(57)【要約】血管形成または血管新生を抑制する方法および組成物、ならびに血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である方法および組成物を提供する。  本発明の組成物は、有効量のエフリンＢ２を含み、そして本発明の方法は、有効量のエフリンＢ２を投与する工程を含む。本発明の組成物および方法は、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である。本発明の組成物および方法はまた、網膜からの血管新生を抑制し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む、動脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ合成が、血管内皮細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、または血小板由来増殖因子によって誘導される、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む、動脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害する方法。
【請求項４】
前記ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化が、血管内皮細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、または血小板由来増殖因子によって誘導される、請求の範囲３に記載の方法。
【請求項５】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む、動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害する方法。
【請求項６】
前記脈管形成が、血管内皮細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、または血小板由来増殖因子によって誘導される、請求の範囲５に記載の方法。
【請求項７】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記動脈内皮細胞を有する哺乳動物に前記エフリンＢ２を投与することにより行われる、請求の範囲１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
網膜からの血管新生を抑制する方法であって、有効量のエフリンＢ２を個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記個体が、網膜外に病的な血管形成または血管新生を有するか、または生じる可能性がある個体である、請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１１】
血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置方法であって、該処置の必要のある個体に有効量のエフリンＢ２を投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症からなる群から選択される、請求の範囲１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲９から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞のＤＮＡ合成を阻害するための組成物。
【請求項１６】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞のｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための組成物。
【請求項１７】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための組成物。
【請求項１８】
有効量のエフリンＢ２を含む、網膜からの血管新生を抑制するための組成物。
【請求項１９】
有効量のエフリンＢ２を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置のための薬学的組成物。
【請求項２０】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症からなる群から選択される、請求の範囲１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求の範囲２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメイン
および膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲１５から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞のＤＮＡ合成阻害剤。
【請求項２４】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞のｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化阻害剤。
【請求項２５】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞からの脈管形成阻害剤。
【請求項２６】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメイン
および膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲２３から２５のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項２７】
有効量のエフリンＢ２を含む、網膜血管新生抑制剤。
【請求項２８】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメイン
および膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲２７に記載の抑制剤。
【請求項２９】
有効量のエフリンＢ２を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の予防・治療剤。
【請求項３０】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症からなる群から選択される、請求の範囲２９に記載の予防・治療剤。
【請求項３１】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求の範囲３０に記載の予防・治療剤。
【請求項３２】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメイン
および膜貫通ドメインを含まない、請求の範囲２９から３１のいずれかに記載の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成または血管新生を抑制する方法および組成物に関し、そしてより特定するとその方法および組成物におけるエフリンＢ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症のような種々の眼病理症状の顕著な特徴である。血管形成カスケードは、多くのメディエータおよびケモカインによって引き起こされる。例えば、多段階血管形成プロセスに関連する内皮細胞受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、血管形成の重要なメディエータとして認識されている。最初に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む血管形成サイトカインが生成し、これは、毛細血管の発生の概念によく当てはまる事象である。近年、アンジオポエチン／Ｔｉｅ２系が、血管アセンブリおよび成熟を媒介するリガンド−レセプター系として同定されている。また、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプターおよびアンジオポエチン／Ｔｉｅ２ファミリーもＲＴＫに属する。
エフリンのレセプターであるＥｐｈレセプターは、８つのＥｐｈＡレセプターおよび６つのＥｐｈＢレセプターからなり、チロシンキナーゼレセプターの最大のファミリーを含む。このＥｐｈレセプターチロシンキナーゼファミリーはＲＴＫの新しいクラスを表す。このファミリーは、元来、神経経路開拓分子として同定されているが、その血管形成における役割は不明である。ノックアウトマウスおよび成熟エフリンＢ２−ｌａｃＺトランスジェニックマウス実験では、ＥｐｈＢレセプターおよびエフリンＢリガンドが、動静脈分化および境界形成を編成する血管アセンブリの重要なレギュレーターとして同定されている（非特許文献２、３、５）。一方、遺伝子ターゲティング実験では、エフリンＢ２が、動脈内皮細胞の初期マーカーであり、そのレセプターであるＥｐｈＢ４が脊椎動物胚においては静脈内皮細胞のマーカーであることが明らかにされている（非特許文献１、２、４、６）。さらに、成人における内皮細胞は、その非対称的動静脈発現パターンを維持し、これは、エフリンＢ／ＥｐｈＢ系が、血管ホメオスタシスを制御する役割をし、そして成人において病理学的血管形成を制御する可能性を有することを示唆している（非特許文献３、５）。Ｅｐｈレセプターのアンタゴニスト（例えば、抗体）の投与により主として癌の血管新生を阻害し、一方アゴニストの投与により血管新生を刺激することも報告されている（特許文献１）。したがって、エフリンの作用の態様を決定すること、ならびに特に病理学的状態において血管系を操作するためにこれらの分子を使用し得る手段が所望される。
糖尿病性網膜症は、米国において２０〜６５歳の人の失明の主要な原因である。糖尿病性網膜症の必須の病態は、網膜の微小血管症およびそれに続く虚血である。網膜症における低酸素状態が網膜血管新生を導くことは、周知である。しかし、網膜血管新生により新規に形成された脈管では、血流が灌流せず、網膜は虚血状態となる。なぜなら、これらの脈管は未熟でかつ漏出性であるからである。さらに、これらの脈管は、しばしば、硝子体眼房に貫通する。糖尿病性網膜症の理想の治療は、このような伸展の方向性の間違った血管の新生を抑制し、そして虚血網膜を灌流し、かつ低酸素症から救助し得る成熟した脈管を得ることである。
加齢黄斑変性症は、欧米の成人失明原因の第一位で、日本でも三大原因の一つである。黄斑に脈絡膜から新生血管の進入が起こることが病態の本質であり、この異常な新生血管からの出血、網膜剥離などにより、社会的失明にいたる。したがって、この異常な新生血管の発生を抑制することは、視機能の維持に本質的な治療法である。新生血管の伸展は、色素上皮が新生血管を覆うことにより抑制されることが公知であるが、その作用機構はまだよく知られていない。
参考文献
以下の文献は，参考文献として本出願に取り込まれる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１３６９８３号明細書
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｈ．ら，（２００１）Ｃｅｌｌ，１０４巻，１号，５７−６９頁
【非特許文献２】Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｈ．ら，（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３巻，３号，２９５−３０６頁
【非特許文献３】Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．ら，（２００１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２３０巻，２号，１５１−１６０頁
【非特許文献４】Ｇｅｒｅｔｙ，Ｓ．Ｓ．ら，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４巻，３号，４０３−４１４頁
【非特許文献５】Ａ  Ｓｈｉｎ，Ｄ．ら，（２００１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２３０巻，２号，１３９−１５０頁
【非特許文献６】Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｕ．ら，（１９９８）Ｃｅｌｌ，９３巻，５号，７４１−７５３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、血管形成または血管新生を抑制する方法，組成物及び予防・治療剤を提供することを目的とする。本発明は、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である方法，組成物及び予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるＤＮＡ合成を阻害する方法を提供し、当該方法は、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、上記ＤＮＡ合成は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）によって誘導される。
本発明はまた、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるｐ４４／ｐ４２
ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害する方法を提供し、当該方法は、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、上記ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦによって誘導される。
本発明はまた、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）からの脈管形成を阻害する方法を提供し、当該方法は、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、上記脈管形成は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦによって誘導される。
一つの実施形態では、上記接触工程は、上記エフリンＢ２を、上記動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）を有する哺乳動物に投与することにより行われる。
本発明はまた、網膜からの血管新生を抑制する方法を提供し、当該方法は、有効量のエフリンＢ２を個体に投与する工程を含む。
一つの実施形態では、上記個体は、網膜外に病的な血管形成または血管新生を有するか、または生じる可能性がある個体である。
本発明はまた、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置方法を提供し、当該方法は、該処置の必要のある個体に有効量のエフリンＢ２を投与する工程を含む。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）のＤＮＡ合成を阻害するための組成物を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）のｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための組成物を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）からの脈管形成を阻害するための組成物を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、網膜からの血管新生を抑制するための組成物を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置のための薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）のＤＮＡ合成阻害剤を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）のｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化阻害剤を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）からの脈管形成阻害剤を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、網膜血管新生抑制剤を提供する。
本発明はまた、有効量のエフリンＢ２を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤を提供する。
一つの実施形態では、上記方法、組成物、ならびに阻害剤、抑制剤、および予防・治療剤において、上記エフリンＢ２は、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない。
別の実施形態では、上記方法、組成物、ならびに阻害剤、抑制剤、および予防・治療剤において、上記疾患または障害は、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、上記方法、組成物、ならびに阻害剤、抑制剤、および予防・治療剤において、上記疾患または障害は、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、血管形成または血管新生を抑制する方法および組成物が提供される。本発明の組成物および方法は、生理的な血流を抑えることなく、病的な血管形成または血管新生を抑制し得る。本発明の組成物および方法は、正常な血管に影響を及ぼすことがないため、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢを処理したＨＡｏＥＣにおけるエフリンＢ２処理およびＥｐｈＢ４処理によるチミジン取り込みの影響を表すグラフである。
図１Ｂは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢを処理したＨＵＶＥＣにおけるエフリンＢ２処理およびＥｐｈＢ４処理によるチミジン取り込みの影響を表すグラフである。
図１Ｃは、コントロール（未処理）、ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４のいずれかでの処理、またはｓエフリンＢ２とｓＥｐｈＢ４との両方の処理を行ってから７日後のＶＥＧＦ刺激した内皮細胞の形態を示す写真である。
図２Ａは、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激したＨＡｏＥＣにおけるＥＲＫリン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す電気泳動写真である。
図２Ｂは、ＶＥＧＦ刺激したＨＡｏＥＣにおけるＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）自動リン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す電気泳動写真である。
図３は、ｂＦＧＦとエフリンＢ２とを同時投与したマウス角膜における血管新生の定量分析の結果を示すグラフである。
図４は、コントロール（Ａ）およびｓエフリンＢ処理モデル（Ｂ）のフラットマウントしたフルオレセイン−デキストラン灌流網膜の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
図５は、コントロールモデル（ＯＩＲ）およびｓエフリンＢ２処理モデル（ＯＩＲ＋エフリンＢ２）の無灌流領域面積比を示すグラフである。
図６は、コントロールモデル（ＯＩＲ）（Ａ）およびｓエフリンＢ２処理モデル（ＯＩＲ＋エフリンＢ２）（Ｂ）のＰ１７新生児マウスの網膜表面の形態を示す走査型電子顕微鏡写真である。
図７は、ｂＦＧＦ処理によるＨＵＶＥＣにおいて、マウスエフリンＢ２処理およびヒトエフリンＢ２処理によるチミジン取り込みの影響を表すグラフである。
図８は、１０ｎｇ／ｍＬのヒトエフリンＢ２処理（Ａ）、ＰＢＳ処理（Ｂ）、および１０ｎｇ／ｍＬのマウスエフリンＢ２処理（Ｃ）を施した眼底の状態を示す蛍光写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４系は、脈管形成および血管形成に重要な役割を果たす。本発明は、エフリンＢ２が、内皮細胞（ＥＣ）のＤＮＡ合成、ならびにＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方で誘導されるｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を抑制することを見い出したことに基づく。エフリンＢ２はまた、ＥＣによる脈管形成も阻害する。さらに、マウスにおける角膜のマイクロポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量によれば、エフリンＢ２は、ｂＦＧＦで誘導された角膜血管形成を抑制する。そのため、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４およびその抗血管形成シグナリング経路をターゲティングすることにより、血管形成依存的疾患を治療し得る。
さらに詳細に本発明を説明する前に、本明細書で使用される用語を、他に指示がない限り以下のように定義する。
（定義）
用語「エフリンＢ２」とは、他に指定がない限り、（１）天然のエフリンＢ２またはその細胞外ドメイン、好ましくは天然のヒトエフリンＢ２と、実質的な配列類似性を有し；そして（２）天然のエフリンＢ２または細胞外ドメインが関与する生物学的活性を有する、ポリペプチドをいう、用語「エフリンＢ２」には、天然のエフリンＢ２（好ましくは天然のヒトエフリンＢ２）およびその細胞外ドメイン、ならびに上記天然のエフリンＢ２または細胞外ドメインの生物学的活性を有するそれらのアナログおよび改変体が含まれる。なお、エフリンＢ２の配列は、当該分野で公知であり、当業者は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの配列および位置を十分に認識できる。
天然のエフリンＢ２のような「天然の」分子は、人工的な介入なく天然に存在する分子である。しかし、天然のエフリンＢ２はまた、人工的な介入なく存在するエフリンＢ２の細胞外ドメインであり得る。
「全長」エフリンＢ２は、細胞外および細胞内の両方のドメインを含むエフリンＢ２である。全長エフリンＢ２は、天然に存在し得、あるいは天然のエフリンＢ２のアナログまたは改変体であり得る。
天然の分子と「実質的な配列類似性」を有するポリペプチドは、天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約３０％同一である。ポリペプチドは、好ましくは、天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、およびなお好ましくは少なくとも約９８％同一、さらに好ましくは約９９％同一、よりさらに好ましくは１００％同一である。
天然の分子とのアナログまたは改変体の用語「パーセント同一性」または「％同一性」とは、２つの配列をアラインした場合に、アナログまたは改変体においても見られる天然分子におけるアミノ酸配列のパーセントをいう。パーセント同一性は、ＬＡＬＩＧＮ、Ｃｌｕｓｔａ１Ｗ、またはＢＬＡＳＴのような当該技術分野で確立された任意の方法またはアルゴリズムによって決定され得る。
ポリペプチドは、天然のエフリンＢ２に対するレセプターに結合し得る場合、あるいはＥＣのＤＮＡ合成、ＥＣにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化、ＥＣ脈管形成、血管形成、または血管新生を阻害し得る場合、天然のエフリンＢ２が関与する「生物学的活性」を有する。ＥＣのＤＮＡ合成、ＥＣにおけるＥＲＫリン酸化、ＥＣ脈管形成、血管形成、または血管新生を阻害する活性は、例えば、本明細書に記載のように、当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。
「有効量」とは、所望の目的を達成するに十分な物質の量である。例えば、ＤＮＡ合成を阻害するためのエフリンＢ２の有効量は、インビボまたはインビトロの場合に応じて、ＤＮＡ合成の量を減少させるに十分な量である。疾患または障害を処置するためのエフリンＢ２の有効量は、疾患または障害の徴候を低減または除去するか、または疾患または障害を予防または遅延させるに十分なエフリンＢ２の量である。所定の物質の有効量は、物質の性質、投与経路、物質を受容する動物のサイズおよび種、ならびに物質を与える目的などの因子で変動する。各場合の有効量は、当該技術分野で確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
用語「個体」とは、任意の動物をいい、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり、より好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、または霊長類、さらに好ましくは、ヒトをいう。
「病的な血管形成または血管新生」は、生理学的に正常な状態でない血管の形成または新生であり得る。このような血管は、未熟であり、漏出性であるため、血液を灌流し得ないような血管となり得る。また、「病的な血管形成または血管新生」とは、生理学的に正常な状態とは異なる様式での血管形成または新生であり得る。例えば、炎症などの刺激を受けることにより、新たに血管が形成されることをも意味する。
「病的な血管形成または血管新生を有するか、または生じる可能性がある個体」とは、上記のような血管形成または血管新生が既に生じている個体、あるいはそのような血管形成または血管新生を生じる要因を有し得る個体をいう。後者の個体は、「病的な血管形成または血管新生」を生じるという徴候を示し得る疾患または障害に罹患しているがまだそのような徴候を示していない個体、「病的な血管形成または血管新生」を生じるような刺激を受けた個体などであり得る。
「病的な血管形成または血管新生」は「網膜内」または「網膜外」に生じ得る。「網膜外」とは、網膜の組織外部をいう。このような血管形成または血管新生には、例えば、網膜から内境界膜を貫通して硝子体内に向かう血管の形成または新生、および網膜から脈絡膜へと向かう血管の形成または新生がある。
用語「血管形成または血管新生に関連する疾患または障害」は、上記の「病的な血管形成または血管新生」を生じるか、または「病的な血管形成または血管新生」に起因して個体に変調をきたす、いかなる疾患または障害をも指す。このような疾患または障害としては、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症が挙げられるが、これらに限定されない。
疾患または障害の「処置」とは、疾患または障害の徴候の低減または完全な除去（「治療」ともいう）、または疾患または障害の発症を予防または遅延させることをいう。
用語「処置の必要がある」とは、個体が処置の利益を得るとの、治療奉仕者（例えば、ヒトに対しては、医師、看護士、臨床看護士など；動物（非ヒト哺乳動物を含む）のに対しては、獣医）によりなされる判断をいう。この判断は、種々の要因に基づいてなされ、これらの要因は、治療奉仕者の意見の領域内にあるが、任意の組成物により処置可能である状態の結果として、その個体が現在病気であるかまたは将来的に病気になり得るとの認識を含む。
用語「組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含み、そしてこの組成物が適用または投与される対象の細胞、組織、器官または動物（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、または霊長類、さらに好ましくは、ヒト）において、当該活性成分の有する効果を発揮させることを目的とする物質の組み合わせをいう。当業者は、活性成分が、当業者の必要性に基づいて所望とされる効果的な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解し認識する。
「薬学的組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含み、そして動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、または霊長類、さらに好ましくは、ヒトにおいて、当該活性成分の有する薬学的効果を発揮させることを目的とする物質の組み合わせをいう。当業者は、活性成分が、当業者の必要性に基づいて所望とされる効果的な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解し認識する。
用語「阻害剤」、「抑制剤」、および「予防・治療剤」は、少なくとも１つの活性成分が、当該活性成分の有する効果を発揮するための適用または投与に適した形態に調製されたものをいう。これらは、この組成物が適用または投与される対象の細胞、組織、器官または動物（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、または霊長類、さらに好ましくは、ヒト）において、活性成分の有する効果を発揮し得る。
（内皮細胞に対するエフリンＢ２の効果）
内皮細胞は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰＤＧＦのＢサブユニット二量体）のような増殖因子に応じて、増殖が誘導され得る。動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）において、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢのすべての刺激によって誘導されたＤＮＡ合成を阻害する。例えば、図１Ａに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＤＮＡ合成の増加量は、２００ｎｇ／ｍＬのエフリンＢ２によってそれぞれ４０％、３０％、および９０％阻害される。あるいは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においても、ほとんど同一の結果が得られる（図１Ｂ参照）。エフリンＢ２によるＤＮＡ合成の阻害は、アポトーシスによって引き起こされるのではない。
このように、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＤＧＦを含む種々の刺激によって誘導されるＥＣのＤＮＡ合成を阻害し得る。エフリンＢ２のレセプター（ＥｐｈＢ４）は、静脈内皮細胞のマーカーであるが、このレセプターが動脈内皮細胞に存在することが知られていないにもかかわらず、ＤＮＡ合成は静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害される。
なお、ＶＥＧＦ誘導脈管形成は、ＥｐｈＢ４処理によって影響を受けない。
エフリンＢ２は、増殖因子誘導有糸分裂応答を阻害する。これは、エフリンＢ２が、動脈および静脈の両方の内皮細胞において、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方で誘導したＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化を抑制することによる。しかし、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦレセプター２自動リン酸化を阻害せず、これは、ＶＥＧＦ機能を阻害するためのメカニズムのように、ＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプター２との間のシグナル伝達を妨害しないことを示す。したがって、エフリンＢ２は、動脈または静脈のいずれかの内皮細胞においてＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ誘導ＥＲＫリン酸化を阻害するために使用され得る。
ｂＦＧＦは、強力な血管形成因子である。エフリンＢ２は、このｂＦＧＦによって誘導されるＥＣ細胞増殖を阻害し得る。エフリンＢ２の投与は、ｂＦＧＦによって誘導される血管形成を顕著にブロックする。なお、ＥｐｈＢ４の投与では顕著な効果を示さない。
（インビボモデルにおけるエフリンＢ２の効果）
角膜マイクロポケットアッセイは、代表的な血管新生のインビボモデルである。このモデルにおいて、エフリンＢ２を投与することにより、ｂＦＧＦによって誘導された血管形成は、顕著にブロックされ得る。なお、ＥｐｈＢ４の投与では効果を示さない。
酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）モデルは、糖尿病性網膜症の動物モデルである。この動物モデルにおいて、エフリンＢ２は、網膜外に向かう病的な血管形成または血管新生を抑制し、かつ網膜中の血管網の形成および血管成熟を増強し得る。
レーザー誘導による脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルは、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の実験的疾患モデルと位置づけられている。エフリンＢ２は、このＣＮＶを抑制し得る。
このように、エフリンＢ２は、網膜内の生理的な血流を抑えることなく、網膜外に向かう病的な新生血管（例えば、脈絡膜新生血管、内境界膜貫通新生血管）の新生を抑制し得る。そのため、エフリンＢ２は、生理的な血流を抑えることなく、病的な血管形成または血管新生を抑制するために使用され得る。したがって、エフリンＢ２は、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症、ならびに血管形成または血管新生に関連する他の疾患または障害の処置に有用である。
一つの実施形態では、エフリンＢ２は、眼における血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である。エフリンＢ２は、主として現在使用されている光線力学的療法（ＰＤＴ）および種々の抗血管形成薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ剤）による治療によって通常引き起こされるような、網膜の生理学的血流へのダメージを生じない。したがって、エフリンＢ２を用いることにより、例えば、網膜の生理学的血流にダメージを与えることなく、病的な脈絡膜血管新生を抑制することによって、湿潤および初期乾燥のＡＭＤを治療し得る。また、網膜の生理学的血流にダメージを与えることなく、病的な内境界膜貫通血管新生を抑制することによって、糖尿病性網膜症を治療し得る。
（エフリンＢ２の使用および投与）
本発明に有用であるエフリンＢ２は、アナログおよび改変体を含む任意のエフリンＢ２であり得、必要とされる活性を有する。エフリンＢ２は、本発明の効果を有する限り、その構造は限定されない。エフリンＢ２は、細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび細胞膜ドメインを含まないものであっても、あるいは全長であってもよい。また、より短縮化した断片であってもよい。
本発明において使用されるエフリンＢ２は、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであっても、遺伝子組換えにより微生物などから生成されたものであってもよい。例えば、米国特許第６，３０３，７６９号もしくはＭｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ；３２（１６）：１１９７−２０５に記載のヒトエフリンＢ２  ｃＤＮＡの配列を参照して、慣用の技術を用いて、全長タンパク質、細胞外ドメインを含むタンパク質などを作製し得る。当業者はまた、当業者が通常用いる技術を用いることにより、天然のエフリンＢ２を好ましく改変することもできる。また、エフリンＢ２は、医薬品や試薬として市販されているいずれを用いてもよい。特に、エフリンＢ２を薬学的組成物に用いる場合、医療用に通常使用される純度にまで精製されたものほど好適である。例えば、免疫特性を考慮して、免疫グロブリンのＦｃドメイン（好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃドメイン）に融合することにより、個体への投与に適した任意の形態に改変し得る。なお、後述する実施例では、その入手が容易であるため可溶性エフリンＢ２（通常、細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない）をヒトＦｃに融合したタンパク質を用いているが、これは、本発明の効果が、実施例で使用したエフリンＢ２に限定されることを示すものではない。
エフリンＢ２を含む組成物は、その組成物を個体（例えば、被験動物）に投与するか、または標本（例えば、細胞（例えば、内皮細胞、特に、動脈または静脈の内皮細胞）、組織、もしくは器官）に適用するのに適した種々の形態であり得る。このような形態を調製する方法は、当該技術分野で周知である。すなわち、本発明は、エフリンＢ２の所定の用途に適した処方物をも提供する。所定の用途に適した処方物とは、特に限定されないが、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるＤＮＡ合成を阻害するための阻害剤」、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための阻害剤」、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）からの脈管形成を阻害するための阻害剤」、「網膜からの血管新生を抑制するための抑制剤」などが挙げられる。このようなエフリンＢ２を含む処方物は、エフリンＢ２の作用を妨害せず、かつ上記個体または標本に有害な作用を与えない限り、エフリンＢ２以外の他の成分を含み得る。このような処方物の個体（例えば、被験動物）への投与または標本（例えば、細胞（例えば、内皮細胞、特に、動脈または静脈の内皮細胞）、組織、もしくは器官）への適用は、処方物中のエフリンＢ２が、上記個体または標本に接触するような様式で行われる。
また、エフリンＢ２を含む薬学的組成物は、個体への投与に適した種々の形態の処方物であり得る。このような形態を調製する方法は、当該技術分野で周知である。すなわち、本発明は、エフリンＢ２の所定の用途に適した処方物をも提供する。所定の用途に適した処方物とは、特に限定されないが、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるＤＮＡ合成を阻害するための阻害剤」、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）におけるｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための阻害剤」、「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）からの脈管形成を阻害するための阻害剤」、「網膜からの血管新生を抑制するための抑制剤」、「血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置のための予防・治療剤」などが挙げられる。本明細書では「動脈内皮細胞（または静脈内皮細胞）」という文言が用いられているが，本発明の好ましい態様は動脈内皮細胞に関する。本発明はまた、エフリンＢ２を含む、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチ、子宮内膜症、および脱毛症からなる群から選択される疾患または障害の処置のための薬学的組成物あるいは予防・治療剤を提供する。エフリンＢ２は、上記疾患または障害の少なくとも１つを治療または予防し得る。このようなエフリンＢ２を含む組成物は、有効量のエフリンＢ２と、薬学的に受容可能なキャリア（担体）とを含み得る。この組成物は、エフリンＢ２の作用を妨害しない限り、薬学的に受容可能な他の成分（エフリンＢ２以外の血管新生抑制剤を含む）を含んでもよい。エフリンＢ２を主として含む薬学的組成物あるいは予防・治療剤もまた、提供される。
エフリンＢ２は、投与経路に適合した薬学的に受容可能なキャリアと混合して、例えば、経口であるいは筋肉内または静脈内注射によって、全身投与され得る。生理学的に受容可能な種々のキャリアがエフリンＢ２を投与するために使用され得、そしてその処方は、当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、およびＰｏｌｌｏｃｋらに記載されている。
エフリンＢ２は、好ましくは、非経口投与される（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、眼内、硝子体内、または皮下注射によって、あるいは移植によって）。非経口投与のための処方物は、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液、あるいは乳化液の形態であり得る。例えば、水、緩衝化水、生理食塩液などの種々の水性キャリアが使用され得る。他の適切なベヒクルの例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、硬化ナファレン、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。このような処方物はまた、保存剤、湿潤剤、緩衝化剤、乳化剤、および／または分散剤のような補助物質を含み得る。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコシドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが、活性成分の放出を制御するために使用され得る。
あるいは、エフリンＢ２は、経口摂取によって投与され得る。経口使用を意図した処方物は、当該技術分野で公知の任意の方法に従って、固体または液体形態に調製され得る。この組成物は、より嗜好性のよい調製物を提供するために、必要に応じて、甘味剤、香味剤、着色剤、着香剤、および保存剤を含み得る。
経口投与用の固体投与形態の処方物としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。一般的に、これらの処方物は、非毒性の薬学的に受容可能な賦形剤と混合された活性成分を含む。
これらとしては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、セルロース、デンプン、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、カオリンなどのような不活性希釈剤が挙げられ得る。結合剤、緩衝化剤、および／または滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）も使用され得る。
錠剤および丸剤は、さらに、腸溶コーティングとともに調製され得る。
経口投与用の液体投与形態の処方物としては、薬学的に受容可能な乳剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、および軟ゼラチンカプセル剤が挙げられる。
これらの形態の処方物は、水または油媒体のような当該技術分野で通常使用される不活性希釈剤を含み、そしてまた、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤などのアジュバントを含み得る。
エフリンＢ２はまた、例えば、貼付剤によって、あるいは眼への直接適用によって、あるいはイオン浸透法によって、局所投与され得る。
エフリンＢ２は、例えば、米国特許第５，６７２，６５９号および第５，５９５，７６０号に記載されるように、持続放出処方物として提供され得る。即時または持続放出組成物の使用は、治療される障害の性質に依存する。障害が急性または超急性障害からなる場合、即時放出形態での治療が、持続放出処方物よりも好適である。あるいは、予防または長期治療については、持続放出処方物が適切であり得る。
エフリンＢ２はまた、移植物を用いて送達され得る。このような移植物は、生分解性および／または生体適合性移植物であり得るか、あるいは非生分解性移植物であり得る。移植物は、活性成分に対して透過性または非透過性であり得る。眼移植物は、前眼房または後眼房のような眼房に挿入され得るか、あるいは強膜、脈絡膜横断腔、または硝子体の外面の無血管領域に移植され得る。好適な実施態様では、眼移植物は、強膜上のような無血管領域に配置され得、そのため、治療の所望部位、例えば、眼内腔および眼の黄斑への薬物の経強膜拡散を可能にする。さらに、経強膜拡散の部位は、好ましくは黄斑の近くである。
エフリンＢ２の送達のための移植物の例としては、米国特許第３，４１６，５３０；３，８２８，７７７；４，０１４，３３５；４，３００，５５７；４，３２７，７２５；４，８５３，２２４；４，９４６，４５０；４，９９７，６５２；５，２４７，６４７；５，１６４，１８８；５，１７８，６３５；５，３００，１１４；５，３２２，６９１；５，４０３，９０１；５，４４３，５０５；５，４６６，４６６；５，４７６，５１１；５，５１６，５２２；５，６３２，９８４；５，６７９，６６６；５，７１０，１６５；５，７２５，４９３；５，７４３，２７４；５，７６６，２４２；５，７６６，６１９；５，７７０，５９２；５，７７３，０１９；５，８２４，０７２；５，８２４，０７３；５，８３０，１７３；５，８３６，９３５；５，８６９，０７９；５，９０２，５９８；５，９０４，１４４；５，９１６，５８４；６，００１，３８６；６，０７４，６６１；６，１１０，４８５；６，１２６，６８７；６，１４６，３６６；６，２５１，０９０；および６，２９９，８９５号；ならびにＷＯ０１／３０３２３およびＷＯ０１／２８４７４（これらのすべては、参考として本明細書に援用される）に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
（投与量）
単回投与剤形を製造するためにキャリア材料と合わせる活性成分の量は、処置する個体および特定の投与態様に依存して変動する。一般的には、エフリンＢ２は、疾患の徴候を低減または除去するに十分な量で投与されるべきである。
１回の投与あたりに約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーでの投与レベルは、一般的に血管新生障害の治療に有用である。眼に直接投与する場合は、好適には、眼内濃度が約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬになるように投与される。投与量は、単回投与として投与され得るか、あるいは多数回投与に分割され得る。一般的に、数ヶ月以上のより長い投与期間が必要とされ得るが、所望の投与量は、長期間、通常は少なくとも数週間に設定された間隔で投与されるべきである。
当業者は、正確な個々の投与量は、例えば、以下の種々の因子に依存して調節され得ることを理解する：投与時間；投与経路；処方物の性質；排泄速度；治療される特定の障害；障害の重篤度；ならびに患者の年齢、体重、健康状態、および性別。必要とされる投与量の広い変動は、種々の投与経路の異なる有効性を考慮して予測されるべきである。例えば、経口投与は、一般的に、静脈内または硝子体内注射による投与よりも高い投与量レベルを必要とすることが予測される。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野で周知の最適化についての標準的経験的ルーチンを用いて調節され得る。正確な治療的に有効な投与量レベルおよびパターンは、好ましくは、上記の因子を考慮して主治医によって決定される。
予め存在している血管新生疾患を治療する以外に、エフリンＢ２は、これらの障害の発症を予防または遅延させるために予防的に投与され得る。予防的な適用において、エフリンＢ２は、特定の血管新生障害になりやすいあるいはその危険性のある個体に投与される。また、投与される正確な量は、個体の健康状態、体重などのような種々の因子に依存する。
以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
【実施例】
【０００８】
以下の実施例において、以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語は、一般的に受容されている意味を有する：
℃＝摂氏度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
μＬ＝マイクロリットル
ｍＬ＝ミリリットル
μｇ＝マイクログラム
ｍｇ＝ミリグラム
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの改変イーグル培地
ＩＴＳ＝インスリン−トランスフェリン−セレニウム
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ＭＥＭ＝改変イーグル培地
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩液
ＶＥＧＦ＝血管内皮細胞増殖因子
ＦＧＦ＝繊維芽細胞増殖因子
ＰＤＧＦ＝血小板由来増殖因子
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＥＣ＝内皮細胞
ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＨＡｏＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞
ＯＩＲ＝酸素誘導性網膜症
ＣＮＶ＝脈絡膜血管新生
ＡＭＤ＝加齢黄斑変性症。
本実施例においては、エフリンＢ２およびＥｐｈＢ４として、それらの入手容易性のために可溶性タンパク質（以下、それぞれ「ｓエフリンＢ２」および「ｓＥｐｈＢ４」という；これらは、細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まないタンパク質である）を用いた。マウスｓエフリンＢ２およびｓＥｐｈＢ４は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（６１４  Ｍｃｋｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  ＮＥ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ５５４１３，ＵＳＡ）より入手した（これらはともに、ヒトＦｃドメインと融合した形態である）。タンパク質下記の実施例５に記載のように作製したヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質もまた、エフリンＢ２として使用した。
以下に示す試験は、特に言及しない限り３回繰り返し、そして代表的な実験からのデータ（平均±ＳＤ）を示す。正常分布した集団においてスチューデントのｔ検定を用いてｐ＜０．０５の場合に、統計学的有意とみなした。
（実施例１：エフリンＢ２による、増殖因子によって刺激されたＥＣの増殖および移動の阻害）
増殖因子によって刺激された血管内皮細胞に対するエフリンＢ２およびＥｐｈＢ４の効果を調べるために、［３Ｈ］チミジン取り込み−ＨＡｏＥＣおよびＨＵＶＥＣのＤＮＡ合成および内皮脈管形成アッセイを行った。
（１．［３Ｈ］チミジン取り込み−ＨＡｏＥＣおよびＨＵＶＥＣのＤＮＡ合成）
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＥＧＭ培地中で維持した。内皮細胞増殖補充物も、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓにより提供された。ＨＡｏＥＣおよびＨＵＶＥＣを、１型コラーゲンでコーティングされたディッシュ（Ｉｗａｋｉ，Ｊａｐａｎ）上の内皮細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中で、５％ＣＯ２、９５％空気中３７℃にて培養し、培地を２〜３日ごとに交換することにより維持した。４〜５継代の細胞を実験に用いた。ＥＣを、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中、２００ｎｇ／ｍＬのｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４のいずれかの存在または不在下で、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢで１８時間処理した。次いで、細胞を、２０μＣｉ／ｍＬにて［メチル−３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に６時間曝露した。細胞を、トリプシン処理し、自動細胞採取機を用いてガラス繊維フィルター上に回収し、そして［メチル−３Ｈ］チミジン取り込みを、直接βカウンターで測定した。結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）をＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢで処理することにより、未処理コントロールと比較して、ＤＮＡ合成が３〜１０倍に増加した。エフリンＢ２は、これらのすべての刺激されたＤＮＡ合成を阻害したが、ｓＥｐｈＢ４およびｓエフリンＢ２＋ｓＥｐｈＢ４は、いずれも阻害しなかった。図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれＨＡｏＥＣ（図１Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１Ｂ）におけるＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢで誘導されたＤＮＡ合成に対するｓエフリンＢ２の効果を示す。図中の符号はそれぞれ、Ｃ：コントロール（未処理）、Ｂ２：ｓエフリンＢ２処理、Ｂ４：ｓＥｐｈＢ４処理を示す。図中、＊は、その結果が、増殖因子で刺激しない未処理の場合に対して有意差があることを示し、＊＊は、同じ増殖因子で刺激したが、ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４で処理していない場合と有意差があることを示す。図１Ａに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、またはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＤＮＡ合成の増加量は、２００ｎｇ／ｍＬのｓエフリンＢ２によって、それぞれ４０％、３０％、および９０％阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてもほとんど同じ結果を得た（図１Ｂ）。このインキュベーション期間中に、顕著なアポトーシス細胞は観察されなかった（データは示さず）。
（２．内皮脈管形成アッセイ）
コラーゲンゲルを、氷冷ゼラチン溶液（１０×Ｍ１９９、Ｈ２Ｏ、０．５３Ｍ  ＮａＨＣＯ３、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｉ型コラーゲン、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、１００：２７．２：５０：１０：７５０：６２．５（容量比））と、１×基本培地（以下を参照）中の３×１０６細胞／ｍＬの濃度の細胞とを、４容量のゼラチン溶液：１容量の細胞の比で一緒に混合することによって形成した。３７℃で３０分間ゲル化した後、ゲルを、４０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および８０ｎＭのＰＭＡを補充した１％ＦＢＳ、１×ＩＴＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、２６．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１００ユニット／ｍＬペニシリン、および１１０ユニット／ｍＬストレプトマイシンからなる１×基本培地で覆った。ｓエフリンＢ２およびｓＥｐｈＢ４（各２００ｎｇ／ｍＬ）は、ゲル化の直後に１×基本培地に添加した。脈管形成を定量するために、高出力（２０×）視野あたりの脈管の数を、基本培地の添加の４８時間後に測定した。脈管を、１００μｍの長さを超える１以上の内皮細胞で構成される延長した構造物として定義した。１００μｍの光学的区切りによって分離された５つの独立視野を、各ウェルについて評価し、そして２０×視野あたりの管の平均数を測定した。細胞傷害性を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した細胞増殖キットＩＩを用いて評価した。また、コントロール（未処理）、ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４のいずれかでの処理、またはｓエフリンＢ２とｓＥｐｈＢ４との両方の処理を行ってから７日後に、ＶＥＧＦ刺激した内皮細胞の形態を観察した。
図１Ｃは、コントロール（未処理）、ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４のいずれかでの処理、およびｓエフリンＢ２とｓＥｐｈＢ４との両方の処理によるＶＥＧＦ刺激内皮細胞の脈管形成の７日目の状態を示す写真である。ＶＥＧＦ誘導した脈管形成は、７日目には、コントロールと比較してｓエフリンＢ２処理群で減少していた（図１Ｃ）。逆に、ＶＥＧＦ誘導した脈管形成は、ｓＥｐｈＢ４処理によって影響を受けなかった。
したがって、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＤＧＦを含む種々の刺激によって誘導されるＥＣのＤＮＡ合成を阻害し得ることが分かった。エフリンＢ２の正確なメカニズムは明らかではないが、ＤＮＡ合成の減少は、細胞傷害性の評価によれば、顕著なアポトーシス細胞がなかったことから、アポトーシスによって引き起こされたのではないと思われる。ＤＮＡ合成が静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは、驚くべきことである。なぜなら、エフリンＢ２のレセプター（ＥｐｈＢ４）は、静脈内皮細胞のマーカーであるが、動脈内皮細胞は、このレセプターを有することが知られていないからである。
このように、ＤＮＡ合成における効果と一致して、エフリンＢ２はまた、ＶＥＧＦによって誘導されるＥＣ脈管形成を阻害し得る。
（実施例２：増殖因子で誘導されたｐ４２／４４  ＥＲＫリン酸化およびレセプター自動リン酸化に対するエフリンＢ２の効果）
内皮細胞に対するＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで誘導された有糸分裂応答をエフリンＢ２が阻害するメカニズムについて、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激した内皮細胞におけるＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化に対するエフリンＢ２の効果をウエスタン分析によって検討した。
ＥＣを、ＥＧＭ−ＤＭＥＭ（３％ＦＢＳを含む）（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中、５０ｎｇ／ｍＬのｓエフリンＢ２の存在または不在下で１時間放置した。さらに、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦまたは１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで５分間処理した（コントロールは未処理とした）。内皮細胞からのタンパク質試料の調製およびウエスタンブロッティングは、以下のようにして行った。全細胞ライセート、サイトゾル抽出物、または核抽出物を、内皮細胞から単離した。ウエスタンブロッティングを、免疫沈降を用いておよび用いずに行った。タンパク質試料を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、次いでニトロセルロースメンブランにエレクトロポレーションでトランスファーした。スキムミルクでブロッキングした後、ブロットを、ホスホチロシンまたはＫＤＲ（ｓｃ−５０４）に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入）とともに４℃にて一晩インキュベートした（１：５００）。洗浄後、メンブランを、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）（１：３０００）とともに室温にて１時間インキュベートした。可視化を、製造業者の指示書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ増強化学発光（ＥＣＬ）検出システムを用いて行った。
図２Ａは、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激したＨＡｏＥＣにおけるＥＲＫリン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す電気泳動写真である（ｐ４４／ｐ４２：総ＥＲＫ。ｐｐ４４／ｐｐ４２：リン酸化したＥＲＫ）。ＥＲＫリン酸化は、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦでの処理または２５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦでの処理によって増加した。ｓエフリンＢ２は、ＶＥＧＦ誘導のＥＲＫリン酸化およびｂＦＧＦ誘導のＥＲＫリン酸化の両方ともを抑制した。例えば、２００ｎｇ／ｍＬのｓエフリンＢ２は、ＶＥＧＦ誘導したＥＲＫリン酸化を７０％阻害した。このように、ＶＥＧＦ刺激およびｂＦＧＦ刺激によるＨＡｏＥＣにおけるＥＲＫリン酸化をエフリンＢ２が阻害したことがわかる。
次に、ＶＥＧＦ刺激したＥＣにおけるＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）自動リン酸化について検討した。ＥＣを、ＥＧＭ−ＤＭＥＭ（３％ＦＣＳを含む）（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中、５０ｎｇ／ｍＬのｓエフリンＢ２の存在または不在下で１時間放置した。さらに、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで５分間処理した（コントロールは未処理とした）。上記と同様にして、レセプター（ＫＤＲ）を、細胞ライセートから免疫沈降（ＩＰ）させ、抗リン酸チロシン抗体（ＰＹ２０）でブロッティングした。
図２Ｂは、ＶＥＧＦ刺激したＨＡｏＥＣにおけるＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）自動リン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す電気泳動写真である。図２Ｂは、エフリンＢ２が、ＶＥＧＦ刺激したＨＡｏＥＣにおけるＶＥＧＦレセプター２の自動リン酸化に対して顕著な効果がないことを示す。ＶＥＧＦレセプター２自動リン酸化は、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで１４倍増加した。ｓエフリンＢ２は、ＶＥＧＦレセプター２自動リン酸化を阻害しなかった。
上記の２つのリン酸化アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣを用いてもほとんど同じ結果を得た（データは示さず）。
したがって、エフリンＢ２が、内皮細胞（動脈および静脈）においてＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで誘導されたＥＲＫリン酸化を阻害することがわかった。この効果は、おそらく、少なくとも一部は、エフリンＢ２がこれらの細胞のＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで誘導した増殖を阻害する活性を説明し得る。しかし、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦレセプター２の自動リン酸化を阻害しない。したがって、エフリンＢ２は、ＶＥＧＦ機能を阻害するメカニズムとして、ＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプター２との間のシグナル伝達を妨害しないと考えられる。
（実施例３：マウス角膜におけるエフリンＢ２の同時投与によるｂＦＧＦで誘導した血管形成の阻害）
塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は、強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンＢ２は、ｂＦＧＦによって誘導されたＥＣ細胞増殖を阻害し得るので、エフリンＢ２が同様に血管形成を抑制し得るかどうかを検討した。
Ｋｅｎｙｏｎ，Ｂ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３７巻，８号，１６２５−１６３２頁に本質的に既述されるように、マウスにおける角膜ポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量を、いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば、９０ｎｇのヒトｂＦＧＦを含む０．３μＬのＨｙｄｒｏｎペレット（ＩＦＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を調製し、雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの角膜に移植した。ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４（１００ｎｇ／ペレット）を、ｂＦＧＦ／Ｈｙｄｒｏｎ溶液に直接添加した。ペレットを、角膜縁から１．０ｍｍに配置した。移植後、オフロキサシン／点眼剤を各眼に適用した。６日後、動物を屠殺し、そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を、ソフトウエアパッケージＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて行った。その結果、ペレットの移植の６日後、新しい血管の発芽を検査した。ｂＦＧＦは、マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。
さらに、ｂＦＧＦで誘導した角膜血管新生に対するｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４の効果を検討した。ｓエフリンＢ２の投与により、ｂＦＧＦによって誘導された血管形成は顕著にブロックされたが、ｓＥｐｈＢ４の投与では効果はなかった。図３に、ｂＦＧＦとエフリンＢ２とを同時投与したマウス角膜における血管新生の定量分析の結果を示す。図３の縦軸は、血管新生を有する領域の面積の値であり、ｂＦＧＦの存在下での血管新生を有する領域を１００％とした場合の割合を表す（％）。バーは、各群におけるすべての動物についてのＳＤである（１群につきｎ＝６）。定量分析によっても、ｂＦＧＦで誘導した角膜血管新生が、エフリンＢ２によって完全に阻害されたことが示された（図３）。
（実施例４：酸素誘導性網膜血管新生に対するエフリンＢ２の効果）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＳＬＣジャパン社から入手）を用いて、以下のようにして酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）モデルを作製した。生後７日目（Ｐ７）のマウスとその母親を７５％高酸素状態にした箱の中に５日間入れた。高酸素状態にしてから５日後の生後１２日目（Ｐ１２）に、これらのマウスを通常の２０％酸素濃度の状態に戻し、その後の網膜血管反応について観察した。このような処置を施したマウスは、広範囲の網膜血管新生の発達を示した。網膜血管新生は、Ｐ１９までに１００％の動物で生じた。Ｐ１９には新生血管束は明白であり、特に中間周辺部において、内境界膜から硝子体へ向かって伸びている。
網膜血管新生に対するエフリンＢ２の効果を検討するために、Ｐ１３およびＰ１５のＯＩＲマウスに、１００μＬのＰＢＳ中ｓエフリンＢ２を２００μｇ（ｎ＝６匹）または対照としてＰＢＳのみ２００μＬ（ｎ＝６匹）を、一日に一回、腹腔内注射した。Ｐ１７で網膜血管新生を評価した。
以下に要約するプロトコルに従って、フルオレセイン−デキストラン血管造影法を用いてフラットマウントした網膜を評価した（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；８４（８）：９７３−８０）。まず、マウスを深麻酔し、２×１０６分子量フルオレセインデキストラン（Ｓｉｇｍａ社）の体重１ｇ当たり０．０３ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ溶液を左心室に灌流させた。眼を摘出し、少なくとも３時間の間４％パラホルムアルデヒド中に固定した。次いで、角膜と水晶体とを取り除き、周囲網膜を解剖し、蛍光顕微鏡下での試験のために顕微鏡スライド上にフラットマウントした。コントロールおよびｓエフリンＢ処理モデルのフラットマウントしたフルオレセイン−デキストラン灌流網膜の蛍光顕微鏡写真を図４に示す（Ａ：コントロールＯＩＲモデル；Ｂ：ｓエフリンＢ処理モデル）。ｓエフリンＢ処理では、フラットマウント網膜の中心部から周辺部にかけて明瞭に白い（図４Ｂ）。これは、網膜内にフルオレセイン−デキストランが灌流できる正常な血管が存在することを示す。ｓエフリンＢ処理モデルでは、ＯＩＲモデル（図４Ａ）に比べて、正常血管の存在が比較的多く観察された。
また、フルオレセイン−デキストランで灌流したフラットマウント網膜の蛍光顕微鏡写真画像をＮＩＨｉｍａｇｅソフトウエア上に取り込み、無灌流領域の面積を計測した。図５は、コントロールモデル（ＯＩＲ）に対するｓエフリンＢ２処理モデル（ＯＩＲ＋エフリンＢ２）の無灌流領域の面積比をグラフに示したものである。図５の縦軸は、無灌流領域面積比を示し、これは、ＯＩＲモデルにおける無灌流領域面積を１００％とした場合の割合を表す（％）。バーは、各群におけるすべての動物についてのＳＤである（１群につきｎ＝６）。図５から、ｓエフリン処理モデルは、コントロールモデルに比較して非灌流領域の面積が減少していることが分かる。ｓエフリンＢ２処理モデルとコントロールモデルとの網膜無血管比は、統計学的に有意である（図面中＊＊で記載：ｐ＜０．０１）。
さらに、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって、新生血管の新生に対するｓエフリンＢ２の効果を検討した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．（１９９２）２７０：１６５−１７２に既述の通りに血管系を分析するために最適化された条件下で、透過型走査電子顕微鏡検査を実施した。日立Ｈ−８００透過形顕微鏡Ｓ−８００走査電子顕微鏡で写真撮影した。図６は、コントロールモデル（ＯＩＲ）（Ａ）およびｓエフリンＢ２処理モデル（ＯＩＲ＋エフリンＢ２）（Ｂ）のＰ１７新生児マウスの網膜表面を示すＳＥＭ写真である（硝子体側から網膜を眺めたもの）。図６Ａのコントロールモデルの写真においては、網膜から硝子体内に向かう異常な新生血管（内境界膜貫通新生血管）の新生が観察される（特に、写真中の右側の部分における穴状部）。これに対して、図６ＢのｓエフリンＢ２処理モデルの写真では、そのような穴状部は見られず、硝子体中への新生血管の新生は抑制されていると思われる。
したがって、ＯＩＲマウスをｓエフリンＢ２処理したことにより、内境界膜において、該膜に対してほぼ平行方向に伸びる血管網が見られたが、硝子体に向かって形成される新生血管の新生は抑制された。また、ｓエフリン処理により、網膜の血流自体を減らすことはなかった。これは、血管発達におけるｓエフリンＢ２の重要な発達の役割である。ｓエフリンＢ２は、網膜外に向かう（本実施例の場合、硝子体に対して伸長する）病的な血管新生を抑制するだけでなく、網膜中の血管網の形成および血管成熟も増強し得る。このような効果は、糖尿病性網膜症の治療に最適であり得る。
（実施例５：ヒト化エフリンＢ２による血管新生抑制効果）
本実施例では、ヒトのＤＮＡライブラリー由来のエフリンＢ２とヒトＦｃとの融合タンパク質を作製し、その血管新生抑制効果の評価を行った。
（１．ヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質の作製）
以下に説明するように、ヒトエフリンＢ２  ｃＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分をコードしているｃＤＮＡの５’末端に融合させた。このヒトエフリンＢ２  ｃＤＮＡの配列は、米国特許第６，３０３，７６９号もしくはＭｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ；３２（１６）：１１９７−２０５を参考にした。
Ｆｃのクローニングを以下のようにして行った。ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（１００ｎｇ）を鋳型として、順方向プライマー：ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ（配列番号１）および逆方向プライマー：ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡ（配列番号２）を用い、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲを行った。増幅された約７００ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、精製したＤＮＡ断片をＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、ヒトＩｇＧ１Ｆｃであることを確認した。
ヒトエフリンＢ２のクローニングを以下のようにして行った。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（１００ｎｇ）を鋳型として、順方向プライマー：ＧＣＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＧＡＣ（配列番号３）および逆方向プライマー：ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ（配列番号４）を用い、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲを行った。増幅された約６８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡ断片をＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、塩基配列を確認したところ、上記ヒトエフリンＢ２  ｃＤＮＡの塩基配列の１〜６７８番目の塩基位置で示される６７８ｂｐのＤＮＡ断片であった。このヒトエフリンＢ２ＤＮＡ断片によりコードされるタンパク質は、ヒトエフリンＢ２タンパク質の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは含まないと推定される。
クローニングしたＥＦＮ−Ｂ２  ＤＮＡ断片の５’末端をＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端をＢｇｌＩＩ制限酵素で処理し、ＦｃのＤＮＡ断片の５’末端をＢｇｌＩＩ、３’末端をＮｏｔＩ制限酵素で処理した。これらの断片を、哺乳動物系発現ベクターｐｃＤＮＡ４−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で処理したものとＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い３者ライゲーションを行った。ライゲーションにより得られたベクターを大腸菌ＸＬ２１に形質転換した。生育した大腸菌コロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を確認したところ、ヒトＥＦＮ−Ｂ２（１−６７８ｂｐ）−Ｆｃであった。
このプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入し、以下の培養条件にて培養した。培地は、ＤＭＦＭ（ＳＩＧＭＡ）と、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）に、抗生物質（ＧＩＢＣＯ  １％ペニシリン＋１％ストレプトマイシン）を添加したものを用いた。５％  ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３日間培養した。エフリンＢ２安定発現株を、リン酸カルシウム法による遺伝子導入およびＺｅｏｃｉｎ  ２５０μｇ／ｍＬ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）による薬剤選択によって取得した。安定発現株から培養上清を集める場合は、ＧＩＴ培地（日本製薬株式会社）にて培養した。
次いで、エフリンＢ２−Ｆｃ安定発現株から、以下のようにして発現タンパク質を精製した。
約１００ｍＬ培養上清を回収し、遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分、４℃）して死細胞などのゴミを除いた。そこにプロテインＡ−セファロース１００μＬを加え、４℃で２時間回転させた。その後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）して上清を除き、沈殿（セファロース＋エフリンＢ２）に洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＰ４０）を加えて非特異的吸着タンパクなどを除いた。この洗浄操作を３回行った。３回洗浄後、溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシンｐＨ３．０）を７０μＬを加え、１０分間氷上に静置し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、４℃）後にこの上清を回収した。この操作を７回繰り返した。集めた上清のタンパク濃度をＯＤ２８０の吸光度にて測定した。タンパク濃度が高かったものを回収し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を１／１０量加えて中和し、リン緩衝生理食塩水に対して一晩透析を行った。透析後サンプルを回収し、タンパク定量をＢＣＡ法にて行った。同時に非還元化または還元化状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量によってヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質であることを確認した。
（２．［３Ｈ］チミジン取り込み−ＨＵＶＥＣのＤＮＡ合成）
実施例１と同様にして、上記ヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質について、ＨＵＶＥＣのＤＮＡ合成における効果を検討した。但し、ＥＣを、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中、１ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは１００ｎＭのヒトエフリンＢ２−Ｆｃタンパク質の存在または不在下で、０．６ｎＭのｂＦＧＦで１８時間処理した。ここで、ポジティブコントロールとして、１００ｎＭのマウスエフリンＢ２−ヒトＦｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  ＮＥ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ５５４１３，ＵＳＡ）を使用した。
ＨＵＶＥＣによるチミジン取り込みの結果を図７に示す。図７の縦軸は、ｂＦＧＦおよびエフリンＢ２処理なしの場合（図中、最も左のカラム）に対する割合（％）を示す。エフリンＢ２処理を施さずにｂＦＧＦ（０．６ｎＭ）でＨＵＶＥＣを刺激した場合、ｂＦＧＦ未処理のコントロールに比較してＤＮＡ合成を約５倍増大した。１００ｎＭのヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質は、ｂＦＧＦによる刺激がなくてもＤＮＡ合成を阻害した。０．６ｎＭのｂＦＧＦによって誘導されたＤＮＡ合成の増大は、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭのヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質によってそれぞれ１０％、３０％、９５％阻害された（図７）。このインキュベーション期間中に、顕著なアポトーシス細胞は観察されなかった（データは示さず）。
（実施例６：ＣＮＶモデルに対するエフリンＢ２の評価）
ＡＭＤの生態モデルと考えられるレーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを用いて、ヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質の血管新生抑制効果を評価した。
（実験動物）
６匹のカニクイザル（オス３．５〜７．５ｋｇ）由来の１２眼を用いた。これらの動物は全て、苦痛のないように扱い、株式会社新日本科学において無病原状態で収容した。実験は、塩酸ケタミンで全身麻酔以下に行った。株式会社新日本科学の実験動物倫理委員会により承認されている倫理基準（承認番号ｃ１８９−００１）に従って行った。
（実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘導）
上記サルの眼の眼底部の後部極において、多色レーザー（波長６４７ｎｍ）（Ｎｏｖｕｓ  Ｏｍｎｉ  Ｌａｓｅｒ；Ｌｕｍｅｎｉｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）を用いた光凝固によって、実験的ＣＮＶを誘導した。スポットの大きさは直径１００μｍであり、照射時間は０．１秒であった。角膜表面での出力は７００ｍＷであった。コンタクトレンズを用いることにより、各眼において、中心窩を除いた箇所に８つの焼き焦げ（ｂｕｒｎｓ）を生じさせた。
（エフリンＢ２投与方法と濃度）
レーザー照射直後と照射後５日の合計２回、上記実施例５で調製したヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質の硝子体内投与を行った。硝子体内のエフリンＢ２濃度が１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬになるように調整したＰＢＳ溶液を０．１ｍＬずつ、２７Ｇ針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射した。ネガティブコントロールとして、０．１ｍＬのＰＢＳを注射した。ポジティブコントロールとして、１０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬの上記マウスエフリンＢ２−ヒトＦｃキメラタンパク質を用いた。
（ＣＮＶの評価）
レーザー照射後１０日目に蛍光眼底造影検査を行って、脈絡膜新生血管を評価した。０．１ｍＬ／ｋｇの５％フルオレセインＮａを静脈内投与し、眼底カメラ（ＴＲＣ−５０ＥＸ，興株式会社トプコン）で蛍光眼底撮影を行った。注射開始から５〜６分後の蛍光眼底写真について脈絡膜新生血管の透過性亢進を評価した。写真上の評価は、一人の熟練した眼科専門医が行った。中間透光体の混濁のために評価不能であった３眼を除き、レーザースポット毎に蛍光色素の透過性亢進が著しい病変を活動性ありと判定した。
図８は、以下の各処理を施した眼底の蛍光写真である。図８Ａは、１０ｎｇ／ｍＬのヒトエフリンＢ２処理、図８Ｂは、ネガティブコントロール（ＰＢＳ処理）、そして図８Ｃは、１０ｎｇ／ｍＬのマウスエフリンＢ２処理の結果である。
ＰＢＳを注射したネガティブコントロールでは、１０／１６が活動性のあるＣＮＶであった。一方、エフリンＢ２投与群では、ＣＮＶの活動性病変の割合は、１ｎｇ／ｍＬでは５／１６、１０ｎｇ／ｍＬでは０／８、１００ｎｇ／ｍＬでは３／８であった。１０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬのマウスエフリンＢ２−ヒトＦｃキメラタンパク質を用いたポジティブコントロール群では、５／８および５／１６が活動性のあるＣＮＶであった。
以上のように、ヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質は、ＨＵＶＥＣを用いたインビトロの系で濃度依存的に増殖能を抑制した。特に１００ｎＭの濃度ではその増殖抑制能は９５％であった。また、ヒトエフリンＢ２−ヒトＦｃ合成タンパク質は、レーザー誘導性ＣＮＶモデルにおいて新生血管の発生を抑制した。その硝子体中の濃度は１０ｎｇ／ｍＬで有効であった。
レーザモデルで遊走してきた色素上皮には、エフリンＢ２が発現している（データは示さず）。したがって、エフリンＢ２が、色素上皮に発現することにより、新生血管の新生が止まることが推測された。本実施例の結果は、エフリンＢ２の新生血管の新生を抑制する効果を実証した。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明の組成物および方法は、血管形成または血管新生に関連した疾患または障害の処置に有用である。特に、本発明の組成物および方法は、網膜内の生理的な血流を抑えることなく、網膜外の病的な血管形成および血管新生を抑制することが可能である。したがって、本発明の組成物および方法は、ＰＤＴおよび種々の抗血管形成薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ剤）の注射によって提案されるような現在の治療法に比べて、ＡＭＤおよび糖尿病性網膜症のような血管形成または血管新生に関連した眼科疾患の処置において、特に有利に使用され得る。
［配列表］
2007043629.tif 000002
2007043629.tif 000003
2007043629.tif 000004
【図１Ａ】
2007043629.tif 000005
【図１Ｂ】
2007043629.tif 000006
【図１Ｃ】
2007043629.tif 000007
【図２Ａ】
2007043629.tif 000008
【図２Ｂ】
2007043629.tif 000009
【図３】
2007043629.tif 000010
【図４】
2007043629.tif 000011
【図５】
2007043629.tif 000012
【図６】
2007043629.tif 000013
【図７】
2007043629.tif 000014
【図８】
2007043629.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月13日(2008.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞のＤＮＡ合成阻害剤。
【請求項２】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の阻害剤を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の予防・治療剤。
【請求項４】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項３に記載の予防・治療剤。
【請求項５】
前記疾患または障害が、網膜からの血管新生である、請求項３に記載の予防・治療剤。
【請求項６】
網膜外に病的な血管形成または血管新生を有するか、または生じる可能性がある個体に投与される、請求項５に記載の予防・治療剤。
【請求項７】
有効量のエフリンＢ２を含む、動脈内皮細胞からの脈管形成阻害剤。
【請求項８】
前記エフリンＢ２が、天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない、請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の阻害剤を含む、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の予防・治療剤。
【請求項１０】
前記疾患または障害が、加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項９に記載の予防・治療剤。
【請求項１１】
前記疾患または障害が、網膜からの血管新生である、請求項９に記載の予防・治療剤。
【請求項１２】
網膜外に病的な血管形成または血管新生を有するか、または生じる可能性がある個体に投与される、請求項１１に記載の予防・治療剤。
【国際調査報告】
2007043629.tif 000016
2007043629.tif 000017
2007043629.tif 000018
2007043629.tif 000019
2007043629.tif 000020
2007043629.tif 000021
2007043629.tif 000022
2007043629.tif 000023