(57)【要約】生体試料等からリン酸基を有する物質を容易に検出できる方法、リン酸化アミノ酸残基を簡便に識別する方法、及びリン酸基を有する物質に高い配位結合能を有することから、当該方法で使用でき得る化合物を提供する。  一般式（Ｉ）：｛式中、Ｍは、２価の陽イオンに成り得る金属原子であり、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される金属錯体化合物は、リン酸基を有する物質に高い配位結合能を有し且つ標識基を有することから、リン酸基を有する物質を容易に特定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
2007018225.tif 000007
｛式中、Ｍは、２価の陽イオンに成り得る金属原子であり、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される金属錯体化合物を用いることを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色方法。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）：
2007018225.tif 000008
｛式中、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される亜鉛錯体化合物を用いることを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色方法。
【請求項３】
標識基がビオチンであることを特徴とする、請求項１又は２記載のリン酸基を有する物質の染色方法。
【請求項４】
請求項１記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法。
【請求項５】
請求項２記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法。
【請求項６】
請求項３記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法。
【請求項７】
一般式（ＩＩＩ）：
2007018225.tif 000009
｛式中、ｍは、２価の陽イオンに成り得る金属原子（但し、亜鉛原子である場合を除く）であり、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される金属錯体化合物。
【請求項８】
標識基がビオチンであることを特徴とする、請求項７記載の金属錯体化合物。
【請求項９】
請求項１の一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物を含むことを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色剤又は染色助剤。
【請求項１０】
請求項１の一般式（Ｉ）（式中、Ｙは酵素である）で示される金属錯体化合物、該酵素に対する発色試薬、及び必要により基質を含む、リン酸基を有する物質の染色用キット。
【請求項１１】
請求項１の一般式（Ｉ）（式中、Ｙはビオチンである）で示される金属錯体化合物、アビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体が結合した酵素、該酵素に対する発色試薬、及び必要により基質を含む、リン酸基を有する物質の染色用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リン酸基を有する物質の染色方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ある種の生体内酵素は、活性中心やアロステリック部位を代表とする特定部位にセリンやトレオニン、チロシン残基を有し、これらの水酸基が、キナーゼ等と呼ばれる酵素によりリン酸化されたり或いは脱リン酸化されることによって、酵素活性が調整されている。また、リシン、アルギニン、ヒスチジンのアミノ基或いはイミノ基や、アスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル基がリン酸化（又は脱リン酸化）されることによって、活性が調整されている酵素もある。このようなリン酸化−脱リン酸化により調整されている代謝系としては、グリコーゲン合成の抑制とその分解系がよく知られている。この代謝系は、主としてリン酸化−脱リン酸化によりカスケード制御され、調整されている。【０００３】  そして近年、このリン酸化−脱リン酸化が、疾病に関係する代謝系において重要な役割を有していることが明らかとなってきている。例えば、細胞のガン化は、リン酸化−脱リン酸化の異常が一因であるといわれている。つまり、細胞周期の進行や停止は様々な酵素（タンパク質）のリン酸化（又は脱リン酸化）により制御されており、このリン酸化（又は脱リン酸化）にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）が関与しているが、斯かるメカニズムが損傷するとリン酸化（又は脱リン酸化）に乱れが生じ、その結果、細胞の異常増殖が引発されることになる。その他にも、プロテインキナーゼＣが、アトピー性皮膚炎や花粉症等のアレルギー疾患の原因となるヒスタミンの脱顆粒に関することや、アルツハイマー病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、リン酸化されたタウタンパク質によることが明らかにされている。従って、タンパク質のリン酸化−脱リン酸化状況を把握することは、生体組織細胞の遺伝子発現を探索したり、酵素活性評価のみならず、疾病の診断や治療にも役立つ可能性がある。【０００４】  ところが、従来より用いられてきたリン酸化タンパク質（又は脱リン酸化タンパク質）の特定方法には、様々な欠点がある。例えば、酵素免疫法は、対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能という利点があるが、必要な抗体を充分量得ることが困難であり、また、対象タンパク質が数ｋＤａ以下である場合には、タンパク質中のリン酸化部位に結合する抗体を調整することができない。また、放射性同位元素３２Ｐで標識されたリン酸を使用することによって、タンパク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、放射性同位元素の取り扱いには当然に注意が必要であり、廃液の管理や処理まで要求される。【０００５】  ところで、非特許文献１には亜鉛錯体が記載されており、当該亜鉛錯体は、二つの亜鉛イオンがジヌクレオチド中のリン酸基（リン酸ジエステル基）に作用し、切断するという機能を有する。しかし、当該文献における当該錯体の機能はあくまで触媒としてのものであり、リン酸基との配位結合能に関しては、一切記載されていない。実際、本発明者らによる実験によれば、当該錯体と２つのヌクレオチド間のリン酸基（リン酸ジエステル基）との解離定数は非常に高い。即ち、リン酸ジエステル基に対する当該錯体の配位結合能は低い。【０００６】  また、同じく非特許文献２にも、上記亜鉛錯体と類似の構造を有する鉄錯体��記載されている。しかし、当該鉄錯体は、酸素分子の運搬タンパク質であるヘムエリトリンのモデルとして合成されたものであり、当該鉄錯体とリン酸モノエステル基との配位結合能に関して全く記載も示唆もされていないことは、上記非特許文献１と同様である。【０００７】  一方で、特許文献１及び非特許文献３には、リン酸基を有する物質を捕捉可能な亜鉛錯体として、アルコキシドで架橋された二核亜鉛錯体構造を有する亜鉛錯体が記載されている。また、特許文献２には、リン酸化ペプチドの標識方法が記載されている。しかし、前者の当該亜鉛錯体については、当該亜鉛錯体のみではリン酸基を有する物質を捕捉可能であっても標識することはできない。更に後者のリン酸化ペプチドの標識方法には、ゲル染色、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）及びアフィニティースピンカラムクロマトグラフィーが挙げられ、リン酸化ペプチドの標識方法に使用される亜鉛錯体化合物の標識基には、蛍光発色基、ニトロオキシドラジカル含有基及びビオチンが挙げられており、また、リン酸化ペプチドの標識方法に使用される錯体化合物の金属原子は、亜鉛原子に限定しているが、それ以外の標識方法及び錯体化合物についての具体的な記載はない。加えて、特許文献３及び非特許文献４にも、ビオチンを有する亜鉛錯体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるリン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の検出方法が記載されているが、それ以外の検出方法についての具体的な記載はない。
【特許文献１】国際公開第０３／０５３９３２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０７８７２４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０３８４４２号パンフレット
【非特許文献１】モリオ  ヤシロ、外２名，″Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｉｎｕｃｌｅａｒ  Ｚｉｎｃ（ＩＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  Ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｎ  ａ  Ｄｉｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ″，ジャーナル  オブ  ザ  ケミカル  ソサエティ、ケミカル  コミュニケーションズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），１９９５年，ｐ．１７９３−１７９４
【非特許文献２】ヒデカズ  アリイ、外６名，″Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｉｒｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ″，ジャーナル  オブ  インオーガニック  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年，８２巻，ｐ．１５３−１６２
【非特許文献３】エイジ  キノシタ、外４名，″Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ  ｄｉａｎｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｌｋｏｘｉｄｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｄｉｎｕｃｌｅａｒ  ｚｉｎｃ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ″，ダルトン  トランザクションズ（Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ），２００４年，ｐ．１１８９−１１９３
【非特許文献４】カズキ  イナモリ、外７名，″Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎ−Ｃｈｉｐ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ″，アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００５年，７７巻，ｐ．３９７９−３９８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  上述した状況の下、本発明が解決すべき課題は、リン酸基を有する物質を容易に検出すべく、これを染色する方法及び当該染色方法を利用してリン酸化アミノ酸残基を識別する方法を提供することにある。これに加えて、本発明では、リン酸基を有する物質に対して優れた配位結合能を有し、上記方法に使用できる化合物を提供することも目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、上記課題を解決すべく、リン酸基を有する物質中のリン酸基（リン酸モノエステル基）に配位可能な金属錯体について鋭意研究を進めたところ、本発明の化合物は、リン酸イオン或いはリン酸モノエステル中の２つの水酸基に対する配位結合能が極めて高く、その結果、リン酸基を有する物質中のリン酸基（リン酸モノエステル基）へ強く配位して、多数の物質を含んだ混合試料中でもリン酸基を有する物質へ特異的に結合して複合体を形成することができ、また、本発明の金属錯体化合物は標識基を有していることから、当該複合体を容易に特定できることを見出して本発明を完成した。【００１０】  即ち、本発明は、
（１）一般式（Ｉ）：【００１１】
2007018225.tif 000002
【００１２】｛式中、Ｍは、２価の陽イオンに成り得る金属原子であり、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される金属錯体化合物を用いることを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色方法；【００１３】（２）一般式（ＩＩ）：【００１４】
2007018225.tif 000003
【００１５】｛式中、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される亜鉛錯体化合物を用いることを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色方法；【００１６】（３）標識基がビオチンであることを特徴とする、上記（１）又は（２）記載のリン酸基を有する物質の染色方法；【００１７】（４）上記（１）記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法；【００１８】（５）上記（２）記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法；【００１９】（６）上記（３）記載のリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることを特徴とする、リン酸化アミノ酸残基の識別方法；【００２０】（７）一般式（ＩＩＩ）：【００２１】
2007018225.tif 000004
【００２２】｛式中、ｍは、２価の陽イオンに成り得る金属原子（但し、亜鉛原子である場合を除く）であり、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基或いはハロゲノ基であり、Ｘは、結合基であり、Ｙは、標識基である｝で示される金属錯体化合物；【００２３】（８）標識基がビオチンであることを特徴とする、上記（７）記載の金属錯体化合物；【００２４】（９）上記（１）の一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物を含むことを特徴とする、リン酸基を有する物質の染色剤又は染色助剤；【００２５】（１０）上記（１）の一般式（Ｉ）（式中、Ｙは酵素である）で示される金属錯体化合物、該酵素に対する発色試薬、及び必要により基質を含む、リン酸基を有する物質の染色用キット；【００２６】（１１）上記（１）の一般式（Ｉ）（式中、Ｙはビオチンである）で示される金属錯体化合物、アビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体が結合した酵素、該酵素に対する発色試薬、及び必要により基質を含む、リン酸基を有する物質の染色用キットである。
【発明の効果】
【００２７】  上記一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物は、リン酸基を有する物質へ特異的に結合して複合体を形成することができ、且つ標識基を有していることから当該複合体を容易に特定できるものとして、特に、生化学的研究や病気の診断治療等において非常に有用である。【００２８】  また、上記一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物は、中性条件下でリン酸基を有する物質へ特異的に強く結合して複合体を形成することができ、且つ標識基を有していることから当該複合体を容易に特定できるものとして、特に、生理条件である中性条件下で行う生化学的研究や病気の診断治療等において非常に有用である。【００２９】  また、上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、標識基がビオチンである錯体化合物は、取り扱いが容易であり、また、様々な染色方法に応用できることから利便性が高く、リン酸基を有する物質を容易に特定できる。【００３０】  また、抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法は一般によく利用されている染色法であるため、上記一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物を用いるリン酸基を有する物質の染色方法と組み合わせることで、リン酸化アミノ酸残基を簡便に識別できる。【００３１】  また、上記一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物を用いるリン酸基を有する物質の染色方法と、抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることで、生理条件である中性条件下でリン酸化アミノ酸残基を簡便に識別できる。【００３２】  また、上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、標識基がビオチンである錯体化合物を用いるリン酸基を有する物質の染色方法と、抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることで、利便性が高くなり、リン酸化アミノ酸残基を簡便に識別できる。【００３３】  また、上記一般式（ＩＩＩ）で示される金属錯体化合物は、リン酸基を有する物質に対して従来にない配位結合能を示すことから、上記方法で使用できる化合物として有用である。【００３４】  また、上記一般式（ＩＩＩ）において、標識基がビオチンである金属錯体化合物は、取り扱いが容易であり、また、様々な染色方法に応用できることから利便性が高く、更に、リン酸基を有する物質に対して従来にない配位結合能を示すことから、上記方法で使用できる化合物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例２における亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ａ）とＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲル（Ｂ）である。
【図２】実施例３における亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ａ）とＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲル（Ｂ）である。
【図３】実施例４における亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ａ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗リン酸化チロシン抗体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂ）、ウサギ抗リン酸化セリン抗体溶液及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｃ）及びＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲル（Ｄ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】  本発明の最大の特徴は、標識基を有する一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物を特異的にリン酸基を有する物質と結合させ複合体を形成させることによって、リン酸基を有する物質を容易に特定できることにある。即ち、従来、リン酸基を有する物質と結合できる金属錯体は種々知られていたものの、一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物に類似の化合物で且つ標識基を有するものはなかったところ、本発明者らは、一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物を用いれば、複数の物質が含まれている試料中でも、極めて容易にリン酸基を有する物質を検出し特定できることを見出し、本発明を完成したものである。【００３７】  一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物、一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物及び一般式（ＩＩＩ）で示される金属錯体化合物について説明する。【００３８】  「２価の陽イオンに成り得る金属原子」とは、２価の正の電荷をもつイオンに成り得る典型元素又は遷移元素の金属原子である。このような２価の陽イオンに成り得る金属原子としては、例えば、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ゲルマニウム、ストロンチウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、スズ、バリウム、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、水銀、鉛、ポロニウム、ラジウム等を挙げることができ、当該錯体化合物のリン酸基を有する物質に対する配位結合能が大きいので、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛が好ましく、マンガン、鉄、亜鉛がより好ましい。【００３９】  「炭素数が１〜１６であるアルキル基」とは、炭素数が１〜１６である直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基等を挙げることができ、炭素数が１〜４である直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、炭素数１〜２であるアルキル基がより好ましい。【００４０】  「アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボシキアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基」中のアルキル部分は上記と同義である。【００４１】  「結合基」とは、当該錯体化合物中、主骨格と標識基とを結合する任意の基であり、当該錯体化合物の製造を容易にしたり、また、当該錯体化合物とリン酸基を有する物質中のリン酸基との配位を標識基が阻害しないようにする作用を有する。従って、当該錯体化合物の製造において、標識基が主骨格に直結した原料化合物の入手が容易であったり、標識基が比較的小さくリン酸基への配位が阻害されない場合には、結合基は、主骨格と標識基を直結する単なる共有結合であってもよい。結合基としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーエル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオニル基（−Ｃ（＝Ｓ）−）、エステル基、アミド基、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）、チオウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−）；アミノ基、エーエル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基からなる群より選択される基を一端に有するＣ１−Ｃ６アルキレン基；アミノ基、エーエル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基からなる群より選択される同一又は異なった基を両端に有するＣ１−Ｃ６アルキレン基；及びアミノ基、エーエル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基及びＣ１−Ｃ６アルキレン基からなる群より選択される２以上、好ましくは２〜１２、特に好ましくは、２〜６の基が直線状に結合された基を挙げることができる。ここで、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基とは、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝鎖状の２価脂肪族炭化水素基をいい、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、エチルメチレン、メチルプロピレン、ジメチルプロピレン等を挙げることができ、Ｃ１−Ｃ４アルキレン基が好ましく、Ｃ１−Ｃ２アルキレン基がより好ましい。【００４２】  「標識基」とは、免疫染色法及びそれと類似する染色法に使用されるものであれば特に制限はないが、取り扱い性の面から放射性同位体元素を含むものは好ましくない。このような標識基としては、例えば、酵素、蛍光発色基、ビオチン、金コロイド等を挙げることができる。標識基は、結合基を介して当該錯体化合物中に導入するが、その方法は、当業者にとって公知である。【００４３】  酵素は、触媒活性を有するタンパク質であるが、生化学の分野で標識酵素として一般に使用されているものを特に制限なく用いることができる。このような酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等を挙げることができる。そして、各酵素に応じた発色試薬又は発色試薬と基質を作用させれば、酵素により標識されたリン酸基を有する物質を染色し、検出することができる。このような酵素に対する発色試薬又は発色試薬と基質の組合せとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にはＥＣＬ（商標）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と過酸化水素等、アルカリホスファターゼにはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）、ＣＳＰＤ（登録商標）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）等、ルシフェラーゼにはルシフェリン等を挙げることができる。【００４４】  蛍光発色基は、比較的長波長の蛍光を安定的に発色し得る置換基をいい、水溶性、脂溶性を問わず、生化学分野で一般的に使用されているものを特に制限なく用いることができる。このような蛍光発色基としては、例えば、アミノメチルクマリン及びその誘���体、フルオレセイン及びその誘導体、テトラメチルローダミン及びその誘導体、アントラニロイル及びその誘導体、ニトロベンゾキサジアゾール及びその誘導体、ジメチルアミノナフタレン及びその誘導体等を挙げることができる。【００４５】  ビオチンは、卵白由来のアビジンと放線菌由来のストレプトアビジンに対して、特異的で且つ強い親和性を有している。従って、標識基としてビオチンを有する当該錯体化合物に、アビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体を結合させ、更にビオチン化した酵素を作用させれば、又はアビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体が結合した酵素を作用させれば、ビオチン及びアビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体等を介して、本発明の錯体化合物と酵素を特異的に結合させることができる。そして、当該酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等を用い、各酵素に応じた発色試薬を作用させれば、リン酸基を有する物質を特定することができる。例えば、リン酸基を有する物質に標識基としてビオチンを有する当該錯体化合物を結合させ、当該錯体化合物にストレプトアビジンを介し酵素としてアルカリホスファターゼを結合させ、発色試薬としてニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を用いて数時間反応させると、リン酸基を有する物質は紫色に発色するので、これにより特定される。また、ローダミン等の蛍光発色基で標識されたストレプトアビジンも市販されており、これを使用すれば、通常の蛍光画像解析法でリン酸基を有する物質を特定できる。【００４６】  金コロイドは、金原子凝集体が液相等に分散したもので、走査型電子顕微鏡又は透過型電子顕微鏡で直接観察できる。従って、金コロイドで標識されたリン酸基を有する物質は、電子顕微鏡でその局在を観察することができる。また、銀試薬を用いた増感法により、転写した膜や光学顕微鏡での免疫組織染色にも利用できる。【００４７】  リン酸基を有する物質の染色方法について説明する。【００４８】  「リン酸基を有する物質」とは、２価のリン酸モノエステルアニオン（−ＯＰＯ３２−）を有する物質、つまり、リン酸モノエステル基を有する物質である。このようなリン酸基を有する物質としては、例えば、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたアミノ酸残基、リン酸化されたアミノ酸残基を有するタンパク質（リン酸化タンパク質）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するポリペプチド（リン酸化ポリペプチド）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するオリゴペプチド（リン酸化オリゴペプチド）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するペプチド（リン酸化ペプチド）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、リン脂質、リン酸化された糖類等を挙げることができる。【００４９】  「染色方法」とは、主に免疫染色法及びそれと類似する染色法のことである。免疫染色法とは、ある特定の分子に対する特異的な抗体を利用して抗原抗体反応を行うことにより、その特定の分子を検出する方法である。検出方法を大別すると直接法と間接法に分けられ、更に、間接法には酵素抗体法、蛍光抗体法、ＡＢＣ（アビジン−ビオチン  ペルオキシダーゼ複合体）法、金���ロイド法等が挙げられる。また、染色する試料としては、例えば、細胞又は電気泳動後のセルロースアセテート膜、ポリアクリルアミドゲル若しくはアガロースゲル等、或いはウェスタンブロット法、サザンブロット法若しくはノーザンブロット法等のブロッティング法により転写したニトロセルロース膜、ナイロン膜又はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜等の膜等を挙げることができる。【００５０】  一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物は、溶媒に溶解した溶液としても用いることができる。使用できる溶媒は、リン酸基を有する物質の検出を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば、水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）；メタノール、エタノール等のアルコール；これらの混合溶媒を挙げることができ、水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）とメタノール又は水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）とエタノール等の水系混合溶媒が好ましい。【００５１】  以下に、本発明に係るリン酸基を有する物質の染色方法を例示する。【００５２】  まず、リン酸化タンパク質の染色方法を例示する。対象となる細胞組織から、その細胞を構成する実質的に全てのタンパク質を含む試料を調整する。この調整は、生化学分野で一般的に用いられている方法により行うことができる。次に、当該試料に含まれるタンパク質を分離する。この分離方法は特に制限なく一般的なものを使用できるが、例えば電気泳動を用いればよい。電気泳動を使用する場合、泳動後のゲル又は泳動後のゲルをウェスタンブロット法により転写した膜等を一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物の溶液に浸漬してリン酸化タンパク質を標識し、標識基の種類に応じた染色方法を用いて、リン酸化タンパク質を特定することができる。【００５３】  次に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の染色方法を例示する。サザンブロット法又はノーザンブロット法により転写した膜等において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）断片上の特定の塩基配列に相補的なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の末端リン酸基（リン酸モノエステル基）に一般式（Ｉ）で示される金属錯体化合物又は一般式（ＩＩ）で示される亜鉛錯体化合物を結合させて標識し、それをデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ又はリボ核酸（ＲＮＡ）プローブとすることができる。次に、当該デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ又はリボ核酸（ＲＮＡ）プローブを利用して、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーションを行い、標識基の種類に応じた染色方法を用いて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を特定することができる。【００５４】  リン酸化アミノ酸残基の識別方法について説明する。【００５５】  「識別方法」とは、リン酸化タンパク質又はリン酸化ペプチド中のリン酸化アミノ酸残基を識別する方法のことであり、本発明に係るリン酸基を有する物質の染色方法と一般によく利用されている抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を組み合わせることで、リン酸化タンパク質又は非リン酸化タンパク質の区別のみならず、そのリン酸化タンパク質の���ン酸化アミノ酸残基までを識別することが可能となる。【００５６】  本発明の識別方法で用いる抗リン酸化アミノ酸抗体としては、例えば、抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体又は抗リン酸化チロシン抗体等を挙げることができる。【００５７】  識別方法は、例えば、先ず、本発明に係るリン酸基を有する物質の染色方法により、試料中の全てのタンパク質の中からリン酸化タンパク質のみを標識して検出する。次いで、ある特定のリン酸化アミノ酸に対する抗リン酸化アミノ酸抗体を用いる免疫染色法を行い、当該染色方法の検出結果と比較することにより、ある特定のリン酸化アミノ酸残基を有するリン酸化タンパク質であるか、それ以外のリン酸化アミノ酸残基を有するリン酸化タンパク質であるかを識別することができる。【００５８】  本発明における金属錯体化合物は、適当な溶媒に溶解した溶液の形態で、リン酸基を有する物質の染色剤又は染色助剤として使用することができる。使用できる溶媒は、リン酸基を有する物質の検出を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば、水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）；メタノール、エタノール等のアルコール；これらの混合溶媒を挙げることができ、水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）とメタノール又は水（緩衝液やその他の塩溶液を含む）とエタノール等の水系混合溶媒が好ましい。【００５９】  本発明において標識基が酵素である金属錯体化合物は、酵素に応じた発色試薬との組合せで、又は酵素に応じた発色試薬及び基質との組合せで、リン酸基を有する物質の染色用キットとして使用できる。このような酵素に対する発色試薬又は発色試薬と基質の組合せとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にはＥＣＬ（商標）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と過酸化水素等、アルカリホスファターゼにはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）、ＣＳＰＤ（登録商標）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）等、ルシフェラーゼにはルシフェリン等を挙げることができる。また、本発明において標識基がビオチンである金属錯体化合物は、アビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体が結合した酵素及び酵素に応じた発色試薬との組合せで、又はアビジン若しくはストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体が結合した酵素、酵素に応じた発色試薬及び基質との組合せで、リン酸基を有する物質の染色用キットとして使用できる。
【実施例】
【００６０】  以下に、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００６１】実施例１
（亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液の調製）
式（ＩＶ）：【００６２】
2007018225.tif 000005
【００６３】で示されるＮ，Ｎ，Ｎ’−トリス（２−ピリジルメチル）−Ｎ’−（２−Ｄ−ビオチンアミドエチル）カルバモイル−２−ピリジルメチル］−１，３−ジアミノ−２−プロパノールを１０ｍＭと１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を１０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で調整し、配位子溶液とする。１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウム及び１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を水で調整し、ＴＢＳ−Ｔ（１０×）とする。１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を水で調整し、ＴＢＳ−Ｔ（１×）とする。配位子溶液５μＬ、ＴＢＳ−Ｔ（１０×）５０μＬ、１０ｍＭ硝酸亜鉛水溶液５μＬ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン１μＬ及び水３９４μＬを混ぜて限外ろ過（３０ｋＤａ）し、残渣をＴＢＳ−Ｔ（１×）３０ｍＬで溶解して、式（Ｖ）：【００６４】
2007018225.tif 000006
【００６５】で示される亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液とする。【００６６】実施例２
（リン酸化タンパク質の染色方法１）
先ず、以下の条件で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲル、泳動槽用緩衝液及びサンプル調整液を調整した。
濃縮ゲル溶液
４．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３０：１）
１２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）
０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
分離ゲル溶液
１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３０：１）
３７５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）
０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
泳動槽用緩衝液
２５ｍＭトリス
１９２ｍＭグリシン
０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
サンプル調整液
１９５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）
９％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
２４％（ｗ／ｖ）グリセロール
１５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール
０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）。【００６７】  次に、レーン１：分子量マーカー（トリプシンインヒビター、炭酸デヒドラターゼ、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ホスホリラーゼｂ）、レーン２：α−カゼイン、レーン３：脱リン酸化α−カゼイン、レーン４：β−カゼイン、レーン５：脱リン酸化β−カゼインをサンプル調整液に溶解して試料とし、これを調整したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲルにプロットした後、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲル下端に到達するまで４０ｍＡの定電流電気泳動を行った。【００６８】  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲルを固定液に約１５分間浸漬し、続いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎに約３時間浸漬した後、溶液から取り出して脱色液で２時間洗浄して、ＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。【００６９】  また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲル上のタンパク質を、セミドライ式ブロッティングにより、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させた。転写したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を実施例１で調製した亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液に約３０分間浸漬した後、溶液から取り出して１０分間洗浄して、発色試薬としてＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓを用いて、化学発光画像解析装置で視覚化した。【００７０】  本発明に係る亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜をＡ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲルをＢとして図１に示す。【００７１】  図１の通り、本発明の方法によれば、リン酸基を有するα−カゼイン及びβ−カゼインのみが特定できる。従って、本発明の方法によれば、生体試料からリン酸化タンパク質のみを特定し得ることが明らかとなった。【００７２】実施例３
（リン酸化タンパク質の染色方法２）
先ず、上記実験例２と同様の条件で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲル、泳動槽用緩衝液及びサンプル調整液を調整した。【００７３】  次に、レーン１：分子量マーカー（トリプシンインヒビター、炭酸デヒドラターゼ、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ホスホリラーゼｂ）、レーン２：卵白アルブミン、レーン３：脱リン酸化卵白アルブミン、レーン４：ペプシン、レーン５：脱リン酸化ペプシンをサンプル調整液に溶解して試料とし、これを調整したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲルにプロットした後、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲル下端に到達するまで４０ｍＡの定電流電気泳動を行った。【００７４】  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲルを固定液に約１５分間浸漬し、続いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎに約３時間浸漬した後、溶液から取り出して脱色液で２時間洗浄して、ＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。【００７５】  また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲル上のタンパク質を、セミドライ式ブロッティングにより、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させた。転写したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を実施例１で調製した亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液に約３０分間浸漬した後、溶液から取り出して１０分間洗浄して、発色試薬としてＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓを用いて、化学発光画像解析装置で視覚化した。【００７６】  本発明に係る亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜をＡ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲルをＢとして図２に示す。【００７７】  図２の通り、本発明の方法によれば、リン酸基を有する卵白アルブミン及びペプシンのみが特定できる。従って、本発明の方法によれば、生体試料からリン酸化タンパク質のみを特定し得ることが明らかとなった。【００７８】実施例４
（リン酸化アミノ酸残基の識別方法）
先ず、上記実験例２と同様の条件で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲル、泳動槽用緩衝液及びサンプル調整液を調整した。【００７９】  次に、レーン１：Ａ−４３１全細胞抽出液、レーン２：上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激Ａ−４３１全細胞抽出液、レーン３：アルカリホスファターゼで処理した上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激Ａ−４３１全細胞抽出液をサンプル調整液に溶解して試料とし、これを調整したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲルにプロットした後、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲル下端に到達するまで４０ｍＡの定電流電気泳動を行った。【００８０】  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲルを固定液に約１５分間浸漬し、続いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎに約３時間浸漬した後、溶液から取り出して脱色液で２時間洗浄して、ＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。【００８１】  また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったゲル上のタンパク質を、セミドライ式ブロッティングにより、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させた。転写したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を実施例１で調製した亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液に約３０分間浸漬した後、溶液から取り出して１０分間洗浄して、発色試薬としてＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓを用いて、化学発光画像解析装置で視覚化した。【００８２】  また、転写したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を１％ウシ血清アルブミンＴＢＳ−Ｔ（１×）溶液に約１時間浸漬した後、溶液から取り出して２０分間洗浄して、次に、０．１％西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗リン酸化チロシン抗体ＴＢＳ−Ｔ（１×）溶液に約１時間浸漬した後、溶液から取り出して２０分間洗浄して、発色試薬としてＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓを用いて、化学発光画像解析装置で視覚化した。【００８３】  また、転写したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を１％ウシ血清アルブミンＴＢＳ−Ｔ（１×）溶液に約１時間浸漬した後、溶液から取り出して２０分間洗浄して、次に、０．１％ウサギ抗リン酸化セリン抗体ＴＢＳ−Ｔ（１×）溶液に約１時間浸漬した後、溶液から取り出して２０分間洗浄して、次に、０．００８％西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体ＴＢＳ−Ｔ（１×）溶液に約１時間浸漬した後、溶液から取り出して２０分間洗浄して、発色試薬としてＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓを用いて、化学発光画像解析装置で視覚化した。【００８４】  本発明に係る亜鉛錯体化合物−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン複合体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜をＡ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗リン酸化チロシン抗体溶液による染色後のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜をＢ、ウサギ抗リン酸化セリン抗体溶液及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体溶液による染色後のポリビニ��デンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜をＣ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによる染色後のゲルをＤとして図３に示す。【００８５】  図３の通り、本発明の方法によれば、Ａ−４３１全細胞抽出液、上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激Ａ−４３１全細胞抽出液及びアルカリホスファターゼで処理した上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激Ａ−４３１全細胞抽出液中のリン酸化タンパク質並びにリン酸化チロシン残基を有するリン酸化タンパク質、リン酸化セリン残基を有するリン酸化タンパク質及びそれ以外のリン酸化アミノ酸残基を有するリン酸化タンパク質の特定が可能となった。従って、本発明の方法によれば、生体試料からリン酸化タンパク質及びリン酸化アミノ酸残基を特定し得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】  本発明に係るリン酸基を有する物質の染色剤及び染色方法は、リン酸基を有する物質を容易に検出することができる。従って、生体試料等に本発明を適用することによって、病気の診断等に応用でき得る点で非常に有用である。また、本発明に係るリン酸基を有する物質の染色方法と抗リン酸化アミノ酸抗体を組み合わせることで、リン酸化アミノ酸残基を簡便に識別することができる。また、本発明に係る化合物は、リン酸基を有する物質に対して従来にない配位結合を示すことから、上記方法で使用できる化合物として有用である。
【図１】
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【図２】
2007018225.tif 000011
【図３】
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【国際調査報告】
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2007018225.tif 000014
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