【手続補正書】
【提出日】令和1年9月12日(2019.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
抗原抗体反応を利用してＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
（Ｂ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３に抗原決定基を有する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体を検出抗体とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
＜実施例３＞  ハイブリドーマの選定と抗原決定基の同定
特許文献２の方法に従い、ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。各抗体の抗原決定基を、ＴＦＰＩ２の各クニッツドメインであるＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３のバリアント発現細胞により同定した。各バリアント発現用プラスミドの具体的調製方法を以下に示す。
（１）下記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）記載のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２のＫＤ１領域、ＫＤ２領域及びＫＤ３からＣ末端領域に相当するポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ｃ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ１用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号４、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３から８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔａｔｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号５、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２５９から２７３番目の塩基配列に相当）
（ｄ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ２用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｔｔｃｃｃａａａｇｔｔｔｇｃ−３’（配列番号６、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２７４から２８８番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｇｇｔｇｃｇｃａ−３’（配列番号７、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４４５から４５９番目の塩基配列に相当）
（ｅ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ３用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔａｔｔｃｃａｔｃａｔｔｔｔｇｃ−３’（配列番号８、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４６０から４７４番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号９、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（２）実施例１（２）記載の方法でＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。
（３）（２）で構築した３種のＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドに挿入されているポリヌクレオチドにより発現されるＴＦＰＩ２が、想定通り細胞表面に局在していることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）（２）で構築したＧＰＩ型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３−２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＴＦＰＩ２を一過性発現させた。（３−３）（３−２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、または、陰性対照としてＦＬＡＧタグとは結合しないマウス抗ＢＮＣ抗体を添加し、３０分静置した。なお、ＢＮＣとは、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるペプチドである（特開２００９−２４０３００号公報）。
（３−４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行ない、１０種のモノクローナル抗体の抗原決定基を同定した。
ＦＡＣＳ解析の結果から判明した各抗体の抗原決定基を表１に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
【表１】
2018054537.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
＜実施例４＞  ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
固相側をクニッツドメイン１に抗原決定基を有するＴＳ−ＴＦ０４抗体、検出側にクニッツドメイン１に抗原決定基を有するＴＳ−ＴＦ０１抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２を包括的に測定対象とする「ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。