(57)【要約】  本発明者らは、RNP構成蛋白であるNP, P, Lタンパク質の遺伝子をゲノムRNAから全て欠損させた非複製型SeVベクターの作製に成功し、GFPなどマーカー遺伝子を搭載したNP/P/L欠損タイプSeVベクターにおいて、高い生産性と高い外来遺伝子の導入及び発現効率（高い発現量を得るには高MOI感染することが必要）が得られることを確認した。本発明のベクターは、L遺伝子、またはNP,P,L遺伝子の複数の遺伝子を欠損させたことにより、宿主細胞内で発現するウイルス由来のタンパク質量が低減し、in vivo投与における免疫原性を低下させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）および（ｂ）からなる複合体を含む、ベクター。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA
（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質
【請求項２】
下記（ａ）および（ｂ）からなる複合体を含む、ベクター。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA
（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質
【請求項３】
パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現しないように改変されている、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、パラミクソウイルス科ウイルスのエンベロープタンパク質の少なくとも一つを発現する、請求項１から３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、Mタンパク質、Fタンパク質、HNタンパク質を発現し、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現しないように改変されている、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
（−）鎖一本鎖RNAがセンダイウイルスに由来する、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
（−）鎖一本鎖RNAがさらに外来遺伝子を搭載している、請求項１から６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のベクターに含まれる（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNA。
【請求項９】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項１に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１０】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２に記載のベクターの製造方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１１】
NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞が、さらにウイルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質を発現可能である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
ウイルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質が、Cタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項１に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAが挿入されたベクター、NPタンパク質発現ベクター、Pタンパク質発現ベクター、およびLタンパク質発現ベクターを発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１４】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２に記載のベクターの製造方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAが挿入されたベクター、NPタンパク質発現ベクター、Pタンパク質発現ベクター、およびLタンパク質発現ベクターを細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１５】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項１に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
【請求項１６】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
【請求項１７】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベクターを製造する方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１８】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベクターを製造する方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
【請求項１９】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、外来遺伝子を標的細胞において発現させる方法。
（ａ）請求項７記載のベクターを製造する工程
（ｂ）請求項７記載のベクターを標的細胞に導入する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非複製型パラミクソウイルス科ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
センダイウイルスベクター（SeVベクター）は細胞質型ウイルスベクター（発現の全段階が細胞質で行われるベクター）であることから、in vivoで使用しても、搭載遺伝子が宿主染色体へ組み込まれて遺伝毒性を生じる心配は全くない。また、in vitroとin vivoの両方において高い遺伝子導入、発現効率が得られることや、in vitroでは長期持続発現が可能であることなど、いくつもの優れた性能を有している。そのためSeVは、遺伝子治療・遺伝子ワクチン、あるいは抗体産生や機能解析への応用など遺伝子導入ベクターとしての多くの応用・利用が期待されている（非特許文献1、2）。【０００３】
しかしながら、センダイウイルスベクターを用いて外来遺伝子を発現させる場合、搭載した外来遺伝子と同時にウイルス構造蛋白（特に転写複製に必要なRNP構成蛋白であるNP, P, L蛋白）も発現するため、生体への応用において、免疫原性を惹起する可能性が考えられる。近年、種々のタイプの遺伝子欠損型SeVベクターが開発された。例えば、ウイルスRNP構成蛋白以外のM,F,HN蛋白質を、それぞれ単独あるいは複数欠損させたタイプがある（特許文献１，２）。これらの遺伝子欠損型SeVベクターでは免疫原性の低減が見られたが、依然残っていることが予想された。【０００４】
SeVベクターのRNP構成蛋白であるNP, P, Lは、センダイウイルスゲノムの転写複製に必要な蛋白質であり、本来、SeVベクターに必要不可欠な蛋白質である。しかし、これらの蛋白遺伝子をゲノム上欠損させた場合であっても、これらの蛋白が発現プラスミドなどにより外部から供給されれば、ウイルスベクター粒子を再構成・増幅させることは理論上可能である。さらに、再構成されたNP, P, L欠損SeVベクターが標的細胞へ感染すると、粒子内に持ち込んでいるNP, PおよびL蛋白を利用して、ゲノム上の外来遺伝子のmRNAを転写し、外来遺伝子を発現させることも可能である。このNP, P, L欠損SeVベクターはゲノム上NP, P, L遺伝子が欠損されているため、RNPを複製することができず、非複製SeVベクターに生まれ変わる。【０００５】
ゲノム上、NP, P, Lのいずれか一つをゲノム上欠損させれば、RNPの複製ができなくなり（あるいは極端に減少し）、非複製SeVベクターになり得る。これまでに、非複製SeVベクターを作製する目的で、NP蛋白遺伝子を単独で欠失させたベクター、P蛋白遺伝子を単独で欠失させたベクターを構築した報告がある（非特許文献3、4）。しかし、L蛋白がRNAポリメラーゼ活性本体であることを考えると、P遺伝子やNP遺伝子をゲノムから単独に欠失させるのではなく、L遺伝子あるいはL遺伝子を含む複数の遺伝子を欠失させることにより、非複製型ベクターの特徴をより確実なものにすることができると考えられる。また、L遺伝子を含む複数の遺伝子の欠失は、ウイルス由来蛋白による影響を最大限に減らすことができるものと期待される。したがって、L遺伝子を含む複数の遺伝子、例えばNP, P, L遺伝子全てを欠損することが、免疫原性低減の観点からは望ましい。また、ゲノム長の約半分の長さを占めるL遺伝子の欠失は、より長い目的遺伝子のゲノムへの搭載を可能にすることが期待され、さらに、ゲノムサイズが短くなるほど、転写効率が高く、より高い目的遺伝子の発現量が期待できる。このように、L遺伝子を欠損させたSeVベクターは極めて有用であると考えられる。しかしながら、SeVベクターを含むパラミクソウイルス科ウイルスベクターについて、L遺伝子を欠損させたベクターを作製した報告はこれまでにない。
【特許文献１】WO00/70070
【特許文献２】WO2003/025570
【非特許文献１】Bitzer M, et al., J Gene Med. 5(7):543-553 (2003)
【非特許文献２】Griesenbach U, et al., Curr Opin Mol Ther.7(4):346-352. (2005)
【非特許文献３】Molecular Therapy Volume 13, Supplement 1, May 2006, page S185
【非特許文献４】NSV2006 (13th International Conference Negative Strand Viruses 2006, Salamance, Spain, June 17-22nd, 2006) 要旨集
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、免疫原性の低い非複製型パラミクソウイルス科ウイルスベクターを作製することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者らは、鋭意研究を重ねた。本発明者らは、RNP構成蛋白であるNP, P, Lタンパク質の遺伝子をゲノムRNAから全て欠損させた非複製型SeVベクターの作製に成功し、GFPなどマーカー遺伝子を搭載したNP/P/L欠損タイプSeVベクターにおいて、高い生産性（1e7 CIU/ml以上）と高い外来遺伝子の導入及び発現効率（高い発現量を得るには高MOI感染することが必要）が得られることを確認した。本発明のベクターは、L遺伝子、またはNP,P,L遺伝子の複数の遺伝子を欠損させることにより、宿主細胞内で発現するウイルス由来のタンパク質量が低減し、in vivo投与における免疫原性を低下させることができる。本発明のベクターは、とりわけ、遺伝子治療の分野において極めて有用である。すなわち、本発明は、L遺伝子を欠損したパラミクソウイルス科ウイルスベクターに関し、より具体的には下記の発明を提供するものである。
（１）下記（ａ）および（ｂ）からなる複合体を含む、ウイルスベクター。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA
（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質
（２）下記（ａ）および（ｂ）からなる複合体を含む、ウイルスベクター。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA
（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質
（３）パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現しないように改変されている、上記（１）または（２）に記載のベクター。
（４）パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、パラミクソウイルス科ウイルスのエンベロープタンパク質の少なくとも一つを発現する、上記（１）から（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAが、Mタンパク質、Fタンパク質、HNタンパク質を発現し、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現しないように改変されている、上記（４）に記載のベクター。
（６）（−）鎖一本鎖RNAがセンダイウイルスに由来する、上記（１）から（５）のいずれかに記載のベクター。
（７）（−）鎖一本鎖RNAがさらに外来遺伝子を搭載している、上記（１）から（６）のいずれかに記載のベクター。
（８）上記（１）から（７）のいずれかに記載のベクターに含まれる（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNA。
（９）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（１）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１０）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（２）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１１）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞が、さらにウイルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質を発現可能である、上記（９）または（１０）に記載の製造方法。
（１２）ウイルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質が、Cタンパク質である、上記（１１）に記載の方法。
（１３）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（１）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAが挿入されたベクター、NPタンパク質発現ベクター、Pタンパク質発現ベクター、およびLタンパク質発現ベクターを発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１４）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（２）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAが挿入されたベクター、NPタンパク質発現ベクター、Pタンパク質発現ベクター、およびLタンパク質発現ベクターを細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１５）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（１）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
（１６）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、上記（２）に記載のベクターの製造方法。
（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
（１７）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベクターを製造する方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１８）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベクターを製造する方法。
（ａ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAを、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程
（１９）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む、外来遺伝子を標的細胞において発現させる方法。
（ａ）上記（７）記載のベクターを製造する工程
（ｂ）上記（７）記載のベクターを標的細胞に導入する工程【０００８】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスを利用した、新規な非複製型ベクターを提供する。【０００９】
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルス科は、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。パラミクソウイルス科ウイルスに含まれるウイルスとして、具体的にはセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1, 2, 3型等が挙げられる。より具体的には、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、麻疹ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。【００１０】
パラミクソウイルスは、一般に、エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに含まれるRNAはパラミクソウイルスのゲノムである（−）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖RNAであり、この一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質と結合し、RNPを形成している。このRNPに含まれるRNAがウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae : The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.）。【００１１】
パラミクソウイルスの「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、およびラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ヌクレオキャプシド（NP）タンパク質は、ゲノムRNAに結合し、ゲノムRNAが鋳型活性を有するために不可欠なタンパク質である。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。ホスホ（P）タンパク質は、RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化タンパク質である。マトリックス（M）タンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から維持する機能を果たす。フュージョン（F）タンパク質は、宿主細胞への浸入にかかわる膜融合タンパク質であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパク質である。ラージ（L）タンパク質は、RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独のmRNAが転写され、タンパク質が転写される。P遺伝子からは、Pタンパク質以外に、異なるORFを利用して翻訳される非構造タンパク質（C）と、Pタンパク質mRNAを読み取り途中のRNA編集により作られるタンパク質（V）が翻訳される。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に、3'から順に、次のように表記される。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L【００１２】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; およびSV-5, D13868が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。【００１３】
本発明の非複製型ベクター（以下において、「本発明のベクター」と称す）は、（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質の一部または全部が発現しないように（−）鎖一本鎖RNAが改変されていることにより、自己複製能を喪失している。本発明において（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質とは、該（−）鎖一本鎖RNAと直接および/または間接に結合し、該（−）鎖一本鎖RNAと複合体を形成するタンパク質のことを言う。本発明の複合体には、パラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAおよびそれに結合するパラミクソウイルスに由来するタンパク質（NP、P、およびLタンパク質）からなる複合体が含まれる。本発明において、「パラミクソウイルスに由来する」とは、パラミクソウイルスの構成物（タンパク質、RNAを含む）がそのままの状態で、または一部を改変された状態であることを意味する。例えば、パラミクソウイルスのタンパク質またはRNAを改変して調製されたタンパク質またはRNAは、「パラミクソウイルスに由来する」タンパク質またはRNAである。本発明のベクターは、上記特徴を有する限り、その種類は問わない。例えば、本発明のベクターは、エンベロープタンパク質（F、HN、および M タンパク質）等を有し、ウイルス粒子の構造をとるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスエンベロープを有さない、RNP自体であるRNPベクターであってもよい。【００１４】
パラミクソウイルス科ウイルスにおいてNP,P,Lタンパク質は、（−）鎖一本鎖RNAと結合し、ゲノムRNA複製およびタンパク質発現に不可欠な機能を果たす（以下において、場合により、NP,P,Lタンパク質を、「ゲノムRNA結合タンパク質」と称す）。NPタンパク質は、ゲノムRNAと非常に強固に結合し、ゲノムRNAに鋳型活性を付与するタンパク質である。ゲノムRNAは、NPタンパク質との結合状態においてのみRNA合成の鋳型活性を有し、NPタンパク質と結合しない状態では鋳型活性は全く有しない。Pタンパク質はRNAポリメラーゼの小サブユニットとして、Lタンパク質はRNAポリメラーゼの大サブユニットとして、ゲノムRNAに結合する。そのためパラミクソウイルス科ウイルスでは、NP、P、Lタンパク質のうち一つでも欠ければ、ゲノムRNA複製は起こらない。【００１５】
このような本発明のベクターの第一の態様は、（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む一以上の（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質、からなる複合体を含むことを特徴とする。本発明のベクターは、改変された（−）鎖一本鎖RNA（ゲノムRNA）とNP、P、Lタンパク質からなる複合体（RNP）を含む、ウイルス粒子である。第一の態様において、本発明のベクターに含まれる（−）鎖一本鎖RNAは、少なくともLタンパク質を発現しないように改変されている。本発明のベクターを宿主に感染させると、本発明のベクター中に含まれるNP、P、Lタンパク質の働きによって、ゲノムRNA中にコードされている遺伝子からタンパク質が発現する。しかし、Lタンパク質を含むゲノム結合タンパク質遺伝子は、本発明のベクターのゲノムRNA中にコードされていないために発現しない。したがって、自己の複製であるウイルス粒子（ゲノムRNAならびにNP,P,およびLタンパク質を含む粒子）を形成することはできない。すなわち、本発明のベクターは、非複製型のウイルスベクターである。本発明のベクターに外来遺伝子を搭載させて宿主に感染させた場合には、外来遺伝子は宿主細胞内で発現するが、本発明のベクターから自己複製能を有するウイルス粒子は産生されない。【００１６】
このように本発明のベクターは、自己複製能を有しない点で、安全性が高いといえる。単に自己複製能を欠損させるのであれば、NP、P、Lタンパク質の機能を損なう変異をゲノムRNA中のNP、P、L遺伝子に導入することにより、目的を達成することも可能である。しかし、本発明のベクターは、遺伝子に変異を導入して機能を欠損したタンパク質を発現させるのではなく、タンパク質発現そのものをなくしている点に意味がある。すなわち、本発明のベクターは、免疫原性が軽減されている点で、単なる非複製型ベクターよりもさらに安全性が高いベクターである。この観点からいえば、本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、L遺伝子単独を欠損していてもよいが、好ましくはL遺伝子の他にNPまたはP遺伝子、最も好ましくは、NP、P、L遺伝子全てを欠損していることが望ましい。【００１７】
本発明のベクターは、RNA結合タンパク質遺伝子のうち、とりわけL遺伝子をゲノム上欠損している点で、以下のような利点を有する。L遺伝子はゲノムRNAの約半分もの長さを占めるため、本発明のベクターのゲノムRNAは、L遺伝子欠損によってゲノムサイズが大幅に短縮されている。そのため、第一の利点として、本発明のベクターは、他の遺伝子を欠損させた場合よりも、より長い外来遺伝子の搭載が可能である。第二の利点としては、ゲノムサイズが短くなったことにより、より高い転写効率、より高い発現量が期待できる。特に、非複製型ウイルスベクターによって外来遺伝子を発現させる場合、ウイルスベクターの自己複製に基づく外来遺伝子発現量の増大が見込めないため、高いタンパク質発現量を確保するためには高い転写効率が重要である。【００１８】
本発明のベクターの第二の態様は、（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質から選択される複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質、からなる複合体を含むことを特徴とする。第二の態様のウイルスベクターのゲノムRNAは、一例を示せば、L遺伝子はコードするがNP遺伝子とP遺伝子の２つの遺伝子をコードしないように改変されているゲノムRNAを挙げることができるが、これに限られず、２または３のゲノムRNA結合タンパク質を発現しないように改変されているゲノムRNAは、すべて含まれる。複数の遺伝子を欠損させることにより、NPまたはPいずれか一つの遺伝子を欠損させる場合よりも、ウイルス由来のタンパク質量が低減される。また、ゲノムRNAの長さがより短縮されるため、より長い外来遺伝子の搭載が可能となる。【００１９】
本発明のベクターのゲノムRNAは、上述のとおり、ゲノムRNA結合タンパク質遺伝子の一部または全部を欠損している。第一の態様においては、ゲノムRNAは、少なくともL遺伝子が欠損しており、好ましくはL遺伝子とNP遺伝子、またはL遺伝子とP遺伝子が欠損しており、最も好ましくは、NP、P、L遺伝子全てが欠損しており、第二の態様においては、複数のゲノムRNA結合タンパク質遺伝子が欠損している。一方、ゲノムRNAにコードされている遺伝子は、ウイルス由来の遺伝子配列そのままであってもよいが、何らかの変異が導入されていてもよい。例えば、当業者であれば、各タンパク質の機能を損なわないような軽微な変異を、公知方法によってゲノムRNA上の各遺伝子に導入することができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入することが可能である。上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の洗浄液および温度条件で実施することができる。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記(-)鎖RNAがコードするポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて開発されたBLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。【００２０】
また、P遺伝子に変異を導入することにより、パラミクソウイルスベクターによる細胞障害性を低下できることが知られている。本発明のベクターのゲノムRNAがP遺伝子をコードする場合、ゲノム上のRNA遺伝子にこのような変異が導入されていてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他の(-)鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が、例として挙げられる。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。具体的には、L511のPheへの置換（L511F）などが例示できる。【００２１】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、エンベロープタンパク質遺伝子を全てコードしていてもよく、一部または全部のエンベロープタンパク質遺伝子をコードしていなくてもよい。ゲノムRNA結合タンパク質遺伝子のみならず、エンベロープタンパク質遺伝子も発現しないように改変することで、ベクターをin vivo投与したときの免疫原性をさらに改善できる可能性がある。ゲノムRNAにコードされるエンベロープタンパク質遺伝子（M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子）は野生型であってもよいが、温度感受性変異が導入されていてもよい。エンベロープタンパク質の温度感受性変異は、WO2003/025570に詳述されている。【００２２】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNAには、少なくともL遺伝子が、または、複数のゲノムRNA結合タンパク質の遺伝子が欠損しているが、NP、P、およびLタンパク質の存在下でこのゲノムRNA（ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を転写させることにより、本発明のRNPを製造することができる。RNPの形成は、例えばBHK-21またはLLC-MK2細胞などで行わせることができる。NP、P、およびLタンパク質の供給は、ウイルスベクターにより供給されるものでない限り、種々の方法により行うことができる。例えば、各遺伝子をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより行われ得る（実施例参照）。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。RNPを形成させるために発現させる NP、P、およびL遺伝子は、ベクターのゲノムにコードされる NP、P、およびL遺伝子と完全に同一である必要はない。すなわち、これらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、RNPゲノムがコードするタンパク質のアミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと結合し、細胞内でゲノムへの転写複製活性を持つ限り、変異を導入してもよく、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００２３】
細胞内でベクターを再構成させる時にNP、P、およびLタンパク質を細胞に発現させれば、これらタンパク質がウイルスベクターに取り込まれ、感染性を保持するウイルスベクターを生産することができる。このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内RNPによりゲノムRNAからタンパク質を発現させることはできても、それ自身はL遺伝子等を持たないため、初めと同じような複製能を持つウイルスを再度生産することはできない。このようなベクターは、特に遺伝子治療などの中でも、ベクターの影響を極力減らす必要のある対象疾患あるいは応用分野に対して極めて有用である。【００２４】
本発明のウイルスベクターを再構成するには、通常、（ａ）パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質のうち、Lタンパク質を含む１または複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするベクターDNAを、該（−）鎖一本鎖RNAと結合するパラミクソウイルスに由来のタンパク質を発現する細胞（ヘルパー細胞）に導入して発現させ、（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調製することができる。または、上記（ａ）において、「NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルス科ウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNA」を、用いることもできる。ベクターDNAを発現させる時に、NP、L、およびPタンパク質を共発現させておくことでRNPが形成され、本発明のウイルスが構築される。【００２５】
ヘルパー細胞で発現させるベクターcDNAは、本発明のベクターに含まれる（−）鎖一本鎖RNA（ネガティブ鎖）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードしている。例えば、（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAをT7プロモーターの下流に連結させ、T7 RNA ポリメラーゼによりRNAに転写させる。ベクターcDNAは、大腸菌で増幅できるようにプラスミドにクローニングされていてもよい。細胞内で転写させる鎖は、ウイルスのポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写されるようにすることが再構成の効率を上げるためには好ましい。例えば、本発明の実施例ではポジティブ鎖が転写されるように、ベクターcDNAを設計している（配列番号3）。【００２６】
ヘルパー細胞としては、NP、LおよびPタンパク質を発現する細胞が用いられる。ヘルパー細胞は、ウイルスベクターにおいて欠損しているタンパク質（NP、L、P）を発現する細胞に限定されず、該ウイルスベクターにおいて欠損している遺伝子がコードするゲノムRNA結合タンパク質とは異なる、ゲノムRNA結合タンパク質を発現する細胞でありうる。例えば、ゲノムRNAの複製、転写が可能な限り、他のパラミクソウイルスのゲノムRNA結合タンパク質を用いることも可能である。【００２７】
これらの遺伝子は、ウイルスベクターによるものでない限り種々の方法によりヘルパー細胞内で発現させることができる。例えば、L遺伝子またはL遺伝子を含む複数の遺伝子が欠損した組換えセンダイウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、NP、P/CおよびLタンパク質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる。また、例えば、L遺伝子が染色体に組込まれた宿主細胞を用いて製造することも可能と考えられる。ウイルスゲノム以外から供給されるこれらのタンパク質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００２８】
ヘルパー細胞は、さらにウイルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質、例えば、Cタンパク質を発現する細胞であってもよい。Cタンパク質は、本発明のウイルスベクターの高い生産性を得るためには、ヘルパー細胞においてCタンパク質が発現していることが好ましい。センダイウイルスにおいてCタンパク質には、同一読み枠上でそれぞれ異なる開始コドンによって翻訳される４種のタンパク質、C’、C、Y1、Y2が含まれる。本発明のウイルスベクターの再構成においてヘルパー細胞中で発現するCタンパク質は、上記4種のタンパク質のうち、いずれか1種でも複数種が発現していてもよいと考えられる。C’、C、Y1、Y2の4種全てが発現するヘルパー細胞は、本発明のウイルスベクターの再構成に用いる細胞として好ましい。本発明のウイルスベクターにおいてゲノムRNAからP遺伝子を欠損させた場合、P遺伝子と読み枠違いのC遺伝子も欠損することになる。ゲノムRNA上C遺伝子が欠損する場合は、C遺伝子をコードする発現ベクターをヘルパー細胞に導入することにより、ヘルパー細胞内でC遺伝子を発現させることが可能である。但し、Cタンパク質をヘルパー細胞中で発現させる方法としては、C蛋白質の持続発現株ではベクターゲノムの複製が抑制されることが知られているため（Kato A, et al., J Virol. 78, 7443-54 (2004)）持続発現での供給は難しい可能性があり、例えば、後述する実施例を参照することができる。【００２９】
RNPまたはウイルスが形成されれば、このRNPまたはウイルスを上記のヘルパー細胞に再度導入して培養することにより、本発明のベクターを増幅することができる。この過程は、（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、少なくともLタンパク質を含む一以上のタンパク質を発現しないように改変された、パラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、エンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む。または、（ａ）パラミクソウイルス科ウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、および該（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質、からなる複合体を、NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、および（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む。【００３０】
RNPを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。【００３１】
エンベロープタンパク質としては、ウイルスのエンベロープタンパク質以外にも、例えば、特定の細胞に接着しうるような、接着因子、リガンド、受容体等由来のポリペプチドを細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを用いることが可能である。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。また、本発明のウイルスベクターは、例えば、免疫原性を低下させるために、または、RNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。【００３２】
本発明のベクターは、（−）鎖一本鎖RNA中に外来遺伝子をコードするRNAを含みうる。外来遺伝子としては、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を用いることが可能である。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウイルスベクター遺伝子に対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウイルスベクター遺伝子に外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクター遺伝子においては、転写開始(S)配列と転写終結(E)配列との間などに、ゲノムの総塩基数が6の倍数となるように考慮して配列を挿入することが必要である（Journal of Virology, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830）。外来遺伝子は、ウイルスの各遺伝子の前または後ろに挿入することができる（実施例参照）。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜 E-I-S配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入する。挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる。また、遺伝子挿入の位置、また遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置が（−）鎖RNAの3'端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域（マイナス鎖においては3'側）に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖RNAの5'端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も5'側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはL遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子の5'隣接部位）、またはL遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子の3'隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。また外来遺伝子と共に、一つまたは複数のゲノムプロモーターを挿入していてもよい。本発明において、ゲノムプロモーターは特に制限されるものではないが、一例としてRNAポリメラーゼＩプロモーターを挙げることができる。RNAポリメラーゼＩを細胞内で発現する細胞を生産細胞として用いる場合には、RNAポリメラーゼＩを外来ベクターにより供給する必要がなく、その供給分のコストが省かれる。その上で、T7系と同様に遺伝子の高い発現効率が実現できる。外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターDNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。本発明のベクターは、このように他の外来遺伝子を保持していてもよい。【００３３】
外来遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587及びYu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466の記載に準じて、次のようにして構築することができる。【００３４】
まず、所望の外来遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子をNotI部位を利用してウイルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより増幅回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側合成DNA配列及びリバース側合成DNA配列(アンチセンス鎖)を作成する。【００３５】
例えば、フォワード側合成DNA配列は、NotIによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCG、GCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末端とすることが好ましい。【００３６】
リバース側合成DNA配列は5'側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCG、GCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。これらのオリゴDNAの長さは、センダイウイルスゲノムの総塩基数が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of six）」；Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998）。さらに挿入断片の3'側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCCT-3'（配列番号８）、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-3'、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTACGG-3'（配列番号９）、さらにその3'側に所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴDNAの3'の末端とする。【００３７】
PCRは、例えば、ExTaqポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、エンベロープ遺伝子を欠損するゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを介さずにNotI部位に直接挿入し、組換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。【００３８】
本発明のウイルスベクターcDNAは、これを試験管内または細胞内で転写させ、別途発現するL、P、NPタンパク質と結合させることにより、RNPを再構成させ、このRNPを含むウイルスベクターを生成させることができる。ウイルス由来タンパク質の一部を発現しないように改変された（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするウイルスベクターcDNAからウイルス粒子を再構成する方法は、公知の方法を参考にして実施することができる（WO97/16539号; WO97/16538号; Durbin, A.P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404）。特に、改良された方法は有効に機能する（WO2005/071092）。本発明のウイルスベクターcDNAにおいて欠失させた遺伝子は、これら欠失させた遺伝子を、宿主細胞に別途導入して発現させることができる。本発明のウイルスベクターcDNAまたは別の発現ベクターにコードされた遺伝子によって、RNPを構築させ、エンベロープタンパク質を発現させて、ウイルス粒子を再構築すれば、該ウイルス粒子は感染性を保持することができる。
また、RNP複合体自体をRNAベクターとして細胞に導入するには上記のように、リポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することも可能である。【００３９】
ウイルスベクターcDNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、(i)目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、(ii)目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、(iii)目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。【００４０】
(ii)としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）などが挙げられる。(i)としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3) 沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。(ii)の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105 ）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。(iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で(i)や(ii)の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。【００４１】
以上、３つのカテゴリーの中で(ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができる。本発明においては、好適に用いうるトランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000（Invitrogen）、 Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169）を挙げることができる。【００４２】
回収されたウイルスの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性(HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）。また、GFP（緑色蛍光タンパク質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。【００４３】
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全タンパク質（但しキャリアーや安定剤として加えたタンパク質は除く）のうち、ウイルスベクター由来のタンパク質の割合が10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができる。【００４４】
本発明のベクターは、非複製型であり、かつLタンパク質等が発現せずに、ウイルス由来タンパク質の発現が全体として大幅に削減されていることから、高い安全性を有する。特に、遺伝子治療用途で使用する場合は、ベクターの免疫原性が高いと、ベクターを繰り返して投与することができなくなるが、本発明のベクターは低免疫原性であることから、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療の応用範囲が広がるものと期待される。【００４５】
本発明のベクターは目的に応じた組成物として調製することができる。ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などで適宜希釈して組成物とすることができる。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。【００４６】
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、タンパク質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。【００４７】
外来遺伝子として、感染症に関する細菌またはウイルスの抗原をコードする遺伝子を用いれば、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導することができる。即ち、ワクチンとして利用することができる。【００４８】
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対し本発明のベクターを適用することが考えられる。例えば腫瘍治療としては、腫瘍細胞、またはDC細胞などの抗原提示細胞（APC）に本発明のベクターを用いて治療効果を有する遺伝子を発現させることができる。このような遺伝子としては、癌抗原 Muc-1 または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、メラノーマ gp100抗原などが挙げられる。このような遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i）IL-2と一本鎖IL-12 との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、ii）IL-2とインターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、iii）単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF）、iv）脳腫瘍を治療対象とした GM-CSF と IL-4 の組み合わせ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）などが挙げられる。【００４９】
感染症の治療としては、インフルエンザにおいては、例えば強毒株 H5N1 型エンベロープ、日本脳炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)）、エイズにおいては、例えばHIV gagまたは SIV gag タンパク質（J. Immunology (2000) vol. 164, 4968-4978）、HIVエンベロープタンパク質の経口投与による鎖クチン治療、ポリ乳酸-グリコール共重合体に包んでの投与（Kaneko, H. et al., Virology 267: 8-16 (2000)）、コレラにおいては、例えばコレラ毒素のBサブユニット（CTB）（Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292-7）、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイルスの糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949-52）、子宮頚癌においては、ヒトパピローマウイルス6型のカプシドタンパクL1（J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)）などが挙げられる。【００５０】
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。経鼻投与は好ましい投与経路の一つである。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクター量は好ましくは約105 CIU/mlから約1011 CIU/ml、より好ましくは約107 CIU/mlから約109 CIU/ml、最も好ましくは約1×108 CIU/mlから約5×108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は 2×105 CIU〜 2×1010 CIUが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造されたタンパク質製剤であれば、タンパク質の投与量は例えば、10ng/kgから100μg/kg、好ましくは100ng/kgから50μg/kg、より好ましくは1μg/kgから5μg/kgの範囲であるとよい。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】pMiniSeV/M/F/HNとpMiniSeV/GFP/M/F/HNの構築の過程を示す図である。
【図２】pCI-4C/P(-)の構築の過程を示す図である。
【図３】MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産性におけるSeVのC蛋白質の影響を示す写真である。（A）pCAGGS-NP (Z)、 pCAGGS-P (Z)/4C(-)、 pCAGGS-L (TDK)と、pCI controlまたはpCI-4C/P(-)のどちらかを導入したBHK-21細胞にMiniSeV/GFP/M/F/HNを感染させ、4日目の生産細胞のGFP蛍光写真である。（B）(A)の4日目の培養上清をLLC-MK2細胞に感染させ3日目のGFP蛍光写真である。
【図４】（A）感染後1〜7日のMiniSeV/GFP/M/F/HN の生産性を示すGFP写真である。（B）1〜7日に回収した培養上清におけるMiniSeV/GFP/M/F/HNのタイターを示すグラフである。
【図５】MiniSeV/GFP/M/F/HNによるin vitroでのGFP発現を示す蛍光写真である。
【図６】pMiniSeVSP/GFPとpMiniSeVSP/ルシフェラーゼの構築の過程を示す図である。
【図７】pMiniSeVDP/GFPとpMiniSeVDP/ルシフェラーゼの構築の過程を示す図である。
【図８】MiniSeVベクターの発現量に対するゲノムプロモーターの影響を示す図である。
【図９】MiniSeVSP/GFPによるGFP発現を示す蛍光写真である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔材料と方法〕
１  プラスミド構築
1.1  pMiniSeV/M/F/HN（pSeV/ΔNP/ΔP/ΔLと記すこともできる）【００５３】
先ず、pSeV(+18)を鋳型として、プライマー M/Not I-F(5’- aagtggcggccgcacggcgcaatggcagatatc、33mer（配列番号：１）)とHN/Sac II-R(5’- ggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattattaagactcggccttgcataatttag、70mer（配列番号：２）)を用いたPCRによりNot I-M/F/HN-Sac II fragmentを得た（図１）。次に、この断片をNotIとSacIIで処理、精製し、インサートとして、同様にNot IとSac IIで処理した後、SeVのNP/P/M/F/HN/L配列を含む断片を取り除いたpSeV (+18)ベクターに挿入し、pMiniSeV/M/F/HN（配列番号：３）を得た。【００５４】
1.2  pMiniSeV /GFP/M/F/HN (pSeV/GFP/ΔNP/ΔP/ΔLと記すこともできる)
pSeV/GFP/ΔFをNot I処理し、GFP-EIS/Not I fragment（配列番号：４）を分離、精製した後、同様にNot Iで処理したpMiniSeV/M/F/HNベクターに挿入し、pMiniSeV/GFP/M/F/HNを得た（図１）。ほかの目的遺伝子（GOI）を搭載する場合にも、GFP-EIS/Not I fragmentの配列を参照した。PCRでGOI-EIS/Not I fragmentを増幅し、Not I処理、精製した後、同様にNot Iで処理したpMiniSeV/M/F/HNベクターに挿入し、pMiniSeV/GOI/M/F/HNを得ることができる。【００５５】
1.3  pCI-4C/P(-)
先ず、pSeV(+18)を鋳型として、プライマー EcoR I-4C/P(-)-F（5’- acttgaattcacggcttcggctacacttaccgcctggatcaagatgccttcattc、55mer（配列番号：５））とEcoR I-4C/P(-)-R（5’- cgaggcggccgcttactcttgcactatgtg、30mer（配列番号：６））を用いたPCRによりEcoR I-4C/P(-)-EcoRI fragment（配列番号：７）を得た（図３）。次に、この断片をEcoR Iで処理、精製し、インサートとして、同様にEcoR Iで処理、精製したpCI-neoベクターに挿入し、pCI-4C/P(-)を得た。【００５６】
２  MiniSeV/GFP/M/F/HN(SeV/GFP/ΔNP/ΔP/ΔLと記することもできる)の再構築
2.1  準備
1) 細胞：前日〜8e5 BHK-21 cells/well (6-ウェルプレート)
2) 20％FBS/opti-MEM [Cat No. 31985-070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S無添加)
3) opti-MEM （原液）【００５７】
2.2  トランスフェクョン溶液準備
1) DNA溶液（1 ウェルあたり）
opti-MEM (無添加原液)                           300 μl
pCAGGS-NP (Z) , 1 μg/ μl                      0.5 μl
pCAGGS-P (Z)/4C(-) , 1 μg/ μl                 0.5 μl
pCAGGS-L (TDK), 1 μg/ μl                      2.0 μl
pCAGGS-T7, 1 μg/ μl                           1.0 μl
pMiniSeV/GFP/M/F/HN cDNA, 1 μg/ μl             5 μl
2) LipofectAMINE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen社] 溶液（1 ウェルあたり）
opti-MEM (無添加原液)                           300 μl
LipofectAMINE2000                                18 μl
3) 2)のLipofectAMINE 2000 reagent溶液を準備した5分後、1)のDNA溶液と混合し、室温で20-30分置いた。【００５８】
2.3  opti-MEM (原液)で1回洗浄、0.6 ml/wellの20％FBS/opti-MEMを添加した後、0.5 ml/wellの上記トランスフェクョン溶液を細胞へ添加した。【００５９】
2.4  37℃で6時間培養した後、1.2 ml/well 10%FBS/G-MEMを添加した。翌日、VP-SFMで１回洗浄した後、2.5 μg/ml Trypsin/VP-SFMを加えて培養した。以後毎日培地交換を行った。また、4-6日の上清（P0ウイルス溶液）を回収し、生産細胞（P0からP1へウイルス継代）へ感染させ、ウイルスの生産を行った。生産細胞は1日前にpCAGGS-NP (Z), pCAGGS-P (Z)/4C (-), pCAGGS-L (TDK), pCI-4C/P(-)を導入したBHK-21細胞を用いた。【００６０】
３  pMiniSeVSP/GFPとpMiniSeVSP/ルシフェラーゼの構築
GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子の上流に、プロモーターを1つ付加したpMiniSeVSP/GFPおよびpMiniSeVSP/ルシフェラーゼを構築した。
SP：Single-promoterのcDNA配列：
5'-accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccctgaggagcaggttccagaccct, (96 nt)（配列番号：２０）
図6-Aに示したように、市販のGFPプラスミドをテンプレートとして、Primer Not I-GFP-N (5’- agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer（配列番号：１０）)とGFP-Sac II-C (5’- caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg, 65 mer（配列番号：１１）)を用いたPCRでNot I-GFP-Sac II断片を得た。次にこの断片をNot IとSac IIで処理、精製した後、同様にNot IとSac IIで処理し、SeVのNP,P,L,M,F,HN配列を含む断片を除いたpSeV(TDK)ベクターにGFPインサートとして挿入し、pMiniSeVSP/GFP（配列番号：１２）を得た。【００６１】
一方、図6-Bに示したように、プライマー Not I-ルシフェラーゼ-N (5’-atccatcgcggccgcagatcttcacgatggaagacgccaaaaacataaag, 50mer（配列番号：１３）)とルシフェラーゼ-Sac II-C (5’- acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc, 66mer（配列番号：１４）)を用いたPCRでルシフェラーゼの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付加し、pMiniSeVSP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることでpMiniSeVSP/ルシフェラーゼ（配列番号：１５）を得た。【００６２】
４  pMiniSeVDP/GFPとpMiniSeVDP/ルシフェラーゼの構築
GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子の上流に、プロモーターを2つ付加したpMiniSeVDP/GFPおよびpMiniSeVDP/ルシフェラーゼを構築した。
DP：Double-promoterのcDNA配列：
accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagtgtcaaagtaTccaccctgaggagcaggttccagaccct / aaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccctgaggagcaggttccagaccct, (GP58A (96 nt) + GPd12 (84 nt))（配列番号：２１）
図7-Aに示したように、pMiniSeVSP/GFPをテンプレートとして、それぞれプライマー 224N (5’- ataccgcatcaggcgccattcg, 22 mer（配列番号：１６）)と(GP58A-GPd12)R (5’- gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, 57 mer（配列番号：１７）)を用いたPCRで得られた断片、およびプライマー (GP58A-GPd12)F (5’- ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer（配列番号：１８）)とGFP-Sac II-C （配列番号：１１）を用いたPCRで得られた断片を精製した。これらの断片をテンプレートとして、さらにプライマー 224N とGFP-Sac II-C を用いたPCRにより断片を得た。この断片をKas IとSac IIで処理、精製した後、同様にKas IとSac IIで処理してシングルプロモーター(Single-promoter)を含む配列を除いたpMiniSeVSP/GFPベクターにインサートとして挿入し、pMiniSeVDP/GFP（配列番号：１９）が得られた。【００６３】
図7-Bに示したように、プライマー Not I-ルシフェラーゼ-Nとルシフェラーゼ-Sac II-Cを用いたPCRでルシフェラーゼの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付け、pMiniSeVDP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることでpMiniSeVDP/ルシフェラーゼが得られた。【００６４】
５  MiniSeVベクター（MiniSeVSP/GFP, MiniSeVSP/ルシフェラーゼ, MiniSeVDP/GFP, MiniSeVDP/ルシフェラーゼ）の再構築及び生産
5.1  準備
1) 細胞：前日〜8e5 BHK-21 cells/well (6-ウェルプレート)
2) 20％FBS/opti-MEM [Cat No. 31985-070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S無添加)
3) opti-MEM （原液）【００６５】
5.2  トランスフェクョン溶液準備
1) DNA溶液（1 ウェルあたり）
opti-MEM (無添加原液)                           300 μl
pCAGGS-NP (Z) , 1 μg/ μl                       0.5 μl
pCAGGS-P (Z)/4C(-) , 1 μg/ μl                  0.5 μl
pCAGGS-L (TDK), 1 μg/ μl                       2.0 μl
pCAGGS-M (Z), 1 μg/ μl                         1.0 μl
pCAGGS-F5R, 1 μg/ μl                       1.0 μl
pCAGGS-HN(Z), 1 μg/ μl                       1.0 μl
pCAGGS-T7, 1 μg/ μl                           1.0 μl
MiniSeVベクター cDNA, 1 μg/ μl             5 μl
2) LipofectAMINE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen社] 溶液（1 ウェルあたり）
opti-MEM (無添加原液)                           300 μl
LipofectAMINE2000                                21 μl
3) 2)のLipofectAMINE 2000 reagent溶液を準備した5分後、1)のDNA溶液と混合し、室温で20-30分置いた。【００６６】
5.3  opti-MEM (原液)で1回洗浄、0.6 ml/wellの20％FBS/opti-MEMを添加した後、0.5 ml/wellの上記トランスフェクョン溶液を細胞へ添加した。【００６７】
5.4  上記細胞を37℃で6時間培養した後、1.2 ml/well 10%FBS/G-MEMを添加した。翌日、VP-SFMで１回洗浄した後、2.5 μg/ml Trypsin/VP-SFMを加えて培養した。以後毎日培地交換を行った。また、3-6日の上清（P0ウイルス溶液）を回収し、生産細胞（P0からP1へウイルス継代）へ感染させ、ウイルスの生産を行った。生産細胞はウイルス感染の1日前にpCAGGS-NP (Z), pCAGGS-P (Z)/4C (-), pCAGGS-L (TDK), pCI-4C/P(-), pCAGGS-M(Z), pCAGGS-F5R, pCAGGS-HN(Z)を導入したBHK-21細胞を用いた。【００６８】
〔実施例１〕  MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産性におけるSeVのC蛋白質の影響
前日2e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞にLipofectamine 2000試薬を用いて、pCAGGS-NP (Z), pCAGGS-P (Z)/4C(-), pCAGGS-L (TDK)とpCI control或いはpCI-4C/P(-)を導入した。翌日MiniSeV/GFP/M/F/HNを種ウイルスとして感染させた後、Trypsin (最終濃度2.5μg/ml)を含むVP-SFM培地を用いてウイルスの生産を行った。感染後4日目に生産細胞のGFP蛍光写真を撮影した。また、この4日目の培養上清を回収して、新鮮なLLC-MK2細胞（24-well plate）へ感染させ、3日目のGFP蛍光写真を撮影した。
C蛋白質発現プラスミド[pCI-4C/P(-)]を導入した条件ではC蛋白質を発現しないコントロールプラスミド[pCI-neo]を導入した条件より高いウイルス生産性が得られた（図３）。また、高い生産性を得るには適量のC蛋白質を発現させる必要があることが明らかになった。【００６９】
〔実施例２〕  MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産
前日8e5 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へLipofectamine 2000試薬を用いて、pCAGGS-NP (Z), P (Z)/4C(-), L (TDK)とpCI-4C/P(-)を導入した。翌日MiniSeV/GFP/M/F/HNを種ウイルスとして感染させた後、Trypsin (最終濃度2.5μg/ml)入りのVP-SFM培地を用いてウイルスの生産を行った。感染後1〜7日、毎日GFP蛍光写真を撮影、培養上清を回収、培地交換を行った。1〜7日回収した培養上清をCIU Assayを行った。
図４に示したように、3-6日の培養上清から1e7 GFP-CIU/ml以上の非常に高いタイターのMiniSeV/GFP/M/F/HNが回収された。【００７０】
〔実施例３〕  MiniSeV/GFP/M/F/HNによるin vitro発現
当日3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたHeLa細胞へMiniSeV/GFP/M/F/HNをMOI=100, 10, 1で感染させた。また、MiniSeV/GFP/M/F/HNをMOI=1とSeVagp55/dFをMOI=5で共感染させた。感染後１日目、２日目のGFP写真を撮影した。
図５に示したように、MiniSeV/GFP/M/F/HN単独MOI=1で感染した場合弱いGFP発現しか見られなかったが、MOI=100で感染した場合、Helper-SeV (SeVagp55/ΔF)共感染（複製型SeVに相当）に近いレベルのGFP 発現が確認された。【００７１】
〔実施例４〕MiniSeVベクターの発現量に対するゲノムプロモーターの影響
前日2e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたLLC-MK2細胞へMiniSeVSP/ルシフェラーゼとMiniSeVDP/ルシフェラーゼを単独感染（n=3）またはHelper-SeV (MOI10)とそれぞれ共感染(n=3)させた。感染後２日目、単独感染させたwellから細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。Helper-SeVと共感染させたWellを抗ルシフェラーゼ抗体を用いて免疫染色し、各wellのルシフェラーゼ陽性細胞数を計測した。ルシフェラーゼ活性の平均値でルシフェラーゼ陽性細胞数の平均値を割ると、細胞あたりのルシフェラーゼ活性を算出することができる。図８に示したように、シングルプロモーター(Single-promoter)を有するMiniSeVSP/ルシフェラーゼベクターの方が、ダブルプロモーター(Double-promoter)を有するMiniSeVDP/ルシフェラーゼと比べて、細胞あたりの蛋白発現量（ルシフェラーゼ活性）が約1.5倍高いことが分かった。【００７２】
〔実施例５〕MiniSeVSP/GFPによるGFP発現
前日2e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたLLC-MK2細胞へMiniSeVSP/GFPを単独感染またはHelper-SeV (MOI10)と共感染させ、２日目にGFP蛍光を観察し、写真撮影を行った。図9に示したように、MiniSeVベクター単独感染の方がHelper-SeVと共感染した場合と比べてGFP発現が弱いものの、単独感染でも明確なGFP発現細胞が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明者らが開発した非複製SeVベクターは高い導入効率と低い免疫原性を有しているため、抗体作製、蛋白機能解析、遺伝子治療、遺伝子ワクチンなど幅広い分野への応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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