(57)【要約】  本発明は、非常に簡便に実施することができる上に、非常に微細なエマルションを調製することができる方法と、当該方法で利用することができるキットを提供することを課題とする。本発明に係る生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法は、少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５〜５容量倍である混合液を調製し；当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ペプチドのエマルション製剤を調製する方法であって、
少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５〜５容量倍である混合液を調製し；
当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法。
【請求項２】
混合液の調製工程において、生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントの混合物を攪拌し、水相と油相からなる分離した層を解消する請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
シリンジ筒部の断面積をコネクタの断面積の２〜５０倍とする請求項１または２に記載の調製方法。
【請求項４】
コネクタの流路の断面形状を円形とし、当該流路の内径を０．８〜１．５ｍｍとする請求項１〜３の何れか１項に記載の調製方法。
【請求項５】
コネクタの流路の長さを１０〜１５ｍｍとする請求項１〜４の何れか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
混合液のシリンジ間の移動を３０回以上繰り返す請求項１〜５の何れか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
混合液のシリンジ間の移動を２０回以上繰り返した後に０．５〜１０分間静置し、再度１回以上移動を繰り返す請求項１〜６の何れか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
生理活性ペプチドのエマルション製剤を調製するためのキットであって、
生理活性ペプチドを生理食塩水または１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥することにより得た生理活性ペプチド組成物を１種以上；
生理活性ペプチド組成物を溶解することによって、血漿と等張または略等張の生理活性ペプチド溶液を得られる量の水を生理活性ペプチド組成物と同数；および
オイルアジュバントを生理活性ペプチド組成物と同数；
含有することを特徴とするエマルション製剤調製用キット。
【請求項９】
生理活性ペプチド組成物として、生理活性ペプチドを１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥することにより得たものを含有する請求項８に記載のエマルション製剤調製用キット。
【請求項１０】
さらに、筒部の断面積が５０〜５００ｍｍ2である２個のシリンジを含有する請求項８または９に記載のエマルション製剤調製用キット。
【請求項１１】
さらに、上記シリンジ用のコネクタであって、流路の断面形状が内径０．８〜１．５ｍｍの円形であるコネクタを含有する請求項８から１０の何れか１項に記載のエマルション製剤調製用キット。
【請求項１２】
上記コネクタの流路の長さが１０〜１５ｍｍである請求項１１に記載のエマルション製剤調製用キット。
【請求項１３】
上記コネクタの断面積が上記シリンジの筒部断面積の０．０２〜０．５倍である請求項１１または１２に記載のエマルション製剤調製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ペプチドのエマルション製剤を製造する方法、および当該方法で使用できるエマルション製剤調製用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌などの悪性腫瘍に対する治療においては、ペプチドを抗原として含むワクチンを投与することによって、悪性腫瘍に対する特異的免疫を増強しようとする試みがなされている。さらに、免疫増強作用を一層高めるため、アジュバントという免疫助成剤が投与されることもある。この場合、アジュバントは流動パラフィン等の油性成分であるため、ペプチドとアジュバントを水に混合した上でエマルションとし、これを注射剤として投与する。【０００３】
しかし、製剤中に含まれるエマルションの中に径の大きなものが含まれていると、生体がこれを異物と認識し、肉腫が形成されるなど様々な副反応が生じるおそれがある。よって、エマルション製剤においては、エマルション径を小さくすることが非常に重要になる。【０００４】
微細なエマルションを製造するための技術としては、様々なものが検討されている。例えば特開２００５−１５２７４０には、大豆油等の分散相とドデシル硫酸ナトリウム水溶液等の連続相を合流させた直後に流速を急激に低下せしめることを特徴とするエマルションの製造方法と、その方法を実施するための装置が記載されている。【０００５】
また、特開２００５−１８６０２６には、エマルションを調製するためのデバイスであって、２個のシリンジをコネクタにより連結し、その間にシラス多孔質ガラス膜製多孔体を挟んだものが開示されている。
【発明の開示】
【０００６】
上述した様に、微細なエマルションを調製するための技術として、従来、様々なものが知られている。しかし、エマルションを製剤として用いる場合には、従来技術で得られるエマルションの径は必ずしも満足できるものでない場合があった。例えば、エマルション製剤におけるエマルション径としては１μｍ前後が好ましいとされているが、特開２００５−１５２７４０の技術で調製されるエマルションの径は、１６、１２および８．９μｍである。
【０００７】
その一方で、特開２００５−１８６０２６の技術によれば、約２μｍのエマルションも得られている。しかし特許文献２には、エマルションに関して単にＷ／Ｏ型エマルションとのみ記載されており、特殊な医薬用のペプチドエマルション製剤を調製するために如何なる原料を用いればよいか一切記載されていない。
【０００８】
また、エマルション製剤は安定性に乏しく、製造した後に出荷した場合、エマルション同士が融合して径が大きくなって危険性が増すという問題がある。よって、エマルション製剤の場合には使用直前に調製することが好ましいため、エマルション製剤をできる限り簡便に用時調製するための技術が求められていた。
【０００９】
そこで本発明が解決すべき課題は、非常に簡便に実施することができる上に、非常に微細なエマルションを調製することができる方法と、当該方法で利用することができるキットを提供することにある。
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、微細なエマルションを容易に得られる条件につき鋭意研究を重ねた。その結果、オイルと水との混合液を、コネクタを介したシリンジ間で繰り返し移動させることによって、上記目的が達成できることを見出して本発明を完成した。
【００１１】
本発明に係る生理活性ペプチドのエマルション製剤の調製方法は、
少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５〜５容量倍である混合液を調製し；
当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係るエマルション製剤調製用キットは、
生理活性ペプチドを生理食塩水または１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥することにより得た生理活性ペプチド組成物を１種以上；
生理活性ペプチド組成物を溶解することによって、血漿と等張または略等張の生理活性ペプチド溶液を得られる量の水を生理活性ペプチド組成物と同数；および
オイルアジュバントを生理活性ペプチド組成物と同数；
含有することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で用いるシリンジの一例を示す模式図である。図中、１はプランジャを示し、２はシリンジ筒部のツバを示し、３はガスケットを示し、４はノズル（ノック式）を示し、５は生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含む混合液を示す。
【図２】本発明で用いるコネクタの一例を示す模式図である。図中、６はシリンジ装着部位を示し、７は通液部を示し、８は気泡抜きを示し、９はコックを示す。
【図３】本発明方法に係るポンピングを行なう装置の一部を示す模式図である。図中、１０はポンピング部を示し、１１は固定台を示す。
【図４】本発明で用いるコネクタの一例を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に係る生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法は、
少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５〜５容量倍である混合液を調製し；
当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする。【００１５】
本発明で用いる生理活性ペプチドの種類は、特に制限されないが、例えば、ヒトや動物の疾患予防や治療などに用いる抗原として利用し得るものを挙げることができる。例えば、癌などの悪性腫瘍に対する患者の特異的免疫を高めるワクチン、ウイルスや細菌による感染症の予防や持続感染患者においてウイルスや細菌等に対する特異的免疫を高めるワクチン、またはアレルギー反応を抑制する減感作療法のための抗原等が挙げられる。【００１６】
さらに、本発明に用いるペプチドの大きさには特に制限はないが、ペプチドを構成するアミノ酸数において好ましくは２０以下、より好ましくは４〜２０、さらに好ましくは８〜２０、さらに好ましくは８〜１５、最も好ましくは９または１０である。ペプチドを構成するアミノ酸数が多過ぎると、溶解性が悪くなり易くなることがあるためである。【００１７】
本発明で用いるオイルアジュバントは、医薬製剤の構成成分として許容されている油性の免疫助成剤であれば特にその種類は問わない。例えば、流動パラフィン、ラノリン、フロイント等を挙げることができる。【００１８】
本発明で用いる水としては、純水、精製水、蒸留水、滅菌水など医薬製剤の構成成分として許容されているものを使用できる。但し、生理活性ペプチドを溶解した場合、その浸透圧が血漿と同等である必要がある。よって、ペプチドが塩類等と共に凍結乾燥されたものである場合には、溶液が血漿と等張または略等張となる様に滅菌水等の量を調整するか、必要に応じて塩化ナトリウム等の塩類を添加する。なお、略等張は、水溶液中の塩濃度がヒトへの投与に許容される濃度であればよいが、水溶液中の塩濃度が０．５〜６ｗ／ｖ％となることが好ましい。ペプチドが塩類等を含まない場合には、生理食塩水やグルコース水溶液などを用いてもよい。また、最終的に、薬理上許容されている酸や塩基によりｐＨを調整してもよい。【００１９】
本発明では、生理活性ペプチド、オイルアジュバントおよび水を混合して混合液とする。好適には、先ず生理活性ペプチドを水に溶解した上でオイルアジュバントを加える。この際の混合割合は、エマルションの形成を容易にするために、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合で０．５〜５容量倍とする。【００２０】
本発明では、上記混合液を調製するに当たり、生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントの混合物を攪拌し、水相と油相からなる分離した層を解消することが好ましい。通常、水相である生理活性ペプチド水溶液と油相であるオイルアジュバントを単に混合すると、水相と油相が二層に分離する。しかし、混合液における二層分離を解消しておけば、続くエマルションの調製工程の効率をよりいっそう高めることができる。ここで、水相と油相からなる分離した層を解消するとは、かかる二層に分離した液を攪拌することによって、少なくとも水相と油相による二層の形成が肉眼で観察できなくなることをいうものとする。なお、当該二層間の界面が解消されると、比較的径の大きなエマルションが形成され、混合液は白濁する。【００２１】
例えば、オイルアジュバントを攪拌しつつ生理活性ペプチド水溶液を少量ずつ加えたり、或いは生理活性ペプチド水溶液の一部をオイルアジュバントへ加えては攪拌するという操作を繰り返し行う。また、生理活性ペプチド水溶液の全量とオイルアジュバントを一方のシリンジへ挿入して振とう攪拌するか、或いは、生理活性ペプチド水溶液の一部とオイルアジュバントを一方のシリンジへ挿入しては振とう攪拌するという操作を繰り返し、シリンジ内で水相と油相からなる分離した層を解消してもよい。より好ましくは、オイルアジュバントへ生理活性ペプチドを半量加えて５秒〜１分間程度攪拌する操作を２回行う。【００２２】
なお、水相と油相からなる分離した層が解消された混合液を静置しておくと、再び相分離が起こる場合があるので、かかる二層を解消した後はできるだけ速やかに次工程へ移行することが好ましい。【００２３】
本発明方法では、次に、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で、上記混合液を繰り返し移動させる。即ち、断面積が大きなシリンジ筒から断面積の小さなコネクタへ、また、コネクタからシリンジへの移動を繰り返して混合液を激しく攪拌することによって、径が１μｍ前後という微細なエマルションを簡便に調製することができる。【００２４】
当該工程で用いるシリンジ筒部の断面積は、コネクタの断面積の２〜１５０倍、好ましくは２〜５０倍とする。シリンジ筒部の断面積がコネクタ断面積の２倍未満であると、上述した効果が十分に発揮されない場合があり、一方、１５０倍を超えるとシリンジや装置等にかかる負担が大きくなり過ぎるおそれがある。【００２５】
より具体的には、シリンジの筒部の断面積は５０〜５００ｍｍ2程度とすればよく、コネクタの断面積は０．５〜３０ｍｍ2程度とすればよい。なお、シリンジ筒部やコネクタの断面の形状は特に制限されないが、負担が局所的にかかることを防ぐために円形や楕円形、或いは多角形である略円形が好適であり、円形が特に好ましい。また、当該規定における断面積は、シリンジの筒部の空洞部分における断面積と、コネクタ内に形成されている通路のうち最も細い部分における空洞部分の断面積とする。つまり、本発明で用いるコネクタは、端部においてシリンジと密着させる必要があるため、端部は円錐状に広げる場合がある。この場合においては、中央の通路部の空洞部分の断面積を基準にする。【００２６】
コネクタの流路の断面形状を円形にする場合には、当該流路の内径を０．８〜１．７ｍｍとすることが好ましく、さらに、０．９ｍｍ以上、１．５ｍｍ以下とすることが好ましい。微細なエマルションを安定して調製できるからである。なお、流路の太さが均一でない場合は、流路の内径とは、最も細い部分における内径をいうものとする。【００２７】
コネクタの流路の長さは１０〜１５ｍｍとすることが好ましい。流路の長さが１０ｍｍ未満となると、抵抗が少なくなるため、エマルションの調製の効率が悪くなることがある。一方、１５ｍｍより長くなるとコネクタの強度が十分確保できなくなる場合がある。【００２８】
なお、本発明のコネクタは、中央部に気泡を抜くための排出口を有する三方活栓としてもよく、排出口を有さない直管状のコネクタのいずれでもよい。但し、液漏れなどを防止する観点からは、直管状のコネクタを用いることが好ましい。【００２９】
混合液のシリンジ間の移動は、３０回以上繰り返すことが好ましい。回数が多いほど微細なエマルションが形成し易くなり、３０回以上であれば製剤として適するエマルションが形成されると考えられるからである。一方、上限は特に制限されないが、過剰に移動を繰り返してもエマルションが無制限に微細となる訳ではないので、例えば目視などで確認しつつ適宜移動を停止すればよい。通常、１５０回程度行えば十分である。【００３０】
また、混合液のシリンジ間の移動を２０回以上繰り返した後に０．５〜１０分間静置し、再度１回以上、より好ましくは１０回以上移動を繰り返すのも好適な態様である。この態様は、特にエマルションが形成され難い場合に効果を発揮でき、エマルションの形成がより一層容易になる。【００３１】
なお、以下では、混合液が一方のシリンジからコネクタを通過して他方のシリンジへ移動するまでを、ポンピング１回という。即ち、混合液のシリンジ間の移動１回を、ポンピング１回とする。【００３２】
さらに本発明においては、事前に混合液を攪拌し、水相と油相からなる分離した層を解消しておいた場合には、より少ないポンピングの回数でエマルションが調製できる。この場合には、ポンピングを少なくとも３回以上で５０回以下、より好ましくは１０〜５０回ポンピングを行う。【００３３】
また、ポンピングの速度は特に制限されないが、ポンピングの速度が遅過ぎたりまたは早過ぎる場合にはエマルションが形成され難くなる場合がある。よって、ポンピングの速度は、好ましくは１分間当たり３０〜９０回、より好ましくは６０〜９０回の速度で行うことが好ましい。【００３４】
本発明に係るエマルション製剤調製用キットは、１種以上の生理活性ペプチド組成物と、これと同数の水およびオイルアジュバントを含有する。【００３５】
本発明キットにおける１種以上の生理活性ペプチド組成物は、それぞれ生理食塩水または１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を、凍結乾燥することにより得たものである。ここで「１種以上」としたのは、特に患者の免疫活性を増強するためのペプチドエマルション製剤においては、患者に応じた生理活性ペプチドを複数投与する場合があることを考慮したものであり、好ましくは２種以上、さらに好ましくは２種を用いる。また、ここでの生理活性ペプチドは、本発明方法に関して説明したものと同様のものを用いることができる。【００３６】
生理活性ペプチドを溶解するための溶媒としては、生理食塩水または１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いる。ここでは、生理食塩水と当該アルカリ金属炭酸水素塩水溶液を混合して用いてもよい。【００３７】
本発明のエマルション製剤調製用キットに含まれるペプチド組成物は、生理活性ペプチドをいったん溶媒に溶解したものをバイアルに分注した後に凍結乾燥することにより製造する。これは、利便性の観点からは溶液の状態のほうがよいが、安定性が悪くなるという問題点があり、凍結乾燥粉末とすることで、安定性が向上するためである。溶媒としては生理食塩水が好適であるが、生理活性ペプチドの中には生理食塩水に溶解し難いものがある。また、使用される生理活性ペプチドの種類は患者により異なる場合が多いので、逐一溶媒を検討していたのではキットの生産性が低下してしまう。そこで本発明では、生理活性ペプチドを溶解するための溶媒として、より好適には１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いる。当該溶媒は、生理食塩水に対する溶解性が低いペプチドにも溶解性を示すため、キットの生産性を向上することができる。【００３８】
本発明のペプチド組成物としては、２種以上のペプチドを溶媒に溶解し凍結乾燥したものや、１種類ずつのペプチドを溶解し凍結乾燥した後に混合したものであってもよいが、好ましくはペプチド１種類ずつを個別に溶解および凍結乾燥し、複数のペプチドを混合しないものであることが好ましい。２種類以上のペプチドを混合した凍結乾燥粉末の状態で保管すると、使用する場合に問題を生ずる可能性があるためである。【００３９】
上記アルカリ金属の炭酸水素塩としては、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムを挙げることができるが、炭酸水素ナトリウムが好適である。また、アルカリ金属の炭酸水素塩水溶液濃度を１〜６ｗ／ｖ％としたのは、１ｗ／ｖ％未満であるとペプチドの溶解効果が十分に発揮されない場合があり、６ｗ／ｖ％を超えると、投与するに当たり適切な塩濃度に調整するために水の容量が多くなってしまい、投与に不適切な状態となってしまうおそれがあるからである。【００４０】
本発明キットにおける水の量は、生理活性ペプチド組成物を溶解することによって、血漿と等張または略等張の生理活性ペプチド溶液を得られる量とする。ここで「略等張」は、前述したものと同義である。【００４１】
本発明キットに含まれる生理活性ペプチド組成物を製造する際において、生理食塩水または炭酸水素塩水溶液の量は、ペプチドを均一溶解できるものであれば特に制限はない。但し、ペプチドと生理食塩水またはアルカリ金属の炭酸水素塩水溶液との比率は、得られるペプチド溶液のペプチド濃度が０．４質量％以下、好ましくは０．１〜０．４質量％、より好ましくは０．３〜０．４質量％となる様にすることが好ましい。【００４２】
本発明キットとしては、さらに筒部の断面積が５０〜５００ｍｍ2である２個のシリンジを含有するものや、当該シリンジ用のコネクタを含むものが好適である。コネクタとしては、その断面積が上記シリンジの筒部断面積の０．０２〜０．５倍であるもの、流路の断面形状が内径０．８〜１．７ｍｍの円形であるもの、また、流路の長さが１０〜１５ｍｍであるものが好適である。エマルション製剤においては患者により使用するペプチドが異なる場合が多いため、エマルション製造用のシリンジやコネクタは逐一交換する必要がある。よって、これらシリンジやコネクタを備えたキットは利便性が高い。【００４３】
本発明のキットに含まれるシリンジは、図１に示すような一般的なものでよい。但し、本発明では油性であるアジュバントを含む混合液を挿入してポンピングを繰り返すため、シリンジ筒部やガスケットの材質は、表面コートされたものなど耐久性の高いものが好適である。【００４４】
本発明のキットに含まれるシリンジ用のコネクタは、２つのシリンジを連結するためのものであり、例えば、図２と４に示すようなものを用いることができる。図２に示すコネクタは、気泡を抜くための排出口を有する三方活栓を有する。また、図４は直管状のコネクタであり、管の左右にシリンジとの結合部を有する。【００４５】
本発明に係るエマルション製剤を調製するには、本発明キットの生理活性ペプチド組成物を水に溶解したものをコネクタにより連結されたシリンジの一方に挿入し、ポンピングする。このポンピングは、図３に示すように、少なくとも、コネクタにより連結されたシリンジを着脱自在に固定する固定台１１と、当該シリンジの各プランジャを同方向に往復動させる連動機構を有するポンピング装置により行なうことができる。【００４６】
上記固定台は、上記方法やキットにおいて説明したシリンジを着脱自在に固定するものである。この固定台は、シリンジのプランジャが押引されるに連れて筒部が移動しない様に固定するものである必要がある。例えば、図３において固定台１１にシリンジ筒部のツバを引っ掛け、上からカバーをして固定する。また、個々の患者に投与すべき製剤を調製するごとに、或いは異なる生理活性ペプチドを用いるごとにシリンジやコネクタを交換する必要が生じる場合があるので、当該固定台は、シリンジが着脱自在なものである必要がある。【００４７】
ポンピング装置は、上記固定台に固定したシリンジの各プランジャを同方向に往復動させるための連動機構を有する。この連動機構としては、例えばモーターの回転運動を水平運動に変えるカムによりポンピング部１０を動かし、各プランジャを同方向に往復動させるものが考えられる。また、当該連動機構は、上記固定台自体が動かない様に固定されている場合には、各プランジャを押引するものであればよく、各プランジャが動かない様に固定されている場合には、上記固定台を往復運動させるものであればよい。【００４８】
ポンピング装置は、好適にはプランジャの往復動速度を調整する手段を有する。当該手段としては、例えばモーターの回転数を変える変速機や、モーターの回転自体を制御する装置などを挙げることができる。【００４９】
本発明に係る生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法によれば、エマルション径が極めて微細なペプチドエマルション製剤を簡便に調製することができる。よって、エマルション製剤を調製してから使用するまでに時間がかかるとエマルション同士が融合して径が大きくなり思わぬ副作用を生じることがあるが、本発明方法によれば、例えば病院等で製剤を調製した後直ぐに投与することが可能になる。【００５０】
また、本発明エマルション製剤調製用キットは、本発明方法で使用できるものであり、且つ特定の溶媒を用いることによりペプチドの分注を効率良く行なうことができ、製造が容易である。【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５２】
実施例１
表１に示す前立腺癌治療用または脳腫瘍治療用の生理活性ペプチド（４ｍｇ）を４ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｍＬ）に溶解し、さらにオイルアジュバントとしてＳＥＰＰＩＣ社製のＩＳＡ５１ＶＧ（１ｍＬ）を加え、混合液とした。２個のシリンジ（ビーブラウン社製、２ｍＬシリンジ、断面積：６６．３ｍｍ2）を断面積：２．４３ｍｍ2のコネクタで連結し、得られた混合液を一方のシリンジへ挿入した。ここで、シリンジの筒部断面積は、コネクタ断面積の約２７倍である。このシリンジをポンピング装置に設置し、１００回／分の速度でポンピングを１００回繰り返した。その結果、表１に示す通り、Ｎｏ．１、５および１４以外はエマルションを形成することができた。次にＮｏ．１、５および１４において、シリンジを５ｍＬ容のもの（断面積：１１１．６３ｍｍ2、シリンジの筒部断面積／コネクタ断面積＝約４６）に変更した以外は同様の処理を行なったが、Ｎｏ．１ではエマルションを形成することができたものの、Ｎｏ．５と１４では形成できなかった。次いで、実施例１〜１６において５ｍＬシリンジを使用し、ポンピングを１００回／分の速度で５０回繰り返した後に５分間静置し、さらに同様の速度でポンピングを５０回繰り返したところ、全ての実施例でエマルションを形成することができた。【００５３】
【表１】
2007083763.tif 000003
【００５４】
５分間の静置を介してポンピングを５０回繰り返して形成したエマルションについて、粒度分布計（日機装社製、マイクロトラックＵＰＡ１５０−ＥＸ）を用いて、ポンピング終了後と、さらに１日間静置した場合におけるエマルションの粒度分布を、動的光散乱法により測定した。各エマルションのメディアン径を表２に示す。【００５５】
【表２】
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【００５６】
当該結果の通り、本発明方法と装置によれば、１μｍ前後という極めて微細なエマルション径を有するペプチドエマルションを簡便に得られることが実証された。【００５７】
実施例２
本発明のエマルション製剤調製用キットを製造する場合を考慮して、種々の溶媒に関し、実施例１で使用したＮｏ．１〜１２のペプチドの溶解性を調べた。具体的には、冷暗所保存されていたペプチドを室温に戻した後、低湿度室（温度：２３．０℃、湿度：１０％ＲＨ）中で約５ｍｇを秤量し、透明容器へ入れた。そこへ溶媒を２００μＬ加え、穏やかに攪拌して溶解したか否かを目視で確認した。溶解が確認できない場合には、さらに溶媒を２００μＬずつ加えて攪拌する操作を繰り返し、溶媒量１．２５ｍＬでも溶解しない場合には「不溶」と判断した。結果を表３に示す。【００５８】
【表３】
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【００５９】
表中、◎は５ｍｇ／２００μＬで溶解した場合、○は少なくとも５ｍｇ／１．２５ｍＬまでで溶解した場合、×は５ｍｇ／１．２５ｍＬでも溶解しなかった場合、−は未実施、＊は１％酢酸を用いたことを示す。【００６０】
上記結果の通り、先ず注射製剤で汎用されている生理食塩水を用いたところ、半数のペプチドを溶解することができたが、溶解性を示さないペプチドが８個あった。そこで、４ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウムを用いたところ、全てのペプチドに溶解性を示した。また、Ｎｏ．１、２、４、６、７、９のペプチドに関しては１０％または１％酢酸でも同様の実験を行なったが、３個のペプチドが不溶であった。【００６１】
エマルション製剤調製用キットを製造するに当たっては、ペプチドを溶解する溶媒の種類はできるだけ統一して数を少なくする方が生産性は高い。本実施例２により、生理活性ペプチドに対しては、炭酸水素ナトリウム水溶液が高い溶解性を示すことが明らかとなった。なお、結果としては示していないが、１Ｍ水酸化ナトリウムでも実験を行なったところ、高い溶解性が示された。しかし、水酸化ナトリウムは注射剤に適さない。一方、炭酸水素ナトリウムは、注射剤の成分として特に問題はない。【００６２】
以上の結果より、本発明のエマルション製剤調製用キットを製造するに当たり、いったん生理活性ペプチドを溶解するための溶媒としては炭酸水素ナトリウム水溶液が適することが実証された。【００６３】
実施例３
上記実施例１で使用した生理活性ペプチド（Ｎｏ．１、３、６）と、生理食塩水または４ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液とを表４に記載の容量で混合してペプチド溶液を得た後に、バイアルへペプチド溶液を充填し、凍結乾燥を行なって生理活性ペプチド組成物を得た。【００６４】
【表４】
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【００６５】
上記生理活性ペプチド組成物の溶解性と安定性について、以下の様に評価した。まず、上記生理活性ペプチド組成物の１バイアルに水１ｍＬを添加し、穏やかに１分間混合攪拌を行った後に目視にて状態を確認した。結果を表５に示す。【００６６】
【表５】
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【００６７】
表５の結果の通り、生理活性ペプチドをいったん生理食塩水または炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した上で凍結乾燥した生理活性ペプチド組成物は、極めて容易に水へ溶解できることが実証された。【００６８】
実施例４
上記実施例３で製造した生理活性ペプチド組成物、実施例１で使用したオイルアジュバントおよび水をそれぞれ別個のバイアルに包装し、また、５ｍＬシリンジ（筒部断面積：１１１．６３ｍｍ2）とそのコネクタ（断面積：２．４３ｍｍ2）を加え、表６に記載のエマルション製剤調製用キットとした。【００６９】
当該エマルション製剤調製用キットを用いて、実施例１と同様に生理活性ペプチド組成物を水に溶解し、オイルアジュバントを加えた後に、コネクタで連結した５ｍＬシリンジの一方に挿入し、断続的にポンピングを繰り返したところ、均一で微細なエマルションを調製することができた。【００７０】
【表６】
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【００７１】
上記結果の通り、本発明のエマルション製剤調製用キットは、エマルション製剤を簡便に用時調製できるものとして極めて有用であることが実証された。【００７２】
実施例５
コネクタの内径を検討するために、生理食塩水（１ｍＬ）とオイルアジュバントとしてＳＥＰＰＩＣ社製のＩＳＡ５１ＶＧ（１ｍＬ）を用いて、以下のようにしてエマルション製剤を調製した。まず、これら生理食塩水とオイルアジュバントを混合した２個のシリンジ（ビーブラウン社製、５ｍＬ容のもの（断面積：１１１．６３ｍｍ2））を準備し、一方のシリンジへ得られた混合液を全量分取し、表７のコネクタのいずれかで連結して、手動で５回のポンピングを行った。次いで、このシリンジをポンピング装置に設置し、表７に記載の条件でポンピングした。【００７３】
また、得られたエマルションについて、以下の通りドロップテストを行った。詳しくは、得られたエマルション分散液の１滴を水面上に滴下し、当該分散液が水中に直ぐ分散しない場合を「良（○）」、直ぐに分散する場合を「不良（×）」とした。なお、エマルションが適切に形成されていれば、その分散液を水中に滴下しても直ぐには分散しないが、適切に形成されていない場合には、直ぐに分散する。以上の結果を表７に示す。【００７４】
【表７】
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【００７５】
表７の結果から、コネクタの流路の内径が０．８ｍｍの場合では、エマルションを安定的に得られない場合があった。しかし、ポンピングの速度を遅くすることによって、エマルションを得ることができた。また、当該内径が１．０〜１．４ｍｍのコネクタを使用した場合では、微細なエマルションをより一層安定して調製できることがわかった。【００７６】
実施例６
エマルションの調製方法とコネクタの長さを以下のようにして検討した。まず、表１に記載のＮ０．１４のペプチド（４ｍｇ）を４Ｗ／Ｖ％炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｍＬ）に溶解した。次いで、２個の５ｍL容シリンジを、表８に記載の直管状のコネクタで連結した。生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバント（１ｍＬ）とを一方のシリンジ内に加え、表８に記載の条件でエマルションを調製した。結果を表８に示す。【００７７】
【表８】
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【００７８】
表８の結果から、混合工程において、生理活性ペプチド水溶液を半量ずつオイルアジュバントと振とう混合して水相と油相からなる二層を解消した後にポンピングを行ったほうが、再現性良くエマルションを調製し得ることがわかった。また、コネクタの長さは、１０ｍｍのものよりも１５ｍｍのものの方が、少ないポンピング回数でエマルションを調製し得ることがわかった。【００７９】
実施例７
表１に記載のＮｏ．１〜Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎ０．９およびＮｏ．１１〜Ｎｏ．１６のペプチドについて、実施例６で用いた内径１ｍｍ、流路の長さが１０ｍｍの直管状コネクタを用いて、実施例６と同様の方法でエマルションの調製を行った。結果を表９と１０に示す。【００８０】
【表９】
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【００８１】
【表１０】
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【００８２】
表９と１０の結果から、ポンピングの前に混合液の水相と油相からなる二層を解消しておけば、様々な生理活性ペプチドで微細なエマルション製剤をより一層効率的に調製し得ることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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