(57)【要約】本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化能が制御された醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターであるＢａｐ３ｐをコードする遺伝子ＢＡＰ３、特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現量を制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
以下の（ｊ）〜（ｍ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｊ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｍ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１１】
請求項７に記載のベクターを導入することによって、分枝アミノ酸資化能が向上した請求項１０に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって分枝アミノ酸資化能が向上した請求項１１に記載の酵母。
【請求項１３】
（Ａ）請求項９に記載のベクターを導入することによって、（Ｂ）請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、（Ｃ）プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制するようにした酵母。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１８】
配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは高発現である被検酵母を選択する、請求項２０記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１２に記載の酵母および請求項２０〜２２に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分枝アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化性を制御した醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターであるＢａｐ３ｐをコードする遺伝子ＢＡＰ３、特にビール酵母に特徴的なｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現量を制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの酒類の開発において重要である。
しかしながら、アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用するためには、アミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低いＧａｐ１や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター（分枝アミノ酸トランスポーターＢａｐ２、ＬｇＢａｐ２、Ｂａｐ３、アルギニントランスポーターＣａｎ１、プロリントランスポーターＰｕｔ４等（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２６９：２７５−２８０，１９９５、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３４５５−３４６２，２００１、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３０：６０３−６１３，１９９８、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ３６：３１７−３２８，１９９９）が知られている。
これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子（ｇａｐ１，ｓｈｒ３，ｃａｎ１，ｐｕｔ４，ｕｇａ４）の変異を有する酵母を用いた例（特開２００１−３２１１５９号公報）や分枝アミノ酸トランスポーターＢＡＰ２を高発現させた例（特開２０００−３１６５５９号公報）が報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
上記のような状況下、酒類中のアミノ酸組成を改変し、特徴ある品質を有する酒類を製造するために、アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から分枝アミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、分枝アミノ酸の資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に存在する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の（ｇ）〜（ｉ）からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７ａ）以下の（ｘ）〜（ｚ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）以下の（ｊ）〜（ｍ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｊ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｍ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（９）上記（８）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１０）上記（７）に記載のベクターが導入された酵母。
（１１）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、分枝アミノ酸の資化能が増強された上記（１０）に記載の酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって分枝アミノ酸の資化能が向上した上記（１１）に記載の酵母。
（１３）（Ａ）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、（Ｂ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、（Ｃ）プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制するようにした酵母。
（１４）上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８）配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法。
（１８ａ）上記（１８）に記載の方法によって、分枝アミノ酸資化能が高い酵母を選別する方法。
（１８ｂ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法で、被検酵母を評価し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量が高いあるいは低い酵母を選別する、分枝アミノ酸資化能の高いあるいは低い酵母を選別する方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２０）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２３）上記（１０）〜（１２）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分枝アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、分枝アミノ酸の資化を制御することができるため、酒類中のアミノ酸組成を改変することができ、特徴ある品質を有する酒類の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はＯＤ６６０の値を示している。
図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
図４は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はＯＤ６６０の値を示している。
図５は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（ｗ／ｗ％）を示している。
図６は、ビール試験醸造におけるバリンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はバリン濃度（ｍＭ）を示している。
図７は、ビール試験醸造におけるロイシンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はロイシン濃度（ｍＭ）を示している。
図８は、ビール試験醸造におけるイソロイシンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はイソロイシン濃度（ｍＭ）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明者らは、酵母の分枝アミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よく分枝アミノ酸を資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開２００４−２８３１６９に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有の分枝アミノ酸トランスポーターをコードするｎｏｎ−ＳｃＢＡＰ３遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするＤＮＡは、上記のビール酵母由来の分枝アミノ酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列と約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上。９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、分枝アミノ酸トランスポーター活性は、例えば（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２６９：２７５−２８０，１９９５）に記載の方法によって測定することができる。
また、本発明は、（ｅ）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、（ｊ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｋ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｌ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；又は（ｍ）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記（ａ）〜（ｉ）のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスＤＮＡのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上：新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７，１９９３などを参照）。アンチセンスＤＮＡの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。
本明細書中、「ＤＮＡの発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、２１〜２５塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号公報；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），１８０−１８３，２０００  Ｆｅｂ．；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），２４０−２４４，２０００  Ａｐｒｉｌ；Ｎａｔｕｒｅ，４０７：６８０２，３１９−２０，２００２  Ｓｅｐ．２１；Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），９４８−９５８，２００２  Ａｐｒ．１５；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），５５１５−５５２０，２００２  Ａｐｒ．１６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），５５０−５５３，２００２  Ａｐｒ．１９；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９，６０４７−６０５２，２００２  Ａｐｒ．３０；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），４９７−５００，２００２  Ｍａｙ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），５００−５０５，２００２  Ｍａｙ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：１０，ｅ４６，２００２  Ｍａｙ  １５等参照）。
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいい、ターゲットとするＤＮＡの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２８，１９８８；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９，１９８６；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９１；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ３：７３３，１９９０；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３８７５，１９９１；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１２５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８６：１２７１，１９９２など参照）。また、「ＤＮＡの発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるＤＮＡの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Ｓｍｙｔｈ  ＤＲ：Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７９３，１９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ  Ｒ：Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：８１０，１９９６など参照）。
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｉ）のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、（ｘ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター；（ｙ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）；及び（ｚ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（ｊ）〜（ｍ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（ＤＮＡ）を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４９５１（１９７９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０２（１９８３）、特開平６−２５３８２６号公報など参照）。また、本発明においてはプロモーターに変異を加えることによって、あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。このような変異の導入方法はＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９、４２３８−４２５０（２００１）に、また、プロモーターの変換による遺伝子の発現制御方法は、例えば、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２，５２６６−５２７３（２００６）に記載されている。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，８３，１９８３）、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，６０，２３７，１９８７）、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＰ，７６，１０３５，１９７９）が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばＭ．Ｆ．Ｔｕｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，６０３（１９８２）に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７  １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サンカロマイセス  カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス  セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９４，ｐ１８２（１９９０）”、スフェロプラスト法“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８）”、酢酸リチウム法“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３）”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１〜６となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約１〜２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するＤＮＡ（約１〜２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約２０％〜５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。  その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第３版」、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でアミノ酸の組成を調節した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分岐アミノ酸の含有量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつ分岐アミノ酸含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ１３０（１９９０））。得られたゲノムを対象にして、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、ＯＲＦ配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０ｂｐ以上であり、１５〜２５ｂｐであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００ｂｐが適当である。
ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０〜９５℃、アニーリング温度：４０〜６０℃、伸長温度：６０〜７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の分枝アミノ酸資化能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価することもできる。なお、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することによって可能である。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９４−２００３）。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中の分枝アミノ酸濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、分枝アミノ酸資化能の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法３９  酵母分子遺伝学実験法、ｐ６７−７５、学会出版センターなど参照）。なお、分枝アミノ酸資化能の評価は、例えば、発酵終了後のビールのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（例えば、Ｌ−８８００高速アミノ酸分析計；日立社製）、標準アミノ酸分析カラムＰ／Ｎ８５５−３５０６；日立製作所社製）を用いて分析し、アミノ酸組成中の分枝アミノ酸濃度を評価することによって行うことができる。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス  パストリアヌス、サッカロマイセス  セレビシエ及びサッカロマイセス  カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）Ｗ３４／７０等、サッカロマイセス  カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＮＣＹＣ４５３、ＮＣＹＣ４５６等、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス  セレビシエＮＣＹＣ９０等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用１号、同３号、同４号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用７号、同９号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子（ｎｏｎＳｃＢＡＰ３）のクローニング
特開２００４−２８３１６９に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーｎｏｎＳｃＢＡＰ３＿Ｆ（配列番号：３）／ｎｏｎＳｃＢＡＰ３＿Ｒ（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン３４／７０株（「Ｗ３４／７０株」と略記することがある）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってｎｏｎＳｃＢＡＰ３の全長遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
上記のようにして得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子断片を、ＴＡクローニングによってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の塩基配列をサンガーの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２１５，１９８１）で分析し、塩基配列を確認した。
実施例２：ビール試醸中のｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスＷ３４／７０株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したｍＲＮＡをビール酵母ＤＮＡマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度    １２．６９％
麦汁容量          ７０Ｌ
麦汁溶存酸素濃度  ８．６ｐｐｍ
発酵温度          １５℃
酵母投入量        １２．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したｍＲＮＡをビオチンラベルして、特開２００４−２８３１６９に記載のビール酵母ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（ＧＣＯＳ；ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．０、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子が発現していることを確認した。
実施例３：ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株の作製
実施例１に記載のｎｏｎＳｃＢＡＰ３／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ消化し、タンパク質コード領域全長を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩ処理したｐＹＣＧＰＹＮｏｔに連結させ、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現ベクターｎｏｎＳｃＢＡＰ３／ｐＹＣＧＰＹＮｏｔを構築した。ｐＹＣＧＰＹＮｏｔはＹＣｐ型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子ＰＹＫ１のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子Ｇ４１８ｒを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平０７−３０３４７５に記載された方法でサッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン３４／７０株を形質転換した。ジェネチシン３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選択した。
実施例４：ビール試験醸造におけるアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例３で得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度      １２％
麦汁容量            １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度    約８ｐｐｍ
発酵温度            １５℃一定
酵母投入量          ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）（図４）、エキス消費量（図５）、分枝アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）（図６、７及び８）の経時変化を調べた。図６、７及び８に示すようにｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株では親株に比べて分枝アミノ酸の資化が促進されていた。また、表１に示すように、ｎｏｎＳｃＢＡＰ３高発現株を用いて製造したビールのアミノ酸組成は、親株を用いて製造したビールに比べてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンなどの分枝アミノ酸が減少し、またグルタミン酸、グリシン、アラニン等が増加しており、異なる特徴を示していた。
【表１】
2007097093.tif 000002
実施例５：ｎｏｎＳｃＢＡＰ３遺伝子の破壊
文献（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｙｅａｓｔ．１５  １５４１（１９９９））の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド（ｐＦＡ６ａ（Ｇ４１８ｒ），ｐＡＧ２５（ｎａｔ１），ｐＡＧ３２（ｈｐｈ））をテンプレートとしたＰＣＲによって遺伝子破壊用断片を作製する。
作製した遺伝子破壊用断片でＷ３４／７０株あるいは胞子クローンＷ３４／７０−２株を形質転換する。形質転換は特開平０７−３０３４７５に記載された方法で行い、選択薬剤の濃度はそれぞれジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）３００ｍｇ／Ｌ、ノーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌとする。
実施例６：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例５で得られたｎｏｎＳｃＢＡＰ３破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度      １２％
麦汁容量            １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度    約８ｐｐｍ
発酵温度            １５℃一定
酵母投入量          ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
実施例４と同様に、発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量及び各種アミノ量の経時変化を調べる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の酒類製造法によれば、酵母の分枝アミノ酸資化能を制御することができるため、分枝アミノ酸含有量が調節された、アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造することが可能となる。
［配列表］
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2007097093.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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