(57)【要約】  本願発明は、下記式（１）又は式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル誘導体を有効成分として含有する動脈硬化抑制剤及びこれを含有する食品又は医薬組成物を提供する。該ポルフィリン誘導体化合物又はそのエステル誘導体は、血管内皮細胞、マクロファージ等で発現されているＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合阻害作用及びＬＯＸ−１を介した酸化ＬＤＬの細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を示し、かつ安全性が高い。式（１）：【化１】
2008001884.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ１〜４個の炭素原子を有する炭化水素基等を示し、Ｒ３〜Ｒ８はそれぞれ１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基、ホルミル基等を示す。）式（２）【化２】
2008001884.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ１〜４個の炭素原子を有する炭化水素基等を示し、Ｒ３〜Ｒ８はそれぞれ１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基、ホルミル基等を示す。）
2008001884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2008001884.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（LOX-1）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤。
【請求項２】
式（２）：
【化２】
2008001884.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（LOX-1）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤。
【請求項３】
前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフェオフォルバイドａ及びエチルフェオフォルバイドａである請求項１記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項４】
前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIである請求項２記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項５】
LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する請求項１〜４いずれか記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項６】
カベオラを経由した細胞内への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する請求項１〜４いずれか記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する食品組成物。
【請求項８】
請求項１〜６いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する医薬組成物。
【請求項９】
式（１）：
【化３】
2008001884.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
あるいは式（２）：
【化４】
2008001884.tif 000010
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を有効成分として含有してなる、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体(LOX-1)アンタゴニスト作用を有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化抑制剤、及びこれを含む食品組成物、又はこれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症は、近年、過脂肪食や運動不足を主な要因とする肥満症が最上流であるメタボリックシンドロームの下流に位置する症状であるとの認識がコンセンサスになりつつあり、この動脈硬化症がさらに進行することにより血栓を形成し、心疾患・脳血管疾患の原因となる。【０００３】
ところで、日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍及び癌）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患となっているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約２８％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である約３０％にほぼ匹敵する（平成１７年(２００５年)）。悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見・早期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。ところが上述のように、生活習慣病に起因する肥満症・動脈硬化症の下流に位置する心疾患・脳血管疾患については、食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、日常的に摂取可能な形態を用いることでの対処方法が望ましい。【０００４】
動脈硬化症において、食生活を含めた食品学的なアプローチが重要であることは上述の通りであるが、複雑・多岐なプロセスにおいてどの作用機序をターゲットにするかは重要である。動脈硬化症は酸化ストレス等による低密度リポ蛋白質（Low-density Lipoprotein: LDL）の変性、血管内皮細胞への取り込みによる血管内皮機能障害を発症の端緒としており、その後のシーケンシャルなプロセスとしてマクロファージや血管平滑筋の分化・脱分化による泡沫化現象を呈する。そして最終的には狭窄性病変を経て血栓形成となる。つまり、予防学的観点から考えれば、初期病変である酸化ストレス等による脂質の変性、あるいは変性LDLが血管内皮細胞に取り込まれることによる機能障害を抑制することが重要である。【０００５】
アポリポプロテインE欠損マウスにおいて、マクロファージのスカベンジャー受容体であるSR-A（Class A scavenger receptor）をノックアウトすると動脈硬化は抑えられるが、むしろ血中のコレステロール値は上昇することが報告されている（例えば、非特許文献１）。また、逆にSR-Aを過剰発現させるとマクロファージ内へのコレステロールの取り込みは促進されても、動脈硬化は促進しないことが報告されている（例えば、非特許文献２）。つまり、血中コレステロールの上昇とマクロファージ等への脂質蓄積は、動脈硬化症の進展に対して２次的なものであるとも考えられる。さらに心血管疾患者の２人に１人は血清脂質が正常であり、また、脂質の変性を防ぐ目的での予防効果はビタミンE以外に十分なものはないとも言われている（例えば、非特許文献３）。つまり、血中脂質を改善することで全ての動脈硬化症が予防・改善できるわけではない。【０００６】
一方で、脂質の変性とともに動脈硬化症の初期原因とされる血管内皮細胞の機能障害は、変性LDL、特に酸化LDLが酸化LDL受容体であるLOX-1（レクチン様酸化低密度リポプロテインレセプター-1 : Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1）を介して血管内皮細胞に取り込まれることに依存するという報告がある（例えば、非特許文献４）。ヒトのスカベンジャー受容体には、タイプAからタイプHまでの少なくとも８種類のクラスが存在するが（例えば、非特許文献５）、血管内皮細胞ではLOX-1を含め、少なくとも６種類のスカベンジャー受容体が機能していると考えられている（例えば、非特許文献６）、これらの受容体を介した変性LDLの取り込みに起因する血管内皮細胞の機能障害は、様々な接着因子の発現亢進や一酸化窒素産生の抑制等を引き起こし、単球・マクロファージの集積・泡沫化あるいは平滑筋細胞の遊走・増殖・形質転換に繋がる。そして結果として動脈硬化症を発症するものと考えられている。【０００７】
LOX-1は血管内皮細胞のみならず、上述のように動脈硬化症に関与するマクロファージ、平滑筋細胞にも発現していることから（非特許文献７）、動脈硬化症の標的因子として非常に注目されている。例えばLOX-1を過剰発現させたアポリポプロテインＥ欠損マウスでは、マクロファージの集積数の増加、接着因子系の発現上昇、アテローム様部位の増大等、LOX-1の過剰発現によって惹起された血管内皮細胞の機能障害を介した動脈硬化症の亢進が確認されている（例えば、非特許文献８）。このようにLOX-1が動脈硬化症の発症に対して非常に大きな影響を与えていることは予想されるものの、LOX-1と変性LDLの結合を阻害する市販の薬剤については現在のところ知られていない。【０００８】
一方で、内皮細胞や平滑筋細胞にはエンドサイトーシスを行う膜ドメインであるカベオラと呼ばれるものも存在する。カベオラ以外の代表的なエンドサイトーシス経路としては、クラスリン被覆ピットと呼ばれるものも存在する。近年になり、カベオラによる脂質代謝との関係が報告されるようになり、動脈硬化症との関係を対象とした研究も行われてきている。例えば、カベオラを介したエンドサイトーシスにより、アルブミン（例えば、非特許文献９）、インスリン（例えば、非特許文献１０）のみならず、LDLあるいは変性LDLの輸送への関与も報告されている（例えば、非特許文献１１）。カベオラはそのコートタンパク質としてカベオリン-1を有するが、遺伝学的にカベオリン-1を欠損したマウスをアポリポプロテインE欠損マウスと交配させダブルノックアウトマウスを作製すると、スカベンジャー受容体の一種であるCD36の発現低下を伴った高い抗動脈硬化作用が確認される（例えば、非特許文献１２）。つまり、カベオラ経由によるリポプロテインの細胞内への輸送を抑制することを標的とした食品・薬剤の開発は、LOX-1のアンタゴニストと同様に抗動脈硬化抑制剤としての利用に繋がることが予想される。よって、これらを同時に抑制することが可能であれば、非常に優れた抗動脈硬化抑制剤になることが期待できる。【０００９】
ところで、ポルフィリンを基本骨格とする物質は、生物種を問わず代謝物質として広く存在する。δ-アミノレブリン酸を前駆物質として、８分子が環状構造を形成することによりテトラピロール骨格が構築され、下流のプロトポルフィリンＩＸにおいて、光合成構成要素であるクロロフィルとヘモグロビン構成要素であるヘムへと派生する。また、上流の代謝中間体であるウロポルフィリノゲンIIIからは上記物質群のみならず、ビタミンB12なども合成される。
植物においてクロロフィルはROS（reactive oxygen species：活性酸素種）の発生源でもあり、葉の老化（senescence）のみならず、組織の損傷に伴い積極的に代謝されているが、同時にこの代謝過程は植物の複数種の防御反応を制御することも示唆されており（例えば、非特許文献１３）、クロロフィルの分解においてクロロフィラーゼ（chlorophyllase）及びＭｇ−デキラターゼ（Mg-dechelatase）により、脱フィトール化と脱Ｍｇ化を経てフェオフォルバイドａが形成される。
近年、フェオフォルバイドａはABC（ATP-binding cassette：ATP結合カセット）輸送体の一種であるABCG2/BCRP（breast cancer resistance protein：乳癌耐性蛋白質）のマーカーとして着目されてきている（例えば、非特許文献１４）。このABCG2は多剤耐性の原因因子でもあり、フェオフォルバイドaを指標としたABCG2阻害剤を開発することで、抗癌物質の開発に繋げる研究も行われてきている。また、フェオフォルバイドaは光過敏症の原因因子であるとも言われているが、これは高濃度摂取した場合に起こる現象であり（ヒトで500mg/day以上（非特許文献１５）、ラットで220mg/kg以上（非特許文献１６））、現在のクロレラにおける配合量も商品100g中に60-80mg以下であれば問題ないとされている。また実際にラットにおいては、フェオフォルバイドaを静脈注射した場合での皮膚への蓄積量は少なく、細網内皮系が主な蓄積ターゲットとされる（非特許文献１７）。
【非特許文献１】Suzuki H. et al. Nature (1997); 386: 292-6
【非特許文献２】Van Eck M. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2000); 20: 2600-6
【非特許文献３】Ross R. N Engl J Med (1999); 340: 115-26
【非特許文献４】Sawamura T. et al. Nature (1997); 386: 73-7
【非特許文献５】Murphy J. E. et al. Atherosclerosis (2005); 182: 1-15
【非特許文献６】Adachi H. and Tsujimoto M. Prog Lipid Res (2006); 45: 379-404
【非特許文献７】Chen M. et al. Pharmacol Ther (2002); 95: 89-100
【非特許文献８】Inoue K. et al. Circ Res (2005); 97: 176-84
【非特許文献９】Ghitescu L. et al. J Cell Sci. (1986); 102: 1304-11
【非特許文献１０】Bendayan M. et al. J Cell Sci. (1996); 109: 1857-64
【非特許文献１１】Kim M-J. et al. Atherosclerosis (1994); 108: 5-17
【非特許文献１２】Philippe G. F. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2003); 24: 98-105
【非特許文献１３】Kariola T. et al. Plant Cell (2005); 17: 282-94
【非特許文献１４】Robey R. W. et al. Cancer Res (2004); 64: 1242-6
【非特許文献１５】Kimura S. et al. Photomed. Photobiol. (1981); 3: 73
【非特許文献１６】Matsuura E et al. Kitasato Arch. Exp. Med. (1988); 61: 201-13
【非特許文献１７】Aprahamian M. et al. Anti-Cancer Drug Design (1993);8: 101-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記観点からなされたものであり、血管内皮細胞、平滑筋細胞等で発現されているLOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつLOX-1を介した酸化LDLの細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を有し、かつ安全性が高い動脈硬化抑制剤及びこれを含有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
また、本発明は、LOX-1以外の他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込み抑制能をも有し、さらにカベオラを経由した細胞内へのリポプロテインのエンドサイトーシスをも抑制するという、多面的な効果を奏する動脈硬化抑制剤及びこれを含有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために、LOX-1に対するアンタゴニスト作用を有し、LOX-1以外のスカベンジャー受容体を含めた酸化LDL取り込み抑制能に優れた成分をスクリーニングにより鋭意探索した。その結果、ポルフィリン骨格を有する化合物に顕著なアンタゴニスト作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、この化合物にはエンドサイトーシスによる細胞内へのリポプロテインの取り込みをも抑制するという作用も見出した。【００１２】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕式（１）：【００１３】
【化１】
2008001884.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤、
〔２〕式（２）：【００１５】
【化２】
2008001884.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（LOX-1）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤、
〔３〕  前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフェオフォルバイドａ及びエチルフェオフォルバイドａである前記〔１〕記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（LOX-1）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤、
〔４〕  前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIである前記〔２〕記載の動脈硬化抑制剤、
〔５〕  LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤、
〔６〕  カベオラを経由した細胞内への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤、
〔７〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する食品組成物、
〔８〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する医薬組成物、
〔９〕  前記式（１）あるいは（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を有効成分として含有してなる、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体(LOX-1)アンタゴニスト作用を有する組成物
に関する。【００１７】
なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価した場合に、LOX-1への酸化LDLの結合を阻害し、かつ酸化LDLの細胞内への取り込みを阻害することを意味する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物を用いることで、動脈硬化症の初期病変に関わりの深い酸化LDL受容体（LOX-1）を介する酸化LDLの細胞内への取り込みを顕著に阻害することができるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、エチルフェオフォルバイドａ(Ethyl pheohorbide a)、フェオフォルバイドａ(Pheophorbide a)、クロロフィルａ(Chlorophyll a)、クロロフィルｂ、シアノコバラミン(Cyanocobalamin)、ヘミン(Haemin)、ヘマチン(Hematin)、ヘマトポルフィリン(Hematoporphyrin)、ウロポルフィリンIII(Uroporphyrin III)、ポルフォビリノーゲン(Porphobilinogen)、フェオフィチンａ(Pheophytin a)、フェオフィチンｂ、Ｍｇ2+を用いた場合の酸化LDLのｂLOX-1、への結合率の結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、プレート上に固定化されたLOX-1への酸化LDLの結合量を相対値で示しており、コントロールは化合物を含まない処理区の値を１００として、酸化LDLを含まない処理区の値を０として換算している。また、各化合物は、終濃度１６μＭになるように添加した。
【図２】図２は、後述の実施例１〜４のうち高いアンタゴニスト活性を有したフェオフォルバイドａについて濃度依存性を検討した結果を示すグラフである。全ての希釈系列において、同濃度のDMSO(dimethyl sulfoxide;和光純薬)が添加されている。
【図３】図３、ｈLOX-1に対する酸化LDLの結合率の結果を示している。グラフの縦軸は、プレート上に固定化されたＬＯＸ−１への酸化LDLの結合量を相対値で示しており、コントロールは化合物を含まない処理区の値を１００として、酸化LDLを含まない処理区の値を０として換算している。また、各化合物は、終濃度１６μＭになるように添加した。
【図４】図４は、実施例６で行った、ｂLOX-1を発現したCHO細胞の酸化LDLの取り込み量の結果を示している。細胞内へ取り込まれた酸化LDL量を示す蛍光量については、全ての処理区において化合物及び蛍光標識した酸化LDLを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量で除したコントロールの値を１００％として換算した値を示す。
【図５】図５は、実施例６で行った、ｈLOX-1を発現したCHO細胞の酸化LDLの取り込み量の結果を示している。細胞内へ取り込まれた酸化LDL量を示す蛍光量については、全ての処理区において化合物及び蛍光標識した酸化LDLを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量で除したコントロールの値を１００％として換算した値を示す。
【図６】図６は、COS-1細胞、bLOX発現CHO細胞、hLOX発現CHO細胞、SR-AII発現COS-1細胞、正常大動脈内皮細胞の各細胞に対する、DiI-OxLDLの取り込み、クラスリン小胞輸送の特異的マーカーとしてのトランスフェリン(Transferrin)、カベオラ経路の輸送マーカーとしてのCTBの各マーカーの取り込みを各阻害剤について後述の実施例６と同様に検証した結果を示す。なお、CTBの特異的阻害剤としてナイスタチン(Nystatin)を使用した。
【図７】図７は、平滑筋細胞に対する酸化LDL取り込み抑制能の結果を示している。細胞内へ取り込まれた酸化LDL量を示す蛍光強度については、DiI-OxLDL由来の蛍光強度と同一視野内のDAPI染色由来の核数で除しており、全12視野の平均を示している。コントロールは阻害剤を含まない処理区であることを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に用いられるポルフィリン系誘導体化合物は、式（１）：【００２１】
【化３】
2008001884.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）【００２３】
又は式（２）：【００２４】
【化４】
2008001884.tif 000006
【００２５】
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ3からＲ8はそれぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表される。【００２６】
式（１）において、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点から、Ｒ1としては、水素原子、炭素数１〜２の直鎖状飽和炭化水素基が好ましく、水素原子又はエチル基がより好ましい。またＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8としては、炭素数１〜２の直鎖状飽和炭化水素基が好ましく、メチル基、エチル基が好ましい。Ｒ5としては炭素数２〜４の直鎖状不飽和炭化水素基が好ましく、エチレン基がより好ましい。
式（２）において、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点からＲ1、Ｒ2としては、水素原子、炭素数１〜２の直鎖状飽和炭化水素基が好ましく、水素原子がより好ましい。また、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ8としては、炭素数１〜２の直鎖状飽和炭化水素基、カルボキシメチル基が好ましく、メチル基、カルボキシメチル基がより好ましい。Ｒ5、Ｒ7としては、炭素数２〜４の直鎖状不飽和炭化水素基、カルボキシエチル基が好ましく、エチレン基、カルボキシエチル基がより好ましい。【００２７】
前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物としては、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点から、フェオフォルバイドａ及びエチルフェオフォルバイドａが好ましい。
前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物としては、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点から、ヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIが好ましい。【００２８】
前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物は、酸化LDL受容体（LOX-1）アンタゴニスト作用を有するのみならず、他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込みについても抑制しており、さらに細胞内へのカベオラを経由した細胞内への酸化LDLの取り込み抑制作用を有する結果として内皮細胞の機能障害抑制あるいは抗動脈硬化作用を有する。【００２９】
前記式（１）又は（２）で表さえるポルフィリン系誘導体化合物は、クロロフィルなどの市販されている原料から公知の方法で合成することができる。【００３０】
本発明において、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物には、エステル類も含まれる。エステル類には、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル  などが挙げられる。【００３１】
また、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物は、動脈硬化抑制効果がより向上するという観点から、前記LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの取り込みも抑制する作用を有するものが好ましい。ここで、LOX-1以外のスカベンジャー受容体とは、血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞等に存在するLOX-1以外の受容体であって、LDLと結合して前記細胞内に取り込むことができる受容体である。このようなスカベンジャー受容体としては、例えば、SR-A I/II、SR-B1、CD36、MARCO、CD68、SRECs、SR-PSOX、FEEL-1等のタイプA、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈに大別されるが、特に限定はない。
本発明では、後述の実施例に記載のように、細胞内への酸化LDLの取り込み阻害活性量が、スカベンジャー受容体中のLOX-1の割合から換算される阻害活性量よりも多ければ、LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化LDLの取り込みが阻害されているとする。【００３２】
本発明においては、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物などが用いられるが、これらのポルフィリン系誘導体化合物は、クロロフィル、シアノコバラミン、へミン、ヘマチン、ポルフォビリノーゲンなどの構造が類似しているポルフィリン系化合物とは相違したアンタゴニスト活性を有する。このようにポルフィリン系化合物間でアンタゴニスト活性が相違している理由としては、明確ではないが、例えば、式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、エステル鎖の炭素数が他の類似の化合物と比べて短いため、エステル鎖が短いほど活性が向上すると考えられる。
また、式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、ポルフィリン環に金属原子とキレートしていないため、活性の発現に金属原子とのキレートは必要ないと考えられる。
また、後述の実施例に記載のようにフェオフォルバイドａは、さらにカベオラを経由した細胞内への酸化LDLの取り込みも阻害する。【００３３】
本発明の動脈硬化抑制剤は、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物を含有するが、前記ポルフィリン系誘導体化合物のみでもよいし、アンタゴニスト活性を妨げないのであれば、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、特に限定はない。【００３４】
また、本発明の動脈硬化抑制剤は、食品・医薬品などの組成物に、公知の技術を用いて、配合することができる。この場合、前記組成物をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設定すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材が、食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。ただし、フェオフォルバイドaは光過敏症の原因因子とも言われていることから、その配合量としては組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が望ましい。【００３５】
また、食品としては、一般食品として、種々の食品原料に前記化合物の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、前記化合物をそのまま、あるいは食べ易い状態にして使用することができる。【００３６】
また、医薬品としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤等が挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤等と共に通常の方法に従って製剤すればよい。【００３７】
これらの組成物における、上記動脈硬化抑制剤の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢等により異なるが、成人１人あたりの摂取量が０．１ｍｇ／ｋｇ・日以下となるように、１回ないし数回に分けて被検体に投与するのが好ましい。【００３８】
なお、本発明において標的としているLOX-1は、ヒトや非ヒトの哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の哺乳動物など）の血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在しており、それぞれの細胞に酸化LDLが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明の動脈硬化抑制剤は、血管内皮細胞などの動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化LDLの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。【００３９】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
なお、実施例で用いた試料は、以下のようにして調製した。
１．ｂLOX-1、ｈLOX-1のｃＤＮＡ
前記ｂLOX-1、ｈLOX-1のｃＤＮＡクローニングは、前記非特許文献４に記載の方法に準じて行った。
即ち、ｂLOX-1については、血管内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーより各独立したクローンを発現ベクターに組み込み、COS-7での一過性発現を行った。その後、DiI-OxLDLとの共培養後にセルソーターによるDiIポジティブの分離を行い、プラスミドを回収した。このスクリーニング方法を3回繰り返し、シングルクローンを単離した。【００４１】
また、ｈLOX-1については、ランダムプライマーとオリゴdTプライマーによりヒト肺のcDNAライブラリーから増幅を行った。全長bLOXcDNAを用いてポジティブスクリーニングを行い、部分断片のhLOXｃDNAを取得後、5'-RACEによる上流配列の取得を行った。【００４２】
（TetOnベクターへの挿入）
pcDNA31-hLOX1-V5プラスミド(Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39(3) 553-561 (2005))をPreI、BamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、ゲルを切り出し・抽出してh-LOX-1断片を回収した。pTRE2hygプラスミド（クロンテック、TetOn）をEcoRV、BamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、ゲルを切り出し・抽出してTet応答ベクター断片を回収した。回収したh-LOX-1断片とTet応答ベクター断片を、ライゲーションして大腸菌を形質転換した。大腸菌から導入プラスミドを回収・精製し、得られたプラスミドDNAをpTRE-hLOX1(B)、とした。【００４３】
Lipofectoamine2000（インビトロジェン製）を用いてCHO-K1 Tet-On Cell Line（クロンテック）ヘFspIにより直鎖化したpTRE-hLOX1(B)を導入し、ハイグロマイシンによる選択培養を行い、コロニーを形成させた。シングルコロニーをピックアップして細胞株12株を取得した。それぞれの細胞株について、ドキシサイクリンを培地に添加して発現誘導を行った細胞抽出液を調製し、抗V5抗体を用いたウェスタンブロッティングにより誘導効率の高い細胞株を3株得た。【００４４】
（SR-AII発現細胞株の作製）
ヒトSR-AIIのcDNAクローニングは、ヒト正常脾臓由来cDNA（インビトロジェン）をテンプレートとして、全長配列（1077塩基対）をPCRにより取得した。なお、上流側のプライマーにはCACC配列を5'側に余分に付加した。このように増幅したPCR産物を、pENTR/D-TOPOベクター（インビトロジェン）に挿入し、Mach1細胞（インビトロジェン）に形質転換した。得られた形質転換体より、正しくSR-AII全長配列が挿入されたプラスミドを持つことが予想されたクローンをコロニーPCR法など常法により選抜し、そのプラスミド配列のシーケンスを行った。シーケンスにより正しい配列が確認されたプラスミドについては、さらに動物細胞発現用ベクターであるpDEST26（インビトロジェン）にマニュアルに従い部位特異的組換え反応を行った。得られたSR-AII全長配列を持つpDEST26ベクターをCOS-1細胞（ヒューマンサイエンス資源バンク）に形質転換し、48時間培養後、一過性発現株を取得した。【００４５】
２．抗LOX-1抗体
抗LOX-1抗体は非特許文献４に記載の方法に準じて製造した。
即ち、ｂLOX-1あるいはｈLOX-1を発現しているCHO細胞を５ｍM  EDTA-PBSで処理（室温、5分間）した後、プロテアーゼ阻害剤含有緩衝液（２５ｍMのHEPES(pH 7.4)）、１０ｍMの塩化マグネシウム、０．２５Mのシュークロース、及びプロテアーゼ阻害剤（１０U／ｍLのAprotinine, 2μg/mLのPepstatin、５０μg/mLのLeupeptin、及び０．３５mg/mLのAPMSF）中に懸濁し、ポッター式ホモゲナイザーで破砕し、低速遠心（１５００rpm、１０分、４℃）した。次いで、上清を回収し、超遠心（１００，０００ｇ、１時間、４℃）し、沈殿した膜画分を回収しリン酸緩衝液中に懸濁し−20℃で保存した。この懸濁液をウシあるいはヒト抗体の作製（免疫源）として用いた。
得られた細胞膜画分を正常マウスに免疫し、ウシあるいはヒトLOX-1に対するマウスモノクローナル抗体を調製した。【００４６】
モノクローナル抗体の作製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、p66-74、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）に記載される一般的方法に従って調製した。
なお、抗LOX-1抗体とは、LOX-1を抗原とした特異抗体であり、抗原抗体反応によりLOX-1のアンタゴニストとして作用するものをいう。【００４７】
３．PBSバッファー
PBSバッファーについては、137mM塩化ナトリウム, 2.7mM塩化カリウム、10mMリン酸水素二ナトリウム十二水和物、1.8mMリン酸二水素カリウムを精製水に混合し、適量の塩酸でpHを7.4とした。【００４８】
４．酸化LDL
酸化LDLの調製は下記の通りに行った。健常人の血漿を遠心チューブに入れ、臭化カリウムを加えて、比重を1.019に調製した後に、Beckman L-80超遠心機で遠心し（20時間、５８０００rpm）、下層を別のチューブに回収した。回収した液量を測定し、臭化カリウムを加えて比重を1.063に調製した。次いで、Beckman L-80超遠心機で遠心し（２０時間、５８０００rpm）、上層を別のチューブに回収した。回収した画分をリン酸緩衝液（外液を2回以上交換）し、精製ヒトLDLを得た。【００４９】
得られた精製LDLから酸化LDLを調製するために、精製LDL及び硫酸銅の濃度が、各々3mg/mL及び75μMとなるように調製した溶液を、CO2インキュベーター内で20時間インキュベートした。次いで、EDTAを含有する0.15Mの塩化ナトリウム溶液にて透析し（外液を2回以上交換）、ヒト酸化LDLを得た。【００５０】
（実施例１）
エチルフェオフォルバイドａは、公知の方法を用いてフェオフォルバイドａ（pheophorbide a，  Frontier Scientific社製）から誘導を行った。すなわち、フェオフォルバイドａ（20 mg）をジターシャルブチルジカルボナート（di-tert-butyl dicarbonate，0.32mmol）とジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine，4mg）を１０分間撹拌後、エタノール（ethanol，0.32mmol）を加えさらに１時間撹拌した。生成物は、順相カラムクロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（２５：１）で精製し、エチルフェオフォルバイドａを6mg（33%）得た。【００５１】
（試験例１）
上記各実施例で得られた動脈硬化抑制剤のLOX-1アンタゴニスト活性に関して、酸化LDLに対するLOX-1結合阻害率について大腸菌より得られた組換えLOX-1蛋白質を用いて評価を行った。【００５２】
組換えLOX-1は、ウシ由来LOX-1（ｂLOX-1）あるいはヒト由来LOX-1（ｈLOX-1）のｃＤＮＡにおいて膜貫通領域を除いたＣ末端までの配列を、Ｎ末端側に６個のヒスチジンタグ配列（６ x His）を持つpQE ３０ベクター（キアゲン社製）に、翻訳フレームを揃える配列で挿入した。このベクターをT５プロモータで制御可能な大腸菌にトランスフォーメーションし、1mMのイソプロピル１-チオ-β-D-ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）誘導下で各LOX-1の発現誘導を行った。３７℃、３時間の発現誘導後、不溶性画分から組換えLOX-1は得られたので、６Mグアニジン塩酸塩を含むバッファー中で大腸菌を溶解し、Ni-NTAアガロースカラム（キアゲン社製）による６ x Hisを指標としたアフィニティーカラム精製を行った（溶媒：リン酸バッファー）。さらに各LOX-1を含む溶出画分について、２０mMトリスバッファー（ｐＨ９．０）、８M尿素を含むバッファー中で透析し、陰イオン交換体であるHiTrap Qカラム（アマシャム社製）にアプライし、ＮａＣｌの直線濃度勾配による溶出・精製を行った。このようにして得られた各LOX-1を含む画分は、過剰量のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含むバッファー中で還元処理を行い、その後、低分子チオール化合物の酸化型（ＧＳＨ）及び還元型（ＧＳＳＧ）の混合物を利用した酸化還元システムによる分子内Ｓ−Ｓ結合の巻き戻しを行った。このようにして得られた各LOX-1は、酸化LDLに対する結合能力を有し、以下のプレートアッセイによる試験用LOX-1標品として用いることにした。【００５３】
プレートアッセイは、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ社製）を用いて行った。上記のように精製した各LOX-1を５μg/mLとなるようにＰＢＳバッファーで調製し、１００μLずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μL x ２回で洗浄し、２５%ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むＰＢＳバッファー３００μLを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、PBSバッファーで各ウェルを４００μL x ２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製したエチルフェオフォルバイドａを１００μLずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μL x ３回で洗浄し、５μg / mLとなるようにＰＢＳバッファーで調製した酸化LDLを、１００μLずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μL x ３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（The Binding Site社製）をＰＢＳバッファーで１０００倍希釈し、１００μLずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μL x ５回で洗浄し、3,3',5,5'-テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ-酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（バイオラッド社製）を１００μLずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２M  H2SO4を５０μLずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０nmで検出を行い、LOX-1アンタゴニスト活性（LOX-1に対する酸化LDL結合阻害率）を定量した。【００５４】
（実施例２）
試験例１と同様の方法を用いてフェオフォルバイドａ（Frontier Scientific社製）の評価を行った。【００５５】
（実施例３）
試験例１と同様の方法を用いてヘマトポルフィリン  （hematoporphyrin，和光純薬工業製）の評価を行った。【００５６】
（実施例４）
試験例１と同様の方法を用いてウロポルフィリンIII（uroporphyrin III、Frontier Scientific社製）の評価を行った。【００５７】
（比較例１）
試験例１と同様の方法を用いてクロロフィルａ（chlorophyll a，和光純薬工業製）の評価を行った。【００５８】
（比較例２）
試験例１と同様の方法を用いてクロロフィルｂ（chlorophyll b，和光純薬工業製）の評価を行った。【００５９】
（比較例３）
試験例１と同様の方法を用いてシアノコバラミン（cyanocobalamin，和光純薬工業製）の評価を行った。【００６０】
（比較例４）
試験例１と同様の方法を用いてヘミン（haemin，Alfa Aesar社製）の評価を行った。【００６１】
（比較例５）
試験例１と同様の方法を用いてヘマチン（hematin，Alfa Aesar社製）の評価を行った。【００６２】
（比較例６）
試験例１と同様の方法を用いてポルフォビリノーゲン（porphobilinogen，Frontier Scientific社製）の評価を行った。【００６３】
（比較例７）
試験例１と同様の方法を用いてフェオフィチンａ  （pheophytin a，和光純薬工業製）の評価を行った。【００６４】
（比較例８）
試験例１と同様の方法を用いてフェオフィチンｂ  （pheophytin b，和光純薬工業製）の評価を行った。【００６５】
（比較例９）
試験例１と同様の方法を用いてＭｇ2+（ＭｇＣｌ2由来）の評価を行った。【００６６】
なお、実施例及び比較例で評価を行った各化合物の構造を以下に示す。
前記式（１）で表される化合物において、エチルフェオフォルバイドａ  （Ｒ1＝Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2），  フェオフォルバイドａ  （Ｒ1＝Ｈ，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2,  Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3），  クロロフィルａ  （Ｒ1＝ｐｈｙｔｙｌ，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝  Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2,  Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3, ＮがＭｇとキレートしている），  クロロフィル  ｂ  （Ｒ1＝ｐｈｙｔｙｌ，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2,  Ｒ6＝ＣＨＯ，  Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3, ＮがＭｇとキレートしている），  フェオフィチンａ  （Ｒ1＝ｐｈｙｔｙｌ，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝  Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2,  Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3,），  フェオフィチンｂ  （Ｒ1＝ｐｈｙｔｙｌ，  Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝ＣＨ：ＣＨ2,  Ｒ6＝ＣＨＯ，  Ｒ7＝ＣＨ2ＣＨ3）。【００６７】
前記式（２）で表される化合物において、ヘミン  （Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ，  Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝Ｒ7＝ＣＨ：ＣＨ2,  ＮがＦｅとキレートして、ＦｅにＣｌが結合している），  ヘマチン  （Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ，  Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝Ｒ7＝ＣＨ：ＣＨ2,  ＮがＦｅとキレートして、ＦｅにＯＨが結合している），  ヘマトポルフィリン  （Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ，  Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ3，  Ｒ5＝Ｒ7＝ＣＨ：ＣＨ2），  ウロポルフィリンＩＩＩ  （Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ，  Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ6＝Ｒ8＝ＣＨ2ＣＯＯＨ，  Ｒ5＝Ｒ7 ＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）。【００６８】
なお、「ｐｈｙｔｙｌ」はＣＨ2ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2を表している。【００６９】
前記実施例１〜４、比較例１〜９の結果のうちｂLOX-1に対する酸化LDLの結合率の結果を図１に示す。各阻害剤については、いずれも終濃度16 μMで試験を行った。エチルフェオフォルバイドａ、フェオフォルバイドａ、ヘマトフィリン、ウロポルフィリンIIIはいずれも結合を有意に阻害していることがわかる。
中でも、エチルフェオフォルバイドａ、フェオフォルバイドａ、ヘマトフィリンは高い阻害活性を示した。【００７０】
また、特に阻害活性の高かったフェオフォルバイドａについて、濃度依存性を調べた。その結果を図２に示す。このように、本試験から得られたＩＣ50は、約0.1μＭであった。【００７１】
図３には、ｈLOX-1に対する酸化LDLの結合率の結果を示している。各化合物は、終濃度１６μＭになるように添加した。ヒト型LOX-1においてもウシのLOX-1に対する阻害様式と同様の傾向を示しており、ヒト由来のLOXでも活性が確認された。【００７２】
（実施例５）
前記実施例１〜４、比較例１〜９の化合物による細胞毒性を検証するために以下のように生細胞数を測定した。生細胞数を測定する方法としては、ミトコンドリア内脱水素酵素によるMTT（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide）のホルマザン（難溶性の沈殿物として生成）への還元を利用したMTT法等が汎用される。よって上記MTT法の変法を利用している、「Cell counting Kit-8」（同仁化学研究所製、MTTの代わりに水溶性ホルマザンを生成するWST-8を用いる）を用いて生細胞数の測定を行った。具体的には、９６ウェルプレート（ファルコン社製）に３．０×１０4cells/mLとなるようにプレートの中心部分である６０ウェルに１００μLずつ細胞の蒔き込みを行った（外側の３６ウェルには温度変化をなくす為に培地のみ１００μLを添加した）。２日間の培養（３７℃）後、培養上清５０μLを除去し、各化合物を適当な希釈倍率で含む５０μLの新しい培養液を添加した。化合物を含む新しい培養液を添加した後に、７時間の培養を行った。７時間後に、化合物を含まない１００μLの培地で３回ずつ各ウェルの洗浄を行った後に、各ウェルに３μLずつとなるように「Cell counting Kit-8」溶液である「WST-8」を含む培地を添加した。１時間の培養後、前記培養液の４５０nmの吸光度を測定し、生細胞数として換算した。なお、途中３回の洗浄操作を行っているので、外液の化合物による吸光度への影響は無いと考えられた。【００７３】
（実施例６）
実施例５と同様の化合物について、bLOX-1を安定的に発現しているチャイニーズハムスター卵巣由来（CHO）細胞を用い、bLOX-1を介したCHO細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能を評価した。また、hLOX-1についてはテトラサイクリン遺伝子発現誘導系を用いたCHO細胞での、hLOX-1を介した蛍光標識酸化LDLの取り込み抑制能を評価した。【００７４】
hLOX-1をテトラサイクリン濃度依存的に発現するCHO細胞については、下記プラスミドを公知の方法で導入したものを用いた。導入プラスミドは、pcDNA3.1-hLOX1-V5 (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39(3) 553-561 (2005))に組み込まれているhLOX-1コーディング領域がテトラサイクリン応答ベクターに組み込まれており、テトラサイクリンあるいはドキシサイクリン濃度依存的にhLOX-1の発現調整が可能なシステムである。
前記ＣＨＯ細胞を用いたアッセイについては、次のように行った。２４ウェルプレート（ファルコン社製）に２．０×１０4 cells / mLとなるように各ウェルに５００μLずつ１０％牛胎児血清（FBS、ただしテトラサイクリンを含まない）含有HamF１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）のもとで細胞の蒔き込みを行い、３７℃、５％のCO2濃度の環境下で1日間培養した。1日間の培養後、培養上清２５０μLを除去し、２００μg/mLの濃度でドキシサイクリンを含む２５０μLの新しい培養液を添加した（ドキシサイクリンの終濃度は１００μg/mL）。さらに1日間の培養後、培養上清を除去し、各化合物を適当な希釈倍率で含む新しい培養液を５００μLずつ各ウェル添加した。各化合物を含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、LOX-1への抽出物の結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（DiI:インビトロジェン社製）で標識した酸化LDLを５μg / mLとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で４時間のCHO細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、１ mL PBSバッファーで３回各ウェルを洗浄し、０．１% SDSによる細胞溶解を行った。溶解後に一定量の溶解液を回収し、９６ウェルのブラックプレート（NUNC社製）に分注し、DiIを指標に取り込まれた酸化LDLの測定を行った。蛍光測定機器は、Molecular Devices社の「SPECTRA MAX GEMINI EM」を用いており、励起波長５４０nm、検出波長５８５nm、遮断波長５７０nmで行った。【００７５】
bLOX-1を安定的に発現しているCHO細胞は、既報の方法に従って経代・維持を行った（Nature, Vol.385, p73-77, 1997）。細胞を用いたアッセイについては、次のように行った。２４ウェルプレート（ファルコン社製）に３．０×１０4 cells / mLとなるように各ウェルに５００μLずつ１０％牛胎児血清（FBS）含有HamF１２培地のもとで細胞の蒔き込みを行い、３７℃、５％のCO2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清２５０μLを除去し、各化合物を適当な希釈倍率で含む２５０μLの新しい培養液を添加した。各化合物を含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、LOX-1への抽出物の結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（DiI:インビトロジェン社製）で標識した酸化LDLを５μg / mLとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で６時間のCHO細胞内への蛍光標識酸化LDLの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、１ mL PBSバッファーで３回各ウェルを洗浄し、０．１% SDSによる細胞溶解を行った。溶解後に一定量の溶解液を回収し、９６ウェルのブラックプレート（NUNC社製）に分注し、DiIを指標に取り込まれた酸化LDLの測定を行った。蛍光測定機器は、Molecular Devices社の「SPECTRA MAX GEMINI EM」を用いており、励起波長５４０nm、検出波長５８５nm、遮断波長５７０nmで行った。【００７６】
図４、５はぞれぞれ、実施例６で行った、ｂLOX-1、ｈLOX-1を発現したCHO細胞の酸化LDLの取り込み量の結果を示している。ｂLOX-１、ｈLOX-1共に活性が認められたのは、数種あるが、特にフェオフォルバイド aは、ｈLOX-1において、抗ｈLOX抗体より強い取り込み阻害を示した。
なお、図には示していないが、実施例５で行ったミトコンドリア活性を指標とした細胞毒性試験より、この抑制効果は細胞毒性によるものでは無いことも明らかである。同様にエチルフェオフォルバイドａ、ヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIも有効な阻害活性が示される濃度では細胞毒性が見られなかった。【００７７】
（実施例７）
実施例１、２と同様の化合物についてアフリカミドリザルの腎臓由来（COS-1）細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）、bLOX発現CHO細胞、hLOX発現CHO細胞、SR-AII発現CHO細胞、正常大動脈内皮細胞（BAEC、Cell Applications Inc.社製）の各細胞に対する、DiI-OxLDLの取り込み、クラスリン小胞輸送の特異的マーカーとしてのAlexa 568をコンジュゲートしたトランスフェリン（励起波長548nm、検出波長605nm、モレキュラープローブ社）の取り込み、カベオラ経路の輸送マーカーとしてのAlexa 488をコンジュゲートしたCTB（cholera toxin subunit B、励起波長480nm、検出波長530nm、モレキュラープローブ社）の取り込みを各阻害剤について実施例６と同様に検証した。なお、ナイスタチン（ワコー社製）はカベオラ輸送の特異的阻害剤として使用した。【００７８】
図６は、実施例７の方法により得られた各マーカーの取り込み量の結果を示す。COS-1細胞での取り込みの結果より、フェオフォルバイドaはカベオラ輸送経路も顕著に阻害することから、フェオフォルバイドaはカベオラを経由した細胞内へのリポプロテインのエンドサイトーシスによる酸化LDL取り込み阻害能を有することが確認できる。また、DiI-OxLDLがbLOX発現CHO細胞でナイスタチンによりCTBと同程度阻害されることから、DiI-OxLDLの輸送経路はその多くがカベオラ輸送経路に依存しており、LOX-1アンタゴニスト活性とカベオラ輸送阻害という２つの阻害活性をフェオフォルバイドaは有していることが示唆された。正常大動脈内皮細胞において、フェオフォルバイドaは抗LOX-1抗体以上の阻害活性を有しており、単なるアンタゴニスト作用よりも強い取り込み抑制能を有することがこの結果からも示唆された。驚くことに、このフェオフォルバイドaはLOXによる酸化LDLの取り込み抑制能のみならず、SR-Aによる酸化LDLの取り込み抑制能も有することが明らかとなった。よって、SR-A及び内皮細胞の結果と併せて、このフェオフォルバイドaは様々なスカベンジャー受容体に対する変性LDL取り込み抑制能を持つことが示唆されたので、さらに変性LDLを取り込む細胞である平滑筋細胞についても検証を行った。
なお、エチルフェオフォルバイドａ、ヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIについてもフェオフォルバイドaと類似の阻害傾向が見られた。【００７９】
（実施例８）
実施例１、２と比較例６の化合物について、平滑筋細胞に対する酸化LDL取り込み抑制能の評価を実施例６と同様な方法で行った。【００８０】
平滑筋細胞を１×１０5 cells/mLとなるように調製し、96ウェルプレートへのまき込みを行った。2日間培養後、実施例６と同様な方法で各阻害剤による処理を行った。阻害剤の処理後、PBSによる洗ｄ浄を3回行い、室温・暗所で１０％ホルマリン溶液での固定を１０分間行った。固定処理を行った細胞を超純水で2回洗浄し、DAPIによる核染色を行った。これらの細胞を「IN Cell Analyzer」（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製）により、DiI標識酸化LDLの平滑筋細胞への取り込みを核数で除した値を算出した。また、１ウェル当たり４視野を測定し、１処理あたりｎ＝３で測定した。【００８１】
図７は実施例８により得られた試験結果を示す。ポルフォビリノーゲン（Porphobillinogen）用した。このように、内皮細胞同様に平滑筋細胞においてもフェオフォルバイドaは非常に強い取り込み抑制能を示し、且つ抗LOX-1抗体以上の抑制効果を示した。よってこれらの結果からもフェオフォルバイドaは、内皮細胞、マクロファージと同様に変性LDLの取り込みを行い動脈硬化症の初期病変と関わりの深い平滑筋細胞においても、LOX-1のアンタゴニスト活性と共に輸送阻害、あるいは他のスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取り込み抑制能を有することにより、多面的な阻害剤であることが示唆された。
なお、ヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンIIIについてもフェオフォルバイドaと類似の阻害傾向が見られた。【００８２】
上記の動脈硬化抑制剤の食品組成物、医薬組成物中への添加量は、前記組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が好ましく、具体的には有効濃度等を考えた上、５〜１０ｍｇで添加することにより、安全性と有効性が両立できる。例えば、食品組成物、医薬組成物の配合例としては、以下のものが挙げられる。【００８３】
（実施例９）
キャンディへの配合例
砂糖６４ｇ、水飴３５ｇを１５０℃で加熱溶解し、１２０℃に冷却後、クエン酸１ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを添加、攪拌後、均一としたものを成型し、冷却してキャンディを得た。【００８４】
（実施例１０）
グミへの配合例
砂糖４５ｇ、水飴５０ｇを１１０℃で加熱溶解し、別途膨潤溶解させたゼラチン８ｇを添加し、さらにクエン酸２ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを添加混合し、型に流し込み、一昼夜静置後、型からはずして、グミを得た。【００８５】
（実施例１１）
錠剤への配合例
デキストリン２０ｇ、乳糖１０ｇ、パラチノース１５ｇ、バレイショデンプン４０ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを均一に混合し、得られた組成物を流動法で造粒してから乾燥し、さらに打錠機にて打錠して錠剤を得た。【００８６】
（実施例１２）
カプセル剤への配合例
スクワレン２０ｇ、リノレン酸トリグリセリド２０ｇ、小麦胚芽油１０ｇ、精製イワシ油２０ｇ、トコフェノール０．２ｇを混合攪拌し、均一な組成物とした。この組成物に脱脂大豆粉末３９.８ｇと動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを加えてニーダーにより十分に混練した。得られた混練物をカプセル充填機によりカプセル化してカプセル剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の動脈硬化抑制剤は、酸化LDL受容体であるLOX-1への酸化LDLの結合を阻害するアンタゴニスト作用、LOX-1とLOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した脂質取り込み抑制作用、あるいはカベオラ経由での細胞内へのエンドサイトーシスによる酸化LDL取り込み阻害能に優れ、また、血管内皮細胞等の動脈硬化症に関連する細胞への酸化LDLの取り込みが継続的に阻害されることで、結果としてヒトあるいは非ヒト動物における動脈硬化症の発症を抑えたり、また症状を緩和することが期待できる。【００８８】
本明細書に包含される本発明の多くの利点を上記に述べたが、この開示は、多くの点で例示に過ぎないことが理解されよう。本発明の範囲を逸脱しなければ、細部にわたり、特に、部品の形状、大きさ及び配置等の事項について、様々な変更を行うことが可能である。
本発明の範囲が添付の請求の範囲に述べられている文言により限定されることは勿論である。
【図１】
2008001884.tif 000013
【図２】
2008001884.tif 000014
【図３】
2008001884.tif 000015
【図４】
2008001884.tif 000016
【図５】
2008001884.tif 000017
【図６】
2008001884.tif 000018
【図７】
2008001884.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月30日(2008.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2008001884.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤。
【請求項２】
式（２）：
【化２】
2008001884.tif 000021
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８はそれぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤。
【請求項３】
前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフェオフォルバイドａ及びエチルフェオフォルバイドａである請求項１記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項４】
前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンＩＩＩである請求項２記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項５】
ＬＯＸ−１以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する請求項１〜４いずれか記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項６】
カベオラを経由した細胞内への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する請求項１〜４いずれか記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
式（１）：
【化３】
2008001884.tif 000022
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
あるいは、式（２）：
【化４】
2008001884.tif 000023
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有するレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１０】
前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフェオフォルバイドａおよびエチルフェオフォルバイドａである請求項９記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１１】
前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がヘマトポルフィリンおよびウロポルフィリンＩＩＩである請求項９記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１２】
ＬＯＸ−１以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する請求項９〜１１いずれか記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１３】
カベオラを経由した細胞内への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する請求項９〜１１いずれか記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤。
【請求項１４】
請求項９〜１３いずれか記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤を含有する食品組成物。
【請求項１５】
請求項９〜１３いずれか記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
動脈硬化抑制剤を製造するための式（１）：
【化５】
2008001884.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８はそれぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）、
あるいは、式（２）：
【化６】
2008001884.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和の１〜４個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され；Ｒ３からＲ８は直鎖状の飽和若しくは不飽和の１〜２個の炭素原子を有する炭化水素基若しくは、ホルミル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
［０００１］
本発明は、動脈硬化抑制剤、アンタゴニスト作用剤、及びこれを含む食品組成物、又はこれを含む医薬組成物に関する。
背景技術
［０００２］
動脈硬化症は、近年、過脂肪食や運動不足を主な要因とする肥満症が最上流であるメタボリックシンドロームの下流に位置する症状であるとの認識がコンセンサスになりつつあり、この動脈硬化症がさらに進行することにより血栓を形成し、心疾患・脳血管疾患の原因となる。
［０００３］
ところで、日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍及び癌）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患となっているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約２８％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である約３０％にほぼ匹敵する（平成１７年（２００５年））。悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見・早期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。ところが上述のように、生活習慣病に起因する肥満症・動脈硬化症の下流に位置する心疾患・脳血管疾患については、食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、日常的に摂取可能な形態を用いることでの対処方法が望ましい。
［０００４］
動脈硬化症において、食生活を含めた食品学的なアプローチが重要であることは上述の通りであるが、複雑・多岐なプロセスにおいてどの作用機序をターゲットにするかは重要である。動脈硬化症は酸化ストレス等による低密度リポ蛋白質（Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＤＬ）の変性、血管内皮細胞への取り込みによる血管内皮機能障害を発症の端緒としており、その後のシーケンシャルなプロセスとしてマクロファージや血管平滑筋の分化・脱分化による泡沫化現象を呈する。そして最終的には狭窄性病変を経て血栓形成となる。つまり、予防学的観点から考えれば、初期病変である酸化ストレス等による脂質の変性、あるいは変性ＬＤＬが血管内皮細胞に取り込まれることに
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
非特許文献１３：Ｋａｒｉｏｌａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００５）；１７：２８２−９４
非特許文献１４：Ｒｏｂｅｙ  Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００４）；６４：１２４２−６
非特許文献１５：Ｋｉｍｕｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｏｔｏｍｅｄ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８１）；３：７３
非特許文献１６：Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｔａｓａｔｏ  Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）；６１：２０１−１３
非特許文献１７：Ａｐｒａｈａｍｉａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（１９９３）；８：１０１−１４
発明の開示
発明が解決しようとする課題
［００１０］
本発明は、上記観点からなされたものであり、血管内皮細胞、平滑筋細胞等で発現されているＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつＬＯＸ−１を介した酸化ＬＤＬの細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を有し、かつ安全性が高い動脈硬化抑制剤、アンタゴニスト作用剤、及びこれらを含有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
また、本発明は、ＬＯＸ−１以外の他のスカベンジャー受容体を介した酸化ＬＤＬの取り込み抑制能をも有し、さらにカベオラを経由した細胞内へのリポプロテインのエンドサイトーシスをも抑制するという、多面的な効果を奏する動脈硬化抑制剤、アンタゴニスト作用剤、及びこれを含有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
［００１１］
本発明者は、上記課題を解決するために、ＬＯＸ−１に対するアンタゴニスト作用を有し、ＬＯＸ−１以外のスカベンジャー受容体を含めた酸化ＬＤＬ取り込み抑制能に優れた成分をスクリーニングにより鋭意探索した。その結果、ポルフィリン骨格を有する化合物に顕著なアンタゴニスト作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、この化合物にはエンドサイトーシスによる細胞内へのリポプロテインの取り込みをも抑制するという作用も見出した。
［００１２］
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕式（１）：
［００１３］
［化１］
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
〕〜〔４〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤、
〔７〕  式（１）あるいは式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有するレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用剤（以下、ＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤と略す）、
〔８〕  前記式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフェオフォルバイドａおよびエチルフェオフォルバイドａである前記〔７〕記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤、
〔９〕  前記式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物がヘマトポルフィリンおよびウロポルフィリンＩＩＩである前記〔７〕記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤、
〔１０〕  ＬＯＸ−１以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する前記〔７〕〜〔９〕いずれか記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤、
〔１１〕  カベオラを経由した細胞内への酸化ＬＤＬの取り込み抑制作用を有する前記〔７〕〜〔９〕いずれか記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤、
〔１２〕  前記〔７〕〜〔１１〕いずれか記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤を含有する食品組成物、
〔１３〕  前記〔７〕〜〔１１〕いずれか記載のＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤を含有する医薬組成物、
〔１４〕  動脈硬化抑制剤を製造するための式（１）あるいは式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類の使用
に関する。
［００１７］
なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価した場合に、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつ酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害することを意味する。
発明の効果
［００１８］
本発明の化合物を用いることで、動脈硬化症の初期病変に関わりの深い酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）を介する酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを顕著に阻害することができるという効果が奏される。
図面の簡単な説明
［００１９］
［図１］図１は、エチルフェオフォルバイドａ（Ｅｔｈｙｌ  ｐｈｅｏｈｏｒｂｉｄｅ  ａ）、フェオフォルバイドａ（Ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ  ａ）、クロロフィルａ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ）、クロロフィルｂ、シアノコバラミン（Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ヘミン（Ｈａｅｍｉｎ）、ヘマチン（Ｈｅｍａｔｉｎ）、ヘマトポルフィリン（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ウロポルフィリンＩＩＩ（Ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＩＩ）、ポルフォビリノーゲン（Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ）、フェオフィチンａ（Ｐｈｅｏｐｈｙｔｉｎ  ａ）、フェオフィチンｂ、Ｍｇ２＋を用いた場合の酸化ＬＤＬのｂＬＯＸ−１、への結合率の結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、プレート上に固定化されたＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合量を相対値で示しており、コントロールは化合物を含まない処理区の値を１００として、酸化ＬＤＬを含まない処理区の値を０として換算している。また、各化合物は、終濃度１６μＭになるように添加した。
［図２］図２は、後述の実施例１〜４のうち高いアンタゴニスト活性を有したフェオフォルバイドａについて濃度依存性を検討した結果を示すグラフである。全ての希釈系列において、同濃度のＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；和光純薬）が添加されている。
［図３］図３、ｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬの結合率の結果を示している。グラフの縦軸は
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
［００３２］
本発明においては、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物などが用いられるが、これらのポルフィリン系誘導体化合物は、クロロフィル、シアノコバラミン、ヘミン、ヘマチン、ポルフォビリノーゲンなどの構造が類似しているポルフィリン系化合物とは相違したアンタゴニスト活性を有する。このようにポルフィリン系化合物間でアンタゴニスト活性が相違している理由としては、明確ではないが、例えば、式（１）で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、エステル鎖の炭素数が他の類似の化合物と比べて短いため、エステル鎖が短いほど活性が向上すると考えられる。
また、式（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、ポルフィリン環に金属原子とキレートしていないため、活性の発現に金属原子とのキレートは必要ないと考えられる。
また、後述の実施例に記載のようにフェオフォルバイドａは、さらにカベオラを経由した細胞内への酸化ＬＤＬの取り込みも阻害する。
［００３３］
本発明の動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤は、前記式（１）又は（２）で表されるポルフィリン系誘導体化合物を含有するが、前記ポルフィリン系誘導体化合物のみでもよいし、アンタゴニスト活性を妨げないのであれば、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、特に限定はない。
［００３４］
また、本発明の動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤は、食品・医薬品などの組成物に、公知の技術を用いて、配合することができる。この場合、前記組成物をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設定すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材が、食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。ただし、フェオフォルバイドａは光過敏症の原因因子とも言われていることから、その配合量としては組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が望ましい。
［００３５］
また、食品としては、一般食品として、種々の食品原料に前記化合物の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、前記化合物をそのまま、あるいは食べ易い状態にして使用することができる。
［００３６］
また、医薬品としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤等が挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤等と共に
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
通常の方法に従って製剤すればよい。
［００３７］
これらの組成物における、上記動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢等により異なるが、成人１人あたりの摂取量が０．１ｍｇ／ｋｇ・日以下となるように、１回ないし数回に分けて被検体に投与するのが好ましい。
［００３８］
なお、本発明において標的としているＬＯＸ−１は、ヒトや非ヒトの哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の哺乳動物など）の血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在しており、それぞれの細胞に酸化ＬＤＬが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明の動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤は、血管内皮細胞などの動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化ＬＤＬの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。
［００３９］
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例
［００４０］
なお、実施例で用いた試料は、以下のようにして調製した。
１．ｂＬＯＸ−１、ｈＬＯＸ−１のｃＤＮＡ
前記ｂＬＯＸ−１、ｈＬＯＸ−１のｃＤＮＡクローニングは、前記非特許文献４に記載の方法に準じて行った。
即ち、ｂＬＯＸ−１については、血管内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーより各独立したクローンを発現ベクターに組み込み、ＣＯＳ−７での一過性発現を行った。その後、ＤｉＩ−ＯｘＬＤＬとの共培養後にセルソーターによるＤｉＩポジティブの分離を行い、プラスミドを回収した。このスクリーニング方法を３回繰り返し、シングルクローンを単離した。
［００４１］
また、ｈＬＯＸ−１については、ランダムプライマーとオリゴｄＴプライマーによりヒト肺のｃＤＮＡライブラリーから増幅を行った。全長ｂＬＯＸｃＤＮＡを用いてポジティブスクリーニングを行い、部分断片のｈＬＯＸｃＤＮＡを取得後、５’−ＲＡＣＥによる上流配列の取得を行った。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
［００８１］
図７は実施例８により得られた試験結果を示す。ポルフォビリノーゲン（Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｌｉｎｏｇｅｎ）用した。このように、内皮細胞同様に平滑筋細胞においてもフェオフォルバイドａは非常に強い取り込み抑制能を示し、且つ抗ＬＯＸ−１抗体以上の抑制効果を示した。よってこれらの結果からもフェオフォルバイドａは、内皮細胞、マクロファージと同様に変性ＬＤＬの取り込みを行い動脈硬化症の初期病変と関わりの深い平滑筋細胞においても、ＬＯＸ−１のアンタゴニスト活性と共に輸送阻害、あるいは他のスカベンジャー受容体を介した酸化ＬＤＬの取り込み抑制能を有することにより、多面的な阻害剤であることが示唆された。
なお、ヘマトポルフィリン及びウロポルフィリンＩＩＩについてもフェオフォルバイドａと類似の阻害傾向が見られた。
［００８２］
上記の動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤の食品組成物、医薬組成物中への添加量は、前記組成物１００ｇあたり１００ｍｇ以下が好ましく、具体的には有効濃度等を考えた上、５〜１０ｍｇで添加することにより、安全性と有効性が両立できる。例えば、食品組成物、医薬組成物の配合例としては、以下のものが挙げられる。
［００８３］
（実施例９）
キャンディへの配合例
砂糖６４ｇ、水飴３５ｇを１５０℃で加熱溶解し、１２０℃に冷却後、クエン酸１ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを添加、攪拌後、均一としたものを成型し、冷却してキャンディを得た。
［００８４］
（実施例１０）
グミへの配合例
砂糖４５ｇ、水飴５０ｇを１１０℃で加熱溶解し、別途膨潤溶解させたゼラチン８ｇを添加し、さらにクエン酸２ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを添加混合し、型に流し込み、一昼夜静置後、型からはずして、グミを得た。
［００８５］
（実施例１１）
錠剤への配合例
デキストリン２０ｇ、乳糖１０ｇ、パラチノース１５ｇ、バレイショデンプン４０ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｇ、動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを均一に混合し、得られた組成物を
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
流動法で造粒してから乾燥し、さらに打錠機にて打錠して錠剤を得た。
［００８６］
（実施例１２）
カプセル剤への配合例
スクワレン２０ｇ、リノレン酸トリグリセリド２０ｇ、小麦胚芽油１０ｇ、精製イワシ油２０ｇ、トコフェノール０．２ｇを混合攪拌し、均一な組成物とした。この組成物に脱脂大豆粉末３９．８ｇと動脈硬化抑制剤５〜１０ｍｇを加えてニーダーにより十分に混練した。得られた混練物をカプセル充填機によりカプセル化してカプセル剤を得た。
産業上の利用可能性
［００８７］
（実施例１２）
本発明の動脈硬化抑制剤又はＬＯＸ−１アンタゴニスト作用剤は、酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬの結合を阻害するアンタゴニスト作用、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１以外のスカベンジャー受容体を介した脂質取り込み抑制作用、あるいはカベオラ経由での細胞内のエンドサイトーシスによる酸化ＬＤＬ取り込み阻害能に優れ、また、血管内皮細胞等の動脈硬化症に関連する細胞への酸化ＬＤＬの取り込みが継続的に阻害されることで、結果としてヒトあるいは非ヒト動物における動脈硬化症の発症を抑えたり、また症状を緩和することが期待できる。
［００８８］
本明細書に包含される本発明の多くの利点を上記に述べたが、この開示は、多くの点で例示に過ぎないことが理解されよう。本発明の範囲を逸脱しなければ、細部にわたり、特に、部品の形状、大きさ及び配置等の事項について、様々な変更を行うことが可能である。
本発明の範囲が添付の請求の範囲に述べられている文言により限定されることは勿論である。
【国際調査報告】
2008001884.tif 000026
2008001884.tif 000027
2008001884.tif 000028
2008001884.tif 000029
2008001884.tif 000030