(57)【要約】  本発明者らは、TPO受容体に対する低分子化アゴニスト抗体（VB22B sc(Fv)2）の投与により、ヒト巨核球特異的分化誘導（血小板前駆細胞の増加）に加え、ヒト臍帯血由来の血液幹細胞(CD34陽性細胞）の生着、およびmulti-lineageな血液前駆細胞の有意な増加を見出した。TPO又はTPO受容体アゴニストは、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植）後に単独投与（G-CSFやerythropoietinの併用なく）するだけで効果を期待し得る、造血系CD34陽性細胞の増殖促進剤又は骨髄での生着促進剤として使用し得る。また、multi-lineageな造血前駆細胞の増殖及び/又は分化促進剤、並びにmulti-lineageな造血能回復促進剤として使用し得る。
2007145227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤。
【請求項２】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤。
【請求項３】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤。
【請求項４】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血能回復促進剤。
【請求項５】
造血幹細胞移植において用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
造血幹細胞移植後に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植からなる群より選択される、請求項５又は６に記載の薬剤。
【請求項８】
臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
複数回投与されることを特徴とする、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤。
【請求項１１】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤。
【請求項１２】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血幹細胞の増殖を促進する方法。
【請求項１３】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する方法。
【請求項１４】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる方法。
【請求項１５】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血能の回復を促進する方法。
【請求項１６】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞を増殖させる方法。
【請求項１７】
TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化を促進する方法。
【請求項１８】
造血幹細胞増殖促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【請求項１９】
造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【請求項２０】
造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【請求項２１】
造血能回復促進剤の製造におけるTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【請求項２２】
リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【請求項２３】
リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞増殖促進剤に関する。また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着促進剤、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンボポエチン（Thrombopoietin：TPO）は、巨核球系の造血細胞の増殖と分化を促進するサイトカインであり、巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte colony-stimulating factor）あるいはc-mplのリガンドとして知られている。サイトカイン受容体の多くは、リガンドの結合により受容体同士が2量体化し、シグナルが細胞内に伝達される。TPOにおいても、その特異的レセプターであるc-mplと結合し、受容体を2量体化することにより、細胞内に情報を伝え、生理作用を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。【０００３】
このような性質をもつ受容体に結合する抗体の中で、アゴニスト活性を示す抗体が存在することが報告されている。例えば、エリスロポエチン（EPO）受容体に対する抗体がエリスロポエチン機能を代替することが報告されており、この抗体を一価（Fab）にするとEPO受容体への結合能を維持したまま、シグナル伝達能を失うことから、二価の結合によるエリスロポエチン受容体の二量体形成が必要と考えられている（非特許文献２参照）。【０００４】
同様に、c-mplに結合するTPO受容体アゴニスト活性を有する抗体も報告されており（非特許文献３〜４、特許文献１〜３参照）、このような抗体を利用した造血幹細胞の増殖を促進させる試みも行われている。【０００５】
例えば、ヒト臍帯血細胞（CD34陽性細胞）を移植されたNOD/SCIDマウスにTPOを１回投与し、臍帯血細胞の増殖を検討した実験例の報告がある（非特許文献５参照）。しかしながらこの報告によると、CD34陽性細胞の生着増強は認められていない。【０００６】
また、臍帯血移植モデルマウスにTPO以外のTPO受容体アゴニスト（PEG-rHuMGDF）を投与した報告もある（非特許文献６参照）。しかしながら、該文献には血小板回復促進作用についての報告があるのみで、CD34陽性細胞の骨髄への生着に対する作用に関しては一切報告されていない。【０００７】
さらに、NOGマウス（NOD/SCIDマウスより、更に免疫不全度が高いマウスである）にヒト臍帯血細胞を移植し、移植後2-6か月後からc-mplアゴニストを投与した実験が報告されている（非特許文献７参照）。しかし該文献によると、骨髄でのCD34陽性細胞の増加は認められなかった。【０００８】
また、実際に患者１名に対して、ヒト臍帯血移植後にTPO、G-CSF及びEPOの３薬剤を同時に投与することにより、血球の回復を早めることが出来たという報告がある。しかしながら、これら３薬剤はtri-lineageな造血を助ける目的で投与されたことが記載されているため（p.198右欄中段）、TPO単独でのCD34陽性細胞の増殖や分化効果について示唆するものではない（非特許文献８参照）。【０００９】
一方、TPOノックアウトマウスにTPOを投与することで移植の効率が上がることが報告されている（非特許文献９参照）。該文献では、TPOが血小板以外の細胞系譜にも作用することが示唆されている。しかしながら、CD34陽性細胞の生着の有無についての報告はなく、また、ヒト臍帯血についての言及もない。
このように、これまでのところ、TPO受容体アゴニスト活性を有する抗体を投与することによって実際に造血幹細胞の増殖を活性化させることに成功したという報告はない。【００１０】
なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
【特許文献１】WO2002/33072
【特許文献２】WO2005/056604
【特許文献３】WO2005/107784
【非特許文献１】Stem Cells.1996年、Vol14 suppl 1,p124-132
【非特許文献２】Elliott Sら著、J.Biol.Chem., 1996年、Vol.271(40)、p.24691-24697
【非特許文献３】Abe ら著、Immunol. Lett. 1998年、Vol.61、p.73-78
【非特許文献４】Bijia Dengら著、Blood、1998年、Vol.92、p.1981-1988
【非特許文献５】British Journal of Haematology 122, 837-846, 2003
【非特許文献６】Japanese Journal of Transfusion Medicine 46(3), 311-316, 2000
【非特許文献７】Blood 2006年、Vol.107, p4300-4307
【非特許文献８】Bone Marrow Transplantation 29, 197-204 (2002)
【非特許文献９】The Journal of Clinical Investigation 110(3), 389-394 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、本発明は、TPO受容体のアゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞増殖促進剤を提供することを課題とする。また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着促進剤、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。本発明者らは、TPO受容体に対する低分子化アゴニスト抗体（VB22B sc(Fv)2）の投与により、ヒト巨核球特異的分化誘導（巨核球系細胞の増加）に加え、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞（造血系CD34陽性細胞）の骨髄での生着促進、およびmulti-lineageな血液前駆細胞の有意な増殖が起こることを見出した。このことから本発明者らは、TPO又はTPO受容体アゴニストが、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植）後に単独投与（G-CSFやerythropoietinの併用なく）するだけで効果を期待し得る、造血系CD34陽性細胞の増殖促進剤又は骨髄での生着促進剤として使用し得ることを想到した。また本発明者らは、TPO又はTPO受容体アゴニストが、multi-lineageな造血前駆細胞の増殖及び/又は分化促進剤、並びにmulti-lineageな造血能回復促進剤として使用し得ることを想到した。【００１３】
より具体的には、本発明は以下の〔１〕〜〔４２〕を提供するものである。
〔１〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤、
〔２〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、
〔３〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、
〔４〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血能回復促進剤、
〔５〕造血幹細胞移植において用いられる、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の薬剤、
〔６〕造血幹細胞移植後に投与される、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の薬剤、
〔７〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植からなる群より選択される、〔５〕又は〔６〕に記載の薬剤、
〔８〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕複数回投与されることを特徴とする、〔８〕に記載の薬剤、
〔１０〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤、
〔１１〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤、
〔１２〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔５〕に記載の薬剤、
〔１３〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、〔１２〕に記載の薬剤、
〔１４〕放射線治療または化学療法を、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人T細胞白血病、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）、ＡＡ（再生不良性貧血）その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、〔１３〕に記載の薬剤、
〔１５〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血幹細胞の増殖を促進する方法、
〔１６〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する方法、
〔１７〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる方法、
〔１８〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血能の回復を促進する方法、
〔１９〕造血幹細胞移植において行われる、〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕造血幹細胞移植後において行われる〔１５〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法、
〔２１〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植から選択される、〔１９〕又は〔２０〕に記載の方法、
〔２２〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、〔２１〕に記載の方法、
〔２３〕複数回投与されることを特徴とする、〔２２〕に記載の方法、
〔２４〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞を増殖させる方法、
〔２５〕TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化を促進する方法、
〔２６〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔１９〕に記載の方法、
〔２７〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、〔２６〕に記載の方法、
〔２８〕放射線治療または化学療法を、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人T細胞白血病、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）、ＡＡ（再生不良性貧血）その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、〔２７〕に記載の方法、
〔２９〕造血幹細胞増殖促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３０〕造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３１〕造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３２〕造血能回復促進剤の製造におけるTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３３〕造血幹細胞移植において用いられる造血幹細胞増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血能回復促進剤の製造におけるTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３４〕造血幹細胞移植後に投与される造血幹細胞増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血能回復促進剤の製造におけるTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３５〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植から選択される、〔３３〕又は〔３４〕に記載の使用、
〔３６〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、〔３５〕に記載の使用、
〔３７〕複数回投与されることを特徴とする、〔３６〕に記載の使用、
〔３８〕リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔３９〕リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤の製造における、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストの使用、
〔４０〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔３３〕に記載の使用、
〔４１〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、〔４０〕に記載の使用、
〔４２〕放射線治療または化学療法を、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人T細胞白血病、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）、ＡＡ（再生不良性貧血）その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、〔４１〕に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各血球系細胞数に対するsc(Fv)2（hVB22 u2-wz4）の影響を示す図である（meanは−、SAS ver.5.0 wilcoxon test）。
【図２】CFU-Megコロニー数に対するsc(Fv)2（hVB22 u2-wz4）の影響を示す図および写真である（meanは−、SAS ver.5.0 wilcoxon test）。
【図３】各血球系細胞数に対するsc(Fv)2（hVB22 u2-wz4）の用量依存的な影響を示す図である（平均値バー＋ＳＤ，Jonckheere-Terpstra 検定）。図中MAB(H)、MAB(M)、MAB(L)は、それぞれhVB22sc(Fv)2の高投与群、中投与群、低投与群を表す。
【００１５】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤（以下本明細書において、これらの薬剤を総称し、「本発明の薬剤」と称する場合あり）を提供する。【００１６】
本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤を提供する。本発明においてアゴニストとは、受容体に働いて神経伝達物質やホルモンなどと同様の機能を示す物質を指す。本発明のアゴニストとしては、これに限定されるものではないが、低分子化合物や抗体が挙げられる。本発明の抗体には、低分子化された抗体、ヒト化抗体やキメラ化抗体などのアミノ酸配列が改変された抗体、他の分子（例えば、ポリエチレングリコールなどの高分子等）が結合した修飾抗体、糖鎖が改変された抗体、など如何なる抗体も含まれる。【００１７】
本発明において造血幹細胞とは、あらゆるリンパ系細胞又は骨髄系細胞への分化が可能な細胞を指す。本発明における造血幹細胞は、このような性質を有するものであれば特に限定されるものではないが、造血系CD34陽性細胞として特徴づけることが可能である。造血系CD34陽性細胞は、CD34陽性造血幹細胞及びCD34陽性造血前駆細胞を含むヘテロな細胞集団であり、例えば、多能性幹細胞、リンパ系幹細胞、CFU-GEMM、CFU-GM、BFU-E、CFU-MEGなどが含まれる。ここで、CD34陽性造血前駆細胞とは、CD34を発現している細胞であって、リンパ系細胞（B細胞、T細胞等）または骨髄系細胞（好中球、単球、赤血球、巨核球等）への分化の過程にあるものの、各系統への分化が方向づけられておらず、また形態学的にも分化先の細胞を同定することが不可能な段階にある細胞を意味する。細胞がCD34を発現しているか否かは、当業者に周知の方法、例えば文献Journal of Hematotherapy 5, 213-226, 1996 (Robert Sutherland et al. The ISHAGE guidelines for CD34 cell determination by Flow Cytometry.)に記載の方法によって判定することが可能である。【００１８】
本発明において「増殖の促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、造血幹細胞、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の増殖が活性化することを意味する。造血幹細胞、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の増殖が活性化したか否かの判定は、当業者が通常行う方法によって行うことが可能であり、例えば造血幹細胞、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の増殖速度の変化、造血幹細胞、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の数（コロニー数）の変化、又は造血幹細胞、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の増殖に関与する細胞内シグナルの変化等を検出することによって行うことが出来る。【００１９】
また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤を提供する。本発明において「造血系CD34陽性細胞の分化」とは、あらゆるリンパ系細胞又は骨髄系細胞へと変化することが可能であった造血系CD34陽性細胞が、そのような状態を脱し、ある特定の細胞へと変化することが決定づけられる過程、及び、該決定づけられた細胞へと至る過程を意味する。ここで、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の分化先の細胞としては、特これらに限定されるものではないが、T細胞、B細胞、NK細胞等のリンパ系細胞及び、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球等の骨髄系細胞が挙げられる。【００２０】
また本発明において「分化の促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、分化が活性化することを意味する。造血系CD34陽性造血幹細胞の分化が活性化したか否かの判定もまた当業者に公知の方法によって行うことが可能であり、例えば細胞の増殖速度の変化、細胞数の変化、分化に関与する細胞内シグナル強度の変化、分化マーカー、細胞形態の変化等を検出することによって行うことができる。【００２１】
また造血幹細胞移植においては、移植された造血幹細胞が骨髄に生着することが求められる。本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤を提供する。本発明の薬剤を投与することによって、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の骨髄への生着を促進することが可能となる。造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着の有無又は程度の測定（造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着率の測定）は、例えば、ヒト造血細胞を移植したNOD/SCIDマウス骨髄におけるヒト造血系CD34陽性細胞の絶対数を測定することによって行うことができる。マウス骨髄細胞中でのヒト細胞は、ヒトCD34特異的蛍光標識抗体を用いて検出することによって測定される。具体的には、以下の手順によって、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着率の測定を行うことが出来る。まず、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞移植3週後に、NOD.CB17-Prkdc<scid>/Jマウスを安楽死させ、大腿骨2本を採取する。次に、大腿骨の骨端をハサミで切除し、26G針シリンジでフラッシュアウトし、骨髄細胞の採取を行う。2%FBS含IMDMで洗浄後、5mLの赤血球溶解液を添加し5分静置する。遠心し上清を除去後、2mLの2%FBS含IMDMに懸濁し、70μmのメンブレンに通し、骨髄細胞懸濁液(2mL/大腿骨2本/mouse)を調製する。これを100μL/サンプルに分注し、蛍光標識ヒトCD34特異的抗体とPI(終濃度2μg/mL)で15分間染色する。洗浄後、FLOW-COUNT蛍光粒子を50μL添加し、細胞解析装置EPICS XLを用いて、ヒトCD34陽性細胞生着数を測定する。測定は、例えばベックマン・コールター社製アプリケーションノート5：Flow-Countを用いた細胞絶対数の測定に準じて実施すればよい。同様に、検出する抗体を変えることで、各種の血球系細胞の骨髄での絶対数を計測することが可能である。大腿骨2本に含まれる各ヒト細胞絶対数は、下記式によって表される。
ヒト細胞絶対数= 測定値(個/μL) × 1/2(FLOW-COUNT添加量(50)/サンプル添加量(100)) × 2000(2mL/大腿骨2本/mouse)
（Barnett D, Granger V, Whitby L, Storie I, Reilly JT. Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: the way forward. Br J Haematol. 1999 Sep;106(4):1059-62.）
また、上記以外の方法にも、例えば造血幹細胞移植を受けたヒトにおける造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着率を測定する場合には、間接的に、末梢血での血球の回復状態をモニターすることによって行うことが可能である。【００２２】
また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する造血能回復促進剤を提供する。一般に、移植後造血幹細胞が生着し白血球が回復するまで、１−３週間の時間を要するとされている。この間、血液中の白血球数は極めて少ないため、肺炎などの細菌やかびによる感染症を起こしやすいという問題がある。また、一般に、移植後造血幹細胞が生着し血小板が回復するまで、２−１０週間の時間を要するとされている。この間、血液中の血小板数は極めて少ないため、出血を起こしやすいという問題がある。本発明の造血能回復促進剤を用いることによって、このような移植後の幹細胞の造血能の活性に関する課題を解決することが可能である。本発明において「造血能回復促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、骨髄における造血能が活性化することを意味する。骨髄における造血能が活性化したか否かは、末梢血での血球の回復状態をモニターすることによって判定することが可能である。【００２３】
また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤を提供する。本発明者らは、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストによって造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着が増加した結果、リンパ系、及び骨髄系のいずれの細胞系譜の細胞も増加することを見出した（実施例参照）。本発明のリンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤は、このような知見に基づくものである。本発明におけるリンパ系細胞としては、これらに限定されるものではないが、T細胞、B細胞、NK細胞が挙げられる。また骨髄系細胞としては、これらに限定されるものではないが、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球などが挙げられる。【００２４】
本発明者らは、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストが、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の分化を活性化させることを見出した。よって本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤を提供する。本発明において、造血系CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、CD34陽性造血前駆細胞）の分化先の細胞としては、T細胞、B細胞、NK細胞等のリンパ系細胞、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球等の骨髄系細胞が挙げられる。【００２５】
本発明の薬剤は、急性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異変形症候群、急性リンパ球性白血病、成人T細胞白血病、再生不良性貧血、悪性リンパ腫その他造血幹細胞が適応となる疾患を治療するために行う造血幹細胞移植において、造血幹細胞の増殖を促進させるため、造血系CD34陽性造血幹細胞の増殖及び/又は分化を促進させるため、造血系CD34陽性造血幹細胞の骨髄への生着を増加させるため、若しくは造血能の回復を促進させるために有用である。【００２６】
本発明の造血幹細胞移植には、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、及び臍帯血移植が含まれる。一般に、白血病等の治療目的で骨髄移植を行う際、骨髄移植に加えて末梢血幹細胞移植、臍帯血移植が広く行われている。【００２７】
c-mplはTPOの受容体であり、ヒトc-mplの遺伝子配列は既に解析されている（Palacios et al、Cell、1985年、Vol.41、p.727-734又は、Genebank:NM_005373）。又、カニクイザルc-mpl（塩基／配列番号：５２、アミノ酸／配列番号：５３）、マウスc-mpl(GenBank#NM_010823)の配列も既に公知である。ヒトc-mplのアミノ酸配列を配列番号：５１に示す。【００２８】
又、本発明におけるc-mplには、上述のc-mplにおいてアミノ酸が置換、欠失、付加等された変異c-mpl受容体も含まれる。変異c-mplの具体例としては、例えば、Matthias Ballmaier et al., BLOOD、(2001)、Vol.97、No.1、P139等に記載された変異c-mplを挙げることができる。【００２９】
本発明においてはc-mplに対するアゴニストは、造血幹細胞の増殖を促進する作用、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する作用、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる作用、もしくは造血能の回復を促進する作用を有する限り限定されない。候補化合物がこれらの作用を有するか否かは当業者に公知の方法により確認することが可能である。【００３０】
c-mplに対するアゴニスト活性とは、造血幹細胞の増殖を促進する活性、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する活性、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる活性、若しくは造血能の回復を促進する活性である。アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。又、アゴニスト活性の測定は、本来の活性を指標に測定するだけでなく、他の活性を指標に測定することも可能である。【００３１】
例えば、細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞にアゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞を測定すること、フローサイトメーターにより細胞数を測定すること、若しくはテトラゾリウム塩WST-8（同仁化学研究所）のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標とすること等によって、アゴニスト活性を測定することが可能である。【００３２】
アゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、受容体が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、受容体が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、G-CSF受容体、mpl、neu、GM-CSF受容体、EPO受容体、c-kit、FLT-3等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、BaF3、NFS60、FDCP-1、FDCP-2、CTLL-2、DA-1、KT-3等を挙げることができる。【００３３】
その他、アゴニスト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び／又は質的な変化が測定可能である限り、どのようなものでも使用することができる。例えば、無細胞系(cell free assay)の指標、細胞系(cell-based assay)の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、DNA、RNAの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、DNA、RNAの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、mRNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、mRNA量、Ca2+やcAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。【００３４】
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はBEACON（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはBIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはARVOなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で2種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、2種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。【００３５】
本発明におけるアゴニストは、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよい。本発明におけるアゴニストとしては公知のものを用いることができる。また、上記方法によってアゴニスト活性を有すると判定された新規化合物を用いることもできる。【００３６】
本発明のアゴニストの好ましい態様の一つとして、低分子化抗体が挙げられる。低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明における低分子化抗体は、whole抗体と比較して、顕著に高い活性を有する。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は／及び軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、VH又は/及びVLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。【００３７】
ここで、「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Fv」断片は1つのVHおよびVLが非共有結合により強く連結されたダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。【００３８】
scFvには、抗体のVHおよびVLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、FvポリペプチドはさらにVHおよびVLの間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりscFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113（Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。【００３９】
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でVL及びVHが、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。【００４０】
本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の特に好ましい態様としては、sc(Fv)2を挙げることができる。sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高いアゴニスト活性を示すことが本願出願人により見出されている。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。【００４１】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。【００４２】
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば、以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］【００４３】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。【００４４】
例えば、ペプチドリンカーの場合：
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７７）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：７８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：８１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８２）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：８３）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８４）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：７９）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：８０）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。【００４５】
よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］【００４６】
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。【００４７】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。本発明において好ましい低分子化抗体はDiabody又はsc(Fv)2であり、特に好ましくはsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。【００４８】
sc(Fv)2化された抗c-mpl抗体は、c-mplに対して特に高いアゴニスト活性を有するので、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。【００４９】
本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、キメラ抗体又はヒト化抗体等の改変抗体を挙げることができ、特にヒト化抗体を挙げることができる。【００５０】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体V領域をコードするDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。【００５１】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576号公報参照）。【００５２】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。【００５３】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes.（1993）53, 851-856）。【００５４】
キメラ抗体及びヒト型化抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域を修飾してもよい。【００５５】
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および定常領域とからなる。【００５６】
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
キメラ抗体における可変領域、又はヒト化抗体におけるCDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能である。【００５７】
c-mplを認識するヒト化抗体の例としては、後述の（９）−（１９）に記載のヒト化抗体を挙げることができる。
キメラ抗体やヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、ヒトに投与する場合に特に有用であり、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。【００５８】
本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、可溶型c-mplに結合する抗体を挙げることができる。ここでいう可溶型c-mplとは、細胞膜上に発現しているc-mpl以外のc-mplのことをいう。可溶型c-mplの具体的な例としては、膜貫通領域の一部又は全部が欠損しているc-mplを挙げることができる。ヒトc-mplの場合、膜貫通領域は配列番号：５１において492番目のアミノ酸〜513番目のアミノ酸の部分が相当する。【００５９】
可溶型組換えc-mplに結合する抗体は、エピトープの詳細な解析や結合における反応速度論的解析に利用できるだけでなく、in vivo試験における血中濃度や体内動態を評価することにも有用である。【００６０】
本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、ヒトc-mplとサルc-mplの両方に対して結合活性又はアゴニスト活性を有する抗体を挙げることができる。ヒトc-mplとサルc-mplの両方に対してアゴニスト活性を有する抗体は、通常、ヒトにおいて測定することが困難な体内動態やin vivoでの効果を、サルを用いて検証できることから、非常に有用であると考えられる。これらの抗体は、さらに、ヒト及びサル以外の動物（例えば、マウスなど）のc-mplに対して、結合活性やアゴニスト活性を有していてもよい。【００６１】
さらに本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、TPOアゴニスト活性（c-mplに対するアゴニスト活性）がEC50=100nM以下、好ましくはEC50=30nM以下、さらに好ましくはEC50=10nM以下である抗体を挙げることができる。【００６２】
さらに本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、可溶型c-mplへの結合活性がKD=10-6M以下、好ましくはKD=10-7M以下、さらに好ましくはKD=10-8M以下の抗体を挙げることができる。【００６３】
本発明において、可溶型組換えc-mplへの結合活性がKD=10-6M以下の抗体であるか否かは、当業者に公知の手段を使用して測定することができる。例えば、BIAcoreを用いた表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。すなわちSensor Chip上に可溶型c-mpl-Fc蛋白質を固定させ、抗体と可溶型c-mpl-Fcの相互作用を測定値から反応速度定数として算出することができる。また、結合活性の評価には、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、被験抗体が結合する抗原をコーティングしたプレートに、被験抗体を含む試料、例えば、被験抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。【００６４】
結合活性の上限は特に限定されないが、例えば、当業者が技術的に作製可能な範囲の上限を設定することができる。しかしながら、技術的に作製可能な範囲は、技術の進歩により拡大される。【００６５】
本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、以下の（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体を挙げることができる。（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体は好ましくは低分子化抗体である。【００６６】
（１）配列番号１、２、３（VB22B：VH CDR1、2、3）に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVHを含む抗体。【００６７】
（２）配列番号４、５、６（VB22B：VL CDR1、2、3）に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVLを含む抗体。【００６８】
（３）配列番号：１、２、３（VB22B：VH CDR1、2、3）に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVH、および配列番号：４、５、６（VB22B：VL CDR1、2、3）に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVLを含む抗体。【００６９】
（４）配列番号：８（VB22B：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVHを含む抗体。【００７０】
（５）配列番号：１０（VB22B：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVLを含む抗体。【００７１】
（６）配列番号：８（VB22B：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、および配列番号：１０（VB22B：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVLを含む抗体。【００７２】
（７）配列番号：１２（VB22B：scFv）に記載のアミノ酸配列を有する抗体。【００７３】
（８）配列番号：１４（VB22B：sc(Fv)2）に記載のアミノ酸配列を有する抗体。【００７４】
（９）以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVHを含むヒト化抗体。
（ａ）配列番号：１５、１６、１７、１８（hVB22B p-z：VH FR1、2、3、4）
（ｂ）配列番号：１９、２０、２１、２２（hVB22B g-e：VH FR1、2、3、4）
（ｃ）配列番号：２３、２４、２５、２６（hVB22B e：VH FR1、2、3、4）
（ｄ）配列番号：５４、５５、５６、５７（hVB22B u2-wz4：VH FR1、2、3、4）
（ｅ）配列番号：５４、５５、５８、５７（hVB22B q-wz5：VH FR1、2、3、4）【００７５】
（１０）以下の（ａ）から（ｄ）に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVLを含むヒト化抗体。
（ａ）配列番号：２７、２８、２９、３０（hVB22B p-z：VL FR1、2、3、4）
（ｂ）配列番号：３１、３２、３３、３４（hVB22B g-eまたはhVB22B e：VL FR1、2、3、4）
（ｃ）配列番号：５９、６０、６１、６２（hVB22B u2-wz4：VL FR1、2、3、4）
（ｄ）配列番号：５９、６３、６４、６２（hVB22B q-wz5：VL FR1、2、3、4）【００７６】
（１１）以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のVHおよびVLを含むヒト化抗体。
（ａ）配列番号：１５、１６、１７、１８に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVH、および配列番号：２７，２８，２９，３０に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVL
（ｂ）配列番号：１９、２０、２１、２２に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVH、および配列番号：３１、３２、３３、３４に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVL
（ｃ）配列番号：２３、２４、２５、２６に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVH、および配列番号：３１、３２、３３、３４に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVL
（ｄ）配列番号：５４、５５、５６、５７に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVH、および配列番号：５９、６０、６１、６２に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVL
（ｅ）配列番号：５４、５５、５８、５７に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVH、および配列番号：５９、６３、６４、６２に記載のアミノ酸配列からなる、FR1、2、3、4を有するVL【００７７】
（１２）配列番号：１、２、３に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVHを含むヒト化抗体。【００７８】
（１３）配列番号：４、５、６に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVLを含むヒト化抗体。【００７９】
（１４）配列番号：１、２、３に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVH、および配列番号：４、５、６に記載のアミノ酸配列からなるCDR1、2、3を有するVLを含むヒト化抗体。【００８０】
（１５）配列番号：３６（hVB22B p-z：VH）、配列番号：３８（hVB22B g-e：VH）、配列番号：４０（hVB22B e：VH）、配列番号：６５（hVB22B u2-wz4：VH）、あるいは配列番号：６６（hVB22B q-wz5：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVHを含むヒト化抗体。【００８１】
（１６）配列番号：４２（hVB22B p-z：VL）、配列番号：４４（hVB22B g-e：VLあるいはhVB22B e：VL）、配列番号：６７（hVB22B u2-wz4：VL）、あるいは配列番号：６８（hVB22B q-wz5：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVLを含むヒト化抗体。【００８２】
（１７）以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のVHおよびVLを含むヒト化抗体。
（ａ）配列番号：３６（hVB22B p-z：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、及び配列番号：４２（hVB22B p-z：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVL
（ｂ）配列番号：３８（hVB22B g-e：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、及び配列番号：４４（hVB22B g-e：VLあるいはhVB22B e：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVL
（ｃ）配列番号：４０（hVB22B e：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、及び配列番号：４４（hVB22B g-e：VLあるいはhVB22B e：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVL
（ｄ）配列番号：６５（hVB22B u2-wz4：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、及び配列番号：６７（hVB22B u2-wz4：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVL
（ｅ）配列番号：６６（hVB22B q-wz5：VH）に記載のアミノ酸配列からなるVH、及び配列番号：６８（hVB22B q-wz5：VL）に記載のアミノ酸配列からなるVL【００８３】
配列番号：３６（hVB22B p-z：VH）、配列番号：３８（hVB22B g-e：VH）、配列番号：４０（hVB22B e：VH）、配列番号：６５（hVB22B u2-wz4：VH）、または配列番号：６６（hVB22B q-wz5：VH）に記載のアミノ酸配列において、
アミノ酸部位：３１〜３５がCDR1、
アミノ酸部位：５０〜６６がCDR2、
アミノ酸部位：９９〜１０７がCDR3、
アミノ酸部位：１〜３０がFR1、
アミノ酸部位：３６〜４９がFR2、
アミノ酸部位：６７〜９８がFR3、
アミノ酸部位：１０８〜１１８がFR4に相当する。【００８４】
又、配列番号：４２（hVB22B p-z：VL）または配列番号：４４（hVB22B g-e：VLまたはhVB22B e：VL）、配列番号：６７（hVB22B u2-wz4：VＬ）、あるいは配列番号：６８（hVB22B q-wz5：VH）に記載のアミノ酸配列において、
アミノ酸部位：２４〜３９がCDR1、
アミノ酸部位：５５〜６１がCDR2、
アミノ酸部位：９４〜１０２がCDR3、
アミノ酸部位：１〜２３がFR1、
アミノ酸部位：４０〜５４がFR2、
アミノ酸部位：６２〜９３がFR3、
アミノ酸部位：１０３〜１１２がFR4に相当する。【００８５】
本発明において、hVB22B p-z VH配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B p-z VH：FR1／配列番号：１５
hVB22B p-z VH：CDR1／配列番号：１
hVB22B p-z VH：FR2／配列番号：１６
hVB22B p-z VH：CDR2／配列番号：２
hVB22B p-z VH：FR3／配列番号：１７
hVB22B p-z VH：CDR3／配列番号：３
hVB22B p-z VH：FR4／配列番号：１８【００８６】
本発明において、hVB22B p-z VL配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B p-z VL：FR1／配列番号：２７
hVB22B p-z VL：CDR1／配列番号：４
hVB22B p-z VL：FR2／配列番号：２８
hVB22B p-z VL：CDR2／配列番号：５
hVB22B p-z VL：FR3／配列番号：２９
hVB22B p-z VL：CDR3／配列番号：６
hVB22B p-z VL：FR4／配列番号：３０【００８７】
本発明において、hVB22B g-e VH配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B g-e VH：FR1／配列番号：１９
hVB22B g-e VH：CDR1／配列番号：１
hVB22B g-e VH：FR2／配列番号：２０
hVB22B g-e VH：CDR2／配列番号：２
hVB22B g-e VH：FR3／配列番号：２１
hVB22B g-e VH：CDR3／配列番号：３
hVB22B g-e VH：FR4／配列番号：２２【００８８】
本発明において、hVB22B g-e VL配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B g-e VL：FR1／配列番号：３１
hVB22B g-e VL：CDR1／配列番号：４
hVB22B g-e VL：FR2／配列番号：３２
hVB22B g-e VL：CDR2／配列番号：５
hVB22B g-e VL：FR3／配列番号：３３
hVB22B g-e VL：CDR3／配列番号：６
hVB22B g-e VL：FR4／配列番号：３４【００８９】
本発明において、hVB22B e VH配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B e VH：FR1／配列番号：２３
hVB22B e VH：CDR1／配列番号：１
hVB22B e VH：FR2／配列番号：２４
hVB22B e VH：CDR2／配列番号：２
hVB22B e VH：FR3／配列番号：２５
hVB22B e VH：CDR3／配列番号：３
hVB22B e VH：FR4／配列番号：２６【００９０】
本発明において、hVB22B e VL配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B e VL：FR1／配列番号：３１
hVB22B e VL：CDR1／配列番号：４
hVB22B e VL：FR2／配列番号：３２
hVB22B e VL：CDR2／配列番号：５
hVB22B e VL：FR3／配列番号：３３
hVB22B e VL：CDR3／配列番号：６
hVB22B e VL：FR4／配列番号：３４【００９１】
本発明において、hVB22B u2-wz4 VH配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B u2-wz4 VH：FR1／配列番号：５４
hVB22B u2-wz4 VH：CDR1／配列番号：１
hVB22B u2-wz4 VH：FR2／配列番号：５５
hVB22B u2-wz4 VH：CDR2／配列番号：２
hVB22B u2-wz4 VH：FR3／配列番号：５６
hVB22B u2-wz4 VH：CDR3／配列番号：３
hVB22B u2-wz4 VH：FR4／配列番号：５７【００９２】
本発明において、hVB22B u2-wz4 VL配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B u2-wz4 VL：FR1／配列番号：５９
hVB22B u2-wz4 VL：CDR1／配列番号：４
hVB22B u2-wz4 VL：FR2／配列番号：６０
hVB22B u2-wz4 VL：CDR2／配列番号：５
hVB22B u2-wz4 VL：FR3／配列番号：６１
hVB22B u2-wz4 VL：CDR3／配列番号：６
hVB22B u2-wz4 VL：FR4／配列番号：６２【００９３】
本発明において、hVB22B q-wz5 VH配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B q-wz5 VH：FR1／配列番号：５４
hVB22B q-wz5 VH：CDR1／配列番号：１
hVB22B q-wz5 VH：FR2／配列番号：５５
hVB22B q-wz5 VH：CDR2／配列番号：２
hVB22B q-wz5 VH：FR3／配列番号：５６
hVB22B q-wz5 VH：CDR3／配列番号：３
hVB22B q-wz5 VH：FR4／配列番号：５７【００９４】
本発明において、hVB22B q-wz5 VL配列におけるCDRおよびFRと配列番号との対応は以下の通りである。
hVB22B q-wz5 VL：FR1／配列番号：５９
hVB22B q-wz5 VL：CDR1／配列番号：４
hVB22B q-wz5 VL：FR2／配列番号：６３
hVB22B q-wz5 VL：CDR2／配列番号：５
hVB22B q-wz5 VL：FR3／配列番号：６４
hVB22B q-wz5 VL：CDR3／配列番号：６
hVB22B q-wz5 VL：FR4／配列番号：６２【００９５】
なお、VB22B VHの塩基配列を配列番号：７、VB22B VLの塩基配列を配列番号：９、VB22B scFvの塩基配列を配列番号：１１、VB22B sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：１３、hVB22B p-z VHの塩基配列を配列番号：３５、hVB22B g-e VHの塩基配列を配列番号：３７、hVB22B e VHの塩基配列を配列番号：３９、hVB22B u2-wz4 VHの塩基配列を配列番号：６９およびhVB22B q-wz5 VHの塩基配列を配列番号：７１、hVB22B p-z VLの塩基配列を配列番号：４１、hVB22B g-e VL、hVB22B e VLの塩基配列を配列番号：４３、hVB22B u2-wz4 VLの塩基配列を配列番号：７０およびhVB22B q-wz5 VLの塩基配列を配列番号：７２、hVB22B p-z sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：４５、hVB22B g-e sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：４７、hVB22B e sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：４９、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：７５およびhVB22B q-wz5 sc(Fv)2の塩基配列を配列番号：７６に記載する。【００９６】
（１８）配列番号：４６（hVB22B p-z：sc(Fv)2）、配列番号：４８（hVB22B g-e：sc(Fv)2）、配列番号：５０（hVB22B e：sc(Fv)2）、配列番号：７３（hVB22B u2-wz4：sc(Fv)2）または配列番号：７４（hVB22B q-wz5：sc(Fv)2）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するヒト化抗体。【００９７】
（１９）上記（１）〜（１８）のいずれかに記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつ上記抗体と同等の活性を有する抗体。ここで、上記抗体と同等の活性を有するとは、造血幹細胞の増殖促進作用、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進作用、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加作用、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進作用において、同等の活性を有することを意味する。【００９８】
上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体はc-mplに対するアゴニスト活性が非常に高い為、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。【００９９】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）であると考えられる。【０１００】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。【０１０１】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。【０１０２】
本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体には、これら抗体を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。【０１０３】
本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明の抗体に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。【０１０４】
さらに、本発明の薬剤に含まれるc-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、上記（１）〜（１９）の抗体が認識するエピトープを認識する抗体を挙げることができる。【０１０５】
抗体が認識するエピトープを認識する抗体は当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、上述の抗体が認識するエピトープを通常の方法により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、上述の抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。【０１０６】
本発明においては、配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有する抗体が認識するエピトープを認識する抗体が特に好ましい。配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有する抗体は、ヒトc-mplの26番目のGluから274番目のLeuまでの領域、好ましくは189番目のAlaから245番目のGlyの領域、さらに好ましくは213番目のGlnから231番目のAlaまでの領域を認識していると予想される。従って、ヒトc-mplの26番目〜274番目、あるいは189番目〜245番目、あるいは213番目〜231番目の領域を認識する抗体も本発明に含まれる。【０１０７】
ヒトc-mplのアミノ酸配列（配列番号：５１）の26番目〜274番目、あるいは189番目〜245番目、あるいは213番目〜231番目の領域を認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能であり、例えば、ヒトc-mplのアミノ酸配列（配列番号：５１）の26番目〜274番目、あるいは189番目〜245番目、あるいは213番目〜231番目のペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製した抗体が認識するエピトープを決定し、本発明の抗体と同じエピトープを認識する抗体を選択する方法などにより得ることが可能である。【０１０８】
c-mplに結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、c-mplタンパク質又はc-mpl発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【０１０９】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、抗体取得の感作抗原として使用されるc-mplタンパク質を、Genebank:NM_005373に開示されたc-mpl遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、c-mplをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトc-mplタンパク質を公知の方法で精製する。【０１１０】
次に、この精製c-mplタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、c-mplの部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトc-mplのアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。【０１１１】
本発明の抗c-mpl抗体の認識するc-mpl分子上のエピトープは特定のものに限定されず、c-mpl分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗c-mpl抗体を作製するための抗原は、c-mpl分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。【０１１２】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。【０１１３】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。【０１１４】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【０１１５】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。【０１１６】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.,Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【０１１７】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【０１１８】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000-6000程度）を通常30-60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【０１１９】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。【０１２０】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでc-mplに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、c-mplへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるc-mplを投与して抗MPL抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からc-mplに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO92/03918 号公報、WO 94/02602 号公報参照）。【０１２１】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【０１２２】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【０１２３】
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。【０１２４】
具体的には、抗c-mpl抗体を産生するハイブリドーマから、抗c-mpl抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。【０１２５】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。【０１２６】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗c-mpl抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。【０１２７】
本発明で使用される抗c-mpl抗体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。【０１２８】
抗体遺伝子の発現は、H鎖またはL鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時に形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。【０１２９】
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。【０１３０】
発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい）などが挙げられる。【０１３１】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。【０１３２】
大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。【０１３３】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。【０１３４】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。【０１３５】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【０１３６】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。本発明においては、CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【０１３７】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。【０１３８】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。【０１３９】
本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。目的とするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【０１４０】
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。【０１４１】
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。【０１４２】
例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。【０１４３】
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。【０１４４】
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。【０１４５】
これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。【０１４６】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。【０１４７】
なお、抗体の精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えること、部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。【０１４８】
また、本発明のTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストは、低分子化合物であってもよい。本発明の低分子化合物は、造血幹細胞の増殖を促進する作用、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する作用、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる作用、若しくは造血能の回復を促進する作用を有する限りどのようなものであっても構わないが、好ましい態様として、以下の化学式で示される化合物、｛5-[(2-{1-[5-(3,4-ジクロロフェニル)-4-ヒドロキシ-3-チエニル]エチレデン}ヒドラジノ)カルボニル-2-チオフェンカルボン酸が挙げられる（Blood First Edition Paper, prepublished online February 16, 2006; DOI10.1182/blood-2005-11-4433）。
2007145227.tif 000003
【０１４９】
また本発明のTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストとして、Amgen AMG-531（recombinant megakaryopoiesis stimulating protein）、SB297115/Eltrombopag（Gsk’s oral TPO-R agonistic compound）、peg-TPOmp、YM477、NIP004を挙げることも出来る。Amgen AMG-531は、Fc domainとPeptide receptor binding domainを有する分子量60,000Dのタンパク質であり、下記表１に記載の性質を有する（Clinical Pharmacology & Therapeutics. 76(6),628,2004, Blood .volume 104,abstract #511, 2004）。
（表１）
----------------------------------------
・MW=60,000D
・4 Mpl binding sites
・No sequence homology with TPO
・Expressed in E.coli.
----------------------------------------【０１５０】
また、SB297115/Eltrombopagは、以下の化学式で示される化合物であり、下記表２に記載の性質を有する（Blood. Volume 104,abstract#2909. 2004）。
2007145227.tif 000004
（表２）
-------------------------------------------------------------------
・Binding site : a hu c-mpl transmembrane domain (His499, Thr496)
・Highly species specificity
・No cross reactive : cynomolgus macaques, cat, mouse…
・Cross reactive : chimpanzee
・In vitro activity
・Hu BM CD34 differentiation assay; EC50~100nM
・T half=12hr
-------------------------------------------------------------------【０１５１】
peg-TPOmpは、Phage display combinatorial peptide libraryから発見されたPEG化ペプチドであり、以下の化学式で特徴づけることが出来る。また、下記表４に記載の性質を有する（Blood volume 106,number11 abstract#1249, 2005 ）。
2007145227.tif 000005
（表３）
------------------------------------------------------------
・14merのペプチドをLysで繋いで29merの両端をPEG化
・hTPOとの相同性なし
・Mouse, Rat, Dogに交差する
------------------------------------------------------------【０１５２】
また本発明のTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストとして、YM477を挙げることもできる。YM477に関しては、Blood volume 106,number11 abstract#2298, 2005 に、その詳細が開示されている。【０１５３】
c-mplを認識する抗体は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。【０１５４】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。【０１５５】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。【０１５６】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。【０１５７】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【０１５８】
また本発明の薬剤の投与時期は限定されず、例えば造血幹細胞の増殖を促進させたいとき、造血系CD34陽性細胞の増殖及び／又は分化を促進させたいとき、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させたいとき、若しくは造血能を回復させたいときに投与することができる。例えば、本発明の薬剤は、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われる造血幹細胞移植の際に投与することができる。本発明の薬剤は、単剤投与によって、造血幹細胞のみならず、骨髄系細胞及び/又はリンパ球系細胞の骨髄における生着増強を、用量依存的傾向をもって示す。
本発明の薬剤は、移植直後からの一定期間の間にある程度の高濃度の量を投与することによって、造血幹細胞の骨髄定着促進効果を得ることが出来る（実施例3を参照）。本発明の薬剤が投与される移植直後からの一定期間および投与量は、当業者であれば、本発明の薬剤の投与を必要とする患者の症状、年齢等を考慮し、適宜設計することが出来る。例えば、本発明の薬剤が投与される一定期間（投与時期）としては、これに限定されるものではないが、移植日もしくはその翌日より３日間以上、好ましくは７日間〜２８日間又はそれ以上を挙げることが出来る。また投与量は、骨髄移植患者の内在血中のTPO濃度の10倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは2倍以上の量を投与することが可能であるが、これらに限定されず、移植後一定期間以上、血中の薬剤濃度を維持するために必要な量を投与することが可能である。
また本発明の薬剤が1回の造血幹細胞移植において投与される回数は制限されず、造血幹細胞移植の際、及び造血幹細胞移植の後のそれぞれにおいて、任意の回数投与することが可能である。本発明の薬剤の投与時期、投与量、及び投与回数は、造血幹細胞移植を受けた患者の症状に応じて適宜判断することが可能であるが、例えば上述の投与時期、投与量を挙げることが可能である。【０１５９】
本発明の薬剤は、造血幹細胞移植において用いられる。また本発明の薬剤は、造血幹細胞移植後において用いられる。本発明における造血幹細胞移植には、これに限定されるものではないが、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植が含まれる。本発明の薬剤が用いられる造血幹細胞移植の特に好ましい態様としては、ヒト臍帯血移植が挙げられる。【０１６０】
本発明の薬剤の投与部位は、特に限定されるものではないが、皮下注射、静脈注射、経口投与などが挙げられる。本発明においては、点滴による静脈投与が特に好ましい。また本発明の薬剤は、造血幹細胞とともに投与することも可能である。造血幹細胞とともに投与する場合、本発明の薬剤と造血幹細胞を同時に同じ部位に投与してもよいし、異なる時期に別々の部位に投与してもよい。同じ部位に投与する場合、例えば静脈より投与することが可能である。また投与時期は、本発明の薬剤を単独で投与する場合と同様の時期を選択することが可能である。
一方、本発明の薬剤と造血幹細胞を異なる時期に投与する場合、これらのうちのどちらを先に投与しても構わない。また、これら２つの投与間隔も制限されない。
本発明の薬剤を造血幹細胞とともに投与する場合、造血幹細胞は、自己に由来するもの（自家移植）であっても、他人から提供されたもの（他家移植）であっても良い。造血幹細胞の取得は、当業者に周知の方法によって行うことが可能であり、例えば以下の文献に記載の方法によって取得することが出来る。
Heike,T et.al. Biochimica et Biophysica Acta 2002年 vol.1592,p313-321. Ex vivo expansion of hematopoietic stem clls by cytokines., Yvette van Hensbergen et.al. Experimental Hematology 2006 vol34,p943-950. Ex vivo culture of human CD34+ cord blood cells with thrombopoietin(TPO) accelerates platelet engraftmnet in a NOD/SCID mouse model.【０１６１】
また本発明においては、造血幹細胞移植を行う疾患はなんら限定されるものではないが、好ましくはＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）またはＡＡ（再生不良性貧血）悪性リンパ腫、成人T細胞白血病が挙げられる。【０１６２】
本発明は、本発明者らが、造血幹細胞とTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストとの接触によって、分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数が増加することを見出したことに基づく。よって本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する薬剤であって、該アゴニストと造血幹細胞との接触により、造血幹細胞の分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数を増加させるための薬剤に関する。また本発明は、TPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを有効成分として含有する薬剤であって、点滴により静脈から造血幹細胞とともに投与することで、造血幹細胞の分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数を増加させるための薬剤に関する。アゴニスト、造血幹細胞、リンパ系細胞、骨髄系細胞、投与時期、投与量などに関する説明は、上述の通りである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対するTPO受容体アゴニストの影響
ヒト臍帯血由来造血幹細胞の移植後の初期段階において、ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対する配列番号：７３に記載のアミノ酸配列からなるsc(Fv)2抗体（hVB22 u2-wz4: sc(Fv)2）の影響を検討することを目的に、以下の方法に従って実験を実施した。なお、配列番号：７３に記載のアミノ酸配列からなるsc(Fv)2抗体は、WO2005/056604に記載の方法によって調整することが可能である。
方法
マウスは馴化したNOD.CB17-Prkdc<scid>/J、6w、♂を用いた。マウスに、3.0GyのX線を全身照射した後、抗アシアロGM1抗体を、照射当日から10日に1回i.p.投与した。照射の翌日に、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を１マウスあたり5x104個尾静脈より移植した。配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の投与は、移植の翌日から連続して10日間行い、その後は5投2休で投与を行った。投与量は、朝0.25mg/5mL/kg、夕2mg/5mL/kg とし、インターバル8時間、s.c.、1日2回通期3週間投与した(n=10)。vehicleとして、0.02%Tween80を含む20mmoL/Lクエン酸緩衝液を、配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体と同様に投与した。移植後3週目で骨髄を採取し、EPIX XLによるFACS解析を実施した。ヒト細胞の絶対数はflow count（Beckman）を用いて測定した。
結果、考察
マウス左右大腿骨に存在するヒト細胞数を解析した。配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体投与群において、当初目的としたヒトCD34陽性細胞数ばかりでなく、CD45陽性細胞数、CD41陽性細胞数、CD19陽性細胞数、CD33陽性細胞数がvehicle群と比較し統計有意に増加した(図1)。これらの結果は、c-mplアゴニストである配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の投与が、ヒト巨核球特異的分化誘導に加えて、造血系CD34陽性細胞の生着数の増加とそれに伴う各血球系細胞数の増加に寄与したと考えられる。【０１６４】
〔実施例２〕ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒトCFU-Megコロニー数に対するTPO受容体アゴニストの影響
ヒト臍帯血由来造血幹細胞移植後、ヒトCFU-Megコロニー数に対する配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の影響を検討することを目的に、以下の実験を実施した。
方法
マウスは馴化したNOD.CB17-Prkdc<scid>/J、6w、♂を用いた。3.0GyのX線を全身照射後、抗アシアロGM1抗体を照射当日から10日に1回、i.p.投与した。照射翌日にヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を5x104/mouse、尾静脈より移植した。移植翌日から連投で10日間、その後は5投2休で配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体を、朝0.25mg/5mL/kg、インターバル8時間、夕2mg/5mL/kg 、s.c.、1日2回通期3週間投与した(n=10)。vehicleとして0.02%Tween80を含む20mmoL/Lクエン酸緩衝液を配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体と同様に投与した。移植後3週目で骨髄細胞を採取し、MegaCult-C(StemCell Technologies)を用いて、各マウス大腿骨1本に含まれる骨髄細胞を配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体と共に13日間培養した。ヒトCFU-Megコロニー数は光学顕微鏡下でCD41陽性の50 cells/colony以上のものをカウントした。
結果、考察
配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体投与群の骨髄には、vehicle投与群と比較し、統計有意により多くのCFU-Megコロニーが存在することが明らかとなった（図2）。【０１６５】
〔実施例３〕ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対するTPO受容体アゴニストの用量依存的な効果
ヒト臍帯血由来造血幹細胞移植後、ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対する配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の用量依存的な効果を検討することを目的に、以下の実験を実施した。
方法
マウスは馴化したNOD.CB17-Prkdc<scid>/J、6w、♂を用いた。3.0GyのX線を全身照射後、抗アシアロGM1抗体を照射当日および8日後に、i.p.投与した。照射翌日にヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を5x104/mouse、尾静脈より移植した。移植翌日から連投で10日間、配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体を、以下の3通りの用量にて投与した（s.c.、各群n=9）。
・高用量投与群(朝0.25mg/kg、インターバル8時間、夕2mg/kg/day)
・中用量投与群(朝0.05mg/kg、インターバル8時間、夕0.2mg/kg/day)
・低用量投与群(朝0.01mg/kg、インターバル8時間、夕0.02mg/kg/day)
高用量、中用量、低用量投与各群において、投与期間中の末梢血中での薬剤最小濃度が、それぞれ、50ng/ml、10ng/ml、2ng/mlになるように設定した。
vehicleとして0.02%Tween80を含む20mmoL/L sodium citrate/150mM NaCl緩衝液（pH 6.5）を、配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体と同様に投与した。移植後２週目で骨髄細胞を採取し、FACS解析を実施した。ヒト細胞の絶対数はflow count（Beckman）を用いて測定した。
結果、考察
マウス左右大腿骨に存在するヒト細胞数を解析した。CD34陽性細胞数ばかりでなく、CD45陽性細胞数、CD41陽性細胞数、CD19陽性細胞数、CD33陽性細胞数、CD38陽性細胞数の増加が、用量依存的傾向をもって認められた（図３）。このことは、配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の投与が、より直接的に薬効に関与している可能性を示唆する。また、投与用量により薬効をコントロールできる可能性を示唆する。
マウスの内在ＴＰＯ濃度は約１ng/ml程度（文献値、および、in house実測値）であり、X線照射により５−１０倍程度上昇する（マウスin house data。ヒト臨床は同様に正常値８０pg/ml程度から１−３ng/ml程度まで上がることが知られている）。本実施例において、内在ＴＰＯ以上の濃度の配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体を投与することによって、用量依存的に薬効が上乗せされることが確認された。
なお本実施例においては、方法のセクションに示されているように、血中の配列番号：７３に記載のsc(Fv)2抗体の濃度の底値が維持されるように、投与プランが設計されている。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明によって、新たな造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤が提供された。本発明の薬剤は、その活性成分としてTPO受容体（c-mpl）に対するアゴニストを含有する。【０１６７】
本発明の新たな造血幹細胞の増殖促進剤、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤は、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植）後に単独投与（G-CSFやerythropoietinの併用なく）するだけで効果を期待し得ることを、その特徴とする。【０１６８】
本発明において提供される上記薬剤は、例えば急性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異変形症候群、急性リンパ球性白血病、成人T細胞白血病、再生不良性貧血、悪性リンパ腫等、造血幹細胞移植が適応となる疾患を治療するために造血幹細胞移植（骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植）を行う際に、造血幹細胞の増殖を促進させるため、造血系CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進させるため、造血系CD34陽性細胞の骨髄への生着を促進させるため、若しくは造血能の回復を促進するために有用である。【０１６９】
特に臍帯血移植においては、移植後の血小板の回復遅延が問題となっている。移植時の骨髄における造血幹細胞の生着促進は、c-mplアゴニストの本来の作用である巨核球分化増殖作用と協調して血小板の回復促進をもたらすため、本発明の薬剤は有用である。
また、従来の造血幹細胞移植においてはG-CSFが用いられているが、G−CSFは作用が好中球系に特化しているという問題がある。これに対してTPOは、巨核球のみならず幹細胞に作用することによって、より多様な細胞系列を回復させることが可能と考えられる。またTPOは、現在認可されているG-CSFやEPOとのシナジー効果も十分期待される。本発明の薬剤は、このような観点からも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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