(57)【要約】  目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクターを提供することを目的とし、この目的を達成するために、目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質、例えば、ホスファチジン酸、カルジオリピン等を含有する脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターを提供する。
2007037444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質を核内に送達するためのベクターであって、
アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクター。
【請求項２】
目的物質を細胞内に送達するためのベクターであって、
アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクター。
【請求項３】
目的物質を核内に送達するためのベクターであって、
アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜の外側に、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクター。
【請求項４】
前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質が、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はカルジオリピンである請求項１又は３記載のベクター。
【請求項５】
前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の２０〜８０％（モル比）である請求項１又は３記載のベクター。
【請求項６】
前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質が、ホスファチジン酸又はカルジオリピンであって、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の４０〜６０％（モル比）である請求項１又は３記載のベクター。
【請求項７】
前記第１の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有する請求項１又は３記載のベクター。
【請求項８】
前記第１の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の２０〜８０％（モル比）である請求項７記載のベクター。
【請求項９】
前記第１の脂質膜が膜透過性ペプチドを有する請求項１又は３記載のベクター。
【請求項１０】
前記膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインを有するペプチドである請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
前記膜透過性ドメインがポリアルギニンである請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
前記ポリアルギニンが、連続した４〜２０個のアルギニン残基からなる請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
前記膜透過性ペプチドが前記第１の脂質膜の表面に存在する請求項９記載のベクター。
【請求項１４】
前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質が、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はホスファチジルセリンである請求項９記載のベクター。
【請求項１５】
前記第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質が、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルキルリン酸又はジアシルリン酸である請求項２又は３記載のベクター。
【請求項１６】
前記第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第２の脂質膜に含有される総脂質量の１０〜９０％（モル比）である請求項２又は３記載のベクター。
【請求項１７】
前記第２の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有する請求項２又は３記載のベクター。
【請求項１８】
前記第２の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量が、前記第２の脂質膜に含有される総脂質量の１０〜９０％（モル比）である請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
前記第２の脂質膜が膜透過性ペプチドを有する請求項２又は３記載のベクター。
【請求項２０】
前記膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインを有するペプチドである請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
前記膜透過性ドメインがポリアルギニンである請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
前記ポリアルギニンが、連続した４〜２０個のアルギニン残基からなる請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
前記膜透過性ペプチドが前記第２の脂質膜の表面に存在する請求項１９記載のベクター。
【請求項２４】
前記脂質膜構造体がリポソームである請求項１、２又は３記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。【０００３】
遺伝子治療に用いるための効率的なベクターを開発する上で、核膜の透過は非常に大きな障壁となる。細胞質−核間の物質輸送には、核膜に存在する核膜孔複合体を介して行われており、低分子のタンパク質やイオンはこの核膜孔複合体を自由拡散することにより核膜を透過するのに対し、高分子はその大きさのために自由に透過することができない。そのため、遺伝子をそのまま細胞内に導入しても、核内へ効率よく送達するのは困難である。【０００４】
最近、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾することにより、凝縮化ＤＮＡの細胞導入効率が１０００倍、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの細胞への導入効率が１００倍向上したことが報告されている（非特許文献１）。また、表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾したリポソームは、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）細胞内に導入できることが報告されている（非特許文献１，２）。
【非特許文献１】Kogure等, 「Journal of Controlled Release」, 2004年, 98巻, 317-323頁
【非特許文献２】カリル・イクラミ等, 「YAKUGAKU ZASSHI」, 2004年, 124巻, Suppl.4, 113-116頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、第１のベクターとして、目的物質を核内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターを提供する。第１のベクターにおいて、第１の脂質膜が核膜と結合及び融合することにより、第１のベクターに含まれる目的物質は、核内に効率よく移行することができる。【０００７】
また、上記課題を解決するために、本発明は、第２のベクターとして、目的物質を細胞内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターを提供する。第２のベクターにおいて、第２の脂質膜は、エンドソーム膜、マクロピノソーム膜等と効率よく結合及び融合することができる。したがって、第２のベクターがエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス等の経路によりエンドソーム画分、マクロピノソーム画分等として細胞内に取り込まれた後、第２の脂質膜がエンドソーム膜、マクロピノソーム膜等と結合及び融合することにより、第２のベクターに含まれる目的物質は、エンドソーム、マイクロピノソーム等を脱出し、細胞内に効率よく移行することができる。【０００８】
さらに、上記課題を解決するために、本発明は、第３のベクターとして、目的物質を核内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜の外側に、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターを提供する。第３のベクターにおいて、第１の脂質膜は、核膜と効率よく結合及び融合することができ、第２の脂質膜は、エンドソーム膜、マクロピノソーム膜等と効率よく結合及び融合することができる。したがって、第３のベクターがエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス等の経路によりエンドソーム画分、マクロピノソーム画分等として細胞内に取り込まれた後、第２の脂質膜がエンドソーム膜、マクロピノソーム膜等と結合及び融合することにより、第３のベクターに含まれる目的物質は、エンドソーム、マイクロピノソーム等を脱出し、細胞内に効率よく移行することができる。そして、第１の脂質膜が核膜と結合及び融合することにより、第３のベクターに含まれる目的物質は、核内に効率よく移行することができる。【０００９】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質がコレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はカルジオリピンであることが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１０】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の２０〜８０％（モル比）であることが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１１】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質がホスファチジン酸又はカルジオリピンであって、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の４０〜６０％（モル比）であることが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１２】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有することが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１３】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の２０〜８０％（モル比）であることが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１４】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜が膜透過性ペプチドを有することが好ましい。これにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１５】
第１又は第３のベクターにおいて、前記膜透過性ペプチドは、例えば、膜透過性ドメインを有するペプチドであり、前記膜透過性ドメインは、好ましくはポリアルギニンであり、前記ポリアルギニンは、好ましくは連続した４〜２０個のアルギニン残基からなる。膜透過性ドメインをポリアルギニンとすることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。また、第１の脂質膜がベクターの表面を構成しており、第１の脂質膜が膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する場合、ベクター表面のポリアルギニン量を調節することにより、ベクターの主要な細胞内移行経路をマクロピノサイトーシスとすることができる。マクロピノサイトーシスでは、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソームはエンドソームと異なりリソソームと融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソームによる分解を回避することができる。したがって、ベクターが主としてマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行する場合、ベクターに含まれる目的物質を効率よく細胞内に送達することができる。【００１６】
第１又は第３のベクターにおいて、前記膜透過性ペプチドが前記第１の脂質膜の表面に存在することが好ましい。膜透過性ペプチドを第１の脂質膜の表面に存在させることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。また、第１の脂質膜がベクターの表面を構成しており、第１の脂質膜の表面に膜透過性ドメインとしてポリアルギニンが存在する場合、ベクターが主としてマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行することができるので、ベクターに含まれる目的物質を効率よく細胞内に送達することができる。【００１７】
第１又は第３のベクターにおいて、前記第１の脂質膜が膜透過性ペプチドを有する場合、前記第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質がコレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はホスファチジルセリンであることが好ましい。第１の脂質膜が上記アニオン性脂質を含有するとともに膜透過性ペプチドを有することにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１８】
第２又は第３のベクターにおいて、前記第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質が、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルキルリン酸又はジアシルリン酸であることが好ましい。これにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００１９】
第２又は第３のベクターにおいて、前記第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量が、前記第２の脂質膜に含有される総脂質量の１０〜９０％（モル比）であることが好ましい。これにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００２０】
第２又は第３のベクターにおいて、前記第２の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有することが好ましい。これにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００２１】
第２又は第３のベクターにおいて、前記第２の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量が、前記第２の脂質膜に含有される総脂質量の１０〜９０％（モル比）であることが好ましい。これにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００２２】
第２又は第３のベクターにおいて、前記第２の脂質膜が膜透過性ペプチドを有することが好ましい。これにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００２３】
第２又は第３のベクターにおいて、前記膜透過性ペプチドは、例えば、膜透過性ドメインを有するペプチドであり、前記膜透過性ドメインは、好ましくはポリアルギニンであり、前記ポリアルギニンは、好ましくは連続した４〜２０個のアルギニン残基からなる。膜透過性ドメインをポリアルギニンとすることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。また、第２の脂質膜がベクターの表面を構成しており、第２の脂質膜が膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する場合、ベクター表面のポリアルギニン量を調節することにより、ベクターの主要な細胞内移行経路をマクロピノサイトーシスとすることができる。マクロピノサイトーシスでは、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソームはエンドソームと異なりリソソームと融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソームによる分解を回避することができる。したがって、ベクターが主としてマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行する場合、ベクターに含まれる目的物質を効率よく細胞内に送達することができる。【００２４】
第２又は第３のベクターにおいて、前記膜透過性ペプチドが前記第２の脂質膜の表面に存在することが好ましい。膜透過性ペプチドを第２の脂質膜の表面に存在させることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。また、第２の脂質膜がベクターの表面を構成しており、第２の脂質膜の表面に膜透過性ドメインとしてポリアルギニンが存在する場合、ベクターが主としてマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行することができるので、ベクターに含まれる目的物質を効率よく細胞内に送達することができる。【００２５】
第１、第２又は第３のベクターにおいて、前記脂質膜構造体がリポソームであることが好ましい。脂質膜構造体がリポソームである場合、脂質膜構造体の内部に目的物質を封入することにより、目的物質を細胞内又は核内に効率よく送達することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクターが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明のベクターについて詳細に説明する。
第１のベクターは、目的物質を核内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターであり、第２のベクターは、目的物質を細胞内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターであり、第３のベクターは、目的物質を核内に送達するためのベクターであって、アニオン性脂質を含有する第１の脂質膜の外側に、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えた脂質膜構造体からなるベクターである。【００２８】
脂質膜構造体は、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物等のうち、いずれの構造体であってもよいが、リポソームであることが好ましい。脂質膜構造体がリポソームである場合、脂質膜構造体の内部に目的物質を封入することにより、目的物質を細胞内に効率よく送達することができる。【００２９】
脂質膜構造体がリポソームである場合、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（small unilamellar vesicle）、ＬＵＶ（large unilamellar vesicle）、ＧＵＶ（giant unilamellar vesicle）等の１枚膜リポソームであってもよいが、多重膜リポソームであることが好ましい。リポソームが第１の脂質膜を２枚以上有することにより、リポソームは２枚の核膜（外膜及び内膜）を突破することが可能となる。また、リポソームが第１の脂質膜の外側に、アニオン性脂質を含有する第２の脂質膜を備えることにより、リポソームはエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜を突破することが可能となる。【００３０】
脂質膜構造体が有する第１の脂質膜の数は特に限定されるものではないが、通常１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは２である。脂質膜構造体が有する第２の脂質膜の数は特に限定されるものではないが、通常１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１である。脂質膜構造体は、第１及び第２の脂質膜以外の脂質膜を有していてもよいし、第１及び第２の脂質膜以外の脂質膜を有していなくてもよい。【００３１】
脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、脂質膜構造体がリポソーム又はエマルションの場合、粒子径は通常５０ｎｍ〜５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径は通常５〜１００ｎｍであり、ひも状ミセル又は不定形の層状構造物の場合、１層あたりの厚みは通常５〜１０ｎｍであり、このような複数の層が積層していることが好ましい。【００３２】
脂質膜構造体の脂質膜（第１の脂質膜、第２の脂質膜、並びに第１及び第２の脂質膜以外の脂質膜を含む）の構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００３３】
脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、脂質膜に含有される脂質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常７０％（モル比）以上、好ましくは７５％（モル比）以上、さらに好ましくは８０％（モル比）以上である。なお、脂質膜に含有される脂質量の上限値は、脂質膜を構成する総物質量の１００％である。【００３４】
脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
[リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。【００３５】
[糖脂質]
グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等。【００３６】
[ステロール]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等。【００３７】
[飽和又は不飽和の脂肪酸]
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等。【００３８】
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜安定化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０である。【００３９】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。【００４０】
抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される抗酸化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０である。【００４１】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。【００４２】
荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。【００４３】
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。【００４４】
膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜タンパク質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常１０％（モル比）以下、好ましくは５％（モル比）以下、さらに好ましくは２％（モル比）以下である。なお、膜タンパク質の含有量の下限値は０である。【００４５】
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。【００４６】
脂質膜構造体において、脂質膜を構成する脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能等を有する脂質誘導体を使用することができる。これにより、上記機能のうち１種又は２種以上の機能を脂質膜構造体に付与することができる。脂質膜構造体に血中滞留性機能を付与することにより、脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。また、脂質膜構造体に温度変化感受性機能及び／又はｐＨ感受性機能を付与することにより、脂質膜構造体に保持された目的物質の放出性を高めることができる。【００４７】
血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドGM1、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドGM3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000}-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000}-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙げられる。【００４８】
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。【００４９】
脂質膜構造体には、標的とする核を含有する細胞、当該細胞が分泌する酵素等を特異的に認識する抗体を保持させることができる。抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましく、モノクローナル抗体としては、単一のエピトープに対して特異性を有する１種のモノクローナル抗体を使用してもよいし、各種エピトープに対して特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用してもよい。また、抗体としては、１価抗体又は多価抗体のいずれを使用してもよいし、天然型(intact)分子又はそのフラグメント若しくは誘導体のいずれを使用してもよく、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、少なくとも二つの抗原又はエピトープ(epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又はクワドローム(quadrome)、トリオーム(triome)等の二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾、加工等が施された誘導体を使用することができる。また、公知の細胞融合、ハイブリドーマ技術、抗体工学等を適用し、合成又は半合成技術によって得られる抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、ＤＮＡ組換え技術によって得られる抗体、あるいは標的エピトープに対して中和特性を有する抗体又は結合特性を有する抗体等を使用することができる。【００５０】
第１又は第２の脂質膜は、その構成成分としてアニオン性脂質を含有する。第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量は特に限定されるものではないが、第１の脂質膜に含有される総脂質量の通常２０〜８０％（モル比）、好ましくは４０〜６０％（モル比）、さらに好ましくは４５〜５５％（モル比）である。第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量を上記範囲とすることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量は特に限定されるものではないが、第２の脂質膜に含有される総脂質量の通常１０〜９０％（モル比）、好ましくは１０〜５０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜３０％（モル比）である。第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量を上記範囲とすることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００５１】
第１又は第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質は特に限定されるものではなく、例えば、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール又はカルジオリピン等が挙げられる。第１の脂質膜は、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はカルジオリピンが好ましく、ホスファチジン酸又はカルジオリピンがさらに好ましい。第２の脂質膜は、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルキルリン酸又はジアシルリン酸であることが好ましく、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルキルリン酸又はジアシルリン酸であることがさらに好ましい。第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質がホスファチジン酸又はカルジオリピンである場合、第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量を、第１の脂質膜に含有される総脂質量の４０〜６０％（モル比）（特に４５〜５５％（モル比））とすることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を顕著に向上させることができる。第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質がホスファチジン酸、カルジオリピン、ジアルキルリン酸又はジアシルリン酸である場合、第２の脂質膜に含有されるアニオン性脂質量を、第２の脂質膜に含有される総脂質量の１０〜５０％（モル比）（特に１０〜３０％（モル比））とすることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を顕著に向上させることができる。【００５２】
第１又は第２の脂質膜は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有することが好ましい。第１の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有することにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができ、第２の脂質膜がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有することにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。第１の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量は特に限定されるものではないが、第１の脂質膜に含有される総脂質量の通常２０〜８０％（モル比）、好ましくは４０〜６０％（モル比）、さらに好ましくは４５〜５５％（モル比）である。第１の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量を上記範囲とすることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。第２の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量は特に限定されるものではないが、第２の脂質膜に含有される総脂質量の通常１０〜９０％（モル比）、好ましくは５０〜９０％（モル比）、さらに好ましくは７０〜９０％（モル比）である。第２の脂質膜に含有されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン量を上記範囲とすることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。なお、脂質は、極性基と非極性基の占める割合に従って、コーン（cone）型、シリンダー（cylindrical）型、逆コーン（inverted cone）型の３種類に大別され、そのうち、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等のコーン型脂質は、疎水性基が親水性基に比べて大きな容積を占める脂質であり、非二重層脂質（nonbilayer lipid）とも称される（奥直人著，リポソームの作成と実験法，27-33頁，広川書店）。脂質二重層中でコーン型脂質が逆ヘキサゴナル構造をとることにより、脂質二重層中に逆ミセル構造が形成され、形成された逆ミセル構造は、膜融合、膜の透過性等に関与すると考えられている。【００５３】
第１又は第２の脂質膜は、膜透過性ペプチドを有することが好ましい。膜透過性ペプチドは、核膜と結合可能な状態で第１又は第２の脂質膜に存在し、好ましくは第１又は第２の脂質膜の表面に存在する。膜透過性ペプチドを第１の脂質膜の表面に存在させることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能が向上させることができ、膜透過性ペプチドを第２の脂質膜の表面に存在させることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能及び融合能が向上させることができる。【００５４】
膜透過性ペプチドが第１又は第２の脂質膜の表面に存在する場合、少なくとも第１又は第２の脂質膜の外表面に膜透過性ペプチドが存在すればよく、内表面には膜透過性ペプチドが存在していてもよいし存在していなくてもよい。第１の脂質膜が膜透過性ペプチドを有する場合、第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質はコレステリルヘミスクシネート、ホスファチジン酸又はホスファチジルセリンであることが好ましい。第１の脂質膜が上記アニオン性脂質を含有するとともに膜透過性ペプチドを有することにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能及び融合能を向上させることができる。【００５５】
第１又は第２の脂質膜が有する膜透過性ペプチドは、脂質膜を透過可能である限り特に限定されるものではない。膜透過性ペプチドが透過可能である脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、細胞膜、核膜等の生体膜、リポソーム膜等の人工膜が挙げられる。膜透過性ペプチドとしては、例えば、膜透過性ドメイン（Protein Transduction Domain (PTD)）を有するペプチドが挙げられる。膜透過性ドメインとしては、例えば、ポリアルギニン、HIV-1由来のTat(48-60)（GRKKRRQRRRPPQ）、HIV-1由来のRev(34-50)（TRQARRNRRRRWRERQR）等が挙げられる。これらの膜透過性ドメインは、アルギニン残基に富んでおり、負電荷を有する核膜と静電的に相互作用することができる。【００５６】
膜透過性ドメインを有するペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４〜４０個、好ましくは６〜３０個、さらに好ましくは７〜２０個である。膜透過性ドメインを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４〜４０個、好ましくは６〜３０個、さらに好ましくは７〜２０個である。膜透過性ドメインとしてのポリアルギニンは、通常４〜２０個、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個の連続したアルギニン残基からなる。【００５７】
膜透過性ドメインを有するペプチドは、膜透過性ドメインのみからなっていてもよいし、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に任意のアミノ酸配列を有していてもよい。膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン）であることが好ましい。ポリプロリンは、柔らかくて不規則な形をとっているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含まれるアルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。【００５８】
第１の脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量は、脂質膜に含有される総脂質量の通常２〜２０％（モル比）、好ましくは３〜１５％（モル比）、さらに好ましくは４〜１０％（モル比）である。第１の脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量を上記範囲とすることにより、第１の脂質膜の核膜に対する結合能を向上させることができ、第１の脂質膜と核膜との結合を契機として、第１の脂質膜と核膜との膜融合を効率よく誘起することができる。【００５９】
第２の脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量は、脂質膜に含有される総脂質量の通常２〜２０％（モル比）、好ましくは３〜１５％（モル比）、さらに好ましくは４〜１０％（モル比）である。第２の脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量を上記範囲とすることにより、第２の脂質膜のエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜に対する結合能を向上させることができ、第２の脂質膜とエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との結合を契機として、第２の脂質膜とエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合を効率よく誘起することができる。【００６０】
第１又は第２の脂質膜における膜透過性ペプチドの存在態様としては、例えば、膜透過性ペプチドが脂質膜構成成分（例えば、疎水性基、疎水性化合物等）に結合しており、脂質膜構成成分が脂質膜内に保持され、膜透過性ペプチドの一部又は全部が脂質膜から露出している態様が挙げられる。【００６１】
膜透過性ペプチドが結合する脂質膜構成成分は特に限定されるものではなく、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基；コレステロール基又はその誘導体；リン脂質、糖脂質又はステロール；長鎖脂肪族アルコール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）；ポリオキシプロピレンアルキル；グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。【００６２】
第１、第２又は第３のベクターには、核内又は細胞内に送達しようとする目的物質を保持させることができる。目的物質は、例えば、脂質膜構造体の内部（例えば、脂質膜構造体の内部に形成された空隙）、脂質膜の表面、脂質膜中、脂質膜層中、脂質膜層表面等に保持させることができる。脂質膜構造体が例えばリポソーム等の微粒子である場合、微粒子内部に目的物質を封入することができる。【００６３】
目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療、予防等の目的に応じて適宜選択することができる。目的物質が疾病の診断、治療、予防等を目的とした物質である場合、目的物質を保持した脂質膜構造体は、医薬組成物の構成成分として使用することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。【００６４】
目的物質が遺伝子である場合、細胞内への遺伝子導入効率を向上させる点から、脂質膜構造体は、遺伝子導入機能を有する化合物を有することが好ましい。遺伝子導入機能を有する化合物としては、例えば、O,O'-N-ジドデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジテトラデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジヘキサデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジオクタデセノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O',O''-トリデカノイル-N-(ω-トリメチルアンモニオデカノイル)アミノメタンブロミド、ノル[α-トリメチルアンモニオアセチル]-ジドデシル-D-グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、3-β-[n-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール等が挙げられる。これらの遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の内部（例えば、脂質膜構造体の内部に形成された空隙）、脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜層中、脂質膜層表面に存在（結合）させることができる。【００６５】
目的物質は、脂質膜構造体（特に脂質膜構造体の内部）に、目的物質の凝集体として保持されていることが好ましい。これにより、目的物質を効率よく核内に送達することができる。【００６６】
目的物質の凝集体は、目的物質のみから構成されていてもよいし、目的物質以外の物質（例えば、目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。【００６７】
目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とアニオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質と所定の担体とを適当な様式（例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的物質とカチオン性物質又はアニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。【００６８】
目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製することができる。【００６９】
目的物質の凝集体を調製する際に使用できるカチオン性物質は、分子中にカチオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては、例えば、カチオン性脂質（例えば、Lipofectamine（Invitrogen社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体（例えば硫酸プロタミン）；キトサン等が挙げられるが、これらのうち特にステアリル化ポリアルギニンが好ましい。ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は通常４〜２０個であり、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個である。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。【００７０】
目的物質の凝集体を調製する際に使用できるアニオン性物質は、分子中にアニオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。アニオン性物質としては、例えば、アニオン性脂質；アニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマー等を使用することができる。アニオン性物質が有するアニオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。アニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、末端カルボキシル基を有する官能基（例えば、コハク酸残基、マロン酸残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。【００７１】
脂質膜構造体の形態は特に限定されるものではなく、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態又はこれを乾燥若しくは凍結した形態等が挙げられ、各形態の脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて製造することができる。【００７２】
以下、各形態の脂質膜構造体の製造方法を説明するが、脂質膜構造体の形態及びその製造方法はこれらに限定されるものではない。
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させた後、エバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。【００７３】
水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体は、乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体を水系溶媒に添加した後、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することによって製造することができる。また、水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体は、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法等によって製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を使用して、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【００７４】
水系溶媒（分散媒）の組成は、特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地等が挙げられる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、脂質膜構造体をさらに安定して分散させるために、単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等）、二糖類（例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等）、三糖類（例えば、ラフィノース、メレジノース等）、多糖類（例えば、シクロデキストリン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等）等の糖又はその水溶液；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコール等の多価アルコール又はその水溶液等を加えてもよい。水系溶媒（分散媒）に分散した形態の脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、物理的安定性の面（例えば、凝集等を防止する面）から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが好ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０）に設定すること、又は窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが好ましい。【００７５】
水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥又は凍結させた形態の脂質膜構造体は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法により乾燥又は凍結することによって製造することができる。水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した後、これを乾燥する場合、脂質膜構造体の長期保存が可能となる他、乾燥した脂質膜構造体に薬効成分含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるため、薬効成分を効率よく脂質膜構造体に保持させることが可能となる等の利点がある。【００７６】
凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合、水系溶媒（分散媒）に、例えば、単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等）、二糖類（例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等）、三糖類（例えば、ラフィノース、メレジノース等）、多糖類（例えば、シクロデキストリン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等）等の糖又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合、水系溶媒（分散媒）に、例えば、上記糖又はその水溶液；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコール等の多価アルコール又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を安定に長期間保存することができる。水系溶媒（分散媒）には、糖と多価アルコールとを組み合わせて加えてもよい。脂質膜構造体が分散した水系溶媒（分散媒）における糖又は多価アルコールの濃度は特に限定されないが、糖の濃度は２〜２０％（Ｗ/Ｖ）であることが好ましく、５〜１０％（Ｗ/Ｖ）であることがさらに好ましい。また、多価アルコールの濃度は、１〜５％（Ｗ/Ｖ）であることが好ましく、２〜２．５％（Ｗ/Ｖ）であることがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として緩衝液を用いる場合、緩衝剤の濃度は５〜５０ｍＭであることが好ましく、１０〜２０ｍＭであることがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体に含有される脂質総量の濃度に換算して０．１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭであることがさらに好ましい。【００７７】
抗体を保持させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体を添加し、抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製造することができる。また、抗体を保持させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体及び抗体中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体を添加し、抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製造することができる。【００７８】
目的物質を保持する脂質膜構造体を含有する医薬組成物の形態は特に限定されるものではなく、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態又はこれを乾燥若しくは凍結した形態が挙げられ、各形態の医薬組成物は、上記した各形態の脂質膜構造体と同様に製造することができる。【００７９】
乾燥した混合物の形態の医薬組成物は、例えば、脂質膜構造体の構成成分と目的物質とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをエバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造することができる。【００８０】
目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物の製造方法としては、以下のように複数の方法が公知となっており、脂質膜構造体における目的物質の保持様式、混合物の性状等に応じて、製造方法を適宜選択することができる。【００８１】
〔製造方法１〕
製造方法１は、脂質膜構造体の構成成分と目的物質とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをエバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥混合物を製造し、次いで、これに水系溶媒を添加した後、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行うことにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。製造方法１は、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥混合物を製造するために、脂質膜構造体の構成成分及び目的物質を有機溶媒に溶解する必要があるが、脂質膜構造体の構成成分と目的物質との相互作用を最大限に利用することができる利点がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、目的物質は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、目的物質の脂質膜構造体への保持率を向上させることができる利点がある。【００８２】
〔製造方法２〕
製造方法２は、脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に目的物質を含む水系溶媒を添加して乳化を行うことにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。製造方法２は、有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る目的物質に適用することができる。製造方法２は、脂質膜構造体がリポソームの場合に内水相部分にも目的物質を保持させることができる利点がある。【００８３】
〔製造方法３〕
製造方法３は、水系溶媒に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、層状構造物等の脂質膜構造体に、さらに目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。製造方法３は、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法３は、既に製造された脂質膜構造体に外部から目的物質を添加する方法であることから、目的物質が高分子の場合、目的物質が脂質膜構造体の内部に入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体がリポソームである場合、製造方法３によって、目的物質がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には「複合体」又は「コンプレックス」と呼ばれる）を形成されることが知られている。製造方法３は、脂質膜構造体単独の水系分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における目的物質の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御を行い易い。したがって、製造方法１及び製造方法２に比べて、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を容易に製造することができる。【００８４】
〔製造方法４〕
製造方法４は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥することにより得られた乾燥物に、目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。製造方法４は、製造方法３と同様に、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法４と製造方法３との相違点は、脂質膜構造体と目的物質との存在様式にあり、製造方法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した後、これを乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、上述したように水系溶媒に糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、あるいは乳糖又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体が再構築され、このとき、目的物質が脂質膜構造体内部に保持された形態の脂質膜構造体が製造される。【００８５】
製造方法４では、脂質膜構造体単独の水系分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の目的物質の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御も行い易い。したがって、製造方法１及び製造方法２に比べて、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を容易に製造することができる。また、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を目的物質の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せることや、高分子の目的物質であっても、脂質膜構造体内部に目的物質を保持させ易いこと等の利点がある。したがって、目的物質が高分子の場合、製造方法３では、目的物質が脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとる可能性があるが、製造方法４ではこの点で大きく異なる。【００８６】
目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法等を採用することができる。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した分散液を乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等が挙げられ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、あるいは乳糖又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した分散液を凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、あるいは上記多価アルコール又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。【００８７】
第１のベクターにおいて、第１の脂質膜が核膜と結合すると、これを契機として、第１の脂質膜と核膜との膜融合が誘起され、脂質膜構造体に保持された目的物質は、核内に放出される。この結果、目的物質は核内に送達される。したがって、第１又は第３のベクターは、目的物質を核内に送達するためのベクターとして使用することができる。【００８８】
第２のベクターにおいて、第２のベクターがエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス等の経路によりエンドソーム画分、マクロピノソーム画分等として細胞内に取り込まれた後、第２の脂質膜がエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜と結合すると、これを契機として、第２の脂質膜とエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合が誘起され、脂質膜構造体に保持された目的物質は、エンドソーム、マイクロピノソーム等を脱出し、細胞内に放出される。この結果、目的物質は細胞内に送達される。したがって、第２のベクターは、目的物質を細胞内に送達するためのベクターとして使用することができる。【００８９】
第３のベクターにおいて、第３のベクターがエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス等の経路によりエンドソーム画分、マクロピノソーム画分等として細胞内に取り込まれた後、第２の脂質膜がエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜と結合すると、これを契機として、第２の脂質膜とエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合が誘起され、脂質膜構造体に保持された目的物質は、エンドソーム、マイクロピノソーム等を脱出し、細胞内に放出される。そして、第１の脂質膜が核膜と結合すると、これを契機として、第１の脂質膜と核膜との膜融合が誘起され、脂質膜構造体に保持された目的物質は、核内に放出される。この結果、目的物質は核内に送達される。したがって、第３のベクターは、目的物質を核内に送達するためのベクターとして使用することができる。【００９０】
第１又は第３のベクターが標的とする核は、細胞から分離された核であってもよいし、細胞内に存在する核であってもよい。第１又は第３のベクターが標的とする核が由来する生物種は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、微生物等が挙げられるが、動物が好ましく、哺乳動物がさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。第１又は第３のベクターが標的とする核を含有する細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。【００９１】
第１のベクターの一実施形態であるリポソームとしては、図１７（ａ）に示すように、脂質膜２ａと、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３とを備えた１枚膜リポソーム１ａであって、脂質膜２ａが第１の脂質膜であり、脂質膜２ａの表面に、膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する膜透過性ペプチド（好ましくはポリアルギニンからなる膜透過性ペプチド）が存在する１枚膜リポソーム１ａが挙げられる。１枚膜リポソーム１ａは、脂質膜２ａの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２ａが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して核膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２ａと核の外膜との膜融合が誘起され、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３は、核内に放出される。【００９２】
第１のベクターの別の実施形態であるリポソームとしては、図１７（ｂ）に示すように、脂質膜２１ｂと、脂質膜２１ｂの外側に位置する脂質膜２２ｂと、脂質膜２１ｂの内側に封入された目的物質３とを備えた２枚膜リポソーム１ｂであって、脂質膜２１ｂ及び２２ｂが第１の脂質膜であり、脂質膜２１ｂ及び２２ｂの表面に、膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する膜透過性ペプチド（好ましくはポリアルギニンからなる膜透過性ペプチド）が存在する２枚膜リポソーム１ｂが挙げられる。２枚膜リポソーム１ｂは、脂質膜２２ｂの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２２ｂが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して核の外膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２２ｂと核の外膜との膜融合が誘起され、リポソームは核の外膜を通過する。核の外膜を通過したリポソームにおいて、脂質膜２２ｂは核の外膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｂは保持されている。核の外膜を通過した後、脂質膜２１ｂが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して核の内膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２１ｂと核の内膜との膜融合が誘起され、脂質膜２１ｂの内側に封入された目的物質３は、核内に放出される。なお、脂質膜２１ｂ又は２２ｂの表面に存在する膜透過性ペプチドは省略が可能である。【００９３】
第２のベクターの一実施形態であるリポソームとしては、図１７（ｃ）に示すように、脂質膜２ｃと、脂質膜２ｃの内側に封入された目的物質３とを備えた１枚膜リポソーム１ｃであって、脂質膜２ｃが第２の脂質膜であり、脂質膜２ｃの表面に、膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する膜透過性ペプチド（好ましくはポリアルギニンからなる膜透過性ペプチド）が存在する１枚膜リポソーム１ｃが挙げられる。１枚膜リポソーム１ｃは、脂質膜２ｃの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２ｃが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して、エンドソーム膜又はマクロピノソーム膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２ｃとエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合が誘起され、脂質膜２ｃの内側に封入された目的物質３は、細胞内（細胞質内）に放出される。【００９４】
第３のベクターの一実施形態であるリポソームとしては、図１７（ｄ）に示すように、脂質膜２１ｄと、脂質膜２１ｄの外側に位置する脂質膜２２ｄと、脂質膜２２ｄの外側に位置する脂質膜２３ｄと、脂質膜２１ｄの内側に封入された目的物質３とを備えた３枚膜リポソーム１ｄであって、脂質膜２１ｄ及び２２ｄが第１の脂質膜であり、脂質膜２３ｄが第２の脂質膜であり、脂質膜２１ｄ、２２ｄ及び２３ｄの表面に、膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する膜透過性ペプチド（好ましくはポリアルギニンからなる膜透過性ペプチド）が存在する３枚膜リポソーム１ｄが挙げられる。３枚膜リポソーム１ｄは、脂質膜２３ｄの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２３ｄが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して、エンドソーム膜又はマクロピノソーム膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２３ｄとエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合が誘起され、リポソームは、エンドソーム又はマクロピノソームを脱出する。エンドソーム又はマクロピノソームを脱出したリポソームにおいて、脂質膜２３ｄはエンドソーム膜又はマクロピノソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｄ及び２２ｄは保持されている。その後、脂質膜２２ｄが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して核の外膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２２ｄと核の外膜との膜融合が誘起され、リポソームは核の外膜を通過する。核の外膜を通過したリポソームにおいて、脂質膜２２ｂは核の外膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｂは保持されている。核の外膜を通過した後、脂質膜２１ｂが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介して核の内膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２１ｂと核の内膜との膜融合が誘起され、脂質膜２１ｂの内側に封入された目的物質３は、核内に放出される。なお、脂質膜２１ｄ又は２２ｄの表面に存在する膜透過性ペプチドは省略が可能である。【００９５】
各ベクターは、in vivo及びin vitroのいずれにおいても使用することもできる。各ベクターをin vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、本発明の脂質膜構造体に保持された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００９６】
本実施例では、以下の略語を使用する。
BCA： bovine serum albumin
Chol：Cholesterol
CHEMS：cholesteryl hemisuccinate
DMSO：dimetyl sulfoxide
DNA：deoxyribonucleic acid
DOPE：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
DOTAP：1,2-dioleoyl-3-trimetylammonium propane
DTT：dithiothreitol
D'MEM：dulbecco's modified eagle medium
EDTA：ethylenediamine N',N',N',N'-tetraacetic acid
EGTA：ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N',N',N',N'-tetraacetic acid
Eｍ：Emission
EPC：egg yolk L-α-phosphatidylcholine
Ex：Excitation
GFP：green fluorescence protein
HBSS：Hank's balanced salt solution
HEPES：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
LB：luria-bertani's broth
NBD-DOPE：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)
NLS：nuclear localization signal
NP-40：nonionic detergent
PA：3-sn-phosphatidic acid
PBS：phosohate-bufferd saline
PC：Phosphatidylcoline
PLL：Poly-L-Lysine
PS：3-sn-phosphatidyl-L-serine
Rho-DOPE：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)
STR-R8：stearylated octaarginine 
SV40：Simian Virus 40
rpm：round per minutes【００９７】
試薬及び実験材料の入手先は以下の通りである。
BCA protein assay kit (PIERCE)
CHEMS (SIGMA)
Cardiolipin (SIGMA)
Cholesterol (AVANTI)
DGDG (SIGMA)
DOPE (AVANTI)
DOTAP (AVANTI)
D’MEM (GIBCO)
EPC (日本油脂)
FCS (GIBCO)
GM1 (本研究室で調製)
Galactocerebroside (SIGMA)
Glucocerebroside (SIGMA)
Lactocerebroside (SIGMA)
Luciferase Assay Substrate (Promega)
NBD-DOPE (AVANTI)
Octylglucoside (SIGMA)
PA (SIGMA)
PG (SIGMA)
PI (SIGMA)
PLL (SIGMA)
PS (SIGMA)
Protamine sulfate (CALBIOCHEM)
Reporter Lysis Buffer (Promega)
Rho-DOPE (AVANTI)
STR-R8 (京都大学二木史郎先生から入手)
pEGFPluc (本研究室で調製)【００９８】
試薬の調製方法は以下の通りである。
PBS：ダルベッコPBS(−)(ニッスイ) 4.9gをDDW 500mLに溶解し、高圧蒸気滅菌を行った。
LB+kan：Bacto tryptone(和光純薬) 10g、Yeastextract(和光純薬) 5g及びNaCl(SIGMA) 10gをDDWに溶解し、1Lとした。高圧蒸気滅菌を行い、kanamysineを20mg/mLとなるように加えた。
HEPES buffer (10mM)：HEPES (和光純薬) 119mgをDDW 50mLに溶解し、1N NaOHでpH 7.4とした後、フィルターろ過滅菌を行った。
HEPES buffer 5% glucose (10mM, pH 5.5)：HEPES (和光純薬) 119mg及びD-glucose(片山化学) 2.5gをDDW 50mLに溶解し、1N NaOHでpH 7.4とした後、クリーンベンチ内でフィルターろ過滅菌を行った。
Import buffer (×10)：HEPES(和光純薬) 4.77g、KOAc(Wako) 10.8g、NaOAc(Wako) 0.25g、MgOAc(SIGMA) 0.43g及びEGTA・4Na 0.23gをDDWに溶解し、KOHでpH 7.3に調整した後、DDWで100mLにメスアップした。使用直前に200mM DTTを加え、10倍希釈し、フィルターろ過滅菌を行った。
200mM DTT：DTT(nacalai tesque) 154.25mgをDTTに溶解し、5mLとした。
IGEPAL beffer：0.5% (W/V) NP-40(SIGMA)、10mM NaCl、3mM MgCl2及び10mM Tris-HClを混合し、pH 7.4に調整した。
HBSS：NaCl(SIGMA) 4.0g、KCl 0.2g、CaCl2 0.07g、MgSO4・7H2O 0.1g、KH2PO4、グルコース 0.5g及びNaHCO3 0.18gをDDWに溶解し、NaOHでpH 7.5に調整した後、DDWで500mLにメスアップした。【００９９】
〔実施例１〕核膜融合性脂質のスクリーニング
1. 核の単離法及び核膜との結合実験系の確立
1-1. はじめに
核膜への融合を評価する上で、核膜への結合は必要不可欠な要素となる。そこで、核膜融合性脂質のスクリーニングの第一段階として、脂質の核膜への結合を評価することにした。過去の報告に、PA、PS等を核膜と融合させている報告があることから（R. Lawaczeck.: Intraction of negatively charged liposomes with nuclear membranes:adsorption, lipid mixing and lysis of the vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 903 (1987) 123-131）、本実施例では電荷、特に負電荷を有する脂質に着目した。また、核に存在するレクチンに糖鎖が親和性を有することが報告されているため、構造中に糖鎖を持つ脂質もスクリーニングに用いた。その他、核膜に存在する脂質をスクリーニングに用いた。なお、核膜に含まれる脂質は、Cardiolipin 4%、PE 13%、PC 55%、PI 10%、PS 3%、PA 2%、リゾグリセロリン脂質 3%、SM 0.5%である。【０１００】
1-2. 核の単離法の確立
1-2-1. 細胞培養
(1) HeLa細胞の立ち上げ
あらかじめ50mLのコニカルチューブに20mLのD'MEM（10% 非働化FCSを含む）を入れておき、HeLa細胞ストックを溶かしながら混ぜた。そのチューブを1000rpm、25℃、5分間遠心し、上清を取り除いた後、10mLのD'MEMを加えて懸濁させ、10cmディッシュにまいて、37℃、CO2インキュベーターで培養した。【０１０１】
(2) 細胞の継代
10cmディッシュ中のD'MEMをアスピレーターにて除き、PBS(−) 5mLで洗った。PBS(−)を除き、PBS(−) 2mLと0.5% トリプシン/5μL EDTA溶液 200μLを加え、37℃、5% CO2インキュベーターで5分間インキュベートし、ディッシュの底に付着した細胞をはがした。8mLのD'MEMを加え、懸濁させた後、50mLのコニカルチューブに移して1000rpm、25℃、5分間遠心した。上清を除き、D'MEMを10mL加えて懸濁させたものをセルカウントし、適当な濃度になるように細胞溶液をD'MEMで希釈して10cmディッシュにまいた。なお、次の継代までに何日も培養するときは、D'MEMを2日に1回は交換するようにした。【０１０２】
(3) セルカウント
細胞をD'MEMで懸濁させた懸濁液を1.5mLサンプルチューブに10μLとり、0.3%トリパンブルー溶液 10μLを混合してよくピペッティングした。その溶液を10μLとり、血球係数板に注入し、カウントした。【０１０３】
(4) 細胞のストック調整
70% コンフルエントな細胞を用いて行った。10cmディッシュ中のD'MEMをアスピレーターにて除き、PBS(−) 5mLで洗った。PBS(−)を除き、PBS(−) 2mLと0.5% トリプシン/5μL EDTA溶液 200μLを加え、37℃、5% CO2インキュベーターで5分間インキュベートし、ディッシュの底に付着した細胞をはがした。8mLのD'MEMを加え、懸濁させた後、50mLのコニカルチューブに移して1000rpm、25℃、5分間遠心した。上清を除き、D'MEMを10mL加えて懸濁させたものをセルカウントし、再度1000rpm、25℃、5分間遠心した。上清を除去した後、D'MEM:DMSOを9:1で混合した溶液で、細胞が目的濃度となるように希釈し、懸濁した後、キャップ付1.5mLサンプルチューブに1mLずつ分注してから、イソプロパノールの入った容器に移し、-80℃フリーザーで4時間以上保存し、その後、液体窒素の入ったセルストッカーに保存した。【０１０４】
1-2-2. 核の単離法
(1) プロトコール案
(a) IGEPAL bufferを用いたプロトコール
前日に6×105 cells/dishの濃度のHeLa細胞を6cmディッシュにまいておいた。IGEPAL buffer及びPBSは室温に戻しておいた。細胞をPBS(−)で2回洗い、PBS(−)を500μL添加した。それからセルスクレーパーで細胞を集め、1.5mLサンプルチューブに回収し、1000rpm、4℃、5分間遠心した。上清をアスピレーターで除去後、IGEPAL befferを500μL添加し、ピペッティングした後、1400g、4℃、5分間遠心した。アスピレーターで上清を除去後、再びIGEPAL befferを500μL添加し、ピペッティングした後、1400g、4℃、5分間遠心した。得られた単離核はImport bufferに懸濁した。【０１０５】
(b) HBSSを用いたプロトコール（J. Hasbold.: Flow cytometric cell division tracking using nuclei. Cytometry. 40 (2000) 230-237）
2日前に適当濃度のHeLa細胞を10cmディッシュにまいておいた。HBSS/0.1% BSA溶液は実験前に氷上に置いておいた。細胞をPBS(−)/0.1% BSA/0.1% NaN3で2回洗い、PBS(−)/0.1% BSA/0.1% NaN3を500μL添加した。それからセルスクレーパーで細胞を集め、1.5mLサンプルチューブに回収し、1000rpm、4℃、5分間遠心した。上清をアスピレーターで除去後、100μL HBSS/0.1% BSAを添加し、タッピングした後、さらに100μL HBSS/0.1% BSA/0.2% NP-40溶液を加え、氷上で5分間インキュベートした。その後、800μL HBSS/0.1% BSAを添加し、10,000rpm、4℃、30秒間遠心した。アスピレーターで上清を除去後、1mL HBSS/0,02% NP-40を加え、懸濁し、10,000rpm、4℃、30秒間遠心した。アスピレーターで上清を除去後、再び1mL HBSS/0,02% NP-40を加え、懸濁し、10,000rpm、4℃、30秒間遠心し、アスピレーターで上清を除去した。得られた単離核はImport bufferに懸濁した。【０１０６】
(c) ヘキストによる核染色
バッファーで50倍希釈したヘキスト(1mg/1mL) 10μLに適当濃度に希釈した核単離サンプル10μLを混合し、室温で10分間インキュベートした。その後、セルカウントに用いた血球係数板に注入し、蛍光顕微鏡で観察しながらカウントした。【０１０７】
(2) 考察
IGEPAL bufferを用いたプロトコールで操作を行った結果、操作中に核が凝集してしまい、全く攪拌できなくなってしまった。主な原因としてIGEPAL befferに含まれるNP-40により細胞が凝集しやすくなっていたこと、遠心速度が速すぎたことが原因と考えられる。そこで、2回目の1400g、4℃、5分間の遠心条件を2000rpm、4℃、5分間に変更してみたが、やはり凝集は起こってしまい、特に変化は見られなかった。次に、2回目のIGEPAL befferを500μL添加の際、bufferをNP-40の含まれていないものに変えてみたところ、やはり凝集は見られたが若干懸濁できるようになった。HBSSを用いたプロトコールで操作を行った結果、凝集は特に起こらず、容易に懸濁できた。前日に2×106cells/dishでまいた細胞から核を抽出し、ヘキストでラベルし、カウントした結果は1.329×106nucsであった。まいた細胞の濃度から算出した抽出効率は69.5％であった。遠心の速度が10,000rpmでは早すぎて核以外の分画も沈殿してしまう可能性もあることから、1,000rpm、4℃、5分間に変更してみたところ、ペレットがゆるすぎてアスピレーターで上清とともに核まで取ってしまう恐れがあったのでこの変更はやめることにした。今度は1,400g、4℃、1分に変更したところ、適度に攪拌しやすい硬さのペレットとなり、顕微鏡で観察した結果もほかの分画の存在は確認できなかったので、この条件を今後採用することにした。また、継代する細胞数は、2日前にまく場合は2.5×106 cells/dish、3日前にまく場合は1.5×106 cells/dishに決定した。【０１０８】
(3) 核抽出プロトコールの決定
2日前に適当濃度のHeLa細胞を10cmディッシュにまいておいた。HBSS/0.1% BSA溶液は実験前に氷上に置いておいた。細胞をPBS(−)/0.1% BSA/0.1% NaN3で2回洗い、PBS(−)/0.1% BSA/0.1% NaN3を500μL添加した。それからセルスクレーパーで細胞を集め、1.5mLサンプルチューブに回収し、1000rpm、4℃、5分間遠心した。上清をアスピレーターで除去後、100μL HBSS/0.1% BSAを添加し、タッピングした後、さらに100μL HBSS/0.1% BSA/0.2% NP-40溶液を加え、氷上で5分間インキュベートした。その後、800μL HBSS/0.1% BSAを添加し、1,400g、4℃、1分間遠心した。アスピレーターで上清を除去後、1mL HBSS/0.02% NP-40を加え、懸濁し、1,400g、4℃、1分間遠心した。アスピレーターで上清を除去後、再び1mL HBSS/0.02% NP-40を加え、懸濁し、1,400g、4℃、1分間遠心し、アスピレーターで上清を除去した。得られた単離核はImport bufferに懸濁した。【０１０９】
1-3. 核膜との結合実験の（Binding assay）系の確立
1-3-1. 膜標識リポソームの調製
(1) lipid:Chol=2:1
10mM 脂質ストック:10mM Cholを2:1のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層としてimport bufferを、総脂質濃度2mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。
(2) lipid:DOPE=2:3
10mM 脂質ストック:10mM DOPEを2:1のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液を添加した。以下は(1)と同じ。【０１１０】
1-3-2. Binding assay 実験方法
1-2-2項の操作法で核を単離し、ヘキストで染色後、核数をカウントした。1.5mL サンプルチューブ内で、約5.0×105個の核にprobe lipをそれぞれ20μLずつ添加し、import bufferを加え、200μLとした。また、蛍光強度の最大値として0.5% Triton溶液 180μLに同様にprobe lipをそれぞれ20μLずつ添加した。それぞれのサンプルを37℃、1時間インキュベート後、1400g、4℃、1分間遠心し、2回washした。その後、100μLの0.5% Triton溶液で懸濁し、530nmでの蛍光強度を測定した。核膜との結合率は下記の式に従って算出し、用いた核の個数は5.0×105個に補正した。
結合率(%)＝(核と結合したリポソームの蛍光強度)/(用いたリポソームの最大蛍光強度)×100【０１１１】
1-4. 核膜結合性脂質のスクリーニング（実験結果）
1-4-1. 電荷による核膜結合能評価
電荷による核膜への影響を調べる目的で以下の脂質を用いた。
EPC (±)，SM (±)，DOTAP (＋)，PA (−)，PS (−)，PI (−)，Cardiolipin (−)，PG (−)，CHEMS (−)
各脂質とChol又はDOPEとを組み合わせてリポソームを調製し、核膜に対する結合率を測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、中性脂質、特にEPCでは結合率が非常に低くかった。また、正電荷脂質では結合率が高かった。これは、核膜を構成する脂質に負電荷のものが多く含まれていることから、静電的相互作用によるものであると考えられる。一方、負電荷の脂質でも高い結合が見られた。また、Cholを主体としたリポソームでもDOPEを主体としたリポソームでも同程度の結合率であった。【０１１２】
1-4-2. その他の細胞機能性脂質による核膜結合能評価
次に、電荷ではなく他の因子による結合能への影響を評価するため、核膜にも存在し、生理的な機能に関する脂質であるGM1、核に存在するレクチンとの相互作用が期待される、糖残基を含む脂質であるcerebroside等を用いて実験を行った。ここで用いた脂質及び界面活性剤を下記に示した。
GM1，DGDG，Galactocerebroside，Glucocerebroside，Lactocerebroside，Octylglucoside
各脂質とEPC/Chol又はEPC/DOPEとを組み合わせてリポソームを調製し、核膜に対する結合率を測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、どれも結合率が非常に低かった。生理的機能には核との親和性のみではなく、細胞質因子が必要であると考えられる。【０１１３】
1-5. まとめ
以上の実験から、核の単離法及び核膜との結合実験方法を確立した。また、実験結果より、単離した核膜への結合には電荷が必要であることが示唆された。核膜における生理機能に関する脂質の作用、糖残基との相互作用等は、単離した試験管内の条件下では、核移行に関連のあるImportinやATP等が存在しないために起こらないと考えられる。したがって、以降の実験には電荷を持つ脂質を使用することにした。【０１１４】
2. FRETを用いた核膜融合脂質の検証実験系の確立
2-1. はじめに
FRETは2種の蛍光物質が近接する際に、それぞれの励起波長と蛍光波長との相互作用により観測される現象である。すなわち、2種の蛍光物質が互いに近接しているとき、一方の蛍光物質(A)を励起することで発せられる蛍光波長が、もう一方の蛍光物質(B)の励起波長に均衡している場合には、(B)がその蛍光波長により励起されて蛍光を発し、(A)の蛍光が観測されなくなる現象である。本研究では、NBDとRhoの2種の蛍光物質を導入してリポソームを調製した。リポソームが核膜と融合していないときには、NBDに由来した蛍光エネルギーがRhoへ移動し、NBDの蛍光が抑制されRhoの蛍光波長である590nmの蛍光が上昇する。一方、核膜との融合が起こると２つの蛍光物質間の距離が広がり、Rhoへのエネルギーの移動が解消され、NBDの蛍光波長である530nmの蛍光が回復する。この原理を利用し、1章での実験に用いた電荷を有する脂質を用いて蛍光ラベルリポソームを調製し、核膜との融合能を評価した。【０１１５】
2-2. FRETを用いた核膜融合性脂質の検証
2-2-1. リン脂質の定量法
単離した核の濃度とリポソームの濃度をそろえるため、核のリン脂質を定量した。定量にはリン脂質C-テストワコーを用いて、添付の操作方法に従って操作し、測定した。【０１１６】
2-2-2. 蛍光脂質の条件検討
最も感度の高いFRET解除の様子を観測するために、蛍光脂質濃度をいくつか変えて検討した。表１に示す組成でprobe Lipを作成した。【０１１７】
【表１】
2007037444.tif 000003
【０１１８】
(1) Non-probe Lip の調製（pH 7.4又はpH 4.7で調製）
EPC 6.65mg (8.65μmol)及びChol 1.7mg (4.35μmol)をとり、CHCl3 2.5mLに溶かし、voltex後、1mLずつガラス試験管2本に入れた。それぞれ窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成し、PBS(−)を1mLずつ加え、10分間水和させた後、超音波処理を行い、リポソームを調製した。さらに、PBS(−)（pH 7.4又は4.7）により2.5倍希釈した。（最終総脂質濃度 2mM）【０１１９】
(2) Probe Lip の調製
10mM DOPE 30μL及び10mM CHEMS 20μLをガラス試験管にとり（脂質濃度 0.5μmol）、NBD-DOPE x mol%量及びRho-DOPE y mol%量（表１参照）添加後、さらにCHCl3を添加し、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。PBS(−)（pH 7.4）を250 μL加えて10分間水和させ、超音波処理によりリポソームを調製した。【０１２０】
(3) FRETの解析
1.5mL サンプルチューブ内で、上記により調製したそれぞれ2 mMのprobe Lip及びnon-probe Lipを、probe Lip:non-probe Lip=1:9となるように混合した。また、FRETコントロールとして、probe-Lip:PBS=1:9、最大蛍光強度用コントロールとして、probe-Lip:0.5% Triton(pH 7.4)=1:9をそれぞれ混合し、37℃、1時間インキュベートした。その後、pHを1N HClにより調整し、ex: 470nm、em: 530nm、590nmにおける蛍光強度を測定した。それぞれの530nmにおける蛍光強度により、Transfer Efficiencyを下記の式に従って算出した。
TF = (F-F0)/(Fmax-F0)×100
TF：Transfer Efficiency
F：サンプルの蛍光強度
F0：ブランクの蛍光強度
Fmax：最終濃度0.5% Tritonによりリポソームを破壊したときの蛍光強度【０１２１】
結果を表２に示す。DOPE/CHEMSはpH依存的に膜融合する脂質なので、pH4.7ではほとんど膜融合が見られず、pH7.4で融合が見られるはずである。表２に示すように、pH4.7とpH7.4のTFの差が最も大きいのはNBD:Rho=1:0.5のときであり、pH7.4でのTFが最も大きくなっていることから、この条件が最もFRET解除の観測の感度が良いと考えられ、以後この濃度を用いることにした。【０１２２】
【表２】
2007037444.tif 000004
【０１２３】
2-2-3. 膜標識リポソームの調製
(1) lipid:Chol=2:1
10mM 脂質ストック:10mM Cholを2:1のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量 のNBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層としてimport bufferを、総脂質濃度2mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。【０１２４】
(2) lipid:DOPE=2:3
10mM 脂質ストック:10mM DOPEを2:1のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量 NBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加した。以下は(1)と同じ。【０１２５】
2-2-4. FRET
1-2-2項の操作法で単離した核でリン脂質の定量を行い、核中に含まれるPCの量を求めた。核膜に含まれるPCの量は文献より55%であるので、これより核の総脂質濃度を求め、リポソームと同じ濃度（2mM）に希釈した。1.5mL サンプルチューブ内で、2-2-3項で調製したprobe Lip及び2mM 単離核溶液を、probe Lip:核=1:9で混合し、37℃、1時間インキュベートした。また、コントロールとして、probe-Lip:Import buffer=1:9、最大蛍光強度用コントロールとして、probe-Lip:0.5% Triton=1:9をそれぞれ混合し、同様に37℃、1時間インキュベートした。インキュベート後に、それぞれのサンプルを0.1mMに希釈し、蛍光強度（励起波長：470nm、吸光波長：530nm、590nm）を測定した。得られた蛍光強度の値を2mMに算出しなおし、530nmでの蛍光強度により、TFを2-2-2項に示した式から算出した。【０１２６】
2-3 核膜融合性脂質のスクリーニング（実験結果）
1-4項の実験結果により核膜との結合の見られた脂質及びEPCを用いてFRET解析を行った。実験には以下の脂質を用いた。
EPC (±)，SM (±)，DOTAP (＋)，PA (−)，PS (−)，PI (−)，Cardiolipin (−)，PG (−)，CHEMS (−)
これらの脂質について2-2-3項の操作法でリポソームを調製し、TFを測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、大まかに見ると、Cholを主体とした脂質の融合能が低いのに対し、DOPEを主体とした脂質では比較的高い膜融合能を示している。但し、DOPE主体の脂質では解析不可能なスペクトルが多かったり、データを取得できなかったりしたので、良い結果とはいえない。DOPEはそれ自体がとても不安定な構造をしており、他の脂質をDOPEと組み合わせることで逆ヘキサゴナル構造をとりやすくするため、膜融合能が上昇する。よって解析不可能なものについてはおそらくリポソームがインキュベーション中に壊れており、うまく解析できなかったものと思われる。Chol主体の脂質はFRET解除が見られないスペクトルが再現良く見られるので、こちらのデータは正しいと思われる。Cholは脂質に組み合わせることで、膜の裏打ち構造として機能するため、脂質が硬くなる。このことからも膜融合は下がると予想されたが、Chol主体の脂質の中で比較的膜融合の高いCardiolipin、PI、PGについては、脂質そのものの膜融合能が高いためにCholによりリポソームを硬くしても、高い融合が見られたものと思われる。リポソームを構成する脂質のうちDOPEが増えることで、若干膜融合能に何らかの影響があり、融合能が減少してしまったのかもしれない。【０１２７】
2-4. まとめ
以上の実験により、FRETを用いた核膜融合性脂質の検証実験系を確立した。また、実験結果より、電荷を持つ脂質では結合と同様に核膜との融合も起こることが認められた。しかし、実験中にリポソームが破壊されている可能性もあり、インキュベートの仕方を工夫する必要があると思われる。DOPE、Cholの脂質中の割合等、脂質組成についても、さらに膜融合能の上昇が見られるような条件を検討することも重要であると考えられる。【０１２８】
3. STR-R8修飾リポソームの核膜親和性評価
3-1. はじめに
STR-R8(CH3(CH2)16CONHRRRRRRRR)は非常に塩基性の高いペプチドである。STR-R8修飾リポソームはMacropinocytosisにより取り込まれ、脂質膜の構造を保持したまま核まで到達されることが報告されている（二木四郎: 細胞膜を透過する塩基性ペプチド. 蛋白質 核酸 酵素. 47 (2002) 1415-1419）。また、STR-R8はリポソーム溶液中に添加することで容易にリポソームに修飾され、正電荷を持たせることができ、これにより核膜への結合性が向上する。すなわち、STR-R8を修飾してもなお核膜への融合能を保持し、結合能の上昇した脂質を用いることで、効率的な遺伝子ベクターが構築できると考えられる。そこで、本研究においては、STR-R8修飾による核膜への親和性の変化及びその結合能と融合能の相関を得ることを目的とし、実験を行った。なお、リポソームを構成する脂質の割合は、STR-R8を修飾しやすい、Lipid : DOPE(Chol)= 9:2で調製した。【０１２９】
3-2. STR-R8修飾リポソームの核膜親和性評価
3-2-1. 膜標識リポソームの調製
(1) Binding assay用リポソームの調製
(a) Lipid:Chol= 9:2
1mM 脂質ストック:1mM Cholストックを9:2のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量 のNBD-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層としてimport bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。さらにSTR-R8で修飾する場合は、超音波処理後のリポソーム溶液に5mol%量のSTR-R8を添加し、ピペッティング後、30分間室温で放置した。
(b) Lipid:DOPE=2:9
1mM 脂質ストック: 1mM DOPEストックを2:9のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液を添加した。以下は(1)と同じ。【０１３０】
(2) FRET解析用リポソームの調製
(a) Lipid:Chol= 9:2
1mM 脂質ストック:1mM Cholストックを9:2のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層としてimport bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。さらにSTR-R8で修飾する場合は、超音波処理後のリポソーム溶液に5mol%量のSTR-R8を添加し、ピペッティング後、30分間室温で放置した。
(b) Lipid:DOPE=2:9
1mM 脂質ストック:1mM DOPEストックを2:9のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量 のNBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加した。以下は(1)と同じ。【０１３１】
3-2-2. Binding assay
ここでは、結合率の高かった1-4-1項の脂質を用いて、STR-R8 ＋/−について検討を行った。操作は1-3-2項に従って行った。結果を図４に示す。
図４に示すように、ほとんど全ての脂質において、核膜との結合の上昇が見られた。なお、DOPE主体の脂質については1-4-1項の結果と比較するとかなり結合率が下がっているが、これは脂質中のDOPEの割合が先ほどよりも増しているために起こってしまったものと思われる。DOPEの構造的な何らかの性質が原因で、結合しにくくなってしまったのかもしれない。逆にChol主体の脂質では、1-4-1項よりもCholの割合が減少しているため膜の流動性が上昇し、結合しやすくなったものと思われる。【０１３２】
3-2-3. FRET解析
3-2-2項と同じ脂質を用いてFRETの解析を行った。操作は2-2-4項の手順で行った。TFに関する結果を図５に示す。
図５に示すように、STR-R8修飾により、結合率とは異なり、TFのすべての脂質における上昇は認められなかった。逆にまったくFRETの解除が起こらなくなってしまうものもあった。DOPE/PGは脂質組成がLipid:DOPE=2:3のときよりもかなり融合能が減少してしまったので、この脂質においては、DOPEと組み合わせることで融合能が減少するという性質を持つことが示唆された。しかし、STR-R8修飾前はほとんど結合も融合も見られなかったDOPE/EPCやDOPE/SMは飛躍的に融合能が上昇していた。STR-R8により電荷を持つようになったことでこれまで見られなかった細胞への親和性が見られるようになったと考えられる。
これまでに行った実験の中で、核膜への融合能が特に低いLipid:Chol=2:1と、融合能の高いLipid:DOPE=2:9及びそのSTR-R8修飾リポソームにおける結合能と融合能との相関を解析した。結果を図６に示す。図６に示すように、いくつかの例外はあるが、大まかに見てCholリポソームよりもDOPEリポソームのほうが傾きが大きいことがわかる。さらに、STR-R8添加により、その傾きをだいたい保持したまま右に移動している。このことから、DOPEを用いた脂質のほうが単位結合量あたりの核膜融合能が大きいことが示唆され、さらにSTR-R8により結合能を兼ね備えたことが示唆された。これにより、負電荷脂質ではDOPE/CHEMS、DOPE/PA、DOPE/PSが特に優れた融合能を持つことが明らかになった。また、中性脂質であるEPCやSMのSTR-R8修飾による融合能、結合能の上昇も顕著にわかるようになった。【０１３３】
3-3. STR-R8修飾リポソームの核膜親和性の視覚化
3-3-1. GFP封入膜標識リポソームの調製
1mM 脂質ストック:1mM DOPEストックを9:2のモル比で混合し、総脂質濃度の0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として、10mM HEPESで0.125mg/mLに希釈したGFPタンパクを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。さらに超音波処理後のリポソーム溶液に5mol%量のSTR-R8を添加し、ピペッティング後、30分間室温で放置した。【０１３４】
3-3-2. 共焦点レーザー顕微鏡による核膜親和性の解析
(1) 操作方法
実験には次の脂質組成のリポソームを用いた。
EPC/Chol/STR-R8，DOPE/CHEMS/STR-R8，DOPE/PA/STR-R8，DOPE/PS/STR-R8
これらのリポソームを3-3-1項の手順で調製した。また、1-2-2項で単離した核を同量のヘキストと混合し、室温で10分間インキュベートして染色した。核の数をカウントした後、2-2-4項と同様にリン脂質の定量によりリポソームと脂質濃度をそろえた。リポソーム:核=9:2となるように混合し、37℃で1時間インキュベート後、1400g、4℃、1分間遠心し、Import bufferで2回washした。適量のImport bufferに懸濁し、スライドガラスに適量を滴下した後、カバーガラスをかけ、マニキュアで固定した。このスライドガラスを、CLSMにより観察した。【０１３５】
(2) 観察結果
観察の結果を図７に示す。膜融合の見られないEPC/Chol/STR-R8においては、リポソームの赤と内封したGFPの緑が共局在して核膜の周りにドット状に観察された。これに対し、他の3種の膜融合性リポソームは、リポソームの赤が単独で存在するものが多く、さらにGFPの緑が単独で核の輪郭に沿って分布しているのが見られる。このことから、DOPE/CHEMS、DOPE/PA、DOPE/PSが核膜に融合し、内封したGFPの一部が核の二重膜構造の間隙に分布していることが示唆された。また、DOPE/CHEMSにおいてはGFPの緑と核の青が共局在して水色に見られる部分もあることから、核内への融合による移行も示唆された。【０１３６】
3-4. まとめ
STR-R8を修飾することにより、結合率が上昇し、膜融合能はほとんど変化しない、あるいは上昇した脂質をいくつか見つけることができた。また、予想と反して中性脂質においてもSTR-R8修飾後の結合、融合の上昇を見ることができた。共焦点画像からは、膜融合を視覚化することに成功し、核膜への融合による遺伝子送達への可能性が大きく上昇した。【０１３７】
〔実施例２〕核膜融合性脂質のスクリーニング
1. FRETを用いたスクリーニング
1-1. 膜標識リポソームの調製
(1) DOPE:lipid=9:2
1mM DOPE:1mM 脂質ストックを9:2のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として10mM HEPES bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。【０１３８】
(2) DOPE:lipid=5:5
1mM DOPE:1mM 脂質ストックを5:5のモル比で混合し、総脂質濃度の1mol%量のNBD-DOPEのCHCl3溶液、0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として10mM HEPES bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。【０１３９】
1-2. FRETによる膜融合能評価
HeLa細胞から核を単離し、リン脂質定量を行い、核中に含まれるPCの量を求めた。核膜に含まれるPCの量は文献より55%であるので、この仮定の下に核の総脂質濃度を求め、0.13mMとなるように希釈した。（実施例1の1/4）
1.5mL サンプルチューブ内で、1-1項で調製したprobe Lip及び単離核溶液を、probe Lip:核=1:9で混合し、37℃、30分間インキュベートした。また、コントロールとして、probe-Lip:Import buffer=1:9、最大蛍光強度用コントロールとして、probe-Lip:0.5% Triton=1:9をそれぞれ混合し、同様に37℃、30分間インキュベートした。インキュベート後に、それぞれのサンプルについて蛍光強度（励起波長：470nm、吸光波長：530nm、590nm）を測定し、スペクトルを得た。また、ここで得られた530nmでの蛍光強度により、TFを実施例１と同様に算出した。【０１４０】
1-1-3. 結果
以下に示した脂質を用いて1-1項の操作法でリポソームを調製し、実験を行った。TFに関する結果を図８に示す。
EPC (±)，SM (±)，DOTAP (＋)，PA (−)，PS (−)，PI (−)，Cardiolipin (−)，PG (−)，CHEMS (−)
図８に示すように、DOPE:lipid=9:2よりもDOPE:lipid=5:5のほうが融合能が高いのがわかる。つまり、膜融合性脂質であるDOPEの割合が減少したほうが核膜との融合能が上昇するという結果が得られた。また、特にPAとCLでは大きな融合能の上昇が見られた。正電荷脂質であるDOTAPでも融合能の上昇が見られたが、これはDOTAPの割合を増やすことで正電性が上昇したため、負電荷を持つ核膜との親和性が上昇したものと思われる。融合能の高かったPA及びCL並びにCHEMSについて、DOPEをEPCに変えることで膜融合性脂質DOPE非依存的な融合能を検討した。結果を図９に示す。図９に示すように、EPC/CHEMSはほとんど膜融合しなかったのに対し、PA、CLはDOPEをEPCに変えても高い融合能が保持された。
以上の結果より、負電荷の脂質の核膜への親和性が示され、さらにPA、CLという核膜への特に親和性の高い脂質をスクリーニングすることに成功した。【０１４１】
2. 共焦点レーザー顕微鏡による膜融合性脂質の視覚化
2-1. GFP封入膜標識リポソームの調製
1mM 脂質ストック: 1mM DOPEストックを指定のモル比で混合し、総脂質濃度の0.5mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として、10mM HEPESで0.125mg/mLに希釈したGFPタンパクを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。【０１４２】
2-2. 共焦点レーザー顕微鏡による解析
ここでは融合性脂質としてDOPE/PA = 5:5  DOPE/CL = 5:5を用いた。また、コントロールとしてEPC/Chol/STR-R8=9:2:0.55 (結合○  融合×)  EPC/CHEMS=5:5（結合×  融合×）を用いた。これらのリポソームを2-1項の手順で調製した。また、単離した核を、同量のヘキストと混合し、室温で10分間インキュベートして染色した後、リン脂質の定量によりリポソームと脂質濃度が同じになるようにメスアップした。リポソーム:核=9:2となるように混合し、37℃で1時間インキュベート後、1400g、4℃、1分間遠心し、Import bufferで2回washした。適量のImport bufferに懸濁し、スライドガラスに適量を滴下した後、カバーガラスをかけ、マニキュアで固定した。このスライドガラスを、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。結果を図１０に示す。【０１４３】
図１０に示すように、核膜とのまったく親和性のないEPC/CHEMSでは核の周りにほとんど蛍光が見られなかったのに対し、核への結合能のみが高いEPC/Chol/STR-R8は核の周りに脂質の赤と内封したGFPの緑が共局在した黄色のドットとしていくらか見られた。一方核膜との融合能の高いPA、CLでは核の周りにリポソームの赤が単独で存在するものが多く、GFPの緑が核の輪郭に沿って分布していた。また、CLでは内封したGFPの一部が核の中に局在していることも示唆される図が得られた。このことから、DOPE/PA、DOPE/CLで構成されたリポソームが核膜に融合し、内封したGFPが一部核内に到達しうることが示唆された。これは核を膜融合によって突破しうることを確信させるものであり、今後の遺伝子デリバリーに大いに貢献できるものであると思われる。【０１４４】
〔実施例３〕エンドソーム脱出促進脂質探索
蛍光スペクトルと励起スペクトルが重なる２種類の蛍光色素（NBDとRhodamine）を脂質膜に含有するリポソームは、通常リポソーム単独では、NBDの励起波長の光を照射してもNBDの蛍光は観察されない（NBDとRhodamineが近接して共存する場合、NBDの蛍光エネルギーがRhodamineの励起に使われるため。Fluorescence Resonance Energy Transfer:FRETと呼ばれる）。このリポソームが他の脂質膜（例えば、細胞膜）と膜融合を起こすと、リポソーム脂質は受け手側脂質膜により希釈されるため、リポソーム膜中のNBDとRhodamineの距離が離れ、FRETは解消される。本研究では、この現象を利用して、細胞膜（エンドソーム膜）に対して高い膜融合能を有する脂質（エンドソーム脱出促進脂質）の探索を行った。なお、本研究では、リポソームと細胞を接触させる条件を、初期エンドソーム内pH 6.5 にすることで、エンドソーム環境を再現し、FRETを用いてリポソームとエンドソーム膜との膜融合を定量的に評価した。【０１４５】
1. 方法
(1) リポソームの調製
試験管内でNBD-DOPE , Rhodamine-DOPEで二重標識したLipid Filmを作成しHEPES-Glucose(5%)を加えて十分に水和させた後、バスタイプのソニケーターで超音波処理を行った。STR-R8は必要に応じて加えた（脂質量の5, 10, 20 mol%）。リポソーム終濃度は0.55mM、 NBD-DOPE , Rhodamine-DOPEは総脂質量の1%、0.5%である。リポソーム調製後、粒子径とZ電位を測定した。なお、リポソームの脂質組成は図１１に示すとおりであり、カッコ内の数値はモル比を表す。【０１４６】
(2)サンプルの調製・蛍光強度の測定
実験24時間前に、6 well plateに1wellあたり5×105個のNIH3T3をplatingして、24時間インキュベーションした。24時間インキュベーションした後、培地DMEMを除去しDMEM (Serum Free)で洗った。1wellに800μLのDMEM (pH6.5, Serum Free)と200μLのリポソームを加え1時間インキュベーションした(Cell Suspension : Liposome = 4:1)。1時間後、膜と融合していない溶媒・リポソーム溶液を除去し、PBSで洗った。トリプシンによって細胞を回収し、10,000rpm、4℃、５分遠心して上清を除去した。得られた細胞を100μLのHEPES-(5%)Glucoseで懸濁させ、２つに分けた。一方には、さらに50μLのHEPES-(5%)Glucoseを加え、これの蛍光強度をF’とした。残りの一方には、50μLのTritonを加え細胞を溶解した（Triton終濃度0.5％）。この蛍光強度をF’maxとした。ブランクの蛍光強度をF0 (Buffer : Liposome = 80μL : 20μL) 、終濃度0.5％のTriton (0.5% Triton : liposome = 80μL : 20μL)でリポソームを破壊したときの蛍光強度をF maxとした。BCA TM Protein Assay Kit (PIERCE)を用いて蛍光強度F’, F ’maxを測定したサンプルのタンパク量を測定し、得られたF’, F ’ maxのサンプルの吸光度からサンプルチューブ内のタンパク量、６-well plateの1 well に含まれるタンパク量を換算した。【０１４７】
(3) 蛍光強度の解析
蛍光強度はNBDの蛍光波長530nmで測定した数値を使用していた。得られた蛍光度のデータF’ , F0 , F’ max , F maxを以下の式を用いてTransfer Efficiency (TF), Binding Efficiency (BE)を求めた。F’ 測定用サンプルに含まれているタンパク量をP (F’)、F’ max 測定用サンプルに含まれているタンパク量をP (F’max)、1 well に含まれるタンパク量をP (total)とした。回収したすべての細胞が含まれている状態に補正したサンプルの蛍光度をF’ collected、さらに細胞の回収時にアプライしたリポソーム量の10倍濃縮したことになるので1/10に補正したものをF’ recoveredとした（（a）、(b)）。すべての細胞に結合したリポソームを0.5％Triton で破壊した場合の蛍光強度を換算したものをF’ max collectedとし、細胞の回収時にアプライしたリポソーム量の10倍濃縮したことになるので1/10に補正したものをF’ max recoveredとした（(c)、(d)）。得られたBE（(e)）とTF（(f)、(g)）から、膜融合を介して細胞質中へベクターを送達できる効率をエンドソーム脱出効率（Endosomal Escape Efficiency：(h)）として算出した。
F’ collected = F’ ／ P (F’) × P (total)・・・(a)
F’ recovered = F’ collected ／ 10・・・（b）
F’ max collected = F’max ／ P (F’ max) × P (total)・・・(c)
F’ max recovered = F’ max collected ／ 10・・・(d)
BE = (F’ max recovered ／ Fmax) × 100・・・(e)
F = F’ recovered × (1／BE)
= F’ recovered × (F max／F’ max recovered)・・・(f)
TF = [(F - F0) ／ (F max − F0)] × 100・・・(g)
Endosomal Escape Efficiency = BE（結合率）×TF（融合率）×100 (%)・・・(h)【０１４８】
(4)トランスフェクションアッセイ
pDNAをPoly-L-Lysineで凝縮化し、凝集化DNAが封入されたリポソームを調製し（脂質終濃度0.55mM）、リポソーム表面を適量のSTR-R8で修飾した。リポソームの脂質組成は図１２に示すとおりであり、カッコ内の数値はモル比を表す。pDNAとして、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドpcDNA3.1(+)lucを使用した。PcDNA3.1(+)lucは、CMVプロモーター及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長約7kbpのプラスミドDNAであり、pGL3プラスミド（Promega社製）から制限酵素によって切り出したルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドpcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）に挿入することによって作製した。24well plateに1wellあたり4×104個のNIH3T3細胞をplatingして24h、37℃、5% CO2でインキュベーションした。24h後500μLのDMEM(- serum) でwashした後、250μLのDMEM(- serum)中にDNAを0.04μg含むようにリポソームを加えた。さらに3h、37℃、5% CO2でインキュベーションした。3h後1mLのDMEM(+ serum)を加え、さらに21h 37℃、5% CO2でインキュベーションした。21h後、500μLのPBS1Xでwashし、75μLのLysis Reporter Buffer 1Xを加えて、30分、-80℃で凍結させた。4℃で融解させてから15,000rpm , 4℃, 4分の条件下で遠心した。上清から50μLを別のチューブに移した。20μLのサンプルと50μLのルシフェラーゼ基質とを混ぜ合わせて、ルシフェラーゼ活性を測定した。残ったサンプルから5μLを20μLのH2Oで希釈してタンパク定量を行った。得られたルシフェラーゼ活性をタンパク量で除することによって単位細胞タンパク質量あたりのルシフェラーゼ活性（R.L.U / mg protein）として評価した。【０１４９】
2. 結果・考察
(1) Endosomal Escape Efficiencyによるエンドソーム膜融合促進脂質の探索
２種の蛍光色素とSTR-R8（マクロピノサイトーシス経路選択のため）を含み、種々の脂質から構成されたリポソームのEndosomal Escape Efficiencyを比較した（図１１）。これまでに、エンドソーム環境において高い膜融合能を示す脂質として知られているDOPE/CHEMS/STR-R8をポジティブコントロールとし、それのEndosomal Escape Efficiency（３％）よりも高い値を示すリポソーム組成を「エンドソーム膜融合促進脂質」として評価した。その結果、従来の常識に基づいた化学構造からは予想できなかった脂質（ホスファチジン酸PA及びカルジオリピンCL）が高い膜融合能力を有すること見出した（図１１）。これらの結果から、CL及びPAはCHEMS以上に高いエンドソーム膜融合能を有する脂質であると判断した。これらの脂質は、負電荷を有しており、同様に負電荷脂質が豊富な細胞膜／エンドソーム膜とは反発しあうのではないかと予想していたが、意外にもこれらの脂質の方が、正電荷脂質などよりも、高い融合能を有していた。これは、世界で初めての発見である。これらの脂質が実際にキャリアの細胞内動態を促進しているかどうかを評価するために、実際に、発見した脂質（PA）をリポソームの脂質膜として用い、トランスフェクションアッセイを行った。その結果、従来の脂質組成（DOPE/CHEMS）では、106程度の活性であったものが、PAを含有することにより30倍以上も高い活性を示した（図１２）。なお、DOPE/CHEMSのSTR-R8量 (5%)がDOPE/PA系のSTR-R8量 (10%)よりも低いが、DOPE/CHEMSのSTR-R8量を10%まであげても同じ結果であった。したがって、STR-R8量による活性の増大はない。この結果から、本研究において発見したエンドソーム脱出促進脂質を用いることにより、非ウイルス性遺伝子デリバリーシステムの遺伝子発現を飛躍的に向上させうることが示唆された。これまでにも、エンドソーム脱出過程に着目した研究は数多くなされているが、本研究のように膜融合過程を定量的に評価し、それに基づいてエンドソームと高い膜融合性を有する脂質を見出したものは皆無であり、世界初の成果である。本研究の成果は、非ウイルス性遺伝子ベクターのin vivoにおける遺伝子デリバリー技術を飛躍的に向上させることが期待される。特に、最近「実現可能な遺伝子治療法」として注目されているsiRNAのデリバリーは、エンドソームからの脱出がボトルネックであるため、本研究によって見出された新規脂質を応用することで、これまでにない高い治療効果が得られることが予想される。そのため、本研究は、siRNAをはじめとする遺伝子治療分野やDNAワクチン等による免疫医療分野における欠くことのできない基盤技術であると思われる。【０１５０】
〔実施例４〕融合による内封物質送達様式の解析
(1) GFP封入膜標識MLVの調製
10mM DOPE及び10mM 脂質ストックを5:5のモル比でガラス試験管内で混合し、総脂質濃度の1mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作製した。内部水層として、10mM HEPES Bufferで0.125 mg/mLに希釈したGFP蛋白質を、総脂質濃度0.55ｍMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。【０１５１】
(2) GFP封入膜標識SUVの調製
10mM DOPE及び10mM 脂質ストックを5:5のモル比でガラス試験管内で混合し、総脂質濃度の1mol%量のRho-DOPEのCHCl3溶液を添加し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作製した。内部水層として10mM HEPES Bufferで0.125mg/mLに希釈したGFP蛋白質を、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、10分間水和させた後、Probe Typeのソニケーターを用いて10分間超音波処理を行い、SUVを調製した。【０１５２】
(3) 共焦点レーザー顕微鏡による解析
ここでは融合性脂質としてDOPE/PA=5:5又はDOPE/CL=5:5を用い、上記の手順でMLVおよびSUVを調製した。また、単離した核を、同量のヘキストと混合し、室温で10分間インキュベートして染色した後、リポソーム:核が9:2 (w/w)となるように混合し、37℃で1時間インキュベート後、1400×g、4℃、30秒間遠心し、Import Bufferで2回ウォッシュした。適量のImport Bufferに懸濁し、スライドガラスに適量を滴下した後、カバーガラスをかけ、マニキュアで固定した。このスライドガラスを共焦点レーザー顕微鏡により観察した。【０１５３】
この結果を図１３に示す。なお、パネルは左から順にヘキスト染色核（青）の局在、GFP（緑）の局在、ローダミン標識脂質（赤）の局在、３者の重ね合わせを示す。
多重膜構造を有するMLVにおいては、PA、CLいずれの場合においても、脂質（赤）が核の周りに局在しているにもかかわらず、内封したGFP（緑）は核の内部に拡散していた。これに対して、１枚膜構造のSUVにおいては、脂質（赤）が核膜表面に局在しているとともに、内封したGFP（緑）も核の輪郭に沿って単独で局在していた。
この結果から、SUVでは、膜が１枚しか存在しないために、核の二重膜構造を突破できず、核膜間隙に捕捉されたことが示唆され、MLVでは融合により、段階的に核膜の二枚膜構造を突破し、内封したGFPが核内に放出されたことが示唆された。【０１５４】
〔実施例５〕非分裂細胞における遺伝子発現評価
(1) DNAコアの調製
プラスミドDNA（pEGFP/Luc）及びProtamineをHEPES Bufferで希釈し、Protamine（0.1 mg/mL）にプラスミドDNA（0.1 mg/mL）をボルテックス条件下で滴下した。（重量比 1:1.5  N/P ratio = 2.2）【０１５５】
(2) リポソームの調製
1mM DOPEおよび1mM 脂質ストックを所定のモル比でガラス試験管内で混合し、さらにCHCl3溶液を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として、上記の方法で調製したpDNA/Protamineコアを総脂質濃度0.55mMになるように添加し、水和させた後、超音波処理を行った。さらに、STR-R8（2 mg/mL）を正電荷になるように添加し、ピペッティング後、30分間室温でインキュベートした。
こうして、DOPE/CHEMS = 9:2 (5% STR-R8)のリポソームA、DOPE/CHEMS = 5:5 (5% STR-R8)のリポソームB、EPC/CHEMS = 9:2 (5% STR-R8)のリポソームC、DOPE/PA = 5:5 (20% STR-R8)のリポソームD、DOPE/CL = 5:5 (20% STR-R8)のリポソームE、DOPE/PA = 7:2 (10% STR-R8)のリポソームFを調製した。なお、リポソームA-Fを総称して「MEND」と呼ぶ場合がある。MENDは1〜複数枚の脂質膜を備えたリポソームである。【０１５６】
(3) リポソームリポソームの調製
(a) 内側の脂質膜DOPE/PA = 5:5  外側の脂質膜DOPE/PA = 7:2
10mM DOPEおよび10 mM PAを5:5のモル比でガラス試験管内で混合し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として10mM HEPES Bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、10分間水和させた後、Probe Typeのソニケーターを用いて10分間超音波処理を行い、SUVを調製した。次に、DOPE/PA = 5:5のSUVと上記の方法で調製したpDNA/Protamineコアを2:1の割合で添加し、2枚膜リポソームを調製した。2枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の20％量添加し、30分室温でインキュベートした。
また、DOPE/PA = 7:2のSUVと2枚膜リポソームを2:1の割合で添加し、4枚膜リポソームを調製した。4枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の10％量添加し、30分室温でインキュベートした。
こうして、内側の2枚の脂質膜がDOPE/PA = 5:5で外側の2枚の脂質膜がDOPE/PA = 7:2である4枚膜リポソームAを調製した。【０１５７】
(b) 内側の脂質膜DOPE/CL = 5:5  外側の脂質膜DOPE/PA = 7:2
10mM DOPEおよび10mM CLを5:5のモル比でガラス試験管内で混合し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として10mM HEPES Bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、10分間水和させた後、Probe Typeのソニケーターを用いて10分間超音波処理を行い、SUVを調製した。
次に、DOPE/PA = 5:5のSUVと上記の方法で調製したpDNA/Protamineコアを2:1の割合で添加し、2枚膜リポソームを調製した。2枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の20％量添加し、30分室温でインキュベートした。
また、DOPE/PA = 7:2のSUVと2枚膜リポソームを2:1の割合で添加し、4枚膜リポソームを調製した。4枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の10％量添加し、30分室温でインキュベートした。
こうして、内側の2枚の脂質膜がDOPE/CL = 5:5で外側の2枚の脂質膜がDOPE/PA = 7:2である4枚膜リポソームBを調製した。【０１５８】
(c) 内側の脂質膜DOPE/PA = 5:5（DOPE/CL=5:5）  外側の脂質膜EPC/CHEMS=9:2
DOPE/PA = 5:5（DOPE/CL=5:5）のSUVは上記の方法で調製した。次に、10mM EPCおよび10 mM PA（CL）を9:2のモル比でガラス試験管内で混合し、さらにCHCl3を添加後、窒素ガス下で乾燥させ、lipid filmを作成した。内部水層として10mM HEPES Bufferを、総脂質濃度0.55mMになるように添加し、10分間水和させた後、Probe Typeのソニケーターを用いて10分間超音波処理を行い、SUVを調製した。
DOPE/PA = 5:5（DOPE/CL=5:5）のSUVと上記の方法で調製したpDNA/Protamineコアを2:1の割合で添加し、2枚膜リポソームを調製した。さらに、2枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の20％量添加し、30分室温でインキュベートした。
また、EPC/CHEMS=9:2のSUVと2枚膜リポソームを2:1の割合で添加し、1N HClを適量混合して膜融合を誘起させ、4枚膜リポソームを調製した。4枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の5％量添加し、30分室温でインキュベートした。
こうして、内側の2枚の脂質膜がDOPE/PA = 5:5で外側の2枚の脂質膜がEPC/CHEMS=9:2である4枚膜リポソームC、内側の2枚の脂質膜がDOPE/CL = 5:5で外側の2枚の脂質膜がEPC/CHEMS = 9:2である4枚膜リポソームDを調製した。【０１５９】
(d) 内側の脂質膜EPC/CHEMS = 9:2  外側の脂質膜DOPE/PA = 7:2 (EPC/CHEMS = 9:2)
EPC/CHEMS = 9:2および DOPE/PA= 7:2 のSUVは上記の方法で調製した。
次に、EPC/CHEMS = 9:2のSUVと上記の方法で調製したpDNA/Protamineコアを2:1の割合で添加し、1N HClを適量混合して膜融合を誘起させ、2枚膜リポソームを調製した。2枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の5％量添加し、30分室温でインキュベートした。 
また、DOPE/PA = 7:2 又は EPC/CHEMS = 9:2のSUVと2枚膜リポソームを2:1の割合で添加し、4枚膜リポソームを調製した。4枚膜リポソーム溶液にSTR-R8（2 mg/mL）を総脂質濃度の5％量添加し、30分室温でインキュベートした。
こうして、内側の2枚の脂質膜がEPC/CHEMS = 9:2で外側の2枚の脂質膜がDOPE/PA = 7:2である4枚膜リポソームE、内側の2枚の脂質膜がEPC/CHEMS = 9:2で外側の2枚の脂質膜がEPC/CHEMS = 9:2である4枚膜リポソームFを調製した。
なお、4枚膜リポソームA-Fを総称して「T-MEND」と呼ぶ場合がある。【０１６０】
(4) トランフェクション
JAWSII細胞を24wellプレートにまき（8.0×104 cells）、2日間培養した後、0.4 μg相当のサンプルを、抗生物質およびFCSを含まないα-MEMで250μLとなるように希釈して細胞に添加した。Nefgative controlとしてNaked DNAおよびHEPES Bufferを同様に希釈し、細胞に添加し、37℃、5％ CO2インキュベーターで培養した。サンプルを添加してから3時間後に10％ FCSを含むα-MEMを500μL添加し、再び37℃、5％ CO2インキュベーターで培養した。サンプルを添加してから24時間後に回収し、ルシフェラーゼ活性測定およびタンパク定量を行った。なお、ここでは分裂による遺伝子発現への寄与を減らす目的で、免疫系の非分裂細胞である、JAWSII細胞（マウス骨髄樹状細胞）を用いた。【０１６１】
(5) 遺伝子発現評価
MENDに関する遺伝子発現効率の測定結果を図１４に示す。なお、図１４中、「Con1」は裸のDNAを添加した場合の結果であり、「Con2」は細胞だけの場合の結果である。図１５及び１６についても同様である。
DOPE/CHEMS（リポソームA, B）及びEPC/CHEMS（リポソームC）と比較して、DOPE/PA（リポソームD）及びDOPE/CL（リポソームE）においては、有意な遺伝子発現の上昇が見られた。
T-MENDに関する遺伝子発現効率の測定結果を図１５及び１６に示す。
MENDよりもT-MENDを用いた場合の方がさらに高い遺伝子発現の上昇が見られた。4枚膜リポソームA及びBを比較すると、PAよりも核膜融合能の高いCLを用いた場合の方が高い発現が得られた。この結果は、T-MENDにより細胞を構成する膜構造を段階的に融合により突破しており、非分裂細胞であるJAWSII細胞にも応用可能なベクターを構築することができたことを示唆する結果であると思われる。
T-MENDの内側および外側の膜を、核膜または細胞膜と親和性の低いEPC/CHEMS=9:2に変えた場合（図１６）、どの場合においても有意な発現の減少が見られた。つまり、外側をEPC/CHEMSに変えることで細胞内への取り込み過程が律速となり、内側を変えることで核内への移行が律速となることが明らかとなった。これらの結果は、細胞内への取り込み、核膜の突破が膜融合を介していることを強く示唆する結果であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】リポソームの核膜に対する結合活性（％）を示す図である。
【図２】リポソームの核膜に対する結合活性（％）を示す図である。
【図３】リポソームの核膜に対する融合活性（ＴＦ（％））を示す図である。
【図４】リポソームの核膜に対する結合活性（％）を示す図である。
【図５】リポソームの核膜に対する融合活性（ＴＦ（％））を示す図である。
【図６】リポソームの核膜に対する結合能及び融合能の相関関係を示す図である。
【図７】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図８】リポソームの核膜に対する融合活性（ＴＦ（％））を示す図である。
【図９】リポソームの核膜に対する融合活性（ＴＦ（％））を示す図である。
【図１０】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図１１】リポソームのエンドソーム脱出効率（％）を示す図である。
【図１２】リポソームにより送達された遺伝子の発現活性を示す図である。
【図１３】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図１４】リポソームにより送達された遺伝子の発現活性を示す図である。
【図１５】リポソームにより送達された遺伝子の発現活性を示す図である。
【図１６】リポソームにより送達された遺伝子の発現活性を示す図である。
【図１７】本発明のリポソーム脂質膜構造体の実施形態を模式的に示す一部断面図である。
【符号の説明】
【０１６３】
１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ・・・リポソーム
２ａ，２１ｂ，２２ｂ，２ｃ，２１ｄ，２２ｄ，２３ｄ・・・脂質膜
３・・・目的物質
【図１】
2007037444.tif 000005
【図２】
2007037444.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図７】
2007037444.tif 000019
【図１０】
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【図１３】
2007037444.tif 000021
【国際調査報告】
2007037444.tif 000022
2007037444.tif 000023
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