物を再びｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に挿入し、それぞれｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を得た。【０１８７】
実施例２６：  Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
実施例２５で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、切り出したフラグメントをｐＹＮＧベクター（片倉工業株式会社製）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。タンパク質産生サービス（SuperwormＲ system）（片倉工業株式会社製）に受託し、カイコサナギ抽出液を得た。カイコサナギ抽出液をANTI-FLAGＲ M2 Agarose（シグマ社）に付し、付属のマニュアルに従い精製を行った。ｓＰＬＡ２酵素活性は、sPLA2 Assay Kit (Cayman Chemical 社）を用いて付属のマニュアルに従い行った。活性分画をＶＹＤＡＣ(商標) Protein ＆ Peptide C18カラム (＃２１８TP54、VYDAC社）に付した後、０．１％ ＴＦＡを含む２４〜４２％アセトニトリルの濃度勾配により溶出した。得られたピークのうち、もっともｓＰＬＡ２の比活性の高かったシングルピークをレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２として、ＰＬＡＰアッセイに用いた。なお、レコンビナントの蛋白濃度は、Ｄｃプロテインアッセイ(BioRad社)を用い測定した。得られたレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を０．１％ＴＦＡに溶かし、実施例７に記載する方法にしたがってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図１３に示すように、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１３Ａ）、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２（図１３Ｂ）において、濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。このことから、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２によってもＧＰＲ１２０が活性化されることが示された。【０１８８】
実施例２７：  Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
実施例２５で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化し、切り出したフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトにサブクローニングし、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＦＡＳＴ Ｂａｃを得た。Bac-to-Bac(商標) Baculovirus Expression System（インビトロジェン社）を用いてバキュロウイルスを得た後、昆虫細胞Ｓｆ−９感染させた。Ｓｆ−９細胞は、ＳＦ−９００ＩＩ培地（インビトロジェン社）（ペニシリン／ストレプトマイシン、２．５％ ＦＣＳ）で培養した。バキュロウイルス感染Ｓｆ−９細胞培養上清をANTI-FLAGＲ M2 Agarose（シグマ社）に付し、付属のマニュアルに従い精製を行った。ｓＰＬＡ２酵素活性は、sPLA2 Assay Kit (Cayman Chemical 社）を用いて付属のマニュアルに従い行った。活性分画をＶＹＤＡＣ(商標) Protein ＆ Peptide C18カラム (＃２１８TP54、VYDAC社）に付した後、０．１％ ＴＦＡを含む２４〜５４％アセトニトリルの濃度勾配により溶出した。得られたピークのうち、もっとも比活性の高かったシングルピークをレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２として、ＰＬＡＰアッセイに用いた。なお、レコンビナントの蛋白濃度は、Ｄｃプロテインアッセイ（BioRad社）を用い測定した。得られたレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を０．０５％ＴＦＡ、１％ ＢＳＡ （Fatty Acid Free、シグマ社）に溶かし、実施例７に記載する方法にしたがってＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図１４に示すように、ＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２細胞（図１４Ａ）、および、ｍＧＰＲ１２０−ＳＥ３０２（図１４Ｂ）において、濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出された。このことから、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きｍＧＸ−ｓＰＬＡ２によってもＧＰＲ１２０が活性化されることが示された。【０１８９】
実施例２８：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いた肺、および、肺胞マクロファージのＧＰＲ１２０の遺伝子発現量の定量
８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）、または、８週令の雄性ＢＡＬＢ/ｃＡｎＮｃｒｌｃｒｌｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）をネンブタール麻酔下、気道よりカテーテルを挿入し、０．８ｍＬのＰＢＳ（−）（Phosphate Buffered Saline、シグマ社、４℃）で４回、肺胞洗浄（Broncho-Alveolar Lavage：ＢＡＬ）を行った。得られた肺胞洗浄液（Broncho-Alveolar Lavage Fluid：ＢＡＬＦ）のうち、５００μｌをサイトスピン（サーモエレクトロン社）で３５０ｒｐｍ、５分間遠心することにより細胞集積し、ディフ・クイック（国際試薬株式会社）により、染色を行った。図１５Ａに示すように、肺胞洗浄液中に含まれる細胞のほとんどは肺胞マクロファージであることが確認できた。残りのＢＡＬＦを４５０ｘｇで１０分間遠心することにより細胞集積を行い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、実施例８に記載の方法に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。また、肺からも同様にｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。図１５に示すように、Ｃ５７ＢＬ/６（図１５Ｂ）、および、マウスＢＡＬＢ/ｃ（図１５Ｃ）において、肺胞マクロファージにおいても肺と同程度のマウスＧＰＲ１２０ ｍＲＮＡの発現が確認された。【０１９０】
また、 ８週令のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラット（日本エスエルシー株式会社）をネンブタール麻酔下、気道にカテーテルを挿入し、５ｍｌのＰＢＳ（−）で５回肺胞洗浄を行った。４５０ｘｇで１０分間延伸することにより細胞集積を行い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。また、肺からも同様にｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。実施例８に記載の方法に従い、逆転写を行いｃＤＮＡを合成した後、５’側プライマー（５’−TGATCCAGAACTTCCGGCA−３’）（配列番号４６）、および、３’側プライマー（５’−CGGAGTTGGCAAACGTGAA−３’）（配列番号４７）および、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、１０ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３．０μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ ２．０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．１２５μｌ、１０μＭ ５’側プライマー０．５μｌ、１０μＭ３’側プライマー０．５μｌ、ｃＤＮＡ溶液を混ぜ、蒸留水で２５μｌとなるよう調製した。なお、配列番号４６および４７のプライマーは、ラットＧＰＲ１２０の塩基配列（配列番号５）を基に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエア Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓを利用して設計した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒでの反応は、５０℃２分、９５℃１０分の後、９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。図１５Ｄに示すように、ラットにおいても肺、および、肺胞マクロファージで同程度のＧＰＲ１２０ ｍＲＮＡの発現が確認された。【０１９１】
実施例２９：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いた種々マクロファージにおけるＧＰＲ１２０の遺伝子発現量の定量
８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）を用いた。肺胞マクロファージは、実施例２８記載の方法に従い採取した。腹腔マクロファージは、腹内を２．５ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗うことにより回収した。また、３％チオグリコレート （シグマ社製） ２ｍｌをマウス腹腔内に投与し、４日後に腹内を２．５ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗うことにより、チオグリコレート投与群腹腔マクロファージを回収した。骨髄は大腿骨から採取した。骨髄由来マクロファージは、骨髄をＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ(商標) Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて５分間赤血球処理した後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μM メルカプトエタノール）、および、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのレコンビナントマウスＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）にサスペンドし、７５ｃｍ２フラスコに播種し５日間培養することにより得た。各サンプルからのＴｏｔａｌ ＲＮＡは、TRIzol Reagent（インビトロジェン社）を用いてマニュアルに従って調製した。得られたtotal RNAをＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、マニュアルに従ってＤＮａｓｅ処理を行った。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。【０１９２】
図１６に示すように、腹腔マクロファージ、チオグリコレート投与マウスの腹腔マクロファージ、および、骨髄由来マクロファージにおいては、肺胞マクロファージと比較して、１０分の１、もしくはそれ以下のＧＰＲ１２０ ｍＲＮＡしか検出されなかった。また、骨髄ではほとんどＧＰＲ１２０の発現が観察されなかったが、腸間膜リンパ節においてはＧＰＲ１２０の発現が観察された。【０１９３】
実施例３０：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いた初代培養肺胞マクロファージにおけるＧＰＲ１２０の遺伝子発現量の定量
肺胞マクロファージの初代培養は、Akagawa K. らの方法に従い行った (Akagawa K. et al., The Journal of Immunology, vol.141, 3383-3390, 1988)。詳しくは、８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）をネンブタール麻酔後、右心室よりＰＢＳ（−）、１０Ｕ/ｍｌヘパリンを灌流し脱血を行った。肺を摘出後、ＰＢＳ（−）／１ｍＭ ＥＤＴＡ中で１−２ｍｍ角にハサミで刻み、７０μｍセルストレイナーでろ過しフロースルーを肺胞マクロファージとして回収した。１，５００ｒｐｍ、５分間遠心により回収された細胞を、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて５分間、赤血球処理を行った。再び１，５００ｒｐｍで５分間遠心後、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ、５０μＭ β−メルカプトエタノール）にサスペンドし、２４穴シャーレに播種した。最終濃度２０ｎｇ/ｍｌのレコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加え、２−３日おきに培地交換を行い、６日目間培養した。図１７Ａ、図１７Ｂには、それぞれ播種直後、および、６日目の肺胞マクロファージの顕微鏡写真を示した。６日後に細胞を回収し、TRIzol Reagent（インビトロジェン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した後、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。図１７Ｃに示すように、ＧＰＲ１２０の発現量は、初代培養肺胞マクロファージにおいても、採取直後の肺胞マクロファージと同程度、維持されていることが示された。【０１９４】
実施例３１：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いた脂肪組織におけるＧＰＲ１２０の遺伝子発現量の定量
８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）より４種類の脂肪組織（皮下脂肪、副睾丸脂肪、腸間膜脂肪、および、褐色脂肪）を摘出し、ＱＩＡｚｏｌ(商標) Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）中でホモジナイズし、クロロホルム抽出を行った後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡをＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、マニュアルに従ってＤＮａｓｅ処理を行った。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。図１８に示すように、いずれの脂肪組織においてもＧＰＲ１２０の発現が観察されたが、褐色脂肪組織においては特に高い発現が観察された。【０１９５】
実施例３２：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いたマウス由来培養脂肪細胞におけるＧＰＲ１２０の発現
３−４週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー社より入手）の鼠蹊部から皮下脂肪を摘出し、天井培養法（Sugihara H, et al. Differentiation 1986, 31:42-49.）により脂肪細胞（２１Ｓｃ細胞と命名）を単離した。細胞は継代培養をおこなった後に凍結ストックを作製した。凍結ストックより２１Ｓｃ細胞を起こし、1:4の希釈率で細胞培養用６穴プレートに播種後、通常培地（ＤＭＥＭ−４.５ｇ／Ｌ glucose、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）で４日間培養しコンフルエントにした。培地を誘導培地（通常培地に、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ， ０．２５ｕＭデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ インスリン、０．２ｍＭインドメタシンを添加したもの）に交換し２日間培養した。ついで、成熟培地（通常培地に5μg/ml インスリンを添加したもの）に交換し１−２日おきに成熟培地で培地交換を行った。分化誘導前、および誘導培地添加から６、１３、２０日後に、TRIzol Reagent（インビトロジェン社）を用いてマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡをＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、マニュアルに従ってＤＮａｓｅ処理を行った。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。各培養日数におけるＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ発現量を図１９に示した。分化誘導前と比べて、分化誘導後の細胞では著しいＧＰＲ１２０ ＲＮＡ量（約２００倍程度）の増加が観察された。【０１９６】
実施例３３：  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いたマウス骨髄由来樹状細胞におけるＧＰＲ１２０の遺伝子発現量の定量
８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）の大腿骨より骨髄を採取し、Lutz M.B. らの方法に従って骨髄由来樹状細胞を得た（Lutz M.B. ら、Journal of Immunological Methods 233, 77-92, 1999)。具体的には、骨髄をＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標） Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ベクトンディッキンソン）を用いて５分間赤血球処理した後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ  メルカプトエタノール）、および、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌのレコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）にサスペンドし、７５ｃｍ２フラスコに播種した。２〜３日おきに培地交換を行い（ＲＰＭＩ１６４０、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭメルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ レコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ）、１１日間培養することにより骨髄由来樹状細胞を得た。一部の樹状細胞に、１１日目に１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（シグマ社）を加え、24時間培養し、活性化した骨髄由来樹状細胞を得た。各サンプルからのＴｏｔａｌ ＲＮＡは、TRIzol Reagent（インビトロジェン社）を用いてマニュアルに従って調製した。得られたtotal RNAをＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、マニュアルに従ってＤＮａｓｅ処理を行った。実施例８に記載の方法に従い逆転写でｃＤＮＡ合成した後、配列番号１９の５’側プライマー、および、配列番号２０の３’側プライマーを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔを用いて、実施例８に記載の方法に従いマウスＧＰＲ１２０のｍＲＮＡ量を測定した。図２０に示すように、骨髄由来樹状細胞にＧＰＲ１２０が発現していることが見出された。また、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで２４時間刺激後は、刺激前と比較してＧＰＲ１２０の発現量が５分の１程度であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１５Ａ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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