(57)【要約】本発明は、植物細胞中で得られる組換えＡ型肝炎ウイルス抗原に関する。より詳しくは、本発明は、キューバで単離されていたＭ２株を使用する、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ゲノムの改変断片に基づく遺伝子構築物の生成に関する。適切な位置及び調節シグナルと融合した前記断片のヌクレオチド配列はトランスジェニック植物中で発現し、五量体及び／又は中空被覆物を含む組換えＨＡＶ抗原が生じ、これによって免疫応答を発生させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＶゲノム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３）の改変断片に基づくキメラＨＡＶ遺伝子を含む遺伝子構築物で形質転換した植物細胞中で得られるＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２】
前記抗原が五量体のみを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３】
前記抗原が、以下の成分
ａ．タンパクＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１及び２Ａをコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２５）と、
ｂ．タンパク３Ａ、３Ｂ、３Ｃをコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １３）との融合物を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １７に記載のキメラ遺伝子の発現から得られることを特徴とする、請求項１及び２に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項４】
前記キメラ遺伝子が適当なプロモーター及び転写終結シグナルによって調節されている植物細胞中で発現される、請求項３に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項５】
前記抗原が、植物細胞の細胞質中で得られることを特徴とする、請求項４に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項６】
前記抗原が、双子葉植物中で発現されることを特徴とする、請求項５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項７】
前記抗原が、タバコ、ニンジン、及び食用植物の果実中で発現されることを特徴とする、請求項６に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項８】
前記抗原が、単子葉植物中で発現されることを特徴とする、請求項５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項９】
前記抗原が、イネ、及び食用植物の果実中で発現されることを特徴とする、請求項８に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１０】
前記抗原が、五量体及び中空キャプシドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１１】
前記抗原が、以下の２つの成分
ａ．タンパクＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１及び２ＡをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．請求項３ｂに記載のタンパク３Ａ、３Ｂ及び３Ｃをコードするヌクレオチド配列との融合物を含むキメラ遺伝子の発現から得られることを特徴とする、請求項１０に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１２】
前記キメラ遺伝子が適当なプロモーター及び転写終結シグナルによって調節されている植物細胞中で発現される、請求項１１に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１３】
前記抗原が、植物細胞の細胞質中で得られることを特徴とする、請求項１２に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１４】
前記抗原が、双子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１５】
前記抗原が、タバコ、ニンジン、及び食用植物の果実中で発現されることを特徴とする、請求項１４に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１６】
前記抗原が、単子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１７】
前記抗原が、イネ、及び食用植物の果実中で発現されることを特徴とする、請求項１６に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１８】
前記抗原が、２つのキメラ遺伝子
ａ．その５’末端でシグナル配列と、その３’末端でスペーサー配列、それに続いてＫＤＥＬペプチドをコードする配列と融合した、タンパクＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１及び２Ａをコードする配列ＩＤ  ＮＯ．２４に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．その５’末端でシグナル配列と、その３’末端でスペーサー配列、それに続いてＫＤＥＬペプチドをコードする配列と融合した、請求項３Ｂで言及したタンパク３Ａ、３Ｂ、３Ｃをコードする配列ＩＤ  ＮＯ．２３に記載のヌクレオチド配列との協調的発現から得られる、請求項２に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項１９】
キメラ遺伝子が、適当なプロモーター及び転写終結シグナルによって調節されている植物細胞中で発現される、請求項１８に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２０】
前記抗原が植物細胞の小胞体中で得られる、請求項１８及び１９に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２１】
前記抗原が、双子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項２０に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２２】
前記抗原が、タバコ、ニンジン、及び食用植物の果実中で得られることを特徴とする、請求項２１に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２３】
前記抗原が、単子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項２０に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２４】
前記抗原が、イネ、及び食用植物の果実中で得られることを特徴とする、請求項２３に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２５】
前記抗原が、２つのキメラ遺伝子
ａ．その５’末端でシグナル配列と、その３’末端でスペーサー配列、それに続いてＫＤＥＬペプチドをコードする配列と融合した、タンパクＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１及び２Ａをコードする配列ＩＤ  ＮＯ．２２に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．請求項１８ｂに記載のヌクレオチド配列との協調的発現から得られる、請求項１０に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２６】
キメラ遺伝子が、適当なプロモーター及び転写終結シグナルによって調節されている植物細胞中で発現されることを特徴とする、請求項２５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２７】
前記抗原が植物細胞の小胞体中で得られることを特徴とする、請求項２５及び２６に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２８】
前記抗原が、双子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項２７に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項２９】
前記抗原が、タバコ、ニンジン、及び食用植物の果実中で得られることを特徴とする、請求項２８に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３０】
前記抗原が、単子葉植物中で得られることを特徴とする、請求項２７に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３１】
前記抗原が、イネ、及び食用植物の果実中で得られることを特徴とする、請求項３０に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３２】
精製して非経口投与することができる、請求項１、３、１１、１８及び２５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３３】
他のウイルス抗原と組み合わせて投与することができる、請求項３２に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３４】
経口投与することができる、請求項１、３、１１、１８及び２５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３５】
凍結乾燥抽出剤、丸剤又はカプセル剤として投与することができる、請求項３４に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３６】
ジュースの形で投与することができる、請求項１、３、１１、１８及び２５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３７】
免疫原性があり、Ａ型肝炎ウイルスに対して保護的免疫応答を引き起こす、請求項１、３、１１、１８及び２５に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３８】
Ａ型肝炎診断キットの一部として使用することができる、請求項３２に記載のＡ型肝炎ウイルス組換え抗原。
【請求項３９】
単一及び混合ワクチンを調製するための、請求項１から３８までに記載の抗原の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの一部門に関し、より具体的には、トランスジェニック植物細胞中での組換えタンパクの発現、及び抗原ワクチンとしてのその植物の使用に関する。具体的には、キューバで単離されたＭ２株由来ＨＡＶゲノムの改変断片の発現に由来する、トランスジェニック植物内で得られる組換えＡ型肝炎ウイルス抗原が示される。
【０００２】
また、様々な方法で接種した後の動物における免疫応答を発生させるのにこの抗原が有用であることも実証される。
【背景技術】
【０００３】
ＨＡＶゲノムは、極性が正であるシンプル鎖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｔｒａｉｎ）ＲＮＡである。これは、約７．５ｋｂであり、２５３ｋＤａのポリタンパクをコードしている（Ｃｏｈｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７），６１：３０３５−３０３９）。このポリタンパクは、翻訳プロセシングをも翻訳後プロセシングをも受け、成熟構造タンパク（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４及び２Ａ）及び非構造タンパク（２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄ）を作り出す。
【０００４】
ウイルスポリタンパクのＰ３ドメインに存在するプロテアーゼ３Ｃ（Ｐｒｏ３Ｃ）は、ＨＡＶポリタンパクの切断に関係するプロテアーゼ（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９９），７３（８）：６２２０−７）であり、後にプロセシングを受ける中間生成物であるＰ１−２Ａ、２ＢＣ及びＰ３を遊離させる。したがって、エンベロープの十分な形成及びＨＡＶの複製には、ＨＡＶのタンパク分解プロセスが示差的に行われることが必要である。Ｐ３領域のプロセシング中に、３Ｃ／３Ｄ部位だけが効率よく切断される。３Ａ／３Ｂ及び／又は３Ｂ／３Ｃ部位でのプロセシングは遅れて起こり、それによって、プロテアーゼ３Ｃに類似した効率でポリペプチドＰ１−２Ａを切断する中間体ポリペプチド３ＡＢＣの蓄積が可能となる（Ｋｕｓｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９），７３：９８６７−９８７８）。このステップで、ペプタマー形成の効率がより高まる。ウイルスの特徴的な形態はこのウイルスタンパクの統合に由来し、その三次元構造は、保護的免疫応答の発生に重要である。ＨＡＶのウイルス粒子は、中和に対して免疫優性である抗原部位を示し、この部位は、様々な地域から単離されたＨＡＶ株の間で厳密に保存されている。それには５種の高次構造エピトープが配置され、そのうち３種は五量体であり、他の２種は、これらの五量体が集合してエンベロープを形成した後に作り出される。
【０００５】
抗原部位の高次構造が変化することに起因して、又は五量体のアセンブリ中に五量体に存在するエピトープ断片が並列することに起因して、この最後のエピトープが形成されると考えられている。五量体もウイルス粒子も中和抗体を誘導し、したがって、これらはワクチン開発に有用である可能性がある（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３），６７：１０８０−１０８５）。ＨＡＶの完全なオープンリーディングフレームを含む組換えバキュロウイルスを用いて、ＨＡＶの巨大ポリタンパクが発現されている。昆虫細胞でのプロセシングの結果、他の中間体タンパクも発現されている（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９５），１７１：９−１４）。さらに、哺乳動物細胞中でＨＡＶの同じポリタンパクを発現する、組換えワクシニアウイルスが構築されている。これらの遺伝子構築物の感染細胞抽出物で、ポリタンパクの翻訳後プロセシングが行われてＨＡＶのものと類似したキャプシドが生じることが判明した（Ｗｉｎｏｋｕｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４），６５：５０２９−５０３６）。１９９３年１月２１日のＷｉｎｏｋｕｒらの国際特許出願公開ＷＯ  ９３０１２７９、米国特許第５２９４５４８号（ＭｃＬｉｎｄｅｎら、１９９４年３月）、国際特許出願公開ＷＯ  ０９８４４１２２（Ｐｒｏｂｓｔ，２００２年８月２７日）、国際特許出願公開ＷＯ  ９１１１４６０、米国特許第５６０５６９２号（Ｔｈｏｍａｓら、１９９７年２月２５日）など、バキュロウイルス及びワクシニアウイルスシステム中で発現させる、ＨＡＶに対する組換えワクチンの変種を記載している特許があり、その中で、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列が免疫原性キャプシド及び五量体の産生に使用され、シス、トランス並びにバイシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物中で構造領域及びＰ３領域を発現させてＨＡＶキャプシドを得る方法が保護されている。
【０００６】
バイオリアクターとしてのトランスジェニック植物
根粒菌のアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による遺伝子移入から生じる最初のトランスジェニック植物は、１９８０年代初頭に作成された（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８３，２：２１４３−２１５０）。この技術は初め、病原微生物（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６，２３２：７３８−７４３）、昆虫（Ｖａｅｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８７，３２８：３３−３７）、及び除草剤に対する（Ｏｆ  Ｂｌｏｃｋら、１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３−２５１８）耐性を獲得する方法として使用されていた。しかし、植物（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）細胞が、高度に複雑な構造の外来タンパクを正確に集合させることができることが実証されると、産業上及び生物薬剤上関心の高い組換えタンパクの実用的な生産を段階的に増大させる新しい戦略として、これに価値がある可能性があることが速やかに示唆された（Ｂａｒｔａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９８６，６：３４７−３５７；Ｃｒａｍｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ  Ａｎｄ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９６，７９２：６２−７１；Ｓｔａｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．２００１．１８：３３３−３３８）。
【０００７】
１９９２年に、サブユニットワクチン生産に関する新しい概念が導入された。これは、トランスジェニック植物がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現することができることが実証されたことから生じた。この知見に基づいて、食品中にワクチンの候補を産生させ、この食品を摂取することだけで免疫感作を実現するのに植物を使用することができることが考えられた。これらの事実によって、「食用ワクチン」との名称が現れた（Ａｒｎｔｚｅｎら、Ｐｌａｎｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４，９４：３３９−３４４）。その後に、ＨＢｓＡｇを含むトランスジェニックジャガイモを飼料として与えられたマウスが、市販のワクチンを単回腹腔内投与したときに得られたものと類似した一次免疫応答を示すことが実証された。これらの結果から、食用植物組織中での抗原の発現を、免疫感作の新しい経路とみなすことができることが示唆された（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１８：１１６７−１１７１）。
【０００８】
米国特許第５４８４７１９号（Ｌａｍら、１９９６年１月１６日）；米国特許第５６１２４８７号（Ｌａｍら、１９９６年１月１６日）；米国特許第５６１２４８７号の分割出願で、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２３３２の一部継続出願である米国特許第５９１４１２３号（Ａｒｎｔｚｅｎら、１９９９年６月２２日）；米国特許第６１３６３２０号（Ａｒｎｔｚｅｎら、１９９９年６月２２日）；国際特許出願公開ＷＯ  ９６１２８０１（Ａｒｎｔｚｅｎら、２００２年５月２８日）；米国特許出願公開第２００２００６４１１号（Ｌａｍら、２００２年６月４日）など、ワクチンの発現に植物を使用することについて記載している特許がいくつか存在する。
【０００９】
前記に挙げた文献には、ワクチンとしての植物の使用、並びに植物中でのＨＢｓＡｇ発現が記載され、ある場合では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＶＨＢ）を指すのに「ウイルス性肝炎」という用語が使用されている。ＶＨＢは、Ａ型肝炎ウイルスとかなり違い、その特徴も非常に異なっている。したがって、これらは、分類学的見地から異なる属に属している。免疫学的に重要な反応を引き起こすことができるＨＡＶの組換えタンパクを得るには、このウイルスゲノムのいくつかのタンパクを発現させ、次いでそのような粒子を五量体又は中空キャプシドとして形成させることが必要である。免疫原性粒子のプロセシング及び形成は、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスシステムのような真核生物システムでしか実現していず、酵母などのより単純なシステムでは実現していない。トランスジェニック植物では、ＨＡＶのような複雑な抗原の発現は行われていなかった。ＶＨＢの場合、抗原は、タンパク１つだけで形成され、酵母などの単純な真核生物システムで効率よく粒子化される。前記で触れた議論により、植物において、ＨＢｓＡｇの発現は、ＨＡＶの五量体又は中空キャプシドの発現を含まないことが考えられる。他の特許出願では、２００１年８月２３日のＳｏｈｎらの国際特許出願公開ＷＯ  ０１６１０２２におけるヒト乳癌ウイルス抗原、２００１年１０月３１日のＺｈｏｎｇらの中国特許出願公開ＣＮ１３１９６７０における口蹄熱ウイルス抗原、２００１年８月１６日のＲｅａｄｓらの国際特許出願公開ＷＯ  ０１５９０７０におけるロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）抗原、２００１年１２月２７日のＳｈａｃｈａｒらの国際特許出願公開ＷＯ  ０１９７８３９におけるガムボロウイルス（ｇｕｍｂｏｒｏ  ｖｉｒｕｓ）抗原など、様々なウイルス抗原の発現が具体的に記載されている。
【００１０】
植物での組換えタンパク産生は、臨床医学で重要な薬剤化合物又はワクチンを生成するための多くの潜在的な利点を提供する。第１に、植物システムは、発酵システムで又はバイオリアクターで使用される産業基盤よりも経済的である。第２に、産業規模で植物及びその産物を採取し試験する技術はすでに利用可能である。第３に、組換えタンパクを含む植物を（食用ワクチンの場合と同様に）食物として使用すると、化合物を精製する必要性をなくすことができる。第４に、組換えタンパクを、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、小胞体のような特定の細胞内区画を対象として発現させることもでき、それをこの区画で（例えば葉緑体で）直接発現させることもできる。第５に、組換え産物のヒト病原体による考えられる汚染に関する健康リスクは最小限である。最後に、製剤上重要な組換えタンパクの発現システムとしての植物は、小胞体レベルでのフォールディング、アセンブリ、糖鎖付加を含めた、分泌経路の多くのステップが哺乳動物細胞と類似しているというさらなる利点を有する（Ｍａ  ｙ  Ｈｅｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５，１０９：３４１−  ３４６；Ｒａｙｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．１９９８，４９：１４６３−１４７２；Ｓａｎｄｅｒｆｏｏｔ  ｙ  Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．１９９９，１１：６２９−６４１；Ｖｉｔａｌｅ及びＤｅｎｅｃｋｅ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９９，１１：６１５−６２８；Ｌｅｒｏｕｇｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１：３４７−３５４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的の基本設計は、構造タンパクの様々な変種及び変異した非構造領域をコードする遺伝子の協調的発現を可能とする遺伝子構築物によって支持され、免疫応答を引き起こすことができる、トランスジェニック植物でのＨＡＶの抗原五量体及びキャプシドの組換え発現を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
基本的に、本発明の新規性は、サイズが小さく、厳密に構造的な領域（最大でもタンパク２Ａだけ）、及びタンパク３Ａ／３Ｂと３Ｂ／３Ｃの間の切断部位が変異しているためにウイルスのプロテアーゼ３Ｃより大きいサイズを示す、ウイルスの改変プロテアーゼによって形成されるポリタンパクをコードする新規オープンリーディングフレームの高次構造に使用されるウイルスゲノム領域にある。特に使用するプロモーター及び調節シグナルの制御下で、トランスジェニック植物の細胞質ゾル及び小胞体中でのＨＡＶウイルスキャプシドの発現が初めて実現する。構造領域とタンパク分解の原因領域の組合せ発現産物として、小胞体中で五量体及びキャプシドを形成させることから、ＨＡＶの場合など、この区画により複雑な構造を構築し保存することができる可能性が実証される。植物中での五量体及びキャプシド産生により、安価かつ確実なワクチンを得るバイオリアクターとしてこれを使用することができる可能性がもたらされる。
【００１３】
本発明は、トランスジェニックタバコ、イネ及びニンジン植物を使用して、植物細胞中でウイルスの免疫原性キャプシド及び五量体が初めて得られた例によって実証される。本発明の結果得られるＨＡＶのキャプシド及び五量体は、抗原ワクチンとして使用することができ、ＨＡＶ検出のための診断法に使用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
遺伝子構築物
ＨＡＶのｃＤＮＡ取得
キューバで単離されたＨＡＶのＭ２株ＲＮＡから、逆転写技術ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、このウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヌクレオチド配列を増幅した。この断片をプラスミド中でクローン化し、そのヌクレオチド配列を決定した。これは、報告されている配列に比べて１１アミノ酸残基の変異が生じる違いを示している。配列分析から、アメリカ株のほとんどすべてが属するサブ遺伝子型ＩＡの一部としてＭ２株を分類することができる。この株のゲノムから、改変断片を設計し、構築し、次いで本発明の対象である様々な遺伝子構築物中で使用した。
【００１５】
トランスジェニック植物中でキャプシド及び五量体を発現させるためのベクター遺伝子構築物
ＨＡＶの組換えプロテアーゼ
ウイルスキャプシドの形成を可能にするには、ポリタンパクのタンパク分解プロセシングが示差的に起こり、ウイルスタンパクを順序通りに放出させることが必要である。キャプシド形成の効率は、タンパク３ＡＢと膜及びウイルスタンパクの疎水性相互作用のために中間体３ＡＢＣが存在するときに増大する。プロテアーゼ３Ｃを放出せず、ＨＡＶの五量体及びキャプシドの形成に必要なそのタンパク分解能を保持するポリペプチド３ＡＢＣを得るために、タンパク３Ａ／３Ｂと３Ａ／３Ｃの間にあるプロテアーゼ３Ｃの切断部位に変異を生じさせた。３Ａ／３Ｂ間ではグルタミン酸をバリンで、３Ｂ／３Ｃ間ではセリンをロイシンで置き換えた。免疫原性キャプシド及び五量体を形成するＨＡＶタンパク発現についての新規のかつ様々な戦略の設計に、このポリペプチドを使用した。
【００１６】
植物細胞の細胞質ゾル中でのキャプシド及び五量体発現のための組換えＨＡＶ
ＨＡＶにおいて、ポリペプチドＰ１−２Ａは、ウイルスキャプシド形成において重要な機能を有する。このポリペプチド中に、キャプシド形成を調節する２つのサインが存在する。そのカルボキシル末端ドメイン中にタンパク２Ａが認められ、これは、キャプシドアセンブリの第１段階で五量体の形成に必要である。この五量体は、ポリペプチドＰ１−２Ａのうちプロセシングを受けない分子を５つ組み合わせて形成される。タンパクＶＰ４は、第２段階で五量体の会合及びキャプシド形成に必要である。
【００１７】
植物細胞の細胞質ゾル中で改変ポリタンパクを発現させるために、改変オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｍ）配列を含むベクターを構築した。この構築物は、（元のＨＡＶポリタンパクと比べて）サイズがかなり小さいポリタンパクをコードしている。この配列は、Ｐ１−２Ａポリペプチドコード配列と変異プロテアーゼ３ＡＢＣをコードする配列を融合させた結果得られる。
【００１８】
Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて植物を形質転換するのに使用されるプラスミドベクターは、植物中でタンパク発現を調節するシグナルをコードするヌクレオチド配列と融合したＨＡＶのタンパクをコードするＤＮＡ配列を含んでいる。この場合、タンパクをコードする配列は、植物細胞の分泌経路を越えて輸送するためのいずれの特定のシグナルとも融合せず、そのためこれは細胞の細胞質ゾル中で発現される。
【００１９】
植物細胞の細胞質ゾル中における五量体の排他的発現のための組換えＨＡＶ
自己プロセシングによって、排他的に免疫原性のウイルス五量体が形成される。キャプシドに比べて五量体のサイズが小さいと、より小さいものの発現が誘発されるので発現レベルをより高くすることができる。前記で記載したように、ポリペプチドＶＰ０の一部であるタンパクＶＰ４は、五量体の会合及びウイルスキャプシド形成に必要である。
【００２０】
ポリタンパクＯＲＦｍをコードするヌクレオチド配列から、タンパクＶＰ４をコードする断片を除去して、ΔＯＲＦｍと称される配列とした。植物細胞の細胞質ゾル中でのその発現を調節する配列と融合したポリタンパクΔＯＲＦｍを発現させるためのプラスミドベクターを構築した。これを、タバコ、イネ及びニンジンの葉にＡ．ツメファシエンスを感染させて、トランスジェニック植物を得るのに使用した。この遺伝子構築物から発現したポリタンパクは、サイズがかなり小さく、植物細胞中で代謝による変化を起こすことができる。得られた産物は、ワクチン開発のための免疫原のように使用することもできる。
【００２１】
植物細胞の小胞体中でのキャプシド及び五量体発現のための組換えＨＡＶ
分泌経路に、したがって小胞体にタンパクを向かわせる配列を使用し、この小器官中に保持させるシグナルも使用することにより、植物において小胞体中に異種のタンパクが蓄積される。
【００２２】
シグナルペプチドとして、サツマイモスポラミンのＮ末端ペプチドをコードする配列を使用した。小胞体中にタンパクを保持させるシグナルとして、このタンパクのカルボキシル末端に位置するペプチドＫＤＥＬをコードする配列を使用した。
【００２３】
サツマイモスポラミンのシグナルペプチドをＰ１−２Ａヌクレオチドコード配列の５’領域と融合させ、ＫＤＥＬコード配列と融合させたスペーサーペプチド配列を３’領域に挿入した。得られたＤＮＡ断片をバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターの植物発現シグナルの調節下に置いた。このベクターは、その５’末端でサツマイモシグナルペプチドと、その３’末端でＫＤＥＬコード配列と融合した変異ポリペプチド３ＡＢＣコード配列を含んでいた。この成分もすべて植物発現シグナルの調節下に置いた。どちらのポリペプチドも小胞体中に位置し、プロテアーゼ３ＡＢＣは、ポリペプチドＰ１−２Ａをプロセシングし、効率よく粒子を形成することができる。
【００２４】
植物細胞の小胞体中で五量体を排他的に発現させるための組換えＨＡＶ
Ｐ１−２Ａポリペプチドコード配列からＶＰ４ヌクレオチドコード配列を除去することにより、ポリペプチドΔＰ１−２Ａを得た。この配列をその５’末端でサツマイモスポラミンシグナルペプチドと、その３’末端で、ＫＤＥＬコード配列と結合したスペーサーペプチドをコードする配列と融合させた。同様に、同じバイナリーベクター中で、変異ポリペプチド３ＡＢＣをコードする配列を、その５’末端でサツマイモスポラミンシグナルペプチドと、その３’末端でＫＤＥＬコード配列と融合させた。すべての成分を植物における発現調節サイン下に置いた。
【００２５】
この２つのポリペプチドは、小胞体中に位置し、プロテアーゼ３ＡＢＣは、ポリペプチドΔＰ１−２Ａをプロセシングし、排他的に五量体を発現させることができる。この植物は、より高レベルの発現、並びにより良好な成長及び発達を示し、これによって、より多くのバイオマスが得られる。
【００２６】
改変ＨＡＶの遺伝子産物を発現するトランスジェニック植物の同定
Ａ．ツメファシエンスを各バイナリーベクターで形質転換し、このプラスミドを含む細菌コロニーを得た。異なる遺伝子構築物をそれぞれ独立に有するＡ．ツメファシエンスを使用して植物を形質転換し、最終的に、選択マーカーであるカナマイシンに耐性の植物を得た。サザンブロット及びＰＣＲ技術を使用して、外来ＤＮＡが植物中に組み込まれていることを確認した。
【００２７】
特定のタンパク抽出緩衝液中でトランスジェニック植物の葉を液体窒素で粉砕して、その葉から可溶性タンパクの抽出を行った。ＨＡＶ特異的抗血清及びモノクローナル中和抗体を使用して、キャプシド及び五量体を同定した。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫顕微鏡法（ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）などの免疫学的方法を行い、これより、トランスジェニック植物が、ポリタンパク、又は場合によっては予想されたポリペプチドを発現することが実証され、これらがプロセシングを受け五量体又はキャプシド中に集合することも実証された。
【００２８】
高レベルの組換えタンパクを発現する植物を、モノクローナル中和抗体を用いるキャプシド及び五量体の精製に使用した。
【００２９】
精製キャプシド及び五量体の免疫原性の決定
タバコ及びイネの植物の葉から精製した産物で免疫感作させたマウスの免疫応答により、ＨＡＶキャプシド及び五量体の免疫力を決定した。ＨＡＶ抗原を発現するトランスジェニックニンジンを飼料として与えたマウスにおける免疫力も評価した。抗原を導入する方法として、経口経路及び非経口経路を用いた。ＥＬＩＳＡ技術を用いて動物の抗血清のＨＡＶに対する反応性、及びＨＡＶ感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和する免疫血清の中和能について決定することにより、免疫応答を調節し確認した。
【００３０】
本発明の利点
本発明が提供する最も重要な利点は、本発明者らの構築物の発現産物であるエンベロープ及び精製五量体と元のウイルスの間に抗原類似性があること；本発明者らの構築物の発現産物として得られるポリタンパクのサイズが元のウイルスのサイズよりかなり小さいので、本発明者らが特許請求する構築物の産物であるエンベロープ及び五量体の植物での発現レベルが、ＨＡＶオープンリーディングフレームを発現させたとき、又はＰ１−２Ａ領域及びＰ３領域を同時に発現させたときに得られるレベルより高いこと；ポリペプチド３ＡＢＣが専らタンパク３Ａ、３Ｂ及び３Ｃによって構成され、タンパク３Ａ／３Ｂと３Ｂ／３Ｃの間の自己プロセシング部位が変異し、それによってこのポリペプチドのプロセシングが回避され、したがってより効率のよいこのポリペプチド自体によるポリタンパクのタンパク分解能が想定されること；植物細胞の小胞体中での五量体及びＨＡＶウイルスエンベロープの発現レベルが細胞質中より高いこと；植物細胞中での五量体の排他的発現が、この粒子のサイズがより小さいために、より効率よく行われ、より良好な植物の成長及び発達を可能にすること；植物から薬剤タンパクをスケールアップし産生させることが大量の抗原の産生に適していること；現在使用され、当分野の最先端で述べられている他のシステムと比べて生産コストが低下すること；植物でのＨＡＶ抗原の発現により、ヒトに影響を及ぼす病原体の混入リスクが低下すること；産物を精製することを必要とせずに植物を使用できる可能性があるために、ＨＡＶに対しての経口免疫感作が、免疫感作にかかるコストを下げるのにかなり貢献することである。
【００３１】
微生物の寄託
微生物の寄託に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔ）の規則に従って、ベルギー微生物保存機関（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）ＢＣＣＭ、ＬＭＢＰ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮに、プラスミドｐＢＶＨＡＲＥ、ｐＢΔＶＨＡＲＥ、ｐＢＭＬＡｍ及びｐＢΔＭＬＡｍを寄託し、これらは、それぞれ受託番号ＬＭＢＰ４７２１、ＬＭＢＰ４７２２、ＬＭＢＰ４７２３及びＬＭＢＰ４７２４で２００３年５月１９日に寄託された。
【実施例１】
【００３２】
ＨＡＶキューバ株Ｍ２のＯＲＦのクローン化
プラスミドｐＭＬＡ１の当該の配列を図１（Ａ）に示す。キューバで単離され特徴付けられたＨＡＶ株Ｍ２からＲＮＡを精製し、ＨＡＶの以前に報告された他の配列に特異的なオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １及び２）を使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）技術を用いて６．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。このバンドを予めＳｍａＩエンドヌクレアーゼで消化したベクターＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＫＳ＋）中にクローン化した。得られたプラスミドをｐＭＬＡ１と名付け、ＨＡＶキューバＭ２株のＯＲＦの配列決定に使用した。ＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３）は、報告されているものに比べて変化を示している。これは、異なるアミノ酸が１１個生じる変化が認められる。この配列分析から、アメリカ株のほとんどすべてが属するサブ遺伝子型ＩＡに、Ｍ２株を分類することができる。実際にキューバ株Ｍ２が以前から報告されているものと異なるＨＡＶ株であることが、この配列から確認された。
【実施例２】
【００３３】
植物細胞の細胞質ゾル中でキャプシド及び五量体を発現させるための遺伝子構築物
プラスミドｐＰ１−２Ａの当該の配列を図１（Ｂ）に示す。プラスミドｐＭＬＡ１に由来するタンパクＶＰ４をコードする配列の５’領域及びタンパク２Ａをコードする配列の３’領域にそれぞれ相補的な特異的オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４）を用いて、構造タンパク（Ｐ１−２Ａ）をコードする配列をＰＣＲで増幅することによって、このプラスミドを得た。２．５ｋｂの増幅バンド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６）をＳｍａＩ消化ベクターＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＫＳ＋）中にクローン化した。
【００３４】
プラスミドｐ３ＡＢＣの当該の配列を図１（Ｃ）に示すが、このプラスミドを得るために、この遺伝子の５’及び３’領域に相補的なオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ７及び８）を用いて、タンパク３Ａをコードする０．２ｋｂの領域をＰＣＲで増幅した。これをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ消化ベクターＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ＋）中にクローン化した。その後、同じベクターであるがＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ部位の間の領域中に、タンパク３Ｂをコードする合成ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ９及び１０）をクローン化した。得られたプラスミドをｐ３ＡＢと名付けた。その一方で、プラスミドｐＭＬＡ１から、オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １１及び１２を用いて、タンパク３Ｃをコードする０．６５ｋｂの配列をＰＣＲで増幅した。このバンドをベクターＰ３ＡＢのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローン化した。その結果得られた配列を３ＡＢＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １３）と名付けた。
【００３５】
これは、タンパク分解活性があるが自己プロセシングを起こし得ないポリタンパクをコードしている。ＴをＣで、ＧをＣでそれぞれヌクレオチド置換することにより、タンパク３Ａ／Ｂ及び３Ｂ／Ｃ間の切断部位に変異が生じているからである。
【００３６】
プラスミドｐＭＬＡｍの当該の配列を図１（Ｄ）に示す。これを得るために、プラスミドｐＰ１−２ＡをＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化した。変異ポリペプチド３ＡＢＣをコードする１ｋｂのバンドをＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ消化によって切り出し、予め消化したｐＰ１−２Ａの適切な部位にクローン化した。プラスミドｐＭＬＡｍは、元のポリタンパクと比べてかなり軽量のＨＡＶポリタンパクをコードする改変配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １４）を含んでいる。
【００３７】
ベクターｐＫＴＰＬ−２でＳｍａＩ／ＣｌａＩ消化した３．４ｋｂのＯＲＦｍのバンドをクローン化することにより、プラスミドｐＫＭＬＡｍを得た。このベクターは、プロモーターである２Ｘ  ３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター配列、ＴＥＶのリーダー配列及び３５Ｓ  ＣａＭＶの転写終結配列を含んでいる。ＯＲＦｍバンドをクローン化するために、プラスミドｐＫＴＰＬ−２をＮｃｏＩで消化し、その後ＤＮＡ  ＰｏｌＩのクレノー断片で平滑化し、最後にＣｌａＩで消化した。
【００３８】
バイナリープラスミドｐＢＭＬＡｍの当該の配列を図１（Ｆ）に示す。プラスミドｐＫＭＬＡｍをＳｐｈＩで消化し、続いてマングビーン（Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで処理し、４．７ｋｂのバンドを、予めＳｍａＩで消化したバイナリーベクターｐＢｉｎ１９中にクローン化して、このプラスミドを得た。
【００３９】
得られたプラスミドｐＢＭＬＡｍは、カナマイシン耐性をもたらす選択マーカーとして働くネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、改変ＨＡＶポリタンパクをコードし、２Ｘ  ３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター配列及びＴＥＶのリーダー配列並びにＣａＭＶの転写終結配列によって調節されるＯＲＦｍ遺伝子を含む。これはまた、植物ゲノムへのこの移入を促進するＴ−ＤＮＡの境界配列をも含む。
【実施例３】
【００４０】
植物細胞の細胞質ゾル中で五量体を発現させるための遺伝子構築物
プラスミドｐΔＭＬＡｍの当該の配列を図２（Ａ）に示す。タンパクＶＰ４を除去しこのプラスミドを得るために、酵素ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断してプラスミドｐＭＬＡｍから１１４ｂｐの断片を除去し、それを合成ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １５及び１６）で置き換えて、タンパクＶＰ２をコードする遺伝子の起始部を回復させた。領域ΔＯＲＦｍの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １７に一致する。ＳｍａＩ／ＣｌａＩ消化したΔＯＲＦｍのバンド（３．４６ｋｂ）を、予めＮｃｏＩ／クレノー／ＣｌａＩで消化したプラスミドｐＫＴＰＬ−２中にクローン化して、プラスミドｐＫΔＭＬＡｍを得た。
【００４１】
バイナリープラスミドｐＢΔＭＬＡｍの当該の配列を図２（Ｂ）に示す。Ｂｉｎ１９を酵素ＳｍａＩで消化して、このバイナリープラスミドを得た。酵素ＳｐｈＩでプラスミドｐＫＭＬＡｍを消化して４．６ｋｂのＤＮＡ断片を得、これをマングビーンヌクレアーゼで処理し、次いでクローン化した。
【００４２】
得られたプラスミドｐＢΔＭＬＡｍは、カナマイシン耐性をもたらす選択マーカーとして機能するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、ＨＡＶ改変ポリタンパクをコードし、プロモーターである配列２Ｘ  ３５Ｓ  ＣａＭＶ及びＴＥＶリーダー配列並びに３５Ｓ  ＣａＭＶの転写終結配列によって調節されるＯＲＦｍ遺伝子を含む。これはまた、植物ゲノムに移入される右側及び左側の境界配列をも含む。
【実施例４】
【００４３】
植物細胞の小胞体中でキャプシド及び五量体を発現させるための遺伝子構築物
プラスミドｐＢＶＨＡＲＥの当該の配列を図３Ｂに示す。このプラスミドを得るために、ＫＤＥＬ保持シグナルをコードする合成断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １８及び１９）をベクターＢＳ（＋）のＥｃｏＲＶ／ＣｌａＩ部位にクローン化した。その一方で、プラスミドｐＰ１−２ＡのＳｔｙＩ／ＥｃｏＲＩ部位に、タンパク２Ａの３’末端を改変し、この領域中のプロテアーゼ切断部位を除去し、かつ遺伝子の結合部とＫＤＥＬシグナルをコードする配列との間に間隔を空けるバーとして働く配列を導入する合成断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２０及び２１）をクローン化した。その後、この配列（２．５ｋｂ）を酵素ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶで切り出し、ベクター  ＢＳ−ＫＤＥＬ中にクローン化し、プラスミドｐＰ１−２ＡＲＥ（図３Ａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２２）を得た。ｐ３ＡＢＣプラスミドを酵素ＸｈｏＩ／クレノー／ＥｃｏＲＩで消化し、３ＡＢＣ配列をＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローン化して、プラスミドｐ３ＡＢＣＲＥを得た（図３Ａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２３）。
【００４４】
対象とする遺伝子に植物発現調節シグナルを供給するために、酵素ＳｍａＩ／ＣｌａＩでプラスミドｐＰ１−２ＡＲＥから切り出した構造領域Ｐ１−２Ａ−ＫＤＥＬ（２．５ｋｂ）を、ＮｃｏＩ／クレノー／ＣｌａＩで消化したプラスミドｐＫＴＰＬ−２中にクローン化した。得られたプラスミドをｐＫＰ１−２ＡＲＥと名付けた。プラスミドｐ３ＡＢＣＲＥから酵素ＮｃｏＩ／ＣｌａＩで１ｋｂの領域３ＡＢＣ−ＫＤＥＬを切り出し、同じ酵素で消化したプラスミドｐＫＴＰＬ−２中にクローン化した。得られたプラスミドは、ｐＫ３ＡＢＣＲＥであった。
【００４５】
最後に、Ａ．ツメファシエンスを用いる植物の形質転換のためのプラスミドを得るために、プラスミドｐＫ３ＡＢＣＲＥから酵素ＳａｌＩで切り出した２ｋｂの配列を、同じ酵素で予め消化したバイナリーベクターｐＢｉｎ  １９中にクローン化した。得られたプラスミドをｐＢ３ＡＢＣＲＥと名付けた。その後、同じベクターのＳｐｈＩ部位に、ＳｐｈＩ消化でプラスミドｐＫＰ１−２ＡＲＥから切り出した配列Ｐ１−２Ａ−ＫＤＥＬに相当する発現カセットをクローン化した。得られたプラスミドｐＢＶＨＡＲＥは、構造領域もプロテアーゼの機能を有する領域も別個に有し、これらは、植物発現調節シグナルの存在下で小胞体保持シグナルと融合している。またこのプラスミドは、選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を有する。
【実施例５】
【００４６】
植物細胞の小胞体中で五量体を発現させるための遺伝子構築物
プラスミドｐＢΔＶＨＡＲＥの当該の配列を図４（Ｂ）に示す。このプラスミドを得るために、酵素ＳｍａＩ／ＰｓｔＩでプラスミドｐＰ１−２ＡＲＥを切断して、その断片を合成ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １５及び１６）で置き換えて、タンパクＶＰ２をコードする遺伝子の起始部を回復させた。得られたプラスミドｐΔＰ１−２ＡＲＥ（図４Ａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２４）をＳｍａＩ／ＣｌａＩで消化し、２．４ｋｂのバンドを、ＮｃｏＩ／クレノー／ＣｌａＩで消化したベクターｐＫＴＰＬ−２中にクローン化して、プラスミドｐＫΔＰ１−２ＡＲＥを得た。酵素ＳｐｈＩで消化した発現カセットをプラスミドｐＢ３ＡＢＣＲＥ（３ＡＢＣ−ＫＤＥＬを含むバイナリープラスミド）中にクローン化した。
【００４７】
得られたバイナリープラスミドは、植物発現シグナルの存在下でＫＤＥＬペプチドと融合した、タンパクＶＰ４をコードする配列を有さない構造領域、同じシグナルの存在下の３ＡＢＣ−ＫＤＥＬ領域、及び選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含む。
【実施例６】
【００４８】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）トランスジェニック植物中でのＨＡＶのキャプシド及び五量体の獲得
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物の遺伝的形質転換をＺａｍｂｒｙｓｋｉら（１９８３）の方法に従って実施した。
【００４９】
Ａ．ツメファシエンス株Ａｔ２２６０（Ｄｅｂｌａｅｒｅら、１９８５）を、液体窒素法（Ｈｏｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、１９８８）により、開発したバイナリープラスミド（ＰＢΔＶＨＡＲＥ、ＰＢＶＨＡＲＥ、ＰＢΔＭＬＡｍ、ＰＢＭＬＡｍ）で形質転換した。「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で培養しているプチハバナ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ）ＭＲ１種のタバコ植物の葉原基を、組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で形質転換した。カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を選択マーカーとして使用した。
【００５０】
サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫顕微鏡法などいくつかの手順を実施して、タバコ植物ゲノム中に対象とする遺伝子が存在し発現しているかどうか、並びにウイルスエンベロープ又は五量体が形成されているかどうかを検出した。
【実施例７】
【００５１】
トランスジェニックニンジン植物（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．）中でのＨＡＶのキャプシド及び五量体の獲得
バイナリープラスミド（ＰＢΔＶＨＡＲＥ、ＰＢＶＨＡＲＥ、ＰＢΔＭＬＡｍ、ＰＢＭＬＡｍ）で形質転換したＡ．ツメファシエンス株Ａｔ２２６０を植物の形質転換に使用した。新クロダ（ＮＥＷ  ＫＵＲＯＤＡ）種の３週齢の発芽した胚軸を、１ｃｍの区分に切断し、ＢＡＮ−９培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２（ＭＳ）、ＮＡＡを０．５ｍｇ／Ｌ補充）に植え、３日間培養した。その後、前記に記載の構築物の各１つを含むＡｔ懸濁液とともにこれを３０分間インキュベートした。外植片をＢＡＮ−９培地に再び移して７２時間培養した。この期間の後、カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を補充した再生培地にこれを植えた。３週間後に苗条が現れ、これを個別化し、やはりカナマイシンを１００ｍｇ／Ｌ補充したＭＳ培地に植えた。遺伝子が組み込まれたことを、ＰＣＲ産物のサザンブロットで確認した（図６）。ポリタンパク発現、そのプロセシング及びウイルスキャプシド及び五量体の形成を、ＥＬＩＳＡ（図８）及びウェスタンブロット（図７）で実証した。
【実施例８】
【００５２】
トランスジェニックイネ植物（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）中でのＨＡＶのキャプシド及び五量体の獲得
Ｈｉｅｉら（１９９４）が使用した方法に従って、イネ植物の遺伝的形質転換を実施した。Ａ．ツメファシエンス株Ａｔ２２６０を、液体窒素法を用いて、開発したバイナリープラスミド（ｐＢΔＶＨＡＲＥ、ｐＢＶＨＡＲＥ、ｐＢΔＭＬＡｍ、ｐＢＭＬＡｍ）で形質転換した。イネの胚盤から得られたカルスを組換えＡ．ツメファシエンスで形質転換した。カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を選択マーカーとして用いた。
【００５３】
イネ植物ゲノム中に対象とする遺伝子が存在し発現していること、並びにウイルスキャプシド又は五量体が形成されていることを確認するために、下記に記載する様々な手順を実施した。
【実施例９】
【００５４】
トランスジェニック植物の分子的免疫化学的特徴付け
サザンブロットによる分析
Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら（１９８３）により記載の方法を使用して、タバコ、ニンジン及びイネ植物から、サザンブロット用の染色体ＤＮＡを得た。サンプルとして、選択マーカーに対して耐性を示す前述の構築物を有する形質転換植物の葉を使用した。非形質転換植物の葉を陰性対照として用いた。
【００５５】
全ＤＮＡ消化、アガロースゲル電気泳動、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜へのトランスファー及びハイブリダイゼーションを標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）で行った。タンパクＶＰ１をコードする遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｐｒｉｍｅｒ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、米国）を用いて３２Ｐで標識し、放射活性プローブとして用いた。同じ断片を陽性対照として用いた。
【００５６】
図５は、細胞質中でＨＡＶのキャプシドと五量体をどちらも発現する構築物ＰＢΔＭＬＡｍ及びＰＢＭＬＡｍで形質転換したトランスジェニックタバコ植物のサザンブロットを示している。ＳｍａＩ及びＣｌａＩでのＤＮＡ消化によって、３．４ｋｂのバンドが得られる。小胞体中で発現する構築物ＰＢΔＶＨＡＲＥ及びＰＢＶＨＡＲＥで形質転換したトランスジェニック植物由来の全ＤＮＡをＳｍａＩとＩ−ＥｃｏＲＩで消化して、２．４ｋｂのバンドを得た。図５に示す結果は、植物がそのゲノム中に構造タンパクをコードする配列を含むことを実証するものである。
【００５７】
トランスジェニックニンジンとイネ植物の両方で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４及び５の配列に相当するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅産物にサザンブロットを行った。図６に示すように、タンパクＶＰ１をコードする放射活性標識配列は、構造タンパクをコードする配列の予想サイズに相当する２．５ｋｂのバンドと相補的に結合している。
【００５８】
ウェスタンブロットによる分析
ウェスタンブロットの結果を図７に示す。Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）により記載の方法に従って、組換え分子を免疫学的に検出するウェスタンブロット法を実施した。ウェスタンブロットのサンプルは、五量体しか発現しない構築物で形質転換したトランスジェニックタバコ、ニンジン及びイネ植物から抽出した全可溶性タンパクからなるものであり、タバコ５、ニンジン７及びイネ３のクローンは、小胞体中で五量体を発現させる構築物ｐＢΔＶＨＡＲＥで形質転換したもの、タバコ２５及びニンジン１０のクローンは、細胞質中で五量体の発現を可能にする構築物ｐＢΔＭＬＡｍで形質転換したものであった。陰性対照として、非形質転換タバコの葉から抽出したタンパクを使用した。陽性対照として、ＶＰ１タンパクを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた。非常に薄い粉塵を得るまで、葉を液体窒素で粉砕した。Ｓｃｈｏｕｔｅｎら（１９９７）の報告の通りに、葉１ｇ当たりにタンパク抽出緩衝液［ｐＨ６．８の６１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、１２．５％グリセロール、及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）］１ｍＬを加えた。１３０００ｒｐｍで遠心分離することによって、不溶性物質を除去した。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った全タンパクをニトロセルロース膜に移し、酵素アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）と結合した抗ＶＰ１ポリクローナル抗体を用いて、対象とするタンパクを同定した。比色反応を用いて、この酵素の検出を行った。
【００６０】
図７において、すべての培養物中にＶＰ１タンパクと同じサイズのタンパクバンドが存在すること、並びにポリタンパクの不完全なプロセシングから他の中間産物が得られることを観察することができる。
【００６１】
免疫酵素検定（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。「サンドイッチ」法を行った。モノクローナル抗体７Ｅ７の１０ｍｇ／ｍＬ炭酸緩衝液（０．０１５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０２８Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）溶液で、プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）をカバーし３７℃で４時間置いた。ミルクの５％ＰＢＳ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）溶液で、ブロッキングを３７℃で２時間実施した。その後、形質転換及び非形質転換タバコ、ニンジン及びイネ植物に対応する（ウェスタンブロットについて記載されたのと同様に調製した）サンプル１００μＬを加えた。プレートを４℃で１晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１／１０００に希釈した（ミルクを０．５％含むＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬ）アルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗体７Ｅ７を１００μＬ加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。０．１％ジエタノールアミン中で調製した４−ニトロフェニルホスフェート（酵素の基質）を加えることによって、反応を生じさせた。色が現れるかどうかを６０分間追跡して調べた。分光光度計で、波長４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。ＥＬＩＳＡのあらゆる段階において、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を０．１％含むＰＢＳでプレートの洗浄を３回行った。
【００６２】
免疫電子顕微鏡法による分析
免疫顕微鏡法の結果を図９に示す。プラスミドｐＢＭＬＡｍで形質転換したタバコ及び非形質転換植物の、どちらも組織培養由来のサンプルを４％ホルムアルデヒド溶液で、その後０．２％グルタルアルデヒドで固定した。これをエタノールで脱水し、次いでＬｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ  ４Ｍ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｗｅｒｋｅ  Ｌｏｗｉ，Ｗａｌｄｋｒａｉｂｕｒｇ）溶液中でインキュベートした。超薄切片をニッケル網に置き、モノクローナル抗体７Ｅ７とともにインキュベートした。このステップの後、１５ｎｍの金コロイド粒子で標識した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともにインキュベートした。酢酸ウランで５分間、その後クエン酸鉛で７分間処理して、免疫標識切片に対比染色を行った後、透過型電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ−Ｊｅｍ  ２０００ＥＸ、日本）で検鏡した。その結果、構築物ｐＢＭＬＡｍで形質転換したタバコ植物でのみ直径約２７ｎｍの粒子が見られ、これによって、このタンパクが細胞の細胞質中に発現していることが示された。
【実施例１０】
【００６３】
トランスジェニックタバコ及びイネ植物からのキャプシド及び五量体の精製
キャプシド及び五量体を精製するために、粒子及び免疫原性五量体を専ら認識する、ＣＩＧＢ研究所で得られた抗ＨＡＶモノクローナル抗体を使用した。ウェスタンブロット分析で説明したプロトコールを用いて、植物細胞タンパクを抽出した。遠心分離から得られた上清を、０．５Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、抗体を付けた親和性ゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）と混合した。この混合物を４℃で１６時間インキュベートした。このゲルを１０倍量のＰＢＳ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、ｐＨ２．５の０．２Ｍグリシンで、対象とするタンパクを溶出させた。この溶出物を塩基性トリスで中和し、ＰＢＳに対して透析した。ＨＡＶウイルスキャプシド及び五量体の認識用の特異的な、市販の７Ｅ７モノクローナル抗体（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ）を用いて、この葉抽出物由来のＨＡＶ粒子及び五量体が存在するかどうかを、ＥＬＩＳＡで検出した。
【実施例１１】
【００６４】
腹腔内投与による、トランスジェニック植物から精製したキャプシド及び五量体の免疫原性の決定
トランスジェニックタバコ及びイネ植物から精製したキャプシド及び五量体７５０ＥＬ．Ｕを２回投与して、１４週齢の白色ＩＣＲマウスを免疫感作させた。同様に、一群のマウスに市販のＨＡＶ抗原（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ）を接種し、これを陽性対照として使用した。他群にＰＢＳを接種し、これを陰性対照として用いた。接種から０日後、１５日後、３０日後、５０日後及び７０日後に血液サンプルを採集した。
【００６５】
抑制ＥＬＩＳＡを用いて、抗体レベルを測定した。モノクローナル抗体７Ｅ７  ５μｇでプレートをカバーし、次いで４時間インキュベートした。その後、それを０．１％トゥイーン入りＰＢＳで１回洗浄した。０．１％トゥイーン入りＰＢＳ中にミルクを５％加えてブロッキングを行い、３７℃で２時間インキュベートした。このプレートを０．１％トゥイーン入りＰＢＳで３回洗浄した。ＨＡＶ抗原（Ｍｅｄｉａｇｎｏｃｔ）とともに３７℃で２０分間予めインキュベートしていた免疫感作マウス血清を加えた。このプレートを１６℃で１２時間インキュベートし、０．１％トゥイーン入りＰＢＳで５回洗浄した。最後に、ミルクを０．５％含むＰＢＳで１／１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗体７Ｅ７を１００μＬ加えた。３７℃で１時間インキュベーションを実施した。ジエタノールアミンで調製した４−ニトロフェニルホスフェート（酵素の基質）を加えることによって、反応を生じさせた。色が現れるかどうかを６０分間追跡して調べた。分光光度計で、波長４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。図１０に、タバコ及びイネ植物によって産生された五量体を接種したマウスの血液中で検出された、トランスジェニック植物から精製した抗原を接種したマウス血清の抑制の平均レベルを示す。同様にして、キャプシド及び五量体の発現を可能にする構築物で形質転換したタバコ及びイネ植物で産生された抗原で免疫感作させたマウスで類似した抗体レベルが認められた。
【実施例１２】
【００６６】
経口投与による、トランスジェニック植物から精製したキャプシド及び五量体の免疫原性の決定
精製抗原を使用する経路と、抗原を発現しているニンジンを動物に飼料として与える経路の２つの経路で、抗原の経口投与を行った。
【００６７】
経口投与した精製キャプシド及び五量体の抗原性を決定するために、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに五量体及びキャプシド７５００ＥＬ．Ｕ．を４回投与した。接種から０日後、１５日後、３０日後、５０日後及び７０日後に血液２００μＬを採集して、抑制ＥＬＩＳＡにより抗ＨＡＶ抗体が存在するかどうかを検出した。
【００６８】
実施例１１で前述した手順を用いて、抑制ＥＬＩＳＡを行った。
【００６９】
図１１に示された結果によれば、トランスジェニック植物中で発現したＨＡＶの五量体の経口投与によって免疫応答が生じ、このことは、この実験に使用したマウス血清の平均抑制レベルによって示されている。経口投与したマウス血清の平均抑制レベルは、腹腔内投与後に得られたものと比べて低かった。植物を介する五量体の経口投与を実施し、（五量体のみを産生するように特別に設計された構築物ｐＢΔＭＬＡｍで形質転換した）生ニンジン５ｇを週１回４週間与えた。非形質転換ニンジンを飼料として与えたマウス血清を、陰性対照として用いた。この植物が免疫反応を引き起こすことができることが、図１２に示す抑制ＥＬＩＳＡによって実証された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】植物植物細胞の細胞質ゾル中でエンベロープ及び五量体を発現させるための遺伝子構築物を示す図である。Ａ）は、ＨＡＶのＭ２株のＯＲＦの概略図である。Ｂ）は、構造タンパク（Ｐ１−２Ａ）をコードする配列の概略図である。Ｃ）は、３ＡＢＣ領域をコードする配列の概略図である。Ｄ）は、ＨＡＶのＯＲＦｍの概略図である。Ｅ）は、植物発現のためのバイナリーベクター中にクローン化された当該の挿入配列の概略図である。
【図２】植物細胞の細胞質ゾル中で五量体を発現させるための遺伝子構築物を示す図である。Ａ）は、ＶＰ４をコードする配列を含まないΔＯＲＦｍの概略図である。Ｂ）は、ΔＯＲＦｍを植物で発現させるためのバイナリーベクター中にクローン化された当該の挿入配列の概略図である。
【図３】植物細胞の小胞体中でエンベロープ及び五量体を発現させるための遺伝子構築物を示す図である。Ａ）は、ＫＤＥＬ配列と融合したＰ１−２Ａ配列の概略図である。Ｂ）は、小胞体中で発現させるためのバイナリーベクター中にクローン化された当該の挿入配列の概略図である。Ｅはスペーサー、ＫはＫＤＥＬを示す。
【図４】植物細胞の小胞体中で五量体を発現させるための遺伝子構築物を示す図である。Ａ）は、ＫＤＥＬ配列と融合した、ＶＰ４配列を含まないＰ１−２Ａ配列の概略図である。Ｂ）は、植物発現のためのバイナリーベクター中にクローン化された当該の挿入配列の概略図である。Ｅはスペーサー、ＫはＫＤＥＬを示す。
【図５】トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す図である。
【図６】ニンジン及びイネトランスジェニック植物のＰＣＲ産物のサザンブロットを示す図である。
【図７】エンベロープ及び五量体を細胞質ゾル中で発現させるための遺伝子構築物で形質転換したトランスジェニックタバコ、ニンジン及びイネの植物タンパクのウェスタンブロットを示す図である。
【図８】ＨＡＶエンベロープ及び五量体を細胞質ゾル中で発現させるための遺伝子構築物で形質転換したタバコ、ニンジン及びイネ植物に行った免疫酵素検定（ＥＬＩＳＡ）を示す図である。
【図９】構築物ｐＢＭＬＡｍで形質転換した、あるタバコ植物の免疫電子顕微鏡法の結果を示す図である。Ａ）は、非形質転換植物である。Ｂ）は、形質転換植物である。Ｃ）は、形質転換植物である。
【図１０】腹腔内経路によってＨＡＶで免疫感作させたマウスの血清の抑制ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１１】イネ及びタバコ植物から精製したＨＡＶ五量体で経口免疫感作させたマウスの血清の抑制ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１２】ＨＡＶ五量体を発現している植物から採集したニンジンを飼料として与えることによって経口免疫感作させたマウスの血清の抑制ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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