(57)【要約】基質タンパク質を酵素タンパク質によって修飾することからなる修飾タンパク質の製造方法であって、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質が、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質である、前記修飾タンパク質の製造方法。  本発明は、タンパク質間相互作用を利用してタンパク質の修飾反応を効率的に行う方法であり、基質タンパク質と酵素タンパク質の間にタンパク質間相互作用を発生させることで、基質タンパク質と酵素の親和性を高め、それにより少ない酵素量で効率的に基質タンパク質を修飾することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質タンパク質を酵素タンパク質によって修飾することからなる修飾タンパク質の製造方法であって、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質が、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質である、前記修飾タンパク質の製造方法。
【請求項２】
蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質と結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質が、該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が付加されたキメラタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
蛋白質結合ドメイン及び／又は該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が、酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を介して基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質に付加されている、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
酵素タンパク質がキナーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【請求項５】
蛋白質結合ドメインがＳＨ３ドメインである、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【請求項６】
前記ＳＨ３ドメインが以下（ａ）又は（ｂ）のペプチドであり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつＳＨ３ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記ＳＨ３ドメイン結合配列はＰＸＸＰＸＺあるいはＺＸＸＰＸＸＰあるいはＰＸＸＸＲＸＸＫ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるプロリンリッチ配列を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ＳＨ３ドメインが以下（ｃ）又は（ｄ）のペプチドであり、
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつＳＨ３ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記ＳＨ３ドメイン結合配列はＰＸ［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］ＲＸＸＫＰ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記基質タンパク質がＳＨ３ドメインを有し、前記キナーゼがＳＨ３ドメイン結合配列を有する、請求項６又は７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記基質タンパク質がＳＨ３ドメイン結合配列を有し、前記キナーゼがＳＨ３ドメインを有する、請求項６又は７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
基質タンパク質と酵素タンパク質との反応後に酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を切断して修飾タンパク質を回収する段階を含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項１１】
キメラタンパク質である基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質と該キメラタンパク質が結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質とを発現するベクターを用いて宿主を形質転換し、基質タンパク質と酵素タンパク質とを宿主細胞内で共発現させることからなる、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
酵素タンパク質がミリストイルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
酵素タンパク質がタンパク質脱リン酸化酵素である、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、基質タンパク質と酵素タンパク質とを用いてタンパク質を修飾する方法ないし修飾タンパク質を製造する方法に関し、より詳細には、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質として、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質を用いる前記修飾方法ないし修飾タンパク質の製造方法に関する。【０００２】
また本発明は、基質タンパク質をキナーゼ（リン酸化酵素）を用いてリン酸化する方法に関し、より詳細には、基質タンパク質またはキナーゼのどちらか一方にSH3ドメインを含み、他方にプロリンリッチ配列などのSH3ドメイン結合配列すなわち蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を含むことを特徴とし、SH3ドメインとSH3ドメイン結合配列との間の相互作用で両分子が会合して基質タンパク質のリン酸化反応を効果的に行う基質タンパク質のリン酸化方法ならびにリン酸化タンパク質を製造する方法に関する。また本発明は、基質タンパク質をミリストイルトランスフェラーゼを用いてミリストイル化する方法に関する。さらに本発明は、基質タンパク質をタンパク質脱リン酸化酵素を用いて脱リン酸化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の増殖、分化、形態形成などは全ての多細胞生物が成り立つための基本過程である。それらの過程は細胞外からシグナルを細胞表面の受容体が認識し、それを細胞内シグナル伝達因子に伝え、適正に処理されることによりなされる。シグナル伝達は膜上の受容体を介した生体膜直下の反応を契機として行われるが、その過程の制御はタンパク質間相互作用によりなされる。その過程においてリン酸化及び脱リン酸化を介したタンパク質間相互作用の制御が重要な役割を果たしている。【０００４】
たとえば細胞の増殖反応や薬物に対する細胞の反応は、ほとんどの場合、細胞内シグナル伝達機構において、Ｇタンパク質などのリン酸化が細胞のシグナル伝達の実態であることが知られている。細胞増殖に関して言えば、正常細胞ではリン酸化の制御は厳密に行われているが癌細胞ではタンパク質リン酸化が亢進して、制御が効かなくなっている。このことからも、細胞内リン酸化を制御することは、細胞の恒常性の維持や疾患の治療につながることが期待できる。しかしながら、基質タンパク質を効率的にリン酸化するための人為的操作や制御分子の利用は、実質的はほとんど実現しておらず、もっぱらキナーゼのタイピングや反応機構の研究が主体である。【０００５】
非リン酸化状態のタンパク質に関しては大腸菌や酵母や昆虫細胞系を用いて大量に調製され、基礎研究、創薬研究、応用研究がなされ、実際に医薬品等にも利用されてきた。【０００６】
しかしリン酸化状態のタンパク質に関してはその大量調製の困難さが研究及び利用の妨げとなってきた。【０００７】
従来、試料を大量(数mgから)に用いる研究を行う場合にはリン酸化部位周辺のみから構成される10残基程度のペプチドを化学的に合成したものがモデルとして用いられてきたが（非特許文献１等）、リン酸化ペプチドの化学合成は通常のペプチドの化学合成に比べて高額であり、また、多くのシグナル伝達タンパク質は複数の機能ドメインから構成され、それらを介したシグナル伝達の制御機構を明らかにするにはペプチドを用いた研究は不十分であった。【０００８】
また、ホスト内で両者を共発現させることでリン酸化タンパク質を大量に得る試みはなされてきたが（非特許文献２等）、リン酸化の効率が低く、更にリン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質を分離する必要があった。また、試験管内でキナーゼと基質タンパク質を反応させることでリン酸化タンパク質を得る方法も試みられてはいるが（非特許文献３等）、リン酸化の効率が低いために大量の高価なキナーゼを必要としていた。【０００９】
また、本発明で利用可能なSH3ドメインが、PxxPで表されるアミノ酸配列（Pはプロリン、ｘは任意のアミノ酸を表し、以下Pro Rich Region：PRRとする）を有するタンパク質に親和性を示すことに関してはよく知られている（特許文献１、２等）。なお、本明細書では、アミノ酸を適宜１文字又は３文字表記で示すこととする。また例外的に、一部のSH3ドメインはPRR以外のアミノ酸配列に親和性を示すことが報告されている。例えばGrb2、Gads、Hbp、STAM2などのSH3ドメインは、PX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP (ただしＸは任意のアミノ酸残基である）を含むアミノ酸配列に（非特許文献４、５、６、１３、１４）、Fyn、Fyb、LckのSH3ドメインはNef (非特許文献７、８、９)およびRKXXZXXZ (ただしＸは任意のアミノ酸残基であり、ＺはＫまたはＲである)を含むアミノ酸配列に（非特許文献１０）、Pex13pのSH3ドメインはWXXXFXXLE（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）を含むアミノ酸配列に（非特許文献６、１１、１２）、Eps8のSH3ドメインはPXXDY（ただしＸは任意のアミノ酸残基を示す）を含むアミノ酸配列に（非特許文献１５）、それぞれ親和性を示す。本発明では、蛋白質結合ドメインであるこれらSH3ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を、SH3ドメイン結合配列とする。
【非特許文献１】J Mol Biol.、1999年、第289巻、439−445頁
【非特許文献２】Protein Expr Purif.、2005年、第41巻、162−169頁
【非特許文献３】Cell、2000年、第102巻、625−633頁
【非特許文献４】ベリーら、（Berry DM, et al.）、J. Curr Biol.、2002年、第12巻、1336−1341頁
【非特許文献５】リウら（Liu Q., et al.）、Mol. Cell.、2003年、第11巻、471−481頁
【非特許文献６】カミら（Kami, K., et al.）、EMBO J.、2002年、第21巻、4268−4276頁
【非特許文献７】リーら（Lee CH, et al.）、Cell、1996年、第85巻、931−942頁
【非特許文献８】グルツェジークら（Grzesiek S, et al.）、Nat. Struct. Biol.、1996年、第３巻、340−345頁
【非特許文献９】リーら（Lee CH, et al.）、EMBO J.、1995年、第14巻、5006−5015頁
【非特許文献１０】カンら（Kang H, et al.）、EMBO J.、2000年、第19巻、2889−2899頁
【非特許文献１１】バーネットら（Barnett P, et al.）、EMBO J.、2000年、第19巻、6382−6391頁
【非特許文献１２】ウルクハルトら（Urquhart AJ, et al.）、J. Biol. Chem.、2000年、第275巻、4127−4136頁
【非特許文献１３】カトウら（Kato M, et al.）、J. Biol. Chem.、2000年、第275巻、37481−37487頁
【非特許文献１４】カネコら（Kaneko T, et al.）、J. Biol. Chem.、2003年、第278巻、48162−48168頁
【非特許文献１５】モンジオービら（Mongiovi AM, et al.）、EMBO J.、1999年、第18巻、5300−5309頁
【特許文献１】特開2003−185655
【特許文献２】国際公開第03/006060号パンフレット
【発明の開示】
【００１０】
従来のリン酸化タンパク質を得るための方法は、主にリン酸化反応の効率が低いため、大量のキナーゼを用いて行なわれていた。本発明は、このような問題を解決するために、互いの親和性を高めた基質タンパク質とキナーゼを、宿主細胞中で共発現させたりあるいはインビトロで混合したりすることを含む、リン酸化タンパク質を得るための効率的な手法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明者等は、蛋白質結合ドメインと該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列、例としてSH3ドメインとSH3ドメイン結合配列を利用して、基質タンパク質あるいはキナーゼのどちらか一方にSH3ドメインを保有させ、他方にSH3ドメイン結合配列を保有させた構造を形成して、基質タンパク質とキナーゼの親和性を高めることにより、リン酸化反応などの修飾反応を効率的に行うことができることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１２】
（１）基質タンパク質を酵素タンパク質によって修飾することからなる修飾タンパク質の製造方法であって、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質が、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質である、前記修飾タンパク質の製造方法。
【００１３】
（２）蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質と結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質が、該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が付加されたキメラタンパク質である、前記（１）に記載の製造方法。
【００１４】
（３）蛋白質結合ドメイン及び／又は該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が、酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を介して基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質に付加されている、前記（１）または（２）に記載の製造方法。
【００１５】
（４）酵素タンパク質がキナーゼである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【００１６】
（５）蛋白質結合ドメインがSH3ドメインである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【００１７】
（６）前記SH3ドメインが以下（ａ）又は（ｂ）のペプチドであり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記SH3ドメイン結合配列はPXXPXZあるいはZXXPXXPあるいはPXXXRXXK（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるプロリンリッチ配列を有する、前記（５）に記載の製造方法。
【００１８】
（７）前記SH3ドメインが以下（ｃ）又は（ｄ）のペプチドであり、
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記SH3ドメイン結合配列はPX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列を有する、前記（５）に記載の製造方法。
【００１９】
（８）前記基質タンパク質がSH3ドメインを有し、前記キナーゼがSH3ドメイン結合配列を有する、前記（６）又は（７）のいずれかに記載の製造方法。
【００２０】
（９）前記基質タンパク質がSH3ドメイン結合配列を有し、前記キナーゼがSH3ドメインを有する、前記（６）又は（７）のいずれかに記載の製造方法。
【００２１】
（１０）基質タンパク質と酵素タンパク質との反応後に酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を切断して修飾タンパク質を回収する段階を含む、前記（３）に記載の製造方法。
【００２２】
（１１）キメラタンパク質である基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質と該キメラタンパク質が結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質とを発現するベクターを用いて宿主を形質転換し、基質タンパク質と酵素タンパク質とを宿主細胞内で共発現させることからなる、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
【００２３】
（１２）酵素タンパク質がミリストイルトランスフェラーゼである、（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【００２４】
（１３）酵素タンパク質がタンパク質脱リン酸化酵素である、（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】SH2ドメインとキナーゼドメインより構成されるAbl（SK）のドメイン構造を示す図である。
【図２】SH2ドメインとキナーゼドメインとProline Rich Regionより構成されるAbl（SKP1）のドメイン構造及びアミノ酸配列を示す図である。
【図３】CrkIIのドメイン構造を示す図である。
【図４】Ablのドメイン構造及びアミノ酸配列を示す図である。
【図５】pProEX-CrkIIのプラスミド構築手順を示す図である。
【図６】精製したCrkIIのSDS-PAGEを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：６×Hisタグ切断前のCrkII、レーン３：６×Hisタグ切断後のCrkII、レーン４：Fraction番号８、レーン５：Fraction番号１６、レーン６：Fraction番号１７、レーン７：Fraction番号１８、レーン８：Fraction番号１９
【図７】pET-Duet-SKのプラスミド構築手順を示す図である。
【図８】pET-Duet-SK-CrkIIのプラスミド構築手順を示す図である。
【図９】pET-Duet-SKP1のプラスミド構築手順を示す図である。
【図１０】pET-Duet-SKP1-CrkIIのプラスミド構築手順を示す図である。
【図１１】SKP1と共発現したCrkIIのSDS-PAGEを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：CrkII、レーン３：SKP1と共発現したCrkII。
【図１２】市販のキナーゼでリン酸化反応を行った後のCrkII、SKと共発現したCrkII、SKP1と共発現したCrkIIの免疫染色を示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：市販のAblを用いて試験管内でリン酸化反応を行ったCrkII、レーン３：SKと共発現したCrkII、レーン４：SKP1と共発現したCrkII
【図１３】市販のキナーゼでリン酸化反応を行う前と行った後のCrkIIのSDS-PAGEを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：リン酸化反応前のCrkII、レーン３：リン酸化反応後のCrkII
【図１４】精製したSKP1を用いてリン酸化反応を行った後のCrkIIの免疫染色を示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製したSKP1を用いて試験管内でリン酸化反応を行ったCrkII
【図１５】Crk-Vav（170−375）のドメイン構造を示す図である。
【図１６】pET22-Crk-Vav(170-375)のプラスミド構築手順を示す図である。
【図１７】Crk-Vav（170−375）ならびにVav（170−375）のSKP1によるリン酸化を示すSDS-PAGEを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：リン酸化反応前のCrk-Vav（170−375）、レーン３：リン酸化反応後のCrk-Vav（170−375）、レーン４：リン酸化反応前のVav（170−375）、レーン５：リン酸化反応後のVav（170−375）
【図１８】Vav（170−375）のドメイン構造とアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】SK-SLPのドメイン構造とアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】Grb2-CrkIIのドメイン構造を示す図である。
【図２１】pET-Duet-SK-SLPのプラスミド構築手順を示す図である。
【図２２】pET22-Grb2-CrkIIのプラスミド構築手順を示す図である。
【図２３】SK-SLP及びSKによりリン酸化したGrb2-CrkIIのSDS-PAGEを示す図である。図左  レーン１：分子量マーカー、レーン２：リン酸化反応前のGrb-CrkII、レーン３：SK-SLPでリン酸化したGrb-CrkII、図右  レーン１：分子量マーカー、レーン２：リン酸化反応前のGrb-CrkII、レーン３：SKでリン酸化したGrb-CrkII
【図２４】プラスミドpTYRとその部分構造を示す図である。
【図２５】pTYR-Vav(170-375)によりリン酸化したCrk-Vav（170−375）のSDS-PAGEを示す図面である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：リン酸化反応前のCrk-Vav(170−375）、レーン３：pTYR-Vav(170-375)で発現させたCrk-Vav（170−375）。
【図２６】pTYR（−）とその部分構造を示す図である。。
【図２７】pSH3-NMTとその部分構造を示す図である。
【図２８】pGB1-Myrとその部分構造を示す図である。
【図２９】SH3-NMTを用いてミリストイル化したGB1-MyrのSDS-PAGEを示す図である。レーン１は10μlのSH3-NMT、レーン２は１μlのSH3-NMT、レーン３は０μlのSH3-NMTによるミリストイル化を示す。
【図３０】ｐPTP1B-PxxPとその部分構造を示す図である。
【図３１】PTP-1B-PxxPを用いて脱リン酸化したリン酸化CrkIIのSDS-PAGEを示す図である。レーン１は10μlのPTP-1B-PxxP、レーン２は１μlのPTP-1B-PxxP、レーン３は０μlのPTP-1B-PxxPによる脱リン酸化を示す。
【図３２】PTP-1B-PxxPを用いて脱リン酸化したリン酸化CrkIIの免疫染色を示す図である。レーン１は10μlのPTP-1B-PxxP、レーン２は１μlのPTP-1B-PxxP、レーン３は０μlのPTP-1B-PxxPによる脱リン酸化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の基質タンパク質の修飾を、タンパク質リン酸化反応を例示として説明するが、本発明における基質タンパク質の修飾はこれに限られるものではなく、脱リン酸化、ミリスチル化、パルミトイル化、ユビキチン化、ユビキチン様タンパク質修飾、ＡＤＰリボシル化、ＰＥ化、糖鎖付加を含めた、酵素タンパク質によるタンパク質翻訳後修飾に有効である。従って、基質及び／又は酵素タンパク質に付加する蛋白質結合ドメインや該ドメインが親和性を示すアミノ酸配列の組み合わせもSH3ドメインとSH3ドメイン結合配列に限定されるものではなく、その他カルモジュリンとカルモジュリン相互作用配列、PDZドメインとPDZドメイン相互作用配列など、あらゆる蛋白質結合ドメインと該ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を利用することができる。また、ファージディスプレイ等によって得た任意のタンパク質に対して結合性を有するアミノ酸配列の使用も可能である。【００２７】
また本発明は、基質タンパク質をキナーゼによりリン酸化して、リン酸化タンパク質を製造する方法であって、該基質タンパク質及び／またはキナーゼに相補的なSH3ドメイン及びSH3ドメイン結合配列を持たせることにより、両分子の親和性を高め、効率的にリン酸化反応を行わせることよりなる。【００２８】
リン酸化反応における「基質タンパク質」は、リン酸化されるタンパク質であって、リン酸化部位（Thr、Ser又はTyr）を有するタンパク質を意味する。このようなタンパク質は、生体内や細胞内の存在するもの、又は単離されたもの等如何なる形態のものであってもよい。またこのような基質タンパク質としては、それ自身がもともとSH3ドメインを有するものであっても、あるいはその様なSH3ドメインをもともと有しないものであってもよい。【００２９】
自身がもともとSH3ドメインを有するものとしては、CrkIIやp130Cas等が挙げられる。またSH3ドメインをもともと有しないものとしては、パキシリンやAKT等が挙げられる。【００３０】
本発明における「SH3ドメイン」とは、50〜70程度のアミノ酸残基より構成され、ほぼ直角で互いに詰め込まれた２つの小さいβシートを有する、SH3ドメイン結合配列に親和性を示す機能性ドメインを意味する。【００３１】
このようなSH3ドメインを含むタンパク質として、Abl、Tec、Btk、Lyn、Frk、Srms、Blk、Hck、Txk、Vav、Crk、CrkL、JNK、CSK、CasL、p130Cas、p47phox、p40phox、Pex13、Grb2、RasGAP、RhoGAP、Fyb、Fyn、PLCganmma、Intersectin、Ctk、ArfGAP、PI3K、PSD-95、Yes、Srk、Fgr、Nck、Gads、Zo-1、Zo-2、Zo-3、Spectrin、Drk、Sem-5等が挙げられる。本発明の「SH3ドメイン」はこれらのタンパク質のいずれかの機能性ドメインを用いることができる。【００３２】
本願発明で利用可能な「SH3ドメイン」の例は、以下（ａ）又は（ｂ）のペプチドである。【００３３】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を示すペプチド。【００３４】
また本発明で利用可能なSH3ドメインの別の例は、以下（ｃ）又は（ｄ）のペプチドである。【００３５】
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を示すペプチド。【００３６】
また、本発明で利用可能なSH3ドメインとしては、配列番号１または２５のアミノ酸配列に60％相同、好ましくは80％相同、より好ましくは90％相同、更に好ましくは95％相同のアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列に親和性を示すペプチドであってもよい。【００３７】
本発明におけるSH3ドメイン結合配列は、上記のSH3ドメインがそれぞれ特異的に、あるいは共通して認識し、親和性を示すアミノ酸配列を意味する。SH3ドメイン結合配列はSH3ドメインの配列により異なる場合もあれば、あらゆるSH3ドメインが共通して結合する場合もある。あらゆるSH3ドメインが結合するアミノ酸配列の例としては、PxxP（ただしｘは任意のアミノ酸残基を示す）を含む10残基程度のアミノ酸配列が挙げられる。このアミノ酸配列は、５〜100μMの解離定数でSH3ドメインに結合する。【００３８】
このSH3ドメイン結合配列は、さらに限定するとXΦPXΦPX（Ｒ，Ｋ）Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Φは疎水性アミノ酸残基、さらに限定するとＩ、Ｌ、Ｖ、Ｐのいずれかを表す。）で表される。【００３９】
例えば、上記ａ）ｂ）のSH3ドメインが親和性を示すSH3ドメイン結合配列は、PXXPXZあるいはZXXPXXPあるいはPXXXRXXK（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるアミノ酸配列である。また、上記ｃ）ｄ）のSH3ドメインが親和性を示すSH3ドメイン結合配列は、PX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列である。【００４０】
本発明に言う「親和性を示す」とは、蛋白質−蛋白質間の特異的な相互作用を発揮させる程度の結合（解離）定数をもって、蛋白質結合ドメインが該ドメイン結合配列に結合する性質をいう。この親和性は、例えばSH3ドメインを有するペプチドに任意のアミノ酸配列を有するペプチドを添加して、核磁気共鳴（NMR）スペクトル、蛍光スペクトル、紫外吸収スペクトル、蛍光偏光法、表面プラズモン共鳴、プルダウンアッセイやELISAなど、またFRETを用いる方法（特許文献１および２）等で測定しその変化等を測定することにより、調べることができる。【００４１】
本発明の酵素タンパク質の例である「キナーゼ」は、タンパク質中のＴ（Thr）、Ｓ（Ser）又はＹ（Tyr）のOH基にリン酸基を付加する反応を触媒する酵素タンパク質である。その特異性により、Ser及びThrをリン酸化するSer／Thrリン酸化酵素とTyrをリン酸化するTyrリン酸化酵素の２種類に分類される。Tyrリン酸化酵素としては、Abl、Lyn、Fyn、Hck、Jak、CSK、Flk、Syk、EGFR、VEGFR、ZAP-70、Blk、Ryk、Btk、Tec、Src、Frk、Itk、Lck、Yes、Kit、Fes、Mer、Fgr、IGFR、FGFR、FAK、EPHR、Alk、Met、Trk、Eck、Hek、Sek、Mdk、Esk、Htk、Rek、erbB等が挙げられる。またSer／Thrリン酸化酵素としては、CK II、nPKC、aPKC、PKC、PKA、PKB、ROCK、STE20、CAMK、MAPK、アーク、Cdk、Chk、Drp、Zip、MAPKK、MAPKKK、JNK、MEKK、MLCK、KIN、YAK、SAT4、PAK等が挙げられる。いずれの酵素も複数の機能ドメインにより構成され、そのうちのキナーゼドメインが触媒機能を担い、キナーゼドメインのみでも活性を示すことが知られている。本発明においては、キナーゼ全体でも、リン酸化活性を有するドメインでも利用することが出来、また本発明にいう「キナーゼ」は、特に断らない限り両者を意味するものとする。【００４２】
本発明の一態様では、SH3ドメイン結合配列又はSH3ドメインのいずれかをアミノ酸配列レベルで付加させたキメラタンパク質である基質タンパク質（リン酸化部位を含む）と、該基質タンパク質のSH3ドメイン結合配列又はSH3ドメインに親和性を示すアミノ酸配列を付加させたキメラタンパク質であるキナーゼを使用する。好ましくは、SH3ドメインを基質タンパク質に、SH3ドメイン結合配列をキナーゼに、それぞれアミノ酸レベルで付加させたキメラタンパク質を使用する。それぞれのキメラタンパク質は、適当なアミノ酸配列、好ましくは特定のアミノ酸配列を認識して切断することの出来るプロテアーゼで切断可能なアミノ酸配列を、基質タンパク質または酵素タンパク質と付加されるアミノ酸配列との間に設けてもよい。また、基質タンパク質または酵素タンパク質と付加されるアミノ酸配列との順序には特に制限はなく、いずれがＮ末端側に位置していてもよい。【００４３】
本発明の方法を用いてリン酸化を行なう方法に特に制限はないが、以下の方法が例示される：
（１）基質タンパク質にSH3ドメインを付加してキメラタンパク質を用意する。SH3ドメインは基質タンパク質又は酵素タンパク質の内在性のドメインを利用してもよいが、他のタンパク質由来のSH3ドメインとのキメラタンパク質としても良い。その場合、前述の通り、目的とする基質タンパク質のアミノ酸配列とSH3ドメインのアミノ酸配列との間に、プロテアーゼなどの酵素的方法により、又はCNBrなどの化学的手法により切断することのできるアミノ酸配列、例えばTev ProteaseやThrombin Proteaseなどのタンパク質分解酵素の切断配列を挿入すれば、リン酸化反応終了後に該切断配列をタンパク質分解酵素などで消化ないし切断することで、目的とするアミノ酸配列のみから構成されるリン酸化タンパク質を得ることができる。【００４４】
一方、キナーゼのアミノ酸配列のＣ端側にSH3ドメイン結合配列を有するキメラタンパク質を用意し、これを基質タンパク質に作用させてもよいし、またこのペプチドを発現するようなベクター等を用意して、基質タンパク質の近傍で発現ないし共発現させてもよい。後者の場合、ベクターとしてpET系、pGEX系、pPRO系等を含むあらゆるベクターを用いることができ、常法に従って発現ベクターを構成すればよい。【００４５】
（２）基質タンパク質がもともとSH3ドメインを有している場合には、上記と同様にしてキナーゼにSH3ドメイン結合配列をアミノ酸レベルで付加させたキメラタンパク質を基質タンパク質に作用させればよい。【００４６】
（３）キナーゼ、特にキナーゼのＣ末端側にSH3ドメイン結合配列をアミノ酸レベルで付加させたペプチドをコードするDNAとSH3ドメインを含んだ基質タンパク質をコードするDNAを導入した形質転換体を用いて、これらを共発現させる。大腸菌、酵母、哺乳細胞、昆虫細胞等を含むあらゆる宿主を用いることができ、プロモーターとしてはT7、Taq、lac等を含むあらゆるプロモーターを用いることができる。【００４７】
上記のSH3ドメインを含む基質タンパク質とSH3ドメイン結合配列を含むキナーゼの組み合わせのほかに、逆にSH3ドメインを含むキナーゼとSH3ドメイン結合配列を含む基質タンパク質の組み合わせでも、同様に基質タンパク質とキナーゼの親和性を高めることができる。【００４８】
リン酸化された基質タンパク質の検出は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)を用いて行うことができる。基質タンパク質がリン酸化されるとリン酸化部位１箇所あたり負電荷が２個増えることになり、リン酸化の前後で電気泳動における移動度が変化する。そのため、リン酸化されていない基質タンパク質とリン酸化された基質タンパク質の移動度を比較することで、リン酸化を確認できる。また、SDS-PAGEを行った後に、リン酸化された標的タンパク質に特異的な抗体、又はリン酸化されたアミノ酸を特異的に認識する抗体を用いた免疫染色を用いることで、より確実にリン酸化された基質タンパク質を検出できる。通常のSDS-PAGEではリン酸化された基質タンパク質と未反応の基質タンパク質の両方が検出されるが、免疫染色ではリン酸化された基質タンパク質しか検出されないため、リン酸化の反応効率を決定するためには、通常のSDS-PAGEを行うことが好ましい。【００４９】
また、本発明は実施例に示すように、酵素タンパク質として、ミリストイルトランスフェラーゼやタンパク質脱リン酸化酵素を利用することもできる。ミリストイル化は、脂肪酸によるタンパク質の修飾反応の一つであり、ミリストイルトランスフェラーゼがミリストイル化を受けるタンパク質に存在する共通配列、例えばG(Eなど)XX(Sなど)Pを認識し、ミリストイルCoAから当該タンパク質のN末端グリシンのアミノ基にミリストイル基を転位して酸アミド結合を形成する反応である。このミリストイル化を触媒する酵素であるミリストイルトランスフェラーゼ（NMT）は、ヒトを含む15種以上の真核生物から19のNMT が同定、報告されている。ヒトにはNMT1とNMT2の存在が報告されており、NMT2はSDS-PAGEで単一の65 kDaのバンドとして検出される一方、NMT1は多様なisoformを示す。本発明では、これらのNMTを適宜利用することができるが、ヒトNMT１又はNMT2の利用が好ましい。【００５０】
ミリストイル化は、細胞内シグナル伝達、タンパク質の細胞内局在性の決定、特にタンパク質の細胞膜へのターゲティング、タンパク質の立体構造の安定化等に関与していると考えられている。またHIV-1においては、ウイルス構造タンパク質p17gag及びウイルス性調節タンパク質p27nefのミリストイル化が、ウイルス粒子形成のためのアセンブリに必須の修飾であることが示唆されている。特に、NMTは脳、神経で最も発現レベルが高く、脳神経系の研究の進展によってミリストイル化による制御を受ける分子が今後多数発見されることが期待される。この様に、ミリストイル化を受ける、すなわちミリストイル化配列を有するタンパク質は多岐にわたっており、本発明はそれらのタンパク質が有するミリストイル化配列を適宜使用することができる。【００５１】
また、本発明は、前記の様にリン酸化された基質タンパク質のみならず、脱リン酸化された基質タンパク質を簡便に提供することもできる。タンパクの脱リン酸化反応は、細胞内のタンパク質リン酸化酵素と共役して働くことで、細胞増殖と分化、細胞の形態と運動、細胞周期、代謝、転写活性など、細胞内情報伝達を精密にコントロールしていることが広く知られており、リン酸化シグナルを正、負の両方に制御するための基本技術として、遺伝子治療等へも応用することも可能である。【００５２】
また本発明の方法は、リン酸化、脱リン酸化、ミリストイル化以外のタンパク質の修飾反応を行う酵素タンパク質と、該酵素タンパク質が認識する特的な配列を組み合わせて使用することで、修飾されたタンパク質を簡便且つ効率的に製造することができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５３】
本実施例では以下の３種のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpProEX-CrkII：基質タンパク質であるCrkII（配列番号２）を発現させるためのプラスミドである。
２．プラスミドpET-Duet-SK-CrkII：図１に示すキナーゼを含むがプロリンリッチ配列を含まないSKをコードするDNA断片（配列番号４）とCrkIIとを含むプラスミドであり、CrkIIとSKとを共発現させる。
３．プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkII：図２に示すキナーゼとプロリンリッチ配列を含むSKP1をコードするDNA断片（配列番号５）とCrkIIとを含むプラスミドであり、CrkIIとSKP1とを共発現させる。【００５４】
本実施例においては、リン酸化の基質としてヒトのCrkII（配列番号２）を用いた。図３にそのドメイン構造を示す。図３に示すようにCrkIIは１つのSH2ドメイン（配列番号２の５〜120番目）とそれに続く２つのSH3ドメイン（配列番号２の134〜191番目及び238〜293番目）により構成される。この２つのSH3ドメインに挟まれた領域にリン酸化部位（配列番号２の221番目のTyr)がある。【００５５】
CrkIIのＮ端側のSH3ドメイン（配列番号２の134〜191番目）は−PXXPXK−（ただしＸは任意のアミノ酸残基を表す。ＫはＲでもよい)に対して特異的に結合する。【００５６】
一方、本実施例においては、キナーゼとしてヒトのAbl（配列番号３）を用いた。図４にそのドメイン構造を示す。図４に示すように、Ablは１つのSH3ドメイン（配列番号３の80〜140番目）とそれに続く１つのSH2ドメイン（配列番号３の141〜239番目）、キナーゼドメイン（配列番号３の247〜253番目）、SH3結合配列（配列番号３の545〜550、589〜594および778〜783番目）、DNA結合ドメイン、及びアクチン結合ドメインにより構成される。上記CrkIIのＮ端側SH3ドメインはこのSH3ドメイン結合配列を認識して結合する。【００５７】
（１）プラスミドpProEX-CrkIIの調製
CrkIIのcDNAは既報記載の方法により調製した（Mol. Cell. Biol.、第12巻、第3482-3489頁、1992年）。CrkIIのcDNA、dNTP 200μM、塩化マグネシウム１mM、２種のプライマー（配列番号６、７）それぞれ300nM、KOD-Plus-に添付されたバッファー（１×）、KOD-Plus-polymerase １Ｕを含む反応溶液100μｌでPCR反応を行った。【００５８】
得られたDNA断片をNcoI（NEB社)及びXhoI（NEB社）により切断し、PCR purification kit (Quiagen社)により精製した。pProEXCrkII Htb(Quiagen社)をNcoI及びXhoIで切断処理して得たpProEX Htbのベクター断片と、上記で得たCrkII遺伝子（配列番号２）を含むPCR断片の両者をTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。これを培養した後、MiniPrep kit（Quiagen社）を用いて、図５に示すプラスミド（pProEX-CrkII）を得た。【００５９】
得られたプラスミドpProEX-CrkIIを用いてCrkIIを大腸菌で発現させ、６×Hisタグを利用して、CrkIIを精製した。これをSDS-PAGEにより分子量34kDaのCrkIIが純度高く精製されていることを確認した（図６）。【００６０】
（２）プラスミドpET-Duet-SK-CrkIIの調製
AblのcDNAは既報記載の方法により調製した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第84巻、第8200-8204頁、1987年）。AblのcDNAとプライマー（配列番号１０、１１）を用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン及びキナーゼドメインのみを含むPCR断片（図１、SK）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（図７、pET-Duet-SK）を得た。このプラスミド（pET-Duet-SK）に、プライマー（配列番号８、９）を用いたPCRにより得たCrkIIを同様に挿入して、プラスミド（pET-Duet-SK-CrkII）を得た（図８）。【００６１】
（３）プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkIIの調製
AblのcDNAとプライマー（配列番号１２、１３）を用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン、キナーゼドメイン及び最もＮ末端側にあるSH3ドメイン結合配列のみを含むPCR断片（図２、SKP1）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（pET-Duet-SKP1）を得た（図９）。このプラスミドに、プライマー（配列番号８、９）を用いたPCRにより得たCrkIIを同様にして挿入して、プラスミド（pET-Duet-SKP1-CrkII）を得た（図１０）。
【実施例２】
【００６２】
本実施例では、大腸菌内でCrkII／Ablを共発現させ、CrkIIのリン酸化を観察した。
プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkIIで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換した。この大腸菌を、アンピシリン含有LB寒天培地に広げ、一晩37℃でインキュベートすることで形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを100μg／mlのアンピシリンを含んだLB培地20mlに植え37℃で一晩培養した。この培養液を100μｇ／mlのアンピシリンを含んだ２×YT培地１Ｌに植え継ぎし、600nmの濁度が0.4〜1.0の間で終濃度0.5mMイソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシドを添加し、さらに25℃で一晩培養した。培養液を3600×ｇ、４℃で15分遠心分離し、菌体を回収した。菌体をPBS緩衝液（NaCl ８ｇ、KCl 0.2ｇ、Na２HPO４・12H２O 14.5ｇ、KH２PO４ １gを合計１Ｌの蒸留水中に溶解させたもの）に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを11900×ｇ、４℃で60分遠心分離し、可溶性画分と不溶性画分に分離した。【００６３】
これを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。その結果を図１１に示す。対照として泳動を行ったCrkIIに比べてバンドが高分子量側にシフトしており、リン酸化反応が行われたことが確認できる。また、非リン酸化CrkIIの分子量のところにはバンドが見られず、発現したCrkIIはほとんど全てがリン酸化されていることが確認された。【００６４】
次に、泳動後のポリアクリルアミドゲルとPVDF膜を転写用緩衝液に浸して５分ほど振盪した。転写用緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 15.14ｇ、グリシン72.07ｇを合計１Ｌの蒸留水中に溶解させたものを４Ｌとメタノール１Ｌを混合したものを用いた。次に、ろ紙を転写用緩衝液に浸し、転写装置 (Bio-Rad社)にのせる。次に、PVDF膜、ゲル、ろ紙の順に重ね、定電圧10Ｖで転写を行った。このときの電流は0.1〜0.15Ａになるように電圧を調節し、約１時間転写を行った。次に、転写後のPVDF膜をブロッキング用緩衝液に浸し、１時間ほど振盪した。その後、TBS-T緩衝液で３回洗浄した。この間にマウス抗リン酸化CrkII抗体 (Zymed社)をブロッキング用緩衝液で1000倍に希釈し、この溶液５mlにPVDF膜を浸し、１時間振盪し、TBS-Tで３回洗浄した。この間に２次抗体をTBS-T緩衝液で5000倍(anti-mouse抗体)に希釈した２次抗体液５mlにPVDF膜を浸して１時間振盪し、TBS-T緩衝液で３回洗浄した。２次抗体はPeroxidase Labeled Anti-Mouse Antibody (Santa Cruz社)を用いた。その後、ペルオキシダーゼ染色DABキット(ナカライテスク社) を用いて染色を行った。【００６５】
その結果、図１２に示すように、ＣｒｋＩＩがリン酸化されたバンドが確認された。【００６６】
比較例１
市販のAbl（New England Biolabs社、SH2ドメインとキナーゼドメインの領域のみを有する)を用いて、CrkIIのリン酸化反応を試みた。
リン酸化反応は、10mg／ml CrkII／20mM Tris-HCl/１mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、添付の10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を１mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で４日間静置することで行った。これを電気泳動装置 (日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。その結果、図１３より、対照として泳動を行ったCrkIIとバンドの位置が同じであり、リン酸化反応がほとんど行われていないことが確認された。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１２に示す。リン酸化CrkIIのバンドが検出されないことを確認した。【００６７】
比較例２
プラスミドpET-Duet-SK-CrkIIで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりCrkIIを含む画分を得た。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１２に示す。リン酸化CrkIIのバンドが検出されないことを確認した。
【実施例３】
【００６８】
本実施例では、SKP1（図２）を６×Hisタグをコードする塩基配列とのキメラタンパク質（配列番号１４）として大腸菌体内に発現させた。プラスミドpET-Duet-SKP1（図９）で大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりSKP1を含む画分を得、さらにSKP1を精製した。精製したSKP1を含む溶出画分に同体積のグリセロールを加えた。【００６９】
この様にして得られたSKP1を用いて、試験管内でCrkIIのリン酸化反応を試みた。このCrkIIには実施例１で得たCrkIIを用いた。10mg／ml CrkII／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で６時間以上静置することで行った。【００７０】
リン酸化反応を行ったCrkIIを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１４に示す。CrkIIがリン酸化されたバンドが確認された。
【実施例４】
【００７１】
本実施例では以下のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpET22-Crk-Vav(170-375)：図１５に示すCrkIIのＮ末端側SH3ドメインとHis-タグおよびプレシジョンプロテアーゼ切断配列とVavのアミノ酸配列の170番目〜375番目のアミノ酸残基（以下、Vav（170-375）とする）からなるキメラタンパク質の遺伝子（配列番号１５）を含むプラスミドである。本実施例ではVav（170-375）（配列番号１６）を基質としてリン酸化を試みた。【００７２】
（１）  プラスミドpET22-Crk-Vav(170-375)の調製
以下のプライマーを用いて得たCrkIIのＮ端側SH3ドメイン（残基番号130−198）のPCR断片を実施例１と同様の方法によりpET22に挿入する。
CCTCTAGACATATGAGGCAGGAGGAGGCGGAG  （Ｆ）（配列番号１７）
CCCTCGAGGAGCTCCGATACTGAGGCGGAGGC  （Ｒ）（配列番号１８）
pProEX HtbのTevプロテアーゼ切断サイトをQuick Change（Quiagene）を用いてあらかじめプレシジョンプロテアーゼ切断サイトに変異させておく。このベクターを以下pProEX Htb-Presと呼ぶ。pProEX Htb-Presに対して以下のプライマーを用いて得たVav（170-375）のPCR断片を挿入する。【００７３】
GCGCCATGGGGGACGAGATCTACGAGG      （Ｆ）（配列番号１９）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG  （Ｒ）（配列番号２０）
挿入したものを以下のプライマーを用いて断片を調製する。
CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC      （Ｆ）（配列番号２１）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG  （Ｒ）（配列番号２２）
これにより、pProEX Htb-Pres由来のHis−タグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトが付加したVav（170-375）をコードするDNA断片（配列番号２３）が得られる。【００７４】
上記で作成したCrkII SH3ドメインをコードするDNA断片を挿入されたpET22に対して得られたHis−タグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトが付加したVavのDNA断片を挿入することでCrkII  SH3−His−タグ−プレシジョンプロテアーゼ切断サイト−Vav（170-375）のキメラタンパク質Crk-Vav（170-375）をコードするプラスミドpET-22-Crk-Vav(170-375)（図１６）が構築される。【００７５】
VavのcDNAは既報記載の方法により調製した(Coppola J., Bryant SKoda T., Conway D., Barbacid M.;"Mechanism of activation of the vav protooncogene.";Cell Growth Differ.、第2巻、第95-105頁、1991年)。【００７６】
本実施例では、実施例３と同様の方法により精製したSKP1を用いて試験管内でCrk-Vav（170-375）のリン酸化反応を試みた。このCrk-Vav（170-375）は実施例1と同様の方法で調製した。リン酸化反応は実施例３と同様の方法により精製したSKP1を10μｌ、10mg／ml Crk-Vav（170-375）／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で４時間以上静置することで行った。
リン酸化反応を行ったCrk-Vav（170-375）を電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のCrk-Vav（170-375）と比較して移動度の変化が見られ、Vav（170-375）のリン酸化が確認された（図１７）。【００７７】
比較例４
実施例４と同じ方法でVav（170-375）（図１８）のリン酸化を行い、電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のVav（170-375）と比較して移動度の変化が見られず、Vav（170-375）のリン酸化されていないことが確認された（図１７）。
【実施例５】
【００７８】
本実施例では以下の２種のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpET−Duet−SK-SLP：図１９に示すキナーゼとSLP76由来のRxxK含有配列を含むSK-SLPをコードするDNA断片（配列番号２４）を含むプラスミドである。
２．プラスミドpET22-Grb2−CrkII：図２０に示すGrb2のＣ末端側SH3ドメインとHis−タグ、およびプレシジョンプロテアーゼ切断配列とVav（170-375）のキメラタンパク質をコードするDNA（配列番号２５）を含むプラスミドである。【００７９】
本実施例ではCrkIIを基質としてリン酸化を試みた。また、Grb2のＣ末端側SH3ドメイン（配列番号２６）がSLP76やGab1などのタンパク質に含まれるPxxxRxxK（ただしｘは任意のアミノ酸を示す）配列と特異的に結合することを利用し、SKにSLP76由来のPxxxRxxK配列を含ませ、基質タンパク質側にGrb2のＣ末端側SH3ドメインを含ませたものを作成し、リン酸化を試みた。【００８０】
（１）プラスミドpET−Duet−SK-SLPの調製
AblのcDNAと以下のプライマーを用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン、キナーゼドメイン及びSLP76由来配列を含むSK-SLPをコードするPCR断片（図１９）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（図２１、pET-Duet-SK-SLP）を得た。
CCGGATCCGAACAGCCTGGAGAAACATTCC  （Ｆ）（配列番号２７）
GCGGATCCGCGGCCGCTCACGCCGGTTTGGTGCTGCGATCAATGCTTGGGGCCTGCAGC（Ｒ）（配列番号２８）
本実施例では、SK-SLP（図２）を６×Hisタグをコードする塩基配列とのキメラタンパク質（配列番号１４）として大腸菌体内に発現させた。プラスミドpET-Duet-SK-SLPで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりSK-SLPを含む画分を得、さらにSK-SLPを精製した。精製したSK-SLPを含む溶出画分に同体積のグリセロールを加えた。【００８１】
（２）プラスミドpET22-Grb2−CrkIIの調製
以下のプライマーを用いてGrb2のＣ末端側SH3ドメイン（残基番号159−217）をコードする遺伝子断片を増幅した。
CCTCTAGACATATGACATACGTCCAGGCC  （Ｆ）（配列番号２９）
GGGAGCTCGACGTTCCGGTTCACGGGGG   （Ｒ）（配列番号３０）
pET22をNdeI／SacIで切断したベクター断片に対して上記で調製したGrb2のＣ末端側SH3ドメインのDNA断片をNdeI／SacIで切断したものを実施例１と同様の方法により挿入し、pET22-Grb2を作成した。次に、以下のプライマーを用いてPCRを行いCrkIIの遺伝子を増幅し、SacI／XhoIで処理したpET22-Grb2のベクター断片に組み込み、プラスミドpET22-Grb2-CrkIIを得た（図２２）。【００８２】
CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC     （Ｆ）（配列番号３１）
GGGCTCGAGTCAGCTGAAGTCCTCTTCGGG  （Ｒ）（配列番号３２）
得られたSK-SLPを用いて試験管内でGrb2-CrkIIのリン酸化反応を試みた。リン酸化反応は10mg／mlのGrb2-CrkII／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、SK-SLPを終濃度が0.001μMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で６時間以上静置することで行った。【００８３】
リン酸化反応を行ったGrb2-CrkIIを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のGrb2-CrkIIとの比較より移動度の変化が見られ、リン酸化が確認された（図２３）。【００８４】
比較例５
実施例５と同じ方法でSKを用いてGrb2-CrkIIのリン酸化を行った。ただし、SKは終濃度が0.1μMになるように添加した。電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のGrb2-CrkIIと比較して移動度の変化が見られず、Grb2-CrkIIのリン酸化されていないことが確認された（図２３）。
【実施例６】
【００８５】
本実施例では以下のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpTYR（図２４）：図２に示すキナーゼとプロリンリッチ配列を含むSKP1をコードするDNA断片（配列番号５）とCrkIIのSH3ドメイン−His−タグ−プレシジョンプロテアーゼ切断サイト−マルチクローニングサイトを含むプラスミドである。マルチクローニングサイトには任意のペプチドおよびタンパク質をコードする遺伝子を挿入することが可能である。【００８６】
（１）プラスミドpTYRの調製
実施例１にて作成したpET−Duet−SKP1のベクター断片に実施例４で作成したpET22- Crk-Vav(170-375)のNdeI／XhoI断片を組み込む。Quick Change（Quiagene）を用いて組み込みに用いたNdeIサイト（CATATG）の配列をCAGATGに置換し、NdeIサイトを消失させた。次にVav（170−375）をpProExHTb-Presに組み込む際に用いたNcoIサイト（CCATGG）をQuick Change（Quiagene）を用いてATATGGに置換し、新たにNdeIサイトを作成する。このプラスミドをpET−Duet−SKP1−Crkと以下呼ぶこととする。【００８７】
次に以下のマルチクローニングサイトより構成される合成遺伝子をリン酸化した後に混合して２本鎖DNA断片を調製する。
TATGGCTAGCGAATTCGTCGACCCGCGGGATATCGGTACCC    （Ｆ）（配列番号３３）
TCGAGGGTACCGATATCCCGCGGGTCGACGAATTCGCTAGCCA  （Ｒ）（配列番号３４）
pET−Duet−SKP1−CrkをNdeI／XhoIで処理したベクター断片に２本鎖化したマルチクローニングサイト断片を挿入する。【００８８】
（２）プラスミドpTYR−Vav(170-375)の調製
VavのcDNAを鋳型として以下のプライマーを用いてPCRを行い、NdeI／XhoIで処理したpTYRのベクター断片に組み込む。
GCCATATGGGGGACGAGATCTACGAGG    （Ｆ）（配列番号３５）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG（Ｒ）（配列番号３６）
実施例２と同様の方法でSKP1とCrkIIのＮ端側SH3ドメイン、６×Hisタグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトとVav（170−375）とのキメラタンパク質（配列番号３７）を大腸菌内に共発現させ、精製した。精製したキメラタンパク質を電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。実施例４にて調製した非リン酸化Crk-Vav（170-375）との間に移動度の差が見られ、リン酸化されていることが確認された（図２５）。
【実施例７】
【００８９】
（１）プラスミドpTYR（―）の作製
実施例６（１）で作成したｐTYRを(NotI/XhoI)で消化し、CrkII SH3の遺伝子を含む側の断片を、pET-Duetを(NotI/XhoI)で消化したベクター断片に組み込み、プラスミドpTYR（―）（図２６）を作製した。このプラスミドは、pTYRのキナーゼ遺伝子（SKP1）がpET-Duet由来のマルチクローニングサイトへと変換された構造を有する。【００９０】
（２）プラスミドpSH3-NMTの作製
Gloverら（Glover C.J.、”Human N-myristoyltransferase amino-terminal domain involved in targeting the enzyme to the ribosomal subcellular fraction.”;J. Biol. Chem.、第272巻、第28680-28689頁、1997年）の方法に従ってNMT1（N-myristoyltransferase）をコードするcDNAを調製した。このcDNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、NMT1の触媒ドメイン（NMT1の81番目−496番目のアミノ酸配列からなるドメイン）をコードするDNAを増幅断片として得た。
GGTCTAGACATATG AACTCTTTGCCAGCAGAGAGG  （Ｆ）（配列番号３８）
CGCCTCGAGTCATTGTAGCACCAGTCCAACC        （Ｒ）（配列番号３９）
NdeI/XhoIで消化した増幅断片を、同じくNdeI/XhoIで消化したpTYR（−）のベクターに組み込んで、pSH3-NMT（図２７）を作製した。【００９１】
（３）プラスミドpGB1-Myrの作製
プラスミドpDEST-532（geneservice社、http://www.geneservice.co.uk/)を鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、該プラスミドにあるStreptococcal proteinGのB1ドメイン（GB1ドメイン）をコードするDNAを増幅断片として得た。
GACCCATGGAGTACAAACTGATCC  （Ｆ）（配列番号４０）
GAGCTCGAGTCAGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGTTCGGTTACCGTGAAGG  （Ｒ）（配列番号４１）
また、下記の合成DNAを混合して２本鎖DNA断片を調製した。
TCTAGACATATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAG GGGCAGCAGCCTGGAAAAGTTCTTGGGGACCAAAGAAGGCCTAGTTTGGCCATGGCAC  （Ｆ）（配列番号４２）
GTGCCATGGCCAAACTAGGCCTTCTTTGGTCCCCAAGAACTTTTCCAGGCTGCTGCCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATCGTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATGTCTAGA  （Ｒ）（配列番号４３）
前記増幅断片をNcoI/XhoIで、２本鎖DNA断片をNdeI/NcoIでそれぞれ処理した両断片を、NdeI/XhoIで処理したpET22-bに組み込んで、プラスミドpGB1-Myr（図２８）を作製した。このプラスミドは、GB1ドメインのN末端側に６ｘHisタグ、TEVプロテアーゼ消化サイト及び１７アミノ酸残基からなるミリストイル化配列（Hantschel Oら、Cell、2003年、第112巻、第6号、第845-857頁）を含み、C末端側にCrkSH3の結合配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。【００９２】
（４）（２）で作製したpSH3-NMTで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、NMT1の触媒ドメインとCrkII SH3および６×Hisタグからなる融合タンパク質（配列番号４４、以下、SH3-NMTと表す）を大腸菌体内に発現させ、実施例２と同様の方法によりSH3-NMTを精製し、SH3-NMTのグリセロール溶液を調製した。また、（３）で作製したpGB1-Myrで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、６×Hisタグ、TEVプロテアーゼ消化部位、ミリストイル化配列、GB1ドメイン、CrkII SH3結合配列からなる融合タンパク質（配列番号４５）として大腸菌体内に発現させ、回収した融合タンパク質を含む画分をTEV消化して、修飾残基であるGlyがN末端に露出した融合タンパク質（以下、GB1-Myrと表す）を調製した。【００９３】
10mg/mlのGB1-Myrを含む20mM Tris-HCl/1mM EDTA/150mM NaCl (pH 7.5)100μlと比較例１で用いた10xAbl緩衝液100μlを混合し、これにミリストイル−CoA（シグマ社）を終濃度0.1mMになるように添加し、SH3-NMT/グリセロール溶液を10μlもしくは１μlもしくは０μl加え、溶液の体積を1mlになるように水で調製し、25℃で２時間インキュベートした。反応後のサンプルを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて18.8％ポリアクリルアミドゲルで泳動した（図２９）。その結果、SH3-NMTを10μl加えたものではミリストイル化に伴うバンドの変化が観測され、SH3-NMTを１μl加えたものではミリストイル化されたGB1-Myrと未反応のGB1-Myrに由来する2本のバンドが観察された。また、SH3-NMTを10μl加えたものとSH3-NMTを加えていないものの２種類のサンプルについてApplied  Biosystem社製のMASスペクトロメーターVoeagerにて質量分析を行ったところ、SH3-NMTを10μl加えたものでは分子量210の増大が見られ、GB1-Myr（理論分子量9036.7、実測分子量9038.1625）がミリストイル化されている（理論分子量9246.7、実測分子量9248.4779）ことが確認された。
【実施例８】
【００９４】
Chernoffらの方法（Chernoff J., Schievella A.R., Jost C.A., Erikson R.L., Neel B.G.;"Cloning of a cDNA for a major human protein-tyrosine-phosphatase.";Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2735-2739(1990)）に従って、ヒトPTB-1B（human protein-tyrosine-phosphatase）をコードするｃDNAを調製した。このｃDNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、PTP-1BのphosphataseドメインをコードするDNAを、増幅断片として得た。
GCGCCATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC  （Ｆ）（配列番号４６）
AGACTCCAGGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGGTCCTCGTGGGAAAG  （Ｒ）（配列番号４７）
得られた増幅断片をNcoI/XhoIで処理し、同じくNcoI/XhoI処理したpET21-dに組み込んで、プラスミドｐPTP1B-PxxP（図３０）を作製した。このプラスミドは、ヒトPTP-1B tyrosine phosphataseの触媒ドメイン（PTB-1Bの１−300番目のアミノ酸配列からなるドメイン）のC末端側にCrkII SH3の結合配列および６×Hisタグを含む融合タンパク質（配列番号４８、以下、PTP-1B-PxxPと表す）を発現する。【００９５】
pPTP-1B-PxxPで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、実施例２と同様の方法によりPTP-1B-PxxPをグリセロール溶液として精製した。実施例２の方法により調製したリン酸化CrkIIを10mg/ml含む20mM Tris-HCl/1mM EDTA/150mM NaCl (pH 7.5)100μlと、比較例１で用いた10×Abl緩衝液100μlとを混合し、これにPTP-1B-PxxP/グリセロール溶液を10μlもしくは１μlもしくは０μl加え、溶液の体積を1mlになるように水で調製し、25℃で２時間インキュベーションした。反応後のサンプルを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した（図３１）。その結果、PTP-1B-PxxPを10μl加えたものでは脱リン酸化に伴うバンドの変化が観測され、PTP-1B-PxxPを１μl加えたものでは脱リン酸化されたリン酸化CrkIIと未反応のリン酸化CrkIIに由来する2本のバンドが観察された。また、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった（図３２）。その結果、PTP-1B-PxxPを10μl加えたものではリン酸化されたCrkIIのバンドの消失が確認され、PTP-1B-PxxPを１μl加えたものではバンドが薄くなっているのが確認され、脱リン酸化が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、タンパク質間相互作用というごくありふれた現象を用いることでタンパク質の修飾反応を効率的に行う上で画期的な手法である。例えば、通常の方法では全くリン酸化されなかったケースにおいても、基質タンパク質とキナーゼの間にタンパク質間相互作用を発生させることで両者の親和性を高め、それにより少ない酵素量で効率的に基質タンパク質をリン酸化することができる。リン酸化は細胞内及び細胞間のシグナル伝達において重要な過程であり、リン酸化タンパク質を効率的に生産することのできる本発明の方法により、リン酸化タンパク質の利用促進あるいは生体反応の誘導を制御することができる。
すなわち、細胞内にキナーゼ又は基質タンパク質を導入し、細胞内で効率的にリン酸化を行うことでリン酸化を介したシグナル伝達の人為的な制御を可能ならしめる遺伝子治療や、リン酸化反応の制御薬のスクリーニング、医療や産業上有用なリン酸化タンパク質の効率的生産等への応用も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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