(57)【要約】  配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質、該タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターを提供する。さらに、配列番号９を含む金属結合ペプチドおよびタンパク質を提供する。本発明により、高塩濃度においても機能しうる、細菌表面に所望のタンパク質またはペプチドを提示するディスプレーシステム、および新規な重金属結合ペプチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のタンパク質：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項２】
以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項３】
以下の(c)または（d)の遺伝子：
(c)配列番号５、６、７および８からなる群から選択される塩基配列からなるDNA、
(d)(c)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グラム陰性細菌で発現させた際に、Ｃ末端がグラム陰性細菌の外膜に位置するタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターであって、該核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸を挿入して用いられる、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌外膜表面に提示させるための組換えベクター：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項５】
以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含み、グラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させると目的タンパク質またはペプチドがグラム陰性細菌の外膜表面に提示される、グラム陰性細菌の外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示させるための組換えベクター：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項６】
グラム陰性細菌が好塩菌である請求項４または５記載の組換えベクター。
【請求項７】
好塩菌がハロモナス属細菌である請求項６記載の組換えベクター。
【請求項８】
目的タンパク質またはペプチドが、金属結合タンパク質、金属結合ペプチド、抗原または酵素である請求項４〜７いずれか記載の組換えベクター。
【請求項９】
目的タンパク質またはペプチドが、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドである請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１０】
目的タンパク質またはペプチドが、スクリーニングされるべき複数のタンパク質またはペプチドである請求項４〜７いずれか記載の組換えベクター。
【請求項１１】
以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを作成する工程、
該組換えベクターをグラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させる工程、
を含む、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌の外膜表面に提示する方法：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項１２】
グラム陰性細菌が好塩菌である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
好塩菌がハロモナス属細菌である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下の(a)または(b)のタンパク質を含む、外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。
【請求項１５】
グラム陰性細菌が好塩菌である請求項１４記載の細菌。
【請求項１６】
好塩菌がハロモナス属細菌である請求項１５記載の細菌。
【請求項１７】
目的タンパク質またはペプチドが、金属結合タンパク質、金属結合ペプチド、抗原または酵素である請求項１４〜１６いずれか記載の細菌。
【請求項１８】
目的タンパク質またはペプチドが、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドである請求項１７記載の細菌。
【請求項１９】
目的タンパク質またはペプチドが、スクリーニングされるべき複数のタンパク質またはペプチドである請求項１４〜１６いずれか記載の細菌。
【請求項２０】
配列番号９の配列を少なくとも１つ含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。
【請求項２１】
Xがグルタミン酸（E)またはアスパラギン酸（D)である、請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２２】
配列番号９の配列を１〜４つ含む、請求項２０または２１のいずれか記載のタンパク質。
【請求項２３】
配列番号９の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチド：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。
【請求項２４】
Xがグルタミン酸（E)またはアスパラギン酸（D)である、請求項２３記載のペプチド。
【請求項２５】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチド。
【請求項２６】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質。
【請求項２７】
以下の(e)または(f)いずれかのタンパク質：
(e)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(f)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質。
【請求項２８】
請求項２０〜２２および２６〜２７のいずれかのタンパク質または請求項２３〜２５のいずれかのペプチドを細胞表面に提示する、ハロモナス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌の細胞表層に所望のタンパク質またはペプチドを提示させるためのタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクターに関する。本発明はまた、グラム陰性細菌の細胞表層に所望のタンパク質またはペプチドを発現させる方法および該方法により得られる所望のタンパク質またはペプチドを表層に提示するグラム陰性細菌に関する。【０００２】
本発明はさらに、重金属に対する結合能を有するペプチドおよびタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、酵母や細菌の細胞表層に所望の有用タンパク質またはペプチドを発現させる、細胞表層ディスプレー技術が注目されている（特許文献１）。特にここ数年間、細菌の表面上に所望のタンパク質またはペプチドを提示させる技術が研究の対象となってきている。組換えDNA技術を用いた、広範な種類のタンパク質またはペプチドの細菌表層での提示を可能にする技術の開発が進んできている。【０００４】
細菌の表面にタンパク質をディスプレーすることが出来るタンパク質としては、OmpA、OmpS、OmpC、LamBおよびPhoE等様々なものが知られており（非特許文献１、非特許文献２）、かかる膜タンパク質を用いて所望のタンパク質またはペプチドを細菌表面にディスプレーするシステムは、ワクチン開発、生物触媒、スクリーニングなどに有用である。【０００５】
さらなる用途として、例えば、重金属などの有害物質に結合するタンパク質またはペプチドを表面に提示させた細菌を用いた、環境浄化（バイオレメディエーション）が考えられる。【０００６】
重金属などに汚染された土壌には、塩類が同時に蓄積していることが多い。また、海水汚染物質をバイオレメディエーションによって除くには、高塩濃度においても生育可能な微生物を用いる必要がある。【０００７】
高塩濃度においても生育可能な微生物として、グラム陰性細菌のハロモナス属の細菌が挙げられる。ハロモナスはエクトインと呼ばれる適合溶質を細胞内に蓄積することにより、高塩濃度に対する耐性を獲得している。しかし、ハロモナス属を初めとする、好塩性細菌の表面にタンパク質を提示するディスプレー技術はいまだ確立されていない。【０００８】
グラム陰性細菌の細胞壁は、細胞質側から順に、内膜、ペリプラズム空間そして外膜から構成されている。グラム陰性細菌である大腸菌については、細胞表面、即ち外膜へのタンパク質の輸送機構についてはある程度研究が進んでいる。【０００９】
一方、工業廃水、農業廃水等が原因で深刻化している水系の重金属汚染に対して、生物を用いたバイオレメディエーション技術に期待が寄せられている。現状では組換え大腸菌を用いたバイオレメディエーション技術の開発研究が主流であり、種々の金属結合性ペプチドを細胞表層に提示することで、重金属の回収効率を高める研究が勢力的に進められている。しかしながら、実際に汚染が深刻な海水や蒸散池などの高塩濃度かつアルカリ性環境におけるバイオレメディエーションに組換え大腸菌を適用することは難しい。
【特許文献１】特開２００５−３１２４２６号公報
【非特許文献１】Wernerus H. and Stahl S. REVIEW Biotechnological applications for surface-engineered bacteria. Biotechnol. Appl. Biochem. (2004)40, 209-228
【非特許文献２】Tokuda H, Matsuyama S. Sorting of lipoproteins to the outer membrane in E.coli. Biochim. Biophys. Acta. (2004)1693:5-13
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明は、高塩濃度においても機能しうる、細菌表面に所望のタンパク質またはペプチドを提示するディスプレーシステムを開発することを目的とする。【００１１】
さらに、本発明は、ハロモナス内のCu/Cd/Zn結合タンパク質を探索し、金属結合ペプチドおよびそれを含む金属結合タンパク質を取得することを目的とする。【００１２】
本発明はまた、高塩濃度かつアルカリ性環境下における重金属浄化技術への応用を目指した、金属結合ドメインを細胞表層に提示したアーミングハロモナス細胞を作製することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、所望のタンパク質またはペプチドを表面に提示するために利用可能なタンパク質を同定し、該タンパク質をコードする遺伝子を単離した。その結果得られた遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子をインフレームにて融合させ、実際にグラム陰性細菌で発現させることにより、細菌表面上に所望のペプチドを提示することに成功した。【００１４】
即ち本発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質を提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００１５】
さらに本発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質；
および、以下の(c)または（d)の遺伝子を提供する：
(c)配列番号５、６、７および８からなる群から選択される塩基配列からなるDNA、
(d)(c)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グラム陰性細菌で発現させた際に、Ｃ末端がグラム陰性細菌の外膜に位置するタンパク質をコードするDNA。【００１６】
本発明はまた、以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターであって、該核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸を挿入して用いられる、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌外膜表面に提示させるための組換えベクターを提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００１７】
さらに本発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含み、グラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させると目的タンパク質またはペプチドがグラム陰性細菌の外膜表面に提示される、グラム陰性細菌の外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示させるための組換えベクターを提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００１８】
さらに本発明は、
以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを作成する工程、
該組換えベクターをグラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させる工程、
を含む、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌の外膜表面に提示する方法を提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００１９】
さらに本発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質を含む、外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌を提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００２０】
本発明において、目的タンパク質またはペプチドは特に限定されないが、例えば、金属結合タンパク質、金属結合ペプチド、抗原または酵素であり、特に金属結合タンパク質または金属結合ペプチドが好ましい。また、目的タンパク質またはペプチドとして、スクリーニングされるべき複数のタンパク質またはペプチドも例示される。この場合、複数のタンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌のプールは、種々のスクリーニングされるべきタンパク質またはペプチドをその表面に発現するため、発現ライブラリーとして有用である。【００２１】
本発明において、グラム陰性細菌は好ましくは好塩菌であり、さらに好ましくはハロモナス属の細菌であり、特にハロモナス・エロンガータ（Halomonas elongata)が好ましい。【００２２】
本発明者はさらに、実際に汚染が深刻な海水や蒸散池などの高塩濃度かつアルカリ性環境におけるバイオレメディエーションに組換え大腸菌を適用することは難しいことから、0.3〜21％ NaClという広い範囲の塩ストレス下で生存可能な好塩性細菌ハロモナス・エロンガータ（Halomonas elongata、以下単にハロモナスとも称する）を用いたバイオレメディエーション技術の開発研究を行うことにより、金属結合能を有するペプチドを見いだした。【００２３】
本発明は、配列番号９の配列を少なくとも１つ含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質を提供する：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。【００２４】
好ましくは、上記タンパク質において、配列番号９における、Xは、グルタミン酸（E)またはアスパラギン酸（D)である。【００２５】
好ましくは、上記タンパク質において、「少なくとも１つ」とは、１〜４つである。【００２６】
本発明は、また、配列番号９の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチドを提供する：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。【００２７】
好ましくは、上記ペプチドにおいて、配列番号９における、Xは、グルタミン酸（E)またはアスパラギン酸（D)である。【００２８】
本発明はさらに、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチドを提供する。好ましくはこれらペプチドはハロモナス由来のものである。【００２９】
本発明はさらに、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質を提供する。【００３０】
本発明はさらに、以下の(e)または(f)いずれかのタンパク質を提供する：
(e)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(f)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質。
ここで、配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含む。【００３１】
本発明はさらに、上記重金属に対する結合能を有するタンパク質またはペプチドを細胞表面に提示する、ハロモナス属細菌を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、細菌表面に所望のタンパク質またはペプチドを提示するディスプレーシステムが提供される。かかるディスプレーシステムは、高塩環境下での環境浄化をはじめ、ワクチン開発、生物触媒開発、スクリーニングシステム等、種々の用途に応用が可能である。【００３３】
本発明により、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチドおよびタンパク質が提供される。これら金属結合能を有するペプチドおよびタンパク質はそれ自体、および、ハロモナスなどの細菌表面に提示させることにより、重金属による汚染を浄化するバイオレメディエーションに有用である。特に、本発明によるハロモナス由来の重金属結合ペプチドをハロモナスに提示させることにより、セルフクローニング型の環境浄化用細菌が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ハロモナスが高塩アルカリ環境下で金属耐性を示すことを表すグラフである。
【図２】図２は、大腸菌による金属浄化のpHによる影響を示すグラフである。
【図３】図３は、ハロモナスによる金属浄化のpHによる影響を示すグラフである。
【図４】図４は、ハロモナスが高pH条件下でCd/Cuを蓄積することを示すグラフである。
【図５−１】図５−１は、プラスミドpET-HeLipopORF1-HAの設計を示す図である。
【図５−２】図５−２は、プラスミドpET-HeLipopORF4-HAの設計を示す図である。
【図５−３】図５−３は、プラスミドpET-HeLipopORF5-HAの設計を示す図である。
【図５−４】図５−４は、プラスミドpET-HeLipopORF13-HAの設計を示す図である。
【図５−５】図５−５は、プラスミドpET-HeLipopORF15-HAの設計を示す図である。
【図５−６】図５−６は、プラスミドpET-HeLipopORF16-HAの設計を示す図である。
【図５−７】図５−７は、プラスミドpHS15N-HeLipop5-EC8の設計を示す図である。
【図５−８】図５−８は、プラスミドpET-FLAG-EC8-EGFPの設計を示す図である。
【図６】図６は、大腸菌におけるHeLipopORF-HA融合タンパク質の発現を示す図である。
【図７】図７は、大腸菌外膜表面におけるHeLipopORF-HA融合タンパク質の発現を示す免疫蛍光染色の結果を示す図である。
【図８】図８は、上パネルは大腸菌におけるHeLipopORF(1および5)-HA融合タンパク質の発現を示す免疫蛍光の結果を示す図であり、下パネルは融合タンパク質の外膜局在パターンを示す模式図である。
【図９】図９は、pHS15からのpHS15Nベクターの構築を示す図である。
【図１０】図１０は、大腸菌およびハロモナスにおけるpHS15N-HeLipopORF-HAからの融合タンパク質の発現を示す図である。
【図１１】図１１は、ハロモナス表面におけるHeLipopORF-HA融合タンパク質の発現を示す免疫蛍光の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ハロモナスにおけるHeLipop5-EC8融合タンパク質の発現を示す図である。
【図１３】図１３は、EC8を外膜表面に提示するハロモナスによる金属の蓄積を示す図である。
【図１４】図１４は、合成金属ペプチドの構造を示す。
【図１５−１】図１５−１は、pET-Helipop5-HAの構造を示す。
【図１５−２】図１５−２は、pET-Helipop5-(EC6)-HAの構造を示す。
【図１５−３】図１５−３は、pET-Helipop5-(DC6)-HAの構造を示す。
【図１５−４】図１５−４は、pET-Helipop5-(GC6)-HAの構造を示す。
【図１５−５】図１５−５は、pET-Helipop5-(HC6)-HAの構造を示す。
【図１５−６】図１５−６は、pET-Helipop5-(HD6)-HAの構造を示す。
【図１５−７】図１５−７は、pET-Helipop5-(HE6)-HAの構造を示す。
【図１５−８】図１５−８は、pET-Helipop5-(HG6)-HAの構造を示す。
【図１５−９】図１５−９は、pET-Helipop5-(H12)-HAの構造を示す。
【図１６−１】図１６−１は、SpeI-MBP-NheI断片を示す。
【図１６−２】図１６−２は、SpeI-MBP-NheI断片を示す。
【図１７】図１７は、合成MBPを提示するハロモナスの金属蓄積量を示す。
【図１８】図１８は、多重合成MBPを提示するハロモナスの発現タンパク質のSDS-PAGEとウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図１９−１】図１９−１は、CysリッチなハロモナスORFによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９−２】図１９−２は、CysリッチなハロモナスORFによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９−３】図１９−３は、CysリッチなハロモナスORFによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９−４】図１９−４は、CysリッチなハロモナスORFによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９−５】図１９−５は、CysリッチなハロモナスORFによりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２０−１】図２０−１は、6%NaCl下での各MBPを提示するハロモナスの金属蓄積量を示す。
【図２０−２】図２０−２は、3%NaCl下での各MBPを提示するハロモナスの金属蓄積量を示す。
【図２１】図２１は、多重人工金属結合ドメインを提示するハロモナスの金属蓄積量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、以下の(a)または(b)のタンパク質である：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００３６】
本発明のタンパク質としては、以下の(b')のタンパク質も挙げられる。
(b') 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００３７】
本発明において、(a)の配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、グラム陰性細菌において発現させた場合にそのC末端が外膜表層に位置するタンパク質であり、それぞれ、HeLipop4（配列番号１）、HeLipop5（配列番号２）、HeLipop15（配列番号３）およびHeLipop16（配列番号４）と称する。【００３８】
(a)の配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を得るために、本発明者は、ハロモナス・エロンガータOUT30018株（野生型）のゲノム配列に含まれるORFの中から、リポボックス配列を有するものを選択し、実際にグラム陰性細菌で発現させて、そのC末端がグラム陰性細菌の外膜に局在することを確認したものである。【００３９】
本発明の、(b) のタンパク質は、「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」という(a)のタンパク質の機能が失われない程度にアミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、上記(a)のタンパク質の機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内である。【００４０】
(b')のタンパク質も、「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」という(a)のタンパク質の機能が失われない程度の(a)のタンパク質に対する相同性を有するタンパク質である。相同性は、80％以上が好ましく、90％以上が特に好ましい。【００４１】
本発明において「相同性」とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方の（アミノ酸または塩基）配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。【００４２】
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体を指し、便宜的に「タンパク質」なる語を比較的長いポリペプチド、「ペプチド」なる語を比較的短いポリペプチドを示すように用いているが、これらはアミノ酸残基の数を限定するわけではない。したがって、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、いずれもポリペプチドの定義内に含まれる。「タンパク質またはペプチド」はあらゆる長さのポリペプチドを包含する概念である。【００４３】
本発明のタンパク質の機能である、「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」ことの確認方法は、例えば、実施例に記載のように、機能を確認すべきタンパク質のC末端にHAタグを付加すること等により、C末端を標識したタンパク質を発現するコンストラクトを構築し、該コンストラクトを大腸菌などのグラム陰性細菌に導入して発現させ、細胞表面にC末端標識が存在しているかを確認することにより行う。例えばHAタグをC末端に付加したタンパク質は、蛍光標識した抗HA抗体を細胞表面と接触させ、表面に蛍光が検出されるか否かによって、そのC末端が表面に提示されているか否かが決定される。【００４４】
本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質、
および、以下の(c)または（d)の遺伝子である：
(c)配列番号５、６、７および８からなる群から選択される塩基配列からなるDNA、
(d)(c)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グラム陰性細菌で発現させた際に、Ｃ末端がグラム陰性細菌の外膜に位置するタンパク質をコードするDNA。【００４５】
さらに本発明の遺伝子としては、以下の(d')の遺伝子も挙げられる。
(d') 配列番号５、６、７および８からなる群から選択される塩基配列に対して、80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、グラム陰性細菌で発現させた場合にＣ末端が該細菌の外膜に位置するタンパク質をコードするDNA。【００４６】
本発明の遺伝子の記載において、(a)の配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本発明のタンパク質の項について記載したとおりである。同様に、(b) のタンパク質も、本発明のタンパク質の項について記載したとおりである。【００４７】
本発明において、(c)の配列番号５、６、７および８からなる群から選択される塩基配列からなるDNAは、ハロモナス・エロンガータOUT30018株（野生型）のゲノム配列に含まれるORF由来であり、前記(a)のタンパク質、即ちそれぞれHeLipop4（配列番号１）、HeLipop5（配列番号２）、HeLipop15（配列番号３）およびHeLipop16（配列番号４）をコードする遺伝子である。即ち配列番号５のDNAはHeLipop4、配列番号６のDNAはHeLipop5、配列番号７のDNAはHeLipop15、配列番号８のDNAはHeLipop16をコードする。【００４８】
また、本発明の(d)の遺伝子は、(c)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グラム陰性細菌で発現させた際に、Ｃ末端がグラム陰性細菌の外膜に位置するタンパク質をコードするDNAからなる。即ち(d)の遺伝子は、「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」という(a)のタンパク質の機能を保持するタンパク質をコードする。【００４９】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、0.2xSSC、0.1%SDS、65℃程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは(c)の塩基配列からなるDNAと80%以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに90%以上の相同性を有することが好ましい。【００５０】
(d')のDNAは、「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」という(a)のタンパク質の機能が失われないようなタンパク質をコードし、かつ、
(c)の遺伝子に対して、80％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAである。相同性の程度は、80％以上が好ましく、90％以上が特に好ましい。
ここで「相同性」については本発明のタンパク質の項に記載したとおりである。【００５１】
本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質の「そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置する」機能の確認方法は、本発明のタンパク質の項に記載したとおりである。【００５２】
本発明の遺伝子は、ハロモナス属細菌を含むグラム陰性細菌のゲノムから、当業者に周知のPCRまたはハイブリダイゼーション技術によって取得することが可能であり、あるいはDNA合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行うことが出来る。【００５３】
本発明の組換えベクター
（１）発現カセットとしての組換えベクター
本発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターであって、該核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸を挿入して用いられる、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌外膜表面に提示させるための組換えベクターを提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００５４】
本発明の該組換えベクターは、(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターであり、ここで(a)または(b)のタンパク質については上記した通りである。該組換えベクターは(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸の下流に、目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸をインフレームにて挿入可能な便宜な制限酵素部位を有する。該組換えベクターは目的タンパク質またはペプチドの細菌表面発現用のカセットとして機能する。即ち、目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸を、該組換えベクター中の(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸の下流、即ちC末端側に、インフレームにて挿入して得られたコンストラクトをグラム陰性細菌に導入し、発現させると(a)または(b)のタンパク質のC末端に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは細菌表面に提示される。【００５５】
上記の核酸が導入される発現ベクターとしては、宿主グラム陰性細菌内で自律的に複製しうるプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入されるグラム陰性細菌に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pET系ベクター、pET15bが挙げられ、ハロモナス属細菌で発現させる場合は、pHS系ベクター、pHS15が挙げられ、好ましくはpHS15Nである。ファージベクターとしてはλファージベクターなどが挙げられる。特にpHS15系ベクターは大腸菌とハロモナス属細菌の両方で機能しうるシャトルベクターであるため好ましい。【００５６】
選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。【００５７】
本発明の発現ベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、DNA配列に適切に連結した場合、グラム陰性細菌において、そのDNA配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。【００５８】
本発明の発現ベクターは、(a)または(b)のタンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質をコードするキメラDNAの構築を容易にするために、(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作成することが出来る。【００５９】
（２）本発明のタンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を発現する組換えベクター
本発明はまた、以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含み、グラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させると目的タンパク質またはペプチドがグラム陰性細菌の外膜表面に提示される、グラム陰性細菌の外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示させるための組換えベクターを提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００６０】
該組換えベクターは上記第（１）の組換えベクターに、目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸を導入したものである。即ち、上記第（１）の組換えベクターにおける、(a)または(b)のタンパク質をコードする核酸の下流にインフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸の断片を導入したものであって、グラム陰性細菌に導入して発現させると、(a)または(b)のタンパク質のC末端に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、細菌表面に目的タンパク質またはペプチドが提示される。【００６１】
目的タンパク質またはペプチドは、特に限定されず、金属結合タンパク質、金属結合ペプチド、酵素、抗原などが挙げられる。例えば、金属結合タンパク質または金属結合ペプチドとしては、金属シャペロン、合成ファイトケラチンなどが挙げられ、これを細菌表面に提示することにより、環境浄化細菌が得られる。酵素を提示した細胞は、バイオカタリストとして機能する。抗原を提示した細胞は、ワクチンとして使用できる。さらに、複数のタンパク質またはペプチドのプールを(a)または(b)のタンパク質のC末端に提示させることにより、細菌表面スクリーニングライブラリーが得られる。【００６２】
目的タンパク質またはペプチドの起源は宿主として用いる細菌に対して異種のものであってもよいし、宿主として用いる細菌由来のものであってもよい。後者の場合、宿主細菌に天然に内在するタンパク質またはペプチドが提示されるセルフクローニング型の細胞が得られ、特に環境問題を考慮すると好ましい。【００６３】
本発明の目的タンパク質またはペプチドを表面に提示させる方法
本発明は、
以下の(a)または(b)のタンパク質のＣ末端に目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを作成する工程、
該組換えベクターをグラム陰性細菌に形質転換し、該融合タンパク質を発現させる工程、
を含む、目的タンパク質またはペプチドをグラム陰性細菌の外膜表面に提示する方法を提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００６４】
組換えベクターの作成については上記の通りである。
組換えベクターのグラム陰性細菌への形質転換方法としては、従来公知の方法を用いることが出来、例えば、塩化カルシウム法、コンピテント法、３親接合（triparental mating）法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。【００６５】
融合タンパク質を発現させる方法は遺伝子工学の常法に基づいて行うことが出来る。グラム陰性細菌に用いられるベクターの情報や外来遺伝子の導入、発現方法は多くの実験書に記載されている（例えば、Sambrook, J.et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, CSHL Press, 2001）。【００６６】
用いる宿主はグラム陰性細菌であれば特に限定されず、大腸菌、ハロモナス属細菌、シュードモナス属細菌などが挙げられる。好ましくは好塩菌であり、さらに好ましくはハロモナス属細菌である。本実施例において用いたハロモナス・エロンガータOUT30018株は、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）に受託番号FERM BP-4841（試料名Halomonas KS3)にて国際寄託されている。【００６７】
形質転換体である宿主細菌の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としては、グルコース、グリセロールなどが挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。【００６８】
培養温度は宿主微生物が成育し、目的タンパク質またはペプチドを提示する範囲で適宜変更できるが、一般に大腸菌の場合、温度37℃、12時間、pH7.2の培養条件でよい。また、ハロモナス・エロンガータの場合、37℃、24時間、pH7.2または8.4の培養条件でよい。【００６９】
目的タンパク質またはペプチドの発現は、該タンパク質またはペプチドの性質を利用して確認すればよい。例えば目的タンパク質またはペプチドが金属結合タンパク質または金属結合ペプチドの場合、形質転換体の金属イオンを浄化する能力のアッセイにより確認できる。目的タンパク質またはペプチドが抗原の場合は、特異的な抗体を用いて確認することが出来る。目的タンパク質またはペプチドが酵素の場合は、菌体を用いて、目的酵素の基質から生成物への変換をアッセイすることにより確認することが出来る。【００７０】
本発明の目的タンパク質またはペプチドを表面に提示した細菌
本発明はまた、以下の(a)または(b)のタンパク質を含む、外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌を提供する：
(a)配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＣ末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質。【００７１】
本発明の外膜表面に目的タンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌は、上記の本発明の(a)または(b)のタンパク質の下流に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを所望のグラム陰性細菌に導入することにより得られる。好ましい宿主、好ましい目的タンパク質またはペプチドについては上記の通りである。【００７２】
本発明の目的タンパク質またはペプチドを提示したグラム陰性細菌は、表面に提示された目的タンパク質またはペプチドの種類に応じて、環境浄化細菌、バイオカタリスト、ワクチン、ライブラリーなどとして利用することが出来る。【００７３】
本発明の金属結合タンパク質および金属結合ペプチド
以上に本発明の細菌表面に所望のタンパク質またはペプチドを提示するタンパク質等について記載したが、本発明は、上記タンパク質によって提示されるペプチドまたはタンパク質の例として、金属結合ペプチドおよび金属結合タンパク質も提供する。【００７４】
まず、本発明の金属結合タンパク質は、
配列番号９の配列を少なくとも１つ含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質である：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。
配列番号９で示される配列は、人工金属結合ペプチドとして有用であることが確認された。Xはいずれのアミノ酸であってもよいが、特にXがグルタミン酸またはアスパラギン酸といった酸性アミノ酸であるのが好ましい。また、少なくとも１つとは特に限定されないが、好ましくは１〜４である。【００７５】
「銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質」とは、実施例に記載の方法にしたがってそれをコードする遺伝子を導入して、ハロモナス表面に発現させた場合に、遺伝子を導入していない野生型のハロモナスと比較して、銅、亜鉛またはカドミウムのいずれか１種をより多く菌体に蓄積することができるタンパク質をいう。【００７６】
次に本発明の金属結合ペプチドは、
配列番号９の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチドである：
XCXCXCXCXCXC（配列番号９）
［式中、Cはシステイン、Xはいずれのアミノ酸であってもよい］。
配列番号９で示される配列は、人工金属結合ペプチドとして有用であることが確認された。Xはいずれのアミノ酸であってもよいが、特にXがグルタミン酸またはアスパラギン酸といった酸性アミノ酸であるのが好ましい。特にXがグルタミン酸である場合は、銅に対する結合能に優れ、Xがアスパラギン酸である場合は、銅およびカドミウムに対する結合能に優れる。【００７７】
また、本発明は、
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列からなる、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するペプチドを提供する。
これらペプチドは、ハロモナスのゲノム情報から得られたものであり、本発明の、ハロモナス表面にペプチドを提示させるタンパク質のＣ末端に結合させ、ハロモナス表面に提示させると、セルフクローニング型の重金属浄化ハロモナス細菌が得られる。
配列番号１０で示されるペプチドは、銅に対する結合能、１１で示されるペプチドはカドミウムに対する結合能、１２で示されるペプチドは亜鉛に対する結合能が優れている。【００７８】
さらに本発明は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含む、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質を提供する。かかるタンパク質は、重金属に対する結合能が優れている、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含むため、当然、タンパク質としても重金属に対する結合能が優れていると考えられる。【００７９】
かかるタンパク質のなかでも、以下の(e)または(f)いずれかのタンパク質が好ましい：
(e)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(f)配列番号１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有するタンパク質。【００８０】
(e)の配列番号１３、１４および１５に示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１１および１２に示す金属結合ペプチドを含む、ハロモナス内在性タンパク質を構成する。配列番号１０、１１および１２に示す金属結合ペプチドの金属結合能から、これらタンパク質も同様に金属結合能を有するものと考えられる。【００８１】
本発明の(f)のタンパク質は、「銅、亜鉛およびカドミウムからなる群から選択される重金属の少なくとも１種に対する結合能を有する」という(e)のタンパク質の機能が失われない程度にアミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、上記(e)のタンパク質の機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内である。【００８２】
好ましくは、本発明の上記金属結合タンパク質または金属結合ペプチドはハロモナス属細菌の細胞表面に提示される。細胞表面への提示は、本発明の、「C末端がグラム陰性細菌で発現させた場合に該細菌の外膜に位置するタンパク質」のC末端に目的金属結合タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をインフレームに挿入し、実施例に記載のようなハロモナス用発現ベクターに組み込んで、ハロモナスを形質転換することにより達成できる。
【実施例】
【００８３】
好塩性細菌ハロモナス・エロンガータ（Halomonas elongata)の環境因子に対する挙動
好塩性細菌ハロモナス・エロンガータ（Halomonas elongata)（以下、単にハロモナスと称する）は、タイ王国東北部の乾燥地域の塩類集積土壌から同定されたグラム陰性細菌であり、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）に受託番号FERM BP-4841（試料名Halomonas KS3)にて国際寄託されている。【００８４】
ハロモナスの、塩、pH、金属などの環境因子に対する挙動を調査した。
以下の４種類の条件の培地のそれぞれに、金属塩を追加しない培地（対照）、0.5mM ZuSO4を追加した培地、6mM CuSO4を追加した培地でハロモナスを37℃で振盪培養し、その生育を600nmでの吸光度を測定することにより評価した。ここで使用した培地は、低リン酸含有の改変MJS培地（15 mM Tris, 50 mM NaCl, 20 mM NH4Cl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 0.05 mM MnCl2, 0.8% (wt/vol) Casamino Acids, 0.4% (vol/vol) glycerol, 0.005% (wt/vol) thiamine）であり、本培地は15mM Trisを追加することで室温でおよそpH8.4になることがわかったので、培地には15mM Trisを追加した。また、培地のpHの調整にはHClを用いた。
1)pH7.0、3% NaCl
2)pH7.0、6% NaCl
3)pH8.4、3% NaCl
4)pH8.4、6% NaCl
【００８５】
結果を図１に示す。この図から、ハロモナスは高塩濃度、高pH条件で良好に生育可能なことがわかる。さらに、Znイオンを追加した培地においても良好に生育し、特に高塩条件での生育が良好であった。また、Cuイオンを追加した培地では、高アルカリ条件で良好な生育を示した。即ち、ハロモナスは高塩濃度かつアルカリ性pHの環境で特徴的な金属ストレス応答を示すことが明らかとなった。【００８６】
大腸菌およびハロモナスにおける金属レメディエーションの比較
大腸菌およびハロモナスの種々のpHにおける水環境圏の汚染金属であるZnとCdを対象とした金属浄化能力を比較した。3% NaClを添加し、pHを7.2に調整した改変MJS培地で前培養した大腸菌及びハロモナス細胞の各培養液25 mLを滅菌50 mL遠心管に移しとり、菌体ペレットを遠心分離（8000 rpm, 1 min）にて回収した。回収菌体ペレットを600 mMマンニトール溶液で洗浄した後、pHを調整した25 mLの20μM ZnCl2および20μM CdCl2を添加した改変MJS培地に再懸濁した。さらに懸濁細胞を37℃で6時間培養後、菌体ペレットを遠心分離（8000 rpm, 1 min）にて回収し、100℃で12時間で乾固した後、菌体とともに回収された金属を1M HClで抽出した。ここで、抽出溶液中の回収金属量の定量には、ICP発光分析装置を用いた。【００８７】
結果を図２（大腸菌）および図３（ハロモナス）に示す。大腸菌ではいずれのpHにおいてもCdイオンとZnイオンの浄化能力は低かった。これに対し、ハロモナスでは、いずれのpHにおいてもZnの浄化能力は低かったが、Cdイオン浄化能力は高く、pHが高くなるにつれてCdイオンを特異的に浄化することができることが判明した。【００８８】
ハロモナスのpH環境に応答した金属蓄積量の変化
上記結果から、好塩性細菌ハロモナスが高塩濃度かつアルカリ性pHの環境で特徴的な金属ストレス応答を示すことが明らかになった。さらにハロモナスの金属ストレスに対する生理応答の理解を深めるために、pH環境に応答した金属蓄積量の変化を誘導結合プラズマ(ICP)発光分析装置により解析した。【００８９】
ICP発光分析
プラスミドpHS15Nの薬剤マーカーとなる抗生物質60 mg/l ストレプトマイシン を加えた5 ml 改変MJS培地(3または6% NaCl, 0.005% チアミンHCl, 0.8% カザミノ酸, 20 mM NH4CL, 0.4% グリセロール, 0.05 mM MnCl2, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl26H2O, 1 mM KCl, 15 mM Tris)でOD600=1.0程度まで37℃で振盪培養した菌体の前培養液を準備した。つづいて、100 mL三角フラスコ内の60 ml 金属含有改変MJS培地(60 mg/l ストレプトマイシン, 各20または25 μM のCdCl2, ZnCl2, CuCl2)に前培養液600 μl（1%）を添加し、37℃で12−24時間（OD600=1.0−1.5程度まで）振盪培養した。培養した菌体を50 ml チューブに移し、遠心分離(3000 rpm, 10 min)し、ペレットとして集菌した。回収した菌体を、3% NaCl 改変MJS培地条件では0.6 Mソルビトール、6% NaCl 改変MJS培地条件では1.2 M ソルビトールを用いて洗浄し、再度遠心分離(3000 rpm, 10 min)して集菌した。集菌した菌体を、100℃, 6 h程度で完全に乾燥させた後、分析のための前処理として硝酸を用いた酸分解反応行った。菌体に1.25 ml硝酸（30％）を加え、65℃, 10 min、95℃, 40 minの加熱分解を行った。95℃の反応終了後に、30%過酸化水素を500 μl加え、余熱で反応させた。最後に反応液を15 mlチューブに回収し、12 mlまでMilliQ水でメスアップした。ICP (Inductively Coupled Plasma) 発光分析装置は、IRIA Intrepid ICAP (Thermo electron社製)を用いて行った。各金属の波長は、それぞれ、Cd2144、Cu3247、Zn2062を用いた。定量解析は、ICP分析装置に付属のTEVA CID Softwareを用いて行った。【００９０】
海水程度の3% NaClを追加した改変MJS培地を使用し、細胞外pHを変化させた環境条件下でのハロモナスのZn/Cd/Cu浄化能について調べた。浄化標的の金属として、20μM ZnCl2、20μM CdCl2、20μM CuCl2を各々単独で、または３種を組みあわせて培地に添加した。用いた条件を以下に示す。【００９１】
【表１】
2007135958.tif 000002
【００９２】
試験はバイオオーグメンテーション（Bioaugmentation；汚染現場に浄化微生物が生息していない培地に、他で培養した微生物を導入して浄化する方法）に近い条件で行った。ハロモナスOUT30018株（野生型）を金属無添加のMJS培地（pH7.2またはpH8.4）で１Lの培養用フラスコ内で400mLスケールで培養（37℃、OD600=1.4程度まで）した後、培養菌液30mLを金属溶液を添加した50mLのファルコンチューブに分注した。次いでロータリーシェーカー内で37℃で6時間培養した後、遠心分離によって菌体ペレットを回収して洗浄した後、ICP発光分析用の試料とした。【００９３】
結果を図４に示す。ハロモナスはアルカリ性pHにおいてCdおよびCuの蓄積量が増大することが明らかになった。【００９４】
ハロモナス外膜にC末端が提示されるリポタンパク質の選抜
大腸菌を用いた研究により、細胞外膜に移行するタンパク質はリポタンパク質であると予測される。リポタンパク質の前駆体はN末端にシグナルペプチドを有し、シグナルペプチド切断部位近傍にリポボックスと呼ばれる共通配列が存在するということが知られている。したがって、ハロモナスの解読されているゲノム配列からリポボックス様配列を有するORFを選択した。以下に候補リポタンパク質を挙げる。
【表２】
2007135958.tif 000003
【００９５】
上記候補タンパク質について、大腸菌でHA-タグ融合タンパク質（即ち候補タンパク質のC末端にTAタグが付加したタンパク質）として生産させ、生細胞の表層をHAタグを利用した免疫蛍光染色することによりC末端が細胞外に提示されたリポタンパク質の選抜を行った。【００９６】
具体的には、上記表中、HeLipop1、4、5、13、15および16の合計6種類の推定リポタンパク質とHAタグの融合タンパク質をコードする組換えベクターを作成した。ベクターにはpETを用いた。組換えベクターの構築は以下のように行った。【００９７】
HeLipop1については、pET15bを用い、そのNcoI/BamHI部位へNcoI-NdeI-HeLipop1-SpeI-HAtag-XhoI-NheI-BamHIのPCR増幅断片を挿入し、pET-HeLipop1-HAを構築した（図５−１）。この際、PCRでゲノムを増幅すると同時に制限酵素部位を付加するため、フォワードプライマーにNcoI-NdeI部位を導入し、制限酵素部位とHAタグを付加するために、リバースプライマーにはSpeI-HAtag-XhoI-NheI-BamHI部位を導入した。【００９８】
その他のORF（HeLipop4、5、13、15および16）については、NdeI-HeLipopORF-SpeIの増幅断片を得るように、フォワードプライマーにNdeI部位を導入し、リバースプライマーにSpeI部位を導入した。PCR増幅で得られたNdeI-HeLipopORF-SpeI断片の、NdeIおよびSpeI部位を利用して、pET-HeLipop1-HA（NcoI-NdeI-HeLipop1-SpeI-HAtag-XhoI-NheI-BamHI）をNdeIとSpeIで切断し、HeLipop1の代わりに各HeLipopORFを導入し、それぞれpET-HeLipop4-HA、pET-HeLipop5-HA、pET-HeLipop13-HA 、pET-HeLipop15-HA、pET-HeLipop16-HAのコンストラクト（図５−２〜図５−６）を得た。【００９９】
得られた6つのpET-HeLipopORF-HAベクターを次いで大腸菌（BL21（DE3)）に導入した。
大腸菌の形質転換は、常套方法の塩化カルシウム法によって行った。【０１００】
その結果得られたpET-HeLipopORF-HAを有する大腸菌を37℃で振盪培養し、OD=0.6のときに0.5 mM IPTGを添加して誘導をかけた。【０１０１】
3時間の培養後、菌体を回収し、PBSバッファー（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, HClにてpH 7.4に調整）で回収ペレットを洗浄した後、細胞を再度PBSバッファーに懸濁してから氷上で超音波破砕した。得られた超音波破砕後の溶液は、全タンパク質サンプルとしてSDS-PAGE解析やウエスタン解析に使用した。【０１０２】
サンプルを常套方法によりSDS-PAGEで分析し、CBB染色およびウエスタンブロッティングにより発現を確認した。結果を図６に示す。ウエスタンブロットの図中、星印は成熟リポタンパク質を示す。いずれのコンストラクトからも、成熟リポタンパク質が発現していることが確認された。【０１０３】
ついで、大腸菌での発現が確認された成熟リポタンパク質について、そのC末端が外膜表面に提示されているのかを確認するため、リポタンパク質のC末端に付加したHAタグに特異的な一次抗体と蛍光標識二次抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。実際の操作としては、pET-HeLipopORF-HAを有する大腸菌を37℃で振盪培養し、OD=0.6のときに0.5 mM IPTGを添加して誘導をかけ、3時間培養後、2 mL の培養菌体を遠心分離によって回収し、2 mL PBSバッファーで回収ペレットを洗浄した。続いて回収ペレット細胞を2 mL PBS-BSAバッファー(0.1% BSA含有PBS)に懸濁し、室温にて１時間インキュベートして細胞表層タンパク質のブロッキングを行った。ブロッキング後、細胞を遠心分離によって回収し、0.5 mL PBS-BSAに懸濁した後、一次抗体（ラット抗HA抗体、1:500希釈）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、1 mL PBS-BSAで３回洗浄した後、0.2 mL PBS-BSAに再懸濁し、蛍光標識用の二次抗体（Alexa488接合抗ラットIgG抗体、1:200希釈）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、1 mL PBS-BSAで３回洗浄した後、0.05 mL PBS-BSAに再懸濁し、蛍光顕微鏡下で免疫蛍光染色された細胞を観察した。【０１０４】
結果を図７に示す。HeLipop4、5、15および16の4種類のリポタンパク質のC末端に付加したHAタグが免疫蛍光によって染色され、該タンパク質が細胞表層ディスプレーシステムの基盤タンパク質として利用可能であることが示された（HeLipop1および13のC末端はペリプラズム側に配向していると考えられる。この点について、図８を参照）。【０１０５】
改変型ハロモナス／大腸菌シャトルベクターpHS15を利用した組換えタンパク質産生
細胞表層ディスプレーシステムの基盤タンパク質をハロモナスを宿主として評価するために、ハロモナス／大腸菌シャトルベクターpHS15（Mol Gen Genet. 1995 Feb 20;246(4):411-418にて発表した開発者のNieto, J.J.教授より入手）の制限酵素部位を改変し、シャトルベクターpHS15Nを構築した。【０１０６】
利用したpHS15シャトルベクターは大腸菌とハロモナスの両方の複製起点を含み、ハロモナスで外来タンパク質を産生することができることが報告されている。特徴としては、発現には内在性のプロモーターが利用可能であること、また、ベクター上のPstI部位に目的遺伝子をポリシストロン性の遺伝子のカセットとして挿入することで発現可能であることの２点が挙げられる（Mol Gen Genet. 1995 Feb 20;246(4):411-118およびFEMS Microbiology Letters 201(2001)221-227を参照）。【０１０７】
しかしpHS15におけるPstI部位のみでは既に大腸菌発現用に構築したpET系プラスミドから直接pHS15系プラスミドへポリシストロン性の遺伝子カセットとして遺伝子断片を移し換えるのは不適であるため、pHS15内のクローニングサイトを改変した。図９に示すようにpHS15のPstI部位にSpeI、NsiI、KpnI、PmlI、SalI、SnaBI、BamHIを導入すると同時に元のPstI部位を破壊した。また、同じく図９に示すように、元のpHS15のBamHI、SpeI、XbaI、NotIを含む断片およびSalI、XhoI、ApaI/DraII、XpnI部位を含む断片を除去した。【０１０８】
先に用いたpET-HeLipopORF-HAベクターでは、XbaI部位の下流にリボゾーム結合部位があるため、目的遺伝子（HeLipopORF）の上流のXbaIと下流のXhoI/BamHI部位で切断することにより、XbaI-HeLipopORF-HA-XhoI/BamHI断片が得られ、それをpHS15NのSpeI部位と新たに導入したSalI/BamHI部位の間の断片と置換することにより、目的遺伝子（HeLipopORF-HA）をpET系からpHS15Nシャトルベクターに移し換えることが可能である。即ち、シャトルベクターpHS15Nの構築の結果、同一のベクターを導入した大腸菌およびハロモナスにおける組換えタンパク質の産生が可能となった。【０１０９】
上記のごとく改変したシャトルベクターpHS15NのSpeI部位とSalI/BamHI部位の間にHeLipopORF-HAを含む6種の組換えベクター（pHS15N-HeLipop1-HA、pHS15N-HeLipop4-HA、pHS15N-HeLipop5-HA、pHS15N-HeLipop13-HA、pHS15N-HeLipop15-HA、pHS15N-HeLipop16-HA）を大腸菌およびハロモナスにそれぞれ導入した。大腸菌の形質転換は塩化カルシウム法を使用した。また、ハロモナスの形質転換は、3親接合法によって次のように行った。構築ベクターを保持した大腸菌株と伝達遺伝子を持つ可動性のヘルパープラスミド（pRK2013）を保持した大腸菌株および受容菌であるハロモナスの３種類の菌株を共存培養培地（2% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, 1.5% Agar）上にて37℃で１晩培養した後、大腸菌の生育を阻害する高濃度のNaClを添加した抗生物質を含有する選抜培地(240 mg/L ストレプトマイシン、6% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, 1.5% Agar) 上で37℃にて２晩培養し、組換えハロモナス菌株を選択した。【０１１０】
その結果得られたpHS15N-HeLipopORF-HAを有する大腸菌およびハロモナスを37℃で１晩振盪培養した。ここで、大腸菌の培養にはLB培地（1% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone）、ハロモナスの培養には3% NaCl含有LB培地（3% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone）を使用した。この系のプロモーターは構成的プロモーターであるため誘導をかける必要はなかった。【０１１１】
一晩培養後、菌体を回収し、PBSバッファー（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, HClにてpH 7.4に調整）で回収ペレットを洗浄した後、細胞を再度PBSバッファーに懸濁してから氷上で超音波破砕した。得られた超音波破砕後の溶液は、全タンパク質サンプルとしてSDS-PAGE解析やウエスタン解析に使用した。【０１１２】
サンプルを常套方法によりSDS-PAGEで分析し、CBB染色およびウエスタンブロッティングにより発現を確認した。結果を図１０に示す。pHS15N-HeLipop1-HA、pHS15N-HeLipop5-HA、pHS15N-HeLipop15-HA、pHS15N-HeLipop16-HAから、大腸菌およびハロモナスの両方で成熟リポタンパク質が発現していることが確認された。【０１１３】
ついで、ハロモナスでの発現が確認された成熟リポタンパク質について、そのC末端が外膜表面に提示されているのかを確認するため、リポタンパク質のC末端に付加したHAタグに特異的な一次抗体と蛍光標識二次抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。実際の操作としては、pET-HeLipopORF-HAを有する大腸菌またはハロモナスを37℃で一晩振盪培養した後、2 mL の培養菌体を遠心分離によって回収し、2 mL PBSバッファーで回収ペレットを洗浄した。続いて回収ペレット細胞を2 mL PBS-BSAバッファー(0.1% BSA含有PBS)に懸濁し、室温にて１時間インキュベートして細胞表層タンパク質のブロッキングを行った。ブロッキング後、細胞を遠心分離によって回収し、0.5 mL PBS-BSAに懸濁した後、一次抗体（ラット抗HA抗体、1:500希釈）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、1 mL PBS-BSAで３回洗浄した後、0.2 mL PBS-BSAに再懸濁し、蛍光標識用の二次抗体（Alexa488接合抗ラットIgG抗体、1:200希釈）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、1 mL PBS-BSAで３回洗浄した後、0.05 mL PBS-BSAに再懸濁し、蛍光顕微鏡下で免疫蛍光染色された細胞を観察した。【０１１４】
結果を図１１に示す。大腸菌と同様に、HeLipop5、15および16の3種類のリポタンパク質のC末端に付加したHAタグが免疫蛍光によって染色され、該タンパク質が細胞表層ディスプレーシステムの基盤タンパク質として利用可能であることが示された。HeLipop1では蛍光を放つ細胞は観察されなかった（HeLipop4については実験せず）。【０１１５】
ハロモナス細菌表面におけるHeLipopと金属結合タンパク質の融合タンパク質の発現
以上の結果から、HeLipop4、5、15および16がハロモナス細菌表面に目的タンパク質を提示させる機能を有することが示唆されたので、実際に重金属（CdおよびHg）浄化に有用であることが大腸菌を用いて確認されている(EC)nGペプチド配列（ファイトケラチンアナログ）をHeLipop5に付加して融合したキメラ遺伝子HeLipop5-(EC)8Gを構築した（Bae W, et al., Biotechnol Bioeng 70:518-524(2000)）。【０１１６】
pHS15N-HeLipop5-HAのHA部分をグルタミン酸とシステインの交互の繰り返し配列であるEC8配列（即ちECECECECECECECEC）と置換して、HeLipop5のC末端にEC8配列を融合させたコンストラクトpHS15N-HeLipop5-EC8を構築した（図５−７参照）。実際の構築手順としては、まず、pET15bにPCRによりFLAGタグおよび制限酵素サイトを付加したEGFP断片（NcoI-FLAG-SpeI-NdeI-XhoI-EGFP-SnaBI-PmlI-SalI-BamHI）を挿入してpFLAG-EGFPを構築した。ついで、EC8断片として、人工のSalI-EC8-XhoI配列をコードした1組の相補鎖オリゴDNA（EC8-U, TCGACGAATGCGAATGCGAATGCGAATGCGAGTGCGAGTGCGAGTGCGAGTGCGGTC; EC8-B, AGCTCTGGCGTGAGCGTGAGCGTGAGCGTGAGCGTAAGCGTAAGCGTAAGCGTAAGC ）のアニーリング産物を得た後、pFLAG-EGFPのXhoIサイトにEC8断片を挿入してpFLAG-EC8-EGFPを構築した（図５−８参照）。そして、pFLAG-EC8-EGFPのSpeI-NdeI-EC8-XhoIを切り出してEC8配列断片とし、HeLipop5-HAのSpeI-HA-XhoI断片と置換することで、pHS15N-HeLipop5-EC8を構築した（図５−７参照）。【０１１７】
得られたpHS15N-HeLipop5-EC8を３親接合法により、ハロモナスに導入した。【０１１８】
その結果得られたpHS15N-HeLipop5-EC8を有するハロモナスを37℃にて3% NaCl含有LB培地を用いて１晩振盪培養した。【０１１９】
１晩培養後、菌体を回収し、PBSバッファー（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, HClにてpH 7.4に調整）で回収ペレットを洗浄した後、細胞を再度PBSバッファーに懸濁してから氷上で超音波破砕した。得られた超音波破砕後の溶液は、全タンパク質サンプルとしてSDS-PAGE解析やシステイン含有のチオールタンパク質の標識解析に使用した。【０１２０】
サンプルを常套方法によりSDS-PAGEで分析し、CBB染色および、システインを標識する試薬であるmBBrを用いて、pHS15N-HeLipop5-EC8の発現を確認した。検出はLAS3000およびGFPフィルターを用いて行った。結果を図１２に示す。pHS15N-HeLipop5-EC8から、システインを含有した融合リポタンパク質が発現していることが確認された。【０１２１】
さらにpHS15N-HeLipop5-EC8を有するハロモナスによる金属浄化能をICP発光分析により評価した。【０１２２】
海水程度の3% NaClを追加した改変MJS培地（15 mM Tris, 3% NaCl, 20 mM NH4Cl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 0.05 mM MnCl2, 0.8% (wt/vol) Casamino Acids, 0.4% (vol/vol) glycerol, 0.005% (wt/vol) thiamine）を使用して、細胞外pHを変化させた環境条件下でのハロモナスのZn/Cd/Cu浄化能について調べた。15mM Trisを追加することでMSJ培地は室温でおよそpH8.4になることがわかったので、培地には15mM Trisを追加した。培地のpHの調整にはHClを用いた。浄化標的の金属として、20μM ZnCl2、20μM CdCl2、20μM CuCl2を各々単独で、または３種を組みあわせて培地に添加した。用いた条件を以下に示す。
【表３】
2007135958.tif 000004
【０１２３】
試験はバイオオーグメンテーション（Bioaugmentation；汚染現場に浄化微生物が生息していない培地に、他で培養した微生物を導入して浄化する方法）に近い条件で行った。pHS15N-HeLipop5-EC8を有するハロモナスOUT30018株を金属無添加の改変MJS培地（pH7.2またはpH8.4）で1Lの培養用フラスコ内で400mLスケールで培養（37℃、OD600=1.4程度まで）した後、培養菌液30mLを金属溶液を添加した50mLのファルコンチューブに分注した。次いでロータリーシェーカー内で37℃で6時間培養した後、遠心分離によって菌体ペレットを回収して洗浄した後、ICP発光分析用の試料とした。【０１２４】
結果を図１３に示す。pHS15N-HeLipop5-EC8を有するハロモナスはZn、CdおよびCuの蓄積量が増大することが明らかになった。Cdについては培地にCdのみを添加した場合の方がZn/Cd/Cuを混合して添加した場合よりもより多くのCdイオンを蓄積した。一方CuについてはZn/Cd/Cuを混合して添加した場合にCuのみを添加した場合よりも多くのCuイオンを蓄積した。これらの結果から金属結合ペプチドEC8が実際にハロモナス細胞表層に発現し、金属イオンを浄化することが出来ることが確認された。【０１２５】
上記の結果から、ハロモナスは、高塩濃度かつアルカリ性環境下で亜鉛（Zn）、銅（Cu）に対して耐性を示し、カドミウム（Cd）、Cuを高蓄積するという特徴的な金属応答性を示すことが明らかとなった。そこで以後、ハロモナスの特徴的な金属応答の分子機構に関与することが予想される金属結合タンパク質に着目し、既に解読が完了したハロモナスゲノム情報を用いて、推定金属結合タンパク質を網羅的に探索することにした。さらに、選抜した推定金属結合タンパク質の金属結合ドメインを細胞表層に提示したアーミングハロモナス細胞を作製し、重金属浄化への応用を試みた。【０１２６】
推定金属結合ドメインの金属結合特性の評価
上記のように、既知の金属結合ドメインである合成ファイトケラチンペプチド（EC8）を細胞表層に提示した組換えハロモナスを用いて、単一金属存在環境下での、Cu, Cd, Znに対する結合能をICP発光分析で確認した。その結果、それぞれの金属に対する結合能が確認されたが、Cu, Cd, Znの混合金属環境下では、Zn, Cdへの結合能はみられず、Cuに特異的な結合能が高いことが示唆された。【０１２７】
そこで、ハロモナスの内在性金属結合ドメインを探索するにあたり、どのような配列のペプチドが金属結合能に優れているのかを調べるため、合成ペプチドを用いた実験を行った。アミノ酸ヒスチジン（His)およびシステイン（Cys)は金属と直接作用していると考えられている。【０１２８】
そこで、本研究では、CysやHisの近傍のアミノ酸配列によって、金属の結合特性が変化するかどうかを調べるため、His/Cys-richの８種類の人工金属結合ペプチド（EC6, DC6, GC6, HC6, HD6, HE6, HG6, H12）を作成し、それらを細胞表層に提示した組換えハロモナスを作製し、混合金属環境下で細胞表層にトラップされた金属をICP発光分析により定量化した。【０１２９】
１−１）人工金属結合ドメイン発現用コンストラクトの作成
この実験では、上記実験において用いたHeLipop5-EC8の場合と異なり、生産されたタンパク質量を比較できるように、HeLipop5とHAエピトープタグの間に人工金属結合ペプチドを挿入したコンストラクトを作成した。【０１３０】
実際に、ハロモナスに導入したプラスミドは以下の通りである。
以下、３つは先の実験において作成したものを使用した。
・pHS15N-HeLiopop5-EC8
・pHS15N vector control
・pHS15N-HeLiopop5-HA
以下、８つは高塩アルカリ環境での金属浄化に有用な合成金属ペプチドを選択するために構築した。
・pHS15N-HeLiopop5-(EC6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(DC6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(GC6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(HC6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(HD6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(HE6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(HG6)-HA
・pHS15N-HeLiopop5-(H12)-HA
以下、６つは、上記の８つから選択された高塩アルカリ環境で有用な合成金属結合ペプチドを多重コピー導入し、金属回収量の増加を試みるために構築した。
・pHS15N-HeLipop5-(EC6)2-HA
・pHS15N-HeLipop5-(EC6)3-HA
・pHS15N-HeLipop5-(EC6)4-HA
・pHS15N-HeLipop5-(DC6)2-HA
・pHS15N-HeLipop5-(DC6)3-HA
・pHS15N-HeLipop5-(DC6)4-HA【０１３１】
上記のプラスミドを構築するために、人工金属結合ドメイン（人工金属結合ドメインを以下MBPと称することもある）（EC6, DC6, GC6, HC6, HD6, HE6, HG6, H12）をコードするDNAを設計し、合成オリゴDNAを用いたアニーリング法によって両端にSpeI/NheI粘着末端を保持したDNA断片（SpeI-MBP-NheI）を合成した。【０１３２】
続いて、以前に構築したpET-HeLipop5-HAプラスミドのSpeI切断部位に上記のSpeI-MBP-NheI断片を挿入し、pET-HeLipop5-MBP-HAを構築した。ここで、SpeI切断部位とNheI切断部位とは連結可能であるが、連結後は認識配列が変化するために切断不可能になることを利用し、導入した遺伝子の向きを判定した。さらに、再切断可能なSpeI切断部位にSpeI-MBP-NheI断片を再挿入することで、MBPを多重コピー導入できるようにし、提示したタンパク質1分子あたりの金属結合量の増加が期待できるpET-HeLipop5-(MBP)n-HAの構築を行った。【０１３３】
下記のpET系プラスミドについては、大腸菌BL21(DE3)細胞の発現系を用いてタンパク質を生産させ、HAエピトープ認識抗体を用いたウエスタン解析によってタンパク質の生産を確認した。
・pET-HeLiopop5-(EC6)-HA
・pET-HeLiopop5-(DC6)-HA
・pET-HeLiopop5-(GC6)-HA
・pET-HeLiopop5-(HC6)-HA
・pET-HeLiopop5-(HD6)-HA
・pET-HeLiopop5-(HE6)-HA
・pET-HeLiopop5-(HG6)-HA
・pET-HeLiopop5-(H12)-HA
MBP多重コピー導入プラスミド
・pET-HeLipop5-(EC6)2-HA
・pET-HeLipop5-(EC6)3-HA
・pET-HeLipop5-(EC6)4-HA
・pET-HeLipop5-(DC6)2-HA
・pET-HeLipop5-(DC6)3-HA
・pET-HeLipop5-(DC6)4-HA
・pET-HeLipop5-(GC6)2-HA
・pET-HeLipop5-(GC6)3-HA
・pET-HeLipop5-(GC6)4-HA【０１３４】
最終的なハロモナス用発現ベクターの構築は、上記と同様に、pET-HeLipop5-MBP-HAのXbaI/XhoIを切断して生じるXbaI-HeLipop5-MBP-HA-XhoI断片をpHS15NのSpeI/SalI切断部位に連結して行った。その結果得られた、pHS15N-HeLipop5-MBP-HAを上記のように三親接合法によりハロモナスに導入し、アーミングハロモナスを作製した。【０１３５】
なお、図１４に、三親接合法に用いたpHS15N-HeLipop5-MBP-HAの部分配列を示す。また、図１５−１に、pET-Helipop5-HA、図１５−２〜１５−９に各人工金属結合ペプチドを含むpET-HeLipop5-MBP-HAの構築を示す。さらに、図１６−１〜１６−２に各人工金属結合ペプチドをコードする、SpeI-MBP-NheIの断片を示す。【０１３６】
１−２）人工金属結合ドメインの金属結合特性の評価
合成ファイトケランチン（EC8）以外の人工金属結合ペプチドについて、ハロモナス細胞表層に提示した場合の重金属捕捉能について検討した。3% NaClかつpH8.4でのCu/Zn/Cd混合条件についてのみ行い、混合金属条件下での特異的な金属の浄化に有用なペプチドの選択を試みた。具体的には以下のようにして、pHS15N-HeLipop5-MBP-HAを有するハロモナスによる金属浄化能をICP発光分析により評価した。【０１３７】
海水程度の3% NaClを追加した改変MJS培地（15 mM Tris, 3% NaCl, 20 mM NH4Cl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 0.05 mM MnCl2, 0.8% (wt/vol) Casamino Acids, 0.4% (vol/vol) glycerol, 0.005% (wt/vol) thiamine）を使用して、ハロモナスのZn/Cd/Cu浄化能について調べた。15mM Trisを追加することでMSJ培地は室温でおよそpH8.4になることがわかったので、培地には15mM Trisを追加した。浄化標的の金属として、20μM ZnCl2、20μM CdCl2、20μM CuCl2を組みあわせて培地に添加した。【０１３８】
試験はバイオオーグメンテーション（Bioaugmentation；汚染現場に浄化微生物が生息していない培地に、他で培養した微生物を導入して浄化する方法）に近い条件で行った。pHS15N-HeLipop5-MBP-HAを有するハロモナスOUT30018株を金属無添加の改変MJS培地（pH8.4）で1Lの培養用フラスコ内で400mLスケールで培養（37℃、OD600=1.4程度まで）した後、培養菌液30mLを金属溶液を添加した50mLのファルコンチューブに分注した。次いでロータリーシェーカー内で37℃で6時間培養した後、遠心分離によって菌体ペレットを回収して洗浄した後、ICP発光分析用の試料とした。【０１３９】
本実験では、EC8と同等な意味合いでEC6-HAを構築したが、HAが末端についているために、以前に構築したEC8と直接に比較することができない。そのため、ベクターのみに加え、HAのみを発現したものをネガティブコントロールとした。また、EC8は、ポジティブコントロールとして使用した。【０１４０】
結果を図１７に示す。Cys-richドメインを表層に提示したとき、金属蓄積量が増加することが示された。特に、EC6, DC6は、それぞれCu, Cdの選択的結合が見られた。また、高塩アルカリ環境では、Hisリッチな配列は金属結合能が低く、Cysリッチな配列（ＥＣ６，ＤＣ６，ＧＣ６，ＨＣ６）の方が金属結合能が高く、金属浄化や金属資源回収に有用であることが判明した。また、Cysリッチな配列の中でも、酸性アミノ酸であるE/Dが隣接したドメイン（ＥＣ６、ＤＣ６）が有用であることが示唆された。さらに、Cuの浄化および資源回収を想定した場合はECモチーフの方が、Cdの浄化および資源回収を想定した場合はDCモチーフの方が、より適切であることが示唆された。結果的にEC6について、EC8と比べても十分金属蓄積の向上が観察されているので、金属結合能の評価には6回繰り返しで十分であることも分かった。【０１４１】
１−３）多重人工金属結合ドメインの発現
EC6およびDC6を多コピー導入したハロモナスについてウエスタン解析を行った。結果を図１８に示す。この結果より、EC6またはDC6ドメインを四回繰り返した場合の発現量は、１回繰り返しに比べて４分の１以下になっていないことがわかる。即ち、発現量が４分の１以下ならば、多コピー発現しても金属結合能力の増加は期待されないが、本実験により、細胞表層に提示されたシステインの数は確実に増えていることが証明された。したがって、多重人工金属結合ドメインの導入により、さらに金属結合能が増強したハロモナスが得られると期待される。【０１４２】
２−１）ハロモナス内在性推定金属結合ドメインの金属結合特性の評価
人工金属結合ドメインの研究により、CysまたはHisリッチなドメインの有効性を検証した結果、これまでに大腸菌等で弱酸性または中性環境で有用とされていたHisリッチなドメインは、高塩アルカリ環境では効果が無いことが示された。この結果により、これまでに環境条件が異なる条件での実験により金属結合能が評価された情報は、現実には他の環境条件では無意味であり、目的の環境において実験的に検討することが重要であることが判明した。その一方で、Cysリッチなドメインは、高塩アルカリ環境でも非常に効果的であることが判明した。さらに、酸性アミノ酸が隣接したCysリッチの金属結合ドメインが特に有効であることが示唆された。そこで、今後の内在性金属結合ドメインの選抜は、Cysリッチドメインについて行い、さらに酸性アミノ酸が隣接したCysリッチドメインを優先的に候補とした。【０１４３】
そこで、ハロモナスのゲノム上から網羅的に選抜したHisまたはCysリッチな推定金属結合ドメインのうち、Cysリッチでかつ酸性アミノ酸が隣接した推定金属結合ドメインについて、高塩アルカリ環境下での金属結合能を評価することにした。【０１４４】
２−２）ゲノム情報を用いた推定金属結合タンパク質の探索
金属と直接作用すると考えられるアミノ酸であるヒスチジン（His）、システイン（Cys）を指標として、推定金属結合ドメインを持つタンパク質を選抜した。タンパク質を10, 20, 30アミノ酸で区切り、その中に含まれるHisまたはCysの個数を指標にして順位付けをした。Cysについては、さらに酸性アミノ酸が隣接するものを上位とした。【０１４５】
具体的には、金属結合性が高い金属結合ドメインとして、イミダゾール基をもつHisやチオール基をもつCysを指標にハロモナスのORFに絞込みをかけた。短いドメインの探索のためには、通常のBLASTなどの相同性解析は使用できないため、独自に絞込みのバイアスをかけて推定翻訳産物のタンパク質配列データから推定金属結合ドメインの絞込みを行った。特に、2価の陽イオンの状態で環境水中に溶存するCu, Zn, Cdなどを標的にした場合は、酸性アミノ酸（E, D）のネガティブチャージによって金属の親和性が高まることが予想されるので、候補配列の多いCysリッチなドメインの場合は、さらに酸性アミノ酸が隣接しているCysを多く含むものをさらに絞り込んでランキングを作成した。実際には、分子生物学研究用に開発された無償のオープンソフトパッケージのEMBOSS（http://emboss.sourceforge.net/）に導入されているOddcomp programを用いて、予想アミノ酸配列データからの重金属結合タンパク質の選抜を試みた。しかしながら、Oddcompによって生成されるデータがORF名の羅列であったため、その後さらなる対象ORFの絞込み作業には適さないという問題が生じた。この問題を回避するために、Oddcompの生成データに対して、すべてのORF名に対して総当り一致比較を行い、一致する場合は値「１」を一致しない場合は値「０」として結果をMatrixとして生成させるPerl programを独自に作成した。これにより、Oddcomp の生成データから、全ORFを網羅したMatrixデータを作成することができた。さらに、MatrixデータをExcelに読み込んで表データとすることで、全ORFに対して絞込み検索ができるようにした。その結果、最終的には表４のような、ランキング表を作成した。【０１４６】
上位に選抜されたHis/Cys-richタンパク質の遺伝子の全長ORFと推定金属結合ドメインの遺伝子配列について、上位のものから順次クローニングを行った。以下の表４に、上位にランキングされたORFを示す。また、そのアミノ酸配列については図１９−１〜１９−５に示す。
【表４】
2007135958.tif 000005
【０１４７】
しかし、先のＩＣＰ発光分析の結果から、これ以降は、選抜した推定金属結合タンパク質のうち、Cys-rich推定金属結合ドメインの遺伝子について、優先的に金属結合特性の評価実験を行うこととした。そこで、推定金属ドメインの遺伝子領域をPCR法又はアニーリング法で合成した。内在性の推定金属結合ドメインをコードするORFの部分領域（遺伝子領域）をサブクローニングするために、ドメイン部分DNA配列で100bp以上の配列はPCR法でクローン化し、それ以下のドメインについては、2本の相補的な合成オリゴDNAをアニ−ル（試験管内で2本鎖DNAとなるように会合）させることでクローン化するアニ−リング法を用いた。内在性ペプチドを提示させるためのコンストラクトの構築は、人工ペプチドと同様に行った。ただし、制限酵素部位を改変し、XbaI-（内在性MBP)-SpeIとなるようにした。【０１４８】
推定金属結合ドメインをコードするDNAをハロモナスの細胞表層に提示するベクターへサブクローニングし、人工金属結合ドメインの実験と同様にICP発光分析を行った。その結果から、標的重金属に特異的な結合ドメインを選定した。実験に使用したハロモナスの内在性ペプチドを以下の表５に示す。
【表５】
2007135958.tif 000006
【０１４９】
なお、人工推定金属結合ペプチドおよび内在性推定金属結合ペプチドのコンストラクト構築に用いたプライマーを以下の表６に示す。
【表６】
2007135958.tif 000007
【０１５０】
金属結合能の評価は、先の人工推定金属ペプチドの場合と同様にして行った。即ち、高塩アルカリ環境中の重金属浄化および金属資源回収に有用な金属結合ドメインを選抜するために、内在性金属結合ペプチドの高塩アルカリ環境中（６％NaClまたは３％NaCl、ｐH8.4、20μM Cu/Cd/Zn)での金属結合能を調べた。【０１５１】
結果を図２０に示す。図２０−１は６％NaCl存在下、図２０−２は３％NaCl存在下でのICP分析の結果を示す。即ち、ゲノム情報から選抜した酸性アミノ酸が隣接しているCysがリッチな内在性タンパク質の推定金属結合ドメインについて、5種類をハロモナスの表層に提示することで、金属結合活性を評価した。【０１５２】
内在性の配列は、人工ドメインと比べ、Cysの繰り返し度合いが少ないためNaCl３％では差を検出しにくなっているが（図２０−２）、6％の厳しい条件にすると差が顕著に現れた（図２０−１）。人工金属結合ドメインでは、3％NaCl, pH 8.4ではEC6, DC6が有用であり、特にCuに対して有効であった（図１７)。しかし、Cdに対しては、EC6よりもDC6の方が有用であることが示唆された（図１７)。さらに厳しい条件である海水の2倍程度の6％NaCl, pH 8.4では、酸性アミノ酸の存在に関わらず、EC6, DC6, GC6とも同様にCuに対して特に有用であることが示され（図２０−１）、さらに、内在性のドメインとしては、C2-1はCdおよびZnに対して有用であり、C5はZnに対して特に有用であることが示された。また、C1-1はCuに対して特に有用であることが示された（図２０−１）。【０１５３】
３−１）多重人工金属結合ドメインを提示するハロモナスの金属蓄積量
図２０−１において、人工の金属結合ペプチドであるEC6およびDC6は、海水の２倍程度の高塩濃度下で、銅に特異的な結合能を有することが示された。そこで１分子当たりの金属結合ドメインのコピー数の増加により、金属結合ドメインを提示する細胞の金属結合能が増加するかどうかを調べた。【０１５４】
上記１−２）の人工金属結合ドメインの金属結合特性の評価の項で記載したようにして、ICP発光分析を行った。ただし、pH8.4、6%NaCl、MJS培地にZn、Cd、Cuの３種の金属を25μMずつ添加した条件で培養後、細胞を回収し、1.2Mソルビトール溶液で洗浄後、ICP発光分析に供した。【０１５５】
その結果、図２１に示すように、結合量は金属結合ドメインのコピー数の増加とともに増加する傾向があることが示された。しかしながら、今回のアッセイ条件では、EC6では２コピー数、DC6では、３コピー数程度の条件で銅の結合能に閾値があることが示された。図２１において、用いた略記は以下の通りである。
Vec: pHS15N
HA: pHS15N-HeLipop5-HA
(EC6)1-HA : pHS15N-HeLipop5-(EC6)1-HA
(EC6)2-HA : pHS15N-HeLipop5-(EC6)2-HA
(EC6)3-HA : pHS15N-HeLipop5-(EC6)3-HA
(EC6)4-HA : pHS15N-HeLipop5-(EC6)4-HA
(DC6)1-HA : pHS15N-HeLipop5-(DC6)1-HA
(DC6)2-HA : pHS15N-HeLipop5-(DC6)2-HA
(DC6)3-HA : pHS15N-HeLipop5-(DC6)3-HA
(DC6)4-HA : pHS15N-HeLipop5-(DC6)4-HA
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
今回、人工金属結合ドメインのみならず、セルフクローニング型組換え技術に有用なハロモナスゲノム配列上に存在する内在性金属結合ドメインを取得することに成功した。また、表層工学技術は、有用な金属結合ドメインの選抜にも有用な技術であると同時に、選抜された有用金属結合ドメインを提示した細胞そのものが環境浄化や金属回収技術に応用可能であると期待される。【０１５７】
本発明によって開発した細胞表層工学により、ハロモナスの金属耐性を保持したまま金属浄化効率を高めることが可能になり、ハロモナスの金属耐性によるバイオマス増加と提示した金属結合ペプチドによる金属浄化量の増加による相乗的な効果が期待される。よって、ハロモナスの性質と細胞表層工学は一緒になることでこれまでにない性質が開発可能となる。また、塩濃度を変化させることにより、金属結合の特異性を制御できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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