(57)【要約】グルタミン酸以外のアミノ酸を代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用いる。より好ましくは、アスパラギン酸、バリン、又はシステインをグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用い、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、又はヒドロキシプロリンをグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用い、システインをグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸以外のアミノ酸から選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなる代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項２】
さらに核酸を含有する、請求項１に記載の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項３】
さらにカチオンを含有する、請求項１又は２に記載の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項４】
アスパラギン酸、バリン、システインから選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項５】
さらに核酸を含有する、請求項４に記載のグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項６】
さらにカチオンを含有する、請求項４又は５に記載のグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項７】
アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項８】
さらに核酸を含有する、請求項７に記載のグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項９】
さらにカチオンを含有する、請求項７又は８に記載のグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項１０】
システインを含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項１１】
さらに核酸を含有する、請求項１０に記載のグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項１２】
さらにカチオンを含有する、請求項１０又は１１に記載のグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療するための医薬。
【請求項１４】
グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
代謝型グルタミン酸受容体がグループI代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸、バリン、又はシステインである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
代謝型グルタミン酸受容体がグループII代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、又はヒドロキシプロリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
代謝型グルタミン酸受容体がグループIII代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がシステインである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項１９】
（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項２０】
（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項２１】
（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかに記載する活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療するための医薬。
【請求項２３】
（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを用いることを特徴とする代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項２４】
代謝型グルタミン酸受容体が、グループI代謝型グルタミン酸受容体、グループII代謝型グルタミン酸、または受容体グループIII代謝型グルタミン酸受容体である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルタミン酸以外のアミノ酸を含有する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤に関する。本発明はまた、グルタミン酸以外のアミノ酸、並びに核酸及び／又はカチオンを含有する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤に関する。本発明はさらに、グルタミン酸及び核酸、又はグルタミン酸、核酸及びカチオンを含有する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の中枢神経系において、アミノ酸の一つであるグルタミン酸は興奮性神経伝達物質の中で主要なものである。電気生理学的、解剖学的、生化学的な分析により、急速な興奮性シナプス伝達、神経伝達物質放出の制御、長期増強、学習・記憶、成長性シナプス可塑性、低酸素性虚血傷害・ニューロン細胞の死、てんかん様発作、いくつかの神経変性障害の病変性など多くのニューロン作用過程には、グルタミン酸が関与していることが示されている。
さらに、最近、グルタミン酸が中枢神経系の神経伝達物質としてはたらくだけでなく、例えば、胃や腸等の消化管に作用した場合、胃酸の分泌や消化管の動きを促進することが示された。神経細胞に留まらず生体内で広く有用に作用することが認められ始めている。【０００３】
近年、グルタミン酸の作用機構を解明するため、グルタミン酸受容体に関する研究が進行した（非特許文献１〜８参照）。グルタミン酸受容体はイオンチャンネル型受容体と代謝型受容体に分類される。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体がリガンドゲートのイオンチャネルであり、グルタミン酸が作用することで細胞内に陽イオンが流れ込む。一方、代謝型グルタミン酸受容体はＧタンパク質結合受容体であり、グルタミン酸が作用することで、Gタンパク質の種類に応じて、細胞外シグナルを細胞内第２メッセンジャーに変換する。【０００４】
代謝型グルタミン酸受容体には、８種類（ｍGluR1〜ｍGluR8）のサブタイプが存在し、アミノ酸配列の相同性に基づき、３つのグループ（グループI、II、III）に分類されている。各グループ内のアミノ酸配列相同性は、70％程度と保存されているが、グループ相互では50％以下となる。また、これまで報告されている代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤や阻害剤はサブタイプ固有のものが存在するものの、グループ内で共通する場合が多いことからも、グループ内の構造は近似していると考えられている。【０００５】
グループ内では結合するGタンパク質の種類も共通している。グループIに属する代謝型グルタミン酸受容体は、サブタイプ１及び５（ｍGluR1及びｍGluR5）であり、この受容体へグルタミン酸が作用すると、Ｇｑに共役してホスホリパーゼＣを活性化し、IP3を産生する。グループIIに属する代謝型グルタミン酸受容体は、サブタイプ２及び３（ｍGluR2及びｍGluR3）で、グルタミン酸が作用すると、Ｇｉに共役してアデニル酸シクラーゼを阻害して、細胞内ｃＡＭＰが減少する。グループIIIに属する代謝型グルタミン酸受容体は、サブタイプ４、６、７及び８（ｍGluR4、ｍGluR6、ｍGluR7及びｍGluR8）で、グルタミン酸が作用すると、Ｇｉに共役してアデニル酸シクラーゼを阻害して、細胞内ｃＡＭＰが減少する。【０００６】
代謝型グルタミン酸受容体は、生体内機能に促進的にはたらく場合もあれば、抑制的にはたらく場合もある。神経疾患、肝臓疾患、循環器疾患、消化器疾患、その他の疾患において、活性化剤作用の治療薬と抑制剤作用の治療薬が病態に応じて使い分けられる。
代謝型グルタミン酸受容体の機能解析は、主として神経細胞活動に関して行われてきたため、今日までの応用研究も神経疾患が中心であった。しかし、遺伝子発現解析などの結果から、代謝型グルタミン酸受容体が中枢神経系以外の生体内に広く分布していることが明らかになり、様々な生体機能、疾患病因に関わっている可能性が提起された。例えば、グループI代謝型グルタミン酸受容体は肝臓、心臓、リンパ球に、グループII代謝型グルタミン酸受容体は心臓、小腸に、グループIII代謝型グルタミン酸受容体は膵臓に発現し、各細胞の機能に関わることが報告されている。本発明者もヒト及びラットの各組織から抽出したＲＮＡを材料とした、RT-PCRによる解析から、生体内において広範囲の組織に発現していることを確認した。以上のことから、現在、代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤や阻害剤の応用価値が急速に高まっていると言っても過言ではない。
【非特許文献１】J Pharmacol Exp Ther. 2003 Apr;305(1):131-42
【非特許文献２】Epilepsia. 2003 Sep;44(9):1153-9
【非特許文献３】Chem Senses. 2000 Oct;25(5):507-15.
【非特許文献４】Ann N Y Acad Sci. 1998 Nov 30;855:398-406.
【非特許文献５】Physiol Behav. 1991 May;49(5):843-54.
【非特許文献６】J Neurosci Res. 2004 Feb 15;75(4):472-9.
【非特許文献７】FEBS Lett. 2003 Jun 19;545(2-3):233-8.
【非特許文献８】Science. 1998 Mar 13;279(5357):1722-5.
【発明の開示】
【０００７】
これまでに代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として、多くの特異的活性化剤が開発されているが、グルタミン酸とシステイン酸など生体内に存在する化合物は少ない。そのため、これらの活性化剤を含有してなる各種疾患に対する治療薬は、副作用や透過性の点で大きな問題があった。
これまで代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤としては、アミノ酸の中では唯一Ｌ−グルタミン酸が知られ、活性化剤開発でもＬ−グルタミン酸以外のアミノ酸に基づいたものはなかった。また、マウス、ラットを用いた動物実験により、Ｌ−グルタミン酸によって惹起される神経活動電位がイノシン酸、グアニン酸等のヌクレオチドによって増強されることが知られるが、これらの動物実験では、Ｌ−グルタミン酸によって惹起された生体分子が、どれであるかの確認は、推測の域を出ない。カルシウム、マグネシウム等の金属二価イオンが、代謝型グルタミン受容体に対して単独あるいはＬ−グルタミン酸と協調して応答を引き起こすことが示されているが、これらの実験で用いられたアミノ酸はＬ−グルタミン酸のみに留まり、他のアミノ酸にも同様な作用を示すかはわからない。グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として有用であることは知られていない。
まして核酸およびカチオンで増強されるということは知られていない。
すなわち、本発明は生体への安全性の高い新規な代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者らは、グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体を活性化することを示した。さらにグルタミン酸以外のアミノ酸による受容体活性化が、核酸、特にイノシン酸、グアニン酸等のヌクレオチド、及びカチオン、特にカルシウム、マグネシウム等の金属二価イオンが共存することにより増強されることを示した。また、グルタミン酸による代謝型グルタミン酸受容体活性化も核酸、又は核酸及びカチオンによって増強されることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）グルタミン酸以外のアミノ酸から選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなる代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（２）さらに核酸を含有する、（１）の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（３）さらにカチオンを含有する、（１）又は（２）の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（４）アスパラギン酸、バリン、システインから選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（５）さらに核酸を含有する、（４）のグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（６）さらにカチオンを含有する、（４）又は（５）のグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（７）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（８）さらに核酸を含有する、（７）のグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（９）さらにカチオンを含有する、（７）又は（８）のグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（１０）システインを含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（１１）さらに核酸を含有する、（１０）のグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（１２）さらにカチオンを含有する、（１０）又は（１１）のグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（１３）（１）〜（１２）の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療するための医薬。
（１４）グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする方法。
（１５）代謝型グルタミン酸受容体がグループI代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸、バリン、又はシステインである、（１４）の方法。
（１６）代謝型グルタミン酸受容体がグループII代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、又はヒドロキシプロリンである、（１４）の方法。
（１７）代謝型グルタミン酸受容体がグループIII代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン酸以外のアミノ酸がシステインである、（１４）の方法。
（１８）（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（１９）（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（２０）（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（２１）（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
（２２）（１９）〜（２１）のいずれかの活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療するための医薬。
（２３）（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを用いることを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする方法。
（２４）代謝型グルタミン酸受容体が、グループI代謝型グルタミン酸受容体、グループII代謝型グルタミン酸または受容体グループIII代謝型グルタミン酸受容体である、（２３）の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR5のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
【図２】グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR5のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図３】グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR5のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、カチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図４】グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR5のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図５】グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR３とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
【図６】グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR３とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図７】グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR３とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、カチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図８】グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR３とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図９】グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR８とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
【図１０】グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR８とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図１１】グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR８とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、カチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【図１２】グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にmGluR８とGIRK1とGIRK4のcRNAをマイクロインジェクションし、18℃にて3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を１として、核酸(IMP)及びカチオン(Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。本明細書中において各アミノ酸は特に断わらない限り、Ｌ−アミノ酸を意味するものとする。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、グルタミン酸以外のアミノ酸から選ばれる１種類以上のアミノ酸を含有する。「グルタミン酸以外のアミノ酸」とは、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸のうちグルタミン酸以外の19種類のアミノ酸、及びオルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンを含む。
なお、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記「グルタミン酸以外のアミノ酸」の1種類以上を含んでいればよく、その他の成分として、グルタミン酸を含んでも構わない。【００１２】
アスパラギン酸、バリンおよびシステインはグループIに属する代謝型グルタミン酸受容体を活性化する。したがって、アスパラギン酸、バリンおよびシステインから選ばれる1種類以上のアミノ酸はグループIに属する代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤として用いることができる。
グループIに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ１（mGluR1）及び代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）が挙げられる。mGluR1としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000838で登録されているヒトｍＧｌｕＲ１遺伝子によってコードされるmGluR1などが挙げられる。また、mGluR5としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000842で登録されているヒトmGluR5遺伝子によってコードされているmGluR5などが挙げられる。なお、mGluR1またはmGluR5は上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、受容体機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、グルタミン酸添加時の電流の変化やカルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。【００１３】
アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンはグループIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を活性化する。したがって、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる1種類以上のアミノ酸はグループIIに属する代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤として用いることができる。
グループIIに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ２（mGluR2）及び代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）が挙げられる。mGluR2としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000839で登録されているヒトmGluR2遺伝子によってコードされるmGluR2などが挙げられる。また、mGluR3としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000840で登録されているヒトmGluR3遺伝子によってコードされるmGluR3などが挙げられる。なお、mGluR2またはmGluR3は上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。【００１４】
システインはグループIIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を活性化する。したがって、システインはグループIIIに属する代謝型グルタミン酸受容体の作動薬として用いることができる。
グループIIIに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ４（mGluR4）、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ６（mGluR6）、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ７（mGluR7）及び代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）が挙げられる。mGluR4としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000841で登録されているヒトmGluR4遺伝子によってコードされるmGluR4などが挙げられる。mGluR6としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000843で登録されているヒトmGluR6によってコードされるmGluR6などが挙げられる。mGluR7としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000844で登録されているヒトmGluR7遺伝子によってコードされるmGluR7などが挙げられる。また、mGluR8としては、例えば、GenBank Accession No. NM#000845で登録されているヒトmGluR8遺伝子によってコードされるmGluR8などが挙げられる。なお、mGluR4、mGluR6、mGluR7またはmGluR8は上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。【００１５】
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記ヒトの代謝型グルタミン酸受容体のみならず、マウス、ラット、イヌなど含めたほ乳類の代謝型グルタミン酸受容体を活性化するものであってもよい。【００１６】
上記グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体を活性化することは、代謝型グルタミン酸受容体又はその断片を発現した生きた細胞、代謝型グルタミン酸受容体又はその断片を発現した細胞膜、代謝型グルタミン酸受容体又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。
代謝型グルタミン酸受容体の８つサブタイプを個別にもしくは複数同時に、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは、プラスミドにクローニングされた８つそれぞれの代謝型グルタミン酸受容体遺伝子を、そのままの状態もしくはプラスミドを鋳型にして得られるｃＲＮＡとして細胞に導入することで可能となる。代謝型グルタミン酸受容体活性化反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。グループII及びグループIII代謝型グルタミン酸受容体の機能解析を行うには、共役Gタンパク質などを同時に用いることが好ましく、例えばＧタンパク質α１５やα１６もしくはGｑとGｉのキメラGタンパク質を一緒に発現させる手法、もしくはアフリカツメガエル卵母細胞の場合はＧタンパク質依存性カリウムチャネル（GIRK）を一緒に発現させる手法も用いることが出来る。【００１７】
代謝型グルタミン酸受容体の発現は、初めにＬ−グルタミン酸もしくは特異的活性化剤による応答で確認する。１０μＭ程度の濃度のＬ−グルタミン酸に対して、細胞内電流（ｎＡ）が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。Ｌ−グルタミン酸の濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸を１μＭ〜１００ｍＭ程度の各溶液に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、アミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体に対して活性化剤として作用するかを測定する。【００１８】
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記グルタミン酸以外のアミノ酸に加えて、核酸を含むものであってもよい。すなわち、本発明によって、（１）アスパラギン酸、バリン、システインから選ばれる１種類以上のアミノ酸、及び核酸を含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（２）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる１種類以上のアミノ酸、及び核酸を含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（３）システイン、及び核酸を含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤が提供される。
ここで、核酸としてはイノシン酸、グアニン酸等のヌクレオチドが好ましく、イノシンモノリン酸がより好ましい。
核酸が共存することによって、より強い受容体活性化が見られる。またはアミノ酸単独では受容体活性化が見られなかった細胞が、核酸が共存することによって同じ濃度のアミノ酸であっても、受容体活性化が見られる。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤におけるアミノ酸と核酸の割合は受容体活性化が可能である限り特に制限されないが、例えば、核酸とアミノ酸の重量比が１：10〜10：1とすることが好ましい。【００１９】
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、グルタミン酸以外のアミノ酸に加えて、カチオンを含むものであってもよい。すなわち、本発明によって、（１）アスパラギン酸、バリン、システインから選ばれる１種類以上のアミノ酸、及びカチオンを含有してなるグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（２）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる１種類以上のアミノ酸、及びカチオンを含有してなるグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（３）システイン、及びカチオンを含有してなるグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤が提供される。
ここでカチオンとしては、金属カチオンが好ましく、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの２価のカチオンがより好ましく、カルシウムイオンが特に好ましい。
カチオンが共存することによって、より強い受容体活性化が見られる。またはアミノ酸単独では受容体活性化が見られなかった細胞が、カチオンが共存することによって同じ濃度のアミノ酸であっても、受容体活性化が見られる。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤におけるアミノ酸とカチオンの割合は受容体活性化可能である限り特に制限されないが、例えば、カチオンとアミノ酸の重量比が1：10〜10：1とすることが好ましい。【００２０】
グルタミン酸による、グループI代謝型グルタミン酸受容体、グループII代謝型グルタミン酸受容体又はグループIII代謝型グルタミン酸受容体の活性化もまた、核酸、又は核酸及びカチオンによって増強されることが本発明者らによって見出された。
したがって、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、（i）グルタミン酸及び核酸、又は（ii）グルタミン酸、核酸及びカチオンを含む、グループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、グループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、又はグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤であってもよい。【００２１】
代謝型グルタミン酸受容体は様々な組織で発現しており、様々な生理作用を担っている。また、代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤が内科系疾患や神経系疾患などをはじめとした数多くの疾患の治療又は予防薬として開発されている（例えば、Ann N Y Acad Sci. 2003 Nov;1003:12-21. ；Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1997;37:205-37.；J Med Chem. 2000 Jul 13;43(14):2609-45.など）。
したがって、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患を予防又は治療するための医薬の有効成分として用いることができる。代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患としては、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患などが挙げられる。【００２２】
本発明に基づく代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を医薬へ適用する方法としては、経口投与あるいは注射等を利用した侵襲的投与あるいは座薬投与あるいは経皮投与を採用することが出来る。有効成分を経口、注射などの投与方法に適した固体または液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することが出来る。このような製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することが出来る。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することも出来る。
本発明の医薬の投与量は治療や予防に有効な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状などに応じて適宜調節されるが、例えば、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、アミノ酸の量として、0.01g〜10gが好ましく、１ｋｇ体重あたり、0.1g〜1gがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回〜数回投与することができる。【００２３】
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤はまた、代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患の治療や予防に効果を有する飲食品として用いることもできる。例えば、容器や包装に上記のような代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患に対する治療効果や予防効果がある旨を表示した飲食品とすることができる。【００２４】
本発明はまた、グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする代謝型グルタミン酸受容体活性化阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
例えば、グループIに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物由来培養細胞に、アスパラギン酸、バリン又はシステイン及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し、アスパラギン酸、バリン又はシステインによる電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する化合物を選択することにより、グループI代謝型グルタミン酸受容体活性化を阻害する化合物（グループI代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬）をスクリーニングすることができる。
また、グループIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させた細胞に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、又はヒドロキシプロリン、及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し、これらのアミノ酸による電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する化合物を選択することにより、グループII代謝型グルタミン酸受容体活性化を阻害する化合物（グループII代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬）をスクリーニングすることができる。
また、グループIIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させた細胞に、システイン及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し、システインによる電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する化合物を選択することにより、グループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化を阻害する化合物（グループIII代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬）をスクリーニングすることができる。
なお、上記スクリーニング系には、核酸やカチオンを上記アミノ酸とともに添加してもよい。
スクリーニングに用いる試験化合物は、低分子化合物、糖類、ペプチド、タンパク質などを用いることができる。【００２５】
さらに、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化阻害物質のスクリーニング方法は、グルタミン酸及び核酸、又はグルタミン酸、核酸及びカチオンを用い、これらによる受容体活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法であってもよい。【００２６】
<実施例>
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
遺伝子（cRNA）の調製
グループI代謝型グルタミン酸受容体として代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）、グループII代謝型グルタミン酸受容体の代表として代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）、グループIII代謝型グルタミン酸受容体の代表として代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）を用いた。これら３種類の代謝型グルタミン酸受容体の遺伝子、およびＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）、Ｇタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）の調製は以下のように行った。ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）に登録されたDNA配列（mGluR5：NM#000842、mGluR3：NM#000840、mGluR8：NM#000845、GIRK1：NM#002239、GIRK4：NM#002239）を元に、PCRに使う合成オリゴDNA（フォワードプライマー（Ｎ）、及びリバースプライマー（Ｃ））を設計した（表１）（配列番号１−１０）。【００２８】
【表１】
2006137469.tif 000002
【００２９】
ヒト脳由来のcDNA（Clontech社製）を材料として、Pfu  ultra  DNA  Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でPCRを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分の反応をした。PCRによって増幅がなされたかをアガロース電気泳動法を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によって検出した。同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマーカーと比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。プラスミドベクターpBR322を制限酵素EcoRV(Takara社製)によって切断した。その切断部位にPCRによって増幅された各遺伝子断片をLigation  Kit（Promega社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、PCR増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。各々のPCR増幅産物をDNA塩基配列解析によって確認した。これらの組換えプラスミドを鋳型とし、cRNA作製キット（Ambion社）を用いて各受容体遺伝子のcRNAを作製した。
【実施例２】
【００３０】
アミノ酸、核酸、カチオンの調製
Ｌ型アミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンの２３種類について特級グレードのものを用いた。イノシン、塩化カルシウムは特級グレードのものを用いた。グルタミン、システインは用事調製し、他の試薬は調製後、−２０℃に保存した。アミノ酸、核酸、カチオンの溶解液、アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶液は、以下の組成のものを使用した。ＮａCｌ  ９６ｍＭ  ／  ＫＣｌ  ２ｍＭ  ／  ＭｇＣｌ2  １ｍＭ  ／  ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ  ／  Ｈｅｐｅｓ  ５ｍＭ  ／  ｐＨ＝７．２。
【実施例３】
【００３１】
アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的測定法
代謝型グルタミン酸受容体を介したシグナル伝達の測定方法は、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電流測定法を用いた。アフリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、１％コラゲナーゼ溶液により２０℃で２時間処理することで個々の卵母細胞を得た。１個あたりの卵母細胞に、マイクロガラスキャピラリーを用いて５０ｎｌの１μｇ／μｌ受容体cRNAもしくは５０ｎｌの滅菌水を導入し、１８℃で２〜３日培養した。培養時には、実施例２で示した溶液に２ｍＭピルビン酸と10U/mlペニシリンと10μg/mlストレプトマイシンを加えたものを使用した。培養後、ｃＲＮＡを注入した卵母細胞もしくは滅菌水を注入した卵母細胞に対し、リガンド溶液を添加した。電気生理学的測定は、増幅器Geneclamp500（Axon社製）および記録用ソフトAxoScope9.0（Axon社製）を用いて行った。卵母細胞を２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌイオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
【実施例４】
【００３２】
グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を調べた。グループI代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM、10μM、30μM、100μM）で反応した結果を図１に示した。この結果より、卵母細胞に注入した各代謝型グルタミン酸受容体のcRNAが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことから、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現していないことが確認された。
【実施例５】
【００３３】
グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸以外のアミノ酸の作用を調べた。グループI代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、アラニン（10mM）、アルギニン（10mM）、アスパラギン（10mM）、アスパラギン酸（300μM）、システイン（1mM）、グルタミン（10mM）、グリシン（10mM）、ヒスチジン（10mM）、イソロイシン（10mM）、ロイシン（10mM）、リジン（10mM）、メチオニン（10mM）、フェニルアラニン（10mM）、プロリン（10mM）、セリン（10mM）、トレオニン（10mM）、トリプトファン（10mM）、チロシン（10mM）、バリン（3mM）、オルニチン（10mM）、タウリン（10mM）、ヒドロキシプロリン（10mM）で反応した結果を表２に示した。この結果より、グルタミン酸だけではなく、アスパラギン酸、システイン、バリンがグループI代謝型グルタミン酸受容体に対する促進作用を有することが示された。【００３４】
【表２】
2006137469.tif 000003
【実施例６】
【００３５】
グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループI代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、バリン（3mM）、システイン（3mM）の作用がイノシン酸（1mM）が共存することによって増強した結果を図２に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、核酸が共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度であっても、核酸が共存することで応答電流された。
【実施例７】
【００３６】
グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループI代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、バリン（3mM）、システイン（3mM）の作用がカルシウムイオン（10mM）が共存することによって増強した結果を図３に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度であっても、カチオンが共存することで応答電流が検出された。
【実施例８】
【００３７】
グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸、核酸、カチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸およびカチオンの作用を調べた。グループI代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ５（mGluR5）のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、バリン（3mM）、システイン（3mM）の作用がイノシン酸（1mM）及びカルシウムイオン（10mM）の両方が共存することによって増強した結果を図４に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度が同じで核酸もしくはカチオンの一方が含まれている溶液あっても、カチオンもしくは核酸の他方を追加することで応答電流が検出された。
【実施例９】
【００３８】
グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を調べた。グループII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）のｃＲＮＡと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のｃＲＮＡ（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM、10μM、30μM、100μM）で反応した結果を図５に示した。この結果より、卵母細胞に注入した各代謝型グルタミン酸受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことから、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現していないことが確認された。
【実施例１０】
【００３９】
グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用を調べた。グループII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、１ｍＭの濃度の、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンで反応した結果を表２に示した。この結果より、グルタミン酸だけではなく、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリンがグループII代謝型グルタミン酸受容体に対する促進作用を有することが示された。
【実施例１１】
【００４０】
グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、バリン（1mM）、ロイシン（1mM）の作用がイノシン酸（1mM）が共存することによって増強した結果を図６に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、核酸が共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度であっても、核酸が共存することで応答電流が検出された。実施例１０で示された、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対して作用する２３種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ４種類のアミノ酸に対して、同様の核酸の増強作用が認められたことから、この核酸による増強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された。
【実施例１２】
【００４１】
グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸以外のアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、ロイシン（1mM）、システイン（1mM）の作用がカルシウムイオン（10mM）が共存することによって増強した結果を図７に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度であっても、カチオンが共存することで応答電流が検出された。実施例１０で示された、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対して作用する２３種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ４種類のアミノ酸に対して、同様のカチオンの増強作用が認められたことから、このカチオンによる増強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された。
【実施例１３】
【００４２】
グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸、核酸、カチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸及びカチオンの作用を調べた。グループII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３（mGluR3）のｃＲＮＡと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、アスパラギン酸（300μM）、ロイシン（1mM）、システイン（1mM）の作用がイノシン酸（1mM）及びカルシウムイオン（10mM）が共存することによって増強した結果を図８に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、核酸及びカチオンが共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったアミノ酸濃度であっても、イノシン酸及びカチオンが共存することで応答電流が検出された。実施例１０で示された、グループII代謝型グルタミン酸受容体に対して作用する２３種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ４種類のアミノ酸に対して、同様のイノシン酸及びカチオンの増強作用が認められたことから、この核酸及びカチオンによる増強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された
【実施例１４】
【００４３】
グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を調べた。グループIII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM、10μM、30μM、100μM）で反応した結果を図９に示した。この結果より、卵母細胞に注入した各代謝型グルタミン酸受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことから、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現していないことが確認された。
【実施例１５】
【００４４】
グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸以外のアミノ酸の作用を調べた。グループIII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、アラニン（10mM）、アルギニン（10mM）、アスパラギン（10mM）、アスパラギン酸（300μM）、システイン（1mM）、グルタミン（10mM）、グリシン（10mM）、ヒスチジン（10mM）、イソロイシン（10mM）、ロイシン（10mM）、リジン（10mM）、メチオニン（10mM）、フェニルアラニン（10mM）、プロリン（10mM）、セリン（10mM）、トレオニン（10mM）、トリプトファン（10mM）、チロシン（10mM）、バリン（3mM）、オルニチン（10mM）、タウリン（10mM）、ヒドロキシプロリン（10mM）で反応した結果を表２に示した。この結果より、グルタミン酸だけではなく、システインがグループIII代謝型グルタミン酸受容体に対する促進作用を有することが示された。
【実施例１６】
【００４５】
グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するシステインと核酸の作用
実施例３に記載した方法を用い、グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループIII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、システイン（1mM）の作用がイノシン酸（1mM）が共存することによって増強した結果を図１０に示した。このとき、システイン濃度が同じであっても、核酸が共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったシステイン濃度であっても、核酸が共存することで応答電流が検出された。
【実施例１７】
【００４６】
グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するシステインとカチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループIII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、システイン（1mM）の作用がカルシウムイオン（10mM）が共存することによって増強した結果を図１１に示した。このとき、システイン濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったシステイン濃度であっても、カチオンが共存することで応答電流値が検出された。
【実施例１８】
【００４７】
グループIII代謝型グルタミン酸受容体に対するシステイン、核酸、カチオンの作用
実施例３に記載した方法を用い、グループI代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸を含むアミノ酸と核酸およびカチオンの作用を調べた。グループIII代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ８（mGluR8）のcRNAと同時にＧタンパク質依存性カリウムチャネル１（GIRK1）及びＧタンパク質依存性カリウムチャネル４（GIRK4）のcRNA（いずれも2.5ng）を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3μM）、システイン（1mM）の作用がイノシン酸（1mM）及びカルシウムイオン（10mM）の両方が共存することによって増強した結果を図１２に示した。このとき、システイン濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が大きくなった。また、応答電流を惹起しなかったシステイン濃度が同じで核酸もしくはカチオンの一方が含まれている溶液あっても、カチオンもしくは核酸の他方を追加することで応答電流が検出された。【００４８】
なお、代謝型グルタミン酸受容体のI、II、IIIの各グループ内では、受容体構造と受容体特性が近似していること、グループ内に共通な活性化剤、阻害剤が利用できることがよく知られている。代表例は、下記のとおりである。
グループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤：DHPG
グループI代謝型グルタミン酸受容体阻害剤：AIDA
グループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤：DCG-IV
グループII代謝型グルタミン酸受容体阻害剤：LY341195
グループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤：L-AP4
グループIII代謝型グルタミン酸受容体阻害剤：CPPG
参考文献；Psychopharmacology Springer-Verlag 2005,「Review;  Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure and pharmacology」James N. C. Kew and John A. Kemp。
したがって、本実施例ではグループＩ代謝型グルタミン酸受容体としてmGluR5を、グループII代謝型グルタミン酸受容体としてmGluR3を、グループIII代謝型グルタミン酸受容体としてmGluR8を用いて受容体活性化実験を行ったが、各グループ内のその他の代謝型グルタミン酸受容体も同様に上記グルタミン酸以外のアミノ酸によって活性化されると考えられた。
【実施例１９】
【００４９】
代謝型グルタミン酸受容体の生体内分布
代謝型グルタミン酸受容体の生体内分布を示すために、ラットから得たＲＮＡを材料として、ＲＴ−ＰＣＲ法を用い、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ１〜８の組織発現を以下のように調べた。ラット組織からのＲＮＡ調製は以下のように行った。１５週令の雄Ｆ３４４ラットから、大脳、小脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、膵臓、脾臓、食道、胃上部、胃底部、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、精巣、副精巣、膀胱、骨髄、ヒフク筋、ヒラメ筋、骨格筋、脂肪、前立腺、舌、舌下腺、胸腺を単離した。Total RNAの調製はIsogen（日本ジーン社製）を用いて行った。Fast Prep（BIO101）またはポリトロンホモジェナイザーを用いて各組織をホモジェナイズし、ホモジェネートからTotal RNAを抽出した。Total RNAをテンプレートとし、OligodＴプライマー、SuperscriptIII 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてcDNA合成を行った。代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ１〜８のRT-PCRは、表３に示すプライマー（配列番号１１−２６）を合成し、以下のように行った。各組織のcDNAをテンプレートとし、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO社製) 、ABI PRISM 7700 Sequence Detectorを用いた定量PCR法により、代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の発現量を解析した。組織発現分布を表４に示した。この結果より、代謝型グルタミン酸受容体が脳だけではなく、生体内に広く発現していることが確認された。このことから、代謝型グルタミン酸受容体が中枢機能だけではなく、末梢組織、末梢臓器の様々な整理機能に関わっていることが示唆された。【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【産業上の利用の可能性】
【００５２】
GPCR（Gタンパク質共役型受容体）に対する受容体活性化剤は各種疾患の治療薬として普遍的に応用できる。現在までに上市もしくは研究中の治療薬の代表例をあげると、
アセチルコリン受容体活性化剤（アルツハイマー病治療）、アドレナリン受容体活性化剤（気管支喘息治療、肥満治療）、オピオイド受容体活性化剤（疼痛病治療）、受容体活性化剤（疼痛病治療）、カルシトニン受容体活性化剤（骨粗鬆症治療）、コレシストキニン受容体活性化剤（糖尿病治療）、セロチニン受容体活性化剤（片頭痛治療）、ドーパミン受容体活性化剤（パーキンソン病治療、鎮静剤）、メラトニン受容体活性化剤（原発性不眠症治療）、メラノコルチン受容体活性化剤（肥満治療）などがある。
GPCRに属する代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤の治療薬応用の範囲は、実施例１９、表３に示すように、代謝型グルタミン酸受容体の各サブタイプが広範な組織に分布していることから、幅広い疾患に対して適用可能であることが予見される。また、代謝型グルタミン酸受容体が舌や消化管にも分布することから、治療薬としてのみでなく、食品領域への応用も可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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