(57)【要約】  第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨髄性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子を正確に検出することが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異を正確に検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子変異を検出するためのアレイであって、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイ。
【請求項２】
前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群は、２以上のプローブスポットを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群は、異なる長さのプローブからなるプローブスポットを含んでいる、請求項１又は２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群において、プローブの長さの順に２以上のプローブスポットが配列されている、請求項３に記載のアレイ。
【請求項５】
前記遺伝子変異は、薬剤感受性又は薬剤耐性に関する遺伝子変異である、請求項１〜４のいずれかに記載のアレイ
【請求項６】
前記遺伝子変異は、後天的変異である、請求項１〜５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項７】
前記遺伝子変異は、慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う変異である、請求項１〜６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項８】
前記遺伝子変異は、フィラデルフィア染色体上のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子における変異である、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおける以下のアミノ酸変異を示す以下の表１から選択される１種又は２種以上である、請求項８に記載のアレイ。
【表１】
2007055244.tif 000016
【請求項１０】
前記遺伝子変異は、Ｔ３１５Ｉである、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記第１のプローブスポット群は、以下の表２から選択される１種又は２種以上のプローブのプローブスポットを含んでいる、請求項１０に記載のアレイ。
【表２】
2007055244.tif 000017
【請求項１２】
前記第２のプローブスポット群は、以下の表３から選択される１種又は２種以上のプローブのプローブスポットを含んでいる、請求項１１に記載のアレイ。
【表３】
2007055244.tif 000018
【請求項１３】
前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、以下の表４から選択されるプローブの１〜２２５とおりの組見合わせから選択されるいずれかを備えている、請求項１２に記載のアレイ。
【表４】
2007055244.tif 000019
【請求項１４】
前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、それぞれ前記表４中、組み合わせ番号３３の組み合わせに相当するプローブのプローブスポットを有している、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、それぞれ前記表４中、組み合わせ番号２２５の組み合わせに相当するプローブのプローブスポットを有している、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、前記表１に示す遺伝子変異の正常配列及び変異配列のそれぞれを含むプローブのプローブスポットをそれぞれ有しており、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbor Method）によるＴｍが４０℃以上８０℃以下の範囲から選択される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のアレイを含む、遺伝子変異検出のためのキット。
【請求項１８】
慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプローブセットであって、
前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３１５Ｉであって、前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブ群とを含んでおり、
前記第１のプローブ群は、以下の表５から選択される１種又は２種以上のプローブを含み、前記第２のプローブ群は、以下の表６から選択される１種又は２種以上のプローブを含んでいる、プローブセット。
【表５】
2007055244.tif 000020
【表６】
2007055244.tif 000021
【請求項１９】
前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、以下の表７から選択されるプローブの１〜２２５とおりの組見合わせから選択されるいずれかを備えている、請求項１８に記載のプローブセット。
【表７】
2007055244.tif 000022
【請求項２０】
前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、それぞれ前記表７中、組み合わせ番号３３の組み合わせに相当するプローブを有している、請求項１９に記載のプローブセット。
【請求項２１】
前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、それぞれ前記表７中、組み合わせ番号２２５の組み合わせに相当するプローブのプローブを有している、請求項１９に記載のプローブセット。
【請求項２２】
慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプローブセットであって、
前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す前記表１から選択される１種又は２種以上であり、これらの遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブ群とを含んでおり、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbor Method）によるＴｍが４０℃以上８０℃以下の範囲から選択される、プローブセット。
【請求項２３】
請求項１に記載のアレイ用である、請求項１８〜２２のいずれかに記載のプローブセット。
【請求項２４】
遺伝子変異を検出する方法であって、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する工程と、
被験遺伝子から検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、
前記プローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる得られるシグナルを検出する工程と、
を備える、検出方法。
【請求項２５】
前記シグナル検出工程において得られた第１のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第２のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又は程度について解析する、請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２６】
前記遺伝子変異は、以下の表８から選択される１種又は２種以上である、請求項２４又は２５に記載の検出方法。
【表８】
2007055244.tif 000023
【請求項２７】
慢性骨髄性白血病の薬剤感受性又は薬剤耐性の検査方法であって、
ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す以下の表９から選択される１種又は２種以上の遺伝子変異を対象として、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する工程と、
被験遺伝子から検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、
前記プローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる得られるシグナルを検出する工程と、
を備える、検査方法。
【表９】
2007055244.tif 000024
【請求項２８】
前記シグナル検出工程において得られた第１のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第２のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又は程度について解析する、請求項２７に記載の検査方法。
【請求項２９】
前記薬剤は、イマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかである、請求項２７又は２８に記載の検査方法。
【請求項３０】
慢性骨髄性白血病に対する薬剤投与方法又は治療方法であって、
請求項２７に記載の検査方法の検査結果から得られる前記遺伝子変異の有無又はその程度に基づいて薬剤を選択する工程を備える、方法。
【請求項３１】
前記薬剤は、イマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
慢性骨髄性白血病に対する薬剤選択プログラムであって、
請求項２７に記載の検査方法の検査結果から前記遺伝子変異の有無又はその程度を解析する解析するステップと、
該解析結果に基づいて有効な薬剤を抽出する薬剤抽出ステップと、
を１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代を迎え、遺伝子配列中の塩基種を正確に、効率よく、さらには低コストで検出するための新しい技術が求められている。例えば、遺伝子変異の一形態であるSNP（Single Nucleotide Polymerphism：一塩基多型）はヒトゲノム中に約０．１％の割合で存在する最も頻度の高い多型である。SNPを含む遺伝子の変異は不完全なタンパク質の合成を生じさせる原因となり、様々な疾病に関連することが明らかになりつつある。このため、診断や遺伝的治療法等を目的として遺伝子変異を正確に判定することの重要性が強く認識されてきており、そのための手法としてアレイ技術が用いられおり、精度向上のために様々な手法が開発されている。例えば、特開２００４―２９８０１７号公報に記載された手法を用いると、アレイ上で核酸合成とハイブリダイゼーション反応を行うことができるため、精度を向上することができる。
【発明の開示】
【０００３】
ところで、アレイの検出精度は、アレイに固定されたプローブによっても大きく影響を受けることが知られている。例えば、SNPの野生型遺伝子と多型遺伝子のそれぞれに由来するｃDNAの違いは一塩基のみであるため、両者の違いを検出するためには、非常に精度の高いプローブを設計する必要がある。
【０００４】
本発明は、遺伝子変異の有無を正確に検出できるアレイ及び検出方法等を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、遺伝子変異の程度を検出することのできるアレイ及び検出方法等を提供することを目的とする。さらに、本発明は、薬剤感受性及び／又は薬剤耐性が先天的な又は後天的な遺伝子変異によって変化する場合の遺伝子変異を検出することを目的とする。さらにまた、本発明は、遺伝子変異によって薬剤感受性及び／又は薬剤耐性が変化するような薬剤、特に分子標的薬剤の選択、投与及びこうした薬剤を用いた治療方法を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明は、上述の目的の少なくとも一部を達成するために以下の手段を採った。
【０００６】
（１）遺伝子変異を検出するためのアレイであって、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイ。
（２）前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群は、２以上のプローブスポットを含む、（１）に記載のアレイ。
（３）前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群は、異なる長さのプローブからなるプローブスポットを含んでいる、（１）又は（２）に記載のアレイ。
（４）前記第１のプローブスポット群及び／又は前記第２のプローブスポット群において、プローブの長さの順に２以上のプローブスポットが配列されている、（３）に記載のアレイ。
（５）前記遺伝子変異は、薬剤感受性又は薬剤耐性に関する遺伝子変異である、（１）〜（４）のいずれかに記載のアレイ（薬剤は、好ましくはイマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかである。）
（６）前記遺伝子変異は、後天的変異である、（１）〜（５）のいずれかに記載のアレイ。
（７）前記遺伝子変異は、慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う変異である、（１）〜（６）のいずれかに記載のアレイ。
（８）前記遺伝子変異は、フィラデルフィア染色体上のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子における変異である、（７）に記載のアレイ。
（９）前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおける以下のアミノ酸変異を示す以下の表１から選択される１種又は２種以上である、（８）に記載のアレイ。
【表１】
2007055244.tif 000002
（１０）前記遺伝子変異は、Ｔ３１５Ｉである、（９）に記載のアレイ。
（１１）前記第１のプローブスポット群は、以下の表２から選択される１種又は２種以上のプローブのプローブスポットを含んでいる、（１０）に記載のアレイ。
【表２】
2007055244.tif 000003
（１２）前記第２のプローブスポット群は、以下の表３から選択される１種又は２種以上のプローブのプローブスポットを含んでいる、（１１）に記載のアレイ。
【表３】
2007055244.tif 000004
（１３）前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、以下の表４から選択されるプローブの１〜２２５とおりの組見合わせから選択されるいずれかを備えている、（１２）に記載のアレイ。
【表４】
2007055244.tif 000005
（１４）前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、それぞれ前記表４中、組み合わせ番号３３の組み合わせに相当するプローブのプローブスポットを有している、（１３）に記載のアレイ。
（１５）前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、それぞれ前記表４中、組み合わせ番号２２５の組み合わせに相当するプローブのプローブスポットを有している、（１３）に記載のアレイ。
（１６）前記第１のプローブスポット群及び前記第２のプローブスポット群は、前記表１に示す遺伝子変異の正常配列及び変異配列のそれぞれを含むプローブのプローブスポットをそれぞれ有しており、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbor Method）によるＴｍが４０℃以上８０℃以下の範囲から選択される、（９）に記載のアレイ。
（１７）  （１）〜（１６）のいずれかに記載のアレイを含む、遺伝子変異検出のためのキット。
（１８）慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプローブセットであって、
前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３１５Ｉであって、前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブ群とを含んでおり、
前記第１のプローブ群は、以下の表５から選択される１種又は２種以上のプローブを含み、前記第２のプローブ群は、以下の表６から選択される１種又は２種以上のプローブを含んでいる、プローブセット。
【表５】
2007055244.tif 000006
【表６】
2007055244.tif 000007
（１９）前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、以下の表７から選択されるプローブの１〜２２５とおりの組見合わせから選択されるいずれかを備えている、（１８）に記載のプローブセット。
【表７】
2007055244.tif 000008
（２０）前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、それぞれ前記表７中、組み合わせ番号３３の組み合わせに相当するプローブを有している、（１９）に記載のプローブセット。
（２１）前記第１のプローブ群及び前記第２のプローブ群は、それぞれ前記表７中、組み合わせ番号２２５の組み合わせに相当するプローブのプローブを有している、（１９）に記載のプローブセット。
（２２）慢性骨髄性白血病における染色体異常に伴う遺伝子変異を検出するためのプローブセットであって、
前記遺伝子変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す前記表１から選択される１種又は２種以上であり、これらの遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブ群と、前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブ群とを含んでおり、これらのプローブは、最近接塩基法（Nearest Neighbor Method）によるＴｍが４０℃以上８０℃以下の範囲から選択される、プローブセット。
（２３）  （１）に記載のアレイ用である、（１８）〜（２２）に記載のプローブセット。
（２４）遺伝子変異を検出する方法であって、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する工程と、
被験遺伝子から検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、
前記プローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる得られるシグナルを検出する工程と、
を備える、検出方法。
（２５）前記シグナル検出工程において得られた第１のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第２のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又は程度について解析する、（２４）に記載の検出方法。
（２６）前記遺伝子変異は、以下の表８から選択される１種又は２種以上である、（２４）又は（２５）に記載の検出方法。
【表８】
2007055244.tif 000009
（２７）慢性骨髄性白血病の薬剤感受性又は薬剤耐性の検査方法であって、
ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を示す以下の表９から選択される１種又は２種以上の遺伝子変異を対象として、
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分が前記遺伝子変異の正常配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第１のプローブスポット群と、前記配列部分が前記遺伝子変異の変異部分を含む変異配列に正確に相補的である１以上のプローブを含む第２のプローブスポット群と、を固相担体上に有する、アレイを準備する工程と、
被験遺伝子から検出のためのポリヌクレオチドを調製する工程と、
調製したポリヌクレオチドを前記固相担体上のプローブに接触させる工程と、
前記プローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる得られるシグナルを検出する工程と、
を備える、検査方法。
【表９】
2007055244.tif 000010
（２８）前記シグナル検出工程において得られた第１のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルと同様に得られた第２のプローブスポット群の１種又は２種以上のプローブスポットのシグナルとを比較して、前記遺伝子変異の有無又は程度について解析する、（２７）に記載の検査方法。
（２９）前記薬剤は、イマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかである、（２７）又は（２８）に記載の検査方法。
（３０）慢性骨髄性白血病に対する薬剤投与方法又は治療方法であって、
（２７）に記載の検査方法の検査結果から得られる前記遺伝子変異の有無又はその程度に基づいて薬剤を選択する工程を備える、方法。
（３１）前記薬剤は、イマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかである、（３０）に記載の方法。
（３２）慢性骨髄性白血病に対する薬剤選択プログラムであって、
（２７）に記載の検査方法の検査結果から前記遺伝子変異の有無又はその程度を解析する解析するステップと、
該解析結果に基づいて有効な薬剤を抽出する薬剤抽出ステップと、
を１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラム。
【０００７】
本発明の遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法は、第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨髄性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子を正確に検出することが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異を正確に検出することができることを要旨とする。
【０００８】
この遺伝子変異検出用アレイ及び検出方法では、第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とを組み合わせることにより、遺伝子変異、なかでも、慢性骨髄性白血病に対する薬剤感受性又は薬剤耐性に関係する遺伝子変異を正確に検出することが可能であり、この遺伝子変異検出用アレイを用いることで、該遺伝子変異を正確に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】コントロールサンプルと変異含有サンプルの蛍光画像の比較図。
【図２】コントロールサンプルと変異含有サンプルのシグナルの比較図。
【図３】42℃10nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図４】42℃1nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図５】42℃100pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図６】42℃10pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図７】55℃10nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図８】55℃1nMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図９】55℃100pMのコントロールサンプルと変異含有サンプルの比較図。
【図１０】42℃各濃度におけるＰＣＲサンプルの比較図。
【図１１】42℃10nMにおける混合サンプルの比較図。
【図１２】42℃1nMにおける混合サンプルの比較図。
【図１３】42℃100pMにおける混合サンプルの比較図。
【図１４】ablキナーゼドメイン領域アミノ酸変異近傍配列を表す説明図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においてポリヌクレオチドとは、遺伝子変異のある遺伝子のゲノムDNA、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はこれらの一部が挙げられる。ポリヌクレオチドの長さは特に限定しないが、好ましくは３０以上、より好ましくは５０以上のヌクレオチド残基を有していることが好ましい。ポリヌクレオチドは好ましくは適宜標識されている。【００１１】
また、本発明においてプローブとは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であればよく、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＰＮＡのほか、塩基に公知に修飾を施した核酸誘導体が挙げられる。【００１２】
本発明においてプローブスポットは、１以上好ましくは１０３〜１０１３個の同一プローブの集団が他のプローブと分離されて存在する領域である。また、プローブスポット群とは、同一配列でかつ同じ長さのプローブからなるプローブスポットの集団を意味している。さらに、この集団は、１以上、好ましくは２以上のプローブスポットからなり、より好ましくは１０以下のプローブスポットからなる。プローブスポットは、異なる長さのプローブからなる２以上のプローブスポットを備えていてもよいし、同一長さで異なる配列のプローブからなる２以上のプローブスポットを備えていてもよいし、同一長さで同一配列のプローブからなる２以上のプローブスポットを備えていてもよい。異なる長さのプローブからなる２以上のプローブスポットを備えることで、より精度の高い検出が可能となる。また、同一長さで同一配列のプローブスポットを備えることでも、同一プローブに対するシグナルの正確性を高めることができ、結果として精度の高い検出が可能となる。【００１３】
第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とは、互いに同じ長さのプローブからなるプローブスポットが対向して配列していてもよい。プローブスポット群に長さの異なるプローブからなるプローブスポットを有する場合には、長さの順にプローブスポットが配列されていてもよい。【００１４】
プローブスポット群における長さの異なるプローブからなるプローブスポット及び／又は同一のプローブからなるプローブスポットの配列は必要に応じて設定できる。縦列と横列とを組み合わせることでプローブスポット群をマトリックス状に配置できる。【００１５】
なお、第１のプローブスポット群と第２のプローブスポット群とを一対として固相担体上に保持していてもよいが、正常型に対応する一つの第１のプローブスポット群に対して複数の第２のプローブスポット群を配置してもよい。【００１６】
プローブを固相担体に固定化する方法は特に限定されないで従来公知の方法を採用できる。また、プローブは固相担体上で直接合成されていてもよいし、合成されたプローブを固相担体に固定されていてもよい。プローブは、一般的にはリンカーやスペーサーを介して固相担体に結合されている。【００１７】
本発明のアレイは、インクジェット、バブルジェット（登録商標）、ピン方式などによって、固相担体上の所定位置にプローブを供給して固定化する方法によってプローブが固定されていることが好ましい。【００１８】
本発明の検出方法において用いるポリヌクレオチドは、血液などの試料から単離したゲノムDNA又は全ＲＮＡから目的の遺伝子変異を含む部分をＰＣＲ法等によって調製することができる。なお、ＰＣＲによるポリヌクレオチドの調製に際して、Ｃｙ５やＣｙ３などが結合したプライマーを用いることで標識ポリヌクレオチドを得ることができる。また、塩基の修飾等を必要に応じて行っても良い。【００１９】
ハイブリダイズ反応は、従来公知の方法で行うことができる。例えば、プローブスポット群に対してポリヌクレオチドを含有する液体を適宜供給する。ハイブリダイゼーションは、室温から８０℃の範囲の適当な温度で行うことが好ましく、またハイブリダイゼーション時間も１〜３０時間程度の範囲で行うことが好ましい。【００２０】
ハイブリダイズ反応後は、適宜洗浄工程を実施し、その後、ハイブリダイズ反応産物の標識シグナルなどを検出することによって遺伝子変異の有無又はその程度を検出できる。【００２１】
例えば、本発明方法によれば、図１及び図２に示すように、
ポリヌクレオチドにおいて正常：変異＝１：０であるとき２０ｍｅｒの変異型プローブに対する正常型プローブのシグナル比が０．２９４３、
ポリヌクレオチドが正常：変異＝０：１であるとき２０ｍｅｒの変異型プローブに対する正常型プローブのシグナル比が１３．５４０３、
ポリヌクレオチドが正常：変異＝１：１であるとき２０ｍｅｒの変異型プローブに対する正常型プローブのシグナル比が１．２８４９、
ポリヌクレオチドが正常：変異＝１０：１であるとき２０ｍｅｒの変異型プローブに対する正常型プローブのシグナル比が０．６４５１、
ポリヌクレオチドが正常：変異＝１００：１であるとき２０ｍｅｒの変異型プローブに対する正常型プローブのシグナル比が０．４５３７として検出することができる。【００２２】
すなわち、予め求められたシグナル比あるいはアッセイ毎に所定の正常：変異の比率のスタンダードを用いることにより、サンプルにおける変異の有無や変異の比率を検出することができる。こうした検出方法によれば、薬剤耐性化や感受性の低下を検出することが可能であり、薬剤の変更や有効な薬剤の探索を効率的に行うことができる。【００２３】
目的とする変異は特に限定しないが、好ましくは薬剤耐性や薬剤感受性に関する遺伝子変異である。本発明方法によれば、高感度にこれらの変異を複数、あるいは多数を一挙に検出することができ、薬剤耐性や感受性を総合的に判断して、有効な薬剤選択が可能となる。【００２４】
遺伝子変異としては、先天的変異であってもよいし、後天的変異であってもよい。後天的変異の場合には、変異数や変異レベルをモニターすることが重要であるが、本発明方法はこうしたモニターに好適である。【００２５】
薬剤感受性及び薬剤耐性に関しては、慢性骨髄性白血病の薬剤を対象薬剤とすることが好ましく、なかでもイマチニブ若しくはその塩、AMN107若しくはその塩、BMS−354825若しくはその塩、NS-187若しくはその塩、ONO-12380若しくはその塩及びVX-680若しくはその塩から選択されるいずれかを対象薬剤とすることが好ましい。
さらに、対象遺伝子変異としては、フィラデルフィア染色体上のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子における変異であることが好ましく、より好ましくは、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を列挙する図１４から選択される１種又は２種以上である。さらに、好ましくは、Ｔ３１５Ｉのアミノ酸変異である。このアミノ酸変異は、イマチニブに対する耐性化に関し強い関連がある。【００２６】
こうした検査結果に基づく変異の有無や変異の程度の解析ステップ、及び予め構築された遺伝子変異と薬剤感受性や耐性のデータベースに基づいて好適な薬剤を抽出するステップを備えるプログラムを１又は２以上のコンピュータに実行させることで、薬剤選択を効率的に行うことができるようになる。【００２７】
本発明によれば、こうした薬剤選択に基づいて薬剤を投与し、治療する方法も提供される。【００２８】
なお、本明細書には、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００５６１２の全内容が引用により組み込まれるものとする。
【実施例】
【００２９】
（ａ）サンプルの抽出
Amersham Bioscience社製Codelink基板に５’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）をスポットした。使用した遺伝子はT315I。各遺伝子のＭａｊｏｒ  Ｈｏｍｏタイプに相補的な配列をもち長さの異なる４種類のオリゴＤＮＡとＭｉｎｏｒ  Ｈｏｍｏタイプに相補的な配列をもち長さの異なる４種類のオリゴＤＮＡを使用した。（表１０及び表１１参照）また、同一種類のオリゴＤＮＡを３スポットずつスポットした。スポット後、20℃、相対湿度７５％の条件下で一晩インキュベートした。次に、0.1%SDSとなるように調製したBlocking Sol.（1M Tris pH8 20mlと99% エタノールアミン 0.6mlと10% SDS 2mlと滅菌水177.4mlとを混合したもの）に15分間浸漬した。次に、滅菌水で2回洗浄を行った。次に、4×SSC 0.1％SDS(50℃)で30分洗浄を行った後、滅菌水で1回洗浄を行った。次に、沸騰水(98℃)に2分浸漬した後、滅菌水で2回洗浄を行った。その後、遠心器で８００ｒｐｍで５分間遠心し、乾燥した。【００３０】
ハイブリダイゼーションサンプルは遺伝子の型がWildまたはMutantタイプの150mer合成DNA、またはWild型のtotalRNAを用いた。totalRNAでは以下のRT-ＰＣＲ条件で増幅しサンプル調製した。【００３１】
T315Iプローブ配列
下記表１０はＭｕｔａｎｔプローブ、表１１はＷｉｌｄプローブを示したものであり、表中のＴｍは、最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）を用いて算出したものである。
【表１０】
2007055244.tif 000011
【表１１】
2007055244.tif 000012
【表１２】
2007055244.tif 000013
【００３２】
（ｂ）totalRNAからcDNAの作成手順
【表１３】
2007055244.tif 000014
溶液I、II、を調製した。次に溶液IIを70℃ヒートブロックで5分反応させた後、42℃ヒートブロックに直接移して3分反応させた。次に、溶液I中に、溶液IIを入れ混合した後遠心し、SSII（Invitrogen社製 Super Script IIReverse Transcriptase）を1μL添加し、混合、遠心し、42℃ヒートブロックで40分反応させた。さらにSSII（Invitrogen社製 Super Script IIReverse Transcriptase）を0.5μL添加し、混合、遠心し、42℃ヒートブロックで40分反応させた。次に、溶液III（滅菌水20μｌ、0.5M EDTA，pH8  ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ 10μｌ）をこの順番に添加、混合、遠心した後、65℃ヒートブロックで60分反応させた。反応後、Tris（１Ｍ、ｐＨ７．５）を25μL入れ、混合、遠心し、キアゲン（QIAquickＴＭ or MinEluteＴＭ）カラム使用し、以下の手順でサンプルを精製した。【００３３】
（ｃ）サンプル精製手順
ｃＤＮＡ溶液に対し、ＰＢ吸着液を、５倍量入れて混合後、混合液を ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭカラム内に入れて遠心（13000rpm、１分）した。次に、ＰＥ洗浄液（キット内添付：あらかじめエタノール入れておく）を750μｌ入れて、遠心（13000rpm、１分）した。再度ＰＥ洗浄液を750μｌ入れて、遠心（13000rpm、１分）した。完全にＰＥ液を除去するために、何も入れないでさらに遠心（13000rpm、１分）した後、滅菌水を44μｌ入れて回収した。次にｃDNAのPCR増幅を行った。【００３４】
（ｄ）ｃDNAのPCR増幅手順
ｃDNAのPCR増幅手順は以下の通りである。
RT-PCR条件
【表１４】
2007055244.tif 000015
プライマー１    ５０ｐｍｏｌ（５’末端Ｃｙ３標識）
プライマー２    ５０ｐｍｏｌ（５‘末端Biotiｎ標識）
×１０緩衝液    １０μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ        ８μｌ
Taq  ＤＮＡポリメラーゼ  ２．５Ｕ
ｃＤＮＡサンプル      １００ｎｇ
増幅条件
９４℃・３０秒
９４℃・３０秒、６４℃・３０秒、６８℃・４０秒（３５サイクル）
７２℃  ５分、４℃
増幅後は上記ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭカラムを用いて精製した。【００３５】
（ｅ）BSAブロッキング手順
（試薬調製）
1％ＢＳＡブロッキング溶液 
１） 滅菌水              １３７．５ ｍＬ 
２） 20×SSC                   ５０ ｍＬ
３） ５％ＢＳＡ（50 mg/ml）     ５０ｍＬ
４） 10%SDS               １２．５ｍＬ 
スライドガラスを上記試料で調製された１％ＢＳＡブロッキング溶液中に浸漬し、４２℃恒温槽内で４５分間インキュベートした後、滅菌水を入れた染色バット内に入れたスライドラックにスライドガラスをセットし、滅菌水で５回上下振とう洗浄（１回目）した。再度滅菌水で５回上下振とう洗浄（２回目）した後、900rpmで1分間遠心乾燥した。【００３６】
（ｆ）ハイブリ操作手順
ハイブリダイゼーションは上記サンプル（PCR増幅サンプルのみ、合成DNAサンプルは一本鎖への変性不要）をStreptavidinセファロース中NaOH存在下で一本鎖に変性した後、サンプルに20×SSC 25μL、10％SDS 5μLを添加（合計100μL）し、95℃ヒートブロックに2分かけた後、室温に3〜5分放置した。次に、サンプル液をチャンバー内に注入し、注入口をシールで閉じ、オーブン中で１６時間ハイブリダイズした。【００３７】
（ｇ）ハイブリ洗浄手順
チャンバーをはがし、2×SSC−0.1％SDS溶液に5分浸漬した。次に１×SSC溶液に５分浸漬した。最後に、０．１×SSC溶液に５分浸漬した後に、1000rpmで10分間遠心乾燥した。
Agilent社製MicroArrayScannerにて適宜、レーザーパワーを調節し、蛍光画像を測定し、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏにて得られた画像のシグナルを数値化した。（図参照）【００３８】
（ｈ）サンプルおよびハイブリ条件と結果
本発明により得られた結果を以下の図に示す。
・図１、図２
図３、図４、図５（コントロールサンプル）と図１１、図１２、図１３(変異含有サンプル)の蛍光画像及びシグナルを比較したもの。
・図３、図４、図５、図６
サンプル種：    5’Cy3標識合成DNA（150mer）、Wild、Mutantそれぞれ単独
サンプル濃度：  10nM、1nM、100pM、10pM
ハイブリ条件：  42℃、16hr
・図７、図８、図９
サンプル種：    5’Cy3標識合成DNA（150mer）、Wild、Mutantそれぞれ単独
サンプル濃度：  10nM、1nM、100pM
ハイブリ条件：  55℃、16hr
・図１０
サンプル種：    5’Cy3標識PCRサンプル（1462mer）、Wild単独
サンプル濃度：  10nM、1nM、100pM
ハイブリ条件：  42℃、16hr
・図１１、図１２、図１３
サンプル種：    5’Cy3標識合成DNA（150mer）、WildとMutantを混合
サンプル濃度：  10nM（1：1、10：1、100：1）、1nM（1：1、10：1）、100pM（1：1）
（Wild：Mutant）
ハイブリ条件：  42℃、16hr【００３９】
これらの結果によれば、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容易に検出することができることがわかる。また、正常型：変異型の比率も容易に検出できることがわかる。したがって、本発明のプローブや検出方法は、薬剤の耐性化や感受性の低下などに対応した遺伝子の変異の検出やモニターに有効であるとともに、薬剤選択や治療のための有用な指標を提供することができる。【００４０】
本出願は、２００５年１１月８日に出願された米国仮出願番号６０／７３４，２７８を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、より正確な遺伝子変異の検出を可能とするアレイと、このアレイを用いて正確な遺伝子変異の検出を行う方法に関するものである。この発明によって、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容易に検出することができる。また、正常型：変異型の比率も容易に検出できる。したがって、本発明のプローブや検出方法は、薬剤の耐性化や感受性の低下などに対応した遺伝子の変異の検出やモニターに有効であるとともに、薬剤選択や治療のための有用な指標の提供に利用可能である。
【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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